PRISCYLLA TATIANA CHALFUN GUIMARÃES

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E IMUNOLÓGICA DO VENENO DE Tityus fasciolatus E SUA AÇÃO SOBRE CAMUNDONGOS

Tese apresentada na Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Ciência Animal Área : Toxicologia e Plantas tóxicas Orientadora : Profa. Marília Martins Melo

Belo Horizonte Escola de Veterinária da UFMG 2009

G936c Guimarães, Priscylla Tatiana Chalfun, 1974- Caracterização molecular e imunológica do veneno de Tityus fasciolatus e sua ação sobre camundongos / Priscylla Tatiana Chalfun Guimarães. – 2009. 130 p. : il.

Orientadora: Marília Martins Melo Tese (doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinária Inclui bibliografia

1. Camundongo como animal de laboratório – Teses. 2. Escorpião – Veneno – Teses. 3. Envenenamento – Teses. 4. Hematologia – Teses. I. Melo, Marília Martins. II. Universidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. III. Título.

CDD – 615.918

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4 AGRADECIMENTOS À Deus, que me fortalece com sua benção, abrindo meus caminhos. Com Ele, ninguém nos detem.

À meu pai e minha mãe, a razão de tudo que faço em minha vida, é por eles que luto e enfrento todos os obstáculos com muito prazer e satisfação.

À minha família, pelo amor e apoio, em especial a minha avó Colete Haddad que me ensinou os princípios de uma vida honesta. Obrigada pelo amor.

À D. Marília, um anjo que Deus colocou em minha vida, obrigada pelo amor e atenção de mãe. Obrigada por me deixar entrar na sua família e fazer parte dela.

À minha orientadora Prof(a). Dr(a). Marília Martins Melo pela dedicação constante para minha vitória nesse doutorado. Obrigada pela oportunidade, paciência, confiança, amizade e principalmente o grande aprendizado na vida profissional e pessoal.

À Prof(a) Dr(a). Zélia pela paciência, ensinamentos e co-orientação para a obtenção de ótimos resultados

Ao Prof. Dr. Jenner pelas valiosas sugestões e atenção.

Ao Prof. Dr. Evanguedes Kalapothakis do Laboratorio de Biotecnologia e Marcadores Moleculares-ICB pela oportunidade e aprendizado na área de Biologia Molecular.

Ao Prof. Dr. Carlos Delfin Chaves Olortegui e sua equipe pela oportunidade e auxílio para a realização deste trabalho

A toda equipe do laboratório de Toxicologia da Veterinária-UFMG, Eduardo, Durval, Márcia, Luana, Carla, Stella, Ana Flavia, Victoria e Felipe muito obrigada pela atenção, carinho e em especial a Mariana pela grande dedicação para alcançarmos excelentes resultados.

Aos amigos do Laboratorio de Biotecnologia e Marcadores Moleculares-ICB, Arthur, Higgor, Ana Luiza, Ana Paula, Carolina, Ana Carolina, Gabriel, Juliana, André e Bárbara pela ajuda, amizade e companherismo durante o tempo que passamos juntos.

À Thais, o outro anjo que Deus colocou na minha vida. Pela valiosa ajuda me enriquecendo com os conhecimento na área de biologia molecular e principalmente por nunca me negar uma ajuda pessoal e profissional.

À Thalita e Sabrina, minhas amigas e irmãs, obrigada pela paciência, carinho e compreensão durante esses 4 anos.

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Aos funcionários da Escola de Veterinária-UFMG pelo carinho e auxilio para realização deste trabalho.

Aos funcionários da Pós-graduação da Escola de Veterinaria-UFMG pelo atenção e apoio durante esses 4 anos.

Aos membros da banca examinadora pelos elogios e críticas construtivas.

Ao CNPq e FAPEMIG pelo suporte financeiro para realização deste trabalho.

A equipe da FUNED pelas sugestões e auxilio para o desenvolvimento deste projeto.

Ao centro de Zoonoses de Ituiutaba pela doação das espécies de Tityus

Aos meus amigos de Liverpool que me fizeram sentir em casa me recebendo com todo carinho e atenção.

Em especial ao Dr. Robert Harrison por ter sido um orientador e amigo me ensinando e apoiando nos momentos felizes e difíceis e sua equipe, Dr. David Theakston, Dr. Gavin, Dr. Darren e Dr. Simon pelo apoio durante os 15 meses que permaneci no grupo. Obrigada pela oportunidade de crescimento profissional e pessoal.

Aos animais meu respeito e amor. Sem vocês esse trabalho não seria possível. Minha eterna gratidão.

6 SUMÁRIO RESUMO ...... 17 ABSTRACT ...... 18 1. INTRODUÇÃO ...... 19 2. REVISÃO DE LITERATURA ...... 20 2.1. Escorpiões ...... 20 2.1.1. Distribuição geográfica e classificação dos escorpiões ...... 20 2.1.2. Aspectos epidemiologicos ...... 22 2.2. Manifestações clínicas ...... 23 2.2.1. Alterações sanguíneas ...... 25 2.3. Diagnóstico ...... 27 2.4. Composição do veneno ...... 29 2.4.1. Toxinas escorpiônicas e seus mecanismos de ação ...... 29 2.4.2. Estrutura molecular das toxinas ...... 31 2.4.3. Toxinas que atuam nos canais de sódio ...... 32 2.4.4. Toxinas que atuam nos canais de potássio ...... 33 2.4.5. Toxinas que atuam nos canais de cloro ...... 33 2.4.6. Toxinas que atuam nos canais de cálcio ...... 33 2.4.7. Toxinas sem ponte dissulfeto ...... 33 2.5. Resposta imune (Soroterapia e vacinas) ...... 34 2.6. Nomenclatura das toxinas ...... 39 2.7. Veneno do Tityus fasciolatus ...... 40 2.8. Veneno do Tityus serrulatus ...... 41 2.9. Homologia entre os venenos ...... 43 3. OBJETIVOS ...... 43 3.1. Objetivo geral ...... 43 3.2. Objetivos específicos ...... 43 4. MATERIAL E MÉTODOS ...... 43 4.1. Veneno e sua extração ...... 43 4.1.1. Tityus fasciolatus ...... 43 4.1.2. Tityus serrulatus ...... 45 4.2. Caracterização clínica do veneno...... 46 4.2.1. Determinação da DL 50 ...... 46 4.2.2. Avaliação anátomo-histológica ...... 46 4..2.3. Avaliação hematológica, bioquímica sérica e plasmática ...... 46 4..2.4. Exames laboratoriais ...... 47 4.3. Caracterização molecular do veneno ...... 47 4.3.1. Extração e purificação do RNA (Ácido ribonucleico) ...... 49 4.3.2. Construção do cDNA da glândula de veneno ...... 50 4.3.3. Padronização da RT-PCR ...... 50 4.3.4. Purificação do cDNA a partir do gel de agarose 1% ...... 51 4.3.5 Ligação do amplicon no vetor de clonagem ...... 51 4.3.6. Preparação de bactérias competentes ...... 52 4.3.7. Transformação da linhagem E. coli XL1 Blue ...... 53 4.3.8. Purificação do plasmídeo ...... 53

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4.3.9. Amplificação do cDNA ...... 54 4.3.10. Sequenciamento ...... 54 4.3.11. Análises computacionais das sequências obtidas ...... 55 4.3.12. Desenho dos iniciadores após resultado do sequenciamento ...... 55 4.4. Caracterização imunológica ...... 56 4.4.1. Imunização dos animais ...... 56 4.4.2. SDS-PAGE do veneno bruto e eletroforese em gel de poliacrilamida ...... 57 4.4.3. Western Blotting ...... 57 4.4.4 Soroneutralização ...... 57 4.5.Análise estatística ...... 58 4.6. Ética em experimentação animal ...... 58 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 59 5.1. Parte I – Estudo Clínico ...... 59 5.1.1. DL 50 ...... 59 5.1.2. Alterações macroscópicas ...... 61 5.1.3. Alterações microscópicas...... 62 5.1.4. Manifestações clínicas ...... 66 5.1.5. Alterações hematológicas ...... 69 5.1.6. Bioquímica Sérica ...... 81 5.2. Parte II - Estudo Molecular ...... 93 5.2.1. Caracterização Molecular ...... 93 5.3. Parte III - Estudo Imunológico ...... 104 5.3.1. SDS-PAGE e Western Blotting...... 104 5.3.2. Soroneutralização in vivo ...... 109 6. CONCLUSÕES ...... 111 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...... 112 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 113 9. ANEXO ...... 130

LISTA DE TABELAS Tabela 1- Divisão dos grupos (tratamentos) 47

Tabela 2- Quantidade de reagentes utilizados na RT-PCR 51

Tabela 3- Descrição de programa utilizado na RT-PCR 51

Tabela 4- Quantidade de material utilizado na ligação do inserto ao vetor 52

Tabela 5- Quantidade de reagentes utilizados no sequenciamento 55

Tabela 6- Descrição do programa utilizado no sequenciamento 55

Tabela 7- Quantidade de reagentes utilizados na segunda RT-PCR 56

8 Tabela 8- Descrição do programa utilizado para realização da segunda RT-PCR 56

Tabela 9- Doses de veneno do Tityus fasciolatus inoculadas via subcutânea nos 60 camundongos e porcentagem de mortes (primeiro intervalo)

Tabela 10- Doses de veneno de Tityus fasciolatus inoculadas por via subcutânea 60 nos camundongos e porcentagem de mortes (segundo intervalo).

Tabela 11- Valores médios do número de hemácias (x 10 6/µl) de camundongos 71 inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Tabela 12- Valores médios das concentrações de hemoglobina (g/dl) de 72 camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Tabela 13- Valores médios do volume globular (%) de camundongos inoculados 73 com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Tabela 14- Valores médios de hemoglobina globular média, HGM (pg), volume 74 globular médio, VGM (g/dl) e concentração de hemoglobina globular média, CHGM (fl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Tabela 15- Valores médios do numero total de leucócitos (x 10 3/µl) de 75 camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. Tabela 16- Valores médios absolutos de neutrófilos e linfócitos (x 103/µl) de 76 camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Tabela 17- Valores médios absolutos de monócitos e eosinófilos (x 10 3/µl) de 77 camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Tabela 18- Valores normais para proteínas séricas (%) de camundongos. 78

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Tabela 19- Valores médios das concentrações de proteínas plasmáticas (g/l) de 78 camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Tabela 20- Valores médios de albumina (g/dl) de camundongos inoculados com 79 PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Tabela 21- Valores médios das α, β e γ-globulinas (g/dl) de camundongos 80 inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Tabela 22- Valores médios de CK total (U/l) e CK-MB (U/l) de camundongos 81 inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Tabela 23- Porcentagem da isoenzima CK-MB em relação a CK total 83

Tabela 24- Valores médios de AST (U/l) de camundongos inoculados com PBS 84 (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Tabela 25- Valores médios de LDH (U/l) de camundongos inoculados com PBS 84 (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Tabela 26- Valores médios de uréia (mg/dl) e creatinina (mg/dl) de camundongos 87 inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Tabela 27- Valores médios séricos de amilase (U/l) de camundongos inoculados 89 com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Tabela 28- Valores médios de glicose (mg/dl) de camundongos inoculados com 90 PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Tabela 29- Valores médios de cortisol (ng/dl) de camundongos inoculados com 92 PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

10 LISTA DE FIGURAS Figura 1- Espécie Tityus serrulatus. 22

Figura 2- Espécie Tityus fasciolatus. 22

Figura 3- Distribuição mundial dos escorpiões (Lourenço, 2002). 22

Figura 4- Exemplar de T. fasciolatus. 44

Figura 5- Extração manual de veneno de T. fasciolatus . 45

Figura 6- Metologia empregada na caracterização molecular do veneno de Tityus 49 fasciolatus

Figura 7- Vetor de clonagem pCR2.1-TOPO utilizado para clonagem dos genes. 52

Figura 8- Áreas de hemorragias nos pulmões do camundongo que veio à óbito 61 após a inoculação de 62,9µg do veneno de Tityus fasciolatus .

Figura 9- Área de hemorragia na região torácica do camundongo que veio à óbito 62 após a inoculação de 62,9µg do veneno de Tityus fasciolatus .

Figura 10- Congestão de vasos cerebrais do camundongo que veio à óbito após a 62 inoculação subcutânea de 62,9µg do veneno de Tityus fasciolatus .

Figura 11- Histologia do coração (HE, 60x) do camundongo que veio à óbito após a 64 inoculação subcutânea de 62,9µg do veneno de Tityus fasciolatus .

Figura 12- Histologia do pulmão (HE, 60x) do camundongo que veio à óbito após a 65 inoculação subcutânea de 62,9µg do veneno de Tityus fasciolatus .

Figura 13- Histologia do cortex cerebral (HE, 60x) do camundongo que veio à óbito 66 após a inoculação subcutânea de 62,9µg do veneno de Tityus fasciolatus .

Figura 14- Sequenciamento e analise das sequências. Em A, B e C, sequências 95 obtidas no MegaBase semelhante a TsNTxP, TsIV e TsVII com resultado da análise no Blastx.

Figura 15- Alinhamento da sequência de nucleotideos de toxinas de Tityus 96 serrulatus e Tityus fasciolatus para otenção de novos iniciadores. Sequência de DNA correspondente ao mRNA da toxina TsNTxP de Tityus serrulatus.

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Figura 16- Alinhamento da sequência de nucleotideos de toxinas de Tityus 97 serrulatus e Tityus fasciolatus para otenção de novos iniciadores. Sequência de DNA correspondente ao mRNA da toxina TsIV de Tityus serrulatus.

Figura 17- Alinhamento da sequência de nucleotideos de toxinas de Tityus 98 serrulatus e Tityus fasciolatus para otenção de novos iniciadores. Sequência de DNA correspondente ao mRNA da toxina TsVII de Tityus serrulatus.

Figura 18- Resultado do segundo sequenciamento. 99

Figura 19- Alinhamento da sequência de aminoácidos da toxina de Tityus 100 fasciolatus (Tf1) com outras toxinas do tipo beta de escorpiões do gênero Tityus.

Figura 20- Alinhamento da toxina de Tityus fasciolatus (Tf3) com outras toxinas de 100 escorpiões.

Figura 21- Alinhamento da toxina de Tityus fasciolatus (Tf4a) com outras toxinas 101 de escorpiões do gênero Tityus .

Figura 22- SDS-PAGE dos principais componentes do veneno de Tityus fasciolatus 106 e Tityus serrulatus .

Figura 23 SDS-PAGE dos principais componentes do veneno de Tityus fasciolatus 107

Figura 24- Identificação da antigenicidade por Western blotting entre os 108 componentes presentes no veneno de Tityus fasciolatus e Tityus serrulatus .

LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1- Valores médios do número de hemácias (x 10 6/µl) de camundongos 71 inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Gráfico 2- Valores médios das concentrações de hemoglobina (g/dl) de 72 camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Gráfico 3- Valores médios do volume globular (%) de camundongos inoculados 73 com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

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Gráfico 4- Valores médios de hemoglobina globular média, HGM (pg), volume 74 globular médio, VGM (g/dl) e concentração de hemoglobina globular média, CHGM (fl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Gráfico 5- Valores médios do numero total de leucócitos (x 10 3/µl) de 75 camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Gráfico 6- Valores médios absolutos de neutrófilos e linfócitos (x 103/µl) de 76 camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Gráfico 7- Valores médios absolutos de monócitos e eosinófilos (x 10 3/µl) de 77 camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Gráfico 8- Valores médios das concentrações de proteínas plasmáticas (g/l) de 79 camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Gráfico 9- Valores médios de albumina (g/dl) de camundongos inoculados com 80 PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Gráfico 10- Valores médios das α, β e γ-globulinas (g/dl) de camundongos 81 inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Gráfico 11- Valores médios de CK total (U/l) e CK-MB(U/l) de camundongos 82 inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Gráfico 12- Porcentagem da isoenzima CK-MB em relação a CK total. 83

Gráfico 13- Valores médios de AST (U/l) de camundongos inoculados com PBS 84 (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

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Gráfico 14- Valores médios de LDH (U/l) de camundongos inoculados com PBS 85 (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Gráfico 15- Valores médios de uréia (mg/dl) de camundongos inoculados com PBS 87 (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Gráfico 15 Valores médios de creatinina (mg/dl) de camundongos inoculados com 88 PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Gráfico 16- Valores médios séricos de amilase (U/l) de camundongos inoculados 90 com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Gráfico 17- Valores médios de glicose (mg/dl) de camundongos inoculados com 91 PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Gráfico 18- Valores médios de cortisol (ng/dl) de camundongos inoculados com 92 PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

LISTA DE QUADROS Quadro 1- Uniformização da nomenclatura das toxinas de Tityus serrulatus 40

Quadro 2- Toxinas purificadas do veneno de Tityus serrulatus nas décadas de 60 a 42 80

Quadro 3- Resultado da Soroneutralização in vivo 110

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LISTA DE ABREVIATURAS Aa Aminoácidos ADP Adenosina difosfata ALT Alanina aminotransferase AMPc Adenosina mono-fosfato cíclico AST Aspartato-aminotransferase ATP Adenosina trifosfata BLAST Basic Local Alignment Search Tool BSA Soro Albumina Bovina cDNA DNA complementar CETEA Comitê de Ética em Experimentação Animal CK Creatina quinase CK-BB Creatina quinase isoenzima BB CK-MB Creatina quinase isoenzima MB CK-MM Creatina quinase isoenzima MM cTnI Troponina I cardíaca DEPC Dietil pirocarbonato Dl Decilitro DL 50 Dose letal de 50% DNA Ácido dexorribonucléico ELISA Enzyme linked immunosorbent assay FUNED Fundação Ezequiel Dias HE Hematoxilina-eosina ICK Inhibitory cystine Knot IL Interleucina INF Interferon Kb Quilobase kDa Quilo Dalton Kg Quilograma Lb Meio de cultura Luria-Bertani LD 1 Lactato desidrogenase isoenzima 1 LDH Lactato-desidrogenase M Molar mg Miligrama Μg Micrograma Ml Mililitro mRNA RNA mensageiro Μl Microlitro mM Mili-Molar Μm Micrômetro N Normal NCBI National Center for Biotechnology Information Ng Nanograma ºC Graus Celsius

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PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida Pb Pares de bases PBS Tampão salina fosfato PBST Tampão salina fosfato Tween 20 PCR Reação em cadeia da polimerase pH Potencial Hidrofeniônico PSA Persufato de amônia PTC Programmable Thermal Controller RNA Ácido ribonucleico RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction SDS Dudecil Sulfato de Sódio SDS-PAGE Gel de poliacrilamida com SDS SEE Síndrome do envenenamento escorpiônico SNC Sistema nervoso central TAE Tampão tris, Ácido acético, EDTA TE Tampão tris e EDTA TEMED Tetrametiletilenodiamino TRIS Tris (hidroximetil) aminometano TsNTxP Tityus serrulatus non-toxic protein U Unidade de enzima UV Ultra-violeta V Volts

LISTA DE ABREVIATURAS DE NOMES DE ESCORPIÕES T. bahiensis Tityus bahiensis T. brazilae Tityus brazilae T. cambridgei Tityus cambridgei T. charreyroni Tityus charreyroni T. costatus Tityus costatus T. fasciolatus Tityus fasciolatus T. lamottei Tityus lamottei T. mattogrossensis Tityus mattogrossensis T. metuendus Tityus metuendus T. neglectus Tityus neglectus T. serrulatus Tityus serrulatus T. stigmurus Tityus stigmurus T. trivittatus Tityus trivittatus

16 RESUMO

Objetivou-se estudar o veneno do escorpião da espécie Tityus fasciolatus, encontrada no Brasil Central, por meio da caracterização molecular, determinação, da dose letal e sua ação refletida nos componentes hematológicos, bioquímicos, anatomo-histopatológicos e imunológicos, utilizando-se o camundongo como modelo experimental. Sessenta camundongos Swiss CF1, machos (18-20g) foram utilizados para determinar a DL 50 do veneno bruto de T. fasciolatus por via subcutânea (SC). Durante o desafio da DL 50 , foi realizado o exame anátomo-histopatológico dos animais que vieram a óbito. Para o estudo do perfil hematológico e da bioquímica sanguínea foram utilizados cinquenta camundongos Swiss CF1, machos, 30g distribuídos em três grupos (n=18), inoculados via SC com 50µl de PBS (G1), 24µg de veneno de T. fasciolatus (G2) e 8µg veneno de T. serrulatus (G3). Cada grupo foi subdividido em três subgrupos (n=6) de acordo com o momento da coleta de sangue, que foi feita 1, 8 e 24h após a inoculação do veneno, e realizados hemograma e dosagem de cortisol, uréia, creatinina, creatina quinase e isoenzima MB, aspartato aminotransferase, lactato desidrogenase, amilase, glicose, proteínas totais e frações. A avaliação molecular foi realizada pela extração e purificação do RNA e técnica de RT-PCR, tendo como moldes iniciadores oriundos da sequência de toxinas do veneno de T. serrulatus . Foi utilizada a técnica de SDS-PAGE e Western Blotting para verificação do perfil protéico das proteínas e reação antigênica cruzada entre as toxinas dos venenos e, a capacidade de neutralização do soro anti-T. serrulatus contra o veneno de T. fasciolatus . A DL 50 do veneno de T. fasciolatus para camundongo foi de 59,65µg/camundongo. Foram observadas alterações histopatológicas no coração, pulmão e cérebro dos camundongos que vieram á óbito. O veneno de T. fasciolatus, na dose de 24µg, causou piloereção, comportamento nociceptivo, secreção nasal e oral acentuadas, dispnéia, prurido na face, reflexos exacerbados, policitemia e leucocitose com linfocitose. O veneno de T. fasciolatus mostrou similaridade ao veneno de T. serrulatus, reatividade e neutralização cruzadas. A metodologia adotada, utilizando iniciadores desenhados a partir do veneno de T. serrulatus e RT-PCR, se mostrou eficaz para o isolamento e obtenção de clones contendo sequências correspondentes aos transcritos de mRNA presentes na glândula de veneno de T. fasciolatus , como a identificação de Tf1, Tf3 e Tf4a. O soro anti-T. serrulatus foi capaz de neutralizar o veneno de T. fasciolatus no estudo in vivo .

Palavras-chave: Tityus fasciolatus , toxina escorpiônica, DL 50 , camundongos, envenenamento, hematologia.

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ABSTRACT

The aim of the study was to investigate the specie Tityus fasciolatus scorpion found in the Central of Brazil. This study was performed through molecular characterization, lethal dose and biochemical, anatomo-histopathological and immunological alterations in mice. Sixty Swiss CF1 mice, male, (18-20kg) were used to determine lethality assays T. fasciolatus (LD 50 ) by subcutaneous injection (SC). The anatomo-histopathological examination was performed with the animals who died during the lethality assays (LD 50 ). To study the blood profile and biochemistry fifty Swiss CF1 mice, male, 30g were used divided into three groups (G) (n= 18) SC with: 50µl of PBS (G1), 24µg of venom of T. fasciolatus (G2) and 8µg venom of T. serrulatus (G3). Each group was subdivided into three subgroups (n = 6) according to the time of blood sample was taken at 1h , 8h and 24h after inoculation of the venom. It was investigated blood profile and levels of cortisol, urea, creatinine, creatine kinase, MB isoenzyme, aminotransferase aspartate, lactate dehydrogenase, amylase, glucose, total protein and fractionated. The molecular characterization was evaluated by molecular extraction and purification of RNA and RT-PCR technique with primers from the sequencie of toxin from venom of T. serrulatus . The antigenic cross-reaction between the toxins of venoms and neutralization ability the anti-T. serrulatus against that of the T. fasciolatus was determined by using the Western Blotting technique. The protein concentration was determined by SDS-PAGE. The LD 50 of the venom of T. fasciolatus for mice was 59.65mg. Histopathological changes were observed in heart, lung and brain of mice who died. The venom of T. fasciolatus at a dose of 24µg caused piloerection, nocioceptive behavior, nasal and oral sharp, dyspnoea, itching on the face and reflexes exacerbated, polycythemia, leukocytosis with lymphocytosis. The venom of T. fasciolatus showed similarity with the venom of T. serrulatus, reactivity and cross- neutralization. The methodology with primers from the venom of T. serrulatus and RT- PCR was effective for the isolation and obtain clones containing sequences corresponding to the mRNA transcripts from the venom gland of T. fasciolatus such as Tf1, Tf3 and Tf4a. In the neutralization assays the antivenon anti-T. serrulatus was able to effectively neutralize the venom of T. fasciolatus .

Keywords : Tityus fasciolatus , scorpion toxin, LD50, mice, envenomation, blood profile.

18 1. INTRODUÇÃO (Cupo et al., 1994; Davila et al., 2002). Cerca de 50 das mais de 1600 espécies A produção de substâncias tóxicas de escorpiões conhecidas em todo o como forma de defesa é um mecanismo mundo são nocivas para os humanos, desenvolvido por muitas espécies de devido ao alto grau de toxicidade plantas e animais ao longo da evolução, (Gazarian et al., 2005). conferindo-lhes uma variabilidade e aumentando a biodiversidade entre No Brasil, os escorpiões estas. comprovadamente perigosos pertencem ao gênero Tityus . Embora ocorram Uma substância produzida por um quase 30 espécies desse gênero no país, animal pode adquirir toxicidade através as responsáveis ou suspeitas de da transformação metabólica obtida pela provocar casos de envenenamentos em alimentação, pelo armazenamento de humanos restringem-se às seguintes: (1) toxinas de outros organismos (bactérias, complexo Tityus stigmurus – inclui os plantas ou outros animais) ou, pela escorpiões atualmente identificados produção de suas próprias proteínas como T. stigmurus (Thorell 1876), T. tóxicas, através da expressão de seus serrulatus (Lutz e Mello, 1922), T. genes. lamottei (Lourenço, 1981) e outras espécies não nominadas. É o grupo mais Toxinas podem ter diferentes atividades importante do ponto de vista do biológicas (locais ou sistêmicas); ser escorpionismo no Brasil e também o sítio-específicas ou não; ser formadas mais complexo, devido aos padrões de por diferentes tipos de compostos polimorfismo apresentados. O grupo é químicos; apresentar numerosos encontrado nos estados de Minas peptídeos em sua estrutura molecular; Gerais, Bahia, Espírito Santo, Rio de participar de processos enzimáticos, de Janeiro, Distrito Federal, norte do inibição, de exacerbação ou de Paraná e São Paulo. Por este motivo, a modulação de funções (Gazarian et al., identificação correta das formas 2005). envolvidas em acidentes por profissionais não especialistas é muito Os escorpiões, como muitos artrópodes, difícil. (2) a espécie polimórfica T. produzem venenos bem adaptados para bahiensis (Perty 1834), encontrada matar ou paralisar presas, especialmente deste a Bahia até Santa Catarina e insetos. A purificação de componentes também descrita no Mato Grosso do tóxicos do veneno bruto dos escorpiões Sul; (3) a espécie polimórfica, T. e a análise dos seus efeitos são os costatus (Karsch 1879), distribuída principais interesses de diversos desde Minas Gerais até o Rio Grande do pesquisadores em todo o mundo Sul, na zona costeira da Mata Atlântica; (Kalapothakis, 2000). (4) T. trivittatus Kraepelin (1898), espécie monomórfica que ocorre apenas O escorpionismo é um problema em algumas localidades do Mato encontrado em muitos países, em áreas Grosso do Sul e do extremo oeste de de clima tropical e subtropical, São Paulo; (5) T. metuendus e T. especialmente nos centros urbanos cambridgei (Pocock, 1897), espécies de

19 grande porte e pigmentação negra que O veneno de escorpião é composto por vivem nas matas da região amazônica; proteínas neurotóxicas de baixo peso (6) T. brazilae , T. neglectus e T. molecular, associadas a aminoácidos mattogrossensis , responsabilizadas por livres e sais. Contém um grande número acidentes de pequena gravidade na de peptídeos e proteínas com 58-76 Bahia e, (7) T. fasciolatus, presente no resíduos de aminoácidos e um número Distrito Federal e Minas Gerais similar de 20-40 (Moreira-Ferreira et (Triângulo Mineiro) e T. charreyroni al., 1998; Castro, et al., 2000; Wagner et existente em Goiás (Lourenço et al., al., 2003). 1997; Barbosa et al., 2002; Soares et al., 2002; Lourenço e Eicksted, 2003; Para facilitar a obtenção de toxinas, as Pardal et al., 2003; Wagner et al., 2003). proteínas do veneno são purificadas, usando-se métodos clássicos da Em 1998, ocorreram no Brasil 10.000 bioquímica, como a cromatografia. acidentes com escorpiões, com uma Porém, este método é lento, caro e taxa de mortalidade que chegou a requer grande volume de veneno. 12,5% entre crianças. Em 2001, as Atualmente, têm sido empregados notificações se elevaram para 18.000 métodos mais modernos, como genética casos e, em 2006, mais de 36.000 casos molecular, com o intuito de isolar novas foram notificados, com uma incidência proteínas. A genética molecular anual de 16 casos/100.000 habitantes emprega métodos cada vez mais (Manual...2001). Em 2008, 856 casos eficiente no isolamento de genes que foram atendidos no Hospital João XXIII codificam toxinas através da técnica de em Belo Horizonte 1. DNA recombinante.

Cinquenta por cento dos casos humanos Diante deste contexto, surgem várias notificados no Brasil ocorreram nos questões: Qual é o perfil molecular do estados de Minas Gerais e São Paulo veneno de T. fasciolatus e como (Chavez-Olórtegui et al., 1994). Esta caracterizá-lo? Quais seriam os efeitos alta incidência no Estado de Minas desse veneno sobre as células Gerais contribui para aumentar o sanguíneas, sobre os tecidos, as interesse dos pesquisadores pelos alterações bioquímicas e anatomo- escorpiões e seus venenos, histopatológicas que causa, além do especialmente por seu potencial comportamento imunológico? toxicológico. Ressalta-se que pouco se sabe sobre a composição do veneno do 2. REVISÃO DE LITERATURA T. fasciolatus e praticamente nada se sabe da ação deste veneno sobre os 2.1. Escorpiões tecidos e as células sanguíneas. 2.1.1. Distribuição Geográfica e classificação dos escorpiões

Os escorpiões pertencem ao grupo dos 1 Comunicação Pessoal. Dr. Délio Campolina. primeiros animais que apareceram na Reponsável pelo setor de Toxicologia do terra, há aproximadamente 400 milhões Hospital João XXIII-Belo Horizonte.

20 de anos (Cupo et al., 2003). Escorpiões Centruroides (América do Norte e são artrópodes que pertencem ao filo Central) e Tityinea – Tityus (América do dos Artropodae , à classe Arachnida e Sul e Trinidade e Tobago). As espécies ordem Scorpionida . São distribuídos em mais venenosas pertencentes a essa nove famílias e hoje 1600 espécies são família são Androctonus (Algéria), conhecidas. A família com a mais Leiurus quinquestriatus (Israel a ampla distribuição no Brasil e no Jordânia), Centruroides (México), mundo e, além de sua maior Buthus occitanus (Jordânia), Tityus importância do ponto de vista serrulatus (Brasil), Parabuthus (África epidemiológico, é a Buthidae (Dias et do Sul), Buthus occitanus (Saara), al., 2001). Tityus trinitatis (Trindade) e Centruroides sculpturatus (América do Os escorpiões podem ser divididos em Norte) (Lira-da-Silva et al., 2000; duas categorias ecológicas, equilíbrio e Murthy e Haghnazari, 1999; Lourenço, oportunistas, dependendo do tipo de 2001). ambiente que eles habitam e sua estratégia de vida. Espécies de No Brasil, o grupo de escorpiões mais equilíbrio ocupam ambientes estáveis e perigosos é representado pelo gênero naturais, enquanto as espécies Tityus (família Buthidae ), que está oportunistas, como os Tityus spp., distribuído por todo o país (Lourenço, podem rapidamente se adaptar a 2003; Wagner et al., 2003), sendo as diferentes ambientes (Lourenço et al., espécies mais responsáveis pelos 1996). A classificação dos escorpiões acidentes Tityus serrulatus (Fig. 1), tem mudado significativamente nos Tityus bahienses , Tityus stigmurus , últimos 10 anos. Especialistas têm Tityus cambridgei , Tityus trivittatus e reconhecido o dobro do número de Tityus fasciolatus (Fig. 2). A espécie de famílias aceitas até 1990. A técnica de escorpião mais estudada, em especial na análise de DNA e, especialmente, os região Sudeste, é a Tityus serrulatus, o estudos moleculares, tem ajudado na escorpião amarelo. Dos 10.000 definição de uma linhagem natural dos acidentes anuais no Brasil, 50% são escorpiões (Lourenço, 2001). diagnosticados nos estados de Minas Gerais e São Paulo (Revelo et al., 1996; Todos os escorpiões possuem veneno, Diego-Garcia et al., 2005). Em Minas sendo que alguns são perigosos ao Gerais, a letalidade pode chegar a homem, podendo até matar. Estes 12,5%, mas, na capital mineira, onde os pertencem à família Buthidae, onde acidentados podem ser socorridos em encontram-se 48 gêneros e serviços especializados, este número aproximadamente 1400 espécies, sendo diminui (Soares et al; 2002). que 25 letais a humanos. A família Buthidae possui quatro subfamílias, as Na Amazônia se encontra os escorpiões quais são responsáveis pelos casos mais Tityus cambridgei, Tityus silvestris , graves, Isometrinae, Buthinae - Tityus metuendus, entre outros. Apesar Androctonus , Buthus , Leiurus , Buthatus de Tityus cambridgei ser a espécie mais e Heterometrus (norte da África, frequente na Amazônia Ocidental, Oriente Médio, Índia), Centrurinea -

21 existem poucos relatos de acidentes de duas espécies: Tityus fasciolatus com o mesmo (Pardal et al., 2003). (Pessôa) e Tityus charreyroni (Vellard). Na região do cerrado brasileiro, Lourenço (2003) descreveu a ocorrência

Figura 2 – Espécie Tityus fasciolatus Figura 1- Espécie Tityus serrulatus

2.1.2. Aspectos epidemiológicos Estados Unidos (Fig. 3). As espécies comumente associadas aos acidentes O escorpionismo desponta, no Brasil, com escorpiões no Brasil são Tityus como um dos maiores problemas de serrulatus e Tityus bahiensis , mas em saúde pública. Além do Brasil, o Brasília e Goiás os acidentes que escorpionismo afeta vários países ocorrem são atribuídos aos Tityus subtropicais como México, Tunísia, serrulatus e Tityus fasciolatus (Pardal et Marrocos, África do Sul, Egito e al., 2003).

Figura 3- Distribuição mundial dos escorpiões (Lourenço, 2002)

22 Tityus fasciolatus é uma espécie Em 1988, iniciou-se a notificação dos endêmica encontrada na região central acidentes escorpiônicos (Manual..., do Brasil (Goiás) e parte de Minas 2001). Considera-se leve a maioria dos Gerais (Triângulo Mineiro), sendo acidentes por escorpiões no Brasil, responsável por muitos casos de sendo que, nos casos graves, a acidentes nesta área. Muitos escorpiões letalidade chega a 0,58%, sendo o óbito da família Buthidae são considerados é associado aos acidentes com Tityus como espécies oportunistas, embora os serrulatus ( Pardal et al., 2003). T. fasciolatus sejam termitófilos e se abriguem exclusivamente em Em Ituiutaba, região do Triângulo cupinzeiros Armitermes euamignathus Mineiro, escorpiões da espécie Tityus Silvestri. Com a variação da fasciolatus têm sido capturados pelo composição do solo, a vegetação Centro de Zoonoses e, segundo os modifica e quando a relva não dados do mesmo, ocorreram 158 permanece por muito tempo, o acidentes no período de 1995 a 1997, cupinzeiro e o Tityus fasciolatus cujos casos foram atendidos no Hospital desaparecem (Lourenço, 1995, Municipal. Ao contrário do que se Lourenço, 2003). observam em outros dados de regiões tropicais, os acidentes ocorreram em Os acidentes podem assumir um perfil maior número na seca, com 24 casos no epidemiológico grave em algumas áreas mês de julho, enquanto no período e sob certas condições. Além do clima chuvoso foram atendidos apenas três tropical e de estações chuvosas, os casos. Não foram pesquisadas as escorpiões possuem a seu favor a alta espécies de escorpião envolvidas nesses adaptabilidade. São muito adaptados ao acidentes (Plazzi et al. 2000). ambiente urbano, onde têm alimentação farta e não possuem os competidores que teriam no meio silvestre, tais como 2.2. Manifestações clínicas macaco, quati, seriema e sapo. Certos locais, como Belo Horizonte, são O escorpião injeta seu veneno na considerados localizados em “solo camada subcutânea e intradérmica da escorpionífero” (Bucherl, 1969, Soares vítima e este posteriormente vai para et al, 2002, Alves et al., 2005). Apesar circulação sanguínea, sendo absorvido de Minas Gerais e São Paulo serem os em poucas horas. A gravidade do estados com maior frequência de envenenamento causado pelo escorpião acidentes escorpiônicos, estes ocorrem T. serrulatus está relacionada com a em quase todos os demais (Soares et al., concentração do veneno no plasma e 2002). nos sítios de ação (Rezende et al., 1996). Vários peptídeos básicos do veneno de Tityus serrulatus têm atividades As substâncias inoculadas pela via neurotóxicas, levando a subcutânea têm uma maior taxa de aproximadamente 1% de mortalidade absorção e caem diretamente na (Kalapothakis e Chávez-olórtegui corrente sanguínea (Klaasen e Rozman, 1997). 1994). Parâmetros farmacocinéticos do

23 veneno de Tityus serrulatus, O envenenamento por escorpião pode determinados por ELISA após injeção levar a um complexo conjunto de subcutânea em ratos, mostraram (1) que sintomas clínicos devido à alteração nos a absorção do veneno do tecido sistemas nervoso, cardiovascular e subcutâneo para o compartimento respiratório, podendo ocasionar central é rápida; (2) que a distribuição insuficiência cardíaca e edema para os tecidos é rápida, sendo de 30 pulmonar óbito (Cupo e Hering, 2002; minutos a meia-vida de distribuição (t ½ Moreira-Ferreira et al., 1998). α); (3) que a afinidade por tecidos é alta, já que a velocidade de distribuição do O primeiro sinal clínico é a dor local compartimento central para os tecidos que nos envenenamentos mais graves foi 28 vezes maior que na direção pode não ser observada devido às oposta e (4) que a excreção é lenta, manifestações sistêmicas (Dias et al., observando-se que a meia-vida de 2001). Os efeitos fisio-farmacológicos eliminação (t ½ β) é 5,5 vezes maior induzidos pelas toxinas escorpiônicas que a meia-vida de distribuição são devidos à ação específica nos canais (Santana et al., 1996). de sódio, seguido da despolarização da membrana das células excitáveis e Hialuronidases, componentes não posterior liberação de catecolaminas e tóxicos do veneno de Tityus serrulatus , acetilcolina pelas terminações nervosas podem contribuir para a rápida absorção dos sistemas simpático e parassimpático e difusão do mesmo através dos tecidos, e zona medular adrenal. Dessa forma, as podendo até mesmo, restringir a eficácia toxinas agem em diferentes sítios do da soroterapia (Pessini et al., 2001). organismo, levando ao aparecimento do quadro clínico. O agravamento dessas Nunan et al. (2003, 2004) mostraram alterações pode se complicar, levar o que há diferenças de valores desenvolvimento de insuficiência toxicocinéticos entre ratos jovens (21- cardio-circulatória, edema pulmonar 22 dias) e adultos (150-160 dias). Após agudo, choque e consequente morte utilização da tityustoxina (TsTX) do (Manual... 2001). veneno de Tityus serrulatus marcada com tecnécio, foi demonstrado, por Rezende et al. (1998) relataram os cintilografia, que animais jovens seguintes achados clínicos dos pacientes apresentam absorção e distribuição atendidos no Hospital João XXIII: dor pelos tecidos (coração, tireóide, local, emese, taquipnéia, sudorese, pulmões, baço, rins e fígado) mais altas agitação, sonolência, ruídos na e mais rápidas, com eliminação mais respiração, arritmias cardíacas, lenta, inclusive com concentração da hipertermia, dispnéia, prostração, toxina no cérebro, cinco minutos após a insuficiência cardíaca, edema pulmonar, aplicação, de 17 vezes maior. hipotermia, bradicardia, palidez, tremores, hipertensão, diminuição da O efeito do veneno depende da idade do perfusão capilar, confusão mental, escorpião, quantidade injetada, estação convulsão e parada cardíaca. do ano e idade e peso da vítima (Murthy e Haghnazari, 1999).

24 Pardal et al. (2003), no Estado do Pará, seguida, às vezes, de hiperestesia, relataram que as manifestações alterações posturais, claudicação, sistêmicas decorrentes de acidentes com espirros, rinorréia, dispnéia, taquicardia, escorpiões ocorreram em 98,6% das elevação da pressão arterial, dor vítimas, sendo que predominaram as abdominal, náuseas e vômitos. alterações neurológicas sobre as autonômicas, diferindo então dos 2.2.1. Alterações sanguíneas envenenamentos por escorpiões em Leucocitose com neutrofilia é uma outros estados do Brasil, demonstrando alteração comum, registrada em muitos assim um comportamento clínico casos clínicos de envenenamento regional do escorpionismo na região de escorpiônico humanos (Gueron et al., Santarém (PA). 1967; Bucaretchi et al., 1995; Cupo e Hering, 2002; Melo et al., 2004) e A função exócrina dos pâncreas altera também em cães (Cordeiro et al., 2006; nas intoxicações por escorpiões. Uma Labarrère et al., 2007, Ribeiro et al., das mais severas consequências dos 2009). Embora sejam relatadas reações acidentes escorpiônicos em humanos é inflamatórias decorrentes do uma grave pancreatite hemorrágica envenenamento escorpiônico, como aguda, seguida de sialorréia, náusea, miocardite e pancreatite, além da vasta diarréia e dor abdominal. Os efeitos no participação de citocinas e mediadores pâncreas são devido à ação do veneno inflamatórios, o mecanismo mais nos receptores muscarínicos. O veneno provável da leucocitose é o estresse de Tityus serrulatus leva a um aumento causado pela dor, que maximiza a significativo e prolongado da secreção descarga de adrenalina e provoca uma pancreática em ratos, além de alterações reação fisiológica devido ao histológicas no órgão (Novaes et al., desprendimento de leucócitos do “pool” 2002). marginal dos vasos sanguíneos (Jain, 1993). A administração de insulina reverte às alterações hemodinâmicas e edema A hiperglicemia é o efeito metabólico pulmonar em crianças e adultos em do envenenamento escorpiônico mais acidentes escorpiônicos. Revertem importante e relacionado a diversas também as mudanças no espécies de escorpiões. Os mecanismos ecocardiograma em animais e reduz os da hiperglicemia são multifatoriais, níveis de angiotensina II, glicogênese e incluindo os efeitos dos lipogênese (Murthy e Haghnazari, neurotransmissores sobre fígado, 1999). pâncreas e tecido adiposo. As catecolaminas agem no fígado ativando Ribeiro (2008), estudando o a adenilciclase, levando à formação de escorpionismo em cães, demonstrou que AMPc (adenosina mono-fosfato a dose de veneno de Tityus serrulatus cíclico), com subsequente glicogenólise, capaz de levar a um quadro clínico de enquanto o efeito lipolítico causa média gravidade é de 250µg/kg. Os liberação de ácidos graxos livres e sinais e sintomas observados nos cães aumento de aminoácidos precursores de foram dor local imediata e intensa, gliconeogênese, tais como leucina,

25 isoleucina e valina . Os efeitos do utilizar os substratos metabólicos, com veneno sobre o pâncreas podem causar falência múltipla dos órgãos (Murthy e lesões que degeneram ilhotas Haghnazari, 1999). pancreáticas e influenciar na produção de hormônios, inibindo a liberação de Os níveis plasmáticos de glicose no insulina e estimulando a secreção de homem, que são considerados normais glucagon (El-Asmar, 1984; Ismail e até 99mg/dl em humanos, variaram de Abd-Elsalam, 1988; Murthy e Hase, 249 a 357mg/dl entre oito pacientes 1994; Murthy e Haghnazari, 1999; com quadro clínico grave, atendidos por Yugandar et al., 1999). A inoculação Cupo e Hering, (2002). Em um caso experimentalmente de veneno do extremo, Bucaretchi et al. (1995) escorpião indiano Mesobuthus tamulus relataram em uma criança uma glicemia concanesis em cães causou de 576mg/dl. hiperglicemia, aumento dos níveis de glucagon e elevação em mais de 200% A dor abdominal, em muitos casos, dos níveis de cortisol, concluindo-se pode ser atribuída à ação tóxica do que a norepinefrina liberada pelas veneno escorpiônico sobre o pâncreas. terminações nervosas e os Atribui-se essa sintomatologia ao glicocorticóides mediam os efeitos de estímulo parassimpático da acetilcolina, gliconeogênese e glicogenólise que aumenta a sua secreção exócrina, decorrentes ao envenenamento determinando níveis plasmáticos escorpiônico (Murthy e Haghnazari, aumentados de amilase pancreática em 1999). Contudo, Sankaran et al. (1983) envenenamentos moderados ou graves induziram experimentalmente a (Bartholomew, 1970; Sofer et al., 1991; secreção pancreática de insulina in vivo Bucaretchi et al., 1995; Cupo et al., em cães e em ratos, usando veneno de 2003; Melo et al., 2004). Novaes et al. T. trinitatis ; essas secreções foram (1982) induziram aumento no fluxo inibidas por atropina, o que revelou a pancreático de ratos vagotomizados participação de receptores colinérgicos com injeção de tityustoxina purificada, muscarínicos na estimulação. Diversos indicando tal resultado que o bloqueio relatos de acidentes escorpiônicos no vagal não pôde impedir os efeitos do Brasil incluem entre os achados veneno sobre o pâncreas. Fletcher et al. laboratoriais a hiperglicemia em (1996), usando venenos de escorpiões quadros clínicos moderados e graves. do gênero Tityus mostraram que o estímulo à secreção de células acinares Com o aumento das catecolaminas pancreáticas de cobaios depende da ocorre a retenção da secreção de abertura de canais de Na + sensíveis a insulina e aumento da angiotensina II. neurotoxinas, assim como acontece nos Pode ocorrer também liberação da neurônios. Machado e Silveira Filho secreção de glucagon e cortisol. O (1976/1977) induziram uma pancreatite aumento dos hormônios reguladores hemorrágica em cães aplicando doses (glucagon, glicocorticóides e letais e sub-letais de veneno total de T. catecolaminas) opõe à ação de insulina, serrulatus por via intravenosa. Possani resultando em deficiência de energia e et al., (1992) observaram o efeito inabilidade dos órgãos vitais para secretagogo do veneno de T. serrulatus

26 sobre o pâncreas de cobaios in vitro e saudáveis, relatou aumento dos níveis caracterizaram microscopicamente a de cortisol, insulina, glicose, alanina depleção de grânulos zimógenos de aminotransferase (ALT) e aspartato células acinares pancreáticas de cães, aminotransferase (AST), além de eliminados após o estímulo do veneno leucocitose com neutrofilia até 12 horas in vivo . Em ratos, o veneno de T. após o envenenamento. serrulatus causou pancreatite aguda 48h após a injeção intravenosa e pancreatite 2.3. Diagnóstico crônica em até 20 dias após o envenenamento, sendo os achados O diagnóstico de acidentes histopatológicos mais importantes escorpiônicos em Minas Gerais, ainda é degranulação e vacuolização acinar, feito pela identificação do animal infiltração difusa de leucócitos, lesões envolvido e exame clínico. Por isso é granulomatosas, dilatação e hiperplasia muito importante levar o espécime ductal, hiperplasia de linfonodos envolvido no acidente para peripancreáticos e mobilização e identificação. Um exame importante degranulação de mastócitos (Novaes et para o tratamento dos acidentes al., 2002). humanos causados por escorpiões é o eletrocardiograma, onde podem ser As lesões de miocárdio são visualizadas várias alterações, que identificadas em análises laboratoriais normalmente desaparecem em torno de por meio da dosagem sérica de enzimas três dias, mas podem persistir por sete de origem muscular, tais como ou mais dias (Manual..., 2001). aspartato-aminotransferase (AST), Mudanças ecocardiográficas foram lactato-desidrogenase (LDH) e creatina- primeiramente reportadas em 1988 em quinase (CK) e principalmente as Jerusalem, após a ocorrência de lesão isoenzimas LD1 e CK-MB, liberadas do miocárdio devido a um acidente por especificamente pelo músculo cardíaco escorpião. No mesmo ano foram lesado. A dosagem de troponina I, uma observadas alterações ecocardiográficas proteína estrutural do miócito, tem sido depois de um acidente com Tityus utilizada para diagnóstico de lesões serrulatus (Cupo et al., 1994). cardíacas, sobretudo infarto agudo do miocárdio. Como as sequências de O acidente escorpiônico, devido ao aminoácidos dessa proteína diferem efeito inotrópico positivo, pode haver entre o músculo cardíaco e o estriado consumo excessivo de oxigênio, esquelético, ensaios imunológicos levando a hipóxia e possível necrose baseados em anticorpos contra teciduais, justificando então o aumento troponina I cardíaca (cTnI) são de das enzimas cardíacas e as alterações altíssima especificidade e auxiliam no observadas no ecocardiograma (Cupo et diagnóstico de miocardite do al., 1994). envenenamento escorpiônico (Cupo e Hering, 2002; Cupo et al., 2003). Antigamente a lesão cardíaca causada por picada de escorpião era avaliada Ribeiro (2008), estudando os efeitos do apenas por mudanças no veneno de T. serrulatus em cães adultos eletrocardiograma. Como o acidente

27 pode levar a um infarto do miocárdio ou rejeição de transplantes (Bertazzi et al., miocardite, atualmente, além do 2003; Bertazzi et al., 2005). eletrocardiograma, avalia-se o aumento das enzimas creatina fosfoquinase (CK- Testes imunodiagnósticos podem ser MB), lactato desidrogenase (LD 1) e úteis na identificação e quantificação de aspartato aminotransferase (AST), além antígenos tóxicos no sangue de de detecção de mioglobina em amostras pacientes picados por escorpiões. Esses de soro e urina e achados de necropsia testes podem fornecem uma base para (Cupo et al., 1994). Entretanto, como determinar a quantidade de antiveneno estas enzimas possuem baixa que deve ser usado no tratamento ou especificidade, os pesquisadores para determinar uma relação entre a começaram a utilizar marcadores mais gravidade e a quantidade de veneno específicos, como a troponina, que circulante. O enzyme-linked apresenta mais de 98% de sensibilidade immunosorbet assay (ELISA) é uma e especificidade para detectar um infarto técnica utilizada para quantificação e agudo do miocárdio em humanos (Cupo verificação da cinética do veneno e Hering, 2002). circulante, podendo estimar a toxicidade do veneno. A técnica de ELISA Bertazzi et al. (2005) observaram que o apresenta várias vantagens, como veneno de T. serrulatus tem a rapidez, sensibilidade e baixo custo, habilidade de induzir o recrutamento de mas requer reagentes de boa qualidade leucócitos, além de ativar o sistema para uma detecção confiável (Revelo et complemento após gerar fatores al., 1996; Manual..., 2001). quimiotáticos. Ocorre também uma reação inflamatória caracterizada por Chávez-Olórtegui et al. (1994) edema, níveis elevados da proteína C- padronizaram um ELISA para detecção reativa, das interleucinas IL-6, IL-1α e de antígenos do veneno de Tityus TNF-α e grave leucocitose com relativa serrulatus . O teste de ELISA detectou neutrofilia. antígenos em soro de pacientes com envenenamento sistêmico por Tityus A ativação do sistema do complemento serrulatus , mas falhou na separação pode explicar algumas manifestações daqueles que apresentaram apenas dor causadas pela picada de Tityus local no sítio da picada de pacientes serrulatus . O aumento da controles. O teste de ELISA pode ser permeabilidade vascular pode exacerbar utilizado para monitoração de níveis de o edema pulmonar e as alterações veneno no soro de pacientes com cardíacas, que são as principais envenenamento sistêmico. A técnica alterações responsáveis pela morte no tem sido utilizada para quantificar envenenamento escorpiônico. Baseado veneno e antiveneno, por ser de fácil nisso, o veneno pode ser considerado execução, baixo custo e não envolver importante para o controle da atividade material radioativo. do sistema complemento durante a resposta imune e inflamação, bem como Revelo et al. (1996) realizaram um em pacientes em condições como experimento para avaliar a distribuição do veneno de T. serrulatus e sua

28 redução com o uso do antiveneno no explica as complicações cardíacas do soro em vários tecidos de ratos, envenenamento. utilizando a técnica de ELISA. Depois da injeção do veneno, os animais Os achados anátomo-patológicos são apresentaram sintomas durante duas raros nos acidentes em humanos que horas e seis animais morreram entre a levam a morte. Apesar disso, pode ser primeira e segunda hora; quando encontrados pneumonia hemorrágica, veneno e antiveneno foram aplicados dilatação do ventrículo esquerdo e juntos, nenhum animal morreu. miocárdio sem alterações a microscopia Entretanto, quando o antiveneno foi ótica, alterações degenerativas de fibras administrado uma hora depois, os cardíacas, necrose focal, edema sintomas foram similares ao do primeiro intersticial e aumento da celularidade, experimento, mas nenhum animal com presença de linfócitos e monócitos. morreu. O veneno foi absorvido Pode ocorrer presença de neutrófilos e rapidamente, observando-se níveis eosinófilos nos espaços alveolar e renais máximo em 15 minutos. A intersticial, além da deposição de eliminação ocorreu rapidamente quando fibrina. São observados aumento do o veneno foi administrado junto com o tamanho do pulmão, áreas de edema e antiveneno, mas foi mais lenta quando hemorragia pulmonar e infiltrado este foi administrado uma hora após; inflamatório (Cupo et al., 2003). isso explicou a ineficiência da soroterapia quando administrada 2.4. Composição do Veneno algumas horas após a picada. 2.4.1. Toxinas escorpiônicas e seus mecanismos de ação Revelo et al. (1996) concluíram que o antiveneno tem uma meia vida de 66 A geração de substâncias tóxicas é uma minutos e uma distribuição entre três evolução adquirida nos sistemas de compartimentos (sangue, tecidos defesa de várias espécies de superficiais e tecidos profundos), com invertebrados e vertebrados (Gazarian et uma eliminação de meia-vida de 43,3 al., 2005). Os primeiros estudos sobre o horas, sendo que o nível máximo se veneno de escorpião no Brasil foram encontra no rim, pulmão, coração e realizados por Murano em 1915 e Vital fígado. O fato de encontrar uma Brasil em 1918 (Pardal et al., 2003). concentração maior de veneno no rim deve-se à eliminação do mesmo por As principais características do veneno esse órgão. A absorção e distribuição de escorpiões são a grande variedade e a em diferentes tecidos são rápidas, complexidade de suas toxinas. O chegando ao nível máximo dentro de 30 veneno é composto por proteínas de minutos após injeção, e sua eliminação baixo peso molecular (toxinas e ocorre em oito 8 horas. Nenhum veneno neurotoxinas, entre outras), foi detectado no SNC, concluindo que aminoácidos livres, sais inorgânicos, esse não atravessa a barreira lipídeos e aminas biogênicas. Os hematocefálica. A concentração do escorpiões utilizam diferentes peptídeos veneno no coração foi baixa e não para neurotóxicos para imobilizarem suas vítimas e estes afetam a permeabilidade

29 dos íons de algumas células. O veneno principal no veneno total e escorpiões dos escorpiões é constituído com grande concentração da mesma principalmente por proteínas, com têm alto nível de toxicidade ponto isoelétrico entre 8,0-9,0, (Kalapothakis e Chávez-Olórtegui dialisável e termo resistente (Possani et 1997). al, 1999; Castro, et al., 2000; Wagner et al., 2003; Vasconcelos et al., 2005). As toxinas β agem no sítio 4 e mudam a dependência de voltagem da ativação do As neurotoxinas de peso molecular canal na direção hiperpolarizante sem entre 6000 a 7000 daltons são moléculas afetar a inativação, promovendo bem estruturadas, resistentes à repetidos disparos após um único desnaturação térmica e contém de 30 a estímulo. São compostas por 60-65 22% de sua estrutura composta por resíduos de aminoácidos e unidas por folhetos β e 4 a 11% composta por α quatro pontes dissulfeto (Possani et al., hélices. As toxinas são classificadas de 1999). acordo com seu efeito em mamíferos, crustáceos e insetos. As neurotoxinas Dois grupos de toxinas de escorpião são compostas por uma cadeia simples altamente específicos para insetos têm de polipeptídeos de 4-9 kDa e sido descritos as excitatórias e estruturalmente estabilizadas por três ou depressivas. As excitatórias causam quatro pontes dissulfeto. As proteínas uma descarga repetida nos axônios e as que contém cisteínas na sua estrutura e depressivas produzem inibição da fazem ponte dissulfeto sendo divididas excitabilidade devido à despolarização em quatro grupos de acordo com sua do mesmo. As toxinas depressivas ação nos canais de sódio, potássio, causam uma diminuição no pico de cálcio e cloro. As toxinas mais sódio e induzem uma corrente negativa estudadas e de maior importância no potencial das membranas (Possani et farmacológica são as toxinas que afetam al., 1999). os mamíferos e atuam nos canais de sódio. Estas toxinas são divididas em O mecanismo de ação do veneno do dois grupos, α e β (Becerril et al., escorpião T. serrulatus e T. bahiensis 1997). envolve ligação da proteína em canais de sódio pós-ganglionares com função As toxinas α agem no sítio 3 dos canais estimuladora, havendo toxinas de sódio, retardando ou bloqueando a voltagem-dependente e outras não. inativação do canal de maneira Ocorre também ligação de outras voltagem-dependente. Sua ligação proteínas em canais de potássio pós- promove uma mudança conformacional, ganglionares, mas com função de tal forma que ao retardar ou bloquear bloqueadora, ou seja, não deixa o a inativação do canal produz uma potássio retornar para célula, contínua despolarização das membranas acumulando-se esse íon no meio das terminações nervosas, causando extracelular; despolarização da uma liberação não controlada de membrana e “disparo” do potencial de neurotransmissores (Becerril, et al., ação e liberação de catecolaminas 1997). A α-toxina é o componente letal (adrenalina e noradrenalina) e

30 acetilcolina pelas terminações neuronais hélice/folha-β estabilizada por cisteína, nas sinapses (Melo et al., 2004; três voltas compactadas tipo I e quatro Gazarian et al.; 2005, Rodríguez et al., pontes dissulfeto. As toxinas γ possuem 2005). uma extensão típica da região C- terminal, seguido de uma α-hélice A liberação dos mediadores químicos adicional que deve ser essencial para pode levar a um aumento substancial da atividade tóxica. O segmento α-hélice secreção das glândulas exócrinas do não está diretamente envolvido na trato gastrointestinal, glândulas atividade biológica e provavelmente age salivares, estômago e pâncreas e, assim, na estabilização da conformação ativa induzir degranulação de mastócitos e de da molécula. Resíduos na região C- outras células, liberando histamina, terminal podem contribuir para a serotonina, peptídeos e citocinas atividade biológica da toxina. A (Novaes et al., 2002). superfície onde há o grupo aromático e resíduos hidrofóbicos, chamado de Lourenço et al. (2002) demonstraram superfície hidrofóbica conservada que as toxinas de escorpiões são constitui o sítio ativo da toxina, embora capazes de causar alterações diretas no alguns autores não concordem (Possani sistema nervoso central. Eles et al., 1999). fracionaram o veneno de T. bahiensis e estudaram os efeitos de algumas frações Existem resíduos de aminoácidos que (P2, P3, P4, P5, P6 e P7) no sistema são conservados ou invariáveis nas nervoso central de mamíferos. toxinas α e β. O resíduo positivo Inoculações de P5, P6 e P7 em (arginina ou lisina) na posição 2, camundongos induziram convulsão e as negativo na posição 3, aromáticos nas frações P5 e P6 determinaram posições 5 e 47 e alifático nas posições alterações eletrocardiográficas. Injeções 4, 6, 7, 45 e 51 (numeração da AaH II) e da fração P3 no hipocampo não as oito cisteínas são conservadas em induziram convulsão ou lesões, porém todas as toxinas (com exceção das quando administrada via endovenosa, toxinas γ-inseto específica). A estrutura causou alterações neurológicas. tridimensional é formada pela presença de quatro pontes dissulfeto, uma 2.4.2. Estrutura molecular das estrutura secundária altamente toxinas conservada com um folheto β-folha

antiparalelo e uma α-hélice. A hélice A estrutura primária das toxinas escorpiônicas apresenta grande está ligada a β3 por duas das quatro semelhança. Há uma estrutura pontes dissulfeto. Um par de cisteína da conservada entre as famílias de α-hélice está separado por um proteínas (Possani et al., 1999). tripeptídeo, enquanto um par de resíduos de cisteína de β3 está separado As toxinas têm a mesma estrutura por um resíduo de aminoácido. Se secundária α-hélice e três fitas folha-β resíduos de cisteína são de N- ou C- antiparalelas conectadas por duas pontes terminal, o α-hélice contém resíduos dissulfeto construindo a estrutura α- Cys3 e Cys4, e enquanto β3 inclui

31 resíduos Cys6 e Cys7. Estruturas 2.4.3. Toxinas que atuam nos canais terciárias conservadas na β2 são Cys5 e de sódio Cys2, exceto na toxina de inseto onde há dois resíduos de cisteína (Possani et As toxinas desse grupo são longas, com al., 1999). aproximadamente 60 a 70 aminoácidos, e têm quatro pontes dissulfetos e são Inspeções nos alinhamentos da estrutura subdivididas em alfa (α) e beta (β) terciária das toxinas revelam quatro (Possani et al., 1999). principais regiões onde se tem observado grande número de gaps , As toxinas que agem nos canais de aumentando a similaridade entre as sódio são as mais reativas neurotoxinas mesmas. Essas regiões estão localizadas e as principais responsáveis pela maior nos resíduos 20, 35, 45 e 65. Esses gaps toxicidade do veneno. A interação da têm o nome de loop J, M, B e F, toxina com o canal de sódio é do tipo respectivamente. O loop F é de toxina hidrofóbica, composta de resíduos de específica de insetos (Possani et al., aminoácidos alifático e aromático 1999). (Vasconcelos et al., 2005). O estudo das toxinas que interferem nos canais de O modelo de organização das toxinas sódio (NaScTxs) tem grande que afetam canais de sódio consiste em importância científica e médica dois exons e um intron, sendo que o (Wagner et al., 2003). intron interrompe o peptídeo sinal. Os genes que codificam toxinas de As toxinas de canal de sódio incluem escorpião apresentam intron que sempre toxinas contra insetos, crustáceos e interrompem a sequência que codifica mamíferos e peptídeos sem ou com para o peptídeo sinal. O significado pouca toxicidade (Possani et al., 1999). funcional desta localização do introns é desconhecido, mas pode estar envolvido De acordo com Possani et al. (1999), as na regulação da expressão destas toxinas de canal de sódio são proteínas. Os íntrons presentes em classificadas em 10 grupos: genes que codificam toxinas têm em 1- Velho mundo: Toxinas α média 400bp e formam uma estrutura clássicas ativas em mamíferos, característica, exon-intron-exon incluindo α toxina do novo (Becerril et al., 1997). mundo. 2- Toxinas β clássicas: específicas Os pesquisadores têm procurado o de mamíferos. isolamento de toxinas por meio de um 3- β toxinas: específicas de par de oligonucleotídeos específicos de mamíferos e insetos. uma sequência de cDNA seguida da 4- Depressivas: específicas de amplificação por PCR da sequência de insetos. interesse, sem a necessidade de fazer 5- Fraca atividade em insetos bibliotecas genômicas e de cDNA 6- α-toxinas insetos: não é só (Corona et al., 1996). específica de insetos. 7- Excitatória em insetos e α e β em mamíferos.

32 8- Toxinas ativas fracas: Não ação em células excitáveis e não tóxicas para mamíferos. excitáveis (Becerril et al., 1997) e uma 9- Novo mundo: Tóxica para alta conservação da estrutura secundária insetos e crustáceos cisteina α/β (Abdel-Mottaleb et al., 10- Excitatórias: Específicas para 2006). insetos. 2.4.5. Toxinas que atuam nos canais O cDNA e sequências genômicas de de cloro algumas toxinas de canal de sódio têm sido estudadas (Diego-Garcia et al., As toxinas que atuam nos canais de 2005). Essas análises mostraram que os cloro são pequenas, com 35 a 38 DNA têm aproximadamente 650-950 aminoácidos e quatro pontes dissulfeto. nucleotídeos contendo um íntron 300- A Clorotoxina, específica para canais de 620 bases. Em todas as sequências o cloro, tem 36 resíduos de aminoácidos e íntron interrompe o último terço na quatro pontes dissulfeto (Becerril, et al., região clonada do peptídeo sinal. Então, 1997; Possani et al., 1999). a estrutura dos genes clonados das toxinas de canal de sódio é composta 2.4.6. Toxinas que atuam nos canais por dois exons e um íntron inserido no de cálcio último terço do peptídeo sinal, que é composto por 18-21 aminoácidos As toxinas que atuam nos canais de (Possani et al., 1999). cálcio são um grupo de toxinas muito heterogêneo, de cadeia longa ou curta, 2.4.4. Toxinas que atuam nos canais que agem em canais dependentes de de potássio voltagem ou em receptores de rianodina responsável pela liberação de cálcio As primeiras toxinas descritas atuavam intracelular, algumas têm motivo ICK em canais de sódio, hoje se sabe que, (inhibitory cystine knot ) (Mosbah et al., além das toxinas que atuam nos canais 2000). de sódio existem também outras que agem nos de potássio; estas toxinas 2.4.7. Toxinas sem ponte dissulfeto ligam-se na superfície extracelular da célula e impedem a passagem desse íon As toxinas sem ponte dissulfeto (Legros et al., 1998; Possani et al, pertencem a uma importante classe de 1999). As toxinas específicas para peptídeos bioativos descobertas canais de potássio (KTx) podem ser recentemente no veneno de escorpiões. longas ou curtas, sendo curtas Vinte e seis peptídeos deste tipo foram compostas por com 20 a 50 descritos. São toxinas de tamanho entre aminoácidos, subdivididas nos três 13 a 50 aminoácidos e um baixo grau de tipos, alfa (α), gama (γ) e kapa-KTx, similaridade. Funcionalmente essas com três ou quatro pontes dissulfeto toxinas atuam como potencializadores (Batista et al., 2000). As toxinas de bradicinina, antimicrobianos, grandes contêm entre 60 e 70 iniciadores da sinalização molecular de aminoácidos, três pontes dissulfeto e célula e modulação imune, entre outras são chamadas de beta-KTx. Elas têm (Zhijian et al., 2006).

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Tityus serrulatus . Após isso, foi 2.5. Resposta imune (Soroterapia e produzido pela primeira vez em ampla vacinas) escala o soro antiescorpiônico utilizando o veneno de Tityus serrulatus O tratamento mais usual para pacientes em cavalos. Para se conseguir o picados por escorpiões é a soroterapia. antígeno, era feito o macerado dos A soroterapia é eficiente quando télson, que contêm a glândula de administrada imediatamente após a veneno, sendo então injetado em picada, diminuindo por completo a cavalos (Lucas, 2003). concentração do veneno no coração, baço e fígado e reduzindo de forma O veneno para a produção de soro pode significativa nos pulmões e rins (Revelo ser obtido de duas formas, por extração et al., 1996; Moreira-Ferreira et al., mecânica ou manual e extração das 1998). proteínas tóxicas das glândulas. Um télson produz, no máximo, 24mg de O primeiro soro antiescorpiônico foi veneno. Alguns pesquisadores citam produzido no Cairo por Todd em 1909 que a extração do veneno por (Hassan, 1984). No Brasil, o primeiro estimulação elétrica provoca a saída de soro produzido foi em 1917, por Eurico substâncias não tóxicas e que a Vilela, aplicando a metodologia estimulação manual libera apenas as utilizada por Vital Brasil, no Instituto tóxicas (Hassan, 1984). Butantã. Após a descoberta do T. serrulatus por Lutz e Mello, em 1922, o O veneno bruto contém vários veneno desta espécie foi utilizado como antígenos, cada um possuindo uma imunógeno na produção de eficientes atividade biológica e imunológica antivenenos para uso terapêutico no diferente. Anticorpos específicos para estado de Minas Gerais (Hassan, 1984). diferentes antígenos não são produzidos em quantidades iguais. O efeito total No Brasil existem três grandes centros desses anticorpos representa a potência onde são produzidos os soros imunológica do antiveneno. Como antiescorpiônicos, Instituto Butantã em todos os venenos contêm diversas São Paulo, Instituto Vital Brasil no Rio toxinas letais com antigenicidade de Janeiro e Fundação Ezequiel Dias em diferente, cada um combina com seu Belo Horizonte, Minas Gerais. Os anticorpo correspondente. Com um estudos com veneno de escorpião no antiveneno altamente concentrado e Instituto Butantã começaram por volta refinado, esse efeito é mínimo (Hassan, de 1905 com o veneno de Tityus 1984). bahiensis Perty (Brazil, 1918). Em 1915, Heitor Maurano testou o soro O uso de mistura de venenos de antiescorpiônico produzido a partir do escorpião é importante para a produção veneno do escorpião Butbus de anticorpos, mas a variabilidade da quinquestriatus e chegou à conclusão de composição do veneno entre espécies que o mesmo deveria ser específico, deve ser considerada e analisada. O pois não apresentava eficácia contra o conhecimento da variabilidade envenenamento causado pela espécie geográfica e individual nos venenos da

34 mesma espécie tem se tornado dois pacientes entre seis e 24 horas após importante para a produção de soro a administração do antiveneno. Assim, efetivo e o entendimento dos sintomas demonstraram a eficácia da clínicos apresentados pelos pacientes imunoterapia no tratamento do (Kalapothakis e Chávez-Olórtegui envenenamento por escorpiões em 1997). humanos.

O soro utilizado na terapia é obtido pela Rezende et. al. (1998) também imunização de cavalos com veneno estudaram a farmacocinética do veneno total. A eficácia do tratamento está de Tityus serrulatus pela via subcutânea relacionada com a rapidez da em ratos e observaram uma rápida administração, pois toxinas de baixo absorção do veneno, alta distribuição e peso molecular se difundem afinidade nos tecidos e uma lenta rapidamente pelo organismo, eliminação. Assim, tais autores dificultando sua captura pelos concluíram que a terapia com o anticorpos específicos. A qualidade do antiveneno deve ser iniciada o mais soro é importante, pois o mesmo rápido possível, devido à sua rápida neutraliza apenas ou absorção e concluíram também que a predominantemente as neurotoxinas no gravidade dos acidentes escorpiônicos compartimento vascular, sendo está relacionada diretamente com a tratamentos tardios ou com doses concentração plasmática do veneno. insuficientes pouco eficazes, podendo levar o indivíduo à morte (Lima et al., Davila et al. (2002) relataram pacientes 1993; Kalapothakis e Chávez-Olórtegui que receberam rapidamente o soro 1997). antiescorpiônico houve diminuição do grau e duração da ativação simpática. Para a conservação do soro, a Organização Mundial da Saúde Delori et al. (1981) estudaram uma recomenda a forma liofilizada, mas no classificação das neurotoxinas de Brasil o soro mesmo é apresentado sob espécies de escorpião do Norte da forma líquida, devendo ser mantido em África e a presença de várias aplicações geladeira entre 4-8 graus (Manual..., para soroterapia. Quinze toxinas 2001). purificadas foram divididas em três grupos e três antitoxinas foram obtidas Rezende et al. (1998), avaliando por injeção das mesmas em coelhos: pacientes picados por escorpião e neurotoxina I e II do escorpião admitidos no Hospital João XXIII em Androctonus australis Hector e Belo Horizonte, observaram que uma neurotoxina I do escorpião Buthus hora após a administração do soro occitanus tunetanus . Foi observada escorpiônico houve diminuição da dor neutralização dessas toxinas local e 12h após a emese e a pertencentes ao mesmo grupo, com a hiperglicemia não foram mais vantagem que a misturas delas mostrou- detectadas. Da mesma forma, as se eficiente em neutralizar o veneno manifestações cardiorespiratórias e o total dos escorpiões africanos. edema pulmonar desapareceram em

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Um outro estudo imunoquímico das ligação da toxina no receptor (Ayeb e toxinas foi realizado com venenos de Delori, 1984). escorpiões norte-africanos da família Buthidae revelando vários grupos de É importante o conhecimento dos sítios toxinas com reação cruzada. Um antigênicos das neurotoxinas, ou seja, o anticorpo contra um membro do grupo número de fragmentos Fab que podem estrutura-antígeno neutralizou toxinas se ligar simultaneamente na superfície do mesmo grupo, de forma mais eficaz das moléculas. Deve-se saber também, do que as toxinas de outros grupos. o número máximo de anticorpos que Estes resultados foram essenciais para a podem ligar-se ao mesmo tempo numa detecção, purificação e caracterização toxina. A modificação ou ausência de estrutural e farmacológica de toxinas um resíduo de uma toxina interfere na individuais e famílias de toxinas, sua antigenicidade (Ayeb e Delori, obtendo-se um antiveneno de boa 1984). qualidade, com localização e descrição estrutural dos determinantes Mendes et al. (2004) estudaram antigênicos, epitopos relativos ao sítio diferentes modelos animais, incluindo tóxico e testando a capacidade de ratos, coelhos e ovelhas para produção neutralização das toxinas (Gazarian et de antivenenos contra o veneno total de al., 2005). Tityus serrulatus , comparando a habilidade das toxinas TsNTxP e a Vários pesquisadores têm realizado uma TsNTxP recombinante na geração de comparação imunológica entre anticorpos neutralizantes. Esse estudo proteínas e suas sequências de revelou um padrão específico de aminoácidos e têm demonstrado grande reconhecimento do peptídeo pelos correlação entre o grau de diferentes anticorpos gerados em cada animal, sequências e o de diferenças além de ter diferença entre os antigênicas. O número de sítios imunógenos da TsNTxP e da antigênicos entre as toxinas homólogas recombinante, devido à diferença na é importante, bem como suas conformação da estrutura secundária e sequências de aminoácidos, além de se terciária da proteína. Os autores estabelecer uma possível correlação concluíram também que, a ovelha é o entre substituições e diminuição do modelo animal mais eficaz para número de sítios antigênicos comuns. produção de anticorpos anti-Tityus Assim, se tem um melhor entendimento serrulatus , e que os anticorpos de cada sobre a ligação dos sítios antigênicos no modelo animal podem identificar alvos mecanismo de neutralização e a relação diferentes presentes nas toxinas do entre estes e os sítios farmacológicos veneno total e/ou diferentes epitopos de das toxinas, além da importância da uma toxina individual. seleção de peptídeos para síntese de vacinas. Estudos com anticorpos Como a rapidez da instituição do soro marcados em microscopia eletrônica antiescorpiônico tem grande influência permitiram visualizar que a ação de um no prognóstico desses acidentes, é ou mais sítios antigênicos viável a preexistência de anticorpos provavelmente não interfere com a circulantes com alta afinidade para

36 reconhecer o antígeno assim que ele toxicidade de um imunógeno, bem estiver no organismo. Com esse intuito, como um baixo custo de produção. alguns especialistas e clínicos de países onde o acidente escorpiônico é um sério A dificuldade da produção do problema de saúde pública, sugeriram o antiveneno para terapia passiva ou ativa desenvolvimento de uma vacina contra contra veneno de escorpião resulta do acidentes escorpiônicos (Moreira- fato de que os antígenos neutralizados Ferreira et al., 1998). A toxicidade pelos anticorpos têm uma alta impede o uso das toxinas como vacinas toxicidade e baixo peso molecular. e investigações da interação entre Vários trabalhos têm demonstrado que a anticorpo (ligação anticorpo) e toxina toxina polimerizada com glutaraldeido (ligação receptor) determinam os limites ou soro albumina bovina (BSA) para os estudos imunológicos. Apenas promove um imunógeno detoxificado as toxinas naturais são capazes de capaz de induzir uma boa resposta de induzir uma resposta para imunidade anticorpos contra as toxinas dos passiva, mas os peptídeos são fortes escorpiões. Usando um antígeno candidatos para produção de vacinas detoxificado, pode-se aumentar a (Gazarian et al., 2005). exposição de anticorpos numa neutralização do veneno de Tityus Devaux et al. (1996) realizaram um serrulatus e os epitopos reconhecidos estudo sobre a antigenicidade de uma por esses anticorpos correspondem as toxina onde foi demonstrado que a regiões das toxinas que estão envolvidas região conservada é pobre em com seu sítio ativo (Ávila et al., 2004). antigenicidade com exceção da região N-terminal que é conservada e Ávila et al. (2004) estudaram a antigênica. O veneno de uma espécie de possibilidade de aumento da resposta escorpião contém várias toxinas e uma imune para proteção in vivo contra os diversidade de outros antígenos, efeitos letais do veneno do escorpião ocasionando um problema na produção Tityus serrulatus em camundongos. Um de soro polivalente. Anticorpos imunógeno foi preparado da fração policlonais contra uma mistura de várias tóxica (TstFG 50 ) e conjugado com BSA sequências representativas da região N- usando glutaraldeido para detoxificação terminal podem ser capazes de da mesma. A fração (TstFG 50 ) acoplada neutralizar os efeitos letais de muitas a BSA rendeu um completo imunógeno toxinas de alguns venenos e então serem detoxificado. Os camundongos que usados para o tratamento de vítimas de foram imunizados com esse imunógeno acidente escorpiônico. Pode haver produziram anticorpos protetores. também estratégias de proteção ativa Proteção in vivo de uma semana após a usando imunógenos sintéticos criados a última imunização demonstrou que partir da neutralização da região N- camundongos vacinados podem resistir terminal associada com epitopos das à mudança de DL 50 e TstFG 50 que levou toxinas. Com isso, a produção de ao óbito todos os camundongos não peptídeos sintéticos tem auxiliado imunizados. A proteção efetiva nesses estudos de resposta imune permanece por nove semanas depois do objetivando completa ausência de último protocolo de imunização. Esse

37 resultado se deve a presença de os efeitos letais causados pela fração anticorpos neutralizantes induzidos por tóxica G50 derivada do veneno de T. TstFG 50 -BSA. Foram feitos peptídeos a serrulatus induzir reação cruzada com partir das sequências das toxinas TsII, anticorpos neutralizantes, produzindo TsVII e TsIV e observadas regiões assim anticorpos monoclonais. Eles específicas na região C-terminal para a foram obtidos com a capacidade de neutralização dos epitopos nas três reconhecer e neutralizar as três toxinas. principais toxinas de T. serrulatus TsIV ou toxina IV-5 uma α toxina, TsII, Maria et al. (2005) observaram a TsVII ou toxina γ, ambas β toxina e capacidade de peptídeos derivados das TsNTxP, uma proteína não tóxica. sequências de aminoácidos de TsII, Foram feitos peptídeos com a sequência TsIV e TsVII reagirem com o soro dessas toxinas. O resultado de (antiveneno) de equino em diferentes imunoensaio com os peptídeos revelou ensaios de neutralização. Assim, que a neutralização com anticorpos observaram três principais regiões monoclonais reconhece um antígeno na antigênicas, o N-terminal, a região região central de parte das toxinas TsIV, central e C-terminal. As toxinas VII TsVII e TsNTxP. O resíduo de lisina da expõem um grande número de epitopos. região N-terminal do epitopo foi Os melhores resultados foram identificado como uma região encontrados com peptídeos sintéticos importante para ligação do anticorpo correspondentes ao N-terminal de TsII, monoclonal. N-terminal de TsVII e C-terminal de TsIV. Vários estudos sobre toxinas e peptídeos sintéticos para a produção de Para obtenção de anticorpos vacinas têm sido desenvolvidos. Um monoclonais ou policlonais, é feita uma dos primeiros estudos foi realizado pelo imunização em animais com veneno Dr. Possani e colaboradores, utilizando puro, que pode levá-los à morte e veneno detoxificado do escorpião prejudicar a produção de antivenenos. Centruroides noxius , que resultou na Uma forma de diminuir esse problema é proteção de coelhos contra a DL 50 da a detoxificação do veneno utilizando fração tóxica do veneno, mas a duração lipossomas ou preparação de BSA e efetividade da proteção foram (Alvarenga et al., 2002; Alvarenga et limitadas. A dificuldade encontrada al., 2005). pelos autores foi a obtenção de veneno suficiente para proteção humana. Outro Alvarenga et al. (2005) imunizaram método utilizado também é a ratos com a fração TstFG 50 do veneno preparação de proteínas expressas em E. Tityus detoxificado. Esse foi o primeiro coli . Os autores acreditam que toxinas estudo que descreveu o reconhecimento expressas como fusão de proteínas são e proteção de um anticorpo monoclonal um avanço para componente da vacina contra uma fração neurotóxica do (Gazarian et al., 2005). veneno de T. serrulatus . De nove anticorpos monoclonais foi obtido Outros experimentos foram realizados apenas um capaz de neutralizar in vivo com mapeamentos de epitopos e

38 vacinas baseadas em epitopos investigação das toxinas de T. miméticos. Esses auxiliaram na serrulatus , que as nomenclaturas foram elucidação da estrutura e localização reunidas em um nome simples como dos epitopos e indução da resposta TsTx e substituída futuramente por imune contra os antígenos, resultando Possani et al. (1981) em Toxina IV-5, assim grande perspectiva para produção TsTx-1 por toxina γ (Possani et al., de vacinas (Gazarian et al., 2005). 1977), TsTx-II por T 1V1, TsTx-III por T1IV e II_8, TsTx-IV por X 2, TsTx-V 2.6. Nomenclatura das Toxinas por XI-2, TsTX-VI por CM-I-S1V1, e TsTX-VII por CM-I-S1-III-2 (Sampaio Devido à falta de uniformidade da et al., 1991). O quadro 1 apresenta a nomenclatura das toxinas escorpiônicas, uniformização dos nomes das toxinas de os autores têm atribuído diferentes T. serrulatus. nomes para uma mesma toxina e os nomes idênticos para diferentes. Por Uma das nomenclaturas de toxinas exemplo, a tityustoxina (TsTx), ao proposta é baseada nas primeiras letras contrário do que foi descrito por Gómez do nome do escorpião do qual a toxina e Diniz (1966) e Gómez (1967), é uma foi isolada, seguida do número. Em mistura de várias proteínas e não é a seguida, os peptídeos homólogos são mesma toxina chamada tityustoxina nomeados por número, seguido de descrita por Coutinho Netto Júnior nomes abreviados (Becerrill et al., (1975). Assim, a tityustoxina seguida 1997). por TsTx-1 e TsTxII foi adaptada por

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Quadro 1. Uniformização da nomenclatura das toxinas de Tityus serrulatus Toxinas Outros nomes Canal de ação TsTx “TsTx” (Gomez e Diniz, 1966) Sódio TsTx (Coutinho Netto, 1975) TsIV-5 (Possani et al., 1981) T2III1 (Sampaio et al., 1983) X4 (Arantes et al., 1989) TsIV (Martin-Eauclaire et al., 1994) TsTx-Ι TsTx-Ι (Toledo e Neves, 1976) Sódio Gama (Possani et al., 1981) T1VIII (Sampaio et al., 1983) TsVII (Bechis et al., 1984) XIII (Arantes et al., 1989) TsTx-Π TsTx-ΙΙ (Toledo e Neves, 1976) Possivelmente sódio T1V1 (Sampaio et al., 1983) TsTx-ΙΙΙ T1IV (Sampaio et al., 1983) Sódio TsIII-8 (Possani et al., 1985) TsII (Mansuelle et al., 1992) TsTx-IV X2 (Arantes et al., 1989) Potássio TsTx-IV (Novello et al., 1999) TsTx-V XI2 (Arantes et al., 1989) Sódio (Arantes et al., 1994) TsTx-VI CM I SIVII (Sampaio et al., 1997) - TsTx-VI (Maragoni et al., 1990) TsTx-VII CM I SIIIIII (Sampaio et al., 1997) Potássio ou cálcio Fonte: Mendes, 2007.

2.7. Veneno de Tityus fasciolatus homóloga à TsTx-VI e TsNTxP de Tityus serrulatus. Devido aos poucos relatos de acidentes com o escorpião Tityus fasciolatus , Wagner et al. (2003) determinaram a pouco se estudou sobre o seu veneno. DL 50 do veneno de Tityus fasciolatus Nos anos de 2006 e 2007, foram em 72,92µg por camundongo (3,646 mg capturados muitos escorpiões desta kg –1). Comparando a letalidade, espécie pelo Centro de Zoonoses de observaram que o veneno desta espécie Ituiutaba, região do Triângulo Mineiro é menos tóxico que o de T. stigmurus –1 (Ribeiro, 2008). (DL 50 = 0,773mg kg ), T. bahiensis –1 (DL 50 = 1,062mg kg ), T. serrulatus –1 Castro et al. (2000) purificaram e (DL 50 = 1,160mg kg ) e T. costatus –1 caracterizaram parcialmente uma (DL 50 =1,590mg kg ) e mais tóxico neurotoxina do veneno de Tityus que T. cambridgei (DL 50 = 12,136mg kg fasciolatus de 6.6 kDa. Essa –1). neurotoxina tem um peso molecular de 6614 daltons e uma sequência N- Wagner et al. (2003) isolaram e terminal de 28 resíduos, sendo caracterizaram o principal peptídeo de T. fasciolatus , Tf4, homólogo à classe 4

40 da toxina de T. serrulatus e T. Palamneus gravimanus (Kalapothakis e bahiensis . Baseado no sistema de Chávez-Olórtegui, 1997). nomenclatura e de sequência de O veneno de Tityus serrulatus foi aminoácidos (77-84%), a nova toxina primeiro estudado por Gómez e Diniz foi denominada Tf4 (classe 4 de T. (1966), do qual foi isolado a fasciolatus . Há 21 diferentes resíduos tityustoxina (TsTx). Durante 26 anos entre as sequências de aminoácidos de essa toxina foi considerada uma fração Ts1 e Tf4. A posição dentro dessas pura, mas posteriormente descobriu-se sequências é a razão da baixa toxicidade que a mesma era composta por vários de Tf4 (Barbosa et al., 2002). peptídeos (Becerril et al., 1997).

Apesar dos trabalhos relatados, pouco Esse mesmo veneno foi isolado em duas se sabe sobre a composição do veneno frações neurotóxicas por Coutinho de Tityus fasciolatus e o mecanismo do Netto (1975), que caracterizou em uma envenenamento causado por esta delas uma proteína básica com 61 espécie. aminoácidos e com lisina no C-terminal (Possani, 1984). Outros pesquisadores 2.8. Veneno do Tityus serrulatus purificaram a Tityustoxina I e Tityustoxina II (Sampaio et al., 1983). O veneno do T. serrulatus contém proteínas de baixo peso molecular e Possani et al. (1977) descreveram cinco atividade neurotóxica. Apresenta outras toxinas do veneno do escorpião toxinas que agem nos canais de sódio e Tityus serrulatus Lutz e Melo, que potássio. O quadro 2 apresenta as foram caracterizadas por cromatografia, toxinas purificadas deste veneno. eletroforese, além detestar sua Algumas toxinas, ativas em canais de toxicidade em ratos. Os peptídeos sódio voltagem-dependente, são tóxicos encontrados no veneno dos subdivididas em α-toxinas e β-toxinas escorpiões são importantes para vários de acordo com o sítio de ligação nestes grupos de pesquisa, pois interferem em canais de mamíferos. As toxinas causam eventos nas membranas das células. alterações nos sistemas nervoso, cardiovascular e respiratório. O veneno Chávez-Olórtegui et al. (1996) do T. serrulatus , assim como de outros purificaram uma proteína não-tóxica do escorpiões, possui proteínas com veneno do escorpião Tityus serrulatus atividade hialuronidase (Sampaio et al., (TsNTxP), básica e com 63 resíduos de 1983). Ele não apresenta atividade de aminoácidos com alto grau de fosfolipase, colinesterase, homologia com as toxinas isoladas do fosfodiesterase, protease, amilase ou veneno de Tityus serrulatus. Em 1997, fibrinólise, mas outras espécies Chávez-Olórtegui et al. injetaram essa apresentam essas atividades enzimáticas toxina em coelhos para produção de e inclusive outras substâncias, como anticorpos e estes reconheceram e serotonina no caso de Leiururs neutralizaram in vitro os efeitos letais quinquestriatus e histamina em do veneno de Tityus serrulatus .

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Quadro 2. Toxinas purificadas do veneno de Tityus serrulatus nas décadas de 60 a 80. Pesquisadores Ano Número de Toxinas Toxinas Caracterizadas Purificadas Gomez e Diniz 1966 2 frações não tóxicas e - 2 Tóxicas Tityustoxina Coutinho Netto 1975 - TsTx Sequência parcial Toledo e Neves 1976 2 toxinas TsTx-I PM 6932 e K N-terminal TsTx-II PM 8580 e G N-terminal Possani et al. 1977 5 toxinas Gama Sequência Parcial PM 7000 62 aa Possani et al. 1981 10 toxinas Tóxicas Frações I-IV II, III, IV Subfrações II 9-11 II 1-11 III 7-8 III 1-10 IV 5,6,8 IV 1-8 II-11 e III-10=δ II-11, III-10, III-8 e IV-5 sequências parciais

Sampaio et al. 1983 2 Frações não tóxicas T2III 63aa PM 7216 sequência e 2 parcial tóxicas T1VIII 61aa PM 6675 T1 → 8 proteínas T1V1 72aa PM 7549 T2 → 4 proteínas T1IV 45aa PM 5188 T2IV = T1VIII Martin-Eauclaire 1985 8 toxinas 5 β (sítio 4) e 3 α (sítio 3) et al.

Arantes et al. 1989 8 frações I-VIII XIII = T1VIII subfrações IX3 = T1V1 IX (5 toxinas) X4 = T2III X (4 toxinas) IX5 e X3 = III-8 X2 → TsTx-IV 61aa PM 6885 Fonte: Adaptada de Mendes, 2007.

2.9. Homologia entre os venenos utilizando-se o camundongo como modelo experimental. O número total de diferentes toxinas produzidas por escorpiões é estimado 3.2. Objetivos específicos em 100.000, das quais, apenas 1% é conhecida. Entre elas, destaca-se a Os objetivos do trabalho foram: primeira toxina de Tityus serrulatus isolada e a mais estudada, a Parte I- Estudo clínico tityustoxina, que é uma toxina composta 1) Determinar a DL 50 do veneno de por proteínas com sítios específicos em Tityus fasciolatus em camundongos; canais de sódio pós-ganglionares. O caráter evolutivo da produção de 2) Estudar as alterações anatomo- toxinas por escorpiões é marcante, histopatológicas de coração, pulmão e principalmente quando se analisam as cérebro após inoculação do veneno de características dos genes que codificam Tityus fasciolatus em camundongos; para essas proteínas, muito móveis e oriundos de mutações pontuais, 3) Estudar a hematologia e bioquímica duplicação de genes e recombinações sérica de camundongos após inoculação (Gazarian et at., 2005). do veneno de Tityus fasciolatus ;

Foi verificado um polimorfismo nos Parte II- Estudo molecular genes de toxinas de escorpiões 4) Clonar a sequência parcial de genes principalmente nos clones de cDNA. de toxinas do veneno de Tityus Esse polimorfismo demonstra que os fasciolatus ; genes clonados dessas toxinas têm um ancestral comum. Também há uma Parte III- Estudo imunológico homologia entre as sequências das 5) Caracterizar parcial bioquímica e toxinas de venenos de escorpiões do imunologicamente o veneno de Tityus gênero Tityus . Muitas vezes, encontram- fasciolatus ; se toxinas homólogas em diferentes espécies de Tityus ou até mesmo 6) Avaliar in vivo a capacidade do soro idênticas. (Possani et al., 1999). antiescorpiônico em neutralizar o veneno de Tityus fasciolatus em 3. OBJETIVOS camundongos.

3.1. Objetivo geral 4. MATERIAL E MÉTODOS

O objetivo geral deste trabalho foi 4.1. Veneno e sua extração estudo do veneno do escorpião Tityus fasciolatus por meio da caracterização 4.1.1. Tityus fasciolatus molecular, determinação da dose letal e sua ação refletida nos componentes Foi utilizado um pool de venenos de hematológicos, bioquímicos, anatomo- vários escorpiões da espécie Tityus histopatológicos e imunológicos, fasciolatus (Fig. 4), capturados na

43 região de Ituiutaba (MG), cedidos pelo Centro de Zoonoses de Ituiutaba (CCZ).

Figura 4: Exemplar de T. fasciolatus

O método de extração do veneno foi manual, pressionando-se o télson contra uma peça de parafilme 2 até este ser perfurado pelo aguilhão. Após coleta e centrifugação para remoção de alguns constituintes, tais como muco e debris celulares, o veneno foi posteriormente liofilizado, conforme técnica descrita por Kalapothakis e Chávez-Olórtegui (1997) (Fig. 5).

2 American National Can Group, Inc – San Diego, EUA

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A B

C Figura 5- Extração manual de veneno de T. fasciolatus . A: Apreensão do animal com auxílio de uma pinça; B: Perfuração e compressão do télson contra a peça de parafilme; C: Coleta do veneno com auxílio de uma micropipeta e ponteira de 200µl.

O veneno liofilizado foi ressuspendido Horizonte (MG), cedido pelos em solução salina tamponada com Professores Chávez-Olórtegui 3 e fosfato (PBS) para a dosagem de Kalaphotakis 4. proteínas pelo método do reagente Folin-Fenol-Ciocalteau (Lowry et al., O veneno de Tityus serrulatus foi 1951). Em seguida a solução foi processado e armazenado nas mesmas aliquotada e congelada a -20 oC.

4.1.2. Tityus serrulatus 3 Professor Dr.Carlos Delfín Chávez-Olórtegui, Departamento de Bioquímica e Imunologia – Instituto de Ciências Biológicas (ICB) – UFMG Foi utilizado um pool de venenos de 4 vários escorpiões da espécie Tityus Professor Evanguedes Kalapothakis, Departamento de Biologia Geral – Instituto de serrulatus capturados na região de Belo Ciências Biológicas (ICB) - UFMG

condições descritas para Tityus 4.2.2. Avaliação anátomo- fasciolatus . histopatológica

4.2. Caracterização clínica do Foi realizado exame necroscópico dos envenenamento animais que durante o desafio da DL 50 vieram a óbito. Os órgãos, coração, 4.2.1. Determinação da DL 50 pulmão e cérebro, foram fixados em solução tamponada de formol a 10% Sessenta camundongos Swiss CF1 neutro e tamponado, sendo processados machos, com peso entre 18 e 20g (peso por técnica rotineira de inclusão em médio 19g), seis em cada grupo, foram parafina (Prophet et al., 1992). Cortes utilizados para determinar a letalidade histológicos de 4µm de espessura de tais do veneno bruto de Tityus fasciolatus . órgãos foram feitos e corados pela Os animais foram acomodados e técnica de hematoxilina-eosina (HE) mantidos em caixas apropriadas, nas para avaliação histopatológica. dependências do Laboratório de Toxicologia da Escola de Veterinária da 4.2.3. Avaliação hematológica, UFMG, recebendo alimentação à base bioquímica sérica e plasmática de ração comercial e água ad libitum. Cinquenta e quatro camundongos Chez Para a determinação da DL 50 , iniciou-se CF1 machos, pesando aproximadamente com uma dose de 8µg e um fator de 30g, foram distribuídos em três grupos diluição de 1,6. Foram utilizados sete de 18 animais cada. Os animais do grupos (sete doses) com seis animais. grupo (G1), inoculados com 50µl de Após o estabelecimento da dose solução salina (PBS), funcionaram máxima, na qual não morreu nenhum como grupo controle negativo; os animal e naquela onde morreram todos, animais do grupo II (G2) foram mais 18 camundongos foram utilizados inoculados com 24µg de veneno de com um fator de diluição de 1,2, Tityus fasciolatus por camundongo, totalizando três doses, 62,9µg, 75,5µg e diluído em 50µl de PBS (40% da DL 50 90,6µg. determinada neste trabalho); e os animais do grupo III (G3) foram Cada dose de veneno utilizada foi inoculados com 8µg de veneno de diluída em PBS/BSA 1%, em um Tityus serrulatus por camundongo, volume final de 100µl, e inoculada por diluído em 50µl de PBS (34% da DL 50 via subcutânea (SC). A contagem de do veneno de Tityus serrulatus animais mortos foi feita 24h após o conforme Nishikawa et al., 1994), desafio. A dose letal para matar 50% funcionando como controle positivo. dos camundongos (DL 50 ) foi calculada pelo programa “PROBITOS”, proposto Cada grupo foi dividido em três por Finney (1971, 1978). subgrupos de seis animais (a, b e c), de acordo com o momento da coleta de sangue, conforme expresso na tabela 1.

46 Tabela 1. Divisão dos grupos (tratamentos). Grupos Placebo (PBS) T. fasciolatus T. serrulatus (8µg) (24µg) Tempos 1h G1 G2 G3 8h G1 G2 G3 12h G1 G2 G3

O local de inoculação do veneno nos concentração de hemoglobina foram camundongos foi a região inter- feitas em contador eletrônico 9 e os escapular, pela via subcutânea, cálculos dos índices hematimétricos utilizando-se seringa hipodérmica realizados conforme Ferreira Neto et al. descartável de 1,0ml 5. (1982). A determinação da glicose foi realizada com sangue total utilizando 4.2.4. Exames laboratoriais tiras no glicosímetro 10 , imediatamente após a coleta do sangue.

Foram coletadas amostras de sangue Os esfregaços sanguíneos foram feitos pelo plexo orbital (1,3ml). Uma, oito e em lâminas de vidro (26 x 76mm) 11 e 24 horas após a administração do corados com May Grunwald - Giemsa 12 veneno (T1, T8 e T24, para a contagem diferencial de respectivamente). O sangue foi leucócitos, de acordo com Ferreira Neto colocado em tubos 6 com sal dissódico et al. (1982). As proteínas totais foram do ácido etilenodiaminotetracético estimadas por técnica de refratometria. (EDTA) a 10%, para realização do O perfil protéico foi feito por meio de hemograma e dosagem de glicose, e eletroforese em tampão Tris em filmes 1000µl sem anticoagulante, para de agarose 13 e as bandas eletroforéticas separação do soro e posterior dosagem foram lidas e quantificadas pelo de uréia, creatinina, aspartato software SE-250 14 para determinar a aminotransferase (AST), creatina porcentagem de albumina e globulinas quinase (CK), isoenzima (CK-MB), α, β e γ, segundo técnica descrita por amilase, lactato desidrogenase (LDH) Naoum (1990). por método colorimétrico cinético 7 em aparelho analisador bioquímico 8. As mensurações quantitativas de cortisol no soro foram realizadas por A contagem total de eritrócitos e leucócitos e a determinação da 9 CELM CC-530® , Cia. Equipadora de Laboratórios Modernos – Barueri-SP 10 Tiras Biochek - Bioeasy 5 BD Plastipak® 11 Lâminas para Microscopia Exacta - Perfecta, 6 VACUETTE®, Greiner Bio-One Brasil – São Paulo-SP Americana-SP 12 May Grunwald/Giemsa – Doles ® Reagentes, 7 SYNERMED® - Synermed International Inc., Goiânia, GO. Westfield, EUA 13 CELMGEL ® - CELM – Cia. Equipadora de 8 Cobas Mira –Roche – GMI, Global Medical Laboratórios Modernos, Barueri-SP Instrumentations, Inc. – Ramsey, EUA 14 Software SE-250

47 técnica de radioimunoensaio 15 em fase- sólida marcado com 125 I e com contador gama 16 , utilizando kit comercial 8.

4.3. Caracterização molecular do veneno

A caracterização molecular do veneno foi realizada no Laboratório de Biotecnologia e Marcadores Moleculares no Instituto de Ciências Biologias da Universidade Federal de Minas Gerais. As etapas da metodologia estão resumidas na Figura 6.

15 COAT-A-COAT® - DPC-Diagnostic Products Corporation, Los Angeles-EUA 16 COBRA II Auto Gama – Packard BioScience Company 8 Coat-a-Count – DPC® USA

48 Obtenção do RNA do veneno de Tityus fasciolatus

Purificação do RNA do veneno de Tityus fasciolatus

Iniciadores oriundos da sequência de toxinas de Tityus serrulatus

RT-PCR

Obtenção do cDNA

Sequências de Tityus fasciolatus

Alinhamento das sequências de toxinas de Tityus fasciolatus com as sequências de DNA correspontende ao mRNA das toxinas de Tityus serrulatus

Novos iniciadores

RT-PCR

Novas sequências toxinas de Tityus fasciolatus Figura 6- Metodologia empregada na caracterização molecular do veneno de Tityus fasciolatus

4.3.1. Extração e purificação do RNA ser formado um pó. Esse foi (Ácido ribonucléico) ressuspendido em 200µl de solução de desnaturação (tiocianato de guanidina Todo procedimento foi realizado a 4 oC, 4M, Tris HCl 0.1M pH 7.0, 0.5 sarcosil usando água tratado por dietil e β-mercaptoetanol 1%) e transferido pirocarbonato (DEPC). A glândula de para um micro tubo de 1,5ml. Após, veneno (télson) do escorpião Tityus foram adicionados 20µl (1/10 do fasciolatus foi extraída e macerada volume) de acetato sódio 2M pH4,0, usando pilão e pistilo em gelo seco até 200µl (1 volume) de fenol ácido e 40µl

(2/10 de volume) de clorofórmio: álcool Primeiro par de iniciadores originado isoamílico (24:1) que foram misturados de TsNTxP por agitação vigorosa e, o tubo Senso - 5’CTC GAG GGT AGA GAA contendo a mistura foi mantido no gelo GGT TAT CCA G 3’ por 15 minutos. Em seguida, a solução Anti-senso - 5’CTC GAG GCC ACA foi centrifugada a 10.000g durante 20 TTT ATT CGT TTC ACT AGT CC 3’ minutos a 4 oC. A fase aquosa foi transferida para um microtubo de 1,5ml e foi acrescentado um volume de Segundo par de iniciadores originado isopropanol e mantido a -20 oC durante da TsTx aproximadamente 15 horas. Senso - 5’ GTC GAC AAG AAA GAC Em seguida, a amostra foi centrifugada GGA TAC CCG 3’ a 13.200g por 30 minutos a 4 oC e o Anti-senso - 5’ GTC GAC GGA TTT sobrenadante descartado com o auxílio GCA TTT TCC GTT GG 3’ de uma micropipeta. O pellet foi ressuspendido em 50µl de solução de desnaturação e acrescentados 125µl de Terceiro par de Iniciadores originado uma solução de (2,5 volume) etanol da TsTx-I 95%. A amostra foi homogeneizada e mantida a -20 oC durante Senso - 5’ AAG CTT AAA GAA GGT aproximadamente 15 horas. TAT CTC ATG 3’ Anti-senso - 5’ AAG CTT ACA TTT A amostra foi centrifugada a 13.200g GTT CGT CGC TCT ATC C 3’ por 30 minutos 4 oC. O sobrenadante foi descartado. O “pellet” foi lavado com 4.3.3. Padronização da RT-PCR álcool etílico 70% com cuidado e em seguida deixado em contato com o ar Foram realizados vários testes para para secar; o “pellet” foi ressuspendido padronizar a quantidade de DNA a ser em água deionizada. usado na RT- PCR (Tab. 2) . A reação foi realizada segundo recomendações do 4.3.2. Construção de cDNA da fabricante 17 (Tab. 3). Os ciclos da glândula de veneno reação foram realizados no termociclador PTC-100 Programmable A síntese de DNA complementar Thermal Controller (MJ Research). (cDNA) foi realizada usando o Kit RT- Após término da reação, as PCR 17 (Reação em cadeia de polimerase amostras foram aplicadas em gel de -transcriptase reversa). Para realização agarose a 1% em tampão Tris-acetato- da RT-PCR foram utilizados iniciadores EDTA (solução estoque 50x: 242 g de de toxinas do escorpião Tityus tris base, 57,1ml de ácido acético e serrulatus pré determinados. 100ml de EDTA 0,5M pH 8.0) (TAE 1x) e submetidas a eletroforese por duas horas à 52V e 170mA. Em seguida, o 17 TM Access Quick RT-PCR System – Promega gel foi colocado em solução de brometo Corporation de etídio (0,5µg/ml) sob agitação por

50 aproximadamente 30 minutos sendo posteriormente visualizado sob luz U.V.

Tabela 2 - Quantidades de reagentes utilizados na RT-PCR Material Quantidade Primer senso (20 pmol/µl) 0,25µl Primer anti-senso (20 pmol/µl) 0,25µl Mix 2x (tampão, DNTp, taq) 12,5µl DNA 0,2µl Água deionizada estéril 6,8µl Volume final 20µl

Tabela 3 – Descrição do programa utilizado na RT-PCR PASSO TEMPERATURA TEMPO 1 (desnaturação) 94 oC 3 min 2 (desnaturação) 94 oC 30 segundos 3 (anelamento) 46 oC 30 segundos 4 (extensão) 72 oC 1 min e 30 segundos 5 Repetir o ciclo 30 vezes a partir da etapa 2 6 72 oC 5 min 7 4oC Infinito

4.3.4. Purificação do cDNA a partir restrição NdeI 20 CATATG. A tabela 4 do gel de agarose 1% apresenta as quantidades utilizadas na reação. A banda correspondente ao DNA amplificado foi recortada do gel com auxílio de um estilete, colocada em um microtubo de centrífuga de 1,5ml e purificada com o kit Wizard PCR Preps DNA purification System 18 .

4.3.5. Ligação do inserto ao vetor de clonagem

Após a purificação do amplicon foi feita a reação de ligação usando o vetor pCR2.1-TOPO 19 (Fig. 7), segundo recomendações do fabricante para posterior digestão com a enzima de

18 Promega

19 Invitrogen 20 New England BioLabs

51

Figura 7- Vetor de clonagem pCR2.1-TOPO utilizado para clonagem dos genes. A figura mostra o sítio múltiplo de clonagem.

A ligação no vetor pCR2.1-TOPO foi realizada de acordo com as especificações do fabricante 19 .

Tabela 4- Quantidade de material utilizado na ligação do inserto ao vetor de clonagem pCR2.1-TOPO MATERIAL QUANTIDADE Vetor 1µl Produto purificado do gel de agarose 2µl Sal 1µl Água deionizada 2µl

A reação foi homogeneizada e mantida levedura, 10g de bactotriptona, 5g de a temperatura ambiente por 10 minutos. NaCl para 1 litro de água destilada- autoclavada), até atingir uma DO 600 = 4.3.6. Preparação de bactérias 0,5-0,6. As células foram centrifugadas competentes a 2.500g por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o O procedimento foi realizado de acordo precipitado ressuspendido com cuidado com Sambrook et al. (1989). Cinco em 40ml de tampão Tfb I (30mM colônias foram coletadas e colocadas acetato de potássio, 50mM de MnCl2, para crescer por 2 a 3 horas em meio 100mM de KCl, 10 mM de CaCl2, 15% 2xYT-caldo (16g de extrato de de glicerol, pH 5,8) gelado por 100ml

de cultura. O material foi colocado no 4.3.8. Purificação do plasmídeo gelo 5-10 minutos e centrifugado novamente. O precipitado foi Extração de plasmídeo de E. coli foi cuidadosamente ressuspendido com 4ml realizada segundo o método de lise de Tfb II (10mM de Na-MOPS, 75mM alcalina-SDS (Sambrook et al. 1989). de CaCl2, 10mM de KCl, 15% de Uma colônia isolada foi colocada para glicerol, pH 7,0) gelado por 100ml de crescer em 10ml de meio LB com cultura. Alíquotas de 100µl foram ampicilina (100µg/ml), em um agitador preparadas e estocadas a -80ºC. a 180 rpm e à temperatura de 37 oC, durante 16 horas; em tubo de 50ml. 4.3.7. Transformação da linhagem E. coli XL1 Blue Após crescimento, a cultura foi mantida no gelo por 10 minutos e centrifugada a Genótipo da linhagem E. coli XL1 Blue : 3000g por 10 minutos, a 4 oC. Todo o ∆ (mcrA) 183 ∆ (mcrCB-hsdSMR-mrr) sobrenadante foi descartado. O 173 endA1 supE44thi-1 recA1 gyrA96 precipitado foi ressuspendido em 300 µl relA1 lac [F’ proAB laclqZ∆M15 Tn10 de solução I (50mM de glicose, 25mM (TetR)]. de Tris-HCl pH 8,0 e a0mM de EDTA pH 8,0) gelada, transferido para um Bactérias E. coli da linhagem XL1 Blue tubo de 1,5ml e deixado por 5 minutos à (50µl) quimicamente competentes temperatura ambiente. Foram foram retiradas do freezer a -80ºC, adicionados 300µl de solução II (0,2N descongeladas no gelo por 15 minutos e de NaOH e 1% de SDS), preparada na acrescidas de 2µl do produto obtido da hora do uso, o conteúdo foi misturado ligação do produto ligação do amplicon cuidadosamente por inversão e deixado no vetor de clonagem PCR2.1-TOPO. A por 5 minutos no gelo. Foram mistura resultante foi homogeneizada adicionados 30µl de solução III (60ml manualmente, incubada no gelo por 30 de uma solução de acetato de potássio minutos, transferida para o banho-maria 5M, 11,5ml de ácido acético glacial e a 42ºC por 90 segundos e 28,5ml de água destilada) e a mistura imediatamente transferida para o gelo. foi homogeneizada novamente por Após esse procedimento, 800µl de meio inversão. O tubo foi deixado no gelo por 2xYT-caldo (16 g de extrato de mais 5 minutos e centrifugado a 12000g levedura, 10 g de bactotriptona, 5 g de por 10 minutos a 4 oC. O precipitado foi NaCl para 1 litro de água destilada) descartado e foram adicionados ao foram adicionados e a mistura incubada sobrenadante 0,6 volumes de por uma hora a 37ºC. Em seguida, isopropanol 100%. O tubo foi deixado 100µl da cultura de bactérias em repouso por 12 minutos e transformadas foram plaqueados em centrifugado novamente (12000g por 10 meio LB-ágar (10g de NaCl; 10g de minutos, à temperatura ambiente). O bactotriptona e 5g de extrato de sobrenadante foi descartado e o levedura), adicionado com ampicilina precipitado foi lavado com 1,0ml de (100µg/ml). As placas obtidas foram etanol 70%. Depois que o precipitado incubadas a 37°C, por 14 a 16 horas. secou foi dissolvido em um volume de 50µl de TE pH 8,0 com RNAse

53

(20 µg/ml). O tubo foi deixado 1 hora a 37 oC para a enzima agir. Um gel de agarose 1% foi corrido para quantificar os plasmídeos purificados.

4.3.9. Amplificação do cDNA

Após a purificação do plasmídeo, foi realizado outro RT-PCR com o intuito de amplificar o gene correspondente à toxina específica. Após a amplificação dos clones positivos que continham o inserto, foi realizada uma nova purificação do plasmídeo e o produto foi enviado para sequenciamento.

4.3.10. Sequenciamento

Os sequenciamentos dos plasmídeos quantificados foram realizados no aparelho MegaBACE DNA sequencer no Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular da UFMG. A reação de sequenciamento foi feita utilizando-se o Kit DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing 21 . A tabela 5 e 6 apresentam as quantidades de reagentes e o programa utilizado para a realização de sequenciamento.

21 Amersham Biosciences

54 Tabela 5 - Quantidades de reagentes utilizados no sequenciamento Material Quantidade Quantidade Quantidade Quantidade Quantidade Primer 1µl 1µl 1µl 1µl 1µl (5 pmol/µl) ET Kit 4µl 4µl 4µl 4µl 4µl DNA molde * 0,7µl 1µl 2µl 0,8µl 0,9µl Água qsp 4,3µl 4µl 3µl 4,2µl 4,1µl Volume final 10µl 10µl 10µl 10µl 10µl * Foram utilizadas diferentes quantidades do DNA molde devido à concentração de cada um.

Iniciador utilizado: M13 anti-senso: GGAAACAGCTATGACCATG

Tabela 6 – Descrição do programa utilizado no sequenciamento PASSO TEMPERATURA TEMPO 1 (desnaturação) 95 oC 25 segundos 2 (anelamento) 50 oC 15 segundos 3 (extensão) 60 oC 3 minutos 4 Repetir o ciclo 35 vezes a partir da etapa 1 5 4oC Infinito

4.3.11. Análises computacionais das (RNA mensageiro) das toxinas sequências obtidas TsNTxP, Ts IV e TsVII de Tityus serrulatus, já descritas na literatura, As sequências de nucleotídeos foram para desenhar os novos iniciadores. O analisadas através do programa “Basic sítio de restrição utilizado foi o Local Alignment Search tool program CATATG de NdeI ¡. Após a definição for amino acids” – Blast – GenBank dos novos iniciadores, foi realizada (Altschul e Lipman, 1990) – novamente a RT-PCR para a obtenção www.ncbi.nlm.nih.gov ) e pelo 22 da nova sequência das toxinas de Tityus programa DNAstar Lasergene 6 . fasciolatus , purificação do cDNA, ligação do amplicon ao vetor de 4.3.12. Desenho dos iniciadores após clonagem, purificação do plasmídeo e resultado do sequenciamento sequenciamento e análise das sequências, como citado anteriormente. Para obtenção de toda a sequência de 24 . A tabela 7 e 8 apresentam as nucleotídeo das toxinas de Tityus quantidades de reagentes e o programa fasciolatus (início do N-terminal e fim do C-terminal) foram usadas as sequências de nucleotídeos do mRNA 23 New England BioLabs

22 SentinelLM® 24 Amersham Biosciences

utilizado para a realização da segunda RT-PCR.

Tabela 7 - Quantidades de reagentes utilizados na segunda RT-PCR. Material Quantidade Primer senso (20pmol/µl) 0,5µl Primer anti-senso (20pmol/µl) 0,5µl Mix 2x (tampão, DNTp, taq) 12µl DNA 0,1µl Água deionizada estéril 6,9µl Volume final 20µl

Programa de RT-PCR: Tabela 8 – Descrição do programa utilizado para a realização da segunda RT- PCR.

PASSO TEMPERATURA TEMPO 1 (desnaturação) 95 oC 3 min 2 (desnaturação) 94 oC 30 segundos 3 (anelamento) 55 oC 30 segundos 4 (extensão) 72 oC 30 segundos 5 Repetir cinco vezes a partir da etapa 2 6 94 oC 30 segundos 7 52 oC 30 segundos 8 72 oC 30 segundos 9 Repetir 25 vezes a partir da etapa 6 10 72 oC 5 min 11 4oC Infinito

4.4. Caracterização imunológica subsequentes foram feitas com intervalo de uma semana entre elas, com a mesma 4.4.1. Imunização dos animais dose em adjuvante incompleto de Freund’s. Sete dias após a última Foram utilizadas duas ovelhas sadias, inoculação, foram realizadas as coletas com dois anos de idade e peso médio de de sangue por punção da veia jugular 40kg, sem padrão racial definido. com sistema para coleta a vácuo 25 . O sangue foi centrifugado e o soro obtido As ovelhas foram inoculadas por via foi mantido a -20 oC. subcutânea com 500µg de veneno de T. fasciolatus e T. serrulatus em adjuvante completo de Freund’s (dia 1), respectivamente. Dez imunizações 25 LABOR IMPORT® - Osasco-SP

56 4.4.2. SDS-PAGE do veneno bruto e membrana de nitrocelulose (0,45 µm)27 , eletroforese em gel de poliacrilamida sob corrente de 110 V, 400 mA, por uma hora em tampão de transferência Foi preparado gel poliacrilamida SDS (25mM Tris, 192mM de glicina e 20% em condições desnaturantes para de metanol), sob agitação. As ligações a quantificação e separação das proteínas sítios não específicos foram bloqueadas dos venenos de Tityus fasciolatus e por uma hora em tampão TRIS salina veneno de Tityus serrulatus segundo Tween (TBST- 10mM TRIS, 150mM Laemmli (1970). O gel de separação foi NaCl) com solução de leite desnatado a constituído de 12% de uma solução de 5%, sob agitação. As membranas de acrilamida/bisacrilamida 30%; Tris-HCl nitrocelulose foram lavadas quatro 1,5 M pH 8,8; SDS 10% ; 10% de vezes com intervalos de 10 minutos, em perssulfato de amônia (PSA) e 0.05% cada lavagem, em PBS contendo 0,5% de TEMED. O gel de concentração foi de Tween 20 (TBST). Posteriormente constituído de 4% de foram incubadas por uma hora à acrilamida/bisacrilamida 30%; Tris-HCl temperatura ambiente com soro imune 1,5 M, pH 6,8; SDS 10%; PSA 10%, de interesse na diluição de 1:200, sob TEMED 0,025% e água destilada. As agitação. Quatro lavagens com amostras foram misturadas ao tampão intervalos de 10 minutos, em cada de amostra SDS-PAGE em condições lavagem, com TBST foram feitas e redutoras e submetidas a uma então o conjugado anti-IgG de ovelha temperatura de 100 oC durante cinco foi acrescentado nas diluições de minutos e aplicadas no gel. A 1:10000 e diluição de 1:5000 para o eletroforese foi desenvolvida soro imune de T. serrulatus e T. verticalmente, em placas de dimensão fasciolatus , respectivamente, em TBST 10,0x 8,0 x 0.8cm, à 150V, 40 mA, com leite em pó desnatado a 5%. A durante uma hora. Após eletroforese, os membrana foi incubada por uma hora a géis foram fixados e revelados com a temperatura ambiente sob agitação. solução corante de Azul de Comassie Após quatro lavagens com TBST a (50% metanol, 10% ácido acético, reação foi revelada pela adição do 0,25% Azul de Coomassie) por 60 substrato DAB-diaminobenzidine. minutos à temperatura ambiente e lavados em solução descorante (10% 4.4.4. Soroneutralização metanol, 5% ácido acético e água destilada) até o desaparecimento da Foram utilizados 20 camundongos coloração de fundo. Foi utilizado padrão Swiss CF1 machos, pesando entre 18 e de peso molecular BenchMark Protein 20g. Ladder 26 . A dose do veneno de T. fasciolatus 4.4.3 Western Blotting utilizada, 134,2µg/camundongo (dose máxima mortal determinada no estudo Após a separação em SDS-PAGE, as da DL 50 ) foi incubada durante uma hora proteínas foram transferidas para

27 Sigma 26 Invitrogen

57 a 37 oC com 100µl e 200µl de soro • veneno de T. serrulatus e antiescorpiônico 28 e PBS. 200µl de PBS (G4b).

A dose do veneno de T. serrulatus Foram ainda formados mais dois grupos utilizada, 52,65µg/camundongo G5a (n=2) e G5b (n=2) que receberam (equivalente à dose máxima mortal 100 e 200µl de soro antiescorpiônico determinada no estudo da DL 50 ), foi anti-T. serrulatus , respectivamente. incubada durante uma hora a 37 oC com 100µl e 200µl de soro antiescorpiônico A contagem de sobreviventes foi feita e PBS. até 48h após o desafio. Foram formados quatro grupos (G) (n=2) inoculados pela via SC com: 4.5. Análise estatística • veneno de T. fasciolatus e 100µl de soro O delineamento experimental aplicado antiescorpiônico anti -T. foi o inteiramente casualizado em serrulatus (G1 ); esquema de parcelas subdivididas, • veneno de T. fasciolatus e conforme preconizou Sampaio (2007). 200µl de soro As parcelas correspondem aos antiescorpiônico anti-T. tratamentos (controle e veneno) e as serrulatus (G2 ); subparcelas aos tempos de avaliação em • veneno de T. serrulatus e horas. Os dados referentes aos 100µl de soro diferentes grupos e tempos foram antiescorpiônico anti-T. plotados em tabelas e analisados pelo serrulatu s ( G3 ); programa de computador SAS 29 • veneno de T. serrulatus e (Statistical Analysis System) . Foi 200µl de soro realizada a análise de variância antiescorpiônico anti-T. (ANOVA) e a comparação de médias serrulatus (G4 ). pelo teste de Tukey e SNK (Student- Newman-Keuls). Mais outros quatro grupos (n=2) funcionaram como controle positivo e 4.6. Ética em experimentação animal foram chamados de G1b , G2b , G3b e G4b , recebendo o mesmo protocolo, O projeto de pesquisa foi aprovado pelo porém utilizando-se PBS no lugar do CETEA – Comitê de Ética em soro antiescorpiônico anti-T. serrulatus: Experimentação Animal da UFMG, com o número de protocolo 131/2006, • veneno de T. fasciolatus e em 20 de dezembro de 2006 (certificado 100µl de PBS (G1b); em anexo). • veneno de T. fasciolatus e 200µl de PBS ( G2b); • veneno de T. serrulatus e 100µl de PBS (G3b);

28 FUNED- Belo Horizonte-MG 29 SAS® – Statistical Analysis System – Cary, EUA

58 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. PARTE I – ESTUDO CLÍNICO

5.1.1. DL 50

Para o cálculo da DL 50 foram testadas inicialmente sete doses diferentes de veneno de Tityus fasciolatus , levando em consideração o fator de diluição, que foi inicialmente 1,6, proposto pelo Prof. Carlos Delfin Chávez-Olórtegui 30 como apresentado na tabela 9.

30 Departamento de Bioquímica e Imunologia, ICB, Universidade Federal de Minas Gerais

59

Tabela 9: Doses de veneno do Tityus fasciolatus inoculadas via subcutânea nos camundongos e porcentagem de mortes (primeiro intervalo) DOSE (µg) PORCENTAGEM DE MORTES (%) 8,0 0 12,8 0 20,5 0 32,8 0 52,4 0 83,9 100 134,2 100

Para o cálculo da DL 50 utilizando o animais morreram (134,2µg), conforme programa Probitos (Finney, 1971,1978) destacado na tabela 9. Assim, foi foi elaborada uma nova faixa, utilizando utilizado um fator de concentração de um novo intervalo. Este segundo 1,2, que resultou em mais três doses, intervalo foi criado a partir da maior como apresentado na tabela 10. dose que não causou mortes (52,4µg) e a maior dose com a qual todos os

Tabela 10. Doses de veneno de Tityus fasciolatus inoculadas por via subcutânea nos camundongos e porcentagem de mortes (segundo intervalo). DOSE (µg) PORCENTAGEM DE MORTES (%) 52,4 0 62,9 66,7 75,5 83,3 90,6 100 134,2 100

Com os resultados obtidos, foi utilizado observaram uma grande variedade da o programa Probitos (Finney, toxicidade entre eles, entre 0,773 1971,1978) com sete doses (µg) para o mg/kg -1 para Tityus stigmurus a cálculo da DL 50 . 90,904mg/kg para o Brotheas amazonicus . Os mesmos autores Neste estudo, o cálculo da DL 50 , pela realizaram-se a comparação de via subcutânea, foi de 59,65µg por letalidade do veneno de T. fasciolatus camundongo (2,984 mg kg-1) com um com outras espécies de escorpiões do intervalo entre 52,72µg por mesmo gênero, verificando-se que ele camundongo e 67,5µg por camundongo. possui uma menor toxicidade do que o -1 Wagner et al. (2003) utilizando a de T. stigmurus (DL 50 0,773 mg kg ), -1 mesma espécie, mas a via T. bahiensis (DL 50 1,062mg kg ), T. -1 intraperitoneal, encontraram uma DL 50 serrulatus (DL 50 1,160 mg kg ) e T. -1 de 72,92µg por camundongo (3,646 mg costatus (DL 50 1,590 mg kg ). kg -1). Nishikawa et al. (1994) Entretanto, o veneno de T. fasciolatus realizaram um estudo comparativo de possui uma toxicidade maior do que o -1 DL 50 com alguns venenos de várias T. cambridgei (DL 50 12,136 mg kg ), o espécies de escorpiões brasileiros e

qual é considerado moderadamente hemorragia pulmonar, variando de tóxico. petéquias a equimoses difusamente distribuídas pela superfície dos órgãos Kalapothakis e Chávez-Olórtegui (Fig. 8 e 9). Além disso, foi observado (1997) afirmaram que a utilização de que os corações apresentavam uma área um pool de venenos é importante para de coloração mais clara, em formato de pesquisa e produção de anticorpos, cunha no ápice, sugerindo infarto. Essas assegurando a melhor qualidade do alterações também foram visualizadas antiveneno. Entretanto, uma por Cupo (2002), após estudos variabilidade individual na composição anátomo-histopatológicos de seis do veneno deve ser considerada e pacientes humanos que apresentaram analisada, sendo o conhecimento de pulmão com aumento de tamanho, variações individuais e geográficas dos edema alveolar difuso, áreas com venenos da mesma espécie hemorragia e infiltrado inflamatório e extremamente importante para a aumento da câmara cardíaca em quatro produção de antivenenos efetivos. pacientes.

A DL 50 não é uma constante biológica, No sistema nervoso central (SNC), pois muitos fatores podem influenciar a observou-se congestão dos vasos toxicidade e, consequentemente, alterar cerebrais e das meninges de intensidade sua estimativa. leve (Fig. 10). Têm sido reportadas alterações no SNC em casos fatais de picadas de escorpião como congestão 5.1.2. Alterações macroscópicas cerebral, hemorragia difusa, infarto cerebral e tromboses cérebro-vascular Os achados macroscópios encontrados (Ismail, 1995). com mais frequência foram áreas de

Figura 8- Áreas de hemorragias nos pulmões do camundongo que veio a óbito após a inoculação de 62,9µg do veneno de T. fasciolatus .

61

Figura 9- Área de hemorragia na região torácica do camundongo que veio a óbito após a inoculação de 62,9µg do veneno de T. fasciolatus .

Figura 10- Congestão de vasos cerebrais do camundongo que veio a óbito após a inoculação de 62,9µg do veneno de T. fasciolatus .

5.1.3. Alterações microscópicas As manifestações cardiovasculares do veneno de escorpião e anormalidades Foi realizado um estudo histopatológico histológicas são relacionadas com o alto do coração, pulmão e cérebro de seis nível de catecolaminas circulantes que animais que vieram a óbito. As ocorre devido ao efeito direto do veneno alterações observadas foram as no sistema nervoso simpático (Corrêa et seguintes: al., 1997).

Coração Foi observada congestão de leve a moderada dos vasos sanguíneos do epicárdio, miocárdio e endocárdio (Fig. 11) e discreto infiltrado inflamatório

62 linfo-histiocitário no endocárdio e coagulativa (contração das bandas) e miocárdio. Cupo et al. (1994) relataram sarcômeros rompidos e hipercontraídos alterações mais graves em três pacientes (Cupo et al., 1994; Benvenuti et al., humanos, como degeneração das fibras 2002); infiltrado inflamatório de cardíacas, necrose local, edema leucócitos polimorfonucleares, intersticial e aumento de celularidade histiócitos e linfócitos dispersos entre envolvendo linfócitos e monócitos. miocardiócitos necróticos e hipereosinofílicos (Daisley et al., 1999). Cupo (2002) também relatou, em cinco pacientes envenenados, degeneração Desde os primeiros trabalhos já se vacuolar de fibras cardíacas, área focal supunha que houvesse um efeito direto com miocitólise e necrose e edema das toxinas do veneno sobre o intersticial com infiltrado inflamatório. miocárdio. Ismail (1995) citou várias lesões identificadas por microscopia Corrêa et al. (1997) realizaram eletrônica que diferem qualitativamente inoculações endovenosas, diferente da daquelas causadas por superdosagem de via utilizada neste trabalho, em ratos catecolaminas, tais como edema com doses sub-letais do veneno de T. intracelular, dilatação de sistema serrulatus e com a principal tubular, destruição de bandas I e neurotoxina (tityustoxina) e deposição de lipídeos que, portanto, descreveram congestão venosa, necrose indicam que a descarga adrenérgica, por das fibras musculares com núcleo si só, não pode explicar as lesões vacuolizado e hemorragias decorrentes cardiovasculares agudas pelo de uma severa resposta cardiovascular. envenenamento escorpiônico grave. Embora efeitos diretos das toxinas Evidências físicas de dano no escorpiônicas ainda não tenham sido miocárdico causado pelo veneno de revelados, evidência da ação direta do escorpião foram descritas à auscultação veneno de T. serrulatus sobre o por Gueron (Gueron et al., 1967; músculo cardíaco foi obtida por Gueron e Yaron, 1970) como “galope Teixeira Júnior et al. (2001). Nesse protodiastólico passageiro” e trabalho, foi verificado que o veneno “murmúrio pansistólico apical pode induzir contratilidade em corações consistente com regurgitação mitral de ratos pré-tratados com 6- aguda”. As lesões cardíacas já descritas hidroxidopamina, uma droga que lesa resultam de degeneração de fibras seletivamente terminações nervosas musculares, necrose local e edema simpáticas, demonstrando que pelo intersticial (Yaron e Braun, 1970; menos os efeitos do veneno de T. Ismail, 1995); edema intersticial com serrulatus sobre o coração isolado de aumento de celularidade, acúmulo rato não dependem unicamente da intersticial local de linfócitos, com liberação de neurotransmissores. envolvimento de músculos papilares e áreas subendocardiais (Gueron e Os efeitos induzidos pelo veneno de Ovsyshcher, 1984); áreas de hemorragia escorpião são explicados pela liberação recentes e múltiplos focos de de neurotransmissores ao nível de cardiomiócitos mostrando miocitólise sinápse. Essa liberação se deve à ação

63 excitatória das toxinas na membrana terminações nervosas pós-glanglionares dos axônios, causado pela modificação e acetilcolina pelos gânglios e nervos da voltagem nos canais de sódio. O terminais pós-ganglionares (Corrêa et veneno de Tityus serrulatus é capaz de al., 1997). O efeito múltiplo dos atrasar a inativação dos canais de sódio. venenos de escorpião no sistema A TsTX-I altera a dependência da cardiovascular é, entretanto, similar ativação da voltagem através dos (Gueron et al., 1992). Assim se potenciais negativos, assim, diminui a explicam as discretas alterações excitação e aumenta a tendência da cardíacas vistas no estudo histológico membrana para ocorrer potenciais após a inoculação do veneno de Tityus espontâneos e repetitivos. Isso explica fasciolatus . o aumento da liberação de catecolaminas pela glândula adrenal e

Figura 11- Histologia do coração (HE, 60x) do camundongo que veio a óbito após a inoculação de 62,9µg do veneno de T. fasciolatus . Congestão de vasos (seta).

Cupo et al. (1994) observaram achados Pulmões compatíveis com edema e áreas difusas de hemorragia pulmonar. O edema Observou-se grande quantidade de pulmonar é, sem dúvida, a patologia hemácias nos capilares alveolares, mais importante. As causas são de levando a uma congestão (Fig. 12). origem cardiogênica, embora a Foram encontrados septos intensamente literatura nunca descarte a participação espessados por grande quantidade de de mecanismos não cardiogênicos, hemácias nos capilares alveolares, muito evidentes na rotina clínica hemorragia intersticial (Fig. 12) e (presença de edema sem alteração presença de leucócitos nas paredes dos cardíaca) e comprovados em alvéolos (Fig. 12). experimentos. As diversas causas apontadas são: (1) a hipertensão arterial

64 de natureza adrenérgica e aumento da além de proporcionar a diminuição do impedância sistêmica, induzindo débito cardíaco e da pressão arterial, insuficiência cardíaca esquerda; (2) após acidentes escorpiônicos, diminuição do débito cardíaco; (3) creditando-se esses efeitos à inibição de aumento de permeabilidade vascular no angiotensina, com consequente pulmão, provocada por mediadores vasodilatação e inibição da liberação de inflamatórios, como a bradicinina e catecolaminas (Karnad et al., 1989). Os histamina; (4) aumento do retorno edemas foram, por vezes, caracterizados venoso devido à ação de catecolaminas como unilaterais e periféricos, sobre a contração do músculo liso de reforçando a participação dos veias periféricas; (5) miocardite, mecanismos não cardiogênicos (Freire- igualmente causando insuficiência Maia et al., 1994). Gueron e Ilia (1996) cardíaca (Gueron e Ovsyshcher, 1984, levantaram essa questão ao relatar 1987; Freire-Maia e Campos, 1987; diversos casos clínicos em que ocorreu Ismail, 1995). O uso do captopril edema pulmonar na ausência de mostrou-se eficiente na reversão do hipertensão. quadro de edema pulmonar e cianose, B

C

A

Figura 12- Histologia do pulmão (HE, 60x) do camundongo que veio a óbito após a inoculação de 62,9µg do veneno de T. fasciolatus . (A) Presença de congestão dos vasos; (B) hemorragia intersticial e (C) infiltrado inflamatório.

O veneno do escorpião T. discrepans da Angústia Respiratória Aguda causou edema e microtrombos em (SARA), frente a tantos mecanismos e pulmões de coelhos, mas ambos foram sinais inerentes à ação pulmonar do inibidos por tratamento com heparina, veneno escorpiônico. A participação do corroborando com a hipótese de que a fator ativador de plaquetas (PAF) ativação da cascata de coagulação esteja também foi evidenciada na gênese do envolvida, também, na gênese do edema edema pulmonar causado por veneno de pulmonar (D´Suze et al., 1999). Nesse T. serrulatus , visto que o influxo de mesmo trabalho, os autores propõem neutrófilos para os pulmões e o aumento que o termo “edema pulmonar” seja de permeabilidade foram inibidos por abandonado e substituído por Síndrome antagonistas de receptores PAF e de

65 citocinas quimiotáticas (Coelho et al., infiltrado inflamatório (Andrade et al., 2007). 2004).

Lesões pulmonares foram descritas em Cérebro pacientes por Cupo et al. (1994) e consistiam no aumento de volume e Observou-se a presença de leve congestão bilaterais, parênquima congestão dos capilares do córtex e congesto contendo líquido espumoso e demais áreas (tronco e cerebelo) (Fig. hemorrágico, alvéolos pulmonares 13). difusamente repletos de material amorfo e proteináceo ou mesmo hemorrágicos Ismail et al. (1988), em estudo da em áreas focais. Em ratos anestesiados e concentração do veneno em diversos ventilados mecanicamente, o veneno de órgãos utilizando marcador radioativo, T. serrulatus causou diminuição de observaram que o veneno de escorpião complacência pulmonar sem modificar tem eliminação rápida. O veneno foi a resistência aérea, devido à ausência de detectado na urina após 15 minutos da contração muscular e outros achados inoculação intramuscular e que justificam essas alterações, como intraperitoneal. A concentração mais edema moderado, espessamento de alta do veneno foi encontrada nos rins, parede alveolar, áreas de colapso e pulmão e coração e a baixa no cérebro.

Figura 13- Histologia do córtex cerebral (HE, 60x). Presença de discreta congestão do vaso (seta).

5.1.4. Manifestações clínicas posição mais cômoda), secreção nasal e oral acentuadas, dispnéia, prurido na Todos os camundongos dos grupos II e face e reflexos normais exacerbados. III, inoculados com os venenos de T. serrulatus e T. fasciolatus , apresentaram A dor no local picado pelo escorpião é o piloereção, comportamento nociceptivo sinal mais comum, predominante no (demonstração de incômodo após o escorpionismo humano em praticamente toque e busca constante por uma 100% dos acidentes. É progressiva e

66 depende da quantidade de veneno estímulo não-nóxico (Rang et al., 2004). inoculada e da sensibilidade individual Embora os resultados sejam limitados do acidentado. Ocorre imediatamente quanto ao estabelecimento de paralelos após o acidente. Pode ser discreta, entre a experiência de dor humana e a restrita ao local de inoculação do manifestação de dor em animais veneno, ou insuportável, manifestada na experimentais, concluiu-se que o forma de ardor, “agulhada” ou veneno de T. serrulatus causou alodinia “ferroada”, acompanhada ou não de térmica e mecânica ipsilateral após hiperestesia. Pode irradiar-se até a raiz injeção intraplantar, qualitativamente do membro atingido, exacerbando-se à diferente da experiência humana, que palpação. Algumas vezes, apesar de registra alodinia de larga distribuição, sentir e identificar a picada, o paciente alcançando órgãos distantes do local da não sente a dor, provavelmente por picada. O comportamento nociceptivo deficiência na inoculação do veneno ou dos animais foi manifestado por por falta deste no momento da incômodo no local onde foi aplicado o inoculação, consumido antes na captura veneno, demarcadamente nos primeiros de uma presa. O local da picada é, às 15 minutos, enquanto o prurido facial vezes, detectado com dificuldade, instalou-se rapidamente e permaneceu podendo-se encontrar hiperemia e por uma hora. Há suspeitas de que a edema discretos, acompanhados ou não resposta nociceptiva imediata tenha sido de sudorese e piloereção local (Ismail e influenciada pela atuação das Abd-Elsalam, 1988; Bucaretchi et al., neurotoxinas e de eicosanóides 1995; Ismail, 1995; Rezende et al., endógenos sobre fibras aferentes 1996; Cupo e Hering, 2002; Soares et nociceptivas primárias. Tratamentos al., 2002; Cupo et al., 2003; Melo et al., com drogas antagonistas de aminas 2004; Campolina, 2006). Neste biogênicas, tais como histamina e 5- experimento foi observado, nos hidroxitriptamina (5-HT ou serotonina), camundongos inoculados com os que foram identificadas como venenos de T. fasciolatus e T. constituintes do veneno, mas também serrulatus , comportamento nociceptivo têm origem endógena, inibiram as (indicativo de dor). respostas nociceptivas e o edema, fazendo-se supor uma ampla Uma investigação farmacológica da participação desses mediadores nesses resposta nociceptiva e da indução de processos. edema pelo veneno de T. serrulatus em ratos e camundongos, conduzida por Experimentos com injeções de veneno Nascimento Júnior et al. (2005), de escorpiões em animais produziram mostrou como determinadas sinais locais e sistêmicos, bem como concentrações de veneno induzem sintomas similares observados em efeitos diferentes. Esse estudo envenenamento humano, como investigou tanto nocicepção , conceito agitação, salivação, lacrimejamento, definido como um estímulo nóxico que aumento da motilidade gastrintestinal, dá origem à sensação intensa e arritmias cardíacas e respiratórias, desagradável de dor aguda, quanto hipertensão arterial seguida de alodinia, dor crônica evocada por hipotensão, insuficiência cardíaca,

67 edema pulmonar e choque (Pessini et cardiovasculares. O escorpião al., 2008). venezuelano T. discrepans também causou aumento de IL-6 em paciente Embora o trabalho de Nascimento humanos e foi encontrada alta Júnior et al. (2005) descarte a atuação correlação com os níveis de amilase de citocinas inflamatórias nos processos pancreática após o acidente (D’Suze et algésicos locais, devido à rapidez com al., 2003). Em trabalhos semelhantes ao que eles se instalam, trabalhos mais anterior, porém envolvendo acidentes recentes sobre escorpionismo têm dado com T. serrulatus, Magalhães et al., amplo destaque para esses mediadores e (1999) e Fukuhara et al., (2003) têm gerado discussões sobre os registraram o aumento plasmático de mecanismos patofisiológicos da IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, fator de Síndrome do Envenenamento necrose tumoral (TNF-α), interferon-γ Escorpiônico (SEE). Há suspeitas de (IFN- γ) e fator estimulador de colônias que parte dos efeitos do veneno de granulócitos e monócitos (GM-CSF) escorpiônico seja atribuída à liberação em pacientes com quadros graves de de mediadores inflamatórios, já que foi intoxicação. Em trabalhos relatada a ocorrência de síndrome de experimentais com T. serrulatus , resposta inflamatória sistêmica, edema Petricevich et al., (2007) constataram a pulmonar e até morte em pacientes estimulação de produção de citocinas reincidentes e já tratados com por macrófagos, in vitro , promovida anticorpos contra veneno escorpiônico pela toxina Ts1 (toxina γ) isolada. (Fukuhara et al., 2004). Sofer et al. Fukuhara et al., (2004) avaliaram os (1996) encontraram níveis muito níveis de cininas em pacientes humanos elevados, quase oito vezes acima do acidentados por T. serrulatus, normal, de interleucina 6 (IL- 6) no coincidindo os maiores níveis com os plasma de crianças acidentadas por quadros mais graves. As cininas, como Leiurus quinquestriatus hebreus e a bradicinina, também causam dor local, Buthotus judaicus ; Meki e El-Dean vasodilatação, aumento da (1998) fizeram um trabalho semelhante permeabilidade vascular, promovem a no Egito e observaram níveis elevados migração de polimorfonucleares e a de IL-6, IL-1β, óxido nítrico (NO), um liberação de citocinas, prostaglandinas e importante modulador farmacológico e leucotrienos. A bradicinina foi relatada antitripsina α-1, uma proteína de fase por Freire-Maia e Campos (1987) como aguda (globulina) produzida pelo fígado possível causadora de edemas em quadros inflamatórios. Essas pulmonares de origem não-cardiogênica interleucinas estão diretamente no envenenamento escorpiônico. A relacionadas com resposta pró- participação de bradicinina NO e IL-1 inflamatória e indução de liberação de foi também constatada outras citocinas. Fatani et al., (1998) experimentalmente por Pessini et al. investigaram a participação de cininas (2006) na indução de febre em ratos no envenenamento de coelhos por L. inoculados com veneno de T. serrulatus quinquestriatus e também encontraram por via intraperitoneal, mostrando-se alta correlação entre a sua concentração esses mediadores os mais importantes plasmática e a ocorrência de alterações na resposta febril da SEE. Os

68 mecanismos exatos dos mediadores permeabilidade vascular causando inflamatórios e farmacológicos no extravasamento de fluido, além de ser envenenamento escorpiônico não estão uma potente estimuladora das secreções definidos a contento, mas tais resultados exócrinas, estimulando a secreção de lhes dão lugar de destaque e poderão muco brônquico, lacrimejamento e explicar, conjuntamente à liberação de salivação (Tizard, 2002). A constrição neurotransmissores, muitos sinais brônquica e secreção de muco são clínicos causados pelo veneno de também consequências da estimulação escorpião, além de auxiliar na de receptores muscarínicos pela terapêutica da SEE. acetilcolina (Rang et al., 2004), um dos neurotransmissores que podem ser Embora não se conheça a composição liberados em função da ação do veneno de T. fasciolatus , neurotóxica do veneno de escorpião. provavelmente a inoculação deste no tecido subcutâneoo dos camundongos O veneno alcança níveis máximos de resultando em liberação de mediadores distribuição nos pulmões de ratos em 30 farmacológicos da dor, semelhante ao minutos (Revelo et al., 1996). Essa que ocorre após a inoculação do veneno característica farmacocinética coincide de T. serrulatus . com a forma aguda como os sinais que foram observados nos camundongos Em humanos, as manifestações deste experimento. Não foi encontrada respiratórias incluem rinorréia, tosse, na literatura consultada relatos de espirros, estertores pulmonares, sibilos, toxinas de veneno escorpiônico que taquipnéia, dispnéia e bradipnéia, mas lesem ou irritem a mucosa do trato sem dúvida o edema pulmonar é o sinal respiratório superior, mas diante desses mais grave e importante do acidente sinais apresentados, tal possibilidade escorpiônico (Campos et al., 1979; deve ser considerada. O prurido facial Cupo et al., 2003). Todos os animais pode ser justificado pela vasodilatação, dos grupos II e III, após a inoculação do aumento de permeabilidade e veneno de T. fasciolatus e T. serrulatus , extravasamento de líquido, estimulados apresentaram acentuada rinorréia. pela histamina.

O prurido facial apresentado pelos Assim como a rinorréia, a salivação camundongos pode ter sido decorrente abundante foi causada por aumento de de reações de hipersensibilidade do tipo secreção. O trato gastrintestinal pode ter I, provocadas por histamina, anticorpos sido influenciado por efeitos do tipo IgE, mastócitos, basófilos e parassimpáticos advindos da liberação eosinófilos. A combinação de IgE com de acetilcolina, que estimula as antígeno na superfície de mastócitos secreções exócrinas (Rang et al., 2004). causa a formação de moléculas vasoativas e a liberação de histamina 5.1.5. Alterações Hematológicas dos grânulos dos mastócitos. A histamina provoca contração da O quadro clínico do envenenamento musculatura lisa nos brônquios, trato escorpiônico está na dependência de gastrintestinal, e bexiga e aumenta a fatores relacionados com o escorpião e

69 com a vítima. Os fatores relacionados fasciolatus quando comparado com ao escorpião são: espécie, condição do outros grupos. télson no momento do acidente, número de picadas ou quantidade de veneno De forma semelhante, Ribeiro et al. injetada. Em relação à vítima há idade, (2009) observaram aumento do número peso corporal, estado de saúde, doenças de hemácias e da concentração de concomitantes e ineficácia do hemoglobina nas primeiras horas após tratamento (Dehesa-Dávila e Possani, inoculação do veneno de Tityus 1994). Assim, a realização dos exames serrulatus em cães . Após 12 horas esses laboratoriais é essencial, objetivando-se valores retornaram aos valores iniciais. a monitoração do paciente e a reversão do quadro clínico de envenenamento Neste experimento, existem duas escorpiônico. possíveis causas do aumento do eritrograma. O discreto aumento do Os parâmetros hematológicos em número dos eritrócitos e os camundongos podem ser influenciados significativos aumentos da concentração por vários fatores, como linhagem, de hemoglobina e do volume globular idade, sexo, espécie, anestesia utilizada podem ter sido decorrentes da dor e do na coleta, método de contenção e estresse (efeito das catecolaminas), estresse (Thrall, 2004). Com o objetivo levando a uma contração esplênica. de minimizar estes fatores, neste Porém, como os animais manifestaram experimento foram escolhidos abundante salivação e rinorréia, que camundongos machos da mesma poderiam levar a um quadro de linhagem ( Swiss ), idade e peso (18 a desidratação, essa também pode ter sido 20g). Todos eram procedentes do responsável pela discreta mesmo biotério, criados nas mesmas hemoconcentração, já que os valores da condições de manejo e recebendo a proteína total também apresentaram mesma alimentação. No momento da discreto aumento. coleta de sangue, todos receberam a mesma contenção, portanto, conseguiu- A contração esplênica pode causar se assim, a padronização dos valores aumento no volume globular em hematológicos. decorrência do efeito simpato-adrenal evocado pelo veneno escorpiônico. Nas tabelas 11, 12, 13, 14 e gráficos 1, Andrade et al. (2004), fizeram avaliação 2, 3 e 4 estão os valores do eritrograma completa dos níveis plasmáticos de dos camundongos após a inoculação dos eletrólitos e do balanço ácido-básico em venenos de T. fasciolatus e T. ratos e observaram aumento serrulatus . Em relação ao número dos significativo de volume globular 60 eritrócitos (Tab.11), não foi observada minutos após a inoculação de veneno de diferença significativa entre grupos e T. serrulatus . O efeito da contração tempos (P>0,05). Houve um aumento esplênica em cães, após o significativo (P<0,05) da concentração envenenamento escorpiônico, foi de hemoglobina (Tab. 12) e do volume estudado por Tarasiuk e Sofer (1999), globular (Tab. 13) no grupo II, 8h após sendo impedida por meio de bloqueios a inoculação do veneno de T. de receptores adrenérgicos esplênicos e

70 ligaduras em vasos sanguíneos do baço, hemoconcentração causada pela demonstrando-se que a contração desidratação. esplênica ocorre em função do efeito das catecolaminas. Bertazzi et al. (2003) avaliaram a hemoconcentração, em ratos, após a Cusinato et al. (2002) avaliaram as inoculação de veneno bruto de T. mudanças hematológicas causadas pelo serrulatus e de sua toxina mais veneno de Tityus serrulatus em ratos e importante, TsTX-I, e atribuíram sua observaram aumento de volume ocorrência às perdas de líquidos por globular e hemoglobina devido a uma salivação, lacrimejamento e micção.

Tabela 11 – Valores médios do número de hemácias (x 10 6/µl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. Hemácias (x 10 6/µl) Tempo Grupo I Grupo II Grupo III T1h 8,60 Aa 8,81 Aa 8,86 Aa T8h 8,41 Aa 9,01 Aa 8,44 Aa T24h 8,48 Aa 8,47 Aa 8,52 Aa Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não diferem estatisticamente entre os grupos (linhas) e seguidas das mesmas letras minúsculas não diferem estatisticamente entre os tempos (colunas), submetidas à análise de variância e ao teste SNK, com P<0,05

Gráfico 1- Valores médios do número de hemácias (x 10 6/µl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

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Tabela 12- Valores médios das concentrações de hemoglobina (g/dl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. Hemoglobina (g/dl) Tempo Grupo I Grupo II Grupo III T1h 14,18 Aa 13,71 Aab 13,83 Aa T8h 13,33 Ba 14,43 Aa 13,42 Ba T24h 13,62 Aa 13,57 Ab 13,45 Aa Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não diferem estatisticamente entre os grupos (linhas) e seguidas das mesmas letras minúsculas não diferem estatisticamente entre os tempos (colunas), submetidas à análise de variância e ao teste SNK, com P<0,05.

Gráfico 2- Valores médios das concentrações de hemoglobina (g/dl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

72 Tabela 13 - Valores médios do volume globular (%) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. Volume globular (%) Tempo Grupo I Grupo II Grupo III T1 42,33 Aa 42,67 Ab 44,67 Aa T8 41,67 Ba 45,67 Aa 42,67 Bab T24 39,67 Aa 41,0 Ab 41,50 Ab Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não diferem estatisticamente entre os grupos (linhas) e seguidas das mesmas letras minúsculas não diferem estatisticamente entre os tempos (colunas), submetidas à análise de variância e ao teste SNK, com P<0,05

Gráfico 3- Valores médios do volume globular (%) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Como mostra a tabela 14, não houve como causador de anemia, hemólise, diferença entre os valores de volume lesões vasculares ou interferências na globular médio (VGM), hemoglobina medula óssea, de modo que a globular média (HGM) e concentração manutenção da contagem de hemácias, de hemoglobina globular média. O da concentração de hemoglobina e do veneno de escorpiões não é volume globular médio é coerente com caracterizado na literatura científica esse fato.

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Tabela 14– Valores médios de hemoglobina globular média, HGM (pg), volume globular médio, VGM (g/dl) e concentração de hemoglobina globular média, CHGM (fl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. Tempo HGM (pg) VGM (g/dl) CHGM (fl) Grupo I Grupo Grupo Grupo I Grupo Grupo Grupo I Grupo II Grupo II III II III III T1h 16,33 Aa 15,55 Aa 15,67 Aa 48,83 Aa 48,52 Aa 50,60 Aa 33,52 Aab 32,18 Aba 31,02 Ba T8h 15,95 Aa 16,05 Aa 15,85 Aa 49,72 Aa 50,75 Aa 50,45 Aa 32,18 Ab 31,67 Aa 31,43 Aa T24h 16,07 Aa 16,05 Aa 15,85 Aa 46,82 Aa 48,60 Aa 48,87 Aa 34,32 Aa 33,08 Aba 32,42 Ba Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não diferem estatisticamente entre os grupos (linhas) e seguidas das mesmas letras minúsculas não diferem estatisticamente entre os tempos (colunas), submetidas à análise de variância e ao teste SNK, com P<0,05.

Gráfico 4- Valores médios de hemoglobina globular média, HGM (pg), volume globular médio, VGM (g/dl) e concentração de hemoglobina globular média, CHGM (fl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

A contagem de leucócitos totais está limites máximos para a espécie (2,61 a representada na tabela 15 e no gráfico 5. 10,05) (Thrall, 2004). Leucocitose Observou-se um aumento significativo também foi observada por Ribeiro et al. (P<0,05) da contagem total dos (2009) em cães envenenados com o leucócitos no GII (T. fasciolatus ) 8h veneno de Tityus serrulatus , retornado a após a inoculação do veneno, normalidade após 24 horas. ultrapassando de forma discreta os

74 Tabela 15- Valores médios do numero total de leucócitos (x 10 3/µl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. Leucócitos totais (x 10 3/µl) Tempo Grupo I Grupo II Grupo III T1h 7,18 Aa 6,45 Ab 7,08 Aab T8h 9,37 Aba 10,18 Aa 7,48 Bb T24h 8,25 Aa 7,22 Ab 8,37 Aa Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não diferem estatisticamente entre os grupos (linhas) e seguidas das mesmas letras minúsculas não diferem estatisticamente entre os tempos (colunas), submetidas à análise de variância e ao teste SNK, com P<0,05.

Gráfico 5- Valores médios do numero total de leucócitos (x 10 3/µl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Os valores absolutos do número de relatadas reações inflamatórias neutrófilos e linfócitos estão decorrentes das neurotoxinas presentes representados na tabela 16 e no gráfico no veneno dos escorpiões, como seis. miocardite e pancreatite, e a vasta participação de citocinas e mediadores Leucocitose com neutrofilia é uma inflamatórios (óxido nítrico, alteração comum, registrada em muitos leucotrienos, catecolaminas, casos clínicos humanos de bradicininas e prostaglandinas) envenenamento escorpiônico (Gueron et conforme descrito por Fukuhara et al., al., 1967; Bucaretchi et al., 1995; Cupo (2003 e 2004), o mecanismo mais e Hering, 2002; Melo et al., 2004) e provável é o estresse causado pela dor, também em cães (Cordeiro et al., 2006; que maximiza a descarga de adrenalina Labarrère et al., 2007). Embora sejam e provoca leucocitose fisiológica devido

75 ao desprendimento de leucócitos do (Jain, 1993). pool marginal dos vasos sanguíneos

Tabela 16– Valores médios absolutos de neutrófilos e linfócitos (x 10 3/µl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. Tempo Neutrófilos (x 10 3/µl) Linfócitos (x 10 3/µl) Grupo I Grupo II Grupo III Grupo I Grupo II Grupo III T1h 0,95 Aa 1,04 Aa 1,33 Aa 5,84 Aa 5,10 Ab 5,50 Aa T8h 0,82 Aa 1,10 Aa 1,45 Aa 7,89 Aa 8,50 Aa 5,60 Ba T24h 0,97 Aa 0,86 Aa 1,30 Aa 6,60 Aa 5,97 Ab 6,53 Aa Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não diferem estatisticamente entre os grupos (linhas) e seguidas das mesmas letras minúsculas não diferem estatisticamente entre os tempos (colunas), submetidas à análise de variância e ao teste SNK, com P<0,05.

Gráfico 6- Valores médios absolutos de neutrófilos e linfócitos (x 10 3/µl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Conforme observado na tabela 16, não Os linfócitos são as principais células houve alteração do número absoluto de circulantes dos camundongos. Portanto, neutrófilos entre grupos ou tempos. Em a leucocitose fisiológica descrita relação ao número de linfócitos, pode-se anteriormente provavelmente foi observar um aumento significativo decorrente da linfocitose. (P<0,05) nos animais do GII ( T. fasciolatus ) 8h após a inoculação do As contagens do número absoluto de veneno. monócitos e eosinófilos estão apresentadas na tabela 17 e no gráfico 7.

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Tabela 17– Valores médios absolutos de monócitos e eosinófilos (x 10 3/µl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. Tempo Monócitos (x 10 3/µl) Eosinófilos (x 10 3/µl) Grupo Grupo II Grupo III Grupo I Grupo II Grupo III I T1h 0,29 Ab 0,23 Aa 0,19 Aa 0,10 Ab 0,10 Ab 0,07 Aa T8h 0,35 Aab 0,27 Aa 0,30 Aa 0,29 Aa 0,30 Aa 0,12 Aa T24h 0,52 Aa 0,32 Aa 0,34 Aa 0,15 Ab 0,07 Ab 0,19 Aa Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não diferem estatisticamente entre os grupos (linhas) e seguidas das mesmas letras minúsculas não diferem estatisticamente entre os tempos (colunas), submetidas à análise de variância e ao teste SNK, com P<0,05.

Gráfico 7- Valores médios absolutos de monócitos e eosinófilos (x 10 3/µl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Em relação ao número absoluto de plasmática de proteínas totais, albumina monócitos e eosinófilos não houve e as frações de globulina, diferença entre os grupos estudados. respectivamente. Uma das funções das Ressalta-se que a eosinofilia ocorre em proteínas presentes no plasma é a doenças alérgicas e nos processos de manutenção da pressão osmótica. hipersensibilização (Jain, 1993), não Assim, quando ocorre um aumento das observados neste experimento. proteínas plasmáticas por deficiência relativa de água, todas as frações, As tabelas 18, 19 e 20 e gráficos 8, 9 e albumina e globulinas, aumentam 10 mostram os valores da concentração aproximadamente na mesma proporção.

Quando o motivo do aumento não for reação culmina com a liberação de por desidratação, apenas as frações citocinas e consequente liberação das globulinas aumentam enquanto a proteínas de fase aguda. O perfil albumina se mantém inalterada ou eletroforético pode sugerir a ocorrência diminui (Kaneko, 1997b). Determinadas de processos inflamatórios agudos e glicoproteínas plasmáticas, crônicos, disfunções hepáticas, perdas normalmente presentes em quantidades protéicas, síndromes nefróticas e diminutas no plasma, aumentam após alterações das globulinas que ajudam o injúrias ou lesões teciduais. Isto ocorre entendimento da resposta imunológica devido ao desencadeamento de uma (Naoum, 1990). série de reações complexas que tentam impedir a progressão dos danos Crispens, 1975, relatou que as teciduais, isolar e, quando possível, concentrações das proteínas plasmáticas destruir o agente agressor, assim como podem variar segundo a tabela 18. parar a ativação dos processos de reparação da injúria. Esta complexa

Tabela 18 - Valores relativos normais para proteínas séricas de camundongos (%). Proteína Valores relativos Albumina 60,8 a 65,7% Alfa-globulinas 12,1 a 14,8% Beta-globulinas 16,5 a 20,4% Gama-globulinas 4,3 a 7% Adaptado de: Crispens, 1975.

Neste experimento, observou-se um Em relação à albumina, ocorreu um aumento significativo (P<0,05) das aumento significativo (P<0,05) no GI proteínas plasmáticas após 8 e 24 horas (PBS), ficando os grupos I e II no GII (Tab. 19). Já no GIII, os valores diferentes (P>0,05) do GIII 24h após a de proteínas totais foram maiores no T8, inoculação (Tab. 20). quando comparado com T1 e T24.

Tabela 19- Valores médios das concentrações de proteínas plasmáticas (g/l) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. Proteínas Plasmáticas (g/L) Tempo Grupo I Grupo II Grupo III T1h 5,60 Ab 5,33 ABb 5,10 Bb T8h 5,80ABb 6,10 Aa 5,50 Ba T24h 6,17 Aa 6,27 Aa 5,13 Bb Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não diferem estatisticamente entre os grupos (linhas) e seguidas das mesmas letras minúsculas não diferem estatisticamente entre os tempos (colunas), submetidas à análise de variância e ao teste SNK, com P<0,05.

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Gráfico 8- Valores médios das concentrações de proteínas plasmáticas (g/l) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Tabela 20- Valores séricos médios de albumina (g/dl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. Albumina (g/dl) Tempo Grupo I Grupo II Grupo III T1h 3,48 Ab 3,53 Aa 3,21 Aa T8h 3,65 Aab 3,67 Aa 3,55 Aa T24h 4,07 Aa 3,74 Aa 3,12 Ba Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não diferem estatisticamente entre os grupos (linhas) e seguidas das mesmas letras minúsculas não diferem estatisticamente entre os tempos (colunas), submetidas à análise de variância e ao teste SNK, com P<0,05.

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Gráfico 9- Valores séricos médios de albumina (g/dl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Os maiores valores da fração α- inflamatória causada pelo veneno globulina foram observados em T24 no escorpiônico. GII ( T. fasciolatus ). Como relatado anteriormente, a presença de leucocitose Também houve aumento de β-globulina observada em T8 e o aumento de α- em T8 e em T24 no GII ( T. fasciolatus ). globulina revelaram uma reação

Tabela 21 – Valores médios das α, β e γ-globulina (g/dl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. Tempo α-globulina (g/dl) β-globulina (g/dl) γ -globulina (g/dl) Grupo Grupo Grupo Grupo Grupo Grupo Grupo Grupo Grupo I II III I II III I II III T1h 0,74 Aab 0,72 Aa 0,65 Aa 1,35 Ab 1,05 Ab 1,21 Aa 0,03 Aa 0,03 Aa 0,02 Aa T8h 0,85 Aa 0,87 Aa 0,81 Aa 1,28 Ab 1,53 Aa 1,22 Aa 0,02 Ba 0,03 ABa 0,04 Aa T24h 0,66 Bb 0,87 Aa 0,81 ABa 1,90 Aa 1,78 Aa 1,17 Ba 0,03 Aa 0,03 Aa 0,03 Aa Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não diferem estatisticamente entre os grupos (linhas) e seguidas das mesmas letras minúsculas não diferem estatisticamente entre os tempos (colunas), submetidas à análise de variância e ao teste SNK, com P<0,05.

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Gráfico 10- Valores médios das α, β e γ-globulinas (g/dl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Na tabela 22 e gráfico 11 encontram-se 5.1.6. Bioquímica sérica os valores da enzima creatina quinase (CK) e sua isoenzima (CK-MB).

Tabela 22 – Valores médios de CK (U/l) e CK-MB (U/l) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. Tempo CK (U/l) CK-MB (U/l) Grupo I Grupo II Grupo III Grupo I Grupo II Grupo III T1h 1110,33 Aa 1040,67 Aa 1491,17 Aa 244,17 Aa 243,67 Aab 334,17 Aa T8h 1673,33 Aa 986,67 Aa 1181,83 Aa 150,00 Ba 363,33 Aa 335,67 Aa T24h 1106,67 Aa 930,00 Aa 1524,50 Aa 236,67 Ba 150,00 Bb 422,17 Aa Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não diferem estatisticamente entre os grupos (linhas) e seguidas das mesmas letras minúsculas não diferem estatisticamente entre os tempos (colunas), submetidas à análise de variância e ao teste SNK, com P<0,05.

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Gráfico 11- Valores médios de CK (U/l) e CK-MB (U/l) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. contração muscular, a CK é a enzima Pode-se observar que não ocorreu mais sensível para indicar lesão diferença significativa da enzima CK muscular e tem meia vida curta, entre grupos ou tempos estudados. Os diferente da AST (Cardinet, 1997; resultados deste experimento se Kramer e Hoffmann, 1997; Thompson, assemelham aos de Ribeiro (2008), que 1997). Em relação à isoenzima CK-MB, também não observou aumento de CK também não houve alteração nos em cães, após a inoculação do veneno diferentes tempos estudados dos grupos de T. serrulatus . Apenas grandes I (PBS) e III ( T. serrulatus ). Porém, no elevações nos níveis de CK têm GII ( T. fasciolatus ) ocorreu uma significância clínica, pois injeções diminuição significativa (p<0,05) 24h intramusculares, ferimentos e decúbito após a inoculação do veneno. prolongado tendem a causar pequenos aumentos dessa enzima. A CK catalisa a Quando ocorre necrose do miocárdio, fosforilação reversível de creatina em há liberação da isoenzima CK-MB para fosfocreatina, uma reserva de energia o meio extracelular, sendo a sua que participa da fosforilação de ADP dosagem um importante recurso para a em ATP, necessário para a contração detecção de tal problema (Kaneko, muscular anaeróbia. As isoenzimas de 1997). Entretanto, é importante CK são formadas por dois protômeros, considerar os valores de CK-MB em M (músculo) ou B (cérebro). Assim, em relação à CK total para determinar se humanos, a CK-BB está presente no está realmente aumentada. Ou seja, a cérebro, a CK-MM, nos músculos porcentagem de CK-MB em relação ao esquelético e cardíaco e a CK-MB valor total de CK fornece um dado principalmente no coração. Por sua confiável quando se avalia uma possível presença no miócito e atuando na lesão do miocárdio, pois valores

82 aumentados de CK-MB acompanhados permitindo-se verificar que houve de aumento de CK podem ser discreta lesão no músculo cardíaco. resultantes de um esforço físico, por exemplo. Porém, quando se observa Quando se calculou a porcentagem da aumento de CK-MB não acompanhado isoenzima CK-MB em relação a CK de aumento da CK, altera-se a total, obtiveram-se os seguintes porcentagem dessa isoenzima, resultados (Tab. 23) e gráfico 12:

Tabela 23- Porcentagem da isoenzima CK-MB em relação a CK total de camundongos Porcentagem de CK-MB (%) Tempo Grupo I Grupo II Grupo III T1h 21,99 23,41 22,41 T8h 8,96 36,82 28,40 T24h 21,39 16,00 27,69

Gráfico 12- Porcentagem da isoenzima CK-MB em relação à CK total de camundongos 24h após a inoculação do veneno Ressalta-se que a porcentagem da escorpiônico em GIII. fração CK-MB representa em torno de 20 a 30% da CK total (Camarozano e Outras enzimas que podem ser Henriques, 1996; Melo et al., 2008). utilizadas para a avaliação do miocárdio Portanto, percebe-se que, 8h após a são aspartato aminotransferase (AST) e inoculação dos venenos de T. lactato desidrogenase (LDH). Nas fasciolatus (GII) e T. serrulatus (GIII), tabela 24, 25 e gráficos 13 e 14 estão os ocorreu um aumento da porcentagem da valores de AST e LDH, isoenzima CK-MB, também observado respectivamente.

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Tabela 24- Valores médios de AST (U/l) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. AST (U/l) Tempo Grupo I Grupo II Grupo III T1h 224,33 Aa 175,67 Ba 225,17 Aa T8h 215,83 Aa 196,17 Aa 219,83 Aa T24h 191,00 Aa 179,83 Aa 209,17 Aa Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não diferem estatisticamente entre os grupos (linhas) e seguidas das mesmas letras minúsculas não diferem estatisticamente entre os tempos (colunas), submetidas à análise de variância e ao teste SNK, com P<0,05.

Gráfico 13 - Valores médios de AST (U/l) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Não houve diferença significativa dos valores de AST entre grupos e tempos estudados (Tab. 24).

Tabela 25- Valores médios de LDH (U/l) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. LDH (U/l) Tempo Grupo I Grupo II Grupo III T1h 1098,33 Aa 1292,67 Aa 975,33 Aa T8h 952,50 Aa 405,00 Bb 930,67 Aa T24h 672,00 Aa 763,50 Ab 1013,83 Aa Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não diferem estatisticamente entre os grupos (linhas) e seguidas das mesmas letras minúsculas não diferem estatisticamente entre os tempos (colunas), submetidas à análise de variância e ao teste SNK, com P<0,05.

Gráfico 14- Valores médios de LDH (U/l) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Não houve alteração da enzima LDH nos diferentes tempos estudados dos A AST, por ser uma enzima grupos I e III. Porém, 8h após a mitocondrial e citosólica, necessita de inoculação do veneno de T. fasciolatus , uma lesão celular mais grave para ser ocorreu uma diminuição da enzima liberada na corrente sanguínea. Motivo LDH. esse que talvez não tenha ocorrido uma lesão tão acentuada para que A atividade total da lactato ocorressem alterações no aumento de desidrogenase (LDH) é alta em AST nos camundongos. Porém CK e músculos de contração rápida, porém LDH por serem citosólicas e de pode-se modificar também nas afecções tamanho pequeno, conseguem hepáticas e nas anemias (Kaneko, ultrapassar a membrana celular, mesmo 1997). que não exista um dano tecidual grande. Assim, de acordo com os resultados As enzimas musculares têm diferentes observados, pode-se afirmar que não meias-vidas no plasma. Por exemplo, a ocorreu lesão muscular cardíaca CK tem uma meia-vida de somente significativa. poucas horas enquanto a AST tem uma meia-vida muito mais longa. Como A complexidade da SEE gera algumas enzimas também apresentam divergências entre pesquisadores, grande flutuação, dependendo da sobretudo acerca do sistema doença na forma subclínica ou na forma cardiovascular. Gueron e Ovsyshcher clínica, a combinação de testes tem (1987) levantaram questões relevantes uma sensibilidade maior do que sobre o tratamento das manifestações somente uma enzima (Boyd, 1988). cardiovasculares do envenenamento

85 escorpiônico relativas às gêneses dos Isto pode ter sido decorrente da menor diferentes quadros clínicos. Assim, o ingestão de alimento nas primeiras envenenamento grave foi separado em horas após o envenenamento causado cinco síndromes, que podem acontecer pela dor. Da mesma forma, quando se isoladas ou em conjunto: (1) compara os tempos, os grupos II e III hipertensão; (2) edema pulmonar com apresentaram valores menores (P<0,05) hipertensão; (3) hipotensão; (4) edema quando comparados com o GI (PBS). pulmonar com hipotensão e (5) distúrbios rítmicos, como taquicardia ou A elevação da uréia sanguínea está bradicardia sinusal, despolarização relacionada a mecanismos renais e atrial e ventricular prematuras, extra-renais. Por ser originária do taquicardias supraventriculares, metabolismo hepático de proteínas, do bloqueio átrio-ventricular e taquicardia catabolismo tecidual devido à febre, ventricular. Freire-Maia e Campos exercícios, inanição, uso de corticóides, (1987), no entanto, salientaram que os assim como o aumento na ingestão de resultados de várias pesquisas têm proteínas podem levar ao aumento de mostrado que o envenenamento sua produção. A desidratação e a escorpiônico é uma síndrome muito diminuição da função cardíaca, por sua complexa, não sendo possível vez, diminuem a sua excreção renal. A diferenciá-la naquelas cinco síndromes. uréia é livremente filtrada pelos Dependendo da dose de veneno usada, glomérulos renais, tendo a mesma taquicardia sinusal e hipertensão arterial concentração plasmática no filtrado poderiam ser seguidas por bloqueio glomerular e é passivamente átrio-ventricular e hipotensão. Além reabsorvida pelos túbulos renais (Finco, disso, alterações de ritmo cardíaco não 1997). Por esse motivo, a uréia não é ocorrem sozinhas, sem efeito por si só, um bom meio de avaliação da simultâneo sobre a pressão arterial função renal. sistêmica. Outra comprovação da complexidade foi a constatação de que a A creatinina é oriunda da degradação de taquicardia sinusal é causada por creatina, que por sua vez é produzida no estimulação β-adrenérgica, ao passo que fígado, a partir do aminoácido a hipertensão é evocada pela metionina e de acetato de guanidina. estimulação de catecolaminas em Liberada no plasma, a creatina é receptores α. estocada nos músculos esqueléticos, onde constitui reserva de energia na Na tabela 26 estão os valores de uréia e forma de fosfocreatina. A degradação creatinina e nos gráfico 15 e 16 estão os espontânea de creatina nos músculos valores de uréia e creatinina, com liberação de creatinina no sangue é respectivamente, dos camundongos um processo contínuo. A concentração após a inoculação dos venenos de T. de creatinina no sangue depende pouco fasciolatus e T. serrulatus . da ingestão de carne, mas pode ser Foi observada diminuição significativa aumentado em função da massa dos valores médios de uréia 8h após a muscular do animal, de lesões inoculação dos venenos de T. musculares e do esforço físico. Assim fasciolatus (GII) e T. serrulatus (GIII). como a uréia, a creatinina é livremente

86 filtrada pelos glomérulos renais, sendo a Em relação à creatinina, 8h após a sua concentração no filtrado a mesma inoculação dos venenos escorpiônicos, do plasma, porém, não é reabsorvida observou-se que o GIII apresentou pelos túbulos renais. Portanto, doenças valores médios superiores (P<0,05) renais que diminuam a função renal quando comparados com os valores de glomerular são identificadas por GI e GII. Ressalta-se que, os valores de aumentos de creatinina, e creatinina se encontram dentro da posteriormente de uréia (Finco, 1997). normalidade para camundongos (0,5mg/dl) (Tab. 26).

Tabela 26– Valores médios de uréia (mg/dl) e creatinina (mg/dl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. Tempo Uréia (mg/dl) Creatinina (mg/dl) Grupo I Grupo II Grupo III Grupo I Grupo II Grupo III T1h 60,17 Ab 67,67 Aa 64,5 Aa 0,30 Ab 0,47 Aa 0,37 Aa T8h 59,00 Ab 42,33 Bb 48,83 ABb 0,23 Bb 0,38 Abab 0,50 Aa T24h 73,83 Aa 65,17 Aa 61,00 Aab 0,53 Aa 0,18 Ab 0,47 Aa Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não diferem estatisticamente entre os grupos (linhas) e seguidas das mesmas letras minúsculas não diferem estatisticamente entre os tempos (colunas), submetidas à análise de variância e ao teste SNK, com P<0,05.

Gráfico 15- Valores médios de uréia (mg/dl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

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Gráfico 16- Valores médios de e creatinina (mg/dl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Estudos em ratos mostraram que o deposição de proteína nos túbulos renais veneno de escorpiões distribui-se e edema renal por aumento de pressão rapidamente do sangue para os tecidos e hidrostática (Alves et al., 2005). A os rins são os órgãos que apresentam regularidade na excreção de uréia e mais altas concentrações de toxinas creatinina dos camundongos deste cerca de 15 min após a inoculação trabalho evidenciada por suas (Ismail e Abd-Elsalam, 1988; Santana et concentrações séricas normais, al., 1996; Nunan et al., 2003, 2004). indicaram que, os venenos de T. Esses achados são condizentes com fasciolatus e T. serrulatus não alteraram resultados de experimentos e relatos a função renal até 24h após. clínicos de pacientes que apresentaram insuficiência renal aguda, aumento de Na tabela 27 e gráfico 17 estão uréia e ácido úrico, diminuição do expressos os valores séricos de amilase, volume urinário e diminuição da onde se pode observar que não houve excreção de creatinina após alteração nos diferentes tempos dos envenenamentos envolvendo escorpiões grupos estudados, resultados dos gêneros Androctonus , Leiurus , e semelhantes aos de Ribeiro (2008), que Buthus (Ismail e Abd-Elsalam, 1988). estudou o efeito do veneno de T. Quanto ao veneno de T. serrulatus , há serrulatus em cães. relato, em ratos, de congestão e hemorragia renais (Corrêa et al., 1997) e A amilase é uma metaloenzima, aumento da pressão de perfusão, produzida pelo pâncreas exócrino e diminuição da taxa de filtração outros tecidos, cuja função é catalisar a glomerular e do fluxo urinário, hidrólise de amido e glicogênio para

88 formar maltose e glicose. É uma enzima et al., 1996; Cupo et al., 2003; Melo et altamente dependente de cálcio e que al., 2004). Fukuhara et al. (2003, 2004) apresenta meia-vida muito alta, razão relacionaram níveis de cininas pela qual a margem de referência para (bradicinina e calicreína), a produção de suas concentrações plasmáticas é muito citocinas, tais como IL-1, IL-6 e TNF-α ampla. Sua secreção geralmente é e a estimulação hepática de proteínas de aumentada na inflamação do pâncreas, fase aguda, como consequências do que pode ser causada por fatores envenenamento escorpiônico em mecânicos, como obstrução de paciente humanos. Está é uma canalículos, doenças infecciosas, informação relevante, pois o fluxo isquemia, deficiências nutricionais, sanguíneo pancreático pode ser intoxicação pelo zinco e na diminuído por histamina, hipercalcemia (Brobst, 1997; Kramer e prostaglandinas, fator ativador Hoffmann, 1997). No escorpionismo, a plaquetário, radicais livres e cininas, ocorrência de pancreatite é relatada sendo a isquemia é uma das causas de sem, contudo, ser elucidado o seu pancreatite (Brobst, 1997). Apesar de mecanismo. Há indícios de ação direta vários autores observarem uma das neurotoxinas sobre as células hiperamilasemia nos acidentes pancreáticas, da mesma forma que escorpiônicos (El-Asmar, 1984; D’Suze atuam sobre os neurônios, mas suspeita- et al., 2003), nos camundongos deste se também do efeito neurogênico experimento, a regularidade das causado pela hiperestimulação concentrações de amilase indicam que colinérgica do sistema parassimpático não houve estímulo pancreático para o (Sankaran et al., 1983; Possani et al., aumento de sua secreção. 1992; Bucaretchi et al., 1995; Fletcher

Tabela 27- Valores médios de amilase (U/l) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. Amilase (U/l) Tempo Grupo I Grupo II Grupo III T1h 1212,00 Aa 1034,17 Aa 1027,17 Aa T8h 1023,83 Aa 1149,17 Aa 1088,33 Aa T24h 1212,67 Aa 1230,50 Aa 875,83 Ba Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não diferem estatisticamente entre os grupos (linhas) e seguidas das mesmas letras minúsculas não diferem estatisticamente entre os tempos (colunas), submetidas à análise de variância e ao teste SNK, com P<0,05.

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Gráfico 17- Valores médios de amilase (U/l) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Na tabela 28 e gráfico 18 estão os venenos de T. fasciolatus e T. valores médios plasmáticos de glicose serrulatus . dos camundongos após inoculação dos

Tabela 28- Valores médios de glicose (mg/dl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. Glicose (mg/dl) Tempo Grupo I Grupo II Grupo III T1h 126,50 Ab 173,67 Aa 145,33 Aa T8h 190,83 Aa 190,33 Aa 123,00 Ba T24h 165,33 Aab 146,83 Aa 115,67 Aa Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não diferem estatisticamente entre os grupos (linhas) e seguidas das mesmas letras minúsculas não diferem estatisticamente entre os tempos (colunas), submetidas à análise de variância e ao teste SNK, com P<0,05.

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Gráfico 18- Valores médios de glicose (mg/dl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

O veneno de escorpião, além de ter uma ação central, tem também uma Estes resultados diferem de El-Asmar periférica, agindo como substância (1984), Ismail e Abd-Absalam (1988), simpatomimética pós-ganglionar, Murthy e Hase 1994, Yugandhar et al. semelhante à adrenalina, levando então (1999), Bucharetchi et al. (1995) e Cupo a uma produção de hiperglicemia e e Hering (2002), que descreveram que a hipertensão (Freire-Maia e Ferreira, hiperglicemia é o efeito metabólico 1960). mais importante e relacionado a diversas espécies de escorpiões. O efeito do veneno de escorpião no aumento dos níveis de glicose se dá pela Na tabela 29 e gráfico 19 estão os liberação da secreção da insulina no valores médios do cortisol dos pâncreas ou por uma lesão pancreática camundongos, após inoculação dos (D’Suze et al., 2003). Como observado venenos de T. fasciolatus e T. anteriormente, não ocorreu uma lesão serrulatus . pancreática, justificando então a normalidade da concentração de glicose observada na tabela 27.

91

Tabela 29- Valores médios de cortisol (ng/dl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos. Cortisol (ng/dl) Tempo Grupo I Grupo II Grupo III T1h 92,42 Ab 86,59 Ab 61,68 Ba T8h 95,55 Aab 97,55 Aa 66,29 Ba T24h 103,96 Aa 103,23 Aa 67,33 Ba Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas não diferem estatisticamente entre os grupos (linhas) e seguidas das mesmas letras minúsculas não diferem estatisticamente entre os tempos (colunas), submetidas à análise de variância e ao teste SNK, com P<0,05.

Gráfico 19 - Valores médios de cortisol (ng/dl) de camundongos inoculados com PBS (grupo I), veneno de Tityus fasciolatus (grupo II) e Tityus serrulatus (grupo III) em diferentes tempos.

Como observado na tabela 29, não O metabolismo da glicose no organismo houve alteração dos níveis de cortisol é influenciado pelo controle hormonal no grupo III após a inoculação do do cortisol, insulina e glucagon. O veneno de T. serrulatus . No GII, houve cortisol é um glicocorticóide, hormônio aumento significativo dos cortisol em esteróide secretado pelas células das T8h e T24h, e no GI (PBS) em T24h, camadas fasciculada e reticular do quando comparado com T1h. Portanto, córtex da glândula adrenal. O controle como os animais do GI (PBS) se de sua secreção é feito por comportaram de maneira semelhante ao corticotrofina, um hormônio trófico GII, não pode ser atribuído o aumento produzido pela hipófise anterior, por do cortisol à ação do veneno de T. meio de sistema de retroalimentação fasciolatus . negativa em que altos níveis de glicocorticóides inibem a secreção do

92 hormônio hipotalâmico liberador da 5.2. PARTE II – ESTUDO corticotrofina. Esse controle não MOLECULAR mantém constantes os níveis de glicocorticóides, pois os padrões de 5.2.1. Caracterização Molecular sono e atividade sobrepõem-se ao sistema de retroalimentação negativa As toxinas presentes no veneno de para que ocorra o ciclo circadiano, no escorpiões apresentam grande qual as concentrações de similaridade em suas sequências de glicocorticóides sejam diminuídas à aminoácidos, principalmente dentro de noite e aumentem nas primeiras horas um mesmo gênero (Gomez, 1967; da manhã. Outro fator controlado pelo Possani et al., 1982; Sampaio et al., SNC e que eleva os níveis de 1983; Martin-Eauclaire et al., 1985). glicocorticóides é o estresse. O cortisol Portanto, para se obter informações é o mais potente dos glicocorticóides sobre a homologia das sequências produzidos naturalmente. Sua principal gênicas que codificam as toxinas do ação é aumentar a glicemia por meio da veneno do T. fasciolatus , foram indução de gliconeogênese utilizados três pares de iniciadores, pré (Cunningham, 2004). definidos, a partir das sequências de aminoácidos das toxinas do T. O cortisol age sobre o fígado e induz a serrulatus : TsNTxP (Chávez-Olórtegui produção do glicogênio hepático e et al., 1996), TsTx (Coutinho Netto, aumento de glicemia e a produção de 1975) e TsTx-I (Toledo e Neves, 1976). enzimas que catalisam a conversão de aminoácidos em carboidratos. Nos Silvestre et al. (2005) citam que o músculos, inibe a síntese protéica, problema no estudo dos artrópodes é a aumenta o catabolismo de proteínas quantidade restrita de veneno durante a para a liberação de aminoácidos e inibe coleta, devendo, portanto, ser utilizada a a captação de glicose pelos tecidos glândula para a extração de veneno. muscular e adiposo. Tecido muscular e Com a glândula do veneno pode-se usar cérebro não sofrem os efeitos de métodos em biologia molecular para catabólicos dos glicocorticóides. isolamento de toxinas ou a produção de (Rijnberk e Mol, 1997; Kaneko. 1997; proteínas recombinantes reduzindo Cunningham, 2004). assim a utilização dos animais.

Apesar de todos os camundongos dos A genética molecular de toxinas foi grupos II e III, inoculados com os introduzida com o objetivo de facilitar venenos de T. serrulatus e T. fasciolatus as etapas de purificação, identificação e apresentarem piloereção, caracterização necessárias ao estudo e comportamento nociceptivo descritos utilização dos componentes presentes anteriormente, não houve alterações nos venenos em geral. Podem ser significativas dos níveis séricos do realizadas clonagem e caracterização de cortisol. toxinas a partir de biblioteca de cDNA construída da glândula de veneno (Martin-Eauclaire et al., 1992; Guatimosin et al., 1999; Legros et al.,

93

1998) e clonagem e caracterização de Os clones purificados e que continham toxinas a partir do estudo de DNA os fragmentos de interesse foram genômico (Becerril et al., 1993; Corona sequenciados e as sequências obtidas et al., 1996). As bibliotecas de cDNA foram analisadas (Fig. 14). construídas a partir do mRNA são também utilizadas para obtenção de Utilizando os iniciadores oriundos de uma grande variedade de proteínas TsNTxP, observou-se uma grande expressadas (Silvestre, 2005; Borges et semelhança entre a sequência obtida al., 2006; Zhijian et al., 2006). com a da única toxina isolada de T. Entretanto essas técnicas necessitam de fasciolatus neurotoxina 4 (Tf4) (Wagner tempo e material específico para um et al., 2003), apresentando apenas um resultado bom e satisfatório. aminoácido diferente (sublinhado), que pode ser resultado de algum problema Foi realizado a RT-PCR e as amostras no sequenciamento ou uma real foram submetidas à eletroforese em gel modificação (Fig. 14). Os clones de agarose 1%, e posteriormente obtidos a partir dos iniciadores da TsTx coradas com brometo de etídio. As apresentam grande semelhança com a bandas foram cortadas do gel com alfa-toxina Ts IV de T. serrulatus . auxílio de um estilete, colocadas em um Resultado semelhante foi obtido tubo de centrífuga de 1,5ml e utilizando os iniciadores oriundos de purificadas. O resultado da purificação TsTx-1, que apresenta semelhança com foi submetido à eletroforese em gel de a beta neurotoxina TsVII de T. agarose 1% posteriormente corado com serrulatus . Portanto, a metodologia brometo de etídio. usada foi adequada para se obter novas sequências de aminoácidos de toxinas Os DNAs purificados foram inseridos de T. fasciolatus . no plasmídeo pCR2.1 TOPO. A ligação foi transformada em E. coli XL1 Blue Com isso foi obtida a sequência de quimicamente competente. nucleotídeos das novas toxinas de T. Posteriormente, 30 clones foram fasciolatus , embora o N-terminal e o C- escolhidos para purificação do terminal ainda estavam iguais aos da plasmídeo, sendo 10 clones de cada par sequência de T. serrulatus , devido aos de iniciadores. Foi realizada uma PCR iniciadores utilizados. Assim, foi para confirmação da presença dos necessário desenhar novos iniciadores, fragmentos de interesse no vetor de com o objetivo de se obter o N-terminal clonagem. e C-terminal das novas sequências.

94 A CATATGCAGTTCATTTGTAAAGGAATTTCAGTGATGATAAATTTATTTTTTGCCACATTTATTCGT AGCACTGTCCCAAACTGACGCTGAATCTGGAAGCCCGTAGCAGTAACACGCCGGCCACGCGCAATA GCCCGATGATGCCTTTTTCAGTTTGCATTCTTTATCGCAGTATCCCACACCTGTAAAAAAACAAGT AACTTTGCAACCTTTGGAATCCGCTGGATAACCTTCTTTGCCTCCTACGACAATGTCGATCAGCAA

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Figura 14 – Sequenciamento e analise das sequências. Em A, B e C, sequências obtidas no MegaBase semelhante a TsNTxP, TsIV e TsVII com resultado da análise no Blastx.

Para desenhar os novos iniciadores, do mRNA das toxinas de T. serrulatus utilizou-se a sequência de nucleotídeos (já descritos), que contém outras

95 sequências (peptídeo sinal, regiões não- iniciadores contêm a sequência traduzidas e aquelas que sofrem imediatamente anterior e posterior à modificações pós-traducionais), além sequência da proteína completa de daquela que é traduzida como a proteína Tityus fasciolatus (Fig. 15, 16 e 17). completa. Deste modo, os novos

TS TCG ATC TGA ACG TCG ATC TGA ACG ATG AAA CGA ATG ATC TTG TTT ATT AGC T CAT ATG GC TTA TTG CTG

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Figura 15: Alinhamento da sequência de nucleotídeos de toxinas de Tityus serrulatus e Tityus fasciolatus para obtenção de novos iniciadores. Em preto, a sequência de DNA correspondente ao mRNA da toxina TsNTxP de Tityus serrulatus (AF039599 ) (Chávez-Olórtegui et al., 1997) e em azul a sequência de nucleotídeos de Tityus fasciolatus . Em amarelo, a sequência escolhida para desenho dos iniciadores. Em lilás o sítio de restrição da enzima (NdeI). B: Desenho dos iniciadores. C: Sequência de nucleotídeos de mRNA da toxina TsNTxP de Tityus serrulatus. TS: Tityus serrulatus e TF : Tityus fasciolatus .

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96

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97

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Figura 17: Alinhamento da sequência de nucleotídeos de toxinas de Tityus serrulatus e Tityus fasciolatus para obtenção de novos iniciadores. Em preto a sequência de DNA correspondente ao mRNA da toxina TsVII de Tityus serrulatus (S69808 ) (Martin-Eauclaire et al., 1992) e em azul a sequência de nucleotídeos de Tityus fasciolatus . Em amarelo a sequência escolhida para desenho dos iniciadores. Em lilás, o sítio de restrição da enzima (NdeI). B: Desenho dos iniciadores. C: Sequência de nucleotídeos de mRNA da toxina TsVII de Tityus serrulatus. TS: Tityus serrulatus e TF : Tityus fasciolatus .

Com os novos iniciadores prontos foi Após a realização do RT-PCR, realizado novamente todo o purificação do DNA a partir do gel de procedimento anterior a partir da agarose, ligação do produto purificado extração e purificação do RNA da no vetor de clonagem e transformação glândula de veneno. Foi utilizada a química, os plasmídeos foram mesma metodologia anterior descrita no purificados e o DNA analisados em gel material e métodos desta tese. de agarose 1% para quantificação.

As sequências de DNA foram chamadas Os clones purificados foram de: Tf1, sequência homóloga a TsVII; sequenciados e as sequências das Tf3, sequência homologa a TsIV e Tf4a, toxinas obtidas foram analisadas (Fig. a sequência homologa a TsNTxP e Tf4 18). purificada por Wagner et al. (2003).

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Figura 18- Resultado do segundo sequenciamento. Em A, sequência de aminoácidos obtida no MegaBase semelhante a TsNTxP com resultado da análise no Blastx. Em B sequências de aminoácidos obtidas no MegaBase semelhante a TsVII com resultado da análise no Blastx e em C sequências de aminoácidos obtidas no MegaBase semelhante a TsVII com resultado da análise no Blastx.

99

Posteriormente as sequências foram alinhadas com o uso do programa DNA- star e analisadas (Fig. 19, 20 e 21).

10 20 30 40 50 Tco_gamma -KEGY AM DHEGCKLSCFI RPSGYCGRECGY KK GSSGYC-AWPA CYCYG LP NWV KVW ERAT 58 Tf1 -KEGY LM DHEGCKLSCFI RPSGYCGRECAI KK GSSGYC-AWPA CYCYG LP NWV KVW ERAT 58 Ts1 -KEGY LM DHEGCKLSCFI RPSGYCGRECGIKK GSSGYC-AWPA CYCYG LP NWV KVW DRAT 58 Tst_gamma GKEGY LM DHEGCKLSCFI RPSGYCGRECTLKK GSSGYC-AWPA CYCYG LP NWV KVW DRAT 59 Tb_gamma -KEGY LM DHEGCKLSCFI RPSGYCGS ECKIKK GSSGYC-AWPA CYCYG LP NWV KVW DRAT 58 Tz1 -KDGY LV GN DGCKYSCFTRPGTYCANECSRVKGKDGYCYAWMA CYCYS MP NWV KTWDRAT 59 * ** *** *** ** ** ** ** *** ** ***** ***** * ***

Tco_gamma NRCGKK - 64 Tf1 NRCGKK - 64 Ts1 NKCGKK - 64 Tst_gamma NKCGKK - 65 Tb_gamma NKCGKK - 64 Tz1 NRCGRGK 66 * ** Figura 19- Alinhamento da sequência de aminoácidos da toxina de Tityus fasciolatus (Tf1) com outras toxinas do tipo beta de escorpiões do gênero Tityus . Aminoácidos básicos estão em rosa, aminoácidos ácidos estão em azul, aminoácidos pequenos, hidrofóbicos e aromáticos estão em vermelho e os aminoácidos amino e hidroxil estão em verde. Espécies e o código de acesso das toxinas são: Tco_gamma ( Tityus costatus -Q5G8B8), Ts1 ( Tityus serrulatus -P15226), Tst_gamma (Tityus stigmurus -P56612), Tb_gamma ( Tityus bahiensis -P56611) e Tz1 ( Tityus zulianus -Q2NME3). Sequências obtidas de Swiss-Prot Database. As cisteinas estão indicadas em amarelo. Os aminoácidos homólogos em todas as sequências estão indicados por (*).

10 20 30 40 50 TbTx5 KK DGY PV EGDNCAFV CFGY DNAYCDKLCKDKK ADSGYCYWV HIL CYCYG LP D--- KEPTK 57 Tf3 KK DGY PV EGDNCAFV CFGY DNAYCDKLCKDKK ADSGYCYWV HIL CYCYG LP D--- KEPTK 57 Ts3 KK DGY PV EYDNCAYICWNY DNAYCDKLCKDKK ADSGYCYWV HIL CYCYG LP D--- SEPTK 57 Ts5 KK DGY PV EGDNCAFA CFGY DNAYCDKLCKDKK ADD GYCVW S-PDCYCYG LP EHIL KEPTK 59 CsE5 KK DGY PV DSGNCKYECLKDD -- YCNDLCLERK ADKGYCYWGKVSCYCYG LP D--- NS PTK 55 Kurtoxin KIDGY PV DYWNCKR ICW-YNN KYCNDLCKGLKADSGYCWGWTLSCYCQG LP D--- NARIK 56 * ***** ** * ** ** *** *** *** *** * 60 TbTx5 TNG RCKPGKK 67 Tf3 TNG RCKPGKK 67 Ts3 TNG KCKSG KK 67 Ts5 TSG RC----- 64 CsE5 TSG KCNPA -- 63 Kurtoxin RSG RCRA--- 63 * * Figura 20- Alinhamento da sequência de aminoácidos da toxina de Tityus fasciolatus (Tf3) com outras toxinas de escorpiões. Aminoácidos básicos estão em rosa, aminoácidos ácidos estão em azul, aminoácidos pequenos, hidrofóbicos e aromáticos estão em vermelho e os aminoácidos amino e hidroxil estão em verde. Nome das toxinas e o código de acesso são: TbTx5 ( Tityus bahiensis - POC5K8), Ts3 ( Tityus serrulatus - P01496), Ts5 ( Tityus serrulatus - P46115), CsE5 ( Centruroides sculpturatus - P46066), Kurtoxin ( Parabuthus transvalicus - P58910). Sequências obtidas de Swiss- Prot Database. As cisteinas estão indicadas em amarelo. Os aminoácidos homólogos em todas as sequências estão indicados por (*).

10 20 30 40 50 Tf4 GKEGY PA DSKGCKVTCFF TG VGYCDTECKLKK ASSGYCAWPA CYCYG LP DSASVW DSATN 60 Tf4a GKEGY PA DSKGCKVTCFF TG VGYCDKECKLKK ASSGYCAWPA CYCYG LP DSASVW DSATN 60 TbIT_1 GKEGY PV DSRGCKVTCFF TG AGYCDKECKLKK ASSGYCAWPA CYCYG LP DSVPV YDNASN 60 TcoNTxP1 GKEGY PA DSKGCKVTCFL TAA GYCNT ECKLQKASSGYCAWPA CYCYG LP DSASVW DSATN 60 Ts6 GREGY PA DSKGCKITCFL TAA GYCNT ECTLKK GSSGYCAWPA CYCYG LP ESVKIW TS ETN 60 TsNTxP GREGY PA DSKGCKITCFL TAA GYCNT ECTLKK GSSGYCAWPA CYCYG LP DSVKIW TS ETN 60 * **** ** *** *** * *** ** * * **************** * *

Tf4 KC--- 62 Tf4a KCGKK 65 TbIT_1 KCB-- 63 TcoNTxP1 KCGKK 65 Ts6 KC--- 62 TsNTxP KCGKK 65 **

Figura 21- Alinhamento da sequência de aminoácidos da toxina de Tityus fasciolatus (Tf4a) com outras toxinas de escorpiões do gênero Tityus . Aminoácidos básicos estão em rosa, aminoácidos ácidos estão em azul, aminoácidos pequenos, hidrofóbicos e aromáticos estão em vermelho e os aminoácidos amino e hidroxil estão em verde. Nome das toxinas e o código de acesso são: Tf4 (Tityus fasciolatus - P83435), TbIT_1 ( Tityus bahiensis - P60275), TcoNTxP1 ( Tityus costatus - Q5G8A8), Ts6 ( Tityus serrulatus - P45669), TsNTxP ( Tityus serrulatus - 077463). Sequências obtidas de Swiss-Prot Database. As cistéinas estão indicadas em amarelo. Os aminoácidos homólogos em todas as sequências estão indicados por (*).

Com o intuito de se obter novas toxinas que abrem e fecham os canais sequências de nucleotídeos de toxinas de sódio, também chamadas de α e β do veneno do escorpião Tityus toxinas, foram primeiramente estudadas fasciolatus e assim um estudo molecular e hoje em dia são bem conhecidas do DNA que codifica as toxinas, foi (Pimenta et al., 2002). utilizado nesse trabalho um estudo a partir da glândula de veneno e o cDNA Possani et al. (1992) descreveram que o foi sintetizado por meio de um RT-PCR veneno de T. serrulatus contém pelo utilizando iniciadores de T. serrulatus. menos três principais peptídeos; As toxinas escolhidas foram a TsVII, a gamma, III-8 e IV-5. Outros autores TsIV e a TsNTxP, todas elas são toxinas chegaram à mesma conclusão (Sampaio classificadas por agirem em canais de et al., 1983, 1991), entretanto, Bechis et sódio, apesar de ainda não ter sido al. (1984) e Martin-Eaucaire et al. provado que a TsNTxP se ligue neste (1992) estudando as mesmas toxinas, canal. observaram diferenças nas sequências das mesmas e as nomearam como O veneno de escorpiões é uma mistura toxina VII (gamma), toxina IV (toxina rica em peptídeos nocivos com baixo IV-5) e toxina II (toxina III-8). Alguns peso molecular, que afetam os canais autores sugerem que a toxina IV-5 seja iônicos alterando a permeabilidade das a tityustoxina (Martin-Euclaire et al., células excitáveis. São descritas quatro 1994), entretanto outros sugerem que a famílias de toxinas, com ação nos toxina IV-5 seja uma componente da canais de sódio, potássio, cloro e cálcio tityustoxina (Possani et al., 1981; (Possani, 1984; Vega e Possani, 2005). Sampaio et al., 1983). Toxina gamma Devido à sua grande letalidade, as ou VII é uma β-toxina e a toxina IV ou

101

IV-5 é uma α-toxina (Becerril et al., homólogas a outras já descritas 1997). pertencentes a escorpiões de um mesmo gênero. Chavez-Olórtegui et al. (1996) purificaram e sequenciaram um No caso da Tf4a, ao verificar as peptídeo nomeado de proteína não- diferenças no alinhamento (Fig. 20) tóxica (TsNTxP), que contêm uma observa-se apenas a diferença de um glicina adicional no C-terminal e um aminoácido (posição 26), onde há uma ácido aspartâmico no lugar do ácido lisina (K) no lugar de treonina (T). Essa glutâmico na posição 50. lisina também é verificada na sequência da toxina de T. bahiensis (TbIt-1), As toxinas TsNTxP, toxina IV-5 e a sugerindo-se que a Tf4a seja uma toxina VII têm grande importância nos isoforma de Tf4. estudos científicos tanto para produção de soro como importância médica, elas Encontrar isoformas das principais apresentam similaridade funcional pela toxinas de escorpião é um fato bastante modificação da permeabilidade dos comum. A análise de sequências das canais de sódio das células excitáveis isoformas tem mostrado que muitas (Becerril et al, 1997). delas ocorrem por substituição, depleção e inserção ao nível de DNA Além da importância das três toxinas genômico. Cerca de 20 anos atrás o selecionadas, outro fator que grupo de Rochat’z encontrou variação influenciou nesta escolha, foi o fato de de polimorfismo e quantitativa de toxinas homólogas a estas toxinas de T. toxinas do escorpião Androctunus serrulatus já terem sido descritas em australis (Zhijian et al., 2006). outros escorpiões do gênero Tityus (Batista et al., 2007). Homologia na Treze toxinas do escorpião sequência de toxinas de escorpião é Centruroides exilicauda foram obtidas comum dentro de um mesmo gênero, da glândula de veneno. A sequência de como já foi bem descrito para o gênero 13 peptídeos deduzidas de cDNA são Centruroides (Gao et al., 2008). altamente homólogas umas com as outras e são possivelmente resultado de Analisando as figuras 19, 20 e 21, pode- um polimorfismo (Valdez-Cruz et al., se confirmar esta homologia. A toxina 2007). Tf1 tem 60% de similaridade com outras toxinas do tipo beta de escorpiões A kurtoxina de Parabuthus transvalicus do gênero Tityus , a Tf3 tem 42% é uma toxina rara, pois age em canais de similaridade com outras do tipo alfa de sódio e de cálcio e apresenta escorpiões do mesmo gênero e a Tf4a similaridade de sequência de tem 63% de similaridade com as aminoácidos com as toxinas que agem proteínas não-tóxicas. em canais de sódio do tipo alfa (Possani et al., 2000). A existência desta toxina Portanto, neste trabalho, descreveu-se demonstra que pode haver outras que uma nova metodologia útil para se obter agem em mais de um tipo de canal sequência de nucleotídeos de toxinas iônico. E sua semelhança com a Tf3

102 pode indicar que esta toxina também são elas que definem a região da toxina tem a mesma ação e novos que é estabilizada pelas pontes experimentos devem ser realizados para dissulfeto. comprovar esta hipótese. Todas as toxinas de escorpião têm uma A nova metodologia descrita neste estrutura semelhante, formada por uma trabalho também possibilita a obtenção α-hélice e três fitas β-folhas, que são da sequência genômica das toxinas mantidas por dois pares de pontes homólogas obtidas. Uma vez conhecida dissulfeto feitas entre duas sequências à sequência de nucleotídeos das novas constantes de Cys-X-X-Cys na região α- toxinas pode-se usá-la para a construção hélice e Cys-X-Cys na região β-folha, de sondas para serem utilizadas em onde X é um aminoácido variável bibliotecas genômicas. A sequência (Couraud et al., 1982; Becerril et al, genômica é importante para melhorar o 1997). As outras duas pontes estudo molecular de um veneno, estabilizam o N- e o C-Terminal das trazendo novas informações valiosas. toxinas.

Martin-Eauclaire et al. (1992) A proximidade na árvore filogenética e descreveram que a sequência da toxina as regiões de cisteínas que são gama (toxina VII) é sintetizada por um encontradas nas toxinas de escorpiões precursor de 84 aminoácidos, peptídeo sugerem que a variabilidade dos sinal de 20 aminoácidos e três peptídeos dos venenos de escorpião carboxilas (COOH), as quais são envolva um ancestral comum (Possani removidas pós-tradução. et al., 2000). Zhijian et al., 2006 também sugerem que, todos os No final das sequências três peptídeos do veneno de escorpião com aminoácidos (GKK) são removidos pós- funções divergentes podem estar tradução (Fig. 19, 20 e 21). Esse fato envolvidos com um gene ancestral também foi observado por Possani et al. comum através de mecanismos como (2000) que estudaram mais de 202 polimorfismo, duplicação gênica, trans- sequências obtidas de 30 diferentes ligação ou ligação alternativa. espécies de escorpiões, 27 da família Buthidae e três da família Scorpionidae. A rica biodiversidade de peptídeos existente devido à função biológica que Os genes que codificam as toxinas de eles exercem. Alguns caminhos Tityus são apresentados na forma de metabólicos e componentes não dois exons interrompidos por um intron. funcionais são eliminados por seleção O intron interrompe a região que natural. Alguns peptídeos de escorpião codifica o peptídeo sinal (Becerril et al., não apresentam função comprovada, 1997). podendo ser talvez devido a nossa falta de pesquisa e estudo, por ainda não Outro ponto que se pode são as posições saber qual a molécula alvo que eles conservadas dos resíduos de cisteínas foram selecionados (Possani et al., observar (Figuras 19, 20 e 21). As oito 2000). Da mesma forma muitas funções cisteínas estão marcadas em amarelo e dos componentes do veneno de

103 escorpião têm sido estudadas. Portanto, também várias bandas de proteínas com muitos estudos ainda são necessários, diferentes pesos moleculares (Fig. 23). nesse sentido. O veneno de escorpiões é letal para 5.3. PARTE III – ESTUDO vertebrados através da ação de toxinas IMUNOLÓGICO de cadeia longas (6-8 kDa) e curta (3-4 kDa), que afetam principalmente os 5.3.1. SDS-PAGE e Western Blotting canais de sódio e potássio (Borges et al., 2008). Observou-se uma grande Alguns testes imuno diagnósticos são quantidade de proteínas abaixo de utilizados para identificar e quantificar 15kDa em ambos os venenos, os antígenos tóxicos no sangue das confirmando assim a presença das vitimas picadas por animais proteínas letais de baixo peso peçonhentos (Lima et al., 1993). Esses molecular. testes também podem ser utilizados para o conhecimento dos componentes Além das toxinas que agem em canais protéicos (Kalapothakis et al., 2001) do iônicos, existem outras proteínas de veneno, como foi utilizado neste baixo peso molecular presentes no experimento. veneno de escorpiões. A classe das serino-proteases é a mais estudada, A toxicidade do veneno dos escorpiões possuindo as enzimas melhor da família Buthidae se deve às proteínas caracterizadas e as mais versáteis neurotóxicas de baixo peso molecular fisiologicamente. Essas enzimas têm a presentes em pouca quantidade no massa molecular relativamente pequena veneno total (Delori et al., 1981). Por entre 12 a 15 kDa, e já foram isso, estas são as mais estudadas e mais encontradas em venenos de escorpiões bem caracterizadas. (Schwartz et al., 2007). Gao et al. (2008) descreveram uma proteína tipo A caracterização bioquímica do veneno serino protease com 33kDa. de T. fasciolatus e T. serrulatus teve início com o perfil obtido através de O veneno de T. fasciolatus mostrou SDS-PAGE corado com Azul de bandas similares ao veneno de T. Coomassie (Fig. 22). Para essa análise serrulatus na região das toxinas letais foram aplicadas 8µg de veneno de T. (abaixo de 6kDa). Os principais fasciolatus e 28µg do veneno de T. componentes desses se encontram nessa serrulatus. Pode-se observar a presença região. Esses resultados foram de várias bandas de proteínas com semelhantes aos resultados encontrados diferentes pesos moleculares no veneno por Borges et al. (2008), que de T. serrulatus. Para uma melhor observaram que, os componentes interpretação, foi realizado outro SDS- principais do veneno de T. zulianus, T. PAGE com veneno bruto de Tityus funestus, T. discrepans e a toxina fasciolatus com a mesma concentração TsVIII de T. serrulatus também se de veneno que foi utilizada para o encontram na mesma região. Tityus serrulatus onde se observa

104 Em ambos os venenos encontram-se Outra enzima também encontrada no bandas de aproximadamente 30-40kDa veneno de escorpiões é a lisozima que (Fig. 22 e 23). Nishikawa et al. (1994) possui um peso molecular de relataram uma quantidade maior de aproximadamente 30kDa (Batista et al., proteína com peso molecular de 30kDa 2007). e demonstraram que as espécies mais tóxicas, T. serrulatus¸ T. bahiensis, T. Pode-se notar que ambos os perfis stigmurus e T. costatus, possuem protéicos apresentaram duas bandas componentes com reação antigênica fortes de peso molecular de cruzada. aproximadamente 40kDa e 80kDa. A hialuronidase é uma proteína já As fosfolipases são enzimas compostas encontrada no veneno de escorpiões por duas subunidades, sendo que o (Possani et al., 1992). Já foram relatadas heterodímero é ligado por pontes hialuronidases de escorpiões com peso dissulfetos; são amplamente relatadas molecular entre 40-50kDa (Pessini et nos venenos de serpentes e apresentam al., 2001; Morey et al., 2006; Batista et um peso molecular de aproximadamente al., 2007) e com 80-100kDa (Possani et 30 kDa. Elas possuem ação citotóxica, al., 1977; Ramanaiah et al., 1990). A neurotóxica, miotóxica, causam edema hialuronidase pode contribuir para e distúrbios na coagulação sanguínea. toxicidade do veneno e ajudar a Recentemente, pesquisadores distribuir as toxinas pelos tecidos. encontraram fosfolipases no veneno de escorpiões; elas também são Na figura 22, nota-se que o veneno de heterodímeros ligadas por pontes T. serrulatus apresenta fracas bandas de dissulfeto, mas parece que são um aproximadamente 25kDa. Zouari et al. pouco menores (20 kDa) do que as (2007) relataram uma nova classe de encontradas nos venenos de serpentes proteínas de peso molecular de 25- (Conde et al., 1999; Valdez-Cruz et al., 28kDa, que foram chamadas de lipases 2007; Schwartz et al., 2007, 2008). digestivas de escorpião.

105

1 1 2 2 3 kDa

220

80 60 50 40

30 25

20

15

10

Figura 22- SDS-PAGE dos principais componentes do veneno de Tityus fasciolatus e Tityus serrulatus . 1= Veneno bruto de Tityus serrulatus (28µg de proteína) 2=Veneno bruto de Tityus fasciolatus (8µg) 3= Padrão de tamanho molecular Bench-Marck TM protein Ladder (10-220 kDa), Invitrogen.

Antes de se instituir um protocolo de de escorpiões do gênero de Tityus têm terapia para o acidente escorpiônico sido realizados (Borges et al., 2004, deve-se pesquisar a composição, 2006, 2008). Esses estudos sugerem a imunogenicidade e toxicidade do existência de variadas regiões (espécie- veneno (Nishikawa et al.; 1994). específicas) dos epitopos neutralizantes das toxinas de do gênero Tityus da Vários estudos de testes de América do Sul que agem nos canais de soroneutralização com algumas espécies sódio (Borges et al., 2008).

106 1 2 kDa

220 160 120 100 90 80 70 60

50

40

30

25

20

Figura 23- SDS-PAGE dos principais componentes do veneno de Tityus fasciolatus . Canaleta 1= Padrão de tamanho molecular Bench Marck Protein Ladder, Invitrogen, canaleta 2=Veneno bruto de Tityus fasciolatus (28µg)

Nesse estudo, a reatividade antigênica no veneno de T. serrulatus , proteínas cruzada entre os venenos de T. essas com o peso de 6,0; 25,9; 37,1; fasciolatus e T. serrulatus foi 64,2; 115,5 e 181,8 kDa. demonstrada no ensaio de Western Blotting, no qual o antiveneno de T. Na Fig. 24B, o soro anti-T. serrulatus , serrulatus reconheceu as toxinas de T. diluído 1:10000 reconheceu algumas fasciolatus como apresentado na Fig. proteínas no veneno de T. fasciolatus : 24. proteínas com 6,0; 25,9; 37,1; 64,2 kDa. Entretanto, o mesmo soro reconheceu Também, foi vista uma forte reatividade várias toxinas no veneno de T. cruzada com os componentes de serrulatus . tamanho molecular de aproximadamente 6kDa, em ambos os As únicas proteínas do veneno de T. venenos. fasciolatus no ensaio de Western blotting que também aparecem no SDS- Como apresentado na Fig. 24A, o soro PAGE são as toxinas que estão com anti-T. fasciolatus diluído 1:5000 aproximadamente 10 kDa e 80 kDa, reconheceu várias proteínas presente no mas isso pode ser devido a pouca veneno de T. fasciolatus . As proteínas quantidade de veneno aplicada no gel. se encontram nos tamanhos moleculares Quando se analisa cuidadosamente o de 6,0; 25,9; 37,1; 64,2 e 115,5 kDa. O gel, pode-se verificar outras bandas bem mesmo soro reconheceu mais proteínas fracas de aproximadamente 20, 30 e 50

107 kDa. Já no veneno de T. serrulatus, as mesmo quando inoculados em pequenas proteínas com tamanho molecular de quantidades. aproximadamente 10, 40, 60 e 70 aparecem também no SDS-PAGE. Borges et al. (2008) realizaram um estudo de comparação entre as Lima et al. (1993) demonstraram que há propriedades antigênicas e funcionais e reação cruzada entre toxinas do mesmo a composição eletroforética dos venenos escorpião. Nishikawa et al. (1994) de escorpiões do gênero Tityus da observaram que a grande taxa de reação Venezuela e do Brasil (reação cruzada), cruzada entre os antígenos presentes nos onde observaram que todas as espécies venenos de Tityus serrulatus e Tityus estudadas apresentaram reação cruzada bahiensis se deve aos componentes com anticorpos contra o veneno total de elevada imunogenicidade, que T. serrulatus em vários graus. estimulam alta produção de anticorpos,

kDa 1 2 3 2 3 181.8 115.5 82.2 64.2 48.8 37.1

25.9

19.4

14.8

6.0

A B Figura 24- Identificação da antigenicidade por Western blotting entre os componentes presente no veneno de Tityus fasciolatus e Tityus serrulatus . 1= Padrão de peso molecular Bench Marck Prestain Protein Ladder-Invitrogen. 2= Veneno bruto de Tityus fasciolatus . 3= Veneno bruto de Tityus serrulatus . A= soro anti-T. fasciolatus 1:5000, B= contra soro anti-T. serrulatus 1:10000.

Vários pesquisadores têm realizado O número de sítios antigênicos entre as estudos fazendo comparação entre toxinas homólogas é importante, bem proteínas e suas sequências de como suas sequências de aminoácidos o aminoácidos e têm mostrado grande estabelecimento de uma possível correlação entre o grau de diferentes correlação entre substituições e sequências e o de diferença antigênica. diminuição do número de sítios

108 antigênicos comuns. Assim se tem um como camundongos, coelhos e ovelhas, melhor entendimento sobre a ligação para a produção de antivenenos contra o dos sítios antigênicos no mecanismo de veneno total de Tityus serrulatus, neutralização, qual a relação entre os comparando a habilidade da toxina sítios antigênicos e sítios TsNTxP e a TsNTxP recombinante na farmacológicos das toxinas e qual a geração de anticorpos neutralizantes. importância da seleção de peptídeos Assim, revelou um padrão específico de para síntese de vacinas. Estudos com reconhecimento do peptídeo pelos anticorpos marcados em microscopia anticorpos gerados em cada animal, eletrônica permitiram visualizar que a além de haver diferença entre os ação de um ou mais sítios antigênicos imunógenos de TsNTxP e a proteína provavelmente não interferem com a recombinante, devido à diferença na ligação da toxina no receptor (Ayeb e conformação da estrutura secundária e Delori, 1984). terciária da proteína. Esses autores concluíram também que, a ovelha é o As espécies pertencentes ao gênero modelo animal mais eficaz para Tityus são altamente diversas do ponto produção de anticorpos anti-Tityus de vista de antigenicidade dos serrulatus, e os anticorpos produzidos componentes do veneno. O mecanismo em cada modelo animal podem dessa diversidade antigênica entre as identificar alvos diferentes presentes nas espécies do gênero Tityus ainda não está toxinas do veneno total e/ou diferentes muito clara, mas isso não pode ser epitopos de uma toxina individual. explicado apenas pela distância geográfica entre os habitats (Borges et 5.3.2. Soroneutralização in vivo al., 2008). Com o intuito de observar a capacidade A relevância da diversidade taxonômica do soro antiescorpiônico (anti-T. é influenciada pelas diferenças da serrulatus ) de neutralizar os efeitos atividade, composição e/ou letais do veneno de T. fasciolatus, foi antigenicidade entre as toxinas de realizado um teste de soroneutralização espécies de importância medicamentosa in vivo. (Borges et al., 2008). Entretanto há a necessidade de pesquisa dos venenos Para o cálculo da dose utilizada no das espécies do gênero Tityus através de procedimento de soroneutralização, no estudos sobre suas proteínas, grupo utilizando veneno de T. componentes semelhantes e epitopos fasciolatus foi levada em consideração a específicos para o estudo da maior dose da DL 50 onde morreram similaridade entre eles e assim chegar todos os animais há uma melhor terapia. (134,2µg/camundongo). Para o cálculo da dose utilizada com o veneno de T. Nesse trabalho, foram produzidos serrulatus (52,65µg/camundongo) anticorpos anti-T. fasciolatus e anti-.T. utilizou-se raciocínio semelhante, ou serrulatus utilizando a ovelha para seja, 2,25DL 50 de T. serrulatus imunização. Mendes et al. (2004) (23,4µg/camundongo). estudaram diferentes modelos animais,

109

Para a realização da soroneutralização incubados durante uma hora a 37 oC. Os foi utilizada a via subcutânea, pois é a ensaios foram realizados com 100 e que mais mimetiza a via natural da 200µl de soro antiescorpiônico no grupo picada do escorpião. Mendes et al. com o veneno de T. fasciolatus e no (2008) utilizaram a mesma via também grupo com o veneno de T. serrulatus . com o intuito de se aproximar da forma mais natural. Após 48 horas, foi verificada a sobrevivência dos animais inoculados. O soro anti -T. serrulatus juntamente Os resultados estão no quadro 3 abaixo. com o veneno foram posteriormente

Quadro 3- Resultados da soroneutralização in vivo. Grupos Descrição Sobrevivência % G1 134,2µg veneno T. fasciolatus +100µl soro anti-T. 1/2 50 serrulatus G1b 134,2µg veneno T. fasciolatus +100µl PBS 0/2 0 G2 134,2µg veneno T. fasciolatus +200µl soro anti- 2/2 100 T.serrulatus G2b 134,2µg veneno T. fasciolatus +200µl PBS 0/2 0 G3 52,65µg veneno T.serrulatus +100µl soro anti-T. 2/2 100 serrulatus G3b 52,65µg veneno T.serrulatus +100µl PBS 0/2 0 G4 52,65µg veneno T. serrulatus +200µl soro anti- 2/2 100 T.serrulatus G4b 52,65µg veneno T. serrulatus +200µl PBS 0/2 0 G5 100µl de soro anti-T. serrulatus 2/2 100 G5b 200µl de soro anti-T. serrulatus 2/2 100

Todos os animais dos grupos onde se que um deles veio a óbito utilizou PBS (1b, 2b, 3b e 4b) aproximadamente após 90 minutos. O apresentaram os sintomas clássicos do outro animal ficou prostrado nas horas envenenamento, como dor local seguintes e sobreviveu após as 48 horas. imediata e intensa, prurido na região do focinho, forte dispnéia, rinorréia e No grupo 2, onde foi utilizado veneno agitação como citado na literatura (Dias de T. fasciolatus e 200µl do soro anti-T. et al., 2001; Pardal et al., 2003; Ribeiro, serrulatus ocorreu 100% de 2008), vindo a óbito em torno de 30 sobrevivência. minutos após a inoculação. Administração do soro anti-T. Os animais do grupo 1 que receberam serrulatus pode prevenir efetivamente a veneno de T. fasciolatus e 100µl de soro morte em indivíduos picados por anti-T. serrulatus também apresentaram escorpião, mas sua ação depende da os sintomas do envenenamento, sendo qualidade do soro e do tempo de

110 administração com melhores resultados antiveneno em doses corretas é eficaz ocorrendo quando administrado dentro na redução da mortalidade das vitimas. das três horas após o acidente (Santana et al., 1996; Maria et al., 2005; Mendes Foi observada a proteção cruzada dos et al., 2007). Observou-se nesta soros antiescorpiônicos, mas, ainda não pesquisa que a dose de 200µl de soro está claramente demonstrado se antiescorpiônico foi capaz de neutralizar qualquer antiveneno é eficaz na os efeitos da dose de 134,2µg de veneno neutralização de um grande número de de Tityus fasciolatus (dose máxima letal diferentes venenos de uma mesma do estudo da DL 50 ). espécie (Delori et al, 1981).

Nos grupos 3 e 4, onde foi utilizado Nishikawa et al. (1994) concluíram que veneno de Tityus serrulatus e 100 e um antiveneno monovalente contra um 200µl de soro anti-T. serrulatus, dos dois mais perigosos escorpiões respectivamente, ocorreu 100% de (Tityus serrulatus ou Tityus bahiensis ) sobrevivência. Uma ampola do soro pode ser usado como terapia nos produzida pela FUNED é capaz de acidentes nos acidentes escorpiônicos. neutralizar 5mg do veneno do escorpião Tityus serrulatus (1mg/1ml) 31 . Mendes et al. (2004) demonstraram que a proteína não tóxica TsNTxP e a No passado, a soroterapia sempre teve TsNTxP-recombinante podem elevar o bons resultados nos acidentes com título de anticorpos circulantes o serpentes e aranhas, mas no caso de suficiente para neutralizar os efeitos escorpiões, a eficácia era questionada tóxicos do veneno bruto. devido à viabilidade de outros tratamentos (Ismail, 1995). Atualmente, Ozkan et al. (2008) observaram o poder o papel dos antivenenos no tratamento neutralizante de 400µl de antiveneno de escorpiônico ainda permanece Androctonus crassicauda contra 40 controverso e sua eficiência depende de doses letais mínimas (DLM) do sua potência (Ozkan et al., 2008). escorpião Androctonus crassicauda e 10 Porém, muito autores consideram que o DLM de Leiurus quinquestriatus. tratamento específico no envenenamento escorpiônico é a 6. CONCLUSÕES utilização do antiveneno (Freire-Maia e Campos, 1987; Hassan, 1984). Outros, A DL 50 do veneno de T. fasciolatus para entretanto, questionam a eficácia deste camundongo foi de 59,65µg por contra a prevenção e tratamento para as camundongo. manifestações cardiovasculares (Gueron e Ovsyshcher, 1987; Gueron et al., O veneno do escorpião T. fasciolatus 1992). Ismail, (1994) concluiu que a causou congestão e hemorragias no soroterapia na SEE, utilizando um coração, pulmão e cérebro dos camundongos. 31 www.funed.mg.gov.br/produtos_servicos/imu nobiologicos/bulas/Bula_Soro_Antiescorpionic Após administração de 24µg de veneno o_ver.04.pdf de T. fasciolatus , os camundongos

111 apresentaram piloereção, 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS comportamento nociceptivo, secreção nasal e oral acentuada, dispnéia, prurido O conhecimento dos efeitos tóxicos do na face e reflexos exacerbados, veneno de T. fasciolatus fornece policitemia, leucocitose com linfocitose informações básicas para estudos e aumento da porcentagem de CK-MB. futuros, tanto na área de fisiologia como na área clínica. O perfil protéico do veneno de T. fasciolatus mostrou similaridade ao As novas sequências de proteínas de veneno de T. serrulatus. Tityus fasciolatus podem servir de instrumentos de estudos futuros com a Ocorreram reatividade e neutralização obtenção de proteínas recombinantes. cruzadas entre os venenos de T. fasciolatus e T. serrulatus. Os resultados descritos neste trabalho reforçam a importância deste tipo de Foram isolados e obtidos clones estudo na geração de novos contendo sequências correspondentes conhecimentos, o que possibilitou o aos transcritos de mRNA presentes na conhecimento do veneno do escorpião glândula de veneno de T. fasciolatus , T. fasciolatus bem como alternativa na identificados como Tf1, Tf3 e Tf4a. geração de novos produtos.

O veneno de Tityus fasciolatus possui moderadas toxicidade e letalidade e o soro anti-T. serrulatus é capaz de neutralizar o veneno de T. fasciolatus no estudo in vivo.

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9.ANEXO

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