Συμβολή Στη Φαρμακογνωστική Μελέτη Του Hypericum Vesiculosum
Total Page:16
File Type:pdf, Size:1020Kb
ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ & ΧΗΜΕΙΑΣ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών στις Φαρμακευτικές Επιστήμες και την Τεχνολογία «Σχεδιασμός & Ανάπτυξη Ουσιών με Φαρμακευτικό Ενδιαφέρον» Συμβολή στη Φαρμακογνωστική Μελέτη του Hypericum vesiculosum Διπλωματική Εργασία Βογιατζόγλου Αμαλία Βιολόγος ΠΑΤΡΑ, ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΣ 2014 0 Τριμελής επιτροπή Φωτεινή Λάμαρη (επιβλέπουσα καθηγήτρια) Επίκουρη Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών Παύλος Κορδοπάτης Καθηγητής Τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών Βασιλική Μαγκαφά Επίκουρη Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών 1 Στους γονείς μου που με στηρίζουν όλα αυτά τα χρόνια στην επίτευξη των στόχων μου 2 Ευχαριστίες Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών του τμήματος Φαρμακευτικής στις Φαρμακευτικές Επιστήμες και την Τεχνολογία, με κατεύθυνση «Σχεδιασμός & Ανάπτυξη Ουσιών με Φαρμακευτικό Ενδιαφέρον», υπό την επίβλεψη της Επίκουρης Καθηγήτριας κ. Φωτεινής Λάμαρη. Με την ολοκλήρωση και τη συγγραφή της διπλωματικής μου εργασίας θα ήθελα να ευχαριστήσω τους ανθρώπους που με βοήθησαν και με στήριξαν έμπρακτα στην προσπάθεια μου στον ερευνητικό τομέα. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στον Καθηγητή κ. Γρηγόρη Ιατρού του τμήματος Βιολογίας, του Πανεπιστημίου Πατρών, αλλά και την ερευνητική του ομάδα, για την συλλογή του φυτικού υλικού στο πλαίσιο αυτής της εργασίας. Επίσης να τον ευχαριστήσω για την στήριξη του σε επαγγελματικό και προσωπικό επίπεδο όλα αυτά τα χρόνια, καθώς η βοήθεια του στην επαγγελματική και προσωπική μου πορεία ήταν καθοριστική. Ακολούθως να ευχαριστήσω την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Μαριγούλα Μαργαρίτη του τμήματος Βιολογίας, του Πανεπιστημίου Πατρών, για την άψογη συνεργασία μας και την αμέριστη βοήθεια της όλο αυτό το διάστημα. Το μεγαλύτερο ευχαριστώ το οφείλω στην επιβλέπουσα καθηγήτρια μου, κ. Φωτεινή Λάμαρη, για την ανάθεση του θέματος της μεταπτυχιακής μου διατριβής και την εμπιστοσύνη που μου επέδειξε αυτά τα δύο χρόνια. Η στήριξη και η καθοδήγηση της ήταν απεριόριστη καθ’ όλη την διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Παρά τις πολλές υποχρεώσεις της ήταν πάντα πρόθυμη να με καθησυχάσει, να με βοηθήσει στα όποια προβλήματα αντιμετώπιζα στο πειραματικό μέρος, αλλά και στην συγγραφή της εργασίας μου. Οι συζητήσεις μας και οι συμβουλές της, σε επαγγελματικό και προσωπικό επίπεδο, συνέβαλαν καθοριστικά στην εξαιρετική συνεργασία μας. Ιδιαίτερες ευχαριστίες στον Καθηγητή Παύλο Κορδοπάτη για τις γνώσεις που μου μετέδωσε και τις συζητήσεις που κάναμε στην επίλυση ποικίλων προβλήματων, τα οποία αντιμετώπισα στο πλαίσιο αυτής της εργασίας. Οι συμβουλές του αποτέλεσαν προσωπικά μαθήματα. Ευχαριστώ επίσης την Επίκουρη Καθηγήτρια Βασιλική Μαγκαφά για τις καίριες επεμβάσεις της στην πειραματική πορεία και την επίλυση των δυσκολιών που αντιμετωπίσαμε. Ευχαριστώ θερμά την μεταδιδακτορική ερευνήτρια Mariana Vallejo, του πανεπιστημίου της Cordoba στην Αργεντινή, η συμβολή της οποίας στην παρούσα εργασία ήταν καταλυτική. Με βοήθησε στα πρώτα μου βήματα σε αυτήν την εργασία και η αρμονική μας συνεργασία ήταν καθοριστική στην μετέπειτα πορεία μου στο εργαστήριο. Η εμπειρία της και η φιλική της διάθεση με βοήθησαν να εγκλιματιστώ γρήγορα στον καινούργιο χώρο. Ευχαριστώ επίσης όλα τα μέλη του εργαστήριου Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, του Πανεπιστημίου Πατρών, την μεταδιδακτορική ερευνήτρια κ. Ελένη Παππά, την μεταδιδακτορική ερευνήτρια κ. Κατερίνα Ζώμπρα, την υποψήφια διδάκτωρ κ. Αναστασία Φερλέμη, τους μεταπτυχιακούς φοιτητές κ. Νικόλαο Κονταξή και κ. Πηνελόπη 3 Μερμίγκη για την άψογη συνεργασία μας αυτά τα δύο χρόνια, την προσωπική στήριξη και το ευχάριστο κλίμα που είχαμε μέσα στο εργαστήριο. Ευχαριστώ ιδιαίτερα την υποψήφια διδάκτωρ κ. Ιωάννα Παπανικολάου, του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, για την προσωπική της στήριξη σε επαγγλεματικό και προσωπικό επίπεδο από την αρχή της γνωριμίας μας. Θερμές ευχαριστίες στον μεταπτυχιακό φοιτητή κ. Αλέξανδρο Κοκκόση και στον φοιτητή κ. Θοδωρή Γκαδρή του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, για την άψογη συνεργασία μας. Να ευχαριστήσω τους φίλους μου που με στήριξαν και στηρίζουν στην προσπάθεια μου. Τέλος, να εκφράσω την απεριόριστη ευγνωμοσύνη μου στους γονείς μου για την αμέριστη και συνεχή στήριξη τους όλα αυτά τα χρόνια στην επίτευξη των προσωπικών μου στόχων, ηθικά και πρακτικά. Η μέχρι τώρα πορεία μου οφείλεται στην αγάπη τους και την εμπιστοσύνη τους. 4 Περιεχόμενα Σελίδα Περίληψη 2 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή-Το γένος Hypericum L. 5 .1.1. Συστηματική ταξινόμηση 5 .1.2. Μορφολογικά χαρακτηριστικά γένους 5 .1.3. Γεωγραφική εξάπλωση – Καλλιέργεια – 6 .1.4. Hypericum vesiculosum 9 .1.5. Σύγκριση H. vesiculosum και H. perforatum 9 .1.6. Ετυμολογία-Ονομασίες-Ιστορικά στοιχεία- Λαϊκή Θεραπευτική 11 .1.7. Ολικό εκχύλισμα υπερικού 12 Κεφάλαιο 2 Χημική Σύσταση 14 2.1 Φλαβονοειδή 14 2.1.1 Φλαβονοειδή στο υπερικό 14 2.1.2 Βιολογικές δράσεις φλαβονοειδών 17 2.2 Φλωρογλουκινόλες 18 2.2.1 Βιολογικές δράσεις υπερφορίνης 19 2.3 Ναφθοδιανθρόνες 20 2.3.1 Άλλες πηγές ναφθοδιανθρονών 24 2.3.2 Βιοσύνθεση 25 2.3.3 Φυσικοχημικές ιδιότητες 26 2.3.4 Εκχύλιση και απομόνωση 28 2.3.5 Βιολογικές δράσεις 29 2.3.5.1 Φωτοδυναμικό φαινόμενο (PDT) και καρκίνος 29 2.3.5.2 Αντικαταθλιπτική Δράση 31 2.3.5.3 Άλλες δράσεις 32 Κεφάλαιο 3 Κατάθλιψη και Αντικαταθλιπτική δράση Hypericum L 33 3.1 Κατάθλιψη και Άγχος 30 3.2 Κατάθλιψη και γήρας 37 3.3 Διαφορές στα αρσενικά και θηλυκά 38 3.4 Καταθλιπτική δράση Hypericum L. 39 5 Κεφάλαιο 4 Σκοπός 41 Κεφάλαιο 5 Πειραματικό μέρος 44 5.1. Υλικά, αντιδραστήρια και όργανα 45 5.1.1 Φυτικό υλικό 45 5.1.2. Διαλύτες, αντιδραστήρια, στήλες 45 5.1.3 Οργανολογία 45 5.2. Εκχύλιση 47 5.2.1 Εκχύλιση φυτικού υλικού Hypericum vesiculosum 47 5.2.2 Κλασματώσεις αρχικού εκχυλίσματος Hypericum vesiculosum 48 5.3 Κλασική Υγρή Χρωματογραφία Στήλης 49 5.3.1 Χρωματογραφικός διαχωρισμός σε στήλη silica gel και Sephadex LH-20 50 5.4 Χρωματογραφία Λεπτής στιβάδας (Thin Layer Chromatography- TLC) 52 5.4.1 Χρωματογραφία Λεπτής στιβάδας Hypericum vesiculosum 53 5.5 Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης 54 (High Performance Liquid Chromatography- HPLC) 5.5.1 Μέθοδοι HPLC ανάλυσης κλασμάτων Hypericum vesiculosum 55 5.6 Φασματομετρία Μαζών (Mass Spectrometry) 57 5.7 Μελέτη της συμπεριφοράς 58 5.7.1 Μοντέλo μελέτης άγχους φόβου 58 5.7.2 Τεστ Συμπεριφοράς με Hypericum vesiculosum 59 5.7.3 Χορήγηση Μεθανολικού εκχυλίσματος Hypericum vesiculosum 60 Κεφάλαιο 6 Αποτελέσματα – Συζήτηση 61 6.1 Απόδοση εκχυλίσεων 62 6.2 Σύγκριση μεθανολικών εκχυλισμάτων H. vesiculosum και H. perforatum με HPLC χρωματογραφία 63 6.3 Σύγκριση των κλασμάτων οξικού αιθυλεστέρα, εξανίου και υδατικού με HPLC ανάλυση 69 6.4 Απομόνωση ναφθοδιανθρονών με κλασική υγρή χρωματογραφία στήλης 76 6.5 Δοκιμή συμπεριφοράς 90 Κεφάλαιο 7 Συμπεράσματα 93 Βιβλιογραφία 96 6 Περίληψη Το γένος Hypericum L. περιλαμβάνει πάνω από 450 taxa παγκοσμίως, ενώ στην Ελλάδα έχουν καταγραφεί 50 taxa (35 είδη και 15 υποείδη). Το υπερικό είναι γνωστό από την αρχαιότητα για την επουλωτική και αντικαταθλιπτική του δράση. Το H. perforatum αποτελεί το γνωστότερο είδος από το οποίο προκύπτουν τα εμπορικά διαθέσιμα φυτικά εκχυλίσματα. Η έρευνα της χημικής σύστασης των εκχυλισμάτων του υπερικού έχει αναδείξει την παρουσία ενώσεων μοναδικών ως προς τη δομή και περιορισμένης κατανομής, όπως οι ναφθοδιανθρόνες και οι φλωρογλουκινόλες. Το Hypericum vesiculosum Griseb. ανήκει στο ίδιο γένος με το H. perforatum L., ωστόσο δεν έχει μελετηθεί ως προς την φυτοχημική του σύσταση. Xαρακτηρίζεται υπενδημικό αυτοφυές φυτό και εξαπλώνεται στη βόρεια και ανατολική Ελλάδα, στη βόρεια και κεντρική Ελλάδα και στην Πελοπόννησο. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η φυτοχημική ανάλυση του H. vesiculosum και η μελέτη της αγχολυτικής δράσης του μεθανολικού εκχυλίσματος σε γηραιούς θηλυκούς και αρσενικούς μύες. Το φυτό συλλέχθηκε στην Πελοπόννησο από την περιοχή της λίμνης Στυμφαλίας, του νομού Κορινθίας. Τα μεθανολικά εκχυλίσματα των H. vesiculosum και H. perforatum μελετήθηκαν και συγκρίθηκαν ως προς τη φυτοχημική τους σύσταση με τη χρήση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (High Performance Liquid Chromatography – Diode Array, HPLC – DAD), σε στήλη αντίστροφης φάσης Luna C-18. Παρατηρήθηκε ταύτιση των HPLC χρωματογραφημάτων ανάμεσα στα δύο taxa, σε μεγάλο βαθμό, ενώ ταυτοποιήθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν οι ενώσεις χλωρογενικό οξύ, ρουτίνη, υπεροζίτης, ισοκεριστρίνη, κερσιτρίνη, κερσετίνη, αμεντοφλαβόνη, κερσετίνη, υπερικίνη και υπερικίνη στο H. vesiculosum για πρώτη φορά. Όλες οι κορυφές που ταυτοποιήθηκαν ήταν σε μικρότερο ποσοστό στο Η. vesiculosum σε σχέση με το H. perforatum, με εξαίρεση την κερσιτρίνη σε ποσοστό 20,3%. Οι ναφθοδιανθρόνες στο σύνολο τους ήταν λιγότερες σε ποσοστό 85%. Με σκοπό την απομόνωση των ναφθοδιανθρονών από το ξηρό μεθανολικό εκχύλισμα πραγματοποιήθηκαν διαδοχικές κλασματώσεις με εξάνιο και οξικό αιθυλεστέρα, αλλά και κλασική υγρή χρωματογραφία στήλης με Silica 60A και Sephadex LH-20. Ύστερα από καθαρισμό τους με ημιπαρασκευαστικό HPLC και καθαρότητα μεγαλύτερη από 98%, πραγματοποιήθηκε η ταυτοποίηση τους με φασματομετρία μάζας (Mass Spectrometry, MS), όπου διαπιστώθηκε ότι οι απομονωθείσες ενώσεις ήταν η υπερικίνη, με μοριακό βάρος 504 και η ψευδοϋπερικίνη, με μοριακό βάρος 520. H αγχολυτική δράση του μεθανολικού εκχυλίσματος από το H. vesiculosum εξετάσθηκε σε γηραιούς αρσενικούς και θηλυκούς μύες, ηλικίας περίπου 12 μηνών, με τη δοκιμή του ανοικτού πεδίου (Open Field Test). Η χορήγηση του εκχυλίσματος έγινε ενδοπεριτοναϊκά