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N° d'ordre : 208 THESE Présentée pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L'UNIVERSITE NANGUI ABROGOUA
Spécialité : Chimie des Substances Naturelles
Par KADJA Amani Brice
Sujet Sept plantes africaines utilisées comme cure-dents : compositions minérale, phénolique et activités biologiques
Soutenue le 08 juillet 2014 devant le jury composé de:
M. LECOUVEY Marc, Professeur (Université Paris 13) Président M. NEMLIN Gnopo Jean, Directeur de recherche (CHRA) Rapporteur M. BOA David, Maître de Conférences (UNA) Rapporteur Mme MAMYRBEKOVA Janat Akhanovna épse BÉKRO, Professeur TrtulaiTe (UNA) Examinatrice Mme MAMBO Véronique, Maître de Conférences (UNA) Examinatrice M. BÉKRO Yves-Alain, Professeur rrtuJaire., (UHA) Directeur scientifique co-Directeur M. PIRA T Jean-Luc, Professeur, (ENSCM} DEDICACE
« Sans toi Seigneur l'homme n'est rien»
Sans ton concours, je ne saurais avancer et réaliser ce travail; c'est pourquoi la présente thèse t'est dédiée ; toi Père, Fils et Esprit.
Je rends grâce à la Sainte Vierge Marie, notre mère Céleste.
,; A mon Père
Yao Emmanuel KADJA, homme de paix et A la mémoire : t de mon grand-père Maurice Koffi AYEGBE décédé le 29 décembre 2012. Homme de sagesse et d'humilité. C'est auprès de toi que j'ai grandi et obtenu mon Certificat d'Etudes Primaire. Tes paroles comme « on ne finit jamais d'étudier» ou« on vous a mis à l'école pour que vous nous montriez ce qu'on ne connaît pas» ont forgé mon mental. Tu resteras vivant dans mon cœur. t de ma mère Angèle Gnambè KOFFI décédée le 05 mai 2013. J'aurai bien voulu que tu sois là en ce jour. Sache que Amani se porte bien. t du Professeur Laurent AKE-ASSI, Professeur émerite du Centre National de Floristique de l'université Félix Houphouët-Boigny décédé le 14 janvier 2014. Homme d'humilité et de simplicité; ni nos mots ni nos actes ne sauront décrire et traduire vos valeurs tant professionnelles qu'humaines. Merci pour votre apport à cette thèse et puisse Dieu vous accorder le repos éternel. REMERCIEMENTS J'exprime d'abord mes profonds remerciements et ma vive reconnaissance à mon directeur scientifique le Professeur Yves-Alain BÉKRO, Professeur Titulaire à l'Université Nangui Abrogoua (UNA), Vice-Président honoraire de l'UNA, Doyen honoraire de l'UFR• SF A, Directeur du Laboratoire de Chimie Bioorganique et de Substances Naturelles (LCBOSN). Vous avez fait de moi un étudiant comblé en m'acceptant dans votre laboratoire et d'accompagner mes différents travaux (DEA et thèse). Votre dynamisme, votre disponibilité, votre aide, vos précieux conseils, votre rigueur et votre sens du travail bien fait ont été la source d'énergie inépuisable qui m'a guidé depuis mes premiers pas au DEA dans votre laboratoire et qui m'accompagne dans mes recherches. Je remercie le Professeur Jean-Luc PIRAT, Professeur à l'Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Montpellier (ENSCM) pour l'honneur qu'il m'a fait en acceptant de co-diriger cette thèse. Ça a été un privilège d'avoir bénéficié de votre accueil au sein de votre laboratoire et de votre encadrement. Je reste sensible à vos grandes qualités humaines et admire votre sens de gestion des affaires. Je ne trouverai pas certainement la formule pour vous exprimer ma sincère reconnaissance. Veuillez accepter cher Professeur, l'expression de mes sentiments d'estime et soyez rassuré de ma profonde gratitude et de mon profond respect. Au Professeur David BOA, Maître de Conférences à l'UNA, Doyen de l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences Fondamentales et Appliquées (UFR-SF A). Qu'il me soit ici permis de vous remercier très sincèrement pour avoir donné un avis scientifique à ce travail malgré vos nombreuses obligations, en tant que rapporteur et membre du jury. Je suis très honoré d'avoir pu bénéficier de vos remarques éclairées et tiens à vous assurer ma grande estime. Je remercie le Professeur Serge Niangoran BAKOU, Maître de Conférences Agrégé à l'Ecole Inter-Etats des Sciences et Médecine Vétérinaires de Dakar pour ses observations judicieuses lors de l'instruction de cette thèse. Je remercie le Professeur Gnopo Jean NEMLIN, Directeur de Recherche au Centre National de Recherche Agronomique (CNRA). Je reste sensible à ses observations et échanges constructifs lors de l'instruction de ma thèse. Aussi suis-je honoré pour votre participation à ce jury. Au Professeur Marc LECOUVEY, Professeur à l'Université Paris 13. Qu'il me soit permis de vous temoigner ma profonde gratitude pour votre simplicité. Ce travail est aussi le fruit de votre encadrement dont nous avons bénéficié au sein de votre laboratoie. Merci pour avoir accepté promptement d'effectuer ce voyage et de présider ce jury. Que Madame le Professeur Janat Akhanovna MAMYRBEKOV A épouse BÉKRO, Professeur Titulaire à l 'UNA, directrice du pôle de recherche Pharmacopée Africaine et Substances Naturelles et sous-directrice du LCBOSN, reçoive mes sincères remerciements pour avoir été pour moi une mère et une conseillère. Votre amour et disponibilité pour le travail ont donné une notoriété indiscutable à notre laboratoire. Merci d'être membre de ce jury en qualité d'examinatrice. Au Professeur Véronique MAMBO, Maître de Conférences à l'UNA. Vous avez été pour moi une conseillère et source de motivation dans mon apprentissage. Je voudrais vous remercier d'avoir accepté examiner ce travail. Je remercie vivement le Service de la Coopération et d' Action Culturelle de l' Ambassade de France en Côte d'Ivoire (SCAC) pour m'avoir octroyé la bourse nécessaire pour effectuer deux stages de cinq mois chacun à l'Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Montpellier. J'exprime ma profonde reconnaissance aux enseignants du LCBOSN à savoir les Maîtres de Conférences Anoubilé BENIE, Charles Guillaume KODJO, Hervé ZABRI, les Maîtres-Assistants Bosson Antoine KOUAME, Boua Benson BOUA, les Assistants Koffi Marcel KONAN, Zana OUATTARA, Christelle N'gaman KOUASSI, à l'équipe AM2N particulièrement à Dr Jean-Noël VOLLE pour son encadrement , son encouragement et sa confiance et au Professeur David VIRIEUX pour ses observations constructives et à Mme Marie-Hélène BOYER, Professeur de microbiologie à l'Université Montpellier 2. Je remercie la famille KADJA, tous mes frères et sœurs pour leur soutien. Mes sentiments de reconnaissance et de remerciements vont également à l'endroit de toute personne qui a participé de près ou de loin, directement ou indirectement à la réalisation de ce travail. Je ne saurais terminer sans faire un clin d'œil à mes amis et collègues. Je citerai particulièrement les paroissiens de Saint Philippe, Guy Roger Mida KABRAN, Emmanuel KOFFI, Amian Brise KASSI, Alain Hugues Olivier N'GUESSAN, Armel Dopé YAPI, Olivier ATTA, Sylvestre TANOH, Lanciné TRAORE, Françoise TREY, Claude DOFFOU, Evelyne TOURE, Carole ALI. SOMMAIRE SOMMAIRE i AVANT-PROPOS V LISTE DES ABREVIATIONS ET DES FORMULES CHIMIQUES vi FIGURES viii TABLEAUX X Introduction 1 Chapitre 1 : Synthèse bibliographique 5 1. Classification des êtres vivants 6 1. Règne végétal 6 2. Présentation des plantes d'étude 10 Il. Généralités sur les plantes d'étude 12 1. Erythropleum africanum 12 2. Guiera senegalensis 12 3. Prosopis africana 14 4. Pseudocedrela kotschyi 15 5. Swartzia madagascariensis 16 6. Terminalia albida 17 7. Zanthoxy/um zanthoxyloides 17 111. Généralités sur la carie dentaire 19 1. Présentation de la dent 19 2. Manifestation de la carie dentaire 20 2.1. Temps 21 2.2. Bactéries du biofilm dentaire 22 2.3. Dent 23 2.4. Alimentation 23 3. Rôle de la salive 24 4. Traitement et prévention 25 IV. Généralités sur les polyphénols 26 1. Définition 26 2. Classification des polyphénols 26 2.1. Exemples de quelques polyphénols 27 2.1.1. Acides phénoliques 27 2.1.2. Flavonoïdes 29 2.1.3. Tannins 32 2.1.4. Coumarines 35 2.2. Analyse structurale des polyphénols 36 2.2.1. Principe de couplage GC-MS 36 2.2.1.1. Chromatographie en phase gazeuse 37 2.2.1.2. Mode de détection: la spectrométrie de masse 37 2.2.2. Couplage chromatographie-spectrométrie de masse 38 2.2.3. Eléments d'identification des flavonoïdes par spectrométrie 40 3. Activités biologiques des polyphénols 41 V. Généralités sur les minéraux .43 1 . Macro-éléments 44 1.1. Calcium 44 1.2. Magnésium 45 1.3. Phosphore 45 1.4. Potassium 45 2. Oligo-éléments 45 2.1. Cuivre 45 2.2. Fer 46 2.3. Zinc 46 Chapitre Il : Matériel et méthodes 47 1 . Matériel 48 1.1. Matériel végétal 48 1.2. Matériel chimique 48 2. Méthodes 48 2.1. Méthodes chimiques 48 2.1.1. Quantification des éléments minéraux 49 2.1.2. Détection, caractérisation et quantification des métabolites secondaires 50 2.1.2.1. Délipidation au Soxhlet 50 2.1.2.2. Criblage phytochimique 50 2.1.2.2.1. Tests par des réactions colorées 50 2.1.2.2.1.1. Détection des qui nones libres 50 2.1.2.2.1.2. Détection des anthraquinones 50 2.1.2.2.1.3. Détection des stérols et polyterpènes par le test de Liebermann-Bürchard 51 2.1.2.2.1.4. Détection des saponines 51 ii 2.1.2.2.1.5. Détection des protéines : réaction de Biuret 51 2.1.2.2.1.6. Détection des polyphénols 51 2.1.2.2.1.7. Détection des coumarines 52 2.1.2.2.1.8. Détection des flavonoïdes 52 2.1.2.2.1.9. Détection des tannins 52 2.1.2.2.1.10. Détection des alcaloïdes 52 2.1.2.2.1.11. Détection des composés réducteurs 53 2.1.2.2.2. Tests de détection par CCM 53 2.1.2.2.2.1. Détection des coumarines 53 2.1.2.2.2.2. Détection des flavonoïdes 54 2.1.2.3. Analyses quantitatives 54 2.1.2.3.1. Dosage des polyphénols totaux 54 2.1.2.3.2. Dosage des flavonoïdes totaux 54 2.1.2.3.3. Dosage des anthocyanes 55 2.1.2.3.4. Dosage des aglycones flavoniques 55 2.1.3. Evaluation de l'activité antioxydante par le test au DPPH 56 2.1.4. Analyse des composés phénoliques par GC-MS et LC-MS 57 2.1.4.1. Analyse par GC-SM 57 2.1.4.2. Analyse LC-MS 58 2.2. Méthodes biologiques 59 2.2.1. Activités antibactériennes 59 2.2.1.1. Antibiogramme réalisé par diffusion sur gélose 59 2.2.1.2. Antibiogramme réalisé sur plaque de microtitration 60 2.2.2. Etude de l'activité cytotoxique 60 2.2.2.1. Cultures cellulaires 61 2.2.2.2. Evaluation de la cytotoxicité 62 Chapitre Ill : Résultats et discussion 63 1 . Quantification des macro-éléments et oligo-éléments 64 1.1. Teneur en macro-éléments 66 1.2. Teneur en oligo-éléments 67 2. Tri phytochimique par les réactions colorées 67 3. Tests de détection de certains composés phénoliques par CCM 69 3.1. Détection des coumarines 69 3.2. Caractérisation des flavonoïdes 71 4. Analyses quantitatives 73 iii 4.1. Dosages des polyphénols, des anthocyanes et aglycones 73 4.2. Dosage des flavonoïdes totaux 74 5. Evaluation de l'activité antioxydante 75 6. Caractérisation des composés phénoliques par GC-MS et LC-MS 77 6.1. Caractérisation par GC-MS 78 6.1.1. Analyse GC-MS de Erythrophleum africanum 78 6.1.2. Analyse GC-MS de Prosopis africana 79 6.1.3. Analyse GC-MS de Swartzia madagascariensis 81 6.1.4. Analyse GC-MS de Terminalia albida 81 6.1.5. Analyse GC-MS de Zanthoxylum zanthoxyloides 82 6.2. Caractérisation des composés phénoliques par LC-MS 83 6.2.1. Analyse de l'extrait de Erythrophleum africanum 83 6.2.2. Analyse de l'extrait de Prosopis africana 88 6.2.3. Analyse de l'extrait de Swartzia madagascariensis 92 6.2.4. Analyse de l'extrait de Terminalia albida 95 6.2.5. Analyse de l'extrait de Zanthoxylum zanthoxyloides 98 7. Activités antibactériennes et anticancéreuses 103 7.2. Activités antibactériennes 103 7.3. Cytotoxicité 105 Conclusion et perspectives 109 Références 113 Annexes iv AVANT-PROPOS La phytochimie ou chimie des végétaux est la science qui étudie la structure, le métabolisme et la fonction des substances naturelles issues des plantes. Elle est indissociable de la pharmacognosie qui traite les matières premières et les substances à potentialité médicamenteuse d'origine animale ou végétale. L'utilisation rationnelle et efficiente des plantes en médecine traditionnelle en général ; et en hygiène buccale en particulier, ainsi que la recherche tous azimuts de nouvelles molécules thérapeutiques atoxiques d'origine naturelle, ont été les raisons qui ont fondé cette thèse. La thèse a été réalisée sous la direction de M. Yves-Alain BÉKRO, Professeur Titulaire à l'Université Nangui Abrogoua, directeur du Laboratoire de Chimie Bioorganique et de Substances Naturelles (LCBOSN) et la co-direction de M. Jean• Luc PIRAT, Professeur à l'Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Montpellier (ENSCM). V LISTE DES ABREVIATIONS ET DES FORMULES CHIMIQUES AcOEt: Acétate d'éthyle AcOH : Acide acétique ADN : Acide désoxyribonucléique AgN03: Nitrate d'argent APG : Angiosperm Phylogeny Group ATP : Adénosine triphosphate BSTFA: N,0-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide BHT : Butylhydroxytoluène CCM : Chromatographie sur Couche Mince CH2Cl2: Dichlorométhane CHCl3 : Chloroforme CMB : Concentration Minimale Bactéricide CMI : Concentration Minimale Inhibitrice CNRA : Centre National de Recherche Agronomique CPP-ACP : Complexes Caséine-Phosphopeptide-Phosphate de Calcium DMEM : Milieu Minimum Essentiel de Dulbecco DPPH : 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle El : Impact Electronique ENSCM : Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Montpellier ESI : Ionisation Electrospray EtOH : Ethanol FeC'3: Chlorure de fer(III) GC-MS : Chromatographie Gazeuse couplée à la Spectroscopie de Masse HCI : Acide chlorhydrique HC02H : Acide formique INRA: Institut National de la Recherche Agronomique KOH : Hydroxyde de potassium LB: Lysogeny broth LCBOSN : Laboratoire de Chimie Bio Organique et des Substances Naturelles LC-MS : Chromatographie Liquide couplée à la Spectroscopie de Masse MEB: Microscope Electronique à Balayage MeOH : Méthanol MH : Mueller Hinton MSTFA : N-méthyl-N-triméthylsilyltrifluoroacétamide MTT: Tétrazolium Na2C03: Carbonate de sodium Na2S04 : Sulfate de soduim NaOH : Hydroxyde de sodium n-BuOH : Butanol normal NH40H : Hydroxyde d'ammonium PBS : Phosphate Buffered Saline (tampon phosphate salin) PhCH3: Toluène Rt: Rapport frontal vi SVF : Sérum de Veau Fœtal UPLC : Chromatographie Liquide Ultra haute Performance UV : Ultraviolet vii FIGURES Figure 1: Rang des êtres vivants 6 Figure 2: Classification et description du règne végétal (Anonyme, 2012) 9 Figure 3: Classification systématique des 7 espèces végétales étudiées 11 Figure 4: Photo de Erythropleum africanum (en Bambara« siri ») 12 Figure 5: Photo de Guiera senegalensis ( en Bambara « koundjè ») 13 Figure 6: Structures chimiques des composés isolés de G. senegalensis 14 Figure 7: Photo de Prosopis africana (en Bambara« guélé ») 14 Figure 8: Photo de Pseudocedrela kotschyi ( en Bambara « chissina») 15 Figure 9: Photo de Swartzia madagascariensis (en Bambara« nérékal») 16 Figure 10: Photo de Terminalia albida (en Bambara« wôlô») 17 Figure 11: Photo de Zanthoxylum zanthoxyloides ( en Bambara « wô ») 18 Figure 12: Structures chimiques des burkinabines A, B et C 18 Figure 13: Cavité buccale, vue antérieure (Reychler et al., 1991 ) 19 Figure 14: Coupe de la dent (Anonyme, 2013) 20 Figure 15: Facteurs impliqués dans l'étiologie carieuse (Selwitz, 2007) 21 Figure 16: Evolution de la carie (Anonyme, 2013) 23 Figure 17: Exemples de quelques acides-phénols dérivés de l'acide benzoïque (Pawlowska et al., 2006; Bruneton, 2009) 28 Figure 18: Exemple de quelques acides-phénols dérivés de l'acide benzoïque (Pawlowska et al., 2006 ; Bruneton 2009) 28 Figure 19: Squelette carboné de base des flavonoïdes 29 Figure 20: Schéma illustrant les différentes réactions enzymatiques conduisant aux principales familles des flavonoïdes (Grisebach, 1982 ; Heller et Forkmann 1993) .. 31 Figure 21: Structures chimiques de l'acide digallique (a) et de l'acide ellagique (b). 32 Figure 22: Structure moléculaire du pentagalloylglucose 33 Figure 23: Squelette de base des monomères des proanthocyanidines 33 Figure 24: Exemple de polymères de flavan-3-ol (Sarni-Manchado et Cheynier 2006) ...... 34 Figure 25: Structure moléculaire des monomères de flavan-3-ol 34 Figure 26: Réaction de Pechmann 35 Figure 27: Silylation des composés (Knapp, 1979) 37 Figure 28: Principe de fonctionnement du couplage GC-MS 38 Figure 29: Nomenclature simplifiée utilisée pour désigner les fragments des flavonoïdes (Ma et al., 1997; Cuyckens et Claeys, 2004) 40 Figure 30: Voies de fragmentations caractéristiques en mode positif des flavones, flavanones et flavonols (Wolfender et al., 2000) 41 Figure 31: Microscope Electronique à Balayage (MEB) 49 Figure 32: Schéma de la délipidation au soxhlet.. 50 Figure 33: Schéma synoptique de l'extraction des échantillons injectés 58 Figure 34: Quantification en macro-éléments 66 Figure 35: Quantification en oligo-éléménts 67 Figure 36: Illustration des indices de mousse 69 Figure 37: Etat comparatif des coumarines présentes dans les différents extraits 71 viii Figure 38: Teneurs en polyphénols, en anthocyanes et en aglycones dans les 7 plantes d'étude 74 Figure 39: Teneurs en flavonoïdes totaux dans les 7 plantes d'étude 74 Figure 40: Réaction de piégeage des radicaux libres par transfert de H sur le DPPH ...... 75 Figure 41: Evaluation de l'activité antioxydante des 7 plantes d'étude 76 Figure 42: Profil chromatographique GC-MS de la tige de E. africanum 78 Figure 43: Profil chromatographique GC-MS de la tige de P. africana 80 Figure 44: Profil chromatographique GC-MS de la tige de S. madagascariensis 81 Figure 45: Profil chromatographique GC-MS de la tige de T. albida 82 Figure 46: Profil chromatographique GC-MS de la tige de Z. zanthoxyloides 83 Figure 47: Profil chromatographique de l'extrait hydroacétonique de E. africanum . 84 Figure 48: Structures moléculaires de quelques composés phénoliques détectés dans la tige de E. africanum 86 Figure 49: Profil chromatographique de l'extrait hydroacétonique de P. africana 88 Figure 50: Chromatogrammes à 278 nm, 318 nm, 358 nm, EIC 271 et 641 91 Figure 51: Structures moléculaires de quelques composés phénoliques détectés dans la tige de P. africana 92 Figure 52: Profils chromatographiques de l'extrait hydroacétonique de S. madagascariensis 93 Figure 53: Structures moléculaires de quelques composés phénoliques détectés dans la tige de S. madagascariensis 95 Figure 54: Profils chromatographiques de l'extrait hydroacétonique de T. a/bida 96 Figure 55: Structures moléculaires de quelques composés phénoliques détectés dans la tige de T. albida 97 Figure 56: Profils chromatographiques de l'extrait hydroacétonique de Z. zanthoxy/oides 98 Figure 57: Structures moléculaires de quelques composés phénoliques détectés dans la tige de Z. zanthoxyloides 100 Figure 58: Hydrolyse acide des flavonoïdes glycosylés 100 Figure 59: Réaction de phloroglucinolyse: exemple d'un dimère catéchol. 101 Figure 60: Inhibition de Micrococcus luteus par des extraits bruts hydroacétoniques ...... 104 Figure 61: Pourcentage de viabilité des cellules 106 ix TABLEAUX Tableau 1: Principales classes de composés phénoliques (Harborne, 1980) 27 Tableau 2: Propriétés biologiques de quelques polyphénols dans l'organisme (Nsemi, 2010) 43 Tableau 3: Quantification des minéraux présents dans E. africanum en % de masse de cendres 64 Tableau 4: Quantification des minéraux présents dans G. senegalensis en % de masse de cendres 64 Tableau 5: Résultats des tests par réactions colorées et de l'indice de mousse 68 Tableau 6: CCM des coumarines révélées 70 Tableau 7: CCM des flavonoïdes révélés 72 Tableau 8: Fragmentations communes à quelques composés silylés 78 Tableau 9: Composés possibles détectés dans E. africanum 85 Tableau 10: Composés possibles détectés dans P. africana 89 Tableau 11: Composés phénoliques possibles détectés dans S. madagascariensis ...... 94 Tableau 12: Composés phénoliques possibles détectés dans T. albida 96 Tableau 13: Composés phénoliques possibles détectés dans Z. zanthoxyloides 99 Tableau 14: Résultats de !'antibiogramme 103 Tableau 15: CMI et CMB des échantillons d'étude 104 Tableau 16: Effet global des extraits de plante sur les souches cancéreuses 107 Tableau 17: Effet des 5 espèces végétales sur six souches cancéreuses 107 Tableau 18: Activité de BAK 5 sur les souches cellulaires à différentes concentrations 108 Tableau 19: Activité de BAK 5 sur les souches cellulaires à différentes concentrations 108 X Introduction 1 La phytothérapie traditionnelle suscite actuellement un regain d'intérêts, son efficacité est de plus en plus prouvée. Elle est perçue comme un ensemble de traitements thérapeutiques peu onéreux pour les populations rurales à faibles revenus. Il est acquis que les plantes médicinales sont capables de soigner des maladies comme le rhume ou bien de prémunir contre celles qui sont plus compliquées comme les ulcères, la migraine, l'infarctus et certaines allergies, etc. Si l'on y ajoute leurs vertus réparatrice, tonifiante, sédative, revitalisante ou immunologique, on mesure mieux l'aide précieuse qu'elles sont susceptibles d'apporter au quotidien de l'Homme (Anonyme, 2005). L'efficacité avérée des plantes médicinales est due en partie aux métabolites secondaires tels que les alcaloïdes, les huiles essentielles, etc. qu'elles renferment. Par exemple, les composés phénoliques ont un effet inhibiteur sur les enzymes (Yousfi et al., 2006) et sont connus pour leur pouvoir antioxydant (Yousfi et al., 2007) ; ce qui justifie leur utilisation thérapeutique. Nonobstant les progrès réalisés en médecine conventionnelle jusqu'à nos jours, le grand nombre de médicaments de synthèse produit reste encore insuffisante et peu efficace. Certains médicaments sont encore incapables de faire face à certaines pathologies en recrudescence telles que les infections fongique, virale et bactérienne, etc. La découverte et le développement de nouveaux moyens thérapeutiques sont indispensables pour véritablement lutter contre ces fléaux. Dans cette optique, l'investigation des espèces végétales représente un arsenal potentiel inestimable à l'effet de découvrir de nouvelles molécules, comme sources naturelles de lutte plus efficace contre certaines maladies. Les maladies bucco-dentaires peuvent être qualifiées de problème majeur de santé publique en raison de leur prévalence et de leur incidence élevées dans toutes les régions du monde. Elles atteignent principalement les populations défavorisées et socialement marginalisées (Poul et al., 2003). Une relation entre la flore bactérienne de la cavité buccale et l'état de santé 2 général a été prouvée (Anonyme, 2003). En effet, les cas les plus terribles d'anémie, de gastrite, de colite de toutes sortes, de fièvre d'origine inconnue, de purpura, de troubles nerveux, de rhumatisme chronique, de troubles rénaux, d'abcès du poumon et de cerveau, de maladies cardiovasculaires, de diabète, d'infections sexuellement transmissibles, etc. trouvent leur origine dans la septicité buccale (Aho, 1998). La grande fréquence des affections bucco-dentaires, leur retentissement sur l'état de santé général et sur la qualité de vie, ainsi que leur répartition très inégale dans la population, en font une question de santé publique à part entière. Outre les aspects médicaux au sens strict, un mauvais état dentaire est une image dégradée de soi. C'est aussi une vie sociale réduite avec la peur de sourire, d'atteinte de la relation à autrui. Le mauvais état dentaire est également un obstacle à l'insertion sociale et professionnelle car une bouche édentée par exemple, est un marqueur de marginalité. Nonobstant ce constat, les moyens de la surveillance bucco• dentaire en Afrique restent insuffisants (Yavo et al., 2009). L'emploi de certaines plantes en qualité de brosse à dents remonte à l'antiquité et à l'époque Babylonienne (5000 ans avant Jésus-Christ). Il s'est répandu longtemps après chez les Grecs et les Romains. C'est une technique d'hygiène buccale qui reste et demeure utile pour les populations d'Afrique, d'Asie du sud, d'Amérique tropicale et pour les communautés indiennes d'Amérique. Cette pratique pourrait s'expliquer rationnellement par le fait que ces plantes contiennent des principes actifs (métabolites secondaires) qui sont à l'origine des activités antibactérienne, anticancéreuse, antifongique, antitumorale, analgésique, anti inflammatoire, etc. qu'elles possèdent (Fatima, 2004). MacGregor a montré en 1963 dans une étude réalisée sur des tribus du Ghana que ces dernières souffriraient moins de caries dentaires parce qu'elles employaient des brosses à dents à base de plantes qu'aux pratiques modernes d'hygiène dentaire (MacGregor, 1963). Au nombre des thématiques de recherche développées au Laboratoire de Chimie Bio Organique et de Substances Naturelles (LCBOSN) de l'Unité de Formation et de Recherche des Sciences Fondamentales et Appliquées (UFR- 3 SFA) de l'Université Nangui Abrogoua (UNA), le présent travail s'inscrit dans la recherche de nouvelles molécules qui peuvent trouver une application thérapeutique. Il se veut une contribution à la valorisation des plantes africaines par l'étude phytochimique avec une plus-value apportée par des tests biologiques. Pour cela, 7 plantes utilisées pour l'hygiène buccale ont été choisies à partir d'une enquête ethnobotanique menée à Sikasso (Mali) et d'informations chimiotaxonomique et biologique receuillies. Ce sont entre autres 2 espèces végétales de la famille des Caesalpiniaceae (Erythrophleum africanum et Swartzia madagascarensis), 2 de la famille des Combretaceae (Guiera senegalensis et Terminalia albida), 1 des Mimosaceae (Prosopis africana), 1 de la famille des Meliaceae (Pseudocedrela kotschyi) et 1 de celle des Rutaceae (Zanthoxylum zanthoxyloïdes) qui ont fait l'objet d'investigations. Pour atteindre l'objectif général du travail, nous avons axé notre étude principalement autour de trois objectifs spécifiques à savoir : 1) l'étude phytochimique des plantes étudiées ; 2) l'étude de leur potentiel antioxydant; 3) l'étude de leur potentiel biologique. La présente thèse est composée de trois chapitres. Le premier consacré à la synthèse bibliographique, concerne la classification des êtres vivants et des généralités sur les plantes objets de notre étude, la carie dentaire, les polyphénols et les minéraux. Le second qui traite de l'étude expérimentale, concerne la caractérisation chimique (analyses qualitative et quantitative), l'activité biologique (antibactérienne et anticancéreuse) des plantes étudiées et le troisième portant sur les résultats et discussion. La thèse s'achève enfin par une conclusion qui résume nos résultats, relève les limites de notre étude, propose des suggestions et dégage des perspectives dans le but d'améliorer les présents acquis. 4 Cliapi,tre I : Synthèse 6i6Cio9raph:ique 5 1. Classification des êtres vivants Des organismes très différents au premier abord peuvent présenter de nombreux points communs dans leur organisation interne et externe. Les scientifiques utilisent ces ressemblances pour établir des classifications. Il existe donc une unité du monde vivant malgré une apparente diversité. Cette classification hiérarchisée avec 8 rangs (Figure 1 ), est la suivante : Empire Règne Embranchement c:===:>I Classe lc:===:>i Ordre j Famille Genre Espèces Figure 1: Rang des êtres vivants Ici, nous nous intéresserons à la classification du règne végétal, celle de l'empire Eucaryote (Anonyme, 2011 ). 1. Règne végétal Si Aristote peut être considéré comme le père de la biologie, celui de la botanique est assurément son disciple Théophraste (370-285 av. J.-C). Auteur d'une histoire naturelle des plantes dans « De historia plantarum », il établit 6 une classification artificielle en 4 groupes principaux : tes herbes, tes sous• arbrisseaux, tes arbrisseaux et tes arbres. Il y rangeait 500 plantes. En regardant de plus près tes titres des 9 livres qui composent « De historia plantarum », il apparaît que ta classification repose respectivement sur l'anatomie des plantes, les plantes domestiquées et leur culture, tes plantes sauvages, tes arbres et tes arbrisseaux, les caractéristiques des différents bois, tes herbes vivaces, tes légumes et leur culture, tes céréales et enfin les drogues médicinales (Alexandre, 2002 ; Richard, 2005). Parmi tes taxons des illustres botanistes, celui de Carl Von Linné (1707- 1778) avait établi au XVIIIe siècle, une classification selon le sexe des plantes d'après tes étamines ; et s'attachait à ta notion d'espèces : c'est ta nomenclature binaire latine. Tous tes végétaux qui se ressemblent et qui donnent naissance par fécondation à des individus semblables, appartiennent à ta même espèce. Ainsi de nos jours, tes classifications sont basées en partie encore sur la variation des critères morphologiques, mais aussi sur de nouveaux critères observables grâce aux progrès des sciences biologiques (biologie cellulaire, biochimie par exempte) (Alexandre, 2002 ; Richard, 2005). Parmi tes critères utilisés, nous pouvons citer : - les caractères anatomiques (anatomie des feuilles, des tiges, des racines) ; - les caractères palynotogiques (la taille, la forme et l'ornementation des grains de pollen) ; - les caractères cytologiques (forme et nombre des chromosomes par exemple); - les caractères physiologiques ( différents modes de photosynthèse et de métabolisme) ; les caractères écologiques (aptitudes des espèces à se développer dans des milieux précis) (Raynal, 1994); - les caractères chimiques : de nombreuses substances ne sont en effet synthétisées que par un groupe bien particulier de plantes par exemple, 7 les hétérosides cardiotoniques de la digitale (utilisés dans l'insuffisance cardiaque) ne se trouvent que dans le genre Oigitalis ; - les caractères moléculaires : l'étude comparée de l'ADN est en plein développement avec les progrès de la biologie moléculaire. Armen Takhtajan (1910-2009) développa un système phylogénétique pour les Angiospermes. Les dicotylédones regroupent 7 sous-classes, 20 super-ordres et 71 ordres. Quant aux monocotylédones, elles regroupent 3 sous-classes, 8 super-ordres et 21 ordres. Armen Takhtajan considéra les plantes à fleurs comme monophylétiques et les Magnoliales comme l'ordre le plus primitif à partir duquel les autres groupes d'Angiospermes auraient évolué (Alexandre, 2002) Actuellement, la classification des angiospermes se base sur les travaux du groupe de Mark Chase (APG Ill, 2009) qui reprennent en partie celle d'Arthur Cronquist publiée en 1957 et 1968 (APG 1, 1998) laquelle s'est appuyée sur les travaux d'Armen Takhatajan. Ainsi, un rapport publié par les Amis du Jardin botanique Littoral Paul Jovet (Anonyme, 2012) le 28 mars 2012, a présenté un schéma de classification et de description du règne végétal (Figure 2). 8 Embranchement Classe Règne ou division Plantes sans racines, .•-··-··-··-··-··-··~ 1 sans éléments Mousses : . Hépatiques Bryophytes conducteurs de sève et sans fleurs i Sphaignes : (Bryophyta) : 1 reproduction par L..-·-··-··-··-··-··-· : spores . 1 . ··-··-··-··-··-··-··-··J ·-··-··-··-··-··-··-··- 1 Plantes avec racines Prêles avec éléments Fougères Ptéridophytes conducteurs de sève DO~ {Ptérydophyta) mais sans fleurs reproduction par .1 spores . .·-··-··-··-··- ·-··-, i..·-··-··-··-··-··-··-··I ! Ginkgo, Cycas : 1. Se' qu01. a, p·m s, 1 ·-··-··-··-··-··-··-··--.. i Épicéa, Sapins Gymnospermes DO~ 1 Plantes à fleurs mais · Cèdres, Mélèzes, [Phynophyta, Gynkgophyta, ovules et graines Cycadophyta .. .) nus ~---··-··-··-··-··-··i ·-··-··-··-··-··-··-··- Gymnospermes+ Angiospermes Graine~ deux cotylédons, Dicotylédones reumes·à nervure = (Magnoliopsida) Spermaphytes ou phanérogames H.pè.r~b a~:J~_ •,. •. ,-â-~-r· br_i,s._ seéae.u;· x~... J. 1 arbustes, arbres (feuillus) ! ~ ~ Graine à un cotylédon, ! feuilles à nervures Monocotylédones ! parallèles : (liliopsida) Qi le plus souvent herbe ou ressemblant à 1 1 : une herbe : L.·-··-··-··-··-··-··-··-··-' 9 Figure 2: Classification et description du règne végétal (Anonyme, 2012) 2. Présentation des plantes d'étude Notre étude porte sur 7 plantes appartenant à la classe des dicotylédones. Elles sont d'une part, utilisées comme des bâtonnets frotte• dents communément appelés cure-dents pour l'hygiène buccale et d'autre part, pour traiter des infections bactériennes et des maladies comme le cancer, l'ulcère, le paludisme, les maux de ventre, l'impuissance sexuelle, ... Ces plantes ont été récoltées le 1er juillet 2010 à Longorola, un village de Sikasso (Mali), puis identifiées le 04 Juillet 2010 par le Professeur Laurent AKE-ASSI. En Côte d'Ivoire, on les trouve dans les régions du N'zi (Dimbokro), Kabadougou (Odienné) et Tchologo (Ferkessédougou). Ce sont: - Erythrophleum africanum et Swartzia madagascariensis (FABACEAE) dans la classification phytogénétique APG Ill. - Guiera senegalensis et Terminalia albida (COMBRETACEAE). - Prosopis africana (MIMOSACEAE). - Pseudocedrela kotschyi (MELIACEAE). - Zanthoxylum zanthoxyloides (RUTACEAE). La classification systématique de ces espèces végétales est présentée dans la figure 3. 10 Empire Eucaryote • Règne Plantae • Embranchement Angiospermes • Classe Dicotylédones • 1 J t l Ordres Fabales Myrtales Spindales 1 r-1--i • l Familles Fabaceae Mimosaceae Combretaceae Meliaceae Rutaceae i • ~ l l l Genres Erythrophleum Swartzia Prosopis Guiera Terminalia Pseudocedrela Zanthoxylum • i l l l l l l l S. P. G. T. P. z. Espèces E. africanum madagascariensis a/ricana senegalensis albida kotschyi zanthoxy/oides Figure 3: Classification systématique des 7 espèces végétales étudiées 11 Il. Généralités sur les plantes d'étude 1. Erythropleum africanum Cette plante (Figure 4) est très appréciée en tant que cure-dents par les populations malienne et ivoirienne du fait de son goût sucré. En effet, les études que nous avons réalisées sur les tiges ont montré un taux important de sucres totaux soit 109 mg/g (Kadja, 2009). Nous avons identifié quelques métabolites secondaires (terpénoïdes, coumarines, flavonoïdes, alcaloïdes, saponosides, sucres réducteurs et tannins) contenus dans la drogue (Kadja et al., 2011 ). Hassan et al., (2007) ont décelé les mêmes métabolites secondaires dans les feuilles de la plante, et ont par ailleurs montré que l'extrait aqueux de celles-ci serait toxique. Figure 4: Photo de Erythropleum africanum (en Bambara « siri ») 2. Guiera senegalensis Les feuilles de G. senegalensis (Figure 5) sont utilisées en Afrique de l'Ouest (Sénégal, Guinée et Mali) pour traiter le rhume, la bronchite et la fièvre (Koumaré, 1968). Ancolio (2002) a montré que l'extrait chloroformique des racines de G. senegalensis signe une activité antipaludique prononcée dont deux alcaloïdes isolés à savoir Harman (GA) et Tétrahydroharman (G8) (Figure 6) sont à l'origine. Un autre alcaloïde (Ge) a été isolé par El Hadi et al., (1997). Nathalie (1996) a quant à elle, isolé un nouveau polyphénol (acide 1,3-di-O-galloylquinique) (G0) à partir des galles. 12 Figure 5: Photo de Guiera senegalensis (en Bambara « koundjè ») Une étude plus approfondie réalisée par Zeljan (1998) a été couronnée par l'isolement de 9 flavonoïdes dont la structure chimique de base est la molécule (GE) (Figure 6). H N H ~ CH3 CA GA \=:- -/' GB HO OH OMe 1 î~ :::--.._ OH 0 HO 0 /~ ~ "'-oMe MeO Ge OH 0 13 OH 0 GE Figure 6: Structures chimiques des composés isolés de G. senegalensis 3. Prosopis africana Les feuilles de P. africana (Figure 7) bouillies, sont utilisées pour traiter les maux d'oreilles et les douleurs dentaires. Cette plante participe à l'amélioration du mode de vie des populations rurales en leur fournissant divers produits (bois, fourrages, fruits, ... ) (Nygârd et al., 2000 ; Agboola et et., 2004). La résistance accrue de la tige par rapport aux termites et aux champignons (Gérardin et al., 2004), la rend utile pour la fabrication des poteaux de construction, des planches, des mortiers et des pilons. Figure 7: Photo de Prosopis africana ( en Bambara « gué lé ») Ses feuilles, ses branches, son écorce et ses racines trouvent usage en médecine traditionnelle (Arbonnier, 2002 ; Kalinganire et el., 2007). Du fait de leur capacité à fixer l'azote, la plante contribue à augmenter la fertilité des sols (Felker et el., 1980 ; Allen et al., 1981 ). Les études phytochimiques 14 réalisées par Ojo et al., (2006) ont révélé que les tiges et feuilles de cette plante contiennent des saponines, des tannins, des phlobatannins, des glycosides cardiotoniques et des anthraquinones. Toutefois, au nombre des 5 métabolites secondaires cités, seuls les tannins sont contenus dans les racines. 4. Pseudocedrela kotschyi Les études réalisées par Kouassi et al., (2007) sur cette plante, ont montré que P. kotschyi (Figure 8) a été testée pour ses effets anti leishmanioses contre les deux formes extracellulaire et intracellulaire de Leishmania major. Figure 8: Photo de Pseudocedrela kotschyi (en Bambara « chissina») Cette plante a montré une très bonne activité contre la forme intracellulaire du parasite. Fekam et et., (2004) ont étudié la composition des huiles essentielles obtenues à partir des écorces des racines de la plante. Les résultats qu'ils ont obtenus indiquent bien que les huiles essentielles extraites sont composées exclusivement de sesquiterpénoïdes. Un criblage phytochimique réalisé par Musa et al., (2008) sur les feuilles de la plante, a révélé la présence de flavonoïdes, de glycosides et de tannins. Les auteurs ont également montré que l'extrait éthanolique des feuilles possède des effets anti nociceptif et anti inflammatoire significatifs chez les animaux de laboratoire. 15 5. Swartzia madagascariensis S. madagascariensis (Figure 9) est l'un des arbres les plus importants de la famille des Légumineuses, avec la présence de phytocomposés utilisés à des fins médicinales et autres. Les feuilles soignent la gale et les infections cutanées alors que l'écorce des racines est préférée comme remède pour les maux de dents (Akerele et al., 1991 ). Figure 9: Photo de Swartzia madagascariensis ( en Bambara « nérékala») A partir des racines de S. madagascariensis, des antifongiques très efficaces ont été découverts (Berger et al., 1995). La plante contient également des composés actifs vis-à-vis des larves de moustiques. Les extraits issus de ses fleurs peuvent être utilisés comme un insecticide pour réduire la transmission de la dengue (infection virale transmise par la piqûre d'un moustique femelle du genre Aedes) (Lwambo et al., 1991 ). Des études pharmacologiques ont également été signalées relativement à l'activité molluscicide des gousses de S. madagascriensis (Hostettmann et al., 1997). Une activité antipaludique de ses feuilles a également été rapportée (Ouattara et al., 2006). Cette plante fait partie des plantes vénéneuses employées comme poison pour pêcher (Neuwinger, 2004). Par ailleurs, quelques travaux rapportent que les racines de S. madagascariensis présentent des propriétés anti bactériennes, lesquelles semblent être dues à la présence abondante de saponines Om=500) (Seydou, 2002). 16 6. Terminalia albida Cette plante (Figure 10) est utilisée au Mali d'une part, comme bâtonnet frotte-dents et d'autre part, pour lutter contre l'ulcère. Figure 10: Photo de Terminalia albida (en Bambara« wôlô») Ayodele et al., (2010) ont montré que les extraits éthanoliques des racines, de la tige et des feuilles de la plante sont efficaces contre certaines bactéries (Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli et Proteus mirabilis) à toutes les concentrations utilisées (100 à 500 mg/ml). L'extrait des racines à 500 mg/ml est le plus efficace contre les bactéries E. coli et K. pneumoniae. L'extrait de tige à 500 mg/ml est plus efficace contre P. aeruginosa et P. mirabilis tandis que l'extrait des feuilles à 500 mg/ml est plus efficace contre P. mirabilis. Au regard de la littérature en notre possession, aucune autre étude chimique n'a été réalisée. 7. Zanthoxylum zanthoxyloides Cette plante (Figure 11) est l'un des cure-dents le plus connu. Elle a fait l'objet de plusieurs études et ses propriétés tant chimiques que biologiques ont été confirmées par plusieurs auteurs entre autres Ngassoum et al., (2003) ; Ouattara et al., (2009). Ces derniers ont par ailleurs isolé en 2004 des écorces des racines de la plante, trois isomères d'acide divanilloylquinique qui ont été nommés burkinabines A, B et C (Figure 12), lesquels auraient une activité contre l'anémie falciforme. 17 Figure 11: Photo de Zanthoxylum zanthoxyloides (en Bambara « wô ») OH OH OH Burkinabine A Burkinabine C OH HO Burkinabine B OH OH Figure 12: Structures chimiques des burkinabines A, B et C Fatima (2004) dans sa thèse intitulée « Investigation phytochimique d'une brosse à dents africaine Zanthoxylum zanthoxyloides » a non seulement rappelé les nombreux travaux antérieurs réalisés sur l'espèce mais a aussi 18 isolé des composés puis réalisé un dépistage des activités antifongique sur Cladosporium cucumerinum et Candida albicans ; et antibactérienne sur Basci/lus substilés. Ill. Généralités sur la carie dentaire 1. Présentation de la dent Au nombre définitif de 32, les dents sont fixées sur les mâchoires (Figure 13) (Reychler et al., 1991) et servent principalement à mâcher. L'ensemble des dents d'une personne est appelé denture. Chaque dent est composée d'une couronne, la partie qui dépasse la gencive et d'une racine qui est située sous la gencive, à l'intérieur de l'os de la mâchoire (Figure 14 ). La dent a en général une seule racine mais les molaires en ont deux ou trois chacune. Une dent comprend une partie vivante et une partie inerte et dure: la pulpe est la partie vivante de la dent. Elle se trouve au centre de la dent et contient un nerf par racine et de petits vaisseaux sanguins ; la dentine (ou ivoire) est une substance relativement dure qui entoure la pulpe. Elle est recouverte d'une couche d'émail au niveau de la couronne et d'une couche de cément au niveau de la racine. ______Frein labial supérieure ---- Lèvre supérieure Luette---- Palais osseuse Pilier antérieur de l'amygdale amygdale Pilier postérieur de l'amygdale Langue Figure 13: Cavité buccale, vue antérieure (Reychler et al., 1991). 19 C Email Couronne-! ._ '·,.,,,,., t·~·. •. li "!Ji., /JI~'!;',~: . , Dentine Pulpe Gencive Cément Racine Orlflct dela racine Figure 14: Coupe de la dent (Anonyme, 2013) 2. Manifestation de la carie dentaire La carie dentaire est une maladie chronique qui touche les populations depuis 12 000 ans avant Jésus-Christ. Elle s'attaque aux dents dans la cavité buccale et est incurable. Elle commence par une déminéralisation de la surface de l'émail, de la dentine ou du cément affecté et est décelable seulement au microscope. C'est une maladie infectieuse et transmissible (Folliguet et Benetiere, 2003) qui est causée par l'interaction de trois principaux facteurs : les glucides alimentaires, les bactéries cariogènes présentes dans la plaque dentaire et les tissus durs vulnérables (Keyes, 1962). La carie dentaire est une maladie multifactorielle qui comprend quatre éléments indispensables à sa formation qui sont : le temps, les bactéries, la dent et l'alimentation (Figure 15). 20 Safu.~ : poavcir tampon., composition., flux es>, PO~l- Couvmme assurance maladie Education Com1in1Dœ1 Fluorures • Facteurs personnels Facteurs de l'environnement buccal • Facteurs contribuant directement au développement carieux Figure 15: Facteurs impliqués dans l'étiologie carieuse (Selwitz, 2007) 2.1. Temps Pour qu'une carie se forme, le pH du biofilm dentaire doit être sous le niveau critique de 5,5 (lmfeld, 1983). C'est la déminéralisation qui constitue la première étape de la carie (Piette et Goldberg, 2001 ). C'est en mangeant un aliment ou en buvant un liquide sucré que le pH du biofilm dentaire diminue jusqu'au niveau critique. Il y a reminéralisation (Piette et Goldberg, 2001) lorsque celui-ci remonte au-dessus du niveau critique après environ 20 min. Le procédé de déminéralisation-reminéralisation se produit plusieurs fois dans une même journée (Selwitz, 2007). Dans le temps et selon l'équilibre, il conduit soit à une carie soit à la cicatrisation de la lésion ou bien au maintien 21 de la situation (Featherstone, 2004). C'est donc, l'action répétée de déminéralisation sans l'étape de reminéralisation qui cause la carie. 2.2. Bactéries du biofilm dentaire Les bactéries sont des procaryotes ( organismes vivants unicellulaires dépourvus de noyau). Leur taille varie de 0,5 à 15 µm et leur forme est variable (sphère, bâtonnet, spirale, chaînette, virgule, ... ) et visible au microscope optique. Une caractéristique importante des bactéries est la paroi cellulaire. Les bactéries se subdivisent en Gram négatif et Gram positif. Cette classification est basée sur la nature de la structure et de la composition chimique de la paroi cellulaire (Ali-Shtayeh et al., 1998), mises en évidence par la coloration de Gram. Les bactéries à Gram positif possèdent entre autres, une paroi cellulaire plus épaisse que les bactéries à Gram négatif. Les bactéries peuvent provoquer une inflammation des parois intestinales. Certaines d'entre elles peuvent même traverser ces parois et infecter d'autres organes en provoquant des dommages graves et parfois mortels. Elles sont la cause de 90 % des intoxications alimentaires (Larpent, 2004). Le milieu buccal composé d'un ensemble de structures épithéliales et dentaires imbibées de salive et de fluide gingival, présente des conditions physico-chimiques et nutritionnelles favorables à l'établissement et à la croissance d'une flore bactérienne commensale très variée (Aho, 1998). Parmi tous les microorganismes que la bouche contient (soit plus de 350), 5 espèces bactériennes identifiées participent au processus carieux. Ce sont Streptocoques mutans, Streptocoques sa/ivarius, Lactobacil/es caseï, Lactobacilles acidophilus et Actinomyces naëslundii. La présence en quantité suffisante de l'une ou de plusieurs de ces bactéries, est donc nécessaire à la formation de la carie. Ce sont elles qui transforment le sucre en acide en diminuant le pH du biofilm dentaire. La plaque bactérienne est certes dominée par des bactéries à Gram positif mais le développement de cette plaque va créer un environnement favorisant la prolifération des anaérobies (Van Winkelhoff et al., 1994). Streptococcus mutans joue un rôle clé à la fois dans le déclenchement et le développement du processus carieux grâce à son métabolisme de type 22 homofermentaire mais aussi grâce à sa capacité à produire des homopolymères de glucose synthétisés par des glucosyltransférases. 2.3. Dent La carie dentaire se forme sur une dent. Elle débute de l'extérieur de la dent vers l'intérieur. Elle traverse premièrement l'émail, ensuite la dentine puis la pulpe (Figure 16). Si le cément est exposé dans la bouche suite à un abaissement de la gencive, appelé récession, la carie traverse celui-ci, suivi de la dentine et finalement de la pulpe. Le cément et la dentine sont plus faibles que l'émail car ils sont moins calcifiés. La carie y progresse plus rapidement et forme une cavité dans la dent. La carie attaque rémaU La carie attaque la de la dent. On ne la dentine, ta carie peut sent pas enc:ore oonvnenoer à faire mal. La carie èst très La carie attaque la profonde, rlnfection peut pulpe, elle peut faire se développer dans l'os très mal. de la mlchoire Figure 16: Evolution de la carie (Anonyme, 2013) 2.4. Alimentation Le régime alimentaire de l'homme est à prendre en considération dans la formation carieuse car les glucides simples constituent le principal «carburant» des bactéries cariogènes. La quantité de glucides simples consommée chaque jour et plus encore la fréquence de consommation déterminent la cariogénicité d'un régime alimentaire. En effet, l'alimentation agit sur le métabolisme de la plaque et particulièrement sur sa capacité à 23 produire des acides. Le pH est le facteur déterminant dans la balance déminéralisation-reminéralisation de l'émail. Le rôle du sucre dans la formation carieuse est évident et la relation de cause à effet entre sucre et carie est connue depuis fort longtemps (Triller, 1990; Dargent-Pare et Levy, 2001). Déjà Hippocrate mettait en garde les Grecs contre les figues qui collent aux dents et provoquent des délabrements dentaires. Des éléments convaincants selon Moynihan (2005), issus d'études expérimentales sur l'animal ainsi que des études d'observations et des interventions sur l'homme, montrent que les sucres sont le principal facteur alimentaire associé aux caries dentaires. En effet, trois études de grande envergure ont été menées sur l'homme. Elles ont permis de mieux comprendre les rapports entre les glucides et la carie dentaire (Frank, 1992 ; Dargent-Pare et Levy 2001 ). C'est à partir du sucre, plus précisément du saccharose qu'il contient, que les bactéries du biofilm dentaire produisent de l'acide qui forme la carie. De nombreuses études épidémiologiques ont clairement montré la relation entre la consommation de saccharose (glucide considéré comme le plus cariogène) et les caries (Sheiham, 1983 ; Navia, 1994 ; Selwitz, 2007). La diminution de la consommation de sucre pendant la deuxième guerre mondiale a été accompagnée d'une chute parallèle du taux de carie (Triller, 1990). 3. Rôle de la salive Les produits de fermentation des bactéries de la plaque sont susceptibles de dissoudre des minéraux dentaires. La prévalence de la carie présente une corrélation négative avec la capacité tampon de la salive. La salive joue donc un rôle majeur dans la protection des dents contre l'attaque acide et dans la défense de l'hôte vis-à-vis de la carie (Haikel, 2001 ; Van Nieuw, 2004). Ses fonctions essentielles sont la dilution et l'élimination des sucres et autres substances (l'on parle alors de clairance salivaire), sa capacité tampon régulant la balance entre les phénomènes de déminéralisation/reminéralisation et son activité anti microbienne (Lenander et Loiramanta, 2000 ; Llena-Puy, 2006). 24 La salive, par son flux, élimine les micro-organismes de la cavité buccale ainsi que les débris alimentaires et les substances potentiellement toxiques. En général, plus le flux salivaire est élevé, plus la clairance est rapide et plus la capacité tampon est importante. C'est pourquoi, la carie dentaire est la conséquence la plus fréquente d'un état d'hyposalivation (Lenander et Loimaranta, 2000). Le pouvoir tampon de la salive est assuré par la présence de carbonates, de phosphates et de protéines, l'urée par exemple. Il lutte contre la baisse du pH occasionnée par les substances acides apportées par l'alimentation ou formées au cours du métabolisme bactérien (Seow, 1998). Enfin, la salive joue un rôle clé dans le maintien de l'équilibre de l'écosystème buccal en empêchant la prolifération bactérienne par la présence de protéines antimicrobiennes (lysosyme, lactoreferrine, péroxydases, histamine) et d'immunoglobulines comme les lgAs (Llena-Puy, 2006). Suite à une attaque acide, la salive constitue la principale source de protection naturelle et de réparation. La réduction du flux salivaire en dessous de 0,7mL/min peut augmenter le risque carieux. Le facteur de protection exercée par la salive est absent durant la nuit car la sécrétion salivaire suit un cycle circadien. Après avoir atteint un sommet à la fin de l'après-midi, elle devient extrêmement basse durant le sommeil, ce qui accentue l'importance d'une bonne hygiène buccale avant le coucher (Dowd, 1999). 4. Traitement et prévention Le traitement de la carie consiste à éliminer les tissus dentaires détruits et à restaurer la dent à l'aide de matériaux (amalgame d'argent, les résines composites ou les ionomères de verre (Pierre, 2002). Si aucun soin n'est apporté à la carie, l'infection continue à progresser de manière centripète et atteint la pulpe qui constitue la partie vivante de la dent. C'est la pulpite, la rage de dent avec son cortège de souffrance et de nuits blanches. Le traitement de la pulpite est la dévitalisation de la dent, c'est-à-dire l'exérèse de la pulpe infectée et son remplacement par un ciment qui obture la cavité pulpaire. 25 Le traitement de la gingivite consiste dans la plupart des cas, en un nettoyage et un détartrage superficiels, accompagnés de conseils destinés à permettre au patient d'assurer lui-même une hygiène dentaire efficace. Pour éviter de plonger dans les cas graves, il suffit d'être dento-conscient. Tout est ici, une affaire de prévention. Ainsi, les quelques précautions simples à respecter sont : - se brosser les dents. Il est recommandé de se brosser les dents après chaque repas et de changer de brosse à dents tous les trois mois ; - consulter une ou deux fois par an un dentiste afin de faire contrôler l'état de ses dents et de soigner les caries s'il y en a. IV. Généralités sur les polyphénols 1. Définition Avec environ 9000 structures naturelles élucidées à ce jour, les polyphénols constituent une famille importante de métabolites secondaires issue du règne végétal (Akowauh et al., 2004) ayant une très large gamme de structures chimiques. Les polyphénols sont biosynthétisés par les plantes. Ce sont des composés dont les structures moléculaires contiennent un noyau aromatique portant un ou plusieurs groupements hydroxyles (Kühnau, 1976 ; Bloor, 2001 ). Ils jouent un rôle fondamental tant chez l'homme que chez les végétaux grâce à leurs effets bénéfiques (Dangles et al., 1992 ; Hagerman et al., 1998 ; Sarni-Manchado et Cheynier 2006). 2. Classification des polyphénols Une classification de ces substances a été proposée par Harborne en 1980 (Tableau 1 ). On peut distinguer les différentes classes des polyphénols en se basant d'une part, sur le nombre d'atomes constitutifs et d'autre part, sur la structure du squelette de base. Ils s'étendent des molécules simples telles que les acides phénoliques, aux composés fortement polymérisés tels que les tannins (Lugasi et al., 2003). 26 Tableau 1 : Principales classes de composés phénoliques (Harborne, 1980) Squelette carboné Classe Exemple Phénols simples Catéchol Acides p-hyd roxybenzoïque hydroxybenzoïques Acides Acide caféique, acide hyd roxycinnamiques, férulique phenylpropènes, Myristicin, eugénol coumarines, Scopolétine isocoumarines Myristicine, eugénol chromones Eugenine Cs-C4 Naphtoquinones Juglone, plumbagine Cs-C1-Cs Xanthones Mangiferine Cs-C2-Cs Stilbènes Resvératrol Anthraquinones Anthraquinones Flavonoïdes, Quercétine, cyanidine, lsoflavonoïdes Daidzéine Lignanes Pinorésinol Neolignanes Eusiderine (Cs-C3-Cs)2 Biflavonoïdes Amentoflavone (Cs-CJ)n Lignines (Cs-C3-Cs)n Tannins 2.1. Exemples de quelques polyphénols 2.1.1. Acides phénoliques Les acides-phénols ou acides phénoliques ont une fonction acide et plusieurs fonctions hydroxyles phénoliques. Ils sont considérés comme des substances phytochimiques à pouvoir complexant ; et manifestant des effets prébiotique, antioxydant, et anti-inflammatoire. Leur toxicité est faible. Pharmacologiquement, le mieux caractérisé est l'acide caféique (Psotovà et al., 2003). Cet acide et l'acide férulique empêchent la formation du cancer des poumons chez les souris. L'acide gallique inhibe la formation du cancer oesophagien chez les rats (Hale, 2003). Les acides phénoliques sont incolores et plutôt rares dans la nature. Ils se classent en deux catégories : les acides-phénols qui dérivent de l'acide benzoïque sont très répandus dans le règne végétal aussi bien sous forme libre que combinée à l'état d'esters ou d'hétérosides (Haslam, 1994). La figure 17 illustre par exemple l'acide gallique qui est un élément principal de la structure des tannins hydrolysables (Clifford et al., 2000) ; 27 0 OH OH OH OH Acide benzoïque Acide gallique Acide vanillique Figure 17: Exemples de quelques acides-phénols dérivés de l'acide benzoïque (Pawlowska et al., 2006; Bruneton, 2009). les acides-phénols dérivés de l'acide cinnamique sont souvent estérifiés. Les acides hydroxycinnamiques sont rarement présents sous forme libre et sont retrouvés essentiellement sous forme conjuguée. Il s'agit de dérivés glycosylés ou d'esters avec les acides quinique, tartrique ou shikimique (Manach et al., 2004; Macheix et al., 2006). Le conjugué le plus commun est l'acide 5-cafféoylquinique également appelé acide chlorogénique. Les plus courants au nombre des acides• phénoliques sont l'acide cinnamique, l'acide caféïque, l'acide férulique, l'acide p-coumarique et l'acide sinaptique (Haslam, 1994 ; Bruneton 2009) dont certains sont représentés dans la Figure 18. 0 0 OH OH OH HO Acide cinnamique Acide férulique Acide caféique Figure 18: Exemple de quelques acides-phénols dérivés de l'acide benzoïque (Pawlowska et al., 2006 ; Bruneton 2009). Les acides hydroxycinnamiques peuvent exister sous deux formes diastéréoisomères (présence de la double liaison dans la chaîne latérale): (Z-) ou ( cis-) et (E-) ou (trans-). Les formes E- ou trans- sont les plus abondantes car thermodynamiquement plus stables. 28 2.1.2. Flavonoïdes Le terme flavonoïde désigne une très large gamme de composés naturels appartenant à la famille des polyphénols qui sont considérés comme des pigments quasi universels des végétaux. Ils sont souvent responsables de la coloration des fleurs et des fruits (Ghestem et al., 2001 ). Les flavonoïdes ont un squelette de base formé par deux cycles en C6 (A et 8) reliés entre eux par une chaîne en C3 qui peut évoluer en un hétérocycle (Figure 19). Figure 19: Squelette carboné de base des flavonoïdes Les flavonoïdes sont généralement très répandus dans toutes les plantes vasculaires où ils peuvent être localisés dans divers organes (racines, tiges, bois, cuticule foliaire et dans les cellules épidermiques des feuilles) (Marfak, 2003 ; Hadi 2004). Au nombre des flavonoïdes, les anthocyanes sont les seules substances du règne végétal capables de produire une vaste gamme de couleurs susceptible de donner des teintes allant du jaune-orangé au bleu, en passant par le pourpre et le rouge (Harborne, 1967 ; Brouillard, 1993). Les flavones, aurones et chalcones donnent plutôt des couleurs jaune, beige voir blanche ou participent aux nuances produites par les anthocyanes et les caroténoïdes. Les flavonoïdes possèdent de nombreuses vertus thérapeutiques. Les activités antivirales, anti-tumorales, anti-inflammatoires, antiallergiques, anticancéreuses leur sont reconnues (Middleton, 1993). D'autres ont des effets hépatoprotecteurs. Des flavonoïdes comme l'hespéridine et la rutine présentes dans plusieurs plantes dont le sarrasin et le citronnier, renforcent les parois capillaires et préviennent l'infiltration dans les tissus voisins. Aussi, d'autres flavonoïdes comme l'apigénine, ont-ils été décrits comme des composés bactéricides et bactériostatiques très efficaces (Basile et al., 1999 ; Cushnie et al., 2003 ; Martini et al., 2004). Ils sont capables en effet, d'inhiber la croissance des bactéries telles que Staphylococcus aureus 29 (Babayi et al., 2004) et Escherichia coli (Ulanowska et al., 2006). De même, les flavonoïdes ont déjà été utilisés pour le traitement des cataractes d'origine diabétique du fait qu'ils inhibent l'aldose réductase (Goodarzi et al., 2006 ; Ouali et al., 2007). La relation entre la structure et l'activité antioxydante des flavonoïdes et des composés phénoliques a montré que l'activité antioxydante était déterminée par la position et le degré d'hydroxylation (Igor, 2002). Leur biosynthèse (Figure 20) se fait à partir d'un précurseur commun, la 4,2',4',6'-tétrahydroxychalcone (Grisebach, 1982 ; Heller et Forkmann 1993). Sous l'action d'enzymes, cette chalcone de couleur jaune, est métabolisée en différentes classes de flavonoïdes: flavanone (2), aurone (1 }, 2,3- dihydroflavonol ou flavanonol (4), flavone (3) (ivoire}, anthocyanidine (7) (rouge-bleu), flavonol (5) (iaune), catéchine (6), etc. Ces composés existent sous forme libre dite aglycone ou sous forme d'hétéroside, c'est à-dire liée à des oses et autres substances (Heller et Forkmann 1993). 30 1) Phénylalanine ammoniolyase (PAL) D ~ 2) Chalcone synthase (CHS) ~.~ + a~/ -OOC NH2 CoAS Phénylalanine 4- cournaryl-CoA OH OH HO OH HO OH 0 OH 0 2,4,6,4'-tétrahydroxychalcone Aurone l Chalcone isornérase (CHI) ~ _OH D _OH HO HO~ ./.::,,_ /0~ 1 2 Flavone synthase OH 0 OH 0 Flavone Flavanone OH OH HO HO Flavonol synthase OH 0 OH 0 Flavonol Flavanonol OH Dihydroflavanol-réductase (DFR) HO OH HO OH 6 Catéchine OH OH OH . Leucoanthocyanidine L OH HO OH OH Proanthocyanidine OH HO HO Uridine flanonoïde 3-o-glucosyl transférosz (UFGR) OH Anthocyanidine OH Figure 20: Schéma illustrant les différentes réactions enzymatiques conduisant aux principales familles des flavonoïdes (Grisebach, 1982; Heller et Forkmann 1993) 31 2.1.3. Tannins Le terme « tannin » ou « tanin » vient de la source de tannin utilisée pour le tannage des peaux d'animaux en cuir. Ce sont des métabolites secondaires de certaines plantes supérieures. Ils se retrouvent dans toutes les parties du végétal (racine, écorce, feuilles, etc.). Ce sont des polyphénols qui protègent les plantes de l'infestation par certains prédateurs. Leur structure chimique leur confère une capacité à fixer et à précipiter des molécules telles que les alcaloïdes, la gélatine, les polysaccharides et essentiellement les protéines (Pengelly, 2004). Ils sont aussi efficaces sur la dentine cariée. On remarque qu'ils bloquent le processus carieux chez les mangeurs de Cola (Bitty, 1982). En effet, ces derniers ont des dents de teinte brun-noire qui stoppe la carie. Par ailleurs, les tannins présentent des intérêts variés : - en solution glycérinée, ils sont momifiants pulpaires; - en bains de bouche, ils manifestent un effet astringent, c'est pourquoi ils s'emploient contre les gingivo-stomatites ; Les tannins peuvent se diviser en deux classes: les pyrogalliques ou hydrolysables (Figure 21 ). Ils donnent après hydrolyse à chaud dans des solutions acides étendues, une fraction glucidique (glucose) et une fraction polyphénolique (acide gallique, acide digallique ou ellagique) 0 ;/ Il HO o-c HO~ C 0 ~ , '-.,__OH Il HO, ~ .,,,c-...... ,__o~ HO--<, ,>----<, ,)---OH OH \ I \ HO- y c-o OH // OH 0 (a) (b) Figure 21: Structures chimiques de l'acide digallique (a) et de l'acide ellagique (b) Les tannins hydrolysables possèdent un noyau polyol (dans la plupart des cas le D-glucopyranose) dont les fonctions hydroxyles sont estérifiées par des unités d'acide gallique. Une forme simple de ce type de tannin est le pentagalloylglucose (Figure 22) qui est très réactif et qui est à l'origine de la 32 plupart des formes plus complexes (par exemple la castalagine chez le châtaignier) ; 0 OH OH HO, ~ ( ~ / OH 0 .OH I ~T"'llali,.._\ Il HO HO 0 OLt-OS HO 0 OH HO OH OH Figure 22: Structure moléculaire du pentagalloylglucose les catéchiques (ou condensés non hydrolysables). Ils font partie de la famille des flavonoïdes qui possède un squelette en C6-C3-C6 comprenant deux cycles aromatiques (A et B) et un hétérocycle (C) (Figure 23). 5' 1 B 1 8 0 l' "î,,,,,,,,·,· 0~ ·3'· C 2 2' '1 A 6 /3 ~10 5 4 Figure 23: Squelette de base des monomères des proanthocyanidines. Ce sont des composés polyphénoliques hétérogènes qui sont des dimères, oligomères ou des polymères (Figure 24) de flavanes, flavan-3-ols, flavan-5- ols, 5-deoxy-3-flavanols et flavan-3,4-diols (Sarni-Manchado et Cheynier 2006). Les tannins condensés se divisent ainsi en plusieurs classes. Parmi eux, sont citées les prodelphinidines, constituées de (épi)gallocatéchine et des procyanidines (dérivés de l'(épi)catéchine) (Figure 25). 33 OH HO OH HO OH OH OH Figure 24: Exemple de polymères de flavan-3-ol (Sarni-Manchado et Cheynier 2006) OH 6 1 ·rBY 8 HO ...... _ - ~...... _...... _ n _. ~ -'-"' - - ...... _ .,,,, . ., ~ OH Monomères R1 R2 RJ R1 catéchine OH H H 4 ::::. épicatéchine H OH H épigallocatechine H OH OH OH épicatéchine gallate H G H 0 épigallocatéchine gallate H G OH /-...... o Jl ~ ,OH OH OH Figure 25: Structure moléculaire des monomères de flavan-3-ol 34 2.1.4. Coumarines Les coumarines tirent leur nom de « coumarou », nom vernaculaire de la fève tonka (Dipteryx odorata Wild, Fabaceae) d'où fut isolée pour la première fois en 1820 la coumarine (Bruneton, 1999). Le squelette de base des coumarines est constitué de deux cycles accolés de types C5-C3. Elles sont des 2H-1-benzopyran-2-ones, que l'on peut considérer en première approximation, comme étant des lactones des acides 2-hydroxy-Z• cinnamiques. 0 OH 0 OH Coumarine Acide 2-hydroxy-Z-cinnamique Les coumarines constituent une classe importante de produits naturels. La structure de la coumarine se trouve dans environ 150 espèces, appartenant à 30 familles de plantes différentes. Elle donne une odeur caractéristique semblable à celle du foin fraîchement fauché (Deiana, 2003 ; Booth, 2004). Les dérivés de la coumarine sont des composés ayant des propriétés anticoagulantes (Abernethy, 1969). La réaction de Pechmann (Sethna, 1953) (Figure 27) permet d'accéder à de nombreux composés possédant cette structure. Ainsi, le traitement du benzène-1,3-diol (ou résorcinol) par le 3-oxobutanoate d'éthyle (ou acétylacétate d'éthyle) en présence d'acide 4-méthylbenzènesulfonique (ou acide paratoluènesulfonique, APTS) conduit à la 7-hydroxy-4-méthylcoumarine A : HO 0 OH OHÙ + APTS 10 min : 9 = 60°( Figure 26: Réaction de Pechmann 35 2.2. Analyse structurale des polyphénols La spectrométrie de masse est une méthode physico-chimique appliquée à la détermination structurale des composés organiques. Elle permet d'accéder à la masse moléculaire d'une substance et apporte des informations structurales par le biais de l'étude des fragments moléculaires engendrés (Hoffmann et al., 1999). Aussi, permet-elle de déterminer le rapport m/z de molécules individuelles et ionisées ; et de leurs produits de fragmentations. Parmi les méthodes analytiques, la spectrométrie de masse (MS) occupe une place privilégiée grâce à ses caractéristiques : méthode hautement sensible (détection de composés à l'état de traces en quantité inférieure au milligramme}, spécifique, applicable à des mélanges complexes, combinable à de nombreuses techniques chromatographiques et possédant une grande variété d'applications (analyses chimiques qualitatives et quantitatives, interaction entre molécules, biomédecine, entre autres) (Prasain et al., 2004). 2.2.1. Principe de couplage GC-MS La GC-MS permet de séparer des mélanges de composés volatiles ou susceptibles d'être vaporisés, par suite d'équilibres entre une phase gazeuse mobile et une phase stationnaire. Elle englobe la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse (Figure 28). La silylation est un procédé idéal pour l'analyse par GC-MS des composés non volatils et thermolabiles. Comparativement à leurs composés parents, les dérivés triméthylsilylés sont plus volatiles, moins polaires et plus thermotolérants. Dans la silylation, un atome d'hydrogène actif dans -OH, -COOH, =NH,-NH2 ou -SH est remplacé par un groupe triméthylsilyle (Figure 27) (Charalampos et Michael, 2013). Les agents de silylation couramment utilisés sont le MSTFA et le BSTFA. Le principe de caractérisation est basé sur l'observation et l'identification des fragmentations. 36 (------~r3 CH3 ' )--o: + H2C-Si0 ~- 0 1 ------1 1 ',,__ )--Q:-Si--CH3 H CH3 ------IJ I H CH3 Figure 27: Silylation des composés (Knapp, 1979) 2.2.1.1. Chromatographie en phase gazeuse Elle comprend trois parties qui sont : l'injecteur. L'échantillon est introduit avec une microseringue à travers un septum en élastomère dans la chambre de vaporisation. L'injecteur a une double fonction. Il porte l'échantillon à l'état de vapeur puis il l'amène dans le flux gazeux en tête de colonne. - la colonne. Elle est placée dans une enceinte à température régulée. Elle se présente sous la forme d'un tube de silice, enroulé sur lui-même et de longueur allant de 1 à plus de 60 m. Entraînés par un gaz vecteur inerte, les analytes étudiés sont séparés en fonction de leur capacité d'interaction avec la phase stationnaire. - le détecteur. Il s'agit du module qui va permettre de détecter voire d'identifier les composés en sortie de colonne. 2.2.1.2. Mode de détection : la spectrométrie de masse Cette phase comprend : - la chambre d'ionisation. En sortie de colonne, l'intégralité des analytes entre dans la chambre d'ionisation. Le mode d'ionisation est l'impact électronique (El) dont le principe est décrit par les équations suivantes : [ M+e- ) Ces ions formés dans la source sont ensuite accélérés et focalisés par une électrode chargée positivement (le repousseur) vers l'analyseur (le quadripôle). 37 l'analyseur quadripolaire. L'étude des trajectoires suivies dans une enceinte où règne le vide, permet de déterminer le rapport (m/z) de l'ion. En balayant les amplitudes U et V, la trajectoire des ions peut être stabilisée ou destabilisée en fonction de leur rapport m/z. Seuls les ions qui ont une trajectoire stable vont pouvoir traverser le quadripôle et arriver au détecteur, les autres étant éjectés ; le détecteur. Il recueille les ions séparés par l'analyseur en fonction de leur rapport m/z. Puis un ordinateur va assurer le traitement des données et fournir un spectre de masse. L'EI est un procédé reproductible qui permet des comparaisons spectrales à l'aide de bibliothèques de spectres (NIST). colonne r -1- 'r ~1 1 LJ F =l·l'YJ'D:~wl ~I 1 1 collectaur de fractions 1 l J ~)('\. ~acultatif) ~-J 1 1 thermostct 1 ~ pa-eillage électronique enregistrement et traitement des données impression du ctrromiilfogramme Figure 28: Principe de fonctionnement du couplage GC-MS 2.2.2. Couplage chromatographie-spectrométrie de masse Les possibilités de couplage avec des techniques chromatographiques ont fait le succès de l'analyse par MS des polyphénols (Stobiecki, 2000). La chromatographie en phase gazeuse (GC) couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) est très peu utilisée pour l'analyse des polyphénols en général et en particulier celle des flavonoïdes car les flavonoïdes glycosylés sont très peu volatils. Avec le développement des sources d'ionisation à pression atmosphérique, l'introduction de l'échantillon en phase liquide permet 38 un couplage facile avec la chromatographie liquide. L'ionisation par electrospray (ESI) conduit ainsi à un spectre assez simple, avec la présence d'ion moléculaire [M+Ht ou [M-Hr, Le couplage de la chromatographie liquide et de la spectrométrie de masse (LC-MS) est devenu la technique la plus efficace et de ce fait, la plus utilisée pour l'analyse des polyphénols dans des mélanges complexes (facilité de mise en œuvre et disponibilité d'appareils de routine performants et abordables). Les techniques de couplage sont plébiscitées car ne nécessitant pas d'étapes de purification préalable des composés. Elles représentent un gain de temps important surtout lorsque les quantités d'échantillons disponibles sont faibles (Cuyckens et Claeys, 2004). Il existe de nombreux exemples de l'application de cette technique pour l'analyse de mélanges de produits naturels complexes et, en particulier, de mélanges de flavonoïdes (Exarchou et al., 2005 ; Lee et al., 2005 ; Sannomiya et al., 2005 ; Shahat et al., 2005 ; Colombo et al., 2006). Le couplage LC-MS fournit en fonction du type de technique de masse employée, divers éléments relatifs à la masse moléculaire de chaque constituant d'un mélange mais également des informations découlant du comportement en LC (temps de rétention en fonction du type de colonne), de l'absorbance UV et permet des comparaisons avec des standards ou des données préalablement acquises. C'est la technique de choix pour caractériser rapidement sans séparation chimique les éléments d'un mélange de composés naturels pour savoir s'ils sont ou non, déjà connus et s'ils méritent les ressources requises pour leur isolement et leur détermination structurale (Constant et al., 1997 ; Prasain et al., 2004). Les informations apportées par la fragmentation sont primordiales pour une identification partielle d'un mélange complexe (Wolfender et al., 2000 ; Cuyckens et Claeys, 2004). Pour l'identification de composés inconnus, la LC-MS à détection UV permet une identification rapide de la classe de polyphénols et est appliquée préalablement à une grande variété de LC-MS/MS ou LCMSn. Ces techniques sont aussi employées pour l'analyse quantitative (Careri et al., 1999 ; Merken et Beecher, 2000). 39 2.2.3. Eléments d'identification des flavonoïdes par spectrométrie. L'interprétation de la fragmentation des flavonoïdes par spectrométrie de masse permet d'accéder à de nombreux éléments utiles pour leur détermination structurale. Cela permet notamment d'établir la distribution des fragments générés entre les cycles A et B de la génine. L'étude minutieuse des schémas de fragmentation peut aussi aider à déterminer la nature, l'enchaînement et le site d'attache des oses portés par la génine. Dans le cas des flavonoïdes 0-glycosylés, est utilisée la nomenclature de Dornon et Costello reprise par Cuyckens et Claeys (2004) : Y O désigne l'ion de la génine et Y n, l'ion de la génine portant n monoglycosides (Figure 29). Pour les génines, les notations i,jA± et i,jB± sont utilisées pour désigner les ions primaires produits contenant les cycles, respectivement A et B, intacts (i et j désignant les liaisons qui ont été scindées). Yo OH -r: B 1 1 ,O-: ~ 1 1 1 1 1 1 OH OH 1 OH 1 1 1 1 OH 0 ~ 1,3A Figure 29: Nomenclature simplifiée utilisée pour désigner les fragments des flavonoïdes (Ma et al., 1997; Cuyckens et Claeys, 2004) Ma et al., (1997) ont étudié les voies de fragmentation en mode positif des génines de flavones et flavonols et ont permis de mettre en évidence les fragments caractéristiques de ces deux classes de flavonoïdes en interprétant les valeurs m/z de ces fragments (Figure 30). 40 R R HO HO OH .\. -CO 1,48+ - 2H - 1,48+ - 2H - CO 0 Flavones R 1'3A+ •29+ o,48+ o,48+-H 0 2 1 Flavanones R 1,3A+ .48+-2H-CO i,49+_H2 Apigénine H 153 121 163 145 119 147 Lutéoline OH 153 137 179 161 Naringénine OH 153 OH Flavonols Kaempférol H H 153 137 133 121 Quercétine OH H 153 137 146 137 Mvricétine OH OH 153 137 165 153 Figure 30: Voies de fragmentations caractéristiques en mode positif des flavones, flavanones et flavonols (Wolfender et al., 2000). 3. Activités biologiques des polyphénols. La principale caractéristique des polyphénols est qu'ils sont des agents antioxydants très puissants (Pietta 2002, Frei et Higdon 2003, Oszmianski et al., 2007). Ils désactivent en effet, les radicaux libres via trois mécanismes (Benaissa, 2012): transfert d'atome d'hydrogène (HAT, hydrogen atom transfer) L'antioxydant phénolique agit avec le radical libre par transfert d'un atome d'hydrogène via la rupture homolytique de la liaison 0-H. 41 -~ HAT RH_;' ~R R. +H -Oo1 /4 ~ R' Bien que cette réaction donne naissance à un autre radical libre, celui-ci est moins réactif. - transfert mono-électronique d'électron (SET, single electron transfer) Dans ce mécanisme, un électron est transféré au radical libre R". L'anion R- et le cation R+· ainsi formés sont généralement des entités stables. H-Oo SET R. + 1 ,,,; .,,r.,,r R' Chélation des métaux de transition Cette chélation sert à empêcher la production du radical hydroxyle à partir du peroxyde d'hydrogène en présence du métal Cu ou Fe (réaction de Fenton) (Wardman, 1996) dans les milieux biologiques. OH HO OH 0 Quercetine Cette même activité antioxydante permet aux polyphénols de réguler les radicaux bon ou mauvais (qui peuvent être les deux), comme l'oxyde nitrique qui favorise une bonne circulation sanguine, coordonne l'activité du système immunitaire avec celle du cerveau et module la communication entre les cellules de ce dernier (Srivastava et al., 2000 ; Kenny et al., 2007). En raison de ces vertus, les composés phénoliques sont largement utilisés dans les 42 domaines thérapeutiques et pharmaceutiques. Les exemples de quelques composés phénoliques et de leurs activités biologiques sont récapitulés dans le tableau 2. Tableau 2: Propriétés biologiques de quelques polyphénols dans l'organisme (Nsemi, 2010) Pol,œhénols Activités biolo2!9ues Acides phénols Antibactériennes, antiulcéreuses, ( cinnamiques et antiparasitaires antifongiques, benzoïques) antioxydantes Coumarines Protectrices vasculaires, anti• inflammatoires, antiparasitaires analgésiques et antioedémateuses Flavonoïdes Antitumorales, antiparasitaires, vasodilatoires, antibactériennes, anticarcinogènes, antiinflammatoires, analgésiques, hypotenseurs, antivirales, diurétiques, ostéogène, antioxydantes, antiatherogéniques, antithrombotique, antiallergique Tannins galliques et Antioxydantes catéchiques Li_ananes Anti-inflammatoires, analgésiques V. Généralités sur les minéraux La lutte contre la plaque dentaire a été pendant longtemps la seule thérapeutique efficace pour prévenir les caries. Par la suite, des auteurs ont imaginé qu'il pouvait aussi être utile de renforcer l'émail dentaire pour le rendre plus résistant aux attaques des acides organiques produits par le métabolisme glycolytique des bactéries colonisant l'émail. Selon Robinson C. (Adou, 1999), la phase minérale de l'émail n'est pas constituée uniquement de calcium, de phosphore, d'oxygène et d'hydrogène comme l'indique la formule de l'hydroxyapatite : Ca10(P04)6(0H)2. On y trouve également du fer, du sodium, du potassium ... Indispensables à la santé et à la croissance, les minéraux sont divisés en deux groupes (Yaya, 1982): les macro-éléments comme le sodium, le calcium, le potassium, le phosphore, le magnésium et les oligo-éléments comme le fer, le cuivre, le zinc, le sélénium, le manganèse, le fluor, le chrome, 43 ces derniers devant être apportés en de très faibles proportions à l'organisme mais restant toutefois indispensables à celui-ci. Les minéraux possèdent quatre grands types d'actions : action catalytique: elle est primordiale. Un seul oligo-élément est en général suffisant pour activer une enzyme composée de plusieurs dizaines ou centaines d'atomes ; action hormonale: par exemple, l'iode entre dans la composition des hormones thyroïdiennes et a un effet régulateur sur la thyroïde ; action plastique : le calcium et le phosphore assurent la rigidité du tissu osseux ; rôle constitutif du silicium dans le tissu conjonctif ... action sur les canaux ioniques : l'insuffisance de magnésium par exemple entraîne l'hyperexcitabilité des neurones et augmente la sensibilité au stress. 1. Macro-éléments Les macro-éléments ne constituent pas une source énergétique, mais ils sont indispensables à la vie. Ils entrent dans la composition des tissus, participent à la conduction de l'influx nerveux, au fonctionnement musculaire, aux réactions enzymatiques (Roussel et al., 2002). Ils sont présents en quantités importantes dans le corps humain dont ils représentent 4% du poids. Ces éléments sont éliminés régulièrement au niveau des reins et notre alimentation doit en apporter chaque jour des quantités suffisantes. 1.1. Calcium Le calcium entre dans la structure et la constitution du squelette et des dents (Delmi et al., 1990), mais aussi dans le bon fonctionnement des systèmes cardiovasculaire et nerveux en régulant le rythme cardiaque, la coagulation du sang, la gestion du sommeil, dans la protection de la peau et agirait contre le risque de cancer du colon ou du rectum. Assimilé grâce à la vitamine D et aux sucs gastriques, son dépôt sur les os se fait par le biais des vitamines A, Cet D. Le déficit en calcium se manifeste par des crampes, des caries, du rachitisme, de l'ostéomalacie, de l'ostéoporose et de la nervosité. 44 1.2. Magnésium Le magnésium est utile dans la production d'énergie, dans la synthèse de protéines, dans la contraction musculaire, dans la transmission de l'influx nerveux. Il lutte contre la formation de calculs et la calcification des vaisseaux et surtout, régule le métabolisme du calcium, du glucose, du phosphore, du magnésium, de la vitamine C et du potassium. Sa carence dans l'organisme entraîne crampes, insomnies, irritabilité, diarrhées et faiblesse musculaire. 1.3. Phosphore Le phosphore se lie au calcium dans le squelette. Il est primordial dans le métabolisme calcique, entre dans la composition de l'ATP qui est une source d'énergie très importante pour la cellule. Egalement, c'est un constituant de la membrane cellulaire et un composant de la myéline qui entoure les fibres nerveuses. Les carences en phosphore, toutefois rares car celui-ci est largement présent dans l'alimentation, se manifestent par une faiblesse musculaire, un fourmillement des extrémités, une respiration irrégulière ou encore une diminution des réflexes. 1.4. Potassium Il joue un rôle dans la régulation du rythme cardiaque et de la pression artérielle, dans la teneur en eau de l'organisme, dans l'excitabilité neuromusculaire, contre les crampes et stimule la sécrétion d'insuline. Chez les alcooliques et les patients sous certains diurétiques ou laxatifs, des carences peuvent être observées. 2. Oligo-éléments. Ethymologiquement, ce sont des minéraux présents en très petite quantité dans l'organisme (oligo signifie peu en Grec). Une carence d'un de ces éléments montre cependant qu'ils sont essentiels pour la santé mais on ne connaît pas encore précisément leur fonction dans l'organisme. 2.1. Cuivre Le cuivre facilite l'absorption du fer et donc la formation de l'hémoglobine. Il est antioxydant, antihistaminique, protège des effets néfastes 45 du cadmium et joue un rôle dans la pigmentation de la peau. Une fatigue, une anémie, une dépigmentation, un essoufflement caractérisent une carence tandis qu'une insomnie, de l'hypertension ou des règles irrégulières se rapprochent d'une surcharge, souvent liée à la prise de tabac, mais bien corrigée par l'apport de zinc. 2.2. Fer Il est présent dans la myoglobine et dans l'hémoglobine, il prévient la fatigue, guérit l'anémie ferriprive et aide à lutter contre les maladies. Les carences en cet oligo-élément sont caractérisées par une moins bonne résistance aux infections et augmentent le risque d'anémie, d'asthénie, de pâleur, de formation de radicaux libres, de tumeurs, en particulier chez la femme chez qui les pertes sont régulières (pertes menstruelles, grossesse). Diabète « bronze », hypertension, hémochromatose sont les signes d'une surcharge en fer, celle-ci étant toxique pour le foie. 2.3. Zinc Il intervient dans la synthèse de l'ADN, de l'ARN et des protéines, est nécessaire au développement des organes reproducteurs, régule la glycémie, l'insulinémie, les contractions musculaires, entre dans la composition de certains types d'enzymes. De plus, cet oligo-élément est un antioxydant puissant. Le zinc stimule le système immunitaire, aide à la guérison des plaies, participe au maintien des capacités visuelles, olfactives et gustatives (Hambidga, 1981 ), neutralise la surcharge en cuivre et aide à éliminer le cadmium apporté par les cigarettes. De ce fait, la carence est particulièrement grave, notamment chez les personnes prenant des diurétiques, de l'alcool ou ayant un mode de vie végétarien. 46 Chapitre II: :M.atérie{ et méthodes 47 1. Matériel 1.1. Matériel végétal Le matériel végétal a été récolté le 1er juillet 2010 à Longorola (Région de Sikasso/Mali) puis identifié le 04 juillet 2010 par le Professeur Laurent AKE• ASSI au Centre National de Floristique (CNF) d'Abidjan, sis à l'Université Félix Houphoët Boigny Cocody-Abidjan (Côte d'Ivoire (Cl)). Il est constitué de tiges de : Erythroph/eum africanum et Swartzia madagascarensis (FABACEAE), Guiera senegalensis et Terminalia albida (COMBRETACEAE), Prosopis africana (MIMOSACEAEJ, Pseudocedrela kotschyi (MELIACEAE) et Zanthoxylum zanthoxyloïdes (RUTACEAE). Les tiges ont été séchées puis pulvérisées à l'aide d'un broyeur électrique (Marque RETSCH, type SM 100) aux fins d'obtenir des poudres qui ont servi à réaliser les analyses chimiques et biologiques. 1.2. Matériel chimique Les solvants et les réactifs utilisés ont été achetés dans le commerce chez Polychimie (Côte d'Ivoire) et Sigma Aldrich (France) et sont de qualité analytique. Pour la Chromatographie sur couche mince, ont été utilisées des chromatoplaques en gel de silice 60 F254 sur support aluminium (Merck). 2. Méthodes 2.1. Méthodes chimiques Pour le criblage phytochimique, nous avons utilisé les méthodologies décrites dans les travaux de Lebreton et al., (1967) ; Gmira (2003) ; Dohou et al., (2003) ; Békro et al., (2007) ; Koffi et al., (2008) ; Kadja (2009). Le dosage des polyphénols totaux a été réalisé suivant la méthode de Singleton et Rossi (1965). La quantification des flavonoïdes totaux a été faite suivant la méthodologie de Hariri et al., (1991). Celles des anthocyanes et des aglycones flavoniques ont été déterminées conformément à la méthode de Lebreton et al., (1967) reprise par Kadja et al., (2011 ), N'gaman (2013). L'étude de l'activité antioxydante des drogues vis-à-vis du radical libre 1, 1-diphényl-2-picrylhydrazyle (DPPH), a été réalisée selon la méthode de 48 Blois (1958) reprise par Koffi (2009), Kadja et al., (2011 ), et N'gaman (2013). 2.1.1. Quantification des éléments minéraux La quantification .des minéraux a été effectuée au Centre d'Analyses et de Recherche (CAR) du laboratoire de PETROCI (Abidjan-Côte d'Ivoire). L'incinération des poudres végétales a été faite à 550°C pendant 24h. Elle a été réalisée dans un four de marque Naberthern MORE THAN HEAT au Centre National de Recherche Agronomique (CNRA/Bingerville (Cl)). Une fois récupérées, les cendres ont été analysées à l'aide du Microscope Electronique à Balayage (MEB) Pression Variable de la D.C.AR. (MEB FEG Supra 40 VP Zeiss ; voltage variable 0, 1 kV à 30 keV), équipé d'un détecteur de rayons-X (OXFORD Instruments) qui est relié à une plateforme de microanalyseur EDS (Inca Dry Cool, sans Azote liquide) (Figure 31 ). Pour le calibrage, une sonde de 30 mm à 120 mm de diamètre a été choisie. Un grossissement a été fait de sorte à observer un maximum de particules (grossissement : 12 x à 1 000 OOOx) avec une résolution de 2 nm. Figure 31: Microscope Electronique à Balayage (MES) 49 2.1.2. Détection, caractérisation et quantification des métabolites secondaires Les tests de détection et de caractérisation des métabolites secondaires ont été réalisés au LCBOSN. 2.1.2.1. Délipidation au Soxhlet 1 O g de poudre végétale sont intimement mélangés avec 2 g de Na2S04 anhydre. Le mélange obtenu est introduit dans une cartouche de Wattman, recouverte de coton puis l'ensemble est mis dans une chambre d'extraction connectée à un ballon à col rodé ; lequel est rempli au 3/4 de son volume avec de l'éther de pétrole. Un réfrigérant est adapté au-dessus de la chambre d'extraction. Le Soxhlet est chauffé sur une calotte chauffante pendant 3 h. Le marc est récupéré (Figure 32) puis séché pour être utilisé pour le criblage phytochimique. _10_:g:_d_ep,o_ud_r_e=-:::-:.- : . - . - . • Délipidation au soxhlet Marc 1 1 Extrait éther de pétrole Figure 32: Schéma de la délipidation au soxhlet 2.1.2.2. Criblage phytochimique 2.1.2.2.1. Tests par des réactions colorées 2.1.2.2.1.1. Détection des quinones libres 1 g de marc est macéré dans 20 ml de CHCl3; ensuite à 2 ml de l'extrait concentré prélevés sont additionnées quelques gouttes de NaOH (1/10). Le virage de la phase aqueuse au jaune, rouge ou violet indique la présence de quinones libres. 2.1.2.2.1.2. Détection des anthraquinones 1 g du marc est macéré dans 20 ml de CHCl3 pendant 4 h. Après filtration, à 2 ml du macéré prélevés sont ajoutés 2 ml de KOH à 10% (m/v). 50 Après agitation, la présence des anthraquinones est mise en évidence par un virage de la phase aqueuse au rouge. 2.1.2.2.1.3. Détection des stérols et polyterpènes par le test de Liebermann-Bürchard Une quantité aliquote d'extrait hexanique du marc introduite dans un tube à essai est dissoute à chaud dans 1 ml de (CH3C0)20. 0,5 ml de H2S04 concentré est coulé lentement sur les parois du tube à essai. L'apparition d'une coloration violette virant au bleu puis au vert indique une réaction positive. 2.1.2.2.1.4. Détection des saponines 2 g de marc sont utilisés pour préparer une décoction avec 100 ml d'eau distillée qui est portée à ébullition pendant 30 min. Après refroidissement et filtration le volume est réajusté à 100 ml. A partir de cette solution mère, 10 tubes à essai (1,3 cm de diamètre interne) avec 1, 2, ... 10 ml sont préparés. Le volume final étant réajusté à 10 ml avec de l'eau distillée pour tous les tubes. Chaque tube est agité avec énergie en position horizontale pendant 15 s. Après 15 min de repos en position verticale, la hauteur de mousse persistante en cm est relevée. Si elle est proche de 1 cm dans le xe tube, alors l'indice de mousse est calculé par la formule suivante : lm= 1000/xe. La présence de saponines est confirmée si lm> 100. 2.1.2.2.1.5. Détection des protéines : réaction de Biuret Dans un tube à essai, une quantité aliquote d'extrait hydrométhanolique 80% (v/v) du marc est reprise dans 2 ml de NaOH aqueux à 20% (m/v) à laquelle sont additionnées 2 à 3 gouttes d'une solution aqueuse à 2% (m/v) de CuS04. L'apparition d'une coloration violette tantôt avec une teinte rougeâtre indique une réaction positive. 2.1.2.2.1.6. Détection des polyphénols A 2 ml d'extrait hydrométhanolique 80% (v/v) du marc, sont additionnées quelques gouttes d'une solution aqueuse de FeC'3 à 2% (v/v). 51 L'apparition d'une coloration bleu-noir ou vert-noir indique la présence de polyphénols. 2.1.2.2.1. 7. Détection des coumarines 1 g de marc est introduit dans un tube à essai en présence de 10 ml d'eau distillée. Le tube à essai est recouvert avec un papier filtre imbibé de NaOH à 10% (m/v) puis est porté à ébullition. Toute fluorescence jaune témoigne de la présence de coumarines après visualisation sous lumière UV à 366 nm. 2.1.2.2.1.8. Détection des flavonoïdes 1 g du marc est macéré dans 10 ml de MeOH à 80% (v/v) pendant 30 min. Après filtration, on ajoute à 1 ml de l'extrait végétal hydrométhanolique 3 à 5 gouttes d'une solution à 10% (m/v) de (CH3C00)2Pb basique. L'apparition d'une coloration jaune indique la présence de flavonoïdes. 2.1.2.2.1.9. Détection des tannins 1,5 g de marc sont introduits dans 10 ml de MeOH à 80% (v/v). Après 15 min d'agitation, l'extrait est filtré et mis dans un tube à essai. L'ajout de FeCl3 à 10% (m/v) permet de détecter la présence ou non de tannins. La couleur du milieu réactionnel vire au bleu noir en présence de tannins galliques ou bien au brun-verdâtre en présence de tannins catéchiques. Test à la gélatine. Test de confirmation de tannins A 2 ml de l'extrait hydrométhanolique, la solution de gélatine à 1 % (m/v) est ajoutée goutte à goutte. En présence des tannins, on observe un trouble qui disparaît en présence d'excès de gélatine. 2.1.2.2.1.10. Détection des alcaloïdes • Test de Draqendor'ff Dans un tube à essai contenant 1 ml d'extrait végétal méthanolique, sont ajoutées deux gouttes de réactif de Dragendor'ff (mélange à volumes égaux d'une solution A contenant 0,85 g de nitrate basique de bismuth et 10 g d'acide tartrique dans 40 ml d'eau distillée; et d'une solution B contenant 16 g 52 d'iodure de potassium dans 40 ml d'eau). L'apparition d'un précipité rouge• orangé ou brun rougeâtre indique un test positif. • Test de Bürchard Dans un tube à essai contenant 1 ml d'extrait végétal méthanolique, sont ajoutées deux gouttes de réactif de Bürchard [mélange à volume égal (5 ml) d'acide sulfurique pur et d'anhydride acétique auquel on ajoute 50 ml d'éthanol absolu. La préparation étant effectuée à 0°C]. L'apparition d'un précipité brun indique un test positif. 2.1.2.2.1.11. Détection des composés réducteurs • Test de Fehling Dans un tube à essai contenant 2 ml de liqueur de Fehling [(constituée de 2 solutions A (1,73 g de Cu2S04 dans 25 ml d'H20 distillée) et B (8,5 g de tartrate double de potassium et de sodium + 2,5 g de NaOH dans 25 ml d'H20 distillée)] à volumes égaux, sont additionnées quelques gouttes d'extrait végétal méthanolique. La formation d'un précipité rouge brique indique une réaction positive. Le mélange réactionnel peut être chauffé au bain-marie pendant 3 min à 60°C. • Test de Ta/Jens Dans un tube à essai contenant 2 ml de réactif de Tollens (composé d'un mélange à volumes égaux de Na OH à 10% (m/v) et d'une solution de AgN03 (5 g de AgN03 dissous dans 50 ml d'H20 distillée), sont introduites quelques gouttes d'extrait végétal méthanolique. La formation d'un miroir d'argent indique une réaction positive. 2.1.2.2.2. Tests de détection par CCM 2.1.2.2.2.1. Détection des coumarines 1 g de marc sont mélangés à 20 ml de CHCl3. Après 2 à 3 min de chauffage et filtration, l'extrait chloroformique est soumis à une CCM ; le solvant de migration a été le mélange AcOEU PhCH3 (1/9,3 : v/v). La visualisation du chromatogramme, est faite à 366 nm sous lumière UV en absence et en présence de vapeurs de NH3 qui se dégagent de NH40H à 25% (v/v). 53 2.1.2.2.2.2. Détection des flavonoïdes 1 g de marc est macéré dans 20 ml de MeOH à 80% (v/v). Après agitation pendant 30 min, l'extrait est filtré et le filtrat est soumis à une CCM, avec comme solvant de migration le gradient CHCliMeOH/H20/AcOH (10/1,5/0,3/0,3 ; v/v/v/v). La révélation sous UV a été faite à 366 nm après pulvérisation avec le réactif de Neu (mélange conservé à 4 °C, obtenu en dissolvant 1,5 g de diphénylboryloxyéthylamine et 2,5 g de polyéthylène glycol respectivement dans 50 ml de MeOH et 50 ml d'EtOH). Ce réactif révèle les flavonoïdes sous forme de taches fluorescentes diversement colorées (bleu, orange, vert, rouge et jaune). 2.1.2.3. Analyses quantitatives 2.1.2.3.1. Dosage des polyphénols totaux A 1 ml d'extrait végétal méthanolique dilué 50 fois, sont ajoutés 1,5 ml d'une solution de Na2C03 à 17% (m/v) et 0,5 ml de réactif de Folin (0,5 N) (Annexe 1 ). L'ensemble est incubé à la température ambiante pendant 30 min ; l'absorbance est mesurée à 720 nm au moyen d'un spectrophotomètre UV visible (KONTRON instruments, type: UVIKON 922 A) contre un blanc sans extrait végétal pris comme référence. La quantification des polyphénols est faite en fonction d'une droite d'étalonnage linéaire (y=ax+b) réalisée par un extrait d'étalon "acide gallique" avec un gradient de concentrations (de 0, 1 à 1 µg/ml) dans les mêmes conditions que l'échantillon. Les résultats sont exprimés en µg équivalent d'acide gallique par gramme de la masse sèche de plante en poudre. 2.1.2.3.2. Dosage des flavonoïdes totaux 1 g de marc est mis en présence de 100 ml de MeOH à 80% (v/v). Après agitation pendant 30 min, 1 ml d'extrait végétal prélevé est mélangé à 50 µL de réactif de Neu et 12 ml de MeOH pur. Le dosage des flavonoïdes est effectué au spectrophotomètre (KONTRON instruments, type : UVIKON 922 A). L'absorbance est déterminée à 404 nm au moyen du spectrophotomètre UV visible et comparée à celle du quercétol pris comme standard: 1 ml de quercétol (0,05 mg/ml) et 12 ml de MeOH pur. Le 54 pourcentage de flavonoïdes totaux est calculé en équivalent quercétol suivant la formule: [ %F = (0,05 x A,,.! Aq) x 100 / c.:{°/o) ) Aext: Absorbance de l'extrait A.q : Absorbance du quercétol Cext: Concentration de l'extrait en poudre, soit 10 mg/ml. 2.1.2.3.3. Dosage des anthocyanes A 2 g de marc sont additionnés 160 ml de HCI (2N) dans des Erlens placés au bain-marie à 100°C pendant 40 min. Après refroidissement et filtration, les anthocyanes et les aglycones sont extraits. D'abord le filtrat aqueux est soumis 2 fois à l'éther éthylique pour extraire les aglycones flavoniques de couleur jaune qui est évaporé sous une hotte ventilée, puis repris dans quelques millilitres d'éthanol pur. Ensuite le filtrat aqueux est traité 2 fois par n-BuOH qui extrait les anthocyanidols dont la couleur est rouge. Le dosage des anthocyanes a été fait en balayant le spectre de 480 à 600 nm et en retenant l'absorbance maximale. La teneur en anthocyanes est calculée selon la formule suivante : Îanthocyanes = (yA /t) X MX V X d / p (en mg/ g) y: Facteur de correction, égale à 6, du rendement de la transformation des proanthocyanes (de l'ordre de 17 %) A : Absorbance à la longueur d'onde d'adsorption maximale E : Coefficient d'absorption molaire du cyanidol (34 700 L/mol) M : Masse molaire du Leucocyanidol (306 g/mol) V : Volume de la solution n-BuOH (ml) d : Facteur de dilution P : Masse de la matière sèche du matériel végétal hydrolysé (g) 2.1.2.3.4. Dosage des aglycones flavoniques Le dosage différentiel au moyen d'un spectrophotomètre UV visible (KONTRON instruments, type: UVIKON 922 A) des flavones et des flavonols 55 est effectué en se basant sur les propriétés chélatantes d'AICl3 à 1 % (m/v) dans EtOH pur. Après 10 min de repos, le spectre est balayé de 380 à 460 nm, et l'absorbance maximale est retenue. L'absorbance du pic différentiel contre un blanc sans AICl3 est proportionnelle à la concentration de l'échantillon en aglycones flavoniques. La teneur en aglycones, exprimée en équivalence de quercétol, est calculée selon la formule suivante: ( T,glycooes = (A /t) X MX V X d I P (en mg/ 9) l A : Absorbance du pic différentiel E : Coefficient d'absorption molaire du quercétol (23000 L/mol) M : Masse molaire du quercétol (302 g/mol) V: Volume de la solution éthanolique d'aglycones (ml) d : Facteur de dilution P: Masse de la matière sèche du matériel végétal hydrolysé (g) 2.1.3. Evaluation de l'activité antioxydante par le test au DPPH Le DPPH est solubilisé dans l'EtOH absolu pour avoir une solution de 0,3 mg/ml. Différentes solutions de concentrations de chaque échantillon végétal (0,5 mg/ml, 0, 1 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,01 mg/ml et 0,001 mg/ml) sont préparées avec l'EtOH absolu. Dans des tubes à essai contenant 2,5 ml d'extrait végétal de concentration donnée, est ajouté 1 ml de DPPH. Les tubes sont incubés pendant 30 min dans l'obscurité et les lectures de l'absorbance sont faites à 517 nm (longueur d'onde maximale du DPPH) avec un spectrophotomètre (KONTRON instruments, type : UVIKON 922 A). Le contrôle positif est représenté par une solution d'un antioxydant naturel (la vitamine C) et d'un antioxydant de synthèse le buthylhydoxytoluène (BHT) pris comme référence (Bernfeld, 1955). Le pourcentage d'inhibition du DPPH qui n'est autre que l'activité antioxydante de chaque extrait végétal à tester, est calculé par la formule suivante : %1 = [(Ab -Ae) / Ab] X 100 56 %/ = pourcentage d'inhibition Ab= absorbance du blanc Ae = absorbance de l'échantillon 2.1.4. Analyse des composés phénoliques par GC-MS et LC-MS L'analyse des composés phénoliques par GC-MS (SHIMADZU, modèle QP201 OSE) a été faite au laboratoire de chimie organique à l'Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Montpellier (ENSCM). Celle faite par LC-MS avec un système de chromatographie liquide ultra haute performance (UPLC) Acquity de Waters et une trappe ionique (IT) AmaZon X de Bruker avec une source d'ionisation en électrospray (ESI) a été réalisée à l'Institut National de la recherche agronomique (INRA) de Montpellier. 2.1.4.1. Analyse par GC-SM Une hydrolyse acide de 10 g de marc est réalisée dans 200 ml de HCI (2N) pendant 2 h. Après refroidissement et extraction liquide-liquide par l'acétate d'éthyle, la phase organique est concentrée sous vide et séchée sous azote. A 3 mg de cette fraction sont additionnés 0,5 ml de CH2Cl2 distillé et 0,2 ml de N-méthyl-N-triméthylsilyltrifluoroacétamide (MSTFA). Après 12 h d'incubation à la température ambiante, le mélange CH2ClrMSTFA est évaporé à l'évaporateur rotatif (Rotavapor R Il BUCHI) puis séché. Le résidu sec est repris avec 1 ml de CH2Cl2 dans un pilulier pour être injecté en GC• MS (Figure 33). Les librairies nist 98 et Wiley 275 ont servi à identifier les différents pics caractéristiques. 57 10 g de marc 1. 200 mL de HCl (2N) chauffage à . _. _. _. _. _. _. _. _..,. ébullition pendant 2h 2. Filtration Extrait aqueux acide Extraction liquide-liquide 3 fois à l'acétate ·-·-·-·-·-·-·-·- •... d'éthyle Test négatif avec la liqueur de Phase aqueuse Phase organique ~·-·-..,. fehling 1 . - . - . - . - . - . • Concentration et séchage 1 T Test positif avec la liqueur de fehling Marc 3 mg du marc + 0,5 mL de CHiClz distillé + ·-·-·-• 0,2mLdeMSTFA Concentration après les 12h d'incubation Résidu sec : : - · - · - · - · - · - · • Récupération avec 1 mL de CH2Clz 1 1 TT ·-·-·-·-·-·-·-·-·-·-·-·-·-·-·-·-·-·1 i Injection 1 µL de l'échantillon en GC-MS j Figure 33: Schéma synoptique de l'extraction des échantillons injectés 2.1.4.2. Analyse LC-MS 10 g de marc de chaque espèce végétale sont macérés dans 200 ml d'acétone (70%, v/v) sous agitation magnétique pendant 4 h. Après filtration, le filtrat est concentré sous vide puis lyophilisé. 1 mg d'échantillon prélevé du marc obtenu, est repris dans 1 ml d'un mélange H20/CH30H (v/v), ensuite l'ensemble est solubilisé au vortex, filtré à l'aide d'un filtre jetable de 0,2 µm de porosité, puis dilué au 1/10e pour injection. Les injections sont réalisées en couplage LC-MS avec un système de chromatographie liquide ultra haute performance (UPLC) Acquity de Waters et une trappe ionique (IT) AmaZon X de Bruker avec une source d'ionisation en électrospray (ESI). La colonne utilisée est en phase inverse C18 Waters Acquity BEH 150x1 mm, avec des particules de 1,7 µm de diamètre. La température de colonne est fixée à 35°C. Les solvants A et B respectivement de composition H20 + 1 % HC02H et CH30H + 1 % HC02H, sont utilisés avec 58 un débit de 0,08 ml/min. 0,5 µL de chaque échantillon est injecté et le gradient d'élution est le suivant : Temps (min) 0 10 12 25 30 35 38 43 % B 2 30 30 75 90 90 2 2 Les spectres UV-visible sont enregistrés de 250 à 600 nm, avec un pas de 2 nm. Les spectres de masse sont acquis en mode positif et en mode négatif, sur une gamme de masse de 70 et 1000 u.m.a. Deux blancs sont injectés avant les échantillons, pour stabiliser la colonne. Chaque échantillon est injecté une fois en mode positif puis en mode négatif et un blanc est intercalé entre chaque échantillon. 2.2. Méthodes biologiques Les tests biologiques ont porté sur des souches bactériennes et cancéreuses, provenant de la société American Type Culture Collection (ATCC). Ils ont été réalisés dans les laboratoires respectivement de microbiologie de l'université Montpellier 2 et de chimie structurale biomoléculaire de l'université Paris 13. 2.2.1. Activités antibactériennes 2.2.1.1. Antibiogramme réalisé par diffusion sur gélose On utilise des disques de papier filtre de 6 mm de diamètre, imprégnés avec 50 µL d'antibactérien à une concentration de 2,5 mg/ml. Le milieu de référence standard est la gélose de Mueller Hinton (MH) qui est coulée dans des boîtes de Petri. Cette gélose est ensemencée par inondation avec la bactérie à tester. Les disques sont ensuite déposés sur la gélose ensemencée en appuyant légèrement. L'ensemencement étant homogène, les bactéries vont former un voile à la surface du milieu. Les antibactériens diffusent dans la gélose et forment des zones de concentrations décroissantes autour des disques. Si la bactérie ensemencée est sensible à certains antibactériens, elle ne se développera pas autour des disques correspondant et on observera des zones d'inhibition qui seront mesurées. 59 2.2.1.2. Antibiogramme réalisé sur plaque de microtitration La concentration initiale de chaque extrait hydroacétonique du marc est de 2,5 mg/ml. Préalablement, des précultures over night de bactéries ont été préparées. La culture est agitée à 37°C jusqu'à une D0600 entre 0,3 et 0, 7 (3 à 4 h). On dilue la culture obtenue dans du milieu Mueller Hinton (MH) de manière à 5 obtenir une DO estimée à 0,001 (CFU/mL=5.10 ). Le remplissage de la plaque de microtitration a été fait de la manière suivante: - déposer 200 µL d'eau stérile dans tous les puits périphériques - déposer 100 µL de milieu MH dans les puits 2 à 11 des lignes 8 à F - déposer 100 µL de la solution d'antibactérien 1 dans le puits 82 ensuite homogénéiser puis prélever 100 µL de ce puits et les déposer dans le puits suivant (83). On réalise ainsi des dilutions successives au 1/2 jusqu'au puits 89. (rejeter les derniers 100 µL). Il reste ainsi 100 µL dans chaque puits - déposer 100 µL de la culture bactérienne correctement diluée dans les puits 2 à 10 - recommencer avec les autres antibactériens sur les lignes suivantes. La colonne 10 est le témoin positif avec une culture bactérienne sans antibactérien et la colonne 11 est le témoin négatif sans bactéries. On ferme la microplaque et on l'entoure de parafilm. On la place enfin à 37°C sous agitation faible toute la nuit. On teste ainsi les antibacteriens à des concentrations comprises entre 625 µg/mL et 1,2 µg/ml. Le lendemain, la CMI (concentration minimale inhibitrice) est déterminée pour chaque antibactérien. La CMI correspond à la plus faible concentration pour laquelle aucune croissance n'est observée. Pour déterminer la CMB (concentration minimale bactéricide), on prélève 10 µL dans chaque puits présentant une inhibition de croissance qu'on dépose sur une boîte de LB agar qu'on incube toute la nuit à 37°C. La CMB correspond à la plus faible concentration pour laquelle aucune colonie ne pousse sur la boîte. 2.2.2. Etude de l'activité cytotoxique Cette étude a été réalisée sur six (6) cellules cancéreuses. Ce sont : 60 - MDA-MB 231 : lignée cancéreuse humaine du sein - Caco-2 : lignée cancéreuse humaine du côlon - B16F10 et MDA-MB 435: lignées cancéreuses du mélanome - SNB75 : lignée cancéreuse du cerveau - C6 : lignée cancéreuse issues du glioblastome de rat 2.2.2.1. Cultures cellulaires Toutes les cellules ont été décongelées et cultivées dans des fioles de Roux T75 (75 crrr'). Le milieu de culture employé est un milieu «Eagle » modifié par Dulbecco (DMEM) (sigma) supplémenté par 10% (v/v) de sérum de veau fœtal (SVF) source de facteurs de croissance indispensables et 1 % (v/v) de Pénicilline Streptomycine. Lorsque les cellules sont arrivées à confluence, elles sont lavées avec du tampon phosphate PBS (9,6 g/L, pH=7,2) et détachées par trypsinisation (2 ml de solution de trypsine à 0,5% /2.6 mM EDTA, Gibco, France) pendant 5 à 10 min dans un incubateur (37°C, 5% C02). L'action de la trypsine est stoppée par un ajout de milieu de culture contenant du sérum de veau fœtal (10%); les cellules se retrouvent alors en solution. Les cellules sont récupérées par centrifugation à 800 tours/min pendant 5 min et sont comptées à l'aide d'une cellule de Mallassez. Ce comptage permet de déterminer le nombre de cellules contenues dans le milieu. Après comptage et dilution recherchée obtenue, les cellules sont réparties sur une micro plaque Nunc de 96 puits (8x12) à fond plat à raison de : - 104 cellules dans 100 µL de milieu de culture/puits pour les lignées MDA-MB 231 et 435 - 5.103 cellules dans 100 µL de milieu de culture/puits pour la lignée Caco-2 - 2,5. 103 cellules dans 100 µL de milieu de culture/puits pour la lignée B16F10 - 1,5. 103 cellules dans 100 µL de milieu de culture/puits pour les lignées SNB75 et C6 La microplaque est incubée à 37°C dans une atmosphère enrichie de 5% de C02 pendant 24 h. 61 2.2.2.2. Evaluation de la cytotoxicité Après 24h, un tapis cellulaire adhérent est obtenu et les différentes concentrations des extraits (2 mg/ml à 0, 125 mg/ml) sont ajoutées. La première colonne de la microplaque sert de référence (milieu sans cellules), la deuxième colonne sert de témoin (sans ajout d'extrait végétal à tester). Les autres colonnes sont utilisées pour mesurer l'effet des différentes concentrations d'extraits végétaux à tester. Après 72h, les puits sont vidés, lavés au PBS, puis 100 µL de DMEM + 50 µL de MTT (sel de tétrazolium) (2 mg/ml) sont ajoutés. La plaque est incubée pendant 4 h à 37° C et 5% de C02. Après incubation, les puits sont vidés, lavés au PBS et les cristaux de formazan formés sont solubilisés dans 100 µL de DMSO. L'intensité de la coloration obtenue est directement liée à la viabilité des cellules. La plaque est agitée pendant 15 min à l'air libre puis une lecture au Multiscan est réalisée (spectrophotomètre, Titertek, MCC/340) afin de mesurer l'absorbance, à 570 nm. La mesure de l'activité mitochondriale des cellules après traitement par la dose choisie d'extraits végétaux par rapport à l'activité mitochondriale des cellules non traitées, permet d'évaluer indirectement la cytotoxicité des différents extraits. Le pourcentage de viabilité est calculé suivant l'équation : PV(¾) = (Abs Essai / Abs Témoin) X 100 Avec : PV : Pourcentage de Viabilité cellulaire Abs Essai : absorbance de l'essai traité par les extraits Abs Témoin : absorbance de l'essai non traité par les extraits Le logiciel SAS a été utilisé pour faire les analyses statistiques (SAS, 1999). 62 Cliapitre III: R<. jsuftats et discussion 63 1. Quantification des macro-éléments et oligo-éléments Les résultats obtenus à l'issue de la quantification des minéraux sont consignés dans les tableaux 3-9. Tableau 3: Quantification des minéraux présents dans E. africanum en % de masse de cendres. Spectres Al Ca Cl Fe K Mg Mn p s Si Spectre 1 0,58 11,23 1,07 0,89 21,49 5,47 0,00 4,97 1, 12 1,58 Spectre 2 0,29 12,57 0,77 0,54 20,68 7,47 0,00 4,14 1,00 1,15 Spectre 3 0,33 12,24 0,77 0,70 21,18 5,49 0,15 4,33 0,77 1,42 Moyenne 0,40 12,02 0,87 0,71 21,12 6,14 0,05 4,48 0,96 1,38 Tableau 4: Quantification des minéraux présents dans G. senegalensis en % de masse de cendres. Spectres Al Ca Cl Fe K Mg Mn Na p s Si Spectre 1 0,40 17,87 1,42 0,35 18,83 7,13 0,89 0,15 3,40 1,69 0,91 Spectre 2 0,30 12,72 1,40 0,36 14,49 5,39 0,54 0,23 2,73 1, 19 0,92 Spectre 3. 0,56 15,15 2,00 0,40 18,39 6,71 0,61 0,12 3,52 1, 19 1,14 Moyenne 0,42 15,25 1,61 0,37 17,24 6,41 0,68 0,17 3,22 1,36 0,99 Tableau 5: Quantification des minéraux présents dans P. africana en% de masse de cendres. Spectres Al Ca Cl Fe K Mg Mn Na p s Si Spectre 1 0,28 9,83 0,28 0,21 27,28 6,18 0,50 0,23 3,88 1,32 0,93 Spectre 2 0,20 10,19 0,48 0,25 29,43 6,77 0,72 0,17 3,65 0,81 0,50 Spectre 3 0,16 9,16 0,27 0,14 27,21 8,76 0,65 0,00 3,32 1,04 0,87 Moyenne 0,21 9,73 0,34 0,20 27,97 7,24 0,62 0,13 3,61 1,05 0,76 Tableau 6: Quantification des minéraux présents dans P. kotschyi en % de masse de cendres. Spectres Al Ca Cl Cu Fe K Mg p s Si Ti Spectre 1 0,15 17,23 1,01 0,26 0,12 22,59 3,26 1,73 0,28 0,31 0,16 Spectre 2 0,12 16,11 0,72 0,18 0,13 19,10 3,35 1,44 0,26 0,31 0,00 Spectre 3 0,17 19,53 1,04 0,23 0,13 19,05 2,77 1,52 0,26 0,43 0,00 Moyenne 0,15 17,62 0,92 0,22 0,13 20,25 3,12 1,56 0,27 0,35 0,05 Tableau 7: Quantification des minéraux présents dans S. madagascariensis en% de masse de cendres. Spectres Al Ca Cl Fe K Mg Mn Na p s Si Spectre 1 0,75 17,57 0,53 0,70 15,55 3,63 0,21 0,26 3,17 0,81 2,75 Spectre 2 0,73 15,84 0,76 0,66 17, 11 3,23 0,21 0,19 2,84 0,73 2,78 Spectre 3 0,75 13,55 0,77 0,69 19,82 3,85 0,20 0,28 3,37 1,03 2,62 Moyenne 0,74 15,65 0,69 0,68 17,49 3,57 0,21 0,24 3,12 0,86 2,72 Tableau 8: Quantification des minéraux présents dans T. albida en % de masse de cendres. 64 Spectres Al Ca Cl Fe K Mg Mn p s Si Zn Spectre 1 0,41 18,42 0,69 0,35 19,56 5,86 0,31 3,06 0,81 1,02 0,00 Spectre 2 0,34 18,55 0,64 0,19 16,66 5,58 0,38 3,50 0,92 0,95 0,00 Spectre 3 0,54 19,64 0,58 0,28 16,72 5,22 0,18 2,97 0,84 2,20 0,19 Moyenne 0,43 18,87 0,64 0,27 17,65 5,55 0,29 3,17 0,86 1,39 0,06 Tableau 9: Quantification des minéraux présents dans Z. zanthoxyloides en % de masse de cendres. Spectres Al Ca Cl Fe K Mg Mn p s Si Ti Spectre 1 0,27 21,02 0,29 0,15 14,46 7,33 0,22 3,62 0,57 0,60 0,00 Spectre 2 0,31 21,12 0,33 0,25 13,06 7,17 0,17 2,92 1,43 0,53 0,00 Spectre 3 0,25 22,98 0,26 0,20 13,38 6,77 0,17 2,96 0,63 0,69 0,13 Moyenne 0,27 21,70 0,29 0,20 13,63 7,09 0,19 3,17 0,88 0,61 0,04 Les tableaux 3-9 et les spectres (Annexe 2) montrent en général la présence des éléments Aluminium (Al), Calcium (Ca), Chlore (Cl), Fer (Fe), Potassium (K), Magnésium (Mg), Manganèse (Mn), Phosphore (P), Soufre (S) et Silicium (Si) dans les 7 échantillons analysés avec une nette abondance en Ca et K. le calcium favorise la formation des os et des dents (Delmi et al., 1990). Il aide à la coagulation et à la fonction musculaire. En outre, les complexes caséine-phosphopeptide-phosphate de calcium (CPP-ACP) se forment dans la cavité buccale pendant la digestion de la caséine. Une étude a montré qu'en 10 jours, 64% des lésions superficielles de l'émail dentaire peuvent être réparées en présence de petites quantités de CPP-ACP (Reynolds, 1997). Ce sont des complexes stables composés de minéraux qui empêchent les bactéries cariogènes d'adhérer à la surface de l'émail (Vacca et al., 1994). En guise d'exemple, des bilans d'un suivi alimentaire sur 24 h en rapport avec des analyses de la santé dentaire des patients font supposer que la parodontose est associée à un approvisionnement faible en Ca (Nishida et al., 2000) ou que la prise de grandes quantités de Ca et de vitamine D développe un effet préventif contre la perte des dents (Kra li et al., 2001 ). Quant au Zn, le déficit en cet élément est responsable d'une variété d'anomalies allant d'un retard de croissance et d'une altération discrète de la perception gustative, jusqu'à des déficiences immunitaires graves (Hambidga, 1981 ). Les minéraux, d'une manière générale, sont des nutriments essentiels, lesquels ne peuvent provenir que du milieu extérieur (Khaled et al., 1997). Ils sont les éléments qui restent après calcination des tissus organiques ; ce sont 65 les catalyseurs biologiques indispensables au fonctionnement harmonieux des systèmes protéiques, enzymatiques et génétiques. Ils participent à la protection contre le stress oxydatif (Roussel et al., 2002). Si l'on s'intéresse au rôle des éléments minéraux par rapport à la santé des dents en particulier et de l'organisme en général, nous devons nécessairement porter notre attention aux produits qui en sont les principales sources. 1.1. Teneur en macro-éléments Les macro-éléments détectés et quantifiés dans les échantillons sont : Ca, Cl, K, Mg, Na, P, S et Si. Au nombre de ceux-ci, nous relevons une abondance en Ca et K dans toutes les drogues (Figure 34 ). 35 30 1 ----- "C•I'..i "g 25 CIi ------~- u 1 1 -- - •EA CIi -- - "O ~ 20 I JI • I[ •GS ro ------~ ~ •PA i 15 LlJl 1~ •PK C CIi ,.•a.., 1111 Il •111 - - - - - SM 10 ~ 1 • Il .,., •TA ::::, CJ , •. ,11- --•111 • Ji - •ZZ 5 0 Ca Cl K Mg Na p s Si macro-éléments EA: Erythrophleum africanum; GS: Guiera senegalensis; PA: Prosopis africana; PK: Pseudocedrela kotschyi; TA: Tenninalia albida; SM : Swartzia madagascariensis; ll.: Zanthoxylum zanthoxyloides Figure 34: Quantification en macro-éléments. Nous observons par ailleurs, que les tiges de Zanthoxylum zanthoxyloides et de Terminalia albida sont les plus riches en Ca. Quant au K, nous remarquons que les tiges de Prosopis africana et de Erythrophleum africanum en renferme une bonne teneur. Ainsi, les macro-éléments contenus dans les tiges des plantes analysées constituent un intérêt sanitaire pour les passionnés de cure-dents. 66 1.2. Teneur en oligo-éléments Les résultats de notre analyse ont montré que les oligo-éléments distribués dans les différentes tiges d'étude sont : Cu, Fe, Mn, et le Zn (Figure 35). Or, les principaux oligo-éléments rencontrés en général dans les végétaux sont : Bore (8), Cuivre (Cu), Fer (Fe), Manganèse (Mn), Molybdène (Mo) et Zinc (Zn) (Anonyme, 2014). Ce qui n'est pas contradictoire aux résultats que nous avons obtenus. aEA aGS a PA a PK ---- - SM aTA azz 0 Al Cu Fe Mn Zn oligo-éléments EA : Erythrophleum africanum; GS : Guiera senegalensis; PA : Prosopis africana ; PK : Pseudocedrela kotschyi; TA: Terminalia albida; SM : Swartzia madagascariensis; ZZ: Zanthoxy/um zanthoxyloides Figure 35: Quantification en oligo-éléménts Hormis Al, Fe et Mn qui se retrouvent dans quasiment tous les échantillons d'étude, seuls Cu et Zn ont été détectés respectivement dans Pseudocedrela kotschyi et Terminalia albida. Au total, nous observons que Erythroph/eum africanum et Swarlzia madagascariensis renferment plus de Fe tandis que Guiera senegalensis et Prosopis africana montrent une bonne teneur en Mn. 2. Tri phytochimique par les réactions colorées Les tests au moyen des réactions colorées réalisés ont permis de rechercher dans les 7 échantillons la présence de quinones libres, d'anthrquinones, de saponines, de protétnes, de coumarines, de flavoïdes, de 67 tannins, d'alcaloïdes et de composés réducteurs. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau 5. Tableau 5: Résultats des tests par réactions colorées et de l'indice de mousse Composés Pp Tan Flav Anth Terp Qui Cou Alca Cp Réducteurs Pro Sapo Recherchés Fehling Tollens (lm) EA + + + + + + + + + 250 GS + + + + + + + + tr 143 PA + + + + + + 167 PK + + + + + + + + + 333 SM + + + + + + + + tr 500 TA + + + + + + tr tr tr 250 zz + + + + + + 167 + : Présence; tr : trace ; - : Absence; lm : Indice de mousse ,ep_ : Polyphénols Tan : tannins ; Cou : coumarine ; Anth : anthraquinones ; 9!!J. : quinones ; Terp : terpènes ; Pro : protéines ; Ale : alcaloïdes ; Sapo : saponines ; Cp Réd : composés réducteurs. EA: Erythrophleum eïncenum ; GS: Guiera senegalensis; PA: Prosopis etticene , PK: Pseudocedrela kotschyi; TA: Terminalia a/bida ; SM : Swartzia medeqesceriensis ; ZZ: Zanthoxylum zanthoxyloides Les tiges des 7 plantes contiennent des polyphénols qui sont des phytocomposés très importants notamment grâce à leur effet sur la santé (Stanley et al., 2003). Ils présentent en effet, des propriétés anticancéreuses, antimutagènes, antioxydantes et antibactériennes (Meyer, 1997; Weissburger 1997; Redoyal, 2005; Hatano, 2005). Parmi ces polyphénols, nous avons pu identifier les flavonoïdes qui possèdent des propriétés vitaminiques P qu'ils renforcent au niveau des capillaires; ils permettent de diminuer la fréquence d'hémorragies mineures (Bitty, 1982; Diby, 2004). Quant aux tannins, ils procurent à la muqueuse buccale une sensation de sécheresse et de construction. En effet l'astringence est due aux tannins catéchiques qui précipitent les protéines salivaires, entrainant avec elles leur cortège de molécules d'eau qui lubrifiaient alors la muqueuse buccale (Vergé et al., 1999). Ils sont également hémostatiques dans le cas de gingivorragies et favoriseraient la fermentation microbienne (Bitty, 1982; Diby, 2004). L'action des triterpènes sur la muqueuse buccale est due à leurs propriétés tensio-actives. Ils jouent un rôle antiphlogistique et analgésique (Bitty, 1982). Les valeurs de lm calculées pour chaque espèce végétale indiquent bien la présence de saponines dans tous les échantillons analysés ; avec une nette abondance dans S. Madagascariensis (Figure 36). Les saponines sont des 68 hétérosides complexes (saponosides) appartenant aux terpènes cycliques ou aux stéroïdes. Elles sont tensio-actives. Elles font mousser leurs solutions et servent de détergent. Elles présentent une toxicité. En effet, elles présentent une activité hémolytique et piscicide. Toutefois, quelques travaux ont rapporté leurs propriétés antimicrobiennes (Roy, 1988; Mahato et al., 1992) et antibactériennes (Fané, 2003). lm 00 '450 - 1 t ·' - - --~ --- -- • EA aoo t '1 ,, ,- ~----- 350 • GS i/" -·-~ 1 --· -- 300 1 ------~41 --- • PA 250 t 1 • PK ·-· -· SM j11= •TA ;~~ tir-,- -, 'IFll-a·. •ZZ 50 0 EA GS PA PK SM TA zz EA: Erythrophleum africanum; GS : Guiera senegalensis PA: Prosopis africana; PK: Pseudocedrela kotschyi; TA: Terminalia a/bida; SM: Swartzia madagascariensis; ZZ: Zanthoxylum zanthoxyloides Figure 36: Illustration des indices de mousse 3. Tests de détection de certains composés phénoliques par CCM 3.1. Détection des coumarines Dans les chromatogrammes CCM, la majorité des coumarines apparaissent sous UV à 366 nm sous forme de taches colorées (bleu, violet, rose, vert, jaune, pourpre) (Ladiguina, 1983 ; N'gaman, 2013). Ces colorations sont aussi observées lorsque les chromatogrammes sont révélés par NH3 (issu de NH40H) ou d'autres révélateurs comme les solutions de KOH 5% (m/v) et d'acétate de plomb basique. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau 6. 69 Tableau 6: CCM des coumarines révélées Organe Rt Sans révélateur Avec révélateur lNH3l Composés végétal visible UV/366nm visible UV/366 nm 0,03 Jaune Coumarines 0,1 Bleu Coumarines EA 0,15 Pourpre Pourpre Coumarines't'' 0 0,73 Rouge Rouge N id b 0,87 Bleu fluro Bleu fluro Cournarines't" 0 0,03 Rouge 0 Orange N id b GS 0,9 Bleu Marron Coumarines" N idb 0,03 Vert Rouge Coumarines" PA 0,31 Bleu pâle Coumarines" 0,74 Vert Cournarines'' 0,83 Rouge Rouge N id"b 0,89 Rouge Rouge N id"b 0,03 Rouge Orange N id"b 0,19 Bleu pâle Vert pâle Cournarines'" PK 0,75 Vert Vert Cournarines'" 0,88 Rouge Rouge N id"b 0,03 Orange Orange N id"b 0, 11 Vert sombre Coumarines SM 0,29 Jaune pâle Vert Coumarines 0,48 Bleu vert Bleu pâle Coumarines 0,76 Violet Vert sombre Coumarines 0,35 Violet Marron Coumarines" TA 0,65 Bleu Coumarines" 0,75 Vert Vert Coumarines'" 0,86 Rouge Rouge N idab 0,03 Rouge 0 Orange N id"b 0,19 Bleu C Coumarines" 0,25 Vert C Vert Cournarines'" zz 0,36 Violet Violet Coumarines'" 0,74 Vert Vert Cournarines'" 0,91 Bleu P Marron Coumarines" N idb 0,95 Bleu Coumarines" EA: Erythrophleum africanum; GS : Guiera senegalensis; PA: Prosopis africana; PK: Pseudocedrela kotschyi; TA: Terminalia albida; SM : Swartzia madagascariensis; ZZ: Zanthoxylum zanthoxyloides N id : Non identifié ; a composé identifié sans révélateur à l'UV ; b composé identifié avec révélateur à l'UV. Ainsi, nous avons pu déceler une coumarine dans G. senega/ensis (spot de Rt = 0,9). 2 coumarines dans P. ktschyi (spots de Rt = 0, 19; 0,75). 3 coumarines dans: P. africana (spots de Rt = 0,03 ; 0,31 ; 0,74), T. albida 70 (spots de Rt = 0,35 ; 0,65 ; 0,74). 4 coumarines dans E. africanum (spots de R. = 0,03 ; 0, 1 ; 0, 15 ; 0,87) et dans S. madagascariensis (spots de Rt = 0, 11 ; 0,29 ; 0,48 ; 0,76) ; et 6 coumarines dans Z. zanthoxyloïdes (spots de Rt = 0,19; 0,25; 0,36; 0,74; 0,91 ; 0,95) (Figure 37). Coumarines dénombrées • EA •GS • PA • PK SM •TA • zz EA GS PA PK SM TA zz EA: Erythrophleum africanum; GS : Guiera senegalensis; PA: Prosopis africana; PK: Pseudocedrela kotschyi; TA: Tennina/ia albida; SM : Swartzia madagascariensis; ZZ: Zanthoxylum zanthoxyloides Figure 37: Etat comparatif des coumarines présentes dans les différents extraits chloroformiques des 7 plantes d'étude. 3.2. Caractérisation des flavonoïdes Les anthocyanidines apparaîsent sous forme de taches orange ou mauves. Les flavonols se détectent sous forme de taches jaunes ; les flavones méthylées donnent des spots de teintes bleue et pourpre. Quant aux chalcones et aurones, ces polyphénols apparaissent sous forme de taches vertes. Les flavones, isoflavones et les flavanones se caractérisent sous forme de taches bleu-blanc fluorescentes alors que les flavonols et les aurones se révèlent sous coloration jaune quelconque (Ladiguina, 1983 ; Markham, 1992; Mohammedi, 2006; Koffi, 2010; N'gaman, 2013). Les résultats que nous avons obtenus sont consignés dans le tableau 7. 71 Tableau 7: CCM des flavonoïdes révélés Organe Rf Sans le réactif de Neu Avec le réactif de Neu Composés possibles végétal Visible UV366nm visible UV/366nm 0,18 Bleu fluo Flavones méthylés Anthocyanidine a Flavones méthylés b EA 0,32 Orange Orange pâle Bleu pâle 0,45 Bleu fluo Vert Flavones méthylés a Flavonoïdes b 0,75 Bleu fluo Bleu Flavones méthylés'" 0,88 - Bleu fluro Orange Flavones méthïlésa Anthocïaneb 0,17 Rouge Nid GS 0,75 Jaune vert Flavonol 0,90 Rouge Orange Anthocyanidine" 0,23 Mauve Mauve Anthoxyanidines'" 0,45 Gris Rouge Chlorophylle a pâle 0,62 Jaune Jaune Marron Flavonols et aurones" Flavones et PA chalcones" 0,67 Bleu Marron Flavones méthyles" Flavones et chalcones" 0,75 Bleu fluo Orange Flavones méthyles" Anthocyanes" 0,82 Bleu Bleu Flavones rnéthylés", Flavonoïdes" 0,92 Bleu fluo Flavones méthïlésa o. 1 Pourpre Chalcones 0,5 Vert Gris Flavonoîdes" 0,68 Jaune Flavonols et aurones Bleu fluo Flavones méthylés PK 0,85 0,92 Bleu fluo Flavones méthïlés 0,35 Gris Nid 0,42 Violet Pourpre Flavones méthylés'' 0,5 Violet Marron Flavones et chalcones'' Violet Orange Anthocyanidine" SM 0,58 0,67 Violet Rouge pâle Jaune vert Flavonols" 0,74 Jaune Jaune flavonols 0,87 Jaune fluo Chalcones et aurones 0,22 Vert bleu Flavonoïdes 0,3 Gris Vert bleu Flavonoïdes" Bleu Flavones méthylés TA 0,7 0,78 Bleu Gris Flavones rnéthylés" 0,88 Bleu fluo Flavones méthylés 0,08 Bleu Bleu vert Flavones méthylés° Flavcnoïdes'' 0,3 Vert pâle Jaune vert Flavones et chalcones'' 0,42 Jaune fluo Jaune Chalcones et aurones 0,48 Jaune fluo Chalcones et aurones 0,53 Jaune Jaune Chalcones et aurones 0,58 Violet Nid zz 0,63 Violet Rouge N id°Chlorophylleb 0,75 Bleu Flavones méthylés 0,87 Bleu fluo Bleu fluo Flavones rnéthytés'" EA : Erythrophleum africanum; GS : Guiera senegalensis; PA : Prosopis africana ; PK : Pseudocedrela kotschyi; TA: Termina/ia albida; SM: Swarlzia madagascariensis; ll: Zanthoxylum zanthoxyloides N id : Non identifié ; a composé identifié sans révélateur à l'UV ; b composé identifié avec révélateur à l'UV 72 4. Analyses quantitatives 4.1. Dosages des polyphénols, des anthocyanes et aglycones Les valeurs décrites dans la figure 38 varient de 934,9 à 206,4 µgEAg/g. Tenant compte du fait que les polyphénols sont distribués de façon inégale dans les différentes parties des plantes (Bano et et., 2003 ; Falleh et et., 2006) et encore moins dans les tiges, nous pouvons estimer que ces teneurs peuvent justifier l'utilisation de ces tiges en médecine traditionnelle. Cette répartition inégale peut s'expliquer par des facteurs biogénétiques et environnementaux. Les chemins biochimiques qui conduisent à ces métaboliques secondaires, peuvent être influencés par certains facteurs (rayonnements UV, excès en éléments minéraux) pour aboutir à des teneurs relativement importantes pour chaque organe donné de la plante (Konan, 2010). Grâce à leurs effets bénéfiques sur la santé, ces métabolites secondaires ont une importance croissante. En effet, leur rôle d'antioxydants naturels suscite de plus en plus d'intérêt pour la prévention et le traitement des cancers, des maladies inflammatoires, cardiovasculaires et neurodégénératives. Aussi trouvent-ils usage dans l'industrie agroalimentaire, pharmaceutique et cosmétique en qualité d'additifs. L'estimation quantitative des anthocyanes et des aglycones a été effectuée selon Lebreton et al., (1967). Les résultats obtenus montrent que E. africanum renferme une forte teneur en anthocyanes. Les aglycones sont faiblement présents dans les 7 plantes (Figure 38) particulièrement dans G. senegalis et P. kotschyi. Ainsi, au nombre des 7 espèces végétales testées, E. africanum occupe à notre humble avis, une place de choix. Bruneton (1999) rapporte les bienfaits des anthocyanes. En effet, les propriétés de ces derniers au niveau capillaro-veineux conduisent à employer les drogues végétales à anthocyanes et les recettes thérapeutiques qui en renferment pour le traitement symptomatique des troubles liés à l'insuffisance veinolymphatique et à la fragilité capillaire. Les anthocyanes trouvent également emploi en ophtamolog ie. 73 1200 ------1000 ------ ' ------800 '•CI..i • Polyphénols (µgEAg/g) •C• 600 (:1,1 Anthocyanes (mg/g) a I -- - f - -- a Aglycones (mg/g) 400 r- - I -- - - 200 - ~ 0 EA GS PA PK SM TA zz EA: Erythrophleum africanum; GS: Guiera senegalensis; PA: Prosopis africana; PK: Pseudocedre/a kotschyi; TA: Terminalia albida; SM : Swartzia madagascariensis; Z2: Zanthoxylum zanthoxyloides Figure 38: Teneurs en polyphénols, en anthocyanes et en aglycones dans les 7 plantes d'étude. 4.2. Dosage des flavonoïdes totaux Les teneurs en flavonoïdes totaux contenus dans les extraits éthanoliques des 7 échantillons d'étude sont présentés dans la figure 39. Flavonoïdes{%} 0,35 0,3 • EA 0,25 •GS 0,2 •PA 0,15 • PK SM 0,1 •TA 0,05 •ZZ 0 EA GS PA PK SM TA zz EA: Erythroph/eum africanum; GS : Guiera senega/ensis; PA: Prosopis africana; PK: Pseudocedrela kotschyi; TA: Terminalia albida; SM: Swartzia madagascariensis; Z2: Zanthoxylum zanthoxyloides Figure 39: Teneurs en flavonoïdes totaux dans les 7 plantes d'étude. Il en ressort que la tige de E. africanum est plus riche en flavonoïdes. Ces métabolites secondaires constituent la plus importante catégorie de polyphénols, des molécules très réputées pour leurs vertus antioxydantes. 74 Très distribués à l'échelle végétale, ils sont rencontrés dans les fruits et légumes mais aussi dans le chocolat ou le vin (rouge, surtout). Leur étude connaît un regain d'intérêt depuis qu'on leur prête, notamment, des propriétés anticancéreuses mais aussi des effets dans le domaine cardiovasculaire. En outre, ils apportent des bienfaits dans l'hygiène bucco-dentaires. Ceci semble justifier la préférence de la tige de E. africanum couramment employée comme cure-dent au Mali et en Côte d' Ivoire notamment dans sa partie nord. Par ailleurs, G. senegalis, P. kotschyi, S. madagascariensis et Z. zanthoxyloides montrent une teneur relativement appréciable en flavonoïdes totaux, contrairement à T. albida. 5. Evaluation de l'activité antioxydante Les résultats obtenus (Figure 41; Annexe 3) concernent les concentrations des différents échantillons étudiés qui inhibent le 2,2-diphényl- 1-picrylhydrazyle (DPPH) en référence à la Vitamine C et au butylhydroxytoluène (BHT). Le DPPH a été l'un des premiers radicaux libres utilisés pour étudier la relation structure-activité antioxydante des composés phénoliques (Blois, 1958 ; Cristina et al., 2009). La capture des radicaux libres par des antioxydants dépend de deux types de mécanismes: (i) la libération de H du groupement OH (cinétique rapide de certains acides et dérivés phénoliques) ; (ii) la libération d'un électron ( cinétique lente des dérivés glycosylés et des anthocyanes) (Cristina et al., 2009). Dans le cas des composés phénoliques (PhOH), le mécanisme principal d'action est le piégeage des radicaux libres par le transfert de l'atome H sur le DPPH alors transformé en une molécule réduite DPPH-H (Figure 40). +PhOH -• donneur de H DPPH (ox) DPPH(red) violet jaune-pâle Figure 40 : Réaction de piégeage des radicaux libres par transfert de H sur le DPPH 75 Dans cette partie, pour évaluer l'activité antioxydante, une approche a été appliquée : c'est celle de la détermination de la concentration en antioxydant (extrait végétal testé) nécessaire pour réduire 50% de DPPH. Ainsi, comme il n'existe pas de mesure absolue de l'activité antioxydante, celle des extraits bruts méthanoliques (EB) a été évaluée par spectrophotométrie par rapport à celle de l'acide ascorbique ou vitamine C (VC) et du BHT qui sont les antioxydants de référence respectivement naturel et de synthèse. 120 100 •%1. BHT C 0 ';p •%1.VC :c 80 ::c •%1. EA (EB) =·=o •%1. GS (EB) QI 60 tlO .n•.i. •%1. PA (EB) C QI .u.. •%1. PK (EB) ::::, 40 0 Q. %1. SM (EB) •%1. TA (EB) 20 •%1. ZZ (EB) 0 0,008 0,004 0,002 0,001 0,0005 0,00025 Concentration en g/ml EA: Erythrophleum africanum; GS: Guiera senega/ensis; PA: Prosopis africana; PK: Pseudocedrela kotschyi; SM : Swartzia madagascariensis; TA: Terminalia albida; ZZ: Zanthoxylum zanthoxyloides; V.C.: Vitamine C; BHT: ButhylHydoxyToluène ; EB : Extrait Brut. Figure 41: Evaluation de l'activité antioxydante des 7 plantes d'étude. Les deux antioxydants de référence ont montré une activité antiradicalaire très importante de la concentration la plus élevée (0,008 g/mL) à la concentration la moins élévée (0,00025 g/mL). Les EB, hormis ceux de S. madagascariensis et de Z. zanthoxyloides qui ont un pourcentage d'inhibition très nettement inférieur à 50%, présentent tous une bonne activité antioxydante à 0,008 g/ml. Nous notons, en effet, à cette concentration pour les EB de E. africanum, G. senegalensis, P. africana, P. kotschyi et de T. albida respectivement des pourcentages d'inhibition 92, 19 %, 84, 12 %, 75,07 %, 87,56 % et 90,08 %. Ce pouvoir inhibiteur est observé jusqu'à 0,001 g/mL 76 pour E. africanum et T. albida. A 0,0005 g/ml seul l'EB de E. africanum conserve son caractère antioxydant. Cette propriété témoigne de sa forte concentration en composés phénoliques (Silviya et al., 2010) soit 934,2 µgEAg/g. Cette plante n'est cependant pas utilisée en medecine traditionnelle, elle est juste préfèrée comme cure-dent du fait de son goût sucré et de ses propriétés tensio-actives. De ces résultats, nous notons que le bon profil antioxydant que manifestent nos échantillons testés à 0,008 g/ml serait dû à la présence des flavonoïdes et des polyphénols. Quant à l'EB de la tige de E. africanum, elle signe une activité antioxydante voisine de celle des antioxydants de référence à 0,0005 g/ml. Ainsi, la manifestation de la propriété antioxydante chez les plantes d'étude, leur conférerait d'autres vertus biologiques notamment antitumorale, anticarcinogène, anti-inflammatoire, hypotensive et diurétique importantes (Bidet, 1987; Stavric, 1992; Das, 1994). C'est pourquoi, nous pensons que l'utilisation récurrente de leurs tiges comme cure-dent, pourrait non seulement protéger et renforcer l'appareil bucco-dentaire mais aussi être un moyen de protection à l'égard du stress oxydatif, soupçonné de nos jours d'être à l'origine de nombreuses maladies (Favier, 2003). Par ailleurs, notre étude confirme également une certaine corrélation entre la teneur en composés phénoliques et l'activité antiradicalaire. En effet, Cistina et al., (2009) rapportent dans leurs travaux que la relation entre la structure chimique des composés phénoliques et leur pouvoir piégeur des radicaux libres est tributaire du nombre, de la position et de la nature des substituants sur les cycles de base (groupements hydroxyles, métaxyles, glycosyles) et le degré de polymérisation. 6. Caractérisation des composés phénoliques par GC-MS et LC-MS. Cinq plantes à savoir Erythrophleum africanum, Prosopis africana, Swartzia madagascariensis, Terminalia albida, Zanthoxy/um zanthoxy/oides, ont été analysées sur la base d'une part des estimations quantitatives des composés phénoliques, de l'évaluation de l'activité antioxydante de nos échantillons et d'autre part de quelques informations obtenues de la littérature (Berger et al., 1995 ; Akerele et al., 1991 ; Ouattara et al., 2004). 77 6.1. Caractérisation par GC-MS Les différents fragments d'ions consignés dans le tableau 8 ont été identifiés dans les spectres de masse de la fraction acétate d'éthyle, après l'hydrolyse acide du marc de la tige de chaque plante (Christina 2010 ; Charalampos et Michael, 2013). La présence d'acide gallique et dérivés a été révélée. Tableau 8: Fragmentations communes à quelques composés silylés Ions m/z Pertes [Mr Ion moléculaire [M-15r -CH3 [M-3or -COH [M-73r -Si(CH3)3 [M-89r -OSi(CH3)3 [M-177r [(CH3)3Si=OSi(CH3)3t 6.1.1. Analyse GC-MS de Erythrophleum africanum Le profil chromatrographique obtenu est présenté dans la figure 42. (~~ 6.0 6 5.0 4.0 2 3.0 5 2.0 1.0 1 ,-, î • 1' '1 ,-1 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 Figure 42: Profil chromatographique GC-MS de la tige de E. africanum Au nombre des pics observables seulement quatre numérotés 1, 3, 4 et 6, désignent des composés phénoliques et les deux autres des sucres silylés. Les structures moléculaires qui correspondent aux différents pics sont ci-après indiquées. OH 1./ .o1 :T ...,..s,, # HO f) ...,.. O hydroquinone 1,4-bis((trimethylsilyloxy)benzene (1) 78 OH 0 HO 0 OH 0 HO i / acide 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-2- /Si'-.... 2-(3,4-bis((triméthylsilyloxy)phenyl)-2-((triméthylsilyloxy)acétate hydroxyacétique de triméthylsilyle (3-4) "S1 i / 1 o... /,0 OH Acide gallique 3,4,5-tris((trirnéthylsilyloxy)benzoate de triméthylsilyle (6) Les sucres devraient être que dans la phase aqueuse ( Cf. paragraphe 2.1.4.1.). Leur présence peut être due au taux assez important de sucre contenu dans cette tige (Kadja, 2009) et qui donc les laisserait sous forme de trace dans le milieu organique. Ci-après, est mise en évidence la structure moléculaire dudit sucre (xylopyranose). -Si/- \ OH 0 HO OH /0 0\/ Si- -Si- HO \ / X y lopyranose 1,2,3,4-tétrakis-O-(triméthylsilyl)xylopyranose (2-5) 6.1.2. Analyse GC-MS de Prosopis africana Le chromatogramme GC-MS de P. africana est présenté dans la figure 43. 79 2.5 ~IC 2.0 1.5 1.0 0.5 1 l 11.0 11.5 12.0 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 Figure 43: Profil chromatographique GC-MS de la tige de P. africana Les pics illustrant les composés phénoliques sont ceux qui portent une numérotation. Les pics 2 et 5 ont été identifiés dans l'extrait de E. africanum comme étant respectivement l'acide 2-(3,4-dihydroxyphényl)-2-hydroxy• acétique et l'acide gallique. Les structures moléculaires des autres composés sont les suivantes : OH OH resorcinol 1,3-bis((triméthylsilyl)oxy)benzène (1) 0 1 ./ S OH 0/ '"---- 0-Si1 / \ acide 2-hydroxy-3-méthylbenzoïque 3-méthyl-2-0-triméthylsilylbenzoate de triméthylsilyle (3) OH acide 4-hydroxy-3,5- diméthoxybenzoïque 3,5-diméthoxy-4-(triméthylsilyloxy)benzoate de triméthylsilyle ( 4) 80 6.1.3. Analyse GC-MS de Swartzia madagascariensis Les pics observés dans le chromatogramme (Figure 44 ), ne correspondent à aucun polyphénol silylé. Il n'y a donc certainement pas d'acide gallique ni de substituant galloyle dans cette tige. 5.01/~_mci: 4.5 40 3.5 3.0 2.5 2.0 2 55 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 Figure 44: Profil chromatographique GC-MS de la tige de S. madagascariensis Les pics référencés ont été caratérisés comme étant des hexoses tels que le mannopyranose (1) et le xylopyranose (2) également identifié dans E. africanum. -si/- \ \/ 0 OH Si-0 / . HO OH 0\/ l Si- -Si- HO \ / mannopyranose 6-méthyl-2,2,4,5-tétrakis-O-(triméthylsilyl)mannopyranose (1) 6.1.4. Analyse GC-MS de Terminalia albida Six pics (Figure 45) ont été indentifiés comme étant des composés phénoliques silylés au nombre desquels sont l'acide 2-(3,4-dihydroxyphényl)- 2-hydroxyacétique (pic 1 ), l'acide 2-hydroxy-3-méthylbenzoïque (pic 2), l'acide 2-(3,3-dihydroxyphényl)-2-hydroxyacétique (pic 3) et l'acide gallique (pic 6). 81 (>!1.000,~'------.------, u~ 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 5 6 1.5 1.0 2 1 O.S1S~,, .~. r;,~ ,,~- i 'I' •t• 111 11' 11 111 111 'I' 'i 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 Figure 45: Profil chromatographique GC-MS de la tige de T. albida Les structures moléculaires des autres composés probables sont mentionnées ci-après. 0 OH 0 HO 1/ /Si""-. Acide 4-hydroxybenzoïque 4-( triméthy lsily loxy )benzoate de triméthy lsily le ( 4) 0 OH 0 Acide 4-(2,3-diméthoxyphényl)-3-hydroxybutanoï que \ /0 4-(2,3-diméthoxyphényl)-3-(triméthylsilyloxy)butanoate de triméthylsilyle (5) 6.1.5. Analyse GC-MS de Zanthoxylum zanthoxyloides Cette analyse n'a révélé aucune présence d'acide gallique. L'unique composé phénolique (silylé) est l'acide vanilique dont les fragmentations caractéristiques m/z sont: 73, 149, 165, 223, 312 (Charalampos et Michael, 2013). Ci-après est indiqué le profil chromatographique obtenu (Figure 46). 82 1!!!..~, 1.00 0,75 O.SO 0.25 ~ 1 ~. ~, ~. ~. • • • 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7 S 8.0 8.5 9.0 9.5 1QO 1Q5 11 0 11 5 120 Figure 46: Profil chromatographique GC-MS de la tige de Z. zanthoxyloides 6.2. Caractérisation des composés phénoliques par LC-MS L'identification des composés a été réalisée à partir des spectres UV, des spectres de masse MSn (en modes positif et négatif) et des temps de rétention, en référence aux propriétés des composés standards et aux identifications disponibles dans la littérature sur ces espèces botaniques ou des espèces voisines. La longueur d'onde à 280 nm correspond au signal commun à tous les composés phénoliques. La longueur d'onde à 320 nm correspond aux acides hydroxycinnamiques, aux stilbènes, aux isoflavones ou aux flavanones. La trace à 360 nm est spécifique des flavonols et celle à 520 nm montre la présence des anthocyanes. 6.2.1. Analyse de l'extrait de Erythrophleum africanum L'ensemble des composés élués dans le massif présente un maximum aux environs de 278 nm (Figure 47). Par ailleurs les masses caractéristiques de flavan-3-ols ont été détectées en mode négatif à m/z 289 : (épi)catéchine, m/z 577 : procyanidines dimères, m/z 865 : procyanidine trimères. On observe une bosse entre 10 et 25 min. Cette bosse est souvent due à la présence de tannins. Pour aller plus loin dans l'analyse de cet extrait, il a fallu procéder à une dépolymérisation (phloroglucinolyse) (Annexe 4). 83 •. .•. .... W.,..,.,. :rt. c •• • , "" ••• ••• i • • Il •.•• :11.-.....:.: u...... L ,,.l 1 n,o0 ,Il 5 1 .Li,.ftêlie. t • 1S :0 25 ~XI Tme (an) ~ün&. ~X~~~ (rMU) 1 ,, 1) 14 "' •• •• .. 15 20 ,. ., Figure 47: Profil chromatographique de l'extrait hydroacétonique de E. africanum Les caractéristiques chromatographiques et spectrales des principaux composés détectés et les hypothèses structurales issues de ces données sont présentées dans le tableau 9. 84 Tableau 9: Composés possibles détectés dans E. africanum Pic Tr A max Masse MS (m/z) MS etMSn Composés possibles ~minl ~nml molaire Ion+/ - 1 3.3 269 273 [M+Ht= 274 Peptide, alcaloïde, ... 2 3,8 269 170 [M-Hr = 169 125 Acide gallique (1.1) 3 5.7 274 344 [M-H]- = 343 [M+Ht = 345 191, 152 Ester quinique de l'acide gallique (1.2) 4 7.7 274 344 Isomère de l'ester quinique de l'acide gallique? 8.5 274 449 450 Erythrophlamine (alcaloïde) ? 5 9.2 274 496 [M+Ht= 497 309 153 [M-H]- = 495 343,152 Acide digalloylquinique (1.3) 6 9.4 277 866 [M-H]- = 865 745,593,495,289 Trimère procyanidine (1.4) 744 [M+Ht= 745 593,575,423,289 Dimère de proanthocyanidine ((épi)gallocatéchine-(épi)catéchine) galloylée? (1.5) 7 9.9 276 496 [M+Ht = 497 479,327 Acide digalloylquinique (1.3) 578 [M+Ht = 579 577 Dimère de procyanidine (1.6) 866 [M-Hr = 865 Trimère de procyanidine (1.4) 8 11.1 276 730 [M+Ht = 731 727 Dimère d'(épi)-catéchine galloylé 746 [M-Hr = 745 575,407,287 Dimère (épi)catéchine-(épi)gallocatéchine galloylé. (1. 7) 9 12.1 277 730 [M+Ht = 731 Dimère d'(épi)-catéchine galloylé 10 12.9 279 714 [M+Ht = 715 Dimère galloylé d'(épi)catéchine-(épi)afzéléchine ou galloylé (1.8) 563 Dimère (épi)catéchine-(épi)afzéléchine 11 15.8 279 442 [M+Ht = 443, (épi)catéchine gallate 730 M+Ht = 731 Dimère d'(épi)-catéchine galloylé. 12 17.1 279 834 [M+Ht = 835 Trimère d'(épi)catéchine-(épi)afzéléchine-(épi)afzéléchine. 714 M+Ht = 715 Dimère galloylé d'(épi)catéchine-(épi)afzéléchine et 13 18 279 866 [M+Hr = 867 Trimère d'(épi)catéchine 714 M+Ht = 715 Dimère galloylé d'(épi)catéchine-(épi)afzéléchine. 14 19 279 442 [M+Ht = 443 333, 273, 163, 139 Epicatéchine gallate (1.9) 15 20.6 279 426 [M+Hr = 443 (épi)afzéléchine galloylée 698 Dimère d'(épi)afzéléchine galloylé 16 30.8 < 250,275 316 [M+Ht = 317 Non Identifié 85 L'érythrophlamine est le seul alcaloïde recherché à avoir été trouvé en apparence. En ce qui concerne les composés phénoliques, la tige de E. africanum semble être riche en tannins, de type tannins hydrolysables (esters galliques de l'acide quinique (pic 3, 4, 5 et 7)) ou condensés (=proanthocyanidines), de type procyanidines (polymères d'(épi)catéchine (Figure 48 (1.10)), de type prodelphinidine (présence d'(épi)gallocatéchine (Figure 48 (1.11)) ou de type propélargonidine (présence d'(épi)afzéléchine (Figure 48 (1.12)). Ces tannins condensés forment deux bosses dans le chromatogramme et sont aussi porteurs de fragments galloyles. HO' T 'OH OH (1.1) ,,OH 0 (1.2) {R=H R'=A J,o (1.3) R = R'= A "'OH R' .R' fragment A\ OH TOH OH 1 OH 1 OH OH 1 OH OH HO Figure 48: Structures moléculaires de quelques composés phénoliques détectés dans la tige de E. africanum 86 HO OH HO HO OH OH HO OH .OH HO HO R=OH (1.7) { R=H -- (1.8) HO HO HO. \ OH OH HO r{" R 1 HO, ,..0, ~ /= OH HO R' OH (1.9) )--c(OH r-H; R' • OH - (I.IO) R= R' = OH -- (1.11) OH OH R=R'=H -- (1.12) Suite Figure 48 87 6.2.2. Analyse de l'extrait de Prosopis africana Une copie d'écran (Figure 49) montre le chromatogramme UV à 280 nm de l'injection en mode positif de l'extrait dilué 10 fois. ••... {""'1) 21 14 46 18 Figure 49: Profil chromatographique de l'extrait hydroacétonique de P. africana Les pics numérotés sont au nombre de 50. On y perçoit aussi une bosse de composés mal résolus entre 20 et 26 min. Une phloroglucinolyse sur les tannins a donc été réalisée pour vérifier que les pics 35-36 sont bien à base de mesquitol (flavan-3-ol), composé présent dans Prosopis glandulosa (Young et al., 1986). En effet, dans ces tannins, la liaison entre les monomères n'est pas sur le C-4 du noyau C, mais sur C-5 ; ce qui les rendraient résistants à l'hydrolyse acide car il n'y a pas de possibilité de formation d'un carbocation. Après phloroglucinolyse, 2 pics correspondant à la masse 415 g/mol (masse du dérivé de la catéchine avec le phloroglucinol) ont été détectés. Ce constat peut donc nous permettre d'affirmer que dans le genre P. africana, il n'y a pas de mesquinol. Le détail des identifications des composés des différents pics est donné dans le tableau 1 O. 88 Tableau 10: Composés possibles détectés dans P. africana tR Amax Masses MS (m/z); MS/MS Composés Pics (min) (nm) molaires Ion+/ - Ion 1 3,6 269 170 [M-H)"= 169 127 Acide gallique (1.1) 2 6,7 305 154 [M-H]"= 153 Acide protocatéchique (2.1) 3 7,8 255 174 Acide shikimique 896 [M-H]"= 895 Oligosaccharide de la gomme 4,5 11 ; 11,2 276,310,320 760 [M-H]"= 761 Oligosaccharide de la gomme 594 [M-H)"= 593 Apigénine diglucoside (2.2) 882 [M-H]" = 881 Oligosaccharide de la gomme 6, 7,8 11,3; 11,4; 11, 9 269,272,274 594 [M-H]"= 593 Apigénine diglucoside (2.2) 896 [M-H)"= 895 Oligosaccharide de la gomme 9,10,11 12; 12,3; 12,5 269,272,276 882 [M-Hr= 881 Oligosaccharide de la gomme 882 [M-H)"= 881 Oligosaccharide de la gomme 12 12,8 262,285 sh 458 [M+Hf = 459 Epigallocatéchine gallate (EGCG) (2.3) 882 [M-H]"= 881 Oligosaccharide de la gomme 13 13,2 272, 310 sh 578 [M-H)"= 577 451,425,407 Dimère de procyanidine (1.6) 14 14 272 760 [M-H]"= 759 Isomère de l'amentoflavone 15 14,3 274,315 338 [M+Hf= 339 181, 163 Isomère de l'acide coumaroylquinique 538 [M+Hf = 539 Non Identifié 16, 17 14,8; 14,9 270,272 480 [M+Hf = 481 Non Identifié 18 15,6 272 866 [M-H]"= 865 785,577,469 Trimère de procyanidine (1.4) 24 18 250 sh, 341 212 [M+Hf = 213 Harmine 28 19,2 260,351 464 [M+Naf = 487 319 Myricétine-3-0-rhamnoside (2.4) 464 [M+Hf = 465 301,179,151 Quercétine 3-0-glucoside (2.5) 29 20 257,300,357 302 [M+Hf = 303 Quercétine (2.6) 30 20,5 262 576 [M+Hf = 577 Dimère de type A 31 21 262 316 [M+Hf = 317 lsorhamnétine (2.7) 578 [M+Hf = 579 451,425,407 Dimère de procyanidine 32 21,3 274 309 [M+Hf = 310 Alcaloïde 33,34,35,36 21,5; 21,7; 21,9; 22,1 260,262,274,350 578 [M+Hf = 579 451,425,407 Dimère de procyanidine 37; 39 22,5 269; 340 311 [M+Hf = 312 Alcaloïde 40,41,42 23,4 ; 23,5 ; 24,3 260, 280 sh, 340 312 [M+Hf = 313 Dérivé de prosopinine 327 [M+Hf = 327 Alcaloïde 43 25,8 260,350 315 [M+Hf = 316 Prosopine 417 [M+Naf = 440 418 Alcaloïde 44,45,46 27,1 ; 27,4; 27,8 260,280 sh 270 [M+Hf =271 Apigénine 47 28,1 260 389 [M+Hf = 390 Alcaloïde 89 En injection directe, le pic majoritaire est celui de l'acide gallique (pic 1 ). On observe la présence de myricétine 3-0 rhamnoside au niveau du pic 28 à 19.2 min. Un composé de type dimère catéchine-(épi)gallocatéchine ou catéchine-(épi)gallocatéchine galloylé (pic 5). Concernant la présence de tannins à base de mesquitol, la dépolymérisation par phloroglucinolyse donne des masses correspondant à des dérivés de procyanidines ( dérivé phloro de l'(épi)gallocatéchine gallate et dérivé phloro de l'(épi)catéchine). On peut donc penser que la liaison qui se brise est de type 4~8, entraînant la formation d'un carbocation pouvant réagir avec le phloroglucinol. Ce type de liaison est celui trouvé dans les procyanidines à la différence des liaisons 5~8 des tannins à base de mesquitol. Les pics 19, 20-23, 25-27, 37, 38, 40 et 48-50 correspondant aux composés de masses molaires respectives 370, 494, 608, 536, 398, 24, 474, 396, 574, 606, 930, 424, 366 et 412, présentent des profils chromatographiques différents de ceux déjà connus de la littérature (Mabry et al., 1970). Par exemple pour le pic 50 à 29,4 min (Figure 50), la recherche de l'apigénine (trace bleu-vert appelée EIC 271, en Ali MS ou en Ali MSn) et de l'isorhamnétine diglucoside (trace orange appelée EIC 641 ), composés cités dans la littérature, donne 2 pics. L'apigénine (flavone), a pour spectre 267, 296sh, 336, avec une bosse à 296 nm aussi haute que celle à 336 nm (Mabry et al., 1970). Or le spectre des pics à cet endroit ne correspond pas. L'isorhamnétine diglucoside (flavonol) devrait absorber à 360 nm (253, 267sh, 306sh, 326sh, 370). A l'endroit du chromatogramme UV à 360 nm (trace marron), on ne voit pas de pic correspondant au pic de masse. De plus, ces deux composés semblent sortir bien tard, surtout pour l'isorhamnétine diglucoside, porteuse de deux sucres. Il peut donc s'agir de nouvelles molécules. Cependant, une telle hypothèse ne peut être soutenue qu'après isolement et caractération de celles• ci. 90 hens. [!TAL! 4 2 OJ ~___, ------vv~wA~¼,&:Y~~' ·' ~ · -·- J 0~ -,------h.;:.î ___,.'VV ••.•• "'-,.J"'JUWI~ ~·~~ ~.~ ... J x1rJ3 6 4 2 a o rrrc/ ~C)Cy'I ~ Henft. d -·---· - ·- . -·· ...~ x1rJ3 2 Oî0 1- =p= ? ·"j== i ,::0Ç "V 1 ?'' \ J 'l'(I\ '-i' Y 1 1 5 10 15 20 25 30 Trm[rm] Figure 50: Chromatogrammes à 278 nm, 318 nm, 358 nm, EIC 271 et 641 Par ailleurs, la présence des alcaloïdes (prosopine et prosopinine) ainsi que d'autres alcaloïdes de type pipéridiniques (prosafrinine, prosophylline, ... ) ou d'alcaloïdes de type tryptamine est avérée. On peut aussi constater la présence possible d'oligosaccharides de la gomme. La figure 51 présente les structures moléculaires de quelques composés phénoliques susceptibles d'être présents dans la tige de P. africana. 91 OH f A ~OH OH T HO OH i;::/0 HO HO OH 0 HQ OH OH ~ OH OH HO..._ ~ .,.o ...... /--=./ HO ------OH OH l....__ /~ O O OH 1 Il OH 0 OH (2.4) ~ OH OH OH R 1 OH Fragment G HO~ Ov v o. 1 -1-ri ~ OH , OH HO OH 0 R = OCH3; R' = G (2.5) R=R'=OH (2.6) R=OCH3; R'=OH - (2.7) Figure 51: Structures moléculaires de quelques composés phénoliques détectés dans la tige de P. africana 6.2.3. Analyse de l'extrait de Swartzia madagascariensis Les profils UV à 280, 320 et 360 nm et visible à 520 nm (Figure 52) de l'extrait hydroacétonique de la tige de S. madagascariensis. Une vingtaine de pics a été numérotée et parmi eux 17 présentent le profil des composés phénoliques. 92 "[-""·1 13 ICI) 18 50 l ,.__.}'-""""'- . -·~19 1 ~ lJl0w0NtOQflll'l, 320m c-1 •o1 l, ''1- , 4 1 ~, ·2 ifl I r t ~ · 1 •••••• Aùil h.aJ· ,_,.,, ie " 2ll 25 30 Tlllt [llin) Figure 52: Profils chromatographiques de l'extrait hydroacétonique de S. madagascariensis Les caractéristiques chromatographiques et spectrales des principaux composés détectés et les hypothèses structurales issues de ces données sont présentées dans le tableau 11. Les composés autres que les phénols n'ont pas tous été détectés. Toutefois, l'on ne peut pas exclure leur présence dans l'extrait. Nous pouvons par contre, croire en une possible présence de l'acide oléanique, de la gyspsogénine -3-0- rhamnoglucuronide et de la gypsogénine. Parmi les composés phénoliques cités dans la littérature, des ptérocarpanes (3.3), (3.5), (3.6) ou (3.7), (3.13) à m/z 418, 314, 284 et 298 respectivement (Figure 53).semblent bien s'y trouver. Les polyphénols présents dans la tige de S. madagascariensis ne sont pas des acides galliques et ne renferment pas d'unités de cet acide. Ceci explique le résultat observé en GC-MS. En effet, certains tannins tels que les formes dimères et oligomères des esters galliques et l'hexahydroxydiphénique glucose chauffés, se décomposent en acide gallique et acide ellagique (Bruneton, 2009). 93 Tableau 11: Composés phénoliques possibles détectés dans S. madagascariensis Pic Tr >.max Masse MS (m/z); MS etMSn Composés possibles !mini (nm) molaire Ion+/ - 1 (Coél.2 20.5 278,320,290 1er:256, [M+Hr = 257, 269,162 1er liquiritigénine(3.1 ), Composés) 2nd: 430 [M+Hr = 431 2ème Hexoside de C1sH12Ü4 formononétine (3.2) 2 (Coél. de 21 265,330,265,327 1er:418 [M+Ht = 401 299,162 418= hexoside d'une dihydroxy(iso)flavanone ou d'un dihydoxyptérocarpane (3.3) 3 2nd: 440, [M+Hr = 441 440 = adduit sodique?, composés) 3ème: 460 [M+Hr = 461 460 = Hexoside de C1sH100s irilone (3.4) 3 21.2 255sh,276,330sh 548 [M+Hr = 259 365 Non Identifié 4 21.7 253,283sh 314 [M+H]+ = 315 C11H140s (ernanine, kumatakénine ou 7-hydroxy-8-méthoxy-4',5'-méthylène dioxyptérocarpane) C1eH1eOs (4', 7,8-triméthoxyptérocarpane(3.5) 5 22 253,282 sh 284 [M+Hr = 285 637,285 Homoptérocarpine (3.6) ou maackiaine (3.7)? 6 22.2 250,285,342 344 [M+Hr = 345 Flavanone tétraméthoxylée (3.8) 284 (M+Hr = 285 Homoptérocarpine ou maackiaine 270 [M+Hr = 271 médicarpine ou 7-hydroxy-4'-méthoxyptérocarpane 7 22.5 288,330 270 [M+Hr = 271 345 Aglycone = C15H1005 (apigénine (3.9), baicaléine (3.10), genistéine (3.11) ou 606 [M+Hr = 607 C16H1404 (alpinétine, médicarpine, 7-hydroxy-4' -méthoxyptérocarpane, dihydroformononétine 8 22.6 257, 280(sh), 272 [M+Hr= 273 607,315,973,870 C1sH120s ou C16H14Ü4: 3-(2-Hydroxy-4-méthoxyphényl)-7-chromanol (3.12) ? 317sh [M-Hr= 272 9 22.9 253, 265sh, 285sh, 314 [M-Hr= 287 337,315 4, 7,8-triméthoxyptérocarpane, 341 4-méthoxymaackiaine ou 4-méthoxyhomoptérocarpine 10 23.8 260,285,335 328 [M+Hr= 329 7,8-diméthoxy-4' ,5' -méthylène-dioxyptérocarpane ou 4-méthoxyptérocarpine 11 24.4 284,382 270 [M+Hr= 271 271, 269, Flavonol ? médicarpine ou 7-hydroxy-4' -méthoxyptérocarpane 12 25.2 250,305 679,619,351 Formononétine, ... ? 13 25.4 283,330 282 [M+Hr= 283 323,283 damnacanthal, pseudobaptigenine ou anhydrovariabiline 14 25.6 257,318 298 [M+Hr= 299 299 Ptérocarpine (3.13)? 15 26 258,325sh,390sh 312 [M+Hr= 313 313 déhydroptérocarpane (par exemple 4' ,7,8-triméthoxyptérocarpane) mais impossible à ce Temps de retention ? 16 26.2 255,290sh,340 312 [M+Hr= 313 313 Isomère du composé précédent ? 17 27 255,300sh,350sh 282 [M+Ht= 283 283 Anhydrovariabiline (3.14) ou 4', 7-diméthoxyptérocarp-3-ène 18 28.5 255sh,288,331 300 [M+Hf= 301 185, 167 7-hydroxy-4' ,8-diméthylptérocarpane ou 4-méthoxymédicarpine 94 OH HO R1 R1=R2=R3=0H-- (3.11) R1=H -- (3.2) (3.1) 1 { 0 R2=0H et R3=0CH3 OH 0 R1=R2=H- (3.5) '--= { R1=H; R2=0H- (3.3) (3.4) HO Ou o- HO (3.12) \ (3.13) (3.14) Figure 53: Structures moléculaires de quelques composés phénoliques détectés dans la tige de S. madagascariensis 6.2.4. Analyse de l'extrait de Terminalia albida A 280 nm, une quinzaine de pics qui ont également une absorbance à 320 et 360 nm est observée. Le chromatogramme UV (Figure 54) à 520 nm ne révèle pas la présence d'anthocyanes dans l'extrait. 95 =~ 6 9 ca,...c:K,îôï~ u,~ 7.._"C, 3 13 12 _.., Figure 54: Profils chromatographiques de l'extrait hydroacétonique de T. albida La tige de cette plante renferme essentiellement entre autres composés phénoliques, l'acide gallique (pic 1 ), l'acide ellagique (pic 4) et un taux élévé d'ellagitannins observable par tous les autres pics. L'ensemble des familles moléculaires hypothétiques identifiées est consigné dans le tableau 12. Tableau 12: Composés phénoliques possibles détectés dans T. albida Pic Tr >..max Masse MS (m/z); MSetMSn Composés imin! i"m! molaire Ion+/ - eossibles 1 3,3 280 170 [M-Hr = 169 127 Acide gallique (1.1) 2,3 3,8; 4,7 360 782,52 [M+Ht = 783 765,603,421 Punicalin (4.1) 4 5,3 360 934 Castalagine (4.2) 5 6 360 1084,71 Ellagitannin 6,7 6,7; 7,3 360 782,52 [M+Ht = 783 765,603,421 Punicalin 8,9,10,11 7,9; 9,2; 12,4; 13,1 360 1084,71 [M+Ht=1085 905,567 Punicalagine (4.3) 12 14,5 360 954,66 Acide chébulagique (4.4) 13 14,6 360 601 Ellagitannin 14 18,3 360 302 Acide ellagique (4.5) 15 20,8 360 356 Ellagitannin 16 24,4 360 344 [M+Ht = 345 191, 152 Acide galloyquinique (1.2) Parmi ces tannins hydrolysables, nous notons la présence du punicalin, un ellagitannin (4,6-gallagylglucose) (4.1) qui donne un fragment en mode positif à m/z 303 et le punicalagine, un ellagitannin [2,3-(S)- 96 hexahydroxydiphénoyl-4,6-(S, S)-gallagyl-D-glucose] (HHDPglucose) (4.3) de masse moléculaire 1084,71 (Figure 55). OH OH HO ~A_/y--oH HO f --- UD 0 HO = OH HO ' I _. 4 '- OH (4.2) OH HO OH OH OH 0 6 o· ~ "" ~ ..,..OH HOY (4.3) HO HO 0 HO'-.... ~ Jl 0 OH HO/ 1 o, OH (4.5) 0 Figure 55: Structures moléculaires de quelques composés phénoliques détectés dans la tige de T. albida 97 OH OH HO 0 OH HO HO OH 0 HO 0 (4.4) 0 Suite de la figure 55 6.2.5. Analyse de l'extrait de Zanthoxylum zanthoxyloides Une douzaine de pics révéle la présence d'acides phénols, d'acides hydroxycinnamiques, de flavones et de flavanones (Tableau 13). La figure 56 illustre les chromatogrammes UV à 280, 320, 360 et 520 nm. lriens. lm'.UI 3 100 75 50 25 1 1;:ûnjJ ~· ~ WC1vomo 15 10 89 10 W Ovomo 10 j 1 lm'.UI WC1vomo 3 Figure 56: Profils chromatographiques de l'extrait hydroacétonique de Z. zanthoxyloides 98 Au nombre des composés phénoliques identifiables (Figure 57), nous constatons la présence des 3 isomères de burkinabine (Cf paragraphe 11.7) avec des temps d'ellution différents (Ouattara et al., 2004). Tableau 13: Composés phénoliques possibles détectés dans Z. zanthoxyloides Pic Tr >..max Masse MS (m/z) MS etMSn Composés (min) (nmi molaire Ion+/ - possibles 1 10,7 320 354 [M-Hr = 353 180 Acide chlorogénique (5.1) 2 11 280 342 [M-Hr = 341 323,173 Acide phenol 3 11,3 280 444 [M-Hr = 443 279,356 Acide phenol 4 11,6 280 372 [M-Hr = 371 191 Acide phenol 5 12 320 354 [M-Hr = 353 180 Acide chlorogénique 6 13, 1 280 341 [Mr = 537 491,441,307 Acide phenol (dérivé d'acide vanillique) 7 17, 1 280 492 [M-Hr = 491 323,168 Burkinabine A 313 [M-Hr = 312 Alcaloïde 8 18, 1 320 492 [M-Hr = 491 323,168 Burkinabine B 9 18,6 320 343 [Mr = 495 450,403,342 Acide hydroxycinnamique 10 19,3 280 610 [M-Hr = 609 301,308,286 Flavanone : neohesperidine (5.3) 11 19,6 280 492 [M-Hr = 491 323,168 Burkinabine C 12 20 360 302 [M-Hr = 607 301,308 Flavone OH 1 HO l0l 0 Il 0 HO~ (5.1) TOH OH 1 0 / "'v9' "' OH - - 0~ ./-"- ... ,,OH 0 OH 0 (5.2) HOn HO ; CH3 OH 99 Figure 57: Structures moléculaires de quelques composés phénoliques détectés dans la tige de Z. zanthoxyloides Nous remarquons que la plupart des composés phénoliques obtenus dans la tige de Z. zanthoxyloides sont des dérivés de l'acide vanillique. Ce résultat est donc en adéquation avec celui obtenu en GC-MS. Après la caractérisation des composés phénoliques par GC-MS et LC• MS, nous faisons l'analyse suivante : premièrement, sur l'ensemble des analyses chromatographiques réalisées, aucun pic d'absorption n'a été constaté à 520 nm ; ce qui d'une part implique l'absence d'anthocyanes dans nos échantillons et d'autre part infirme le résultat des quantifications réalisées en amont (Cf paragraphe 2.1.2.3.3.). Cette contradiction pourrait résider dans la méthodologie de quantification. En effet, celle-ci commence par une hydrolyse acide qui peut conduire à deux types de réaction : une hydrolyse acide des hétérosides (Figure 58) qui concerne les flavonoïdes 0-glycosylés, les hétérosides C-glycosylés étant résistants à l'hydrolyse acide. GluO HO + Glu 0 0 0-Glucosylflavone Flavone + Glu GluOGlu (100°C) Glu 0 0 C-glucosy lflavone C-Glucosyltlavone Figure 58: Hydrolyse acide des flavonoïdes glycosylés 100 une hydrolyse des tannins condensés (Figure 59) qui sont en principe non hydrolysables (Cf paragraphe 2.1.3) mais peuvent être dépolymérisés en anthocyanidols lorsqu'ils sont traités à chaud en présence d'un acide. Cette réaction conduit principalement à des monomères de proanthocyanidol et à un produit de dégradation qui est l'anthocyanidol. Ainsi, pour empêcher la formation de ce dernier, en général au cours de cette hydrolyse, un nucléophile (phloroglucinol par exemple) est utilisé afin de former des unités d'extension sous forme d'adduit de phloroglucinol. -,:7...... _ ,OH 1 ~ bH OH ~ bH OH OH W/'.. ~çgC, w ~ v' 100°c ~ -,:7...... _/oH ,6, Ho oa OH~O~ ~J. OH + ~ .,,1 Y ~ OH l y (0 OH OH Catéchine l ~-OH .,:PyOH OHyYO~ bH ,?"...... _ ,OH OH_~O ~1. 0 1 OH 1 # OH + OH OH_ ~ o"" ~ bH OH HO, ,.d-..._ /OH # # OH OH Catéchine Adduit stable OH Anthocyanidine Figure 59: Réaction de phloroglucinolyse: exemple d'un dimère catéchol 101 Deuxièment, nous notons la présence de composés phénoliques qui sont des antioxydants naturels par excellence, qui suscitent de plus en plus d'intérêt pour la prévention et/ou le traitement de nombreuses affections cancérigènes, inflammatoires, cardiovasculaires, neurodégénératives, etc. Parmi ceux-ci, nous pouvons citer : Liquiritigénine, à m/z 257 en mode positif, retrouvée uniquement dans S. madagascariensis. Cette molécule est l'une des nombreuses substances naturelles qui sont impliquées dans la prévention de la cancérisation (Kinghorn, 2004). - Formononétine, à m/z 431 en mode positif, observée dans S. madagascariensis, réduit la perte osseuse (Atkinson, 2004). - l'acide gallique, à m/z 169 en mode négatif, présent dans E. africanum, P. africana et T. albida. Il est reconnu pour son pouvoir anticancéreux (Bo Ra et al., 2010) et antiviral contre le virus de l'herpès HSV-2 (Kratz et al., 2008). - l'épigallocatéchine gallate (EGCG) à m/z 459 en mode positif et de l'épicatéchine gallate (ECG) à m/z 443 en mode positif, observés et/ou dans E. africanum, P. africana et T. albida. Ces deux métabolites secondaires empêchent la formation de la plaque dentaire et combattent les bactéries de la cavité buccale en inhibant la prolifération de Streptococcus mutans impliquée dans la formation de la carie (Ooshima et al., 1994 ; Hamilton-Miller et al., 2001 ; Yun et al., 2004 ; Sakanaka et al., 2004). Aussi, L'EGCG permet-il d'aider à réguler la charge virale du VIH, de réduire la croissance des cellules cancéreuses (Hussain et al., 2004) et serait efficace contre la démence, comme la maladie d'Alzheimer (Lee et et; 2004 ; Guo et eï., 2007). - L'acide vanillique de masse molaire 168 g/mol qui a des propriétés antimicrobiennes (Yvonne, 2006) a été identifié dans l'extrait de Z. zanthoxyloides. L'acide chlorogénique à m/z 353 en mode négatif, présent uniquement dans Z. zanthoxy/oides semble posséder des propriétés antivirale (Jassim et al., 2003), antibactérienne (Sotillo et al., 1998), 102 antifongique (Bowels et al., 1994) et une activité anticancéreuse. Il est considéré comme le composé le plus actif parmi les acides phénoliques (Bruneton, 2009). La composition en phytosubstances phénoliques des espèces végétales que nous avons analysées, peut être à l'origine des propriétés décrites par les populations qui utilisent leur tige comme bâtonnet frotte-dent. Au terme de l'étude phytochimique de notre étude, nous abordons l'aspect biologique aussi important qui consiste à tester l'efficacité de nos extraits bruts identifiés BAK 1 (extrait hydroacétonique de E. africanum), BAK 2 (extrait hydroacétonique de P. africana), BAK 3 (extrait hydroacétonique de S. madagascariensis), BAK 4 (extrait hydroacétonique de T. albida) et BAK 5 (extrait hydroacétonique de Z. zanthoxyloïdes) sur des souches bactériennes et cancéreuses. 7. Activités antibactériennes et anticancéreuses 7 .2. Activités antibactériennes Les tests ont été réalisés sur 4 souches bactériennes dont 2 à gram• négatif, Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa ; et 2 autres à gram• positif, Staphylococcus aureus et Micrococcus luteus. Les résultats obtenus mettent en exergue un exemple d'inhibition de bactéries par les extraits testés (Tableau 14 et Figure 60). Tableau 14: Résultats de !'antibiogramme Souches bactériennes BAK1 BAK2 BAK3 BAK4 BAKS Escherichia co/i 0 0 0 0 0 Pseudomonas aeruginosa 0 0 0 0 0 Staphy/ococcus aureus 00 21 22 0 25 Micrococcus luteus 19 0 12 12 0 0 =pas de halo d'inhibition ; Les diamètres des halos d'inhibition sont en mm 103 Figure 60: Inhibition de Micrococcus /uteus par des extraits bruts hydroacétoniques Au regard de ces résultats, nous pouvons dire que nos échantillons semblent avoir une activité sur les grams positifs à savoir S. aureus et M. Juteus tout comme les bactéries responsables de la carie dentaire. Ce sont des bactéries du sol et qui font partie de la flore naturelle de la peau, mais aussi qui peuvent coloniser la bouche notamment M. luteus. Pour les souches E.coli et P. aeruginosa, aucune zone d'inhibition de croissance n'a été constatée autour des pastilles, ce qui montre la résistance de ces souches. Cela est certainement dû à la différence de la structure de la paroi cellulaire entre les bactéries à gram positif et les bactéries à gram négatif (Ali-Shtayeh et al., 1998). Ainsi, nous avons pu déterminer les CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) pour chaque extrait de plante et les CMB (Concentration Minimale Bactéricide) (Tableau 15). Tableau 15: CMI et CMB des échantillons d'étude BAK1 BAK2 BAK3 BAK4 BAKS S. aureus M. S. S. M. S. M. S. luteus Aureus aureus luteus aureus luteus aureus CMI 156 78 625 39 µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml CMB 312 78 625 625 µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml Les tests permettent de constater que BAK 1 signe une bonne activité sur les deux souches bactériennes en particulier sur la bactérie buccale M. luteus avec une CMI et une CMB estimées à 78 µg/ml. BAK 1 est riche en composés phénoliques notamment en tannins. Son activité potentielle 104 antibactérienne manifestement semble être liée à la présence de ces métabolites secondaires. En effet, une étude réalisée par Weiss et al, (2004) a démontré qu'une fraction polyphénolique intégrée à un bain de bouche peut entraîner une réduction significative de S. mutans. Ceci peut être le cas de BAK 4 qui a une CMI inférieure à celle de BAK 1 (39 µg/ml). Cet extrait est en effet, riche en ellagitannin. Les polyphénols constituent donc de potentiels agents anticarie puisqu'ils inhibent la production d'acides organiques par les bactéries cariogènes de même que leur capacité à former un biofilm (Laetitia et Daniel, 2010). Les échantillons BAK 3 et BAK 5 ne contenant pas de tannins au regard des résultats obtenus des analyses de caractérisation réalisées, ne manifestent aucun effet bactéricide aux différentes concentrations d'étude. Il nous semble par conséquent juste de soupçonner les tannins notamment EGCG et ECG d'être à l'origine par action synergique de l'activité bactéricide exprimée. 7 .3. Cytotoxicité L'objectif a été de rechercher une possible activité anticancéreuse des différents extraits par la détermination de la viabilité des cellules dans les puits de culture. Cette activité a été évaluée sur les cellules MDA-MB 231 (lignée cancéreuse humaine du sein), Caco-2 (lignée cancéreuse humaine du côlon), 816F10 et MDA-MB 435 (lignées cancéreuse du mélanome), SNB75 (lignée cancéreuse du cerveau) et C6 (lignée cancéreuse issue du glioblastome de rat). Ci-après sont présentés les pourcentages de viabilité de ces différentes cellules après un traitement de 72 h avec une gamme de concentrations allant de 2 à 0, 125 mg/ml (Figure 61). 105 140,000 'CIi :~a 120,000 RI '> 100,000 CIi "Cl 80,000 CIi 110 RI •C• 40,000 CIi u 20,000 :•::.,. 0 Cl. 0,000 BAK 1 BAK 2 BAK3 BAK4 BAKS BAK 1 BAK 2 BAK 3 BAK4 BAK 5 Différents échantillons Différents échantillons 120,000 60,000 -_8¼6Fl0 • 2 mg/ml ~ 100,000 ~ 50,000 'CIi r~---_ 'CIi •• •• :: 80,000 :: 40,000 • 1 mg/ml ..Q ..Q RI RI > 60,000 > 30,000 1 1± • 0,5 mg/ml CIi CIi ! 40,000 ! 20,000 110 110 • 0,250 mg/ml RI 20,000 ~ 10,000 •C• C CIi CIi 0,125 mg/ml ~ 0,000 ~ 0,000 :::, :::, 0 BAK 1 BAK 2 BAK 3 BAK 4 BAK 5 0 BAK 1 BAK 2 BAK 3 BAK4 BAK 5 Cl. Cl. Différents échantillons Différents échantillons É 120.000 t _ _ s;s::1s ______'GI 100,000 I :~s - -- --_ ------ni 80,000 1 - '> ,8 60,000 Gl S 40,000 C: ~ 20,000 ::s ~ 0,000 BAK 1 BAK2 BAK3 BAK4 BAK5 BAK 1 BAK2 BAK3 BAK4 BAK5 Différents échantillons Différents échantillons Figure 61: Pourcentage de viabilité des cellules 106 Les pourcentages de viabilité obtenus varient (Annexe 5) d'une souche à une autre et également d'un échantillon à un autre. Ils sont pour chacune des souches de BAK 5 et presqu'à toutes les concentraions, très inférieurs à 50%. A 0,5 mg/ml, nos extraits ont une toxicité considérable sur les différentes cellules cancéreuses. Sur la C6, les pourcentages de viabilité sont tous inférieurs à 50%. Les échantillons testés signent donc un bon effet cytotoxique. Le traitement statistique des pourcentages de viabilité (Tableau 16) est indiqué ci-après. L'effet global des plantes est observé sur toutes les souches cancéreuses testées. Tableau 16: Effet global des extraits de plante sur les souches cancéreuses Echantillons N Molennes ± Ecart ~ee F p BAK 1 90 51,139 ± 25,384 BAK2 90 44,405 ± 23,467 BAK3 90 37,299 ± 25,870 21,72 < 0,0001 BAK4 90 44,208 ± 25,563 BAKS 90 20,720 ± 16,573 L'échantillon BAK 5 se dégage nettement avec un faible pourcentage de survie (20,720 ± 16,573) des cellules cancéreuses pour un seuil a= 0,0001%. Il apparaît donc sur l'ensemble de ces cellules, comme l'extrait végétal le plus actif. Ensuite, nous avons de façon décroissante ceux de BAK 3, BAK 4, BAK 2, et BAK 1. Il serait donc difficile d'attribuer ces activités à un certain groupe de composés phénoliques de façon générale. L'hypothèse envisageable à cet effet, serait que l'activité anticancéreuse pourrait être due à la composition individuelle des échantillons. Les tests statistiques ont montré que pour BAK 5, les souches C6, Caco- 2 et SNB75 sont égales et différentes de 816F10, MDA-MB231 et MDA-MB435 au seuil a= 0,0001 %. Il ressort du tableau 17 que BAK 5 a une activité anticancéreuse plus élevée sur les trois premières souches citées. Tableau 17: Effet des 5 espèces végétales sur six souches cancéreuses Souches N Molenne ± Ecart-~ee F p 816F10 15 26,773 ± 1,9133 CS 15 14,975 ± 1,504b Caco-2 15 15,151 ± 2,317b 6,91 < 0,0001 MDA-MB231 15 25,347 ± 1,6653 MDA-MB435 15 26,254 ± 1,1103 SNB75 15 15,820 ± 0,614b *Les moyennes portant les mêmes lettres sont statistiquement égales. 107 Dans le tableau 18, est comparée l'activité de BAK 5 à différentes concentrations. Les plus grandes concentrations 0,5 ; 1 et 2 mg/ml présentent une meilleure activité (ceci peut être dû a un effet d'empêchement de la substance la plus active dans BAK 5 par des substances moins actives). Notons aussi que l'activité de la plante à 0, 125 mg/ml est plus faible. Tableau 18: Activité de BAK 5 sur les souches cellulaires à différentes concentrations Concentrations N Moyenne ± Ecart-type F p (mg/ml) 31 0,125 18 45,934 ± 3,081 0,25 18 21,527 ± 1,818b 0,5 18 14,125 ± 1,055c 50,98 < 0,0001 1 18 11,721 ± 0,884c 2 18 10,292 ± 0,766c "Les moyennes portant les mêmes lettres sont statistiquement égales. Le tableau 19 est le résumé de l'activité de BAK 5 (à différentes concentrations) vis-à-vis des souches cancéreuses sur lesquelles elle est plus active. Tableau 19: Activité de BAK 5 sur les souches cellulaires à différentes concentrations Souches Concentrations N Moyenne ± Ecart-type (mg/ml) 0,125 3 32,728 ± 2,928 0,25 3 12,659 ± 1,366 CS 0,5 3 11,579 ± 1.590 1 3 8,965 ± 0,455 2 3 8,944 ± 1,183 0,125 3 40,680 ± 8,652 0,25 3 12,235 ± 0,889 Caco-2 0,5 3 8,061 ± 1,268 1 3 7,728 ± 0,503 2 3 7,053 ± 0,270 0,125 3 20,863 ± 0,596 0,25 3 15,820 ± 1,129 SNB75 0,5 3 16,011 ± 0,517 1 3 13,680 ± 0,631 2 3 12,724 ± 0,198 108 Conclusion et perspectives 109 La présente étude réalisée aux Laboratoires de Chimie Bio Organique et de Substances Naturelles (LCBOSN) de l'Université Nangui Abrogoua, d'Architectures Moléculaires et Matériaux Nanostructurés (AM2N) de l'Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Montpellier, de Microbiologie de l'Université Montpellier 2, de Chimie Structurale Biomoléculaire de l'Université Paris 13 et à l'Institut National de Recherche Agronomique (INRA) de Montpellier, est une contribution à la valorisation des plantes africaines notamment ouest-africaines dont les organes (tige ou racine) sont employés comme ustensiles de toilette bucco-dentaire. A cet effet, 7 espèces végétales ont été sélectionnées pour nos investigations. Ce sont : 2 Caesalpiniaceae (Erythroph/eum africanum et Swartzia madagascarensis), 2 Combretaceae (Guiera senegalensis et Terminalia albida), 1 Mimosaceae (Prosopis africana), 1 Meliaceae (Pseudocedrela kotschyi) et 1 Rutaceae (Zanthoxylum zanthoxyloïdes). Les objectifs scientifiques de ladite étude ont été : (i) de connaître la composition en éléments minéraux desdites plantes ; (ii) de quantifier leurs teneurs en polyphénols totaux, en flavonoïdes totaux et en anthocyanes et aglycones ; (iii) d'estimer leur activité antioxydante ; (iiii) de révéler leur caractérisation phénolique et d'évaluer leurs propriétés antibactérienne et anticanréreuse en fonction d'une part, des meilleures estimations quantitatives et d'activité antioxydante qu'elles ont présentées et d'autre part, des informations tirées de la littérature. L'analyse minérale effectuée au moyen d'un microscope électronique à balayage a mis en lumière la composition en Al, Ca, Cl, Fe, K, Mg, Mn, P, S et en Si avec une prédominance respectivement en K, Ca dans toutes les espèces. Contrairement aux autres espèces étudiées, l'analyse quantitative a révélé que G. senegalensis et P. kotschyi sont moins riches en polyphénols totaux et en aglycones flavoniques. Toutefois, elles ont présenté une teneur appréciable en flavonoïdes totaux. L'évaluation de l'activité antioxydante a indiqué dans l'ensemble, que toutes les plantes ont un bon profil antiradicalaire à 0,008 g/ml. Cependant, 110 une tendance se dégage avec E. africanum qui signe une activité antioxydante voisine de celle des antioxydants de référence à 0,0005 g/ml. La caractérisation phénolique a concerné E. africanum, P. africana, S. madagascariensis, T. albida et Z. zanthoxyloides. Elle a été obtenue en couplage GC-MS et LC-MS ; ces méthodes spectrales ont révélé la présence de phytocomposés phénoliques dans toutes les plantes. Contrairement au profil chromatographique des autres espèces, ceux de E. africanum, P. africana et T. a/bida ont montré qu'elles renferment l'EGCG et l'ECG, deux métabolites secondaires phénoliques entre autres, qui interviennent directement dans l'hygiène bucco-dentaire. Relativement à l'étude biologique de BAK 1, BAK 2, BAK 3, BAK 4 et BAK 5 des tests antibactérien et anticancéreux ont été effectués sur des souches bactériennes à Gram positif et négatif ; et sur des souches cancéreuses humaines et de rat. Il ressort que : - E. africanum, P. africana et T. albida ont manifesté une activité antibactérienne sur Staphylococcus aureus et Micrococcus luteus ; - E. africanum, P. africana, S. madagascariensis, T. albida et Z. zanthoxyloides ont signé une activité anticancéreuse sur les souches MDA-MB 231, Caco-2, 816F10 et MDA-MB 435, SNB75 et C6. Ils se sont signalés plus actifs sur les souches Caco-2 (lignée cancéreuse humaine du côlon), SNB75 (lignée cancéreuse du cerveau) et C6 (lignée cancéreuse issue du glioblastome de rat). L'extrait de tige de Z. zanthoxyloides s'est révélé le plus actif sur les 6 souches cancéreuses. Ainsi, au regard des résultats escomptés, nous ouvrons une piste explicative de l'emploi récurrent de certaines plantes issues de la flore africaine comme ustensile de toilette bucco-dentaire par les populations, tout en espérant avoir marqué un point de départ vers la mise au point d'une thérapeutique traditionnelle améliorée indiquée dans les pathologies bactérienne et cancéreuse. En guise de perspectives, nous envisageons améliorer les effets antibactérien et anticancéreux de nos extraits par purification, isolement et élucidation structurale par RMN 1H, 13C des phytomolécules dont les groupes 111 sont déjà connus par caractérisation GC-MS et LC-MS. Par ailleurs, les effets antibactériens que manifestent nos extraits seront comparés à des antibiotiques commerciaux de référence. Aussi, serait-il souhaitable d'effectuer des essais in vitro puis in vivo plus approfondis avec les molécules isolées aux fins d'une appréciation plus nette de la réponse structure-activité. 112 (JlJjérences 113 Abernethy J.L. (1969); The historical and current interest in coumarin; J. Chem. Educ. 46, p. 561 et 856. Adou A. J., Bakayoko-LY R, Ndobo-Epoy Ph. (1999); Asiderose amelaire et carie dentaire ; Odonto-Stomatologie Tropicale - N°87 Agboola D.D. (2004); Prosopis africana (Mimosaceae): stems, roots and seeds in the economy of the savannah areas of Nigeria. Econ. Bot. 58 (Suppl.), S34-S42. Aho M. E. (1998) ; Infections focales (Manifestations à distance de la septicité bucco• dentaire). Thèse en chirurgie dentaire (UFR d'odonto-stomatologie) Université de cocody (R. C. I.), p 41 . Akerele, O., V. Heywood and H. Synge (1991 ); Conservation of Medicinal Plants. Cambridge University Press, pp: 56-84. Akowauh G.A, Zhari. 1, Norgyati. 1, Sadikun.A et Khamsah S.M. 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Porter à l'ébullition sous reflux durant 10 heures, ajouter ensuite 150 g de sulfate de lithium, quelques gouttes de brome et porter à nouveau à l'ébullition durant 15 min. Refroidir et compléter à 1 litre avec de l'eau distillée. 2. Spectres de l'analyse au microscope électronique à balayage Sample: EA Element 1 Weight% Atomic% Compd% Formula CK 7.83 13.65 28.67 C02 8000 MgK 7.47 6.44 12.38 MgO 0.29 0.23 0.55 Al203 AIK 6000 Si K 1.15 0.86 2.46 Si02 PK 4.14 2.80 9.48 P205 SK 1.00 0.65 2.49 503 4000 CIK 0.77 0.46 0.00 KK 20.68 11.08 24.91 K20 2000 Ca K 12.57 6.57 17.59 cao MnK 0.00 0.00 0.00 MnO Fe K 0.54 0.20 0.69 FeO 0 43.57 57.06 0 2 4 6 8 10 12 Totals 100.00 Full Scale 9924 cts Cursor: 0.000 ke\ Samp_le: GS Element 1 Weight% Atomic% Compd% Formula CK 11.24 18.31 41.18 C02 6000 Na K 0.23 0.20 0.31 Na20 MgK 5.39 4.33 8.93 MgO Al K 0.30 0.22 0.57 Al203 4000 Si K 0.92 0.64 1.97 Si02 PK 2.73 1.73 6.27 P205 SK 1.19 0.72 2.97 503 Cl K 1.40 0.77 0.00 2000 KK 14.49 7.25 17.45 K20 Ca K 12.72 6.21 17.79 CaO MnK 0.54 0.19 0.70 MnO Fe K 0.36 0.12 0.46 FeO 0 0 48.49 59.30 0 2 4 6 8 10 12 Totals 100.00 Full Scale 7450 cts Cursor: 0.000 keV SamQle: SM Element 1 Weight% Atomic% Compd% Formula CK 9.31 15.89 34.11 C02 6000 Na K 0.19 0.17 0.25 Na20 MgK 3.23 2.72 5.35 MgO AIK 0.73 0.55 1.37 Al203 Si K 2.78 2.03 5.95 Si02 4000 PK 2.84 1.88 6.50 P205 SK 0.73 0.47 1.83 503 Cl K 0.76 0.44 0.00 2000 KK 17.11 8.97 20.61 K20 Ca K 15.84 8.10 22.16 cao MnK 0.21 0.08 0.27 MnO Fe K 0.66 0.24 0.85 FeO 6 8 10 12 0 45.63 58.47 0 2 4 ke Totals 100.00 Full Scale 7977 cts Cursor: -0.004 (13131 cts) SamQle: PA Element 1 Weight% Atomic% Compd% Formula 10000 13.14 26.94 C02 CK 7.35 8000 Na K 0.23 0.21 0.31 Na20 MgK 6.18 5.46 10.25 MgO Al K 0.28 0.22 0.52 Al203 6000 Si K 0.93 0.71 1.99 Si02 PK 3.88 2.69 8.88 P205 SK 1.32 0.88 3.29 503 4000 CIK 0.28 0.17 0.00 14.98 32.87 K20 KK 27.28 2000 Ca K 9.83 5.27 13.76 cao MnK 0.50 0.20 0.65 MnO Fe K 0.21 0.08 0.27 FeO 0 41.73 55.99 0 2 4 6 8 10 12 Totals 100.00 Full Scale 10278 cts Cursor: -0.004 (13133 cts) keV SamQle: PK 10000 Element 1 Weight% Atomic% Compd% Formula CK 11.72 19.48 42.96 C02 8000 MgK 3.35 2.75 5.55 MgO AIK 0.12 0.09 0.22 Al203 Si K 0.31 0.22 0.67 Si02 6000 PK 1.44 0.93 3.29 P205 SK 0.26 0.16 0.66 503 4000 CIK 0.72 0.40 0.00 KK 19.10 9.75 23.01 K20 Ca K 16.11 8.02 22.54 cao 2000 TiK 0.00 0.00 0.00 Ti02 Fe K 0.13 0.05 0.16 FeO 0 Cu K 0.18 0.06 0.22 cuo 0 2 4 6 8 10 12 0 46.57 58.09 Full Scale 10278 ds Cursor: -0.004_(13422 cts) ke' Totals 100.00 SamQle: TA Element 1 Weight% Atomic% Compd% Formula 10000 CK 8.29 14.45 30.38 C02 8000 MgK 5.58 4.81 9.26 MgO Al K 0.34 0.26 0.63 Al203 Si K 0.95 0.71 2.03 Si02 6000 PK 3.50 2.37 8.02 P205 SK 0.92 0.60 2.29 503 CIK 0.64 0.38 0.00 4000 KK 16.66 8.92 20.07 K20 Ca K 18.55 9.69 25.95 cao MnK 0.38 0.15 0.50 MnO 2000 Fe K 0.19 0.07 0.24 FeO Zn K 0.00 0.00 0.00 ZnO 0 44.01 57.60 Totals 100.00 0 2 4 6 8 10 12 ke Fun Scale 10278 cts Cursor: -0.004 (13799 cts) ------ SamQle: ZZ Element 1 Weight% Atomic% Compd% Formula CK 8.18 14.17 29.97 C02 MgK 7.17 6.13 11.89 MgO 8000 AIK 0.31 0.24 0.58 Al203 Si K 0.53 0.40 1.14 Si02 6000 PK 2.92 1.96 6.70 P205 SK 1.43 0.93 3.57 503 CIK 0.33 0.20 0.00 4000 KK 13.06 6.95 15.74 K20 Ca K 21.12 10.96 29.54 Cao TiK 0.00 0.00 0.00 Ti02 2000 MnK 0.17 0.06 0.22 MnO Fe K 0.25 0.09 0.32 FeO 0 44.53 57.91 Totals 100.00 ~ 2 4 6 8 10 12 full Scale 10278 cts Cursor: -0.004 (13349 cls) 3. Activité antioxydante Concentration en 0,008 0,004 0,002 0,001 0,0005 0,00025 g/ml %1. BHT 93,29 93,09 92,59 92,35 84,04 66,00 %1. vc 93,99 93,42 92, 57 92,15 91,84 85,20 %1. PA (EB) 75,07 38,77 18,87 11,28 02,19 01,64 %1. TA (EB) 90,08 90,00 92,04 75,60 48,44 04,02 %1. PK (EB) 87, 56 83,16 77,83 33,42 10,43 02,23 %1. SM (EB) 28,89 18,87 03,13 01,33 01,33 01,33 %1. EA (EB) 92,19 91,19 85,30 81,20 81, 10 36,78 %1. GS (EB) 84,12 60,40 25,45 03,28 01,07 0,96 %1. ZZ (EB) 02,12 02,12 02,12 01,25 01,25 01,25 4. Réaction de Polymérisation 3 tubes ont été préparés avec 100 µL de l'échantillon BAK 3 et ont été mis à sec à l'évaporateur centriguge (GeneVac EZ-2). Réactif de phloroglucinolyse : 250 mg de phloroglucinol, 50 mg d'acide ascorbique, QSP 5 ml dans Métanol/HCI 0.2M. Tampon formiate d'ammonium: 0.063 g de formiate d'ammonium dans QSP 5 ml d'eau milli-Q. 0.5ml et 0.75 ml de réactif de phloroglucinolyse ont été ajoutés aux tubes 1 et 2, et 3 respectivement. Les tubes ont été mis au bain marie à 50°C pendant 20 minutes. A l'issue de cette étape, 0.5 ml et 0.75 ml de tampon formiate d'ammonium ont été ajoutés aux tubes 1 et 2, et 3 respectivement. Les milieux réactionnels ont été injectés selon les mêmes conditions que pour l'analyse en injection directe. 5. Courbes de variations des pourcentages de viabilité par souches cancéreuses et par échantillon 5.1. B16F10 BAK 1- B16F10 ,-.. 110 ~ e_, 90 •QI :=.E 70 e,s ·;:: 50 QI '0 QI 30 e~,s 10 -=QI <:J ; -10 ô 0,5 1 1,5 2 2,5 0 ~ Conc (mg/mL) BAK 2- B16F10 BAK 3- B16F10 100 -. 100 =-~ =~ -:~ 80 -~ 80 :E 60 ·=.,-Q 60 ·;=::: ·;=::: ~ ~ 'C 40 'C 40 ~ ~ 1:)1) 1:)1) .•=.. 20 .•=.. 20 ~= ~= !:: 0 i~.. 0 =Q 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Q= 0 0,5 1 1,5 2 2,5 ~ ~ Conc (mg/mL) Conc (mg/mL) BAK 4- B16F10 BAK 5- B16F10 80 100 ~ 70 - ~ - t. ~- 80 -.•~.. 60 -~ l\r; ::: 50 60 .,Q =:E .~ 40 ..=. > 40 : 30 .l ~ "' 1 ~ T 'C -: 20 .•. ~ 20 .•:.. 10 .•=.. 0 ~= 0 f ~ !:: 0 0,5 1 1,5 2 2,5 i.. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Q= =Q ~ Conc (mg/mL) ~ Conc (mg/mL) 5.2. Caco-2 BAK 1- Caco-2 BAK 2- Caco-2 120 ~ ~ 60 .0-._ , .0-._ , -~ 100 -~ : t 450 ~ :ë 80 \_ :=.ë ·;'":= 60 ·;'":= 30 ~ 40 \ ~ 20 "O '1" - "O ~ - - ~ 10 0.0 20 - 0.0 .•'."=. 0 .•'."=. 0 ~= ~= (,j 1,5 2 2,5 (,j 0 0,5 1 1,5 2 2,5 J., 0 0,5 1 J., ::s ::s 0 Conc (mg/mL) 0 Conc (mg/mL) ~ ~ BAK 3- Caco-2 BAK 4- Caco-2 100 ,_ 60 ~ -.0._ , -.•~.. 80 ê5o :.: -~ 40 :ë 60 ;=: ..'~"=. ~ 30 ~ 40 ·;: "O ~ 20 ~ "O 0.0 20 ~10 .•'."=. =~ ~'"= 0 (,j 0 J., ~ ::s 0 0,5 1 1,5 2 2,5 ~ 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 ::s ~ 0 Conc (mg/mL) ~ Conc (mg/mL) BAK 5- Caco-2 .- 60 ê 50 .•.. :-.~: 40 :.ë .~ 30 ~ ' ~ 20 \ ~ \ .•f.. 10 - ~= 0 ; 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 ~ Conc (mg/mL) 5.3. C6 BAK 1- CG BAK 2- CG 50 35 ~ -c:, -c~:, '-' 30 ·.•~.. 40 ·'.•~-.. ' :.= .... 25 -,_F ' :E 30 ~ -:E~ 20 ·;;:: ·;;:: 15 ~ 20 ~ "O "O '' - ~ ~ 10 b.l) 10 b.l) .•~.. .•~.. 5 ~ 0 ~ 0 =CJ C=J ,.. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 ,.. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0= 0= ~ Conc (mg/mL) ~ Conc (mg/mL) BAK 3- CG BAK4-CG 50 60 -~c:, ~ '-' ~- 50 ·~ 40 ·.•~.. = :: 40 :ë~ 30 ,.Q ·;;:: .! 30 ~ > "O 20 ~ "O 20 ~ ~ ~b.O t)J) .•.. 10 $! 10 ~ =CJ =~ ,.. 0 ,C.J. 0 0 2,5 = 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 0 0,5 1 1,5 2 ~ ~= Conc {mg/mL) Conc (mg/mL) BAK 5- CG 40 -~ 35 - '-' ·~ 30 i 25 :=ë~ ·;;:: 20 \ ~ "O 15 \ ~ l_ T b.l) 10 .•~.. i ~= 5 ,C.J. 0 0= 0,5 1 1,5 2 2,5 ~ 0 Conc (mg/mL) 5.4. MDA-MB 231 BAK 1- MDA-MB 231 BAK 2-MDA-MB 231 ...... 120 130 c~:, ~c:, '-' '-' 100 -~ 110 -:=~: .-.<:: 80 -:ë 90 :ëc,: c,: ..~• 60 ·;;;: 70 ~ ~ "Cl "Cl 50 40 ~ ~ t)J) t)J) c,: 30 .•c.,:. 20 .•.. ~= ~= 10 C,I C,I 1,., 0 1,., -10 O =0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 =0 0,5 1 1,5 2 2,5 ~ ~ Conc (mg/mL) Conc (mg/mL) BAK 3- MDA-MB 231 BAK 4- MDA-MB 231 ..-.. 100 ...... 150 ~c:, c':J, :. '-' 130 80 '-' -~ -~ 110 i = ..• :ëc,: =~ \ 60 c,: 90 ·;;;: ·;;;: \ ~ 70 "Cl ~ 40 "Cl -.....___~ ~ 50 t)J) ~ ..•. c,: en ~ .•.. 20 .•c.,:. 30 ~ C=,I ~ 1,., C=,I 10 0 1,., 0= -10 O 0 0,5 1 1,5 2 2,5 =0 ~5 1 L5 2 2,5 ~ ~ Conc (mg/mL) Conc (mg/mL) BAK 5- MDA-MB 231 ...... 50 'c:J, :. '-' 40 -:5~ :cë,: 30 ·;;;: ~ "Cl 20 ~ t)J) c,: .•.. 10 ~= C,I 1,., 0 0= ~ 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Conc (mg/mL) 5.5. MDA-MB 435 BAK 1- MDA-MB 435 BAK 2- MDA-MB 435 110 90 0~ 80 ~0 - - '-" '-" 90 •ci> 70 •ci> ..•..... ;::: 60 ... 70 :-.ë -~ ~ 50 ·s~;: ·s;: 50 Cl> 40 Cl> "0 "0 Cl> 30 Cl> 0.1) 30 ~ 20 .•~... .•... Cl> 10 Cl> 10 C=J C=J t.. t.. 0 0= 0= -10 ~5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 ~ ~ Conc (mg/ mL) Conc (mg/L) BAK 3- MDA-MB 435 BAK 4- MDA-MB 435 100 ,-.. 100 ~ ~ Q- 0 '-" '-" 'Cl> 80 •ci> 80 ... ~ =~ 60 :.ë 60 ·s~;: ·s~;: Cl> 40 Cl> 40 "0 "0 Cl> Cl> l:)J) 20 l:)J) 20 .•~... .•~... Cl> Cl> C=J 0 C=J 0 t.. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 t.. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0= 0= ~ Conc (mg/mL) ~ Conc (mg/mL) BAK 5- MDA-MB 435 90 ~ -Q '-" •ci> 70 :=.ë .~... 50 Cl> "0 Cl> 30 l:)J) .•~... =Cl> 10 CJ t.. 0= -10 (:) ~ 0,5 1 1,5 2 2,5 Conc (mg/mL) 5.6. SNB 75 BAK 1- SNB 75 BAK 2- SNB 75 100 130 ~ Q~ -Q - '-' '-' 110 •Q,I 80 •Q,I : : 90 :E 60 :E~ , ·s~;: "> 70 Q,I 40 Q,I \ "O "O 50 Q,I Q,I ~- t)I) t)I) 30 .•~.. 20 .•~.. ---- 10 - Q=,I =Q,I V 0 V i. i. -10 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 =0 0= ~ ~ Conc (mg/mL) Conc (mg/mL) BAK 3- SNB 75 BAK4-SNB 75 ,__ 60 ,-._ 120 Q~ Q~ •'-Q,I ' 50 ~ 100 .t:: :-ë 40 =:E 80 ~ ..~. .... 30 ... 60 Q,I Q,I "O "O 20 Q,I 40 ~ t)I) b~J ) ~ .•.. 10 .•.. 20 Q=,I =Q,I V V i. 0 i. 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 =0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 ~= 0 ~ Conc (mg/mL) Conc (mg/mL) BAK 5- SNB 75 ,-._ 25 ~ ~ 20 rt :ë 15 ~ "> 10 Q,I "O Q,I 5 t)I) ~ .•.. 0 =Q,I V 0 0,5 1 1,5 2 2,5 i. =0 Conc (mg/mL) ~ Joum al of Medïcinal Plants Research VoL 5(27). pp. 6273-6277. 23 November. 2011 Available on1ine· al http://www.academicjouma.ls.c,gfJMPR ISSN 1gg~875 C2D11 Academic Journals DOi: 1D.5897/JMPR11.678 Full Length Research Paper Erythroph/eum africanum Afzel. (Caesalpiniaceae), an African toothpick: Phytochemical screening, total flavonoid content and antioxidant activity KADJA Amani Brice*, MAMYRBÉKOVA-BÉKRO Janat Akhanovna. BENIE Anoubilé, BOUA Boua Benson, N'GAMAN Kohué Christelle and BEKRO Yves-Alain Laboratoire de Chimie Bio Organique et des Substances Naturelles (LCBOSN), UFR-SFA, Université d'Abob<>Adjamé, 02 BP 0601 Abidjan 02, Côte d'Ivoire. Acoepll!d 14 ,vl 2011 Eiythrophleum africanum is an endangered West Afrïcan medicinal plant because of the large-scale use of its stems as toothpicks. Phytochemical screening (preliminary test and thin layer chromatography (TLC) method), a quantitative analys'is of total flavonoids, anthocyan.idins and radical scavenging activity (2,2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) method) of stems of E. africanum were undertaken. The study shows that the quantification of the phenolic compounds (flavonic aglycones and anthocyanjdins) and the assessment of the antioxidant activity put in evidence that in spite of the weak percentage (0.05%) of total flavonoids in the stem of E. etticsnum, the flavonoids are responsible to 94.46% of its antioxidant propriety. Key words: Erythroph/eum africanum, total flavonoids, toothpick, antioxidant activity, 2,2'-diphenyl-1- picrythydrazyt (DPPH). INTRODUCTION Plants have been used as medicine or drugs ail over the So in Malinké, it is known as "tali", "gouélé téli", or wortd throughout the ages (Apak and Olila, 2006). Our kabala". ln Bobo-Dioulasso it is caUed "kiri" or "kiri work will consist in showing that lheir choice, sometimes gbèsè" (gbèsè stands for loothpick). Sénoufo people call guided by chance or instinct, is s<:ientifically confirmed by it "djéguélW (Michel, 2003). lt is used to cure many theïr biological and chemical proprieties .The elhno diseases .ln tact the stem bark of E. africanum is used as botanic ·inquiries carried out in the martcets of the district diuretic and emetic. lt is also used in the treatment of of Abidjan, targeted herbalists led us to list many plants toothache and in the magic - religious practices. such as "Erythrophleum africanum._ Our choice is To evaluate the stem bark of E. otncenum as justified by the tact that no photochemical study of ils alternative means in the dental and mouth hygiene, we stem has been made to our knowledge. However, had to know its phytochemical composition and to test ils research made on the leaves show an important toxicity antioxidant power in vitro. (Hassan et al., 2007). lt is a pan African plant of dry fores1s, dense or light, and wooded savannah. lt is a tree of 10 to 15 m of high that we can mistake for Burke~ MATERIAU AND METHODS o.fricana (Aubréville, 1950; Michel, 2003) and for Albizzia cari.Jria. lt possesses smooth and scaled leaves, hard and breakable interiorly into red orange slice .That tree has alternate leaves of 10 to 15 cm long (Priya, 2008). Stems of E. .Jfricanum were oollected in Longorola (Sik,usoJMali) i lts vemacu'lar name differs from one region to another. July 2001>. They were kindly identified by Pr. AKE-Assi Lauren boéan:ist in the National Center of Floristique (Centre National de Floristique CNF) of the Urtivenity of Cocody (Abidjan/Côte d'Ivoire). The stems of plant were eut and dried under ventilation at room temperatun! then finefy ground with an electrica:I 9rinder (RETSCH ·Com!sp<1nding aU1hor. E-mail: kadjama:[email protected]_ type SM 100). 6274 J. Med. Plants Res. SolVt!nt, reagen~ and lechnical material contents were assessed using the method desaibed by Letreton et aL ( 1967) and Oohou et al. (2003). Two gram of plant material was Ali the solvents. raagents and chemi.cal produc!s were purcha.sed put in cooling at room temperature; the aglycon.es were extracted from Carlo Erba. Reagents fat the phytochem.~ sueening were treating the aqueous phase by ethylic eth« (2 x 50 ml). The ether prepared to the Lab Anthocyanidins (T) (mg/g) = [(yAl'e:) x M x V x d) / P Pre~ralîon of erude utrxt Wheœ: y i5 the factor of correction equals to 6 of the yield o Fa [dentifica1ion of secondary maabolites, 1 g of the plant powde, transformation of leucoan1hocyanidins (of the order of 17%), A is was maœrated il 50 ni, 80,% {11,f!il) for I h at roam temperature. e absorbance to the maximal absorp6on wa'i/e length, E i:s the m.elhanolic crude extrad W.15 cbtained .sfterflltratrœ under vi coelfJCient of molar absorption of cyanidol (= 34700). Mis the molar mass of leucocyanidol (= 306), V is the volum.e of n-butanolic solution. D is the facta of dilution, and p is ma.ss of dry m.atler lwlation of total flDonoidP'!i by c~lating œdmtq~ oi hydrolyz:ed plant materiaL The differential dosage of flavonols and flavone.s agfyt:ones was We used the new method of isola1ian isaelawnes by ,complexa1i realized using chelating proper1ies of ethanolic solu6on of ~'1, 1 % tedlnique described by Priya et al. {2008). The methanolic crude ( 1 g of AlCh dissolves il gg ml of EtOH, g5~ ). An a.!iquoè of cru de extrar::i of stems ( 10 ml) was treated wjth 10 ml of a solution of AICh extract obtained after evaporation of the solvem was dissolved i {0.05 g/ ml) for 5 days at room œnrperature. The residue was 60 ml of ethanol 95% and 6 ml of solution af AICh (1%) was fitefed out and washed wjth MeOH and dried under a vacuum to give a solid residue. The residue was hydrolyzed usilg a d added. The al is hatched durilg 10 mil. The specter ts swept sdution of HCI (2 N), to release free total fbvonods 11flich were between 3aO to 460 nm and the m,ax:mal abs()rba.nœ was extracted using AcO El The ethyl ac.eu~ fraction was .analyz:ed by determined. The absorbance of the differen1i.11 peak aga'ilst a blan lC using Neu's reagent to confirm the pn!Sence offlavonoids. wilhoul AJCb îs proportional to the concentration of the sarn avonic aglycones. The aglycones content calculated was expressed in equivalent af quercetin according the follOW11g formula (Dohou et al., 2003): Phytochemigl '!icr.Pning and TLC Tests for qu:ilones, anthraœnics, saponins. flavcnoids, C0'11111..arins. Aglycones (T) (mg/g) = [(AIE) X ,., X V JC d), p alkaloids, reducing compounds and tannins were pern,rmed according to Dohou et al. (2000) and Bekro el al. (2007). TLC fa Where: A is the absorbance of the diffelential [email protected], r is ttle the presenoe of flavonoids Total flavonoid content Frtt radical ~cav.nging activity ant.nm~nt 42)'-ifiphe,nyl-1- picrylhydrazyl {DPPH) a~'!i.ly) One gram of dry and ground plant material was put in presenœ af 100 ml of MeOH {80% ,,Jv). After agitaf10n durng 30 min, 1 ml af The antiox:idant activily of the melhandic crude extract and ethyl crude extract approprtated was m.ixed in 50 pl al Neu"s reagenl and acetate extract {total flavonoids) was ,15sessed by the me.an af 2,2'• pure MeOH {12 ml}. The absOl'banœ was de!ermined at 404 nm diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) spectrophotometric method and was compared to 1 ml of quwœfin solufion (0.05 mg}mL) used (Blois, 1958). as positive con1rol. The percentage af toi.li fl.1.'l'onoids was The v,it,amn C was used lite antioxidant contrai. The percentage calculated in equivalent quercetin accorcfng to the folowing, form or inhibition of the DPPH 'by the methanolic crude extract and ethyl {Lebreton et al., 1967): acebte extract was calculated according the folowing fŒmula (Wu et al .. 2008): Perœntage of total flavonoids {%F) = (0.05 x A..,J Aq) JC 100 / C.>1 {'-) Perœntage of inhibition {%1) = [(Ab- A.)/ Ail) x 100 Where: is absorbanœ of crude extract. A~ is absorbance o A., Where: Ab = absorbance of blanck and A. = absor'bance of sample querœtin and C.,. is the concentra1ion of crude exiract in plant material eifher 10 mgfml. RESULTS QuantiUtiv,. anal~is of anthocyanidin'!i and tlavon~ aglyconts Phytochemical screening The anlhocyanid.ils, flavonic aglycones (flavonols and' llawnes) Table 1 shows the resutts of the tests by means of the Brice et al. 6275 hconcl!!J IM'tabollu Qui Anth Tan hpo Cou M flawo R• com Oit.cllion + + {lm • 250) + Tr + + t: PrtM,a; · :A.bltnot: Tt· Tta0t, ~ · ln6t:l of mou. TM. tamM: Cou: ~: ,,,.-. : dWaoanic1. Oui: qulnonots: .-ic1s: Sapo: ~: Re COl'll): l'tduClng ~- Ft.o ilaonocfs T_. 2-. TLC ~ ol 1M ~nok cNdt t.ltr.act Rf Colot UVIHI 11111 0.1 ~ Of\vlot 0.29 lnvi •Ortn~ 0.34 Yt41ow Fluo~t yellow Ch.ab>netJ1uronH 0.73 8~ ·uorftQlflt bl~ Mech~ted fllvone1 Tablt l. R:eiiUh ol qu.vd!Utlvt an.llysis of wms d E. nir• ••••. TOUi l.awonaids 0.05~ 1.803~ T ••• ,. TLC analy5is d t!hyl .-tate fraction. Possi»le compounds 0.14 Me1hyla1edftavones 0.4e Anfhocyanidins 0.59 Methylattd tlavones 0.87 Flavonols/aurones colorf\l reac:tions. We were looking for the folowing Isolation of total flavonoids by chelating technique groups of phytocbemical ~oods: .quinooes ~racenics. ta"f'lins, saponins, coumanns. allaloids ln order to highlight the intrinSic antioxidant activity of the and reducing c0f11)()Wl(ls. llavonoids, we extraded them with ethyl aœtate after i9olatiorl by complexaion and acicic hydroiys3. The qualtative analysis on TLC by means of lhe reagent of Detection of ftavonoids in the melhanolk: avde Neu of the ett,ytacetate fraction makes the blue, orange extr8ct and ~ ~~ to appear under UV/366 nm on the chromatogrwn. Whie refen'lng us to the WOfls of The reagent of Neu has been used to reveal ftavono.ds. Wagner et al. (1996), we de 72 ,------j- 70 +- - A;1: 68 ---- ! 66 0 Î64 %i. F.T. & 62 ~ • %i. E. 8 C ~ EiO i. vit.C A•. 58 56 0.48 0.25 0.2 0.1 Concentrations (mg/ml) fÎ9'11'• 1. R.e:Kdls of the percflltlllg• of Inhibition of OPPH. F.T: Tcùl Flavoooids; .E.B: C~ E.xtract; Và C: WÎO'lt n• C. proteins. thal act indirectt'i. as the proteins vec1or of iron stems of E. :>lricanum, encourage defJense against the and copper_ The antiaxklant actidy of crude extract (E.B) rnîcrobial fermentation (Oiby, 2004; Billy, 1982). and of the f0tal ftavonoids (F. T) has t>een valued by The quantitative anatyses 'Ï'Je us the ratH of 0.05% of spectrophotometry in co.mparlson Wdh the one of vrtamin total ftavonoids, 1-803 mgtg of anthocyanidins and 0.123 C taken as refere1lce antioKidant. For induded mo,'9 of ftavoric agtycones. The9e resuts justify thot the concentrations between 0.1 and 0.48 mg/ml, the stem of E. ofnconum is. poor in flavonoids. Never1heless, pen:enmge of inhibitiof'I of the induœd OPPH by vitamin the qua~ of the anthocyanidins is 14 times superior to C (69.14 to 69.69%} 1S dlSltictly superi DISCUSSION The present research achieved on E africanum allowed us to identlfy some secondary metabobms: coumarina, Vafious. ehemicals such as tanlâls, saponins, counarins, flavonoids, alkaloids, saponins, reducing compounds and alkaloids and tlavonoids which are obviously present in tanoos. Oosa,oes done at the end of the phytochemlc-al Brice et al. 62n scret11IÏIICJ. pe,mitted to quantify the flavonoids containing ln the atema. ln lpite of the weak rate (0.05%) of ftavonoids in lhïs ~ck. they are respousible to 94_46"' of b arfioxidant :actMty, which justifies ltle large UM of the stems of E. african11n in part as toothpidl. Composition chimique de deux Fabaceae africaines employées comme cure-dents Amani Brice Kadja, Jean-Luc Pirat, Jean-Noël Voile, Janat Akhanovna Mamyrbèkova-Bèkro, Yves-Alain Bêkro, Nicolas Sornmerer, Arnaud Verbaere", Emmanuelle Meudec Journal de la Société Ouest-Africaine de Chimie J. Soc. Ouest-Afr. Chim.(2013), 036: 47 - .i4 18tmeAnnée, Décembre 2013 lSS~ 0796-6687 Code Chemtcot Abstracts : JS0CF2 Cote INIST (CNRS France}: <17680> Site JFeb: /1ttp:l!lviv"'.soachl111.org J. Soc. Ouest-Afr. Chim. (2013) 036; -17 - 54 Composition chimique de deux Fabaceae africaines employées comme cure-dents Amani Brice Kadja", Jean-Luc Pirat\ Jean-Noël Voile\ Janat Akbanovna Mamyrbêkova-Bèkro", Yves-Alain Bêkro'", Nicolas Sommerer", Arnaud Verbaere", Emmanuelle Meudec' 0L aboratoire de Chimie Bio organique et de Substances Naturelles I UFR-SFA I Université Nm1g11i Abrogoua, 01 BP 801 Abidjan 02 bW.,[R 5253, !CG Montpellier, Equipe AM1N, ENSClvL 8, rue de l'Ecole Normale, 34196 Montpellier cedex 5, France 'INRA, UMR SPO, Plateforme Polvphéuols. 3./060 Montpellier cedex 1, France (Reçu le 28/10/2013 -Accepté après corrections le 03/03/2014) Résumé: La composition chimique des tiges de Ervthrophlenm africanuut et de Swartzia niadagascariensis a été réalisée. L 'analyse minérale faite au moyen du microscope électronique à balayage a révélé la présence dans ces organes de Al. C. Ca. Cl. Fe. K. Mg. Mn. O. P. S et Si avec une prédominance respectivement eu O. K. Ca. Toutefois. Na est présent seulement dans S. madagascariensis. L · analyse LC -MS a mis en évidence leurs caractéristiques phénoliques. Contrairement à S. madagascariensis. les tiges de E. africaniun renfenneur l'épigallocaréchine gallate. un très puissant anri-oxydant aux multiples effets bénéfiques et l'épicaréchine gallate. un flavan-3-ol. Mets-clès : Erythrophleum africanunt, Swartzia madngascariensis. minéraux. polyphéuols. LC-MS. Chemical composition of two African Fabaceae used as toothpicks Abstract: The chemical composition of stems of Ervthrophleum nfricn1111111 aud Swartzia madagascariensis was achieved. The minerai analysis made with the sca1111Î11g electron microscope. revealecl the preseuce in these organs of Al. C. Ca. Cl. Fe. K. Mg. Mn. O. P. S and Si with a predominance of O. K. Ca. LC-MS aualysis showed their pheuolic characrerisrics. Coutrary to S. madagascariensis. stems of E. africanum coutain epigallocatechin gallate. a powerful anrioxidanr with mauy beuefits and epicatechin gallare. a flavan-3-ol. Key words: Erythrophleum africanum, Swartzia madagascariensis. minerais. polypheuols. LC-MS. Auteur correspondant : E-mail: bekro200 [email protected] A.B. Kadja et ni 47 J. Soc. Ouest-Afr. Chi m. (!0 I 3) 036; ./ ï - 5./ 1. Introcluction La quantification des minéraux a été réalisée au Centre d'Analyses et de Recherche (CAR) du Le cure-dent est une tige, une racine ou un laboratoire de la PETROCI (Abidjan-Côte d'Ivoire). rameau. issu de différentes plantes africaines. En L "inciuératiou des échantillons végétaux a été faite plus d'être la brosse à dents africaine par à 550°C pendant 24 h dans un four de marque excellence. il joue à la fois Je rôle de dentifrice, de aberrhern MORE THAN HEAT. Une foi bain de bouche, de détartrant et d'antiseptique. Au récupérées. les cendres ont été analysées à l'aide du nombre des plantes africaines utilisées connue Microscope Electronique à Balayage (MEB) à frotte-dents eu Afrique de l'Ouest notamment. nous Pression Variable de la D.C.AR. (MEB FEG Supra avons pour notre part choisi pour cette étude et ce, -tO VP Zeiss), équipé d'un détecteur de rayons-X uite à une enquête etliuobotauique menée à Sikasso OXFORD Insrnunents) relié à mie plate-forme de Iali) à partir de considérations microanalyseur EDS (Inca Dry Cool. sans Azote chimiotaxouomique et etlmophannacologique. liquide). Erythrophletnn africauum et Swartzia madagascariensis. Ce sont deux légumineuses dont 1.1.2. Caractérisation des composés phénotiques les tiges sont employées comme ustensiles de toilette servant à nettoyer les dents. Concernant E. 10 g de poudre de chaque espèce végétale ofricanum. les études menées par Kadja en 2009 sur préalablement délipidée à l'éther de pétrole, sont es tiges [ l]. rapportent que l'espèce renferme uu macérés dans 200 ml d'acétone 70% (v/v) sou taux important de sucres totaux soit 109 mg/g. agitation magnétique pendant 4 h. Après filtration. raison pour laquelle elle serait très appréciée par le le filtrat est concentré sous vide puis lyophilisé. l populations ivoirienne et malienne. La présence mg d'échantillon prélevé de chaque espèce d'alcaloïdes. de coumarines. de flavonoïdes. de végétale. est repris dans 1 ml d'un mélange aponines et de terpènes est signalée dans la plante H20/CH30H à volume égal. ensuite l'ensemble est par le même auteur [2]. Quant à S. olubilisé au vortex. filtré à raide d'un filtre jetable madagascariensis, de nombreux travaux font de 0.2 ~1m de porosité. puis dilué au 1/ 1 onue pour mention de ses différentes activités : antalgique injection. Les injections ont été réalisées en dentaire et anri-infectieuse [3]. antifongique [ 4]. couplage LC-1\IIS avec un système de insecticide (coutre un moustique femelle du genre chromatographie liquide ultra haute performance Aedes notammeut) [5]. molluscicide [6]. (UPLC) Acquiry de Waters et une trappe ionique antipaludique [7) et antibactérienne [8]. (IT) Amazou X de Brüker avec une source d'ionisation en élecrrospray (ESI). La colonne 2. Matériel et méthodes utilisée est en phase inverse C 18 Waters Acquiry BEH 150 x Imm. avec des particules de 1,7 11m de 2.1. l\laté •. Iel végétal diamètre. La température de la colonne a été fixée à Le matériel végétal constitué essentiellement 35°C. Les solvants utilisés ont été A (H20 + 1 % des tiges de E. africanunt et de HC02H) et B (CH30H + 1 % HC02H) avec un débit S. ntadogascariensis, a été récolté les 30 juin et la de 0.08 ml/min. 0.5pl de chaque échantillon est juillet 20 l O à Longorola dans la région de Sikasso injecté et le gradient d'élution est présenté au au Mali et identifié le 04 juillet 2010 par le tableau I. Professeur Lament Aké-ASSI au Centre National de Les spectres UV-visible ont été enregistrés de 250 à Floristique (CNF / Université Félix Houphouët• 600 nm avec un pas de 2 mu. Les spectres de masse Boigny Abidjan-Cocody). Il a été ensuite nettoyé. ont été acquis en mode positif et en mode négatif éché puis pulvérisé à l'aide d'un broyeur électrique .ur une gamme de masse de 70 et 1000 u.m.a. Deux Iarque RETSCH. type SM 100) aux fins d'obtenir blancs ont été injectés avant les échantillons pour des fines poudres pour analyse. tabiliser la colouue. Chacun des échantillons est injecté une fois en mode positif. une fois en mode 2.2. Méthodes négatif. puis un blanc est intercalé entre eux. 1.2.1. Q11011tijicotio11 des minéraux Tableau I : Gradient d'élutiou tem2s 0 10 12 25 30 35 38 43 %B 2 30 30 75 90 90 2 2 A.B. Kadja et al 48 J. Soc. Ouest-Afr. Chi111. (1013) 036: ./7 - 5.J 3. Résultats et dlscusslon harmonieux des systèmes protéiques. enzymatique 3.1. Quantification des mlnêraux et génétiques. lis participent à la protection contre le Les résultats de la quantification des sels stress oxydant [9]. Les complexes caséine• minéraux sont consignés dans les Tableaux Il et phosphopepride-phosphate de calcium (CPP-ACP) m. Ils montrent que E. africa11T1111 et S. e forment dans la cavité buccale pendant la madagascariensis contiennent les éléments C, Ca. digestion de la caséine. Une étude a montré qu'en Cl. Fe. K. Mg. Al. Si. P. S et O avec une nette 10 jours. 64 % des lésions superficielles de l'émail abondance en O. Ca et K (Figure l). En revanche, dentaire peuvent être réparées en présence de petites Na est présent dans S. madagascariensis. Les quaurirés de CPP-ACP [10]. Ce sont des complexes minéraux sont les éléments qui restent après stables composés de minéraux qui empêchent les calcination des tissus organiques; ce sont de bactéries cariogènes d'adhérer à la surface de biocatalyseurs indispensables au fouctionnement l'émail [l l]. Tableau II: Quantification des éléments minéraux présents dans E. africanum (en °ode masse) Spectre C Mg Al Si p s Cl K Ca Mn Fe 0 total 1 7.77 5.47 0.58 1.58 4.97 1.12 1.07 21.-49 11.23 0.00 0.89 43.84 100.0 2 7.83 7.47 0.29 1.15 4.14 1.00 0.77 20.68 12.57 0.00 0.54 43.57 100.0 J 8.43 5.49 0.33 1.42 4.33 0.77 0.77 21.18 12.24 0.15 0.70 44.19 100.0 :\loytDDf' 8.01 6.14 0.40 1.38 4.48 0.96 0.87 21.12 12.02 0.05 0.71 43.86 100.0 Tabjean ru: Quantification des éléments minéraux présents dans S. iuadagascariensis (en% de masse) Spectre (' Na Mg Al Si p s Cl K C'a l\lln Fe 0 Tora! 1 8.74 0.2 3.6 0.7 2.7 3.1 0.81 0.5 15.55 17.57 0.2 0.7 45.33 100.0 6 3 5 5 7 3 1 0 2 9.31 0.1 .~, __') 0.7 2.7 2.8 0.73 0.7 17.11 15.8-t 0.2 0.6 -t5.63 100.0 9 3 3 8 4 6 1 6 J 8.51 0.2 3.8 0.7 2.6 3.3 1.03 0.7 19.82 13.55 0.2 0.6 44.57 100.0 8 5 5 2 7 7 0 9 :\Ioytnnt 8.85 0.2 3.5 0.7 2.7 3.1 0.86 0.6 17.49 15.65 0.2 0.6 45.17 100.0 -t 7 -t 2 2 9 1 8 50 -t5 40 35 x= -c, 30 ·.: =C 25 EA 6 20 SM 15 ~ X 10 5 0 Al C Ca Cl Fe K Mg Mn 0 p s EA : E. africanum; SM : S. tuadagascariensis Flgurt 1: Quantification des éléments minéraux contenus dans E. africamnn et S. madagascariensis A.B. Kadja et al 49 J. Soc. Ouest-Afr. Chi111. (2013) 036; ./7 - 5./ 3.2. Caractérisation des composés phénoliques On perçoit bien la présence de I'épigallocaréchine gallate (EGCG) et de I'épicatéchine gallate (ECG) La figure 2 présente le profil dans E. africa1111111 . chrouiatographique de E. africanum. L'ensemble Ces deux métabolites secondaires empêchent la des composés élué, présente dans le massif. un formation de la plaque dentaire et combattent le maximum aux euvirous de 278 um. Par ailleurs. les bactéries de la cavité buccale en inhibant la masses caractéristiques des flavau-3-ols ont été prolifération de Streptococcus 11111Ta11s impliquée détectées en mode négatif à m/z = 289: (épi) dans la fonuation de la carie [12-15]. La figure 3 caréchiue, m/z = 577 : procyanidines dimères. ni/z = montre les profils spectraux UV à 280. 320 et 360 865 : procyanidine trimères. Pour aller plus loin um et visible à 520 lllll de S. tuadagascariensis. Une dans l'analyse. une dépolymérisarion vingtaine de pics a été numérotée au nombre de (pWoroglucinolyse) a été réalisée. laquelle 17 pics présentent le profil des composés Les caractéristiques chromarographiques et phénoliques. Les caractéristique pecrrales des principaux composés détectés et le chromatographiques et spectrales des principaux composés possibles issus de ces données, sont composés détectés et les composés possibles issu présentés dans le Tableau IV. de ces données sont présentés dans le Tableau , . 0 A (fragment galoyl) /.- " OH 0 OH EGCG: R1 = A; R2 : OH ECG: R1 = A; R2 = H Structures chimiques de EGCG et ECG . -M " ., Flgurt' 2 : Profils cbromarographiques de E. afi1cm111111 u -~·· • .. --.- ,U .. __ • • " Flgm·t' 3: Profils chromarographiques de S. madagascariensis A.B. Kadja et al 50 J. Soc. Ouest-Afr. Chim. (2013) 036: ./7 - 54 Tableau IV: Phytocomposés phénoliques possibles détectés dans E. africauum Pic T1· #.lllllX MSet~1Sn ~lasse Pb~·tocompost possible (min) fom) molall"e l 3.3 269 [~l+Hr =27-1 27 3 Peptide. alcaloïde .... 2 3.8 269 [M+H]" = 169. fragment à 125 170 Acide gallique (-)= perte du carboxyle 3 5. 274 [M-H]- = 343 / [M+Hr = 345 344 Ester quinique de l'acide gallique fragment à m/z=l91(-): acide quinique? -152 = galloyl 274 on identifié 3-1-1 Isomère de rester quinique de l'acide gallique? 9.2 274 [M+H]• =49 -196 Acide digalloylquinique Fragments à 309 et 153 (+) [M-H).=495 fragment à 343(-) (-152 = - galloyl 6 9.-1 2 [M+H]·= 745 866. 74-1 Mélange de procyanidine trimère et de [M-H]": 865. 745. 593. -195.289 proauthocyanidine dimère 45 donne des fragments à 593 (-152 =• ((épi)gallocatécllÏne-(épi)catécllÏne) galloyl). 575 (-galloyl-H20). 423 (= 575-152 galloylée ? : RDA= perte noyau B carechine). 289 ((épi)catéchine en position terminale 7 9.9 276 (M+H]• = 497. [M-H]"= -195 -196 Coélutiou d'un acide digalloylquinique Fragmeuts f+) à 479 (-18) et 327 (-170 578 et d'un trimère de procyanidine (et peut (M+H]• = 579. [M-H]·= 577. [M-H]-= 865 866 être d'un dimère). 8 11.l 276 [M+H]-=731 30. Dimère d'(épij-catéchine galloylé [M-H]" = 745 fragments à 727 (-18). 575 \- -16 et dimère (épijcatéchine• 170 : galloyl). -107 (=575-168 : RDA= perte épijgallocatéchine galloylé. noyau B d'unité (épijgallocatéchine). 287 (unité (épijcatéchine en position supérieure 9 12.1 2 [M+H]· = 731 30 dimère d'(épij-catéchine galloylé 10 12.9 279 [M+Hr = 715. 563 1-1. 563 Coélution d'un dimère (épi)catéchine- (épijafzéléchine et d'un dimère galloylé d'(épijcatéchine- (épijafzéléchine ou galloylé et le fragment (-gallate) correspondant li 15.8 279 (M+Hr = 443. 731 -1-12. 730 Coéluriou d. (épijcatéchiue gallate et d'un dimère d'(épij-catéchine galloylé. 12 17.1 279 (M+Hr = 835. 715 834. 714 Coélution d'un dimère galloylé d'(épijcatéchine-Iépijafzéléchiue et d"IUI trimère d'(épijcméchiue• épi)afzéléchine-(épi)afzéléchine. 13 18 279 (M+Hr=867. 715 866. 714 Coélution d·101 trimère d'(épijcatéchine et d'un dimère galloylé d · ( épi)catéchine-( épijafzéléchine. 14 19 279 [M+H]-=443 442 Epicatéchine gallate Fragments à 333. 273. 163 et 139(+). - 1 70 = gallate entier - 110 = catéchol du noyau B 15 20.6 279 (M+Hr = 699. 42 426. 698 Coélution d'(épijafzéléchine galloylée et d'un dimère d'(épijafzéléchiue galloylé 16 30.8 50.275 ~=31 316 Bmit A.B. Kadja et al 51 J. Soc. Ouest-Afr. Chi111. (2013) 036; -17 - 5-1 Tableeu V: Phyrocomposés phénoliques possibles détectés dans S. madagascarieusis Pk Tr #.llllU MStt MSn Masst pb~·tocomposé possible (min) (Dm) molaire 1 (Coél.dt 20.5 ler:278.320 Ier: [M+Hr=25,. •••. : 256. l"' liquiririgénine. nd 2 2""': 290 lèmt : fM+Ht = -B 1 2 :430 2""' Hexoside de C16H1204 (Ilavone. composés) Fragment à m/z = 269(+ isoflavone (fonnononétine) ou • -162 = hexoside déhydroptérocarpane) 2 (Coél. dt .1 •••. :265.330 1 cr [M+Hr = 401. l" :418(400,. 418 = hexoside d'une nd 0 3 2": 265. 32 zëmt : [M+Hr = 441. 2 : 440. dihydrcxyûsojflavanone ou d tU1 composts) 3": 265. 334 r=. [M+H)+ = 461 s=. 460 dihydoxyptérocarpane. • Fragment à u1'z = 299(+). -162 440 = adduit sodique?. = hexoside 460 = Hexoside de C11;H1006 (irilone) 4 21. 253. 283sb fM+Hr = 315 314 C11H14Û6 (emanine. kumatakéuiue ou ,. bydroxy-8-méthoxy-4 · .5 · -méthylène dioxyptérocarpane) C1sH1aOs (4 .. 7.8- triméthoxyptérocarpane) 22 253. 182 sh 637. 285(+ 284 Homoptérocarpine ou maackiaiue 6 .2.2 250. 285. 345. 285 ou 271(+) 344 Flavanone rétramérhoxylëe (344). 342 Non exploitable en négatif 284 Homoptérocarpine ou maackiaine (284. 270 fin du pic précèdent ?) ? ou médicarpine Oil 7-hydro:\'.)'-4 · -méthoxyptérocarpane 270)? 7 225 .88.330 fM+Hr=60 606 Aglycoue = C15H1005 (apigénine . Frag à m/z = 345. 271(+ 270 baicaléine, genisréine ... ) ou C1~14Û4 (alpinérine. médicarpine. 7-hydroxy-4 · - méthoxyprérocarpane, dihydrofonnononérine=t · -méthyl équol)? 8 .2.6 157.280sh. 607. 315. 273 (+) C1sH1~0s ou C1~1404 (3-(2-Hydro:\-.y-4- 317sh 973. 870. 272(-) 111é1l10:\'.YPhényl)- 7-cbromanol 9 .2.9 253. 265sb. 337. 315. 287(- 314 7-bydro:\.-y-8-métho:\.-y-4 · .5 · -méthylène• 285sh. 3-H dioxy prérocarpane, 4·-7.8- triméthoxyptérocarpane, 4-méthoxymaackiaine Oil 4-méthoxyhomoptérocarpùie 10 23.8 260. 285. 329(+) 328 7 .8- 11 24.-t 284.382 [M+Hf= [M-H]· = 557 268 Flavonol? médicarpine on 7-hydroxy-4·• Fragment à m/z= 271(+)/269(• méthoxyprérocarpane ) 12 25.2 250.305 679.619.351.269(+) 268 Formououétine .... ? 13 25.-t 283.330 [M+H]•=623 622 Aglycone = C1~100s (damnacauthal, Fragments à m/z = 323. 283(+) 282 pseudobaptigenine) 011 anhydrov 'ariabiliue ou 4 ·. ,• diméthoxyptérocarp-3-ène '! 14 25.6 257.318 299(+) 298 Ptérocarpine 15 26 258.325sh. 313(+) 312 fasse compatible avec 390sh -15 = perte d·1m méthyle? déhydroptérocrupane (par exemple A.B. Kadja et ni 52 J. Soc. Ouest-Afr. C/1i111. (!013) 036; ./ï - 5./ -t •. 7 .S-rriméthoxyptérocarpane) mai impossible à ce temps de rétention ? 16 26.2 255. 290sh. 313(+) 12 Isomère du composé précédent ? 3-tO 17 27 255. 300sh. 283(+) 282 Anhydrovariabiline ou 4 ·. ,• 350sh diméthoxyptérocarp-J-èue 18 28.5 255sh. 288. [M+Hr = 301 (et 559) 300 C1csHn06. C11H16Ûs ou C1sH200~ ou ,• 331 Fragments à m/z = 185. 167(+ hydroxy-l · .B-diœéthyiprérocarpaue ou 4- méthoxvmédicarpine •coéL= cœlulioo De nos jours. les composés phénoliques intéressent ouvrons une piste explicative de l'emploi récurrent les équipes de recherche à cause de leurs effets de certaines plantes issues de la flore africaine bénéfiques sur la sauté [ l 6]. Ce sont de comme ustensile de toilette bucco-dentaire par Je antioxydants naturels par excellence, qui suscitent populations africaines. de plus eu plus d'intérêt pour la prévention et/ou Je traitement de nombreuses affections cancérigènes, Remerciements inflammatoires. cardiovasculaires. Les auteurs expriment leur sincère gratitnde et leurs ueurodégéuératives. etc. L · engouement pour ce remerciements à l'é111i11e111 Professeur AKE-ASSJ phytocomposés est en rapport avec Jeurs vertus Laurent. au laboratoire de la PETROCI (Abidjan/Côte d'Ivoire) pour l'analyse minérale, à la plate-forme pharmacologiques potentielles. Eu effet dans le cas d'analyse des polvpliénols de l'Institut National de la d'un régime alimentaire riche en polyphénols, de Recherche Agronomique (INRA) de Montpellier pour études ont montré mie baisse de plus de 50 % des l'analyse LC-MS et le Service de Coopération et risques de maladies cardiovasculaires [ 17-19] ou d'Action Culturelle (SCAC) de l 'Ambassade de France neurodégéuératives [20. 21] chez des sujets e11 Côte d 'Ivoire pour/ 'appui financier. exposés. ~- Réfèrences BlbUographiqnts 4. Conclusion L'objectif scientifique de la présente étude a été [ 1] Kadja A. B .. Mémoire de DEA Etude phytochimique de contribuer significativement à fa valorisation de d'un cure-dent africain ErytbropWeum africanum plantes africaines à vernis pharmacologiques et ce, Caesalpiniaceae): dosage. isolement par complexariou et activité Antioxydante / Université dAbobo-Adjamé par des approches rationnelles. Ainsi. nous avons 2009. Abidjan. sélectionné Erythrophlemn africa1111111 et Swartzia [2] Kadja A. B .. Mamyrbékova-Békro J. A .. Beuie A .. uutdagascariensis. deux Fabaceae africaine Boua B. B .. N'gaman K. C.. Békro Y.A.. J. Med. Plant utilisées comme cure-dents. Leur analyse chimique Res. (201 J) 5(27). 6273-6277. a été effectuée. La composition minérale de la tige [3] Akerele O.: Heywood V.: Synge H .. Conservation of de chaque plante réalisée au moyen du microscope Medicinal Plants/Cambridge University Press 1991. électronique à balayage. a montré qu'elles Cambridge contiennent les éléments suivants : Al. C. Ca, CL [4] Berger K.. Schaffner W., Plant Cell Tiss. Org, Cutt Fe. K. Mg. l\iln, O. P. S et Si avec une (1995) 40. 289-291. prédominance respectivement en O. K, Ca. Quant à [5] Lwambo N. J .. Moyo H. G .. East Afr. Med. J. (1991 68(10). 827-830. la caractérisation phénolique de chaque drogue. elle [6] Hostermiaun K.. Wolfender J. L.. Pesric. Sei (1997) 51. a été obtenue en couplage LC-MS: laquelle a mis en 471-482. évidence la présence de phytosubstances [7] Ouartara Y.. Sanon S .. Traoré Y .. Malùou V .. Azas N .. phénoliques dans E. africanum et S. Sawadogo L.. A.fr. J. Trad. (2006) 3(1). 75-81. madagascarieusis, Toutefois. contrairement au [8] Fane S .. Thèse de pharmacie. Etude de la toxicité de profù chromatographique de S. tuadagascariensis, certaines plantes vendues sur les marchés du district de celui de E. africanum montre bien que la plante Bamako/Faculté de médecine et d'odontostomatologie du renferme l'EGCG et l'EGC, deux métabolites Mali 2002. secondaires phénoliques entre autres, qui [9] Roussel A. M .. Ferry M .. Nutr. Clin. Métabol. (2002) interviennent directement dans l'hygiène bucco• 16 (4). 285-292. [10] Reynolds EC. J. Dent. Res. (1997) 76(9). 1587- dentaire. Au travers donc de J'analyse chimique de 1595. E. af,·ica1111111 et de S. madagascariensis, nous A.B. Kadja et al 53 J. Soc. Ouest-Afr. Chint. (2013) 036: 47 - 54 (11] Vacca S. A. M .. Van Wuycklmyse B. C .. Tabak L. [17] Frankel E., Kanner J .. German J .. Parks E .. Kinsella A.. Bowen W. H .. Arch Oral Biot (1994) 39. 1063-1069. J .. Lancer (1993) 341. 454-457. [12] Ooshima T .. Minami T .. Aono W .. Tamura Y. . [18] Fitzpatrick D. F .. Hirschfield S. L.. Coffey R. G .. Hamada S .. Caries Res. {1994) 28(3). 146-9. Am. J. Physiol. (1993) 265. H774-H778. [13] Hamilton-Miller JM .. J. Med. Microbiol. (2001) [19] Facino R. M .. Carini M .. Aldini G .. Life Sei. (1999) 50(4). 299-302. 64, 627-642. [14] Ynn J.H .. Pang E. K .. Kim C. S .. Yoo Y. J .. Cho K. [20] Orgogozo J. M .. Dartigues J. F .. Lafont S .. Rev, S .. Chai J. K.. Kim C. K.. Choi S. H. . J. Neurol. (1997) 153. 185-192. Periodontal Res. (2004) 39 (5). 300-7. [21) Draczynska-Lusiak B .. Doung A., Sun A.. Mol. [ 15] Sakanaka S .. Okada Y .. Agric Food Chem. (2004) Chem. Neuropathol. (1998) 33. 139-148. 52(6). 1688-92. [Ië] Wainapel SF .. Alreruarive Medicine and Rehabilitation, A guide for practirioners/Demos Medical Publishing 2003. New York. A.B. Kadja et al 54 Abstract This thesis is primarily to provide a scientific contribution to the recovery of plants from the African flora and aim, the study of seven African plants used as toothpick, we have chosen for our study. These are 2 CAESALPINIACEAE (Erythroph/eum africanum and Swartzia madagascarensis), 2 COMBRETACEAE (Guiera senegalensis and Terminalia a/bida), 1 MIMOSACEAE (Prosopis africana), a MELIACEAE (Pseudocedre/a kotschyî; and 1 RUTACEAE (Zanthoxylum zanthoxyloides). Two components constituted the study said plants. The first focused on a chemical study (qualitative and quantitative analysis) and the second was to make bioassays. As regards the chemical component, four steps were performed: 1. Minerai analysis of plants revealed that they contain the minerai Al, Ca, Cl, Fe, K, Mg, Mn, P, Sand Si respectively, with a predominance of K, Ca 2. Phytochemical screening reactions and colored by TLC showed the presence of saponins, alkaloids, proteins, reducing compounds, sterols and terpenes, coumarins, and flavoids of tannins. 3. Antioxidant potential of the plants was detected by spectrophotometrically evaluated in comparison with those of the vitamin C and BHT. lt appears that up to 0.5 mg/ml, E. africanum has antioxidant activity almost equal to that of reference antioxidants. 4. Chemical characterization by GC- MS and LC- MS of effices plants did note the presence of phenolic secondary metabolites among which EGCG, EGC, chlorogenic acid, gallic acid, formononetin, burkinabines, ellagitannins. As for the biological side, it was to evaluate the antibacterial and anticancer properties of five selected for their effectiveness among 7 studied plants. This assessment revealed that 5 plants exhibited antibacterial activity against Staphy/ococcus aureus and Micrococcus luteus and cancer stem MDA-MB 23, Caco-2, B16F10 and MDA- MB 435, SNB75 and C6. The antibacterial activity is due to the presence of EGCG and EGC in the stems of E. africanum, P. africana and T. albida. As shown in the anticancer property, this hypothesis would be that it is due to the synergistic action of the phenolic compounds contained in each tested plant stem. Keywords: African plants, TLC, antioxidant activity assay, GC-MS, LC- MS, cytotoxicity Résumé La présente thèse a pour but principal d'apporter une contribution scientifique à la valorisation des plantes issues de la flore africaine et ce, par l'étude de 7 plantes africaines utilisées comme cure-dent, que nous avons choisies pour notre étude. Ce sont deux CAESALPINIACEAE (Erythrophleum africanum et Swartzia madagascarensis), deux COMBRETACEAE (Guiera senegalensis et Termina/ia albida), une MIMOSACEAE (Prosopis africana), une MELIACEAE (Pseudocedrela kotschyi; et une RUTACEAE (Zanthoxylum zanthoxyloïdes). Deux volets ont constitué l'étude desdites plantes. Le premier a porté sur une étude chimique (analyses qualitative et quantitative) et le second a consisté à faire des tests biologiques. En ce qui concerne le volet chimique, quatre étapes ont été réalisées : 1. L'analyse minérale des plantes a révélé qu'elles contiennent les minéraux Al, Ca, Cl, Fe, K, Mg, Mn, P, Set Si avec une prédominance respectivement en K, Ca. 2. Le criblage phytochimique par réactions colorées et par CCM a mis en évidence la présence de saponines, d'alcaloïdes, de protéines, de composés réducteurs, de stérols et de terpènes, de coumarines, de flavoïdes et de tannins. 3. Le potentiel antioxydant des plantes a été évalué par spectrophotométrie en comparaison avec ceux de la vitamine C et du BHT. Il en ressort que jusqu'à 0,5 mg/ml, E. africanum a une activité antioxydante quasiment égale à celles des antioxydants de référence. 4. La caractérisation chimique par GC-MS et LC-MS des plantes efficaces a fait constater la présence de métabolites secondaires phénoliques au nombre desquels l'EGCG, l'EGC, l'acide chloroqénlque, l'acide gallique, la formononétine, les burkinabines, les ellagitannins. Quant au volet biologique, il a consisté à évaluer les propriétés antibactérienne et anticancéreuse de 5 plantes sélectionnées pour leur efficacité au nombre des 7 étudiées. Cette évaluation a révélé que les 5 plantes ont manifesté des activités antibactérienne sur Staphylococcus aureus et Micrococcus luteus et anticancéreuse sur les souches MDA-MB 23, Caco-2, B16F10 .et MDA-MB 435, SNB75 et C6. L'activité antibactérienne est que à la présence de EGCG et de EGC dans les tiges de E. africanum, P. africana et T. albida. Quant à la propriété anticancéreuse manifestée, l'hypothèse envisagée est qu'elle serait due à l'action synergique des composés phénoliques contenus de chaque tige de plante testée. Mots-clés : plantes africaines, CCM, activité antioxydante, dosage, GC-MS, LC-MS, cytotoxicité L