Efeitos Do Veneno De Loxosceles Similis No Modelo De Implante Subcutâneo De Esponja Em Camundongos Swiss
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1 Núbia Braga Pereira Efeitos do veneno de Loxosceles similis no modelo de implante subcutâneo de esponja em camundongos Swiss Belo Horizonte - MG Faculdade de Medicina Universidade Federal de Minas Gerais Fevereiro de 2014 2 Faculdade de Medicina Tese de doutorado Efeitos do veneno de Loxosceles similis no modelo de implante subcutâneo de esponja em camundongos Swiss Tese apresentada ao curso de Pós-graduação em Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Patologia. Área de concentração: Patologia investigativa Orientadora: Profa. Dra. Luciana Moro Coorientadores Profa. Dra. Silvia Passos Andrade Prof. Dr. Evanguedes Kalapothakis Dra. Patrícia Martins Parreiras Fevereiro de 2014 3 4 5 Ainda que eu falasse as línguas dos homens e dos anjos, e não tivesse amor, eu nada seria.... 1 coríntios 1:14 6 AGRADECIMENTOS Ao Deus da minha vida, obrigada por estar ao meu lado, todo o tempo e, por me carregar no colo nos momentos de exaustão. Minha eterna gratidão a ti, por cada uma das pessoas, que eu citar nesses agradecimentos, que o Senhor amorosamente colocou na minha vida, sem elas a minha caminhada até aqui não teria sido possível. Aos meus pais, pelo exemplo de vida, pelo amor incondicional, por sempre me incentivar e me apoiar em tudo. Sei o que quanto essa conquista é gratificante para vocês e o quanto vocês torceram para que esse dia chegasse. Minha eterna gratidão a vocês. Amo muito vocês. Aos meus irmãos Henrique, Davidson, Graciely e Dalisa, o apoio de vocês foi essencial para eu continuar firme e não desistir. Obrigada pela torcida, amor e pelos momentos de descontração ao longo de todos esses anos. Olívia, princesa mais linda da tia, a sua chegada adoçou ainda mais a minha vida. À minha vó Geralda, à minha vó Conceição, à família Braga e família Amorim por todo incentivo, pela torcida e pelo apoio. À minha orientadora Profa. Luciana Moro, pela confiança depositada em mim, pela sua dedicação, disposição e por ter me acolhido, antes mesmo de me conhecer. Foram oito anos de convívio, dias difíceis e dias bons, mas vencemos! Serei eternamente grata por todo o cuidado que você teve com a minha formação, tanto na patologia, na pesquisa, na biossegurança e na minha caminhada como docente. Ver a sua alegria e emoção quando eu passei no concurso de profa. Substituta foi imensamente gratificante para mim. Obrigada! À profa. Silvia Passos Andrade, pela coorientação, paciência, disposição, ensinamentos e apoio sempre. Obrigada por abraçar a minha causa e o nosso projeto com todo amor, dedicação e pelos valiosos ensinamentos. Ao professor Evanguedes Kalapothakis, pela coorientação, ensinamentos, críticas e sugestões. À Dr. Patrícia Martins Parreiras, pela coorientação, paciência e disponibilidade sempre. Obrigada pelos valiosos ensinamentos sobre biossegurança, bem estar animal e pela correção da minha tese. Ah, e pelos conselhos nas diversas áreas da vida. c 7 À profa. Paula Peixoto Campos, pelo apoio, colaboração, disposição e apoio em todos os experimentos e em tudo que precisei. Obrigada pelo incentivo na minha caminhada docente, pelos conselhos e pelas caronas (rrsss). Aos membros da banca prof. Mary Suzan, prof. Paulo Alencar, profa. Roselene Ecco e Profa. Milene Alvarenga Rachid por aceitarem me avaliar e pelas valiosas críticas e sugestões. À minha amiga Teresa! Terê obrigada pelos bons momentos, por caminhar ao meu lado, por sorrir e chorar comigo, pelas nossas conversas. E também por toda a sua disposição em me ajudar nos experimentos e nas análises. À minha amiga Irma Ximena, pela disposição, amizade e bons momentos vividos. Você já está fazendo muita falta. Muito obrigada! Aos meus companheiros de laboratório Bruno, Heloisa, Camila Raiana, Camila Couto, Barbarela e Tati Vet. Obrigada por todo apoio, incentivo, companheirismo, solidariedade e também pelos momentos de descontração. As minhas alunas de iniciação científica Camila Couto e Camila Raianna pelo apoio e dedicação. À minha amiga Marlene de Miranda, do Laboratório de Genética, por ter levado o meu curriculum até a profa. Luciana Moro, para eu fazer um estágio voluntário no laboratório de apoptose. Foi através de você que tudo começou... Minha madrinha científica, muito obrigada! Sorray e Olinda, obrigada por todo o apoio, atenção e dedicação. O trabalho de vocês foi fundamental para que esse trabalho acontecesse. Aos colegas Celso, Poliane e Suzane, do Laboratório de Angiogênese, por ter me acolhido e me auxiliado nas análises bioquímicas. Aos integrantes do Laboratório de Aracnologia, ICB/UFMG: prof. Adalberto J. Santos, Bárbara Teixeira Faleiro e ao Pedro pelas imagens de Loxosceles, pela atenção e pelo apoio sempre que precisei . Ao prof. Gregory Kitten, pelo auxilio na escolha dos anticorpos e pelo auxilio na técnica de imunofluorescência. Ao professor Laser Antônio, por todo apoio, críticas, sugestões na imunofluorescência e pela colaboração. Ao professor Hélio Chiarini, por todo auxilio e apoio na microscopia eletrônica de transmissão. 8 Aos técnicos do CAPI (Centro de aquisição e processamento de imagens) do Instituto de ciências biológicas da UFMG: Diego, Olga, e Ivete pelo apoio, pelo processamento do material e auxilio na aquisição das imagens da microscopia eletrônica de transmissão. Ao professor Anilton César Vasconcelos, chefe do laboratório de Apoptose, obrigada por me acolher no seu laboratório, pelo seu apoio didático e científico sempre que precisei. Ao departamento de Patologia Geral: a todos os professores que me apoiaram sempre que precisei e também as secretárias Marília e Regina, por todo o cuidado e disposição. À profa. Carolina Cavalieri, com quem tive a oportunidade de dividir a disciplina de Patologia Geral por três semestres. Obrigada pelo incentivo e apoio durante todo esse tempo. À Dona Áurea Moro, não posso esquecer-me da senhora, sempre tão carinhosa, risonha e receptiva. Obrigada pelos cafés com chocolate e por ter rezado junto a Deus para que eu passasse no concurso de profa. substituta. Deu certo, ele ouviu as suas preces. Obrigada! Aos meus amigos Nilbe, Cassiano, Patrícia e Alex, Patrick e Agnes mesmo tão longe, eu pude contar com vocês sempre que precisei. Obrigada pelas orações e cuidado! Às minhas amigas Vanessa, Rose, Vivian, Ana Patrícia e Grossolina, Gisele por todo apoio e pela amizade durante esse tempo. Vocês nunca mediram esforços em apoiar em todas as horas À toda equipe da Pós-graduação em Patologia: coordenação, colegiado, professores, colegas de mestrado e doutorado e secretárias por todo auxílio e dedicação. Aos meus professores e amigos da minha época de graduação (PUC-Minas). Profa. Andréa Carla Leite Chaves foi com você que eu dei os meus primeiros passos dentro da Ciência e da Pesquisa. Obrigada! 9 Esse estudo foi realizado com o apoio financeiro das seguintes instituições: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais 10 RESUMO CAPÍTULO 1 O envenenamento por aranhas do gênero Loxosceles provoca um conjunto de sinais e sintomas, chamado de loxoscelismo, que na maioria dos casos manifesta-se através do quadro dermonecrótico. O modelo mais utilizado para o estudo do loxoscelismo cutâneo é o coelho. No entanto, o desenvolvimento de um modelo animal de menor porte, fácil manuseio, menor custo e manutenção são necessários para o estudo da patogênese do loxoscelismo. A inflamação provocada pelo veneno bruto de Loxosceles similis, foi avaliada considerando a ativação de neutrófilos e macrófagos, vasodilatação, hiperemia, edema, hemorragia e a produção do TNFα e VEGF utilizando o modelo murino de implante de esponjas. Trinta e dois camundongos Swiss, machos (6-8 semanas) foram implantados subcutaneamente com discos de esponjas de poliéster-poliuretano. Quatorze dias após a implantação os animais foram separados em dois grupos: (1) grupo controle: 16 camundongos que receberam intra- implante 30 µL de solução salina; (2) grupo tratado: 16 camundongos que receberam a injeção intra-implante de 30 µL (0.5 µg) do veneno bruto de L. similis. Os animais foram eutanaziados com xilazina/quetamina 1h e 4h pós-injeção intra-implante. Microscopicamente, os implantes dos grupos tratados apresentaram inflamação aguda caracterizada por: infiltrado neutrofílico, edema, vasodilatação, hiperemia e hemorragia intensa. Alguns vasos apresentaram-se com as suas paredes rompidas. Através da análise morfométrica foi possível observar que a área de vasos foi significativamente maior nos grupos tratados. Os parâmetros bioquímicos como: conteúdo de hemoglobina, níveis das citocinas fator de necrose tumoral (TNFα), fator de crescimento endotelial (VEGF), atividade das enzimas n-acetil- β- glucosaminidase (NAG) e mieloperoxidase (MPO) foram significativamente maiores nos grupos tratados. Os efeitos do veneno de Loxosceles no tecido de granulação do implante em camundongos foram similares ao que se observa no loxoscelismo cutâneo em outras espécies (humanos ou coelhos). Consequentemente, o modelo murino de implante de esponjas promove um novo método para investigação de mecanismos celulares e moleculares associados com o loxoscelismo cutâneo. Palavras chaves: Loxoscelismo, implante de esponja, Loxosceles, Loxosceles similis 11 ABSTRACT CHAPTER 1 Envenomation by Loxosceles spider bite leads to a set of signs and symptoms, called loxoscelism, which in most cases manifests through the dermonecrotic frame. The development of a smaller size animal model, of easy handling and