Συμβολή Στη Φαρμακογνωστική Μελέτη Του Hypericum Vesiculosum

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ & ΧΗΜΕΙΑΣ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ

Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών στις Φαρμακευτικές Επιστήμες και την Τεχνολογία

«Σχεδιασμός & Ανάπτυξη Ουσιών με Φαρμακευτικό Ενδιαφέρον»

Συμβολή στη Φαρμακογνωστική Μελέτη του Hypericum vesiculosum

Διπλωματική Εργασία Βογιατζόγλου Αμαλία Βιολόγος

ΠΑΤΡΑ, ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΣ 2014

Τριμελής επιτροπή

Φωτεινή Λάμαρη (επιβλέπουσα καθηγήτρια) Επίκουρη Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών

Παύλος Κορδοπάτης Καθηγητής Τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών

Βασιλική Μαγκαφά Επίκουρη Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών

Στους γονείς μου

που με στηρίζουν όλα αυτά τα χρόνια

στην επίτευξη των στόχων μου

Ευχαριστίες

Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών του τμήματος Φαρμακευτικής στις Φαρμακευτικές Επιστήμες και την Τεχνολογία, με κατεύθυνση «Σχεδιασμός & Ανάπτυξη Ουσιών με Φαρμακευτικό Ενδιαφέρον», υπό την επίβλεψη της Επίκουρης Καθηγήτριας κ. Φωτεινής Λάμαρη.

Με την ολοκλήρωση και τη συγγραφή της διπλωματικής μου εργασίας θα ήθελα να ευχαριστήσω τους ανθρώπους που με βοήθησαν και με στήριξαν έμπρακτα στην προσπάθεια μου στον ερευνητικό τομέα.

Ένα μεγάλο ευχαριστώ στον Καθηγητή κ. Γρηγόρη Ιατρού του τμήματος Βιολογίας, του Πανεπιστημίου Πατρών, αλλά και την ερευνητική του ομάδα, για την συλλογή του φυτικού υλικού στο πλαίσιο αυτής της εργασίας. Επίσης να τον ευχαριστήσω για την στήριξη του σε επαγγελματικό και προσωπικό επίπεδο όλα αυτά τα χρόνια, καθώς η βοήθεια του στην επαγγελματική και προσωπική μου πορεία ήταν καθοριστική. Ακολούθως να ευχαριστήσω την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Μαριγούλα Μαργαρίτη του τμήματος Βιολογίας, του Πανεπιστημίου Πατρών, για την άψογη συνεργασία μας και την αμέριστη βοήθεια της όλο αυτό το διάστημα.

Το μεγαλύτερο ευχαριστώ το οφείλω στην επιβλέπουσα καθηγήτρια μου, κ. Φωτεινή Λάμαρη, για την ανάθεση του θέματος της μεταπτυχιακής μου διατριβής και την εμπιστοσύνη που μου επέδειξε αυτά τα δύο χρόνια. Η στήριξη και η καθοδήγηση της ήταν απεριόριστη καθ’ όλη την διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Παρά τις πολλές υποχρεώσεις της ήταν πάντα πρόθυμη να με καθησυχάσει, να με βοηθήσει στα όποια προβλήματα αντιμετώπιζα στο πειραματικό μέρος, αλλά και στην συγγραφή της εργασίας μου. Οι συζητήσεις μας και οι συμβουλές της, σε επαγγελματικό και προσωπικό επίπεδο, συνέβαλαν καθοριστικά στην εξαιρετική συνεργασία μας.

Ιδιαίτερες ευχαριστίες στον Καθηγητή Παύλο Κορδοπάτη για τις γνώσεις που μου μετέδωσε και τις συζητήσεις που κάναμε στην επίλυση ποικίλων προβλήματων, τα οποία αντιμετώπισα στο πλαίσιο αυτής της εργασίας. Οι συμβουλές του αποτέλεσαν προσωπικά μαθήματα. Ευχαριστώ επίσης την Επίκουρη Καθηγήτρια Βασιλική Μαγκαφά για τις καίριες επεμβάσεις της στην πειραματική πορεία και την επίλυση των δυσκολιών που αντιμετωπίσαμε.

Ευχαριστώ θερμά την μεταδιδακτορική ερευνήτρια Mariana Vallejo, του πανεπιστημίου της Cordoba στην Αργεντινή, η συμβολή της οποίας στην παρούσα εργασία ήταν καταλυτική. Με βοήθησε στα πρώτα μου βήματα σε αυτήν την εργασία και η αρμονική μας συνεργασία ήταν καθοριστική στην μετέπειτα πορεία μου στο εργαστήριο. Η εμπειρία της και η φιλική της διάθεση με βοήθησαν να εγκλιματιστώ γρήγορα στον καινούργιο χώρο.

Ευχαριστώ επίσης όλα τα μέλη του εργαστήριου Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, του Πανεπιστημίου Πατρών, την μεταδιδακτορική ερευνήτρια κ. Ελένη Παππά, την μεταδιδακτορική ερευνήτρια κ. Κατερίνα Ζώμπρα, την υποψήφια διδάκτωρ κ. Αναστασία Φερλέμη, τους μεταπτυχιακούς φοιτητές κ. Νικόλαο Κονταξή και κ. Πηνελόπη

Μερμίγκη για την άψογη συνεργασία μας αυτά τα δύο χρόνια, την προσωπική στήριξη και το ευχάριστο κλίμα που είχαμε μέσα στο εργαστήριο.

Ευχαριστώ ιδιαίτερα την υποψήφια διδάκτωρ κ. Ιωάννα Παπανικολάου, του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, για την προσωπική της στήριξη σε επαγγλεματικό και προσωπικό επίπεδο από την αρχή της γνωριμίας μας.

Θερμές ευχαριστίες στον μεταπτυχιακό φοιτητή κ. Αλέξανδρο Κοκκόση και στον φοιτητή κ. Θοδωρή Γκαδρή του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, για την άψογη συνεργασία μας.

Να ευχαριστήσω τους φίλους μου που με στήριξαν και στηρίζουν στην προσπάθεια μου.

Τέλος, να εκφράσω την απεριόριστη ευγνωμοσύνη μου στους γονείς μου για την αμέριστη και συνεχή στήριξη τους όλα αυτά τα χρόνια στην επίτευξη των προσωπικών μου στόχων, ηθικά και πρακτικά. Η μέχρι τώρα πορεία μου οφείλεται στην αγάπη τους και την εμπιστοσύνη τους.

Περιεχόμενα Σελίδα

 Περίληψη 2

 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή-Το γένος Hypericum L. 5 .1.1. Συστηματική ταξινόμηση 5 .1.2. Μορφολογικά χαρακτηριστικά γένους 5 .1.3. Γεωγραφική εξάπλωση – Καλλιέργεια – 6 .1.4. Hypericum vesiculosum 9 .1.5. Σύγκριση H. vesiculosum και H. perforatum 9 .1.6. Ετυμολογία-Ονομασίες-Ιστορικά στοιχεία- Λαϊκή Θεραπευτική 11 .1.7. Ολικό εκχύλισμα υπερικού 12

 Κεφάλαιο 2 Χημική Σύσταση 14 2.1 Φλαβονοειδή 14 2.1.1 Φλαβονοειδή στο υπερικό 14 2.1.2 Βιολογικές δράσεις φλαβονοειδών 17 2.2 Φλωρογλουκινόλες 18 2.2.1 Βιολογικές δράσεις υπερφορίνης 19 2.3 Ναφθοδιανθρόνες 20 2.3.1 Άλλες πηγές ναφθοδιανθρονών 24 2.3.2 Βιοσύνθεση 25 2.3.3 Φυσικοχημικές ιδιότητες 26 2.3.4 Εκχύλιση και απομόνωση 28 2.3.5 Βιολογικές δράσεις 29 2.3.5.1 Φωτοδυναμικό φαινόμενο (PDT) και καρκίνος 29 2.3.5.2 Αντικαταθλιπτική Δράση 31 2.3.5.3 Άλλες δράσεις 32

 Κεφάλαιο 3 Κατάθλιψη και Αντικαταθλιπτική δράση Hypericum L 33 3.1 Κατάθλιψη και Άγχος 30 3.2 Κατάθλιψη και γήρας 37 3.3 Διαφορές στα αρσενικά και θηλυκά 38 3.4 Καταθλιπτική δράση Hypericum L. 39

 Κεφάλαιο 4 Σκοπός 41

 Κεφάλαιο 5 Πειραματικό μέρος 44 5.1. Υλικά, αντιδραστήρια και όργανα 45 5.1.1 Φυτικό υλικό 45 5.1.2. Διαλύτες, αντιδραστήρια, στήλες 45 5.1.3 Οργανολογία 45 5.2. Εκχύλιση 47 5.2.1 Εκχύλιση φυτικού υλικού Hypericum vesiculosum 47 5.2.2 Κλασματώσεις αρχικού εκχυλίσματος Hypericum vesiculosum 48 5.3 Κλασική Υγρή Χρωματογραφία Στήλης 49 5.3.1 Χρωματογραφικός διαχωρισμός σε στήλη silica gel και Sephadex LH-20 50 5.4 Χρωματογραφία Λεπτής στιβάδας (Thin Layer Chromatography- TLC) 52 5.4.1 Χρωματογραφία Λεπτής στιβάδας Hypericum vesiculosum 53 5.5 Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης 54 (High Performance Liquid Chromatography- HPLC) 5.5.1 Μέθοδοι HPLC ανάλυσης κλασμάτων Hypericum vesiculosum 55 5.6 Φασματομετρία Μαζών (Mass Spectrometry) 57 5.7 Μελέτη της συμπεριφοράς 58 5.7.1 Μοντέλo μελέτης άγχους φόβου 58 5.7.2 Τεστ Συμπεριφοράς με Hypericum vesiculosum 59 5.7.3 Χορήγηση Μεθανολικού εκχυλίσματος Hypericum vesiculosum 60

 Κεφάλαιο 6 Αποτελέσματα – Συζήτηση 61 6.1 Απόδοση εκχυλίσεων 62 6.2 Σύγκριση μεθανολικών εκχυλισμάτων H. vesiculosum και H. perforatum με HPLC χρωματογραφία 63 6.3 Σύγκριση των κλασμάτων οξικού αιθυλεστέρα, εξανίου και υδατικού με HPLC ανάλυση 69 6.4 Απομόνωση ναφθοδιανθρονών με κλασική υγρή χρωματογραφία στήλης 76 6.5 Δοκιμή συμπεριφοράς 90

 Κεφάλαιο 7 Συμπεράσματα 93  Βιβλιογραφία 96

Περίληψη Το γένος Hypericum L. περιλαμβάνει πάνω από 450 taxa παγκοσμίως, ενώ στην Ελλάδα έχουν καταγραφεί 50 taxa (35 είδη και 15 υποείδη). Το υπερικό είναι γνωστό από την αρχαιότητα για την επουλωτική και αντικαταθλιπτική του δράση. Το H. perforatum αποτελεί το γνωστότερο είδος από το οποίο προκύπτουν τα εμπορικά διαθέσιμα φυτικά εκχυλίσματα. Η έρευνα της χημικής σύστασης των εκχυλισμάτων του υπερικού έχει αναδείξει την παρουσία ενώσεων μοναδικών ως προς τη δομή και περιορισμένης κατανομής, όπως οι ναφθοδιανθρόνες και οι φλωρογλουκινόλες. Το Hypericum vesiculosum Griseb. ανήκει στο ίδιο γένος με το H. perforatum L., ωστόσο δεν έχει μελετηθεί ως προς την φυτοχημική του σύσταση. Xαρακτηρίζεται υπενδημικό αυτοφυές φυτό και εξαπλώνεται στη βόρεια και ανατολική Ελλάδα, στη βόρεια και κεντρική Ελλάδα και στην Πελοπόννησο. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η φυτοχημική ανάλυση του H. vesiculosum και η μελέτη της αγχολυτικής δράσης του μεθανολικού εκχυλίσματος σε γηραιούς θηλυκούς και αρσενικούς μύες. Το φυτό συλλέχθηκε στην Πελοπόννησο από την περιοχή της λίμνης Στυμφαλίας, του νομού Κορινθίας. Τα μεθανολικά εκχυλίσματα των H. vesiculosum και H. perforatum μελετήθηκαν και συγκρίθηκαν ως προς τη φυτοχημική τους σύσταση με τη χρήση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (High Performance Liquid Chromatography – Diode Array, HPLC – DAD), σε στήλη αντίστροφης φάσης Luna C-18. Παρατηρήθηκε ταύτιση των HPLC χρωματογραφημάτων ανάμεσα στα δύο taxa, σε μεγάλο βαθμό, ενώ ταυτοποιήθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν οι ενώσεις χλωρογενικό οξύ, ρουτίνη, υπεροζίτης, ισοκεριστρίνη, κερσιτρίνη, κερσετίνη, αμεντοφλαβόνη, κερσετίνη, υπερικίνη και υπερικίνη στο H. vesiculosum για πρώτη φορά. Όλες οι κορυφές που ταυτοποιήθηκαν ήταν σε μικρότερο ποσοστό στο Η. vesiculosum σε σχέση με το H. perforatum, με εξαίρεση την κερσιτρίνη σε ποσοστό 20,3%. Οι ναφθοδιανθρόνες στο σύνολο τους ήταν λιγότερες σε ποσοστό 85%. Με σκοπό την απομόνωση των ναφθοδιανθρονών από το ξηρό μεθανολικό εκχύλισμα πραγματοποιήθηκαν διαδοχικές κλασματώσεις με εξάνιο και οξικό αιθυλεστέρα, αλλά και κλασική υγρή χρωματογραφία στήλης με Silica 60A και Sephadex LH-20. Ύστερα από καθαρισμό τους με ημιπαρασκευαστικό HPLC και καθαρότητα μεγαλύτερη από 98%, πραγματοποιήθηκε η ταυτοποίηση τους με φασματομετρία μάζας (Mass Spectrometry, MS), όπου διαπιστώθηκε ότι οι απομονωθείσες ενώσεις ήταν η υπερικίνη, με μοριακό βάρος 504 και η ψευδοϋπερικίνη, με μοριακό βάρος 520. H αγχολυτική δράση του μεθανολικού εκχυλίσματος από το H. vesiculosum εξετάσθηκε σε γηραιούς αρσενικούς και θηλυκούς μύες, ηλικίας περίπου 12 μηνών, με τη δοκιμή του ανοικτού πεδίου (Open Field Test). Η χορήγηση του εκχυλίσματος έγινε ενδοπεριτοναϊκά 24 ώρες και 1 ώρα πριν από τη δοκιμασία, σε ποσότητα 250mg/Kg. Η παράμετρος που εξετάστηκε ήταν ο θιγμοτακτισμός μετρώντας τον χρόνο που παρέμειναν οι μύες στην περιφέρεια της συσκευής. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την αγχολυτική δράση του εκχυλίσματος στους γηραιούς μύες και στα δύο φύλα. Συγκεκριμένα ο χρόνος θιγμοτακτισμού μειώθηκε σε ποσοστό 24% στις ομάδες που έλαβαν το εκχύλισμα. Στο H. vesiculosum εδείχθη για πρώτη φορά η παρουσία των ναφθοδιανθρονών και έγινε σύγκριση της φυτοχημικής του σύστασης σε σχέση με το H. perforatum. Η αγχολυτική δράση που επέδειξε το φυτό στους γηραιούς μύες, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στην θεραπευτική για μελλοντική εφαρμογή η οποία, ωστόσο, χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση.

Abstract The genus Hypericum L. includes over 450 taxa worldwide and in Greece there have been recorded 50 taxa (35 species and 15 subspecies). St. John’s wort is known since ancient times for it’s healing and antidepressant actions. H. perforatum is the best known species from which the commercially available herbal extracts are produced. The investigation of Hypericum extracts’ chemical composition has revealed the presence of unique compounds, in structure and limited distribution, such as naphthodianthrones and phloroglucinols. The taxon Hypericum vesiculosum Griseb. belongs to the same genus with H. perforatum L., however, it has not been studied before for its phytochemical composition. It is a subendemic plant and spreads to the northern and eastern Greece, the northern and central Greece and the Peloponnese. The purpose of this study was the phytochemical analysis of H. vesiculosum and investigation of methanolic extract’s potential anxiolytic activity, in aged female and male mice. The plant was collected from the Peloponnese region of Lake Stymfalia (prefecture of Corinthia). The methanol extract of H. vesiculosum Griseb. and H. perforatum L. were analysed with high performance liquid chromatography, connected with a photodiode array detector (High Performance Liquid Chromatography - Diode Array, HPLC - DAD) and a reversed phase column Luna C-18. The HPLC chromatograms demonstrated great resemblance between the two taxa. In H. vesiculosum, the compounds chlorogenic acid, rutin, hyperoside, isoquercitrin, quercitrin, quercetin, amentoflavone, hypericin and hypericin were identified and quantified for the first time. All peaks were quantified in smaller proportion in H. vesiculosum compared to H. perforatum, with the exception of quercitrin of which the percentage was 20.3 %. The total propotion of naphthodianthrones was less than 85 % in Η. vesiculosum. In order to isolate the naphthodianthrones from the dry methanol extract, sequential fractionations were performed with hexane and ethyl acetate but also classic liquid column chromatography with Silica 60A and Sephadex LH-20. After isolating the two compounds with semipreparative HPLC and purity greater than 98%, their identification was performed with mass spectrometry (Mass Spectrometry, MS). The isolated compounds were hypericin, with molecular weight 504 and pseudohypericin, with molecular weight 520. The potential anxiolytic activity of the methanolic extract of H. vesiculosum was examined in aged male and female mice (12 months old), with the open-field test (Open Field Test). The short-term administration of the extract was intraperitoneally 24 h and 1 h before the test, at the dose of 250mg/Kg body weight. The parameter which was considered was the time the mice stayed in the periphery of the device (thigmotaxis time). The results confirmed the anxiolytic activity of the extract at the aged mice in both sexes. More specifically the thigmotaxis time was decreased in a percentage of 24% for the groups who received the extract. The presence of naphthodianthrones was shown in H. vesiculosum for the first time but also the phytochemical compositions of Η. vesiculosum and H. perforatum were compared. In conclusion, the present results show that H. vesiculosum contains the main bioactive constituents of H. perforatum in almost the same quantities and engenders anxiolytic behavior in both male and female aged mice

Εισαγωγή

1. Το γένος Hypericum L.

1.1.Συστηματική ταξινόμηση

Βασίλειο: Φυτά Άθροισμα: Magnoliophyta Τάξη: Malpighiales Οικογένεια: Hypericaceae Υποοικογένεια: Hypericoidae Γένος: Hypericum

Η συστηματική κατάταξη πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το APG III system (Angiosperm Phylogeny Group III system) και η ονοματολογία επιβεβαιώθηκε σύμφωνα με το σύγγραμμα "Vascular Plants of Greece: An annotated checklist" (Dimopoulos et al, 2013).

1.2 Μορφολογικά χαρακτηριστικά γένους

Το γένος Hypericum περιλαμβάνει πολυετείς (σπανιότερα μονοετείς) πόες ή θάμνους. Τα φύλλα είναι απλά, αντίθετα ή σπάνια σε σπονδύλους από 3-4 και γεμάτα με ημιδιαφανείς αδενώδεις κηλίδες ή ελαιώδεις αδένες, οι οποίοι είναι ορατοί με την έκθεση του φύλλου στο φως. Οι κηλίδες αποτελούν ένα στρώμα από άχρωμα έλαια και ρητίνες. Οι αδένες ανάλογα με τη μορφή, την παρουσία ή απουσία τους και τη διάταξή τους αποτελούν βασικότατο ταξινομικό κριτήριο για τη διάκριση των διαφόρων taxa του γένους (Εικόνα 1). Διακρίνονται σε: -περιθωριακούς (marginal): προεξέχουν αρκετά ώστε να διακόπτουν τη γραμμή του περιθωρίου ενός φύλλου, πετάλου ή σέπαλου, -ενδοπεριθωριακούς (intramarginal): καταλήγουν στο περιθώριο, αλλά δε διακόπτουν τις γραμμές του και -επιφανειακούς (superficial): είναι ανεξάρτητοι από το περιθώριο.

Εικόνα 1. Περιθωριακοί (αριστερά), ενδοπεριθωριακοί (κέντρο) και επιφανειακοί (δεξιά) αδένες.

Τα άνθη είναι ακτινόμορφα, ερμαφρόδιτα, έχουν έντονo κίτρινο χρώμα και σχηματίζουν ταξιανθία σε σχήμα κορύμβου. Ο κάλυκας αποτελείται από 5 σέπαλα ενωμένα στη βάση και η στεφάνη αποτελείται από 5 ελεύθερα πέταλα, τα οποία έχουν συχνά πολυάριθμες μαύρες κηλίδες. Η ωοθήκη είναι επιφυής, με 3 καρπόφυλλα και οι στήμονες είναι πολυάριθμοι συχνά κατά δέσμες. Ο καρπός έχει μορφή φραγμορραγούς κάψας, σπάνια είναι σαρκώδης, ενώ κάποιες φορές είναι διαρρηκτός ή αδιάρρηκτος. Το υπερικό ανθίζει από τον Ιούνιο έως το Σεπτέμβρη. Η καλύτερη εποχή συλλογής του είναι από τον Ιούλιο έως τον Αύγουστο, οπότε είναι και η περίοδος εκτεταμένης ανθοφορίας. Τα υπέργεια τμήματα του φυτού αποκόπτονται από τις ρίζες, ξηραίνονται υπό σκιά και φυλάσσονται σε σκοτεινό αεριζόμενο χώρο (Πυλαρά, Ερευνητική εργασία).

1.3 Γεωγραφική εξάπλωση – Καλλιέργεια

Το γένος Hypericum L. Περιλαμβάνει πάνω από 450 taxa, τα οποία κατατάσσονται σε 36 ομάδες (sections). Κατανέμεται και στα δύο ημισφαίρια σε εύκρατες, υπο-τροπικές και ορεινές τροπικές περιοχές. Οι πληθυσμοί του φύονται σε ποικίλα ενδιαιτήματα, από απότομες βραχώδεις παραθαλάσσιες πλαγιές μέχρι υγροβιότοπους, καθώς και κοντά σε καλλιέργειες. Σύμφωνα με νέες βιβλιογραφικές πηγές έχουν καταγραφεί 50 taxa (35 είδη και 15 υποείδη) που απαντώνται στην Ελλάδα και κατατάσσονται σε 13 ομάδες (Πίνακας 1), εκ των οποίων τα 12 taxa είναι ελληνικά ενδημικά και κατατάσσονται σε 6 ομάδες (Πίνακας 2). Η Ελλάδα χωρίζεται σε 13 φυτογεωγραφικές περιοχές (Εικόνα 2), όπως αυτές ορίζονται στη “Flora Hellenica” (1997). Συγκεκριμένα, οι φυτογεωγραφικές περιοχές είναι οι εξής: ΝΕ: βόρεια-ανατολική, NC: βόρεια-κεντρική, Npi: βόρεια Πίνδος, Spi: νότια Πίνδος, EC: ανατολική-κεντρική, Ste: Στερεά Ελλάδα, Pe: Πελοπόννησος, IoI: Ιόνια νησιά, Wαe: νησιά δυτικού Αιγαίου, Nαe: νησιά βόρειου Αιγαίου, Eαe: νησιά ανατολικού Αιγαίου, Kik: Κυκλάδες και KK: Κρήτη-Κάρπαθος.

Εικόνα 2. Οι 13 φυτογεωγραφικές περιοχές στις οποίες είναι χωρισμένος ο ελλαδικός χώρος

Πίνακας 1. Κατανομή των 28 μη ενδημικών taxa του γένους Hypericum που φύονται στον ελλαδικό χώρο (Πυλαρά, 2007) Taxa Φυτογεωγραφικές Περιοχές NE NC Npi Spi EC Ste Pe NAe WAe EAe Kik IoΙ KK H. aegypticum ssp. * * * webbii H. annulatum ssp. * * annulatum H. atomarium * * H. aucheri * H. aviculariifolium ssp. * byzantinum H. barbatum * * * * * * * * H. cerastoides * * H. cuisinii * * H. empetrifolium ssp. * * * * * * * empetrifolium H. hircinum ssp. * * * * albimontanum H. hircinum ssp. majus * * H. hirsutum H. linarioides * * * H. maculatum ssp. * immaculatum H. montbretii * * H. olympicum * * * * * * * * * * * H. perfoliatum * * * * * * H. perforatum ssp. * * * perforatum H. perforatum ssp. * * * * * * * * * * * veronense H. polyphyllum ssp. * subcordatum H. rochelii * H. rumeliacum ssp. * * * * apollinis H. rumeliacum * * ssp. rumeliacum H. spruneri * * * * * * H. tetrapterum * * * * * * * * * var. tetrapterum

Πίνακας 2. Κατανομή των 12 ελληνικών ενδημικών taxa του γένους Hypericum (Πυλαρά, 2007) Taxa Φυτογεωγραφικές Περιοχές NE NC Npi Spi EC Ste Pe NAe WAe EAe Kik IoΙ KK H. aciferum * H. amblycalyx * H. athoum * * H. delphicum * * H. elongatum * ssp.tymphresteum H. empetrifolium ssp. * Oliganthum H. empetrifolium ssp. * Tortuosum H. fragile * H. jovis * H. kelleri * H. taygeteum * H. trichocaulon *

Το υπερικό αναπαράγεται μέσω των σπορίων (αέρας, έντομα, ζώα) του. Ένα μόνο φυτό μπορεί να παράγει 15.000 – 30.000 σπόρια /έτος, τα οποία παραμένουν βιώσιμα για 10 χρόνια. Για την καλλιέργεια του Hypericum χρησιμοποιούνται είτε κομμένα κλαδιά, είτε σπόρια των θάμνων. Κυρίως λαμβάνονται βλαστοί από μητρικά φυτά και φυτεύονται σε αμμώδη εδάφη όπου σύντομα θα δημιουργηθούν νέες ρίζες. Τα σπέρματα /σπόρια των φυτών χρησιμοποιούνται όταν είναι πλέον ώριμα και εμφυτεύονται σε περιβάλλον θερμοκηπίου. Φυσιολογικά βλαστάνουν σε 1 έως 3 μήνες και όταν αναπτυχθούν αρκετά μπορούν να εκφυτευθούν και να τοποθετηθούν στη μόνιμη θέση τους. Σε μερικές περιπτώσεις η εξάπλωσή τους είναι τόσο ραγδαία ώστε απαιτούνται μέτρα περιορισμού των φυτών. Στην χώρα μας δεν καλλιεργείται, όμως έχουν προταθεί πιλοτικές καλλιέργειες στη Στερεά Ελλάδα και στη Πελοπόννησο. Στην Ευρώπη καλλιεργείται σε 6100 στρέμματα από περίπου 138 καλλιεργητές.

1.4.Hypericum vesiculosum Griseb.

Το Hypericum vesiculosum (Εικόνα 3) ανήκει στην ομάδα (section) Drosocarpium. Περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον καθηγητή Χάινριχ Άουγκουστ Ρούντολφ Γκρίζεμπαχ (γερμανικά Heinrich August Rudolf Grisebach), (1814-1879) στο σύγγραμμα του με τίτλο «Spicilegium Florae Rumelicae et Bithynicae Exhibens Synopsin Plantarum quas in aest 1839» το 1843 (δημοσιεύσεις: 2 volumes, 6 parts: 1(1), Mar 1843; 1(2/3), Dec 1843: 2(4), Jul 1844; 2(5/6), Jan 1846). Ο βλαστός του φτάνει σε ύψος τα 30 με 70 εκατοστά. Τα Εικόνα 3. H. vesiculosum (Πηγή: φύλλα του είναι πρασινωπά, τα μεσαία άμισχα, http://eliastselos.blogspot.gr/2011/06/hy καρδιόσχημα, αμβλεία με ημιδιαφανείς κηλίδες, ενώ τα pericaceae-guttiferae_11.html) χαμηλότερα (στη βάση) είναι σκουρόχρωμα, οδοντωτά. Στην επιφάνεια τους φέρουν μαύρους αδένες. Φέρει αμβλεία σέπαλα, βλεφαριδωτά ή οδοντωντά στην περιφερειά και στην επιφάνεια τους έχουν μαύρες κηλίδες με λιγοστούς αδένες. Τα πέταλα είναι κίτρινα με πολυάριθμους μαύρους αδένες σε όλη την επιφάνεια τους, ενώ ο καρπός είναι επιμήκης πορτοκαλί (Tutin, 1968),(Lafranchis & Sfikas, 2009).

1.5 Σύγκριση H. vesiculosum Griseb και H. perforatum L.

Μορφολογικά χαραστηριστικά:

Περιοχές εξάπλωσης των δύο taxa:

Το Hypericum vesiculosum φύεται στην βόρεια-ανατολική (NE), βόρεια-κεντρική (NC), Πελοπόννησο (Pe), ενώ το Hypericum perforatum εμφανίζει μεγαλύτερο εύρος εξάπλωσης στις εξής φυτογεωγραφικές περιοχές: βόρεια-ανατολική (NE), βόρεια-κεντρική (NC), βόρεια Πίνδος (Npi), νότια Πίνδος (Spi), Στερεά Ελλάδα (Ste), Πελοπόννησος (Pe), νησιά βόρειου Αιγαίου (NAe), νησιά δυτικού Αιγαίου (WAe), νησιά ανατολικού Αιγαίου (EAe), Ιόνια νησιά (IoI), Κρήτη-Κάρπαθος (KK).

1.6 Ετυμολογία-Ονομασίες-Ιστορικά στοιχεία- Λαϊκή Θεραπευτική

Το όνομα Hypericum – υπερικό προέρχεται από της ελληνικές λέξεις «υπέρ» και «Εικόνα» και αναφέρεται στην παράδοση να τοποθετείται το βότανο πάνω από μια Εικόνα την ημέρα εορτασμού του Αγ. Ιωάννη του Βαπτιστή, για να εκδιώξει το κακό. Όσον αφορά στο πιο γνωστό είδος του το οποίο είναι το Hypericum perforatum, η ονομασία οτυ οποίου προέρχετια από την λατινική και σημαίνει «διάτρητο», καθώς αναφέρεται στις μικρές διάφανες περιοχές των φύλλων του. Οι χριστιανοί του 6ου αιώνα το ονόμασαν St. Εικόνα 4. Άνθος Hypericum perforatum John»s Wort από τον Ιωάννη τον Βαπτιστή, καθώς πίστευαν ότι το φυτό μάτωνε (κόκκινο έλαιο από τους αδένες των πετάλων) εξαιτίας του αποκεφαλισμού του. Μια δεύτερη παράδοση, της εποχής του μεσαίωνα, λέει ότι το βότανο φύτρωσε από το αίμα του Αγ. Ιωάννη του Βαπτιστή όταν αποκεφαλίστηκε. Μάλιστα, τα σκούρα κόκκινα στίγματα των πετάλων συμβολίζουν το αίμα του, ενώ οι διάφανες κηλίδες των φύλλων, τα δάκρυα που χύθηκαν για το γεγονός αυτό. Στα γερμανικά η κύρια ονομασία είναι Johanneskraut, από τον Αγ. Ιωάννη. Hexenkraut σημαίνει μαγικό βότανο ή βότανο των μαγισσών, Tumpfelkraut, Herrgotsblut (αίμα του Κυρίου ), Elfenblut (αίμα ξωτικών), Frauenkraut (βότανο των γυναικών), Teufelsflucht (φυγή του διαβόλου), Wundskraut (βότανο των πληγών). Μία ακόμη ονομασία του είναι το Löcherkraut (τρυπητό βότανο), που προέρχεται από την γερμανική παράδοση σύμφωνα με την οποία ο διάβολος ήταν τόσο οργισμένος με το φυτό λόγω των ισχυρών δυνάμεών του, που πήρε μία βελόνη και τρύπησε τα φύλλα. Το φυτό ήταν τόσο δυνατό αφού άντεξε και μέχρι σήμερα εμφανίζει της «τρύπες» αυτές. Τα κοινά ονόματα στην Ελλάδα είναι υπερικό, βάλσαμο, βαλσαμόχορτο, σπαθόχορτο, περίκη, λειχηνόχορτο, χελωνόχορτο, βότανο του προδρόμου. Στα αγγλικά η κοινή ονομασία του H. perforatum είναι St. John’s wort, ενώ άλλες αγγλικές κοινές ονομασίες είναι Goatweed, Tiptonweed, Amber, Rose of Sharon, Aaron’s beard, Jerusalem Star. Η ονομασία που κυριαρχεί στη Β. Αμερική είναι Klamath weed (Καββαδάς, 1956). Στη λαϊκή θεραπευτική (Ελλάδα) το υπερικό χρησιμοποιείται ως αφέψημα κατά της επιληψίας, για την αντιμετώπιση γαστρεντερικών διαταραχών, χολικής στάσης, διαταραχών της εμμηνοροής. Το λάδι (βαλσαμόλαδο) χρησιμοποιείται ως κατάπλασμα σε πληγές, κοψίματα και αιματώματα (Μιτάκης, ). Από τον Ιπποκράτη ακόμη είχε χρησιμοποιηθεί ως νευροτονωτικό, αναλγητικό κατά της αρθρίτιδας και των πόνων της εμμηνορροής, κατά των διαταραχων του γαστρεντερικού συστήματος και για την αντιμετώπιση των έλκων. Τον πρώτο αιώνα μ. Χ. χρησιμοποιήθηκε από ιατρούς/θεραπευτές, όπως ο Γαληνός και ο Διοσκουρίδης, που το συνιστούσαν ως διουρητικό, επουλωτικό πληγών και για τη θεραπεία της δυσμηνόρροιας. Την ίδια εποχή και ο Πλίνιος ο Πρεσβύτερος (Ρωμαίος φυσικός φιλόσοφος και ιστοριογράφος) στο έργο του «Historia naturalis», περιγράφει το υπερικό για την ικανότητά του να θεραπεύει τη διάρροια, να προωθεί τη ροή των ούρων και να αντιμετωπίζει προβλήματα κύστης. Το 16ο αι. ο Παράκελσος (Εικόνα 5) που ήταν γνωστός ιατρός και χημικός, έγραψε «Ο θεός έδωσε στο perforatum τη δύναμη να διώκει τα φαντάσματα της φύσης αλλά και παράσιτα, πληγές, κατάγματα οστών και όλα τα δεινά – είναι πραγματικά οικουμενικό φάρμακο πέρα από κάθε δημιουργία του ανθρώπου». Επέκτεινε τη χρήση του στη θεραπευτική αντιμετώπιση της κατάθλιψης και άλλων ψυχικών νόσων, τα συμπτώματα των οποίων αποκαλούσε «φαντάσματα». Ο Παράκελσος επηρέασε μεταγενέστερους θεραπευτές, όπως τον Samuel Hahnemann, ιδρυτή της ομοιοπαθητικής και τον πατέρα

Sebastian Kniepp, σημαντικό πρόσωπο στην φυσιοθεραπευτική του 19ου αιώνα. Στο Saltenitan Drug List του 13ου αιώνα, το υπερικό αναφέρεται ως herba demonis fuga, δηλαδή βότανο που διώχνει το κακό. Στη διάρκεια του 16ου και 17ου αι. δύο από τα μεγαλύτερα εγχειρίδια βοτανικής των Hieronymous Bock (1540) και Matthiolus (1544) περιέγραφαν το υπερικό ως χρήσιμο για τη θεραπεία πληγών, αιμοστατικό, εμμηναγωγό, διουρητικό και ανθελονοσιακό. Το 1630 ο Angelo Sala δήλωσε ότι το φυτό αυτό θεραπεύει ασθένειες της ψυχής, μελαγχολία, άγχος και διαταραχές της αντίληψης. Το 1616 το έλαιο υπερικού προστέθηκε στην πρώτη Φαρμακοποιία του Λονδίνου (Pharmacopoeia Londinensis), ως “Oleum Hyperici” διότι είχε ισχυρές θεραπευτικές ιδιότητες σε πληγές. Αναφέρονταν δύο μέθοδοι Εικόνα 5. Παράκελσος προετοιμασίας /επεξεργασίας του σκευάσματος:  κατεργασία των ανθέων με έγχυση σε ελαιόλαδο και τοποθέτησή του σε γυάλινο βάζο στον ήλιο για αρκετές εβδομάδες (παρασκεύη ελαίου),  εμποτισμός της δρόγης σε λευκό οίνο και ρετσίνι τον οποίο ακολουθεί διπλή απόσταξη (παρασκευή αιθέριου ελαίου), (Kolaci και συνεργάτες, ερευνητική εργασία 2007).

1.7 Ολικό εκχύλισμα υπερικού

Τα ανθισμένα υπέργεια τμήματα του φυτού, νωπά ή αποξηραμένα, χρησιμοποιούνται ως πρώτη ύλη (Hyperici herba-δρόγη) για την παρασκευή των φυτικών σκευασμάτων. Τα εκχυλίσματα υπερικού είναι από τα καλύτερα μελετημένα φαρμακευτικά σκευάσματα. Αν και πάνω από 150 συστατικά έχουν ταυτοποιηθεί με ποικίλες δράσεις, το 30-50% του συνόλου των συστατικών του δεν έχουν ταυτοποιηθεί και χαρακτηριστεί δομικά και τα οποία ενδέχεται να συμβάλλουν στις κλινικές δράσεις του. Το 1986 στο Deutscher Arzneimittel – Codex (Γερμανικός Κώδικας Φαρμάκων), το Hypericum perforatum αναγνωρίστηκε ως το είδος από το οποίο λαμβάνεται το «φάρμακο». Συγκεκριμένα εγκρίθηκε ως έγχυμα η χρήση του σε ψυχιατρικά φάρμακα σε μορφές όπως αμπούλες (Hyperforat®), επικαλυμμένα δισκία (LI 160, Jarsin®, Lichtwer Pharma, Berlin), χυμούς (Kneipp®Johanniskraut Pflanzensaft N), τσάι (Kneipp® Johanniskraut- Tee) και βάμμα (Psychotonin®M). Χρησιμοποιείται επίσης σε σκευάσματα διουρητικά. Τα τελευταία χρόνια τα σκευάσματα εκχυλισμάτων υπερικού κυκλοφορούν είτε ως συμπληρώματα διατροφής, είτε ως φάρμακα στην Ευρωπαϊκή κοινότητα, με κύριους αγοραστές την Γερμανία, Ρωσία και Πολωνία. Οι πωλήσεις τους έφτασαν τα 3,8 εκατομμύρια σκευάσματα στην Γερμανία, 2,2 εκατομμύρια στην Ρωσία και 1,6 εκατομμύρια στην Πολωνία την περίοδο του Απριλίου του 2007 έως και τον Μάρτιο του 2008. Οι τρεις αυτές χώρες μόνο καλύπτουν το 79% όλων των πωλήσεων του υπερικού σε όλη την Ευρώπη (Linde 2009). Στην πρόσφατη μονογραφία του Ευρωπαϊκού Οργανισμού Φαρμάκων (European Medicines Agency, EMA) το 2009 αναφέρεται ότι αλκοολικά εκχυλίσματα της πόας υπερικού δύναται να χρησιμοποιηθούν σε παραδοσιακά φάρμακα βοτανικής προέλευσης με θεραπευτική ένδειξη για «επεισόδια ήπιων καταθλιπτικών διαταραχών», σύμφωνα με το διαγνωστικό σύστημα ICD-10 (International Classification of Diseases 10th revision F32.0, F32.1, F33.0, F33.1). Όσον αφορά τα φυτικά σκευάσματα, να είναι σε μορφή ξηρού εκχυλίσματος με διαλύτη εκχύλισης μεθανόλη σε ποσοστό 80% (Α), είτε αιθανόλη σε

ποσοστό 80% (Β) ή 50-68% (Γ). Τα φυτικά σκευάσματα (Α) και (Β) ενδείκνυνται για την θεραπεία ήπιων και μέτριων καταθλιπτικών επεισοδίων, ενώ το σκεύασμα (Γ) ενδείκνυται για την βραχυχρόνια αντιμετώπιση των συμπτωμάτων της μέτριας κατάθλιψης. Όσον αφορά στη δοσολογία, σε ενήλικες και ηλικιωμένους, το σκεύασμα (Α) χορηγείται σε ημερήσια δόση των 600 έως 1800 mg. Η χορήγηση του (Β) προτείνεται να είναι 900 mg ημερησίως, ενώ η ημερήσια δόση του (Γ) είναι 500 έως 1200mg. Η εκδήλωση της δράσης των σκευασμάτων αναμένεται μετά από 4 εβδομάδες θεραπείας, εντούτοις αν τα συμπτώματα επιμένουν κατά τη διάρκεια χρήσης, απαιτείται η συμβουλή γιατρού. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δίνεται κατά τη χρήση του υπερικού στην έντονη έκθεση σε UV-ακτινοβολία, η οποία καλό είναι να αποφεύγεται. Δεν συνίσταται επίσης η χρήση των σκευασμάτων υπερικού από παιδιά και εφήβους κάτω των 18 ετών, εγκύους και θηλάζουσες μητέρες. Το ξηρό εκχύλισμα υπερικού μειώνει τη δράση των κυτοχρωμάτων CYP3A4, CYP2C9, CYP2C19 και P-γλυκοπρωτεΐνης, για αυτό και πρέπει να δίνεται προσοχή σε περιπτώσεις ταυτόχρονης χρήσης του με φάρμακα όπως κυκλοσπορίνη, τακρολίμη, αμπρεναβίρη, ινδιναβίρη, άλλοι αναστολείς πρωτεασών, ιρινοτεκάνη, βαρφαρίνη. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δίνεται στην ταυτόχρονη χρήση με φάρμακα των οποίων ο μεταβολισμός εξαρτάται από τα κυτοχρώματα, όπως η μεθαδόνη και τα αντισυλληπτικά, γιατί μπορεί να επηρεαστεί η συγκέντρωση τους στο πλάσμα του αίματος. Η ενζυμική δραστηριότητα των κυτοχρωμάτων επανέρχεται στα φυσιολογικά επίπεδα ύστερα από μια εβδομάδα αφότου διακοπεί η χρήση του φυτικού σκευάσματος. Τέλος το υπερικό μπορεί να συμβάλλει στην εκδήλωση του σεροτονεργικού συνδρόμου όταν συνδυάζεται με άλλα αντικαταθλιπτικά, όπως αναστολείς επαναπρόσδεσης σεροτονίνης, βουσπιρόνη ή τριπτάνες. Το σύνδρομο σεροτονίνης είναι μια κατάσταση υψηλής συγκέντρωσης σεροτονίνης, με συμπτώματα την ευφορία, υπνηλία, γρήγορη κίνηση των ματιών, απώλεια συντονισμού των κινήσεων, ανησυχία, αίσθημα μέθης και ζάλης, συστολή μυών, εφίδρωση, μυϊκές συσπάσεις, δυσκαμψία, υψηλή θερμοκρασία σώματος, τρόμο και διάρροια.

2. Χημική Σύσταση

Τo υπερικό, λόγω της δραστικότητας του, έχει αποτελέσει αντικείμενο έρευνας για αρκετές δεκαετίας όσον αφορά στη χημική του σύσταση. Μέσα στην πληθώρα ενώσεων που απαντώνται στα είδη του γένους Hypericum, τα συστατικά που παρουσιάζουν βιολογικές δράσεις, ή αλλιώς οι δευτερογενείς μεταβολίτες με βιολογική δράση, διακρίνονται στις εξής 4 ομάδες:  Φλαβονοειδή (κερσετίνη, κερσιτρίνη, ισοκερσιτρίνη, Ι3-ΙΙ8 διαπιγενίνη κ.α.)  Φαινολικά οξέα (χλωρογενικό οξύ)  Φλωρογλουκινόλες (υπερφορίνη, αντιυπερφορίνη)  Ναφθοδιανθρόνες (υπερικίνη, πρωτοϋπερικίνη, ψευδοϋπερικίνη, πρωτοψευδοϋπερικίνη) και άλλες, όπως ταννίνες, ξανθόνες, αμινοξέα, αιθέρια έλαια και άλλες υδατοδιαλυτές ενώσεις.

2.1 Φλαβονοειδή

Τα φλαβονοειδή αποτελούν συστατικά φρούτων, λαχανικών και αφεψημάτων με ιδιαιτέρα ευεργετικές ιδιότητες. Είναι αποκλειστικά φυτικά προϊόντα που αποτελούνται από έναν ανθρακικό σκελετό με 15 ατόμα άνθρακα διατεταγμένα σε δύο αρωματικούς δακτυλίους που ενώνονται με μία γέφυρα τριών ανθράκων (Εικόνα 6). Τα φλαβονοειδή διαφοροποιούνται μεταξύ τους από την ύπαρξη ή όχι κάποιων χαρακτηριστικών ομάδων στην δομή τους, αλλά και από την θέση αυτών των ομάδων. Τα διαφοροποιούν επίσης η φύση και η θέση των διαφόρων υποκαταστατών, η φύση, ο τρόπος και η θέση σύνδεσης των σακχάρων στον σκελετό τους, αλλά και ο βαθμός διμερισμού τους. Διακρίνονται με αυτόν τον τρόπο σε επιμέρους ομάδες όπως τις ανθοκυανίνες, φλαβόνες, φλαβονόνες, διϋδροφλαβονόλες, χαλκόνες, φλαβονόλες, φλαβάνες, τα ισοφλαβονοειδή και τις ταννίνες.

Εικόνα 6 Βασική δομή ανθρακικού σκελετού των φλαβονοειδών

2.1.1 Φλαβονοειδή στο υπερικό

Η κερσετίνη αποτελεί ένα άγλυκο φλαβονοειδές, ο βασικός σκελετός της οποίας απεικονίζεται στην Εικόνα 7. Ανάλογα με το σάκχαρο που συνδέεται Στην γλυκοζιλιωμένη μορφή τους ανήκουν ενώσεις όπως η κερσετίνη, κερσιτρίνη, ισοκερσιτρίνη, ρουτίνη, υπεροζίτης. Είναι μόρια υδρόφιλα και στο υπερικό συγκεντρώνονται κυρίως στα φύλλα και στο βλαστό σε ποσοστό 2-4% του συνόλου των δευτερογενών μεταβολιτών του. Τα διφλαβονοειδή Ι3, ΙΙ8-διαπιγενίνη και αμεντοφλαβόνη(Εικόνα 8) είναι επίσης χαρακτηριστικές ενώσεις στο υπερικό, εμφανίζονται αποκλειστικά στα άνθη και σε αυτές προσδίδονται ιδιότητες αντι-φλογιστικές και κατασταλτικές (Butterweck & Schmidt, 2007). Ο βασικός σκελετός στην δομή τους απεικονίζεται στην Εικόνα 7,

Εικόνα 7. (Αριστερά)Δομής κερσετίνης, της κυρίαρχης φλαβανόλης στο εκχύλισμα υπερικού. (Δεξιά) Σάκχαρα που συνδέονται με τον βασικό σκελετό της κερσετίνης για να προκύψουν τα γλυκοζιλιωμένα φλαβονοειδή

Ανάλογα με το σάκχαρο που συνδέεται με Ο-γλυκοζιτικό δεσμό στη θέση 3 (R), διαφοροποιούνται ως εξής: ο υπεροζίτης περιέχει γαλακτόζη, η ρουτίνη το δισακχαρίτη γλυκόζη-ραμνόζη, η ισοκερσιτρίνη τη γλυκόζη και η κερσιτρίνη τη ραμνόζη.

Εικόνα 8. Ι3, ΙΙ8 -διαπιγενίνη (αριστερά) & αμεντοφλαβόνη (δεξιά)

Φλαβονοειδή έχουν βρεθεί και σε άλλους αντιπροσώπους του γένους Hypericum. Στην μελέτη των Crockett και των συνεργατών της (2005) όπου σύγκριναν τα φυτοχημικά προφίλ 74 taxa του γένους Hypericum κατέγραψαν μεταβολικά αποτυπώματα των διαφόρων αντιπροσώπων. Τα φλαβονοειδή που εντόπισαν ήταν η ρουτίνη, ο υπεροζίτης, η ισοκερσιτρίνη, η κερσιτρίνη, η κερσετίνη και η αμεντοφλαβόνη (Πίνακας 3).

Πίνακας 3. Taxa του γένους Hypericum και φλαβονοειδή που ανιχνεύθηκαν. Ρουτίνη, υπεροζίτης, ισοκερσιτρίνη, κερσιτρίνη, κερσετίνη και η αμεντοφλαβόνη (Crockett et al, 2005) Taxa Φλαβονοειδή Ρουτίνη Υπεροζίτης Ισοκερσιτρίνη Κερσιτρίνη Κερσετίνη Αμεντοφλαβόνη H. acmosepalum X X H. adenotrichum X X X X H. aegypticum ssp. X aegypticum H. aegypticum ssp. X marrocanum H. anagalloides X X H. apocynifolium X X X H. athoum X X X X X H. balearicum X X Ίχνη Ίχνη Ίχνη H. beanii Χ Χ H. bithynicum Χ H. brachyphyllum Χ Χ H. buckleyi Χ Χ Χ H. calycinum Χ Χ Χ Χ Ίχνη

Taxa Φλαβονοειδή Ρουτίνη Υπεροζίτης Ισοκερσιτρίνη Κερσιτρίνη Κερσετίνη Αμεντοφλαβόνη H. cerastoides Χ H. chapmanii Χ Χ H. choisyanum Χ Χ Χ H. confertum Χ Χ Χ H. delphicum Χ Χ Χ H. densiflorum Χ Χ Χ H. denticulatum Χ H. dolabriforme Χ Χ Χ H. drummondii Χ Χ H. edisonianum Χ Χ H. empetrifolium Χ H. ericoides Χ Χ Χ H. forrestii Χ Χ Χ Χ H. frondosum Χ Χ Χ H. galioides Χ Χ Χ H. gentianoides Χ Χ Χ H. graveolens Χ Χ Χ Χ H. gymnanthum Χ Χ Χ H. henryi H.Leveille & Χ Χ Χ Vaniot ssp. uraloides H. hypericoides Χ H. hyssopifolium ssp. Χ Χ elongatum H. kouytchense Χ Χ Χ Χ H. lancasteri Χ Χ H. leschenaultii Χ Χ Χ H. linarioides Χ Χ H. lissophloeus Χ Χ H. lloydii Χ Χ Χ H. lobocarpum Χ Χ Ίχνη Ίχνη Ίχνη H. microsepalum Χ Χ H. monogynum Χ Χ Χ H. montbretii Ίχνη Ίχνη Χ Ίχνη H. mutilum Χ Χ Χ H. myrtifolium Χ Χ Χ H. nanum Χ Χ H. nitidum ssp. exile Χ Χ Χ H. nudiflorum Χ Χ H. olympicum spp. Ίχνη Χ auriculatum H. orientale Χ H. pallens Χ Χ Χ H. patulum Χ Χ Ίχνη H. perforatum ssp. Χ Χ Χ Χ Χ perforatum H. perforatum ssp. Χ Χ Χ veronense H. prolificum Χ Χ Χ H. pseudohenryi Χ Χ H. punctatum Χ Χ Χ Χ H. scabrum Χ

Taxa Φλαβονοειδή Ρουτίνη Υπεροζίτης Ισοκερσιτρίνη Κερσιτρίνη Κερσετίνη Αμεντοφλαβόνη H. scouleri (forma Χ Χ formosum) H. scouleri (forma Χ Χ Χ scouleri) H. sphaerocarpum Χ Χ Χ Χ H. suffruticosum Χ Χ H. tenuifolium Χ Χ H. tetrapetalum Χ H. triquetrifolium Χ Χ H. venustum Χ Χ Χ H. X inodorum Χ Χ (H. hircinum Xandrosaemum) H. X moserianum Χ Χ Χ (H. patulum X calycinum)

Τα φλαβονοειδή υπεροζίτης, ισοκερσιτρίνη και κερσιτρίνη εντοπίστηκαν σχεδόν σε όλα τα δείγματα, ενώ σε 4 taxa δεν εντοπίστηκε κανένα από τα πρότυπα φλαβονοειδή, τα οποία ήταν τα H. apocynifolium, H. cistifolium, H. hypericoides ssp. hypericoides and H. roeperanum (Crockett et al. 2005).

2.1.2 Βιολογικές δράσεις φλαβονοειδών

Τα φλαβονοειδή φαίνεται να έχουν αντικαταθλιπτικές ιδιότητες, δρώντας συνεργατικά με ενώσεις, χαρακτηριστικές του υπερικού, όπως η υπερικίνη, με στόχο τη βελτίωση των φαρμακευτικών ιδιοτήτων αυτής. Σε in vitro μελέτες έχει δειχθεί η πρόσδεση της αμεντοφλαβόνης σε υποδοχείς της βενζοδιαζεπίνης, με αυξημένη χημική συγγένεια συγκρινόμενη με τη διαζεπάμη (φάρμακο χορηγούμενο για το άγχος και την αϋπνία) (Nielsen et al 1988, Baureithel et al 1997). Υψηλή χημική συγγένεια παρουσιάζει με τους δ-

υποδοχείς οπιοειδών και τους ΗΤ1D , 5-HT2C και D3 υποδοχείς (Butterweck et al 2002). Σε in vivo μελέτες σε επίμυες στους οποίους χορηγήθηκε κλάσμα εκχυλίσματος πλούσιο σε φλαβονοειδή ο χρόνος ακινησίας μειώθηκε σε δοκιμή εξαναγκασμένης κολύμβησης (δοκιμή όπου ελέγχεται η αντικαταθλίπτική δράση), στην οποία υποβλήθηκαν τα πειραματόζωα. Η χορήγηση γινόταν επαναλαμβανόμενα δια στόματος για 12 μέρες σε δοσολογίες συγκρίσιμες με το φαρμακευτικό σκεύασμα και τα μόρια που φέρονταν να ήταν κυρίως υπεύθυνα ήταν ο υπεροζίτης και η ισοκερσιτρίνη (Butterweck et al 2000). Τα φλαβονοειδή είναι ευρέως γνωστά για την αντιοξειδωτική τους δράση. Φυτοχημικές αναλύσεις σε αλκοολικά εκχυλίσματα Hypericum perforatum έδειξαν έντονη αντιοξειδωτική δράση για την οποία υπεύθυνα ήταν τα φλαβονοειδή (Silva et al 2008, Gioti et al 2009). Τέλος τα φλαβονοειδή φαίνεται πως συμβάλλουν στην αντιβακτηριακή δράση των φυτών του γένους Hypericum. Στην μελέτη των Agnol και των συνεργατών του (2003) 6 μεθανολικά εκχυλίσματα ελέγχθηκαν για την αντιβακτηριακή τους δράση (H. caprifoliatum, H. carinatum, H. connatum, H. ternum, H. myrianthum και H. polyanthemum) ενάντια στα βακτήρια Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, S. epidermidis, Escherichia coli και Saccharomyces cerevisiae. Τα H.caprifoliatum, H. polyanthemum και H. ternum εμφάνισαν αντιβακτηριακή δράση ενάντια των Staphylococcus aureus και Bacillus subtilis, ενώ ενάντια των υπόλοιπων βακτηρίων δεν εμφάνισαν καμία δραστικότητα. Τα μεθανολικά εκχυλίσματα από τα δείγματα που εμφάνισαν την δράση ήταν πλούσια σε φλαβονοειδή.

2.2. Φλωρογλουκινόλες

Μια άλλη ομάδα ενώσεων που εντοπίζονται στο υπερικό είναι οι φλωρογλουκινόλες στις οποίες εντάσσονται οι ενώσεις υπερφορίνη και η αντι-υπερφορίνη (Εικόνα 10). Βρίσκονται σε αφθονία στο υπερικό ωστόσο είναι δύσκολο να απομονωθούν, αφού είναι ιδιαιτέρως ευαίσθητα μόρια και αποικοδομούνται πολύ γρήγορα μετά την έκθεση τους στο φως, στον αέρα και σε οργανικούς διαλύτες (Beerhues, 2006). Η υπερφορίνη (C35H52O4), η κύρια ένωση, είναι ένα ισοπρενοειδές με 35 άτομα άνθρακα (C). Απομονώθηκε πρώτη φορά από τον Bystrov και τους συνεργάτες του το 1975 από το Hypericum perforatum, για αυτό και την ονόμασαν έτσι (Bystrov et al, 1975).H δομή της αποτελείται από ένα φλωρογλουκινολικό σκελετό (φαινολικός δακτύλιος με τρία υδροξύλια) με 5 λιπόφιλες ισοπρενικές αλυσίδες και η απόλυτη δομή της προσδιορίστηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ (Brondz et al, 1982 & 1983).

Εικόνα 9. Φλωρογλουκινόλες στο υπερικό (Butterweck et al, 2007)

To γεγονός ότι είναι ένα ασταθές μόριο έγκειται στο β-δικαρβονυλικό ισομερές της αφού φυσικά παράγωγα, στα οποία απουσίαζε, ήταν πιο σταθερά (Verotta et al, 1999,2000). Ένα σταθερό παράγωγο της, παρόλη την έκθεση του στο φως και στην ατμόσφαιρα, βρέθηκε να είναι το δικυκλοεξυλαμμώνιο άλας της υπερφορίνης(Εικόνα 11) (Lang et al, 2002). Σύμφωνα με τις μονογραφίες για το υπερικό, η υπερφορίνη, μαζί με την αντι- υπερφορίνη, εντοπίζονται κυρίως στους ανώριμους καρπούς, συνεπώς οι απομονωθείσες φλωρογλουκινόλες θα είναι σε μεγαλύτερη ποσότητα όταν το φυτό συλλέγεται κατά την καρποφορία, παρά την ανθοφορία(Butterweck et al,2007). Η υπερφορίνη φτάνει το 8,5% στους άγουρους καρπούς, ενώ το ομόλογο της αντι-υπερφορίνη φτάνει το 1,9% στις κάψουλες κατά τη διαδικασία ωρίμανσης των καρπών (Beerhues, 2006). Η υπερφορίνη βρίσκεται σε ποσότητες 2-5% ξηρής δρόγης και μπορεί να φτάσει το 6% σε κάποια εκχυλίσματα, όταν σε παραδοσιακά εκχυλίσματα υπερικού η υπερφορίνη απουσιάζει εντελώς. Ποσοτικά βρέθηκε να είναι περισσότερη στο H.perforatum σε σχέση με άλλα είδη υπερικού, στα οποία τα ποσοστά κυμάνθηκαν από 0,05 έως 2,7% (H. barbatum, H. richeri, H. rumeliacum, H. maculatum, H. tetrapterum, H. hirsutum, H. linarioides, H. olympicum) (Smelcerovic & Piteller, 2006). Πέρα από την υπερφορίνη και τις ομόλογες δομές της, υπάρχουν και άλλες δομές φλωρογλουκινολών στα διάφορα taxa του γένους Hypericum. Μερικές από αυτές δίνονται στον Πίνακα 4:

Πίνακας 4. Taxa του γένους Hypericum όπου έχουν απόμονωθεί φλωρογλουκινολικά παράγωγα Taxa Αναφορά Hypericum ellipticum Ακυλο-φλωρογλουκινόλη, Maning et al (2011) ελλιπτοφενόνη Α (elliptophenone A) Hypericum scabrum Βενζοφλωρογλουκινόλες, Mathuhisa et al (2002) Υπεριμπόνες Α-Ι (hyperibones A-I) Hypericum ascyron Ακυλο-φλωρογλουκινόλες Hashida et al 2008 Τομεόνες Α-Η (tomeones A-H) Hypericum perforatum var. Πρενυλιωμένες φλωρογλουκινόλες Hashida et al 2008 angustifolium φουροαντιυπεριφορίνη ισομερή A και Β

2.2.1 Βιολογικές δράσεις υπερφορίνης

Έχουν ταυτοποιηθεί διάφορα φυσικά ανάλογα της υπερφορίνης, όπως η αντι- υπερφορίνη και η φυροϋπερφορίνη (ορθοϋπερφορίνη), όμως κανένα δεν φαίνεται να είναι το ίδιο δραστικό, όπως το αρχικό μόριο, στην επαναπρόσληψη της συναπτικής σεροτονίνης (L. Beerhues, 2006). H υπερφορίνη, η οποία θεωρείται ως η κύρια υπεύθυνη ένωση για την αντικαταθλιπτική δράση του υπερικού, μέσω της αλλαγής της συγκέντρωσης των ιόντων νατρίου (βλέπε μηχανισμός αντικαταθλιπτικής δράσης παρακάτω) μπορεί να αναστέλλει την επαναπρόσληψη διαβιβαστών στις νευρωνικές συνάψεις όπως της σεροτονίνης, νοραδρεναλίνης, ντοπαμίνης, γλουταμικού και γ-αμινοβουτυρικού οξέος (Muller, 2003). Σε αντίθεση με τα άλλα αντικαταθλιπτικά, εξαιτίας της μη-εκλεκτικότητας της, αλληλεπιδρά με περισσότερα εκ των δύο νευροδιαβιβαστικών συτστημάτων, έχοντας μεγαλύτερο εύρος δράσης. Σε in vivo μελέτες με δοκιμές συμπεριφοράς όπου ελέγχθηκε η αντικαταθλιπτική δράση του υπερικού με δοκιμή εξαναγκασμένης κολύμβησης, η τριπλή χορήγηση οξικής υπερφορίνης (5-20mg/Kg) μείωσε σημαντικά τον χρόνο ακινησίας στους επίμυες (Zanoli et al, 2002). Σε μια άλλη μελέτη συμπεριφοράς, η υπερφορίνη μείωσε σημαντικά το χρόνο ακινησίας στους μύες σε δόσεις 4 και 8 mg/Kg, ενώ σε μικρότερες δόσεις δεν είχε δράση. Στην ίδια μελέτη ωστόσο έδειξαν πως το εκχύλισμα ήταν εξίσου δραστικό ακόμα και όταν απομακρύνθηκαν η υπερφορίνη και η υπερικίνη, που σημαίνει πως υπάρχουν και άλλα μόρια που συμβάλλουν στην αντικαταθλιπτική δράση του υπερικού και μάλιστα πως δρουν συνεργιστικά (Butterweck et al, 2003). Άλλες δράσεις που φέρεται να έχει η υπερφορίνη είναι αντιβακτηριακή κατά Gram θετικών βακτηρίων σε υψηλές συγκεντρώσεις, αντιφλεγμονώδης (Schempp et al. 1999,2000), κυτταροτοξική μέσω της επαγωγής της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα, όπως λευχαιμικά κύτταρα, αλλά και ανασταλτική δράση της αγγειογένεσης in vitro αλλά και in vivo (Martinez-Poveda et al. 2005). Tέλος, σύμφωνα με τον Dona και τους συνεργάτες του το σταθερό άλας του δικυκλοεξυλαμμωνίου της υπερφορίνης (Hyp-DCHA) (Εικόνα 11) φαίνεται πως μπορεί να αποτρέψει την εξάπλωση ενός όγκου και την μετάσταση του, μέσω της επαγωγής της απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων ποντικού (B16-LU8, C-26) αλλά και σε ανθρώπινα κύτταρα (HT1080). Συγκεκριμένα στα HT1080, παρατηρήθηκε μείωση της αύξησης τους, ενώ τα αδιαφοροποίητα ενδοθηλιακά κύτταρα επηρεάστηκαν ελάχιστα. Επίσης σε μυες που είχαν λάβει ενδοφλέβια B16-LU8 και C26 κύτταρα, στα οποία χορηγείτο καθημερινά ενδοπεριτοναϊκά Hyp-DHCA, παρατηρήθηκε μείωση της αγγειογένεσης και του μεγέθους της μετάστασης και για τους δύο τύπους κυττάρων (Dona et al, 2004).

Εικόνα 10. δομή άλατος δικυκλοεξυλαμμώνιου υπερφορίνης (Dona et al, 2004)

2.3 Ναφθοδιανθρόνες

Στην οικογένεια των ναφθοδιανθρονών ανήκουν η υπερικίνη και η ψευδοϋπερικίνη. Είναι ενώσεις που δεν απαντώνται σε πολλά είδη φυτών, έχουν βρεθεί μόνο σε taxa του γένους Hypericum, ενώ απομονώθηκαν για πρώτη φορά από το Hypericum perforatum. Η υπερικίνη (Εικόνα 12) απομονώθηκε για πρώτη φορά από τον Buchner το 1830 και την αποκάλεσε κόκκινο υπερικό. Έναν αιώνα μετά, ξανααπομονώθηκε και μετονομάστηκε σε υπερικίνη από τον Cerny, μαζί με άλλες παρόμοιες ενώσεις. Ήταν λάθος τοποθετημένη στην ομάδα των ανθοκυανιδών το 1927, ενώ η σωστή δομή της προσδιορίστηκε το 1953 από τους Brockman και Sanne (Huang et al, 2012). Στο H.perforatum το ποσοστό των ναφθοδιανθρονών ανέρχεται από 0,05% έως 0,30%, το οποίο ποικίλλει ανάλογα τις συνθήκες που φύεται το φυτό (υψόμετρο, καιρικές συνθήκες, σύσταση εδάφους, ηλιοφάνεια) και την περίοδο συλλογής (Brockman et al. 1939, 1953) (Cameron & Raverty, 1976), ενώ εντοπίζονται κυρίως στα άνθη και τα φύλλα.

Εικόνα 11. Δομές ναφθοδιανθρονών. (Ι) υπερικίνη, (ΙΙ) ψευδοϋπερικίνη, (ΙΙΙ) ψευδοπρωτοϋπερικίνη, (IV) πρωτοϋπερικίνη (Huang et al, 2012)

Άλλες ναφθοδιανθρόνες που περιλαμβάνονται στην ομάδα είναι η πρωτοϋπερικίνη, πρωτοψευδοϋπερικίνη (Εικόνα 11) και κυκλοψευδοϋπερικίνη (Εικόνα 13), οι οποίες όμως αποτελούν πρόδρομες ενώσεις της υπερικίνης και ψευδοϋπερικίνης αντίστοιχα και βρίσκονται σε μικρότερο ποσοστό στα φυτό. Η κυκλοψευδοϋπερικίνη είναι ένωση που προκύπτει από μετατροπή της ψευδοϋπερικίνης (Poutaraud et al. 2001) (Wirz et al. 2001). Όλες οι ενώσεις εντοπίζονται στο ανθισμένο τμήμα του φυτού και μάλιστα στους κοκκινωπούς ελαιώδεις αδένες (φύλλα και άνθη) (Zobayed et al. 2006). Η ψευδοϋπερικίνη εντοπίζεται σε μεγαλύτερο ποσοστό (0,03-0,34%) από την υπερικίνη (0,03-0,09%), 2 έως 4 φορές περισσότερο ανάλογα με το φυτό (Mauri & Pietta, 2000).

Εικόνα 12. Δομή κυκλοψευδοϋπερικίνης (http://www.molecular- networks.com/biopath3/biopath/mols/Cyclopseudohypericin)

Ναφθοδιανθρόνες έχουν βρεθεί και σε άλλα taxa του γένους Hypericum. Σε μια πρόσφατη μελέτη των Bruni και Sacchetti (2009) πραγματοποιήθηκε η σύγκριση μεταξύ πολλών taxa του γένους, όπου διαπιστώθηκαν ποικίλλες μορφολογικές αλλά χημικές διαφοροποιήσεις ανάμεσα τους. Ωστόσο περίπου τα ¾ του γένους δεν έχουν μελετηθεί ακόμα για την χημική τους σύσταση. Σε 74 taxa (περίπου το 20%) που μελέτησαν η Crockett και οι συνεργάτες της με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC), διαπίστωσαν πως ναφθοδιανθρόνες, συγκεκριμένα υπερικίνη, έφεραν μόνο 7 αντιπρόσωποι των ομάδων Hypericum*, Adenotras** και Drosocarpium+ , ομάδες οι οποίες είναι φυλογενετικά μεταγένεστερες (Πίνακας 5). Στα είδη H. bithynicum, H. olympicum and H. perforatum ssp. veronense εντοπίστηκε μόνο ψευδοϋπερικίνη και, ενώ στα είδη H. apocynifolium, H. cistifolium, H. hypericoides ssp. hypericoides and H. roeperanum δεν εντοπίστηκαν ούτε υπερικίνη, ούτε ψευδοϋπερικίνη (Crockett et al., 2005).

Πίνακας 5. Taxa του γένους Hypericum και ομάδες (sections) που ανήκουν (Crockett et al, 2005). Με έντονο χρώμα επισημαίνονται τα taxa στα οποία έχει ανευρεθεί η υπερικίνη και η ψευδοϋεπρικίνη. Taxa Ομάδα (Section) H. acmosepalum N. Robson Ascyreia H. adenotrichum Spach. Crossophyllum H. aegypticum L. ssp. aegypticum Adenotrias** H. aegypticum L. ssp. marrocanum Adenotrias** H. anagalloides Cham. & Schlecht. Trigynobrathys H. apocynifolium Small Myriandra H. ascyron L. Roscyna H. athoum Boiss. & Orph. Adenosepalum H. balearicum L. Psorophytum H. beanii N. Robson Ascyreia H. bithynicum Boiss. Drosocarpium+

Taxa Ομάδα (Section) H. brachyphyllum (Spach) Steudel Myriandra H. buckleyi M. A. Curtis Myriandra H. calycinum L. Ascyreia H. cerastoides (Spach) N. Robson Campylopus H. chapmanii P. Adams Myriandra H. choisyanum Wallich ex N. Robson Ascyreia H. cistifolium Lam. Myriandra H. confertum Choisy ssp. confertum Taeniocarpium H. delphicum Boiss. & Orph. Adenosepalum H. densiflorum Pursh Myriandra H. denticulatum Walter Trigynobrathys H. dolabriforme Vent Myriandra H. drummondii (Grev. & Hook) T. & A. Gray Brathys H. edisonianum (Small) W. P. Adams Myriandra H. empetrifolium Willd. Coridium H. ericoides L. Coridium H. fasciculatum Lam. Myriandra H. forrestii N. Robson Ascyreia H. frondosum Michaux. Myriandra H. galioides Lam. Myriandra H. gentianoides (L.) Britt., Sterns & Pogg. Brathys H. graveolens Buckley Graveolentia H. gymnanthum Engl. & Gray Trigynobrathys H. henryi H. Leveille & Vaniot ssp. uraloides Ascyreia (Rehder) N. Robson H. hypericoides (L.) Crantz ssp. hypericoides Myriandra H. hypericoides (L.) Crantz ssp. multicaule Myriandra H. hyssopifolium Vill. ssp. elongatum Hirtella H. kouytchense H. Lev. Ascyreia H. lancasteri N. Robson Ascyreia H. leschenaultii Choisy Ascyreia H. linarioides Bosse Taeniocarpium. H. lissophloeus P. Adams Myriandra H. lloydii (Svenson) P. Adams Myriandra H. lobocarpum Gatt. Myriandra H. maculatum Crantz. Hypericum* H. microsepalum (T. & A. Gray) A. Gray ex S. Myriandra Wats. H. monogynum L. Ascyreia H. montbretii Spach Drosocarpium+ H. mutilum L. Trigynobrathys H. myrtifolium Lam. Myriandra H. nanum Poiret Arthrophyllum H. nitidum Lam. ssp. exile Myriandra H. nitidum Lam. ssp. nitidum Myriandra H. nudiflorum Michaux. Myriandra H. olympicum L. spp. auriculatum Olympia H. orientale L. Crossophyllum H. pallens Banks & Solander Triadenoides H. patulum Thunb. ex Murray Ascyreia H. perforatum L. ssp. perforatum Hypericum* H. perforatum L. ssp. veronense (Schrank) H. Hypericum* Lindb.

Taxa Ομάδα (Section) H. prolificum L. Myriandra H. pseudohenryi N. Robson Ascyreia H. punctatum Lam. Graveolentia H. roeperanum W. G. Schimper ex. A. Rich Campylosporus H. scabrum L. Hirtella H. scouleri Hook. (forma formosum) Hypericum* H. scouleri Hook. (forma scouleri) Hypericum* H. sphaerocarpum Michaux. Myriandra H. suffruticosum Adams & Robson Myriandra H. tenuifolium Pursh Myriandra H. tetrapetalum Lam. Myriandra H. triquetrifolium Turra Hypericum* H. venustum Fenzl Taeniocarpium H. X inodorum Miller (H. hircinum X Androsaemum androsaemum) H. X moserianum Luquet ex Andre (H. patulum Ascyreia X calycinum)

Όσον αφορά στα ποσοστά των ναφθοδιανθρόνων, αυτά ποικίλλουν ανάμεσα στα διάφορα taxa του γένους Hypericum. Στην μελέτη του Kitanov (2001) από 36 taxa Hypericum, τα 27 μόνο έφεραν ναφθοδιανθρόνες, τα οποία άνηκαν σε 17 ομάδες (Πίνακας 6). Ψευδοϋπερικίνη εντοπίστηκε σε 15 taxa για πρώτη φορά, ενώ στα περισσότερα είδη εντοπίστηκαν και οι δύο ενώσεις με την ψευδοϋπερικίνη να έχει μεγαλύτερη συγκέντρωση από την υπερικίνη. Στα H. hirsutum, H. empetrifolium εντοπίστηκε μόνο υπερικίνη, στο H. formosissimum εντοπίστηκε μόνο ψευδοϋπερικίνη. Τα ποσοστά των ναφθοδιανθρόνων κυμάνθηκαν από 0,009% στο H. empetrifolium, έως 0,512% στο H. boissieri.

Πίνακας 6. 36 Taxa που μελετήθηκαν για τον εντοπισμό και την ποσοτικοποίηση των ναφθοδιανθρόνων (Kitanov 2001) (+ εντοπίστηκε / - δεν εντοπίστηκε) Είδος Ομάδα (Section) Υπερικίνη/Ψευδοϋπερικίνη Ποσοστιαία συγκέντρωση H. calycinum L. Ascyreia Choisy -/- H. patulum Thunb. ex -/- Murray H. androsaemum L. Androsaemum -/- (Duhamel) Godron H. xylosteifolium Inodora Stef. -/- (Spach) N. Robson (H. inodorum Wild.) H. ascyron L. Roscyna -/- (Spach) R. Keller H. bupleuroides Griseb. Bupleuroides Stef -/- H. maculatum Crantz – +/+ 0.058 Hypericum H. tetrapterum Fries +/+ 0.052 H. perforatum L. +/+ 0.125 H. triquetrifolium Turra +/+ 0.090 H. attenuatum Choisy +/+ 0.072 H. elegans Stephan ex +/+ 0.104 Willd. H. olympicum L. +/+ 0.015 Οlympia (Spach) Nyman H. polyphyllum Boiss. et +/+ 0.012 Balansa H. cerastoides (Spach) Campylopus Boiss +/+ 0.029 N. Robson H. origanifolium Willd. Origanifolia Stef +/+ 0.064

Είδος Ομάδα (Section) Υπερικίνη/Ψευδοϋπερικίνη Ποσοστιαία συγκέντρωση H. montbretii Spach Drosocarpium Spach +/+ 0.174 H. umbellatum A. +/+ 0.063 Kerner H. richeri Vill +/+ 0.134 H. rochelii Griseb. et +/+ 0.232 Schenk H. boissieri Petr +/+ 0.512 H. barbatum Jacq. +/+ 0.306 H. rumeliacum Boiss. +/+ 0.263 H. bithynicum Boiss +/+ 0.056 H. perfoliatum L +/+ 0.056 H. aucheri Jaub. Et Oligostema (Boiss.) Stef +/+ 0.031 Spach H. thasium Griseb Thasia Boiss +/+ 0.124 H. scabrum L Hirtella Stef -/- H. hirsutum L. Taeniocarpium Jaub. et +/- 0.043 Spach H. linarioides Bosse +/+ 0.019 H. asperuloides Czernj. Coridium Spach. -/- Ex Turcz H. empetrifolium Willd. +/+ 0.009 H. annulatum Moris (H. Adenosepalum Spach +/+ 0.066 degenii Bornm.) H. montanum L. +/+ 0.040 H. formosissimum -/+ 0.054 Takht H. japonicum Thunb. Ex Spachium (R. Keller) N. -/- Murray Robson

2.3.1 Άλλες πηγές ναφθοδιανθρονών

Άλλη κατηγορία οργανισμών που έχουν εντοπιστεί ναφθοδιανθρόνες είναι σε μύκητες όπως ο Dermocybe ή σε ενδοφυτικούς μύκητες με «ζουν» μέσα σε διάφορα φυτά του γένους Hypericum (Dewick, P.M. 2002). Η τελευταία περίπτωση αποτελεί ένα ενδιαφέρον πεδίο για έναν νέο εναλλακτικό τρόπο παραγωγής ναφθοδιανθρονών. Έχει υποτεθεί πως, ιδιαίτερα σε τροπικά περιβάλλοντα, οι αλληλεπιδράσεις, μεταξύ φυτών και μικρόκοσμου μπορεί να Εικόνα 13. Μύκητας οδηγήσουν σε οριζόντια μεταφορά γονιδίων και γενετικών Dermocybe semisanguinea ανασυνδυασμών, από το φυτό-ξενιστή προς το ενδοφυτικό (biology.duke.edu) παράσιτο και αντίστροφα, τα οποία στην συνέχεια να οδηγήσουν σε νέους ενδοφυτικούς οργανισμούς ικανούς να συσσωρεύουν συγκεκριμένους μεταβολίτες στο φυτό-ξενιστή. Αν και μόνο συγκεκριμένοι ενδοφυτικοί οργανισμοί είναι ικανοί να παράγουν συγκεκριμένες ενώσεις και η συνεξέλιξη των φυτών-μυκήτων είναι ακόμα άγνωστη, αυτές οι μέθοδοι μπορεί να καταδεικνύουν μια νέα προοπτική για την παραγωγή φυσικών προϊόντων και έχουν πολλαπλά οφέλη όπως το χαμηλό κόστος, χρήση ανανεώσιμων πηγών και τέλος επαναλήψιμα αποτελέσματα μέσω τεχνολογιών ζύμωσης.

Στο πλαίσιο της μελέτης αυτής εξετάσθηκε ο πιθανός μικροβιακός μηχανισμός βιοσύνθεσης της εμοδίνης και την υπερικίνης σε αξενική καλλιέργεια στον μύκητα Thielavia subthermophila, που απομονώθηκε από το H.perforatum (Kusari et al. 2008, 2009). Η αξενική καλλιέργεια, όπου μόνο ένας τύπος μικροοργανισμού μπορεί να αναπτυχθεί, χρησιμοποιείται Εικόνα 14. για τη μελέτη βασικών αναπτυξιακών μηχανισμών. Τα αποτελέσματα αξενική καλλιέργεια έδειξαν ότι ούτε ανθρόνη εμοδίνη (πρόδρομη ένωση από την οποία Thielavia προκύπτει η υπερικίνη), ούτε πρωτοϋπερικίνη μπορούσε να ανιχνευτεί σε subthermophila οποιοδήποτε στάδιο της ζύμωσης. Επιπλέον, το γονίδιο Hyp-1 απουσίαζε (Kusari et al, από τον Τ. subthermophila, υποδεικνύοντας ότι η βιοσυνθετική οδός του 2009) ενδοφυτικού μύκητα μπορεί να είναι διαφορετική ή / και να διέπεται από έναν διαφορετικό μοριακό μηχανισμό από το φυτό ξενιστή.

2.3.2. Βιοσύνθεση

Η βιοσύνθεση της υπερικίνης και της ψευδοϋπερικίνης γίνεται μέσω της οδού των πολυκετιδίων, σύμφωνα με την οποία ένα μόριο ακετυλο-συνενζύμουΑ αντιδρά με 7 μόρια μηλονυλο-συνενζύμου Α για να σχηματίσει ένα γραμμικό οκτακετίδιο το οποίο υφίσταται κυκλοποίηση και απόκαρβοξυλίωση, οδηγώντας έτσι στο σχηματισμό της εμοδίνης. Η εμοδίνη θεωρείται πρόδρομο μόριο της υπερικίνης. Διαδοχικές οξειδώσεις οδηγούν στην δημιουργία της πρωτοϋπερικίνης, η οποία ύστερα από ακτινοβόληση με ορατό φως δίνει την υπερικίνη. Οξείδωση της μεθυλομάδας της πρωτοϋπερικίνης καταλήγει σε σχηματισμό της ψευδοπρωτοϋπερικίνης, η οποία όμως μετατρέπεται και αυτή, υπό ακτινοβόληση ορατού φωτός, σε ψευδοϋπερικίνη. Οι αντιδράσεις αυτές καταλύονται από τα ένζυμα συνθάση πολυκετιδίων (PKS) και Hyp-1, όπως απεικονίζονται στην Εικόνα 16.

Εικόνα 15. Βιοσύνθεση ναφθοδιανθρονών (Karioti & Bilia, 2010)

2.3.3 Φυσικοχημικές ιδιότητες

H υπερικίνη έχει μελετηθεί εκτενώς για τις φυσικοχημικές της ιδιότητες, σε αντίθεση με την ψευδοϋπερικίνη. Η υπερικίνη δεν είναι επίπεδο μόριο, όπως αποδείκτηκε ύστερα από μελέτες με περίθλαση ακτίνων-Χ (Etzlstorfer et al. 1993). Οι πλευρικές μεθυλομάδες του αρωματικού σκελετού απωθούν η μία την άλλη και εμποδίζουν το μόριο να αποκτήσει επίπεδη διαμόρφωση.

Εικόνα 16. Χημική δομή υπερικίνης (7,14 διοξυ ταυτομερές - 1). Στην δομή (1α) οι σκιασμένοι δακτύλιοι έχουν τη βασική δομή π-ηλεκτρονιακής σύζευξης. Υπάρχουν 16 θεωρητικά ταυτομερή της υπερικίνης, με πιο σταθερό να είναι το 7,14- διοξυταυτομερές (1) όπως αυτά απεικονίζονται στην Εικόνα 17 (Gutman et al. 1998).

Εικόνα 17. Ταυτομερή υπερικίνης και απεικόνιση π-ηλεκτρονιακής σύζευξης (δακτύλιοι σκιασμένοι). Στα ταυτομερή απεικονίζονται τα δύο καρβονύλια, ενώ οι υδροξυλικές ομάδες και τα μεθύλια παραλείπονται (φαίνονται στην Εικόνα 17). Τα ταυτομερή έχουν τοποθετηθεί με σειρά αυξανόμενης ενέργειας.

Πίνακας 7. Ταυτομερή υπερικίνης με αυξανόμενη ενέργεια. Η χημική δομή τους δίνεται στην Εικόνα 17. Ταυτομερή Ενέργεια Ταυτομερή Ενέργεια (KJ/mol) (KJ/mol) Q(7, 14) 0 Q(3, 8) 110.2 Q(1, 7) 41.5 Q(3, 4) 118.3 Q(7, 13) 43.9 Q(3, 14) 149.8 Q(3, 7) 60.1 Q(7, 8) 176.4 Q(8, 13) 70 Q(3, 13) 176.5 Q(1, 6) 70.6 Q(1, 14) 198.5 Q(1, 4) 84.3 Q(1, 13) 201 Q(1, 8) 92.3 Q(1, 3) 202.3

Τα ανωτέρω αποτελέσματα του Πίνακα 7 είναι σε αρμονία με το γεγονός ότι το Q (7, 14) ταυτομερές είναι το πιο σταθερό της υπερικίνης. Οι ενέργειες των αμέσων επόμενων πιο σταθερών ταυτομερών Q (1, 7) και Q (7, 13) είναι περισσότερο από 40 kJ / mol παραπάνω από το Q (7, 14). Σε πυκνά διαλύματα υπερικίνης, το 1,6-διοξυταυτομερούς μετατρέπεται σε 7,14-διοξυ ταυτομερές. Η διάλυση ή η προσθήκη DMSO (διμεθυλοσουλφοξείδιο) ή άλλων πολικών διαλυτών στα διαλύματα ενεργοποιεί την αντίδραση αυτή. Το 1,6-διοξυ ταυτομερές ακινητοποιείται σε στερεή φάση και σε συμπυκνωμένα διαλύματα με δεσμούς υδρογόνου. Άλατα της υπερικίνης με αλκαλικά μέταλλα διατηρούν την δομή του 7,14- διοξυ-ταυτομερούς και σε υγρά διαλύματα και σε κρυσταλλική φάση (Kapinus et al. 1999). Η υπερικίνη έχει την τάση να σχηματίζει διμερή. Διαλύεται μονομοριακώς σε κοινούς πολικούς διαλύτες σε συγκεντρώσεις από 10-3 mol / L. Υπό ορισμένες συνθήκες (δηλ., υπό την παρουσία νερού), ωστόσο, σχηματίζει ομοδιμερή. Η μορφή των ομοδιμερών εξαρτάται από την κατάσταση ταυτομέρειας της υπερικίνης. Οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις του αρωματικού πυρήνα είναι υπεύθυνες για το 7,14-διοξυ ταυτομερές, ενώ οι δεσμοί υδρογόνου είναι υπεύθυνοι για το σχηματισμό των ομοδιμερών του 1,6-διοξυ ταυτομερούς. Αυτά τα ομοδιμερή επηρεάζουν σημαντικά το φάσμα απορρόφησης της υπερικίνης και αυτό θα πρέπει να εξετάζεται κατά τις HPLC-DAD αναλύσεις. Για παράδειγμα, τα ομοδιμερή των 1,6-διοξυ ταυτομερών δείχνουν πιο υψηλούς συντελεστές απόσβεσης και στενές ζώνες απορρόφησης από εκείνες του 7,14-διοξυ ταυτομερούς. Οι Falk & Schmitzberger ανέφεραν ότι ο συντελεστής απόσβεσης της υπερικίνης σε νερό είναι το 1/4 από αυτόν σε καθαρό διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (Kapinus et al. 1999), (Falk & Meyer, 1994). Άλλοι παράγοντες που επηρεάζουν το φάσμα απορρόφησης της υπερικίνης είναι ο διαλύτης, το pH, ο ιοντισμός της και η στεροχημική της κατάσταση (ταυτομέρεια). Σε διαλύματα ένα ταυτομερές μπορεί να μετατραπεί σε κάποιο άλλο. Επίσης, αύξηση της θερμοκρασίας, προσθήκη πυριδίνης και DMSO στα διαλύματα, διαταράσσουν τους δεσμούς υδρογόνου, διαλύοντας τα μόρια υπερικίνης, ενισχύοντας έτσι την δημιουργία άλλων ενώσεων (Falk & Schmitzberger, 1992), (Etzlstorfer et al, 1996). Η εγγύτητα των όξινων και βασικών δραστικών ομάδων της υπερικίνης επιτρέπει τον σχηματισμό πολλών δεσμών υδρογόνου, οι οποίοι διαδραματίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην μοριακή αναγνώριση και την εξειδίκευση των αλληλεπιδράσεων της με μοριακούς στόχους. Δεδομένα από αναλύσεις ακτίνων-Χ έδειξαν ότι, η αποπρωτονίωση της υπερικίνης σχηματίζει πέντε μικρούς ενδομοριακούς δεσμούς υδρογόνου που επηρεάζουν την ισορροπία των ταυτομερών και καθορίζουν τις όξινες-βασικές ιδιότητες τους. Η υπερικίνη έχει την τάση να «δίνει» ένα πρωτόνιο σε πολικούς διαλύτες και να προκύπτει ένα ανιόν υπερικίνης. Αυτό το ανιόν καθορίζει την ευαισθησία της υπερικίνης στο φως. Περαιτέρω, έχει προταθεί ότι πραγματοποιείται μία ενδομοριακή μεταφορά πρωτονίου και συνδέεται με ενδομοριακές μεταβολές διαμόρφωσης (διεγερμένη κατάσταση ταυτομερείωσης) (Gai et al, 1994), (English et al, 1997).

Οι ναφθοδιανθρόνες είναι αρκετά δυσδιάλυτες στο νερό, με την ψευδοϋπερικίνη να είναι περισσότερο διαλυτή σε πολικούς διαλύτες εξαιτίας της ύπαρξης μιας πρόσθετης υδροξυλομάδας στη δομή της. Έχει υποτεθεί ότι οι προκυανιδίνες μπορεί να ευθύνονται για την διαλυτότητα των ναφθοδιανθρονών σε υδατικά διαλύματα μέσω της δημουργίας συμπλόκων μεταξύ τους (Butterwek et al. 1998). H προσθήκη αλάτων καλίου αυξάνει τη διαλυτότητα των ναφθοδιανθρονών αλλά και τη δυνατότητα εκχύλισης τους από το φυτό (Falk et al. 1992). Πρότυπα διαλύματα ναφθοδιανθρονών σε μεθανόλη:πυριδίνη (99:1, v/v) μπορούν να αναλυθούν και είναι αρκετά διαυγή, εξαιτίας της προσθήκης της πυριδίνης. Η πυριδίνη σχηματίζει σύμπλοκα με τις ναφθοδιανθρόνες, αλλά η προσθήκη αυτή επιταχύνει την αποικοδόμηση της ψευδοϋπερικίνης (Wirz et al. 2002). H πρόσδεση της στην ανθρώπινη αλβουμίνη επιτρέπει στην υπερικίνη να διαλύεται σε φυσιολγικά υδατικά διαλύματα, αφού οδηγεί στη διάλυση των συναθροίσεων μονομερών υπερικίνης που εμφανίζονται σε υδατικά διαλύματα (Miskovsky, P. 2002). Η υπερικίνη χρησιμοποιείται σε βιολογικές και κλινικές δοκιμές σε μορφή άλατος (Huang et al, 2012). Η υπερικίνη εμφανίζει μεγαλύτερη σταθερότητα σε σχέση με την ψευδοϋπερικίνη στο σκοτάδι, ενώ σε διαλύματα εκχύλισης η ψευδοϋπερικίνη είναι σταθερότερη σε σχέση με τα πρότυπα διαλύματα. Όσον αφορά στις συνθήκες αποθήκευσης των πρότυπων διαλυμάτων ναφθοδιανθρονών, η σταθερότητα αυτών είναι μεγαλύτερη στους -20οC (Wirz et al. 2001).Το pH είναι ένας άλλος παράγοντας που συμβάλλει στην αποικοδόμηση των ναφθοδιανθρονών. Όξινες ή βασικές συνθήκες οδηγούν σε αποσύνθεση των ναφθοδιανθρονών στο εκχύλισμα του H. perforatum (Fourneron &Nait-Si, 2003), (Liu et al. 2005). Πρότυπα διαλύματα υπερικίνης και ψευδοϋπερικίνης παρουσιάζουν μείωση της τάξης του 20% μετά από 4 μέρες έκθεσης στο φως, σε θερμοκρασία δωματίου, για αυτό και είναι απαραίτητο να χρησιμοποιούνται το συντομότερο (Karioti et al. 2009).

2.3.4. Εκχύλιση και απομόνωση

Πολλές μέθοδοι εκχύλισης ναφθοδιανθρονών από την πόα υπερικού, έχουν περιγραφεί, όπως εκχύλιση στερεού με υγρό, εκχύλιση σε λουτρό υπερήχων, Soxhlet εκχύλιση, εκχύλιση με υπερκρίσιμα υγρά και υγρή εκχύλιση υπό πίεση. Εξαιτίας της μικρής περιεκτικότητας τους στο H. perforatum οι διαδικασίες εκχύλισης είναι υψηλού κόστους και απαιτούν αρκετούς κύκλους επανάληψης με γρήγορο χειρισμό του φυτικού υλικού, αφού οι επιθυμητές ενώσεις είναι ασταθή μόρια. Η ευρωπαϊκή φαρμακοποιία αναγράφει τη χρήση THF για την εκχύλιση. Οι μέθοδοι που έχουν εφαρμοστεί ποικίλλουν στη φύση και σύσταση των διαλυτών. Γενικώς, απαιτείται μικρότερο ποσοστό νερού στη σύσταση των υδροαλκοολικών διαλυμάτων για την εκχύλιση της υπερικίνης σε σχέση με την ψευδοϋπερικίνη. Ακριβώς, επειδή η περιεκτικότητα τους στο φυτό είναι μικρή, η διαδικασία απομόνωσης τους είναι περίπλοκη και απαιτεί πολλά διαφορετικά βήματα. Κάποιες από τις μεθόδους περιλαμβάνουν την εφαρμογή της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (HPLC) σε στήλες αντίστροφης φάσης C18 (Liu et al 2005), (Tolonen et al. 2002), ενώ σε άλλες εφάρμοσαν κλασική υγρή χρωματογραφία στήλης σε silica (Kubin et al. 1996), (Kacerovska et al. 2008) ή Sephadex LH-20 (Vandenbogaerde et al.1998), (Butterweck et al. 2003) ή συνδυασμό όλων των ανωτέρω τεχνικών.

2.3.5. Βιολογικές δράσεις

2.3.5.1 Φωτοδυναμικό φαινόμενο (PDT) και καρκίνος

Η υπερικίνη έχει μελετηθεί εκτενώς για την εφαρμογή της στη φωτοδυναμική θεραπεία, η οποία περιλαμβάνει την χορήγηση ενός μη τοξικού φαρμάκου (συστημικά, τοπικά, ενδοφλέβια) με στόχο την επιλεκτική καταστροφή παθολογικών ιστών, μέσω της ενεργοποίησης αυτού κάτω από την επίδραση φωτός (μήκος κύματος 620-690 nm ερυθρή περιοχή συνήθως) και παρουσία οξυγόνου, αφού πρώτα το μόριο αυτό φτάσει στον ιστό- στόχο. Η χορηγηθείσα ένωση (φωτοευαίσθητη) προκαλεί τη δημιουργία ελεύθερων ριζών και άλλων μορίων υψηλής χημικής δραστικότητας, ύστερα από μια σειρά φωτοχημικών αντιδράσεων. Το αποτέλεσμα είναι η εκλεκτική νέκρωση του παθολογικού ιστού με την ελάχιστη βλαπτική επίδραση στους περιβάλλοντες υγιείς ιστούς. Οι ναφθοδιανθρόνες παρουσιάζουν ισχυρή ικανότητα να παράγουν δραστικές μορφές οξυγόνου (reactive oxygen species-ROS), οδηγώντας τα κύτταρα σε απόπτωση (προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο), κάτι που τις κατατάσσει στις πιο ισχυρές φωτοευαισθητοποιές «φυσικές» ενώσεις. Ο Vandenbogaerde και οι συνεργάτες του μελετώντας αυτές τους τις ιδιότητες πρότειναν τις ναφθοδιανθρόνες ως φωτοχημειοθεραπευτικά μόρια και μάλιστα διαπίστωσαν πως η ψευδοϋπερικίνη είναι λιγότερο αποτελεσματική από την υπερικίνη (Vandenbogaerde et al. 1997,1998). Ο Agonistis και οι συνεργάτες του μελέτησαν τα σηματοδοτικά μονοπάτια που διέπουν τη φωτοκυτταροτοξική δράση της υπερικίνης. Η αντικαρκινική δραστικότητα της υπερικίνης διεκπεραιώνεται μέσω πολλαπλών οδών. Η υπερικίνη φαίνεται να δεσμεύεται επιλεκτικά με την πρωτεΐνη κινάση C και άλλες κινάσες επηρεάζοντας την λειτουργία τους, αναστέλλοντας έτσι την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Επιπροσθέτως, οι in vitro αντικαρκινική δράση της υπερικίνης έγκειται σε αναστολή της μιτοχονδριακής λειτουργίας, αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, αναστολή της δραστικότητας της εξοκινάσης, οξείδωση των λιπιδίων, αμινοξέων και πρωτεϊνών, καθώς και δέσμευση ενός υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα και τη δραστικότητα των κινασών της τυροσίνης (Agonistis et al., 1995). Η φωτοευαισθητοποίηση της υπερικίνης έχει τεκμηριωθεί για διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές in vitro. Η φωτοκυτταροτοξική επίδραση της υπερικίνης σε ανθρώπινα λευχαιμικά κύτταρα HL60 μπορεί να ενισχυθεί in vitro όταν επωαστούν με ακεταζολαμίδη (Solar et al., 2002). Και η αναστολή της παραγωγής ιντερλευκίνης 12 ενδεχομένως οφείλεται στην δράση της υπερικίνης μέσω της μείωσης της ενεργοποίησης του NF-kB (Kang et al., 2001). Η φωτοτοξικότητα και η επαγωγή της απόπτωσης προκύπτουν με την έκθεση στην υπερικίνη, in vitro. H φωτοεπαγόμενη απόπτωση παρουσία υπερικίνης μπορεί να περιλαμβάνει τον παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF), την αναστολή της λειτουργίας του πρωτεασώματος (η οποία εμπλέκεται στην ενεργοποίηση των κασπασών) και την ενεργοποίηση των κασπασών, όπως η κασπάση-8 (Schempp et al 2001), (Ali et al.,2001), (Pajonk et al 2005). Σύμφωνα με τον Song και τους συνεργάτες του, η χορήγηση ραδιοσημασμένης υπερικίνης σε μυες που έφεραν υποδόρια όγκο ανθρώπινου μαστού BT474, έδειξε ιδιαίτερη χημική συγγένεια στα νεκρωτικά κύτταρα, η οποία μπορεί να συνδέεται με την κατάρρευση της κυτταρικής μεμβράνης και την έκθεση της φωσφατιδυλοσερίνης στο ραδιενεργό ιχνηθέτη, ο οποίος συνδέεται επιλεκτικά στα φωσφολιπίδια (Song et al., 2011). Η υπερικίνη μπορεί να έχει αντικαρκινική δράση, αναστέλλοντας την αύξηση του όγκου είτε σε καθαρή μορφή, είτε σε φυτικό εκχύλισμα υπερικού. Σε μύες που τους χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκώς μεθανολικό εκχύλισμα H. perforatum (0,3% περιεκτικότητα υπερικίνης), 10 μέρες πριν την εμφύτευση σε αυτούς ανθρώπινων αδενωκαρκινοματικών κύτταρων προστάτη PC-3, παρατηρήθηκε μείωση της αύξησης του

όγκου αλλά και των μεταστάσεων των περιφερειακών λεμφαδένων. Το εκχύλισμα σε μια συγκέντρωση 1,41 mg / mL, επίσης ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC3 in vitro (Martarelli et al., 2004). Το in vitro πείραμα έδειξε ότι η υπερικίνη μαζί με τα φλαβονοειδή και την υπερφορίνη, συστατικά εκχυλίσματος υπερικού, συμβάλλει στα αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα στις καρκινικές κυτταρικές σειρές Κ562 και U937 (Hostanska et al., 2003). Οι Sanovic και οι συνεργάτες της, σε in vivo μελέτη σε μυες BALB/c, οι οποίοι έπασχαν από καρκίνο του παχέος εντέρου CT26, χορήγησαν ενδοφλεβίως υπερικίνη και κατέγραψαν την ανάπτυξη του όγκου, ύστερα από την ακτινοβόληση των ζώων. Αυτό που παρατήρησαν ήταν πως η χαμηλή δόση της υπερικίνης (2.5 mg/kg) και ο ελάχιστος χρόνος της ακτινοβόλησης (0,5 h) οδήγησε σε πλήρη εξάλειψη του όγκου (Sanovic et al, 2011). Στον Πίνακα 8 παρουσιάζονται συνοπτικώς δοκιμές in vitro ελέγχου της κυτταροτοξικής δράσης της υπερικίνης στηριζόμενες στο φωτοδυναμικό φαινόμενο σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα κύτταρα επωάζονται πρώτα με την υπερικίνη, ακτινοβολούνται και τελικώς αξιολογελιται με τη δοκιμασία ΜΤΤ η κυτταρική βιωσιμότητα. Σε όλες τις έρευνες απαραίτητη προϋπόθεση ήταν η ακτινοβόληση τους, για την επαγωγή της κυτταροτοξικής δράσης της υπερικίνης. Πιο ενδιαφέρουσες ήταν οι in vitro δοκιμές που έδωσαν θετικά αποτελέσματα κατά του νεανικού ραβδομυοσαρκώματος, όπου παρατηρήθηκε σχεδόν ολοκληρωτική αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (*) και των παιδικών επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων ήπατος, όπου παρατηρηθήκαν σοβαρές αλλοιώσεις μετά την ακτινοβόληση (**).

Πίνακας 8. In vitro μελέτες με υπερικίνη και φωτοδυναμικό φαινόμενο σε καρκινικές κυτταρικές σειρές Καρκινικά κύτταρα Αναφορά ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιου λώρου και Stupakova et al, 2009 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα γλοιώματος U-87 MG & U-373 MG Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα ήπατος HepG2 Wang et al, 2008. Ηπατικά κύτταρα ηπατοβλαστώματος HUH6, & HepT1 cells Seitz et al, 2008 καρκινικά κύτταρα ήπατος HepG2 cells(**) Seitz et al, 2008 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα SpcA1 Wang et al, 2008 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα A549 Wang et al, 2007 MDA231 κύτταρα ανθρώπινου μαστικού καρκινώματος Wang et al., 2008 κύτταρα ανθρώπινου νεφρικού καρκινώματος Wessels et al, 2008 κύτταρα ραβδομυοσαρκώματος(*) και ινοβλάστες Seitz et al., 2007

Ένα άλλος τομέας που η υπερικίνη θεωρείται εξαιρετικά χρήσιμη για την φωτοδυναμικότητα της είναι η διάγνωση, μέσω της ανίχνευσης φθορισμού, στα πρώιμα στάδια του καρκίνου. Η πρώτη κλινική χρήση της φωτοενεργοποιημένης υπερικίνης για την φωτοδυναμική διάγνωση ήταν από τον D’Hallewin και τους συνεργάτες το 2000 για την ανίχνευση των αλλοιώσεων της ουροδόχου κύστης in situ. Από τότε χρησιμοποιείται στην φωτο-διάγνωση αρκετά και φαίνεται να είναι πολύ καλύτερο εργαλείο σε σχέση με άλλες διαγνωστικές μεθόδους για τον ίδιο σκοπό. Οι μελέτες της υπερικίνης έχουν εστιάσει κυρίως, στη διάγνωση του καρκίνου της ουροδόχου κύστεως, όπως αυτή του Kubin και των συνεργατών του το 2008, όμως και άλλες μορφές καρκίνου μελετώνται όπως ο στοματικός, στομαχικός και το γλοιώμα (Huang et al, 2012). O Malini και οι συνεργάτες του σε άρθρο ανάσκοπησης αναλύει την πρόσφατη εξέλιξη της χρήσης της υπερικίνης στην διάγνωση του καρκίνου με τις τρέχουσες οπτικές τεχνολογίες, και υπογραμμίζει την τάση στον τομέα της νανοτεχνολογίας, που ενισχύει σταδιακά την συνδυασμένη εφαρμογή της υπερικίνης στη θεραπευτική και στην απεικόνιση (Malini et al., 2012).

2.3.5.2 Αντικαταθλιπτική Δράση

Επί του παρόντος, από το σύνολο της επιστημονικής βιβλιογραφίας, είναι γενικώς αποδεκτό ότι τα σκευάσματα του υπερικού έχουν ένα καλό προφίλ αποτελεσματικότητας σε ασθενείς με ήπια έως μέτρια κατάθλιψη και υψηλή ανεκτικότητα. Για το λόγο αυτό τα δεδομένα της βιβλιογραφίας σχετικά με την αντικαταθλιπτική δραστικότητα των απομονωμένων ναφθοδιανθρονών είναι περιορισμένη. Αρχικές βιοχημικές μελέτες ανέφεραν ότι η υπερικίνη είναι αναστολέας της ΜΑΟ-Α και

ΜΑΟ-Β. Οι συγκεντρώσεις που έδιναν 50% αναστολή (IC50) σύμφωνα με τον Suzuki και τους συνεργάτες του ήταν 100 - έως 1000-φορές υψηλότερες από τις μέγιστες τιμές συγκεντρώσεων της υπερικίνης στο εκχύλισμα του υπερικού, μετά από χορήγηση των εκχυλισμάτων δια στόματος.

Η υπερικίνη μπορεί να συνδεθεί με τους υποδοχείς NMDA, GABA και 5-ΗΤ1 (Suzuki et al.,1984). Τα δύο υψηλότερα επίπεδα αναστολής (> 40%) παρατηρήθηκαν στους (μη επιλεκτική πρόσδεση) μουσκαρινικούς χολινεργικούς υποδοχείς (49%) και στους υποδοχείς σ (μη εκλεκτικοί) (περίπου 48%) (Denke et al.,1999). Απροσδόκητα, αύξηση της συγκέντρωσης 5-υδροξυτρυπταμίνης (5-ΗΤ) παρατηρήθηκε στον υποθάλαμο των επίμυων μετά τη χορήγηση καθαρής υπερικίνης για οκτώ εβδομάδες, αλλά όχι όταν χορηγήθηκε για δύο εβδομάδες. Σε αντίθεση, η συγκέντρωση της νορεπινεφρίνης μειώθηκε στον ιππόκαμπο μετά από δύο εβδομάδες ημερήσιας χορήγησης της υπερικίνης, ενώ τα επίπεδα νορεπινεφρίνης στον υποθάλαμο δεν επηρεάστηκαν καθόλου. Παρ 'όλα αυτά, η υπερικίνη έδειξε κάποια αποτελεσματικότητα στην εξέταση Porsolt, ένα ευαίσθητο ζωικό μοντέλο που μελετάται για την κατάθλιψη (Butterweck et al., 2002) Η υπερικίνη αναστέλλει το ένζυμο β-υδροξυλάση της ντοπαμίνης με IC50 3,8 μmol/L (Denke et al.,1999), ενώ η τυροσινάση και αποκαρβοξυλάση της τυροσίνης δεν επηρεάζονται σε συγκεντρώσεις υπερικίνης 1 έως 10 μΜ. Η ψευδοϋπερικίνη επίσης

αναστέλλει το ένζυμο β-υδροξυλάση της ντοπαμίνης (IC50 = 3 μΜ) (Denke et al.,1999). H υπερικίνη αύξησε τα επίπεδα της συγκέντρωσης σεροτονεργικής 5- υδροξυτρυπταμίνης (5-ΗΤ) στον υποθάλαμο μετά από θεραπεία 8 εβδομάδων και μείωσε τα επίπεδα της φλοιοεπινεφριδιοτρόπου ορμόνης και κορτικοστερόνης στο πλάσμα αρουραίων μετά από 14 ημέρες από του στόματος θεραπείας (Butterweck et al.,2001,2002). Επίσης, επηρέασε τη μεταγραφή των γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση του άξονα υποθαλάμου-υπόφυσης-επινεφριδίων. Τα επίπεδα του mRNA τόσο του παράγοντα έκλυσης κορτικοτροπίνης (CRF) όσο και του υποδοχέα σεροτονίνης 5-ΗΤ1Α μειώθηκαν στην παρακοιλιακό πυρήνα του υποθαλάμου και στον ιππόκαμπο, αντιστοίχως (Butterweck et al.,2001). Τα αποτελέσματα από τις in vitro μελέτες αν και ενθαρρυντικά για την δραστικότητα της υπερικίνης, δεν συνάδουν πάντα με τις in vivo, οι οποίες δίνουν αρκετά αντιφατικά αποτελέσματα. Μια πιθανή αιτία στην δυσκολία φαρμακολογικής αξιολόγησης της αντικαταθλιπτικής δράσης της υπερικίνης είναι η μικρή διαλυτότητα που παρουσιάζει στα υδατικά διαλύματα. Όταν οι ναφθοδιανθρόνες χορηγήθηκαν σε κλάσμα μαζί με προκυανιδίνες, αυξήθηκε η δραστικότητα του εκχυλίσματος στην δοκιμή εξαναγκασμένης κολύμβησης (Butterweck et al., 2003). Η εξήγηση στην αύξηση αυτή ίσως έγκειται στην συνεργιστική δράση των φλαβονοειδών με τις ναφθοδιανθρόνες, με τα πρώτα να αυξάνουν την διαλυτότητα των δεύτερων, αυξάνοντας έτσι τη βιοδιαθεσιμότητα τους.

2.3.5.3 Άλλες δράσεις

Οι ιδιότητες αυτές των ναφθοδιανθρονών έγειραν το ενδιαφέρον και για την πιθανή αντιική δράση τους, στοχεύοντας στην χρήση τους κατά του ιού HIV-1 (Meruelo et al. 1988). Τα αποτελέσματα δεν ήταν τα αναμενόμενα αφού οι ασθενείς στους οποίους χορηγήθηκε η υπερικίνη εμφάνισαν φωτοτοξικότητα (Kubin et al. 2008). Το ίδιο παρατηρήθηκε σε μια άλλη κλινική μελέτη στην οποία ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα C τους χορηγήθηκε υπερικίνη δια στόματος. Εν ολίγοις, η υπερικίνη σε όποια δόση των 0,05 και 0,10 mg/kg/ημέρα και αν χορηγήθηκε, προκάλεσε σημαντική φωτοτοξικότητα και δεν είχε ουδεμία ανιχνεύσιμη αντι-ιική (HCV) δραστικότητα (Jacobson et al, 2001). Η παραδοσιακή χρήση του υπερικού περιλαμβάνει τη θεραπεία βακτηριακών λοιμώξεων, ασθενειών του αναπνευστικού συστήματος, πληγών στο δέρμα, του πεπτικού έλκους και φλεγμονών. Πολλές αντιμικροβιακές δοκιμασίες έχουν πραγματοποιηθεί με εκχυλίσματα από διάφορα είδη του γένους Hypericum. Δυστυχώς, τα δεδομένα που αφορούν τη δραστικότητα των απομονωμένων συστατικών είναι λιγοστά και ακόμη περισσότερο, δεν υπάρχουν δεδομένα σχετικά με την επίδραση του φωτός ή οξυγόνου στην δραστικότητα της υπερικίνης ή της ψευδοϋπερικίνης. Πρόσφατα, εντούτοις, στη μελέτη του Nogueira και των συνεργατών του (2013), όπου εξέτασαν την αντιβακτηριακή δράση 15 ειδών Hypericum ενάντια σε 2 Gram αρνητικά και 2 Gram θετικά, αλλά και τη δράση της υπερικίνης και ψευδοϋπερικίνης, παρατήρησαν πως πέρα από τα αιθανολικά εκχυλίσματα, δράση εμφάνισαν και οι ναφθοδιανθρόνες ενάντια σε όλα τα εξεταζόμενα στελέχη, όπως το Staphylococcus aureus και Streptococcus faecium. Τέλος, ύστερα από in vitro πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε οφθαλμούς μυών με ρετινοπάθεια, αποδείχτηκε η ισχυρή ανασταλτική δράση της υπερικίνης στην ρετιονοϊκή αγγειογένεση, καταδεικνύοντας την εν δυνάμει οφθαλμολογική εφαρμογή της (Higuchi et al. 2008). Επίσης σε in vivo πειράματα σε επίμυες η υπερικίνη έδειξε ισχυρή ανασταλτική αντι-αγγειογενετική δράση (Lavie et al. 2005).

3. Κατάθλιψη και Αντικαταθλιπτική δράση Hypericum L.

3.1 Κατάθλιψη και άγχος

Στην καθημερινή ζωή με τον όρο κατάθλιψη εννοούμε μια κατάσταση θλίψης και μελαγχολίας, συνήθως παροδική, η οποία μάλλον πυροδοτείται από κάτι σχετικά ασήμαντο και επουσιώδες. Η κατάθλιψη, διαφέρει από την κλινική κατάθλιψη, η οποία χαρακτηρίζεται από συμπτώματα που διαρκούν πάνω από δύο εβδομάδες και είναι τόσο σοβαρά ώστε να επηρεάζουν την καθημερινότητα ενός ατόμου. Η κατάθλιψη έχει συσχετιστεί με ποικίλους αιτιολογικούς παράγοντες, εξωγενείς και ενδογενείς. Στους εξωγενείς παράγοντες περιλαμβάνονται δυσάρεστες εμπειρίες κατά τη διάρκεια της ζωής του ατόμου ή το χρόνιο στρες, ενώ στους ενδογενείς παράγοντες εντάσσονται ποικίλες γενετικές, ορμονικές και νευροχημικές διαταραχές. Όσον αφορά στους νευροχημικούς παράγοντες, η κατάθλιψη σχετίζεται με την ελάττωση των επιπέδων των κατεχολαμινών, όπως της επινεφρίνης και σεροτονίνης, στον εγκέφαλο (Παναγής Γ. 2002). Αρκετές περιοχές του εγκεφάλου που ρυθμίζουν το συναίσθημα (μεταιχμιακό σύστημα) διαταρράσονται στην κατάθλιψη (Berton & Nestler, 2006), (Εικόνα 20). Σε πολλές μεταθανάτιες απεικονιστικές μελέτες εγκεφάλων ατόμων που έπασχαν από κατάθλιψη, διαπιστώθηκε μείωση στον όγκο της φαιάς ουσίας και της νευρογλοίας στον προμετωπιαίο φλοιό και τον ιππόκαμπο, περιοχές που πιστεύεται ότι προκαλούν τις γνωστικές πτυχές της κατάθλιψης, όπως τα συναισθήματα αναξιότητας και ενοχής (Sheline, 2003), (Harrison, 2002). Σε πειράματα αξιολόγησης της λειτουργίας του εγκεφάλου, όπως η λειτουργική μαγνητική τομογραφία (fMRI) και η τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (PET), έδειξαν ότι η δραστηριότητα στην αμυγδαλή και στον φλοιό του προσαγώγιου (Cg25, μια υποπεριοχή του προμετωπιαίου φλοιού) σχετίζεται με συναισθήματα δυσφορίας. Συγκεκριμένα οι δείκτες της νευρωνικής δραστηριότητας στις περιοχές αυτές αυξήθηκαν κατά την παροδική θλίψη σε υγιείς εθελοντές, και χρονικά αυξήθηκε σε καταθλιπτικά άτομα, επιστρέφοντας σε φυσιολογικά επίπεδα ύστερα με την επιτυχή θεραπεία (Krishnan & Nestler, 2008). Ο επικλινής πυρήνας (NAc), μια υποπεριοχή του ραβδωτού σώματος είναι σημαντικός σε μεγάλο βαθμό για το αίσθημα της ικανοποίησης και για την έλλειψη σεξουαλικής διάθεσης στην κατάθλιψη. Τα δίκτυα αυτά του πρόσθιου εγκεφάλου διαμορφώνονται κυρίως από τις μονοαμινικές προβολές από τον μεσεγκέφαλο και τους πυρήνες του εγκεφαλικού στελέχους (ντοπαμίνη από την κοιλιακή περιοχή της καλύπτρας (VTA), σεροτονίνη από την ραχιαία ραφή που βρίσκεται στην γκρίζα ζώνη και νοραδρεναλίνη από τον υπομέλανα τόπο). Εκτός από τον έλεγχο της εγρήγορσης και της ευαισθητοποίησης, οι νευροδιαβιβαστές ρυθμίζουν την περιοχή των συναισθηματικών ερεθισμάτων. Οι μειώσεις του όγκου του στον ιπποκάμπου και άλλων περιοχών του πρόσθιου εγκεφάλου σε ασθενείς με κατάθλιψη, πιθανώς σχετίζονται με μείωση του νευροτροφικού παράγοντα (BDNF) με την εμφάνιση κατάθλιψης, ο οποίος αναπτυξιακά συμβάλλει στην πλαστικότητα του εγκεφάλου. Ο BDNF εκφράζεται σε αφθονία στις ενήλικες μεταιχμιακές δομές, όμως σε καταστάσεις στρες παρατηρείται μείωση του στον ιππόκαμπο. Κατά την χρόνια αγωγή με αντικαταθλιπτικά ωστόσο, παρατηρήθηκε αποκατάσταση των επιπέδων του BDNF. Παρόμοιες μεταβολές έχουν καταγραφεί σε μεταθανάτιες μελέτες του ιππόκαμπου ασθενών με κατάθλιψη (Krishnan & Nestler, 2008).

Εικόνα 18. Μηχανισμοί και διάφορες περιοχές του εγκεφάλου που εμπλέκονται στην παθοφυσιολογία της κατάθλιψης. (a) Η εν τω βάθει διέγερση του εγκεφάλου του προσαγωγίου φλοιού (Cg25) ή του επικλινή πυρήνα (NAc), έχει αντικαταθλιπτική δραση σε άτομα που δεν έχουν ανταποκριθεί στην φαρμακευτική θεραπευτική αγωγή. Αυτή η δράση πιστεύεται πως μεσολαβείται μέσω της αναστολής της δραστικότητας των περιοχών αυτών, είτε με αποπόλωση ή με διέγερση των διερχόμενων νευραξονικών ινών. (b) Αυξημένη απελευθέρωση του νευροτροφικού παράγοντα (BDNF) εντός του μεσομεταιχμιακού κυκλώματος της ντοπαμίνης (παραγωγή ντοπαμίνης από την κοιλιακή περιοχή της καλύπτρας (VTA) προς τον επικλινή πυρήνα NAc) προκαλεί την ευαισθητοποίηση στο κοινωνικό στρες, πιθανώς μέσω της ενεργοποίησης του παράγοντα μεταγραφής CREB με φωσφορυλίωση (Ρ). (c) Απεικονιστικές μελέτες αναφέρουν έντονα την αμυγδαλή (κόκκινα εικονοστοιχεία δείχνουν ενεργοποιημένες περιοχές) ως ένα σημαντικό κόμβο του μεταιχμιακού συστήματος για την επεξεργασία των βασικών συναισθηματικών ερεθισμάτων, όπως ο φόβος. (d) Το στρες μειώνει τις συγκεντρώσεις των νευροτροφινών (όπως ο BDNF), την έκταση της νευρογένεσης και την πολυπλοκότητα των νευρωνικών διεργασιών στον ιππόκαμπο (ΗΡ), επιδράσεις που προκαλούνται εν μέρει μέσω των αυξημένων συγκεντρώσεων της κορτιζόλης και της μειωμένης δραστικότητας του CREB. (e) Περιφερικά εκκρινόμενες μεταβολικές ορμόνες εκτός από την κορτιζόλη, όπως η γκρελίνη και η λεπτίνη, προάγουν μεταβολές της διάθεσης που σχετίζονται μέσω της επίδρασής των ορμονών αυτών στον υποθάλαμο (ΗΥΡ) και σε αρκετές μεταιχμιακές περιοχές (για παράδειγμα, τον ιππόκαμπο, VTA και NAc). DR, ραχιαία ραφή LC, υπομέλανος τόπος PFC, προμετωπιαίος φλοιός (Krishnan & Nestler, 2008)

Οι βιογενείς αμίνες θεωρούνται ένας άλλος αιτιολογικός παράγοντας εμφάνισης της κατάθλιψης, εξαιτίας της ανεπαρκούς διαβίβασης της ντοπαμίνης, της νορεπινεφρίνης και της σεροτονίνης, η οποία δυσχεραίνει την εγκεφαλική επικοινωνία. Οι φαρμακευτικές αγωγές στηρίζονται στην χρήση εκλεκτικών αναστολέων επαναπρόσληψης μονοαμινών, τρικυκλικών αντικαταθλιπτικών και αναστολέων της μονοαμινοξειδάσης (ΜΑΟ), που στόχο έχουν την ενίσχυση της ντοπαμινεργικής, νοραδρενεργικής, σεροτονεργικής και μονοαμινεργικής διαβίβασης αυξάνοντας την ποσότητα των νευροδιαβιβαστών στο χώρο ανάμεσα στα κύτταρα και επαναφέροντας την ισορροπία των νευροδιαβιβαστών στις εγκεφαλικές νευρικές συνάψεις (Εικόνα 21). Αυτό επιτυγχάνεται:  είτε αυξάνοντας την ποσότητα του νευροδιαβιβαστή που παράγεται  εμποδίζοντας την διάσπαση των νευροδιαβιβαστών  αναστέλλοντας την επαναρρόφηση (ή επαναπρόσληψη) των νευροδιαβιβαστών της σύναψης από τα νευρικά κύτταρα. Αυτές οι ενώσεις ωστόσο έχουν αρκετά μειονεκτήματα στη χρήση τους, όπως καθυστερημένη μείωση των καταθλιπτικών συμπτωμάτων, ανεπιθύμητες παρενέργειες και την μη απόκριση σε ορισμένους ασθενείς.

Εικόνα 19. Αναπαραγωγή από McKenzie (2008).

Όλοι οι άνθρωποι έχουν βιώσει άγχος: μια δυσάρεστη αίσθηση ανησυχίας, η οποία συνοδεύεται από ποικίλα σωματικά συμπτώματα όπως η εφίδρωση, η ζάλη, βάρος στο στήθος, αστάθεια, ναυτία, πόνους στο στομάχι, μυϊκούς πόνους. Το άγχος αποτελεί μια προειδοποίηση για τον οργανισμό για έναν επερχόμενο κίνδυνο και τον προετοιμάζει για τη σωστή αντιμετώπιση του (Καστελλάκης & Παναγής, 1997). Το φυσιολογικό άγχος, το «δημιουργικό», αποτελεί έναν προσαρμοστικό μηχανισμό. Το έντονο και παρατεταμένο άγχος, από την άλλη μεριά, κυριαρχεί στις εκδηλώσεις του ατόμου, διαταράσσοντας την ικανότητα του ατόμου να ανταποκρίνεται στις καθημερινές

δραστηριότητες, χωρίς όμως να επηρεάζει την προσωπικότητα του. Το παθολογικό άγχος εκφράζεται με συμπτώματα από την ψυχική και τη σωματική σφαίρα (Καστελλακης & Παναγής, 1997). Τα συμπτώματα του άγχους δίνονται στον Πίνακα 9.

Πίνακας 9. Συμπτώματα άγχους, ψυχολογικά και σωματικά Ψυχολογικά συμπτώματα Σωματικά συμπτώματα Ανησυχία Ταχυκαρδία αίσθημα παλμών Ανυπομονησία Εφιδρώσεις Εκνευρισμός Τρόμος (τρέμουλο) Ευερεθιστότητα Συσπάσεις των μυών Αγωνία Αίσθημα πνιγμού-κόμπου στο λαιμό Αίσθημα φόβου Βάρος στο στήθος Δυσχέρεια στην συγκεντρώση Ζάλη Διαταραχές της μνήμης Αστάθεια Διάσπαση της προσοχής Ναυτία Επιλεκτική προσοχή Μούδιασμα των άκρων Συχνουρία Πόνοι στο στομάχι Υπέρταση

Οι σωματικές εκδηλώσεις του άγχους (προκύπτουν από την αυξημένη δραστηριότητα του αυτόνομου νευρικού συστήματος) είναι θορυβώδεις τρομάζουν το άτομο που τις εκδηλώνει, διότι τις θεωρεί απειλητικές για τη ζωή του. Η ανησυχία αυτή του προκαλεί το αίσθημα του φόβου, ενισχύοντας έτσι τα συμπτώματα του άγχους και με αυτόν τον τρόπο οδηγείται σε επανατροφοδότηση του άγχους του. Ο φόβος υποχωρεί όταν η απειλή αποχωρήσει, ενώ το άγχος, επειδή η απειλή είναι ασαφής και άγνωστη, διαρκεί πολύ περισσότερο και έχει την τάση να γίνεται χρόνια κατάσταση. Ο φόβος συνιστά και αυτός μια προειδοποίηση, όμως προκαλεί την αντίδραση σε μια συγκεκριμένη απειλή, όταν εκδηλώνεται σε φυσιολογικά επίπεδα (όταν συνεχίζει να υπάρχει χωρίς την ύπαρξη κάποιας απειλής, πλέον μετατρέπεται σε φοβία). Ο φόβος είναι ένα βασικό συναίσθημα που προκαλείται από την συνειδητοποίηση ενός πραγματικού ή πλασματικού κινδύνου και είναι ένας μηχανισμός προστασίας (Καστελλάκης & Παναγής,1997). Η αντίδραση στα ερεθίσματα που μας οδηγούν στην ενεργοποίηση του φόβου είναι αυθόρμητη και όχι συνειδητή. Ο φόβος αποτελεί μια αντίδραση στιγμιαία που καταλήγει σε αντανακλαστική αντίδραση φυγής ή μάχης με στόχο την εξάλειψη της απειλής, όπως η μείωση της αίσθησης του πόνου διακόπτοντας μια πράξη (Blanchard . et al. 1993, Carlsson et. al. 2006). Το άγχος, ωστόσο προκύπτει και από ανύπαρκτες απειλές. Συμπεριφορικά το άγχος σχετίζεται με την αποφυγή. Η διάκριση μεταξύ άγχους και φόβου ενισχύεται από φυσιομετρικές αναλύσεις της αγχώδους συμπεριφοράς και εκδήλωσης συμπτωμάτων, τα οποία διακρίνουν το γενικό stress και την αγχώδη κατανόηση (anxiety) από αυτά της μάχης ή της φυγής (fear) (Brown et. al. 1998) που προκύπτουν από το αίσθημα του φόβου. Επίσης ηθολογικές μελέτες έχουν συνδέσει το φόβο με συμπεριφορές που σχετίζονται με άμεσο κίνδυνο και το άγχος ακραίες ή ισχυρές απειλές.

3.2 Κατάθλιψη και Γήρας

Η κατάθλιψη σε γηραιά άτομα είναι μια διαταραχή με ολοένα και μεγαλύτερη σημασία για τη δημόσια υγεία. Η συχνότητα της βαριάς κατάθλιψης ιδιαίτερα, εκτιμάται από 1% έως 10% σε άτομα ηλικίας 60 ετών και άνω, ενώ τα καταθλιπτικά συμπτώματα μπορεί να εμφανιστούν σε ποσοστά έως και 20%. Σημαντικά υψηλότερα ποσοστά είτε ήπιας είτε βαριάς κατάθλιψης εμφανίζονται σε ηλικιωμένα άτομα που βρίσκονται σε ιδρύματα. Η κατανόηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ της γνωστικής δυσλειτουργίας και της απορρύθμισης της διάθεσης στους ηλικιωμένους εστιάζεται στην επίδραση των αλλαγών στο 5-HT σεροτονεργικό σύστημα, όπου με την αύξηση της ηλικίας, αλλά και των ασθενειών που εμφανίζουν τα γηραιά άτομα, το επηρεάζουν (Meltzer et al., 1998). Σε μια μελέτη όπου χορηγήθηκε σε επίμυες, νεαρούς και γηραιούς, ενδοπεριτοναϊκά ο LPS (λιποπολυσακχαρίτης- ένωση που βρίσκεται στην κυτταρική μεμβράνη των Gram αρνητικών βακτηρίων, δρά ως ενδοτοξίνη, ενεργοποιώντας το ανοσοποιητικό σύστημα και προκαλεί την ανοσοαπόκριση του οργανισμού στα ζώα,) σε ποσότητα 0,33mg/Kg σωματικού βάρους 24 και 72 ώρες πριν την δοκιμασία εξαναγκασμένης κολύμβησης (μελετάται η κατάθλιψη), τα πειραματόζωα εμφάνισαν αύξηση του χρόνου ακινησίας (Godbout et al., 2008). Αξιοσημείωτο ήταν πως 72 ώρες μετά την χορήγηση του LPS αυξημένο χρόνο ακινησίας παρουσίασαν μόνο το γηραιά άτομα, ενώ τα νεαρά είχαν αποκαταστήσει την κινητικότητα τους. Την ίδια στιγμή στα γηραιά άτομα παρατηρήθηκε αύξηση των 5-ΗΤ υποδοχέων, αντισταθμιστικά στην μείωση της σεροτονίνης, που παρατηρείται στην κατάθλιψη. Η απόδειξη για την σεροτονεργική δυσλειτουργία στην κατάθλιψη, βασίζεται στην μεταθανάτια εξέταση της συγκέντωσης της σεροτονίνης και των υποδοχέων της σε εγκεφαλικών ιστών, την νευροενδοκρινική απόκριση, αλλά και την παρατήρηση ότι ο κύριος τρόπος δράσης των αντικαταθλιπτικών έγκειται στην μεταβολή της 5-ΗΤ σεροτονεργικής νευροδιαβίβασης (Meltzer et al., 1998). Σε αρκετές μεταθανάτιες μελέτες (σε ανθρώπινους εγκεφάλους) έχει παρατηρηθεί

μείωση του αριθμού των 5-ΗΤ1Α, 5-ΗΤ1Β / D υποδοχέων στον φλοιό και των θέσεων δέσμευσης στους 5-ΗΤ2Α υποδοχείς, στον μετωπιαίο λοβό, τον ινιακό λοβό και τον ιππόκαμπο, λόγω της μείωσης της σεροτονίνης με την αύξηση της ηλικίας. Η συσχέτιση της

μείωσης της δέσμευσης στους 5-ΗΤ2Α υποδοχείς στον φλοιό, με την ηλικία, υποστηρίζεται και σε ζώντες υγιείς εθελοντές ύστερα από απεικόνιση ΡΕΤ (μαγνητικής τομογραφίας) με [11C]-Ν methylspiperone, έναν ραδιενεργό προσδέτη με χημική συγγένεια για τους 5-ΗΤ2Α και D2 υποδοχείς (Arranz et al., 1993), (Cheetham et al., 1988), (Gross-Isseroff et al., 1990), (Marcusson et al., 1984), (Shih & Young 1978, (Sparks, 1989), (Iyo & Yamasaki, 1993). Η συσχέτιση των δομικών αλλαγών στον εγκέφαλο, όπως η ατροφία του φλοιού και οι βλάβες στη λευκή ουσία, και στα εγκεφαλικά αγγεία, στην τρίτη ηλικία με την καθυστερημένη εμφάνιση της κατάθλιψης, υποδεικνύει μια αλληλεπίδραση μεταξύ της γήρανσης και των βιολογικών παραγόντων που συμβάλλουν στην εκδήλωση της στα ηλικιωμένα άτομα (Alexopoulos et al., 1992), (Baldwin & Tomenson, 1995), (Figiel et al., 1991). Επίσης, τόσο η γήρανση όσο και οι μετεμμηνοπαυσιακές μειώσεις στα επίπεδα των οιστρογόνων μπορεί να συμβάλουν στην μεταβολή της 5-ΗΤ νευροδιαβίβασης και της συγκέντρωσης των 5-ΗΤ1Α και 5-ΗΤ2Α υποδοχέων στα θηλυκά άτομα (Biver et al., 1996), (Frankfurt et al., 1994), (Gonzales & Carillo, 1993), (Zhang et al., 1994). Η μείωση της λειτουργίας της 5-ΗΤ νευδοδιαβίβασης με τη γήρανση είναι σύμφωνη με τις παρατηρούμενες αλλαγές στην συμπεριφορά, με την αύξηση της ηλικίας, όπως ο ύπνος, που συνδέεται με την σεροτονεργική λειτουργία (DeKosky & Palmer 1994), (Myers a& Badia, 1995), (Sharpley et al., 1994). Η Walf και οι συνεργάτες της χορήγησαν υποδόρια

οιστραδιόλη Ε2 (500mg/Kg)σε 24 μηνών επίμυες μία ώρα πριν από τις δοκιμασίες ανοικτού

πεδίου (δοκιμασία ελέγχου άγχους) και εξαναγκασμένης κολύμβησης. Τα πειραματόζωα που έλαβαν το οιστρογόνο εμφάνισαν και αγχολυτική αλλά και αντικαταθλιπτική δράση, αυξάνοντας τον αριθμό εισόδων στο κέντρο της συσκευής ανοικτού πεδίου και μειώνοντας τον χρόνο ακινησίας, αντίστοιχα (Walf et al., 2010). Το ίδιο παρατηρείται και για τα αρσενικά με την μείωση των ανδρογόνων, όπως η τεστοστερόνη. Ο Frye οι συνεργάτες του (2008) μελέτησαν την απόκριση γηραιών επίμυων στη χορήγηση ανδρογόνων, ελέγχοντας την αγχολυτική και αντικαταθλιπτική δράση τους. α Τα ζώα ήταν 24 μηνών και τους χορηγήθηκαν τεστοστερόνη, 3 -διόλη και Ε2 οιστρογόνο (ανδρογόνα) σε δόσεις 1mg/Kg σωματικού βάρους 1 ώρα πριν από κάθε δοκιμασία. Όλα τα ανδρογόνα συνέβαλλαν στην αύξηση του αριθμού εισόδων στο κέντρο της συσκευής ανοικτού πεδίου, άλλα επίσης μείωσαν τον χρόνο ακινησίας στην εξαναγκασμένη κολύμβηση, σε σχέση με τους μάρτυρες.

3.3 Διαφορές στα αρσενικά και θηλυκά

Η ανάπτυξη των σεξουαλικών διμορφισμών στη συμπεριφορά και τη γνωστική λειτουργία και τις διαφοροποιήσεις σε περιοχές του εγκεφάλου στα σπονδυλωτά, εξαρτάται κυρίως από την επιγενετική δράση των ορμονών των γονάδων, ανδρογόνα και οιστρογόνα. Για τη σεξουαλική διαφοροποίηση των ανώτερων σπονδυλωτών, τα θηλαστικά και τα πουλιά, το φύλο καθορίζει γονίδια που ελέγχουν την ανάπτυξη των γονάδων. Ο καθορισμός του φύλου και η διαμόρφωση των γονάδων οδηγούν στη συνέχεια στην απελευθέρωση στεροειδών ορμονών από τις γονάδες, τα ανδρογόνα (αρσενικά) και τα οιστρογόνα (θηλυκά). Η δράση των ανδρογόνων και των οιστρογόνων καθορίζει στη συνέχεια την αρσενική ή θηλυκή-τυπική ανάπτυξη του εγκεφάλου, η οποία αρχικά είναι μονομορφική μεταξύ των φύλων (McEwen, 1981), (Arnold & Breedlove, 1985). Τα στεροειδή ασκούν ισχυρές επιδράσεις στο νευρικό σύστημα κατά τη διάρκεια κρίσιμων αναπτυξιακών περιόδων αλλά και στην ενήλικη ζωή με την οργάνωση και αναδιοργάνωση του νευρωνικού κυκλώματος, εμπλεκόμενα στις νευροενδοκρινικές λειτουργίες και την εκδήλωση διαφόρων συμπεριφορών. Οι φυλετικές διαφορές ή οι ορμόνες των γονάδων φαίνεται πως επηρεάζουν διάφορα ανατομικά ή λειτουργικά χαρακτηριστικά των διαφόρων νευροδιαβιβαστών και των νευροτροποποιητικών συστημάτων, συμπεριλαμβανομένων των GABA / βενζοδιαζεπίνης (Meng & Drugan, 1993), ντοπαμίνης, νοραδρεναλίνης, ακετυλοχολίνης και των (5-ΗΤ) συστημάτων της σεροτονίνης (Morissette & Di Paolo, 1993), (Liaw et al., 1992), (Biegon & McEwen, 1982), (Overstreet, 1979). Οι εν λόγω διαφορές έχουν αναφερθεί και για τα τρωκτικά και για τους ανθρώπους. Οι φυλετικές διαφορές στον εγκέφαλο φαίνεται να εξηγούν τις διαφορές στην συμπεριφορά αλλά και στις διάφορες εγκεφαλικές λειτουργίες. Για παράδειγμα, οι διαφορές μεταξύ των φύλων όσον αφορά τις συγκεντρώσεις των υποδοχέων ντοπαμίνης στον ραχιαίο ακουστικό πυρήνα (D1) και στο ραβδωτό σώμα (D2), φαίνεται να σχετίζεται με την αυξημένη αναζήτηση νέων ερεθισμάτων και κατάχρηση ουσιών, όπως και την υψηλή συχνότητα εμφάνισης ελλειμματικής προσοχής/υπερκινητικότητας-ΔΕΠ (Attention-Deficit Hyperactivity Disorder - ADHD) στους άνδρες (Andersen & Teicher, 2000). Ενώ ορισμένες από αυτές τις διαφορές των δύο φύλων αντανακλούν επιδράσεις της οιστραδιόλης και της τεστοστερόνης στο αίμα ενήλικων αρσενικών και θηλυκών, πολλές επίσης οφείλονται σε διαφορές στις λειτουργίες του εγκεφάλου που οργανώθηκαν στα πρώιμα στάδια ανάπτυξης με τις διαφορικές ενέργειες των φυλετικών στεροειδών (Perrot- Sinal et al. 2000). Στα τρωκτικά, όπως και σε άλλα θηλαστικά, οι περισσότερες μη αναπαραγωγικές συμπεριφορές που έχουν περιγραφεί για να δείξει διαφορές στα δύο φύλα, εμφάνιζουν διαφοροποιήσεις σε μεγάλο βαθμό (Goy & McEwen, 1980).

Όσον αφορά την εκδήλωση της κατάθλιψης ανάμεσα στα δύο φύλα, είναι γεγονός πως η ηλικία που εμφανίζεται διαφέρει ανάμεσα σε θηλυκά και αρσενικά άτομα. Η αιτία την διαφοροποίηση αυτή ίσως έγκειται και στον τρόπο που μειώνονται αντίστοιχα τα οιστρογόνα και τα ανδρογόνα μεγαλώνοντας. Η μείωση της τεστοστερόνης στους άνδρες είναι πιο βαθμιαία από ό, τι είναι η παύση της λειτουργίας των ωοθηκών στις γυναίκες και κατ’ επέκταση η παύση της έκκρισης των οιστρογόνων(προεμμηνοπαυσιακό και εμμηνοπαυσιακό στάδιο). Τα επίπεδα ενδογενών ανδρογόνων, μειώνονται σιγά-σιγά, δεκαετία-με-δεκαετία στους υγιείς άνδρες. Συγκεκριμένα μέχρι την ηλικία των 70 τα επίπεδα της τεστοστερόνης είναι περίπου 40% χαμηλότερο από αυτό στα είκοσι τους, ενώ στις γυναίκες η εμμηνόπαυση (μόνιμη διακοπή οιστρογόνων) εμφανίζεται κατά μέσο όρο στα 46 έτη (Janowsky, 2006).

3.4 Αντικαταθλιπτική δράση Hypericum.

Η αντικαταθλιπτική δράση των φυτών του γένους Hypericum προκύπτει μέσω της αναστολής της επαναπρόσληψης σεροτονίνης, ντοπαμίνης, αδρεναλίνης, στο σεροτονεργικό, ντοπαμινεργικό, νοραδρενεργικό σύστημα αλλά και των νευροδιαβιβαστών γ-αμινοβουτυρικό οξύ GABA και γλουταμινικό οξύ. Σε in vitro μελέτες έχει φανεί πως υπεύθυνο μόριο κατά κύριο λόγο για την αναστολή αυτή είναι η υπερφορίνη και το ανάλογο της, αντι-υπερφορίνη (Muller, 2003) (Mennini & Gobbi, 2004). Η κινητήρια δύναμη επαναπρόσληψης των νευροδιαδιβαστών στις νευρικές συνάψεις είναι η διαβάθμιση ιόντων Na+ μεταξύ εξωκυττάριου και ενδοκυττάριου χώρου, με την συγκέντωση των ιόντων Na + να είναι υψηλότερη στον εξωκυττάριο χώρο. Λόγω αυτής της κλίσης που δημιουργείται, οι νευροδιαβιβαστές περνούν στο εσωτερικό του νευρικού κυττάρου, συνδεδεμένοι με τα ιόντα αυτά. Η υπερφορίνη, μειώνει την κλίση αυτή δρώντας στις αντλίες Να+, αυξάνοντας το ενδοκυτταρικό νάτριο, αναστέλλοντας έτσι την επαναπρόσληψη των νευροδιαβιβαστών από τα νευρικά κύτταρα (Singer et al., 1999). Ένας άλλος μηχανισμός αντικαταθλιπτικής δράσης έγκειται στην αναστολή της μονοαμινο-οξειδασης(ΜΑΟ), ένζυμο που καταβολίζει τις αμίνες-νευροδιαβιβαστές μέσα στους νευρώνες μέσω των φλαβονοειδών που εμπεριέχονται στα φυτικά εκχυλίσματα του υπερικού H αναστολή της ΜΑΟ in vitro καταδείχθηκε για την κερσετίνη, κεμπφερόλη και την λουτεολίνη(Sparenberg et al.,2993) . Ωστόσο, η συγκέντρωση των φλαβονοειδών αυτών, που εμφάνισαν την αναστολή της ΜΑΟ, είναι πολύ χαμηλή στο H. perforatum για να είναι υπεύθυνη για τη θεραπευτική δράση του εκχυλίσματος υπερικού (Jurgenliemk et al., 2002). Από την άλλη μεριά μικρομοριακές συγκεντρώσεις υπερικίνης ανέστειλλαν αμετάκλητα την δραστικότητα των ΜΑΟ-Α και ΜΑΟ-Β in vitro( Suzuki et al.,1984). Ωστόσο, το δείγμα της υπερικίνης αργότερα αποδείκτηκε πως περιείχε τουλάχιστον 20% των άλλων συστατικών του εκχυλίσματος, μεταξύ αυτών και φλαβονοειδή. Η αδυναμία δράσης των μεμονωμένων συστατικών σε σχέση με την δράση τους ολικού εκχυλίσματος υπερικού καταδεικνύει την συνεργιστική δράση των συστατικών (Butterweck et al.,2007). Σε in vivo μελέτες σε επίμυες εξετάσθηκε κλάσμα εκχυλίσματος με υψηλή ποσότητα φλαβονοειδών, δείχνοντας μείωση του χρόνου ακινησίας στο τεστ εξαναγκασμένης κολύμβησης (Butterweck et al.,2000). Εξίσου αυξημένη δράση έδειξαν εκχυλίσματα (έως 500mg/kg) από τα οποία είχαν απομακρύνει την υπερφορίνη και την υπερικίνη η ίδια ομάδα το 2003, επιβεβαιώνοντας την υπόθεση τους πως το ολικό εκχύλισμα υπερικού φέρει ποικίλες ενώσεις με αντικαταθλιπτική δράση (Butterweck et al.,2003). Η δραστικότητα μάλιστα του εκχυλίσματος ήταν αντίστοιχο της ιμιπραμίνης (τρικυκλικό αντικαταθλιπτικό). Όσον αφορά την αγχολυτική δράση του υπερικού διάφορες μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί με ιδιαίτερα ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Σύμφωνα με τους και τους συνεργάτες του, το εκχύλισμα του H. perforatum αυξάνει την κινητική δραστηριότητα στο

ανοιχτό πεδίο και ενισχύει αγχολυτική δράση (Vandenbogaerde et al. 1999). Σε μια άλλη μελέτη των Flausino και των συνεργατών του, το σκεύασμα υπερικού HP LI 160 φέρεται να είχε αγχολυτική δράση, σε μια ομάδα συμπεριφορών που αφορούσαν το γενικευμένο άγχος(δόσεις 250mg/mL αλλά και 500mg/kg). Πολλές κλινικές μελέτες έχουν γίνει για τον έλεγχο της δραστικότητας των εκχυλισμάτων υπερικού σε σχέση με τα χορηγούμενα συνθετικά αντικαταθλιπτικά φάρμακα. Πρόσφατες κλινικές μελέτες έδειξαν πως τα σκευάσματα υπερικού όχι μόνο είναι αποτελέσματικά και καλά ανεκτά, από τους ασθενείς που τα έλαβαν, για την θεραπεία των ήπιων έως μέτριων καταθλιπτικών επεισοδίων αλλά και για τη βραχυχρόνια θεραπεία των συμπτωμάτων των ήπιων καταθλιπτικών διαταραχών (Chen et al, 2011, Kasper et al, 2010). Τέλος ο Singer και οι συνεργάτες του ανέλυσαν ξανά και τα δεδομένα που είχαν λάβει από το σύνολο των 154 ασθενών σε μια κλινική μελέτη (τυχαιοποιημένη, πολυκεντρική, διπλά-τυφλή, ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο), χρονικής διάρκειας 6 εβδομάδων για την θεραπεία ενός επεισοδίου μέτριας κατάθλιψης, είτε με σιταλοπράμη (citalopram-20mg) ή εκχύλισμα υπερικού (Hypericum extractSTW3-VI 900mg). Αυτό που εξέτασαν ήταν η ανταπόκριση στη αγωγή και η πιθανή υποτροπή των ασθενών (Singer et al., 2011). Συνολικά, 30 (19,5%) από τους 154 ασθενείς που ανταποκρίθηκαν είχαν διαγνωστεί στην πορεία με κάποια υποτροπή. Οι αριθμοί των ασθενών που υποτροπίασαν ήταν υψηλότερα στην ομάδα που έλαβε σιταλοπράμη(citalopram) (14 από 54 συνολικά ασθενείς), ενώ οι ασθενείς που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με εκχύλισμα υπερικού (Hypericum STW 3-VI) παρουσίασε το χαμηλότερο ποσοστό υποτροπής (8 από τους 54 συνολικά ασθενείς). Ασθενείς από την ομάδα που έλαβε το εικονικά φάρμακο παρουσίασαν ποσοστό υποτροπής 8 στους 46. Δεν καταγράφηκε διαφορά στη σοβαρότητα της υποτροπής θα που θα μπορούσε να παρατηρηθεί. Η διάρκεια της ανταπόκρισης ήταν μεγαλύτερη για την ομάδα του υπερικού (1817 ημέρες), ενδιάμεση για την ομάδα της σιταλοπράμης (1755 ημέρες) και μιρότερη για την ομάδα του εικονικού φαρμάκου (802 ημέρες). Όπως φαίνεται, το εκχύλισμα υπερικού (Hypericum STW 3-VI) αποδείκτηκε πιο αποτελεσματικό στη μείωση των υποτροπής και της επανεμφάνισης των καταθλιπτικών επεισοδίων, σε σέση με το εικονικό φάρμακο και τη σιταλοπράμη. Επιπλέον, η διάρκεια της ανταπόκρισης αυξήθηκε στην ομάδα που υποβλήθηκε σε αγωγή με εκχύλισμα υπερικού (Singer et al.,2011).

Σκοπός εργασίας

4. Σκοπός

Η κατάθλιψη είναι μια πολυπαραγοντική νόσος που έχει συσχετιστεί με ποικίλους παράγοντες όπως το χρόνιο στρες και την μείωση των επιπέδων των κατεχολαμινών στον εγκέφαλο. Η φαρμακευτική αγωγή κατά της κατάθλιψης στηρίζεται στη χρήση εκλεκτικών αναστολέων επαναπρόσληψης μονοαμινών, τρικυκλικών αντικαταθλιπτικών και αναστολέων της μονοαμινοξειδάσης (ΜΑΟ), που στόχο έχουν την ενίσχυση της ντοπαμινεργικής, νοραδρενεργικής, σεροτονεργικής και μονοαμινεργικής διαβίβασης. Η κατάθλιψη εμφανίζεται σε μεγάλο ποσοστό με την αύξηση της ηλικίας και ιδιαίτερα σε γηραιά άτομα. Η συσχέτιση των δομικών αλλαγών στον εγκέφαλο στην τρίτη ηλικία με την καθυστερημένη εμφάνιση της κατάθλιψης, υποδεικνύει μια αλληλεπίδραση μεταξύ της γήρανσης και των βιολογικών παραγόντων που συμβάλλουν στην εκδήλωσή της. Διαφοροποιήσεις όσον αφορά τη εκδήλωση της νόσου, ωστόσο, παρατηρούνται και ανάμεσα στα δύο φύλα. Είναι γεγονός πως η ηλικία εκδήλωσης της κατάθλιψης διαφέρει ανάμεσα σε θηλυκά και αρσενικά άτομα. Η αιτία για τη διαφοροποίηση αυτή ίσως έγκειται και στον τρόπο που μειώνονται αντίστοιχα τα οιστρογόνα και τα ανδρογόνα μεγαλώνοντας. Τα αλκοολικά εκχυλίσματα υπερικού (Hypericum. perforatum) χρησιμοποιούνται ως αντικαταθλιπτικά εδώ και αιώνες, ενώ σύγχρονες έρευνες in vitro, in vivo και σε ανθρώπους επιβεβαιώνουν την αποτελεσματικότητά του ως αντικαταθλιπτικό και αγχολυτικό (Vandebogaerde et al.,1999, Flausino et al.,2002). Ο μηχανισμός δράσης διερευνάται ακόμα, και δεν έχει αναδειχθεί ένα συστατικό το οποίο είναι αποκλειστικά υπεύθυνο για τη δράση. Η δράση του εκχυλίσματος αποδίδεται σε συνεργειακή και πλειοτρόπο δράση όλων των φυτοχημικών συστατικών του (φλαβονοειδών, φλωρογλουκινολών και των ναφθοδιαθρονών), παρά σε μεμονωμένες ενώσεις. Το γένος Hypericum L. περιλαμβάνει πάνω από 450 taxa παγκοσμίως, ενώ στην Ελλάδα έχουν καταγραφεί 50 taxa (35 είδη και 15 υποείδη). Το H. perforatum αποτελεί το γνωστότερο είδος από το οποίο παράγονται τα φυτικά φάρμακα που είναι εμπορικά διαθέσιμα για την ήπια προς μέτρια κατάθλιψη. Η χημική σύσταση των εκχυλισμάτων του υπερικού έχει αποτελέσει αντικείμενο μεγάλου ενδιαφέροντος, αφού φέρει ενώσεις με περιορισμένη κατανομή, όπως οι φλωρογλουκινόλες και οι ναφθοδιανθρόνες. Το Hypericum vesiculosum ανήκει στο ίδιο γένος με το H. perforatum, ωστόσο δεν έχει μελετηθεί ως προς την φυτοχημική του σύσταση. Σε αντίθεση με το H. perforatum που έχει ευρεία εξάπλωση, χαρακτηρίζεται υπενδημικό αυτοφυές φυτό και εξαπλώνεται στην βόρεια και ανατολική Ελλάδα, στην βόρεια και κεντρική Ελλάδα και στην Πελοπόννησο. Ανήκει στην ομάδα (section) Drosocarpium, ενώ το H. perforatum στην ομάδα (section) Hypericum. Το φυτό που μελετήθηκε στην παρούσα εργασία συλλέχθηκε στην Πελοπόννησο από την περιοχή της λίμνης Στυμφαλίας, του νομού Κορινθίας. Σκοπός της εργασίας αυτής ήταν η συμβολή στη φαρμακογνωστική μελέτη του H. vesiculosum σε δύο μέρη. Το πρώτο μέρος αφορούσε τη φυτοχημική ανάλυση του φυτού. Στο πλαίσιο αυτό πραγματοποιήθηκε σύγκριση των μεθανολικών εκχυλισμάτων των H. vesiculosum και H. perforatum με τη χρήση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (High Perormance Liquid Chromatography – Diode Array, HPLC – DAD), σε στήλη αντίστροφης φάσης Luna C-18. Η χρωματογραφική μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε είχε αναπτυχθεί στο εργαστήριο μας, και στόχο είχε τη διερεύνηση της φυτοχημικής σύστασης του H. perforatum. Ήταν ιδιαίτερα αποτελεσματική αφού κάλυπτε όλο το εύρος πολικότητας των συστατικών του φυτού και με αυτόν τον τρόπο ήταν δυνατή η σύγκριση των μεθανολικών εκχυλισμάτων των δύο taxa. Επίσης έγινε ποσοτικοποίηση των ενώσεων χλωρογενικού οξέος, ρουτίνης, υπεροζίτη, ισοκερσιτρίνης, κερσιτρίνης, κερσετίνης, Ι3-ΙΙ8 αμεντοφλαβόνης, υπερικίνης και ψευδοϋπερικίνης. Με σκοπό την απομόνωση των ναφθοδιανθρονών πραγματοποιήθηκαν κλασματώσεις στο ξηρό μεθανολικό εκχύλισμα του H. vesiculosum με εξάνιο και οξικό αιθυλεστέρα. Στην

συνέχεια στο κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα έγιναν περαιτέρω διαδοχικές κλασματώσεις με κλασική υγρή χρωματογραφίας στήλης, σε στήλες silica 60A και Sephadex LH-20, ενώ ο καθαρισμός των ναφθοδιανθρόνων έγινε σε ημιπαρασκευαστικό HPLC αντίστροφης φάσης. H silica gel 60A αποτελεί ένα από τα πλέον χρησιμοποιούμενα υλικά πλήρωσης στην υγρή χρωματογραφία. Το μέγεθος των σωματιδίων (στην προκειμένη περίπτωση 43-60mesh) επιτρέπει το διαχωρισμό μιγμάτων ενώσεων μεγάλου εύρους ως προς την πολικότητα τους. Η Sephadex LH-20 είναι ένα υδροξυπροπυλιωμένο πολυμερές δεξτράνης και έχει διπλό χρωματογραφικό χαρακτήρα, τόσο υδρόφιλο, όσο και λιπόφιλο. Ο διαχωρισμός βασίζεται στο μοριακό βάρος των ενώσεων του δείγματος, κατά κύριο λόγο, αλλά και στην πολικότητα τους. Η περαιτέρω ταυτοποίηση τους πραγματοποιήθηκε με φασματομετρία μάζας (Mass Spectrometry, MS) με αρνητικό ιονισμό από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό (ESI). Στο δεύτερο μέρος της παρούσας εργασίας εξετάσθηκε η αγχολυτική δράση του μεθανολικού εκχυλίσματος από το H. vesiculosum σε γηραιoύς αρσενικούς και θηλυκούς μύες (Balb-c /βάρους 25-35 g), ηλικίας 12 μηνών, με τη δοκιμή του ανοικτού πεδίου (Open Field Test). Η δοκιμή ανοικτού πεδίου αποτελεί μια καθιερωμένη δοκιμασία για τον έλεγχο της αγχολυτικής δράσης. Σύμφωνα με τα βιβλιογραφικά δεδομένα, σε μελέτες όπου η χορήγηση γινόταν βραχυχρόνια, η δοσολογία χορήγησης ήταν, ως επί των πλείστων, 500mg/Kg ή 250mg/Kg σωματικού βάρους. Η χορήγηση του εκχυλίσματος, στην παρούσα μελέτη, επιλέχθηκε να γίνει βραχυπρόθεσμα, 24 ώρες και 1 ώρα πριν από τη δοκιμασία, ενδοπεριτοναϊκά, σε ποσότητα 250 mg/Kg σωματικού βάρους. Η παράμετρος που εξετάστηκε ήταν ο θιγμοτακτισμός που παρουσίασαν τα πειραματόζωα. Ο θιγμοτακτισμός, έγκειται στον χρόνο παραμονής κοντά στα τοιχώματα της συσκευής και αποτελεί ένδειξη αγχογενούς συμπεριφοράς.

Πειραματικό μέρος

5. Πειραματικό μέρος

5.1. Υλικά, αντιδραστήρια και όργανα

5.1.1 Φυτικό υλικό

Το δείγματα του Hypericum vesiculosum συλλέχθηκαν το Μάιο του 2009 και τον Ιούνιο του 2013 στην περιοχή Στυμφαλία του νομού Κορινθίας (βορειοανατολική Πελοπόννησος- Εικόνα 20) από τον καθηγητή Γρηγόριο Ιατρού (τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών) και την ερευνητική του ομάδα. Οι φυτικοί ιστοί ταυτοποιήθηκαν, ενώ δείγματα κατατέθηκαν στο Βοτανικό Μουσείου του Τμήματος Βιολογίας. Το φυτικό υλικό Εικόνα 20. Περιοχή συλλογής αποξηράθηκε γρήγορα σε θερμοκρασία δωματίου με πολύ H.vesiculosum χαμηλή σχετική υγρασία.

5.1.2. Διαλύτες, αντιδραστήρια, στήλες

 Μεθανόλη (CH3OH), πυριδίνη (C5H5N), οξικό οξύ (CH3COOH), φωσφορικό οξύ (H3PO4) – καθαρότητας αναλυτικού βαθμού, προμηθεύτηκαν από την εταιρεία Merck (Γερμανία)  Μεθανόλη (βαθμού καθαρότητας κατάλληλου για HPLC ανάλυση)

από την Chem Lab (Βέλγιο), ακετονιτρίλιο (CH3CN) (βαθμού καθαρότητας κατάλληλου για HPLC ανάλυση) από την Honeywell (Γερμανία) και αιθανόλη

(CH3CH2OH) (βαθμού καθαρότητας κατάλληλου για HPLC ανάλυση) από την Fisher scientific (Ηνωμένο Βασίλειο).  Υπερκάθαρο νερό (αγωγιμότητα <18 ΜΩ) από την συσκευή παραγωγής υπερκάθαρου νερού LABCONCO (USA)  Οξικό αμμώνιο (CH3COONH4) από την εταιρεία Merck (Γερμανία)  Τολουόλιο - καθαρότητας αναλυτικού βαθμού, από την εταιρεία Merck (Γερμανία)  Εξάνιο, διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) – καθαρότητας αναλυτικού βαθμού, από την εταιρεία Carlo Erba Reagenti (Rodano)  Υπερικίνη (Cat. No. 10092215, LOT: 10092215), (95% καθαρότητα) από την Extrasynthese (Genay, Cedex, Γαλλία)  Sephadex LH-20 (Cat. No. ) από την εταιρεία GE healthcare Biosciences AB (Uppsala, Σουηδία)  Silica 60A C.C 40-63 mesh (Cat. No. ) από την Carlo Erba reactifs/SDS (Cedex, Γαλλία)  Στήλη HPLC Luna C18 RP (αντίστροφης φάσης 250mm x 4.6 mm I.D, 5μm, Phenomenex, USA) (Cat. Νο)  Στήλη HPLC SP-120-5-ODS-RPS (αντίστροφης φάσης, διαστάσεις 4.6mmL. D. x 150mm, DAISOPAK) (Cat. Νο 022802921)  Στήλη semi-prep HPLC XBridge C18 (5μm, 10x150mm, Waters) (Cat. No. 186002974)

5.1.3 Οργανολογία  Συσκευή συμπύκνωσης υπό κενό (rotavapor R-200) με θερμαντικό λουτρό Β-490 της εταιρείας Buchi (USA).  Συσκευή λυοφιλοποίησης (Freeze dry system, Freezone 6, Labconco Corp., Kansas, Missouri, Η.Π.Α)  Σύστημα υγρής χρωματογραφίας σε σύζευξη με Ανιχνευτή Συστοιχίας Φωτοδιοδίων (HPLC-DAD):  Αντλία άντλησης τεσσάρων διαλυτών Ultimate 300 Pump (Pump LPG- 3400  Βαλβίδα έγχυσης 8125 (Rheodyne, Ronhert Park, CA, USA) με βρόγχο 20μL  Θερμοστατούμενος χώρος (Column compartment, TCC-3100)  Ανιχνευτής συστοιχίας φωτοδιοδίων (Diode Array Detector) Ultimate DAD-3000 από την εταιρεία Dionex Corporation (Sunnyvale, CA, USA). Το λογισμικό ήταν Chromeleon v. 6.80.  Ημιπαρασκευαστικό HPLC purifier Amersham Pharmacia Biotech 900 του οίκου ΑΚΤΑ  Αναλυτικό HPLC 2695 της εταιρείας Waters (?) με ανιχνευτή φωτόμετρο της ίδιας εταιρείας Waters Detector 2484  Περισταλτική αντλία LKB-Pump P-1 της εταιρείας Pharmacia  Μικροσύριγγες με φίλτρο, RC Membrane, 0.2 μm, 4mm της Phenomenex (USA) (Cat. No. )  Φυγόκεντρος της εταιρείας P Selecta  Λουτρό υπερήχων Branson 2200 (Dunbury, USA)  Αναλυτικός ζυγός

5.2. Εκχύλιση

Η εκχύλιση είναι μια από τις πιο συνηθισμένες τεχνικές διαχωρισμού και βασίζεται στην ισορροπία κατανομής μιας ένωσης μεταξύ των δύο φάσεων, που αναμειγνύονται ελάχιστα μεταξύ τους. Η πιο συνηθισμένη διεργασίας εκχύλισης είναι η υγρού-υγρού, δηλαδή η εκχύλιση και ο διαχωρισμός ενός διαλύματος ενώσεων με ένα άλλο υγρό. Σε αυτήν την περίπτωση μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιοσδήποτε συνδυασμός διαλυτών, που αναμειγνύονται ελάχιστα μεταξύ τους. Συνήθως η μια από τις δύο φάσεις είναι ένα υδατικό διάλυμα, ενώ η άλλη είναι ένας οργανικός διαλύτης. Οπότε τα μεν ανόργανα ιόντα και οι πολικές οργανικές ενώσεις, κατά κύριο λόγο, κατανέμονται στην υδατική φάση, , ενώ οι μη πολικές ενώσεις στην οργανική. Ορισμένος όγκος του προς εκχύλιση διαλύματος φέρεται σε επαφή με δεδομένο όγκο εκχυλιστικού μέσου μέσα σε διαχωριστική χοάνη και αναταράσσεται, μέχρις ότου αποκατασταθεί η ισορροπία. Μετά την αποκατάσταση της ισορροπίας, οι δύο φάσεις χωρίζονται, συνήθως με εκροή της κάτω στοιβάδας από τη στρόφιγγα της διαχωριστικής χοάνης. Ωστόσο υπάρχει και η μέθοδος της εκχύλισης στερεών με υγρό, όπου αποτελεί ένα ενδιαφέρον στάδιο στην παρασκευή φαρμακοτεχνικών παρασκευασμάτων. Τέτοιου είδους εκχυλίσματα λαμβάνονται συνήθως από φυτικές δρόγες. Η εκχύλιση στερεών χρησιμοποιείται ευρύτατα στην φαρμακοτεχνία και στην φαρμακευτική ανάλυση για τον προσδιορισμό των δραστικών συστατικών τόσο των ακατέργαστων δρογών, όσο και των στερεών σκευασμάτων, όπως τα δισκία. Μετά το τέλος της εκχυλίσης το στερεό απομακρύνεται με διήθηση ή φυγοκέντρηση, ενώ το εκχύλισμα που εχει προκύψει λαμβάνεται για περαιτέρω αναλύσεις.

5.2.1 Εκχύλιση φυτικού υλικού Hypericum vesiculosum

Για την παρασκευή του εκχυλίσματος, 63,932 g ξηρού δείγματος τοποθετήθηκαν σε κωνική φιάλη του 1L, καλυμμένη με αλουμινόχαρτο για την αποφυγή έκθεσης στο φως, με 800mL μεθανόλης σε υδατόλουτρο στους 40o C όλο το βράδυ. Την επόμενη μέρα και αφού απομακρύνθηκε το εκχύλισμα που είχε προκύψει (ερυθρού χρώματος), προστέθηκαν άλλα 800mL μεθανόλης και το αιώρημα Εικόνα 22. αφέθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 48 ώρες απουσία Εικόνα 21. Διαδικάσία Φωτογραφία φωτός. Τέλος, προστέθηκε άλλη μια φορά μεθανόλη (500mL) εκχύλισης φυτικού από εκχύλιση και το αιώρημα αφέθηκε για 48 ώρες. Η εκχύλιση ήταν υλικού της φυτικού υλικού εξαντλητική, αφού στο τέλος τα εκχυλίσματα ήταν σχεδόν παρούσας της παρούσας διπλωματικής άχρωμα Το συνολικό εκχύλισμα διηθήθηκε και υπεβλήθη σε εργασίας (2012) διπλωματικής συμπύκνωση υπό κενό στους 35ο C. Το βάρος του ξηρού εργασίας (2012) εκχυλίσματος ήταν 12,655 g.

5.2.2 Κλασματώσεις αρχικού εκχυλίσματος Hypericum vesiculosum

Σε συνολικά 600 mL ζεστού (απιονισμένου) νερού (40ο C) διαλύθηκε πλήρως το ξηρό εκχύλισμα, το οποίο διηθήθηκε και τοποθετήθηκε σε διαχωριστική χοάνη των 2L, ώστε να πραγματοποιηθούν οι κλασματώσεις. Το πρώτο κλάσμα δημιουργήθηκε με εξάνιο, το οποίο προστέθηκε στη διαχωριστική χοάνη (250mL), το μείγμα ανακινήθηκε και αφέθηκε σε ηρεμία για 10 λεπτά να γίνει διαχωρισμός των φάσεων. Η διαχωριστική χοάνη ήταν καλυμμένη με αλουμινόχαρτο καθ’όλη τη διάρκεια της διαδικασίας. Στη συνέχεια απομακρύνθηκε η οργανική φάση (εξανίου). Η διαδικασία επαναλήφθηκε 7 φορές για κάθε κλάσμα 250 mL. Το επόμενο κλάσμα που δημιουργήθηκε ήταν αυτό του οξικού αιθυλεστέρα, το οποίο παραλήφθηκε με την ίδια διαδικασία όπως παραπάνω, και η οποία επαναλήφθηκε 8 φορές. Τα κλάσματα που προέκυψαν συμπυκνώθηκαν υπό κενό σε θερμοκρασία περίπου 35o C μέχρι ξηρού σε σφαιρικές φιάλες των 250mL. Το ξηρό βάρος του κλάσματος του εξανίου ήταν 4,165 g. Το ξηρό βάρος του κλάσματος του οξικού αιθυλεστέρα ήταν 3,793 g. Το ξηρό βάρος του εναπομείναντος υδατικού κλάσματος ήταν 4,690 g.

5.3 Κλασική Υγρή Χρωματογραφία Στήλης

Στην υγρή χρωματογραφία στήλης, η στατική φάση είναι πορώδες υλικό ή υγρό καθηλωμένο σε στερεό υπόστρωμα, που βρίσκεται συσκευασμένο σε στήλη, ενώ η κινητή φάση είναι κάποιος υγρός διαλύτης. Η διαβίβαση της κινητής φάσης από τη στατική πραγματοποιείται με τη βοήθεια της βαρύτητας ή μέσω αντλιών χαμηλής πίεσης. Η κλασική υγρή χρωματογραφία στήλης χρησιμοποιείται κυρίως για διαχωρισμούς και όχι ποσοτικούς προσδιορισμούς. Οι χρωματογραφικοί μηχανισμοί διαχωρισμού, οι οποίοι λαμβάνουν χώρα στην υγρή χρωματογραφία στήλης και με βάση τους οποίους μπορούν να ταξινομηθούν τα διάφορα είδη υγρής χρωματογραφίας, είναι η προσρόφηση, η κατανομή, η ιοντοανταλλαγή, ο μοριακός αποκλεισμός και η χημική συγγένεια. Τα όργανα που απαιτούνται για τη διεξαγωγή κλασικής υγρής χρωματογραφίας στήλης είναι σχετικά απλά και χαμηλού κόστους. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν υάλινοι ή πλαστικοί σωλήνες, προχοΐδες ή ειδικά κατασκευασμένοι σωλήνες ανάλογα με τις απαιτήσεις για τον εκάστοτε διαχωρισμό. Για δεδομένο βάρος πληρωτικού υλικού, η απόδοση είναι μεγαλύτερη με τη χρησιμοποίηση στήλης μικρής διαμέτρου και μεγάλου μήκους, παρά μεγάλης διαμέτρου και μικρού μήκους. Ωστόσο εάν το μήκος γίνει πολύ μεγάλο, η ταχύτητα ροής της κινητής φάσεως μειώνεται. Ο τρόπος πληρώσεως και η προετοιμασία της στήλης ποικίλλουν ανάλογα με τον μηχανισμό του διαχωρισμού. Το κάτω άκρο του σωλήνα φράσσεται με υαλοβάμβακα ή φρυγμένη ύαλο για την αποφυγή διαρροής του πληρωτικού υλικού. Η πλήρωση γίνεται με προσοχή, ώστε να αποφεύγονται οι κενοί χώροι (φυσαλίδες αέρα). Στην χρωματογραφία κατανομής, η υγρή στατική φάση προσροφάται στην επιφάνεια των σωματιδίων του υλικού πληρώσεως και ακολούθως διασπείρεται στην κινητή φάση. Για το σκοπό αυτό, συνήθως, παρασκευάζεται ρευστή μάζα του υλικού πληρώσεως με την κινητή φάση και ακολούθως προστίθεται η υγρή στατική φάση και αναταρράσονται. Στις χρωματογραφίες ιοντοανταλλαγής και μοριακού αποκλεισμού, όπου χρησιμοποιούνται συνήθως ρητίνες ή πήκτες πολυμερών, η πλήρωση γίνεται με απόχυση των διαβρεγμένων υλικών μέσα στο σωλήνα, ο οποίος είναι γεμάτος με τον ίδιο διαλύτη και αναμονή για την καθίζηση των σωματιδίων. Επειδή τα υλικά αυτά διογκώνονται σημαντικά με την προσρόφηση διαλύτη, ουδέποτε γίνεται πλήρωση της στήλης με ξηρό υλικό. H silica gel 60A (43-60mesh) αποτελεί ένα από τα πλέον χρησιμοποιούμενα υλικά πλήρωσης στην υγρή χρωματογραφία, είτε είναι κλασική είτε υψηλής απόδοσης. Το μέγεθος των σωματιδίων (στην προκειμένη περίπτωση 43-60mesh) επιτρέπει το διαχωρισμό μιγμάτων ενώσεων μεγάλου εύρους ως προς την πολικότητα τους και το μέγεθος Εικόνα 23. τους. Ανάλογα με το σύστημα διαλυτών είναι δυνατός ο διαχωρισμός δομή πολυμερούς ενώσεων από ένα δείγμα (π,χ βαθμιδωτή έκλουση αυξανόμενης Silica gel πολικότητας) με την έκλουση, εν τέλει, των επιθυμητών ενώσεων. Ένα άλλο υλικό πλήρωσης που χρησιμοποιείται στην χρωματογραφία στήλης είναι η Sephadex και συγκεκριμένα στην παρούσα μελέτη η Sephadex LH-20 (25-100μm). Η Sephadex LH-20 είναι ένα υδροξυπροπυλιωμένο πολυμερές δεξτράνης και έχει διπλό χρωματογραφικό χαρακτήρα, τόσο υδρόφιλο, όσο και λιπόφιλο. Η διόγκωση της Sephadex πριν την τοποθέτηση της σε στήλη είναι Εικόνα 24. Δομή απαραίτητη και πραγματοποιείται με προσθήκη του αρχικού εκλουτή. Η Sephadex LH-20 διόγκωση των σωματίδιων εξαρτάται από τον αρχικό εκλουτή και συγκεκριμένα όσο πιο πολικός είναι ο διαλύτης τόσο μεγαλύτερη διόγκωση αποκτά. Επίσης ο διαχωρισμός βασίζεται και στο μοριακό

μέγεθος των ενώσεων του δείγματος. Τέλος το μειονέκτημα της Sephadex έγκειται στο υψηλό κόστος αγοράς της, αλλά και στον δύσκολo καθαρισμό της (χρονοβόρα διαδικασία και απαιτεί αρκετή ποσότητα διαλυτών, που σημαίνει πάλι αυξημένο κόστος). Το δείγμα στην στήλη μπορεί να εφαρμοστεί είτε στην κινητή φάση (διαλύεται σε έναν από τους διαλύτες της κινητής φάσης και το διάλυμα που προκύπτει προστίθεται με σιφώνιο στο άνω μέρος της στήλης) είτε στη στατική φάση, ιδιαίτερα όταν πρόκειται για υδατικό διάλυμα (αναμειγνύεται με κατάλληλη ποσότητα στερεού προσροφητικού υλικού και το μείγμα τοποθετείται ως λεπτή ζώνη στην κορυφή της στήλης). Η ροή της κινητής φάσης μέσα από την στήλη πετυχαίνεται συνήθως με σιφωνισμό του διαλύτη από μια δεξαμενή, που βρίσκεται υψηλότερα από την στήλη. Η κατάλληλη ταχύτητα ροής, εξαρτάται από τη διάμετρο της στήλης και τον επιδιωκόμενο διαχωρισμό, ο οποίος μεγιστοποιείται σε μικρές ταχύτητες ροής. Η ταχύτητα ροής ελέγχεται από την υδροστατική πίεση μεταξύ της επιφάνειας του υγρού στην αποθήκη της κινητής φάσης και του σημείου εκροής από την στήλη. Για τον καλύτερο έλεγχο της ταχύτητας ροής μπορούν να χρησιμοποιηθούν περισταλτικές αντλίες χαμηλής πίεσης. Σε περιπτώσεις βαθμιδωτής έκλουσης, που απαιτείται συνήθως χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής, η αλλαγή της σύστασης της κινητής φάσης επιτυγχάνεται με διάφορα συστήματα αναμείξης των διαλυτών. Το έκλουσμα συλλέγεται συνήθως με κλασματοσυλλέκτη (fraction collector), οποίος προγραμματίζεται να συλλέγει συγκεκριμένο όγκο δείγματος σε κάθε σωλήνα. Η ανάλυση των κλασμάτων που προκύπτουν γίνεται με άλλες αναλυτικές τεχνικές, όπως η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC- βλέπε παρακάτω), η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) κ.α. Η κλασική υγρή χρωματογραφία στήλης χρησιμοποιείται ευρέως στην προκατεργασία πολύπλοκων δειγμάτων και όχι τόσο στην ποσοτική ανάλυση.

5.3.1 Χρωματογραφικός διαχωρισμός σε στήλη silica gel και Sephadex LH-20

Για την περαιτέρω κλασμάτωση του δείγματος, το κλάσμα του οξικού αιθυλεστέρα (AcOEt) υποβλήθηκε σε κλασική χρωματογραφία στήλης σε silica gel 60A (43-60 mesh μέγεθος σωματιδίων). Η επιλογή του κατάλληλου συστήματος έκλουσης (κινητή φάση) έγινε ύστερα από δοκιμές σε TLC με διάφορα συστήματα έκλουσης τα οποία είχαν χρησιμοποιηθεί σε άλλες ερευνητικές εργασίες. Το κλάσμα του οξικού αιθυλεστέρα επαναδιαλυτοποιήθηκε στην ελάχιστη δυνατή ποσότητα ακετόνης και στη συνέχεια αναμείχθηκε με cellite (silica όχι τόσο καλής ποιότητας), περίπου 4g σε δοχείο ζέσεως, έως ότου γίνει στερεό. Στην συνέχεια αφέθηκε καλυμμένο με αλουμινόχαρτο, ώστε να εξατμιστεί η ακετόνη. Η στήλη πληρώθηκε με περίπου 70g silica 60A, τα οποία είχαν αναμειχθεί με εξάνιο (πρώτος διαλύτης που θα περνούσε από την στήλη) και στη συνέχεια το δείγμα τοποθετήθηκε στο άνω μέρος της στατικής φάσης. Στη συνέχεια το πρώτο σύστημα έκλουσης, το εξάνιο, άρχισε να περνά από την στήλη, σε ποσότητες των 250mL πολύ προσεκτικά, ώστε να μη αναταράσσεται η στήλη. Η χρωματογραφία πραγματοποιήθηκε με βαθμιδωτό σύστημα έκλουσης αυξανόμενης πολικότητας και αποτελείτο από εξάνιο, οξικό αιθυλεστέρα και μεθανόλη. H σύσταση διαλυτών έκλουσης ξεκίνησε με 100% εξάνιο, ανά 10% μειωνόταν με αύξηση του οξικού αιθυλεστέρα και όταν ο οξικός αιθυλεστέρας έφτασε το 100% , έγινε σταδιακή μετάβαση, ανά 10% σε μεθανόλη. Από την χρωματογραφία αυτήν προέκυψαν 11 κλάσματα (Α-Κ) (σχεδιάγραμμα 1). Το επόμενο κλάσμα στο οποίο πραγματοποιήθηκε κλασική υγρή χρωματογραφία στήλης ήταν το I (0,31g), αφού, ύστερα από δοκιμές σε TLC των διαφόρων κλασμάτων, έδειχνε να φέρει τις επιθυμητές ενώσεις προς απομόνωση, τις ναφθοδιανθρόνες. Η στήλη πληρώθηκε με περίπου 42g silica 60A, που είχαν αναμειχθεί με το αρχικό σύστημα διαλυτών, το οποίο ήταν Οξικός Αιθυλεστέρας(AcOEt):Μεθανόλη(MeOH):Ακετόνη (80:5:5) και στη συνέχεια το

δείγμα τοποθετήθηκε στο άνω μέρος της στατικής φάσης. Το δείγμα είχε πρώτα επαναδιαλυτοποιηθεί σε 3 mL του αρχικού συστήματος των διαλυτών. Στη συνέχεια η σύσταση άλλαξε σε AcOEt:MeOH (8:1) και σταδιακά έφτασε σε 100% MeOH. Από τη στήλη αυτήν προέκυψαν 4 κλάσματα (I1-I4) με την βοήθεια των TLC που πραγματοποιούνταν παράλληλα με το πείραμα. Η HPLC ανάλυση έδειξε ότι το κλάσμα Ι2 έχει τις επιθυμητές προς απομόνωση ενώσεις μαζί με άλλα φαινολικά συστατικά, οπότε και διαχωρίστηκε περαιτέρω στα συστατικά του με τη βοήθεια της LH-20. Επειδή ήταν επιθυμητή η απομόνωση των υδρόφοβων ναφθοδιανθρονών από τα άλλα συστατικά τα οποία ήταν πολικά, επιλέχθηκε η ρητίνη Sephadex LH-20, για να προσδώσει ένα νέο μηχανισμό διαχωρισμού σε σχέση με τη silica. Ζυγίστηκαν περίπου 20g του υλικού πληρώσεως, τα οποία αναμίχθηκαν με υπερκάθαρο νερό και αφέθηκαν προς διόγκωση πριν τοποθετηθούν στον υάλινο σωλήνα. Στην συνέχεια το αιώρημα τοποθετήθηκε στην στήλη, ενώ το δείγμα τοποθετήθηκε σε αυτήν όταν το σύστημα διαλυτών ήταν στο ποσοστό 70:30 ddΝερό:Μεθανόλη (σε αυτό το ποσοστό ήταν δυνατή η διάλυση του). Η μέθοδος έκλουσης ήταν βαθμιδωτή, από πολικούς διαλύτες σε όλο και λιγότερο πολικούς, δηλαδή από υπερκάθαρο νερό σε μεθανόλη και τέλος οξικό αιθυλεστέρα. Χρησιμοποιήθηκε περισταλτική αντλία για να υπάρχει σταθερή ροή διαλυτών, 3 mL ανά 15 λεπτά και συλλέκτης κλασμάτων για την συλλογή δειγμάτων. Από αυτή την στήλη προέκυψαν 13 κλάσματα, εκ των οποίων τα VII και VIII έφεραν τις ναφθοδιανθρόνες (Εικόνα 25).

Εικόνα 25 Διάγραμμα διαδοχικών κλασματώσεων

5.4 Χρωματογραφία Λεπτής στιβάδας (Thin Layer Chromatography- TLC)

Στη τεχνική αυτή χρησιμοποιείται ένα σχετικά λεπτό επίπεδο στρώμα μιας ουσίας προσροφητικής, η οποία είναι σε μορφή κονιοποιημένων σωματιδίων όπως της silica. Το λεπτό στρώμα τοποθετείται ως φύλλο πάνω σε μια επιφάνεια υάλου, πλαστικού ή μετάλλου. Η κινητή φάση διέρχεται μέσα από τη σταθερή φάση με τριχοειδή φαινόμενα, τα οποία πολλές φορές υποβοηθούνται και από την βαρύτητα ή από ένα ηλεκτρικό πεδίο. Η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) και η υγρή χρωματογραφία στήλης παρουσιάζουν ομοιότητες, τόσο θεωρητικά όσο και πρακτικά, δηλαδή στο είδος στατικών και κινητών φάσεων, αλλά και στις εφαρμογές τους. Η TLC χρησιμοποιείται ως οδηγός εύρεσης των βέλτιστων συνθηκών για την πραγματοποίηση κλασικής υγρής χρωματογραφίας στήλης. Με αυτόν τον τρόπο μειώνεται ο χρόνος και το κόστος της διερεύνησης των συνθηκών για την χρωματογραφία στήλης. Πλάκες TLC διατίθενται στο εμπόριο σε διάφορα μεγέθη. Σε αυτές τις πλάκες η τοποθέτηση του δείγματος προς διαχωρισμό είναι το πιο κρίσιμο σημείο στην TLC. Συνήθως αυτό τοποθετείται ως σταγόνα διαλύματος 0,01%-0,1% σε απόσταση 1 έως 2 cm από το άκρο της πλάκας με έναν απλό τριχοειδή σωλήνα. Για βελτίωση της απόδοσης η σταγόνα πρέπει να έχει τη μικρότερη δυνατή διάμετρο, ιδιαιτέρως όταν πρόκειται για ποσοτικές αναλύσεις. Η ανάπτυξη του χρωματογραφήματος είναι η διεργασία όπου το δείγμα κατανέμεται και αλληλεπιδρά με τη στατική φάση με τη βοήθεια μιας κινητής φάσης. Το στάδιο αυτό αντιστοιχεί με το στάδιο της έκλουσης στην κλασική υγρή χρωματογραφία στήλης. Αφού τοποθετηθεί το δείγμα και εξατμιστεί ο διαλύτης αυτού η πλάκα τοποθετείται σε ένα κλειστό δοχείο, κορεσμένο με ατμούς του διαλύτη ανάπτυξης. Το ένα άκρο της βυθίζεται στον διαλύτη ανάπτυξης, χωρίς να βραχεί το δείγμα και στη συνέχεια ο διαλύτης ανάπτυξης μετακινείται προς το πάνω μέρος της πλάκας με τη βοήθεια τριχοειδών Εικόνα 26. Τυπικός θάλαμος ανάπτυξης φαινομένων (Εικόνα 26). Με αυτόν τον τρόπο, το TLC (πηγή: δείγμα συμπαρασύρεται και κατενέμεται μεταξύ http://bheem.hubpages.com/hub/tlc-thin- κινητής και στατικής φάσης. Όταν ο διαλύτης layer-chromatography-Principle-Procedure) ανάπτυξης φτάσει τα 4/5 του ύψους της πλάκας, αυτή απομακρύνεται από το δοχείο ανάπτυξης και ξηραίνεται. Ο εντοπισμός της θέσης των διαφόρων συστατικών του δείγματος πάνω στην πλάκα γίνεται με διάφορους τρόπους, όπως ο ψεκασμός με διάλυμα ιωδίου ή θειικού οξέος, ή την χρήση ειδικών αντιδραστηρίων, όπως η νινυδρίνη. Ένας άλλος τρόπος ανίχνευσης πραγματοποείται μέσω της τοποθέτησης της πλάκας σε υπεριώδες φως, όπου τα συστατικά του δείγματος, τα οποία έχουν συζυγιακό σύστημα διπλών δεσμών, αποσβένουν τον φθορισμό από την ενσωματωμένη φθορίζουσα ουσία της πλάκας και έτσι εντοπίζονται.  Χαρακτηριστικά απόδοσης TLC Εικόνα 27. Χρωματογράφημα TLC (πηγή:http://glossary.periodni.com/diction Ένας όρος που εισάγεται στην TLC είναι ο συντελεστής ary.php?en=paper+chromatography) επιβράδυνσης RF ο οποίος ορίζεται ως εξής:

R = F όπου a και b είναι οι αποστάσεις από την αρχική γραμμή ανάπτυξης της εκλουόμενης ένωσης και του διαλύτη αντίστοιχα (Εικόνα 27).

Οι σπουδαιότεροι παράγοντες που καθορίζουν την τιμή του RF είναι το πάχος της στατικής φάσης, η περιεχόμενη υγρασία της κινητής και της στατικής φάσης, η θερμοκρασία, ο βαθμός κορεσμού του θαλάμου ανάπτυξης με τους ατμούς διαλύματος κινητής φάσης, ο όγκος και η συγκέντρση του δείγματος.

5.4.1 Πειραματική πορεία

Στην παρούσα εργασία η χρήση της TLC γινόταν για δύο λόγους: 1. Για τη διερεύνηση των βέλτιστων συνθηκών για την περάτωση της εκάστοτε χρωματογραφίας στήλης 2. Για την ομαδοποίηση των ληφθέντων δειγμάτων κατά τη διάρκεια της έκλουσης σε κλάσματα, διαδικασία που πραγματοποιείτο παράλληλα με τα πειράματα.

Οι TLC δοκιμές γίνονταν σε πλάκες silica gel 60 με δείκτη φθορισμού F254 της Merck με διάφορα συστήματα έκλουσης κάθε φορά, ενώ η εμφάνιση των χρωματογραφημάτων πραγματοποιείτο με τη βοήθεια θαλάμου υπεριώδους ακτινοβολίας (UV) στα 254 nm.

5.5 Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography- HPLC)

Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης είναι μια αναλυτική τεχνική διαχωρισμού η οποία βασίζεται σε φαινόμενα κατανομής. Καθοριστικές στην κατανομή είναι οι αλληλεπιδράσεις που αναπτύσσονται μεταξύ των εκλουόμενων ενώσεων και των δύο φάσεων, εξαιτίας της πολικότητας που παρουσιάζουν το δείγμα, η κινητή (mobile phase) και η στατική φάση (stationary phase). Η κινητή φάση είναι ένα υγρό (νερό, ρυθμιστικό διάλυμα ή οργανικός διαλύτης) το οποίο διαπερνά την στατική φάση της στήλης. Οι στήλες που χρησιμοποιούνται σήμερα φέρουν υλικό πλήρωσης αποτελούμενο από σωματίδια μεγέθους 2-10μm, με σφαιρικό ή ακανόνιστο σχήμα. Συνήθως, χρησιμοποιούνται στήλες με C-18 αλκύλια δεσμευμένα πάνω στην επιφάνεια σωματιδίων σίλικας. Στην HPLC αναπτύσσονται υψηλές πιέσεις (μέχρι και αρκετές χιλιάδες psi), φαινόμενο που οφείλεται στην αντίσταση που συναντά η κινητή φάση, όταν διέρχεται μέσα από από το υλικό πλήρωσης της στήλης. Η κινητή φάση μπορεί να έχει ροή από 1-5mL/min. Τα συστατικά (ενώσεις προς ανάλυση) διέρχονται μέσα από τη στήλη και με τη βοήθεια της κινητής φάσης διαχωρίζονται και εκλούονται σε διαφορετικό χρόνο, χαρακτηριστικό για το καθένα. Ένας ανιχνευτής που είναι τοποθετημένος στην έξοδο της στήλης αποκρίνεται στην παρουσία των ενώσεων και δίνει ένα ηλεκτρικό σήμα, το οποίο καταγράφεται στον υπολογιστή συναρτήσει του χρόνου. Με αυτόν τον τρόπο λαμβάνεται μια σειρά κορυφών, το γνωστό χρωματογράφημα, με το οποίο μπορεί να γίνει ποιοτική και ποσοτική ανάλυση. Η οργανολογία της HPLC είναι πολυπλοκότερη και αρκετά δαπανηρή σε σχέση με άλλα είδη χρωματογραφίας. Η πολικότητα στη χρωματογραφία αποτελεί δείκτη κατανομής των ουσιών στο τελικό χρωματογράφημα. Ανάλογα με την πολικότητα της κινητής ή της στατικής φάσης διακρίνουμε δύο τύπους χρωματογραφίας: A. Την κανονική, όπου η στατική είναι φάση είναι πολική, ενώ η κινητή δεν είναι. B. Την αντίστροφη, όπου η κινητή φάση είναι πολική, ενώ η στατική δεν είναι. Στην HPLC αντίστροφης φάσης το πολικότερο συστατικό εκλούεται πρώτο. Όσο αυξάνεται η πολικότητα της κινητής φάσης, αυξάνεται και ο χρόνος έκλουσης. Η έκλουση πιο υδρόφοβων ενώσεων γίνεται με τη μείωση της πολικότητας της κινητής φάσης. Όταν η σύσταση της κινητής φάσης αποτελείται από έναν διαλύτη σταθερής σύστασης, η έκλουση καλείται ισοκρατική. Η απόδοση του διαχωρισμού αυξάνεται με βαθμιδωτή έκλουση (gradient elution), όπου χρησιμοποιούνται δύο ή τρία συστήματα διαλυτών, που διαφέρουν σημαντικά ως προς την πολικότητα. Όταν σχεδιάζεται η μέθοδος HPLC, το ζητούμενο είναι ένας επαρκής βαθμός διαχωρισμού των συστατικών του αναλυόμενου δείγματος, στο μικρότερο δυνατό χρονικό διάστημα. Παράγοντες που επηρεάζουν το διαχωρισμό είναι η στήλη (μήκος και υλικό πλήρωσης), η θερμοκρασία, η ροή και το σημαντικότερο η σύσταση της κινητής φάσης.

Εικόνα 28. διάταξη HPLC

 Πλεονεκτήματα της μεθόδου: 1. Γρηγορότερος και αποτελεσματικότερος διαχωρισμός από την κλασική υγρή χρωματογραφία 2. Μικρότερο σχετικά κόστος (χρήση μικρότερων ποσοτήτων διαλυτών) 3. Αυξημένη ευαισθησία 4. Ακρίβεια ικανή για ποσοτικό προσδιορισμό Για τους παραπάνω λόγους, η HPLC βρίσκει ευρεία εφαρμογή στο επιστημονικό και βιομηχανικό πεδίο.

5.5.1 Μέθοδοι HPLC ανάλυσης κλασμάτων Hypericum vesiculosum

Για την φυτοχημική ανάλυση του αρχικού εκχυλίσματος αλλά και την απομόνωση των ναφθοδιανθρονών, πραγματοποιήθηκαν αρκετές αναλύσεις HPLC. Στο αρχικό εκχύλισμα (μεθανολικό), στο κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα (AcOEt), στο κλάσμα εξανίου (n-Hexane) και στο κλάσμα Ι, η μέθοδος που ακολουθήθηκε για την ανάλυση τους ήταν αντίστροφης φάσης, σε αναλυτική στήλη αντίστροφης φάσης Luna C-18 (250mm x 4.6 mm I.D, 5μm, Phenomenex, USA). Το πρωτόκολλο που επιλέχθηκε ήταν βαθμιδωτή έκλουση με σύστημα 3 διαλυτών σε χρόνο 60 λεπτών (Πίνακας 10). Η μέθοδος αυτή είχε αναπτυχθεί στο εργαστήριο Φαρμακογνωσίας από την κ. Ευαγγελία Μαργιάννη στο πλαίσιο της μεταπτυχιακής της διπλωματικής εργασίας για την ανάλυση του μεθανολικού εκχυλίσματος H. perforatum (Μαργιάννη, 2011).

Πίνακας 10. Σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης της μεθόδου Α Χρόνος (min) 0 25 35 50 55 56 63 68

A (%): CH3COONH4 85 70 10 5 5 0 85 85 10mM, pH=4,5

B (%): CH3CN 15 20 75 80 80 100 15 15 C (%): CH3OH 0 10 15 15 15 0 0 0

Στο κλάσμα H, στα κλάσματα Ι2, Ι3, Ι4, αλλά και στα κλάσματα IV, VII, VIII, IX, X, XI, τα οποία προέκυψαν από χρωματογραφία στήλης του I2 κλάσματος σε Sephadex LH-20, η μέθοδος που ακολουθήθηκε για την ανάλυση τους ήταν επίσης αντίστροφης φάσης. Η ανάλυση των συστατικών τους έγινε σε αναλυτική στήλη αντίστροφης φάσης SP-120-5- ODS-RPS (150mm x 4.6 mm I.D, DAISOPAK). Το πρωτόκολλο που επιλέχθηκε ήταν βαθμιδωτή έκλουση με σύστημα δύο διαλυτών σε χρόνο 45 λεπτών (Πίνακας 11).

Πίνακας 11. Σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης της μεθόδου Β Χρόνος (min) 0 10 30 40 45

A (%): CH3COONH4 80 80 0 0 80 10mM, pH=4,5

B (%): CH3CN 20 20 100 100 20

Ο διαλύτης Α ήταν ρυθμιστικό διάλυμα οξικού αμμωνίου (CH3COONH4) 10mM, με pH=4,5 (η ρύθμιση του έγινε με HCl 1M).

Ο διαλύτης Β ήταν ακετονιτρίλιο (CH3CN). O διαλύτης C ήταν μεθανόλη (CH3OH). Η ροή ήταν 1 mL/min και η θερμοκρασία ορισμένη στους 30ο C, ενώ όλοι οι διαλύτες πριν τη χρήση ήταν απαερωμένοι και διηθημένοι. Τέλος, η ανίχνευση των εκλουόμενων συστατικών έγινε στα 300nm (μέγιστο απορρόφησης φαινολικών οξέων), 350nm (μέγιστιο απορρόφησης φλαβονοειδών) και 590nm (μέγιστο απορρόφησης ναφθοδιανθρονών).

Στην συνέχεια έγινε καθαρισμός των κλασμάτων VII και VIII με ημι-παρασκευαστικό HPLC, σε ημι-παρασκευαστική στήλη αντίστροφης φάσης C18 (5μm, 10x150mm - XBridge columns, Waters), ενώ η μέθοδος που ακολουθήθηκε ήταν η ίδια με το αναλυτικό HPLC, με

μικρές αλλαγές στην αρχική σύσταση του ακετονιτριλίου (CH3CN) και στον συνολικό χρόνο της μεθόδου (Πίνακας 12).

Πίνακας 12. Σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης ημι-παρασκευαστικού HPLC (μέθοδος Γ) Χρόνος (min) 2 7 20 25 28

A (%): CH3COONH4 100 40 0 0 100 10mM, pH=4,5

B (%): CH3CN 0 60 100 100 0

Ο συνολικός χρόνος της μεθόδου ήταν 28 λεπτά, η ροή ήταν 2 mL/min και η θερμοκρασία 30ο C.

5.6 Φασματομετρία Μαζών (Mass Spectrometry)

Η φασματομετρία μάζας (Μass spectrometry, MS) είναι μια αναλυτική τεχνική, η οποία χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της μάζας μιας χημικής ένωσης, μέσω του ιονισμού της. Τα ιόντα που παράγονται διαχωρίζονται σύμφωνα με το λόγο της μάζας προς το φορτίο τους, σε ένα φασματόμετρο μαζών. Η αναλογία μάζας-φορτίου των σωματιδίων μπορεί να υπολογιστεί με βάση τη συμπεριφορά των ιόντων, καθώς αυτά διεγείρονται από τα ηλεκτρικά και μαγνητικά πεδία που παράγονται από το όργανο της MS.

Ένα όργανο MS αποτελείται από:  Ένα σύστημα εισαγωγής δείγματος  μια πηγή ιονισμού, η οποία μετατρέπει τα μόρια ενός δείγματος σε ιόντα  έναν αναλυτή μάζας, ο οποίος ταξινομεί τα ιόντα με βάση το λόγο μάζα/φορτίο (m/z) εφαρμόζοντας ηλεκτρικά και μαγνητικά πεδία  έναν ανιχνευτή, ο οποίος καταγράφει το επαγόμενο φορτίο ή το παραγόμενο ρεύμα, όταν ένα ιόν περνάει από μια κατάλληλα επιστρωμένη επιφάνεια ή χτυπάει πάνω σε αυτήν. Ο ανιχνευτής ενισχύει το λαμβανόμενο ασθενές σήμα και το Εικόνα 29. Διάταξη Φασματομετρίας Μάζας οδηγεί στην κεντρική συσκευή ελέγχου και μέτρησης.

Ένας φασματόμετρο είναι συνδεδεμένο με έναν υπολογιστή για την κεντρική λειτουργία του, αλλά και για τη λήψη και επεξεργασία των δεδομένων από το αναλυόμενο δείγμα. Το σήμα που παράγεται στον ανιχνευτή, λαμβάνεται από τον συνδεδεμένο υπολογιστή και ύστερα από επεξεργασία των δεδομένων που έχει λάβει, θα δώσει το φάσμα μάζας με τη μορφή ενός γραφήματος, όπου η τετμημένη είναι ο λόγος μάζα/φορτίο (m/z) και τεταγμένη, η σχετική ένταση (%) ως προς τη βασική κορυφή (Sparkman et al., 2000). Ο ιονισμός των μορίων γίνεται με διάφορες τεχνικές, με συνηθέστερες τις α) με ηλεκτρονιακή πρόσκρουση (Electron impact ionization, EI) με ταχέως κινούμενα ηλεκτρόνια σε ηλεκτρικό πεδίο, β) με φωτοϊονισμό (Photoionization, PI), με την βοήθεια φωτός στην υπεριώδη περιοχή του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος και γ) με χημικό ιονισμό (Chemical ionization, CI), μέσω κρούσεως με άλλα ιόντα. Ο ιονισμός από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό (Electrospray Ionization, ESI) είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται στη φασματομετρία μάζας για την παραγωγή ιόντων (φασματομετρία μάζας ιονισμού από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό, electrospray ionization mass spectometry ESI-MS). Στον ιονισμό από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό, ένα διάλυμα εισάγεται μέσα σε ένα μικρό, φορτισμένο και συνήθως μεταλλικό τριχοειδές (Fenn et al., 1990). Αυτό το διάλυμα περιέχει την προς μελέτη ουσία διαλυμένη σε μια μεγάλη ποσότητα διαλύτη, ο οποίος συνήθως είναι πιο πτητικός από την ουσία. Ένα φυσικό αέριο- φορέας, όπως άζωτο, συνήθως χρησιμοποιείται για τη μετατροπή του υγρού σε σπρέι και την εξάτμιση του διαλύτη σε σταγονίδια. Καθώς ο διαλύτης εξατμίζεται, τα μόρια της ουσίας έρχονται πιο κοντά, απωθούνται και δημιουργούν μικρότερα σταγονίδια. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται σχάση Coulomb επειδή προκαλείται από απωθητικές δυνάμεις

Coulomb μεταξύ των φορτισμένων μορίων. Η διαδικάσία επαναλαμβάνεται μέχρι να προκύψουν πολλαπλά φορτισμένα σωματίδια της προς ανάλυσης ουσίας, τα οποία οδηγούνται προς τον αναλυτή μάζας του φασματομέτρου. Στη φασματομετρία μάζας ιονισμού από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό (ESI-MS) τα παρατηρούμενα ιόντα μπορεί να είναι ψευδομοριακά ιόντα, που σχηματίζονται από την προσθήκη ενός πρωτονίου (ένα ιόν υδρογόνου) και συμβολίζονται ως [Μ + Η]+ (θετικός ιονισμός), ή από ένα άλλο κατιόν, όπως ιόν νατρίου, [Μ+ Νa]+. Τέλος, ο ιονισμός μπορεί να αρνητικός με την απομάκρυνση ενός πρωτονίου και συμβολίζεται ως [Μ - Η]-. Τα κύρια πλεονεκτήματα της φασματομετρίας μαζών είναι η αυξημένη ευαισθησία της σε σχέση με άλλες αναλυτικές τεχνικές και η υψηλή της εξειδίκευση κατά την ταυτοποίηση ουσιών.

Φασματομετρία Μάζας

Ύστερα από την απομόνωση και τον καθαρισμό των ναφθοδιανθρονών, οι δύο κορυφές που καθαρίστηκαν υποβλήθηκαν σε φασματομετρία μάζας κάτω από συνθήκες αρνητικού ιονισμού δια ψεκασμού ηλεκτρονίων (ESI-MS) με τη συσκευή Waters 2695 separation model και ανιχνευτή Photodial Array Detector Waters 2996, ενώ η επεξεργασία έγινε με το λογισμικό massLynx. V4.1. στο τμήμα Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών.

5.7 Μελέτη της συμπεριφοράς

Η συμπεριφορά είναι το σύνολο των αντιδράσεων ενός οργανισμού, που ελέγχεται από το νευρικό σύστημα και χαρακτηρίζεται από μεγάλη ποικιλία στη μορφή και τις εκφράσεις της (Παναγής, 2002). Ο εγκέφαλος καθορίζει το σύνολο της συμπεριφοράς, αφού οποιαδήποτε ενέργεια προκύπτει από μια σειρά λειτουργιών που εκτελούνται από αυτόν, όπως η βάδιση και η λήψη τροφής, αλλά και πιο σύνθετες, όπως η σκέψη και η ομιλία. Μεγάλο ενδιαφέρον έχει η ερμηνεία της συμπεριφοράς με βάση τις δραστηριότητες του εγκεφάλου. Μια παράμετρος που μελετάται συχνά είναι η εκδήλωση του άγχους και η εύρεση πιθανών αγχολυτικών φαρμάκων. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα μοντέλα μελέτης κατάθλιψης, τα οποία χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο της δράσης των αντικαταθλιπτικών. Στόχος των ερευνητών που μελετούν τη συμπεριφορά σε πειραματόζωα είναι η παρατήρηση και η μέτρηση με ποσοτικά μεγέθη της συμπεριφοράς και η συσχέτιση αυτής με ειδικούς μηχανισμούς και λειτουργίες του ΚΝΣ.

5.7.1 Μοντέλo μελέτης άγχους φόβου

Δοκιμή θιγμοτακτισμού-ανοικτού πεδίου-Open Field Test

Ο έμφυτος φόβος των ανοικτών πεδίων εθεωρείτο το πιο σημαντικό ερέθισμα που μπορεί να προκαλέσει ανησυχία στα τρωκτικά (Barnett 1975), άποψη που υποστηρίχτηκε πειραματικά. Ο Barnett υποστηρίζει ότι οι επίμυες, αλλά και άλλα μικρά θηλαστικά, τείνουν να κινούνται σε επαφή με μια κάθετη επιφάνεια (Εικόνα 7) και προτιμούν να τρώνε σε μία γωνία, παρά σε μια ανοικτή περιοχή. Ο ίδιος θεωρεί ακόμα πως ο θιγμοτακτισμός είναι ένας τρόπος κάλυψης από έναν πιθανό εχθρό. Η δοκιμή ανοικτού πεδίου είναι μια δοκιμασία που εξετάζει την τάση των τρωκτικών να εξερευνούν νέα περιβάλλοντα (Walsh, Cummins 1976). Τα πειραματόζωα είναι πιο δραστήρια και παραμένουν στην περιφέρεια περισσότερο χρόνο σε σχέση με την κεντρική περιοχή (Valle 1970). Ο όρος θιγμοτακτισμός αναφέρεται στην τάση του πειραματόζωου να παραμένει κοντά στις κάθετες επιφάνειες (Εικόνα 31). Η συμπεριφορά ελέγχεται σε μια συσκευή που ονομάζεται συσκευή ανοικτού πεδίου (open field) και αποτελεί το μέσο για να εξεταστεί η εξερευνητική τάσου του ζώου. Στην βιβλιογραφία υπάρχουν πολλές εκδοχές αυτής της δοκιμασίας, η πλειοψηφία των οποίων προσφέρονται για τον προσδιορισμό του βαθμού άγχους (anxiety).

Εικόνα 30. Συμπεριφορά θιγμοτακτισμού

Η πειραματική συσκευή αποτελείται από ένα τετράγωνο ανοικτό πεδίο από plexy-glass διαστάσεων 40x40cm το οποίο περιτριγυρίζεται από τοίχους ύψους 30cm. Όλη αυτή η συσκευή είναι βαμμένη μαύρη εκτός από έναν τοίχο, από τον οποίο αφήνεται να περνάει ένας ασθενής φωτισμός. Το δάπεδο της συσκευής χωρίζεται σε 25 τετράγωνα διαστάσεων 8x8cm (περιφερειακή περιοχή). Η κεντρική περιοχή της συσκευής απέχει 2,5cm από τα τοιχώματα και περιλαμβάνει τα 9 κεντρικά τετράγωνα. (Εικόνα 31). Η δοκιμασία θιγμοτακτισμού χρησιμοποιείται για την εκτίμηση του άγχους καταγράφοντας το χρόνο παραμονής στην περιφερειακή περιοχή και τον αριθμό εισόδων στην κεντρική περιοχή.

Εικόνα 31. Συσκευή ανοικτού πεδίου Η περίοδος παραμονής του ζώου στην συσκευή είναι 10min, αφού πρώτα έχει προηγηθεί η περίοδος οικειοποίησης που διαρκεί 5min. Ο τρόπος υπολογισμού του θιγμοτακτισμού, η βάδιση δηλαδή κοντά στα τοιχώματα, προσδιορίζεται από το χρόνο που παραμένει το ζώο, κοντά στην κάθετη επιφάνεια των τοίχων (απόσταση μικρότερη των 2,5cm). Πολλές ερευνητικές ομάδες προσδιορίζουν τη συχνότητα επιμέρους συμπεριφορικών καταστάσεων των πειραματοζώων, όπως το σκαρφάλωμα στα τοιχώματα και η ακινησία. Η συσκευή του ανοικτού πεδίου χρησιμοποιείται για να μελετηθεί ή επίδραση αγχογενών και αγχολυτικών φαρμάκων/ουσιών στη συμπεριφορά των πειραματόζωων. Οι Treit & Fundytus (1998) επιβεβαίωσαν προηγούμενες μελέτες που υποστήριζαν πως το τεστ θιγμοτακτισμού αποτελεί μια διαδικασία για τη μελέτη της αγχολυτικής συμπεριφοράς στα τρωκτικά. Με βάση τα αποτελέσματα που είχαν, η τάση των πειραματόζωων να παραμένουν στην περιφέρεια μειωνόταν από αγχολυτικούς παράγοντες όπως το diazepam 1-5mg/kg ή το chlordiazepoxide 1-10mg/kg. Η μείωση αυτή ήταν ανάλογη με αυτή αντίστοιχων μελετών για το άγχος σε ανθρώπους.

5.7.2 Τεστ Συμπεριφοράς με Hypericum vesiculosum

Τα τεστ συμπεριφοράς πραγματοποιήθηκαν στον εργαστήριο Φυσιολογίας Ανθρώπου & ζώων - τομέας Βιολογίας Ζώων, του τμήματος Βιολογίας, του Πανεπιστημίου Πατρών, σε συνεργασία με την Επίκουρη Καθηγήτρια Μαργαρίτη Μαριγούλα και την ερευνητική της ομάδα.

Πειραματόζωα

Τα πειραματόζωα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη ήταν ενήλικοι γηραιοί μυες (περίπου 12 μηνών), αρσενικοί και θηλυκοί Balb-c βάρους 25-35g (Εικόνα 32), ο οποίοι τρέφονταν σε πολυακρυλικά κλουβιά κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκρασίας 24-26οC, σχετικής υγρασίας 50-60% και 12h κύκλο εναλλαγής ημέρας-νύκτας. Η τροφή είχε τη μορφή κόκκων και το νερό ήταν διαθέσιμο ad lilibitum. Όλες οι πειραματικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις αρχές του κώδικα φροντίδας Εικόνα 32. Balb-c μύες, 12 των πειραματοζώων (Animal act. 160/91) μηνών. τα οποία υποβληθηκαν στην δοκιμασία ανοικτού πεδίου στην παρούσα διατριβή.

Τα πειραματόζωα διαχωρίστηκαν στις εξής ομάδες:

Αρσενικά Μάρτυρες: 6 ζώα Πειραματικά: 8 ζώα

Θηλυκά Μάρτυρες: 6 ζώα Πειραματικά: 8 ζώα

5.7.3 Χορήγηση Μεθανολικού εκχυλίσματος Hypericum vesiculosum

Η δοσολογία του μεθανολικού εκχυλίσματος που χορηγήθηκε στα πειραματόζωα, ήταν 250mg/kg. Για την χορήγηση σε 28 μύες συνολικά διαλύθηκαν 150mg ξηρού μεθανολικού εκχυλίσματος σε 400μL διμεθυλσουφοξειδίου (DMSO). Ο τρόπος χορήγησης ήταν 24 ώρες και 1 ώρα (Εικόνα 33)πριν από την δοκιμασία του θιγμοτακτισμού, ενώ ο όγκος της ένεσης ήταν 20μL για 30g ζώου.

Εικόνα 33. Σχήμα χορήγησης μεθανολικού εκχυλίσματος H. vesiculosum. Η δοσολoγία ήταν 250mg/kg σωματικού βάρους, 20μL για 30g ζώου, ενδοπεριτοναϊκά, 24h και 1h πριν από την δοκιμασία

Δοκιμασία θιγμοτακτισμού - ανοικτού πεδίου

Αρχικά τα πειραματόζωα παρέμειναν σε χαμηλό φωτισμό για 1h, στον χώρο που θα πραγματοποιείτο η δοκιμή της συμπεριφοράς, με σκοπό την ηρεμία και την εξοικείωση με το περιβάλλον. Εν συνεχεία, κάθε πειραματόζωο τοποθετήθηκε στο κέντρο της συσκευής και η παραμονή του στην συσκευή ήταν 10λεπτά. Οι παράμετροι που καταγράφηκαν ήταν ο χρόνος θιγμοτακτισμού και ο αριθμός των εισόδων στην κεντρική περιοχή της συσκευής.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

6. Αποτελέσματα και Συζήτηση

6.1 Απόδοση εκχυλίσεων

Το βάρος του ξηρού εκχυλίσματος ήταν 12,655 g, άρα η απόδοση της εκχύλισης ήταν 19,8% κ.β. Οι ποσότητες των τριών κλασμάτων που προέκυψαν από την κλασμάτωση του ξηρού μεθανολικού εκχυλίσματος ήταν οι εξής:

Το ξηρό βάρος του κλάσματος του εξανίου ήταν 4,165 g. Το ξηρό βάρος του κλάσματος του οξικού αιθυλεστέρα ήταν 3,793 g. Το ξηρό βάρος του εναπομείναντος υδατικού κλάσματος ήταν 4,690 g.

6.2 Σύγκριση μεθανολικών εκχυλισμάτων H. vesiculosum και H. perforatum με HPLC χρωματογραφία

Το H. vesiculosum ανήκει στην ομάδα Drosocarpium του γένους Hypericum L., ενώ το H. perforatum ανήκει στην ομάδα Hypericum του ίδιου γένους. Η σύγκριση των μεθανολικών εκχυλισμάτων των δύο taxa ως προς την χημική τους σύσταση έγινε με HPLC ανάλυση. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε ήταν αυτήν που είχε αναπτυχθεί στο Εργαστήριο μας, από την κ. Ευαγγελία Μαργιάννη στο πλαίσιο της μεταπτυχιακής διατριβή της το 2011, για τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό των επικρατέστερων ποσοτικά συστατικών της πόας υπερικού (H. perforatum). Η μέθοδος καλύπτει όλο το εύρος της πολικότητας που εμφανίζουν τα συστατικά του H. perforatum, όπως τα φαινολικά οξέα, τα φλαβονοειδή και οι ναφθοδιανθρόνες. Πλεονέκτημα της μεθόδου ήταν η ικανότητα διαχωρισμού ενώσεων στους χρόνους έκλουσης (γλυκοζίτες φλαβονειδών). Η καταγραφή των χρωματογραφημάτων έγινε στα 300nm, στα 350nm και στα 590nm. Στα 300nm εμφανίζουν μέγιστο απορρόφησης τα φαινολικά οξέα, στα 350nm τα φλαβονοειδή και στα 590nm οι ναφθοδιανθρόνες (Μαργιάννη, 2011).

Τα HPLC χρωματογραφήματα των μεθανολικών εκχυλισμάτων των δύο taxa απεικονίζονται στα 300nm (Εικόνα 34), στα 350nm (Εικόνα 35) και στα 590nm (Εικόνα 39). 1 - H_PERF NIK #9 meth extract h.perf UV_VIS_3 721 2 - Quantification #12 methanolic extract UV_VIS_3 mAU WVL:300 nm 1  H. vesiculosum  H. perforatum 400 1’ 2 200

2 3 1

-107 2’ min 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 62.8 Εικόνα 34. Χαρακτηριστικά HPLC μεθανολικών εκχυλισμάτων H. vesiculosum και H. perforatum στα 300nm συγκέντρωσης 1mg/mL με την μέθοδο A.

Διαπιστώθηκε ότι ανάμεσα στα δύο taxa υπάρχει ταύτιση των χρωματογραφημάτων τους, ως προς τον αριθμό των εκλουόμενων κορυφών, τους χρόνους έκλουσης και τα φάσματα απορρόφησης τους. Στα πρώτα 5 λεπτά, σύμφωνα με την προγενέστερη μελέτη, εκλούονται τα φαινολικά οξέα. Η κορυφή (1’) στο H. perforatum εκλούεται σε διαφορετικό χρόνο (2,77min) από την κορυφή (1) στο H. vesiculosum (3,78min). Το φάσμα απορρόφησης της (1) μοιάζει με της (1’) και της (2) με της (2’) (3,82 και 3,98min αντίστοιχα) (Εικόνα 35).

Σύμφωνα με την προγενέστερη μελέτη, η κορυφή (2’) είναι το χλωρογενικό οξύ. Επομένως, η ταύτιση του χρόνου έκλουσης και των φασμάτων απορρόφησης συνηγορούν στο ότι η κορυφή (2) είναι το χλωρογενικό οξύ. Η ταυτότητα, όμως, των κορυφών (1), (1’) και (3) δεν μπορεί να ταυτοποιηθεί στην παρούσα στιγμή και χρειάζονται περαιτέρω πειράματα.

Κορυφή (1’) Κορυφή (1)

Peak #11 100% at 2.77 min Peak #13 100% at 3.78 min 60.0 60.0 % Peak #11 2.73 min: 982.04 % Peak #10 2.73 min: 925.79 50% at 2.74 min: 996.68 50% at 3.76 min: 995.77 204.4 205.5 -50% at 2.80 min: 971.76 -50% at 3.81 min: 998.21

37.5 37.5

25.0 324.2 25.0 300.7

12.5 12.5 300.8322.7

nm -10.0 -10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800 Κορυφή (2’) Κορυφή (2)

Peak #21 100% at 3.82 min Peak #14 100% at 3.98 min 60.0 60.0 % 50% at 3.79 min: 977.18 % 50% at 3.94 min: 963.07 Peak #21 3.80 min: 989.48 Peak #14 3.95 min: 980.83 309.6 310.9 -50% at 3.87 min: 979.21 -50% at 4.02 min: 992.48 209.9

37.5 37.5 209.0

25.0 25.0

12.5 12.5

nm -10.0 nm -10.0 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Εικόνα 35 UV-vis φάσματα των δύο εκλουόμενων κορυφών στο H. perforatum (αριστερά-μαύρο πλαίσιο) και στο H. vesiculosum (δεξιά - μπλε πλαίσιο)

Peak #22 100% at 4.23 min 60.0 % 50% at 4.19 min: 999.49 Peak #22 4.27 min: 999.77 209.1 304.6 -50% at 4.28 min: 999.54

37.5

25.0

12.5

-10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800 Εικόνα 36. UV-vis φάσμα κορυφής (3) στα 4,23min του H. vesiculosum

1 - H_PERF NIK #9 meth extract h.perf UV_VIS_4 721 2 - Quantification #12 methanolic extract UV_VIS_4 mAU WVL:350 nm  H. vesiculosum 5  H. perforatum 400 6 200 4 7 9 11 12 2 8 10 1

-107 min 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 62.8 Εικόνα 37. Χαρακτηριστικά HPLC μεθανολικών εκχυλισμάτων H. vesiculosum και H. perforatum στα 350nm συγκέντρωσης 1mg/mL με την μέθοδο Α

Προχωρώντας στα 350nm (Εικόνα 37) όπου φαίνεται η πλειοψηφία των ενώσεων που υπάρχουν στα δύο εκχυλίσματα, παρατηρήθηκε μια ομάδα κορυφών στο διάστημα των 14 έως τα 35 λεπτά, οι οποίες υπήρχαν και στα δύο δείγματα στους ίδιους χρόνους έκλουσης. Στην ίδια περιοχή έκλουσης στην ανάλυση υπερικού από την κ. Μαργιάννη(2011) εκλούστηκαν φλαβονοειδή με μεγάλη ομοιότητα στην δομή τους αφού επρόκειτο για γλυκοζίτες της κερσετίνης, κατά κύριο λόγο. Στην προγενέστερη μελέτη και ανάλυση των πρότυπων ενώσεων, οι κορυφές (5), (6) και (11) αντιστοιχούν στον υπεροζίτη, την ισοκερσιτρίνη και την κερσετίνη, ενώ η κορυφή (12) στη Ι3-ΙΙ8 διαπιγενίνη. Οι κορυφές (4), (8) και (9) αποτελούν φλαβονοειδή , των οποίων η ταυτοποίηση χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση Όπως διαπιστώνεται, από την σύγκριση των χρόνων έκλουσης και των φασμάτων απορρόφησης, στο H. vesiculosum έχουν εκλουστεί οι αντίστοιχοι γλυκοζίτες (4 έως 6, 8, 9, 11 και 12) στους ίδιους χρόνους έκλουσης. Συγκεκριμένα η κορυφή (5) αντιστοιχεί στον υπεροζίτη, η κορυφή (6) στην ισοκερσιτρίνη, η κορυφή (11) στην κερσετίνη και η κορυφή (12) στην Ι3-ΙΙ8 διαπιγενίνη. Τα UV-vis φάσματα των κορυφών (4) έως (12) από το H. perforatum και το H. vesiculosum, παρουσιάζονται στην Εικόνα 38. Η διαφορά στα ύψη των κορυφών στην απορρόφηση είναι δηλωτική της διαφοράς συγκέντρωσης αυτών. Επομένως, στο H.perforatum οι συγκεντρώσεις των κορυφών (4) έως (6), (8), (11) και (12) είναι υψηλότερες. Η κορυφή (9), ωστόσο, ήταν υψηλότερη στο H.vesiculosum. Τα UV-vis φάσματα τους δίνονται στην Εικόνα 38, ενώ στην ίδια εικόνα φαίνονται τα φάσματα UV-vis των κορυφών (4) έως (12) στο H. vesiculosum. To χρωματογράφημα του H. vesiculosum στα 22 λεπτά και στα 30 λεπτά εμφανίζει δύο κορυφές, τις κορυφές (7) και (10), οι οποίες απουσιάζουν από το HPLC του Η. perforatum στους αντίστοιχους χρόνους. Τα φάσματα απορρόφησης τους δίνονται στην Εικόνα 39.

Κορυφή (4)

Peak #40 100% at 14.69 min Peak #53 100% at 15.28 min 60.0 60.0 % Peak #40 14.45 min: 974.30 % 50% at 15.10 min: 998.03 50% at 14.47 min: 982.21 Peak #53 15.41 min: 994.97 205.0 209.7 -50% at 14.84 min: 999.94 -50% at 15.43 min: 992.61

37.5 37.5

256.4 343.5 25.0 355.3 25.0 266.8

12.5 12.5

nm -10.0 nm -10.0 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Κορυφή (5)- υπεροζίτης

routin 100% at 20.62 min Peak #64 100% at 20.74 min 60.0 60.0 % routin 20.27 min: 894.51 % 50% at 20.64 min: 999.78 routin 50% at 20.45 min: 998.07 Peak #64 20.80 min: 999.99 205.1 203.4 routin -50% at 20.74 min: 998.64 -50% at 20.84 min: 999.98

37.5 37.5

255.2 256.3 25.0 25.0 354.9 353.3

12.5 12.5

nm -10.0 nm -10.0 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Κορυφή (6)- ισοκερσιτρίνη

hyperosite 100% at 21.41 min Peak #65 100% at 21.54 min 60.0 60.0 % hyperosite 50% at 21.23 min: 993.69 % 50% at 21.44 min: 999.93 hyperosite -50% at 21.53 min: 991.18 Peak #65 21.60 min: 999.26 205.2 203.2 hyperosite 21.57 min: 970.26 -50% at 21.64 min: 995.70

37.5 37.5

255.3 25.0 25.0 256.4 353.0 354.3

12.5 12.5

-10.0 nm -10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Κορυφή (8)

isoquercetrin 100% at 24.36 min Peak #70 100% at 24.59 min 70.0 60.0 % isoquercetrin 24.13 min: 952.16 % 50% at 24.50 min: 986.43 isoquercetrin 50% at 24.21 min: 975.60 Peak #70 24.66 min: 998.60 201.4 isoquercetrin -50% at 24.61 min: 945.93 -50% at 24.69 min: 994.04 204.4

37.5 40.0 264.1 347.1 256.5 25.0 354.6 20.0 12.5

-10.0 nm -10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Κορυφή (9)

quercitrin 100% at 26.52 min Peak #74 100% at 26.55 min 60.0 60.0 % quercitrin 26.31 min: 975.57 % 50% at 26.46 min: 999.93 quercitrin 50% at 26.38 min: 997.51 Peak #74 26.64 min: 999.83 204.4 202.9 quercitrin -50% at 26.63 min: 999.90 -50% at 26.64 min: 999.82

37.5 37.5

256.5 255.3 25.0 25.0 349.1 347.8

12.5 12.5

-10.0 nm -10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Κορυφή (11)- κερσετίνη

quercetin 100% at 31.85 min Peak #97 100% at 31.79 min 60.0 60.0 % quercetin 50% at 31.82 min: 996.65 % 50% at 31.75 min: 994.27 quercetin -50% at 31.90 min: 993.53 Peak #97 31.75 min: 994.41 205.2 207.1 quercetin 31.96 min: 868.51 -50% at 31.84 min: 984.00

37.5 37.5 254.5 365.7 255.7 375.3 25.0 25.0

12.5 12.5

-10.0 nm -10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Κορυφή (12)- Ι3-ΙΙ8 διαπιγενίνη

biapigenin 100% at 32.96 min Peak #101 100% at 32.87 min 60.0 60.0 % biapigenin 32.89 min: 918.46 % 50% at 32.83 min: 997.18 biapigenin 50% at 32.92 min: 991.36 Peak #101 32.84 min: 998.10 210.9 210.8 biapigenin -50% at 32.99 min: 982.70 -50% at 32.91 min: 992.46

269.0 267.8

37.5 37.5

331.3 330.1 25.0 25.0

12.5 12.5

-10.0 nm -10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Εικόνα 38. UV- vis φάσματα των κορυφών 4-12 των δύο taxa στο διάστημα 20-35 min. Αριστερά (μαύρο πλαίσιο) H. perforatum και Δεξιά (μπλέ πλαίσιο) H. vesiculosum

Κορυφή (7)

Peak #60 100% at 22.02 min 60.0 % Peak #60 21.85 min: 998.31 50% at 21.93 min: 999.97 203.1 -50% at 22.12 min: 999.95

37.5

255.4 25.0 352.7

12.5

-10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800

Κορυφή (10)

Peak #86 100% at 30.07 min 60.0 % 50% at 30.04 min: 999.84 -50% at 30.12 min: 994.87 203.1 Peak #86 30.12 min: 993.61

37.5

255.3 25.0 352.9

12.5

-10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800

Εικόνα 39. Φάσματα απορρόφησης κορυφών (7) και (10) στο H. vesiculosum

Τέλος σύμφωνα με την ανάλυση του H. perforatum μεταξύ 35 και 45 min εκλούονται οι ναφθοδιανθρόνες, με μέγιστο απορρόφησης στα 590nm. Στην ίδια περιοχή εκλούονται μια ομάδα ενώσεων και στο H. vesiculosum, των οποίων o αριθμός των κορυφών αλλά και ο χρόνος έκλουσης και τα φάσματα απορρόφησης σχεδόν ταυτίζονται με το H. perforatum. Στην Εικόνα 40 φαίνονται τα HPLC χρωματογραφήματα των δύο δειγμάτων στα 590nm.

1 - H_PERF NIK #9 [1 peak manually assigned] meth extract h.perf UV_VIS_5 160 2 - Quantification #12 methanolic extract UV_VIS_5 mAU WVL:590 nm

 H. vesiculosum 14  H. perforatum 100

2 13 15 1

-20 min -0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 63.0 Εικόνα 40. Χαρακτηριστικά HPLC μεθανολικών εκχυλισμάτων H. vesiculosum και H. perforatum στα 590nm συγκέντρωσης 1mg/mL με την μέθοδο Α

Όπως φαίνεται και παραπάνω οι κορυφές και ο χρόνος έκλουσης των δύο taxa ταυτίζονται, ενώ όπως παρατίθεται στην Εικόνα 41 τα φάσματα των κορυφών μοιάζουν αρκετά. Πιο συγκεκριμένα οι κορυφές εκλούονται και στα δύο δείγματα στους χρόνους 37min (13), 38min (14) και 42min (15). Σύμφωνα με τη προηγούμενη μελέτη και την ανάλυση της πρότυπης ένωσης της υπερικίνης, η κορυφή (14) αντιστοιχεί στην ψευδοϋπερικίνη, ενώ η κορυφή (15) στην υπερικίνη. Από την σύγκριση των χρόνων έκλουσης και των φασμάτων απορρόφησης (Εικόνα 40 και 41) εικάζεται ότι και οι

Data_Collection_Rate = 2.00, Rise_Time = 2.00, Wvl = 590, Bw = 10, RefWavelength = Off, RefBandwidthAz10, = RefWavelength Off, 10, = = 590,Bw = Wvl 2.00, Data_Collection_Rate = Rise_Time 2.00, = αντίστοιχες κορυφές στο H. vesiculosum, είναι η ψευδοϋπερικίνη και η υπερικίνη, άλλα η τελική επιβεβαίωση έγινε με την απομόνωση αυτών σε μεγάλη καθαρότητα και χαρακτηρισμό τους με φασματοσκοπικές τεχνικές.

Κορυφή (13)

Peak #109 100% at 37.38 min Peak #174 100% at 37.15 min 60.0 60.0 % 50% at 37.35 min: 994.94 % 50% at 37.12 min: 998.69 -50% at 37.43 min: 986.36 Peak #174 37.16 min: 991.56 256.0 254.6 Peak #109 37.45 min: 916.19 -50% at 37.18 min: 922.44 217.1220.1

37.5 37.5 292.6

25.0 25.0 539.4

12.5 12.5

nm -10.0 -10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Κορυφή (14)- ψευδοϋπερικίνη

pseudohypericin 100% at 38.19 min Peak #175 100% at 37.98 min 60.0 60.0 % pseudohypericin 38.14 min: 973.32 % 50% at 37.94 min: 974.61 pseudohypericin 50% at 38.15 min: 985.84 -50% at 38.02 min: 988.92 232.5 216.2 218.2 pseudohypericin -50% at 38.25 min: 963.39 Peak #175 38.07 min: 881.84

591.2 37.5 37.5 249.0 589.6

25.0 25.0

12.5 12.5

-10.0 nm -10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Κορυφή (15)- υπερικίνη

hypericin 100% at 42.58 min Peak #193 100% at 42.18 min 60.0 60,0 % hypericin 42.50 min: 920.23 % Peak #193 42.08 min: 925.86 50% at 42.12 min: 996.94 hypericin 50% at 42.51 min: 957.44 234.4 218.8 -50% at 42.28 min: 997.95 hypericin -50% at 42.70 min: 889.05 50,0 230.9 591.0 37.5 37,5 285.7 589.4

25.0 25,0

12.5 12,5

0,0

nm -10.0 -10,0 nm 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Εικόνα 41. UV- vis φάσματα των κορυφών 13, 14, 15 των δύο taxa στο διάστημα 35-45 min. Αριστερά (μαύρο πλαίσιο) H. perforatum και Δεξιά (μπλε πλαίσιο) H. vesiculosum

Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 13 τα ποσοστά των κορυφών που ταυτοποιήθηκαν στο H. vesiculosum είναι μικρότερα σε σχέση με το H. perforatum, με εξαίρεση την κορυφή (9) που βρέθηκε να είναι 20,3% παραπάνω στο H. vesiculosum. Όσον αφορά τις ναφθοδιανθρόνες στο σύνολο τους, το ποσοστό τους ήταν αρκετά μικρότερο σε σχέση με το H. perforatum , το οποίο ήταν 85% περίπου λιγότερο στο H.vesicusolsum. Στην μελέτη του Kitanov (2001) όπου μελέτησε 36 taxa ως προς την φυτοχημική τους σύσταση σε ναφθοδιανθρόνες, με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας, διαπίστωσε πως το πόσοστο των ναφθοδιανθρόνων κυμάνθηκε από 0,009% έως 0,512% σε σχέση με το H.perforatum.

Πίνακας 13 Σύγκριση εμβαδών κορυφών από την χρωματογραφική ανάλυση, στις ίδιες συνθήκες, των μεθανολικών εκχυλισμάτων των H.perforatum και H.vesiculosum (1mg/mL). Η ολοκλήρωση για κάθε κορυφή έγινε στο μέγιστο μήκος απορρόφησης, δηλαδή του χλωρογενικού οξέος στα 300nm, των φλαβονοειδών στα 350nm και των ναφθοδιανθρονών στα 590nm. Ένωση Χρόνος έκλουσης Hypericum Hypericum Ποσοστιαία (min) perforatum vesiculosum αναλογία (εμβαδό (εμβαδό (εμβαδό κορυφής) κορυφής) κορυφής) % Υπεροζίτης (5) 20 144.5727 80.5363 -44,3 Ισοκερσιτρίνη (6) 21 44.3484 38.1897 -13,9 Φλαβονοειδές (9) 26 11.5168 13.8574 +20,3 Κερσετίνη (11) 31 12.1806 3.4213 -71,9 Ι3-ΙΙ8 Διαπιγενίνη (12) 32 11.5008 3.3828 -70,6 Ψευδοϋπερικίνη (14) 38 13.3453 2.0069 -84,97 Υπερικίνη (15) 42 13.0221 1.8952 -85,45

6.3 Σύγκριση των κλασμάτων οξικού αιθυλεστέρα, εξανίου και υδατικού με HPLC ανάλυση

Το ξηρό εκχύλισμα του H. vesiculosum επαναδιαλυτοποιήθηκε σε ζεστό νερό (40o C) και διηθήθηκε σε ηθμό. Ενδεχομένως υδρόφοβα συστατικά που «παρέμειναν» στον ηθμό, ελήφθησαν ύστερα από πλύση αυτού με ελάχιστη ποσότητα μεθανόλης. Στην συνέχεια από αυτό το διάλυμα προέκυψαν 3 κλάσματα, ύστερα από εξαντλητική εκχύλιση πρώτα με εξάνιο(hexane) και στην συνέχεια με οξικό αιθυλεστέρα (AcOEt). Τα κλάσματα αυτά (εξανίου, οξικού αιθυλεστέρα, υδατικό) αναλύθηκαν με HPLC χρωματογραφία με μέθοδο την ίδια που αναλύθηκε και το μεθανολικό εκχύλισμα του H. vesiculosum.

Στην Εικόνα 42 απεικονίζονται τα HPLC χρωματογραφήματα των 3 κλασμάτων του Η. vesiculosum στα 300nm, στην Εικόνα 45 στα 350nm και στην Εικόνα 53 στα 590nm.

1 - Quantification #17 H. vesiculosum hexane 1.2mg/ml Mariana UV_VIS_3 2 - Quantification #16 H. vesiculosum AcOEt 1mg/ml Mariana UV_VIS_3 203 3 - Quantification #13 H. vesiculosum aq 1mg/ml UV_VIS_3 mAU WVL:300 nm  Aqueous 150 2  AcOEt  100 16 hexane 2 50 3 1 2 1

-43 min -0.3 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 63.1

Εικόνα 42. Χαρακτηριστικά HPLC χρωματογραφήματα των τριών κλασμάτων, εξανίου(hexane), οξικού αιθυλεστέρα(AcOEt) και υδατικού κλάσματος(Aqueous) με τη μέθοδο Α στα 300nm. Η συγκέντρωση ήταν 1mg/mL για τα κλάσματα AcOEt και Aqueous, ενώ η συγκέντρωση του κλάσματος hexane ήταν 1,2mg/mL.

Το πιο εμπλουτισμένο κλάσμα από τις εκχυλίσεις φαίνεται να είναι αυτό του οξικού αιθυλεστέρα, συμπέρασμα το οποίο προκύπτει από την πλειάδα κορυφών στο χρωματογράφημα, αλλά και από την ένταση τους. Η εκχύλιση ήταν εξαντλητική κάτι το οποίο φαίνεται στο χρωματογράφημα του υδατικού κλάσματος(στο οποίο έγινε η εκχύλιση) και στα 3 μήκη κύματος.

Data_Collection_Rate = 2.00, Rise_Time = 2.0, Wvl = 300, Bw = 10, RefWavelength = Off, RefBandwidthAz10, = RefWavelength Off, 10, = = 300,Bw = Wvl 2.0, Data_Collection_Rate = Rise_Time2.00, = Πιο συγκεκριμένα στα 5 πρώτα λεπτά, στην περιοχή που εκλούονται τα φαινολικά οξέα, στην Εικόνα 42 η κορυφή (2) εκλούεται στον ίδιο χρόνο στα κλάσματα Aqueous και AcOEt και τα φάσματα απορρόφησης απεικονίζονται στην Εικόνα 43.

Peak #14 100% at 2.99 min Peak #15 100% at 3.37 min 60.0 60.0 % 50% at 2.93 min: 995.87 % 50% at 3.31 min: 999.13 Peak #14 3.05 min: 999.25 Peak #15 3.38 min: 999.98 323.2 323.4 -50% at 3.08 min: 998.98 -50% at 3.44 min: 999.76 216.1 217.1 37.5 37.5

236.1 25.0 25.0

12.5 12.5

-10.0 nm -10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Εικόνα 43. UV-vis φάσματα της κορυφής (2) στο υδατικό κλάσμα(αριστερά-ροζ πλαίσιο) και στο AcOEt κλάσμα(δεξιά - μπλε πλαίσιο) στα 3 λεπτά

Στα 2,5 min παρατηρήσαμε στο Aqueous κλάσμα την κορυφή (16) η οποία δεν φαίνεται στα HPLC των άλλων κλασμάτων, ενώ τo φάσμα απορρόφησης δίνεται στην Εικόνα 44.

Peak #12 100% at 2.50 min 120 % 50% at 2.47 min: 976.87 Peak #12 2.48 min: 999.13 -50% at 2.53 min: 979.08

286.2 50 229.5

-20 nm 200 300 400 500 600 700 800

Εικόνα 44. UV-vis φάσμα κορυφής (16) στα 2,5 λεπτά του υδατικού κλάσματος(Aqueous)

1 - Quantification #17 H. vesiculosum hexane 1.2mg/ml Mariana UV_VIS_4 2 - Quantification #16 H. vesiculosum AcOEt 1mg/ml Mariana UV_VIS_4 341 3 - Quantification #13 H. vesiculosum aq 1mg/ml UV_VIS_4 mAU WVL:350 nm 7  Aqueous  AcOEt 200 17  hexane 6 11 12 100 3 4 9 2 18 19 2 8

0 1

-109 min -0.1 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 63.0 Εικόνα 45. Χαρακτηριστικά HPLC χρωματογραφήματα των τριών κλασμάτων, εξανίου(hexane), οξικού αιθυλεστέρα(AcOEt) και υδατικού κλάσματος(Aqueous) με τη μέθοδο Α στα 350nm. Η συγκέντρωση ήταν 1mg/mL για τα κλάσματα AcOEt και Aqueous, ενώ η συγκέντρωση του κλάσματος hexane ήταν 1,2mg/mL.

Προχωρώντας στα 350nm (Εικόνα 45) παρατηρούνται 10 περίπου κορυφές στο κλάσμα AcOEt στο διάστημα των 14 λεπτών έως τα 35 λεπτά. Στην ίδια περιοχή έκλουσης στο αποτύπωμα του μεθανολικού εκχυλίσματος εκλούστηκαν τα φλαβονοειδή. Συγκεκριμένα στα 15 λεπτά στο κλάσμα του AcOEt έχει εκλουστεί η κορυφή (4), η οποία στο HPLC του μεθανολικού εκχυλίσματος του H. perforatum είχε εκλουστεί στον ίδιο χρόνο. Το φάσμα

απορρόφησης της δίνεται στην Εικόνα 46. Data_Collection_Rate = 2.00, Rise_Time = 2.0, Wvl = 350, Bw = 10, RefWavelength = Off, RefBandwidthAz10, = RefWavelength Off, 10, = = 350,Bw = Wvl 2.0, Data_Collection_Rate = Rise_Time2.00, =

Κορυφή (4)

Peak #53 100% at 15.28 min 60.0 % 50% at 15.10 min: 998.03 Peak #53 15.41 min: 994.97 209.7 -50% at 15.43 min: 992.61

37.5

343.5 25.0 266.8

12.5

-10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800

Εικόνα 46. UV-vis φάσμα απορρόφησης κορυφής (4) στο κλάσμα AcOEt (αριστερά) και στο μεθανολικό εκχύλισμα του H. vesiculosum (δεξιά)

Στα 19 min και στα 3 κλάσματα έχει εκλουστεί η κορυφή (17), της οποίας το φάσμα απορρόφησης φαίνεται στην Εικόνα 47 (μπλε πλαίσιο). Στον ίδιο χρόνο δεν είχε εκλουστεί στο μεθανολικό εκχύλισμα κάποια κορυφή. Όσον αφορά το ύψος της κορυφής, το οποίο είναι ενδεικτικό της συγκέντρωσης, στο κλάσμα του AcOEt είναι υψηλότερο σε σχέση με τα άλλα κλάσματα(ίσα που ξεχωρίζουν στο HPLC) του εξανίου και το υδατικό. Κατόπιν ανάλυσης με πρότυπα δείγματα και μελέτη των φασμάτων απορρόφησης, η κορυφή (17) αποτελεί το φλαβονοειδές ρουτίνη.

Κορυφή (17)- ρουτίνη

Peak #58 100% at 19.73 min Peak #80 100% at 19.50 min 60.0 60.0 % Peak #58 19.57 min: 996.07 % 50% at 19.40 min: 999.57 50% at 19.63 min: 999.75 Peak #80 19.40 min: 999.61 212.6 212.5 -50% at 19.83 min: 999.76 -50% at 19.61 min: 999.02

37.5 37.5

337.1 267.3 334.9337.3 25.0 25.0

12.5 12.5

-10.0 nm -10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Peak #73 100% at 18.98 min 60.0 % 50% at 18.87 min: 995.54 Peak #73 18.93 min: 999.61 212.2 -50% at 19.10 min: 994.97

37.5

337.2 267.1 25.0

12.5

-10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800

Εικόνα 47. UV-vis φάσμα απορόφησης κορυφής (17)- ρουτίνη στα 19 λεπτά των κλασμάτων AcOEt(μπλε πλαίσιο), hexane(μαύρο πλαίσιο) και Aqueous(ροζ πλαίσιο)

Η κορυφή (6) που αντιστοιχεί στην ισοκερσιτρίνη στο μεθανολικό εκχύλισμα εκλούστηκε στα 21 λεπτά. Στον ίδιο χρόνο εκλούστηκε μόνο στο κλάσμα του AcOEt, ενώ στα άλλα δύο κλάσματα απουσίαζε. Τα φάσμα απορρόφησης της κορυφής στα δύο HPLC δίνονται στην Εικόνα 48.

Κορυφή (6)- ισοκερσιτρίνη

Peak #59 100% at 21.25 min Peak #65 100% at 21.54 min 60.0 60.0 % Peak #59 21.11 min: 999.18 % 50% at 21.44 min: 999.93 50% at 21.13 min: 999.62 Peak #65 21.60 min: 999.26 202.8 203.2 -50% at 21.35 min: 999.69 -50% at 21.64 min: 995.70

37.5 37.5

255.2 255.3 25.0 25.0 353.2 353.0

12.5 12.5

nm -10.0 nm -10.0 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Εικόνα 48. UV- vis φάσμα απορρόφησης της κορυφής (6)- ισοκερσιτρίνη στο κλάσμα του AcOEt (αριστερά) και του μεθανολικόυ εκχυλίσματος(δεξιά)

Η κορυφή (7), που εκλούεται στα 22 λεπτά, φαίνεται να ταυτίζεται σε μεγάλο βαθμό με την αντίστοιχη κορυφή στον ίδιο χρόνο στο κλάσμα του εξανίου(Εικόνα 50-μαύρο πλαίσιο), με πολύ μικρότερη ένταση όμως. Η κορυφή είχε εκλουστεί στο μεθανολικό εκχύλισμα του H. vesiculosum αλλά όχι στο H. perforatum.

Κορυφή (7)

Peak #60 100% at 22.02 min Peak #82 100% at 21.88 min 60.0 60.0 % Peak #60 21.85 min: 998.31 % 50% at 21.77 min: 999.76 50% at 21.93 min: 999.97 Peak #82 21.83 min: 999.99 203.1 203.8 -50% at 22.12 min: 999.95 -50% at 21.98 min: 998.15

37.5 37.5

255.4 255.6 25.0 25.0 352.7 352.4

12.5 12.5

nm -10.0 nm -10.0 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Εικόνα 49. UV-vis φάσμα απορρόφησης κορυφής (7) στα 22 λεπτά των κλασμάτων AcOEt (αριστερά), hexane (δεξιά), μεθανολικού εκχυλίσματος(κάτω)

Στην συνέχεια η κορυφή (8) που εκλούεται στα 24 λεπτά εμφανίζει μεγάλη ομοιότητα με την αντίστοιχη κορυφή, στον ίδιο χρόνο έκλουσης, στο υδατικό κλάσμα. Τα UV-vis φάσματα των δύο κορυφών παρατίθενται στην Εικόνα 50. Η κορυφή (8) είχε τον ίδιο χρόνο έκλουσης στο μεθανολικό εκχύλισμα του H. vesiculosum.

Κορυφή (8)

Peak #65 100% at 24.10 min Peak #85 100% at 24.43 min 60.0 60.0 % 50% at 24.01 min: 979.29 % 50% at 24.34 min: 991.54 Peak #65 24.03 min: 994.50 Peak #85 24.34 min: 991.54 202.8 205.1 -50% at 24.18 min: 992.55 -50% at 24.53 min: 997.22

37.5 37.5 264.5 264.2 346.3 25.0 347.3 25.0

12.5 12.5

-10.0 nm -10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Peak #70 100% at 24.59 min 60.0 % 50% at 24.50 min: 986.43 Peak #70 24.66 min: 998.60 201.4 -50% at 24.69 min: 994.04

37.5 264.1 347.1 25.0

12.5

-10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800

Εικόνα 50. UV-vis φάσματα κορυφής (8) με χρόνο έκλουσης τα 24 λεπτά στα κλάσματα AcOEt (αριστερά), Aqueous(δεξιά) και μεθανολικό εκχυλίσμα(κάτω)

Στο κλάσμα του οξικού αιθυλεστέρα(AcOEt) στα 25 και 27 λεπτά εκλούστηκαν οι κορυφές (18) και (19) αντίστοιχα. Αντίστοιχες κορυφές δεν υπήρχαν στα άλλα δύο κλάσματα. Τα φάσματα των δύο κορυφών (Εικόνα 51) εμφανίζουν μεγάλη ομοιότητα με τα φάσματα των γλυκοζιτών φλαβονοειδών, αλλά η ταυτότητα τους δεν έχει εξακριβωθεί.

Peak #67 100% at 25.01 min 100 % 50% at 24.91 min: 999.62 Peak #67 24.91 min: 999.68 -50% at 25.11 min: 999.19 80

60 264.4 346.7 40

-10 nm Κορυφή (18) 200 300 400 500 600 700 800 Peak #72 100% at 27.30 min 120 % 50% at 27.22 min: 987.25 Peak #72 27.38 min: 995.25 -50% at 27.39 min: 993.20

336.0 50 266.2

-20 nm Κορυφή (19) 200 300 400 500 600 700 800 Εικόνα 51 UV-vis φάσματα κορυφών (18) και (19) που εκλούστηκαν στο κλάσμα AcOEt

Οι κορυφές (9), (11) και (12) που εκλούστηκαν στα 26, 31 και 32 λεπτά, εκλούστηκαν στους ίδιους χρόνους στο κλάσμα AcOEt σε σχέση με το μεθανολικό εκχύλισμα. Οι κορυφές (11) και (12) αντιστοιχούν στην κερσετίνη και στην Ι3-ΙΙ8 διαπιγενίνη, ενώ η Ι3-ΙΙ8 διαπιγενίνη εκλούστηκε και στο κλάσμα του εξανίου. Τα φάσματα των τριών κορυφών δίνονται στην Εικόνα 52.

Κορυφή (9)

Peak #71 100% at 26.65 min Peak #74 100% at 26.55 min 100 60.0 % Peak #71 26.54 min: 999.11 % 50% at 26.46 min: 999.93 50% at 26.56 min: 999.68 Peak #74 26.64 min: 999.83 202.9 -50% at 26.74 min: 999.11 -50% at 26.64 min: 999.82 80

37.5 60 264.4 255.3 346.2 25.0 40 347.8

12.5 20

nm -10 -10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800 UV-vis φάσματα της κορυφής (9) του κλάσματος AcOEt(αριστερά) και της αντίστοιχης κορυφής στο μεθανολικό εκχύλισμα (δεξιά) στον ίδιο χρόνο έκλουσης στα 26 λεπτά

Κορυφή (11)- κερσετίνη

Peak #91 100% at 31.87 min Peak #97 100% at 31.79 min 60.0 60.0 % 50% at 31.83 min: 990.45 % 50% at 31.75 min: 994.27 Peak #91 31.91 min: 975.08 Peak #97 31.75 min: 994.41 205.7 207.1 -50% at 31.91 min: 968.90 -50% at 31.84 min: 984.00

37.5 37.5 254.6 365.8 254.5 365.7

25.0 25.0

12.5 12.5

nm -10.0 -10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

UV-vis φάσματα της κορυφής (11)-κερσετίνη του κλάσματος AcOEt(αριστερά) και της αντίστοιχης κορυφής στο μεθανολικό εκχύλισμα (δεξιά) στον ίδιο χρόνο έκλουσης στα 31 λεπτά

Κορυφή (12)- Ι3-ΙΙ8 διαπιγενίνη

crocetin 100% at 32.91 min 60.0 % crocetin 50% at 32.88 min: 993.93 H_PERF NIK #9 meth extract h.perf: biapigenin 32.92 min: 997.42 209.8 crocetin -50% at 32.95 min: 978.08 267.8

37.5

329.7 25.0

12.5

-10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800 Εικόνα 52. UV-vis φάσματα της κορυφής (12) του κλάσματος AcOEt(αριστερά), της αντίστοιχης κορυφής στο κλάσμα hexane(δεξιά) στον ίδιο χρόνο έκλουσης στα 32 λεπτά

Τέλος στα 590nm (Εικόνα 53), όπου εκλούονται οι ναφθοδιανθρόνες, είχαμε 3 κορυφές στα 37, 38 και 42 λεπτά, τις κορυφές (13), (14) και (15) αντίστοιχα, στο κλάσμα του οξικού αιθυλεστέρα. Στο κλάσμα του εξανίου φαίνεται να εκλούστηκαν ίχνη των αντίστοιχων κορυφών, ενώ στο υδατικό κλάσμα δεν εντοπίστηκαν καθόλου. Στα κλάσμα εξανίου, ωστόσο, εμφανίστηκε μια κορυφή (20) στα 46 λεπτά, αν και με μικρή απορρόφηση, το φάσμα της οποίας δίνεται στην Εικόνα 56.

1 - Quantification #17 H. vesiculosum hexane 1.2mg/ml Mariana UV_VIS_5 2 - Quantification #16 H. vesiculosum AcOEt 1mg/ml Mariana UV_VIS_5 50.9 3 - Quantification #13 H. vesiculosum aq 1mg/ml UV_VIS_5 mAU WVL:590 nm  Aqueous  AcOEt  hexane 20.0 3 14 15 2 13

0.0 1 20 -14.4 min -0.2 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 63.2 Εικόνα 53. Χαρακτηριστικά HPLC χρωματογραφήματα των τριών κλασμάτων, εξανίου(hexane), οξικού αιθυλεστέρα(AcOEt) και υδατικού κλάσματος(Aqueous) με τη μέθοδο Α στα 590nm. Η συγκέντρωση ήταν 1mg/mL για τα κλάσματα AcOEt και Aqueous, ενώ η συγκέντρωση του κλάσματος hexane ήταν 1,2mg/mL.

Data_Collection_Rate = 2.00, Rise_Time = 2.0, Wvl = 590, Bw = 10, RefWavelength = Off, RefBandwidthAz10, = RefWavelength Off, 10, = = 590,Bw = Wvl 2.0, Data_Collection_Rate = Rise_Time2.00, = Τα φάσματα απορρόφησης των κορυφών (13), (14) και (15) στο AcOEt δίνονται στην Εικόνα 54.

Κορυφή (11)

Peak #174 100% at 37.15 min 60.0 % 50% at 37.12 min: 880.37 Peak #174 37.13 min: 956.89 254.7 -50% at 37.20 min: 791.62

37.5 293.6

539.2 25.0

12.5

-10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800

Κορυφή (12)- ψευδοϋπερικίνη

Peak #175 100% at 37.98 min 60.0 % 50% at 37.94 min: 974.61 -50% at 38.02 min: 988.92 216.2 Peak #175 38.07 min: 881.84

37.5 249.0 589.6

25.0

12.5

-10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800

Κορυφή (13)- υπερικίνη

hypericin 100% at 42.84 min 60.0 % hypericin 50% at 42.77 min: 998.67 hypericin 42.91 min: 996.43 218.6 hypericin -50% at 42.94 min: 987.04 233.4

589.4 37.5

25.0

12.5

-10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800 Εικόνα 54. κορυφές (13), (14)-ψευδοϋπερικίνη και (15)-υπερικίνη των ναφθοδιανθρονών στο κλάσμα AcOEt

Στην Εικόνα 55 φαίνεται το φάσμα απορρόφησης της κορυφής που εμφανίζεται στο κλάσμα εξανίου(hexane) με χρόνο έκλουσης τα 46 λεπτά. To συγκεκριμένο φάσμα απορρόφησης είναι «περίεργο», όχι χαρακτηριστικό των ναφθοδιανθρονών, για αυτό το λόγο η ταυτοποίηση της χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση.

Peak #163 100% at 46.43 min 60.0 % 50% at 46.34 min: 999.29 Peak #163 46.42 min: 1000.00 407.2 -50% at 46.54 min: 999.58

37.5

25.0 663.6

327.6 12.5

-10.0 nm 200 300 400 500 600 700 800

Εικόνα 55. UV-vis φάσμα απορρόφησης κορυφής στα 46 λεπτά του κλάσματος του εξανίου(hexane)

6.4 Απομόνωση ναφθοδιανθρονών με κλασική υγρή χρωματογραφία στήλης

Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκαν δοκιμές με χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) για να εντοπιστεί το κατάλληλο σύστημα έκλουσης για την πραγματοποίηση κλασικής υγρής χρωματογραφίας στο κλάσμα του οξικού αιθυλεστέρα με στόχο την απομόνωση των ναφθοδιανθρονών.

Εικόνα 56. (αριστερή εικόνα)Σύστημα έκλουσης από αριστερά προς τα δεξιά  εξάνιο (100%)  εξάνιο:AcOEt (5:5)

 εξάνιο:AcOEt (1:4) (δεξιά εικόνα) Σύστημα έκλουσης από αριστερά προς τα δεξιά  MeOH: AcOEt (5:5)  MeOH (100%)

Στην πρώτη δοκιμή (Εικόνα 56), όπου ο διαλύτης ήταν 100% εξάνιο, δεν παρατηρήθηκε μετακίνηση του δείγματος στην πλάκα TLC. Αυτό σημαίνει πως οι περιεχόμενες ενώσεις χρειάζονται ένα πιο πολικό σύστημα διαλυτών για να «τρέξουν», κατ’επέκταση να εκλουστούν στην χρωματογραφία στήλης. Στην δεύτερη περίπτωση, όπου οι διαλύτες ήταν εξάνιο:AcOEt (50:50), παρατηρήθηκε μετακίνηση των ενώσεων του δείγματος επάνω στην πλάκα, ενώ το ίδιο παρατηρήθηκε και στην τρίτη περίπτωση (εξάνιο:AcOEt-1:4). Ωστόσο επειδή η μετακίνηση ήταν «ομαλότερη» στην τρίτη περίπτωση, σε σχέση με την δεύτερη που οι ενώσεις μετακινήθηκαν «μαζί», το εναρκτήριο σύστημα έκλουσης της στήλης επιλέχθηκε το εξάνιο:AcOEt (1:4) Εικόνα 57. Εικόνα από v/v. Η πολικότητα του συστήματος έκλουσης για την χρωματογραφία στήλης silica 60A χρωματογραφία στήλης του κλάσματος του οξικού αιθυλεστέρα με σύστημα έκλουσης εξάνιο: ήταν αυξανόμενης πολικότητας, διότι με αυτόν τον τρόπο ο οξικός αιθυλεστέρας: μεθανόλη διαχωρισμός των ενώσεων ήταν καλύτερος. Όταν ο εκλούτης (αυξανόμενης πολικότητας) του έφτασε στο 100% AcOEt, η πολικότητα αυξήθηκε με τη κλάσματα οξικού αιθυλεστέρα (AcOEt) προσθήκη μεθανόλης. Η τελική έκλουση έγινε με 100% MeOH. Η κλασική χρωματογραφία στήλης έγινε σε silica gel 60A (43-60 mesh μέγεθος σωματιδίων) (Εικόνα 58). Κατά τη διάρκεια του πειράματος λαμβάνονταν κλάσματα μικρού όγκου σε δοκιμαστικούς σωλήνες, ώστε να επιτευχθεί ο καλύτερος δυνατός διαχωρισμός ενώσεων. Παράλληλα με το πείραμα πραγματοποιούνταν δοκιμές TLC των δειγμάτων, που

λαμβάνονταν διαδοχικά σε πλάκες silica gel 60 με δείκτη φθορισμού F254, για την ομαδοποίηση αυτών σε όσο το δυνατόν λιγότερα κλάσματα. Τα συστήματα που χρησιμοποιήθηκαν για της δοκιμές αυτές ήταν δύο (Lauro Nuevas-Paz et al. 2005) : A. Χλωροφόρμιο: Μεθανόλη (9:1) B. Οξικός αιθυλεστέρας: Φορμικό οξύ: Οξικό οξύ: Νερό (100:11:11:27) Το πρώτο σύστημα χρησιμοποιήθηκε κατά την έκλουση των λιγότερο πολικών ενώσεων και όταν τα δείγματα προς ανάλυση δεν διαχωρίζονταν καλά, άρχισε να χρησιμοποιείται το δεύτερο σύστημα. Στις Εικόνα 58 παρατίθενται δείγματα από δοκιμές TLC κατά την διάρκεια της χρωματογραφίας στήλης.

Εικόνα 58. Δοκιμές TLC σε διαδοχικά κλάσματα της χρωματογραφίας στήλης του κλάσματος AcOEt με το σύστημα (Α) Στην Εικόνα 59 φαίνεται η μετάβαση από το σύστημα (A) στο σύστημα (B). Και στις δύο εικόνες πρόκειται για τα ίδια δείγματα προς ανάλυση όμως αριστερά το σύστημα δεν είναι κατάλληλο για να «τρέξουν» τα δείγματα στην πλάκα TLC. Στην δεξιά Εικόνα που έγινε χρήση του συστήματος (A) ο διαχωρισμός ήταν επιτυχής.

Εικόνα 59. Δοκιμή TLC στα ίδια κλάσματα με τα δύο συστήματα έκλουσης. Αριστερά (Α) και Δεξιά (Β)

Από την χρωματογραφία αυτήν προέκυψαν 11 κλάσματα (Α-Κ) όπως αυτά απεικονίζονται στην Εικόνα 60.

Εικόνα 60. Σχεδιάγραμμα με κλάσματα από στήλη silica 60A του AcOEt κλάσματος

Στην Εικόνα 61 απεικονίζονται τα 11 κλάσματα που προέκυψαν από την στήλη με TLC χρωματογραφία. H TLC των κλασμάτων A-H έγινε με το σύστημα (A) και των κλασμάτων Ι-K με το σύστημα (B).

Σε κύκλο εντοπίζονται οι ναφθοδιανθρόνες, οι επιθυμητές ενώσεις προς απομόνωση

Α Β C D E F G H I J K Εικόνα 61. TLC κλασμάτων A-K

Στην συνέχεια έγιναν δοκιμές TLC με διάφορα συστήματα έκλουσης (Wagner, H., S. Bladt & E.M. Zgainski, 1984) στα κλάσματα G,H,I,J με σκοπό να βρεθεί το κατάλληλο σύστημα έκλουσης για την ανίχνευση των ναφθοδιανθρονών και σε ποιο από τα τέσσερα αυτά κλάσματα θα γινόταν η επόμενη χρωματογραφία στήλης. Ο λόγος που το ενδιαφέρον εστιάστηκε σε αυτά τα κλάσματα έγκεται στο γεγονός πως οι ναφθοδιανθρόνες σε οργανικούς διαλύτες έχουν χρώμα κόκκινο (Wynn and Cotton, 1995) και στην προκειμένη περίπτωση το κλάσμα Ι είχε χρώμα κόκκινο. Έγινε, παρόλα αυτά, έλεγχος και στα κλάσματα G, H, J για να διαπιστωθεί μήπως είχαν και εκείνα ποσότητα των επιθυμητών ενώσεων. Τα πρώτα συστήματα που δοκιμάστηκαν ήταν τα εξής: 1. Οξικός αιθυλεστέρας: Μεθανόλη: Νερό (100:17:13) 2. Οξικός αιθυλεστέρας: Μεθανόλη: Νερό (100:13,5:10) 3. Πετρελαϊκός αιθέρας: Οξικός αιθυλεστέρας:Φορμικό οξύ (75:25:1) Τα αποτελέσματα δεν «έδωσαν» ικανοποιητικούς διαχωρισμούς (Εικόνα 62).

Εικόνα 62. TLC δοκιμές των κλασμάτων G,H,I,J με τα συστήματα έκλουσης (1),(2),(3) από αριστερά προς τα δεξιά

Άλλα πιλοτικά συστήματα έκλουσης που δοκιμάστηκαν ήταν τα εξής: 4. Οξικός αιθυλεστέρας: Μεθανόλη (8:1) 5. Οξικός αιθυλεστέρας: Μεθανόλη: Ακετόνη (8:1:1) 6. Οξικός αιθυλεστέρας: Ακετόνη (8:2) 7. Οξικός αιθυλεστέρας: Μεθανόλη: Ακετόνη (8:0,5:0,5)

Τα αποτελέσματα τους δίνονται στην Εικόνα 62, 63 όπου φαίνεται πως με το σύστημα (7) γινόταν καλύτερος διαχωρισμός των ναφθοδιαθρόνων από τις υπόλοιπες ενώσεις του κλάσματος.

Εικόνα 63. TLC δοκιμές των κλασμάτων G,H,I,J με τα συστήματα έκλουσης (4),(5),(6) από αριστερά προς τα δεξιά

Εικόνα 64. TLC δοκιμές των κλασμάτων G,H,I,J με το συστήμα έκλουσης (7)

Σύμφωνα με βιβλιογραφικά δεδομένα οι ναφθοδιανθρόνες, κάτω από υπεριώδες φώς, παράγουν έναν κόκκινο φθορισμό. (Kitanov 2001). Αυτός ο φθορισμός παρατηρήθηκε στο κλάσμα I (με γυμνό μάτι στην πλάκα TLC απεικονίζεται με χρώμα ιώδες). Το κλάσμα I επιλέχθηκε για την περαιτέρω κλασμάτωση του, με βάση τα αποτελέσματα από την TLC, με εναρκτήριο σύστημα έκλουσης το σύστημα (7) σε silica 60A (43-60mm). Στην συνέχεια η σύσταση άλλαξε σε AcOEt:MeOH (8:1) και σταδιακά έφτασε σε 100% MeOH. Από την στήλη αυτήν προέκυψαν 4 κλάσματα (I1-I4) (Εικόνα 65), ύστερα από δοκιμές TLC που πραγματοποιούνταν παράλληλα με το πείραμα, με σύστημα έκλουσης το A (δίνεται παραπάνω).

Εικόνα 65. Σχεδιάγραμμα με κλάσματα από στήλη silica 60A του κλάσματος Ι

Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) στα τρία κλάσματα Ι2, Ι3, Ι4 για να διαπιστωθεί σε ποιο κλάσμα βρίσκονταν οι ναφθοδιανθρόνες, αλλά και στο κλάσμα H για να ελεγχθεί η ύπαρξη ναφθοδιανθρονών σε αυτό. Η μέθοδος Β που ακολουθήθηκε για την ανάλυση τους ήταν αντίστροφης φάσης,

στην ίδια αναλυτική στήλη με τις προηγούμενες αναλύσεις. Το πρωτόκολλο που επιλέχθηκε ήταν βαθμιδωτή έκλουση με σύστημα 2 διαλυτών σε χρόνο 45 λεπτών με την μέθοδο Β. Παρακάτω απεικονίζονται τα αποτελέσματα από την HPLC ανάλυση σε σύγκριση των κλασμάτων μεταξύ τους στα μήκη κύματος 300, 350, 590nm στην Εικόνα 66.

HPLC χρωματογράφημα των κλασμάτων H, I2, I3, I4 στα 300nm συγκέντωσης 1mg/mL με τη μέθοδο Β

HPLC χρωματογράφημα των κλασμάτων H, I2, I3, I4 στα 350nm συγκέντωσης 1mg/mL με τη μέθοδο Β

HPLC χρωματογράφημα των κλασμάτων H, I2, I3, I4 στα 590nm συγκέντωσης 1mg/mL με τη μέθοδο Β

Εικόνα 66. χρωματογράφημα των κλασμάτων H, I2, I3, I4 στα 300nm, 350nm, 590nm συγκέντωσης 1mg/mL με τη μέθοδο Β

Με το ίδιο σύστημα έγινε ανάλυση και του πρότυπου διαλύματος υπερικίνης ώστε να προσδιοριστεί ο χρόνος έκλουσης της υπερικίνης.

Εικόνα 67 HPLC χρωματογράφημα πρότυπου δ/τος υπερικίνης στα 590nm(αριστερά) και φάσμα UV-vis υπερικίνης (δεξιά)

Σύμφωνα με τα αποτελέσματα (Εικόνα 67) η υπερικίνη εκλούεται στα 38min. Προχωρώντας στο κλάσμα I2, το οποίο φαίνεται να εντοπίζονται ναφθοδιανθρόνες είχαμε τα εξής αποτελέσματα από την HPLC ανάλυση του (Εικόνα 68):

HPLC χρωματογράφημα Ι2 κλάσματος στα 350nm συγκέντρωσης 1mg/mL με τη μέθοδο Β

Εικόνα 68 HPLC χρωματογράφημα Ι2 κλάσματος στα 590nm όπου απορροφούν μέγιστα οι ναφθοδιανθρόνες (κορυφές 14 και 15) συγκέντρωσης 1mg/mL με τη μέθοδο Β

Παρατηρώντας την Εικόνα 68, στα 590nm μήκος κύματος φαίνονται οι ναφθοδιανθρόνες, παρόλα αυτά στα 350nm ανιχνεύθηκε μια σειρά κορυφών μεταξύ 5min και 17min των οποίων τα φάσματα UV-vis δίνονται στην Εικόνα69.

Εικόνα 69. UV- vis φάσματα κορυφών a-h που εκλούστηκαν σε χρόνο 5 έως 17 λεπτά

Τέλος τα φάσμα των UV-vis των ναφθοδιανθρονών που εκλούστηκαν στα 29min και 38min φαίνονται στην Εικόνα 70.

Εικόνα 70. UV-vis φάσματα κορυφών ναφθοδιανρόνων

Το επόμενο βήμα ήταν να αντιμετωπιστεί το «πρόβλημα» των φλαβονοειδών, τα οποία δεν απομακρύνθηκαν εξολοκλήρου στους προηγούμενους διαχωρισμούς του κλάσματος Ι2. Οι ενώσεις αυτές έχουν χρόνο έκλουσης έως τα 17 min (μήκος κύματος 350nm) στο διάστημα βαθμίδωσης του διαλύτη, ενώ οι ναφθοδιανθρόνες με χρόνο έκλουσης τα 29min και 38min εκλούστηκαν λίγο πριν το 100% ακετονιτριλίου (η πρώτη κορυφή) και στο 100% του διαλύτη η δεύτερη. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία το επόμενο βήμα ήταν η χρήση της Sephadex LH-20 σε υγρή χρωματογραφία στήλης, ώστε να επιτευχθεί η Εικόνα 71. Εικόνα από χρωματογραφία στήλης απομόνωση τους (Karioti et al, 2009) από το κλάσμα Ι2 (Εικόνα 72). Sephadex LH20 του κλάσματος Η Sephadex LH-20 είναι ένα υδροξυπροπυλιωμένο πολυμερές Ι2 με σύστημα έκλουσης ddH2O: δεξτράνης και λόγω της δομής της έχει διπλό χρωματογραφικό μεθανόλη: οξικός αιθυλεστέρας χαρακτήρα τόσο υδρόφιλο όσο και λιπόφιλο. Λόγω του διπλού της (βαθμιδωτή έκλουση με χαρακτήρα, η Sephadex LH-20 διογκώνεται στο νερό και μια σειρά εναρκτήρια συσταση 70:30 μεθανόλη: ddH2O)

οργανικών διαλυτών και με αυτόν τον τρόπο είναι δυνατή η απομόνωση των ναφθοδιανθρονών. Το σύστημα έκλουσης που χρησιμοποιήθηκε ήταν βαθμιδωτής

έκλουσης εκκινώντας από υπερκάθαρο νερό (ddH20, στη σύνεχεια μετάβαση σε μεθανόλη και τέλος sε οξικό αιθυλεστέρα. Η ένθεση τους δείγματος στην στήλη έγινε όταν η σύσταση τους συστήματος έκλουσης ήταν ddH20:MeOH (30:70). Παρόλα τα τεχνικά προβλήματα που προέκυψαν για την περάτωση αυτού του σταδίου από αυτήν την χρωματογραφία προέκυψαν 13 κλάσματα (Ι-ΧΙΙΙ) (Εικόνα 732).

Εικόνα 72. Τελικό διάγραμμα κλασματώσεων

Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκε υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) στα κλάσματα VII, VIII, IX, X για να διαπιστωθεί σε ποιο κλάσμα βρίσκονταν οι ναφθοδιανθρόνες. Η μέθοδος που ακολουθήθηκε για την ανάλυση τους ήταν η ίδια με την ανάλυση του κλάσματος I2, ενώ η στήλη ήταν αναλυτική αντίστροφης φάσης SP-120-5-ODS- RPS (150mm x 4.6 mm I.D, DAISOPAK), για αυτό ο χρόνος έκλουσης των ναφθοδιανθρονών ήταν μικρότερος. Λόγω τεχνικών προβλημάτων τα δείγματα προς ανάλυση δεν ήταν σε ξηρή μορφή για αυτό και ο προσδιορισμός της ποσότητας δεν ήταν δυνατός. Τα εξεταζόμενα δείγματα ήταν όσο το δυνατόν πιο αραιά γινόταν. Τα αποτελέσματα φαίνονται στις παρακάτω εικόνες.

1.200 Quantification #61 H.vesiculosum LH-20 61-66 UV_VIS_3 mAU WVL:300 nm

750

500

250

-200 min 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 Α:HPLC χρωματογράφημα του κλάσματος VII στα 300nm με τη μέθοδο Β

180 Quantification #61 H.vesiculosum LH-20 61-66 UV_VIS_4 mAU WVL:350 nm

100

-20 min 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 Β:HPLC χρωματογράφημα του κλάσματος VII στα 350nm με τη μέθοδο Β

500 Quantification #61 H.vesiculosum LH-20 61-66 UV_VIS_5 mAU WVL:590 nm

400

300

200

100

-50 min 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 Γ:HPLC χρωματογράφημα του κλάσματος VII στα 590nm με τη μέθοδο Β Εικόνα 73. HPLC χρωματογράφημα του κλάσματος VII στα 300nm(Α), 350nm(Β) και 590nm(Γ) Peak #151 25.54 min 60,0 % Peak #165 29.80 min 60,0 % 213.7 50,0 217.0 50,0

229.1 231.1 40,0 40,0 590.1 30,0 589.2 30,0

20,0 20,0

10,0 10,0

0,0 0,0

nm -10,0 -10,0 nm 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Όπως φαίνεται και στα χρωματογραφήματα (Εικόνα 74) το κλάσμα είναι αρκετά καθαρό από άλλες ενώσεις κοντά στις ναφθοδιανθρόνες με την κορυφή της ψευδοϋπερικίνης στα 25min, να έχει αρκετά μεγαλύτερη απορρόφηση από την κορυφή της υπερικίνης στα 30min. Σύμφωνα με βιβλιογραφικά δεδομένα η ψευδοϋπερικίνη εκλούεται νωρίτερα από την υπερικίνη και εντοπίζεται σε μεγαλύτερο ποσοστό (0,03-0,34%) από την υπερικίνη (0,03- 0,09%), 2 έως 4 φορές περισσότερο ανάλογα με το είδος Hypericum (Mauri P.,Pietta P., 2000). Το επόμενο βήμα είναι ο διαχωρισμός των δύο αυτών κορυφών μεταξύ τους.

Αποτελέσματα HPLC του κλάσματος VIII στα 300nm, 350nm, 590nm:

994 Quantification #60 H.vesiculosum LH-20 67-99 UV_VIS_3 mAU WVL:300 nm

750

500

250

-332 min 0,3 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,3 Α:HPLC χρωματογράφημα του κλάσματος VIII στα 300nm με τη μέθοδο Β

25,0 Quantification #60 H.vesiculosum LH-20 67-99 UV_VIS_4 mAU WVL:350 nm

20,0

10,0

0,0

-5,0 min 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 Β:HPLC χρωματογράφημα του κλάσματος VIII στα 350nm με τη μέθοδο Β

70,0 Quantification #60 H.vesiculosum LH-20 67-99 UV_VIS_5 mAU WVL:590 nm

40,0

20,0

-10,0 min 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 Γ:HPLC χρωματογράφημα του κλάσματος VIII στα 590nm με τη μέθοδο Β Εικόνα 74. HPLC χρωματογράφημα του κλάσματος VIII στα 300nm(A), 350nm(B) και 590nm(Γ) Peak #150 100% at 29.85 min 60,0 Peak #139 100% at 25.63 min % 50% at 29.81 min: 996.94 60,0 % 50% at 25.58 min: 903.94 -50% at 29.90 min: 994.97 -50% at 25.68 min: 945.13 Peak #150 29.94 min: 979.40 216.6 Peak #139 25.70 min: 830.24 229.9 50,0 50,0 231.6

40,0 40,0 589.2 590.1 284.9 30,0 30,0

20,0 20,0

10,0 10,0

0,0 0,0

nm -10,0 nm -10,0 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800

Όπως στο κλάσμα VII έτσι και το κλάσμα VIII φαίνεται είναι αρκετά «καθαρό» από άλλες ενώσεις, κοντά στις ναφθοδιανθρόνες, με την πρώτη κορυφή στα 25min, η οποία αντιστοιχεί στην ψευδοϋπερικίνη και την δεύτερη στα 30min, η οποία αντιστοιχεί στην υπερικίνη.Ωστόσο εδώ οι απορροφήσεις και των δύο είναι αρκετά μικρότερες σε σχέση με το προηγούμενο κλάσμα. Και εδώ το επόμενο βήμα είναι ο διαχωρισμός των κορυφών μεταξύ τους.

Αποτελέσματα HPLC του κλάσματος IX στα 300nm, 350nm, 590nm:

450 Quantification #67 H.vesiculosum 100-139 04/12/12 UV_VIS_3 mAU WVL:300 nm

300

200

100

-50 min 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 Α:HPLC χρωματογράφημα του κλάσματος IX στα 300nm με τη μέθοδο Β

14,0 Quantification #67 H.vesiculosum 100-139 04/12/12 UV_VIS_4 mAU WVL:350 nm

10,0

5,0

0,0

-5,0 SB1 SB2

-8,0 min 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 Β:HPLC χρωματογράφημα του κλάσματος IX στα 350nm με τη μέθοδο Β

50,0 Quantification #67 H.vesiculosum 100-139 04/12/12 UV_VIS_5 mAU WVL:590 nm

40,0

30,0

20,0

10,0

-5,0 min 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 Γ:HPLC χρωματογράφημα του κλάσματος IX στα 590nm με τη μέθοδο Β Εικόνα 75. HPLC χρωματογράφημα του κλάσματος IX στα 300nm(A), 350nm(B) και 590nm(Γ) Peak #186 100% at 31.54 min 60,0 % 50% at 31.49 min: 987.62 -50% at 31.59 min: 974.18 215.4 Peak #186 31.60 min: 918.52 50,0 231.6

40,0 589.8

30,0

20,0

10,0

0,0

-10,0 nm 200 300 400 500 600 700 800

Στο κλάσμα X παρατηρείται μια αυξημένη απορρόφηση της υπερικίνης στα 31min, ; ενώ η ψευδοϋπερικίνη δεν απορροφά σχεδόν καθόλου. Λόγω μικρής ποσότητας του κλάσματος αυτού δεν ήταν δυνατός ο περαιτέρω καθαρισμός της.

Αποτελέσματα HPLC του κλάσματος X στα 300nm, 590nm:

600 Quantification #69 H.vesiculosum 141-149 06/12/12 UV_VIS_3 mAU WVL:300 nm

375

250

125

-100 min 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 Α:HPLC χρωματογράφημα του κλάσματος X στα 300nm με τη μέθοδο Β

18,0 Quantification #69 H.vesiculosum 141-149 06/12/12 UV_VIS_5 mAU WVL:590 nm

10,0

5,0

0,0

-4,0 min 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 Β:HPLC χρωματογράφημα του κλάσματος X στα 590nm με τη μέθοδο Β Εικόνα 76. HPLC χρωματογράφημα του κλάσματος X στα 220nm(A), 270nm(Β), 300nm(Γ) και 590nm(Δ)

Όπως φαίνεται στα 300 nm(με μικρότερη απορρόφηση) η επιθυμητή ένωση έχει εκλουστεί μαζί με άλλες, άρα ο διαχωρισμός της δεν ήταν επιτυχής. Λόγω της μικρής ποσότητας του κλάσματος η περαιτέρω κλασμάτωση δεν κατέστη δυνατή.

Σύμφωνα με τα παραπάνω αποτελέσματα, αλλά και με τις ποσότητες που ήταν τα κλάσματα, η απομόνωση των ναφθοδιανθρονών προχώρησε με τα κλάσματα VII και VIII τα οποία ζύγιζαν 65mg και 46mg αντίστοιχα. Οι κορυφές διαχωρίστηκαν με ημιπαρασκευαστικό HPLC, ενώ η μέθοδος που ακολουθήθηκε για την ανάλυση τους ήταν η ίδια με το αναλυτικό HPLC, με μικρές αλλαγές στην εναρκτήρια σύσταση του ακετονιτριλίου

(CH3CN) και στον συνολικό χρόνο της (μέθοδος Γ) σε ημιπαρασκευαστική στήλη αντίστροφης φάσης X-Bridge C18 (5μm, 10x150mm, Waters). Στην Εικόνα 78 και 79 απεικονίζονται τα HPLC χρωματογραφήματα των κλασμάτων VII και VIII των οποίων οι δύο κορυφές συλλέχθηκαν ξεχωριστά στα 350nm.

Εικόνα 77. Ημι-παρασκευαστικό HPLC χρωματογράφημα του κλάσματος VII στα 350nm με τη μέθοδο Γ

15 14

Εικόνα 78. ημι-παρασκευαστικό HPLC χρωματογράφημα του κλάσματος VIIΙ στα 350nm με τη μέθοδο Γ

Οι δύο κορυφές αφού συλλέχθηκαν ξεχωριστά, αφού συμπυκνώθηκαν έως ξηρού, εξετάστηκαν αν ήταν απόλυτα καθαρές ώστε να συνεχιστεί περαιτέρω η ταυτοποίηση τους με φασματομετρία μάζας. Ο έλεγχος έγινε σε αναλυτικό HPLC με σύστημα έκλουσης το ίδιο με το ημιπαρασκευαστικό HPLC και στήλη την αναλυτική που είχε χρησιμοποιηθεί σε προηγούμενο βήμα για την ανάλυση των κλασμάτων VII και VIII (SP-120-5-ODS-RPS, 150mm x 4.6 mm I.D, DAISOPAK). H μόνη διαφοροποίηση στο σύστημα έκλουσης ήταν η αρχική σύσταση των διαλυτών, όπου το σύστημα άρχιζε με ποσοστό ακετονιτριλίου 60%.

Εικόνα 79. HPLC χρωματογράφημα κορυφών 1 (αριστερά) και 2 (δεξιά) στα 370nm

Σύμφωνα με τα παραπάνω αποτελέσματα οι κορυφές απομονώθηκαν σε καθαρότητα >98% και το επόμενο βήμα ήταν η ταυτοποίηση τους με φασματομετρία μάζας. Η ανάλυση των δύο κορυφών πραγματοποιήθηκε στο τμήμα Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών. Τα δείγματα προς ανάλυση είχαν πρώτα συμπυκνωθεί μέχρι ξηρού, όπου παρατηρήθηκε πως το ξηρό δείγμα της κορυφής (14) είχε χρώμα βιολετί, ενώ της κορυφής (15) κόκκινο. Τα φάσματα από την ανάλυση απεικονίζονται παρακάτω:

Ψευδοϋπερικίνη(14) Υπερικίνη (15)

Εικόνα 80. Φάσμα Μάζα/φορτίου κορυφής (14) (αριστερά) και κορυφής (15) (δεξιά)

Η σάρωση έγινε με ηλεκτροψεκασμό με αρνητικό ιοντισμό των δειγμάτων. Από τα πειραματικά και βιβλιογραφικά δεδομένα φαίνεται πως η ένωση με μοριακό βάρος 520 (14) είναι η ψευδοϋπερικίνη, ενώ η ένωση με μοριακό βάρος 504 (15)είναι η υπερικίνη.

6.5 Δοκιμή συμπεριφοράς

Δοκιμή θιγμοτακτισμού

Όπως προαναφέρθηκε η δοκιμή του θιγμοτακτισμού έγκειται στην προτίμηση των πειραματοζώων να είναι πιο δραστήρια και να παραμένουν στην περιφέρεια της συσκευής ανοικτού πεδίου σε σχέση με τις κεντρικές περιοχές. Η παράμετρος που προσδιορίστηκε είναι ο χρόνος θιγμοτακτισμού, δηλαδή ο χρόνος παραμονής κοντά στα τοιχώματα της συσκευής και αποτελεί ένδειξη αγχογενούς συμπεριφοράς. Στην προκειμένη περίπτωση οι ομάδες μελέτης Εικόνα 81. Balb-c μύες που χωρίστηκαν σε δύο μεγάλες, αρσενικά και θηλυκά γηραία, όπου κάθε χρησιμοποιήθηκαν στην ομάδα είχε ομάδα μαρτύρων (6 ζώα) και ομάδα που τους χορηγήθηκε δοκιμή. Τμήμα Βιολογίας, το μεθανολικό εκχύλισμα Hypericum vesiculosum (8 ζώα), σε πανεπιστημίου Πατρών δοσολογία 250mg/Kg (20μl ένεση/30g πειραματοζώου). Παρακάτω παρουσιάζονται τα αποτελέσματα από την δοκιμασία για τον έλεγχο της αγχολυτικής δράσης του εκχυλίσματος, έχοντας υπολογίσει τον χρόνο παραμονής στην περιφέρεια (θιγμοτακτισμού), (Πίνακας 14), (Εικόνα 82).

Πίνακας 14. Χρόνος παραμονής στην περιφέρεια Δοκιμασία Θιγμοτακτισμού Αρσενικά Θηλυκά

Μάρτυρες ενήλικοι 448±12 467±45

Μάρτυρες γηραιοί 511±37* (↑12%) 550±47* (↑15%)

Εκχύλισμα 372±133# (↓27%) 433±51# (↓21%) Οι τιμές δίνονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση *Στατιστικά σημαντική διαφορά p≤0,05 από ενήλικες μάρτυρες (unpaired t-student test) # Στατιστικά σημαντική διαφορά p≤0,05 από γηραιούς μύες(unpaired t-student test) Μάρτυρες ενήλικοι: τιμές από μελέτη κ. Κοκκόση Αλέξανδρου (τμήμα Βιολογίας, Παν. Πατρών)

Εικόνα 82 Γράφημα όπου εμφανίζονται οι χρόνοι παραμονής στην περιφέρεια σε μάρτυρες ενήλικες, μάρτυρες γηραιοί και ομάδες που τους χορηγήθηκε εκχύλισμα, αρσενικά και θηλυκά, ύστερα από βραχύχρονη χορήγηση μεθανολικού εκχυλίσματος, 24h και 1h πριν την δοκιμή, ποσότητας 250mg/Kg σωματικού βάρους.

Ο συνολικός χρόνος της δοκιμασίας ήταν 10 λεπτά. Ο έλεγχος του θιγμοτακτισμού στην δοκιμασία ανοικτού πεδίου αποτελεί ένα δείκτη αγχογενούς συμπεριφοράς. Σύμφωνα με το γράφημα της εικόνας 82 παρατηρήθηκε αύξηση του χρόνου θιγμοτακτισμού στους γηραιούς μύες σε σχέση με τους ενήλικους, σε ποσοστό περίπου 14%. Από την άλλη μεριά παρατηρήθηκε μείωση του χρόνου θιγμοτακτισμού (ένδειξη αγχολυτικής δραστηριότητας εκχυλίσματος) στους γηραιούς μύες που έλαβαν το εκχύλισμα σε ποσοστό 24%, και στα δύο φύλα. Όσον αφορά την αύξηση του χρόνου θιγμοτακτισμού στους γηραιούς επίμυες , αυτή ενδεχομένως σχετίζεται με την ηλικία των πειραματοζώων. Η γήρανση επιφέρει δομικές και ορμονικές αλλαγές οι οποίες συμβάλλουν στην εκδήλωση αγχολυτικής-καταθλιπτικής

συμπεριφοράς. Οι Walf και οι συνεργάτες της (2010) χορήγησαν υποδόρια οιστραδιόλη Ε2 (10μg/μL) σε επίμυες 24 μηνών (γηραιοί), μία ώρα πριν από τις δοκιμασίες ανοικτού πεδίουν και εξαναγκασμένης κολύμβησης (δοκιμασία ελέγχου καταθλιπτικής συμπεριφοράς). Τα πειραματόζωα που έλαβαν το οιστρογόνο εμφάνισαν αγχολυτική και αντικαταθλιπτική δράση, αυξάνοντας τον αριθμό εισόδων στο κέντρο της συσκευής ανοικτού πεδίου χρόνο και μειώνοντας τον χρόνο ακινησίας στην δοκιμασία εξαναγκασμένης κολύμβησης αντίστοιχα. Το ίδιο έχει διαπιστωθεί και για τα αρσενικά με την μείωση των ανδρογόνων. Συγκεκριμένα στην μελέτη των Frye και των συνεργατών του (2008) μελέτησαν την συμπεριφορά γηραιών επίμυων στην χορήγηση ανδρογόνων, ελέγχοντας την αγχολυτική και αντικαταθλιπτική τους δράση. Τα πειραματόζωα ήταν 24 μηνών και τους χορηγήθηκαν τεστοστερόνη, 3α-διόλη και Ε2 οιστρογόνο (ανδρογόνα) σε δόσεις 1mg/Kg σωματικού βάρους, μία ώρα πριν από κάθε δοκιμασία. Όλα τα ανδρογόνα συνέβαλαν στην αύξηση του αριθμού εισόδων στο κέντρο της συσκευής, αλλά και στην μείωση του χρόνου ακινησίας στην εξαναγκασμένη κολύμβηση σε σχέση με τους μάρτυρες. Αναφορικά με την αγχολυτική δράση των φυτών του γένους Hypericum, ο Vandenbogaerde και οι συνεργάτες του (1999) κατέδειξαν πως το εκχύλισμα του H. perforatum αυξάνει την κινητική δραστηριότητα των επίμυων στο ανοιχτό πεδίο και εξασκεί αγχολυτική δράση στην δοκιμή φωτός-σκότους που μελέτησαν, και μάλιστα τη στιγμή που τα μεμονωμένα συστατικά δεν έδειξαν καμία επίδραση. Σε μια άλλη μελέτη των Flausino και των συνεργατών του, το σκεύασμα υπερικού HP LI 160 φέρεται να έχει αγχολυτική δράση, σε ένα υποσύνολο συμπεριφορών που αφορούν το γενικευμένο άγχος, και σε χρόνια χορήγηση(δόση 250mg/Kg) και σε βραχεία χορήγηση(δόση 125mg/Kg) (Flausino et al., 2002).

Συμπεράσματα

7. Συμπεράσματα

Το Hypericum vesiculosum ανήκει στο ίδιο γένος με το H. perforatum, ωστόσο δεν έχει μελετηθεί ως προς την φυτοχημική του σύσταση. Το φυτό το οποίο μελετήθηκε στην παρούσα εργασία συλλέχθηκε στην Πελοπόννησο από την περιοχή της λίμνης Στυμφαλίας, του νομού Κορινθίας. Στο πλαίσιο της φαρμακογνωστικής μελέτης του H. vesiculosum έγινε φυτοχημική ανάλυση του και έλεγχος της αγχολυτικής δράσης του. Κατά τη σύγκριση των μεθανολικών εκχυλισμάτων των H. vesiculosum και H. perforatum με τη χρήση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (High Perormance Liquid Chromatography – Diode Array, HPLC – DAD), σε στήλη αντίστροφης φάσης Luna C-18 διαπιστώθηκε ταύτιση των μεταβολικών αποτυπωμάτων των δύο taxa σε μεγάλο βαθμό. Πιο συγκεκριμένα οι μεγάλες ομάδες ενώσεων, δηλαδή φαινολικά οξέα, φλαβονοειδή και ναφθοδιανθρόνες, τα οποία ταυτοποιήθηκαν σε προγενέστερη μελέτη στο εργαστήριο μας, εντοπίστηκαν και στο H. vesiculosum και μάλιστα στους ίδιους χρόνους έκλουσης. Συγκεκριμένα στα 5 πρώτα λεπτά εκλούστηκαν φαινολικά οξέα, στα 14 έως και 35 λεπτά εκλούστηκαν φλαβονοειδή και οι γλυκοζίτες αυτών, όπως:  υπεροζίτης(6) (21min),  ισοκερσιτρίνη(6) (24min),  κερσετίνη(11) (31min)  Ι3-ΙΙ8 διαπιγενίνη(12) (32min). Τέλος μεταξύ 35 και 45 λεπτών εκλούστηκαν οι ναφθοδιανθρόνες,  ψευδοϋπερικίνη(14) (38min)  υπερικίνη(15) (42min). Όσο αφορά την ποσοστιαία αναλογία των κορυφών που εντοπίστηκαν στο H. vesiculosum σε σχέση με το H. perforatum, στο σύνολο τους οι κορυφές ήταν σε μικρότερο ποσοστό. Στη συνέχεια έγινε σύγκριση με HPLC ανάλυση και ίδια μέθοδο, των τριών κλασμάτων που προέκυψαν από την εκχύλιση του ξηρού μεθανολικού εκχυλίσματος (το οποίο διαλύθηκε σε υπερκάθαρο νερό) με εξάνιο και οξικό αιθυλεστέρα. Όπως παρατηρήθηκε από τα HPLC, το πιο εμπλουτισμένο κλάσμα σε κορυφές ήταν αυτό του οξικού αιθυλεστέρα, το οποίο έφερε τις περισσότερες κορυφές των φλαβονοειδών και των ναφθοδιανθρονών. Στο υδατικό κλάσμα παρατηρήθηκε η κορυφή (16) στα 2,5 λεπτά, στην περιοχή που εκλούστηκαν τα φαινολικά οξέα, η οποία δεν εντοπίστηκε στα HPLC των άλλων κλασμάτων. Στο διάστημα μεταξύ 14 και 35 λεπτών εκλούστηκαν τα φλαβονοειδή στο κλάσμα του οξικού αιθυλεστέρα με εξαίρεση την Ι3-ΙΙ8 διαπιγενίνη (12) που εκλούστηκε, επίσης, στο κλάσμα του εξανίου. Στα 19 λεπτά εκλούστηκε και στα 3 κλάσματα το φλαβονοειδές ρουτίνη. Οι ναφθοδιανθρόνες (κορυφές 13, 14 και 15) εκλούστηκαν στο κλάσμα του οξικού αιθυλεστέρα, ενώ ίχνη τους εντοπίστηκαν στο κλάσμα εξανίου. Τέλος στα 46 λεπτά εκλούστηκε μια κορυφή στο κλάσμα εξανίου, της οποίας ανάλογη κορυφή δεν είχε ταυτοποιηθεί στην προγενέστερη ανάλυση του υπερικού (Μαργιάννη, 2011), και η ταυτοποίηση της χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Προχωρώντας στην απομόνωση και ταυτοποίηση των ναφθοδιανθρονών, πραγματοποιήθηκαν διαδοχικές κλασματώσεις στο κλάσμα του οξικού αιθυλεστέρα με κλασική υγρή χρωματογραφίας στήλης, σε στήλες silica 60A και Sephadex LH-20. Η περαιτέρω ταυτοποίηση τους πραγματοποιήθηκε με φασματομετρία μάζας (Mass Spectrometry, MS) όπου διαπιστώθηκε η μάζα των δύο απομονωθεισών κορυφών. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως οι απομονωθείσες ενώσεις ήταν:  υπερικίνη, με μοριακό βάρος 504  ψευδοϋπερικίνη, με μοριακό βάρος 520.

Στο δεύτερο σκέλος της εργασίας εξετάσθηκε η αγχολυτική δράση του μεθανολικού εκχυλίσματος από το H. vesiculosum σε γηραιούς αρσενικούς και θηλυκούς μύες, ηλικίας 12 μηνών, με την δοκιμή του ανοικτού πεδίου (Open Field Test in Mice). Αυτό που εξετάσθηκε ήταν ο θιγμοτακτισμός που παρουσίασαν τα πειραματόζωα, δείκτης αγχογενούς συμπεριφοράς, ύστερα από βραχύχρονη χορήγηση του εκχυλίσματος ενδοπεριτοναϊκά. Παρατηρήθηκε αύξηση το χρόνου θιγμοτακτισμού στους γηραιούς μύες και στα δύο φύλα, σε ποσοστό 14%, ενώ ύστερα από τη χορήγηση του εκχυλίσματος οι μύες μείωσαν τον χρόνο θιγμοτακτισμού (ένδειξη αγχολυτικής δραστηριότητας εκχυλίσματος) σε ποσοστό 24% και στα δύο φύλα. Η αγχολυτική δράση που επέδειξε το φυτό στους γηραιούς μύες και στα δύο φύλα, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στη θεραπευτική για μελλοντική εφαρμογή, όμως χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση.

100

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

 Agonistis, P., Vandenbogaerde, A., Donella-Deana, A., Pinna, L. A., Lee, K. T., Goris, J., Merlevede, W., Vandenheede, J. R., De Witte, P. Photosensitized inhibition of growth factor-regulated protein kinases by hypericin. Biochem Pharmacol 49, 1615-1622. (1995)  Ali S. M., Chee S.K., Yuen G.Y., Malini O. Hypericin and hypocrellin induced apoptosis in human mucosal carcinoma cells. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 65 59–73. (2001)  Andersen S.J., Teicher M.H. Sex differences in dopamine receptors and their relevance to ADHD. Neurosci Biobehav Rev,24:1137±41. (2000)  Angiosperm Phylogeny Group. "An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG III", Botanical Journal of the Linnean Society 161 (2): 105–121. (2009)  Arnold A.P., Breedlove S.M. Organizational and activational effects of sex steroids on brain and behavior: a reanalysis. Hormones and Behavior,19:469±98. (1985)  Barnes, J., Anderson, L. A., Phillipson, J. D. St John's wort (Hypericum perforatum L.): a review of its chemistry, pharmacology and clinical properties. J Pharm Pharmacol 53, 583- 600. (2001)  Beerhues, L. Hyperforin. Phytochemistry 67, 2201-2207. (2006)  Berton, O. & Nestler, E. J. New approaches to antidepressant drug discovery: beyond monoamines. Nature Rev. Neurosci. 7, 137–151 (2006).  Biegon A, McEwen B.S. Modulation by estradiol of serotonin 1 receptors in brain. J Neurosci,2:199±205. (1982)  Brolis M, Gabetta B, Fuzzati N, Pace R, Panzeri F & Peterlongo F. Identification by high- performance liquid chromatography−diode array detection−mass spectrometry and quantification by high-performance liquid chromatography−UV absorbance detection of active constituents of Hypericum perforatum. J Chromatogr A 825: 9−16. (1998)  Brondz I., Greibrokk T., Groth P.A., Aasen A.J. The absolute configuration of hyperforin, an antibiotic from Hypericum perforatum L., based on the crystal structure determination of its p-bromobenzolate ester. Acta Chem . Scand. A37, 263-265. (1983)  Brondz I., Greibrokk T., Groth P.A., Aasen A.J. The relative stereochemistry of hyperforin – an antibiotic from Hypericum perforatum L. Tetrahedron Lett. 23:1299-1300. (1982)  Bruni, R., Sacchetti, G. Factors affecting polyphenol biosynthesis in wild and field grown St. John’s Wort (Hypericum perforatum L. Hypericaceae/Guttiferae). Molecules, 14, 682– 725. (2009)  Butterweck V, Lieflander-Wulf U, Winterhoff H, Nahrstedt A. Plasma levels of hypericin in presence of procyanidin B2 and hyperoside: a pharmacokinetic study in rats. Planta Med 69: 189–192. (2003)  Butterweck V., Bockers T., Korte B., Wittkowski W., Winterhoff H. Long-term effects of St. John’s wort and hypericin on monoamine levels in rat hypothalamus and hippocampus. Brain Research 930 21–29. (2002)  Butterweck, V., Bockers, T., Korte, B., Wittkowski, W., Winterhoff, H. Long-term effects of St. John’s wort and hypericin on monoamone levels in rat hypothalamus and hippocampus. Brain Res., 930, 21–29. (2002)  Butterweck, V., Christoffel, V., Nahrstedt, A., Petereit, F., Spengler, B., Winterhoff, H.,. Step by step removal of hyperforin and hypericin: activity profile of different Hypericum preparations in behavioral models. Life Sci 73, 627-639. (2003)

101

 Butterweck, V., Jurgenliemk, G., Nahrstedt, A., Winterhoff, H. Flavonoids from Hypericum perforatum show antidepressant activity in the forced swimming test. Planta Med 66, 3- 6. (2000)  Butterweck, V., Korte, B., Winterhoff H. Pharmacological and endocrine effects of Hypericum perforatum and hypericin after repeated treatment. Pharmacopsychiatry, 34 (Suppl. 1), 2–7. (2001)  Butterweck, V., Schmidt, M. St. John's wort: role of active compounds for its mechanism of action and efficacy. Wien Med Wochenschr 157, 356-361. (2007)  Butterweck, V., Winterhoff, H., Herkenham, M. St. John’s wort, hypericin, and imipramine: a comparative analysis of mRNA levels in brain areas involved in HPA axis control following short-term and longterm administration in normal and stressed rats. Mol. Psychiatry, 6, 547–564. (2001)  Bystrov, N. S., Dobrynin, V. N., Kolosov, M. N., Chernov, B. K., Chervin, I.I. Structure of the chromophoric part of hyperforin. Dokl Akad Nauk SSSR 225, 1327-1328. (1975)  Crockett, S.L., Schaneberg, B., Khan, I.A. Phytochemical profiling of new and old world Hypericum (St. John’s wort) species. Phytochem. Anal., 16, 479–485. (2005)  Denke, A., Schneider, W, Elstner F.F. Biochemical activities of extracts from Hypericum perforatum L. 2nd communication: Inhibition of metenkephaline and tyrosine dimerization. Drug Res., 49, 109–114. (1999)  Dewick, P.M. Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach, 2 ed., Jonh Wiley & sons: Baffins Lane, Chichester, West Sussex, UK, , p. 67. (2002)  Di Carlo G, Borrelli F, Ernst E & Izzo A.A. St John’s wort: Prozac from the plant kingdom. Trends Pharmacol Sci 22: 292−297. (2001)  Di Pedacio Dioscoride Anazarbeo Libri cinque Della historia, et materia medicinale tradotti in lingua volgare italiana da M. Pietro Andrea Matthiolo Sanese Medico, con amplissimi discorsi, et comenti, et dottissime annotationi, et censure del medesimo interprete,-Discorsi (1544)  Dimopoulos P., Raus Th., Bergmeier E., Constantinidis Th., Iatrou G., Kokkini S., Strid A., & Tzanoudakis D.: Vascular plants of Greece: An annotated checklist.-Berlin: Botanischer Garten und Botanisches Museum Berlin-Dahlem, Athens: Hellenic Botanical Society. [Englera 31] (2013)  Dona, M., Dell'Aica, I., Pezzato, E., Sartor, L., Calabrese, F., Della Barbera, M., Donella- Deana, A., Appendino, G., Borsarini, A., Caniato, R., Garbisa, S. Hyperforin inhibits cancer invasion and metastasis. Cancer Res 64, 6225-6232. (2004)  English, D.S., Zhang, W., Kraus, G.A., Petrich. J.W. Excited-state photophysics of hypericin and its hexamethoxy analog: intramolecular proton transfer as a nonradiative process in hypericin. J. Am. Chem. Soc., 119, 2980–2986. (1997)  Etzlstorfer, C., Falk, H.., Müller, N., Tran, T.N.H. Structural aspects and electronic absorption of the hydroxyphenanthroperylene quinones fringlit D, hypericin, and stentorin. Monatsh. Chemie, 127, 659–668. (1996)  European Medicines Agency Evaluation (EMEA) of Medicines for Human Use. Community herbal monograph on Hypericum perforatum L., herba, (2009).  Falk, H., Meyer, J. On the homo- and heteroassociation of hypericin. Monatsh. Chemie, 125, 753–762. (1994)  Falk, H., Schmitzberger, W. On the nature of "Soluble" hypericin in Hypericum species. Monatsh. Chemie, 123, 731–739. (1992)  Falk, H., Schmitzberger, W. On the nature of "Soluble" hypericin in Hypericum species. Monatsh. Chemie, 123, 731–739. (1992)

102

 Flausino, O.A. Jr, Zangrossi, H. Jr., Salgado, J.V., Viana, M.B. Effects of acute and chronic treatment with Hypericum perforatum L. (LI 160) on different anxiety-related responses in rats. Pharmacology, Biochemistry and Behavior 71 251– 257. (2002)  Gai, F., Fehr, M.J., Petrich, J.W. Observation of excited-state tautomerization in the antiviral agent hypericin and identification of its fluorescent species. J. Phys. Chem., 98, 5184–5195. (1994)  Gioti, E., Fiamegos, Y., Skalkos, D., Stalikas, C. Antioxidant activity and bioactive components of the aerial parts of Hypericum perforatum L. from Epirus, Greece. Food Chem., 117(3): 398-404. (2009)  Godbout J. P., Moreau M., Lestage J., Chen J., Sparkman N. L., O’ Connor J., Castanon N., Kelley K., Dantzer R., Johnson W. R. Aging Exacerbates Depressive-like Behavior in Mice in Response to Activation of the Peripheral Innate Immune System. Neuropsychopharmacology. Sep;33(10):2341-51. (2008)  Goy R.W, McEwen B.S. Sex differences in behavior: rodents, birds, and primates. In: Goy RW, McEwen BS, editors. Sexual differentiation of the brain, Cambridge, MA: The MIT Press p. 13±73 (1980)  Harrison, P. J. The neuropathology of primary mood disorder. Brain 125, 1428–1449 (2002).  Hostanska K., Bommer S., Weber M., Krasniqi B. Saller R. Comparison of the growth- inhibitory effect of Hypericum perforatum L. extracts, differing in the concentration of phloroglucinols and flavonoids, on leukaemia cells. Journal of Pharmacy and Pharmacology Volume 55, Issue 7, pages 973–980, (2003)  Huang L., Chen S. Hypericin in Hypericum: chemistry, botanical sources and biological activities. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences 21 388–400. (2012)  Kang B.Y., Chung S.W., Kim T.S. Inhibition of Interleukin-12 Production in Lipopolysaccharide-Activated Mouse Macrophages by Hypericin, an Active Component of Hypericum perforatum.. Planta Med, 67(4): 364-366. DOI: 10.1055/s-2001-14333. (2001)  Karioti, A. & Bilia, A.R. Hypericins as Potential Leads for New Therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. Int. J. Mol. Sci., 11, 562-594. (2010)  Karioti, A., Vincieri, F. F., Bilia, A. R. Rapid and efficient purification of naphthodianthrones from St. John's wort extract by using liquid-liquid extraction and SEC. J Sep Sci 32, 1374-1382. (2009)  Kitanov, M.K. Hypericin and pseudohypericin in some Hypericum species. Biochem. Syst. Ecol., 29, 171–178. (2001)  Kolaci M., Γκόκου Π., Πέτρου Α., Πέτσιου Β., Τα είδη του Hypericum. Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης. (2007)  Kubin, A., Meissner, P., Wierrani, F., Burner, U., Bodenteich, A., Pytel, A., Schmeller, N.,. Fluorescence diagnosis of bladder cancer with new water soluble hypericin bound to polyvinylpyrrolidone: PVP-hypericin. Photochem Photobiol 84, 1560-1563. (2008)  Kusari, S, Lamshöft, M, Zühlke, S, Spiteller, M. An endophytic fungus from Hypericum perforatum that produces hypericin. J. Nat. Prod., 71, 159–162. (2008)  Kusari, S., Zuhlke, S., Kosuth, J., Cellarova, E., Spiteller, M. Light-independent metabolomics of endophytic Thielavia subthermophila provides insight into microbial hypericin biosynthesis. J. Nat. Prod., 72, 1825–1835. (2009)  Kwame. «Μάθετε για την κατάθλιψη» Εκδόσεις Πασχαλίδη, Σειρά "Οικογενειακός Ιατρός" της British Medical Association. (2008)  Laakmann, G., Schüle, C., Baghai, T., Kieser M. St John’s wort in mild to moderate depression: the relevance of hyperforin for the clinical efficacy. Pharmacopsychiatry, 31 (Suppl. 1):S54–S59. (1998)

103

 Lafranchis T. & Sfikas G “Flowers of Greece”. Published by Diatheo, Paris. p 357-359. (2009)  Lavie, G., Mandel, M., Hazan, S., Barliya, T., Blank, M., Grunbaum, A., Meruelo, D., Solomon, A. Anti-angiogenic activities of hypericin in vivo: potential for ophthalmologic applications. Angiogenesis 8, 35-42. (2005)  Liaw J.J., He J.R., Hartman R.D., Barraclough C.A. Changes in tyrosine hydroxylase mRNA levels in medullary A1 and A2 neurons and locus coerulus following castration and estrogen replacement in rats. Brain Res,13:231±8. (1992)  Linde, K. St. John's wort - an overview. Forsch Komplementmed 16, 146-155. (2009)  Liu, F., Ang, C.Y.W., Heinze, T.M., Rankin, J.D., Beger, R.D., Freeman, J.P., Lay, J.O. Jr. Evaluation of major active components in St. John’s Wort dietary supplements by high- performance liquid chromatography with photodiode array detection and electrospray mass spectrometric confirmation. Journal of Chromatography A, 888, 85–92. (2000)  Liu, F., Pan, C., Drumm, P., Ang, C. Y. Liquid chromatography-mass spectrometry studies of St. John's wort methanol extraction: active constituents and their transformation. J Pharm Biomed Anal 37, 303-312. (2005)  Malini, O., Fu, C.Y., Raghavan, V., Lau, W.K.O. New Frontier in Hypericin-Mediated Diagnosis of Cancer with Current Optical Technologies. Annals of Biomedical Engineering, Vol. 40, No. 2, pp. 460–4. (2012)  Martarelli, D., Martarelli, B., Pediconi, D., Nabissi, M. I., Perfumi, M., Pompei, P. Hypericum perforatum methanolic extract inhibits growth of human prostatic carcinoma cell line orthotopically implanted in nude mice. Cancer Lett 210, 27-33. (2004)  Mauri, P., Pietta, P. High performance liquid chromatography/electrospray mass spectrometry of Hypericum perforatum extracts. Rapid Commun Mass Spectrom 14, 95- 99. (2000)  McEwen B.S. Neural gonadal steroid actions. Science,211:1301±3. (1981)  Meng I.D., Drugan R.C. Sex differences in open field behavior in response to the beta- carboline FG7142 in rats. Physiol Behav,54:701±5. (1993)  Mennini, T., Gobbi, M. The antidepressant mechanism of Hypericum perforatum. Life Sci 75, 1021-1027. (2004)  Morissette M, Di Paolo T. Sex and estrus cycle variations of rat striatal dopamine uptake sites. Neuroendocrinology,58:16±22. (1993)  Muller, W. E. Current St John's wort research from mode of action to clinical efficacy. Pharmacol Res 47, 101-109. (2003)  New Kreuterbuch von Underscheidt, Würckung und Namen der Kreuter, so in teutschen Landen wachsen (1540)  Overstreet D.H. Sex differences following pharmacological manipulation of the cholinergic system, DFP and pilocarpine. Psychopharmacology,61:49±58. (1979)  Ozturk, N., Korkmaz, S., Ozturk, Y. Wound-healing activity of St. John's Wort (Hypericum perforatum L.) on chicken embryonic fibroblasts. J Ethnopharmacol 111, 33-39. (2007)  Pajonk F., Scholber Ζ.J., Fiebich Ζ.B. Hypericin—an inhibitor of proteasome function Cancer Chemother Pharmacol 55: 439–446. DOI 10.1007/s00280-004-0933-8. (2005)  Perfumi, M., Panocka, I., Ciccocioppo, R., Vitali, D., Froldi, R., Massi, M. Effects of a methanolic extract and a hyperforin-enriched CO2 extract of Hypericum perforatum on alcohol intake in rats. Alcohol Alcohol 36, 199-206. (2001)  Perrot-Sinal T, Ossenkopp K.P., Kavaliers M. Influence of a natural stressor (predator odor) on locomotor activity in the meadow vole (Microtus pennsylvanicus): modulation by sex, reproductive condition and gonadal hormones. Psychoneuroendocrinology,25:3259±76. (2000)

104

 Piperopoulos, G., Lotz, R., Wixforth, A., Schmierer, T., Zeller, K.P. Determination of naphthodianthrones in plant extracts from Hypericum perforatum L. by liquid chromatography–electrospray mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 695 309–316. (1997)  Reichling J., Weseler A., Saller R. A current review of the antimicrobial activity of Hypericum perforatum L. Pharmacopsychiatry,34 Suppl.1:S116–8. (2001)  Russo, E., Scicchitano, F., Whalley, B. J., Mazzitello, C., Ciriaco, M., Esposito, S., Patanè, M., Upton, R., Pugliese, M., Chimirri, S., Mammì, M., Palleria, C., De Sarro, G. B. Hypericum perforatum: Pharmacokinetic, Mechanism of Action, Tolerability, and Clinical Drug–Drug Interactions. Phytother. Res. (2013)  Sanchez-Mateo C.C., C.X. Bonkanka, R.M. Rabanal. Hypericum grandifolium Choisy: A species native to Macaronesian Region with antidepressant effect. Journal of Ethnopharmacology 121 297–303. (2009)  Sanovic R., Verwangerb T., Hartl A., Krammer B. Low dose hypericin-PDT induces complete tumor regression in BALB/c mice bearing CT26 colon carcinoma. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, doi:10.1016/j.pdpdt.2011.04.003. (2011)  Schempp C.M., Simon-Haarhaus B., Termeer C.C., Simon J.C. Hypericin photo-induced apoptosis involves the tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) and activation of caspase-8. FEBS Letters 493, 26-30. (2001)  Schmidt B., Jaroszewski J.W., Bro R., Witt M., Staerk D. Combinig PARAFAC analysis of HPLC-DAD profiles and structural characterization using HPLC-PDA-SPE-NMR-MS experiments: commercial preparations of St John’s wort. Analytical Chemistry, 80:1978- 1987.(2008)  Seitz, G., Krause, R., Fuchs, J., Heitmann, H., Armeanu, S., Ruck, P., Warmann, S.W. In vitro photodynamic therapy in pediatric epithelial liver tumors promoted by hypericin. Oncol. Rep., 20, 1277–1282. (2008)  Seitz, G., Warmann, S.W., Armeanu, S., Heitmann, H., Ruck, P., Hoffman, R.M., Fuchs, J., Wessels, J.T. In vitro photodynamic therapy of childhood rhabdomyosarcoma. Int. J. Oncol., 30, 615–620. (2007)  Sheline, Y. I. Neuroimaging studies of mood disorder effects on the brain. Biol. Psychiatry 54, 338–352 (2003).  Silva B.A., Malva J. O., Dias A.C.P. St John’s wort (Hypericum perforatum) extracts and isolated phenolic compounds are effective antioxidants in several in vitro models of oxidative stress. Food Chemistry 110:611-619. (2008)  Singer A., Schmidt M., Hauke W., Stade K. Duration of response after treatment of mild to moderate depression with Hypericum extract STW 3-VI, citalopram and placebo: A reanalysis of data from a controlled clinical trial. Phytomedicine 18 739–742. (2011)  Singer, A., Wonnemann, M., Muller, W. E. Hyperforin, a major antidepressant constituent of St. John's Wort, inhibits serotonin uptake by elevating free intracellular Na+1. J Pharmacol Exp Ther 290, 1363-1368. (1999)  Singewald N., Sinner C., Hetzenauer A., Sartori S. B., Murck H. Magnesium-deficient diet alters depression- and anxiety-related behavior in mice—influence of desipramine and Hypericum perforatum extract. Neuropharmacology 47 1189–1197. (2004)  Skoog D.A, Holler F. J, Nieman T. A. «Αρχές της ενόργανης ανάλυσης». Εκδόσεις Κωσταράκης(5η έκδοση).  Solar P., Cavarga I., Hofmanova I., Cekanova M., Miskovsky P., Brezani P., Hrckova G., Kozubik A., Fedorocko P. "Effect of acetazolamide on hypericin photocytotoxicity" Planta medica 68.7: 658-660. (2002)

105

 Song S., Xiong C., Zhou M., Lu W., Huang Q., Ku G., Zhao J.,. Flores L. G. Jr, Ni Y., Li C. Small-Animal PET of Tumor Damage Induced by Photothermal Ablation with 64Cu-Bis- DOTA-Hypericin. J Nucl Med, 52:792–799. (2011)  Stupakova, V., Varinska, L., Mirossay, A., Sarissky, M., Mojzis, J., Dankovcik, R., Urdzik, P. Ostro, A., Mirossay, L. Photodynamic effect of hypericin in primary cultures of human umbilical endothelial cells and glioma cell lines. Phytother. Res., 23, 827–832. (2009)  Suzuki O, Katsumata Y., Oya M., Bladt S., H. Wagner. Inhibition of monoamine oxidase by hypericin. Planta Medica, 50:272–274. (1984)  Tekel’ová D., Repčák M., Zemková E., Tóth J. Quantitative changes of dianthrones, hyperforin and flavonoids content in the flower ontogenesis of Hypericum perforatum. Planta Med 66: 778−780. (2000)  Tolonen, A., Hohtola, A., Jalonen, J.,. Fast high-performance liquid chromatographic analysis of naphthodianthrones and phloroglucinols from Hypericum perforatum extracts. Phytochem Anal 14, 306-309. (2003)  Tutin T.G., Heuwood V.H., Burges N.A., Moore D.M., Valentine D.G., Walters S.M., Webb D.A.. “Flora Europea, volume 2, From Rosaceae to Umbelliferae”. Assisted by Ball P. W., Chater A. O.,. Ferguson I. K. Cambridge University Press, January p266-269. (1968)  Vandenbogaerde P., Zanoli P., Puia G., TruzzI C., Kamuhabwa A., De witte P., Merlevede W., Baraldi M. Evidence That Total Extract of Hypericum perforatum Affects Exploratory Behavior and Exerts Anxiolytic Effects in Rats. Pharmacology Biochemistry and Behavior, Vol. 65, No. 4, pp. 627–633. (1999)  Vandenbogaerde, A. L., Cuveele, J. F., Proot, P., Himpens, B. E., Merlevede, W. J., de Witte, P. A. Differential cytotoxic effects induced after photosensitization by hypericin. J Photochem Photobiol B 38, 136-142. (1997)  Vandenbogaerde, A. L., Delaey, E. M., Vantieghem, A. M., Himpens, B. E., Merlevede, W. J., de Witte, P. A. Cytotoxicity and antiproliferative effect of hypericin and derivatives after photosensitization. Photochem Photobiol 67, 119-125. (1998)  Wang D., Bai J., Sun F., Yang D. Chemical constituents and antidepressant activity of the new species Hypericum enshiense occurring in China. Phytomedicine 17 410–413 (2010)  Wang, X., Liu, J., Zhang, J., Yang, R. Killing effects of hypericin and extracts from hypericin on SpcA 1 lung cancer cell lines of human in vitro. Chin. Pharmaceut. J., 17, 13–15. (2008)  Wang, X., Zhang, J., Liu, J., Yang, R. In vitro damage effects of hypericin extract from Hypericum perforatum on human lung cancer cells A549. Chin. Tradit. Patent Med., 29, 1058–1061. (2007)  Wang, X., Zhang, J., Liu, J., Yang, R. Photocytotoxic effect of hypericin and extract in Hypericum perforatum L. on HepG2 cancer cell line of human liver in vitro. J. Chin. Integr. Med., 19, 69–71. (2008)  Wang, X., Zhang, J., Liu, J., Yang, R. Photocytotoxic effect of hypericin extract from Hypericum perforatum L. on MDA231 human mammary carcinoma cell lines in vitro. Chin. J. Morden Appl. Pharm., 25, 1–4. (2008)  Wessels, J.T., Busse, A.C., Rave-Fraenk, M., Zaenker, S., Hermann, R., Grabbe, E., Mueller, G.A. Photosensitizing and radiosensitizing effects of hypericin on human renal carcinoma cells in vitro. Photochem. Photobiol., 84, 228–235. Int. J. Mol. Sci. 2010, 11 594. (2008)  Williams, F. B., Sander, L. C., Wise, S. A., Girard, J. Development and evaluation of methods for determination of naphthodianthrones and flavonoids in St. John's wort. J Chromatogr A 1115, 93-102. (2006)  Wirz A, Meier B & Sticher O. Stability of hypericin and pseudohypericin in extract solutions of Hypericum perforatum and in standard solutions. Pharm Ind 63: 410−415. (2001)

106

 Wirz, A., Meier, B., Sticher, O. Solubility of hypericin in methanol and methanol-pyridine. Pharmazie 57, 543-545. (2002)  World Health Organization Monographs on selected medicinal plants. Herba hyperici. Vol 2:149-171. (2004)  Wynn J.L., Cotton T.M. Spectroscopic Properties of Hypericin in Solution and at Surfaces. J. Phys. Chem., 99 (12), pp 4317–4323. (1995)  Zanoli P, Rivasi M, Baraldi C, Baraldi M. Pharmacological activity of hyperforin acetate in rats. Behav. Pharmacol 13: 645–651. (2002)  Διοσκουρίδης, ΑΠΑΝΤΑ, «Περί ύλης Ιατρικής», εκδότης Οδυσσέας Χατζόπουλος.  Καββαδάς Δ., Εικονογραφημένον Βοτανικόν φυτολογικόν λεξικόν (9 τόμοι), εκδότης Πελεκάνος.  Κοκκόσης Α. Μελέτη της επίδρασης του Μολύβδου (Pb) στη συμπεριφορά: άγχος/κατάθλιψη, και σε βιοχημικούς δείκτες εγκεφαλικών περιοχών, θηλυκών ενήλικων μύων, τμήμα Βιολογίας, τομέας Βιολογίας Ζώων, πανεπιστήμιο Πατρών. (2011).  Μαργιάννη Ε. Φυτοχημική ανάλυση εκχυλίσματος πόας υπερικού, διπλωματική εργασία, Τμήμα Φαρμακευτικής, Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας, Πανεπιστήμιο Πατρών. (2011).  Μιτάκης Μ., Η εθνοφαρμακολογία του υπερικού.  Πυλαρά Α., Καρατζά Ε., Ιατρού Γ., Το γένος Hypericum L. Στην Ελλάδα. Τμήμα Βιολογίας, τομέας Βιολογίας Φυτών, Πανεπιστήμιο Πατρών.

107