Sultan Sazliği Ekosisteminde Anopheles (Diptera: Culicidae) Türlerinin Dna Barkodlamasi Ve Filogenetik Karakterizasyonu

T.C ERCİYES ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ VETERİNER PARAZİTOLOJİ ANABİLİM DALI

SULTAN SAZLIĞI EKOSİSTEMİNDE ANOPHELES (DIPTERA: CULICIDAE) TÜRLERİNİN DNA BARKODLAMASI VE FİLOGENETİK KARAKTERİZASYONU

Hazırlayan Mehmet KÖRLÜ

Danışman Prof. Dr. Alparslan YILDIRIM

Yüksek Lisans Tezi

Ocak 2018 KAYSERİ

T.C ERCİYES ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ VETERİNER PARAZİTOLOJİ ANABİLİM DALI

SULTAN SAZLIĞI EKOSİSTEMİNDE ANOPHELES (DIPTERA: CULICIDAE) TÜRLERİNİN DNA BARKODLAMASI VE FİLOGENETİK KARAKTERİZASYONU

Hazırlayan Mehmet KÖRLÜ

Danışman Prof. Dr. Alparslan YILDIRIM

Yüksek Lisans Tezi

Bu çalışma Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TYL-2016-6404 nolu proje ile desteklenmiştir.

Ocak 2018 KAYSERİ ii

BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK

Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kural ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim.

iii

YÖNERGEYE UYGUNLUK ONAYI

“Sultan Sazlığı Ekosisteminde Anopheles (Diptera: Culicidae) Türlerinin DNA Barkodlaması ve Filogenetik Karakterizasyonu”, Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi’ne uygun olarak hazırlanmıştır.

Prof. Dr. Alparslan YILDIRIM danışmanlığında Mehmet KÖRLÜ tarafından hazırlanan “Sultan Sazlığı Ekosisteminde Anopheles (Diptera: Culicidae) Türlerinin DNA Barkodlaması ve Filogenetik Karakterizasyonu” konulu çalışma jürimiz tarafından Erciyes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Veteriner Parazitoloji Anabilim Dalı’nda Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir.

31/01/2018

TEŞEKKÜR

Başta tez konumun seçilmesinden çalışmalarımın yürütülmesine kadar her aşamasında bilgi, öneri ve yardımlarını esirgemeyerek akademik ortamda sonsuz desteğiyle gelişmeme katkıda bulunan değerli danışman hocam Prof. Dr. Alparslan YILDIRIM’a en içten duygularımla teşekkür ederim.

Parazitoloji Anabilim Dalı’nda çalışmaya başladığım günden bu yana desteğini gördüğüm değerli hocalarım ERÜ Veteriner Fakültesi Dekanı sayın Prof. Dr. Abdullah İNCİ ile Parazitoloji Anabilim Dalı öğretim üyeleri Doç. Önder DÜZLÜ, Yrd. Doç. Dr. Zuhal ÖNDER ve Yrd. Doç. Dr. Arif ÇİLOĞLU’na, çalışma süresince malzeme bazında TYL-2016-6404 kodlu proje ile destek sağlayan Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi’ne teşekkür ederim.

Tez çalışmalarımın her aşamasında birçok fedakârlıklar gösterip beni destekleyerek her an yanımda olan aileme teşekkürü borç bilirim.

SULTAN SAZLIĞI EKOSİSTEMİNDE ANOPHELES (DIPTERA: CULICIDAE) TÜRLERİNİN DNA BARKODLAMASI VE FİLOGENETİK KARAKTERİZASYONU

T.C. Erciyes Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü Veteriner Parazitoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi, Ocak 2018 Danışman: Prof. Dr. Alparslan YILDIRIM

ÖZET

Bu çalışmada Sultan Sazlığı Ekosisteminde yayılış gösteren Anopheles türlerinin belirlenmesi ve DNA barkodlarının sağlanarak filogenetik yapılanmalarının ortaya konulması amaçlanmıştır. Çalışmada, 2016 yılının Haziran-Ağustos ayları arasında araştırma bölgesinden CO2 beslemeli ışık tuzakları kullanılarak sivrisinek örneklemeleri yapılmıştır. Yakalanan insekt türleri içerisinden Anopheles sp.’ye ait olanlar ayrılmış ve morfolojik identifikasyonları sağlanmıştır. Araştırma periyodu boyunca toplam 1225 Anopheles örneği toplanmış olup bunlar arasında en yaygın tür An. sacharovi (%94,0) belirlenmiş bunu sırasıyla An. maculipennis (%5,0) ve An. claviger (%1,0) izlemiştir. Her tür için en yüksek dağılım oranları Ağustos ayında tespit edilmiştir. Morfolojik identifikasyonu sağlanan türlere ait örneklerin DNA barkodlaması ve filogenetik analizleri için genomik DNA izolasyonlarını takiben mitochondrial cytochrome oxidase I (mt-COI) gen bölgeleri PCR’da amplifiye edilmiştir. An. sacharovi için 15, An. maculipennis için 6 ve An. claviger için de 4 izolata ait PCR ürünü jel pürifiye edilerek sekanslanmıştır. İlgili Anopheles türlerine ait mt-COI sekansları arasında 558 (%84,8) identik bölge belirlenirken 9 farklı haplotipi ortaya koyan 100 polimorfik bölge saptanmıştır. An. sacharovi içinde 6, An. maculipennis içinde 2 ve An. claviger içinde de 1 haplotip karakterize edilmiştir. An. sacharovi ve An. maculipennis için intraspesifik nükleotid farklılığı sırasıyla %0,5 ve %2,1 saptanmıştır. Interspesifik nükleotid farklılıkları incelendiğinde An. claviger ve An. sacharovi arasında %14,7, An. claviger ve An. maculipennis arasında %14,6 ve, An. sacharovi ile An. maculipennis arasında da %5,7 genetik farklılık belirlenmiştir. Karakterize edilen tüm türlere ait izolatların filogenetik ağaç üzerinde Dünyada çeşitli bölgelerden bildirilmiş homolog izolatlarla monofiletik küme oluşturduğu belirlenmiştir.

vii

Anahtar kelimeler: Anopheles sp., Sultan Sazlığı, DNA barkodlama, filogenetik karakterizasyon

viii

DNA BARCODING AND PHYLOGENETIC CHARACTERIZATION OF ANOPHELES (DIPTERA: CULICIDAE) SPECIES IN SULTAN MARSHES ECOSYSTEM

Erciyes University, Graduate School of Health Sciense Department of Veterinery Parasitology M.Sc. Thesis, January 2018 Supervisor: Prof. Dr. Alparslan YILDIRIM

ABSTRACT

In this study, it was aimed to determine the prevalent Anopheles species in Sultan Marshes Ecosystem and to reveal their phylogenetic construction by providing DNA barcodes. Mosquito samplings were utilized between June and August of 2016 by using light traps with CO2 supply in the study. The specimens belonging to Anopheles sp. were separated from catched insect species and morphological identifications were done. A total of 1225 Anopheles specimens were collected during the research period and the most prevalent species was determined as An. sacharovi (94.0%) and this was followed by An. maculipennis (5.0%) and An. claviger (1.0%). The highest distribution rates were determined in August for each species. Mitochondrial cytochrome oxidase I (mt-COI) gene region was amplified in PCR following the genomic DNA isolations in order to DNA barcoding and phylogenetic analyses of the morphologically identified species. PCR products of 15, six and four isolates belonging to An. sacharovi, An. maculipennis and An. claviger, respectively were gel purified and sequenced. 558 (84.8%) identical sites were determined among the mt-COI sequnces belonged to related Anopheles species while 100 polimorphic sites were designated leading to detection of nine different haplotypes. Six, two and one haplotypes were characterized within the An. sacharovi, An. maculipennis and An. claviger, respectively. Intraspesific nucleotide differences of 0.5% and 2.1% were determined for An. sacharovi and An. maculipennis. When examine the interspecific nucleotide differences, 14.7%, 14.6% and 5.7% genetic distances were revealed between An. claviger and An. sacharovi, An. claviger and An. maculipennis, and An. sacharovi and An. maculipennis, respectively. Isolates form all characterized species formed monophyletic clusters on the phylogenetic tree with the homologous isolates reported from several regions in the World.

Key words: Anopheles sp., Sultan Marshes, DNA barkoding, phylogenetic characterization

İÇİNDEKİLER

Sayfa

İÇ KAPAK ...... i

BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK ...... ii

YÖNERGEYE UYGUNLUK ONAYI ...... iii

TEŞEKKÜR ...... v

ÖZET ...... vi

ABSTRACT ...... viii

İÇİNDEKİLER ...... ix

TABLOLAR LİSTESİ ...... xi

ŞEKİLLER LİSTESİ ...... xii

1. GİRİŞ VE AMAÇ ...... 1

2. GENEL BİLGİLER ...... 2

2.1 ANOPHELES TÜRLERİNİN SINIFLANDIRILMASI VE FİLOGENİSİ ...... 2

2.1.1 Anopheles Soyunun Sınıflandırılması ...... 3

2.1.2 Anopheles’lerin Filogenisi ...... 4

2.2 ANOPHELES’LERİN YAYILIŞI VE FİLOCOĞRAFYASI ...... 7

2.3 ANOPHELES TÜRLERİNİN GENEL HAYAT SİKLUSLARI ...... 11

2.3.1 Yumurtalar ...... 11

2.3.2 Larvalar ...... 11

2.3.3 Pupa ...... 12

2.3.4 Erginler ...... 13

2.4 ANOPHELES MACULIPENNIS KOMPLEKSİNİN GENEL BİYOEKOLOJİK ÖZELLİKLERİ ...... 14

3. GEREÇ VE YÖNTEM ...... 18

3.1 SAHA ÇALIŞMALARI ...... 18

3.1.1 Araştırma Sahası ve Sivrisinek Örneklerinin Toplanması ...... 18

3.2 LABORATUVAR ÇALIŞMALARI ...... 21

3.2.1 Anopheles Örneklerinin İdentifikasyonu ...... 21

3.2.2 Anopheles Örneklerinden Genomik DNA izolasyonu ...... 21

3.2.3 Anopheles Örneklerinin Mitochondrial Cytochrome Oxidase I Gen Bölgesinin Amplifikasyonu ...... 21

3.2.4 Mt-COI Gen Bölgesi Sekans Analizleri ...... 22

3.2.5 Mt-COI Gen Bölgesi Filogenetik Analizleri ...... 22

4. BULGULAR ...... 24

4.1 MORFOLOJİK İDENTİFİKASYON SONUÇLARI VE ANOPHELES TÜRLERİNİN DAĞILIMI ...... 24

4.2 MOLEKÜLER ANALİZ SONUÇLARI ...... 27

4.2.1 Mt-COI Gen Bölgesi PCR Analiz Sonuçları ...... 27

4.2.2 Mt-COI Gen Bölgesi Sekans Analiz Sonuçları ...... 28

4.2.3 Mt-COI Gen Bölgesi Filogenetik Analiz Sonuçları ...... 30

5. TARTIŞMA VE SONUÇ ...... 32

6. KAYNAKLAR ...... 36

ÖZGEÇMİŞ ...... 46

TABLOLAR LİSTESİ

Sayfa

Tablo 2.1 Anopheles soyunda yer alan alt soylar ve mevcut türlerin güncel taksonomisi ...... 3

Tablo 4.1 Araştırmada 2016 yılı Haziran-Ağustos ayları arasında Sultan Sazlığı Ekosisteminde identifiye edilen Anopheles türlerinin dağılımı ...... 24

Tablo 4.2 Araştırmada 2016 yılı Haziran-Ağustos ayları arasında Sultan Sazlığı Ekosisteminde identifiye edilen Anopheles türlerinin dağılımı ...... 28

Tablo 4.3 Anopheles türlerinde belirlenen haplotiplerin mt-COI sekanslarının çoklu hizalama analizlerine göre genetik farklılıkları ...... 30

xii

ŞEKİLLER LİSTESİ

Sayfa

Şekil 2.1 Anophelinae aile altının filogenisi ...... 7

Şekil 2.2 Anopheles sp. yumurtası ...... 11

Şekil 2.3 Anopheles sp. larva ve pupası ...... 12

Şekil 2.4 Anopheles maculipennis s.s. ergin dişi ...... 13

Şekil 3.1 2016 Ağustos ayında çalışma alanının genel bir görüntüsü ...... 18

Şekil 3.2 Sivrisinek örneklemesinde kullanılan CDC Mini Light Trap ...... 19

Şekil 3.3 Sivrisinek örneklemesinde kullanılan Heavy Duty EVS CO2 tuzağı ...... 19

Şekil 3.4 Sivrisinek örneklemesinde kullanılan EVS Black CO2 tuzağı ...... 20

Şekil 3.5 Sivrisinek örneklemesinde kullanılan pilli aspiratör ...... 20

Şekil 4.1 Anopheles türlerinin aylara göre dağılım oranları ...... 25

Şekil 4.2 An. sacharovi (dişi) ...... 26

Şekil 4.3 An. maculipennis (dişi) ...... 26

Şekil 4.4 An. claviger (dişi) ...... 27

Şekil 4.5 Anopheles türlerine ait izolatların parsiyel mt-COI gen bölgesini amplifiye eden primerler ile PCR sonucu elde edilen pozitif amplikonların jel elektroforezde görünümü ...... 28

Şekil 4.6 Çalışmada saptanan Anopheles türlerine ait izolatların mt-COI nükleotid sekanslarının çoklu hizalamaları ...... 29

Şekil 4.7 Anopheles izolatlarının mt-COI gen bölgesi Bayesian inference (BI) ve Maximum Likelihood (ML) analizine göre filogenetik ilişkileri...... 31

1. GİRİŞ VE AMAÇ

Global halk sağlığı konseptinde, Anopheles soyu insan sıtma etkenlerini nakletmelerinden dolayı patojen taşıyan sivrisinekler içerisinde en önemli grubu oluşturmaktadır. Sıtmanın etkin bir şekilde kontrolünde Dünya Sağlık Örgütü (WHO) vektör Anopheles türleriyle mücadelenin anahtar rol üstlendiğinin altını çizmiştir (1). Bu çerçevede Anopheles popülasyon dinamiklerinin daha iyi anlaşılmasının gelecekte sıtma eliminasyonunda başarıya ulaşılabilmesinde çok önemli olduğu vurgulanmıştır (2). Sivrisineklerin vektörlüğünü yaptığı vektör-borne hastalıkların başında sıtma gelmektedir. Sıtma hastalığı, Anopheles cinsine bağlı yaklaşık 70 kadar türün, Plasmodium (P. falciparum, P. vivax, P. malariae ve P. ovale) türlerini taşıması ile olmaktadır. Hastalık, dünyada her yıl 250 milyon yeni olguya ve yaklaşık 600 milyon insanın ölümüne yol açmaktadır. Bu hastalık özellikle, zayıf sosyal ve ekonomik koşullarla birlikte, nisbi nem ve sıcaklığın yüksek olduğu, vektör gelişimi için uygun çevre koşullarının sağlandığı tropikal ve subtropikal bölgelerde yaygın olarak görülmektedir. Bu noktada özellikle ilgili bölgede yaygınlık gösteren Anopheles türlerinin başarılı identifikasyonu risk potansiyellerinin ortaya çıkarılması açısından primer öneme sahiptir. Türkiye coğrafi konumu, iklimsel, jeolojik ve ekolojik özellikleri nedeniyle sivrisinek türlerinin rahatça üremesi ve yaşaması için uygun habitatlara sahip olmasına karşın Anopheles türleri üzerine moleküler düzeyde çalışmaların sınırlı kaldığı görülmektedir. Bu çalışmada, Türkiye’nin çok önemli sulak alanlarından birisi olan ve birçok kuş türüne ev sahipliği ile kuş cenneti statüsü olan Sultan sazlığı Ekosisteminde Anopheles türlerinin yaygınlıklarının belirlenmesi, oluşturdukları risk potansiyellerinin ortaya çıkarılması ve DNA barkodlarının sağlanarak filogenetik yapılanmalarının belirlenmesi hedeflenmiştir.

2. GENEL BİLGİLER

2.1 ANOPHELES TÜRLERİNİN SINIFLANDIRILMASI VE FİLOGENİSİ

Anopheles türleri, Diptera konusunda çalışmaları bulunan ünlü Alman entomolog Johann Wilhelm Meigen tarafından 1818 yılında sivrisineklerin bir soyu olarak nitelendirilmiştir (3). 19. yüzyılın son 20 yılına doğru sivrisineklerin mikrofilerleri ve malaryal protozoonları naklettiklerinin ortaya çıkarılması bu insektlerin sınıflandırılmasında ve isimlendirilmesinde öncü olmuştur. Nitekim ilgili dönemde Anopheles türlerinin taksonomileri hakkında çok az çalışma bulunmaktaydı. Theobald, abdomen ve toraks üzerindeki pulların şekilleri ve dağılımlarına göre Anopheles türlerinin 18 cinste toplandığını ileri sürmüştür. Bu cinslerden dördü (Cellia, Kerteszia, Nyssorhynchus ve Stethomyia) Anopheles’lerin alt türleri olarak bilinmekte olup diğer 14’ü ise Anopheles, Cellia veya Nyssorhynchus cinslerindeki alt cinslerin sinonimleri olarak nitelendirilmektedir. Theobald Anopheles türlerinin isimlendirilmelerini yapan tek kişi değildir. 20. yüzyılın ilk 30 yılı süresince Anopheles türleri için toplam 37 cins (Theobald tarafından tarif edilen 18 cins dahil) tanımlanmıştır (4).

Yeni türlerin keşfiyle birlikte açıkça görüldü ki Theobald’ın sınıflandırma sistemi ne pratik ne de doğaldı. Bu sınıflandırma sistemini ilk eleştirenlerden biri olan Kuzey Amerika’lı Frederick Knab, gelişigüzel farklılaştırılmış ve tanımlanmamış birçok soy içerisinde Anopheles cinsindeki alt türlerin tanımlanması aşamasında gereksiz yere aceleci davranıldığını, entomologların bu sisteme tam olarak güvenemediklerini için bu sistemdeki karışıklıkların bilimsel ve pratik olacak şekilde sağlam bir zeminde değerlendirilmediğini ve bu durumun talihsizlikten ve ümitsizlikten öte gidemeyeceğini vurgulamaktadır (5). Theobald’ın monografisini 1910 yılında tamamlamasını takibenki 20 yıllık süreçte Anopheles’i de kapsayan 38 cins-grup isminin tek bir cinse (Anopheles) 3 indirgenmesi kapsamındaki en son noktaya ulaşılmasına dair çok önemli değişiklikler gerçekleştirilmiştir.

Anopheles cinsi 465 tür ismi içermekte olup bunlar 7 alt soyda toplanmaktadır: Anopheles (182 tür), Baimaia (Oriental, tek tür), Cellia (Eski dünya, 220 tür), Kerteszia (neotropik, 12 tür), Lophopodomyia (neotropik, 5 tür), Nyssorhynchus (neotropik, 39 tür) ve Stethomyia (neotropik, 5 tür) (6). Anopheles, Cellia, Kerteszia ve Nyssorhynchus alt soyları insan malaryal parazitlerin naklinden sorumlu türleri içermektedir. Anopheles’lerin birçok vektör türü birbirine kardeş türlerdir.

2.1.1 Anopheles Soyunun Sınıflandırılması

Anopheles cinsindeki türlerin sınıflandırılması ilk olarak Edwards (7), John A. Reid & Kenneth L. Knight (8), Alexis Grjebine (9), M.T. Gillies & Botha de Meillon (10), Reid (11), Michael E. Faran (12) ve Kenneth J. Linthicum (13) tarafından yapılmıştır. Bu sınıflandırma 1994 yılında ve takiben 2004 ve 2012 yıllarında tekrar revize edilmiştir (6, 14). Anopheles, Cellia ve Nyssorhynchus gibi 3 alt cins hiyerarşik sistem dahilinde taksonomik kategorilere bölünmüştür. Anopheles soyunda yer alan alt soylar ve mevcut türlerin güncel taksonomisi Tablo 1’de verilmiştir (15).

Tablo 2.1 Anopheles soyunda yer alan alt soylar ve mevcut türlerin güncel taksonomisi Diptera Takımı Nematocera Takım altı Culicomorpha Infraorderı Maculipennis tür kompleksi Culicidae Ailesi Anopheles artemievi Anopheles atroparvus Anophelinae Aile altı Anopheles beklemishevi Anopheles Soyu Anopheles daciae Anopheles Soy altı Anopheles labranchiae Angusticorn Bölümü Anopheles maculipennis Anopheles Serisi Anopheles martinius Aitkenii grubu Anopheles melanoon Anopheles algeriensis Anopheles messeae Anopheles persiensis Anopheles claviger Anopheles sacharovi Anopheles petragnani Lindesayi grubu Maculipennis grubu Plumbeus grubu Pseudopunctipennis grubu Punctipennis grubu Lophoscelomyia Serisi Anopheles interruptus Laticorn Bölümü Arribalzagia Serisi

Anopheles fluminensis Anopheles intermedius Anopheles malefactor Anopheles mattogrossensis Anopheles mediopunctatus Anopheles minor Anopheles peryassui Anopheles punctimacula Christya Serisi Anopheles implexus Myzorhynchus Serisi Albotaeniatus grubu Anopheles freyi Bancroftii grubu Barbirostris grubu Coustani grubu Hyrcanus group Umbrosus group Anopheles incertae sedis Bölümü Anopheles apicimacula Anopheles argyropus Anopheles calderoni Anopheles costai Anopheles crucians Anopheles forattinii Anopheles fragilis Anopheles insulaeflorum Anopheles neomaculipalpus Anopheles nilgiricus Anopheles pursati Anopheles vestitipennis Anopheles xui

2.1.2 Anopheles’lerin Filogenisi

Anopheles türleri en çok çalışılan ve en iyi bilinen sivrisinek cinsi olup büyük çoğunluğunun insan sağlığı üzerinde çok büyük etkileri vardır. Malarya ve filaryalar parazitlerin vektörü olarak bilinen Anopheles sinekleri diğer insektlerle kıyaslanamayacak derecede insanlarda ölümlere yol açmışlardır. Şu bir gerçektir ki Anopheles’ler orak hücre anemisinin ortaya çıkmasına bağlı olarak insan evriminde önemli etkiye sahip birkaç ökaryotik canlıdan biridir. Tıbbi entomologlar, taksonomistler ve genetikçiler tarafından yüzyıllardır yapılan çalışmaların bir sonucu olarak şu an için Anopheles cinsinde 537 tür bilinmekte olup bunların büyük çoğunluğunun (%87) usulüne

5 uygun olarak isimlendirilmeleri yapılmış olmasına karşın bugüne kadar bu sineklerin filogenetik yakınlıkları ve evrimleri hakkındaki çalışmalar ise oldukça sınırlıdır.

Sivrisineklerin evrimlerinin; ilk kuşun, ilk çiçek bitkisinin ve ilk memelilerin keşfiyle birlikte dinazor çağına dayandığı tahmin edilmektedir (146-200 milyon yıl önce) (7, 16, 17). Ancak maalesef günümüzde çok az sivrisinek fosili bulunması sebebiyle anophelin sivrisineklerin evrimsel tarihleri hakkında çok az bilgi bulunmaktadır. Mesozoik dönemden kalma (66-100,5 milyon yıl önce) bilinen en eski ikinci sivrisinek fosili olan Paleoculicis minutus (18) morfolojik olarak anopheline sineklerden çok culicine sineklere daha yakın özellikler sergilemektedir. Anopheles (Nyssorhynchus?) dominicanus (19) ve An. (?) rottensis (20) bilinen tek anopheline sivrisinek fosilleridir. İlki, üçüncü zamanını ortalarında (yaklaşık 15-45 milyon yıl önce), ikincisi ise Almanya’nın geç oligosen döneminde (yaklaşık 25 milyon yıl önce) bulunmuştur. Nükleer protein kodlayan genlerin ve fosil kalibrasyon noktalarındaki sekans bilgilerindeki farklılık temelinde, en büyük sivsisinek hatlarının erken mesozoik döneme (145 milyon yıl önce) denk geldiği, Anophelinlerin atalarının ise dinazor çağına dayanabileceği görülmektedir (145 miyon yıl önce) (21).

Anopheles türleri Anophelinae alt ailesinde bulunan nominotipikal bir soydur. Anopheles’lere (kozmopolit) ilaveten bu alt aile Bironella (Avusturalyan) ve Chagasia (neotropikal) soylarını da kapsamaktadır. Çeşitli ribozomal, mitokondriyal ve nükleer genlerin DNA sekans analizleri ve morfolojik analizler Chagasia türlerinin diğer tüm anopheline türlere yakın olduğunu göstemektedir (21-29).

Sallum ve ark. (28) 2000 yılında morfolojik kriterler temelinde Anophelinae al ailesinin ilk filogenetik analizlerini gerçekleştirmişlerdir. Elde edilen bulgulara göre Bironella cinsini de kapsadığı için Anopheles türlerinin parafiletik oldukları belirlenmiştir. Bironella soyu ile birlikte Kerteszia, Nyssorhynchus, Cellia, Lophopodomyia ve Stethomyia alt soylarının Anopheles alt soyundaki birçok tür gruplarının ve serilerinin arasında monofiletik yapı gösterdikleri saptanmıştır. Anopheles alt soyundaki Christya serileri Kerteszia + Nyssorhynchus ile genetik yakınlık göstermiş ve filogenetik küme Cellia+Chagasia hariç diğer tüm anophelinler ile kardeş özelliği göstermiştir.

Sallum ve ark. (29) iki yıl sonra (2012) ribozomal (18S, 28S) ve mitokondriyal (COI, COII) DNA sekansları temelinde anophelinlerin yakınlıkları hakkında moleküler analiz

6 gerçekleştirmişlerdir. Bu çalışma sonuçları ilk çalışma (29) sonuçları ile direkt kıyaslanamamaktadır, çünkü bu analizlere çok daha az takson ilave edilmiştir. Bununla birlikte moleküler analiz sonuçları Anopheles soyundaki türlerde parafili olduğunu ve Bironella ile Kerteszia ve Nyssorhynchus soyundaki kardeş türlere yakın olduklarını göstermiştir. Çalışmada ayrıca diğer alt soylar ve Bironella soyunun monofili gösterdikleri ve Stethomyia’dan ziyade Lophopodomyia ile kardeş oldukları belirlenmiştir.

Harbach ve Kitching (24), altsoyların teşhisinde kritik rol oynayan erkek gonocoxitlerindeki özelleşmiş setalar üzerinde daha ayrıntılı çalışarak 2005 yılında Sallum ve ark.’nın (28) yaptıkları filogenetik analizleri revize etmişlerdir. Parsimoni analizleri Cellia, Kerteszia ve Nyssorhynchus ile Kerteszia + Nyssorhynchus kardeş türler arasında monofili olduğunu göstermiştir. Anopheles alt soyu çalışma sonucunda polifiletik bir nesil şeklinde düzeltilmiştir. Bironella, Lophopodomyia ve Stethomyia alt soylarının kuvvetle muhtemel Anopheles altsoylarıyla iç içe olduğu saptanmıştır. Baimaia alt soyunun (An. kyondawensis), Bironella+diğer tüm Anopheles türleriyle kardeş olduğu teyit edilmiştir. Sallum ve ark. (28) tarafından yapılan çalışma sonuçlarının aksine, Bironella ve Stethomyia Anopheles alt soyundan ayrı olarak monofiletik oldukları tespit edilmiştir. Harbach & Kitching (Şekil 2.1)’in cladogramı, anophelinlerin evrimsel ve filogenetik yakınlıklarının tahmin edilmesindeki en iyi şekildir. Çünkü bu cladogramda birçok taksonomik grup ve homolog karakterler yer almaktadır.

İnsan sağlığı üzerinde sıtmanın etkisi göz önüne alındığında; insan sıtma protozoonlarının vektörünün bulunduğu gruplar, alt gruplar ve kompleksler hakkında yapılan çalışmalar çok da sürpriz değildir. Malarya vektörlerinin evrimsel yakınlıkları diğer gruplara oranla bilimsel anlamda daha çok dikkat çekmektedir. Filogenetik kalıplar, ergin dişilerin kan beslenme özellikleri, beslenme davranışları ve sucul habitatlarda larval ve pupa dönemlerinin gelişimi gibi biyonomik özelliklerin yorumlanmasında kullanılmaktadır.

Şekil 2.1 Anophelinae aile altının filogenisi, (Harbach & Kitching [36]; Sylvie Manguin Kitap 2013)

Bugüne kadarki bütün filogenetik çalışmalar, Cellia (24, 26-29), Kerteszia (22, 26-30) ve Nyssorhynchus (24, 26-29) alt soyları ile kardeş Kerteszia ve Nyssorhynchus (24, 28, 29) soylarının monofiletik yapı sergilediklerini göstermiştir. Cellia ve iki yeni dünya alt soyu arasındaki kardeş yakınlığı, eğer Lophopodomyia + Bironella grubu Kerteszia + Nyssorhynchus’u içeren filogenetik kümeden çıkarılırsa Sallum ve ark. (29)’nın yaptıkları moleküler analizlerle uyumlu değildir. Anopheles implexus (Christya serileri), Kerteszia, Nyssorhynchus ve Cellia tarafından oluşturulan terminal kümeyle kardeş grupta bulunmaktadır.

2.2 ANOPHELES’LERİN YAYILIŞI VE FİLOCOĞRAFYASI

Anopheles sineklerinin evrimsel dağılımları konusunda net bilgiler bulunmamaktadır. Buna karşın, DNA dizi analizleri ve fosil kayıtlardan (21) elde edilen verilere göre Pangea’nın ayrılmasından yaklaşık 217 milyon yıl önce (Myö) (230-192) Anophelinler Culicinlerden ayrıldığı bildirilmiştir. Bu durum, Anopheles ve ve Bironella cinslerinin ayrılmasının yaklaşık 54 milyon yıl önce (75.8-37.1 Myö, Kreatease’in sonu, Senozoik

Eosen Devri'nin bitimi), Kretease dönemde, Gondwana'nın birden fazla kıtaya, Afrika, Güney Amerika, Hindistan, Antarktika ve Avustralya'ya ayrılmasından sonra gerçekleşmiş olduğunu göstermektedir. Atlantika (bugünkü Güney Amerika ve Afrika’yı kapsayan bölge) 150-140 Myö doğudaki Gondwana'dan (Antarktika, Hindistan ve Avustralya'yı kapsayan bölge) ayrılmıştır. Güney Amerika, Orta Kretase döneminde (yaklaşık 125-115 Myö) (31) güneyden kuzeye doğru Afrika'dan ayrılmaya başlamıştır. Aynı zamanda bu dönemde Madagaskar ve Hindistan Antarktika'dan ayrılmaya başlamış, geç Kretase'nin Senomaniyen ve Turonya dönemlerinde ise 100-90 Myö birbirlerinden ayrılmışlardır. Afrika, kuzeydoğu’da Avrupa'ya doğru hareket etmeye başlamış ve Güney Amerika, Antarktika'dan ayrılarak kuzeye doğru ilerlemiştir. Kuzey ve Güney Amerika, yaklaşık 3.7-3.0 Myö, Pliosen döneminde Panama kanalına bağlanmıştır. Belkin (32) Anopheles’lerin ilk olarak Amerikan Akdeniz Bölgesi'nde farklılaştığını öne sürmüştür. Belkin’nin (32) varsayımı temelinde, Harbach ve Kitching (24) sivrisinek cinslerinin filogenisinde Anopheles+Bironella’ya yakın olan Chagasia’nın bazal yerleşimine dayanarak, Anophelinae alt ailesinin Yeni Dünya orijinli olabileceğini ileri sürmüştür. Anopheles cinsinin yedi alt türünden dördü, Chagasia'nın Neotropikal dağılımı ve iki protein kodlayan nükleer gen dizilerinden elde edilen 16 Anopheles türünün filogenisi üzerine elde edilen veriler ile, Krzywinski ve ark.’nın (27) Anophelinae'nin orijinin Güney Amerika olduğu hipotezi birbiri ile uyum sağlamıştır.

Ana grup taksonların dağılımı ve jeolojik tarih verilerine göre Anopheles atalarının soylarının Pangaea'nın ayrılmasından önce var olduğu ve kıtaların ayrılmasından sonra altcins ve türlere ayrıldığı anlaşılmaktadır. Daha önce de belirtildiği gibi, Anopheles alt türü bütün Dünya’da geniş bir yayılıma sahiptir. Türler, ılıman, subtropikal ve tropikal bölgelerde kıyı bölgelerinden dağlık arazilere kadar uzanan çeşitli yüksekliklerde bulunmakta; ancak Yeni Zelanda, Fiji ve Yeni Kaledonya'nın büyük bir kısmını içeren Pasifik Adaları'nın birçoğunda ise bulunmamaktadırlar.

Baimaia alt soyunun tek türü, yalnızca ormanlık alanlarda, Tayland-Myanmar sınırının her iki yanında 14 ° ile 17 ° arasındaki dağlık alanlarda ve Tayland'daki Tayland-Laos sınırına yakın bir yerde bulunmakta olup nesli tükenen bir takson özelliğindedir (24). Cellia alt soyunun birçoğu Afrotropik, Avustralya taraflarında ve Doğu Bölgelerde dağılım gösterirken bazı türleri ise Palearktik bölgenin güneyinde görülmektedir. Cellia

9 türleri, Yeni Zelanda, Fiji ve Yeni Kaledonya’yı içeren Pasifik adalarının birçoğunda bulunmamaktadır.

Kerteszia alt soyunun türleri, Orta Amerika ve Güney Amerika boyunca Meksika’da Veracruz Eyaletinden, And dağları ve kıyı boyunca, Arjantin'deki Misiones eyaletlerine, Brezilya'daki Rio Grande do Sul’a, Güney Amerika’nın Pasifik Kıyısı boyunca Ekvator El Oro Eyaletine kadar uzanan Neotropikal Bölgede bulunmaktadır. Bu alt soy Güney Amerika'daki Amazon havzasının geniş alanlarının çoğunda ve Trinidad dışında, Batı Hint adalarının tümünde görülmemektedir (33). Lophopodomyia alt soyu türlerinin, Kuzey Güney Amerika (Brezilya, Kolombiya, Ekvator, Fransız Guyanası ve Venezuela) ve Panama alanlarında olduğu bilinmektedir. Nyssorhynchus alt soyunun türleri, An. albimanus dışında, Neartik bölge (Kuzey Meksika ve Teksas'taki Rio Grande Nehri boyunca) ile sınırlanmıştır. Son olarak, Stethomyia alt soyunun türleri esas olarak, Güney ve Orta Amerika'da (Kosta Rika ve Panama) ve Kuzey ve Güney Amerika'da (Brezilya, Kolombiya, Fransız Guyanası, Guyana, Surinam ve Venezuela) bulunmakta ancak bir veya iki türün ise Trinidad ve Tobago adalarında ve Peru ve Bolivya’nın güneyinde bulunduğu bilinmektedir.

Kerteszia, Lophopodomyia, Nyssorhynchus ve Stethomyia alt soyları ve Anopheles alt soyunun Arribalzagia ve Cycloleppteron dizileri, Güney Amerika ve Afrika’nın ayrılmasından orijinlenen Neotropikal Bölgeye özgüdürler. Pseudopunctipennis Grubu, An. pseudopunctipennis’in küçük bir uzantısı ve An. franciscanus hariç, Neotropikler ile sınırlandırılmıştır. Bu iki tür dışında, Nearktik Bölgedeki tüm Anopheles türleri, Anopheles alt soyundaki Anopheles dizisinin üyeleridir. Holarktik Maculipennis Grubu (24 tür) türlerinin yarısı, Nearktik Bölgede, diğer yarısı ise Palearktik bölgede bulunmaktadır. Bu sonuçlar, Maculipennis grubunun Paleocene ve Eocene dönemlerinde (60-55 Myö), Kuzey Amerika ve Avrasya’nın ayrılmasından önce Kuzey yarım kürede gelişmiş olabileceklerini göstermektedir. Plumbeus Grubu, Nearktik (34), Neotropikal (35) ve Palaearktik (36) Bölgelerdeki türleri içermektedir.

Cellia alt soyundaki türler, Afrotropikal, Avustralasya, Oriental ve Palaearktik bölgelerdeki üyelerle birlikte Doğu Yarımküre ile sınırlandırılmıştır (Şekil 5, Ek 6). Afrotropikal Bölge, Cellia alt soyunun birçok türü ve Anopheles alt soyunun az sayıdaki

10 türü ile karakterize bir bölgedir. Bölgede özellikle Myzomyia dizisi baskın olup aynı zamanda Neocellia, Neomyzomyia ve Pyretophorus dizilerinin türleri de görülmektedir.

Myzomyia, Neocellia ve Pyretophorus dizilerinin, Afrotropikal ve Oriental Bölgelerde varlığı bildirilmiş ancak bu dizilerin (Minimus Alt Grubu hariç) hiçbir alt grup, tür grubu ve türlerinin her iki bölgede yaygın olarak bulunmadığı rapor edilmiştir. Myzomyia dizisi, sıtmanın ana vektörü An. funestus’un bulunduğu Afrika’da baskın olan bir gruptur (37, 38). An. minimus ve Minimus Alt Grubunun diğer üyelerini içeren Funestus Grupla ilişkili türler, Güney Asya'da sıtma parazitlerinin başlıca vektörleridir (37, 39). Mitokondriyal DNA'nın (ITS2 ve D3 sekansları) filogenetik analizlerinden elde edilen bulgular, Funestus Grubun Afrotropikal Bölgeden orijinlendiğini göstermiştir (40). Neocellia dizisi An. stephensi ve Maculatus grubu üyeleri başta olmak üzere, Güney Asya'da önemli sıtma vektörlerini içermektedir (37, 39). Pytrophorus dizisi, Güneydoğu Asya'da Sundaicus ve Subpictus Komplekslerinin ve Afrika'da Gambiae Kompleksinin önemli sıtma vektörlerini bulundurmaktadır (38, 39). Anthony ve ark.’nın (41) morfoloji- tabanlı filogeni çalışmaları, Pytrophorus dizisinin Afrika orijinli olduğunu ve sıtma parazitlerine vektörlük kapasitelerinin çeşitli nesillerde ortadan kaybolduğunu göstermiştir.

İnsan sıtmasının Afrika'daki sivrisineklerde ve diğer primatlarda zamanla geliştiği rapor edilmiştir. Modern insanların yaklaşık 200.000 yıl önce Afrika'da ortaya çıkması ve Avrasya'ya (42) doğru yayılması ve yaklaşık 40.000 yıl öncede Avustralya'ya ulaşmış oldukları düşünülmektedir. Yeni Dünya'ya göçler ise 15- 20 bin yıl önce gerçekleşmiş ve Pasifik Adaları'nın birçoğu dört bin yıl önce sömürgeleştirilmiştir. Bu bilgiler ışığında, modern insanların ortaya çıkışı ve farklı yönlere dağılımlarının, kıtaların oluşumundan ve Anopheles'lerin evriminden çok sonra gerçekleştiği yönünde hipotezler öne sürülmüştür.

Sonuç olarak, insan sıtma parazitlerinin, Afrika'dan göç sırasında insanlarla birlikte taşındıkları, enfeksiyonu yaymak ve bulaşmayı sağlamak için gerekli olan ekolojik, fizyolojik ve davranışsal özelliklere sahip diğer bölgelerdeki Anopheles türlerine geçirildiği kabul edilmektedir. Bu taksonun Homo sapiens'in ataları da dâhil olmak üzere primatlar üzerinde beslenmeye adapte olması ve bu konaklara Plasmodium türlerini taşıma ve geliştirme yeteneğine sahip olduğu bildirilmiştir (43).

2.3 ANOPHELES TÜRLERİNİN GENEL HAYAT SİKLUSLARI

Tüm sivrisinekler gibi, Anophelineler de yaşam döngülerinde yumurta, larva, pupa ve ergin olmak üzere dört evre geçirirler. İlk üç evre akuatiktir, türlere ve ortam sıcaklığına bağlı olarak 5-14 gün sürer. Çeşitli dişi Anopheles türleri ergin dönemde sıtma vektörü olarak rol oynar. Ergin dişiler bir aya kadar yaşayabilse de birçoğu doğada 1-2 haftadan fazla yaşayamaz (44).

2.3.1 Yumurtalar

Ergin dişiler her ovipozisyonda 50-200 yumurta bırakırlar. Yumurtalar doğrudan suyun üzerine bırakılır ve her iki tarafta spesifik olarak şamandıra tarzında çıkıntılar bulunur (Şekil 2.2). Yumurtalar kuraklığa karşı dayanıklı değildir ve 2-3 gün içinde larvalar yumurtadan çıkarlar, buna rağmen daha soğuk iklimlerde yumurtadan çıkma 2-3 haftayı bulabilir (44).

Şekil 2.2 Anopheles sp. yumurtası (http://entnemdept.ufl.edu)

2.3.2 Larvalar

Anopheles larvaları diğer sivrisinek larvalarında olduğu gibi, beslenme için kullanılan ağız fırçaları, büyük bir toraks ve segmentli bir abdomenle iyi gelişmiş bir kafaya sahiptirler. Bacakları yoktur. Diğer sivrisinek türlerinin aksine, Anopheles larvalarının solunum sifonları yoktur ve bu nedenle vücutları suyun yüzeyine paralel olarak konumlanmıştır. Larvalar 8. abdominal segment üzerinde yer alan spiraküller vasıtasıyla nefes alırlar ve bu yüzden sıklıkla yüzeye gelmek zorundadırlar. (Şekil 2.3A).

Şekil 2.3 Anopheles sp. larva (A) ve pupası (B) (http://entnemdept.ufl.edu)

Larvalar, yüzey mikrotabakasında alg, bakteri ve diğer mikroorganizmalarla beslenerek zamanlarının çoğunu geçirir. Yalnızca rahatsız olduklarında yüzeyin altına dalarlar. Larvalar, vücudun sarsıntı hareketleriyle veya ağız fırçaları ile iterek yüzerler.

Larvalar, 4 evre veya instarda gelişir ve metamorfozla pupa haline gelirler. Her instarın sonunda, larvalar daha fazla büyüyebilmek için dış iskeletlerini uzaklaştırarak gömlek değiştirirler.

Larvalar çok çeşitli habitatlarda görülür, fakat bazı türler temiz, kirlenmemiş suları tercih ederler. Anopheles larvaları taze ya da tuzlu su bataklıkları, mangrov bataklıkları, pirinç tarlaları, çimenlik hendekler, akarsuların ve nehirlerin kenarları ve küçük, geçici yağmur havuzlarında bulunurlar. Birçok tür, diğerlerinin aksine bitki örtüsü olan habitatı tercih eder. Bazıları açık, güneş ışığı alan havuzlarda yetişirken bazıları yalnızca ormanlık gölgeli ıslah alanlarında bulunur. Birkaç tür ağaç deliklerinde veya bazı bitkilerin yapraklarında yetişir (44).

2.3.3 Pupa

Pupalar, yandan bakıldığında virgül şeklindedir. Baş ve toraks, abdomen altında kavisli olarak bir cephalotoraks içine birleşmiştir (Şekil 2.3B). Larvadaki gibi, pupalar da cephalotoraks üzerinde bulunan bir çift solunum trumpeti aracılığıyla nefes almak için

13 sıkça yüzeye gelmek zorundadırlar. Birkaç gün sonra pupa, cephalotoraksın dorsal yüzeyinden bölünür ve ergin sivrisinek ortaya çıkar.

Yumurtadan ergine kadar geçen süre türler arasında önemli ölçüde değişir ve çevre sıcaklığından çok etkilenir. Sivrisinekler yumurtadan ergine 5 gün kadar kısa bir sürede gelişebilir, fakat tropikal koşullarda genellikle 10-14 günü bulur (44).

2.3.4 Erginler

Tüm sivrisinekler gibi, ergin Anophelineler de 3 bölümlü ince gövdeden oluşmuştur: baş, toraks, abdomen (Şekil 2.4).

Baş, beslenmek ve duyusal bilgi edinmek için özelleşmiştir. Baş kısmı gözler ve bir çift uzun, çok segmentli anten ihtiva eder. Antenler, dişilerin yumurtalarını bırakacağı üreme alanlarının kokusunun yanı sıra konağın kokusunu belirlemek için de önemlidir. Baş, beslenmek için kullanılan uzatılmış ve ileriye çıkıntılı bir proboscise ve iki adet sensör palplerine sahiptir.

Şekil 2.4 Anopheles maculipennis s.s. ergin dişi (https://diptera.info) Abdomen besinlerin sindirimi ve yumurta gelişimi için uygundur. Bu segmentli vücut kısmı, bir dişi kan besini aldığında önemli ölçüde genişler. Kan, abdomeni kademeli olarak dolduran yumurta üretimi için bir protein kaynağı olarak zamanla sindirilir.

Anopheles türü sivrisinekler proboscisleri kadar uzun olan palpleri ve kanatları üzerindeki siyah beyaz ışınların varlığı ile, diğer sivrisineklerden ayırt edilebilir. Ergin Anophelesler, tipik istirahat pozisyonları ile de ayırt edilebilir: erkek ve dişiler abdomenleri, dinlendikleri yerin yüzeyine paralel değil, havaya doğru açı oluşturacak şekilde bulunur.

Ergin sivrisinekler genellikle pupadan çıktıktan sonra birkaç gün içinde çiftleşirler. Çoğu türlerde erkekler genellikle akşam karanlığında büyük sürüler oluştururlar ve dişiler çiftleşmek için sürülerin içine doğru uçarlar.

Erkekler nektar ve diğer şeker kaynaklarıyla beslenerek yaklaşık bir hafta yaşarlar. Dişiler enerji için şeker kaynaklarıyla da beslenirler fakat yumurtaların gelişimi için kanla beslenme gereksinimi duyarlar. Kanla beslendikten sonra, dişiler kanı sindirmek ve yumurtaları geliştirmek için birkaç gün istirahat halinde olurlar. Bu süre sıcaklığa bağlıdır fakat genellikle tropikal koşullarda 2-3 günü alır. Yumurtalar tamamen geliştikten sonra, dişiler yumurtlar ve konak aramaya devam ederler.

Bu döngü dişi ölene kadar devam eder. Dişiler bir aya kadar hayatta kalabilir fakat büyük olasılıkla doğada 1-2 haftadan daha uzun süre yaşayamazlar. Hayatta kalma şansları sıcaklığa ve neme, aynı zamanda da konak savunmalarından kaçarken başarılı bir şekilde kan emebilmelerine bağlıdır (44).

2.4 ANOPHELES MACULIPENNIS KOMPLEKSİNİN GENEL BİYOEKOLOJİK ÖZELLİKLERİ

Anopheles artemievi daha önce yapılan çalışmalar da An. martinius olarak tanımlanmıştır. 2005 yılında yapılmış olan çalışmanın sonucunda bu türün dağlar arasındaki alçak kesimlerde daha baskın olduğu saptanmıştır. Yumurtlama evresinde bataklık benzeri, durgun ve yavaş akan sularda ayrıca iyi ısınan, çakıllı dere yataklarını tercih ettikleri tespit edilmiştir. An. martinius türü gibi aynı biyo-ekolojik özellikleri taşıdığı varsayılmaktadır (45).

Zoofilik özellik gösteren An. atroparvus, genellikle yoğun populasyonlara ulaştığı zaman oldukça önemli bir vektör tür olup Riga (Letonya)- Astrakhan (Rusya) hattının batısında yayılış göstermektedir (46). Üreme habitatı, floral yönden zayıf, mineralce zengin nispeten acı ve soğuk sular olmasına rağmen tatlı sularda da bulunabildiği bildirilmiştir.

15 pH değeri 6.0–8.0 aralığında olup temiz ve akışkan sularda bulunmaktadır. An. atroparvus, tuz konsantrasyonundaki ani artışlara göre An. messeae’den daha dayanıklıdır. Çiftleşmeleri daha çok ahır duvarlarında gözlemlenmiş olup bu türün erkeklerinin çiftleşme sırasında küme oluşturduğuna rastlanmamıştır (47). Hibernasyon için ılık yerleri tercih edip sıcağa karşı da oldukça dirençlidir. Kış mevsimi boyunca nadiren kan emer ve havaların ısınmasıyla beraber An. messeae ve An. maculipennis s.s türlerine göre çok daha kısa sürede aktif hale gelir (48, 49).

Anopheles beklemishevi, An. maculipennis s.s. ile allopatrik olarak dağılım göstermektedir (50). Soğuk havayı seven bir tür olup dünya üzerindeki dağılımı güney sınırı 60° Kuzey enlemi olacak şekilde tayga ormanları ve yüksek ovalardır (51). Yayılış gösterdiği bu bölgelerde organik kirlenmenin mevcut olduğu, durgun ve soğuk sulara yumurta bırakmaktadır. An. maculipennis s.s’da da olduğu gibi tam bir hibernasyon gözükmektedir. Zoo-antropofilik (kan emmek için hem insan hem hayvanları tercih etme) özellik gösterdikleri için insan sağlığının yanı sıra hayvan sağlığı açısından da önem arz etmektedir (52).

Anopheles labranchiae, yumurtlama dönemi için tuzlu suları tercih ederler fakat An. atroparvus’a benzese de farklı klimatik bölgelere özelleşmişlerdir. Aynı zamanda, farklı türlerle rekabetin olduğu zamanlarda tatlı suları da tercih edebilmektedirler. Hem laboratuvar hem doğal koşullarda kış durgunluğu (diyapoz) karakteristik olup sıcaklığın artmasıyla hibernasyon kırılabilmekte ve kış döneminde de yumurta bırakabilmektedir. Çiftleşme esnasında çiftleşme kümesi oluşumu görülmektedir. Endofilik özellik taşımasına rağmen uygun koşullarda da ekzofilik özellik gösterebilmektedir (53).

Kış mevsimin başlamasıyla An. maculipenis s.s türleri vücutlarında yağ biriktirir ve soğuk ahırlarda gerçek bir diyapoz göstermektedir. An. maculipenis s.s türleri daha düşük sıcaklıklarda daha hızlı yumurta geliştirip bıraktığı için, soğuk iklimede göstermiş olduğu bir diğer adaptasyondur (53). An. maculipennis s.s. dişi bireylerin her bir yumurta bırakma döneminde An. messeae’ye göre daha az yumurta bıraktığı rapor edilmiştir. An. messeae daha durgun sulara yumurta bırakmayı tercih ederken, An. maculipennis s.s hafif akıntının olduğu oksijence zengin suları tercih etmektedirler (48, 52). Yoğun populasyonlarına deniz seviyelerinde bulunmalarına rağmen 2300 m yüksekliğe kadar çıktıkları bildirilmiştir (54).

Anopheles melanoon, An. maculipennis s.s. ve An. messeae’ye göre tuzluluğa direnci fazla olsa da An. sacharovi kadar dayanıklı değildir (55). Zengin, aşırı sulak, tarıma elverişsiz arazilerde veya güneş alan bataklık ve pirinç tarlalarına yumurta bırakırlar. Zoofilik özellik taşımasına rağmen etkili bir vektör olduğu tahmin edilmektedir.

Anopheles messeae ise Kuzey Avrupa’da yayılış gösteren bir türdür. Yumurtlama dönemi için genellikle durgun ve soğuk suları tercih etmektedir. Dar bir alanda ve küçük boyutlu kafeslerde çiftleşmelerinin zor olduğu, oluşturulan kültürlerde tespit edilmiştir. An. messeae’nin erkek bireyleri sıklıkla çiftleşme kümesi oluşturmaktadır. Kış mevsiminde soğuk ahırlarda bulunan ve tamamen hibernasyona girerek beslenmesini ve eşeysel aktivitesini durdurduğu bildirilmiştir (48). Avrupa’daki en önemli vektör olarak bilinmektedir.

Anopheles martinius türleri, güneyde 46° Kuzey enlemini sınır alacak şekilde Türkmenistan, Özbekistan ve Kazakistan’ı içine alan hatta yayılış göstermektedir. Genellikle vejetasyon oranı yüksek seviyedeki durgun sulara yumurtalarını bırakmaktadır. An. martinius larvalarının tuzluluğa karşı dirençleri yüksektir. Ergin sinekler, sıcak sevmektedirler ve kan emmek için hayvanlardan daha çok insanları tercih etmektedir. Kış mesimindeki davranışları An. messeae’ye benzerlik göstermektedir. Eylül- Şubat aylarında diyapoza girerler.

An. sacharovi ve An. labranchiae ile karşılaştırılacak olursa, üreme alanları açışından benzerlik gösterse de larvaların tuz konsantrasyonuna toleransı oldukça yüksektir. Güneşe açık, durgun, yoğun suları tercih etmektedir. Erkek bireyler çiftleşme sırasında çiftleşme kümesi oluşturmaktadır.

An. labranchiae’da görüldüğü gibi ısıya karşı duyarlı bir hibernasyon gözlemlenmektedir (48). An. sacharovi, An. melanoon ve An. maculipennis s.s. türlerine göre gizlenmek için hayvan barınakları yerine evleri daha çok tercih ettikleri tespit edilmiştir. Vektörel bakımdan bu durum oldukça önemlilik arz etmektedir (54).

Yaz başlangıcında, An. maculipennis s.s. tarafından tercih edilen, yosunlu ve gölgesiz göletler, yaz sonlarına doğru havaların ısınmasıyla beraber An. sacharovi tarafından işgal edilmektedir (48).

Son yıllarda tanımlanmış yeni bir tür olan An. persiensis kompleksin genellikle kıyı bölgelerdeki uygun habitatları tercih etmektedir. An. melanoon’un yumurta morfolojisi ile çok benzediği bildirilmiştir (45). Bu durum, daha önce İran ve Azerbeycan’ın bazı bölgelerinden An. melanoon olduğu bildirilen populasyonların aslında bu yeni türe ait olduğunu göstermektedir. Ancak, bu bölgelerde bu türün öncelikli olarak hangi habitatı tercih ettiklerine dair yeterli bir bilgi olmayışı ve halen biyo-ekolojik özellikleri bakımından ayrıntılı bir bilgi mevcut değildir.

An. daciae için de benzer durumlar mevcut olup An. messeae ile benzerlik göstermektedir. Moleküler çalışmalar doğrultusunda yakınlıkları da oldukça yüksektir ve hatta tür statüsü konusunda halen belirsizlikler devam etmektedir (45, 56, 57).

Vektörel özellik konusunda değinilmesi gereken önemli bir hususta, türlerin kan emme davranışlarıyla ilgilidir. Türler bu davranışlarına göre antropofilik (kan emmek için insanı tercih eden) ve zoofilik (hayvanı tercih eden) olarak ikiye ayrılmaktadır.

Kiszewski ve ark. (58) vektör Anopheles türleri tarafından emilmiş olan kanların analizleriyle, insan kanı ortanca (medyan) değerleri türler arasında 0.01 ile 0.98 arasında değişiklik gösterdiğini tespit etmişlerdir. Araştırıcılar (58) An. maculipennis kompleksine ait türlerin durumu şu şekilde verilmiştir: An. atroparvus: 0.245, An. labranchiae: 0.151, An. messeae: 0.172, An. sacharovi: 0.087. Şimşek (59), İran’da ve Türkiye’de (Şanlıurfa) ev ve ahırlardan daha önceden tespit edilen tür yoğunluğundaki farklılığı dikkate alarak türlerin beslenme eğiliminin bulundukları ortama göre önemli ölçüde değiştiğini belirtmiştir.

Linton ve ark.’nın (60) derlediği bilgilere göre de An. atroparvus, An. labranchiae ve An. sacharovi Avrupa için en etkin vektörler iken, An. messeae’nin de Rusya ve Ukrayna için potansiyel bir vektör olduğu bildirilmiştir. Ülkemizde An. superpictus ve An. claviger’in de önemli vektörler olduğu tespit edilmiş olmasına rağmen An. sacharovi’nin de özellikle yaz aylarındaki yoğunluğu ile en etkin sıtma vektörü olduğu bildirilmiştir (45, 61, 62).

3. GEREÇ VE YÖNTEM

3.1 SAHA ÇALIŞMALARI

3.1.1 Araştırma Sahası ve Sivrisinek Örneklerinin Toplanması

Çalışma, 2016 yılının Haziran-Ağustos ayları arasında Sultan Sazlığı ekosisteminde yürütülmüştür. Sultan Sazlığı, Kayseri ilinin güneyindeki Develi Ovası’nda 17.200 hektarlık bir alanı kaplamaktadır. Sazlık 38°.05 - 38°.40 kuzey ve 35°.00–35°.35 doğu koordinatlarında bulunmakta ve konum olarak; Erciyes Dağı’nın güneybatısında olup, Kızılırmak Havzasında bulunan Develi Kapalı havzasının en alçak kesimlerinde yer almaktadır. Sulak alanın büyük çoğunluğu Yeşilhisar İlçesinin sınırları içinde bulunmaktadır (Şekil 3.1).

Şekil 3.1 2016 Ağustos ayında çalışma alanının genel bir görüntüsü

Araştırma sahasında sivrisinek örneklerinin toplanması amacıyla “CDC Mini Light Trap,

With Photo Cell & Air Gate 6VDC (Bioquip Inc., 2836BQX)”, “EVS Black CO2 Light 19

Trap, 4W Black Light Tube (Bioquip Inc., 2801BL)” ve “Heavy Duty EVS CO2 Mosquito

Trap (Bioquip Inc., 2801A)” ışık tuzakları (Şekil 3.2-3.4) kullanılmıştır. CO2’li tuzakların hazneleri kuru buz ile doldurulmuştur. Tuzaklar 17.30-19.00 saatleri arasında aktive edilmiş ve ertesi gün 07.00-08.30 saatleri arasında geri toplanmıştır. Sivrisinek örneklemesinde ayrıca pilli aspiratörlerden (D-Cell Aspirator Bioquip Inc., 2809D) de yararlanılmıştır (Şekil 3.5).

Şekil 3.2 Sivrisinek örneklemesinde kullanılan CDC Mini Light Trap

Şekil 3.3 Sivrisinek örneklemesinde kullanılan Heavy Duty EVS CO2 tuzağı

Şekil 3.4 Sivrisinek örneklemesinde kullanılan EVS Black CO2 tuzağı

Şekil 3.5 Sivrisinek örneklemesinde kullanılan pilli aspiratör

Yakalanan örnekler saha çalışma istasyonunda öncelikle tutuldukları fileler içerisinde -20C’de derin dondurucuya konularak insektlerin ölmesi sağlanmış ve tekniğine uygun olarak stereo mikroskopta incelenerek içerisinden Anopheles örnekleri ayıklanmıştır. Ayıklanan örnekler identifikasyon ve moleküler analizler için %70 alkol içerisine alınmış ve kayıtları sağlanarak laboratuvara intikal ettirilmiştir.

3.2 LABORATUVAR ÇALIŞMALARI

3.2.1 Anopheles Örneklerinin İdentifikasyonu

Saha çalışmalarında toplanan ve ayıklanarak %70 alkol içerisine alınan Anopheles örneklerinin identifikasyonları dijital kamera ataçmanlı stero-mikroskop (Olympus SZX- 16) altında ilgili teşhis anahtarlarına göre yapılmış (63, 64) ve görüntüleme işlemleri CellSens Standard 1.13 (Olympus) yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İdentifiye edilen örneklerde dişi ve erkekler ayrılmış, toplanma tarihi ve türe göre kategorize edilerek %70 alkol içerisine moleküler analizlere kadar muhafaza edilmiştir.

3.2.2 Anopheles Örneklerinden Genomik DNA izolasyonu

Anopheles ergin örneklerinden genomik DNA izolasyonları, DNA ekstraksiyon kitleri (Axygen® AxyPrep™ Multisource Genomic Miniprep DNA, Corning; GeneJET Genomic DNA Purification Kit, Thermo Scientific) ile ilgili basamaklar takip edilerek gerçekleştirilmiştir. Örneklerinin genomik DNA izolasyonundan önce sıvı azot ve steril pestlelar ile ön homojenizasyonu gerçekleştirilmiş ve örneklere lysis buffer eklenerek bir gece 56C’de su banyosu ve/veya kuru ısıtmalı blokta inkübe edilmiştir. Final basamakta elüsyon 35 µl’ye ayarlanmıştır. Elde edilen genomik DNA ekstraktlarından alınan örnekler Qubit® Fluorometric Quantitation (Life Technologies) cihazında işlenerek DNA izolasyon etkinliği ve total genomik DNA miktarları (ng/µl) belirlenmiştir. Örneklere ait genomik DNA’lar kullanılana kadar -20°C’de muhafaza edilmiştir.

3.2.3 Anopheles Örneklerinin Mitochondrial Cytochrome Oxidase I Gen Bölgesinin Amplifikasyonu

Morfolojik identifikasyonları sağlanan Anopheles örneklerinin tür identifikasyonlarının doğrulanması ve filogenetik analizleri için mitochondrial cytochrome oxidase I (mt-COI) gen bölgeleri PCR’da amplifiye edilmiştir. Bu amaçla Anopheles genomik DNA izolatlarının mt-COI gen bölgesinin parsiyel 709 bp kısmı, LCO1490 (5’- GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’) ve HCO2198 (5’- TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’) (65) primerleri ile PCR’da amplifikasyona tabii tutulmuştur. Reaksiyon karışımı 25 µl final konsantrasyonda, 2,5 µl 10XPCR buffer, 2 mM MgCl2, 0.5µM her bir primer, 0.5 mM her bir dNTP, 1.25U Taq DNA polymerase ve 10-20 ng template DNA olarak hazırlanmıştır. Thermalcyclerda protokol 96 ̊C’de 1 dk; 35 siklus, denaturation: 94 ̊C’de 1 dk, annealing: 55 ̊C’de 1 dk,

22 extension: 72 ̊C’de 1,5 dk; final extension: 72 ̊C’de 10 dk olacak şekilde programlanmıştır (65).

PCR analizlerinin geçerliliğinin ve herhangi bir kontaminasyonun olup olmadığının tespit edilmesi amacıyla pozitif kontrol olarak Anabilim Dalında mevcut referens DNA izolatları ve çalışma süresince elde edilen genomik ve plazmid DNA izolatları, negatif kontrol olarak ise sterilize edilmiş deiyonize su kullanılmıştır. Amplifikasyon sonunda elde edilen PCR ürünleri (10 µl) % 1,5 ’luk agaroz jelde elektoforeze tabi tutularak, CLP Jel Dökümantasyon Sistemi ve Gene Snap from Syngene analiz programı (UVP INC Uplant, CA) ile görüntülenip analiz edilmiştir.

3.2.4 Mt-COI Gen Bölgesi Sekans Analizleri

Anopheles izolatlarının PCR analizleri sonrası mt-COI amplikonları sekans analizleri için jel pürifiye (High Pure PCR Product Purification Kit, Roche) edilmiştir. Sekans analizleri PCR analizlerinde kullanılan gen spesifik forward ve reverse primer dizileri ile çift yönlü olarak gerçekleştirilmiştir (Macrogen Europe). Çift yönlü DNA dizisi belirlenen plazmidlere ait kromotogramlar dikkatlice analiz edildikten sonra Geneious 11.0.2 (66) yazılımı ile forward ve reverse dizilimlerin ikili hizalamaları yapılarak, tek bir consesus dizilim belirlenmiş ve bu dizilimden PCR primerleri trimlenerek barkod bölge sekansları (658 bp) sağlanarak izolatlar için final dizilimler elde edilmiştir. Elde edilen sekansların Geneious 11.0.2 yazılımı (66) üzerinden BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) algoritması kullanılarak GenBank’ta mevcut homolog izolatlara ait ilgili gen bölgesi sekanslarıyla çoklu hizalamaları yapılarak moleküler karakterizasyonları sağlanmış ve akabinde GenBank kayıtları sağlanmıştır.

3.2.5 Mt-COI Gen Bölgesi Filogenetik Analizleri

Çalışmada karakterize edilen izolatlarda DNA polimorfizmi ve haplotip yapısının belirlenmesinde DnaSP 5.10.01 (67) yazılımı kullanılmıştır. Intra ve inter-spesifik genetic farklılıklar Kimura two-parameter (K2P) uzaklık modeli (68, 69) kullanılarak MEGA 7 yazılımında (70) gerçekleştirilmiştir. Haemosporidian nesillerinin, sivrisinek ve Culicoides türlerinin filogenetik yapılanmaların belirlenmesinde Bayesian inference (BI) ve Maximum Likelihood (ML) analizleri uygulanmıştır. BI ve ML analizlerinde sekans evrimi için en uygun substitution modelin belirlenmesinde jModelTest v.0.1.1 (71) kullanılmış ve en düşük AIC (Akaike Information, Criterion, correction) değerine sahip

23 belirlenen modeller filogenetik ağaçların oluşturulmasında kullanılmıştır. BA ve ML analizleri Geneious 11.0.2 (66) yazılımı üzerinden sırasıyla MrBayes (72) ve PhyML (73) pluginler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. BA analizlerinde, Markov Chain Monte Carlo taramaları 1.100,000 jenerasyon için 4 zincirle ve ağaç örneklemesi her 200 jenerasyonda bir (ilk 100,000 ağaç) “burn in” olarak çıkarılmıştır. ML analizleriyle oluşturulan ağaçların güvenilirliğinin tespit edilmesinde 1000 tekrarlı Bootstrap testi kullanılmıştır.

4. BULGULAR

4.1 MORFOLOJİK İDENTİFİKASYON SONUÇLARI VE ANOPHELES TÜRLERİNİN DAĞILIMI

2016 yılının Haziran-Ağustos ayları arasında Sultan Sazlığı ekosisteminde saha çalışmalarında toplam 1225 Anopheles örneği (150 erkek, 1075 dişi) toplanmış olup morfolojik identifikasyonlarla belirlenen Anopheles türlerin aylara göre dağılımı Tablo 4.1’de verilmiştir. Araştırma yöresinde çalışma periyodu boyunca en yaygın tür An. sacharovi belirlenmiş bunu sırasıyla An. maculipennis ve An. claviger izlemiştir. Belirlenen Anopheles türlerinin toplam örnek sayısı bazında aylara göre dağılım oranları (%) ayrıca Şekil 4.1’de sunulmuştur. Şekil 4.1’de görüleceği üzere her tür için en yüksek dağılım oranları Ağustos ayında tespit edilmiştir.

Tablo 4.1 Araştırmada 2016 yılı Haziran-Ağustos ayları arasında Sultan Sazlığı Ekosisteminde identifiye edilen Anopheles türlerinin dağılımı Haziran Temmuz Ağustos Toplam

Tür ÖS E D ÖS E D ÖS E D ÖS E D

An. sacharovi 234 29 205 376 42 334 541 67 474 1151 138 1013 An. maculipennis 10 2 8 21 3 18 30 5 25 61 10 51 An. claviger 2 0 2 4 1 3 7 1 6 13 2 11 TOPLAM 246 31 215 401 46 355 578 73 505 1225 150 1075

Anopheles Türlerinin Aylara Göre Dağılımı (%)

0,6 An. claviger 0,3 0,2

2,4 An. maculipennis 1,7 0,8

44,2 An. sacharovi 30,7 19,1

0 10 20 30 40 50

Ağustos Temmuz Haziran

Şekil 4.1 Anopheles türlerinin aylara göre dağılım oranları

Araştırma yöresinde morfolojik identifikasyonları yapılan türlerin teşhiste belirlenen özellikleri aşağıda verilmiş olup mikroskobik görüntüleri de Şekil 4.2-4.4’de verilmiştir.

An. sacharovi: Palpler proboscis kadar uzundur. Mesonotumda renklenme hafiftir. Scutumda median soluk bant bulunmaz. Kanadın apeksi tamamen koyu renkli olup spot bulunmamaktadır. Kanatlarda furkasyon ve çapraz damar bölgelerindeki spotlanma az belirgindir. (Şekil 4.2).

Şekil 4.2 An. sacharovi (dişi)

An. maculipennis: Palpler proboscis kadar uzundur. Mesonotumda renklenme hafiftir. Scutumun median bölgesinde dardan orta genişliğe kadar soluk tüyler bulunur. Kanadın apeksi tamamen koyu renkli olup spot bulunmamaktadır. Kanatlarda furkasyon ve çapraz damar bölgelerindeki spotlanma bariz belirgindir (Şekil 4.58).

Şekil 4.3 An. maculipennis (dişi)

An. claviger: Palpler proboscis kadar uzundur. Mesonotumda renklenme hafiftir. Scutumun median bölgesinde dardan orta genişliğe kadar soluk tüyler bulunur. Kanadın apeksi tamamen koyu renkli olup spot bulunmamaktadır. Kanadın apeksi tamamen koyu renkli olup spot bulunmamaktadır. Kanatlarda furkasyon ve çapraz damar bölgelerinde spotlanma bulunmaz Şekil (4.4).

Şekil 4.4 An. claviger (dişi)

4.2 MOLEKÜLER ANALİZ SONUÇLARI

4.2.1 Mt-COI Gen Bölgesi PCR Analiz Sonuçları

Morfolojik identifikasyonlarla belirlenen örneklere ait genomik DNA izolatlarının LCO1490 ve HCO2198 primerleriyle mt-COI geninin barkod bölgesinin amplifikasyonu sonucu hedef büyüklükte (709bp) amplikonlar saptanmıştır (Şekil 4.5). An. sacharovi için toplam 15, An. maculipennis için 6 ve An. claviger için de 4 izolata ait PCR ürünleri jel pürifiye edilerek sekans analizlerine dahil edilmiştir.

Şekil 4.5 Anopheles türlerine ait izolatların parsiyel mt-COI gen bölgesini amplifiye eden primerler ile PCR sonucu elde edilen pozitif amplikonların jel elektroforezde görünümü M: Marker; 1-12: Anopheles izolatları

4.2.2 Mt-COI Gen Bölgesi Sekans Analiz Sonuçları

Mt-COI gen bölgesine göre mt-COI barkodlaması sağlanan ve moleküler karakterizasyonu yapılan Anopheles türlerine izolatlar, morfolojik identifikasyona göre belirlenen türler, sekans analizleri sonucu belirlenen haplotipler ve GenBank aksesyon numaralarıyla birlikte Tablo 4.2’de verilmiştir.

Tablo 4.2 Araştırmada 2016 yılı Haziran-Ağustos ayları arasında Sultan Sazlığı Ekosisteminde identifiye edilen Anopheles türlerinin dağılımı

Belirlenen Haplotip Sekanslanan izolat Sivrisinek türü sayısı GenBank Adı Sayısı Aksesyon SS-An.sac1 4 MF095668

SS-An.sac2 3 MF095669

SS-An.sac3 3 MF095670 An. sacharovi 15 SS-An.sac4 2 MF095671

SS-An.sac5 2 MF095672 SS-An.sac6 1 MF095673 SS-An.mac1 4 MF095666 An. maculipennis 6 SS-An.mac2 2 MF095667

An. claviger 4 SS-An.clav1 8 MF095665

Çalışmada araştırma yöresinde belirlenen Anopheles türlerine ait mt-COI sekansları arasında 558 (%84,8) identik bölge belirlenirken 9 farklı haplotipi ortaya koyan 100 polimorfik bölge saptanmıştır. Mt-COI gen bölgesi sekans analizleriyle karakterizasyonları yapılan Anopheles izolatlarının nükleotid sekanslarının çoklu hizalamaları Şekil 4.6’da gösterilmiştir. Şekil 4.6’da görüldüğü üzere izolatlar arasında farklı haplotipleri ortaya koyan interspesifik ve intraspesifik nükleotid varyasyonları belirlenmiştir. Sekanslanan izolatlar arasında identiklik oranı ortalama %94,6 belirlenmiş olup ikili hizalama analiz sonucu belirlenen genetik farklılıklar ayrıca Tablo 4.3’de verilmiştir.

Şekil 4.6 Çalışmada saptanan Anopheles türlerine ait izolatların mt-COI nükleotid sekanslarının çoklu hizalamaları

Tablo 4.3 Anopheles türlerinde belirlenen haplotiplerin mt-COI sekanslarının çoklu hizalama analizlerine göre genetik farklılıkları

Haplotip 1 2 3 4 5 6 7 8 1 SS-An.clav1 2 SS-An.mac1 0,147 3 SS-An.mac2 0,145 0,021 4 SS-An.sac1 0,149 0,059 0,059 5 SS-An.sac2 0,147 0,057 0,057 0,002 6 SS-An.sac3 0,149 0,055 0,055 0,003 0,002 7 SS-An.sac5 0,149 0,059 0,059 0,003 0,002 0,003 8 SS-An.sac4 0,143 0,054 0,057 0,006 0,005 0,006 0,006 9 SS-An.sac6 0,143 0,055 0,055 0,008 0,006 0,008 0,008 0,002

An. sacharovi ve An. maculipennis için belirlenen haplotipler arasında intraspesifik nükleotid farklılığı sırasıyla ortalama %0,5±0,2 ve %2,1±0,6 saptanmıştır. Interspesifik nükleotid farklılıkları incelendiğinde An. claviger ve An. sacharovi haplotipleri arasında %14,7±1,9, An. claviger ve An. maculipennis haplotipleri arasında %14,6±1,8 ve, An. sacharovi ile An. maculipennis haplotipleri arasında da %5,7±1,0 genetik farklılık belirlenmiştir.

4.2.3 Mt-COI Gen Bölgesi Filogenetik Analiz Sonuçları

Moleküler olarak karakterize edilen ve DNA barkodlaması sağlanan sivrisinek türlerine ait izolatların Dünyada çeşitli bölgelerden izole edilmiş izolatlarla birlikte filogenetik yapılanmaları Şekil 4.7’de gösterilmiştir. Bayesian inference (BI) ve Maximum Likelihood (ML) filogenisine göre oluşturulan filogenetik çözünürlük yüksek posterior olasılıklar ve bootstrap oranları ile desteklenmiştir. Çalışmada morfolojik analizlerle An. sacharovi olarak identifiye edilen ve moleküler karakterizasyonla SS-An.sac1-6 olarak isimlendirilen haplotiplerden SS-An.sac1,2,3,5 Azerbaycan (KM224664, KM224671) ve İran (KY196460) izolatlarına filogenetik olarak yakın (%99,0) belirlenmişler ve küme oluşturmuşlardır. SS-An.sac4 ve SS-An.sac6 haplotipleri ise İran izolatına (KY196452) filogenetik olarak daha yakın (%99,2) bulunmuşlardır (Şekil 4.7). An. maculipennis türü içinde karakterize edilen SS-An.mac1 ve SS-An.mac2 haplotipleri filogenetik ağaçta iki ayrı cluster içerisinde yer almış ve bu haplotiplerden SS-An.mac1 haplotipi en yüksek identikliği %995 ile İran izolatına (JF966746) gösterirken SS-An.mac2 haplotipi ise Belçika izolatı (KM258234) ile %100 identik bulunmuştur. Çalışmada An. claviger için

31 belirlenen SS-AN.clav1 haplotipi en yüksek identikliği %99,4 ile Hollanda izolatıyla (KM457606) göstermiş ve birlikte ayrı bir küme oluşturmuştur (Şekil 4.7).

Şekil 4.7 Anopheles izolatlarının mt-COI gen bölgesi Bayesian inference (BI) ve Maximum Likelihood (ML) analizine göre filogenetik ilişkileri. Node’ların önündeki rakamlar sırasıyla ML bootstrap desteği ve BI posterior olasılığını göstermektedir. Dış grup olarak Cx. pipiens kullanılmıştır. Ölçek çizgisi yerleşim yeri başına nükleotid değişimini göstermektedir.

5. TARTIŞMA VE SONUÇ

Sultan sazlığı Avrupa ve Ortadoğu'nun en önemli sulak alanlarından biridir. Yoğun saz ve bitki örtüsüyle kaplı, besin maddesi bakımından oldukça zengin tatlı su ekosistemi; tatlı su ekosistemi ile ekolojik olarak ilişkili tuzlu su ekosistemi, farklı ekolojik istekleri olan çok sayıda canlı türünün beslenmesi, barınması ve biyolojisini devam ettirmesi için ideal ortamlar oluşturmuştur. Ekosistemin Anadolu yarımadası üzerinde birleşen, Afrika, Asya ve Avrupa kıtaları arasında süregelen kuş göç yolları üzerinde bulunması, Türkiye’nin en önemli sulak alanlarından Tuz gölü, Seyfe Gölü ve Ereğli Sazlıkları ile ılıman iklim koşullarına sahip Akdeniz kıyı sulak alanlarına yakın olması, Sultan Sazlığı’na kuşlar için de vazgeçilmez bir sulak alan olma avantajı sağlamaktadır. Bölgede günümüze kadar 301 kuş türü tespit edilmiştir (74). Sultan Sazlığı Ekosistemi ayrıca birçok artropod türünün gelişimi için de oldukça uygun ortam sağlamaktadır. Bölgede vektör poyansiyeli yüksek olan başta sivrisinek ve Culicoides türleri olmak üzere çeşitli insekt türlerinin yayılış gösterdiği ve insan ve hayvan sağlığı açısından risk oluşturdukları Erciyes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı bünyesinde yürütülen yapılan son çalışmalarla (TÜBİTAK, 114O646 Araştırma projesi) ortaya konmuştur.

Dünyanın birçok bölgesinde vektör potansiyeli olan başta sivrisinek, Culicoides ve simuliid türleri olmak üzere birçok artropod üzerine moleküler düzeyde genotipleme ve DNA barkodlama çalışmaları artan bir ivme ile devam etmesine karşın Türkiye’de ilgili insektler üzerine genetik çalışmaların sınırlı olduğu görülmektedir. Çalışmamızda Sultan Sazlığı yöresinin Anopheles türlerinin gelişimi için oldukça uygun bir ekosisteme sahip olduğu görülmüştür. Çalışma periyodu boyunca CDC Mini Light Trap, EVS Black CO2

Light Trap, Heavy Duty EVS CO2 Mosquito Trap ve Onderstepoort ışık tuzakları ile çok sayıda Anopheles örnekleri toplanmıştır. Bunlar arasında en yaygın tür An. sacharovi belirlenmiş bunu sırasıyla, An. maculipennis ve An. claviger türleri izlemiştir. An. sacharovi, Maculipennis kompleks içerisinde yer almakta olup An. atroparvus ve An. labranchiae ile birlikte Palearktik bölgede geçmişten günümüze en etkin sıtma 33 vektörlerinden biri olarak nitelenmektedir (75, 76). Türkiye, Suriye ve Orta Doğu’nun farklı bölgelerinde P. vivax malaryasının en etkin vektörünün An. sacharovi olduğu kaydedilmiştir (77, 78). Ayrıca Güney Avrupa bölgelerinde ana potansiyel vektör olarak da görülmektedir (79). An. maculipennis grubu, Culicidae içinde Dünya üzerinde sibling türler olarak tanımlanmış ilk gruptur (80, 81) ve Palearktik Bölgede 12 türü identifiye edilmiştir. Türkiye’nin de içinde yer aldığı Doğu Akdeniz havzasında An. sacharovi’nin yanısıra An superpictus, An. maculipennis s.s. ve An. melanoon türlerinin de sıtma taşınımından sorumlu ikincil türler olduğu kaydedilmiştir (77). Türkiye’de Anopheles cinsine ait 13 tür tanımlanmış olup, bu türlerden üçü (An. maculipennis, An. sacharovi ve An. supalpinus) An. maculipennis grup içinde yer almaktadır (79, 82). Ancak An. supalpinus’un sonraki sistematik çalışmalara An. melanoon’un sinonimi olduğu ortaya çıkarılmıştır (77, 83, 84)Mevcut çalışmada elde edilen bulgularla araştırma yöresinin turistik potansiyeli de göz önüne alındığında P. vivax sıtmasının en etkin vektörü olarak nitelenen An. sacharovi’nin uygun ekosistem içerisinde yüksek popülasyonlara ulaşmasının yöreye gelebilecek olası portörler de dikkate alındığına yüksek risk oluşturduğu görülmüştür.

Sivrisinekler medikal, veteriner ve çevresel önemleri ile Diptera içerisinde oldukça önem arz etmektedir. Bu önemleri sebebiyle örneklerin detaylı identifikasyonu temelinde ayrıntılı DNA barkod referans kütüphaneleri oluşturulmaya başlanmış ve Barcode of Life Data Systems (BOLD; www.boldsystem.org) (85) üzerinden örneklerin tür identifikasyonları için spesifik markerlar geliştirilmiştir. DNA barkodlama amacıyla en yaygın kullanılan ve referans olan gen bölgelerinin başında mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (mt-COI) bölgesi gelmektedir. Mt-COI bölgesini kodlayan gen, enerji kaynağı olarak oksidatif fosforilasyonu kullanan organizmlerde üniversal olarak bulunmasıyla birçok organizmin filogenetik analizinde yaygın olarak kullanılmaktadır (65, 86). Bu teknik her türün yegane genetik identikliğe sahip olduğu konseptine dayalıdır (87). Bir DNA barkodu tür identifikasyonunda genetik marker olarak kullanılabilen kısa standardize DNA sekansından oluşmaktadır (88). DNA barkodlama üzerine önceki çalışmalarda hedef gen bölgesi olarak nuclear internal transcribed spacer 2 (89), cytochrome b oxidase (90), 12S rRNA (91, 92) ve nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (93, 94) gibi gen bölgeleri kullanılmıştır. Ancak son yıllarda mt-COI geni üniversal primerlerle kolay amplifiye edilebilir olması ve diğer gen bölgelerine göre

34 göstermiş olduğu hızlı evrimleşme oranı ile tür içi ve türler arası yüksek sekans varyasyonu sağlaması açısından artan bir popülarite kazanmıştır (65). Mt-COI geni tabanlı DNA barkodlamanın, dolayısıyla farklı kaynaklardan kıyaslamalı sonuçların elde edilebilmesinde kolaylıkla standardize edilebilen alternatif bir tür identifikasyon tekniği olduğu belirtilmiştir (88) Herbert ve ark. (65, 95) mt-COI geninin 658 bp kısmının hayvan yaşamının barkodlanmasında universal bir marker olarak kullanılabilirliğini önermişlerdir. Nitekim önceki çalışmalar (96-101) da mt-COI geninin sivrisinekler de dahil metazoon gruplarının identifikasyonu ve filogenetik ilişkilerinin araştırılması için etkin bir gen ve barkodlama aracı olduğunu göstermiştir. Tüm bu yönleri ile çalışmamızda Sultan Sazlığı Ekosisteminde yayılış gösteren Anopheles türlerinin genetik karaktertizasyonu ve barkodlanmasında mt-COI referans gen bölgesi kullanılmış ve tüm ziolatların filogenetik yapılanmaları ortaya çıkarılmıştır

Türkiye’de Anopheles türleri üzerine moleküler araştırmaların sınırlı olduğu gözükmektedir. An. sacharovi’nin de yer aldığı Maculipennis Kompleks grubundaki bazı türlerin yumurta, larva ve erginlerinin morfolojik teşhisleri oldukça güçtür ve hatta bazı durumlarda imkansızdır (102). Bu açıdan ilgili kompleks türlerin identifikasyonunda moleküler teknikler önem kazanmıştır. Akıner ve Çağlar (103), Birecik, Beyşehir ve Çankırı bölgelerinde yayılış gösteren Anopheles türlerini araştırdıkları çalışmalarında Maculipennis kompleks grubundaki türlerin identifikasyonu ve ayrımında ribozomal ITS-2 gen bölgesini kullanmışlar ve An. sacharovi ile birlikte An. maculipennis ss. ve An. melanoon nesillerini yaygın olarak belirlemişlerdir. Simsek ve ark. (104), Adana, Antalya, Burdur, Hatay, Isparta, Kayseri, Niğde, Mersin, Muğla ve Osmaniye’den örnekledikleri sivrisinek nesillerinden izole ettikleri gDNA izolatlarının ribosomal ITS-2 gen bölgelerine göre karakterizasyonlarını gerçekleştirmişler ve An. sacharovi, An. maculipennis s.s. ve An. melanoon türlerinin identifikasyonu ve dağılımlarını belirlemişlerdir. Araştırıcılar (104) ayrıca genel olarak bilindiği gibi (95) ilgili gen bölgesinde intraspesifik farklılıkların bulunmadığını, interspesifik farklılıkların ise yüksek olduğuna dikkat çekmişler ve çalışmadaki türlerin ayrımında ilgili gen bölgesinin efektifliğine dikkat çekmişlerdir. Ancak bilindiği üzere özellikle insektlerde evrimsel analizler ve filogenetik yapılanmaların araştırılmasında yukarıda da bahsedildiği üzere ITS-2 gibi diğer protein kodlamayan ribosomal gen bölgeleri intraspesifik nükleotid varyasyonlarının çok düşük olması sebebiyle genellikle tercih edilmemektedir (95).

Araştırmamızda Sultan Sazlığı yöresinde belirlenen Anopheles nesillerinin identifikasyonları standart morfolojik kriterlere göre referans interaktif yazılımlar (64, 105) ile gerçekleştirilmiş ve sonrasında tür identifikasyonları mt-COI DNA barkodları ile konfirme edilmiş ve nesillerin filogenetik analizleri gerçekleştirilmiştir. Ribosomal DNA (rDNA) ile kıyaslandığında mitokondrial DNA COI gen bölgesinin bazı avantajları bulunmaktadır: 1-) Evrimleşme oranı 5-10 kat daha hızlıdır (106) ki bu durum bu gen bölgesinin özellikle tür bazında sınıflandırmada öne çıkmasını sağlamaktadır (65, 107), 2-) mt-DNA haplotiptir ve böylece sekanslamadan önce yeterli konsantrasyonda PCR ürünleri mevcut ise klonlama basamağına gereksinim göstermez, klonlama basamağı moleküler marker olarak rDNA kullanıldığında gereklidir (108), 3-) Genom içerisinde çok sayıda kopyası bulunmaktadır ki bu durum amplifikasyonu çok daha kolay hale getirmektedir (109). Daha üst taksonomideki COI sekansları arasındaki farklılıklar artış gösterir (96). COI barkodlama aralığı tür içinde genellikle %2’dir. Türler arasındaki yüksek farklılıklar muhtemelen kriptik türlerin varlığıyla alakalı olarak coğrafik izolasyondan kaynaklanmaktadır (65, 99). Bundan dolayı örneklemede tüm coğrafik alanı temsil edecek daha kapsamlı alan tercih edilmeli, örnekleme alanları arasındaki mesafe uzak olmalı, daha farklılaşmış bireysel örnekler tercih edilmeli ve tür içindeki veya türler arasındaki genetik farklılıklar çok daha doğru hesaplanmalıdır (107, 110). Çalışmamızda araştırma yöresinde izole edilen An. sacharovi haplotipleri arasında ortalama %0,5±0,2 genetik farklılık belirlenmiş ve filogenetik olarak monofiletik olduğu görülen bu haplotiplerin Azerbaycan ve İran izolatlarına yakın oldukları belirlenmiştir. An. maculipennis türü içinde iki haplotip belirlenmiş ve aralarındaki genetik farklılık %2,1±0,6 bulunmuştur. İki ayrı filogenetik cluster içerisinde yer alan bu haplotipler İran ve Belçika izolatı ile yüksek identik bulunmuştur. Çalışmada An. claviger için belirlenen haplotip ise en yüksek yakınlığı Hollanda izolatıyla göstermiş ve birlikte ayrı bir kümede yer almıştır.

Sonuç olarak bu tez çalışması ile Sultan Sazlığı Ekosisteminde yayılış gösteren Anopheles türleri belirlenmiş ve bu türlere ait nesillerin DNA barkodları sağlanarak filogenetik yapılanmaları ortaya konulmuştur. Elde edilen sonuçlar başta An. sacharovi olmak üzere ilgili türlerin sıtma ve diğer vektör-kaynaklı hastalıklar göz önüne alındığında araştırma yöresinde önemli bir risk potansiyeli oluşturduklarını ortaya çıkarmıştır. Bu açıdan ilgili

36 türlere ait nesiller üzerine vektör-patojen-konak bütününde sürveyans çalışmalarına ve risk analiz değerlendirmelerine ihtiyaç bulunmaktadır.

6. KAYNAKLAR

1. WHO. WHO malaria report. In: WHO, editor. WHO global malaria program. Geneva2012. p. 260.

2. malERA. Consultative Group on Vector Control A research agenda for malaria eradication: vector control. PLoS Med. 2011;8(1):e1000401.

3. Meigen JM. Systematische Beschreibung der bekannten Europäischen Zweiflügeligen Insekten. V. 1. 123456789/1078. 1818.

4. Knight K, Stone A. A catalog of the mosquitoes of the world (Diptera: Culicidae). Second ed: Thomas Say Foundation; 1977. 6 1–611 p.

5. Knab F. The Species of Anopheles that transmits Human Malaria. Am J Trop Dis Prev Med. 1913;1(1).

6. Harbach R. Mosquito taxonomic inventory. 2013.

7. Edwards F. Genera Insectorum. Diptera. Fam. Culicidae. . Brussels: Desmet- Verteneuil; 1932.

8. Reid JA, Knight KL. Classification within the subgenus Anopheles (Diptera, Culicidae). Ann Trop Med Parasitol. 1961;55(4):474-488.

9. Grjebine A. Insectes Diptères Culicidae Anophelinae. Madagaskar: Office de la recherche scientifique et technique outre-mer; 1966.

10. Gillies MT, De Meillon B. The anophelinae of Africa south of the Sahara (Ethiopian zoogeographical region): South African Institute for Medical Research; 1968. 1–343 p.

11. Reid J. Anopheline mosquitoes of Malaya and Borneo. Studies from the Institute for Medical Research. Malaysia1968. 37

12. Faran ME. Mosquito studies (Diptera: Culicidae). XXXIV. A revision of the albimanus section of the subgenus Nyssorhynchus of Anopheles. Estudios sobre zancudos (Diptera, Culicidae). XXXIV. Una revisión de la sección albimanus del subgénero Nyssorhynchus de Anopheles. Contrib Am Entomol Inst. 1980;15:1- 215.

13. Linthicum KJ. A revision of the Argyritarsis Section of the subgenus Nyssorhynchus of Anopheles (Diptera: Culicidae). Army Medical Research Inst Of Infectious Diseases Fort Detrick Md, 1988.

14. Harbach R. The classification of genus Anopheles (Diptera: Culicidae): a working hypothesis of phylogenetic relationships. Bull Entomol Res. 2004;94(6):537-553.

15. PubMed. Taxonomy [cited 2017 10.12.2017]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/.

16. Borkent A, Grimaldi DA. The earliest fossil mosquito (Diptera: Culicidae), in mid-Cretaceous Burmese amber. Ann Entomol Soc Am. 2004;97(5):882-888.

17. Bertone MA, Courtney GW, Wiegmann BM. Phylogenetics and temporal diversification of the earliest true flies (Insecta: Diptera) based on multiple nuclear genes. Syst Entomol. 2008;33(4):668-687.

18. Poinar GO, Zavortinik T, Pike T, et al. Paleoculicis minututs (Diptera: Culicidae) n. Gen., n. Sp., from Cretaceous Canadian amber, with a summary of described fossil mosquitoes. Acta Geol Sin. 2000;35(1):119-130.

19. Zavortink TJ, Poinar GO. Anopheles (Nyssorhynchus) dominicanus sp. n.(Diptera: Culicidae) from Dominican amber. Ann Entomol Soc Am. 2000;93(6):1230-1235.

20. Statz G. Neue Dipteren (Nematocera) aus dem Oberoligozän von Rott. VI. Familie: Tendipedidae (Zuck-oder Schwarmücken). VII. Familie: Heleidae (Ceratopogonidae),(Gnitzen). VIII. Familie: Lycoriidae (Trauermücken). Palaeontographica Abt A. 1944;95:123-188.

21. Reidenbach KR, Cook S, Bertone MA, et al. Phylogenetic analysis and temporal diversification of mosquitoes (Diptera: Culicidae) based on nuclear genes and morphology. BMC Evol Biol. 2009;9(1):298.

22. Harbach RE, Kitching IJ. Phylogeny and classification of the Culicidae (Diptera). Syst Entomol. 1998;23(4):327-370.

23. Besansky NJ, Fahey GT. Utility of the white gene in estimating phylogenetic relationships among mosquitoes (Diptera: Culicidae). Mol Biol Evol. 1997;14(4):442-454.

24. Harbach RE, Kitching IJ. Reconsideration of anopheline mosquito phylogeny (Diptera: Culicidae: Anophelinae) based on morphological data. Syst Biodivers. 2005;3(4):345-374.

25. Foley DH, Bryan JH, Yeates D, et al. Evolution and Systematics ofAnopheles: Insights from a Molecular Phylogeny of Australasian Mosquitoes. Mol Phylogenet Evol. 1998;9(2):262-275.

26. Krzywinski J, Wilkerson RC, Besansky NJ. Evolution of mitochondrial and ribosomal gene sequences in Anophelinae (Diptera: Culicidae): implications for phylogeny reconstruction. Mol Phylogenet Evol. 2001;18(3):479-487.

27. Krzywinski J, Wilkerson RC, Besansky NJ. Toward understanding Anophelinae (Diptera, Culicidae) phylogeny: insights from nuclear single-copy genes and the weight of evidence. Syst Biol. 2001;50(4):540-556.

28. Sallum M, Schultz T, Wilkerson R. Phylogeny of Anophelinae (Diptera Culicidae) based on morphological characters. Ann Entomol Soc Am. 2014;93(4):745-775.

29. Sallum M, Schultz T, Foster P, et al. Phylogeny of Anophelinae (Diptera: Culicidae) based on nuclear ribosomal and mitochondrial DNA sequences. Syst Entomol. 2002;27(3):361-382.

30. Collucci E, Sallum MAM. Phylogenetic analysis of the subgenus Kerteszia of Anopheles (Diptera: Culicidae: Anophelinae) based on morphological characters. Insect Syst Evol. 2003;34(4):361-372.

31. Valencio D, Vilas J. Age of the separation of South America and Africa. Nature. 1969;223(5213):1353-1354.

32. Belkin JN. The Mosquitoes of the South Pacific (Diptera, Culicidae), Vol. 2. Berkeley: University of California Press; 1962.

33. Zavortink TJ. Mosquito studies (Diptera, Culicidae) XXIX. A review of the subgenus Kerteszia of Anopheles. Estudios sobre zancudos (Diptera, Culicidae). XXIX. Revisión del subgénero Kerteszia de Anopheles. Contrib Amer Ent Inst. 1973;9(3):1-54.

34. Theobald FV. A monograph of the Culicidae, or mosquitoes: Longmans & Co.; 1901.

35. Theobald FV. A monograph of the Culicidae, or mosquitoes: Longmans & Co.; 1903.

36. Theobald FV. A monograph of the Culicidae, or mosquitoes: Longmans & Co.; 1901.

37. Mattingly PF. The biology of mosquito-borne disease. London: George Allen & Unwin Ltd; 1969.

38. Sinka ME, Bangs MJ, Manguin S, et al. The dominant Anopheles vectors of human malaria in Africa, Europe and the Middle East: occurrence data, distribution maps and bionomic précis. Parasit Vectors. 2010;3(1):117.

39. Sinka ME, Bangs MJ, Manguin S, et al. The dominant Anopheles vectors of human malaria in the Asia-Pacific region: occurrence data, distribution maps and bionomic précis. Parasit Vectors. 2011;4(1):89.

40. Garros C, Harbach RE, Manguin S. Systematics and biogeographical implications of the phylogenetic relationships between members of the Funestus and Minimus groups of Anopheles (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 2005;42(1):7-18.

41. Anthony T, Harbach RE, Kitching I. Phylogeny of the pyretophorus series of Anopheles subgenus Cellia (Diptera: Culicidae). Syst Entomol. 1999;24(2):193- 205.

42. Stringer C. The origin of our species: Penguin UK; 2011.

43. Manguin S. Highlights on Anopheles nili and Anopheles moucheti, Malaria Vectors in Africa--Anopheles Mosquitoes: New Insights into Malaria Vectors: InTech; 2013.

44. O’Roke EC. The incidence, pathogenicity and transmission of Leucocytozoon anatis of ducks. J Parasitol. 1930a;17: 112.

45. Organization WH. Meeting on progress achieved with malaria elimination in the WHO European Region: Ashgabat, Turkmenistan, 30 October-01 November 2007. 2008.

46. Organization WH. Scaling up the response to malaria in the WHO European Region: progress towards curbing an epidemic, 2000-2004. 2005:55.

47. De Buck A, Schoute E, Swellengkebel N. Racial Differentiation of" Anopheles maculipennis" in Netherlands and its Relation to Malaria. Riv Malariol. 1930;9(2):97-110.

48. Hackett LW, Missiroli A. The varieties of Anopheles maculipennis and their relation to the distribution of malaria in Europe. Riv Malariol. 1935;14(1).

49. Cambournac FJ, Hill R. The Biology of Anopheles maculipennis, var. atroparvus in Portugal. Amsterdam: Ada Conv. ter. Malar. Morb.; 1938.

50. Stegnii V, Kabanova V. Cytoecological study of indigenous populations of the malaria mosquito in the territory of the USSR I. Identification of a new species of Anopheles in the maculipennis complex by the cytodiagnostic method1978.

51. Ramsdale C, Snow K. Distribution of the genus Anopheles in Europe. J Eur Mosq Control Assoc. 2000(7):1-26.

52. White GB. Systematic reappraisal of the Anopheles maculipennis complex. Mosq Syst. 1978;10(1):13-44.

53. Kettle D, Sellick G. The duration of the egg stage in the races of Anopheles maculipennis Meigen (Diptera, Culicidae). J Anim Ecol. 1947:38-43.

54. Postiglione M, Tabanli S, Ramsdale C. Anopheles daviger in Turkey. Riv Parassitol. 1973;34:128-159.

55. Bates M, Hackett L, editors. The distinguishing characteristics of the populations of Anopheles maculipennis found in Southern Europe. The Proceedings of the International Congress of Entomology; 1939.

56. Nicolescu G, Linton Y-M, Vladimirescu A, et al. Mosquitoes of the Anopheles maculipennis group (Diptera: Culicidae) in Romania, with the discovery and formal recognition of a new species based on molecular and morphological evidence. Bulletin of entomological research. 2004;94(6):525-535.

57. Bezzhonova O, Goryacheva I. Intragenomic heterogeneity of rDNA internal transcribed spacer 2 in Anopheles messeae (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 2008;45(3):337-341.

58. Kiszewski A, Mellinger A, Spielman A, et al. A global index representing the stability of malaria transmission. Am J Trop Med Hyg. 2004;70(5):486-498.

59. Şimşek FM. Şanlıurfa (Siverek)'da Sıtma Vektörü Anopheles claviger (Diptera: Culicidae)'in Ekolojik Özellikleri Üzerine Araştırmalar. Turkiye Parazitol Derg. 2006;30(2):115-120.

60. Linton Ym, Smith L, Koliopoulos G, et al. The Anopheles maculipennis complex (Diptera: Culicidae) in Greece. J Nat Hist. 2007;41(41-44):2683-2699.

61. Şimşek FM. Seasonal frequency and relative density of larval populations of mosquito species (Diptera: Culicidae) in Şanlıurfa province, Turkey. Turk J Zool. 2006;30(4):383-392.

62. Djadid ND, Gholizadeh S, Tafsiri E, et al. Molecular identification of Palearctic members of Anopheles maculipennis in northern Iran. Malar J. 2007;6(1):6.

63. Darsie RF, Jr., Samanidou-Voyadjoglou A. Keys for the identification of the mosquitoes of Greece. J Am Mosq Control Assoc. 1997;13(3):247-254.

64. Schaffner F. Les moustiques d'Europe = The mosquitoes of Europe. Paris: IRD Éditions; 2001.

65. Hebert PD, Ratnasingham S, deWaard JR. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc Biol Sci. 2003;270 Suppl 1:S96-99.

66. Kearse M, Moir R, Wilson A, et al. Geneious Basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data. Bioinformatics. 2012;28(12):1647-1649.

67. Librado P, Rozas J. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics. 2009;25(11):1451-1452.

68. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol. 1980;16(2):111-120.

69. Nei M, Kumar S, Oxford University P. Molecular evolution and phylogenetics. Oxford [etc.]: Oxford University Press; 2005.

70. Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 2013;30(12):2725-2729.

71. Posada D. jModelTest: phylogenetic model averaging. Mol Biol Evol. 2008;25(7):1253-1256.

72. Huelsenbeck JP, Ronquist F. MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees. Bioinformatics. 2001;17(8):754-755.

73. Guindon S, Gascuel O. A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood. Syst Biol. 2003;52(5):696-704.

74. Turan L. Sultan Sazlığı Fauna Raporu. Biyolojik Çeşitlilik ve Doğal Kaynak Yönetimi Gef-2 Projesi. 2004.

75. Romi R, Sabatinelli G, Majori G. Could malaria reappear in Italy? Emerg Infect Dis. 2001;7(6):915-919.

76. Linton YM, Smith L, Koliopoulos G, et al. Morphological and molecular characterization of Anopheles (Anopheles) maculipennis Meigen, type species of the genus and nominotypical member of the Maculipennis Complex. Systematic Entomology. 2003;28(1):39-55.

77. Alten B, Çaglar SS, Özer N. Malaria and its vectors in Turkey. European Mosquito Bulletin. 2000(No. 7):27-33.

78. Yurttas H, Alten B. Geographic differentiation of life table attributes among Anopheles sacharovi (Diptera: Culicidae) populations in Turkey. Journal of Vector Ecology. 2006;31(2):275-284.

79. Ramsdale C, Snow K. Distribution of the genus Anopheles in Europe. European Mosquito Bulletin. 2000(No. 7):1-26.

80. Falleroni D. Fauna anofelica italiana e suo ‘habitat’(paludi, risaie, canali). Metodi di lotta contro la malaria. Riv Malariol. 1926;5:553-593.

81. Van Thiel P. Investigations on the Range and Differentiation of Anopheles maculipennis Races and their Bearing on the Existence or Absence of Malaria in Italy. Riv Malariol. 1933;12(fasc. 2).

82. Postiglione M, Tabanli B, Ramsdale CD. The Anopheles of Turkey. Rivista di Parassitologia. 1973;34(2):127-159.

83. Boccolini D, Di Luca M, Marunici M, et al. Further molecular and morphologic support for he formal synonymy of An. subalpinus with An. melanoon. European Mosque Bull. 2003;16:1-5.

84. Linton Y-M, Smith L, Harbach RE. Observation on the taxonomic status of Anopheles subalpinus Hackett and Lewis and An. melanoon Hackett. 2002.

85. Ratnasingham S, Hebert PD. bold: The Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife.org). Mol Ecol Notes. 2007;7(3):355-364.

86. Nielsen SA, Kristensen M. Delineation of Culicoides species by morphology and barcode exemplified by three new species of the subgenus Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae) from Scandinavia. Parasit Vectors. 2015;8:151.

87. Rueanghiran C, Apiwathnasorn C, Sangthong P, et al. Utility of a set of conserved mitochondrial cytochrome oxidase subunit I gene primers for Mansonia annulata identification. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2011;42(6):1381-1387.

88. Chan A, Chiang LP, Hapuarachchi HC, et al. DNA barcoding: complementing morphological identification of mosquito species in Singapore. Parasit Vectors. 2014;7:569.

89. Merget B, Koetschan C, Hackl T, et al. The ITS2 Database. J Vis Exp. 2012(61).

90. Shen YY, Chen X, Murphy RW. Assessing DNA barcoding as a tool for species identification and data quality control. PLoS One. 2013;8(2):e57125.

91. Vences M, Thomas M, van der Meijden A, et al. Comparative performance of the 16S rRNA gene in DNA barcoding of amphibians. Front Zool. 2005;2(1):5.

92. Chu KH, Li CP, Qi J. Ribosomal RNA as molecular barcodes: a simple correlation analysis without sequence alignment. Bioinformatics. 2006;22(14):1690-1701.

93. Rach J, Desalle R, Sarkar IN, et al. Character-based DNA barcoding allows discrimination of genera, species and populations in Odonata. Proc Biol Sci. 2008;275(1632):237-247.

94. Webster BL, Emery AM, Webster JP, et al. Genetic diversity within Schistosoma haematobium: DNA barcoding reveals two distinct groups. PLoS Negl Trop Dis. 2012;6(10):e1882.

95. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, et al. Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci. 2003;270(1512):313-321.

96. Cywinska A, Hunter FF, Hebert PD. Identifying Canadian mosquito species through DNA barcodes. Med Vet Entomol. 2006;20(4):413-424.

97. Kumar NP, Rajavel AR, Natarajan R, et al. DNA barcodes can distinguish species of Indian mosquitoes (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 2007;44(1):1-7.

98. Khamis FM, Masiga DK, Mohamed SA, et al. Taxonomic identity of the invasive fruit fly pest, Bactrocera invadens: concordance in morphometry and DNA barcoding. PLoS One. 2012;7(9):e44862.

99. Wang G, Li C, Guo X, et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. PLoS One. 2012;7(10):e47051.

100. Bourke BP, Oliveira TP, Suesdek L, et al. A multi-locus approach to barcoding in the Anopheles strodei subgroup (Diptera: Culicidae). Parasit Vectors. 2013;6:111.

101. Laurito M, Oliveira TM, Almiron WR, et al. COI barcode versus morphological identification of Culex (Culex) (Diptera: Culicidae) species: a case study using samples from Argentina and Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2013;108 Suppl 1:110-122.

102. Patsoula E, Samanidou-Voyadjoglou A, Spanakos G, et al. Molecular characterization of the Anopheles maculipennis complex during surveillance for the 2004 Olympic Games in Athens. Med Vet Entomol. 2007;21(1):36-43.

103. Akiner MM, Caglar SS. [Identification of Anopheles maculipennis group species using polymerase chain reaction (PCR) in the regions of Birecik, Beysehir and Cankiri]. Turkiye Parazitol Derg. 2010;34(1):50-54.

104. Simsek FM, Ulger C, Akİner MM, et al. Molecular identification and distribution of Anopheles maculipennis complex in the Mediterranean region of Turkey. Biochemical Systematics and Ecology. 2011;39(4/6):258-265.

105. Rawlings P. A key, based on wing patterns of biting midges (Genus Culicoides Latreille Diptera: Ceratopogonidae) in the Iberian Peninsula, for use in epidemiological studies. Graellsia. 1996;52:57-71.

106. Castro JA, Picornell A, Ramon M. Mitochondrial DNA: a tool for populational genetics studies. Int Microbiol. 1998;1(4):327-332.

107. Beebe NW, van den Hurk AF, Chapman HF, et al. Development and evaluation of a species diagnostic polymerase chain reaction-restriction fragment-length polymorphism procedure for cryptic members of the Culex sitiens (Diptera: Culicidae) subgroup in Australia and the southwest Pacific. J Med Entomol. 2002;39(2):362-369.

108. Hemmerter S, Slapeta J, Beebe NW. Resolving genetic diversity in Australasian Culex mosquitoes: incongruence between the mitochondrial cytochrome c oxidase I and nuclear acetylcholine esterase 2. Mol Phylogenet Evol. 2009;50(2):317-325.

109. Ruiz-Lopez F, Wilkerson RC, Conn JE, et al. DNA barcoding reveals both known and novel taxa in the Albitarsis Group (Anopheles: Nyssorhynchus) of Neotropical malaria vectors. Parasit Vectors. 2012;5:44.

110. Hebert PD, Stoeckle MY, Zemlak TS, et al. Identification of Birds through DNA Barcodes. PLoS Biol. 2004;2(10):e312.

ÖZGEÇMİŞ

KİŞİSEL BİLGİLER

Adı, Soyadı: Mehmet KÖRLÜ

Uyruğu: (TC)

Doğum Tarihi ve Yeri: 13 Ocak 1989, Mersin

Medeni Durumu: Bekar

Tel: +90 506 349 9812 email: [email protected]

Yazışma Adresi: Erciyes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı, Melikgazi/ KAYSERİ

EĞİTİM

Derece Kurum Mezuniyet Tarihi

Lise Melikgazi Mustafa Eminoğlu Lisesi/Kayseri 2006 Lisans Erciyes Üniversitesi Fen Fakültesi/Biyoloji Bölümü 2011

Yüksek Lisans Erciyes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Veteriner Parazitoloji

YABANCI DİL

İngilizce