Identifikasi Tumbuhan Paku Air (Azolla sp.) Secara Morfologi dan Molekuler dengan Menggunakan Gen rbcL (Identification of Water Ferns (Azolla sp.) Based on Morphologycal Traits and Molecular Marker Using rbcL Gene)
Wianita Mantang1*), Feky R. Mantiri1), Beivy J. Kolondam1) 1)Program Studi Biologi, Jurusan Biologi FMIPA UNSRAT Manado, 95115 *Email korespondensi: [email protected]
Diterima 30 Juli 2018, diterima untuk dipublikasi 30 Agustus 2018
Abstrak
Azolla merupakan salah satu tumbuhan paku air yang memiliki banyak manfaat, namun belum banyak dikenal dan sering dianggap sebagai tumbuhan gulma. Pengidentifikasian akan keberadaan jenis-jenis tumbuhan paku air (Azolla sp.) penting untuk dilakukan guna mendukung upaya pengembangan, pembudidayaan dan eksplorasi tumbuhan Azolla sp. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi spesies tumbuhan paku air (Azolla sp.) secara morfologi dan molekuler dengan menggunakan gen rbcL. Hasil penelitian menunjukkan bahwa berdasarkan karakter morfologi sampel tumbuhan Azolla sp. asal Tondano Sulawesi Utara menunjukkan kemiripan dengan spesies A. pinnata dan Azolla asal Magelang Jawa Tengah menunjukkan kemiripan dengan spesies A. microphylla. Identifikasi menggunakan sekuens gen rbcL menunjukkan bahwa sekuens sampel tumbuhan Azolla asal Tondano (WM1) memiliki tingkat kemiripan 100% dengan A. pinnata dan Azolla asal Magelang (WM2) memiliki tingkat kemiripan 100% dengan A. microphylla yang terdapat dalam GenBank. Analisis jarak genetik menunjukkan kedua sampel WM1 dan WM2 memiliki hubungan kekerabatan yang cukup dekat dengan nilai jarak genetik 0,060. Kata kunci: Azolla sp., identifikasi morfologi, identifikasi molekuler, gen rbcL
Abstract
Azolla is one of the water ferns that has many benefits, but it is not yet widely known and is often regarded as a weed plant. Identification of water ferns (Azolla sp.) is important to be carried out to support the development, cultivation, and exploration of Azolla sp. This study aimed to identify species of aquatic plants (Azolla sp.) morphologically and molecularly using the gene rbcL. The results demonstrated that based on the morphological characters, the Azolla sp. from Tondano, North Sulawesi, showed similarity with species A. pinnata and Azolla from Magelang, Central Java, showed similarity to species A. microphylla. Identification using rbcL gene sequences showed that the sample sequence of plants Azolla from Tondano (WM1) had a 100% similarity level with A. pinnata and Azolla from Magelang (WM2) had a 100% similarity level with A. microphylla available in GenBank. Genetic distance analysis showed that both WM1 and WM2 samples had a close relationship with the genetic distance value of 0.060. Key words: Azolla sp., morphological identification, molecular identification, rbcL gene
Mantang dkk., Identifikasi ….. 39
PENDAHULUAN untuk mengetahui berbagai jenis Indonesia merupakan salah dan keragaman varietas dilihat dari satu negara tropis yang memiliki bentuk luar tubuh organisme (Syah, keanekaragaman hayati yang tinggi, 2016). Penggunaan karakter baik hewan maupun tumbuhan. morfologi dalam identifikasi mudah Salah satu keanekaragaman hayati dilakukan dan cepat, namun mudah tumbuhan yang banyak di Indonesia berubah karena dipengaruhi oleh adalah tumbuhan paku beberapa faktor seperti faktor (Pteridophyta) (Sandy et al., 2016). lingkungan dan perbedaan umur Azolla sp. adalah salah satu jenis tumbuhan (Khanuja et al., 2005). tumbuhan paku berukuran kecil yang Identifikasi spesies secara hidup di perairan. Tumbuhan ini molekuler merupakan salah satu secara tidak langsung mampu cara baru untuk mengkonfirmasi mengikat nitrogen bebas yang ada identifikasi dan pengklasifikasian di udara, karena adanya simbiosis yang sudah ada (Darus, 2016). antara tumbuhan Azolla sp. dengan Identifikasi secara molekuler dapat Anabaena azollae (Arifin, 1996). dilakukan melalui teknik DNA Beberapa penelitian menyebutkan barcoding (Herbert et al., 2003). bahwa Azolla sp. merupakan Dalam proses DNA barcoding, the tumbuhan gulma eksotik yang Consortium for the Barcoding of Life memiliki peranan penting dalam (CBoL) merekombinasikan konservasi dan dapat membantu penggunaan dua gen standar yang dalam pengelolaan tanah di lahan dapat digunakan untuk basah (Sadeghi et al., 2013). mengidentifikasi tumbuhan yaitu Tumbuhan Azolla sp. dapat rbcL (ribulose-1,5- biphosphate ditemukan pada semua persawahan carboxylase oxygenase) dan matK di Indonesia (Hidayat et al., 2011). (maturase K) (Kress et al., 2010). Tumbuhan ini banyak tumbuh Dalam beberapa penelitian secara liar dan berkembang tanpa tumbuhan paku air (Azolla sp.) lebih dibudidayakan. Kurangnya informasi banyak menggunakan gen rbcL mengenai pengenalan serta manfaat dibandingkan gen matK, karena tumbuhan ini, sehingga pada pada tumbuhan paku sekuen rbcL beberapa daerah masih banyak telah diaplikasikan hingga tingkat petani yang menganggap tumbuhan marga dan jenis (Wolf, 1995). Di lain Azolla sp. sebagai tumbuhan gulma sisi, walaupun gen matK (pengganggu) (Sudjana, 2014). memberikan resolusi yang lebih Pengidentifikasian akan jenis-jenis tinggi dibandingkan dengan gen tumbuhan paku air (Azolla sp.) rbcL, pada tumbuhan paku, data penting untuk dilakukan guna matK sulit untuk diperoleh (Lestari, mendukung upaya pengembangan, 2013). pembudidayaan, dan eksplorasi Penelitian ini bertujuan untuk tumbuhan Azolla sp. mengidentifikasi tumbuhan paku air Identifikasi merupakan suatu (Azolla sp.) berdasarkan karakter kegiatan karakterisasi semua sifat morfologi dan profil molekuler yang dimiliki oleh keragaman genetik dengan menggunakan gen rbcL. spesies sebagai pangkalan data Sampel tumbuhan Azolla sp. (data base) sebelum memulai diperoleh dari Tondano Sulawesi rencana pemuliaan (Ferita et al., Utara dan Magelang Jawa Tengah. 2015). Identifikasi organisme dapat Lokasi dipilih karena berdasarkan dilakukan dengan karakterisasi hasil survei dari beberapa lokasi di secara morfologi dan secara Sulawesi Utara, tumbuhan Azolla sp. molekuler. Identifikasi berdasarkan hanya ditemukan di Tondano karakteristik morfologi bertujuan Sulawesi Utara. Oleh karena itu,
40 JURNAL BIOSLOGOS, AGUSTUS 2018, VOL. 8 NOMOR 2
untuk membandingkan dengan yaitu 20 µL 2X My Taq HS Red Mix tumbuhan Azolla sp. dari tempat (Bioline), 1,5µL primer forward, lain, satu sampel dipesan dari 1,5µL primer reverse, 15µL ddH2O Magelang Jawa Tengah. Lokasi dan 2 µL templat DNA. Pengaturan dipilih karena berdasarkan pencarian suhu untuk proses PCR dimulai lewat literatur, diketahui bahwa pada dengan pengaturan suhu denaturasi beberapa daerah di Jawa salah awal pada suhu 95°C selama 3 satunya di Magelang Jawa Tengah, menit yang dilanjutkan dengan 35 tumbuhan Azolla sp. ini sudah siklus yang terdiri atas tahap dibudidayakan dan tersedia dalam denaturasi pada suhu 95°C selama pemesanan secara online. 30 detik, penempelan primer pada suhu 50°C selama 30 detik, dan METODE ekstensi pada suhu 72°C selama 50 Identifikasi Karakter Morfologi detik, dan ekstensi akhir pada suhu Identifikasi karakter morfologi 72°C selama 1 menit (Kolondam, dilakukan dengan mengamati dan 2015). DNA hasil PCR divisualisasi mengukur tumbuhan Azolla sp. menggunakan elektroforesis gel secara langsung. Bagian-bagian agarosa 0,8% dan sisanya dikirim yang diamati adalah daun, batang, untuk sekuensing ke First Base dan akar. Data hasil pengamatan Malaysia. Proses sekuensing dianalisa secara deskriptif dan dilakukan sebanyak dua kali dengan disesuaikan dengan morfologi arah yang berbeda (forward dan tumbuhan paku air (Azolla sp) yang reverse) sesuai primer yang terdapat dalam artikel ilmiah seperti tersedia. Federal Noxious Weed Disseminules of the U.S pada situs Analisis Data http://keys.lucidcentral.org, Dave’s Data hasil sekuensing Garden pada situs disunting menggunakan software https://davesgarden.com, Ferns of Genious V.5.6. Sekuens DNA Texas pada situs http://ferns.brit.org, dianalisis menggunakan software dan iNaturalist pada situs Basic Local Alignment Search Tool https://www.inaturalist.org. (BLAST) pada situs (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) untuk Ekstraksi DNA Tumbuhan Azolla mencari sekuens yang serupa yang Ekstraksi DNA dilakukan tersedia di GenBank. Setelah itu, menggunakan Genomic DNA Mini untuk mengukur jarak genetik Kit (Geneaid). DNA genomic digunakan metode Kimura’s 2- diekstrak dari tumbuhan Azolla sp. parameter pada MEGA6. yang diperoleh dari Tondano Sulawesi Utara dan Magelang Jawa HASIL DAN PEMBAHASAN Tengah. Identifikasi Karakter Morfologi Hasil identifikasi karakter Amplifikasi Gen rbcL morfologi dari kunci identifikasi, Pasangan primer yang menunjukkan bahwa Azolla sp. yang digunakan untuk amplifikasi gen ditemukan di Tondano Sulawesi rcbL yaitu rbcL-1F-R (5’-ATG TCA Utara (Gambar 1A) memiliki karakter CCA CAA ACA GAA AC-3’) dan morfologi yang sama dengan A. rcbL-724R-F (5’-TCG CAT GTA CCT pinnata, sedangkan Azolla sp. yang GCA GTA GC-3’) (Oshingboye et al., dipesan dari Magelang Jawa Tengah 2017). Proses amplifikasi dilakukan (Gambar 2B) memiliki karakter dengan membuat Master Mix PCR morfologi yang sama dengan A. dalam 40 µL reaksi PCR. Komponen microphylla. Data hasil pengamatan yang dicampur untuk satu kali reaksi karakter morfologi pada tumbuhan Mantang dkk., Identifikasi ….. 41
Mantang dkk., Identifikasi ….. 41
Azolla sp. yang terdapat di Tondano perbedaan dan kemiripan. dan Magelang dapat dilihat pada Perbedaan ini terlihat pada ukuran Tabel 1. tumbuhan, tata letak daun, warna Berdasarkan hasil karakter daun, bentuk akar, dan panjang morfologi (Tabel 1), sampel akar. tumbuhan Azolla sp. asal Tondano dengan Magelang memiliki beberapa
Tabel 1. Karakter Morfologi Tumbuhan Azolla sp. di Tondano, Sulawesi Utara dan Magelang, Jawa Tengah
Morfologi Azolla sp. Karakteristik Tondano Magelang Tinggi tumbuhan 0,8 – 1 cm 1 – 2 cm Warna daun Hijau tua Hijau tua dengan tepi hijau muda Panjang daun 1 mm – 1,5 mm 1 – 1,5 mm Lebar daun 0,8 – 1 mm 0,9 – 1 mm Sifat permukaan Terdapat trikoma Terdapat trikoma daun Berseling Tumpang tindih Letak daun Panjang akar 1 – 5 cm 1 – 3 cm Bentuk akar Menyerupai benang Seperti rambut, tidak (filiformis), berbulu, tidak berbulu, tidak bercabang bercabang Warna batang Hijau muda Hijau muda
A B
Gambar 1. Bentuk Morfologi Azolla sp., (A) Tondano Sulawesi Utara dan (B) Magelang Jawa Tengah
Identifikasi Molekuler dengan memperlihatkan hasil pola pita yang Menggunakan Gen rbcL terlihat jelas (Gambar 2). Hasil amplifikasi DNA dengan teknik PCR Sampel tumbuhan Azolla sp. menggunakan primer rbcL-1F-R dan yang diambil dari Tondano Sulawesi rbcL-724R-F menunjukkan bahwa Utara yaitu WM1 dan Magelang sampel WM1 dan WM2 memiliki Jawa Tengah yaitu WM2 berhasil urutan nukleotida sekitar 600 bp. diamplifikasi dengan menggunakan teknik PCR. Sampel DNA hasil isolasi dan amplifikasi gen rbcL
42 JURNAL BIOSLOGOS, AGUSTUS 2018, VOL. 8 NOMOR 2
Sekuens yang memiliki identitas paling serupa dengan sampel WM2 yaitu A. microphylla EF520921.1 dan A. mexicana MG215093.1 dengan tingkat kemiripan 100%. Studi molekuler sebelumnya (Reid et al., 2006; Metzgar et al., 2007) telah melaporkan bahwa A. mexicana dan A. microphylla adalah spesies yang sama. Evrard and Van Hove (2004) juga menyimpulkan bahwa Gambar 2. Visualisasi hasil berdasarkan morfologi A. amplifikasi DNA gen rbcL sampel microphylla dan A. mexicana adalah WM1 dan WM2. spesies yang sama. Hasil tersebut menandakan bahwa A. microphylla Sekuens sampel tumbuhan dengan A. mexicana merupakan Azolla sp. WM1 dan WM2 dianalisis spesies yang sama dengan nama dengan menggunakan program yang berbeda. Geneious v5.6.4, kemudian diubah Jarak genetik antara sampel menjadi format FASTA dan dengan kerabat Azolla sp. dihitung digunakan dalam pencarian sekuens menggunakan metode Kimura-2- yang serupa di GenBank dengan Parameter pada MEGA6. Hasil menggunakan BLAST. Berdasarkan menunjukkan bahwa jarak genetik hasil penelusuran dengan antara sampel WM1 dan WM2 yaitu menggunakan BLAST, sekuens 0,060. Hasil tersebut menunjukkan yang memiliki identitas paling serupa bahwa kedua tumbuhan tersebut dengan sampel WM1 adalah A. memiliki hubungan kekerabatan pinnata AM177355.1 dan A. yang cukup dekat. Tallei et al. (2016) imbricata AB574738.1 dengan menyatakan bahwa hubungan tingkat kemiripan 100%. IUCN kekerabatan antar spesies dapat (2017) menyebutkan bahwa dilihat dari besar kecilnya nilai jarak tumbuhan A. pinnata memiliki nama genetik. Semakin sedikit nilai jarak yang bersinonim dengan A. africana, genetik antara dua organisme, maka A. guineensis dan A. imbricata. hubungan kekerabatan keduanya Sebayang (1996) juga semakin dekat. Pohon filogenetik menambahkan bahwa berdasarkan antara sampel WM1 dan WM2 persebarannya A. pinnata terbagi dengan kerabat terdekatnya dapat menjadi dua subspesies yaitu dilihat pada Gambar 3. A. pinnata var . Imbricata yang tersebar di sekitaran Asia dan A. pinnata var. Pinnata yang tersebar di Africa dan biasa dikenal dengan Afrika Strain. Hal tersebut menandakan bahwa kedua jenis tumbuhan Azolla sp. tersebut merupakan spesies yang sama dan merupakan subspesies.
Mantang dkk., Identifikasi ….. 43
MG215093.1 A.mexicana EF520919.1 A.microphylla WM2 rcbLaF EF520919.1 A.caroliniana KT862375.1 A.japonica KM360662.1 A.filiculoides EF520930.1 A.rubra EF520925.1 A.nilotica WM1 rcbLaF AM177355.1 A.pinnata AB574738.1 A.Imbricata
0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 Gambar 3. Pohon filogenetik Azolla sp. menggunakan metode UPGMA dalam MEGA6
KESIMPULAN Azolla Species (Azollaceae): a Identifikasi karakter morfologi critical review. Syst. Geogr. dan molekuler menggunakan Plants. 74: 301 – 318. sekuens gen rbcL menunjukkan Federal Noxious Weed Disseminules bahwa sampel Azolla sp. asal of the U.S (2018) Tondano Sulawesi Utara memiliki http://keys.lucidcentral.org. kemiripan dengan A. pinnata dan Diakses pada 10 Mei 2018 sampel tumbuhan Azolla sp. asal Ferita I, Tawarati, Syarif Z (2015) Magelang Jawa Tengah memiliki Identifikasi dan Karakterisasi kemiripan dengan A. microphylla Tanaman Enau (Arenga dengan tingkat kemiripan 100% pinnata) di Kabupaten Gayo dengan sekuens yang terdapat Lues. Pros Sem Nas Masy Biodiv dalam GenBank. Indon 1(1): 31 – 37. Ferns of Texas (2014) DAFTAR PUSTAKA www.ferns.brit.org. Diakses Arifin (1996) Azolla Pembudidayaan pada 10 Mei 2018. dan Pemanfaatan pada Hebert PDN, Cywinska NA, Ball SL, Tanaman Padi. Penebar de Waard JR (2003) Biological Swadaya. Jakarta. identifications through DNA Darus, FR (2016) Perbandingan barcodes. Proc Roy Soc B-Biol Karakter Morfologi dan Sci, 270: 313 – 321. Molekuler Antara Karang Hidayat C, Fanindi A, Sopiyana S, Acanthophyllia deshayesiana Komarudin (2011) Peluang (Michelin, 1850) dengan Pemanfaatan Tepung Azolla Cynarina lacrymalis (Milne Sebagai Bahan Pakan Sumber Edwards & Haime, 1848). Protein untuk Ternak Ayam. Di Tesis. Sekolah Pascasarjana dalam: Prosiding Seminar Institut Pertania Bogor. Bogor. Nasional Teknologi Dave’s Garden. Azolla pinnata Peternakan dan Veteriner. (2009) Balai Penelitian Ternak. Bogor. www.davesgarden.com. INaturalist. (2018) Diakses pada 10 Mei 2018. www.inaturalist.org. Diakses Evrard C, Van Hove C (2004) pada 10 Mei 2018 Taxonomy of the American
44 JURNAL BIOSLOGOS, AGUSTUS 2018, VOL. 8 NOMOR 2
IUCN (2017) Azolla sp. IUCN Red Reid JD, Plunkett GM, Peters GA List of Threatened Species. (2006) Phylogenetic www.iucnredlist.org. Diakses Relationships In The pada 22 Juni 2018. Heterosporous Fern Genus Khanuja SPS, Shasany AK, Pawar Azolla (Azollaceae) Based On A, Lal RK, Darokar MP, Naqvi DNA Sequence Data From AA, Rajkumar S, Sundaresan Three Noncoding Regions. Int. V, Lal N, Kumar S (2005) J. Plant Sci. 167: 529–538. Essential Oil Constituents and Sadeghi R, Zarkani R, Sabretaftar K, RAPD Markers to Establish Van Damme P (2013) A Species Relationship in Review of Some Ecological Cymbopogon Spreng Factors Affecting the Growth of (Poaceae). Biochemical Azolla spp. Environment systematics and ecology 33(2): Science, 11(1): 65 – 76. 171 – 186. Sandy FS, Pantiwati Y, Hudha MA, Kolondam BJ (2015) Applying Matk Latifa R (2016) Gene For Identification Of Keanekaragaman Jenis Liliopsida Plant Species From Tumbuhan Paku North Sulawesi Through Bold (Pteridophyta) Di Kawasan Air Systems. International Journal Terjun Lawean Sendang Of Applied Biology and Kabupaten Tulungagung. Pharmaceutical Technology Universitas Muhammadiyah 6(2): 242 – 245. Malang. Kress WJ, Erickson DL, Swenson Sebayang HT (1996) Azolla, Suatu NG, Thompson J, Uriarte M, Kajian Produksi dan Zimmer JK (2010) Advances in Potensinya dalam Bidang the Use of DNA Barcodes to Pertanian. Habitat 97(8): 45 – Build a Community Phylogeny 48. for Tropical Trees in a Puerto Sudjana B (2014) Pengunaan Azolla Rican Forest Dynamics Plot. Untuk Pertanian Plos One 5(11). Berkelanjutan. Jurnal Ilmiah Lestari WS (2013) Keanekaragaman Solusi 1(2): 72 – 81. dan Hubungan Kekerabatan Syah MA (2016) Karakterisasi Marga Adiantum dari Morfologi Dan Fragmen rDNA Kepulauan Sunda Kecil Trichoderma sp. Asal Berdasarkan Variasi Sekuen Perkebunan Kakao Pada DNA Kloroplas (rbcl dan (Theobromacacao L.) Konawe. trnl-f). Tesis. Denpasar: Skripsi. Universitas Haluoleo. Universitas Udayana. Kendari. Metzgar JS, Schneider H, Pryer KM Tallei TE, Rembet RE, Pelealu JJ, (2007) Phylogeny and Kolondam BJ (2016) Divergence Time Estimates for Sequence Variation and the Fern Genus Azolla Phylogenetic Analysis of (Salviniaceae). Int. J. Plant Sansevieria trifasciata Sci. 168: 1045–1053. (Asparagaceae). Bioscience Oshingboye A, Nodza G, Onuminya Research 13(1): 01 – 07. T, Ogundipe O (2017) Wolf PG (1995) Phylogenetic Evaluating the Utility of rbcL in Analysis of rbcL and Nuclear Identifying Nigerian Species of Ribosomal RNA Gene the Genus Afzelia Sm. Sequences in (Fabaceae; Caesalpinioideae). Dennstaedtiaceae. American Turkish Journal of Botany 41: Fern Journal 85: 306 – 327. 455 – 463.