Mgr. Tereza Schořálková

Home , Eublepharis

Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakulta Katedra ekologie Charles University, Faculty of Science Department of Ecology

Doktorský studijní program: Ekologie Doctoral study programme: Ecology

Autoreferát disertační práce Summary of the Doctoral Thesis

Hormonální kontrola pohlavně-dimorfních znaků ještěrů Hormonal control of sexually dimorphic traits in lizards

Mgr. Tereza Schořálková

Školitel/Supervisor: prof. Lukáš Kratochvíl, Ph.D. Školitel-konzultant/Supervisor-consultant: RNDr. Lukáš Kubička, Ph.D.

Praha, 2017

ABSTRAKT

Disertační práce se zabývá hormonální kontrolou pohlavního dimorfismu u ještěrů a je tvořena čtyřmi příspěvky. Pohlavní hormony jsou důležité pro vývoj a regulaci pohlavního dimorfismu, jednotlivé znaky jsou však ovlivňovány různými mechanismy. Samčí sexuální chování gekona Eublepharis macularius je regulováno testosteronem a lze jej úspěšně indukovat také u samic, jen náběh a vyhasínání jednotlivých prvků chování trvá déle než u samců. Nástup a vyhasínání znaků nejsou ani u jednoho pohlaví okamžité, s čímž je nutné v experimentech využívajících hormonální manipulace počítat, což se v předchozím výzkumu nedělo. U dalšího druhu gekona Paroedura picta stimuluje expresi samčího sexuálního chování u samic testostosteron i dihydrotestosteron. Samčí ofenzivní agrese se však u samic objevuje pouze po dodání testosteronu, který tím, že je v mozku aromatizován na biologicky aktivní estradiol, patrně stimuluje ofenzivní chování jen nepřímo. Oba androgeny také u samic stimulují růst samčích kopulačních orgánů. Se sexuálním chováním obou druhů gekonů je spojené i rozpoznání pohlaví, které umožňují znaky vyvolané působením gonadálních androgenů u samců, kdežto pro rozpoznání jedince jako samice není nutný specifický samičí feromon kontrolovaný ovariálními hormony. Pohlavní rozdíly ve velikosti těla gekonů vznikají působením samičích ovariálních hormonů, kdežto samčí gonadální androgeny ani snížená reprodukční zátěž samic se na něm vůbec nepodílí a samci jsou v tomto ohledu spíše neutrálním pohlavím. Předkládaná disertační práce, která je zaměřená na dva modelové druhy významné skupiny šupinatých plazů – gekonů, do značné míry nabourává obecné vžité představy o endogenních mechanismech kontroly jednotlivých znaků pohlavního dimorfismu šupinatých plazů i obratlovců jako celku a přispívá tak k jejich hlubšímu poznání.

ABSTRACT

This Ph.D. thesis is fosuced on hormonal control of sexual dimorphism in lizards and is composed of four contributions. Sex steroid hormones are important for development and regulation of sexual dimorphism in reptiles, but particular traits are controlled by different endogenous mechanisms. Male sexual behaviour of the gecko E. macularius is controlled by testosterone and can be successfully induced in females, only the onset and cessation of the behaviour take longer than in males. The onset and cessation of particular traits are not immediate for both sexes, and this time component has to be taken into account in future experiments using hormonal manipulations. In other species of the gecko, P. picta, testosterone and dihydrotestosterone stimulates the expression of male sexual behaviour in females as well. Male offensive aggression occurs only in testosterone-treated females, probably due to its conversion to biologically active estradiol in the brain, testosterone thus stimulates offensive behaviour probably only indirectly. Both androgens also stimulate the growth of the male copulatory organs, hemipenes, in females, but in different way than the size of penis in male mammals. Sexual behaviour of both gecko species is associated with sex recognition, which is allowed by androgen-triggered cues in males, whereas female attractiveness pheromone controlled by ovarian hormones is not required for identification of an individual female as a sexually attractive female. Sexual size dimorphism in geckos is caused by growth feminization by ovarian hormones in females, whereas male gonadal androgens and female reproductive costs are not involved - males thus are rather neutral sex in the respect of growth control by gonadal hormones. This Ph.D. thesis, focused on two model gecko species, provides new insights into the current knowledge of endogenous mechanisms controlling particular components of sexual dimorphism in squamate reptiles and vertebrates as a whole.

1. Úvod

Disertační práce je zaměřena na odhalení vlivů hormonální kontroly pohlavně dimorfních znaků u ještěrů, konkrétně u gekonů (Gekkota). Pohlavní rozdíly u plazů nalezneme ve velkém množství znaků včetně velikosti a tvaru těla, ve zbarvení, chování, pachu či rychlosti metabolismu (např. Cox a kol., 2005; Garland a Else, 1987; Greenberg, 1943). Mnoho z těchto znaků je řízeno pohlavně-specifickými hladinami cirkulujících steroidních hormonů. Konkrétní mechanismy účinků hormonů na expresi pohlavně dimorfních znaků jsou ale dosud jen málo probádané. U obratlovců včetně plazů obsahuje samčí sexuální chování specifické stereotypní prvky a je obecně spojováno s testosteronem (T) produkovaným samčími gonádami (Phoenix a kol., 1959; Rhen a Crews, 1999). Tvrdí se však, že působení T na expresi těchto znaků se i u blízce příbuzných druhů často liší (u gekonů např. Golinski a kol., 2011, 2014, 2015; Rhen a Crews, 1999) a liší se i senzitivita k vyvolání samčího sexuálního chování androgeny mezi pohlavími (Golinski a kol., 2011, 2015; Rhen a Crews, 1999, 2000). Tvrdilo se, že samci některých druhů potřebují pro správnou expresi samčího sexuálního chování v dospělosti projít v rámci rané ontogeneze obdobím se zvýšenými hladinami androgenů (pro některé prvky chování viz Golinski a kol., 2015; Rhen a Crews, 1999), kdy dojde k takzvané organizaci těchto znaků. Až teprve po této „organizaci“ mohou být dané znaky vyvolány v dospělosti působením androgenů (tzv. „hypotéza organizace“ dle Phoenix a kol., 1959). U dalších druhů (Golinski a kol., 2011, 2014; Rhen a Cews, 1999) bylo doloženo, že pro vyvolání samčího sexuálního chování je podstatné pouze aktuální zvýšení hladin T („aktivační hypotéza“ dle Arnold a Breedlove, 1985). Dosavadní experimenty byly založeny na jednorázovém behaviorálním testování po krátké době od začátku hormonální manipulace (tj. po odstranění gonád či dodání exogenních hormonů) trvající někdy pouze jen 4 až 10 týdnů (Golinski a kol., 2011, 2015; Rhen a Crews, 1999). Přišlo nám podezřelé, že by se blízce příbuzné druhy natolik lišily ve fyziologické kontrole homologického a značně konzervativního chování. Uvědomili jsme si, že rozdílné výsledky by mohly odrážet pouze rozdíly v načasování behaviorálního testování. Proto jsme se rozhodli detailně prozkoumat postupné účinky působení T na expresi jednotlivých prvků samčího sexuálního chování u samců i samic gekončíka druhu Eublepharis macularius (čeleď Eublepharidae). Výsledná

studie navrhující parsimonní vysvětlení zdánlivých rozdílů v kontrole samčího sexuálního chování představuje první kapitolu předkládané disertační práce. Dosavadní poznatky o vlivu pohlavních hormonů na specifické samčí chování jsme následně rozvíjeli i v druhé kapitole, tentokrát u gekona druhu Paroedura picta (čeleď Gekkonidae). Zde se srovnávalo dlouhodobé působení dvou androgenů (T a dihydrotestosteronu, DHT) na expresi samčího sexuálního a agonistického chování u ovariektomizovaných samic. Tyto androgeny byly vybrány za účelem zjištění dalších poznatků v komplikované ose endogenních mechanismů hormonální kontroly pohlavně specifického chování. T lze, oproti DHT, v rámci steroidogeneze aromatizovat na estradiol

(E2), který se u některých obratlovců zásadně podílí na typických projevech samčího sexuálního a agonistického chování (Crews a Morgentaler, 1979; Simon a kol., 1996). Dalším zjištěním také bylo, že se oba dva tyto androgeny u ovariektomizovaných samic podílely na rozvoji samčích kopulačních orgánu – hemipenisů. Vliv T na rozvoj hemipenisů u samic gekonů byl dokumentován již v předešlých experimentech (Golinski a kol., 2011, 2014, 2015; Rhen a kol., 1999), avšak porovnáním s dlouhodobými účinky DHT na rozvoj těchto struktur je naše studie unikátní. V této práci jsme se nevěnovali jen tomu, jak hormony ovlivňují manipulované samice. Další částí tohoto komplexního experimentu je i to, jak jsou manipulované samice vnímány samci. Znaky, kterými se samci a samice odlišují, jim totiž také umožňují rozpoznání pohlaví. Rozpoznání pohlaví u plazů pravděpodobně probíhá na základě vizuálních, nebo chemických stimulů (Cooper a Steele, 1997; Greenberg, 1943; Kubie a kol., 1978; López a Martín, 2001). U druhů orientujících se spíše pomocí pachů se dosud pro samičí atraktivitu předpokládala nutná přítomnost specifického feromonu (Mason a kol., 1989; Mason a Gutzke, 1990). Tento samičí feromon má být pod vlivem samičích ovariálních hormonů, pravděpodobně estrogenů (Parker a Mason, 2012), nicméně se předpokládá, že za inhibici jeho produkce u samců mohou gonadální androgeny (Parker a Mason, 2014). Právě nutností přítomnosti ovariálních hormonů pro samičí atraktivitu a rozdíly ve vlivu T a DHT na vnímání jedince jako samce jsme se rovněž zabývali v druhé kapitole této práce. Problematiku rozpoznávání pohlaví včetně nutnosti přítomnosti samičího feromonu pro sexuální atraktivitu samic jsme dále rozvíjeli ve třetí kapitole u gekončíka E. macularius. Kromě hypotéz rozpoznávání pohlaví, uvedených v závěru předchozí kapitoly, se také předpokládá, že feromon samičí atraktivity je dle některých autorů spojen s lipidy v pokožce (Garstka a Crews, 1981). V období těsně před svlékáním pokožky, kdy je již stará vrstva oddělená od nové, je pak zamezeno uvolňování lipidů s feromonální funkcí, čímž je omezené

i rozpoznání svlékající se samice samcem (Mason a Gutzke, 1990). Detailním testem poznatků a hypotéz týkajících se znaků nutných k rozpoznávání pohlaví včetně jejich hormonální kontroly se právě zabývá tato kapitola. Čtvrtá kapitola se věnuje jednomu z nejzásadnějších a nejčastěji studovaných znaků pohlavního dimorfismu, a to rozdílu ve velikosti těla mezi samci a samicemi, konkrétně u modelového plaza P. picta. Mezi plazy najdeme druhy s většími samci, většími samicemi a druhy, kde jsou samci a samice velikostně srovnatelní (vztaženo na délku těla). Mechanismů, jak tento rozdíl vzniká, může být v ontogenezi více. „Hypotéza dvojího účinku androgenů“ (Cox a John-Alder, 2005) se věnuje tomu, jak androgeny maskulinizují růst, tj. pozitivně ovlivňují finální velikost samců u druhů s většími samci a negativně u druhů s většími samicemi. Další uvažovanou hypotézou je „vliv investice do reprodukce“, podle které je velikost negativně ovlivněna u pohlaví, které musí více investovat do reprodukce, ať jsou to samci, kteří musí bránit teritorium a bojovat o samice, nebo samice, které více investují do péče o potomky (Cox a John-Alder, 2005). V předchozích experimentech naší skupiny byla na základě nepřímých důkazů navržena možnost vlivu ovariálních hormonů (Starostová a kol., 2013; Kubička a kol., 2013). Tato „hypotéza ovariálních hormonů“ předpokládá, že za rozdíly mezi pohlavími ve velikosti těla mohou samice, jejichž růst je feminizován působením ovariálních hormonů, a že samci jsou, co se velikosti těla týče, neutrální pohlaví. Komplexní test těchto tří hypotéz, které se zabývají endogenní příčinou pohlavního dimorfismu ve velikosti těla, je předmětem poslední kapitoly.

2. Cíle práce

Cílem disertační práce bylo prozkoumat, jak pohlavní steroidní hormony, a to především

T, nearomatizovatelný DHT a E2, ovlivňují jednotlivé znaky, kterými se mezi sebou samci a samice odlišují (především samčí sexuální a agonistické chování, znaky umožňující rozpoznávání pohlaví, délka těla a velikost samčích kopulačních orgánů). Dále s použitím vhodných metod hormonální manipulace rozlišit maskulinizující a feminizující efekty těchto hormonů a nastínit možné endogenní dráhy jejich působení. V neposlední řadě bylo také cílem otestovat zažité i recentně navržené hypotézy jejich působení na pohlavně dimorfní znaky a přispět tak k současné debatě o roli endogenní kontroly v evoluci životních strategií šupinatých plazů.

3. Materiál a metodika

Pro dosažení cílů předkládané disertační práce bylo využito 1) manipulací s hladinami gonadálních steroidů (jako je odstranění gonád a dodání exogenních hormonů pomocí šetrné kožní aplikace), 2) morfologických měření (zejména se jednalo o délku těla a velikost hemipenisů) a 3) behaviorálních testů (kdy pokusní jedinci interagovali s kontrolními skupinami). Studovanými jedinci byly zástupci druhu gekončíka nočního (Eublepharis macularius) a gekona madagaskarského (Paroedura picta). Oba druhy patří v rámci evoluční biologie a ekofyziologie mezi dobře prozkoumané (Flores a kol., 1994; Kratochvíl a Frynta, 2002, 2006; Kubička a Kratochvíl 2009; Rhen a Crews, 1999; Rhen a kol., 1999; Starostová a kol., 2010, 2013). Úspěšnost hormonálních manipulací byla ověřena v Endokrinologickém

ústavu Praha pomocí analýzy hladin vybraných gonadálních steroidů – zejména T, DHT a E2.

4. Výsledky a diskuze

První kapitola disertační práce je zaměřena na odhalení vlivu dlouhodobého působení T na jednotlivé projevy samčího sexuálního chování u obou pohlaví gekončíka E. macularius. Z výsledků vyplývá, že všechny prvky samčího sexuálního chování (dvoření i kopulace) je možno u samců i samic vyvolat aplikací T, přičemž nástup projevů po zvýšení hladin T v plasmě a jejich vyhasínání po snížení hladin se u obou pohlaví liší, což může být dáno vystavením rozdílným hladinám gonadálních hormonů během raného ontogenetického vývoje. Mechanismus působení T na samčí sexuální chování označujeme jako „dočasnou organizací“ a tvoří tak alternativní hypotézu k dosud postulovaným hypotézám „aktivačního a organizačního působení hormonů“. Dle nového konceptu „dočasné organizace“ nějaký čas trvá, než dojde stimulací zvýšenými hladinami hormonů k vývinu příslušných neurálních drah zodpovědných za dané chování, a zase nějaký čas trvá, než po odstranění zdroje příslušných hormonů dojde k degeneraci těchto neurálních okruhů. Tento koncept také vysvětlí, proč se v rámci předchozích studií blízce příbuzné druhy gekončíků lišily v hormonální kontrole samčího sexuálního chování. Hlavním důvodem byl rozdíl v délce jednotlivých experimentů – zatímco u druhů, kde se nepodařilo vyvolat u samic samčí sexuální chování (Golinski a kol., 2015; Rhen a Crews, 1999), byl manipulativní experiment patrně příliš krátký, tak u druhů, kde se samčí sexuální chování podařilo vyvolat, už bylo působení T dostatečně dlouhé

(Golinski a kol., 2014). Na základě našeho experimentu je jasné, že se různé druhy, a dokonce i obě pohlaví liší v době, která je potřebná k vyvolání příslušného znaku. Dočasná organizace, která klade důraz na umožnění dostatečně dlouhého působení gonadálních hormonů pro vyvolání příslušných znaků, tak může vysvětlit tyto rozdíly v působení hormonů i u ostatních obratlovců.

Druhá kapitola využívá znalostí získaných v první kapitole a dále je rozšiřuje u druhu P. picta a pro další prvky chování. Potvrdily se efekty dlouhodobého podávání T a DHT na vyvolání samčího sexuálního chování u ovariektomizovaných samic. Ovšem ofenzivní agresi u těchto samic stimuloval pouze T. Možnou příčinou je, že DHT nelze přeměnit na E2, který se zdá být u obratlovců, včetně plazů, pro expresi samčí agresivity zásadní (Heimovics a kol., 2015; Huffman a kol., 2013; Schlinger a Callard, 1990; Woodley a Moore, 1999; Wu a kol.,

2009). To nejspíš platí i u našeho modelového ještěra, pro kterého se aromatizace T na E2 pro vyvolání ofenzivního chování zdá být také významná. Rozdíly v působení obou androgenů u manipulovaných samic jsme pozorovali i při srovnání velikosti samčího kopulačního orgánu hemipenisu. T stimuloval maximální zvětšení hemipenisů, které byly velikostně srovnatelné s hemipenisy nemanipulovaných samců. DHT však měl v naší studii menší účinnost než T, což je opakem situace u savců, kde rozvoj sekundárních samčích struktur řídí právě DHT (Wilson a kol., 1981). Další problematikou řešenou ve druhé kapitole bylo rozpoznávání pohlaví a ovlivnění exprese klíčových znaků rozpoznání pohlavními hormony. Podle našich výsledků není pro samičí atraktivitu potřeba odpovídající feromon, jehož produkci stimulují ovariální hormony, jak se dosud předpokládalo (Garstka a Crews, 1981; Parker a Mason, 2012), protože ovariektomizované samice byly pro samce stále atraktivní. Naopak samčí gonadální androgeny mají zásadní vliv na rozpoznání jedinců jako samců. Zvláště T způsoboval, že manipulované samice byly samci často napadány. DHT také zvýšil napadání manipulovaných samic, ale pravděpodobně díky jejich pasivitě, způsobené nemožností aromatizovat DHT na E2, docházelo i k jejich páření. Pro některé druhy obratlovců je typickým znakem dominantního samce páření submisivního samce (Adkins-Regan, 2014; Bailey a Zuk, 2014). Páření mezi samci bylo pozorováno i u kontrolních testů v rámci této studie. Problematika vlivu dominance a pasivity v sexuálním a agonistickém chování ještěrů je však dosud jen málo studovaná a je ji proto potřeba dále experimentálně testovat.

Třetí kapitola opětovně vyvrátila nutnost přítomnosti feromonu samičí atraktivity a potvrdila důležitost samčích hormonů pro rozpoznání pohlaví – zatímco se samci dvořili kastrátům, kteří měli velmi nízké hladiny E2, tak na DHT a T manipulované samice byli

agresivní. Zároveň se nepotvrdil jakýkoliv vliv svlékání pokožky na rozpoznávání pohlaví. Dle výsledků je pravděpodobné, že samci se chovají k jedinci vlastního druhu včetně mláďat, který nemá androgeny maskulinizované znaky pro rozpoznání, jako k samici a snaží se s ním spářit. V práci z první kapitoly jsme zjistili, že samci vnímají samice jako atraktivní, a to bez ohledu na jejich receptivitu. Samice tohoto druhu uchovávají spermie několik měsíců po páření pro pozdější oplodnění (LaDage a kol., 2008). Z toho důvodu se snaha pářit se s jakýmkoliv jedincem, který, i když není receptivní, nevykazuje znaky samcovitosti, jeví jako výhodná, protože existuje možnost pozdějšího oplodnění budoucí snůšky.

Ve čtvrté kapitole se v rámci našeho experimentu nepotvrdil vliv androgenů na konečnou velikost těla pokusných jedinců, podobně jako tomu bylo již v minulých pracích naší skupiny (Kubička a kol., 2013, 2015; Starostová a kol., 2013). Ovariektomizované samice se zvýšenými hladinami androgenů (T a DHT) dorostly do srovnatelné velikosti jako samice, které byly pouze ovariektomizované, přičemž délka jejich těla byla srovnatelná i s délkou těla kontrolních samců. Srovnatelné velikosti, jako výše zmíněné skupiny, dorostly i samice ovariektomizované v nižším věku, čímž se možný vliv délky působení přirozených hladin ovariálních hormonů také neprokázal. Menší délky těla, než předchozí skupiny, dosáhly kontrolní samice a samice s jednostrannou ovariektomií, které se pravidelně rozmnožovaly a měly srovnatelné hormonální profily. Jednostranně ovariektomizované samice však měly přibližně o polovinu sníženou investici do potomků, přesto dorostly stejných rozměrů jako kontrolní samice, které investovaly do svých potomků daleko více. Snížená reprodukční zátěž tedy na velikost samice také nemá vliv. Tyto dvě skupiny se kromě velikosti od ostatních odlišovaly také shodně zvýšenými hladinami progesteronu, který je v tomto případě, protože se jedná o množící se samice, ovariálního původu. U potkanů byl zdokumentován vliv progesteronu na tvorbu kostí a je možné, že růst samic je ovlivněn právě tímto hormonem (Schmidt a kol., 2000). Skupinou s nejmenšími jedinci byly ovariektomizované samice s experimentálně zvýšenými hladinami E2, tento hormon tedy jako jediný výrazně zpomalil růst manipulovaných jedinců. E2 ale také může mít výrazné negativní účinky na zdravotní stav pokusných jedinců, jak jsme se přesvědčili v našem předběžném experimentu. A i když manipulované samice před ukončením této části experimentu ještě nevykazovaly výrazné zdravotní potíže, nelze přesto bezpečně odlišit, jestli se jedná o přímý vliv E2 na velikost těla samic nebo zda jde o vliv nepřímý přes jejich možný zhoršený zdravotní stav. Celkově je ale patrné, že jediná hypotéza, která vysvětlí rozdíl ve velikosti těla mezi samci a samicemi gekona P. picta, je hypotéza ovariálních hormonů - ať už se jedná o

efekt E2, progesteronu, či jiného ovariálního hormonu. Pro bližší prozkoumání vlivu ovariálních hormonů na vznik pohlavního dimorfismu ve velikosti těla u šupinatých plazů je však zapotřebí dalších výzkumů.

5. Závěry

Pohlavní hormony jsou důležité pro vývoj a regulaci pohlavního dimorfismu, jednotlivé znaky jsou však ovlivňovány různými mechanismy. Samčí sexuální chování gekona E. macularius je regulováno T a lze jej úspěšně indukovat také u samic, jen náběh a vyhasínání jednotlivých prvků chování trvá déle než u samců. Nástup a vyhasínání znaků tedy nejsou ani u jednoho pohlaví okamžité, s čímž je nutné v experimentech využívajících hormonální manipulace počítat. U dalšího druhu gekona P. picta stimuluje expresi samčího sexuálního chování u samic T i DHT. Samčí ofenzivní agrese se však u samic objevuje pouze po dodání

T, který tím, že je v mozku aromatizován na biologicky aktivní E2, patrně stimuluje ofenzivní chování jen nepřímo. Oba androgeny také u samic stimulují růst samčích kopulačních orgánů, ovšem jinak, než je tomu u savců. Se sexuálním chováním obou druhů gekonů je spojené i rozpoznání pohlaví, které umožňují znaky vyvolané působením gonadálních androgenů u samců, kdežto pro rozpoznání jedince jako samice není nutný specifický samičí feromon kontrolovaný ovariálními hormony. Pohlavní rozdíly ve velikosti těla gekonů vznikají působením samičích ovariálních hormonů, kdežto samčí gonadální androgeny ani snížená reprodukční zátěž samic se na něm vůbec nepodílí a samci jsou v tomto ohledu spíše neutrálním pohlavím. Předkládaná disertační práce, která je zaměřená na dva modelové druhy významné skupiny šupinatých plazů – gekonů, do značné míry nabourává obecné vžité představy o endogenních mechanismech kontroly jednotlivých znaků pohlavního dimorfismu šupinatých plazů i obratlovců jako celku a přispívá tak k jejich hlubšímu poznání.

6. Použitá literatura

Arnold A.P., Breedlove S.M. (1985) Organizational and activational effects of sex steroids on brain and behavior - A reanalysis. Hormones and Behavior 19: 469-498.

Adkins-Regan E. (2014) Male-male sexual behavior in Japanese quail: Being "on top" reduces mating and fertilization with females. Behavioural processes 108: 71-79.

Bailey N.W., Zuk M. (2009) Same-sex sexual behavior and evolution. Trends in ecology & evolution 24: 439- 446.

Cooper W.E., Steele L.J. (1997) Pheromonal discrimination of sex by male and female leopard geckos (Eublepharis macularius). Journal of Chemical Ecology 23: 2967-2977.

Cox R.M., John-Alder H.B. (2005) Testosterone has opposite effects on male growth in lizards (Sceloporus spp.) with opposite patterns of sexual size dimorphism. Journal of experimental biology 208: 4679-4687.

Cox R.M., Skelly S.L., Leo A., John-Alder H.B. (2005) Testosterone regulates sexually dimorphic coloration in the eastern fence lizard, Sceloporus undulatus. Copeia 2005: 597-608.

Crews D., Morgentaler A. (1979) Effects of intracranial implantation of oestradiol and dihydrotestosterone on the sexual behaviour of the lizard Anolis carolinensis. The Journal of endocrinology. 8: 373-381.

Flores D., Tousignant A., Crews D. (1994) Incubation temperature affects the behavior of adult leopard geckos (Eublepharis macularius). Physiology & Behavior 55:1067-1072.

Garland Jr T., Else P.L. (1987) Seasonal, sexual, and individual variation in endurance and activity metabolism in lizards. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology 252: 439-449.

Garstka W.R., Crews D. (1981) Female sex pheromone in the skin and circulation of a garter snake. Science 214: 681-683.

Golinski A., John-Alder H., Kratochvíl L. (2011) Male sexual behavior does not require elevated testosterone in a lizard (Coleonyx elegans, Eublepharidae). Hormones and Behavior 59: 144-50.

Golinski A., Kubička L., John-Alder H., Kratochvíl L. (2014) Elevated testosterone is required for male copulatory behavior and aggression in Madagascar ground gecko (Paroedura picta). General and comparative endocrinology 205: 133-141.

Golinski A., Kubička L., John-Alder H., Kratochvíl L. (2015) Androgenic control of male-typical behavior, morphology and sex recognition is independent of the mode of sex determination: a case study on Lichtenfelder’s gecko (Eublepharidae: Goniurosaurus lichtenfelderi). Hormones and Behavior 72: 49-59.

Greenberg B. (1943) Social behavior of the western banded gecko, Coleonyx variegatus. Baird Physiological Zoology 16: 110-122.

Heimovics S.A., Trainor B.C., Soma K.K. (2015) Rapid effects of estradiol on aggression in birds and mice: The fast and the furious. Integrative and Comparative Biology 55: 281-293.

Huffman L.S., O'Connell L.A., Hofmann H.A. (2013) Aromatase regulates aggression in the African cichlid fish Astatotilapia burtoni. Physiology & Behavior 112: 77-83.

Kratochvíl L., Frynta D. (2002) Body size, male combat and the evolution of sexual dimorphism in eublepharid geckos (Squamata: Eublepharidae). Biological journal of the Linnean Society 76: 303-314.

Kratochvíl L., Frynta D. (2006) Egg shape and size allometry in geckos (Squamata: Gekkota), lizards with contrasting eggshell structure: Why lay spherical eggs? Journal of zoological systematics and evolutionary research 44: 217-222.

Kubička L., Kratochvíl L. (2009) First grow, then breed and finally get fat: hierarchical allocation to life-history traits in a lizard with invariant clutch size. Functional ecology 23: 595-601.

Kubička L., Golinski A., John-Alder H., Kratochvíl L. (2013) Ontogeny of pronounced female-biased sexual size dimorphism in the Malaysian cat gecko (Aeluroscalabotes felinus: Squamata: Eublepharidae): A test of the role of testosterone in growth regulation. General and comparative endocrinology 188: 183-188.

Kubička L., Starostová Z., Kratochvíl L. (2015) Endogenous control of sexual size dimorphism: Gonadal androgens have neither direct nor indirect effect on male growth in a Madagascar ground gecko (Paroedura picta). General and comparative endocrinology 224: 273-277.

Kubie J.L., Vagvolgyi A., Halpern M. (1978) Roles of vomeronasal and olfactory systems in courtship behavior of male garter snakes. Journal of Comparative and Physiological Psychology 92: 627-641.

LaDage L.D., Gutzke W.H.N., Simmons R.A., Ferkin M.H. (2008) Multiple mating increases fecundity, fertility and relative clutch mass in the female leopard gecko (Eublepharis macularius) Ethology 114: 512–520.

López P., Martín J. (2001) Pheromonal recognition of females takes precedence over the chromatic cue in male Iberian wall lizards Podarcis hispanica. Ethology. 107: 901-912.

Mason R.T., Fales H.M., Jones T.H., Pannell L.K., Chinn J.W., Crews D. (1989) Sex pheromones in snakes. Science. 245: 290-293.

Mason R.T., Gutzke W.H.N. (1990) Sex recognition in the leopard gecko, Eublepharis macularius (Sauria, Gekkonidae). Possible mediation by skin-derived semiochemicals. Journal of chemical ecology 16: 27- 36.

Parker M.R., Mason R.T. (2012) How to make a sexy snake: estrogen activation of female sex pheromone in male red-sided garter snakes. Journal of experimental biology 215: 723-730.

Parker M.R., Mason R.T, (2014) A novel mechanism regulating a sexual signal: The testosterone-based inhibition of female sex pheromone expression in garter snakes. Hormones and Behavior 66: 509-516.

Phoenix C.H., Goy R.W., Gerall A.A., Young W.C. (1959) Organizing action of prenatally administered testosterone propionate on the tissues mediating mating behavior in the female guinea pig. Endocrinology 65: 369-382.

Rhen T., Crews D. (1999) Embryonic temperature and gonadal sex organize male-typical sexual and aggressive behavior in a lizard with temperature-dependent sex determination. Endocrinology 140: 4501-4508.

Rhen T., Ross J., Crews D. (1999) Effects of testosterone on sexual behavior and morphology in adult female leopard geckos, Eublepharis macularius. Hormones and Behavior 36: 119-128.

Rhen T., Crews D. (2000) Organization and activation of sexual and agonistic behavior in the leopard gecko, Eublepharis macularius. Neuroendocrinology 71: 252-261.

Schlinger B.A., Callard G.V. (1990) Aromatization mediates aggressive behavior in quail. General and Comparative Endocrinology 79: 39-53.

Schmidt I.U., Wakley G.K., Turner R.T. (2000) Effects of estrogen and progesterone on tibia histomorphometry in growing rats. Calcified tissue international 67: 47–52.

Simon N.G., McKenna S.E., Lu S.F., Cologer-Clifford A. (1996) Development and expression of hormonal systems regulating aggression. Annals of the New York Academy of Sciences 794: 8-17.

Starostová Z., Kubička L., Kratochvíl L. (2010) Macroevolutionary pattern of sexual size dimorphism in geckos corresponds to intraspecific temperature-induced variation. Journal of evolutionary biology 23: 670-677.

Starostová Z., Kubička L., Golinski A., Kratochvíl L. (2013) Neither male gonadal androgens nor female reproductive costs drive development of sexual size dimorphism in lizards. Journal of experimental biology 216: 1872-1880.

Wilson J.D., George F.W., Griffin J.E. (1981) The hormonal control of sexual development. Science 211: 1278- 1284.

Woodley S.K., Moore M.C. (1999) Ovarian hormones influence territorial aggression in free-living female mountain spiny lizards Hormones and Behavior 35: 205-214.

Wu M.V., Manoli D.S., Fraser E.J., Coats J.K., Tollkuhn J., Honda S.I., Harada N., Shah N.M. (2009) Estrogen masculinizes neural pathways and sex-specific behaviors. Cell 139: 61-72.

1. Introduction

The Ph.D. thesis is focused on the effect of hormonal control of sexually dimorphic traits in lizards, particularly in geckos, an important group of squamate reptiles. In animals, sexual dimorphism is a widespread phenomenon. In reptiles, sexually dimorphic traits include body size and shape as well as coloration, behaviour, scent, and metabolic rate (e.g. Cox et al., 2005; Garland and Else, 1987; Greenberg, 1943). Sexually dimorphic traits use to be controlled by circulating levels of steroid hormones. However, the precise mechanisms of hormone effect on the expression of sexually dimorphic traits are still poorly explored.

In many vertebrates, including reptiles, male sexual behaviour is composed of specific stereotypic behaviours and in general it is associated with male gonadal testosterone (T) (Phoenix et al., 1959; Rhen and Crews, 1999). It was reported that even closely related species differ in the mechanism of the action of T (e.g. Golinski, et al., 2011, 2014, 2015; Rhen and Crews, 1999), and that males and females of a single species may differ in the sensitivity to androgens (Golinski et al., 2011, 2015; Rhen and Crews, 1999, 2000). It was argued that males of some species need to go through an early period with elevated androgen levels (for some elements of behaviour see Golinski et al., 2015; Rhen and Crews, 1999). Only after this "organization", the particular behaviours can be induced in adulthood by the action of elevated androgens (the so-called "organization hypothesis" by Phoenix et al., 1959). In other species (Golinski et al., 2011, 2014; Rhen and Cews, 1999), it was documented that only the actual increase of T levels is sufficient to induce male sexual behaviour ("activation hypothesis" by Arnold and Breedlove, 1985). Nevertheless, the previous experiments were based on behavioral testing in a single time shortly after the onset of hormonal manipulation,i.e. after removal of gonads or the supply of exogenous hormones, sometimes only after 4-10 weeks (Golinski et al., 2011, 2015; Rhen and Crews, 1999). We suspected that closely related species would not differ in physiological control of this homologous and considerably evolutionary conserved behaviour. We realized that different results could only reflect differences in the timing of behavioral testing. Therefore, we decided to examine in detail the progressive temporal effects of T on the expression of individual elements of male sexual behaviour in males and females of the species Eublepharis macularius (family Eublepharidae). Our study, the first chapter of the dissertation, proposes a parsimonious explanation of the apparent interspecific differences in the control of male sexual behavior. In the second chapter, we compared the long-term effects of two androgens (T and dihydrotestosterone; DHT) on the expression of male sexual and agonistic behavior in

ovariectomized females of the gecko Paroedura picta (family Gekkonidae). These androgens were selected to give further information on the complex endogenous control of sexually specific behaviour. T can be aromatized to estradiol (E2), which plays the key role in male sexual and agonistic behaviour in many vertebrates (Crews and Morgentaler, 1979; Simon et al., 1996). The T action on the development of hemipenes in gecko females has been documented in the previous experiments as well (Golinski et al., 2011, 2014, 2015; Rhen et al., 1999), but our long-term study of the effect of DHT on the development of these organs is unique. In this complex experiment, we also focused on the way females are recognized by males. Many species of reptiles use for sex recognition visual or chemical stimuli (Cooper and Steele, 1997; Greenberg, 1943; Kubie et al., 1978; López and Martín, 2001). In the case of scent-oriented species, the presence of a specific pheromone controlled by female ovarian hormones, especially estrogens, was assumed to be necessary for female attractiveness (Mason et al., 1989; Mason and Gutzke, 1990). It was also assumed that the production of this pheromone is inhibited by male gonadal androgens (Parker and Mason, 2014). In the second chapter of this thesis we tested the necessity of the presence of ovarian hormones for female attractiveness and differences in the effects of T and DHT on the perception of an individual as a male.

In the light of our previous findings we tested whether the presence of female pheromone for their sexual attractiveness is also necessary in the leopard gecko, E. macularius. In addition to the sex recognition hypotheses mentioned above, there was also supposed that the female pheromone is associated with lipids in the skin (Garstka and Crews, 1981). In the period just before skin shedding, when the old skin is separated from the new one, the releasing of lipids with pheromone function should be prevented and males should not able to recognize shedding females as females and should attack them (Mason and Gutzke, 1990). The detailed test of these hypotheses and other hypotheses related to the cues used for sex recognition and their hormonal control, forms the part of the third chapter.

The fourth chapter is focused on important and highly studied sexually dimorphic trait - body size. Among reptiles we can find male-larger species, female-larger species and monomorphic species. There are several hypotheses on the proximal control of sexual size dimorphism in squamates. The "Male androgen hypothesis" (Cox and John-Alder, 2005) assumes that male gonadal androgens are able to masculinize growth, i.e. to stimulate the growth in male-larger species and to suppress it it in female-larger species. According to the "reproductive cost hypothesis", the sex allocating more energy to reproduction (e.g. males

defending territory and fighting for females, or females investing a large amount of energy to egg production) should achieve smaller body size (Cox and John-Alder, 2005). Based on our previous experiments and indirect published evidence, we proposed the other growth- regulating mechanism (Starostová et al., 2013; Kubička et al., 2013). This "ovarian hormone hypothesis" assumes that differences between sexes in body size are controlled by the feminizing effect of ovarian hormones on female growth and that, regarding the hormonal control of body size, males are the neutral sex. A comprehensive test of these three alternative hypotheses on the developmental control of sexual size dimorphism in the model gecko is described in the last chapter.

2. Aims of the study

The aim of the doctoral PhD. thesis was to investigate how sex steroid hormones, namely

T, non-aromatizable DHT and (E2), affect the particular sexually dimorphic traits in squamate reptiles, particularly with the focus on male sexual and agonistic behaviour, cues responsible for sex recognition, body length and size of male copulatory organs. The appropriate methods of hormonal manipulation were used to distinguish between the masculinizing and feminizing effects of sex steroids and to uncover possible endogenous pathways of their action. Moreover, the goal was also to test the well-established and the recently proposed hypotheses suggesting the role of hormones in the endogenous control of sexually dimorphic traits and to contribute to the ongoing debate on this role in the evolution of squamate life-history.

3. Material and methods

To achieve the objectives of this thesis, it was performed: 1) the manipulation with the levels of gonadal steroids by removal of gonads and skin application of exogenous hormones), 2) morphological measurements, (particularly of body length and hemipenes size and 3) behavioural tests, i.e. interactions of experimental groups with animal stimuli. The experimental animals were representatives of two gecko species, Eublepharis macularius and Paroedura picta. Both species are well-established experimental model reptiles in the field of evolutionary ecology and ecophysiology (Flores et al., 1994; Kratochvíl and Frynta, 2002, 2006; Kubička and Kratochvíl 2009; Rhen and Crews, 1999; Rhen et al., 1999; Starostová et al., 2010, 2013). The hormonal manipulations were verified by analyzing the levels of gonadal steroids, particularly T, DHT and E2 in the Endocrinological Institute in Prague.

4. Results and discussion

The first chapter reveals the effect of long-term T treatment on the expression of male sexual behaviour in males and females of E. macularius. The results show that all components of male sexual behaviour (courting and copulation) can be induced in both sexes. However, the onset and cessation of this behaviour are different for each sex, perhaps due to exposure to different T levels during the early ontogeny. We called this mechanism of T action on male sexual behaviour "temporal organization" forming an alternative hypothesis to previously postulated hypotheses of hormonal activation and organization. According to this new concept, the neural pathways responsible for given behaviour needs longer time to develop properly after the elevation of levels of hormones controlling the behavior and also it takes some time to degenerate these neural circuits after the source of hormones is removed. This concept also explains why in previous studies closely related geckos were reported to vary in the mechanisms of hormonal control of male sexual behaviour. The main reason for the observed differences was likely the difference in the duration and timing of the experiments. For example, the manipulative experiment was probably too short and females failed to express male sexual behaviour in some studies (Golinski et al., 2015; Rhen and Crews, 1999), while in other studies, the hormonal treatment was long enough to provoke the male-typical sexual behaviour in females (Golinski et al., 2014). Species and even sexes of a single species can differ in the time needed for proper development of neural circuits. The temporal organization can explain differences in hormonal effect on trait expression even among other vertebrates.

The second chapter extends the knowledge gained in the first chapter in other animal species and in other behavioural elements. The long-term administration of T and DHT induced male sexual behaviour in ovariectomized females. However, only T stimulated offensive aggression in these females. Unlike the T, DHT is not convertible to E2, which seem to be essential for the expression of male aggressiveness in vertebrates (Heimovics et al., 2015; Huffman et al., 2013; Schlinger and Callard, 1990; Woodley and Moore , 1999; Wu et al., 2009). This is probably also the case in our model lizard where aromatization of T to E2 seems to be mandatory for the induction of male offensive behaviour. Moreover, different effects of androgens on hemipenal size were observed. T stimulated maximal enlargement of hemipenes to a size comparable to non-manipulated males. However, DHT stimulated their enlargement, but not to the typical male size. This is the opposite situation to mammals where the development of male copulatory organs is controlled largely by DHT (Wilson et al.,

1981). Next, we also focused on sex recognition and cues responsible for sex recognition including their hormonal control. According to our results, female pheromone controlled by ovarian hormones is not required for female attractiveness, as has been proposed in the past for squamates (Garstka and Crews, 1981; Parker and Mason, 2012). Ovariectomized females were still attractive to males. In contrast, male gonadal androgens have a large influence on the recognition of individuals as males, mainly T-treated females were frequently attacked by male controls. DHT-treated females were also attacked, but they were mated as well, probably due to their passivity as we did not observe any offensive aggression in this group. Male-male mating was also observed during the control tests in this study. I was documented that dominant males of some vertebrate species mate submissive males (Adkins-Regan, 2014; Bailey and Zuk, 2014). However, the question of dominance and passivity in the sexual and agonistic interactions in lizards is still very poorly studied and further research is needed.

The third chapter supports the findings of the second chapter. The female pheromone controlled by ovarian hormones is also not necessary for recognition an individual as a female, but androgens are important for recognition of males also in the other gecko species.

Males courted male castrates possessings very low E2 levels and attacked both DHT- and T- treated females. At the same time, no effect of skin shedding on individual recognition was confirmed. Based on our results, males are sexually attracted to individuals of the same species including juveniles and non-receptive females) if they are not masculinized by elevated androgen levels. Females of this species are able to store sperms for later fertilization even for several months after mating (LaDage et al., 2008). It seems to be advantageous for male to attempt to mate with any individual not exhibiting male characteristics, due to the possibility of later fertilization.

Based on the results of the fourth chapter, the androgen regulation of growth was not confirmed as in the previous papers of our group (Kubička et al., 2013, 2015, Starostová et al., 2013). Ovariectomized females treated with androgens (T and DHT) reached the comparable size as control males and both groups of only ovariectomized females. Smaller but similar body size was achieved reproductively active females with unilateral ovariectomy and control females. Both groups shared similar hormonal profiles, however, the control females produced twice more eggs than the other group with experimentally reduced allocation to reproduction. Reproductive costs thus also have little effect on body size in females. These two groups possessed consistently elevated levels of progesterone. The effects of progesterone on bone formation was documented in rats and it is possible that female

growth can be affected by this hormone (Schmidt et al., 2000). The ovariectomized females with experimentally elevated E2 levels were the smallest. This hormone significantly slowed the growth of manipulated individuals, but exogenous E2 may also have significant negative effects on animal health, as we observed in our preliminary experiment. Although manipulated females did not have significant health problems before the end of this part of the experiment, it is impossible to precisely distinguish between direct effect of E2 on the female body size and its indirect influence through the effect of the health condition. Overall, the only tested hypothesis consistent with the results in P. picta is the ovarian hormones hypothesis regardless whether the effect is mediated by E2, progesterone or other ovarian hormone. However, further research is needed to investigate the exact role of ovarian hormones in the development of sexual size dimorphism in squamate reptiles.

5. Conclusions

Sex steroid hormones are important for development and regulation of sexual dimorphism in reptiles, but particular traits are controlled by different endogenous mechanisms. Male sexual behaviour of the gecko E. macularius is controlled by T and can be successfully induced in females, only the onset and cessation of the behaviour takes longer than in males. The onset and cessation of particular traits are not immediate for both sexes, and this time component has to be taken into account in future experiments using hormonal manipulations. In other species of the gecko, P. picta, T and DHT stimulates the expression of male sexual behaviour in females as well. Male offensive aggression occurs only in T-treated females, probably due to its conversion to biologically active E2 in the brain, T thus stimulates offensive behaviour probably only indirectly. Both androgens also stimulate the growth of the male copulatory organs, hemipenes, in females, but in different way than the size of penis in male mammals. Sexual behaviour of both gecko species is associated with sex recognition, which is allowed by androgen-triggered cues in males, whereas female attractiveness pheromone controlled by ovarian hormones is not required for identification of an individual female as a sexually attractive female. Sexual size dimorphism in geckos is caused by growth feminization by ovarian hormones in females, whereas male gonadal androgens and female reproductive costs are not involved - males thus are rather neutral sex in the respect of growth control by gonadal hormones. This Ph.D. thesis, focused on two model gecko species, provides new insights into the current knowledge of endogenous mechanisms controlling particular components of sexual dimorphism in squamate reptiles and vertebrates as a whole.

6. References