THESE Présentée En Vue De L'obtention Du Diplôme De DOCTORAT

اﻟﺠﻤﮭﻮرﯾﺔ اﻟﺠﺰاﺋﺮﯾﺔ اﻟﺪﯾﻤﻘﺮاطﯿﺔ اﻟﺸﻌﺒﯿﺔ République Algérienne Démocratique et Populaire وزارة اﻟﺘﻌﻠﯿﻢ اﻟﻌﺎﻟﻲ واﻟﺒﺤﺚ اﻟﻌﻠﻤﻲ Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

FACULTE DES SCIENCES DE DEPARTEMENT DE LA NATURE ET DE LA VIE BIOTECHNOLOGIE

THESE Présentée en vue de l'obtention du diplôme de DOCTORAT

Spécialité: Biotechnologie Option: Production Aquatique et Contrôle de Qualité

Présentée par Mme. OUCIF Hanane

Intitulée:

Valorisation des algues de la côte Ouest algérienne: potentiel antioxydant et hormonal

Le : 12 / 12 / 2018

Devant le jury composé de:

Président : ABI-AYAD S.-M. E.-A. Prof. Université Oran1 Examinateur : BENALI M. Prof. Université de Sidi Bel Abbes Examinateur : MERZOUK H. Prof. Université de Tlemcen Examinateur : NEMICHE S. Prof. Université de Mostaganem Encadreur : ALI-MEHIDI S. Prof. Université Oran1 Co-encadreur : BOUKORTT F. O. Prof. Université Oran1

Année Universitaire 2018/2019

" Vagabonder à la surface des océans est souvent source de sérénité

et parfois, permet de tutoyer ses rêves.

S'y immerger, c'est s'ouvrir à son

observation et à sa compréhension "

-Nicolas HULOT-

Remerciements

Il est difficile de commencer à écrire cette page par le nombre et l’importance des personnes qui ont contribué, d’une manière ou d’une autre, à

l’aboutissement de ce travail de six enrichissantes et intenses années.

Tout d’abord, je voudrais exprimer toute ma gratitude et mes sincères remerciements au Pr. ALI-MEHIDI Smail, pour m’avoir fait l’honneur de diriger ce travail et de continuer à m’initier à la recherche avec exigence et générosité.

Depuis le début, il m’a supporté et encouragé en me permettant de compléter mon projet de doctorat. Très indulgent, il a montré beaucoup de patience en vers mon engagement professionnel et personnel dans une autre ville (Relizane). Ses conseils et ses pensés positives m’ont été précieux et utiles tout au long de mon doctorat. Je lui suis reconnaissante pour la confiance et le soutien permanent qu’il m’a témoigné dans ce travail, ainsi que pour sa disponibilité et pour la grande autonomie qu’il m’a accordé.

J’adresse mes sincères remerciements à ma codirectrice de thèse le Pr.

BOUKORTT Farida Ouda. Parmi ses nombreuses qualités, la motivation constante, la joie de vivre et les conseils constructeurs, sans oublier son côté très humain, sa gentillesse et sa générosité.

Par ces quelques mots, je tiens également à exprimer toute ma gratitude à mon directeur du Laboratoire d’Aquaculture et Bioremédiation (AQUABIOR) de l’université d’Oran1, le Pr. ABI-AYAD Sidi-Mohammed El-Amine, pour m’avoir accueilli au sein de son équipe. Nous nous connaissons depuis plusieurs années maintenant (déjà dix ans), et vous m’avez vu évoluer. Merci de m’avoir accompagné durant ces années, de m’avoir fourni d’excellentes conditions de

travail qui m’ont permis d’obtenir de bons résultats de recherche. Je tiens à le remercier de m’avoir appris les principes essentiels en science que sont la curiosité et la rigueur scientifique, la ténacité, l’humilité et la patience.

Mes remerciements vont également aux examinateurs de ces travaux, à savoir le Pr. MERZOUK Hafida de l'université de Tlemcen, le Pr. BENALI Mohammed de l'université de Sidi Bel Abbes et le Pr. NEMICHE Said de l'université de

Mostaganem, merci de me faire profiter de votre expertise dans l’évaluation de ce manuscrit.

Je suis également très redevable à Dr. MAGHARBI Ahmed pour son aide précieuse au niveau des traitements statistiques.

Merci au Dr. DERGAL Nadir Boudjlal d’avoir fait la prélecture de ma thèse et pour ses bons conseils afin de l’améliorer. Je ne vais pas oublier votre aide.

Je tiens à remercier le Pr. AUBOURG-MARTINEZ Santiago P. de l’Institut de Recherches Marines de Vigo (CSIC), Espagne, de m’avoir permis de réaliser une grande partie de cette thèse au sein de son unité. Les travaux de son équipe ont été pour moi une grande source d’inspiration et je leur suis particulièrement reconnaissante de m’avoir accompagné dans ce travail. Je ne peux pas oublier

également l’aide apporté à la rédaction des publications. Un grand merci donc pour votre accueil à Vigo, votre sympathie et les bons et mémorables moments.

J’espère que de nombreux doctorants auront, comme moi, la chance de travailler avec vous. Je vous serai toujours reconnaissante. Merci à toi « Santi »!. Je remercie également Mr. TRIGO Marcos pour sa disponibilité et son aide dans la réalisation de ces tests. Je suis impressionnée et admirative par tout ce qu’il accomplit au travail, mais aussi par ce qu’il fait à l’extérieur notamment sa patient pour le Sky Surf.

Je voudrais également adresser mes remerciements à toute l’équipe du Pr.

PREGO Ricardo de l'Institut de Recherches Marines de Vigo, Espagne, et le Pr.

BARROS‑VELAZQUEZ Jorge du département de Chimie Analytique, de

Nutrition et Bromatologie, de l'Université de Saint-Jacques-de-Compostelle

(USC), Campus de Lugo, Espagne, pour leur aide par les analyses minérales et microbiologiques, respectivement.

Je remercie vivement Mr. MARCOS Manuel de l’unité de spectrométrie de masse du centre CACTI (Centre de Soutien à la Recherche Scientifique et

Technologique), à l’Université de Vigo, Espagne, pour sa contribution par l’analyse

LCMS, sa générosité et sa patience face à mes exigences et mon esprit perfectionniste.

Toute ma reconnaissance et ma gratitude vont également aux membres Sénior du laboratoire AQUABIOR, le Pr. BABA HAMED Mohammed EL Bey, Pr.,

LAMARA Sid-Ahmed Chawki, Pr. BENSAHLA TALET Ahmed et Mr.

AMEZIANE Houcine, d’avoir été les membres de mon comité de thèse et qui ont, par conséquent, jugé ces travaux à mi-parcours et m’ont donné des conseils et des pistes d’orientation de recherche.

Je tiens à remercier tout particulièrement MELIANI Meriem pour sa très

(voire trop) grande disponibilité lorsqu’un appareil ne fonctionnait pas et pour ses conseils avisés et sa générosité et à ASFOURI Yasmine, pour mon initiation à la culture de microalgues, ton aide m’a été précieuse dans ma thèse. A toutes les deux un grand merci, nous nous sommes mutuellement soutenus au cours de cette expérience qu’est la thèse.

Mes pensées vont également à SEDDIKIOUI Leila et BENZIDANE Dehiba, avec qui j’ai partagé les enthousiasmes et les doutes inhérents à nos parcours de doctorants. Nombreux sont les bons moments où j’ai pu leur parler jusqu’à ce qu’elles n’en peuvent plus et combien de fois nous nous sommes amusés. Votre bonne humeur et vos sourires m’ont permis d’évacuer une partie du stress généré par cette thèse.

Un grand merci à mes collègues de l’AQUABIOR: Soumia, Malika, Khadidja,

Faiza, Aicha, Samia, pour tous les moments passés ensembles. Vous avez toutes contribué à l’avancement de ce projet aussi bien d’un point de vue scientifique qu’humain.

Merci à ceux et à celles que j’ai pu malencontreusement oublier et envers qui je m’excuse par avance. Mes derniers remerciements vont aux personnes qui me sont les plus chères pour leur amour, leur soutien et leur patience. Un immense merci, venant du fond du cœur, à mes parents, à mon frère Houari, à ma belle- sœur Nassima, aux grands-parents, aux tantes, et cousin(e)s et à toute la famille

OUCIF, BOUDIA et BENAISSA.

Ce travail a été rendu possible grâce au sacrifice et la patience de ma famille.

Mes parents et mon mari ont sacrifié beaucoup de choses pour mes études et ils ont attendu la fin de ma thèse très longtemps. Merci à ma belle-famille pour leur touchante inquiétude quant à l’avancée de mes travaux.

Je ne pouvais finir sans remercier très fortement mon rayon de soleil ma petite fille Besma et mon incroyable époux Dr. BENAISSA Miloud, qui a su m’épauler, me pousser dans mes choix, et qui m’encourage toujours à aller plus loin, quoique cela nous coûte. Ta joie de vivre au quotidien, pour ne pas dire ton humour si particulier, m’a toujours égayé même dans les moments les plus durs.

Sans toi je ne serai pas arrivé jusque là et j’espère que l’on ira encore plus loin ensemble. Le meilleur reste à venir.

Résumé

Les algues marines constituent une source peu explorée et inexploitée en Algérie, alors qu’elles constituent un enjeu de développement économique. Le présent travail a pour objectifs de fournir des informations sur la composition nutritionnelle de cinq espèces d’algues de la côte oranaise (Cystoseira stricta, Cystoseira compressa, Corallina elongata, Enteromorpha compressa et Ulva lactuca) et de valoriser ces algues d’intérêt dans le domaine de la recherche de nouvelles sources d’antioxydants et de régulateurs de croissance végétale.

La détermination de la composition proximale (humidité, cendre, protéines, lipides et carbohydrates), lipidique (profil en acides gras et contenus en phospholipides, stérols et tocophérols) et minérale (macroéléments et éléments traces) a révélé que ces espèces constituent une excellente source de minéraux, polysaccharides, protéines, d’AGPI essentiels et d’antioxydants alternatifs. Néanmoins, une attention particulière doit être portée au contenu en métaux lourds, une surveillance est donc nécessaire pour assurer la sécurité du produit.

L’évaluation des propriétés antioxydantes a mis en évidence que les algues brunes du genre Cystoseira se sont révélées actives, présentant ainsi les meilleures activités anti- radicalaires, avec des pourcentages d'inhibitions de plus de 90% et enregistrent de remarquables IC50 (83,3 µg/ml, C. stricta et 105,1 µg/ml, C. compressa) et d'excellents pouvoirs réducteurs (DO700nm=1,32, C. compressa et DO700nm=1,59, C. stricta), avec de bons contenus en polyphénols (87,02 mg EAG/g MS, C. compressa et 122,20 mg EAG/g MS, C. stricta). Cette activité est dépendante de la méthode et du solvant organique d’extraction, dont les plus efficaces semblent être : l'extraction par soxhlet en présence d’éthanol (C. stricta) et la macération dans l’eau ou l’éthanol (C. compressa).

L’extrait d’algue éthanol-aqueux combiné de C. compressa incorporé dans la glace pendant la réfrigération du chinchard commun Trachurus trachurus a permis une inhibition du développement de l’activité microbienne (p<0,05) (flore mésophile aérobie, psychrothrophes, bactéries protéolytiques et lipolytiques, entérobactéries) dans le muscle du chinchard. Cet effet préservateur est confirmé par l'évaluation chimique de l'activité microbienne (pH et triméthylamine). Cette glace traitée a également ralenti l'hydrolyse des lipides (formation d'AGL) et l'oxydation tertiaire (formation de composés fluorescents) (p<0,05), et réduit le processus de propagation de l'oxydation primaire et secondaire (p≥0,05).

L’étude de l’activité biologique de la fraction enrichie de C. compressa obtenue par la méthode D.L.L.M.E. (Microextraction Dispersive Liquide-Liquide), sur une culture de Nannochloropsis gaditana a révélé une bonne activité élicitrice de croissance microalgale, à raison d’une concentration de 0,1%. Cette fraction contient cinq classes de régulateurs de croissance végétale (auxines, cytokinines, gibbérelines et dérivé de l’ABA et de polyamines).

Les algues du genre Cystoseira ont montré des potentialités intéressantes et suggèrent la possibilité d’utilisation de leurs extraits comme antioxydants naturelles en industrie alimentaire et thérapeutique, et comme biostimulant naturel en algoculture, ce qui améliorerait la productivité en biomasse, la résistance aux stress et la stimulation de la synthèse de certains métabolites d’intérêt économique. Mots clés : Algues, antioxydants, biostimulant, microalgue, phytohormones, valorisation.

Abstract

Marine seaweeds are a source little explored and unexploited in Algeria, while they constitute an economic development issue. The present work has for objectives, to provide informations on nutritional composition of five species of seaweeds from Oran coast (Cystoseira stricta, Cystoseira compressa, Corallina elongata, Enteromorpha compressa and Ulva lactuca) and to exploit these seaweeds of interest in the field of search for a new source of antioxidants and plant growth regulators.

The determination of proximale (moisture, ash, proteins, lipids and carbohydrates), lipidic (profile of fatty acids and phospholipids, sterols and tocopherols contents) and mineral composition (macroelements and trace elements) revealed that these species constitute an excellent source of minerals, polysaccharides, proteins, essential PUFA and alternative antioxidants. However, a particular attention must be paid on their heavy metal content, thus a monitoring is necessary to assure the chemical safety.

The evaluation of antioxidants properties highlighted that brown algae of Cystoseira genus were the most effective, presenting the best anti-free radical activities, with a pourcentage of inhibition about more than 90% and recorded a exceptional IC50 (83,3 µg ml-1, C. stricta and -1 105,1 µg ml , C. compressa) and an excellent reducing power (DO700nm=1,32, C. compressa -1 and DO700nm=1,59, C. stricta), with a good polyphenols content (87,02 mg GAE g MS, C. compressa and 122,20 mg GAE g-1 MS, C. stricta). This activity depends on extraction method and organic solvent, and the most effective which seem to be: extraction by soxhlet with ethanol (C. stricta) and maceration in water or ethanol (C. compressa).

A combined ethanol-aqueous extract of C. compressa included in the icing system for the chilled horse mackerel Trachurus trachurus revealed an inhibitory effect on development of microbial activity (p<0,05) (total aerobic mesophilic flora, psychrotrophs, proteolytic and lipolytic bacteria and Enterobacteriaceae) in a horse mackerel muscle. This preservative effect was also proved by chemical determinations related to microbial activity (pH and trimethylamine values). This icing system has also slowing down lipids hydrolysis (free fatty acids formation) and tertiary oxidation (fuorescent compounds formation) (p<0,05) and reduced the primary and secondary oxidation propagation (p≥0,05).

The study on biological activity of fraction enriched by D.L.L.M.E. method (Dispersive Liquide-Liquid Microextraction) of C. compressa, on a culture of Nannochloropsis gaditana revealed a good stimulant activity of microalgal growth, at a concentration of 0.1%. This fraction contains five classes of plant growth regulators (auxins, cytokinins, gibbérelins and by-product of ABA and polyamines).

Seaweeds of Cystoseira genus showed interesting potentialities and suggest the possibility of use their extracts as natural antioxidants in food and therapeutic industries, and as natural biostimulant in algoculture, what could improve biomass productivity, resistance for stress and enhancement synthesis of metabolites of economical interest.

Key words: Seaweeds, antioxidants, biostimulant, microalga, phytohormons, valuation.

ﻣﻠﺧص

ﺗﺷﻛل اﻟطﺣﺎﻟب اﻟﺑﺣرﯾﺔ ﻣﺻدر ٌدرس إﻻ ﻗﻠﯾﻼ و ﻏﯾرﻣﺳﺗﻐل ﻓﻲ اﻟﺟزاﺋر, ﻓﻲ ﺣﯾن ھﻲ ﺗﺷﻛل ﻣﺻﻠﺣﺔ ﻟﻠﺗطور اﻹﻗﺗﺻﺎدي. اﻟﮭدف ﻣن ھذا اﻟﻌﻣل ھو ﺗوﻓﯾر ﻣﻌﻠوﻣﺎت ﻋن اﻟﺗرﻛﯾﺑﺔ اﻟﻣﻐذﯾﺔ ﻟﺧﻣﺳﺔ أﻧواع ﻣن اﻟطﺣﺎﻟب ﻣن ﺳواﺣل وھران (Cystoseira compressa,Cystoseira stricta,Enteromorpha compressa, Corallina elongata Ulva lactuca) وﺗﻘﯾﯾم ھذه اﻟطﺣﺎﻟب اﻟﺑﺣرﯾﺔ اﻟﻣﺛﯾرة ﻟﻺھﺗﻣﺎم ﻓﻲ ﻣﺟﺎل اﻟﺑﺣث ﻋن ﻣﺻﺎدر ﺟدﯾدة ﻟﻣﺿﺎدات اﻻﻛﺳدة و ٌﻣ ﻧظﻣﻲ اﻟﻧﻣو اﻟﻧﺑﺎﺗﺎت.

ﺗﺑﯾن ﻣن ﺗﺣدﯾد اﻟﺗرﻛﯾﺑﺔ اﻟﻛﺎﻣﻠﺔ (اﻟرطوﺑﺔ , اﻟرﻣﺎد , اﻟﺑروﺗﯾﻧﺎت , اﻟدھون و اﻟﻧﺷوﯾﺎت) و اﻟدھﻧﯾﺔ (اﻻﺣﻣﺎض اﻟدھﻧﯾﺔ ,اﻟﻔﺳﻔوﻟﯾﺑﯾدات و اﻟﺳﺗﯾروﻻت و اﻟﺗﻛوﻓﯾرول) و اﻟﻣﻌدﻧﯾﺔ (اﻷﻣﻼح اﻟﻣﻌدﻧﯾﺔ اﻟرﺋﯾﺳﯾﺔ واﻟﻧﺎدرة), أن ْھده اﻷﺻﻧﺎف ﻣﺻدرا ﻣﻣﺗﺎزا ﻟﻸﻣﻼح اﻟﻣﻌدﻧﯾﺔ و اﻟﺳﻛرﯾﺎت و اﻟﺑروﺗﯾﻧﺎت واﻷﺣﻣﺎض اﻟدھﻧﯾﺔ اﻷﺳﺎﺳﯾﺔ و اﻟﻣﺿﺎداة ﻟﻸﻛﺳدة اﻟﺑدﯾﻠﺔ, و ﻣﻊ ذﻟك , ﯾﺟب اﯾﻼء اھﺗﻣﺎم ﺧﺎص ﺑﻣﺣﺗوى اﻟﻣﻌﺎدن اﻟﺛﻘﯾﻠﺔ ﺑﺎﻟﻣراﻗﺑﺔ, واﻹﺷراف ﻋﻠﯾﮭﺎ ﺿروري ﻟﺗﺄﻣﯾن ﺳﻼﻣﺔ اﻟﻣواد.

ﺗﻘﯾﯾم اﻟﺧﺻﺎﺋص اﻟﻣﺿﺎدة ﻟﻸﻛﺳدة ﺑﯾ َن أن اﻟطﺣﺎﻟب ﻣن اﻟﻧوع ﺳﯾﺳﺗوزﯾر أﺑرزت ﻧﺷﺎط ﻗوﯾﺎ و ﺗﻘدم أﻓﺿل اﻟﻸﻧﺷطﺔ اﻟﻣﺿﺎدة ﻟﻠﺟدور اﻟﺣرة ﺑﻧﺳﺑﺔ ﻣﺋوﯾﺔ ﻟﻠﺗﺛﺑﯾط ﺗﻔوق 90 % و ﺗﺳﺟﯾل أﺣﺳن µg/ml , C. compressa ) IC50 105,1 و µg/ml , C. stricta 83,3) و ﻛدا ﻗوة إرﺟﺎﻋﮭﺎ

( DO 700nm = 1,59 , C. stricta و DO 700nm = 1,32 , C. compressa) و ﻛﻣﯾﺔ ﺟﯾدة ﻣن اﻟﺑوﻟﯾﻔﯾﻧول ( mg EAG/g MS, C. stricta 122,20 و mg EAG/g MS, C. compressa 87,02). ھذا اﻟﻧﺷﺎط ﯾﻌﺗﻣد ﻋﻠﻰ اﺳﻠوب اﻹﺳﺗﺧﻼص و اﻟﻛﺣوﻻت اﻟﻌﺿوﯾﺔ اﻟﻣﺳﺗﻌﻣﻠﺔ. و أﻛﺛرھﺎ ﺟودة ﺗﺑدو اﻹﺳﺗﺧﻼص ب soxhlet ﺑﺎﻻﯾﺛﺎﻧول و macération ﺑﺎﻻﯾﺛﺎﻧول أو اﻟﻣﺎء.

و ﻣﺳﺗﺧﻠص C. compressa ﺑﺎﻹﯾﺛﺎﻧول- ﻣﺎء اﻟذي أدﻣﺞ ﻓﻲ اﻟﺟﻠﯾد ﺧﻼل ﺗﺑرﯾد Trachurus tra churus َﻣﻛن ﻣن ﺗﺛﺑﯾط ﺗطوراﻟﻧﺷﺎط اﻟﻣﻛروﺑﯾوﻟوﺟﻲ ﻋﻧد ﺣوت اﻟﻣﺎﻛرﯾل mésophile aérobie, psychrothrophes) اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎت lipolytiques و entérobactéries, protéolytiques ) ھذا اﻟﺗﺄﺗﯾر اﻟﺣﺎﻓظ َﺗم ﺗﺄﻛﯾده ﺑﺎﻟﺗﻘﯾﯾم اﻟﻛﯾﻣﯾﺎﺋﻲ ﻟﻠﻧﺷﺎط اﻟﻣﯾﻛروﺑﯾوﻟوﺟﻲ ( pH و اﻟﺗرﯾﻣﯾﺗﯾﻼﻣﯾن) ھذا اﻟﺛﻠﺞ أظﮭر أﯾﺿﺎ ﺑطﺊ ﻓﻲ ﺗﺣﻠل اﻟدھون (ﺗﻛون اﻷﺣﻣﺎض اﻟدھﻧﯾﺔ اﻟﺣرة) و اﻷﻛﺳدة اﻟﺛﺎﻟﺗﯾﺔ (ﺗﻛون اﻟﻣرﻛﺑﺎت اﻟﻣﺷﻌﺔ ) و إرﺟﺎع ﺗطور اﻷﻛﺳدة اﻷوﻟﯾﺔ و اﻟﺛﺎﻧوﯾﺔ.

دراﺳﺔ اﻟﻧﺷﺎط اﻟﺑﯾوﻟوﺟﻲ ﻟﻣﺳﺗﺧﻠص C. compressa ٌﺣ ﺻل ﻋن طرﯾﻖ ﺗﻘﻧﯾﺔ Dispersive microextraction liquid e - liquid e ﻛﺷﻔت ﻧﻣو ﺟﯾد ﻟﻠطﺣﺎﻟب اﻟﻣﺟﮭرﯾﺔ Nannochloropsis gaditana. وھذا اﻟﻣﺳﺗﺧﻠص ﯾﺗﺿﻣن ﺧﻣس ﻓﺋﺎت ﻣن ﻣﻧظﻣﻲ ﻧﻣواﻟﻧﺑﺎﺗﺎت (ABA, auxines, cytokinines, gibbérelines .(polyamine اﻟطﺣﺎﻟب ﻣن اﻟﻧوع Cystoseira أظﮭرت إﻣﻛﺎﻧﯾﺎت ﻣﺛﯾرة ﻟﻼھﺗﻣﺎم واﻗﺗراح إﻣﻛﺎﻧﯾﺔ اﺳﺗﺧدام ﻣﺳﺗﺧﻠﺻﺎﺗﮭم ﻛﻣﺿﺎدات ﻟﻸﻛﺳدة طﺑﯾﻌﯾﺔ ﻟﻠﻘطﺎع اﻟﺻﻧﺎﻋﻲ اﻟﻐذاﺋﻲ واﻟﻌﻼﺟﻲ , و ﻛﻣﻧﺷط ﺣﯾوي طﺑﯾﻌﻲ ﯾﻣﻛن أن ﯾﺣﺳن إﻧﺗﺎﺟﯾﺔ اﻟﻛﺗﻠﺔ اﻟﺣﯾوﯾﺔ ﻟﻠطﺣﺎﻟب اﻟﻣﺟﮭرﯾﺔ وﻣﻘﺎوﻣﺔ ﺣﺎﻻت اﻹﺟﮭﺎد و ﯾﺣﻔز ﺧﻼﺻﺔ ﺑﻌض اﻟﻣﻛوﻧﺎت ذات ﻣﺻﻠﺣﺔ إﻗﺗﺻﺎدﯾﺔ. اﻟﻛﻠﻣﺎت اﻟﻣﻔﺗﺎﺣﯾﺔ: اﻟطﺣﺎﻟب, ﻣﺿﺎد ﻟﻸﻛﺳدة, ﻣﻧﺷط ﺣﯾوي, اﻟطﺣﺎﻟب اﻟﻣﺟﮭرﯾﺔ, ھرﻣون ﻧﺑﺎﺗﻲ, ﺗﻘﯾﯾم.

TABLE DES MATIERES

LISTE DES FIGURES i LISTE DES TABLEAUX iii LISTE DES ABREVIATIONS iv INTRODUCTION GENERALE 1

PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 6

Chapitre 1: Biodiversité, chimiodiversité et applications des macroalgues marines 6 1. Introduction 6 2. Généralités sur les macroalgues 7 2.1 Habitat et écologie 7 2.2 Reproduction 9 2.3 Classification 10  Les algues brunes (Phéophycées) 10  Les algues rouges (Rhodophycées) 10  Les algues vertes (Chlorophycées) 10 3. Composition biochimique des macroalgues 11 3.1. Métabolites primaires 11 3.1.1. Polysaccharides 11 3.1.2. Protéines 13 3.1.3. Lipides 14 3.1.4. Minéraux 14 3.2. Métabolites secondaires 15 3.2.1. Polyphénols 15 3.2.1.1.Flavonoïdes 17 3.2.1.2.Tannins 17 a) Tannins hydrolysables 18 b) Tannins condensés 18 c) Phlorotannins 18 3.2.2. Mycosporine-like acide aminé (MAAs) 19 3.2.3. Diterpènes 19 3.2.4. Caroténoïdes 19 3.2.5. Vitamines 20 3.2.6. Régulateurs de croissance végétale (PGR) 21 4. Application des macroalgues 21

Chapitre 2 : Oxydation et antioxydants d’origine algale 23 1. Introduction 23 2. Radicaux libres 23 2.1. Les différents types des radicaux libres 24 2.1.1. Les espèces radicalaires dérivées de l’oxygène 24 •  L'anion superoxyde (O 2) 24  Le radical hydroxyle (HO•) 24  L’oxyde nitrique (NO•) 24

2.1.2. Les espèces réactives de l’oxygène non radicalaires 24 1  L’oxygène singulet ( O2) 24

 Le peroxyde d’hydrogène H2O2 25  L’anion hypochlorite (HOCl-) 25  Le peroxynitrite (ONOO-) 25 2.2. Sources des ERO 26 2.3. Cibles biologique des radicaux libres 26  Les lipides 26  L’acide désoxyribonucléique (ADN) 26  Les protéines 27  Les polysaccharides 27 3. Les maladies liées au stress oxydant 27 4. L’oxydation dans l’industrie alimentaire 27 5. Les antioxydants 28 5.1. Classification des antioxydants par rapport aux mécanismes d’actions 28  Les antioxydants primaires 28  Les antioxydants secondaires 28  Les co-antioxydants 29 5.2. Classification des antioxydants par rapport aux sources 29  Les antioxydants endogènes 29  Les antioxydants exogènes 29 6. Antioxydants naturelles d’origine marine 30

Chapitre 3: Régulateurs de croissance végétale chez les algues 31 1. Introduction 31 2. Régulateurs de croissance végétale et biosynthèses chez les macroalgues 31 2.1. Auxines 31 2.2. Cytokinines 33 2.3. Gibbérellines 34 2.4. Acide abscissique 36 2.5. Ethylène 36 2.6. Brassinostéroides 38 2.7. Jasmonates 38 2.8. Acide salicylique 39 2.9. Bétaïnes 39 2.10. Polyamines 41 3. Rôle physiologique des phytohormones chez les algues 42 4. Utilisations potentielles des PGRs en biotechnologie des algues 44 4.1. Mariculture et aquaculture 44 4.2. Algues comestibles et aliments fonctionnels 45

Chapitre 4: Modèles biologiques de l’étude 46 1. Présentation des espèces 46 1.1. Cystoseira amentacea var. stricta 46  Taxonomie 46  Caractéristiques botaniques et phénotypiques 46

1.2. Cystoseira compressa 47  Taxonomie 47  Caractéristiques botaniques et phénotypiques 47 1.3. Corallina elongata 48  Taxonomie 48  Caractéristiques botaniques et phénotypiques 48 1.4. Enteromorpha compressa 49  Taxonomie 49  Caractéristiques botaniques et phénotypiques 49 1.5. Ulva lactuca 50  Taxonomie 50  Caractéristiques botaniques et phénotypiques 50 2. Applications potentielles des espèces cibles 51

DEUXIEME PARTIE : MATERIELS & METHODES 52

1. Campagne d’échantillonnage 52 1.1. Présentation du site d’échantillonnage 52 1.2. Sélection et identification des espèces cibles 52 1.3. Collecte et traitement des échantillons 53 2. Composition proximale et minérale des algues 53 2.1. Caractérisation chimique 53 2.1.1. Détermination de la teneur en eau 53 2.1.2. Détermination de la teneur en cendres 54 2.1.3. Détermination de la teneur en protéines brutes 54 2.1.4. Détermination de la teneur en carbohydrates 54 2.1.5. Détermination de la teneur en lipides 55 2.2. Analyse de la fraction lipidique 55 2.2.1. Quantification des phospholipides 55  Réactif 55  Procédure 56 2.2.2. Quantification des stérols 56  Réactif 56  Procédure 56 2.2.3. Analyse du profil en acides gras 57 2.2.4. Analyse des tocophérols 57 2.3. Analyse des minéraux 58  Digestion 58  Analyse 58 3. Etude du potentiel antioxydant des algues collectées de l’ouest algérien 60 3.1. Evaluation in vitro de l’activite antioxydante d’extraits d’algues 60 3.1.1. Préparation des extraits bruts 60 3.1.1.1.Extraction par macération 60  Procédé d’extraction 60 3.1.1.2.Extraction par Soxhlet 60

 Procédé d’extraction 61 3.1.1.3.Détermination du rendement 61 3.1.2. Analyse quantitative des composés secondaires des extraits organiques et aqueux 61 3.1.2.1.Dosage des polyphénols totaux 61  Protocole 62 3.1.2.2.Dosage des flavonoïdes totaux 62  Protocole 62 3.1.2.3.Dosage des tannins condensés 62  Protocole 63 3.1.3. Détermination du pouvoir antioxydant des extraits d’algues 63 3.1.3.1.Activité antiradicalaire : test de piégeage du radical libre DPPH 63  Protocole 64 3.1.3.2.Dosage du pouvoir réducteur 65  Protocole 65 3.2. Evaluation de l’effet de la glace traitée par l’extrait éthanol-aqueux combiné de « Cystoseira compressa » sur la conservation de la qualité du Chinchard commun 66 3.2.1. Préparation de l’extrait de C. Compressa et de la glace 66 3.2.2. Echantillonnage, répartition et conservation du poisson 67 3.2.3. Analyses chimiques 68 3.2.3.1. Détermination du pH. 68 3.2.3.2. Détermination de la teneur en TMA 68  Préparation de l’extrait acide trichloroacétique (TCA) 68  Protocole 68 3.2.3.3. Détermination de la teneur en acides gras libres (AGL) 69  Préparation de l’extrait lipidique 69  Protocole 69 3.2.3.4. Détermination de l’indice de peroxydes 70  Protocole 70 3.2.3.5. Détermination de l’indice de l’acide thiobarbiturique (i-TBA) 70  Protocole 70 3.2.3.6. Détermination des composés fluorescents 71 3.2.4. Analyses microbiologiques 71 4. Etude des activités biologiques de fractions algales enrichies en régulateurs de croissance végétale (PGR) sur une culture de microalgues 72 4.1. Préparation des fractions algales enrichies en PGR 72 4.1.1. Extraction 72 4.1.2. Prétraitement et enrichissement par DLLME 72 4.2. Evaluation de l’effet des différentes fractions algales enrichies sur la croissance de la microalgue Nannochloropsis gaditana 73 4.3. Evaluation de l’effet de la fraction enrichie de C. compressa sur la teneur en lipides et pigments d’une culture de Nannochloropsis gaditana 74 4.3.1. Conditions de cultures 74 4.3.2. Extraction et quantification des lipides 75 4.3.3. Détermination de la concentration en pigments 75 4.4. Caractérisation par LC-TIMS-TOF MS de la fraction de C. compressa 76 5. Analyse statistique 77

TROISIEME PARTIE : RESULTATS & DISCUSSION 78

1. Composition proximale et minérale des algues collectées de l’ouest algérien 78 1.1. Caractérisation chimique 78 1.1.1. Teneur en humidité 78 1.1.2. Teneur en matières minérales 80 1.1.3. Teneur en protéines totales 80 1.1.4. Teneur en carbohydrates 81 1.1.5. Teneur en lipides 82 1.2. Composition de la fraction lipidique des algues 83 1.2.1. Teneur en phospholipides 83 1.2.2. Teneur en stérols 85 1.2.3. Teneur en tocophérols 85 1.2.4. Profils en acides gras 87 1.3. Composition minérale des algues 92 2. Etude du potentiel antioxydant des algues collectées de l’Ouest algérien 97 2.1. Comparaison de l’activité antioxydante in vitro des algues 97 2.1.1. Rendements d’extractions 97 2.1.2. Estimation quantitative des polyphénols, des flavonoïdes et des tannins condensés 99 2.1.2.1. Teneur en polyphénols totaux 99 2.1.2.2. Teneur en flavonoïdes totaux 102 2.1.2.3. Teneur en tannins condensés 103 2.1.3. Evaluation de l’activité antioxydante des extraits algaux 104 2.1.3.1. Activité anti-radicalaire vis-à-vis du radical DPPH 104 2.1.3.2. Pouvoir réducteur 110 2.1.4. Analyse factorielle des correspondances AFC 112 2.1.5. Classification ascendante hiérarchique CAH 115 2.2. Efficacité d'un extrait éthanol-aqueux combiné de l’algue Cystoseira compressa sur l’amélioration de la qualité du chinchard commun Trachurus trachurus 117 2.2.1. Evolution temporelle de la qualité microbiologique post mortem 117 2.2.1.1. Flore mésophile aérobie totale (FMAT) et psychrotrophes 117 2.2.1.2. Entérobactéries 119 2.2.1.3. Microorganismes d’altération spécifique 119 2.2.2. Evolution de la qualité biochimique du chinchard au cours de sa conservation 122 2.2.2.1. Evaluation chimique de l’activité microbienne 122 a) pH 122 b) Teneur en Triméthylamine 123 2.2.2.2. Évaluation chimique de la dégradation des lipides 124 a) Teneur en acides gras libres 124 b) Teneurs en produits primaires, secondaires et tertiaires 125 3. Etude préliminaire sur les activités biologiques de fractions algales enrichies en PGR sur la régulation de la croissance et du métabolisme des microalgues 130 3.1. Obtention d’une fraction enrichie en régulateurs de croissance végétale 130 3.2. Effet des cinq fractions algales enrichies sur la croissance de Nannochloropsis gaditana 132 3.3. Effet de la fraction de C. compressa sur la teneur en lipides et en pigments 136 3.4. Caractérisation par LC-TIMS-TOF MS de la fraction de C. compressa 137

QUATRIEME PARTIE : CONCLUSION GENERALE & PERSPECTIVES 145

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 151 ANNEXES 186 PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES 190

LISTE DES FIGURES

Figure 01: Microalgue « Chlorella vulgaris » 6 Figure 02: Morphologie comparée entre une algue et une plante 7 Figure 03: Étagement de la biocénose de l'estran rocheux 8 Figure 04: Diversité des cycles de reproduction des algues 9 Figure 05: Structures de différents types de carraghénanes et leurs transformations 12 par traitement alcalin Figure 06: Structures de l’ulvane (à gauche) et le fucoidane (à droite) 12 Figure 07: Les différentes classes de composés phénoliques 16 Figure 08: Structures de (a) Dictyodial ; (b) Dictyol C ; (c) Dictyol H. 19 Figure 09: Structure moléculaire de la fucoxanthine 20 Figure 10: Origines des différents radicaux libres oxygénés et espèces réactives de 25 l’oxygène impliqués en biologie Figure 11: Voie de biosynthèse de l’auxine IAA chez Ectocarpus siliculosus 32 Figure 12: Voie de biosynthèse des cytokinines 33 Figure 13: Voie de biosynthèse des gibbérelines chez les plantes 35 Figure 14: Métabolisme de l’ABA, voies de biosynthèse, de dégradation et de 37 conjugaison de la forme acide 2-cis, 4-trans, S(+) abscissique chez les végétaux supérieurs Figure 15: Représentation schématique de la voie de biosynthèse de l’acide 40 jasmonique (JA) Figure 16: Voie de biosynthèse des polyamines 41 Figure 17: Stratégies potentielles de la manipulation du métabolisme phytohormonal 44 pour stimuler certains aspects à intérêt économique chez les microalgues Figure 18: Cystoseira amentacea var. stricta 46 Figure 19: Cystoseira compressa 47 Figure 20: Corallina elongata 48 Figure 21: Enteromorpha compressa 49 Figure 22: Ulva lactuca 50 Figure 23: Localisation géographique du site d’échantillonnage 52 Figure 24: Chinchard commun frais (à droite) et conservation du poisson dans la 67 glace traitée (à gauche). Figure 25: Observation microscopique de Nannochloropsis gaditana 73 Figure 26: Dispositif de culture de Nannochloropsis gaditana en bouteilles 74 Figure 27: Distribution des groupes d’acides gras (saturés, AGS; monoinsaturés, 91 AGMI; polyinsaturés, AGPI) parmi les AG totaux (%) des différentes algues des côtes algériennes. Figure 28: Sommes des AGPI n-3 et n-6 et ratios n-6/n-3 chez les différentes algues 92 collectées des côtes algériennes Figure 29: Evolution du pourcentage d’inhibition des extraits d’algues (EM, EE et 105 EAQ) extrait au soxhlet et des antioxydants standards (BHT, Vit C et Vit E) vis-à-vis du radical DPPH, en fonction de différentes concentrations. Figure 30: Evolution du pourcentage d’inhibition des extraits d’algues (EM, EE et 106

EAQ) extrait par macération et des antioxydants standards (BHT, Vit C et Vit E) vis- à-vis du radical DPPH, en fonction de différentes concentrations. Figure 31: Représentation graphique du plan factoriel F1-F2 114 Figure 32 : Classification hiérarchique des paramètres 116 Figure 33: Evolution temporelle du pH chez le chinchard commun (T. trachurus) du 123 lot témoin, CAF et CAE Figure 34: Evolution temporelle du la teneur en TMA (mg N-TMA/kg de muscle) 124 chez le chinchard commun (T. trachurus), du lot témoin, CAF et CAE. Figure 35: Evolution temporelle de la teneur en AGL (mg/kg de muscle) chez le 125 chinchard commun (T. trachurus), du lot témoin, CAF et CAE. Figure 36: Evolution temporelle de la teneur en peroxydes (meq oxygène actif/kg de 126 lipides) chez le chinchard commun (T. trachurus) du lot témoin, CAF et CAE. Figure 37: Evolution temporelle de l’indice de TBA (mg MDA/kg de muscle) chez 127 le chinchard commun (T. trachurus) du lot témoin, CAF et CAE. Figure 38: Evolution temporelle des composés fluorescents chez le chinchard 128 commun (T. trachurus) du lot témoin, CAF et CAE. Figure 39: Extraction à partir de l’algue Cystoseira stricta 132 Figure 40: Phase sédimentée récupérer à l’issu du prétraitement par DLLME 132 Figure 41: Effets de différentes concentrations des fractions algales sur la croissance 134 de Nannochloropsis gaditana, (a) 0,05%, (b) 0,1%, (c) 0,2% et (d) 0,4%. Figure 42: Effets de fraction de C. compressa (0,1%), sur la croissance de 136 Nannochloropsis gaditana pendant 11 jours de cultures. Figure 43: Chromatogramme LC-ESI-TIMS-TOF MS de l’extrait de C. compressa 138 en mode positif Figure 44: Chromatogramme LC-ESI-TIMS-TOF MS de l’extrait de C. compressa 141 en mode négatif

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1: Applications potentielles des composés détectées chez des espèces des 51 genres Cystoseira, Corallina, Ulva et Enteromorpha, en nutrition et santé humaine Tableau 2: Contrôle de la précision de la procédure analytique de détermination des 59 éléments traces (moyenne ± ET)*. Tableau 3: Programme du gradient d’élution (HPLC). 76 Tableau 4: Composition proximale des échantillons d’algues brunes, rouge et vertes 79 collectés des côtes Ouest algérienne* Tableau 5: Teneurs* en phospholipides, stérols et tocophérols de différentes algues 84 brunes, rouge et vertes collectés des côtes Ouest algérienne** Tableau 6: Composition en acides gras des différentes algues brunes, rouge et vertes 88 collectés des côtes Ouest algérienne* Tableau 7: Composition en minéraux des différentes algues brunes, rouge et vertes 93 collectés des côtes Ouest algérienne* Tableau 8: Rendements extractions (%) par macération et soxhlet; extraits 98 méthanoliques, éthanoliques et aqueux à partir de 5g, des algues C. compressa, C. stricta, C. elongata, E. compressa et U. lactuca Tableau 9: Teneur en polyphénols totaux, flavonoïdes totaux et tannins condensés des 100 différents extraits d’algues (à 2000 µg/ml) Tableau 10: Concentration d’inhibition (IC50) des extraits d’algues, du BHT, vit C et 107 vit E Tableau 11: Pouvoir réducteur des extraits d’algues, du BHT, vit C et vit E 111 Tableau 12: Valeur propre, variance et pourcentage de variance de l'AFC 113 Tableau 13: Dénombrement de FMAT et des psychrotrophes (log CFU/g muscle) 118 dans le muscle du chinchard commun réfrigéré sous différentes conditions. Tableau 14: Dénombrement des entérobactéries, des bactéries protéolytiques et 120 lipolytiques (log CFU/g muscle) dans le muscle du chinchard commun réfrigéré sous différentes conditions. Tableau 15: Composition cellulaire en lipides, chlorophylle-a et caroténoides, après 137 11 jours d’incubation sous des conditions optimales (n=3). (Les lettres a et b, indiquent les différences significatives). Tableau 16: Temps de rétention (TR), spectre de masse, tentatives d’identification et 138 formules moléculaires des produits présents dans l’extrait de C. compressa en mode positif. Tableau 17: Temps de rétention (TR), spectre de masse, tentatives d’identification et 141 formules moléculaires des produits présents dans l’extrait de C. compressa en mode négatif.

iii

LISTE DES ABREVIATIONS

1O2 : Oxygène singulet ABA : Acide abscissique A.G.: Acide gras A.G.P.I : Acide gras polyinsaturé * (A )n : Un nouveau radical libre formé (AHn) : Substance antioxydante A D N : Acide désoxyribonucléique ATP : Adénosine Triphosphate AMP : Adénosine Monophosphate AlCl3 : Trichlorure d'aluminium B.H.A : Butylhydroxyanisol B.H.T : Butylhydroxytoluène CIO- : Anion hypochlorite CK : Cytokinin DLLME : Dispersive liquid-liquid micro-extraction DHA : Acide Docosahexaenoique DMA : Diméthylamine DPPH : 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazil DPPH-H : 2,2-diphényle-1-pirylhydrazine EAG : Equivalent acide gallique EC : Equivalent catéchine EQ : Equivalent quercétine E.P.A : Acide eicosapentaénoïque ERO: Espèces réactives de l'oxygène F.A.O : Food and Agriculture Organization GA: Gibberellic Acid GC : Gaz Chromatrography GPS: Global Positioning System HO•: Radical hydroxyle HPLC: Chromatographie liquide à haut performance IC50 : Concentration d’inhibition à 50 % IAA: Indole-3-acétique acid IBA: Indole-3-butyric acid IPA: Indole-3-propionic acid K: Kinétine K3[Fe (CN6)] Ferricyanure de potassium LT : Lipides Totaux MDA : Malonaldehyde M.H. : Matière Humide M.S. : Matière sèche MS : Spectrométrie de masse NAA: 1-naphthylacetic acid NADPH : Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate NO• : Oxyde nitrique • O 2 : Anion superoxyde ONOO- : Peroxynitrite SH : Sulfhydryle SOD : Superoxyde dismutase

INTRODUCTION GENERALE

Introduction générale

Dans les mers et les océans qui recouvrent les deux tiers de la surface de la terre, vingt- cinq mille espèces d’algues sont recensées. Elles représentent la presque totalité de la flore marine et sont considérées comme les premiers êtres vivants apparus, il y a quelques six cent millions d’années (Mérigout, 2006).

Ces algues marines se présentent parmi les végétaux les plus productifs de la planète. Pour faire face à l’absence de racines, ces végétaux marins ont dû développer des stratégies de développement et de nutrition particulièrement performantes. Leur ingéniosité biochimique les a ainsi amenées à développer différentes stratégies d’adaptation et de lutte tout à fait exceptionnelles, pour résister et survivre aux différents stress abiotiques (hydrique, osmotique, thermique, …) et biotiques (herbivores, champignons, …). Ces stratégies ont abouti à la mise en place de tout un arsenal biologique d’une remarquable efficacité. Les algues ont aussi une faculté extraordinaire à concentrer les principes actifs présents dans l'eau de mer (jusqu'à 50000 fois) (Mérigout, 2006).

Parmis ces biomolécules algales, on trouve : des caroténoïdes, des fibres, des vitamines et des minéraux; et plusieurs substances actives telles que les protéines, les acides gras essentiels, les polysaccharides et les polyphénols (Meenakshi et al., 2011). Ces dernières offrent un éventail d'activités biologiques, notamment le pouvoir anti-inflammatoire, antimicrobien, anticancéreux, antiviral, anti-protozoaire, anticoagulatif, antifongique, antioxydant, etc (Hellio et al., 2004 ; Cox et al., 2010 ; Taboada et al., 2012).

Le secteur algal est de ce fait en plein essor. En effet, la production mondiale des macroalgues s’est élevée à plus de 27 millions de tonnes en 2014. Ainsi la masse monétaire mondiale brassée chaque année par l’industrie algale est estimée entre 5,5 et 6,5 milliards d’euros, une croissance continue liée à la culture (F.A.O., 2016). 40% de la biomasse algale sont dédiés à l’alimentation, 55% au secteur des texturants et 5% à d’autres usages : engrais, cosmétiques, pharmaceutiques ou textiles (Marfaing, 2017).

Introduction générale

Actuellement, un intérêt particulier est porté à la recherche d'antioxydants naturels, pour la lutte contre le stress oxydatif responsable du vieillissement, et de nombreuses maladies tels que le cancer, les accidents cardiovasculaires et les maladies inflammatoires et neurodégénératives (Favier, 2003). Et les algues sont une source potentielle d’antioxydants naturels, comme les acides phénoliques, les flavonoïdes et les tannins; qui possédent la capacité d’éliminer les espèces réactives de l’oxygène (ERO) et minimisent ainsi, les dommages oxydatifs causés aux cellules vivantes (Cornish & Garbary, 2010)

Les macroalgues permettent également de prévenir la dégradation oxydative des aliments, offrant ainsi aux domaines de l’industrie pharmaceutique et alimentaire une alternative intéressante aux antioxydants synthétiques carcinogènes comme le butyl-hydroxytoluène (BHT), le Butyl-hydroxyanisol (BHA) et le propyl gallate (PG) (Safer & Al-Nughamish, 1999).

Les algues possèdent aussi de nombreuses propriétés biologiques intéréssantes pour l'agriculture et l'algoculture, de part leur activité hormonale. En effet, le développement d’une algue est sous la dépendance d’un système de régulation, grâce à des messages chimiques internes à l’algue qu’on appelle les hormones végétales. Ces phytohormones sont des composés organiques connus pour induire de fortes réponses physiologiques à de très faibles concentrations. De plus, il est rapporté la présence de plus d’un groupe de phytohormones et de régulateurs de croissance végétale (PGR) dans des extraits de macroalgues et de microalgues (Stirk et al., 2003 ; Ördög et al., 2004 ; Plettner et al., 2005), jouant un rôle important dans plusieurs voies métaboliques.

Ces phytohormones et leurs dérivés participent à la régulation de la croissance et du développement des végétaux, offrant une meilleure germination des graines, une augmentation du développement racinaire, ainsi qu'une meilleure résistance aux stress et aux maladies (Mérigout, 2006).

Ils peuvent aussi avoir un effet stimulant sur la croissance des microalgues (biomasse) et la production de métabolites (caroténoides, lipides, carbohydrates et protéines) (Salama et al., 2014). Ces hormones peuvent également stimuler la croissance dans des conditions défavorables telles qu’une salinité élevée, la dessiccation ou une carence en nutriments (Bajguz & Piotrowska-Niczyporuk, 2013). Ce qui pourrait présenter un intérêt à l'échelle industrielle de production, où il est important d'optimiser un milieu nutritif approprié pour la culture d'une espèce de microalgue, qui permettrait de favoriser la croissance et d'augmenter le rendement des cultures.

Introduction générale

L’extraction de principes actifs à haute valeur ajoutée à partir de matière végétale, notamment les antioxydants et les hormones de croissance, suscitent actuellement beaucoup d’intérêt. Néanmoins, les méthodes utilisées pour la préparation des extraits d’algues sont variées. Elles font souvent l’objet d’un dépôt de brevets et ne sont décrites dans les publications que de manière sommaire et incomplète. Le processus industriel qui prend en compte les spécificités physiques et biochimiques des algues, fait intervenir différentes technologies dans le domaine de l’extraction végétale et de la purification. Le matériel végétal peut être soumis à l’action de différentes températures, d’un milieu alcalin, ou de pressions variées. La nature des extraits commerciaux peut dans certains cas, être très différente de la composition originelle des algues qui ont servi à leur préparation. Plusieurs usines en ont fait leur activité principale. Il y a là encore, une voie de recherche très intéressante qui doit conduire à la mise en service de produits plus performants.

L’Algérie est un pays avec une face maritime s’étalant sur 1600 km et qui constitue une source riche en algues marines, qui reste cependant inexploitée, alors que les algues constituent un enjeu de développement économique.

La Méditerranée renferme plus de huit cents espèces et la flore algale du littoral algérien reste largement inexplorée. Cependant, en regroupant tous les taxons et stades d’algues signalés sur les côtes algériennes (d’Ouest en Est), plus de 468 taxons ont été inventoriés (Perret-Boudouresque & Seridi, 1989). D'autres travaux ont enrichis la diversité spécifique de cette flore de 26 espèces (Seridi, 1990 ; Kadari-Meziane, 1994 ; Ould-Ahmed; 1994), auxquelles s’ajoutent des mentions nouvelles sur la présence d’un taxon invasif en l’occurrence Caulerpa racemosa devant le port d’Alger et de Mostaganem (Ould-Ahmed & Meinesz, 2007 ; Bachir-Bouiadjra et al., 2010 ; Bachir-Bouiadjra, 2012). Selon Seridi (2007), la flore algale de l’Algérie reste peu étudiée et en adoptant la méthode phytosociologique, cet auteur signale que le nombre d’algues a légèrement augmenté (497 espèces) (Zitouni, 2015).

Compte tenu, des quelques contributions d’ordre chimique sur la flore algale algérienne, qui ont porté essentiellement sur la caractérisation chimique partielle de quelques espèces (Benchabane, 1988 ; 1989; Zitouni et al., 2014 ; Nil et al., 2016 ; Mellouk et al., 2017) et leurs activités biologiques : antioxydante, antimicrobienne, antifongique, anti-parasitique et cytotoxique (Saidani et al., 2012 ; Metidji et al., 2015 ; Aissaoui et al., 2017); l’exploration plus approfondis des potentialités de cette flore marine s’avère nécessaire, dans la perspective d’une valorisation.

Introduction générale

Ce travail de recherche a pour objectif de contribuer à fournir des informations sur la composition nutritionnelle de la macroflore algale et d’identifier les espèces qui présentent un intérêt pour des applications pharmaceutiques, alimentaires ou fertilisantes. Cette étude vise également la recherche de nouvelles sources d’antioxydants naturels et de régulateurs de croissance végétale (phytohormones) chez les macroalgues. Et leur exploitation dans le domaine de la conservation alimentaire des produits de la pêche et dans un nouveau domaine en l’occurrence l’aquaculture d’algues. Deux voies de valorisation qui à ce jour n’ont jamais été entreprise en Algérie.

Pour ce faire, les travaux réalisés durant cette thèse s’articulent autour de trois volets :

1) La détermination de la composition proximale (humidité, cendres, protéines, lipides et carbohydrates), lipidique (profil en acides gras et contenus en phospholipides, stérols totaux et composés tocophérols) et minérale (macroéléments et éléments traces; essentiels et toxiques) de cinq espèces d’algues abondantes sur la côte oranaise, à savoir : Cystoseira stricta, Cystoseira compressa, Corallina elongata, Enteromorpha compressa et Ulva lactuca).

2) L’évaluation des propriétés antioxydantes, structurées en 3 actions complémentaires : une étude comparative de deux méthodes d’extraction des antioxydants (macération et soxhlet, en présence de différents solvants). Le criblage des espèces pour leur capacité anti-radicalaire (DPPH), leur pouvoir réducteur et leur contenus en composés phénoliques. Et l’étude de l’efficacité d’un extrait antioxydant sur la peroxydation lipidique et l'altération microbienne pendant la conservation du poisson.

3) L’étude de l’activité biologique de fractions algales enrichies en régulateurs de croissance végétale, obtenues par la méthode de pré-enrichissement D.L.L.M.E. (Microextraction Liquide-Liquide Dispersive), sur la croissance et la composition chimique d’une culture de microalgues et l’identification des PGRs présents dans l’extrait bioactif et stimulateur.

Nous réaliserons également une synthèse bibliographique des travaux antérieurs que nous présenterons au sein d’une première partie, divisée en quatre chapitres dans lesquels : la biodiversité, la chimiodiversité et les applications des macroalgues marines seront exposées, des notions sur les antioxydants, leur mode d’action et leur occurrence chez les algues seront

Introduction générale rappelés et la biosynthèse et les applications en biotechnologie des régulateurs de croissance végétale des algues seront présentées. Et enfin, les espèces étudiées seront décrites.

La seconde partie est consacrée à la description de la campagne d’échantillonnage, des protocoles expérimentaux et des analyses statistiques employées. Dans une troisième partie, les résultats acquis seront expliqués et discutés en paralléle. Et enfin, une conclusion générale de l’ensemble des travaux réalisés clôturera ce manuscrit laissant place à de nouvelles perspectives.

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

Synthèse bibliographique

Chapitre 1: Biodiversité, chimiodiversité et applications des macroalgues

1. Introduction

Les algues sont des organismes aquatiques, chlorophylliens, thallophytes qui appartiennent au groupe des cryptogames (Roland et al., 1999). Elles possèdent toutes de la chlorophylle et en ce sens, ce sont des végétaux (Leclerc & Floc'h, 2010). La photosynthèse leur permet de fixer le carbone atmosphérique ou dissous dans l’eau à partir de l’énergie lumineuse pour produire de la biomasse. Les algues utilisent différents pigments chlorophylliens leur permettant de capter des photons de diverses longueurs d’ondes (Person, 2010). Elles sont une partie des producteurs primaires constituant le premier niveau trophique des écosystèmes. Les algues sont donc un élément fondamental du fonctionnement des milieux aquatiques et en particulier la ressource trophique des organismes phytophages (Dutartre et al., 2008).

Les algues regroupent un ensemble d’organismes très variés, divisés en deux groupes:

 Les macroalgues  Les microalgues: la cellule unique de microalgues unicellulaires est capable d’assurer toutes les fonctions. Leur taille est d’une dizaine de microns et la plupart d’entre elles sont adaptées à la flottaison, de nombreuses espèces possèdent un ou plusieurs flagelles mobiles qui leur confèrent une véritable aptitude à la nage (Hortense, 2011) (Figure 01).

Figure 01: Microalgue « Chlorella vulgaris » (www.algaebase.org).

(Karl Bruun, 2008; Seattle, Washington, USA; x1000).

Synthèse bibliographique

2. Généralités sur les macroalgues

Les algues macroscopiques se distinguent par rapport aux autres végétaux par leur thalle, appareil végétatif pluricellulaire, dépourvu de racines, de tige, de feuilles ou de fleurs (Figure 02). En effet, l’algue possède des crampons qui lui permettent de se fixer au substratum. Elle n’a pas besoin de racines pour s’alimenter car elle absorbe les nutriments par toute sa surface en contact avec l’eau. Les macroalgues ne possèdent pas non plus de vaisseaux conducteurs sauf quelques ébauches rudimentaires chez certaines algues brunes comme les laminaires et les fucus. Les crampons sont surmontés d’un pédoncule appelé le stipe, qui se termine par une arborescence ou plusieurs ramifications appelées frondes (Garon-Lardiere, 2004 ; Leclerc & Floc'h, 2010). Cependant, les cellules des algues possèdent les mêmes éléments de structure que celles des plantes supérieures. Elles ont une paroi cellulaire partiellement cellulosique, des petits noyaux et des plastes pigmentés ou chromatophores (Garon-Lardiere, 2004).

Figure 02: Morphologie comparée entre une algue et une plante (Leclerc & Floc'h, 2010).

2.1. Habitat et écologie

Les macroalgues peuvent être considérées comme des organismes généralement inféodés aux zones humides (d’eaux marines, d’eaux saumâtres ou d’eaux douces) (Person, 2010). La plupart des algues vivent en effet dans les océans et y représentent plus de 90 % des végétaux (Leclerc & Floc'h, 2010). Mais les macroalgues ne vivent pas seulement dans les océans, il y en a aussi sur les continents. Là, elles colonisent les lacs, les rivières, les étangs et les mares. C’est dans ces milieux d’eau douce aux conditions si variées que l’on rencontre le plus grand nombre d’espèces (Leclerc & Floc'h, 2010).

Synthèse bibliographique

Les macroalgues des côtes rocheuses sont fixées par des crampons robustes aux rochers ou aux galets jusqu'à une profondeur de 50 à 75 mètres, mais elles se raréfient très rapidement avec la profondeur au-delà de 30 mètres. Elles ne peuvent occuper que des niches écologiques permettant l’accès à la lumière quoiqu’il puisse exister parfois durant le cycle de vie un stade non photosynthétique. Il s’agit de la zone photique qui n’excède pas 100 m de profondeur voire beaucoup moins selon la turbidité des eaux ; les macroalgues sont donc limitées à la frange littorale (Figure 03) (Person, 2010).

Les variations des facteurs environnementaux, physiques ou chimiques, comme l’éclairement, l’acidification, l’augmentation ou la forte diminution de la température et/ou des teneurs en nutriments, modifient profondément la composition des communautés (Dutartre et al., 2008).

Figure 03: Étagement de la biocénose de l'estran rocheux.

(https://www.svt-lycee-elorn.ovh/mer_iroise_photo.php).

Synthèse bibliographique

2.2. Reproduction

Dans de très nombreux cas, la reproduction s'effectue par multiplication végétative (asexuée) qui consiste en une fragmentation du thalle aboutissant à la formation de plusieurs organismes identiques. Elle est souvent réalisée par la formation de cellules spécialisées : les spores. Les macroalgues réalisent également une reproduction sexuée au cours de laquelle l'union de deux cellules reproductrices, ou gamètes produit un zygote (Garon-Lardiere, 2004).

La reproduction des macroalgues se déroule ainsi selon une alternance de phases de reproduction asexuée assurée par les thalles (sporophytes), et de phases de reproduction sexuée, assurée par des thalles producteurs de gamètes (gamétophytes). Aux cycles d'alternance de génération plus ou moins variés, se superpose également une alternance de phases de n à 2n chromosomes où différents stades se succèdent, les gamétophytes haploïdes et les sporophytes diploïdes (Garon-Lardiere, 2004).

L’importance relative des phases est très variable selon les espèces (Figure 04). Chez l’ulve ou le Dictyota, les deux générations sont morphologiquement semblables; dans d’autres espèces elles sont différentes. Par exemple, les thalles des laminaires présentent une diplophase très dominante sur une haplophase microscopique réduite à quelques cellules portant les gamétocystes. Chez les algues rouges, on distingue un cycle où se succèdent trois générations car la phase diploïde se déroule en deux périodes distinctes (la première issue du zygote, se développe en parasite des rameaux porteurs des gamètes femelles, elle dissémine des spores donnant des thalles diploïdes indépendants où se fera la méiose). De nombreuses espèces (Ulothrix) produisent des spores directes (non produites par méiose) qui assurent une multiplication végétative se situant en marge du cycle sexué (Roland & Vian, 1985).

Figure 04: Diversité des cycles de reproduction des algues (Roland & Vian, 1985).

a. Cycle haplophasique (Chlamydomonas, Ulothrix, Spirogyre). b. Cycle haplo-diplophasique (Ulva, Dictyota). c. Cycle diplophasique (Fucus, Codium, Diatomées). d. Cycle à trois générations successives (Algues rouges). F, fécondation; g, gamètes; RC, réduction chromatique; s, spore ; Z, zygote.

Synthèse bibliographique

2.3. Classification

Les algues peuvent être classées en une dizaine d’embranchements selon des critères basés sur leur composition pigmentaire, leurs polysaccharides de réserve ou leurs caractéristiques structurales (Ruiz, 2005). Un des critères de classification des macroalgues est leur pigmentation, qui permet de définir plusieurs grands groupes :

 Les algues brunes (Phéophycées)

Il existe autour de 1800 espèces de macroalgues brunes (Person, 2010). La couleur brune de ces algues résulte de la dominance des pigments xanthophylles et surtout la fucoxanthine, qui masque les autres pigments (chlorophylle a et c, ainsi que le β-carotène). Toutes possèdent une structure pluricellulaire, mais leur dimension varie depuis les éléments microscopiques jusqu'aux très grands spécimens (Garon-Lardiere, 2004).

 Les algues rouges (Rhodophycées)

Les rhodophytes forment un groupe très diversifié, on répertorie environ 6000 espèces de macroalgues rouges (Person, 2010). Ces algues doivent leur couleur à la présence de plastes roses dans lesquels un pigment rouge, la phycoérythrine, est associé à plusieurs autres pigments dont les chlorophylles. La plupart de ces algues rouges sont pluricellulaires et marines et quelques-unes vivent également en eau douce. Les algues rouges sont divisées en deux groupes: celui des Bangiophycées (qualifiées de primitives) et celui des Floridéophycées (plus complexes). Elles se distinguent généralement par leur cycle de reproduction particulièrement complexe (Garon-Lardiere, 2004).

 Les algues vertes (Chlorophycées)

Elles sont de formes très variées. Leurs plastes sont colorés en vert par les chlorophylles a et b, auxquelles sont associés des carotènes et des xanthophylles. La photosynthèse permet la formation d'amidon, comme pour les plantes supérieures. La plupart des algues vertes vivent en eau douce ou en milieux marins, mais certaines espèces peuvent également se développer sur terre. Elles jouent un rôle important dans l'oxygénation des eaux, favorisant ainsi la vie animale. (Garon-Lardiere, 2004). Il a été recensé approximativement 1200 espèces de macroalgues vertes (Person, 2010).

Synthèse bibliographique

3. Composition biochimique des macroalgues

La composition chimique des algues varie en fonction de l’espèce, la maturité, l’habitat et les conditions environnementales (Ortiz et al., 2006). La synthèse de métabolites algaux varie selon le groupe phylogénétique et atteint son maximum en saison printanière et estivale, qui correspond à la période de croissance active et de maturité sexuelle, ainsi qu’à l’augmentation de la température et de la photopériode (Hornsey & Hide, 1974 ; Farid et al., 2007).

3.1. Métabolites primaires

Les algues se composent généralement d’une fraction minérale variée, de protéines bien équilibrées en acides aminés, d'une faible quantité de lipides riche en AGPI, ainsi qu’une proportion élevée en polysaccharides (Mabeau & Fleurence, 1993).

3.1.1. Polysaccharides

Le fort intérêt des macroalgues réside non seulement dans leur richesse en polysaccharides classiques, comme ceux trouvés dans des plantes supérieures (amidon, cellulose), mais surtout dans leur richesse en polysaccharides très particuliers: les phycocolloïdes (Person, 2010).

Les algues constituent des sources importantes de polysaccharides de 32 à 74%, ayant des structures variées et originales, différentes des fibres des végétaux terrestres (Lahaye, 1991 ; Leclerc & Floc’h, 2010 ; Zitouni, 2015). La majeure partie de ces polysaccharides n'est pas digérée par les enzymes endogènes humaines et peuvent être considérés comme des fibres alimentaires.

Les plus important polysaccharides algaux sont: les ulvanes chez les algues vertes (Chlorophycée), les alginates, les fucoidanes et les laminarines chez les algues brunes (Phéophycée) et les galactanes, les carraghénanes, les xylomannanes et les porphyranes chez les algues rouges (Rhodophycée) (Pujol et al., 2002). Ces composés sont caractérisés par des propriétés antibactériennes, anti-prolifératives, anti-coagulantes, antioxydantes, anti- lipidémiques, anti-inflammatoires, antitumorales, anti-thrombotiques, antivirales, immunorégulateurs et prébiotiques (Jiao et al., 2011 ; Mohamed et al., 2012).

Synthèse bibliographique

Figure 05: Structures de différents types de carraghénanes et leurs transformations par traitement alcalin (Jiao et al., 2011).

Figure 06: Structures de l’ulvane (à gauche) et le fucoidane (à droite) (Jiao et al., 2011).

Les hydrocolloïdes constituent, à ce jour, les principaux produits industriels dérivés des macroalgues (Person, 2010). L’agar, les carraghénanes ou les alginates sont communément utilisés comme gélifiant et épaississant dans l’industrie agroalimentaire et en industrie pharmaceutique comme des stabilisateurs. Les polysaccharides sont aussi utilisés comme additif alimentaire pour les animaux (Gupta & Abu-Ghannam, 2011). Ils sont aussi bénéfiques pour les plantes, en effet, ils peuvent stimuler les réponses de défense et de protection contre les pathogènes des plantes et grâce aux propriétés chélatrices des

Synthèse bibliographique polysaccharides, ils peuvent être utilisés comme supports de micro-éléments pour la production de nouvelles préparations de fertilisants (Vera et al., 2011).

3.1.2. Protéines

La teneur en protéines des algues marines est variable de phylum à phylum. Généralement, la fraction protéique la plus élevée est enregistrée chez les algues vertes et rouges (10-47% de matière sèche), alors qu’elle est généralement petite chez les algues brunes (5-24% MS) (Fleurence, 1999 ; Matanjun et al., 2009). Certaines espèces d'algues rouges telles que Porphyra sp. commercialement cultivée possèdent une fraction protéique qui s'étend de 30 à 50%. Ces teneurs peuvent être comparables, du point de vue quantitatif, à celles des légumineuses comme le soja (35%) (Mohamed et al., 2012).

Les protéines trouvées dans les algues contiennent tous les acides aminés essentiels. La leucine, la valine et la méthionine sont les plus abondants chez Palmaria palmata et leurs teneurs sont comparables à ceux de l’ovalbumine. Les concentrations en isoleucine et thréonine sont similaires à ceux rapportées dans les protéines de légumes (Bocanegra et al., 2009). La leucine, la phenylalanine et la valine sont les acides aminés essentiels majeurs chez Ulva rigida, alors que la teneur en histidine est similaire à celle trouvée dans les légumes et les œufs (Taboada et al., 2009 ; Lordan et al., 2011). D’autres comme Ulva spp. contiennent 26 et 32% des acides aminés totaux, en acide aspartique et glutamique, respectivement (Fleurence, 1999), ce qui explique leurs propriétés de rehausseur de goût.

Les biliprotéines des algues rouges sont utilisées comme marqueurs fluorescents. Il existe trois types de phycobiliprotéines : l'allophycocyanine, la phycocyanine et la phycoérythrine (Tierney et al., 2010). Les phycobiliprotéines ont montré en plus des propriétés antioxydantes qui sont bénéfiques pour la prévention et le traitement des maladies neurodégénératives, le cancer et les ulcères gastriques, des propriétés anti-inflammatoires et antivirales (Holdt & Kraan, 2011).

Une autre importante protéine active qui peut être extraite des macroalgues est la lectine, qui se lie aux carbohydrates et participe à différents processus biologiques tels que les communications intracellulaires. Les lectines possèdent également des activités antibactériennes, antivirales ou anti-inflammatoires (Chojnacka et al., 2012).

Synthèse bibliographique

3.1.3. Lipides

La teneur lipidique est très faible et varie de 1-5% (Person 2010). Les phospholipides et les glycolipides sont les principales classes de lipides et les algues accumulent des AGPI, lorsqu’il y a chute de la température environnementale (Holdt & Kraan, 2011).

Du point de vue qualitatif, les lipides algaux présentent une proportion en AG essentiels importante, qui sont les ω-3 polyinsaturés (acides α-linoléique, eicosapentaénoïque) à activité antioxydante. Ces acides gras protègent des maladies cardiovasculaires et cérébro-vasculaires et sont actifs contre les œdèmes, les inflammations et les érythèmes (Chouikhi, 2013).

Les algues vertes ont une teneur en acide oléique (C18:1) et en acide α-linolénique (C18:3 ω3) (acides gras indispensables, non synthétisés par l’homme) beaucoup plus élevée que les végétaux supérieurs. Les algues rouges contiennent des taux élevés d’acides gras polyinsaturés à 20 carbones. On trouve également de l’acide arachidonique (C20:4 ω6) et des acides gras polyinsaturés à 18 carbones. L’acide eicosapentaénoïque (C20:5 ω3) constitue 50% des acides gras polyinsaturés chez les algues rouges Porphyra sp. et Palmaria palmata (Darcy-Vrillon, 1993). Quant aux algues brunes, elles ont une distribution en acides gras comparable à celle des algues rouges. A ce jour, aucune étude n’a rapporté la présence d’acides gras trans indésirables chez les macroalgues.

Les lipides algaux sont des sources de stérols particulières, qui sont une caractéristique intéressante de quelques algues brunes (Fucostérol). Leur contribution comme source d'énergie alimentaire semble faible, en revanche, les phytostérols présentent des activités antifongiques, antibactériennes, anti-inflammatoires, anti-tumorales, antioxydantes et anti- cholestérol (Sánchez-Machado et al., 2004 ; Hamid et al., 2015).

3.1.4. Minéraux

Les algues possédent une composition minérale élevée qui varie selon le phylum et divers autres facteurs (variation saisonnière, environnementale, géographique et physiologique), d'où une fraction minérale qui peut représenter jusqu'à 40% de la masse sèche.

Les algues brunes, vertes et rouges ont des quantités équivalentes en matières minérales totales. Cependant, les algues vertes en ont un taux un peu inférieur par rapport aux deux autres catégories d’algues qui possédent un contenu très élevé en minéraux (15-36% d'algues séchées) (Person, 2010).

Synthèse bibliographique

La plupart des macroalgues ont des teneurs élevées en macroéléments tels que le sodium, le magnésium, le potassium, le calcium, le phosphore, le chlore, le soufre, ainsi qu’une grande variété d'oligoéléments. Parmis lesquels : de l’iode, du zinc, du fer, de l’aluminium, du manganèse, du nickel, du sélénium, du cuivre, du molybdène, du fluor, du bore, du cobalt, de l’étain, de l’argent, du plomb, du bismuth, une forme toxique d’arsenic, de l’antimoine, du lithium, de l’or, du baryum, du strontium et du titane. Il est donc fondamental, que les algues alimentaires se développent dans des milieux exempts de pollution (Hortense, 2011).

3.2. Métabolites secondaires

En général, les algues sont capables de produire une large gamme de métabolites secondaires aux différentes activités biologiques.

3.2.1. Polyphénols

Les polyphénols constituent le groupe de composés chimiques le plus distribué dans le royaume des végétaux, avec plus de 8000 structures phénoliques connues (Tsao, 2010). Ils résultent de deux voies de biosynthéses principales: la voie shikimate et acétate (Bravo, 1998). L’élément structural fondamental qui caractérise les composés phénoliques est la présence d’un cycle aromatique portant au moins un groupement hydroxyle. Ainsi, le phénol est la structure de base de tout le groupe. Il se trouve généralement sous forme d’ester lié aux acides organiques ou de glycoside lié aux sucres (Vermerris & Nicholson, 2006).

Les polyphénols peuvent être divisés en plusieurs classes différentes selon leur structure chimique de base (Harborne, 1989). On distingue : les acides phénoliques, les flavonoïdes, les tannins hydrolysables et condensés, les phlorotannins, les stilbènes, les lignanes, les saponines et les phytostanols (Figure 07).

Ces substances chimiques sont réputées avoir plusieurs activités biologiques, y compris des propriétés antioxydantes meilleures que celles de la vitamine E (Rice-Evans et al., 1995). Des rapports antérieurs (Ganesan et al., 2008 ; Cho et al., 2010 ; Shanab et al., 2011 ; Rico et al., 2012) ont révélé que des extraits d’algues rouges et vertes, en particulier leurs polyphénols ont une activité antioxydante très intéressante.

Synthèse bibliographique

Les différentes classes de phénoliques différentes de composés 2010).Les classes (Rezzag,

Figure 07: Figure

Synthèse bibliographique

Les composés phénoliques présentent d’autres actions bénéfiques sur la santé telles que des activités antiprolifératives, anti-inflammatoires (Wijesekara et al., 2010) et antimicrobiennes (Goecke et al., 2012). De plus, ils peuvent protéger les neurones contre le stress oxydatif, stimuler la vasodilatation et améliorer la sécrétion d'insuline (Hwang et al., 2006).

Les flavonoïdes et les tannins sont considérés comme les composés phénoliques les plus importants (Rezzag, 2010) de par leurs activités biologiques.

3.2.1.1. Flavonoïdes

Les flavonoïdes avec plus de 4000 composés identifiés (Middleton & Kandaswami, 1994), possèdent le même élément structural de base: le noyau flavane (Bruneton, 1999). Ils sont connus pour contenir un large éventail d’activités chimiques et biologiques: activité antitumorale, antioxydante, antivirale, antihypertensive, antiallergique, anti-inflammatoire et antimicrobienne (Das et al., 1994 ; Cushine & Lamb, 2005 ; Asres et al., 2005 ; Kim et al., 2007). Ils jouent également un rôle dans la prévention des maladies cardiovasculaires (Tijburg et al., 1997).

Des études ont révélé que les flavonoïdes sont de bons inhibiteurs d’enzymes responsables de la production des radicaux libres comme la cyclooxygenase et la lipooxygènase et la xanthine oxydase (Marfak, 2003) et des piégeurs efficaces des radicaux hydroxyles et peroxydes impliqués dans la peroxydation lipidique (en particulier la quercétine), ce qui est un élément important pour la protection des membranes cellulaires et qui complète les systèmes enzymatiques de défense cellulaire (Milane, 2004).

3.2.1.2. Tannins

Les tannins sont des composés phénoliques solubles dans l’eau, avec en outre les propriétés habituelles des phénols, à savoir la capacité de précipiter les alcaloïdes, la gélatine et autres protéines. Ils ont de grandes capacités antioxydantes dues à leur noyau phénol. Les tannins hydrolysables et condensés sont 15 à 30 fois plus efficaces que les phénols simples. Ils contiennent de nombreux groupements hydroxyles (sur les noyaux phénoliques), ce qui leur permet de former des complexes insolubles avec les hydrates de carbone, des ions métalliques et des protéines. Cette réaction avec les protéines est à l’origine de nombreux

Synthèse bibliographique effets biologiques, les enzymes complexées de cette façon montrent une réduction marquée de leurs activités (Peronny, 2005).

Les applications médicales des plantes à tannins découlent de leur affinité pour les protéines : par voie externe, ils imperméabilisent les couches superficielles de la peau, et limitent la perte en fluides. Ces propriétés ajoutées par ailleurs à leur effet antiseptique, en font des molécules intéressantes pour la régénération des tissus en cas de blessures superficielles ou de brûlures (Bruneton, 1999).

a) Tannins hydrolysables

Les tannins hydrolysables sont définit comme des esters de glucose, c’est à dire un noyau central de glucose auquel est lié, au moyen d’une liaison ester, l’acide gallique pour le groupe des gallotannins ou l’acide éllagique pour le groupe des éllagitannins. Leur hydrolyse par action des acides, des bases ou certaines enzymes libère le glucose ainsi que les acides galliques ou phénoliques liés (Ghestem et al., 2001).

b) Tannins condensés

Egalement connus sous le nom de proanthocyanidines (Porter, 1989). Ce sont des polymères de flavan-3-oles (catéchine) et de flavan-3,4-dioles (leucoanthocyanidines), ou un mélange des deux. De structure plus complexe, les chaines de polymères comptent de 2 à 20 unités environ, et il existe de nombreuses hydroxylations possibles en différents endroits de chaque monomère. Cette diversité structurale explique la variation de leurs activités biologiques (Peronny, 2005).

c) Phlorotannins

Chez les algues brunes, le seul groupe de tannins présent est représenté par les phlorotannins où ils peuvent constituer jusqu’à 15% du poids sec des algues brunes (Targett & Arnold, 1998 ; Zitouni, 2015). Il s’agit de polymères de phloroglucinol (1,3,5- trihydroxybenzene). Parmis les phlorotannins des macroalgues contenant une sous unité de phloroglucinol: eckol, dieckol, triphlorethol A, phlorofucofuroeckol et eckstolonol (Tierney et al., 2010). Du fait de leur rôle d’antioxydants naturels, ces composés suscitent beaucoup d’intérêts pour la prévention et le traitement du cancer, des maladies inflammatoires, cardiovasculaires et neurodégénératives.

Synthèse bibliographique

3.2.2. Mycosporine-like amino-acides (MAA)

Les algues ont également développé différentes stratégies de protection contre les rayons ultraviolets (UV). Par exemple, elles synthétisent des composés qui agissent comme un écran solaire (mycosporine-like amino-acides). Ces composés sont petits (<400 Da), hydrosolubles, et consistent en un anneau de cyclohexenone ou cyclohexenimine, conjugué à une grande variété de substitues azotés d’acides aminés, par exemple : la mycosporine-glycine (Nakamura et al., 1982). Ces MAA présentent une activité antioxydante et antiproliférative (Yuan et al., 2005 ; Cornish & Garbary, 2010).

Leur contenu chez les macroalgues varie avec la profondeur, la latitude et entres les classes. Par exemple, les espèces de rhodophycées accumulent plus de MAA que les espèces de phéophycées et de chlorophycées (Singh et al., 2008).

3.2.3. Diterpènes

La famille des macroalgues Dictyotaceae est capable de produire des métabolites secondaires comme les diterpènes, composés halogénés non volatils, avec différentes structures carbonées : dolabellanes, hydroazulenoides, xenicanes et sesquiterpenoides (Gupta & Abu-Ghannam, 2011). Le dictyodial, le dictyol C et le dictyol H sont des diterpènes isolés de l’algue brune Dictyota ciliolate (Manzo et al., 2009). Ils possèdent des activités cytotoxiques, antivirales, antifongiques et algicidales. Les diterpènes extraits de Dictyota pfaffii et Dictyota menstrualis inhibent l’infection au virus herpes simplex type 1 (Abrantes et al., 2010).

Figure 08: Structures de (a) Dictyodial ; (b) Dictyol C ; (c) Dictyol H. (Manzo et al., 2009).

3.2.4. Caroténoïdes Toutes les macroalgues contiennent des caroténoïdes qui sont des pigments liposolubles composés d'unités isoprènes. Ils représentent en moyenne 0,1% du poids sec de l’algue mais

Synthèse bibliographique certaines espèces, dans certaines conditions environnementales en produisent beaucoup plus (Person, 2010). Les caroténoïdes sont divisés en deux classes : les carotènes et les xanthophylles. Les principaux caroténoïdes des algues rouges sont le ß-carotène, la lutéine et la zéaxanthine, ainsi que la violaxanthine et néoxanthine chez les algues vertes et principalement de la fucoxanthine chez les algues brunes (Lordan et al., 2011). Plusieurs études ont démontré les propriétés antioxydantes des caroténoïdes algaux et le rôle qu’ils jouent dans la prévention de plusieurs pathologies liées au stress oxydatif, mais aussi des activités antibactériennes, antivirales, antifongiques, anti-inflammatoires et antitumorales (Mikami & Hosokawa, 2013).

Figure 09: Structure moléculaire de la fucoxanthine (Mikami & Hosokawa, 2013).

3.2.5. Vitamines

La composition vitaminique des macroalgues est intéressante car l'ensemble des vitamines est bien représenté par les groupes A, B1, B2, B6. B12, C, D, E, K et PP ; malgré de grandes variations saisonnières et des disparités liées au procédé de traitement des algues. De plus, des quantités significatives en provitamine A et en vitamines B1 et B2 sont rapportées chez les algues rouges, ainsi qu'en vitamines C et E chez les algues brunes et vertes (Person, 2010). Ces vitamines ont une signification nutritionnelle majeure pour la consommation humaine.

L’intérêt principal des macroalgues réside dans la présence de vitamine B12 dont les teneurs sont assez importantes, contrairement aux plantes terrestres qui en sont totalement dépourvues (Watanabe et al., 1999). Certaines algues renferment autant de vitamines B12 que le foie.

Le contenu en vitamine C des algues brunes et vertes est important entre 500-3000 mg/kg MS. Cette vitamine présente une activité antioxydante, active l’absorption intestinale du fer et renforce le système immunitaire. Les algues sont également riches en vitamine E, notamment les fucales (200 à 600 mg/kg MS). De part son pouvoir antioxydant, elle inhibe l’oxydation

Synthèse bibliographique des lipoprotéines de basse densité. Elle freine la formation des prostaglandines et des thromboxanes dans la cascade de l’acide arachidonique (Lordan et al., 2011; Hortense, 2011).

3.2.6. Régulateurs de croissance végétale (PGR)

Tous les composés bioactifs isolés des algues mentionnées précédemment sont principalement bénéfiques aux hommes et aux animaux. Les algues sont aussi une source riche en substances stimulatrices ou hormones de croissance végétale (cytokinines, auxines, gibbérellines, acide abscissique, éthylène, bétaine et polyamines) (Chojnacka et al., 2012 ; Crouch & Van Staden, 1993) qui sont détectés chez les algues vertes, brunes et rouges, aussi bien que dans des extraits algaux préparés de différentes espèces de Kelp. Les algues sont aussi riches en phytostérols (qui appartiennent aux stéroïdes) qui peuvent avoir des activités biologiques particulières (Hamid et al., 2015).

4. Applications des macroalgues

Les domaines d’utilisations des macroalgues sont divers et variés. Entre autres, les usages alimentaires. En effet, il existe une grande industrie mondiale pour l’utilisation des algues pour la consommation humaine. Des études épidémiologiques menées en Asie avaient mis en évidence une incidence plus faible des cancers du sein, du colon et de la prostate liée à leur consommation régulière (Teas, 1981).

Plus récemment, il y a une demande croissante sur les algues pour leur utilisation comme des aliments ou ingrédients fonctionnels, des boissons et des compléments alimentaires et nutritionnels ; puisque les algues sont riches en métabolites secondaires bioactifs comme les phénols, les polysaccharides et les acides organiques (Gupta & Abu-Ghannam, 2011).

Les algues ont également beaucoup d'applications industrielles notamment avec les phycocolloides qu’elles contiennent (les alginates, les carraghénanes et l'agar), utilisés comme des agents structurels, de coagulation et de gélifications (Stirk & Van Staden, 2014).

Elles sont aussi largement utilisées en agriculture comme engrais organique végétales (fertilisants) en raison de la présence de PGRs (Stirk & Van Staden, 2014). Aussi bien que dans l'alimentation du bétail et de poisson. Les algues peuvent être transformées en farines, afin de les intégrer dans la composition des aliments pour le bétail (Ascophyllum nodosum,...). Malgré leur médiocre apport énergétique, les farines d'algues sont de remarquables sources de

Synthèse bibliographique vitamines et d'oligoéléments. Complémentées avec du calcium, du magnésium et du phosphore, les farines incorporées à un niveau de 5 à 10% dans un aliment complet, permettent de réduire considérablement les apports minéraux. Outre ces qualités, les farines disposent d'autres propriétés intéressantes : antibiotiques, antifongiques et digestives (Indergaard & Minsaas, 1991).

Les algues peuvent aussi avoir un intérêt écologique puisqu’elles sont très efficaces dans l’absorption d'ions de l'eau environnante. Cette caractéristique peut être utile pour le nettoyage de zones polluées par des métaux lourds, où les algues peuvent être utilisées comme des organismes de contrôle et/ou de surveillance des conditions environnementales (Schramm, 1999).

Les applications des macroalgues se sont étendues depuis quelques années aux domaines de la pharmacologie (enrobage des médicaments, propriétés amincissantes, propriétés antioxydantes), la cosmétologie (savon, crème, dentifrice), les produits de nettoyage, les industries textiles et plus généralement de la chimie verte et des biotechnologies avec des marchés très porteurs (Person, 2010).

Synthèse bibliographique

Chapitre 2: Oxydation et antioxydants d’origine algale

1. Introduction

L’oxydation est le phénomène qui fait rouiller les métaux, flétrir les légumes et les fruits et rancir les graisses. Par conséquent, il modifie le goût et la couleur des aliments. De plus, l’organisme subit également le phénomène d’oxydation, mais il est équipé pour lutter contre ces altérations. En effet, un énorme système de défense est en permanence mis en place, avec des systèmes enzymatiques et/ou des systèmes de régénération de complexes mettant en jeu ; par exemple l’acide ascorbique. Mais ce système de défense est parfois débordé (Favier, 2003).

En effet, les espèces réactives de l'oxygène (ERO) sont produites en permanence par notre organisme (rôle physiologique), mais un système efficace de défense antioxydant (vitamines, enzymes, oligoéléments) permet de réguler cette production afin de prévenir tout dégât cellulaire excessif. Dans certaines conditions, une surproduction d’ERO due à l’activation de divers mécanismes biochimiques peut submerger rapidement les défenses antioxydantes: c’est le stress oxydatif (Favier, 2003). Le stress oxydatif est donc le déséquilibre entre la génération d’ERO, pro-oxydants hautement réactifs et toxiques et la capacité du corps à les neutraliser et à réparer les dommages oxydatifs (Boyd et al., 2003). Ce déséquilibre a pour conséquences, l’apparition de dégâts souvent irréversibles chez les cellules.

Sur le plan chimique, l’oxydation est ainsi générée par des radicaux libres.

2. Radicaux libres

Les radicaux libres sont des espèces chimiques, atomiques ou moléculaires, instables, contenant un ou plusieurs électron(s) libre(s) non apparié(s) sur leurs orbitales électroniques externes et qui ne cherchent qu’à récupérer un proton dans leurs environnement pour retrouver un état plus stable (Lehucher-Michel et al., 2001). L’ensemble des radicaux libres et de leurs précurseurs sont souvent appelés espèces réactives de l’oxygène. Cette appellation inclut les radicaux libres de l’oxygène proprement dit et qui sont des radicaux primaires, mais aussi certains dérivés oxygénés réactifs non radicalaires dont la toxicité est importante représentés par des radicaux secondaires (Favier, 2003).

Synthèse bibliographique

2.1. Les différents types de radicaux libres 2.1.1. Les espèces radicalaires dérivées de l’oxygène

Ces radicaux dérivent de l'oxygène par des réductions à un électron tels que:

•  L'anion superoxyde (O 2)

La molécule d'oxygène peut acquérir un électron supplémentaire et former ainsi l'anion superoxyde. Cette réaction est catalysée par de nombreuses enzymes oxydases, présentes en concentration élevée dans les hépatocytes (xanthine oxydase) et les phagocytes (NADPH oxydase) (Chabaud, 2007). L’anion superoxyde est celui qui a la réactivité la plus faible vis-à- vis des substrats bio-organiques (Delattre et al., 2005). Par contre, il a une toxicité indirecte en tant que précurseur d’autres radicaux libres (Chabaud, 2007).

 Le radical hydroxyle (HO•)

Il se forme lorsque l’anion superoxyde réagit avec le peroxyde d’hydrogène (H2O2), en présence de métaux de transition, par exemple l’ion ferreux (Fe2+). Le radical hydroxyle est le plus réactif et le plus agressif de tous les radicaux libres. De plus, il est peu sélectif d'où sa capacité à interagir avec de nombreuses molécules (Chabaud, 2007).

 L’oxyde nitrique (NO•)

Produit par la NO synthétase, c’est un vasodilatateur physiologique et joue aussi un rôle de messager inter-neuronal. Cependant, il peut avoir un rôle néfaste (Yoshikawa et al., 2000).

(Le symbole • indique la présence d’un électron célibataire)

2.1.2. Les espèces réactives de l’oxygène non radicalaires

D'autres espèces dérivées de l'oxygène, ne sont pas des radicaux libres, mais sont aussi réactives et peuvent être des précurseurs de radicaux (Figure 10) (Favier, 2003).

1  L’oxygène singulet ( O2)

Il se forme lors du processus d’activation photodynamique de l’oxygène faisant intervenir des pigments actifs : l’énergie d’excitation est transférée et il y a formation de l’oxygène singulet. Ainsi, il peut être produit dans les tissus exposés à la lumière, tels que la peau et l’œil (Chabaud, 2007). L’oxygène singulet est d’une grande réactivité et peut oxyder de nombreuses molécules organiques (Bonnefis, 2005).

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 Le peroxyde d’hydrogène H2O2

Il provient d’une réaction entre deux anions superoxydes où l’enzyme superoxyde dismutase catalyse la dismutation de l’anion superoxyde en peroxyde d’hydrogène. Il s’agit d’un intermédiaire stable. Mais, il participe à la production de plusieurs molécules dont les plus réactives sont le radical hydroxyle (HO•) et l’acide hypochlorique (HOCl) (Chabaud, 2007).

 L’anion hypochlorite (HOCl-)

L’hypochlorite provient de la réaction entre le peroxyde d’hydrogène et l’ion chlore, catalysé par une myéloperoxydase (Chabaud, 2007).

 Le peroxynitrite (ONOO-)

• • Il est issu de la réaction entre (O 2) et (NO ).Très néfaste pour les protéines et les gènes, il est impliqué dans l’athérosclérose et la polyarthrite rhumatoïde (Hennebelle, 2006).

Figure 10: Origines des différents radicaux libres oxygénés et espèces réactives de l’oxygène impliqués en biologie (Favier, 2003).

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2.2. Sources des ERO

Les radicaux libres sont produits par divers mécanismes physiologiques car ils sont utiles pour l'organisme à dose raisonnable. Les radicaux libres de source endogène sont produits lors du fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale, par les cycles redox produits dans l’organisme par l’oxydation de certaines molécules notamment les quinones (Djouahra, 2012). Ils sont aussi produits afin de détruire les bactéries à l'intérieur des cellules immunitaires (macrophages, polynucléaires) (Van Antwerpen, 2006), d'inactiver les virus, réguler des fonctions cellulaires létales comme l'apoptose ou utiliser comme médiateurs tissulaires. Dans les circonstances quotidiennes normales, cette production physiologique est parfaitement maîtrisée par des systèmes de défense (Favier, 2003).

Les ERO sont également générées d’une source exogène, sous l’effet de stress environnementaux comme les radiations (UV, rayons gamma) (Valko et al., 2006), les polluants atmosphériques, les particules inhalées (amiante, silice), l’effort intense et prolongé, ainsi que le tabagisme (Pincemail et al., 2002), l'ingestion d'alcool, d’antibiotiques et d’anticancéreux (Athamena, 2009).

2.3. Cibles biologiques des radicaux libres

Les radicaux libres interagissent particulièrement avec les macromolécules intracellulaires et les cibles biologiques les plus vulnérables à cet endommagement oxydatif sont:

 Les lipides

Les lipides et principalement leurs acides gras polyinsaturés sont la cible privilégiée de l'attaque par le radical hydroxyle, réaction appelée peroxydation lipidique. L'attaque des lipides circulants aboutit à la formation de lipoprotéines de basse densité (LDL) oxydées qui captées par des macrophages, formeront le dépôt lipidique de la plaque d'athérome des maladies cardiovasculaires. L'attaque des phospholipides membranaires modifie la fluidité de la membrane cellulaire et donc le fonctionnement de nombreux récepteurs et transporteurs, et la transduction des signaux (Favier, 2003).

 L’acide désoxyribonucléique (ADN)

Les radicaux libres peuvent induire des effets mutagènes ou l'arrêt des réplications de l'ADN. Ils agissent en provoquant des altérations des bases azotées, des pontages ADN- protéines ou des ruptures de brins (Hadi, 2004).

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 Les protéines

Les protéines les plus sensibles aux attaques radicalaires sont surtout celles qui comportent un groupement sulfhydryle (SH). C’est le cas de nombreuses enzymes cellulaires et protéines de transport qui vont ainsi être oxydées et inactivées. Les radicaux libres peuvent modifier les structures primaires, secondaires et tertiaires des protéines. Les protéines modifiées par oxydation perdent leurs propriétés biologiques et deviennent beaucoup plus sensibles à l'action des protéases et notamment du protéasome (Favier, 2003).

 Les polysaccharides

Les espèces réactives de l'oxygène attaquent les mucopolysaccharides et notamment les protéoglycanes du cartilage. Par ailleurs, le glucose peut s'oxyder en présence de traces • métalliques, en libérant des cétoaldéhydes, H2O2 et OH , qui entraîneront la coupure de protéines ou leur glycation par attachement du cétoaldéhyde. Ce phénomène de glycosoxydation contribue chez les diabétiques à la fragilité des parois vasculaires et de la rétine (Favier, 2003).

3. Les maladies liées au stress oxydant

Le stress oxydant est impliqué dans de très nombreuses maladies comme facteur déclenchant. Il est la principale cause de l’athérosclérose (Harrisson et al., 2003), la cancérogénèse (Hussain et al., 2003), l’arthrose, l’arthrite, l’asthme (Cavin, 1999), les maladies neurodégénératives (la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer et le mongolisme) (Favier, 2003), les maladies cardiovasculaires, le diabète, la chute de cheveux et le vieillissement accéléré (Surveswaran et al., 2007 ; Bekro et al., 2008), les inflammations gastro-intestinales et l’ulcère (Atawodi, 2005). La plupart des maladies induites par le stress oxydant apparaissent avec l'âge car le vieillissement diminue les défenses antioxydantes et augmente la production mitochondriale de radicaux (Sohal et al., 2002).

4. L’oxydation dans l’industrie alimentaire

L’étude des mécanismes de l’oxydation et des moyens de les prévenir connaissent un regain d’intérêt du fait de leurs implications dans les domaines de la nutrition et de la santé. En effet, elle pose de sérieux problèmes pour l’industrie alimentaire. Elle entraîne des changements organoleptiques: le rancissement et la modification des propriétés fonctionnelles

Synthèse bibliographique du produit (phénomène d’agrégation, modification de couleur) (Meynier et al., 2004) et l'altération des propriétés rhéologiques (viscosité, texture,...) (Genot et al., 2004). Des conséquences nutritionnelles vont aussi résulter: la disparition des vitamines A, E, C, et l'oxydation des acides aminés, voir même une toxicité due aux produits issus de la peroxydation lipidique (peroxydes, époxydes, aldéhydes) hautement cytotoxiques et mutagènes, qui vont s’accumuler dans les aliments (Cillard & Cillard, 2006).

Pour limiter l’oxydation, l’industrie agroalimentaire peut baisser le taux d’oxygène (sous vide, atmosphère sous azote), ralentir les réactions par réfrigération ou congélation, détruire les enzymes d’oxydation (polyphénols oxydases) et user d’antioxydants naturels (thé vert, extrait d’herbe, poudre de miel, extrait de fruits, de légumes, de thé vert…) ou d'antioxydants synthétiques (BHT…) (Eymard, 2003).

5. Les antioxydants

Les antioxydants sont des composés qui inhibent ou retardent l’oxydation des substrats biologiques, en bloquant l’initiation ou la propagation des chaînes de réactions oxydatives (Boyd et al., 2003).

5.1. Classification des antioxydants par rapport aux mécanismes d’actions

 Les antioxydants primaires

Ces antioxydants peuvent inhiber la réaction d’initiation et la propagation de l’oxydation, en participant au processus d’oxydation et en convertissant les radicaux libres vers leurs formes inactives. Les antioxydants primaires sont des composés capables de donner un atome d’hydrogène rapidement à un radical libre, formant un composé stable non radicalaire. Se sont généralement des composés phénoliques, par exemple, les flavonoïdes, l'acide ascorbique et les tocophérols qui peuvent arrêter des réactions en chaîne en faisant don d'un électron au radical pyroxylé de l'acide gras pour arrêter la propagation (Pryor, 1994).

 Les antioxydants secondaires

Les antioxydants secondaires englobent une large gamme de différentes substances chimiques qui peuvent agir comme des chélateurs de métaux pro-oxydatifs, des désactivateurs de l’oxygène singlet, des piégeurs de la molécule d’oxygène, des inhibiteurs des enzymes pro-

Synthèse bibliographique oxydatives (comme les peroxidases, l'oxydase NADPH, l'oxydase xanthine, etc) et des enzymes antioxydantes et destructrices des hydroperoxydes.

 Les co-antioxydants

La combinaison d'acide ascorbique et de tocophérol peut provoquer un fort effet antioxydatif. Le rôle de l’acide ascorbique est de reconstituer les concentrations épuisées de tocophérol, en aidant la vitamine E à se régénérer après oxydation, agissant ainsi comme un co-antioxydant (Esterbauer, 1995).

5.2. Classification des antioxydants par rapport aux sources

 Les antioxydants endogènes

Ils constituent un système enzymatique spécifique qui agit sur les ERO spécifiques et les dégrade en dérivés inoffensifs. La glutathion peroxydase (GPx), la catalase (CAT) et la superoxyde dismutase (SOD) sont les principales enzymes antioxydantes endogènes primaires, qui métabolisent des intermédiaires oxydatifs toxiques. En effet, la superoxyde dismutase (SOD) transforme l’anion superoxyde en eau oxygénée, cette dernière va être dégradée par la catalase et la glutathion peroxydase (Poortmans & Boisseau, 2003) conduisant finalement à la formation d’eau et d’oxygène moléculaire (Lehucher-Michel et al., 2001).

Ces enzymes exigent des microsubstances nutritives comme le sélénium, le fer, le cuivre, le zinc et le manganèse, comme cofacteurs pour une activité catalytique optimale et des systèmes de défense antioxydants efficaces (Mika et al., 2004).

 Les antioxydants exogènes

Ce sont des antioxydants non-enzymatiques extracellulaires : la glutathion, l'acide urique, l'albumine et les protéines chélatrices de métaux de transition, les oestrogènes, les polyamines, le co-enzyme (Q10), ainsi que des micronutriments qui sont apportés par l’alimentation tels que les vitamines E et C, les caroténoïdes, les oligoéléments, les flavonoïdes et les composés phénoliques (Koechlin-Ramonatxo, 2006 ; Negre-Salvayre et al., 2008). Ils sont principalement du type préventif (empêchent la formation ERO en interceptant les catalyseurs d'oxydation et les métaux de transition) ou bien piégeurs « chain breaking »

Synthèse bibliographique

(interceptent les radicaux propagateurs de la peroxydation lipidique et la retardent) (Buettner, 1993 ; Shalaby & Shanab, 2013).

D’autres antioxydants sont synthétiques, représentés par des produits utilisés dans l’industrie alimentaire pour la conservation des aliments comme le butylhydroxytoluène (BHT) et le butylhydroxyanisole (BHA), le propylgallate (PG) et le tétrabutylhydroquinone (TBHQ). Ils sont largement utilisés parce qu’ils sont efficaces et moins chers que les antioxydants naturels, néanmoins actuellement l’utilisation de ces produits est remise en question en raison des risques toxicologiques. En effet, le BHA convertirait certains produits ingérés en substances toxiques ou carcinogènes, en augmentant la sécrétion des enzymes microsomales du foie et des organes extra-hépatiques (Barlow, 1990) et le BHT présenterait des effets carcinogènes chez le rat (Ito et al., 1985).

6. Antioxydants naturels d’origine marine

L’environnement marin est connu pour sa richesse en composés chimiques présentant beaucoup d’effets bénéfiques pour la santé. Parmi les organismes marins, les algues sont une ressource végétale sous-exploitée, pourtant ils ont longtemps été considérés comme une importante source de composés bioactifs.

Actuellement, un regain d’intérêt est porté sur la recherche de nouvelles sources sûres et moins chers d’antioxydants d’origine naturelle. Les algues ou leurs extraits peuvent être donc une source potentielle. La biomasse fraiche d’algue contient de l’acide ascorbique (Vitamine C) et de la glutathion (GSH). Les algues produisent aussi une large gamme de métabolites secondaires antioxydants : des tocophérols, des pigments comme les caroténoides (ß-carotène, fucoxanthine), la phycocyanine et la phycoerythrine, des polyphénols (phlorotannins, catéchines, flavonoïdes, tannins, lignanes), des polysaccharides sulfatés (fucoidanes et hétérofucanes) et des mycosporine-like amino-acides (MAA) (Cornish & Garbary, 2010).

Ces antioxydants algaux ont une large gamme d’activités : anti-tumorale, antivirale, anti- inflammatoire, antiproliférative, antimicrobienne, anti-angiogène et antimutagène. Ce qui ouvre de nouvelles perspectives d’utilisation des algues comme des ingrédients antioxydants fonctionnels en industrie alimentaire, pharmaceutique et nutraceutique (Cornish & Garbary, 2010).

Synthèse bibliographique

Chapitre 3: Régulateurs de croissance végétale chez les algues

1. Introduction

En agriculture, l’utilisation d’algues marines pour amender les sols et fertiliser les cultures n’est pas une pratique récente. De nombreux effets agronomiques sont attribués aux extraits d’algues: une meilleure germination des graines, une augmentation du développement racinaire et du rendement, une plus grande assimilation de l’azote et du phosphore, une meilleure résistance aux stress et aux maladies et une amélioration de la conservation des fruits (Mooney & Van Staden, 1986 ; Jolivet et al., 1991 ; Verkleij, 1992). Les minéraux, les stérols, les polysaccharides, les bétaïnes et les phytohormones apportés par les substances marines, et en particulier les cytokinines sont considérés comme les générateurs de ces effets biologiques induits chez les plantes (Mooney & Van Staden, 1986).

Les phytohormones sont des composés organiques connus pour induire de fortes réponses physiologiques à de très faibles concentrations. Ainsi, de nombreux régulateurs de croissance sont identifiés chez les algues (Brain et al., 1973 ; Augier, 1976 ; Kingman & Moore, 1982 ; Mooney & Van Staden, 1986 ; Bradley, 1991 ; Crouch & Van Staden, 1993 ; Stirk et al., 2003 ; Ördög et al., 2004 ; Plettner et al., 2005). De plus, les hormones de croissance des algues sont pour l’essentiel semblables à celles des végétaux supérieurs.

2. Régulateurs de croissance végétale et biosynthèse chez les macroalgues

La présence et la biosynthèse des 5 classes de phytohormones classiques, qui sont les auxines, les cytokinines, les gibbérellines, l’acide abcissique et l’éthylène, ainsi que les récemment découvertes les brassinostéroïdes, l’acide jasmonique, l’acide salicylique, les polyamines et la bétaine, sont décrites.

2.1. Auxines

La présence des auxines chez de nombreuses algues marines est clairement avérée. En effet, l’acide indole-3-acétique (IAA) endogène et plusieurs formes conjuguées sont détectées dans une grande gamme de macroalgues. L’IAA est présent dans des extraits d’algues brunes (Fucus et Ascophyllum) (Stirk & Van Staden, 1997 ; Sitnik et al., 2003) et chez Kappaphycus alvarezii (Rhodophyceae) et Sargassum tenerrimum (Phaeophyceae) et l’acide indole-3- pyruvique (IPA) chez Gracilaria edulis (Rhodophyceae ; Prasad et al., 2010). L’IAA et

Synthèse bibliographique l’acide indole-3-butyrique (IBA) sont présents chez quatre espèces d’Ulva et Monostroma oxyspermum (Gupta et al., 2011).

L’IAA et l’indole-3-acétamide (IAM) sont les principaux indoles présents chez 11 espèces de Rhodophyceae, appartenant aux ordres des Bangiales, Gelidiales, Gracilariales et Gigartinales, avec de faibles concentrations des autres formes conjuguées : l’indole-3-éthanol (IEt), l’acide indole-3-acétyl glutamique (IAGlu) et l’indole-3-acétyl leucine (IALeu) (Yokoya et al., 2010). L’analyse d’Ulva fasciata et Dictyota humifusa a révélé la présence d’IAA et d'une faible concentration d’IAM.

La synthèse des auxines est réalisée à partir de tryptophane ou d’indole. L’indole-3- acétamide (IAM) est détecté en concentration relativement élevée chez des macroalgues (Stirk et al., 2009 ; Yokoya et al., 2010) et des microalgues (Jirástová et al., 2009 ; Stirk et al., 2013b). En revanche, l’analyse de la biosynthèse de l’IAA chez la macroalgue Ectocarpus siliculosus (Phaeophyceae) a révélé que l’IAA, l’acide indole-3-carboxylique (ICA) et l’acide indole-3-pyruvique (IPA) sont présents, mais pas d’IAM ou ses dérivés. Des gènes homologues codant pour les enzymes impliqués dans les voies de biosynthèses Tryptophane- dépendante, la voie tryptamine (TAM) et l'indole-3-acétaldoxime (IAOx) sont identifiés et il n’existe pas de preuve moléculaire pour les voies IPA et IAM (Figure 11). La biosynthèse De novo chez les macroalgues semble donc favoriser la voie TAM (Le Bail et al., 2010).

Figure 11: Voie de biosynthèse de l’auxine IAA chez E. siliculosus (Le Bail et al., 2010).

Synthèse bibliographique

2.2. Cytokinines

Les cytokinines sont présents chez diverses macroalgues. Par exemples, la trans-zéatine (tZ) est présente chez K. alvarezii, G. edulis et S. tenerrimum (Prasad et al., 2010); l'isopentényladénosine (iPR), la tZ et la trans-ribosylzéatine (tZR) sont identifiés chez L. japonica (Duan et al., 1995) ; alors que l’isopentényladénine (iP) et la cis-ribosylzéatine (cZR) sont présents chez Porphyra perforata et Sargassum muticum (Zhang et al., 1991 ; Zhang et al., 1993).

Ces hormones sont aussi trouvées dans des extrait d’algues fucoides : Z, ZR, iP et iPR (Stirk & Van Staden, 1997). Des cytokinines isoprénoides : iP, iPR, Z, ZR et des cytokinines aromatiques (topolins) sont identifiés chez des Characean et des micro- et macroalgues vertes (Ördög et al., 2004 ; Sitnik et al., 2003). Des traces de O-glucosides sont aussi détectés chez quelques microalgues et macroalgues brunes (Sargassum heterophyllum, Macrocystis pyrifera) (Stirk et al., 2003).

Il est supposé que la voie de biosynthèse des cytokinines chez les algues diffère de celle des végétaux supérieurs et apparait moins complexe. Chez les plantes vasculaires, l’étape initiale de biosynthèse des cytokinines isoprénoides est la prénylation des nucléotides (AMP, ADP et ATP) en cytokinines ribonucléotides par l’adénylate-isopentenyl transférases (IPT). Les ribonucléotides sont par la suite modifiés en cytokinines libres inter-convertibles et ribonucléotides (Figure 12) (Sakakibara, 2006).

Figure 12: Voie de biosynthèse des cytokinines (Kiseleva et al., 2012).

Synthèse bibliographique

En plus de la voie de biosynthèse isoprénoide, il semble fort probable que les cytokinines algales sont principalement produites lors de la dégradation de l’ARNt (Stirk et al., 2003), ce qui n’est pas la source principale de cytokinines chez les plantes. Quelques formes conjuguées apparaissent lors de la biosynthèse et l’inter-conversion entre ribonucléotides, bases libres et ribosides. La glycosylation permet aussi de synthétiser des O-glucosides. En revanche, la voie de biosynthèse des cytokinines aromatiques n’est toujours pas élucidée (Sakakibara, 2006).

2.3. Gibbérellines

L’acide gibbérellique est un acide carboxylique diterpénoide tetracyclique impliqué dans divers processus physiologiques. Il n'y a que quelques données indiquant la présence de composés avec une activité gibbérelline chez les algues. Des gibbérellines actives, GA1 et

GA3 et inactive GA6 ont été isolées chromatographiquement d’un extrait de tissus de Fucus vesiculosus et F. spiralis (Radley, 1961).

La GA3 a été identifiée chez des espèces d’Ulva (U. fasciata, U. lactuca, U. taeniata, U. reticulata et U. linza) (Gupta et al., 2011) ; chez K. alvarezii et G. edulis et la GA9 chez S. tenerrimum (Prasad et al., 2010). Récemment, 18 gibbérellines ont été identifiés chez la kelp

E. maxima, où la GA4 et GA6 prédominent (Stirk & Van Staden, 2014).

La biosynthèse de gibbérellines peut être séparée en trois étapes:

Premièrement, le geranylgeranyl diphosphate (GGDP) (C20 précurseur de diterpénoides) est convertis par différentes étapes en ent-kaurene par une classe de terpènes cyclases localisée dans le plastide.

Deuxièmement, une étape d’oxydation impliquant la Cyt P450 mono-oxygénase associée au réticulum endoplasmique, convertit l'ent-kaurene en GA12-aldehyde (Weiss & Ori, 2007).

La dernière étape est la conversion du GA12-aldehyde via GA12 en GAs bioactives (GA1 et

GA4) par la 2-oxoglutarate dépendante dioxygénase localisée dans le cytoplasme (Figure 13) (Yamagushi & kamiya, 2000 ; Stirk & Van Staden, 2014).

Synthèse bibliographique

Figure 13: Voie de biosynthèse des gibbérellines (Bömke &Tudzynski, 2009).

Synthèse bibliographique

2.4. Acide abscissique

L'acide abcissique (ABA) est un sesquiterpène C15, un messager capital de nombreuses voies de transduction du signal en réponse à des stress biotiques et abiotiques.

Hussian & Boney (1973) démontrent la présence d’inhibiteurs de croissance solubles dans l’eau chez Laminaria digitata et Ascophyllum nodosum, dont les propriétés sont similaires à celles de l’ABA. Hartmann & Kester (1983) ont démontré l’accumulation de l’ABA dans l’algue verte Ulva lactuca. Puis, Hirsch et al. (1989) ont ensuite montré que l’acide abscissique est universellement répandu chez les algues.

L’ABA est retrouvé dans toutes les classes de macroalgues. Par exemple, l’ABA et une faible concentration de 2-trans-méthyle ABA sont identifiés chez des espèces du genre Ascophyllum et certaines espèces de Laminaria (Phaeophyceae) (Boyer & Dougherty, 1988 ; Tominaga et al, 1993 ; Nimura & Mizuta, 2002). L’ABA est également identifié chez U. fasciata et D. humifusa (Stirk et al., 2009), chez 10 espèces de Rhodophyceae (Yokoya et al., 2010) et chez cinq espèces d’Ulva (Gupta et al., 2011).

La voie métabolique de l’ABA est similaire chez les plantes vasculaires et non vasculaires. La synthèse de l’ABA à partir de C15 précurseur xanthoxine se fait en deux étapes via l’intermédiaire l’aldéhyde abscissique. Ces deux étapes sont catalysées par AtABA2 et l’aldéhyde abscissique oxydase respectivement (Figure 14) (Nambara & Marion-Poll, 2005).

2.5. Ethylène

L'éthylène est un gaz naturel, hydrocarbure insaturé. C'est "une hormone de stress", étant produite en réponse à divers stresses biotiques et abiotiques (Bleecker & Kende, 2000).

La production d’éthylène a été très peu étudiée et a été mise en évidence chez quelques espèces d’algues : Acetabularia, Enteromorpha intestinalis, Porphyra perforata et chez Pterocladiella capillaceae (Vanden Driessche et al., 1988 ; Zhang et al., 1993 ; Plettner et al., 2005 ; García-Jiménez & Robaina, 2012). L’acide-1aminocyclopropane-1-carboxylique, molécule précurseur de l’éthylène a été identifié dans un extrait commercial d’algue brune Kelp E. maxima (Nelson & Van Staden, 1985). De nouvelles expériences ont montré que sur une dizaine d’espèces d'algues examinées, toutes produisent de l'éthylène, avec des concentrations élevées chez Asparagopsis armata et Ulva intestinalis et plus faibles chez les Phéophycées (Broadgate et al., 2004).

Synthèse bibliographique

Figure 14: Métabolisme de l’ABA, voies de biosynthèse, de dégradation et de conjugaison de la forme acide 2-cis, 4-trans, S(+) abscissique chez les végétaux supérieurs (Belin, 2006).

Les flèches noires épaisses indiquent la voie principale.

Synthèse bibliographique

Les algues produisent beaucoup de composés volatils, y compris l'éthylène (García- Jiménez et al., 2013). Il y a deux voies de biosynthèses proposées chez les macroalgues, la voie ACC comme chez les plantes vasculaires et la voie acrylate décarboxylase. Ces deux voies convertissent la méthionine en diméthylsulphoniopropionate (DMSP) et puis l’enzyme DMSP lyase converti le DMSP en acrylate et diméthylsulphide (DMS). L’acrylate est ensuite converti en éthylène par décarboxylation (Plettner et al., 2005). Il apparaîtrait aussi que comme chez les plantes vasculaires, la voie ACC est la voie de biosynthèse d'éthylène favorite chez les algues plutôt que la voie acrylate décarboxylase.

2.6. Brassinostéroides

Les Brassinostéroïdes (BR) représentent une classe d’hormones végétales présentant en commun des structures de stéroïdes (Bagjuz & Tretyn, 2003). Il y a deux voies de biosynthèse parallèles des C28 brassinostéroides, chez les plantes vasculaires, deux voies C6-oxydation, à partir d’un stérol végétal de répartition très générale, le campestérol qui est convertis en castastérone (CS), puis en Brassinolide (BL). Elles comprennent une série de réduction, d’oxydation et d’épimérisation.

Jusque là, seules quelques études ont mis en évidence la présence de brassinostéroides dans des cellules algales. Deux C28 brassinostéroides: le 24-epi-CS et le 28-HomoCS sont identifiés chez les algues vertes Hydrodictyon reticulatum. La concentration de ces hormones dans les cellules de cette algue est de 0,3 et 4,0 µg/kg MF, respectivement, ce qui correspond aux teneurs en brassinostéroides chez les végétaux supérieurs (Bajguz & Tretyn, 2003) et les BL et CS sont détectés en quantités semblables dans le stipe et les frondes de la kelp E. maxima (Stirk & Van Staden, 2014). Les Brassinostéroides sont présents aussi chez des microalgues, avec les BL et CS qui sont détectés chez 24 souches de microalgues (Stirk et al., 2013a) et sept C28 brassinostéroids (TE (teasterone), TY (typhasterol), 6-deoxoTE, 6- deoxoTY, 6-deoxoCS, CS et BL) isolés de C. vulgaris (Bajguz, 2009).

2.7. Jasmonates

Plusieurs oxylipines, parmi eux l’acide jasmonique (JA) et ces dérivés volatils méthyle esters (MeJA) sont trouvés dans la plupart des algues. Cette hormone est détectée chez l’algue rouge Gelidium latifolium. Des oxylipines et leur lipoxygénases correspondantes sont également trouvées chez des algues brunes (Arnold et al., 2001 ; Sitnik et al., 2003). Les

Synthèse bibliographique jasmonates des macroalgues, notamment F. vesiculosus sont impliqués dans l’augmentation de la synthèse de métabolites secondaires, en l'occurence les terpénoides et les polyphénols comme un mécanisme de défense chimique contre les herbivores tels que l’escargot littorine et plusieurs pathogènes (Arnold et al., 2001 ; Küpper et al., 2009).

La biosynthèse des jasmonates se fait via la voie oxylipine octadecanoide, initialement l’acide α-linolénique est libéré par des phospholipases à partir de lipides membranaires et ensuite catalysé par des lipoxygénases en JA, par de multiples réactions d’oxydation et de réduction. Et l’enzyme JA carboxyle méthyle-transférase métabolise l’acide jasmonique en MeJA volatil (Figure 15) (Cheong & Choi, 2003 ; Kombrink, 2012).

2.8. Acide salicylique

L'acide salicylique (AS) (acide 2-hydroxybenzoïque) est un composé phénolique dérivé de la voie shikimate-phénylpropanoide. Les ERO produits par des plantes en réponse au stress peuvent causer des dommages cellulaires. L’AS peut régler les concentrations d'ERO en contrôlant l'activité d'enzymes antioxydantes, aussi bien qu’en relation avec d'autre PGRs comme les auxines et les jasmonates (Staswick et al., 2002). Il a été aussi mis en évidence que l’AS est impliqué dans les systèmes de défense oxydatifs pour la protection contre le stress environnemental chez les algues (Zhou et al., 2010).

L’AS endogène est rapporté dans quelques espèces d'algue comme Ulva (U. fasciata, U. lactuca, U. taeniata et U. linza) (Gupta et al., 2011). L’AS représente aussi un composant majeur des acides phénoliques chez Halimeda incrassate et Halimeda monile (Halimedaceae) (Mancini-Filho et al., 2009 ; Novoa et al., 2011).

2.9. Bétaïnes

Les bétaïnes sont des composés de type ammonium quaternaire qui présentent une activité cytokinine-like (Blunden et al., 1984). Plusieurs bétaïnes sont d’ailleurs isolées à partir de nombreuses espèces d’algues brunes, des laminariales, Fucaceae et Ascophyllum nodosum (Blunden et al., 1985). La glycine bétaïne, l’acide γ-aminobutyrique bétaïne et l’acide δ- aminovalérique bétaïne ont pu être identifiés et quantifiés dans des extraits commerciaux (Crouch & Van Staden, 1993). Whapham et al. (1993) ont montré que les bétaïnes d’extraits d’algues entraînaient une augmentation des taux de chlorophylle dans les plantes traitées. Des

Synthèse bibliographique résultats similaires sont décrits par Blunden et al. (1997), qui suggèrent un ralentissement de la dégradation de la chlorophylle plutôt qu’une augmentation. Les bétaïnes joueraient également un rôle dans la résistance des plantes au gel (Blunden et al., 1984) et la protection des plantes contre l’invasion des nématodes (Blunden et al., 1997 ; Mérigout, 2006).

Figure 15: Représentation schématique de la voie de biosynthèse de l’acide jasmonique (JA) (Avanci et al., 2010).

Synthèse bibliographique

2.10. Polyamines

Les polyamines sont des polycations organiques, trouvés dans presque toutes les cellules et les microbes vivant libres sauf chez certains archées méthanogènes et halophiles. Chez les eucaryotes, la triamine spermidine est essentielle pour la prolifération cellulaire, la croissance et la physiologie cellulaire normale. La spermidine est trouvée principalement attacher à l'ARN dans les cellules (Miyamoto et al., 1993 ; Fuell et al., 2010).

Chez les algues rouges (Cyanidium caldarium, Gelidium canariensis, Grateloupia doryphora), brunes (Dictyota dichotoma) et vertes (Ulva rigida, Chlorella sp.), des composés du groupe des putrescines (putrescine, spermine et spermidine) sont présents (Hamana et al., 1990 ; Marián et al., 2000).

Le contenu en polyamines chez les algues ne diffère pas de celui chez les plantes supérieures (50-150 μg/g matière fraiche) (Marián et al., 2000), les voies de leur biosynthèse sont évidemment aussi similaires (à partir de l’arginine ou l’ornithine) (Figure 16). Ces teneurs en polyamines endogènes changent considérablement en fonction de la saison et le stade de développement de l'algue (Hamana et al., 1990 ; Tarakhovskaya et al., 2007).

De plus, les activités des enzymes catalysant des étapes de synthèse des polyamines ont été montrées chez les algues (Sacramento et al., 2004).

Figure 16: Voie de biosynthèse des polyamines (Fuell et al., 2010).

Synthèse bibliographique

3. Rôle physiologique des phytohormones chez les algues

L’auxine stimule la formation de rhizoïdes chez l'algue verte Bryopsis plumosa et active la croissance de quelques microalgues (Arendarchuk, 1974 ; Provasoli & Carlucci, 1974). Chez des macrophytes rouges, le traitement par des auxines naturelles ou synthétiques a accéléré la croissance tissulaire dans la culture et le développement de cals (Yokoya & Handro, 1996 ; Yokoya et al., 1999). Quelques données indiquent que l’auxine contrôle la ramification des thalles de macrophytes rouges et brunes sur le principe de la dominance apicale (Yokoya & Handro, 1996 ; Moss, 1974). Le traitement avec l'IAA ou l'acide naphthylacétique a réduit le nombre de branches produites par F. vesiculosus et le déplacement de la cellule apicale et le traitement avec l'inhibiteur du transport de l'auxine (l'acide triiodobenzoique) présente l'effet opposé (Moss, 1974). L’IAA exogène stimule la polarisation et la germination des zygotes chez les fucanes (Basu et al., 2002 ; Tarakhovskaya et al., 2007).

Les données concernant les effets des cytokinines exogènes sur la croissance et le développement algal ont été obtenues principalement sur les membres de la division Rhodophyta. Les cytokinines ont montré une accélération de la croissance d'algues rouges en culture (Yokoya et al., 1999). Le traitement d'algue avec des cytokinines a activé la division cellulaire et l’accumulation de protéines et stimulé les processus photosynthétiques (Tarakhovskaya et al., 2007).

En présence de gibbérelline exogène, la croissance hétérotrophique de Westiellopsis prolifica s'est accélérée (Padhy & Pattanaik, 1976). Les gibbérellines sont aussi impliquées dans le contrôle de l'assimilation des sources exogènes de carbone organique par les cellules. L’acide gibbérellique réprime la formation de cals et l’organogénèse dans les cultures tissulaires de l'algue rouge G. Doryphora (García-Jiménez et al., 1998). Il est aussi supposé que les gibbérellines pourraient être impliquées dans le contrôle de la ramification des macrophytes brunes (Dworetzky et al., 1980). Chez des macrophytes brunes et rouges, les gibbérellines exogènes ont accélèré la croissance et augmenté la longueur des thalles (Jennings, 1968).

L’ABA exogène a inhibé la croissance de coupes de disques des thalles cultivés de Laminaria japonica et a facilité le développement de tissus reproducteurs (Nimura & Mizuta, 2002). Dans quelques cas, l’ABA a stimulé la synthèse et l'accumulation de caroténoïdes dans les cellules de microalgues (Kobayashi et al., 1997). Chez certaines microalgues, la concentration d'ABA endogène a augmenté sous des conditions de stress, à savoir, après l'augmentation de la teneur en sel dans l'eau ou sous un faible taux d'humidité (Tominaga et

Synthèse bibliographique al., 1993 ; Kobayashi et al., 1997). L’ABA est l’une des phytohormones qui fournit aux algues une activité vitale dans des conditions de stress (Polevoi, 1982).

L'éthylène semble avoir chez les algues des fonctions physiologiques semblables à celles chez les plantes vasculaires, notamment l’accroissement de la dégradation de la chlorophylle- a chez U. intestinalis (Plettner et al., 2005) et l’influence sur la maturation de structures reproductrices chez Pterocladiella capillaceae (Rhodophyceae) (García-Jiménez & Robaina, 2012). L'éthylène et les polyamines aussi rivalisent pour le même intermédiaire, le S- adénosylméthionine (SAM) et les traitements optimaux par l’éthylène ont augmenté les concentrations en putrescine chez P. capillaceae (García-Jiménez & Robaina, 2012).

Le traitement avec le méthyle jasmonate a stimulé le métabolisme des polyphénols chez F. vesiculosus (Arnold et al., 2001 ; Van Alstyne et al., 2001). Le traitement par le jasmonate augmente la croissance cellulaire et le contenu en métabolites chez C. vulgaris (en dose dépendante) (Czerpak et al., 2006), réduit les infections bactériennes et améliore la tolérance à la salinité et la température chez Scenedesmus incrassulatus (Christov et al., 2001 ; Fedina & Benderliev, 2000). L’acide linolénique et le MeJA exogène stimulent la poussée oxydative chez L. japonica (Küpper et al., 2009) et le MeJA active le métabolisme oxydatif des acides gras chez Chondrus crispus (Rhodophyceae), stimulant les enzymes impliquées dans les réactions de défense et la transcription des gènes liés à la défense (Collén et al., 2006).

Le prétraitement par l’acide salicylique des sporophytes juvéniles sains de L. japonica avant le stress par la chaleur a amélioré la thermo-tolérance par l’accroissement de l'activité de la superoxydase dismutase (SOD), la peroxydase (POD) et la catalase (CAT) (Zhou et al., 2010).

Toutes les algues pourraient assimiler de grandes concentrations de polyamines passivement et les transporter dans d'autres parties du thalle (Badini et al., 1994). La seule fonction hormonale des polyamines discutée chez les algues est la stimulation de la croissance et la morphogénèse des macrophytes. La majeure partie de ces études a été réalisée sur des cultures tissulaires de G. doryphora (García-Jiménez et al., 1998 ; Marián et al., 2000) où la spermine apparait la plus efficace dans ces expérimentations, par la stimulation de la sporulation chez le thalle algal mature (Sacramento et al., 2004).

Jusqu'à présent, il n'y a aucun rapport sur les effets d'application exogène de brassinostéroides chez les macroalgues. L'application de BR exogènes (brassinolide, 24- epibrassinolide, castasterone et homoCS) a accéléré la croissance de la microalgue Chlorella

Synthèse bibliographique vulgaris, a augmenté la concentration en protéines et acides nucléiques dans les cellules et a stimulé les processus photosynthétiques (Bajguz & Czerpak, 1996 ; Bajguz, 2011). Ces hormones permettent aussi de surmonter le stress par les métaux lourds en inhibant leur accumulation (Bajguz, 2000 ; Tarakhovskaya et al., 2007).

Figure 17: Stratégies potentielles de la manipulation du métabolisme phytohormonal pour stimuler certains aspects à intérêt économique chez les microalgues (Lu & Xu, 2015).

4. Utilisations potentielles des PGRs en biotechnologie des algues 4.1. Mariculture et aquaculture

La demande accrue en algues combinée à la baisse des populations d'algues naturelles ont mené au développement de la mariculture et plus récemment, l’aquaculture. Les PGRs peuvent promouvoir la reproduction et la croissance des algues. Par exemple, la mariculture de Porphyra ('nori') compte sur la production de conchospores de haute qualité, qui est semé sur des filets. La croissance de la phase conchocelis de trois espèces de Porphyra a été stimulée par l'application exogène d'IAA, de kinétine et dans une moindre mesure, par la GA3 (Lin & Stekoll, 2007). Des traitements à l’ABA ont accéléré la formation de sorus chez L. japonica et peut être ainsi une technologie utile pour produire des jeunes plants pour la mariculture (Nimura & Mizuta, 2002).

L'aquaculture terrestre implique un pompage d'eau de l’océan ou d’une seconde source d'aquaculture de poisson et d'ormeau, dans un réservoir où l'algue est cultivée (Hafting et al.,

Synthèse bibliographique

2012). Cette eau peut être traitée avec des PGRs pour améliorer la croissance d'algue et empêcher les maladies. Il est suggéré que les PGRs comme l’ABA, les brassinostéroïdes, les jasmonates et l’AS puissent augmenter la tolérance des algues aux stress biotiques et abiotiques comme chez les plantes vasculaires. Cependant, les études de toxicité devront être conduites pour confirmer que les algues traitées avec des PGRs exogènes sont sûres pour l'utilisation et la consommation tant humaine qu'animale.

4.2. Algues comestibles et aliments fonctionnels

Les algues fraîches comestibles ont une courte durée de vie qui limite leur commercialisation et leur expédition à de plus grands marchés. Le contrôle de l’étape post- récolte des espèces de Gracilaria a montré que la production d'éthylène est semblable, si elles sont stockées exposer ou à l’abri de la lumière. Tandis que les températures élevées accélèrent la production d'éthylène. Le meilleur traitement post-récolte est une immersion de 5 min dans l'eau de mer chauffée (38-42°C) (Paull & Chen, 2008). Une meilleure compréhension du rôle physiologique de l’éthylène, sa biosynthèse et les voies d’inactivation peut fournir une approche pratique à la prolongation de la durée de vie des algues comestibles.

Les macroalgues sont également riches en composés phénoliques, y compris l'acide salicylique; qui ont une activité antioxydante et peuvent être utilisés dans l'industrie alimentaire pour protéger les produits des processus oxydatifs ou comme des aliments fonctionnels en raison de la présence d'autres métabolites secondaires bénéfiques pour la santé (Novoa et al., 2011).

Synthèse bibliographique

Chapitre 4: Modèles biologiques de l’étude 1. Présentation des espèces 1.1. Cystoseira amentacea var. stricta  Taxonomie

Embranchement : Ochrophyta Classe : Phaeophyceae

Ordre : Fucales Famille : Sargassaceae Genre : Cystoseira Espèce : amentacea var. stricta (Montagne, 1846)

Figure 18: Cystoseira amentacea var. stricta

 Caractéristiques botaniques et phénotypiques

C. stricta est une algue érigée, de couleur brune, fixée au substrat par une base encroûtante étendue, d’où partent plusieurs axes dressés, présentant des rameaux primaires cylindriques à sommet épineux à peine saillants, mesurant de 2 à 15 cm et qui tombent en automne; pouvant atteindre 30 cm de longueur, et qui portent des rameaux secondaires beaucoup plus courts, disposés irrégulièrement et eux-mêmes divisés (Figure 18) (Cabioc'h et al., 2006).

Cette algue se rencontre sur les substrats rocheux superficiels exposés aux vagues (mode battu). Elle se développe dans les zones bien éclairées, soumises à un fort hydrodynamisme marquant la limite supérieure de l’étage infralittoral (0-1 m de profondeur). Elle peut former localement une ceinture dense et continue (Sauvageau, 1912).

Cette espèce est présente en Méditerranée, et plus particulièrement l’occidentale: Tunisie, Espagne, France, Italie. Elle a été signalé en Algérie, à El Kala (Grimes, 2005), sur les côtes algéroises (Boudouresque, 1971 ; Chalabi et al., 2002 ; Seridi et al., 2007), oranaises

Synthèse bibliographique

(Tremblin et al., 1986 ; Hashem Khalil Kawas, 2010) et Mostaganemoises (Bachir Bouiadjra, 2012).

1.2. Cystoseira compressa

 Taxonomie

Embranchement : Ochrophyta Classe : Phaeophyceae

Ordre : Fucales Famille : Sargassaceae Genre : Cystoseira Espèce : compressa (Esper) Gerloff & Nizamuddin (1975)

Figure 19: Cystoseira compressa

 Caractéristiques botaniques et phénotypiques Cystoseira compressa est une algue qui possède un thalle brun clair arborescent, aplati à la base et sans « épines », lui permettant de se fixer sur les rochets. C’est un thalle à branches cylindriques, branches primaires comprimées, de 2 à 3 cm de hauteur et qui sont ramifiés profusément, donnant une structure parenchymateuse d’une taille jusqu’à 40 cm de hauteur (Lami & Orignac, 2015) (Figure 19).

Cette algue est principalement localisée sur les fonds rocheux et dans des milieux peu profonds (inférieur à 1m 50) ; liée à la mer par le passage d’eau dans l’étage littorale. C’est une espèce présente en Atlantique Nord-Est (du Sud de l’Espagne aux Canaries), Méditerranée et mer Noire (Boudouresque et al., 1992 ; Guiry & Guiry, 2014).

La reproduction chez les Cystoseires est sexuée. Au cours des cycles de développement le passage de l'œuf à l'œuf ne met en jeu qu'une seule génération, le cycle est monogénétique diploïde (Gómez Garretaa et al., 2001). Les individus de la nature sont des gamétophytes et les organes de reproduction sont contenus dans des conceptacles eux même groupés dans des

Synthèse bibliographique réceptacles. Il n’y a qu’un seul gamète femelle (oosphère) dans chaque gamétocyste (oogone) car 7 des 8 noyaux résultants de la méiose disparaissent (Fischer et al., 1986).

1.3. Corallina elongata  Taxonomie

Embranchement : Rhodophyta Classe : Florideophyceae Ordre : Corallinales Famille : Corallinaceae Genre : Corallina Espèce : elongata (J.Ellis et Solander, 1786)

Figure 20: Corallina elongata

 Caractéristiques botaniques et phénotypiques C’est une algue rosée ou jaunâtre de consistance très dure (calcifiée). Frondes dressées à ramification régulièrement pennée, formée d’articles comprimés, généralement beaucoup plus larges à la partie supérieure; chaque article donne naissance à deux articles secondaires (ou se transforme en conceptacle). Articles à tissus fortement calcifiés unis entre eux par des portions (articulations) non calcifiées. La croissance du thalle est apicale. La structure de cette algue est multiaxiale et la taille du thalle varie de 2 à 12 cm (Fischer et al., 1987).

Espèce fixée aux rochers par une croûte, colonisant les substrats durs de l’étage infralittoral supérieur. Elle est présente en Méditerranée, mer Noir et Atlantique Nord Est (à priori jusqu'au Nord de l'Espagne) et le Pacifique Nord (Guiry & Guiry, 2014).

Cette algue rouge a un cycle trigénétique où se succèdent trois générations. En effet, sa phase diploïde se déroule en deux périodes distinctes. Aucune différence morphologique ne semble exister entre le sporophyte et le gamétophyte. Les organes reproducteurs se développent dans des cavités closes appelées conceptacles, de formes piriformes ou arrondis, mais toujours terminaux (Fischer et al., 1987).

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1.4. Enteromorpha compressa (Ulva compressa)  Taxonomie

Embranchement : Chlorophyta Classe : Ulvophyceae Ordre : Ulvales Famille : Ulvaceae Genre : Enteromorpha Espèce : compressa (Linnaeus) Nees (1820)

Figure 21: Enteromorpha compressa

 Caractéristiques botaniques et phénotypiques

Ce sont des algues ayant un thalle vert clair tubulaire ramifié fixé sur le substrat par un disque formé de rhizoïdes. La paroi du tube est formée d’une assise de cellules; en vue superficielle les cellules ne sont ordonnées ni en lignes ni en rangées. La taille du thalle varie de 10 à 20 cm (Fischer et al., 1987).

C’est une algue annuelle, qui se développe généralement en quantité très importante sur les rochers, au niveau des étages médiolittoraux en eau agitée (mode battu), et infralittoraux en mode calme ou peu battu, dans les flaques, les cuvettes et les stations riches en sels nutritifs (Fischer et al., 1987).

C’est une algue cosmopolite, largement distribuée sur la côte Pacifique de l'Amérique du Nord, dans toute la Méditerranée, et aussi en Afrique et en Australie (Guiry & Guiry, 2014).

Le cycle de vie des espèces d'Enteromorpha est identique à celui de toute la famille des Ulvaceae et présente deux générations, c’est un cycle haplodiplophasique, digénétique isomorphe (les générations haploïdes et diploïdes ont la même morphologie). Au départ, le sporophyte mature subit une méiose et donne des sporocystes. Ceux-ci libèrent des zoospores quadriflagellés, qui à leur tour subissent une mitose et donnent des gamétophytes. Après la méiose, les gamétophytes donneront des gamétocystes qui vont libérer des gamètes biflagellés. Ces derniers vont évoluer en passant par une syngamie pour donner le zygote qui par mitose donnera un sporophyte mature (Gayral, 1975 ; Fischer et al., 1987).

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1.5. Ulva lactuca  Taxonomie

Embranchement : Chlorophyta Classe : Ulvophyceae Ordre : Ulvales Famille : Ulvaceae Genre : Ulva Espèce : lactuca Linnaeus (1753)

Figure 22: Ulva lactuca

 Caractéristiques botaniques et phénotypiques

Elle forme une lame très mince (bicouche cellulaire), orbiculaire et translucide et ressemble à la laitue. Le thalle mesure jusqu'à 10 cm d'envergure, aplati et entier, membraneux et irrégulièrement perforé, il est fixé par un petit crampon discoïde. Une lame bistromatique possède des cellules de 20 à 23 µm de long et 20 à 21 µm de haut, sub- rectangulaires et jointives, pourvues d'un chloroplaste unique pariétal. La bordure est un peu ébouriffée et souvent déchirée. Un thalle de la laitue de mer peut atteindre 18 cm de longueur, mais généralement beaucoup moins, et jusqu'à 30 cm de diamètre (Fischer et al., 1986).

Cette espéce pousse généralement en eau peu profonde jusqu'à 10 mètres, bien éclairée, au niveau de l'étage médiolittoral et infralittoral supérieur. Elle peut se fixer sur n'importe quel substrat solide : rocher, digue. Elle est cosmopolite, largement distribué en Méditerranée, mer Noire, en Atlantique et en océan Pacifique et Indien (Guiry & Guiry, 2014).

Leur durée de vie est de quelques mois, mais on en trouve toute l'année, le cycle est caractérisé par l'alternance régulière de générations haploïde (gamétophyte) et diploïde (sporophyte), qui sont morphologiquement identiques (Fischer et al., 1986).

Synthèse bibliographique

2. Applications potentielles des espèces cibles

Tableau 01: Applications potentielles des composés détectés chez des espèces des genres Cystoseira, Corallina, Ulva et Enteromorpha, en nutrition et santé humaine, d’après les données de Cornish & Garbary (2010).

Espèces d’algues Applications Références Cystoseira crinita Antibactérien, Antiviral, Kamenarska et al. (2009) Activité cytotoxique Taskin et al. (2010) Cystoseira mediterranea Antimicrobien Taskin et al. (2010) C. tamariscifolia, C. mediterranea Anti-tumoral Zubia et al. (2009) Roberto et al. (2003) Cystoseira sp., Cystoseira tamariscifolia Activité antioxydante Zubia et al. (2009) Corallina elongata Antibactérien, Antiviral, Kamenarska et al. (2009) Activité cytotoxique Aliments fonctionnels Zhang et al. (2007) Corallina pilulifera, Corallina spp. Inhibition du peroxynitrite Lee et al. (2004) (Pharmaceutique) Ulva lactuca, Ulva pertusa Antioxydants alimentaires Yangthong et al. (2009) Ulva pertusa, Ulva fasciata, Ulva sp. Aliments fonctionnels Garcia-Casal et al.(2009) Ulva reticulata Fonction liée à la santé Gunji et al. (2007) Ulva pertusa Activité antioxydante Roberto et al. (2003) Ulva lactuca Inhibition du peroxynitrite Lee et al. (2004) (Pharmaceutique) Stimule le mécanisme de Hassan et al. (2011) défense antioxydant hépatique et réduit le taux de lipides, triglycérides et cholestérol total. Enteromorpha prolifera, E.intestinalis Antioxydants alimentaires Zubia et al. (2007) Enteromorpha intestinalis Effet médical Zubia et al. (2007) Enteromorpha linza Inhibition du peroxynitrite Lee et al. (2004)

MATERIELS & METHODES

Matériels & méthodes

1. Campagne d’échantillonnage

1.1. Présentation du site d’échantillonnage

Le site de collecte se situe dans la wilaya d’Oran qui se trouve sur la rive Sud du bassin méditerranéen et au Nord-Ouest de l'Algérie. La récolte est effectuée au niveau des côtes rocheuses de la grande plage, sur le littoral de la ville d’Oran situées dans la commune de Bousfer (position GPS: 35°44’29.72’’N et 0° 50’14.21’’O) (Figure 23).

La grande plage est choisie pour son accessibilité, sa sécurité et sa proximité de la ville d’Oran, ainsi que la présence de différentes espèces d’algues tout au long de l’année.

Figure 23: Localisation géographique du site d’échantillonnage (Google Earth, 2018).

1.2. Sélection et identification des espèces cibles

Une étude préliminaire est effectuée afin de définir les espèces d’algues largement présentes au niveau du littoral oranais et particulièrement dans la région d’étude.

Parmi les espèces d’algues collectées, cinq sont retenues pour cette étude. Il s’agit de deux algues vertes (Chlorophytes), deux algues brunes (phéophytes ou ochrophytes) et une algue rouge (Rhodophyte). La sélection et la collecte des espèces sont effectuées sur la base de leur disponibilité et leur abondance sur le site d’échantillonnage.

La caractérisation botanique et la confirmation du genre et de l’espèce sont réalisées au laboratoire d’Aquaculture et Bioremédiation (AQUABIOR), du département de Biotechnologie de l’Université Oran1, en s’appuyant sur des données assemblées de travaux algologiques sur des espèces d’algues des côtes Ouest algériennes, ainsi qu’en utilisant le Guide F.A.O. (Food and Agriculture Organization) d'identification des espèces pour les besoins de la pêche (Fischer et al., 1987), le site Doris (http://doris.ffessm.fr) et le site Algabase (www.algabase.com) (Guiry & Guiry, 2014).

Matériels & méthodes

Les espèces d’algues brunes correspondent à Cystoseira amentacea var. stricta et Cystoseira compressa. L’algue rouge correspond à Corallina elongata et les algues vertes correspondent à Enteromorpha compressa et Ulva lactuca.

1.3. Collecte et traitement des échantillons

Les thalles des différentes espèces d’algues sont récoltés en pleine période printanière. Ces algues sont prélevées à la main à une profondeur allant de 0,5 à 1 m et conservées dans des bacs en plastiques, remplis d’eau de mer, et transportées immédiatement dans une glacière (4 ± 1°C) jusqu’à leur traitement au laboratoire.

Après l’élimination des débris, des petits crustacés et des autres algues, les thalles sont lavés avec l’eau de mer puis rincés à l'eau distillée et nettoyés complètement des épiphytes. Les algues sont ensuite séchées à température ambiante (23 ± 2°C) pendant 72 heures à l’abri de la lumière, puis broyées jusqu'à l’obtention d’une poudre fine (Bouhlal et al., 2010) et conservées dans des flacons en plastiques à - 20°C, jusqu’à leur utilisation.

2. Composition proximale, lipidique et minérale des algues

Les analyses chimiques et minérales sont réalisées dans le laboratoire de Chimie des Produits Marins, département des Technologies Alimentaires et le laboratoire de Biogéochimie Marine, département d’Océanographie, respectivement, à l'Institut de Recherches Marines de Vigo, ESPAGNE.

2.1. Caractérisation chimique 2.1.1. Détermination de la teneur en eau

Elle est déterminée par dessiccation dans une étuve ventilée jusqu’à poids constant selon la méthode officielle 950.46B (AOAC, 1995). Les taux d’humidité des algues fraîches et des algues séchées, correspondent à la différence de pesée entre le poids d’un gramme d’algue et son poids une fois chauffé à 105 ± 2 ºC pendant 4 heures. Les résultats sont exprimés en g/100 g matière fraîche (MF) ou bien en g/100 g matière sèche (MS).

Matériels & méthodes

2.1.2. Détermination de la teneur en cendres

Cette analyse est réalisée selon la méthode officielle 920.153 (AOAC,1995), et consiste à placer dans un creuset en porcelaine 2 g d’algues préalablement séchés, tarer puis incinérer dans un four à moufle à 550 °C pendant 6 heures. Le poids du résidu correspond à la matière minérale. Les résultats sont exprimés en g/100 g de matière sèche (MS).

2.1.3. Détermination de la teneur en protéines brutes

L’azote total (N) est déterminé par la technique de Kjeldahl, selon la procédure alternative II 928.08 (AOAC, 1995). Cette méthode de dosage comporte trois étapes : la minéralisation, la distillation et la titration.

La minéralisation est la transformation de l’azote organique de l’échantillon sec (1g) en azote minéral (sulfate d’ammonium), en présence de 15 ml d’acide sulfurique concentré et d’un catalyseur au titane/cuivre (Kjeltabs CT, Thompson et Capper LTD), chauffé à 450 °C pendant 90 min. Le minéralisât est ensuite placé dans un système de distillation automatique, type Kjeldahl VELP Scientifica UDK 129. Après transformation du sulfate d’ammonium en ammoniac par une base forte (NaOH, 10N), l’ammoniac est entraîné par la vapeur d’eau et repris dans une solution d’acide borique contenant un indicateur coloré. Puis, il est titré par une solution d’HCl (0,1N).

La teneur en azote de la matière sèche est obtenue par l’équation suivante :

Vol (HCl)(ml)x 14 x 0,1 N(%) = Poids de l′échantillon x 100

La teneur en protéines totales est obtenue en multipliant la teneur en azote par 6,25 et exprimée en g/100 g de matière sèche (MS).

2.1.4. Détermination de la teneur en carbohydrates

Les carbohydrates totaux sont estimés par différence (Marinho-Soriano et al., 2006), par l’équation suivante :

Carbohydrates (%) = [100% ‐ (% protéines + % lipides + % cendres)]

La concentration en carbohydrates est exprimée en g/100 g de matière sèche (MS).

Matériels & méthodes

2.1.5. Détermination de la teneur en lipides

L’extraction de la fraction lipidique est réalisée par la méthode de Sánchez-Machado et al. (2004). 2 g de poudre d’algue est extraite avec 14 ml de dichlorométhane : méthanol (2:1, v/v), homogénéisé pendant 2 min; puis centrifugé à 3500 rpm, 10 min, à 4°C. Le surnageant est récupéré et le culot est ré-extrait avec 5 ml du mélange dichlorométhane : méthanol, puis les deux surnageants obtenus sont mixés (12-15 ml).

La quantification des lipides est réalisée par la méthode d’Herbes & Allen (1983). Pour cela, des capsules de papier d'aluminium sont pesées à l’aide d’une balance analytique. 500 µl de l'extrait lipidique sont ajoutés dans chaque capsule et placés sur une plaque chauffante jusqu'à l'évaporation complète du solvant. Les capsules sont refroidies sous dessiccateur et par la suite pesées. La différence de poids représente la quantité de lipides et les résultats sont exprimés en g/100 g de matière sèche (MS).

2.2. Analyse de la fraction lipidique 2.2.1. Quantification des phospholipides

La teneur en phospholipides (PL) est quantifiée en mesurant le phosphore organique total dans l'extrait lipidique, selon la méthode décrite par Raheja et al. (1973) basée sur la formation d'un complexe avec le molybdate d'ammonium.

 Réactif

Le réactif chromogène réagi avec les phospholipides pour donner lieu à la formation d'un complexe bleu et sa composition est la suivante :

Solution 1: 4g de molybdate d’ammonium dans 30 ml d’eau distillée.

Solution 2: 20 ml de la solution (1), 10 ml d’acide chlorhydrique 37% et 2,5 ml de mercure.

Solution 3: 10 ml de la solution (1), 50 ml d’acide sulfurique et toute la solution (2).

Le réactif est préparé en mélangeant 45 ml de méthanol, 5 ml de chloroforme, 20 ml d'eau distillée et 25 ml de la solution (3).

Matériels & méthodes

 Procédure

100 µl d'extrait lipidique sont évaporés sous courant d’azote, puis 400 µl de chloroforme et 100 µl du réactif chromogène sont ajoutés et le mélange est mis dans un bain marie à 50 ºC durant 30 min. Après refroidissement, 5 ml de chloroforme sont ajoutés au mélange et centrifugés pendant 15 min à 3000 rpm. Les phospholipides présents dans la phase organique sont quantifiés par spectrophotométrie à 710 nm, faisant référence à l’équation de la droite de régression (y = 0,001x - 0,008) obtenue de la courbe étalon du 1,2-dipalmitoyl- phosphatidylcholine (DPPC), réalisée dans du chloroforme pour des concentrations variant de 16 à 260 mg/ml. Les résultats sont exprimés en g PL/100 g de lipides totaux.

2.2.2. Quantification des stérols

Les stérols totaux (ST) sont déterminés dans l'extrait lipidique par la méthode de Huang et al. (1961) basée sur la réaction de Liebermann-Buchardt. En milieu anhydride acétique, les noyaux stérols réagissent avec l'acide sulfurique concentré provoquant ainsi des changements de coloration dus à l'augmentation de la conjugaison des doubles liaisons au sein des cycles adjacents.

 Réactif

Afin de préparer le réactif de Liebermann-Buchardt, 90 ml d'acide acétique et 180 ml d'anhydride acétate sont mélangés et introduit dans un bain de glace. 30 ml d'acide sulfurique concentré sont rajoutés. Après agitation, 150 ml de ce mélange sont ajoutés à 5 g de sulfate de sodium et ajustés à 250 ml avec le reste du mélange.

 Procédure

A 250-1000 µl d'extrait lipidique évaporé sous courant d’azote, on additionne 200 µl d'acide acétique et 5 ml du réactif chromogène. Le mélange est laissé reposer durant 15 min et centrifugé à 2500 rpm pendant 10 min, puis l'absorbance est mesurée à 615 nm. La quantification est réalisée en préparant une courbe étalon de cholestérol (y = 0,001x + 0,004), dans de l’acide acétique pour des concentrations variant de 10 à 314 mg/ml. Les résultats sont exprimés en g de stérols/100 g de lipides totaux.

Matériels & méthodes

2.2.3. Analyse du profil en acides gras

Les lipides de l’extrait sont convertis en esters méthyliques d’acides gras (EMAG), par transestérification direct dans du méthanol : benzène (4:1) à l'aide du chlorure d’acétyle, selon la méthode décrite par Lepage & Roy (1986). L'analyse est réalisée par une chromatographie gazeuse (GC) (Perkin-Elmer 8700 chromatograph, Madrid, Espagne), selon la procédure établie par Álvarez et al. (2009), en utilisant une colonne capillaire SP-2330 (0,25 mm x 30 m, Supelco, Inc., Bellefonte, PA, USA). La température est programmée comme suit: une augmentation de 145 jusqu’à 190 ºC à 1,0 ºC/min et de 190 ºC jusqu’à 210 ºC à 5,0 ºC/min; et enfin, mené à 210 ºC pendant 13,5 min. L’azote est utilisé comme gaz vecteur à 10 psig et la détection est réalisée avec un détecteur à ionisation de flamme (FID) à 250 ºC. L’injecteur est utilisé en mode split (150:1) et chauffé de 45 jusqu’à 275 ºC à 15 ºC/min.

Les pics sont identifiés en comparant les chromatogrammes obtenus et leur temps de rétention avec ceux des standards correspondants (Qualmix Fish, Larodan, Malmo, Sweden; FAME Mix, Supelco, Inc.). Les surfaces de pics sont automatiquement intégrées et l’acide gras C19:0 est utilisé comme étalon interne à des fins quantitatives.

Les concentrations des acides gras sont exprimées en g/100 g d’acides gras totaux (AGT). Les teneurs en AGT sont également calculées pour chaque algue en g/100 g de lipides (LP) et en mg/g de matière sèche (MS).

2.2.4. Analyse des tocophérols

Les composés tocophérols (α-, β-, γ- et δ-) sont déterminés dans les différents échantillons d’algues selon la méthode de Cabrini et al. (1992). Ces antioxydants lipophiles sont extraits à partir de l’algue sèche avec de l’hexane/éthanol, évaporés sous courant d’azote, dissout dans de l’isopropanol et injectés dans l’HPLC (colonne ODS, 15 cm x 0,46 cm).

Un système binaire de méthanol et d'isopropanol est utilisé comme phase mobile et la détection (UV) est réalisée à 280 nm. La présence des différents composés tocophérols (α, β, γ et δ) est recherchée. Seulement, α, γ et δ-tocophérols sont détectés et des tocophérols commerciaux sont utilisés comme étalons internes à des fins quantitatives. Les résultats sont exprimés en mg/kg de matière sèche (MS).

Matériels & méthodes

2.3. Analyse des minéraux

Les minéraux dans les échantillons secs sont analysés par spectrométrie d'émission optique à plasma à couplage inductif (ICP-OES), à l’exception du Mercure (Hg) qui est analysé par un spectromètre d’absorption atomique équipé d’un système d’injection en flux continu et d’une lampe de mercure, après digestion en micro-ondes.

 Digestion

Vingt deux éléments minéraux sont analysés selon la procédure EPA 3050B (US-EPA, 1996). 1 g de chaque échantillon d’algues est pesé dans un verre en téflon, puis 9 ml d’acide nitrique à 69% (TMA, Hiperpur), 3 ml de H2O2 et 3 ml d’eau pure (Milli-Q) sont ajoutés. L’échantillon est soumis à une digestion en micro-ondes (Mars-Xpress CEM Corp. Matthews, NC, USA).

 Analyse

Les analyses des échantillons digérés sont réalisées pour le Mercure par FIMS400 Perkin Elmer (lampe émission: 253,7 nm) et pour les autres éléments par ICP-OES Perkin Elmer Optima 4300 DV (conditions d’ICP-OES: puissance RF: 1300 W; débit du gaz plasma: 15 L/min; débit du gaz auxiliaire: 0,2 L/min; débit du gaz vecteur: 0,6 L/min).

La précision de la méthode analytique est assurée par l’utilisation de matériel certifié de référence Duck Weed, Aquatic plant, BCR-670, préparé par l’institut du matériel de références et de mesures, comme matériel de contrôle de la qualité (Tableau 02). Les résultats sont en accord avec la comparaison aux matériels de référence standards (environ 200 mg Duck Weed, Aquatic plant, BCR-670). Les résultats sont exprimés en mg/kg de matière sèche (MS).

Matériels & méthodes

Tableau 02: Contrôle de la précision de la procédure analytique de détermination des éléments traces (moyenne ± ET)*.

Elément Certifié Mesuré Unité As 1,98 ± 0,19 2,01 ± 0,01 mg/kg B nd 1480 ± 40 mg/kg Ba 56,5 ± 0,3 54,9 ± 1,1 mg/kg Ca nd 28,0 ± 1,1 g/kg Cd 0,0755 ± 0,0025 0,00752 ± 0,0004 mg/kg Co 1,25 ± 0,22 1,25 ± 0,01 mg/kg Cr 2,05 ± 0,10 2,01 ± 0,01 mg/kg Cu 1,82 ± 0,30 1,75 ± 0,02 mg/kg Fe 1,01 ± 0,01 0,98 ± 0,03 g/kg Hg nd 8,1 ± 1,6 mg/kg K nd 24,44 ± 0,93 g/kg Li 1,48 ± 0,03 1,37 ± 0,08 mg/kg Mg nd 4,91 ± 0,19 mg/kg Mn 1,53 ± 0,02 1,50 ± 0,03 g/kg Na nd 7,80 ± 0,29 g/kg Ni 2,45 ± 0,27 2,51 ± 0,02 mg/kg Pb 2,06 ± 0,12 2,01 ± 0,02 mg/kg Rb 7,96 ± 0,09 8,02 ± 0,05 mg/kg Se 0,183 ± 0,040 0,175 ± 0,04 mg/kg Sr 180 ± 1 182 ± 4 mg/kg V 3,48 ± 0,18 3,51 ± 0,02 mg/kg Zn 24,0 ± 2,1 22,7 ± 0,5 mg/kg

Le matériel certifié de référence est Aquatic Plant BCR-CRM670 (GeoReM).

* Résultats (n=3, triplicata), ET : écart-type; nd : pas de donnée (no data).

Matériels & méthodes

3. Etude du potentiel antioxydant des algues collectées de l’ouest algérien 3.1. Evaluation in vitro de l’activite antioxydante d’extraits d’algues

3.1.1. Préparation des extraits bruts 3.1.1.1. Extraction par macération

Dans des conditions de température optimale et d’obscurité assurant la préservation des composés bioactifs des algues, l’obtention des extraits bruts méthanoliques, éthanoliques et aqueux de chaque espèce d’algue est réalisée tout d’abord par macération. Cette méthode consiste à laisser une quantité de chaque poudre précédemment obtenue en contact avec un volume de solvant d'extraction.

 Procédé d’extraction

La technique consiste à mettre 5 g de poudre d’algue dans un volume de 100 ml de solvant (méthanol, éthanol ou eau distillée). Une macération est lancée à l’abri de la lumière sous agitation mécanique dans un agitateur-incubateur (Heidoiph Unimax 1010 - Inkubator 1990), à température ambiante (25 °C) pendant 24 heures. Les extraits obtenus sont centrifugés à 3500 rpm pendant 10 min à 4 °C et filtrés. Les extraits organiques sont évaporés à sec à 30- 35°C avec un évaporateur rotatif de type Hahnvapor HS-2005-N et les extraits aqueux sont lyophilisés (Kelman et al., 2012). Les résidus secs des différents extraits obtenus sont pesés et conservés à -20 °C.

3.1.1.2. Extraction par Soxhlet

Un extracteur Soxhlet est une pièce de verrerie utilisée en chimie analytique et en chimie organique qui permet de faire l’extraction continue d’un solide par un solvant. Quand le ballon est chauffé, les vapeurs de solvant passent par le tube adducteur, se condensent dans le réfrigérant et retombent dans le corps en verre, faisant ainsi macérer les résidus dans le solvant. Le solvant condensé s’accumule dans l’extracteur jusqu’à atteindre le sommet du tube siphon, qui provoque alors le retour du liquide dans le ballon, accompagné des substances extraites. Le solvant contenu dans le ballon s’enrichit progressivement en composés solubles.

Matériels & méthodes

 Procédé d’extraction

Les extraits bruts des algues sont obtenus par le traitement de 5 g de poudre d’algue avec séparément 100 ml de deux solvants organiques: le méthanol et l’éthanol et d’eau distillée dans le Soxhlet pendant 6 heures. Les extraits organiques résultants sont concentrés à sec sous pression réduite à 30-35 °C, avec un évaporateur rotatif (Hahnvapor HS-2005-N) et les extraits aqueux sont lyophilisés (Bouhlal et al., 2010). Les résidus secs des différents extraits obtenus, sont pesés et conservés à -20 °C.

3.1.1.3. Détermination du rendement

Le rendement désigne la masse de l’extrait brut déterminée après évaporation du solvant organique, il est exprimé en pourcentage par rapport à la masse initiale de la poudre d’algue soumise à l’extraction. Le rendement (R) est calculé par la formule suivante :

R (%) = M/M0 x 100

Où :

R : Rendement exprimé en %

M : Masse en gramme de l’extrait sec résultant

M0 : Masse en gramme du matériel végétal à traiter

3.1.2. Analyse quantitative des composés secondaires des extraits organiques et aqueux 3.1.2.1. Dosage des polyphénols totaux

Le dosage des phénols totaux des extraits est effectué selon la méthode de Folin-Ciocalteu (Singleton & Rossi, 1965). Ce réactif jaune est constitué d’un mélange d’acide phosphotungstique et d’acide phosphomolybdique. Il est réduit lors de l’oxydation des phénols, en un mélange bleu d’oxydes de tungstène et de molybdène possèdant une absorption maximale aux environs de 765 nm. L’intensité de la couleur est proportionnelle aux taux des composés phénoliques oxydés (Boizot & charpentier, 2006).

Matériels & méthodes

 Protocole

Un volume de 400 µl de chaque extrait d’algue à 2000 µg/ml est ajouté à 2 ml du réactif de Folin-Ciocalteu (dilué 10 fois), le mélange est laissé reposer 4 min à température ambiante à l’obscurité. Ensuite, 1,6 ml de Na2CO3 (7,5 %) sont additionnés. Les tubes sont agités et incubés pendant 2 heures à l’obscurité à température ambiante. L’absorbance est lue à 765 nm contre un blanc. La concentration des extraits en polyphénols totaux est déduite à partir de l’équation de la régression linéaire (y = 0,003x + 0,033) de la courbe d'étalonnage établie avec de l’acide gallique (15 - 250 µg/ml), et exprimée en mg équivalents d'acide gallique par gramme de matière sèche algale (mg EAG/g MS).

3.1.2.2. Dosage des flavonoïdes totaux

La teneur en flavonoïdes des extraits est déterminée en utilisant la méthode du trichlorure d’aluminium (Bahorun et al., 1996). Cette méthode est basée sur les propriétés chélatrices de l’ion aluminium. Le trichlorure d'aluminium (AlCl3) forme un complexe très stable avec les groupements hydroxyles (OH) des flavonoïdes. Ce complexe de couleur jaune absorbe dans la lumière visible à une longueur d’onde de 415 nm.

 Protocole

Un volume de 2 ml des extraits à 2000µg/ml est ajouté à 2 ml de la solution d’AlCl3 à 10% (dissout dans le méthanol), le mélange est agité afin d'homogénéiser le contenu et laissé réagir pendant 10 min à température ambiante. L'absorbance est déterminée à l’aide d’un spectrophotomètre à 415 nm contre un blanc. Une courbe d'étalonnage est réalisée en parallèle dans les mêmes conditions opératoires en utilisant la quércétine (5 - 50 µg/ml). La teneur en flavonoïdes des extraits est calculée à partir de l’équation de régression linéaire de la courbe d'étalonnage (y = 0,282x - 0,115), et exprimée en mg équivalents de quércétine par gramme de matière sèche algale (mg EQ/g MS).

3.1.2.3. Dosage des tannins condensés

Les tannins condensés sont déterminés par la méthode à la vanilline en milieu acide (Julkunen-Titto, 1985). Cette méthode consiste à faire réagir les tannins avec de la vanilline,

Matériels & méthodes qui libérent après leur dépolymérisation en présence d’acide, par rupture de la liaison intermonomérique des anthocyanidols de couleur rouge spécifique mesurée à 500 nm.

 Protocole

L’estimation de la quantité des tannins condensés repose sur la mise en réaction d’un volume de 200 µl de l’extrait algal (2000 µg/ml) avec un volume de 1,5 ml de la solution vanilline/éthanol (4 %, m/v). Le mélange est bien homogénéisé et 750 µl de la solution d’acide chlorhydrique concentré (HCl) est additionné et laissé réagir 15 min à température ambiante à l’obscurité.

L’absorbance est mesurée à 500 nm contre à un blanc. La quantité des tannins condensés exprimée en mg d’équivalent de catéchine par gramme de matière sèche (mg EC/g MS); est déterminée à partir d’une droite d’étalonnage (y = 0,002x + 0,006) tracée avec de la catéchine (100 - 300 µg/ml).

3.1.3. Détermination du pouvoir antioxydant des extraits d’algues

Il est recommandé d'utiliser au moins deux tests pour confirmer une activité antioxydante (Lehtonen et al., 2009 ; Yang et al., 2011a). Le choix s'est porté sur l'utilisation du test de l’activité antiradicalaire (DPPH) évaluant la capacité de piégeage des radicaux libres, et le test déterminant le pouvoir réducteur.

3.1.3.1. Activité antiradicalaire : test de piégeage du radical libre DPPH

L’activité antiradicalaire des extraits est testée par la méthode au DPPH (Yen & chen, 1995). Le DPPH (2,2-diphényle-1-picrylhydrazyl) est un radical libre stable violet en solution, il présente une absorbance caractéristique dans un intervalle compris entre 512 et 517 nm. Cette couleur disparait rapidement lorsque le DPPH est réduit en 2,2-diphényle-1- picrylhydrazine par un composé à propriété antiradicalaire, entrainant ainsi une décoloration qui explique le pouvoir de l'extrait à piéger ce radical. L’intensité de la couleur (coloration jaune pâle) est proportionnelle à la capacité des antioxydants présents dans le milieu à donner des protons (Sanchez-Moreno, 2002).

Matériels & méthodes

On peut résumer la réaction sous la forme de l’équation :

* * DPPH + (AH)n DPPH-H + (A )n

Où:

(AH) représente un composé capable de céder un hydrogène au radical DPPH* (violet) pour le transformer en diphényle picrylhydrazine (DPPH-H) (jaune) (Brand-William et al., 1995).

 Protocole

Plusieurs concentrations des extraits d'algues (100µg/ml, 1000µg/ml, 2000µg/ml) sont préparées. La solution au DPPH est préparée dans du méthanol pour une concentration de 0,16 mM.

Un volume de 2 ml de chaque extrait aux trois concentrations à tester est ajouté à 2 ml de solution au DPPH. Après agitation par un vortex, les tubes sont placés à l’obscurité, à température ambiante pendant 30 min. La lecture est effectuée par la mesure de l’absorbance au spectrophotomètre à 517 nm.

Le contrôle positif est représenté par une solution d’un antioxydant synthétique; le BHT et d’un antioxydant naturel la vitamine E et l’acide ascorbique (à différentes concentrations: 100µg/ml, 1000µg/ml, 2000µg/ml) dont l’absorbance est mesurée dans les mêmes conditions expérimentales que les extraits.

Les résultats sont exprimés en % d’inhibition, calculé par la formule suivante:

% d’inhibition = (A – A )/ A ) x 100 controle échantillon controle

A controle: Absorbance du contrôle négatif (DPPH + méthanol sans extrait)

A échantillon : Absorbance de l’échantillon

L’IC50 est déterminée pour chaque extrait, elle est définie comme étant la concentration nécessaire pour inhiber 50% du radicale libre DPPH. La valeur IC50 est calculée graphiquement par la régression linéaire du pourcentage d’inhibition.

Matériels & méthodes

3.1.3.2. Dosage du pouvoir réducteur

Le pouvoir réducteur du fer (Fe3+) dans les extraits est déterminé selon la méthode décrite par Oyaizu (1986). L'activité réductrice d'un extrait est évaluée par la réaction d’oxydo- réduction entre l'extrait et les ions métalliques de transition, notamment le fer (Huang et al., 3+ 2005). Le ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6] fournit des ions Fe qui seront réduit en Fe2+ par les antioxydants présents dans l'extrait algal. Le mécanisme est connu comme étant un indicateur de l’activité donatrice d’électrons, caractéristique de l’action antioxydante des polyphénols (Yildirim et al., 2001).

Le mécanisme d’action peut être schématisé comme suit :

3+ 2+ FeCl3 Fe Fe

En ajoutant un réducteur (substance antioxydante présente dans l’extrait algal) à cette 3+ 2+ solution (FeCl3), le Fe est réduit en Fe ; ce dernier réagi donc avec l’hexacyanoferrate de potassium K3 [Fe(CN)6]. Suite à cette réaction, la coloration jaune passe à une coloration bleu verte, selon la réaction suivante :

2+ Fe + K3 [Fe (CN)6] KFe [Fe(CN)6] + 2K

 Protocole

Un millilitre de chaque extrait à 2000 µg/ml est mélangé avec 2,5 ml d’une solution tampon phosphate 0,2 M (pH 6,6) et 2,5 ml d’une solution de potassium ferricyanide à 1%. L’ensemble est incubé au bain marie à 50 °C pendant 30 min et un volume de 2,5 ml d’acide trichloroacétique à 10% est ajouté. Le mélange est centrifugé à 3000 rpm pendant 10 min et 2,5 ml de la couche supérieure de la solution sont mélangés à 2,5 ml d'eau distillée et 0,5 ml de FeCl3 à 0,1 %. Le BHT, la vitamine E et l’acide ascorbique sont utilisés comme contrôles positifs dans les mêmes conditions expérimentales. Les résultats sont représentés par l’absorbance du milieu réactionnel (DO) à 700 nm.

Matériels & méthodes

3.2. Evaluation de l’effet de la glace traitée par l’extrait éthanol-aqueux combiné de « Cystoseira compressa » sur la conservation de la qualité du Chinchard commun

Cette expérience est réalisée au laboratoire de Chimie des Produits Marins, département des Technologies Alimentaires, de l'Institut de Recherches Marines de Vigo, ESPAGNE. Les analyses microbiologiques sont réalisées par le département de Chimie Analytique, de Nutrition et Bromatologie, de l'Université de Saint-Jacques-de-Compostelle (USC), Campus de Lugo, ESPAGNE.

3.2.1. Préparation de l’extrait de C. Compressa et de la glace

L’extraction est réalisée à partir de 20 g de poudre de Cystoseira compressa, par macération successive avec de l’éthanol absolue et de l’eau distillée (décrite précédemment). Les volumes finaux obtenus de l’extraction éthanolique et de l’extraction aqueuse sont ajustés à 200 ml. Deux différentes concentrations d’extrait éthanol-aqueux combiné (mixte) sont prises en considération, donc deux différentes glaces sont à préparer.

Afin de préparer le lot de concentration algale élevée (lot: CAE), 180 ml de chaque extrait (éthanolique et aqueux) sont mélangés ensemble et ajustés avec de l’eau distillée à un volume de 6 litres.

Pour le lot de concentration algale faible (lot: CAF), 20 ml de chaque extrait (éthanolique et aqueux) sont mélangés ensemble et ajustés avec de l’eau distillée à un volume de 6 litres, auxquels est rajoutés 160 ml d’éthanol absolue, afin d’avoir la même quantité d’éthanol dans chaque glace traitée.

Et en ce qui concerne, la glace utilisée comme lot témoin (contrôle), 180 ml d’éthanol absolue sont dilués à 6 litres avec de l’eau distillée. Chaque solution est placée dans un sac en polyéthylène et stockée à -18 °C. Les différentes glaces sont ensuite broyées afin d’obtenir des flocons de glace.

Les conditions expérimentales (concentration d’extrait en poudre d’algue dans la glace) employées dans la présente étude sont basées sur de précédentes recherches réalisées dans le laboratoire d'accueil, concernant l’utilisation d’extraits éthanolique et aqueux d’autres algues (Barros-Velázquez et al., 2016 ; Miranda et al., 2016).

Matériels & méthodes

3.2.2. Echantillonnage, répartition et conservation du poisson

L’expérimentation a porté sur du chinchard commun (60 spécimens) capturés prés de la côte Atlantique galicienne (Nord-Ouest de l’Espagne). Le poisson est obtenu sur un marché local 10 heures après capture. De sa capture à l'arrivée au laboratoire les spécimens sont conservés dans de la glace. La taille et le poids des individus de poissons sont compris entre 21 à 24 cm et de 170 à 190 g, respectivement.

Dés l’arrivée au laboratoire, immédiatement, les spécimens de poissons sont répartis en trois lots (18 spécimens par lot), placés dans différentes caisses et directement recouvert par les différentes glaces (lot témoin, CAF et CAE, respectivement).

Toutes les caisses de poissons sont placées dans une pièce réfrigérée (2 ± 1 ºC). Les caisses contiennent un système d’évacuation de l’eau de la glace fondue. Dans tous les lots, la glace est renouvelée quand c’est nécessaire afin de maintenir le ratio 1:1 (poisson : glace).

Les lots sont conservés 11 jours et des analyses biochimiques et microbiologiques sont réalisées aux jours 0, 4, 7 et 11. Chaque jour d’échantillonnage, six spécimens sont prélevés de chaque lot pour l’analyse et divisés en trois groupes (deux spécimens par groupe) qui sont analysés séparément (n=3).

Figure 24: Chinchard commun frais (à gauche) et conservation du poisson dans la glace traitée (à droite).

Matériels & méthodes

3.2.3. Analyses chimiques

3.2.3.1. Détermination du pH

L’évolution du pH dans le muscle du poisson pendant la conservation est déterminée en utilisant un pH mètre (Crison, Barcelone, Espagne), pourvu d’une électrode de 6 mm de diamètre de pénétration. La lecture du pH est effectuée au moyen d'une pénétration de l'électrode dans le muscle.

3.2.3.2. Détermination de la teneur en TMA

L’indice de TMA-N (Trimethylamine-nitrogen) est déterminé selon Tozawa et al. (1971), par une méthode colorimétrique au picrate (Beckman Coulter, DU 640; London, UK). Cette méthode nécessite la préparation de l’extrait à l’acide trichloroacétique à 5% du muscle du poisson (10 g/50 ml).

 Préparation de l’extrait acide trichloroacétique (TCA)

10 g de muscle est homogénéisé pendant 45 s, sous un bain de glace avec 30 ml d’acide trichloroacétique à 5 %, à l’aide d’un ultraturrax. Ensuite, le mélange est laissé reposer pendant 15 min à -20 ºC, filtré à travers des filtres en papier sur des fioles jaugées de 50 ml et finalement ajusté au volume de 50 ml avec de l’acide trichloroacétique à 5 % froid. Les extraits sont stockés à -30 ºC.

 Protocole

1 ml de cet extrait TCA est mélangé à 0,5 ml de formaldéhyde à 10 %, 5 ml de toluène et 1,5 ml d'hydroxyde de potassium à 25 %. Le mélange est mis dans un bain marie à 30 ºC pendant 5 min, énergiquement agité pendant 5 s et centrifugé à 1500 rpm pendant 5 min, afin d’obtenir la séparation des deux phases. 2 ml de la phase organique sont transférés dans un tube, auquel sont ajoutés 2 ml d’acide picrique standard (1 ml d’acide picrique stock (2 g/100 ml de toluène) dans 100 ml de toluène). La quantification est réalisée par spectrophotométrie à 410 nm, faisant référence à l’équation (y = 0,033x + 0,032) de régression linéaire de la courbe d'étalonnage de trimethylamine (TMA) réalisée pour des concentrations variant de 1 à 29 µg/ml. Le résultat final est exprimé en mg N-TMA/kg de muscle.

Matériels & méthodes

3.2.3.3. Détermination de la teneur en acides gras libres (AGL)

Les acides gras libres sont déterminés par la méthode de Lowry & Tinsley (1976) basée sur la formation d'un complexe coloré entre le groupe acide de l'acide gras et de l'acétate cuprique en présence de pyridine.

 Préparation de l’extrait lipidique

L'extraction de la fraction lipidique est réalisée conformément à la méthode de Bligh & Dyer (1959). 4 g de muscle, 8 ml de méthanol et 4 ml de dichlorométhane sont homogénéisés pendant 30 s avec un homogénéisateur Waring-Blender. Puis, 4ml de dichlorométhane et 4 ml d’eau distillée sont rajoutés et l’homogénat est centrifugé pendant 10 min à 3250 rpm à 4°C, ainsi deux phases et une émulsion intermédiaire se forment.

La phase supérieure aqueuse est séparée et réservée pour réaliser les mesures de fluorescence, la phase organique est récupérée séparément et l’émulsion est ré-extraite avec 4 ml de méthanol, 4 ml de dichlorométhane et 2 ml d’eau distillée. Les deux phases organiques sont récupérés et du sulfate de sodium anhydre est ajouté ; puis une filtration est réalisée. Les tubes centrifuges sont lavés avec 2 ml de dichloromethane qui sont additionnés antérieurement. Finalement, tous les extraits sont ajustés au même volume (15 ml) avec du dichlorométhane et conservés à -30 º C.

 Protocole

Une fraction de 4 ml de l’extrait lipidique est évaporée sous courant d’azote. Puis, 5 ml de toluène et 1 ml d’acétate cuprique à 5 % à un pH de 6,1 (stabilisé avec de la pyridine) sont ajoutés. Le mélange est agité pendant 45 s et centrifugé à 3000 rpm pendant 10 min. L'absorbance de la phase organique est mesurée à 715 nm et la quantification est réalisée au moyen d’une courbe étalon (y = 0,034x + 0,027) réalisée avec de l’acide oléique dans du toluène, pour des concentrations variant de 0,5 à 15 µmole/ml. Le résultat est exprimé en mg acides gras libres/kg de muscle.

Matériels & méthodes

3.2.3.4. Détermination de l’indice de peroxydes

L'indice de peroxydes est déterminé par la méthode de Chapman & MacKay (1949) basée sur l'oxydation du Fe (II) en Fe (III) par les hydroperoxydes présents dans les échantillons, en présence de thiocyanate d'ammonium. Il se forme alors un composé de couleur pourpre.

 Protocole

500 µl d'extrait lipidique sont évaporés sous courant d’azote, puis 200 µl d'hexane, 5 ml d'éthanol à 96% et 100 µl de thiocyanate d'ammonium à 30 % sont ajoutés, homogéneisés et ensuite, additionnés de 100 µl d'une solution ferreuse. Le mélange est agité et après 3 min l'absorbance est mesurée à 500 nm. Pour la quantification, une courbe étalon est préparée avec une solution ferrique FeCl3 x 6H2O, pour des concentrations variant de 0,5 à 10 µg/ml. Les résultats sont exprimés en milliéquivalents (meq) d'oxygène active/kg de lipides, par l’interpolation des valeurs des échantillons à partir de la droite de régression (y = 0,038x + 0,028).

3.2.3.5. Détermination de l’indice de l’acide thiobarbiturique (i-TBA)

Cette analyse est réalisée conformément à la méthode de Vyncke (1970) pour la détermination des substances réactives à l'acide thiobarbiturique.

 Protocole

Un volume de 5 ml de l’extrait d’acide trichloroacétique est ajouté à 5 ml d'une solution d'acide thiobarbiturique à 0,02 M. Le mélange est doucement agité pendant 5 s et plongé dans un bain marie à 97 °C pendant 40 min. Les échantillons sont agités jusqu’à disparition de la turbidité et laissés refroidir à température ambiante. L'absorbance est mesurée à 532 nm et la quantification est réalisée au moyen d'une courbe étalon (y = 0,171x + 0,018) préparée à partir du 1,1,3,3-tetraethoxy-propane (TEP) pour des concentrations allant de 0,1 à 3 (10-8 moles MDA/ml). L'indice de TBA est exprimé en mg malonaldehyde/kg de muscle.

Matériels & méthodes

3.2.3.6. Détermination des composés fluorescents

La formation de métabolites tertiaires de l’oxydation lipidique est déterminée par le spectromètre à fluorescence (Fluorimeter LS 45, Perkin Elmer España, Madrid, Espagne), au moyen de mesures à 393/463 nm et 327/415 nm ; conformément à la méthodologie décrite par Aubourg (2000). La fluorescence relative (RF) est calculée selon la formule :

RF = F/Fst

Où F est la fluorescence mesurée à chaque paire de longueur d’onde d’excitation/émission, et Fst est l'intensité de fluorescence d'une solution de sulfate de quinine (1 µg/ml dans du

H2SO4 à 0,05 M) mesurée aux paires de longueur d’onde correspondantes. Le résultat est exprimé en ratio de fluorescence (RF), qui est défini comme le ratio entre les deux valeurs de la fluorescence relative : RF = RF393/463 nm / RF327/415 nm. La valeur de RF est déterminée sur la phase aqueuse résultante de l'extraction lipidique.

3.2.4. Analyses microbiologiques

Un échantillon de chinchard commun de 10 g de muscle est prélevé aseptiquement et homogénéisé dans des sacs stomacher stériles (AES, Combourg, France) avec 90 ml d’eau peptonnée à 0,1% (Merck, Darmstadt, Allemagne), comme décrit par de précédentes études (Ben-Gigirey et al., 1998 ; 1999). Des séries de dilution des suspensions microbiennes sont réalisées dans une solution d’eau peptonée à 0,1%.

La flore mésophile aérobie totale (FMAT) est dénombrée sur la gélose PCA (plate count agar, Oxoid Ltd., London, UK), ensemencée en masse, aprés incubation à 30 ºC pendant 48 h. La flore psychrotrophe est recherchée sur la gélose PCA, après incubation à 7 - 8 ºC pendant 7 jours. Les Entérobacteries (ENT) sont isolées sur la gélose VRBG (gélose glucosée biliée au cristal violet et au rouge neutre) (Merck, Darmstadt, Allemagne), aprés incubation pendant 24h à 37 ± 0,5 ºC. Les microorganismes à activité protéolytique ou lipolytique sont recherchés sur milieu de culture casein-agar et tributyrine-agar, respectivement, après incubation à 30 ºC pendant 48 h, comme décrit par de précédentes études (Ben-Gigirey et al., 2000).

Toutes les analyses sont réalisées en triplicata et les résultats sont exprimés en log UFC/g.

Matériels & méthodes

4. Etude des activités biologiques de fractions algales enrichies en régulateurs de croissance végétale (PGR) sur une culture de microalgues

4.1. Préparation des fractions algales enrichies en PGR

La préparation de ces fractions est réalisée, selon le protocole détaillé de Gupta et al. (2011), à partir des cinq algues cibles de cette étude.

4.1.1. Extraction

0,2 g de poudre d’algue est transféré dans des tubes micro-centrifuges et mélangé à 2 ml du solvant d’extraction « Bieleski » froid, contenant du méthanol, de l’eau distillée et de l’acide formique dans les proportions suivantes : 15 :4 :1 (v/v/v). Ces tubes sont homogénéisés à haute vitesse puis maintenus toute la nuit à 4 °C, et centrifugés à 5000 rpm pendant 5 min à 4°C. Le surnageant est récupéré, alors que le culot subit une deuxième extraction avec 1 ml de solvant d’extraction pendant 1 heure. Toutes les fractions de surnageant sont mélangées et diluées dans de l’eau distillée (1 : 5, v/v), afin d’être immédiatement purifiées et enrichies par la méthode de la microextraction liquide-liquide dispersive (DLLME) décrite par Lu et al. (2010a).

4.1.2. Prétraitement et enrichissement par la DLLME

Après dilution, 5 ml de l’échantillon sont mélangés à 0,375 g de NaCl avec ajustement du pH à 4. Puis 50 µl de chloroforme (solvant d’extraction) et 1 ml d’acétone (solvant dispersif) sont mélangés et injectés dans les échantillons à l’aide d’une seringue de 2 ml. Les tubes sont ensuite agités pendant 6 s, puis centrifugés à 4500 rpm pendant 3 min. La phase organique qui sédimente au fond du tube (d’environ 25 µl) est récupérée grâce à une seringue HAMILTON de 50 µl et placée dans des contenants en verre hermétiques.

Matériels & méthodes

4.2. Evaluation de l’effet des différentes fractions algales enrichies sur la croissance de la microalgue Nannochloropsis gaditana

La culture de Nannochloropsis gaditana utilisée dans cette étude est obtenue de la collection de souches de microalgues, du laboratoire d'Aquaculture et Bioremédiation

(AQUABIOR), Département de Biotechnologie, Université Oran1. La souche choisie est étudiée en culture axénique.

Des tubes stériles contenant 10 ml de milieu f/2 (Guillard, 1975) stériles sont ensemencés par un inoculum d’une culture mère de microalgue en phase exponentielle, pour une concentration finale de 9.105 cellules/ml. Les fractions enrichies à tester sont évaporées sous courant d’azote et reprises dans de l’éthanol. Elles sont ensuite rajoutées aux cultures à raison de 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,4%, v/v, après filtration à travers un filtre seringue de 0,2 µm.

Les tubes sont incubés à 23 ± 1 °C, pH 8, avec aération par agitation manuelle 2 fois par jour, une intensité lumineuse de 100 µmol/m2 s et avec une photopériode de (12/12 h). L’expérience est menée pendant 5 jours et des témoins négatifs sont préparés contenant de l'éthanol (0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,4%, v/v). Tous les tests sont effectués en triplicata.

La concentration cellulaire est déterminée par la mesure de la densité optique à 750 nm et le comptage des cellules à l’aide d'une cellule de Malassez. Une courbe linéaire entre la densité optique DO750nm et le nombre de cellules/ml est réalisée, et utilisée pour convertir la DO en nombre de cellules/ml de culture.

(750 0,203) [/] = 0,005

Figure 25: Observations microscopiques de Nannochloropsis gaditana.

Matériels & méthodes

4.3. Evaluation de l’effet de la fraction enrichie de C. compressa sur la teneur en lipides et pigments d’une culture de Nannochloropsis gaditana

4.3.1. Conditions de cultures

Les cultures sont réalisées dans des bouteilles d’un litre avec 300 ml de milieu f/2 (Guillard, 1975), ensemencées par un inoculum d’une culture mère de microalgue en phase exponentielle pour une concentration finale de 13.105 cellules/ml dans les mêmes conditions citées précédemment. L’extrait de C. compressa est ajouté aux cultures à la concentration optimale de 0,1%, après filtration à travers un filtre seringue de 0,2 µm. Chaque traitement est réalisé en triplicata.

L'expérience est conduite pendant 11 jours et la densité cellulaire est évaluée quotidiennement par la lecture de l’absorbance à 750 nm, puis la conversion de la DO en nombre de cellules est réalisée à l’aide de la courbe linéaire décrite précédemment.

Pour chaque échantillon, les mesures sont réalisées deux fois et la valeur moyenne est calculée.

Figure 26: Dispositif de culture de Nannochloropsis gaditana en bouteilles.

Matériels & méthodes

4.3.2. Extraction et quantification des lipides

Après la croissance, la biomasse est séparée du milieu par centrifugation à 4000 rpm pendant 10 min, utilisant une centrifugeuse (Sigma 3-30KS) et lyophilisée.

Les lipides totaux sont extraits des cellules de microalgues par la méthode modifiée de Zhu et al. (2002). 0,2 g de poudre d’algue lyophilisée est dissoute dans 3 ml d’un mélange de solvant chloroforme : méthanol (2:1, v/v). Ensuite, les échantillons sont centrifugés à 8000 rpm pendant 10 min et la phase organique est récupérée. La quantification de lipides est réalisée par la méthode d’Herbes & Allen (1983) comme décrite précédemment. Les résultats sont exprimés en g de lipide/100 g d’algue.

4.3.3. Détermination de la concentration en pigments

La concentration en pigments est déterminée selon Henriques et al. (2007). Au préalable une préparation de l’échantillon est nécessaire. Un volume de 2 ml de culture microalgal est prélevé. Les cellules sont centrifugées à 4000 rpm pendant 5 min. Le surnageant est éliminé et les cellules sont resuspendues dans 2 ml d’eau distillée, afin d’éliminer le sel qui pourrait être retenu par la biomasse, et soumis à une nouvelle centrifugation. Cette opération est répétée deux fois.

Ensuite, l’extraction des pigments est réalisée avec 2 ml de méthanol absolue (99,8 %) pendant 24 h, puis une centrifugation est réalisée à 4000 rpm pendant 5 min. L'absorbance du surnageant contenant les pigments dissous est mesurée à différentes longueurs d'ondes (470, 666 et 750 nm). Ces absorbances sont utilisées pour calculer les concentrations de chlorophylle-a et des caroténoïdes totaux, en utilisant les coefficients d’extinction spécifiques, de Lichtenthaler & Wellburn (1983) et Wellburn (1994), dont les équations sont les suivantes :

µg /ml =15,65 x A chlorophylle milieu 666 µg / ml = ((1000 x A – 44,76 x A ) / 221) caroténoïdes totaux milieu 470 666

Axxx correspond à l’absorbance à XXX nm, après soustraction de l’absorbance de l’échantillon à 750 nm, contre un blanc constitué du solvant utilisé.

Matériels & méthodes

4.4. Caractérisation par LC-TIMS-TOF MS de la fraction de C. compressa

L’analyse est réalisée par l’unité de spectrométrie de masse du centre CACTI (Centre de Soutien à la Recherche Scientifique et Technologique), à l’Université de Vigo, ESPAGNE.

La chromatographie est effectuée sur un appareil HPLC de type Bruker ELUTE, couplée à à la spectrométrie à mobilité ionique et à l’analyse de masse par temps de vol (TIMS-TOF MS). Le volume d’injection est de 5 µl sur une colonne de type Bruker Intensity Trio C18 (1,9 µm, 2,6x100 mm); la température de colonne est de 40 °C. Le run time est de 40 min et le flux est de 0,3 ml/min. Le programme du gradient d’élution utilisé est repris au tableau 03.

Tableau 03: Programme du gradient d’élution (HPLC).

Temps (min) Solution A (%) Solution B (%)

100% H2O avec 0,1% acide 100% ACN avec 0,1% acide formique formique 0 40 60 5 40 60 30 0 100 35 0 100 36 40 60 40 40 60

Les mesures sont réalisées sur un spectromètre de masse TIMS-TOF-MS (Bruker Daltonics Inc, Billerica, MA) équipé d’une source d’ionisation à éléctro-nébulisateur (ESI) (Bruker Daltonics Inc, Billerica, MA).

La détection en mode négatif est effectuée dans les conditions suivantes : voltage du capillaire 3000 V ; énergie de collision 7,0 eV ; énergie d’ion 4,0 eV ; température de désolvatation 300°C ; Flux du gaz sec 6 L/min et pression de nébulisation 2,0 bar.

Ainsi qu’en mode de détection positive, selon les paramètres suivants : voltage du capillaire 4500 V ; énergie de collision 7,0 eV ; énergie d’ion 4,0 eV ; Température de désolvatation 220ºC, Flux du gaz sec 8 L/min et pression de nébulisation 2,0 bar.

Dans les deux modes, les spectres MS sont enregistrés de 50 à 1300 m/z. Le logiciel servant à piloter les appareils et à quantifier les résultats est Bruker Compass Data Analysis 4.4 (Bruker Daltonics Inc, Billerica, MA).

Matériels & méthodes

L’identification des constituants de la fraction est réalisée par comparaison des propriétés spectrales (profil de fragmentation du spectre MS, formule brute et masse mono-isotopique) des composés élués avec les données de la littérature et en les comparant avec ceux des banques de spectres telle que le MetFrag.

5. Analyse statistique

Toutes les analyses sont réalisées en triplicata.

Le traitement statistique est réalisé à l’aide du logiciel STATISTICA 6.

Dans tout les cas, les statistiques descriptives (moyennes ± écarts types) sont utilisées pour décrire l’ensemble des résultats.

Les résultats sont statistiquement interprétés par l’analyse de la variance (test paramétrique Anova 1) et la différence entre les moyennes est déterminée par le test de Tukey (P<0,05).

Dans le deuxième chapitre de cette thèse, une analyse factorielle des correspondances (AFC) est réalisée afin de déterminer la relation qualitative entre les paramètres d’étude de l’activité antioxydante et les espèces d'algues, suivie d’une classification ascendante hiérarchique pour la discrimination des grands ensembles homogènes. L’ensemble de ces analyses sont réalisées à l’aide du logiciel R version 3.4.2.

RESULTATS & DISCUSSION

Résultats & discussion

1. Composition proximale et minérale des algues collectées 1.1. Caractérisation chimique La composition chimique des cinq espèces d’algues: C. compressa, C. stricta, C. elongata, E. compressa et U. lactuca, appartenant aux trois groupes de macroalgues est présentée dans le tableau 04.

1.1.1. Teneur en humidité D’après le tableau 04, les résultats obtenus démontrent une variation quantitative de l’humidité entre 84% MF chez Cystoseira compressa et 47,05% MF chez Corallina elongata (p<0,05). Ces valeurs correspondent bien à ceux rapportés dans la littérature, chez Cystoseira abies-marina (83,80%) (Phaeophyta: Sargassaceae) (Patarra et al., 2011), Ulva reticulata (75,33%), Ulva lactuca (79,60%) (Chlorophyta: Ulvaceae) (Shanmugam & Palpandi, 2010; Marsham et al., 2007) et Jania rubens (44,55%) (Rhodophyta: Corallinaceae) (Polat & Ozogul, 2009).

Des taux plus faibles sont rapportés chez l’algue rouge Corallina officinalis (31,50%) et les algues brunes C. compressa (69,70%), C. barbata (62,27%) et C. corniculata (68,39 et 70,46%) (Ozgun & Turan, 2015 ; Polat & Ozogul, 2009) et plus importants chez les algues vertes E. clathrata (87,22%) (Kasimala et al., 2017) et U. lactuca (84%, 87,40% et 85,05%) (Wong & cheung, 2000 ; Ortiz et al., 2006 ; Yaich et al., 2011).

En effet, les algues proviennent d’un milieu marin et sont immergées dans de l’eau durant tout leur cycle de vie, c’est ce qui explique leur contenu élevé en humidité, à l’exception des algues à thalle calcifié, à faible taux d’humidité, telles que les espèces appartenant à la famille des Corallinaceae.

Concernant les espèces d’algues vertes et brunes, la différence notée pour le contenu hydrique peut s’expliquer par la profondeur à laquelle se situe les algues. Il a été admis que la composition pigmentaire des algues soit la cause de leur répartition altitudinale. Les algues vertes riches en chlorophylles sont limitées aux zones peu profondes, tandis que les algues brunes riches en caroténoïdes sont localisées plus profondément. De plus, les algues vertes situées au niveau de l’étage supralittoral sont sujettes à des périodes d’émersion et de dessiccation, ce qui est très rare chez les algues brunes (Zitouni et al., 2014).

Résultats & discussion

Tableau 04: Composition proximale des échantillons d’algues brunes, rouges et vertes collectés des côtes Ouest algérienne*.

Composition** Algues brunes Algues rouges Algues vertes

C. compressa C. stricta C. elongata E. compressa U. lactuca

Humidité (état frais) 84,00 ± 0,00 a 80,25 ± 0,01 b 47,05 ± 0,02 e 71,91 ± 0,15 d 74,94 ± 0,52 c

Humidité (état sec) 17,61 ± 0,17 b 23,09 ± 0,20 a 3,69 ± 0,24 e 12,91 ± 0,15 d 16,53 ± 0,16 c

Cendres 32,04 ± 0,42 b 24,61 ± 0,17 d 76,42 ± 0,22 a 26,36 ± 0,28 c 27,13 ± 0,35 c

Protéines 8,91 ± 0,84 b 14,14 ± 0,03 a 5,85 ± 0,06 c 13,61 ± 0,67 a 12,54 ± 0,07 a

Carbohydrates 56,84 ± 0,20 b 57,73± 0,15 ab 17,07 ± 0,13 c 58,87 ± 0,34 a 59,15 ± 0,43 a

Lipides 2,22 ± 0,22 b 3,52 ± 0,01 a 0,66 ± 0,03 d 1,15 ± 0,02 c 1,18 ± 0,01 c

* Moyenne ± Ecart-type (n = 3). Sur chaque ligne, les valeurs moyennes marquées de lettres différentes (a-e) indiquent des différences significatives (test de Tukey, P<0,05). ** Toutes les données sont exprimées en g/100g de matière sèche, sauf l’humidité à l’état frais (g/100g de matière fraiche).

Résultats & discussion

1.1.2. Teneur en matières minérales Le taux de cendres qui est la teneur en matière minérale représente la proportion majeur chez l'algue C. elongata (76,42% MS; p<0,05) (Tableau 04). Cette valeur est proche de celles rapportées chez Corallina officinalis (77,80%) (Marsham et al., 2007) et chez une autre Corallinale J. rubens (80,73%) (Polat & Ozogul, 2009). Ce résultat est expliqué encore une fois par la caractéristique principale de la famille des Corallinaceae, algues calcaireuses et calcifiées.

Dans cette étude, la teneur en cendres des algues brunes et vertes varie entre 24,61% MS (C. stricta) et 32,04% MS (C. compressa) (Tableau 04). Ces valeurs correspondent à celles rapportées par la littérature pour certaines espèces : Cystoseira corniculata (28,97%) (Polat & Ozogul, 2009), C. tamariscifolia (23,85%) (Vizetto-Duarte, 2016), C. trinodis (33,64%) (Mwalugha et al., 2015); U. lactuca (24,60% et 29%) (Rajeswary & Sivasurbramaniam, 1984; Behairy & El-Sayed, 1983), E. compressa (26%) (Lahaye & Jegou, 1992) et E.intestinalis (25,6%) (Robert, 1984). Néanmoins, elles sont considérablement plus élevées que celles rapportées par d’autres auteurs particulièrement pour les espèces d’algues vertes : U. lactuca (19,6% et 11%) (Yaich et al., 2011 ; Ortiz et al., 2006) et Enteromorpha (18,6%) (Wong & cheung, 2000).

La différence peut être expliquée par le fait que le contenu minéral des algues varie en fonction de plusieurs facteurs : espèce, localisation géographique, saison, variations environnementales et physiologiques et procédure de minéralisation (Mabeau & Fleurence, 1993 ; Kaehler & Kennish, 1996 ; Sanchez-Machado et al., 2004 ; Siddique et al., 2013).

Les teneurs en minéraux obtenues avec ces algues constituent un facteur intéressant pour combler les carences en minéraux de certains régimes alimentaires tant humain qu’animal.

1.1.3. Teneur en protéines totales Des teneurs en protéines brutes du tableau 04 ressort que l’algue rouge C. elongata montre la teneur la plus faible (5,85% MS; p<0,05) comme chez C. officinalis (5,91% et 6,90%) (Ismail, 2016 ; Marsham et al., 2007) et J. rubens (7,20%) (Polat & Ozogul, 2009). Par contre, les concentrations sont considérablement élevées chez C. stricta (14,14%), suivie des algues vertes E. compressa (13,61% MS) et U. lactuca (12,54% MS).

Les valeurs enregistrées rejoignent les données de la littérature. En effet, d’après Ganesan & Kannan (1994) et Anitha et al. (2008), la fraction protéique des macroalgues brunes est

Résultats & discussion significativement élevée. En revanche, d’après Fleurence (1999), généralement, les algues brunes contiennent moins de protéines (3–15% MS) que les algues vertes (9-26% MS).

Des résultats similaires sont enregistrés chez les algues brunes et vertes : Cystoseira myrica (8,16%) (Mwalugha et al., 2015), C. nodicaulis (9,20%), C. humilis (10,34%), C. tamariscifolia (12,52%) (Vizetto-Duarte, 2016) ; E. clathrata (13,64%) (Kasimala et al., 2017), U. lactuca (15,30%) des côtes Est algérienne (Zitouni et al., 2014) et le contenu d’E. compressa (U. compressa) est similaire à ceux publiés par d’autres auteurs pour la même espèce (3-14%) (Dere et al., 2003 ; McDermid & Stuercke 2003 ; Aguilera-Morales et al., 2005 ; Renaud & Luong-Van, 2006 ; Patarra et al., 2011).

Toutefois, il est aussi rapporté des valeurs plus faibles pour ces espèces : C. abies-marina (6,81%), C. barbata (5,31%), C. corniculata (4,37%), C. compressa (2,89%) (Ozgun & turan, 2015); U. lactuca (7,06% et 8,46%) (Wong & cheung, 2000 ; Yaich et al., 2011) et plus élevées seulement chez E. compressa (26,62%) (Patarra et al., 2011).

Les variations de la teneur en protéines peuvent être proportionnelles aux valeurs de températures, aux saisons ou bien dû à leur consommation par l’algue pendant la croissance et la reproduction. Ils peuvent être aussi liés à la différence entre les espèces, la localisation géographique et les conditions environnementales (Fleurence, 1999 ; Ismail, 2016).

Tenant compte des résultats, les algues étudiées : C. stricta, E. compressa et U. lactuca représentent une source protéique excellente (complément nutritif). Sachant que la plupart des algues contiennent tous les acides aminés essentiels, par exemple : chez Enteromorpha ssp, 9 des 10 acides aminés essentiels pour les vertébrés sont détectés en teneurs plus élevées comparativement à un poids équivalent en soja (Aguilera-Morales et al., 2005). Et de très importantes protéines bioactives peuvent être extraites des macroalgues, telles que les lectines qui se complexent aux carbohydrates et participent à plusieurs processus biologiques tels que les communications intercellulaires. Ils ont aussi des activités antibactériennes, antivirales et anti-inflammatoires (Cunningham & Joshi, 2010).

1.1.4. Teneur en carbohydrates Les carbohydrates sont considérés comme les composés biochimiques les plus importants chez les algues, puisqu'ils représentent la principale source d’énergie pour les voies métaboliques.

Résultats & discussion

Les résultats de l’analyse des carbohydrates totaux des échantillons sont représentés par le tableau 04. Globalement, les carbohydrates sont la fraction la plus abondante dans toutes les algues étudiées. Les contenus en carbohydrates des algues vertes U. lactuca (59,15% MS) et E. compressa (58,87% MS) sont les plus élevés, suivie des algues brunes; par contre C. elongata enregistre la valeur la plus faible (17,07%) (p<0,05).

De précédentes études ont relevé des teneurs comparables, chez des espèces de chlorophycées (43,40 - 60,20%) (Mamatha et al., 2007), chez U. lactuca (61,50%) (Ortiz et al., 2006), C. tamariscifolia (54,06%) et C. barbata (57,52%) (Vizetto-Duarte, 2016).

Toutefois, la teneur en carbohydrates d’U. lactuca est beaucoup plus élevée que celle rapportée par Wong & Cheung (2000) (14,60%), il est de même chez E. compressa 48,20% (Mamatha et al., 2007) et E. flexuosa 39,90% (McDermid et al., 2007), ainsi que Corallina officinalis (27,98%) (Ismail, 2016) et C. compressa (73,09%) (Vizetto-Duarte, 2016).

En accord avec Kasimala et al. (2017), la concentration en carbohydrates est plus élevée chez les algues vertes, suivie des algues brunes et rouges. Ceci est probablement dû au fait que les espèces de chlorophycées poussent en eau peu profonde, sous une forte exposition au soleil, ceci leur permet de synthétiser plus de carbohydrates par photosynthèse.

1.1.5. Teneur en lipides En accord avec Gosch et al. (2012), les algues brunes (Phaeophyta) enregistrent les plus hautes valeurs en lipides totaux, suivie des algues vertes (Chlorophyta) et les algues rouges (Rhodophyta).

Dans la présente étude, le taux de lipides des algues brunes est significativement élevé (p<0,05), chez C. compressa et C. stricta (2,22% et 3,52% MS; respectivement) (Tableau 04). Ce qui correspond à l’intervalle de la teneur en lipides rapportée pour les algues brunes (1-4,5% MS) (Dawczynski et al., 2007) et est comparable à ceux d’autres espèces du même genres et de quelques algues brunes (Mwalugha et al., 2015 ; Zitouni, 2015 ; Ismail, 2016).

Les teneurs en lipides (1,15% et 1;18%MS, respectivement) enregistrées chez U. lactuca et E. compressa correspondent à l’intervalle donné pour la famille des Ulvaceae (0,7–5,1% MS) (Wielgosz-Collin et al., 2016) et est en accord avec ceux de Manivannan et al. (2008) ; Kumari et al. (2013) ; Zitouni et al. (2014) (côtes Est algérienne) et Kasimala et al. (2017). Par contre, chez U. lactuca, ce taux est différent de ceux de Wong & Cheung (2000) (1,64%), Ortiz et al. (2006) (0,3%) et Yaich et al. (2011) (7,9%).

Résultats & discussion

Quand à C. elongata appartenant à la famille des Corallinaceae a significativement le plus faible taux de lipides (0,66%) (p<0,05), ceci est également rapporté chez C. officinalis (0,3%) et une autre corallinale J. rubens (0,12%) (Polat & Ozogul, 2009) et correspond à l’intervalle donné pour la famille des Corallinaceae (0,1–2,3% MS) (Wielgosz-Collin et al., 2016).

En général, les algues présentent une quantité relativement faible en lipides (1–5% de matière sèche) et varie beaucoup entre espèces (Burtin, 2003 ; Polat & Ozogul, 2008). Elles ne sont pas une source d’énergie conventionnelle, mais leurs acides gras polyinsaturés, peuvent être aussi élevés que ceux des végétaux terrestres (Darcy Vrillon, 1993).

1.2. Composition de la fraction lipidique des algues Les lipides sont divisés en deux groupes selon leurs fonctions dans les cellules algales: les lipides neutres et les lipides polaires (glycolipides et phospholipides) (MacDougall et al., 2011), et consistent en acides gras essentiels et fractions lipidiques fonctionnelles, nommés les acides gras oméga-3, les phytostérols et les vitamines liposolubles.

1.2.1. Teneur en phospholipides Les phospholipides (PL) représentent 10-20% des lipides totaux chez les macroalgues (Dembitsky & Rozentsvet, 1996 ; Kumari et al., 2013). D’après les résultats de l’analyse des PL dans les échantillons, représentées dans le tableau 05, le contenu en PL varie entre 5,44% (U. lactuca) et 19,16% LT (C. stricta) (p<0,05). Ces valeurs correspondent à ceux enregistrées chez Fucus vesiculosus, Ascophyllum nodosum (4,70%) et Fucus serratus (2,70%) (Le Tutour et al., 1998), Ulva armoricana (15,30%) et Solieria chordalis (23,70%) (Kendel et al., 2015).

De plus, chez l’algue rouge comestible Grateloupia turuturu, les PL représentent 22% (de lipides totaux), la valeur la plus élevée étant enregistrée en été (33%) et la plus faible en hiver (11%). Ceci peut être dû à l’utilisation des lipides de réserve (lipides neutres) pour la croissance des thalles pendant l’été (Kendel et al., 2013).

Résultats & discussion

Tableau 05: Teneurs* en phospholipides, stérols et tocophérols de différentes algues brunes, rouge et vertes collectés des côtes Ouest algérienne**.

Algues brunes Algues rouges Algues vertes

C. compressa C. stricta C. elongata E. compressa U. lactuca

Phospholipides totaux 14,07 ± 0,10 b 19,16 ± 0,55 a 8,37 ± 0,39 c 8,29 ± 1,20 c 5,44 ± 0,05 d

Stérols totaux 13,59 ± 0,72 b 13,62 ± 0,04 b 10,43 ± 0,55 c 16,19 ± 0,43 a 10,08 ± 0,17 c

α-tocophérol 266,36 ± 34,12 a 113,99 ± 5,04 b 259,21 ± 9,00 a 410,69 ± 107,22 a 291,02 ± 0,11 a

β-tocophérol nd** Nd nd nd nd

γ-tocophérol 13,64 ± 19,29 a Nd nd nd 26,40 ± 37,34 a

δ-tocophérol 267,67 ± 101,28 b Nd nd 278,41 ± 24,29 b 1916,29 ± 200,59 a

* Moyenne ± Ecart-type (n = 3). Sur chaque ligne, les valeurs moyennes marquées de lettres différentes (a-d) indiquent des différences significatives (test de Tukey, P<0,05). Les teneurs en phospholipides et stérols sont exprimées en g/100g de lipides totaux. La teneur en composés tocophérols est exprimée en mg/kg de matière sèche. ** nd: non détecté

Résultats & discussion

Les phospholipides d'origine marine ont la particularité d’être plus résistants à l’oxydation (rancidité) et présentent une grande quantité d’acides gras tels que l’EPA et le DHA. Cette caractéristique fournit une meilleure biodisponibilité et une gamme d’effets bénéfiques sur la santé pour l’homme et les animaux (Holdt & Kraan, 2011).

1.2.2. Teneur en stérols Il ressort du tableau 05, que les teneurs en stérols varient de 10,08 à 16,19% LT. La teneur la plus importante est observée chez E. compressa (Chlorophyceae) (p<0,05), suivie de C. stricta (13,62% LT) et C. compressa (13,59% LT) (Pheaophyceae).

Alors qu’il est rapporté chez C. abies-marina 5,40%, G. turuturu 46,90%, S. chordalis 53% et U. armoricana 68,50% de stérols dans la fraction insaponifiable (Moreno et al., 1998 ; Kendel et al., 2015).

Le cholestérol est présent à raison de 2 à 76% des stérols totaux chez les macroalgues vertes et brunes et en teneur plus importante chez les algues rouges (Gancheva et al., 2003). En effet, le cholestérol est le stérol dominant chez toutes les Rhodophytes, le fucostérol chez les Phéophytes, par contre le stérol dominant a tendance à varier entre les ordres parmis les chlorophytes tels que l’iso-fucostérol chez les Ulvales et le clionastérol chez les Bryopsidales et les Siphonocladales (Kendel et al., 2013).

D’après la littérature, il est à signaler que les algues appartenant au genre Cystoseira sont très riches en stérols (Shalaby, 2011). Ces phytostérols ont beaucoup d’effets bénéfiques notamment l’inhibition de l’absorption du cholesterol et des activités anti-cancer, antioxydantes, antidiabétiques, anti-inflammatoires, antibactériennes, antifongiques et anti- ulcératives (Lee et al., 2003 ; Plaza et al., 2008 ; Balboa et al., 2013).

1.2.3. Teneur en tocophérols La vitamine E est la plus abondante des vitamines liposolubles chez les algues (MacArtain et al., 2007). Le tableau 05 reprend les teneurs en tocophérols (exprimées en mg/kg) qui s’avèrent très variables chez les échantillons analysés.

Les algues vertes ont enregistré les teneurs les plus élevées en tocophérols, comparativement aux algues brunes et rouges. Pourtant en général, les algues brunes enregistrent des taux importants de tocophérols, spécialement Fucus et Ascophyllum (Burtin,

Résultats & discussion

2003). Parmi les isomères de tocophérols, le β-tocophérol n’a pas été détecté. C. compressa et U. lactuca contiennent de l'α-, γ - et δ-tocophérol, E. compressa contient de α- et δ- tocophérol. Alors que, C. stricta et C. elongata contiennent seulement de l’α-tocophérol. Des variations similaires sont observées par Sabeena Farvin & Jacobsen (2013). En effet, Dictyota dichotoma (phaeophyceae), U. lactuca et E. intestinalis (chlorophyceae) contiennent de α-, γ - et δ-tocophérol, alors que Saccharina latissima (phaeophyceae), Chondrus crispus et Porphyra purpurea (rhodophyceae) contiennent uniquement de l’α-tocophérol.

La teneur en α-tocophérol la plus élevée est notée chez E. compressa (410,7 mg/kg) (p 0,05), et l’γ - et δ-tocophérol sont significativement abondants chez U. lactuca (26,40 et 1916,29 mg/kg, respectivement). Les données indiquent une très grande quantité d’α- tocophérol chez les algues étudiées par rapport à d’autres rapportées chez d’autres espèces par Sánchez-Machado et al. (2002) et Ortiz et al. (2006) (Laminaria ochroleuca, 8,9 mg/kg ; Himanthalia elongata, 12,0-33,3 mg/kg ; U. lactuca, 9,3 mg/kg).

En revanche, la différence entre les deux espèces de cystoseires en contenu d’α-tocophérol est aussi montrée chez Cystoseira barbata, qui contient une concentration significativement élevée d’α-tocophérol par rapport à Cystoseira crinita, alorqu’il appartienent au même genre (Panayotova et al., 2013).

De plus, Ortiz et al. (2006) rapportent des teneurs comparables en tocophérols, chez l’algue brune D. antarctica, l'δ-tocophérol (245,9 ± 3,7 mg/kg), l'α-tocophérol (179,4 ± 12,1 mg/kg) et l'γ-tocophérol en faible quantité sont déterminés dans les frondes, et seulement de l’α-tocophérol (258.0 ± 7.2 mg/kg) est déterminé dans le stipe.

Par ailleurs, la concentration des vitamines chez les algues dépend aussi de l’exposition au soleil (MacArtain et al., 2007).

La vitamine E est impliquée dans le système de défense antioxydatif (Gregory, 1996). Il est également montré que l’α- et l'γ-tocophérols augmentent la production de monoxyde d’azote et l’activité du monoxyde d’azote synthase et ils jouent également un rôle important dans la prévention des maladies cardiovasculaires (Hamid et al., 2015).

Résultats & discussion

1.2.4. Profils en acides gras Le tableau 06 illustre les pourcentages en acides gras totaux (exprimés en % de lipides totaux), ainsi que les résultats de la composition en acides gras des algues (exprimés en % des acides gras totaux).

Un ensemble de 18 acides gras est détecté et quantifié par GC-FID. L’acide palmitique (C16:0) représente la proportion la plus importante des AGS, mais aussi de tous ces profils lipidiques. Il varie de 28,69% chez C. stricta à 50,47% AGT chez E. compressa (tableau 06). Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par Polat & Ozogul (2009), Shanmugam & Palpandi (2010) et Vizetto-Duarte et al. (2015). Il est connu qu’une importante consommation de l’acide palmitique augmente le taux de cholestérol, néanmoins cette effet peut être contre balancer par une proportion élevée de l’acide linoléique (AL) (Clandinin et al., 2000).

Les AGMI les plus abondants sont l’acide palmitoléique (C16:1 n-7), l’acide oléique (C18:1 n-9) et son isomère l’acide vaccinique (C18:1 n-7) et varient entre espèces. Chez les algues brunes et rouges, l’AGMI majoritaire est l’acide oléique, avec le pourcentage le plus élevé de 9,38% chez C. stricta. Vizetto-Duarte et al. (2015) rapporte aussi l’acide oléique comme le principale AGMI chez les algues brunes et enregistre 9 et 17% chez C. tamariscifolia et C. compressa, respectivement. L’acide vaccinique (AV) représente la proportion la plus importante du groupe des AGMI chez les algues vertes étudiées (de 23,05 à 29,02%), un taux d’AV similaire de 17,3% est enregistré chez Ulva armoricana (Kendel et al., 2015), alors qu’il n’a pas été identifié chez U. lactuca (Ortiz et al., 2006).

L’acide vaccinique ne figure que sur quelques profils d’AG d’algues comme chez E. intestinalis (6,2%), Colpomenia sinuosa (0,4%), Gracilaria cortica (0,7%) et Hypnea valentiae (3,1%) (Rohani-Ghadikolari et al., 2012), l’algue brune Durvillaea antarctica (0,85- 1,43%, Ortiz et al., 2006) et les algues rouges Grateloupia turuturu (3,2%, Kendel et al., 2013) et Solieria chordalis (4%, Kendel et al., 2015). De récentes études suggèrent que la consommation d’AV est associée à divers effets bénéfiques sur la santé, en relation avec les maladies cardiovasculaires, le cancer, les fonctions immunitaires et les inflammations (Field et al., 2009).

Résultats & discussion

Tableau 06: Composition en acides gras des différentes algues brunes, rouges et vertes collectés des côtes Ouest algérienne*.

Algues brunes Algues rouges Algues vertes

C. compressa C. stricta C. elongata E. compressa U. lactuca

Acides gras

Acide myristique C14:0 6,11 ± 0,62 b 7,49 ± 0,02 a 4,70 ± 0,09 c 1,01 ± 0,05 d 1,07 ± 0,02 d

Acide pentadécylique C15:0 1,10 ± 0,17 bc 1,38 ± 0,01 ab 1,68 ± 0,02 a 1,10 ± 0,02 bc 0,79 ± 0,04 c

Acide palmitique C16:0 48,34 ± 0,67 b 28,70 ± 0,74 e 40,17 ± 0,16 d 50,48 ± 0,42 a 44,93 ± 0,07 c

Acide margarique C17:0 1,33 ± 0,08 a 1,57 ± 0,05 a 0,88 ± 0,08 b 0,42 ± 0,15 c 0,32 ± 0,02 c

Acide stéarique C18:0 2,53 ± 0,00 b 5,52 ± 0,11 a 2,21 ± 0,08 b 1,19 ± 0,13 c 1,37 ± 0,02 c

Acide palmitoléique C16:1 (n-7) 6,66 ± 0,11 b 8,26 ± 0,23 a 3,05 ± 0,07 c 2,14 ± 0,01 d 3,08 ± 0,07 c

Acide Vaccénique C18:1 (n-7) 5,59 ± 0,03 d 6,26 ± 0,14 c 3,45 ± 0,06 e 23,05 ± 0,08 b 29,02 ± 0,16 a

Acide oléique C18:1 (n-9) 7,69 ± 0,25 b 9,39 ± 0,12 a 7,40 ± 0,12 b 2,08 ± 0,10 d 4,79 ± 0,01 c

Acide éicosénoïque C20:1 (n-9) 0,18 ± 0,25 c 0,98 ± 0,06 ab 1,26 ± 0,13 a 0,25 ± 0,00bc 0,22 ± 0,31 c

Acide cétoléique C22:1 (n-11) 0,69 ± 0,65 a 1,18 ± 0,42 a 2,11 ± 0,64 a 0,51 ± 0,55 a nd**

Acide nervonique C24:1 (n-9) 0,15 ± 0,22 b 3,25 ± 0,02 a 0,78 ± 0,06 b 0,28 ± 0,39 b 0,38 ± 0,41 b

Acide linoléique C18:2 (n-6) 4,66 ± 0,15 b 3,47 ± 0,18 c 2,35 ± 0,09 d 8,69 ± 0,01 a 5,12 ± 0,10 b

Acide eicosadiénoïque C20:2 (n-6) 0,60 ± 0,21 ab 1,12 ± 0,32 a 1,09 ± 0,04 a 0,10 ± 0,15 b nd**

Acide arachidonique C20:4 (n-6) 8,72 ± 0,65 b 12,60 ± 0,00 a 11,95 ± 0,14 a 3,58 ± 0,02 c 1,35 ± 0,10 d

Acide eicosapentaénoïque C20:5 (n-3) 3,62 ± 0,04 c 6,37 ± 0,03 b 15,82 ± 0,16 a 1,63 ± 0,15 d 1,59 ± 0,12 d

Acide docosatétraénoïque C22:4 (n-6) 0,86 ± 0,33 b 0,51 ± 0,24 b 0,33 ± 0,10 b 1,76 ± 0,08 a 0,41 ± 0,01 b

Acide docosapentaénoïque C22:5 (n-3) 0,17 ± 0,23 c 0,62 ± 0,28bc 0,19 ± 0,26 c 1,36 ± 0,05 b 5,39 ± 0,22 a

Acide docosahexaénoïque C22:6 (n-3) 0,99 ± 0,02 ab 1,33 ± 0,01 a 0,60 ± 0,10 bc 0,37 ± 0,01 cd 0,15 ± 0,21 d

EMAG totaux (mg/g matière sèche) 2,61 ± 0,09 b 4,54 ± 0,07 a 0,88 ± 0,01 e 1,73 ± 0,01 d 1,83 ± 0,02 c

EMAG totaux (g/100g lipides totaux) 11,76 ± 0,50 c 12,89 ± 0,23 b 13,39 ± 0,14 b 15,02 ± 0,03 a 15,49 ± 0,02 a

* Moyenne ± Ecart-type (n = 3). Sur chaque ligne, les valeurs moyennes marquées de lettres différentes (a-e) indiquent des différences significatives (test de Tukey, P<0,05). La teneur en acides gras est exprimée en pourcentage des acides gras totaux. ** nd: non détecté

Résultats & discussion

Parmi le groupe des AGPI, le plus abondant est l’acide arachidonique (AA, C20:4 n-6) chez les algues brunes, ce résultat est en accord avec de précédentes études (Khotimchenko et al., 2002). De plus, l’acide arachidonique peut avoir un rôle pro-in ammatoire, de récente études ont montré que la supplémentation de l’AA peut contribuer à réduire le risque de maladies coronariennes et peut être bénéfique pour le développement du système nerveux central (Vizetto-Duarte et al., 2015). L’acide linoléique (AL, C18:2 n-6) est l’AGPI majeur chez les algues vertes, avec un taux le plus élevé chez E. compressa (8,69%). En effet, selon Aguilera-Morales et al. (2005), chez Enteromorpha spp. l’acide gras C18:2 n-6 constitue l’AGPI majeur et varie entre 6,9% et 9,1%. L’acide linoléique constitue avec l’acide oléique des composés antibactériens et peuvent aider à réduire le risque de maladies du cœur par l’augmentation du taux de lipoprotéines de haute densité (McGaw et al., 2002).

L’acide docopentaénoique (DPA) est présent en grande proportion chez U. lactuca (5,39%). En effet, le DPA est généralement présent en taux très faible (<1%). Néanmoins, Padina pavonica et D. dichotoma présentent 4% de DPA (Tabarsa et al., 2012) et Agarum clathratum 11% de DPA (Kelly et al., 2008). L’acide docopentaénoique a montré aussi des effets bénéfiques, tels que l’inhibition de l’agrégation des plaquettes et une puissante capacité de migration des cellules endothéliales (Kaur et al., 2011).

De plus, l’algue rouge C. elongata peut être une bonne source d’acide eicosapentaénoique (EPA; C20: 5 n-3) (15,82%), ainsi que l’algue brune C. stricta (6,37%). En effet, Denis et al. (2010) ont trouvé que l’EPA est le majeur AGPI chez l’algue rouge Grateloupia turuturu. De plus, Gosch et al. (2012) ont rapporté aussi que le C20:5 (n-3) est l’AGPI essentiel le plus dominant chez l’algue rouge Champia parvula. L’AGPI n-3, comme l’EPA entre en compétition avec la conversion de AL en AA, régulant ainsi la teneur relative en AGPI n-3 et n-6 (Calder, 2012). L’EPA présente également des applications bénéfiques potentielles : asthme, psoriasis, arthrite rhumatoide, antibiotique, maladies intestinales in ammatoires, dépression, allergies, maladies cardiovasculaire et traitement du cancer et autres (Calder, 2010).

Le pourcentage d’AGPI essentiel l’acide docosahexaenoic est trés faible, avec la teneur plus élevée chez les algues brunes. En effet, le DHA est généralement absent ou présent à de trés faibles taux chez différentes phéophycées, y compris C. nodicaulis, C. tamariscifolia et C. usneoides (Pereira et al., 2012 ; Silva et al., 2013).

Le contenu en acides gras totaux (AGT) est aussi rapporté sur le tableau 06 et en accord avec Gosch et al. (2012), il existe une corrélation positive entre le taux de lipides totaux et les

Résultats & discussion

AGT, mesurés comme des esters méthyliques d’acides gras (EMAG) (mg/g MS). Néanmoins, cette tendance est plus prononcée chez les algues brunes comparativement aux algues vertes et rouges. En effet, C. compressa et C. stricta (Phaeophyta) ont montré les pourcentages les plus élevés d’EMAG (2,61-4,54 mg/g MS, respectivement) et de lipides totaux (2,22-3,52% MS, respectivement). Néanmoins, la proportion d’acides gras par rapport aux lipides totaux (g/100g) diminue remarquablement avec le contenu en lipides totaux (Gosch et al., 2012). En effet, dans la présente étude, C. elongata (Rhodophyta), E. compressa et U. lactuca (Chlorophyta) ont montré les taux d’EMAG les plus élevés (13,39, 15,02 et 15,49% LT, respectivement) et les taux de lipides les plus faibles (0,66-1,18% MS.). De plus, la concentration d’EMAG totaux varie de 0,88 chez C. elongata à 4,54 mg/g MS chez C. stricta (Tableau 06). Silva et al. (2013) ont rapporté chez Cystoseira nodicaulis et Cystoseira tamariscifolia des teneurs de 1,9 et 0,8 mg/g MS, respectivement. En revanche, Vizetto- Duarte et al. (2015) ont enregistré des valeurs plus élevées de 6,7-9,4 mg/g MS chez les algues du genre Cystoseira.

Concernant l’analyse des groupes d’acides gras (Figure 27), les AGS sont les plus abondants et varient de 44,64% chez C. stricta à 59,40% AGT chez C. compressa, contre une proportion de MUFA qui varie entre 18,03% chez C. elongata et 37,49% chez U. lactuca. Alors que la proportion en acides gras polyinsaturés (AGPI) varie entre 14,02% chez U. lactuca et 32,34% chez C. elongata. En générale, les AGS et les AGMI prédominent dans les profils lipidiques, alors que la proportion en AGPI est faible chez toutes les algues, à l’exception de C. elongata. Le ratio AGPI/AGS enregistré varie de 0,28 chez U. lactuca à 0,65 chez C. elongata. D’après le département de santé britannique qui recommande un ratio moyen AGPI/AGS de 0,45 ou plus (HMSO, 1994), seulement C. elongata et C. stricta présente un ratio favorable. Simopolous et al. (2000) rapporte que plusieurs études trouvent une corrélation inverse entre ratio AGPI/AGS et maladies cardiovasculaires et suggère que le remplacement des AGS par des AGPI dans le régime alimentaire diminuera les problèmes de santé.

Résultats & discussion

(%) a C. compressa 60 b c C. stricta c 50 d C. elongata a E. compressa 40 a b U. lactuca 30 b b c d c 20 c d 10

Distribution des classes d'AGDistribution 0 ∑AGS (%) ∑AGMI (%) ∑AGPI (%)

Figure 27: Distribution des groupes d’acides gras (saturés, AGS ; monoinsaturés, AGMI ; polyinsaturés, AGPI) parmi les AG totaux (%) des différentes algues des côtes algériennes. Les histogrammes (du même groupe) portant des indices différents sont significativement différents (p<0,05).

La proportion la plus élevée d’AGPI n-3 est de l’ordre de 16,62% chez C. elongata, suivie de C. stricta (8,31%), U. lactuca (7,13%), C. compressa (4,78%) et E. compressa (3,37%). La proportion la plus élevée d’AGPI n-6 est observée chez C. stricta (17,72%), suivie de C. elongata (15,72%), C. compressa (14,86%), E. compressa (14,14%) et U. lactuca (6,89%) (Figure 28). Et le rapport moyen de l’ensemble des ratios n-6/n-3 varie entre 0,95 (C. elongata) et 4,20 (E. compressa). Selon, l’organisation mondiale de la santé (OMS) le ratio n- 6/n-3 recommandé ne doit pas dépasser 10 dans un régime (Matanjun et al., 2009), afin de prévenir des troubles inflammatoires, cardiovasculaires et neurologiques (Kumari et al. 2013). De plus, d’après la société nutritionnelle Européenne un ratio 5:1 du rapport n-6/n-3 constitue un régime alimentaire sain pour l’homme (Simopoulos, 2002). D’après nos résultats, on déduit que toutes les algues répondent à ces critères.

Les variations de classes de lipides et de profils d’acides gras dépendent de l’espèce, la localisation géographique, la saison, la température, la salinité, l'intensité lumineuse, la disponibilité nutritionnelle et l'état physiologique de l’algue, autant que des interactions entre ces facteurs et la méthode d’extraction (Yaich et al., 2011).

Résultats & discussion

20 a 18 a C. compressa 16 b b b C. stricta 14 C. elongata 12 E. compressa 10 b U. lactuca c 8 c d Indices d’AGPI Indices 6 e a 4 b c 2 d d 0 ∑AGPI n-3 ∑AGPI n-6 Ratio n-6/n-3

Figure 28: Sommes des AGPI n-3 et n-6 et ratios n-6/n-3 chez les différentes algues collectées des côtes algériennes. Les histogrammes (de la même classe) portant des indices différents sont significativement différents (p<0,05).

1.3. Composition minérale des algues L’eau de mer est très riche en minéraux, permettant aux macroalgues de puiser une richesse incomparable de macroéléments et d’oligoéléments. D’où l’attention particulière portée sur l’analyse de 22 éléments minéraux (essentiels et toxiques) chez les échantillons étudiés. La composition minérale des différentes espèces d’algues est exposée au tableau 07.

Les résultats en éléments minéraux essentiels (Ca, K, Mg, Na) indiquent que les algues brune sont riches en potassium K (47100, 79400 mg/kg MS chez C. stricta et C. compressa, respectivement), suivie du sodium Na (19570, 18400 mg/kg MS chez C. compressa et C. stricta, respectivement). El-Said & El-Sikaily (2013) ont observé que les algues vertes ont montré des teneurs faibles en Na et K par rapport aux algues rouges et brunes des côtes marines méditerranéennes Egyptiennes. Rohani-Ghadikolaei et al. (2012) trouvent aussi des concentrations élevées en K chez des algues brunes du golf perse (515,6-876,6 mg/100g), alors que Matanjun et al. (2009) rapportent des teneurs plus importantes (8371,2-13155,2 mg/100g).

Résultats & discussion

Tableau 07: Composition en minéraux des différentes algues brunes, rouges et vertes collectés des côtes Ouest algérienne*.

Minéraux (mg/kg) Algues brunes Algues rouges Algues vertes

C. compressa C. stricta C. elongata E. compressa U. lactuca

MACROELEMENTS

Calcium (Ca) 12510 ± 360 c 12050 ± 80 c 254600 ± 5000 a 27200 ± 940 b 14080 ± 320 c

Magnésium (Mg) 16100 ± 400 c 6540 ± 60 d 30500 ± 700 b 40300 ± 1200 a 30500 ± 200 b

Potassium (K) 79400 ± 2000 a 47100 ± 100 b 6090 ± 170 e 10800 ± 400 d 22500 ± 140 c

Sodium (Na) 18400 ± 430 b 19570 ± 90 a 2670 ± 40 c 3740 ± 40 d 15660 ± 130 c

OLIGOELEMENTS

Arsenic (As) 141,00 ± 1,00 a 136,00 ± 1,00 b 7,41 ± 0,77 c 4,48 ± 0,63 c 6,20 ± 0,10 c

Bore (B) 132,00 ± 2,00 a 100,00 ± 1,00 c 60,50 ± 0,20 d 47,80 ± 1,8 e 104,00 ± 1,00 b

Baryum (Ba) 9,89 ± 0,15 a 10,02 ± 0,06 a 5,74 ± 0,01 c 6,13 ± 0,03 b 2,85 ± 0,01 d

Cadmium (Cd) 4,18 ± 0,02 a 3,09 ± 0,02 b < 0,30 c < 0,30 c < 0,30 c

Cobalt (Co) 0,25 ± 0,00 b < 0,20 b 0,36 ± 0,01 a < 0,20 b < 0,20 b

Chrome (Cr) < 0,40 e 0,64 ± 0,05 d 1,48 ± 0,02 c 2,02 ± 0,06 b 3,08 ± 0,10 a

Cuivre (Cu) 0,59 ± 0,06 d 0,86 ± 0,08 c < 0,30 e 2,67 ± 0,15 b 2,04 ± 0,00 a

Fer (Fe) 65,10 ± 0,60 d 133,00 ± 1,00 c 228,00 ± 1,00 a 230,00 ± 10,00 a 189,00 ± 1,00 b

Plomb (Pb) 0,49 ± 0,02 b 0,56 ± 0,14 b 1,23 ± 0,19 a < 0,40 b < 0,40 b

Lithium (Li) 0,32 ± 0,00 d 0,37 ± 0,00 c 1,49 ± 0,02 a 0,45 ± 0,00 b 0,46 ± 0,01 b

Manganèse (Mn) 3,65 ± 0,03 e 8,14 ± 0,15 a 12,50 ± 0,02 b 8,11 ± 0,33 d 8,67 ± 0,09 c

Mercure (Hg) 0,02 ± 0,00 a 0,01 ± 0,00 b 0,01 ± 0,00 b 0,009 ± 0,00 c 0,01 ± 0,00 b

Nickel (Ni) 2,35 ± 0,01 b 1,43 ± 0,02 d 1,26 ± 0,01 e 2,06 ± 0,03 c 2,77 ± 0,03 a

Rubidium (Rb) 49,00 ± 0,70 a 32,90 ± 0,30 b < 1,60 e 6,61± 0,16 d 10,70 ± 0,40 c

Sélénium (Se) < 0,04 a < 0,04 a < 0,04 a < 0,04 a < 0,04 a

Strontium (Sr) 1102,0 ± 26,0 b 1076,0 ± 3,0 b 1455,0 ± 34,0 a 272,0 ± 6,0 c 133,0 ± 3,0 d

Vanadium (V) < 0,70 d < 0,70 d 2,18 ± 0,06 c 18,02 ± 0,99 a 7,63 ± 0,14 b

Zinc (Zn) 10,58 ± 0,06 b 10,26 ± 0,03 c 21,61 ± 0,17 a 5,56 ± 0,03 e 7,88 ± 0,08 d

* Moyenne ± Ecart-type (n = 3). Sur chaque ligne, les valeurs moyennes marquées de lettres différentes (a-e) indiquent des différences significatives (test de Tukey, P<0,05). Les minéraux sont exprimés en mg/kg de matière sèche. ** Arsenic total

Résultats & discussion

Chez les algues vertes, le magnésium (Mg) est l’élément prédominant (30500, 40300 mg/kg). Certaines espèces notamment Ulva et Enteromorpha spp., sont caractérisées par un niveau élevé d'éléments particuliers avec une fonction catalytique comme le magnésium : 3,7- 4,7% MS, respectivement (Marfaing & Lerat, 2007).

Yaich et al. (2010) ont également démontré que le Mg est le plus abondant chez l’algue verte U. lactuca (38910 mg/kg). En accord avec Mamatha et al. (2007), Enteromorpha compressa est riche en Ca et Mg. En revanche, chez l’algue rouge C. elongata, le calcium est le plus abondant, comme l’ont conclue Polat & ozogul (2009) chez les algues rouges (L. papillosa et J. rubens) comparés aux algues brunes. En effet, C. elongata est une algue calcaireuse; ceci justifie la quantité très importante de Ca (254600 mg/kg).

De plus, les ratios Na/K sont inférieurs à 0,7 chez toutes les macroalgues. En effet, les algues présentent de faible ratios Na/K, notamment Eucheuma cottonii, Caulerpa lentillifera et Sargassum polycystum (0,14-0,16) (Matanjun et al., 2009), Ulva rigida (1,0) (Taboada et al., 2009) et les algues brunes (Fucus vesiculosus, Laminaria digitata, Undaria pinnatifida) et rouges (Chondrus crispus, Porphyra tenera) (<1,5) (Ruperez, 2002). Un apport d’un faible ratio Na/K (< 0,1) réduit l’incidence de l’hypertension (Yang et al., 2011b). Les algues peuvent contribuer ainsi à équilibrer ce ratio Na/K dans un régime alimentaire (Matanjun et al., 2009).

Des différences entre les éléments traces sont aussi enregistrées entre les cinq espèces (Tableau 07). Les éléments traces les plus abondants sont d’As, B, Ba, Cd, Hg, Rb chez les algues brunes, les éléments Cr, Cu, Ni, V, Fe prédominent chez les algues vertes, alors que chez les algues rouges se sont le Li, Mn, Zn, Pb, Sr. En effet, Polat & ozogul (2009) ont démontré aussi que le Mn et le Zn sont abondants chez les algues rouges. De plus, des variations similaires en As, Cd, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb et Zn sont enregistrés par Bonanno & Orlando-Bonaca (2018) chez les espèces et les genres d’algues brunes, rouges et vertes étudiées.

Le cobalt (Co) est détecté en très faible concentration en accord avec Krishnaiah et al. (2008) et le sélénium est relativement similaire chez toutes les algues. Par contre, le Sr, Fe et B enregistrent les concentrations les plus élevées parmi les éléments traces. Le strontium est élevé chez C. elongata (1455 mg/kg). En effet, le strontium est nécessaire pour stimuler la croissance des coraux et la production des Corallinaceae qui colonisent les roches. Ces organismes fixent le strontium dans leurs squelettes en même temps que le calcium. Les teneurs en fer et en bore sont prédominantes chez E.compressa (230 mg/kg) et C. compressa

Résultats & discussion

(132 mg/kg), respectivement. Mamatha et al. (2007) ont aussi observé un taux élevé de Fer chez Enteromorpha.

Dans la présente étude, la teneur en Zn varie entre 5,56 mg/kg chez E. compressa et 21,61 mg/kg chez C. elongata. En effect, l’intervalle de la teneur moyenne en zinc annoncé pour U. lactuca collectée de sites non contaminés est de 0,05 - 2,3 mg/100g MS et de sites pollués de 4,2 - 16 mg/100g MS (Wong et al., 1982). En tenant compte de ces valeurs, il est clair que nous pouvons considérer cette zone d’échantillonnage comme non contaminée.

De plus, l’intervalle de concentrations pour le cuivre (Cu) chez U. lactuca collectée de sites non contaminés est de l’ordre de 0,1 - 3 µg/g, alors que les concentrations de sites très contaminés varient de 14 µg/g à 134 µg/g (Wong et al., 1982). D’après ces résultats, la concentration en cuivre dans les algues étudiées (<0,3 - 2,67 mg/kg) indiquent que la zone n’est pas contaminée par le cuivre.

Les éléments traces tels que le Fer et le Cuivre sont considérés essentiels dans les processus biologiques, y compris la croissance, la reproduction, le métabolisme hormonale et les défenses antioxydatifs (Girodon et al., 1997 ; Gibney et al., 2004).

Dans le but d’évaluer la sécurité alimentaire des échantillons analysés, la réglementation d’autres pays est consultée. La teneur en Pb et Hg ne dépasse pas la limite permise (mg/kg MS) (<5 pour Pb et <0,1 pour Hg) dans la législation française. En revanche, les concentrations du Cadmium (Cd) chez C. compressa et C. stricta dépassent la limite autorisée de 0,5 mg/kg MS chez les macroalgues comestibles en France. En revanche en Australie et en New Zélande, le taux maximal admit est de 0,2 µg/g MS pour le Cd (Besada et al., 2009). En tenant compte de la teneur maximale de Cd de 5,18 mg/kg MS, la consommation de 3g de cette algue signifie une ingestion de 0,015 mg/jour de Cd. Ce qui représente 22% de la concentration, établie par la WHO (World Health Organization, 1989) (0,068 mg de Cd/jour pour un poids corporel de 68 kg), un pourcentage élevé obtenus d’un seul produit alimentaire.

Les concentrations en Arsenic total (As) varient de 4,48 - 141 mg/kg MS, et sont similaires à celles trouvées dans la bibliographie chez des algues alimentaires (entre 2,0 et 172 mg/kg MS) (Almela et al., 2002). Le contenu en As total chez les espèces d'algues brunes étudiées peut être considéré comme très élevé (p<0,05). En accord avec la littérature, en général, le contenu en As chez les algues brunes est relativement élevé, comparativement aux algues rouges et vertes (Almela et al., 2002). Cela suggère que l’accumulation d’As est plus dépendante de l’espèce d’algue que de son taux dans l’environnement.

Résultats & discussion

De plus, l’As se présente sous deux formes de complexe, l'un organique qui n'est pas toxique et l'autre inorganique, très toxique. Toutefois, l'arsenic se retrouve dans les algues sous la forme organique (non toxique), par exemple chez les macroalgues l’espèce d’As prédominante est l’arsénosucre (non-toxique). A l'exception de l'algue Hizikia fusiforme qui contient une teneur élevée en As inorganique (60 et 72 % d’As total) (Almela et al., 2002). La FAO-WHO recommande de mesurer en plus de la concentration As total présente dans l’aliment, la concentration d’As inorganique, puisqu'il se pourrait que les algues qui montrent une concentration élevée en As total ne présentent aucune toxicité car la plupart de l’As est sous sa forme organique (Besada et al., 2009). De plus, les teneurs des autres éléments chez toutes les espèces d’algues analysées sont en dessous des limites admises établies par la FAO/WHO.

Il est connu que les algues brunes sont d'importants accumulateurs de métaux lourds, ceci est principalement dû aux polysaccharides sulfatés et les alginates qu’ils contiennent (Nielsen, 2003), sites de liaison avec des cations métalliques (Teresa et al., 2001).

Le contenu minéral important de ces algues peut être expliqué par l’absorption des éléments nutritifs dans le milieu et leur accumulation. Mehtougui et al. (2013) ont montré dans l’environnement marin du site d’échantillonnage (commune de Bousfer), que les eaux rejetées par la station de dessalement de Bousfer directement proche des côtes; présente une forte concentration en sels (58,85 ‰), par rapport à celle de l’eau de mer (36,55 ‰) et enregistre aussi une haute valeur en conductivité, ce qui justifie la présence de teneurs importantes en minéraux.

De plus, Villares et al. (2002) ont montré également l’influence de la variation saisonnière sur la concentration de métaux lourds. Cette dernière diminue pendant la période de croissance et augmente pendant la période de dormance (hiver). D’autres études montrent des concentrations élevées de métaux pendant la période de croissance (été) d’U. lactuca. Cela est expliqué, par l’existence d’une vitesse de photosynthèse et de respiration élevée pendant cette saison, ce qui favorise l’assimilation de métaux (Catsiki & Papathanassiou, 1993).

Au regard des résultats de la composition chimique et minérale, il s’avère que les cinq espèces d'algues sont riches en composés bioactifs possédant une activité antioxydante mais aussi de nombreuses propriétés biologiques intéressantes pour l’agriculture et l’algoculture. Ces constatations, nous permettent de préconiser ces algues pour de plus ample investigations par l’étude des propriétés antioxydantes d’extraits de ces cinq espèces, et pour mettre en évidence l’éventuel effet régulateur de croissance végétale.

Résultats & discussion

2. Etude du potentiel antioxydant des algues cibles 2.1. Comparaison de l’activité antioxydante in vitro des algues La plupart des études rapportées sur l'activité antioxydante de différentes espèces d'algues utilisent des extraits de différentes polarités et concentrations (Shanab et al., 2011). L'eau et une variété de solvants organiques sont utilisés dans le criblage de l'activité antioxydante des algues, tels que le méthanol, l'éthanol, l'acétone et le chloroforme (Duan et al., 2006 ; Yuan & Walsh, 2006).

Dans cette étude, et afin d’évaluer les techniques d’extraction des composés phénoliques les plus efficace, deux méthodes d’extraction sont utilisées, différentes de part le procédé et la température de travail, à savoir le soxhlet (90 °C) et la macération (25 °C) et ceux avec trois solvants à polarité croissante (éthanol, méthanol, eau).

Le choix de l’eau et l’éthanol comme solvant d’extraction s'est fait vis-à-vis de la sécurité de leur utilisation, et le méthanol et l’éthanol du fait que ces solvants organiques donnent de meilleurs taux d’extraction et sont hautement sélectifs pour les polyphénols (Spigno et al., 2007).

2.1.1. Rendements d’extractions Les rendements des extraits bruts d’algues obtenus sont illustrés dans le tableau 08. Il est à noter que les rendements d’extractions par macération (M) (1,15 - 37,80%) sont plus importants que ceux de l’extraction par soxhlet (S) (1,10 - 21,3%). Cela est probablement dû à la sensibilité de certains composés aux températures élevées.

De plus, les rendements obtenus par l'extraction aqueuse (EAQ) (3,50 - 37,80%) sont beaucoup plus élevés qu’en extraits méthanoliques (EM) (1,50 - 20,26%). Alors que, les plus faibles rendements sont enregistrés par les extraits éthanoliques (EE) (1,10 - 8,89%).

Ce qui suggère que l’augmentation de la polarité du solvant (indice de polarité de l'eau 9, du méthanol 6,6 et de l'éthanol 5,2), augmente le rendement d’extraction et indique la présence de quelques composés polaires extractibles avec de l’eau (Sabeena Farvin & Jacobsen, 2013).

Résultats & discussion

Tableau 08 : Rendements d'extractions (%) par macération et soxhlet; extraits méthanoliques, éthanoliques et aqueux à partir de 5g, des algues C. compressa, C. stricta, C. elongata, E. compressa et U. lactuca.

Espèces Taxonomie Méthode Rendement d’extraction (%)

d’extraction METHANOL ETHANOL EAU

Cystoseira compressa Ph., Fucales, Sargassaceae Macération 20,26 ± 0,45 β,a 8,89 ± 0,11 γ,a 37,80 ± 0,09 α,a

Soxhlet 10,20 ± 0,24 β,b 3,55 ± 0,34 γ,b 16,05 ± 0,50 α,d

Cystoseira stricta Ph., Fucales, Sargassaceae Macération 8,41 ± 0,26 β,d 3,81 ± 0,13 γ,b 36,00 ± 0,89 α,a

Soxhlet 5,60 ± 0,29 β,f 2,55 ± 0,10 γ,c 13,80 ± 0,12 α,d

Corallina elongata Rh., Corallinales, Corallinaceae Macération 2,53 ± 0,09 β,h 1,70 ± 0,05 γ,d 10,00 ± 0,14 α,d

Soxhlet 1,50 ± 0,03 β,i 1,10 ± 0,10 β,e 3,50 ± 0,08 α,e

Enteromorpha compressa Ch., Ulvales, Ulvaceae Macération 4,14 ± 0,20 β,g 1,82 ± 0,42 γ,d 30,00 ± 0,28 α,b

Soxhlet 6,32 ± 0,05 β,e 1,70 ± 0,12 γ,d 21,35 ± 0,22 α,c

Ulva Lactuca Ch., Ulvales, Ulvaceae Macération 9,29 ± 0,16 β,c 1,15 ± 0,24 γ,e 31,00 ± 0,05 α,b

Soxhlet 2,90 ± 0,02 β,h 1,60 ± 0,11 γ,d 14,55 ± 0,09 α,d

Moyenne ± Ecart-type (n = 3). Sur chaque ligne, les valeurs moyennes marquées de lettres différentes (α-γ) indiquent des différences significatives (test de Tukey, P<0,05) entre les solvants d’extractions. Sur chaque colonne, les valeurs moyennes marquées de lettres différentes (a-i) indiquent des différences significatives (test de Tukey, P<0,05) entre les espèces d'algues. Ph. (phéophytes), Rh. (rhodophytes) et Ch. (chlorophytes).

Résultats & discussion

Les rendements significativement élevés sont enregistrés par les extraits aqueux de Cystoseira compressa, Cystoseira stricta, Enteromorpha compressa et Ulva lactuca. Et les rendements les plus faibles sont obtenus avec les différents extraits bruts de Corallina elongata. Cette différence entre espèces peut être attribuée à la polarité des composés présents chez ces algues. En effet, dans cette étude les algues brunes et vertes ont montré des teneurs élevées en composés hydrosolubles tels que les polysaccharides et les protéines.

Il a été démontré dans plusieurs études que les résultats des extractions chimiques dépendent du type de solvant (pH, polarité), le temps et la température d’extraction, comme de la composition biochimique de l’algue (Vincentiu-Bogdan et al., 2011 ; Cho et al., 2011).

2.1.2. Estimation quantitative des polyphénols, des flavonoïdes et des tannins Afin d’obtenir plus d’informations sur la composition phytochimique des extraits d’algues, ils sont évalués pour leurs contenus en polyphénols totaux, en flavonoides totaux et en tannins condensés.

2.1.2.1. Teneur en polyphénols totaux Des différences significatives (p<0,05) en teneur des polyphénols totaux sont observées entre les différentes espèces d’algues et entres les méthodes et les solvants d’extraction (Tableau 09).

L’éthanol peut être considéré comme un excellent solvant d’extraction des composés phénoliques chez toutes les algues, toutes méthodes confondus, à l’exception de Cystoseira compressa extraites par macération, où le taux de polyphénols est plus élevé dans l’extrait aqueux suivie de l’extrait éthanolique. Selon Sabeena Farvin & Jacobsen (2013), chez les 16 espèces d’algues analysées, l’extraction éthanolique est efficace comparativement à l’extraction aqueuse, à l’exception chez Sargassum muticum. Alors que, Cho et al. (2007) montrent chez Sargassum siliquastrum, une efficacité de l’éthanol par rapport à l’eau. En opposition, Haddar et al. (2012) ont rapporté que l’eau est meilleure pour l’extraction des composés phénoliques chez Cystoseira barbata.

Une exception est à noter, avec les extraits obtenus par macération d’U. lactuca et E. compressa où aucun effet significatif de la nature du solvant n'est observé. Ces résultats sont en accord avec Cox et al. (2010) qui ont rapporté que les extraits méthanoliques d’E. spirulina ont eu le même taux de polyphénols totaux que les extraits éthanoliques.

Résultats & discussion

Tableau 09: Teneurs en polyphénols totaux, flavonoïdes totaux et tannins condensés des différents extraits d’algues (à 2000 µg/ml).

Espèces Méthode Teneur en polyphénols totaux (mg EAG/g MS) Teneur en flavonoïdes totaux (mg EQ/g MS) Teneur en tannins condensés (mg EC/g MS) d’extraction EM EE EAQ EM EE EAQ EM EE EAQ

C. compressa M 44,20 ± 0,33 γ,b 71,49 ± 2,57 β,b 87,02 ± 0,83 α,a 4,53 ± 0,06 α,g 4,41 ± 0,03 α,g 1,61 ± 0,01 β,b 1,75 ± 0,05 αβ,e 2,68 ± 0,23 α,de 1,17 ± 0,03 β,de

S 24,87 ± 2,07 β,de 39,33 ± 0,80 α,c 13,96 ± 0,57 γ,d 4,18 ± 0,16 β,h 10,00 ± 0,17 α,b 1,18 ± 0,01 γ,c 3,83 ± 0,55 β,d 3,90 ± 0,26 β,c 7,77 ± 0,33 α,c

C. stricta M 34,22 ± 3,17 α,c 36,20 ± 0,77 α,c 22,02 ± 0,10 β,c 8,67 ± 0,16 α,c 8,82 ± 0,14 α,c 1,88 ± 0,06 β,b 19,73 ± 0,43 α,b 10,53 ± 0,13 γ,b 14,90 ± 0,26 β,a

S 66,89 ± 3,17 β,a 122,20 ± 1,87 α,a 20,42 ± 0,43 γ,cd 6,31 ± 0,06 β,e 10,63 ± 0,10 α,a 1,21 ± 0,01 γ,c 26,17 ± 0,03 β,a 31,48 ± 0,45 α,a 11,78 ± 0,45 γ,b

C. elongata M 15,89 ± 0,50 β,f 8,47 ± 0,60 γ,e 33,53 ± 0,20 α,b 7,44 ± 0,08 α,d 7,02 ± 0,05 β,e 2,40 ± 0,15 γ,a 1,00 ± 0,10 α,e 1,53 ± 0,14 α,e 1,95 ± 0,83 α,d

S 25,67 ± 0,07 β,d 33,82 ± 8,30 α,c 28,20 ± 0,40 αβ,bc 5,30 ± 0,24 β,f 6,00 ± 0,19 α,f 1,16 ± 0,01 γ,c 1,75 ± 0,82 β,e 3,77 ± 0,38 α,cd 0,90 ± 0,05 β,de

E. compressa M 12,73 ± 1,00 α,f 11,13 ± 0,60 α,e 13,13 ± 2,57 α,d 7,40 ± 0,02 β,d 8,80 ± 0,13 α,c 1,10 ± 0,02 γ,c 1,73 ± 0,33 β,e 2,98 ± 0,12 α,cd 0,80 ± 0,15 β,de

S 14,47 ± 0,60 α,f 20,27 ± 3,07 α,d 2,80 ± 0,07 β,e 10,11 ± 0,14 α,a 9,86 ± 0,08 α,b 0,73 ± 0,01 β,d 5,63 ± 0,35 α,c 2,33 ± 0,10 β,de 1,28 ± 0,15 β,de

U. lactuca M 4,27 ± 0,27 α,g 11,16 ± 0,30 α,e 8,69 ± 0,23 α,de 4,66 ± 0,05 β,g 8,12 ± 0,11 α,d 1,00 ± 0,04 γ,dc 1,12 ± 0,29 β,e 3,30 ± 0,40 α,cd 0,32 ± 0,16 β,e

S 17,82 ± 1,17 β,ef 38,93 ± 4,80 α,c 3,93 ± 0,07 γ,e 9,53 ± 0,20 α,b 8,96 ± 0,01 β,c 0,63 ± 0,02 γ,d 4,27 ± 0,88 α,d 2,25 ± 0,18 β,de 1,03 ± 0,15 γ,de

Moyenne ± Ecart-type (n = 3). Sur chaque ligne, les valeurs moyennes marquées de lettres différentes (α-γ) indiquent des différences significatives (test de Tukey, P<0,05) entre les solvants d’extractions. Sur chaque colonne, les valeurs moyennes marquées de lettres différentes (a-h) indiquent des différences significatives (test de Tukey, P<0,05) entre les espèces d'algues. Macération (M) ; soxhlet (S) ; extraits méthanoliques (EM), extraits éthanoliques (ET) ; extraits aqueux (EAQ) ; EAG : équivalent acide gallique ; EQ : équivalent quercétine ; EC : équivalent catéchine.

100

Résultats & discussion

En général, il est considéré que le type de solvant influence la sélection des composés phénoliques, qui sont généralement plus solubles dans les solvants organiques polaires que dans l'eau. Les solvants efficaces recommandés sont le méthanol, l’éthanol et l’acétone (Waterman & Mole, 1994). En effet, avec les solvants non polaires (l’éthanol), les composés phénoliques, les terpènes et les alcaloïdes, qui sont de faible polarité, peuvent être extraits; toutefois avec les solvants polaires comme l’eau, les composés phénoliques attachés aux sucres ou protéines, saponines, glycosides, acides organiques, sels et mucus peuvent être extraits (Cho et al., 2007).

En accord avec Matanjun et al., (2008), Soo-Jin et al. (2005) et Parthiban et al. (2014), les algues brunes ont montré les contenus polyphénoliques les plus importants, par rapport aux algues vertes et rouges. Les teneurs en PT les plus élevées sont enregistrées par les extraits éthanoliques (EE) (soxhlet, S) de Cystoseira stricta (122,20 mg GAE/g MS), Corallina elongata (33,82 mg GAE/g MS), Ulva lactuca (38,93 mg GAE/g MS) et Enteromorpha compressa (20,27 mg EAG/g MS), alors que chez Cystoseira compressa, la concentration la plus élevée (87,02 mg GAE/g MS) est enregistrée par l’extrait aqueux (EAQ) (macération). Quant à la plus faible teneur, elle est observée chez E. compressa (2,80 mg GAE/g MS, EAQ, soxhlet).

Des concentrations comparables sont décrites, chez les Cystoseires : Cystoseira crinita (56,5 mg/g), C. sedoides (50,3 mg/g), C. compressa (61 mg/g) (Mhadhebi et al., 2014), C. tamariscifolia (10,91-105,0 mg/g) (Zubia et al., 2009 ; Vizetto-Duarte et al., 2016 ; Custodio et al., 2016 ; Pinteus et al., 2017), C. barbata (19,6 et 207,95 mg/g) (Haddar et al., 2012) et C. usneoides (86,81 mg/g) (Pinteus et al., 2017). Chez les algues rouges Corallina elongata et Jania rubens (10,39 et 37,08 mg/g, respectivement) (Pinteus et al., 2017) et chez les algues vertes Enteromorpha compressa (5,04-26,2 mg/g) (Soo-Jin et al., 2005 ; Ganesan et al., 2011 ; Parthiban et al., 2014), E. intestinalis (2,65 mg/g) et Ulva lactuca (2,36 mg/g) (Sabeena Farvin & Jacobsen, 2013) et U. compressa (2,78 mg/g) (Pinteus et al., 2017).

Les algues brunes sont riches en phlorotannins, qui représentent l’unique groupe de composé phénolique, par exemple : C. usneoides et C. tamariscifolia contiennent jusqu’à 105,20 et 64,93 mg Eq. phloroglucinole/g, respectivement (Pinteus et al., 2017). Cependant, il est aussi montré chez C. tamariscifolia la présence remarquable d’acide hydroxycinnamique 106 mg/g par rapport aux flavonoïdes et tannins condensés (Custodio et al., 2016).

Les phénols protègent les thalles algaux contre la photo-destruction causée par les radiations UV, les herbivores et les microorganismes pathogènes. De plus, ces composés

101

Résultats & discussion phénoliques sont considérés parmi les molécules thérapeutiques potentiellement utilisable grâce à leur capacité de prévenir des maladies liées au stress oxydatif tels que le cancer et les maladies neurodégénératives (Custodio et al., 2016).

2.1.2.2. Teneur en flavonoïdes totaux Les concentrations des flavonoïdes dans les extraits algaux (Tableau 09) sont comprises entre 0,63 - 10,63 mg EQ/g MS. L’analyse statistique révèle un effet significatif (p<0,05) du changement de solvant d’extraction sur la teneur en flavonoïdes. En effet, il apparait que les solvants organiques (éthanol et méthanol) soient meilleurs que l’eau en termes d’extraction des flavonoïdes. De plus, globalement l’extraction au soxhlet est plus efficace. Selon la bibliographie (Yuan & Walsh, 2006 ; Duan et al., 2006 ; Ganesan et al., 2008), le méthanol et l’éthanol sont fonctionnels d’une manière reproductive lors de l’extraction des composés phénoliques.

Chez les trois groupes d’algues des concentrations importantes en flavonoïdes sont notées. En termes de valeur absolue, les plus fortes teneurs sont enregistrées chez C. stricta avec une valeur maximale de 10,63 mg EQ/g MS (EE ; S), suivi d’E. compressa (10,11 mg EQ/g MS, EM, S), C. compressa (10 mg EQ/g MS, EE, S), U. lactuca (9,53 mg EQ/g MS, EM, S) et C. elongata (7,44 mg EQ/g MS, EM, M). La plus faible teneur de l’ordre de 0,63 mg EQ/g MS est enregistrée par l'extrait aqueux (S) d'U. lactuca.

Les résultats obtenus concordent relativement avec ceux de la littérature : C. barbata (5,31 et 7,90 mg/g) (Haddar et al., 2012), C. nodicaulis (4,15 mg/g) (Custodio et al., 2016) et C. stricta (4,91 mg/g, côte Ouest algérienne) (Guezzen, 2014). L’algue verte E. compressa a montré une teneur significativement supérieure à celle constatée chez l’algue rouge. Cela est également rapporté par Cox et al. (2010) qui ont trouvé que l’extrait méthanolique de l’algue verte E. spirulina a enregistré une teneur en flavonoïdes (19,05 mg/g) supérieure à celles des algues rouges (Palmaria palmata, Chondrus crispus). En revanche, elle est inférieure à celle d’E. compressa (131,1 mg/g) (Cho et al., 2010).

Certaines teneurs en flavonoïdes totaux sont supérieures à celles des polyphénols totaux. Cela a été déjà rapporté par Güner et al. (2015) et peut être dû à la présence chez les algues de plusieurs composés ayant la même structure chimique que les flavonoïdes ; qui peuvent interférer dans le dosage et donner une surestimation des concentrations en flavonoïdes.

Dans cette étude, l’analyse des flavonoïdes est très importante car c’est une classe de phénols végétaux secondaires possédant une puissante activité antioxydante, piégeant ainsi

102

Résultats & discussion une large gamme d'ERO et inhibant la lipoperoxydation, ce qui en fait un agent thérapeutique potentiel contre une large variété de maladies (Haddar et al., 2012).

2.1.2.3. Teneur en tannins condensés L’estimation quantitative des tannins condensés révèle que nos extraits renferment des teneurs variant de 0,22 à 31,48 mg EC/g MS (Tableau 09). De manière identique aux flavonoïdes, une influence des solvants organiques (éthanol et méthanol) sur la capacité d’extraction de la matière sèche algale est observée chez les différentes algues étudiées. Et l’extraction au soxhlet apparait comme la meilleure méthode.

L’examen statistique des résultats obtenus révèle que les teneurs en tannins condensés sont significativement élevées chez l’algue brune C. stricta par rapport aux autres espèces d’algues. Ce résultat est également rapporté par Cox et al. (2010) qui ont montré que les espèces d’algues rouges (P. palmata, C. crispus) et vertes (E. compressa) renferment des teneurs en tannins condensés inférieures à celles enregistrées chez les algues brunes.

Tandis que les autres espèces d’algues présentent des concentrations en tannins condensés comparables (p ≥ 0,05) dont la plus faible est enregistrée en extrait aqueux (M) d’U. lactuca (0,22 mg EC/g MS).

Des concentrations en tannins condensés très variables sont rapportées par d’autres auteurs, chez C. stricta (60,96 mg/g, côte Ouest algérienne) (Guezzen, 2014), C. tamariscifolia (64,2 mg/g) et C. nodicaulis (4,23 mg/g) (Custodio et al., 2016) et E. compressa (3,21 mg/g) (Cox et al., 2010).

Seulement chez C. stricta les teneurs en tannins condensés sont plus élevées que les teneurs en flavonoïdes. En effet, cette tendance est également observée chez l’espèce C. tamariscifolia; alors que leurs concentrations sont identiques chez C. nodicaulis; de plus, les tannins condensés sont un groupe de composés phénoliques identifiés dans plusieurs espèces d’algues brunes (Custodio et al., 2016).

Chez C. compressa, ainsi que les différentes algues étudiées, les teneurs en tannins condensés sont plus faibles par rapport à celles des flavonoïdes, cela a été mentionnée auparavant par Alghazeer et al. (2013), chez C. stricta et Cox et al. (2010) chez plusieurs algues dont E. spirulina.

103

Résultats & discussion

Enfin, les teneurs en P.T, flavonoïdes et tannins condensés chez les espèces d’algues sont variables. Cela est probablement dû aux propriétés très différentes de chaque espèce, qui sont en relation avec les facteurs extrinsèques (irradiation, salinité, nutriments, la saison, le site d’échantillonnage et sa profondeur) et les facteurs intrinsèques (le stade de développement et de reproduction de l’algue).

2.1.3. Evaluation de l’activité antioxydante des extraits algaux 2.1.3.1. Activité anti-radicalaire vis-à-vis du radical DPPH L'analyse de l’activité antioxydante par le test de piégeage du radicale libre DPPH a été intensivement employée dans de nombreuses études car cette méthode peut s’adapter à divers matrices et elle est assez sensible pour détecter les substances actives à de basses concentrations (Sanchez-Moreno, 2002).

D’après les résultats, l’activité antiradicalaire est dose-dépendante. La réduction du radicale DPPH augmente significativement en fonction de l’augmentation des concentrations des extraits d’algues (Figure 29 et 30). Ce résultat est également rapporté par Ismail & Hong (2002), Cho et al. (2011) et Hwang & Do Thi (2014).

En accord avec Sadi (2010), Saidani (2010), Mhadhebi et al. (2014) et Güner et al. (2015), le genre Cystoseira a révélé une forte activité antiradicalaire aux différentes concentrations. En effet, tous les extraits de Cystoseires ont révélé un pourcentage d’inhibition de plus de 90% à 1000 et 2000 µg/ml (Figure 29 et 30). Un résultat identique de 92% est observé chez C. tamariscifolia à 1000 µg/ml (Custodio et al., 2016). Les espèces étudiées appartenant à ce genre ont enregistré de remarquables IC50 (C. stricta, 83,31 et 98,44 µg/ml, EE, S et M) et C. compressa (105,17 et 132,41 µg/ml, EAQ et EE, M) (Tableau 10).

Des résultats similaires sont rapportés chez C. tamariscifolia 109,3 (87,3-136,8) µg/ml et C. usneoides 55,41 (30,79-99,7) µg/ml (Pinteus et al., 2017) et chez Cystoseira crinita 90 et 110 µg/ml et C. sedoides 75 µg/ml (Mhadhebi et al., 2011 ; 2014).

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Résultats & discussion

100 90 80 C. compressa 70 C. stricta 60 50 C. elongata 40 E. compressa 30 U. lactuca 20 BHT Pourcentaged'inhibition 10 Vit C 0 Vit E 0 500 1000 1500 2000 Concentrations des extraits aqueux

100 90 80 C. compressa 70 C. stricta 60 50 C. elongata 40 E. compressa 30 U. lactuca 20 BHT Pourcentaged'inhibition 10 Vit C 0 Vit E 0 500 1000 1500 2000 Concentrations des extraits éthanoliques

100 90 80 C. compressa 70 C. stricta 60 50 C. elongata 40 E. compressa 30 U. lactuca 20 BHT pourcentaged'inhibition 10 Vit C 0 Vit E 0 500 1000 1500 2000 Concentrations des extraits méthanoliques

Figure 29: Evolution du pourcentage d’inhibition des extraits d’algues (EM, EE et EAQ) extrait au soxhlet et des antioxydants standards (BHT, Vit C et Vit E) vis-à-vis du radical DPPH, en fonction de différentes concentrations.

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Résultats & discussion

100 90 80 C. compressa 70 C. stricta 60 50 C. elongata 40 E. compressa 30 U. lactuca 20 BHT Pourcentaged'inhibition 10 Vit C 0 Vit E 0 500 1000 1500 2000 Concentrations des extraits aqueux

100 90 80 C. compressa 70 C. stricta 60 50 C. elongata 40 E. compressa 30 U. lactuca 20 BHT Pourcentaged'inhibition 10 Vit C 0 Vit E 0 500 1000 1500 2000 Concentrations des extraits éthanoliques

100 90 80 C. compressa 70 C. stricta 60 50 C. elongata 40 E. compressa 30 U. lactuca 20 BHT Pourcentaged'inhibition 10 Vit C 0 Vit E 0 500 1000 1500 2000 Concentrations des extraits méthanoliques

Figure 30: Evolution du pourcentage d’inhibition des extraits d’algues (EM, EE et EAQ) extrait par macération et des antioxydants standards (BHT, Vit C et Vit E) vis-à-vis du radical DPPH, en fonction de différentes concentrations.

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Résultats & discussion

Tableau 10: Concentration d’inhibition (IC50) des extraits d’algues, du BHT, vit C et vit E

Espèces Méthodes DPPH IC50 d’extraction (µg/ml)

EM EE EAQ

C. compressa M 157,3 ± 1,3 γ,ab 132,4 ± 1,1 β,ab 105,1 ± 2,2 α,a

S 209,5 ± 3,3 β,b 175,9 ± 1,3 α,ab 809,9 ± 8,3 γ,c

C. stricta M 171,2 ± 2,5 γ,ab 98,4 ± 2,3 α,a 102,4 ± 2,6 β,a

S 105,3 ± 2,6 β,a 83,3 ± 3,0 α,a 745,1 ± 4,9 γ,b

C. elongata M 1787,7 ± 6,0 β,cd 2144,0 ± 2,0 γ,e 953,8 ± 1,3 α,d

S 1497,2 ± 4,0 β,c 1651,0 ± 1,0 γ,cd 903,3 ± 2,0 α,d

E. compressa M 1320,4 ± 1,2 β,c 1260,4 ± 4,0 α,c 3166,5 ± 7,2 γ,f

S 1923,6 ± 3,0 α,cd 3042,5 ± 24,0 β,f 3514,9 ± 25,0 γ,f

U. lactuca M 3450,0 ± 17,0 β,f 1910,0 ± 7,0 α,cd 3663,0 ± 3,0 γ,f

S 2094,1 ± 3,3 β,e 1123,8 ± 2,7 α,c 4191,1 ± 10,0 γ,g

BHT Témoin + 54,4 ± 5,0 a

VIT C Témoin + 52,2 ± 5,4 a

VIT E Témoin + 2383,5 ± 12,0 e

Moyenne ± Ecart-type (n = 3). Sur chaque ligne, les valeurs moyennes marquées de lettres différentes (α-γ) indiquent des différences significatives (test de Tukey, P<0,05) entre solvants d’extractions. Sur chaque colonne, les valeurs moyennes marquées de lettres différentes (a-g) indiquent des différences significatives (test de Tukey, P<0,05) entre les espèces d'algues. Macération (M); soxhlet (S); extraits méthanoliques (EM), extraits éthanoliques (ET); extraits aqueux (EAQ).

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Résultats & discussion

Concernant l’algue rouge C. elongata, le pourcentage d’inhibition des extraits dépasse les 50% à 2000 µg/ml (Figure 29 et 30), pour atteindre un maximum de 76% dans les extraits aqueux (S et M) où des valeurs d’IC50 de 903,34 et 953,83 µg/ml sont observés (Tableau 10).

Pinteus et al. (2017) ont également enregistré des pourcentages d’inhibitions IC50 comparables chez C. elongata et J. rubens ( 1000 µg/ml) et Rico et al. (2012) ont rapporté que l’extrait aqueux de Corallina elongata a une activité antiradicalaire supérieure à celle obtenue par l’extrait méthanolique et éthanolique.

En accord avec Parthiban et al. (2014), la meilleure activité antiradicalaire est obtenue chez les espèces du genre Cystoseira comparée à celle d’Enteromorpha compressa. Chez U. lactuca et E. compressa, les pourcentages d’inhibitions du radical libre DPPH sont plus faibles à 2000 µg/ml (23,86 et 28,45%, respectivement ; EAQ, S) et atteignent un maximum de 77% (EE; S) et 67,51% (EE; M), respectivement (Figure 29 et 30). Les meilleurs concentrations d’inhibitions de 50% du radical DPPH enregistrés chez U. lactuca sont de 1123,87 et 1910 µg/ml et chez E. compressa sont de 1260,41 et 1320,40 µg/ml (Tableau 10).

Des résultats très proches des notres sont rapportés par Ganesan et al. (2011) et Sabeena Farvin & Jacobsen (2013) chez E. compressa (IC50 ; 1890 µg/ml), E. intestinalis (1333,3 µg/ml) et U. lactuca (1266,7 µg/ml). De plus, cette concentration d’inhibition (IC50) est meilleure que celle chez E. linza (3660 µg/ml) et E. tubulosa (2910 µg/ml) (Ganesan et al., 2011).

D’aprés Marinova & Yanishlieva (1997), l'activité antioxydante des extraits d'algues dépend fortement du type de solvant utilisé pour l'extraction. A partir des résultats, l’éthanol et l’eau présentent un meilleur effet sur la concentration d’inhibition par rapport au méthanol. Ceci est également rapporté par Hwang & Do Thi (2014) et Ismail & Hong (2002). A l’exception d’E compressa, où le méthanol et l’éthanol se révèlent être les solvants les plus appropriés, en accord avec Cho et al., 2010 ; Vincentiu-Bogdan et al., 2011 ; Madalena et al., 2013).

Nos résultats indiquent que la capacité des extraits d’algues rouges et vertes à piéger le radicale libre DPPH est inférieure à celle du contrôle positive le butyl-hydroxytoluène (IC50 ; 54,42 µg/ml) et la vitamine C (IC50 ; 52,21 µg/ml). Néanmoins, l’activité anti-radicalaire des espèces du genre Cystoseira reste comparable (p≥0,05) à celle du BHT et la vit C, et la

108

Résultats & discussion plupart des extraits algaux présentent des capacités anti-radicalaires supérieures à celles de la vitamine E (IC50 ; 2383,52 µg/ml) (Tableau 10 et Figures 29, 30).

En effet, Pinteus et al. (2017) ont observé que la valeur d'IC50 du BHT de 40,55 (27,39- 60,05) µg/ml était comparable à celle des extraits de C. usnoides, Sargassum vulgare, S. muticum et Bifurcaria bifurcata. Il est aussi rapporté par Aruna et al. (2015) que la vit E montre une activité antiradicalaire inférieure à celle du BHT. Ismail & Hong (2002), Zhang et al. (2007) et Shanab et al. (2011) ont également montré que le pourcentage d’inhibition du radicale libre DPPH par le BHT était supérieur à celui de Corallina officinalis et Enteromorpha compressa. Ce qui confirme que cet antioxydant synthétique est avantageusement utilisé pour sa meilleure capacité antioxydante en dépit de ses risques toxicologiques (Diallo, 2005).

De plus, Narasimhan et al. (2013) ont rapporté que la capacité de l’algue rouge Gracilaria corticata et de l’algues verte Enteromorpha antenna à piéger le radicale libre DPPH était supérieure à celle de la vit E. Ce qui rend l’utilisation des algues comme source de composés phénoliques plus avantageuse que la vit E.

Les extraits d’algues brunes Cystoseira aux teneurs en phénols totaux les plus élevées ont présenté une forte activité antioxydante, ce qui suggère que les polyphénols algaux peuvent être les principaux constituants responsables des propriétés anti-radicalaires de ces extraits.

Par contre, on constate que certains extraits présentant des activités anti-radicalaires très importantes contiennent moins de polyphénols totaux, ce qui confirme que l'activité antioxydante de nos extraits n’est pas uniquement liée à leur contenu en composés phénoliques (Heo et al., 2005). En effet, cette activité peut résulter de leurs pigments tels que les chlorophylles et les caroténoïdes, les vitamines (tocophérols, β-carotène, fucoxanthine, acide ascorbique), les protéines telles que la phycoérythrine des algues rouges, les polysaccharides, les phospholipides en particulier la phosphatidylcholine, les terpénoïdes et d'autres substances antioxydantes (Shahidi, 2008).

De plus, l’activité anti-radicalaire des composés phénoliques dépend aussi de leur structure phénolique et le nombre et la localisation des groupements hydroxyles. En effet, les composés avec un groupement hydroxyle secondaire en position ortho ou para ont une activité élevée par rapport à lorsqu’il est en position méta.

De précédentes études ont rapporté également que l’acide caféique possédant deux groupements hydroxyles est un composé anti-radicalaire plus efficace que l’acide coumarique,

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Résultats & discussion un monohydroxyle. Il est de même pour l’acide gallique qui est un trihydroxyle phénol plus efficace que le protocatéchique et l’acide gentisique (des dihydroxyles) (Brand-Williams et al., 1995).

2.1.3.2. Pouvoir réducteur Les propriétés réductrices indiquent que les composés antioxydants sont donneurs d’électrons et peuvent réduire les intermédiaires oxydants du processus de peroxydation lipidique et de cette façon les antioxydants peuvent agir comme antioxydants primaires et secondaires (Yen & Chen, 1995).

Le tableau 11 montre le pouvoir réducteur estimé en densité optique mesuré à 700 nm des concentrations d’extraits de 2000 µg/ml.

Les résultats obtenus par l’analyse statistique montrent que la capacité de nos extraits à réduire le fer est significativement supérieure (p<0,05) à celle de la vitamine E avec des valeurs comprises entre 0,06 et 1,59. Le pouvoir réducteur le plus élevé (p<0,05) est rapporté dans l’extrait éthanolique de C. compressa (DO=1,32), C. stricta (DO=1,59), E. compressa (DO=0,37), U. lactuca (DO=0,32) et aqueux de C. elongata (DO=0,37). Quant aux témoins positives le BHT et la vit C, ils ont montré un important pouvoir réducteur (DO=2,49 et 3,98, respectivement) comparé aux algues et la vit E (DO=0,08).

Les algues brunes du genre Cystoseira présentent en accord avec Luo et al. (2010), les plus fortes activités réductrices (p<0,05), avec une influence du solvant d’extraction. Alors que le plus faible pouvoir réducteur est enregistré chez E. compressa et U. lactuca (DO=0,06) dans les EAQ, obtenus par extraction au soxhlet. Le BHT présente une meilleure capacité réductrice par rapport aux différentes espèces d’algues (p<0,05). Quant à la vitamine E, elle a enregistré un faible pouvoir réducteur comparable à ceux d’E. compressa et U. lactuca dans les extraits aqueux (p<0,05).

Les extraits éthanoliques ont un pouvoir réducteur supérieur à ceux des extraits méthanoliques. Cho et al. (2010) ont également rapporté que la capacité réductrice la plus efficace est obtenue avec les extraits éthanoliques des algues vertes Enteromorpha compressa et Capsosiphon fulvescens.

L’éthanol est un solvant agréé par les industries en vue de sa sécurité. Ce qui rend donc l’utilisation par les industriels de ces algues, récoltées au niveau de la côte Ouest algérienne, plus intéressante.

110

Résultats & discussion

En comparaison avec le contrôle positive (BHT et vitamine E), nos résultats indiquent que la capacité réductrice de nos extraits est inférieure à celle du BHT et supérieure à celle de la vitamine E. Cela est également rapporté par Shanab et al. (2011) qui ont montré que la capacité à réduire le fer par le BHT est supérieure à celle de l’algue verte Enteromorpha compressa et Ganesan et al. (2008) et Cho et al. (2010) ont rapporté que la capacité réductrice de l’algue rouge Euchema kappaphycus et l’algue verte Enteromorpha compressa est supérieure ou comparable à celle de la vitamine E .

Tableau 11: Pouvoir réducteur des extraits d’algues, du BHT, vitamine C et vitamine E

Espèces Méthodes Pouvoir réducteur à 2000 µg/ml

d’extraction (Abs à 700 nm)

EM EE EAQ

C. compressa M 0,76 ± 0,04 β,d 1,32 ± 0,09 α,d 1,21 ± 0,05 α,c

S 0,39 ± 0,01 α,e 0,50 ± 0,03 α,e 0,25 ± 0,01 β,f

C. stricta M 0,87 ± 0,04 γ,d 1,26 ± 0,00 α,d 1,12 ± 0,01 β,d

S 1,20 ± 0,05 β,c 1,59 ± 0,04 α,c 0,40 ± 0,01 γ,e

C. elongata M 0,21 ± 0,01 α,f 0,22 ± 0,00 α,fg 0,24 ± 0,00 α,f

S 0,23 ± 0,01 β,f 0,27 ± 0,00 αβ,fg 0,37 ± 0,01 α,e

E. compressa M 0,32 ± 0,00 α,e 0,37 ± 0,00 α,f 0,08 ± 0,01 β,g

S 0,22 ± 0,02 α,f 0,17 ± 0,00 αβ,g 0,06 ± 0,00 β,g

U. lactuca M 0,13 ± 0,01 β,g 0,32 ± 0,14 α,f 0,07 ± 0,00 β,g

S 0,20 ± 0,00 α,f 0,30 ± 0,00 α,f 0,06 ± 0,00 β,g

BHT Témoin + 2,49 ± 0,04 b

VIT C Témoin + 3,98 ± 0,43 a

VIT E Témoin + 0,08 ± 0,02 g

Moyenne ± Ecart-type (n = 3). Sur chaque ligne, les valeurs moyennes marquées de lettres différentes (α-γ) indiquent des différences significatives (test de Tukey, P<0,05) entre solvants d’extractions. Sur chaque colonne, les valeurs moyennes marquées de lettres différentes (a-g) indiquent des différences significatives (test de Tukey, P < 0,05) entre les espèces d'algues. Macération (M) ; soxhlet (S) ; extraits méthanoliques (EM), extraits éthanoliques (ET) ; extraits aqueux (EAQ).

111

Résultats & discussion

Chez les cystoseires étudiées, le pouvoir réducteur est important, probablement dû aux teneurs élevées en polyphénols totaux. Selon Pulido et al. (2000), parmi les acides phénoliques l’acide caféique a un très bon pouvoir réducteur de fer. Cependant, chez les fucales, le pouvoir réducteur est attribué à la présence de fucoidanes (Rupérez et al., 2002). En effet, les chaînes polysaccharidiques possèdent un groupement terminal réducteur et un autre non réducteur. Il est rapporté par Matsukawa et al. (1997) et Rupérez et al. (2002) que les polysaccharides sulfatés des algues brunes ont une activité réductrice plus élevée que celle des galactanes des algues rouges.

Les algues étudiées sont donc une excellente source de composés bioactifs et possèdent une activité antioxydante potentiel, qui est significativement améliorée par le chauffage lors de l’extraction au soxhlet, à l’exception chez C. compressa. Alors qu’il est connu, que les constituants naturels peuvent être significativement perdus pendant le processus de chauffage, comme Jimenez-Escrig et al. (2001) l’ont rapporté (l’activité anti-radicalaire de l’algue brune Fucus diminue de 98% après séchage à 50°C pendant 48h), car la plupart des composés biologiquement actifs sont relativement thermolabiles.

En effet, les travaux de Rajauria et al. (2010) ont montré que le traitement par chauffage (à 85-95°C) a un effet stimulateur sur le contenu en polyphénols, flavonoïdes et tannins condensés et les activités antioxydantes naturelles des algues brunes. Parfois, le chauffage a le potentiel de produire de nouveaux composés qui ont une capacité antioxydante par la réaction de Maillard.

Yoshiki et al. (2009) ont relevé également une stimulation de l’activité antioxydante d’une fraction à faible poids moléculaire d’un extrait hydrosoluble de Porphyra yezoensis à une température de plus de 100°C. L’extrait s’est avéré contenir un composés déshydraté de porphyra-334 (qui est typiquement une mycosporine-like acido-amine), exerçant une IC50 très importante de 10,1 µg/ml, comparé à porphyra-334 ( 1000 µg/ml).

2.1.4. Analyse factorielle des correspondances -AFC-

Une analyse factorielle des correspondances (AFC) est réalisée afin de déterminer la relation qualitative entre les paramètres d’étude de l’activité antioxydante et les espèces d'algues.

L’AFC qui est due à Cordier (1965) et développée par Benzecri (1973) est une technique qui permet de décrire sous forme de graphique, le maximum de l’information contenue dans

112

Résultats & discussion un tableau rectangulaire de données qualitatives. Celles-ci proviennent de mesures faites sur deux groupes de caractères qui sont disposés l’un en lignes et l’autre en colonnes.

Le terme de correspondance provient du fait que l’on cherche la dépendance (ou encore la liaison) possible entre ces deux groupes de caractères.

Le choix des axes factoriels est articulé sur les valeurs propres, ainsi que l’inertie des axes.

Tableau 12: Valeurs propres et pourcentages de variance des facteurs.

Axe 1 Axe 2 Axe 3 Valeur propre 0,49 0,30 0,16 % variance 46,39 27,74 14,79 % variance cumulée 46,39 74,14 88,93

Une valeur discriminante est obtenue pour chaque paramètre après analyse factorielle. Cette dernière permet de classer les paramètres en fonction de leur spécificité aux groupes d'espèces (Figure 31).

Les deux plans factoriels (F1-F2) expliquent 46,39% et 27,75% de la variance des données, respectivement (Figure 31).

Le plan factoriel F1 montre une corrélation positive entre le taux de polyphénols et le pouvoir réducteur chez tous les extraits issus de la macération, de part leur localisation proche les uns des autres sur le coté droit du plan F1.

Ce plan factoriel F1 reste expliquer dans son coté positive par les paramètres TMH (+0,57) et TMT (+0,37). Ces deux paramètres sont caractérisés par un taux de polyphénols élevé, chez les extraits obtenus par macération à l’eau (MH) et à l’éthanol (MT). Ces paramètres se localisent à proximité de l’espèce Cystoseira compressa, ce qui suggère que son taux élevé de polyphénols contribue aux bonnes propriétés réductrices des extraits de cette espèce, obtenus par macération à l’eau ou à l’éthanol. Il est observé également chez cette espèce une corrélation positive entre les trois paramètres avec l’extrait MH.

Le plan factoriel F2 reste expliquer dans son coté positive par les paramètres TSH (+0,65), PSH (+0,45) et DSH (+0,19). Ces derniers expliquent la corrélation positive entre les trois paramètres : le taux de polyphénols, le pouvoir réducteur et l’activité antiradicalaire chez

113

Résultats & discussion l’extrait obtenu par soxhlet à l’eau. Ces paramètres se localisent à proximité de l’espèce Corallina elongata, ce qui suggère que l’activité antioxydante de l’extrait de C. elongata (SH) est principalement dûe aux polyphénols présents.

Toujours sur le plan factoriel F2, il est observé une corrélation entre la concentration en polyphénols et le pouvoir réducteur, chez les extraits obtenus par soxhlet à l’éthanol et méthanol, en particulier chez Cystoseira stricta.

CA factor map

0.8

TSH

0.6 PSH 0.4

8 CE9 7

0.2 TSM DSH PST DMH Dim 2 (27.75%) Dim2 PSM 4CS PMH TST 5 6 TMM TMH 0.0 PMM 3 DSM 1CC DMM 2 DST PMT 13 10 TMT -0.2 UL DMT 15 14 EC12 11

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

Dim 1 (46.39%)

Figure 31: Représentation graphique des résultats de l'AFC.

CC : Cystoseira compressa - CS : Cystoseira stricta - CE : Corallina elongata - EC : Enteromorpha compressa - UL : Ulva lactuca - TMM : Polyphénol-macération-méthanol - TMT : Polyphénol-macération-éthanol - TMH : Polyphénol-macération- eau - DMM : DPPH-Macération-méthanol - DMT : DPPH-Macération-éthanol - DMH : DPPH-Macération-eau - PMM : pouvoir réducteur-macération-méthanol - PMT : pouvoir réducteur-macération-éthanol - PMH : pouvoir réducteur- macération-eau - TSM : Polyphénol-soxhlet-méthanol - TST : Polyphénol-soxhlet-éthanol - TSH : Polyphénol-soxhlet-eau - DSM : DPPH-soxhlet-méthanol - DST : DPPH-soxhlet-éthanol - DSH : DPPH-soxhlet-eau - PSM : Pouvoir réducteur- soxhlet-méthanol - PST : Pouvoir réducteur-soxhlet-éthanol - PSH : Pouvoir réducteur-soxhlet-eau.

114

Résultats & discussion

Enfin, en considérant les deux plan factoriel F1-F2, de leurs cotés négatifs, il est retrouvé les paramètres DSM, DST et DMT, qui suggère une corrélation négative de l’activité antiradicalaire avec les autres paramètres. Il est à noter également que la proximité de ces paramètres des espèces d’algues vertes Ulva lactuca et Enteromorpha compressa explique que l’activité antiradicalaire soit similaire avec les trois types d’extractions.

De la figure 31, il est aussi possible de distinguer l’opposition qui existe entre les deux espèces appartenant au même genre, les cystoseires : C. compressa et C. stricta, ainsi qu’entre l’algue rouge C. elongata et les deux algues vertes. Mais également la conjonction entre les deux espèces d’algues vertes appartenant à la même famille des ulvacés : U. lactuca et E. compressa.

2.1.5. Classification Ascendante Hiérarchique (CAH)

La méthode de classification hiérarchique (CAH) vient compléter la méthode factorielle qui fournit une interprétation de cette dernière.

Par la méthode du « Clustering », il est possible d’effectuer une séparation. Ceci amènera par conséquent un groupement des paramètres d’une part et des espèces d’autre part (Figure 32). Une fois ces groupements effectués, il s’agit de faire une comparaison et de voir quelles sont les correspondances entre les différents groupements obtenus.

Dans notre cas et selon les dendrogrammes obtenus, ce sont deux groupes de paramètres qu’il est possible de faire ressortir, ainsi que quatre sous-groupes entre autre.

D'aprés le premier sous-groupe, une relation trés étroite est déduite entre le taux de polyphénols totaux et le pouvoir réducteur, ensuite dans un deuxième temps une corrélation de ces deux paramètres avec l'activité antiradicalaire (TSH-PSH-DSH) et ceux avec l'extrait aqueux obtenu par soxhlet, mais également que l'activité antiradicalaire de cet extrait est similaire à celle obtenus par l'extrait aqueux macéré (DMH).

Du deuxième et troisième sous-groupe, une relation trés étroite est déduite entre le taux de polyphenols totaux et le pouvoir réducteur des extraits issus de la macération dans les trois solvants, ainsi que les extraits issus de l'extraction éthanolique et méthanolique par soxhlet.

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Résultats & discussion 0.030 Hierarchical Clustering 0.015

Hierarchical Classification 0.000

0.035 inertia gain 0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 TST PST PSH TSH DST DSH TMT PMT TSM PSM TMH PMH DSM DMT DMH TMM PMM DMM

Figure 32: Classification hiérarchique des paramètres.

Finalement le dernier sous-groupe des DSM, DMT et DMM reste exclusif par rapport aux autres sous groupes, ces paramètres sont complètement dissociés (Figure 32).

De précédentes études ont aussi montré une corrélation positive entre le taux de polyphénols totaux et l’activité antioxydante de différents extraits d’algues (Sabeena Farvin & Jacobsen, 2013 ; Pinteus et al., 2017).

Par déduction, les meilleurs contenus en composés phénoliques et activités antioxydantes sont ceux des extraits d’algues brunes appartenant au genre Cystoseira, dont les méthodes d’extraction et les solvants les plus efficaces semblent être : l'extraction par soxhlet en présence d’éthanol (C. stricta) ou la macération dans l’eau ou l’éthanol (C. compressa). Ces espèces d’algues peuvent donc servir de très bonnes sources d’antioxydants biologiques naturels.

116

Résultats & discussion

2.2. Efficacité d'un extrait éthanol-aqueux combiné de Cystoseira compressa sur l’amélioration de la qualité du chinchard commun Trachurus trachurus

2.2.1. Evolution temporelle de la qualité microbiologique post mortem L’évolution temporelle de la charge bactérienne, représentée par la flore mésophile aérobie totale (FMAT), les psychrotrophes, les entérobactéries, les flores protéolytiques et lipolytiques, du chinchard commun réfrigéré entreposé dans de la glace traitée par un extrait algal sont reprises dans les tableaux 13 et 14.

2.2.1.1. Flore mésophile aérobie totale (FMAT) et psychrotrophes La flore mésophile aérobie totale (FMAT) est déterminée dans les trois lots (Tableau 13). Les deux lots (CAF et CAE), contenant l’extrait algal de C. compressa permettent un meilleur contrôle de ce groupe microbien comparativement au lot témoin. Ainsi, des différences significatives (p<0,05) sont déterminées entre les lots CAF, CAE et le lot témoin au 7ème et 11ème jour. La différence entre les lots atteint un maximum de 2 log cfu/g au 11ème jour, cela révèle 99% de réduction des aérobies dans le lot CAF, grâce à l’effet antimicrobien de l’algue.

En ce qui concerne les psychrotrophes, l’effet antimicrobien de la présence de l’extrait de l’algue a aussi fournit un effet de protection contre ces microorganismes (Tableau 13). Ainsi, chaque lot traité par l’extrait, que ce soit à concentration faible ou élevée présente un nombre de psychrotrophes significativement (p<0,05) plus faible que le lot témoin. La différence en nombre de microorganismes atteint un maximum de 1,68 log cfu/g au 11ème jour dans le lot CAF. Ce qui est particulièrement intéressant, c’est que le lot contenant une faible concentration d’algue dans la glace présente au moins un effet bénéfique similaire à celui du lot contenant la concentration la plus élevée, cela indique que les teneurs en composés antimicrobiens dans le lot CAF sont suffisantes afin de procurer une protection significative contre la croissance microbienne dans la chair du chinchard commun.

117

Résultats & discussion

Tableau 13: Dénombrement de FMAT et des psychrotrophes (log CFU/g muscle) dans le muscle du chinchard commun réfrigéré sous différentes conditions.

Durée de Flore mésophile aérobie totale (FMAT) Psychrotrophes conservation Témoin CAF CAE Témoin CAF CAE (Jours)

0 4,48 ± 0,40 4,67 ± 0,46

4 6,13 ± 0,69 a 4,72 ± 0,17 b 5,09 ±1,17 ab 6,45 ± 0,90 a 5,22 ± 0,33 b 5,05 ± 0,37 b

7 6,34 ± 0,65 a 5,14 ± 0,23 b 5,21 ± 0,37 b 7,21 ± 0,36 a 5,78 ± 0,07 b 6,09 ± 0,37 b

11 7,90 ± 0,55 a 5,90 ± 0,53 b 6,70 ± 0,33 b 8,51 ± 0,02 a 6,83 ± 0,53 b 7,01 ± 0,54 b

Moyenne ± Ecart-type (n = 3). Sur chaque ligne, les valeurs moyennes marquées de lettres différentes (a, b) indiquent des différences significatives (test de Tukey, P < 0,05), en termes d’effet des conditions de réfrigération. Les abbréviations: CAF et CAE (lots : Concentration Algale Faible et Concentrations Algale Elevée, respectivement).

118

Résultats & discussion

2.2.1.2. Entérobactéries La recherche des entérobactéries dans tous les trois lots ont montré au 4ème jour, un effet inhibiteur (p<0,05) sur ce groupe microbien, provoqué par la présence de chaque extraits dans la glace (Tableau 14). Au-delà, les différences entre lots ne peuvent être considérées comme significatives (p≥0,05); néanmoins en termes de valeur absolue, la croissance des entérobactéries dans le lot CAF et dans une moindre mesure dans le lot CAE, est ralentie par la présence de l’extrait de C. compressa pendant la réfrigération. Les nombres de ce groupe microbien sont en dessous de 4 log cfu/g dans les lots témoins et CAE et encore plus faible, en dessous de 3 log cfu/g dans le lot CAF; on en déduit que le taux en entérobactéries peut être considéré comme faible dans les trois lots.

2.2.1.3. Microorganismes d’altération spécifique Le tableau 14 résume les résultats de la recherche des microorganismes d’altération spécifique (MAS) présentant les phénotypes protéolytiques ou lipolytiques dans la chair du chinchard commun. Encore une fois, comme avec les autres groupes microbiens considérés dans cette étude, la présence de l’extrait d’algue de C. compressa dans la glace exerce un effet de protection en ce qui concerne le développement et la croissance des MAS. En ce sens, les bactéries présentant un phénotype protéolytique sont inhibées dans les lots CAF et CAE, comparés au lot témoin. Ainsi, des différences significatives (p<0,05) entre les lots contenant ou non l’extrait d’algue sont enregistrées, tout les jours d’échantillonnage (4-11 jours). La différence atteint un maximum de 1,47 log cfu/g pour les bactéries protéolytiques au 11ème jour dans le CAE.

En ce qui concerne, les bactéries lipolytiques, c’est une préoccupation majeure dans le cas d’espèces de poissons semi-gras telle que le chinchard commun. L’incorporation de l’extrait de C. compressa dans la glace des lots CAE et CAF, conduit également à une croissance moyenne faible de ce groupe de MAS comparée au témoin; les différences sont significatives au 7ème jour dans le lot CAE et pendant toute la période de conservation dans le lot CAF. Les différences maximales atteintent entre le témoin et les lots CAF et CAE sont de 1,66 et 1,59 log cfu/g, respectivement au 7ème jour. Les résultats laissent conclure que l’altération microbienne causée à la chair du chinchard, par des protéases extracellulaires microbiennes et des lipases, peut être limitée par l’incorporation des composés antimicrobiens présents dans l’extrait d’algue.

119

Résultats & discussion

Tableau 14: Dénombrement des entérobactéries, des bactéries protéolytiques et lipolytiques (log CFU/g muscle) dans le muscle du chinchard commun réfrigéré sous différentes conditions.

Durée de Entérobactéries Protéolytiques Lipolytiques conservation Témoin CAF CAE Témoin CAF CAE Témoin CAF CAE (Jours)

0 1,07 ± 0,12 2,69 ± 0,27 2,26 ± 0,24

4 2,74 ± 0,23 a 1,70 ± 0,17 b 1,78 ± 0,16 b 5,76 ± 0,25 a 5,09 ± 0,23 b 5,05 ± 0,37 b 5,04 ± 0,39 a 4,22 ± 0,39 b 4,28 ± 0,54 ab

7 2,13 ± 0,31 a 1,56 ± 0,31 a 1,63 ± 0,35 a 6,51 ± 0,18 a 5,13 ± 0,18 b 5,53 ± 0,50 b 6,02 ± 0,17 a 4,36 ± 0,39 b 4,43 ± 0,23 b

11 3,88 ± 0,89 a 2,92 ± 0,60 a 3,09 ± 1,21 a 8,09 ± 0,36 a 6,95 ± 0,42 b 6,62 ± 0,50 b 6,73 ± 0,09 a 5,20 ± 0,35 b 6,51 ± 0,94 ab

120

Résultats & discussion

En dépit des nombreuses informations dont on dispose sur l’activité antimicrobienne in vitro des algues brunes, les applications pratiques de ces extraits algaux dans le cadre de la conservation des produits de la pêche restent rares.

Dans la présente étude, les extraits de Cystoseira sont pour la première fois incorporés dans de la glace pour la conservation réfrigéré d’espèces de poissons marins. Au vue des résultats, les extraits combinés de cette algue C. compressa ont montré qu’ils exercent un remarquable effet antimicrobien sur la flore mésophile aérobie total, les psychrothrophes et les bactéries protéolytiques et lipolytiques, ainsi que quelques effets inhibiteurs sur le taux d’entérobactéries. Il est à noter que de très rares différences peuvent être décrites entre individus correspondant à chaque concentration d’extrait algal.

La fonte des cristaux de glace contenant l’extrait de cette algue peut exercer un effet lavant qui réduit la charge microbienne à la surface du poisson et limite la diffusion des microorganismes aux muscles.

La présence des composés naturels à activité antimicrobienne est répandue chez les macroalgues et une large gamme de métabolites ont été isolés et caractérisés. Les composés antimicrobiens clés identifiés chez les macroalgues sont les acides gras (Ara et al., 2005), les composés lipophiliques, les lectines (Cordeiro et al., 2006), les métabolites secondaires principalement acétogènes, terpènes, alcaloïdes et les composés phénoliques, dont beaucoup sont halogénés (Watson & Cruz-Rivera, 2003 ; Devi et al, 2008), les métabolites isoprénoides (Paul & Puglisi, 2004) et le peroxyde d’hydrogène (Mohamed et al., 2012).

Leur effet antimicrobien se traduit par leur action dans plusieurs mécanismes, tels que l’inhibition des enzymes microbiennes extracellulaires, privation en substrats nécessaire pour la croissance microbienne, action directe sur le métabolisme microbien par l’inhibition de la phosphorylation oxydative et la complexation des ions métalliques dans l’environnement de croissance microbienne (Sandsdalen et al., 2003 ; Smit, 2004).

Concernant le genre Cystoseira, on compte que quelques études sur l'activité antimicrobienne in vitro. Ainsi, l’extrait méthanolique de C. hakodatensis a montré un effet inhibiteur sur la croissance de Bacillus cereus et Bacillus licheniformis, en expérimentation in vitro, où les majeurs agents antimicrobiens ont été isolés dans la fraction hydrophobique de l’extrait (Jun et al., 2015). Bennamara et al. (1999) ont montré une activité antifongique et antibactérienne due à la présence de Methoxybifurcarenone chez C. tamariscifolia. De plus, Andrade et al. (2013) ont prouvé que C. tamarisfolia, C. nodicaulis et C. usneoides sont

121

Résultats & discussion parmis les espèces d’algues les plus actives contre l’activité des enzymes à importance biologique; cet effet est expliqué par la présence de teneurs élevées en phloroglucinole, mannitol, fucostérol et en acides oléique, arachidonique et eicosapentaenoique.

Concernant d’autres algues brunes, l’incorporation dans la glace d’un extrait éthanol- aqueux de Fucus spiralis (Barros-Velázquez et al., 2016) et d'un extrait éthanolique de Bifurcaria bifurcata (Miranda et al., 2016) a conduit à une inhibition marquée de l’activité microbienne dans la chair du merlu (Merluccius merluccius) et chez la cardine franche (Lepidorhombus whiffiagonis) pendant la conservation sous réfrigération.

2.2.2. Evolution de la qualité biochimique du chinchard au cours de sa conservation Selon Nunes et al. (1992), au cours de la conservation, différentes réactions biochimiques ont eu lieu induisant la formation d’amines et d’hypoxantine, d’acides gras libres, de composés volatils et des modifications physico-chimiques du muscle.

2.2.2.1. Evaluation chimique de l’activité microbienne

a) pH

La valeur initiale du pH du muscle du chinchard est de 5,99. Une augmentation progressive du pH au cour de la conservation est observée, cela est en accord avec l’évolution des mécanismes de dégradations microbiennes (Figure 33).

La comparaison entre les lots révèle peu de différences significatives. Cependant et en accord avec les résultats mentionnés ci-dessus concernant la charge en microorganismes d’altération, des valeurs moyennes élevées sont obtenues pendant toute l’expérimentation chez les échantillons du lot témoin. Par conséquent, un effet inhibiteur sur l’augmentation du pH est exercé par la présence de l'extrait de C. compressa dans la glace.

L’augmentation de la valeur de pH du muscle du poisson indique l’accumulation de composés basiques tels que l’NH3, la TMA, la DMA, les peptides et les amines, issus principalement des métabolismes bactériens (Sandsdalen et al., 2003 ; Tokur et al., 2004). Miranda et al. (2016) ont rapporté une inhibition de l’augmentation du pH du muscle de la cardine franche réfrigérée (Lepidorhombus whiffiagonis), lors de l’incorporation de l’extrait éthanolique de B. bifurcata dans la glace.

122

Résultats & discussion

6,8 a 6,6 a a a a 6,4 b a ab

pH 6,2 a TEMOIN CAF 6 CAE 5,8

5,6

5,4 0 4 7 11 Durée de conservation (Jours)

Figure 33: Evolution temporelle du pH chez le chinchard commun du lot témoin, CAF et CAE. Les histogrammes (du même jour de conservation) portant des indices différents sont significativement différents (p<0,05).

b) Teneur en Triméthylamine

Le chinchard fraîchement prélevé contient une faible concentration en TMA de 0,23 ± 0,03 mg N-TMA/kg de muscle (Figure 34). Les résultats démontrent que l’évolution des concentrations de TMA est linéaire en fonction du temps indépendamment des lots de poissons. L'analyse a montré une inhibition significative (p<0,05) chez les échantillons de chaque lot algal pour la période 4-7 jours. A une période de conservation plus avancée, seulement le lot CAE a montré un effet inhibiteur.

La tendance de la production du TMA pendant la conservation dépend de la croissance des bactéries d’altérations. Ces dernières se servent de la TMAO comme substrat en conditions d’anaérobie et le réduisent en TMA induisant des odeurs désagréables chez le poisson (Seibel & Walsh, 2002).

Les concentrations du TMA obtenues sont en accord avec les valeurs mentionnées précédemment, concernant l’inhibition du développement microbien par l’algue présente dans la glace. L’analyse du contenu en TMA a donc prouvé l’effet inhibiteur, résultat de la présence de C. compressa dans la glace. Un effet inhibiteur sur la formation du TMA a été aussi observé chez la cardine franche réfrigérée conservée dans de la glace contenant l’extrait éthanolique de B.bifurcata (Miranda et al., 2016).

123

Résultats & discussion

60 b 50

b 40

TEMOIN 30 TMA/kg de muscle) TMA/kg

- CAF 20 a CAE

(mg N (mg b

N a - 10 b a

MA a

T a 0 0 4 7 11 Durée de conservation (Jours)

Figure 34: Evolution temporelle du la teneur en TMA (mg N-TMA/kg de muscle) chez le chinchard commun, du lot témoin, CAF et CAE. Les histogrammes (du même jour de conservation) portant des indices différents sont significativement différents (p<0,05).

2.2.2.2. Évaluation chimique de la dégradation des lipides

a) Teneur en acides gras libres

L’hydrolyse des lipides est mesurée par l’analyse de la teneur en AGL. A J0, la chair du chinchard présente une teneur en AGL de l’ordre de 5,43 ± 1,08 mg AGL/kg de muscle. Dans tous les échantillons, une augmentation de la formation d’acides gras libres (AGL) pendant le temps de conservation peut être observée (Figure 35).

La comparaison a montré un taux d’AGL significativement élevé chez le chinchard du lot témoin par rapport aux lots traités, pendant toute la période de conservation. Néanmoins, aucune différence ne peut être décrite entre les lots contenant les extraits d’algues. Ainsi, un effet inhibiteur lors de l’utilisation des différentes concentrations algales (lots CAF et CAE) est enregistré sur la formation des AGL. Ce résultat est en accord avec ceux du développement de l’activité microbienne, où un effet inhibiteur de l’extrait d’algue sur le développement microbien est détecté.

En effet, la formation d’AGL par la lipolyse dans la présente expérimentation peut être considérée comme le résultat de l’activité d’enzymes endogènes et de l’activité microbienne (Campos et al., 2012). Avant la fin de la phase logarithmique microbienne (autours de 6-9 jours), la formation d’AGL est le résultat de l’activité des enzymes endogènes (lipases et

124

Résultats & discussion phospholipases). Après cette période, l’activité microbienne devient plus importante et les AGL sont produits par les processus cataboliques bactériens.

Dans la présente étude, les teneurs élevées relevées dans les poissons témoins pendant la période 7-11 jours correspondent à la période de conservation où l’activité microbienne est devenue importante dans le muscle du poisson. Pendant cette période, une remarquable inhibition de la formation d’AGL est détectée dans les lots de poissons contenant l’extrait de C. compressa. Une inhibition de la production d’AGL est également observée chez la cardine franche réfrigérée conserver dans de la glace contenant l’extrait éthanolique de B.bifurcata (Miranda et al., 2016), aussi bien que l’extrait éthanol-aqueux de F. spiralis (Barros- Velázquez et al., 2016).

50 b 45 40 35 b

/kg de muscle) /kg 30 25 TEMOIN 20 CAF libres (mg libres 15 a CAE 10 b a a a a a 5

Acides gras Acides 0 0 4 7 11 Durée de conservation (Jours)

Figure 35: Evolution temporelle de la teneur en AGL (mg/kg de muscle) chez le chinchard commun, du lot témoin, CAF et CAE. Les histogrammes (du même jour de conservation) portant des indices différents sont significativement différents (p<0,05).

b) Teneurs en produits primaires, secondaires et tertiaires

Le suivi de l’oxydation des lipides est un outil indispensable dans l’évaluation de la qualité du poisson (Melton, 1983). Cependant, les produits de l’oxydation des lipides interagissent rapidement avec d’autres constituants qui ne sont pas sensibles au dosage (Aubourg et al., 2007). Le développement de l’oxydation lipidique primaire, secondaire et tertiaire dans le muscle du chinchard commun est mesuré par l’analyse du contenu en peroxydes, en TBARS et composés fluorescents.

125

Résultats & discussion

À quelques exceptions, nous remarquons une augmentation de la teneur en peroxydes, dans tous les lots, pendant la période de conservation (Figure 36). Aucune différence significative (p≥0,05) n’est détectée entre les lots. Cependant, la teneur en peroxydes dans le lot témoin atteint rapidement (p<0,05) un maximum à J7 (2,92 ± 1,69 meq oxygène actif/kg de lipides), suivie d’une diminution (p<0,05) à J11 (1,49 ± 0,83.). Alors que dans les lots CAF et CAE, la concentration en peroxydes augmente pour atteindre à J11 une valeur maximale comparable à celle du lot témoin au J7. Il apparait donc un ralentissement du processus de propagation de ces composés d’oxydation primaire par la glace traitée.

La baisse des peroxydes est due à leurs interactions avec des constituants biologiques ou leur décomposition en produits secondaires (Aubourg, 1999 ; Undeland, 2001). A cet effet, nous pouvons conclure que la cinétique de formation des hydroperoxydes varie considérablement en fonction de la teneur en lipides, les espèces à taux de lipides élevé, présentent une augmentation brutale de la concentration en peroxydes et une décomposition rapide (Undeland et al., 1999). En plus de l’effet préservateur des basses températures, les algues brunes notamment C. compressa sont riches en caroténoïdes, qui sont considérés comme des antioxydants naturels et d'excellents agents piégeurs du radical hydroxyl et peroxyl, ainsi que de l’oxygène singulet (Stahl & Sies, 1997).

actif/kg LP) actif/kg 4

3 TEMOIN CAF eq oxygène eq 2 CAE

Peroxydes (m Peroxydes 0 0 4 8 12 Durée de conservation (Jours)

Figure 36: Evolution temporelle de la teneur en peroxydes (meq oxygène actif/kg de lipides) chez le chinchard commun du lot témoin, CAF et CAE. Les histogrammes (du même jour de conservation) portant des indices différents sont significativement différents (p<0,05).

126

Résultats & discussion

Concernant l’oxydation lipidique secondaire, une augmentation marquée de la formation des TBARS dans tous les lots est constatée pendant la période 0-7 jours (Figure 37).

Bien qu’une seule différence significative n'est été détectée qu’au J7 entre les lots témoin et

CAE, les poissons du lot témoin enregistrent un pic de formation de ces composés au J7 (1,84 ± 0,28 mg MDA/kg de muscle), suivie d'une légère diminution (p≥0,05). Ce schéma d’évolution a été déjà observé par Oucif (2011), chez le Trachurus mediterraneus réfrigéré.

Alors que, les poissons correspondant au lot CAE et CAF ont montré une augmentation (p<0,05) de ces composés d’oxydation pour atteindre une valeur maximale comparable à celle du lot témoin qu’au J11. Cette comparaison fournit une information sur le ralentissement de l’oxydation secondaire de la glace traitée par l'algue.

2,5

1,5 TEMOIN 1 CAF MDA/kg de muscle MDA/kg CAE

0,5 TBA (mg TBA - i 0 0 4 8 12 Durée de conservation (Jours)

Figure 37: Evolution temporelle de l’indice de TBA (mg MDA/kg de muscle) chez le chinchard commun du lot témoin, CAF et CAE. Les histogrammes (du même jour de conservation) portant des indices différents sont significativement différents (p<0,05).

Le suivie de l’oxydation lipidique tertiaire est réalisé par le suivie de la formation des composés fluorescents (ratio de fluorescence). Une formation progressive des composés fluorescents en fonction du temps de conservation peut être observée pour tous les lots (Figure 38). La comparaison parmi les lots ne fournit que de rares différences significatives. Cependant, aux différents jours de conservation, les spécimens de poissons du lot témoin enregistrent le ratio (RF) moyen le plus élevé, donc un effet inhibiteur sur la formation de ces composés d’oxydation peut être conclu.

127

Résultats & discussion

2 a 1,8 1,6 a 1,4 1,2 a b 1 ab TEMOIN b b CAF 0,8 a 0,6 a CAE 0,4 Ratio de fluorescencede Ratio 0,2 0 0 4 7 11 Durée de conservation (Jours)

Figure 38: Evolution temporelle des composés fluorescents chez le chinchard commun du lot témoin, CAF et CAE. Les histogrammes (du même jour de conservation) portant des indices différents sont significativement différents (p<0,05).

L’inhibition de l’oxydation lipidique observée peut être expliqué par le fait que les algues brunes produisent une large gamme de composés antioxydants, notamment les polyphénols, les phycocyannines et les caroténoides (Sabeena Farvin & Jacobsen, 2013 ; Maharan et al., 2015 ; Tenorio-Rodríguez et al., 2017). Parmis eux, les phlorotannins, composés polyphénoliques formés d’oligomères et polymères de phloroglucinol (1,3,5-trihydroxy benzène), qui représentent le groupe le plus important de polyphénols chez les algues brunes (Zou et al., 2008 ; Tierney et al., 2010), et la fucoxanthine mentionnée comme le caroténoïde dominant chez les algues brunes (Dembitsky & Maoka, 2007).

De précédentes études in vitro de l’effet antioxydant de différentes espèces appartenant au genre Cystoseira ont démontré leur efficacité.

En effet, C. tamariscifolia a montré une forte activité chélatrice, attribuer aux phlorotannins présents dans l’extrait méthanolique (Custódio et al., 2016). Les extraits éthanoliques de C. Tamariscifolia, C. nodicaulis et C. usneoides ont aussi montré de puissantes réponses contre la formation de radicaux libres, expliquées par les hautes teneurs en phloroglucinole, mannitol, fucostérol et en acides oleique, arachidonique et eicosapentaenoique (Andrade et al., 2013). Alors que, Fisch et al. (2003) ont démontré que les

128

Résultats & discussion activités antioxydantes et anti-radicalaires de C. crinita sont dues à la présence de Prényltoluquinones.

De plus, une forte activité antioxydante est aussi rapportée avec des extraits de C. tamarisfolia (Zubia et al., 2009) et C. hakodatensis (Airanthi et al., 2011), due pas seulement à la teneur élevée en composés phénoliques, mais aussi à la présence de fucoxanthine. Enfin, des extraits aqueux et éthanoliques de C. barbata, incorporés dans un film de gélatine de peau de thon ont provoqué une augmentation de la capacité réductrice du Fer, et de l’effet de piégeage sur la formation du radical libre DPPH (Haddar et al., 2012).

Concernant d’autres algues brunes, des glaces traitées par l’extrait éthanolique et aqueux combiné de F. spiralis (Barrios-Velázquez et al., 2016), et par l’extrait éthanolique de B. bifurcata (Miranda et al., 2016) ont montré un effet inhibiteur sur le développement de l’oxydation lipidique (la formation des composés fluorescents), chez le merlu et la cardine franche réfrigérée, respectivement. De même que l'extrait aqueux-éthanolique (à 50%) de l’algue rouge Polysiphonia fucoides s'est révèlé efficace sur le ralentissement du développement de l’oxydation lipidique chez du maquereau commun (Scomber scombrus) hacher (Babakhani et al., 2015).

129

Résultats & discussion

3. Etude de l'influence de fractions algales enrichies sur la régulation de la croissance et du métabolisme des microalgues

3.1. Obtention d’une fraction enrichie en régulateurs de croissance végétale (PGR) La préparation d’une fraction concentrée en PGR présents et actifs en faibles concentrations dans le tissu algal, nécessite une technique efficace et sensible. En effet, la méthode idéale est d’isoler les composés cibles de la matrice végétale en réduisant ou éliminant les composés interférents coexistant dans l’échantillon et en concentrant l’analyte.

La procédure typique pour la détermination des phytohormones dans les tissus végétaux comprend l’homogénéisation, l’extraction et la purification.

Pendant l’étape de l’homogénéisation, l’échantillon doit être conserver à basse température, pour éviter la dégradation chimique ou le changement métabolique de l’hormone d’intérêt (Pan et al., 2010).

Pour l’extraction, le solvent Bieleski (méthanol/eau/acid formique) (Bieleski, 1964) est préconisé car il permet de prévenir la dégradation des hormones végétales et bloque l’extraction de plusieurs lipides (Giannarelli et al., 2010).

En ce qui concerne la purification, une variété de nouvelles techniques de micro- extractions ont peu à peu remplacé les techniques traditionnelles (l’extraction liquide-liquide, LLE et l’extraction en phase solide, SPE). A titre d’exemple : l’analyse des phytohormones par la microextraction en phase solide (SPME) est rapportée par Zadra et al. (2006) et Liu et al. (2007). La microextraction en phase liquide avec fibre creuse (HF-LPME) est utilisée pour mesurer plusieurs phytohormones dans de la noix de coco (Wu & Hu, 2009). Parmi ces techniques, il existe aussi la microextraction liquide-liquide dispersive (DLLME), une méthode développée par Razaee et al. (2006) qui contrairement à la SPME ou l’HF-LPME, présente beaucoup d’avantages et un mode opératoire trés simple.

En effet, la méthode DLLME choisie dans ce travail est qualifiée de très simple, rapide et ne nécessite que de petites quantités de matériel végétal. C’est aussi une technique très peu couteuse car elle ne nécessite ni de grande quantité de solvants organiques, ni de purification sur colonne. Elle permet de purifier et concentrer les PGRs, même à très faible concentration.

La méthode de prétraitement par DLLME avec HPLC couplé au détecteur Ultraviolet (UV) est aussi employée pour l’analyse des hydrocarbures aromatiques polycycliques (Xu et al., 2009), des substances psycotropes (Xiong et al., 2009) et des pesticides organophosphorés

130

Résultats & discussion

(Berijani et al., 2006). Elle est également utilisée dans d’autres études afin de concentrer, des Rhodamines (Biparva et al., 2010), du cadmium (Jahromi et al., 2007), du plomb (Naseri et al., 2008), des phtalates (Liang et al., 2008), des herbicides Sulfonylurée (Wu et al., 2009), des Triazines (Wang et al., 2010), des Méthomyls (Wei et al., 2007), du thiomphénicol et du chloromphénicol (Chen et al., 2009).

De plus, cette méthode a permis d’extraire des phytohormones (molécules hydrophobes) de matériel végétal dans de précédentes études, en l'occurence à partir d'algues avec des résultats satisfaisants.

En effet, Lu et al. (2010a) ont pour la première fois démontré avec succès que la DLLME combinée à l’HPLC-FLD est une méthode sensible de pré-concentration pour la détection des auxines IAA, IBA, IPA et NAA, à partir de Chlorella vulgaris (algue verte unicellulaire). Selon Gupta et al. (2011), la DLLME combinée à l’HPLC-UV a permis également d’extraire les principales classes de régulateurs de croissance végétales l’IAA, IBA, ABA, GA3, KR et SA, dans des extraits d’algues vertes d’Ulva fasciata, U. lactuca, U. linza, U. reticulata et U. taeniata.

Luo et al. (2013) ont aussi appliqué avec succés la DLLME combinée à une GC-MS pour l’analyse de 11 phytohormones (BA, PAA, 4-CPA, SA, 2,4-D, NAA, HPA, IAA, IPA, IBA, ABA) d’extraits de plantes (riz et concombre). Lu et al. (2015) ont détecté par DLLME-LC- ITMS la présence de SA et ABA dans des fruits (pêche).

Dans cette étude, à l’issu de l’extraction et l’étape de prétraitement et d’enrichissement par la microextraction liquide-liquide dispersive (DLLME), un pool de 75 µl est obtenu à partir de 0,2g d’algue (Figure 39 et 40). Cette étape de fractionnement permet d’éliminer un certain nombre de composés autres que les hormones et d’obtenir une fraction organique concentrant probablement des pigments, certains lipides et polyphénols, des terpènes et des hormones.

131

Résultats & discussion

Figure 39: Extraction à partir de l’algue Cystoseira stricta.

Figure 40 : Phase sédimentée récupérer à l’issu du prétraitement par DLLME.

3.2. Effet des fractions algales enrichies sur la croissance de Nannochloropsis gaditana

Après une incubation de 5 jours, l'effet des extraits des macroalgues Cystoseira compressa, Cystoseira stricta, Corallina elongata, Enteromorpha compressa et Ulva lactuca sur la croissance d’une microalgue Nannochloropsis gaditana est évalué par dénombrement des cellules algales pendant la culture. Les courbes de croissance de la microalgue traitée par différentes concentrations des fractions algales sont présentées dans la figure 41.

Les résultats obtenus montrent une stimulation significative de la croissance vis-à-vis de Nannochloropsis gaditana, de toutes les fractions algales, aux concentrations testées de 0,05% et 0,1%. Avec des augmentations de la biomasse cellulaire par rapport au témoin au jour 4 de 75,5-163% (C. compressa), 44,8-143% (C. stricta), 55,1-90,2% (C. elongata), 59,1- 75,6% (E. compressa) et 48,9-68,2% (U. lactuca), aux concentrations de 0,05% et 0,1%, respectivement.

132

Résultats & discussion

La fraction de C. compressa à la concentration de 0,2% enregistre encore une légère augmentation du nombre de cellules de l’ordre de 2,1%, et une diminution de la biomasse microalgale de 14,5% qu’à la concentration de 0,4%. Alors qu'avec les autres fractions algales, la densité cellulaire enregistrée est faible au jour 4, aux deux concentrations de 0,2 et 0,4% comparé au témoin; avec une diminution de 8,4-19,7%, 26,3-21,8%, 20-82,2% et 57,8- 84,3% avec C. stricta, C. elongata, E. compressa et U. lactuca, respectivement.

Il est donc clair que le meilleur effet stimulateur de la croissance de Nannochloropsis gaditana est obtenu lors du traitement de la culture à la concentration de 0,05 et 0,1% avec la fraction de C. compressa (p<0,05), alors qu’un ralentissement de la croissance de la microalgue est observée sous l’effet de la concentration de 0,2% des extraits de : C. stricta, C. elongata, E. compressa et U. lactuca. En ce qui concerne les traitements algaux aux concentrations de 0,4%, deux tendances sont observées:

 Un ralentissement par les espèces : C. compressa, C. stricta et C. elongata.  Une inhibition par les fractions de E. compressa et U. lactuca.

L’absence de travaux testant de telles fractions enrichies obtenues par la méthode suivie dans cette étude, rend difficile toute comparaison.

Néanmoins, selon Hunt et al. (2010), le traitement d’une culture de Chlorella sorokiniana avec 250 ppm (0,25 g/L) d’extrait brute de Kelp (algue brune) a un effet inhibiteur et réduit la productivité de 44%. Cette diminution est probablement due à l’augmentation de la turbidité du milieu affectant ainsi la pénétration de la lumière, ou de la présence de molécules qui peuvent être des inhibiteurs de microalgues.

Chez divers groupes d'algues, certains composés sont détectés à plusieurs reprises, qui ont inhibé la croissance des plantes lors d'essais biologiques. Au moins un composant de ce complexe inhibiteur a été isolé de l'algue verte Enteromorpha compressa et étudié. Ce composant a été identifié comme étant l'acide lunularique. Il se pourrait que le complexe inhibiteur de croissance présent dans divers groupes d'algues comprenne plusieurs composants, y compris l'acide lunularique, l'ABA et l'acide salicylique (Tarakhovskaya et al., 2007).

133

Résultats & discussion

Témoin Témoin 100 C. compressa 0,05% 120 C. compressa 0,1% 90 C. stricta 0,05% C. stricta 0,1% C. elongata 0,05% C. elongata 0,1% 100 80 E. compressa 0,05% E. compressa 0,1% U. lactuca 0,05% U. lactuca 0,1% Cellule /ml) Cellule 70 /ml) Cellule 5 5 80 60 50 60 40 30 40 cellulaire (x (x 10 cellulaire (x 10 cellulaire

é 20 20 10

Densit 0 Densité 0 Jours Jours J0 J1 J2 J3 J4 A J0 J1 J2 J3 J4 B Témoin 120 Témoin 120 C. compressa 0,2% C. compressa 0,4% C. stricta 0,2% C. stricta 0,4% 100 C. elongata 0,2% 100 C. elongata 0,4% E. compressa 0,2% E. compressa 0,4%

Cellule /ml) Cellule U. lactuca 0,2% /ml) Cellule U. lactuca 0,4% 5 80 5 80

60 60 laire (x (x 10 laire 40 40 cellu (x 10 cellulaire 20 20

Densité 0 Densité Jours 0 Jours J0 J1 J2 J3 J4 J0 J1 J2 J3 J4 C D

Figure 41: Effets de différentes concentrations des fractions algales sur la croissance de Nannochloropsis gaditana, (A) 0,05%, (B) 0,1%, (C) 0,2% et (D) 0,4%. Chaque point représente la moyenne ± ET d’un triplicata.

134

Résultats & discussion

De plus, seules quelques études ont concerné l'activité algicide d'extraits organiques bruts de macroalgues, traitant à des concentrations très élevées des microalgues. Hellio et al. (2002) n’ont pas obtenu d'inhibition de l’extrait brut au dichlorométhane d'Ulva lactuca à 30 µg/ml sur Tetraselmis sp. (Chlorophycée), comme pour U. rigida de Cap zébib à raison de 100 µg/ml d’extrait brut (Chérif et al., 2011). Nan et al. (2008) ont également montré que U. lactuca présente un effet allélopathique négatif sur des microalgues formant des blooms. En revanche, selon ces mêmes auteurs, les extraits d’Enteromorpha intestinalis collectées sur la côte Atlantique française sont inactifs vis-à-vis de Tetraselmis sp., à la différence des résultats obtenus par Chérif et al. (2011) pour l'espèce E. linza (52%).

L’effet allélopathique de Corallina pilulifera, Ulva linza et Sargassum thunbergii sur la croissance de la microalgue Prorocentrum donghaiense est également rapporté (Wang et al., 2007).

Le résultat d’un screening d’activité anti-diatomée a montré que des composés isolés de Bifurcaria bifurcata (Cystoseiracée, collection Quiberon) ont une activité inhibitrice élevée, alors que l’extrait brut duquel ils ont été isolés et purifiés n’est pas inhibiteur (Hellio et al., 2001).

Il est à noter aussi que les résultats observés avec les témoins préparés pour les différentes concentrations suggèrent une stimulation de la croissance sous l’effet des concentrations croissantes d’éthanol (0,05-0,4%). En effet, plusieurs auteurs ont montré que l’éthanol comme source de carbone a un effet positif, sur la croissance et l’accumulation de certains métabolites chez les microalgues : Euglena gracilis (Mokrosnop et al., 2016), Scenedesmus obliquus, Chlorella ellipsoidea, Nannochloropsis sp., Gleocystis ampla, Navicula saprophila, Nitzschia sp., Nitzschia dissipata et Thalassiosira weiss ogii (Tadros, et al., 1994 ; 1995).

Néanmoins, une inhibition de la croissance peut être observée au dessus de la concentration limite qui diffère d’une espèce à une autre. A titre d’exemple : Chez Chlorella vulgaris, la croissance est améliorée quand la concentration en éthanol est inférieure à 0,1% et inhibe la division cellulaire à 0,5% (Mehdizadeh Allaf, 2013). Alors que, l’éthanol à 15,78 g/L cause une inhibition de la croissance de 44% chez Monodus subterraneus (Bosma et al., 2008). De plus, l’éthanol a inhibé de 50% la croissance de Dunaliella tertiolecta, Isochrysis galbana et Heterosigma akashiwo, à 16 g/L (16000 ppm), 15 g/L (15000 ppm) et 2,5 g/L (2500 ppm), respectivement (Okumura et al., 2001). Il est aussi rapporté que même une concentration aussi faible que 0,39 g/L peut exercer une inhibition sur Chlorella vulgaris et Selenastrum capricornutum (El Jay, 1996).

135

Résultats & discussion

Parmi les 5 espèces testées, l’algue Cystoseira compressa a permis d’avoir une réponse positive de la microalgue Nannochloropsis gaditana, cet extrait a montré une activité stimulatrice significative au test de croissance réalisé, avec une production en biomasse maximale de 163% atteinte à la concentration de 0,1%. D’où l’intérêt de poursuive les investigations avec cette fraction, en suivant l’évolution de la croissance sur 11 jours.

D’après la figure 42, comme attendu la fraction de C. compressa stimule jusqu’à la fin de la culture la croissance de la microalgue par rapport au témoin, avec un pourcentage d’augmentation observé de 18,18% au 11ème jour.

Témoin 350 C. compressa 300

250 Cellule /ml) Cellule 5 200

150

lulaire (x (x 10 lulaire 100 cel

Densité 0 Jours J0 J2 J4 J6 J8 J11

Figure 42: Effet de la fraction de C. compressa (0,1%), sur la croissance de Nannochloropsis gaditana pendant 11 jours de cultures. Chaque point représente la moyenne ± ET d’un triplicata.

3.3. Effet de la fraction de C. compressa sur la teneur en lipides et en pigments

La fraction issue de C. compressa n’a montré aucun effet significatif sur la biosynthèse des lipides, la chlorophylle-a et les caroténoïdes (P>0,05) à la concentration testée (Tableau 15). En revanche, en termes de valeur absolue une légère augmentation du taux de lipides totaux dans les cultures traitées est observée.

136

Résultats & discussion

Tableau 15: Composition cellulaire en lipides, chlorophylle-a et caroténoides, après 11 jours d’incubation sous des conditions optimales (n=3).

Lipides totaux Chlorophylle-a Caroténoides totaux (%) (µg/ml) (µg/ml) Témoin 24,22 ± 0,16 a 0,54 ± 0,10 a 0,66 ± 0,04 a C. compressa 25,16 ± 0,23 a 0,56 ± 0,06 a 0,60 ± 0,03 a Les lettres a et b, indiquent les différences significatives.

Les algues marines contiennent tous les oligoéléments nécessaires aux microalgues mais aussi beaucoup d’autres, pouvant ainsi supprimer des carences en certains minéraux (Aitken & Senn, 1965). Des études antérieures indiquent aussi que des stimulants biochimiques tels que les phytohormones, extraits végétaux, polyamines et des composés chimiques (Azide, surfactant) offre un potentiel significatif pour stimuler la productivité microalgale (Hunt et al., 2010). Ce qui suggère la probabilité de la présence d’une ou plusieurs substances stimulatrices chez l’algue C. compressa.

3.4. Caractérisation par LC-TIMS-TOF MS de la fraction de C. compressa

Afin d'identifier les régulateurs de croissance végétale responsable probablement de l’activité stimulatrice de la croissance de Nannochloropsis gaditana, présents dans cette fraction de l’algue C. compressa, il est nécessaire de réaliser une analyse extrêmement sensible, surtout que les phytohormones ne sont présentes qu'en très faibles concentrations dans le tissu végétal. De plus, la matrice végétale est un mélange extrêmement complexe de substances, si bien qu'il est difficile de détecter et de quantifier des analytes peu abondants.

La chromatographie liquide (LC) couplée à la spectrométrie de mobilité ionique à piège à ions (TIMS) et spectrométrie de masse à temps de vol (TOF MS) est adaptée à ce type d'analyse complexe et a permis d’obtenir des informations qualitatives sur la composition en PGR de cette fraction.

Dix produits sont identifiés comme des substances régulatrices de croissance végétale au moyen de comparaison des données MS (profil de fragmentation du spectre MS, formule brute et masse molaire) avec la littérature et les propositions fournis par la banque de spectres MetFrag.

137

Résultats & discussion

D’après l’analyse des données MS en mode positif présentées dans la figure 43, les PGR identifiés sont montrés dans le tableau 16.

Figure 43: Chromatogramme LC-ESI-TIMS-TOF MS de l’extrait de C. compressa en mode positif.

Tableau 16: Temps de rétention (TR), spectre de masse, tentatives d’identification et formules moléculaires des produits présents dans l’extrait de C. compressa en mode positif.

Pic TR [MS-H]+ Autres Composés proposés Formule Références N° (min) (m/z) ions moléculaire (m/z)

2 0,7 116 72 3-acétamidopropanol C5H9NO2 Fitzgerald et al., 2017

3 0,9 137 91 Acide phényl acétique C8H8O2 Irmisch et al., 2015

4 1,0 183 137 Alcool dihydroconiferyl C10H14O3 Lee et al., 1981

11 21,3 176 130 Acide indole acétique C10H9NO2 Ma et al., 2013

12 22,2 226 90 6-benzylamino purine C12H11N5 Ma et al., 2013

17 24,5 289 130 Indole-3-acetyl-L-isoleucine C16H20N2O3 Matsuda et al., 2005

138

Résultats & discussion

Le métabolite 2 est identifié comme le 3-acétamidopropanol (formule brute C5H9NO2). En fait, la fragmentation de l’ion précurseur protoné à m/z 116 conduit à la formation d’ion compatible avec cette hypothèse, à savoir l’ion fragment à m/z 72 (Fitzgerald et al., 2017). Ce produit est un amino-propional aldehyde produit d’oxydation des polyamines putrescine, spermine et spermidine, ce qui suggère leur présence.

Chez les algues brunes (Dictyota dichotoma), des composés du groupe des putrescines (putrescine, spermine et spermidine) sont présents (Hamana et al. 1990 ; Marián et al. 2000) et les activités des enzymes catalysant des étapes de synthèse des polyamines sont également montrées chez les algues (Sacramento et al. 2004).

L’acide phényl acétique (PAA) correspond au produit 3, ayant la formule brute C8H8O2 et présente un modèle de fragmentation indiqué dans le tableau 16. L’ion moléculaire protoné observé à m/z 137, ainsi que le fragment produit à m/z 91 (Irmisch et al., 2015), est un composé appartenant aux phytohormones, une substance auxine-like.

L’acide phényl acétique (PAA) et l’acide hydroxyphényl acétique ont été précédemment détectés chez l’algue brune Undaria pinnatifida (Abe et al., 1974), Enteromorpha compressa (Fries & Aberg, 1978) et Pelagophycus porra (Hart, 1982).

Le métabolite 4 est caractérisé comme étant l’alcool dihydroconiferyl (formule brute:

C10H14O3). En effet, l’ion moléculaire protoné est observé à m/z 183, ainsi qu’un fragment produit à m/z 137. Ce schéma de fragmentation de l’ion moléculaire présente une fragmentation similaire à celle observée par Lee et al. (1981). C’est un monomère de lignine qui stimule la croissance des plantes par une activité cytokinine-like, il est montré qu’il agit synergiquement avec la kinétine pour stimuler la croissance de calles de soja avec des propriétés distinctes de celles des purines cytokinines (Lee et al., 1981).

Dovgan' & Medvedeva (1983) ont détecté ce composé chez Cystoseira barbata, qu’après deux ans de maturité. Une autre tentative est réalisée par Espiñeira et al. (2011), qui ont rapporté l’absence de l’alcool dihydroconiferyl chez Cystoseira barbata, Mastocarpus stellatus et Ulva rigida, justifiant ainsi l’absence de lignine chez les algues. Néanmoins, Takagi et al. (2017) affirme que les algues brunes ne contiennent que peu ou pas de lignine. Alors que, Martone et al. (2009) et Trinh et al. (2013) ont montré sans équivoque la présence de lignine chez Calliarthron cheilosporioides (rhodophyte) et Ulva lactuca (chlorophyte).

139

Résultats & discussion

Le pic 11 présente un modèle de fragmentation indiqué dans le tableau 16. L’ion moléculaire observé à m/z 176 ainsi que le fragment produit à m/z 130 (Ma et al., 2013) indique que le produit est l’acide indole acétique (IAA) dont la formule brute est C10H9NO2.

En effet, les algues marines sont rapportés aussi pour leur richesse en auxines, notamment chez les algues brunes : Ascophyllum nodosum (Kingman & Moore, 1982), Ecklonia maxima et Laminaria japonica (Crouch & Van Staden, 1991 ; 1993). Sitnik et al. (2003) rapportent que le contenu en auxines dans les thalles des algues est variable selon la qualité de l’eau, la phase de développement et les saisons. En effet, les concentrations en auxines sont faibles pendant les mois les plus froids et augmentent pendant les mois chauds chez U. fasciata, alors qu’aucun effet saison n’est montré chez D. humifusa (Stirk et al., 2009). De plus, dans les zygotes et plants adultes de Fucus distichus et F. vesiculosus, l'IAA est présente à des concentrations un peu plus faibles que dans les tissus des plantes (2-9 ng/g MF) (Basu et al., 2002 ; Polevoi et al., 2003) et des concentrations plus élevées sont observées en été dans les tissus végétatifs (Sitnik et al., 2003).

Le pic 12 correspond au 6-benzylamino purine (BA), une cytokinine aromatique dont l’ion précurseur à m/z 226, produit un fragment à m/z 90 (Ma et al., 2013), dont la formule brute est C12H11N5.

Les cytokinines sont les phytohormones qui se trouvent en plus forte proportion dans les tissus algaux et auxquelles est attribuée la plupart des effets biologiques des extraits commerciaux (Mérigout, 2006). Les profils en cytokinines endogènes de 31 macroalgues (5 Chlorophyceae; 7 Phaeophyceae and 19 Rhodophyceae) collectées des eaux chaudes de KwaZulu-Natal et des eaux froides de Cape en sud Afrique sont rapportés. Ces macroalgues contiennent 13 cytokinines isoprénoides conjuguées avec une concentration élevée d’IP et cZ, des concentrations moyenne de tZ et de très faible quantité de DHZ. De plus, les cytokinines aromatiques (BA et 5 topolins) sont aussi présentes (Stirk et al., 2003). Les concentrations en cytokinines varient aussi selon les saisons chez U. fasciata avec de faibles concentrations pendant les mois froids (Stirk et al., 2009).

Le produit 17 est identifié comme l’indole-3-acétyl-L-isoleucine (C16H20N2O3). Le profil de fragmentation présente un ion précurseur à m/z 289, et des ions fragments à m/z 130. Ce composé est un IAA-acide aminé conjugué. En fait, les métabolites des IAA incluent des produits d’oxydation et des conjugués avec des sucres, des cyclitols et des acides aminés (Matsuda et al., 2005).

140

Résultats & discussion

D’après l’analyse des données MS en mode négatif présentées dans la figure 44, les PGR identifiés sont montrés dans le tableau 17.

Figure 44: Chromatogramme LC-ESI-TIMS-TOF MS de l’extrait de C. compressa en mode négatif.

Tableau 17: Temps de rétention (TR), spectre de masse, tentatives d’identification et formules moléculaires des produits présents dans l’extrait de C. compressa en mode négatif.

Pic TR [MS-H]- Autres Composés proposés Formule Références N° (min) (m/z) ions moléculaire (m/z)

3 10,3 299 - Acide rétinoïque C20H28O2 Van Breeman & Huang, 1996

5 13,6 301 - Acide ent kaurénoique C22H33NO9 Miyazaki et al., 2015

6 14,4 301 - Acide ent kaurénoique C22H33NO9 Miyazaki et al., 2015

13 22,9 281 171 Acide dihydro-phaséique C15H22O5 Owen & Abrams, 2009

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Résultats & discussion

Le pic 3 correspond au produit le plus abondant dans ce spectre, qui présente la formule brute C20H28O2 et forme un ion moléculaire déprotoné [M-H]- à m/z 299, sans fragmentation significative (Van Breemen & Huang, 1996). Ce composé est désigné comme l’acide rétinoïque, un dérivé actif issu de la métabolisation de la vitamine A1 (caroténoides) synthétisée par les algues.

Hormis les bienfaits de l’acide rétinoique qui joue un rôle important dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation cellulaire, il est rapporté la présence de substance gibbéreline-like chez les algues, notamment une activité gibbéreline chez Enteromorpha prolifera et Ecklonia radiata attribuée à la vitamine A1 et A4 qui miment l’activité des gibbérelines GA3 et GA7 (Crouch & Van Staden, 1993).

Le produit 5 présente la formule brute C22H33NO9 et a montré un ion moléculaire déprotoné à m/z 301, stable sans aucune fragmentation de l’ion. Sur la base des données expérimentales, ce produit est identifié comme de l’acide ent kaurenoique (KA) (Miyazaki et al., 2015), un diterpène phytohormone, précurseur des gibbérelines et régulateur du développement (Hayashi et al., 2010).

Dans cet extrait algal, les gibbérellines n’ont pas été détectées. En effet, la présence des gibbérellines chez les algues, bien qu’elle soit bien documentée (Crouch & Van Standen, 1993), elle n’est pas clairement établie dans les extraits d’algues commerciaux. En revanche, la détection de KA, précurseur de la gibbérelline G12, première gibbérelline de la voie, précurseur de toutes les autres gibbérellines, indiquent certainement leur présence. En effet, il a été démontré par Prasad et al. (2010), la présence de gibbérelines chez les algues vertes (Kappaphycus alvaresii) et par Wang et al. (2014), chez les algues brunes (Laminaria japonica) et rouges (Pyropia haitanensis).

De plus, les gibbérelines sont des molécules fragiles, dont l’activité serait limitée dans le temps. En effet, Williams et al. (1974) ont détecté une faible activité gibbéreline dans trois extraits commerciaux fraichement préparés, qui devient négligeable après une conservation de quatre mois à température ambiante.

Le produit 6 présente les mêmes caractéristiques que le produit 5 (tableau 17), il est donc identifié comme un isomère de l’acide ent kaurénoique.

Le métabolite 13 présente la formule brute C15H22O5 et a montré un ion moléculaire à m/z 281. En se basant sur la fragmentation qui libère un ion à m/z 171 [M-H]- et la littérature (Owen & Abrams, 2009), ce produit est désigné comme l’acide dihydrophaséique, un

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Résultats & discussion terpénoïde catabolique de l’acide abscissique, produit par l’inactivation de l’ABA via son hydroxylation en 8’hydroxy-ABA, spontanément isomérisé en acide phaséique, puis en acide dihydrophaséique. Comme l'acide abscissique, c'est une phytohormone qui améliore la tolérance au stress (Belin et al., 2006).

Ce qui indique la présence d’ABA dans la fraction algale. En effet, il est retrouvé dans toutes les classes de macroalgues. Par exemple, l’ABA et une faible concentration de 2-trans- méthyle ABA sont identifiés chez des espèces du genre Ascophyllum et certaines espèces de Laminaria (Phaeophyceae) (Tominaga et al, 1993 ; Nimura & Mizuta, 2002). L’ABA est également identifié chez Enteromorpha compressa (Niemann & Dörffling, 1980), U. fasciata et D. humifusa (Stirk et al. 2009), dix espèces de Rhodophyceae (Yokoya et al. 2010) et cinq espèces d’Ulva (Gupta et al. 2011).

Il a été donc mis en évidence la présence dans la fraction enrichie de l’algue brune Cystoseira compressa, d’auxines de type : acide indole acétique (IAA), acide indole acétique isoleucine (IAA-ILE) et acide phényl acétique (PAA), une cytokinine : benzylamino purine (BA) et l’alcool dihydroconiferyl (cytokinine-like), l’acide ent-kaurénoique et l’acide rétinoique (gibbéreline like), l’acide dihydro-phaséique (ABA-like) et le 3-acétamidopropanol (dérivé de polyamines).

Plusieurs autres études ont rapporté qu’il existe un effet des auxines et cytokinines sur la croissance et la division cellulaire de microalgues, la composition lipidique et la tolérance au stress (Lu & Xu, 2015). Selon Li et al. (2007), l’addition d’IAA pure isolée de l’extrait de l’algue brune kelp (Laminaria japonica) a stimulé la croissance cellulaire chez les deux chlorophycées Chlorella sp. et Dunaliella salina et a augmenté les concentrations en protéines cellulaires solubles et la chlorophylle chez Chlorella sp.

Chez Chlamydomonas reinhardtii et Haematococcus pluvialis le taux de lipides a augmenté (Maor, 2010), alors que chez Nannochloropsis oceanica le taux d’acide eicosapentaenoique est beaucoup plus élevé en présence d’IAA (Udayan & Arumugam, 2017) De plus, chez Nannochloropsis oculata, la densité cellulaire, la division et la production de chlorophylle-a sont améliorés (Trinh et al., 2017). Il est possible que l’IAA affecte les activités des enzymes qui régulent la biosynthèse de ces constituants biochimiques chez quelques espèces de microalgues. Le PAA a également permis d’augmenter la croissance de 261% chez Chlorella vulgaris (Brannon & Bartsch, 1939).

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Résultats & discussion

En présence de gibbérellines, la vitesse de croissance de Chlamydomonas reinhardtii (Park et al., 2013) est accélérée, la biosynthèse d’astaxanthine est stimulée chez Haematococcus pluvialis (Lu et al., 2010b) et le diamètre cellulaire et le taux de lipide chez Nannochloropsis oculata sont beaucoup plus importants (Trinh et al., 2017). Quant aux polyamines putrescine et spermidine, elles augmentent la croissance de 50% chez Chlorella vulgaris (Czerpak et al., 2003) et de 60% chez Dunaliella primolecta, ainsi que le taux de Chlorophyll-a de176% chez Dunaliella primolecta (Hourmant et al., 1994).

La DLLME est donc une méthode très efficace pour concentrer des régulateurs de croissance végétale, néanmoins elle est pH sensible, d’où la nécessité de faire attention aux variations du pH. De plus, il est rapporté que ces extraits sont stables quand ils sont conservés à -20°C pendant un seul mois, et la réduction observée est de 1,72% pour tous les PGRs à l’exception de la kinétine riboside (cytokinine) qui n’est plus retrouvée après conservation (Gupta et al., 2011).

Enfin, le rôle de médiateur chimique des PGR, sur la croissance et le métabolisme des microalgues est clairement établi. Cependant, des concentrations d'hormones seulement basses (au-dessous de 1 mg/L) exercent un effet bénéfique, en effet, une concentration élevée en auxine (10 mg/L) supprime considérablement la croissance (Polevoi, 1982).

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CONCLUSION GENERALE

PERSPECTIVES

Conclusion générale et perspectives

Les algues sont des produits biologiques parées de nombreuses qualités : riches en vitamines, en minéraux et très peu caloriques. Elles sont clairement perçues comme naturelles et saines auprès des consommateurs, qui même lorsqu’ils n’en ont jamais consommé sont prêts à les tester.

Présentes depuis longtemps dans les produits cosmétiques, on en trouve de plus en plus dans l'alimentation. En effet, les algues sont le nouveau créneau des industries agroalimentaires et pharmaceutiques, et leurs vertus nutritionnelles et thérapeutiques leur permettront sûrement d’être de plus en plus valorisées dans les années à venir par d'autres secteurs.

Le présent travail s’oriente vers l’exploration des potentialités naturelles d’algues marines du littorale oranais, dont on ne connait que trés peu de chose. Par la détermination de la composition nutritionnelle de la macroflore algale, ainsi que l'étude du potentiel antioxydant et l'activité régulatrice de la croissance végétale (phytohormonal). Pour la recherche d'extraits d’algues intéressants, qui constitueraient une source naturel, sûr et peu coûteuse, et la valorisation de ces derniers par leur exploitation comme antioxydants pour la conservation alimentaire des produits de la pêche et dans le domaine de l'algoculture dans le but de stimuler la croissance et la production de métabolites d'intêret.

La composition proximale et lipidique révèle que les teneurs en lipides et phospholipides totaux sont significativement élevées chez les algues brunes (p<0,05), et les carbohydrates (p<0,05) sont plus abondants chez les algues vertes. Alors que, la teneur en stérols est élevée (p<0,05) chez E. compressa, C. compressa et C. stricta, les algues C. elongata et C. Stricta contiennent le contenu le plus élevé en acides gras polyinsaturés (AGPI) et en AGPI n-3.

De plus, le contenu en cendres (p<0,05) est le constituant majoritaire chez l’algue rouge C. elongata (76,42% MS), et C. stricta, E. compressa et U. lactuca montrent les taux de protéines les plus élevés (12,54-14,14% MS). Quant aux teneurs en tocophérols, elles sont en concentrations intéréssantes chez toutes les algues.

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Conclusion générale et perspectives

Concernant les macroéléments, le potassium et le sodium sont en teneurs élevées (79,4, 19,6 g/kg, respectivement) chez les algues brunes (C. compressa et C. stricta), alors que le Magnésium est prédominant (40,3 g/kg) chez l’algue verte E. compressa et le Calcium est le macroélément le plus important chez l’algue rouge C. elongata. Parmi les éléments traces, les plus abondants sont Sr, Fe et B et la concentration de Cadmium chez C. compressa et C. stricta a dépassé la limite permise considérée par la législation internationale.

Au regard des résultats de la composition chimique et minérale, les cinq espèces de macroalgues constituent une excellente source alternative d’antioxydants et de minéraux, qui permettraient d’atteindre l’apport journalier recommandé en vitamine E et certains oligoéléments, et de constituer également une source potentielle pour des applications pharmacologiques et cosmétiques. En revanche, si les algues brunes sont utilisées à des fins alimentaires, une attention particulière doit être portée au contenu en métaux lourds, une surveillance est donc nécessaire pour assurer la sécurité du produit.

Une autre voie de valorisation de ces algues est l’extraction de composés spécifiques. En l’occurrence E. compressa et U. lactuca, qui de part leurs teneurs élevées en carbohydrates 58,87 et 59,15% MS, respectivement, en fait des espèces trés intéressantes pour l’extraction de polysaccharides. Les concentrations protéiques élevées des algues C. stricta, E. compressa et U. lactuca (14,14; 13,61 et 12,54% MS, respectivement), en fait également une excellente source de protéines bioactives (lectines et AA essentiels). Alors que, C. elongata avec une proportion élevée en AGPI essentiels (n-3) de 16,62% AGT et un taux exceptionnel d’EPA C20:5 (n-3) de 15,82% AGT, est idéale pour la consommation humaine et la production de nutraceutiques. Néanmoins, la fraction soluble doit être purifiée par une méthode appropriée (ultrafiltration ou chromatographie échangeuse d’ions) afin d’éviter la présence de métaux lourd dans le produit final.

Tout cela est révélateur des potentialités nutritionnelles de ces algues qui sont riches en différents composés bioactifs possédant probablement une activité antioxydante mais aussi de nombreuses propriétés biologiques intéressantes pour l’algoculture.

En effet, l’étude de l'activité antioxydante de trente extraits brutes provenant des cinq algues (Cystoseira compressa, Cystoseira stricta, Corallina elongata, Enteromorpha compressa et Ulva lactuca) a été mise en évidence par le test de l’activité anti-radicalaire DPPH, le pouvoir réducteur du fer et une analyse des composés phénoliques. De plus, une étude comparative de deux techniques d’extraction a été réalisée, il s’agit en l’occurrence de: l’extraction par macération à température ambiante pendant 24h et l’extraction au soxhlet

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Conclusion générale et perspectives pendant 6h, en présence de méthanol, d’éthanol et d’eau. Ces deux méthodes étant le plus souvent préconisées pour l’extraction de polyphénols. La comparaison porte sur le rendement d’extraction et l’activité antioxydante des extraits bruts.

Les algues brunes appartenant au genre Cystoseira se sont révélées significativement actives, présentant ainsi les meilleures activités anti-radicalaires, avec des pourcentages d'inhibitions de plus de 90% et enregistrent de remarquables IC50 (83,3 µg/ml, C. stricta et

105,1 µg/ml, C. compressa) et d'excellents pouvoirs réducteurs (DO700nm=1,32, C. compressa et DO700nm=1,59, C. stricta), avec de bons contenus en polyphénols (87,02 mg EAG/g MS, C. compressa et 122,20 mg EAG/g MS, C. stricta).

Les résultats de la présente étude ont démontré que l'activité antioxydante des algues est dépendante de la méthode et du solvant organique d’extraction, dont les plus efficaces pour l’extraction de composés actifs (en particulier les polyphénols) semblent être : l'extraction par soxhlet en présence d'éthanol (C. stricta, E. compressa et U. lactuca) et d'eau (C. elongata) et la macération dans l’eau ou l’éthanol (C. compressa). Néanmoins, ce résultat reste à confirmer pour d’autres espèces d’algues.

Ces extraits d’algues riches en antioxydants peuvent donc servir de très bonnes sources d’antioxydants biologiques naturelles et saines, comme compléments alimentaires ou antioxydants naturels en industrie alimentaire, notamment dans la conservation de la qualité des produits de la pêche. D’où l’évaluation de l’effet d’extraits d’algues sur l’activité microbienne et le développement de la peroxydation lipidique au cours de la conservation du chinchard.

Au vue des résultats, des analyses microbiologiques (la flore mésophile aérobie total, les psychrothrophes, les bactéries protéolytiques et lipolytiques et les entérobactéries), les extraits combinés de C. compressa ont montré qu’ils exercent un remarquable effet inhibiteur (p<0,05) sur l'activité microbienne dans le muscle du chinchard commun. Cet effet préservateur (p<0,05) est confirmé par l'évaluation chimique de l'activité microbienne (pH et la teneur en triméthylamine-TMA). Cette glace traitée a également ralenti significativement l'hydrolyse des lipides (formation d'AGL) et l'oxydation tertiaire (formation de composés fluorescents) (p<0,05), et réduit le processus de propagation de l'oxydation primaire et secondaire (p≥0,05).

L’extrait d’algue éthanol-aqueux combiné de C. compressa incorporé dans la glace pendant la réfrigération du chinchard commmun a permis une inhibition du développement de

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Conclusion générale et perspectives l’activité microbienne et un ralentissement de l’hydrolyse et l’oxydation des lipides. Cela peut être expliqué par le fait que les algues brunes sont rapportées pour produire une large gamme de composés antioxydants, notamment les polyphénols, les phycocyannines et les caroténoides, et des composés antibactériens tels que les acides gras, les terpènes, alcaloïdes et les composés phénoliques.

De plus, aucune différence n’est décelable entre les lots de poissons correspondants aux deux concentrations d’algues testés, cela indique que la concentration en composés préservant dans le lot CAF (concentration algale faible) est suffisante pour fournir une protection significative dans le muscle du chinchard commun, ce qui présente un grand intéret.

La plupart des études sur l’effet protecteur des algues ont été réalisées par des expérimentations in vitro, et les applications des dérivés d’algues sur les produits de la pêche sont rares. Par conséquent la glace traitée proposer dans ce travail peut constituer une stratégie prometteuse pour ouvrir la voie à l’application d’extraits d’algues naturels pour la conservation du poisson et la préservation de la qualité pendant les processus technologiques. L’emploi d’un extrait combiné (éthanolique-aqueux) est recommandé, car une large gamme de molécules conservatrices (lipophiles et hydrosolubles) seront présentes dans la glace.

Et enfin, en ce qui concerne, l’étude préliminaire sur l’activité biologique d’extraits enrichis en régulateurs de croissance végétale sur une culture de microalgues a permis de déduire, que le fractionnement par la microextraction liquide-liquide dispersive entreprise à partir des cinq macroalgues s’avére une méthode très simple, rapide et efficace pour concentrer des PGR notamment les phytohormones les plus abondantes et dominantes chez les algues; à savoir les auxines et les cytokinines.

L’étude biologique montre que la réponse de Nannochloropsis gaditana diffère d’un extrait à un autre, en rapport direct avec les différences de leurs compositions chimiques respectives. Ainsi, le traitement présentant une bonne activité élicitrice de croissance microalgale est celui de la fraction de C. compressa à 0,1%. Quant aux traitements aux concentrations de 0,2 et 0,4%, ils se sont révélés inhibiteurs de la croissance de Nannochloropsis gaditana. Les activités promotrices et inhibitrices des différentes hormones naturelles, et leur implication dans la régulation de la croissance et du développement, ainsi que les composés algicides pourraient potentiellement expliquer les variations observées.

Une méthode associant un système LC couplé à un spectromètre de masse à temps de vol (LC-TIMS-TOF MS) a été utilisée afin de déterminer la composition en régulateurs de

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Conclusion générale et perspectives croissance végétale de la fraction élicitrice obtenue à partir de l’algue C. compressa. L’utilisation d’une telle technique a conduit à l’amélioration de la vitesse de séparation, à la résolution et surtout à la sensibilité de détection, permettant ainsi de détecter les produits minoritaires. Ces méthodes offrent en outre d’intéressantes perspectives dans le domaine de l’analyse d’extraits végétaux.

L’analyse par LC-TIMS-TOF MS a donc permis l’identification dans la fraction enrichie de C. compressa de cinq classes de régulateurs de croissance végétale, des auxines de type IAA, IAA-ILE et PAA, une cytokinine BA et l’alcool dihydroconiferyl (cytokinine-like), l’acide ent-kaurénoique et l’acide rétinoique (gibbéreline-like), l’acide dihydro-phaséique (ABA-like) et le 3-acétamidopropanol (dérivé de polyamines).

A notre connaissance, l’alcool dihydroconiferyl a été caractérisé pour la première fois chez les algues. Alorsqu'il est présent dans un grand nombre de plantes supérieures.

Le rôle de médiateur chimique des PGR, sur la croissance et le métabolisme des microalgues est clairement établi. Cependant, les PGR exercent un effet bénéfique aux concentrations basses. Plusieurs autres études ont rapporté qu’il existe un effet des auxines et des cytokinines sur la croissance et la division cellulaire des microalgues, et sur la composition lipidique et la tolérance au stress.

Comprendre les interactions entre la croissance, les PGRs et les indices environnementales pourrait potentiellement permettre au contenu en métabolites secondaires d'être manipuler pour un rendement maximal. Cependant, il est exigé une qualité et une sécurité rigoureuse avec « les Bonnes Pratiques de Fabrications » particulièrement pendant la croissance des algues pour l'utilisation humaine. Les PGRs sont largement utilisés dans la récolte d'agriculture et ainsi ne devrait pas être un problème s’ils sont utilisés dans l'aquaculture d'algues. Cependant, des études cytotoxiques devront être conduites pour le confirmer.

Ces conclusions sont prometteuses car les algues étudiées ont montré des potentialités intéressantes : antioxydantes, antibactériennes et régulatrices de croissance végétale, et suggèrent la possibilité de leur utilisation comme antioxydants naturels pour le secteur de l’industrie alimentaire et thérapeutique, mais également comme biostimulant naturel en algoculture, ce qui pourrait améliorer la productivité en biomasse, la résistance aux stress et la stimulation de la synthèse de certains métabolites d’intérêt économique.

En perspectives, il est envisagé de poursuivre l’exploitation d’autres espèces d’algues des côtes algériennes et de réaliser une évaluation quantitative d’autres constituants

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Conclusion générale et perspectives phytochimiques (chlorophylles, caroténoïdes, vitamine C, acides aminés, phycoérythrine, terpénoïdes, fibres).

Afin d’évaluer davantage l’activité antioxydante des échantillons étudiés, le présent travail doit être poursuivi par une étude de l’effet antioxydant in vivo, sur divers organismes vivants, telles que leur introduction dans l’alimentation des animaux marins en aquaculture ou d’explorer l’effet de ces extraits sur des cellules cancéreuses d’animaux de laboratoires.

Il serait également intéressant de poursuivre l’étude de l’activité hormonale par une évaluation quantitative des PGRs trouvés dans la fraction analysée et d’isoler et purifier les phytohormones par des techniques de purification performantes. De plus, une détermination du type de produits actifs inhibiteurs présents dans les extraits d’algues vertes et rouges testés et nécessaire afin d’expliquer leurs modes d’actions. Et enfin, envisager l’exploration de l’effet de ces extraits ou bien des phytohormones isolées et purifiées sur la croissance et la multiplication de culture de végétaux et d’autres espèces de micro-algues.

Les macroalgues représentent actuellement un considérable champ d’étude et de valorisation de leurs molécules biologiquement actives, ainsi que de leurs diverses activités. Dans ce contexte, l’étude des genres Cystoseira, Corallina et Ulva est encourageante pour la recherche et l’isolement de nouvelles molécules actives et d’étudier leur potentiel en activité antibactérienne, antifongique, antiprotozoaire, anti-tumorale ou bien antivirale.

Cependant, l’engouement des industriels pour les algues est croissant, et les techniques actuelles d’approvisionnement ne permettent pas de répondre à la demande d’un marché en plein essor. Ainsi, créer des fermes aquacoles pour la culture d’algues naturellement présentes dans les eaux oranaises, afin de ne pas modifier l’écosystème, serait une perspective intéressante; car les avantages des algues cultivées par rapport aux algues sauvages sont une qualité constante et plus calibrée, ainsi qu’une meilleure traçabilité, ce que recherchent les industriels.

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ANNEXES

Annexes

Annexe 1 Composition des milieux de culture utilisés dans les analyses microbiologiques, pour un volume final d'un litre et l’autoclavage se fait à 121°C pendant 20 min.

Milieu PCA Peptone 5,0 g Extrait de levure 2,5 g Glucose 1,0 g Agar 15,0 g pH = 7

Milieu VRBG Extrait de levure 3,0 g Peptone 7,0 g Chlorure de sodium 5,0 g Sels biliaires n°3 1,5 g Glucose 10,0 g Rouge neutre 0,03 g Cristal violet 0,002 g Agar 12,0 g pH= 7,4

Milieu Caseine-agar Lait sec, sans gras instantané 50,0 g Digestif pancréatique de caséine 5,0 g Extrait de levure 2,5 g Glucose 1,0 g Agar 12,5 g H= 6,8

Tributyrine-agar Peptone 10 g Extrait de viande 3 g Extrait de levure 3 g Chlorure de sodium 5 g Tributyrine 10 ml Alcool polyvinylique 1 g Agar 15 g pH= 7,2

Eau peptonée Peptone exempte d'indole 10,0 g Chlorure de sodium 5,0 g pH = 7,2

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Annexes

Annexe 2

Milieu de culture F/2 Guillard (Guillard, 1975)

Ajouter à 1 L d'eau de mer naturelle filtrée:

Volume Composé Concentration de la Concentration finale solution stock dans le milieu (stérile) -4 1 ml NaNO3 75 g/L 8,82.10 M -5 1 ml Na2HPO4 5 g/L 3,62.10 M 1 ml Solution de Métaux lourds ci-dessous - 0,5 ml Solution de vitamines ci-dessous -

Solution de métaux lourds

Ajouter à 1 L d'eau distillée:

Volume ou poids Composé Concentration de la Concentration finale solution stock dans le milieu (stérile) -5 3,14 g FeCl3 - 1.10 M 4,36 g NaEDTA - -8 1 ml CuSO4 9,8 g/L 3,93.10 M -8 1 ml NaMoO4 6,3 g/L 2,6.10 M -8 1 ml CoCl2 10 g/L 4,20.10 M -7 1 ml MnCl2 18 g/L 9,10.10 M -8 1 ml ZnSO4 22 g/L 7,65.10 M

Solution de vitamines

Ajouter à 1 L d'eau distillée stérile:

Volume ou poids Composé Concentration de la Concentration finale solution stock dans le milieu (stérile) 1 ml Cyanocobalamin 0,5 g/L 3,69.10-10 M (B12) 5 ml Biotin (H) 0,1 g/L 2,04.10-9 M -7 100 mg Thiamine HCl (B1) - 2,96.10 M

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Annexes

Annexe 3

Profils de fragmentation des pics identifiés par détection en mode positif

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Annexes

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Résumé Résumé Les algues marines constituent une source peu explorée et inexploitée en Algérie, alors qu’ellesLes algues constituent marine uns enjeuconstitue de développemennt une sourcet peuéconomique. explorée Le et présent inexploitée travail en aAlgérie pour objectifs, alors dequ’elles fournir constituent des informations un enjeu sur de la composition développemen nutritionnellet économique. de cinqLe présent espèces travail d’algues a pourde la côteobjectifs oranaise de fournir (Cystoseira des informationsstricta, Cystoseira sur la compressa, composition Corallina nutritionnelle elongata, de Enteromorpha cinq espèces compressad’algues de et laUlva côte lactuca oranaise) et (deCystoseira valoriser stricta,ces algues Cystoseira d’intérêt compressa,dans le domaine Corallina de la elongata,recherche deEnteromorpha nouvelles sources compressa d’antioxydants et Ulva lactuca et de )régulateurs et de valoriser de croissance ces algues végétale. d’intérêt dans le domaine de la recherche de nouvelles sources d’antioxydants et de régulateurs de croissance végétale. La détermination de la composition proximale (humidité, cendre, protéines, lipides et carbohydrates),La détermination lipidique de la (profil composition en acides proximale gras et (humidité, contenus e cendre,n phospholipides, protéines, lipides stérols et et tocophérols)carbohydrates), et lipidique minérale (profil (macroéléments en acides et gras élément et contenuss traces e)n a phospholipides, révélé que ces stérols espèces et constituenttocophérols) une et excellente minérale sour (macroélémentsce de minéraux et , élémentpolysaccharidess traces), protéinesa révélé, d’AGPI que ces essentielsespèces etconstituent d’antioxydants une excellente alternatifs. sour Néanmoins,ce de minéraux une attention, polysaccharides particulière, protéines doit être, d’AGPI portée auessentiels contenu enet d’antioxydantsmétaux lourds, alternatifs.une surveillance Néanmoins, est donc une nécessaire attention p particulièreour assurer doitla sécurit être portéé du produite au contenu. en métaux lourds, une surveillance est donc nécessaire pour assurer la sécurité du produit. L’évaluation des propriétés antioxydantes a mis en évidence que les algues brunes du genre CystoseiraL’évaluati seon sont des révélées propriétés actives antioxydantes, présentant a ainsi mis les en meilleures évidence que activités les algues antiradicalaire brunes dus, avecgenre des Cystoseira pourcentages se sontd'inhibitions révélées de actives plus de, présentant90% et enregistrent ainsi les de meilleures remarquables activités IC50 anti(83,3- µg/ml,radicalaire C. s, stricta avec deset 105,1 pourcentages µg/ml, C. d'inhibitions compressa de) et plus d'excellents de 90% pouvoirs et enregistrent réducteurs de remarquables IC50 (83,3 µg/ml, C. stricta et 105,1 µg/ml, C. compressa) et d'excellents (DO700nm=1,32, C. compressa et DO700nm=1,59, C. stricta), avec de bons contenus en polyphénolspouvoirs réducteurs (87,02 mg (DO EAG/g700nm=1,32, MS, C.C. compressacompressa etet 122,20DO700nm mg=1,59, EAG/g C. strictaMS, C.), avecstricta de). bonsCette activitécontenus est en dépendantepolyphénols de (87,02 la méthode mg EAG/g et duMS, solvant C. compressa organique et 122,20 d’extraction, mg EAG/g dont lesMS, p C.lus efficacesstricta). Cette semblent activité être est : dépendante l'extraction de par la méthodesoxhlet enet du présence solvant organique d’éthanol d’extraction,(C. stricta) dontet la macérationles plus efficaces dans l’eau semblent ou l’éthanol être : l'extraction (C. compressa par )soxhlet. en présence d’éthanol (C. stricta) et la macération dans l’eau ou l’éthanol (C. compressa). L’extrait d’algue éthanol-aqueux combiné de C. compressa incorporé dans la glace pendant la L’extrait réfrigération d’algue du chinchard éthanol-aqueux commun combiné Trachurus de C. trachurus compressa a permisincorporé une dans inhibition la glace du développementpendant la réfrigération de l’activité du chinchardmicrobienne commun (p<0,05) Trachurus (flore mésophile trachurus aérob a permisie, psychrothrophes, une inhibition bactériesdu développement protéolytiques de et lipolytiques, l’activité microbienneentérobactéries (p<0,05)) dans le muscle (flore du mésophile chinchard . Cet aérob effetie, préservateurpsychrothrophes, est bactéries confirmé protéolyt par l'évaluationiques et lipolytiques, chimique deentérobactéries l'activité microbienne) dans le muscle (pH du et triméthylamine).chinchard. Cet effet Cette préservateur glace traitée est a également confirmé ralenti par l'évaluation l'hydrolyse chimi des lipidesque de (formation l'activité d'AGL)microbienne et l'oxydation (pH et triméthylamine). tertiaire (formation Cette de glace composés traitée a fluorescents) également ralenti(p<0,05), l'hydrolyse et réduit des le processuslipides (formation de propagation d'AGL) de l'oxyda et l'oxydationtion primaire tertiaire et secondaire (formation (p ≥0,05) de composés. fluorescents) (p<0,05), et réduit le processus de propagation de l'oxydation primaire et secondaire (p≥0,05). L’étude de l’activité biologique de la fraction enrichie de C. compressa obtenue par la méthodeL’étude D.L.L.M.E. de l’activité (Microextraction biologique de la Dispersive fraction enrichie Liquide de-Liquide) C. compressa, sur uneobtenue culture par la de Nannochloropsisméthode D.L.L.M.E. gaditana (Microextraction a révélé une bonne Dispersive activité Liquide élicitrice-Liquide) de croissance, sur une microalgale culture de, à raisonNannochloropsis d’une concentration gaditana a derévélé 0,1%. une Cette bonne fraction activité contient élicitrice cinq de croissance classes de microalgale régulateurs , deà croissanceraison d’une végétale concentration (auxines, decytokinines, 0,1%. Cette gibbéreline fraction s contient et dérivé cinq de l’ABA classes et dede régulatepolyamines).urs de croissance végétale (auxines, cytokinines, gibbérelines et dérivé de l’ABA et de polyamines). Les algues du genre Cystoseira ont montré des potentialités intéressantes et suggèrent la possibilitLes alguesé d’utilisation du genre de C ystoseiraleurs extraits ont commemontré antioxydantsdes potentialités naturelles intéressantes en industrie et suggèrent alimentaire la etpossibilit thérapeutique,é d’utilisation et comme de leursbiostimulant extraits naturel comme en antioxydants algoculture, naturelles ce qui amélioreren industrieait la productivitéalimentaire eten thérapeutique, biomasse, la etrésistance comme biostimulantaux stress et naturel la stimulation en algoculture, de la synthèse ce qui améliorer de certainsait métabolitesla productivité d’inté en rêtbiomasse, économique. la résistance aux stress et la stimulation de la synthèse de certains métabolites d’intérêt économique. Mots clés : Algues, antioxydants, biostimulant, microalgue, phytohormones, valorisation.

Vol. 16(26), pp. 1474-1480, 28 June, 2017 DOI: 10.5897/AJB2017.16043 Article Number: 051C88564956 ISSN 1684-5315 African Journal of Biotechnology Copyright © 2017 Author(s) retain the copyright of this article http://www.academicjournals.org/AJB

Full Length Research Paper

Comparison of in vitro antioxidant activity of some selected seaweeds from Algerian West Coast

Hanane Oucif1,2*, Rebiha Adjout1, Rahma Sebahi1, Farida Ouda Boukortt3, Smail Ali-Mehidi1 and Sidi-Mohamed El-Amine Abi-Ayad1

1Laboratory of Aquaculture and Bioremediation, Department of Biotechnology, Faculty of Natural and Life Sciences (Campus I.G.M.O.), University of Oran 1 Ahmed Ben Bella, Oran 31000, Algeria. 2Department of Biology, Institute of Exact Sciences and Natural and Life Sciences, University Center Ahmed Zabana of Relizane, Relizane 48000, Algeria. 3Laboratory of Clinical and Metabolic Nutrition, Faculty of Natural and Life Sciences, University of Oran 1 Ahmed Ben Bella, BP 1524 El M’Naouer, Oran 31000, Algeria.

Received 22 April, 2017; Accepted 14 June, 2017

In vitro antioxidant activity of methanolic (ME) and ethanolic (ET) extracts of six species of seaweeds (Cystoseira stricta, Cystoseira compressa, Corallina elongata, Porphyra umbilicalis, Enteromorpha compressa and Ulva lactuca) collected from Algerian West Coast was evaluated, using 1,1-diphenyl-2- picryl-hydrazyl (DPPH) radical scavenging assay and reducing power assay. They were tested for total phenolic content. The highest phenolic content was observed in C. compressa [10.24 ± 0.09 mg gallic acid equivalent (GAE) g-1 dry weight (DW) in ME extract and 15.70 ± 0.72 mg GAE g-1 DW in ET extract]. In general, the ET seaweed extracts were the most effective fractions. In addition, C. compressa and C. stricta extracts showed the highest antioxidant activity in all assays and better than vitamin E. However, these extracts present lower DPPH radical scavenging activity and reducing power than butylhydroxytoluene (BHT), except at concentration of 1 mg mL-1, in which it was similar. Therefore, C. compressa and C. stricta had a potential to be used as a natural antioxidant agent.

Key words: Algerian, antioxidant activity, 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) radical scavenging, reducing power, seaweed.

INTRODUCTION

The marine flora and fauna constitute precious biological vegetables, mushrooms or microorganisms. For several resources. The importance of these resources is due to years, a particular look has been concerned with the the presence of marine organism having a wide range of research for new substances of biotechnological interests. metabolites which can be rare or even absent in animals, In the international pharmaceutical market and cosmetic,

*Corresponding author. E-mail: [email protected]. Tel: +213665379382. Fax: +21341325958.

Author(s) agree that this article remains permanently open access under the terms of the Creative Commons Attribution License 4.0 International License Oucif et al. 1475

30% of active substance was developed from natural Preparation of seaweeds extracts substances among which 10% was isolated from marine Samples were extracted with two different solvents methanol (ME) organisms (Ruiz, 2005). and ethanol (ET), according to the method of Kelman et al. (2012) Among these, seaweeds are an important source of modified. Five grams of each sample was extracted with 100 ml of bioactive compounds such as carotenoids, dietary fiber, solvent for 24 h with mixing, at room temperature (25°C) and under protein, essential fatty acids, vitamins and minerals and dark condition. Resultant extracts were filtered and solvent many active substances like lipids, proteins, poly- removed under reduced pressure to yield dry material. Extracts saccharides and polyphenols (Meenakshi et al., 2011). weights were recorded and the yield expressed as percentage.

Having many activities, anti-protozoan, antibacterial, anti- inflammatory, anticoagulative, antifungal, anti-free Determination of total phenolic content radical, antioxidant, etc (Hellio et al., 2004; Cox et al., 2010; Taboada et al., 2012) seem promising for the Total phenolic content of each seaweed extract was quantified pharmaceutical, cosmetics and food industries. according to the method of Folin-Ciocalteu (Singleton and Rossi, 1965). A volume of 400 µl of each seaweed extract (at a An outbreak of interest is on the biological effects of concentration of 2 mg ml-1) was added to 2 ml of the reactive of natural antioxidants, included in the fight against Folin-Ciocalteu (diluted 10 times). The mixture was allowed to oxidative stress that causes ageing, the release and incubate for 4 min at room temperature. Then, 1.6 ml of Na2CO3 progress of several diseases such as cancer, (7.5 %) was added. Tubes were shaken and incubated for 2 h in cardiovascular accidents, inflammatory diseases and darkness, at room temperature. Samples’ absorbencies were read at 765 nm. Gallic acid was used as the standard for a calibration neurodegenerative diseases (Favier, 2003). To prevent curve. The total phenolic contents of seaweed extracts were the toxic effects of oxygen, several species of seaweeds expressed as mg of gallic acid equivalents per gram of dry weight containing a wide specter of phytochemical substances, (mg GAE g-1 DW). which are sources of natural antioxidants agents, such as phenolic acids, flavonoids and tannins, have the capacity DPPH radical scavenging assay to eliminate the reactive species of oxygen (RSO). They can thus minimize the oxidative damage caused by these 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) radical scavenging activity of RSOs in living cells and prevent oxidative degradation of samples was performed according to the method of Yen and Chen food while supplying simultaneously remarkable (1995). Aliquot (2 ml) of test sample (at a concentration of 0.1, 1 -1 -3 -1 nutritional advantages (Cornish and Garbary, 2010). and 2 mg ml ) was added to 2 ml of 0.16 × 10 mol L DPPH These seaweeds also offer to industrial domain an methanolic solution. The mixture was vortexed for 1 min and then left to stand at room temperature for 30 min in the dark, and its interesting alternative to synthetic antioxidant substances absorbance was read at 517 nm. The ability to scavenge DPPH as butylhydroxyanisol (BHA), butylhydroxytoluene (BHT) radical was calculated using the following equation: and propyl gallate (PG) which are reported carcinogenic (Safer and Al-Nughamish, 1999). Scavenging effect (%) = [1 – (Asample – Asample blank) / Acontrol] × 100 Algeria with its long coastal constitutes a rich but a where Acontrol is the absorbance of the control (DPPH solution useless source of marine algae. Indeed, there are few without sample), Asample is the absorbance of the test sample (DPPH studies estimating the antioxidant potential of seaweeds solution plus test sample), and Asample blank is the absorbance of the in Algeria and even less industrial exploitation. These sample (sample without DPPH solution). Then, the IC50 seaweeds constitute a pathway of economic (concentration of 50% inhibition of the radical DPPH) was calculated. Vitamin E and BHT were used as positive control. development. In this regard, the aim of this study was to investigate the antioxidant activity of seaweed extracts of various species from Algerian West Coast: Cystoseira Reducing power stricta (Montagne) Sauvageau, Cystoseira compressa (Esper) Gerloff & Nizamuddin, Corallina elongata Ellis & The reducing power was measured as described by Oyaizu (1986). 1 ml of each extract (at a concentration of 2 mg ml-1) was mixed Solander, Porphyra umbilicalis Kützing, Enteromorpha with 2.5 ml of phosphate buffer (0.2 M, pH 6.6) and 2.5 ml of 1% compressa (Linnaeus) Nees, and Ulva lactuca Linnaeus, potassium hexacyanoferrate solution. After 30 min of incubation at with the prospect of a valuation. 50°C, 2.5 ml of 10% trichloroacetic acid was added. The mixture was centrifuged at 3000 rpm, for 10 min. Finally, 2.5 ml of the upper layer were mixed with 2.5 ml of distilled water and 0.5 ml, 0, and 1% MATERIALS AND METHODS FeCl3. The absorbance was measured at 700 nm. Vitamin E and BHT were used as positive controls.

Sample collection Statistical analysis Six species of fresh seaweeds were collected from Algerian West Coast: Division Pheaophyte: C. stricta and C. compressa; Division All data were expressed as the mean ± standard deviation (SD) and Rhodophyta: C. elongata and P. umbilicalis; and Division are statistically compared by one-way variance analysis (ANOVA) Chlorophyta: E. compressa and U. lactuca. These seaweeds were and Tukey HSD test (for homogeneous variance) and by non- cleaned from epiphytes, salt and dried at room temperature (23 ± parametric variance analysis of Kruskal-Wallis and Mann-Withney 2°C) for 72 h. The dried samples were powdered and stored at - U-test (for non homogeneous variance), after verification of 20°C until used for further experiments. variance homogeneity by Hartley test. 1476 Afr. J. Biotechnol.

Table 1. Yield (%) and total phenolic content (mg GAE g-1 DW) of methanolic and ethanolic extracts.

Yield (%) Total phenolic content (mg GAE g-1 DW) Seaweed ME extract ET extract ME extract ET extract Cystoseira stricta 8.41 ± 0.26a 3.81 ± 0.13a 8.24 ± 0.89a 4.63 ± 0.21a Cystoseira compressa 20.26 ± 0.45b 8.89 ± 0.11b 10.24 ± 0.09b 15.70 ± 0.72b Corallina elongata 2.53 ± 0.90c 1.70 ± 0.55de 4.58 ± 0.14c 3.09 ± 0.16c Porphyra umbilicalis 5.19 ± 0.23d 2.55 ± 0.09c 3.80 ± 0.05d 4.56 ± 0.02a Enteromorpha compressa 4.14 ± 0.20e 1.82 ± 0.42d 3.94 ± 0.28cd 3.62 ± 0.16c Ulva lactuca 9.29 ± 0.16f 1.15 ± 0.24e 2.25 ± 0.05e 3.63 ± 0.06c

Each value is the mean ± standard deviation (n = 3). Different lowercase letters indicate significant difference between means (p < 0.05).

Figure 1. DPPH radical scavenging activity (%) of methanolic seaweeds extracts and positive control (BHT and Vit E), at various concentrations.

RESULTS Ethanol can be considered as an excellent solvent of extraction (p < 0.05) in C. compressa, P. umbilicalis and Extracts yield U. lactuca. The brown seaweeds of Cystoseira genus showed higher phenolic contents, with the best amount in Six species of seaweeds were extracted with methanol C. compressa (10.24 mg GAE g-1 DW in ME extract; and ethanol. The yields of ME extracts recorded were 15.70 mg GAE g-1 DW in ET extract). superior to those of ET extracts (p < 0.05), except for C. elongata in which no effect of extraction solvent was shown (Table 1). A significantly higher yields were DPPH radical scavenging activity obtained in C. compressa (20.26% in ME extract and 8.89% in ET extract). Percentage of inhibition and IC50 of six seaweeds are presented in Figures 1 and 2 and Table 2. No significant effect of extraction solvents was recorded, except for Total phenolic content ethanol, in C. stricta, C. compressa, E. compressa and U. lactuca at 0.1 mg ml-1 and in P. umbilicalis at 2 mg ml-1 (p Phenolic contents of seaweeds extracts were evaluated < 0.05). Moreover, the extracts from Cystoseira genus and presented in Table 1. No significant effect of both showed the highest scavenging activity (p < 0.05) in both organic solvents on the capacity of extraction of these solvents (Figures 1 and 2). The ET extract of C. stricta compounds was recorded, except only in E. compressa. recorded an IC50 of 0.1 mg ml-1 followed by C. compressa Oucif et al. 1477

Figure 2. DPPH radical scavenging activity (%) of ethanolic seaweeds extracts and positive control (BHT and Vit E), at various concentrations.

Table 2. IC50 (mg mL-1) of methanolic and ethanolic extracts.

IC50 (mg ml-1) Seaweed ME extract ET extract Cystoseira stricta 0.35 0.10 Cystoseira compressa 0.29 0.15 Corallina elongata 1.78 2.14 Porphyra umbilicalis 2.08 1.53 Enteromorpha compressa 1.32 1.26 Ulva lactuca 3.45 1.91 BHT 0.05 Vit E 2.38

with an IC50 of 0.15 mg ml-1 (Table 2). All seaweed higher reducing power (OD = 5.18) than all seaweed extracts showed higher anti-radical activity than vitamin E samples and Vitamin E (OD = 0.079). and lower than BHT (p < 0.05), except C. compressa and C. stricta extracts at concentration of 1 and 2 mg m-1 that showed a similar percentage of inhibition of the radical DISCUSSION DPPH than BHT. In the present study, the extraction yield in ME extracts was higher than ET extracts. These results are in Reducing power agreement with those of Lopez et al. (2011), which showed that the yield of ME extract of brown alga was Figure 3 presented results of reducing power. A higher than that obtained with ethanol. Matanjun et al. significantly higher reducing activity was reported in ET (2008) noticed that ME extracts of red and green extracts of all seaweeds (p < 0.05). Moreover, seaweeds seaweeds had a higher yield, compared with those of of Cystoseira genus showed a maximum absorbance diethylether and reported that more polar compounds (OD) value in both organics extracts (p < 0.05): C. were found in seaweed extracts and increasing solvent compressa (OD = 1.32) in ET extract and C. stricta (OD = polarity increased the extraction yield (Boonchum et al., 0.87) in ME extracts. The positive control BHT showed 2011). 1478 Afr. J. Biotechnol.

Figure 3. Reducing Power of methanolic and ethanolic seaweeds extracts (concentration of extract used = 2 mg mL-1). Each value is the mean ± standard deviation (n = 3). Different lowercase letters indicate significant difference between means (p < 0.05).

Marine seaweed substances, especially polyphenols connection with the extrinsic factors (irradiation, salinity, have antioxidant activity and the major active compounds nutriments, season, site of sampling and its depth) and are phlorotannins and fucoxanthin (Yan et al., 1999). In intrinsic factors (stage of development and reproduction the polar organic solvents, the phenolic compounds are of seaweed). Our results also indicate that the higher generally more soluble than in water. The recommended antioxidant activity was observed in extract with higher effective solvents are methanol, ethanol and acetone phenolic contents which are in agreement with Duan et (Waterman and Mole, 1994). By polar solvents, phenolic al. (2006) and Boonchum et al. (2011). compounds which were attached in sugars or proteins, Screening of antioxidant activity by DPPH radical saponines, glycosides, organic acids, salts, and in the scavenging activity was well used by authors because it mucus can be extracted (Cho et al., 2007). The most can be used for various samples and a low amount of important contents in P.T were found in the brown active substances can be detected (Sanchez-Moreno, seaweeds Cystoseira from Algerian West Coast. 2002). Our results showed an anti-radical activity which is Matanjun et al. (2008) observed the same result. The dependent-dose. In fact, Ismail and Tan (2002) and Cho brown seaweeds (Dictyota dichotoma, Sargassum et al. (2011) reported that the reduction of radical DPPH polycystum and Padina species) contained higher increased significantly according to the increase of phenolic content than the green (Caulerpa lentillifera and concentrations of seaweeds extracts and positive Caulerpa racemosa) and red seaweeds (Eucheuma controls. In general, results indicate that ethanol has a cottonii, Eucheuma spinosum and Halymenia durvillaei). better effect than methanol on the anti-radical activity Similar phenolic amounts to those observed were (Ismail and Tan, 2002). In agreement with Güner et al. reported in C. elongata (4.43 ± 4.01 mg GAE g-1 DW) (2015) and Mhadhebi et al. (2014), the genre Cystoseira (Rico et al., 2012), Porphyra tenera (4.70 ± 0.60 mg GAE revealed a strong anti-radical activity, at various g-1 DW) (Machu et al., 2015), Enteromorpha intestinalis concentrations. Parthiban et al. (2014) also reported that (2.65 ± 0.08 mg GAE g-1 DW), U. lactuca (2.36 ± 0.07 mg brown algae showed significantly higher phenolic content GAE g-1 DW) (Farvin and Jacobsen, 2013), C. stricta and antioxidant activities than the red and green (10.14 ± 0.16 mg GAE g-1 DW) (Guezzen, 2014); seaweeds. C. stricta recorded strong IC50 of 0.1 mg ml-1 Cystoseira myrica (10.08 ± 1.13 mg GAE g-1 DW) (Sadati compared to those found in Cystoseira crinita (20 ± 0.5 et al., 2011), and Cystoseira tamariscifolia (10.91 ± 0.07 µg ml-1), Cystoseira sedoides (50.3 ± 0.1 µg ml-1) and C. mg GAE g-1 DW) (Zubia et al., 2009). compressa (61 ± 0.3 µg ml-1) (Mhadhebi et al., 2014). In Other works reported different phenolic contents. addition, the capacity of all seaweed extracts to inhibit the Ganesan et al. (2011) observed higher amount in E. DPPH radical is lower than that of positive control BHT compressa (7.76 ± 0.10 mg GAE g-1 DW); in C. (Ismail and Tan, 2002; Shanab et al., 2011), except, the compressa, Güner et al. (2015) reported 0.16 ± 0.08 mg anti-radical activity of Cystoseira, that remains GAE g-1 DW, and Mhadhebi et al. (2014), reported 61 ± comparable to that of BHT at 1 and 2 mg ml-1. However, 0.30 mg GAE g-1 DW. This difference is probably due to vitamin E showed an anti-radical activity lower than that the very variable properties of every species, which are in of BHT and the various studied seaweeds. This is also Oucif et al. 1479

reported by Narasimhan et al. (2013). This suggests the of Biotechnology, University of Oran 1 Ahmed Ben Bella, use of this seaweeds species as a better source of Algeria). They thank Mr. Miloud Benaissa, polyphenols and it is more advantageous than vitamin E. teacher/researcher at Department of Biology, Institute of The brown algae of Cystoseira genus present a better Exact Sciences and Natural and Life Sciences, University reducing power, with an influence of the solvent of Center, Ahmed Zabana of Relizane for assistance with extraction. Luo et al. (2010) also reported the highest sample collection. amount of reducing power in brown seaweeds. The ET extracts have a reducing power superior to that of REFERENCES methanolic extracts. Cho et al. (2010) also related that the most effective reducing power is obtained from ET Boonchum W, Peerapornpisal Y, Vacharapiyasophon P, Pekkoh J, extracts of the green algae E. compressa and Pumas C, Jamjai U, Amornlerdpison D, Noiraksar T, Kanjanapothi D (2011). Antioxidant activity of some seaweed from the Gulf of Capsosiphon fulvescens. Ethanol is a solvent that is not Thailand. Int. J. Agric. Biol. 13:95-99. toxic and more interesting for industrialists. Our results Cho ML, Kang IJ, Won MH, Lee HS, You SG (2010). Antioxidant revealed also that green alga E. compressa had a activities of ethanol extracts and their solvent partitioned fractions capacity to reduce the iron higher than that of red from various green seaweeds. J. Med. Food 13:1232-1239. Cho ML, Lee HS, Kang IJ, Won MH, You SG (2011). Antioxidant seaweeds (C. elongata and P. umbilicalis). These results properties of extract and fractions from Enteromorpha prolifera, a are in agreement with those of Zhang et al. (2007) and type of green seaweed. Food Chem. 127:999-1006. Narasimhan et al. (2013) which related that the reducing Cho SH, Kang SE, Cho JY, Kim AR, Park SM, Hong YK, Ahn DH power of green seaweeds is superior to that of the red (2007). The antioxidant properties of brown seaweed (Sargassum siliquastrum) extracts. J. Med. Food 10:479-485. seaweed. In comparison with the positive control (BHT Cornish ML, Garbary DJ (2010). Antioxidants from macroalgae: and vitamin E), our results indicate that the reducing potential applications in human health and nutrition. Algae 25:155- capacity of our extracts is lower than that of the BHT and 171. superior to that of the vitamin E. It was also reported by Cox S, Abu-Ghannam N, Gupta S (2010). An assessment of the antioxidant and antimicrobial activity of six species of edible Irish Shanab et al. (2011), who showed that the capacity to seaweeds. Int. Food Res. J. 17:205-220. reduce the iron by BHT is higher than that of the green Duan XJ, Zhang WW, Li XM, Wang BG (2006). Evaluation of alga E. compressa. Ganesan et al. (2008) and Cho et al. antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, (2010) observed that reducing capacity of the red Polysiphonia urceolata. Food Chem. 95:37-43. Farvin KS, Jacobsen C (2013). Phenolic compounds and antioxidant seaweed Euchema kappaphycus and green seaweed E. activities of selected species of seaweeds from Danish coast. Food compressa is higher or comparable to that of the vitamin Chem. 138:1670-1681. E. Favier A (2003). Le stress oxydant intérêt conceptuel et expérimental The BHT revealed an antioxidant capacity superior to dans la compréhension des mécanismes des maladies et potentiel thérapeutique. L’act. Chim. 1:108-115. those of the seaweeds. However, this synthetic Ganesan P, Chandini SK, Bhaskar N (2008). Antioxidant properties of antioxidant has proved toxic and carcinogenic (Safer and methanol extract and its solvent fractions obtained from selected Al-Nughamish, 1999). So, it must be replaced by safe Indian red seaweeds. Biores. Technol. 99:2717-2723. and little expensive natural antioxidants. Ganesan K, Suresh Kumar K, Subba Rao PV (2011). Comparative assessment of antioxidant activity in three edible species of green In conclusion, the brown algae Cystoseira collected seaweed, Enteromorpha from Okha, Northwest coast of India. Innov. from Algerian West Coast revealed the best anti-radical Food Sci. Emerg. Technol. 12(1):73-78. and reducing capacities, with higher phenolic content Güner A, Köksal Ç, Erel ŞB, Kayalar H, Nalbantsoy A, Sukatar A, among the six seaweeds, in both solvents of extraction. Yavaşoğlu NÜK (2015). Antimicrobial and antioxidant activities with acute toxicity, cytotoxicity and mutagenicity of Cystoseira compressa This suggests that methanol and ethanol can be used for (Esper) Gerloff & Nizamuddin from the coast of Urla (Izmir, Turkey). extraction of active compounds (in particular the total Cytotechnology 67:135-143. polyphenols); and preferentially ethanol, which would Hellio C, Marechal JP, Véron B, Bremer G, Clare AS, Le Gal Y (2004). present less risk in industrial products. Also, it would be Seasonal variation of antifouling activities of marine Algae from the Brittany coast (France). Mar. Biotechnol. 6:67-82. interesting to study in vivo antioxidant activity of this Ismail A Jr, Tan S (2002). Antioxidant activity of selected commercial antioxidant-rich extracts which may be used as a dietary seaweeds. Malays. J. Nutr. 8(2):167-177. supplementary or as a natural antioxidant in food Kelman D, Posner EK, Mcdermid KJ, Tabandera NK, Wright PR, Wright industries. AD (2012). 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Résumé La détermination de la composition proximale, lipidique et minérale de Cystoseira stricta, Cystoseira compressa, Corallina elongata, Enteromorpha compressa et Ulva lactuca ont révélé que ces espèces constituent une excellente source de minéraux, polysaccharides, protéines, d’AGPI essentiels et d’antioxydants alternatifs. L’évaluation des propriétés antioxydantes a mis en évidence que les algues du genre Cystoseira se sont révélées actives, présentant ainsi les meilleures activités anti-radicalaires, de remarquables IC50 et d'excellents pouvoirs réducteurs, avec de bons contenus en polyphénols. Cette activité est dépendante de la méthode et du solvant d’extraction, dont les plus efficaces : l'extraction éthanolique par soxhlet (C. stricta) et la macération dans l’eau ou l’éthanol (C. compressa). L’extrait d’algue éthanol-aqueux combiné de C. compressa incorporé dans la glace pendant la réfrigération du chinchard commun a permis une inhibition du développement microbienne, un ralentissement de l'hydrolyse des lipides (formation d'AGL) et l'oxydation tertiaire (formation de composés fluorescents), et une réduction du processus de propagation de l'oxydation primaire et secondaire. La fraction enrichie de C. compressa par la méthode Microextraction Dispersive Liquide-Liquide, a révélé une stimulation de la croissance de Nannochloropsis gaditana, à raison d’une concentration de 0,1%. Cette fraction contient cinq classes de régulateurs de croissance végétale.

Mots clés : Algues; Antimicrobien; Antioxydants; Biostimulant; Chinchard; Cystoseira; Microalgue; Nannochloropsis; Phytohormones; Valorisation.