Estudo Fitoquímico E Bioatividades Do Extrato Em Hexano De Anteremanthus Piranii (ROQUE E SANTANA), (Vernonieae, Asteraceae)

UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Estudo fitoquímico e bioatividades do extrato em hexano de Anteremanthus piranii (ROQUE e SANTANA), (Vernonieae, Asteraceae)

CAMILA CAMPELO BOUÉRES

São Paulo

2015

CAMILA CAMPELO BOUÉRES

Estudo fitoquímico e bioatividades do extrato em hexano de Anteremanthus piranii (Vernonieae, Asteraceae)

Monografia apresentada ao Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, da Universidade Presbiteriana Mackenzie como parte dos requisitos exigidos para a conclusão do Curso de Ciências Biológicas

Orientadora: Profª. Drª. Ana Paula Pimentel Costa

Co-orientador:Profº Drº Marcelo J. Pena Ferreira

São Paulo

2015

“A coisa mais maravilhosa que podemos vivenciar é o misterioso. O reconhecimento do mistério do universo é o caminho para toda a Ciência verdadeira.”

Albert Einsten

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a fonte geradora da vida, Deus, por me guiar nesse caminho e me dar à oportunidade de estudar na Universidade Presbiteriana Mackenzie (Centro de Ciências Biológicas e da Saúde – CCBS - UPM) que me deu toda base profissional.

Aos meus orientadores, Profª Drª. Ana Paula Pimentel Costa que me indicou o Profº Drº Marcelo J. Pena Ferreira, e este, por me aceitar fazer parte deste trabalho e me apoiar durante todo o andamento sempre esclarecendo minhas dúvidas. Obrigada pela oportunidade e pela paciência. Agradeço à Universidade de São Paulo e aos envolvidos nesse trabalho, mesmo que indiretamente, tais como os técnicos de laboratórios e amigos doutorandos da USP por toda ajuda prestada, principalmente à Priscila.

Aos meus excelentes professores da UPM, que durante estes longos anos de formação fizeram parte da minha rotina.

Com vocês pude aprimorar meus conhecimentos. Gratidão a todos.

E gratidão à minha família, principalmente meu irmão Paulo Henrique e minha querida mãezinha, Izildinha que me apoiaram, e sempre acreditaram no meu sucesso. E também à todos os meus amigos e colegas, pelas palavras de incentivo e por me fazerem relaxar em momentos de pressão ao longo desse semestre.

RESUMO

Asteraceae é uma das maiores famílias entre as Eudicotiledôneas e apresenta elevada produção de metabólitos secundários com inúmeras bioatividades. O objetivo desse trabalho foi realizar a análise fitoquímica do extrato em hexano da espécie Anteremanthus piranii (Vernonieae, Asteraceae) e avaliar a atividade tóxica frente a plântulas de cebola e Artemia sp.. Da análise fitoquímica foram identificados onze triterpenóides e dois n-alcanos presentes nos extratos hexânicos das folhas e galhos de A. piranii. Os resultados dos bioensaios frente ao modelo vegetal e animal foram positivo e negativo, respectivamente.

Palavras-chave: Anteremanthus piranii, Asteraceae, estudo fitoquímico, atividade fitotóxica, Artemia sp.

ABSTRACT

Asteraceae is one of the largest families of the Eudicots and has high production of secondary metabolites with numerous bioactivities. The aim of this study was the phytochemical analysis of the extract in hexane species Anteremanthus piranii (Vernonieae, Asteraceae) and evaluate the toxic activity against onion seedlings and Artemia sp.. The phytochemical analysis identified eleven triterpenoids and two n-alkanes present in the leaf extracts of the leaves and branches of A. piranii. The results of the bioassays against vegetable or animal model were positive and negative, respectively.

Keywords: Anteremanthus piranii, Asteraceae, phytochemical study, phytotoxic activity, Artemia sp.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO...... 1

2. OJETIVOS...... 8

3. MATERIAIS E MÉTODOS...... 9

3.1. Coleta da espécie vegetal e preparo dos extratos...... 9

3.2. Análise da composição química...... 9

3.3. Procedimento para extração e análise de ceras cuticulares...... 10

3.4. Avaliação das atividades alelopáticas...... 11

3.5. Avaliação da toxicidade frente à Artemia sp...... 13

4. RESUTADOS E DISCUSSÃO...... 15

5. CONCLUSÃO...... 25

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 26

1. INTRODUÇÃO

As plantas constituem uma das fontes mais importantes de substâncias utilizadas como agentes medicinais. O Brasil possui uma grande biodiversidade, o que contribui para descoberta de novas plantas medicinais. A química de produtos naturais (QPN) de vegetais – Fitoquímica – dedica-se à caracterização estrutural, avaliação de propriedades químicas e biológicas e investigações biossintéticas de substâncias naturais produzidas pelo metabolismo secundário de organismos vivos. Tais metabólitos participam da dinâmica ambiental envolvendo interações planta-planta, planta-microrganismo, planta-animal e animal-animal dependentes, essencialmente, da convivência controlada pelo quimismo dos diversos organismos vivos e interações ecológicas (BRAZ-FILHO, 2010). Esses metabólitos secundários são oriundos dos metabólitos primários e originados por reações diversas e adaptações estando relacionados com a seleção natural dos organismos (FERREIRA; ÁQUILA, 2000) e, consequentemente, com o sucesso evolutivo destes. Apesar de não estarem relacionados à produção de protoplasma e aos processos vitais do vegetal, os metabólitos secundários proporcionam vantagens e desempenham papéis importantíssimos tanto na interação biótica quanto abiótica, entre as quais na atração de polinizadores, como para repelência à herbivoria, em interações planta-planta, como é o caso da função alelopática (aleloquímica) de certos constituintes (TAIZ e ZEIGER, 2013).

As plantas desencadeiam respostas mediante ao reconhecimento de um eliciador, produzindo espécies reativas de oxigênio (EROs) em decorrência a diversas perturbações ambientais bióticas e abióticas como, por exemplo, excesso de luz, seca, temperaturas elevadas, herbicidas, dano físico, ou seja, situações de estresse em geral. O conhecimento de como os vegetais se protegem é essencial para obter, através da bioengenharia, variedades agrícolas mais resistentes, aumentando a produção e a qualidade das plantas (PIRES e OLIVEIRA, 2001).

Além disso, os metabólitos secundários fornecem modelos para modificações estruturais e otimização das propriedades farmacológicas e bioquímicas, assim como o isolamento e a determinação estrutural de 2 substâncias orgânicas produzidas pelo metabolismo secundário de organismos vivos são fundamentais para o desenvolvimento científico da própria química de produtos naturais contribuindo para o avanço de outras atividades científicas e tecnológicas no País (BRAZ-FILHO, 2010).

Asteraceae apresenta grande produção de metabólitos secundários (FUNK et al., 2009; EMERENCIANO et al.,1986) e, entre as Eudicoltiledôneas, possui aproximadamente 1600 gêneros e mais de 23000 espécies sendo o terceiro maior representante da flora mundial. As espécies possuem inflorescências características desse táxon, chamados de capítulos florais, que são um conjunto de flores sésseis assentadas sobre um receptáculo comum, cercado por brácteas involucrais (BARROSO, 1991). Muitos dos representantes da família são conhecidos por diversas propriedades terapêuticas, cosméticas, aromáticas e suas diversas atividades farmacológicas, como anti-inflamatória, antiespasmódica, ansiolítica e carminativa estão associadas aos diferentes grupos de constituintes químicos presentes (EVANS, 1996; FETROW e AVILA, 2000; KUHN e WINSTON, 2000; LORENZI e MATOS, 2002; NEWALL e ANDERSON, PHILLIPSON, 2002; ROTBLATT e ZIMENT, 2002 apud DUARTE e LIMA, 2003). Também é relatado na literatura o uso medicinal de constituintes químicos dessa família como antihelmíntico, adstringente, antihemorrágico, antimicrobiano, diurético, analgésico e antiespasmódico (PORTILLO et al., 2001; ISCAN et al., 2006; ABAD e BERMEJO, 2007; BENEDEK et al., 2007; JEON et al., 2008 apud FABRI et al., 2011).

Segundo Cronquist (1981), as espécies de Asteraceae armazenam carboidratos do tipo inulina, produzem poliacetilenos e óleos aromáticos terpênicos, normalmente apresentam lactonas sesquiterpênicas e não possuem iridóides. Schultes e Raffauf (1990) relatam que essa família é rica em constituintes potencialmente biodinâmicos, incluindo alcaloides pirrolizidínicos (nas tribos Eupatorieae e Senecioneae), sesqui-, di- e triterpenóides, óleos voláteis, saponinas esteroidais e triterpênicas, esteróis, carotenóides, poliacetilenos, amidas, flavonoides, cumarinas e derivados de ácido clorogênico. As substâncias não comumente encontradas em membros dessa família são, as catequinas e azulenos conforme relata Schultes e Raffauf 3

(1990) e Villareal et al. (1994). As espécies apresentam variações no conteúdo de lactonas sesquiterpênicas devido à sazonalidade, idade, estágio de desenvolvimento da planta e intensidade de luz (PICMAN, 1986; GOBBO- NETO e LOPES, 2007) e, geralmente, tais variações qualitativas e quantitativas estão relacionadas a uma estratégia contra herbivoria. Alguns fatores podem apresentar correlações entre si e não atuam isoladamente, podendo influir sinergicamente no metabolismo secundário, como desenvolvimento e sazonalidade, índice pluviométrico, temperatura, altitude, entre outros (GOBBO-NETO e LOPES, 2007).

Dentre as 40 tribos reconhecidas de Asteraceae, Vernonieae apresenta maior problema de delimitação taxonômica sendo designada de “Evil tribe” (FUNK et al., 2009), por conter mais de 50 gêneros monotípicos, cerca de 35 gêneros com menos que três espécies e por possuir uma natureza altamente variável, devido sua grande capacidade de adaptação à diversos tipos de habitats apresentando sobreposição da maioria dos caracteres morfológicos, culminando em uma elevada similaridade na aparência das espécies (KEELEY et al., 2007). Desta forma, as relações entre os táxons são mal compreendidas.

A tribo é classificada a partir de dados filogenéticos, morfológicos e moleculares em 21 subtribos, 127 gêneros e mais de 1.000 espécies, distribuídas nas Américas, Ásia e África. É geralmente definida pela falta de nó alargado na base do estilo e sobre as glândulas apendiculares da antera, receptáculo geralmente epaleáceo e um papo de cerdas capilares ou tiras retorcidas. A tribo Vernonieae apresenta ervas perenes ou raramente anuais, arbustos e árvores pequenas, raramente com látex, folhas geralmente alternas, raramente opostas, às vezes em roseta basal, sésseis ou pecioladas, inflorescência cimosa ou com ramos pentacimosos, muitas vezes escorpioides ou seriados, flores geralmente bissexuais e férteis, brácteas involucrais, geralmente imbricados, brácteas internas persistentes ou decíduas, corolas avermelhadas, arroxeadas ou brancas, raramente amareladas, base da antera geralmente calcarada, com ou sem apêndices estéreis, apêndice apical não constrito na base, com ou sem glândulas e base de estilete imerso no nectário, com ou sem alargamento basal ou anel basal diferenciado (ROBINSON, 1999). 4

Para delimitação das subtribos podem ser usadas características como tipos de pólen, apêndices das anteras, número e forma dos cristais na parede do aquênio e análise do cariótipo (ROBINSON, 1999). Estudos moleculares revelaram que Vernonieae é a única tribo da família Asteraceae de origem paleotropical (Madagascar / África) (KEELEY et al., 2007).

A tribo Vernonieae é de grande importância econômica, medicinal e ecológica. Muitas de suas espécies são utilizadas para tratar doenças de pele, para livrar o corpo de parasitas e vermes, dores de estômago, cólicas menstruais e do parto e como um analgésico geral, tendo sido isolada uma variedade de substâncias farmacologicamente ativas de algumas espécies brasileiras e africanas, testados para uso contra parasitas tropicais e câncer (KEELEY et al., 2012). Além disso, a folha de algumas espécies é utilizada como fonte de vitamina C e sais minerais na África e agricultores utilizam-na para alimentar os animais domésticos (KEELEY et al., 2012). No Brasil a tribo é representada por 55 gêneros e 437 espécies, do qual 332 são espécies endêmicas, ocorrendo em todos os domínios fitogeográficos.

A subtribo Lychnophorinae foi revisada por Robinson (em 1992, 1999, 2007) e alterada por Keely e Robinson em 2009. Esta subtribo é praticamente restrita à região Central do Brasil, do qual 94 espécies estão distribuídas em 11 gêneros (Anteremanthus, Chronopappus, Eremanthus, Lychnophoriopsis, Minasia, Paralychnophora, Piptolepis, Prestelia, Proteopsis, Pychonophora e Vinicia) dos quais cinco são monotípicos (ROQUE e SANTANA, 2014).

Anteremanthus era um dos gêneros monotípicos da subtribo Lychonophorinae que, atualmente, apresenta duas espécies descritas, Anteremanthus hatschbachii (H.Rob.) e Anteremanthus piranii (ROQUE e SANTANA). Anteremanthus hatschbachii foi descrito como um novo gênero em 1992, e a espécie foi localizada em Minas Gerais, Brasil. A. piranii foi coletada aproximadamente 270 km distante do local típico de A. hatschbachii (ROQUE e SANTANA, 2014).

A espécie Anteremanthus piranii, foi descrita em julho de 2014 a partir da coleta na Serra Geral do município Licínio de Almeida localizada na parte 5 central da Serra do Espinhaço, no estado da Bahia, Brasil. O nome dado à espécie pela sistemata Profª. Drª. Nádia Roque homenageou o sistemáta Prof. Dr. José Rubens Pirani do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (USP). Anteremanthus piranii pode ser distinguido da espécie típica A. hatschbachii principalmente pelo capitulo terminal, 6-13 cm de comprimento (vs. axilar, 20-60 cm de comprimento), brácteas subinvolucral linear na base do capítulo (vs. brácteas subinvolucral ovadas), filários rosa-verde (vs. esverdeada), florzinhas 20-30, e corola branca, lóbulos da corola, anteras e ápice estilo lavanda (comparada florzinhas 45-60, corola verde-creme) (ROQUE e SANTANA, 2014). A. piranii é predominantemente distribuída em áreas de Caatinga (IBGE, 2012), mas também é encontrada em uma ampla área de Cerrado (campos rupestres com 900-1.100 m) e áreas mais baixas de mata de galeria. (ROQUE e SANTANA, 2014). Na Figura 1 são apresentadas fotos da espécie em campo.

As substâncias de maior ocorrência na subtribo Lychnophorinae são os flavonoides e os terpenóides, destes destacam-se as lactonas sesquiterpênicas das quais foram identificadas e/ou isoladas em 90% das espécies investigadas (KELES et al., 2010). Em geral, o grupo dos terpenóides são encontrados em resinas, ceras, látex e óleos essenciais e caracterizam-se por serem insolúveis em água por isso há necessidade de uso de solventes de baixa polaridade para sua extração. As plantas produzem uma grande variedade dessas substâncias, que atuam como reguladores de crescimento, fitoalexinas e repelentes para insetos herbívoros (ORTEGA et al., 2001; INDEJIT e DUKE 2003; MAIRESSE et al., 2007).

O gênero Anteremanthus ainda não foi analisado fitoquimicamente. Assim, esse trabalho tem grande importância, pois tem como um dos objetivos a caracterização dos metabólitos secundários, a partir dos extratos em hexano das folhas e dos galhos de Anteremanthus piranii.

Figura 1. Fotos de Anteremanthus piranii em campo e detalhe do capítulo floral (Fonte: ROQUE e SANTANA, 2014)

N. Roque N. Roque

Conforme relatos da literatura, essa família costuma produzir uma elevada diversidade de metabólitos para mediar as interações bióticas e abióticas das espécies. Entre essas, vem ganhando destaque recente a produção de substâncias alelopáticas por espécies de Asteraceae, que as produzem e exudam em solo para colonizar os ambientes. Essa estratégia tem permitido aos indivíduos de Asteraceae conquistar diversos habitat, sendo atualmente encontrados em todos os ambientes terrestres exceto a Antártida (FUNK et al., 2009).

Algumas espécies de Asteraceae podem atuar como invasoras em determinadas regiões ou podem colonizar ambientes devido a liberação de componentes fitotóxicos a outras espécies. Nesse último grupo, podemos citar Conyza canadensis (L.) Cronquist, Cynara cardunculus L., Flourensia oolepis 7

S.F. Blake, Helianthus annuus L., Onopordum acanthium L. e Tithonia diversifolia (Hemsl.) A.Gray que possuem em comum a capacidade de produzir aleloquímicos, em especial lactonas sesquiterpênicas, que interferem no desenvolvimento de plantas circundantes. Essas substâncias possuem ação fitotóxica ativa em certas espécies alvo padrão como alface, agrião, tomate, cebola e ervas daninhas, como o capim, Echinochloa (E. crus-galli L.) e braquiária (Urochloa decumbens (Stapf) R.D. Webster), ambas espécies de ervas daninhas importantes em todo o mundo, dado que o capim é uma erva daninha nativa da Ásia, mas invade as plantações de arroz de todo o mundo enquanto a braquiária é especialmente invasiva na America do Sul (QUEIROZ et al., 2012; NAPAL et al., 2013; WATANABEA et al., 2014; RIAL et al., 2014).

A quantidade e o caminho pelos quais os componentes químicos são liberados diferem de espécie para espécie, mas os aleloquímicos podem estar presentes em diferentes órgãos, incluindo raízes, caules, folhas, flores, frutos e gemas de muitas espécies vegetais. As substâncias químicas podem ser seletivas em suas ações e as plantas podem ser seletivas em suas respostas, por este motivo torna-se difícil sintetizar o modo de ação destes compostos (EINHELLIG 1995 e 1996 apud SEIGLER, 1996). A capacidade que determinadas plantas possuem capacidade de interferir no metabolismo de outras, por meio de substâncias liberadas no ambiente, pode ser uma alternativa de combate às plantas invasoras, dispensando ou reduzindo a utilização dos herbicidas (OLIVEIRA et al., 2014). Levando-se em consideração este fator, outra proposta deste trabalho foi avaliar o potencial alelopático dos constituintes químicos presentes nos extratos em hexano dos ramos e folhas de Anteremanthus piranii, na germinação e crescimento inicial de plântulas de cebola.

2. OBJETIVOS

Considerando a elevada diversidade e potencial bioativo dos metabólitos produzidos por espécies de Asteraceae, os objetivos desse trabalho foram identificar os constituintes químicos extraídos em hexano e produzidos nos ramos e folhas de Anteremanthus piranii e avaliar bioatividades como, o potencial alelopático sobre a germinação e crescimento inicial de plântulas de cebola e a toxicidade frente à Artemia sp.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Coleta da espécie vegetal e preparo dos extratos

A espécie vegetal Anteremanthus piranii foi coletada pela Profª. Drª. Nádia Roque em 06 de agosto de 2014, na Trilha do Riacho Fundo, Serra Geral, Licínio de Almeida, Bahia, coordenadas 14° 35’ 13,7''S, 42° 32’ 24,6''W, à 887m de altitude em região de caatinga sobre afloramento rochoso. Uma exsicata da espécie foi depositada sob o número 4408 no Herbário Alexandre Leal Costa (ALCB), fiel depositário de amostras do componente genético, no Departamento de Botânica do Instituto de Biologia da Universidade Federal da Bahia (DB/IBIO/UFBA).

O material vegetal foi submetido à secagem em estufa a 60C, visando eliminação total de água. Posteriormente, as folhas e os galhos foram separados, moídos e extraídos exaustivamente por maceração com hexano. Após obtenção deste extrato, o material vegetal foi extraído com metanol até esgotamento. As amostras foram concentradas em evaporador rotatório sob pressão reduzida obtendo-se, então, os extratos brutos.

3.2. Análise da composição química

Os extratos em hexano foram analisados por Cromatografia à Gás (CG) em um cromatógrafo Agilent 570C equipado com o software Agilent GC 10, utilizando uma coluna capilar DB-5 (comprimento: 30m, diâmetro interno: 0,25mm espessura do filme: 0,25m). As temperaturas do injetor e do detector foram mantidas em 220°C e 250°C, respectivamente. A temperatura do forno foi programada de 60-300°C com taxa de aquecimento de 3ºC/min sendo empregado Hélio como gás de arraste (1mL/min) nas análises.

A composição percentual dos componentes foi obtida através de um integrador eletrônico tendo como base às áreas dos picos no cromatograma. A análise por Cromatografia a gás acoplada espectrometria de massas (CG/EM) foi realizada em cromatógrafo a gás Agilent acoplado com sistema quadruplo 10 de espectrometria de massas (QP 5000), operando por impacto eletrônico (70eV) e utilizando as mesmas condições empregadas na cromatografia a gás descrita acima.

A identificação dos componentes foi realizada por comparação dos espectros de massas, os quais estão disponíveis no sistema através das bibliotecas NIST 21, NIST 107 e WILEY 229, e em literatura apropriada (AHMAD e ATTA-UR-RAHMAN, 1994).

3.3. Procedimento para extração e análise de ceras cuticulares

Quatro folhas intactas e não submetidas à extração com hexano foram utilizadas para extração das ceras cuticulares, a fim de se verificar se os constituintes químicos identificados no extrato em hexano estão presentes na superfície foliar, que costumam ser compostas por ceras.

Para esse procedimento, desenvolvido em colaboração com a Profª. Drª. Déborah Yara Alves Cursino dos Santos, o solvente de baixa polaridade diclorometano foi utilizado para extração. As quatro folhas foram submersas, individualmente, em um béquer contendo 300mL de diclorometano, por 1 minuto cada e retiradas com auxílio de uma pinça. Tal procedimento foi repetido três vezes, com cada folha, renovando-se o solvente em cada rodada de extração. Da solução resultante, o solvente foi removido em evaporador rotatório formando assim 343 miligramas do extrato dos componentes presentes apenas na cutícula foliar.

A análise da constituição química desse extrato, somente pode ser realizada após derivatização da amostra. Essa etapa baseia-se no desejo de tornar as substancias voláteis para que possa ser feita a análise através de um cromatógrafo à gás (CG). Nesse procedimento, reações de substituição na parte polar do composto são realizadas, tais como reações de alquilação, acetilação e sililação, sendo esta última a técnica mais utilizada, para então tornar os componentes mais voláteis. Separou-se 1,3 miligramas do extrato para este procedimento. 11

Foi pesado 400 microlitros da amostra com o extrato, após isso adicionou-se 10 microlitros de alcano C24 com a concentração de 1mg/ml, onde foram colocados no vidro e secos completamente no nitrogênio. Após remoção do solvente da amostra, foram adicionados 50 microlitros de piridina e 50 microlitros do reagente derivatizador BSTFA (N,O-bis-(trimetilsilil)- trifluoracetamida). O vial lacrado contendo a mistura foi colocado à temperatura de 80ºC em termobloco por 40 minutos (ALLWOOD, et al., 2009). Decorrido o tempo reacional, uma alíquota de 10L da amostra foi injetada em Cromatógrafo a gás, utilizando as mesmas condições cromatográficas descritas no item 3.2.

3.4. Avaliação da atividade alelopática

Bioensaio de sementes e crescimento de plântulas: O bioensaio consiste no segundo nível de estudo alelopático para os extratos, frações ou substâncias e estuda os efeitos das soluções de interesse sobre a germinação das sementes e seu crescimento inicial. Nesse bioensaio procurou-se reproduzir as condições naturais de ação dos constituintes químicos sobre as sementes e, por isso, esses são ministrados em solução aquosa.

Como diásporos de espécies-alvo foi utilizada Allium cepa L. (cebola), modelo representante de monocotiledôneas. Esse bioensaio foi realizado com extratos, frações, substâncias e controles nas concentrações designadas no ensaio de coleóptilos e usuais neste tipo de bioensaio. Assim, as amostras foram dissolvidas em 5µL.mL-1 de dimetilsulfóxido (DMSO) e diluídas em solução tampão de pH 5,6, composta por 10mM de MES (ácido 2-[N-morfolino]- etanossulfônico) e 1mM de hidróxido de sódio, em quantidades suficientes para obter as concentrações adequadas. As seis placas de Petri utilizadas no bioensaio possuíam 4 cm de diâmetro foram forradas com papel de filtro e receberam 1mL de solução da concentração de 0,8 M. dos 4 extratos (2 hexânicos, um proveniente dos ramos e o outro das folhas de A. piranii e 2 metanólicos, um proveniente dos ramos e o outro das folhas de A. piranii) e 10 sementes de cebola em cada pocinho, sendo, quatro pocinhos utilizados 12 totalizando 40 sementes por placa. As placas foram seladas e mantidas em câmara de crescimento, na ausência de luz a 25°C no intervalo de 7 dias para as sementes de cebola. Após esse período, foram realizadas as medidas de porcentagem de germinação e comprimentos iniciais da parte aérea (P.A.) e da raiz (P.S.). Os parâmetros avaliados foram as percentagens de sementes germinadas por placa, o comprimento da raiz e do caule conforme o protocolo descrito abaixo:

Protocolo do Bioensaio de Sementes

Preparou-se as placas de 6 poços com nomes e papel de filtro, onde foi colocado 10 sementes de cebola por réplica. Preparou-se a solução tampão composta por 1,95 g/L de MES (ácido 2-[N-morfolino] etanossulfônico) e 0.04 g/L NaOH, com pH 6.0. Foi usado 6,4 mg do extrato hexânico e extrato metanólico dos ramos e folhas de Anteremanthus piranii, na proporção de 8 ml de tampão e 40 µl de DMSO, formando uma concentração final de 0,8 M.

Controle positivo: foi preparado com 40 µl do Herbicida glifosato, 8 ml de solução Tampão e 40 µl de DMSO (acrescentando-se o proporcional de tampão + DMSO em cada amostra para chegar a concentração 0.8 mg/ml) e distribuiu-se 1 ml de amostra em cada um dos poços das 4 réplicas.

Controle negativo: distribuiu-se 1 ml tampão + DMSO em cada um dos poços das 4 réplicas para 10 sementes por réplica para cebola.

Selou-se com parafilme a lateral das placas e colocou-se as placas em BOD (câmara de cultivo) com 12h de fotoperíodo climatizada à 25 graus. Deixando-as em crescimento durante seis dias para a espécie cultivada.

Cada microplaca representou um tratamento avaliado (extratos ou controle negativo ou positivo) e cada poço da microplaca foi considerado uma repetição deste tratamento (6 repetições). No sétimo dia, as microplacas foram transferidas para freezer (-20°C) por 24 h para, após o descongelamento, facilitando as medidas de crescimento inicial. Então foram retiradas as microplacas do freezer e esperado que as plântulas descongelassem para serem analisadas e com auxílio de uma pinça foram colocadas sobre o 13 escâner. Foram escaneadas em 600 dpi e a imagem salvas em jpeg para então serem movidas para o programa ImageJ®, onde pela foto foi feita a mensuração do tamanho da raiz e do hipocótilo. Após fazer as medições os valores foram transferidos para uma planilha de dados como no Excel® e calculada a média do comprimento das plântulas de cebola.

Tradicionalmente, os ensaios de alelopatia são realizados em placas de Petri com 9 cm de diâmetro, usando cerca de 5 mL de solução de extratos ou de substâncias isoladas para serem testados (WEIDENHAMER et al. 1987; DORNBOS e SPENCER, 1990). Com essas placas, em uma prateleira de uma câmara de germinação convencional (por exemplo, Câmara Germinadora - Fanem® modelo 347-CDG) podem ser abrigadas cerca de 15 placas de Petri. Com o protocolo apresentado, o espaço ocupado pelas placas de seis poços é bastante otimizado, possibilitando a análise de um maior número de réplicas. O espaço ocupado por uma placa de seis poços é equivalente ao ocupado por uma única placa de Petri de 9 cm. Além disso, também, é possível reduzir drasticamente a quantidade de solução de extratos ou de substâncias puras utilizadas. Com os mesmos 5 mL normalmente usados em uma placa de 9 cm são montadas cinco réplicas, visto ser necessário somente 1 mL de solução para cada poço. Neste trabalho foram usados apenas 4 poços com 10 sementes cada. O presente protocolo foi estabelecido utilizando-se alface como espécie alvo modelo, mas pode ser empregado para ensaios com outras espécies que tenham sementes diminutas, tais como cebola e as espécies analisadas por Macías et al. (2000).

3.5. Avaliação da toxicidade frente à Artemia sp. (SOLIS et al. 1993)

Protocolo do Bioensaio frente à Artemia sp.

Preparação das amostras: Foi pesado 2 mg dos extratos metanólico e hexânico diluídos em 20 µL de DMSO, depois ainda acrescentou-se 980 µL de água do mar e colocado no sonicador para secar os solventes por completo. A concentração final no microtubo foi 2 mg/mL. 14

Para diluições seriadas e para o controle negativo, preparou-se uma solução de DMSO 2% em água do mar, onde foram feitas as diluições com esta solução. Para o controle positivo foi usado dicromato de potássio (50, 100, 150 e 200 µg/mL em DMSO 2%) (Sigma- Aldrich).

Preparação da placa: Foi adicionado uma alíquota de 100 µL da suspensão de náuplios em todos os pocinhos e verificado se em algum pocinho tem mais ou menos indivíduos que o previsto no intervalo do ensaio ou se há algum indivíduo morto. Adicionando em sequência, 100 µL de cada amostra dos extratos (250, 500, 1000 e 2000 µg/mL), onde a concentração final do poço do DMSO foi de 0,1% e das amostras de 1 mg/mL. A placa foi colocada novamente em BOD.

Leitura da placa (contagem de indivíduos mortos): Foi visualizado os pocinhos da placa utilizando o estereomicroscópio para ver o número de indivíduos mortos após permanecerem por 24 horas na BOD.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

O material seco foi separado em folhas (419g) e ramos (671g) e submetido à extração com hexano. O extrato bruto das folhas (26,94g); e ramos (8,12g) foi analisado por Cromatografia à Gás acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM) sendo possível caracterizar uma elevada similaridade qualitativa entre a composição química das folhas e ramos, apresentada na Tabela 1.

Nº Componentes Ramos (%) Folhas (%) 1 Acetato de -amirina 8,52 10,72 2 Acetato de germanicol 6,45 8,29 3 Acetato de -amirina 11,02 12,36 4 Acetato de taraxasterila 0,15 1,06 5 Acetato de pseudotaraxasterila 2,83 2,96 6 Acetato de taraxerila 1,77 1,57 7 Friedelina 0,15 - 8 Lupenona 4,48 - 9 Lupeol 4,23 3,40 10 Acetato de lupeíla 39,26 44,68 11 Acetato de cicloartenila 5,29 1,90 12 Heneicosano 8,65 6,34 13 Heptacosano 5,85 1,54 Identificado 98,65 94,82 n-Alcanos 14,50 7,88 Alcoóis triterpênicos 4,23 3,40 Cetonas triterpênicas 4,63 - Ésteres triterpênicos 75,29 83,54

Tabela 1. Componentes químicos, e seu percentual relativo, identificados no extrato em hexano dos ramos e folhas de Anteremanthus piranii.

Para identificar de modo inequívoco os componentes majoritários, o extrato bruto dos ramos foi submetido a análise por RMN 13C obtendo-se os 16 sinais dos constituintes presentes na mistura. Da análise dos dados de massas e RMN 13C e posterior comparação com dados de literatura (AHMAD, 1994) foram confirmadas as identificações dos dois n-alcanos e onze triterpenóides nos extratos hexânicos de A. piranii, os quais são apresentados na Figura 2.

Figura 2. Estruturas das substâncias identificadas nas folhas e ramos de A. piranii

AcO AcO AcO AcO 3 4 1 2

AcO AcO O O 5 6 7 8

(CH2)19 12

(CH2)25 HO AcO AcO 13 9 10 11

Os resultados obtidos corroboram com o perfil metabólico de Vernonieae que, entre as tribos de Asteraceae, destaca-se pela maior ocorrência de triterpenóides (CALABRIA et al., 2009). Em Lychnophorinae esse grupo de componentes é relatado nos gêneros Eremanthus, Lychnophora, Piptolepis e Proteopsis. (RIBEIRO et al., 2010; ABREU et al., 2011)

Os extratos apolares e triterpenos isolados das partes aéreas de Lychnophora pinaster, apresentam componentes semelhantes, tais como o acetato de lupeíla e acetato de α-amirina, que mostraram baixa atividade tripanocida. Porém triterpenos α-amirina isolados de extratos apolares de 17 folhas e caules mostraram efeitos contra Staphylococcus aureus. O acetato de α-amirina não mostrou atividade e supõe-se que a hidroxila livre em C-3 pode estar relacionada com a atividade bactericida deste triterpeno. Os triterpenos lupeol e acetato de lupeol ocorrem naturalmente em muitas plantas, principalmente em Asteraceae e têm demonstrado várias atividades biológicas, tais como antitumoral, antioxidante, citotóxica e diurética (ABREU et al., 2011).

O potencial dos triterpenos isolados de espécies vegetais tem sido verificado in vitro contra inúmeros patógenos e parasitas, tais como formas promastigotas de Leishmania donovani (FOKIALAKIS et al., 2006). Torres- Santos et al. (2004), também estudaram a ação de 11 triterpenos isolados de Pourouma guianensis sobre formas promastigotas de L. amazonensis onde descobriram que triterpenos pentacíclicos com maior número de grupos de hidroxilas apresentavam maior ação anti-promastigotas. Esses resultados obtidos contribuem para informações sobre as espécies e auxiliam na relação do seu uso terapêutico a partir de nossa biodiversidade, visando uma produção de fármacos de origem natural, uso múltiplo e desenvolvimento sustentável.

A presença majoritária de ésteres triterpênicos e n-alcanos, bem como de outros componentes de elevado caráter hidrofóbico pode estar relacionado a uma adaptação metabólica de A. piranii ao estresse hídrico gerado pelo ambiente semiárido da caatinga. Se essa hipótese for plausível, tais componentes estariam alocados na superfície foliar reduzindo, então, a perda não-estomática de água pela espécie. Para verificar essa hipótese, os constituintes químicos presentes na superfície foliar foram extraídos e analisados seguindo a metodologia apresentada no item 3.3. A partir dessa análise foi possível comprovar que os componentes presentes no extrato hexânico das folhas estão alocados na superfície foliar e não internamente na folha, visto que todos os triterpenóides e os dois n-alcanos encontrados no extrato em hexano das folhas foram também extraídos da cera cuticular.

Através dessa análise também foi possível inferir que a extração das ceras cuticulares realizada com diclorometano, solvente de polaridade levemente superior ao hexano, também foi responsável pela ruptura das estruturas dos tricomas visto que inúmeras lactonas sesquiterpênicas, 18 reconhecidamente presentes nos tricomas glandulares de folhas de espécies de Asteraceae (QUEIROZ et al., 2012; NAPAL et al., 2013; WATANABEA et al., 2014; RIAL et al., 2014) foram obtidas através dessa metodologia. As estruturas desses componentes estão em processo de separação cromatográfica e elucidação estrutural.

Os resultados da atividade alelopática com sementes de cebola são apresentados nas Figuras e Tabelas a seguir: Fig. 3. Crescimento das plântulas de cebola submetidas ao extrato Hexânico dos ramos de A. piranii.

Fig. 4. Crescimento das plântulas de cebola submetidas ao extrato Hexânico das folhas de A. piranii.

Fig. 5. Crescimento das plântulas de cebola submetidas ao extrato Metanólico dos ramos de A. piranii.

Fig. 6. Crescimento das plântulas de cebola submetidas ao extrato Metanólico das folhas de A. piranii.

Fig.7. Crescimento das plântulas de cebola do grupo Controle negativo

Fig.8. Crescimento das plântulas de cebola do grupo Controle positivo

Tabela 2. Germinação das sementes de cebola submetidos aos quatro extratos e os controles positivo e negativo. Diferença Quantidade. sobre o Extrato de sementes Controle germinadas Negativo (%) Hexano - Ramo 15 87,5% ↑

Hexano - Folha 9 12,5% ↑

Metanol - Ramo 12 50,0% ↑

Metanol - Folha 16 100,0% ↑

Controle Negativo 8 -

Controle Positivo 3 -

Conforme mostra a tabela 2, há uma aparente interferência positiva na germinação das sementes de cebola tratadas com qualquer um dos quatro extratos frente ao controle negativo. A maior influencia é observada na germinação nas sementes tratadas com o extrato metanólico da folha de A. piranii, para as quais observou-se o dobro de sementes germinadas frente ao controle negativo. 20

Tabela 3. Médias dos crescimentos da raiz e do hipocótilo dos bioensaios.

Raiz Hipocótilo

Extrato Crescimento Dif. Controle Crescimento Dif. Controle médio Negativo médio Negativo (cm) (%) (cm) (%)

Hexano Ramo 0,563 -10,1% 1,744 22,5% ↑

Hexano Folha 0,417 -33,4% 0,917 -35,6% ↓

MeOH Ramo 0,508 -18,9% 1,339 -6,0% ↓

MeOH Folha 0,561 -10,4% 1,194 -16,2% ↓

Controle Negativo 0,626 - 1,424 -

Controle Positivo 0,100 - 0,130 -

Por outro lado, a tabela 3 indica que os extratos das partes aéreas de A. piranii inibem o crescimento das sementes de cebola, com exceção do extrato hexânico dos ramos que, aparentemente, favoreceu o crescimento dos hipocótilos.

Tabela 4. Teste ANOVA sobre o crescimento das raízes.

Qtde. de Soma Média ANOVA obsevações crescimento crescimento Variância (germinações) raiz (cm) raiz (cm)

Hexano Ramo 15 8,442 0,563 0,170

Hexano Folha 9 3,757 0,417 0,182

MeOH Ramo 12 6,097 0,508 0,063

MeOH Folha 16 8,979 0,561 0,089

Controle Negativo 8 5,011 0,626 0,215

Valor de P 0,798

Tabela 5. Teste ANOVA sobre o crescimento dos hipocótilos. Média Qtde. de Soma crescimento ANOVA obsevações crescimento Variância hipocótilo (germinações) hipocótilo (cm) (cm) Hexano Ramo 15 26,159 1,744 0,964

Hexano Folha 9 8,254 0,917 0,294

MeOH Ramo 9 12,048 1,339 0,693

MeOH Folha 16 19,101 1,194 0,364

Controle Negativo 8 11,393 1,424 0,524

Valor de P 0,125

Conforme as tabelas 4 e 5, os testes ANOVA sobre os crescimentos das raízes e dos hipocótilos resultaram em valores de p superiores a 0,05 (respectivamente 0,798 e 0,125). Desta forma, apesar da aparente interferência dos extratos na germinação e no crescimento das sementes de cebola, a análise estatística dos dados obtidos no bioensaio mostra que tais observações não podem ser admitidas com um nível de significância aceitável.

Muitas espécies do cerrado e da caatinga vêm sendo pesquisadas e tais extratos de diferentes partes vegetais têm apresentado ação alelopática no desenvolvimento e no crescimento de plantas alvo (DUKE et al., 2000; et al., 2007). A maioria dos trabalhos relata os compostos alelopáticos agindo como inibidores da germinação e do crescimento (RAWAT et al., 1998; VACCARINI et al., 1999; PERIOTTO et al., 2004). Mas alguns trabalhos demonstraram que alguns compostos podem atuar também como promotores de crescimento (YAMADA et al., 1995; YOKOTANITOMITA et al., 1998; LEÃO et al., 2004). Aparentemente, a maior parte, se não todos os compostos orgânicos que são inibitórios em alguma concentração, são estimulantes em menores concentrações (RICE, 1984; INDERJIT et al., 2006).

A cada ano a comercialização de pesticidas vem crescendo. Juntamente com a inovação das culturas transgênicas, os herbicidas são sintetizados para resistirem a algumas pragas e impedir o florescimento de ervas daninhas no campo. Atualmente, o herbicida glifosato (N-(fosfonometil)glicina), vem sendo 22 intensamente utilizado devido a sua elevada eficiência na eliminação de ervas daninhas. Entretanto, componente do grupo químico da Glicina substituída, C3H8NO5P, pertence em relação a classificação toxicológica à classe II, o que significa que esse produto é altamente tóxico. Após a ingestão de doses elevadas podem causar efeitos agudos e crônicos em seres humanos, tais como dermatite de contato e síndrome tóxica (epigastralgia, ulceração ou lesão de mucosa gástrica, hipertermia, anúria, oligúria, hipotensão, conjuntivite, edema orbital, choque cardiogênico, arritmias cardíacas, edema pulmonar não- carcinogênico, pneumonite, necrose tubular aguda, elevação de enzimas hepáticas, aumento da quantidade de leucócitos, acidose metabólica e hipercalemia. Além disso, podem prejudicar o meio ambiente, dado que este composto não sofre lixiviação devido à forte interação deste composto com o solo, assim como os ambientes aquáticos, onde a toxicidade do glifosato é acentuada com o aumento da temperatura e do pH, principalmente pelo fato da sua fórmula ser rica em Fósforo, o que induz o crescimento e floração das algas, ou seja, deixando-os mais eutrofizados (DINHAM, 1998). Portanto, é importante pesquisar herbicidas com menor potencial de toxicidade, visando uma melhor qualidade do ambiente, dos alimentos e consequentemente da saúde da população.

Recentes estudos estão sendo realizados na tentativa de diminuir o uso de herbicidas comerciais por meio de manejos alternativo de ervas daninhas e pragas, rotação de culturas, sistemas adequados de semeadura entre espécies e entre safras, adubação verde, além de sistemas agroecológicos (WU et al., 2000; KHAN et al., 2002; KATO-NOGUCHI, 2003). Dentro deste contexto a alelopatia pode ser uma alternativa para o manejo de diversas espécies de plantas invasoras, daninhas e pragas agrícolas (SOUZA FILHO, 2006) devido ao seu excelente potencial de interação e importância ecológica, podendo fornecer novas estruturas químicas para produção de bioativos que combatam as pragas e sejam menos danosos ao ambiente. Por isso algumas substâncias químicas naturais têm servido como modelo para obtenção de novos herbicidas.

Além disso, substâncias químicas com atividade alelopática comprovada podem ser concentradas e ter seu efeito alelopático potencializado em 23 laboratório (SOUZA FILHO et al., 2006). A onda de sustentabilidade não deve ser encarada apenas como algo que está na moda, por isso busca-se cada vez mais o aprimoramento de novos produtos químicos de origem natural que causem baixo impacto ambiental, com isso a pesquisa com produtos naturais é cada vez mais estimulada, sendo a alelopatia uma alternativa interessante e viável para obtenção de novas substâncias que venham atender as necessidades atuais e futuras da agricultura (SALVADOR, 2006).

Um caso interessante é o do girassol (Helianthus annuus L., Asteraceae) que é empregado em técnicas de alternância de semeaduras (PELEGRINI, 1985). Pasqualeto et al. (2007) notou, em estudos desenvolvidos no campo, que espécies vegetais infestantes à cultura de soja, podem ser reduzidas quando o girassol é cultivado antes da soja e concluiu que esta redução pode ter ocorrido pela interferência alelopática desenvolvida por resto vegetais do girassol deixada no solo. Tal fenômeno pode ser explicado, pois é comum a presença de metabólitos secundários como fenóis e terpenos em diversas variedades de girassol, substâncias que apresentam funções importantes nos vegetais, que podem agir como compostos de defesa contra insetos, herbívoros e fungos, além, de limitar o crescimento de outras plantas no solo (KUPIDLOWSKA et al., 2006).

Os resultados do teste toxicidade frente à Artemia sp. foram apresentados conforme mostra a Tabela 6.

Tabela 6: Valores de IC50 (mg/mL) para os diferentes extratos analisados frente a Artemia sp. O dicromato de potássio foi usado como controle positivo (IC50 = 0,061 mg/mL).

Extrato IC50 (mg/mL)

Galho Folha

Hexano > 1 > 1 Metanol > 1 > 1 Controle + 0,061 0,061 Controle - > 1 > 1

A figura 9, mostra os indivíduos de Artemia sp. quando visualizados pelo estereomicroscópio após um dia submetidos aos extratos.

Fig. 9. Artemia sp. vista no estereomicroscópio

O valor do IC50 representa a concentração necessária para inibir 50% de indivíduos de Artemia sp. No biensaio realizado com essa espécie animal, foi verificado toxicidade negativa (IC50 > 1), ou seja, os extratos não mataram nenhuma Artemia sp. Esse resultado pode ser um indício de que a planta não é tóxica para modelos animais.

5. CONCLUSÃO

Esse trabalho é o primeiro relato em literatura de um estudo fitoquímico desenvolvido com espécies de Anteremanthus. A presença majoritária de triterpenóides no extrato hexânico das folhas e ramos é compatível com estudos desenvolvidos com outros gêneros da subtribo e da tribo. Conforme os resultados obtidos, todos os extratos favoreceram a germinação das sementes de cebola frente ao controle negativo. Por outro lado, uma vez germinadas, as sementes tratados com os extratos tiveram um menor crescimento médio tanto das raízes quanto dos hipocótilos quando comparadas ao controle negativo, com exceção do extrato hexânico dos ramos que promoveu um maior crescimento médio dos hipocótilos. Os extratos hexânicos das folhas de A. piranii apresentaram melhor resposta alelopática ao crescimento das sementes de cebola causando interferência na evolução das plântulas. Porém, os extratos metanólicos também se mostraram eficientes inibidores do desenvolvimento destas. Esse fato pode ser explicado pela ação dos triterpenóides que atuariam como uma cera, logo impermeabilizando essa semente como uma capsula, impedindo-a de receber água e nutrientes suficientes para seu crescimento adequado. O procedimento de ceras cuticulares detectou os triterpenóides e as lactonas sesquiterpênicas, porém não foi feita análise para a identificação de quais lactonas sesquiterpênicas estão presentes na superfície foliar impossibilitando a conclusão de que estas também podem estar interferindo no crescimento das plântulas de cebola. Apesar dos resultados observados indicarem influência dos extratos na germinação e no crescimento das sementes de cebola, a análise estatística dos dados obtidos no bioensaio mostra que tais resultados não são conclusivos dentro de um nível de significância aceitável. Seria oportuno a realização de novos ensaios para estudar os indícios observados

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