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Caractérisation De La Flore (Fongique, Bactérienne, Acariens) Des

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Caractérisation De La Flore (Fongique, Bactérienne, Acariens) Des Université de Bourgogne - Franche-Comté UFR Sciences Médicales et Pharmaceutiques Ecole doctorale « Environnement, Santé » Année 2015 THESE Pour obtenir le grade de Docteur de l’Université de Bourgogne - Franche-Comté Présentée par Emeline SCHERER Caractérisation de la microflore (fongique, bactérienne, acariens) des logements par QPCR et impact sanitaire Soutenue le 01 décembre 2015 devant le jury composé de Pr Françoise Botterel-Chartier Rapporteur Pr Chantal Raherison-Semjen Rapporteur Pr Laurence Millon Examinateur Dr Jean-Benjamin Murat Examinateur Dr Gabriel Reboux Directeur Dr Sandrine Roussel Co-directeur DEFINITIONS ET LISTE DES ABREVIATIONS AI : Aspergillose Invasive. ATOPIE : Aptitude à présenter, isolées ou associées, un certain nombre de manifestations cliniques « immédiates » (rhinite allergique, asthme bronchique, urticaire, eczéma constitutionnel, allergies alimentaires) et biologique (augmentation des IgE totales ou spécifiques), au contact d’allergènes banals, inoffensifs pour les sujets normaux. Cq : Cycle seuil, nombre de cycles nécessaires pour détecter la fluorescence émise lors d’une analyse par QPCR. Il est inversement proportionnel à la quantité d’ADN présente au départ dans l’échantillon. EBRA-ELFE : Environnement microBiologique et Risque Allergique sous cohorte nichée de la cohorte de l’Etude Française Longitudinale depuis l’Enfance. EDC : Electrostatic Dust Collector, capteur électrostatique à poussière. Dispositif constitué d’une lingette électrostatique permettant le recueil de la poussière. EPA : US Environmental Protection Agency, agence américaine pour la protection de l’environnement et de la santé publique. (http://www.epa.org) ERMI : Environmental Relative Moldiness Index, correspond à un score calculé à partir de la quantification en QPCR de 36 moisissures (26 reconnues comme indicatrice de logements moisis et 10 communes de l’environnement). L’ERMI pourrait permettre d’évaluer si un logement est à risque pour un enfant de développer de l’asthme ou non. LPS : Lipopolysaccharides, composant essentiel de la membrane des bactéries à gram négatif. C’est une endotoxine pyrogène. MALDI-TOF : instrument, spectromètre de masse couplant une source d'ionisation laser assistée par une matrice (MALDI, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation) et un analyseur à temps de vol (TOF, time-of-flight mass spectrometry). Le laser frappe la souche à identifier, associée à une matrice spécifique, les protéines libérées sont ensuite identifiées en fonction de leur masse et leur charge et le spectre obtenu comparé à une base de données pour fournir une identification en quelques minutes. QPCR : quantitative polymerase chain reaction, ou PCR en temps réel, est une méthode permettant l’amplification exponentielle de 2 brins d’un segment d’ADN, au cours d’un cycle de température permettant alternativement la dénaturation de l’ADN, l’hybridation des amorces spécifiques de l’espèce étudiée, et l’élongation par une enzyme : l’ADN polymérase. Les produits d'amplification, peuvent être détectés au fur et à mesure qu’ils s’accumulent, en utilisant l’augmentation de l’émission de fluorescence produite au cours de l’amplification. 1 Résumé Objectifs L’objectif de la thèse est de caractériser par PCR quantitative en temps réel (QPCR) l’environnement fongique, bactérien ainsi que l’exposition à d’autres organismes allergisants (acariens et animaux de compagnie). Cette caractérisation des logements a pour but de mieux comprendre les interactions entre les différents micro-organismes de l’environnement intérieur et leurs relations aux maladies allergiques, dans le cadre d’une étude de grande cohorte. L’objectif secondaire est la mise en place de nouvelles QPCR dans d’autres circonstances sanitaires (infections, PHS) afin de mieux caractériser l’impact des microorganismes de l’environnement. L’ étude EBRA-ELFE L’étude ELFE incluant 18 319 enfants est la première cohorte française qui s’intéresse au développement des enfants de la naissance à leur majorité dans une approche multi-disciplinaire. Une étude nichée EBRA (Environnement microBiologique et Risque Allergique) est centrée sur l’étude microbiologique des poussières dans les chambres d’enfant. Le mode d’échantillonnage (par capteur électrostatique à poussière, EDC) et d’analyse (QPCR) ont été validés et optimisés pour garantir l’acceptabilité du dispositif et la qualité des quantifications. Un panel de 10 cibles (moisissures, acariens, bactéries) sélectionnées pour leur caractère allergisant, toxique, infectieux ou potentiellement protecteur vis-à-vis des maladies allergiques a été initialement utilisé. Ainsi lors de la première collecte à la naissance des enfants en 2011, 3217 CEP ont été quantifiés par QPCR. Les concentrations de six moisissures (Aspergillus fumigatus, Aspergillus versicolor, Alternaria alternata, Cladosporium sphaerospermum, Penicillium chrysogenum, Stachybotrys chartarum), trois groupes de bactéries (Enterobacteriaceae, Mycobacteria et Streptomyces) et un acarien (Dermatophagoïdes pteronissynus) de l’environnement immédiat du nouveau- né ont été obtenues. Ces données ont permis d’identifier six profils de logements différents avec un gradient géographique E-O recouvrant la distribution des sifflements de l’asthme en France. Un deuxième panel de 10 cibles a été choisi et documenté. Il inclut entre autres des cibles « chien » et « chat » pour proposer un test complet comprenant les allergènes principaux des logements. La collaboration avec le groupe ELFE continue et un projet pour une deuxième campagne d’échantillonnage à 5 ans se met en place. L’utilisation de la QPCR pour caractériser d’autres situations à risque La QPCR est un outil de quantification standardisé et reproductible et ses applications sont multiples. Au cours de ce travail de thèse, elle a été utilisée pour caractériser d’autres situations à risque : quantifier la présence de Thermoactinomyces vulgaris dans les aérosols des stations de compostages, détecter la présence d’Aspergillus fumigatus dans des environnements pouvant recevoir des patients immunodéprimés, mettre en évidence la présence d’ADN d’ Aspergillus fumigatus ou de mucorales dans le sérum de patients immunodéprimés. Conclusion Les outils développés et les résultats obtenus pendant la thèse représentent une avancée pour une meilleure connaissance du monde microbien qui nous entoure et contribueront à mieux comprendre les mécanismes de développement des maladies allergiques. Mots clés : PCR quantitative en temps réel, flore intérieure, monde microbien, profil de logements, cohorte, asthme et maladie allergique, développement de l’enfant. 2 SOMMAIRE DEFINITIONS ET LISTE DES ABREVIATIONS ........................................................................... 1 I. INTRODUCTION : BESOIN DE MESURER L’INVISIBLE, DE L’ENVIRONNEMENT A L’INDIVIDU .......................................................................................................................................... 5 1. Caractériser l’environnement .................................................................................................................. 5 1.1. Impact des micro-organismes ............................................................................................................... 5 a. Allergique ............................................................................................................................................... 5 Emergence des maladies allergiques et rôle des micro-organismes ......................................................... 5 Allergies de l’enfant, asthme ..................................................................................................................... 6 Allergie professionnelle, pneumopathies d’hypersensibilité ..................................................................... 7 b. Infectieux ............................................................................................................................................... 8 c. Toxique .................................................................................................................................................. 9 d. Emergence de liens entre micro-organismes et pathologies autres que l’allergie ............................... 9 1.2. Micro-organismes : une flore mal connue, caractéristique d’un environnement ............................... 10 a. Moisissures .......................................................................................................................................... 10 b. Bactéries .............................................................................................................................................. 11 c. Acariens ............................................................................................................................................... 12 d. Blattes .................................................................................................................................................. 13 e. Autres… (pneumocystis, virus) ............................................................................................................ 13 1.3. Méthodes d’échantillonnage et représentativité de l’environnement ............................................... 14 1.4. Méthodes d’analyses et quantification de l’environnement............................................................... 18 2. Etudier un grand nombre d’échantillons pour comprendre les impacts (cohortes) ................................ 21 II. OBJECTIFS DE LA THESE
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