Vabalų Genetinė Analizė

VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS

GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS BIOLOGIJOS KATEDRA

Aurelia Auruszkiewicz

CICINDELA HYBRIDA IR C. MARITIMA (COLEOPTERA: CARABIDAE) VABALŲ GENETINĖ ANALIZĖ

Magistro baigiamasis darbas

Molekulinės biologijos ir biotechnologijos studijų programa, valstybinis kodas 621C71001 Molekulinės biologijos studijų kryptis

Vadovė dr. Brigita Tamutė ______(Parašas) (Data)

Apginta prof. Algimantas Paulauskas ______(Parašas) (Data)

Kaunas, 2012 Darbas atliktas: 2009–2012 m. Vytauto Didžiojo universitete, Biologijos katedroje.

Recenzentas: Irma Puraitė

Darbas ginamas: viešame bakalauro darbų gynimo komisijos posėdyje 2012 metų gegužės 31 d. Vytauto Didžiojo universitete, Biologijos katedroje, 801 auditorijoje 9 valandą. Adresas: Vileikos 8, LT - 44404 Kaunas, Lietuva.

Protokolo Nr.

Darbo vykdytojas: Aurelia Auruszkiewicz ______(Parašas) Mokslinis vadovas: dr. B. Tamutė ______

(Parašas) Biologijos katedra, vedėjas: prof. A. Sruoga ______(Parašas)

2 TURINYS

SANTRAUKA...... 4 SUMMARY ...... 5 ĮVADAS...... 6 I. LITERATŪROS APŽVALGA ...... 8 1.1 Baltijos pajūris ...... 8 1.2 Cicindela hybrida ir Cicindela maritima sistematika ...... 8 1.3 Cicindela genties vabalų morfologiniai ypatumai...... 11 1.3.1 Cicindela hybrida ir C. maritima charakteristika...... 12 1.3.2 Cicindela hybrida, C. maritima vabalų paplitimas...... 16 1.4 Carabidae vabalų rūšių įvairovės tyrimai...... 17 1.5 Vabzdžių tyrimų metodai ...... 19 1.5.1 DNR molekuliniai tyrimo metodai...... 20 1.5.2 DNR išskyrimas...... 22 II. MEDŽIAGA IR METODIKA ...... 24 2.1 Tyrimų medžiaga ...... 24 2.2 DNR išskyrimas iš vabalų audinių...... 30 2.2.1 DNR Švarumo ir koncentracijos nustatymas ...... 32 2.3 Polimerazės grandininė reakcija (PGR) ...... 32 2.4 Elektroforezė agarozės gelyje...... 38 2.5 PGR fragmento kirpimas ir valymas...... 39 2.5.1 Sekvenavimas...... 41 2.5.2 Statistinė duomenų analizė...... 41 III. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ...... 42 3.1 Vabalų identifikavimas ir morfometrinė analizė ...... 42 3.2 Vabalų molekuliniai tyrimai...... 48 3.2.1 DNR išskyrimas...... 48 3.2.2 Polimerazės grandininė reakcija (PGR)...... 49 3.2.3 Mitochondrinės DNR cox 1 sekų analizė...... 51 IŠVADOS...... 55 LITERATŪRA ...... 56

3 SANTRAUKA

Darbo autorius: Aurelia Auruszkiewicz Darbo pavadinimas: CICINDELA HYBRIDA ir C. MARITIMA (COLEOPTERA: CARABIDAE) VABALŲ GENETINĖ ANALIZĖ Darbo vadovė: dr. Brigita Tamutė Darbas atliktas: Vytauto Didžiojo Universitete, Gamtos mokslų fakultete, Kaune. Puslapių skaičius: 59 Lentelių skaičius: 16 Paveikslų skaičius: 34 Priedų skaičius: 2 Šio darbo tikslas buvo įvertinti Carabidae šeimos Cicindela hybrida ir C. maritima vabalų genetinę įvairovę Lietuvoje. Molekuliniaims tyrimams buvo panaudoti 157 vabalų pavyzdžių iš 5 skirtingų Lietuvos vietovių: Kuršių nerijos (Grobšto gamtinio rezervato ir Naglių gamtinio rezervato); Šakių r. (Juškinės miško); Kauno r. (Noreikiškių) ir Vilniaus apyl. (Pučkorių atodanga). Tiriant tradiciniais entomologijos metodais ištirti Cicindela hybrida ir C. maritima vabalų rūšių skirtumai. DNR išskyrta iš fiksuotų spirite vabalų kojų, galvos bei krūtinės. DNR išskyrimas iš Cicindela hybrida ir C. maritima rūšies vabalų buvo vykdytas 3 metodais: panaudojant DNR išskyrimo rinkinį „NucleoSpin® Tissue Kit“, panaudojant amoniako tirpalą bei DNR išskyrimo rinkinį „Zymo Research Insect/Tissue DNA Kit-5“. Vabalų genetinės įvairovės tyrimams buvo panaudotos mitochondrinės DNR citochromoksidazės I (COI) geno atkarpą amplifikuojančių pradmenų poros: Pat ®, Jer ir COI-Cic1, COI-Cic4. Nustatyta, kad mtDNR citochromoksidazės (COI) geno atkarpą amplifikuojančių pradmenų poros Pat ®, Jer ir COI-Cic1, COI-Cic4 tinkamos tirti C. hybrida, C. maritima rūšies vabalus. Panaudojant mtDNR citochromo c oksidazės (COI) geno sekų duomenis, nubraižytas C. hybrida ir C. maritima vabalų rūšių NJ (angl., Neighbor- Joining) giminingumo medis bei atlikta vabalų morfologinių struktūrų analizė.

4 SUMMARY

Author of term paper: Aurelia Auruszkiewicz Full title of term paper: GENETIC ANALYSIS of CICINDELA HYBRIDA and C. MARITIMA (COLEOPTERA: CARABIDAE) BEETLES SPECIES Term paper advisor: dr. Brigita Tamutė Presented at: Vytautas Magnus University, Faculty of Natural Scienses, Kaunas, 2010, June. Number of pages: 59 Number of tables: 16 Number of pictures: 34 Number of addition: 2 The aim of this study was to evaluate the genetic structure of Cicindela hybrida and C. maritima (Coleoptera: Carabidae) beetles species. 157 beetles from 5 different Lithuanian regions were used in our research: Curonian spit (Grobštas and Nagliai nature reserves), Šakiai district (Juškinė forest), Kaunas district (Noreikiškės) and Vilnius district (Pučkorių exsposure). In the present study Cicindela hybrida and C. maritima species were examined using traditional entomological methods (such as identifying of species, documenting of important for taxonomy morphological structures). DNA was extracted from fixed ethanol specimens usually from leg, head or thorax using the Nucleospin Tissue Kit (Machery-Nagel, Düren, Germany), with ammonia solution and „Zymo Research Insect/Tissue DNA Kit-5“. Two cytochrome c oxidase subunit I (COI) primers were used for polymerase chain reaction: Pat ®, Jer and COI-Cic1, COI-Cic4. MtDNR cytochrome c oxidase (COI) gene primers pair Pat ®, Jer ir COI-Cic1, COI-Cic4 was suitable as the tool for analysis C. hybrida and C. maritima species. Using the data of mtDNA cytochrome c oxidase (COI) gene sequences, the NJ (Neighbor-Joining) relationship tree of Cicindela hybrida and C. maritima beetle species was drawn and the analysis of the morphologic structures of the beettles was conducted.

5 ĮVADAS

Vabzdžiai yra pagrindinė gyvybės forma žemėje. Iš viso aptikta beveik 900 000 vabzdžių rūšių, jie sudaro 75% visų užregistruotų gyvūnų rūšių. Vabzdžius galima rasti beveik visose ekosistemose; dykumoje, taip pat Antarkties ir net vandenyse. Kai kurias vabzdžių rūšis (Halobates) galime sutikti vandens paviršiuje. Tai tikrai parodo didžiulį ekologinį vabzdžių prisitaikymą įvairiose aplinkos sąlygose, kuriose kiti gyvūnai nesugebėtų išgyventi. Tokia vabzdžių įvairovė leidžia įvesti subtilius santykius su žmogaus gyvenama aplinka. Vabzdžiai yra naudingi, nes jie apdulkina augalus, veikia kaip natūralūs priešai žalingų kenkėjų, teikia žmonėms naudingų produktų, pvz: medų, vašką ir šilką. Tuo pačiu, vabzdžiai yra pagrindiniai mūsų maisto kultūrų kenkėjai, veikia kaip mirtinų ligų pernešiotojai. Taigi, labai dažnai yra svarstoma, kodėl vabzdžiai taip vieni nuo kitų skiriasi, kokią įtaką turi tam genai o svarbiausia, kaip jie gali paveikti žmogaus gyvenimą (tiesiogiai arba netiesiogiai) (Behura, 2006). Šiame darbe molekuliniams tyrimams pasirinktos keturios Carabidae šeimos vabalų rūšys: Cicindela hybrida, C. maritima, C. sylvatica ir Harpalus rufipes. Tiriant Pajūrio žaliosios zonos rūšinę vabzdžių įvairovę, buvo aptikti Cicindela genties vabalai: baltalūpis šoklys Cicindela hybrida (Linnaeus, 1758) ir pajūrinis šoklys Cicindela maritima (Latreille, Dejean, 1822). Šių abiejų rūšių morfologiniai požymiai tirtoje teritorijoje persidengia, tad spėjama, kad susiformavo hibridinė populiacija. Gamtoje dažnai tos pačios populiacijos rūšys gyvenančios toje pačioje teritorijoje susikryžmina, sudaro hibridus. Šios rūšys pasižymi specifiškumu kitos rūšies atžvilgiu. Dėl šių pokyčių kyla daug netikslumų nustatant rūšių paplitimo ribas, geografinę padėtį. Molekuliniai tyrimo metodai sparčiai išplito paskutiniaisiais dešimtmečiais. Šiandien jie plačiai taikomi įvairiose biologijos mokslo šakose: ekologijoje, evoliucijoje, populiacijų, genetinės įvairovės tyrimuose ir kt. Šių metodų pagalba galime atsakyti daugelį klausimų, į kuriuos sunku būtų atsakyti pasitelkus tik tradicinius tyrimo metodus. Pastaruoju metu daugelis entomologų pritaikė molekulinės biologijos metodus vabzdžių įvairovei, ekologinei sistematikai ir taksonomijai tirti (Pons, 2011; Will, Gill, 2008; Cardoso, Vogler, 2005; Pascual, 2006) Pagrindinis DNR tyrimo pranašumas, lyginant juos su anksčiau naudotais metodais yra tai, kad šiuo atveju yra tiriama tiesiogiai genetinė medžiaga, o ne jos produktai, o patys DNR tyrimo metodai pasižymi dideliu specifiškumu ir gauti rezultatai yra labai tikslūs. DNR galima išskirti iš nedidelio kiekio kraujo, audinio ar plaukų, o kadangi DNR molekulės yra gana stabilios ir ilgą laiką nesuyra, išskirtą DNR galima užkonservuoti ir saugoti ilgą laiką. Be to, DNR tyrimus galima atlikti bet kokio amžiaus ar fiziologinės būklės organizmui, netgi jam neesant gyvam (Miceikienė et. al., 2002).

6 Mitochondrinės DNR tyrimai padeda nustatyti geografinį rūšių paplitimą, filogenetinius ryšius, taip pat atskleidžia rūšių vystymosi dėsningumus bei ekologinių populiacijų grupių ribas. Cardoso ir Vogler (2005) atliko genetinius tyrimus su Cicindela hybrida vabalų grupe. Šios grupės vabalus lygino tarpusavyje atskleisdami jų genetinius skirtumus. Svari priežastis lėmusi šio darbo temą, tai kad vabalų genetiniai tyrimai Lietuvoje dar nėra plačiai vykdomi. Šiuo metu didesnis dėmesys skiriamas stambesniems gyvūnams. Šiame darbe yra tiriami Cicindela hybrida ir C. maritima vabalai. Atliktais tyrimais tikimasi įvertinti šių rūšių morfologinius skirtumus.

Darbo tikslas:  Įvertinti Carabidae šeimos Cicindela hybrida ir C. maritima vabalų įvairovę Lietuvoje.

Darbo uždaviniai: • Charakterizuoti C.hybrida, C. maritima skiriamuosius morfologinius požymius; • Atlikti C. hybrida ir C. maritima morfometrinę analizę. • Įvertinti C. hybrida ir C. maritima rūšių paplitimą Lietuvoje; • Pritaikyti molekulinius DNR tyrimo metodus tiriamiems vabalams; • Įvertinti C. hybrida ir C. maritima cox1 mitochondrinės DNR sekų polimorfizmą.

Padėka. Nuoširdžiai dėkoju darbo vadovei dr. B. Tamutei už visapusišką pagalbą, vertingas pastabas ir nuoširdų rūpinimąsi rašant mokslinį darbą. Dėkoju prof. A. Paulauskui ir dr. J. Radzijevskajai už konsultacijas ir pagalbą. Dėkoju dr. J. Žukauskienei, L. Griciuvienei už naudingus patarimus ir pagalbą. Dėkoju dr. P. Ivinskiui, dr. J. Rimšaitei, dr. A. Gedminui, A. Meržijevskiui už surinktą tiriamą medžiagą.

7 I. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Baltijos pajūris

Išilgai Kuršių nerijos vakarinės pakrantės besitęsiančio smėlio paplūdimio plotis svyruoja nuo 25 iki 70 m. Šioje Kuršių nerijos dalyje vyrauja skurdi, tačiau specifinė flora. Dėl nuolat vėjo perpustomo smėlio ir audrų, paplūdimyje augmenijos nėra. Tik apsauginis kopagūbris apaugęs halofitiniais augalais, iš kurių būdingiausi smiltyninė rugiaveidė (Elymus arenarius), smiltyninė smiltlendrė (Ammophila arenaria), pajūrinis pelėžirnis (Lathyrus maritimus), vietomis pasitaiko pajūrinė našlaitė (Viola littoralis), baltijinė linažolė (Linaria loeselii). Sumedėjusių augalų apsauginiame kopagūbryje yra nedaug, dominuoja raukšlėtalapis erškėtis (Rosa rugosa) ir karklai (Salix sp.) (http://www.nerija.lt). Baltijos pajūrio klimato rajonas artimesnis Vakarų Europos klimatui ir gali būti priskirtas atskiram Pietinės Baltijos klimato posričiui. Baltijos pajūryje yra užregistruota nemažai šiam regionui būdingų, tačiau kitur retų rūšių. Kai kurios jų įrašytos į Lietuvos Raudonąją knygą, pvz: Cicindela maritima. Pajūrio regioniniame parke aptinkama 123 dieninių bei naktinių drugių (Macrolepidoptera) rūšys bei 36 rūšys vabalų (Coleoptera). Pajūrio zonoje dažnai sutinkamos psamofilinės rūšys, pvz: Cicindela hybrida, Calathus erratus. Palyginus su kitomis Lietuvos pajūrio zonomis Pajūrio regioninio parko teritorijoje yra didelė jūros bestuburių įvairovė (Pileckis, Monsevičius, 1995).

1.2 Cicindela hybrida ir Cicindela maritima sistematika

Cicindela hybrida ir Cicindela maritima priklauso gyvūnų (Animalia) karalystei, nariuotakojų (Arthropoda) tipui, vabzdžių (Insecta) klasei, vabalų (Coleoptera) būriui, plėšriųjų vabalų (Adephaga) pobūriui, žyginių (Caraboidea) antšeimiui, žygių (Carabidae) šeimai, šoklių (Cicindelinae) pošeimiui, (Cicindela) genčiai. Plėšriųjų vabalų pobūriui priklauso vabalai, turintys didelius užpakalinius dubenėlius, kurie dengia visą pilvelio pirmąjį sternitą. Pobūryje vienas antšeimis – žyginiai (Caraboidea). Antšeimiui priklauso 4 šeimos: žygiai (Carabidae), dumbliavabaliai (Hali plidae), dusios (Dytiscidae), sukučiai (Gyrinidae) (Pileckis, Monsevičius, 1995). Žygiai (Carabidae), įvairaus dydžio (Lietuvoje – 1,5 – 40 mm), grakštūs ir labai judrūs vabalai. Vabalų kūno paviršius dažniausiai juodas ar tamsiai rudas, kartais su gelsvomis ar raudonomis dėmelėmis. Kai kurių rūšių kūnas žalias, žvilgantis su metalo blizgesio duobutėmis ar 8 vagutėmis. Užpakaliniai dubenėliai dideli ir uždengia pirmąjį pilvelio narelį – sternitą. Kojos bėgiojamosios, letenos penkianarės, patinų priekinės letenos dažniausiai paplatėjusios, jų narelių apatinė dalis plaukuota. Antenos siūliškos, šeriškos, išskyrus 3–4 pirmuosius narelius, beveik visuomet plaukuotos, išaugusios skruostuose po kaktos šoniniu kraštu. Viršutiniai žandai pjautuvo pavidalo, aštrūs, kartais vidinėje pusėje būna papildomi danteliai. Žygių lervos platokos, į kūno galus siaurėjančios. Galva stambi, su dideliais viršutiniais žandais. Kojos ilgos, letenos su 1–2 nagais. Kūno oda standi, stora, paprastai tamsi, segmentacija ryški. Pilvelio devintas segmentas dažnai būna su gana ilgomis ataugomis (Pileckis, Monsevičius, 1995). Žygių lervos ir suaugeliai daugiausia yra grobuonys, minta kitais vabzdžiais ir jų lervomis, moliuskais, sliekais. Lervos ieško grobio požeminiuose urvuose arba dirvožemio paviršiuje. Būdamos įsirausiusios dirvožemyje, virsta lėliuke ir dirvožemio paviršiuje pasirodo tik po metų (Wallace, 2004). Žygiai yra naudingi, nes naikina žemės ūkio ir sumedėjusių augalų kenkėjus. Kai kurios žygių rūšys augalėdės, kenkia žemės ūkio kultūroms. Grobį medžioja dirvos viršutiniuose sluoksniuose, dirvos paviršiuje, miško paklotėje, vandens telkinių krantų drėgname smėlyje, pūvančiose augalų, liekanose, komposto krūvose, graužikų ir kurmių urvuose, rėčiau ant augalų ar po medžių žieve, kinivarpų takuose. Dauguma rūšių yra būdingi polifagai, rečiau oligofagai. Tik nedaugelis Lietuvoje paplitusių žygių (kai kurie Bembidion, Amara, Harpalus) yra fakultatyviniai augalėdžiai. Carabidae šeimos plėšrieji vabalai dažnai sutinkami natūraliose ekosistemose. Manoma, kad gausi augalija yra pagrindinis veiksnys sąlygojantis jų paplitimą todėl, kad tokia aplinka įgalina juos išgyventi žiemą. Didelis vabalų paplitimas dirbamose žemėse sumažina kenkėjų poveikį žemės ūkio kultūroms (Sanderlnd, Vickerman, 1980). Dauguma žygių, ypač gyvenančių miškuose, lervų ir suaugėlių yra aktyvūs tik vakarais ir naktį; naktinėms rūšims būdingas teigiamas fototoksis. Dieną jie slapstosi po dirvos grumsteliais, samanose, po akmenimis, augalų liekanomis, miško paklotėje, smėlyje. Saulėtomis dienomis aktyvūs šokliai (Cicindela), puikiažygiai (Calosoma), puošniažygiai (Carabus) ir kai kurios kitos, ypač dirbamuose laukuose gyvenančios rūšys. Žygių patelės kiaušinius deda dirvoje, 2–4 cm gylyje. Jos labai vislios – sudeda apie 30–50 kiaušinių. Kiaušinius deda su pertraukomis, todėl vasarą tuo pačiu laiku galima aptikti įvairių vystymosi fazių žygių. Tačiau atsižvelgiant į žygių aktyvumą, juos galima suskirstyti į dvi grupes: aktyvūs pavasarį (V–VI) ir aktyvūs rudenį (VIII–IX). Pirmajai grupei priklauso žygiai, žiemojantys po dirvos grumsteliais, augalų likučiais, miško paklotėje, po atšokusia kelmų žieve. Antroje vasaros pusėje ir rudenį aktyvių žygių lervos dažniausiai žiemoja dirvoje. Dauguma žygių turi specifinį kvapą, kuris apsaugo nuo kai kurių vabzdžiaėdžių plėšrūnų (bombožygiai) ištikus pavojui, iššvirkščia labai lakų skystį, kuris ore garsiai sprogdamas išgaruoja ir virsta smirdančiu debesėliu, kuris atbaido visus vabzdžius. Visų Lietuvoje išplitusių žygių generacijos trukmė vieneri metai. Pasaulyje žygių yra daugiau kaip 25 000 rūšių. Tai viena iš stambiausių rūšių skaičiumi ir individų gausumu vabalų šeimų. Carabidae šeimos

9 vabalai ir lervos yra plėšrios, maitinasi negyvų vabzdžių ar kitų bestuburių likučiais. Kelios rūšys maitinasi vikšrais, sraigėmis, amarais, erkėmis. Carabidae vabalų rūšys maitinasi ir augaliniu maistu. Atsitiktinis žemuogių kenkėjas, toks kaip Harpalus rufipes, kuris kartais gadina žemuoges. Zabrus tenebrioides, kuris kai kuriose Europos dalyse gadina grūdinius javus. Plėšrieji vabalai yra nepaprastai naudingi ir svarbūs grobuonys. Jie sunaikina sodų, pasėlių kenkėjus: žiogus, termitus, amarus, lapgraužius, straubliukus, karkvabalio lervas, drugelius ir kandies vikšrus, vaisines museles, mašalus, daug kitų musės kenkėjų o taip pat kaip šliužus ir sraiges. Lietuvoje 285 žygių rūšys (50 – 60 rūšių ieškotina), nepakankamai ištirti respublikoje smulkūs Dyschirius, Bembidion, Dromius genčių žygiai. Šiaurės Amerikoje yra 168 vabalų genčių ir daugiau kaip 2200 žygių (Coleoptera: Carabidae) rūšių. Lervos ir suaugėliai vabalai yra plėšrūs. Carabidae šeimos vabalai yra paplitę vaismedžių soduose, žemės ūkyje bei natūraliose ekosistemose. Dauguma Carabidae šeimos vabalų, tai polifagai. Žygiai yra labai jautrūs antropogeniniams aplinkos pokyčiams (Smith, 2004). Lietuvos teritorijoje žygius tyrinėjo B. Ogijevičius, Žuvinto rezervate bei Kuršių nerijoje I. Šarova, S. Griuntalas. Kiti koleopterologai kolekcionavo juos atsitiktinai, kartu su kitais vabalais (Pileckis, Monsevičius, 1995). Didelį dėmesį vabalams skiria įžymūs koleopterologai V. Monsevičius, V. Tamutis, R. Ferenca, A. Meržijevskis. Į Lietuvos raudonąją knygą įrašytas žiaurusis puikiažygis (Calosoma inquisitor), didysis puikiažygis (Calosoma sycophanta), didysis puošniažygis (Carabus coriaceus), žalvarinis puošniažygis (Carabus nitens), grakštusis puošniažygis (Carabus intricatus), palinis žvitražygis (Agonum ericeti).

1 pav. Cicindela rūšių grupės: Cicindela campestris, C. hybrida, C. sylvatica, C. silvicola, C. maritima, Cylindera arenaria, C. germanica (//caliban.mpizkoeln.mpg.de/.../species_00071.html)

Cicindela, tai pati gausiausia Lietuvoje gyvenanti šoklių pošeimio gentis. Vabalai vidutinio dydžio (8–17 mm). Kūnas bronzinis arba bronziškai žalias, kartais rusvo atspalvio (1 pav.). Antsparniai su baltu ar gelsvu piešiniu. Antenos išaugusios tarp viršutinių žandų pagrindų. Priekaktis siekia antenų pamatinę dalį. Galva, kartu su didelėmis, stipriai išgaubtomis akimis

10 platensė už priešnugarėlę. Antenos ir kojos ilgos, plonos. Vabalai aktyvūs šiltomis saulėtomis dienomis. Aptinkami atvirose, su reta augalija, vietose: smėlio kalvelėse, smėlėtuose keliuose, retuose pušynuose, sausose pievose. Skraido šuoliais. Lervos gyvena vertikaliai išraustuose urveliuose, kuriuose tyko grobio. Minta įvairiais vabzdžiais. Pasaulyje gyvena apie 1000 šios genties vabalų rūšių. Lietuvoje 5 rūšys: žaliasis šoklys (Cicindela campestris), baltalūpis šoklys (Cicindela hybrida), pajūrio šoklys (Cicindela maritima), miškinis šoklys (Cicindela sylvatica) ir (Cylindera germanica) (Pileckis, Monsevičius, 1995). Cicindela dumolinii, C. rugosa, C. scalaris, C. heros, C. guadrilineata, C. campensis, vabalų rūšys pasižymi dideliu grobuoniškumu. Jie greitai nuplėšia sparnus, kojas savo aukoms ir išmeta jų pilvelius. Kartais nuskrenda su savo grobiu į ramią vietą, tačiau jų skrydis nėra pakankamai ilgas ir galingas, jie fiziologiškai nėra pajėgūs nešioti savo aukas (Smith, 2004).

1.3 Cicindela genties vabalų morfologiniai ypatumai

2 pav. Carabidae šeimos vabalų sandaros ypatumai (Cicindela campestris (1c. a. funebris); C. funebris, C. hybrida (2g. a. integra); C. integra; C. maritima; C. silvicola; C. sylvatica; C. litterata; C. viennensis; C. litoralis; C. germanica ) (//caliban.mpizkoeln.mpg.de/.../species_00071.html)

11 Cicindela genties vabalai yra morfologiškai labai panašūs. Vabalų galva kartu su akimis platesnė už priešnugarėlę. Antenos išaugusios kaktoje tarp viršutinių žandų pamatų. Antsparniai ryškiai žali ar rudi su baltu piešiniu. Kojos ir antenos laibos ir ilgos (2 pav.).

3 pav. Galvos: 44 – Cicindela, 45 – Elaphrus genties vabalų būdingi bruožai; cly –priekaktis (clypeus), lbr – viršutinė lūpa (labrum) (Lindroth, 1985)

Galva apvali su didelėmis, išgaubtomis akimis. Tarp akių yra kakta. Nuo jos tęsiasi priekaktis (clypeus), nuo kaktos jis dažniausiai atskirtas siūle, prie priekakčio priekinio krašto priaugusi viršutinė lūpa (labrum). Cicindela genties vabalų burnos organai graužiamieji, pritaikyti graužti, smulkinti kietą maistą. Sudaryti iš 2 lūpų ir 2 porų žandų. Viršutinė lūpa (labrum), tai nenariuota plokštelė dengianti vabalo burną iš viršaus. Viršutiniai žandai – mandibulės (mandibulae) stambokos, trikampės, pjautuvo formos kietos plokštelės su danteliais vidinėje dalyje (3 pav.). Jie juda horizontalia kryptimi (Lindroth, 1985).

1.3.1 Cicindela hybrida ir Cicindela maritima charakteristika

Baltalūpis šoklys (Cicindela hybrida) (Linnaeus, 1758) yra 12–16 mm ilgio, kūnas bronzinis su ryškiu žalsvu atspalviu, žalsva apačia. Apatinių žandikaulių skiltis susideda iš lūpinių čiuptuvėlių sudarantys dvi bazines dalis ir yra rausvai rudos spalvos. Glaustos elitros, ant jų matyti netaisyklingos formos, išblyškusios dėmės (4 pav.). Kartais centrinė dėmė būna šiek tiek labiau vingiuota negu pavaizduota (5 pav.). Edeagusas su ilgesne viršūne ir labiau išlenkta nei C. maritima (Latreille, Dejean, 1822) kurios vidinis maišelis su dviem stiprais viršūniniais dantimis (9 pav.) (Lindroth, 1985). C. maritima rūšies vabalai turi baltus šerelius ties akių galiniu kraštu, leteų ilgis šiek tiek trumpesnis už blauzdų ilgį, centrinė dėmė yra ryškių lenktų formų su ilgu vidiniu susiaurėjimu. C. hybrida akių galiniai kraštai be baltų plaukelių, letenų ilgis toks pat kaip ir blauzdų ilgis arba šiek tiek ilgesnis (Бей-Биенко, 1965).

4 pav. Baltalūpis šoklys (Cicindela hybrida) (http://www.zin.ru/animalia/Coleoptera/rus/cicind29.htm)

5 pav. Cicindela vabalų elitros. 47 – C. sylvatica; 48 – C. hybrida; 49 – C. maritima; 50 – C. campestris (Lindroth, 1985)

Pajūrio šoklys (Cicindela maritima) 12–15 mm ilgio. Plonesnis už C. hybrida, ypač pilvelis. Didžiausias skirtumas pastebimas elitrų struktūrose. C. maritima centrinės dėmės forma gali būti pavaizduota trijais būdais (6 pav.). Kūnas tamsiai šokoladinės spalvos, retai su žalsvu atspalviu (8 pav.). Šviesios dėmės ant elitrų kaip pas C. hybrida, akys mažiau išgaubtos ir jų viršutinėje dalyje yra baltų šerelių sankaupos. C. hybrida tik su 1–3 šeriais. Elitros yra labiau platesnės ties viršūne, ant jų yra išblyškusios dėmės. C. hybrida nuo C. maritima taip pat skiriasi centrinės dėmės vidiniu susiaurėjimo ilgiu, ji yra stipriai išlenkta (Freude et. al., 1976). Blauzdikaulis ilgesnis ir plonesnis palyginus su čiurna (Lindroth, 1985). Patino edeagusas tiesus 10-14 mm ilgio su nedideliu iškilu gumbeliu ir ilgesniu vidiniu maišeliu (7, 9 pav.), kitaip apsiginklavo nei C. hybrida, be viršūninio danties. C. hybrida vabalų rūšių penis su didelių, danties formos galu, ilgis 11-16 mm (Trautner et. al., 1987).

6 pav. C. maritima Dej. elitrų dėmių formos

Atsižėlgiant į patinų ir patelių genitalijas charakterizuojami Cicindela resplendens Dokht. vabalai priklausantys maritima giminystės linijai, hybrida vabalų grupei (C. hybrida, C. coerulea, C. transbaicalica, C. altaica, C. maritima) (Matalin, 2000). Išoriniai bruožiai, kurie sieją šią rūšį su maritima: plonas, siauras (3,0-3,2 mm), stipriai lenktas apatinis žandikaulis, kurio išlinkimo spindulio ilgio santykis lygus 3,0-3,3 mm. pas hybrida rūšies vabalus šis koeficientas siekia 4,0-5,5 mm. Cicindela genties vabalus revizave autoriai nurodo, kad C. hybrida patinų genitalijos yra sudarytos iš edeaguso (aedeagus). C. maritima edeaguso viršūnė su mažais, skirtingo dydžio gumbeliais, kurių skaičius gali kisti nuo vieno iki keturių, edeagusas ilgas, plonas, viršūnė palenkta žemyn. Gumbelis su vidiniu maišeliu, kuris neturi vidurinio danties (Matalin, 1999). Edeaguso forma, struktūra rodo, kad C. resplendens Dokht. priklauso maritima giminystės linijai. C. resplendens Dokht., taip pat priskiriamas hybrida vabalų grupei. Jis skiriasi nuo campestris žandikaulio forma, galvos viršūnės ir pakaušio dydžiu (Matalin, 2000). Hybrida grupės vabalai turi išgaubtą priešakį, tvirtą, platų žandikaulį, gana trumpas užpakalines kojas (blauzdos ir čiurnos ilgio santykis 0,75-0,80 mm), elitrų baltos dėmės yra žymiai platesnės palyginus su C. maritima dėmių forma. Hybrida Edeaguso viršūnė be gumbelių, vidaus maišelis su skirtingu viduriniu dantim (7 pav.) (Matalin, 1999).

7 pav. Cicindela genties vabalų edeagusos iš kairės (9, 13), nugaros (10, 14), dešinės (11, 15) ir pilvinės pusės. C. maritima Dej. (9-12), C. transbaicalica (13-16), B–pagrindinis gumbelis, MT–vidurinis dantys

8 pav. Pajūrio šoklys (Cicindela maritima) (www.zin.ru/animalia/Coleoptera/rus/cicind29.htm)

9 pav. Viršutinė edeaguso pusė. 51 – Cicindela hybrida; 52 – Cicindela maritima (Lindroth, 1985)

15 Baltalūpiai šokliai (Cicindela hybrida) yra medžiotojai ir gali pamatyti grobį ganėtinai lengvai jų didelėmis akimis. Cicinidela hybrida sugeba persekioti savo aukas lengvai su savo ilgomis kojomis.

10 pav. Baltalūpio šoklio (Cicindela hybrida) lerva (//gallery.photo.net)

Lervų akys su fotoreceptoriais, sutekia jiems galimybę matyti trimatį vaizdą. Tai duoda jiems didelį pranašumą prieš jų aukas. Suaugę vabalai pasirodo vidurvasaryje ir per žiemą prieš veisimąsį. Gyvena apie du metus. Lervos grobuoniškos, gyvena vertikaliuose, smėlyje išraustuose urveliuose (11 pav.), kaip suaugę vabalai, sugeba gerai šokinėti (Pileckis, Monsevičius, 1995).

1.3.2 Cicindela hybrida, C. maritima vabalų paplitimas

Daugeliui šoklių (Cicindelinae) rūšių pajūryje yra vienintelė gyvenamoji vieta Lietuvoje, kai kurios rūšys sudaro neskaitlingas populiacijas. Baltalūpis šoklys (Cicindela hybrida) – žygių Carabidae šeimos vabalas. Jo populiacija randama Grobšto gamtos rezervate. Skraido šuoliais atvirose, smėlėtose miško aikštelėse, smėlynuose gegužės–birželio mėnesiais. Lietuvoje dažna rūšis (Pileckis, Monsevičius, 1995). Baltalūpis šoklys (Cicindela hybrida) yra randamas didžiojoje dalyje Europos. Yra įrašų nuo Šiaurės Velso ir Rytų Anglijos, kad pastarieji yra labai artimai susiję su Cicindela maritima vabalais. Anksčiau buvo manyta, kad Cicindela hybrida ir Cicindela maritima reprezentuoja vieną populiaciją dėl jų morfologinio ir geografinio panašumo (http://www.arkive.org/northern-dune- tiger-beetle/cicindela-hybrida/info.html). Pajūrio šoklys (Cicindela maritima). Ši rūšis paplitusi Azijoje ir Europoje upių, ežerų ir jūrų pakrantėse. Lietuvoje aptiktas 1961 m. Kuršių nerijoje, Nidoje, Parnidžio kopose. Gyvena smėlėtose atvirose vandens telkinių, daugiausia jūrų, pakrantėse. Lietuvoje aptinkamas Baltijos pajūryje ir Kuršių nerijoje, viena radimvietė žinoma ir Rytų Lietuvoje, Krivasalyje (Ignalinos raj.). Kuršių nerijoje aptiktas Baltijos jūros pakrantėje. Ši rūšis saugoma daugelyje Europos šalių,

16 Lietuvoje pajūrio šoklys įrašytas į Raudonąją knygą. Pagrindinės nykimo priežastys – intensyvi rekreacija pajūryje (poilsiautojai sutrypia lervų urvelius) ir vėjo erozija. Miškinis šoklys (Cicindela sylvatica). Ši rūšis paplitusi visoje Europoje. Lietuvoje dažnai sutinkamas pušynuose, smėlėtose vietose, ypač miško keliuose (Pileckis, Monsevičius, 1995).

1.4 Carabidae vabalų rūšių įvairovės tyrimai

Netiksliai pažymėtose teritorijose, kuriose vabalų morfologiniai pakitimai yra nuolatiniai, rūšies ribų nustatymas yra sudėtingas. Taksonomiškai vertinant, tai yra įprasta praktika, atskirti ir pavadinti geografines grupes, sugaunant šių rūšių pakitimą. DNR pagrįsti metodai gali padėti išsiaiškinti ar šios vabalų grupės iš tikrųjų atstovauja atskiras rūšis. Mokslininkai Cardoso ir Vogler (2005) atliko Cicindela hybrida vabalų grupės taksonominę analizę norint ištirti vabalų giminingumą, paplitimo ribas. Tiriamos teritorijos tesėsi nuo centrinės Iberijos, Ukrainos, centrinės Europos iki Iberijos pusiasalio Atlanto vandenyno pakrantės. Surinktas Cicindela hybrida kompleksas (Coleoptera: Cicindelidae), iki 7 morfologinių pripažintų rūšių ir 15 porūšių (panašių rūšių); C. majalis, C. transbaicalica, C. campestris, C. japana, C. maroccana, C. lusitanica, C. iberica, C. lagunensis, C. transversalis, C. hybrida, C. sahlbergi. Vabalai gauti iš muziejinės kolekcijos. Tyrimų metu surinktiems 99 pavyzdžiams iš 36 Europos vietovių buvo ištirtas mtDNA genomas, kuris apėmė tris sritis (coxI, rrnL+trnL2+nad1). Palearktiniame regione atlikti tyrimai DNR sekvenavimo metodu buvo aptiktos 5 skirtingos Cicindela hybrida vabalų rūšies grupės. Atlikti tyrimai pagrįsti mtDNA sekomis (mtDNR seka palyginta su kitų rūšių mtDNR sekomis), kurios buvo susijusios su DNR sekomis. Kaip vienos vabalų grupės mtDNR sekos sutapdavo su kitos grupės mtDNR sekomis, vabalus priskirdavo tai pačiai rūšies grupei. Atlikti tyrimai su C. hybrida vabalų kompleksu, didžiąja dalimi sutapo su tyrimų rezultatais, kurie buvo atlikti pasitelkiant vabalų morfologiniais požymiais. Tyrimų rezultatus aiškiai matomi penkiuose nustatytuose kladose, kuriose buvo sudarytos pagal vabalų geografines vietoves (Cardoso, Vogler, 2005) (11 pav.).

11 pav. Filogenetinis medis pristatantis 5 skirtingas Cycindela hybrida Palearkties regiono rūšies grupes (Cardoso, Vogler, 2005)

Atliekami DNR tyrimai padeda įvertinti vabalų skirtingus požymius ir šių požymių kintamumą. Naudojant mitochondrinės DNR tyrimų metodą buvo ištirti Šiaurės Amerikos baltalūpio šoklio C. hybrida (Cicindela rūšies grupė) morfologiniai pakitimai ir genetinė įvairovė. Kadangi vabalų geografinė padėtis skyrėsi, tyrimai buvo atliekami atsižvelgiant į giminystės liniją. C. hybrida neįprasta vabalų grupė, apytiksliai 130 rūšių Šiaurės Amerikoje ir daugiau kaip 1 000 rūšių, surastų visuose žemynuose, visame pasaulyje (išskyrus Antarktidą). Visos rūšys yra grobuonys, pasižymintys greitu šokinėjimu ir dideliu viršutiniu žandikauliu. Jie yra gerai žinomi, ypač Šiaurės Amerikoje, kur jų taksonomija, ekologija ir geografinis dalijimas yra geriau žinomi negu daugelyje kitų vabzdžių grupių. Cicindela hybrida rūšiai įvertinti buvo naudojami statistiniai modeliai. Tyrimai parodė nežymų rūšies požymių paplitmą per paskutinį milijoną metų (Barraclough, 2002). Didelė Cicindela hybrida vabalų grupė yra paplitusi Palearkties regione. Naudojant DNR analizę buvo tirtos Iberijos mokslininkų 3 Cicindela genties vabalai: iš Iberijos C. hybrida rūšies atsovai – C. lagunensis, C. iberica ir C. lusitanica, bandyta nustatyti šių porūšių morfologiniai skirtumai, lytinių požymių savitumai. Suaugę individai buvo apibūdinami ir lyginami su kitais

18 individais. Skirtingų lyčių individų morfologiniai genitalijų požymiai buvo taip pat tirti. Tyrimų analizė, patvirtino, kad šios rūšys gyvenančios Pirėnų pusiasalyje yra skirtingos (Matalin, 1998). MtDNR tyrimai atlikti JAV padėjo taip pat atskleisti Cicindela limbata albissim skirtumus nuo kitų rūšių. Filogenetinėje analizėje, kuri apėmė C. maritima rūšies grupę, C. l. albissima buvo pripažinta kaip giminingą kitoms septynioms Šiaurės Amerikos aptiktoms rūšims (Morgan, Vogler, 2000). Naujojoje Zelandijoje atlikta Cicindela rūšių taksonominė analizė atskleidė vabalų morfologinius skirtumus. Atsižvelgiant į elitrų struktūrą, spalvotumą ir kūno dalių specifišumą buvo nestatytos jų gyvenamosios vietas. Atlikti taip pat vabalų mtDNR tyrimai. Analizuotos trys mitochondrinės DNR sritys, 757bp citochromo oxidazės I (cox1), 377bp citochromo 6 ir 769bp 16 rRNR genas (rrnl). Pastebėta, kad geografiniai bei morfologiniai vabalų skirtumai sutapo su rūšių mtDNR analizę. Nustatytas žymus skirtumas tarp Cicindela dorsalis ir Cicindela limbata rūšies vabalų. Panašūs skirtumai pastebėti tarp C. hybrida rūšies vabalų. Atsižvelgiant į vabalų morfologinius pakitimus bei geografinį paplitimą didžiausi skirtumai pastebėti tarp C. hybrida ir C. limbata rūšies vabalų. Atlikta mtDNR Cicindela plėšrųjų vabalų analizė naudojant 161 rūšių vabalų atskleidė 123 skirtingus haplotipus (Pons et. al., 2011). Vabalų genetinės įvairovės ir tapatumo tyrimai, yra labai svarbūs nustatant rūšies genetinį statusą, saugant genetinę įvairovę. Rūšies ribų nustatymas sudaro sunkumus, kai nuolat stebime vabalų morfologinius pakitimus, nenuoseklų vabalų paplitimą tam tikroje teritorijoje, vienalyčius pakitimus. Molekulinės genetikos metodai gali būti panaudoti, nustatant individų rūšis. Tokiu būdu galime juos atskirti nuo kitų rūšių. Cicindela (Cylindera) terricola yra viena labiausiai paplitusių ir kintamų rūšių su šešiais pripažintais porūšiais. Tyrime buvo panaudotas mtDNR metodas, kad išaiškintų C. lunalonga ir gretimo porūšio C. terricola giminingumą (Woodcock, Kippenhan, 2007).

1.5 Vabzdžių tyrimų metodai

Vabzdžiai, tai gausiausia bestuburių gyvūnų klasė. Ji sudaro apie 80% visų gyvūnų rūšių (Pileckis, Monsevičius, 1995). Vabzdžių genetinė įvairovė tiriama naudojant molekulinius DNR žymenų metodus. Dabartinės DNR žymenys metodo taikymas įvairiose vabzdžių ekologinių tyrimų srityse padeda įvertinti genetinę vabzdžių įvairovę, tapatumą. Metodo patikimumas, saugumas ir informatyvumas suteikė šiam metodui populiarumą. Tiriant vabalų genetinę įvairovę naudojami mitochondrinė DNR (mtDNA), atsitiktinai padauginta polimorfinė DNR (APPD), restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo (RFLP) tyrimų metodai. Naudojant molekulinius DNR žymenis nustatoma genetinė vabzdžių įvairovė, sudaromi genetiniai žemėlapiai, analizuojami mediciniškai žemės ūkiui svarbūs genai bei vabzdžių kenkėjų kiekybiniai lokusų požymiai. Atliekant tyrimus

19 DNR sekoje analizuojama polimorfinių lokusų skaičius, alelių skaičius, stebimi ir teoriniai heterozigotiškumai kiekviename lokuse, genų dažniai ir genetinė įvairovė tarp populiacijų, genetiniai panašumai ir skirtumai. Stebimi technologiniai pasiekimai siekiant geriau suvokti vabzdžių ekologiją molekuliniame lygmenyje (Behura, 2006).

1.5.1 DNR molekuliniai tyrimo metodai

DNR žymenų taikymas turi didelę reikšmę molekuliniuose vabzdžių ekologijos tyrimuose, kadangi dėka jų galima įvertinti specifinę vabzdžių įvairovę. Tiksliau, šie žymenys padeda geriau įžvelgti į naujų rūšių formavimosi genetinį pagrindą ir rūšies fenotipinį vystymąsi. DNR tyrimo metodai pvz: mtDNR, APPD, RFIP ir mikrosatelitinai žymenys buvo naudojami vabzdžių genetiniuose tyrimuose. Nors kiekvienai žymenų sistemai yra būdingi privalumai ir trūkumai, jų taikymo pasirinkimas priklauso nuo tyrimo tikslo (Behura, 2006). PGR (polimerazinė grandininė reakcija) – tai molekulinės biologijos metodas, leidžiantis padauginti (amplifikuoti) DNR seką in vitro (mėgintuvėlyje). PGR būdingas didelis greitis ir selektyvumas. Jos naudojimas įvairiems tikslams atvėrė labai daug galimybių molekulinėje biologijoje. Genetiniams tyrimams PGR naudojama labai plačiai. Taikant PGR genolapių sudarymui, reikia pradmenų komplementarių konkrečioms matricinėms DNR sekoms. PGR metodas yra labai jautrus, todėl padauginta pasirinkta DNR atkarpa gali sudaryti netgi vieną milijoninę genominės DNR dalį. Tai reiškia, kad naudojant PGR, galima amplifikuoti net ir vienintelį pasirinktą geną ar jo fragmentą. PGR, sėkmingai atliekamas turint net ir 0,1 – 1 μg genominės DNR. Nuo DNR koncentracijos priklauso PGR kokybė ir susintetinto produkto išeiga, todėl, atsižvelgiant į pradinį DNR kiekį, būtina optimaliai parinkti kitų PGR komponentų koncentraciją. Per didelė DNR koncentracija sąlygoja specifinių PGR produktų sintezę (Miceikienė et. al., 2002). M. Gilbert (2007) tyrė muziejinės kolekcijos vabalus. Pagrindinai dėmesį skyrė bombožygių (Brachinus) genties vabalams. Siekiant ištirti vabalų filogenetinius ryšius išskyrė iš jų DNR ir atliko PGR reakciją. APPD (atsitiktinai padauginta polimorfinė DNR), plačiai taikomas įvairių organizmų genetiniuose tyrimuose. Kaip ir įprastai PGR, APPD reikia labai mažai DNR (10-100 ng) ir todėl šis metodas gali būti taikomas net tais atvejais, kai prieinami tik labai maži DNR kiekiai. Amplifikacijos produktai atskiriami agarozės gelyje ir ryškinami etidžio bromidu. Naudojant šį metodą galima nustatyti genetinę įvairovę ar įvertinti giminingumą, net neturint jokios informacijos apie tiriamų objektų genomines DNR nukleotidų sekas. Tai nustatoma pagal amplifikacijos spektrų panašumo laipsnį. Šie metodai vabzdžių populiacijoje naudojami gana dažnai, nes jie yra parastai atliekami ir informatyvūs (http://www.plantbionet.lt/index.php?page=details&id=64). D.

20 Hawthorne (2001) atliko bandymus su kolorado vabalais. Naudojant APPD metodą įvertino vabalų genetinę įvairovę. M. Pearcy (2004) tyrė bites ir kamanes. Naudojant APPD metodą nustatė geną atsakingą už mitybos ypatumus bei poravimosi elgesį. RFIP (restrikcijos fermentų ilgio polimorfizmo), DNR žymenų sistema, leidžianti nustatyti nukleotidų sekų skirtumus tarp DNR molekulių (genetinius skirtumus), pagal restriktazėmis sukarpytų ir specialių markerių pažymėtų DNR fragmentų dydį. RFIP sistemos privalumai: (a) Gali atskirti homozigotinius (AA) nuo heterozigotinių (Aa) individų (kodominantinis žymuo); (b) Stabilumas: tie patys rezultatai pakartojus analizes su genetiškai identiškais individais, augančiais skirtingose aplinkose ar pakartojus analizes po tam tikro laiko tarpo; (c) Detalumas: gebėjimas nustatyti kelių nukleotidų sekų skirtumus (http://www.plantbionet.lt/index.php?page=details&id=63). Australijoje atlikti DNR tyrimai su 19 grambuolių (Coleoptera: Scarabaeidae) rūšių lervomis (Miller, 1999). Tyrimų analizėj panaudoti mtDNR ir PGR–RFIP metodai. DNR buvo išskirta iš lervų galvų. Šie metodai padėjo įvertinti morfologinius pakitimus kiekvienos vabalų rūšies viduje ir patvirtino jų geografinę padėtį. Daugeliuose tyrimuose naudojami yra izofermentiniai žymenys. Jie yra vertingi vabzdžių (plėvasparnių, amarų, uodų, kandžių, drugių) populiacijos genetiniai tyrimai. Izofermentai yra naudojami populiacijų genetinės variacijos tyrimuose viduje ir tarp gyventojų. Didelės molekulinės masės junginių (baltymai, fermentai, DNR ir pan.) analizei dažniausiai naudojama krakmolo elektoferezė, poliakrilamido, agaro ir acetilceliuliozės geliuose. Pagrįstas struktūros dryžuotumu, galima nustatyti gyventojų įvairiarūšiškumą (Behura, 2006). C. Whitfield (2002) atliko tyrimus su vabzdžiais. Naudojant izofermentinius žymenis nustatė alelinius genus atsakingus už lytinį dimorfizmą. Mitochondrinės DNR žymenys dažniausiai naudojami norint nustatyti rūšių haplotipus. MtDNR tyrimai gali atskleisti rūšių vystymosi dėsningumus, įvertinti genetinį kintamumą bei identifikuoti geografines rūšių paplitimo ribas. Vabzdžių, papildoma nauda naudojant mitochondrinės DNR žymenis yra tai, kad daugelis šių lokusų gali būti lengvai išplėsta naudojant universalus pradmenis skirtus iš labai užkonservuotų mitochondrijų genų. Mitochondrinės DNR metodas yra plačiai naudojamas vabalų genetinės įvairovės tyrimuose. Vabzdžių mtDNR yra patikimas ir veiksmingas metodas norint tirti amarų, vaisinių musių, uodų, bičių genetinę bioįvairovę, o taip pat skruzdžių motinystės stadiją, judėjimą tarp lizdų, bakterijų endosimbiozę vabzdžiuose. Mitochondrinė DNR yra iš esmės perduodama per motinos liniją (Loxdale, 1998). M. Woodcock (2007) atliko bandymus su Cicindela terricola ir C. lunalonga rūšies vabalais. Naudojant mtDNR metodą įvertino šių vabalų filogenetinius ryšius bei rūšių paplitimo ribas. DNR molekuliniai tyrimo metodai gali būti taikomi daugeliui vabzdžių rūšims, siekiant nustatyti jų konservatyvias sekas, kartotinius, senus ir nekoduojančius, reguliavimo elementus.

21 Nauji DNR žymenys pritaikyti daugeliui vabzdžių rūšių analizėj, turėtų suteikti naują entomologinių tyrimų kryptį ateityje (Behura, 2006).

1.5.2 DNR išskyrimas

DNR išskyrimas susideda iš trijų etapų: vabalo ląstelių lizės (ląstelių membranos suardymas), DNR išgryninimo ir nusodinimo. Daug metodų yra vabalo ląstelių membranoms suardyti. Veikiami joniniais detergentais, organiniais tirpikliais bei aukšta temperatūra. Šių metodų pasirinkimą apsprendžia keli faktoriai: vabalo dydis; metodika, kuria toliau bus gryninama DNR (Pascual, 2006). Molekuliniams tyrimams naudojami sausi kolekciniai arba fiksuoti 96% etanolyje vabalai. Vabzdžių DNR išskyrimas gali būti atliekamas iš įvairų kūno dalių: krūtinės, galvos arba kojos. Siekiant vabalus panaudoti kitiems morfologiniams, entomoligniams tikslams DNR išskyrimas atliekamas nepažeidžiant vabalo audinių. Australijos mokslininkai tyrė Cicindela campestris vabalų rūšį, norint nustatyti vabalų paplitimo ribas ir genetinę įvairovę. Buvo tiriami 468 kolekcijos vabalai. Tyrimams atlikti buvo naudojamas mtDNR metodas (Pons, 2006). Rinkimo metu vabalai nedelsiant buvo panardinti etanolyje vėliau džiovinti ore. DNR ištraukimas buvo įvykdytas nepažeidžiant jų audinių. Tiriami vabalai panardinti DNR ekstrakcijos buferyje ir inkubuojami. Vykstant ląstelių lizėj buvo išskirtas DNR turinys. Išdžiovinti vabalai iš muziejinės kolekcijos buvo panardinti į lizuojantį buferį ir inkubuojami 16-20 val. Po inkubacijos ištraukti vabalai panardinti 2-4 val 100% etanolyje, kad sustabdyti vabalų ląstelių ardymą. Vabzdžiai išdžiovinti ir gražinami į kolekciją. DNR valymui (nuo įvairių kitų išsiskyrusių medžiagų ląstelės lizės metu) naudojamas fenolio-chloroformas (Maddison, 2008). DNR nusodinimas stebimas įpylus izopropanolio. Centrifūguota maksimalu greičiu, 25 minutes, kambario temperatūroje. Po centrifūgavimo supernatantas išpiltas, nuosėdos du kartus praplautos 1,5 ml 85% šaltu etanoliu ir išdžiovinamos. Išgryninta DNR buvo panaudota tolimesniems modeliniams tyrimams (Gilbert, Moore, 2007). P. Z. Goldstein (2003) atliko Cicindela dorsalis rūšies vabalų genetinę analizę. DNR išskyrimui panaudojo vabalų kojas. Nuo 92 muziejinių pavyzdžių nutrauktos po vieną iš jų. DNR išskirta iš homogenizuotų vabalų kojų, taikant A. J. Phillips ir C. Simon (1995) metodiką. DNR molekulinių žymenų tyrimams išskirta DNR buvo amplifikuota. Atliekant polimerazės grandininę reakciją (PGR), naudota specifinė pradmenų pora, amplifikuojanti mitochondrinės DNR citochromo c oksidazės I (COI) geno atkarpą: ALF101 (5′GGAATAATTTTATTTATTACATCAG-3′); ALF104 (5′ TCCTAGTTCAACTGCAGGAG-3′).

22 Reakcija vygdyta šiomis sąlygomis: 28 ciklai 30 s prie 90C, 30 s prie 50C, 45 s prie 72C. PGR reakcijos produktas vertintas 5% polikrilamido gelio elektroforezės metodu. A. N. Pascual (2006) tirdamas vabzdžius, DNR išskyrė iš bičių a) galvų, b) šešių kojų, c) krūtinės plius sparnų ir d) pilvo. A. Cardoso, A. P. Vogler (2005) atliekant tyrimus su Cycindela hybrida rūšimi, norint nepažeisti viso vabalo kūno, DNR išskyrė iš krūtinės bei kojų. Audinio ląstelių lizėj panaudojo fenolio-chloroformo tirpalą bei DNR ištraukimo įrankį (QIAGEN).

23 II. MEDŽIAGA IR METODIKA

2.1 Tyrimų medžiaga

Tyrimų medžiaga surinkta 2006–2011 metais Kuršių nerijoje, Kauno r., Vilniaus apylinkėse ir Šakių r. Detalesnės tiriamo objekto radvietės pateiktos 1 lentelėje (1 lentelė).

1 lentelė. Tiriamos medžiagos rinkimo vietos. Lentelėje patiktos rūšys, rinkimo vietovės, vietovių koordinatės, mėginiai, tirtų individų skaičius, data ir rinkėjas Tirtų Medžiagos Rūšis Vietovė Koordinatės Mėg. individų Data rinkėjas skaičius Cicindela hybrida Juškinės N R1 1 2006 07 R. Ferenca (Linnaeus, 1758) miškas, 55°01'02,4'', 07 Šakių r. E 23°27'25'' Cicindela hybrida Grobšto N R2 1 2009 05 R. Ferenca (Linnaeus, 1758) gamtinis 55°17'04,8'', 25 rezervatas, E 20°57'52'' Kuršių nerija Cicindela hybrida Pučkoriai, N R3 1 2006 06 R. Ferenca (Linnaeus, 1758) Vilniaus 54°41'36,6'', 08 apyl. E 25°21'13,6'' Cicindela sylvatica Juškinės N R4 1 2009 07 R. Ferenca (Linnaeus, 1758) miškas, 55°01'02,4'', 25 Šakių r. E 23°27'25'' Cicindela hybrida Naglių N M1, M2 2 2009 07 P. Ivinskis, (Linnaeus, 1758) gamtinis 55°29'13,2'', 27-08 10 J. Rimšaitė rezervatas, E 21°06'58'' Kuršių nerija Cicindela hybrida Naglių N M3-M6 4 2009 05 P. Ivinskis, (Linnaeus, 1758) gamtinis 55°29'13,2'', 01-18 J. Rimšaitė rezervatas, E 21°06'58'' Kuršių nerija Cicindela hybrida Alksnynas, N M7, M8 2 2009 06 S. Süβ (Linnaeus, 1758) išdegintas, 55°29'13,2'', 01-15 iškirstas E 21°06'58'' miškas, Kuršių nerija Cicindela hybrida Naglių N M9 1 2009 05 S. Kühnel (Linnaeus, 1758) gamtinis 55°29'13,2'', 18-06 01 rezervatas, E 21°06'58'' Kuršių nerija Cicindela hybrida Naglių N M10 1 2009 06 S. Süβ (Linnaeus, 1758) gamtinis 55°29'13,2'', 29-07 13 rezervatas, E 21°06'58'' Kuršių nerija

24 1 lentelė. Tiriamos medžiagos rinkimo vietos. Lentelėje patiktos rūšys, rinkimo vietovės, vietovių koordinatės, mėginiai, tirtų individų skaičius, data ir rinkėjas (tęsinys) Tirtų Medžiagos Rūšis Vietovė Koordinatės Mėg. individų Data rinkėjas skaičius Cicindela maritima Naglių N C1,C2 2 2009 06 S. Süβ (Latreille, Dejean, gamtinis 55°29'13,2'', 29-27 13 1822) rezervatas, E 21°06'58'' Kuršių nerija Cicindela maritima Naglių N C3-C6 4 20009 05 P. Ivinskis, (Latreille, Dejean, gamtinis 55°29'13,2'', 01-18 J. Rimšaitė 1822) rezervatas, E 21°06'58'' Kuršių nerija Cicindela maritima Naglių N C7-C10 4 2009 05 S. Kühnel (Latreille, Dejean, gamtinis 55°29'13,2'', 18-06 01 1822) rezervatas, E 21°06'58'' Kuršių nerija Cicindela sp. Naglių N B1 1 2009 07 P. Ivinskis, gamtinis 55°29'13,2'', 27-08 10 J. Rimšaitė rezervatas, E 21°06'58'' Kuršių nerija Cicindela sp. Naglių N B2, B3 2 2009 05 P. Ivinskis, gamtinis 55°29'13,2'', 01-18 J. Rimšaitė rezervatas, E 21°06'58'' Kuršių nerija Cicindela sp. Alksnynas, N B4 1 2009 06 S. Süβ išdegintas, 55°29'13,2'', 01-15 iškirstas E 21°06'58'' miškas, Kuršių nerija Cicindela sp. Naglių N B5 1 2009 05 P. Ivinskis, gamtinis 55°29'13,2'', 18-06 01 J. Rimšaitė rezervatas, E 21°06'58'' Kuršių nerija Cicindela sp. Naglių N B6, B7 2 2009 07 S. Süβ gamtinis 55°29'13,2'', 13-27 rezervatas, E 21°06'58'' Kuršių nerija Cicindela sp. Naglių N B8, B9 2 2009 05 P. Ivinskis, gamtinis 55°29'13,2'', 01-18 J. Rimšaitė rezervatas, E 21°06'58'' Kuršių nerija Cicindela sp. Naglių N B10 1 2009 06 S. Kühnel gamtinis 55°29'13,2'', 01-16 rezervatas, E 21°06'58'' Kuršių nerija Harpalus rufipes Noreikiškės, N H1-H6 6 2009 06 S. Kühnel (Degeer, 1774) Kauno r. 54°52'47,4'', 23 E 23°50'20''

Pterostichus Juškinės N A1, A2, 2 2010 08 R. Ferenca aethiops miškas, 55°01'02,4'', K1-K3, 09 (Panzer, 1797) Šakių r. E 23°27'25'' O1, O2

25 1 lentelė. Tiriamos medžiagos rinkimo vietos. Lentelėje patiktos rūšys, rinkimo vietovės, vietovių koordinatės, mėginiai, tirtų individų skaičius, data ir rinkėjas (tęsinys) Tirtų Medžiagos Rūšis Vietovė Koordinatės Mėg. individų Data rinkėjas skaičius Cicindela hybrida Kauno marių N 55°33'14'', 1R-7R, 58 2011 07 A. (Linnaeus, 1758) smėlėta E 21°06'47'' 9R-12R, 14-16 Auruszkiewicz pakrantė 14R-32, 34R, 35R, 39R, 41R, 43R, 46R, 47R, 50R, 51R, 54R- 57R, 59R- 61R, 63R- 73R, 75R

Cicindela sp. Kauno marių N 55°33'14'', 13R, 33R, 9 2011 07 A. smėlėta E 21°06'47'' 36R-38R 14 Auruszkiewicz pakrantė 48R, 52R, 53R, 58R Cicindela maritima Kauno marių N 55°33'14'', 8R, 40R, 8 2011 07 A. (Latreille, Dejean, smėlėta E 21°06'47'' 42R, 44R, 14 Auruszkiewicz 1822) pakrantė 45R, 49R, 62R, 74R Cicindela hybrida Juodkrantė, N 2, 4, 8, 22 2011 05 B. Tamutė (Linnaeus, 1758) smiltynė 55°01'02,8', 16, 18, 26-28 E 23°27'25'' 22, 24, 27, 29-32, 34-36, 38- 44

Cicindela sp. Juodkrantė, N 3, 5, 10, 9 2011 05 B. Tamutė smiltynė 55°01'02,8'', 12, 13, 28 E 23°27'25'' 15, 17, 19, 21,

Cicindela sp. Naglių N 28, 33 2 2011 06 R. Ferenca gamtinis 55°01'02,4'', 01 rezervatas, E 23°27'25'' Kuršių nerija, pilkosios kopos Cicindela maritima Juodkrantė, N 1 1 2011 05 R. Ferenca (Latreille, Dejean, pajūris 55°01'02,4'', 31 1822) E 23°27'25''

1 lentelė. Tiriamos medžiagos rinkimo vietos. Lentelėje patiktos rūšys, rinkimo vietovės, vietovių koordinatės, mėginiai, tirtų individų skaičius, data ir rinkėjas (tęsinys) Tirtų Medžiagos Rūšis Vietovė Koordinatės Mėg. individų Data rinkėjas skaičius Cicindela maritima Juodkrantė, N 6,7,9,11, 10 2011 07 B. Tamutė (Latreille, Dejean, smiltynė 55°01'02,8'', 14, 20, 1822) E 23°27'25'' 23, 25, 26, 37 Cicindela sylvatica Juodkrantė, N 45s-68s 24 2011 05 B. Tamutė (Linnaeus, 1758) smiltynė 55°01'02,8'', 28 E 23°27'25'' Cicindela sylvatica Naglių N 49s-73s 5 2011 06 R. Ferenca (Linnaeus, 1758) gamtinis 55°01'02,8'', 01 rezervatas, E 23°27'25'' Kuršių nerija, pilkosios kopos

12 pav. Vietovės iš kurių buvo surinkti vabalai (1 – Kuršių nerija, Naglių gamtinis rezervatas (pustomos kopos, kopos su Leymus); 2 – Kuršių nerija, Grobšto gamtinis rezervatas; 3 – Šakių r. Juškinės miškas; 4 – Kauno r. Noreikiškės, 5 – Kauno marių smėlėta pakrantė; 6 – Vilnius (Pučkoriai)

C. hybrida, C. maritima, C. sylvatica, P. aethiops ir Harpalus rufipes rusies vabalai buvo rinkti entamologiniu sietu (13 pav.) o taip pat panaudojant barberio gaudyklę (14 pav.). Šienavimas. Šis metodas buvo taikytas renkant vabzdžius žoline augmenija, puskrūmiais ir neaukštais krūmais ar medžiais apaugusiuose plotuose. Šienaujant, staigiais mostais braukiama per

27 augalus entomologiniu sietu (13 pav.). Ant augalų esantys vabzdžiai tokiu būdu nubraukiami ir patenka į sietą, iš kurio yra išrenkami ar susiurbiami ekshausteriu. Tai vienas efektyviausių vabzdžių rinkimo metodų, duodančių patikimus rezultatus tiek atliekant vabzdžių apskaitą, tiek ir tiriant jų rūšinę sudėtį. Šio metodo trūkumas yra tai, kad šienauti negalima tuo atveju, jeigu augalai šlapi (po lietaus ar iškritus rasai) nes vabzdžiai sušlampa, apsivelia smulkiomis augalų dalelėmis ir prilimpa prie sietelio medžiagos, dėl to surinkta medžiaga būna nekokybiška, tai apsunkina rūšių identifikavimą (Švitra, 2008).

13 pav. Vabalų rinkimas entomologiniu sietu (Ivinskis, 2000)

Barberio gaudyklės. Barberio žemės gaudyklių metodas mokslininkų tarpe yra plačiai naudojamas paklotės entomofaunos ir kitų nariuotakojų tyrimuose (Gedminas et. al., 1996). Barberio gaudyklė – tai iki kraštų į žemę įkastas 15 cm aukščio ir 10 cm skersmens plastikinis ar stiklinis indas (14 pav.). Rekomenduojama tokią gaudyklę iš viršaus pridengti neperšlampamu stogeliu, paliekant apie 3 cm tarpą. Į gaudyklę įpilama fiksuojančio skysčio, 7% formalino tirpalo, etilenglikolio ar ledinės acto rūgšties. Fiksuojančio skysčio turi būti 1/6–1/7 gaudyklės tūrio. Tikrinant gaudykles kiekvieną dieną – fiksuojantis skystis nebūtinas. Šiuo metodu patogu naudotis renkant vabalus, gyvenančius paklotėje ar viršutiniame dirvos sluoksnyje: žygius (Carabidae), trumpasparnius (Staphylinidae), maitvabalius (Silphidae), graibvabalius (Pselaphidae) (Ivinskis, 2000).

14 pav. Barberio gaudyklė, naudojama vabzdžiams surinkti (Ivinskis, 2000)

Lietuvoje surinkti 152 Cicindela genties vabalai buvo fiksuoti 40% ir 96% etanolyje. Užpilti spiritu mėginiai laikomi 1-2 savaites –20 C temperatūroje. Morfometrinė analizė atlikta atsižvelgiant į tris pagrindinius C. hybrida, C. maritima skiriamuosius morfologinius požymius (Lindroth, 1985, Matalin, 1999, Freude et. al., 1976). Vabalai ištraukiami iš mėgintuvelio, dedami ant objektinio stiklelio ir tiriami mikroskopu MOTIC SMZ-168 10x, 40x padidinimais (15 pav.). Morfometrinių duomenų analizės rekonstrukcija sudaryta remiantis Treview kompiuterine programa (Roderic, 1996).

15 pav. Morfologinių struktūrų analizė, panaudojant binokuliarą MOTIC SMZ-168

2.2 DNR išskyrimas iš vabalų audinių

Molekuliniams tyrimams panaudoti 157 vabalai. Harpalus rufipes, Cicindela hybrida, C. maritima, C. sylvatica, Pterostichus aetiops vabalų rūšių genominė DNR išskirta iš galvos, krūtinės, kojos, krūtinės raumenų bei viso vabalo. DNR išskyrimui buvo panaudoti 3 skirtingi išskyrimo metodai. Pirmasis DNR išskyrimo metodas panaudojant DNR išskyrimo rinkinį „NucleoSpin® Tissue Kit“ (Macherey-Nagel, Düren, Vokietija) (Kaila, Stahls, 2006), kurį sudaro: filtrinės su silicio dioksido membrana kolonėlės, proteinazė K, lizės buferiai (T1, B3), plovimo buferiai (BW, B5), išplovimo buferis (BE). DNR buvo išskiriama remiantis gamintojo protokolu. Darbo eiga: 1. Vabalų audiniai homogenizuojami su skystu azotu. Vabalų kojos nebuvo homogenizuojamos. 2. Į kiekvieną mėgintuvėlio turinį įpilama 180 μl T1 buferio ir 25 μl proteinazės K ir gerai išmaišoma. 3. Mėginiai inkubuojami 56oC temperatūroje per visą naktį. Inkubavimas: ramybės fazė kas 15 min, maišoma 2 min. 4. Po inkubacijos mėginiai gerai išmaišomi ir į kiekvieną mėgintuvėlį įpilama 200 μl B3 buferio, mėginiai inkubuojami 70oC temperaturoje 10 min. 5. Po inkubacijos mėginiai išmaišomi ir centrifuguojami 5 min 11000 aps/min greičiu. Nuosėdos nusėda, o centrifūgate, kuris yra viršutiniame vandeniniame sluoksnyje, lieka išsiskyrusi DNR. Centrifūgatas nusiurbiamas pipetės pagalba ir pernešamas į kitus ependorf mėgintuvėlius. 6. Į mėgintuvėlius įpilama 210 μl etanolio, gerai išmaišoma ir skystis perpilamas į 2 ml NucleoSpin® Tissue kiuvetes. Mėginiai centrifuguojami 1 min 11000 aps/min greičiu ir pašalinamas nutekėjęs skystis. 7. Į mėgintuvėlius įpilama 500 μl BW buferio ir centrifuguojama 1 min 11000 aps/min greičiu. Po centrifugavimo pašalinamas nutekėjęs skystis. NucleoSpin® Tissue kiuvetė įstatoma į

mėgintuvėlį ir įpilama 600 μl B5 buferio. Mėginiai centrifuguojami 1 min 11000 aps/min greičiu ir pašalinamas nutekėjęs skystis. NucleoSpin® Tissue kiuvetės vėl įstatomos į mėgintuvėlius ir centrifuguojama 1 min 11000 aps/min greičiu, taip pašalinamas likusis etanolis, o DNR pasilieka mėgintuvėliuose. 8. Į kiuvetes su DNR įpilama 50 μl iš anksto 70oC temperatūroje pašildyto BE buferio ir centrifuguojama 1 min 11000 aps/min greičiu. Tokia DNR paruošta tolimesniam naudojimui arba saugojimui -20°C temperatūroje. Šiuo DNR išskyrimo metodu genominė DNR buvo išskiriama iš 2 gyvų Pterostichus aethiops rūšies vabalų, 3 sausų Harpalus rufipes, 6 Cicindela sylvatica, 19 C. maritima ir 107 C.

30 hybrida rūšies vabalų.

Antrasis DNR išskyrimo metodas panaudojant amoniako tirpalą (Stanczak et. al., 1999). Genominė DNR buvo išskiriama iš vabalo kojos, galvos ir krūtinės. Darbo eiga: Darbinių tirpalų ruošimas. 10 ml 2,5% amoniako tirpalui paruošti reikia:

1. 1 ml 2,5% NH4OH ir 9 ml dH2O 2. DNR išskyrimas iš audinio: a) į mėgintuvėlius su nehomogenizuotais vabalų audiniais įpilama 2,5% amoniako tirpalo. Priklausomai nuo tiriamo vabalo audinio dydžio buvo pilamas skirtingas amoniako tirpalo kiekis. Į mėgintuvėlį su vabalo koja įpilama 80 μl 2,5 % amoniako tirpalo į mėgintuvėlį su vabalo galva ir krūtine įpilama 120 μl amoniako tirpalo; b) mėgintuvėliai patalpinami į termostatą ir inkubuojami 99oC temperatūroje 25 min. Vėliau centrifuguojami 1 min kambario temperatūroje 13000 aps/min greičiu; c) mėgintuvėliai atidaromi ir inkubuojami termostate 99oC temperatūroje 15 min, kad išgaruotų amoniakas vėliau mėgintuvėliai uždaromi, įdėdami į ledo padėklą 2-3 min. Praėjus šaldymo laikui mėginiai centrifuguojami 1 min kambario temperatūroje 13000 aps/min greičiu. Paruoštas mėginys laikomas šaldytuve - 20oC temperatūroje. Šiuo išskyrimo metodu DNR buvo išskiriama iš 2 gyvų Pterostichus eathiops rūšies vabalų, 3 sausų Harpalus rufipes, 1 Cicindela sylvatica, 6 C. hybrida rūšies vabalų.

Trečiasis DNR išskyrimo metodas panaudojant DNR išskyrimo rinkinį „Zymo Research Insect/Tissue DNA Kit-5“, kurį sudaro: ZR BashingBeadTM lizės tūbelė, Zymo-SpinTM IV filtras, Collection tūbelė, genomo lizės buferis, Zymo-SpinTM IC kolonėlė, DNA Pre-Wash buferis, g-DNA Wash buferis, DNA išplovimo buferis. DNR buvo išskiriama remiantis gamintojo protokolu. Genominė DNR buvo išskiriama iš vabalo kojos, galvos, krūtinės bei krūtinės raumenų. Darbo eiga: 1. Į ZR BashingBeadTM lizės tūbelę įdėti ne daugiau kaip 10 mg nehomogenizuotų vabalo audinių. Į kiekvieną tubelę įpilama 750 μl lizės buferio ir 10 min palaikome kratintuve. 2. Mėginiai esantys ZR BashingBeadTM lizės tūbelėse centrifuguojami 1 min 10000 aps/min greičiu. 3. Po centrifūgavimo perkelti 400 μl tirpalo į Zymo-SpinTM IV filtrą ir kartu su Collection tūbele centrifuguoti 1 min 7000 aps/min greičiu. 4. Į Collection tubelę įpilti 1200 μl genomo lizės buferio ir centrifuguoti 1 min 7000 aps/min greičiu.

31 5. Po centrifugavimo 800 μl tirpalo perkelti į Zymo-SpinTM IC kolonėlę ir kartu su Clollection tūbelę centrifuguoti 1 min 10000 aps/min greičiu ir pašalinamas nutekėjęs skystis. 6. Filtrą perkėlėme į kitą Collection tūbelę ir pakartojome 5 žingsnį. 7. Įpylėme 200 μl DNA Pre-Wash buferio į Zymo-SpinTM IC kolonėlę ir kartu su Collection tūbelę centrifugavome 1 min 10000 aps/min greičiu. 8. Įpylėme 500 μl g-DNA Wash buferio buferio į Zymo-SpinTM IC kolonėlę ir kartu su Collection tūbelę centrifugavome 1 min 10000 aps/min greičiu. 9. Filtras perkėliamas į švarius ependorfo mėgintuvėlius, įpilama 10 μl DNA išplovimo buferio ir centrifuguoti 30 s 10000 aps/min greičiu. Šiuo DNR išskyrimo metodu genominė DNR buvo išskiriama iš 2 gyvų Pterostichus aethiops, 6 C. hybrida ir 6 C. sylvatica rūšies vabalų.

2.2.1 DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas

Į ependorf 0,5 µl mėgintuvėlį įpilama po 10 μl DNR tirpalo ir po 90 μl dejonizuoto H2O (skiedžiama 10 kartų). Mėginiai matuojami spektrofotometru, prie 260 nm bangos ilgio. Kontrolei naudojamas dejonizuotas H2O. Mėginių optinis tankis nustatomas prie 280 nm bangos ilgio. Optinių tankių santykis 260 nm/ 280 nm rodo DNR tirpalų švarumą. Jis turi būti lygus arba didesnis už 1,8. 2.3 Polimerazės grandininė reakcija (PGR)

Atliekant polimerazės grandininę reakciją (PGR) buvo naudoti reagentai nurodyti 2 lentelėje (2 lentelė).

2 lentelė. PGR naudoti reagentai Medžiaga Gamintojas, šalis 2X PCR Master Mix MBI, Fermentas, Lietuva 10xPCR buferis MBI, Fermentas, Lietuva

25 mM MgCl2 MBI, Fermentas, Lietuva 10 mM dNTP mišinys MBI, Fermentas, Lietuva Taq polimerazė MBI, Fermentas, Lietuva Pradmuo (LCO1490-J-1514) Roth, Vokietija Pradmuo (HCO2198-N-2175) Roth, Vokietija Pradmuo (COI-Cic1) Roth, Vokietija Pradmuo (COI-Cic4) Roth, Vokietija

32 Atliekant PGR bandėme pritaikyti pradmenis, kurie buvo anksčiau panaudoti kitų sistematinių grupių tyrimuose (3 lentelė).

3 lentelė. Polimerazės grandininei reakcijai (PGR) naudotų pradmenų poros su pateiktais bazių porų skaičiais ir literatūros šaltiniais

Pradmens Pradmens Bazių pora pavadinimas Pradmens seka porų Šaltinis skaičius fragmente COI LCO1490- 5’– 700 Folmer J-1514 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG et. al., –3’ 1994

COI HCO2198- 5’– 700 Folmer N-2175 TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATC et. al., A–3’ 1994

cox1 COI-Cic1 5’–GAGTAGCTATGTTCAGC–3’ 717 Cardoso, Vogler, 2005

cox1 COI-Cic4 5’–GAAACATTTGGTTCATTAGG –3’ 717 Cardoso, Vogler, 2005 cox1 Jer 5’–CAACATTTATTTTGATTTTTTGG–3’ 700 Cardoso, Vogler, 2005 cox1 Pat ® 5’– 700 Cardoso, TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA–3’ Vogler, 2005 BembF 5’–GTATTAGCAGGAGCTATTAC–3’ 750 Sokolov et. al., 2007

BembR 5’–GAAATTGTTGATCCAATAG–3’ 750 Sokolov et. al., 2007

Pradmenų tinkamumas įvertintas amplifikuojant vabalų DNR. Iš pateiktų pradmenų PGR bandymas buvo atliktas su mitochondrinės DNR citochromo c oksidazės I (COI) genu LCO1490-J-1514, HCO2198-N-2175. PGR reakcija atlikta 25 μl galutinio tūrio su reagentais: 2 μl išskirtos vabalo DNR, po 2μl kiekvieno pradmens (5 pmol/μl) (Roth, Vokietija), 0,5 μl Taq palimerazės (5 U/μl) (MBI

Fermentas, Lithuania), 2,5μl 25 mM MgCl2, 2,5μl 10xPGR buferis (Fermentas, Lietuva), 0,5μl 25 mM dNTP ir 12,5 μl distiliuoto vandens. PGR reakcija vykdyta amplifikatoriuje (Eppendorf Mastercycler personal, Vokietija) (16 pav.) pagal 4 lentelėje pateiktas sąlygas (4 lentelė).

33 4 lentelė. Polimerazės grandininės reakcijos metu DNR pagausinimui naudota programa Žingsniai Temperatūra Laikas 1 ciklas Denatūracija 94ºC 2 min 35 ciklai Denatūracija 94ºC 30 s DNR pradmenų hibridizacija 50ºC 45 s DNR fragmento sintezė 72ºC 1 min 1 ciklas Paskutinė DNR sintezės fazė 72ºC 4 min

Sekanti PGR reakcija vykdyta naudojant COI-Cic1, COI-Cic4 pradmenis (4 lentelė). Reakcija atlikta 50 μl galutinio mišinio tūrio su šiais reagentais ir jų kiekiais: 2 μl išskirtos vabalo DNR, po 2,5 μl kiekvieno pradmens (5 pmol/μl) (Roth, Vokietija), 1,8 μl Taq palimerazės (5 U/μl)

(MBI Fermentas, Lithuania), 3,5μl 25 mM MgCl2, 5μl 10xPGR buferis (Fermentas, Lietuva), 0,5μl 25 mM dNTP ir 33,7 distiliuoto vandens. PGR reakcija vykdyta amplifikatoriuje (Eppendorf Mastercycler personal, Vokietija) (16 pav.) pagal 5 lentelėje pateiktas PGR sąlygas (5 lentelė).

5 lentelė. Polimerazės grandininės reakcijos metu DNR pagausinimui naudota programa Žingsniai Temperatūra Laikas 1 ciklas Denatūracija 94ºC 2 min 40 ciklai Denatūracija 94ºC 30 s DNR pradmenų hibridizacija 45ºC 30 s DNR fragmento sintezė 72ºC 1 min 1 ciklas Paskutinė DNR sintezės fazė 72ºC 3 min

PGR reakcija vykdyta su mitochondrinės DNR citochromo c oksidazės I (COI) genu COI- Cic1, COI-Cic4 (3 lentelė), naudojant „2X PGR Master Mix“ (2X PCR Master Mix) mišinį. Reakcija atlikta 25 μl galutinio mišinio tūrio: 2 μl išskirtos vabalo DNR, po 0,5 μl kiekvieno pradmens (5 pmol/μl) (Roth, Vokietija), 12,5μl 2xPGR Master Mix buferis (Fermentas, Lietuva) ir 9,5 distiliuoto vandens. Amplifikacija vykdyta amplifikatoriuje (Eppendorf Mastercycler personal, Vokietija) (16 pav.) pagal 6 lentelėje pateiktas PGR sąlygas (10 lentelė).

34 6 lentelė. Polimerazės grandininės reakcijos metu DNR pagausinimui naudota programa Žingsniai Temperatūri Laikas 1 ciklas Denatūracija 94ºC 2 min 40 ciklai Denatūracija 94ºC 30 s DNR pradmenų hibridizacija 45ºC 30 s DNR fragmento sintezė 72ºC 1 min 1 ciklas Paskutinė DNR sintezės fazė 72ºC 4 min

PGR reakcija vykdyta su mitochondrinė DNR citochromo c oksidazės I (COI) genu B1490 (F) ir (Pat ®) (3 lentelė). PGR reakcija atlikta 25 μl galutinio tūrio su reagentais: 2 μl išskirtos vabalo DNR, po 2μl kiekvieno pradmens (5 pmol/μl) (Roth, Vokietija), 0,5 μl Taq palimerazės (5

U/μl) (MBI Fermentas, Lithuania), 2,5μl 25 mM MgCl2, 2,5μl 10xPGR buferis (Fermentas, Lietuva), 0,5μl 25 mM dNTP ir 12,5 μl distiliuoto vandens. PGR reakcija vykdyta amplifikatoriuje (Eppendorf Mastercycler personal, Vokietija) (16 pav.) pagal 7 lentelėje pateiktas sąlygas (7 lentelė).

7 lentelė. Polimerazės grandininės reakcijos metu DNR pagausinimui naudota programa Žingsniai Temperatūra Laikas 1 ciklas Denatūracija 94ºC 3 min 35 ciklai Denatūracija 94ºC 30 s DNR pradmenų hibridizacija 51ºC 30 s DNR fragmento sintezė 72ºC 90 s 1 ciklas Paskutinė DNR sintezės fazė 72ºC 5 min

PGR reakcija vykdyta su mitochondrinė DNR citochromo c oksidazės I (COI) genu BembF ir BembR (3 lentelė). PGR reakcija atlikta 25 μl galutinio tūrio su reagentais: 2 μl išskirtos vabalo DNR, po 2μl kiekvieno pradmens (5 pmol/μl) (Roth, Vokietija), 0,5 μl Taq palimerazės (5

35 8 lentelė. Polimerazės grandininės reakcijos metu DNR pagausinimui naudota programa Žingsniai Temperatūra Laikas 1 ciklas Denatūracija 96ºC 3 min 35 ciklai Denatūracija 94ºC 15 s DNR pradmenų hibridizacija 55ºC 30 s DNR fragmento sintezė 72ºC 60 s 1 ciklas Paskutinė DNR sintezės fazė 72ºC 7 min

Vienuoliktoji PGR reakcija vykdyta su mitochondrinė DNR citochromo c oksidazės I (COI) genu Pat® ir Jer (3 lentelė). PGR reakcija atlikta 25 μl galutinio tūrio su reagentais: 2 μl išskirtos vabalo DNR, po 2μl kiekvieno pradmens (5 pmol/μl) (Roth, Vokietija), 0,5 μl Taq palimerazės (5 U/μl) (MBI Fermentas, Lithuania), 1 μl 25 mM MgCl2, 2,5μl 10xPGR buferis (Fermentas, Lietuva), 1 μl 25 mM dNTP ir 17,6 μl distiliuoto vandens. PGR reakcija vykdyta amplifikatoriuje (Eppendorf Mastercycler personal, Vokietija) (16 pav.) pagal 9 lentelėje pateiktas sąlygas (9 lentelė).

9 lentelė. Polimerazės grandininės reakcijos metu DNR pagausinimui naudota programa Žingsniai Temperatūra Laikas 1 ciklas Denatūracija 94ºC 2 min 35 ciklai Denatūracija 94ºC 20 s DNR pradmenų hibridizacija 53ºC 15 s DNR fragmento sintezė 65ºC 50 s 1 ciklas Paskutinė DNR sintezės fazė 72ºC 7 min

Kituose bandymuose atlikta lizdinė PGR naudojant mitochondrinės DNR citochromo c oksidazės I (COI) geno poras: Pat® , Jer ir COI-Cic1, COI-Cic4. Pirma reakcija vykdyta naudojant Pat® ir Jer pradmenis. Antra PGR reakcija vykdyta su COI-Cic1, COI-Cic4 geno porą panaudojant pirmos PGR reakcijos produktą. Pirma PGR reakcija vykdyta su mitochondrinė DNR citochromo c oksidazės I (COI) genu Pat® ir Jer (3 lentelė). PGR reakcija atlikta 50 μl galutinio tūrio su reagentais: 2 μl išskirtos vabalo DNR, po 2,5 μl kiekvieno pradmens (5 pmol/μl) (Roth, Vokietija), 0,3 μl Taq palimerazės (5 U/μl)

(MBI Fermentas, Lithuania), 3,5 μl 25 mM MgCl2, 5μl 10xPGR buferis (Fermentas, Lietuva), 0,5 μl 25 mM dNTP ir 33,7 μl distiliuoto vandens. PGR reakcija vykdyta amplifikatoriuje (Eppendorf Mastercycler personal, Vokietija) (16

36 pav.) pagal 10 lentelėje pateiktas sąlygas (10 lentelė).

10 lentelė. Polimerazės grandininės reakcijos metu DNR pagausinimui naudota programa Žingsniai Temperatūra Laikas 1 ciklas Denatūracija 95ºC 2 min 35 ciklai Denatūracija 94ºC 20 s DNR pradmenų hibridizacija 53ºC 15 s DNR fragmento sintezė 65ºC 50 s 1 ciklas Paskutinė DNR sintezės fazė 72ºC 7 min

Atliktos PGR reakcijos naudojant COI geną su C. hybrida rūšies vabalų išskirtą genominę DNR. PGR reakcijos produkto dalis pernešama į antrą gausinimo reakciją. PGR reakcija atlikta 50 μl galutinio tūrio su mitochondrinė DNR citochromo c oksidazės I (COI) genu COI-Cic1, COI-Cic4 ir reagentais nurodytais ankstenėje PGR rekcijoje. PGR reakcija vykdyta amplifikatoriuje (Eppendorf Mastercycler personal, Vokietija) (16 pav.) pagal 11 lentelėje pateiktas sąlygas (11 lentelė).

11 lentelė. Polimerazės grandininės reakcijos metu DNR pagausinimui naudota programa Žingsniai Temperatūra Laikas 1 ciklas Denatūracija 94ºC 2 min 40 ciklai Denatūracija 94ºC 30 s DNR pradmenų hibridizacija 40ºC 30 s DNR fragmento sintezė 72ºC 1 min 1 ciklas Paskutinė DNR sintezės fazė 72ºC 10 min

16 pav. Amplifikatorius Mastercycler personal kuriame buvo atliekama PGR reakcija 37 2.4 Elektroforezė agarozės gelyje

Atliekant elektroforezę buvo naudoti reagentai pateikti 12 lentelėje (12 lentelė). 12 lentelė. Elektroforezei naudoti reagentai

Medžiaga Firma, gamintojas, šalis Molekulinės masės žymuo (100bp) MBI, Fermentas, Lietuva Bromfenolio mėlio dažas MBI, Fermentas, Lietuva Agarozės milteliai Sigma, Vokietija Etidžio bromidas Roth, Vokietija 50xTAE buferis MBI, Fermentas, Lietuva

PGR produktai buvo frakcionuojami elektroforezės būdu. Elektroforetinis DNR fragmentų frakcionavimas leidžia nustatyti šių fragmentų dydį. Elektroforezė buvo atliekama horizontaliame 1,5% agarozės (Fermentas, Lietuva) gelyje su etidžio bromidu (Roth, Vokietija). Agarozės gelio ruošimas ir darbo eiga: 1. 1xTAE buferio paruošimas: 40 ml 50xTAE tirpalo praskiedžiama distiliuotu vandeniu iki 2000 ml. 2. 3 g agarozės miltelių „Top VisionTM LE GQ Agarose“ (Fermentas, Lietuva) ištirpinama 200 ml 1xTAE buferyje kaitinant mikrobangų krosnelėje ir maišant tol, kol tirpalas pasidaro skaidrus ir vientisos konsistencijos. Vėstant, indas su ištirpinta agaroze maišomas atsargiai, kad agarozėje nesusidarytų oro burbulų. 3. Į atvėsintą agarozę įdėdama 10 μl etidžio bromido. Agarozė greitai, bet tolygiai supilama į paruoštą formą. Po to, į gelį įstatomos šukutes ir forma paliekama 30 min kambario temperatūroje, kad gelis sustingtų. Elektroforezės aparatas užpildomas darbiniu 1xTAE buferiu. 4. Sustingus geliui, šukutės atsargiai ištraukiamos. Prieš įvedant DNR mėginius į susiformavusius šulinėlius, gelis įstatomas į elektroforezės vonelę, užpildytą buferiu taip, kad šis apsemtų gelį. 5. Į kiekvieną šulinėlį įvedama po PGR produkto. DNR mėgino sumaišytą su bromfenolio mėlio dažais (5 μl DNR mėginio + 1 μl dažo). Paruošiamas molekulinės masės žymeklis (Fermentas, Lietuva). 6. Elektroforezė vykdoma leidžiant elektros srovę per gelį, ko pasėkoje DNR fragmentai juda nuo anodo link teigiamo poliaus – katodo. Atsižvelgiant į gelio dydį ir DNR fragmentų molekulinę masę, elektroforezė vykdoma 30 – 60 min, esant 100 V srovės stipriui. 7. Rezultatai buvo vertinami UV šviesoje transliuminatoriuje (16 pav.), kur specialios kompiuterinės video dokumentavimo sistemos pagalba gelis fotografuojamas, o gautas

38 vaizdas yra perkeliamas į kompiuterį, kur yra analizuojamas ir išsaugojamas duomenų bazėje. PGR reakcijos metu, pagausintiems fragmentams įvertinti buvo naudojamas 100 bp molekulinės masės žymuo Gene RulerTM DNA Ladder Plus (18 pav.) (Fermentas, Lietuva). Gauti fragmentai buvo vizualizuojami UV šviesoje naudojant Herolab transliuminator ir Win32 sistemą (Vokietija) (17 pav.)

17 pav. Transliuminatorius Herolab transliuminator ir Win32 sistema (Vokietija)

18 pav. 100 bp molekulinės masės žymuo Gene RulerTM DNA Ladder Plus spektras, kuriame yra 14 fragmentų 100–3000 bp

2.5 PGR fragmento kirpimas ir valymas

PGR produktai valymui buvo frakcionuojami 1,5% agarozės gelyje. 1x TBE buferyje. PGR produktai (20 μl) sumaišomi su 2 μl 6x dažo (Fermentas, Lietuva) ir įnešami į kas antrą gelio griovelį. Elektroforezė vykdoma apie 1 val. esant 100 V įtampai. PGR reakcijos metu, pagausintiems fragmentams įvertinti buvo naudojamas 100 bp molekulinės masės žymuo Gene RulerTM DNA Ladder Plus (18 pav.). Gauti fragmentai buvo vizualizuojami UV šviesoje, naudojant Herolab transliuminator ir Win32 sistemą (Vokietija).

39 Iš gelio iškirpti PGR fragmentai buvo valomi „GeneJet Gel Extraction kit“ (Fermentas, Lietuva) rinkiniu. Darbo eiga: 1. Iš gelio iškerpamas fragmentas, patalpinamas į 1,5 ml mėgintuvėlį ir pasveriamas. 2. Įpilamas 1:1 dalimis rišamasis buferis (Binding buffer) (100 μl rišamo buferio (Binding buffer) atitinka 100 mg agarozės gelio). 3. Mišinys inkubuojamas 10 min. 50−60°C, kas 2 min. pamaišant, kol agarozės gelis ištirps. 4. Turinys iš mėgintuvėlio perkeliamas į „GeneJet“ kolonėles. Centrifuguojama 1 min. 13000 aps./min. greičiu. Pašalinamas supernatantas. 5. Įpilama 100 μl rišamo buferio (Binding Buffer). Centrifuguojama 1 min. 13000 aps./min. greičiu. Pašalinamas supernatantas. 6. Įpilama 700 μl plovimo buferio (Wash Buffer). Centrifuguojama 1 min. 13000 aps./min. greičiu. Pašalinamas supernatantas. 7. Centrifuguojama 1 min. 13000 aps./min. greičiu. 8. „GeneJet“ kolonėlės perkeliamos į 1,5 ml mikromėgintuvėlius. Pilama 20 μl išplovimo buferio (Elution Buffer) (gamintojo protokole rekomenduojama naudoti 50 μl išplovimo buferio (Elution Buffer), tačiau mes naudojome 20 μl norėdami padidinti PGR išvalyto produkto koncentraciją). Centrifuguojama 1 min. 13000 aps./min. greičiu. Mėgintuvėlyje gaunamas PGR produktas paruoštas tolimesniam naudojimui. Valymo iš gelio rinkiniai: „PCR clean-up Gel extraction“ (Macherey-Nagel, Vokietija) ir „GeneJet Gel Extraction kit“ (Fermentas, Lietuva) PGR produktą išvalydavo, tačiau sekvenavimo rezultatai nebuvo geri dėl juose likusių agarozės likučių. Todėl, norint gauti gerus mėginius, skirtus sekvenavimui, Biotechnologijos instituto Sekvenavimo centro darbuotojai 50 rekomendavo juos po valymo iš agarozės gelio su rinkiniu išvalyti etanoliu remiantis protokolu. Darbo eiga: 1. Mišiniui naudojama 25 μl (7,5 M) amonio acetato ir 190 μl 95 % etanolio. Medžiagos gerai sumaišomos. 2. Mišinys pilamas ant išvalyto PGR produkto. Gerai sumaišoma ir patalpinama 30 min. į šaldiklį prie -20°C. 3. Centrifuguojama 10 min. 10000 aps./min. greičiu. Atsargiai pašalinamas supernatantas. 4. Nuosėdos išdžiovinamos 54°C temperatūroje. 5. Išdžiovintos nuosėdos ištirpdomos 20 μl distiliuoto vandens. Išvalyti produktai buvo tikrinami 1,5 % agarozės (Fermentas, Lietuva) gelyje 1x TBE buferyje (Fermentas, Lietuva). Išvalytas PGR produktas (5 μl) sumaišomas su 1 μl 6x dažo

40 (Fermentas, Lietuva) ir įnešamas į gelį. Fragmentų masei nustatyti buvo naudojamas molekulinių masių žymuo MassRuler Ladder Mix (80−10000 bp) (Fermentas, Lietuva) (19 pav.).

19 pav. Molekulinių masių žymuo MassRulerTM Ladder Mix (80-10000 bp) (Fermentas, Lietuva), kuriame yra 20 fragmentų 80–10000 bp

2.5.1 Sekvenavimas

Meginiai buvo sekvenuojami Biotechnologijos institute sekvenavimo centre automatiniu 16 kapiliarų genetiniu analizatoriumi 3130xl (Applied Biosystems).

2.5.2 Statistinė duomenų analizė

Sekvenuotų fragmentų chromotogramų įvertinimui ir lyginimui naudota kompiuterinė BioEdit 5.0.9 sekų analizės programa (BioEdit Sequence Alignment Editor). Filogenetinių ryšių nustatymui panaudota „MEGA 4“ kompiuterinė programa (Tamura et. al, 2007). Sekvenuotų sekų nukleotidų analizė atlikta Neighbor-Joning metodu (Saitou, Nei, 1987). Filogenetinis medis su nukleotidais sudarytas remiantis p-distance modeliu.

41 III. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Vabalų identifikavimas ir morfometrinė analizė

C. hybrida ir C. maritima rūšies vabalai yra labai panašūs, todėl sunku juos atskirti. Šiuos vabalus galima atpažinti remiantis trimis pagrindiniais morfologiniais požymiais: antsparnių piešiniu, blauzdų ir letenų ilgio santykiu bei galvos šerelių pasiskirstymu kaktos srityje (1 priedas). Analizuoti Lietuvoje surinkti 152 Cicindela genties vabalai naudojant apibūdintojus (Lindroth, 1985, Matalin, 1999, Freude et. al., 1976). Vienas iš esminių skiriamųjų požymių C. hybrida ir C. maritima yra blauzdų ir letenų santykio ilgis. Cicindela hybrida rūšies vabalų, letenų ilgis toks pat kaip ir blauzdų ilgis, tačiau gali būti šiek tiek ilgesnės. Tuo tarpu, C. maritima letenų ilgis yra šiek tiek trumpesnis nei blauzdų ilgis (20 pav.). Kadangi vizualiai blauzdų ir letenų santykį įvertinti yra pakankamai sunku, todėl palyginimui buvo naudotas matavimo prietaisas su matavimo skale.

20 pav. Cicindela hybrida (A), C. maritima (B) vabalų rūšių blauzdų ir letenų ilgio santykis

Dar vienas labai svarbus C. hybrida ir C. maritima vabalų skiriamasis požymis, tai antsparnių piešinio centrinės dėmės forma. Ji šiuose vabaluose labai įvairuoja. C. maritima rūšies vabalų elitrų šviesi centrinė dėmė esti labiau kampuota, o C. hybrida ši dėmė yra labiau vingiuota (21 pav.).

21 pav. Cicindela maritima (A, B), C. hybrida (C, D) elitrų šviesi centrinės dėmės forma

Trečiasis vienas iš svarbiausių C. maritima ir C. hybrida skiriamasis požymis yra galvos šerelių pasiskirstymas ties kakta. Šerelių paprastai yra nuo 2 iki 3. C. maritima rūšies vabalų šereliai yra matomi ant kakos ties akių galiniu kraštu, C. hybrida šereliai yra sutinkami tik ant kaktos (22 pav.).

22 pav. Cicindela maritima (A) ir C. hybrida šerelių pasiskirstymas

Vienas iš svarbiausių vabalų identifikavimo požymių yra patino genitalijos. Primiausiai, atskiriant patiną nuo patelės atkreipiame dėmesį į vabalų priekinių galūnių šerelių išsidėstymą. Patinai turi pakankamai didelį šerelių kiekį, šepėčio pavidale, patelės turi tik pavienius šerelius (23 pav.).

23 pav. Cicindela hybrida patino (A) ir patelės (B) priekinės galūnės

Stebint C. hybrida ir C.maritima patinų genitalijas ženkliai išsiskiria edeaguso struktūra ir išvaizda. Pastebėta, kad edeaguso viršūnė buka su nedideliais gumbeliais. Tuo tarpu C. hybrida edeaguso viršūnė smaili ir joje nėra gumbelių (24 pav.).

24 pav. Cicindela maritima (A), C. hybrida (B) patinų genitalijos (edeagusas)

Remiantis Cicindela genties vabalų C. hybrida ir C. maritima 3 esminiais morfologiniais požymiais (galvos plaukuotumu, blauzdos, letenų ilgio santykiu bei centrinės dėmės forma), sudaryta rekonstrukcija pagal kurią įvertinti vabalų panašumai bei skirtumai. Rekonstrukcijoje išryškėja 2 stambūs klasteriai A ir B. A klasteryje išsidėsto C. hybrida rūšies vabalai. A klasteryje suformuoja 2 subklasteriai A1 ir A2 (25 pav.). Atsižvelgiant į vabalų 3 pagrindinius morfologinius požymius pastebėta, kad A1 subklasterio C. hybrida vabalų morfologiniai požymiai labai stipriai varijuoja. C. hybrida (13), (19), (21), C.sp (19M), C.sp (20M) vabalai sudaro A2 subklasterį. Šių individų elitrų šviesi centrinės dėmės forma nesutampa su kitų C. hybrida individų požymiais. C. maritima rūšies vabalai suformuoja atskirą B klasterį. Šiame klasteryje yra mažesni 2 subklasteriai B1 ir B2. B2 klasterį suformuoja tik C. maritima individai. Jų visi morfologiniai 44 požymiai sutampa. B1 subklasterį suformuoja iki galo neidentifikuoti C.sp vabalai. Jų morfologiniai požymiai persidengia su C. hybrida ir C.maritima skiriamaisiais požymiais. Remiantis šia rekonstrukciją, galime teigiti jog šie neidentifikuoti vabalai, remiantis 3 pagrindiniais morfologiniais požymiais gali būti priskiriami C. maritima rūšiai.

45 A A1

B1 B B

25 pav. C. hybrida ir C. maritima vabalų rūšių rekonstrukcija sudaryta remiantis 3 pagrindiniais požymiais: elitrų šviesia centrine dėme, blauzdų ir letenų ilgio santykiu bei galvos šerelių pasiskirstymu kaktos srityje

46 Patinų genitalijų struktūra turi didelę reikšmę identifikuojant C. hybrida ir C. maritima vabalus. Atsižvelgiant į patinų edeaguso formą, analizuoti 68 Cicindela ginties patinai. Rekonstrukcijoje ženkliai išsiskiria 2 stambūs klasteriai A ir B. A klasteryje išsidėsto C. hybrida rūšies vabalai. B klasteryje išsidėsto tik C. maritima rūšies vabalai (26 pav.).

26 pav. C. hybrida ir C. maritima vabalų patinų rekonstrukcija sudaryta remiantis 4 pagrindiniais požymiais: elitrų šviesia centrine dėme, blauzdų ir letenų ilgio santykiu, galvos šerelių pasiskirstymu kaktos srityje bei edeaguso forma

Taigi remiantis šiomis dvejomis rekonstrukcijomis (25, 26 pav.) galime teigti jog esminis požymis identifikuojant C. hybrida ir C. maritima rūšių vabalus yra patinų genitalijų struktūros. Kiti 3 morfologiniai požymiai, kaip elitrų šviesi centrinė dėmė, blauzdų ir letenų ilgio santykis bei galvos šerelių pasiskirstymas kaktos srityje gali šiek tiek varijuoti ir sukelti keblumų identifikuojant šias rūšis.

47 3.2 Vabalų molekuliniai tyrimai

Molekuliniai tyrimai su Harpalus rufipes, Cicindela hybrida, C. maritima, C. sylvatica, Pterostichus aethiops vabalų rūšimis Lietuvoje atliekami pirmą kartą. Kitose šalyse molekuliniams tyrimams šios rūšys taip pat nėra dažnai naudojamos, todėl trūksta molekulinių tyrimo metodų duomenų susijusių su šiais vabalais. Atliekant tyrimus su Harpalus rufipes, Cicindela hybrida, C. sylvatica, C. maritima, Pterostichus aethiops vabalų rūšimis tinkami DNR išskyrimo metodai buvo ieškomi tik eksperimentiniu būdu, o taip pat bandyta pritaikyti molekulinius tyrimų metodus anksčiau panaudotus kitų sistematinių grupių tyrimuose.

3.2.1 DNR išskyrimas

DNR buvo išskiriama panaudojant 3 skirtingus metodus: panaudojant DNR išskyrimo rinkinį „NucleoSpin® Tissue Kit“ (Macherey-Nagel, Düren, Vokietija) (Kaila, Stahls, 2006), panaudojant amoniako tirpalą (Stanczak et. al., 1999) ir panaudojant DNR išskyrimo rinkinį „Zymo Research Insect/Tissue DNA Kit-5“. Išskiriant DNR su NucleoSpin® Tissue rinkiniu iš Cicindela hybrida ir Harpalus rufipes rūšies vabalų, nedavė gerų rezultatų. Išskiriant DNR su NucleoSpin® Tissue rinkiniu iš Harpalus rufipes rūšies vabalų DNR koncentracija buvo nedidelė. Didžiausia DNR koncentracija pastebima H1 mėginyje, mažiausia H2 mėginyje. Iš Cicindela hybrida, C. sylvatica ir Harpalus rufipes rūšies vabalų amoniako tirpalu išskirtoje DNR koncentracija buvo daug didesnė. Didžiausia koncentracija pastebima M4 mėginyje, mažiausia R4 mėginyje. Švariausia DNR buvo aptikta H1, H2 mėginuose, kuri iš vabalų buvo išskirta naudojant NucleoSpin® Tissue rinkinį. Amoniako tirpalu išskirtoje DNR švarumas nebuvo didelis (13 lentelė).

48 13 lentelė. Mėginiai, DNR išskyrimo metodas, DNR koncentracija, DNR švarumas, baltymų kiekis

Mėginių DNR išskyrimo DNR DNR švarumas, Baltymų kiekis, pavadinimai metodas koncentracija bangos ilgis 260/280 nm A320

M1 Panaudojant amoniako 198,26 1,3 0,155 tirpalą M2 Panaudojant amoniako 294,24 1,1 0,257 tirpalą M3 Panaudojant amoniako 198,21 1,2 0,167 tirpalą M4 Panaudojant amoniako 372,49 1,2 0,335 tirpalą M5 Panaudojant amoniako 284,25 1,3 0,203 tirpalą H1 Su NucleoSpin® 3 1,5 0,001 Tissue rinkiniu H2 Su NucleoSpin® 12,11 1,7 0 Tissue rinkiniu R3 Panaudojant amoniako 180,36 1,2 0,153 tirpalą R4 Panaudojant amoniako 164,78 1,2 0,167 tirpalą

3.2.2 Polimerazės grandininė reakcija (PGR)

Amplifikuojant Cicindela hybrida ir Harpalus rufipes DNR su mitochondrinės DNR citochromo c oksidazės I (COI) geno poromis: LCO1490-J-1514, HCO2198-N-2175, COI-Cic1, COI-Cic4 (3 lentelė.) dauguma molekulinių žymenų tiko tik Harpalus rufipes genominei DNR ir buvo gauti neryškūs fragmentai, kurių dydis svyravo nuo 717 iki 700 bazių porų. Pirmieji bandymai buvo atlikti naudojant LCO1490-J-1514, HCO2198-N-2175 molekulinius žymenis. Tolimesniuose tyrimuose šie žymenys nebuvo naudoti, kadangi amplifikuojant vabalų DNR su šiais žymenimis Cicindela hybrida, C. sylvatica fragmentų gauti nepavyko. Kadangi LCO1490-J-1514, HCO2198-N-2175 molekuliniai žymenys tiko tik Harpalus rufipes DNR, tolimesni molekuliniai tyrimai buvo vykdomi panaudojant mitochondrinės DNR citochromo c oksidazės I (COI) geną COI-Cic1, COI-Cic4. Bandymai buvo vykdyti atliekant lizdinę PGR reakciją. Pirmos PGR reakcijos produkto dalis buvo pernešama į antrą gausinimo reakciją.

Amplifikuojant tirtų vabalų DNR su COI-Cic1, COI-Cic4 molekuliniais žymenimis, DNR pagausinimo programą pateiktą 5 lentelėje, susidarė fragmentai, kurių dydis svyravo ties 700 bazių porų. Amplifikuoti fragmentai rasti Cicindela hybrida (1,2,3,4,5) PGR mėginiuose (27 pav.).

27 pav. Elektroforegrama, gauta atlikus DNR fragmentų padauginimą su COI-Cic1, COI-Cic4 pradmenimis.M – Gene RulerTM 100bp DNA Ladder Plus

Amplifikuojant vabalų DNR su COI-Cic1, COI-Cic4 molekuliniais žymenimis atlikti PGR bandymai naudojant skirtingus mišinio komponentus ir jų kiekius. Kiekviename bandyme atliktos 4-12 PGR reakcijų, kurių metu panaudota C. hybrida, C. maritima rūšies vabalų genominė DNR. Elektroforegramose pastebėti fragmentai, kurie buvo rasti C. maritima ir C. hybrida PGR mėginiuose (28 pav.).

28 pav. Elektroforegrama, gauta atlikus DNR fragmentų padauginimą su COI-Cic1, COI-Cic4 molekuliniais žymenimis. M – Gene RulerTM 100bp DNA Ladder Plus

29 pav. Elektroforegrama, gauta atlikus DNR fragmentų padauginimą su COI-Cic1, COI-Cic4 molekuliniais žymenimis. M – Gene RulerTM 100bp DNA Ladder Plus

30 pav. Elektroforegrama, gauta atlikus DNR fragmentų padauginimą su COI-Cic1, COI-Cic4 molekuliniais žymenimis. M – Gene RulerTM 100bp DNA Ladder Plus

31 pav. Elektroforegramos, gautos atlikus DNR fragmentų padauginimą su COI-Cic1, COI-Cic4 molekuliniais žymenimis. M – Gene RulerTM 100bp DNA Ladder Plus. 1R – 4R- Cicindela hybrida

3.2.3 Mitochondrinės DNR cox 1 geno sekų analizė

Molekulinių tyrimų metu buvo ištirtos 2 Cicinela genties vabalų rūšys. Cox 1 genas buvo amplifikuotas 4 šios genties individų DNR (priedas 2). Amplifikuoti fragmentai buvo sekvenuojami. Gauti COI geno 678 nukleotidų sekų fragmentai, esantys 717 nukleotidų pozicijos atkarpoje. DNR molekulinių žymenų paieškos metu nustatyta, kad specifinių, mitochondrinės DNR citochromo c oksidazės I (COI) geno atkarpą amplifikuojančių dvi pradmenų poros Pat ®, Jer ir COI-Cic1, COI-Cic4 (Cardoso, Vogler, 2005) yra tinkamos tirti Cicindela genties vabalus. C. hybrida ir C. maritima rūšių vabalų mitochondrinės DNR COI geno sekų analizė parodė skirtingą nukleotidų pasiskirstymo dažnį (14 lentelė). Visose sekvenuotose sekose aptikta 30% T(U), 14,2% C, 39,2% A ir 16,7% G nukleotidų. Gausiausiai T nukleotidų aptikta C. maritima sekoje – 30,1%. Didelį C nukleotidų kiekį turi abi rūšys – 14,2%. Daugiausia A nukleotidų rasta C. hybrida sekose – 39,4%. C. maritima sekoje aptikta didžiausias G nukleotidų procentas – 17,3%.

14 lentelė. Nukleotidų kompozicijos

Analizuojant Cicindela genties vabalus mitochondrinės DNA COI geno sekas aptikti 61 nukleotidų kodonas: 15 lentelėje pateikti visi kodonai, esantys sekose ir jų procentinis dažnis. Dažniausiai pasitaikantis kodonas šios šeimos drugių mitochondrinės DNR COI geno sekose yra AAU(N), kuris sudaro 19,8 %. Taip pat dažnai pasitaikantis kodonas yra AAA(K), kuris sudaro 14,8 %. Sekvenuotose sekose neaptikta 16 kodonų: UUA(F), CUU(L), CUC(L), CUA(L), CAA(Q),

51 CAG(Q), CGU(R), CGC(R), CGA(R), CGR(R), ACA(T), GCC(A), GCA(A), GAC(D), GAG(E), GGU(G).

15 lentelė. Kodonai sekvenuotose C. hybrida ir C. maritima vabalų rūšių mitochondrinės DNR COI geno sekose

*Šalia kiekvieno kodono skliaustuose nurodomas jo koduojamos aminorūgšties panaudojimo trumpinys iš vienos raidės. **Šalia kiekvieno skaičiaus skliaustuose nurodoma paklaida.

Sekvenuotose Cicindela hybrida ir C. maritima COI geno sekose buvo nustatyti 47 variabilūs nukleotidai iš 678 (34 pav.). 631 nukleotidai yra konservatyvūs šioms vabalų rūšims. Gauti rezultatai buvo apibendrinti ir sudarytas C. hybrida ir C. maritima vabalų rūšių mtDNR COI geno Neighbor-Joining (NJ) medis. Pateiktas medis yra nukleotidų tipo (Saitou, Nei, 1987), remiantis p-distance modeliu (32 pav.) Sudaranat NJ medį panaudoti 678 nukleotidai. Cicindela hybrida ir C. maritima rūšių individų sekos NJ medyje suformuoja 2 klasterius A ir B (32 pav.). Remiantis nustatytomis sekomis genetiškai panašūs yra A klasterio vabalai: C. hybrida (1), C. hybrida (2), C. hybrida (3). Tarp šių individų neaptikti variabilūs nukleotidai. B klasterį suformuoja tik vienas sekvenuotas C. maritima rūšies individas.

32 pav. C. hybrida ir C. maritima vabalų rųšių Neighbor-joining medis pagal p-distance modelį , remiantis mtDNR COI geno sekomis. Skalė apačioje parodo genetinį atstumą. Įkėlų (angl. bootstrop) reikšmės, pavaizduotos ant medžio šakų, gautos naudojant 1000 pakartojimų. C. hybrida seka (AJ583541) naudota kaip išorinė grupė

Cicindela hybrida ir C. maritima rūšių aminorūgščių NJ medyje susiformuoja taip pat 2 klasteriai A ir B (33 pav.). Konservatyvių sekos vietų aptikta 165 iš 236. Tuo tarpu variabilių vietų aptikta tik 36 iš 236. A klasteryje išsidėsto: C. hybrida (1), C. hybrida (2), C. hybrida (3) vabalai. B klasteryje yra C. maritima rūšis. Esminių skirtumų neaptikta tarp NJ medžio paremto nukleotidais ir NJ medžio remiantis aminorūgštimis. Jie sąlyginai identiški.

33 pav. C. hybrida ir C. maritima vabalų rūšių Neighbor-Joining amino rūgščių medis pagal p-distance modelį, remiantis mtDNR COI geno sekomis. Skalė apačioje parodo genetinį atstumą. Įkėlų (angl. bootstrop) reikšmės, pavaizduotos ant medžio šakų, gautos naudojant 1000 pakartojimų. C. hybrida seka (AJ583541) naudota kaip išorinė grupė

Remiantis sekvenuotomis COI geno sekomis buvo įvertinti C.hybrida ir C.maritima COI sekų genetinių atstumų skirtumai (16 lentelė).

53 16 lentelė. Genetinių atstumų skirtumai sekvenuotose COI geno sekose. Žymėjimas: 1. C. hybrida (1), 2. C. hybrida (2), 3. C. hybrida (3), 4. C. maritima (1)

Didžiausias genetinio atstumo skirtumas yra tarp C. hybrida (1, 2, 3) ir C. maritima (4) rūšies vabalų – 0,046. Genetinio atstumo skirtumo neaptikta tarp C. hybrida (1), C. hybrida (2), C. hybrida (3) vabalų rūšių.

34 pav. C. hybrida ir C. maritima vabalų rūšių mitochondrinės DNR COI geno sekos pažymetos vietos žymi polimorfinius lokusus

54 IŠVADOS

1. Esminis požymis identifikuojant C. hybrida ir C. maritima rūšių vabalus yra patinų genitalijų struktūros. Kiti 3 morfologiniai požymiai, kaip elitrų šviesi centrinė dėmė, blauzdų ir letenų ilgio santykis bei galvos šerelių pasiskirstymas kaktos srityje gali šiek tiek varijuoti ir sukelti keblumų identifikuojant šias rūšis;

2. Pritaikius molekulinius tyrimo metodus Cicindela vabalams, nustatyta, kad mtDNR cox1 geno sekos yra pakankamai informatyvios ir tinkamos šių vabalų tyrimuose, naudojant specifinius molekulinius žymenis: Pat®, Jer ir COI-Cic-1, COI-Cic-4; 3. Nustatyta, kad Cicindela genties vabalų sekvenuotose mitochondrinės DNR COI geno sekose iš 678 nukleotidų buvo nustatyti 47 variabilūs ir 631 konservatyvūs visiems ištirtiems vabalams; 4. Išaiškinta, kad Cicindela genties specifinėse COI geno sekose dažniausiai aptinkami A (%) ir T(U) (%) nukleotidai, bei dažniausiai pasitaikantis kodonas yra AAU(N) 19,8 %. Sekvenuotose sekose neaptikta 16 kodonų: UUA(F), CUU(L), CUC(L), CUA(L), CAA(Q), CAG(Q), CGU(R), CGC(R), CGA(R), CGR(R), ACA(T), GCC(A), GCA(A), GAC(D), GAG(E), GGU(G);

5. Didžiausias genetinio atstumo skirtumas yra tarp C. hybrida (1, 2, 3) ir C. maritima (4) rūšies vabalų – 0,046. Genetinio atstumo skirtumo neaptikta tarp C. hybrida (1), C. hybrida (2), C. hybrida (3) vabalų rūšių.

55 LITERATŪRA

1. Barraclough T. G. 2002. Recent Diversification Rates in North American Tiger Beetles Estimated from a Dated mtDNA Phylogenetic Tree. Society for Molecular Biology and Evolution 19(10): 1706–1716. 2. Behura S. K. 2006. Molecular marker systems in insects: current trends and future avenues. Journal compilation 15: 3087–3113. 3. Cardoso A., Vogler A. P. 2005. DNA taxonomy, phylogeny and Pleistocene diversification of the Cicindela hybrida species group (Coleoptera: Cicindelidae). Molecular Ecology 14: 3531–3546. 4. Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., Vrijenhoek R. 1994. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subnit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology 3: 294–297.

5. Freude H., Harde K. W., Lohse G. A. 1976. Die käfer mitteleuropas.

6. Gedminas A., Žiogas A., Tamutis V. 1996. Kai kurių saugotų gamtinių teritorijų entomofaunos tyrimai. Lietuvos entomologų darbai. Lietuvos entomologų draugijos 30- mečiui: 138–141. 7. Gilbert M. T. P., Moore W. 2007. DNA Extraction from Dry Museum Beetles without Conferring External Morphological Damage. PLoS ONE 2(3): 272–274. 8. Goldstein P. Z., Desalle R. 2003. Calibrating phylogenetic species formation in a threatened insect using DNA from historical specimens. Molecular Ecology 12: 1993–1998. 9. Hawthorne D. J. 2001. AFLP-based genetic linkage map of the Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata: sex chromosomes and a pyrethroid-resistance candidate gene. Genetics 158: 695–700. 10. Ivinskis P. 2000. Bestuburių zoologijos lauko praktika. Vilnius. 11. Kaila L., Stahls G. 2006. DNA barcodes: Evaluating the potential of COI to diffentiate closely related species of Elachista (Lepidoptera: Gelechioidea: Elachistidae) from Australia. Zootaxa 1170: 1–26 12. Lindroth C. H. 1985. Fauna entomologica Scandinavica. The Carabidae (Coleoptera) of Fennoscandia and Denmark. Scandinavian science Press 15: 35–39. 13. Loxdale H. D., Lushai G. 1998. Molecular markers in entomology. Bulletin of Entomological Research 88: 577–600.

56 14. Maddison D. R. 2008. Systematics of the north american beetle subgenus Pseudoperyphus (Coleoptera: Carabidae: Bembidion) based upon morphological, chromosomal and molecular data. Annals of carnagie museu 77: 147-193.

15. Martinez-Navarro E. M., Galian J., Serrano J. 2005. Phylogeny and molecular evolution of the tribe Harpalini (Coleoptera, Carabidae) inferred from mitochondrial cytochrome-oxidase I. Molecular Phylogenetics and Evolution 35: 127–146. 16. Matalin A. V. 1998. The Tiger-Beetles of “Hybrida”- species group (Coleoptera,Carabidae, Cicindelinae). III. A taxonomc review of the Iberian Cicinidela laguensis gautier, 1872 complex. Graellsia 54: 75–96. 17. Matalin A. V. 1999. The tiger-beetles of the hybrida species-group. II. A taxonomic review of subspecies of Cicindela sahlbergii Fischer von Waldheim, 1824 Advances in Carabidology 13–66. 18. Matalin A. V. 2000. On the Taxonomic Position of Cicindela resplendens Dokht.

(Coleoptera, Carabidae) within the Genus Cicindela L. Entomological Review 80 (6): 673– 677. 19. Miceikiene I., Paulauskas A., Grigaliūnaitė A., Malevičiūtė J., Tubelytė – Kirdienė V. 2002. Genetikos praktikumas (IV. DNR poimorfizmo tyrimo metodai). Kaunas. 20. Miller L. J. 1999. Identification of morphologically similar canegrubs (Coleoptera: Scarabaeidae: Melolonthini) using a molecular diagnostic technique. Australian Journal of Entomology 38: 189–196. 21. Morgan M., Vogler A. P. 2000. New Taxonomic Status of the Endangered Tiger Beetle Cicindela limbata albissima (Coleoptera: Cicindelidae): Evidence from mtDNA. Ecology and population biology 93: 1108–1115. 22. Pascual A. N., Suzuki K. M., Almeida F. S. 2006. Evaluation of the RAPD Profi les from Different Body Parts of Euglossa pleosticta Dressler Male Bees (Hymenoptera: Apidae, Euglossina). Neotropical Entomology 35: 811–817. 23. Pearcy M. A. S., Doums C. 2004. Conditional use of sex and parthenogenesis for worker and queen production in ants. Science 306: 1780–1783. 24. Pileckis S., Monsevičius V. 1995. Lietuvos fauna. Vilnius. 25. Pons J. 2006. DNA-based identification of preys from non-destructive, total DNA extractions of predators using arthropod universal primers. Jurnal compilation 10: 1471– 8286. 26. Pons J., Fujisawa T., Claridge E. M., Savill A. R., Barraclough T. G., Vogle A. P. 2011. Deep mtDNA subdivision within Linnean species in an endemic radiation of tiger beetles

57 from New Zealand (genus Neocicindela). Molecular Phylogenetics and Evolution 59: 251– 262. 27. Roderic D. M. 1996. TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on personal computers. Computer Applications in the Biosciences 12: 357–358. 28. Saitou N., Nei M., 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4(4): 406–425. 29. Smith R. F. 2004. Species of ground beetle (Coleoptera: Carabidae) in organic apple orchards of British Columbia. Journal of the Entomological Society of British Columbia 101: 93–100. 30. Sokolov M. I., Sokolova Y. Y., Carlton Ch. E. 2007. New species of Anillinus Casey (Carabidae: Trechinae: Bembidiini) from Great Smoky Mountains National Park, U.S.A. and phylogeography of the A. Langdoni species group. Magnolia press, Zootaxa 15442: 1- 20. 31. Stanczak J., Racewicz M., Kubica-Biernat B., Kruminis-Łozowska W., Dabrownski J., Adamczyk A., Markowska M. 1999. Prevalence of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks (Acari, Ixodidae) in different Polish woodlands. Annals of Agricultural and Environmental Medicine 6:127–132. 32. Sunderland K. D., Vickerman G. P. 1980. Aphid feeding by some polyphagous predators in relation to aphid density in cereal fields. Journal of Applied Ecology 17: 389–396. 33. Švitra G. 2008. Vabzdžių rinkimo tikslai ir būdai. 34. Tamura K., Dudley J., Masatoshi M., Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular biology and evolution 24(8): 1596– 1599. 35. Trautner J., Geigenmüller K. 1987. Tiger beetles. Ground beetles. Illustrated Key to the Cicindelidae and Carabidae of Europe. Germany. 36. Wallace S. K. 2004. Molecular gut analysis of Carabids (Coleoptera: Carabidae) using amphid primers. Annual Review of Entomology. Montana, 68. 37. Whitfield C.W., Band M. R., Bonaldo M. F. 2002. Annotated expressed sequence tags and cDNA microarrays for studies of brain and behavior in the honeybee. Genome Research 12: 555–566. 38. Woodcock M. R., Kippenhan M. G. 2007. Molecular genetics of Cicindela (Cylindera) terricola and elevation of C. lunalonga to species level, with comments on its conservation status. Conserv Genet 8: 865–877. 39. Бей-Биенко Г. Я. 1965. Эпределитель насекомыx европейскoй части CCCP. Москва. 40. http://www.plantbionet.lt/index.php?page=details&id=731 (2009-10-23)

58 41. http://www.nerija.lt (2009-11-01) 42. http://www.arkive.org/northern-dune-tiger-beetle/cicindela-hybrida/info.html (2009-10-23)

59 PRIEDAI

Priedas 1 1lentelė. Vabalų rūšis, blauzdų ir letenų ilgio santykis, galvos šerelių pasiskirstymas, elitrų centrinės dėmės forma, lytis, edeaguso forma Elitrų Mėg. Vabalų Blauzdų ir letenų Galvos šerelių centrinės rūšis ilgio santykis pasisikirstymas dėmės forma Lytis Įdegos forma Letenų Blauzdų igis ilgis 1. C. 5,5 6 Ties akių Centrinės ♂ Buka maritima viršutiniu dėmės ilgas viršūnė su kraštu (3 vidinis gumbeliais šereliai) susiaurėjimas 2. C. 6,5 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 3. C. 5 6 Ant kaktos Centrinės hybrida dėmės trumpas ♀ vidinis susiaurėjimas 4. C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 5. C. 6,2 7 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 6. C. 6,2 7 Ties akių Centrinės ♂ Buka maritima viršutiniu dėmės ilgas viršūnė su kraštu (3 vidinis gumbeliais šereliai) susiaurėjimas 7. C. 6 7 Ties akių Centrinės ♂ Buka maritima viršutiniu dėmės ilgas viršūnė su kraštu (3 vidinis gumbeliais šereliai) susiaurėjimas 8. C. 5,5 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Buka hybrida dėmės trumpas viršūnė su vidinis gumbeliais susiaurėjimas 9. C. 6 7 Ties akių Centrinės ♂ Buka maritima viršutiniu dėmės ilgas viršūnė su kraštu (3 vidinis gumbeliais šereliai) susiaurėjimas 10. C. 6,8 8 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 11. C. 6 6 Ties akių Centrinės ♀ maritima viršutiniu dėmės ilgas kraštu (2 vidinis šereliai) susiaurėjimas

60 1 lentelė. Vabalų rūšis, blauzdų ir letenų ilgio santykis, galvos šerelių pasiskirstymas, elitrų centrinės dėmės forma, lytis, edeaguso forma (tęsinys) Elitrų Mėg. Vabalų Blauzdų ir letenų Galvos šerelių centrinės rūšis ilgio santykis pasisikirstymas dėmės forma Lytis Įdegos forma Letenų Blauzdų igis ilgis 12. C. 6 7 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 13. C. 6 7 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės ilgas vidinis susiaurėjimas 14. C. 6,2 7 Ties akių Centrinės ♀ maritima viršutiniu dėmės ilgas kraštu (3 vidinis šereliai) susiaurėjimas 15. C. 6,8 7 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 16. C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 17. C. 6 7 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 18. C. 6,5 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 19. C. 6,5 7 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės ilgas vidinis susiaurėjimas 20. C. 6 7 Ties akių Centrinės ♀ maritima viršutiniu dėmės ilgas kraštu (3 vidinis šereliai) susiaurėjimas 21. C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės ilgas vidinis susiaurėjimas 22. C. 6,3 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 23. C. 6 7 Ties akių Centrinės ♀ maritima viršutiniu dėmės ilgas kraštu (3 vidinis šereliai) susiaurėjimas

61 1 lentelė. Vabalų rūšis, blauzdų ir letenų ilgio santykis, galvos šerelių pasiskirstymas, elitrų centrinės dėmės forma, lytis, edeaguso forma (tęsinys) Elitrų Mėg. Vabalų Blauzdų ir letenų Galvos šerelių centrinės rūšis ilgio santykis pasisikirstymas dėmės forma Lytis Įdegos forma Letenų Blauzdų igis ilgis 24. C. 6,6 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Buka hybrida dėmės trumpas viršūnė su vidinis gumbeliais susiaurėjimas 25. C. 7 7 Ties akių Centrinės ♀ maritima viršutiniu dėmės ilgas kraštu (3 vidinis šereliai) susiaurėjimas 26. C. 6 6 Ties akių Centrinės ♂ Buka maritima viršutiniu dėmės ilgas viršūnė su kraštu (3 vidinis gumbeliais šereliai) susiaurėjimas 27. C. 6,7 7 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 28. C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Buka hybrida dėmės trumpas viršūnė su vidinis gumbeliais susiaurėjimas 29. C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 30. C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Buka hybrida dėmės trumpas viršūnė su vidinis gumbeliais susiaurėjimas 31. C. 6,5 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Buka hybrida dėmės trumpas viršūnė su vidinis gumbeliais susiaurėjimas 32. C. 6,5 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Buka hybrida dėmės trumpas viršūnė su vidinis gumbeliais susiaurėjimas 33. C. 5,7 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 34. C. 6,5 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 35. C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas

62 1 lentelė. Vabalų rūšis, blauzdų ir letenų ilgio santykis, galvos šerelių pasiskirstymas, elitrų centrinės dėmės forma, lytis, edeaguso forma (tęsinys) Elitrų Mėg. Vabalų Blauzdų ir letenų Galvos šerelių centrinės rūšis ilgio santykis pasisikirstymas dėmės forma Lytis Įdegos forma Letenų Blauzdų igis ilgis 36. C. 6,3 6 Ties akių Centrinės ♂ Buka maritima viršutiniu dėmės ilgas viršūnė su kraštu (3 vidinis gumbeliais šereliai) susiaurėjimas 37. C. 5,8 6 Ties akių Centrinės ♀ maritima viršutiniu dėmės ilgas kraštu (3 vidinis šereliai) susiaurėjimas 38. C. 5,8 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Buka hybrida dėmės trumpas viršūnėsu vidinis gumbeliais susiaurėjimas 39. C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 40. C. 6,5 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 41. C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 42. C. 6,3 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 43. C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 44. C. 6,3 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 1R C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 2R C. 6,5 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 3R C. 6,3 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas

63 1 lentelė. Vabalų rūšis, blauzdų ir letenų ilgio santykis, galvos šerelių pasiskirstymas, elitrų centrinės dėmės forma, lytis, edeaguso forma (tęsinys) Elitrų Mėg. Vabalų Blauzdų ir letenų Galvos šerelių centrinės rūšis ilgio santykis pasisikirstymas dėmės forma Lytis Įdegos forma Letenų Blauzdų igis ilgis 4R C. 6,4 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 5R C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 6R C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 7R C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 8R C. 6 7 Ties akių Centrinės ♂ Buka maritima viršutiniu dėmės ilgas viršūnė su kraštu (2 vidinis gumbeliais šereliai) susiaurėjimas 9R C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 10R C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 11R C. 5 5 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 12R C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 13R C. 6 7 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 14R C. 6,4 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 15R C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas

64 1 lentelė. Vabalų rūšis, blauzdų ir letenų ilgio santykis, galvos šerelių pasiskirstymas, elitrų centrinės dėmės forma, lytis, edeaguso forma (tęsinys) Elitrų Mėg. Vabalų Blauzdų ir letenų Galvos šerelių centrinės rūšis ilgio santykis pasisikirstymas dėmės forma Lytis Įdegos forma Letenų Blauzdų igis ilgis 16R C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 17R C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas C. 18R hybrida 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♀ dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 19R C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 20R C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 21R C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 22R C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Buka hybrida dėmės trumpas viršūnė su vidinis gumbeliais susiaurėjimas 23R C. 6,3 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 24R C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 25R C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 26R C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas

65 1 lentelė. Vabalų rūšis, blauzdų ir letenų ilgio santykis, galvos šerelių pasiskirstymas, elitrų centrinės dėmės forma, lytis, edeaguso forma (tęsinys) Elitrų Mėg. Vabalų Blauzdų ir letenų Galvos šerelių centrinės rūšis ilgio santykis pasisikirstymas dėmės forma Lytis Įdegos forma Letenų Blauzdų igis ilgis 27R C. 6,7 7 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 28R C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 29R C. 6,3 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 30R C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas Centrinės 31R C. 6,2 6 Ant kaktos dėmės trumpas ♀ hybrida vidinis susiaurėjimas 32R C. 6,3 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 33R C. 5,7 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 34R C. 6,3 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 35R C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 36R C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 37R C. 6,3 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 38R C. 5,8 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas

66 1 lentelė. Vabalų rūšis, blauzdų ir letenų ilgio santykis, galvos šerelių pasiskirstymas, elitrų centrinės dėmės forma, lytis, edeaguso forma (tęsinys) Elitrų Mėg. Vabalų Blauzdų ir letenų Galvos šerelių centrinės rūšis ilgio santykis pasisikirstymas dėmės forma Lytis Įdegos forma Letenų Blauzdų igis ilgis 39R C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 40R C. 6 6 Ties akių Centrinės ♀ maritima viršutiniu dėmės ilgas kraštu (2 vidinis šereliai) susiaurėjimas 41R C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 42R C. 6 6 Ties akių Centrinės ♀ maritima viršutiniu dėmės ilgas kraštu (2 vidinis šereliai) susiaurėjimas 43R C. 6,3 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 6 Ties akių Centrinės 44R C. 6 viršutiniu dėmės ilgas ♂ Buka maritima kraštu (3 vidinis viršūnė su šereliai) susiaurėjimas gumbeliais 45R C. 6 6 Ties akių Centrinės ♀ maritima viršutiniu dėmės ilgas kraštu (2 vidinis šereliai) susiaurėjimas 46R C. 6,3 6 Ant kkatos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 47R C. 6,3 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 48R C. 5,2 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 49R C. 5,3 6 Ties akių Centrinės ♀ maritima viršutiniu dėmės ilgas kraštu (3 vidinis šereliai) susiaurėjimas 50R C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas

67 1 lentelė. Vabalų rūšis, blauzdų ir letenų ilgio santykis, galvos šerelių pasiskirstymas, elitrų centrinės dėmės forma, lytis, edeaguso forma (tęsinys) Elitrų Mėg. Vabalų Blauzdų ir letenų Galvos šerelių centrinės rūšis ilgio santykis pasisikirstymas dėmės forma Lytis Įdegos forma Letenų Blauzdų igis ilgis 51R C. 6,5 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 52R C. 6,7 7 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 53R C. 6 7 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 54R C. 5,3 5 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 55R C. 5,7 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 56R C. 5,6 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas Centrinės 57R C. 5,5 6 Ant kaktos dėmės trumpas ♀ hybrida vidinis susiaurėjimas 58R C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 59R C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 60R C. 6,3 6 Ant katos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 61R C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas

68 1 lentelė. Vabalų rūšis, blauzdų ir letenų ilgio santykis, galvos šerelių pasiskirstymas, elitrų centrinės dėmės forma, lytis, edeaguso forma (tęsinys) Elitrų Mėg. Vabalų Blauzdų ir letenų Galvos šerelių centrinės rūšis ilgio santykis pasisikirstymas dėmės forma Lytis Įdegos forma Letenų Blauzdų igis ilgis 62R C. 6 6 Ties akių Centrinės ♀ maritima viršutiniu dėmės ilgas kraštu (3 vidinis šereliai) susiaurėjimas 63R C. 6,3 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 64R C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 65R C. 6,2 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 66R C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 67R C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 68R C. 5,7 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 69R C. 5,8 6 Ant kaktos Centrinės ♂ Smaili hybrida dėmės trumpas viršūnė be vidinis gumbelių susiaurėjimas 6 Centrinės 70R C. 6 Ant kaktos dėmės trumpas ♂ Smaili hybrida vidinis viršūnė be susiaurėjimas gumbelių 71R C. 6,3 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 72R C. 6 6 Ant katos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas 73R C. 6,3 6 Snt kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas

69 1 lentelė. Vabalų rūšis, blauzdų ir letenų ilgio santykis, galvos šerelių pasiskirstymas, elitrų centrinės dėmės forma, lytis, edeaguso forma (tęsinys) Elitrų Mėg. Vabalų Blauzdų ir letenų Galvos šerelių centrinės rūšis ilgio santykis pasisikirstymas dėmės forma Lytis Įdegos forma Letenų Blauzdų igis ilgis 74R C. 6 6 Ties akių Centrinės ♀ maritima viršutiniu dėmės ilgas kraštu (3 vidinis šereliai) susiaurėjimas 75R C. 6 6 Ant kaktos Centrinės ♀ hybrida dėmės trumpas vidinis susiaurėjimas

Meržijevskio Cicindela genties, muziejinės kolekcijos apibūdintų vabalų analizė pateikta 2 lentelėje.

2 lentelė. Vabalų rūšis, blauzdų ir letenų ilgio santykis, galvos šerelių pasisikirstymas, elitrų centrinės dėmės forma, lytis

Nr. Lytis Blauzdų ir letenų Galvos šerelių Elitrų centrinės Vabalų rūšis ilgio santykis pasisikirstymas dėmės forma

Letenų Blauzdų igis μm ilgis μm

1. C. hybrida 6,2 5,8 Ant kaktos Centrinės dėmės Patinas trumpas vidinis susiaurėjimas

2. C. hybrida 5,3 5,7 Ant kaktos Centrinės dėmės Patelė trumpas vidinis susiaurėjimas

3. C. hybrida 5,8 5,8 Ant kaktos Centrinės dėmės Patinas trumpas vidinis susiaurėjimas

4. C. hybrida 5 5,8 Ant kaktos Centrinės dėmės Patelė trumpas vidinis susiaurėjimas

5. C. hybrida 5 5 Ant kaktos Centrinės dėmės Patinas trumpas vidinis susiaurėjimas

6. C. hybrida 5,8 6 Ant kaktos Centrinės dėmės Patinas trumpas vidinis susiaurėjimas

70 2 lentelė. Vabalų rūšis, blauzdų ir letenų ilgio santykis, galvos šerelių pasisikirstymas, elitrų centrinės dėmės forma, lytis (tęsinys)

Nr. Lytis Blauzdų ir letenų Galvos šerelių Elitrų centrinės Vabalų rūšis ilgio santykis pasisikirstymas dėmės forma

Letenų Blauzdų igis μm ilgis μm

7. C. hybrida 5,5 5,5 Ant kaktos Centrinės dėmės Patelė trumpas vidinis susiaurėjimas

8. C. hybrida 5,5 5,5 Ant kaktos Centrinės dėmės Patinas trumpas vidinis susiaurėjimas

9. C. hybrida 6 5,9 Ant kaktos Centrinės dėmės Patinas trumpas vidinis susiaurėjimas

10. C. hybrida 5 5 Ant kaktos Centrinės dėmės Patelė trumpas vidinis susiaurėjimas

11. Cicindela sp. 5,8 5,8 Ant kaktos Centrinės dėmės Patelė trumpas vidinis susiaurėjimas

12. Cicindela sp. 5 5,2 Ant kaktos, ties Centrinės dėmės Patelė akių viršutiniu trumpas vidinis kraštu (2 šėreliai) susiaurėjimas

13. Cicindela sp. 4,3 5,3 Ant kaktos Centrinės dėmės Patelė trumpas vidinis susiaurėjimas

14. Cicindela sp. 6 6 Ant kaktos, ties Centrinės dėmės Patinas akių viršutiniu trumpas vidinis kraštu (1 šėrelis) susiaurėjimas

15. Cicindela sp. 5,6 5,9 Ant kaktos, ties Centrinės dėmės Patinas akių viršutiniu trumpas vidinis kraštu (3 šėreliai) susiaurėjimas

16. Cicindela sp. 5,2 5 Ant kaktos Centrinės dėmės Patelė trumpas vidinis susiaurėjimas

17. Cicindela sp. 4,2 5,2 Ant kaktos Centrinės dėmės Patelė trumpas vidinis susiaurėjimas

71 2 lentelė. Vabalų rūšis, blauzdų ir letenų ilgio santykis, galvos šerelių pasisikirstymas, elitrų centrinės dėmės forma, lytis (tęsinys)

Nr. Lytis Blauzdų ir letenų Galvos šerelių Elitrų centrinės Vabalų rūšis ilgio santykis pasisikirstymas dėmės forma

Letenų Blauzdų igis μm ilgis μm

18. Cicindela sp. 5 5,8 Ant kaktos, ties Centrinės dėmės Patelė akių viršutiniu trumpas vidinis kraštu (2 šėreliai) susiaurėjimas

19. Cicindela sp. 5,5 5,5 Ant kaktos Centrinės dėmės Patinas ilgas vidinis susiaurėjimas

20. Cicindela sp. 6 6 Ant kaktos Centrinės dėmės Patelė ilgas vidinis susiaurėjimas

21. C. maritima 4,8 5,5 Ant kaktos, ties Centrinės dėmės Patelė akių viršutiniu ilgas vidinis kraštu (3 šereliai) susiaurėjimas

22. C. maritima 4,9 5,5 Ant kaktos, ties Centrinės dėmės Patelė akių viršutiniu trumpas vidinis kraštu (3 šereliai) susiaurėjimas

23. C. maritima 4,8 5,6 Ant kaktos, ties Centrinės dėmės Patelė akių viršutiniu trumpas vidinis kraštu (3 šereliai) susiaurėjimas

24. C. maritima 4 5,3 Ant kaktos, ties Centrinės dėmės Patinas akių viršutiniu trumpas vidinis kraštu (3 šereliai) susiaurėjimas

25. C. maritima 4,8 5 Ant kaktos, ties Centrinės dėmės Patelė akių viršutiniu trumpas vidinis kraštu (3 šereliai) susiaurėjimas

26. C. maritima 5,2 6 Ant kaktos, ties Centrinės dėmės Patinas akių viršutiniu ilgas vidinis kraštu (3 šereliai) susiaurėjimas

27. C. maritima 6 6,2 Ant kaktos, ties Centrinės dėmės Patinas akių viršutiniu trumpas vidinis kraštu (3 šereliai) susiaurėjimas

72 2 lentelė. Vabalų rūšis, blauzdų ir letenų ilgio santykis, galvos šerelių pasisikirstymas, elitrų centrinės dėmės forma, lytis (tęsinys)

Nr. Lytis Blauzdų ir letenų Galvos šerelių Elitrų centrinės Vabalų rūšis ilgio santykis pasisikirstymas dėmės forma

Letenų Blauzdų igis μm ilgis μm

28. C. maritima 5,1 5,7 Ant kaktos, ties Centrinės dėmės Patelė akių viršutiniu trumpas vidinis kraštu (3 šereliai) susiaurėjimas

29. C. maritima 4,2 5,3 Ant kaktos, ties Centrinės dėmės Patelė akių viršutiniu ilgas vidinis kraštu (3 šereliai) susiaurėjimas

30. C. maritima 4,5 5 Ant kaktos, ties Centrinės dėmės Patelė akių viršutiniu ilgas vidinis kraštu (3 šereliai) susiaurėjimas

73 Priedas 2

1 pav. Sekvenuotos C. hybrida ir C. maritima vabalų rūšių mitochondrinės DNR COI geno sekos