Universidade Estadual De Campinas Instituto De Biologia

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA

AMANDA TEIXEIRA MESQUITA

ESTUDOS CROMOSSÔMICOS EM 16 ESPÉCIES PERTENCENTES À FAMÍLIA SOLANACEAE JUSS.

CHROMOSOMAL STUDIES IN 16 SPECIES BELONGING TO THE FAMILY SOLANACEAE JUSS.

CAMPINAS

2016

AMANDA TEIXEIRA MESQUITA

ESTUDOS CROMOSSÔMICOS EM 16 ESPÉCIES PERTENCENTES À FAMÍLIA SOLANACEAE JUSS.

CHROMOSOMAL STUDIES IN 16 SPECIES BELONGING TO THE FAMILY SOLANACEAE JUSS.

Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Biologia Vegetal.

ORIENTADORA: ELIANA REGINA FORNI MARTINS COORIENTADORA: MARÍA VICTORIA ROMERO DA CRUZ

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA AMANDA TEIXEIRA MESQUITA E ORIENTADA PELO PROFA. DRA. ELIANA REGINA FORNI MARTINS.

CAMPINAS

2016

Campinas, 17 de fevereiro de 2016

COMISSÃO EXAMINADORA

Profa. Dra. Eliana Regina Forni Martins

Profa. Dra. Giovana Augusta Torres

Prof. Dr. André Olmos Simões

Prof. Dr. João Semir

Prof. Dr. Ricardo Augusto Lombello

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

Aos meus pais, Edilson e Isabel, sinônimos de coragem e determinação, dedico.

AGRADECIMENTOS O ingresso na pós-graduação foi para mim, mais uma etapa para a realização do sonho de uma criança curiosa, que queria ser cientista, pesquisadora e com igual entusiasmo, uma docente. Desde o primeiro dia como mestranda aqui na Instituição, tive o prazer de conviver com pesquisadores incríveis já consolidados e também com aqueles que, assim como eu estão no processo de formação como acadêmicos. Tudo isso, foi uma motivação, fazendo com que esse percurso fosse muito prazeroso. Por isso, tenho muito a agradecer à Unicamp pela oportunidade, ao Programa de pós-graduação em Biologia Vegetal e ao Laboratório de Biossistemática e Polinização, por fornecer todos os subsídios necessários à minha formação. Agradeço também ao Cnpq pela concessão da bolsa de estudos que possibilitou a condução dessa pesquisa. Agradeço imensamente à minha orientadora, Profa. Dra. Eliana Regina Forni Martins, por ter confiado no meu trabalho desde o início e apoiado minhas aspirações. Agradeço pelos ensinamentos compartilhados, pelas longas conversas sobre o fantástico mundo dos cromossomos, a atenção dada em todos os momentos e pela paciência acima de tudo. Sua postura e dedicação com a pesquisa e docência, são um grande exemplo que quero levar para o resto da vida! Agradeço também à minha coorientadora Dra. Maria Victoria Romero da Cruz, por me apresentar às Solanaceae e instigar a minha paixão por elas! Agradeço por direcionar meu trabalho desde o primeiro dia de mestrado e ensinar pacientemente todas as técnicas utilizadas no desenvolvimento dessa pesquisa. Além de tudo agradeço pela amizade, conselhos e grande exemplo de dedicação profissional! Agradeço aos professores pela troca de experiência e por compartilhar seus conhecimentos que só os longos anos de pesquisa, campo e docência podem proporcionar. Não posso me esquecer também de todos os funcionários do departamento que, com desempenho de suas funções na Instituição contribuíram para a realização desse trabalho, em especial agradeço à secretária do programa Maria Roseli. Ao Marcelo Monge e ao Prof. Dr. João Vascocellos Neto agradeço pela ajuda no envio de frutos e sementes. Agradeço aos membros da minha banca de qualificação e pré banca, Profa. Dra. Eliane Kaltchuk dos Santos, Prof. Dr. João Semir, Dra. Luana Olinda Tacuatiá, Prof. Dra. Lisete Chamma Davide e Profa. Dra. Giovana Augusta Torres, pelas valiosas contribuições para a finalização desse trabalho. Agradeço também, à toda equipe do Laboratório de Citogenética da Universidade Federal de Lavras, pela ajuda concedida em vários momentos no decorrer no desenvolvimento da minha pesquisa. Agradeço aos meus queridos amigos de laboratório de Biossistemática: João, Luana, Vic, Raquel, Rafael e Thaíssa. Cada um com suas qualidades e particularidaes, foram amigos,

conselheiros e companheiros! Acima de tudo, se tornaram parte da minha família em Campinas, e fizeram os meus dias mais felizes dentro e fora do laboratório. Aos colegas de pós-graduação, agradeço pela ótima convivência, troca de experiências e longas conversas que de fato despertaramem mim, a paixão pela botânica! Agradeço também, às minhas amigas da Casamarela por serem mais uma parte da minha família em Campinas, ajudando assim a conviver melhor com a saudade de casa. Aos meus pais, Edilson e Isabel, maiores exemplos de vida que eu poderia ter, agradeço pelo otimismo que me faz tentar perceber a melhor parte de todas as situações, mesmo as mais adversas. Por acreditarem e me fazer acreditar na capacidade de realizar todos os meus sonhos! Agradeço o apoio, a confiança e, acima de tudo pelo nosso lar sempre receptivo nas minhas voltas pra casa! Aos meus irmãos, Lucas e Marco Tulio, agradeço à amizade que nos une, o companheirismo e os momentos tão divertidos que partilhamaos ao longo desses anos! Ao Murilo, grande incentivador dos meus sonhos, por ser grande parte do que falta em mim, principalmente calma e paciência. Agradeço pelos nossos momentos e pela cumplicidade, por viver comigo mesmo que à distância, essa etapa tão importante para a minha formação, se interessando pelo meu trabalho e apoiando as minhas idéias. Te amo! Aos meus familiares, agradeço pelo carinho, torcida e orações. Ao Claudio, Elenice e família, agradeço pela receptividade e hospitalidade, pelos momentos tão incríveis que fizeram com eu me sentisse parte da família de vocês! Por fim, agradeço às muitas outras pessoas que partilharam comigo vários momentos durante essa etapa, que de alguma forma contribuíram para a realização desse sonho, cujos nomes não cabem aqui, mas estarão para sempre em minha memória e no meu coração!

RESUMO

A família Solanaceae Juss. é uma das mais representativas entre as angiospermas, reunindo cerca de 2.500 espécies e 100 gêneros. Possui ampla distribuição geográfica, com maior diversidade em regiões neotropicais. O uso da citogenética clássica e molecular vem sendo amplamente documentado em alguns grupos da família, mas ainda existem muitas espécies e gêneros ainda não caracterizadas citogeneticamente. O presente trabalho apresenta estudos cromossômicos em 16 espécies de Solanaceae dos gêneros Acnistus Schott, Brunfelsia L., Cestrum L., Physalis L. e Solanum L., objetivando fornecer subsídios taxonômicos e evolutivos. Foram elaborados cariótipos, incluindo bandamento CMA/DAPI e hibridização in situ (DNAr 18S e 5S), e calculadas a assimetria cariotípica e a proporção de heterocromatina em relação ao comprimento total do lote haploide (CTLH). Acnistus arborescens Schltdl., P. pubescens L. e todos os representantes de Solanum apresentaram número cromossômico 2n=24, ao passo que Brunfelsia uniflora D. Dom, 2n=22 e Cestrum laevigatum Schltdl.e C. mariuitense Kunth, 2n=16. Foi observada constância de número cromossômico em cada gênero e predominância de cromossomos metacêntricos. Exceções à simetria cariotípica ocorreram em P. pubescens, S. acerifolium Humb. & Bonpl. ex Dunal, S. concinnum Schott ex Sendtn., S. inodorum Vell. e S. palinacanthum Dunal. O bandamento cromossômico evidenciou padrões distintos de distribuição de heterocromatina entre as espécies estudadas, CMA+/DAPI-, CMA+/DAPI0, CMA+/DAPI+, CMA-/DAPI+, CMA0/DAPI+, nas posições terminais, intercalares e associadas à NOR. A proporção da heterocromatina no complemento cromossômico não está relacionada ao aumento do CTLH. Foi observada diferenciação na distribuição das sequências de DNAr entre os cinco gêneros. As espécies de Solanum e Acnistus possuem um par cromossômico que porta um sítio de DNAr 18S na região terminal do braço curto, coincidente com regiões CMA+, diferentemente de Physalis e Cestrum que apresentam dois locos. Em B. uniflora o sítio ocorre na região pericentromérica e Solanum inodorum diferenciou-se por apresentar dispersão de DNAr 18S (18 locus). O sítio de DNAr 5S mostrou- se presente em regiões intersticiais do braço curto em A. arborescens, B. uniflora e na maioria dos representantes de Solanum, exceto em S. diploconos (Mart.) Bohs, (região pericentromérica). Solanum acerifolium e S. flaccidum apresentam um segundo locus ocupando a posição terminal e pericentromérica do braço curto, respectivamente. Em P. pubescens o sítio de DNAr 5S ocorre na posição terminal do braço curto de um par cromossômico, em C. laevigatum na região pericentromérica do braço longo e Cestrum intermedium possui dois sítios na região pericentromérica do braço longo. Os resultados obtidos mostram que apesar da

uniformidade em alguns caracteres cariotípicos presente na família, as diferenças na distribuição de heterocromatina e DNAr podem ser úteis na separação dos cinco gêneros e na melhor compreensão das tendências evolutivas em Solanaceae. No gênero Solanum, considerado megadiverso, as características cariotípicas distintas encontradas em S. diploconos, o tamanho cromossômico e o padrão de bandas heterocromáticas, podem reforçar a consideração dessa espécie (e outras relacionadas) como um gênero à parte (Cyphomandra). As diferenças encontradas também nas outras espécies podem auxiliar no entendimento da diversidade morfológica e ecológica presente em Solanum.

Palavras chave: Acnistus, Brunfelsia, Cestrum, Physalis, Solanum, números cromossômicos, bandamento CMA/DAPI, FISH (DNAr).

ABSTRACT

The family Solanaceae Juss. is one of the most representative among the angiosperms, comprising around 2,500 species and 100 genus. It has a broad geographic distribution, with greatest diversity in neotropical regions. The use of classical and molecular cytogenetics has been widely documented in some family groups, but there are many species and genus not characterized cytogenetically yet. This work presents chromosomal studies in 16 Solanaceae species belonging to the genus Acnistus Schott, L. Brunfelsia L., Cestrum L., Physalis L. and Solanum L., and aims to provide taxonomic and evolutionary subsidies. Fluorescence banding (CMA/DAPI) and ribosomal DNA mapping (rDNA 5S and 18S) data were used for karyotype description. The karyotype asymmetry and the proportion of heterochromatin of the total length of the haploid lot (CTLH) were calculated. Acnistus arborescens Schltdl., P. pubescens L. and all Solanum species studies here showed chromosome number 2n= 24, while Brunfelsia uniflora D. Dom presented 2n= 22 and Cestrum laevigatum Schltdl. e C. mariuitense Kunth 2n= 16. The chromosome number was regular in each genus with predominance of metacentric chromosomes. Exceptions in karyotype symmetry were observed in P. pubescens, S. acerifolium Humb. & Bonpl. ex Dunal, S. concinnum Schott ex Sendtn., S. inodorum Vell. and S. palinacanthum Dunal. Flurescence banding showed distinct patterns of heterochromatin distribution among some species (CMA+/ DAPI-, CMA+/ DAPI0, CMA+/ DAPI+, CMA-/ DAPI +, CMA0/ DAPI+) at positions (terminal, interstial position, and NOR associated). The amount of heterochromatin present in chromosome complement is not related to CTLH increased. Differentiation in the distribution of rDNA sequences was observed between the five genus. The species of Solanum and Acnistus have a chromosome pair that carries one 18S rDNA site in the terminal position of the short arm, coincident with CMA+ regions, while Physalis and Cestrum presented two loci. Brunfelsia uniflora, presented one site at the pericentromeric region while Solanum inodorum presented dispersion of 18S rDNA (18 loci). The 5S rDNA site was observed in interstitial region of the short arm of A. arborescens, B. uniflora and in most of the species of Solanum, except in S. diploconos (Mart.) Bohs (pericentromeric region). Solanum acerifolium and S. flaccidum have a second site in terminal and pericentromeric position of the short arm, respectively. In P. pubescens the 5S rDNA site occurs in the terminal position of the short arm of a chromosome pair, in C. laevigatum in the pericentromeric region of the long arm and Cestrum intermedium has two sites in the pericentromeric region of the long arm. Although the uniformity in some karyotypic characters present in the family, the results show that, the differences in the distribution of repetitive DNA and rDNA may be useful

in the genusidentification and better understanding of the evolutionary trends in Solanaceae. In the genus Solanum, considered megadiverse, the karyotypic features found in S. diploconos (chromosomal size and heterochromatin band pattern) can strengthen the consideration of this species (and other related) as an apart genus (Cyphomandra). Differences also found in other species may help to understand the morphological and ecological diversity present in Solanum.

Keywords: Acnistus, Brunfelsia, Cestrum, Physalis, Solanum, chromosome numbers, CMA / DAPI banding, FISH (rDNA).

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

INTRODUÇÃO GERAL Figura 1. Cladograma da Ordem Solanales (Angiosperm Phylogeny Website, versão 12, novembro de 2015) ...... 16 Figura 2. Relações filogenéticas entre os maiores clados em Solanaceae. Modificado de Särkinen et al. (2013) ...... 18 Figura 3: Acnistus arborescens. A: detalhe das flores; B: aspecto geral do ramo fértil, C: vista geral dos ramos ...... 26 Figura 4. Brunfelsia uniflora. A, B: detalhe das flores; C: detalhe dos frutos, D: vista geral do hábito ...... 27 Figura 5: C. mariquitense (A e B), C. laevigatum (C e D). A: detalhe das flores; B, C: Detalhe dos frutos; D: vista geral do hábito ...... 28 Figura 6: Physalis pubescens. A, B: detalhe das flores; C: vista geral do hábito; D: detalhe do fruto ...... 29 Figura 7: Solanum pseudocapsicum (A e B), S. palinacanthum (C e D). A, B, C: detalhe da flor; D: detalhe do fruto ...... 30 ESTUDOS CROMOSSÔMICOS EM 16 ESPÉCIES DE SOLANACEAE: NÚMERO, TAMANHO E MORFOLOGIA DOS CROMOSSOMOS, BANDAMENTO CMA/DAPI E FISH Figura 1. Representação gráfica da análise de variância do comprimento total do lote haploide (CTLH) das espécies de Solanaceae estudadas. A-Acnistus, B-Brunfelsia, C-Cestrum, P- Physalis e S-Solanum ...... 47 Figura 2. Representação gráfica da variância da quantidade de heterocromatina evidenciada por bandamento CMA/DAPI das espécies de Solanaceae estudadas. A-Acnistus, B-Brunfelsia, C- Cestrum, P-Physalis e S-Solanum ...... 53 Figura 3: Bandamento cromossômico CMA/DAPI e hibridização in situ fluorescente em Acnistus arborescens. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm.}, par heteromórfico ...... 57 Figura 4: Bandamento cromossômico CMA/DAPI e hibridização in situ fluorescente em Brunfelsia uniflora. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm ...... 58 Figura 5: Bandamento cromossômico CMA/DAPI e hibridização in situ fluorescente em Cestrum laevigatum. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm.}, par heteromórfico ...... 59

Figura 6: Bandamento cromossômico CMA/DAPI e hibridização in situ fluorescente em Cestrum mariquitensse. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm.}, par heteromórfico ...... 60 Figura 7: Bandamento cromossômico CMA/DAPI e hibridização in situ fluorescente em Physalis pubescens. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm ...... 61 Figura 8: Bandamento cromossômico CMA/DAPI e hibridização in situ fluorescente em Solanum acerifolium. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm ...... 62 Figura 9: Bandamento cromossômico CMA/DAPI e hibridização in situ fluorescente em Solanum adspersum. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm ...... 63 Figura 10: Bandamento cromossômico CMA/DAPI e hibridização in situ fluorescente em Solanum concinnum. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm ...... 64 Figura 11: Bandamento cromossômico CMA/DAPI e hibridização in situ fluorescente em Solanum diploconos. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm ...... 65 Figura 12: Bandamento cromossômico CMA/DAPI e hibridização in situ fluorescente em Solanum flaccidum. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm ...... 66 Figura 13: Bandamento cromossômico CMA/DAPI e hibridização in situ fluorescente em Solanum inodorum. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm.}, par heteromórfico ...... 67 Figura 14: Bandamento cromossômico CMA/DAPI e hibridização in situ fluorescente em Solanum palinacanthum. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm ...... 68 Figura 15: Bandamento cromossômico CMA/DAPI e hibridização in situ fluorescente em Solanum pseudocapsicum. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm ...... 69 Figura 16: Bandamento cromossômico CMA/DAPI e hibridização in situ fluorescente em Solanum sanctae-catharinae. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm ...... 70

Figura 17: Bandamento cromossômico CMA/DAPI e hibridização in situ fluorescente em Solanum scuticum. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm ...... 71 Figura 18: Bandamento cromossômico CMA/DAPI e hibridização in situ fluorescente em Solanum variabile. A, bandamento CMA; B, bandamento DAPI; C, FISH com sondas de DNAr 5S (em vermelho) e 18S (em verde). Barra: 10 µm. D, Ideograma. Barra: 5µm ...... 72 Figura 19. Relações filogenéticas em Solanum. Modificado de Särkinen et al. (2013) ...... 77

LISTA DE TABELAS

INTRODUÇÃO GERAL Tabela 1. Maiores gêneros em número de espécies da família Solanaceae ...... 17 ESTUDOS CROMOSSÔMICOS EM 16 ESPÉCIES DE SOLANACEAE: NÚMERO, TAMANHO E MORFOLOGIA DOS CROMOSSOMOS, BANDAMENTO CMA/DAPI E FISH Tabela 1. Lista de espécies de Solanaceae coletadas, voucher e local de coleta ...... 41 Tabela 2. Pré-tratamentos utilizados para representantes de cada gênero de Solanaceae estudado ...... 45 Tabela 3: Teste de Tukey Alfa para o comprimento total do lote haploide (CTLH) de espécies de Solanaceae. A-Acnistus, B-Brunfelsia, C- Cestrum, P-Physalis e S- Solanum...... 48 Tabela 4. Características cariotípicas de espécies da família Solanaceae...... 49 Tabela 5. Teste de Tukey Alfa para quantidade de heterocromatina evidenciada por bandamento CMA/DAPI de espécies de Solanaceae. A-Acnistus, B-Brunfelsia, C- Cestrum, P-Physalis e S- Solanum ...... 52 Tabela 6. Localização dos diferentes tipos de heterocromatina evidenciada por bandamento CMA/DAPI em Solanaceae. A-Acnistus, B-Brunfelsia, C-Cestrum, P-Physalis e S-Solanum ...... 51 Tabela 7. Porcentagem de heterocromatina (evidenciada por bandamento CMA/DAPI) na composição do cariótipo e sítios de DNAr em espécies de Solanaceae ...... 56

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO GERAL ...... 17 1.1 A Família Solanaceae ...... 17 1.2 A utilização da citogenética na taxonomia de plantas ...... 21 1.3 Estudos citogenéticos em Solanaceae ...... 24 1.4 Materiais estudados ...... 26 1.4.1 Acnistus Schott ...... 26 1.4.2 Brunfelsia L...... 27 1.4.3 Cestrum L...... 28 1.4.4 Physalis L...... 29 1.4.5 Solanum L...... 30 2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 32 1 INTRODUÇÃO ...... 39 2 MATERIAL E MÉTODOS ...... 40 2.1 Material vegetal e preparo de lâminas ...... 40 2.2 Análise morfométrica do cariótipo ...... 42 2.3 Bandamento CMA/DAPI ...... 43 2.4 Hibridização in situ fluorescente (FISH) ...... 44 3 RESULTADOS ...... 44 3.1 Pré tratamentos ...... 44 3.2 Análise e morfométrica do cariótipo...... 45 3.3 Bandamento CMA/DAPI ...... 50 3.4 Hibridização in situ fluorescente (FISH) ...... 55 4 DISCUSSÃO ...... 73 4.1 Número cromossômico ...... 73 4.2 Características cariotípicas...... 74 4.3 Bandamento cromossômico ...... 80 4.4 Número e localização de DNAr ...... 83 5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 86 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 88 ANEXOS ...... 95

1 INTRODUÇÃO GERAL 1.1 A Família Solanaceae A família Solanaceae A. L. Jussieu (1789) é considerada uma das maiores famílias botânicas entre as plantas vasculares, reunindo cerca de 2500 espécies agrupadas em aproximadamente 100 gêneros (Olmstead & Bohs, 2007). De acordo com APG II (2003), Solanaceae está inserida na ordem Solanales Dumort. (1829), juntamente com as famílias Convolvulaceae Juss. (1789), Hydroleaceae Bercht. & J. Presl (1820), Montiniaceae Nakai (1943) e Sphenocleaceae (Lindl.) Baskerville (1839) (Figura 1), sendo Colvolvulaceae considerado grupo irmão de Solanaceae (Soltis et al., 2000). O que difere as Solanaceae das outras famílias da ordem são caracteres como: óvulos e semente numerosos, dois carpelos obliquamente orientados, ausência de látex, cotilédones não plicados, estilete simples e estigma único, pouco ou nada lobado (Cronquist, 1988)

Entre os gêneros agrupados em Solanaceae, cinco deles reúnem cerca de 50% de todos dos representantes da família (Tabela 1) e, Solanum L. é o mais diverso com 1500 espécies reconhecidas até o momento (Knapp, 2002 a).

Figura 1. Cladograma da Ordem Solanales (Angiosperm Phylogeny Website, versão 12, novembro de 2015).

Tabela 1. Maiores gêneros em número de espécies da família Solanaceae Gênero Número de espécies Solanum L. 1000-1500 Lycianthes Bitter ca.200 Cestrum L. ca.175 Nicotiana L. 75-80 Physalis L. ca.75 Brunfelsia L. 45 Nierembegia Ruiz & Pavón 36

De acordo com as classificações tradicionais de Solanaceae, baseadas em caracteres morfológicos, Cestroideae e Solanoideae, são consideradas as duas únicas subfamílias dentro do grupo (Hunziker, 2001; Olmstead & Palmer, 1992). Dentre as principais características em Solanoideae, destaca-se o embrião curvo contido em sementes discoides e frutos tipo baga (D’Arcy, 1979; Hunziker, 1979). A subfamília Cestroideae é caracterizada pelo embrião reto ou levemente curvado, contido em sementes angulares a subglobosas e fruto tipo cápsula (D’Arcy, 1979; Hunziker, 1979). No entanto, com a utilização de caracteres moleculares em estudos evolutivos e filogenéticos, outras classificações vêm sendo propostas, de maneira a se obter um melhor entendimento sobre a organização e evolução desse grupo (Olmstead & Palmer, 1992; Hunziker, 2001).

Olmstead et al (2008), através do estudo das regiões de DNA cloroplastidial ndhF e trnLF, em 190 espécies e 89 gêneros, propôs uma nova organização para Solanaceae em quatro subfamílias, Cestroideae, Goetzeoideae, Nicotianoideae e Solanoideae, 14 tribos, e três subtribos. Esse estudo, no entanto, possui uma amostragem baixa, uma vez que abrange apenas cerca 7,3% das espécies pertencentes à família. Särkinen et al. (2013), mediante dados moleculares e fósseis, conseguiram reunir informações sobre aproximadamente 40% das espécies de Solanaceae, e assim estabelecer uma visão geral do conhecimento sistemático para o grupo. O trabalho, o mais completo até o momento, suporta as quatro subfamílias reconhecidas por Olmstead et al. (2008) (Figura 2A) e outros clados previamente estabelecidos, principalmente aqueles pertencentes ao gênero Solanum (Figura 2B).

Figura 2. Relações filogenéticas entre os maiores clados em Solanaceae. Retirado de Särkinen et al. (2013)

Em relação à distribuição, a família é considerada cosmopolita, ocorrendo em todos os continentes, em regiões tropicais e temperadas, mas a maior diversidade está presente em regiões neotropicais. O principal centro de diversidade taxonômica e provável centro de origem da família são as América Central e do Sul, onde já foram documentados cerca de 50 gêneros e mais de 400 espécies endêmicas (D’Arcy, 1991; Olmstead, 2013). As evidências da diversificação de grupos próximos à família (por exemplo Convolvulaceae), bem como o grande número de espécies presentes na América do Sul, sugere que as Solanaceae se diversificaram após o isolamento da América do Sul, no fim do período Cretáceo (Olmstead et al., 2013). Com a ocorrência de representantes da família também no Velho Mundo, acredita- se que cerca de 10 clados foram envolvidos em 8-9 eventos de dispersão (Tu et al., 2010; Olmstead, 2013). Os primeiros clados divergentes possuem hoje uma distribuição temperada e/ou andina, refletindo as preferências originais dos mesmos (Olmstead et al., 2013).

Na América do Sul, onde há a maior diversidade de Solanaceae, é possível encontrar representantes da família em todos os ecossistemas. A maioria dos grandes clados, por exemplo, Solaneae, Capsiceae, Physalinae / Iochrominae, Petunieae e Nicotiana L., têm representação significativa em ambientes secos e úmidos, além de atingirem grandes amplitudes latitudinais, chegando a habitar locais de clima temperado (Olmstead, 2013). Essa grande amplitude ecológica pode estar relacionada a eventos de dispersão e também à grande variabilidade morfológica encontrada entre os seus representantes, favorecendo a ocupação dos mais diversos nichos.

As Solanaceae possuem hábito arbóreo, herbáceo ou arbustivo e, em sua maioria, encontram-se como ervas anuais, bianuais ou perenes, subarbustos, pequenas árvores ou trepadeiras e, raramente, como grandes árvores de dossel (Duckeodendron) (Knapp, 2010). A morfologia floral na família também é muito diversa. Alguns grandes grupos exibem flores completamente simétricas ou actinomorfas (Solanum) e outros, flores assimétricas ou zigomórficas. Entre os indivíduos que se inserem nesse último grupo existem ainda duas divisões: zigomorfia funcional (Physalis), que envolve principalmente a ordem de maturação e deiscência das anteras e zigomorfia morfológica, que se relaciona à forma dos órgãos florais, podendo ocorrer em um ou em todos os tratos florais (Nicotiana) (Knapp, 2002a). Diante da grande variabilidade foral exibida pela família, muitas síndromes de polinização são relatadas (abelhas, moscas, mariposas, outros insetos). A família também é muito diversificada nos tipos

de frutos, podendo-se encontrar cápsulas, drupas, bagas e vários tipos de frutos deiscentes não- capsulares (Knapp, 2002b).

A família Solanaceae agrupa espécies cultivadas de grande importância na alimentação, como batata (S. tuberosum L.), um dos alimentos mais utilizado em todo o mundo como fonte de carboidrato, berinjela (S. melongena L.), tomate (S. lycopersicum L.), pimentão (Capsicum annum L.) e pimentas em geral (Capsicum spp.), entre outras (Hawkes, 1999). Algumas espécies pertencentes à família também são amplamente utilizadas para fins ornamentais, como o manacá-de-cheiro (Brunfelsia uniflora D. Don), algumas espécies de petúnia, como Petunia hybrida E.Vilm. e as damas-da-noite (Cestrum spp.) (Souza & Lorenzi, 2001). Alguns representantes da família (“tabaco”, “batata”, “tomate”) são utilizados como organismos modelo para diversos estudos em biologia celular, desenvolvimento e genética (Doganlar et al., 2002; Gebhardt et al., 2003; Lim et al., 2006). Na atualidade, está disponível o sequenciamento do genoma completo da batata, tomate e pimentão (Fernandez-Pozo et al., 2015) de grande importância para a área do melhoramento vegetal. Uma característica marcante na família é a produção de grande quantidade e variedade de metabólitos secundários, que conferem proteção contra herbívoros (alcaloides, esteroides, flavonoides, terpenos, etc). Muitos desses metabólitos secundários têm sido utilizados na indústria farmacêutica para fins medicinais como a atropina (Atropa belladonna) e psicotrópicos como a nicotina (Nicotiana tabacum), além de grande utilidade na culinária como a capsaicina (Capsicum) (Heiser, 1969). Nicotiana tabacum é uma das plantas mais utilizadas no mundo para extração de drogas (Chase et al., 2003). As Solanaceae também são conhecidas pelo seu papel como colonizadores em áreas perturbadas, frequentemente encontradas em pastagens, clareiras, estradas e margens florestais e assim, consideradas espécies pioneiras (Bohs, 1995; Tabarelli et al., 1999). Com isso, as solanáceas possuem uma função fundamental na estruturação de comunidades vegetais.

1.2 A utilização da citogenética na taxonomia de plantas Os primeiros estudos cromossômicos foram relatados no fim do século XIX, na descrição dos processos relacionados à mitose e, o envolvimento de “uma figura cromática nuclear” (cromossomos). Posteriormente, foram publicadas descrições de cromossomos mitóticos em plantas e animais por Strasburguer, em 1875 e Flemming, em 1879-1882 e esses trabalhos constituem a base dos modernos estudos cromossômicos, principalmente dos processos de divisão celular (Sumner, 2003). Outros trabalhos importantes são os de Balbiane (1881), que descreveu pela primeira vez os cromossomos politênicos e de Flemming (1883), que encontrou os cromossomos plumosos, estudando anfíbios (Guerra, 1988). Diante de todas

as descobertas na área da citologia nesse período e, baseada nas Leis Mendelianas da herança, foi proposta a “Teoria da herança cromossômica”, que possibilitou a união de duas áreas, genética e citologia em uma nova vertente de estudos, a “Citogenética” (Guerra, 1988; Sumner, 2003). Sendo assim, a Citogenética atual agrega todo estudo relativo aos cromossomos, isolados ou em conjunto, e tudo o que se relaciona à sua morfologia, organização, função, replicação além de sua variação e evolução (Guerra, 1988).

Estudos citogenéticos podem ser empregados em muitas áreas do conhecimento e, a utilização de informações cromossômicas em estudos taxonômicos de grupos vegetais vem sendo relatada desde o início do século XX (Guerra, 1990), uma vez que alterações numéricas e estruturais nos cromossomos são fatores muito importantes nos processos de evolução e especiação (Leitch & Leitch, 2008; Levin, 2002; Soltis et al., 2009)

O número cromossômico é o caráter cariotípico mais utilizado na citotaxonomia vegetal, pois além da sua fácil obtenção, geralmente é uma característica conservada dentro de determinados grupos, e pode auxiliar no estabelecimento das relações filogenéticas entre espécies ou grupos próximos (Guerra, 2008).

Segundo Stebbins (1971), o cariótipo de determinada espécie geralmente é sujeito a pouca variação, ainda que duas espécies podem ser diferenciadas de acordo com rearranjos cromossômicos (estruturais ou numéricos) relacionados à distância filética entre elas. Com isso, além da determinação do número cromossômico, o tamanho de cada cromossomo, bem como o comprimento total da cromatina, a relação entre braços (que fornece um índice para a classificação morfológica dos mesmos), a presença de constrição secundária, os padrões diferenciais de coloração longitudinal, são de grande utilidade em estudos taxonômicos e evolutivos (Stace, 2000). Mas muitas vezes, a descrição do cariótipo deve ser associada a outras informações, como conteúdo de DNA, além de uma filogenia bem sustentada, para que sejam possíveis inferências evolutivas em grandes ou pequenos grupos (Guerra, 2012; Weiss- Schneeweiss & Schneeweiss 2003).

Outras características cariomorfológicas frequentemente utilizadas na citotaxonomia relacionam-se ao padrão de distribuição de heterocromatina, bem como de determinadas sequências de DNA repetitivo, como os sítios de DNAr 45S, 5S e DNA satélite (Guerra 2000, 2002; Roa & Guerra, 2012; Heslop-Harrison &Schwarzacher 2011). Para a diferenciação dessas regiões cromossômicas, é necessária a utilização de técnicas de coloração diferencial, denominadas bandamento cromossômico e de hibridização de DNA in situ fluorescente (FISH),

que fornecem a distinção longitudinal de algumas regiões, permitindo identificar individualmente os cromossomos (Schwarzacher & Heslop-Harrison, 2000; Sumner, 2003; Vosa, 1985).

O conceito de heterocromatina talvez seja o mais controverso dentro do estudo dos cromossomos. Caracteriza-se por sequências de DNA altamente repetitivas, com composição e tamanho variado, desde regiões altamente ricas em A-T até altamente ricas em G-C e desde dois até centenas ou milhares de pares de bases (Beridze 1986, Sumner 1990). Embora já tenha sido considerada sem atividade transcricional, situação oposta tem sido descrita em alguns grupos de plantas. (Nagaki et al., 2004; Wang et al., 2006; Carchilan et al. 2007) e mamíferos (Saksouk et al., 2015). A heterocromatina também tem sido associada a replicação tardia, porém nem toda região cromossômica com replicação tardia é heterocromatina. (Sumner 2003).

Na era molecular, o conceito de heterocromatina esta evoluindo em função aos avanços no conhecimento do genoma. Porém, para o estudo da heterocromatina em plantas, duas principais técnicas (bandeamento C e bandeamento CMA/DAPI) têm sido empregadas historicamente e tem mostrando sua utilidade até hoje nos estudos evolutivos (Acosta et al. 2015). O bandamento C identifica a ocorrência e distribuição de heterocromatina através do uso de soluções que eliminam proteínas e também regiões eucromáticas, evidenciando as porções altamente heterocromáticas (Holmquist, 1979). Já o bandamento fluorescente CMA

DAPI, utiliza a especificidade dos fluorocromos cromomicina A3 (CMA) e 4’,6-diamidino-2- fenilindol (DAPI) por regiões do DNA ricas em sequências CG e AT, respectivamente, possibilitando identificar a composição de bases da heterocromatina (Guerra, 2000; Sumner, 2003). O fato de se detectar a ocorrência e a posição física de diferentes famílias de DNA altamente repetitivo (heterocromatina) permite maior compreensão de como os genomas estão organizados e as relações entre espécies, gêneros e famílias. Também permite entender os mecanismos de ajustes que ocorrem nos cariótipos de diferentes organismos durante o processo evolutivo (Soares-Scott et al., 2005).

Com o advento da biologia molecular, tem sido possível muitos avanços importantes na citogenética de plantas, como a identificação do número e posição de sítios de DNAr 45S e 5S, DNA satélite e elementos transponíveis (Heslop-Harrison, 2000; Heslop-Harrison, 2011; Roa & Guerra, 2012). Tais análises são feitas através da técnica de hibridização in situ fluorescente, que consiste na utilização de segmentos de DNA ou RNA marcados (que funcionam como sondas) para localizar as sequências do DNA cromossômico complementares a ela (denominado DNA-alvo). Para visualizar as regiões hibridizadas com a sonda é necessário

associar um corante à sonda e outro ao restante dos cromossomos (Soares-Scott et al., 2005). A identificação dessas regiões tem sido muitas vezes usada como uma ferramenta adicional para estimar similaridades cariotípicas entre as espécies ou compreender a evolução cromossômica nesses grupos (Heslop-Harrison, 2000; Guerra et al., 2012)

1.3 Estudos citogenéticos em Solanaceae As descrições citogenéticas sobre Solanaceae mostram predominância do número básico de cromossomos de x=7 a x=13, embora outros números básicos derivados como x=17, x=19 e x=23 já tenham sido reportados (Bolkhovskikh et al., 1969; Hunziker et al., 2001; Moscone, 1992). Entretanto, x=12 é o mais frequente, encontrado em mais de 50% das espécies de Solanaceae já estudadas citogeneticamente, e também considerado o número básico ancestral para a família (Grant, 1982; Raven, 1975).

Em alguns gêneros de Solanaceae (Solanum, Lycium L. Capsicum e Cestrum) é possível encontrar certa uniformidade cariotípica, principalmente em relação ao número, tamanho e morfologia dos cromossomos. O número cromossômico constante (2n=24), cariótipo simétrico composto por cromossomos pequenos (< 4μm), predominantemente metacêntricos e submetacêntricos, têm sido reportados para os gêneros Solanum (Acosta et al., 2005, 2012; Bernardello et al., 1994; Bernardello & Anderson, 1990; Chiarini et al., 2014; Chiarini & Bernadello, 2006; Moyetta et al., 2013; Rego et al., 2009), Lycium (Stiefkens et al., 2010, 2012), Lycianthes (Acosta et al., 2005; Rego et al., 2009) e Vassobia (Rego et al., 2009). Já em Capsicum, apesar de um grande número de espécies apresentarem 2n=24 cromossomos e cariótipo simétrico, é possível encontrar também espécies com 2n=26 cromossomos e cariótipo mais assimétrico (Moscone et al., 2007). O gênero Cestrum também possui certa uniformidade cariotípica, com 2n=16, cromossomos grandes (6 μm a 12 μm) e cariótipo simétrico (Fernandes et al., 2009; Fregonezzi et al., 2006).

Apesar da uniformidade no número cromossômico (a nível genérico), a poliploidia tem sido importante na evolução de algumas espécies de Solanaceae, principalmente nos gêneros Atropa L., Hyoscyamus L., Lycium, Nicotiana, Physalis, Salpiglossis Ruiz & Pav., Solanum e Withania Pauq. (Badr et al., 1997; Moscone et al., 1992). Entre tais gêneros é possível encontrar espécies tetraploides, como Lycium (Stiefkens & Bernadello, 2005; Stiefkens et al., 2010, Venter & Spies, 2008), Physalis (Badr et al., 1997; Gupta & Roy, 1981; Zhao & Turner, 1993), Solanum (Melo et al., 2011) e Nicotiana (Badr et al., 1997; Leitch et al., 2008), com 2n=4x=48 e Hyoscyamus com 2n=4x=68 (Badr et al., 1997; Srivastava & Lavania 1987) e Withania com

2n=4x=44 (Badr et al., 1997). Espécies hexaploides também já foram reportadas para os gêneros Lycium (Stiefkens et al., 2010, Venter & Spies, 2008), Physalis (Badr et al., 1997, Gupta & Roy, 1981), Solanum (Melo et al., 2011) e Nicotiana (Badr et al., 1997), com 2n=6x=72. Solanum e Lycium são os gêneros que apresentam o maior nível de ploidia encontrado até o momento para a família, com 2n=8x=96 cromossomos (Edmonds et al., 1972; Chen et al., 2013).

Diante dessa estabilidade em alguns caracteres cariotípicos em nível genérico, dados de bandamento cromossômico e localização de sequências por FISH, associados a análises cariotípicas convencionais têm sido muito úteis na identificação de pares cromossômicos e tendências evolutivas para alguns grupos da família, como nos gêneros Capsicum (Moscone et al., 2007; Romero-da Cruz et al., 2015), Nicotiana (Lim et al., 2004b), Cestrum (Fernandes et al., 2009, Fregonezi et al., 2006, Urdampilleta et al., 2015) e Solanum (Chiarini et al., 2014).

Alguns grupos em Solanaceae têm sido bastante estudados, apresentando grande variação na ocorrência e distribuição de DNA repetitivo. Pode-se citar, por exemplo, o gênero Capsicum, que apresenta diferenças na distribuição de heterocromatina bem como de sítios de DNAr 45S (Moscone et al., 1993, 1996a). Nicotiana kawakamii Y. contém regiões heterocromáticas ricas em AT, caso pouco reportado para a família (Nakamura et al., 2001), enquanto a tribo Cestrae (subfamília Cestroideae) evidencia diferentes tipos de DNA repetitivo na composição do cariótipo (Fregonezi et al., 2006; Fernandes et al., 2009; Urdampilleta et al., 2015). No gênero Solanum, também têm sido mostrada uma variação na composição e localização da heterocromatina (Chiarini et al., 2014), bem como alterações no número e posição de DNAr 45S e 5S (Rego et al., 2009; Chiarini et al. 2014).

Diante do exposto, o presente estudo teve como objetivo ampliar o conhecimento cromossômico em Solanaceae afim de se mapear as tendências taxonômicas e evolutivas para a família. Foram obtidos dados cariotípicos, incluindo número cromossômico, bandamento CMA/DAPI e hibridização in situ para 16 espécies pertencentes a cinco gêneros, Acnistus, Brunfelsia, Cestrum, Physalis e Solanum. Para Acnistus, Brunfelsia e Physalis, foram estudas uma espécie de cada gênero (A. arborescens, B. uniflora e P. pubescens). Em Cestrum, foram amostradas duas espécies, C. Laevigatum e C. mariquitense. Já em Solanum, foram obtidos dados sobre espécies pertencentes à quatro clados (sensu Bohs, 2005; Weese & Bohs, 2007): Lepstotemonum seção Acanthophora (S. palinacanthum e S. acerifolium) e seção Torva (S. adspersum, S. scuticum e S. variabile), clado Geminata (S. pseudocapsicum), Cyphomandra (S.

diploconos) e Dulcamaroid (S. flaccidum e S. inodorum). As espécies S. concinnum e S. sanctae-catharinae ainda não possuem uma posição bem definida na filogenia.

1.4 Materiais estudados Nesse trabalho foram estudados cinco gêneros pertencentes à família Solanaceae. A seguir, uma breve caracterização de cada um deles.

1.4.1 Acnistus Schott Gênero monotípico, descrito por Hunziker (1992), está inserido na subfamília Solanoideae Kostel, tribo Physaleae Miers, subtribo Ichrominae (Miers) Hunz. Apresenta distribuição no México, América Central, Antilhas e América do Sul, incluindo o Brasil. A única espécie é A. arborescens, conhecida popularmente por marianeira ou fruto-do-sabiá (Carvalho et al., 2001). A espécie apresenta-se como uma pequena árvore, medindo de 2 a 4 metros, sendo até mesmo considerada um arbusto. Possui folhas simples e grandes (30cm) e flores branco-esverdeadas pendentes do tronco, em cachos (Figura 3). Os frutos são pequenos (1cm) com sementes numerosas e polpa adocicada, sendo assim extremamente atrativos à fauna. Por ser uma planta pioneira e rústica, tem utilização em projetos de revegetação. O número cromossômico relatado para a espécie é 2n=24 (Fedorov, 1974).

Figura 3: Acnistus arborescens. A: detalhe das flores; B: aspecto geral do ramo fértil, C: vista geral dos ramos. Fotos: E. S. Cândido

1.4.2 Brunfelsia L. O gênero Brunfelsia reúne cerca de 45 espécies e está inserido na subfamília Solanaoideae e tribo Petuniae Horan. que também agrupa os gêneros Petunia L. Bouchetia Dunal, Calibrachoa La Llave & Lex, Fabiana Ruiz & Pav., Hunzikeria D’Arcy, Leptoglossis Benth., Nierembergia Ruiz & Pav. e Plowmania Hunz. & Subilis (Olmstead et al. 2008). Brunfelsia possui dois centros de diversidade, a América do Sul, onde aproximadamente metade das espécies são nativas e a América Central, mais especificamente as ilhas Antilhas, onde ocorrem 23 espécies endêmicas (Filipowicz & Renner, 2010). Em geral suas espécies possuem hábito arbustivo lenhoso e algumas apresentam-se como pequenas árvores. A inflorescência geralmente é terminal e ou axilar com flores zigomórficas. Extremamente perfumadas à noite, as flores de Brunfelsia são um grande atrativo para a polinização por mariposas noturnas (Plowman, 1998). As espécies de Brunfelsia caracterizam-se pela produção de compostos alucinógenos ou tóxicos muito utilizados por grupos indígenas. Além disso, são ornamentais já que suas flores apresentam uma coloração muito atrativa, que muda ao longo do seu ciclo de vida (Figura 4), devido à degradação de antocianinas (Filipowicz & Renner, 2010). Apenas 9 espécies do gênero já foram estudadas citogeneticamente, Brunfelsia americana L., Brunfelsia

australis Benth., Brunfelsia dwyeri D'Arcy, Brunfelsia grandiflora D. Don, Brunfelsia lactea Krug & Urb., Brunfelsia latifolia hort. ex Steud., Brunfelsia nitida Benth., Brunfelsia pauciflora Benth. e Brunfelsia undulata Sw. e, as contagens disponíveis mostram que n=11 e 2n=22 é o número cromossômico predominante (Darlington & Wylie, 1955).

Figura 4. Brunfelsia uniflora. A, B: detalhe das flores; C: detalhe dos frutos, D: vista geral do hábito. Fotos: Fotos: E.S.Cândido, J.R.Stehmann e R.M. Machado

1.4.3 Cestrum L. O gênero Cestrum pertence à subfamília Cestroideae Burnett, tribo Cestreae G. Don, juntamente com Sessea Ruiz & Pav. e Vestia Willd e agrupa cerca de 175 espécies (D’Arcy, 1986). Geralmente, os representantes do gênero são arbustos ou pequenas árvores com distribuição neotropical (Hunzinker, 1979) (Figura 5). As flores actinomorfas com corola tubular, presença de cinco estames inclusos e soldados ao tubo da corola, poucas sementes compridas e embrião reto são características morfológicas diagnósticas para o gênero (Cronquist, 1988). Alguns representantes de Cestrum são utilizados como ornamentais e também para fins medicinais, embora algumas sejam tóxicas (Peixoto et al., 2000). As espécies

de Cestrum possuem número cromossômico constante de 2n=16, e a única alteração numérica encontrada no cariótipo está relacionada à ocorrência de um ou dois cromossomos B, nas espécies Cestrum intermedium Sendtn. e C. strigilatum Ruiz & Pav (Fregonezi et al., 2004; Fernandes et al., 2009; Urdampilleta et al., 2015).

Figura 5: C. mariquitense (A e B), C. laevigatum (C e D). A: detalhe das flores; B,C: Detalhe dos frutos; D: vista geral do hábito. Fotos: E. S. Cândido e R.M. Machado

1.4.4 Physalis L. O gênero Physalis pertence à subfamília Solanoideae, tribo Physaleae, subtribo Physalinae (Miers) Huz e reúne entre 60 e 70 espécies, com centro de diversidade no México e América do Norte (Olmstead et al., 2008). Physalis é dividido em quatro subgêneros e 12 seções taxonômicas (Martinez, 1999). O gênero é pouco diverso morfologicamente, com hábito predominantemente herbáceo, flores solitárias, axilares e amarelas, polinizadas por abelhas (Sullivan, 1984). O formato do cálice, inflado, é uma característica importante para a identificação de representantes desse grupo, já que é extremamente raro em outras Solanaceae (Whitson & Manos, 2005) (Figura 6). O gênero reúne muitas espécies de importância econômica, utilizadas na alimentação, ornamentação e também na medicina popular, como

antitérmico e diurético (Nurit & Agra, 2005; Whitson & Manos, 2005). Os estudos citogenéticos disponíveis na literatura mostram que 49 espécies já foram estudadas citogeneticamente com uma predominância do número cromossômico n=12 e 2n=24. No entanto, já foram encontrados alguns números cromossômicos distintos como n=10 em Physalis virginiana var. sonorae (Torr.) Waterf. (Gupta & Roy, 1979), n=11 em Physalis lobata Torr. (Averet & Powell, 1972), n=24 em Physalis angulata L., Physalis divaricata D. Don, Physalis minima L. e Physalis peruviana L. (Averet & Powell, 1972, Rao & Prasad, 1984; Stober & Parks, 1985) e 2n=48 em Physalis angulata L., Physalis divaricata D. Don, Physalis hederifolia A. Gray, Physalis longifolia Nutt., Physalis minima L., Physalis peruviana L. e Physalis pubescens L. (Badr et al., 1997, Ganapathi et al., 1991).

Figura 6: Physalis pubescens. A, B: detalhe das flores; C: vista geral do hábito; D: detalhe do fruto. Fotos: E. S. Cândido

1.4.5 Solanum L. O gênero Solanum está inserido na subfamília Solanoideae, tribo Solaneae Dumort.e é considerado um dos maiores em número de representantes entre as angiospermas, agrupando cerca de 1500 espécies, divididas em 12 (D’ arcy, 1991; Bohs, 2005; Särkinen et al., 2013). Solanum é extremamente diverso em termos morfológicos e ecológicos e ocorre nos continentes

tropicais e temperados, embora a maior diversidade esteja presente nas Américas Central e do Sul, com cerca de 500 espécies endêmicas (D’arcy, 1999; Wesse & Bohs, 2007). A maioria das espécies possui hábito herbáceo ou arbustivo, com poucos representantes arbóreos (Figura 7). De grande importância econômica, o gênero agrupa espécies amplamente utilizadas na alimentação como o tomate (S. lycopersicum) e a batata (S. tuberosum), além de outras espécies com uso medicinal, devido à produção de metabólitos secundários (Bohs, 2005). Alguns grupos em Solanum vêm sendo amplamente estudados cariologicamente e o número cromossômico n=12, 2n=24 é o mais encontrado entre seus representantes, presente em 79% das espécies estudadas até o momento (Acosta et al. 2005; Chiarini & Bernardello 2006; Melo et al. 2011; Rego et al. 2009).

Figura 7: Solanum pseudocapsicum (A e B), S. palinacanthum (C e D). A, B, C: detalhe da flor; D: detalhe do fruto. Fotos: R. M. Machado

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1 INTRODUÇÃO

A família Solanaceae, inserida no clado das Asterídeas (Euasterídias I), ordem Solanales, agrupa aproximadamente 2500 espécies e 100 gêneros com distribuição cosmopolita. Embora os representantes do grupo ocorram em todas as regiões, tropicais e temperadas, a maior diversidade encontra-se na região neotropical (D’Arcy, 1991; Hunziker, 2001). O Brasil apresenta grande riqueza de espécies de Solanaceae, com cerca de 470 espécies, sendo 221endêmicas e 33 gêneros, sendo quatro endêmicos (Stehmann et al., 2015).

Os membros da família exibem grande diversidade morfológica e ecológica, características que favoreceram a ocupação dos mais diversos habitats, tanto regiões desérticas como florestas tropicais úmidas e até mesmo áreas de vegetação secundária (D’Arcy, 1991; Knapp, 2002a).

Entre os membros da família, incluem-se importantes culturas alimentícias, como o tomate (Solanum lycopersicum L.) e a batata (S. tuberosum L.), além de plantas utilizadas como drogas, como Nicotiana tabacum L., da qual se extrai a nicotina, além de muitas ornamentais, como espécies dos gêneros Brunfelsia L. e Petunia Juss. Além disso, os genomas do tomate e tabaco estão entre os mais bem estudados entre as angiospermas, comparáveis aos de gramíneas de importância econômica e Arabidopsis Heynh., que é um organismo modelo para diversos estudos biológicos (Knapp, 2004).

Desde o início da década de 90, muitos estudos moleculares vêm sido conduzidos em Solanaceae a fim de obter uma filogenia consistente para o grupo (Olmstead et al., 1999; Weese & Bohs, 2007). Segundo taxonomistas tradicionais, baseando-se em caracteres morfológicos, a família é dividida em apenas duas subfamílias, Cestroideae e Solanoideae (D’Arcy, 1991, Olmstead & Palmer, 1992). Com o uso de caracteres moleculares (DNA plastidial e nuclear) outras organizações vêm sendo propostas, de maneira a se obter uma filogenia que explique melhor as relações entre os grupos pertencentes à família. Com isso, a circunscrição de quatro subfamílias Solanoideae, Cestroideae, Goetzeoideae e Nicotianoideae tem sido bem suportada por estudos moleculares (Olmstead et al., 2008; Särkinen et al., 2013). Outros grandes grupos monofiléticos como as tribos Petunieae, Physaleae, Capsiceae e Solaneae, e o clado Atropina também possuem uma posição bem definida na filogenia e as relações infragenéricas de alguns grupos do gênero Solanum já são bem resolvidas (Särkinen et al., 2013). Alguns clados, no entanto, ainda não possuem uma posição definida na árvore filogenética para Solanaceae, por isso mais estudos são necessários a fim de entender melhor essas relações.

Alguns grupos em Solanaceae têm sido amplamente estudados do ponto de vista citogenético, enquanto em outros há pouca ou nenhuma informação sobre seus cromossomos. Dentro da maioria dos gêneros estudados, nota-se uniformidade em relação ao número cromossômico. Lycium L. e Solanum L., apresentam um número cromossômico predominante de 2n=24, embora existam relatos de polipliodia, em cerca de 20% das espécies já estudadas. (Bernadello et al., 1990, 1994; Chiarini et al., 2006, 2014; Melo et al., 2011; Rego et al., 2009; Rice et al., 2014; Stiefkens et al., 2010). Em Capscicum L., são reportados 2n=24 e 2n=26 cromossomos (Aguilera et al., 2014; Moscone et al., 1992, 1993, 1995, 2007). Para a tribo Cestreae, composta pelos gêneros Cestrum L., Sessea Ruiz et Pav e Vestia Willd., o único número cromossômico reportado até o momento é de 2n=16 (Fernandes et al., 2009; Fregonezi et al., 2006; Las Penas et al., 2006; Urdampilleta et al., 2015). A maior variação é encontrada no gênero Nicotiana no qual já foram relatados n=9, n=10, n=12, n=20 e n=24 cromossomos e 50% das espécies já estudadas citogeneticamente são poliploides (Rice et al., 2014)

No entanto, maiores variações no cariótipo das espécies de Solanaceae estão presentes quando se trata do estudo de DNA repetitivo (heterocromatina e DNAr). Em geral, a quantidade e a distribuição de heterocromatina apresenta é bem distinta entre e dentro dos diferentes gêneros. Caso semelhante ocorre com os sítios de DNAr, que variam em número e posição nos cromossomos de espécies relacionadas sistematicamente (Acosta et al., 2012; Chiarini et al., 2014; Rego et al., 2009; Moscone et al., 2007; Fregonezi et al., 2006; Urdampilleta et al., 2015). O estudo dessas regiões do DNA pode auxiliar no entendimento da organização do genoma das espécies e assim, tentar compreender um pouco mais os aspectos evolutivos da família.

Diante do exposto, o presente estudo teve como objetivo ampliar o conhecimento cromossômico na família Solanaceae para mapear tendências taxonômicas e evolutivas, analisando espécies da região sudeste do Brasil.

2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Material vegetal e preparo de lâminas Para os estudos cromossômicos, foram coletados frutos com sementes de 16 espécies (Tabela 1), de cinco dos 21 gêneros de Solanaceae que ocorrem no estado de São Paulo (Stehmann et al., 2015; Biral & Lombardi, 2012; Lombardi et al., 2012). Foram confeccionadas exsicatas a partir do material botânico, coletado que foram depositadas no Herbário UEC. A identificação das espécies foi realizada através de bibliografias especializadas, análise comparativa com exsicatas e consultas a especialistas.

Tabela 1. Lista de espécies de Solanaceae coletadas, classificação infragenérica (clados informais sensu Bohs 2005) para os representantes de Solanum, voucher e local de coleta Espécies Voucher Localização Acnistus arborescens Monge 2787/ Aratinga-RS/ Schltdl. Mesquita 23 Ubatuba-SP Brunfelsia uniflora D. Don Mesquita 15 Campinas-SP Cestrum laevigatum Schltdl. Mesquita 12 Campinas-SP Cestrum mariquitense Kunth Mesquita 14 Campinas-SP Physalis pubescens L. Vasconcellos Neto 00-068 Jundiaí-SP Solanum Clado Cyphomandra S. diploconos (Mart.) Bohs Mesquita 23 Jundiaí-SP Clado Dulcamaroid S. flaccidum Vell. Mesquita 7 Campinas-SP S. inodorum Vell. Vasconcellos Neto 20401 Jundiaí-SP Clado Geminata S. pseudocapsicum L. Mesquita 24 Jundiaí-SP Clado Leptostemonum Seção Acanthophora S. acerifolium Sendt. Mesquita 2 Campinas-SP S. palinacanthum Dunal Mesquita 20 Ubatuba-SP Seção Torva Solanum adspersum Witasek Monge 2748 c 240 Arraial do Cabo-RJ S. scuticum M. Nee Vasconcellos Neto 8503 Jundiaí-SP S. variabile Mart Monge 2324 Itacaré-SP Posição incerta S. concinnum Schott ex Mesquita 8 Campinas-SP Sendtn. S. sanctae catharinae Dunal Vasconcellos Neto 20873 Jundiaí-SP

As sementes foram germinadas em caixas de germinação (Gerbox®) com papel filtro umedecido, em temperatura ambiente (TA) e, em alguns casos, foi utilizado 1 ml de ácido

giberélico (GA3) 0,01% para a quebra de dormência (Ellis et al., 1985 apud Acosta et al., 2005). Os seguintes pré-tratamentos, utilizados para inibir o fuso mitótico, foram testados em representantes de cada gênero, a fim de se obter um bom padrão de condensação cromossômica: solução saturada de paradiclorobenzeno por 2-5 horas (h) em TA, 8-hidroxiquinoleína (8-HQ) a 0,002M por 6 h a 14ºC, 8-HQ a 0.002M + cicloexamida 25mg/L (1:1) por 8h a 4ºC e colchicina 0,1% por 6h em TA.

Em seguida, as raízes foram fixadas em solução Farmer 3:1 (etanol: ácido acético, v: v) por no mínimo12 h em TA, sob agitação, e armazenadas a -20ºC até o preparo das lâminas.

Os meristemas das raízes pré-tratadas e fixadas foram utilizados para a confecção das lâminas após digestão enzimática (1% macerozima, 2% celulase e 20% pectinase) por 10-15 minutos a 37°C. Após a digestão, foi feita a dissecação das células meristemáticas sobre uma lâmina, em ácido acético 45%, seguida do esmagamento com uma lamínula de vidro de 18x18mm. A lâmina foi congelada em nitrogênio líquido por pelo menos 15 minutos para a remoção da lamínula. As lâminas foram envelhecidas por no mínimo três dias em TA, para serem utilizadas no bandamento CMA/DAPI e FISH. As lâminas não utilizadas após nesse período foram armazenadas a -21ºC.

Pelo menos dois indivíduos de cada uma das 16 espécies foram analisados pela técnica de bandamento cromossômico e, pelo menos uma lâmina de cada espécie, contendo no mínimo 10 metáfases foi selecionada para a utilização na FISH. Dessa maneira, 10-30 células por espécie foram fotografadas em microscópio Olympus® BX51, com câmera DP72 acoplada e as imagens foram capturadas utilizando programa Olympus® DP2 BSW (Olympus Corporation). O programa Adobe Photoshop® CS6 PT-BR (Adobe Systems, Inc.) foi utilizado para auxiliar no balanceamento uniforme de cores, brilho e contraste.

2.2 Análise morfométrica do cariótipo As medidas cromossômicas foram realizadas através do software Micro Measure© (3.3) em cinco células de cada indivíduo com padrão semelhante de condensação. Para cada metáfase, foi obtida a medida absoluta do braço curto (S) e longo (L), o comprimento absoluto e relativo de cada cromossomo e o tamanho das regiões heterocromáticas presentes em cada cromossomo.

Para cada cromossomo a posição do centrômero foi calculada pelo índice r (relação entre braços) = L/S e a classificação foi feita de acordo com Levan et al. (1964): m-metacêntrico (r

=1,0-1,69), sm-submetacêntrico (r = 1,70-2,99), st-subtelocêntrico (r = 3,0-6,99) e t- telocêntrico (r = 7,0 -∞).

O comprimento total do lote haploide (CTLH), calculado através da soma do tamanho médio dos pares cromossômicos de cada espécie, bem como o tamanho médio da heterocromatina (% de heterocromatina em relação ao CTLH), foram calculados para a montagem dos ideogramas. Na representação dos ideogramas, os cromossomos foram agrupados primeiramente de acordo com a morfologia cromossômica (m, sm e st) e, dentro de cada grupo, de acordo com o tamanho decrescente.

A fim de se comparar o CTLH e a quantidade de heterocromatina entre as espécies estudadas, foi realizada uma análise de variância simples (ANOVA) com nível de signiﬁcância de p < 0,05. A fim de se verificar a normalidade da distribuição das amostras foi realizado o teste de Shapiro Wilk e, para a comparação das médias, foi realizado o teste de Tukey Infestat© (versão 2015, grupo Infostat). Posteriormente, foram plotados gráficos de barras com a variância encontrada em cada espécie, para uma melhor visualização dos resultados obtidos.

Para medir a simetria cariotípica, foram utilizados os índices A1= 1-[Ʃbi/Bi)/n] (bi=média do braço curto de cada par cromossômico, B= média do braço longo de cada par cromossômico, n= número de pares cromossômicos) e A2= s/x (desvio padrão, x= média do comprimento do complemento cromossômico) (Zarco, 1986). O índice A1 mede a assimetria intracromossomal isto é, indica diferenças no tamanho dos braços cromossômicos. Já o índice

A2 mede a assimetria intercromossomal e indica a variação existente no tamanho do complemento cromossômico.

2.3 Bandamento CMA/DAPI

Lâminas envelhecidas foram coradas com CMA (cromomicina A3) por 90 minutos e contracoradas com DAPI (4’- 6- diamidino- 2- fenilindol) por 30 minutos, segundo Schweizer (1976), com algumas adaptações. As lâminas foram montadas com meio glicerol/McIlvaine (1:1) e armazenadas a 37ºC no escuro por pelo menos cinco dias. Após observação e registro dos dados, as melhores lâminas foram descoradas para posterior aplicação da técnica de FISH.

Para a retirada da coloração CMA/DAPI, primeiramente as lâminas foram colocadas em uma cuba contendo água destilada sob agitação até a remoção lamínulas. Em seguida, foi utilizada solução Farmer a 4 ºC overnight para posterior desidratação em álcool 100% por 3 minutos.

Uma banda foi designada positiva (CMA+ ou DAPI+) quando a região apresentou coloração mais brilhante em relação ao restante do cromossomo, com o respectivo corante (fluorocromo), CMA e DAPI. A banda foi considerada neutra (CMA0 ou DAPI0) quando o cromossomo não apresentou coloração diferenciada por um dos corantes, apesar de se mostrar positiva com o outro. E, foi considerada banda negativa (CMA- ou DAPI-) aquela região cromossômica que não apresenta qualquer coloração com um dos corantes, apesar de aparecer corada positivamente com o fluorocromo contrário.

2.4 Hibridização in situ fluorescente (FISH) As sequências dos genes ribossomais 5S e 18S foram obtidas por PCR a partir de DNA genômico de Capsicum chinense. Para o DNAr 5S, foram utilizados os primers 5S DNAr-3 e 5S DNAr-4, com as respectivas sequências, 5’- GTG CTT GGG CGA GAG TAG TA- 3’ e 5’- GGT GCG TTA GTG CTG GTA TG-3’ (Kitamura et al., 2001). Já para o DNAr 18S os primers usados foram NS1 e NS4, com sequência 5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3’ e5’-CTT CCG TCA ATT CCT TTA AG-3’, respectivamente (White et al., 1990).

As sondas de DNAr 5S e 18S foram marcadas por nick translation (Roche Biochemicals®, UK) utilizando digoxigenina-11-dUTP (Roche Biochemicals®, UK) e biotina- 14-dATP (Roche Biochemicals®, UK), respectivamente. A hibridização in situ foi realizada segundo Schwarzacher & Heslop-Harrison (2000), com modificações. As lâminas foram tratadas com RNase por 1 hora a 37°C, fixadas em paraformaldeído 4% por 10 minutos a TA e desidratadas em série alcoólica 70% e 100% por 10 minutos cada. A mistura de hibridização foi composta por formamida 100%, dextran 10%, SDS 10%, 2X SSC, sondas DNAr 5S e 18S (ambas 3,33ng/μl). As lavagens de estringência (72%) foram realizadas em 0,1XSSC a 42°C, 2XSSC à temperatura ambiente (TA), 2XSSC a 42ºC, 4XSSC TA e 4XSSC a 42ºC. As sondas foram detectadas por anticorpos ligados ao fluorocromo, sendo o DNAr 5S detectado por anti- digoxigenina-Rodamina (Roche Biochemicals®, UK) e o DNAr18S pela Avidina-FITC (Roche Biochemicals®, UK). As lâminas foram montadas em DAPI/Vectashield (1:1) (Vector®).

3 RESULTADOS 3.1 Pré tratamentos Os melhores pré tratamentos foram escolhidos para cada gênero e padronizados, como mostrado na Tabela 2.

Tabela 2. Pré-tratamentos utilizados para representantes de cada gênero de Solanaceae estudado

Gênero Pré-tratamento Acnistus e 8-hidroxiquinoleína (8-HQ) 0.002M + cicloexamida Physalis 25mg/L (1:1) ,8h, 4ºC Brunfelsia 8-hidroxiquinoleína (8-HQ) 0.002M, 6 h, 14ºC Cestrum Colchicina 0,1% 6h, TA Solanum solução saturada de paradiclorobenzeno 2h, TA Solanum (S. diploconos) solução saturada de paradiclorobenzeno 5h, TA

3.2 Análise e morfométrica do cariótipo Foram encontrados números cromossômicos somáticos 2n=24 (Acnistus, Physalis e Solanum), 2n=22 (Brunfelsia) e 2n=16 (Cestrum) (Tabela 3, Figuras 3 a 18). A espécie que apresentou menor valor de CTLH foi Solanum sanctae-catharinae com 24,33 µm e variação de 1,68-2,35 µm do menor para o maior par cromossômico. Já os maiores valores de CTLH foram encontrados em S. diploconos, com 72,29 µm (4,63-7,49 µm), C. mariquitense, 75,51 µm (7,35- 11,39 µm) e C. laevigatum, 77,41 µm (7,92-10,88 µm).

As espécies diferiram estatisticamente quanto ao CTLH (Figura 1; Tabela 4). A espécie que apresentou menor valor foi S. sanctae-catharinae (22,15 µm), estatiscamente distinto das médias apresentadas por A. arborescens, P. pubescens e espécies de Solanum (exceto S. diploconos) que formam um grupo com valores intermediários de CTLH. Brunfelsia uniflora, por sua vez, apresenta média de CTLH diferente das espécies citadas anteriormente (50,26 µm), mas não se encaixa no grupo dos indivíduos com maiores médias. Cestrum laevigatum, C. mariquitense e S. diploconos se diferenciam em um grupo por apresentar maior CTLH que todas as outras espécies estudadas, e suas médias são estatisticamente semelhantes (75,51 µm; 77,41 µm e 72,29 µm, respectivamente) (Tabela 4) (Figura 1).

Além disso, foi encontrada grande diversidade na fórmula cariotípica, mas a maioria das espécies analisadas mostra uma predominância de cromossomos metacêntricos (Tabela 3). Acnistus arborescens foi a única espécie em que o cariótipo é composto unicamente por cromossomos metacêntricos, enquanto P. pubescens, S. inodorum e S. palinacanthum apresentaram predominância de cromossomos submetacêntricos, ao passo que S. concinnum possui um cariótipo composto por 6m+6sm.

A assimetria cariotípica foi calculada pelos índices A1 e A2, e apresentaram valores para cada espécie, entre os intervalos 0,17 a 0,39 e 0,04 a 0,23 respectivamente. Ambos os índices fornecem valores de 0 a 1, indicando que quanto mais próximo de 0, maior a simetria cariotípica inter e intracromossomal. Espécies com baixos valores de A2 (próximo à 0) apresentam pouca variação entre o tamanho dos pares cromossômicos e com valores A1 próximo a 0, caracterizam-se por pequenas diferenças em relação ao tamanho dos braços de cada par cromossômico. Assim, as espécies aqui estudadas, possuem cariótipos relativamente simétricos sendo que, S. palinacanthum (A1+A2=0,49), S. acerifolium e S. inodorum (0,54) são os mais assimétricos enquanto A. arborescens é a espécie que apresenta o cariótipo mais simétrico (0,27), além de C. laevigatum (0,32), C. mariquitense e S. adspersum (0,34).

Figura 1. Representação gráfica da análise de variância do comprimento total do lote haploide (CTLH) das espécies de Solanaceae estudadas. A- Acnistus, B-Brunfelsia, C-Cestrum, P-Physalis e S-Solanum

Tabela 3. Teste de Tukey Alfa para o comprimento total do lote haploide (CTLH) de espécies de Solanaceae. A-Acnistus, B-Brunfelsia, C- Cestrum, P-Physalis e S-Solanum Espécie Médias n E.E. S. sanctae-catharinae 22,15 5 1,26 A S. adspersum 25,17 5 1,26 A B S. flaccidum 26,04 5 1,26 A B S. pseudocapsicum 27,99 5 1,26 A B C S. scuticum 28,03 5 1,26 A B C S. concinnum 30,71 5 1,26 B C D P. pubescens 31,29 5 1,26 B C D S. variabile 32,78 5 1,26 C D S. acerifolium 35,71 5 1,26 D E S. palinacanthum 36,90 5 1,26 D E S. inodorum 39,75 5 1,26 E F A. arborescens 45,55 5 1,26 F G B. uniflora 50,26 5 1,26 G S. diploconos 72,29 5 1,26 H C. mariquitense 75,51 5 1,26 H C. laevigatum 77,41 5 1,26 H Médias com uma letra comum não são significativamente diferentes (p< 0,05)

Tabela 4: Características cariotípicas de espécies da família Solanaceae

Espécie 2n Fórmula CTLH Sítios de Variação do A1 A2 cariotípica (µm) DNAr tamanho (DP) 18S cromossômico

Acnistus arborescens 24 12m 45,55(0,36) 1 (par 8) 3,17-4,38 0,17 0,10 Brunfelsia uniflora 22 7m+4sm 50,26(0,45) 1(2) 3,89-5,37 0,32 0,10 Cestrum laevigatum 16 6m+2sm 77,41(0,92) 2(2,6) 7,92-10,88 0,23 0,10 C. mariquitense 16 7m+1sm 75,51(1,15) 2(7,8) 7,35-11,39 0,21 0,12 Physalis pubescens 24 3m+8sm+1st 30,76(0,30) 2 (8,12) 2,14-3,15 0,27 0,10 Solanum acerifolium 24 10m+2sm 35,71(0.70) 1(3) 1,71-3,87 0,26 0,23 S. adspersum 24 9m+3sm 25,17(0,2) 1(3) 1,77-2,44 0,25 0,09 S. concinnum 24 6m+6sm 30,7 (0,2) 1(2) 2,26-2,86 0,39 0,08 S. flaccidum 24 9m+2sm+1st 26,33(0,22) 1(12) 1,89-2,59 0,27 0,10 S. inodorum 24 5m+7sm 39,75(0,31) 18(tods os pares) 2,83-3,86 0,39 0,09 S. palinacanthum 24 5m+7sm 36,9(0,39) 1(6) 2,51-3,86 0,41 0,13 S. pseudocapsicum 24 9m+3sm 27,85(0,3) 1(11) 1,76- 2,72 0,28 0,13 S. sanctae-catharinae 24 10m+2sm 24,33(0,2) 1(6) 1,68-2,35 0,26 0,09 S. diploconos 24 8m+4sm 72,29(0,87) 1(12) 4,63-7,49 0,32 0,14 S. scuticum 24 9m+3sm 29,82(0,28) 1(11) 1,95-2,79 0,31 0,04 S. variabile 24 9m+3sm 32,77(0,31) 1(3) 2,15-3,26 0,24 0,11 2n=número somático de cromossomos; m=metacêntrico, sm=submetacêntrico, st=subtelocêntrico; NOR= região organizadora do nucléolo; CTLH=comprimento total do lote haploide; A1=índice de assimetria intracromossomal; A2= índice de assimetria intercromossomal; DP: desvio padrão

3.3 Bandamento CMA/DAPI O bandamento cromossômico CMA/DAPI possibilitou identificar diferentes padrões de composição e distribuição de heterocromatina entre os representantes de Solanaceae estudados (Figuras 3 a 18). Além disso, também pode-se notar que a porcentagem de heterocromatina (totalizada pela soma de bandas grandes e puntiformes) (Figuras 3 a 18) na composição do cariótipo (CTLH) foi variável (Tabela 7), sendo possível separar os grupos com valores menores, intermediários e maiores, fato comprovado pela análise de variância. As espécies que apresentaram a menor quantidade de heterocromatina na composição do cariótipo foram B. uniflora (1,51%), S. diploconos (1,85%), S. mariquitense (2,21%), S. palinacanthum (2,57%) e S. concinnum (5,93%). Já S. acerifolium (51,92%), S. inodorum (38,96%), P. pubescens (34,27%) e S. sanctae-catharinae (20,34%) apresentarm as maiores quantidades. As outras espécies analisadas possuem valores intermediários de heterocromatina na composição do cariótipo (Tabelas 4 e 5) (Figura 2).

Em todas as espécies foi possível visualizar pelo menos um par cromossômico com forte sinal CMA+, correspondendo à NOR (região organizadora do nucléolo). Em A. arborescens (Figura 3) e em todos os indivíduos do gênero Solanum (Figuras 8 a 18) foi encontrado um par cromossômico portando a NOR, enquanto em C. laevigatum (Figura 5), C. mariquitense (Figura 6) e P. pubescens (Figura 7) foi possível identificar dois pares cromossômicos portando tal região. Diferentemente de todos os indivíduos analisados, a NOR em B. uniflora, está presente na região pericentromérica de um par cromossômico (Figura 4), ao passo que em todos os outros, localiza-se na região terminal. Os pares cromossômicos que portam a NOR apresentaram morfologia variável, sendo possível observá-la em cromossomos metacêntricos (nove espécies), submetacêntricos (cinco espécies) e subtelocêntricos (duas espécies) (Figuras 3 a 18). A composição da heterocromatina na NOR é variável, sendo na maioria das espécies DAPI-, exceto em, S. adspersum (Figura 9) e S. concinnum (Figura 10) (DAPI0) e P. pubescens (Figura 7) (DAPI+) (Tabela 7). As bandas CMA+ indicam a alta repetitividade de sequências GC associadas à NOR.

Acnistus arborescens, P. pubescens e S. sanctae-catharinae foram as únicas espécies em que foi possível encontrar bandas DAPI+ sempre terminais (Tabela 7) (Figuras 3, 7 e 16, respectivamente). Entretanto, somente A. arborescens apresentou bandas CMA+/DAPI+ sem

associação à NOR, ao passo que em P. pubescens, o único par de CMA+/DAPI+encontra-se associado à NOR (Tabela 8) (Figuras 3 e 7, respectivamente).

Em outras espécies foi possível ver claramente em um par cromossômico uma banda CMA+ intersticial. Em B. uniflora, C. laevigatum, C. mariquitense, S. concinnum e S. sanctae- catharinae essa banda é CMA+/DAPI0 (Figuras 4, 5, 6, 10 e 16 respectivamente), enquanto em A. arborescens, S. acerifolium, S. diploconos, S. inodorum, S, scuticum e S. variabile é CMA+/DAPI- (Tabela 8) (Figuras 3, 8, 11, 13, 17 e 18 respectivamente).

Além disso, pequenos blocos heterocromáticos terminais foram visualizados em algumas espécies. Em S. adspersum, S. concinnum, S. flaccidum, S. scuticum e S. variabile foram encontradas regiões CMA+/DAPI0 em todos os pares cromossômicos (Figuras 9, 10, 12, 17 e 18 respectivamente) e, em S. pseudocapsicum, além de pequenas bandas CMA+/DAPI0, também foram visualizadas bandas CMA+/DAPI- (Figura 15) (Tabela 7). Por outra parte, em S. sanctae-catharinae foram observadas bandas CMA+/DAPI0, CMA+/DAPI+ e CMA0/ DAPI+ (Figura 16).

As únicas espécies que apresentaram grandes blocos de heterocromatina terminais e intersticiais CMA+/DAPI- foram S. acerifolium e S. inodorum (Tabela 7) (Figuras 8 e 13 respectivamente). Nessas duas espécies também foram visualizadas pequenas regiões terminais CMA+/DAPI- além de regiões com heterocromatina dispersa, padrão bem distinto de todos os outros indivíduos estudados. Após a FISH, também foi possível visualizar bandas DAPI + em S. diploconos, S. flaccidum e S. palinacanthum (Figuras 11, 12 e 14, respectivamente) .

Finalmente, foram observadas bandas terminais do tipo CMA-/DAPI+ nos representantes de Physalis (Figura 7) e Acnistus. No gênero Acnistus também foram reveladas bandas do tipo CMA+/DAPI+, CMA+/DAPI- e CMA0/ DAPI+ (Figura 3) (Tabela 7).

Tabela 5. Teste de Tukey Alfa para quantidade de heterocromatina evidenciada por bandamento CMA/DAPI de espécies de Solanaceae. A- Acnistus, B-Brunfelsia, C- Cestrum, P-Physalis e S-Solanum

Especie Medias n E.E. B. uniflora 1,51 5 0,75 A S. diploconos 1,85 5 0,75 A C. laevigatum 2,17 5 0,75 A C. mariquitense 2,21 5 0,75 A B S. palinacanthum 2,57 5 0,75 A B S. concinnum 5,93 5 0,75 B

S. adspersum 10,60 5 0,75 C A. arborescens 11,49 5 0,75 C S. scuticum 12,44 5 0,75 C S. variabile 12,92 5 0,75 C S. flaccidum 13,04 5 0,75 C S. sanctae-catharinae 20,34 5 0,75 D P. pubescens 34,27 5 0,75 E S. inodorum 38,96 5 0,75 F

S. acerifolium 51,92 5 0,75 G médias com uma letra comum não são significativamente diferentes (p< 0,05)

Figura 2. Representação gráfica da variância da quantidade de heterocromatina evidenciada por bandamento CMA/DAPI das espécies de Solanaceae estudadas. A-Acnistus, B-Brunfelsia, C-Cestrum, P-Physalis e S-Solanum

Tabela 6. Localização dos diferentes tipos de heterocromatina evidenciada por bandamento CMA/DAPI em Solanaceae. A-Acnistus, B-Brunfelsia, C-Cestrum, P- Physalis e S-Solanum Heterocromatina NOR Intercalar Terminal Espécies CMA+/DAPI- CMA+/DAPI0 CMA+/DAPI+ CMA+/DAPI- CMA+/DAPI0 CMA+/DAPI- CMA+/DAPI0 CMA+/DAPI+ CMA-/DAPI+ CMA0/DAPI+ A. arborescens x x x x x x B. uniflora x x - - - - - C. laevigatum x x - - - - - C. mariquitense x x - - - - - P. pubescens x - - - - x S. acerifolium x x x S. adspersum x - - x S. concinnum x x x S. flaccidum x - - - x S. inodorum x x x S.palinacanthum x ------S. x - - x x pseudocapsicum S.sanctae- X x x x x catharinae S. diploconos X x - - - - - S. scuticum X x x S. variabile X x x

3.4 Hibridização in situ fluorescente (FISH) A maioria dos indivíduos avaliados possuem um par cromossômico portando o sítio de DNAr 18S terminal co-localizado com uma região CMA+ (Figuras 3 a 18). Somente em B. uniflora, o sítio se encontra nas proximidades do centrômero (Figura 4). Cestrum laevigatum, C. mariquitense e P. pubescens apresentaram mais um par cromossômico portando o locus de DNAr 18S (Figuras 5, 6 e 7, respectivamente) e S. inodorum apresentou 18 sítios para o gene (Figura 13).

Resultado semelhante foi obtido para o sítio de DNAr 5S, já que também foi encontrado um par cromossômico com o locus na maioria das espécies. Acnistus arborescens, C. mariquitense, S. acerifolium e S. flaccidum foram as espécies que apresentaram dois sítios de DNAr 5S (Figuras 3, 6, 8, 12, respectivamente). O loco de DNAr apresentou grande variação de distribuição, ocorrendo tanto no braço curto quanto no braço longo dos pares cromossômicos e em regiões terminais, subterminais ou pericentromérico (Figuras 3 a 18, Tabela 7).

Em C. laevigatum, C. mariquitense e S. inodorum foi encontrado heteromorfismo no par cromossômico portador da NOR (Figuras 5, 6 e 13, respectivamente). Três indivíduos de cada espécie foram analisados e, para os representantes de Cestrum, dois deles apresentaram heteromorfismo, enquanto para S. inodorum, todos os indivíduos apresentaram um par cromossômico heteromórfico em relação à NOR. Acnistus arborescens também apresentou heteromorfismo cromossômico entre as duas populações estudadas, mas, para essa espécie tal situação ocorreu em relação a um dos sítios de DNAr 5s (o maior deles). Na população coletada em Aratinga/RS o maior sítio de DNAr 5s está localizado na posição intersticial no braço longo do par cromossômico 6. Já na população coletada em Ubatuba/SP o locus está co-localizado no par cromossômico 8, que porta o sítio de DNAr 18s (Figura 3).



Tabela 7. Porcentagem de heterocromatina (evidenciada por bandamento CMA/DAPI) na composição do cariótipo e sítios de DNAr em espécies de Solanaceae Espécies Heterocromatina (%) Sítios DNAr

Total NOR- Interc. 5s 18s assoc T Subt Per

Acnistus arborescens 11,49 0,59 10,91 2(BL)/1(BC) 1

Brunfelsia uniflora 1,51 1,11 0,40 1(BC) 1

Cestrum mariquitense 2,21 1,60 0,45 2(BL) 2

Cestrum laevigatum 2,17 2,12 0,61 1(BL) 2

Physalis pubescens 34,27 1,37 32,93 1(BC) 2

Solanum acerifolium 51,92 2,77 49,12 1(BC) 1(BC) 1

S. adspersum 10,60 0,40 10,05 1(BC) 1

S. concinnum 5,93 1,79 4,14 1(BC) 1

S. flaccidum 13,04 1,97 9,57 1(BC) 1(BC) 1

S. inodorum 38,96 0,88 35,04 1(BL) 18

S. palinacanthum 2,57 2,66 - 1(BC) 1

S. sanctae-catharinae 20,34 2,34 18,04 1(BL) 1

S. scuticum 12,44 1,04 10,70 1(BC) 1

S. pseudocapsicum 19,82 1,26 18,56 1(BC) 1

S. diploconos 1,85 1,24 0,62 1(BC) 1

S. variabile 12,92 1,50 12,45 1(BC) 1

NOR-assoc=heterocromatina associáda à região NOR, Interc.=intercalar, T=terminal, St=subterminal, Peric.=pericentromérica, (BL)= braço longo, (BC)=braço curto

4 DISCUSSÃO

Os dados de número cromossômico, bandamento CMA/DAPI e FISH são inéditos para B. uniflora, S. adspersum, S. concinnum, S. inodorum, S. flaccidum, S. inodorum e S. sanctae- catharinae. Para todas as outras espécies aqui estudadas, os números cromossômicos aqui obtidos, corroboram os já disponíveis na literatura. A. arborescens e P. pubescens, já existem trabalhos anteriores com contagem cromossômica, porém com nenhuma informação referente a bandamento ou FISH para DNAr (Ganapathi et al., 1991; Heiser 1956, 1963a; Venkateswarlu et al., 1979; Pedrosa, 1999). A espécie S. diploconos já foi estudada anteriormente através de análise convencional do cariótipo e bandamento C, mas nenhum trabalho com bandamento fluorescente e FISH havia sido realizado para essa espécie até o momento (Pringle e Murray, 1993). Para S. pseudocapsicum, os dados de DNAr (5S e 18S) aqui obtidos são inéditos, mas já haviam informações sobre número cromossômico e bandamento CMA/DAPI disponíveis na literatura que corroboram as obtidas nesse trabalho (Acosta et al., 2005; 2012). Os resultados obtidos nesse estudo em S. variabile e S. scuticum confirmam dados obtidos por Rego et al. (2009). Em C. laevigatum foram encontradas diferenças na morfologia de um par cromossômico e no bandamento CMA/DAPI em relação aos trabalhos realizados por Fernandes et al. (2009), mas a distribuição de DNAr apresentou padrão semelhante. Cestrum mariquitense (sin. C. sendtherianum) apresentou diferenças no número de sítios de DNAr 5S e bandamento CMA/DAPI comparando-se ao trabalho feito por Fregonezi et al. (2006). Em Solanum palinacanthum e S. acerifolium, embora o número e posição de sítios de DNAr sejam coincidentes com estudos prévios (Rego et al., 2009; Chiarini et al., 2014), a distribuição de heterocromatina apresentou padrões distintos no presente trabalho, indicando uma variabilidade entre populações dessas espécies, possivelmente relacionada à ocorrência de rearranjos em sequências de DNA repetitivo (Flavel et al., 1986; Fregonezi et al., 2006, Heslop-Harrison, 2000).

4.1 Número cromossômico Os números cromossômicos encontrados nesse trabalho em Acnistus, Physalis e Solanum (subfamília Solanoideae), 2n=24, corroboram informações disponíveis na literatura para os gêneros estudados. O número cromossômico x=12, considerado por Raven (1975) ancestral para a família, foi reconhecido como uma sinapomorfia unindo a subfamília Solanoideae, a tribo Anthocercideae G. Don e o gênero Nicotiana em um clado reconhecido informalmente como “x=12” (Olmstead & Palmer, 1992; Olmstead et al., 2008). Embora o

gênero Nicotiana apresente variação em relação ao número cromossômico (n=12, 11, 9, 8, 7 e 6), n=12 é o mais frequentemente observado, encontrado na maioria dos subgêneros do grupo (Chase et al., 2003; Hunziker, 2001; Moscone, 1992; Stehmann et al., 1997) e também em aproximadamente 50% das Solanaceae estudadas citogeneticamente até o momento (Huzinker 2001). Alguns exemplos em que esse número cromossômico é frequente (2n=24) são as tribos Solaneae, composta pelos gêneros Solanum e Jaltomata Schlecht., a tribo Capsiceae (gêneros Capsicum e Lycianthes) e a tribo Lycieae com três gêneros, Grabowskia Schltdl., Lycium L. e Phrodus Miers. Outros grupos em Solanaceae apresentam números diferentes de x=12, como a subfamília Cestroideae e a tribo Petuniaeae Horan. Os dados obtidos no presente trabalho para B. uniflora e para os dois representantes de Cestrum confirmam os números cromossômicos já relatados para esses grupos. Brunfelsia uniflora, inserida na tribo Petunieae, apresenta 2n=22 cromossomos. De acordo com contagens cromossômicas já realizadas para a tribo Petunieae, uma série disploide de x=7 a x=11 é relatada para os diferentes gêneros que a compõem. Em Petunia é possível observar o número básico x=7, enquanto em Hunzikeria D'Arcy, Bouchetia DC. ex Dunal e Nierembergia Ruiz & Pav.é relatado x=8, embora Nierembergia também apresente x=9. Os representantes de Calibrachoa Cerv. estudados citogeneticamente até o momento, apresentam x=9, diferentemente de Leptoglossis Benth.(x=10) e Brunfelsia (x=11) (Chase et al., 2003; Hunziker, 2001; Moscone, 1992; Stehmann et al., 1997) Por fim, C. mariquitense e C. laevigatum, apresentaram número cromossômico 2n=16, único número reportado até o momento para a tribo Cestreae (Fernandes et al., 2009; Fregonezi et al., 2006, 2009; Las Peñas et al., 2006; Urdampilleta et al., 2015). Em C. intermedium e C. strigilatum já foi reportada a ocorrência de cromossomos B em algumas populações do sul do Brasil, resultando em diferenças no número cromossômico (Fregonezi et al., 2004).

4.2 Características cariotípicas

A família Solanaceae caracteriza-se por uma certa estabilidade cariotípica em relação ao tamanho e morfologia de seus cromossomos, além de baixa ocorrência de poliploides e rearranjos cromossômicos (Wu & Tanksley, 2010). Em relação ao tamanho da cromatina, os resultados aqui obtidos para Solanum mostram que, exceto S. diploconos que é estatisticamente distinto de todos os outros membros de Solanum, o gênero apresenta cariótipos pequenos. O CTLH em Solanum variou de 24,33 μm em S. sancthae-catharinae a 39,75 μm em S. inodorum, sendo aproximadamente um terço ou

metade do encontrado em S. diploconos (72,29 μm). O tamanho cromossômico relativamente pequeno em Solanum tem sido amplamente documentado em estudos citogenéticos para o gênero. Acosta et al. (2005), estudando quatro subgêneros de Solanum, encontrou CTLH variando de 16,30 a 38,75 μm, com o menor par cromossômico medindo 1.36 μm em S. palustre e o maior par medindo 3.23 μm em S. sisymbriifolium. Bernadello & Anderson (1990) encontraram os menores valores de tamanho cromossômico reportados para o gênero estudando a seção Basarthrum (Bitter) Bitter (subgênero Leptostemonum), variando de 12,14 a 18,84 μm. Outros trabalhos realizados em diferentes subgêneros e seções de Solanum também têm corroborado essa tendência (Chiarini et al., 2006; Melo et al., 2011; Moyetta et al., 2013; Rego et al., 2009). Além do gênero Solanum, outros clados em Solanaceae também exibem cromossomos relativamente pequenos, como a espécie aqui estudada Physalis pubescens, que apresentou cromossomos medindo de 2,14μm a 3,15μm. Rego et al. (2009) encontraram cromossomos medindo em média 2μm em Lycianthes e Vassobia, gêneros filogeneticamente próximos a Solanum. Em Lycium, foi reportado tamanho cromossômico variando de 1,67 μm a 2,07 μm (Stiefkens & Bernadello, 2002). Outros grupos em Solanaceae apresentam cromossomos com tamanhos intermediários, como o gênero Capsicum (Guerra, 2001; Moscone, 1996) e as espécies aqui estudadas, A. arborescens e B. uniflora. Apesar do tamanho intermediário do complemento cromossômico, a uniformidade cariotípica relatada para a família é mantida nesses grupos. Diferentemente dos cromossomos pequenos reportados para alguns grupos em Solanaceae, a tribo Cestreae (subfamília Cestroideae) é caracterizada por apresentar os maiores tamanhos cromossômicos da família. As duas espécies do gênero Cestrum estudadas nesse trabalho apresentaram os maiores valores de CTLH (77,41 μm em C. laevigatum e 75,51 μm em C. mariquitensis), chegando a ser até três vezes maior que algumas espécies de Solanum, como S. sanctae-catharinae (24,33 μm) e S. adspersum (25,17 μm). Muitos outros trabalhos têm corroborado essa tendência para a tribo. Fregonezi et al. (2006), estudando o gênero Cestrum, encontraram CTLH variando de 63.3 μm, (C. strigilatum Ruiz & Pav, com o menor cromossomo do cariótipo medindo 7,2 μm e o maior 8,6 μm) a 77,3 μm (C. intermedium Sendtn, com cromossomos variando de 7,3 a 11,8 μm). As espécies Sessea corymbiflora Goudot ex Rich. Taylor & R. Phillips e Vestia foetida Hoffmanns., pertencentes aos outros gêneros da tribo, apresentam CTLH de 84,20 μm e 57,70 μm, respectivamente e, a média do tamanho cromossômico para essas espécies é de 10,52μm em Sessea e 7,21μm em Vestia (Las Penas et al., 2006). Sykorova et al. (2003) propôe que esse incremento do tamanho cromossômico na

tribo pode ser devido à substituição da sequência telomérica “tipo Arabidopsis” por sequências teloméricas curtas (ITSs) que se dispersam por todo o genoma levando à sua ampliação. Diferenças no tamanho cromossômico podem ser úteis na delimitação de alguns grupos em Solanum. O gênero Solanum é extremamente diverso em termos morfológicos e ecológicos, sendo considerado um dos mais ricos entre as angiospermas, agrupando cerca de 1500 espécies, com cerca de 500 endemismos nas Américas Central e do Sul (D’Arcy, 1999; Wesse & Bohs, 2007). De acordo com a classificação formal (sensu D’Arcy 1972, 1991), Solanum é dividido em sete subgêneros: Archaesolanum, Bassovia, Leptostemonum, Lyciosolanum, Minon, Potatoe, e Solanum. Porém, estudos filogenéticos atuais apontam outas subdivisões para o gênero. Segundo Bohs (2005) e Weese & Bohs (2007), Solanum agrupa 12 clados principais e, Sarkinem (2013) apontam uma subdivisão em um menor número de clados (Särkinen et al., 2013) (Figura 19). No presente trabalho foram amostradas espécies de quatro clados dos 12 propostos por Bohs (2005) e Weese & Bohs (2007): Lepstotemonum seção Acanthophora (S. palinacanthum e S. acerifolium) e seção Torva (S. adspersum, S. scuticum e S. variabile), Geminata (S. pseudocapsicum), Cyphomandra (S. diploconos) e Dulcamaroid (S. flaccidum e S. inodorum). As espécies S. concinnum e S. sanctae-catharinae ainda não possuem uma posição bem definida na filogenia. O clado Cyphomandra (sensu Bohs 2005; Weese & Bohs 2007) (Figura 19), anteriormente considerado um gênero distinto (Cyphomandra), foi incluído em Solanum após análises filogenéticas baseadas nos genes plastidiais ndhF e rbcL (Bohs 1995, 2004, 2005; Bohs & Olmstead 1997, 1999; Olmstead et al., 1999; Olmstead & Palmer 1997). Entretanto é de grande importância a consideração de algumas características morfológicas, como anteras com conectivos espessos e glandulares, para a manutenção desse grupo como um gênero independente (Bohs 1989, 1994; Hunkinker 2001; Child & Lester 2001). Adicionalmente, o maior tamanho cromossômico das espécies pertencentes ao antigo gênero Cyphomandra como observado nesse trabalho na espécie S. diploconos, tem sido observado em muitos trabalhos, como o de Miguel et al. (2012), Moscone et al. (1992), Pringle & Muray (1993), Rego et al. (2009) (Tabela 3). Dessa maneira, existem fortes indícios para a separação do clado Cyphomandra do gênero Solanum, como proposto por Child & Lester (2001), Moscone (1992) e Hunziker (2001).

Figura 19. Relações filogenéticas em Solanum. Modificado de Särkinen et al. (2013)

Além do número cromossômico, outros caracteres cariotípicos amplamente conservados em Solanaceae são a morfologia cromossômica e a simetria cariotípica. Quatro dos cinco gêneros aqui estudados possuem cariótipo com predominância de cromossomos metacêntricos e cariótipo simétrico. Acnistus arborescens foi a única espécie que apresenta cromossomos exclusivamente metacêntricos, tendo assim o cariótipo mais simétrico. Entre os representantes de Solanum e Cestum, bem como em B. uniflora, essa tendência também foi observada. Em Solanum foram encontradas três espécies com o cariótipo mais assimétrico, S. inodorum e S. palinacanthum com a predominância de cromossomos submetacêntricos e S. acerifolium com predominância de cromossomos metacêntricos.

Exemplos ilustrativos dessa tendência á simetria cariotípica na família são os trabalhos realizados nos gêneros Solanum (Acosta et al., 2005; Chiarini et al., 1996), Capsicum (Guerra et al., 2001; Moscone et al., 1990, 1993; Pozzoboon et al. 2006) Lycium (Stiefkens & Bernadello, 2012), Cestrum (Fernandes et al., 2009; Fregonezi et al., 2006; Las Peñas et al., 2006), Brunfelsia (Boaventura et al., 1993), Lycianthes e Vassobia (Rego et al., 2009) os quais mostram que a maioria das espécies desses gêneros já estudadas possuem cariótopos simétricos segundo índices A1 e A2 (Zarco, 1986) com predominância de cromossomos metacêntricos. A predominância de cromossomos submetacêntricos e subtelocêntricos no cariótipo de algumas espécies é uma exceção que ocorre em alguns grupos da família, como visto no presente trabalho na espécie P. pubecens. Algumas espécies do gênero Nicotiana (Burns, 1982; Villa, 1984) e em alguns clados em Solanum (Acosta et al., 2005; Bernardello & Anderson, 1990; Chiarini et al., 2014), ocorre situação semelhante. Entre as angiospermas em geral, o incremento da assimetria cariotípica está associada a táxons mais derivados (Stebbins, 1971). Em alguns clados da família Solanaceae essa tendência pode ser observada, como na tribo Cestreae (Las Peñas et al., 2006), Solanum seção Acanthophora (Chiarini et al., 2014) e Nicotiana subgêneros Tabacum e Petunoides (Goodspeed, 1954). Entretanto, geralmente a assimetria cariotípica não está associada à posição basal ou derivada dos táxons na filogenia. O gênero Solanum aqui estudado, pertencente à subfamília Solanoideae, considerada um grupo basal na filogenia (Martins & Barkman, 2005) agrupa algumas espécies com o cariótipo assimétrico. Por outro lado, os representantes de Cestrum, mais derivado segundo Martins & Barkman (2005), reúne espécies com o cariótipo simétrico. No gênero Solanum seção Basarthum (subg. Leptostemonum), composto por 22 espécies, a assimetria cariotípica associa-se a um incremento no tamanho do genoma, visto que em sete espécies em o que CTLH apresenta valores superiores a 15μm, o cariótipo é mais assimétrico, com a presença de cromossomos subtelocêntricos e telocêntricos (Bernadello & Anderson, 1990). Já na seção Lisocarpa do mesmo subgênero, o cariótipo de seus representantes é predominantemente simétrico, não sendo possível detectar nesse grupo uma associação entre assimetria cariotípica e tamanho do genoma como na seção Basarthrum (Bernadello & Anderson, 1990), já que aquelas espécies com cariótipo mais assimétrico possuem os menores valores de CTLH (Bernadello et al., 1994). Nos dois grupos estudados não foram identificadas inversões ou translocações em análises meióticas, assim a assimetria não pode ser explicada por esses fatores.

No presente estudo foram analisadas cinco espécies de outras seções (sect. Acantophora e Torva) do clado Leptostemonum e, na seção Acantophora, pode-se observar um aumento de CTLH e assimetria cariotípica diferentemente das espécies da outra seção do mesmo clado. Na seção Torva, o CTLH foi 25,17 µm em S. adspersum, 29,82 µm em S. scuticum e 32,77 µm em S. variabile, porém todas as espécies apresentaram a mesma fórmula cariotípica (9m + 3sm), e a soma dos índices A1+A2 atingindo o máximo em S. scuticum (0,36), evidenciando assim cariótipos simétricos. Na sect. Acantophora, as espécies apresentaram maior CTLH, sendo 35,71 µm em S. acerifolium e 36,89 µm em S. palinacanthum. Essa última espécie apresentou também maior número de cromossomos submetacêntricos (5m + 7sm) e o maior valor nos

índices entre as espécies aqui estudadas, A1+A2= 0, 54. Na seção Acanthophora, subg. Leptostemonum, a assimetria cariotípica já havia sido relatada para o grupo (Chiarini et al., 2014) Em outros casos, a assimetria ocorre aleatoriamente em determinado grupo, como nos clados de Solanum, Morelloid e Dulcamaroid (Moyetta et al., 2013) (Figura 20). As duas espécies aqui estudadas pertencentes ao clado Dulcamaroid corroboram esses dados, já que S. flaccidum apresenta cariótipo mais simétrico (9m + 2sm + 1st e A1+A2= 0,37) do que S. inodorum (5m + 7sm e A1+A2 =0,49), portanto com cariótipo mais assimétrico. A tribo Lyaceae que também é caracterizada por um cariótipo simétrico, com predominância de cromossomos metacêntricos e submetacêntricos, possui um gênero monotípico, Phrodus, considerado basal na filogenia da tribo com o cariótipo mais assimétrico, se opondo da mesma maneira à tendência postulada por Stebbins (1971). Caso semelhante ocorre no gênero Capsicum (Sehr et al. submetido) e outros exemplos em muitos grupos de plantas mostram que um incremento da assimetria não está associado a caracteres mais derivados (e.g. Moretti 1990; Cota & Wallace 1995). As espécies analisadas nesse trabalho apresentam certa uniformidade cariotípica relatada para alguns gêneros de Solanaceae, relacionada ao número e morfologia cromossômicos, bem como simetria do cariótipo. Entre as 16 espécies analisadas, apenas quatro apresentaram um cariótipo mais assimétrico e P. pubescens e S. flaccidum foram as únicas que apresentaram um par cromossômico subtelocêntrico. Em relação à assimetria cariotípica, não foi encontrada uma tendência nos gêneros analisados, e nem mesmo entre os representantes de Solanum. Na subfamília Solanoideae, considerada ancestral na família, a assimetria apareceu no gênero Solanum. Essa estabilidade no cariótipo conferida a alguns gêneros em Solanaceae, inclusive nos estudados nesse trabalho, é uma evidência de ortoseleção cariotípica, que preserva

complementos cromossômicos semelhantes, independentemente do tamanho dos cromossomos (Acosta et al., 2005; Moscone et al., 2003). Segundo Wu et al. (2010), inversões têm ocorrido na história evolutiva da família em uma taxa bem maior que translocações, preservando assim a morfologia cromossômica. Assim, o acúmulo de pequenos rearranjos cromossômicos derivados de mudanças estruturais crípticas pode alterar a morfologia cromossômica em algumas espécies ou grupos (Stebbins, 1971). Entre as angiospermas, a ortoseleção cariotípica é encontrada em algumas espécies, gêneros e famílias (Brandham et al., 1998). Existem situações em que os cariótipos de espécies de determinado gênero são quase indistinguíveis. O gênero Billevalia Lapeyr. (família Asparagaceae) é um exemplo em que todas as espécies apresentam cariótipos idênticos, com x=4 e um par de cromossomos metacêntrico e três acrocêntricos (Ozhatay & Johnson, 1996). A nível familiar, em Agavaceae Dumort.e Aloaceae Batch. também ocorre ortoseleção cariotípica.

4.3 Bandamento cromossômico O estudo das regiões heterocromáticas presentes no genoma da família Solanaceae tem mostrado que existe uma grande diversidade em relação à composição e dispersão dessas sequências no cariótipo dos gêneros estudados (Acosta et al., 212; Chiarini et al., 2014; Fregonezi et al., 2006; Moscone et al., 1993). Variações no padrão de distribuição de heterocoromatina (HC) são amplamente documentados, mas grandes mudanças em espécies relacionadas de determinado grupo de plantas é um fato raro (Guerra, 2000).

Os cinco gêneros aqui estudados também apresentaram essa diversidade na composição e distribuição da heterocromatina ao longo dos cromossomos. Foi possível encontrar diferentes distribuições de DNA repetitivo (CMA+/DAPI-, CMA+/DAPI0, CMA+/DAPI+, CMA-/DAPI+, CMA0/DAPI+) nas posições terminais, intercalares e associadas à NOR. Nesse trabalho foram estudadas as regiões heterocromáticas com alta repetitividade de sequências AT e CG. No entanto, podem existir outras regiões de heterocromatina distribuídas ao longo dos cromossomos não evidenciadas pela técnica de bandamento utilizada, que poderiam ser visualizadas através do bandamento C, por exemplo. Isso ocorre devido às variações que podem ocorrer na heterocromatina constitutiva em relação ao tamanho e sequências que a compõem (Sumner 2003).

A presença de heterocromatina rica em sequências GC, marcada por bandas CMA+/DAPI-, associadas à NOR, tem sido observada em muitas espécies de Solanum,

Capsicum e Lycium (Brasileiro-Vidal et al., 2009; Chiarini et al., 2014; Melo et al., 2011; Miguel et al., 2012; Moscone et al., 2007; Rego et al., 2009, Romero-da Cruz et al., 2015; Stiefkens & Bernadello et al., 2010), bem como em espécies de outros grupos de plantas (Guerra, 2000). As espécies aqui estudadas também apresentaram esse padrão, exceto S. adspersum e S. concinnum, em que a HC associada à NOR é CMA+/DAPI0. O heteromorfismo presente na NOR das espécies de Cestrum aqui estudadas, já foi observado em outras espécies de Solanaceae (Brasileiro-Vidal et al., 2009; Moscone et al., 1995; Brasileiro-Vidal et al., 2009). Esse fato pode ser atribuído a rearranjos que ocorrem na heterocromatina associada ao satélite ou à NOR, promovendo eventual heteromorfismo nessas regiões (Sato, 1981).

Outros padrões de bandas heterocromáticas foram bem distintos entre os cinco gêneros estudados, como a composição da heterocromatina na região terminal dos cromossomos. Acnistus arborescens foi a espécie em que foi encontrada a maior diversidade na composição das sequências repetitivas (CMA+/DAPI-, CMA+/DAPI+, CMA-/DAPI+, CMA0/DAPI+), ao passo que em P. pubescens a heterocromatina presente nas regiões terminais é rica em sequências AT (CMA-/DAPI+). Os dois representantes de Cestrum e B. uniflora não apresentaram bandas terminais além das bandas visualizadas na região da NOR e, entre todos os indivíduos de Solanum estudados, houve grande variação na composição das sequências terminais. A localização terminal de bandas heterocromáticas tem sido reportada em algumas espécies pertencentes ao gênero Solanum como, S. platense (Chiarini et al., 2014) S. nitidibaccatum e S. luteum (Melo et al., 2011), S. eleagnifloium, S. pseodocapscium, S. sisymbriifolium e S. chenopodioides (Acosta et al. 2012) e em muitas espécies do gênero Capsicum (Moscone et al., 2007; Romero-da Cruz et al., 2015).

Na posição intercalar também foram encontradas regiões heterocromáticas marcadas por bandas CMA+/DAPI- em algumas espécies, exceto em B. uniflora e S. sanctae-catharinae, em que as bandas intercalares são CMA+/DAPI0. As bandas heterocromáticas intersticiais possuem distribuição equilocal em diferentes grupos de espécies. Em A. arborescens, B. uniflora, S. acerifolium, S. inodorum e S. sanctae-catharinae as bandas intersticiais localizam- se no braço longo dos pares cromossômicos. Já em C. laevigatum e C. mariquitense essa heterocromatina está presente nas proximidades do centrômero, também no braço longo. Por outro lado, em S. diploconos, S. scuticum e S. variabile as bandas aparecem no braço curto de um par cromossômico, embora em S. diploconos esteja mais proximamente ao centrômero.

A ocorrência de bandas CMA+ intersticiais tem sido observada no gênero Solanum. Chirini et al. (2014) observaram bandas CMA+/DAPI- em quatro espécies do gênero Solanum

subg Lepstotemonum. Em S. mammosum L., S. platense Dieckmann e S. palinacanthum, essas bandas possuem distribuição equilocal, em regiões intersticias e subterminais do braço longo dos cromossomos, enquanto em S. aculeatissimum Jacq., ocorrem no braço curto. Em Solanum subgênero Cyphomandra, também ocorre essa distribuição intersticial equilocal da heterocromatina, como mostrado por Miguel et al. (2012), corroborando os dados aqui obtidos para S. diploconos que pertence ao mesmo subgênero. Em Capsicum, bandas CMA+/DAPI e CMA+/DAPI0 intersticiais também têm sido observadas em algumas cultivares de espécies pertencentes ao gênero Capsicum (Moscone et al., 2007; Romero-da Cruz et al., 2015).

Outros padrões de distribuição de heterocromatina têm sido observados através do bandamento C na família Solanaceae e, em alguns casos, esse bandamento é associado a corantes fluorescentes (bandamento C-CMA e C-DAPI). Em trabalhos realizados com o gênero Capsicum, por exemplo, tem sido mostrado a ocorrência de bandas C em na região centromérica de todos os pares cromossômicos (Moscone et al., 1993). Em Cestrum ocorre grande variabilidade na distribuição de bandas C-CMA+ e C-DAPI+, em regiões intersticiais, terminais e pericentroméricas (Fernandes et al., 2009; Fregonezi et al., 2006). A localização de bandas C-DAPI+ pericentroméricas também podem ser observadas em Lycianthes australe (C.V. Morton) Hunz. & Barboza (Rego et al., 2009) e em algumas espécies de Solanum, bem como em Vassobia breviflora (Sendtn.) Hunz. ocorrem bandas C-CMA+ na região terminal de todos os pares cromossômicos (Rego et al., 2009). No gênero Nicotiana também é possível visualizar grandes blocos C-DAPI+ no braço longo dos maiores pares cromossômicos de algumas espécies (Nakamura et al., 2001).

Em geral, existe uma correlação positiva reportada para muitas famílias de plantas entre o tamanho do cariótipo e o número e tamanho de bandas heterocromáticas uma vez que as sequências codificantes do DNA são altamente conservadas ao longo da evolução (Chiarini et al., 2014; Greilhuber, 1984; Pringle & Murray, 1993; Moscone et al., 1996; Benko-Iseppon & Morawetz, 2000). Entretanto, nas espécies de Solanaceae aqui estudadas essa correlação não é sustentada. As espécies com maior CTLH, C. laevigatum, C. mariquitense e S. diploconos, apresentam os menores valores de heterocromatina na composição do genoma 2,73%, 2,05% e 1,87%, respectivamente. As espécies com maiores valores de heterocromatina, S. acerifolium (51,95%), S. inodorum (35,92%) e P. pubescens (34,30%) apresentaram valores intermediários de CTLH e S. sanctae-catharinae (20,34%) apresenta o menor valor de CTLH entre as espécies estudadas. Essa correlação negativa já foi relatada e outros grupos de plantas, como por exemplo, o gênero Pyrrhocactus A. Berger (Cactaceae) (Las Peñas et al., 2008). No entanto,

essas espécies com maior quantidade de heterocromatina citadas anteriormente, possuem um cariótipo assimétrico e, essa correlação entre assimetria e número de bandas heterocromáticas já foi reportada no gênero Solanum (Chiarini et al., 2014) e também em Pyrrhocactus (Cactaceae) (Las Peñas et al., 2008).

Para essas espécies com alto valores de CTLH, o incremento do genoma pode estar associado à inserção de elementos transponíveis nas regiões intergênicas de eucromatina. Sabe- se que os retrotansposons das classes Gypsy e Copia são as sequências repetitivas mais abundantes no genoma da maioria das plantas (Flavell et al., 1992a, 1992b). Esses retroelementos também já foram sequenciados no genoma do tomate (S. lycopersicumL.) (Morgante, 2006) e, em alguns cereais, onde esses elementos têm contribuído para o incremento do tamanho do genoma (Morgante, 2006).

Diante da grande diversidade em relação ao número de bandas, composição, posição, par cromossômico e proporção de heterocromatina em relação ao CTLH, entre os diferentes gêneros estudados, bem como entre as espécies do gênero Solanum, é possível inferir que diferentes modos de amplificação e dispersão dessas sequências podem estar ocorrendo no genoma das Solanaceae a nível específico, gerando tal diversidade (Schweizer & Loidl 1987).

4.4 Número e localização de DNAr Os sítios de DNAr 18S correspondentes à NOR em todos os indivíduos foram fortemente marcados por bandas CMA+, a maioria DAPI-, exceto em P. pubescens (DAPI+) e S. adpersum e S. concinnum (DAPI0). Nem todas as regiões CMA+, apresentam-se associadas ao DNAr, mostrando que essas sequências CG podem ser independentes de genes de DNAr (Jo et al., 2009). Em muitos grupos de plantas essa localização comum tem sido observada (Guerra et al., 2000), bem como na família Solanaceae, como no gênero Solanum (Acosta et al., 2012; Brasileiro-Vidalet al., 2009; Chiarini et al., 2014; Melo et al. 2011; Miguel et al. 2012) e Cestrum (Fernandes et al., 2009; Fregonezi et al., 2006).

A localização dos sítios de DNAr 18-5.8-26S segue um padrão comum de distribuição na grande maioria das espécies de plantas, preferencialmente em regiões terminais do braço curto dos cromossomos (Roa & Guerra, 2012). A maioria das espécies aqui estudadas apresentaram esse padrão de localização, exceto B. uniflora, em que o sítio de DNAr localiza- se na região pericentromérica, e S. inodorum, que apresenta alguns sítios em posição intersticial no braço longo. Em diferentes gêneros de Solanaceae já estudados, esses segmentos são encontrados em diferentes números, mas na maioria das vezes em regiões terminais como

Cestrum (Fernandes et al., 2009; Fregonezi et al., 2006; Urdampilleta et al., 2014), Capsicum (Moscone et al., 1995), Nicotiana (Lim et al., 2000) e Solanum (Chiarini et al., 2014).

A maioria das espécies aqui estudadas apresentaram um sítio de DNAr 18S, exceto C. laevigatum, C. mariquitense e P. pubescens, que apresentaram dois sítios, e S. inodorum que apresentou 18 sítios. Variações no número de sítios de DNAr 18S já foram reportadas em outros estudos realizados para a família. No gênero Cestrum, já foi encontrada uma variação de quatro a oito sítios (Fregonezi et al., 2006). Em Capsicum já foi reportada uma variabilidade de um a oito pares cromossômicos com o locus (Aguilera et al., 2014; Kown e Kim, 2009, Romero-da Cruz et al., 2015).

Em todas as espécies estudadas foi encontrado um par cromossômico portando o sítio de DNAr 5S, exceto em A. arborescens, C. mariquitense, S. acerifolium e S. flaccidum, em que foram encontrados dois pares cromossômicos com o locus para o gene. Essas variações também já foram encontradas em estudos prévios realizados na família (Fregonezi et al., 2006; Rego et al., 2009; Urdampilleta et al., 2014).

Em geral, os sinais de DNAr 5S são encontrados no braço curto de cromossomos pequenos em Solanum (Rego et al., 2009; Chiarini et al., 2014). Entretanto, algumas vezes os sinais estão presentes no braço longo (Rego et al., 2009) ou em cromossomos maiores (Dong et al., 2000). Em outros gêneros, como Nicotiana (Lim et al., 2000) e Cestrum (Fregonezi et al., 2006), o DNAr 5S está localizado em regiões pericentroméricas. Nas espécies aqui estudadas também foi encontrada variabilidade em relação à posição dessas sequências.

Além disso, sítios de DNAr 5S intercalares estão co-localizados com regiões ricas em sequências GC em A. arborescens, B. uniflora, C. laevigatum, C. mariquitense, S. concinnum, S. sanctae-catharinae, S. diploconos, S. scuticum e S. variabile. A localização desses sítios em regiões eucromáticas, como mostrada nas outras espécies, já foi reportada para outros representantes de Solanaceae (Brasileiro-Vidal et al., 2009), evidenciando que algumas regiões cromossômicas, contendo pequenas porções de DNA repetitivo podem estar distribuídas no cariótipo e não serem diferenciadas por técnicas de bandamento.

Em geral, o número de sítios de DNAr 18-5.8-26S é mais polimórfico que os sítios de DNAr 5S (Garcia et al., 2012). Mas na família Solanaceae tanto os sítios de DNAr 18S quanto 5S têm se mostrado altamente variáveis em relação ao número e posição. Esse tipo de variação tem sido frequentemente encontrada entre espécies filogeneticamente relacionadas (Cai et al., 2006; Melo & Guerra, 2003; Nani et al., 2015; Shishido et al., 2000) e até mesmo entre

cultivares ou acessos pertencente à uma mesma espécie (Bustamente et al., 2014; Rocha et al., 2015; Pedrosa-Harand et al., 2006, Raskina et al., 2004b). Essa variabilidade documentada tem levantado a hipótese de que os sítios de DNAr podem ser elementos móveis que compõem o genoma e, diferentes mecanismos têm sido propostos para explicar tal mobilidade (Schubert & Wobus 1985; Dubcovsky & Dvorak 1995).

Em Lotus japonicus (Regel) K. Larsen foi demonstrado que rearranjos estruturais, como translocações podem ser responsáveis por mudanças em relação à localização dos sítios de DNAr (Hayashi et al., 2001). A organização terminal ou subterminal desses segmentos pode levar à ocorrência de rearranjos sem efeitos deletérios para a célula (Hanson et al., 1996; Pedrosa-Harand et al., 2006). Por outro lado, mecanismos de dispersão, amplificação e deleção do locus DNAr parecem ser os responsáveis por mudanças na posição de tais regiões na radiação de espécies de Triticaceae (Dubcovsky and Dvorak, 1995). Outro possível evento responsável pela dispersão de locus de DNAr seria a associação a elementos transponíveis. Já foi mostrado em Cestrum (Fregonezi et al., 2007) e em Arabidopsis (Franz et al., 2000) que elementos transponíveis se associam a NOR e podem estar envolvidos na mobilidade de tais regiões. Estudos em Aegilops L. também sugerem que a mobilidade de tais regiões do DNA pode ser mediada por elemento transponíveis (Raskina et al., 2004 a, b). A recombinação ectópica, ocasionada por um crossing over desigual de determinados segmentos cromossômicos também pode resultar na dispersão desses sítios de rDNA e, alguns estudos têm mostrado que esse mecanismo está associado a variabilidade de locus terminais de DNAr (Pedrosa-Harand et al., 2006; Raskina et al., 2004 a). Esses dados sugerem que os sítios de DNAr 5S e 18S não apresentam uma localização e número de sítios conservados em Solanaceae e essa característica parece ser comum em outros grupos de plantas, como por exemplo Sapindaceae Juss. (Urdampilleta et al., 2006).

Tais mecanismos citados anteriormente, podem explicar também o heteromorfismo em relação à posição e tamanho de regiões de DNAr presente em A. arborescens, C. laevigatum, C. mariquitense e S. inodorum. Adicionalmente, estudos realizados em Asparagales mostram que a perda da sequência telomérica tipo Arabidopsis pode favorecer a ocorrência de recombinação ectópica nessa região (Pich et al., 1996; Adams et al., 2000). A presença de sequências teloméricas diferentes de Arabidopsis em espécies do gênero Cestrum (Sycorova et al., 2003) pode ser um mecanismo reponsável pela ocorrência do hetermorfismo encontrado no tamanho dos sítios de DNAr 18s terminais em em C. laevigatum e C. mariquitense.

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS

As espécies de Solanaceae aqui estudadas apresentaram certa uniformidade em alguns caracteres cariotípicos, mas grande diversidade em outros, principalmente nos padrões de distribuição de heterocromatina (analisado pelo bandamento CMA/DAPI) e de DNAr 5S e 18S.

O número cromossômico parece ser um caráter conservado dentro de cada gênero aqui estudado. Para os gêneros que tiveram mais de uma espécie estudada, Solanum (2n=24) e Cestrum não ocorreram variações quanto ao número cromossômico; os representantes de Acnistus (2n=24), Brunfelsia (2n=22) e Physalis (2n=24) também apresentam a estabilidade, relatada para os grupos, segundo a literatura.

Outro parâmetro cariotípico que se mostrou pouco variável foi a simetria cariotípica, com predominância de cromosssomos metacêntricos no complemento, fato também bem suportado pela literatura disponível para a família. Embora alguns representantes de Solanum não apresentem essa característica, é possível associar essas diferenças a alterações pontuais a nível específico que ocorrem no cariótipo, como inversões pericentroméricas, que podem alterar a morfologia dos cromossomos. Diante disso, pode-se inferir que existe uma evidência de ortoseleção cariotípica ocorrendo na família Solanaceae.

Os valores obtidos de CTLH mostraram diferenças significativas entre algumas espécies estudadas e assim foi possível identificar um grupo de espécies que possui cromossomos maiores formado pelos dois representantes de Cestrum e S. diploconos (subg Cyphomandra). Dessa forma, conclui-se que S. diploconos possui CTLH estatisticamente diferentes dos outros representantes do gênero, fornecendo mais uma evidência à manutenção de Cyphomandra como um gênero distinto de Solanum.

As medidas da heterocromatina também mostraram diferenças significativas entre algumas espécies, mas não mostrou uma correlação positiva com o aumento do CTLH. Com isso, é possível inferir que o incremento do tamanho cromossômico em algumas espécies pode estar relacionado à inserção de elementos transponíveis na eucromatina.

O padrão de distribuição da heterocromatina e DNAr foi bem distinto entre os cinco gêneros estudados e essas diferenças podem ser úteis na separação dos gêneros e no entendimento da evolução cariotípica da família. No entanto, entre os representantes de Solanum, embora tenha ocorrido uma uniformidade no número e localização dos sítios de DNAr 5S e 18S (exceto em S. acerifolium e S. flaccidum), a distribuição da heterocromatina foi bem

variável. Com isso, devido à grande diversidade no número de espécies do gênero, essa diferenciação da heterocromatina pode auxiliar no entendimento das diferenças morfológicas ou ecológicas que ocorrem em espécies relacionadas.

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ANEXOS