Tityus Serrulatus

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Expressão Heteróloga e Purificação da Tityustoxina: Obtenção da proteína recombinante Ts3 do escorpião Tityus serrulatus ORIENTADO: Anderson Oliveira do Carmo ORIENTADOR: Prof. Dr. Evanguedes Kalapothakis BELO HORIZONTE Fevereiro - 2011 Anderson Oliveira do Carmo Expressão Heteróloga e Purificação da Tityustoxina: Obtenção da proteína recombinante Ts3 do escorpião Tityus serrulatus Dissertação apresentada ao curso de mestrado em Genética do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais com requisito parcial para obtenção de título de Mestre em Genética Orientador: Prof.Dr. Evanguedes Kalapothakis Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Biologia Geral Programa de Pós-Graduação em Genética Belo Horizonte, Fevereiro de 2011 Á minha família e a todos que contribuíram para a conclusão deste trabalho. iv Agradecimentos Gostaria de agradecer a todas as pessoas que colaboraram comigo durante o período de realização do meu curso de Mestrado. Ao programa de Programa de Pós-Graduação em Genética, todos os professores e alunos, aos quais tive a oportunidade de conviver neste período. Ao meu orientador o Prof. Dr. Evanguedes Kalapotahakis gostaria de agradecer a oportunidade única de ter me orientado. Nesse período aprendi muito, não só sobre pesquisa e meio acadêmico, mas também muitos valores. Ao pessoal do Laboratório de Biotecnologia e Marcadores Moleculares, que estão presentes hoje ou que já passaram por lá um dia e que fizeram com que a rotina e os experimentos fossem muito agradáveis, Ana Paula, Bárbara Leal, Bárbara Freitas, Arthur, Higgor, Ana Luiza, Gabriel, Flávia Dias, Ana Carolina (PUC), Cibele, Tatiana, Luiz Felipe, Cleide, Denise, Isabella, Susane, Egian, Camila, Patrícia, Kelly, Marcelo, Érika, Valéria Lucilânia e Débora. E em especial agradeço a Thaís Mendes e Carolina Campolina por terem me ensinado muito. Marcele Prazeres pela ajuda em todas as horas, Flávia Siqueira pela força na formatação da dissertação, além do André companheiro de iniciação e grande amigo. A todos os amigos do Laboratório de Imunoquímica de Proteínas, com destaque a Clara Duarte que me deu grande apoio durante meu projeto. A minha família, especialmente aos meus pais grandes incentivadores da minha busca pelo conhecimento. Também meus irmãos Eduardo pela tolerância e ajuda e Nathália pela ajuda na correção e formatação de meu trabalho. Aos primos, por várias conversas e incentivos. A vó Divina e Tia Ereni pela torcida constante. Aos meus colegas de graduação que permaneceram amigos Cynthia, Felipe, Daniel e Marina. E aos meus grandes amigos Bruno, Tinê, Magno, Izinara, Décio e especial ao Alexandre que sempre me incentivou a nunca desistir. Esta dissertação também tem participação de todos vocês. Muito obrigado! v SUMÁRIO LISTA DE ILUSTRAÇÕES ................................................................................................................................. VIII LISTA DE TABELAS ........................................................................................................................................... IX LISTA DE ABREVIAÇÕES .................................................................................................................................... X 1. RESUMO .................................................................................................................................................12 2. ABSTRACT ...............................................................................................................................................13 3. INTRODUÇÃO .........................................................................................................................................14 3.1 Os Escorpiões..............................................................................................................................14 3.2 Tityus serrulatus .........................................................................................................................16 3.3 Veneno dos Escorpiões e Toxinas ................................................................................................18 3.4 Veneno de T. serrulatus e sua nomenclatura ...............................................................................22 3.5 A Toxina Ts3 ...............................................................................................................................25 3.6 Escorpionismo e epidemiologia no Brasil .....................................................................................27 3.6.1 Quadro clínico e tratamento .......................................................................................................29 4. JUSTIFICATIVA ........................................................................................................................................31 5. OBJETIVOS ..............................................................................................................................................33 5.1 Objetivos Gerais..........................................................................................................................33 5.2 Objetivos Específicos ...................................................................................................................33 6. MATERIAL E MÉTODOS ...........................................................................................................................34 6.1 Animais Utilizados e Genótipo das Linhagens de E. coli ................................................................34 6.2 Obtenção do clone de cDNA correspondente à ORF da Ts3 ..........................................................34 6.3 Seleção dos Vetores Bacterianos .................................................................................................34 6.4 Seleção das Linhagens de Escheriachia coli ..................................................................................39 6.5 Inserção de adaptadores a sequência da Ts3 por PCR ..................................................................39 6.6 Resolução Eletroforética em Gel de Agarose................................................................................40 6.7 Purificação de DNA a partir de gel de Agarose.............................................................................41 6.8 Subclonagem do Produto de PCR da Ts3 ao vetor PCR 2.1 TOPO ..................................................41 6.9 Preparação de células eletrocompetentes ...................................................................................42 6.10 Eletrotransformação Bacteriana .................................................................................................42 6.11 PCR de Colônia............................................................................................................................43 6.12 Extração Plasmidial por Lise Alcalina ...........................................................................................44 6.13 Quantificação do DNA Plasmidial ................................................................................................45 6.14 Reação de Sequenciamento ........................................................................................................45 6.15 Analises das sequências obtidas ..................................................................................................46 vi 6.16 Digestão com Enzimas de Restrição ............................................................................................46 6.17 Ligação ORF da Ts3 aos Vetores pET 26b e pET 32c .....................................................................46 6.18 Expressão piloto da Ts3 ...............................................................................................................47 6.19 Resolução Eletroforética SDS-PAGE .............................................................................................48 6.20 Lise de Choque Osmótico ............................................................................................................48 6.21 Lise para purificação com coluna de Níquel em condições não desnaturantes ..............................49 6.22 Teste de solubilidade da Ts3 recombinante .................................................................................49 6.23 Purificação da Ts3 em Condições Nativas com Resina de Níquel ..................................................49 6.24 Digestão da Ts3 purificada com Enteroquinase ...........................................................................50 6.25 Dosagem de Proteínas pelo Método de Bradford .........................................................................50 6.26 Imunização de Coelhos com Ts3 expressa em pET 26b .................................................................51 6.27 Sangria dos Coelhos ....................................................................................................................52 6.28 Preparação do Soro dos Coelhos .................................................................................................52 6.29 ELISA ..........................................................................................................................................52 6.30 Western Blot...............................................................................................................................53

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