Bakalářská Práce

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE

Bakalářská práce

Brno 2018 Monika Kopečková

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE

STANOVENÍ GENOSPECIES RODU BORRELIA ZÍSKANÝCH Z RŮZNÝCH OBLASTÍ ČESKÉ REPUBLIKY POMOCÍ DNA SEKVENACE Bakalářská práce Monika Kopečková

Vedoucí práce: prof. RNDr. Omar Šerý, Ph.D. Brno 2018 Bibliografický záznam

Autor: Monika Kopečková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie

Název práce: Stanovení genospecies rodu Borrelia získaných z různých oblastí České republiky pomocí DNA sekvenace Studijní program: Biochemie

Studijní obor: Biochemie

Vedoucí práce: Prof. RNDr. Omar Šerý, Ph. D.

Akademický rok: 2017/2018

Počet stran: 59

Klíčová slova: Borrelia burgdorferi; Ixodes ricinus; Lymská borelióza; sekvenování DNA

Bibliographic Entry

Author: Monika Kopečková Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry

Title of Thesis: Determination of genespecies of the genus Borrelia obtained from various regions of the Czech Republic by DNA sequencing Degree Biochemistry programme:

Field of Study: Biochemistry

Supervisor: Prof. RNDr. Omar Šerý, Ph. D.

Academic Year: 2017/2018

Number of Pages: 59

Keywords: Borrelia burgdorferi; Ixodes ricinus; Lyme disease, DNA sequencing

Abstrakt Tato bakalářská práce pojednává o problematice Lymeské boreliózy. Jedná se o velmi závažné onemocnění způsobované bakterií rodu Borrelia. Hostitelem těchto bakterií jsou především klíšťata rodu Ixodes. V první části práce lze nalézt fakta jak o nemoci, tak o původcích i přenašečích. Cílem práce bylo zjistit pozitivitu klíšťat pomocí qPCR (Real-Time PCR) a následně pozitivní vzorky sekvenovat a zjistit tak zastoupení jednotlivých druhů. Celkem bylo otestováno 733 vzorků klíšťat získaných ze všech krajů České republiky. Bylo zjištěno, že 165 vzorků (22,5 %) tvoří vzorky pozitivní na Bbsl, u 114 vzorků byl zjištěn i konkrétní druh.

Abstract

This Bachelor thesis is about Lyme disease, which is serious illness caused by complex of bacteria Borrelia burgdorferi. Host of these bacteria is a tick of genus Ixodes. The first part of this thesis talks about the illness, bacteria and hosts. The aim was to test the positivity of the ticks within qPCR (Real-Time PCR). Then we were sequencing the positive samples and found out the species of Borrelia. There were 733 samples together and 165 (22,5 %) of them were positive. In 114 samples we were able to determine the genospecies of Borrelia.

Poděkování

Zde bych chtěla poděkovat v první řadě mé rodině, která je mi velkou oporou nejen při psaní této bakalářské práce, ale i během celé mé cesty životem. Dále bych chtěla poděkovat svému příteli, který mě také velmi podporuje a bez kterého bych nejspíš měla velký problém s ovládáním některých programů, které byly nezbytné k vypracování této práce. V neposlední řadě chci poděkovat prof. RNDr. Omaru Šerému, Ph.D. a firmě ELISABETH PHARMACON za vůbec umožnění pracovat na této velmi zajímavé a mně blízké problematice.

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval(-a) samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 27. dubna 2018 ……………………………… Monika Kopečková

Obsah Obsah ...... 9

Seznam použitých zkratek ...... 11

Seznam obrázků, tabulek a grafů ...... 12

1. Úvod ...... 13

2. Přenašeči ...... 14

Klíště obecné Ixodes ricinus ...... 14

3. Borrelia burgdorferi ...... 19

Morfologie Borrelia burgdorferi ...... 21

Genom Borrelia burgdorferi ...... 22

Přenos a patogenita Borrelia burgdorferi ...... 23

4. Lymeská borelióza ...... 25

Prevence nákazy a léčba lymské boreliózy ...... 25

Diagnostika lymské boreliózy ...... 27

Jak si stojí Česká republika ve výskytu lymské boreliózy? ...... 29

5. Cíle práce ...... 31

6. Metodika ...... 32

Izolace DNA z klíšťat ...... 32

qPCR ...... 33

První nested PCR ...... 34

Druhá nested PCR ...... 34

Gelová elektroforéza ...... 35

Přečištění naamplikované DNA pomocí ExoSap ...... 36

Sekvenační reakce ...... 37

Přečištění DNA pomocí EDTA a ethanolu ...... 37

Sekvenační analýza ...... 38

7. Výsledky ...... 39

Vyhodnocení qPCR ...... 39

Vyhodnocení gelové elektroforézy ...... 42

Výsledky DNA sekvenování ...... 42

Výskyt jednotlivých druhů Borrelia na českém území ...... 43

Fylogenetický strom ...... 46

8. Diskuze ...... 47

9. Závěr ...... 51

10. Příloha ...... 52

11. Zdroje ...... 54

Seznam použitých zkratek ACA acrodermatitis chronica atrophicans

Bbsl Borrelia burgdorferi sensu lato

Bbss Borrelia burgdorferi sensu stricto

Bdr Borrelia direct repeat

BSK Barbourův-Stoenerův-Kellyho agar

BosR stress related geny

CNS centrální nervová soustava

EM erythema migrans

IgG imunoglobulin G

IgM imunoglobulin M

LB lymská borelióza

MEP hlavní extracelulární protein

Osp Outer surface proteins

PerR peroxid related geny

Seznam obrázků, tabulek a grafů Obrázek 1: Morfologie klíštěte (upraveno dle: (Stafford, 2007) ...... 16 Obrázek 2: Životní cyklus klíštěte (upraveno dle: Stafford, 2007) ...... 17 Obrázek 3: Buněčná stavba Bbsl (Kumar et al., 2017) ...... 21 Obrázek 4: Procentuální zastoupení pozitivních vzorků v jednotlivých krajích za rok 2017 (Zdroj: vlastní zpracování) ...... 40 Obrázek 5: Vyhodnocení druhé nested PCR (Zdroj: vlastní zpracování) ...... 42 Obrázek 6: Části sekvencí jednotlivých osekvenovaných druhů Bbsl sestupně: B. afzelii, B. bavariansis, Bbss, B. garinii, B. lusitaniae, B. spielmanni, B. valaisiana (Zdroj: vlastní zpracování) ...... 43 Obrázek 7: Procentuální zastoupení druhů Bbsl v jednotlivých krajích České republiky v roce 2017 (Zdroj: vlastní zpracování) ...... 44 Obrázek 8: Fylogenetický strom sekvenovaných druhů Bbsl (Zdroj: vlastní zpracování) ...... 46 Obrázek 9: Vyhodnocení druhé nested PCR (Zdroj: vlastní zpracování) ...... 52 Obrázek 10: Vyhodnocení druhé nested PCR (Zdroj: vlastní zpracování) ...... 52 Obrázek 11: Vyhodnocení druhé nested PCR (Zdroj: vlastní zpracování) ...... 53

Tab. 1: Taxonomie druhu Ixodes ricinus (“Sheep Tick - Ixodes ricinus - Overview,” n.d.) ...... 14 Tab. 2: Taxonomie druhu Borrelia burgdorferi (“Borrelia burgdorferi,” 2008) ...... 19 Tab. 3: Složení genomu genospecies Bbsl (Bolehovská et al., 2009)...... 23 Tab. 4: Počet hlášených případů LB v České republice 1986-2017 (Bartůněk, 2013; Petráš et al., 2018) ..... 30 Tab. 5: Protokol amplifikace qPCR ...... 33 Tab. 6: Protokol aplifikace první nested PCR ...... 34 Tab. 7: Protokol aplifikace první nested PCR ...... 35 Tab. 8: Protokol sekvenační reakce ...... 37 Tab. 9: Celkový počet a počet negativních a pozitivních vzorků Bbsl v jednotlivých krajích (Zdroj: vlastní zpracování) ...... 39 Tab. 10: Celkový počet a počet negativních a pozitivních vzorků Bbsl v jednotlivých měsících (Zdroj: vlastní zpracování) ...... 41 Tab. 11: Počty druhů Bbsl v českých krajích (Zdroj: vlastní zpracování) ...... 45 Tab. 12: Zastoupení jednotlivých druhů v krajích v roce 2013, 2014 a 2017 (Bardelčík, 2015; Klíč, 2014; vlastní zpracování) ...... 49 Tab. 13: Zastoupení jednotlivých druhů v krajích v roce 2013, 2014 a 2017 (Bardelčík, 2015; Klíč, 2014; vlastní zpracování) ...... 50

Graf 1: Počet hlášených případů LB v České republice 1986-2017 (Bartůněk, 2013; Petráš et al., 2018) ...... 29 Graf 2: Počet případů LB v roce 2017 v jednotlivých krajích (Zdroj: vlastní zpracování) ...... 40 Graf 3: Počet případů LB během roku 2017 (Zdroj: vlastní zpracování) ...... 41 Graf 4: Procentuální zastoupení Bbsl v pozitivních vzorcích v roce 2017 (Zdroj: vlastní zpracování) ...... 43

1. Úvod Předpokládá se, že název onemocnění „lymeská borelióza“ poprvé zmínil dermatolog Buchwald v roce 1883, který v témže roce popsal acrodermatitis chronica atrophicans (ACA, ztenčení kůže). Erythema migrans (EM, kruhovité začervenání kůže) byla poprvé popsána v roce 1910 Švédem Afzeliem, detailněji v roce 1913 australskými dermatology Lipschützem a Riehlem. Afzelius si také v roce 1921 poprvé všiml souvislosti mezi EM a kousnutím klíštěte. První případ výskytu radikulitidy (zánět míšních nervů) po kousnutí klíštětem byl zaregistrován francouzskými fyziology Garinem a Bujadouxem v roce 1922. V dalších letech byly zaznamenány další a další případy výše uvedených příznaků a obtíží (Weber, 2001).

Nakonec zbývalo objevit původce a společného jmenovatele. K nalezení pomohla událost, která se stala v 80. letech minulého století, kdy v městečku Old Lyme vypukla epidemie zánětlivé atrofie. Nakaženo bylo 12 dospělých a 39 dětí, u 23 z nich se objevily příznaky juvenilní revmatoidní artritidy a také erytém. Nepovšimnut nezůstal ani fakt, že v této oblasti byl rozšířený výskyt klíšťat Ixodes dammini (Bartůněk, 2013).

Původce nemoci byl objeven v nymfě klíštěte I. scapularis (též I. dammini) v roce 1981 Willym Burgdorferem, který se zabýval výzkumem bakterií rodu Borrelia a Rickettsia v krvi klíšťat. Spirocheta byla pojmenována po svém objeviteli jako Borrelia burgdorferi (Steere et al., 2004). Posledním krokem ve vymezení tohoto onemocnění byla III. mezinárodní konference v New Yorku, kde se spojily příznaky s původcem a výsledek dostal jméno lymeská borelióza (LB) (Bartůněk, 2013).

LB nezpůsobuje jeden jediný patogen. Celý soubor bakterií, které způsobují LB, se souhrnně nazývá Borrelia burgdorferi sensu lato (Bbsl), tedy Borrelia burgdorferi „v širším slova smyslu“. Naopak pojmenování Borrelia burgdorferi sensu stricto (Bbss) odkazuje na jediný druh bakterie, neboť sensu stricto lze přeložit z latiny jako „v přesném slova smyslu“. Mezi hlavní strůjce LB tedy patří Bbss, Borrelia afzelii a Borrelia garinii. Pokud je např. při diagnostice nalezen geneticky obměněný druh Bbsl, většinou jeho název vychází ze jména druhu, za které se přidá „kmen XYZ“, např. Borrelia burgdorferi sensu stricto kmen B31 (Buhner, 2014).

2. Přenašeči Nejčastějším přenašečem bakterií rodu Borrelia jsou klíšťata rodu Ixodes, která jsou popsána níže. Mezi další živočichy z bezobratlých sloužící jako hostitelé těchto bakterií lze zařadit komáry (Culicidae), kde byly spirochety nalezeny u larev a dospělců. Dalšími rezervoáry je několik druhů členovců, např. blechy (Siphonaptera), vši (Anoplura) a čmelíkovci (Mesostigmata). Přestože tyto druhy mohou být infikovány Bbsl, přenos bakterií na člověka byl doposud spolehlivě prokázán pouze při sání klíšťat (Bonczek et al., 2015; Netusil et al., 2013).

Předpokládá se, že v České republice jsou komáři a další hmyz potenciálními zdroji infekcí až z 20 %. Vyvstává tak zde otázka, zda nemohou být i přenašeči Bbsl. Studie z roku 2009 se zabývala výskytem Bbsl u larev komárů pisklavých (Cules pipiens). Z celkového množství 1179 vzorků bylo 299 pozitivních na spirochety (25,4 %), z nich byly 4 pozitivní na Bbsl (0,3 %). Bylo tak dokázáno, že se Bbsl mohou vyskytovat v larvách komárů, nad přenosem na člověka stále zůstává otazník (Nejedla et al., 2009).

Klíště obecné Ixodes ricinus

Doména Eukarya

Říše Animalia Kmen Arthropoda

Podkmen Chelicerata

Třída Arachnida Řád Ixodida

Čeleď Ixodidae

Rod Ixodes Druh Ixodes ricinus Tab. 1: Taxonomie druhu Ixodes ricinus (“Sheep Tick - Ixodes ricinus - Overview,” n.d.)

Klíšťata celkově patří mezi roztoče živící se krví savců, ptáků, plazů i obojživelníků (Rodriguez et al., 2018). Jedná se o živočicha, kterého lze nalézt ve všech biotopech nehledě na klimatické podmínky. Hned po komárech jsou klíšťata považována za druhé nejčastější přenašeče patogenů způsobujících nejrůznější závažná onemocnění (Fuente J. et al., 2016). Z těch nejznámějších nemocí to jsou klíšťová encefalitida, anaplazmóza, ehrlichióza, babezióza, Krymsko-konžská hemoragická horečka, horečka Skalistých hor (Rocky Mountain horká horečka), koloradská klíšťová horečka, skvrnitý tyfus, tularémie, zavodnění srdce a LB, kterou se zabývá tato práce. Nejbližšími příbuznými klíšťat jsou pavoukovci a stejně jako oni mají v dospělosti 4 páry noh (Ostfeld et al., 2006).

Rod Ixodes zahrnuje celkem 251 popsaných druhů, z nichž nejvýznamnější jsou Ixodes ricinus žijící v Evropě, I. scapularis (I. dammini) vyskytující se v Severní Americe a I. persulcatus, který obývá Asii a částečně Evropu. Všechny tyto druhy jsou vektory pro přenos Bbsl (Michel et al., 2017; Netusil et al., 2013). I. ricinus parazituje na více než 300 druzích živočichů, nejvíce na savcích, dále na ptácích a na plazech (Netusil et al., 2013). Dalšími druhy klíšťat, která mohou přenášet patogena LB, jsou nepříliš známí piják stepní (Dermacentor marginatus) a klíšť stepní (Haemaphysalis punctata) (Nader et al., 2018; Zicha, 2018a, 2018b).

Když Ixodes potřebuje najít hostitele, uplatňuje taktiku číhání v záloze, což zahrnuje vyšplhat na stéblo nebo vyšší vegetaci (až do výše 1 metru), nikoliv však na strom, a tam čekat na vhodného obratlovce (Ostfeld et al., 2006; Sprong et al., 2018). Stébla se přidržuje třemi zadními páry noh a poslední pár noh roztahuje do okolí a natáčí své tělo do stran. V tzv. Hallerově orgánu v prohlubni posledního článku prvního páru noh se nacházejí senzory, kterými Ixodes přijímá fyzikální a chemické vjemy z okolí. Dokáže tak vnímat pachové stopy i otřesy, když se potencionální hostitel přiblíží. Jakmile se např. člověk otře o vegetaci, Ixodes využije příležitosti a přichytí se (Benelli et al., 2018). Tohoto jevu se využívá při sběru klíšťat Ixodes, kdy se flanelová látka připomínající zvířecí srst standardizované velikosti otírá o vegetaci. V tomto případě se proces sběru nazývá vlajkování (Zakovska et al., 2008).

Ústní ústrojí se skládá z chelicer a hypostomu a je uzpůsobeno k naříznutí pokožky a udržení klíštěte Ixodes na kůži hostitele. Hypostom svým tvarem připomíná harpunu a na jeho povrchu se nacházejí protisměrné háčky, které jsou zodpovědné za přichycení. Při sání se zároveň do rány vylučují sliny ze slinných žláz, které mj. obsahují látky tvořící tzv. cementovou vrstvu kolem hypostomu. Díky této vrstvě je velice obtížné klíště odstranit (Ruzic-Sabljic et al., 2017). Cementová vrstva se skládá z velké části z proteinů bohatých na glycin (Fuente J. et al., 2016). Ve slinách se nachází i protisrážlivé a protizánětlivé látky, antihistaminika a analgetika, takže působí jako lokální anestetikum a člověk ani neví, že byl Ixodem napaden (Ostfeld et al., 2006; Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017). Může trvat 2 až 3 dny, než místo začne svědit a než se Ixodes začne zvětšovat, tehdy je snadnější jej nalézt (Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017).

Obrázek 1: Morfologie klíštěte (upraveno dle: (Stafford, 2007)

Životní cyklus klíštěte Ixodes se skládá ze čtyř fází: vajíčko, larva (šestinohá), nymfa (osminohá) a imago. Někdy se klíštěti Ixodes říká „tříhostitelské“, což odkazuje na fakt, že každé aktivní životní stádium (larva, nymfa, imago) potřebuje k přeměně do dalšího stádia sát krev hostitele (Sprong et al., 2018; Stafford, 2007; Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017). Mezi jednotlivými stádii může nastat až dvouroční pauza, kterou Ixodes přežije bez příjmu potravy. Každé stádium může trvat až 2 roky, celý cyklus pak od 2 do 6 let, záleží na klimatických podmínkách, ve kterých se zrovna Ixodes nachází (Grigoryeva and Stanyukovich, 2016; Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017).

Podle stádia vývoje si Ixodes vybírá hostitele – larva drobné obratlovce, jako jsou např. hlodavci a někteří ptáci („napadení“ člověka je zde téměř vyloučeno), nymfa ptáky a větší savce, někdy i člověka, imago (nutno poznamenat, že pouze samička) výhradně velké savce, jako jsou dobytek, lišky, psi, ježci, kanci, vysoká zvěř a samozřejmě lidé (Cayol et al., 2017; Sprong et al., 2018; Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017). Larva vylíhnutá z vajíčka bývá velmi malá, asi 0,7 mm. Na rozdíl od nymfy a imaga jsou u ní vyvinuty pouze 3 páry noh. Po nasátí krve larva odpadá a po několika týdnech až měsících nastává metamorfóza (Ostfeld et al., 2006; Rajagopalan and M., 1966).

Nymfa jako další vývojové stádium bývá větší než larva a troufne si už na větší živočichy, jako jsou zajíci, psi i člověk. Stejně jako larva i nymfa po nasátí krve odpadá od rány a trvá až několik měsíců, než projde další metamorfózou, na jejímž konci se přemění na dospělce, ať už na samce nebo samici (Stafford, 2007). Jakmile se klíště (samice) přemění na dospělce, přezimuje a na jaře naklade vajíčka (bývá jich až 18 000), celý cyklus začíná nanovo (Sonenshine and Roe, 2013; Stafford, 2007). Podle mnoha studií je nymfa považována za nejrizikovější stádium, co se přenosu infekce týče. Je také nejnáchylnější ke klimatickým podmínkám. Burks Charles S. et al. (2008) dokázali, že teploty pod -22°C při normálních klimatických podmínkách a -14°C při suchém počasí jsou pro nymfy klíšťat Ixodes smrtelné (Brunner et al., 2012).

Obrázek 2: Životní cyklus klíštěte (upraveno dle: Stafford, 2007)

U klíštěte se vyskytuje pohlavní dimorfismus, takže samce od samice poznáme dokonce pouhým okem. Samice je vždy větší. Rozdíl mezi velikostí samce a samice bývá od 0,5 cm do 1 cm, záleží na druhu klíštěte

(Belozerov et al., 1993). Na zádech samice se nachází černohnědý štítek, který pokrývá třetinu až polovinu těla, ostatní část zadečku je oranžová až načervenalá. Při sání krve se tato část může až sto dvacetkrát zvětšit. Naproti tomu samec je celý tmavý a štítek mu zakrývá celou zadní část těla, takže nemůže přijmout tolik potravy jako samice a téměř nemění velikost těla (Stafford, 2007).

Klíšťata Ixodes, stejně jako snad všichni živočichové, mají své přirozené nepřátele, mezi kterými najdeme zástupce hub, hlístic, hmyzu, ptáků a dalších. Houba rodu Metarhizium brunneum F52 (dříve známá též jako M. anisopliae) (Fischhoff et al., 2017; Ostfeld et al., 2006) se přirozeně nachází v půdě, je patogenní vůči klíšťatům, ale nepatogenní vůči savcům. Jakmile se spory houby octnou na kutikule klíštěte Ixodes, nastává germinace, penetrace, houba roste a tím obrůstá celé klíště, až jej zabije (Stafford, 2007). Tato houba je testována v laboratorních podmínkách i v přirozeném prostředí jako biologická kontrola klíšťat Ixodes, kde dosahuje i více než 50 % účinku (50 % Ixodes usmrceno) (Ostfeld et al., 2006). Larvy hlístic z čeledí Heterorhabditidae a Steinernematidae žijí volně v půdě. Do těla hostitele se dostávají jakýmkoli tělním otvorem, např. genitáliemi. Hlístice proliferuje v hemolymfě, kde produkuje toxiny a další metabolity, které klíště Ixodes usmrtí (Hartelt et al., 2008). Jedním z nejnebezpečnějších protivníků klíšťat Ixodes z hmyzí říše je vosička Ixodiphagus hookeri, která do těl klíšťat Ixodes naklade vajíčka, ze kterých se vylíhnou larvy a ty sežerou klíště Ixodes zevnitř (Ostfeld et al., 2006; Ramos et al., 2015).

Velké nebezpečí pro klíšťata představují hmyzožraví ptáci a hlodavci, kteří je požírají během čištění peří nebo srsti. Mezi ptáky, kteří se podílejí na úbytku klíšťat Ixodes patří divocí krocani (Meleagris). Perlička kropenatá (Numida meleagris) se podílí na redukci pouze dospělých klíšťat Ixodes v travních porostech. Největší ztráty působí klíšťatům Ixodes africký klubák žlutozobý (Buphagus africanus), který vyzobává stovky až tisíce klíšťat Ixodes denně z kůže divokých i domestikovaných zvířat (Ostfeld et al., 2006).

3. Borrelia burgdorferi

Doména Bacteria

Kmen Spirochaetes Třída Spirochaetes Řád Spirochaetales

Čeleď Spirochaetaceae Rod Borrelia Druh Borrelia burgdorferi Tab. 2: Taxonomie druhu Borrelia burgdorferi (“Borrelia burgdorferi,” 2008)

Bakterie rodu Borrelia patří do velké skupiny spirochet. Jejich nejbližšími příbuznými (také spirochety) jsou treponemy (např. Treponema pallidum způsobující syfilis). Společnou vlastností těchto dvou skupin je schopnost použití ornitinu při tvorbě vazeb mezi peptidoglykany (Barbour and Hayes, 1986; Kumar et al., 2017).

Bakterie rodu Borrelia se řadí mezi gramnegativní mikroaerofilní nebo anaerobní spirochety (Kříž et al., 2015). Jsou závislé na hostitelích, ať už se jedná o obratlovce nebo členovce (Brisson et al., 2012), volně žijící nebyly dosud nalezeny. Jejich pohyb mezi různými hostiteli zajišťují klíšťata Ixodes (Vanderhoof- Forschner, 2004). Z obratlovců nejvíce šíření bakterií a tedy i LB napomáhají ptáci, kteří rozšiřují přírodní ohniska nákazy i na velké vzdálenosti. (Bartůněk, 2013). Jednotlivé druhy a genotypy rodu Borrelia se liší počtem bičíků, plazmidů, antigenními vlastnostmi i různou afinitou k určitým orgánům (Bolehovská et al., 2009). Vlastnosti společné všem bakteriím z rodu Borrelia jsou následující: pomocí členovců jsou přenositelné na obratlovce a poměr guanosinu a cytosinu ku celkovému počtu bazí se nachází mezi 27 až 32 % (Kříž et al., 2015). Jako zdroj uhlíku pro tvorbu energie slouží těmto bakteriím glukóza (glykolýza), manóza, N-acetylglukosamin, maltóza, chitobióza (dimer N-acetylglukosaminu), dále dostatek energie zajišťuje fermentace cukrů na kyselinou mléčnou (Brisson et al., 2012; Talagrand-Reboul et al., 2018). Přestože se jedná o primárně extracelulárního patogena, jsou tyto bakterie schopny přežít v buňkách hostitele, dokonce i v imunitních buňkách. Takovým příkladem jsou makrofágy nebo dendritické buňky (Valek, n.d.).

Bbsl přežívají ve střevech klíšťat, kde rostou a vyvíjejí se. Živí se krví a lymfou hostitele. Velice důležitým prvkem pro život Bbsl není železo, jako u jiných bakterií, ale zinek, který potřebují pro růst, pro správné fungování metabolismu a také pro syntézu DNA (Bartůněk, 2013; Kříž et al., 2015). Teplotní optimum pro růst se pohybuje mezi 33 a 35 °C, jsou schopny koexistovat i při 22 °C, taková teplota se udržuje v těle

klíštěte Ixodes (Talagrand-Reboul et al., 2018). Borrelia způsobující LB se vyznačují tvorbou EM po přenosu z klíštěte Ixodes na člověka (Bartůněk, 2013).

Bbsl tvoří komplex, který obsahuje přes 30 genospecies (Bolehovská et al., 2009). V Evropě bylo detekováno celkem dvanáct kmenů: Bbss, Borrelia afzelii, Borrelia bissettii (též Borrelia bissettiae), Borrelia garinii, Borrelia spielmanii, Borrelia bavariensis, Borrelia carolinensis, Borrelia finlandensis, Borrelia kurtenbachii, Borrelia valaisiana a Borrelia lusitaniase, Borrelia mayonii (Obiegala et al., 2017; Raulf et al., 2018). LB způsobuje prvních pět druhů (Kříž et al., 2015; Zakovska et al., 2008). U ostatních druhů není nákaza jistá, ovšem existují studie, které potvrzují jejich přenos na člověka (Casjens et al., 2018). Nejrozšířenějšími druhy jsou B. garinii a B. afzelii, které se vyskytují na celém evropském kontinentu (Zakovska et al., 2008). Naproti tomu se Bbss nachází převážně v západní Evropě (Wilske et al., 2007). Dalšími druhy, které se nacházejí mimo Evropu, jsou např. Borrelia andersoni, Borrelia californiensis, Borrelia japonica, Borrelia sinica, Borrelia turdi (Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017).

Každá Bbsl má jinou afinitou k orgánům (popsáno níže), které přednostně napadají. Proč tomu tak je zatím vysvětleno nebylo. Odpověď by mohla být zapsána např. v proteinech a lipoproteinech, které bakterie tvoří (Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017).

B. afzelii se nejčastěji vyskytuje u hlodavců, jako jsou například myšice křovinná (Apodemus sylvaticus), veverka obecná (Sciurus vulgaris) a norník rudý (Myodes glareolus), kteří napomáhají šíření tohoto druhu na delší vzdálenosti (Ruyts et al., 2018). U člověka způsobuje kožní problémy, jako jsou dermatoborelióza (onemocnění kůže), ACA a EM (Bolehovská et al., 2009; Zakovska et al., 2008).

Hostitelé B. garinii jsou především zpěvaví ptáci, kteří stejně jako hlodavci rozšiřují její působení (Ruyts et al., 2017; Zakovska et al., 2008). B. garinii je spojována s neuroboreliózou (onemocnění centrální nervové soustavy) (Buhner, 2014). Druh B. garinii lze rozdělit do čtyř skupin, které se liší složením svých OspA proteinů (viz. níže) (Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017).

Bbss se vyskytuje v Severní Americe a velmi vzácně i v Evropě. Jejím přenašečem jsou malí savci i ptáci (Bolehovská et al., 2009; Ruyts et al., 2017). Na základě geografické distribuce a analýz se předpokládá, že Bbss je zodpovědná za lymskou artritidu (kloubní postižení) (Van der Heijden et al., 1999).

Borrelia lusitaniae využívá jako hostitele ještěrky (Ferreri et al., 2017). Přenašečem Borrelia valaisiana jsou pravděpodobně ptáci (Bolehovská et al., 2009).

Morfologie Borrelia burgdorferi Jako všechny spirochety má i Bbsl úzké spirálovité tělo dlouhé 10 – 20 μm mající průměr 0,3 μm. Kolem těla se obtáčejí bičíky, které zajišťují pohyb a tvar těla. Na každém konci se jich nachází 7 – 11, může jich být tedy až 22, a zanořují se zpět do těla na konci druhém, jsou od sebe vzdáleny 3 nm nebo méně a jejich složení je stejné jako u bičíků jiných bakterií (Kumar et al., 2017). Bičíky se dohromady skládají z více než třiceti proteinů a jsou rozděleny na tři části: bazální část, háček a vlákno (Lin et al., 2015). Vlákno je tvořeno proteiny FlaA a hlavně FlaB. Háček, který spojuje vlákno s bazálním tělem, pak proteinem FlgE (Guyard et al., 2013; Kumar et al., 2017; Moon et al., 2016). Bazální část je tvořena proteiny FliF a dalšími podobnými (Sultan et al., 2013).

Obrázek 3: Buněčná stavba Bbsl (Kumar et al., 2017)

Bbsl se pohybují rotací kolem své osy nebo smršťováním a natahováním rychlostí až 2 mm za minutu, což je na tak malou buňku úctyhodná rychlost. Pro srovnání: neutrofilní granulocyt se pohybuje rychlostí 4 μm za minutu, takže je pět set krát pomalejší než Bbsl (Valek, n.d.). Bylo zjištěno, že se bičíky pohybují asymetricky, např. na jednom konci těla rotují po směru hodinových ručiček a na druhém konci naopak (Moon et al., 2016).

Buněčná stěna Bbsl se skládá ze tří vrstev. První (vnitřní) je složena z peptidoglykanu, druhá (střední) z lipopolysacharidů a třetí (vnější) z lipoproteinů (Valek, n.d.), které se neustále mění (Valek, 2012).

Životní cyklus Bbsl se skládá z několika fází. Při první fázi, které se říká iniciační, se nachází Bbsl v těle hladového klíštěte Ixodes. Ve druhé fázi se bakterie dostává nejdříve do kůže a odtud do krve a dalších tělních tekutin teplokrevných živočichů. Třetí fáze zahrnuje setrvání Bbsl v hostitelské buňce. V poslední čtvrté fázi nastává smrt napadené buňky, Bbsl se dostává do krve, odtud při sání klíštěte Ixodes až do jeho trávicího traktu a celý cyklus může začít od začátku (Sultan et al., 2013; Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017).

Bbsl se rozmnožují jednou za 12 až 16 hodin. Ve srovnání s E. coli, která je schopna se rozmnožit každých 20 minut, jde o velmi pomalý proces (Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017).

Jako obranu před imunitním systémem člověka tvoří Bbsl cysty, což jsou kulovité útvary. Ty mohou být tvořeny i za nepříznivých podmínek (např. přítomnost antibiotik). Tato schopnost je známa od roku 1997 (Bolehovská et al., 2009). Po odeznění se z cyst mohou stát opět aktivní bakterie (Kříž et al., 2015).

Genom Borrelia burgdorferi Na rozdíl od ostatních bakterií, které mají kruhový chromozom, se genom Bbsl skládá z malého lineárního chromozomu, obsahuje i plazmidovou DNA (Valek, 2012; Vanderhoof-Forschner, 2004). Chromozom má délku přes 910 kbp, což jej činí jedním z největších bakteriálních genomů (Brisson et al., 2012). Nachází se zde 853 oblastí kódujících proteiny potřebné pro replikaci DNA, transkripci, translaci, energetický metabolismus, geny kódující transportní bílkoviny a regulační geny (Borrelia direct repeat, Bdr). Bdr jsou uložené v cytoplazmatické membráně, nemohou je ovlivnit antibiotika ani protilátky a řídí tvorbu proteinů pro tvorbu imunokomplexů. Tyto geny jsou důsledkem výměny plasmidů a zvyšování jejich množství v genomu velice variabilní napříč druhy i v rámci druhu jednoho (Bartůněk, 2013). Nenachází se zde jediný gen, který by kódoval geny pro biosyntézu látek. Plazmidová DNA obsahuje informace pro tvorbu proteinů nacházejících se na buněčné stěně, např. tzv. „Outer surface proteins“ (Osp), tyto geny souvisejí s virulencí a infekčností (Bolehovská et al., 2009; Valek, 2012). Bez chromozomu nejsou schopny plasmidy samostatně fungovat. U druhu Bbss je na plazmidu cp9 známa oblast o délce 3,3 kb, která kóduje tři geny pro autonomní replikaci plazmidu (tzn. bez účasti chromozomu). Mezi důležité geny patří BosR (stress related geny) a PerR (peroxid related geny), které umožňují dýchání Bbsl v mikroaerofilním prostředí (Bartůněk, 2013), a RpoS gen, který umožňuje Bbsl využívat chitin, což je polymer N-acetylglokasaminu, který je nutný pro tvorbu peptidoglykanu a bakterie jej degradují a importují do buněk ve formě monomeru nebo dimeru (Rhodes et al., 2010).

Jelikož každý kmen syntetizuje proteiny s odlišným složením (různá molekulová hmotnost i antigenní vlastnosti), lze je na základě těchto parametrů od sebe odlišit. Variabilitu ve složení genomu u jednotlivých genospecies lze porovnat v následující tabulce: 22

Počet plazmidů Chromozom Počet párů bazí Počet genů Lineární Cirkulární

B. afzelii lineární dsDNA 905 394 894 6 2 Bbss lineární dsDNA 910 725 874, z nich kódujících 851 12 9 B. garinii lineární dsDNA 904 246 904 1 1

Tab. 3: Složení genomu genospecies Bbsl (Bolehovská et al., 2009).

Mezi nejdůležitější proteiny vnější membrány patří OspA (adhezin), OspB, OspC (reduktin), FlaA, FlaB (oba bičíkové flageliny zmíněné výše) a VIsE (variable major like sequence E). Osp proteiny jsou důležité pro hostitelskou imunitní reakci (Bolehovská et al., 2009). Prvním nalezeným proteinem z této skupiny byl OspA v devadesátých letech minulého století. V té době se uvažovalo, že by mohl být jako antigen součástí vakcíny proti LB. Hraje zásadní úlohu v osidlování střev klíštěte (Liang et al., 2004). OspC protein je důležitý pro přenos Bbsl ze střev klíštěte do jeho slinných žláz a následně do těla dalšího hostitele (Bartůněk, 2013), je také nepostradatelný po přenosu, kdy s dalšími proteiny chrání bakterii před imunitní reakcí hostitele (Bernard et al., 2017). Bičík se skládá z proteinů FlaA a FlaB, přičemž FlaB je zodpovědný za chemotaxi a motilitu. Na antigenu VIsE doslova závisí život bakterie. Jakmile pronikne do těla hostitele, je vystavena riziku rozpoznání a eliminace. Tomuto se snaží zabránit expresí VIsE (Bolehovská et al., 2009).

Přenos a patogenita Borrelia burgdorferi Podle studie Žákovské et al. (2013) nejrizikovějšími měsíci, co se týče přisání klíštěte Ixodes a přenosu Borrelia, jsou květen až srpen. Statisticky tak byla dokázána závislost počtu klíšťat Ixodes na teplotě, tzn. když je vyšší teplota, jako je tomu právě v letních měsících, klíšťatům Ixodes se daří.

Infekční jsou všechna aktivní vývojová stádia klíštěte Ixodes – larva, nymfa, dospělec. Nejvyšší riziko onemocnění bývá v letech, kdy jsou teplé zimy, takže přežije daleko více hlodavců i přezimujících klíšťat Ixodes, a navíc za těchto podmínek klíšťata Ixodes zkracují svůj životní cyklus (Kříž et al., 2015)

Přenos Bbsl z klíštěte Ixodes na dalšího hostitele (obratlovce) je závislý na přemístění Bbsl do slinných žláz, na rezistenci a odolnosti Bbsl vůči působícím faktorům a na počtu spirochet ve žlázách klíštěte Ixodes. Pouze třetina infikovaných klíšťat Ixodes je schopna předat patogena dalšímu hostiteli (Bartůněk, 2013). Důležitým faktorem je i hostitel sám, jeho tělesná zdatnost, odolnost a imunitní reakce. Po přenosu se Bbsl v místě průniku do těle nového hostitele musí pomnožit. Tento proces může trvat několik dní i řadu týdnů.

Jakmile se Bbsl pomnoží, nastává diseminace, tzn. rozšíření bakterií po těle hostitele (Hyde, 2017). Diseminace jsou schopny jen ty Bbsl, které mají na svém povrchu membránové adherenční faktory. Existují případy, kdy byl člověk infikován i více než jedním druhem Bbsl. Jedná se ale o ojedinělé případy, neboť

Bbsl ve střevech klíšťat Ixodes mezi sebou bojují a přenosu jsou schopny jen ty nejodolnější a nejvíce virulentní (Bartůněk, 2013; Hamšíková et al., 2017).

4. Lymeská borelióza LB je zoonóza postihující velké množství orgánů (Kříž et al., 2015). Vyskytuje se po celém světě kromě Antarktidy a Jižní Ameriky v celkem 43 státech. Jedná se tak o nejrozšířenější onemocnění vůbec (Bolehovská et al., 2009). V Evropě a Severní Americe je to nejčastěji se vyskytují nemoc, kterou způsobují patogeny přenášené klíšťaty (Obiegala et al., 2017).

Jedním z hlavních projevů této nemoci je EM, což je kruhovité začervenání kůže většinou v místě přisání klíštěte Ixodes, které má velikost minimálně 5 cm v průměru a objevuje se za 3 dny až 4 týdny u asi poloviny populace (Moniuszko et al., 2015; Valek, n.d.). EM se nemusí objevit pouze v místě přisátí klíštěte Ixodes, ale v podstatě po celém těle. Pokud se objeví dříve (v řádu hodin), jedná se o hypersenzitivní reakci a nikoliv o EM. Další příznaky mohou být chřipkovitého charakteru, také poškození srdce, oční komplikace atd., které jsou nespecifické, proto je obtížné určit, zda se u pacienta jedná opravdu o LB či jinou nemoc. Pokud není onemocnění léčeno, může docházet k horečce, bolestem hlavy, ztuhlosti krku, bolesti svalů a kloubů a dalším komplikacím v řádech týdnů až měsíců (Kříž et al., 2015; Moniuszko et al., 2015).

LB mohou onemocnět i domácí zvířata, zejména psi, skot a koně. V hlodavcích může Bbsl přežívat celý jejich život bez projevů onemocnění (Bartůněk, 2013). Stejné je to i u divoká zvěře, která je přenašečem, ale sama LB netrpí (Valek, n.d.).

LB probíhá ve třech stádiích: časné lokalizované, časné diseminované, pozdní diseminované. První stádium se vyznačuje tvorbou EM (popsána výše) (Rodriguez et al., 2018). Pro druhé stádium jsou význačné několikanásobné léze kdekoliv na kůži, které jsou obvykle menších rozměrů a objevují se většinou po dobu 3 – 4 týdnů. Ve třetím stádiu mohou nastat obtíže nejrůznějšího charakteru – otok a bolest kloubů, potíže CNS, kožní abnormality jako je ACA a další (Parola and Raoult, 2001).

Prevence nákazy a léčba lymské boreliózy V devadesátých letech byla v USA vyvinuta vakcína, avšak kvůli nízké poptávce a potencionálním vedlejším účinkům byla stažena (Fischhoff et al., 2017). Proto jedinou možností vyvarování se nákazy LB je chránit se před klíšťaty, vyhýbat se lesům a zatravněným plochám od jara do podzimu, kdy je aktivita klíšťat nejvyšší, popř. pokud se klíště přichytí, co nejdříve jej odstranit (Fuente J. et al., 2016; Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017).

I když prozatím nebyla vymyšlena vakcína proti LB, jsou snahy o vyvinutí vakcíny proti klíšťatům. Od devadesátých let minulého století existuje jediná komerčně dostupná vakcína určená pro dobytek, která má za úkol chránit očkované zvíře před ektoparazity (Fuente J. et al., 2016). Součástí vakcíny jsou BM86/BM95 antigeny z australského klíštěte Rhipicephalus (Boophilus) microplus, nazývaného též „dobytčí 25

klíště“ (Constantinoiu C. C. et al., 2018; Fuente J. et al., 2016). Mimo ochrany před ektoparazity je vakcína finančně nenákladná a ekologická. Mechanismus účinku je založen na interakci specifických protilátek hostitele, které ovlivňují biologické funkce cílového antigenu tkáně klíštěte a znemožňují tak jeho sání. Očkování pro lidi je zatím stále ve vývoji. Uvažuje se nad několika desítkami proteinů, které by mohly být cílovými oblastmi protilátek vakcíny. (Fuente J. et al., 2016).

My sami se můžeme při pobytu v přírodě chránit vhodným výběrem oblečení, např. pokrývkou hlavy, dlouhými rukávy, také dlouhými světlými nohavicemi, nejlepší je vložit nohavice do ponožek a přelepit je lepicí páskou. Také není vhodné sedat si do podrostu, ve kterém se může ukrývat velké množství nymf klíšťat (Rodriguez et al., 2018). Ochranu před klíšťaty lze podpořit i použitím repelentů, které obsahují DEET (N,N-diethyl-toluamide) a permethrin. Repelenty s DEET lze aplikovat na kůži i oblečení, u repelentů s permethrinem se doporučuje aplikace pouze na oblečení (Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017). Neméně důležitá je i prohlídka těla po návratu z přírody (Bartůněk, 2013).

Jakmile je klíště objeveno, musí být co nejdříve odstraněno. Rozhodně se nedoporučuje před odstraněním klíštěte infikované místo potřít nějakými mastmi, petrolejem, lakem na nehty. Ty by mohly způsobit rychlejší přenos nemocí, protože se klíště při těchto podmínkách vyzvrací do rány (Rodriguez et al., 2018; Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017). Jelikož je Bbsl schopná se do těla dostat i skrz neporušenou kůži, je důležité se vyvarovat přímého kontaktu s klíštětem při jeho odstraňování, protože se Bbsl může nacházet i v jeho výkalech (Bartůněk, 2013).

Nejlepším nástrojem odstranění klíštěte je pinzeta, která uchytí klíště velmi blízko kůže. Klíště se odstraňuje vyvikláním a ne vytočením, ať už na jednu nebo na druhou stranu, jak se mnoho lidí mylně domnívá. Důležité také je při vytahování vyvíjet stále stejnou sílu, určitě není dobré snažit se klíště odstranit jedním prudkým pohybem (Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017). Po odstranění klíštěte se místo sání vyčistí dezinfekcí. Vytažené klíště se nerozmačkává mezi nehty, nespaluje apod., protože vzniklý aerosol je také infekční a člověk se tak může nakazit některou z nemocí, kterou bylo klíště infikováno. Nakonec je nutné místo kontrolovat aspoň po dobu 4 týdnů, zda se netvoří EM a zda nemá pacient některý z příznaků, které byly popsány výše. Odstraněné klíště lze odeslat na diagnostiku, kde zjistí, zda klíště bylo některou nemocí infikováno či nikoliv.

Úspěch léčby LB velmi úzce souvisí se stadiem, ve kterém se pacient nachází, resp. na době od vypuknutí infekce po její zjištění a léčení (viz. výše). Pokud je nemoc odhalena včas (při prvním stádiu), je poměrně vysoká šance na vyléčení. Pokud je onemocnění zjištěno později (ve druhém či třetím stádiu), pravděpodobnost na vyléčení se snižuje (Rodriguez et al., 2018).

Velmi dobrým příkladem zákeřného průběhu nemoci je příběh amerického muže, který byl infikován LB po přisání klíštětem. Po několika dnech od napadení objevil muž na svém krku vyrážku. Muž předpokládal, že klíště se muselo na něj přenést před dvěma týdny. Jelikož vyrážka neměla typický tvar a muž netrpěl žádnými obtížemi, lékař jej poslal domů. Po třech týdnech začal muž trpět bolestmi kloubů. Na klinice mu však nebyly diagnostikovány žádné abnormální protilátky, takže byl opět poslán domů s tím, že nebyl LB infikován. Za další měsíc se bolesti stupňovaly, muž trpěl anorexií a ztrátou paměti. Rozhodl se tedy vyhledat odborníka na LB. Tento odhalil LB u muže a okamžitě jej začal léčit (Patton and Phillips, 2018).

Nejčastěji se LB léčí antibiotiky. Velmi dobrých výsledků dosahuje antibiotikum doxycyklin, který se podává 100 mg dvakrát denně po dobu až 28 dnů. Dalšími možnostmi jsou tetracyklin, naproxen, ceftriaxon a další medikamenty (Patton and Phillips, 2018; Rodriguez et al., 2018).

Diagnostika lymské boreliózy Jak lze odvodit z výše napsaného, diagnostika LB může být velmi obtížná. Je založena na klinických nálezech, době přisání klíštěte, potenciálním vystavení se klíštěti a dalších faktorech. Běžné laboratorní testy nejsou většinou schopné LB objevit. Odhalení nemoci nepomáhá ani fakt, že leukocyty, hemoglobin, hematokrit a další látky ve většině případů zůstávají v normě (Vasudevan and Chatterjee, 2013).

Metody používané pro identifikaci nemoci lze rozdělit na přímé, kam se řadí kultivace a PCR, a nepřímé, mezi které patří sérologické testy, jako je např. ELISA (Schoen, 2013).

Jelikož ani jedna z metod není stoprocentně spolehlivá, je doporučována dvoustupňová analýza. První metoda by tak měla určit IgG a IgM protilátky nacházející se v těle pacienta. Pokud se tato první metoda ukáže jako pozitivní, následuje druhá, která má za úkol separovat protilátky (Aguero-Rosenfeld and Wormser, 2015).

Následující výčet představuje ty nejčastěji používané (nikoli všechny) metody pro detekci LB.

ELISA

Zkratka ELISA vychází z anglického enzyme-linked immunosorbet assay. Tato metoda slouží k detekci protilátek (nebo imunitní odpovědi) i antigenů. ELISA metoda se může pyšnit svou vysokou citlivostí. Na druhou stranu se může stát, že pacientovi bude diagnostikována LB, přestože ji nemá. Příčinou můžou být jiné nemoci, jako jsou např. syfilis, anaplazmóza a leptospiróza. Proto se výsledek této metody testuje ještě Western blottem, aby se oddělily falešně pozitivní výsledky od těch skutečně pozitivních (“Understanding the EIA Test| Lyme Disease | CDC,” n.d.).

Při detekci Bbsl se používají přečištěné neporušené bičíky jako antigeny. Kmeny, které jsou zdrojem těchto bičíků, by měly exprimovat OspC, které poskytují nejvyšší výpovědní hodnotu v rámci imunitní reakce IgM a IgG (Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017). IgM protilátky jsou detekovatelné 2 – 4 týdny po výskytu vyrážky, IgG se začínají objevovat po 4 – 6 týdnech, přičemž jsou detekovatelné až několik let (Vasudevan and Chatterjee, 2013).

Správné vyhodnocení výsledků metody ztěžují nespecifické zkřížené reakce a falešně pozitivní výsledky, které jsou nerozpoznatelné (Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017), proto je nutné diagnostiku neprovádět dříve než po několika týdnech od spatření vyrážky (Vasudevan and Chatterjee, 2013).

Kultivace

Kultivace Bbsl je poměrně složitá. Jak již bylo popsáno výše, jsou Bbsl schopny se množit in vitro každých 12 až 16 hodin. Naproti tomu in vivo jejich rozmnožovací cyklus trvá 6-12 hodin. V infikovaných odebraných tkáních jsou Bbsl schopny přežít delší dobu. Např. v citrátové krvi několik dní při 4 °C a 8 dní v mozkomíšních moku. Lze je také nalézt ve vodě, kterou znečistila klíšťata, hlodavci nebo ptáci svými výkaly (Bartůněk, 2013). Ke kultivaci se používají Kelly-Pettenkofer médium a Barbour-Stoenner-Kelly médium (Ruzic-Sabljic et al., 2017). Nejen, že kultivace je náročná na čas, ale ani citlivost metody není nijak vysoká, zvláště v případě kultivace Bbsl z mozkomíšního moku, kde se citlivost pohybuje mezi 10 až 30 % (Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017).

PCR

PCR se velice často využívá k diagnostice OspA typů B. garinii. Tato metoda je schopna detekovat i méně běžné B. valaisiana a B. spielmanii (Tylewska-Wierzbanowska and Chmielewski, 2017). Velkou výhodou metody je rychlost, citlivost a identifikace infikovaného vektoru. Velice často se používají modifikace klasické PCR, např. nested PCR, která zahrnuje amplifikaci dvou párů primerů a tím ještě zvyšuje specifitu reakce (Wills et al., 2018).

Western Blot

Výhodou metody Western Blot je vysoká specifita, která se pohybuje okolo až 95 %. Pokud buněčný lyzát určený k diagnostice obsahuje antigeny, membrána, na kterou se tyto antigeny vážou, musí obsahovat monoklonální protilátky. U rekombinantních antigenů je situace méně složitá, reakce poskytují pouze specifické proteiny. Navíc je možné použít u jednoho druhu jak specifické proteiny, tak i specifické peptidy, které jsou v podstatě proteinovými fragmenty. Ovšem i tato metody má jednu nevýhodu. Může se stát, že i když pacient byl infikován některým rodem Bbsl, v časném stádiu onemocnění nemusí tato metoda vykázat

pozitivní výsledky. Proto je doporučeno, aby se test zopakoval ještě jednou za asi 4 týdny od prvních příznaků, aby se definitivně potvrdilo nebo vyvrátilo, zda pacient trpí LB či nikoliv (Tylewska- Wierzbanowska and Chmielewski, 2017).

Jak si stojí Česká republika ve výskytu lymské boreliózy? V České republice je průměrně 4000 nových případů onemocnění LB. Jak je vidět z grafu 1 a tabulky 4, v posledních letech počet nových případů fluktuuje, takže lze předpokládat, že v letošním roce (2018) bude případů více než v roce loňském.

Výskyt LB u člověka se v České republice začal zaznamenávat a zkoumat v roce 1986, protože v tomto roce se zavedla sérologická diagnostika. První čtyři roky sloužila jako nespecifický antigen Borrelia recurrentis, od roku 1990 se pracuje se specifickým antigenem Bbsl. Jak je patrné z grafu 1 a tabulky 4, velký nárůst nahlášených pacientů byl v letech 1993 – 95. Toto byl důsledek zvýšeného výskytu klíšťat na našem území (Bartůněk, 2013).

Graf 1: Počet hlášených případů LB v České republice 1986-2017 (Bartůněk, 2013; Petráš et al., 2018)

Počet hlášených případů LB rok počet případů rok počet případů 1986 333 2003 3677 1987 458 2004 3243 1988 1429 2005 3647 1989 2134 2006 4370 1990 1663 2007 3558 1991 1433 2008 4350 1992 1851 2009 3863 1993 3488 2010 3597 1994 4063 2011 4834 1995 6302 2012 3304 1996 4193 2013 4646 1997 2443 2014 3743 1998 2138 2015 2913 1999 2722 2016 4694 2000 3847 2017 3939 2001 3547 Celkem: 104 080 2002 3658 Tab. 4: Počet hlášených případů LB v České republice 1986-2017 (Bartůněk, 2013; Petráš et al., 2018)

5. Cíle práce Cíle této bakalářské práce byly dva. Tím prvním bylo sledování infekčnosti klíšťat na přítomnost Bbsl na území České republiky za rok 2017. Druhý cíl se zaměřil na určení konkrétního druhu Bbsl a vysledování zastoupení jednotlivých genotypů v českých krajích.

6. Metodika Celkem bylo zpracováno 733 vzorků klíšťat zaslaných pro analýzu do společnosti Elisabeth Pharmacon z celé České republiky. Z těchto 733 vzorků bylo 165 vzorků pozitivních na Bbsl. U 114 z nich se podařilo určit i konkrétní druh.

Použity byly následující metody:

1. Izolace DNA z klíšťat 2. qPCR 3. První nested PCR 4. Druhá nested PCR 5. Gelová elektroforéza 6. Přečištění naamplifikované DNA pomocí ExoSap 7. Sekvenace 8. Přečištění DNA pomocí EDTA a ethanolu 9. Sekvenační analýza a vyhodnocení

Izolace DNA z klíšťat Nejdříve bylo potřeba izolovat potenciální bakteriální DNA. Tento proces byl proveden použitím automatického izolátoru Prepito. Do vzorku se přidala interní kontrola (IC DNA 01), která sloužila ke sledování kvality izolace a k detekci případných chyb během ní. Dále vzorek obsahoval proteinkinázu K, která slouží k degradaci bílkovin.

Materiál:

• Kit BodyFluid NA Prepito, který obsahoval magnetické částice, Lysis Buffer, Binding Buffer, Wash Buffer 3, 4, 5, 6, Elution Buffer, proteinkinázu K • Destička deep well plate • Automatický izolátor Prepito • Interní kontrola IC DNA 01

Postup:

1. Vzorky klíšťat byly rozbity sterilní jehlou. 2. Do mikrozkumavky se připravila směs obsahující 450 μl Lysis Buffer, 200 μl vody, 10 μl proteinkinázy K a 20 μl IC DNA. 3. Zkumavka byla inkubována 20 minut při 56°C při 700 otáčkách a následně krátce stočena. 32

4. Celý objem zkumavky byl rozplněn do deep well plate destičky. 5. Dalším krokem byla příprava Tip a Tube Rack: Do první řady mikrozkumavek bylo napipetováno 50 μl Elution Buffer, do druhé řady 150 μl Magnetic Beads a do třetí řady se umístily jednorázové špičky. 6. Destičky se umístily do izolátoru a zahájil se příslušný program. qPCR Metoda qPCR sloužila k detekci DNA Bbsl. K detekci byly použity přístroje MyGo Pro (IT-IS Life Science Ltd, Mahon) a LightCycler® 480 II (Roche Daignostic Ltd., Rotkreuz). Se vzorky obsahující tuto DNA se následně prováděly další metody, vzorky negativní na DNA Bbsl byly zlikvidovány.

Materiál:

• Kit EliGene® Borrelia RT (ELISABETH PHARMACON) obsahující MasterMix pro qPCR (primery, fluorescenční sondy, interní kontrola PC DNA Borrelia, Taq polymeráza) • Izolovaná DNA získaná předchozí izolací • PCR strip

Postup:

1. Do jamky stripu se napipetovalo 15 μl MasterMixu a 5 μl vzorku vyizolované DNA. 2. Do jiné jamky bylo napipetováno 5 μl interní kontroly, která sloužila ke sledování funkčnosti MasterMixu. 3. Do další jamky se napipetovala voda sloužící jako negativní kontrola. 4. Takto nachystaný strip se zavíčkoval, zamíchal, stočil a umístil do qPCR systému LightCycler. 5. V něm byl nastaven a spuštěn následující program: 1 cyklus 95 °C, 180 s

95 °C, 20 s

45 cyklů 55 °C, 20 s

72 °C, 30 s

Tab. 5: Protokol amplifikace qPCR

6. Výsledky této analýzy byly odečítány v kanálech FAM 510 – 528 pro Bbsl a HEX 530 – 548 pro interní kontrolu.

První nested PCR První nested PCR slouží k amplifikace specifického úseku DNA, který je později použit jako matrice pro sekvenační analýzu. Tímto specifickým úsekem je oblast IGS1 (intergenic spacer), která je dlouhá 454 bp. Důležitější je fakt, že tato oblast je mezidruhově velice variabilní, a proto je vhodná pro identifikaci jednotlivých kmenů.

Materiál:

• 2x PCRBIO Ultra mix (PCR Biosystems, Londýn) obsahující HotStart DNA polymerázu, PCR pufr,

dNTPs, MgCl2, stabilizátory • Primery B03 a B04 • PCR voda • Vzorky DNA • Termocyklér

Postup:

1. Jako první byl vytvořen MasterMix (množství pro jednu jamku): 12,5 μl 2x PCRBIO Ultramix, 0,5 μl každého primeru, 6,5 μl PCR vody. 2. Do každé jamky se napipetovalo 20 μl MasterMixu a 5 μl vzorku DNA. 3. Strip byl zamíchán, stočen a vložen do termocykléru, kde byl nastaven a spuštěn následující program: 1 cyklus 95 °C, 150 s

95 °C, 15 s (denaturace)

40 cyklů 56 °C, 15 s (annealing)

72 °C, 10 s (extenze)

1 cyklus 72 °C, 420 s

Tab. 6: Protokol aplifikace první nested PCR

4. Nakonec byly vzorky umístěny do chladničky.

Druhá nested PCR Kvůli stáří vzorků a neideální amplifikaci při elektroforéze byly všechny vzorky podrobeny druhé nested PCR. Úsek amplifikovaný touto metodou měl délku 331 bp.

Materiál:

• 2x EliZyme HS FAST (Elisabeth Pharmacon, ČR) HotStart ReadyMix obsahující HotStart DNA

polymerázu, PCR pufr, dNTPs, MgCl2, stabilizátory • Primery B01 a B02 • PCR voda • Vzorky DNA • Termocyklér

Postup:

1. Jako první byl vytvořen MasterMix (množství pro jednu jamku): 12,5 μl 2x EliZyme HS FAST, 0,7 μl každého primeru, 10 μl PCR vody. 2. Do každé jamky se napipetovalo 24 μl MasterMixu a 1 μl vzorku DNA. 3. Strip byl zamíchán, stočen a vložen do termocykléru, kde byl nastaven a spuštěn následující program: 1 cyklus 95 °C, 150 s

95 °C, 15 s (denaturace)

40 cyklů 56 °C, 15 s (annealing)

72 °C, 10 s (extenze)

1 cyklus 72 °C, 420 s

Tab. 7: Protokol aplifikace první nested PCR

4. Po proběhnutí reakce byly vzorky umístěné do chladničky. 5. I po této nested PCR následovala gelová elektroforéza. Vzorky, které se ani zde nepodařilo naamplifikovat, byly zlikvidovány.

Gelová elektroforéza Jelikož některé vzorky už byly staršího data, bylo potřeba zjistit, se kterými primery budou vzorky dobře pracovat. Proto část těchto vzorků byla nanesena do agarózového gelu a podrobena elektroforéze, kde se ukázalo, že ze tří typů použitých mastermixů (KAPA, EliZyme FAST Taq a EliZye HS FAST) je nejlepší poslední zmíněný.

Materiál:

• Agaróza • TBE pufr 1x koncentrovaný • Ethidiumbromid • PCR produkt • Elektroforetická vana a zdroj stejnosměrného napětí • Parafilm • Nanášecí pufr • GeneRulerTM DNA Ladder Mix • Transluminátor

Postup:

1. Nejdříve byl připraven 1,5 % agarózový gel. Na jeho přípravu bylo spotřebováno 3,97 g agarózy a 260 ml TBE pufru. Následně se směs vařila v mikrovlnné troubě až do úplného rozpuštění agarózy. 2. Než byla směs uvařena, byla sestavena elektroforetická vana a vanička s hřebínkem. 3. K uvařenému gelu se přidalo 5 μl ethidiumbromidu a směs se zamíchala tak, aby nevznikly bublinky. Následně se směsí zalila vanička a gel se nechal ztuhnout. 4. Ztuhlý gen se přemístil do elektroforetické vany a zalil TBE pufrem tak, aby byl zcela ponořen. Poté byl vytažen hřebínek. 5. Do každé jamky se napipetovalo 10 μl vzorku, který byl na pásu parafilmu smíchán s nanášecím pufrem. Do poslední jamky bylo napipetováno 3 μl Ladder Mixu, tzv. žebříček sloužící jako standard. 6. Do vany bylo zavedeno na 15 hodiny stejnosměrné napětí, jehož hodnota činila 85 V. 7. Nakonec se gel umístil na UV transluminátor a hodnotila se úspěšnost amplifikace.

Přečištění naamplikované DNA pomocí ExoSap Aby mohly být vzorky osekvenované, musely se nejdříve odstranit nezreagované primery a dNTPs. Právě k tomu slouží metoda Exosap, což je enzymatická reakce.

Materiál:

• Shrimp Alkaline Phospatase (SAP) • Exonuclease I E. coli (EXO) • Vzorky z druhé nested PCR

• PCR voda

Postup:

1. Do zkumavky se napipetovalo 1 μl SAP, 0,5 μl EXO a 5 μl vzorku. 2. Zkumavka se zamíchala, stočila a vložila do termocykleru, kde byl nastaven tento program: 37 °C 15 minut a 80 °C také 15 minut, nakonec ochlazení na 10 °C.

Sekvenační reakce Tato reakce má za úkol vytvořit statisticky různě dlouhé úseky DNA, které se poté podrobí sekvenační analýze.

Materiál:

• BigDy Terminator v 3.1. Cycle Sequencing Kit (DNA polymeráza, pufr, dNTPs, ddNTPs) • Primer • PCR voda • Vzorky

Postup:

1. Nejdříve se namíchala sekvenační směs: 2 μl sekvenačního mixu, 2 μl sekvenačního pufru, 0,6 μl primer, 2,4 μl PCR vody a 5 μl DNA. 2. Tato směs byla vložena do termocykleru, kde byl nastaven následující program: 1 cyklus 96 °C, 60 s

96 °C, 10 s

35 cyklů 50 °C, 5 s

60 °C, 180 s

Tab. 8: Protokol sekvenační reakce

Přečištění DNA pomocí EDTA a ethanolu Materiál:

• EDTA • 70 % a 100 % ethanol • Adhezivní fólie • Centrifuga 37

• Termostat • Formamid • Vortex • Vzorky • Papírová utěrka

Postup:

1. Do jamek destičky se napipetovalo 2,5 μ 125 mM EDTA, 10 μl vzorku a 25 μl 100 % ethanolu. 2. Destička se zalepila fólií a nechala inkubovat 15 minut ve tmě při laboratorní teplotě. 3. Následovala centrifugace po dobu 30 minut při 3 000 otáčkách a 4 °C. 4. Fólie se odlepila, destička se umístila na papírovou destičky vzhůru nohama a nechala se centrifugovat 1 minutu při 8 otáčkách a 4 °C. 5. Do jamek se napipetovalo 30 μl 70 % ethanolu, destička se zalepila fólií a opět nechala centrifugovat, tentokrát na 15 minut při 3 000 otáčkách a 4 °C. 6. Zopakoval se krok 4. 7. Destička se vložila do termostatu na 1 minutu při 95 °C. 8. Do jamek destičky se přidalo 10 μl formamidu, destička se zvortexovala a stočila. 9. Vzorky byly přeneseny na novou destičku, ta se vložila do termostatu na 2 minuty a poté do mrazáku.

Sekvenační analýza Přečištěná směs byla podrobená sekvenaci v kapilárním sekvenátoru Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems, USA). Výsledky z této sekvenace byly zpracovány ve volně dostupném programu MEGA7 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0). Databáze BLAST poté sloužila k odhalení druhů z komplexu Bbsl. Byl nastaven komplex organismů Borrelia group a vysoká podobnost sekvencí. Následně byl sestaven fylogenetický strom osekvenovaných druhů.

7. Výsledky

Vyhodnocení qPCR Celkem se vyhodnocovalo 733 vzorků. qPCR bylo zjištěno, že pozitivních vzorků na Bbsl je 165, což je 22,5 %. Pro detekci byla využita sonda v kanálu FAM, interní kontrola pak v kanálu HEX. Pozitivita vzorků byla detekována vzrůstem signálu ve FAM kanálu před 45. cyklem, u negativních vzorků k nárůstu nedošlo nebo se projevil po 45. cyklu. V tabulce 8, grafu 2 a na obrázku 4 je uvedeno zastoupení negativních i pozitivních vzorků v každém kraji České republiky. Obrázek 4 poukazuje na procentuální zastoupení pozitivních vzorků v jednotlivých krajích. Předpokládalo se, že v severních krajích bude nižší procentuální zastoupení než v jižních, toto ale z dostupných dat nevyplývá. V tabulce 9 a grafu 3 lze nalézt údaje o zastoupení Bbsl v jednotlivých měsících.

Celkem vzorků Negativní Pozitivní Pozitivní [%] Celkem 733 564 169 23,01 Jihočeský kraj 9 7 2 22,22 Jihomoravský kraj 314 241 73 23,25 Karlovarský kraj 8 7 1 12,50 Královehradecký kraj 30 23 7 23,33 Liberecký kraj 8 8 0 0,00 Moravskoslezský kraj 32 25 7 21,88 Olomoucký kraj 33 28 5 15,15 Pardubický kraj 21 14 7 33,33 Plzeňský kraj 14 11 3 21,43 Praha 109 82 27 24,77 Středočeský kraj 80 62 18 22,50 Ústecký kraj 14 10 4 28,57 Vysočina kraj 26 19 7 26,92 Zlínský kraj 35 27 8 22,86 Tab. 9: Celkový počet a počet negativních a pozitivních vzorků Bbsl v jednotlivých krajích (Zdroj: vlastní zpracování)

Graf 2: Počet případů LB v roce 2017 v jednotlivých krajích (Zdroj: vlastní zpracování)

Obrázek 4: Procentuální zastoupení pozitivních vzorků v jednotlivých krajích za rok 2017 (Zdroj: vlastní zpracování)

Celkem Negativní Pozitivní Pozitivní [%] Celkem 733 564 169 23,1 leden 0 0 0 0,0 únor 0 0 0 0,0 březen 5 5 0 0,0 duben 52 35 17 32,7 květen 159 116 43 27,0 červen 184 140 44 23,9 červenec 124 94 30 24,2 srpen 80 73 7 8,8 září 49 38 11 22,4 říjen 75 59 16 21,3 listopad 4 3 1 25,0 prosinec 1 1 0 0,0 Tab. 10: Celkový počet a počet negativních a pozitivních vzorků Bbsl v jednotlivých měsících (Zdroj: vlastní zpracování)

Graf 3: Počet případů LB během roku 2017 (Zdroj: vlastní zpracování)

Vyhodnocení gelové elektroforézy Pozitivní vzorky byly podrobeny první i druhé nested PCR, následovala elektroforéza, pomocí které byly rozlišeny vyřazeny nenaamplifikované vzorky. Pokud toto nastalo, s velkou pravděpodobností to znamenalo, že DNA byla poškozena dlouhým skladováním, proto se s těmito vzorky již nadále nepracovalo. Ze 165 vzorků se tak k přečišťovacím metodám dostalo 137, což je 83 % úspěšnost druhé nested PCR.

Výsledky gelové elektroforézy lze vidět na přiloženém snímku (obr. 5), ostatní jsou přiloženy v příloze. U tohoto obrázku (a dalších v příloze) je na pravé nebo levé straně vzorků umístěn žebřík. Dalo by se říct, že žebříky jsou sady fragmentů o různě dlouhých úsecích DNA. Ty nejkratší měří 100 bp, ty nejdelší 3000 bp. 100 bp úseky jsou na gelu vidět nahoře, protože díky své malé velikosti se pohybovaly nejrychleji. Délka naamplifikovaných vzorků je 331 bp. Pokud vzorek naamplifikován nebyl, je na gelu vidět prázdný prostor (např. vzorek TB70063 na obrázku 5). K vyhodnocení byl použit UV transluminátor.

Obrázek 5: Vyhodnocení druhé nested PCR (Zdroj: vlastní zpracování)

Výsledky DNA sekvenování Osekvenováno bylo všech 137 vzorků. Ze sekvenátoru byla data přemístěna do programu MEGA7. Zde byl vybrán úsek DNA dlouhý 200 bp, pokud to délka sekvence umožňovala. Tento úsek byl vložen do

internetové databáze BLAST, kde byl podle shody sekvence určen konkrétní druh komplexu Bbsl. U 23 vzorků se nepovedlo určit konkrétní druh, takže celkově bylo určeno 114 vzorků Bbsl. Celkem se povedlo určit 7 druhů Borrelia, rozdíly mezi sekvencemi těchto druhů lze spatřit na obrázku 6.

Obrázek 6: Části sekvencí jednotlivých osekvenovaných druhů Bbsl sestupně: B. afzelii, B. bavariensis, Bbss, B. garinii, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. valaisiana (Zdroj: vlastní zpracování)

Výskyt jednotlivých druhů Borrelia na českém území Graf 4 ukazuje celkové procentuální zastoupení druhů Bbsl v pozitivních vzorcích. Obrázek 7 uvádí procentuální zastoupení jednotlivých druhů v krajích České republiky, tabulka 10 přesné počty druhů.

Graf 4: Procentuální zastoupení Bbsl v pozitivních vzorcích v roce 2017 (Zdroj: vlastní zpracování) 43

Obrázek 7: Procentuální zastoupení druhů Bbsl v jednotlivých krajích České republiky v roce 2017 (Zdroj: vlastní zpracování) 44

B. B. B. B. B. B. B. Neurčeno Celkem afzelii bavariensis burgdorferi garinii lusitaniae spielmanii valaisiana

Jihočeský kraj 0 0 1 0 1 0 0 0 2

Jihomoravský kraj 25 0 6 12 1 0 7 22 73

Karlovarský kraj 1 0 0 0 0 0 0 0 1

Královehradecký 3 0 1 1 0 0 1 1 7 kraj

Liberecký kraj 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Moravskoslezský 3 0 0 2 0 0 0 2 7 kraj

Olomoucký kraj 1 1 0 1 0 0 0 3 6

Pardubický kraj 2 0 2 0 1 0 0 2 7

Plzeňský kraj 0 0 1 0 0 0 0 2 3

Praha 13 0 0 2 0 0 1 11 27

Středočeský kraj 5 1 0 1 0 1 3 7 18

Ústecký kraj 1 0 0 1 0 0 2 0 4

Vysočina kraj 4 0 1 0 0 0 0 2 7

Zlínský kraj 4 0 0 0 0 0 1 3 8

Celkem 62 2 12 20 3 1 15 55 170 Tab. 11: Počty druhů Bbsl v českých krajích (Zdroj: vlastní zpracování)

Fylogenetický strom Fylogenetický strom (obrázek 8) byl vytvořen v programu MEGA7. Znázorňuje příbuznost mezi jednotlivými vzorky Bbsl, které se podařilo osekvenovat. Sekvence Bbsl byly nejdříve zkráceny na délku 200 bp, pomocí nich se určily jednotlivé druhy a celý strom byl sestaven pomocí metody UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean).

Obrázek 8: Fylogenetický strom sekvenovaných druhů Bbsl (Zdroj: vlastní zpracování) 46

8. Diskuze LB je velmi vážné multisystémové onemocnění, které si nevybírá, zda napadne dítě či starce, ženu nebo muže. Onemocnění způsobují bakterie z komplexu Bbsl, přičemž nejčastěji jsou diagnostikovány tři z nich: B. afzeli, B. garinii a Bbss. Komplex zahrnuje přes tři desítky druhů. Nám se podařilo izolovat 7 z nich, a to B. afzelii, B. bavariensis, Bbss, B. garinii, B. lusitaniae, B. spielmanii a B. valaisiana.

V některých kruzích se vedou rozepře, zda kromě B. afzelii, B. garinii a Bbss způsobují LB i jiné druhy. Důkazů lze nalézt několik. V roce 2007 byla mužskému pacientovi v Českých Budějovicích nalezena v srdeční chlopni B. bissettii (Rudenko et al., 2008). O dva roky později byla ve stejné nemocnici provedena diagnostika LB u 12 pacientů. U 4 z nich byla nalezena Bbss, v jednom případě se jednalo o B. garinii a další 4 vzorky obsahovaly více než jeden druh Bbsl, konkrétně byly nalezeny Bbss, B. bissettii a B. garinii (Rudenko et al., 2009).

Pro tuto práci byla důležitá izolace DNA Bbsl z klíšťat Ixodes. Pozitivní klíšťata Ixodes tvořila 22,5 % z celkového počtu. Podle práce Klíče (2014) bylo v roce 2013 21 % klíšťat pozitivních, v práci Bardelčíka (2015) z roku 2014 to bylo 16 %. Tato data korenspondují s novými případy LB v těchto letech (viz. graf 1). Lze jen odhadovat, proč tomu tak je. Možná za to mohou mírné zimy, kdy spousta klíšťat přežije, možná brzká teplá jara, neboť klíšťatům vyhovuje teplé a vlhké počasí.

Jak se očekávalo, nejčastějším druhem byla B. afzelii, která se vyskytovala v 54 % případů. V roce 2013 tvořila B. afzelii 72 % a v roce 2014 taktéž 72 %. Tento velký rozdíl je nespíš způsoben počtem sekvenovaných druhů, protože co se týče množství vzorků, to bylo u všech tří prací zhruba srovnatelné (687, 621, 733). V roce 2014 i 2015 byly shodně zjištěny druhy B. afzelii, B. garinii, Bbss a B. lusitaniae, v letošním roce to bylo 7 druhů uvedených výše.

Jak ukazuje obrázek 4, podle získaných dat bylo procentuálně nejvíce pozitivních klíšťat Ixodes na Vysočině a v Ústeckém a Pardubickém kraji. Nejvyšší počet pozitivních vzorků byl získán z Jihomoravského kraje (tab. 10). Z Libereckého kraje nebyl získán ani jeden pozitivní vzorek, z Karlovarského kraje pouze 1.

Studie z roku 2017 shrnuje data z výzkumů prováděných v letech 2010 až 2016, kdy byla promořenost klíšťat rodu Ixodes v Evropě stanovena na 12,3 %. Soubor obsahoval 115 028 testovaných vzorků, 14 134 z nich bylo pozitivních na Bbsl. Studie byly následně rozděleny do sedmi regionů podle geografického umístění pro podrobnější analýzu dat: Britské ostrovy (Anglie, Skotsko, Wales), Iberský poloostrov (Portugalsko, Španělsko), západní Evropa (Belgie, Francie, Lucembursko, Nizozemí), Skandinávie (Bělorusko, Dánsko, Estonsko, Finsko, Norsko), centrální Evropa (Rakousko, Česká republika, Německa, Maďarsko, Polsko, Slovensko, Švýcarsko), jižní Evropa (Itálie), Balkánský poloostrov (Rumunsko, Srbsko, Bosna a Hercegovina). Ukázalo se, že nejvíce promořenými částmi evropského kontinentu jsou centrální Evropa (19,3 %) a Balkánský poloostrov (18,5 %), nejméně pak Britské ostrovy (3,6 %). Iberský poloostrov je promořen z 9,5 %, západní Evropa 10,2 %, jižní Evropa 15,3 % a Skandinávie 15,5 %. U pozitivních vzorků byly zjištěny i jednotlivé druhy z komplexu Bbsl. Nejčastěji zastoupenou bakterií byla B. afzelii (46,6 %), následovaly B. garinii (23,8 %), B. valaisiana (11,4 %), Bbss (10,2 %), B. lusitaniae (7,0 %), B. bavariansis (2,0 %), B. spielmanii (1,7 %), B. finlandensis (0,2 %) a B. bissettii (0,06 %) (Strnad et al., 2017). Tato data jsou ve shodě s daty, která jsme získali my ze vzorků zaslaných do firmy Elisabeth Pharmacon. Celková promořenost klíšťat rodu Ixodes byla stanovena na 23,01 %, zastoupení jednotlivých druhů je následující:

B. afzelii (54 %), B. garinii (17 %), B. valaisiana (13 %), Bbss (10 %), B. lusitaniae (3 %), B. bavariensis (2 %) a B. spielmanii (1 %) (viz. graf 4).

Jedna z nejstarších studií týkající se promořenosti klíšťat na našem území a jejich testování na Bbsl pochází z let 1988 – 1996. Klíšťata byla sbírána na Jižní Moravě pomocí vlajkování. V celkovém souboru klíšťat se nacházeli zástupci tří druhů: I. ricinus, Dermacentor reticularis a Haemaphysalis concina. Z celkového počtu 9 020 tvořila klíšťata infikovaná Bbsl 20,4 %. Infikována byla pouze klíšťata rodu I. ricinus, u ostatních dvou druhů nebyly Bbsl nalezeny. Celkem byly zjištěny 3 druhy Bbsl: B. afzelii, B. garinii a B. lusitaniae (Hubálek et al., 1998).

Od roku 1996 bylo v Brně v Jihomoravském kraji provedeno několik dalších studií, které testovaly promořenost klíšťat rodu Ixodes. V letech 1996 – 2002 byla průměrná pozitivita určena u 5,8 % z celkového počtu 2 813 klíšťat (Norek et al., 2017). Práce z roku 2015 srovnávala prevalenci Bbsl v klíšťatech druhu I. ricinus v letech 2008 – 2012. V jednotlivých rocích pozitivita kolísala mezi 16,7 až 33,3 %, konkrétně: v roce 2008 bylo pozitivních 16,7 % vzorků, v roce 2009 33,3 %, v roce 2010 31,8 %, v roce 2011 23,1 % a v roce 2012 to bylo 17,7 %. Nejčastěji se objevujícím druhem byla B. afzelii (70 %) následovaná B. garinii (10 %), B. valaisiana (8,6 %), B. spielmanii (7,1 %) a konečně Bbss (4,3 %) (Bonczek et al., 2015).

V roce 2016 bylo testováno 18 vzorků klíšťat I. ricinus posbíraných v Brně-Pisárkách, které se nacházejí v Jihomoravském kraji. Všechny vzorky byly již dříve označeny jako pozitivní na Bbsl. Zastoupeny byly druhy B. afzelii (23,81 %), B. garinii (66,67 %), B. valaisiana (9,5 %) (Norek et al., 2017). Výsledky z let 2008 – 2012 korespondují s výsledky, které byly zjištěny v této bakalářské práci, výsledky z roku 2016 nikoliv. Celková promořenost byla stanovena na 23,25 %, sekvenováním byly zjištěny druhy B. afzelii (24 %), B. garinii (17 %), B. valaisiana (10 %), Bbss (8 %) a B. lusitaniae (1 %).

V roce 2009 se studie Daniela et. al zaměřila na zjištění vztahu mezi výskytem klíšťat rodu Ixodes, promořeností Bbsl a nadmořskou výškou. Klíšťata byla sbírána v nadmořské výšce 990 – 1 370 m n. m. v pohoří Hrubý Jeseník, které se rozkládá na území Moravskoslezského a Olomouckého kraje. Dohromady bylo nashromážděno 1 207 vzorků, z nichž se 35 (2,90 %) prokázalo jako pozitivních. Klíšťata byla nacházena do nadmořské výšky 1 300 m n. m., ve výšce 1 300 – 1 370 nebylo nalezeno ani jedno. Byly objeveny tyto druhy: B. afzelii (48,57 %), B. garinii (31,43 %), Bbss (5,17 %), B. valaisiana (2,86 %) (Daniel et al., 2009). Klíšťata zaslaná do firmy Elisabeth Pharmacon byla pravděpodobně z nižších nadmořských výšek, protože jejich pozitivita na Bbsl činí 21,88 % v Moravskoslezském kraji a 15,15 % v kraji Olomouckém. B. afzelii i B. garinii byly shodně nalezeny v obou krajích. B. afzelii tvořila 43 % pozitivních vzorků z Moravskoslezského kraje a 16 % z kraje Olomouckého, B. garinii pak 28 % a 17 %. Navíc byla objevena B. bavariensis v 15 % případů v Olomouckém kraji, Bbss ani B. valaisiana nalezeny nebyly.

V roce 2009 Dubská et. al provedli sběr klíšťat z ptáků na Čerťáku, což je přehrada ležící v Moravskoslezském kraji. Z 1 084 chycených ptáků mělo 1 080 (99,6 %) přisáté klíště. Celkem bylo ze 446 (41,1 %) ptáků odstraněno 2 240 klíšťat. Ve všech případech se jednalo o klíšťata druhu I. ricinus. Bbsl byly nalezeny v 613 (27,4 %) klíšťatech. B. garinii byla identifikována v 497 (22,2 %) případech, B. valaisiana v 285 (12,7 %), B. afzelii v 36 (1,6 %) a Bbss v 6 (0,3 %). Zároveň bylo 109 klíšťat rodu Ixodes posbíráno pomocí vlajkování z vegetace. B. afzelii byla detekována v 7 (6,4 %) klíšťatech, dále byly detekovány B. garinii a B. valaisiana, každá po jednom případu (0,9 %) (Dubska et al., 2009). Z obrázku 7 lze vyčíst, že ani v jednom kraji B. garinii nebyla nejvíce procentuálně zastoupená, většinou se jednalo o B. afzelii.

Pravděpodobně je to dáno tím, že sběr klíšťat nebyl prováděn otěrem látky o vegetaci, ale klíšťata byla sbírána přímo z ptáků, kteří jsou běžní hostitelé B. garinii.

V roce 2014 byl prováděn sběr klíšťat rodu Ixodes v Ostravě. Jak se ukázalo, klíšťat pozitivních na Bbsl bylo 21,72 %, stanoveny byly tyto druhy: B. afzelii, B. garinii, Bbss, B. valaisiana, B. lusiataniae a B. spielmanii (Venclíková et al., 2014). Toto koresponduje s výsledky získanými v letošním roce, kdy byla pozitivita v Moravskoslezském kraji stanovena na 21,88 % (tab. 8), jen zjištěné druhy byly pouze dva: B. afzelii (43 %) a B. garinii (28 %).

V roce 2000 byla pomocí vlajkování sbírána klíšťata I. ricinus v okolí Českých Budějovic (Jihočeský kraj). Celkem bylo posbíráno 374 klíšťat, přičemž 76 (20,5 %) se ukázalo jako infikovaných Bbsl. Ve 43 (56,5 %) případech byla nalezena B. afzelii, ve 14 (18,4 %) B. garinii, v 7 (9,2 %) B. valaisiana a ve 2 (2,6 %) případech byla odhalena koinfekce B. afzelii a Bbss (Derdáková et al., 2003).

V roce 2010 byl uskutečněn sběr klíšťat v Jižních Čechách na celkem 4 místech. Posbíráno bylo 435 klíšťat Ixodes ricinus. 23 % tvořila klíšťat pozitivní na Bbsl. V 91 % se jednalo o infekci jedním druhem, v ostatních případech šlo o koinfekce dvou druhů. Nejčastěji se vyskytující byl druh B. afzelii, který se vyskytoval ve 34,9 %. Dalšími objevenými druhy byly: Bbss (29,4 %), B. garinii (21,1 %), B. valaisiana (7,3 %), B. lusitaniae (7,3 %) a B. miyamotoi (2,1 %) (Honig et al., 2017). V této bakalářské práci tvoří infikovaná klíšťata 22,2 %, což je srovnatelné s výsledky studie z let 2000 i 2010. Naopak v určených druzích a v procentuálním zastoupení se všechny tři studie liší. Zastoupeny byly pouze dva druhy, a to B. lusitaniae (50 %) a Bbss (taktéž 50 %). B. miyamotoi nebyla nalezena v žádném vzorku z Jihočeského ani z jiného kraje.

V roce 2016 byla provedena studie srovnávající promořenost klíšťat rodu Ixodes v Ústí nad Labem, v Olomouci, v Jižních Čechách a na Českomoravské vrchovině. Tato místa byla vybrána podle vysokého výskytu patogenů přenášených klíšťaty v letech 2001 – 2010. Výsledky studie jsou následující: Pozitivní vzorky tvořily 11,4 % z celkového počtu 2 773 vzorků. Nejméně pozitivních vzorků bylo nalezeno v Ústí nad Labem (1,4 %), nejvíce v Jižních Čechách (19,7 %). V pozitivních vzorcích byly určeny tyto druhy: B. afzelii, B. garinii, Bbss, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. spielmanii a B. lusitaniae (Daniel et al., 2016). Výsledky práce z roku 2016 a mé práce si lehce odporují. Promořenost Jihočeského kraje sice byla stanovena na 22,22 %, což není tak velký rozdíl, ovšem na Vysočině, kde se z velké části Českomoravská vrchovina rozprostírá, byla promořenost stanovena na 26,92 % a v Ústeckém kraji dokonce na 28,57 %.

Co se týče promořenosti a zjištěných druhů v ostatních krajích, nebyly nalezeny studie zahraničních autorů, takže výsledky lze srovnat pouze s pracemi Bardelčíka a Klíče, které jsou zmíněny již v prvních odstavcích diskuze. Výsledky ze všech tří prací shrnují následující tabulky (tab. 11 a 12):

Kraj Druh Klíč (2014) Bardelčík (2015) Kopečková (2018) Bbss 50,0 % Jihočeský - - B. lusitaniae 50,0 % B. afzelii 77,8 % 33,3 % 34,0 % Bbss 3,7 % 5,6 % 8,0 % Jihomoravský B. garinii 11,1 % 33,3 % 17,0 % B. lusitaniae 7,4 % 11,1 % 1,0 % B. valaisiana - 16,7 % 10,0 % Tab. 12: Zastoupení jednotlivých druhů v krajích v roce 2013, 2014 a 2017 (Bardelčík, 2015; Klíč, 2014; vlastní zpracování)

Kraj Druh Klíč (2014) Bardelčík (2015) Kopečková (2018) B. afzelii 50,0 % 100,0 % Karlovarský - B. garinii 50,0 % - B. afzelii 100,0 % 43,0 % Bbss - 15,0 % Královehradecký - B. garinii - 14,0 % B. valaisiana - 14,0 % B. afzelii 100,0 % 40,0 % Liberecký B. bavariensis - - - Bbss - 60,0 % B. afzelii 66,7 % - 43,0 % Moravskoslezský B. garinii 33,3 % 100,0 % 28,0 % B. afzelii 71,4 % 50,0 % 16,0 % B. bavariensis - - 15,0 % Olomoucký B. garinii 28,6 % 37,5 % 17,0 % B. valaisiana - 12,5 % - B. afzelii - 100,0 % 28,0 % Bbss 33,3 % - 29,0 % Pardubický B. garinii 66,7 % - - B. lusitaniae - - 14,0 % B. afzelii 100,0 % - Plzeňský - Bbss - 33,0 % B. afzelii 60,0 % 25,0 % 48,0 % B. garinii 20,0 % 62,5 % 7,0 % Praha B. lusitaniae 20,0 % - - B. spielmanii - 12,5 % - B. valaisiana - 12,5 % 4,0 % B. afzelii 66,7 % 66,7 % 28,0 % B. bavariensis - - 5,0 % Bbss 16,7 % - - Středočeský B. garinii 16,7 % 33,3 % 5,0 % B. spielmanii - - 6,0 % B. valaisiana - - 17,0 % B. afzelii 33,3 % 33,3 % 57,0 % Vysočina Bbss - - 14,0 % B. garinii 66,7 % 66,7 % - B. afzelii 100,0 % 57,1 % 25,0 % B. garinii - 14,3 % 25,0 % Ústecký B. lusitaniae - 14,3 % - B. spielmanii - 14,3 % - B. valaisiana - - 50,0 % B. afzelii 75,0 % 50,0 % Zlínský Bbss 25,0 % - - B. valaisiana - 12,0 % Tab. 13: Zastoupení jednotlivých druhů v krajích v roce 2013, 2014 a 2017 (Bardelčík, 2015; Klíč, 2014; vlastní zpracování) 50

9. Závěr LB patří mezi širokou škálu nemocí, které způsobují patogeny přenášené klíšťaty. Dalšími jsou např. klíšťová encefalitida, ehrlichióza, anaplazmóza a babezióza a stále se objevují nové patogeny a tedy i nové nemoci. I proto je zejména na jaře a v letních měsících vysoký zájem o informace spojené s výskytem klíšťat. Např. na stránkách SZÚ lze nalézt předpověď aktivity klíšťat a riziko spojené s přenášenými patogeny.

Prvním cílem této práce bylo zjistit promořenost klíšťat Ixodes ricinus na českém území. Z dostupných 733 vzorků bylo 165 pozitivních na Bbsl, což tvoří 22,5 %. Druhý cíl stanovoval určit druhy Bbsl. Ze 165 se 114 vzorků se podařilo osekvenovat a určit konkrétní druh. Nejvyšší zastoupení měla B. afzelii, která tvořila 54 % vzorků, na druhém místě byla B. garinii se 17 %. Nejvíce vzorků bylo otestováno z Jihomoravského kraje, konkrétně 73, poté z Prahy a ze Středočeského kraje. I v těchto případech platilo, že nejvíce zastoupená byla B. afzelii (34 %). Data z ostatních krajů jsou nedostatečná, bylo k dispozici malé množství vzorků.

10. Příloha

Obrázek 10: Vyhodnocení druhé nested PCR (Zdroj: vlastní zpracování)

Obrázek 9: Vyhodnocení druhé nested PCR (Zdroj: vlastní zpracování)

Obrázek 11: Vyhodnocení druhé nested PCR (Zdroj: vlastní zpracování)

11. Zdroje Aguero-Rosenfeld, M.E., Wormser, G.P., 2015. Lyme disease: diagnostic issues and controversies. Expert Review of Molecular Diagnostics 15, 1–4. https://doi.org/10.1586/14737159.2015.989837 Barbour, A.G., Hayes, S.F., 1986. Biology of Borrelia species. Microbiol Rev 50, 381–400. Bardelčík, M., 2015. Přítomnost rodu Borrelia a druhu Anaplasma phagocytophilum v klíšťatech Ixodes ricinus získaných z různých oblastí České republiky (Bachelor’s thesis). Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta. Bartůněk, P., 2013. Lymeská borelióza. Grada, Praha. Belozerov, V.N., Fourie, L.J., Lingen, F.J. van der, 1993. Sexual dimorphism in nymphal size of the Karoo paralysis tick, Ixodes rubicundus. Exp Appl Acarol 17, 627–629. https://doi.org/10.1007/BF00053493 Benelli, G., Romano, D., Rocchigiani, G., Caselli, A., Mancianti, F., Canale, A., Stefanini, C., 2018. Behavioral asymmetries in ticks – Lateralized questing of Ixodes ricinus to a mechatronic apparatus delivering host-borne cues. Acta Tropica 178, 176–181. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2017.11.024 Bernard, Q., Wang, Z., Di Nardo, A., Boulanger, N., 2017. Interaction of primary mast cells with Borrelia burgdorferi (sensu stricto): role in transmission and dissemination in C57BL/6 mice. Parasites Vectors 10, 313. https://doi.org/10.1186/s13071-017-2243-0 Bolehovská, R., Plíšek, S., Čermáková, Z., Palička, V., 2009. Lymeská borelióza 17, 24–28. Bonczek, O., Zakovska, A., Vargova, L., Sery, O., 2015. Identification of Borrelia burgdorferi genospecies isolated from Ixodes ricinus ticks in the South Moravian region of the Czech Republic. Ann. Agr. Env. Med. 22, 637–641. https://doi.org/10.5604/12321966.1185766 Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C.H., Samuels, D.S., 2012. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annu Rev Genet 46. https://doi.org/10.1146/annurev-genet-011112-112140 Brunner, J.L., Killilea, M., Ostfeld, R.S., 2012. Overwintering Survival of Nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) Under Natural Conditions. J. Med. Entomol. 49, 981–987. https://doi.org/10.1603/ME12060 Buhner, S.H., 2014. Borelióza: přírodní prevence a bylinná léčba lymské boreliózy a jejích koinfekcí. Triton, Praha. Burks Charles S., Stewart Richard L., Needham Glen R., Lee Richard E., 2008. The role of direct chilling injury and inoculative freezing in cold tolerance of Amblyomma americanum, Dermacentor variabilis and Ixodes scapularis. Physiological Entomology 21, 44–50. https://doi.org/10.1111/j.1365-3032.1996.tb00833.x Casjens, S.R., Di, L., Akther, S., Mongodin, E.F., Luft, B.J., Schutzer, S.E., Fraser, C.M., Qiu, W.- G., 2018. Primordial origin and diversification of plasmids in Lyme disease agent bacteria. BMC Genomics 19. https://doi.org/10.1186/s12864-018-4597-x Cayol, C., Koskela, E., Mappes, T., Siukkola, A., Kallio, E.R., 2017. Temporal dynamics of the tick Ixodes ricinus in northern Europe: epidemiological implications. Parasites Vectors 10, 166. https://doi.org/10.1186/s13071-017-2112-x Constantinoiu C. C., Lew‐Tabor A., Jackson L. A., Jorgensen W. K., Piper E. K., Mayer D. G., Johnson L., Venus B., Jonsson N. N., 2018. Local immune response to larvae of Rhipicephalus microplus in Santa Gertrudis cattle. Parasite Immunology 40, e12515. https://doi.org/10.1111/pim.12515 Daniel, M., Materna, J., Honig, V., Metelka, L., Danielová, V., Harcarik, J., Kliegrová, S., Grubhoffer, L., 2009. Vertical distribution of the tick Ixodes ricinus and tick-borne pathogens in the northern Moravian mountains correlated with climate warming (Jeseníky Mts., Czech Republic). Cent. Eur. J. Public Health 17, 139–145.

Daniel, M., Rudenko, N., Golovchenko, M., Danielova, V., Fialova, A., Kriz, B., Maly, M., 2016. The occurrence of Ixodes ricinus ticks and important tick-borne pathogens in areas with high tick-borne encephalitis prevalence in different altitudinal levels of the Czech Republic Part II. Ixodes ricinus ticks and genospecies of Borrelia burgdorferi sensu lato complex. Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. 65, 182–192. Derdáková, M., Beati, L., Pet’ko, B., Stanko, M., Fish, D., 2003. Genetic Variability within Borrelia burgdorferi Sensu Lato Genospecies Established by PCR-Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis of the rrfA-rrlB Intergenic Spacer in Ixodes ricinus Ticks from the Czech Republic. Appl Environ Microbiol 69, 509–516. https://doi.org/10.1128/AEM.69.1.509-516.2003 Dubska, L., Literak, I., Kocianova, E., Taragelova, V., Sychra, O., 2009. Differential Role of Passerine Birds in Distribution of Borrelia Spirochetes, Based on Data from Ticks Collected from Birds during the Postbreeding Migration Period in Central Europe. Appl. Environ. Microbiol. 75, 596–602. https://doi.org/10.1128/AEM.01674-08 Ferreri, L., Perazzo, S., Venturino, E., Giacobini, M., Bertolotti, L., Mannelli, A., 2017. Modeling the effects of variable feeding patterns of larval ticks on the transmission of Borrelia lusitaniae and Borrelia afzelii - ScienceDirect [WWW Document]. ScienceDirect. URL https://www-sciencedirect- com.ezproxy.muni.cz/science/article/pii/S0040580917301065?via%3Dihub (accessed 4.24.18). Fischhoff, I.R., Keesing, F., Ostfeld, R.S., 2017. The tick biocontrol agent Metarhizium brunneum (= M. anisopliae) (strain F52) does not reduce non-target arthropods. PLOS ONE 12, e0187675. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0187675 Fuente J., Kopáček P., Lew‐Tabor A., Maritz‐Olivier C., 2016. Strategies for new and improved vaccines against ticks and tick‐borne diseases. Parasite Immunology 38, 754–769. https://doi.org/10.1111/pim.12339 Grigoryeva, L.A., Stanyukovich, M.K., 2016. Life cycle of the taiga tick Ixodes persulcatus (Acari: Ixodidae) in the North-West of Russia. Exp Appl Acarol 69, 347–357. https://doi.org/10.1007/s10493-016-0038-1 Guyard, C., Raffel, S.J., Schrumpf, M.E., Dahlstrom, E., Sturdevant, D., Ricklefs, S.M., Martens, C., Hayes, S.F., Fischer, E.R., Hansen, B.T., Porcella, S.F., Schwan, T.G., 2013. Periplasmic Flagellar Export Apparatus Protein, FliH, Is Involved in Post-Transcriptional Regulation of FlaB, Motility and Virulence of the Relapsing Fever Spirochete Borrelia hermsii. PLOS ONE 8, e72550. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0072550 Hamšíková, Z., Coipan, C., Mahríková, L., Minichová, L., Sprong, H., Kazimírová, M., 2017. Borrelia miyamotoi and Co-Infection with Borrelia afzelii in Ixodes ricinus Ticks and Rodents from Slovakia. Microb Ecol 73, 1000–1008. https://doi.org/10.1007/s00248-016- 0918-2 Hartelt, K., Wurst, E., Collatz, J., Zimmermann, G., Kleespies, R.G., Oehme, R.M., Kimmig, P., Steidle, J.L.M., Mackenstedt, U., 2008. Biological control of the tick Ixodes ricinus with entomopathogenic fungi and nematodes: Preliminary results from laboratory experiments. Int. J. Med. Microbiol. 298, 314–320. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2007.10.003 Honig, V., Carolan, H.E., Vavruskova, Z., Massire, C., Mosel, M.R., Crowder, C.D., Rounds, M.A., Ecker, D.J., Ruzek, D., Grubhoffer, L., Luft, B.J., Eshoo, M.W., 2017. Broad-range survey of vector-borne pathogens and tick host identification of Ixodes ricinus from Southern Czech Republic. FEMS Microbiol Ecol 93. https://doi.org/10.1093/femsec/fix129 Hubálek, Z., Halouzka, J., Juricová, Z., 1998. Investigation of haematophagous arthropods for borreliae--summarized data, 1988-1996. Folia Parasitol. 45, 67–72.

Hyde, J.A., 2017. Borrelia burgdorferi Keeps Moving and Carries on: A Review of Borrelial Dissemination and Invasion. Front. Immunol. 8, 114. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.00114 Klíč, V., 2014. RealTime PCR detekce a DNA sekvenace rodu Borrelia ze vzorků klíšťat získaných z různých oblastí České republiky (Bachelor’s thesis). Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta. Kříž, B., Daniel, M., Beneš, Č., Malý, M., Kolář, J., Potůčková, M., Štefanová, E., 2015. Mapování přírodních ohnisek zoonóz přenosných na člověka v ČR a jejich změny ovlivněné modifikacemi klimatu., SZÚ [WWW Document]. URL http://www.szu.cz/tema/prevence/mapovani-prirodnich-ohnisek-zoonoz-prenosnych-na- cloveka-v?highlightWords=boreli%C3%B3za (accessed 3.17.18). Kumar, B., Miller, K., Charon, N.W., Legleiter, J., 2017. Periplasmic flagella in Borrelia burgdoferi function to maintain cellular integrity upon external stress. PLOS ONE 12, e0184648. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0184648 Liang, F.T., Caimano, M.J., Radolf, J.D., Fikrig, E., 2004. Borrelia burgdorferi outer surface protein (osp) B expression independent of ospA. Microbial Pathogenesis 37, 35–40. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2004.02.007 Lin, T., Gao, L., Zhao, X., Liu, J., Norris, S.J., 2015. Mutations in the Borrelia burgdorferi Flagellar Type III Secretion System Genes fliH and fliI Profoundly Affect Spirochete Flagellar Assembly, Morphology, Motility, Structure, and Cell Division. mBio 6, e00579- 15. https://doi.org/10.1128/mBio.00579-15 Michel, T., Souza, U., Dall’Agnol, B., Webster, A., Peters, F., Christoff, A., Luza, A.L., Kasper, N., Becker, M., Fiorentin, G., Klafke, G., Venzal, J., Martins, J.R., Jardim, M.M.D.A., Ott, R., Reck, J., 2017. Ixodes spp. (Acari: Ixodidae) ticks in Rio Grande do Sul state, Brazil. Systematic and Applied Acarology 22, 2057–2067. https://doi.org/10.11158/saa.22.12.3 Moniuszko, A., Dunaj, J., Zajkowska, J., Czupryna, P., Swierzbinska, R., Guziejko, K., Aleksiejczuk, P., Barry, G., Kondrusik, M., Pancewicz, S., 2015. Comparison of detection of Borrelia burgdorferi DNA and anti-Borrelia burgdorferi antibodies in patients with erythema migrans in north-eastern Poland. Postep. Dermatol. Alergol. 32, 11–14. https://doi.org/10.5114/pdia.2014.40940 Moon, K.H., Zhao, X., Manne, A., Wang, J., Yu, Z., Liu, J., Motaleb, M.A., 2016. Spirochetes flagellar collar protein FlbB has astounding effects in orientation of periplasmic flagella, bacterial shape, motility, and assembly of motors in Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol 102, 336–348. https://doi.org/10.1111/mmi.13463 Nader, J., Król, N., Pfeffer, M., Ohlendorf, V., Marklewitz, M., Drosten, C., Junglen, S., Obiegala, A., 2018. The diversity of tick-borne bacteria and parasites in ticks collected from the Strandja Nature Park in south-eastern Bulgaria. Parasites & Vectors 11, 165. https://doi.org/10.1186/s13071-018-2721-z Namebank Record Detail [WWW Document], 2008. . uBio. URL http://www.ubio.org/browser/details.php?namebankID=2554496 (accessed 3.20.18). Nejedla, P., Norek, A., Vostal, K., Zakovska, A., 2009. What Is the Percentage of Pathogenic Borreliae in Spirochaetal Findings. Ann. Agr. Env. Med. 16, 273–276. Netusil, J., Zakovska, A., Vostal, K., Norek, A., Stanko, M., 2013. The occurrence of Borrelia burgdorferi sensu lato in certain ectoparasites (Mesostigmata, Siphonaptera) of Apodemus flavicollis and Myodes glareolus in chosen localities in the Czech Republic. Acta Parasitolog. 58, 337–341. https://doi.org/10.2478/s11686-013-0147-5 Norek, A., Janda, L., Zakovska, A., 2017. DNA-based identification and OspC serotyping in cultures of Borrelia burgdorferi s.l. isolated from ticks collected in the Moravia (Czech

Republic) (vol 41, pg 171, 2016). J. Vector Ecol. 42, 207–207. https://doi.org/10.1111/jvec.12260 Obiegala, A., Krol, N., Oltersdorf, C., Nader, J., Pfeffer, M., 2017. The enzootic life-cycle of Borrelia burgdorferi (sensu lato) and tick-borne rickettsiae: an epidemiological study on wild-living small mammals and their ticks from Saxony, Germany. Parasites Vectors 10, 115. https://doi.org/10.1186/s13071-017-2053-4 Ostfeld, R.S., Price, A., Hornbostel, V.L., Benjamin, M.A., Keesing, F., 2006. Controlling Ticks and Tick-borne Zoonoses with Biological and Chemical Agents. BioScience 56, 383–394. https://doi.org/10.1641/0006-3568(2006)056[0383:CTATZW]2.0.CO;2 Parola, P., Raoult, D., 2001. Ticks and Tickborne Bacterial Diseases in Humans: An Emerging Infectious Threat. Clin Infect Dis 32, 897–928. https://doi.org/10.1086/319347 Patton, S.K., Phillips, B., 2018. CE: Lyme Disease Diagnosis, Treatment, and Prevention. AJN The American Journal of Nursing 118, 38. https://doi.org/10.1097/01.NAJ.0000532071.32468.f7 Petráš, P., Macková, B., Beneš, Č., Částková, J., Kříž, B., Křížová, P., Kynčl, J., Urban, J., 2018. Infekce v ČR 2017, kumulativně, SZÚ 21. proteináza | Velký lékařský slovník On-Line [WWW Document], n.d. URL http://lekarske.slovniky.cz/pojem/proteinaza (accessed 4.5.18). Rajagopalan, P.K., M., J.B., 1966. Hosts and Life Cycle of Ixodes ceylonensis Kohls, 1950, with Descriptions of Its Male, Nymph, and Larva. The Journal of Parasitology 52, 1203–1209. https://doi.org/10.2307/3276369 Ramos, R.A.N., Campbell, B.E., Whittle, A., Lia, R.P., Montarsi, F., Parisi, A., Dantas-Torres, F., Wall, R., Otranto, D., 2015. Occurrence of Ixodiphagus hookeri (Hymenoptera: Encyrtidae) in Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae) in Southern Italy. Ticks and Tick-borne Diseases 6, 234– 236. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2015.01.001 Raulf, M.-K., Jordan, D., Fingerle, V., Strube, C., 2018. Association of Borrelia and Rickettsia spp. and bacterial loads in Ixodes ricinus ticks. Ticks and Tick-borne Diseases 9, 18–24. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2017.10.014 Rhodes, R.G., Atoyan, J.A., Nelson, D.R., 2010. The chitobiose transporter, chbC, is required for chitin utilization in Borrelia burgdorferi. BMC Microbiol. 10, 21. https://doi.org/10.1186/1471-2180-10-21 Rodriguez, Y., Rojas, M., Eric Gershwin, M., Anaya, J.-M., 2018. Tick-borne diseases and autoimmunity: A comprehensive review. J. Autoimmun. 88, 21–42. https://doi.org/10.1016/j.jaut.2017.11.007 Rudenko, N., Golovchenko, M., Mokracek, A., Piskunova, N., Ruzek, D., Mallatova, N., Grubhoffer, L., 2008. Detection of Borrelia bissettii in cardiac valve tissue of a patient with endocarditis and aortic valve stenosis in the Czech Republic. J. Clin. Microbiol. 46, 3540– 3543. https://doi.org/10.1128/JCM.01032-08 Rudenko, N., Golovchenko, M., Ruzek, D., Piskunova, N., Mallatova, N., Grubhoffer, L., 2009. Molecular detection of Borrelia bissettii DNA in serum samples from patients in the Czech Republic with suspected borreliosis. FEMS Microbiol. Lett. 292, 274–281. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2009.01498.x Ruyts, S.C., Frazer-Mendelewska, E., Berge, K.V.D., Verheyen, K., Sprong, H., 2017. Molecular detection of tick-borne pathogens Borrelia afzelii, Borrelia miyamotoi and Anaplasma phagocytophilum in Eurasian red squirrels Sciurus vulgaris. Eur J Wildl Res 63, 43. https://doi.org/10.1007/s10344-017-1104-7 Ruyts, S.C., Tack, W., Ampoorter, E., Coipan, E.C., Matthysen, E., Heylen, D., Sprong, H., Verheyen, K., 2018. Year-to-year variation in the density of Ixodes ricinus ticks and the prevalence of the rodent-associated human pathogens Borrelia afzelii and B. miyamotoi in 57

different forest types. Ticks and Tick-borne Diseases 9, 141–145. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2017.08.008 Ruzic-Sabljic, E., Maraspin, V., Stupica, D., Rojko, T., Bogovic, P., Strle, F., Cerar, T., 2017. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One 12, e0171622. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0171622 Schoen, R.T., 2013. Better Laboratory Testing for Lyme Disease: No More Western Blot. Clin. Infect. Dis. 57, 341–343. https://doi.org/10.1093/cid/cit238 Sheep Tick - Ixodes ricinus - Overview [WWW Document], n.d. . Encyclopedia of Life. URL http://www.eol.org/pages/514939/overview (accessed 4.5.18). Sonenshine, D.E., Roe, R.M., 2013. Biology of Ticks. OUP USA. Sprong, H., Azagi, T., Hoornstra, D., Nijhof, A.M., Knorr, S., Baarsma, M.E., Hovius, J.W., 2018. Control of Lyme borreliosis and other Ixodes ricinus-borne diseases. Parasites & Vectors 11. https://doi.org/10.1186/s13071-018-2744-5 Stafford, D.K.C., 2007. Tick Management Handbook. Bulletin 84. Steere, A.C., Coburn, J., Glickstein, L., 2004. The emergence of Lyme disease. J Clin Invest 113, 1093–1101. https://doi.org/10.1172/JCI21681 Strnad, M., Hönig, V., Růžek, D., Grubhoffer, L., Rego, R.O.M., 2017. Europe-Wide Meta- Analysis of Borrelia burgdorferi Sensu Lato Prevalence in Questing Ixodes ricinus Ticks. Appl. Environ. Microbiol. 83, e00609-17. https://doi.org/10.1128/AEM.00609-17 Sultan, S.Z., Manne, A., Stewart, P.E., Bestor, A., Rosa, P.A., Charon, N.W., Motaleb, M.A., 2013. Motility Is Crucial for the Infectious Life Cycle of Borrelia burgdorferi. Infect. Immun. 81, 2012–2021. https://doi.org/10.1128/IAI.01228-12 Talagrand-Reboul, E., Boyer, P.H., Bergström, S., Vial, L., Boulanger, N., 2018. Relapsing Fevers: Neglected Tick-Borne Diseases. Front. Cell. Infect. Microbiol. 8. https://doi.org/10.3389/fcimb.2018.00098 Tylewska-Wierzbanowska, S., Chmielewski, T., 2017. Tick-Borne Bacterial Diseases in Poland. HEALTH PROBL. CIVILIZ. 11, 56–65. https://doi.org/10.5114/hpc.2017.69017 Understanding the EIA Test| Lyme Disease | CDC [WWW Document], n.d. URL https://www.cdc.gov/lyme/diagnosistesting/labtest/twostep/eia/index.html (accessed 4.27.18). Valek, Z., 2012. Lymská borelióza: komplexní pohled [WWW Document]. Borelioza.cz. URL http://www.borelioza.cz/cs/ke_stazeni/? (accessed 3.31.18). Valek, Z., n.d. Co je to Lymská borelióza? [WWW Document]. Borelioza.cz. URL http://www.borelioza.cz/cs/co_je_lymska_borelioza/? (accessed 3.18.18). Van der Heijden, I.M., Wilbrink, B., Rijpkema, S.G.T., Schouls, L.M., Heymans, P.H.M., Van Embden, J.D.A., Breedveld, F.C., Tak, P.P., 1999. Detection of Borrelia burgdorferi sensu stricto by reverse line blot in the joints of Dutch patients with lyme arthritis. Arthritis Rheum. 42, 1473–1480. https://doi.org/10.1002/1529-0131(199907)42:7<1473::AID- ANR22>3.0.CO;2-I Vanderhoof-Forschner, K., 2004. Everything You Need to Know About Lyme Disease and Other Tick-Borne Disorders. John Wiley & Sons. Vasudevan, B., Chatterjee, M., 2013. Lyme Borreliosis and Skin. Indian J Dermatol 58, 167–174. https://doi.org/10.4103/0019-5154.110822 Venclíková, K., Betášová, L., Šikutová, S., Jedličková, P., Hubálek, Z., Rudolf, I., 2014. Human pathogenic borreliae in Ixodes ricinus ticks in natural and urban ecosystem (Czech Republic). Acta Parasitologica 59, 717–720. https://doi.org/10.2478/s11686-014-0296-1 Weber, K., 2001. Aspects of Lyme Borreliosis in Europe. EJCMID 20, 6–13. https://doi.org/10.1007/s100960000412 58

Wills, M.K.B., Kirby, A.M., Lloyd, V.K., 2018. Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR. J. Vis. Exp. e56471. https://doi.org/10.3791/56471 Wilske, B., Fingerle, V., Schulte-Spechtel, U., 2007. Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis. FEMS Immunol Med Microbiol 49, 13–21. https://doi.org/10.1111/j.1574-695X.2006.00139.x Zakovska, A., Janouskovcova, E., Pejchalova, K., Halouzka, J., Dendis, M., 2008. Identification and characterization of 31 isolates of Borrelia burgdorferi (Spirochaetales, Spirochaetaceae) obtained from various hosts and vectors using PCR-RFLP and SDS-PAGE analysis. Acta Parasitolog. 53, 186–192. https://doi.org/10.2478/s11686-008-0028-5 Zakovska, A., Nejezchlebova, H., Bartonkova, N., Rasovska, T., Kucerova, H., Norek, A., Ovesna, P., 2013. Activity of the tick Ixodes ricinus monitored in a suburban park in Brno, Czech Republic, in association with the evaluation of selected repellents. J. Vector Ecol. 38, 295– 300. Zicha, O., 2018a. BioLib: Biological library: piják stepní [WWW Document]. BioLib.cz. URL https://www.biolib.cz/cz/taxon/id76114/ (accessed 4.18.18). Zicha, O., 2018b. BioLib: Biological library: klíšť stepní [WWW Document]. BioLib.cz. URL https://www.biolib.cz/cz/taxon/id76124/ (accessed 4.18.18).