Aislamiento, Identificación Y Caracterización Ecológica De Nematodos Entomopatógenos De La Rioja

Zubía 23-24 27-58 Logroño 2005-2006

AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN ECOLÓGICA DE NEMATODOS ENTOMOPATÓGENOS DE LA RIOJA

Raquel CAMPOS-HERRERA*1,2 Miguel ESCUER* Sonia LABRADOR* Carmen GUTIÉRREZ*2

Resumen El ecosistema edáfico es un sistema complejo con un alto grado de diversidad, donde los organismos interactúan en complejas redes tróficas de las que depende la productividad de los ecosistemas naturales y agrarios. El aislamiento, identificación y estudio bioecológico de algunos de estos organismos puede proporcionar las bases para desarrollar nuevas tecnolo- gías para el control de insectos plaga. La finalidad de este estudio es realizar las investigaciones básicas para identificar las poblaciones autóctonas de nematodos entomopatógenos (NEPs) de La Rioja que proporcionen las bases para su desarrollo como productos de biocontrol, compatibles con el medioambiente. Se estudió la distribución, frecuencia de recuperación y abundancia de los NEPs en los tipos de hábitat naturales y márgenes de los cultivos más representativos de La Rioja y el efecto de las variables ambientales, de vegetación y edáficas en las poblaciones de NEPs en quinientas muestras de suelo procedentes de cien localidades, utilizando la técnica de la trampa de Galleria. La presencia de NEPs fue registrada en un 14% de las localidades y en un 5,4% de las muestras estudiadas, identificándose un total de 11 poblaciones de Steinernema feltiae, 2 de S. kraussei y 2 de S. carpocapsae. El género Heterorhabditis no fue recuperado en este estudio.

* Departamento de Agroecología, Centro de Ciencias Medioambientales, CSIC. C/ Serrano 115 Dpdo, 28006, Madrid, España. Tlf: 91 745 25 00, fax: 91 564 08 00. 1. Investigador agregado del IER, Área de Recursos Naturales. 2. Autores para la correspondencia: - Carmen Gutiérrez: e-mail de contacto: [email protected] - Raquel Campos-Herrera: e-mail de contacto: [email protected] Artículo presentado en formato resumido en el XXVII European Society of Nematologysts (ESN) Internacional Symposium, celebrado del 14 al 18 de junio de 2004 en Roma (Italia), bajo el título “Distribution of entomopathogenic nematodes in La Rioja, Spain”, de los mismos autores. Subvenciones: • Ayuda para la realización de estudios de temática riojana convocatoria de 13 de junio de 2002, BOR nº 72. • Proyecto CICYT, Plan Nacional De Recursos Naturales 2002, REN2002-02550/ GLO. • Beca FPU del Ministerio de Educación, Cultura y Deportes (2002-2005).

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Se observó una mayor presencia de NEPs en las zonas de márgenes de cultivo de tipo anual, aunque esta tendencia no resultó estadísticamente significativa ni en el estudio de la abundancia ni en la frecuencia de recupe- ración, sugiriéndose un incremento del esfuerzo de muestreo para mejorar el análisis estadístico. Palabras clave: Steinernema carpocapsae, Steinernema feltiae, Steiner- nema kraussei, distribución, agricultura ecológica, España, La Rioja.

The soil ecosystem is complex with a large degree of biodiversity. Orga- nisms interact in complex trophic webs, which depend on the productivi- ty of natural and agricultural ecosystems. The isolation, identification and bioecological study of some of these organisms could lead to the development of new technologies for insect pest control. The aim of this study is to perform basic studies to isolate native strains of entomopathogenic nematodes (EPNs) from La Rioja, which provide a basis for the development of biocontrol agents which are environmentally friendly. We studied the distribution, recovery frequency and abundance of EPNs in natural habitats and crop field edges, taking into account environmental, vegetation and soil variables. Five hundred soil samples from hundred sites were assessed for the occurrence of EPNs using the Galleria baiting technique. Entomopathogenic nematodes were recorded from 14% sites and 5.4% samples, and they were identified 11 Steinernema feltiae strains, 2 S. kraussei strains and 2 S. carpocapsae strains. Heterorhabditis genus was not recovered in this survey. It was observed higher EPN occurrence in annual crops field edges, although this trend was not statistical significant neither abundance nor recovery frequency study. Increasing sample effort is suggested to improve the statistical analysis. Key words: Steinernema carpocapsae, Steinernema feltiae, Steinernema kraussei, distribution, organic agriculture, Spain, La Rioja. 0. INTRODUCCIÓN El grave impacto ambiental y sanitario ocasionado por la utilización indiscriminada de fitosanitarios de síntesis en la agricultura convencional (Edwards, 1993; Georghiou, 1990; Metcalf, 1993), ha dado lugar a que la Unión Europea trate de adaptar su producción agrícola a la de la agricultura sostenible, cuyo objetivo es producir alimentos de calidad a un costo acep- table para la sociedad y el medioambiente (Wijnands y Kroonen-Backbier, 1993). Este sistema de producción evita, en el caso de la agricultura ecológi- ca, o restringe, en el caso de la producción integrada, la utilización de fitosanitarios, y se basa en el uso de prácticas agrícolas tales como la rotación de cultivos, la utilización de variedades resistentes y fechas de siembra, el empleo de fertilizantes orgánicos y residuos de restos de cosecha, el manejo de enemigos naturales, etc., con el fin de mantener la producción, la estructura y fertilidad del suelo y controlar las plagas de insectos. En la actualidad se están desarrollando nuevas tecnologías con gran potencial para el control de insectos que se basan en la búsqueda de enemigos

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naturales como virus, bacterias, hongos y nematodos, producción masiva de los mismos y desarrollo de formulaciones para su aplicación en campo. De estos grupos, los nematodos entomopatógenos (NEPs) están considerados actualmente como una de las alternativas con más futuro para el control de insectos ya que poseen características comunes a depredadores, parasitoi- des y patógenos (Gaugler y Kaya, 1990; Poinar, 1990). Estos organismos son capaces de localizar activamente a su hospedador, resultan muy virulentos a muchas especies de insectos provocando su muerte en 24-48 horas, tienen un alto potencial reproductivo, pueden criarse masivamente in vitro, son fáciles de aplicar y no presentan riesgos sanitarios ni medioambientales. Los NEPs se incluyen en las familias Steinernematidae y Heterorhabdi- tidae, que presentan una asociación simbióntica con bacterias entéricas de los géneros Xenorhabdus y Photorhabdus, respectivamente, que les confiere una gran virulencia frente a insectos (Boemare, 2002; Boemare et al., 1997). Los juveniles infectivos que se corresponden al tercer estadío juvenil (J3), se encuentran de forma natural en el suelo. Cuando localizan a un insecto hospedador, penetran por los orificios naturales (boca, ano y espiráculos), hasta localizar el hemocele donde liberan la bacteria simbionte que portan en la parte anterior del tubo digestivo. La bacteria digiere los tejidos del insecto, se multiplica y provoca su muerte por septicemia. El nematodo se alimenta de los tejidos degradados, completa su desarrollo y se reproduce durante 2 o 3 generaciones dentro del hospedador en función del alimento disponible. Los juveniles infectivos (JIs) de la última generación vuelven a incorporar las bacterias en su tubo digestivo y salen al exterior en busca de un nuevo hospedador (Adams y Nguyen, 2002; Boemare, 2002). La supervivencia, virulencia y potencial reproductivo de estos organismos son características que dependen de la especie e incluso de la pobla- ción, estando además influenciadas por las condiciones ambientales (Ehler, 1990). Por ello, el aislamiento e identificación de poblaciones autóctonas de NEPs adaptadas a las condiciones locales es considerado una parte esencial dentro de los estudios encaminados a su utilización como agentes de biocontrol (Bedding,1990). Además se evitarían los desequilibrios ecológicos que pudiesen ocasionarse al introducir NEPs foráneos que podrían afectar a otros organismos del suelo o desplazar parcial o totalmente a los NEPs autóctonos (Bathon, 1996; Ehlers y Hokkanen, 1996; Lynch y Thomas, 2000; Millar y Barbercheck, 2001). Estudios recientes muestran que los NEPs tienen una distribución mundial, aunque no han podido detectarse en la Antártida (Adams et al., 2006; Griffin et al., 1990; Hominick, 2002). Las especies identificadas en España se corresponden con Steinernema feltiae, S. carpocapsae, S. affine, S. kraussei, una especie del grupo de S. glaseri y Heterorhabditis bacteriophora en Cataluña (De Doucet y Gabarra, 1994; García del Pino y Palomo, 1996a, b; García del Pino, 2005), S. feltiae y S. arenarium (= anomali) en Salamanca (García del Pino, 1994; García del Pino y Palomo, 1995), y una especie del grupo de S. bicornotum, Steinernema spp. y Heterorhabditis spp. en Cana- rias (García del Pino, 2005; García del Pino y Palomo, 1996c; Nogueroles et

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al., 1992). Recientemente, se ha descrito el aislamiento directo de una pobla- ción de S. feltiae a partir de una agregado de larvas de Bibio hortulanus L. (Diptera: Bibionidae) en La Rioja (Campos-Herrera et al., 2006a). En nuestro país, se han realizado diversos estudios sobre la utilidad de los NEPs en el control biológico de insectos (De Doucet y Gabarra, 1994; García del Pino, 1988, 1994; García del Pino y Morton, 2005; Jiménez, 2002; Jiménez et al., 2002; Santos Lobatón et al., 1998), su tolerancia a insecticidas (García del Pino y Jové, 2005; Palomo y García del Pino, 2000) y su foresis mediante lombrices de tierra (Campos-Herrera et al., 2006b). Los estudios encaminados a conocer la ecología de los NEPs en España son escasos (García del Pino y Palomo, 1996a, 1997), y sin embargo aportan una valiosa información para estimar su eficacia como agente de biocontrol en condiciones de campo, por lo que es aconsejable realizar este tipo de investigaciones cuando se realiza el aislamiento de poblaciones autóctonas. En La Rioja, la agricultura convencional es mayoritaria, aunque en los últimos años se está incrementando la superficie de producción en manejo ecológico. Por tanto, proporcionar las herramientas adecuadas para combatir las plagas resulta determinante para su consolidación y expansión. Teniendo en consideración la eficacia demostrada por los NEPs en el control de insectos, el auge mundial de su estudio para su integración en programas de control biológico, y dado el desconocimiento general sobre este tema en la región, con la excepción de la publicación reciente sobre un aislamiento directo (Campos-Herrera et al., 2006a), con este trabajo se pretende realizar las investigaciones necesarias para el aislamiento, identificación y caracterización ecológica de los NEPs de La Rioja como base para el desarrollo, producción y formulación de nuevos bioinsecticidas adaptados a las condiciones locales. 1. MATERIAL Y MÉTODOS 1.1. Toma de muestras de suelo Las muestras de suelo se tomaron de Marzo a Abril de 2003, ya que García del Pino y Palomo (1997) observaron fluctuaciones en la presencia de NEPs en Cataluña a lo largo del año y algunos autores han sugerido que durante la primavera se registran los valores más elevados (Mrá#ek, 1980; Puza y Mrá#ek, 2005; Rio y Cameron, 2000). Se seleccionaron 100 localidades distribuidas en las tres regiones bioclimáticas de La Rioja: oro-, supra- y mesomediterránea, que incluyen 10 series de vegetación potencial (Rivas- Martínez, 1987, Rivas-Martínez et al., 2001, 2002) y 11 tipos de suelo (Soil Survey Staff, 1994) (Figura 1). La selección de la zona para la toma de muestras dentro de cada localidad se ha realizado siguiendo las recomendaciones de Hominick (2002). La vegetación real observada en cada localidad (prado, matorral o bosque) se asoció a tres grupos de intensidad de manejo agríco- la: zona natural (nula intensidad), margen de cultivo de tipo perenne (frutal, olivo y viña) (media intensidad) y margen de cultivo de tipo anual (cereal y hortícola) (alta intensidad). De cada localidad de muestreo se registraron las coordenadas UTM (GARMIN® GPS 12 Personal Navigator), la altitud y el tipo de zona (natural o margen de cultivo), determinado la temperatura y

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Figura 1. Mapas de La Rioja. A. Series de vegetación potencial: 1, Vaccinio myrtilli-Junipereto nanae S., 2, Ilici-Fageto S., 3, Festuco heterophyllae- Querceto pyrenaicae S., 4, Luzulo forsteri-Querceto pyrenaicae S., 5, Junipero oxycedri-Querceto rotundifoliae S., 6, Cephalanthero longifoliae-Querceto faginiae S., 7., Junipero thuriferae-Querceto rotundifoliae S., 8., Spiraeo obovaeta-Quercetum rotundifoliae S., 9, Asparago acutifolii-Quercetum rotundifoliae S., 10, Rhamno lycioidi-Querceto cocciferae S. B. Tipo de suelo: 1. Calcisol háplico, CLh, 2.Cambisol Calcárico, CMc, 3. Cambisol Dístrico, CMd, 4. Fluvisol Calcárico, FLc, 5. Leptosol Litico, LPq, 6. Leptosol Renzico, LPk, 7. Luvisol Calcárico Crómico, LVkx, 8. Phaeozems Calcárico, PHc, 9. Regosol Calcárico, RGc, 10. Regosol Dístrico, RGd, 11. Cambisol Húmico, Mu.

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precipitación media anual (TMA y PMA, respectivamente) según los mapas del Gobierno de La Rioja (2001a, b). También se incluyeron las característi- cas de vegetación potencial y real de la zona, así como el tipo de suelo (Soil Survey Staff, 1994), de forma que se obtuviera una visión completa de las características ambientales de cada punto en estudio (Tabla 1). En cada una de las localidades, se establecieron 5 unidades de muestreo (A-E), separadas 2 m a lo largo de un transepto lineal y cada una enu- merada de forma consecutiva de la A a la E. En cada unidad de muestreo se tomó una muestra de suelo de aproximadamente de 1 kg, tomada a una profundidad de 2-20 cm. Las muestras de suelo se recogieron en bolsas de polietileno para evitar la pérdida de humedad y se llevaron al laboratorio en contenedores aislados térmicamente. Las muestras se almacenaron en el laboratorio a 15 ºC hasta que fueron procesadas, no transcurriendo más de 15 días desde su llegada al laboratorio hasta que terminó su análisis. De cada muestra de suelo se tomaron 200 g para determinar el contenido en humedad, pH y el porcentaje de arena, limo y arcilla. Cada unidad de muestreo fue tratada individualmente tanto para el aislamiento de NEPs como para el análisis del suelo, contabilizándose un total de 500 muestras de suelo.

Ta b l a 1 Ca r a ct e r í s t i c a s a m b i e n t a l e s d e l a s l o c a l i d a d e s c orrespondien t e s a z o n a s n a t u r a l e s y m á r g e n e s d e c u l t i v o s e n La Ri o j a Media anual Región Serie de Número Vege- Tipo de Vegeta- de loca- Altitud Tempera- Precipi- bioclimá- tación Suelob ción realc lidades (msnm) tica a tura del tación Potencial (réplicas) aire (ºC) (mm) Oromedi- terráneo 1 RGd Np 2 1700-1800 5-6 1000-1100 Suprame- diterráneo 2 CMc Np 1 1000-1600 6-9 800-1000 CMd Nb 6 RGd UM 3 CMc Np 1 900-1100 7-10 700-900 CMd Nm 1 UM Nb 2 Nmp 4 Nbm 2 4 CMc Np 1 700-1100 9-11 500-700 CMd Nm 2 CLh Nmp 2 PHc Nbm 5 RGd Ap 3 UM Pm 1 5 CMc Nm 1 700-1000 9-11 500-600 CMd Nmp 2

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PHc Nbm 2 Ap 1 Amp 2 Pm 1 Pmp 1 6 CMc Nm 1 600-900 9-12 400-700 LPq Nmp 2

LPk Nbm 1 LVkx Ap 5 PHc Amp 5 RGc Am 1 RGd 7 CLh Nmp 3 700-800 10-12 300-600 CMc Am 3 PHc Pp 1 RGc Pm 1 RGd Pmp 1 8 PHc Nm 1 600-700 12 400-500 Am 1 Mesome- diterráneo 9 CLh Nm 1 400-700 12-13 400-500 FLc Ap 6 LPq Amp 3 LVkx Abm 5 PHc Pp 5 RGc Pm 2 RGd Pmp 3 10 CLh Ap 1 300-400 13 300-400 FLc Amp 2 LVkx Pp 2 RGc Pmp 1 a Series de Vegetación potencial: 1, Vaccinio myrtilli-Junipereto nanae S., 2, Ilici-Fageto S., 3, Festuco heterophyllae- Querceto pyrenaicae S., 4, Luzulo forsteri-Querceto pyrenaicae S., 5, Junipero oxycedri- Querceto rotundifoliae S., 6, Cephalanthero longifoliae-Querceto faginiae S., 7., Junipero thuriferae- Querceto rotundifoliae S., 8., Spiraeo obovaeta-Quercetum rotundifoliae S., 9, Asparago acutifolii-Quer- cetum rotundifoliae S., 10, Rhamno lycioidi-Querceto cocciferae S. b Tipos de suelo: Calcisol háplico, CLh, Cambisol Calcárico, CMc, Cambisol Dístrico, CMd, Fluvisol Cal- cárico, FLc, Leptosol Litico, LPq, Leptosol Renzico, LPk, Luvisol Calcárico Crómico, LVkx, Phaeozems Calcárico, PHc, Regosol Calcárico, RGc, Regosol Dístrico, RGd, Cambisol Húmico, CMu. c Tipos de vegetación real según el código según su naturaleza: área natural, N, margen de cultivo anual, A, margen de cultivo perenne, P; y según la estructura de la vegetación, prado, p, matorral, m y bosque, b.

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1.2. Aislamiento de las poblaciones de nematodos entomopató- genos El aislamiento de NEPs se realizó mediante el método de la “Trampa de Galleria” (Bedding y Akhurst, 1975). Para ello, las muestras de suelo se dejaron a temperatura ambiente durante 24 h y se homogeneizaron antes del análisis. De cada muestra de suelo, se prepararon tres réplicas dispo- niéndolas en placas de Petri de 9 cm de diámetro (Stuart y Gaugler, 1994). La humedad fue corregida, en los casos en los que fue necesario añadiendo agua mQ (Milli-Q Water System, Millipore S.A. Molsheim, France). En la superficie de cada placa se depositaron diez larvas de último estadío de Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae). Las placas se cerraron y se incubaron invertidas en cámara de ambiente controlado a 24 ± 1 ºC, 55% de humedad y sin fotoperiodo durante 6 días. Transcurrido ese periodo, las larvas encontradas muertas fueron lavadas y depositadas individualmente en placas de Petri de 5 cm de diámetro con papel de filtro húmedo sobre un soporte que le permita estar en contacto con una película de agua mQ depositada en la base de la placa, de forma que los JIs que salgan del cadá- ver se desplacen activamente hasta el agua (White, 1927). En caso de que los resultados del aislamiento fueran negativos, el ensayo se repitió una vez más extrayendo otras tres réplicas de la muestra de suelo para confirmar los resultados (Hominick, 2002). Los JIs que emergieron del cadáver, fueron multiplicados en nuevas larvas de G. mellonella para producir nematodos su- ficientes para su identificación y mantenimiento en el laboratorio, utilizando la técnica de producción in vivo de Woodrig y Kaya (1988) modificada. Para ello, se depositan 5 larvas de último estadío de G. mellonella en placas de Petri de 5 cm de diámetro, forradas ambas partes con discos de papel de filtro a los que se les añaden 300 µl de una suspensión de 6.542 JIs/ml del aislado que se desea multiplicar, de forma que se obtenga una concentración de 100 JIs/cm2. En todos los casos, siempre se realizaron dos inoculaciones por cada población de NEPs para evitar la pérdida de la población. Las placas se etiquetan con la fecha en la que se produce la muerte de las larvas durante el aislamiento, la población de NEPs que contienen y se incuban en las condiciones señaladas anteriormente. A los 2-3 días se extraen las larvas muertas y se lavan en agua destilada. Los JIs son recolectados mediante el método de White (1927), descrito anteriormente. 1.3. Distribución de los nematodos entomopatógenos de La Rioja La presencia de NEPs en la Rioja se analizó en función del tipo de vegetación real asociada en cada localidad: áreas naturales (nº de localidades = 43) y márgenes de cultivos (nº = 57), de los cuales se estudiaron 38 correspondientes a cultivos anuales (cereal y hortícola) y 19 a cultivos perennes (frutal, olivo y viña) que conforman tres unidades experimentales que definen distintos grados de presión antrópica. Se valoró la frecuencia de recuperación (nº muestras positivas/nº muestras totales) y la abundancia (nº localidades positivas/nº localidades totales) (Liu y Berry, 1995). El estudio de las diferencias estadísticas en la frecuencia de recuperación y la

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abundancia de los NEPs en los tres hábitat considerados (natural, margen de cultivos anuales y margen de cultivos perennes) se realizó mediante una prueba de Chi-cuadrado de Pearson a un nivel de significación de p ≤ 0,05, utilizando el programa estadístico SPSS (SPSS, 2003). La distribución espacial de los NEPs en cada uno de los transeptos que resultaron positivos para su presencia se analizó mediante un estudio cuantitativo, en el que se evaluó el porcentaje de mortalidad larval de G. mellonella medio en cada una de las muestras del transepto, calculando los valores descriptivos (media y desviación típica) de las tres réplicas estudiadas. Además, se calculó dicho valor para cada unidad experimental (zona natural, margen de cultivo anual y margen de cultivo perenne). 1.4. Identificación de los nematodos entomopatógenos Para la determinación taxonómica de NEPs se observaron los machos de la primera generación (MPG), que fueron obtenidos a partir de disección de larvas de G. mellonella tras 3-4 días de su exposición a los JIs, así como los JIs (Adams y Nguyen, 2002; Hominick et al., 1997; Stock et al., 2000). De forma excepcional, se han realizado preparaciones de algunas hembras para verificar los caracteres que en ocasiones son requeridos en las claves dicotómicas o que pueden proporcionar más información cuando la identi- ficación es dificultosa. Los nematodos fueron fijados y procesados siguiendo la metodología propuesta por Gómez et al. (2004) y Steinhorst (1966). Se realizó la observación y biometría de un total de 25 M1G y 25 JIs, así como algunas H1G, en cada población de referencia, utilizando un microscopio óptico Leica DML provisto con interferencia diferencial y cámara clara (Nor- marsky, 1955). Las medidas realizadas para el estudio de los machos y de los juveniles se muestran en la Tabla 4. También se han realizado fotografías con el microscopio óptico de aquellas regiones más relevantes en el estudio de los M1G, H1G y de los JIs. El estudio de los detalles de la morfología de la región caudal de los M1G, como la presencia y disposición de las papilas genitales, y el recuento de las bandas laterales de los juveniles se realizó mediante la observación de los ejemplares en un microscopio electrónico de barrido. Los ejemplares a estudiar se mantienen en fijador I hasta el momento de su estudio, en el que se preparan in situ, mediante su congelación con nitrógeno líquido (Crio-SEM) sin ningún tratamiento físico-químico previo (Robards y Wilson, 1993). Para su observación se siguió el protocolo descrito por Aballe et al. (1996) utilizando un microscopio electrónico de barrido marca Zeiss DSM 960, equipado con Crio-SEM modelo Crio CT 1500 Oxford G, a 5-10 kV. 1.5. Tendencias ecológicas de los nematodos entomopatógenos en La Rioja Se determinaron las condiciones ambientales y físico químicas del suelo en donde fueron aisladas las poblaciones de NEPs autóctonas de La Rioja. Las tendencias ecológicas de estos organismos en La Rioja se determinaron a partir de la evaluación de la relación entre las variables ambientales y

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físico-químicas del suelo con las especies de NEPs encontradas mediante un análisis multivariante CAPTA (del inglés, Categorical Principal Compo- nents Analysis, análisis de componentes principales para datos categóricos). El análisis aporta valores de correlación entre las variables en estudio de forma que cuanto más se aproxime este valor a 1 en valor absoluto, mayor es la relación entre ambas variables, de forma positiva o negativa. El análisis estadístico de los resultados fue realizado mediante el programa estadístico SPSS (SPSS, 2003). 2. RESULTADOS 2.1. Distribución de los nematodos entomopatógenos de La Rioja Se aislaron NEPs en un 14% de las localidades muestreadas y en un 5,4% de las muestras estudiadas. La situación de las localidades positivas se muestran en la Figura 2 y la caracterización ambiental y físico-química de cada localidad positiva se muestra en la Tabla 2. Se han aislado NEPs en muestras de suelo de diferentes localidades, registrándose la presencia de

Figura 2. Mapa de la distribución de los puntos de muestreo, indicando mediante símbolos la presencia (•) o ausencia (o) de nematodos entomopatógenos. Los números se corresponden con el código establecido para la localidad de muestreo, mostrándose únicamente aquellas localidades que fueron positivas para la presencia de NEPs, que a su vez coinciden con los valores presentados en la Tabla 2. Este número se mantuvo como código de identificación de las poblaciones de NEPs obtenidas.

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7,7 7,9 5,3 5,7 7,9 8,3 6,6 7,8 4,9 6,0 7,1 7,6 7,9 6,5 pH Características físico-químicas o d o s t 17 21 9,6 9,7 7,1 dad n e m a 20,4 38,9 20,6 35,2 29,6 42,8 11,9 14,9 13,5

% Hume - o n c

d Pp Pp Pp Ab Ap Ap Ap Nb Np Nm Nbp Abm Amp Nbm real - Vege tación a l i d a d e s c c l o

8 1 1 2 1 3 3 9 8 2 10 11 10 10 l a s Suelo

Tipo de Tipo d e

2 a b c 5 9 4 9 2 4 1 7 4 3 6 6 6 6 a b l a T - Vegeta tencial q u í m i - ción Po - o c A f í s i

500 500 400 400 600 500 700 700 500 400 500 500 y 1000 1100 PM (mm)

a l t Características ambientales 6 5 9 9 10 10 12 12 10 11 11 11 11 11 a m b i e n

TM A (°C) i ó n c 494 699 812 695 785 686 916 639 602 677 651 ltitud 1569 1754 1115 e r i z a A (msnm) ct a r a c

TM U i ó n 4689665 c y: 4670438 y: 4671463 y: y: 4683256 y: y: 4684873 y: y: 4660706 y: y: 4693638 y: y: 4678707 y: y: 4689688 y: y: 4686463 y: y: 4699437 y: y: 4707432 y: x: 0585610 x: 0567712 x: y: 4701270 y: x: 0564669 0564669 x: y: 4698908 y: x: 0564420 0564420 x: x: 0516579 0516579 x: x: 0500564 0500564 x: x: 0522823 0522823 x: x: 0506143 0506143 x: x: 0503815 0503815 x: x: 0500764 0500764 x: x: 0498205 0498205 x: x: 0504346 0504346 x: X: 0509965 0509965 X: (Zona 30T) x: 0504908 y: 0504908 y: x: a l i z a

c o L Ocón Yerga Santo Santo Arriba Grañón Pipaona Préjamo Villarejo Domingo Domingo Localidad Ruedas de Ochánduri Pazuengos Santurdejo Camprovín Viniegra de Valdezcaray a 17 23 37 38 58 63 66 75 88 89 91 96 98 100 Codigo a: nº de localidad en el muestreo, cuya situación se corresponde con la Figura 2. a: nº de localidad en el muestreo, de la figura 1.A. b: nº correspondientes con la leyenda de la figura 1.B. c: nº correspondientes a la leyenda b. m y bosque, p; matorral, prado, P y según la estructura perenne, de la vegetación, de cultivo A; margen anual, de cultivo real según su naturaleza:N ; margen área natural, de vegetación Tipo d:

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NEPs en las tres regiones bioclimáticas estudiadas (oro-, supra- y mesome- diterráneas), aunque de forma mayoritaria en la región mesomediterrénea, probablemente debido a su mayor extensión con relación a las otras dos regiones. De las localidades positivas para la presencia de NEPs, el 35,7% corresponden a zonas naturales (prado, matorral y bosque), el 42,9% a zonas de márgenes agrícolas de cultivos anuales (prado, matorral y bosque) y un 21,4% a márgenes de cultivos perennes (prado). En cuanto a las muestras positivas, el 44,4% del total lo fueron tanto para las zonas naturales como en los márgenes de cultivos anuales, mientras que sólo un 11,2% lo fueron para los márgenes de cultivos perennes. Los resultados de la abundancia y la frecuencia de recuperación en fun- ción del número de localidades muestreadas para cada tipo de hábitat, se muestran en la Tabla 3. Se observó que, en el caso de la abundancia, tanto los márgenes de cultivos anuales como los de cultivo perenne, alcanzan un valor de 0,158, superior al estimado para las zonas naturales, que fue de 0,116. Sin embargo, no existieron diferencias estadísticamente significativas entre la abundancia de los tres tipos de hábitat (Chi2-Pearson = 0,353; gl = 2; p = 0,868). En el caso de la frecuencia de recuperación, el mayor valor fue registrado en los márgenes de cultivos anuales (0,063), seguido de las zonas naturales (0,056) y por último por los márgenes de cultivos perennes (0,032), aunque las diferencias entre los tipos de hábitat tampoco fueron estadísticamente significativas (Chi2-Pearson = 1,261; gl = 2; p = 0,556). Ta b l a 3 Ab u n d a n c i a y f r e c u e n c i a d e r e c u p e r a c i ó n d e n e m a t o d o s e n t o m o p a t ó g e n o s e n d i f e r e n - t e s t i p o s d e h á b i t a t d e La Ri o j a . Localidades Muestras Frecuencia Re- Hábitat Abundanciaa Total Positivos Total Positivas cuperaciónb Natural 43 5 0,116 215 12 0,056 Margen Anual 38 6 0,158 190 12 0,063 Margen Perenne 19 3 0,158 95 3 0,032 a: nº localidades positivas /nº localidades totales b: nº muestras positivas/nº muestras totales La distribución espacial de los NEPs en el suelo presentó una gran heterogeneidad en los tres tipos de hábitat estudiados. Las localidades correspondientes para la zona natural fueron las codificadas como 37, 58, 66, 88 y 89. El porcentaje de mortalidad larval medio para la zona natural fue de 3,2 ± 2,68%, registrándose el mayor porcentaje de mortalidad larval en la muestra 88C (16,7± 15,30%). Las localidades positivas para el margen de tipo perenne fueron la 17, 23 y 75. El porcentaje de mortalidad medio para este tipo de zona fue de 2,2 ± 1,02% y el mayor valor de porcentaje de mortalidad larval fue registrado en la muestra 75C (16,7± 28,90%). Por último, las localidades positivas para el margen de cultivo de tipo anual fueron las codificadas como 38, 63, 91, 96, 98 y 100.E l porcentaje de mortalidad larval medio fue de 10,4 ± 15,90% y el mayor valor de porcentaje de mortalidad larval fue registrado en la muestra 96C (96,3 ± 6,40%).

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2.2. Identificación de las poblaciones de nematodos entomopa- tógenos Se han aislado un total de 27 muestras positivas para NEPs y se han identificando 20 de ellas a nivel específico (74,1%). La identificación del resto no fue posible debido a que los aislados no se pudieron mantener en condiciones de laboratorio para obtener el material suficiente para proceder a su identificación morfológica, aunque fue posible la observación de M1G y H1G en el interior de las larvas de G. mellonella parasitadas por los NEPs no identificados y la emergencia de JIs del cuerpo del cadáver. Basándose en las características morfológicas y morfométricas estudiadas en el microscopio óptico y el microscopio electrónico de barrido, se identificaron 11 muestras correspondientes a S. feltiae (Filipjev) Wouts, Mrá#ek, Gerdin and Bedding, 1982 (Figura 3 y Figura 6.A, B), 2 muestras correspondientes a S. kraussei (Steiner) Travassos 1927 (Figura 4 y Figura 6.C, D) y 7 muestras correspondientes a S. carpocapsae (Weiser) Wouts, Mrá#ek, Gerdin and Bedding, 1982 (Figura 5 y Figura 6.E, F). Para establecer el número de poblaciones autóctonas de las especies de NEPs aisladas en La Rioja, se determinó que en aquellas localidades en las que varias muestras fueron positivas para la misma especie, se consideró que se trataba de la misma población, más ampliamente distribuida. Por lo tanto, el número total de poblaciones autóctonas obtenidas a partir del estudio de NEPs en esta re- gión fue de 15, correspondientes a 11 de S. feltiae, 2 de S. carpopcasae y 2 de S. kraussei. En la Tabla 4 se presentan los valores correspondientes a la morfome- tría característica de cada especie obtenidos a partir de las poblaciones estudiadas, tomando en consideración una población de referencia por especie: la 63 para S. feltiae, la 58C para S. kraussei y la 96 para S. carpocapsae. Los JIs de las especies S. feltiae y S. kraussei poseen una morfología y morfo- metría similar. Sin embargo, S. feltiae se caracteriza por presentar los JIs una longitud del cuerpo ligeramente menor y ocho bandas laterales en la región media ventral (Figura 6.B). Los MPGs presentan mayor longitud total del cuerpo, una espícula alargada y de gran tamaño (75 µm) y un mucrón pro- minente (Figura 3.C). La longitud total del cuerpo de los JIs de S. kraussei es ligeramente superior a los de S. feltiae y presentan ocho bandas laterales, aunque en la Figura 6.D sólo son visibles las cuatro bandas impares debido a que éstas están replegadas sobre las pares. Los MPGs de S. kraussei son más pequeños que los machos de S. feltiae, siendo además la forma de la espícula diferente, menor su longitud (57 µm), por lo que el valor del índice SW en S. kraussei (1,56) es menor que el obtenido para S. feltiae (1,91). Sin embargo, el mucrón es ligeramente inferior que el de S. feltiae (Figura 4.C). La vulva de las hembras de S. kraussei presenta la particularidad de que uno de los labios está cabalgando ligeramente sobre el otro (Figura 4.E). Los JIs de S. carpocapsae se caracterizan por ser de pequeño tamaño y presentan seis bandas laterales (Figura 6.F). Los MPGs tienen un tamaño similar a los de S. kraussei con un mucrón poco apreciable y una espícula de tamaño intermedio (Figura 5.C).

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Figura 3. Morfología de Steinernema feltiae vista al microscopio óptico. A, D: Región anterior y caudal del juvenil infectivo. B, C: Región anterior y caudal del macho de primera generación. E: región vulvar de la hembra. F: Región caudal de la hembra (1.000x)

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Figura 4. Morfología de Steinernema kraussei vista al microscopio óptico. A, D: Región anterior y caudal del juvenil infectivo. B, C: Región anterior y caudal del macho de primera generación. E: región vulvar de la hembra. F: Región caudal de la hembra (1.000x).

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Figura 5. Morfología de Steinernema carpocapsae vista al microscopio óptico. A, D: Región anterior y caudal del juvenil infectivo. B, C: Región anterior y caudal del macho de primera generación. E: región vulvar de la hembra. F: Región caudal de la hembra (1.000x).

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Figura 6. Morfología de los nematodos entomopatógenos vista en el microscopio electrónico de barrido. A. Parte posterior de un macho de primera generación de S. feltiae. B. Bandas laterales de un juvenil infectivo de S. feltiae. C. Parte posterior de un macho de primera generación de S. kraussei. D. Bandas laterales de un juvenil infectivo de S. kraussei. E. Parte posterior de un macho de primera generación de S. carpocapsae. F. Bandas laterales de un juvenil infectivo de S. carpocapsae.

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Ta b l a 4 Me d i d a s e n μ m e í n d i c e s d e l o s JIs y l o s M1G d e u n a p o b l a c i ó n d e r e f e r e n c i a d e l a s t r e s e s p e c i e s d e NEPs a i s l a d a s e n La Ri o j a . Va l o r e s m e d i o s ± l a d e s v i a c i ó n t í p i c a (r a n g o )

Población 63 Población 58C Población 96 Medidas/ S. feltiae S. kraussei S. carpocapsae índicesa JIs M1G JIs M1G JIs M1G L 776 ± 65,2 1508 ± 140,6 849 ± 44,3 1398 ± 202,9 501 ± 24,4 1388 ± 324,8 (684-922) (1243-1776) (770-918) (1101-1666) (474-548) (853-1882) A 30 ± 2,5 118 ± 17,6 33 ± 1,6 125 ± 17,7 22 ± 2,7 124 ± 44,0 (25-35) (85-150) (29-35) (101-145) (18-27) (64-189) ES 104 ± 11,7 148 ± 9,2 116 ± 8,2 152 ± 14,0 95 ± 7,1 153 ± 10,3 (86-131) (125-163) (103-131) (133-168) (83-104) (136-171) AN 74 ± 8,6 85 ± 7,2 62 ± 6,9 (58-89) (74-99) (50-76) PE 62 ± 7,9 97 ± 6,6 56 ± 5,6 85 ± 7,8 42 ± 7,6 71 ± 12,7 (45-75) (82-109) (52-68) (75-94) (31-56) (48-97) C 74 ± 6,3 87 ± 5,7 54 ± 4,5 (61-86) (76-97) (47-66) LE 75 ± 5,5 57 ± 3,4 66 ± 5,9 (66-85) (52-60) (58-73) LG 47 ± 4,0 34 ± 4,0 40 ± 3,3 (40-52) (30-37) (36-47) ACA 39 ± 4,2 38 ± 6,3 39 ± 4,4 (31-47) (25-45) (32-46) a 26 ± 2,8 13 ± 2,0 26 ± 1,7 11 ± 1,1 23 ± 2,6 12 ± 2,5 (22-33) (10-17) (21-28) (9-13) (18-28) (10-19) B 7,4 ± 0,82 10,2 ± 0,80 7,3 ± 0,50 9,5 ± 0,99 5,4 ± 0,49 9,2 ± 1,44 (5,9-9,2) (8,3-12,1) (5,3-8,3) (8,1-11,2) (4,8-6,6) (7,1-11,6) C 10,7 ± 0,89 9,9 ± 0,71 9,5 ± 0,82 (8,8-12,6) (8,5-11,2) (8,0-11,1) D 61 ± 8,0 66 ± 5,3 48 ± 5,2 58 ± 2,1 44 ± 8,3 47 ± 7,9 (50-74) (55-75) (41-59) (54-60) (30-57) (35-66) E 81 ± 10,8 63 ± 6,9 77 ± 13,7 (62-96) (53-78) (63-105) GS 0,63 ± 0,06 0,60 ± 0,09 0,62 ± 0,09 (0,52-0,74) (0,50-0,74) (0,50-0,89) SW 1,91 ± 0,27 1,56 ± 0,22 1,70 ± 0,23 (1,41-2,39) (1,33-2,06) (1,41-2,27)

a: Medidas: L, longitud total del cuerpo, A, anchura total del cuerpo, PE, distancia del extremo anterior al poro excretor, AN, distancia del extremo anterior al anillo nervioso, ES, longitud del esófago, LE, largo de la espícula, LG, largo del gubernáculo, ACA, anchura de la cola al nivel del ano. Índices: a (L/A), b (L/ES), c (PE/ES), D% (PE/ES x 100), E% (PE/C x 100), GS (LG/LE), SW (LE/ACA). MUC, mucrón, P, presente, n = 25.

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2.3. Tendencias ecológicas de los nematodos entomopatógenos en La Rioja Las características ecológicas asociadas a cada especie se muestran en la Tabla 5. La especie de mayor distribución fue S. feltiae, que representa el 73,4 % de las poblaciones identificadas (n = 11), y se aisló en 11 de las localidades muestreadas y 11 muestras de suelo. La especie S. carpocapsae representa un 13,3% de las poblaciones de NEPs identificadas (n = 2), y se aisló en 7 muestras de suelo de 2 localidades, por lo que se consideró que las dos poblaciones aisladas presentaron una distribución más amplia en cada localidad de muestreo. Por último, S. kraussei también representa un 13,3% de las poblaciones identificadas (n = 2), localizándose en 2 localidades y 2 muestras de suelo. Ta b l a 5. Ra n g o d e v a l o r e s d e l a s c a r a ct e r í s t i c a s a m b i e n t a l e s y f í s i c o -q u í m i c a s a s o c i a d o s a c a d a e s p e c i e d e NEPs S. feltiae S. kraussei S. carpocapsae Variables ambientales Altitud (msnm) 494-1754 1115-1569 602-677 TMA (ºC) 5-12 6-9 11 PMA (ºC) 400-1100 700-1000 400-500 Vegetación Potenciala 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 2, 4 6 Tipo de suelob 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11 2, 3 2, 8

Vegetación realc Nb, Nbm, Nm, Np, Pp, Ab, Abm, Amp, Ap Nb, Nm Ap Variables físico-químicas % Humedad 7,1-38,9 29,6-38,9 11,9-14,9 pH 4,9-8,3 4,9-7,9 7,6-7,9 % Arena 37-70 40-55 26-27 % Limo 18-45 36-43 41-44 % Arcilla 3-18 9-17 30-32 a: nº correspondientes a la leyenda de la figura 1.A. b: nº correspondiente a la leyenda de la figura 1.B. c: Tipo de vegetación real según su naturaleza: área natural, N; margen de cultivo anual, A; margen de cultivo perenne, P y según la estructura de la vegetación, prado, p; matorral, m y bosque, b.

Como se aprecia en la Tabla 5, la especie S. feltiae presenta un amplio rango de distribución ecológica, ya que aparece tanto en zonas de altitud media como alta, con temperaturas y precipitaciones medias anuales que oscilan de 5 a 12 ºC y de 400 a 1100 mm, respectivamente. Se encuentra dentro de 7 tipos de suelos diferentes y de 7 series de vegetación potencial. Además, se ha aislado en los tres tipos de hábitat (natural, margen de cultivo anual y margen de cultivo perenne). En cuanto a las características físico-químicas del suelo cabe decir que también presentan un amplio rango de valores ya que se encuentra tanto en suelos secos como muy húmedos, de pH ácido y básico, y con porcentajes de arena, limo y arcilla muy variados.

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La especie S. kraussei se ha aislado en localidades de elevada altitud, asociada, por tanto, a zonas frías y húmedas, siendo el tipo de vegetación potencial más restringida, así como el tipo de suelo. En general, el porcentaje de humedad resultó elevado, aunque el rango de pH osciló de ácido a ligeramente básico y el porcentaje de arena, limo y arcilla fue poco homo- géneo. La especie S. carpocapsae se ha aislado en localidades de caracterís- ticas ecológicas más homogéneas. Las variables ambientales asociadas se corresponden con zonas de altitud media (unos 600 m), de temperatura y precipitación media anual semejante, lo que implica su asociación a una única serie de vegetación potencial, aunque están presentes en dos tipos de suelos diferentes. El hábitat asociado ha sido el margen de cultivos anuales, con una humedad relativamente baja, un pH básico no muy acentuado y un porcentaje de arcilla elevado. Por último, el análisis de la asociación de las variables ambientales y físico-químicas con las especies define la afinidad de cada una de ellas con dichas variables, lo que permite conocer las tendencias ecologicas de estas especies en La Rioja (Figura 7). El estudio realizado para las variables ambientales incluyó los valores de altitud, temperatura (TMA) y precipitación media anual (PMA), tipo de vegetación potencial, tipo de vegetación real y tipo de suelo asociadas a cada especie aislada en La Rioja (Figura 7.A). El modelo explica el 70,33% de la varianza, de forma que la dimensión I resume el 48,57% y la dimensión II, el 21,76%. Se observó que la especie S. feltiae no estuvo asociada a ninguna de las variables en estudio, ya que

los valores de correlación obtenidos fueron muy bajos (raltitud = 0,016, rTMA = 0,103, rPMA = -0,077, r Veg potencial = 0,108, r Veg real = 0,000 y r SueloO = 0,237). Como ya se había indicado en la descripción ecológica de las poblaciones riojanas, esta especie fue aislada en localidades muy diferentes entre sí, lo que denota su gran adaptabilidad al medio. Las poblaciones riojanas de S. carpocapsae se aislaron en lugares no muy elevados, con temperaturas suaves y no muy

húmedas (raltitud = -0,422, r TMA= 0,269, rPMA = -0,327). Así mismo, existe una correlación positiva con la variable tipo de vegetación potencial (r = 0,207) y con el tipo de vegetación real (r = 0,439) lo que indica su asociación con las series supramediterránea de zonas con influencia agrícola. Por último, la especie S. kraussei presentó los valores de correlación más elevados con respecto a las variables ambientales en estudio, mostrando una asociación con lugares de cierta altitud (r = 0,402), de temperaturas más bien frescas (r = -0,403) y con una mayor precipitación (r = 0,428). Su asociación con el

tipo de suelo, vegetación potencial y vegetación real (rsuelo = -0,203, r Veg potencial = -0,347, r Veg real = -0,439, respectivamente) indica una alta relación con la vegetación supramediterráneas, suelos de tipo Cambisol y zonas naturales. El análisis CAPTA realizado para las variables físico-químicas del suelo a partir del cual se aislaron las poblaciones riojanas incluyó los valores correspondientes al porcentaje de humedad del suelo, el pH, y el porcentaje de arena, limo y arcilla (Figura 7.B). El modelo explica sólo el 65,83% de la varianza, de forma que la dimensión I resume el 42,92% y la dimensión

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II, el 22,93%, por lo que el ajuste del modelo fue inferior que en el caso del estudio de las variables ambientales. La especie S. feltiae no presentó valores de correlación muy elevados con las variables estudiadas, debido a que fue aislada en lugares muy heterogéneos. La presencia de esta especie parece ser independiente del pH (r = -0,093) y del porcentaje de humedad (r = -0,129), ya que como se señaló anteriormente, esta especie fue aislada en suelos tanto ácidos como básicos así como en suelos secos y húmedos. Sin embargo, se observó una ligera asociación a suelos con elevado porcentaje de arena (r = 0,428) y baja proporción de arcilla (r = -0,485), siendo muy baja la asociación con el contenido en limo (r = -0,174). La especie S. carpocapsae presentó una ligera asociación con el pH (r = 0,230) y con el porcentaje de humedad (r = -0,269). Sin embargo, se observó la tendencia a ser aislada en suelos con bajo contenido en arena (r = -0,604) y elevado porcentaje de arcilla (r = 0,644), siendo el contenido en limo poco determinan- tes (r = 0,267). Por último, los resultados para la especie S. kraussei fueron en general bajos, tanto para el pH (r = -0,110), como para los porcentajes de arena (r = 0,048), limo (r = -0,041) y arcilla (r = -0,013), por lo que en prin- cipio la textura del suelo y su acidez o alcalinidad no estarían restringiendo su presencia. Sin embargo, obtuvo un valor de correlación bastante elevado respecto a la variable porcentaje de humedad de la muestra de suelo (r = 0,437), mostrando su tendencia a asociarse a lugares con mayor humedad. 3. DISCUSIÓN El estudio de distribución de NEPs realizado en La Rioja evaluó su presencia en tres tipos de hábitat diferentes: natural, márgenes de cultivos anuales y márgenes de cultivos perennes, abarcando la variabilidad eda- foecológica de esta región en función de las series de vegetación potencial y los tipos de suelo. Se obtuvo un 5,4% de muestras positivas, resultado que está dentro del rango obtenido en otros países de clima mediterráneo como Grecia (5%, Menti et al., 1997) e Italia (5%, Ehlers et al., 1991; 14%, Tarasco y Triggiani, 1997), así como en otras regiones bioclimáticas como las islas Azores (4%, Rosa et al., 2000), Hawaii (7%, Hara et al., 1991), Irlanda (11%, Griffin et al., 1991) y Japón (10%, Yoshida et al., 1998). Los resultados pre- vios registrados en España son variables, oscilando de un 3% (De Doucet y Gabarra, 1994) al 11,9% (García del Pino, 1994), mientras que en Galicia se registró un 26%, en Mallorca un 6,5% y en las Islas Canarias osciló entre un 0,66 y un 11% (García del Pino, 2005) de muestras positivas. Esta variabilidad en la presencia de NEPs se puede atribuir a la propia tendencia de agregación o distribución en parches de estos organismos en el suelo (Stuart y Gaugler, 1994), la formación de agregados de los insecto que parasitan estos nematodos (Mrá#ek y Becvar, 2000), o al esfuerzo de muestreo o el método de aislamiento de los NEPs (Hominick, 2002). Diversos estudios sobre la preferencia de hábitat de los NEPs indican que está relacionada con la densidad de población de sus posibles insectos hospedadores, las condiciones del suelo y con el equilibrio dinámico de la relación hospedador-parásito (Barberchek, 1992; Mrá#ek et al, 2005; Nielsen

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y Philipsen, 2003; Peters, 1996; Puza y Mrá#ek, 2005). En este trabajo se ha evaluado la presencia de estos nematodos en función del hábitat (natural, margen de cultivos anuales y margen de cultivos perennes). Se ha observado que la abundancia y frecuencia de recuperación de estos organismos en los márgenes de cultivo anuales fue mayor que en las áreas naturales, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas. Esta tendencia podría explicarse sobre la base de que las zonas naturales proporcionan un hábitat muy estable donde puede desarrollarse una relación hospedador-pa- rásito equilibrada, con un nivel de población de insectos regulado por dicho equilibrio, mientras que en las zonas de cultivo con un laboreo del suelo muy intenso, como el caso de zonas con producción de dos cultivos anuales, no se pueden mantener de forma continua las poblaciones de insectos susceptibles de ser parasitados por NEPs, originando que los insectos super- vivientes pasan a refugiarse en los márgenes próximos al campo de cultivo, permitiendo así un aporte de hospedadores más intenso y masivo que pro- piciaría la explosión poblacional de los NEPs. En los cultivos perennes, donde el laboreo es menos intenso, los insectos pueden refugiarse en el propio cultivo (vid, olivo, frutal), por lo que los márgenes pueden recibir un aporte de insectos menos intenso. Sin embargo, es posible que este fenómeno no se esté produciendo con la suficiente intensidad como para ser detectado con las pruebas estadísticas realizadas en este estudio. Además, debido a la baja probabilidad de aislar NEPs en muestras de suelo, para comprobar esta hipótesis sería necesario aumentar el número de localidades de muestreo e incluir además en el estudio los cultivos asociados a dichos márgenes para aportar más datos al análisis estadístico. Además, tal y como propone Puza y Mrá#ek (2005), se debería tener en cuenta la entomofauna asociada con el fin de detectar especies de insectos que puedan actuar como hospedadores de NEPs, tanto en la parcela del cultivo como en el margen. El análisis del porcentaje de mortalidad larval de G. mellonella mostró que a lo largo del transepto lineal estudiado existió una gran variación, y en la mayor parte de los casos sólo una de las muestras resultó positiva. Estos datos concuerdan con el comportamiento descrito para estos nematodos en el campo (Campbell et al., 1998; Stuart y Gaugler, 1994), que se distribuyen en agregados, lo que produce estos resultados tan variables. El valor medio de porcentaje de mortalidad larval de G. mellonella en el margen de cultivo anual fue muy superior al observado tanto en las zonas naturales como en el margen de tipo perenne, lo que reforzaría de forma cuantitativa la hipó- tesis anteriormente mencionada sobre la presión antrópica y la presencia de NEPs. Sin embargo, la distribución en agregados de estos organismos impide la realización de estudios estadísticos satisfactorios debido a la gran variabilidad de los datos obtenidos, por lo que de nuevo se recomienda un estudio más amplio. En este estudio sólo se han aislado, en las 14 localidades positivas, nematodos del género Steinernema resultando ausente el género Heteror- habditis, que presenta un menor número de especies (Stock y Reid, 2004) pero tiene mayor diversidad a nivel intraespecífico (Hominick, 2002). Su

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baja proporción respecto a la presencia de steinernemátidos se ha observado en muchos trabajos, tanto del ámbito mediterráneo como de otras zonas bioclimáticas: 1,3% de Heterohabditis vs 22,0% de Steinernema en Cataluña (García del Pino y Palomo, 1996a), 5,3% de Heterohabditis vs 8,5% de Steinernema en Italia (Tarasco y Triggiani, 1997), 9,0% de Heterohabditis vs 23,0% de Steinernema, en California, USA (Stock et al., 1999) y 0,2-1,3% de Heterohabditis vs 49,0-37,0% de Steinernema en Japón (Yoshida et al., 1998). La baja presencia del género Heterorhabditis en los suelos podría ser una explicación para los resultados obtenidos en este estudio, donde sólo se aislaron NEPs de 5,4% de las muestras, aunque también se podría explicar en base a la preferencia de hábitat descrito para las especies de este género, asociadas en su mayoría a zonas costeras y arenosas (Griffin et al., 1999; Liu y Berry, 1995; Rosa et al., 2000). No obstante, este hecho no implica necesa- riamente que no exista dicho género en esta región. Futuras investigaciones que incluyan una mayor proporción de suelos arenosos, podrían confirmar esta hipótesis. Las especies identificadas fueron S. feltiae, S. kraussei y S. carpocapsae, caracterizadas por su amplia distribución mundial (Hominick, 2002). La morfometría y morfología características de las mismas están dentro del rango de las especies de referencia descritas por Adams y Nguyen (2002). En las poblaciones de S. feltiae se han observado ligeras diferencias en la longitud total del cuerpo, que influyen en las medidas relativas al esófago, anillo nervioso, poro excretor y cola. Sin embargo, este tipo de variaciones morfológicas también han sido descritas en poblaciones de diferentes regiones bioclimáticas e incluso entre poblaciones aisladas en diferentes tipos de hábitat de una misma región (Poinar, 1992; Stock et al., 2000), por lo que se puede atribuir estas diferencias dentro de las poblaciones riojanas a su heterogeneidad en su distribución ambiental. El estudio molecular posterior de estas poblaciones mediante análisis de RFLP o secuenciación confirmaría estos resultados (Stock y Reid, 2004). Hominick (2002) considera a S. feltiae y S. carpocapsae como ubiquis- tas, siendo además muy frecuentes en las zonas templadas, fenómeno que podría estar relacionado con lo observado por Peters (1996), tras su estudio sobre los hospedadores naturales de los NEPs, en el que determinó que estas dos especies desarrollaban un tipo de ciclo biológico generalista. La caracterización ecológica realizada en este trabajo concuerda con estas ob- servaciones previas encontrándose que S. feltiae muestra gran plasticidad en su distribución, aislándose tanto en zonas frescas y húmedas como en zonas templadas o secas dentro de la región, en 7 tipos diferentes de suelos y series de vegetación y a pH tanto ácidos como básicos. Debido a la gran diversidad de condiciones en los que esta especie aparece, los valores de correlación del análisis CAPTA resultaron muy bajos para la mayor parte de las variables en estudio. La distribución de S. kraussei está más limitada a zonas húmedas y frías, encontrándose en altitudes superiores a los 1000 m, donde la precipitación media anual es de 700-1000 mm y la temperatura media anual no sobrepasa los 9 ºC. Además, los valores de correlación

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obtenidos en el análisis CAPTA tanto de las variables ambientales como físico-químicas del suelo corroboraron estos resultados. Estos valores coinciden con los obtenidos por otros autores, que han observado que tiene una distribución holártica (Stock et al., 2000) y que está presente en zonas con un clima templado-frío (Hominick, 2002). S. carpocapsae también está ampliamente distribuido en el mundo (Hominick, 2002) y muestra un amplio rango de hábitat. Sin embargo, las poblaciones riojanas aisladas resultan muy interesantes, ya que están asociadas a suelos con un contenido en arcilla muy elevado, tal y como mostró el análisis multivariante. Los suelos arenosos o franco arenosos son los suelos en los que con mayor frecuencia se han aislado NEPs, (Griffin et al. 1991, Hara et al. 1991; Kaya, 1990; Kung et al. 1990; Stock et al. 1999), por lo que el aislamiento de dos poblaciones riojanas asociadas a suelos arcillosos resulta de gran interés para el desarrollo y formulación de bioplaguicidas. El estudio de carácter básico realizado en La Rioja ha permitido aislar, identificar y caracterizar poblaciones autóctonas deNE Ps, adaptados a condiciones ambientales y físico-químicas del suelo muy diferentes que consti- tuyen los primeros aislamientos a partir de muestras de suelo realizados en la región hasta la fecha. Debido al interés agronómico y socioeconómico que suscitan estos organismos, es de esperar que futuros estudios sobre la biología de estas poblaciones y su eficacia frente a insectos de interés regional (Anónimo, 2003; Pérez-Marín, 2005) permitirán determinar su potencial como agentes de control biológico susceptibles de ser desarrollados comercialmente. AGRADECIMIENTOS Los autores desean expresar su agradecimiento a los compañeros del Centro de Ciencias Medioambientales (CSIC) D. Fernando Pinto, por la ayuda con las fotografías del microscopio electrónico, a D. Octavio Cedenilla y Dña. Margarita Pérez-Peñasco por los análisis físico-químicos del suelo, a D. Manuel Fernández por su apoyo técnico y a los Dres. Lee Robertson y Ana Piedra Buena por su revisión inicial del manuscrito. También quieren agradecer a los compañeros de la UAGR/COAG y a Dña. Milagros Herrera su apoyo logístico durante los muestreos, a Dña. Laura Ezquerro y D. Alejandro Peláez por su apoyo en la toma de muestras de suelo y a D. Rubén Blanco por su apoyo en el estudio de morfometría. También desean agradecer al Instituto de Estudios Riojanos y al Ministerio de Ciencia y Tecnología por la ayuda financiera aportada para la realización de este trabajo, así como al Ministerio de Educación, Cultura y Deportes por la beca FPU concedida. Los resultados presentados en este trabajo de investigación son parte de la Tesis Doctoral presentada por Raquel Campos Herrera. BIBLIOGRAFÍA Aballe, M., López-Ruíz, J., Badía, J. M., Adeva, P., 1996. Microscopía electró- nica de barrido y microanálisis por rayos X. CSIC, Editorial Rueda S.L., Madrid. 476 pp.

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