DEVELOPPEMENT D'OUTILS MOLECULAIRES POUR DETERMINER LES NIVEAUX D'ACTIVITE DES GROUPES BACTERIENS PRESENTS DANS LE LISIER DE PORC

par

Caroline Roy

memoire presents au Departement de biologie en vue de l'obtention du grade de maitre es sciences (M.Sc.)

FACULTE DES SCIENCES UNIVERSITE DE SHERBROOKE

Sherbrooke, Quebec, Canada, novembre 2007

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While these forms may be included Bien que ces formulaires in the document page count, aient inclus dans la pagination, their removal does not represent il n'y aura aucun contenu manquant. any loss of content from the thesis. •*• Canada Le 30 novembre 2007 lejury a accepte le memoire de Mme Caroline Roy dans sa version finale.

Membres dujury

Mme Carole Beaulieu Directrice Departement de biologie

Madame Caroline Talbot Codirectrice Departement de biologie

Mme Marie-France Palin Membre Departement de biologie

M. SebastienRoy President-rapporteur Departement de biologie SOMMAIRE

La production porcine represente une part importante de l'economie au Quebec. Bien que Ton note une diminution du nombre de fermes possedant des pores, celles qui demeurent se specialised et augmentent leur volume. La bonne gestion du lisier produit est par consequent imperative pour le maintien de la sante des sols et des cours d'eau en plus d'une bonne qualite de Fair. Les odeurs et autres composes nuisibles sont produits lors de la degradation anaerobie de la matiere organique par les microorganismes indigenes au systeme digestif. Les etudes portant sur les communautes microbiennes du systeme digestif et du lisier de pore sont encore peu nombreuses. La connaissance de cette population microbienne et la comprehension de leurs interactions sont fondamentales dans Pelaboration des techniques de traitement. L'une de ces methodes de traitement est la digestion anaerobie effectuee par un bioreacteur.

Pour etudier les communautes mibrobiennes, Putilisation de methodes moleculaires, telles Pheterogeneite des longueurs d'amplicon PCR (LH-PCR) et le polymorphisme des longueurs de fragment terminal de restriction (T-RFLP), permet la detection d'organismes non-cultivables en laboratoire. Le projet presente dans ce memoire vise a demontrer Pefficacite de ces deux techniques d'empreintes a ADN (profils de phylotypes) dans Petude des dynamiques de communautes microbiennes dans le lisier de pore, ainsi que la quantification de certains groupes microbiens par PCR en temps reel. II vise egalement a caracteriser les microorganismes metaboliquement actifs via Panalyse de PARN ribosomal (ARNr) 16S. De plus, ce travail veut montrer Putilite de differentes analyses statistiques permettant le traitement des nombreuses donnees produites de maniere a en degager des interpretations sur le dynamisme microbien.

Pour atteindre ces objectifs, deux approches experimentales ont ete utilisees. La premiere approche consistait a Petude de la dynamique des communautes microbiennes d'un bioreacteur a huit compartiments a ecoulement piston. La seconde visait a determiner les differences de population entre des lisiers bruts preleves a la ferme. Les resultats obtenus du traitement par bioreacteur ont montre une specialisation des compartiments dans la digestion de la matiere organique. Durant les six mois d'operation, chaque compartiment

1 s'est specialise et a favorise le developpement d'une population qui lui etait propre et presentait differents niveaux d'acides gras volatils (AGV) et de degagement de methane. Des phylotypes qui pourraient expliquer la difference entre les profils obtenus ont ete identifies. De plus, des profils semblables ont ete correles a la production d'acides gras volatils ou de methane. La seconde approche experimentale portait sur la caracterisation de trois lisiers bruts preleves a un mois d'intervalle et provenant des operations de finition, ainsi que d'un melange de lisiers de finition et de maternite. Les analyses des profils de phylotypes obtenus ont mene a la conclusion que la structure des communautes bacteriennes et archaebacteriennes des trois lisiers de pore provenant des operations de finition etaient semblables mais se distinguaient de celle du lisier mixte provenant des operations de finition et de maternite. De plus, ces analyses ont permis de faire la detection de changements subtils entre les echantillons.

Dans ce travail, il a ete montre que l'etude au niveau de PARNr des bacteries etait plus appropriee qu'au niveau de l'ADNr. En effet, les resultats obtenus pour ces deux cibles etaient differents. L'utilisation de l'ARNr a permis d'observer plus precisement les changements des bacteries metaboliquement actives. Par contre, la difference entre les resultats de l'ADNr et l'ARNr pour les archaebacteries etait beaucoup moins marquee. Finalement, l'utilisation d'outils statistiques tels que les indices de diversite, l'analyse en composantes principales (PCA), le positionnement multidimensionnel non-metrique (NMS), l'UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean) ainsi que l'analyse des especes indicatrices (ISA) a confirme leur utilite dans l'analyse des donnees complexes et la visualisation des resultats obtenus.

n REMERCIEMENTS

Je remercie ma directrice de recherche Guylaine Talbot pour m'avoir offert cette maitrise et d'avoir cm en mes capacites. Elle a su rendre l'experience agreable et enrichissante tout en m'accordant toujours sa grande disponibilite. Elle est pour moi plus qu'un guide mais une amie. De plus, je remercie ma co-directrice Carole Beaulieu pour ses conseils et ses encouragements. De merae, je remercie Claude Dery pour son incroyable disponibilite et l'interet qu'il porte a tous les etudiants. Je remercie egalement Sebastien Roy pour le temps et Penergie portes a la correction et a revaluation de ce memoire.

Je desire egalement remercier la Federation des Producteurs de Pore du Quebec pour son important apport financier. Merci d'avoir cru en ce projet. De plus, je remercie Daniel Masse pour l'opportunite offerte ainsi que toute son equipe d'experts.

Je remercie tous les membres du laboratoire 211 du centre de recherche d'AAC de Lennoxville pour leur accueil, leur amitie, leurs conseils et leur comprehension. J'ai grandement apprecie l'atmosphere de camaraderie qu'ils ont si naturellement inspiree. Un gros merci a Marie-France Palin et Daniele Beaudry qui m'ont consideree comme un membre a part entiere de leur equipe. Je souligne aussi l'important apport de Benoit Labrecque par son ecoute, ses idees et surtout son amitie.

Je tiens aussi a remercier toute ma famille qui m'a soutenue et encouragee durant toute cette aventure mais surtout ma mere qui a toujours eu notre education a cceur. Un merci special a Paul-Aime Roy pour son aide financiere et a mes neveux qui m'ont laisse faire mon tres long devoir.

iii TABLE DES MATIERES

SOMMAIRE i REMERCIEMENTS iii TABLE DES MATIERES iv LISTE DES ABREVIATIONS viii LISTE DES TABLEAUX x LISTE DES FIGURES xii INTRODUCTION 1 1.1. La production porcine et sa problematique environnementale 1 1.2. La degradation anaerobie du lisier 3 1.3. Les odeurs 5 1.3.1. Les acides gras volatils 6 1.3.1.1. Catabolisme desproteines 6 1.3.1.2. Catabolisme des hydrates de carbone 9 1.3.1.3. Catabolisme des lipides 9 1.3.2. Indicateur d'odeur 9 1.3.3. Microorganismes indigenes au pore 10 1.4. Methodes de microbiologie classique et moleculaire 13 1.5. Le gene de l'ARN ribosomal 16S 14 1.5.1. Activite metabolique 15 1.5.2. L'ARNr et les genes fonctionnels 15 1.5.3. Methodes de biologie moleculaire 16 1.5.3.1. LH-PCR 18 1.5.3.2. T-RFLP 18 1.5.3.3. DGGE 19 1.5.3.4. Hybridation de fluorescence in-situ (FISH) 20 1.5.3.5. PCR en temps reel 21 1.6. Approche experimentale 23

iv CHAPITRE 1 DYNAMIQUE DES COMMUNITES BACTERIENNES ET ARCHAEBACTERIENNES D'UN BIOREACTEUR DE TYPE ECOULEMENT PISTON TRAITANT LE LISIER DEPORC 26

Bacterial and archaeal community dynamics from an anaerobic plug flow type digester treating swine manure 28 Abstract 29 Introduction 30 Results and Discussion 32 VFA and CH4 production 32 LH-PCR and LH-RT-PCR analyses 35 T-RFLP and RT-T-RFLP analyses 39 UPGMA analysis 42 NMS 44 Diversity indices 47 Conclusion 51 Environmental procedures 51 Environmental samples 51 Volatile fatty acids and methane production 52 DNA and RNA co-extraction 52 Bacterial community analysis using LH-PCR and reverse transcription LH-PCR (LH-RT-PCR) 53 Archaeal community analysis using T-RFLP and reverse transcription T-RFLP (RT-T-RFLP) 54 Analysis on automated sequencer 55 Data analysis 55 Acknowledgments 56 References 56

v CHAPITRE 2 COMPARAISON DES STRUCTURES DES COMMUNITES BACTERIENNES ET ARCHAEBACTERIENNES DU LISIER DE PORC ET DE L'ACTIVITE TRANSCRIPTIONNELLE PAR L'ANALYSE STATISTIQUE MULTIVARIEE DES EMPREINTES GENETIQUES DE L'ADN ET DES ARN RIBOSOMAL 63

Comparison of swine manure bacterial and archaeal community structure and transcriptional activity by multivariate statistical analysis of ribosomal DNA and RNA fingerprints 65 Abstract 66 Introduction 67 Materials and methods 68 Environmental samples 68 Volatile fatty acids production 69 DNA and RNA co-extraction 69 Bacterial community analysis using LH-PCR and reverse transcription LH-PCR (LH-RT-PCR) 69 Archaeal community analysis using T-RFLP and reverse transcription T-RFLP RT-T-RFLP) 70 Analysis on automated sequencer 71 Data analysis 71 Results and discussion 72 Volatile fatty acids production 72 DNA- and RNA-based length heterogeneity polymerase chain reaction (LH-PCR) analysis 74 DNA- and RNA-based terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis 81 Conclusions 87 Acknowledgments 87 References 87

VI CONCLUSION 92 ANNEXE PCR EN TEMPS REEL 95

1.0. Introduction 95 2.0. Materiel et methodes 96 2.1. Designs des amorces oligonucleiques desbacteries cibles 96 2.2. Culture de Thermus aquaticus et decompte microbien microscopique 98 2.3. Extraction de l'ARNr 16S et synthese de l'ADNc 98 2.4. Extraction de l'ADN genomique (ADNg) des bacteries en cultures pures 99 2.5. Courbes d'etalonnage et specificite des designs 99 2.6. Essais de PCR en temps reel du lisier en traitement dans un bioreacteur de type ecoulement piston 100 3.0 Resultats et Discussion 100 3.1. Courbes d'etalonnage 100 3.2. Verification de la specificite des designs 102 3.3. Resultats des echantillons du lisier en traitement 109 4.0. Conclusion 112

BIBLIOGRAPHIE 114

vii LISTE DES ABREVIATIONS

16S petite sous-unite ribosomale 16 Svedbergs 23S grande sous-unite ribosomale 23 Svedbergs ACP analyse en composantes principales ADN acide desoxyribonucleique ADNc ADN complementaire ADNdb ADN double brin ADNg ADN genomique ADNr ADN ribosomal ARN acide ribonucleique ARNm ARN messager ARNr ARN ribosomal AGV acide gras volatil ATP adenosine triphosphate bp paire de bases °C degre Celsius cDNA ADN complementaire

CH4 methane cm centimetre co2 dioxyde de carbone COD demande chimique en oxygene Ct cycle seuil ARn delta de reaction DGGE electrophorese de gel denaturant a gradient EB tampon d'elution xg fois la gravite GC guanine et cytosine

H2 dihydrogene

H20 eau

H2S sulfure d'hydrogene

Vlll ISA analyse d'especes indicatrices IV valeur indicatrice L litre LH-PCR heterogeneite des longueurs d'amplicon PCR m/s metre par seconde mg milligramme min minute mM milimolaire

N20 oxyde nitreux

NH3 ammoniac NMS positionnement multidimensionnel non-metrique nM nanomolaire dNTP desoxynucleotide triphosphate P probabilite pb paire de bases PCA analyse de composante principale PCR polymerase chain reaction PEG polyethylene glycol PVC chlorure de polyvinyle R2 coefficient de determination REA reglement sur les exploitations agricoles RT-PCR PCR de transcription inverse s seconde SSCP polymorphisme de conformation simple brin T-RFLP polymorphisme des longueurs de fragment terminal de restriction T-RF fragment terminal de restriction U unite ul microlitre UNG uracile N-glycosylase UPGMA unweighted pair group method with arithmetic mean VFA acide gras volatil

IX LISTE DES TABLEAUX

Introduction 1. Acides gras volatils obtenus par desamination par les bacteries en mode anaerobie dans le systeme gastro-intestinal et les dejections animales 8

2. Genres bacteriens indigenes au lisier de pore et leurs composes odorants 12

Chapitre 1 1. Effect of sampling date on diversity indices 49

2. Analysis of diversity indices in the compartments 50

Chapitre 2

1. Indicator species analysis from LH-PCR and LH-RT-PCR fingerprint data... 76

2. Diversity indices calculated from LH-PCR and LH-RT-PCR fingerprints 77

3. Diversity indices calculated from T-RFLP and RT-T-RFLP fingerprints 82

4. Indicator species analysis from T-RFLP and RT-T-RFLP fingerprint data 83

Annexe 1. Designs d'amorces utilises pour le PCR en temps reel et les courbes d'etalonnage 97

2. Parametres des differentes courbes d'etalonnage 101

x 3. Specificite du design Clostridium coccoides pour le PCR en temps reel 104

4. Specificite du design Syntrophomonas pour le PCR en temps reel 105

5. Specificite du design Peptostreptococcus pour le PCR en temps reel 106

6. Specificite du design Methanosaeta pour le PCR en temps reel 107

7. Specificite du design Methanosarcina pour le PCR en temps reel 108

xi LISTE DES FIGURES

Introduction 1. Les trois etapes de la degradation anaerobie du lisier de pore par methanogenese 4

2. Production et utilisation des composes odorants en condition anaerobie 6

Chapitre 1 1. Volatile fatty acids concentration and methane production rate in the reactor compartments (PF01-PF08) and the effluent (PF09) during a 6-month trial 34

2. Standardized 16S rRNA-based profiles obtained after 6 months of operation A. LH-PCR; B. LH-RT-PCR 36

3. Principal components analysis of (A) LH-PCR and (B) LH-RT-PCR fingerprints after 0, 2, 4 and 6 months 38

4. Standardized 16S rRNA profiles obtained after 6 months of operation. A. T-RFLP; B. RT-T-RFLP 39

5. Principal components analysis of (A) T-RFLP and (B) RT-T-RFLP fingerprints after 0, 2, 4 and 6 months 41

6. Comparison of fingerprints by UPGMA cluster analysis from (A) LH- PCR; (B) LH-RT-PCR; (C) T-RFLP; and (D) RT-T-RFLP fingerprints from the 8 compartments 43

xn 7. Overlays of (A) DNA LH-PCR and (B) RNA LH-PCR fingerprints with total volatile fatty acids level and methane production rate using nonmetric multidimensional scaling (NMS) ordination 45

8. Overlays of (A) DNA T-RFLP and (B) RNA T-RFLP fingerprints with total volatile fatty acids level and methane production rate using nonmetric multidimensional scaling (NMS) ordination 46

9. Schematic diagram of an 8-compartment plug-flow reactor 52

Chapitre 2 1. Volatile fatty acids concentration (A) and relative percentage (B) for the manures Fl, F2, F3 and MF 73

2. UPGMA dendrograms of A. LH-PCR and B. LH-RT-PCR fingerprints 74

3. LH-PCR (A) and LH-RT-PCR (B) fingerprints from manures F1, F2, F3 andMF 78

4. Biplot representation of Principal Components Analysis of (A) LH-PCR and

(B) LH-RT-PCR fingerprints from manures F1, F2, F3 and MF 80

5. UPGMA dendrograms of A. T-RFLP and B. RT-T-RFLP samples 81

6. T-RFLP (A) and RT-T-RFLP (B) fingerprints from manures #1, #3, #4, and #5 84

7. Biplot representation of Principal Components Analysis of (A) T-RFLP and (B) RT-T-RFLP fingerprints from manures Fl, F2, F3 and MF 86

xiii Annexe 1. Courbes d'etalonnage des differents designs pour les PCR en temps reel 102

2. Nombre de copies d'ARNr 16S par mL provenant des compartiments 1, 3, 5 et 8 du bioreacteur 110

3. Resultats du rapport des PCR en temps reel pour les differents designs sur celui de Thermus aquaticus pour les quatre compartiments etudies 112

xiv INTRODUCTION

1.1. La production porcine et sa problematique environnementale

La production porcine est une industrie importante au Quebec. En effet, selon des donnees de 2002, elle representait 3,2 milliards de dollars en retombees economiques (Federation des Producteurs de Pore du Quebec, 2005). Lors d'un recensement au commencement de l'annee 2007, le Quebec possedait la plus grande part de cette industrie, soit 28,51% des pores du Canada (Conseil canadien du pore, 2007). Au Quebec comme dans le reste du pays, le nombre de fermes porcines ne cesse de diminuer. En trente ans, elles sont passees de 9 067 a 2 490. Par contre, elles se specialised et voient leur echelle de production augmenter passant de 178 a 1 635 betes en moyenne par ferme (Federation des Producteurs de Pore du Quebec, 2005; Conseil canadien du pore, 2007). Cette concentration des animaux en mega-porcheries fait peur au public qui craint des repercussions nocives sur leur environnement. Ces dernieres peuvent etre classees en trois categories selon qu'elles affectent le sol, l'eau ou Fair, mais toutes sont dues au lisier.

L'epandage du lisier sur les terres agricoles est depuis longtemps une facon de les enrichir. Par contre, le besoin nutritionnel de ces terres n'est pas toujours en equilibre avec l'apport du lisier a epandre. Par consequent, le sol peut accumuler une trop grande concentration d'azote, de phosphore et de mineraux comme le cuivre et le zinc (Foulkes et al, 2006; Jongbloed and Lenis, 1998). Bien que le phosphore soit un nutriment essentiel a la croissance vegetale, la concentration maximale en phosphore que peuvent soutenir les terres agricoles est de 0,01 a 0,03 mg/L. En ce qui concerne le nitrate, son seuil tolerable pour l'eau douce est de 50 mg/L, ce qui est souvent excede (Tabbara, 2003). Lorsque l'apport du lisier en phosphore et en nitrate est superieur a ces seuils, le lessivage par les eaux de ruissellement favorise l'eutrophication des cours d'eau provoquant une penurie d'oxygene. Le Ministere du Developpement Durable, de l'Environnement et des Pares (2005) a publie une etude sur la capacite de support des rivieres du Quebec pour le phosphore residuel decoulant des activites agricoles. lis ont demontre que 83% des cours d'eau en territoires agricoles avaient depasse le seuil d'eutrophication. La pollution de l'air

1 par le lisier de pore provient surtout de la liberation d'odeurs derangeantes et de gaz a effet de serre comme le gaz carbonique (C02), le methane (CH4) et l'oxyde nitreux (N2O).

Puisque la problematique environnementale est maintenant connue et acceptee, le gouvernement a pris des mesures legislatives afin de coordonner les pratiques de toute l'industrie agricole par le Reglement sur les exploitations agricoles (REA) (Ministere de l'Environnement du Quebec, 2002; Ministere de l'Environnement du Quebec, 2005). En effet, les producteurs de pores comme tous les autres producteurs doivent se conformer a cette reglementation. Tout d'abord, Pepandage du lisier sur les terres agricoles n'est pas permis durant la periode de gel au sol. Consequemment, le surplus de lisier doit alors etre entrepose de fa9on etanche afin d'eviter les ecoulements. Aussi, le REA a limite la quantite de depot de matieres fertilisantes sur les terres selon leur besoins et leur capacite a retenir le phosphore selon des abaques (Federation des Producteurs de Pores du Quebec, 2002). Les producteurs faisant face a des surplus de lisier doivent alors trouver des moyens pour abaisser leur niveau phosphore. Premierement, ils peuvent reduire a la source la charge de phosphore et du volume de leur lisier. Diverses possibilites s'offrent a eux comme Pincorporation de phytase a la moulee, ou Pajustement de la diete selon Page et le sexe du pore (Jongbloed et Lenis, 1998; Knowlton et al, 2004). De plus, ils peuvent faire l'achat ou la location de superficie additionnelle en culture afin d'y epandre le lisier. Bien sur, des frais en decoulent, pouvant varier selon le cout de l'achat de nouvelles terres, la distance des terres, la marge de profit des cultures et Papport en phosphore pouvant etre depose sur ces terres. Finalement, le traitement du lisier peut aussi etre considere. Par exemple, l'utilisation de bioreacteurs permet la separation du phosphore qui s'accumule dans leurs boues sedimentees (Masse et al, 2007). La purge de ces boues allege la charge en phosphore livree par le lisier lors de Pepandage.

Pour ameliorer le probleme des odeurs, plusieurs facons de faire et technologies sont disponibles aux producteurs. Au batiment, un environnement propre, un plancher partiellement latte, une diete appropriee aux besoins specifiques des pores, une ventilation adequate et la separation de Purine des feces peuvent aider a reduire la presence des odeurs. Aussi, des moyens visant la reduction des odeurs a Pentreposage du lisier peuvent etre mis en place tels que le type de toiture des bassins, Paeration du lisier, les traitements

2 chimiques (ex.: controle du pH), les bioreacteurs de digestion anaerobie, la biofiltration et le refroidissement du lisier. Puis, le type de rampe d'epandage, les additifs chimiques et la presence de brise-vents permettent de minimiser les odeurs a Pepandage (Federation des Producteurs de Pores du Quebec, 2002).

1.2. La degradation anaerobie du lisier

L'entreposage du lisier dans des bassins favorise la formation d'un milieu sans oxygene qualifie d'anaerobie. Certains microorganismes provenant initialement du systeme digestif du pore degradent la matiere organique pour former du biogaz constitue surtout de methane et de C02. Contrairement a la degradation aerobie ou les bacteries peuvent transformer directement la matiere organique complexe en CO2 et en eau (H2O); en absence d'oxygene, il s'agit plutot d'une serie d'etapes effectuees par differents microorganismes rendant le processus plus complexe dans son ensemble. Les microorganismes participant au processus sont specialises a certaines etapes et par ce fait, l'energie demandee pour la regulation de leur metabolisme en est reduite (Schink, 2006).

II est generalement admis que la degradation anaerobie se fait en trois etapes impliquant effectivement une communaute microbienne propre a chacune (Zhang et at, 2004), comme le montre la figure 1. La premiere etape est l'hydrolyse des molecules complexes en plus simples ainsi que la fermentation, aussi appelee acidogenese. Tout d'abord, les bacteries hydrolytiques reduisent des composes organiques complexes en molecules simples tels des sucres, des acides amines, des acides gras et des alcools par la secretion d'enzymes extracellulaires (Masse et Droste, 2000; Schink, 1997). Par la suite, les bacteries acidogenes transforment ces produits en molecules encore plus simples comme l'ammoniac (NH3), le sulfure d'hydrogene (H2S) et les acides gras volatils (AGV), ces derniers constituant les principaux composes formes. De plus, il y a formation de gaz carbonique, d'hydrogene (H2) ainsi que d'acetate. Lors de la seconde etape, e'est-a-dire l'acetogenese, ces composes intermediaires (NH3, H2S, AGV, etc.) sont a leur tour metabolises par les bacteries acetogenes productrices de H2 aussi connues sous les noms de

3 matiere organique Hydrolyse et (hydrates de carbone, proteines et iipides) Fermentation m

I;; iiiy Sy iaidjifes; griais; jvieijiaJcijis; (A0:VtK: gjsiOioiijy III; I l^rriltri^ iSJ^i &#&sj Iq^jj&isfes; ^oJEnatlqjiiieisiI

Acetosenese

n,.co. Kefdtt

Mclluinc. t (K. humus

Figure 1. Les trois etapes de la degradation anaerobie du lisier de pore par methanogenese. Adapte de Schink (1997) et Schink (2006). 1 bacteries hydrolytiques et fermentaires ; 2 bacteries acetogenes productrices de H2 ; 3 bacteries acetogenes consommatrices de H2 ; 4 methanogenes hydrogenotrophes ; 5 methanogenes acetotrophes. bacteries fermentaires secondaires et de syntrophes (Schink, 2006). II existe egalement des bacteries acetogenes consommatrices de H2 qui produisent de Pacetate a partir de l'utilisation de H2. Finalement, la derniere etape de la degradation anaerobie du lisier est la methanogenese produite par deux groupes trophiques de methanogenes. Les procaryotes responsables de cette production de methane sont des archaebacteries. Les methanogenes hydrogenotrophes metabolisent le H2 et le CO2 et produisent 25% du methane alors que les methanogenes acetotrophes ou utilisent plutot l'acetate, ils produisent 75% du methane (Masse et Droste, 2000). La cooperation syntrophique entre les bacteries acetogenes productrices de H2 et les methanogenes est capitale a la formation du biogaz par un transfert d'hydrogene donnant lieu a des conditions metaboliques et energetiques favorables (Schink, 1997). Les bacteries syntrophes ont besoin d'une faible concentration de H2 afin de permettre la conversion de leurs substrats, comme les AGV inaccessibles aux

4 methanogenes, en CO2. Cela est possible grace a Paction des methanogenes hydrogenotrophes qui maintiennent ces bas niveaux de H2 en les convertissant en CH4 (Zhang et al, 2004).

1.3. Les odeurs

Le lisier de pore se retrouve sous forme liquide et est constitue du melange des urines, des feces ainsi que des eaux de lavage a la ferme. L'entreposage du lisier engendre une importante formation de gaz responsables des odeurs mais leur diffusion a travers le lisier se fait lentement puisque ce milieu reste au repos. Lors du brassage des fosses et de Pepandage au champ, la liberation dans Pair des gaz odorants est fortement accrue. Les composes odorants degages proviennent de la degradation des matieres organiques, principalement en absence d'oxygene, par des microorganismes. Theoriquement, cette degradation se conclue par la production du biogaz compose de methane et de gaz carbonique, et de Phumus. Ce dernier consiste de la matiere organique stabilised et d'elements mineralises. Cependant, la pratique en est tout autre. En effet, puisque chaque etape de la degradation demande Paction de groupes bacteriens differents qui necessitent des conditions de milieux et de substrats differents, le lisier de la ferme ne subit pas une degradation complete (Pigeon, 2004). Ainsi, les composes intermediaires odorants de la degradation ne seront pas tous metabolises par les bacteries et pourront etre liberes dans Penvironnement, ce qui affectera la qualite de vie des producteurs et des membres de leur voisinage.

D'apres O'Neill et Phillips (1992), il existerait plus de 170 composes chimiques produits lors de la degradation anaerobie du lisier. Mackie et al. (1998) les ont classes en quatre categories chimiques (figure 2) so it: 1) les acides gras volatils, 2) les alcools, dont les indoles et les phenols (incluant indole, scatole, cresol, et 4-ethylphenol), 3) Pammoniac et les amines volatiles (incluant putrescine, cadaverine, methylamine et ethylamine) et finalement, 4) les composes volatils sulfures (sulfide, methyl- et ethyl-mercaptans).

5 Matieres organiques

Hydrates de carbone Proteines Lipides // \ \ (Hydrolyse et fermentation)

AGV NH3et Indoles et Composes amines Phenols soufres volatils \ / y (Degradation et utilisation)

Cellules microbiennes

CH4, C02 et H20

Figure 2. Production et utilisation des composes odorants en condition anaerobic D'apres Mackie et al. (1998).

1.3.1. Les acides gras volatils Les acides gras volatils retrouves dans le lisier de pore sont generalement les acides acetique, propionique, butyrique, z'so-butyrique, valerique, wo-valerique, caproi'que et caprique. Ceux-ci proviennent de la degradation, ou catabolisme, des hydrates de carbones, des proteines et des lipides contenus dans le lisier (voir figure 2).

1.3.1.1. Catabolisme des proteines

La premiere etape de la degradation des proteines est Phydrolyse, par des proteases associees a la surface membranaire des bacteries hydrolitiques, qui brisent les liens peptidiques entre les acides amines. Ces derniers peuvent alors etre assimiles par les bacteries. Le tableau 1 montre les acides gras volatils produits lors du catabolisme des differents acides amines. La premiere etape de la degradation proteique est la desamination

6 oxydative qui consiste a enlever le groupement amine de l'acide amine tel qu'illustre par la formule suivante (Mackie et al, 1998):

NH2 i

R-CH-COOH + 2H20 -> R-COOH + NH3 + 2H2 + C02 (1) Par la suite, les acides desamines peuvent subir differentes transformations. Generalement, ils sont convertis en pyruvate et en acetyl-CoA pour produire de l'energie par le cycle de Krebs. Puisqu'il y existe 20 acides amines, les voies metaboliques de decomposition par differents microbes sont done complexes. En plus des acides gras volatils, la degradation des proteines produit des acides carboxyliques a chaine aliphatique, des acides gras a chaine ramifiee, des composes sulfures, des amines, de l'ammoniac, du phenol et des indoles (Rappert et Miiller, 2005). Les travaux de Hobbs et al. (1996) ont montre que la reduction des proteines brutes dans les moulees de pores en croissance et en finition permettait de reduire la concentration d'AGV dans le lisier. Aussi, on a note une diminution de l'ammoniac et d'autres composes tels Pindole, le p-cresol et le scatole. Les acides gras volatils degages du lisier de pore proviennent principalement de la decomposition des proteines par les microorganismes comme le montrent les travaux de Miller et Varel (2003). Dans le but d'identifier les sources d'odeurs durant la fermentation de lisier, differents substrats (amidon, caseine et cellulose) ont ete ajoutes. Les composes considered comme les plus representatifs de l'odeur (AGV ramifies et les composes aromatiques) etaient toujours produits mais e'est Pajout de la caseine, utilisee comme proteine temoin, qui en a fait produire le plus. Ces auteurs ont conclu que la fermentation proteique dans le lisier de pore frais etait responsable de pres de la moitie de la perte en substrat alors qu'elle n'a pu etre detectee dans le lisier de vache frais. En combinant ces resultats avec ceux d'une etude precedente des memes auteurs sur les lisiers de vache (Miller et Varel, 2002), nous pouvons conclure que l'amidon serait le substrat principal et prefere des microorganismes fermentaires du lisier de vache. Bien que les bacteries fermentaires du lisier de pore utilisent aussi preferentiellement l'amidon, on en retrouve relativement peu par rapport aux proteines. Par consequent, toutes les proteines disponibles dans le lisier sont catabolisees et produisent alors d'avantage de composes odorants.

7 Tableau 1. Acides gras volatils obtenus par desamination par les bacteries en mode anaerobie dans le systeme gastro-intestinal et les dejections animales Adapte de Muller et Rappert (2005)

Acides amines AGV produits

Alanine Acetate, propionate Asparagine Acetate, lactate Acide aspartique Acetate, lactate, propionate Cysteine Acetate, propionate, butyrate, valerate, formate Acide glutamique Acetate, propionate, butyrate, lactate, formate Phenylalanine Phenylpyruvate, phenyllactate, phenylacetate, phenylpropionate, benzoate Glycine Acetate Histidine Acetate, butylate, lactate, formate Isoleucine Isobutyrate, isovalerate, valerate Lysine Acetate, butyrate Leucine Isobutyrate, isovalerate, valerate Methionine cc-cetobutyrate Proline Acetate, valerate, propionate Glutamine Acetate, butyrate, lactate, formate Arginine Acetate, propionate, valerate Serine Acetate, propionate, butyrate, valerate, lactate, formate Threonine Acetate, propionate, butyrate, valerate, formate Valine Isobutyrate, isovalerate, valerate Tryptophane Indolepyruvate, indolelactate, indoleacetate Tyrosine Phenylacetate, phenylpropionate, 4-hydroxyphenyl- pyruvate, 4-hydroxyphenyllactate, 4-hydroxyphenylpropionate, 4-hydroxyphenylacetate, 3-hydroxyphenylpropionate, 4- hydroxybezoate

8 1.3.1.2. Catabolisme des hydrates de carbone

La voie la plus importante pour le catabolisme microbien des hydrates de carbone (glucides) est la glycolyse ou le sucre est transforme en pyruvate et ce, en presence comme en absence d'oxygene. Dans un environnement anaerobie, le pyruvate passe par plusieurs processus de fermentation et sert aux reactions subsequentes dans lesquelles les acides gras volatils sont formes. Generalement, la fermentation des sucres produit des acides gras volatils a chaine aliphatique courte et droite comme l'acide acetique, propionique, lactique, succinique, formique et butyrique. Le catabolisme des sucres peut etre resume par 1'equation suivante :

34,5 C6H1206 -> 64 AGV + 23,75 CH4 + 34,25 C02 + 10,5 H20 (2) (Zhu et al, 1999).

1.3.1.3. Catabolisme des lipides

Les lipides retrouves dans le lisier sont aussi degrades par les microorganismes. Tout d'abord, les lipides sont hydrolyses en acides gras a longue chaine, tels Poleate et le stearate, et en glycerol. Cette etape est catalysee par des lipases extracellulaires produites par des bacteries acidogenes. Par la suite, alors que le glycerol est fermente en differents alcools, formate et acides gras volatils, les acides gras a longue chaine sont oxydes en acides gras a courte chaine par les bacteries acetogenes. Ultimement, P acetate et le H2 produits sont convertis en methane, C02 et H20 (Angelidaki et al, 1999).

1.3.2. Indicateur d'odeur

L'odeur est une perception de l'odorat qui varie d'une personne a l'autre. Pour en faire F etude, il est necessaire de trouver des moyens de le quantifier. Connaitre les composes presents dans le lisier qui en sont responsables constitue la base dans le potentiel de generation malodorante. Cependant, les composes odorants sont souvent plus offensifs lorsqu'ils sont melanges ensemble et sentent differemment d'un produit pur. De plus, il n'est pas utile de s'attarder a tous les composes odorants puisqu'ils ne contribuent pas tous egalement a Pintensite de l'odeur. Chaque compose odorant a son seuil de perception et de

9 nuisance. Connaitre la portee de ces composes permet d'identifier les plus importants afin de determiner des indicateurs d'odeurs (Zhu et al, 1999).

L'odeur provenant des lisiers de pore peut etre evaluee par olfactometrie par panel humain qui permet d'obtenir le seuil de la concentration minimale ou un echantillon odorant peut etre distingue d'un echantillon inodore (Mackie et al, 1998; Pelletier et al, 2005; Trabue et al, 2006). Cependant, si elle est utilisee de facon routiniere, cette technique peut s'averer dispendieuse et complexe puisqu'elle demande l'implication humaine du panel (Zhang et al, 2006). Puisque la formation d'ammoniac dans le lisier est importante, il a ete initialement suppose qu'il pouvait s'agir d'un bon indicateur de l'odeur mais ce n'est pas le cas (Lunn et van De Vyver, 1977; Spoelstra, 1980; Zhu, 2000). Bien que l'ammoniac est produit lors de la degradation anaerobie des proteines, il est principalement engendre par l'hydrolyse de Puree (Rappert et Muller, 2005). Ce sont done plutot les AGV qui ont ete retenus par la communaute scientifique comme indicateur d'odeur (Williams, 1984; Zhu et al, 1999). En effet, Zahn et al (1997) ont rapporte que les acides organiques volatils de 2 a 9 carbones montraient le meilleur potentiel de l'odeur du lisier. Cependant, ce sont les AGV a longue chaine de carbone (C4 a C9) ou ramifies qui ont ete correles a une odeur plus importante (Zhu et al, 1999). Deja, plusieurs etudes ont utilise les AGV afin d'evaluer l'efficacite des techniques de traitement des lisiers de pore dans le reduction des odeurs (Castillo-Gonzalez et Bruns, 2005; Liao et al, 1997; Miller et Varel, 2003; Ndegwa et al, 2002; Zhang et al, 2000; Zhang et Zhu, 2005; Zhang et al, 2006).

1.3.3. Microorganismes indigenes au pore

Les bacteries responsables de la production d'odeurs lors de la degradation anaerobie, proviennent du systeme digestif de l'animal. En effet, e'est dans le tractus gastro-intestinal que commence la production d'acides gras volatils par sa microflore indigene. Cette derniere se retrouvera aussi dans les feces excretees et le processus se poursuivra si le milieu anaerobie est maintenu comme dans les fosses a lisier.

Depuis pres de quarante ans, quelques etudes ont ete menees afin de connaitre les genres bacteriens pouvant etre isoles des intestins et des feces chez le pore (Rail et al, 1970;

10 Russell, 1979; Zhu, 2000). Certaines methodes classiques de microbiologie ont isole et identifie certains genres bacteriens a partir de feces porcines. Les bacteries dominantes qui y etaient retrouvees sont les suivantes, aussi decrites au tableau 2. II y a les Streptococcus (Cotta et al, 2003), bacteries pour la plupart anaerobes facultatives. Toutes ces bacteries fermentent les hydrates de carbone et produisent principalement l'acide lactique et, en plus faibles proportions, les acides acetique, formique, propionique et butyrique (Zhu, 2000). II y a aussi les Peptostreptococcus qui sont des anaerobes chimioheterotrophes et qui catabolisent les acides amines en acides acetique, formique, iso-caprique, iso-butyrique, valerique et iso-valerique. Whitehead et Cotta (2004) ont isole des bacteries hyper productrices d'ammoniac provenant d'une fosse d'entreposage de lisier de pore. Parmi les plus efficaces, plusieurs etaient apparentees a Peptostreptococcus anaerobius selon P analyse phylogenetique de la sequence de leur gene encodant 1'ARN de la petite sous unite ribosomale 16S (ADNr 16S). Le lisier contient aussi les Eubacterium (Salanitro et al, 1977) et les Clostridium (Russel, 1979) qui sont des bacteries anaerobes utilisant surtout les hydrates de carbone et les acides amines, respectivement. Elles sont connues pour produire de grandes quantites d'acides gras volatils comme l'acide acetique, butyrique, formique, lactique, caproique, propionique, succinique, valerique, iso-butyrique, iso-caproi'que et iso-valerique en plus des indoles et phenols. Etant donne le grand nombre de ces produits odorants, le vaste genre Clostridium est une cible de choix dans P etude de la production des odeurs.

Les Lactobacillus (Yin et Zheng, 2005), aussi presents dans le lisier, ont une tolerance variee a Poxygene selon leur espece et produisent de l'acide lactique, du CO2, de Pethanol ou de l'acide acetique selon leur mode de fermentation. Puisque leur produit majeur est l'acide lactique, il peut etre assume que leur role dans Papport en composes odorants est negligeable (Zhu, 2000). Dans le lisier, le genre Escherichia est represente surtout par E.coli (Salanitro et al, 1977) qui est anaerobe facultatif. II fermente le glucose et autres hydrates de carbone en acides lactique, acetique et formique. Presque la totalite de ce genre bacterien produit de Pindole. Finalement, les Bacteroides (Cotta et al, 2003) sont des anaerobes chimioheterotrophes qui utilisent les hydrates de carbones ou la peptone. Leurs produits de fermentation sont les acides succinique, lactique, acetique, formique, propionique et butyrique.

11 Tableau 2. Genres bacteriens indigenes au lisier de pore et leurs composes odorants Adapte de Zhu (2000)

Genre bacterien Composes odorants potentiels Streptococcus acides formique, acetique, propionique, butyrique, ammoniac et amines volatiles Peptostreptococcus acides formique, acetique, propionique, butyrique, iso-butyrique, valerique, caproi'que, iso-valerique, iso-caproi'que, ammoniac et amines volatiles Eubacterium acides formique, acetique, propionique, butyrique, iso-butyrique, valerique, caproi'que, iso-valerique, iso-caproi'que, indoles et phenols Clostridium acides formique, acetique, propionique, butyrique, iso-butyrique, valerique, caproi'que, iso-valerique, iso-caproi'que, indoles et phenols Lactobacillus acides formique, acetique, propionique et butyrique Escherichia acides formique, acetique, propionique et butyrique Bacteroides acides formique, acetique, propionique, butyrique, iso-butyrique, valerique, caproi'que, iso-valerique, iso-caproi'que, ammoniac et amines volatiles

L'utilisation de techniques de biologie moleculaire dans ce domaine de recherche a permis de constater que la communaute microbienne du lisier de pore etait beaucoup plus vaste que ce qui etait anticipe au depart. Nous comprenons desormais que la communaute microbienne du lisier de pore est complexe. En effet, seulement 35 a 55% des phylotypes observes dans le lisier de pore par analyse de PADNr 16S etaient relies a un microorganisme connu (Peu et al, 2006; Snell-Castro et ah, 2005; Whitehead et Cotta, 2001). Neanmoins, la microflore du lisier de pore semble constituer un ecosysteme de digestion anaerobie qui est domine par des groupes de bacteries fermentaires telles Eubacterium, Clostridium, Lactobacillus, Streptococcus, Bacillus, Bacteroides (Cotta et ah, 2003; Leser et ah, 2002; Snell-Castro et ah, 2005; Whitehead et Cotta, 2001).

12 Nos connaissances sur les archaebacteries presentes dans le lisier de pore sont plus limitees. En effet, les sequences phylogenetiques disponibles dans les banques de donnees sont plutot restreintes et souvent non-identifiees. Le purin de pore s'avere lui aussi une source de nouvelles especes d'archaebacteries methanogenes. Snell-Castro et al. (2005) n'ont retrouve dans les fosses a lisier que des methanogenes hydrogenotrophes tels des Methanobacteriales et des Methanomicrobiales. Par contre, les travaux d'Angenent et al. (2002), portant sur la population microbienne d'un bioreacteur anaerobie, ont montre la presence de methanogenes acetotrophes de l'ordre Methanosarcinales. Dans celle-ci, la famille des Methanosaetaceae possede une grande affinite pour l'acetate seulement et presente une croissance relativement lente, alors que les Methanosarcinaceae ont une affinite pour l'acetate beaucoup plus faible mais croissent plus rapidement (Yu et al, 2006). Ainsi, lorsque peu d'acetate est disponible, les Methanosaetaceae sont favorises alors que dans le cas contraire, ce sont les Methanosarcinaceae qui le sont. Une etude recente d'un bioreacteur traitant le lisier de pore a permis la detection de plusieurs methanogenes dont Methanosaeta, Methanolobus, Methanobrevibacter, Methanosarcina, Thermoplasma et Methanospirillum (Padmasiri et al., 2007).

1.4. Methodes de microbiologic classique et moleculaire

L'identification bacterienne en microbiologie classique consiste, entre autres, a Putilisation de techniques de microscopie, de culture microbienne en laboratoire, de serologic et d'immunologie. De nos jours, ces techniques jouent toujours un role important dans la decouverte de microbes encore inconnus, non-caracterises et atypiques (Mackay, 2004). Par contre, ces methodes phenotypiques sont influencees par les mutations et peuvent etre sujettes aux biais d'interpretation (Petti et al, 2005). De plus, la culture microbienne en laboratoire peut etre limitee par des organismes a croissance tres lente ou non-cultivables en laboratoire. La communaute scientifique a change sa perception de la diversite microbienne dans l'environnement avec Parrivee des techniques de biologie moleculaire. Effectivement, on a decouvert que seulement un faible pourcentage des microorganismes presents dans les echantillons environnementaux pouvaient 6tre cultives selon les methodes classiques utilisees en microbiologie (Amann et al, 1995; Santos et Ochman, 2004). Au niveau du lisier de pore, il a ete determine que des 109a 1010 cellules par mL presentes,

13 seulement 10 a 20% pouvaient etre mises en culture sur differents milieux de culture (Peu et al, 2006). D'ailleurs, pres de 45% des phylotypes observes par l'analyse d'ADNr 16S etaient fortement apparentes a des microorganismes inconnus (Snell-Castro et al, 2005; Whitehead et Cotta, 2001).

Les methodes moleculaires ont l'avantage de cibler le materiel genetique microbien sans avoir a modifier les echantillons en isolant les individus. Bien qu'elle presente elle aussi des inconvenients, 1'identification bacterienne par genotypage a partir du gene de l'ARNr 16S est maintenant reconnue comme etant une approche plus objective, precise et fiable (Amann et al, 1995).

1.5. Le gene de l'ARN ribosomal 16S

Aujourd'hui, la cible de choix pour l'analyse des populations microbiennes d'echantillons environnementaux reste l'ARNr 16S. Cet ARN d'environ 1500 pb qui n'est pas traduit en proteine se lie aux proteines ribosomales pour former la petite sous-unite 30S du ribosome bacterien. Du a Pimportance que joue ce dernier dans la survie de la cellule, la sequence de son gene est rested tres conservee au cours de revolution. Des analyses comparatives de P architecture des ARNr ont revele des patrons dans lesquels des regions de structures primaires et secondaires alternaient avec des domaines variables qui different en poids moleculaires, en nucleotides et en structures secondaires (Gray et al, 1984). Ces regions conservees et variables font de l'ARNr 16S un marqueur devolution. Ce sont Woese et Fox (1977) qui, dans les annees 70, ont songe a utiliser PADNr 16S pour classer les organismes selon leur lien phylogenetique. En ciblant les regions tres conservees et universelles du gene, il etait alors possible de repecher des organismes non-cultivables ou inconnus. Quant aux regions plus variables, elles peuvent permettre de faire la distinction entre deux organismes apparentes.

II est a noter que le nombre d'operons des genes ribosomaux varie d'une espece a Pautre. La probability que des especes bacteriennes possedent le meme nombre de copies augmente avec leur rapprochement phylogenetique. II est done possible de surestimer certaines populations. Cette variabilite de la quantite d'operons ribosomaux est contestee

14 par certains auteurs. Par exemple, Lyons et al. (2000) n'ont montre qu'une petite variation des signaux PCR en temps reel entre quatre especes differentes utilisees afin de construire une courbe d'etalonnage suggerant que le nombre d'operons ribosomaux est un facteur negligeable pour la quantification.

1.5.1. Activite metabolique

L'etude moleculaire des microorganismes a partir de la sous-unite ribosomale 16S peut se faire sur deux niveaux, soit l'ADNr 16S et l'ARNr 16S. L'utilisation de l'ARN est connue pour etre plus ardue puisque l'ARN est tres sensible a la degradation par les ribonucleases presentes dans les milieux. La duree de vie de l'ADN est superieure a celle de l'ARN. Effectivement, il a ete montre que l'ADN de bacteries mortes peut persister longtemps dans un milieu sans etre degrade (Aellen et al, 2006; Keer et Birch, 2003). Bien que l'ARNr possede une demi-vie plus longue que l'ARNm, l'ARNr peut tout de meme fournir une information de viabilite cellulaire et d'activite metabolique (Gourse et al, 1996; Ruimy et al, 1994). En effet, la presence de l'ARNr implique que l'organisme est actif, reagit a son milieu et y croit. Deja en 1966, Maaloe et Kjeldgaard avaient demontre que la regulation de la transcription des ARNr etait proportionnelle a la croissance cellulaire et depuis, plusieurs etudes l'ont cible dans les etudes de communautes bacteriennes actives (Felske et al, 1997; Morgan et al, 2002).

1.5.2. L'ARNr et les genes fonctionnels

Puisque la majorite des etudes sur les microorganismes environnementaux se font a partir du gene de l'ARNr 16S, l'information disponible dans les banques de donnees telle que GenBank concerne majoritairement les sequences de ce gene. Le Ribosomal Database Project II (Cole et al, 2005) comporte aujourd'hui plus de 350 000 sequences d'ADNr 16S, ce qui peut influencer favorablement le choix d'une telle cible. Cependant, 1'identification des microorganismes peut se faire aussi par des genes plus specifiques au role que joue une bacterie dans son milieu. Par exemple, on peut cibler les bacteries capables de denitrification, permettant a 1'azote fixe de retourner dans 1'atmosphere. L'un des genes responsables de cette denitrification est le gene nirK. C'est ce qu'a utilise

15 l'equipe de Philippot et al. (2004) dans leurs travaux sur les bacteries denitrifiantes dans le sol. Leur PCR en temps reel etait lineaire et sensible, permettant la detection jusqu'a 102 copies du gene nirK. Contrairement a l'ARNr 16S, ce gene n'est present qu'en une seule copie dans le genome ce qui permet de correler directement le nombre de copies du gene au nombre de cellules. En clonant et sequencant les produits PCR obtenus, ils ont remarque qu'il y avait une forte similitude entre les genes nirK caracterises. Par contre, une analyse phylogenetique a montre que la majorite de ces clones n'etaient pas apparentes au gene nirK des bacteries cultivables en laboratoire.

Dans le but de faire l'etude de methanogenes dans un site d'enfouissement des dechets, Luton et al. (2002) ont plutot cible un gene fonctionnel specifique aux methanogenes, soit le gene mcrA codant pour une enzyme, methyle coenzyme-M reductase, de la formation du methane unique aux methanogenes. Ils ont demontre que Putilisation de mcrA permettait la detection des cinq ordres connus de methanogenes chez les archaebacteries. De plus, une comparaison des resultats obtenus a partir de ce gene a ceux de l'ARNr 16S a montre que ces deux approches phylogenetiques s'equivalaient. Par contre, un probleme potentiel et non negligeable de cette detection avec le gene mcrA est le haut degre de conservation entre sa sequence et celle du gene mrtA present chez quelques especes de methanogenes. Consequemment, le risque de detection non specifique pourrait etre present. De plus, certains methanogenes possedent ces deux genes. Ainsi, les deux copies seraient detectees ce qui occasionnerait une surestimation de cette population (Friedrich, 2005). L'avantage de cibler un gene fonctionnel plutot que l'ADNr 16S est la formation de PARNm. Ainsi, en etudiant cet ARNm, on peut detecter les bacteries ayant une fonction particuliere et qui y participent activement dans le milieu etudie.

1.5.3. Methodes de biologie moleculaire

L'etude des populations presentes dans les echantillons environnementaux s'est grandement developpee depuis la venue des techniques moleculaires dans ce domaine. On peut separer ces techniques en deux grandes categories soit les profilages et les detections specifiques.

16 Les methodes de profilage se basant sur le gene de l'ARNr 16S permettent de faire l'etude des communautes bacteriennes des echantillons environnementaux simplement en faisant l'extraction directe du materiel genetique suivi d'une amplification PCR a partir d'amorces universelles. L'avantage principal de ces techniques est qu'une connaissance prealable de la communaute bacterienne n'est pas essentielle, ce qui s'avere tres utile. Cependant, les amplifications PCR peuvent aussi apporter des biais. Premierement, les amorces se voulant universelles ne peuvent l'etre totalement. De plus, l'activite de la polymerase peut etre modulee selon le contenu en bases GC de l'ADN (Sipos et ah, 2007). L'amplification exponentielle d'un melange de fragments d'ADN peut resulter en une distorsion des ratios entre les amplicons des differents ADNr 16S et ceux du materiel de depart. II s'agit alors de techniques semi-quantitatives. Finalement, bien que chaque « pic » ou « bande » obtenu represente theoriquement une sequence precise, il peut etre difficile de distinguer les profils biomoleculaires d'ecosystemes ayant une grande diversite (Dabert et ah, 2002).

Lorsqu'il s'agit de detection specifique, le bon choix des amorces et des sondes est primordial. Bien entendu, la detection specifique implique une connaissance minimale des microorganismes recherches. Le Ribosomal Database Project II (Cole et ah, 2005) represente un outil sur le Web tres pratique pour le design des amorces et des sondes ciblant le gene d'ARNr 16S. Elle comprend des milliers de sequences d'ADNr 16S de bacteries identifiees ou non, provenant de differents milieux environnementaux. Selon le niveau phylogenetique des groupes a etudier, les designs d'amorce peuvent etre laborieux. En effet, trouver des regions du gene specifiques au groupe a cibler tout en etant assez different du gene des autres organismes pour en eviter la detection n'est pas toujours aise. Song et ah (2004) ont voulu quantifier les Clostridia dans les feces humaines. Ce groupe de bacteries represente un bon exemple des difficultes rencontrees lors d'etudes sur les echantillons environnementaux. En effet, la detection au niveau de l'espece fut impossible due a la grande diversite de l'ecosysteme dans l'intestin humain. II est alors plus simple de faire la detection au niveau du genre bacterien. Malheureusement, le genre Clostridium est un genre entrelace, c'est-a-dire qu'il est extremement difficile de trouver des sequences assez specifiques pour tous ses membres sans inclure d'autres genres bacteriens. Done, pour detecter le maximum d'individus, ils ont du les separer par groupes a Pinterieur du genre (Song et ah, 2004). Ces auteurs ont ainsi utilise trois paires d'amorces specifiques

17 aux groupements des Clostridium (groupes I, XI et XlVab) avec une sonde TaqM&n commune, pour quantifier par PCR en temps reel.

1.5.3.1. LH-PCR

Le LH-PCR {length heterogeneity PCR) est une technique moleculaire de profilage basee sur Famplification PCR de FADNr 16S. Plus precisement, cette methode cible une region du gene qui possede une variabilite de longueur de sequence specifique a un organisme. Cette variabilite est due aux changements evolutifs de deletions et d'insertions de bases. On utilise alors des amorces universellement reconnues chez les bacteries qui bordent cette region variable. Ainsi, on obtient un amalgame d'amplicons, de differentes longueurs, associes a un microorganisme particulier. La detection des differentes longueurs d'amplicon se fait grace au fluorophore couple a une des deux amorces de PCR et qui est detecte par un laser lors de la migration sur sequenceur automatique. Cette technique est considered comme une methode simple et reproductible (Ritchie et al, 2000; Tiirola et al, 2003). Par contre, il n'existe pas de banque de donnees publique qui permette de faire directement F identification bacterienne des profils obtenus. En effet, pour ce faire, le sequencage demeure le moyen le plus sur. Le sequenceur automatique a capillaire est l'outil de choix puisqu'il permet une detection precise, nette et rapide des profils d'amplification. Cependant, il ne permet pas de faire un sequencage direct de chacun des fragments obtenus puisque ceux-ci ne peuvent etre physiquement isoles. Le LH-PCR a ete utilise dans plusieurs ecosystemes pour en evaluer la diversite bacterienne (Field et al, 2003; Mills et al, 2003; Ritchie et al, 2000; Suzuki et al, 1998; Tiirola et al, 2003; Yang et al, 2006). Cette technique n'a cependant pas encore ete utilisee pour etudier le lisier de pore et la digestion anaerobic

1.5.3.2. T-RFLP

Le T-RFLP {terminal restriction fragment length polymormism) est aussi une technique d'amplification PCR de FADNr 16S. Semblable au LH-PCR, il differe cependant par une ou plusieurs digestions enzymatiques des amplicons produisant des fragments de restriction detectables par la fluorescence. Puisqu'une seule des amorces (generalement

18 Pamorce sens 5') est liee au fluorophore, la notion de terminal provient du fait que seuls les fragments contenant l'extremite 5' fluorescent sont detectes. L'avantage de l'utilisation d'enzymes de restrictions est qu'elles permettent de differencier les amplicons de meme poids moleculaire. Le T-RFLP s'applique a tous les procaryotes et est aussi utilise dans Petude des archaebacteries (Banning et al, 2005; Collins et al, 2006; Lueders et Friedrich, 2002). Padmasiri et al. (2007) ont eu recours au T-RFLP afin de suivre la population methanogene dans un bioreacteur anaerobie traitant le lisier de pore. Les populations de Methanosarcinaceae et Methanosaetaceae obtenues etaient correles aux concentrations d'acetate produites.

Bien que l'emploi de plusieurs enzymes de restrictions permette une detection plus precise, l'analyse des profils obtenus devient plus ardue. L'analyse des profils de T-RFLP est possible par l'utilisation d'outils informatiques d'assignation de longueur de fragments. Par exemple, TAP T-RFLP (http://rdp.cme.msu.edu) (Marsh et al, 2000), TORAST (http://www.torast.com) and MiCA (http://mica.ibest.uidaho.edu/) (Kent et al, 2003) sont disponibles sur internet. Ces outils permettent de simuler in silico cette technique de T- RFLP pour faire un choix eclaire de la combinaison optimale d'amorces et d'enzymes de restriction. Cette situation permet d'obtenir une meilleure resolution au niveau taxonomique desire, tel qu'effectue par Padmasiri et al. (2007). De plus, ces simulations peuvent etre utilisees pour predire les fragments de restriction et en faire 1'identification. Par contre, tout comme le LH-PCR, le clonage est necessaire pour permettre une identification convenable. Puisque l'electrophorese se fait generalement sur un sequenceur automatique, 1'excision des bandes est alors impossible. Une alternative interessante pour 1'identification rapide des profils obtenus est de creer une banque de reference de clones prealablement sequences et testes selon la technique de profilage utilisee.

1.5.3.3. DGGE

Le DGGE {Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) ou l'electrophorese de gel denaturant a gradient, est aussi une technique permettant l'obtention de profils associes aux sequences de l'ADNr 16S. Se basant sur la difference de stabilite de l'ADN double brin inherent aux differences de leur composition en bases GC, cette technique permet la

19 separation des amplicons d'ADNr 16S lors de l'electrophorese sur un gel de polyacrylamide avec un gradient lineaire de denaturation de formamide/uree. La mobilite des molecules est reduite lorsque les deux brins se detachent partiellement. Une region riche en GC est ajoutee a l'extremite 5' d'une amorce ce qui previent la separation complete des brins. La popularity du DGGE s'explique par le fait que les fragments peuvent etre excises du gel, clones et sequences directement ou encore hybrides a des sondes specifiques. De plus, ce systeme est beaucoup moins couteux qu'un sequenceur automatique. Malheureusement, faire la distinction entre les bandes, est nettement plus difficile puisqu'il n'implique pas de detection au laser. De plus, la reproductibilite des gels entre eux et entre les laboratoires reste relativement faible (Dorigo et al, 2005). Dans l'etude des communautes microbiennes du lisier de pore, cette technique a ete effectuee avec succes par Topp et Leung (2001). En comparant un lisier traite dans des bioreacteurs anaerobies et aerobies, les patrons de bandes, semblables au depart, montraient une dominance des phylotypes specifiques aux aerobes lorsque celui-ci etait aere. Recemment, Cook et al. (2007) ont utilise le DGGE pour caracteriser les microorganismes responsables de la formation du scatole, compose malodorant, dans un lisier enrichi par son precurseur, le L-tryptophane. Les profils releves dans les echantillons riches en scatole etaient associes a une augmentation des bacteries gram-positives, faibles en GC, et des Bacteroides.

1.5.3.4. Hybridation de fluorescence in-situ (FISH)

L'hybridation de fluorescence in-situ (FISH), s'appuyant sur l'usage de sondes fluorescentes specifiques a l'ADNr 16S d'un seul microorganisme ou d'un groupe, a couramment ete realisee pour l'etude des populations microbiennes presentent dans les bioreacteurs (Sousa et al, 2007; Tang et al, 2004), de la microfiore intestinale et fecale (Franks et al, 1998; Lay et al, 2005; Martin-Orue et al, 2007) et des sols (Wellington et al, 2003). L'hybridation est effectuee sur des cellules entieres fixees. Ces dernieres sont alors observees par microscopie epifluorescente ou par microscopie confocale. Les resultats sont generalement exprimes par la proportion de microorganismes detectes par les sondes specifiques compares a la communaute microbienne totale detectee par des sondes universelles (Dabert et al, 2002). C'est une methode utile pour la determination de l'abondance de populations specifiques et par le fait meme, pour la quantification de ces

20 communautes. De plus, le FISH evite le biais potentiel du a 1'amplification par polymerase et permet de connaitre la distribution spatiale des cibles. Cependant, le choix de la sonde et du fluorophore,d e meme que les conditions de l'astringence, la temperature d'hybridation, Pautofluorescence de certains organismes, le type d'ecosysteme et le stade physiologique de la cellule cible peuvent influencer significativement l'efficacite' du FISH (Dorigo et al, 2005). Aussi, la limite de detection est dans l'ordre de 105 copies d'ADN/ARN et la sensibilite est reduite pour les milieux a haute concentration microbienne.

Peu d'etudes ont ete effectuees pour connaitre la microflore intestinale des pores. Martin- Orue et al. (2007) ont fait l'usage du FISH dans une etude visant a identifier les microorganismes presents dans tout le systeme digestif de pores traites avec des dietes fournissant differentes sources de fibres. Les resultats du FISH ont permis de constater d'importantes differences des populations selon quatre sites digestifs distincts mais non en fonction de leur diete. Alors qu'un T-RFLP sur ces memes echantillons a montre une difference de profils selon la diete, une mauvaise specificite des sondes ainsi qu'un changement des populations non ciblees peuvent expliquer ces resultats.

1.5.3.5. PCR en temps reel

Le PCR en temps reel est de plus en plus utilise en microbiologic environnementale. Cette technique tres sensible permet la quantification des especes, des populations bacteriennes autant que du total bacterien. La difference majeure entre le PCR en temps reel et le PCR traditionnel est que les donnees obtenues dans le premier correspondent au debut de V amplification exponentielle de l'amplicon alors que dans le second, elles refletent la quantite finale de l'amplicon qui peut n'avoir aucun lien avec la quantite de materiel presente au depart. En fait, le nombre de copies du gene cible est obtenu a partir du cycle PCR (Ct) ou la fluorescence detectee depasse une ligne de base, de meme que par l'utilisation d'une courbe d'etalonnage.

Deux technologies peuvent etre utilisees pour ce type de detection. La methode 7agMan se base sur la destruction d'une sonde placee entre deux amorces. Cette destruction emet alors une fluorescence detectable par l'appareil. La methode SYBR Green est basee sur la

21 presence d'un agent fluorescent qui s'intercale a l'ADN double brin. Consequemment, la detection est moins specifique puisque le fluorophore peut s'intercaler dans tout fragment amplifie. Le PCR en temps reel comporte de nombreux avantages. Tout d'abord, puisqu'il detecte chaque nouvelle amplification, la phase d'ampflification logarithmique fournit les donnees utilisees pour la quantification. Cela permet d'eviter les erreurs dues a l'efficacite de l'amplification ou a la diminution de reactifs. De plus, il ne comprend pas de manipulations apres le PCR, ce qui aide a prevenir la contamination entre les echantillons. Aussi, cette methode permet d'obtenir des resultats tres rapidement pour un grand nombre d'echantillons. Enfin, il ne faut pas oublier sa sensibilite qui est beaucoup plus grande que le PCR conventionnel. II existe aussi des desavantages a cette technique. Premierement, elle demande une mise au point des conditions reactionnelles (concentrations d'amorces et d'ADN a amplifier) et il faut s'assurer de la specificite du design d'amorces et/ou de la sonde. Par contre, une fois la mise au point effectuee, cette methode est tres rapide. Aussi, la sensibilite de la technique doit etre analysee. Cette analyse demande la presence d'un temoin interne exogene ou endogene pour normaliser les resultats (Sharkey et al, 2004), de merae que la determination de Pechelle de linearite de la courbe d'etalonnage afin de valider les resultats. De plus, pour faire du PCR en temps reel, le laboratoire doit etre equipe de l'appareil de detection specialise qui est couteux. A cela s'ajoute les couts des reactifs et enzymes necessaires a l'amplification. S'il s'agit de la methode TaqMan, la sonde fluorescente represente des couts additionnels mais la specificite est theoriquement amelioree.

Rousselon et al. (2004) ont utilise les sondes d'ADN fluorogeniques MGB {Minor Groove Binder), derivees de la technologie TaqMm pour faire la detection de bacteries fecales dans l'environnement. lis ont du identifier un indicateur de la contamination fecale base sur la dominance bacterienne dans les feces humaines. Par l'analyse comparative de phylotypes a l'interieur du groupe des bacteries Gram-positif a faible teneur en GC, un design d'amorces a ete cree, appele Feci. II s'est avere que l'utilisation de ce design a permis de quantifier et de tester positivement les echantillons de feces humaines et animales et negativement les echantillons de sols, d'eaux et de bioreacteurs presumes non contamines. Le SYBR Green a ete la methode choisie par Fey et al. (2004) dans la quantification de PADNr et de l'ARNr bacteriens. Grace a ce dernier, ils ont pu determiner

22 la presence et Pactivite metabolique d'une bacterie pathogene dans l'eau. lis arrivent a la conclusion que leur technique peut etre utilisee dans la quantification bacterienne d'6chantillons environnementaux ainsi que dans la determination de leur niveau d'activite. De plus, en choisissant des cibles appropriees, il est possible d'etudier la situation physiologique ou le potentiel pathogenique de diverses populations bacteriennes. Les archaebacteries ont aussi ete quantifies par PCR en temps reel (Sawayama et ah, 2006; Shigematsu et ah, 2003; Stewart et ah, 2006). Yu et ah (2006) ont utilise la technologie TaqMan pour la detection et la quantification de methanogenes acetotrophes dans differents systemes de digestion anaerobie. lis ont recouru a des amorces et des sondes ciblant distinctement PADNr 16S de l'ordre Methanosarcinales et des families Methanosarcinaceae et Methanosaetaceae.

1.6. Approche experimentale

L'objectif du projet presente dans ce memoire consistait a developper des outils moleculaires afin de determiner les niveaux d'activite des groupes bacteriens presents dans le lisier de pore. Les odeurs provenant du lisier sont produites lors de la degradation anaerobie de la matiere organique par des microorganismes indigenes. Puisque la microbiologic classique ne permet la detection et 1'identification que d'une faible proportion des populations microbiennes environnementales, des techniques de biologie moleculaire ont ete utilisees. Differents lisiers ont ete analyses; soit du lisier brut recueilli directement a la ferme, du lisier entrepose ainsi que du lisier en traitement dans un bioreacteur anaerobie a ecoulement piston.

Differents protocoles d'extraction du materiel genetique ont ete eprouves dans le lisier de pore. Suite a quelques modifications, il a ete determine que la co-extraction de l'ADN et de l'ARN, selon la methode de Griffiths et ah (2000), permettait d'obtenir un materiel de meilleure qualite tout en etant simple, rapide et peu couteuse. Afin de faire la detection des populations microbiennes actives, l'etude a ete faite en ciblant l'ARNr 16S en plus de l'ADNr 16S.

23 Dans le but d'etudier les changements de la communaute bacterienne dans un bioreacteur en fonction, les techniques moleculaires de LH-PCR et de T-RFLP ont ete utilisees afin de suivre les bacteries et les archaebacteries sur une periode de six mois. Ce bioreacteur etait compose de huit compartiments relies en serie et munie d'une pompe manuelle situee a l'entree de meme que d'une sortie de Peffluent a son extremite. De la periode de demarrage a six mois d'utilisation, les compartiments ont vu leur composition microbienne se preciser et se specialiser selon les differentes etapes de la degradation anaerobie.

Pour correler les resultats a la production des odeurs, Paccumulation d'acides gras volatils a ete quantified par chromatographie en phase gazeuse puisque ces acides gras volatils sont considered comme etant des indicateurs d'odeur adequats. De plus, l'efficacite du bioreacteur a pu etre suivie par la production du biogaz, produit final de la degradation anaerobie.

Des essais de PCR en temps reel ont aussi ete effectues sur les echantillons de lisier provenant du meme bioreacteur a ecoulement piston apres les 6 mois d'operation. De nouvelles extractions d'ARNr 16S ont ete realisees en inoculant chaque echantillon d'une quantite connue d'une bacterie de reference Thermus aquaticus. La quantification du nombre de copies d'ARNr 16S a ete obtenue a partir des designs specifiques aux genres Clostridium coccoides, Syntrophomonas, Peptostreptococcus, Methanosarcina et Methanosaeta.

Lors d'un autre volet du projet, l'analyse de profits de LH-PCR et T-RFLP sur des lisiers de pores en finition, preleves de la fosse a lisier d'une ferme estrienne ainsi que d'un melange de lisiers de pores en finition et de maternite utilise pour l'alimentation de bioreacteur, a ete effectuee pour observer les differences microbiologiques qui existaient entre eux.

Puisque les techniques moleculaires utilisees produisent de nombreuses donnees, l'analyse des profils a ete facilitee par divers outils statistiques. L'analyse en composante principale (ACP) et le positionnement multidimensionnel non-metrique (NMS) ont ete utilises pour visualiser les differences de profil entre les echantillons de lisier. L'ACP a pour but

24 d'illustrer les relations entre les variables (ici, longueur d'amplicon ou fragment de restriction) et les observations (effet de date et de compartiment ou lisier) dans un espace de dimension reduite, soit sur un plan bidimensionel. L'ACP a permis d'identifier les phylotypes pouvant expliquer les changements observes dans les echantillons. Cette analyse est frequemment utilisee en ecologie microbienne dans la comparaison de communautes complexes (Wang et at, 2004). Bien qu'il possede des similarites avec le PCA, le NMS permet d'evaluer un champ plus vaste de structures (McCune et Grace, 2002). II est represente par une carte ou la position de chaque echantillon est determined par sa distance avec toutes les autres donnees de l'analyse. Son utilisation est particulierement utile dans l'etude des relations entre des communautes ecologiques puisqu'il peut traiter les valeurs nulles (l'absence de certains groupes dans les profils) et evite l'assomption d'une relation lineaire entre les variables. L'UPGMA (Unweight Pair Group Method with Arithmetic mean) est une methode simple et rapide utilisee pour construire des arbres phylogenetiques. II s'agit d'un algorithme de regroupement sequentiel ou les relations sont identifies dans l'ordre de leur similarity pour produire un arbre de distance. Plus la distance entre deux branches est rapprochee, plus similaire est leur sequence d'ADN. Finalement, trois parametres de diversite ont ete evalues pour chaque echantillon ou chaque phylotype represente une population donnee. Le parametre de richesse correspond au nombre total de phylotypes differents dans un echantillon alors que le parametre d'egalite reflete l'equilibre dans l'abondance de chacune des populations microbiennes presentes. Le parametre de diversite, appele indice Shannon, exprime le nombre de phylotypes d'abondance egale. Finalement, l'analyse des especes indicatrices (ISA) est une methode statistique qui a permis d'identifier les phylotypes montrant une distribution preferentielle aux lisiers analyses. Ainsi, une valeur indicatrice (IV) de 100% pour un lisier indique que le phylotype y est parfaitement correle.

Ainsi, les connaissances engendrees par l'utilisation de ces technologies permettront de connaltre les microorganismes responsables de la production des odeurs. Ces nouvelles connaissances et les outils moleculaires developpes pourront servir a l'elaboration de traitements du lisier plus efficaces et stables, pour en reduire les odeurs et aussi accroitre leur valeur agronomique.

25 CHAPITRE 1

DYNAMIQUE DES COMMUNITES BACTERIENNES ET ARCHAEBACTERIENNES D'UN BIOREACTEUR DE TYPE ECOULEMENT PISTON TRAIT ANT LE LISIER DE PORC

Un bioreacteur a ecoulement piston consistant en huit reservoirs relies en serie a ete employe pour etudier la composition microbienne et de Pactivite metabolique dans le traitement du lisier de pore a basse temperature. Le profilage de l'abondance relative des phylotypes a partir de l'ADN microbien obtenu par les techniques de LH-PCR et de T- RFLP par 1'amplification PCR respective du gene de l'ARN ribosomal 16S des bacteries et des archaebacteries. Pour ces deux techniques, les proflls obtenus par la transcription inverse de l'ARNr 16S (RT-LH-PCR et RT-T-RFLP) ont aussi ete analyses afin de determiner quels phylotypes microbiens y sont actifs. La comparaison des profils des differents compartiments du bioreacteur a ete visualisee par la methode de regroupement UPGMA, par les analyses de composantes principals et de positionnement multidimensionnel non-metrique. Ces analyses ont demontre que les phylotypes etaient specifiquement relies aux changements temporels et spatiaux (relatifs aux compartiments) de la composition microbienne. Les indices de diversite Shannon, de la richesse et d'egalite ont ete calcules a partir des abondances relatives obtenues avec l'ADN et l'ARN pour evaluer la reponse de la biomasse aux changements des substrats et de l'environnement a travers le systeme simule de bioreacteur piston en serie. La richesse representant le nombre de phylotypes n'a pas varie significativement pour les profils LH- PCR obtenus a partir de l'ADN comme de l'ARN. Par contre, les indices de diversite Shannon et de l'egalite des profils RT-LH-PCR ont decru significativement {P < 0,05) a travers les differents compartiments du bioreacteur. Apres quatre mois d'operation, les phylotypes de 375 pb et 352 pb ont semble etre les plus pertinents dans Pexplication des variabilites entre les profils, variabilites directement reliees a l'ordre de passage de l'echantillon dans les compartiments. Les phylotypes de 344 pb et 345 pb pourraient expliquer les differences entre les deux premieres dates de prelevement et les dernieres. Les indices de diversite archaebacteriens des profils de T-RFLP ont baisse significativement (P < 0,0002) aux niveaux de l'ADN et de l'ARN. Les analyses de

26 composantes principales ont confirme que le phylotype de 183 pb etait dominant et responsable de la production de methane dans les compartiments 6 a 8; alors que les phylotypes de 287 pb et 87 pb etaient aussi presents et actifs dans les compartiments 1 a 3 apres quatre mois d'operation. Les correlations des profils avec la production des acides gras volatils (AGV) et de methane ont aussi ete utiles pour comprendre les changements observes dans la communaute bacterienne. Ces analyses multivariees des profils d'ADN et d'ARN se sont averees etre des outils statistiques importants dans la caracterisation de la composition et de Pactivite du consortium microbien anaerobie adapte au traitement du lisier de pore.

Ces travaux sont decrits au chapitre 1. Ce chapitre est constitue de Particle suivant: Bacterial and archaeal community dynamics from an anaerobic plug flow type digester treating swine manure. Caroline Roy, Guylaine Talbot, Ed Topp, Carole Beaulieu, Marie- France Palin & Daniel Masse. Environmental Microbiology, (soumis pour publication)

La contribution des auteurs a ete la suivante. L'echantillonnage a ete effectue par C. Roy et G. Talbot. Toutes les manipulations en laboratoire ont ete effectuees par C. Roy sous la supervision de G. Talbot. Le bioreacteur a ete alimente et entretenu par l'equipe de D.I. Masse qui a aussi fait l'analyse des AGV et du methane. L'article a ete redige par C. Roy et G. Talbot alors que E. Topp, M.-F. Palin et C. Beaulieu et D.I. Masse ont collabore a la redaction.

Des modifications a l'article ont ete apportees lors de la correction du memoire et elles n'engagnent que la responsabilite de l'etudiante.

27 Bacterial and archaeal community dynamics from an anaerobic plug flow type digester treating swine manure. Environ. Microbiol.

Caroline S. Roy1, Guylaine Talbot1*, Ed Topp2, Carole Beaulieu3, Marie-France Palin1, and Daniel I. Masse1. 1 Dairy and Swine Research & Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, 2000 rue College, Sherbrooke, QC JIM 1Z3, Canada Southern Crop Protection and Food Research Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, 1391 SandfordStreet, London, ONN5V4T3, Canada 3Departement de biologie, Universite de Sherbrooke, Sherbrooke, QC J1K 2R1, Canada

*For correspondence. E-mail [email protected]; tel. (819) 565-9174; Fax (819) 564-5507

28 Abstract

A modified plug flow digester, which consisted of eight compartments connected in series was used to study the temporal and spatial shifts in microbial composition and activity of a biomass treating swine manure. Bacterial and archaeal DNA and RNA fingerprints were obtained by using amplicon length heterogeneity PCR (LH-PCR) and terminal fragment restriction length polymorphism (T-RFLP), respectively. Comparative analyses of the fingerprints were done by statistical methods of ordination and clustering and showed that specific phylotypes were linked to temporal and spatial changes of the microbial composition and activity. Diversity indices were calculated to assess diversity along the simulated plug flow system. Richness (number of phylotypes) did not vary significantly from LH-PCR data but Shannon diversity index and evenness from RNA based LH-PCR profiles decreased significantly (P < 0.05) along the plug flow system. Archaeal diversity indices from both T-RFLP and RT-T-RFLP profiles decreased significantly (P < 0.0002). Molecular fingerprints data treated with multivariate analyses (principal component analysis (PCA) and nonmetric multidimensional scaling (NMS) ordination) were found useful to compare the composition and activity of the anaerobic microbial consortium adapted to treat swine manure. NMS was used to correlate the fingerprints with the total volatile fatty acids level and methane production rate.

29 Introduction

It is well known that the fast growth of swine industries makes an impact on the environment (Jongbloed and Lenis, 1998). Today, this industry is constrained by the population to reduce odors and toxic production from manure and, many efforts are provided to find solutions (Zhu, 2000; Gralapp et al, 2002; Ndegwa et al, 2003; Castillo- Gonzalez and Bruns, 2005; Cote et al, 2005; Pelletier et al, 2005; Zhang and Zhu, 2005; Zhang et al, 2006) and facilitate cohabitation.

Methanogenic digesters are operated to mineralize complex organic waste components to carbon dioxide, methane, and water through the sequential actions of four major metabolic groups: hydrolytic-fermentative bacteria, acetogenic bacteria, aceticlastic methanogens, and hydrogenotrophic methanogens (Zinder et al, 1984). Hydrolytic-fermentative bacteria are responsible for the degradation of polymeric organic matter into volatile fatty acids and other reduced organic compounds (e.g. lactate, ethanol). Proton-reducing acetogenic bacteria produce hydrogen, formate and acetate from these reduced organic substrates. Some acetogens utilize hydrogen to produce acetate. The last step of methanogenesis by methanogens, which are members of the Archaea, is the production of methane and carbone dioxide by using hydrogen, formate, or acetate (Mah et al, 1990; Stams and Zehnder, 1990). Boone et al (1993) have defined five orders of methanogenic Archaea: Methanobacteriales, Methanococcales, Methanomicrobiales, Methanosarcinales, and Methanopyrales (extreme thermophiles). The taxonomic classification and validation of cultivable species was done by a combination of 16S rRNA sequencing, DNA hybridization, and phenotypic characterization (Garcia et al, 2000). Methanogens are separated in three main nutritional categories: 1) the hydrogenotrophs that oxidize H2 and reduce carbon dioxide to form methane. Among them, some species also use formate; 2) the methylotrophs that use methanol, methylamines or dimethylsulfide; 3) the aceticlastics (or acetotrophs) that utilize acetate to produce methane. VFA (Volatil Fatty Acid) has been considered an appropriate odour indicator in swine manure (Williams, 1984; Zhu et al, 1999; Miller and Varel, 2003; Zhang et al, 2006). Knowledge of swine manure microbial community and its degradation is an important step towards improving its treatment.

30 The application of molecular technologies that did not require microbe cultivation has revolutionized our knowledge on microorganisms in environmental samples. More than a decade ago, scientists discovered that in environmental samples the majority of microorganisms are uncultivable in laboratories thus changing our perception of microbial diversity. To study the bacterial composition of environmental samples, researchers targeted the small subunit ribosomal RNA (SSUrRNA) gene and obtained precious informations on taxons and species present in environment (Woese and Fox, 1977; Ludwig and Schleifer, 1994).

Nucleic acids profiling methods are molecular approaches commonly used to characterize a microbial community. The length heterogeneity PCR (LH-PCR) is based on variations in the length of a variable region located within the 16S rRNA gene (Field et al, 2003; Mills et al, 2003; Tiirola et al, 2003) to distinguish the different bacterial populations. The terminal restriction length polymorphism (T-RFLP) of archaeal 16S rRNA gene is another molecular technique that has been frequently used to study the diversity of methanogens (Lueders and Friedrich, 2000; Lueders, 2002; Collins et al, 2006a; Penning, 2006). For these two fingerprinting technologies, peak intensities within each fragment size (or phylotype) are assumed to be proportional to the original template concentrations. Since DNA can stay in the environment long after the cell death, results from RNA, which is more unstable, would be considered to be more accurate (Sheridan et al, 1998; Fey et al, 2004; Rogers et al, 2005; Aellen et al, 2006). The fact that cellular growth is closely related to transcriptional regulation of rRNAs (Maaloe and Kjeldgaard, 1966; Gourse et al, 1996; Fey et al, 2004) also justify the use of rRNA profiling methods. In this study, we looked at both the 16S rDNA and 16S rRNA to obtain a better knowledge on bacterial composition and metabolic activity (Keer and Birch, 2003). An estimate of the microorganisms' relative activity, by their corresponding phylotypes, can be obtained by reverse transcription (RT) of rRNA followed by fingerprinting of the SSUrRNA molecules (RT-LH-PCR and RT-T-RFLP).

Our objective was to evaluate over a 6 month period, the spatial and temporal changes in composition and metabolic activity of an anaerobic microbial community adapted to liquid swine manure degradation in a modified plug flow reactor of 8 tanks serially linked.

31 Multivariate statistical analyses were used to compare the microbial community fingerprints in compartments of the simulated plug flow system, and to correlate these fingerprints with corresponding VFA profiles and methane production rate. To our knowledge, this is the first report using LH-PCR method to monitor bacterial community in anaerobic digestion.

Results and Discussion

In this study, shifts in microbial populations of an 8-compartments plug flow reactor treating swine manure were characterized by LH-PCR and T-RFLP analysis of amplified 16S rDNA and rRNA, from start-up to six months of operation. To our knowledge, no microbial community study has been done on this type of reactor. This model was chosen because of its potential to specialize the microflora through the compartments according to the anaerobic digestion model. Therefore, it provides an interesting environment to study the dynamics of microbial communities in swine manure anaerobic degradation. The PCA and NMS statistical ordination methods allowed visualization of spatial and temporal changes in microbial population composition and metabolic activity.

VFA and CH4 production In the first month of operation, most of the VFAs are produced in the first two compartments (PF01 and PF02), these VFAs were mostly composed of acetate and propionate (Fig. 1). In those compartments, methane formation was detected at the same rate of 0.3 mL/hr. After two months of operation, PF01 and PF02 produced most of the VFAs as well but acetate production was more effective in the first compartment. Moreovers, a highest peak of methane was detected in the second compartment and decreased in the followings. After 4 and 6 months of operation, reactors produced most of the VFAs in the first compartment whereas methane was more abundant at the end of the process. After six months of operation, most of the VFAs produced were found at the beginning of the plug flow reactor thus suggesting that the first steps of the anaerobic degradation had occurred in the first compartments of the system. As expected, the last compartments are the ones where most of methane formation occurred, corresponding to the final step of anaerobic digestion. Since VFAs are considered to be adequate odor

32 indicator in swine manure (Zhu et al, 1999), this plug flow reactor permitted to considerably reduce odors. Indeed, because this system provided a closed environment, most of the intermediate anaerobic degradation products were used to produce methane before leaving the reactor through the effluent.

33 12000 At start-up r 1.2 _ 10000 1.0 _J CD 3* "5) 8000 0.8 0) 3 r" 6000 0.6 "3 ^ 4000 0.4 2000 0.2 3 0 lU iV. i, 0.0 PF01 PF02 PF03 PF04 PF05 PF06 PF07 PF08 PF09

12000 After 2 months 1.2 ^ 10000 - 1.0 3 CD '3) 8000 0.8 J 3 E 0.6 CD ^ 6000 0.4 3 ^ 4000 0.2 3 J]_ I m i~i Li 0.0 PF01 PF02 PF03 PF04 PF05 PF06 PF07 PF08 PF09

12000 After 4 months 1.2 10000 1.0 S <**

• acetate • propionate •isobutyrate obutyrate • isovalerate • valerate Qcaproate • methane

Fig. 1. Volatile fatty acids concentration and methane production rate in the reactor compartments (PF01-PF08) and the effluent (PF09) during a 6-month trial; mean + SD; n = 3.

34 LH-PCR and LH-RT-PCR analyses

Since the last sampling date had a more defined production of VFAs and CH4 through whole the reactor system, changes in bacterial 16S fingerprints was measured in each compartment using rDNA- (Fig. 2A) and rRNA-based (Fig. 2B) LH-PCR after 6 months of operation. Through the 8 compartments (PF01-PF08) and the effluent (PF09), the relative height of the 334-bp, 344-bp, 345-bp, 369-bp and 375-bp peaks, obtained by rRNA targeting, increased while the 349-bp, 352-bp and 353-bp peaks decreased. Other peaks did not vary and stayed in relatively low levels. When rDNA was considered (Fig. 2A), the 352-bp, 359-bp, 362-bp and 369-bp decreased while the 344-bp, 345-bp, 354-bp and 375- bp peaks increased through the compartments although the 345-bp and 375-bp peaks showed a fall in the last compartments. A dominance of the 352-bp peak was observed in the first two compartments changing to a dominance of the 344-bp peak form the fourth to last compartments. The 353-bp peak was present in the rRNA-based fingerprints but was undetectable with the rDNA-based fingerprints. This was probably because this population existed in a small percentage of the total community but was active, therefore detected by rRNA-based LH-PCR. In counterpart, some rDNA fingerprints that were present at low abundance were not detected by rRNA analysis thus suggesting that the bacteria represented in those phylotypes were inactive or dead in these conditions. Such detection divergences between 16S rDNA and rRNA fingerprints were previously observed in other studies (Delbes et al, 2000; Lueders and Friedrich, 2002; Morgan et al, 2002; Lozada et ah, 2006) where rRNA profiles gave a more precise look on the active population dynamics.

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Relative abundance (%) Relative abundance (%) -» -» ro M o> t»> *. op" ooiowotnooiooio K> V2 • & % T3 3 -? Pa. **>

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to r X H I o the compartments were better spread in the biplot, even at start-up. The same peaks as obtain by the DNA LH-PCR seemed responsible for the variations encountered, except for the 359-bp phylotype that was associated to the start-up samples clustered in the bottom of the graphic. Furthermore, the 375-bp phylotype was of lower relative abundance and was not involved in the variability (thus, not shown in RNA LH-PCR PC A biplot).

37 A) DNA UH-PCR fingerprints

5

3 an

58.5 % Prinl B) RNA LH-PCR fingerprints

4 9 •1 5 G 8 1 / 34 5 2 • ; s / w 8 'm 4 s S •' 3 1 / « .* —C_344 .. _ _ • ... - - - " " - - 3_ • ° -1 i\ 7 • O i • \ • 8 • 2 ! 3 3 -1 • • 7 6 i n -4 i—, 1- , , -j , r T 1 r "1 i r- — I I

Pr.nl 66.6 °0 • •• 0 months

Fig. 3. Principal components analysis of (A) LH-PCR and (B) LH-RT-PCR fingerprints after 0, 2, 4 and 6 months. The first principal component (Prinl) explains 58.5% and 66.6% of the total variability and the second principal component (Prin2) explains 25.3% and 20.3% of the total variability, for LH-PCR and LH-RT-PCR fingerprints, respectively. 1 to 8 = Serial compartments. 9 = Effluent.

38 T-RFLP and RT-T-RFLP analyses Fingerprints of amplified 16S rDNA and rRNA-targeted terminal restriction fragments (T- RFs) from the same 6-month samples are shown in Fig 4. Through the reactor compartments, the 183-bp peak became dominant and continued to increase as the manure was processed whereas most other peaks decreased.

78 87 183 281 287 374 385 387 Length (bp) IPF01 BPF02 DPF03 QPF04 oPFQS BPF06 BPF07 BPF08 HPFOS

281 287 374 385 387 Length (bp)

Fig. 4. Standardized 16S rRNA profiles obtained after 6 months of operation. A. T- RFLP; B. RT-T-RFLP. Each sample was done in triplicate of extraction and PCR. All peaks detected were standardized to make the total peaks heights represent the total quantity of nucleic acids for each profile; mean + SD; n = 3.

39 At the last sampling date, the rDNA-based T-RFLP fingerprints indicated that the first compartments had a more diversified population (more peaks) and both 183-bp peak and the 287-bp peaks had similar relative abundance. As the manure passed through the next compartments, the dominance of the 183-bp peak became obvious. With the rRNA T-RFs, dominance of the 183-bp peak was observed from the start of the reactor's operation thus suggesting a greater metabolic activity of the associated populations. In sillico T-RFLP analysis of NCBI archaeon 16S rRNA sequences using Microbial Community Analysis (MiCA, http://mica.ibest.uidaho.edu/) showed that the 183-bp T-RF may include aceticlastic Methanosarcina and hydrogenotrophs Methanoculleus, Methanomicrobium, and Methanoplanus genera. The 87- and 287-bp T-RF would be specific for some Methanoculleus and Methanosaeta species, respectively. The other T- RFs that were obtained in the current study could not clearly be defined when using in sillico T-RFLP analysis. PCA analysis was done with the T-RFs obtained by T-RFLP from 16S rDNA (Fig. 5A). The x-axis representing the first principal component explained 98.3% of the variability observed in the samples and was dominated by the 183-bp phylotype. The second principal component represented only 1.20% of the variability encountered. Through time, the first compartments were incleasingly spread on both principal components and distinguished themselves from the last compartments. The presence of the 87-bp and 287-bp phylotypes at the start-up and two months later opposed the 385-bp phylotype after 4 and 6 months of operation. As illustrated by the 6th month results, the first axis was correlated with the progression of manure degradation through the reactor and explained nearly all the T-RFs variability. When samples were analysed by RT-T-RFLP, the results were similar to those obtained with rDNA templates (Fig. 5B). The first principal component explained 99.3% of the variability thus covering almost the totality of the variability between RT-TRFLP fingerprints. Vectorial projections suggested that, at the beginning of the reactor operation, the fingerprints obtained were more similar to the last compartments after 4 and 6 months of operation, where the 183-bp phylotype was dominant, whereas the 287-bp and 87-bp phylotypes represented a more significant part of the active population in the first compartments after 4 months of operation.

40 A) DNA T-RFUP fingerprints

on 1

» !!• } i.li­ •1 lt u '£ 0 K ' G.87 e 9 0 14 G_287 o u • Si • 8 0.15 ; . •• 0.0&' *3 0 it • 1 • a at v\i* C „ 1 33 0 O! • 0 00 >*-•—^ • mk — - — -• — — — — — ~ ~- — — — — # - -- — —— ~ — — —- — — — -0.01 A • 4 3 P 7 -0 DS 2 / *;• 8 8 -o on 1 3 m 9 -5 If fi?3B5 \ 7 -0.11 l -CM • m6 H -0 11 • 3 H -0 11 5 i| -C.JO' 1 -0.21 •1 | ••It ' 4 ' i i

98.3 Prlnl B) RNA RT-T-RFLP fingerprints

0 IS ' 1 0 14 c. 2S? 0 15 5 II Oil' 0 10 ' 1 z 9 0 OS ' 0 01 ' • 0 07 ^ 0 01 0 OS ' 0 04 0 OS a A s 0 01 1 4 • • • __^-— —G. ! S3 0 00 - -0 01 3 " • -0 01 s -0 03 • m "sr6 " -0 04 2 4 >3 4 -0 OS f -0 0( M -0 07 MB 7 -0 0E 9 -0 0! -0 10 m -0 11' s -0 11 3 m -0 13 m s ] 1

99.3 »o Pr.nl • •• 0 2 4 6 months Fig. 5. Principal components analysis of (A) T-RFLP and (B) RT-T-RFLP fingerprints after 0, 2, 4 and 6 months. The first principal component (Prinl) explains 98.3% and 99.3% of the total variability and the second principal component (Prin2) explains 1.2% and 0.6%) of the total variability, for T-RFLP and RT-T-RFLP fingerprints, respectively. 1 to 8 = Serial compartments. 9 = Effluent.

41 UPGMA analysis UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) dendrograms clustered similar samples as illustrated in Fig. 6 and showed a dynamic flow, and support a sequential breakdown of manure along the tanks with time. At start-up, the bacterial DNA dendrogram (Fig. 6A) showed that the profiles were distinct from the others after 2, 4, and 6 months of operation. When compared to the VFAs and CH4 production (Fig. 2), the bacterial RNA dendrogram (Fig. 6B) seemed to confirm those results. In the first two compartments, when the VFAs production was at its higher points, the profiles formed a cluster at the left side of the dendrogram (Fig. 6A). The last compartments at 0 and 2 months that showed no significant production of VFAs or CH4 were similar and clustered. The manure to be treated might not have reached the last compartments, still containing the acclimated sludge used to initially feed the reactor. After 2 months and more of operation, in the compartments where the VFA productions decreased while CH4 was produced, the fingerprint profiles were clustered. Thus, the DNA fingerprints described a temporal distribution whereas the RNA fingerprints rather described a spatial distribution. This means that RNA permitted to detect subtle changes in the population activity through the compartments at a specific time. Archaeal DNA and RNA dendrograms (Fig. 6C, 6D) gave similar information. In the first compartments after 2 months and more of operation, when acetate and other VFA productions were higher, the profiles were clustered at one side of the dendrograms. When decreasing acetate productions occurred in the adjacent compartments, they clustered on the opposite side of the dendrogram confirming a change in the population. The center clusters showed similarities with each other and with the compartments that preceded them.

42 0000000002222 66 6 2 66 66662222 002 6 6600000002222226 622 66 66 t2i33i2l23467589567S9244S534S7G78899| 12348567-998713231 1223454567889673456! Nsne of Qbsorvot.on or Cluster Kane of Observation or Cluster

n

Ml I fTl'rfl rfrtl rfTj?^ I f"ri rYl n 0 62602 2 600 22222060000 662 6 66 062 06222 2222 00000006 6 6 26 6 66 t 3425J3469S395764S78948S67B8791 231 1 2, S*38G34546?8S33fl34e$77S63788!4!l223s Mi. of Observation or Cluster Mane of Observation or Cluster Fig. 6. Comparison of fingerprints by UPGMA cluster analysis from (A) LH-PCR; (B) LH-RT-PCR; (C) T-RFLP; and (D) RT-T-RFLP fingerprints from the 8 compartments (1 to 8, 9 = effluent) indicated by a after 0, 2, 4 and 6 months of operation indicated by b- NMS Principal components analysis (PCA) and nonmetric multidimensional scaling (NMS) are community data reduction and ordination methods, but even if PCA has been more often used, NMS should be the method of choice because it deals with zero values (absence of some groups in the fingerprints) and avoids the assumption of linear relationship among variables (McCune and Grace, 2002; Fromin et ah, 2002). Nonmetric multidimensional scaling ordination were performed to correlate the different phylotypes from LH-PCR (RT-LH-PCR) and T-RFLP (RT-T-RFLP) obtained in the tanks with their respective production of total VFAs and methane production rates. Triplicate of independent PCR amplifications are shown in Fig. 7 and 8 showing their reproducibility (spatial grouping). Overlaying the levels of total VFA concentration and methane production rate showed that clustered fingerprints were correlated to these parameters. Initial reactors in the series were associated with total VFA production, whereas compartments at the end of the series were associated with methane production. These results are in agreement with the sequential anaerobic breakdown of manure in methanogenic digesters. Fingerprints from the plug-flow start-up were distinct from the other sampling times. After 2 months, fingerprints are in a transitional position and after 4 and 6 months, fingerprints are clustered, showing more similarity. At the reactor start-up, RNA fingerprints were more spread than DNA fingerprints.

44 A) DNA UH-PCR fingerprints B) RNA LH-PCR fingerprints

Total VFA Methane Total VFA Methane •% i * m •' • * m * • • % m • *, Fig. 7. Overlays of (A) DNA LH-PCR and (B) RNA LH-PCR fingerprints with total volatile fatty acid levels and methane production rates using nonmetric multidimensional scaling (NMS) ordination. The size of the symbols in the graphs is proportional to the relative concentration of these parameters. The larger biplots show PCR triplicates and the compartments (1 to 8) and effluent (9) are numbered. A) DNA T-RFLP fingerprints B) RNA T-RFLP fingerprints . 4

m , m

* i* * % m Month • o m . • 2 m 4 • r »

* *

Total VFA Methane Total VFA Methane ON • • • \ • •>.•'•

* • • •

Fig. 8. Overlays of (A) DNA T-RFLP and (B) RNA T-RFLP fingerprints with total volatile fatty acid levels and methane production rates using nonmetric multidimensional scaling (NMS) ordination. The size of the symbols in the graphs is proportional to the relative concentration of these parameters. The larger biplots show PCR triplicates and the compartments (1 to 8) and effluent (9) are numbered. Diversity indices With rDNA-based fingerprints, richness of the population did not significantly change through the compartments although their abundance varied, which is not the case with results from rRNA, as shown in Table 1. Indeed, the first compartments had more rRNA- based peaks showing a greater diversity which decreased in the following compartments, explaining a specialization of some bacteria to digest the swine manure or the assumption that manure substrates are less complex (Briones et ah, 2007; Huang et al, 2004). These findings illustrate that rRNA study gives a more accurate knowledge on the active bacteria since the level of ribosomal RNA in bacteria is a function of the ribosome content, and may be considered as an indicator of the metabolic activity (Herbert, 1961; Wagner, 1994). Diversity indices were calculated from quantitative fingerprints data (peak relative abundances) and statistically treated. Because only one simulated plug flow system was studied, the sampling dates were considered as the repetition to analyse the effect of the compartments on diversity indices, and vice-versa. Tukey's tests for non-additivity (Milliken and Johnson, 1989) were applied on archaeal and bacterial community diversity indices data to determine if the effect of the compartments was the same regardless of the sampling dates (i.e. no interaction between these two parameters). Firstly, LH-PCR and RT-LH-PCR diversity indices data subjected to the Tukey's test for non-additivity indicated no significant interaction between sampling date and compartment parameters (data not shown). We could then conclude that all diversity indices (e.g. Shannon, evenness and richness) similar when using LH-PCR data, whereas such indices from RT-LH-PCR data significantly {P < 0.05) decreased, during the 6 months of operation (Table 1). These results showed that the global diversity of the bacterial community structure did not change but the diversity of the bacterial transcriptional activity in the community decreased. Analysis of variance and polynomial contrast applied on LH-PCR diversity indices data in the compartments allowed to conclude that Shannon diversity of the bacterial community was not significantly shifted along the compartments, but evenness and richness linearly (P = 0.01 and 0.02, respectively) decreased (Table 2). Shannon, evenness and richness linearly and significantly (P = 0.001, 0.001, and 0.05, respectively) decreased when LH-RT-PCR diversity data were analysed (Table 2). These results suggest that the decrease in the diversity of transcriptionnally active bacteria is accentuated when compared to the mere presence of bacteria in the community. The

47 absence of significant decrease in bacterial 16S rDNA diversity may be caused by the persistence of less transcriptionally active bacterial groups. The analysis of bacterial rRNA diversity would then be more sensitive than bacterial rDNA diversity analysis to detect shifts in metabolically active bacteria. The T-RFLP and RT-T-RFLP diversity indices data failed the Tukey's test (data analysis not shown). This suggests that the diversity indices were shifted differently along the compartments at the different sampling dates. The following analyses were then cautiously interpreted and were made by considering data from compartments of each sampling date (data not shown). Shannon and evenness archaeal diversity indices tended to be higher after 6 months of operation (Table 1), especially in intermediary compartments (compartments 3 to 5, data not shown). Diversity analysis of both DNA- and RNA-based T-RFLP fingerprints data showed a decrease of archaeal diversity along the simulated plug flow system (Table 2). The lesser diversity at the end of the system is in concordance with the low VFA level (Fig. 1) and the predominance of the 183-bp T-RF (Fig. 4). From start­ up to 6 months of operation, the Shannon diversity index, which reflects the number of species that have the same abundance, decreased throughout the compartments. The dominant populations must be of great importance in the reactor process however, minor populations may play a more important role than their abundance suggested. Indeed, those minor microorganisms are likely contributing to community dynamics. Functional stability of an ecosystem may not be the result of community stability and the number and diversity of minority populations might affect the dynamics of bacterial community (Fernandez et al, 1999; Miura et al, 2007). The archaeal diversity in this reactor treating swine manure was lower than the bacterial diversity, as expected, because the variety of substrates is higher for Bacteria than for Archaea communities. This was also observed by Snell-Castro et al. (2005) in pig manure slurry and in methanogenic bioreactors (e.g. Collins et al, 2006b; Hori et al, 2006). Even if it is assumed that a T-RF represent one phylotype, more than one archaeal group can have the same restriction fragment length. The use of more than one restriction enzyme might have distinguished the possible heterogeneous populations of one phylotype.

48 Table 1. Effect of sampling date on diversity indices Fingerprint Months s.e.m. max Date 0 2 4 6 P value LH-PCR Shannon 2.12 2.18 2.20 2.16 0.04 0.57 Evenness 0.77 0.76 0.78 0.76 0.01 0.61 Richness 16.00 17.44 17.11 17.33 0.47 0.14 LH-RT-PCR Shannon 2.07a 2.00ab 19?ab 1.92b 0.04 0.05 Evenness 0?4ab 0.75ab 0.76a 0.73b 0.01 0.07 Richness 16.22a 14.44b 13.33b 14.22b 0.41 0.001 T-RFLP

Shannon 0.77b 1.01ab 0.98ab 1.23a 0.079 0.01

Evenness 0.4b 0.5 lab 0.48ab 0.59a 0.039 0.04

Richness 6.11c 7.22b 7.44b 8.00a 0.095 <.0001

RT-T-RFLP

Shannon 0.36° 0.56b 0.69bT 0.85at 0.047 <.0001

Evenness 0.21c 0.28bc 0.34b 0.42a 0.023 <.0001

Richness 5.22b 7.11a 7.33a 7.44a 0.170 <.0001 a, b, c Values with different superscripts differ at P < 0.05 t These two values have a tendancy to differ at P < 0.1

49 Table 2. Analysis of diversity indices in the compartments Fingerprint Compartments Linear Quadratic 1 2 3 4 5 6 7 8 9 s.e.m. max** P value P value P value LH-PCR Shannon 2.14 2.19 2.22 2.19 2.15 2.12 2.14 2.13 2.20 0.06 0.93 0.66 0.88 Evenness 0.78 0.79 0.78 0.77 0.76 0.75 0.75 0.74 0.77 0.01 0.22 0.01 0.25 Richness 15.50 16.00 17.25 17.25 17.00 17.00 17.50 17.50 17.75 0.70 0.38 0.02 0.35 LH-RT-PCR Shannon 2.13 2.08 2.05 2.03 2.03 1.93 1.90 1.85 1.94 0.05 0.03 0.001 0.55 Evenness 0.79 0.77 0.76 0.74 0.74 0.73 0.73 0.70 0.74 0.01 0.01 0.001 0.04 Richness 14.75 14.75 14.75 15.50 15.75 14.00 13.75 14.00 13.75 0.61 0.23 0.05 0.17 T-RFLP

Shannon 1.60 1.41 1.19 0.95 0.84 0.78 0.71 0.67 0.81 0.119 0.0001 <.0001 0.0029

Evenness 0.78 0.69 0.59 0.48 0.44 0.41 0.37 0.35 0.41 0.059 0.0002 <.0001 0.0074

Richness 7.75 7.75 7.50 7.00 6.75 6.75 7.00 7.00 7.25 0.142 0.0001 <0001 <.0001

RT-T-RFLP

Shannon 1.33 1.03 0.72 0.53 0.43 0.40 0.35 0.30 0.42 0.070 <.0001 <0001 <.0001

Evenness 0.65 0.50 0.36 0.27 0.22 0.21 0.20 0.18 0.23 0.035 <.0001 <.0001 <0001

Richness 7.75 7.75 7.50 7.00 6.75 6.50 5.75 5.50 6.50 0.255 <.0001 <.0001 0.1277

** S.e.m. max: Standard error of the means maximum.

50 Conclusion Polymerase chain reaction-based methods such as LH-PCR and T-RFLP on 16S rDNA and rRNA are appropriate tools to monitor microbial population dynamics in swine manure treatment and could be useful to follow their performance and stability. However, bacterial RNA fingerprints gave a more precise view on the shifts of metabolically active bacteria throughout the compartments and time. This was also shown by diversity indices analyses which indicated that the bacterial RNA profiles diversity was significantly decreasing through the operation time whereas bacterial DNA fingerprints data were not.

PCA and NMS analysis showed the similarities and differences within complex data set. It demonstrated that the first three compartments fingerprints, after 6 months, were correlated with the production of VFAs. Also, the production of methane was correlated with the last four compartments. The simulated plug flow reactor system was able to separate the two main anaerobic digestion reactions: production of VFA and methane through the sequential compartments. This technology has the advantage to produce methane, the end product of anaerobic degradation, which could be used as an energy source without liberation of massive odorous compounds in the environment. The phylotypes that have been identified as beeing involved in the manure degradation should next be cloned and sequenced for phylogenetic identification without underestimation of the minor populations that might have an important role.

Environmental procedures

Environmental samples To fill the reactors, a biomass adapted to treat swine manure was taken from a semi- industrial scale sequencing batch reactor (Masse et al., 1996, 1997). Samples were collected from eight PVC reactors made with 6-feet long and 6-inch diameter PVC (polyvinyl chloride) pipes (effective volume of approximately 23L each reactor) connected in series (Fig. 9) and treating liquid swine manure at a rate of 1 to 2 g COD/L/day at 25°C. Aliquots of 1 ml were immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C until needed. Each reactor was connected with a wet cup gas meter counting the volume of

51 biogas produced and released the gas into a collector. At the same time, samples were also taken to determine the composition of volatile fatty acids (VFA).

PF01 PF02 PFttJ PF04 PP05 PF06 PF07 PF08

Fig. 9. Schematic diagram of an 8-compartment plug-flow reactor. Compartments named PF01 to PF08, PF09 being the effluent. 1) Feed port; 2) Manual pump; 3) Compartment; 4) Sampling port; 5) Compartment-connecting pipe; 6) Gas outlet; 7) Gas meter; 8) Effluent.

Volatile fatty acids and methane production VFA concentration was determined using a Perkin Elmer gas chromatograph (Perkin- Elmer, Etobicoke, ON, Canada) equipped with a high-resolution megabore column connected to a flame ionisation detector (GC-FID) (Perkin-Elmer). Biogas production was measured daily with wet cup gas meters.

DNA andRNA co-extraction Microbial nucleic acids were co-extracted in triplicates from frozen samples as described in Griffiths et al. (2000) with a minor modification. Samples were lyzed twice for 2 min with a MiniBeadbeater-8TM (BioSpec Products, Bartlesville, OK) and zirconia-silica beads 0.1 mm (Fisher Scientific Ltd, St-Laurent, QC, Canada) with a 5 min cooling on ice in between. The aqueous phase containing nucleic acids was separated by centrifugation (10,000 x g) for 15 min at 4°C. The PEG (polyethylene glycol) precipitation step was done on ice instead of room temperature. The pellet was suspended in 200 ul of autoclaved Milli-Q water and aliquot of 100 ul were used as DNA. To get RNA, 1 ul (40 U) of RNasin (Promega, Fisher Scientific Ltd), was added to the other 100 ul. In order to obtain

52 RNA templates, one aliquot of 25 ul of extracted nucleic acids was DNase-treated with 6 U of the RNase-free DNase I included in the DNA-free™ kit (Ambion, Applied Biosystems Canada, Streetville, ON, Canada) for 30 min at 37 °C. The DNase was then inactivated by the addition of an inactivation reagent (Ambion, Applied Biosystems Canada). Treatment efficiency was verified by PCR and showed no amplification when using universal primers. The quality of nucleic acids was verified on 1% agarose gel and then revealed with ethidium bromide staining. A 16S/23S rRNA standard (Roche Applied Science, Laval, Qc, Canada) was used as molecular weight marker.

Bacterial community analysis using LH-PCR and reverse transcription LH-PCR (LH-RT- PCR) To determine the bacterial community changes in the different reactors, we used the LH- PCR technique already used by Suzuki et al. (1998) and Mills et al. (2003). PCR amplification of nucleic templates were done in triplicates with universal 16S rDNA primers 6FAM-27F (5'-6-FAM-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3') and 355R (5'- GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3') (Lane, 1991). DNA templates (25 ng) were incorporated to the 25 ul PCR reaction mixture which was composed at a final concentration of IX PCR buffer containing MgCb (Amersham, GE Bio-Sciences Inc, Baie d'Urfe, QC, Canada), 0.5 uM of each primer, 0.2 mM of deoxynucleotide triphosphate (dNTP) (Amersham, GE Bio-Sciences Inc) and 0.625 U of Taq polymerase (Amersham, GE Bio-Sciences Inc). The reaction mixture was initially denatured at 94°C for 2 min, followed by 25 cycles of 94°C for 60 s, annealing at 55°C for 60 s and elongation at 72°C for 60 s, terminated by a final extension step at 72°C for 30 min in an Eppendorf gradient thermal cycler (Fisher Scientific Ltd). As for the LH-PCR based on DNA templates, LH- RT-PCR was done on RNA templates using the same set of primers. The reverse transcription and the PCR were done in one step by the Titan One-Tube RT-PCR kit (Roche Applied Science). One microliter of DNase-treated RNA was added to a 25 ul PCR mixture of a final concentration of IX RT-PCR buffer containing MgCk, 0.5 uM of both primers, 0.2 mM of dNTP, 5 mM of DTT, 5 U of RNasin (Promega, Fisher Scientific Ltd.) and 0.5 ul of Titan enzymes mix. The one step RT-PCR conditions were started by incubation at 60°C for 30 min to obtain cDNA followed by a denaturation step at 94°C for 2 min, followed by 25 cycles of 94°C for 60 s, annealing at 55°C for 60 s, elongation at

53 68°C for 60 s, and terminated by a final extension step at 68°C for 30 min. LH-PCR and LH-RT-PCR samples were stored at -20°C in the dark until they were used (usually less than a week).

Archaeal community analysis using T-RFLP and reverse transcription T-RFLP (RT-T- RFLP) In this study, T-RFLP was used to analyze the archaeal community changes in the different reactors. RNA and DNA-based T-RFLP were done in triplicates. Archaeal primers, Arl09F (5'-ACK GCT CAG TAA CAC GT-3') and 6FAM-Ar912RT (5'-6FAM-GTG CTC CCC CGC CAA TTC CTT TA-3') were used (Lueders and Friedrich, 2000). DNA templates (25 ng) were incorporated to the 25 ul PCR reaction mixture which was composed at a final concentration of IX PCR buffer containing MgCL: (Amersham, GE Bio-Sciences Inc), 0.5 uM of each primer, 0.2 mM of dNTP (Amersham, GE Bio-Sciences Inc) and 0.625 U of Taq polymerase (Amersham, GE Bio-Sciences Inc). The reaction mixture was initially denatured at 94°C for 2 min, followed by 25 cycles of 94°C for 60 s, annealing at 54°C for 60 s and elongation at 72°C for 60 s, terminated by a final extension step at 72°C for 30 min. As for the T-RFLP reactions based on DNA templates, RT-T- RFLP reactions were done on RNA templates using the same set of primers. The reverse transcription and the PCR amplification were performed using the Titan One Tube RT- PCR System (Roche Applied Science). One microliter of RNA treated with DNase was added to a 25 ul PCR mixture of a final concentration of IX RT-PCR buffer containing

MgCl2, 0.5 uM of both primers, 0.2 mM of dNTP, 5 mM of DTT, 5 U of RNasin (Promega, Fisher Scientific Ltd) and 0.5 ul of Titan enzymes mix. The one step RT-PCR conditions were started by incubation at 60°C for 30 min to obtain cDNA followed by a denaturation step at 94°C for 2 min, followed by 25 cycles of 94°C for 60 s, annealing at 54°C for 60 s, elongation at 68°C for 60 s, and terminated by a final extension step at 68°C for 30 min. Once the amplifications were completed, 10 JJ.1 aliquots were purified on Qiagen PCR purification MinElute columns as described by the manufacturer and eluated in lOul of EB (elution buffer) solution. 4 ul of these purified amplicon were then incubated with IX of enzyme buffer and 5 U of Taql restriction enzyme (Promega, Fisher Scientific Ltd) at 65°C for 3 hours. The T-RFLP samples were then stored at -20°C in the dark until they were used (usually less than a week).

54 Analysis on automated sequencer One microliter of each amplicons and terminal restriction fragments were mixed with 0.06 ul of molecular weight standard Liz 500 (Applied Biosystems Canada, ON, Canada) and 12.34 ul of formamide Hi-Di (Applied Biosystems Canada) and samples were then run on a 47 cm capillary sequencer ABI Prism 310 (Applied Biosystems Canada) for 28 min for LH-PCR and 40 min for T-RFLP. The electrophoresis was performed with POP-4 polymer from Applied Biosystems in the Gene Scan mode and analysis was done using the GeneScan analysis software (Applied Biosystems Canada).

Data analysis Standardization of the peak heights obtained for each sample was done to determine the total quantity of nucleic acids in each profile. The PCA, NMS and UPGMA analyses were done using the PC-ORD software (McCune and Grace, 2002). Richness (number of unique peaks), eveness (even abundance between the peaks and the number of peaks) and Shannon diversity (number of peaks having similar abundance) indices were calculated from peak heights and length from fingerprints, as previously reported in (Ritchie, 2000). Statistical analyses on these indices were done by using SAS v. 8.02 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Data were then analysed using Tukey's single-degree of freedom test for non- additivity (i.e. no interaction between Date and Compartment; Milliken and Johnson, 1989). Analysis of variance was applied to determine sampling date and compartment simple effects. Comparisons between sampling dates were made using Tukey correction for multiple comparisons. Polynomial contrast was used to compare compartments.

55 Acknowledgments We thank Steve Methot for statistical analysis and helpful discussions. This work was financially supported by Bio-Terre Systems Inc. and the Matching Investment Initiative of Agriculture and Agri-Food Canada.

References Aellen, S., Que, Y.-A., Guignard, B., Haenni, M. and Moreillon, P. (2006) Detection of Live and Antibiotic-Killed Bacteria by Quantitative Real-Time PCR of Specific Fragments of rRNA. Antimicrob Agents Chemother 50: 1913-1920.

Boone, D.R., Whitman, W.B. and Rouviere, P. (1993) Diversity and taxonomy of methanogens. In Methanogenesis. J. G. Ferry Editor. New York, USA: Chapman and Hall Co., pp. 35-80.

Briones, A.M., Daugherty, B.J., Angenent, L.T., Rausch, K.D., Tumbleson, M.E., and Raskin, L. (2007) Microbial diversity and dynamics in multi- and single-compartment anaerobic bioreactors processing sulfate-rich waste streams. Environ Microbiol 9: 93-106.

Castillo-Gonzalez, H.A. and Bruns, M.A. (2005) Dissimilatory iron reduction and odor indicator abatement by biofilm communities in swine manure microcosms. Appl Environ Microbiol 71: 4972-4978.

Collins, G., Mahony, T. and O'Flaherty, V. (2006a) Stability and reproducibility of low- temperature anaerobic biological wastewater treatment. FEMS Microbiol Ecol 55: 449- 458.

Collins, G., Kavanagh, S., McHugh, S., Connaughton, S., Kearny, A., Rice, O., Carrigg, C, Scully, C, Bhreathnach, N., Mahony, T., Madden, P., Enright, A.M., O'Flaherty, V. (2006b) Accessing the black box of microbial diversity and ecophysiology: Recent advances through polyphasic experiments. J. Environ. Sci. Health Part A, 41,897-922.

Cote, C, Masse, D.I. and Quessy, S. (2005) Reduction of indicator and pathogenic microorganisms by psychrophilic anaerobic digestion in swine slurries. Bioresource Technol 97: 686-691.

56 Delbes, C, Moletta, R., and Godon, J.-J. (2000) Monitoring of activity dynamics of an anaerobic digester bacterial community using 16S rRNA polymerase chain reaction-single- strand conformation polymorphism analysis. Environ Microbiol 2: 506-515.

Fey, A., Eichler, S., Flavier, S., Christen, R., Hofle, M.G., and Guzman, C.A. (2004) Establishment of a real-time PCR-based approach for accurate quantification of bacterial RNA targets in water, using Salmonella as a model organism. Appl Environ Microbiol 70: 3618-3623.

Fernandez, A., Huang, S., Seston, S., Xing, J., Hickey, R., Criddle, C. and Tiedje, J. (1999) How stable is stable? Function versus community composition. Appl Environ Microbiol 65: 3697-3704.

Field, K.G., Bernhard, A.E., and Brodeur, TJ. (2003) Molecular approaches to microbiological monitoring: fecal source detection. Environ Monit Assess 81: 313-326.

Fromin, N., Hamelin, J., Tarnawski, S., Roesti, D., Jourdain-Miserez, K., Forestier, N. et al. (2002) Statistical analysis of denaturing gel electrophoresis (DGGE) fingerprinting patterns. Environ Microbiol 4: 634-643.

Garcia, J.L., Patel, B.K.C. and Ollivier, B. (2000) Taxonomic, phylogenetic, and ecological diversity of methanogenic ^IrcAoea. Anaerobe 6: 205-226.

Gourse, R.L., Gaal, T., Bartlett, M.S., Appleman, J.A., and Ross, W. (1996) rRNA transcription and growth rate-dependent regulation of ribosome synthesis in Escherichia coli. Annu Rev Microbiol 50: 645-77.

Gralapp, A.K., Powers, W.J., Faust, M.A., and Bundy, D.S. (2002) Effects of dietary ingredients on manure characteristics and odorous emissions from swine. J Anim Sci 80: 1512-1519.

Griffiths, R.I., Witheley, A.S., O'Donnell, A.G., and Bailey, M.J. (2000) Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA and rRNA-based microbial community composition. Appl Environ Microbiol 66: 5488- 5491.

57 Herbert, D. (1961) The chemical composition of micro-organisms as a function of their environment. In Microbial reaction to environment. G.G. Meynell and H. Godder (eds). Cambridge, Great Britain: The Syndics of the Cambridge University Press, pp.391-416.

Hori, T., Haruta, S., Ueno, Y., Ishii, M. and Igarashi, Y. (2006) Direct comparison of single-strand conformation polymorphism (SSCP) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) to characterize a microbial community on the basis of 16S rRNA gene fragments. J Microbiol Methods 66: 165-169.

Huang, L.-N., Zhou, H., Zhu, S., and Qu, L.-H. (2004) Phylogenetic diversity of bacteria in the leachate of a full-scale recirculating landfill. FEMS Microbiol Ecol 50: 175-183.

Jongbloed, A.W. and Lenis, N.P. (1998) Environmental concerns about animal manure. J AnimSci 76: 2641-2648.

Keer, J.T. and Birch, L. (2003) Molecular methods for the assessment of bacterial viability. JMicrobiol Methods 53: 175-183.

Lane, DJ. (1991) 16S/23S rRNA sequencing. In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. Stackebrandt, E. and Goodfellow, M. (eds). Wiley, Chichester, England, pp. 115-175.

Lozada, M., Figuerola, E.L.M., Itria, R.F., and Erijman, L. (2006) Replicability of dominant bacterial populations after long-term surfactant-enrichment in lab-scale activated sludge. Environ Microbiol 8: 625-638.

Lueders, T. and Friedrich, M. (2000) Archaeal Population Dynamics during Sequential Reduction Processes in Rice Field Soil. Appl Environ Microbiol 66: 2732-2742.

Ludwig, W. and Schleifer, K.H. (1994) Bacterial phylogeny based on 16S and 23 S rRNA sequence analysis. FEMS Microbiol Rev 15: 155-73.

Lueders, T. and Friedrich, M. (2002) Effects of Amendment with Ferrihydrite and Gypsum on the Structure and Activity of Methanogenic Populations in Rice Field Soil. Appl Environ Microbiol 68: 2484-2494.

58 Maaloe, O. and Kjeldgaard, N.O. (1966) Control of macromolecular synthesis: a study of DNA, RNA, and protein synthesis in bacteria. W.A. Benjamin (eds). New York.

Mah, R.A., Xun, L.Y., Boone, D.R, Ahring, B.K., Smith, P.H. and Wilkie, A. (1990) Methanogenesis from propionate in sludge and enrichment systems. In Microbiology and biochemistry of strict anaerobes involved in interspecies hydrogen transfer. Belaich J.P., Bruschi, M., Garcia, J.L. (eds). New York, USA: Plenum Press, pp. 99-111.

Masse, D.I., Patni, D.K., Droste, R.L. and Kennedy, KJ. (1996) Operation strategies for psychrophilic anaerobic digestion of swine manure slurry in sequencing batch reactors. Can J Civ Eng 23: 1285-1294.

Masse, D.I., Droste, R.L., Kennedy, K.J. and Patni, D.K. (1997) Potential for the psychrophilic anaerobic digestion of swine manure slurry in sequencing batch reactors. Can Agri Eng J39: 25-33.

McCune, B. and Grace, J.B. (2002) Analysis of ecological communities. Gleneden Beach, Oregon: MjM Software Design, 300 pp.

Miller, D.N. and Varel, V.H. (2003) Swine manure composition affects the biochemical origins, composition, and accumulation of odorous compounds. JAnim Sci 81: 2131-2138.

Milliken, G.A. and Johnson, D.E. (1989) Nonreplicated experiments. In Analysis of messy data. Van Nostrand Reinhold, New York, pp. 7-12.

Mills, D.K., Fitzgerald, K., Litchfield, CD., and Gillevet, P.M. (2003) A comparison of DNA profiling techniques for monitoring nutrient impact on microbial community composition during bioremediation of petroleum-contaminated soils. J Microbiol Methods 54: 57-74.

Miura, Y., Hiraiwa, M.N., Ito, T., Itonaga, T., Watanabe, Y. and Okabe, S. (2007) Bacterial community structures in MBRs treating municipal wastewater: relationship between community stability and reactor performance. Wat Res 41: 627-637.

59 Morgan, C.A., Hudson, A., Konopka, A., and Nakatsu, C.H. (2002) Analyses of microbial activity in biomass-recycle reactors using denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rDNA and 16S rRNA PCR products. Can J Microbiol 48: 333-341.

Ndegwa, P.M., Zhu, J., and Luo, A. (2003) Effects of bioreactor temperature and time on odor-related parameters in aerated swine manure slurries. Environ Technol 24: 1007-1016.

Pelletier, F., Marquis, A., Godbout, S., Joncas, R., Larouche, J.-P., Masse, D. et al. (2005) Gas and odor emissions from swine building materials. ASAE standards 48: 721-728.

Penning, H. and Conrad, R. (2006) Effect of inhibition of acetoclastic methanogenesis on growth of archaeal populations in an anoxic model environment. Appl Environ Microbiol 72: 178-184.

Ritchie, N.J., Schutter, M.E, Dick, R.P, and Myrold, D.D. (2000) Use of length heterogeneity PCR and fatty acid methyl ester profiles to characterize microbial communities in soil. Appl Environ Microbiol 66: 1668-75.

Rogers, G.B., Carroll, M.P., Serisier, D.J., Hockey, P.M., Kehagia, V., Jones et al. (2005) Bacterial activity in cystic fibrosis lung infections. Respir Res 6: 49.

SAS Statistical Analysis System, Release 8.02 (2000) SAS Institute Inc., Cary NC.

Sheridan, G.E., Masters, C.I., Shallcross, J.A., and MacKey, B.M. (1998) Detection of mRNA by reverse transcription-PCR as an indicator of viability in Escherichia coli cells. Appl Environ Microbiol 64: 1313-1318.

Snell-Castro, R., Godon, J.-J. and Delgenes, J.-P. and Dabert, P. (2005) Characterisation of the microbial diversity in a pig manure storage pit using small subunit rDNA sequence analysis. FEMS Microbiol Ecol 52: 229-242.

Stams, A.J.M. and Zehnder, A.J.B. (1990) Ecological impact of syntrophic alcohol and fatty acid utilization. In Microbiology and biochemistry of strict anaerobes involved in interspecies hydrogen transfer. Belaich J.P., Bruschi, M., Garcia, J.L. (eds). New York, USA: Plenum Press, pp. 87-89.

60 Suzuki, M., Rappe, M.S., and Giovannoni, S.J. (1998) Kinetic bias in estimates of coastal picoplankton community structure obtained by measurements of small-subunit rRNA gene PCR amplicon length heterogeneity. Appl Environ Microbiol 64: 4522-4529.

Tiirola, M.A., Suvilampi, J.E., Kulomaa, M.S., and Rintala, J.A. (2003) Microbial diversity in a thermophilic aerobic biofilm process: analysis by length heterogeneity PCR (LH- PCR). Water Res 37: 2259-2268.

Wagner R. (1994) The regulation of ribosomal RNA synthesis and bacterial cell growth. Arch Microbiol 161: 100-109.

Wang, M., Ahrne, S., Antonsson, M., and Molin, G. (2004) T-RFLP combined with principal component analysis and 16S rRNA gene sequencing: an effective strategy for comparison of fecal microbiota in infants of different ages. J Microbiol Methods 59: 53- 69.

Williams, A.G. (1984) Indicators of piggery slurry odour offensiveness. Agr Wastes 10: 15-36.

Woese, C.R. (1977) Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: the primary kingdoms. Proc Natl Acad Sci USA 74: 5088-5090.

Zhang, Z., Zhu, J., and Park, K J. (2006) A bench-scale aeration study using batch reactors on swine manure stabilization to control odour in post treatment storage. Water Res 40: 162-174.

Zhang, Z. and Zhu, J. (2005) Effectiveness of short-term aeration in treating swine finishing manure to reduce odour generation potential. Agri Ecosys Environ 105: 115-125.

Zhu, J., Riskowski, G.L. and Torremorell, M. (1999) Volatile fatty acids as odor indicators in swine manure - A critical review. Transactions ASAE 42: 175-182.

Zhu, J. (2000) A review of microbiology in swine manure odor control. Agric Ecosys Environ 78: 93-106.

61 Zinder, S.H., Cardwell, S.C., Anguish, T., Lee, M. and Koch, M. (1984) Methanogenesis in a thermophilic (58°C) anaerobic digestor: Methanothrix sp. as an important aceticlastic methanogen. Appl Environ Microbiol 47: 796-807.

62 CHAPITRE 2

COMPARAISON DES STRUCTURES DES COMMUNITES BACTERIENNES ET ARCHAEBACTERIENNES DU LISIER DE PORC ET DE L'ACTIVITE TRANSCRIPTIONNELLE PAR L'ANALYSE STATISTIQUE MULTIVARIEE DES EMPREINTES GENETIQUES DE L'ADN ET DE L'ARN RIBOSOMAL

Des echantillons de lisiers de pore provenant des operations de finition ont ete preleves de la fosse d'une ferme estrienne mensuellement, durant trois mois d'ete consecutifs (Fl, F2 et F3), puis compares entre eux. lis ont egalement ete compares a un lisier mixte (MF) provenant des operations de finition et de maternite. La communaute microbienne des lisiers de pore a ete caracterisee par des techniques d'empreintes moleculaires et a ete analysee a l'aide d'outils statistiques multivaries. Les profils obtenus en ciblant l'ADN et l'ARN ribosomal 16S ont ete produits par les methodes de LH-PCR et de T-RFLP. La premiere technique est specifique au domaine bacterien alors que la seconde designe les archaebacteries. La caracterisation des empreintes des differents echantillons de lisier a ete effectuee par assemblage UPGMA, par analyse en composante principale, par positionnement multidimensionnel non-metrique et par analyse d'especes indicatrices. Ces analyses multivartees ont montre que les profils des echantillons triplicata se superposaient et qu'ils etaient distincts selon la provenance du lisier. Les analyses des phylotypes obtenus nous amenent a conclure que les trois lisiers de pore provenant des operations de finition etaient distincts mais plus semblables entre eux qu'envers le lisier MF. De plus, ces analyses ont permis de faire la detection de changements subtils entre des echantillons semblables. L'indice de diversite de richesse (nombre de phylotypes) n'a pas montre une variation significative en ciblant l'ADNr comme l'ARNr. Par contre, les indices de diversite Shannon et d'egalite des profils provenant de l'ADNr etaient significativement (P < 0,05 et P < 0,01, respectivement) plus hauts dans le lisier mixte que dans les lisiers de finition seulement. L'indice d'egalite des profils LH-PCR d'ARNr etait significativement superieurs (P < 0,01) pour le lisier mixte que pour les autres lisiers. Cependant, l'indice de Shannon du lisier MF n'etait pas significativement different du lisier F2. Du point de vue des archaebacteries, les indices de diversite Shannon et d'egalite, a partir des T-RFLP

63 d'ADNr, etaient en diminution significative (P < 0,001 et P < 0,05, respectivement), le lisier MF presentant une plus grande diversite. Les T-RFLP d'ARNr ont aussi des indices de diversite significativement (P < 0,01 pour l'egalite et P < 0,05 pour Shannon) plus grands pour le lisier MF. En conclusion, les resultats ont montre que les methodes de LH- PCR et de T-RFLP combinees a une analyse statistique multivariee etaient convenablement associes a la caracterisation et a la distinction de la composition microbienne (ADNr) et a l'activite transciptionnelle (ARNr) des lisiers de finitions et des lisiers mixtes.

Ces travaux sont decrits au chapitre 2. Ce chapitre est constitue de l'article suivant: Comparison of swine manure bacterial and archaeal community structure and transcriptional activity by multivariate stastistical analysis of ribosomal DNA and RNA fingerprints. Caroline Roy, Guylaine Talbot, Ed Topp, Martin Kalmokoff, Steven Brooks, Carole Beaulieu, Marie-France Palin & Daniel Masse. FEMS Microbiology Ecology, (soumis pour publication)

La contribution des auteurs a ete la suivante. L'echantillonnage a ete effectue par C. Roy. Toutes les manipulations en laboratoire ont ete effectuees par C. Roy sous la supervision de G. Talbot. Les analyses d'AGV et de methane ont ete effectuees par l'equipe de D. I. Masse. L'article a ete redige par C. Roy et G. Talbot alors que E. Topp, M.-F. Palin, C. Beaulieu, M.L. Kalmokoff, S.PJ. Brooks et D.I. Masse ont collabore a la redaction.

Des modifications a l'article ont ete apportees lors de la correction du memoire et elles n'engagnent que la responsabilite de l'etudiante.

64 Comparison of swine manure bacterial and archaeal community structure and transcriptional activity by multivariate statistical analysis of ribosomal DNA and RNA fingerprints

Caroline S. Roy1, Guylaine Talbot1*, Edward Topp2, Martin Kalmokoff3, Steven Brooks4, Carole Beaulieu5, Marie-France Palin1, and Daniel I. Masse1

Agriculture and Agri-Food Canada, Dairy and Swine Research and Development Centre, Sherbrooke QC, Canada; 2Agriculture and Agri-Food Canada, Southern Crop and Food Research Centre, London ON, Canada; 3Agriculture and Agri-Food Canada, Atlantic Food and Horticulture Research Centre, Kentville NS, Canada; 4Health Canada, Bureau of Nutritional Sciences, Health Products and Foods Branch, Banting Research Centre, Ottawa ON, Canada; department de Biologie, Universite de Sherbrooke, Sherbrooke QC, Canada.

Correspondence: Guylaine Talbot, AAFC: P.O. Box 90, 2000 College street, Stn Lennoxville, Sherbrooke, QC JIM 1Z3, Canada. Tel: 819 565-9174; fax: 819 564-5507; e-mail: [email protected]

Keywords: LH-PCR (length heterogeneity PCR); T-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism); swine manure microbial population.

65 Abstract The microbial community in swine manure was characterized by molecular fingerprinting and analysed using multivariate statistical tools. Microbial 16S ribosomal DNA and RNA (rDNA and rRNA) fingerprinting profiles were obtained by amplicon length heterogeneity PCR (LH-PCR) and by terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP), using PCR primers targeting Bacteria and Archaea. These multivariate analyses showed that triplicate fingerprints clustered and were distinct according to their provenance. Analyses of the fingerprints led us to conclude that the three manures from the finishing operation were more similar to each other, but were distinct from the mixed manure from maternity and finishing operations. Also, those analyses were able to distinguish subtle changes in similar samples. These results showed that LH-PCR and T-RFLP technologies, combined with multivariate statistical analysis, are suitable to characterize and distinguish the microbial composition (ribosomal DNA) and transcriptional activity (ribosomal RNA) of finishing manures sampled at different times and manures from maternity or finishing operations.

66 Introduction

Even if swine manure microbiology is more and more studied, knowledge about its metabolically active community is still unknown. Because culture-dependent microbiology is limited by diverse factor such as slow growth rate or non-cultivable organisms in laboratory, the arrival of molecular techniques in environmental microbiology has allowed new insight into microbial diversity (Mackay, 2004; Santos & Ochman, 2004; Petti et ah, 2005). Indeed, only a small percentage of environmental microorganisms can be cultured on media (Amann et ah, 1995). In swine manure, Snell-Castro et ah (2005) showed that of the 109 to 1010 cells per mL present, only 10 to 20% could be cultured on different media. The 16S ribosomal RNA gene has conserved and variable domains that make it a marker of evolution (Woese & Fox, 1977). By targeting a more conserved and universal region of the gene, non-cultivable or yet unknown organisms can be detected. Polymerase chain reaction targeting the 16S rDNA is now commonly used to obtain a more objective, precise and reliable picture of the microbial community structure. Swine intestine and manure community studies have mostly been characterized by sequence analysis of PCR amplified 16S rDNA clone libraries (Pryde et ah, 1999; Whitehead & Cotta, 2001; Leser et ah, 2002; Snell-Castro et ah, 2005). More recently, fingerprinting techniques, such as DGGE, T- RFLP and SSCP, have emerged as less time consuming methods (Topp & Leung, 2001; Konstantinov et ah, 2006; Peu et ah, 2006; Cook et ah, 2007; Martin-Orue et ah, 2007). Another fingerprinting technique, the length heterogeneity PCR (LH-PCR), is based on variations in the length of a variable region within the 16S rRNA gene fingerprints (Field et ah, 2003; Mills et ah, 2003; Tiirola et ah, 2003). Also, terminal restriction length polymorphism (T-RFLP) of archaeal 16S rRNA gene is the molecular technique commonly used to study the diversity of methanogens (Lueders & Friedrich, 2000; Lueders & Friedrich, 2002; Collins et ah, 2006; Penning & Conrad, 2006). For both fingerprinting technologies, the peak intensities within each fragment size (or phylotype) are assumed to be proportional to the original template concentrations. Fingerprints are useful to study shifts of a given microbial community under different conditions (e.g. time, space, chemicals exposure, etc.).

67 Since environmental communities have large proportion of micro-organisms in low activity or in resting mode (Felske et al, 1997) and, because DNA can survive cell death, we can't directly associate the fingerprints obtained to an active microbial population. Therefore, the ribosomal RNA is a more appropriate target for the detection of still metabolically active bacteria. Because the number of ribosomes in a cell is approximately proportional to its growth rate, the use of 16S rRNA is can be considered as an indicator of transcriptional activity ( Maaloe & Kjeldgaard, 1966; Kerkhof & Ward, 1993; Wagner, 1994; Gourse et al, 1996; Fey et al, 2004; Aellen et al, 2006).

The principal objective of this study was to compare the effectiveness of 16S rRNA- and rDNA-based LH-PCR and T-RFLP technologies to characterize and distinguish microbial communities in finishing pigs raw manures, sampled at different time, at the farm. The microbial community in raw manure from a maternity-finishing pig confinement was also characterized and compared to the others. Diversity indices, principal components analysis (PCA) and indicator species analysis (ISA) were used for the characterization and comparisons of the different swine manure samples. To our knowledge, it is the first time that metabolically active bacterial community in swine manure is studied by co-comittant rDNA and rRNA profiling.

Materials and methods

Environmental samples Slurry samples from an outside manure storage tank were taken monthly, for 3 consecutive months, during the summer (Fl, F2 and F3: May, June and July 2005, respectively) on an intensive pig-fattening farm located in the province of Quebec, Canada. Samples from a mixture of finishing pigs and maternity barn manure (MF) were also taken at the same farm. Aliquots of 0.5 ml were immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C until needed.

68 Volatile fatty acids production VFA concentration was determined using a Perkin Elmer gas chromatograph (Perkin- Elmer, Etobicoke, ON, Canada) equipped with a high-resolution megabore column connected to a flame ionisation detector (GC-FID) (Perkin-Elmer).

DNA and RNA co-extraction Microbial nucleic acids were co-extracted in triplicates from frozen samples as described in Griffiths et al. (2000) with a minor modification. Samples were lyzed twice for 2 min with a MiniBeadbeater-8™ (BioSpec Products, Bartlesville, OK) and zirconia-silica beads 0.1 mm (Fisher Scientific Ltd, St-Laurent, QC, Canada) with a 5 min cooling on ice in between. The aqueous phase containing nucleic acids was separated by centrifugation (10,000 x g) for 15 min at 4°C. The PEG (polyethylene glycol) precipitation step was done on ice instead of room temperature. The pellet was suspended in 200 ul of autoclaved Milli-Q water and aliquot of 100 ul were used as DNA. To get RNA, 1 ul (40 U) of RNasin (Promega, Fisher Scientific Ltd), was added to the other 100 ul that will be treated with DNase. In order to obtain RNA templates, one aliquot of 25 ul of the extracted nucleic acids was DNase-treated with 6 U of the RNase-free DNase I included in the DNA-free™ kit (Ambion, Applied Biosystems Canada, Streetville, ON, Canada) for 30 min at 37°C. The DNase was then inactivated by the addition of an inactivation reagent (Ambion, Applied Biosystems Canada). Treatment efficiency was verified by PCR and showed no amplification when using universal primers. The quality of nucleic acids was verified on 1% agarose gel and then revealed with ethidium bromide staining. A 16S/23S rRNA standard (Roche Applied Science, Laval, QC, Canada) was used as a molecular weight standard.

Bacterial community analysis using LH-PCR and reverse transcription LH-PCR (LH-RT-PCR) To determine the bacterial community in swine manures, we used the LH-PCR technique already used by Suzuki et al (1998) and Mills et al. (2003). Triplicate PCR amplifications of nucleic templates were done with universal 16S rDNA primers 6FAM-27F (5'-6-FAM- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3') and 355R (5'-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-

69 3') (Lane, 1991). DNA templates (25 ng) were incorporated to the 25 ul PCR reaction mixture which was composed at a final concentration of IX PCR buffer containing MgCL. (Amersham, GE Bio-Siences Inc, Baie d'Urfe, QC, Canada), 0.5 uM of each primer, 0.2 mM of deoxynucleotide triphosphate (dNTP) (Amersham, GE Bio-Siences Inc) and 0.625 U of Taq polymerase (Amersham, GE Bio-Siences Inc). The reaction mixture was initially denatured at 94°C for 2 min, followed by 25 cycles of 94°C for 60 s, annealing at 55°C for 60 s and elongation at 72°C for 60 s, terminated by a final extension step at 72°C for 30 min in an Eppendorf gradient thermal cycler. As for the LH-PCR based on DNA templates, LH-RT-PCR was done on RNA templates using the same set of primers. The reverse transcription and the PCR were done in one step by the Titan One-Tube RT-PCR kit (Roche Applied Science). One microliter of DNase-treated RNA was added to a 25 ul PCR mixture of a final concentration of IX RT-PCR buffer containing MgCb, 0.5 |iM of both primers, 0.2 mM of dNTP, 5 mM of DTT, 5 U of RNasin (Promega, Fisher Scientific Ltd) and 0.5 ul of Titan enzymes mix. The one step RT-PCR conditions were started by incubation at 60°C for 30 min to obtain cDNA followed by a denaturation step at 94°C for 2 min, followed by 25 cycles of 94°C for 60 s, annealing at 55°C for 60 s, elongation at 68°C for 60 s, and terminated by a final extension step at 68°C for 30 min. LH-PCR and LH-RT-PCR samples were stored at -20°C in the dark until they were used (usually less than a week).

Archaeal community analysis using T-RFLP and reverse transcription T-RFLP (RT- T-RFLP) In this study, T-RFLP was used to analyze the archaeal community in manures. Archaeal primers, Arl09F (5'-ACK GCT CAG TAA CAC GT-3') and 6FAM-Ar912RT (5'-6FAM- GTG CTC CCC CGC CAA TTC CTT TA-3') were used (Lueders & Friedrich, 2000). DNA templates (25 ng) were incorporated to the 25 ul PCR reaction mixture which was composed at a final concentration of IX PCR buffer containing MgCl2 (Amersham, GE Bio-Siences Inc), 0.5 uM of each primer, 0.2 mM of dNTP (Amersham, GE Bio-Siences Inc) and 0.625 U of Taq polymerase (Amersham, GE Bio-Siences Inc). The reaction mixture was initially denatured at 94°C for 2 min, followed by 25 cycles of 94°C for 60 s, annealing at 54°C for 60 s and elongation at 72°C for 60 s, terminated by a final extension step at 72°C for 30 min. As for the T-RFLP reactions based on DNA templates, RT-T-

70 RFLP reactions were done on RNA templates using the same set of primers. The reverse transcription and the PCR amplification were performed using the Titan One Tube RT- PCR System (Roche Applied Science). One microliter of RNA treated with DNase was added to a 25 ul PCR mixture of a final concentration of IX RT-PCR buffer containing

MgCl2, 0.5 uM of both primers, 0.2 mM of dNTP, 5 mM of DTT, 5 U of RNasin (Promega, Fisher Scientific Ltd) and 0.5 ul of Titan enzymes mix. The one step RT-PCR conditions were started by incubation at 60°C for 30 min to obtain cDNA followed by a denaturation step at 94°C for 2 min, followed by 25 cycles of 94°C for 60 s, annealing at 54°C for 60 s, elongation at 68°C for 60 s, and terminated by a final extension step at 68°C for 30 min. Once the amplifications were completed, 10 JJ.1 aliquots were purified on Qiagen PCR purification MinElute columns (Qiagen, Mississauga, ON, Canada) as described by the manufacturer and eluated in 10 ul of elution buffer. 4 ul of these purified amplicons were then incubated with IX of enzyme buffer and 5 U of Taql restriction enzyme (Promega, Fisher Scientific Ltd) at 65°C for 3 hours. The T-RFLP samples were then stored at -20°C in the dark until they were used (usually less than a week).

Analysis on automated sequencer One microliter of each amplicon and terminal restriction fragments were mixed with 0.06 ul of molecular weight standard Liz 500 (Applied Biosystems Canada) and 12.34 ul of formamide Hi-Di (Applied Biosystems Canada). Samples were run on a 47 cm capillary on ABI Prism 310 capillary sequencer sequencer (Applied Biosystems Canada) for 28 min for LH-PCR and 40 min for T-RFLP. The electrophoresis was performed with POP-4 polymer (Applied Biosystems Canada) in the GeneScan mode and analysis was done using GeneScan analysis software (Applied Biosystems Canada).

Data analysis Standardization of the fingerprints data was done as described in Dunbar et al. (2001). ISA was done using Bray-Curtis (Sorenson) distance measures using the PC-ORD software (McCune and Mefford, 1999). Richness (number of unique peaks), eveness (even abundance between the peaks and the number of peaks) and Shannon diversity (number of peaks having similar abundance) indices were calculated from peaks height and length from fingerprints using the PC-ORD software, as previously reported (Ritchie et al, 2000).

71 Statistical analyses on these indices, PCA, and Unweighted Pair-Group Method Averaging (UPGMA) were done by using SAS v. 8.02 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Analysis of variance and Tukey correction were applied on diversity indices data to discriminate the microbial communities in the different manure samples.

Results and discussion

Volatile fatty acids production Different volatile fatty acids, normally produced by manure microflora in anaerobic conditions, were quantified (Fig.lA) in order to examine the divergence in manure composition. Manure F2 and F3 produced the highest VFA concentrations and manure MF the lowest. When the relative percentage of VFA produced was considered (Fig. IB), all manure samples were similar. However the total VFA levels were 19.7, 32.0, 27.1, and 12.0 g/L for manures Fl, F2, F3, and MF, respectively.

72 60%

DPI OF2 • F3 • MF

<1 rrm ill rra. y ./ y «** / *

Fig.l. Volatile fatty acids concentration (A) and relative percentage (B) for manures Fl, F2, F3 and MF. DNA- and RNA-based length heterogeneity polymerase chain reaction (LH-PCR) analysis Dendrograms based on the UPGMA method are shown in fig.2. Manure samples were distinct enough to gather in homogeneous clusters. LH-PCR fingerprints formed two major clusters composed of Fl and MF manures opposed to F2 and F3 manures, which had similar total VFAs levels, whereas the LH-RT-PCR dendrogram showed a cluster composed of Fl, F2 and F3 manures distant from manure MF. Thus, community transcriptional activity profile was more discriminative in separating manure MF from the

n^^rTfeYThl I rt'rVrfi I r?T?i Hi rS FFFFFFFFFMMMMNIMMIVIMFFFFFFFFFFFFFFFFFF 111111111FFFFFFFFF222222222333333333 Manure

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AAACCcBBBAAAIBCCBAACAIBBCCAAABCBBCC Extraction

123132T23T23T3T32T223T32T3T231T2323 PCR F1 F2 F3 MF Fig. 2. UPGMA dendrograms of A. LH-PCR and B. LH-RT-PCR fingerprints.

74 others. The indicator species analysis was used to identify the phylotypes that were significantly (P < 0.05) associated with the manure samples. Major significant amplicons are shown in table 1. Most of the amplicons represented phylotypes of lower relative abundance (from 0.4% to 3%). When the bacterial DNA LH-PCR data were considered, the 304-bp phylotype had a perfect indicator value (IV) for manure F2 whereas it changed for manure F3 when RNA was considered. This could be explained by inactive bacteria, represented though this phylotype, in manure F2 and which became metabollicaly active enough to be detected in manure F3. Also, the DNA 339-bp phylotype had an IV of 100% for the manure MF but decreased to 81% when RNA was considered. RNA phylotype 347- bp was entirely associated with manure MF but was distributed amongst all manures when DNA was considered. Therefore, the 339-bp phylotype might be associated to maternity manure where those bacteria were active. The 376-bp phylotype had a perfect IV for manure F3 only but had a relative abundance of 0.3% only. It is well known that, minor populations can play a more important role than their abundance suggest. Indeed, these minor microorganisms likely contribute to the community dynamic. Functional stability of an ecosystem may not be the result of community stability and the number and diversity of minority populations might affect the dynamics of bacterial community (Fernandez et al, 1999;Miura^a/., 2007).

Diversity indices were calculated from the fingerprints and are shown in Table 2. Global diversity was generally higher for mixed maternity and finishing pig manure (MF) than for the finishing pig manures. Since manure MF is a mixture of two slurries, these results were expected. Richness (number of phylotypes) did not show significant variation neither from the rDNA-based nor the rRNA-based profiles. However, Shannon diversity index and evenness from rDNA-based LH-PCR profiles were significantly (P < 0.05 and 0.01, respectively) higher for manure MF than for the others. Evenness from rRNA-based LH- PCR were significantly (P < 0.01) higher for manure MF than for the others. But Shannon diversity index from manure MF was not significantly different from manure F2.

75 Table 1. Indicator species analysis from LH-PCR and LH-RT-PCR fingerprint data Phylotype Cluster's indicator valuey IVmaxz (bp) MF Fl F2 F3 p-vahiQ LH-PCR 304 0 0 100 0 0.001 320 48 14 17 20 0.001 334 25 11 27 38 0.001 336 18 28 35 19 0.001 339 100 0 0 0 0.001 343 0 100 0 0 0.001 345 100 0 0 0 0.001 347 25 13 22 36 0.001 375 60 28 0 12 0.001 LH-RT-PCR 304 0 0 0 100 0.001 320 47 8 21 24 0.001 334 19 12 27 42 0.001 336 0 0 67 33 0.001 339 81 19 0 0 0.001 347 100 0 0 0 0.001 353 0 31 36 33 0.001 358 0 35 32 33 0.01 375 66 0 0 34 0.001 376 0 0 0 100 0.001 For major significant phylotypes only. y Relative abundance x relative frequency = % of perfect indication in an UPGMA cluster. z Statistical significance of the highest indicator value for a given phylotype across clusters.

76 Table 2. Diversity indices calculated from LH-PCR and LH-RT-PCR fingerprints LH-PCR LH-RT-PCR Manure Richness* Evenness Shannon Richness* Evenness Shannon MF 15 0.874a 2.423a 14 0.832a 2.195b Fl 16 0.790b 2.140b 14 0.798b 2.106c F2 14 0.736c 1.941c 14 0.823a 2.173b F3 14 0.753c 1.986c 17 0.795b 2.253a P <0.05 <0.01 <0.01 <0.01 abc Values within a column which do not share a common superscript letter were significantly different. * Richness data could not be statistically treated because there were no different values between triplicates.

Triplicates of LH-PCR peak heights obtained by the sequencer were standardized to express the results in relative abundance of the fluorescence detected (Fig.3). Based on the rDNA profiles, the 352-bp was the most important in all the manures and was most present in manures F2 and F3. The 339-bp and 345-bp phylotypes were specific to manure MF and the 343-bp, 349-bp, 359-bp and 362-bp phylotypes were higher in manure Fl. From rRNA fingerprints data, changes in phylotypes relative abundance were observed. Again, the 352- bp phylotype was dominant but it was more abundant in manures Fl and F2. The 338-bp, 343-bp and 345-bp phylotypes were absent or under the detection level in all samples. The 349-bp phylotype appeared to be metabolically important and active in manure MF. The 347-bp phylotype was specific to manure MF and the 339-bp phylotype was also detected in manure Fl. All finishing pig manures had an important phylotype of 353-bp (Fig. 3B) that was absent in the mixed manure. The use of universal 16S primers and the presence of a dominant phylotypes might have hidden the changes or presence in minor populations. Peu et al. (2006) showed, in a swine manure population study, that the use of group- specific primers produced data suggesting greater diversity than when universal primers were used.

77 45 g 40 | 35

f * • F1 UF2 $ 20 • F3 I 15- • MF 10 5 -J rffc ifta w-1 IfflJ.I JLLJI it JbJh^i-i , 304320334336338339 341343344345 347 349 352 353 355 358359362366369 375 Length (bp) 45 B 40 35 30- Fl 25- I OF2 0 20- • F3 1 15- • MF 2 io- 5- ^JL JZL. .IW.TI.1.^. 304 320 334 336 338 339 341 343 344 345 347 349 352 353 355 358 359 362 366 369 375 length (tap)

Fig. 3. LH-PCR (A) and LH-RT-PCR (B) fingerprints from manures Fl, F2, F3 and MF.

Principal component analyses (PCA) were performed on fingerprints data to visualize the differences between manure samples. In fact, PCA applies a rotation to the multidimensional data points, including triplicates of extraction and PCR to the four manures analysed, to bring out the maximal variability by projection on a bi-dimensional plane. From the rDNA fingerprints data, the first and second principal components explained 76.8% and 17.6% of the total variability, respectively (Fig.4A). The PCR and extractions triplicates were well clustered together and showed that there was more variability between the manure samples themselves. The vectorial projection of the 352-bp phylotype suggests that this phylotype is the most important to explain the profiles variability between manures F2 and F3 versus manures Fl and MF. Indeed, the manure Fl appeared to be influenced by the 359-bp and 349-bp phylotypes while the 345-bp phylotype isolated the MF sample. Again, the fingerprints similarities between F2 and F3 are in agreement with the total VFA levels. The PCA based on the rRNA analysis had first and second principal components explaining 78.8% and 17.4% of the variability,

78 respectively (Fig.4B). Except for one repetition of the F2 manure that was rejected (data point not shown), triplicates are still clustered. This suggested that PCA analysis was a tool that easily permitted the detection of repetitive problems. These results also allowed us to conclude that the differences of profiles obtained by the different manure samples were not likely caused by the laboratory techniques used but to the samples nature itself (data not shown). From a simple glimpse, it permitted to distinguish the finishing manure (Fl, F2 and F3) from the mix of maternity and finishing manure (MF). The first principal component opposed the 353-bp phylotype to the 349-bp phylotype. Therefore, they were assumed to be the ones explaining the most the variability between profiles. The first principal component seemed to be related to manure samples effect as for the DNA profiles. The second principal component seemed to be related to the profiles distinction between Fl, F2 and MF, and F3 which was related to the 352-bp and 344-bp phylotypes, respectively. Manure MF was from a mixture of maternity and finishing part of the industry, therefore this manure came from pigs fed a different diet when compared to manures Fl, F2 and F3. It is well known that change in diets can affect gut and manure microbial composition due to substrate changes (Leser et al, 2000; Gralapp et al, 2002; Miller & Varel, 2003). Therefore, the distinction of manure MF in microbial community structure was expected.

79 1"^

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Prinl 79.3%

Fig. 4. Biplot representation of Principal Components Analysis of (A) LH-PCR and (B) LH-RT-PCR fingerprints from manures Fl, F2, F3 and MF. LH-PCR: The first principal component (Prinl) explains 76.8% of the total variability between the fingerprints and the second principal component (Prin2) explains 17.6% of the total variability. LH-RT-PCR: Biplot representation of Principal Components Analysis of LH-RT-PCR fingerprints of manures Fl, F2, F3 and MF. The first principal component (Prinl) explains 79.3% of the total variability between the fingerprints and the second principal component (Prin2) explains 17% of the total variability.

80 DNA- and RNA-based terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis UPGMA dendrograms based on the T-RFLP and RT-T-RFLP profiles were also constructed as illustrated in fig. 5. The archaeal populations in finishing pig manures formed a distinct cluster from the mixed manure (MF) in both rDNA- and rRNA-based profiles. While manures Fl and F3 overlapped in a cluster of rDNA profiles, rRNA profiles analysis permitted a better discrimination between these two manures.

I—*-—• ZL rJiffl JTI tfim&i D. Hfa, HI m. rm FFFFFF FFFFFF FFFFFFFFFFFFFFFMMMMMMMMM 1 11111 111333333333222222222FFFFFFFFF Manure AAACCCIBIACBAABBCCAAABBICCCACACCBBBA Extraction

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AAACCCBBBABCABCCABABBACCCABAAABCBBCC Extraction TliTiiTiiTiTiilillilssTiiiTTIiSiTiii PCR F1 F2 F3 MF Fig. 5. UPGMA dendrograms of A. T-RFLP and B. RT-T-RFLP samples.

81 Table 3. Diversity indices calculated from T-RFLP and RT-T-RFLP fingerprints T-RFLP RT-T-RFLP Manure Richness* Evenness Shannon Richness* Evenness Shannon MF 11 0.750a 1.799a 14 0.717a 1.892a Fl 9 0.726b 1.595b 14 0.532c 1.404c F2 9 0.678c 1.490c 16 0.538c 1.439c F3 9 0.737ab 1.620b 15 0.660b 1.787b P <0.05 < 0.001 <0.01 <0.05 abc Values within a column which do not share a common superscript letter were significantly different. * Richness data could not be statistically treated because there were no different values between triplicates.

Archaeal Shannon diversity indices and evenness (Tab. 3) from rDNA-based T-RFLP profiles decreased significantly (P < 0.001 and 0.05, respectively), manure MF being the most diversified. Diversity indices derived from rRNA-based T-RFLP were significantly (P < 0.01 for evenness, and P < 0.05 for Shannon) higher for manure MF, as well. Since manure samples were taken from the farm pit, anaerobic fermentation had already started. Archaeal manure diversity in storage pits was found to be higher than in the animal gut (Whitehead & Cotta, 1999; Peu et al, 2006). Here, results suggested that there are minor populations (78-, 227-, 258-, 352-, 360-, 385-, and 387-bp T-RFs) that were under the detection level by T-RFLP fingerprinting and whose rRNA level was high enough to be detected by RT-T-RFLP. This finding suggests that these minor populations were transcritionnally active. Indicator species analysis was also performed with T-RFLP and RT-T-RFLP data (Table 4). The 78-bp and 387-bp phylotypes from archaeal rDNA showed a perfect IV for manure MF. However, these two phylotypes were unevenly distributed through all manure samples when considering rRNA-based results. The 385-bp phylotype was associated to manures MF (87%) and F3 (13%) when DNA was targeted With RNA, this phylotype was also present in manures Fl, F2 and F3 (3%, 2% and 10 %, respectively). One of the minor populations, the 352-bp phylotype, was only detected in manure F2 with RNA (100%).

82 Table 4. Indicator species analysis from T-RFLP and RT-T-RFLP fingerprint data Phylotype Cluster's indicator valuey IVmaxz (bp) MF Fl F2 F3 p-value T-RFLP 78 100 0 0 0 0.001 87 9 28 29 33 0.01 160 0 33 28 39 0.01 252 20 26 27 27 0.16 342 30 44 26 0 0.001 374 25 33 22 19 0.001 385 87 0 0 13 0.001 387 100 0 0 0 0.001 RT-TRFLP 78 52 8 8 33 0.001 87 9 23 23 45 0.001 160 15 12 20 54 0.001 252 0 16 25 59 0.001 258 23 0 37 40 0.05 342 23 16 17 44 0.05 352 0 0 100 0 0.001 374 28 36 21 15 0.001 385 84 3 2 10 0.001 387 71 8 8 12 0.001 For major significant T-RFs only y Relative abundance x relative frequency = % of perfect indication in an UPGMA cluster. z Statistical significance of the highest indicator value for a given phylotype across clusters.

83 Standardized T-RFLP and RT-T-RFLP profiles are shown in Fig. 6. For manures Fl, F2, and F3, the most abundant phylotype from DNA analysis was the 287-bp (ca. 40-45%) followed by the 183-bp (ca. 25%), the 87-bp (ca. 15%) and the 374-bp (8-12%) T-RFs. Manure MF phylotypes showed lower relative abundance than for the finishing manures except for the 385-bp representing 30% of the total MF phylotypes abundance. This phylotype was detected at lower level (5%) in manure F3 and under the detection level in manures Fl and F2. With rRNA as a target, four more phylotypes were detected but they were found to be in lower relative abundance. This can be explained by a low proportion of populations that were metabolically active. Those populations should not be discarded by their discrete presence. As described in literature, functional stability of an ecosystem is not the result of community stability. A higher minority populations diversity might affect the dynamics of bacterial community (Fernandez et al, 1999; Miura et al, 2007).

50 3" 40 UF1 30 a F2 • F3 20 • WF

10 4

o Iw.ffli, na.T« ,!m, .mi, ,;,L ^» m i 71 73 78 87 160 183 227 252 258 287 342 352 360 374 385 387 Length (bp) B

71 73 78 87 160 183 227 252 258 287 342 352 360 374 385 387

Fig. 6. T-RFLP (A) and RT-T-RFLP (B) fingerprints from manures #1, #3, #4, and #5.

84 PCA analysis was also performed on T-RFLP and RT-T-RFLP profiles as shown in Fig. 7. For the DNA-based PCA, the first principal components explained 90.2% and the second 4.6% of the variability between the profiles. Manure MF was clearly distinct from the other manures mainly caused by the predominance of the 385-bp phylotype. The three major phylotypes, namely the 87-bp, the 183-bp and the 287-bp T-RFs explained the most the variability between the manures Fl, F2, and F3. The first DNA-based PCA axis opposed the three dominant phylotypes to the 78-bp, 385-bp and 387-bp T-RFs that were seen mostly in manure MF. These phylotypes were important to explain the profile differences between manure MF and the others. The second principal component seemed to be linked to the difference between manure Fl and F2 which were different only by the change of dominance of the 183-bp and 287-bp phylotypes. PCA analysing RNA-based T- RFLP had a first principal component explaining 59.2% and a second of 25.8% of the variability. The divergence between all the samples was well shown by the spatial disposition. Again, phylotypes 87-bp, 183-bp, 287-bp, and 385-bp seemed to be important to explain their variation.

85 C

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Prinl 59.2 %

Fig. 7. Biplot representation of Principal Components Analysis of (A) T-RFLP and (B) RT-T-RFLP fingerprints from manures Fl, F2, F3 and MF. T-RFLP: The first principal component (Prinl) explains 90.2 of the total variability between the fingerprints and the second principal component (Prin2) explains 4.2% of the total variability. RT-T-RFLP: Biplot representation of Principal Components Analysis of RT-T-RFLP fingerprints of manures Fl, F2, F3 and MF. The first principal component (Prinl) explains 59.2% of the total variability between the fingerprints and the second principal component (Prin2) explains 25.8% of the total variability.

86 Conclusions LH-PCR and T-RFLP fingerprinting technologies, combined with multivariate statistical analyses, are suitable to characterize and distinguish the microbial composition (rDNA) and transcriptional activity (rRNA) of finishing manures sampled at different times, and manures from maternity or finishing operations. Bacterial and archaeal community structure in manure MF was found to be more different than finishing manures. Among finishing manures, sampled at different times, subtle changes in microbial compositions were discriminated when using PCA and UPGMA analyses. Although DNA fingerprinting was a suitable tool to evaluate differences of microorganisms presence, rRNA fingerprinting by techniques such as the LH-RT-PCR and RT-T-RFLP allowed us to reveal the diversity of metabolically active populations, differentiate between similar manures, and detect other archaeal phylotypes. The next steps in the identification of microbial groups associated with phylotypes, would be the cloning and sequencing of rRNA genes from manure samples.

Acknowledgments We thank Steve Methot for statistical analysis and helpful discussions. This work was financially supported by Bio-Terre Systems Inc. and the Matching Investment Initiative of Agriculture and Agri-Food Canada.

References

Aellen S, Que Y-A, Guignard B, Haenni M & Moreillon P (2006) Detection of live and antibiotic-killed bacteria by quantitative real-time PCR of specific fragments of rRNA. Antimicrob Agents Chemother 50: 1913-1920.

Amann RI, Ludwig W & Schleifer KH (1995) Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol Rev 59: 143-169.

87 Collins G, Mahony T & O'Flaherty V (2006) Stability and reproducibility of low- temperature anaerobic biological wastewater treatment. FEMS Microbiol Ecol 55: 449- 458.

Cook KL, Rothrock MJJ, Loughrin JH & Doerner KC (2007) Characterization of skatol- producing microbial populations in enriched swine lagoon slurry. FEMS Microbiol Ecol 60: 329-340.

Felske A, Rheims H, Wolterink A, Stackebrandt E & Akkermans AD (1997) Ribosome analysis reveals prominent activity of an uncultured member of the class Actinobacteria in grassland soils. Microbiology 143: 2983-2989.

Fernandez A, Huang S, Seston S, Xing J, Hickey R, Criddle C & Tiedje J (1999) How stable is stable? Function versus community composition. Appl Environ Microbiol 65: 3697-3704.

Fey A, Eichler S, Flavier S, Christen R, Hofle MG & Guzman CA (2004) Establishment of a real-time PCR-based approach for accurate quantification of bacterial RNA targets in water, using Salmonella as amodel organism. Appl Environ Microbiol 70: 3618-3623.

Field KG, Berahard AE & Brodeur TJ (2003) Molecular approaches to microbiological monitoring: fecal source detection. Environ Monit Assess 81: 313-326.

Gourse RL, Gaal T, Bartlett MS, Appleman JA & Ross W (1996) rRNA transcription and growth rate-dependent regulation of ribosome synthesis in Escherichia coli. Annu Rev Microbiol 50: 645-677.

Gralapp AK, Powers WJ, Faust MA & Bundy DS (2002) Effects of dietary ingredients on manure characteristics and odorous emissions from swine. JAnim Sci 80: 1512-1519.

Kerkhof L & Ward BB (1993) Comparison of nucleic acid hybridization and fluorometry measurement of the relationshio between RNA/DNA ratio and growth rate in marine bacterium. Appl Environ Microbiol 59: 1303-1309.

88 Konstantinov SR, Awati AA, Williams BA, Miller BG, JonesP, Stokes CR, Akkermans ADL et al. (2006) Post-natal development of the porcine microbiota composition and activities. Environ Microbiol 8: 1191-1199.

Lane DJ (1991) 16S/23S rRNA sequencing. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. (Stackebrandt E & Goodfellow M, eds.), pp. 115-175. Wiley, Chichester, England.

Leser TD, Amenuvor JZ, Jensen TK, Lindecrona RH, Boye M & Moller K (2002) Culture- independent analysis of gut bacteria: the pig gastrointestinal tract microbiota revisited. Appl Environ Microbiol 68: 673-690.

Leser TD, Lindecrona RH, Jensen TK, Jensen BB & Moller K (2000) Changes in bacterial community structure in the colon of pigs fed different experimental diets and after infection with Brachyspira hyodysenteriae. Appl Environ Microbiol 66: 3290-3296.

Lueders T & Friedrich M (2000) Archaeal population dynamics during sequential reduction processes in rice field soil. Appl Environ Microbiol 66: 2732-2742.

Lueders T & Friedrich MW (2002) Effects of Amendment with Ferrihydrite and Gypsum on the Structure and Activity of Methanogenic Populations in Rice Field Soil. Appl Environ Microbiol 68: 2484-2494.

Maaloe O & Kjeldgaard NO (1966) Control of macromolecular synthesis: a study of DNA, RNA, and protein synthesis in bacteria. (WA Benjamin, eds) New York.

Mackay IM (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin Microbiol Infect 10: 190-212.

Martin-Orue SM, Castillo M, Skene G, Roca M, Anguita M, Badiola I, Duncan SH et al. (2007) Application of 16S rRNA gene-targetted fluorescence in situ hybridization and restriction fragment length polymorphism to study porcine microbiota along the gastrointestinal tract in response to different sources of dietary fibre. FEMS Microbiol Ecol 59: 138-146.

89 McCune B & Mefford MJ (1999) PC-ORD for Windows. Multivariate analysis of ecological data. MjM Software Design, Gleneden Beach, Oregon, USA.

Miller DN & Varel VH (2003) Swine manure composition affects the biochemical origins, composition, and accumulation of odorous compounds. JAnim Sci 81: 2131-2138.

Mills DK, Fitzgerald K, Litchfield CD & Gillevet PM (2003) A comparison of DNA profiling techniques for monitoring nutrient impact on microbial community composition during bioremediation of petroleum-contaminated soils. J Microbiol Methods 54: 57-74.

Miura Y, Hiraiwa MN, Ito T, Itonaga T, Watanabe Y & Okabe S (2007) Bacterial community structures in MBRs treating municipal wastewater: Relationship between community stability and reactor performance. Wat Res 41: 627-637.

Penning H & Conrad R (2006) Effect of inhibition of acetoclastic methanogenesis on growth of archaeal populations in an anoxic model environment. Appl Environ Microbiol 72: 178-184.

Petti CA, Polage CR & Schreckenberger P (2005) The role of 16S rRNA gene sequencing in identification of microorganisms misidentified by conventional methods. J Clin Microbiol 43: 6123-6125.

Peu P, Brugere H, Pourcher AM, Kerouredan M, Godon JJ, Delgenes JP & Dabert P (2006) Dynamics of a pig slurry microbial community during anaerobic storage and management. Appl Environ Microbiol 72: 3578-3585.

Pryde SE, Richardson AJ, Stewart CS & Flint HJ (1999) Molecular analysis of the microbial diversity present in the colonic wall, colonic lumen, and cecal lumen of a pig. Appl Environ Microbiol 65: 5372-5377.

Ritchie NJ, Schutter ME, Dick RP & Myrold DD (2000) Use of length heterogeneity PCR and fatty acid methyl ester profiles to characterize microbial communities in soil. Appl Environ Microbiol 66: 1668-1675.

90 Santos SR & Ochman H (2004) Identification and phylogenetic sorting of bacterial lineages with universally conserved genes and proteins. Environ Microbiol 6: 754-759.

Snell-Castro R, Godon JJ, Delgenes JP & Dabert P (2005) Characterisation of the microbial diversity in a pig manure storage pit using small subunit rDNA sequence analysis. FEMS Microbiol Ecol 52: 229-242.

Suzuki M, Rappe MS & Giovannoni SJ (1998) Kinetic bias in estimates of coastal picoplankton community structure obtained by measurements of small-subunit rRNA gene PCR amplicon length heterogeneity. Appl Environ Microbiol 64: 4522-4529.

Tiirola MA, Suvilampi JE, Kulomaa MS & Rintala JA (2003) Microbial diversity in a thermophilic aerobic biofilm process: analysis by length heterogeneity PCR (LH-PCR). Water Res 37: 2259-2268.

Topp E & Leung K (2001) Bacterial community dynamics in liquid swine manure during storage: molecular analysis using DGGE/PCR of 16S rDNA. FEMS Microbiol Ecol 38: 169-177.

Wagner R (1994) The regulation of ribosomal RNA synthesis and bacterial cell growth. Arch Microbiol 161: 100-109.

Whitehead TR & Cotta MA (1999) Phylogenetic diversity of methanogenic archaea in swine waste storage pits. FEMS Microbiol Lett 179: 223-226.

Whitehead TR & Cotta MA (2001) Characterisation and comparison of microbial populations in swine faeces and manure storage pits by 16S rDNA gene sequence analyses. Anaerobe!: 181-187.

Woese CR & Fox GE (1977) Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: The primary kingdoms. Proc Natl Acad Sci USA 74: 5088-5090.

91 CONCLUSION

Des techniques de biologie moleculaire ont ete appliquees a differents lisiers de pore afin de determiner la structure et les niveaux d'activite des microorganismes presents. Les technologies moleculaires utilisees etaient l'heterogeneite de longueur d'amplicon PCR (LH-PCR) et le polymorphisme de fragment de restriction terminal (T-RFLP) ciblant les bacteries et les archaebacteries, respectivement.

Un bioreacteur a ecoulement piston, comportant 8 compartiments relies en serie, a ete analyse a partir de son demarrage jusqu'a six mois d'operation. Un des objectifs de Poperation de ce bioreacteur etait de specialiser les compartiments selon les differentes etapes de la degradation anaerobie du lisier, afin de mieux caracteriser la communaute microbienne (domaines Bacteria and Archaea) selon la sequence de degradation de la matiere organique, depuis l'acidogenese jusqu'a la production du biogaz. En effet, a partir du quatrieme mois d'operation, nous assistons a une specialisation des compartiments par leur composition en AGV et en methane ainsi que leurs populations microbiennes. Ainsi, les premiers compartiments produisent une plus forte concentration d'AGV alors que leur production de methane reste faible. Dans les compartiments suivants, les niveaux d'AGV diminuent alors que la formation de methane augmente. Finalement, les derniers compartiments voient leur production de methane decrottre suggerant une degradation tres avancee du lisier traite. Des changements dans la dynamique des communautes bacteriennes et archaebacteriennes ont ete observes au travers des compartiments et des mois d'operation. En effet, des phylotypes importants, associes a ces changements, ont ete releves. Ces phylotypes etant maintenant reveles, il serait interessant d'identifier, par sequencage, les populations microbiennes qu'ils representent. Pour la premiere fois, une telle etude permettant la compartimentalisation des processus anaerobies et l'analyse de ses communautes microbiennes dans le lisier de pore a ete effectu6e.

Le second modele d'etude portait sur la caracterisation de la communaute microbienne de lisiers de pore de finition preleves a la ferme sur une periode de trois mois consecutifs. Ces lisiers ont ete compares entre eux, ainsi qu'a un lisier mixte de maternite et de finition. L'analyse des profils obtenus par LH-PCR et T-RFLP montre que les trois lisiers de

92 finition presentent une plus grande similitude entre eux qu'avec le lisier mixte. Cette difference de population microbienne peut etre expliquee par Palimentation des pores. En effet, la diete et les besoins nutritionnels des pores en periode de maternite different des individus en periode de finition,c e qui peut affecter la flore intestinale et la composition de lisier. De plus, l'utilisation d'outils statistiques a permis de cerner les subtils changements entre les lisiers semblables.

L'etude de PADNr 16S ainsi que l'ARNr 16S a confirme notre hypothese selon laquelle l'ARNr serait un meilleur indicateur des microorganismes actifs que PADNr. Effectivement, les profils obtenus des differents echantillons de lisier montrent des changements de la population plus marques avec l'ARNr.

Les analyses des coefficients de variation (CV) des profils obtenus a Paide ces deux techniques moleculaires ont ete effectuees au niveau des extractions des echantillons, des PCR ainsi que de la nature de Pechantillon meme. Ces analyses ont demontre que la variation entre les extractions et les PCR representaient un plus faible pourcentage que pour les differents echantillons de lisier. Ces resultats suggerent que la variation rencontree etait principalement due a la difference existant entre les echantillons plutot qu'aux techniques moleculaires utilisees.

Dans ce projet, plusieurs outils statistiques ont ete employes pour faciliter Panalyse des nombreuses donnees obtenues. L'analyse en composantes principales (PCA) a permis de visualiser graphiquement les similitudes et les divergences entre les echantillons de lisier et d'identifier les phylotypes pouvant expliquer la variabilite rencontree. Le positionnement multidimensionnel non-metrique (NMS) a aussi permis de representer les divergences et les ressemblances des echantillons tout en les correlant aux profils obtenus de production d'AGV et de methane. En plus des informations inherentes a ces analyses, les indices de diversite et Panalyse des especes indicatrices (ISA) permettent d'obtenir les valeurs de probabilite (P) de differences significatives entre les lisiers. Finalement, Parbre phylogenetique UPGMA fourni un outil visuel interessant, qui permet de classer les echantillons selon leurs similitudes.

93 Cette etude a permis 1'identification de phylotypes cles, qui pourront, dans un avenir rapproche, etre sequences afin d'obtenir de precieux renseignements sur la communaute microbienne d'un milieu. Ces technologies permettent la detection de microorganismes non-cultivables en laboratoire grace a l'utilisation d'amorces PCR universelles. Cependant, ces techniques sont considerees comme etant semi-quantitatives. Pour obtenir un portrait plus precis et quantifiable des populations, le PCR en temps reel quantitatif peut s'averer un outil de choix et d'avenir. II est de plus en plus utilise en microbiologie environnementale. Cette technique tres sensible permet la quantification des especes, des populations bacteriennes autant que du total bacterien. L'emploi du PCR en temps reel dans 1'etude du lisier de pore, tout en ciblant les microorganismes non-pathogenes actifs metaboliquement via l'ARNr 16S, n'a pas encore ete publie. Des essais de PCR quantitatif ont ete mis au point pour cibler des populations produisant ou degradant certains AGV et des resultats partiels d'echantillons preleves du systeme a ecoulement piston sont presentes en annexe. De plus, le PCR en temps reel pourrait servir d'outil a la detection et a la quantification rapide de pathogenes presents dans le lisier de pore. Cette technique presenterait aussi l'avantage de ne pas avoir a faire la croissance de bacteries pathogenes dans le laboratoire.

Les microorganismes sont a la fois la cause et la solution au probleme des odeurs lies au lisier de pore. Consequemment, obtenir le plus de connaissances sur leur identite et sur leurs interactions constitue une etape essentielle dans l'elaboration de methodes de traitement efficaces. Ces techniques de biologie moleculaire pourront servir a determiner la sante des bioreacteurs traitant le lisier de pore et ainsi, permettre de predire les evenements du processus de degradation anaerobic II pourrait etre alors envisage que les bioreacteurs en detresse soient inocules de microorganismes (bioaugmentation) ou alimentes de composes favorisant la croissance de certaines bacteries, permettant leur remise en fonction. De plus, ces techniques pourront permettre d'examiner des lisiers soumis a divers autres types de traitements comme l'ajout d'additif, l'aeration, l'entreposage, etc. De plus, puisque la presence de population mineures, presentes en faible abondance, est suspectee de jouer un role important dans la dynamique des communautes, il pourrait etre d'interet d'evaluer l'effet de ces populations mineures sur la stabilite des bioreacteurs.

94 ANNEXE

PCR EN TEMPS REEL

1.0. Introduction

Ce projet vise a developper et a appliquer une technologie de biologie moleculaire quantitative existante, le RT-PCR en temps reel, pour etudier les niveaux d'activite des groupes bacteriens impliques dans la generation de produits indesirables tels les composes odorants, toxiques (H2S, NH3) et les gaz a effet de serre qui sont presents dans le lisier de pore. Ce projet permettra de developper un outil qui servira a comprendre les mecanismes d'action des bacteries actives dans le lisier, dans le cadre d'autres projets de recherche portant sur la digestion anaerobie, la performance des additifs de lisier, la reduction des gaz a effet de serre et sur Pattenuation des odeurs. Cette etude est originale car tres peu d'equipes de recherche en microbiologic environnementale travaillent au niveau de TARN, lequel est beaucoup plus difficile a extraire que l'ADN dans des echantillons de lisier. Cependant, l'avantage majeur d'etudier les niveaux d'activite d'ARN ribosomal est qu'on peut les relier directement aux niveaux d'activite des groupes de bacteries cibles. A notre connaissance, aucune etude fondee sur la technologie du RT-PCR en temps reel n'a 6t& publiee dans le domaine du traitement du lisier. Ce projet represente done une occasion unique d'etudier Pecosysteme bacterien du lisier au moyen d'une approche quantitative. Pour ce faire, les niveaux d'ARN ribosomal 16S des principaux groupes bacteriens du lisier, qui sont responsables du degagement des odeurs et de produits toxiques, ont ete determines. Les bacteries methanogenes et les bacteries ayant des interactions avec celles- ci ont aussi ete etudiees car leur role est important, particulierement lors du traitement du lisier en conditions anaerobies. Une bacterie de reference, Thermus aquaticus, a ete ajoutee aux echantillons afin de determiner le rendement des extractions et autres etapes successives. Les essais ont ete menes sur du lisier de pore en traitement anaerobie, dans un bioreacteur de type ecoulement piston a huit compartiments, preleve apres six mois d'operation. Une etude precedente a montre que les differentes etapes de la degradation anaerobie etaient representees par une specialisation des differents compartiments du bioreacteur (Chapitre 1).

95 2.0. Materiel et methodes

2.1. Designs des amorces oligonucleiques des bacteries cibles

Les genres bacteriens et archaebacteriens cibles etaient initialement composes des Clostridium, Eubacterium, Peptostreptococcus, Syntrophomonas, Methanosarcina et Methanosaeta. Les Clostridium et les Eubacterium ont ete identifies comme etant d'importants producteurs d'acides gras volatils dans le lisier de pore alors que les Syntrophomonas metabolisent ces AGV. Les Peptostreptococcus produisent aussi des AGV et Pequipe de Whitehead et Cotta (2004) ont isole plusieurs bacteries hyper- productrices d'ammoniac dans le lisier de pore. Les methanogenes Methanosarcina et Methanosaeta y sont aussi retrouves (Angenent et al, 2002) et participent a la derniere etape de la digestion anaerobie du lisier par la production de methane. De plus, puisque Thermus aquaticus a ete ajoute aux echantillons lors de l'extraction, un design ciblant specifiquement cette bacterie a du etre elabore. Des amorces specifiques aux sequences d'ARNr 16S des differents groupes bacteriens ont ete determines grace aux banques de donnees accessibles sur internet, dont le NCBI (National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov/), le Ribosomal Database Project II (Cole et al, 2005) et les sequences de clones obtenus dans differentes etudes microbiologiques du lisier de pore et de son systeme digestif, ainsi que d'autres travaux sur la microflore de feces (Leser et al, 2002; Whitehead and Cotta, 1999; Angenent et al, 2002; Varel et al, 1995; Pryde et al, 1999; Whitehead and Cotta, 2004; Snell-Castro et al, 2005; Whitehead and Cotta, 2001; Dabert et al, 2006; Rousselon et al, 2004; Rinttila et al, 2004; Song et al, 2004). Avec l'aide du logiciel ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw/), les sequences ont ete alignees afin d'identifier des regions susceptibles d'offrir une specificite adequate pour les differents groupes cibles. Le logiciel PrimerExpress d'Applied Biosystems (Applied Biosystems Canada, Streetville, ON, Canada) a permis d'obtenir des amorces respectant les caracteristiques recommandees par la compagnie. Finalement, la specificite des designs a ete verifiee in silico en soumettant ces sequences d'oligonucleotides a la banque de donnees de NCBI par le logiciel Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Les Clostridium et Eubacterium ont ete combines en deux groupements, soit les Clostridium coccoides et les Clostridium perfringens. Ces

96 regroupements sont necessaires puisque leurs sequences d'ADNr 16S sont trop similaires pour obtenir des regions assez specifiques pour les differencier au niveau du genre. Les sequences de ces amorces sont decrites au tableau 1.

Tableau 1. Designs d'amorces utilises pour le PCR en temps reel et les courbes d'etalonnage Amorces Design Nom Sequence (5'-> 3') aqual67FOR GGG TGT GTT TAA AGG GTT TTG C Thermus aquaticus aqua241REV TGG GCT CTT ACC CCA CCA A syntroll27FOR CAA CCC TTG CTA TTA GTT GCT AAC A Syntrophomonas syntroll86REV GTC ACG GGC AGT CCC ATT A saeta520FOR CGG CCG RAT AAG TCT CTT G Methanosaeta saeta586REV GCC AGA CAG TAT CTC CTG AAA GC peptol35FOR GCC CTA TAC ACA TGG ATA ACA TRC T Peptostreptococcus pepto231REV TCC TAT ACC GCT AAC MCT TTG ATA Clostridium cocc419FOR GTG ARB GAA GAA GTA TKT CGG TAT GT coccoides cocc493REV GKG CTT CTT AGT CAG GTA CCG TCA T sarcina524FOR GCC GGT TTG GTC AGT CCT C Methanosarcina sarcina601REV CGG TCC AAG YCT GGC AGT ATC GAA AGG RAG ATT AAT ACC KCA TAA Clostridium perfl55FOR BATTG perfringens perf212REV TCT YAT AGC GGA TTG CTC CTT T Amorces pour produire les amplicons des courbes d'etalonnage Design Sequence (5'-> 3') 27F AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG Bacteria 1390R GAC GGG CGG TGT GTA CAA Ar 109F ACK GCT CAG TAA CAC GT Archaebacteria Ar912RT GTG CTC CCC CGC CAA TTC CTT TA

97 2.2. Culture de Thermits aquaticus et decompte microbieu microscopique

La bacterie Thermus aquaticus YT-1 (DSMZ, Brauscheig, Allemagne) a ete cultivee dans le milieu de culture Thermus 162, ajoute a de l'agar tel qu'indique par la compagnie. Une colonie a ete inoculee dans un second milieu de culture Thermus 162 liquide et incubee toute une nuit a 70°C avec agitation. Cette culture a ete utilisee pour inoculer un autre milieu de culture a une dilution de 1/100 qui a ete incubejusqu'a l'obtention d'une densite optique a 600 nanometres de 0,604. A cette densite optique, la croissance de T. aquaticus se situe dans la phase exponentielle selon la courbe de croissance prealablement determined. Des aliquotes de 1 ml ont ete immediatement congeles a -80°C. Pour obtenir le decompte cellulaire de la culture, 1 ml d'une solution de Norris-Powell a ete ajoute au culot de la culture ainsi que 1 ml de bleu de methylene-HCl. Lorsqu'un melange homogene est obtenu, celui-ci est alors mis dans une chambre Petroff Hausser et utilise selon les directives indiquees. La concentration bacterienne de la culture a ete calculee a 3,29 x 109 bacteries/ml.

2.3. Extraction de I'ARNr 16S et synthese de l'ADN complementaire (ADNc)

Les echantillons de lisier analyses provenaient du bioreacteur a ecoulement piston (plug flow) a 6 mois d'operation. Les compartiments cibles etaient PF01, PF03, PF05 et PF08 (voir fig. 9, chapitre 1). L'extraction du materiel genetique a ete effectuee en triplicata tel que decrit aux chapitres 1 et 2. Cependant, 20 ul d'une culture de Thermus aquaticus ont ete ajoutes a chaque echantillon avant l'extraction. De plus, des 200 ul d'ADN et d'ARN co-extraits, une aliquote de 100 ul a ete conservee pour d'eventuelles etudes a partir de l'ADN. La seconde 100 ul a ete deposee sur une colonne RNeasy de Qiagen et eluee avec 50 ul d'eau Milli-Q autoclavee. Cette colonne permet de purifier l'ARN total des echantillons contenant de faibles quantites de materiel isoles par differentes methodes d'extraction. Dans le but d'eliminer toute contamination a l'ADN, 25 \il de l'ARN a ete soumis a un traitement avec 12 U de la DNase Turbo™ (Ambion, Applied Biosystems, Streetville, ON, Canada). Pour inactiver la DNase, un inactivateur provenant de la trousse Ambion a ete ajoute au melange. L'efficacite de ce traitement a ete verifiee par PCR ou aucune amplification n'a ete detectee. Pour obtenir 50 ul d'ADN complementaire, la

98 transcriptase inverse Superscript II (Invitrogen, Montreal, QC, Canada) a ete utilisee avec un melange d'amorces hexameres et 11 ul d'ARN traite selon le protocole de la compagnie. Des aliquotes d'une dilution 1/5 ont ete preparees pour permettre d'appliquer 5 ul d'echantillon lors du PCR en temps reel.

2.4. Extraction de l'ADN genomique (ADNg) des bacteries en cultures pures

Afin d'evaluer la specificite des designs d'amorces qui seront utilisees pour le PCR en temps reel, des essais ont tout d'abord ete effectues sur l'ADNg de bacteries en culture pure. Ces bacteries ont ete achetees chez DSMZ (Braunschweig, Germany) et ATCC (Manassa, VA, USA) en cultures pures actives ou lyophilisees. De plus, pour certaines bacteries, l'ADNg deja extrait etait aussi disponible. Par souci d'economie de temps, une extraction du materiel genetique a ete faite directement a partir de chacune des cultures recues (100 ul extraits) sans effectuer les etapes de croissances bacteriennes qui auraient neanmoins fourni une plus grande quantite d'ADN. Puisque le rendement d'extraction de l'ADN etait faible, un PCR a ete effectue pour verifier le succes de ces extractions. Les amorces universelles 16S utilisees sont 27F (Suzuki et al, 1998) et 1390R (Zheng et al, 1996) ainsi que Arl09F et Ar912RT (Lueders, 2000) pour les bacteries et pour les archaebacteries, respectivement (Tableau 1). L'amplification a ete visualisee sur gel d'agarose 1% et revelee au bromure d'ethidium.

2.5. Courbes d'etalonnage et specificite des designs

Pour chaque design, Pelaboration d'une courbe d'etalonnage est necessaire pour faire la quantification a chaque PCR effectue. Dans ce but, une serie de dilutions 10"1 d'amplicons couvrant pres de la totalite de la sequence d'ADNr 16S pour chaque groupe cible a ete obtenu a partir des amorces 27F et 1390R pour les bacteries et Arl09f et Ar912rt pour les archeabacteries (Tableau 1). Pour le groupe des Clostridium coccoides, l'ADNg de Eubacterium rectale (ATCC) a ete utilise. Pour le groupe Clostridium perfringens, ce fut celui de C. perfringens (ATCC), Syntrophomonas curvata (DSMZ) pour les Syntrophomonas, Peptostreptococcus anaerobius (ATCC) pour les Peptostreptococcus, Methanosaeta concili (DSMZ) pour les Methanosaeta et Methanosarcina mazei (DSMZ)

99 pour les Methanosarcina. Enfin, PADNg de Thermus aquaticus (DSMZ) a ete utilise pour obtenir une courbe d'etalonnage. Les amplicons ont ete quantifies a l'aide du Quant-it™ PicoGreen® d'ADNdb (Invitrogen, Molecular Probes) et d'une courbe d'etalonnage d'ADN lambda detectee par l'appareil de PCR en temps reel 7700 (Applied Biosystems Canada) utilise en mode lecture post-PCR. La specificite des designs a ete verifiee par des PCR en temps reel a partir de l'ADNg extrait des bacteries et archaebacteries achetees. Pour chaque microorganisme, la meme quantite de materiel a ete utilisee pour chacun des designs d'amorces.

2.6. Essais de PCR en temps reel du lisier en traitement dans un bioreacteur de type ecoulement piston

Des PCR en temps reel ont ete effectues avec les differents designs d'amorces sur l'ADNc obtenus des quatre compartiments choisis du bioreacteur a piston (un design par plaque de PCR) apres six mois d'operation (voir chapitre 1). Cing microlitres des aliquotes d'ADNc dimes 1/5 ont ete mis dans chaque puits d'une plaque a 96 puits. A chaque puits a ete ajoute un pool contenant 12,5 ul du reactif SybrGreen (Applied Biosystems Canada), 300 nM d'amorces, 0,1 ul d'AmpErase® uracile N-glycosylase (UNG) (Applied Biosystems Canada), le tout a ete complete avec 2,4 ul d'eau pour s'assurer d'une uniformite entre les puits. Pour chaque extraction, le PCR en temps reel a ete effectue en triplicata. Le programme utilise etait constitue d'une etape d'activation de la polymerase a 95°C pour 10 minutes suivie de 40 cycles de denaturation a 95°C pour 15 secondes et d'hybridation et d'elongation a 60°C pour 1 minute. Une fois le PCR complete, une courbe de dissociation a ete effectuee. Les amplicons ont ensuite ete mis sur gel d'agarose 3% pour verifier l'absence d'amplification non-specifique ou de dimere d'amorces.

3.0 RESULTATS ET DISCUSSION

3.1. Courbes d'etalonnage

L'optimisation des concentrations d'amorces pour chaque design a ete effectuee (donnees non presentees). Les resultats des courbes d'etalonnage sont illustres a la figure 1 et leurs

100 parametres sont indiques au tableau 2. La linearite des courbes d'etalonnage est essentielle pour permettre une quantification adequate. Ainsi, les points ne participant pas a cette linearite ont ete exclus puisqu'ils peuvent amener un biais dans la quantification. De facon generate, les courbes d'etalonnage obtenues presentent une echelle de linearite d'environ 101 a 107 copies d'ARNr 16S excepte pour le design des Syntrophomonas qui debute a 104 copies. En pratique, pour une courbe d'etalonnage fiable, le coefficient de determination (R2) doit etre egal ou superieur a 95% et la pente doit etre situee entre -3,0 a -3,9 ce qui correspond a une efficacite PCR de 80 a 115%. Les resultats obtenus possedaient les parametres adequats a une fiable quantification. Cependant, le design du groupe Clostridium perfringens ne nous a pas permis d'obtenir une courbe d'etalonnage satisfaisante. Les ARn obtenus, magnitudes des signaux obtenus selon les conditions PCR choisies, etaient beaucoup trop faibles pour considerer les resultats. Puisque l'optimisation des amorces avec l'ADNc de lisier brut a donne des valeurs de ARn normal, la specificite du design a ete mise en doute. Ce design a done ete abandonne.

Tableau 2. Parametres des differentes courbes d'etalonnage Echelle de linearite R2 Pente Efficacite Design (nombre de copies) coefficient d'amplification

Minimum Maximum (%) Methanosaeta 27 2,72 xlO7 0,994 3,3609 98,4 Methanosarcina 10 1,04 xlO7 0,999 3,1275 108,8 Syntrophomonas 37784 3,78 x 107 0,998 3,3375 99,4 Peptostreptococcus 10 1,00 xlO7 0,992 3,5283 92 Clostridium coccoides 27 2,73 x 107 0,997 3,4839 93,7 Thermus aquaticus 31 3,07 xlO7 0,995 3,6675 87,3

101 Memanosarcma Memanosaeta 55

y = -3,1275x+32.724 y = -3.3609X + 39,064 iO R2 = 0.9969 R2 = 0,994

25

20

15

10 i 6 i 6 3 log nombre de oopies log nombre de copies

Clostridium coccoides Peptostreptococcus 55- ,>? - K

50- "V y = -3,4839x + 36,768 S3- Ik y = -3,5283x+37,872 >H R2 = 0,9974 Xfl R2 = 0,9916

25- ^a 25 • ^v o" ^Nn

Syntrophomtmas Thermus aquaticus J5-I lA •

y = -3,3375x +43,186 50 - \q y = -3,6675x + 38,451 50- R2 = 0,9979 ^V^ R2= 0,9954 B 25 - 25- ^^fl

Figure 1. Courbes d'etalonnage des differents designs pour les PCR en temps reel.

3.2. Verification de la specificite des designs

Puisqu'une quantite connue d'une culture de Thermus aquaticus a ete ajoutee aux echantillons, il a fallu s'assurer que cette souche n'etait pas deja presente dans le lisier, ce qui pourrait surestimer les resultats. Ainsi, des PCR en temps reel ont ete effectues sur de l'ADNc de lisier brut et de l'ADNc de lisier brut auquel a ete ajoute la bacterie Thermus aquaticus avant de proceder a l'extraction. Nous avons obtenu une amplification pour le lisier contenant la bacterie ajoutee et aucune amplification pour le lisier brut. De plus, tous

102 les designs d'amorces ont ete testes sur l'ADNc de Thermus aquaticus en culture pure afin de verifier si le design de T. aquaticus etait reellement specifique a cette bacterie. Puisqu'aucune amplification n'a ete detectee avec ces autres amorces, nous pouvons affirmer que 1'amplification de T. aquaticus etait specifique. Afin de s'assurer de la specificite des autres designs d'amorces, ils ont ete utilises lors de PCR en temps reel sur l'ADNg de differentes bacteries et archaebacteries en cultures pures. Les tableaux 3 a 7 montrent les resultats obtenus pour chacun des designs. Ceux des C. coccoides (Tableau 3) et des Methanosarcina (Tableau 7) semblent etre specifiques, Eubacterium rectale, Butyrivibrio flbrisolvens, Clostridium popuileti et Ruminococcus productus faisant partie du groupe des C. coccoides. Le design ciblant les Syntrophomonas (Tableau 4) a detects l'ADNg de C. coccoides a 0,3% de la quantite utilisee. II a done fallu tenir compte de la possible amplification non-specifique de C. coccoides pour ce design. Pour les designs des Peptostreptococcus (Tableau 5) et des Methanosaeta (Tableau 6), il y a eu certaines amplifications non-specifiques. Cependant, ces microorganismes ont ete detectes a de grands Ct et ne representaient que 0,0003% a 0,08% de la quantite mise soit R. productus pour les Peptostreptococcus ainsi que M. mazei, M. barkeri et M. acetivorans pour les Methanosaeta.

103 Tableau 3. Specificite du design Clostridium coccoides pour le PCR en temps reel Design non- Specificite Desig n specifique Difference Souche testee specifique croisee

CT log qte (ng) CT log qte (ng) Log Fois % Clostridium bifermentans 40 negatif 0 Clostridium paraputrijicum 40 negatif 0 Hespellia porcina 40 negatif 0 Clostridium perfringens 40 negatif 0 Enterococcus faecalis 40 negatif 0 Peptostreptococcus anaerobius 40 negatif 0 Eubacterium rectale 22,58 -3,9 Syntrophomonas curvata 40 negatif 0 Eubacterium budayi 40 negatif 0 Clostridium butyricum 40 negatif 0 Clostridium aceticum 40 negatif 0 Butyrivibrio fibrisolvens 17,01 -2,5 Clostridium coccoides 30,69 -6,1 Clostridium popuileti 27,69 -5,3 Ruminococcus productus 22,03 -3,8

104 Tableau 4. Specificite du design Syntrophomonas pour le PCR en temps reel Design non- Specificite Design specifique Difference Souche testee specifique croisee

CT log qte (ng) CT log qte (ng) Log Fois %

Peptostreptococcus anaerobius 40 negatif 0 Syntrophomonas curvata 17,58 -3,7 Butyrivibrio fibrisolvens 34,03 -9,2 17,01 -2,5 6,7 5,0 xlO6 0,00002 Clostridium coccoides 32,07 -8,6 30,69 -6,1 2,5 3,2 xlO2 0,3 Syntrohpomonas wolfei 18,45 -4 Hespellia porcina 40 negatif 0 Clostridium perfringens 40 negatif 0 Syntrophomonas erecta 16,35 -3,3 Eubacterium rectale 40 Ruminococcus productus 35,66 -9,8 22,03 -3,8 6 1,0 xlO6 0,0001

105 Tableau 5. Specificite du design Peptostreptococcus pour le PCR en temps reel Design non- Specificite Design specifique Difference Souche testee specifique croisee

CT log qte (ng) CT log qte (ng) Log Fois % Hespellia porcina 40 negatif 0 Clostridium perfringens 36,53 -9,1 ND Peptostreptococcus anaerobius 29,42 -7 Syntrophomonas curvata 40 negatif 0 Butyrivibrio fibrisolvens 40 negatif 0 Clostridium coccoides 40 negatif 0 Syntrohpomonas wolfei 40 negatif 0 Rum inococcus pro ductus 36,96 -9,2 22,03 -3,8 5,4 2,9 xlO5 0,0003

106 Tableau 6. Specificite du design Methanosaeta pour le PCR en temps reel Design non- Specificite Design specifique Difference Souche testee specifique croisee

CT log qte (ng) CT log qte (ng) Log Fois % Methanosarcina mazei 37,44 -7,8 17,52 -4,3 3,5 3,2 x 10" 0,03 Hespellia porcina 40 negatif 0 Clostridium perfringens 40 negatif 0 Peptostreptococcus anaerobius 40 negatif 0 Clostridium coccoides 40 negatif 0 Methanosaeta thermoacetophila 40 negatif 0 Methanosarcina barkeri 37,65 -7,4 17,47 -4,3 3,1 1,3 xlO3 0,08 Methanosarcina acetivorans 31,02 -5 10,15 -1,9 3,1 1,3 xlO3 0,08 Methanocorpusculum parvum 40 negatif 0 Methanobrevibacter smithii 40 negatif 0 Methanosphaera stadtmaniae 40 negatif 0 Methanogenium cariaci 40 negatif 0 Methanobacterium formicium 40 negatif 0 Methanoculleus bourgensis 40 negatif 0

107 Tableau 7. Specificite du design Methanosarcina pour le PCR en temps reel Design non- Specificite Design specifique Difference Souche testee specifique croisee log qte (ng) log qte (ng) Log Fois % Methanosarcina mazei 17,52 -4,3 Hespellia porcina 40 negatif 0 Peptostreptococcus anaerobius 40 negatif 0 Clostridium coccoides 40 negatif 0 Methanosaeta thermoacetophila 40 negatif 0 Methanosarcina barkeri 17,47 -4,3 Methanosarcina acetivorans 10,15 -1,9 Methanocorpusculum parvum 37,8 -11,3 Negligeable Methanobrevibacter smithii 39,17 -11,7 Negligeable Methanosphaera stadtmaniae 37,73 -11 Negligeable Methanogenium cariaci 37,8 -11 Negligeable Methanobacterium formicium 40 negatif Methanoculleus bourgensis 36,56 -10,9 Negligeable

108 3.3. Resultats des echantillons du lisier en traitement

Les Ct obtenus ont permis de fournir une quantite de materiel de depart par comparaison aux courbes d'etalonnage specifiques aux designs. Le nombre de copies 16S des courbes d'etalonnage d'ADN ont ete determines selon la formule suivante (Yu et al, 2006):

Nombre de copie 16S/ml = 6,023x1023(copies/mol) x concentration (g/ml) (3) 660 (g ADNr 16S/mol/pb) x longueur d'amplicon (pb)

Malheureusement, Putilisation d'ADNdb comme standard n'est pas un choix ideal pour la quantification d'ARN. En effet, un standard d'ARN aurait ete plus approprie (Fey et al, 2004). Les nombres de copies 16S ont neanmoins ete calcules a partir des amplicons d'ADN utilises pour l'elaboration des courbes d'etalonnage. Meme s'il est admis que plus un organisme est proche phylogenetiquement d'un autre, plus leur nombre d'operons d'ARNr risque d'elre identique, les resultats n'ont pas ete donnes en nombre de bacteries. En effet, il existe peu d'informations sur le nombre d'operons ribosomaux des bacteries retrouvees dans des echantillons environnementaux et surtout des archaebacteries. Ainsi, pour les groupes representes par une vaste etendue d'individus (p.ex. : les Clostridium) le nombre d'operon peut varier. Les resultats en copies/mL de lisier sont presented a la figure 2. Cependant, il est important de noter que ces resultats ne prennent pas en consideration l'efficacite de la transcriptase inverse lors de la synthese de l'ADNc. A travers le bioreacteur, les resultats obtenus presentent peu de variation d'un compartiment a l'autre. On note une diminution du nombre de copies des Peptostreptococcus passant de 3,65 x 107 copies/ml de lisier dans le premier compartiment a 6,45 x 105 copies/ml de lisier. Une augmentation des Syntrophomonas de pres de huit fois a travers les compartiments du bioreacteur est egalement observee. De plus, les Methanosaeta semblent avoir diminues dans le dernier compartiment. En effet, au debut du reacteur le nombre de copies/ml de lisier a ete calcule a 4,04 x 1013 alors qu'a la fin du reacteur, il etait a 4,36 x 1012 copies/ml de lisier.

109 S C. OOCCQfCfeS S Peptostreptococcus E3 Syntnophomonas i,oe+i6 • Methanosarcina •£ 1,0 £+14 Q Methanosaeta

<8 1.0E+12 71 i % 1.0E+10 B<

m 1.0E+08 i! I m il 8 1.0E+06 =m :S£» ': S * 1H 0) 1,0E-K)4 mn

5 1.0E+02 m I:: 1.0E+OO sm wu 1A 1B 1C 3A 3B 3C EA 5B 5C 8A 8B 8C 8 Corrpartim=rrt Figure 2. Nombre de copies d'ARNr 16S par mL provenant des compartiments 1, 3, 5 et 8 du bioreacteur. A, B et C indiquent les triplicates d'extraction alors que les barres d'erreur indiquent les ecarts types des triplicatas de PCR.

Dans le but de pallier au probleme de l'efficacite de la transcription inverse et de reduire les variations dues aux differentes techniques moleculaires utilisees, les resultats ont aussi ete rapportes sur ceux obtenus de Thermus aquaticus (Fig. 3). En fait, pour chaque extraction, le nombre de copies obtenu pour le design etudie a ete divise par le nombre de copies de T. aquaticus. II est alors suppose que l'efficacite de la transcription inverse et du design de T. aquaticus etait semblable aux autres profils. De cette facon, une etape causant une perte de materiel genetique serait corrigee par ce controle. En ce qui concerne les Methanosarcina, la variation a travers les compartiments etait difficile a evaluer due aux variations des triplicatas. Toutefois, le nombre de copies au 8e compartiment etait inferieur au 3e signifiant une baisse de Pactivite metabolique des Methanosarcina a la fin du traitement. Quant aux Methanosaeta, le nombre de copies a diminue tout au long du passage dans les compartiments du bioreacteur. Par contre, le nombre de copies minimal des Methanosaeta etait pres de 2000 fois superieures a celles des Methanosarcina. Les Methanosaetaceae sont connus pour avoir une faible croissance et une grande affinite pour l'acetate ce qui les favorisent lorsque la concentration d'acetate dans le milieu est faible.

110 Lorsque l'acetate est present en grande quantite, meme si leur affinite pour l'acetate est plus faible, ce sont les Methanosarcinaceae qui sont avantages etant donne leur taux de croissance eleve. Ici, la concentration de l'acetate dans les compartiments etait plus forte a l'entree du reacteur qu'a sa sortie (voir figure 1, apres 6 mois d'operation, chapitre 1). Les resultats obtenus sont done contradictoires a la theorie. En effet, nous nous attendions plutot a ce que les Methanosarcina soient dominants dans les premiers compartiments du bioreacteur et que les Methanosaeta prennent le relais dans les derniers. Une hypothese pourrait etre que le design du bioreacteur favoriserait la retention des Methanosaeta filamenteux sur les Methanosarcina dans les compartiments (Conklin, 2006). Le groupe des Clostridium coccoides a vu son nombre de copies 16S diminuer du deux tiers du premier compartiment au compartiment 3. Par la suite, les compartiments 5 et 8 ne represented plus que la moitie du nombre de copies obtenus dans le 3e compartiment. Cette diminution de l'activite est conforme au role que jouent ces bacteries dans la degradation anaerobie de la matiere organique. En effet, les Clostridium catabolisent les acides amines pour produire des acides gras volatils, de l'ammoniac et du sulfure d'hydrogene, produits intermediate de la degradation (Zhu, 2000). Ainsi, une activite accrue de cette population au debut du bioreacteur est vraisemblable. Les Peptostreptococcus agissent aussi a la premiere etape de la degradation anaerobie pour former des composes intermediates tels les AGV et l'ammoniac (Zhu, 2000). D'apres le nombre de copies 16S obtenu, leur activite etaient plus importante dans les premiers compartiments, ce qui est en accord avec la litterature. Les Syntrophomonas sont des bacteries qui degradent les acides gras volatils comme le butyrate et travaillent en cooperation avec les methanogenes hydrogenotrophes et acetotrophes (Zhang et ah, 2004). Par consequent, leur activite devrait etre accrue plus tard dans le processus de degradation, en association avec les methanogenes. D'apres les resultats de PCR en temps reel, leur activite a augmente de plus de cinq fois des premiers compartiments au dernier. Lors de la verification de la specificite du design Syntrophomonas, il a ete note qu'une amplification de C. coccoides etait possible. Cependant, d'apres les resultats PCR obtenus avec les designs C. coccoides et Syntrophomonas, il semblerait que ce ne fut pas le cas. L'augmentation observee dans le compartiment 8 ne serait pas lie a l'amplification de C. coccoides puisque le nombre de copies specifiques a ce dernier etait beaucoup plus faible.

Ill Methanosarclna Methanosaeta

jg 1.0E+00 i. 6.0E+04- 1 8 S 8.0E-01 - 8<£ I ||6.0E-01' °|4,0E+04- Q < | $ 4.0E-01 - E T3 o | 2.0E+04 - Z 2.0E-01 ill lllll ill 0.0E+00 - l l l l l l - - 1 ABC A B C A B C; A B c ABCABCABCABC 1 3 S 8 13 5 8 Compartiment Compartiment

C. coccoides Peptostreptococcus 5.0E-02 - „ 4.0E+00 - T m 4.0E-02 8 S3.0E+00 8<°3,0E-O2 ill °0) zi_ 2 t£2,OE+00 £o:2,0E-02 h < Q < £ ta g 1.0E+00 Ml o 1.0E-02- O.OE+00 Mini 0.0E+00 • iilih..ABCABCABC.A B C 3 S 1 3 5 8 Compartiment Compartiment

Syntrophomonas Tharmus aquaticus

in .£ §" co2,0E+02 0) ^ g) Q; "1 § 1 .OE+02 " o z •••••lllllll ABCABCABCA B C 1 3 5 8 3 5 Comoartiment Compartiment Figure 3. Resultats du rapport des PCR en temps reel pour les differents designs sur celui de Thermus aquaticus pour les quatre compartiments etudies. Le resultat de chaque echantillon a ete rapporte a son equivalent obtenu de T. aquaticus. A, B et C indiquent les triplicatas d'extraction alors que les barres d'erreur indiquent les ecarts types des triplicatas de PCR.

4.0. CONCLUSION

Ces resultats de PCR en temps reel sont une premiere etape dans la quantification des microorganismes actifs dans le lisier de pore en traitement anaerobie. II serait interessant de quantifier aussi PADNr 16S afin de verifier si la variation entre les triplicatas d'extraction provient de l'extraction merae, de Pinstabilite de l'ARN ou encore des etapes

112 de traitement de l'ARN. De plus, en ayant les resultats provenant de l'ARNr et de l'ADNr, un ratio ARN/ADN peut etre obtenu. Ce ratio est generalement correle au taux de croissance cellulaire. Un ratio plus eleve suggerera une activite metabolique plus elevee. Bien qu'une linearite positive entre le taux de croissance et le ratio ait ete montree pour plusieurs bacteries, la pente variait entre les souches (Muttray and Mohn, 1999). Chez les archaebacteries ayant une croissance tres lente, cette linearite n'a pas ete confirmee. Les designs utilises dans cet essai forment une premiere etape et plusieurs autres cibles bacteriennes pourront etre etudiees. Par exemple, plusieurs autres groupes de Clostridium pourraient etre quantifies tout comme un plus large eventail de bacteries syntrophes et de methanogenes. Les connaissances derivees de cette etude sur les communautes microbiennes dans le lisier de pore nous permettront de cibler plus precisement les populations d'interet via l'ARN ribosomal ou alors avec des genes fonctionnels. Cette etude ouvre egalement la voie a 1'etude des lisiers ayant subi divers traitements.

113 BIBLIOGRAPHIE

Aellen, S., Que, Y.-A., Guignard, B., Haenni, M., and Moreillon, P. (2006). Detection of live and antibiotic-killed bacteria by quantitative real-time PCR of specific fragments of rRNA. Antimicrob. Agents Chemotherapy 50, 1913-1920.

Amann, R.I., Ludwig, W., and Schleifer, K.H. (1995). Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143- 169.

Angelidaki, I., Ellegaard, L., and Ahring, B.K. (1999). A comprehensive model of anaerobic bioconversion of complex subtrates to biogas. Biotechnol. Bioeng. 63, 363-372.

Angenent, L.T., Sung, S., and Raskin, L. (2002). Methanogenic population dynamics during startup of a full-scale anaerobic sequencing batch reactor treating swine waste. Water Res. 36, 4648-4654.

Banning, N., Brock, F., Fry, J.C., Parkes, R.J., Hornibrook, E.R., and Weightman, A.J. (2005). Investigation of the methanogen population structure and activity in a brackish lake sediment. Environ. Microbiol. 7, 947-960.

Castillo-Gonzalez, H.A., and Bruns, M.A. (2005). Dissimilatory iron reduction and odor indicator abatement by biofilm communities in swine manure microcosms. Appl. Environ. Microbiol. 71, 4972-4978.

Cole, J.R., Chai, B., Farris, R.J., Wang, Q., Kulam, S.A., McGarrell, D.M., Garrity, G.M., and Tiedje, J.M. (2005). The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 33, D294-D296.

Collins, G., Mahony, T., and O'Flaherty, V. (2006). Stability and reproducibilityof low- temperature anaerobic biological wastewater treatment. FEMS Microbiol. Ecol. 55, 449- 458.

114 Conseil canadien du pore. (2007). Donnees generates sur l'industrie canadienne du pore. (WWW document) URL www.cpc-ccp.eom/stats.html#farms.

Cook, K.L., Rothrock, M.J.J., Loughrin, J.H., and Doerner, K.C. (2007). Characterization of skatol-producing microbial populations in enriched swine lagoon slurry. FEMS Microbiol. Ecol. 60, 329-340.

Conklin, A., Stensel, H.D., and Ferguson, J. (2006). Growth kinetics and competition between Methanosarcina and Methanosaeta in mesophilic anaerobic digestion. Wat. Environ. Res. 78, 486-496.

Cotta, M.A., Whitehead, T.R., and Zeltwanger, R.L. (2003). Isolation, characterization and comparison of bacteria from swine faeces and manure storage pits. Environ. Microbiol. 5, 737-745.

Dabert, P., Delgenes, J.-P., Moletta, R., and Godon, J.-J. (2002). Contribution of molecular microbiology to the sudy in water pollution removal of microbial community dynamics. Rev. Environ. Sc. Biotechnol. /, 39-49.

Dabert, P., Peu, P., Brugere, H., Pourcher, A.-M., Kerouredan, M., Godon, J.-J., and Delgenes, J.-P. (2006). Dynamics of a pig slurry microbial community during anaerobic storage and management. Appl. Environ. Microbiol. 72, 3578-3585.

Dorigo, U., Volatier, L., and Humbert, J.F. (2005). Molecular approaches to the assessment of biodiversity in aquatic microbial communities. Water Res. 39, 2207-2218.

Federation des Producteurs de Pores du Quebec. (2002). Fermes en surplus. Analyse des solutions. Plan des interventions agroenvironnementales de la FPPQ. URL www.leporcduquebec.qc.ca/fppq/pdf/6-2-4_Fiche_Ferme.pdf

F6d6ration des Producteurs de Pore du Quebec. (2005). La production porcine quebecoise. URL www.leporcduquebec.qc.ca/fppq/pdf/6-2-6_Mini-blitzinfo.pdf

Felske, A., Rheims, H., Wolterink, A., Stackebrandt, E., and Akkermans, A.D. (1997). Ribosome analysis reveals prominent activity of an uncultured member of the class Actinobacteria in grassland soils. Microbiology 143, 2983-2989.

115 Fey, A., Eichler, S., Flavier, S., Christen, R., Hofle, M.G., and Guzman, C.A. (2004). Establishment of a real-time PCR-based approach for accurate quantification of bacterial RNA targets in water, using Salmonella as a model organism. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3618-3623.

Field, K.G., Bernhard, A.E., and Brodeur, T.J. (2003). Molecular approaches to microbiological monitoring: fecal source detection. Environ. Monit. Assess. 81, 313-326.

Foulkes, B., Khanal, S.K., and Sung, S. (2006). Bioleaching of zinc and copper from anaerobically digested swine manure: effect of sulfur levels and solids contents. Wat. Environ. Res. 78, 202-208.

Franks, A.H., Harmsen, H.J., Raangs, G.C., Jansen, G.J., Schut, F., and Welling, G.W. (1998). Variations of bacterial populations in human feces measured by fluorescent in situ hybridization with group-specific 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes. Appl. Environ. Microbiol. 64, 3336-3345.

Friedrich, M.W. (2005). Methyl-coenzyme M reductase genes: unique functional markers for methanogenic and anaerobic methane-oxidizing Archaea. Methods Enzymol. 397, 428- 442.

Gourse, R.L., Gaal, T., Bartlett, M.S., Appleman, J.A., and Ross, W. (1996). rRNA transcription and growth rate-dependent regulation of ribosome synthesis in Escherichia coli. Annu. Rev. Microbiol. 50, 645-677.

Gray, M.W., Sankoff, D., and Cedergren, R.J. (1984). On the evolutionary descent of organisms and organelles: a global phylogeny based on a highly conserved structural core in small subunit ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. 12, 5837-5852.

Griffiths, R.I., Witheley, A.S., O'Donnell, A.G., and Bailey, M.J. (2000). Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66, 5488- 5491.

116 Hobbs, P.J., Pain, B.F., Kay, R.M., and Lee, P.A. (1996). Reduction of odorous compounds in fresh pig slurry by dietary control of crude protein. J. Sci. Food Agric. 71, 508-514.

Initiative for Bioinformatics and Evolutionary Studies (IBEST), University of Iowa. Microbial Community Analysis (MiCA) 3. (WWW document). URL mica.ibest.uidaho.edu/

Institute for Applied Microbiology, Dresden University of Technology. T-RFLP Operation Results Analysis Software Tool. (WWW document). URL www.torast.com

Jongbloed, A.W., and Lenis, N.P. (1998). Environmental concerns about animal manure. J. Anim. Sci. 76, 2641-2648.

Keer, J.T., and Birch, L. (2003). Molecular methods for the assessment of bacterial viability. J. Microbiol. Methods 53, 175-183.

Kent, A.D., Smith, D.J., Benson, B.J., and Triplett, E.W. (2003). Web-based phylogenetic assignment tool for analysis of terminal restriction fragment length polymorphism profiles of microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6768-6776.

Knowlton, K.F., Radcliffe, J.S., Novak, C.F., and Emmerson, D.A. (2004). Animal management to reduce phosphorus losses to the environment. J. Anim. Sci. 82, E173-E195.

Lay, C, Sutren, M., Rochet, V., Saunier, K., Dore, J., and Rigottier-Gois, L. (2005). Design and validation of 16S rRNA probes to enumerate members of the Clostridium leptum subgroup in human faecal microbiota. Environ. Microbiol. 7, 933-946.

Leser, T.D., Amenuvor, J.Z., Jensen, T.K., Lindecrona, R.H., Boye, M., and Moller, K. (2002). Culture-independent analysis of gut bacteria: the pig gastrointestinal tract microbiota revisited. Appl. Environ. Microbiol. 68, 673-690.

Liao, CM., Liang, H.M., and Singh, S. (1997). Swine manure cleanup criteria calculation for odor causing volatile organic compounds based on manure-to-ventilation air exposure pathway. J. Environ. Sci. Health B 32, 449-468.

117 Lueders, T., and Friedrich, M. (2002). Effects of Amendment with Ferrihydrite and Gypsum on the Structure and Activity of Methanogenic Populations in Rice Field Soil. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2484-2494.

Lunn, F., and van De Vyver, J. (1977). Sampling and analysis of air in pig houses. Agric. Environ. 3, 159-169.

Luton, P.E., Wayne, J.M., Sharp, R.J., and Riley, P.W. (2002) The mcrA gene as an alternative to 16S rRNA in the phylogenetic analysis of methanogen populations in landfill. Microbiology 148, 3521-3530.

Lyons, S.R., Griffen, A.L., and Leys, E.J. (2000). Quantitative real-time PCR for Porphyromonas gingivalis and total bacteria. J. Clin. Microbiol. 38, 2362-2365.

Maaloe, O., and Kjeldgaard, N.O. (1966). Control of macromolecular synthesis: a study of DNA, RNA, and protein synthesis in bacteria. (New York : Benjamin).

Mackay, I.M. (2004). Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10: 190-212.

Mackie, R.I., Stroot, P.G., and Varel, V.H. (1998). Biochemical identification and biological origin of key odor components in livestock waste. J. Anim. Sci. 76: 1331-1342.

Marsh, T.L., Saxman, P., Cole, J., and Tiedje, J. (2000). Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis Program, a Web-Based Research Tool for Microbial Community Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 66, 3616-3620.

Martin-Orue, S.M., Castillo, M., Skene, G., Roca, M., Anguita, M., Badiola, I., Duncan, S.H., and Flint, H.J. (2007). Application of 16S rRNA gene-targetted fluorescence in situ hybridization and restriction fragment length polymorphism to study porcine microbiota along the gastrointestinal tract in response to different sources of dietary fibre. FEMS Microbiol. Ecol. 59, 138-146.

Masse, D.I., Croteau, F., and Masse, L. (2007). The fate of crop nutrients during digestion of swine manure in psychrophilic anaerobic sequencing batch reactors. Bioresour. Technol. 98, 2819-2823.

118 Masse, D.I., and Droste, R.L. (2000). Comprehensive model of anaerobic digestion of swine manure slurry in a sequencing batch reactor. Water Res. 43, 3087-3106.

McCune, B. and Grace, J.B. (2002). Analysis of ecological communities. Gleneden Beach,

Oregon: MjM Software Design, 300 pp.

Michigan State University. TAP T-RFLP. (WWW document). URL //rdp.cme.msu.edu

Miller, D.N., and Varel, V.H. (2003). Swine manure composition affects the biochemical origins, composition, and accumulation of odorous compounds. J. Anim. Sci. 81, 2131- 2138.

Mills, D.K., Fitzgerald, K., Litchfield, CD., and Gillevet, P.M. (2003) A comparison of DNA profiling techniques for monitoring nutrient impact on microbial community composition during bioremediation of petroleum-contaminated soils. J. Microbiol. Methods 54, 57-74.

Ministere de l'Environnement du Quebec. (2002). Le Reglement sur les exploitations agricoles (REA). (Editeur officiel du Quebec).

Ministere de l'Environnement du Quebec. (2005). Reglement modifiant le Reglement sur les exploitations agricoles. Gazette Officielle du Quebec 137e annee 41A, 5859A-5868A.

Ministere du Developpement durable, Environnement et Pares du Quebec. (2005). Capacite de support des activites agricoles par les rivieres: le cas du phosphore total. (Gouvernement du Quebec).

Morgan, C.A., Hudson, A., Konopka, A., and Nakatsu, C.H. (2002). Analyses of microbial activity in biomass-recycle reactors using denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rDNA and 16S rRNA PCR products. Can. J. Microbiol. 48, 333-341.

Muttray, A.F., and Mohn, W.W. (1999). Quantitation of the population size and metabolic activity of a resin acid degrading bacterium in activated sludge using slot-blot hybridization to measure the rRNA:rDNA ratio. Microb Ecol 38, 348-357.

119 Ndegwa, P.M., Zhu, J., and Luo, A. (2002). Effects of solids separation and time on the production of odorous compounds in stored pig slurry. Biosys. Engin. 81, 127-133.

O'Neill, D.H., and Phillips, V.R. (1992). A review of the control of odour nuisance from livestock buildings: Part 3. Proprieties of the odorous substances which have been identified in livestock wastws or in the air around them. J. Agric Eng. Res. 53, 23-50.

Padmasiri, S.I., Zhang, J., Fitch, M., Norddahl, B., Morgenroth, E., and Raskin, L. (2007). Methanogenic population dynamics and performance of an anaerobic membrane bioreactor (AnMBR) treating swine manure under high shear conditions. Water Res. 41, 134-144.

Pelletier, F., Marquis, A., Godbout, S., Joncas, R., Larouche, J.-P., Masse, D., and Begue, P. (2005). Gas and odor emissions from swine building materials. ASAE Standards 48, 721-728.

Petti, C.A., Polage, C.R., and Schreckenberger, P. (2005). The role of 16S rRNA gene sequencing in identification of microorganisms misidentified by conventional methods. J. Clin. Microbiol. 43, 6123-6125.

Peu, P., Brugere, H., Pourcher, A.-M., Kerouredan, M., Godon, J.-J., Delgenes, J.-P., and Dabert, P. (2006). Dynamics of a pig slurry microbial community during anaerobic storage and management. Appl. Environ. Microbiol. 72,3578-3585.

Philippot, L., Henry, S., Baudoin, E., Lopez-Gutierrez, J.C., Martin-Laurent, F., and Brauman, A. (2004). Quantification of denitrifying bacteria in soils by nirK gene targeted real-time PCR. J. Microbiol. Methods 59, 327-335.

Pigeon, S. (2004). Les odeurs, les comprendre pour mieux les controler. Pore Quebec avril, 33-39.

Pryde, S.E., Richardson, A.J., Stewart, C.S., and Flint, H.J. (1999). Molecular analysis of the microbial diversity present in the colonic wall, colonic lumen, and cecal lumen of a pig. Appl. Environ. Microbiol. 65, 5372-5377.

Rail, G.D., Wood, A.J., Westcott, R.B., and Dommert, A.R. (1970). Distribution of bacteria in feces of swine. Appl. Microbiol. 20, 789-792.

120 Rappert, S., and Muller, R. (2005). Odor compounds in waste gas emissions from agricultural operations and food industries. Waste Man. 25, 887-907.

Rinttila, T., Kassinen, A., Malinen, E., Krogius, L., and Palva, A. (2004). Development of an extensive set of 16S rDNA-targeted primers for quantification of pathogenic and indigenous bacteria in faecal samples by real-time PCR. J. Appl. Microbiol. 97, 1166- 1177.

Ritchie, N.J., Schutter, M.E., Dick, R.P., and Myrold, D.D. (2000). Use of length heterogeneity PCR and fatty acid methyl ester profiles to characterize microbial communities in soil. Appl. Environ. Microbiol. 66, 1668-1675.

Rousselon, N., Delgenes, J.P., and Godon, J J. (2004). A new real time PCR (TaqMan PCR) system for detection of thel6S rDNA gene associated with fecal bacteria. J. Microbiol. Methods 59, 15-22.

Ruimy, R., Breittmayer, V., Boivin, V., and Christen, R. (1994). Assessment of the state of activity of individual bacterial cells by hybridization with a ribosomal RNA targeted fluorescently labelled oligonucleotidic probe. FEMS Microbiol. Ecol. 75, 207-213.

Russell, E.G. (1979). Types and distribution of anaerobic bacteria in the large intestine of pigs. Appl. Environ. Microbiol. 37, 187-193.

Salanitro, J.P., Blake, I.G., and Muirhead, P.A. (1977). Isolation and identification of fecal bacteria from adult swine. Appl. Environ. Microbiol. 33, 79-84.

Santos, S.R., and Ochman, H. (2004). Identification and phylogenetic sorting of bacterial lineages with universally conserved genes and proteins. Environ. Microbiol. 6, 754-759.

Sawayama, S., Tsukahara, K., and Yagishita, T. (2006). Phylogenetic description of immobilized methanogenic community using real-time PCR in a fixed-bed anaerobic digester. Bioresour. Technol. 97, 69-76.

Schink, B. (1997). Energetics of Syntrophic Cooperation in Methanogenic Degradation. Microbiol. Molec. Biol. Rev. 61, 262-280.

121 Schink, B. (2006). Syntrophic Associations in Methanogenic Degradation. Prog. Mol. Subcell. Biol. 41, 1-19.

Sharkey, F.H., Banat, I.M., and Marchant, R. (2004). Detection and quantification of gene expression in environmental bacteriology. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3795-3806.

Shigematsu, T., Tang, Y., Kawaguchi, H., Ninomiya, K., Kijima, J., Kobayashi, T., Morimura, S., and Kida, K. (2003). Effect of dilution rate on structure of a mesophilic acetate-degrading methanogenic community during continuous cultivation. J. Biosci. Bioeng. 96, 547-558.

Sipos, R., Szekely, A.J., Palatinszky, M., Revesz, S., Marialigeti, K., and Nikolausz, M. (2007). Effect of primer mismatch, annealing temperature and PCR cycle number on 16S rRNA gene-targetting bacterial community analysis. FEMS Microbiol. Ecol. 60, 341-350.

Snell-Castro, R., Godon, J.-J., Delgenes, J.-P., and Dabert, P. (2005). Characterisation of the microbial diversity in a pig manure storage pit using small subunit rDNA sequence analysis. FEMS Microbiol. Ecol. 52, 229-242.

Song, Y., Liu, C, and Finegold, S.M. (2004). Real-time PCR quantitation of Clostridia in feces of autistic children. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6459-6465.

Sousa, D.Z., Pereira, M.A., Smidt, H., Stams, A.J.M., and Alves, M.M. (2007). Molecular assessment of complex microbial communities degrading long chain fatty acids in methanogenic bioreactors. FEMS Microbiol. Ecol. 60, 252-265.

Spoelstra, S.F. (1980). Origin of objectionable odorous components in piggery wastes and the possibility of applying indicator components for studying odor development. Agric. Environ. 5, 241-260.

Stewart, J.A., Chadwick, V.S., and Murray, A. (2006). Carriage, quantification, and predominance of methanogens and sulfate-reducing bacteria in faecal samples. Letters in Appl. Microbiol. 43, 58-63.

122 Suzuki, M., Rappe, M.S., and Giovannoni, S.J. (1998). Kinetic bias in estimates of coastal picoplankton community structure obtained by measurements of small-subunit rRNA gene PCR amplicon length heterogeneity. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4522-4529.

Tabbara, H. (2003). Phosphorus loss to runoff water twenty-four hours after application of liquid swine manure or fertilizer. J. Environ. Qual. 32, 1044-1052.

Tang, Y., Shigematsu, T., Ikbal, Morimura, S., and Kida, K. (2004). The effects of micro- aeration on the phylogenetic diversity of microorganisms in a thermophilic anaerobic municipal solid-waste digester. Water Res. 38, 2537-2550.

Tiirola, M.A., Suvilampi, J.E., Kulomaa, M.S., and Rintala, J.A. (2003). Microbial diversity in a thermophilic aerobic biofilm process: analysis by length heterogeneity PCR (LH-PCR). Water Res. 37, 2259-2268.

Topp, E., and Leung, K. (2001). Bacterial community dynamics in liquid swine manure during storage: molecular analysis using DGGE/PCR of 16S rDNA. FEMS Microbiol. Ecol. 38, 169-177.

Trabue, S.L., Anhalt, J.C., and Zahn, J.A. (2006). Bias of Tedlar Bags in the mesurement of agricultural odorants. J. Environ. Qual. 35, 1668-1677.

Varel, V.H., Tanner, R.S., and Woese, C.R. (1995). Clostridium herbivorans sp. nov., a cellulolytic anaerobe from the pig intestine. Int. J. Syst. Bacteriol. 45, 490-494.

Wang, M., Ahrne, S., Antonsson, M., and Molin, G. (2004). T-RFLP combined with principal component analysis and 16S rRNA gene sequencing: an effective strategy for comparison of fecal microbiota in infants of different ages. J. Microbiol. Methods 59, 53- 69.

Wellington, E.M.H., Berry, A., and Krsek, M. (2003). Resolving functional diversity in relation to microbial community structure in soil: exploiting genomics and stable isotope probing. Curr. Opinion Microbiol. 6, 295-301.

Whitehead, T.R., and Cotta, M.A. (1999). Phylogenetic diversity of methanogenic archaea in swine waste storage pits. FEMS Microbiol. Lett. 179, 223-226.

123 Whitehead, T.R., and Cotta, M.A. (2001). Characterisation and comparison of microbial populations in swine faeces and manure storage pits by 16S rDNA gene sequence analyses. Anaerobe 7, 181-187.

Whitehead, T.R., and Cotta, M.A. (2004). Isolation and identification of hyper-ammonia producing bacteria from swine manure storage pits. Curr. Microbiol. 48, 20-26.

Williams, A.G. (1984). Indicators of piggery slurry odour offensiveness. Agr. Wastes 10, 15-36.

Woese, C.R., and Fox, G.E. (1977). Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: The primary kingdoms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5088-5090.

Yang, C, Mills, D., Mathee, K., Wang, Y., Jayachandran, K., Sikaroodi, M., Gillevet, P., Entry, J., and Narasimhan, G. (2006). An ecoinformatics tool for microbial community studies: Supervised classification of Amplicon Length Heterogeneity (ALH) profiles of 16S rRNA. J Microbiol Methods. 65, 49-62.

Yin, Q, and Zheng, Q. (2005). Isolation and identification of the dominant Lactobacillus in gut and faeces of pigs using carbohydrate fermentation and 16S rDNA analysis. J. Biosci. Bioeng. P9, 68-71.

Yu, Y., Kim, J., and Hwang, S. (2006). Use of real-time PCR for group-specific quantification of aceticlastic methanogens in anaerobic processes: population dynamics and community structures. Biotechnol. Bioeng. 93, 424-433.

Zahn, J.A., Hatfield, J.L., Do, Y.S., DiSpirito, A.A., Laird, D.A., and Pfeiffer, R.L. (1997). Characterization of volatile organic emissions and wastes from a swine production facility. J. Environ. Qual. 26, 1687-1696.

Zhang, C, Liu, X., and Dong, X. (2004) Syntrophomonas curvata sp. nov., an anaerobe that degrades fatty acids in co-culture with methanogens. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 969-973.

124 Zhang, R.H., Tao, J., and Dugba, P.N. (2000). Evaluation of two-stage anaerobic sequencing batch reactor systems for animal wastewater treatment. Trans. ASEA 43, 1795- 1801.

Zhang, Z., and Zhu, J. (2005). Effectiveness of short-term aeration in treating swine finishing manure to reduce odour generation potential. Agricul. Ecosys. Environ. J 05, 115- 125.

Zhang, Z., Zhu, J., and Park, KJ. (2006). A bench-scale aeration study using batch reactors on swine manure stabilization to control odour in post treatment storage. Water Res. 40, 162-174.

Zheng, D., Aim, E.W., Stahl, D.A., and Raskin, L. (1996). Characterization of universal small-subunit rRNA hybridization probes for quantitative molecular microbial ecology studies. Appl. Environ. Microbiol. 62, 4504-4513.

Zhu, J. (2000). A review of microbiology in swine manure odor control. Agric. Ecosys. Environ. 78, 93-106.

Zhu, J., Riskowski, G.L., and Torremorell, M. (1999). Volatile fatty acids as odor indicators in swine manure - A critical review. Transactions ASAE 42, 175-182.

125