ROBERTO TARAZI

CARACTERIZAÇÃO DA ESTRUTURA GENÉTICA E CONSERVAÇÃO DE POPULAÇÕES NATURAIS DE CANELA-PRETA ( catharinensis MEZ.) NO ESTADO DE

FLORIANÓPOLIS 2006

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS GENÉTICOS VEGETAIS

CARACTERIZAÇÃO DA ESTRUTURA GENÉTICA E CONSERVAÇÃO DE POPULAÇÕES NATURAIS DE CANELA-PRETA (Ocotea catharinensis MEZ.) NO ESTADO DE SANTA CATARINA

Dissertação apresentada à Universidade Federal de Santa Catarina como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de MESTRE EM CIÊNCIAS, área de concentração: RECURSOS GENÉTICOS VEGETAIS.

Orientador: Prof Dr Maurício Sedrez dos Reis Co-orientador: Prof Dr Adelar Mantovani

Roberto Tarazi

Florianópolis Estado de Santa Catarina Maio – 2006

TARAZI, Roberto. Caracterização da Estrutura Genética e Conservação de Populações Naturais de Canela-preta (Ocotea catharinensis Mez.) no Estado de Santa Catarina. / Roberto Tarazi – Florianópolis, 2006.

117p.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Santa Catarina, 2006.

1.Ocotea catharinensis 2. Diversidade genética 3. Demografia 4.Autocorrelação espacial 5.Conservação

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“A educação custa caro, mas a ignorância custa muito mais.” Francisco Gabriel Heidemann

ii Agradecimentos

Ao Profº Dr. Maurício Sedrez dos Reis pela orientação, paciência e por ter sido um verdadeiro pai nos últimos dois anos; Ao Profº Dr. Adelar Mantovani pela amizade, orientação e pelas discussões que engrandeceram a mim e a este trabalho; Ao Profº Dr. Ademir Reis pela amizade e pelos contatos e informações imprescindíveis para a realização deste trabalho; Ao Msc. Biólogo Fernando Bruggemann pela amizade, formação nos anos de iniciação científica e contribuição neste trabalho; À minha família pelo amor e carinho de todos os momentos; À Monita Fiori de Abreu, meu grande amor e companheira, por sua incansável disposição para ajudar; Às famílias Zago da Silva, Hardt de Carvalho e Schivinski pela imensa amizade, imensurável apoio, carinho e por todos os momentos de alegria, paz e descontração; Ao Profº Dr. Ronaldo Antônio Salum pelo exemplo, orientação e apoio incondicional em toda a minha vida; Ao Profº Dr. Benedito Cortes Lopes e Profª Dr. Tânia T. Castellani pela amizade e pelo estímulo na minha vida acadêmica; Ao Herbário “Barbosa Rodrigues” por disponibilizar a área e alojamento do Parque Botânico Morro Baú; À MOBASA, em especial ao Alexandre Marcante, Sandro Basso, Reinaldo e Sr.Elias, por disponibilizarem a área, alojamento, transporte, alimentação e todo o apoio necessário para as coletas em Corupá; Ao Sr. Antônio Alberton e seu filho Josias por disponibilizarem sua propriedade e ajudarem na coleta em Grão-Pará; Ao Hotel Plaza Caldas da Imperatriz pelo apoio e à FATMA por permitir as coletas no PEST; À todos do NPFT e LFDGV pelos momentos de trabalho realizados com muita alegria; Aos amigos que torceram pelo sucesso deste trabalho e foram compreensivos na minha ausência; À CAPES pela concessão da bolsa e ao CNPQ pelo apoio financeiro.

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Índice Lista de Figuras ...... iv Lista de Tabelas...... vi Resumo...... vii Abstract ...... ix Introdução...... 11 Revisão Bibliográfica...... 13 Biologia da Ocotea catharinensis Mez...... 13 Estrutura Demográfica ...... 15 Diversidade Genética e Espécies Tropicais ...... 17 Estrutura Genética Interna...... 21 Hipóteses ...... 24 Objetivo Geral...... 24 Objetivos Específicos...... 24 Material e Métodos...... 25 Áreas de Estudo...... 25 Estrutura Demográfica ...... 30 Caracterização da Diversidade Genética...... 32 Análise dos Dados...... 36 Resultados ...... 42 Estrutura Demográfica ...... 42 Caracterização da Diversidade Genética...... 49 Estrutura Genética das Populações ...... 57 Estrutura Genética Interna...... 65 Discussão...... 69 Estrutura Demográfica ...... 69 Estrutura Genética...... 74 Estrutura Genética Interna...... 83 Conclusões ...... 86 Referências Bibliográficas ...... 87 Anexos...... 98

iv

Lista de Figuras Figura 01 Imagem de satélite da localização das áreas de estudo (•) dentro da provável área de ocorrência da O. catharinensis (▬) no Estado de Santa Catarina...... 25 Figura 02 Imagem de satélite da localização da área de estudo no Parque Estadual da Serra do Tabuleiro e entorno em Santo Amaro da Imperatriz, SC (PEST)...... 27 Figura 03 Imagem de satélite da localização da área de estudo no Parque Botânico do Morro Baú em Ilhota, SC (MB)...... 28 Figura 04 Imagem de satélite da localização da área de estudo na área particular da MOBASA em Corupá, SC (CP)...... 29 Figura 05 Imagem de satélite da localização da área de estudo na área particular do produtor Antônio Alberton em Corupá, SC (CP)...... 30 Figura 06 Representação da distribuição dos indivíduos georeferenciados de O. catharinensis amostrados nas áreas de estudo do Parque Estadual da Serra do Tabuleiro, Santo Amaro da Imperatriz –SC; N = 35)...... 44 Figura 07 Representação tridimensional do relevo e distribuição dos indivíduos georeferenciados de O. catharinensis amostrados nas áreas de estudo do (Parque Estadual da Serra do Tabuleiro, Santo Amaro da Imperatriz –SC; N = 35)...... 44 Figura 08 Representação da distribuição dos indivíduos georeferenciados de O. catharinensis amostrados nas áreas de estudo do Parque Botânico Morro Baú, Ilhota –SC; N = 51...... 45 Figura 09 Representação tridimensional do relevo e distribuição dos indivíduos georeferenciados de O. catharinensis amostrados nas áreas de estudo do Parque Botânico Morro Baú, Ilhota –SC; N = 51...... 45 Figura 10 Representação da distribuição dos indivíduos georeferenciados de O. catharinensis amostrados nas áreas de estudo da propriedade particular da MOBASA, Corupá –SC; N = 49...46 Figura 11 Representação tridimensional do relevo e distribuição dos indivíduos georeferenciados de O. catharinensis amostrados nas áreas de estudo da propriedade particular da MOBASA, Corupá –SC; N = 49...... 46 Figura 12 Representação da distribuição dos indivíduos georeferenciados de O. catharinensis amostrados nas áreas de estudo da propriedade particular de Antônio Alberton, Grão Pará – SC; N = 53...... 47 Figura 13 Representação tridimensional do relevo e distribuição dos indivíduos georeferenciados de O. catharinensis amostrados nas áreas de estudo da propriedade particular de Antônio Alberton, Grão Pará –SC; N = 53...... 47 Figura 14 Distribuição das classes diamétricas dos indivíduos de O. catharinensis amostrados: A. PEST (Parque Estadual da Serra do Tabuleiro, Santo Amaro da Imperatriz –SC; N = 35); B. MB (Parque Botânico Morro Baú, Ilhota –SC; N = 51); C. CP (propriedade particular da MOBASA, Corupá –SC; N = 49); D. GP (propriedade particular de Antônio Alberton, Grão Pará –SC; N = 53); E. SC...... 48 Figura 15 Zimogramas, ainda em gel, para os 12 sistemas enzimáticos (α-EST, ACP, DIA, GOT, GTDH, IDH, MDH, , ME, PRX, PGM, SKDH e SOD) empregados para O. catharinensis...... 52 Figura 16 Esquema dos zimogramas apresentando os fenótipos dos locos α-EST 1, 2 e 3 (EST 1, 2 e 3), ACP 1, DIA 1 e 2, GOT 1 e 2, GTDH 1, IDH 1, MDH 1 e 2, , ME 1, PRX 1 e 2, PGM 1, SKDH 1 e SOD 1...... 53 v

Figura 17 Dendograma das Identidades não viesadas de Nei (1978) obtido através da técnica UPGMA, para 4 populações naturais de O. catharinensis, a partir de indivíduos reprodutivos, empregando-se 16 locos alozímicos...... 61 Figura 18 Análise da estrutura genética interna em uma população natural de O. catharinensis no Parque Estadual da Serra do Tabuleiro, Santo Amaro da Imperatriz, SC...... 65 Figura 19 Análise da estrutura genética interna em uma população natural de O. catharinensis no Parque Botânico Morro Baú, Ilhota, SC...... 66 Figura 20 Análise da estrutura genética interna em uma população natural de O. catharinensis na propriedade particular da MOBASA, Corupá, SC...... 67 Figura 21 Análise da estrutura genética interna em uma população natural de O. catharinensis na propriedade particular de Antônio Alberton, Grão Pará – Linha Braga, SC...... 68 vi

Lista de Tabelas Tabela 1 Distância geográfica (km) entre as áreas de estudo de populações naturais de O. catharinensis Mez., no Estado de Santa Catarina ...... 26 Tabela 2 Sistema de tampão eletrodo/gel testado para eletroforese de isoenzimas em O. catharinensis Mez...... 32 Tabela 3 Sistemas enzimáticos (coloração) testados para eletroforese de isoenzimas em O. catharinensis Mez...... 33 Tabela 4 Solução extratora número 1 de Brune et al. (1998, p.96), empregada para extração das enzimas de tecidos foliares de O. catharinensis Mez...... 35 Tabela 5 Estrutura demográfica de diferentes populações naturais de O. catharinensis Mez. no Estado de Santa Catarina, avaliado a partir de indivíduos de DAP> 5cm...... 43 Tabela 6 Resultados obtidos para as combinações tampão eletrodo/gel, sistemas enzimáticos e camadas do gel testadas para eletroforese de isoenzimas em populações naturais de O. catharinensis Mez...... 50 Tabela 7 Freqüências alélicas para 18 locos alozímicos em quatro populações naturais de O. catharinensis Mez ...... 55 Tabela 8 Índices de diversidade genética dos indivíduos em populações naturais de O. catharinensis Mez...... 57 Tabela 9 Estimativas das Estatísticas F de Wright e do fluxo gênico aparente ...... 58 Tabela 10 Estimativas dos coeficientes de coancestralidade para 4 populações naturais de O. catharinensis, empregando 16 locos alozímicos...... 60 Tabela 11 Distâncias Genéticas (diagonal superior) e Identidade Genética (diagonal inferior) não viesadas de Nei (1978) para indivíduos reprodutivos de quatro populações naturais de O. catharinensis. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005...... 61 Tabela 12 Estimativa do fluxo gênico aparente Nˆm (diagonal superior) e divergência entre populações FST (diagonal inferior) para indivíduos reprodutivos de quatro populações naturais de O. catharinensis. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005...... 62 Tabela 13. Área mínima viável para quatro populações de O. catharinensis no Estado de Santa Catarina...... 64 Tabela 18 Análise da estrutura genética interna em uma população natural de O. catharinensis no Parque Estadual da Serra do Tabuleiro, Santo Amaro da Imperatriz, SC...... 65 Tabela 15 Análise da estrutura genética interna em uma população natural de O. catharinensis no Parque Botânico Morro Baú, Ilhota, SC...... 66 Tabela 16 Análise da estrutura genética interna em uma população natural de O. catharinensis na propriedade particular da MOBASA, Corupá, SC...... 67 Tabela 17 Análise da estrutura genética interna em uma população natural de O. catharinensis na propriedade particular de Antônio Alberton, Grão Pará – Linha Braga, SC...... 68 Tabela 18 Dados sobre cinco populações de O. catharinensis Mez na Floresta Ombrófila Densa, estudadas em diferentes Comunidades e Zonações no Município de Brusque, SC, por Veloso & Klein (1959)...... 69 Tabela 19 Índices de diversidade genética em utilizando locos alozímicos...... 75 vii

Resumo

O. catharinensis Mez. é uma árvore nativa, monóica, com flores hermafroditas, dispersão zoocórica e ameaçada de extinção, que ocorre na Floresta Ombrófila Densa nos Estados da região Sul e Sudeste do Brasil. Estudos demográficos e o entendimento da distribuição da variabilidade genética entre e dentro de populações permitem melhor orientação das práticas de restauração, conservação e manejo de uma espécie. Este trabalho teve por objetivo contribuir para a definição de estratégias de conservação em populações naturais de O. catharinensis a partir da avaliação da estrutura demográfica, estrutura genética e estrutura genética interna. Para isto, foram amostrados indivíduos reprodutivos (DAP ≥ 5cm) em quatro populações naturais de O. catharinensis no Estado de Santa Catarina: Parque Estadual da Serra do Tabuleiro (PEST), Santo Amaro da Imperatriz, SC (27o44’43”S, 48o49’13”W), Parque Botânico do Morro Baú (PMB), Ilhota, SC (26o47’56”S, 48o55’49”W), Área Particular da MOBASA (CP), Corupá, SC (26º25’06”S, 49º22’02”W) e Área Particular do Produtor Antônio Alberton (GP), Grão Pará, SC (28º14'17”S, 49º17’40”W). O estudo da estrutura demográfica foi realizado a partir do georeferenciamento destes indivíduos nas populações. Obteve-se para a O. catharinensis uma densidade média para o Estado de Santa Catarina de 7 indivíduos por hectare, densidade inferior a registrada para a espécie em estudos realizados na década de 1950. Foi encontrada para a O. catharinensis uma distribuição espacial agregada e similar nas quatro populações estudadas. Sugere-se que esta distribuição agregada nos indivíduos adultos seja conseqüência da possível dispersão e deposição de sementes de maneira agrupada realizados pela fauna, especialmente por primatas (Cebus apella e Alouatta spp). A estrutura genética das quatro populações de O. catharinensis foi investigada utilizando-se 18 locos alozímicos. As estimativas do número médio de alelos por loco (2.2), percentagem de locos polimórficos (83.3%) e a diversidade genética (0.4265), foram similares às obtidas para outras espécies de Lauraceae. A endogamia detectada nas populações ( fˆ = -0.0114) e a endogamia total ( Fˆ = 0.1330) sugerem estrutura nas populações; foi ˆ encontrada uma alta divergência entre as populações (θ P = 0.1428). Sugere-se que a divergência populacional está relacionada à migração e dispersão de sementes realizadas pelos dispersores da O. catharinensis, e associado com a paisagem e as distâncias entre as populações. O resultado obtido da estimativa do tamanho mínimo viável de cada população revelou a possibilidade de sobrevivência de 10 gerações de O. catharinensis, nos locais amostrados. Contudo, a área atual dos fragmentos amostrados mostrou-se insuficiente quando comparada a área mínima viável para viii conservação destas populações (64ha) por mais de 10 gerações. A análise de autocorrelação espacial evidenciou a presença de uma estrutura interna nas primeiras classes (até 100m), sugerindo a presença de uma estrutura familiar. Os resultados do presente estudo sugerem que a dispersão das sementes da espécie, que ocorre de forma zoocórica, também seja o principal fator responsável pela estruturação dentro das populações. Os presentes resultados sugerem que as estratégias para a conservação in situ da O. catharinensis devem ser intensificadas em diferentes populações localizadas em floresta climáxica entre cotas de 300 a 900m de altitude e que a conectividade dos fragmentos de floresta climáxica tem que ser restabelecida para a manutenção do fluxo gênico e para contrapor um futuro aumento da divergência entre as populações. Palavras chave: Demografia; diversidade genética; autocorrelação espacial, conservação. ix

Abstract

O. catharinensis is a native, endangered of the Brazilian occurring from the South to the Southeastern regions of Brazil. It is monoecious with flowers and its fruits are dispersed by animals. Demographic studies as well as the understanding of the genetic variability among and within populations allow better practices of restoration, conservation and management of a species. The objective of this work was to contribute for a definition of conservation strategies in natural population of O. catharinensis based on the evaluation of the demographic structure, genetic structure and the spatial genetic structure. For this purpose, reproductive individuals (DBH ≥ 5cm) were sampled in four natural populations of O. catharinensis in Santa Catarina State: Parque Estadual da Serra do Tabuleiro (PEST), Santo Amaro da Imperatriz, SC (27o44’43”S, 48o49’13”W), Parque Botânico do Morro Baú (PMB), Ilhota, SC (26o47’56”S, 48o55’49”W), Private area of MOBASA (CP), Corupá, SC (26º25’06”S, 49º22’02”W) and Private area of Mr. Antônio Alberton (GP), Grão Pará, SC (28º14'17”S, 49º17’40”W). Demographic structure was studied using georeferenced data of individuals in populations. The estimated density of O. catharinensis in the studied sites was 7 individuals per hectare, which in turn is lower than previous studies of this species performed in the decade of 1950. A similar and aggregated spatial distribution was observed in the four studied populations. It is suggested that the aggregated distribution of adult individuals may be a consequence of dispersion and deposition of seeds in an aggregated form carried out by the fauna, specially by primates (Cebus apella e Alouatta spp). Genetic structure of four O. catharinensis populations was investigated using 18 allozyme loci. Estimates of average number of alleles per loci (2.2), percentage of polymorphic loci (83.3%) and genetic diversity (0.4265), were similar to those recorded for other Lauraceae species. The inbreeding within populations ( fˆ = -0.0114) and the total inbreeding ( Fˆ = 0.1330) suggests a population structure; once a high

ˆ level of divergence among populations (θ P = 0.1428) was also detected. It is suggested that population divergences is related to migration and seed dispersal carried out by O. catharinensis disperser, associated with landscape and distances among populations. The estimated minimum viable population size of each sampled population reveled for O. catharinensis a survival of at least 10 generations. Nevertheless, the actual area of the sampled forest fragments is showed to be insufficient when compared to the minimum viable area (64ha) for the survival of at least 10 generations. The analysis of spatial genetic autocorrelation demonstrated the presence of internal x structure in the first distance classes (up to 100m), suggesting the presence of a family structure. This study suggests that O. catharinensis seed dispersion, done by animals, is the probable factor responsible for the spatial genetic structure. These results suggest that in situ conservation strategies must be intensified in different populations located in mature forest between 300 to 900m and the connectivity between the mature forest fragments must be reestablished for the gene flow maintenance and to withstand a future gain of divergence among populations. Keywords: Demography, genetic diversity, spatial autocorrelation; conservation. 11

Introdução

A espécie O. catharinensis Mez. (Lauraceae), conhecida popularmente com o nome de canela-preta, é nativa da Floresta Atlântica (Floresta Ombrófila Densa), de ocorrência natural nos Estados de Minas Gerais, Paraná, , , Santa Catarina e São Paulo. É uma espécie perenifólia, climáxica, podendo atingir, excepcionalmente, 45m de altura e 150cm ou mais de diâmetro a altura do peito (DAP) (Carvalho, 1994). Esta espécie possuiu importância econômica pela produção de madeira, sendo o principal produto a madeira serrada e roliça, muito utilizada em marcenaria para o uso interior e exterior, construção naval e civil, tacos, móveis, assoalhos, laminação, compensados e moirões. Também foi importante, como outras espécies da família Lauraceae, pela produção de óleos essenciais. Foram identificados 10 componentes do óleo essencial da casca de O. catharinensis, sendo o linalol (95,7%) o principal componente (Carvalho, 1994). A canela-preta era a árvore mais comum e característica da Floresta Ombrófila Densa (FOD) em Santa Catarina e chegou a representar 1/3 do volume de todas as madeiras existentes em um hectare (Reitz et al., 1978). Devido à importância econômica, esta espécie foi intensamente explorada desde a década de 40. Este intenso extrativismo, aliado à expansão das fronteiras agrícolas ocasionou a redução do número de indivíduos e das populações. Atualmente, esta espécie encontra-se ameaçada de extinção (Port.37N-IBAMA, 1992, Varty & Guadagnin, 1999) e está inserida na Lista Vermelha de espécies ameaçadas de extinção - "Red List" - da União Internacional para Conservação da Natureza e Recursos Naturais (I.U.C.N) (2003) na categoria vulnerável de extinção. Espécies inseridas nesta categoria necessitam urgentemente do estabelecimento de programas de conservação. Nos últimos anos, a preocupação com a proteção da diversidade genética de espécies, tornou-se prioridade para os planos de conservação, cujo objetivo é manter em longo prazo a viabilidade evolutiva destas espécies. O conhecimento da variação genética é um requisito fundamental para a conservação in situ e formação de bancos de germoplasma, auxiliando no desenvolvimento de estratégias que visam à conservação, o manejo sustentável e melhoramento das espécies. Nesse contexto torna-se imprescindível gerar informações relacionadas com variabilidade genética dos poucos núcleos restantes da canela-preta (O. catharinensis Mez.). Para isso, o conhecimento da biologia da espécie, da dinâmica e estrutura das populações são fatores 12 importantes para que se promova uma conservação genética eficiente, proporcionando à espécie e ao ecossistema a expressão de seu potencial evolutivo. Além disso, o conhecimento da magnitude e a organização da variabilidade genética determinam o tamanho, a localização das áreas e a necessidade de expansão da base genética (Guerra & Reis, 1999). Para O. catharinensis Mez. existe apenas um estudo preliminar da caracterização genética em uma população natural (Tarazi et al., 2003). Portanto, para o estabelecimento de um programa eficiente de conservação da O. catharinensis, ainda são necessários mais estudos sobre a biologia, estrutura demográfica e genética de populações. Neste sentido, o presente trabalho incluiu avaliação de populações in situ, coleta de material e a caracterização genética de quatro populações naturais de O. catharinensis em Santa Catarina no intuito de investigar os fatores que interferem na diversidade e estrutura genética da espécie. Tais estudos foram realizados com a finalidade de contribuir para a definição de estratégias de conservação em populações naturais de O. catharinensis. 13

Revisão Bibliográfica

Biologia da Ocotea catharinensis Mez.

A ordem comprende sete famílias, com aproximadamente 85 gêneros e pelo menos 2400 espécies (Renner, 1999). Esta ordem apresenta grande interesse filogenético por ser uma das ordens mais antigas de plantas florescentes (Renner, 1999). As Lauraceae estão entre as famílias mais importantes desta ordem, com 50 gêneros e um estimado de 3000 espécies (Renner & Chanderbali, 2000), sendo estas espécies de difícil identificação taxonômica (Baitello, 2001). O. Aublet é o maior gênero da família Lauraceae na região Neotropical, com cerca de 350 espécies, a maioria nas Américas tropical e subtropical. Estima-se que no Brasil ocorra entre 120 a 160 espécies (Baitello, 2001). É o gênero menos definido da família e muito variável servindo como depósito de espécies que não são prontamente acomodadas em outros gêneros (Baitello, 2001). O gênero Ocotea caracteriza-se por flores trímeras bissexuadas, polígamas ou unissexuadas, com nove estames, estéreis nas flores pistiladas, anteras 4-loceladas, esporângios arranjados em dois pares sobrepostos ou raramente, os locelos superiores entre os inferiores, formando um arco fechado, filetes pouco mais longos que as anteras a ausentes, estames da terceira série com um par de glândulas na base dos filetes, glândulas em geral globosas ou reniformes, estaminódios da quarta série ausentes a conspícuos, nunca claramente sagitadas, nas flores estaminadas ovário bem desenvolvido a ausente, fruto sobre cúpula de tamanho e forma variadas (Baitello, 2001). A O. catharinensis Mez. (espécie tipo coletada em Santa Catarina) é uma árvore monóica de 25 - 45m de altura e 60 - 150cm de diâmetro na altura do peito (DAP). Apresenta folhas opostas, simples, inteiras, coriáceas, oblongo-lanceoladas ou lanceoladas, bem acuminadas, porém o acúmen obtusiúsculo, em cima nítidas e obscuramente reticulada-venosas, em baixo dotadas de retículo mais proeminente, glabras, medem comumente entre 6 - 10cm de comprimento, por 2 à 3cm de largura. Nas axilas das nervuras basais existem domácias, as quais na face superior são abauladas e na inferior mostram-se cobertas de pêlos alvacentos conspícuos. Pecíolo quase plano superiormente, glabro muito curto cerca de 1cm de comprimento (Reitz et al., 1978). Suas inflorescências em racemos pequenos axilares, 1 - 3cm, muito mais curto do que as folhas, paucifloras. Flores hemafroditas com lobos perigonais triangulares, por fora um tanto, por 14 dentro muito vilosas, cerca de 2mm de comprimento. Estames externos com filetes quase do mesmo comprimento das anteras, estas suborbiculares, anteras internas mais estreitas. Apresenta glândulas globosas e sésseis, estaminódios centrais, pequeninos, vilosos, no ápice atenuados, estigma capitado, receptáculo densamente revestido de pêlos fulvo-seríceos. O fruto, uma baga elipsóide, pardo escuro, enrugado, com 20 - 25 X 10 - 15mm, envolvido pela cúpula até perto da metade. Cúpula hemisférica, negra, crassa, cerca de 10 X 15 - 18mm, lisa ou com verrúculos esparsos (Reitz et al., 1978). A O. catharinensis é nativa do Brasil e ocorre em Minas Gerais (Carvalho et al., 1995), no Paraná (Vattimo, 1979b; Inoue et al., 1984; Roseira, 1990; Socher et al., 2000), no Rio de Janeiro (Vattimo, 1979a), no Rio Grande do Sul (Vattimo, 1979b; Reitz et al., 1983; Possamai et al., 1998), em Santa Catarina (Reitz et al., 1978) e no Estado de São Paulo (Vattimo, 1979a; Cavassan et al., 1984; Pagano et al., 1987; Custódio Filho et al., 1992). Esta espécie abrange áreas desde latitudes de 21º20' S (Minas Gerais) (Carvalho, 1994) a 30º15' S (Rio Grande do Sul), e altitudes de 30m (litoral da Região Sul) até 1.400 m de altitude, no Paraná (Roderjan, 1994), sendo comum entre 300 a 700m de altitude (Reitz et al., 1978). A O. catharinensis é encontrada na Floresta Ombrófila Densa nas formações Alto Montana (Roderjan, 1994; Socher et al., 2000), Montana (Roderjan, 1994) e Submontana (Bigarella, 1978), onde é árvore característica e já representou a terceira espécie em volume de madeira por hectare no Paraná (Carvalho, 1994) e em Santa Catarina (Reitz et al., 1978). É mais abundante no alto das encostas e pouco freqüente na planície litorânea. Também é encontrada, em menor freqüência, na Floresta Ombrófila Mista Montana (Floresta com Araucária), infiltrando-se nos capões com Araucaria angustifolia do primeiro planalto paranaense, como em Curitiba - PR (Roseira, 1990). Foi abundante nas grandes disjunções de Araucaria no vale do rio Itajaí-açu, em Santa Catarina (Veloso et al., 1991). Na região de Porto Alegre - RS é encontrada nos morros graníticos, na Floresta Estacional Semidecidual (Possamai et al., 1998). A O. catharinensis é uma árvore essencialmente climáxica, onde apresenta regeneração natural em vários estratos. Domina grande parte do estrato superior da floresta, encontrando-se em todos os estágios de desenvolvimento (Reitz et al., 1978; Klein, 1979). A O. catharinensis assim como outras espécies da família Lauraceae na Mata Atlântica apresenta uma grande interação com a fauna, uma vez que disponibiliza uma grande quantidade de alimento durante o período de florescimento e frutificação (Moraes & Paoli, 1995; 1999, Galetti et al., 1997). Apesar de não existirem trabalhos específicas sobre a polinização da O. 15 catharinensis, há relatos sobre a polinização na família Lauraceae que é realizada por pequenos insetos como vespas, abelhas, coleópteros e moscas (Reitz et al., 1978; Chung et al., 2000). Os principais prováveis dispersores da O. catharinensis são primatas (Cebus apella e Alouatta spp) (Moraes & Paoli, 1995) e aves (Pipile jacutinga) (Galletti et al., 1997). As sementes de O. catharinensis germinam melhor sob condições de umidade maior do solo (Moraes & Paoli, 1995). Num estudo realizado em mata primária no Parque Estadual de Carlos Botelho, SP, na Floresta Ombrófila densa Sub-Montana, Moraes & Paoli (1999) constataram que plântulas de O. catharinensis se estabelecem na sombra, independente da formação de clareiras para seu desenvolvimento, apresentando inúmeros juvenis no sub-bosque. Os mesmos autores observaram a deposição dos frutos sob árvores-mãe de O. catharinensis e verificaram que em declives inferiores a 10% a densidade média ao redor da planta-mãe foi de 12 plântulas/m2 e quando os declives eram superiores a 20% esta densidade média foi de 1 a 3 plântulas/m2, a 5m da árvore-mãe.

Estrutura Demográfica

Para a compreensão de aspectos de ecologia visando a elaboração de propostas sobre o manejo e conservação de espécies vegetais muitos estudos têm sido realizados a partir de dados de estrutura demográfica (Alvarez-Buylla et al., 1996). Estes são gerados a partir da densidade e idade de indivíduos, distribuição espacial, distribuição diamétrica e associações com fatores edafoclimáticos (Alvarez-Buylla et al., 1996). Os estudos sobre estrutura demográfica são de grande importância para o desenvolvimento de práticas de manejo, avaliação da viabilidade econômica e compreensão dos padrões de distúrbio dentro das florestas tropicais (Fantini et al., 1992; Reis et al., 1996; Martinez-Ramos & Alvarez-Buylla, 1998; Boll et al., 2005). Para a obtenção de dados de estrutura demográfica a metodologia de amostragem na forma de parcelas e demais metodologias, que envolvem balizamento são as mais utilizadas a várias décadas (Veloso & Klein, 1959; Clark & Clark, 1984; Condit, 1995; Condit et al., 2000). Entretanto, estes métodos são muito trabalhosos e de difícil aplicação em florestas densas, comuns dos trópicos (Dominy & Duncan, 2001). Portanto, desde 1995 vários autores têm utilizado a tecnologia GPS (Global Positioning System) para este fim (Dominy & Duncan, 2001). A adoção da tecnologia GPS ocorre, pois a mesma permite que muitos indivíduos sejam 16 mapeados em curto tempo, e em grandes áreas. Wadt et al. (2005) chegaram a mapear uma área de 420 ha num estudo de estrutura demográfica de Bertholletia excelsa. A análise da estrutura demográfica permite que a dinâmica de populações naturais seja estudada e, sendo assim, os fenômenos dependentes da densidade de plantas, como a interação com patógenos, mortalidade, competição e sucessão de comunidades vegetais sejam desvendados (Gilbert, 2002). Quanto maior a densidade de plantas numa população, maior é a competição intraespecífica, maior é a susceptibilidade à patógenos e, conseqüentemente maior é a mortalidade (Gilbert, 2002). Neste sentido, há um maior espaçamento entre os indivíduos adultos que sobrevivem (Janzen,1970; Connell, 1971). Moraes & Paoli (1995) na tentativa de avaliar hipótese de Janzen-Connell encontraram sob árvores-mãe de O. catharinensis uma grande quantidade de sementes em deterioração causada por fungos que impediram a formação do “tapete” de plântulas. Contudo, os mesmos autores não obtiveram dados demográficos de indivíduos adultos para inferir sobre a distribuição espacial dos sobreviventes. O recrutamento de plantas, a distribuição espacial e a viabilidade das populações são fortemente influenciados pela dispersão e o padrão de deposição de sementes (Clark et al, 2001). Os benefícios da dispersão de sementes normalmente incluem a redução dos níveis de predação, o aumento nos índices de germinação de sementes e a colonização de novos habitats (Clark et al, 2001). Neste sentido Reis et al. (1996) relataram que para Euterpe edulis a dispersão de sementes afetou a distribuição espacial da espécie. Assim como para outras espécies da floresta tropical, Fragoso & Huffman (2000) e Fragoso et al. (2003) trabalhando com Maximiliana maripa e Enterolobium shomburgkii verificaram que a distribuição de indivíduos numa população poderia ser mais agregada ou mais aleatória caso a dispersão de sementes fosse realizada por mamíferos ou por aves, respectivamente. A hipótese de Janzen (1970) e Connell (1971) engloba grande parte dos fatores anteriormente mencionados, uma vez que explica a manutenção da diversidade nas florestas tropicais através da interação de alguns efeitos: dispersão de sementes a partir da planta-mãe, sobrevivência de propágulos dependente da distância deste parental e densidade local de indivíduos. Diversos autores relataram que a hipótese de Janzen-Connell foi o fundamento principal para as discussões sobre conservação e distribuição espacial de espécies vegetais das florestas tropicais (Condit, 1995; Gilbert et al., 2001; Condit, et al., 2002; Hyatt, 2003). Além da densidade populacional, a distribuição diamétrica também permite inferências sobre o recrutamento de indivíduos, a qual pode originar os “gargalos” populacionais. Neste caso, 17 a forma de distribuição “J”- invertido indica que há uma pequena quantidade de indivíduos de grande porte e uma grande quantidade de indivíduos de pequeno porte. Este padrão de distribuição diamétrica representa a sobrevivência das plantas mais aptas, as quais constituem os indivíduos que irão repor os regenerantes (Harper, 1981; Reis et al., 1996). Eventos climáticos (ventos intensos, enchentes e mudanças bruscas de temperatura) também influenciam negativamente na densidade populacional, pois tornam as plântulas predispostas a patógenos Gilbert et al. (2001). Não se pode desconsiderar a exploração madeireira e o avanço das fronteiras agrícolas na redução da densidade populacional de espécies como a O. catharinensis. Segundo Veloso & Klein (1959) a ação antrópica sobre as comunidades vegetais tende a reduzir a quantidade de indivíduos numa área e estes efeitos podem perdurar por mais de um século. A redução de indivíduos adultos por corte seletivo pode causar abalos na estrutura populacional, diminuindo a quantidade de regenerantes numa população (Reis et al., 1996). Neste contexto Reis et al. (1996) relatam que a exploração de plantas adultas reprodutivas de Euterpe edulis compromete a manutenção de populações naturais em um longo prazo pela redução no recrutamento de plantas jovens. A distribuição espacial de espécies pode ser influenciada pelo relevo e solo. Itoh (1997) encontrou para duas espécies emergentes da floresta tropical malaia diferenças na estrutura das populações, observadas em locais íngremes com solo arenoso e em um vale com solo argiloso. Hirayama & Sakimoto (2003) também relataram em seus estudos com coníferas que a declividade influenciou significativamente a distribuição espacial da espécie. Diante do exposto vale salientar que segundo Oyama (1993) e Reis (1996) a interação de estudos demográficos e genéticos é de grande importância, pois esta interação apresenta informações precisas que auxiliam no manejo e conservação de espécies arbóreas tropicais.

Diversidade Genética e Espécies Tropicais

O conceito de diversidade genética proposto por Nei (1973), refere-se ao nível de heterozigosidade (H) de uma população obtido a partir das freqüências alélicas desta. Segundo Reis (1996a), este valor é o complemento da identidade genética, ou a probabilidade de não identidade e equivale à quantidade de heterozigotos esperada (heterozigosidade) em uma população de cruzamentos ao acaso (panmítico). Desta forma, independente de efeitos de 18 migração, seleção, mutação, ou sistema reprodutivo, este valor permite uma idéia do nível de variação genética em uma população de uma determinada espécie. Segundo Reis (1996a) além da heterozigosidade, têm sido empregados a percentagem de locos polimórficos (P) e número médio de alelos por loco (A), com índices de diversidade em populações naturais, no sentido de caracterizar e comparar os níveis de variação genética nestas populações. Para a caracterização da estrutura genética são geralmente utilizadas duas abordagens: a análise da diversidade em populações subdivididas (Nei, 1973), as estatísticas de F de Wright (Wright, 1951; 1965) estimados a partir de Nei (1977) ou empregando os coeficientes de coancestralidade de Cockerham (Cockerham, 1969). Entende-se como estrutura genética, a distribuição da variabilidade genética manifestada entre populações geograficamente distintas, dentro de um grupo, ou mesmo nos indivíduos de uma progênie, entre e dentro populações naturais. Em espécies tropicais, Hamrick & Loveless (1986) analisaram 29 taxa da floresta semidicídua do Panamá através de 20 sistemas enzimáticos, concluindo que as mesmas apresentavam uma heterozigosidade média por espécie (He) de 0.111, variando de 0 a 0.216. Para outras 38 espécies tropicais, Hamrick et al. (1992) mencionam que a heterozigosidade média (He) foi de 0.191, com 57.9% de locos polimórficos. Para espécies da Floresta Tropical Atlântica os valores de diversidade genética (He) foram desde 0.085 para Araucaria angustifolia (Auler et al., 2002) até 0.536 para Cryptocarya aschersoniana Mez. (Lauraceae) (Moraes et al., 2002). Usando marcadores alozímicos, Kageyama et al. (2003) encontraram altos índices de diversidade genética (He = 0.360) em duas populações de O. odorífera, com média de 2.36 alelos por loco (A), 67.8% de locos polimóficos (P) e 0.005 de endogamia (F). Silva et al. (2003) encontraram para uma população natural de O. porosa, uma média de 2.07 alelos por loco (A),

71.43% de locos polimórficos (P), uma diversidade genética de 0.301 (He) e 0.067 de endogamia (F). Para Crypotocarya aschersoniana, outra Lauraceae da Floresta Ombrófila Densa, Moraes & Derbyshire (2002) encontraram uma média de 2.74 alelos por loco (A), 95.12 % de locos polimóficos (P), uma diversidade genética de 0.536 (He) e endogamia significativa (F = 0.395). Numa população natural de O. catharinensis, em um estudo preliminar, Tarazi et al. (2003) encontraram uma média de 2.13 alelos por loco (A), 87.5% de locos polimóficos (P), uma diversidade genética de 0.336 (He) e excesso de heterozigotos F = -0.1667. 19

O uso de marcadores alozímicos tem proporcionado grandes avanços para quantificar os eventos que determinam a estrutura genética em populações naturais, permitindo avaliar a movimentação de alelos nestas populações: efeito de deriva genética, sistema reprodutivo, fluxo gênico, níveis de endogamia, fornecendo com isto subsídios para determinar estratégias de manejo e conservação das mesmas (Reis, 1996). A eletroforese de isoenzimas tem sido a principal técnica utilizada em estudo de populações naturais de plantas. A capacidade para observar a variação alélica em locos isoenzimáticos tem direcionado pesquisas nas áreas de genética de populações e evolução. É amplamente empregada na área florestal, como marcadores genéticos para determinar a diversidade genética dentro e entre populações naturais e sua vulnerabilidade, além de determinar as ligações gênicas, ambos no auxílio na seleção de plantas com características desejadas e conservação de populações naturais (Alfenas, 1998). Esta técnica tem sido usada com êxito, na quantificação da diversidade genética, taxa de cruzamento, taxa de endogamia e fluxo gênico em populações de espécies tropicais (O´Malley & Bawa, 1987; Bawa, 1992; Hall et al., 1996; Moraes et al., 1999; Seoane et al, 2000; Moraes & Derbyshire, 2002; Mariot, 2002; Sebbenn et al., 2003; Kageyama et al., 2003). Na conservação genética uma medida importante é o tamanho efetivo de populações (Ne). O Ne representa o tamanho de uma população ou vizinhança que apresenta a mesma redução na variabilidade genética pela endogamia ou deriva de uma população de referência, panmítica, de tamanho finito N (Crow & Kimura, 1970; Crossa & Vencovsky, 1999). O Ne relaciona-se com a representatividade genética das populações (Vencovsky, 1987; Sebbenn et al., 2000). O tamanho efetivo de uma população depende do número de indivíduos que efetivamente participam na reprodução de suas contribuições relativas para a geração seguinte (Crossa & Vencovsky, 1999). O tamanho efetivo pode ser estimado para uma população adulta, uma população estruturada de progênies, várias populações, populações em várias regiões e acessos de um banco de germoplasma. Para a compreensão desta estimativa é necessária uma população referência definida (Sebbenn, 2001). Franklin & Soule (1981) sugere como referência um tamanho efetivo mínimo de 50 indivíduos por população para manter em curto prazo o valor adaptativo. O tamanho efetivo é dependente dos níveis de endogamia e parentesco existentes nas amostras, sendo que quanto maiores estes níveis, menor é a representatividade genética da amostra (Vencovsky, 1997). O Ne é afetado pelo número desigual de indivíduos masculinos e femininos, variação no tamanho das progênies, flutuações temporais no tamanho da população, 20 sobreposição de gerações, presença de estruturação e endogamia dentro das populações e assincronismo no florescimento (Wright, 1969; Loveless & Hamrick, 1984 e Lande, 1988). Além desses fatores, a apomixia e a reprodução vegetativa também influenciam o Ne (Sebbenn, 2001). A manutenção de um tamanho efetivo populacional adequado diminui a probabilidade de ocorrência das oscilações genéticas e da endogamia. Quanto maior o tamanho efetivo menor será a magnitude da deriva genética e maior probabilidade de as freqüências alélicas permanecerem próximas da população de origem (Ellstrand & Elam, 1993). Flutuações nas freqüências alélicas podem resultar em aumento na diferenciação entre subpopulações e na redução da variabilidade genética em pequenas populações (Falconer, 1989). Da mesma forma, quanto maior o tamanho efetivo menor será o nível de endogamia da população. O nível de endogamia (F) de uma população aumenta com o tempo numa taxa dependente do tamanho efetivo populacional por geração (Wright, 1922, 1931). Desta maneira, populações se tornam endogâmicas mais rapidamente quando apresentam pequenos tamanhos (Barret & Kohn, 1991). Segundo Sebbenn, (2001), áreas fragmentadas onde existem pequenas populações principalmente de plantas alógamas estão propensas à endogamia e deriva genética resultante da subdivisão. A endogamia pode atuar expondo determinados alelos deletérios recessivos, diminuindo num curto espaço de tempo o valor adaptativo da população, nas quais ocorre redução da heterozigosidade e pode resultar em perda da diversidade alélica. Futuyma (2002) demonstra que a importância do fluxo gênico, principalmente em populações naturais, está na homogeneização das freqüências alélicas entre as populações pequenas, deste modo, mesmo que separadas geograficamente elas comportam-se como uma grande população panmítica. Com freqüências alélicas que antes do fluxo gênico eram diferentes, depois do fluxo gênico elas se tornam homogêneas entre si. Neste contexto, a importância do fluxo gênico está em contrapor os efeitos da deriva genética, favorecendo a homogeneização das freqüências alélicas. Para Neigel (1997), o fluxo gênico é definido como movimento de genes em populações e, portanto inclui todos os movimentos de gametas, propágulos e indivíduos que efetivamente trocam genes na distribuição espacial. O fluxo gênico pode ser quantificado através de medidas diretas e indiretas. Os métodos diretos referem-se ao fluxo gênico contemporâneo e são inferidos através da utilização de corantes, marcadores morfológicos e análise de paternidade. Os métodos indiretos são baseados na estrutura das populações e referem-se ao fluxo gênico histórico, ou 21 passado e são estimados através do FST, alelos exclusivos, autocorrelação espacial e análise de coalescência. O modelo de ilhas infinitas de Wright é um modelo que utiliza um número efetivo de migrantes, Nm, estimado através da estatística F para um conjunto n de populações (Wright, 1951). Segundo Wright (1951) este modelo assume equilíbrio entre migração e deriva genética entre todas as populações havendo igual troca de genes entre elas. Este modelo também assume que todas as populações são iguais fontes de migrantes e produz estimativas que não refletem a variação contemporânea na troca de genes entre populações ou mudanças atuais no processo dispersivo. O fluxo estimado utilizando o modelo de ilhas infinitas de Wright e o parâmetro FST é chamado fluxo gênico aparente. Existem diversos modelos de fluxo gênico (modelo continente-ilha; modelo de ilhas; modelo de alpondras; modelo de isolamento por distância) e atualmente novas abordagens têm sido utilizadas para estudar o fluxo gênico como o modelo de metapopulação e o de paisagens (Sork et al., 1999). Outro método indireto de estimar o fluxo gênico baseia-se na autocorrelação espacial e/ou estrutura genética interna e tem sido utilizado a fim de detectar o padrão espacial da variabilidade genética e inferir sobre processos microevolutivos na diferenciação de populações (Vekemans & Hardy, 2004).

Estrutura Genética Interna

A estrutura genética interna (EGI) é a distribuição espacial não aleatória de genótipos dentro de uma população. Segundo Vekemans & Hardy (2004) a EGI pode ser resultado de diferentes processos, incluindo a dispersão, seleção e eventos históricos. A causa mais provável da EGI é a formação de estruturas familiares locais (pedigrees) originadas de um fluxo gênico limitado. Neste contexto há uma maior similaridade entre os vizinhos do que indivíduos mais distantes levando ao modelo de isolamento por distância (Vekemans & Hardy, 2004). Para o estudo da EGI em populações naturais são utilizadas análises de autocorrelação espacial (Heywood, 1991; Epperson, 1993), estas análises permitem inferir sobre fatores microevolutivos como a mutação, seleção, migração e isolamento por distância (Sokal & Wartenberg, 1983). Segundo Epperson & Li (1996) desde retomada dos estudos da EGI por Sokal, R.R. em 1979 muitos estudos relacionados com a compreensão da EGI tem sido realizados, demonstrando 22 que as estatísticas baseadas na distribuição espacial de genótipos são extremamente poderosas, mesmo nos casos de pouca estruturação. Os mesmos autores relatam sobre as diferenças entre a autocorrelação espacial e o FST. Valores de FST estão relacionados à variação espacial das freqüências alélicas, enquanto a autocorrelação espacial mede aspectos relacionados aos padrões espaciais. As estatísticas FST requerem uma média das subpopulações em um ou mais níveis hierárquicos demonstrando os efeitos da subdivisão das populações, contudo os processos de dinâmica populacional, como as migrações, geralmente não funcionam através de caminhos hierárquicos, mas sim através de proximidade espacial que podem ser analisadas através das estatísticas de distribuição espacial (Epperson & Li, 1996). Segundo Slatkin & Arter (1991) quando a escala de amostragem de indivíduos está próxima à escala do padrão espacial da espécie, a possibilidade de realizar inferências baseadas nas estatísticas I de Moran é limitada a um sistema de populações discretas. Contudo, segundo Epperson (1993) as estatísticas de I de Moran são muito úteis no contexto de encontrar padrões espaciais numa maior escala. Neste contexto, para Epperson & Li (1996) há um limite ótimo para a avaliação da EGI utilizando as estatísticas de I de Moran, as populações avaliadas não podem estar muito distantes e quanto menor as distâncias entre as populações, as estatísticas I de Moran num sistema de populações discretas tornam-se mais poderosas com menores desvios padrões. A EGI é freqüentemente encontrada dentro de populações naturais de plantas (Heywood, 1991; Epperson, 1993) uma vez que, a dispersão de sementes é o principal fator que contribui para sua ocorrência (Chung et al., 2000; 2003; Vekemans & Hardy 2004). A presença de uma estrutura genética interna tem importante aplicação nos programas de conservação e pode afetar as estimativas de diversidade genética (Ennos & Clegg 1982). A EGI auxilia nas estratégias de coleta para projetos de conservação ex situ, uma vez que possibilita evitar a coleta de genótipos similares numa população (Vekemans & Hardy, 2004). A EGI também auxilia no manejo de populações naturais, onde os padrões de exploração tendem a afetar a diversidade genética (Doligez & Joly, 1997). Entretanto é importante ressaltar que, caso a EGI seja ignorada pode haver uma interpretação errônea da endogamia e seleção sobre genótipos (Shapcott, 1995). Segundo Chung et al. (2000), estudos recentes da EGI têm levado em consideração à diferença de idade entre plantas de uma mesma população, demonstrando diferenças significativas quanto à estrutura interna. Estas diferenças são causadas por mudanças na dinâmica populacional (p.e. mudança de densidade) e eventos reprodutivos que ocorreram no passado. 23

Contudo, ainda há poucos estudos relacionados com a diferença de idade relacionada com a EGI em espécies arbóreas levando a falta de compreensão de muitos fatores associados a estes processos (Chung et al., 2003). Portanto a associação e o entendimento da EGI, índices de diversidade genética e estrutura demográfica são fundamentais para fundamentar programas eficientes de conservação em espécies vegetais. O uso destas estimativas também é muito importante para estabelecer estratégias de garantia de sobrevivência durante várias gerações de espécies ameaçadas de extinção, como a O. catharinensis.

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Hipóteses

A O. catharinensis por apresentar ampla abrangência entre as latitudes 21º20' S a 30º15' S dentro da área de ocorrência da Floresta Ombrófila Densa, deve apresentar alto nível de diversidade genética, um amplo fluxo gênico originado pela migração dos dispersores, no qual deve resultar numa estrutura fraca ou inexistente. Uma vez que as sementes de O. catharinensis são dispersas por aves e primatas, dispersores de longa distância, a distribuição dos indivíduos adultos deve ser aleatória. Em função da dispersão aleatória de sementes não deve existir estrutura genética interna na população.

Objetivo Geral

Contribuir para a definição de estratégias de conservação em populações naturais de canela-preta (O. catharinensis Mez.).

Objetivos Específicos

Conhecer a estrutura demográfica de quatro populações naturais de O. catharinensis, baseada em indivíduos reprodutivos. Estimar a diversidade genética em populações naturais de O. catharinensis. Estimar o fluxo gênico e tamanho efetivo das populações. Estimar a estrutura genética interna de cada uma das quatro populações do presente trabalho. Estabelecer estratégias de conservação com base nas estimativas realizadas. 25

Material e Métodos

Áreas de Estudo

Os locais utilizados para o estudo foram: Parque Estadual da Serra do Tabuleiro e entorno (PEST); Parque Botânico do Morro Baú (MB); Área particular da MOBASA em Corupá (CP); Área particular do produtor Antônio Alberton, em Grão Pará – linha Braga – (GP) (Figura 01).

Figura 01 Imagem de satélite da localização das áreas de estudo (•) dentro da provável área de ocorrência da O. catharinensis (▬) no Estado de Santa Catarina - Área particular da MOBASA em Corupá (CP); Parque Botânico do Morro Baú em Ilhota (MB); Parque Estadual da Serra do Tabuleiro e entorno em Santo Amaro da Imperatriz (PEST); Área particular do produtor Antônio Alberton, em Grão Pará – linha Braga – (GP). Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005.

As populações estudadas estão localizadas ao leste do Estado de Santa Catarina na extensão Norte-Sul. As distâncias geográficas entre as áreas de estudo (Tabela 1) e as figuras dos locais de estudo (Figuras 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12 e 13) foram confeccionados com o auxílio de um aparelho GPS (Garmin GPSMap 76S) e os programas de georeferenciamento: GPS Trackmaker (Ferreira, 2002), Google Earth (Google, 2005) e QuikGrid v5.1 (Coulthard, 1993). As áreas de estudo representam o caminhamento realizado nos locais de coleta das amostras foliares de O. catharinensis. O marco inicial para o caminhamento e montagem da parcela virtual foi a partir da primeira O. catharinensis amostrada. 26

Tabela 1 Distância geográfica (km) entre as áreas de estudo de populações naturais de O. catharinensis Mez., no Estado de Santa Catarina . Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. PEST MB CP GP PEST - 105.49 156.88 72.14 MB 105.49 - 60.68 163.06 CP 156.88 60.68 - 202.07 GP 72.14 163.06 202.07 - Parque Estadual da Serra do Tabuleiro (PEST); Parque Botânico do Morro do Baú (MB); propriedade particular MOBASA (CP) e propriedade particular Antônio Alberton (GP).

Parque Estadual da Serra do Tabuleiro (PEST)

O Parque Estadual da Serra do Tabuleiro – PEST é uma unidade de conservação (UC) de uso indireto e está inserido na Reserva da Biosfera como uma Zona Núcleo para conservação. O PEST é uma UC destinada à preservação integral de áreas naturais com características de grande relevância sob os aspectos ecológicos, cênicos, científicos, culturais, educativos e recreativos, vedados às modificações ambientais e à interferência humana direta (FATMA, 2002). Criado em 1975 e gerenciado pela FATMA, localiza-se na porção centro-leste do Estado de Santa Catarina, ao sul da Ilha de Santa Catarina, entre os paralelos 27º42’09’’ e 48º57’13’’ de longitude oeste, com altitude variando entre o nível do mar e 1200m (FATMA, 2002). O PEST possui 90.000ha, correspondentes a cerca de 1% da área do Estado de Santa Catarina. A Serra do Tabuleiro é constituída principalmente por granitos, gnaisses, granito-gnaisses, migmatitos e quartzitos, formando encostas muito íngremes e recortadas, que atingem altitudes entre 900 a 1200 metros acima do nível do mar (Klein, 1981). O clima da região, segundo Köeppen, classifica-se como mesotérmico úmido, sem estação seca, com verões frescos nas áreas mais altas. O local escolhido para a realização das coletas no Parque Estadual da Serra do Tabuleiro (PEST) é o Município de Santo Amaro da Imperatriz, SC. Nesta área de estudo foram coletadas amostras foliares de 35 indivíduos reprodutivos de O. catharinensis em 7.5ha (150 x 500m) de Floresta Ombrófila Densa (Figura 02). Há indicativos nesta área de corte seletivo de algumas espécies de valor comercial (Sócio-ambiental, 2003).

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Figura 02 Imagem de satélite da localização da área de estudo no Parque Estadual da Serra do Tabuleiro e entorno em Santo Amaro da Imperatriz, SC (PEST). Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005.

Parque Botânico do Morro Baú (MB)

O Parque Botânico Morro Baú assim como o Parque Estadual da Serra do Tabuleiro está inserido na Reserva da Biosfera como uma Zona Núcleo para conservação. O Parque Botânico do Morro Baú possui 750ha e foi oficialmente criado em 08 de abril de 1961 sendo administrado pelo Herbário Barbosa Rodrigues. Está situado no Médio Vale do Itajaí, Estado de Santa Catarina e abrange parte dos municípios de Ilhota e Luiz Alves, localiza-se entre as coordenadas 26º49’10” e 26º50’15” Sul e entre 48º55’33” e 48º57’35” Oeste (Marterer, 1996). O Parque estende-se da cota 200 até a cota 819.44m acima do nível do mar. O clima apresenta-se como tropical úmido não se registrando estação seca. As temperaturas médias não são inferiores a 15º C, as chuvas são abundantes e bem distribuídas ao longo do ano, embora ocorra nos meses de verão um período de elevada precipitação. (Gaplan, 1986). O Parque é coberto pela a Floresta Ombrófila Densa (Klein, 1978). 28

Foram coletadas numa área de estudo de 12.5ha (250 x 500m), dentro do Parque Botânico do Morro Baú, amostras foliares de 51 indivíduos reprodutivos de O. catharinensis (Figura 03). Não houve corte seletivo na área de estudo (Ademir Reis, comunicação pessoal)

Figura 03 Imagem de satélite da localização da área de estudo no Parque Botânico do Morro Baú em Ilhota, SC (MB). Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005.

Área particular da MOBASA (CP)

Localizada na divisa dos Municípios de Corupá e Rio Negrinho, entre as coordenadas 26º25’06”e 26º25’02” Sul e entre 49º22’02” e 49º21’54” Oeste, esta área particular da MOBASA encontra-se num ecótono entre a Floresta Ombrófila Densa e Floresta Ombrófila Mista, numa altitude média de 750m. Este local não apresenta indícios de corte seletivo e está localizado à menos de 3Km da RPPN ‘Parque Ecológico Emilio Battistella’ de propriedade da própria MOBASA. A escolha pelo local deve-se pela grande quantidade de mata nativa (40ha) e pelo grau de ameaça imposta no local para a construção de uma pequena central hidrelétrica. Numa área de estudo de 3.0ha (150 x 200m) foram coletadas amostras foliares de 49 indivíduos reprodutivos de O. catharinensis (Figura 04). Segundo Sr. Elias (comunicação pessoal), um dos 29 funcionários mais antigos do conglomerado MOBASA/Battistella, esta área nunca foi explorada pelas empresas madeireiras.

Figura 04 Imagem de satélite da localização da área de estudo na área particular da MOBASA em Corupá, SC (CP). Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005.

Área particular do produtor Antônio Alberton (GP)

Localizada no município de Grão Pará, entre as coordenadas 28º 14' 17”e 28 14' 29” Sul e entre 49º17’40” e 49º21’52” Oeste, esta área particular do produtor Antônio Alberton encontra-se próximo a subida da Serra do Corvo Branco e coberto pela Floresta Ombrófila Densa, numa altitude média de 340m. Nunca houve corte seletivo neste pequeno fragmento isolado por plantações de milho, fumo e eucalipto (Antônio Alberton, comunicação pessoal). A escolha pelo local deve-se pela indicação da existência de várias canelas pretas de grande porte que abrigam Anthurium coriaceum, espécie também ameaçada de extinção (Berkenbrock, 2005), por ser um dos últimos remanescentes de floresta no Sul do Estado de Santa Catarina e pelo grau de ameaça imposta no local devido às intensas atividades agropecuárias na região. Na área de estudo de 14ha (350 x 400m) foram coletadas amostras foliares de 53 indivíduos reprodutivos de O. catharinensis (Figura 05). 30

Figura 05 Imagem de satélite da localização da área de estudo na área particular do produtor Antônio Alberton em Corupá, SC (CP). Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005.

A principal diferença entre as áreas estudadas está no grau de isolamento e tamanho dos fragmentos. As populações PEST e CP apresentam-se cercadas por grandes conglomerados de floresta em diversos estágios de sucessão. Enquanto as populações MB e GP são fragmentos isolados por áreas que apresentam intensas atividades agrícolas, no entanto a população MB está inserida num grande fragmento (com presença de outras populações inclusive) enquanto GP é um pequeno fragmento com esta única população amostrada.

Estrutura Demográfica

Os parâmetros de estrutura demográfica foram obtidos com o intuito de auxiliar nas inferências sobre estrutura genética e estrutura genética interna (EGI). As amostragens utilizadas para obtenção dos parâmetros de estrutura demográfica estavam restritas a amostragem dos indivíduos utilizados para a análise da estrutura genética e EGI. Para obtenção dos parâmetros de estrutura demográfica, tais como do índice de dispersão de Clark & Evans (1954) (R), distância média do vizinho mais próximo (DVMP), diâmetro a altura do peito (DAP) e densidade de indivíduos por hectare (D) foram utilizados indivíduos reprodutivos de O. catharinensis com 31

DAP≥ 5 cm. Em cada população foi realizado um caminhamento na área a partir do primeiro indivíduo reprodutivo (adulto) encontrado. A partir deste indivíduo foram amostrados os vizinhos mais próximos com a meta de amostrar 50 indivíduos reprodutivos de O. catharinensis por população. Em cada local, procurou-se amostrar todos os indivíduos com DAP ≥ 5 cm no polígono envolvendo as plantas avaliadas. Todos os indivíduos amostrados foram marcados e georreferenciados com auxílio de um aparelho GPS (Garmin GPSMap 76S). Para o cálculo de área amostrada em cada população e densidade de indivíduos de O. catharinensis, utilizou-se o programa de georeferenciamento GPS Trackmaker (Ferreira 2002), a partir dos dados obtidos no aparelho GPS. O programa GPS Trackmaker permite o usuário transformar manualmente cada ponto das coordenadas geográficas em ordenadas x e y em metros. Posteriormente foi utilizado o programa computacional SGS (Degen et al., 2002) para a obtenção da distância média do vizinho mais próximo e do índice de dispersão. Para obtenção do DAP foi utilizado paquímetro florestal (suta) e quando necessário uma trena para tomada da circunferência. Foram obtidos os valores do índice de dispersão de Clark-Evans conforme Clark & Evans, 1954: R R= O R E Se R = 1 distribuição aleatória, R < 1 distribuição agregada (0 = mínimo) e R > 1 distribuição uniforme (2.149 = máximo). Onde:

RO= distância média observada do vizinho mais próximo

∑ ri RO = n

ri = distância do vizinho mais próximo n = número de observação;

RE = distância esperada do vizinho mais próximo 1 R E = 2 d d = densidade média de indivíduos/m2; s = desvio padrão

32

Para a significância estatística foi utilizado o teste Z. RR− z = OE s Caracterização da Diversidade Genética

Para caracterização da diversidade genética de O. catharinensis Mez., foram utilizados marcadores alozímicos, revelados a partir de eletroforese em gel de amido, seguindo as recomendações de Shaw & Prasad (1970), Vallejos (1983), Cheliak & Pittel (1984), Kephart (1990), Alfenas et al. (1991) e Alfenas (1998). Foi otimizado o protocolo de Tarazi et al. (2003) realizado para O. catharinensis Mez. e testado no sistema de tampão eletrodo/gel Tris-citrato (Tabela 2) 23 sistemas enzimáticos (coloração) em 6 camadas de gel, obtendo as melhores combinações entre os tampões eletrodo/gel, sistemas enzimáticos e camadas do gel (Tabela 3). Procurou-se obter sistemas que produzissem géis nítidos e que apresentassem regiões com interpretação genética possível. As receitas de tampão eletrodo/gel foram extraídas de Cheliack & Pittel (1984) e Alfenas et al. (1991), e as colorações foram extraídas de Shaw & Prasad (1970), Vallejos (1983), Alfenas et al. (1991) e Brune et al. (1998). Tabela 2 Sistema de tampão eletrodo/gel testado para eletroforese de isoenzimas em O. catharinensis Mez. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. Denominação Tampão eletrodo Tampão gel Referência Tris-Citrato Tris 27 g/l Diluição a 3,5 % do Alfenas et al., 1991. (TC) Ácido cítrico 16,52 g/l tampão eletrodo pH = 7,5

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Tabela 3 Sistemas enzimáticos (coloração) testados para eletroforese de isoenzimas em O. catharinensis Mez. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. Enzima Código Sigla Alfa-Esterase EC 3.1.1.1. α-EST Beta-Esterase EC 3.1.1.1. β-EST Fosfatase Ácida EC 3.1.3.2. ACP Álcool Desidrogenase EC 1.1.1.1. ADH Fosfatase Alcalina EC 3.1.3.1 ALP Diaforase EC 1.8.1.4 DIA Glucose Desidrogenase EC 1.1.1.47. GDH Glutamato Oxalocetato EC 2.6.1.1. GOT Glutamato Desidrogenase EC 1.4.1.2. GTDH Glicerato-2-Desidrogenase EC 1.1.1.29. G2DH Glucose-6-Fosfato desidrogenase EC 1.1.1.49. G6PDH, Isocitrato Desidrogenase EC 1.1.1.42 IDH Manitol Desidrogenase EC 1.1.1.67 MADH Malato Desidrogenase EC 1.1.1.37 MDH Enzima Málica EC 1.1.1.40 ME Nicotiamida Adenina Dinicleotídeo EC 1.6.99.3 NADHDH Fosfogluco Isomerase EC 5.3.1.9. PGI Fosfoglucomutase EC 5.4.2.2. PGM Peroxidase EC 1.11.1.7. PRX Sorbitol Desidrogenase EC 1.1.1.14. SDH Xiquimato Desidrogenase EC 1.1.1.25. SKDH Superóxido Desmutase EC 1.15.1.1. SOD 6-Fosfogluconato Desidrogenase EC 1.1.1.44. 6PGDH

Após o estabelecimento do protocolo de eletroforese de isoenzimas, foram coletadas amostras foliares de indivíduos reprodutivos (DAP ≥ 5cm) de O. catharinensis nas quatro áreas de estudo. As folhas coletadas (folhas inteiras com pecíolo) foram acondicionadas em sacos plásticos, fechados com fitas adesivas e colocados em caixa de isopor contendo barras de gelo, isoladas com papel jornal (Hamrick & Loveless, 1986b). O material foi levado para o Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal (LFDGV) e acondicionado em refrigerador (5º) por até 2 semanas (Tarazi et al., 2003). O meio suporte utilizado para a eletroforese de isoenzimas foi o gel de amido de milho (penetrose 30) à 13%. Para o preparo do gel, foram pesados 39g de penetrose e colocados em um erlenmeyer de 500ml, adicionando-se a seguir 300ml da solução tampão do gel. A mistura foi homogeneizada e cozida em forno de microondas, agitando o frasco fortemente a cada 40 segundos nas três primeiras vezes e a seguir a cada 20 segundos para a homogeneização do 34 cozimento, até atingir fervura. Antes da solução extravasar o frasco, o mesmo foi retirado do microondas e agitado fortemente, repetindo esse procedimento mais duas vezes, sendo que na última fervura o gel foi despejado em uma moldura sobre superfície plana. Essa moldura é composta de uma placa de vidro temperado, delimitado com 4 barras de acrílico fixadas com fita adesiva (19cm largura X 13cm comprimento X 1cm altura). Após o resfriamento, o gel foi coberto com uma placa de vidro e mantido sob refrigeração (5º) por 12 horas, até sua utilização. A extração das enzimas foi realizada utilizando-se aproximadamente 40mg de tecido foliar por amostra, macerado com 7mg de Polivinil Polipirrolidona (PVPP), 30mg de areia lavada (24 horas em água corrente, 24 horas em ácido sulfúrico e 24 horas em água corrente) e duas gotas da solução extratora número 1 de Brune et al. (1998) (Tabela 4). Os tecidos foram macerados sobre placas de porcelana resfriadas, com auxílio com bastão de vidro, e mantidas sobre barras de gelo durante o processo de extração. O material extraído de cada amostra foi absorvido em papel filtro (Whatman nº 3), com dimensões de 5 X 20mm e aplicado diretamente no gel. Para a aplicação das amostras no gel, a placa de vidro que cobria o gel foi removida, com auxílio de um bisturi a fita adesiva que fixava a moldura foi cortada. A seguir o gel foi cortado perpendicularmente a 3.5cm de uma das extremidades, com o auxílio de um bisturi. A menor porção do gel foi afastada para facilitar a aplicação das amostras. Foram aplicados até 30 amostras de papéis filtros lado a lado ao longo da fase cortada do gel maior. Para marcar a linha de frente durante a corrida foi colocado, nas duas extremidades da moldura, papel filtro embebido em solução de azul de bromofenol (1%). Após a aplicação de todas as amostras a porção menor do gel era aproximada da porção maior, ficando as amostras em contato com as duas extremidades. Para aumentar este contato, foram colocados 2 canudos de plástico entre a porção menor do gel e a barra de moldura do acrílico e fixada novamente as barras com fita adesivas. 35

Tabela 4 Solução extratora número 1 de Brune et al. (1998, p.96), empregada para extração das enzimas de tecidos foliares de O. catharinensis Mez. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. Componente Quantidade Fosfato de sódio bibásico 0,6g Sacarose 7g PVP – 40 2,56g DTT 50mg L-ácido ascórbico 100mg DIECA 100mg Bissulfito de sódio 50mg Borato de sódio (bórax) 50mg β-mercaptoetanol 0,2mL Polietilenoglicol - 6000 1g Água destilada 100mL

Para manter a integridade das enzimas a migração era realizada à temperatura aproximada de 5º C (sob condições de geladeira). A moldura com o gel foi colocada sob as cubas contendo as soluções tampão e conectado o gel as cubas dos eletrodos mediante ponte (Perflex) previamente embebida na solução tampão das cubas, cobrindo 2cm em cada extremidade. Nos 20 primeiros minutos de corrida eletroforética, o gel foi mantido a 100 Volts a fim que as proteínas fossem liberadas do papel filtro. Ao final desse período os papeis filtros foram retirados, a voltagem aumentada para 230 Volts e mantida constante. Sobre o gel foi colocada uma placa de vidro e sobre esta, uma placa de gelo, visando manutenção da temperatura. A cada hora foi realizada a leitura da voltagem no gel para a manutenção da mesma em aproximadamente 6 Volts/cm. Quando o marcador azul de bromofenol 1% atingiu 7cm de migração foi realizada a última leitura da voltagem no gel e a aparelhagem foi desligada. Foram retiradas as barras de acrílico que mantinham a forma do gel e o gel manteve-se sobre a placa de vidro, onde foi colocado sobre uma armação de madeira, contendo um prego em cada extremidade. Réguas de acrílico furadas nas extremidades foram encaixadas nos pregos formando pilhas de 5 unidades, possibilitando o corte do gel em 6 fatias de 2mm de espessura. Um fio de Nylon era passada ao longo das réguas de cada camada e o mesmo procedimento realizado para todas as camadas. As fatias foram retiradas com auxílio de uma folha de papel absorvente umedecido. Cada camada foi colocada em uma travessa de porcelana, na qual recebia a solução de coloração. 36

As soluções de coloração foram preparadas momentos antes da revelação exceto as soluções – tampão, que foram preparadas com antecedência e armazenadas (refrigerado, 5º C) para uso posterior. Cada camada do gel recebia uma solução de coloração apropriada para a revelação da enzima específica. A solução de coloração era preparada pela adição dos reagentes nas seguintes seqüências: nº 1 Tampão de coloração, nº 2 Substrato, nº 3 Catalisador, nº 4 Cofator, nº 5 enzima e nº 6 Sal de coloração; ocorrendo variação de acordo com a reação para obtenção do produto ou derivados que revelam a posição relativa das enzimas (banda). Após a revelação das alozimas, foi realizada a interpretação dos zimogramas, considerando a estrutura quaternária da enzima e a segregação aparente da região definindo o genótipo de cada indivíduo estudado. Os géis foram então desenhados e fotografados, para posterior inferência, quando necessário. Foram obtidos os valores de Rf e de RM, conforme citado por Ferraz et al. (1994), onde: Rf = de / db RM = di / df x 100 Sendo Rf = migração relativa ao marcador de bromofenol; RM = migração relativa à banda mais freqüente; di = distância da origem à banda em questão; db = distância da origem até a posição média do marcador de bromofenol df = distância da origem até a posição da banda mais freqüente.

Análise dos Dados

A partir da interpretação dos zimogramas e da definição dos genótipos de cada indivíduo estudado, foram estabelecidas as freqüências alélicas e genotípicas. A variação genética foi caracterizada a partir das estimativas das freqüências alélicas e dos índices de diversidade (heterozigosidade, percentagem de locos polimórficos, número médio de alelos por loco e índices de fixação), para cada amostra individualmente. As estimativas das freqüências alélicas juntamente com a percentagem de locos polimórficos (P), do número de alelos por loco (A), das heterozigosidades médias observada (Ho) e esperada (He) e dos índices de fixação (F), foram realizadas empregando-se o programa BIOSYS-2 (Swofford & Selander, 1981, modificado por Black, 1997). 37

A percentagem de locos polimórficos (P) foi estimada considerando o número de locos que apresentam o alelo mais freqüente com ocorrência inferior a 95% em relação ao total de locos. O número médio de alelos por loco (A) foi estimado a partir da média aritmética do número de alelos de cada loco, em cada amostra, para cada loco, fazendo-se a média aritmética entre locos.

A heterozigosidade média observada (Ho) foi obtida pela média aritmética das proporções do número total de heterozigotos em relação ao número total de indivíduos entre os locos analisados. Já a heterozigosidade esperada (He) foi obtida pela seguinte equação:

2 He = 2n(1- ∑pi ) / (2n-1) (Nei,1978) onde: n = número de indivíduos amostrados fazendo-se a média aritmética entre os locos estudados.

O índice de fixação (F) foi estimado como desvio da heterozigosidade esperada,

F = (He -Ho) / He

A hipótese da nulidade (F=0) foi testada para as populações empregando-se: X2 = N F2 (K-1); com GL = [K(K-1)]/2 (Li & Horvitz, 1953) onde: N = tamanho médio da amostra por loco; F = índice de fixação; K= número médio de alelos por loco.

Para testar a significância do valor médio dos locos foi empregado o somatório do X2 dos locos e o somatório dos GL dos locos (Workman & Niswander, 1970).

As estatísticas F de Wright (Wright, 1951, 1965) (FIS, FIT e FST) foram estimadas para as populações estudadas fazendo-se as correções para estimativas N menor que 50 indivíduos por população (Nei, 1987), empregando-se o programa BIOSYS-2 (Swofford & Selander, 1981, modificado por Black, 1997). 38

Assim: FIS = (1-Hot)/ Hei

FIT = (1-Hot)/Het

FST = (1-Hei)/Het onde: Hot = 1 – (ΣΣXil)/ls 2 Hei = 1 (ΣiΣlΣkx ilk)/ls 2 Het = 1 – (ΣlΣkxlk)/s] /l Sendo:

Het = heterozigosidade esperada total;

Hei = heterozigosidade média entre as populações;

Hot = heterozigosidade observada total;

Xil=freqüência de heterozigotos dos locos l na população i;

Xilk = freqüência do alelo k do loco l na população i; S = número de populações; l = número de locos.

A significância dos três coeficientes (FIS, FIT e FST) foi testada por loco empregando-se (Li & Horvitz, 1953; Workman & Niswander, 1970): 2 2 FIS → X = NFis (K-1); com GL = [K(K-1)]/2 2 2 FIT → X = 2N Fit (K-1); com GL = [K(K-1)]/2 2 FST → X = 2N Fst (K-1); com GL = (n-1)(k-1) Onde: N = número total de indivíduos, por loco; K = número de alelos por loco; n = número de populações estudadas.

ˆ ˆ ˆ Os valores dos coeficientes de coancestralidade foram estimados ( F = FIT, θP = FST e f =

FIS) (Cockerham, 1969; Vencovsky, 1992) utilizando o programa computacional GDA (Lewis & Zaykin, 2001). Para estes estimadores foi realizado o procedimento de 10000 reamostragens do tipo bootstrap sobre os locos para obter os intervalos de confiança ao nível de 5% de probabilidade. 39

A taxa de cruzamento aparente foi estimada a partir do fˆ em cada amostra bootstrap de acordo com a expressão: ˆ ˆ ˆ ta = (1− f )/(1+ f ) como sugerido por Carlini-Garcia et al.(2001).

A diversidade genética total (HT), diversidade genética entre (DST) e dentro (HS) de populações subdivididas de Nei (1987) foram analisadas utilizando o programa computacional FSTAT (versão 2.9.3) de Goudet (2001). A variação geográfica foi relacionada à distância genética entre as 4 populações estudadas através das estimativas das distâncias genéticas não viesadas de Nei (1978). Para o cálculo foi empregado o programa BIOSYS-2 (Swofford & Selander, 1981, modificado por Black, 1997), onde: Dˆ = −InIˆ ˆ ˆ ˆ ˆ I = J XY / J X J Y

r a ˆ   J XY = ∑ ∑ xi yi  / r  a=1 i=1 

r ˆ   J X = ∑ ()2n X ∑Yi −1 /()2n X −1  / r  i=1 

r ˆ   J Y = ∑ ()2nY ∑Yi −1 /()2nY −1  / r  i=1  sendo:

Iˆ = identidade genética não viesada; xi = freqüência do alelo i na população x; yi = freqüência do alelo i na população y; r = número de locos.

Os valores obtidos foram utilizados para a construção dos dendogramas, empregando-se o método UPGMA de agrupamento conforme descrito em Sneath & Sokal (1973), através do programa BIOSYS-2 (Swofford & Selander, 1981, modificado por Black, 1997). O fluxo gênico aparente (Nm) entre populações foi estimado de forma indireta, segundo modelo de ilhas proposto por Crow & Aoki (1984) o qual corrige a análise para pequeno número 40 de populações, em que, Fst a divergência genética entre populações e a correção para o número de populações (n), sendo: α = [n/(n-1)]2.

1 1 Nˆm = /4 α [( / Fˆ ST) – 1]

ˆ Utilizou-se o estimador θ P no lugar do FST, conforme demonstração de Cockerham & Weir (1993), por este ser menos viesado.

Foi estimado o Tamanho de vizinhança ( Nˆ b – número de indivíduos numa área de vizinhança ou área onde ocorre panmixia, conforme Wright (1931), como sugerem Slatkin & Barton (1989) para modelos contínuos, como o isolamento por distância). Sendo:

Nˆ b = 2π Nˆm (Eguiarte et al. 1993)

Desta forma, considera-se a densidade de indivíduos reprodutivos por área (D), pode-se definir a área de vizinhança (A) como:

Aˆ = Nˆ b/D (Eguiarte et al. 1993).

O tamanho efetivo populacional foi obtido através dos componentes da variância, de acordo com a metodologia apresentada por Vencovsky (1997). Para o caso de uma única população, com ausência de estruturação genética, o tamanho efetivo de população foi calculado por:

Nˆe = N /(1 + fˆ ) (Vencovsky, 1997) sendo: N = número de plantas adultas; fˆ = coeficiente de endogamia intrapopulacional. Para o caso de indivíduos de várias populações, em modelo de infinitas populações (sem correção para tamanho finito de populações) tem-se que: 0,5 Nˆ = ˆ ˆ 1+ CP 1  1+ F θ P  −  +  P N  2N 41

onde: ˆ θP = coeficiente de coancestralidade relativo a populações; Fˆ = coeficiente médio de endogamia de todas as plantas nas populações analisadas;

CP = quadrado do coeficiente de variação do número de indivíduos (Ni) entre as populações; N é o número de indivíduos amostrados nas P populações;

N = ΣNi; i = 1, 2 ... P. A área mínima viável (AMV) para conservação genética in situ foi estimada em função do tamanho efetivo de referência (Ne(ref)=1000), proposto por Lynch (1996), da relação entre tamanho efetivo e o tamanho amostral ( Nˆ e/n) e da densidade de indivíduos por hectare (d) na população alvo da conservação: N (ref ) AMˆV = e ˆ dN e

Para a análise da estrutura genética interna foi utilizado o programa Spatial Genetic Software (SGS) v.1.0d (Degen et al., 2002). Foi realizado o teste Monte-Carlo (Manly, 1997) com 500 permutações sobre a localização de cada genótipo a fim de obter intervalos de confiança. A análise de autocorrelação genética espacial foi realizada individualmente em cada população (Sokal e Oden, 1978). As extensões das classes de distâncias foram selecionadas de acordo com o número de pares de dados tentando obter um mínimo de 30 pares para a classe selecionada. Foram calculados os valores do índice I de Moran (Sokal e Oden, 1978) para cada uma das classes de distância, em cada loco e para a média dos locos pela expressão:

I = n ΣiΣjwijzizj/wΣiz2i, Os valores estimados do índice I de Moran foram utilizados para testar a significância dos desvios dos valores esperados, E(I) = -1/(n-1), sobre a hipótese de nulidade de distribuição aleatória (Cliff & Ord, 1981). A significância total de cada correlograma foi testada usando critérios de Bonferroni (Sokal & Wartenberg, 1983). 42

Resultados

Estrutura Demográfica

Numa área de 7.5ha (150m x 500m) na população PEST, a espécie apresentou 35 indivíduos com uma distribuição tendendo a agregada (R=0.780; P< 0.05) (Tabela 5, Figuras 06 e 07). Nesta população a distância média do vizinho mais próximo (DMPV) foi de 17 m, o diâmetro a altura do peito (DAP) médio foi de 25.52cm e a densidade de indivíduos por hectare (D) foi de 4.1(Tabela 5, Figuras 06 e 14A). Na população MB, em 12.5ha (250m x 500m) a espécie apresentou 51 indivíduos com uma distribuição também agregada (R=0.733; P< 0.01), a distância média do vizinho mais próximo (DMPV=17m) foi similar à população PEST, o DAP médio foi de 56.18cm e a densidade de indivíduos por hectare (D=4.1) foi igual a da população PEST (Tabela 5, Figuras 08, 09 e 14B). Na população CP, em 3.00ha (200m x 150m) a espécie apresentou 49 indivíduos com uma distribuição tendendo a agregada (R=0.830; P< 0.05), esta população apresentou a menor distância média do vizinho mais próximo (DMPV=8m), o DAP médio desta população foi de 46.47cm e a densidade de indivíduos por hectare foi a maior entre as quatro populações (D=16.3) (Tabela 5 e Figuras 10, 11 e 14C). Na população GP, em 14.0ha (350m x 400m) a espécie apresentou 53 indivíduos com a mesma distribuição tendendo a agregada da CP (R=0.827; P< 0.05), esta população apresentou a distância média do vizinho mais próximo (DMPV=19m) similar ao PEST e MB, um DAP médio similar da população CP (DAP=47.49cm) e a menor densidade de indivíduos por hectare (D=3.79) das quatro populações (Tabela 5 e Figuras 12, 13 e 14D). A distribuição espacial dos indivíduos de O. catharinensis nas quatro populações foi similar, porém houve diferenças significativas quanto ao DAP médio entre as populações, com exceção da população CP e GP (t-teste: GL=48; P=0.81), nas quais o DAP médio não foi diferente. A população PEST apresentou indivíduos de menor DAP médio sendo que a maior freqüência destes indivíduos está contida na classe diamétrica de 30 à 35cm (Figura 14A). Na população MB as classes diamétricas com maior freqüência de indivíduos foram de 35 à 40 e 60 à 70cm (Figura 14B). Na população CP a maior freqüência de indivíduos está contida na classe diamétrica de 50 à 55cm e na GP, as classes diamétricas com maior freqüência de indivíduos foram de 15 à 20, 30 à 35 e 45 à 55cm (Figuras 14C e D). Considerando os indivíduos de todas as 43 populações amostradas no Estado de Santa Catarina, a classe diamétrica que apresentou maior freqüência foi de 30 à 35cm (Figura 14E).

Tabela 5 Estrutura demográfica de diferentes populações naturais de O. catharinensis Mez. no Estado de Santa Catarina, avaliado a partir de indivíduos de DAP> 5cm. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. População N Área R DMPV DAP média DAP DAP D (ha) (m) (cm) mínimo máximo (cm) (cm) PEST 35 7.5 0.780* 17.06 25.52(12.821) 6.85 63.30 4.1 MB 51 12.5 0.733** 16.98 56.18(20.081) 25.15 107.59 4.1 CP 49 3.00 0.830* 8.22 46.47(21.691) 7.55 97.08 16.3 GP 53 14.0 0.827* 18.98 47.49(24.451) 11.35 148.3 3.79 Parque Estadual da Serra do Tabuleiro (PEST); Parque Botânico do Morro do Baú (MB); propriedade particular MOBASA (CP) e propriedade particular Antônio Alberton (GP); N= número de indivíduos; ha= hectare; R= índice de agregação; *= p<0.05; **= p<0.01; DMPV= distância média do vizinho mais próximo; m= metro; DAP= diâmetro à altura do peito; 1 = Desvio padrão; D= densidade de indivíduos por hectare.

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Figura 06 Representação da distribuição dos indivíduos georeferenciados de O. catharinensis amostrados nas áreas de estudo do Parque Estadual da Serra do Tabuleiro, Santo Amaro da Imperatriz –SC; N = 35). Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005.

Figura 07 Representação tridimensional do relevo e distribuição dos indivíduos georeferenciados de O. catharinensis amostrados nas áreas de estudo do (Parque Estadual da Serra do Tabuleiro, Santo Amaro da Imperatriz –SC; N = 35). Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. 45

Figura 08 Representação da distribuição dos indivíduos georeferenciados de O. catharinensis amostrados nas áreas de estudo do Parque Botânico Morro Baú, Ilhota –SC; N = 51. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005.

Figura 09 Representação tridimensional do relevo e distribuição dos indivíduos georeferenciados de O. catharinensis amostrados nas áreas de estudo do Parque Botânico Morro Baú, Ilhota –SC; N = 51. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. 46

Figura 10 Representação da distribuição dos indivíduos georeferenciados de O. catharinensis amostrados nas áreas de estudo da propriedade particular da MOBASA, Corupá –SC; N = 49. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005.

Figura 11 Representação tridimensional do relevo e distribuição dos indivíduos georeferenciados de O. catharinensis amostrados nas áreas de estudo da propriedade particular da MOBASA, Corupá –SC; N = 49. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. 47

Figura 12 Representação da distribuição dos indivíduos georeferenciados de O. catharinensis amostrados nas áreas de estudo da propriedade particular de Antônio Alberton, Grão Pará –SC; N = 53. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005.

Figura 13 Representação tridimensional do relevo e distribuição dos indivíduos georeferenciados de O. catharinensis amostrados nas áreas de estudo da propriedade particular de Antônio Alberton, Grão Pará –SC; N = 53. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. 48

A. PEST B.MB

C. CP D. GP

E. SC

Figura 14 Distribuição das classes diamétricas dos indivíduos de O. catharinensis amostrados: A. PEST (Parque Estadual da Serra do Tabuleiro, Santo Amaro da Imperatriz –SC; N = 35); B. MB (Parque Botânico Morro Baú, Ilhota –SC; N = 51); C. CP (propriedade particular da MOBASA, Corupá –SC; N = 49); D. GP (propriedade particular de Antônio Alberton, Grão Pará –SC; N = 53); E. SC (todos os indivíduos das 4 populações estudadas; N = 188), Florianópolis- SC, RGV/UFSC, 2005. N = número de indivíduos. 49

Caracterização da Diversidade Genética

Sistemas Enzimáticos e Camadas do Gel Testadas

Os resultados tampão eletrodo/gel, sistemas enzimáticos e camadas do gel testados, passíveis de interpretação e que foram utilizadas para análise genética das populações naturais de O. catharinensis Mez em estudo (CP, GP, MB e PEST) estão representados na Tabela 6. As combinações com melhores resultados (B = bom) foram utilizados para a análise das populações naturais em estudo. A partir desses resultados adotou-se como protocolo padrão para o tampão eletrodo-gel TC e os sistemas enzimáticos: α-EST, ACP, DIA, GOT, GTDH, IDH, MDH, ME, PGM, PRX, SKDH e SOD (Figura 015). Com base na estrutura quartenária referenciado em literatura (Kephart, 1990) e na segregação aparente das regiões, a interpretação dos zimogramas indicou os seguintes resultados (Figuras 15 e 16): α-EST (monomérica, locos 1 e 3 com 2 alelos, loco 2 com 3 alelos), ACP (monomérica, com 2 alelos), DIA (monomérica, loco1 e loco2 com 2 alelos), GOT (monomérica, loco 2 com 3 alelos e loco 1 monomórfico), IDH(monomérico, loco 1 com 3 alelos), MDH (dimérica, loco 1 com 3 alelos e 2 com 2 alelos), ME(monomérico, loco com 2 alelos), PGM (monomérica, loco 1 com 2 alelos), PRX(monomérica, loco 1 com 3 alelos e loco 2 com 2 alelos), SKDH(monomérico, loco com 2 alelos) e SOD(monomérico, loco com 2 alelos). Não foi possível verificar a estrutura das enzimas para o sistema GTDH e para o loco 1 da GOT por não apresentarem polimorfismo. 50

Tabela 6 Resultados obtidos para as combinações tampão eletrodo/gel, sistemas enzimáticos e camadas do gel testadas para eletroforese de isoenzimas em populações naturais de O. catharinensis Mez. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. Tampão eletrodo/gel Enzima Camada do gel Tris-Citrato α-EST* S D M B e R I D Β-EST S D M B e R I D ACP* S N M B I D ADH S N M D I N ALP S N M N I N DIA* S D M B I N G2DH S N M N I N 6PGDH S N M N I N G6PDH S D M D I D GOT* S N M B I N GTDH* S D M D I B IDH* S N M D I B GDH S N M N I N

51

Continuação Tabela 6 MADH S N M N I N MDH* S B M D I N ME* S D M B I D NADHDH S N M N I N PGI S D M D I D PGM* S D M D I B PRX* S D M B I D SDH S N M N I N SKDH* S B M N I N SOD* S B M N I N *Sistemas passíveis de interpretação e utilizados para à análise da diversidade genética em populações naturais de O. catharinensis. S = superior (1 ou 2); M = médio (3 ou 4); I = inferior (5 ou 6); B = bom; F = fraco; N= inexistente; D = difusa; R = Locos e alelos idênticos. 52

Figura 15 Zimogramas, ainda em gel, para os 12 sistemas enzimáticos (α-EST, ACP, DIA, GOT, GTDH, IDH, MDH, , ME, PRX, PGM, SKDH e SOD) empregados para O. catharinensis. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. (Fotos: R. Tarazi, 2005) 53

Figura 16 Esquema dos zimogramas apresentando os fenótipos dos locos α-EST 1, 2 e 3 (EST 1, 2 e 3), ACP 1, DIA 1 e 2, GOT 1 e 2, GTDH 1, IDH 1, MDH 1 e 2, , ME 1, PRX 1 e 2, PGM 1, SKDH 1 e SOD 1. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. 54

Freqüências Alélicas

As freqüências alélicas por loco, nas quatro populações estudadas, são apresentadas na Tabela 7. O número de alelos variou de 1 a 3 nos locos estudados. As freqüências alélicas variaram desde a completa fixação para o loco GTDH 1 e GOT1 nas quatro populações, até 0.481 e 0.480 nos locos α-EST 1 e ACP 1, respectivamente. A distribuição das freqüências alélicas foi semelhante apenas para os locos MDH 2, α-EST 3 e ACP 1 nas quatro populações. No loco MDH 1 o alelo 3 foi o mais freqüente nas populações, PEST, MB e CP. No loco PRX 1 o alelo 3 foi o mais freqüente nas populações PEST e MB. No loco α-EST 1 o alelo 1 foi o mais freqüente nas populações MB, CP e GP. No loco α-EST 2 não houve predominância alélica entre as populações. No loco GOT 2 o alelo 1 apresentou baixa freqüência na população PEST. No loco SKDH 1 houve predominância do alelo 1 nas população MB e GP. No loco DIA 1 o alelo 2 foi o mais freqüente nas populações PEST, CP e GP. No loco DIA 2 o alelo 1 apresentou baixa freqüência na população CP. No loco SOD 1 houve predominância do alelo 2 nas populações PEST, MB e GP. No loco ME 1 o alelo 1 foi predominante nas populações MB, CP e GP. Houve a presença de um alelo exclusivo na população MB no loco PRX 2 e na população GP no loco IDH 1. 55

Tabela 7 Freqüências alélicas para 18 locos alozímicos em quatro populações naturais de O. catharinensis Mez. Florianópolis, RGV/UFSC, 2005. Populações Loco Alelo PEST MB CP GP N 33 51 49 53 1 .273 .206 .214 .387 MDH 1 2 .303 .098 .378 .349 3 .424 .696 .408 .264 N 35 51 49 53 1 .914 .735 .673 .868 MDH 2 2 .088 .285 .327 .132 N 34 51 49 53 1 .206 .118 .102 .198 PRX 1 2 .191 .206 .745 283 3 .603 .676 .153 .519 N 35 51 49 53 1 1.000 .902 1.000 1.000 PRX 2 2 0 .098 0 0 N 33 50 49 52 1 .273 .620 .694 .519 α-EST 1 2 .727 .380 .306 .481 N 32 47 49 52 1 .203 .660 .265 .279 α-EST 2 2 .359 .181 .398 .279 3 .438 .160 .337 .442 N 34 51 49 53 1 .397 .373 .286 .491 α-EST 3 2 .603 .627 .714 .509 N 34 51 49 53 GOT 1 1 1.000 1.000 1.000 1.000 N 34 50 49 53 1 .088 .210 .459 .160 GOT 2 2 .191 .400 .429 .726 3 .721 .390 .112 .113 N 34 51 49 53 1 .544 .716 .663 .311 IDH 1 2 .456 .284 .337 .491 3 0 0 0 .198 N 34 51 49 53 1 .471 .637 .388 .642 SKDH 1 2 .529 .363 .612 .358 N 33 49 49 53 ACP 1 1 .606 .653 .520 .660 2 .394 .347 .480 .340 N 34 51 49 53 1 .368 .725 .173 .292 DIA 1 2 .632 .275 .827 .708 N 34 51 49 53 1 .221 .814 .051 .726 DIA 2 2 .779 .186 .949 .274 N 34 51 47 53 1 .324 .412 .755 .264 SOD 1 2 .676 .588 .245 .736 N 35 51 49 53 1 .557 .441 .255 .462 ME 1 2 .443 .559 .745 .538 N 35 51 49 53 GTDH 1 1 1.000 1.000 1.000 1.000 N 35 51 49 53 1 0 0 .296 .311 PGM 1 2 1.000 1.000 .704 .689 N = número de indivíduos analisados; Parque Estadual da Serra do Tabuleiro (PEST); Parque Botânico do Morro do Baú (MB); propriedade particular MOBASA (CP) e propriedade particular Antônio Alberton (GP). 56

Índices de Diversidade

Na Tabela 8 estão expostos os valores de P (%) para as populações estudadas, sendo a média de locos polimórficos das três populações de 81.9 %. Dentre os 18 locos alozímicos estudados apenas dois locos (GOT 1 e GTDH 1) apresentaram alelos fixados em todas as populações. Na Tabela 8 também estão expostos os valores de A para as populações estudadas, sendo o total médio de alelos de 2.1, não diferindo entre as populações.

Os valores de Ho e He foram 0.379 e 0.368, respectivamente, para a população PEST, 0.396 e 0.371 para população MB, 0.351 e 0.368 para a população CP e 0.405 e 0.406 para a população GP. O valor médio de Ho e He foi 0.3827e 0.3782, respectivamente. Os valores de Ho e He não diferiram entre si, entre e dentro das populações (Tabela 8). Os valores de F para as populações estudadas foram -0.0302, -0.0686, 0.0462 e 0.0031 nas populações PEST, MB, CP e GP, respectivamente. A PEST e MB apresentaram valores de F negativos e significativos (X2 = 47.17, GL = 22; X2 = 65.34, GL = 23, respectivamente; p<0.01), indicando a existência de excesso de heterozigotos nestas populações. Por outro lado às populações CP e GP apresentarem os valores de F também significativamente diferentes de zero, porém positivos (X2 = 81.95, GL = 23; X2 = 89.57, GL = 25, respectivamente; p<0.01), indicando a existência de endogamia nestas populações. O valor médio das populações, indicando a possível existência de excesso de heterozigotos foi de -0.012 (Tabela 8). Porém o valor total médio para espécie foi de 0.1006 e diferente de zero (X2 =203.94; p=0.01; GL = 26), indicando a possível existência de estrutura. 57

Tabela 8 Índices de diversidade genética dos indivíduos em populações naturais de O. catharinensis Mez. no Parque Estadual da Serra do Tabuleiro (PEST), Parque Botânico do Morro do Baú (MB), propriedade particular MOBASA (CP) e propriedade particular Antônio Alberton (GP) a partir de 18 locos alozímicos. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005.

População N P(%) A Ho He F PEST 35 77.8 2.0(.2) 0.379(.064) 0.368(.054) -0.0302** MB 51 83.3 2.1 (.2) 0.396(.058) 0.371(.046) -0.0686** CP 49 83.3 2.1(.2) 0.351(.061) 0.368(.050) 0.0462** GP 53 83.3 2.1(.2) 0.405(.064) 0.406(.051) 0.0031** Média das populações 47 81.9 2.1 0.3827 0.3782 -0.012 Média para espécie 186 83.3 2.2 0.3837 0.4265 0.1006** PEST (Parque Estadual da Serra do Tabuleiro); MB (Parque Botânico do Morro do Baú); CP (propriedade particular MOBASA) e GP (propriedade particular Antônio Alberton).N= número de indivíduos; P= percentagem de locos polimorficos; p=0.05; A= número médio de alelos/loco; Ho= heterozigosidade média observada; He= heterozigosidade média esperada; F = índice de fixação; ( ) = desvio padrão; ns = não significativo, ** singnificativo,p=0.01.

Estrutura Genética das Populações

Análise da diversidade em populações subdivididas

ˆ A heterozigosidade média total não viesada ( H T ) para as quatro populações de O. ˆ ˆ catharinensis foi de 0.440 e nas subpopulações ( H S ) de 0.378. O GS T alcançou o valor de 0.141, indicando a existência de divergência entre as populações. Os valores obtidos também indicaram que a maior parte da variabilidade genética ocorre dentro de populações.

Estatísticas de F de Wright

Os valores das estatísticas de F de Wright para as 4 populações naturais de O. catharinensis estão expostos na Tabela 9. Os resultados revelaram uma endogamia total (FIT) de 0.097, significativamente diferente de zero(X2 = 402.60; p<0.01; GL = 25). Os valores individuais por loco variaram de 0.554 no loco DIA 2 a -0.227 no loco IDH 1, sendo que o valor estimado para os locos α-EST 1, α-EST 2, α-EST 3, ACP 1 , DIA 1, DIA 2, GOT 2, IDH 1 , ME 1, PGM 1, PRX 2 e SKDH 1 foram diferentes de zero (Tabela 9) (Anexo 1). Os resultados indicaram também, em média, a existência de excesso de heterozigotos nas 2 populações com FIS (FIS = -0.0233) significativamente diferente de zero (X = 162.49; p<0.01; GL = 26). Os valores individuais por loco variaram de 0.472 no loco α-EST 3 a -0.324 no loco 58

SKDH 1, sendo que os valores estimados para os locos α-EST 3, IDH 1, ME 1, PRX 1 e SKDH 1 foram diferentes de zero (Tabela 9) (Anexo 1). 2 Os resultados revelaram divergência significativa entre as populações (FST = 0.1175; X = 827.93; p<0,01; GL = 60). Os valores individuais por loco variaram de 0.42 para o loco DIA 2 a 0.01 para o loco ACP 1, sendo que o valor estimado para os locos α-EST 1, α-EST 2, DIA 1, DIA 2, GOT 2, IDH 1, MDH 1, MDH 2, ME 1, PGM 1, PRX 1, PRX 2, SKDH 1 e SOD 1 foram diferentes de zero (Tabela 9) (Anexo 1). O fluxo gênico aparente (Nm) entre as populações variou de 10.61 para o loco ACP 1 a 0.19 para o loco DIA 2. A média do fluxo gênico aparente entre os locos foi de 1.06 (Tabela 9).

ˆ Tabela 9 Estimativas das Estatísticas F de Wright e do fluxo gênico aparente ( Nm ) entre indivíduos adultos de quatro populações naturais de O. catharinensis, empregando 16 locos alozímicos. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. Loco ˆ ˆ ˆ ˆ F IS F ST F IT Nm MDH1 -0.0493ns 0.0643** 0.0181ns 2.05 MDH2 -0.0693ns 0.0586** -0.0066ns 2.26 PRX1 -0.2500** 0.1542** -0.0572ns 0.77 PRX2 0.1130ns 0.0754** 0.1799** 1.73 α-EST 1 0.0558ns 0.1015** 0.1516* 1.25 α-EST 2 -0.0226ns 0.0788** 0.0580ns 1.65 α-EST 3 0.4720** 0.0225ns 0.4839** 6.12 GOT2 -0.0254ns 0.1837** 0.1629** 0.63 IDH1 -0.3237** 0.0728** -0.2273** 1.80 SKDH -0.2747** 0.0479** -0.2137** 2.80 ACP1 -0.1699* 0.0131ns -0.1546** 10.61 DIA1 0.0705ns 0.1781** 0.2360** 0.65 DIA2 0.2259** 0.4242** 0.5543** 0.19 SOD1 -0.1770* 0.1469** -0.0041ns 0.82 ME1 0.2548* 0.1792** 0.3152** 2.74 PGM1 0.1657* 0.1792** 0.3152** 0.65 Média -0.0233** 0.1175** 0.0970** 1.06 ** e *: significativo à 1 e 5%, respectivamente; ns: não significativo, pelo teste de contingência - X2 59

Coeficientes de coancestralidade

ˆ ˆ ˆ ˆ Os valores para as estimativas dos coeficientes de coancestralidade ( F = F IT, θ P = F ST e ˆ f = Fˆ IS) para as 4 populações naturais de O. catharinensis estudadas, com os dados a partir de indivíduos reprodutivos são apresentados na Tabela 10. ˆ Os resultados indicam divergência entre as populações, com um θ P médio de 0.1428, coerente com o obtido para a estimativa de divergência entre populações ( Fˆ ST) através das estatísticas F de Wright (0.1175). Os valores individuais por loco variaram de 0.0101 para o loco ACP 1 a 0.499 no loco DIA 2 (Tabela 10). ˆ O fluxo gênico aparente entre as populações, obtido a partir do θ P , variou de 13.84, para o loco ACP 1, à 0.1409, para o loco DIA 2. A média do fluxo gênico aparente entre os locos foi de 0.9181 (Tabela 10). A taxa média de cruzamento aparente foi de 1.023, não diferindo significativamente 1. A taxa de cruzamento aparente variou de 0.34, para o loco α-EST 3, à 1.939, para o loco IDH 1 (Tabela 10). O valor médio de Fˆ foi de 0.1330 que indica uma endogamia total significativa, de forma semelhante a obtida para Fˆ IT. Os valores individuais por loco variaram de -0.1920 para o loco IDH 1 a 0.6086 para o loco DIA 2 (Tabela 10). O valor fˆ foi de -0.0114, indicando excesso de heterozigotos nas populações foi significativo, de forma semelhante a obtida para Fˆ IS. Os valores individuais por loco variaram de -0.3195 para o loco IDH 1 a 0.4887 no loco α-EST 3 (Tabela 10). 60

Tabela 10 Estimativas dos coeficientes de coancestralidade para 4 populações naturais de O. catharinensis, empregando 16 locos alozímicos. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. Loco ˆ ˆ ˆ ˆ ˆ f θ P F Nm ta MDH1 -0.0542 0.0839 0.0342 1.538 1.115 MDH2 -0.0564 0.0616 0.0087 2.1456 1.120 PRX1 -0.0564 0.1937 0.0036 0.5863 1.120 PRX2 0.1236 0.0852 0.1983 1.5123 0.780 α-EST 1 0.0521 0.0999 0.1468 1.2690 0.900 α-EST 2 -0.0050 0.0934 0.0888 1.3671 1.010 α-EST 3 0.4887 0.01682 0.4973 8.2328 0.343 GOT2 -0.0288 0.2047 0.1819 0.5472 1.059 IDH1 -0.3195 0.0966 -0.1920 1.3171 1.939 SKDH -0.2189 0.0587 -0.1757 2.2585 1.560 ACP1 -0.1844 0.0101 -0.1724 13.8042 1.452 DIA1 0.1369 0.2326 0.3377 0.4647 0.759 DIA2 0.2173 0.4999 0.6086 0.1409 0.643 SOD1 -0.1626 0.1837 0.0509 0.6259 1.388 ME1 0.2778 0.0478 0.3122 2.8057 0.565 PGM1 0.1760 0.2018 0.3423 0.5571 0.701 Média -0.0114* 0.1428* 0.1330* 0.9181 1.023 (IC) (-0.0091 à -0.0165) (0.1360 à 0.1425) (0.1280 à 0.1360) ˆ ˆ ˆ ˆ f = endogamia nas populações;θ P = divergência entre as populações; F = endogamia total; Nm = fluxo gênico ˆ aparente (número de migrantes por geração); ta = taxa de cruzamento aparente; (IC)= intervalo de confiança, p=0.05; * = significativo.

Distâncias Genéticas

Os valores obtidos para a identidade e distância genética não viesada de Nei (1978) que demonstram valores de divergência entre as 4 populações estudadas (Tabela 11) estão coerentes com o valor de FST obtidos. Os agrupamentos realizados através da técnica UPGMA para as identidades não viesadas de Nei (1978) (Figura 17) demonstrou que população MB está mais próxima geneticamente da população GP, e apresenta a maior distância genética com a população CP. As distâncias geográficas medidas com auxílio de um aparelho GPS demonstram que as populações CP e MB são as mais próximas (60.68km) e a população MB está mais próximo de PEST (105.49km) do que GP (163.06) (Tabela 1). Portanto, quando comparado às distâncias geográficas com as genéticas não foi encontrada uma associação das distâncias genéticas com as distâncias 61 geográficas nas populações estudadas utilizando o coeficiente de correlação de Spearman (R= - 0.2; p= 0.704). No entanto, quando comparado os agrupamentos realizados através da técnica UPGMA com a localização das populações no relevo do Estado de Santa Catarina, as populações mais próximas geneticamente (PEST, MB e GP) localizam-se na Floresta Ombrófila Densa Montana e a população mais distante geneticamente (CP) localiza-se numa transição da Floresta Ombrófila Mista com a Ombrófila Densa Alto Montana.

Tabela 11 Distâncias Genéticas (diagonal superior) e Identidade Genética (diagonal inferior) não viesadas de Nei (1978) para indivíduos reprodutivos de quatro populações naturais de O. catharinensis. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. Populações PEST MB CP GP PEST - 0.0875 0.1094 0.0751 MB 0.9163 - 0.1641 0.0741 CP 0.8964 0.8486 - 0.1227 GP 0.9277 0.9286 0.8845 - Parque Estadual da Serra do Tabuleiro (PEST); Parque Botânico do Morro do Baú (MB); propriedade particular MOBASA (CP) e propriedade particular Antônio Alberton (GP).

Correlação cofenética = 0.852

Figura 17 Dendograma das Identidades não viesadas de Nei (1978) obtido através da técnica UPGMA, para 4 populações naturais de O. catharinensis, a partir de indivíduos reprodutivos, empregando-se 16 locos alozímicos. Parque Estadual da Serra do Tabuleiro (PEST); Parque Botânico do Morro do Baú (MB); propriedade particular MOBASA (CP) e propriedade particular Antônio Alberton (GP). Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. 62

Fluxo Gênico

Os valores das estimativas do fluxo gênico aparente ( Nˆm ) e FST para as quatro populações naturais de O. catharinensis estão expostos nas Tabelas 9, 10 e 12. Os resultados revelaram que as populações apresentam fluxo gênico próximo a um migrante por geração (Nm≈1), sendo o fluxo gênico aparente médio entre as populações Nˆm = 1.06, utilizando o ˆ ˆ ˆ estimador F ST e baixo Nm = 0.92 utilizando o estimador θ P .

Tabela 12 Estimativa do fluxo gênico aparente Nˆm (diagonal superior) e divergência entre populações FST (diagonal inferior) para indivíduos reprodutivos de quatro populações naturais de O. catharinensis. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. Populações PEST MB CP GP PEST - 0.7948 0.6477 0.9705 MB 0.0729 - 0.4605 1.0077 CP 0.0880 0.1195 - 0.6397 GP 0.0605 0.0584 0.0890 - Parque Estadual da Serra do Tabuleiro (PEST); Parque Botânico do Morro do Baú (MB); propriedade particular MOBASA (CP) e propriedade particular Antônio Alberton (GP).

A Tabela 12 demonstra que a população CP apresentou as maiores divergências (FST) e os menores fluxos gênicos ( Nˆm ) aparentes entre as populações quando analisada aos pares. A população GP apresentou as menores divergências e os maiores fluxos gênicos aparentes entre as populações quando analisadas aos pares. A maior divergência e o menor fluxo gênico aparente encontrado foram entre as populações MP e CP, justamente as populações mais próximas geograficamente. Os valores estimados para o fluxo gênico aparente entre populações e FST estão coerentes com as estimativas das distâncias genéticas. ˆ ˆ Utilizando θ P , o número de indivíduos numa área de vizinhança ( Nb ) ou área onde ocorre panmixia foi estimado em 5.77 indivíduos. A densidade de indivíduos reprodutivos por área (D) foi de 4.1, 4.1, 16.3 e 3.79 indivíduos por hectare na população PEST, MB, CP e GP, respectivamente. A área de vizinhança ( Aˆ ) foi de 14000, 14000, 3500 e 15200 m2 para a população PEST, MB, CP e GP, respectivamente. ˆ ˆ Utilizando o estimador θ P , foram estimados os valores de Nm separadamente utilizando as populações que apresentavam a menor distância geográfica entre elas, os resultados revelaram 63 que as populações do sul do Estado de Santa Catarina (PEST e GP) apresentam fluxo gênico aparente maior ( Nˆm =1.24), ao contrário das populações do Norte do Estado (MB e CP) que apresentaram um fluxo gênico aparente baixo ( Nˆm =0.55), e os valores de Nˆb foram de 8 e 3.5 indivíduos, respectivamente.

Tamanho Efetivo

Sob um contexto intrapopulacional, para a amostragem dos indivíduos reprodutivos do ˆ PEST, os 35 indivíduos amostrados correspondem a um N e de 36 indivíduos. De forma semelhante, os tamanhos efetivos encontrados para as populações MB, CP e GP foram 54.7, 46.8, e 52.9 indivíduos, respectivamente, para os 51, 49 e 53 indivíduos amostrados em cada população, indicando uma adequada representatividade genética das amostras obtidas, a partir das ˆ freqüências alélicas dos locos analisados. Esta semelhança entre N e e N está associada ao fato de ˆ ˆ que os valores de f foram reduzidos, isto faz com que N e seja praticamente igual ao número de ˆ ˆ indivíduos amostrados, pois N e = N/(1 + f ). No entanto, sob um contexto metapopulacional, considerando o conjunto de indivíduos amostrados (populações como unidades amostrais), assumindo que a mesma é composta por infinitas populações, o tamanho efetivo populacional resultante é de 12.8 indivíduos, para os 188 amostrados. Estes 12.8 indivíduos correspondem ao tamanho efetivo resultante da variação das amostras entre as populações. Para uma amostra hipotética suficientemente grande e sem variação nos tamanhos amostrais para a população, considerando a amostra de 188 indivíduos ˆ ˆ como uma única população, o tamanho efetivo ( N e →(0.5 P)/ θ P ) foi de 14 indivíduos. Com isto, a amostragem realizada para a espécie correspondeu a 91.43% do tamanho efetivo máximo, este valor corresponde a percentagem do tamanho efetivo das subpopulações amostradas (12.8) ˆ com o tamanho efetivo da amostra inteira (14). Os 12.8 indivíduos de quatro populações com θ P de 0.1428, correspondendo a apenas 6.81% dos indivíduos amostrados. Isto indica que o tamanho efetivo no contexto metapopulacional foi pequeno devido a divergência entre as populações e que apenas 6.81% dos indivíduos estão contribuindo efetivamente para trocas alélicas no Estado de Santa Catarina. 64

Área Mínima Viável para Conservação

Baseando-se no tamanho efetivo de 1000, proposto por Lynch (1996) para a conservação do potencial adaptativo de caracteres quantitativos em uma simples população, a área mínima viável para a conservação de O. catharinensis para cada população estudada está apresentada na Tabela 13.

Tabela 13. Área mínima viável para quatro populações de O. catharinensis no Estado de Santa Catarina. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005.

População Nˆe /n Densidade(ind/ha) AMˆV (ha) PEST 1.03 4.1 237 MB 1.07 4.1 227 CP 0.95 16.3 64 GP 0.99 3.79 265 Parque Estadual da Serra do Tabuleiro (PEST); Parque Botânico do Morro do Baú (MB); propriedade particular MOBASA (CP) e propriedade particular Antônio Alberton (GP); Ne/n = tamanho efetivo estimado para cada população dividido pelo tamanho da amostra; (ind/ha)= indivíduos por hectare; AMV= área mínima viável em hectares. 65

Estrutura Genética Interna

A análise da autocorrelação espacial no PEST demonstrou que 15 dos 140 valores do I de Moran foram significativos (Anexo 2). Nove, ou 60%, destes valores foram significativos nas três primeiras classes de distâncias (Anexo 2), indicando uma estrutura genética nestas classes de até 60m (Figura 18, Tabela 14). O mínimo de 30 pares de dados por classe de distância para uma análise robusta de autocorrelação espacial manteve-se até os 140m, nesta população.

Figura 18 Análise da estrutura genética interna em uma população natural de O. catharinensis no Parque Estadual da Serra do Tabuleiro, Santo Amaro da Imperatriz, SC. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005.

Tabela 18 Análise da estrutura genética interna em uma população natural de O. catharinensis no Parque Estadual da Serra do Tabuleiro, Santo Amaro da Imperatriz, SC. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. Distância (m) D(- IC) D(obs.) D(+ IC) P(D)<(-IC) P(D)>(+ IC) 0-20 -0.097786 0.117779 0.043008 0.000 1.000 20-40 -0.079700 0.023749 0.020565 0.016 0.984 40-60 -0.074349 0.011434 0.016463 0.044 0.956 60-80 -0.083740 -0.051160 0.027889 0.762 0.238 80-100 -0.084158 -0.040758 0.021187 0.674 0.326 100-120 -0.087352 -0.067369 0.024517 0.908 0.092 120-140 -0.094015 -0.093907 0.039504 0.976 0.024 140-160 -0.122340 -0.012874 0.069419 0.414 0.586 160-180 -0.114184 -0.201950 0.055319 1.000 0.000 180-200 -0.095468 -0.011192 0.033078 0.278 0.722 m=metros; D= distância genética; IC= intervalo de confiança; P= probabilidade.

66

Para MB, a análise de autocorrelação espacial demonstrou que 21 dos 150 valores de I de

Moran foram significativos (Anexo 3). Quatorze, ou 67%, destes valores foram significativos em quatro classes de distâncias (Anexo 3), indicando uma estrutura genética nestas classes, exceto aos 40m, de até 100m (Figura 19, Tabela 15). O número de pares de dados por classe de distância foi superior ao mínimo de 30 pares e manteve-se por todos as classes de distâncias.

Figura 19 Análise da estrutura genética interna em uma população natural de O. catharinensis no Parque Botânico Morro Baú, Ilhota, SC. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005.

Tabela 15 Análise da estrutura genética interna em uma população natural de O. catharinensis no Parque Botânico Morro Baú, Ilhota, SC. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. Distância (m) D(- IC) D(obs.) D(+ IC) P(D)<(-IC) P(D)>(+ IC) 0-20 -0.100729 0.166450 0.068476 0.002 0.998 20-40 -0.080916 0.008597 0.035977 0.160 0.840 40-60 -0.065799 0.043869 0.025503 0.006 0.994 60-80 -0.061456 0.037250 0.020246 0.004 0.996 80-100 -0.062124 0.013888 0.018153 0.046 0.954 100-120 -0.066787 -0.048441 0.028990 0.880 0.120 120-140 -0.068297 -0.048667 0.024929 0.876 0.124 140-160 -0.062041 -0.075594 0.023808 0.992 0.008 160-180 -0.081879 -0.003519 0.037444 0.310 0.690 180-200 -0.075371 -0.056679 0.041435 0.898 0.102 m=metros; D= distância genética; IC= intervalo de confiança; P= probabilidade.

Em CP, a análise de autocorrelação espacial demonstrou que 19 dos 140 valores de I de Moran foram significativos (Anexo 4). 10, ou 53%, destes valores foram significativos nas duas primeiras classes de distâncias (Anexo 4), indicando uma estrutura genética nestas classes de até 67

40m (Figura 20, Tabela 16). O mínimo de 30 pares de dados por classe de distância para uma análise robusta de autocorrelação espacial manteve-se até os 140m.

Figura 20 Análise da estrutura genética interna em uma população natural de O. catharinensis na propriedade particular da MOBASA, Corupá, SC. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005.

Tabela 16 Análise da estrutura genética interna em uma população natural de O. catharinensis na propriedade particular da MOBASA, Corupá, SC. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. Distância (m) D(- IC) D(obs.) D(+ IC) P(D)<(-IC) P(D)>(+ IC) 0-20 -0.063804 0.072066 0.030504 0.000 1.000 20-40 -0.055862 0.036702 0.015025 0.000 1.000 40-60 -0.056784 -0.014571 0.006166 0.320 0.680 60-80 -0.052023 -0.059742 0.009379 0.994 0.006 80-100 -0.050553 -0.059882 0.007413 0.996 0.004 100-120 -0.064905 -0.072954 0.017672 0.986 0.014 120-140 -0.076379 -0.019480 0.035863 0.492 0.508 140-160 -0.176898 -0.113270 0.117639 0.878 0.122 m=metros; D= distância genética; IC= intervalo de confiança; P= probabilidade.

Em GP, a análise de autocorrelação espacial demonstrou que 23 dos 150 valores de I de Moran foram significativos (Anexo 5). Quatorze, ou 61%, destes valores foram significativos nas três primeiras classes de distâncias (Anexo 5), indicando uma estrutura genética nestas classes de até 60m(Figura 21, Tabela 17). O número de pares de dados por classe de distância foi superior ao mínimo de 30 pares e manteve-se por todos as classes de distâncias. 68

Figura 21 Análise da estrutura genética interna em uma população natural de O. catharinensis na propriedade particular de Antônio Alberton, Grão Pará – Linha Braga, SC. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005.

Tabela 17 Análise da estrutura genética interna em uma população natural de O. catharinensis na propriedade particular de Antônio Alberton, Grão Pará – Linha Braga, SC. Distância (m) D(- CI) D(obs.) D(+IC) P(D)<(-IC) P(D)>(+IC) 0-20 -0.115822 0.190958 0.079708 0.000 1.000 20-40 -0.074241 0.038731 0.034100 0.018 0.982 40-60 -0.068378 0.047694 0.031289 0.004 0.996 60-80 -0.067676 -0.025417 0.026646 0.588 0.412 80-100 -0.060954 -0.010177 0.028932 0.360 0.640 100-120 -0.064325 -0.007521 0.026695 0.314 0.686 120-140 -0.058671 0.004116 0.018298 0.146 0.854 140-160 -0.064002 -0.009614 0.016107 0.282 0.718 160-180 -0.067516 -0.057610 0.025272 0.952 0.048 180-200 -0.061740 0.015256 0.021886 0.072 0.928 m=metros; D= distância genética; IC= intervalo de confiança; P= probabilidade.

Estes resultados indicam a presença de uma fraca estruturação de genótipos dentro da população, o qual é distinto de uma completa distribuição panmítica. As correlações positivas e significativas encontradas neste estudo para as populações nas primeiras classes de distância indicam que as plantas mais próximas compartilham alelos numa freqüência não aleatória. 69

Discussão

Estrutura Demográfica

Veloso & Klein (1959) relatando sobre as comunidades e associações vegetais da Mata Pluvial do Sul do Brasil caracterizaram a O. catharinensis como sendo uma espécie dominante do estrato superior da floresta. Esta espécie nas associações clímax tende para a formação do tipo “Ocotietum”, o qual representa o estágio final da vegetação. Estes mesmos autores encontraram para oito associações situadas em cinco comunidades diferentes (Ribeirão do Ouro, Azambuja, São Pedro, Muller e Maluche) no município de Brusque, SC, uma média extrapolada de 33.5 indivíduos por hectare (avaliando indivíduos com DAP ≥ 6.36cm) (Tabela 18), o dobro registrado para a população CP, a mais densa do presente estudo.

Tabela 18 Dados sobre cinco populações de O. catharinensis Mez na Floresta Ombrófila Densa, estudadas em diferentes Comunidades e Zonações no Município de Brusque, SC, por Veloso & Klein (1959). Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005. Comunidades e Zonação Tamanho da área N (DAP ≥ 6.36cm) Extrapolação D de estudo (m2) (N/ha) Ribeirão do Ouro A 2672 21 79 Ribeirão do Ouro B 3744 35 93 Azambuja A 2224 3 13 Azambuja B* 4144 27 65 Azambuja C 3952 3 8 São Pedro 4096 0 0 Muller 2640 0 0 Maluche* 5184 7 13.5 Média 3582 12 33.5 N= número de indivíduos observados; DAP= diâmetro à altura do peito; D= densidade; A, B e C = Zonação proposta por Veloso & Klein (1959); Zonação A= sopé das encostas de solo úmido; Zonação B= meia encosta, solo seco e melhor drenado; Zonação C= solo raso e drenagem muito rápida; * locais com histórico de exploração.

A diferença entre as densidades encontradas neste estudo quando comparadas às apresentadas por Veloso & Klein (1959) pode ser atribuída a uma variação natural da região avaliada e principalmente às diferentes metodologias de amostragem utilizadas. Veloso & Klein (1959) adotaram a metodologia de parcelas de maneira estratificada visando o levantamento das diferentes comunidades vegetais no município de Brusque. Por outro lado, no presente estudo a metodologia de amostragem foi baseada em tecnologia GPS, a qual vem sendo utilizada em 70 estudos sobre a estrutura demográfica de espécies arbóreas tropicais (Dominy & Duncan, 2001; Wadt et al., 2005). Neste estudo houve uma limitação da metodologia GPS empregada, pois só permitiu caracterizar aspectos demográficos em locais onde havia ocorrência natural de O. catharinensis, superestimando a densidade de indivíduos. Neste caso, o presente estudo não avaliou áreas de baixa densidade ou de não ocorrência da espécie como fizeram Veloso & Klein (1959) que possuíam duas áreas com sem ocorrência registrada da espécie, o que levou a média 33.5, do contrário a média do referido estudo seria ainda maior. Uma solução para o emprego da metodologia GPS no levantamento demográfico em diferentes populações é a padronização do tamanho e forma da área, além do sorteio da parcela virtual dentro da região a ser avaliada, respeitando o princípio da aleatoriedade. Apesar da limitação da metodologia empregada, é notório o avanço da exploração madeireira que vem ocorrendo desde 1950. Esta exploração pode também ser considerada um dos fatores que causaram uma diminuição dos valores de densidade obtidos, especialmente nas áreas onde há registro de cortes seletivos. A população CP localizada na região Norte do Estado de Santa Catarina apresentou a maior densidade de indivíduos de O. catharinensis por hectare (D=16), em contraste com a população GP, do sul do Estado, a qual apresentou a menor densidade de indivíduos (D=3.8) (Tabela 5). Quando confrontados os dados obtidos para as quatro áreas estudadas, foi possível observar que as densidades apresentaram valores decrescentes quanto mais ao sul estava localizado o fragmento. Estes dados sugerem a classificação de como uma espécie dominante seletiva, que tende a desaparecer completamente no sul do Estado. Entretanto, a distância compreendida entre as populações CP e GP é de 202km, abrangendo uma área geográfica insuficiente para uma inferência precisa do padrão densidade populacional da O. catharinensis até o limite sul do Estado. Também o número de populações amostradas em cada região precisa ser aumentado para tal inferência. Portanto, apesar de ter sido observada uma redução nos valores de densidade pode-se ainda classificar a O. catharinensis, assim como proposto por Veloso & Klein (1959), como uma espécie dominante indiferente, em virtude de sua grande adaptação aos diferentes habitats. Contudo, estudos adicionais, com ampliação da amostragem podem trazer elementos para um aprofundamento deste aspecto. Veloso & Klein (1959) afirmam que as espécies dominantes seletivas, ao contrário da O. catharinensis, tendem a desaparecer no sul do Estado devido aos fenômenos climáticos que 71 ocorrem nestas regiões, especialmente, em relação aos ventos provenientes da região sul da América Latina, que danificam a vegetação severamente durante vários dias consecutivos, tanto no inverno como no verão. Sendo assim, as populações situadas ao Centro e ao Norte do Estado de Santa Catarina seriam beneficiadas, estando protegidas pelo conjunto de serras de Jaraguá, Itajaí e do Tabuleiro, que servem como uma barreira aos ventos gelados provenientes do sul que seguem em direção ao noroeste. Estes fenômenos podem ser uma justificativa para a diferença encontrada entre os valores mencionados. Neste contexto Gilbert et al. (2001) encontrou para a O. whitei uma redução da densidade de indivíduos influenciada pelas condições climáticas (ventos intensos, enchentes e mudanças bruscas de temperatura). O mesmo autor relata que estes eventos climáticos influenciam negativamente na densidade populacional, pois tornam as plântulas predispostas a patógenos. Em relação ao DAP médio a população PEST apresentou o menor valor, seguida pelas populações CP e GP que não apresentaram diferenças significativas entre si, e pela população MB que apresentou indivíduos de maior DAP médio. Estes dados refletem que a ação antrópica deve ter influenciado no diâmetro médio das populações, uma vez que a população PEST é a única que possui registros documentados de exploração madeireira com corte seletivo (Sócio- Ambiental, 2001). As demais áreas (MB, CP e GP) não apresentam históricos ou relatos de exploração. A ação antrópica que deve ter influenciado o diâmetro médio das populações também pode ter influenciado a estrutura genética, especialmente a estrutura genética interna da população, reduzindo o fluxo gênico entre os vizinhos mais próximos, discutida no item “Estrutura Genética Interna”. Fui constatado que a população MB foi a única população que não apresentou indivíduos na classe de 5 à 25cm, indicando uma possível estabilização na dinâmica da população. Uma provável conseqüência desta estabilização pode acarretar num maior número de indivíduos senis e uma futura extinção populacional. Contudo, neste estudo não foi analisado a regeneração natural da espécie e futuros trabalhos relacionados com a dinâmica populacional poderiam confirmar a hipótese de estabilização na dinâmica populacional da população MB. O padrão de distribuição espacial, encontrado no presente estudo, em todas as populações de O. catharinensis foi similar ao encontrado por Condit et al. (2000) para maioria das espécies arbóreas tropicais, cuja tendência é uma distribuição mais agregada do que aleatória. A distribuição espacial de plantas está diretamente relacionada ao processo de dispersão, à maneira pela qual a planta utiliza seus recursos e como ela é utilizada como recurso (Condit et al., 2000). 72

A dispersão de sementes é um fator de extrema importância para a compreensão da estrutura demográfica de uma espécie arbórea tropical (Fragoso & Huffman, 2000; Fragoso et al., 2003). Entretanto, para que haja uma correlação hipotética e coerente da dispersão de sementes (variável não analisada) com os resultados obtidos no presente estudo, é importante ressaltar que a ingestão de um fruto não é sinônimo de uma dispersão eficiente de sementes (González-Solis et al., 2001; Pizo, 2003). A eficiência de um determinado animal frugívoro como dispersor depende, dentre outros fatores, de aspectos relacionados ao padrão de deposição das sementes que esse animal produz, ou seja, como e onde as sementes ingeridas são depositadas (Clark et al., 2001). Em relação a estes aspectos, aves e primatas ou animais terrestres como a anta, podem diferir consideravelmente (Fragoso & Huffman, 2000; Clark et al., 2001; Fragoso et al., 2003). A O. catharinensis apresenta uma frutificação sincronizada, porém supra-anual, com ciclos reprodutivos de pelo menos 2 anos (Silva et al., 2000). Durante o período de frutificação a O. catharinensis produz uma quantidade relativamente alta de frutos nutritivos por unidade de tempo. Seus frutos são grandes e ricos em lipídeos (Moraes & Paoli, 1995; Silva et al., 2000). Devido a estas características, as sementes de O. catharinensis constituem-se como uma rica fonte alimentar e são dispersas por espécies frugívoras, especialmente por aves (Francisco & Galetti, 2002) e primatas (Moraes & Paoli ,1995; 1999). Enquanto os primatas defecam as sementes de forma agregada ao se deslocarem pela floresta ou sob seus dormitórios (González- Solis et al., 2001), as aves freqüentemente as regurgitam ou defecam uma a uma ao se deslocarem pelo ambiente (Jordano, 1995). Sugere-se então para a O. catharinensis que o grande consumo e deposição agregada de sementes por primatas tende a agregar a população adulta, tornado o efeito homogeneizador gerado pela dispersão de aves de menor significado. Moraes & Paoli (1995; 1999) sugerem que a dispersão de O. catharinensis está associada as síndromes de zoocoria e barocoria. Na primeira, Moraes & Paoli (1995; 1999) observaram a ingestão de frutos de O. catharinensis por uma grande quantidade de primatas, sendo O. catharinensis a espécie que mais contribui para a alimentação destes primatas (Cebus apella, Alouatta fusca e Brachyteles arachnoides). Dentro deste contexto, pode-se sugerir que a síndrome de dispersão zoocórica realizada por primatas contribuiu para o padrão agregado de distribuição espacial de indivíduos adultos nas quatro populações estudadas no Estado de Santa Catarina. Este aspecto será retomado no item “Estrutura Genética Interna”. 73

A síndrome barocórica associada a outros fatores edáficos, como o tipo de solo, drenagem e principalmente a topografia do local também podem influenciar no padrão agregado de distribuição espacial de indivíduos adultos (Clark et al., 1998; 1999; Svenning, 2001). Moraes & Paoli (1995; 1999) ao observarem a deposição dos frutos sob árvores-mãe de O. catharinensis, verificaram que em declives inferiores a 10% a densidade média ao redor da planta-mãe foi de 12 plântulas/m2 e quando os declives eram superiores a 20% esta densidade média foi de 1 a 3 plântulas/m2, a 5 m da árvore-mãe. No presente trabalho, nas quatro áreas de estudo as declividades foram similares, apresentando valores entre 12% a 17%. Portanto, tendo em vista a influência da topografia, pode-se apenas inferir que as quatro áreas em questão podem apresentar influencia semelhante em relação a este fator sobre distribuição espacial. A partir dos dados avaliados para a distância do vizinho mais próximo (DMPV), nas quatro áreas estudadas, foi possível verificar que em todos os casos as altas densidades de indivíduos promoveram os menores DMPV. Porém, a DMPV não interferiu no índice de agregação. Este último se manteve constante independente da variação da densidade ou da DMPV. Desta forma os indivíduos se apresentavam de maneira agregada, mas a distância média entre os agrupamentos dentro de cada área variou consideravelmente interferindo no valor de DMPV, mas não no índice de agregação. As áreas utilizadas para este estudo estão entre os poucos núcleos remanescentes de Floresta Ombrófila Densa que se encontram em estágio clímax. Uma grande quantidade de indivíduos adultos foi amostrada nestas áreas levando a resultados que sugerem um grande potencial para a manutenção da regeneração natural e conseqüentemente da estrutura populacional de O. catharinensis. 74

Estrutura Genética

O presente trabalho caracterizou a estrutura genética de árvores originadas de diversos ciclos reprodutivos, cujos efeitos de deriva genética não foram predominantemente originados por fatores recentes. Isto se deve pelo fato da amostragem ter sido realizada com árvores já em fase reprodutiva e com DAP acima de 5cm (em média 43.41 cm), portanto, resultantes de ciclos reprodutivos anteriores ao processo de superexploração e fragmentação ocorrido no último século. O número médio de alelos por loco (A) foi de 2.2 para a espécie e de 2.1 entre as populações de O. catharinensis, valores superiores aos encontrados para a média de várias espécies vegetais (1.97 e 1.52) por Hamrick et al. (1992). A porcentagem de locos polimórficos (P) dentro da espécie foi de 83 % e entre populações foi de 82%, valores também superiores aos encontrados para a média de várias espécies vegetais (51,3 e 34,6%) por Hamrick et al. (1992). Por outro lado, os valores de A encontrados para O. catharinensis neste estudo são similares aos valores encontrados para outras duas espécies de O. (O. porosa e O. odorifera) nativas da Mata Atlântica estudadas com marcadores alozímicos. Estas duas espécies apresentaram um valor médio de A de 2.07 (Silva et al., 2003) e 2.36 (Kageyama et al. 2003), respectivamente. Os valores de A refletem também a alta percentagem de locos polimórficos encontrados para a espécie, bem como pelas outras espécies do gênero mencionadas O. porosa (P= 71.43%; Silva et al., 2003) e O. odorífera (P= 67.8%; Kageyama et al., 2003).

Os valores da diversidade gênica (He) estimada nas populações de O. catharinensis foram superiores aos relatados para espécies tropicais por Hamrick & Loveless (1986) (He = 0.111) e

Hamrick et. al. (1992) (He =0.191) mas, semelhantes a outras espécies de Lauraceae nativas da Mata Atlântica. Os principais índices de diversidade genética utilizando locos alozímicos em espécies de Lauraceae estão representados na Tabela 19. 75

Tabela 19 Índices de diversidade genética em Lauraceae utilizando locos alozímicos. Florianópolis-SC, RGV/UFSC, 2005.

Espécie A P% Ho He Autor O. skutchii 2.00 11.1 - 0.039 Hamrick & Loveless, 1986 O. tenera 1.83 44 0.174 0.205 Gipson et al., 1995 O. porosa 2.07 71.43 0.277 0.301 Silva et al., 2003 O. odorifera 2.36 67.8 0.358 0.360 Kageyama et al., 2003 Cinnamomum 2.25 87.5 0.307 0.334 Chung et al., 2003 insularimontanum Neolitsea sericea 1.2 20 0.08 0.073 Chung et al., 2003 Cryptocarya 2.74 95.12 0.324 0.536 Moraes et al., 2002 aschersoniana O. catharinensis 2.2 83.3 0.384 0.427 A= alelos por loco; P%= percentagem de locos polimórficos; Ho e He= heterozigosidade observada e esperada, respectivamente.

Os altos valores observados para a diversidade da O. catharinensis podem estar associados a diversos fatores. Segundo Hamrick et al. (1992) as espécies arbóreas tropicais que acumulam maior variabilidade genética dentro de suas populações, com menor diferenciação entre as mesmas são as que apresentam ampla distribuição geográfica, ciclo de vida longo e reprodução sexuada por fecundação predominantemente cruzada, características comum à O. catharinensis. Os valores de F encontrados nas populações de O. catharinensis no Estado de Santa Catarina indicaram que das freqüências genotípicas não aderiram as proporções do modelo de Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW), como já mencionado no item “Resultados”. A alta heterozigosidade observada e os baixos níveis de fixação de alelos nas populações de O. catharinensis, sugerem que a polinização seja cruzada. Este fato foi confirmado pelo cálculo da taxa de cruzamento aparente que não foi diferente de 1.0, sugerindo que a espécie é predominantemente alógama. ˆ O valor de f médio de -0.0114 e de FIS médio de -0.0233 indica um excesso de heterozigotos nas populações, sugerindo uma possível seleção em favor dos mesmos. A hipótese de seleção a favor dos heterozigotos pode ser sugerida na população GP onde foram constatadas a maior heterozigosidade observada e esperada. Uma vez que a população GP está localizada no sul do Estado, apresentou a menor densidade populacional e está na região cuja vegetação é fortemente influenciada por adversidades climáticas quando comparada às outras populações estudadas no Estado de Santa Catarina. Pode ser sugerida neste caso a aplicação da afirmação de 76

Gilbert et al. (2001) na qual o sucesso de sobrevivência de uma espécie em condições climáticas desfavoráveis é genótipo dependente. A hipótese de seleção em favor de heterozigotos corrobora com Veloso & Klein (1959) que classificaram a O. catahrinensis como uma espécie dominante indiferente, em virtude de sua grande adaptação aos diferentes habitats. A seleção a favor de heterozigotos só poderia ser comprovada diante da análise de progênies, como realizado por Eguiarte et al. (1992) e Reis (1996a). Entretanto, Conte et al.(2003) trabalhando com Euterpe edulis relata hipóteses alternativas para o excesso de heterozigotos na população. Uma delas descreve a seleção contra homozigotos em estágios de desenvolvimento da planta e outra aponta o desequilíbrio de ligação que pode expressar fenômenos como a sobredominância. Contudo, tal abordagem não foi objeto deste trabalho. O excesso de heterozigotos das populações não foi observado na avaliação da endogamia total para espécie ( Fˆ =0.1330) o que indica a existência de estrutura.

O valor de HT 0.440 superior a HS 0.378 também indica a existência de uma estruturação nas populações estudadas da espécie. Fato que é evidenciado pelo alto valor de GST (0.141), indicando uma divergência de 14.1% entre as populações estudadas. Os valores de HT e HS são superiores aos valores médios encontrados para outras espécies vegetais tropicais (0.302 e 0.224, respectivamente) conforme Hamrick & Loveless (1986), porém o valor médio de GST encontrado para O. catharinenesis é inferior ao valor médio encontrado para as mesmas espécies, que foi de 0.228 (Hamrick & Loveless, 1986). ˆ Os valores de GST, FST e θ P (0.141, 0.1175 e 0.1428, respectivamente) foram similares ˆ entre si. Porém, a estimativa θ P possibilita a obtenção de um valor mais preciso, com um menor ˆ viés agregado ao valor estimado (Weir & Cockerham, 1984). Comparando o valor θ P da O. catharinensis com outras três espécies de Lauraceae nativas da Mata Atlântica e que possuem ˆ síndromes de dispersão similares, o valor obtido foi superior ao encontrado para O. odorífera (θ P ˆ = 0.063; Kageyama et al, 2003), similar a Cryptocarya moschata (θ P = 0.123; Moraes et al., ˆ 1999) e inferior a Cryptocarya aschersoniana (θ P =0.335; Moraes et al., 2002). De qualquer forma, a O. catharinensis apresenta uma alta divergência genética entre as populações que pode ser uma conseqüência das síndromes de polinização e dispersão da espécie ou ainda resultado da amostragem realizada em poucas populações localizadas a dezenas de quilômetros de distância entre si. 77

ˆ Os valores de θ P calculado entre as populações mais próximas (CP-MB= 0.2055; MB- PEST= 0.1256; PEST-GP= 0.1023), foram significativos. Com relação ao modelo de fluxo gênico avaliado, no modelo de alpondras (dispersão entre os vizinhos mais próximos) as populações que nunca trocam migrantes não deveriam exibir valores muito maiores do que as que o fazem (Rousset, 1997). Este modelo pode ser aplicado neste estudo, uma vez que os valores ˆ ˆ encontrados para as populações PEST-GP (θ P = 0.1023) e GP-MB (θ P = 0.1017) propiciam esta ˆ mesma afirmativa. Contudo, isto não foi observado na combinação das populações MB e CP (θ P = 0.2055), fato que pode ser explicado pela existência uma barreira física (Serra de Jaraguá), que estaria impedindo o fluxo gênico. Uma hipótese alternativa seria a análise dos valores a partir de um modelo de isolamento ˆ pela distância, no qual deveria ocorrer um aumento esperado do θ P com o aumento da distância entre os pares (Raybould et al., 1995). Os dados do presente estudo não aderem a este modelo. Sugere-se, portanto, que a dinâmica de movimentação dos alelos da O. catharinensis deve estar realmente associada a uma síndrome de dispersão que promova estrutura genética interna e um efeito fundador nas populações. O loco DIA 2 que apresentou baixa freqüência do alelo 1 apenas na população CP é um exemplo de como o efeito fundador pode estar estruturando as populações naturais de O. catharinensis, assim como a existência de um alelo exclusivo na população MB no loco PRX 2 e na população GP no loco IDH 1. Além disso, não se pode descartar o papel, mesmo que parcial, da fragmentação e superexploração como elementos que promovem a perda de alelos e formação de estrutura antes inexistente ou existente, mas não tão forte. Uma vez que, para os marcadores alozímicos, a superexploração ou mesmo um corte seletivo aliados à fragmentação, podem influenciar de maneira semelhante ao efeito da deriva na população remanescente. Hamrick & Loveless (1986b) verificaram que para espécies vegetais cujas sementes são dispersas por animais ocorre uma alta divergência entre populações, indicando que a maioria das sementes ingeridas são depositadas localmente ou que ocorre uma dispersão a longas distâncias, levando ao estabelecimento de novas populações pela ação de um ou poucos indivíduos. Promovendo assim, um baixo fluxo gênico entre populações estabelecidas. Além disso, as sementes levadas a longas distâncias podem ser dispersas agrupadas, alterando a distribuição de indivíduos e genótipos. Este argumento está coerente com as observações realizadas para mamíferos como antas que propiciam a dispersão agrupada de sementes de Maximiliana maripa 78 em longas distâncias (Fragoso et al., 2003), assim como para primatas (Cebus apella e Alouatta spp) que possivelmente são responsáveis pela dispersão de sementes de maneira agrupada de O. catharinensis (Moraes & Paoli, 1995; 1999). As observações anteriormente mencionadas (Hamrick & Loveless, 1986b; Moraes & Paoli, 1995; 1999; Fragoso et al., 2003) podem sugerir uma correlação com a idéia de que a eficiência de um determinado animal frugívoro como dispersor influa no padrão de deposição das sementes que esse animal deposita (Clark et al., 2001). Neste caso, os primatas mencionados por Moraes & Paoli (1995; 1999) defecariam as sementes em grupos ao se deslocarem pela floresta ou sob seus dormitórios (González-Solis et al., 2001), produzindo um espectro de deposição mais agregado que poderia levar ao efeito fundador numa população, originando divergências genéticas como as observadas no presente estudo para a O. catharinensis. É importante ressaltar que o deslocamento de animais por grandes distâncias para obtenção de seu alimento, e conseqüente influência sobre a divergência genética entre populações, só ocorre se a disponibilidade de alimentos for escassa (Shilton et al., 1999). Outro suposto fator relacionado com a divergência da população CP é o comportamento do Cebus apella, o qual aumenta a sua densidade populacional em Florestas com altitude acima de 500m, devido a maior oferta de alimento encontrado nestas cotas (González-Solis et al., 2001). Sendo assim, pode-se sugerir que há um maior consumo de sementes de O. catharinensis em florestas de Santa Catarina em maiores altitudes, o que levaria a uma menor dispersão, maior deposição agregada e conseqüentemente uma maior endogamia como aquela encontrada na população CP. Corroborando assim, com uma hipótese de que divergência genética pode estar relacionada com a dispersão de sementes por primatas. Ainda assim, para a confirmação desta hipótese são necessárias observações diretas dos dispersores das sementes de O. catharinensis no Estado de Santa Catarina. Por outro lado é importante ressaltar que os mecanismos de polinização também devem ser considerados, pois constituem um dos primeiros fatores que determinam os níveis de fluxo gênico em populações de plantas (Govindaraju, 1988). Uma menor divergência entre as populações poderia ocorrer caso o polinizador tivesse vôo longo, por exemplo. Entretanto, este parece não ser o caso das Lauraceae, pois nesta família a polinização é realizada por pequenos insetos como vespas, abelhas, coleópteros e moscas (Chung et al., 2000). Apesar de não existirem informações específicas sobre a polinização da O. catharinensis, supõe-se que o polinizador de O. catharinensis percorra curtas distâncias. Uma vez que as populações estudadas 79 estão situadas a grandes distâncias, entre si, o polinizador estaria ocasionando uma maior divergência entre as populações e promovendo uma estruturação interna. Observações diretas do polinizador e estimativas diretas de fluxo gênico poderiam auxiliar no estudo da estrutura genética de O. catharinensis. Além das distâncias, as grandes diferenças de altitude presentes entre as populações estudadas e, conseqüentemente os diferentes microclimas proporcionados por estas altitudes, fariam com que o fator altitude influenciasse indiretamente na divergência genética. Isto porque os diferentes microclimas tendem a promover diferenças fenológicas afetando polinizadores e dispersores. Desta forma Reich et al. (2005) afirma que diferenças na altitude refletem em diferenças fenológicas devido a mudanças na temperatura e umidade, resultando assim em divergência genética. No presente estudo a população CP localizada na altitude mais elevada estaria sendo influenciada por este fator, e, portanto apresentou a maior divergência genética entre as populações analisadas. ˆ No presente estudo o valor do fluxo gênico aparente (Nm) utilizando θ P foi de 0.92 e o tamanho de vizinhança aparente (Nb) foi de 6 indivíduos. Os valores Nm estimados separadamente, a partir das populações do sul e do norte do estado, foram de 1.24 e 0.55, e os valores de Nb de 8 e 3.5 indivíduos, respectivamente. Segundo Reis (1996), uma redução no valor do tamanho de vizinhança implicaria na alteração da estrutura genética das populações, acentuando os efeitos de deriva que podem levar a perda de alelos com menor freqüência, elevando também os níveis de endogamia e reduzindo a diversidade genética das populações. Os valores de Nm e Nb determinam se a deriva per se, é capaz de produzir variabilidade genética substancial entre populações (Reis, 1996a). Neste caso, o Nm menor que 1.0 significa que o fluxo gênico aparente é insuficiente para contrapor uma divergência originada por deriva (Slatkin & Barton, 1989). Este resultado se repetiu para as populações CP-MB (Nm=0.55), MB- PEST (Nm=0.98), CP-GP (Nm=0.77). Os resultados obtidos através de métodos indiretos para Nb sugerem que os grupos parentais que trocam genes ao acaso estão em torno de 6 indivíduos, número que reflete a divergência das populações.

Quando a divergência genética (FST) e o fluxo gênico aparente (Nm) foram analisados por pares populacionais, o par MB-GP apresentou a menor divergência genética e o maior fluxo gênico (FST=0.0584; Nm=1.0077) entre os pares populacionais. Estas duas populações apesar da distância imposta (163km) apresentam fluxo gênico suficiente para contrapor os efeitos de deriva. 80

A população GP apresentou os dois maiores valores entre as três combinações possíveis de fluxo gênico aparente, demonstrando que provavelmente esta população não apresentava isolamento genético no passado. Contudo, todas as três combinações com a população CP demonstraram alta divergência e baixo fluxo gênico, indicando isolamento genético desta população antes do efeito de fragmentação gerado pelo homem. A população CP apresentou o menor número de migrantes por geração em relação às demais populações estudadas, constituindo-se como a única população que potencialmente pode apresentar diminuição nos níveis de heterozigosidade e perda de alelos de baixa freqüência. Esta população quando comparada às demais é a única localizada no planalto catarinense num ecótono da Floresta Ombrófila Mista com a Ombrófila Densa. Esta característica de relevo pode indicar que a mesma seja uma barreira ao fluxo gênico. A análise dos agrupamentos UPGMA indicou coerência com os resultados obtidos para o fluxo gênico, evidenciando a população CP como um único braço isolado das três populações do litoral de Santa Catarina. Considerando a longevidade da espécie e o processo de fragmentação da Floresta Ombrófila Densa ter ocorrido efetivamente nos últimos 100 anos, pode-se esperar no futuro um aumento na divergência, caso ocorra aumento no processo fragmentação entre essas populações. A partir dos valores de Nb foram estimadas as áreas de vizinhaça (A), onde a população mais densa (CP) obteve a menor área (A= 3500m2) e a menos densa (GP) a maior área (A= 15200m2). O tamanho médio da área de vizinhança para a O. catharinensis foi estimado em 11675m2, o que significa que seriam necessários cerca de 5 indivíduos, em média, por hectare para manter a estrutura genética atual nas populações estudadas. O tamanho efetivo intrapopulacional (PEST= 36, MB= 54.7, CP= 46.8, e GP= 52.9) foi semelhante ao tamanho amostrado (35, 51, 49 e 53, respectivamente) devido ao valor reduzido de ƒ. As populações que apresentam um Ne ≥ 50 representam populações que, segundo Frankel & Soulé (1981) têm a possibilidade de manter a variabilidade genética e superar os efeitos estocásticos em um curto prazo (10 gerações). Para Nunney & Campbell (1993), tamanhos efetivos populacionais estimados por parâmetros genéticos devem ser 5 a 10 vezes superior ao encontrado. Neste caso, a população mínima viável de O. catharinensis, utilizando a média de 47.6 indivíduos, está em torno de 238 a 476 indivíduos (Ne médio 5x e 10x, respectivamente). Num contexto metapopulacional o tamanho efetivo de 12.8 indivíduos para uma amostra de 188 foi pequeno devido a grande divergência entre as populações. Segundo Vencovsky (1997) em caso de divergências entre populações, mesmo sendo esta considerada pequena, deve-se 81 adotar uma estratégia de amostragem que aborde várias populações, a fim de contemplar a diversidade genética existente na espécie. Portanto para manutenção de diversidade genética há necessidade de manter a conectividade de vários fragmentos florestais, principalmente Unidades de Conservação. No Estado de Santa Catarina existem pelo menos 40 Unidades de Conservação, enquadradas e não enquadradas pelo Sistema Nacional de Unidades de Conservação (SNUC) (FATMA, 2002), na área de abrangência da O. catharinensis, que constituem populações atualmente isoladas, porém com um real potencial de conectividade podendo ser utilizadas futuramente com esta finalidade. A análise da diversidade genética e a estimativa do tamanho efetivo revelaram que as populações estudadas apresentam potencial de conservação in situ. Mas, vale ressaltar que as análises realizadas no presente estudo são indicadores instantâneos. Desta forma, há a necessidade de um monitoramento contínuo, principalmente nas progênies das populações analisadas (Reis, 1996a). Uma vez que através das progênies é possível obter a taxa de cruzamento, avaliar a perda de diversidade genética ao longo das gerações e conhecer os efeitos gerados pela recente fragmentação das florestas. Estes índices são de grande importância para auxiliar programas de conservação já fundamentados nos indicadores instantâneos aqui apresentados. Para o cálculo da área mínima viável (AMV) foi utilizado um tamanho efetivo conservador (Ne= 1000) proposto por Lynch (1996). A densidade populacional foi o fator que mais influenciou no cálculo da AMV. Para a população mais densa (CP) a AMV foi de 64 hectares e para a população de menor densidade (GP) a AMV foi de 265 hectares. Para todas as áreas amostradas foi observado um déficit em tamanho real quando comparado à ideal prevista para os fragmentos analisados. A atual situação fragmentada da Floresta Ombrófila Densa no Estado de Santa Catarina faz com que sejam poucas as áreas que abranjam 64 a 265 ha de floresta climáxica contínua, área mínima necessária para garantir a conservação da O. catharinensis a partir de um tamanho efetivo proposto por Lynch (1996). Contudo, há áreas maiores de floresta contínua secundária no Estado de Santa Catarina que poderiam manter populações mínimas viáveis de O. catarinensis. A AMV proposta por Lynch (1996) de 1000 indivíduos para O. catharinensis é similar à área utilizada pelos prováveis e já referenciados dispersores (Cebus apella e Alouatta spp.) da espécie. Esta área corresponde a média utilizada durante a vida de um bando de Cebus apella que é de 161 ± 77ha (Di Bitetti, 1999) e 44ha para Alouatta guariba (González-Solis et al., 2001). 82

Estes valores reforçam a hipótese de que esta é a área que possibilita a manutenção dos dispersores e da dinâmica de alelos. Nunney & Campbell (1993) por sua vez, propõem um mínimo de cinco vezes o tamanho efetivo populacional para o cálculo da AMV. Neste caso seriam necessárias áreas menores, de 15 a 62ha para garantir a conservação da O. catharinensis. Entretanto, os mesmos autores ressaltam que para a viabilidade desta proposta é requerida uma maior quantidade de pequenos fragmentos apresentando conectividade, para a manutenção do fluxo gênico. Desta forma seria possível a sustentabilidade da espécie e seus polinizadores e dispersores. O que reforça a importância de estabelecer elementos de conectividade entre os fragmentos. 83

Estrutura Genética Interna

As correlações positivas e significativas encontradas nas primeiras classes de distância, nas quatro populações de O. catharinensis, indicaram que as plantas compartilham alelos numa freqüência não aleatória. Estas correlações positivas dentro das classes de distância sugerem a presença de estrutura interna. Neste contexto, a similaridade genética foi maior entre os vizinhos do que entre os indivíduos mais distantes, sugerindo um padrão de isolamento por distância (Vekemans & Hardy, 2004). Nas duas populações estudadas (PEST e MB) que obtiveram F negativo significativo

(FPEST= -0.0302 e FMB= -0.0686), observou-se uma correlação positiva e significativa nas classes de distância mais próximas (PEST até 60m; MB até 100m). Em contraste, as outras duas populações (GP e CP) que obtiveram um F positivo significativo (FGP=0.0031; FCP=0.0462), observou-se uma correlação positiva e significativa nas classes de distâncias também mais próximas (GP até 60m; CP até 40m). Os dados de autocorrelação obtidos para a população CP e GP estão coerentes com a endogamia do local, demonstrando uma estruturação fraca na população e uma deme que compartilha alelos em distâncias curtas. Contudo, o excesso de heterozigotos obtidos nas populações PEST e MB não apresentam coerência com os valores de autocorrelação que demonstra também uma fraca estruturação. Neste caso, uma possível hipótese foi a existência de cruzamentos preferências aliada a seleção em favor dos heterozigotos. As diferenças encontradas entre os correlogramas eram esperadas, uma vez que os diferentes alelos e os diferentes locos provavelmente estiveram sujeitos a diferentes históricos de exploração, índices de mortalidade e demais fatores influentes neste ponto. Contudo, a amostragem realizada foi suficiente para detectar um padrão similar de autocorrelação espacial em O. catharinensis independente do tamanho de área ocupado pelos indivíduos amostrados. A estruturação genotípica em distâncias curtas dentro de populações vegetais foi verificada em diversas espécies (Schnabel et al., 1991; Wagner et al., 1991; Shapcott, 1995; Berg & Hamrick, 1995). Os valores obtidos usando I de Moran para O. catharinensis neste estudo foram similares aos obtidos para O. odorifera (Kageyama et al., 2003), uma Lauraceae nativa da Mata Atlântica. Kageyama et al. (2003) relataram que para O. odorifera que houve uma estrutura genética interna de 35 a 74m numa área conservada de 166ha e, 22m para uma pequena população localizada em 30ha de floresta. Quando comparados estes mesmos valores com os obtidos para Cryptocarya moschata (Moraes et al., 2004) outra Lauraceae da Floresta Ombrófila 84

Densa, a O. catharinensis apresentou uma estrutura interna com menores distâncias. Moraes et al (2004) encontrou para Cryptocarya moschata uma autocorrelação positiva e significativa entre indivíduos em até 150m. Esta similaridade genética foi maior entre os indivíduos distantes entre si em 105m. Moraes et al. (2004) atribuiu este fato a uma possível dispersão promovida pelo Brachyteles arachnoids (Primetes –Cebidae). Porém, quando comparados os dados da O. catharinensis com outras espécies da família Lauraceae, as quais são polinizadas por insetos e cuja síndrome de dispersão zoocórica é realizada por aves (p.e. Neolitsea sericea: Chung et al., 2000; Cinnamomum insularimontanum: Chung et al., 2003) verificou-se que a O. catharinensis apresentou uma estrutura interna em maiores distâncias. Segundo Chung et al. (2000; 2003) e Vekemans & Hardy (2004) o isolamento por distância dentro de uma população é influenciado de maneira significativa pela dispersão de sementes. Isto contribui fortemente para o desenvolvimento da estrutura genética interna de uma população. Portanto, sugere-se que enquanto as aves promovem uma distribuição mais aleatória de genótipos (Chung et al., 2003), os primatas, prováveis dispersores da O. catharinensis (Moraes & Paoli, 1995; 1999), poderiam promover uma estruturação interna na população. Além disso, a estrutura interna da população também pode ser influenciada pela heterogeneidade ambiental (Heywood, 1991; Epperson, 1993). Neste sentido, a heterogeneidade ambiental pode ter sido um dos fatores responsáveis pela variação da estrutura genética interna observada para as quatro populações de O. catharinensis analisadas que resultaram em valores de 40 a 100m. Nas quatro áreas do presente trabalho, as declividades foram similares apresentando valores entre 12% a 17% e a população com a menor declividade (CP) obteve a menor distância de correlação positiva e significativa (40m). Entretanto, a relação entre estas duas variáveis (declividade e distância) não se repetiu nas demais populações estudadas. A população MB, única cuja paisagem era constituída por uma montanha (IBGE, 2004), foi a que apresentou a maior correlação positiva e significativa (100m). Sugere-se, neste caso que o fator determinante para esta influência pode ter sido a dispersão barocórica que, por sua vez é fortemente influenciada pelo relevo. È importante lembrar que umas das principais diferenças entre os locais de estudo foi a presença de exploração madeireira na população PEST. Uma hipótese proposta é que este fator pode ter influenciado negativamente na estrutura interna desta população, pois foi justamente esta área que apresentou a maior declividade (17%) e, portanto deveria refletir de maneira mais 85 explícita a influência da síndrome de dispersão barocórica que tornaria a estrutura interna com maior distância. Entretanto, a PEST apresentou uma correlação positiva até 60m de distância. Outra abordagem para o entendimento da estrutura interna da população baseia-se na densidade de indivíduos (Perry & Knowles, 1991; Vekemans & Hardy, 2004). No presente estudo verificou-se que a população (CP) com a menor correlação positiva e significativa (40m) apresentou a maior densidade de indivíduos. Porém, uma vez mais, a relação entre estas duas variáveis não foi observada nas demais populações estudadas. É importante ressaltar que, como anteriormente explicado nos itens “Estrutura Demográfica” e “Estrutura Genética”, os dispersores supostamente podem constituir um dos principais fatores que contribuiu para o padrão de distribuição espacial tornando-o agregado, sendo também um dos responsáveis pelo efeito fundador nas populações, propiciando uma maior densidade e endogamia na população CP, diferentemente das demais populações analisadas. Para comprovação destes supostos efeitos são necessários estudos complementares como testes de progênie, observações diretas dos polinizadores e dispersores e estimativas diretas de fluxo gênico nas áreas em questão. Os resultados obtidos no presente trabalho permitem sugerir que as forças microevolutivas geradas pelos prováveis dispersores da O. catharinensis associado ao relevo influenciaram fortemente todos os índices estudados e, portanto, devem ser considerados como mais um fator de grande importância para subsidiar estratégias de conservação. 86

Conclusões

Os resultados obtidos para a O. catharinensis evidencia a existência de estrutura genética interna nas populações, associada a uma forte estrutura genética entre as populações. Aparentemente, estas duas estruturas são determinadas pela síndrome de dispersão associada ao relevo. A alta diversidade genética encontrada para O. catharinensis em todas as populações estudadas revela a importância da manutenção destas para a conservação da espécie. A presença de alelos raros e exclusivos nas populações, bem como a alta divergência entre as mesmas, sugere que a conservação genética in situ deve ser efetuada em diferentes populações de O. catharinensis além das já estudadas. Estes resultados também sugerem que para uma conservação in situ da O. catharinensis necessita-se de grandes áreas e uma quantidade grande de fragmentos para a manutenção do tamanho mínimo viável das populações. Os resultados do presente estudo sugerem um futuro aumento na divergência das populações devido a fragmentação florestal e superexploração da espécie nos últimos séculos. Para a manutenção do fluxo gênico com a finalidade de contrapor os efeitos gerados pela deriva genética e estabilizar a divergência entre as populações, a conectividade entre os fragmentos deve ser restabelecida. Neste sentido, o Estado de Santa Catarina possui muitos fragmentos em diversos graus de sucessão secundária localizados na Floresta Ombrófila Densa. Sugere-se que a restauração e o uso racional destes fragmentos poderiam auxiliar na manutenção da conectividade dos poucos núcleos remanescentes de O. catharinensis.

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Wright, S., 1969. Evolution and the Genetics of Populations. The Theory of Gene Frequencies. Vol.2. The University of Chicago Press, Chicago, USA. 98

Anexos

Anexo 1 Resultados do Teste Qui-quadrado(X2), graus de liberdade (GL) e probabilidades (p), para as estatísticas F de Wright (FIT, FIS e FST) nos locos significativos a p=0.01 e 0.05.

FIT Locos X2 GL p α-EST 1 8.46 1 0.01 α-EST 2 56.74 3 0.01 α-EST 3 8.42 1 0.01 ACP 1 8.8 1 0.01 DIA 1 20.83 1 0.01 DIA 2 114.91 1 0.01 GOT 2 19.74 3 0.01 IDH 1 38.65 3 0.01 ME 1 31.91 1 0.01 PGM 1 37.36 1 0.01 PRX 2 12.17 1 0.01 SKDH 17.08 1 0.01 FIS Locos X2 GL p α-EST 3 41.66 1 0.01 IDH 1 39.18 3 0.01 ME 1 12.21 1 0.01 PRX 1 23.375 3 0.01 SKDH 1 14.11 1 0.01 PGM 1 5.16 1 0.05 SOD 1 5.795 1 0.05 DIA 2 9.54 1 0.01 ACP 1 5.31 1 0.05 FST Locos X2 GL p α-EST 1 37.35 6 0.01 α-EST 2 56.74 6 0.01 DIA 1 66.61 3 0.01 DIA 2 158.65 3 0.01 GOT 2 136.67 6 0.01 IDH 1 54.45 6 0.01 MDH 1 47.84 6 0.01 MDH 2 22.03 3 0.01 ME 1 18.39 3 0.01 PGM 1 67.38 3 0.01 PRX 1 115.34 6 0.01 PRX 2 12.17 3 0.01 SKDH 1 17.91 3 0.01 SOD 1 54.35 3 0.01

99

Anexo 2 Resultados, por loco, da autocorrelação espacial na população PEST. Correlogram using Moran's Index Value indicating absense of spatial autocorrelation = -0,0294 ACP 1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,281525 -0,050587 0,265434 0,516 0,484 20-40 -0,238879 0,092892 0,157222 0,090 0,910 40-60 -0,213099 -0,171648 0,125743 0,934 0,066 60-80 -0,243035 -0,108749 0,158113 0,806 0,194 80-100 -0,217213 0,155017 0,162163 0,030 0,970 100-120 -0,257968 0,046584 0,158478 0,236 0,764 120-140 -0,346613 -0,140083 0,182855 0,806 0,194 140-160 -0,390858 -0,219049 0,296379 0,874 0,126 160-180 -0,410850 -0,353372 0,301466 0,970 0,030 180-200 -0,286657 0,073864 0,217559 0,178 0,822 DIA 1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,258798 -0,130723 0,272579 0,720 0,280 20-40 -0,221185 -0,027211 0,152179 0,512 0,488 40-60 -0,226028 -0,087961 0,136398 0,774 0,226 60-80 -0,249260 0,032051 0,170118 0,228 0,772 80-100 -0,231893 0,025017 0,123324 0,246 0,754 100-120 -0,220826 0,089824 0,157726 0,092 0,908 120-140 -0,302930 -0,171598 0,229975 0,904 0,096 140-160 -0,365192 -0,023025 0,314639 0,510 0,490 160-180 -0,399408 0,056213 0,230178 0,244 0,756 180-200 -0,293269 -0,029216 0,229660 0,530 0,470 DIA2 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,263754 0,235522 0,238503 0,028 0,972 20-40 -0,231050 0,230001 0,174962 0,014 0,986 40-60 -0,215107 0,016513 0,139947 0,304 0,696 60-80 -0,249595 -0,093851 0,171386 0,750 0,250 80-100 -0,250133 -0,050121 0,149891 0,624 0,376 100-120 -0,274895 -0,168126 0,159611 0,896 0,104 120-140 -0,320388 -0,266517 0,208659 0,952 0,048 140-160 -0,394259 -0,044604 0,337062 0,574 0,426 160-180 -0,404207 -0,107443 0,320712 0,716 0,284 180-200 -0,335963 -0,000405 0,237460 0,410 0,590 EST1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,251467 0,229021 0,280349 0,056 0,944 20-40 -0,225461 0,084354 0,166005 0,124 0,876 40-60 -0,210229 -0,034492 0,130130 0,554 0,446 60-80 -0,228844 -0,255031 0,182921 0,984 0,016 80-100 -0,188678 -0,089235 0,128169 0,816 0,184 100-120 -0,252144 0,012536 0,155535 0,336 0,664 120-140 -0,341916 -0,018161 0,199879 0,498 0,502 140-160 -0,420514 0,118926 0,272042 0,138 0,862 160-180 -0,393189 -0,211146 0,274303 0,864 0,136 180-200 -0,320046 0,005031 0,251548 0,376 0,624

100

EST2 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,207187 0,080879 0,233124 0,162 0,838 20-40 -0,178066 -0,072577 0,105943 0,724 0,276 40-60 -0,168118 0,149801 0,094712 0,012 0,988 60-80 -0,188214 -0,147405 0,127858 0,934 0,066 80-100 -0,184421 -0,105416 0,104252 0,868 0,132 100-120 -0,201129 -0,131474 0,116845 0,900 0,100 120-140 -0,241778 -0,073154 0,163388 0,668 0,332 140-160 -0,335152 -0,132671 0,205493 0,814 0,186 160-180 -0,322085 -0,222222 0,215638 0,934 0,066 180-200 -0,229424 0,382716 0,171468 0,000 1,000 EST3 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,264229 -0,025398 0,295900 0,486 0,514 20-40 -0,234196 0,034638 0,175074 0,258 0,742 40-60 -0,236658 0,159362 0,153101 0,020 0,980 60-80 -0,254554 -0,072771 0,206008 0,634 0,366 80-100 -0,246320 -0,067560 0,132323 0,706 0,294 100-120 -0,269443 0,002097 0,151544 0,372 0,628 120-140 -0,315088 -0,205899 0,224901 0,932 0,068 140-160 -0,449697 -0,092265 0,343023 0,654 0,346 160-180 -0,340698 -0,094884 0,320233 0,716 0,284 180-200 -0,297965 -0,115843 0,219913 0,746 0,254 GOT2 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,198892 0,306059 0,212769 0,008 0,992 20-40 -0,173384 -0,020425 0,115099 0,406 0,594 40-60 -0,161720 -0,145849 0,094381 0,958 0,042 60-80 -0,208467 0,011924 0,139469 0,290 0,710 80-100 -0,159510 -0,046970 0,089076 0,624 0,376 100-120 -0,185467 -0,184545 0,112487 0,974 0,026 120-140 -0,231433 0,118540 0,156968 0,062 0,938 140-160 -0,283168 -0,036069 0,233049 0,528 0,472 160-180 -0,275241 -0,056913 0,183923 0,628 0,372 180-200 -0,234727 0,021302 0,169011 0,282 0,718 IDH1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,266996 0,028509 0,266447 0,328 0,672 20-40 -0,216403 0,041373 0,153316 0,230 0,770 40-60 -0,233440 0,099359 0,131143 0,060 0,940 60-80 -0,246528 0,209201 0,161806 0,010 0,990 80-100 -0,226530 -0,046545 0,146361 0,604 0,396 100-120 -0,289959 0,033982 0,149932 0,246 0,754 120-140 -0,327744 -0,123222 0,250254 0,814 0,186 140-160 -0,388134 -0,153533 0,299819 0,798 0,202 160-180 -0,445833 -0,279583 0,280417 0,924 0,076 180-200 -0,341927 -0,279948 0,239583 0,952 0,048

101

MDH1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,209714 0,135035 0,180519 0,050 0,950 20-40 -0,175361 0,050647 0,123955 0,138 0,862 40-60 -0,170803 -0,034073 0,098377 0,530 0,470 60-80 -0,192434 -0,107651 0,125094 0,850 0,150 80-100 -0,168371 -0,053261 0,108341 0,678 0,322 100-120 -0,205350 -0,121957 0,108581 0,886 0,114 120-140 -0,208617 -0,084545 0,155457 0,708 0,292 140-160 -0,251940 0,164788 0,233104 0,074 0,926 160-180 -0,296072 -0,080808 0,195735 0,672 0,328 180-200 -0,228114 -0,020412 0,153900 0,450 0,550 MDH2 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,269510 0,222777 0,286298 0,062 0,938 20-40 -0,218067 0,175733 0,189898 0,034 0,966 40-60 -0,210875 0,173372 0,142426 0,008 0,992 60-80 -0,285920 -0,054598 0,193487 0,534 0,466 80-100 -0,208133 -0,098647 0,178888 0,784 0,216 100-120 -0,271246 -0,030526 0,187111 0,512 0,488 120-140 -0,322960 -0,381833 0,275582 0,994 0,006 140-160 -0,422789 0,049475 0,399300 0,276 0,724 160-180 -0,380460 0,062069 0,327586 0,224 0,776 180-200 -0,336207 -0,185345 0,282328 0,884 0,116 ME1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,276893 0,163435 0,277893 0,114 0,886 20-40 -0,226691 -0,143090 0,170414 0,870 0,130 40-60 -0,259353 0,047665 0,132291 0,184 0,816 60-80 -0,239279 -0,163377 0,181165 0,900 0,100 80-100 -0,217559 0,033108 0,185321 0,242 0,758 100-120 -0,290336 -0,066365 0,160124 0,640 0,360 120-140 -0,397197 -0,055235 0,275496 0,576 0,424 140-160 -0,392639 0,475019 0,328185 0,006 0,994 160-180 -0,422807 -0,604971 0,297661 1,000 0,000 180-200 -0,341192 0,013158 0,270285 0,380 0,620 PRX1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,205067 0,085390 0,169469 0,104 0,896 20-40 -0,198177 -0,023800 0,088189 0,460 0,540 40-60 -0,166334 -0,020640 0,089677 0,440 0,560 60-80 -0,166753 0,020228 0,108575 0,250 0,750 80-100 -0,151610 0,059798 0,091969 0,060 0,940 100-120 -0,160176 -0,236361 0,117186 0,996 0,004 120-140 -0,249949 -0,149884 0,162711 0,894 0,106 140-160 -0,299116 -0,044967 0,213918 0,524 0,476 160-180 -0,272407 -0,204149 0,198133 0,930 0,070 180-200 -0,218491 -0,095047 0,168179 0,774 0,226

102

SKDH1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,254244 0,093379 0,215195 0,132 0,868 20-40 -0,211268 -0,123807 0,141754 0,868 0,132 40-60 -0,195203 -0,014268 0,123242 0,474 0,526 60-80 -0,236022 0,145968 0,166667 0,042 0,958 80-100 -0,209677 -0,156799 0,119028 0,956 0,044 100-120 -0,287414 0,006875 0,153094 0,366 0,634 120-140 -0,311566 0,093234 0,219906 0,128 0,872 140-160 -0,376578 -0,224404 0,300842 0,914 0,086 160-180 -0,336129 0,025161 0,278065 0,296 0,704 180-200 -0,339516 0,047177 0,199597 0,198 0,802 SOD1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,268006 0,350069 0,257964 0,002 0,998 20-40 -0,237213 0,065048 0,162342 0,142 0,858 40-60 -0,218286 0,073381 0,132422 0,108 0,892 60-80 -0,235526 0,280263 0,192763 0,000 1,000 80-100 -0,208361 -0,260826 0,135576 0,998 0,002 100-120 -0,269198 -0,091027 0,155091 0,738 0,262 120-140 -0,373235 0,071566 0,213094 0,166 0,834 140-160 -0,359268 -0,291190 0,297483 0,950 0,050 160-180 -0,392105 -0,502632 0,311579 0,992 0,008 180-200 -0,325329 -0,309211 0,234211 0,970 0,030

103

Anexo 3 Resultados, por loco, da autocorrelação espacial na população MB.

ACP1 Correlogram using Moran's Index Value indicating absense of spatial autocorrelation = -0,0200 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,295930 0,122743 0,343522 0,172 0,828 20-40 -0,236280 -0,166376 0,200131 0,892 0,108 40-60 -0,198233 0,023364 0,186784 0,330 0,670 60-80 -0,158836 -0,046681 0,120459 0,654 0,346 80-100 -0,146552 0,051625 0,103339 0,134 0,866 100-120 -0,160714 -0,182491 0,126307 0,984 0,016 120-140 -0,179393 -0,036479 0,126134 0,576 0,424 140-160 -0,200784 0,080139 0,122387 0,100 0,900 160-180 -0,243556 -0,132189 0,170875 0,870 0,130 180-200 -0,223730 -0,015049 0,164989 0,518 0,482 DIA1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,338922 0,117957 0,325095 0,206 0,794 20-40 -0,239306 0,048004 0,216968 0,272 0,728 40-60 -0,241071 0,012290 0,185429 0,356 0,644 60-80 -0,173471 0,079256 0,142438 0,096 0,904 80-100 -0,175856 0,082826 0,137365 0,102 0,898 100-120 -0,201046 -0,046103 0,156844 0,606 0,394 120-140 -0,204669 -0,118687 0,154351 0,878 0,122 140-160 -0,203422 -0,194867 0,155418 0,968 0,032 160-180 -0,238945 0,055250 0,199359 0,252 0,748 180-200 -0,237092 0,002752 0,194754 0,398 0,602 DIA2 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,290397 0,223303 0,364789 0,070 0,930 20-40 -0,219366 -0,083099 0,197887 0,704 0,296 40-60 -0,220976 -0,099547 0,195473 0,780 0,220 60-80 -0,195140 -0,006731 0,141642 0,420 0,580 80-100 -0,178433 0,130216 0,136389 0,036 0,964 100-120 -0,198592 -0,035915 0,171127 0,562 0,438 120-140 -0,192918 0,057813 0,151329 0,198 0,802 140-160 -0,208451 0,071127 0,146479 0,148 0,852 160-180 -0,224619 0,049913 0,194559 0,248 0,752 180-200 -0,242939 -0,184340 0,167254 0,928 0,072 EST1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,309527 0,091318 0,289423 0,228 0,772 20-40 -0,250000 -0,136432 0,195277 0,848 0,152 40-60 -0,210350 -0,110677 0,171959 0,828 0,172 60-80 -0,177096 0,170742 0,144106 0,008 0,992 80-100 -0,185802 -0,159518 0,126318 0,956 0,044 100-120 -0,209520 -0,200150 0,135307 0,974 0,026 120-140 -0,182725 -0,034490 0,141517 0,586 0,414 140-160 -0,185532 0,244378 0,158921 0,000 1,000 160-180 -0,232240 0,030663 0,174159 0,302 0,698 180-200 -0,233873 -0,099059 0,169060 0,744 0,256 104

EST2 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,251753 0,052655 0,219760 0,256 0,744 20-40 -0,183884 -0,047262 0,152376 0,632 0,368 40-60 -0,159952 0,047656 0,121667 0,174 0,826 60-80 -0,143349 -0,013074 0,099927 0,460 0,540 80-100 -0,140835 0,034648 0,107640 0,174 0,826 100-120 -0,158747 -0,127410 0,099518 0,954 0,046 120-140 -0,176244 -0,049002 0,119825 0,694 0,306 140-160 -0,163395 -0,063017 0,115702 0,746 0,254 160-180 -0,171459 0,073927 0,134312 0,112 0,888 180-200 -0,181288 0,083066 0,124429 0,080 0,920 EST3 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,324567 0,415193 0,352474 0,012 0,988 20-40 -0,263658 0,281478 0,196410 0,004 0,996 40-60 -0,221012 0,033912 0,165954 0,276 0,724 60-80 -0,171112 0,122947 0,155789 0,064 0,936 80-100 -0,193174 0,054346 0,137889 0,190 0,810 100-120 -0,225546 -0,009625 0,161030 0,476 0,524 120-140 -0,194692 0,103950 0,156269 0,090 0,910 140-160 -0,227367 -0,127471 0,158429 0,880 0,120 160-180 -0,264657 -0,004761 0,210426 0,448 0,552 180-200 -0,238519 -0,282861 0,183245 0,992 0,008 GOT2 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,233181 0,252645 0,179771 0,006 0,994 20-40 -0,175127 0,211024 0,140612 0,004 0,996 40-60 -0,168983 0,220218 0,119629 0,000 1,000 60-80 -0,129483 0,033184 0,090899 0,182 0,818 80-100 -0,127127 0,045010 0,092064 0,126 0,874 100-120 -0,135089 -0,148683 0,099405 0,988 0,012 120-140 -0,136865 -0,125010 0,107380 0,958 0,042 140-160 -0,149533 -0,172897 0,107052 0,994 0,006 160-180 -0,170191 -0,189482 0,136387 0,984 0,016 180-200 -0,178146 -0,086354 0,120322 0,850 0,150 IDH1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,326387 0,139819 0,299503 0,180 0,820 20-40 -0,217933 -0,055819 0,215855 0,684 0,316 40-60 -0,224847 0,159484 0,189769 0,050 0,950 60-80 -0,184786 0,068416 0,134448 0,146 0,854 80-100 -0,181831 0,154617 0,111555 0,006 0,994 100-120 -0,216152 0,036223 0,138955 0,260 0,740 120-140 -0,212018 -0,256017 0,168545 0,992 0,008 140-160 -0,193587 -0,301663 0,152613 1,000 0,000 160-180 -0,237481 -0,090619 0,218039 0,720 0,280 180-200 -0,234904 -0,020518 0,189883 0,522 0,478

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MDH1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,279352 0,204335 0,232327 0,058 0,942 20-40 -0,193766 -0,037700 0,158804 0,540 0,460 40-60 -0,181099 0,126053 0,122217 0,020 0,980 60-80 -0,151960 -0,017958 0,101782 0,482 0,518 80-100 -0,142201 -0,168551 0,128347 0,992 0,008 100-120 -0,171230 0,012848 0,125105 0,354 0,646 120-140 -0,163795 -0,028210 0,113454 0,530 0,470 140-160 -0,168703 -0,142376 0,120051 0,946 0,054 160-180 -0,206610 0,191556 0,162716 0,012 0,988 180-200 -0,187331 0,022974 0,146782 0,290 0,710 MDH2 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,301455 0,254909 0,335273 0,060 0,940 20-40 -0,243000 0,261000 0,222000 0,018 0,982 40-60 -0,237429 0,265286 0,165714 0,010 0,990 60-80 -0,175082 0,132590 0,149311 0,036 0,964 80-100 -0,169125 0,168750 0,125719 0,012 0,988 100-120 -0,216000 -0,098000 0,150000 0,798 0,202 120-140 -0,201962 -0,094189 0,150226 0,770 0,230 140-160 -0,192000 -0,276000 0,158000 0,996 0,004 160-180 -0,218466 -0,170959 0,195123 0,932 0,068 180-200 -0,201000 0,126474 0,190895 0,086 0,914 ME1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,308367 0,114815 0,404704 0,188 0,812 20-40 -0,272618 -0,113842 0,224065 0,820 0,180 40-60 -0,215621 -0,184495 0,184624 0,948 0,052 60-80 -0,198981 0,007767 0,127529 0,368 0,632 80-100 -0,172605 0,049924 0,135955 0,190 0,810 100-120 -0,213812 0,062726 0,153498 0,172 0,828 120-140 -0,219684 -0,101287 0,148565 0,810 0,190 140-160 -0,216526 -0,096200 0,167370 0,804 0,196 160-180 -0,244485 0,020556 0,204273 0,368 0,632 180-200 -0,244358 0,011436 0,162402 0,396 0,604 PRX1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,249194 0,024823 0,200193 0,368 0,632 20-40 -0,164894 0,166223 0,135638 0,008 0,992 40-60 -0,156028 0,147543 0,112019 0,004 0,996 60-80 -0,150593 0,011728 0,095483 0,294 0,706 80-100 -0,145903 -0,047706 0,084400 0,700 0,300 100-120 -0,153369 -0,056738 0,107270 0,704 0,296 120-140 -0,133280 -0,133280 0,113258 0,976 0,024 140-160 -0,157801 -0,136525 0,100177 0,962 0,038 160-180 -0,178738 0,007068 0,139609 0,330 0,670 180-200 -0,175462 -0,021976 0,121990 0,526 0,474

106

PRX2 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,265909 0,091477 0,323295 0,210 0,790 20-40 -0,210938 -0,154688 0,210937 0,914 0,086 40-60 -0,195536 0,058705 0,199107 0,260 0,740 60-80 -0,176127 0,171363 0,134785 0,014 0,986 80-100 -0,157471 -0,010547 0,131396 0,430 0,570 100-120 -0,178125 -0,115625 0,159375 0,866 0,134 120-140 -0,174057 0,012382 0,165743 0,344 0,656 140-160 -0,181250 -0,018750 0,150000 0,468 0,532 160-180 -0,224229 -0,106336 0,194949 0,836 0,164 180-200 -0,221299 -0,019984 0,181332 0,492 0,508 SKDH1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,346921 0,358504 0,390909 0,030 0,970 20-40 -0,248790 -0,102419 0,200000 0,788 0,212 40-60 -0,238134 0,103629 0,192742 0,120 0,880 60-80 -0,185510 -0,023017 0,128014 0,514 0,486 80-100 -0,203768 -0,181918 0,119481 0,966 0,034 100-120 -0,216129 0,178226 0,144355 0,006 0,994 120-140 -0,199148 0,025122 0,167909 0,312 0,688 140-160 -0,200806 -0,012097 0,174194 0,482 0,518 160-180 -0,241648 -0,032059 0,202320 0,548 0,452 180-200 -0,230454 -0,128714 0,165683 0,872 0,128 SOD1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,321253 -0,081081 0,315725 0,614 0,386 20-40 -0,245777 -0,134291 0,200169 0,852 0,148 40-60 -0,226713 0,107625 0,208132 0,106 0,894 60-80 -0,195475 -0,154519 0,139233 0,942 0,058 80-100 -0,175306 0,009106 0,123522 0,336 0,664 100-120 -0,206081 0,076014 0,167230 0,168 0,832 120-140 -0,186735 -0,014438 0,156234 0,472 0,528 140-160 -0,217905 -0,018581 0,165541 0,552 0,448 160-180 -0,227416 0,105378 0,211588 0,118 0,882 180-200 -0,251111 -0,140025 0,186433 0,886 0,114

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Anexo 4 Resultados, por loco, da autocorrelação espacial na população CP.

Value indicating absense of spatial autocorrelation = -0,0208 ACP1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,156504 0,045460 0,179855 0,216 0,784 20-40 -0,147552 -0,062782 0,108918 0,724 0,276 40-60 -0,143034 -0,069809 0,072828 0,816 0,184 60-80 -0,152327 0,073834 0,080740 0,036 0,964 80-100 -0,155999 -0,117147 0,100260 0,952 0,048 100-120 -0,195381 -0,102871 0,154578 0,864 0,136 120-140 -0,246045 0,199474 0,161658 0,020 0,980 140-160 -0,771171 0,098381 0,472136 0,184 0,816 DIA1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,154578 -0,028550 0,208567 0,488 0,512 20-40 -0,151233 0,049802 0,103129 0,102 0,898 40-60 -0,139982 0,093174 0,083336 0,022 0,978 60-80 -0,127863 -0,123766 0,078058 0,972 0,028 80-100 -0,157305 -0,030431 0,092391 0,574 0,426 100-120 -0,180152 -0,078410 0,148380 0,792 0,208 120-140 -0,234261 -0,138543 0,172386 0,876 0,124 140-160 -0,488436 0,255300 0,491407 0,150 0,850 DIA2 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,125925 -0,003200 0,167251 0,328 0,672 20-40 -0,112008 0,068291 0,091325 0,064 0,936 40-60 -0,106990 0,141652 0,074414 0,000 1,000 60-80 -0,108445 -0,039328 0,069105 0,640 0,360 80-100 -0,114943 -0,035242 0,082412 0,564 0,436 100-120 -0,158442 -0,178197 0,139198 0,990 0,010 120-140 -0,192665 -0,344583 0,180618 1,000 0,000 140-160 -0,411664 -0,341624 0,414808 0,946 0,054 EST1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,166099 0,165207 0,169715 0,030 0,970 20-40 -0,154837 0,116644 0,112443 0,026 0,974 40-60 -0,151923 0,023110 0,087937 0,240 0,760 60-80 -0,161974 -0,138917 0,085367 0,964 0,036 80-100 -0,147645 -0,166714 0,108036 0,988 0,012 100-120 -0,187643 0,046573 0,151056 0,200 0,800 120-140 -0,269685 -0,157770 0,189453 0,894 0,106 140-160 -0,694387 0,301172 0,592894 0,120 0,880

108

EST2 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,142146 -0,083684 0,148802 0,816 0,184 20-40 -0,133045 0,004594 0,085797 0,306 0,694 40-60 -0,116231 -0,023206 0,060089 0,496 0,504 60-80 -0,117751 0,040866 0,065328 0,074 0,926 80-100 -0,119671 -0,072791 0,068153 0,856 0,144 100-120 -0,147257 -0,059732 0,131638 0,730 0,270 120-140 -0,194474 0,058852 0,135197 0,146 0,854 140-160 -0,515628 -0,234244 0,413919 0,846 0,154 EST3 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,162510 -0,134352 0,186645 0,912 0,088 20-40 -0,150187 -0,012418 0,094189 0,478 0,522 40-60 -0,153512 -0,021901 0,095248 0,516 0,484 60-80 -0,143472 -0,019080 0,071268 0,492 0,508 80-100 -0,161442 0,025078 0,092476 0,224 0,776 100-120 -0,181041 -0,015152 0,112665 0,476 0,524 120-140 -0,231754 0,028169 0,185019 0,304 0,696 140-160 -0,603306 -0,169421 0,582645 0,742 0,258 GOT2 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,150155 -0,074664 0,145370 0,728 0,272 20-40 -0,143557 0,071925 0,079844 0,048 0,952 40-60 -0,131756 0,018873 0,068001 0,210 0,790 60-80 -0,126478 -0,013010 0,065630 0,462 0,538 80-100 -0,134858 -0,051610 0,079170 0,726 0,274 100-120 -0,167231 -0,057462 0,115081 0,734 0,266 120-140 -0,214006 -0,101071 0,138087 0,832 0,168 140-160 -0,523427 -0,528328 0,473822 0,978 0,022 IDH1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,164773 0,128419 0,168661 0,052 0,948 20-40 -0,159511 0,105026 0,084456 0,018 0,982 40-60 -0,153383 -0,141994 0,093388 0,974 0,026 60-80 -0,143768 -0,017739 0,084993 0,464 0,536 80-100 -0,148772 -0,048655 0,098093 0,738 0,262 100-120 -0,193328 -0,152875 0,133466 0,944 0,056 120-140 -0,240584 0,054818 0,164613 0,232 0,768 140-160 -0,595041 0,096763 0,527032 0,350 0,650 MDH1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,134571 0,077672 0,110944 0,078 0,922 20-40 -0,121410 0,001684 0,070046 0,300 0,700 40-60 -0,108152 -0,161674 0,060490 0,998 0,002 60-80 -0,105684 0,006360 0,041470 0,242 0,758 80-100 -0,117317 0,013956 0,064023 0,198 0,802 100-120 -0,140146 0,062016 0,084263 0,068 0,932 120-140 -0,155072 -0,137033 0,134717 0,958 0,042 140-160 -0,445999 -0,096696 0,385942 0,636 0,364

109

MDH2 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,162938 -0,079903 0,197301 0,712 0,288 20-40 -0,153842 -0,002149 0,093606 0,368 0,632 40-60 -0,168758 0,072925 0,092742 0,058 0,942 60-80 -0,130036 -0,033113 0,087797 0,626 0,374 80-100 -0,153772 0,022477 0,097879 0,244 0,756 100-120 -0,193986 -0,181025 0,136116 0,968 0,032 120-140 -0,246452 -0,102950 0,186722 0,796 0,204 140-160 -0,638122 0,408739 0,576754 0,054 0,946 ME1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,168945 0,005302 0,161249 0,324 0,676 20-40 -0,151665 -0,060366 0,106706 0,750 0,250 40-60 -0,139128 -0,004266 0,088503 0,396 0,604 60-80 -0,132922 0,051890 0,070389 0,074 0,926 80-100 -0,143436 -0,049098 0,097058 0,702 0,298 100-120 -0,181604 -0,137803 0,144217 0,930 0,070 120-140 -0,233880 0,012418 0,166275 0,354 0,646 140-160 -0,652627 -0,570892 0,548874 0,972 0,028 PGM1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,172839 0,221065 0,144214 0,006 0,994 20-40 -0,147335 0,025663 0,117136 0,218 0,782 40-60 -0,132355 -0,140746 0,085223 0,982 0,018 60-80 -0,133681 -0,193416 0,077460 0,998 0,002 80-100 -0,141120 0,084760 0,083520 0,022 0,978 100-120 -0,194305 0,136650 0,134857 0,026 0,974 120-140 -0,243681 -0,103644 0,183521 0,800 0,200 140-160 -0,607176 -0,302070 0,498833 0,870 0,130 PRX1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,142224 0,086132 0,153526 0,086 0,914 20-40 -0,128704 -0,122342 0,079096 0,970 0,030 40-60 -0,117030 -0,045576 0,071504 0,662 0,338 60-80 -0,112911 -0,028189 0,059600 0,576 0,424 80-100 -0,126377 0,046512 0,067507 0,078 0,922 100-120 -0,157417 -0,034602 0,099160 0,604 0,396 120-140 -0,222279 -0,023503 0,129679 0,510 0,490 140-160 -0,498228 0,323237 0,448151 0,068 0,932 SKDH1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,166748 0,526676 0,177924 0,000 1,000 20-40 -0,160505 0,221054 0,111720 0,002 0,998 40-60 -0,150730 -0,079608 0,084433 0,836 0,164 60-80 -0,144585 -0,239716 0,074771 1,000 0,000 80-100 -0,160472 -0,322502 0,098018 1,000 0,000 100-120 -0,198125 -0,048891 0,133186 0,630 0,370 120-140 -0,215906 0,256455 0,188913 0,006 0,994 140-160 -0,580814 0,017224 0,548192 0,438 0,562

110

SOD1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,153038 0,135146 0,153411 0,046 0,954 20-40 -0,133711 0,063307 0,096012 0,052 0,948 40-60 -0,141579 0,148383 0,079411 0,000 1,000 60-80 -0,114299 -0,110209 0,072090 0,968 0,032 80-100 -0,132390 -0,093980 0,086960 0,916 0,084 100-120 -0,185587 -0,407076 0,129332 1,000 0,000 120-140 -0,232878 0,003988 0,175716 0,380 0,620 140-160 -0,638633 -0,485747 0,476741 0,962 0,038

111

Anexo 5 Resultados, por loco, da autocorrelação espacial na população GP.

Correlogram using Moran's Index Value indicating absense of spatial autocorrelation = -0,0192 ACP1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,331007 -0,293622 0,395048 0,958 0,042 20-40 -0,230606 -0,020588 0,191450 0,474 0,526 40-60 -0,221190 0,064093 0,193493 0,230 0,770 60-80 -0,240098 -0,113639 0,172617 0,842 0,158 80-100 -0,227844 0,137914 0,146998 0,036 0,964 100-120 -0,196350 -0,067059 0,159433 0,720 0,280 120-140 -0,174746 0,049679 0,145647 0,204 0,796 140-160 -0,193058 -0,055969 0,131478 0,670 0,330 160-180 -0,198172 -0,231581 0,152628 0,992 0,008 180-200 -0,189860 -0,008808 0,150662 0,442 0,558 DIA1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,335168 0,167119 0,430920 0,156 0,844 20-40 -0,246569 0,238399 0,192363 0,008 0,992 40-60 -0,212641 -0,005206 0,179000 0,492 0,508 60-80 -0,228178 0,170383 0,180892 0,032 0,968 80-100 -0,184167 -0,098699 0,146051 0,806 0,194 100-120 -0,175870 -0,024082 0,139358 0,528 0,472 120-140 -0,190878 -0,089991 0,126196 0,800 0,200 140-160 -0,169981 -0,036560 0,123111 0,600 0,400 160-180 -0,202914 -0,188776 0,182726 0,964 0,036 180-200 -0,183512 0,055183 0,154504 0,192 0,808 DIA2 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,347919 0,770541 0,390633 0,000 1,000 20-40 -0,206125 -0,050939 0,225972 0,608 0,392 40-60 -0,236415 0,208034 0,187221 0,016 0,984 60-80 -0,225180 0,176931 0,168235 0,024 0,976 80-100 -0,188118 0,034745 0,161504 0,292 0,708 100-120 -0,205235 0,043381 0,154956 0,236 0,764 120-140 -0,177045 0,068039 0,122920 0,136 0,864 140-160 -0,197502 0,102535 0,139392 0,058 0,942 160-180 -0,225632 -0,045486 0,173398 0,600 0,400 180-200 -0,204413 -0,076278 0,160124 0,756 0,244 EST1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,315271 0,147885 0,353733 0,190 0,810 20-40 -0,234655 -0,108483 0,190319 0,814 0,186 40-60 -0,223868 0,183656 0,177098 0,022 0,978 60-80 -0,206132 0,021881 0,173472 0,354 0,646 80-100 -0,224705 -0,065617 0,142448 0,698 0,302 100-120 -0,197533 -0,104278 0,139672 0,848 0,152 120-140 -0,169035 0,101714 0,132370 0,064 0,936 140-160 -0,174198 -0,029305 0,137656 0,572 0,428 160-180 -0,217978 -0,098134 0,139659 0,806 0,194 180-200 -0,185232 -0,028724 0,132719 0,552 0,448 112

EST2 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,256902 0,237403 0,259275 0,036 0,964 20-40 -0,168882 0,174564 0,130231 0,004 0,996 40-60 -0,162885 0,005207 0,122286 0,364 0,636 60-80 -0,154823 -0,089170 0,113538 0,832 0,168 80-100 -0,153108 -0,080429 0,114619 0,842 0,158 100-120 -0,133167 -0,008318 0,093009 0,452 0,548 120-140 -0,126345 -0,044262 0,090227 0,688 0,312 140-160 -0,136444 -0,012381 0,093134 0,442 0,558 160-180 -0,138872 -0,081715 0,108761 0,842 0,158 180-200 -0,144108 -0,013603 0,092801 0,472 0,528 EST3 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,401458 0,234706 0,373225 0,090 0,910 20-40 -0,220141 0,033474 0,205769 0,298 0,702 40-60 -0,219542 -0,067583 0,176441 0,702 0,298 60-80 -0,210406 0,003917 0,154791 0,368 0,632 80-100 -0,209845 0,051947 0,142535 0,220 0,780 100-120 -0,199260 0,113194 0,136436 0,064 0,936 120-140 -0,176297 -0,177108 0,128941 0,980 0,020 140-160 -0,185075 -0,000449 0,144230 0,434 0,566 160-180 -0,214637 -0,000261 0,163753 0,432 0,568 180-200 -0,172396 0,128251 0,159167 0,042 0,958 GOT2 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,257360 0,792266 0,261374 0,000 1,000 20-40 -0,162257 -0,067287 0,147261 0,710 0,290 40-60 -0,176892 -0,063466 0,127125 0,724 0,276 60-80 -0,157058 -0,096678 0,119681 0,852 0,148 80-100 -0,136870 -0,028302 0,101684 0,536 0,464 100-120 -0,150831 -0,132631 0,101572 0,950 0,050 120-140 -0,125332 0,087903 0,100017 0,044 0,956 140-160 -0,136478 -0,045516 0,101217 0,652 0,348 160-180 -0,151951 0,084052 0,108781 0,062 0,938 180-200 -0,129687 0,073023 0,109449 0,080 0,920 IDH1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,258900 0,058465 0,229354 0,280 0,720 20-40 -0,166916 0,032332 0,134640 0,214 0,786 40-60 -0,157249 0,171318 0,119313 0,004 0,996 60-80 -0,158702 -0,035424 0,116637 0,610 0,390 80-100 -0,136461 -0,050870 0,108872 0,710 0,290 100-120 -0,149090 0,051427 0,094292 0,086 0,914 120-140 -0,128487 -0,056508 0,095721 0,738 0,262 140-160 -0,140351 -0,013192 0,087401 0,428 0,572 160-180 -0,150146 -0,116836 0,102914 0,938 0,062 180-200 -0,130965 0,044543 0,090058 0,124 0,876

113

MDH1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,247292 0,223663 0,251194 0,040 0,960 20-40 -0,173578 0,108776 0,140638 0,060 0,940 40-60 -0,150710 0,057133 0,109452 0,140 0,860 60-80 -0,156538 0,010648 0,112637 0,304 0,696 80-100 -0,156948 0,047588 0,099968 0,114 0,886 100-120 -0,141450 0,008911 0,108182 0,346 0,654 120-140 -0,134898 0,007285 0,088103 0,278 0,722 140-160 -0,125471 -0,039565 0,093339 0,662 0,338 160-180 -0,144018 0,035166 0,114579 0,202 0,798 180-200 -0,130231 0,067044 0,099288 0,078 0,922 MDH2 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,314238 -0,050690 0,355389 0,506 0,494 20-40 -0,210630 0,246615 0,213495 0,014 0,986 40-60 -0,227580 0,004392 0,208397 0,406 0,594 60-80 -0,205731 0,002461 0,204367 0,386 0,614 80-100 -0,177287 -0,100831 0,172318 0,838 0,162 100-120 -0,190189 0,072331 0,151787 0,124 0,876 120-140 -0,166054 0,147314 0,117713 0,016 0,984 140-160 -0,192633 -0,147293 0,133482 0,952 0,048 160-180 -0,208039 -0,069625 0,165823 0,696 0,304 180-200 -0,166959 -0,175153 0,143315 0,984 0,016 ME1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,360018 -0,161774 0,407099 0,784 0,216 20-40 -0,229283 -0,167360 0,208231 0,936 0,064 40-60 -0,223884 0,162362 0,164669 0,028 0,972 60-80 -0,208720 -0,257192 0,176218 0,990 0,010 80-100 -0,201769 -0,015891 0,147996 0,464 0,536 100-120 -0,186868 -0,030252 0,154632 0,606 0,394 120-140 -0,182111 0,100469 0,135229 0,058 0,942 140-160 -0,171437 0,072579 0,152241 0,140 0,860 160-180 -0,206498 -0,093590 0,158239 0,778 0,222 180-200 -0,194854 -0,000954 0,134733 0,390 0,610 PGM1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,339220 0,050007 0,372250 0,352 0,648 20-40 -0,232647 0,014467 0,200266 0,368 0,632 40-60 -0,230279 0,038847 0,184484 0,278 0,722 60-80 -0,216746 -0,078183 0,148702 0,704 0,296 80-100 -0,184866 -0,119761 0,147259 0,876 0,124 100-120 -0,197255 -0,044066 0,170313 0,590 0,410 120-140 -0,169245 0,196315 0,122791 0,000 1,000 140-160 -0,188423 0,114218 0,135178 0,056 0,944 160-180 -0,229601 -0,068221 0,168567 0,706 0,294 180-200 -0,199455 -0,031035 0,146578 0,564 0,436

114

PRX1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,248012 -0,063387 0,267083 0,604 0,396 20-40 -0,168234 -0,067580 0,157666 0,748 0,252 40-60 -0,167080 -0,125305 0,116319 0,914 0,086 60-80 -0,160184 -0,041231 0,135598 0,642 0,358 80-100 -0,139221 0,154329 0,101273 0,002 0,998 100-120 -0,156320 -0,044135 0,095748 0,656 0,344 120-140 -0,128682 -0,024367 0,087627 0,526 0,474 140-160 -0,124955 -0,007997 0,091324 0,418 0,582 160-180 -0,147398 -0,039369 0,106012 0,596 0,404 180-200 -0,135401 -0,007312 0,103482 0,388 0,612 SKDH1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,345642 0,848487 0,411243 0,000 1,000 20-40 -0,223198 0,264754 0,219363 0,016 0,984 40-60 -0,219666 -0,028733 0,186182 0,532 0,468 60-80 -0,239761 -0,001911 0,173393 0,428 0,572 80-100 -0,199856 0,056600 0,145261 0,194 0,806 100-120 -0,222391 0,047741 0,151089 0,226 0,774 120-140 -0,197663 0,062152 0,130253 0,168 0,832 140-160 -0,166362 -0,026096 0,136222 0,592 0,408 160-180 -0,222377 0,047232 0,172035 0,212 0,788 180-200 -0,193926 -0,078772 0,144797 0,776 0,224 SOD1 Distance D(- CI) D(obs.) D(+ CI) P(D)<(-CI) P(D)>(+ CI) ------0-20 -0,373901 0,106593 0,426923 0,212 0,788 20-40 -0,213966 0,155639 0,179549 0,048 0,952 40-60 -0,217025 0,092067 0,158874 0,132 0,868 60-80 -0,212231 -0,049743 0,169743 0,602 0,398 80-100 -0,212430 -0,148037 0,149159 0,924 0,076 100-120 -0,197429 -0,115519 0,161870 0,862 0,138 120-140 -0,181512 -0,200302 0,137372 0,992 0,008 140-160 -0,178973 -0,223337 0,149319 0,992 0,008 160-180 -0,221997 0,072362 0,175889 0,146 0,854 180-200 -0,169509 0,126842 0,134531 0,042 0,958