G.A. Carrillo-B, S. Martin-Solano. Estudio Preliminar Sobre La Comunidad De Primates En El Bosque Protector Del Oglán Alto

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G.A. Carrillo-B, S. Martin-Solano. Estudio Preliminar sobre la comunidad de primates en el bosque protector del Oglán Alto. Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas. V...

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ISSN 00349313

Revista Ecuatoriana de

MEDICINA Y CIENCIAS BIOLÓGICAS

VOLUMEN XXXI NÚMEROS 1 y 2 OCTUBRE / 2010 FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 2

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas Volumen XXXI Números 1 y 2 Octubre 2010 Casa de la Cultura Ecuatoriana Benjamín Carrión, 2010 Dirección de Publicaciones / CCE Av. Seis de Diciembre N16-224 y Patria, Quito, Ecuador Diseño portada: Andrés Cepeda, AC Imagen Fotografía portada: Santiago F. Burneo Diagramación: César E. Salazar O. Corrección: SEB-Pichincha ISSN 00349313 FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 3

DIRECTORIO Casa de la Cultura

Presidente: Dr. Marco Antonio Rodríguez Secretario General: Dr. José Merino Director de Publicaciones: Dr. Fabián Guerrero Obando

Sección de Ciencias Naturales, Biológicas y Ciencias Exactas

Presidente: Dr. Claudio Cañizares Proaño Secretaria: Dra. Nina León (E) Vocales: Dr. Plutarco Naranjo Vargas Dra. Laura Arcos Terán Dr. David Niell

Miembros Laura Arcos Terán Plutarco Naranjo Vargas Fernando Astudillo Arroyo (+) Celín Astudillo Espinoza Holm Nielsen Lauritz David Niell Enriqueta Banda de Naranjo Arturo Nina León Jaime Bhreil Tjitte de Vries Augusto Bonilla Barco Milton Paz y Miño Claudio Cañizares Proaño Hernán Proaño Eugenia Del Pino Edgar Samaniego Rojas Jaime Díaz Moreno Cristóbal Santacruz Rodrigo Fierro Benítez Fausto Sarmiento Rodríguez Raúl Granda Jorge Suárez Armijos Alex Hirtz Fernando Sempértegui Ontaneda Eduardo Luna Yépez Jorge Soria Aníbal Jarrín José Varea Terán Oswaldo Morán Pinto Henrik Balslev Marcelo Moreano Dávila Rodrigo Yépez Miño Miguel Moreno Espinoza (+)

Editores Comité Editorial

Dr. Sergio Barba (Medicina) Licd. Santiago Burneo Dr.Carlos A. Soria (Ciencias Naturales) FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 4

ISNN 003349313 Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXXI Números 1 y 2 1-127, octubre 2010

ÍNDICE

Directorio de la Casa de la Cultura ...... pág. 3 Editorial ...... pág. 5 Trabajos originales Impacto genético en comunidades Amazónicas del Ecuador localizadas en zonas petroleras César Paz-y-Miño, Bernardo Castro, Andrés López-Cortés, María José Muñoz, Alejandro Cabrera, Catalina Herrera, Adolfo Maldonado, Carolina Valladares, María Eugenia Sánchez...... pág. 7

Resistencia a carbapenemes asociada a integrones clase 1 en Pseudomonas aeruginosa María Fernanda Yauri, Iliana Alcocer, Mercedes Rodríguez-Riglos & Jeannete Zurita...... pág. 20

Estandarización de la metodología para el conteo cromosómico en especies del género Polylepis en el Ecuador Quija-Lamina, P., Segovia-Salcedo, C., Jadán, M. & Proaño K ...... pág. 33

Análisis RAPD de la diversidad genética de Theobroma cacao L. de una población del Literol Ecuatoriano. Mercedes Carranza, Emmerick Motte, Virma Cedeño, Orly Cevallos, Silvia Saucedo, Hyron Canchingnia, Ariel Escobar ...... pág. 50

Control de nemátodos en maracuyá usando benzimidazoles en ácidos húmicos Carlos A. Soria…………………………………………………………………………..……pág. 58

Un método cuantitativo para medir el área de tubérculo dañado por larvas de Tecia solanivora (Lep.; Gelechiidae) a través de análisis de imágenes digitales Carlos Carpio, Jean-Louis Zeddam , Álvaro Barragán, Gustavo Nuñez, Marcelo Patiño & Olivier Dangles ...... pág. 69

Estudio preliminar sobre la comunidad de primates en el bosque protector del Oglán Alto. Araujo-Pastaza. Gabriel Alberto Carrillo Bilbao & Sarah Martin-Solano...... pág. 79 Trabajos de revisión La gastrulación en ranas con diversos modos de reproducción Eugenia del Pino ...... pág. 94

Resúmenes Simposio: 200 años de Humboldt...... pag. 106 FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 5

EDITORIAL

standarizar conteos cromosómicos o hablar de huellas digitales con microsaté- Elites como marcadores de la diversidad genética o de la necesidad de la conser- vación, tiene similar importancia como hablar de resistencia o sensibilidad micro- biana o de métodos para remover nitratos, contaminantes del agua y modernos detractores de la salud. También podríamos especializarnos en el uso de membranas proteicas bacterianas que secuestran nanobiomoléculas, estimuladoras de la absorción de nutrientes o en el uso de enzimas o cepas microbiológicas para degradar colorantes o desperdicios industriales. La investigación plantea infinidad de temas, antes impensables, como la extracción de carotenoides o de keratinasas de los desperdicios orgánicos y de su uso en la medicina o en la industria cosmética, o quizá nos advierte sobre el meta- no de los rumiantes o de los basureros y su significativa contribución al efecto invernadero. Imagínese lector lo fascinante que sería ahondar en temas como las diferencias a nivel molecular en los procesos de gastrulación o el papel de la argino decarboxilasa en la transformación de los estados extracelulares a intracelulares en los protozoos parasíticos. No estará muy lejos el día en que se pueda hablar de vacunas efectivas contra los mismos retrovirus o entender molecularmente el papel de las poliaminas de la leche materna o del maíz como factores de crecimiento infantil, o hasta podría imaginar a las arañas fabricando variadas proteí- nas en fase líquida que al expulsarse por las hilanderías, en contacto con el medio y al cambiar su pH, se vuelve fibra muy resistente o tela de araña para cazar o bolas de fibroin que responde a las corrientes de aire y que les sirve para trans- portarse grandes distancias. No dejaría de sorprendernos que los mortiños de nuestros páramos fueran fuente de prociamidinas conocidas en la prevención de enfermedades coronarias, diabetes y obesidad. O que los aceites esenciales del clavo de olor o del árbol del té o de la canela, entre otros, controlen infecciones entéricas o parasitarias o actú- en como antioxidantes naturales. Como ciudadanos de la tierra, se vuelve deber el entender y enseñar el respe- to por la vida y su entorno; que nuestros bosques, por ejemplo, no son solamente celulosa y clorofila o que debajo de ellos se esconden riquezas hidrocarburíferas. ¿Qué pasó por ejemplo con la sobreexplotación del saprol del árbol de canela hace años no muy lejanos? Ahora conocemos la disminución continua de su biomasa por falta de sostenibilidad y equilibrio entre producción y comercialización. La des- trucción de las frágiles comunidades ecológicas del páramo, del bosque tropical, de FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 6

los manglares, causarían una disminución peligrosa de la disponibilidad de hábitats silvestres a medida que crece la densidad poblacional, las plagas, el avance de los cultivos extensivos o la explotación no controlada de orgánicos y minerales. ¿Cuán- tas hectáreas de mundo ecológico destruimos al día? El tener conciencia sobre estos temas se lo debemos a nuestros investigadores, capital intelectual importante en la toma de decisiones, especialmente en los conflictos entre economía política y economía ecológica. Nuestra Revista de Medicina y Ciencias Biológicas recogerá y publicará artí- culos científicos generados por los diferentes caminos que ofrece la investigación de las Ciencias Biológicas y Médicas. Es nuestra forma de socializar lo aprendido y estimular la creatividad del investigador.

Dr. Carlos A. Soria Editor, Sección Ciencias Biológicas FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 7

TRABAJOS ORIGINALES

Impacto genético en comunidades Amazónicas del Ecuador localizadas en zonas petroleras

César Paz-y-Miño1, Bernardo Castro1, Andrés López-Cortés1, María José Muñoz, Alejandro Cabrera1, Catalina Herrera1, Adolfo Maldonado2, Carolina Valladares2, María Eugenia Sánchez1 1 Instituto de Investigaciones Biomédicas. Facultad de Ciencias de la Salud Universidad de las Américas. Av. de los Granados y Colimes. Quito, Ecuador. Postal code: 1712842 [email protected] 2 Corporación Acción Ecológica. Área de investigación en salud y ambiente. Alejandro de Valdez N24-33 y La Gasca. Quito, Ecuador. Postal code: 1715246-C Recibido: 2010-02-05, aprobado: 2010-08-31

RESUMEN.- La exposición de agentes carcinógenos usados en la industria petrolera incrementa el desarrollo de cáncer tanto en hombres como en mujeres y niños. Se ha observado que los individuos expuestos a agentes genotóxicos presentan una inestabilidad general del genoma humano que puede ser evaluada por medio del estudio de cromosomas o de genes involucrados en daño genético a través del aná- lisis del nivel de fragmentación del ADN en individuos expuestos a los hidrocarburos. Para el estudio se escogieron 23 mujeres que viven cerca de la actividad petrolera y a quienes se supone presentaron una mayor exposición a las fuentes de con- taminación. Los individuos control fueron 25 mujeres provenientes de la Joya de Los Sachas, en Orellana, sin antecedentes de exposición continua a genotóxicos. La técnica usada para determinar alteraciones genéticas fue el ensayo cometa. Los datos obtenidos indican que existe un mayor riesgo a padecer cáncer, malformacio- nes congénitas y abortos en las zonas ubicadas más cerca a la actividad petrolera, por ende con mayor exposición a factores tóxicos. La distancia al foco de exposi- ción y la asimilación de los mismos facilita la mutación del ADN en las células, originando fallas en los sistemas de reparación.

PALABRAS CLAVE: Petróleo, genotóxicos, inestabilidad genómica, fragmenta- ción de ADN, ensayo cometa.

ABSTRACT.- The exposition to the carcinogenic agents used in the oil industry increment the development of cancer in the Amazonian communities. According to revised health data, exposed individuals to genotoxic agents present general instability of the human genome. This instability can be measured through analysis of the

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DNA fragmentation level in individuals exposed to hydrocarbons. For the present study, 23 women who live near oil activity and contamination sources, are considered to be exposed to major contamination environments. Control individuals were 25 women who live in Joya de los Sachas, in the Orellana province, without continuous exposure to genotoxics. The technique used to determine genetic alterations was the Comet Assay. The data obtained indicate that there is an increased risk of cancer, con- genital malformation and abortions in the zones located closer to oil activity. The distance to the contamination source and assimilated genotoxic agents, facilitate the DNA mutation in the cells, originating failures in the repairing systems.

KEY WORDS: Oil, genotoxics, genomic instability, DNA fragmentation, Comet Assay.

INTRODUCCIÓN.- En Ecuador, El petróleo y sus componentes pue- el petróleo ha sido y continúa siendo, den ingresar al cuerpo por medio de tres además de la fuente principal de ingre- vías: a) absorción por la piel, b) ingestión so económico, una de las amenazas de comida y bebida, y, c) inhalación de más importantes hacia el ambiente y la gases por medio de la respiración (4); población nativa de la región Amazó- además, la exposición al petróleo no está nica del Ecuador. La actividad petrole- limitada al área cercana a la contamina- ra, en Ecuador, empezó en 1972 (1). ción. Cuando el petróleo contamina el En el proceso, millones de galones de ambiente, los componentes más pesados petróleo y desechos tóxicos han sido tienden a depositarse en los sedimentos eliminados directamente al ambiente, desde donde pueden contaminar repetida- ocasionando problemas a la salud mente las fuentes de agua o ser consumi- pública (2). dos por organismos que pueden entrar en Desde los primeros años de la la cadena alimenticia del hombre. Los explotación petrolera en el Ecuador, las componentes del petróleo más ligeros comunidades indígenas y campesinas, pueden evaporarse en cuestión de horas y así como grupos ecologistas nacionales, ser depositados a gran distancia de su se han organizado en oposición a la lugar de producción a través del aire o del falta de regulación del desarrollo petro- agua (5). lero y denunciado que la contaminación Los hidrocarburos de gran poder ha causado un daño enorme tanto al toxicológico, que se encuentran presen- ambiente como a la salud de la pobla- tes en el petróleo, son compuestos orgá- ción (2, 3). nicos volátiles, como el benceno, tolue-

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no, xileno e hidrocarburos aromáticos mente. Desde entonces, compañías polinucleares (6). Altas concentraciones petroleras internacionales junto con la de benceno causan síntomas neurotóxi- compañía nacional Petroecuador han cos que desarrollan daños en la médula extraído miles de millones de barriles ósea con pancitopenia persistente y la de crudo de la Amazonía ecuatoriana. exposición a este agente químico es una Las actividades de explotación petrole- de las causas del desarrollo de leucemia ra incluyen diversos procesos contami- y tumores de carácter hematológico (1). nantes del ambiente. En la Amazonía La exposición de agentes carcinógenos del Ecuador, la explotación del petróleo usados en la industria petrolera incre- ha ocasionado la apertura de caminos menta el desarrollo de cáncer tanto en en el interior de la selva y cientos de hombres como en mujeres y niños. Se ha miles de detonaciones en la fase sísmi- observado incremento en el número de ca que han causado la erosión de la tie- casos con cáncer de pulmón, esófago, rra y la dispersión de la fauna. Cada recto, piel y riñones en hombres; en pozo de exploración que se perfora pro- mujeres se ha observado más casos de duce un promedio de 4.000 metros cáncer de cérvix, ganglios linfáticos y cúbicos de desechos de perforación. vejiga; en niños, los casos de cáncer de Estos desechos se depositaron durante carácter hematopoyético han ido en muchos años en huecos excavados en la aumento (1). tierra que se denominan piscinas donde por filtración, sobreflujo o directamen- Las petroleras en la Amazonía te, son eliminados al ambiente (3); en la Ecuatoriana actualidad suelen depositarse, sin aisla- La Amazonía del Ecuador está for- miento o tratamiento alguno, en las pla- mada por más de 10 millones de hectá- taformas de los mismos pozos. reas de bosque tropical situadas en las Si se encuentran cantidades de cabeceras de la inmensa red de ríos petróleo comerciales, comienza la fase amazónicos. La región contiene una de producción. Durante esta fase, el diversidad de plantas y animales más petróleo se extrae mezclado con agua rica del mundo, que tiene su máxima de formación y gas y se lleva a una cen- concentración en el denominado Par- tral de separación. En esta central, más que Nacional Yasuní (7, 8). de 4,3 millones de galones de líquidos En 1967, el consorcio Texaco-Gulf de desechos se generan cada día y se descubrió un rico campo de petróleo eliminan sin tratamiento a las piscinas. bajo el suelo amazónico ecuatoriano Aproximadamente, millones de pies que condujo a un “boom” petrolero que cúbicos de gas procedentes del proceso ha modificado la región permanente- de separación se queman diariamente

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en la Amazonía ecuatoriana. Este gas se británico Percival Pott, en cuyos resul- quema sin ningún tipo de control de la tados publicados en 1775 describe una temperatura o de las emisiones conta- prevalencia del cáncer genital en indi- minándose el aire con un gran número viduos expuestos al hollín (10). de sustancias tóxicas (7). Las activida- Los hidrocarburos aromáticos poli- des de mantenimiento en los más de cíclicos son un grupo numeroso de sus- 1.000 pozos de producción de la Ama- tancias que, químicamente, son deriva- zonía Ecuatoriana descargan cada año dos poliméricos del benceno. Histórica- aproximadamente 5 millones de galo- mente fueron los primeros agentes quí- nes de desechos tóxicos no tratados en micos en ser reconocidos como causan- el ambiente. Los escapes y derrames de tes de tumores malignos en humanos los pozos y tanques son también habi- (11) y actualmente se ha correlacionado tuales (9). la exposición a hidrocarburos aromáti- cos policíclicos con el desarrollo de Los daños genéticos y el petróleo cáncer pulmonar (12, 13, 14). En 1994, el Centro de Derechos Según datos de salud revisados, se Económicos y Sociales publicó un ha observado que los individuos informe documentando peligrosos expuestos a los compuestos volátiles de niveles de contaminación por petróleo los hidrocarburos presentan síntomas en los ríos del nororiente ecuatoriano. leves como irritación de la piel, come- En ese estudio, se encontraron concen- zón, irritación de los ojos, náusea, traciones de hidrocarburos aromáticos mareo, vértigo y dolor de cabeza (15). policíclicos (HAP) en las aguas utiliza- De la misma forma, la exposición a das para beber, bañarse o pescar de 10 a agentes genotóxicos produce una ines- 10.000 veces superiores a los límites tabilidad general del genoma humano permitidos por la Agencia de Protec- que puede ser evaluada por medio del ción Medio Ambiental de los Estados estudio de cromosomas o de genes Unidos. En ese mismo informe se involucrados en daño genético a través reportaron numerosos problemas de del análisis del nivel de fragmentación piel (dermatosis) entre la población del ADN en individuos expuestos a los local aparentemente relacionados con hidrocarburos. A nivel cromosómico la contaminación petrolera. Asimismo, los agentes genotóxicos producen rotu- el gobierno ecuatoriano fue acusado de ras e inestabilidad cromosómica. Medir violación de los derechos humanos (5). el porcentaje de presentación de estas La relación entre exposición a agen- alteraciones citogenéticas constituye un tes químicos y cáncer se inicia con una método confiable de biomonitorización observación efectuada por el médico de población expuesta (1).

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Muchas actividades enzimáticas la actividad petrolera en el cantón de involucradas en el metabolismo de la Joya de los Sachas. xenobióticos humanos son sujetas a polimorfismos genéticos y se han Población de estudio y obtención reportado los estudios de asociación de las muestras entre la susceptibilidad al cáncer y la La población de estudio consiste en presencia de estos polimorfismos (1). 23 mujeres que viven cerca de la activi- Otros factores que influencian la res- dad petrolera. De las cuales, ocho propuesta a los xenobióticos y el daño que vienen de la comunidad de Los Vence- puede ser inducido en el ADN son los dores, siete de la comunidad Flor de genes de reparación (1). Manduro y ocho de las comunidades El objetivo de este estudio fue evaluar Payamino–15 de Abril; a estas últimas el impacto genético en los individuos que se les ubicó en un mismo grupo ya que viven en las comunidades que se encuen- ambas comunidades se encuentran muy tran en las cercanías de la actividad petro- cerca una de la otra. Las comunidades lera, reportadas en los Bloques 7 y 21, y fueron escogidas porque suponen localizadas en la provincia de Orellana; mayor exposición a contaminantes además de relacionar la distancia entre los debido a que los focos de emisión se focos de contaminación y las viviendas de encuentran en los alrededores de las los individuos con el daño genético pre- mismas. sente en las células. Los individuos control fueron 25 mujeres provenientes de la Joya de Los MATERIALES Y MÉTODOS Sachas en Orellana, sin antecedentes de Áreas de estudio exposición continua a genotóxicos. El Las comunidades seleccionadas grupo de exposición a petróleo tiene para el estudio como afectadas por la una media de edad de 36,4 años frente contaminación petrolera fueron: Los a los 37,5 de edad media del grupo con- Vencedores, 15 de Abril, Asociación trol en la Amazonía ecuatoriana. El Payamino y Flor de Manduro en la rango de edad de los individuos afectos provincia de Orellana, reportadas se encuentra entre los 3 y 72 años, como comunidades influenciadas por mientras que en el grupo control el las actividades petroleras en los Blo- rango se encuentra entre los 21 y 71 ques 7 y 21 (16). Estas muestras fue- años de edad. Se realizaron historias ron comparadas con un grupo control clínicas y se obtuvieron muestras de con características geográficas simila- sangre periférica para los análisis gené- res, localizada dentro de la misma ticos de los individuos de estudio y los provincia a más de diez kilómetros de individuos control.

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Análisis genético un filtro de 515-560nm de excitación. Ensayo cometa – Electroforesis en El daño es clasificado por medio de 6 gel alcalino de células individuales categorías predefinidas (de la A hasta La técnica del ensayo cometa es un F) dependiendo del nivel de fragmen- método relativamente rápido y simple tación del ADN presente en la cola del para la detección del daño de ADN in cometa, siendo A: sin daño, B: bajo vivo (17, 18), debido a la exposición de nivel de daño, C: nivel medio de daño, factores como rayos X, pesticidas, D: alto nivel de daño, E y F: daño total hidrocarburos (17, 19, 20). La prueba (Figura 1).

Figura 1. Tipos de núcleos observados en el ensayo cometa. El tamaño de la cola determina la cantidad ADN fragmentado. consiste en someter los leucocitos san- RESULTADOS guíneos a un campo eléctrico. Si no hay Comparando los grupos expuestos y daño celular el material genético no se los control es a la actividad petrolera, se altera y los núcleos celulares se mantie- observa un incremento notable del nen circulares. Conforme se incrementa cometa tipo C en el grupo de expuestos el daño al material genético, los núcleos (21,6% daño medio), D (0,3% daño celulares se van deformando por el des- alto) y E (0,1% daño muy alto) que plazamiento de los fragmentos de las están presentes en una media del 22%, cadenas y van adquiriendo una forma de lo que significa tres veces más fragmen- cometa estelar, de ahí su nombre, que en tación del ADN que el grupo control de función del daño tendrá mayor o menor la Amazonía (Figura 2). extensión de la dispersión (16). Se observa que en las comunidades Las muestras fueron analizadas por donde existe mayor contaminación, medio de la técnica descrita por Singh como son en Los Vencedores y Flor de y colaboradores (17) con implementa- Manduro, existe una mayor cantidad de ciones realizadas en otras investigacio- cometas tipo B y C. Los cometas tipo C nes (20, 21). Las placas fueron analiza- se encuentran con mayor frecuencia en das usando un microscopio de fluores- la población de Los Vencedores (Figura cencia con una lámpara de mercurio y 3) y los cometas tipo B en la población

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* n = Número de individuos

Figura 2. Relación entre afectos y grupo control. Los valores observados corresponden a la media de los resultados observados.

de Flor de Manduro y Joya de los taminación: distancia menor a 250 m, Sachas (Figuras 4, 5). Mientras que la de 251 a 500 m y de 501 a 1.500 m. comunidad Payamino 15 de abril pre- Conforme los individuos se encuen- senta mayor porcentaje de cometas tipo tran más lejos de los focos de contami- A (Figuras 6). nación se observa que la cantidad de Se observa una relación entre la dis- cometas tipo C analizados también distancia de las viviendas de los indivi- minuye, pasando de 49,5 % presente en duos afectos con las fuentes de conta- individuos que viven a una distancia minación (mecheros) y los daños celu- menor a 250 m, a 24,2 % y 14 % obser- lares registrados por el ensayo. Los vados en individuos que viven a una individuos fueron agrupados en 3 cate- distancia de 251 a 500 m y 501 a 1.500 gorías de acuerdo a la distancia de la m, respectivamente (Figura 7). Usando que se encuentran de los focos de con- una escala de distancia más precisa (de

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Figura 3. Porcentaje y tipos de cometas en los individuos afectos de la comunidad Los Vencedores. 375 a 3 025 m), se observa que la can- DISCUSIÓN Y tidad de cometas tipo A presentes en la CONCLUSIONES población estudiada van en aumento La evidencia científica indica que conforme los individuos vivan más los individuos expuestos a hidrocar- lejos de los focos de contaminación buros presentan mayor riesgo muta- (6,5% de cometas A en una distancia de génico y carcinogénico (1). Los indi- 375 m y 72% de cometas A en una dis- viduos que están expuestos a los tancia de 3.025 m; Figura 8). agentes químicos usados en la indus-

Figura 4. Porcentaje y tipos de cometas en los individuos afectos de la comunidad Flor de Manduro.

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ha actuado el agente genotóxico. La genotoxicidad es la facilidad para producir alteraciones en el material genético y por lo tanto aumenta la propensión al cáncer, a las mutacio- nes y alteraciones en el embrión que pueden acabar en abortos (22). Los datos indican que existe un mayor riesgo a padecer cáncer, mal- formaciones congénitas y abortos en las zonas ubicadas más cerca a la actividad petrolera, por ende con mayor exposición a factores tóxicos. Figura 5. Porcentaje y tipos de cometas en los Comparando estos resultados con los individuos control de Joya de los Sachas obtenidos en un estudio realizado en trabajadores petroleros de la comuni- tria petrolera presentan ligeros, pero dad de San Carlos en la provincia de frecuentes síntomas de fatiga, micosis Orellana, Ecuador, se observa que la cutánea, dolores de cabeza, dermati- exposición a hidrocarburos afecta tis, irritación nasal y ocular, gastritis, directamente al daño del ADN en las náusea y diarrea (1). El ensayo come- células (1). ta es una técnica muy sensible a los La presencia de cometas tipo C en cambios o alteraciones de una o de las las células de los individuos que se dos cadenas de ADN, sobre las cuales

Figura 6. Porcentaje y tipos de cometas en los individuos afectos de la comunidad Payamino 15 de Abril.

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Figura 7. Daño genético observado en cometas, de acuerdo a la distancia de la fuente de contaminación (mecheros). encuentran expuestos a contaminantes estudio realizado en San Carlos, se rela- hidrocarburíferos indican daño genéti- ciona los resultados de individuos co medio en la población afectada. Los expuestos a hidrocarburos con polimor- individuos que viven más cerca de los fismos del gen MSH2, en el cromosoma focos de contaminación o mecheros 13, encargado de la reparación de nucle- presentan una mayor cantidad de daño ótidos mal pareados en el ADN (1). Los genético (como cometas tipo C) a dife- resultados obtenidos en ese estudio rencia de los individuos que viven más demuestran que los individuos expues- lejos de los focos de contaminación que tos a hidrocarburos y los polimorfismos no presentan daño genético (cometas en los genes tienen una mayor suscepti- tipo A) o daño genético bajo (cometas bilidad mutagénica, carcinogénica y tipo B). Este dato sugiere que la distan- teratogénica (1), lo que nos permite cia está relacionada con una mayor suponer que las comunidades que viven exposición a agentes contaminantes. cerca de los focos de contaminación pre- La distancia al foco de emisión de sentes en los Bloques 7 y 21 pueden pre- agentes genotóxicos y la asimilación de sentar alteraciones genéticas. los mismos facilitan la mutación del Los derrames de petróleo y de des- ADN en las células, originando fallas en echos tóxicos en el ambiente sin trata- los sistemas de reparación (1). En el miento son problemas graves en el

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Impacto genético en comunidades Amazónicas del Ecuador localizadas en zonas petroleras 17

Figura 8. Cometas según distancia a la fuente de contaminación (mecheros).

Ecuador. No existe una legislación clara 2. Kimmerling J., Henriksen S. 1991. que proteja a los habitantes de las cerca- Amazon crude. Natural Resources nías de los campos de explotación, ni al Defense Council. New York, USA. ambiente de la selva ecuatoriana. Se 3. Jochnick C., Normand R., Zaidi S. deben desarrollar programas de control 1994. Rights violations in the de explotación de recursos hidrocarbu- Ecuadorian Amazon: The human ríferos, productos primarios y secunda- consequences of oil development. rios derivados del petróleo y desechos The Center for Economic and generados por la explotación petrolera Social Rights. para disminuir el impacto de la misma 4. San Sebastián M. 2000. Informe en la Amazonía a nivel ambiental, sani- Yana Curi – Impacto de la activi- tario y social. dad petrolera en poblaciones rura- les de la Amazonía Ecuatoriana. REFERENCIAS Instituto de Epidemiología y BIBLIOGRÁFICAS Salud Comunitaria “Manuel Amu- 1. Paz-y-Miño C., López-Cortés A., nárriz”. Ecuador. Arévalo M., Sánchez M. 2008. 5. Centro de Derechos Económicos y Monitoring of DNA damage in Sociales (CDES). 1994. Violacio- individuals exposed to petroleum nes de derechos en la Amazonía hydrocarbons in Ecuador. Annals of Ecuatoriana. Hombre y ambiente. the New York Academy of Science Abya Yala. Quito, Ecuador. (NYAS) 1140, 121-8.

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César Paz-y-Miño, Bernardo Castro, Andrés López-Cortés, María José Muñoz, Alejandro Cabrera, 18 Catalina Herrera, Adolfo Maldonado, Carolina Valladares, María Eugenia Sánchez

6. ARC. 1989. IARC Monographs Marea negra en la Amazonía: Con- on the evaluation of the carcino- flictos socioambientales vinculados genic risk of chemicals to man: a la actividad petrolera en el Ecua- Occupational exposures to petro- dor. Abya-Yala. Quito, Ecuador. leum refining; crude oil and major 12. IARC. 1983. IARC Monographs petroleum fuels. International on the evaluation of the carcino- Agency for Research on Cancer genic risk of chemicals to man: Vol 45. Lyon, France. Polynuclear aromatic hydrocar- 7. Hurtig AK., San Sebastián M. bons. International Agency for 2002. Cáncer en la Amazonía del Research on Cancer Vol 34. Lyon, Ecuador (1985-1998). Instituto de France. Epidemiología y Salud Comunita- 13. Mastrangelo G., Fadda E., Marzia ria “Manuel Almunárriz”. Coca, V. 1996. Polycyclic aromatic Ecuador. hydrocarbons and cancer in man. 8. Bass M., Finer M., Clinton N., Environmental Health Perspectives Kreft H., Cisneros-Heredia D., 104(11), 1166-1170. McCracken S., Pitman N., English 14. Nadon L., Siemiatycki J., Dewar P., Swing K., Villa G., Di Fiore A., R., Krewski D., Gerin M. 1995. Voigt C., Kunz T. 2010. Global Cancer risk due to occupational Conservation Significance of exposure to polycyclic aromatic Ecuador's Yasuní National Park. hydrocarbons. American Journal of PLoS One 5(1), e8767. Industrial Medicine 28, 303-324. 9. Almeida A. 2000. Reseña sobre la 15. Campbell D., Cox D., Crum J., historia ecológica de la Amazonía Foster K., Christie P. 1993. Initial Ecuatoriana. En: Martínez E. (ed.). effects of the grounding of the Ecuador post petrolero. Acción tanker Braer on health in Shetland. Ecológica. Quito, Ecuador. British Medical Journal 307(6914), 10. Vives I., Grimalt J., Guitart R. 1251–1255. 2001. Los hidrocarburos aromáti- 16. Maldonado A., Saravia A., Valla- cos policíclicos y la salud humana. dares C., Álvarez S., Bonilla M., Apuntes de Ciencia y Tecnología. Maldonado P., Supliguicha V. Asociación para el Avance de la 2008. Estudio del Impacto de la Ciencia y la Tecnología en España Actividad Petrolera de Perenco en (AACTE) 3, 45-51. el Bloque 7 de la Región Amazó- 11. Ortiz P., Varea A. 1995. La explota- nica Ecuatoriana. Acción Ecológi- ción petrolera en el Ecuador: histo- ca. Quito, Ecuador. ria e impactos socioambientales.

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17. Singh N., McCoy M., Tice R., 2007. Evaluation of DNA damage Schneider E. 1988. A simple tech- in an Ecuadorian population nique for quantification of low levels exposed to glyphosate. Genetics of DNA damage in individual cells. and Molecular Biology 30(2), 456- Experimental Cell Research 175(1), 460. 184-91. 21. Paz-y-Miño C., Dávalos V., 18. Monroy C., Cortes A., Sicard D., de Sánchez M.E., Arévalo M., Leone Restrepo H. 2006. Cytotoxicity and P. 2002. Should gaps be included in genotoxicity of human cells chromosomal aberration analysis? exposed in vitro to glyphosate. Bio- Evidence based on the comet assay. medica 25(3), 335-45. Mutation Research/Genetic Toxi- 19. Leroy T., van Hummelen P., Anard cology and Environmental Mutage- D. 1996. Evaluation of three meth- nesis 516 (1-2), 57-61. ods for the detection of DNA sin- 22. Paz-y-Miño C., Bustamante G., gle-strand breaks in human lym- Dávalos V., Burgos R., Pérez J., phocytes: alkaline elution, nick Sánchez M.E., Leone P. 2000. translation, and single-cell gel elec- Monitoreo citogenético en pobla- trophoresis. Journal of Toxicology ción ecuatoriana expuesta ocupa- and Environmental Health 47(5), cionalmente a pesticidas. Revista 409-422. de la Facultad de Ciencias Médicas 20. Paz-y-Miño C., Sánchez M.E., Aré- 25(1), 15-21. valo M., Muñoz M.J., Witte T., Oleas De-la-Carrera G., Leone P.

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Resistencia a carbapenemes asociada a integrones clase 1 en Pseudomonas aeruginosa

María Fernanda Yauri1, Iliana Alcocer1, Jeannete Zurita2 & Mercedes Rodríguez-Riglos1 1Laboratorio de Microbiología, Escuela de Ciencias Biológicas, PUCE, Quito, Ecuador. [email protected] 2Departamento de Microbiología, Zurita&Zurita Laboratorios, Quito, Ecuador Recibido: 2010-05-27, aprobado: 2010-08-31.

RESUMEN: Pseudomonas aeruginosa es un microorganismo, oportunista de humanos, comúnmente aislado de infecciones nosocomiales. Es difícil de tratar por su inherente resistencia a varios antibióticos y por su rápida adquisición de genes de resistencia. En los últimos años han sido reportados aislados multiresistentes de P. aeruginosa con genes que codifican enzimas que confieren resistencia a los carbapenemes: las metalo-β-lactamasas (MBLs). Estos genes, comúnmente, se encuentran localizados en integrones. El objetivo del estudio fue identificar genes que codifican metalo-β-lactamasas (MBLs) y su ubicación en integrones clase 1 en aislados clínicos de P. aeruginosa. Se colectaron 129 aislados clínicos en Zurita&Zurita Laboratorios entre enero de 2005 a diciembre de 2008. La detección de genes que codifican MBLs se realizó por PCR, amplificando los genes mayormente diseminados entre bacilos Gram negativos no fermentadores productores de MBLs y encontrados en Latinoamérica: blaVIM, blaIMP y blaSPM. La ubicación de estos genes en integrones clase 1 fue determinada por PCR anidado. De los 129 aislados analizados, 46 aislados fueron resistentes a carbapenemes. De los 46 aislados resistentes 34 (73,9%) presentaron genes que codifican MBLs y el 14,7% estuvieron ubicados en integrones clase 1. Fue evidente la alta prevalencia de genes productores de MBLs en la población estudiada.

PALABRAS CLAVE: Carbapenemes, integrones, metalo-β-lactamasas, multiresistencia, Pseudomonas aeruginosa.

ABSTRACT.- Pudomonas aeruginosa is a microbial agent, human opportunistic and commonly isolated from nosocomial infections. It is a difficult organism to treat because of its inherent resistance to various antibiotics and rapid acquisition of resistance genes. In recent years, it has been reported multiresistant isolates of P. aeruginosa with genes that encode enzymes which confer principally resistance

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to carbapenems: metallo-β-lactamases (MBLs). These genes are often located in integrons. Its importance lies in the spread of resistance genes between Gram-negative bacteria. The aim of this study was to identify genes that encode metallo-β- lactamases (MBLs) and their location in class 1 integrons in clinical isolates of P. aeruginosa. The 129 clinical isolates were collected in Zurita&Zurita Laboratories between 2006 and 2008. The detection of genes that encode MBLs was performed by PCR, amplifying the genes mostly scattered among non-fermenting Gram negative bacilli that produce MBLs: blaVIM, blaIMP and blaSPM. The location of these genes in class 1 integrons was determined by nested PCR. Of the 129 isolates analyzed, 46 were resistant to carbapenems. Of the 46 resistant isolates, 34 (73.9%) had genes encoding MBLs. Only 14.7% were located in class 1 integrons. It was evident the high prevalence of MBLs producing genes in the population studied.

KEYWORDS: Carbapenems, integrons, metallo-β-lactamase, multiresistance, Pseudomonas aeruginosa.

INTRODUCCIÓN.- Pseudomonas valencia mundial de infecciones intra- aeruginosa es una bacteria aerobia, hospitalaria corresponde a América Lati- Gram negativa, no fermentadora ni for- na, donde el 11,4% de los aislados obte- madora de esporas, móvil por la presen- nidos son de P. aeruginosa (3). cia de flagelos lofótricos y miembro de Pseudomonas aeruginosa es inhe- la familia Pseudomonadaceae. Es un rentemente resistente a una amplia patógeno oportunista comúnmente aso- variedad de antisépticos y antibióticos ciado a personas inmunocomprometidas como cefalosporinas de primera y que presentan infecciones en pulmones, segunda generación, tetraciclinas, clo- oído, válvulas cardíacas, tracto urinario, ranfenicol, macrólidos, novobiocina; sistema nervioso central, piel y en heri- dejando como última alternativa de tra- das quirúrgicas. Adquiere especial tamiento al grupo de los carbapenemes importancia en pacientes con fibrosis (4). Los carbapenemes son los antimi- quística (1). El programa Internacional crobianos β-lactámicos en la terapia de Control de las Infecciones Nosoco- contra P. aeruginosa mayormente miales (INICC) describe a las infeccio- empleados. Sin embargo, durante la nes nosocomiales como uno de los última década, la aparición de nuevos mayores problemas sanitarios, siendo de factores de resistencia ha elevado el particular importancia las infecciones número de aislados resistentes a estos causadas por bacterias multiresistentes antibióticos (5 y 6). (2). Además, establece que la mayor pre-

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La resistencia en P. aeruginosa a los rica no fueron encontradas sino hasta el carbapenemes es generada por múlti- 2003, siendo descritas por primera vez ples mecanismos, tales como: bombas en Chile y Venezuela (13). de flujo, mutación de porinas, produc- Las MBLs han sido descritas y cla- ción de enzimas que hidrolizan al anti- sificadas en cuatro tipos clínicamente biótico. Este estudio se centró en este relevantes: IMP reportada en Japón último mecanismo: la producción de (14), VIM detectada originalmente en metalo-β-lactamasas (MBLs; 7). Las Italia (15); GIM observada en Alema- MBLs son enzimas bacterianas con una nia (16) y SPM descubierta en Sao elevada actividad hidrolítica que inacti- Paulo, Brasil (17). van a todos los antibióticos β-lactámi- Diversos estudios de genes que cos (penicilinas, cefalosporinas y car- codifican MBLs demostraron su ubica- bapenemes), transformando a estos ción como genes “cassette” en integro- agentes terapéuticos en compuestos nes clase 1 (18). Los integrones son sis- inofensivos para las bacterias (8). Las temas formados de dos segmentos con- más comunes y ampliamente reporta- servados y separados por una región das MBLs son las tipo VIM e IMP, las variable capaz de insertar y escindir cuales exhiben una amplia distribución genes en “cassettes” (19). Los genes en a nivel mundial con más de 50 varian- “cassette” son elementos móviles extra- tes alélicas descritas (9 y 10). Los genes cromosómicos circularizados que no se que codifican enzimas tipo MBLs son, expresan hasta que son insertos en un generalmente, transferidos por determi- integrón. Los integrones son moviliza- nantes genéticos móviles como son los dos por transposición en plásmidos y plásmidos o transposones, los cuales a transposones (19). su vez pueden contener sistemas de En el Ecuador no existen datos que recombinación sitio-específica denomi- demuestren el estudio de la resistencia nados integrones (11). Esto sumado a en Gram negativos no fermentadores. su frecuente relación con otros genes Así, este trabajo contribuye en el cono- que confieren resistencia a diversas cimiento de la multiresistencia, la pre- familias de antibióticos (como amino- sencia de genes relacionados con la glucósidos), convierten a estos aislados resistencia y su relación con integrones en un importante problema terapéutico clase 1. El objetivo de este estudio fue a nivel hospitalario (12). identificar los genes relacionados con Los primeros aislados resistentes a la resistencia a carbapenemes tipo carbapenemes y productores de MBLs metalo-β-lactamasas y su ubicación en fueron registrados en la década de los integrones clase 1 en aislados clínicos 80 en Asia y Europa (8). En Latinoamé- de Pseudomonas aeruginosa resistentes

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a imipenem y meropenem. Los objeti- identifica como un bacilo Gram negativos específicos fueron: a) Identificar vo móvil, no fermentador de azúcares, fenotípica y genotípicamente los aisla- oxidasa positiva, productora de ornitina dos de Pseudomonas aeruginosa descarboxilasa, no productora de tripto- mediante pruebas bioquímicas y mole- fanasas y sintetizadora de lisina descar- culares como la Reacción en Cadena de boxilasa. Para evidenciar este perfil se la Polimerasa (PCR) por amplificación realizaron las pruebas bioquímicas del gen de la proteína de la membrana estándares: Agar con triple azúcar y externa oprL. b) Detectar la presencia hierro (TSI), Motilidad, Indol, Ornitina de genes productores de metalo-β-lac- (MIO), Motilidad, indol, lisina (MILI), tamasas (MBLs) mediante PCR. c) óxido fermentación (O-F). Determinar la localización de los genes La confirmación molecular de los que codifican metalo-β-lactamasas a aislados se realizó mediante la técnica través de la amplificación de la región de PCR amplificando el gen que codifi- variable de integrones clase 1. ca la proteína oprL de la membrana externa, empleando los iniciadores y MATERIALES Y MÉTODOS condiciones descritos por Xu et al. Aislamientos bacterianos (20): F 5’ ATGGAAATGCT- Se analizaron 129 aislados de Pseu- GAAATTCGGC 3’ y R 5’CTTCTT- domonas aeruginosa recibidas de la CAGCTCGACGCGACG 3’. colección del Departamento de Micro- El templado fue preparado median- biología de los laboratorios Zurita & te kit de extracción de ADN genómico Zurita y tomados de muestras clínicas (PROMEGA nro. A1120). La reacción de pacientes atendidos en diversos cen- se preparó en un volumen final de 25 tros hospitalarios de Quito. El período βl, conteniendo 1,25 U de Taq polime- de colección de los aislados fue com- rasa (PROMEGA nro.M8295) 0,l mM prendido entre enero de 2005 a diciem- de cada dNTP, 2,5 mM de MgCl2, 3,5 bre de 2008. La identificación y el per- mM de KCl, 0,1 µM de cada iniciador fil de resistencia fueron obtenidos y 4 µl de ADN templado en tampón mediante MicroScan (VITEK) siguien- para PCR 1X. La amplificación se rea- do las especificaciones del fabricante. lizó en un termociclador GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Elmer). El Caracterización fenotípica y programa de PCR consistió en 35 ciclos genotípica de Pseudomonas de 96 ºC por 1 minuto, 55 ºC por 1 aeruginosa minuto y 72 ºC por un minuto, seguido Pseudomonas aeruginosa de acuer- de un paso de extensión final de 72 ºC do a sus reacciones bioquímicas se por diez minutos.

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Los productos de PCR se sometie- (21). Las condiciones de amplificación ron a electroforesis en geles de agaro- fueron las descritas por Pitaut et al. sa (Invitrogen) al 1% a 125 V/cm por (21). 60 min en tampón 44,5 mM tris-HCl, El templado fue preparado median- 44,5 mM ácido bórico, 1,5 mM te kit de extracción de ADN genómico EDTA (TBE). Se empleó como mar- (PROMEGA No. A1120). La reacción cador molecular ADN de 100 pb se preparó en un volumen final de 25 (Invitrogen). Los geles fueron teñidos µl, conteniendo 1 U de Taq polimerasa empleando Syber gold 10.000x en (PROMEGA No.M8295), 0,16 mM de DMSO (Invitrogen). Los productos cada dNTP, 1,5 mM de MgCl2, 0,16 de amplificación se analizaron en mM de cada iniciador y 2 µl de ADN Safe Imager (Invitrogen) por examen templado en tampón para PCR 1X visual considerando todas las bandas (PROMEGA). La amplificación se rea- visibles, independientemente de su lizó en un termociclador GeneAmp intensidad. PCR system 9700 (Perkin Elmer). El programa de PCR consistió de una Detección de genes que codifican incubación inicial de 37 ºC por 10 MBLs minutos, una denaturación inicial de 94 La detección de genes productores ºC por 5 minutos, seguido por 30 ciclos de MBLs se realizó por PCR. Fueron de 94 ºC por 1 minuto, 54 ºC por 31 analizados los dos genes más frecuen- minutos y un paso de extensión final de temente encontrados entre bacilos 72 ºC por 1,5 minutos. Gram negativos no fermentadores y un Los productos de PCR se sometie- gen reportado únicamente para Latino- ron a electroforesis con las mismas américa (7 y 10). condiciones empleadas para la identifi- Los iniciadores empleados para el cación molecular de P. aeruginosa. gen blaVIM fueron: F 5' GTTTGG TCGCATATCGCAAC 3' y R 5' Determinación de la localización AATGCGCAGCACCAGGATAG 3' de los genes que codifican MBLs (21); para el gen blaIMP los iniciadores El ADN de los aislados que resulta- empleados fueron F 5' GAAGGYGTT- ron positivos para la presencia de genes TATGTTCATAC 3' y R 5' codificantes de MBLs fue empleado en GTAMGTTTCAAGAGTGATGC 3' una segunda PCR para determinar la (10); y para el gen blaSPM se usaron los región variable de integrones de clase iniciadores F 5` CTGCTTGGATTC 1. Los iniciadores empleados son los ATGGGCGC 3` y blaSPM R 5` detallados por Pitout et al. (21). Para la CCTTTT CCGCGACCTTGATC 3` reacción en cadena de la polimerasa se

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prepararon reacciones de 25 µl conte- Los perfiles de resistencia a los car- niendo: 1 U de Taq polimerasa (PRO- bapenemes evaluados en los 46 aisla- MEGA nro. M8295), 0,16 mM de cada dos de Pseudomonas aeruginosa mos- dNTP, 1,5 mM de MgCl2, 0,16 mM de traron un alto porcentaje de resistencia β cada iniciador y 2 µl de ADN templado a ambos -lactámicos empleados (imi- en tampón para PCR 1X. penem y meropenem), con 34 aislados Los parámetros de amplificación resistentes (73,9%); nueve aislados fueron: 95 °C por 5 minutos; seguido (19,6%) fueron resistentes únicamente de 30 ciclos de 95 °C por 1 minuto, 52 a imipenem y tres (6,5%) fueron única- °C por 1 minuto y 72 °C por 2 minutos, mente para meropenem (Figura 2). y un período de extensión final de 72 De los 46 aislados resistentes, 34 °C por 10 minutos. (73,9%) presentaron uno o dos genes Los productos resultantes de la PCR que codificaban MBLs. En los doce ais- fueron separados a través de electrofo- lados restantes (26,1%) no fue detecta- resis horizontal en geles de agarosa do ningún gen estudiado. De los 34 ais- (Invitrogen 15510-027) al 1%. lados portadores de genes que codifican Los productos obtenidos de las MBLs, 24 (70,6%) presentaron el gen amplificaciones anteriores fueron usados blaVIM, seis (17,6%) registraron el gen como templados para la ejecución de la blaIMP y cuatro aislados (11,8%) pre- PCR anidada y fueron empleados inicia- sentaban ambos genes blaVIM /blaIMP dores para cada uno de los genes encon- (Figura 3). Cinco (14,7%) de los 34 ais- trados (blaVIM y blaIMP). Las cantidades lados codificantes de MBLs fueron ubi- y los parámetros de amplificación son los cados en la región variable de integro- mismos descritos anteriormente. nes clase 1 y 29 (84,3%) no lo fueron. RESULTADOS De los 24 aislados que presentaron El 100% de los aislados (129) fue- el gen blaVIM, cinco (20,8%) fueron ron confirmados como Pseudomonas ubicados en la región variable de inte- aeruginosa mediante análisis molecular grones clase 1 (Figura 4). De los seis del gen que codifica la proteína oprL de aislados portadores del gen blaIMP, la membrana externa (Figura 1). La tan solo uno (16,7%), pudo ser situa- identificación molecular concordó con do en la región variable de integrones la identificación fenotípica realizada a clase 1 (Figura 5). Finalmente, de los través de pruebas bioquímicas. cuatro aislados positivos para ambos De los 129 aislados estudiados, 46 genes, dos aislados (50%) fueron ubi- mostraron resistencia a carbapenemes. cados en región variable de integro- Los datos del origen de los aislados nes clase 1. resistentes se encuentran en la Tabla 1.

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Figura 1. Representación gráfica de la identificación de la proteína de la membrana externa oprL para con- firmación genotípica de Pseudomona aeruginosa. M, marcador de peso molecular 100pb; canaletas 1-13, aislados de Pseudomonas aeruginosa confirmados. DISCUSIÓN El gen blaIMP fue registrado en un En los últimos años se ha observado menor porcentaje (17,6 %). Anterior- el incremento de genes productores de mente se ha descrito porcentajes simila- MBLs asociados a integrones, los cua- res de presencia para genes blaIMP en les a su vez se relacionan con plásmidos aislados clínicos de Pseudomonas y transposones, facilitando su transfe- aeruginosa resistentes a carbapenemes rencia vertical a una amplia gama de (8, 21 y 24). agentes patógenos (11). Los aislados clínicos de P. aerugi- El estudio de la presencia de genes nosa resistentes a carbapenemes arroja- que codifican MBLs reveló un alto por- ron un 0,0% de presencia de genes pro- centaje de genes blaVIM (70,6%), en los ductores de MBLs tipo SPM, resultado aislados analizados resistentes a carba- que contribuye a su localización endé- penemes. Datos que concuerdan con mica al norte de Brasil (17). estudios previos, donde el gen blaVIM, Mecanismos como la baja permea- especialmente la variante alélica bla- bilidad para el ingreso del antibiótico VIM-2, ha sido identificada de manera por pérdida de porinas o expulsión predominante en Latinoamérica y del mismo a través de bombas de varios países alrededor del mundo (7, 9, flujo podrían explicar la resistencia 12 y 22). observada en los aislados que no pro-

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Tabla 1 Datos de origen de los aislados de Pseudomonas aeruginosa analizados en este estudio (Continuación) Bacteria Paciente Código de Código Fecha de Aislamiento Sexo Edad Origen de la Congelación Hospital (años) muestra 13 Ps aer 10 01/07/2005 M 2 Herida 16 Ps aer 4 01/07/2005 M 5 Biopsia 17 Ps aer 7 08/07/2005 F 7 Herida 23 Ps aer 274 09/08/2005 F 16 Herida 28 Ps aer 60 09/09/2005 M 59 Herida 29 Ps aer 237 22/09/2005 F 19 Esputo 40 Ps aer 189 01/10/2005 D ND Absceso 45 Ps aer 773 01/10/2005 D ND Absceso 48 Ps aer 835 24/10/2005 M 8 Biopsia 57 Ps aer 430 13/12/2005 M 30 Herida quirúrgica 95 Ps aer 714 22/03/2006 F 79 Herida 97 Ps aer 483 15/03/2006 M 6 Hemocultivo 104 Ps aer 1042 31/03/2006 F 34 Secreción traqueal 130 Ps aer 597 19/05/2006 F 40 Secreción traqueal 140 Ps aer 638 22/06/2006 F 31 Secreción traqueal 142 Ps aer 632 22/06/2006 M 56 Líquido peritoneal 150 Ps aer 899 30/06/2006 M 26 Secreción traqueal 167 Ps aer 3532 22/08/2006 F 48 Herida quirúrgica 191 Ps aer 4149 03/10/2006 M ND Absceso 228 Ps aer 26 01/12/2006 M 36 Secreción traqueal 235 Ps aer 565 20/06/2007 F 2 meses Hemocultivo 236 Ps aer 945 28/12/2006 M 27 Secreción traqueal 237 Ps aer 942 28/12/2006 M 72 Secreción traqueal 310 Ps aer 4831 15/11/2007 M ND Esputo 319 Ps aer 924 28/11/2007 M 60 Secreción traqueal 326 Ps aer 256 08/12/2007 F 77 Secreción traqueal 330 Ps aer 528 16/12/2007 M 21 Secreción traqueal 332 Ps aer 742 22/12/2007 M 86 Líquido pleural 333 Ps aer 768 23/12/2007 F 80 Secreción traqueal 335 Ps aer 800 24/12/2007 F 61 Herida quirúrgica 345 Ps aer 963 29/12/2007 F 61 Secreción traqueal 346 Ps aer 975 30/12/2007 M 61 Esputo 355 Ps aer 183 06/03/2008 M ND Urocultivo 362 Ps aer 595 26/09/2008 F 22 Secreción traqueal 365 Ps aer 466 26/09/2008 F ND Esputo 377 Ps aer 332 26/09/2008 M ND Secreción traqueal 381 Ps aer 334 30/09/2008 F ND Herida 385 Ps aer 467 30/09/2008 M 46 Secreción traqueal 387 Ps aer 531 30/09/2008 M 8 Herida quirúrgica 403 Ps aer 792 30/09/2008 M 77 Secreción traqueal 411 Ps aer 944 30/09/2008 F ND Herida quirúrgica 413 Ps aer 153 30/09/2008 M 74 Hemocultivo 429 Ps aer 818 01/10/2008 F ND Herida quirúrgica 437 Ps aer 508 02/10/2008 M ND Herida quirúrgica 438 Ps aer 170 01/10/2008 M 26 Secreción traqueal 443 Ps aer 3560 01/10/2008 F 75 Esputo F, femenino; M, masculino; ND, no determinado

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Figura 2. Porcentaje de resistencia a carbapenemes en aislados clínicos de Pseudo- monas aeruginosa.

ducían MBLs (7). Estos mecanismos CONCLUSIONES no fueron analizados en el presente Los 129 aislados clínicos fueron trabajo. confirmados como Pseudomonas aeru- En cuanto a la ubicación de los ginosa mediante pruebas bioquímicas. genes que codifican MBLs, el estudio La identificación genotípica de Pseu- demostró que fueron pocos los aislados domonas aeruginosa mediante la reac- de P. aeruginosa, alrededor del 14,0%, ción en cadena de la polimerasa (PCR) encontrados como “cassettes” génicos fue positiva para los 129 aislados. en la región variable de integrones clase La mayoría de aislados resistentes a 1; a pesar de encontrarse a estos ele- carbapenemes, imipenem y meropenem mentos genéticos ampliamente distri- (73,9%), presentaron genes que codifi- buidos entre los bacilos Gram negati- can metalo-β-lactamasas. vos no fermenteadores (19,23). Los genes blaVIM y blaIMP fueron La presencia del “cassette” portador encontrados en la mayoría de aislados del gen blaVIM y blaIMP en un integrón resistentes a carbapenemes en un no confiere movilidad por sí solo, pero 70,6% y 17,6%, respectivamente. Un sí pueden encontrarse insertos en ele- bajo porcentaje de aislados presentaron mentos genéticos móviles como plás- ambos genes. El gen blaSPM no fue midos y transposones. Los integrones al encontrado en ningún aislado resistente encontrarse asociados a plataformas de origen hospitalario. genéticas móviles incrementan su dise- Un considerable porcentaje del total minación y transferencia intra e interes- de los aislados resistentes a carbapene- pecífica (18). mes fueron ubicados en integrones clase 1.

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Resistencia a carbapenemes asociada a integrones clase 1 en Pseudomonas aeruginosa 29

Figura 3. Porcentaje genes que codifican metalo-β-lactamasas en aislados clínicos de Pseudomonas aeruginosa.

Figura 4. Representación gráfica de electroforesis de los genes bla- VIM y blaIMP de aislados de Pseu- domonas aeruginosa resistentes a carbapenemes. Canaletas 1, inte- grón; canaleta 2 y 4, integrón y gen blaVIM; canaleta 3, gen blaVIM; canaleta 5, marcador de peso molecular 100pb; canaletas 6 y 7, control negativo y canaleta 8, gen blaIMP

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Figura 5. Representación gráfi- ca de eletroforesis del gen blaIMP de aislados de Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenemes. M, marcador de peso molecular 100pb; canaleta 1, control negativo; canaleta 2, inte- grón y gen blaIMP; canaleta 3, 4 y 5, integrón; canaletas 6 ausencia integrón y canaleta 7 inte- grón.

LITERATURA CITADA Infection Control Consortium report, data summary for 2002- 1. RUIZ, S. 2007. Pseudomonas 2007, issued January 2008. Ameri- aeruginosa: Aportación al conoci- can Journal of Infection Control. miento de su estructura y al de los 36: 627-637. mecanismos que contribuyen a su 3. CANO, M.; DOMÍNGUEZ, M.; resistencia a los antimicrobianos. EZPELETA, C.; PADILLA, B.; Tesis de Doctorado, Universidad de RAMÍREZ, E.; MARTÍNEZ, L. Barcelona. Barcelona, España. 2008. Cultivos de vigilancia epi- 2. ROSENTHAL, D.; MAKI DG, L.; demiológica de bacterias MEHTA, A.; ALVAREZ- resistentes a los antimicrobianos de MORENO, C.; HIGUERA, F.; interés nosocomial. Enfermedades CUELLAR, L.; MADANI, N. Infecciosa y Microbiología Clínica. 2008. International Nosocomial 26: 220-229.

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXXI Números 1 y 2: 20-32, octubre 2010 FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 31

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4. RAHAL, J. 2008. The role of car- 2006. Prevalencia de metalo--lac- bapenems in initial therapy for seri- tamasas a carbapenemes en un hos- ous Gram negative infections. Bio- pital Universitario de Buenos Med Central LTD. 12 (Suppl 4). Aires. Revista Argentina de Micro- 5. OLIVER, A. 2009. Impacto de la biología. 38: 33-37. diseminación de Pseudomonas 11. GILLINGS, M.; BOUCHER, Y.; aeruginosa multiresistente produc- LABBATE, M.; HOLMES, A.; tora de metalo−β-lactamasas en los KRISHNAN, S.; HOLLEY, M.; hospitales: presente y futuro. STOKES, W. 2008. The Evolution Enfermedades Infecciosas y Micro- of class 1 Integrons and the Rise of biología Clínica. 27: 255-256. Antibiotic resistance. Journal of 6. PFEIFER, Y.; CULLIK, A.; Bacteriology. 190: 5095-5100. WITTE, W. 2010. Resistance to 12. LOLANS, K.; QUEENAN, A.; cephalos-porins and carbapenems in BUSH, K.; SAHUD, A.; QUINN, Gram-negative bacterial pathogens. J. 2005. First Nosocomial outbreak International Journal of Medical of Pseudomonas aeruginosa pro- Microbiology. 34: 235-240. ducing an Integron-borne Metallo- 7. ANDRADE, V. 2005. Emergencia −β-lactamase (VIM-2) in the Unit- de la resistencia a carbapenemes en ed States. Journal of Antimicrobial Pseudomonas aeruginosa produc- Chemotherapy. 49: 3538-3540. tora de metalo-−β-lactamasas. Bio- 13. SÁNCHEZ, D.; MARCANO, D.; quimia. 30: 52-58. SPADOLA, E.; LEÓN, L.; 8. WALSH, T.; TOLEMAN, M.; PAYARES, D.; UGARTE, C.; POIREL, L.; NORDMANN, P. SALGADO, N.; GUEVARA, A.; 2005. Metallo−β-lactamase: the TORRES, S.; RODRÍGUEZ, J.; Quiet before the Storm? Clinical FLORES, R. 2008. Metaloenzimas Microbiology Reviews. 18: 306-325. tipo VIM detectadas en aislamien- 9. AUBRON, C.; POIREL, L.; FOR- tos clínicos en Pseudomonas aeru- TINEAU, N.; NICOLAS, P.; COL- ginosa en cuatro hospitales en LET, L.; NORDMANN, P. 2005. Venezuela. Revista del Instituto Nosocomial spread of Nacional de Higiene Rafael Ran- Pseudomonas aeruginosa isolates gel. 39 (2). expressing the metallo-−β-lacta- 14. OSANO, E.; ARAKAWA, Y.; mase VIM-2 in a hematology unit PORN, R.; OHTA, M. 2004. Molec- of a French hospital. Microbial ular Characterization of an Enter- Drug Resistance. 11:254-259. obacterial Metallo−β-lactamase 10. PAGNIEZ, G.; RADICE, M.; CUI- found in a clinical isolate of Serratia ROLO, A.; RODRÍGUEZ, O.; marcescens that shows Imipenem RODRÍGUEZ, H.; CAY, C.; resistance. Antimicrobial Agents FAMIGLIETTI, A.; GUTKIND, G. and Chemotherapy. 38: 71-78.

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXXI Números 1 y 2: 20-32, octubre 2010 FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 32

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15. LAURETTI, L.; RICCIO, A.; MILLAR, C.; ELBORN, J. 2006. MAZZARIOL, G.; CORNAGLIA, Early detection of Pseudomonas G.; AMICOSANTE, R.; aeruginosa – comparison of con- FONTANA, R.; ROSSOLINI, G. ventional versus molecular (PCR) 2000. Cloning and Characterization detection directly from adult of blaVIM, a new integron-borne patients with cystic fibrosis (CF). metallo-β-lactamase gene from Annals of Clinical Microbiology Pseudomonas aeruginosa clinical and Antimicrobials. 3: 21-25. isolate. Journal of Antimicrobial 21. PITOUT, J.; GREGSON, D.; POI- Chemotherapy. 43: 1584-1590. REL, L. 2005. Detection of 16. CASTANHEIRA, M.; TOLEMAN, Pseudomonas aeruginosa produc- M.; JONES, R.; SCHMID, F.; ing Metallo-β-Lactamases in a WALSH, T. 2004. Molecular char- large centralized laboratory. Jour- acterization of a −β-lactamase nal of Clinical Microbiology. 43: gene, blaGIM-1 enconding a new 3129 – 3135. subclass of Metallo-b-lactamase. 22. SIARKOU, V.; VITTI, D.; PRO- Antimicrobial agents and TONOTARIOU, E.; IKONOMI- Chemotherapy. 48: 4654-4661. DIS, A.; SOFIANOU, D. 2009. 17. MAGALHAES, V.; LINS, A.; Molecular epidemiology of Out- MAGALHAES, M. 2005. Metallo- break related Pseudomonas aerugi- b-lactamase producing nosa strains carrying the novel −β Pseudomonas aeruginosastrains variant blaVIM-17 Metallo -lac- isolated in Hospitals in Recife, PE, tamase gene. Antimicrobial Agents Brazil. Brazilian Journal of Micro- and Chemotherapy. 53: 1325-1330. biology. 36: 123-125. 23. GOOTZ, T. 2010. The global prob- 18. IYOBE, S.; YAMADA, H.; MINA- lem of antibiotic resistance. Criti- MI, S. 2006. Insertion of a car- cal Reviews in Immunology. 30: bapenemase gene cassette into an 79-93. integron of a Pseudomonas aerugi- 24. GIBB, A.; TRIBUDDHARAT, R.; nosa plasmid. Journal Antimicro- MOORE, T.; LOUIE, W.; bial Chemotherapy. 39: 824-829. KRULICKI, D.; LIVERMORE, 19. XU, Z.; LI, L.; SHIRTLIFF, M.; M.; PALEPOU, F.; WOODFORD, ALAM, M.; YAMASAKI, S.; SHI, N. 2002. Nosocomial outbreak of L. 2009. Ocurrence and Character- carbapenem-resistant istics of Class 1 and 2 Integrons in Pseudomonas aeruginosa with a Pseudomonas aeruginosa isolates new blaIMP allele, blaIMP-7. from patients in Southern China. Antimicrobial Agents and Journal of Clinical Microbiology. Chemotherapy. 46: 255-258. 47: 230-234. 20. XU, J.; MOORE, J.; MURPHY, P.;

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXXI Números 1 y 2: 20-32, octubre 2010 FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 33

Estandarización de la metodología para el conteo cromosómico en especies del género Polylepis en el Ecuador Quija-Lamina, P1., Segovia-Salcedo, C1, 2., Jadán, M.1 & Proaño K.1 1Departamento de Ciencias de la Vida, Carrera de Ing. en Biotecnología, ESPE, Sangolquí, Ecuador. [email protected] 2Universidad de Florida, Departamento de Biología, Florida Museum of Natural History (FLMNH), Gainesville, USA

Recibido: 2010-05-21, aprobado: 2010-08-30

RESUMEN.- El género Polylepis incluye 26 especies de árboles y arbustos que habitan desde Venezuela hasta la parte central de Argentina. Los bosques de Poly- lepis constituyen en su mayor parte la vegetación natural de los Andes con una fauna y flora sumamente especializada y de gran importancia ecológica. En las últi- mas décadas, varios intentos de clarificar su filogenia a través de técnicas moleculares no han tenido éxito. Debido posiblemente a la frecuente hibridización; otras hipótesis se centran en la poliploidía, la cual no ha sido analizada con éxito, debido a la falta de protocolos en el área de citogenética. Esta investigación presenta por primera vez una metodología estandarizada para la visualización y conteo de cromosomas, así como para la obtención de fases celulares en las especies del género Polylepis. Se utilizaron meristemos radiculares y botones florales para estandarizar la metodología. Adicionalmente, fueron llevados a cabo estudios del ciclo celular para determinar la hora apropiada de recolección de las muestras. Las placas preparadas permitieron obtener los números cromosómicos de las especies de Polylepis presentes en el Ecuador, los cuales revelan por primera vez la presencia de poliplodía dentro del género, proceso muy importante dentro de la diversifi- cación de las especies.

PALABRAS CLAVE: Ciclo celular, conservación, cromosomas, índice mitótico, Polylepis

ABSTRACT.- The genus Polylepis include 26 species of trees and shrubs distrib- uted from Venezuela to central Argentina. Polylepis forests are mostly natural veg- etation of the Andes with a highly specialized fauna and flora and they have great ecological importance. In recent decades, several attempts to clarify their phyloge-

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ny through molecular techniques have not been successful. One of the possible rea- sons could be the frequent hybridization, other hypotheses focus on the presence of polyploidy, phenomenon that has not been tested with success, due to lack of pro- tocols for conducting cytogenetic studies. This research has developed for the first time a standardized methodology for visualization and chromosome counting of genus Polylepis as well as data about the cellular phases. Root tips and flower buds were used to standardize the methodology. Additionally cell cycle studies were car- ried out to determine the proper time of collection of samples. The plates prepared allowed to obtain the chromosome numbers of Polylepis species present in Ecuador, which revealed for the first time, the presence of polyploidism in this genus, a very important condition in the diversification of the species.

KEYWORDS: Cell cycle, conservation, chromosomes, mitotic index, Polylepis

INTRODUCCIÓN.- El género a nivel de especies (3). Una de las posi- Polylepis incluye 26 especies de árbo- bles razones de esta falta de claridad les y arbustos que habitan desde los evolutiva se puede centrar en la frecuen- Andes Venezolanos hasta la parte cen- te hibridización entre las especies de este tral de Argentina (1). En el Ecuador género, por razones naturales (polen que encontramos ocho especies que perte- puede viajar largas distancias) y por reu- necen a los diferentes complejos evolu- bicación de poblaciones debido a activi- tivos desde el grupo basal Sericea hasta dades humanas (reforestación no tecnifi- el más derivado: el complejo Incana cada; 4, 5, 6). Otras hipótesis se enfocan (2). Los bosques de Polylepis forman en la existencia de poliplodía en el géne- parte de la vegetación natural de los ro, la cual no ha podido ser analizada Andes con una fauna sumamente espe- con éxito (7). cializada. Sin embargo, la distribución Los estudios cromosómicos son una actual de éstos ha sido disminuida de herramienta importante y básica para el manera alarmante por procesos antro- análisis intra e inter-poblacional, evolu- pogénicos como agricultura, pastoreo, tivo y sistemático, permitiendo diferen- tala, quema e introducción de especies ciar especies morfológicamente simila- exóticas (2). res o con un estatus taxonómico incier- En las últimas décadas varios inten- to. Los conteos cromosómicos mitóti- tos de aclarar su filogenia a través de téc- cos y meióticos son usados comúnmen- nicas moleculares se han visto truncados te para determinar hibridización, rela- por la falta de resolución en los análisis ciones entre especies, análisis de cario-

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tipos y translocaciones (8), además partículas del colorante y suciedades constituyen la vía más directa para esta- (3). Posteriormente, Schmidt-Lebuhn et blecer niveles de ploidía (9, 10). al., aseguran que debido al tamaño de De igual manera, el análisis del los cromosomas y a la dificultad de ciclo celular presenta varias aplicacio- determinar metafases en este género, es nes como eliminar el factor del azar y virtualmente imposible obtener conteos utilizar criterios objetivos para la toma cromosómicos (14). de las muestras vegetales y esclarecer La presente investigación presenta las causas que determinan el rol de la una metodología estandarizada que per- poliploidía (11, 12). Además, permite mite la visualización de fases celulares determinar la mejor hora del día para la y cromosomas metafásicos en las espe- prefijación, en función del número de cies del género Polylepis, presentes en células en división y de los componen- el Ecuador. Método que nos permitirá tes del índice mitótico (11). Estos datos obtener por primera vez los números constituyen las herramientas principa- cromosómicos para el género Polylepis, les para aumentar la efectividad de los datos sumamente importantes y básicos métodos químicos y físicos para la para aclarar las hipótesis sobre su ori- visualización de cromosomas en espe- gen y evolución. cies vegetales (13). Además, los estudios del ciclo celu- En el caso del género Polylepis, los lar en P. pauta y P. incana permitirán estudios cromosómicos son relevantes realizar análisis genéticos comparativos para aclarar las hipótesis sobre poliploi- para la determinación de mecanismos día, así como supuestos de hibridiza- citológicos como la duplicación somá- ción y apomixis (3). Sin embargo, tica y la no reducción de los gametos dichos estudios no se han podido reali- que inducen poliploidía en plantas (17). zar debido a la falta de una metodología estandarizada que permita la visualiza- MATERIALES Y MÉTODOS ción de cromosomas metafásicos. Muestras de meristemo radicular y Simpson (16) menciona, en su estu- botón floral de las especies del género dio sistemático, que los ensayos no die- Polylepis fueron obtenidas para estan- ron resultados específicos, y Kessler darizar la metodología para la obten- (15) observó números cromosómicos ción de cromosomas metafásicos, así de 80 en muestras de raíces meristemá- como células en diferentes fases del ticas en tres especies de Polylepis, pero ciclo celular. Diferentes variaciones en el conteo exacto no fue posible debido los procesos de pretratamiento, fija- al tamaño reducido de los cromosomas ción, hidrólisis, tinción y preparación que fácilmente se pueden confundir con de placas, en base a las características

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de los cromosomas observados en ensa- técnica del Ejército, en donde fueron yos previos fueron utilizadas para la transferidas a macetas con un sustrato estandarización de la metodología. apropiado para su enraizamiento con la finalidad de obtener muestras de meris- Recolección de las muestras temo radicular en forma regular y en vegetales cantidades adecuadas para la estandari- Se utilizaron muestras de meriste- zación de la metodología. mos radiculares (1-2 cm de longitud) Los botones florales encontrados y ovarios de botones florales de las fueron pretratados en el sitio de colec- especies de género Polylepis las cua- ción y transportados en un contenedor les fueron colectadas durante los que permitía mantenerlos a temperatu- meses de junio y julio del 2008, en ras bajas. En el laboratorio, después del diferentes localidades de los páramos proceso de fijación y lavado, las mues- ecuatorianos. tras se almacenaron a -20 °C en etanol Se tomaron datos de localización al 70% hasta su posterior uso. geográfica, localidad, especie y tipo de muestras de cada una de las poblaciones. Estudio del ciclo celular Se colectaron plántulas de 5–10 cm y Los estudios del ciclo celular fueron muestras de botones florales (Tabla 1). realizados en muestras de meristemo Las plántulas fueron transportadas con radicular en dos especies del género

Tabla 1. Muestras de las especies del género Polylepis con sus detalles de localidad, puntos de localización geográfica (GPS) y tipo de muestra colectada.

Especie Localidad Puntos GPS Muestra P. incana Illinizas S 00 º12' 8.56''W 68 º40' 24.65'' Plántulas, Botón floral Papallacta S 00 º19' 01.0'' W 78 º13' 28.6'' Plántulas, Botón floral El Ángel, Potrerillos N 00 º48' 31.6'' W 77 º58' 31.9'' Plántulas Mojanda N 00 º08' 18.9'' W 78 º5' 17.4'' Plántulas, Botón floral P. pauta Papallacta S 00 º20' 41.5'' W 78 º12' 2.0'' Plántulas, Botón floral Mojanda N 00 º08' 07.4'' W 78 º15' 22.5'' Plántulas, Botón floral bloques de tierra hasta los invernaderos Polylepis: P. pauta de la localidad de del laboratorio de la Carrera de Ingenie- Papallacta, Páramo de Guamaní y P. ría en Biotecnología de la Escuela Poli- incana de los Illinizas. El cálculo del

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tamaño la muestra “n” o número de mitosis por cada imagen proyectada, células en mitosis a analizar por cada por lo que para lograr obtener las 385 hora de colección, fue determinado células mitóticas y por ende las 1.085 mediante la fórmula del tamaño mues- células totales, 60 imágenes diferentes tral para la estimación de la proporción fueron analizadas. poblacional (18). Z2 S2 Preparación de las placas. Para el n= a/2 estudio del ciclo celular se colectaron E2 de tres a cuatro raíces meristemáticas 2 de 1 a 2 cm de longitud directamente en Za/2 Donde la expresión 2 correspon- el fijador Carnoy (etanol:ácido acético de al percentil de la ley normal estándar 1:3; 19), cada 30 minutos, desde las cuyo valor es de 1.96 para un 95% de 7:30h hasta las 18:00 h. Después de confianza en el estudio, S2 es la varian- hidrolizar con HCl (ácido clorhídrico) za de la proporción, su valor es de 0,25, 1N durante 25 minutos a 60 °C y teñir ya que la varianza se maximiza con una con aceto-carmín al 1% durante al proporción poblacional estimada de menos tres horas a temperatura ambien- 0,5, debido a la ausencia de estudios te, se prepararon las placas para su previos en el género y E2 es el error observación. máximo permitido del 5%. Para calcular el tamaño muestral Recopilación de datos. Fueron pre- total a analizar que incluye células en paradas al menos tres placas, para exa- interfase, se realizó una prueba piloto minar un total de 60 imágenes (20 por en P. incana con un total de 3.751 célu- cada placa). Se anotaron las frecuencias las de las cuales 1.332 eran mitóticas, de interfases, profases, metafases, ana- esto nos indica que por cada 2,82 célu- fases y telofases encontradas en cada las una se encuentra en mitosis. En con- imagen y se capturaron aquellas donde secuencia, se debe multiplicar 2,82 por se observaron las mejores células en el tamaño muestral mitótico (385), cada fase. Las microfotografías fueron determinado mediante la ecuación para tomadas con una cámara fotográfica obtener el número de células totales que digital de 20 MPX adaptada al micros- se deben contabilizar por cada hora de copio invertido marca LOMO con un colección para obtener resultados con aumento de 1.040 X. el 95% de confianza, el resultado es de 1.085 células. Los datos tomados de la Análisis de los datos. Los cálculos prueba piloto demuestran que se puede del índice mitótico (IM) y los índices de encontrar en promedio 6,76 células en fases (IF), parciales y totales se llevaron

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a cabo mediante las ecuaciones utiliza- También fueron probadas temperaturas das por Matos & Molina (1997) (22) en bajas durante 4 horas antes de usar los trabajos realizados con Aloe vera. agentes químicos.

No. células en mitosis IM= x100 Botones florales. Las muestras No. células totales fueron pretratadas a diferentes horas No. células en fase del día en los sitios de colección en 8 IF= x No. total de células en mitosis 100 hidroxiquinolina 2mM y agua helada durante 24 horas a 4 °C (20, 19), Pretratamiento razón por la cual no se determinó la Meristemo radicular. Una vez hora de colección. conocida la o las horas apropiadas para la recolección de las muestras, se colec- Fijación taron meristemos radiculares limpios Meristemo radicular. Se usaron de 1 - 2 cm de longitud en microtubos diferentes soluciones de fijación: ácido que contenían los diferentes agentes acético, etanol (1:3; 26) ácido acético, antimitóticos, permitiéndonos variar cloroformo, etanol (1:3:6; 19) y meta- tanto la concentración, como la tempe- nol, ácido propiónico, cloroformo ratura y el tiempo de aplicación para la (6:3:2; 21). Los meristemos radiculares estandarización del proceso (Tabla 2). después de varios lavados con agua

Tabla 2. Agentes inhibidores de la mitosis, con sus detalles de variación en la concentración, tiempo y temperatura utilizados para estandarizar el proceso de pretratamiento en muestras de meristemo radicular. Agente Tratamiento Concentración Periodo Temperatura Agua helada 24 horas 4 ˚C 48 horas 0 ˚C 4 horas 8-hidroxiquinolina 2mM 3 horas 4 ˚C 4 horas RT* 5 horas 24 horas 1 hora RT más 24 h a 4 ˚C Colchicina 0,2 % 1 hora RT 0,5 % 2 horas 3 horas

*RT, Temperatura ambiente (16 – 18 °C).

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destilada fueron fijadas en dichas soluciones ensayándose diferentes tiempos: 4, 21, 22, 23, 24 y 48 horas, a diferentes temperaturas: 4 ºC y a temperatura ambiente. En caso de no usarlas inme- diatamente, luego de la fijación se repi- ten los lavados y se preservan en alco- hol al 70% a -20 ºC, hasta su posterior uso.

Botones florales. Las muestras pretratadas en el lugar de colección, fueron fijadas en una solución de etanol, ácido Figura 1. Botón floral de P. incana disectado para acético (3:1; 19) durante 24, 48 y 72 obtener el ovario y los estambres (2.5X). horas a 4°C. Posteriormente fueron lavadas para ser preservadas en etanol mín/orceína 1%, lacto-propiónico orce- al 70% a -20 °C, hasta su posterior uso. ína 2% (26, 27) y Reargent Shiff (10). Después de hidrolizar y lavar la mues- Hidrólisis tra, se colocó el colorante en el micro- Meristemo radicular. Después de tubo, durante diferentes periodos de lavar la muestra se utilizó una hidrólisis tiempo: 1, 2, 3 y 24 horas, a temperatu- con HCl 1N a 60 °C (11), ensayando ra ambiente y 60 °C. Una vez teñidas diferentes tiempos (5, 10, 15, 20, 25, las muestras, se prepararon las placas 30, 40 y 60 minutos). con la técnica convencional del aplasta- do o squash (11). Botones florales. Fueron retirados del etanol al 70% y disectados para obte- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ner los ovarios y estambres (Figura 1), Estudio del ciclo celular. El estu- los cuales fueron lavados para someterlos dio microscópico de las células mitóti- al proceso de hidrólisis en HCl 1N a 60 cas e interfásicas en meristemos radica- °C (11), ensayando diferentes tiempos (5, les permitió conocer cuantitativamente 10, 15, 20 y 25 minutos). el proceso de división mitótica en las dos especies del género Polylepis: P. Tinción y preparación de placas. incana y P. pauta cuyos resultados y Fueron probados diferentes colorantes: análisis son presentados por primera aceto-carmín/orceína 1%, aceto-car- vez para estas especies. mín/orceína 2%, propiónico car-

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Figura 2. Secuencia del ciclo celular en P. incana de los Illinizas en un periodo de recolección de12 horas La determinación del ciclo celular y analizadas un total de 55 200 células, de la hora mitótica constituyen las discriminadas en células en interfase y herramientas principales para aumentar células en mitosis. En base a la eva- la efectividad de los métodos químicos luación de un período de 12 horas de y físicos usados en la preparación y los índices de fase (IF) e índice mitó- visualización de los cromosomas en tico (IM) parciales y totales, se esta- especies vegetales, así como la elimina- bleció que la mejor hora para la prefi- ción del azar, utilizando criterios objeti- jación de las muestras de meristemo vos para la toma de las muestras. De radicular en P. incana, está compren- igual manera permiten determinar la dida entre las 08:00h y 08:30h presencia de poliploidía como un pro- (IM=57,50 %). Durante las demás ceso de diversificación de las especies horas los IM fueron bajos, fluctuando propias de zonas montañosas (13, 11). entre el 9 % (14H30) y 28 % (11H00) La información obtenida en esta inves- de la población celular (Figura 2). Es tigación en relación al ciclo celular posible observar que el porcentaje de ofrece la oportunidad de investigar pro- profases ocupa la mayor parte de la cesos de poliplodía en este género, no población celular en división, espe- solamente en las especies ecuatorianas cialmente entre las 08:00h y 08:30h. si no a nivel regional. Durante las otras horas, las fases res- Para la estimación del ciclo mitóti- tantes (metafases, anafases y telofa- co en las dos especies del género ses) se presentan en pequeña propor- Polylepis, P. incana y P. pauta, fueron ción, en forma irregular (Figura 3).

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Figura 3. Secuencia de los índices de fase en P. incana de los Illinizas en un periodo de recolección de12 horas. La mejor hora para la prefijación de De igual manera, es posible observar las muestras de meristemo radicular en P. que el porcentaje de profases ocupa la pauta, está comprendida entre las 8:00h mayor parte de la población celular en y 9:30h (IM = 43,08 – 49,00 %), obser- división, especialmente entre las 08:00h vando un pico mayor a las 8:30h (IM = y 10:00h. Durante las demás horas, se 53,92%). Durante las demás horas los IM nota una acumulación leve de telofases. fueron bajos, fluctuando entre el 14 % Las fases restantes (metafases y anafa- (17:00 h) y 37 % (10:00 h) (Figura 4). ses) se presentan en pequeña proporción, en forma irregular (Figura 5).

Figura 4. Secuencia del ciclo celular en P. pauta del Páramo de Guamaní - Papallacta, en un periodo de reco- lección de 12 horas.

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Figura 5 Secuencia de los índices de fase en P. pauta del Páramo de Guamaní-Papallacta, en un periodo de recolección de12 horas. Las horas de colección obtenidas de división celular completo, por lo que para las dos especies son consistentes la duración del ciclo mitótico en base a con otras investigaciones donde el mayor la evaluación de los IF e IM totales, es número de células en mitosis se observan de 53 minutos, de los cuales 35 minutos en las primeras horas de la mañana hasta son ocupados por la profase; seis minu- aproximadamente las 11:00h. Sin embar- tos por la metafase, cuatro minutos por go, es importante tomar en cuenta que el la anafase y siete minutos por la telofa- momento del día en el cual las células se se. En las Figuras 6 y 7 se muestran multiplican con mayor rapidez varía de fotografías de fases mitóticas observa- una especie a otra (22). das en las especies evaluadas. La curva de la Figura 2 nos permite Se destaca un mayor tiempo para las asumir un valor medio de 2 horas para células en interfase, aunque una vez ini- un ciclo de división celular completo en ciada la actividad mitótica, las células P. incana, por lo que la duración del permanecen más tiempo en profase, la ciclo mitótico en base a la evaluación anafase dura un lapso más corto, lo que de los índices de fase (IF) e índices concuerda con Raven, Evert & Curtis mitóticos (IM) totales es de 29 minutos, (1976) (23) quienes señalan que las de los cuales 18 minutos son ocupados fases de la mitosis son variables en lon- por la profase; cuatro minutos por la gitud siendo la profase la más larga y la metafase, tres minutos por la anafase y anafase la más corta. En este sentido, cuatro minutos por la telofase. En P. las frecuencias de las fases mitóticas pauta la Figura 4 nos permite asumir un permanecen dentro de los rangos nor- valor medio de tres horas para un ciclo males reportados (23, 24).

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Figura 6. Algunas de las fases mitóticas observadas Figura 7. Algunas de las fases mitóticas observadas en P. incana de los Illinizas. (a) Interfase, (b) Profase, en P. pauta del Páramo de Guamaní. (a) Interfase, (b) (c) Metafase, (d) Anafase, (e) Telofase. Barra repre- Profase, (c) Metafase, (d) Anafase y (e) Telofase. senta 5 μm. Barra representa 5 μm La variación presentada tanto en la Estandarización de la metodolo- hora de colección como en la duración gía. La metodología que se logró estan- del ciclo mitótico y sus distintas fases darizar para el conteo cromosómico uti- en P. incana y P. pauta, se debe posible- lizando muestras de meristemo radicu- mente a la propiedades celulares de lar y botón floral, para las especies del cada especie y a su distinta reacción género Polylepis, no se basó en un pro- ante la acción de factores ambientales tocolo específico, sino sobre la base de (11), probablemente se obtendrán resul- las características de los cromosomas tados diferentes en las mismas especies descritos por Kessler (1995) (28) en bajo diferentes condiciones. tres especies de Polylepis: P. neglecta, En las dos especies se registra cier- P. triacontandra, P. tarapacana, quien ta irregularidad en el curso del ciclo observó numerosos cromosomas (2n = celular, caracterizado por un mayor 82) de tamaños sumamente pequeños, porcentaje de profases dentro de la los que se confundían con las partículas población celular en división y a una de colorante (3). acumulación de telofases en P. pauta, Pretratamiento de las muestras. indicándonos la presencia ciclos irregulares. La alternancia de interfases nor- Otro factor crítico, a más de la determi- males con mitosis irregulares en otras nación de la hora de colección apropiada, especies analizadas como oca y olluco, para mejorar los resultados del proceso constituyen uno de los probables meca- de pretratamiento, es el tipo de agente nismos de poliploidización (11). inhibidor de la mitosis que se utiliza (25).

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En los pretratamientos con agentes quí- Se deben usar períodos de al menos micos no se obtuvo buena condensación 24 horas y no más de 26 horas en agua y dispersión de los cromosomas como se destilada a 4 °C, ya que la longitud de observó al utilizar temperaturas bajas los cromosomas se acorta considerable- positivas de 4 °C (Figura 8). La utiliza- mente (19) y las células se destruyen. ción de frío o calor, previo al tratamiento Los periodos cortos (cuatro horas) tam- con sustancias químicas, ayuda a deses- poco arrojan buenos resultados, no se tabilizar los microtúbulos. Además, el observa destrucción celular pero tam- tratamiento previo de meristemos radicu- poco cromosomas claros e individuales. lares con frío induce la acumulación de Con la utilización de la temperatura de células en metafase (26) condición dese- congelación, se destruyen las células y able para la realización de pretratamien- sus componentes. Para las muestra de tos con agentes químicos. Sin embargo, botones florales funcionan bien los pre- en este caso la utilización de frío no tratamientos utilizados en meristemo ayudó a mejorar la acción de la 8-hidro- radicular. xiquinolina. Por lo que se sugiere utilizar como pretratamiento, agua destilada a 4 Fijación de las muestras. Las tres °C durante 24 horas, la cual se recomien- mezclas de fijación, ensayadas durante da cuando las especies a estudiar poseen 24 horas a 4 °C proporcionaron buenos numerosos cromosomas (19), como es el resultados en la interrupción de los pro- caso del género Polylepis. cesos vitales de la célula sin dañar su estructura (4). Se prefirió usar Carnoy (ácido acético:etanol 1:3; 19) ya que las otras mezclas contenían cloroformo, el cual es un químico nocivo para la salud y el medio ambiente.

Hidrólisis de las muestras. El proceso de hidrólisis con HCl 1N a 60 °C fue estandarizado para las muestras de meristemo radicular, ovario y estambre, obteniéndose diferentes períodos de tiempo, los cuales dependen de la naturaleza del tejido (20). En las muestras de ovario y estambre se obtuvo una Figura 8. Cromosomas metafásicos en muestras de buena separación de las células sin des- meristemo radicular de P. microphylla de la localidad trucción de las mismas con cinco y diez de Achupallas. Barra representa 5 μm.

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minutos respectivamente, tiempo caba un mayor tiempo de tinción, el menor al utilizado con raíces meriste- cual se reduce calentando las mues- mos radiculares (25–30 minutos), debi- tras en el colorante. Cabe recalcar do probablemente a que tanto el tejido que concentraciones mayores del del ovario como el del estambre son colorante destruyen el tejido. Una blandos y están protegidos por las otras vez teñidas las muestras pueden per- estructuras florales externas a diferen- manecer en el colorante, debido a que cia de la raíz que está expuesta directa- el ácido acético del mismo actúa tam- mente al suelo. bién como fijador (20), pero se deben evitar dejarlas durante largos perio- Tinción de las muestras. La dos de tiempo ya que las partículas superposición, la pobre coloración y del colorante tienden a sedimentar el tamaño extremadamente pequeño acumulándose en el tejido. Se reco- de los cromosomas son factores que mienda mantener las muestras en han limitado los estudios citogenéti- refrigeración para evitar la prolifera- cos (27). Sin embargo, el uso de ción de bacterias. aceto-carmín o aceto-orceína ha faci- litado la obtención de buenos resulta- Números Cromosómicos. Los cro- dos (28) en las especies donde se han mosomas son reconocidos por su observado dichos factores como es el importancia en los estudios taxonómi- caso de las del género Polylepis (3). cos y evolutivos. El número cromosó- En el presente estudio, de todos los mico, teniendo en cuenta dos variables: colorantes probados, sólo el uso del el número básico y el nivel de ploidía, aceto-carmín al 1% permitió obtener constituyen datos relevantes para la una tinción adecuada de los cromoso- resolución de problemas taxonómicos y mas, fases celulares y citoplasmas la comprensión de las tendencias evolu- claros en las muestras de meristemo tivas (29, 11). A pesar de esta importan- radicular y ovario. cia, los estudios cromosómicos comple- La partículas del colorante que tos en las especies del género Polylepis pueden confundirse con los cromoso- no han sido realizados, se han intentado mas han impedido también obtener conteos cromosómicos desde 1979 sin conteos exactos en ensayos anterio- resultados específicos (3). res en algunas especies de Polylepis En el presente trabajo, se presentan (15, 16), ésta dificultad fue superada por primera vez los números cromosó- usando el colorante en baja concen- micos (2n) de la especies del Género tración (1%) y filtrándolo, cada vez Polylepis presentes en el Ecuador antes de utilizarlo, aunque esto impli- (Tabla 3), iniciando de esta manera el

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Tabla 3. Números cromosómicos somáticos de las especies del género Polylepis con detalles de muestra utilizada, localidad y número de células metafísicas analizadas. Especie Muestra Localidad No No. Cromosomas 2n células P. incana Meristemo El Ángel 2 38(1), 40(1) 38-40 radicular Illinizas 23 38(11), 39(5), 40(4), 41(1), 42(2) 38-42 Papallacta 25 39(2), 40(7), 41(9), 42(7) 39-42

Ovario Papallacta 15 40(7), 41(3), 42(5) 40-42

P. pauta Meristemo Papallacta 1 71(1) 71 Radicular Ovario Papallacta 25 67(9), 68(2), 72(2) 73(2), 67 - 83 74(1) 75(1), 76(3), 77(1), 78(1), 80(1), 81(1), 83(1)

Mojanda 12 70(6), 71(1), 72(1), 73(1), 70 - 84 75(1), 78(1), 84(1)

P. sericea Ovario El Ángel 8 37(5), 39(2), 40(1) 37 - 40 Fierrourco 25 39(10), 40(6), 41(7), 42(2) 39 - 42 Yanacocha 9 59(2), 64(1), 66(1), 10(1), 59 - 77 71(1), 74(1), 76(1), 77(1)

P. microphylla Meristemo Achupallas 25 70(3), 71(1), 72(1), 73(2), 70 - 82 radicular 74(4), 75(2), 76(1), 77(5), 78(2), 79(2), 82(2)

P. weberbauri Meristemo Zhud 10 37(9), 42(1) 37 - 42 Radicular

Ovario Zhud 16 37(7), 38(1), 39(4), 40(2), 37- 42 41(1), 42(1)

P. lanuginosa Meristemo Zhud 25 38(2), 39(8), 40(5), 41(5), 38 - 42 radicular 42(5)

P. reticulata Meristemo Oyacachi 15 87(2), 94(1), 96(1), 104(3), 87 - 118 radicular 108(2), 109(2), 111(1), 114(1), 118(2)

Ovario Soldados 11 36(5), 38(1), 39(1), 40(2), 36 - 42 41(1), 42(1)

P. racemosa Meristemo Oyacachi 25 69(9), 70(4), 71(3), 72(2), 69 - 80 Radicular 74(3), 76(2), 78(1), 80(1)

Ovario Oyacachi 2 72(1), 77(1) 72 - 77

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conocimiento cromosómico de este AGRADECIMIENTOS género y contribuyendo a su delimita- ción taxonómica. La variación presen- Este estudio se realizó gracias al tada en los números cromosómicos apoyo económico del Proyecto Pára- dentro de las especies y entre poblacio- mo Andino, Tropical Development nes de la misma especie nos confirma, and Conservation Program y la Escue- por primera vez, la presencia de poli- la Politécnica del Ejército con su pro- ploidía en el género en poblaciones grama de iniciación científica ESPE naturales, lo cual estaría indicando la 2008. importancia de los cambios cromosó- micos numéricos en la diversificación BIBLIOGRAFIA de las especies de este género, posiblemente debido a causas, entre ellas 1. KESSLER, M., & SCHMIDT- medioambientales, que aún no están LEBUHN, A. 2006. Taxonomical muy claras. and distributional notes on Teniendo esta diversidad de Polylepis (Rosaceae). Diversity and números cromosómicos y niveles de Evolution, 6, 67-69. ploidía, es obvio que tanto la aneu- 1. JAMESON, S., & RAMSAY, P. ploidía como la poliploidía han juga- 2007. Changes in high-altitude do un rol importante en la evolución Polylepis forest cover and quality in del género Polylepis, así como en the Vilcanota Cordillera, Peru 1956- otros, lo cual lo convierte también en 2005. Biological Conservation, 138, un género atractivo para el análisis de 38-46. dichos eventos (25).En el futuro, 2. SCHMIDT-LEBUHN, A, sería interesante estudiar los cromo- KESSLER, M., & KUMAR, M. somas de un mayor número de pobla- 2006. Promiscuity in the Andes: ciones, establecer las relaciones entre Species Relationships in Polylepis los niveles de ploidía y su localiza- (Rosaceae, Sanguisorbeae) Based ción geográfica, hábitat, etc. Además, on AFLP and Morphology. System- sugerir modelos evolutivos para las atic Botany, 31, 547-559. especies de este género cuyo rol eco- 3. SELTMANN, D., COCUCCI, A., lógico es fundamental para el ecosis- HENSEN, I., & JUNG, J. 2007. tema en donde habita. En la Figura 8 Fragment size, pollination efficien- se presenta una fotografía de cromo- cy and reproductive success in natu- somas metafísicos de P. microphylla, ral populations of wind-pollinated resultado de la utilización de la meto- Polylepis australis (Rosaceae) dología antes descrita. trees. Flora, 202, 547-554.

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48 Quija-Lamina, P., Segovia-Salcedo, C. Jadán, M. & Proaño K.

4. HOCH, G., & KÖRNER, C. 2005. 9. TUNA, M., VOGEL, P., ARUMU- Growth, demography and carbon GANATHAN, K. & GILL, S. 2001. relations of Polylepis trees at the DNA content and ploidy determina- world’s highest tree line. Functional tion of bromegrass germplasm Ecology, 19, 941-951. accessions by flow cytometry. Crop 5. CIERJACKS, A., IGLESIAS, K., Science, 41, 1629–1634. WESCHE, K., & HENSEN, I. 10. SEMINARIO, J. 2004. Raíces andi- 2007. Impact of sowing, canopy nas: Contribuciones al conocimien- cover and litter on seedling dynam- to y a la capacitación. Serie: Con- ics of two Polylepis species at upper servación y uso de la biodiversidad tree lines in central Ecuador. Jour- de raíces y tubérculos andinos: Una nal of Tropical Ecology, 23, 309- década de investigación para el des- 318. arrollo (1993-2003). No. 6. Lima, 6. SCHMIDT-LEBUHN, A., SELT- Perú: Universidad Nacional de MANN, P., & KESSLER, M. 2007. Cajamarca, Centro Internacional de Consequences of the pollination la Papa, Agencia Zuiza para el des- system on genetic structure and pat- arrollo y la cooperación. tern of species distribution in the 11. TALLEDO, D., ESCOBAR, E., & Andean genus Polylepis ALLEMAN, V. 1995. El ciclo celu- (Rosaceae): a comparative study. lar en vegetales; su estudio, impor- Plant Systematic and Evolution, tancia y aplicaciones. Biotempo, 2, 266, 91-103. 13-31. 7. ORTIZ, V. 2007. Chromosome 12. FERRER, H., ALCORCÉS DE numbers, nuclear DNA content, and GUERRA, N. C., & MÉNDEZ, J. polyploidy in Consolea (Cac- R. 2007. Determinación del ciclo taceae), an endemic cactus of the mitótico de dos cultivares de Goss- Caribbean Islands. American Jour- ypium hirsutum L. y dos ecotipos de nal of Botany, 94, 1360–1370. Gossypium barbadense L. Acta 8. PÉREZ, R., HERNÁNDEZ, M., Biol. Par., Curitiba, 36, 121-149. ROSE, V., CALLEROS, V., & 13. SCHMIDT-LEBUHN A, FUCHS, PANZERA, F. 2003. Citotaxonomía J., HERTE, D., HIRSCH, H., y evolución cromosómica en Triato- TOIVONEN, J., & KESSLER, M. minae, insectos vectores de la enfer- 2010. An Andean radiation: Poly- medad de Chagas (heteroptera- ploidy in the tree genus Polylepis reduviidae). Entomology Vector 10: (Rosaceae, Sanguisorbeae). Plant 543-550. Biology. Publicado online Feb 2010.

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXXI Números 1 y 2: 33-49, octubre 2010 FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 49

Estandarización de la metodología para el conteo cromosómico en especies del género Polylepis en el Ecuador 49

14. RAMSEY, J., & SCHEMSKE, D. 22. MATOS, A., & MOLINA, J. 1997. 1998. Pathways, mechanisms, and Estudio citogenético en células radi- rates of polyploidy formation in flow- cales de Aloe vera L. Rev. Fac. ering plants. Annual Review of Ecol- Agron. (LUZ), 14, 173-182. ogy and Systematic, 29, 467–501. 23. RAVEN P., EVERT, R., & CURTIS, 15. JARA-SEGUEL, P., ROMERO- H. 1976. Biology of plants. New MIERES, M., & PALMA-ROJAS, York, U.S.A.: Worth Publishers, C. (2006). Chromosome numbers of INC. Chilean pteridophytes: First contri- 24. RODRÍGUEZ, V., & SEIJO, G. bution. Guyana Botany, 63, 115-118. 2001. Estudio del ciclo celular de 16. FERNÁNDEZ, A., KRAPOVIC- una especie leñosa: Gleditsia amor- KAS, G., & SEIJO, A. (2003). Los phoides (Leguminosae). Ciencias cromosomas de Malváceas. (Resu- Agrarias, 14, 321-324. men, Universidad Nacional del 25. GOULD, A. 1984. Staning and Norte, 2003). Resumen: B-044. Nuclear Cytology of Cultured Cells. 17. GALINDO, E. 2006. Problemas y Indra Vasil (Ed.). In Cell Culture and ejercicios de probabilidad y estadís- Somatic Cell Genetics of Plants. Aca- tica. Quito – Ecuador: Policiencia demic Press, Inc., 1, 699-711. Editores. 26. IDEHEN, E., KEHINDE, O., & 18. SINGH, J. 2002. Plant cytogenetic. ADEGBITE, A. 2006. Somatic Illinois, Estados Unidos: CRC chromosome counts and yields per- Press. formance of some accessions of 19. SHARMA, A., & SHARMA, A. ‘egusi’ melon (Citrullus lanatus). 1999. Plants Chromosome, analy- African Journal of Biotechnology 5, sis, manipulation end engineering. 2049-2052. London. England: CRC Press. 27. SCHIMOTSUMA, M 1961. Chro- 20. MARTINEZ-GOMEZ, P., SAN- mosome number of Citrullus CHEZ-PEREZ, R., VAKNON, Y., species. Chromosome information DICENTA, F. AND GRADZIEL, service 2, Kyushu, kukuoka. Japan. T., 2005. Improved technique for 28. KESSLER, M. 1995. The genus counting chromosomes in almond. Polylepis (Rosaceae) in Bolivia. Scientie Horticulturae 105:139-143 Candollea, 50, 31-71. 21. SWANSON, C., MERZ, T., & 29. SIMPSON, B. B. 1979. A revision YOUNG, W. 1981. Cytogenetics. of the genus Polylepis (Rosaceae: The chromosome in division, inher- Sanguisorbeae). Smithsonian Con- itance, and evolution. New Jersey, tributions to botany, 43, 1-62. U.S.A: Prentice Hall, INC. Engleaood Cliffs.

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Análisis RAPD de la diversidad genética de Theobroma cacao L. de una población del Litoral Ecuatoriano

Mercedes Carranza1, Emmerick Motte2, Virna Cedeño2, Orly Cevallos1, Silvia Saucedo1, Hayron Canchignia 1, Ariel Escobar1.

1Unidad de Investigación, Laboratorio de Biotecnología, Universidad Técnica Estatal de Quevedo. Quevedo, Los Ríos, Ecuador. [email protected]

2Laboratorio del Programa de Biotecnología. Universidad de Guayaquil. Guayaquil (Guayas, Ecuador) Recibido: 2010-06-01, aprobado: 2010-08-31

RESUMEN.- En este estudio, los análisis con marcadores RAPD (Random Ampli- fication of Polymorphic DNA) fueron usados para estimar la diversidad genética y la relación de 20 accesiones de Theobroma cacao L. de la variedad Nacional en la finca (La Buseta) ubicada en la Parroquia Tenguel provincia del Guayas. Las plantas fueron seleccionadas con criterios de productividad, resistencia, susceptibilidad a enfermedades causadas por hongos como Ceratocystis fimbriata, Moniliophtora roreri y Crinipelis perniciosa. Se utilizaron 14 primers, de los cuales nueve ampli- ficaron, generando 67 bandas de las cuales 59 (88%) fueron polimórficas. Los resultados indican la formación de dos grupos de accesiones A y B, en el grupo A se incluyen dos accesiones y, en el grupo B se encuentran 18 de los cuales incluyen 2 subgrupos B1 y B2. E el subgrupo B1 se incluye la accesión (L-22-H-40), y en el subgrupo B2 están incluidas las accesiones que poseen características de productividad. El nivel de diversidad génica más alto se obtuvo con los primers OPC 04 (0,80), OPC 07 (0,82) y el nivel más bajo fue OPC 01 (0,37). Las accesiones (L- 22-H-40; 0,75; L-34-H-07; 0,86) y el (L-42-H-60; 0.72) presentaron los niveles de variabilidad génica más altas, siendo los valores más bajos los mostrados por las accesiones (L-26-H-64; 0,48) y (L-23-H63; 0,47). El valor de la diversidad total (Ht) obtenida para las 20 accesiones de T. cacao L. mediante RAPD fue de 0,636.

PALABRAS CLAVE: accesiones, génica, polimórficas, subgrupos.

ABSTRACT.- In this study, the analysis with RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) was used to estimate genetic diversity and relationships of 20 accessions of Theobroma cacao L. National variety on the farm (the minibus) located in the parish Tenguel province of Guayas. Plants were selected on criteria

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Análisis RAPD de la diversidad genétic de Theobroma cacao L. de una población del Litoral Ecuatoriano 51

of productivity, resistance, susceptibility to diseases caused by fungi such as Cer- atocystis fimbriata, Moniliophtora roreri and Crinipelis perniciosa. We used 14 primers, nine of them amplified, generating 67 bands of which 59 (88%) were polymorphic. The results indicate the formation of two groups of accessions A and B. The group A includes two accessions while in B are 18, divided in two subgroups B1 and B2. The subgroup B1 includes the accession (L -22-H-40) and the subgroup B2 includes accessions that have productivity features. The highest level of genetic diversity was obtained with the primers OPC 04 (0.80), OPC 07 (0.82) and the lowest was OPC 01 (0.37). Accessions (L-22-H-40; O.75; L-34-H-07; 0.86) and (L-42-H-60; 0.72) had levels of genetic variability quite large, reaching the lowest values shown by the accessions (L-26-H-64; O.48) and (L-23-H63; O.47). The value of the total diversity (Ht) obtained for the 20 accessions of T. cacao L. RAPD was 0.636.

KEYWORDS: Accessions, gene, polymorphic, subgroups

INTRODUCCION colección sistemática de muestras El cacao (Theobroma cacao L.) es representativas de cacao Nacional exis- una de las principales plantas perennes tentes en la región desde la década del de uso agroindustrial que se cultiva en 40 por la United Fruit. Sin embargo, la mayoría de países que se encuentran esta caracterización se ha basado en en la zona intertropical; tiene gran caracteres fenotípicos, directamente importancia dentro de la economía del influenciados por factores ambientales, Ecuador que es exportador desde 1830 herencia multigénica, herencia cuanti- del cacao fino de aroma a base de la tativa y por la dominancia parcial de variedad conocida como Nacional (1). algunos caracteres, la cual puede con- En la actualidad la superficie cultivada fundir la expresión de un rasgo genéti- en el país de cacao se estima en aproxi- co (3). madamente 362 120 hectáreas, con una El mejoramiento genético en culti- producción anual de 95 000 TM y un vos perennes puede tomar varios años y rendimiento de 0.27 TM/ha-1, lo que en el caso del cacao puede llevar de diez significa 5,40 quintales por hectárea al a doce años hasta lograr un nuevo culti- año (2). El Banco de germoplasma de vo; este proceso puede ser acelerado cacao variedad “Nacional” existente en mediante el uso de técnicas moleculares, la finca experimental “La Buseta”, pro- las cuales han demostrado ser herra- piedad de la Universidad Técnica Esta- mientas útiles para el mejoramiento tal de Quevedo, es el resultado de la genético y para la selección de varieda-

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des con características importantes Con inestables con las cuales se podría ini- la identificación de marcadores molecu- ciar programas de mejoramiento gené- lares asociados a loci que codifican tanto tico. El objetivo de este estudio fue esti- para características cualitativas como mar la diversidad genética de una cuantitativas (QTL´s), por su acrónimo colección de Theobroma cacao L. en inglés, es posible realizar una selec- variedad Nacional usando marcadores ción asistida por marcadores (4). RAPD´s. El presente trabajo busca identificar y caracterizar clones de cacao de la MATERIALES Y METODOS variedad Nacional de las cuales existen Las muestras foliares de las 20 registros de comportamiento en campo, accesiones de cacao fueron recolecta- utilizando marcadores moleculares das e identificadas en la Finca “La RAPD´s, la cual es una herramienta Buseta” ubicada en la Parroquia Ten- adecuada para estudios genéticos, ya guel provincia del Guayas, Ecuador, que destacan en la mayoría de los casos Figura 1; posteriormente llevadas al las limitaciones de los métodos tradi- Laboratorio del Programa de Biotecno- cionales (5); además, se lograría una logía de la Universidad de Guayaquil mejor reclasificación de los materiales para la extracción de ADN. Las acce- en grupos de determinadas tendencias y siones fueron seleccionadas en base a sería de incalculable ayuda para traba- los siguientes criterios: productivo, jos a mediano plazo en la obtención de tolerante, susceptible y resistente a progenies con características estabiliza- Monillia, susceptible y resistente a das gracias al descarte de plántulas Ceratocystis y susceptible a Crinipellis.

Figura 1. Ubicación geográfica de los principales bancos de germoplasma de cacao Nacional y plano de la finca La Buseta (centro de cacao de aroma Tenguel) Provincia del Guayas de donde se seleccionaron las accesiones de Theobroma cacao L.

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Análisis RAPD de la diversidad genétic de Theobroma cacao L. de una población del Litoral Ecuatoriano 53

El análisis estadístico se basó en la cer segmento 7 minutos a 72 ºC, y Con- codificación de cada banda polimórfi- servación a 4 ºC). A cada muestra se ca representada a través de las varia- colocó 3 ml de una mezcla de azul de bles presencia (1) o ausencia (0) los bromofenol (0,25%; 10). Para la mez- mismos que fueron procesados con el cla de la AP-PCR en cada tubo de reac- método de agrupamiento UPGMA ción se colocó una alícuota de los (Unweighted Paired Prouping Method siguientes componentes: ADN (5 with Arithmetic Average) y el coefi- ng/ml) 1,00 ml 10X buffer, 5 ml 50mM ciente de similitud de Nei & Li (1979) ClMg, 5 ul primer (1,0 mM), 2,00 ml (6). Se registraron por inspección en dNTPs (2,5 mM cada uno), 4,00 ml Taq una matriz de datos binarios en el pro- polimerasa Invitrogen (5 U/ml) 0,2 ml, grama Ntedit del paquete estadístico agua ultra pura 31,8m volumen final: Ntsys pc ver. 2,0 (Applied Biostatis- 50,00 ml. Se probaron 14 primers tics Inc, 1998). No se tomaron en (OPA-02, OPA-04, OPA-07, OPA-12, cuenta polimorfismos que involucren OPA-15, OPA-16, OPC-01, OPC-04, datos dudosos. OPC-08, OPC-09, OPC-10, OPC-07, Para la extracción de ADN de OPC-13, OPC-14), mismos que han cacao se probaron algunos protocolos sido empleados en trabajos anteriores aplicados a tejidos vegetales, con la de caracterización y diversidad genéti- finalidad de obtener ADN de buena ca de cacao realizados por (Faleiro et calidad y aplicable a todas las mues- al. 2002 y Araujo et al. 1999) (9), res- tras sometidas al proceso de extrac- pectivamente. ción. El protocolo modificado (Doyle & Doyle 1990) (7) fue el que mejores RESULTADOS Y DISCUSION resultados dio en cuanto a la calidad y La extracción de ADN de cacao se concentración del ADN. La integridad la realizó a partir de hojas de cacao en y concentración del ADN fueron ana- estado intermedio de madurez, las cua- lizadas por electroforesis en minigeles les mostraron los mejores resultados, de agarosa al 1,2% en tampón TAE con el protocolo modificado de Doyle y 1X. La electroforesis se realizó a 90 V Doyle (1990), se obtuvo ADN de buena por 30 min. (8). calidad y cantidad, sin degradación, Las muestras de ADN fueron ampli- que migró en el gel de agarosa como ficadas utilizando el protocolo propues- una banda única de alto peso molecular to por Faleiro (2001) (10); 40 ciclos (Figura 2). cada uno constituido por el primer seg- Utilizando las condiciones óptimas mento 94º C 4’, segundo segmento 15´´ de amplificación fue posible analizar la a 94 ºC, 30´´ a 36 ºC 90 ´´ a 72 ºC, ter- diversidad genética de 20 accesiones de

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Figura 2. Bandas de ADN a partir de la extracción de 10 accesiones de Theobroma cacao L con el méto- do modificado de Doyle y Doyle (1990).

cacao. De los nueve primers utilizados Estos primers fueron aplicados a las 20 se generaron un total de 67 bandas con accesiones con dos repeticiones mos- un buen nivel de repetitividad. De ellas trando perfiles polimórficos. (Figura 3). el 88% (59) bandas mostraron perfiles Los datos obtenidos con los nueve polimórficos (Tabla 1). primers permitieron la construcción de Sobre los 14 primers probados se un dendrograma que mostró las relacio- pudo obtener marcadores RAPD´s diri- nes génicas entre las 20 accesiones de gidos a tres de las 20 accesiones, de los cacao (Figura 4). Este dendrograma cuales nueve primers (OPA-15, OPC- mostró dos grandes grupos A y B, el 07, OPC-9, OPC-4, OPA-O3, OPC-1, grupo A se incluyó a las accesiones (L- OPA-12, OPC-13 y OPA-7) amplifica- 30-H-62) que fenológicamente poseen ron bandas claras y reproducibles. características de susceptibilidad a Cri- Código Operón Productos amplificados Polimorfismo Monomórficas Polimórficas (%)

OPA-15 1 8 87 OPA-03 2 9 77 OPC-04 2 3 33 OPC-13 1 5 80 OPA0-07 0 6 100 OPC-09 1 7 85 OPA-12 0 8 100 OPC-01 1 7 85 OPC-07 0 6 100

TOTAL 8 59

Tabla 1. Productos RAPD amplificados con nueve primers decaméricos en 20 accesiones de Theobroma cacao L. existentes en la finca la Buseta.

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1 5 10 15 18 2 3 4 6 7 8 9 11 12 13 14 16 17 19 20

Figura 3. Perfiles RAPDs obtenidos con el primer OPA- O3. Carril 1 al 20 accesiones de Theobroma cacao L Se marcan con una flecha algunas bandas Monomórficas ( Ver tabla 1 para la identificación de las accesiones) . nipellis y la accesión (L-34-H07) resis- CONCLUSIONES tencia a Ceratocystis, y en el grupo B se encuentran las 18 accesiones restantes el Los resultados obtenidos permiten cual incluye dos subgrupos B1 y B2, en concluir que el mejor protocolo de el subgrupo B1 se incluye la accesión extracción de ADN de Theobroma (L-22-H40) el cual fenológicamente cacao L. fue el propuesto por Doyle y posee características de resistencia a Doyle (1990) con modificaciones des- Crinipellis. Y el subgrupo B2 en donde arrolladas en nuestro laboratorio. están incluidos las accesiones que pose- Los primers OPC-4 y OPC-7 mos- en características de productividad. Los traron los niveles de diversidad más primers que produjeron los niveles más altos. Los niveles de diversidad media altos de diversidad fueron OPC 04 para los primers usados en todas las (0,80) y OPC 07 (0,82). El primer que muestras fue de (Ht=0.63). Los por- reportó el nivel más bajo fue OPC 01 centaje de bandas polimórficas para (0,37). Las accesiones que presentaron las 20 accesiones de cacao fue 88% los niveles de variabilidad más altos fue- con los nueve primers. Las accesiones ron (L-22H-40; 0,75; L-34-H07; 0,86) y con características de productividad (L-42-H60; 0,72) mientras que los valo- mediante el análisis RAPD fueron res más bajos los mostraron las accesio- agrupadas en el mismo grupo B2. nes (L-26-H64; 0,48) y (L-23-H63; Con el propósito de contribuir con 0,47). La diversidad génica total (Ht) la selección asistida por marcadores obtenida para las 20 accesiones de cacao (MAS) es imperioso desarrollar otros mediante RAPD´s fue de 0,636. marcadores moleculares hasta alcanzar la cobertura completa del genoma de

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Figura 4. Dendrograma de las 20 accesiones de Theobroma cacao L. basado en los RAPDs obtenidos con el coeficiente de similitud de Nei y Li y el método de agrupamiento UPGMa (los números indican a cada acce- sión, las letras A y B representan cada una de los grupos principales del árbol y las letras B1 y B2 corresponden a los sub grupos). RCr resistencia Crinipellis, RC resistencia a Ceratocystis, P Productores, SC susceptible a Ceratocystis, SCr susceptible a Crinipellis, RM resistencia a Monillia TM Tolerante a Monillia, SM susceptible a Monillia

Theobroma cacao L. como los AFLP para establecer el rumbo tecnológi- (Amplificación de fragmentos de longi- co que han limitado el impacto eco- tud polimórfica) y SSCP (Polymerase nómico de la investigación de cacao chain reaction single- strand conforma- durante los últimos 50 años Quito - tion polymorphism). Ecuador, tesis de maestría. Univer- sidad Internacional SEK pág. 188. LITERATURA CITADA 2. SICA. 2005. Servicio de informa- ción agropecuaria del Ministerio de 1. AMORES, F. 1999. La dificultad Agricultura y Ganadería del Ecua-

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXXI Números 1 y 2: 50-57, octubre 2010 FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 57

Análisis RAPD de la diversidad genétic de Theobroma cacao L. de una población del Litoral Ecuatoriano 57

dor. Ecuador: Producción mundial 6. NEI, M. Y W.H. LI. 1979. Mathe- de cacao. Fuente:1991-1995- Siste- matical model for studying genetic ma Estadístico Agropec. Nacional - variation in terms of restriction INEC-1996-1999 Direcciones Pro- endonucleases. Proc. Natl. Acad. vinciales -MAG- DIA *Proyecto Sci. 76: 5269-5273. ECUANECACAO- Elaboración: 7. DOYLE, J. J.; DOYLE, J. L. 1990. Proyecto SICA/MAG- Ecuador Isolation of plant DNA from fresh (www.sica.gov.ec) 14/septiem- tissue. Focus 12: 13-15. bre/2005. 8. FERREIRA, M. Y GRATTAPA- 3. WILDE, J. R. WAUGH Y POW- GLIA, D. 1998. Introducción al uso ELL. 1992. Genetic fingerpriting of de marcadores moleculares en el Theobroma clones using randomly análisis genético. p 100-105. amplified polymorphic dna MARK- EMBRAPA. Brasil.. ERS. Theor. Apll. Genet 83: 87.877. 9. ARAUJO, L. G., PRABHU, A.S. & 4. FALEIRO, F. 2001. Proyecto BIO- FILLIPI, M.C. 1999. Genetic analy- MOL/CEPEC/CEPLAC El uso de sis of leaf blast resistance in Técnicas Moleculares para la bús- somaclones of rice cultivar Aragua- queda de variedades resistentes a ia. Fitopatología Brasileira 24:182- enfermedades de escoba de bruja en 184. cacao. Ilhéus, Brasil, CEPLAC 10. FALEIRO, F., ARAUJO, I., 5. WILLIAMS, J.G.K. LIVAK, K. BAHIA, R., SANTOS, R., YOMA- RAFASKI, J. TINGEY, S. 1990 DA, M. Y ANHERT, D. 2002. Oti- DNA polymorphic GOMEZ, P. mização da extração e amplificação 1998. amplified by arbitrary de DNA de Theobroma cacao L. primers are useful as genetic mark- visando obtenção de marcadores ers Nucleic Acids. Reserach 18: RAPD. Agrotrópica (Brasil) 14(2): 341-345. 31-34.

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Control de nemátodos en maracuyá usando benzimidazoles en ácidos húmicos Carlos A. Soria

Laboratorios Labitech Cia. Ltda., Quito. Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito. [email protected]

Recibido: 2010-04-19, aprobado 2010-08-25

RESUMEN.- Los nemátodos son un problema fitosanitario en los cultivos de maracuyá. Su presencia se asocia, generalmente, con el aparecimiento de nódulos radiculares que obstruyen el flujo savial, disminuyen la vida de la planta y afectan considerablemente su producción. Del estudio fitonemático del maracuyá, se descubre su susceptibilidad al ataque de géneros polifitófagos encontrados, como Meloidogyne, Helicotylenchus y Rotylenchus. Los benzimidazoles son compuestos orgánicos cíclicos nitrogenados con actividad antiparasitaria. Bioterr de Labitech, un nematicida formulado con derivados de benzimidazol, nos permitió estudiar su efecto novedoso en el control de nemá- todos, más aún, si se administra acompañado de ácidos húmicos (Orgánica, Labi- tech), conocidos como modificadores de los corpúsculos de suelo y como acarreadores moleculares, en presencia de saprófitos poco afectados por el benzimidazol. Los controles indicaron una infección significativa con nemátodos, algunos, forma- dores de nódulos radiculares, pocas raicillas nuevas, menor peso radicular y menor producción. Mientras que en los cultivos tratados, se observó lo contrario: dismi- nución significativa de nemátodos, presencia de más raicillas, mayor peso radicular y aumento significativo de la producción.

PALABRAS CLAVE: maracuyá, nemátodos, control, benzimidazol, rendimiento.

ABSTRACT.- Nematodes are a very common phytosanitary problem for passion fruit, causing the appearance and proliferation of typical root nodules which obstruct sap flux, reduce yield production and plant’s life expectancy. Susceptibil- ity of this crop is mainly to the attack of phytonematodes belonging to the genera: Meloidogyne, Helicotylenchus and Rotylenchus. Benzimidazoles are cyclic nitrogenated organic compounds with anti- parasite activity. Bioterr from Labitech, formulated with types of benzimidazole, allowed us to study its novel effect in phytonematode´s control when administered with

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Control de nemátodos en maracuyá usando benzimidazoles en ácidos húmicos 59

humic acids, known as soil corpuscle modifiers and molecular carriers. Little effect was found in saprofites also considered as soil modifiers. Controls indicated a significant nematode infection, evidenced by the presence of root nodules, absence of secondary roots, lower root weights and scarce production, contrary to the results observed after treatment, evidenced by a significant reduction of numbers of nematodes, presence of secondary roots, increased total root weight and better yields.

KEYWORDS: passion fruit, nematodes, benzimidazole, control, better yields.

INTRODUCCION sitos), productores de huevos con Los nemátodos fitófagos, phylum matrices gelatinosas (Meloidogyne, Nematoda, clase Secernentea del orden Tylenchus, Rotylenchus) o quistes (Glo- Tylenchida, son las plagas que más daño bodera, Heterodera) difíciles de elimi- causan a la agricultura (1) ocasionando nar; y, además, otros endoparásitos exi- problemas como pudrición o daños a la gentes (Pratylenchus, Rodopholus), raíz de más de 2 000 especies de hortali- cuyo control resulta aun más difícil por zas, leguminosas y frutales (2, 3). estar protegidos dentro de tejidos radi- Cuando el parásito daña los tejidos culares, por ende, difíciles de ser alcan- externos de la raíz o avanza hacia el zados y fácilmente transmisibles de una conducto interno radicular, inyecta sus plantación a la siguiente (1). toxinas esofágicas y puede transmitir Estos diferentes tipos de parasitis- virus, bacterias u hongos que ingresan a mo, solos o en sinergismo entre ellos, través de las heridas ocasionadas. Se debilitan a las plantas huéspedes, oca- reporta, por ejemplo, infecciones con sionando pérdidas económicas calcula- Fusarium oxysporum a través de lesio- das en miles de millones de dólares a nes causadas por Pratylenchus sp. (4) o nivel mundial, ya sea por mermas en la Meloidogyne sp. (5). producción, aumento de la mortalidad El ataque del género Meloidogyne es del cultivo o por la suma de las dos (2, el más común (5) y se caracteriza por el 5, 6). aparecimiento de nódulos o agallas en la Productos fosforados o carbamata- raíz que obstaculizan el flujo de nutrien- dos, tóxicos tanto para el usuario como tes y pueden causar necrosis tisular. para el medio ambiente, se han utiliza- Pero los nematoparásitos son diver- do por mucho tiempo en controles fito- sos, algunos de vida libre o ectoparási- sanitarios. En humanos y animales, el tos (Trychodoridos) fáciles de contro- efecto de los organofosforados se mide lar; otros facultativos (ecto o endopará- por la inhibición de la colinesterasa,

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enzima que interviene en la hidrólisis adultas de dos años de edad. Tres de las de la acetocolina, en las sinapsis neuro- fincas, totalizando 4 ha, fueron asigna- nales colinérgicas. El uso continuo de das para recibir tratamiento; las otras estos organofosforados se asocia con dos no recibieron ninguno y sirvieron daños neuronales (2, 7, 8). de control. El benzimidazol y la úrea sustituida son los componentes principales del Tratamiento Bioterr de Labitech Cia. Ltda., una Bioterr (Labitech Cia. Ltda.) es un nueva alternativa para control fitone- nematicida consistente de 150 g de deri- mático, libremente soluble en el agua vados de benzimidazol y 820 g de úrea de riego y de fácil migración en el amoniacal más excipiente, por kg. Orgá- suelo, por difusión y convección. nica (Labitech) es un desestresante y En el Ecuador, el cultivo de maracu- activador de suelos que contiene 150 g de yá, Passiflora edulis, se ha extendido a ácidos húmicos por litro de producto. aproximadamente 30 000 ha, principal- Las plantas tratadas recibieron 188 mente en las provincias de Los Ríos, mg de Bioterr (benzimidazol) y 188 mg Guayas, Manabí, Bolívar, Esmeraldas y de Orgánica (ácidos húmicos), aplica- Santo Domingo de los Tsáchilas (9). Los dos en 250 cc de agua de riego por nemátodos están entre los problemas fito- planta. El producto fue aplicado una sanitarios más comunes de este cultivo. sola vez, en drench, de acuerdo con las Durante este estudio, se probaría la instrucciones del fabricante. Previo a la eficacia antinemática de una formula- aplicación, el suelo debe estar húmedo ción con derivados de benzimidazol y a capacidad de campo, para favorecer la ácidos húmicos, en maracuyá. Se reco- penetración del producto hacia el sector nocería y cuantificaría los diferentes de las raíces secundarias donde se loca- tipos de nemátodos en muestras de liza mayormente la infección (10). El suelo control y tratado. Se estudiaría los resultado que se obtenga, dependerá daños ocasionados a la raíz y se asocia- totalmente de esta condición. ría este parasitismo con disminución en los niveles de producción. Conteo e identificación de nemátodos MATERIALES Y METODOS Muestras de 100 g de suelo colectadas al azar, totalizando aproximada- Cultivos mente 1 kg por cada finca, por control o Se utilizaron 6 ha de cultivos por suelo tratado, fueron mezcladas en comerciales de maracuyá en cinco fin- una funda plástica, separado los contro- cas pequeñas de Chone. Cada ha en les de los suelos tratados. producción constaba de 750 plantas

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De cada total de muestra provenien- Las raíces de cada grupo (15 g por te de cada finca, se pesaron 20 g de planta) fueron mezcladas manualmente suelo, cantidad que fue suspendida con en fundas separadas, luego se pesaron agitación continua durante dos min, en 100 g de cada grupo y se contaron 250 cc de agua de la llave reposada nódulos de 3 mm o más de diámetro. (durante la noche) en botellas cilíndri- Los muestreos y conteos de los contro- cas de boca ancha, de 500 cc de capaci- les y de las plantas tratadas se hicieron dad. Luego se dejó decantar durante 1 a los 30 días posteriores a la aplicación minuto y el sobrenadante fue filtrado del tratamiento; los nódulos encontra- por malla de tela fina. dos se reportaron por 100 g de raíces en A continuación se pasó por una cada grupo y para cada uno de tres malla de 40 um, y lo que quedó en la ensayos o repeticiones. malla fue recolectado y lavado con 20 cc de agua en un vaso de precipitación. Desarrollo radicular De esta fracción, se tomó una muestra Se seleccionaron al azar y en forma volumétrica de 5 cc, la cual fue deposi- separada tres plantas adultas tanto del tada en una caja petri para el conteo o cultivo control como del que recibió identificación de nemátodos en 25 cam- tratamiento. Se sacrificó cada una de pos, usando un estéreo microscopio con estas plantas, se extrajo completamente 50 aumentos. la raíz y se procedió a pesarla y a repor- Se reportó el total observado por tarla en gramos, tanto el peso de las rai- género, incluyendo estadíos larvales y cillas como el de la raíz total, incluido adultos por volumen de muestra. El su peso promedio. resultado obtenido en cada muestra se multiplicó por 20 y se reportó como Producción número total por género (o grupo de Durante tres semanas se registró la saprófitos y otros) por 100 g de suelo. producción semanal de maracuyá tanto Los conteos corresponden al promedio en los cultivos que recibieron trata- de 3 repeticiones. miento como en los que no recibieron, y el resultado se reportó como kg de Nódulos en las raíces producción semanal por ha; se calculó también la producción promedio sema- Se estudiaron los nódulos radicula- nal. Los datos extrapolados de la pro- res en las raíces colectadas a 20 cm de ducción en kg por ha fueron obtenidos profundidad, de cada una de las 20 contabilizando el peso de la producción plantas que sirvieron de control y por semanal de las dos fincas control, com- separado, de otras 20 que recibieron parado con la producción de las tres fin- tratamiento. cas que recibieron tratamiento.

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Estadística ros Meloidogyne, Pratylenchus y Heli- Se realizaron análisis de varianza cotylenchus, así como una población para detectar diferencias estadísticas en numerosa de saprófitos (entre 300 y las muestras ensayadas y adicionalmen- 360). También se detectaron números te pruebas de significación de Tukey al menores de Radophylus y Rotylenchus 0,05. (entre 40 y 80) y de otros nemátodos (entre 100 y 160) que no pudieron ser RESULTADOS identificados. Los resultados obtenidos (Figura En las muestras de suelos que reci- 1, cultivo tratado) se expresaron como bieron tratamiento, se notó una dismi- número de nemátodos por género y nución significativa (p < 0,05) en el por muestra en 100 g de suelo, tanto número de nemátodos de casi todos los para los controles como para las géneros parásitos con la excepción de muestras tratadas. Muestreos y conte- Radophylus (p=0,058). Con el trata- os se realizaron 30 días después de miento, también se encontró una apa- aplicado el nematicida con los ácidos rente disminución de saprófitos (de un húmicos. promedio de 330 a 293), pero esta dife- Del conteo realizado en los suelos rencia en los resultados no fue signifi- controles (Tabla 1), se pudo observar cativa (p > 0,05). una infección considerable de nemáto- Se reportaron nódulos en las raíces dos parásitos (entre 160 hasta 400 indi- tanto de los controles como de las plan- viduos por 100 g de suelo), de los géne- tas tratadas (Tabla 2). Se contaron de 125 a 155 nódulos (Prom = 138) por 100 g de raíces controles. Y en las plantas tratadas, el número fue de 120 a 150 (Prom = 133); por lo tanto, tampoco hubo diferencias significativas (p >0,05) entre el número de nódu- los en las raíces controles y los encontrados en las Figura 1. Cultivo de maracuyá tratado con benzimidazoles y ácidos húmicos (Foto de Abdón Tapia). plantas tratadas.

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Tabla 1. Efecto del tratamiento con derivados de benzimidazoles y ácidos húmicos (a) sobre el número de nemátodos en 100 g de suelo cultivado con maracuyá.

Género/ grupo Controles Tratados 1(b) 2(b) Prom(c) 1(b) 2(b) 3(b) Prom(c)

Meloidogyne 400 360 380 80 100 60 80 Pratylenchus 320 300 310 60 20 40 40 Helicotylenchus 160 180 170 40 20 20 27 Rodophylus 80 60 70 20 40 0 20 Rotylenchus 40 60 50 20 0 0 7 Otros 160 100 130 20 40 40 33 Saprófitos 300 360 330 280 340 260 293

(a)Tratamiento: 188 mg de Bioterr + 188 mg de Orgánica en 250 cc de agua /planta; (b)Repeticiones: 1,2,3; (c)Prom: promedio

Tres plantas adultas del grupo con- tamiento varió entre 197 y 210 g (Prom trol y 3 tratadas fueron sacrificadas para = 203 g) en comparación con las plan- poder observar completamente sus raí- tas tratadas que mostraron pesos entre ces (Figura 2, Tabla 3). Se encontró 250 y 281 g (Prom = 262 g), un resulta- diferencias significativas (p<0,05) en el do significativamente más alto que el peso promedio de raicillas nuevas en reportado para los controles (p<0,05). las plantas tratadas (Prom = 8 g por La producción semanal de las dos planta), comparado con el de los con- fincas sin tratamiento fue comparada troles (Prom = 3 g por planta). De igual con la de las otras tres fincas que sí fue- forma, el peso total de las raíces sin traron tratadas. Cada una de estas produc-

Tabla 2. Efecto del tratamiento con derivados de benzimidazoles y ácidos húmicos (a) sobre el número de nódulos en 100 g de raíces de maracuyá.

Número Número nódulos / 100 g de raíces Ensayo Controles Tratados 1 155 130 2 125 150 3 134 120

(a)Tratamiento: 188 mg de Bioterr + 188 mg de Orgánica en 250 cc de agua /planta.

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ciones semanales (tres semanas) fue riego, facilita su uso. A esto se suma el extrapolada y reportada como produc- hecho de ser aparentemente un produc- ción semanal de maracuyá por ha (750 to no tóxico, de sello verde, cuyas plantas adultas por ha) en kg ( Tabla 4). moléculas activas, además de actuar Se encontró una producción promedio por contacto, probablemente pueden ser de 245 kg semanal por ha comparada absorbidas o acarreadas a través de la con una producción significativamente raíz hacia los tejidos infectados cerca- mayor (p<0,05), promedio de 287 kg en nos (12). Los otros componentes incor- las fincas tratadas. porados, por ejemplo, la úrea sustituida amoniacal y/o los ácidos húmicos, DISCUSION actuarían como moléculas catiónicas Los benzimidazoles son compues- con poder surfactante y tensoactivo, tos orgánicos cíclicos nitrogenados, que probablemente ayudarían en la derivados de los imidazoles, con inten- penetración o acarreo del benzimidazol sa actividad antiparasitaria en animales y de los nutrientes del suelo. y en el hombre. El tratamiento aplicado Se sabe que la absorción radicular con benzimidazoles y ácidos húmicos, de un pesticida en solución acuosa, para uso agrícola, nos permitió estudiar dependerá de su formulación y entre su efecto novedoso en el control de los otros, de la presencia de los ácidos nemátodos del suelo (11). húmicos y fúlvicos (13), como los La capacidad del tratamiento para administrados, cuya incorporación al disolverse totalmente en el agua de suelo también ocasionan soltura cor- puscular, oxigena- ción por aereación y solubilización por quelación de sales insolubles u otros principios activos no disueltos (datos no reportados). De lo encontrado, se desprende que estos cultivos de maracuyá son bastante suscepti- bles al ataque de varios géneros de Figura 2. Raíces de maracuyá (Foto de Abdón Tapia)

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Tabla 3. Efecto del tratamiento (a) sobre el peso de las raicillas y raíces de plantas de maracuyá.

Peso Sin tratamiento Tratados (g) 1(b) 2(b) 3(b) Prom(c) 1(b) 2(b) 3(b) Prom(c)

Raicillas 342381078 Raíces 203 197 210 203 255 250 281 262

(a)Tratamiento: 188 mg de Bioterr + 188 mg de Orgánica en 250 cc de agua /planta; (b)Planta número: 1,2,3; (c)Prom: promedio.

nemátodos polifitófagos (Tabla 1), de por la sanidad del cultivo (Figura 1) y la los cuales, los géneros Meloidogyne, reducción significativa (p<0,05) en el Pratylenchus y Helicotylenchus fueron número de los nemátodos encontrados los más abundantes en el estudio de los (Tabla 1). El benzimidazol, mejor aca- grupos control. Otros, como Radophy- rreado parcialmente por los ácidos lus y Rotylenchus, se encontraron en húmicos, en contacto con el nemátodo, números significativamente más bajos sea afuera en el suelo o dentro en la (p<0,05), comparados con Meloidogy- raíz, probablemente es absorbido a su ne, por ejemplo, pero no por eso pueden sistema muscular, por contacto externo ser considerados infectivamente menos o con el alimento, provocando parálisis importantes, ya que algunos son endo- por inhibición enzimática e incapacidad parásitos portadores y transmisores de para metabolizar la glucosa muscular. infecciones virales (14). Interacciones del benzimidazol con las Fue claro el control de la infección glicoproteínas o con los esteroles de las después del tratamiento, evidenciado membranas parasitarias (15), podría

Tabla 4. Efecto del tratamiento con benzimidazoles y ácidos húmicos (a) sobre la producción extrapolada semanal de maracuyá en kg/ha/750 plantas.

Sin tratamiento Tratados

1(b) 2(b) 3(b) Prom(c) 1(b) 2(b) 3(b) Prom(c)

265 240 230 245 280 300 280 287

(a)Tratamiento: 188 mg de Bioterr + 188 mg de Orgánica en 250 cc de agua /planta. (b)Semana número: 1,2,3. (c)Prom: promedio.

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desencadenar en catástrofes metabóli- El cultivo queda disminuido en el cas suficientes como para causar su flujo de nutrientes y agua por necrosis mortalidad (16). radicular y por el aparecimiento de La poca mortalidad observada en infecciones bacterianas, fungosas y los saprófitos después del tratamiento, virales (5) que ocasionan bajos rendi- también resulta interesante (Tabla 1). mientos, como se pudo observar en los Esta selectividad podría explicarse por- cultivos control. Estos últimos mantu- que éstos, al alimentarse de tejidos vieron poblaciones altas de nemátodos muertos, en vez de tejidos vivos, como (Tabla 1) y baja producción (Tabla 4). es su hábito, no ingieren los antiparasi- Al estudiar las raíces control y las tarios incorporados sistémicamente a la del grupo tratado (Figura 2), se encon- savia (1, 12). tró en ambos la presencia de agallas La presencia de saprófitos es una (Tabla 2) en números similares; es ventaja para el cultivo porque al ser decir, en cifras estadísticamente no sig- convertidores de tejidos muertos en nificativas (p>0,05). Pero sí se observó substratos, algunos asimilables, se una renovación significativamente vuelven remodeladores y acondiciona- abundante de raicillas (Tabla 3) en los dores iónicos de los suelos, más aun, en grupos tratados (p<0,05). presencia de ácidos húmicos (13). Es la Estos resultados se explican porque actividad fisiológica de estos nemáto- una vez iniciado el daño del tejido con dos, más la presencia de los ácidos el aparecimiento de los nódulos (6), húmicos que actúan como quelantes o éstos permanecen temporalmente aun acarreadores iónicos, lo que permite la en ausencia de nemátodos que podrían liberación de nutrientes que pueden haber sido ya controlados por el trata- estar localizados en algunos nichos y no miento (12). en otros (17), causando, además, un El número bajo de nemátodos que se mejor aprovechamiento del agua y del encontraron en el suelo tratado 30 días oxígeno del suelo (8). atrás, podría explicarse porque los ben- El ataque del género Meloidogyne es zimidazoles no sufren fácilmente bio- peculiar en más de 3.000 variedades de transformaciones (19) por descarboxili- cultivos (18) y se caracteriza por estimu- zación, debido a su estructura anillada lar una multiplicación de células gigan- que les confiere estabilidad; esta propie- tes y aledañas, formadoras de nódulos, dad, permite que estas moléculas puedan donde se acumulan toxinas, celulasas, permanecer activas en el suelo por más proteinasas o radicales oxigenados de de 30 días, quizá al mantenerse débil- alta reactividad que suprimen procesos mente queladas a los ácidos húmicos. fotosintéticos y de respiración. Esta característica de los derivados ani-

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llados imidazólicos se traduce en la 4. Castillo P., Jimenez R., Gomez A., obtención de mejores cosechas (Tabla Vovlas N., 1995. Parasitism of the 4), debido, entre otros, al control fitone- root-lesion nematode Pratylenchus mático prolongado, a la disponibilidad thornei on chickpea. Plant Patholo- de nutrientes acondicionados por los gy 44, 728-733. nemátodos saprófitos y por los ácidos 5. Leonard D., 1991. The nematode. húmicos, así como al mejoramiento de la Horticulture 69 (3), 1-7. absorción que pudiera explicarse por el 6. Hofmann J., Grundler M., 2007. aumento de la masa radicular, especial- How do nematodes get their mente de las raicillas absorbentes sweets? Solute supply to sedentary (Tablas 1,2,3). Además del ahorro que plant-parasitic nematodes. Nematol- ocasiona la implementación de trata- ogy 9 (4), 451-458. mientos menos seguidos requeridos para 7. Pink R., Hudson A., Mourie´s M., romper ciclos nemáticos (5) que ocurren Bendig M., 2005. Opportunities and aproximadamente cada 30 días. challenges in antiparasitic drug dis- covery. Nature reviews 4, 727-740. LITERATURA CITADA 8. Blouin M., Zuily-Fodil Y., Pham- 1. Lamberti F., Greco N., Basile M., Thi A., Laffray D., Reversat G., 1986. Treatments of soil-nemato- Pando A., Tondoh J., Lavelle P., logical aspects. Bulletin 2005. Belowground organism activ- OEPP/EPPO Bulletin 16, 327-333. ities affect plant aboveground phe- 2. Fleming C., McKinney S., McMas- notype, inducing plant tolerance to ter S., Johnston M., Donnelly P., parasites. Ecology letters 8, 202- Kimber, M., Maule A., 2007. Get- 208. ting to the root of neuronal signal- 9. Servicio de Información Agrope- ing in plant-parasitic nematodes cuaria del Ministerio de Agricultura using RNA interference. Nematol- y Ganadería del Ecuador. Presenta- ogy 9 (3), 301-315. ción de Maracuyá (Ing. Olmedo 3. Ubidia P., Soria C., 2006. Revisión Luna). El cultivo de maracuyá en el de efectos y daños causados por los Ecuador (Ing. Pablo Rizzo Pástor). nemátodos fitoparásitos en cultivos http://www.sica.gov.ec/cade- importantes en la producción agrí- nas/2009. cola. XXX Jornadas Nacionales de 10. Araya M., Vargas A., Cheves A., Biología. Sociedad Ecuatoriana de 1999. Nematode distribution in Biología y Pontificia Universidad roots of banana (Musa AAA cv. Católica del Ecuador. Libro de resú- Valery) in relation to plant height, menes, p. 112. distance from the pseudostem and

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXXI Números 1 y 2: 58-68, octubre 2010 FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 68

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soil depth. Nematology 1 (7-8), 711- Haemonchus contortus. Parasite 716. Immunology 24, 189-201. 11. Soria C., 2006. Benzimidazoles en el 16. Kerboeuf D., Riou M., 2006. Nema- control de nemátodos. XXX Jornadas todes as Models for the Study of the Nacionales de Biología. Sociedad Regulation of Activity of P-glyco- Ecuatoriana de Biología y Pontificia proteins in Multidrug Resistance Universidad Católica del Ecuador. (MDR). Anti-Infective Agents in Libro de resúmenes, p. 51-52. Medicinal Chemistry 5, 389-402. 12. Soria C., 2009. Bioterr Labitech, un 17. Wurst S., Langel R., Scheu S., nuevo fitonematicida a base de ben- 2005. Do endogeic earthworms zimidazol. Rev Ecuat Med Cienc change Plant competition? A micro- Biologicas 30 (1,2), 28-41. cosm study. Plant and Soil 271, 13. Kyriakopoulos G., Doulia D., 2006. 123-130. Adsorption of pesticides on car- 18. Castagnone P., 2002. Genetic vari- bonaceous and polymeric materials ability in parthenogenetic root-knot from aqueous solutions: a review. nematodes, Meloidogyne spp., and Separation and Purification their ability to overcome plant Reviews 35, 97-191. resistance genes. Nematology 4, 14. González L. 1985. Introducción a la 605-608. Fitopatología. 4ta Edición, Editoril 19. Ballinger D., Kollmorgen J., 1986. IICA, San José de Costa Rica, Costa Control of take-all of wheat in the Rica, p. 57-64. field with benzimidazole and tria- 15. Vervelde L., Van Leeuwen M., Krui- zole fungicides applied at seeding. denier M., Kooyman F., Huntley J., Plant Pathology 35, 67-73. VaDie I., Cornelissen A., 2002. Pro- tection studies with recombinant excretory / secretory proteins of

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Un método cuantitativo para medir el área de tubérculo dañado por larvas de Tecia solanivora (Lep.; Gelechiidae) a través de análisis de imágenes digitales

Carlos Carpio 1*, Jean-Louis Zeddam 1,2, Álvaro Barragán1, Gustavo Nuñez3, Marcelo Patiño3 & Olivier Dangles1,2

Escuela de Biología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Apartado 17-01-2184, Quito, Ecuador. [email protected] 2 IRD-LEGS and University Paris-Sud 11, Gif-sur-Yvette, Francia. 3 Carrera de Ingeniería en Ciencias Agropecuarias, Departamento de Ciencias de la Vida, Escuela Politécnica del Ejército, Apartado 171-5-231B, Sangolquí, Ecuador.

Recibido: 2010-03-18, aprobado: 2010-08-30

RESUMEN.- Se desarrolló un nuevo método de evaluación del nivel de daño provocado a los tubérculos por las larvas de polillas de la papa. El método se basa en el análisis de imágenes digitales, mediante la utilización de herramientas tecnoló- gicas como son los paquetes libres: Gimp 2.6.4 y Scion Image. Se hizo una com- paración entre la metodología propuesta y la metodología convencional basada en una evaluación visual de los daños. Se encontró que el nuevo método es particular- mente confiable para medir los niveles de daño intermedios que son difíciles de estimar de manera visual. Finalmente, se determinó que con el uso de la metodolo- gía propuesta se pueden obtener datos más objetivos y precisos debido a que no están sujetos a interpretaciones humanas.

PALABRAS CLAVE: Gimp 2.6.4, índice de daño, polilla de la papa, Scion Image.

ABSTRACT.- This study presents a new method to evaluate the level of tuber damage caused by potato moth larvae. This methodology was based on analyses of digital images through the use of technological tools available on the market such as the free softwares: Gimp 2.6.4 and Scion Image. A comparison was made between the proposed methodology and the conventional one based on a visual assessment of damage. It was found that the new method is particularly reliable for measuring intermediate levels of damage that are difficult to estimate visually.

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Carlos Carpio, Jean-Louis Zeddam, Álvaro Barragán, Gustavo Nuñez, 70 Marcelo Patiño & Olivier Dangles

Finally, we discuss how the use of this methodology could be more objective and accurate to quantify by eliminating human interpretations.

KEY WORDS: Damage index, Gimp 2.6.4, potato moth, Scion Image.

INTRODUCCIÓN a 4 (entre 76% a 100% de daño); el pro- El complejo de las polillas de la blema con este tipo de evaluación es papa, Phthorimaea operculella (Zeller), que puede ser subjetivo y tiene limita- Tecia solanivora (Polvony) y Symme- ciones en cuanto a precisión (8). trischema tangolias (Gyen, 1913) Los avances en el procesamiento de (Lepidoptera: Gelechiidae), es uno de imágenes digitales, en las metodologías los grupos de plagas que causa mayor usadas para los análisis y en cuanto a la daño a este cultivo, tanto en campo tecnología de las computadoras, han como en almacenamiento (1). T. solani- exhibido un crecimiento impresionante vora fue introducida a Ecuador en en las pasadas décadas (9). Todo esto se 1996, a través de una importación de constituye en tecnologías que lideran semilla no certificada proveniente de importantes áreas; por ejemplo, teleco- Colombia, con destino a las zonas municaciones digitales, radiodifusión, paperas del Carchi (2). La larva se ali- imágenes médicas, biología, ciencias menta inicialmente encima de la piel de los materiales, sistemas multimedia del tubérculo, para luego barrenar más y sensores remotos; esto se refleja en la profundamente y formar galerías sinuo- existencia de un gran número de publi- sas (3). caciones en revistas científicas interna- La estimación visual del daño cau- cionales, así como en libros especiali- sado por las plagas ha sido uno de los zados (9). métodos utilizados históricamente por El software de dominio público los investigadores y extensionistas para SCION IMAGE es utilizado para reali- evaluar la eficiencia de los diferentes zar análisis de imágenes digitales y ha controles usados para el manejo de sido aplicado dentro de una amplia estos insectos (4, 5). En este tipo de gama de novedosos métodos de investi- evaluación se realiza una estimación gación en agricultura aplicada, como visual del porcentaje de daño del tubér- para medir el área de las hojas, la defo- culo y se aplica un sistema de puntaje liación y el impacto de insectos fitófa- basado en los valores propuestos por gos sobre las hojas (10, 11); el porcen- Arias et al. (6) o Murcia y Barreto (7), taje de cobertura de plagas invasivas con valores que van de 0 (0% de daño) (12); la senescencia de las hojas (13,

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14), el estado del nutriente foliar (15). al interior de la bodega se registró usan- Sin embargo, SCION IMAGE no había do un termómetro máximo-mínimo sido utilizado para estudios relaciona- (Ertco, Dubuque, IA), fue de 14,5 ºC dos con tubérculos y más específica- (min = 9,5 ºC; máx = 20 ºC). Después mente para análisis de daños provoca- de 50 días se retiró el ensayo de la dos por polillas de la papa. bodega y los tubérculos fueron llevados Los entomólogos agrícolas siempre a los laboratorios de la Pontificia Uni- han tenido el reto de estimar con preci- versidad Católica del Ecuador en Quito sión el daño causado por las plagas en para ser evaluados. los cultivos (10, 16). Aunque la papa (Solanum tuberosum) es uno de los Estimación visual del índice principales cultivos de la región andina, de daño provocado por sorprendentemente, no existía una T. solanivora en tubérculos metodología que permita evaluar de de papa una manera cuantitativa y objetiva el En total se evaluaron 300 tubércu- daño provocado por las plagas en los los. Cada tubérculo fue cortado longitu- tubérculos. Este trabajo tiene como dinalmente en cuatro partes; en cada objetivo específico el validar una meto- parte se estimó visualmente la intensi- dología que se basa en el análisis de dad del daño evaluando el área afectada imágenes digitales para la determina- por las larvas (Figura 1A). La sumato- ción precisa del nivel de daño produci- ria de daño de cada parte representa la do por T. solanivora, intensidad total del daño por papa que varía entre 0 (ningún daño) y 100 (papa MATERIALES Y MÉTODOS totalmente dañada). Luego, este porcentaje fue transformado a un índice Establecimiento del ensayo que va de 0 a 1 (6). Se utilizaron 30 cajas de cartón corrugado de 20 cm de ancho, 20 cm de Adquisición de la imagen digital largo y 25 cm de altura. Cada caja de los tubérculos representó una unidad experimental Se tomaron fotografías de las cua- donde se depositaron diez tubérculos de tro partes en las que fue cortada cada la variedad de papa Leona Blanca, los una de las papas con una cámara digi- cuales fueron infestados con 60 huevos tal Canon Power Shot S40 (Canon, de T. solanivora. El ensayo se ubicó en Tokyo, Japón). Se usó un soporte para una bodega del cantón Salcedo, provin- ubicar la cámara a una altura de 21 cia de Cotopaxi (Ecuador), a una altitud cm y un negatoscopio a manera de de 2.729 msnm. La temperatura media caja de luz para evitar las sombras.

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Como fondo, se utilizaron hojas cua- driculadas A4 (0,5 cm), para tener una medida conocida de referencia. Las fotos fueron exportadas a un computador. Con ayuda del programa de libre acceso GIMP 2.6.4 (Spencer Kimball, Peter Mattis and the GIMP Development Team), se estandarizó el brillo de las fotos, se definió algunos márgenes en los bordes de los tubér- culos y se cambió de formato de jpg a tif para que las fotos puedan ser analizadas con el programa de libre acceso Scion Image 4.0.2. Las fotos fueron editadas para generar dos tipos diferentes de imágenes; una para calcular el área dañada de los tubérculos (Figura 1B-1) y otra en la que se Figura 1 (A).- Foto de tubérculo cortado en cuatro partes usado para el análisis del daño provocado invirtieron los colores para poder cal- por larvas de T. salanivora. (B) Secuencia seguida cular el área total de la papa (Figura durante el manejo del programa SCION IMAGE: (1) 1B-2). foto del tubérculo a color, (2) foto de la papa en escala de grises, (3) visualización del área del tubérculo dañada mediante la aplicación de la función Thres- Procesamiento de las imágenes hold, (4) nivel donde se ubicó la función Threshold con Scion Image para realizar el análisis, (50 área del tubérculo daña- da, calculada (66) cuadro de los resultados corres- Para determinar el índice de daño pondientes al área de daño calculada, (7) área total de provocado por las larvas de T. solanivo- papa calculada, (8) cuadro de los resultados corres- ra se utilizó el software de dominio pondientes al área calculada. público Scion Image 4.0.2 para Win- escala real. Se utilizó la hoja cuadricu- dows (National Institute of Health, lada A4 para establecer cuantos pixeles Bethesda, MD, correspondían a un centímetro. Luego www.scioncorp.com/pages/scion se escogió del menú: Analize > Set image_windows.htm). scale y se ingresó la equivalencia de 1 centímetro en pixeles. Luego, se cerró El programa permite analizar las la imagen a color y se continuó traba- imágenes en color (Figura 1B-1) o en jando con la imagen en gradación de escala de grises (Figura 1B-2). Se utili- grises (Figura 1B-2). zó la versión a color para establecer la

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Posteriormente se escogió del (Figura 1B-6). Esta información fue menú: Analize > Options > Area > OK. copiada y exportada a una plantilla Luego se seleccionó del menú: Options hecha con el programa Excel (Micro- > Threshold y se comenzó a bajar el soft, USA). Este procedimiento se contraste hasta que el umbral llegue a siguió para calcular el área de daño pro- 155, una medida previamente estableci- ducido por las larvas (Figura 1B-5, 1B- da para todas las imágenes (Figura 1B- 6) y un procedimiento similar se aplicó 3, 1B-4). Con este valor se consigue el para calcular el área total de cada tubér- óptimo de contraste entre las zonas culo (Figura 1B-7, 1B-8). Para determi- dañadas y las zonas sanas de la papa (en nar el índice de daño de cada tubérculo, negro en la Figura 1B-3). Seguidamen- se dividió el área dañada para el total te, se escogió del menú: Analyze > fotografiado. El tiempo total para pro- Analyze particles y el programa proce- cesar cada foto fue de aproximadamen- de a señalar las área que se va a calcu- te cuatro minutos. lar (Figura 1B-5). Finalmente, se esco- gió del menú: Analyze > Show results Análisis estadístico donde apareció en un recuadro los Para evaluar los métodos (visual vs. resultados de las áreas calculadas análisis de imágenes digitales) de esti- mación del daño se hizo un análisis de regresión usando Minitab (Versión 1.5). Se asumió que los datos obtenidos a tra- vés de la evaluación de las imágenes digitales corresponderían a los valores observados y los datos obtenidos a tra- vés de la evaluación visual correspon- derían a los valores esperados. Siguien- do las recomendaciones de Piñeiro et al. (17), se ubicaron los valores esperados en el eje de las X y los valores observados en el eje de las Y. Se calcu- ló la pendiente y la intersección. Se calculó el coeficiente parcial de Figura 2.- Relación entre el área evaluada con el desigualdad de Theil (Usesgo, Upendiente, método SCION IMAGE y el área evaluada con el Uerror), el cual separa el error real de la método visual. La línea punteada representa una línea de relación 1:1 que ayuda a visualizar mejor predicción (la suma de cuadrados del relación entre los dos métodos evaluados. La línea error predicho), en diferentes compo- continua representa la linea de la regresión (Y = nentes y complementa la evaluación 0.758 * X - 0.029. P. 0.001)

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del error medio o RMSE (la diferencia entre los datos obtenidos por el método visual y el Scion Image).

RESULTADOS Los valores de la estimación visual y de la estimación por análisis de imá-

Figura 3.- Distribución del error. Los puntos representan las diferencias entre lo evaluado con el análisis visual y el análisis de imágenes digitales.

hecha con la regresión (18, 19). El coeficiente de Theil divide la varianza de los valores observados no explicados por los valores predichos (llamado la suma de cuadrados del error predicho), siendo Usesgo, la proporción asociada con la diferencia de las medias entre los valores observados y los valores predichos, Upendiente, la proporción asociada con la pendiente del modelo ajustado y la línea 1:1 y Uerror, es la proporción asociada con la varianza inexplicada (18). Para observar la tendencia en la dis- tribución del error se graficaron los valores promedio de los pares de los valores esperados y los valores observados en el eje de las abscisas y las diferencias en el eje de las ordenadas con el software Grapher (Versión 4.00). Figura 4.- Análisis de la relación del área eva- Para hacer un análisis del error se hizo luada con SCION IMAGE y el RMSE (raíz cuadrada del error medio). (B) Frecuencia de la distribución una correlación de los datos obtenidos del error RMSE que cuantifica la diefrencia entre por el Scion Image y la raíz cuadrada ambos métodos.

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genes digitales muestran una buena DISCUSIÓN correspondencia (Figura 2, n= 300, r2= Una buena correspondencia de la 0,79, P <0,001). La intercepción y la estimación visual del porcentaje de pendiente fueron significativamente daño con la evaluación de imágenes diferentes de 1 y 0 (p < 0,001). La falta digitales ya ha sido reportada en traba- de ajuste fue principalmente relaciona- jos anteriores en estudios realizados da al sesgo o a la diferencia media entre con enfermedades de plantas (6), en la lo observado y lo esperado (Usesgo= evaluación de daño causado por plagas 0.48; Upendiente= 0.13; Uerror= 0,35). (20, 21) y en la evaluación de lesiones La distribución del error sugiere que gástricas (22). En cuanto a la distribu- hay una subestimación cuando aplicamos ción del error, éste es mayor en los la evaluación visual para determinar el valores intermedios, lo que se explica porcentaje de daño (Figura 3). Este error a través de la ley de Weber-Fechner, es mayor en los valores intermedios. La que propone que el ojo humano estima desviación estándar de la estimación daños altos o bajos con mayor preci- visual del porcentaje de daño fue de 0,22 sión que rangos medios de severidad y de la evaluación a través del análisis de (23). imágenes digitales fue de 0,19. En la práctica, la existencia de una El análisis del error producido al distribución normal es de especial usar el método de la evaluación visual importancia. De hecho, se da mayor (RMSE) confirmó que la diferencia peso a los resultados correspondientes más grande entre los dos métodos de a estos niveles intermedios, que son medida se presentó cuando se evalua- difíciles de medir o donde existe ron niveles de daño intermedio, que mayor probabilidad de cometer errores están entre 0,3–0,7 (Figura 4A) y no en de apreciación. Esta situación puede los casos extremos (0–0,3 ó 0,7–1). ser importante al momento de tomar Con respecto a la distribución del error una decisión para recomendar un con- (Figura 4B), se observó que el grueso trol enfocado en mejorar el manejo de de las diferencias entre los dos métodos la plaga. fue concentrado al inicio del cuadro de Los resultados obtenidos apuntan a barras (0 – 0,2). En el 53% de las mues- que con el procesamiento de imágenes tras evaluadas, se presentó una diferen- digitales se pueden obtener datos más cia en el índice obtenido de 0,1; mien- precisos y se eliminan errores origina- tras que en el 84% de las muestras eva- dos por subjetividad. Esto concuerda luadas existió una diferencia en el índi- con resultados obtenidos por otros ce obtenido de 0,2. Los datos se ajusta- investigadores (10, 20, 24, 25). ron a una curva normal (n = 300; = 0,1164; SD = 0,091).

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CONCLUSIONES AGRADECIMIENTOS El análisis de imágenes digitales Los autores agradecen a la Funda- se ha utilizado con éxito desde hace ción McKnight por el financiamiento algún tiempo atrás en investigaciones de este estudio a través del proyecto relacionadas con agricultura aplicada. Innovative Approaches for Integrated Esta es la primera vez que se propone Pest Managment in the Andes (Grant un método cuantitativo, con un proce- 09-022). Gracias a Omar Torres por los dimiento de evaluación más objetivo y comentarios y sugerencias que ayuda- preciso para evaluar niveles de daño ron a mejorar este manuscrito. provocados por las polillas de la papa y en particular T. solanivora. Se REFERENCIAS podría también usar en el caso de BIBLIOGRÁFICAS otros insectos plaga de la papa o de 1. BARRAGÁN, A.; ZEDDAM, J. L.; otros tubérculos. Esta metodología ONORE, G.; CHEVASCO, V.; deja de lado la percepción humana y CHEVASCO, D.; MORTENSEN, da paso al uso de herramientas tecno- E.; PADILLA, J.; ORBE, K. & lógicas que están a nuestro alcance y LASSO, D. 2005. Problemática de nos permiten tener mayor precisión. las polillas de la papa en el Ecuador. La evaluación de los daños mediante Memorias del I Encuentro Ecuato- el método presentado en este trabajo riano de la Papa. Quito, Ecuador, requiere de un poco más de tiempo y CIP, INIAP-PNRT-Papa, FCA- esfuerzo que la evaluación visual UCE. 8 pp. pero, en contraparte, sin gastos exce- 2. GALLEGOS, P. & SUQUILLO, J. sivos (por el uso de acceso libre), se 1996. Monitoreo de la polilla de la obtienen datos más depurados y con- papa Tecia solanivora (Polvony), en fiables. Además, hay que mencionar el centro y zonas paperas de fronte- que el SCION IMAGE tiene otras ra de la zona del Carchi. En informe opciones, como la de poder medir Anual 1996 – 1997. INIAP. Quito, cada una de las partículas dañadas. Ecuador. Esto permitiría cuantificar, por sepa- 3. TORRES, F. 1998. Biología y rado, el daño producido por varias manejo integrado de la polilla cen- plagas en un mismo tubérculo. Esta troamericana de la papa Tecia sola- posibilidad parece muy interesante, en nivora en Venezuela. Fondo Nacio- particular en la zona andina, conside- nal de Investigaciones Agropecua- rando que diferentes especies de poli- rias. Fundación para el desarrollo de llas de la papa se encuentran en sim- la Ciencia y Tecnología del estado patría. de Táchira. Serie A-No 14. 57 p.

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4. MENA, A. 2004. Comportamiento Colombiana de Investigación Agro- y control de polillas de la papa pecuaria. 23 pp. (Tecia solanivora, Symmetrischema 8. WIJEKOON, C.P.; GOODWIN, tangolias y Phthorimaea opercule- P.H. & HSIANG, T. 2008. Quanti- lla) en el Valle de Salcedo, Cotopa- fying fungal infection of plant xi. Facultad de Agronomía, Univer- leaves by digital image analysis sidad Técnica de Cotopaxi, Ecua- using Scion Image software. Jour- dor. 125 pp. nal of Microbiological Methods, 74: 5. GALLEGOS, P. 2003. Problemática 94-101. de la polilla guatemalteca de la papa 9. PITAS, I. 2000. Digital Image Pro- Tecia solanivora (Lepidoptera: cessing Algorithms and Applica- Gelechiidae) en el Ecuador: antece- tions. John Wiley & Sons, Inc. dentes, desarrollos y perspectivas. 10. O’NEAL, M.; LANDIS; D. & En: López, A. (eds.). 2005. III Taller ISAACS, R. 2002. An inexpensive, Internacional sobre la polilla guate- accurate, method for measuring leaf malteca de la papa Tecia solanivora. area and defoliation through digital Cartagena de Indias, Colombia. image analysis. Journal of Econom- Centro Internacional de la Papa ic Entomology, 95 (6): 1190-1194. (CIP). 25-36. 11. JOHNSON, S. 2001. Indirect 6. ARIAS, J.; JARAMILLO, J.; ARÉ- impacts on a phytophagous insect of VALO, E.; ROCHA, N. & birch: The role of fungal phy- MUÑOZ, L. 1996. Evaluación de la topathogens and leaf-mining incidencia y severidad del daño de insects. Tesis de Doctorado submiti- la polilla gigante de la papa Tecia da a Departamento de Biología de la solanivora en el Departamento de Universidad de York. 223 pp. Antioquia. Boletín de divulgación. 12. AUKER, L. & OVIATT, C. 2007. Medellín, Colombia, ICA – COR- Observations on the colonization of POICA. 24 pp. the invasive tunicate Didemnum sp. 7. MURCIA, G. & BARRETO, N. Rhode Island Naturalist, 14 (1): 1 – 4. 1997. Evaluación de parámetros 13. LEE, D.; O’KEEFE, J.; HOL- para el almacenamiento de semilla BROOK, N. & FIELD, T. 2003. de papa (Solanum tuberosum) y Pigment dynamics and autumn leaf mecanismos de control de polilla senescence in a New England guatemalteca (Tecia solanivora) deciduous forest, Eastern USA. durante el mismo. Ministerio de Ecological Research, 18: 677-694. Agricultura y Desarrollo Rural de 14. FEILD, T.; LEE, D. & HOL- Colombia, Centro Internacional de BROOK, N. 2001. Why leaves turn Agricultura Tropical y Corporación red in autumn. The role of antho-

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXXI Números 1 y 2: 69-78, octubre 2010 FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 78

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cyanins in senescing leaves of Red- Adobe Photoshop and Scion osier dogwood. Plant Physiology, Image Software. Journal of the 127: 566-574. Kansas Entomological Society, 79 15. BUSCAGLIA, H. & VARCO, J. (1): 83-87. 2002. Early detection of cotton leaf 21. GILBERT, M. & GRÉGOIRE, J. C. nitrogen status using reflectance. 2003. Visual, semi-quantitative Journal of Plant Nutrition, 25: assessments allow accurate esti- 2067-2080. mates of leafminer population den- 16. BAKR, E. M. 2005. A new software sities: an example comparing image for measuring leaf area, and area processing and visual evaluation of damaged by Tetranychus urticae damage by the horse chestnut Koch. Journal of Applied Entomol- leafminer Cameraria ohridella ogy, 129(3): 173–175. (Lep., Gracillaridae). Journal of 17. PIÑEIRO, G.; PERELMAN, S.; Applied Entomology, 127: 354 – GUERSCHMAN, J. P. & PARUE- 359. LO, J. M. 2008. How to evaluate 22.KHAN, H. A. 2004. Computer- models: Observed vs. predicted or assisted visualization and quantita- predicted vs. observed? Ecological tion of experimental gastric Modelling, 216: 316–322. lesions in rats. Journal of Pharma- 18. PARUELO, J. M., JOBBAGY, cological and Toxicological Meth- E.G., SALA, O.E., LAUENROTH, ods, 49: 89-95. W.K. & BURKE, I.C., 1998. Func- 23. HORSFALL, J. G. & BARRAT, R. tional and structural convergence of W. 1945. An improved grading sys- temperate grassland and shrubland tem for measuring plant diseases. ecosystems. Ecological Modelling, Phytopathology, 35: 655. 8: 194–206. 24. SU, N. Y. & MESSENGER, M. T. 19. SMITH, E.P. & ROSE, K.A., 1995. 2000. Measuring wood consumption Model goodness-of-fit analysis by subterranean termites (Isoptera: using regression and related tech- Rhinotermitidae) with digitized niques. Ecological Modelling, 77: images. Journal of Economic Ento- 49–64. mology 93 (2): 412-414. 20.CHEN, Y. & WILLIAMS, K. A. 25. ALCHANATIS, V.; NAVON, A.; 2006. Quantifying Western Flower GLAZER, I. & LEVSKI, S. 2000. Thrips (Frankliniella occidentalis An image analysis system for meas- Pergande) (Thysanoptera: Thripi- uring insect feeding effects caused dae) Damage on Ivy Geranium by biopesticides. Journal of Agri- (Pelargonium peltatum (L.) L’Her cultural Engineering Research, 77 ex Ait.) (Geraniaceae Juss.) with (3): 289-296.

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXXI Números 1 y 2: 69-78, octubre 2010 FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 79

Estudio preliminar sobre la comunidad de primates en el bosque protector del Oglán Alto. Arajuno-Pastaza

Gabriel Alberto Carrillo Bilbao1,2,3,4 & Sarah Martin-Solano1,5

1 Estación Científica Amazónica de la Universidad Central del Ecuador, Quito, Ecuador. [email protected] 2 Escuela de Biología y Química, Universidad Central del Ecuador, Quito, Ecuador. 3 Universidad Internacional Menéndez Pelayo, Madrid, España. 4 Ecociencia, Quito, Ecuador. 5 Unidad de Biología del comportamiento, Universidad de Lieja, Lieja, Bélgica. [email protected]

Recibido: 2010-05-27, aprobado: 2010-08-31

RESUMEN.- Los primates juegan un papel ecológico crucial en los ecosistemas donde se encuentran, por lo tanto los esfuerzos que se realicen para su conserva- ción apoyarán de manera directa la preservación de otros elementos del mismo ecosistema. La Reserva Amazónica del Oglán Alto es, en su mayoría, un bosque primario piemontano y de tierras bajas, entre 420 y 1.100 m.s.n.m., de donde se registran ocho especies de primates, de las cuales cinco se encuentran en el Libro Rojo (1) y además cuatro están bajo presión de caza. Por tal razón, es imprescindible conocer el estado real de la comunidad de primates presentes en esta reserva. Gra- cias a la elaboración de un sistema de senderos y a la creación de tres transectos, se registró seis especies de primates de las ocho mencionadas en el plan de manejo. Los índices de diversidad sugerirían una diversidad considerable. En el Ecua- dor, además, existen muy pocos estudios de primates en bosques de estribaciones amazónicas, por lo que estos resultados aportarán datos a las comparaciones y correlaciones tanto ecológicas como etológicas con estudios de primates de ama- zonía baja y de occidente.

PALABRAS CLAVE: Amazonía, diversidad, ecología, Oglan Alto, primates.

ABSTRACT.- Primates play a crucial ecological role within the ecosystems they inhabit; therefore any effort done in favor of their conservation, will also support

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80 Gabriel Alberto Carrillo Bilbao & Sarah Martin-Solano

the preservation of the other elements of their ecosystem. The Amazonian Reserve of Oglán Alto is in its majority, a lowland forest and a piemontano primary forest, between 420 and 1100 m.s.n.m. Eight species of primates are registered, five of them are in the Red Book of Ecuador (1) and other four are under hunting pressure which makes it critical to know the real status of the primate community in this reserve. Thanks to the creation of a trail system and three transects, we have registered six of the eight registered species according with the environmental management plan from the Reserve. The diversity index suggests a considerable diversity. Considering that up to date, there is little data recorded in this region, these results will contribute to comparative research, ecological as well as ethological studies, on primates from the low Amazonia and the West.

KEY WORDS: Amazon, diversity, ecology, Oglan Alto, primates.

INTRODUCCIÓN rangos de distribución de primates (4, La Amazonía, considerada el bos- 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11). El distrito de Ecua- que tropical más extenso del planeta, dor se encuentra dividido en dos zonas, abarca alrededor de 6,6 millones de Imeri y Napo que al igual que la de kilómetros cuadrados, lo que representa Guiana, mantienen más del 40 % del el 53 % de las selvas tropicales (2). Los total de su extensión en áreas protegi- bosques amazónicos se extienden en das (12). nueve países: Ecuador, Brasil, Surinam, Las actividades antropogénicas son Guyana, Guayana Francesa, Venezuela, importantes en la pérdida de hábitats Perú, Bolivia, y Colombia, presentando en la Amazonía ecuatoriana, especial- altos niveles de diversidad y endemis- mente por la conversión de bosques en mo (2) y la más alta diversidad de pri- tierras dedicadas a la agricultura, mates en el mundo, siendo así que por ganadería o industria (13, 14). En el lo menos seis nuevas especies de pri- caso de los primates, la destrucción de mates se han descubierto en los diez sus hábitats, la caza y la captura de últimos años (3) . ejemplares vivos para su exportación y A partir del análisis de los rangos de uso local son las mayores amenazas distribución de primates, se ha dividido para su conservación (15, 16). Como la Amazonía en cuatro áreas o distritos producto de la explosión demográfica, de endemismo (Guayana, Ecuador, que coincidencialmente es mayor en Perú y Brazil). Esto, a su vez, ha sido países tropicales, se sabe que entre validado por estudios en otros grupos 1985 y 1995 América Latina y el Cari- de vertebrados y por el análisis de los be han perdido el 9,7 % de bosques.

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En concreto, los países en los que se ta que el Ecuador registra el 40 % del registran poblaciones de primates, per- total de especies de primates del Nuevo dieron 125 140 km2 de bosques anual- Mundo (Platyrrhini) y el 10,7 % del mente, lo cual no sólo afecta a los pro- total de especies a nivel mundial. pios primates, sino a todos los compo- Existen numerosas razones por las nentes del ecosistema (16, 14). Por cuales se deben realizar esfuerzos en la otro lado, el avance del desarrollo conservación de los primates. Los pri- social, petrolero y minero, la creación mates juegan un papel ecológico crude proyectos de construcción de carre- cial en los ecosistemas donde estos se teras, colonización, proyectos hidroe- encuentran, y su pérdida causaría dra- léctricos y tala de bosques, entre otros, máticos efectos; por ejemplo, todas las han causado que el Ecuador pierda especies de primates forman parte de anualmente alrededor del 1,8 % de su las cadenas alimenticias actuando como cobertura boscosa original (14). Por presas o predadores y son también dis- tanto, priorizar en el desarrollo e persores de semillas. Para tener una implementación de planes efectivos de idea de la importancia que tienen los conservación es fundamental para primates como dispersores en los bos- detener la fragmentación de estos bosques tropicales, más del 90 % de las ques (12). plantas leñosas dependen de especies El Ecuador, hasta la fecha, registra frugívoras para dispersar sus semillas, y 20 especies de primates distribuidas en los primates comprenden la mayor por- cuatro familias: Cebidae, Atelidae, ción del total de la biomasa de los fru- Pitheciidae y Aotidae (17, 1, 18). Un gívoros neotropicales (22, 23, 17, 16, total de 15 especies se encuentran en 24, 25). Dada la diversidad de primates los bosques tropicales de la Amazonía en el Ecuador, su importancia en la ecuatoriana. dinámica de los bosques tropicales Existe poca información acerca de amazónicos es alta y su ausencia causa- los aspectos ecológicos y etológicos de ría un efecto cascada en la dinámica de muchas de las especies de primates pre- los ecosistemas (26). Recordemos que sentes en el país (19, 20). Prueba de usualmente tienen bajas tasas de creci- esto es que la mayoría de los recursos miento, una reproducción con largos bibliográficos existentes sobre los pri- intervalos entre nacimientos y un tiem- mates ecuatorianos está basada en fuen- po largo de desarrollo (27), lo cual indi- tes extranjeras (14); por tal razón, es ca que sus bajas densidades poblacio- necesario obtener datos relevantes nales en bosques intervenidos o en peli- sobre el estado actual de las poblacio- gro los hacen indicadores muy sensi- nes de primates (21), tomando en cuen- bles del estrés antropogénico (21).

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Finalmente, las similitudes genéti- más, la gran variedad de especies vege- cas y ecológicas entre los primates no tales no arbóreas son las que conforman humanos y los humanos pueden permi- la mayor porción de la biomasa vegetal, tir dar paso a la necesidad instintiva y lo cual es un verdadero potencial ali- ética de conservar y preservar los hábi- menticio para las distintas especies que tats de nuestros parientes cercanos (25). se desarrollan en este tipo de ecosiste- Por lo tanto, los esfuerzos satisfactorios mas (32). que se realicen para su conservación El plan de manejo ambiental de la apoyarán de manera directa a la preser- Reserva, realizado previamente a este vación de otros elementos del mismo proyecto (29), fue la base para la deci- ecosistema (24). sión de estudiar las poblaciones de primates, ya que se registraron ocho espe- Antecedentes cies: Callithrix pygmaea, Saguinus fus- La Reserva Amazónica del Oglán cicollis, Cebus albifrons, Saimiri sciu- Alto es un área de 3 344 ha ubicada en reus, Lagothrix poeppigii, Ateles belze- las coordenadas 0º5’19,9”N - - buth, Alouatta seniculus y Pithecia 80º30’46,0”O, entre los 420 y 1.000 monachus, de las cuales cinco (Lagoth- m.s.n.m. en el Cantón Arajuno, Provin- rix poeppigii, Ateles belzebuth, Alouat- cia de Pastaza. En su mayoría es bosque ta seniculus, Cebus albifrons y Sagui- primario piemontano y de tierras bajas nus fuscicollis) se encuentran incluidas según la clasificación vegetal de Sierra en el libro rojo de mamíferos ecuatoria- (28). Estos bosques reciben una pluvio- nos (1) y cuatro (Alouatta seniculus, sidad de 2.000–4.000 mm anuales y no Ateles belzebuth, Lagothrix poeppigii y se registran más de cuatro meses conse- Cebus albifrons) se consideran como cutivos con una pluviosidad menor a especies sometidas a presiones de caza los 100 mm. Este bosque se caracteriza según Redford y Robinson (33). Por tal por grandes árboles, llegando en algu- razón fue imprescindible conocer el nos casos a cincuenta o sesenta metros estado real de la comunidad de primates (1, 20, 29, 30). presentes en esta reserva. En abril de El tipo de ecosistema presente en la 2006 se inició el Proyecto Primates reserva se extiende a lo largo de la línea Oglán con una salida de prospección. ecuatorial, en las áreas con tierras bajas. En julio de 2006 se realizó la socializa- La gran diversidad de especies vegeta- ción del Proyecto frente a representan- les es otra característica de estos bos- tes de ACIA (Asociación de Comunida- ques; de 400 individuos muestreados se des Indígenas Arajuno), logrando la han registrado 200 especies de árboles aceptación por parte de las comunida- en 128 géneros y 49 familias (31). Ade- des para la ejecución del proyecto.

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MÉTODOS Cabe recalcar que este estudio se Este estudio se llevó a cabo desde apoya en la metodología de “Roadside enero del 2007 a noviembre del 2008, counts” (34) para monitorear siguiendo para lo cual se destinaron diez días de un sistema de senderos, el cual utiliza cada mes para la apertura y mapeo de zonas heterogéneas donde los senderos senderos y transectos y diez días para la mantienen distancias óptimas de sepa- búsqueda, habituación y recolección de ración para evitar el reconteo de indivi- datos. duos. Para minimizar el sesgo en las Se establecieron tres transectos: uno observaciones se tomó muy en cuenta de tres kilómetros, otro de 1,5 km y otro el protocolo del método de “Traversing de 300 m. Además de los transectos, se the area and detecting animals” (35) y construyó una red de senderos de alre- “Line Transect Sampling from a Cur- dedor de 17 km, los cuales abarcan el ving Path” (36) que básicamente es área de una manera espaciada y hetero- similar al de “Roadside counts”, pero génea evitando así el re-conteo de indi- pone énfasis en variables como condi- viduos (Figura 1). ciones del hábitat respecto a variacio-

Figura 1. Avistamientos, transectos y senderos del Proyecto Primates Oglán

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nes estacionales y condiciones climáti- Animal Movement 2.04 beta. Se gene- cas. Por la dificultad propia asociada a ró un “minumun convex poligon” que las características geográficas de la es el polígono que incluye a todas las zona las metodologías tradicionales observaciones de menor área y se cal- requieren más tiempo y esfuerzo para culó la superficie del polígono (20, su construcción. 39, 40). Los primeros diez días de cada El mapeo de los senderos y de los mes, dos grupos de observación (un transectos se realizó con brújula y fle- investigador y un asistente) recorrie- xómetro; los senderos fueron marcados ron los senderos y los transectos en un cada 25 m. Los datos de dirección y sentido entre las 6:00 h y 11:00 h y en distancia fueron transformados a coor- el sentido contrario entre 13:00 h y denadas UTMs usando un punto geo- 18:00 h, abarcando los picos de activi- referenciado con un GPS y trigonome- dad de los primates; la velocidad pro- tría básica en hojas de cálculo de medio fue de 1,2 km/h (36, 35) con Microsoft Excel; finalmente los mapas paradas cortas cada 100 m. Se deter- fueron elaborados en los programas minó la presencia de primates median- Arcview 3.2 y Arcgis 9.0. Se han te rastros (fecas), audición y visuali- incluido en el mapa también caminos zación por medio de binoculares 8 x vecinales y árboles marcados así como 40 (37, 38). los puntos de avistaje de primates Se tomaron datos de ubicación de (Figura 1). todos los registros y el número total de Los índices de diversidad fueron individuos observados; se siguió la calculados de acuerdo con Jost (41, 42, misma metodología de mapeo de sen- 43). Para la estimación del número de deros y transectos para marcar y grafi- especies esperadas se utilizaron los car estos puntos en un mapa. Se usaron índices Chao1 y Chao1-bc. planillas de avistaje para el registro de Los paquetes estadísticos utilizados datos del estudio de monitoreo que para todos los análisis estadísticos fue- incluyeron: ubicación, fecha, hora de ron ESTIMATES, que se usó para esti- inicio y hora de finalización de la mar el número de especies totales, observación, especie, número de indivi- SPSS para los cálculos de la curva acu- duos, composición grupal y datos des- mulativa, SPADE en el que se genera- criptivos como observaciones y eventos ron los análisis de Chao1 y Chao1-bc; y inusuales. DiversityCalculatorLJost500sp para El área de vida de los grupos estu- calcular los índices de diversidad. diados fue realizada mediante el programa Arcview 3.2 con la extensión

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RESULTADOS gistró un individuo macho adulto soli- Seis especies de primates se han tario. El grupo A de S. fuscicollis está registrado en el área de estudio: tres constituido ≥ 5 individuos siendo todos correspondientes a la familia Atelidae y sus integrantes de similar tamaño y se una especie de cada una de las familias han categorizado como adultos o sub- Pitheciidae, Aotidae y Cebidae. De las adultos. El área de vida preliminar para seis especies se obtuvieron 42 registros: el grupo A de A. seniculus fue de 26,6 Alouatta seniculus (20 registros), ha y para el grupo A de S. fuscicollis fue Saguinus fuscicollis (15 registros), Ate- de 46,8 hectáreas (Figura 2). les belzebuth (un registro), Aotus voci- Un total de 807 minutos de observa- ferans (un registro), Lagothrix poeppi- ción de primates se contabilizó hasta la gii (dos registros) y Pithecia sp.(tres fecha: 588 para Alouatta, 109 para registros) mediante el método de obser- Saguinus, 62 para Lagothrix, 8 para vación directa, auditiva (Figura 1). Aotus, 10 para Pithecia y 30 para Ateles. Se registraron seis grupos de A. (Tabla 2). seniculus (21 individuos), cuatro gru- La curva de acumulación de espe- pos de S. fuscicollis (16 individuos), un cies (Figura 3) muestra que la pendien- grupo de L. poeppigii (≥ 35 individuos), te aún se encuentra en ascenso, no se dos grupos de Pithecia sp. (≥ 2 indivi- evidencia una tendencia a estabilizarse. duos), un grupo de Ateles belzebuth (≥ El índice de Diversidad Exponen- 8 individuos) y un grupo de Aotus voci- cial de Shannon (effective number of ferans (≥ 1 individuo; Tabla 1). species) es de 4,046. El índice Inverso El grupo A de A. seniculus está de Simpson (Diversity of order ) es de constituido por un macho adulto, una 3,460. El valor del índice de Chao1 hembra adulta, un juvenil y un infante (especies esperadas) es de 10,5 y del independiente; adicionalmente, se re- índice del Chao1-bc es de 7,5.

Tabla 1. Avistajes de Especies según el Número de grupos (n.o de Grupos), solitario (ind/solitarios), media de individuos por grupo (Ind/solitarios) y total de individuos (Total ind), en la reserva del Oglan Alto.

n.o de n.o Especie Grupos Ind/solitarios ind/grupo Total ind

Alouatta seniculus 6 1 3.5 21 Saguinus fuscicollis 40 416 Pithecia sp. 2 . ≥1 ≥2 Ateles belzebuth 1 0 ≥8 ≥8 Aotus vociferans 1 . ≥1 ≥1 Lagothrix poeppigii 1 0 ≥35 ≥35

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Figura 2. Área de vida de Alouatta seniculus A1 y de Saguinus fuscicollis A1

grupos de primates, datos que serán DISCUSIÓN Y aceptados o rechazados a medida que CONCLUSIONES se continúe con la toma de datos Mediante la metodología planteada demográficos. La curva acumulativa se han observado seis especies de pri- de especies no se saturó con los datos mates, lo que difiere con respecto a los recogidos (Figura 3), lo que sugiere datos incluidos en el plan de manejo que el monitoreo tiene que continuar. de la reserva, en el que se incluyeron Estos análisis permitirán en el futuro ocho especies, a partir de las encuestas realizar y justificar comparaciones con realizadas. Hay que destacar que las análisis de datos de un monitoreo a estimaciones de la riqueza de especies largo plazo o con estudios en otras alcanzan diez (Chao1) y 7,5 (Chao1- zonas. bc) especies en la zona de estudio. Los valores obtenidos con los dife- Adicionalmente, basados en informa- rentes índices podrían sugerir que ción bibliográfica sobre el área de vida existe una diversidad considerable, lo de las distintas especies (44, 45, 46, que podría ser producto de las caracte- 47, 40), se podría sugerir que hasta la rísticas de la reserva. El número de fecha se han registrado un total de 15 especies registradas mediante métodos

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Tabla 2. Comportamiento por minutos registrados

Especie Comportamiento Minutos Registrados

Alouatta seniculus Vter 140 Vxx,Val,Esc 448 Saguinus fuscicollis Vxx,Val,Esc 108 Vcon 1 Lagothrix poeppigii Vxx,Esc,Mxx 62 Ateles belzebuth Mxx 30 Pithecia sp. Esc,Val 5 NR 5 Aotus vociferans Vter 8

Vter=vocalización territorial, Vxx=Vocalización desconocida, Val=vocalización alarma, Esc=escape, Mxx=Movimiento desconocido, Nr=no registra

directos e indirectos para este estudio reflejaría la importancia de realizar es de seis especies de primates, siendo monitoreos constantes y a largo plazo, mayor al número de especies registra- minimizando el uso de registros das en los estudios llevados a cabo en bibliográficos ya que esto no permite el Parque Nacional Napo-Galeras y en evidenciar de manera concreta la pre- el Parque Nacional Sangay con tres y sencia o ausencia de primates de un ninguna especie respectivamente (48, sector. 49). Al contar con escasos sitios de En el futuro se monitorearán zonas comparación en amazonía de estriba- más bajas para abarcar la totalidad del ciones, podemos comparar con otros rango altitudinal de la reserva y hacer sitios de amazonía baja. Por ejemplo, comparaciones a lo largo de este gra- en un estudio realizado por Heymann diente. Se predice que el número de y Encarnación (50), encontraron en un especie aumentará a medida que se monitoreo realizado en el río Curaray incluyan más zonas de tierras bajas. y Napo de tres a cinco especies; sin Esta reserva representa un refugio embargo, hay que tomar en cuenta que para la fauna ya que, en las zonas ale- estos monitoreos se realizaron a corto dañas, los primates y demás mesoma- plazo (menos de un mes). En el Parque míferos sufren una alta presión de caza Nacional Yasuní, los estudios a largo (Bovy et al, en rev). De las seis espe- plazo han logrado identificar diez cies encontradas, según la IUCN (53), especies de primates (51, 52), lo cual dos se encuentran amenazadas: L.

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poeppigii (EN) y A. belzebuth (VU). de vida de A. seniculus (26,6 ha) es Además, tres se encuentran también en inferior a los estudios realizados en el libro rojo de mamíferos del Ecuador Caparú, Colombia (182 ha) y en Guya- (1). Esto es una razón más para conti- na (45 ha) pero levemente superior al nuar con el monitoreo de la comunidad estudio de La Macarena, Colombia (25 de primates de la Reserva del Oglán ha) (56, 57, 58). Es importante desta- Alto. car que las áreas de vida presentadas Basados en la cantidad de informa- son propias para los grupos en estudio ción recopilada, los grupos de prima- dentro de la reserva del Oglán Alto. tes que mayor número de avistajes pre- Durante el desarrollo de este estu- sentaron fueron seleccionados como dio se registraron datos comportamen- los grupos de estudio. Según Emmons tales, ocasionales, ya que en un 77,8 % (46), el área de vida de la especie S. son comportamientos de vocalizacio- fuscicollis, puede ser de 16 a 100 ha. nes de alarma y eventos de escape, los El área de vida del grupo de este estu- cuales son característicos de grupos de dio (46,8 ha) es mayor a los estudios primates no habituados, lo cual impide realizados en Bolivia (15,25 ha) y en determinar las estrategias comporta- Perú (15,7 a 16,5 ha) (54, 55). Hay que mentales de las especies en estudio tomar en cuenta que estos estudios son (59). realizados en Amazonía baja. El área En el Ecuador existen muy pocos estudios de primates en bosque de estribaciones amazó- nicas, por lo que estos resultados permiti- rán comparaciones y co-rre- laciones tan-to ecológicas como etológi- cas con estudios de primates de la Ama- zonía baja y Figura 3. Curva Acumulación de Especies por jornadas de 3 meses de marzo también del oc- 2007 a octubre 2008

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cidente del país. AGRADECIMIENTOS Agradecemos a nuestras instituciones donantes FNRS, ECOCIENCIA, RECOMENDACIONES ORGÁNICA, AECID, UCE, así como – Dadas las condiciones geográfi- a nuestros mentores y tutores Dr. cas de los bosques de estribación, Anthony Di-Fiore, Dr. Eduardo Fernán- la preparación de un transecto dez-Duque, Marie Claude Huynen; a lineal de más de un kilómetro y nuestra institución Universidad Central medio requiere un incremento no del Ecuador, a los investigadores y pro- lineal del esfuerzo hombre–tiem- fesores quienes nos han asesorado, Lou po, y por lo tanto del dinero nece- Jost, David Neill, Stella de la Torre, sario. Por este motivo, se propone Esteban Suárez y un agradecimiento como forma de apoyo a esta especial a la comunidad Pablo López metodología clásica el recorrido del Oglán Alto, a todos los pasantes, de senderos de una manera siste- voluntariados y tesistas del Proyecto mática, previendo variables como Primates Ecuador. picos de actividad y condiciones climáticas, además de un análisis de datos apropiado, lo que se cree LITERATURA CITADA es una alternativa para la determi- 1. TIRIRA D. ed, 2001. Libro Rojo de nación acertada de la densidad los Mamíferos del Ecuador. Quito- poblacional de primates. Ecuador. – Es imprescindible mencionar que 2. CONSERVATION INTERNATIO- al monitorear a largo plazo estarí- NAL, 2008. Estrategias de Conser- amos tomando constantemente vación: Áreas Silvestres. PERU: CI datos demográficos sobre los gru- PERU ed. pos encontrados con el objetivo 3. MITTERMEIER RA, RYLANDS de no subestimar o sobrestimar la AB, 2008. The World's 25 most abundancia de primates del sector endangered primates - 2008-2010. (Jost, comm. pers.), lo que apor- In: IPS 2008. Edinburg. 4. SNETHLAGE E, 1910. Sobre a dis- taría confiabilidad a los análisis. tribuicao da avifauna campestre na – No se debe realizar ningún análi- Amazônia. Boletim do Museu sis etológico mientras la habitua- Emılio Goeldi 6:226–235. ción de los grupos no esté conse- 5. SICK H, 1967. Rios e enchentes na guida. Amazônia como obstáculo para a avifauna. Atas do Simpósio sobre a Biota Amazônica 5 (Zoologia): pp.

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXXI Números 1 y 2: 79-93, octubre 2010 FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 90

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495–520. Gascon C, Lovejoy T, Mesquita R, 6. HAFFER J, 1969. Speciation in eds). New Haven, Connecticut: Yale Amazonian forest birds. Science University Press; 22–30. 165:131-137. 7. RYLANDS AB, 1987. Primate 14. CARRILLO-BILBAO GA, 2005. communities in Amazonian forests: Primates ecuatorianos en Peligro, Their habitats and food resources. un Universo por Descubrir. El Gav- Experientia 43:265-279. ilán Digital 5. 8. CAPARELLA AP, 1988. Genetic 15. MITTERMEIER RA, CHENEY variations in neotropical birds: DL, 1987. Chapter 39: Conserva- implications for the speciation tion of primates and their habitats. process. Acta Congressus Interna- In: Primate Societies (Smuts BB, tionalis Ornithologici 19:1658-1673. Cheney DL, Seyfarth RM, Wrang- 9. CAPARELLA AP, 1991. Neotropi- ham RW, Struhsaker TT, eds). cal avian diversity and riverine bar- Chicago: University of Chicago riers. Acta Congressus Internation- Press; pp. 477-490. alis Ornithologici 20:307–316. 16. CHAPMAN CA, PERES CA, 2001. 10. AYRES JM, CLUTTON-BROCK Primate Conservation in the New T, 1992. River boundaries and Millennium: The Role of Scientists. species range size in Amazonian Evolutionary Anthropology 10:16- primates. The American Naturalist 33. 14:531–537. 17. DE LA TORRE S, 2000. Primates 11. HAFFER J, 1992. On the “river de la Amazonía del Ecuador/ Prima- effect” in some forest birds of tes of Amazonian Ecuador. In: Sim- southern Amazonia. Boletim do bioe. Quito-Ecuador. Museu Paraense Emılio Goeldi 18. VAN ROOSMALEN M, VAN Serie Zoologia 8:217–245. ROOSMALEN, T. Y MITTER- 12. CARDOSO DA SILVA JM, MEIER, R.A., 2002. A taxonomic RYLANDS AB, DA FONSECA review of the titi monkeys, genus GAB, 2005. The Fate of the Ama- Callicebus Thomas, 1903, with the zonian Areas of Endemism. Conser- description of two new species, Cal- vation Biology 19:689-694. licebus bernhardi and Callicebus 13. GASCON C, BIERREGAARDM R, stephennashi, from Brazilia, Ama- LAURANCE W, RANKIN-DE- zonia. Neotrop Primates MERONA J, 2001. Deforestation and 10(Suppl.):1–52. forest fragmentation in the Amazon. 19. ALBUJA V. L, 2002. Mamíferos In: Lessons from Amazonia: the ecol- del Ecuador. In: Diversidad y Con- ogy and Conservation Biology (Jr. B, servación de los Mamíferos Neo-

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXXI Números 1 y 2: 79-93, octubre 2010 FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 91

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tropicales (Ceballos G, Simonetti mates: Primate/plant codependency. JA, eds). México: CONABIO; American Journal of Primatology 271-327. 45:127–141.

20. CARRILLO-BILBAO GA, 2005. 27. COWLISHAW G, DUNBAR RIM, Uso del Tiempo, área de vida y 2000. Chapter 4 - Community Ecol- especies vegetales que forman parte ogy. In: Primates Conservation. de la dieta de Callicebus discolor Chicago, EUA: The University of (Primates: Cebidae) en el Parque the Chicago Press; pp. 57-92. Nacional Yasuní. Tesis de Licencia- 28. SIERRA R, 1999. Propuesta Preli- tura. Quito: Universidad Central del minar de un Sistema de Clasifica- Ecuador. ción de Vegetación para el Ecuador 21. CARRILLO-BILBAO GA, MAR- Continental. (INEFAN/GEF-BIRF TIN-SOLANO S, BRAVO J, HUY- P, ed). Quito- Ecuador: Ecociencia. NEN M-C. eds, 2008. Ecuador and 29. UNIVERSIDAD CENTRAL DEL Belgium working for the conserva- ECUADOR, 2006. Plan de Manejo tion of primates. BELGIUM: Lieja del Bosque del Oglán Alto. Araju- University. no-Pastaza. (Amazónica EC, ed). 22. CHENEY DL, SEYFARTH RM, Quito-Ecuador: ECA. SMUTS BB, WRANGHAM RW, 30. CITES, 2000. Convención sobre el 1987. The Study of Primates Soci- Comercio Internacional de Especies eties Research. In: Primate Soci- Amenazadas de Fauna y Flora Sil- eties (Smuts BB, Cheney DL, Sey- vestre. farth RM, Wrangham RW, Struh- 31. CERÓN CE, REYES C. MCA, saker TT, eds). Chicago: The Uni- VARGAS-GREFA M, 2006. La versity of Chicago Press; 1-8. cuenca alta del río Oglán, Pastaza- 23. TIRIRA D, 1999. Mamíferos del Ecuador, diversidad, ecología y Ecuador. Quito - Ecuador: flora. Quito: Editorial Universitaria. ImpreFEPP. 32. OATES JF, 1987. Food distribution 24. DI FIORE A, 2004. Primate Con- and foraging behavior. In: Primate servation. New-York, EEUU.: Mac- societies (Smuts BB, Cheney DL, Graw-Hill. Seyfarth RM, Wrangham RW, 25. LOVETT JC, MARSHALL AR, Struhsaker TT, eds). Chicago: Uni- 2006. Why should we conserve pri- versity of Chicago Press; pp mates. African Journal of Ecology 197–209. 44:113-115. 33. REDFORD KH, ROBINSON JG, 26. CHAPMAN CA, ONDERDONK 1987. The game of choice: patterns DA, 1998. Forests without pri- of indian and colonist hunting in the

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neotropics. American Anthropolo- to de Tiempo en Cotoncillos (Callice- gist 89:650-667. bus discolor) del Parque Nacional 34. BROWER J, ZAR, J., ENDE C. ed, Yasuní en la Amazonia Ecuatoriana. 1998. Field and Laboratory Meth- Neotropical Primates 13:7-11. ods for General Ecology, 4th ed. 40. FERNANDEZ-DUQUE E, DI USA: McGraw-Hill. FIORE A, CARRILLO-BILBAO 35. ROSS C, REEVE N, 2003. Survey G, 2008. Behavior, Ecology, and and census methods: population dis- Demography of Aotus vociferans in tribution and density in: Setchell, J & Yasuní National Park, Ecuador. Int J Curtis, D. (ed.). In: Field and Labora- Primatol 29:421–431. tory Methods in Primatology, a prac- 41. JOST L, 2006. Entropy and diversi- tical guide (Cambridge-University, ty. Oikos 113:363-375. ed). Cambridge-UK; pp. 91-101. 42. JOST L, 2007. Partitioning diversi- 36. HIBY L, KRISHNA M, 2001. Line ty into independent alpha and beta Transect Sampling from a Curving components. Ecology 88:2427 Path. Biometrics 57:727-731. –2439. 37. CARRILLO-BILBAO GA, 2004. 43. JOST L, 2008. Dangerous diversity Monitoreo Biológico, Socio-Econó- measures. In: Forum,Conservation mico y Cultural en el Bloque Sur. Biology. Baños. Reserva de la Biosfera Yasuní. 44. CROCKETT CM, EISENBERG JF, Especialidad Primates. In: Monito- 1987. Howlers: Variations in Group reo, Biológico, Socio-Económico y Size and Demography. In: Primates Cultural en el Bloque Sur Reserva Societies (Smuts BB, Cheney DL, de la Biosfera Yasuní (SIMBIOE, Seyfarth RM, Wrangham RW, ed). Ecuador. Struhsaker TT, eds). Chicago: The 38. CARRILLO-BILBAO GA, 2005. University of Chicago Press; 54-68. Monitoreo Biológico, Socio-Econó- 45. WILSON GOLDIZEN A, 1987. mico y Cultural en el Bloque Tara- Tamarins and Marmosets: Commu- poa. Reserva de Producción Faunís- nal Care of Offspring. In: Primate tica Cuyabeno. Especialidad Prima- Societies (Smuts BB, Cheney DL, tes. In: Monitoreo, Biológico, Seyfarth RM, Wrangham RW, Socio-Económico y Cultural en el Struhsaker TT, eds). Chicago: The Bloque Tarapoa Reserva de Produc- University of Chicago Press; 34-43. ción Faunística Cuyabeno (SIM- 46. EMMONS LH. ed, 1997. Neotropi- BIOE, ed). Ecuador. cal Rainforest Mammals: A Field 39. CARRILLO-BILBAO GA, DI Guide., 2nd ed. IL: The University FIORE A, FERNÁNDEZ-DUQUE of Chicago Press, Chicago, 396 pp. E, 2005. Dieta, Forrajeo y Presupues- 47. SCHMITT CA, DI FIORE A, LINK

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Estudio preliminar sobre la comunidad de primates en el bosque protector del Oglán Alto. 93 Arajuno-Pastaza

A, MATTHEWS LJ, MONTAGUE ences of six non-atelidae primates of MJ, DERBY AM, HURST D, CAR- Yasuni, Ecuador. Ecol apl 3:128-133. RILLO-BILBAO GA, SENDALL 53. IUCN, 2009. IUCN Red List of C, FIELD MY, FERNÁNDEZ- Threatened Species. Version DUQUE E, 2007. Comparative 2009.2. . ranging behavior of eight species of Downloaded on 22 January 2010. primates in a western Amazonian 54. SOINI P, 1987. Ecology of the Sad- rainforest. Program of the Seventy- dle-Back Tamarin Saguinus fusci- Sixth Annual Meeting of the Amer- collis illiger on the Río Pacaya, ican Association of Physical Northeastern Peru. Folia Primato- Anthropologists. logica 49:11-32. 48. TIRIRA D, BURNEO S, CASTRO 55. BUCHANAN-SMITH H, 1990. I, 1996. Mamíferos del Parque Polyspecific association of two Nacional Napo-Galeras (Napo- tamarin species, Saguinus labiatus Ecuador). Quito: Jatun Sacha-Triton and Saguinus fuscicollis, in Bolivia. Ecuador. American Journal of Primatology 49. CASTRO I, JACOME M, NOLI- 22:205-214. VOS L, SORNOZA F, 1999. Inven- 56. IZAWA K, NISHIMURA A, 1988. tario de Fauna (Aves y Mamíferos) Primate fauna at the study site, La del Parque Nacional Sangay. Quito: Macarena, Colombia. Field Studies Museo Ecuatoriano de Ciencias of New World Monkeys. La Naturales. Macarena, Colombia 1:5-11. 50. HEYMANN EW, ENCARNA- 57. JULLIOT C, 1992. Diet diversity CIÓN C. F, 2002. Primates of the and habitat of howler monkeys. río Curaray, Northern Peruvian XIVth congress of the International Amazon. International Journal of Primatological Society, Strasbourg, Primatology 23:191-201. IPS:278. 51. DI FIORE A, 2001. Investigación 58. PALACIOS E, RODRIGUEZ A, ecológica y de comportamiento de 2001. Ranging pattern and use of primates en el Parque Nacional space in a group of red howler mon- Yasuní. In: Memorias del Semina- keys (Alouatta seniculus) in a rio-Taller Yasuní: “Conservación y southeastern Colombian rainforest. desarrollo sostenible del Parque American Journal of Primatology Nacional Yasuní y su área de 55:233-251. influencia“ - (Jorgenson JP, Coello 59. WILLIAMSON EA, FEISTNER Rodríguez M, eds). Quito, Ecuador: ATC, 2003. Habituating primates: SIMBIOE; 165-173. processes, techniques, variables and 52. POZO R. WE, 2004. Habitat prefer- ethics. In: Field and Laboratory

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REVISIÓN DE TRABAJOS CIENTÍFICOS

La gastrulación en ranas con diversos modos de reproducción

Eugenia M. del Pino1

1Escuela de Ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito. [email protected]

Recibido: 2010-04-12, aprobado: 2010-08-27

RESUMEN.- Las características de la gastrulación fueron analizadas en las siguientes ranas ecuatorianas Gastrotheca riobambae, Colostethus (=Epipedoba- tes) machalilla y Engystomops (=Physalaemus) randi en comparación con Xeno- pus laevis, la rana que se estudia como organismo modelo del desarrollo embrionario. Se han encontrado profundas diferencias en el proceso de gastrulación en estas ranas. La comparación señala que en C. machalilla y G. riobambae, ranas con desarrollo lento, la convergencia y extensión dorsales (CED) es un proceso que ocurre después de la gastrulación mientras que en las de desarrollo rápido (X. laevis, y E. randi) la CED ocurre durante la gastrulación. PALABRAS CLAVE: Gastrulación, Colostethus, Epipedobates, Engystomops, Physalemus, Gastrotheca, Xenopus.

ABSTRACT.- The features of gastrulation were analyzed in the following frogs from Ecuador Gastrotheca riobambae, Colostethus (=Epipedobates) machalilla, and Engystomops (=Physalaemus) randi in comparison with Xenopus laevis, the model organism of frog development. There are major differences in the gastrulation process among these frogs. The comparison indicates that in C. machalilla and G. riobambae, frogs with slow development, dorsal convergence and extension (CED) occurs after gastrulation, whereas in frogs with rapid development (X. laevis and E. randi), CED occurs during gastrulation.

KEY WORDS: Gastrulation, Colostethus, Epipedobates, Engystomops, Physale- mus, Gastrotheca, Xenopus.

INTRODUCCIÓN a las que se les conoce como los organis- La Biología del Desarrollo analiza los mos modelo del desarrollo embrionario mecanismos celulares y moleculares de (1). Así, en muchos laboratorios del la embriogénesis en unas pocas especies, mundo se analiza a fondo el desarrollo de

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la rana acuática Xenopus laevis, el orga- tomops (=Physalaemus) randi Leiupe- nismo modelo de desarrollo para las ridae, de la rana dendrobátida Coloste- ranas (1). El conocimiento del desarrollo thus (=Epipedobates) machalilla y de de las especies modelo nos brinda un la rana marsupial Gastrotheca riobam- marco conceptual comparativo para el bae Hemiphractidae, entre otras. En estudio de otras, cuya embriogénesis este trabajo se resumen los avances en puede presentar modificaciones. la compresión del desarrollo embriona- En nuestro laboratorio estudiamos rio temprano de estas especies en com- el desarrollo embrionario de ranas con paración con la rana X. laevis. diversos modos reproductivos y lo Muchas ranas, como es el caso de X. comparamos con la embriogénesis de laevis, depositan los gametos en el X. laevis, pues las variaciones de los agua, la fecundación es externa y al fenómenos del desarrollo en diferentes cabo de 24 a 48 horas eclosionan larvas especies corresponden a experimentos de vida libre, los renacuajos (2). Estas naturales, cuyo análisis permite un larvas crecen y durante la metamorfo- mejor entendimiento de la embriogéne- sis, el cuerpo se remodela. En la meta- sis. Nuestro propósito es avanzar en la morfosis se reabsorben la cola y las comprensión de los mecanismos del branquias, y se desarrollan las extremi- desarrollo embrionario y a la vez con- dades para dar origen a una nueva rana. tribuir al mejor conocimiento de la La rana juvenil requiere crecer y madu- naturaleza del Ecuador. rar sexualmente para convertirse en un Para estudiar el desarrollo temprano adulto (1). Cabe señalar que la repro- se requiere mantener a las ranas en el ducción acuática es solamente una de laboratorio y por tal motivo solamente las 29 maneras diferentes de reproduc- una pequeña parte de la gran biodiver- ción que han sido detectadas en las sidad de anfibios ecuatorianos ha podi- ranas y que muchas especies de ranas do analizarse desde el punto de vista del que habitan en las regiones tropicales desarrollo embrionario. En nuestros del mundo depositan sus huevos en estudios hemos tenido la importante ambientes terrestres (3). La humedad colaboración del laboratorio de Herpe- del bosque tropical ha permitido a las tología de la Escuela de Ciencias Bioló- ranas experimentar con la reproducción gicas de la Pontificia Universidad Cató- y evolucionar modos reproductivos ale- lica del Ecuador y de su proyecto jados del agua (3). Cabe resaltar que los “Balsa de los sapos”, cuya meta es la huevos de las ranas carecen de meca- reproducción en cautiverio de numero- nismos que impidan su desecación, y es sas especies de ranas. Hemos estudiado por eso que la humedad ambiental de el desarrollo de la rana túngara Engys- los bosques húmedos ha sido un factor

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determinante para la evolución de El caso de la rana marsupial G. rio- muchos modos reproductivos en las bambae, Hemiphractidae, es más com- ranas que viven en tales regiones. plejo debido a que los huevos son aloja- Las ranas del género Engystomops dos en el cuerpo de la madre. Al momen- protegen a sus huevos y embriones tem- to del amplexus los embriones son depo- pranos en nidos de espuma que flotan sitados en una bolsa especializada de la en los charcos temporales en los que madre (9). La hembra transporta a sus estas ranas se reproducen (4, 5). El nido embriones en la bolsa materna por apro- de espuma se construye a partir de la ximadamente 4 meses, al cabo de los gelatina de huevo y durante el ample- cuales nacen renacuajos avanzados, los xus, o abrazo sexual, el macho bate con que completan su desarrollo en el agua sus patas ese material gelatinoso para (9). Cabe señalarse que las crías nacen formar espuma en la cual los blancos directamente como ranas en la mayoría huevos se camuflan y se mantienen sus- de especies de ranas marsupiales. En pendidos sobre el agua, evitando de tales casos se ha eliminado totalmente el esta manera la depredación de huevos y desarrollo acuático. embriones. Al cabo de aproximadamen- Hemos analizado la biología repro- te 2 días, ocurre la eclosión y los rena- ductiva de la hembra y las característi- cuajos caen al agua subyacente (6). cas de los embriones de la rana marsu- Hemos analizado el desarrollo embrio- pial G. riobambae. La bolsa materna es nario temprano de E. pustulosus, E. una especialización de la piel dorsal de coloradorum y E. randi (6). la hembra y responde a una hormona El desarrollo a partir de huevos similar a la progesterona, la hormona terrestres ocurre en las ranas dendrobá- de la gestación, con la formación de tidas, entre otras. En C. machalilla, los cámaras vascularizadas para cada uno huevos son depositados en nidos terres- de los 120 embriones que por promedio tres que son protegidos por el macho se alojan en la bolsa materna (9). Por su hasta la eclosión de los renacuajos (7). parte, las branquias, que en los renacua- En tal momento, el macho transporta a jos de otras ranas corresponden a sus renacuajos sobre su espalda hasta el estructuras filamentosas que permiten agua en donde se completa el desarrollo el intercambio gaseoso en el agua, han y los renacuajos alcanzan la metamor- sido modificadas notablemente. Las fosis (7). El desarrollo de C. machalilla branquias de G. riobambae se denomi- en el nido terrestre dura 19 días y nan branquias acampanadas debido a su hemos podido analizar su desarrollo morfología, pues son dos discos que embrionario hasta la eclosión de los forman un saco altamente vasculariza- renacuajos (8). do alrededor de cada embrión. La circu-

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lación sanguínea materna de las cáma- (2). La velocidad del desarrollo de X. ras embriónicas de la bolsa materna y la laevis es rápida en comparación con circulación embrionaria, presente en las otras ranas. branquias acampanadas, se encuentran Las ranas con nidos de espuma del en estrecha cercanía. El tipo de inter- género Engystomops presentan gran cambios que ocurren entre la madre y similitud con X. laevis en cuanto al los embriones durante el largo período tamaño del huevo y velocidad del desde incubación es en gran parte descono- arrollo. Los huevos de E. coloradorum cido, pero la morfología sugiere una miden 1.2 mm de diámetro, como en X. estrecha adaptación morfológica y laevis. En contraste, el huevo de E. fisiológica entre la madre y embriones randi mide solamente 0.9 mm de diá- para permitir la incubación en el cuerpo metro, lo que significa que el volumen materno. Las adaptaciones morfológi- del huevo de X. laevis y E. colorado- cas y fisiológicas para la incubación de rum es superior en 2.3 veces al del embriones de la rana marsupial G. rio- huevo de E. randi. Los huevos de E. bambae representan un modo paralelo coloradorum son uniformemente blan- al de los mamíferos para la reproduc- cos a diferencia de X. laevis. Esta carac- ción terrestre (9). En este trabajo se terística ha sido observada también en revisan las modificaciones del desarro- E. randi, E. pustulosus (6) y otras espe- llo embrionario temprano de la rana cies de Engystomops (trabajo en pro- marsupial G. riobambae, de la rana greso). El color blanco tiene importan- dendrobátida C. machalilla y de la rana cia para el camuflaje de los aproxima- con nidos de espuma E. randi en com- damente 120 huevos en el blanco nido paración con X. laevis. de espuma de estas especies. Aún cuando los embriones de Engystomops son Tamaño del huevo y velocidad blancos, se encontró que no son albi- del desarrollo nos, pues tienen pigmento oscuro inter- Los huevos de la rana X. laevis tie- no, que se distribuye alrededor de los nen un hemisferio pigmentado de color núcleos (6). La velocidad del desarrollo oscuro, el denominado “hemisferio ani- de los huevos de E.randi y E. colorado- mal”; en tanto, el hemisferio opuesto, rum en el nido de espuma es similar a lo llamado “hemisferio vegetal”, tiene observado en X. laevis, y al cabo de 2 color claro. El huevo de X. laevis mide días eclosionan los renacuajos. Es 1.2 mm de diámetro y en cada desove, decir, la estrategia reproductiva de la hembra deposita miles de huevos en Engystomops consiste en la formación el agua. Los renacuajos eclosionan al de nidos de espuma con pequeños hue- cabo de dos días desde la fecundación vos dotados de rápido desarrollo (6).

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Los nidos terrestres de la rana den- El desarrollo que alcanza el rena- drobátida C. machalilla contienen cuajo al tiempo de la eclosión es entre 8 a 16 huevos con pigmento variable en las diferentes especies. oscuro en el hemisferio animal, como Por tal motivo, consideramos que el en X. laevis (8). El tamaño del huevo tiempo requerido para que los embrio- varía grandemente entre especies de nes avancen desde la fecundación dendrobátidos, así en C. machalilla el hasta la culminación del proceso de huevo mide 1.6 mm de diámetro, en gastrulación brinda un mejor indica- Epipedobates tricolor 2 mm de diáme- dor de la velocidad del desarrollo. Los tro, y en Dendrobates auratus el diá- embriones de X. laevis requieren 14 metro del huevo es de 3.5 mm de diá- horas para este proceso (2). Las 24 metro (10). La relación de volúmenes horas requeridas por los embriones de señala que el huevo de C. machalilla es E. coloradorum es un tiempo ligera- 2.3 veces más grande que el huevo de mente superior a lo que necesitan los X. laevis, en tanto que el volumen del embriones de X. laevis para avanzar huevo de D. auratus es 25 veces supe- hasta el final de la gastrulación. (6). rior al de X. laevis. A pesar de las dife- En cambio, los embriones de la rana rencias en el tamaño del huevo, el des- dendrobátida C. machalilla requieren arrollo embrionario de las ranas den- de 4 días (8) y los embriones de la drobátidas es parecido entre sí en cuan- rana marsupial G. riobambae toman to a su morfología y a que requieren de 14 días para el mismo proceso (12). aproximadamente de 19 días desde la De acuerdo a estas diferencias consi- fecundación hasta la eclosión de rena- deramos que X. laevis y E. colorado- cuajos avanzados (8, 10). rum tienen desarrollo rápido, en tanto Los embriones de la rana marsupial que la rana dendrobátida C. machali- G. riobambae tienen una apariencia lla y la rana marsupial G. riobambae blanco amarillenta uniforme, miden 3 gozan de desarrollo lento. Cabe seña- mm de diámetro y su volumen es apro- lar que aunque el desarrollo embrio- ximadamente 16-25 veces superior al nario de las ranas es influenciado por del huevo de X. laevis. En otras espe- la temperatura, las diferencias tempo- cies de ranas marsupiales los huevos rales en la embriogénesis de las ranas alcanzan hasta 10 mm o más de diáme- de desarrollo lento y rápido son extre- tro (11). El desarrollo embrionario pro- madamente grandes para que puedan tegido en el interior de la bolsa materna homologarse solamente con cambios ocurre lentamente y alrededor de 100 de la temperatura. renacuajos avanzados eclosionan des- pués de 120 días de incubación (11).

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Patrones de gastrulación sa en el labio dorsal del blastoporo de La morfología de la gastrulación de X. laevis, E. randi, C. machalilla y G. X. laevis al igual que la de varias espe- riobambae (15). Estos descubrimientos cies de ranas y urodelos ha sido amplia- señalan que la expresión génica del mente analizada debido a la facilidad de organizador es altamente conservada. obtener embriones para estudio. Duran- No se ha determinado si el transplante te el proceso de la gastrulación en las del labio dorsal del blastoporo en la ranas se forma una hendidura, el labio gástrula de diferentes ranas produciría dorsal del blastoporo, en la región sube- duplicación de los ejes (15). cuatorial. El labio dorsal del blastoporo Una vez que se ha formado el labio tiene la propiedad de duplicar los ejes al del blastoporo, se profundiza y extien- ser transplantado al lado ventral de otro de lateral y ventralmente hasta formar embrión. Por tal motivo se le conoce un anillo alrededor del tapón de yema como “el organizador”. Las caracterís- (Fig. 1). La formación del blastoporo ticas moleculares del organizador han obedece a movimientos morfogenéti- sido ampliamente estudiadas y se han cos, entre los cuales cabe señalar el encontrado numerosos genes que se expresan en esta región del embrión y que tienen la propiedad de duplicar los ejes del embrión al ser expresados en el lado ventral (13). Uno de los genes del organizador es el gen Lim1 (también conocido como Lhx1) (14). Debido a que todas las ranas analizadas forman un labio dorsal del blastoporo, era de importancia determinar la expresión del gen Lim1 en la gástrula temprana. Realiza- mos este análisis al nivel de proteína mediante inmuno- detección en montaje entero Figura 1. Apariencia externa de la gástrula media de C. con un anticuerpo contra la machalilla. El blastoporo rodea al tapón de yema. Conforme proteína Lim1. Determinamos avanza la gastrulación el tapón de yema se reduce hasta ser completamente internalizado cuando se cierra el blastoporo. Abrevia- que la proteína Lim1 se expre- tura: ty, tapón de yema.

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proceso de involución que guía la forma un disco embriónico alrededor internalización de las células superfi- del blastoporo cerrado (Fig.2). El ciales, así como el proceso de CED cuerpo del embrión se deriva de este que cambia la forma del embrión de la pequeño disco de células (17). En el esférica del huevo a la alargada del interior, debido a los movimientos de renacuajo (16). Al completar la gas- la gastrulación se forma una nueva trulación se establece el plan del cuer- cavidad, el arquenterón o intestino pri- po con sus tres capas germinales: el mitivo, la cual es muy pequeña y situa- ectodermo, el mesodermo y el endo- da directamente por debajo del disco dermo tanto en las ranas, como en embriónico (Fig. 2). El desarrollo a todos los vertebrados (1). partir de un disco embriónico es carac- En nuestro trabajo nos hemos cen- terístico de las aves y no de las ranas y trado en el estudio de la gastrulación el modo de gastrulación de G. riobam- por la importancia de este proceso y bae es el modo más divergente de gas- justamente para contribuir a su mejor trulación que se ha detectado en las entendimiento. Todas las ranas estu- ranas (17). diadas (X. laevis, E. randi, C. macha- Al comparar los embriones de G. lilla y G. riobambae) forman un blas- riobambae con los embriones de X. toporo alrededor de un tapón de yema laevis detectamos que la extensión del (Fig. 1). En todos los casos, se forma arquenterón se había retardado en la un labio dorsal del blastoporo en la gástrula de G. riobambae (17). Mien- región sub ecuatorial del huevo. El tras en X. laevis el proceso de gastrula- mismo es morfológicamente visible al ción y extensión del arquenterón ocu- inicio de la gastrulación. Sin embargo rren simultáneamente, en los embrio- hemos detectado sutiles diferencias nes de la rana marsupial G. riobambae, respecto a la extensión del arquenterón primero se completa el cerramiento del y al inicio de la CED, como se señala blastoporo y luego se inicia la exten- a continuación. sión del arquenterón (Fig.2). De modo Uno de los descubrimientos más similar a X. laevis, los embriones de significativos de nuestro trabajo fue rápido desarrollo de la rana con nidos determinar el modo de gastrulación de de espuma, E. randi, expanden el la rana marsupial G. riobambae (17). arquenterón durante la gastrulación, en Los grandes huevos de esta rana for- tanto que la rana dendrobátida, C. man un área de pequeñas células alre- machalilla, cuyo desarrollo es lento, dedor del blastoporo. Cuando al final sigue un patrón similar al de G. rio- de la gastrulación se retrae el tapón de bambae con un retardo en la extensión yema y se cierra el blastoporo, se del arquenterón.

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Figura 2. Esquemas de secciones sagitales de la gástrula media de G. riobambae y X. laevis. En G. riobambae el arquenterón se forma durante la gastrulación y se expande después del cerramiento del blastoporo. En cambio, en X. laevis la extensión del arquenterón está solapada con el proceso de gastrulación. Los dibujos están realizados a escala. Imagen modificada de la referencia (9). Abreviaturas: a, arquenterón; bl, blastocele.

Varios movimientos morfogenéticos evidencia molecular de que se han ini- contribuyen a la formación y extensión ciado los movimientos de CED (20). del arquenterón, entre ellos la CED Mediante inmuno-detección en mon- juega un importante papel. Los movi- taje entero para la proteína Bra hemos mientos de CED se inician en la gástru- determinado el inicio del alargamiento la media de X. laevis y son responsables del notocordio, es decir el inicio de la de concentrar a las células hacia el lado CED en los embriones de diferentes dorsal, mientras al mismo tiempo el ranas (12, 21, 22). Los resultados seña- embrión se alarga en sentido antero-pos- lan importante variabilidad. En las ranas terior (18, 19). La CED permite el cam- con desarrollo rápido, X. laevis, y en la bio de forma del embrión de la forma rana con nidos de espuma, E. randi, el esférica del huevo a la alargada del rena- alargamiento del notocordio se inicia en cuajo. Como resultado de proceso de la gástrula media (Fig. 3). En tanto en las CED, se forma el notocordio en la línea ranas con desarrollo lento, C. machalilla media dorsal del embrión de X. laevis y G. riobambae, el inicio de la extensión (18, 19). La expresión del gen Brach- del notocordio se ha retardado hasta yury (Bra) en el notocordio temprano es completar la gastrulación (Fig. 3).

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Figura 3. Comparación de la expresión de Bra en la gástrula de (A) X. laevis. (B) C. machalilla y (C) G. riobambae. La expresión de Bra se representa en color negro. Se muestra la expresión de Bra en células profundas del mesodermo prospectivo, que aparece como un anillo alrededor del tapón de yema y en el notocordio en X. laevis (24). La extensión del notocordio se inicia durante la gastrulación en X. laevis (24) y está retrasada hasta el cerramiento del notocordio en G. riobambae y C. machalilla (12, 21). Imagen modificada de la referencia (25). Abreviaturas: n, notocordio; ty, tapón de yema. Cabe preguntarse sobre el significa- la CED y los embriones defectuosos do de las diferencias encontradas: en para dsh brindan una evidencia experi- primer lugar la comparación señala que mental de la modularidad de los proce- los movimientos de CED no son intrín- sos de desarrollo embrionario (23). secos a la gastrulación. La CED es un módulo del desarrollo que se encuentra INTERPRETACIÓN solapado con la gastrulación en ranas Y CONCLUSIONES de desarrollo rápido (10, 22). Los Debido a que la CED alarga el cuer- embriones de X. laevis, que experimen- po del embrión, cabe suponer que en talmente tienen defectos en el gen dis- especies con desarrollo acuático el rápi- hevelled (dsh), cierran el blastoporo en do alargamiento del cuerpo es una ausencia de alargamiento del notocor- necesidad para el desarrollo del rena- dio y del cuerpo (23). El gen dsh es cuajo, dicha larva puede nadar y así parte de la ruta metabólica de la polari- ocultarse de los predadores. En tanto dad celular plana que es responsable de que en aquellas ranas que tienen repro-

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ducción más lenta, no existe esa presión críticos. Se reconoce con gratitud la de un rápido alargamiento del cuerpo donación de embriones de diferentes debido a sus adaptaciones terrestres, y ranas realizada por los Drs. L. Coloma, la CED ha sido retrasada hasta comple- S. Ron, D. Almeida Reinoso, otros tar la gastrulación. miembros del laboratorio de Herpetolo- Nuestros resultados señalan que la gía de la PUCE y de su proyecto “Balsa tarea importante que se realiza durante de los sapos”. Este trabajo se benefició la gastrulación es la internalización de de las becas de investigación de la las células para formar las tres capas PUCE 2008 y 2009 y de becas de inves- germinales. El alargamiento del cuerpo tigación anteriores de la PUCE. Se es otro proceso que puede o no estar agradece la beca de investigación otor- solapado con la gastrulación. La com- gada por la Academia de Ciencias para paración del desarrollo temprano de el Mundo en Desarrollo, TWAS 07-017 diversas ranas nos ha permitido alcan- LDC/BIO/LA. zar esta conclusión. Desde el punto de vista del mejor REFERENCIAS conocimiento de las especies ecuatoria- BIBLIOGRÁFICAS nas, es de resaltar que las adaptaciones 1. Wolpert, L.; Jessell, T.; Lawrence, terrestres en las ranas dendrobatidas P.; Meyerowitz, E.; Roberson, E. & (Dendrobatidae) y de la rana marsupial Smith, J. 2007. Principles of devel- G. riobambae (Hemiphractidae) van opment. Tercera Edición. Oxford asociadas con lento desarrollo, en tanto University Press, Oxford, United que el desarrollo sobre el agua en los Kingdom. nidos de espuma de las ranas túngara 2. Nieuwkoop, P.D. & Faber, J. 1994. (Leuiperidae) es acelerado, al igual que Normal Table of Xenopus laevis en el organismo modelo del desarrollo, (Daudin), Garland Publishing, New la rana X. laevis. York. 3. Duellman W. E. & Trueb L. 1986. AGRADECIMIENTOS Biology of Amphibians. McGraw- Se expresan sinceros agradecimien- Hill, New York. tos a todos los estudiantes y colabora- 4. Davidson E. H. & Hough B. R. dores del laboratorio de Biología del 1969. Synchronous oogenesis in Desarrollo de la Pontificia Universidad Engystomops pustulosus, a neotrop- Católica del Ecuador (PUCE) por su ic anuran suitable for laboratory apoyo a lo largo de muchos años. Sus studies: localization in the embryo aportes han permitido alcanzar esta sín- of RNA synthesized at the lamp- tesis. En particular se agradece a la Lic. brush stage. Journal of Experimen- N. Sáenz Ponce por sus comentarios tal Zoology 172: 25-48.

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104 Eugenia M. del Pino

5. Ryan M. J. 1985. The Túngara Frog: ment. Proceedings of the National A Study in Sexual Selection and Academy of Sciences, U. S. A. 104: Communication. Chicago: The Uni- 11882-11888. versity of Chicago Press. Chicago. 12.del Pino E. M. & Escobar 6. Romero-Carvajal A.; Sáenz-Ponce B. 1981.Embryonic stages of Gas- N.; Venegas-Ferrín M.; Almeida- trotheca riobambae (Fowler) during Reinoso D.; Lee C.; Bond J.; Ryan maternal incubation and compari- M. J.; Wallingford J. B. & del Pino, son of development with that of E.M. 2009. Embryogenesis and other eggbrooding hylid frogs. Laboratory Maintenance of the Journal of Morphology 167: Foam-Nesting Túngara Frogs, 277295. Genus Engystomops (= Physalae- 12. del Pino, E. M. 1996. The expres- mus). Developmental Dynamics sion of Brachyury (T) during gastru- 238: 1444–1454. lation in the marsupial frog Gas- 7. Coloma, L. A. 1995. Ecuadorian trotheca riobambae. Developmen- frogs of the genus C. machalilla tal Biology 177: 64–72. (Anura: Dendrobatidae). Miscella- 13. De Robertis, E.M. 2006. Spemann's neous Publication Natural History organizer and self-regulation in Museum. University of Kansas, amphibian embryos. Nature Lawrence 87: 1-74. Reviews Molecular and Cell Biolo- 8. del Pino, E. M.; Ávila, M. E.; gy 7: 296–302. Pérez, O. D.; Benítez, M. S.; Alar- 14. Taira, M.; Otani, H.;Saint-Jeannet, cón, I.; Noboa, V. & Moya, I. M. J.P. & Dawid, I.B. 1994. Role of the 2004. Development of the dendro- LIM class homeodomain protein batid frog Colostethus machalilla. Xlim-1 in neural and muscle induc- International Journal of Develop- tion by the Spemann organizer in mental Biology. 48: 663-670. Xenopus. Nature 372: 677-679. 9. del Pino, E. M. 1989. Modifications 15. Venegas-Ferrín, M.; Sudou, N.; of oogenesis and Development in Taira, M. & del Pino, E.M. 2010. Marsupial frogs. Development 107: Comparison of Lim1 expression in 169-187. embryos of frogs with different 10. del Pino, E. M.; Venegas-Ferrín, M.; modes of reproduction. Internation- Romero-Carvajal A.; Montenegro- al Journal Developmental Biology Larrea P.; Sáenz-Ponce N.; Moya I. 54: 195-202. M.; Alarcón I.; Sudou N.; Yamamo- 16. Keller, R. & Shook, D. 2004. Gas- to S. & Taira, M. 2007. A compara- trulation in amphibians. En: Stern, tive analysis of frog early develop- C.D. ed. Gastrulation from Cells to

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La gastrulación en ranas con diversos modos de reproducción 105

Embryo. 171-203. Cold Spring Har- 22. Moya, I. M.; Alarcón, I. & del Pino, bor, Cold Spring Harbor Laboratory E. M. 2007. Gastrulation of Gas- Press. Cold Spring Harbor, New trotheca riobambae in comparison York. with other frogs. Developmental 17. del Pino E. M. & Elinson Biology 304: 467-478. R. P. 1983. Gastrulation produces an embryonic disc, a novel develop- 23. Ewald, A.J.; Peyrot, S.M.; Tyszka, mental pattern for frogs. Nature J.M.; Fraser, S.E. & Wallingford 306: 589591. J.B. 2004. Regional requirements 18. Keller, R. 1975. Vital dye mapping for Dishevelled signaling during of the gastrula and neurula of Xeno- Xenopus gastrulation: separable pus laevis. I. Prospective areas and effects on blastopore closure, morphogenetic movements of the mesendoderm internalization and superficial layer. Developmental archenteron formation. Develop- Biology 42: 222-241. ment 131: 6195-6209. 19. Keller, R. 1976. Vital dye mapping 24. Smith, J. C.; Price, B. M. J. ; Green, of the gastrula and neurula of Xeno- J. B.A.; Weigel, D. & Herrmann, pus laevis. II. Prospective areas and B.G. 1991. Expression of a Xenopus morphogenetic movements of the homolog of Brachyury (T) is an deep layer. Developmental Biology immediate-early response to meso- 51: 118−137. derm induction. Cell 67: 79-87. 20. Winklbauer, R. 1990. Mesodermal 25. Benítez, M. S. & del Pino, E. M. cell migration during Xenopus gas- 2003. La expresión de Brachyury en trulation. Developmental Biology ranas con modos divergentes de 142: 155-168. desarrollo. Revista de la Pontificia 21. Benítez, M.-S. & del Pino, E. M. Universidad Católica del Ecuador 2002. The expression of Brachyury 71: 7-14. during development of the dendro- batid frog Colostethus machalilla. Developmental Dynamics 225: 592-596.

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NOTAS CIENTÍFICAS Simposio: 200 años de Humboldt

Carlos A. Soria

Escuela de Ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Sociedad Ecuatoriana de Ciencias Biológicas, núcleo de Pichincha

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A partir del siglo XV, llegaron a ratura del aire y del mar, puntos de ebu- América grandes exploradores europe- llición del agua, cambios de altura os que desafiaron temerariamente el desde el mar a las nieves perpetuas, rico legado natural y humano de las duración solar diurna y refracción de la nuevas tierras, desconocidas hasta luz , la inclinación magnética o las con- entonces, guiados por intereses de diciones del suelo, entre las que puedo variada índole. citar, fueron bases para el desarrollo de El naturalista alemán, Alexander sus conceptos sobre líneas isotérmicas von Humboldt fue un gran explorador y geomagnetismo. científico, un filántropo y humanista Humboldt dio a entender desde ese que usó su fortuna personal para reali- momento que las variedades vegetales zar sus exploraciones, de las cuales encontradas respondían a la composi- nacieron la geoecología y la climatolo- ción volcánica de nuestros suelos y ver- gía, disciplinas que iba desarrollando tientes, a los microclimas creados por con cada paso que daba en los más de los vientos alisios y rayos solares casi 10 000 kilómetros de recorrido por perpendiculares, a la altura de los reco- Sudamérica en menos de un año. vecos de los Andes y a las corrientes Sus observaciones, colecciones y marinas de nuestra geografía. escritos de nuestros volcanes, páramos, Se sentaban las bases del Ecuador altiplanos, trópicos y corrientes mari- mega-diverso, cuyo territorio, a pesar nas describieron desde su cosmovisión de representar apenas cerca del 1 % de la existencia de geografías y ecologías la superficie de la tierra, alberga más de impensables y desconocidas en la Euro- veinte mil especies botánicas. Dentro pa de hace doscientos años. Sus regis- de ellas, un sinnúmero de plantas medi- tros sobre presión atmosférica, tempe- cinales de conocimiento ancestral, que

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Simposio: 200 años de Humboldt 107

han inspirado a químicos, farmacéuti- brindado por la Dra. Laura Arcos Terán, cos, médicos y shamanes en el descu- Decana de la Facultad de Ciencias brimiento, extracción y aplicación de Exactas y Naturales, y a la Mter. Mer- nuevos principios activos. cedes Rodríguez-Riglos, Directora de Hay mucho que explorar y escribir la Escuela de Biología. Aprecio la cola- sobre estos temas: fibras maderables boración de la Dra. Eugenia del Pino en diversas, lignocelulosas, frutos exóti- la organización del evento, a los pane- cos, los aceites alimenticios o aromáti- listas, otros colaboradores y al público cos perfumados y otros aceites lineales que llenó nuestro auditorio con su pre- no saturados de alto y fino rendimiento sencia y entusiasmo. mecánico; los azúcares, amino- ácidos, péptidos, colorantes, vitaminas y antioxidantes, por nombrar unos pocos, son BIBLIOGRAFÍA los secretos moleculares que podrían inspirar a las nuevas generaciones de Franzle O. 2001. Alexander von Hum- científicos, ávidos por conocer nuestra boldt`s holistic world view and riqueza genética, inicialmente reporta- modern inter-and transdisciplinary da por pioneros como Humboldt. ecological research. Northeastern El nombre de este naturalista se Naturalist 8, 57. puede encontrar en instituciones, fun- Knobloch E. 2006. Alexander von daciones, monumentos, parques, fenó- Humboldt: The Explorer and the menos naturales o fauna que llevan su scientist. The global and the local: nombre; su paso fortuito dejó una hue- The History of Science and the Cul- lla inmortal en América. ture Integration of Europe. Pro- La Pontificia Universidad Católica ceedings of the 2nd ICESHS (Cra- del Ecuador y la Sociedad Ecuatoriana cow, Poland, September 6-9) p 38- de Biología, Núcleo de Pichincha, aus- 48. Ed. M Kokowski. piciaron este simposio en honor a Hum- Romero G. 2001. Alexander von Hum- boldt, el cual se llevó a cabo el 19 de boldt`s legacy in Venezuela. North- agosto del 2010. Su quehacer científico eastern Naturalist 8, 33. fue redescubierto por conferencistas ecuatorianos y alemanes que refresca- ron el paso de este explorador por América. Fue un honor haber sido responsable de la organización y moderación de este simposio. Agradezco el apoyo

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Unidad de la ciencia en el pensamiento de Humbolt Oswaldo Báez Tobar

Universidad Central del Ecuador

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Para entender la amplitud del pensa- finalidad es investigar cómo se entrete- miento científico de Alexander von jen todas las fuerzas naturales, la Humboldt y su proyecto científico es influencia de la naturaleza muerta sobre preciso mencionar la preparación aca- el mundo vivo animal y vegetal”. El démica que recibió en la Universidad viaje a América tuvo lugar entre 1799 y de Berlín, Gotinga, Hamburgo y en la 1804, visitó Venezuela, Cuba, Colom- Escuela de Minas de Freiberg. Estudió bia, Ecuador, Perú, México y Estados matemática, botánica, zoología, anato- Unidos. (Mayer-Abich, 1985). mía comparada, geografía, geología, Los conocimientos científicos de vulcanología; minería, lenguas, historia Humboldt fueron los más avanzados de la cultura, economía política nacio- de su época; a eso se sumó el dominio nal e internacional, además dibujo y del método y técnicas de investiga- grabado. Se relacionó con las más dis- ción científica. Sostuvo que no puede tinguidas personalidades de la cultura y haber conocimiento científico sin ciencia europea: Johann Goethe, demostración verificable. Empleó Johann Blumenback (zoólogo), Karl numerosos instrumentos de observa- Ludwig Willenou (botánico), Georg ción y medición geofísica: sextante, Forster (geólogo), Cuvier cronómetro, hipsómetro, barómetro, (zoólogo),Gay-Lussac y Bethelot (quí- telescopio; inclinómetro y declinóme- micos), Laplace (astrónomo). tro; termómetro y aerómetro; eudió- Humbldt se preparó para su proyec- metro, electrómetro y el higrómetro, to científico. Sus primeros 30 años los cianómetro... Y estudió las plantas y dedicó a su preparación para el viaje de los animales en relación con las con- estudio en tierras equinocciales de diciones ambientales. Además obser- América que le tomaría cinco años; tra- vó y describió a las personas que viví- bajó 50 años en el análisis e interpreta- an en cada paisaje, en sus contextos ción de datos, la preparación y publica- sociales, económicos, políticos e his- ción de los libros que contienen su gran tóricos, con lo cual logró la aprehen- obra científica. “Mi verdadera y única sión de la realidad total.

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Contribución científica Contribución a la Botánica La principal contribución a la cien- y la Fitogeografía cia consta en los textos sudamericanos Los aportes a la botánica morfológi- y otras publicaciones: ca y botánica sistemática fueron impor- – Viaje a las regiones equinocciales tantes; pero la contribución científica del Nuevo Continente. Obra en 35 mayor está en la geografía de las plan- volúmenes, publicados en París tas o fitogeografía. En el Ensayo sobre entre 1805-1834. Incluye varias la geografía de la plantas (terminado en obras subordinadas, entre ellas: Guayaquil en 1803) Humboldt resume Ensayo sobre la geografía de las las más innovadoras concepciones de la plantas, acompañado de una tabla geología, historia de las plantas, taxo- física de las regiones equinocciales nomía, ecología, distribución de las (1807), y Nova génera de especies plantas y el transformismo. (Zúñiga, de plantas, que contiene la descrip- 1964). Es, por lo mismo, una síntesis de ción de más de 4 000 especies de conceptos y principios de varias cien- plantas, Humboldt, Bonpland y cias naturales para explicar la regulari- Kunth. dad en la distribución de las plantas y – Observaciones Zoológicas y Anato- las formaciones vegetales. “La geogra- mía Comparada, París, 1799-1803. fía de las plantas hizo visibles los varia- – Cuadros de la Naturaleza. dos mosaicos paisajísticos y su interre- Cosmos. Contiene una descripción del lación funcional y propuso la idea de la mundo físico que había observado y unidad dinámica y variada de la natura- estudiado durante 50 años; repre- leza” (Castrillón, 2001). senta la síntesis filosófica de todos los conocimientos de su tiempo. Contribución a la Ecología – Contribuciones a la cartografía La base conceptual inicial de la eco- mediante el levantamiento de mapas logía es otra de las contribuciones de físicos de algunas regiones visitadas Humboldt; está contenida en el entendi- y perfiles de mapas de asociaciones miento humboldtiano de “las interrela- vegetales. ciones entre los organismos entre sí y – Concepción de varios principios con su entorno animado e inanimado”. científicos: de la relación entre la En esta concepción se halla el núcleo de latitud y la altitud, unidad dinámica la ecología. Humboldt se propuso “reu- de la naturaleza y del principio de la nir datos para ampliar una ciencia que continentalidad, este último luego apenas está en esbozo y falta defini- de viajar a Rusia y comparar las ción, que en ocasiones es llamada Físi- observaciones de América y Asia. ca del mundo, Teoría de la Tierra, Geo-

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grafía física”. (Holl, 2001). Esta contiene la virtud de ampliar la visión más cepción sustenta a la ecología, aunque allá del ecosistema, del paisaje, de la la denominación de ecología se debió a ecorregión… para abarcar escalas supe- Ernest Haeckel en 1866. riores. La macroecología es una nueva El paisaje como término científico- manera de estudiar las relaciones entre geográfico fue también introducido a los organismos y su ambiente; esto principios del siglo XIX por Humboldt implica caracterizar y explicar los al definir al paisaje como la totalidad patrones estadísticos de abundancia, de características de una región de la distribución y diversidad, para lo cual Tierra, que abarca la fisiografía, geolo- trabaja a escalas espaciales y tempora- gía y geomorfología regional. (Naveh les grandes, según James Brown & Lieberman, 1990). De la conjunción (2003). En los trabajos de Humblodt se de la ecología y el paisaje surgió la encuentra el germen del enfoque Ecología del Paisaje, que es la descrip- macroecológico para el estudio de la ción de un área geográfica a base de naturaleza viviente. los factores que lo generan: suelo, latitud y altitud, el clima y sus elementos: La unidad de la Ciencia en el temperatura, pluviosidad, heliofanía, pensamiento de Humboldt vientos, humedad ambiental, y la des- Humboldt fue formado en la obser- cripción de la cubierta vegetal como el vación y experimentación científica de reflejo de su ecología. Bajo el concep- exigencia y reflexión newtonianas, de to de paisaje, la naturaleza es concebi- hondura y rigor kantianos, y amplitud da como un mosaico de unidades defi- enciclopedista. Hombre sabio con sen- nibles: el paisaje ecológico (cuya defi- sibilidad para lo natural y lo humano. nición global fue desarrollada en por el Tuvo una capacidad intelectual geógrafo y botánico alemán Carl Troll extraordinaria para relacionar el mundo en 1938). natural y humano. Humboldt logró Humboldt consideró al paisaje conocer distintas ramas de la ciencia; su como un espacio de interrelación den- deseo fue discernir los fenómenos físi- tro de la naturaleza y también entre el cos en su interconexión para compren- ser humano y la naturaleza. Así prefi- der a la naturaleza como un todo… guró una visión integradora y globali- (Meyer-Alich, 1985). La naturaleza zante, que casi dos siglos después se aprehendida por la ciencia cultivada concretó en la macroecología, discipli- por Humboldt aflora como una unidad na que surgió de la necesidad de apre- en la diversidad de los seres y fenóme- hender la realidad regional y global del nos que lo constituyen, entre los cuales mundo viviente. La macroecología existe armonía.

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol.XXXI Números 1 y 2: 108-111, octubre 2010 FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 111

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He aquí la clave para entender el BIBLIOGRAFÍA pensamiento humboldtiano: la unidad de la naturaleza expresada en la unidad Brown, J. 2003. Macroecología. Fondo y totalidad de la ciencia. Humboldt de Cultura Económica. México. buscó la comprensión integral de la Castrillón, A. 2001. Humboldt: los via- Tierra como un todo orgánico, como jes, las naturalezas y las ciencias. un cosmos. Así la visión y compren- En: El regreso de Humboldt. Expo- sión integral de la ciencia alcanzó con sición en el Museo de la Ciudad de Humboldt su apogeo y su culminación Quito, junio-agosto 2001. histórica. Holl, F. 2001. El regreso de de Hum- “Sé muy bien que no estoy a la altu- boldt: Alexander von Humboldt en ra de mi gran obra sobre la naturaleza. Colombia y Ecuador. En: El regreso Esta empresa es un poco grande para un de Humboldt. Exposición en el particular, pero no es deshonra sucum- Museo de la Ciudad de Quito, bir ante un gran proyecto. El ser huma- junio-agosto 2001. no debe querer lo grande y bueno” afir- Meyer-Abich, A. 1985. Humboldt. Sal- mó Humboldt en el ocaso de su vida. vat Editores, S. A., Barcelona. Este es el mensaje del gran científico y Naveh, Z., Lieberman, A. 1990. Lands- humanista. En esta frase expresa la cape Ecology: Teoría y Aplicación. relación necesaria entre las ciencias Spriger-Verlag, New York. naturales y las humanidades. Zúñiga, N. 1964. Humboldt y la Geo- grafía de las Plantas. Talleres Gráfi- cos Nacionales, Quito.

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXXI Números 1 y 2: 108-111, octubre 2010 FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 112

Animal Asymmetries: Evolution and Mechanisms Martin Blum

University of Hohenheim, Institute of Zoology, Garbenstrasse 30, D-70593 Stuttgart, Germany

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Asymmetry is a feature of animal archenteron roof during gastrulation. body plans, which often reveals itself The chick as an example for the highly only upon closer inspection. While derived birds lacks superficial meso- asymmetric coiling of snail shells is derm and flow. This loss should be obvious even to the untrained eye, sea secondary, as flow is present from fish stars and sea urchins don't even seem to and amphibians to mammals. qualify as bilaterians at first glance, and As well established as leftward flow vertebrate asymmetry is restricted to is as a mechanism of symmetry breaka- the asymmetric placement of many of ge, as little understood are the exact the inner organs of the chest and abdo- events around flow, i.e. whether a mor- men. phogen is asymmetrically transported In my talk I will present asymme- across the ciliary field, or whether flow tries of animal body plans in protosto- is sensed on the left side, and a cascade mians and deuterostomians and discuss of events set into action downstream of their origin and functional relevance. flow. As to the underlying molecular mecha- We have recently performed a num- nisms, the asymmetric Nodal signaling ber of experiments in the South African cascade is a conserved prerequisite for clawed frog Xenopus laevis, which is a asymmetric body plan specification in particularly accessible model organism all cases. I will present evidence that for laterality studies, to get insight into symmetry breakage by cilia-driven left- these questions. To that end we have ward flow presents an ancestral charac- performed gain- and loss-of-function ter of vertebrates, likely the chordate studies in which particular components phylum and maybe all deuterostomes. have been knocked down or misexpres- In vertebrates, leftward flow occurs in a sed in defined tissues of the frog gastru- transient structure, a monociliated epi- la and neurula embryo. Our results thelium, which is derived from superfi- show that asymmetric transport of a cial mesoderm and localizes to the morphogen from right to left via flow

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol.XXXI Números 1 y 2: 112-113, octubre 2010 FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 113

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cannot account for symmetry breakage, ble because of international collaborati- as flow on the right side is dispensible ons of scientists from different back- for symmetry breakage. Rather, flow grounds and working on different down-regulates an inhibitor of Nodal, model organisms. What nowadays is which in frog is called Coco (cerl2 in considered standard for scientific mouse, charon in zebrafish) specifical- research was uncommon in Alexander ly on the left side of the ciliated epithe- von Humboldt's days. Humboldt him- lium. Thus, symmetry breakage occurs self can be considered a pioneer of glo- by release of repression of the Nodal balized research, as well as of research signaling cascade. across discipline boundaries. It is there- Earlier components, which have fore with particular delight to be able to been described to be asymmetrically present this lecture to an international localized in early Xenopus embryos, audience at the Symposium "200 años could not be confirmed in our experi- of Humboldt" in Quito, the capital of ments. Rather we could show that these Ecuador, where Humboldt has travelled so-called early determinants (such as and worked extensively, and to conduct serotonin and the ion pump H-K-ATPa- research in collaboration with Ecuado- se) are involved in the morphogenesis rian scientists on Ecuadorian frog spe- of the ciliated epithelium, most likely cies. by acting upon non-canonical Wnt signaling. Finally, we have studied the mecha- nims by which the first asymmetric cue is transported to the left side, where the Nodal cascade is activated and asymmetric heart looping is induced. We find gap junctional communications to be at the center of this transfer. I will present a comprehensive model of symmetry breakage in the frog Xenopus, which should serve as a reference point to investigate symmetry breakage in other deuterostomians as well.

The insights gained in recent years into evolution and mechanisms of animal asymmetry have been made possi-

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXXI Números 1 y 2: 112-113, octubre 2010 FINAL REVISTA CIENCIAS 2010. 1 .qxp:MaquetaciÛn 1 8/10/10 11:42 Página 114

El impacto de Humboldt en la Botánica y Fitogeografía del Ecuador Katya Romoleroux

Escuela de Ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Católica del Ecuador

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Breve reseña sobre el viaje Estadía de Humboldt y Bonpland de Humboldt a América en el Ecuador A fines de diciembre de 1801, Hum- Alexander von Humboldt nace en boldt y Bonpland llegan al Ecuador, Berlín en 1769 de una familia rica y atraviesan Carchi e Imbabura y llegan a noble, su padre muere cuando aún es Quito en enero de 1802, su anfitrión fue niño. En 1790, inicia sus estudios en Juan Pío Montúfar, su estadía en Quito economía en Göttingen; sin embargo, se prolonga hasta julio de 1802. Duran- su interés fue siempre las ciencias natu- te este período los dos científicos rales y termina especializándose en ascendieron al Antisana, al Pichincha y estas áreas. En 1796, mientras es direc- posteriormente al Chimborazo, consi- tor de una industria minera en Freiberg, derado en ese entonces el volcán más su madre muere dejando una herencia alto del mundo; otras montañas visita- apreciable, la cual Humboldt posterior- das por ellos fueron Cotacachi, Imba- mente usa para la gran expedición cien- bura, Cayambe, Pasochoa, Atacazo, tífica que había planificado a América. Corazón, Rumiñahui e Iliniza. Luego En 1799, inicia su viaje a América viajan al sur del Ecuador, en compañía en compañía del botánico francés Aimé de Carlos Montúfar, ascendieron el de Bonpland, reciben un permiso espe- Cotopaxi y visitaron varias localidades cial del rey de España para ser recibidos pasando por Cuenca y Loja donde visi- en las colonias españolas. Desde 1799 tan y estudian los bosques de Cinchona, hasta 1804 visitan los actuales países de planta conocida como remedio para Venezuela, Cuba, Colombia, Ecuador, curar la malaria; visitan además Zaru- Perú, México, Estados Unidos, y el 9 de ma, Gonzanamá hasta Macará. En julio de 1804 regresan desde Filadelfia agosto de 1802, dejan el Ecuador y se hasta Francia (Nelken, 1980). dirigen al Perú, posteriormente el 9 de enero de 1803 regresan a Guayaquil, donde se reúnen con Juan Tafalla, botá-

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nico español, y visitan Samborondón. 14 000 especies, ningún otro viaje Durante su estadía en el Ecuador reco- había añadido tantas nuevas especies de rren un total de 169 localidades, en la plantas. mayoría de éstas, Humboldt y Bon- Muchas de las especies descritas pland, hacen colecciones de plantas y por Humboldt, Bonpland y Kunth fue- de otros organismos, además de valio- ron anteriormente descritas e ilustradas sas observaciones y gráficos que serán por el botánico español radicado en esenciales para el progreso de la botáni- Colombia José Celestino Mutis (1770- ca y la fitogeografía (Sandwith, 1926). 1806); sin embargo, los datos de Mutis no llegaron a publicarse sino mucho Resultados científicos del viaje después que los de Humboldt. Humboldt a América Una de las publicaciones más com- pletas con las descripciones de las plan- Colecciones de plantas: tas colectadas es la obra en siete tomos: Se colectaron más de 25 000 especí- “Nova Genera et Species Plantarum” menes de plantas, además de datos cli- descritas por Kunth, Bonpland y Hum- matológicos, geográficos y ecológicos boldt (1815-1825). Las colecciones se hicieron por tri- Aporte de las colecciones realiza- plicado y fueron enviadas a París en das por Humboldt y Bonpland para tres diferentes barcos para evitar perdi- la botánica del Ecuador das, todas llegaron. Humboldt y Bonpland fueron los Entre los años 1805-1825 Hum- primeros botánicos que hicieron una boldt, Bonpland y Kunth, botánico ale- colección importante de plantas ecuato- mán discípulo de Willdenow, trabajaron rianas que fue transportada exitosamen- arduamente en la catalogación, identifi- te a Europa. Sus colecciones fueron cación y descripción en estas muestras. depositadas en los principales herbarios de esa época París y Berlín y fueron la Descripciones de plantas: base para la publicación de muchos Se realizan descripciones de 7 000 nuevos taxones ecuatorianos. diferentes especies de plantas incluyen- En la publicación en dos tomos de do 4 000 nuevas especies para la cien- “Plantes Équinoxiales” (Humboldt y cia. De estas descripciones 5 500 fue- Bonpland 1808, 1809), describen por ron angiospermas (plantas con flores), primera vez varias plantas americanas de éstas 3 000 eran enteramente nuevas y más de 20 nuevas especies ecuatoria- (Humboldt, 1807). nas con sus respectivas ilustraciones. La diversidad de las plantas conoci- Algunas de ellas muy útiles como es el das en el mundo aumentó de 10 000 a caso de Andromachia igniaria, cuya

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116 Katya Romoleroux

corteza era utilizada para encender leña 1. “Ideas para una Geografía de las (Suplemento Ministerial, 2009); en Plantas” (1807), más un Cuadro de Loja, Humboldt estudia las variedades la Naturaleza de los países tropica- de Cinchona o quinina, la planta curati- les, esta publicación contiene: va contra la malaria, descubre una A. Descripciones de 17 diferentes for- variedad nueva y mejor a la que nom- mas de vida de las plantas; es decir, bran Cinchona condaminea (Minguet, las adaptaciones ecológicas de las 1985). Aunque los duplicados de estas plantas, este fue el primer sistema especies tipo enviados a Berlín fueron de formas de vida vegetales pro- quemados durante la segunda guerra puesto. mundial, la mayoría de especies tipo se B. Descripción de la relación entre encuentran en la actualidad en el Her- clima, elevación y distribución de bario de París y algunos herbarios esta- las plantas en los trópicos plasmado dounidenses y otros europeos, ya que en su Cuadro de la Naturaleza, con en muchos casos se hicieron más de tres el volcán Cotopaxi y el Chimborazo duplicados. Actualmente, se cuenta con como modelos. La distribución alti- imágenes digitalizadas de muchas de tudinal de los taxones vegetales fue ellas. correlacionada con 14 diferentes parámetros abióticos. Fue la prime- Aporte del viaje de Humboldt ra descripción de cinturones altitu- para la Geografía de las Plantas dinales de vegetación de los Andes y Ecología vegetal y de los trópicos. Después de del viaje de Humboldt y 2. “La distribución geográfica de las Bonpland y sus observaciones, prácti- plantas en relación al clima y a la camente fundan el nuevo campo de la elevación” (1817), esta publicación ciencia que es el estudio de la Fitogeo- contiene: grafía o Geografía de la plantas en los A. Análisis de la distribución mundial trópicos. El concepto de Humboldt de la riqueza de especies, basados sobre geografía de las plantas fue bas- en las familias de plantas. Constitu- tante amplio e incluye distribución, ye el primer análisis de biodiversi- ecología y biodiversidad, posterior- dad. mente se diferenciaron como discipli- B. Comparación latitudinal de los cin- nas separadas. turones altitudinales de vegetación, Las dos principales publicaciones desde el ecuador hasta los polos, en las que Humboldt plasma sus estu- Humboldt demuestra que los cintu- dios sobre la geografía de las plantas rones altitudinales de vegetación, son: que incluyen las líneas de bosque,

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decrecen hacia las latitudes más Tübingen u. Paris. altas. Los cambios latitudinales y de Humboldt, F. W. H. A. Von. 1817. La elevación en la vegetación son simi- distribución geográfica de las plan- lares y correlacionados con los cam- tas en relación al clima y a la eleva- bios climáticos (temperatura). Esta ción. Librariae Graeco Latino Ger- correlación entre temperatura y los manico, Paris. cambios de latitudinales y altitudi- Kunth K. S., A. Bonpland y F. W. H. A. nales en la vegetación es llamada la von Humboldt. 1915-1825. Nova Ley de Humboldt. Genera et Species Plantarum, vols. Se puede afirmar que Alexander 1-7, Librariae Graeco Latino Ger- von Humboldt fundó las ciencias de la manico, Paris. Ecología vegetal y la Fitogeografía Minguet, C. 1985. Alejandro de Hum- como resultado de sus viajes al Ecuador boldt Historiador y Geógrafo de la y otras regiones tropicales con Aimé de América Española (1700-1804), Bonpland durante 1799 y 1804. Por lo vol. 1. Imprenta Universitaria, Méx- tanto, con la llegada de Humboldt, hace ico. 200 años, se iniciaron los estudios de Nelken, H. 1980. Alexander von Hum- vegetación en el Ecuador y fueron el boldt. Bildenisse und Künstler eine puntal para varios botánicos que siguie- Dokumentierte Ikonographie, ron estudiando y publicando descrip- Berlin. ciones de la vegetación y de la Fitoge- Sandwith, N. Y. 1926. Humboldt and ografía ecuatoriana. Bonpland´s itinerary in Ecuador and Peru. Kew Bulletin 181-190. Suplemento Ministerial. 2009. Plantas BIBLIOGRAFÍA Ecuatorianas Bicentenarias: Hum- boldt y Bonpland, contribución al Botting, D. 1973. Humboldt and the conocimiento de la flora del Ecua- Cosmos. Prestel, Munich. dor, Mayo 2009. Ministerio de Cul- Humboldt F. W. H. A. von y A. Bon- tura, Quito, Ecuador. pland. 1808, 1809. Voyage de Hum- boldt et Bonpland. Plantes Equinocciales, vol. 1, 2. Tübingen u. Paris. Humboldt, F. W. H. A. von y A. Bon- pland. 1807. Ideen zur einer Geo- graphie der Pflanzen nebst einen Naturalgemälde der Tropenländer.

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Two Hundredth Anniversary of Humboldt – University, time for new cooperations with old friends

Peter Hegemann

Instituto de Biología, Biofísica experimental, Universidad Humboldt de Berlin

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The Berlin University was founded Darwin, who established the first con- by the linguist Wilhelm von Humboldt sistent concept about “The Origin of (WvH) in 1810 under a strong influence Species”. of the philosopher Fichte and the the- The international and interdiscipli- ologian Schleiermacher. In the follow- nary perspective of both AvH and WvH ing years the University was greatly and – for his time – exceptional inde- promoted by the natural Scientist pendence of political supervision has Alexander von Humboldt (AvH) who established the Berlin University as a was basically an interdisciplinary and paradigm for many other Universities internationally active observer and col- world wide. The highest proficiency lector. The young University acquired level was reached around 1900 before it and established great collections in the declined during World War I and during fields of botany, geology, mineralogy, the Nazi Regime, and totally collapsed paleontology, zoology etc. that are during World War II. During the DDR based on AvHs own expeditions and time a few branches again reached research activities in South America world standard but a broad internation- and Russia, on his promotion of expedi- al cooperation and the reestablishment tians of other scientists world wide, but of former cooperation has been possi- – equally important – on his and WvHs ble only after reunification of the coun- great political influence. The collec- try. The Times that AvH has spent in tions have been steadily extended and South America, and in Ecuador in par- many of them are now unified within ticular, his excursions including the the Museum of Natural Science in profit that has been gained from it Berlin, which is the second largest of its should be reconsidered and the connec- kind in Europe. The collections had a tions he established in these lands. strong influence on many zoologists in Klaus Angerer of our group is work- Europe and in particular on the Charles ing on a project that traces and critical-

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Two Hundredth Anniversary of Humboldt – University, 119 time for new cooperations with old friends

ly analyses the modes of sample collec- edge and how they contribute to a sus- tion and exploitation of biological tainable development of the region. In materials (Biodiversity Prospecting), the Sumaco biosphere reserve, cacao is which is with the perspective of com- produced in both forms of land use sys- mercialization an extremely sensitive tems, in monoculture and in the chakra issue, disregarding in past the interest system, which will allow her to com- of the home countries. pare both systems directly. Daniela Selesi will consider and Other members of the group will analyze factors that determine the effi- follow up AvHs climatology studies at ciency of a sustainable agriculture and different altitudal levels around the vol- the perspective for ancient crops in canos. such context. This will involve special We will also briefly discuss current considerations of the ethnic and cultur- projects of our group at the Humboldt al circumstances as well as the particu- University and discuss the potential for lar climatic and logistic conditions of further cooperation with local universi- Ecuador. The aim of the study will be to ties in Quite and in Ecuador in general. show the development of land use systems in the context of cacao production. The focus will be on how traditional agricultural systems are modified today by combining existing and new knowl-

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¡Humboldt tenía la razón!

Christoph Hirtz Fotógrafo, Quito

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El Chimborazo es la montaña más Y siempre me ocurre lo mismo, voy por alta del mundo. En 1802 el científico una calle, viajo por una carretera, o alemán Alexander von Humboldt camino por el campo y de repente ahí ascendió al coloso hasta una altura de está, la montaña, en su máxima expre- 5.881 metros sobre el nivel del mar y sión y mientras avanzo parece que la por mucho tiempo fue el récord que un altura disminuyera, la montaña se des- hombre había alcanzado. vanece en la cordillera entre los demás Esto lo llevó a afirmar que el Chim- picos. Pero nuestra imagen ya expresa borazo era la montaña más alta del lo que sentimos. mundo. En 1852 se determinó que el Aquí varios ejemplos de cómo Everest es la más alta. Pero consideran- diversos artistas ven a nuestro Chimbo- do que el globo terráqueo es achatado razo, esta hermosa montaña que es uno en los polos y ensanchado a lo largo de de los símbolos de nuestra Patria. la línea equinoccial, la posición del Chimborazo con 1,6° al sur de la línea Bibliografía: ecuatorial es privilegiada frente al Eve- Der Report-Nr.22 Magazin November rest que se encuentra 28° al norte. 1977. Entonces la distancia desde el centro de la Tierra al Everest es de 6.382.478 metros y al Chimborazo es de 6.384.673 metros, lo que nos da una altura mayor de 2.195 metros. ¡Hum- boldt tiene la razón! Todo depende de cómo se mida o se mire. A nosotros los fotógrafos, como a todos los artistas, nos impresiona el Chimborazo y lo plasmamos en nuestras imágenes con la espectacularidad que se nos presenta: alto, majestuoso. ¡Aquí cuenta la primera impresión!

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¡Humboldt tenía la razón! 121

Humboldt Atlas der kleineren Schriften

Del Viajero italiano Osculati

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122 Christoph Hirtz

Anónimo

Emilio Moncayo 1940

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¡Humboldt tenía la razón! 123

Gottfried Hirtz 1942

Christoph Hirtz 2010

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INSTRUCTIVO PARA AUTORES

REVISTA ECUATORIANA DE MEDICINA Y CIENCIAS BIOLÓGICAS DE LA CASA DE LA CULTURA ECUATORIANA

La Revista Ecuatoriana de Medici- Los Trabajos de revisión y notas na y Ciencias Biológicas es el órgano científicas, tendrán un formato perso- oficial de divulgación científica de la nalizado por sus autores, pero es obli- Sección de Ciencias Naturales, Bioló- gatorio el uso de las siguientes seccio- gicas y Ciencias Exactas de la Casa de nes: Título, Autor(es), Afiliación Insti- la Cultura Ecuatoriana y de la Socie- tucional, Texto y Referencias Biblio- dad Ecuatoriana de Biología, Núcleo gráficas. de Pichincha. Sus objetivos son: divul- Las Hojas de Vida de los miembros gar artículos científicos, presentar de la Sección de Ciencias Naturales y casos médicos y publicar notas cientí- Ciencias Exactas de la Casa de la Cultu- ficas en las áreas de ciencias biológi- ra Ecuatoriana y de la Sociedad Ecuato- cas puras, aplicadas y biomédicas; esta riana de Biología Núcleo de Pichincha y revista tiene tres secciones: las Reseñas Institucionales de centros A) Artículos Originales, B) Revi- de investigación adscritos a universida- sión de trabajos y Notas Científicas y des o independientes tendrán un formato C) Hojas de Vida y Reseñas Institucio- libre. Son un ensayo libre descriptivo de nales. Las secciones B) y C) son una persona o institución que trabaje en opcionales. áreas importantes de la medicina y de las Los Artículos originales provienen Ciencias Exactas y Naturales. de trabajos de investigación científica realizados por los autores, es responsa- Formato del manuscrito bilidad de ellos el uso de datos de terce- Los manuscritos deben ser presenta- ros. Los artículos originales constarán dos, en idioma español o inglés, en de las siguientes partes: Título, papel A4, con los cuatro márgenes de Autor(es), Afiliación Institucional, 2,5 cm, tipo de letra “Times New Resumen, Palabras Clave, Abstract, Roman” 12 puntos, doble espacio, jus- Keywords, Introducción, Materiales y tificado y páginas numeradas. Métodos, Resultados, Discusión, Con- Título en minúsculas, con una clusiones, Agradecimientos y Referen- extensión ideal de 15 palabras, negrita, cias Bibliográficas. centrado, 14 puntos. Ejemplo:

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Preferencia de estratos boscosos dor DVela col., mar. 2001. Ocho parati- en la alimentación de Turdus fuscater pos (disectados y guardados en micro- del Pasochoa tubos), etiquetados D. quillu paratipo Autor o Autores: Nombre(s), Ape- DVela det. 2003 / Pasochoa, Pichincha, llido(s), en negrita, centrado, 12 puntos. Ecuador DVela col., abr. 2002. Holoti- Ejemplo: pos y paratipos depositados en el Juan Eduardo Pueblo P.1 & Este- QCAZ. lita Estrella2 RESUMEN con una extensión Afiliación institucional: Institución, máxima de 200 palabras. Palabras ciudad, país, correo electrónico del clave: cinco palabras separadas por autor encargado de la correspondencia: coma, la primera letra en mayúscula y Si los autores representan a diferentes en orden alfabético instituciones indicar con un numeral, el ABSTRACT (Título en inglés) tra- texto en 10 puntos, centrado. Ejemplo: ducción del resumen, Keywords: pala- 1Centro de Investigaciones Científi- bras clave traducidas al idioma inglés. cas del IASA, Facultad de Ciencias Como se nota de los puntos 7 y 8 los Agropecuarias, ESPE, Sangolquí, títulos de las secciones van en mayús- Ecuador. [email protected]. culas, negrita, 12 puntos. Si se requiere 2Departamento de Zoología, Escue- un subtítulo este va en el mismo párra- la de Biología, Universidad Amazónica fo con negrita, separado del texto por del Uruguay. punto y raya. Para los nombres genéricos y espe- Las figuras (esquemas, diagramas, cíficos usar itálicas y al ser citados por dibujos, gráficos, fotografías y mapas) primera vez en el texto, se debe incluir deben ser preparadas en formato JPG, y el nombre del autor(s) y el año de publi- presentase en hoja aparte y numeradas, cación. adoptando el criterio de rigurosa econo- En los trabajos que así lo requieran mía de espacio, considerando, que el es necesario presentar el listado del área útil de la página (16,5 x 24 cm) y la material examinado, con las coordena- columna (8 x 24 cm) con el título al pie das de las localidades muestreadas de la figura en 12 puntos. La posible ubi- (dentro de lo posible), asimismo citar cación de las figuras deben señalarse en las instituciones depositarias de los el texto del manuscrito con una cita en especímenes. Ejemplo: paréntesis. Ejemplo (Figura 1, aquí). El Material examinado: Holotipo Comité Editorial se reserva el derecho (disectado y guardado en microtubo), de ubicar las figuras, en función del etiquetado D. quillu holotipo DVela espacio disponible, o solicitar a los auto- det. 2003/Pasochoa, Pichincha, Ecua- res hacer los cambios correspondientes.

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Las tablas deben presentarse con el DYKE, F. G. V.; BROKE, R. H. & título en la parte superior, de un modo SHAW, H. G. 1986. Use of road track conciso y explicativo, en 12 puntos. La count as indices of mountain lions pre- posible ubicación de las mismas, igual sence. Journal of wildlife Management, debe ser indicada como en el punto 10. Bethesda, 50(1): 102-109.

REFERENCIAS BIBLIOGRA- b) CAPÍTULO DE LIBRO FICAS. Se prefieren a revisiones que EISENBERG, J. F. 1979. Habitat, provengan de artículos publicados en economy and society: some correla- revistas científicas indizadas, libros tions, and hypotheses for the Neotro- reconocidos, tesis de doctorado, maes- pical primates. En: Bernsteind, I.S tría o pre-grado que reposen en las and O.E. SMITH. eds. Primates eco- bibliotecas de las instituciones otorgan- logy and human origins: ecologycal tes. Los artículos en revisión o en pren- influences on social organization: sa, así como las comunicaciones perso- 215- 262. Granland STPM Press. nales se citarán en el texto, pero no for- New York y London. marán parte de la bibliografía. Las refe- c) TESIS DE GRADO rencias, deben constar en el texto JIMÉNEZ P., P. J. 1995. Área de vida numeradas entre paréntesis y aparecer y uso preferencial del hábitat de de acuerdo a la secuencia de citación. Cebus albifrons (Primates: Cebidae) Ejemplos de referencias bibliográficas: en Cuyabeno, Amazonía Ecuatoria- na. Tesis de Licenciatura, Pontificia ARTÍCULO DE REVISTA Universidad Católica del Ecuador. CIENTÍFICA Quito, Ecuador. DUCHICELA, E. J. I. 2004. Diversi- dad funcional de las micorrizas arbuscu- d) LIBROS ENTEROS lares asociadas a Brosimun utile en con- KREBS, C. H. 1985. Ecología: estu- diciones naturales. Ciencia 7(8): 65-77. dio de la distribución y abundancia. STAIKOU, A. & LAZARIDOU- Segunda edición. Harla. Ciudad de DIMITRIADOU, M. 1991. The life México. 340 pp. cycle, population dynamics, growth and secondary production of the snail e) INFORMACIÓN Xeropicta arenosa Ziegler (Gasteropo- PROVENIENTE DE INTERNET da: Pulmonata) in northern Greece. Ciertas páginas que tengan informa- Zoological Journal of Linnean Society, ción científica relevante pueden London, 101: 179—188. citarse así: DI FlORE, A. 2001. Pro- yecto Primates Ecuador.

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Página de Internet: tros asignados por el editor, su aproba- www.nyu.edu/projects/difiore Con- ción estará sujeta al contenido científi- sultada 13-enero-2006. co, respaldado por el parecer de los árbitros y del comité Editorial. Se soli- En la presentación de casos, las citará a los autores realizar los cambios referencias bibliográficas deben ir de y sugerencias pertinentes mediante la acuerdo a la connotación editorial inter- devolución de los manuscritos o docu- nacional que consta en la página web: mento electrónico, acompañados de las http://www.icmje.org/. sugerencias. Para la presentación de casos, notas El autor principal deberá enviar el científicas, hojas de vida o reseñas ins- manuscrito original (más dos impresio- titucionales, igualmente dirigirse a los nes, una copia electrónica del docu- editores de la Revista o al Presidente mento en CD bajo el formato Word del Núcleo de Pichincha de la Sociedad 3000 o inferior y de ser factible por vía Ecuatoriana de Biología (SEB-P). electrónica), acompañado de una carta Información disponible en el portal de dirigida al Editor de la Revista, indican- Internet de la SEB-P http://www.sebpi- do la originalidad del trabajo. Los chincha.org/ manuscritos serán revisados por árbi-

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