Aloe Analavelonensis Letsara (Vaho) Et Aloe Helenae Danguy (Vahondrandra) : Caractérisations En Vue De Leurs Valorisations À Madagascar »

Université d’Antananarivo

Ecole Supérieure Polytechnique d`Antananarivo Ecole Doctorale « Génie des Procédés et des Systèmes Industriels, Agricoles et Alimentaires »

L’Excellence au service du Développement

Thèse pour lòbtention dùn Diplôme de Doctorat de lÙniversité dÀntananarivo

« Génie des Procédés et des Systèmes Industriels, Agricoles et Alimentaires (GPSIAA) »

Aloe analavelonensis Letsara (Vaho)

et Aloe helenae Danguy (Vahondrandra) :

caractérisations en vue de leurs valorisations à Madagascar.

par Rokiman LETSARA

11 Novembre 2020

Vaho Vahondrandra

Université d’Antananarivo

Ecole Supérieure Polytechnique d`Antananarivo Ecole Doctorale « Génie des Procédés et des Systèmes Industriels, Agricoles et Alimentaires »

L’Excellence au service du Développement Thèse pour lòbtention dùn Diplôme de Doctorat de lÙniversité dÀntananarivo

« Génie des Procédés et des Systèmes Industriels, Agricoles et Alimentaires (GPSIAA) »

Aloe analavelonensis LETSARA (Vaho)

et Aloe helenae Danguy (Vahondrandra) :

caractérisations en vue de leurs valorisations à Madagascar.

par Rokiman LETSARA

Soutenue le 11 Novembre 2020, devant la commission d`examen

PRESIDENT : Professeur Jean Roger Emile RASOARAHONA RAPPORTEUR EXTERNE : Professeur Rado RASOLOMAMPIANINA RAPPORTEUR INTERNE : Professeur Nicole RAMANAMBE RAVELOMANANTSOA EXAMINATEUR : Professeur Miadana Harisoa FARAMALALA EXAMINATEUR : Professeur Nambinina Richard Fortuné RANDRIANA

DIRECTEUR DE THESE : Professeur Baholy ROBIJAONA RAHELIVOLOLONIAINA

REMERCIEMENTS Le présent travail a essentiellement été réalisé au Centre National de Recherches sur lÈnvironnement (CNRE). Je tiens donc à remercier les différents responsables de màvoir accueilli dans leur équipe. Ainsi, mes vifs remerciements sàdressent à :

- M Jean Roger Emile Rasoarahona, Professeur Titulaire, Président de Jury de cette thèse, Enseignant-Chercheur à lÈcole Supérieure des Sciences Agronomiques dÀntananarivo (ESSA), Directeur de lÈcole Doctorale Génie Des Procédés et des Systèmes Industriels Agricoles et Alimentaires (GPSIAA). - M Rado Rasolomampianina, Directeur de Recherche Associé, Rapporteur Externe, Chercheur- Enseignant, Chef du Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement auprès du Centre National de Recherches sur lÈnvironnement (CNRE), pour avoir suivi de près mon travail auprès du CNRE et accepté de le rapporter aujourd’hui.

- Mme Nicole Ramanambe Ravelomanantsoa, Professeur Titulaire, Rapporteur Interne, Enseignant- Chercheur à lÈcole Supérieure Polytechnique dÀntananarivo (ESPA), Responsable Equipe dÀccueil Ecole Doctorale Génie Des Procédés et des Systèmes Industriels Agricoles et Alimentaires (GPSIAA), pour avoir accepté de rapporter mon travail, pour les qualités de vos conseils, votre disponibilité ainsi que votre enseignement.

- Mme Miadana Harisoa Faramalala, Professeur Titulaire, Enseignant-Chercheur à la Faculté des Sciences, Equipe dÀccueil de lÈcole Doctorale Sciences du Végétal qui a examiné ce travail et accepté d’être parmi les membres de Jury, malgré ses nombreuses occupations. Veuillez trouver ici lèxpression de mon profond respect.

- M. Nambinina Richard Fortuné Randriana, Professeur, Enseignant-Chercheur à lÈcole Supérieure Polytechnique dÀntananarivo (ESPA), Chef de Mention Génie Des Procédés et des Systèmes Industriels Agricoles et Alimentaires (GPSIAA), pour avoir accepté de juger ce présent travail. Veuillez trouver ici lèxpression de mes sincères remerciements. - Mme Baholy Robijaona Rahelivololoniaina, Professeur agrégé CAMES. Directeur de thèse, Enseignant-Chercheur à lÈcole Supérieure Polytechnique dÀntananarivo (ESPA), Ecole Doctorale Génie Des Procédés et des Systèmes Industriels Agricoles et Alimentaires (GPSIAA). Vous màvez fait le grand honneur dàccepter d’être le Directeur de thèse. Je tiens à vous remercier pour votre disponibilité et votre confiance. Veuillez trouver dans ce travail lèxpression de ma plus vive reconnaissance et de mon profond respect.

Mes vifs remerciements s`adressent également à tous ceux qui, de près ou de loin ont contribué à la réalisation de la présente thèse. Mes remerciements s`adressent à :

- M. Heriniaina Ramanankierana, Directeur de Recherche Associé, Chercheur-Enseignant, Directeur Général de la Recherche Scientifique auprès du Ministère de lÈnseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique, ancien Directeur du Centre National de Recherches sur lÈnvironnement (CNRE), pour avoir accepté de me recevoir en tant que stagiaire auprès du Centre National de Recherches sur lÈnvironnement (CNRE).

- M. Rigobert Andrianantenaina, Docteur, Chef de Laboratoire: Chimie des Substances Naturelles, Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement auprès du Centre National de Recherches sur l`Environnement (CNRE), pour m`avoir aidé et soutenu dans la réalisation des travaux de laboratoires pour cette thèse. Ton extrême gentillesse et ton amitié qui me sont si chères, je ne te remercierai jamais assez.

- Mme Onja Andriambeloson, Maitre de Recherches, Chercheur-Enseignante, Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement, Chef de Laboratoire d’Hygiène Alimentaire auprès du Centre National de Recherches sur l`Environnement (CNRE), pour son assistance aux travaux de manipulations microbiologiques.

- M. Franck Rakotonasolo, Docteur, Chef de Division Jardin au Département Flore, Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza (PBZT), Chercheur au Royal Botanic Gardens Kew (RBG Kew), pour ses conseils et discussions pour l`amélioration de notre recherche.

- Les équipes du Département Flore du PBZT, pour m`avoir soutenu et encouragé durant toute mes études.

Et à tous ceux que j`ai oubliés … MERCI

Psaume 23

A ma famille

J`espère que vous serez fiers de moi et avec tout mon amour, je vous dédie cette thèse

SOMMAIRE

INTRODUCTION GENERALE

1ère Partie : GENERALITES SUR LES ALOES

CHAPITRE 1 : CONSIDERATIONS SUR LES ALOES

CHAPITRE 2 : LOCALISATION DE Aloe analavelonensis Letsara ET Aloe helenae Danguy

CHAPITRE 3 : MODELISATION DES HABITATS NATURELS ET TYPES ECOLOGIQUES DE Aloe analavelonensis Letsara ET Aloe helenae Danguy

2ème Partie : METHODOLOGIE DE L`ETUDE PHYTOCHIMIQUE ET ACTIVITE BIOLOGIQUE SUR Aloe analavelonensis Letsara ET Aloe helenae Danguy

CHAPITRE 4 : LE SCREENING PHYTOCHIMIQUE

CHAPITRE 5 : MISE EN EVIDENCE DES ACTIVITES ANTIOXYDANTES DES EXTRAITS

CHAPITRE 6 : TESTS DES ACTIVITES ANTIMICROBIENNES

CHAPITRE 7 : TESTS DE TOXICITE DES EXTRAITS

CHAPITRE 8 : EVALUATION DE L`EFFET LARVICIDE 3ème Partie : RESULTATS DES ETUDES ECOLOGIQUES, PHYTOCHYMIQUES ET ACTIVITES BIOLOGIQUES

CHAPITRE 9 : MODELES DE NICHE ECOLOGIQUE FAVORABLE POUR LES DEUX ESPECES

CHAPITRE 10 : RESULTATS DES SCREENING PHYTOCHIMIQUES

CHAPITRE 11 : RESULTATS DES ACTIVITES ANTIOXYDANTES CHEZ LES DEUX ESPECES

CHAPITRE 12 : RESULTATS DES TESTS MICROBIOLOGIQUES

CHAPITRE 13 : RESULTATS DES TESTS DE TOXICITE

CHAPITRE 14 : RESULTATS DES ACTIVITES LARVICIDES

DISCUSSION GENERALE CONCLUSION GENERALE

LISTE DES FIGURES

Figure 01 : Gravure égyptienne, avec des plantes d`Aloès. 05

Figure 02 : Les Aloès décrits par l`auteur 08

Figure 03 : La plante entière de Aloe analavelonensis 11

Figure 04 : Périanthe de la fleur de Aloe analavelonensis 11

Figure 05 : Pollen de Aloe analavelonensis vu au microscope électronique. 11

Figure 06 : Fleurs de Aloe helenae 14

Figure 07 : La plante en fleur de Aloe helenae 14

Figure 08 : Inflorescence de Aloe helenae 14

Figure 09: Carte de distribution de Aloe analavelonensis recensés dans la nature établie avec 18 GeoCAT Figure 10 : Carte de distribution de Aloe helenae recensés dans la nature établie avec GeoCAT 18

Figure 11 : Appareil lyophilisateur auprès du CNRE 25

Figure 12 : Ballon à décanter auprès du CNRE 25

Figure 13 : Schéma des différents processus de l`extraction des alcaloïdes 30

Figure 14 : Schéma des différents processus de l`extraction des polysaccharides 31

Figure 15 : Photo du rotavapor pour l`évaporation et séchage des extraits 32

Figure 16 : Extraits d`alcaloïdes et poudre de polysaccharides obtenus à partir des feuilles 41

Figure 17 : Hotte à flux laminaire pour l’inoculation des souches microbiennes auprès du CNRE 43

Figure 18 : Etuve pour l`incubation des souches microbiennes auprès du CNRE 49

Figure 19 : Méthode de diffusion par disque 50

Figure 20 : Lieu de récolte des larves 52

Figure 21 : Acclimatation des larves au labo pendant 24 h 52

LISTE DES FIGURES (suite)

Figure 22 : Photo des adultes de Culex quinquefasciatus 53

Figure 23 : Habitat de Culex quinquefasciatus : Canal Andriantany 53

Figure 24 : Tests de propriétés larvicides des extraits 54

Figure 25 : Gavage de souris dans l`animalerie de PBZT 58

Figure 26 : Courbe représentant la fiabilité du modèle proposé sur MaxEnt de Aloe 60

analavelonensis

Figure 27: Carte de distribution potentielle de Aloe analavelonensis 61

Figure 28: Carte des habitats favorables pour Aloe analavelonensis 62

Figure 29 : Profil écologique en diagramme de Aloe analavelonensis 64

Figure 30 : Aloe analavelonensis et son habitat naturel (Forêt d`Analavelona, Sakaraha) 64

Figure 31 : Courbe représentant la fiabilité du modèle proposé sur Maxent de Aloe helenae 66

Figure 32 : Carte de distribution favorable pour Aloe helenae 67

Figure 33 : Carte des habitats favorables pour Aloe helenae 68

Figure 34: Profil écologique en diagramme de Aloe helenae 69

Figure 35: Aloe helenae et son habitat naturel (Forêt de Petriky, Fort Dauphin) 70

Figure 36: Migration des extraits sur Chromatographie sur Couche Mince (CCM). 75

Figure 37: Effet scavenger du radical DPPH 76

Figure 38 : Résultats négatifs des tests sur des polysaccharides 80

Figure 39 : Résultat de l`aromatogramme sur les extraits testés 81

Figure 40 : Variation du taux de mortalité des larves en fonction des concentrations utilisées 88

Figure 40 : Diagramme de Concentration Létale CL50 pour les deux espèces 89

Figure 41 : Photos de quelques espèces d`Aloès cités dans cet ouvrage 91

iii

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 01 : Liste des études taxonomiques effectuées 09 Tableau 02 : Résumé des cinq critères utilisés de la liste rouge de l’UICN 15 Tableau 03 : Les différents extraits utilisés pour les tests microbiologiques 43 Tableau 04 : Les différentes souches microbiennes utilisées pour les tests. 45 Tableau 05 : Lecture des résultats du test aromatogramme selon Ponce et al. 2003 50 Tableau 06 : Classe de toxicité, selon l’échelle de toxicité de Hodge et Sterner (1943) 59 Tableau 07: Interprétation du tableau exprimant la probabilité dòccurrence de Aloe 61 analavelonensis par MaxEnt Tableau 08 : Contribution des variables écologiques sur la répartition de Aloe analavelonensis 63 Tableau 09 : Interprétation du tableau exprimant la probabilité dòccurrence de Aloe helenae par 66 MaxEnt Tableau 10 : Contribution des variables écologiques sur la répartition de Aloe helenae 67 Tableau 11: Résultats des réactions de caractérisation des contenus dans l'extrait dÀloes 72 analavelonensis Tableau 12: Résultats des réactions de caractérisation des contenus dans l'extrait dÀloes helenae 73 Tableau 13: Pourcentage dìnhibition des extraits 76 Tableau 14 : Pourcentage dìnhibition de làcide ascorbique 77 Tableau 15: Concentration Inhibitrice à 50% des deux espèces comparée avec de làcide 77 ascorbique Tableau 16 Résultats des tests antioxydants pour les extraits bruts et alcaloïdes 78 Tableau 17 Comparaison des activités antimicrobiennes 82 Tableau 18 Mortalité (%) de larves testées 87

Tableau 19 Concentration Létale CL50 pour les deux espèces avec C. quinquefasciatus 88 Tableau 20 : Synthèse bibliographique des effets larvicides des Aloès 90

LISTE DES ANNEXES

Annexe 1 : Curriculum Vitae de Letsara Rokiman I

Annexe 2: Poster Réalisé concernant les Aloes lors du GIS day 2014) IX

Annexe 3: Article sur la découverte de trois nouvelles espèces d`Aloès X

Annexe 4 : Article sur des études chromatographiques faites sur les Aloès XXVII

Annexe 5 : Article sur l`évaluation de la toxicité de deux Aloès XXXVIII

LISTE DES ABBREVIATIONS

3CL PRO 3-chymotrypsin-like protease ADN : Acide Désoxyribonucléique AGPI : Acide Gras Polyinsaturé ANOVA : Analysis of Variance ARN : Acide Ribonucléique AUC : Area Under the Curve AVC : Accident Vasculaire Cérébral CAMES : Conseil Africain et Malgache pour lÈnseignement Supérieur CAS : California Academy of Sciences CCM : Chromatographie sur Couche Mince CITES : Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora CL : Concentration Létale CNRE : Centre National de Recherches sur lÈnvironnement DL : Dose Létale DMT : Dose Maximale Tolérée DO : Densité Optique DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ESPA : Ecole Supérieure Polytechnique dÀntananarivo GBIF : Global Biodiversity Information Facility GeoCAT : Geospatial Conservation Assessment Tool GPSIAA : Génie des Procédés et des Systèmes Industriels, Agricoles et Alimentaires GPX : Glutathion Peroxydase HPLC: High Pressure Liquid Chromatography HTST : High Temperature Short Time IMVAVET : Institut Malgache des Vaccins Vétérinaires IUCN : International Union for Conservation of Nature J.C. Jésus Christ

LISTE DES ABBREVIATIONS (suite)

K : Herbier du Royal Botanic Garden`s Kew MaxEnt : Maximum Entropy OMS : Organisation Mondiale de la Santé P : Herbier de Paris PBZT : Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza RBG Kew: Royal Botanic Gardens Kew S : Herbier du Swedish Museum of Natural History SAVA: Régions Sambava - Antalaha - Vohémar - Andapa SOD: Superoxyde Dismutase SRO Espèce Réactive à l'Oxygène ou ROS TAN: Herbier de Tananarive

vii

GLOSSAIRE

Fourré : -Type de végétation, surtout tropical, caractérisé par la présence de nombreux petits arbres ou arbustes, Massif de bois jeunes et serrés, dont les tiges sont encore garnies de leurs branches dès la base. Holotype : -Le seul spécimen ou illustration utilisé par l'auteur, ou désigné par l'auteur comme type nomenclatural. Humidité -Consiste en une humidité causée par l'ascension d'air humide au-dessus d'une orographique barrière (un relief terrestre en hauteur tel qu'une montagne ou une colline haute). Indigène : -En biogéographie, une espèce, un taxon ou une population est défini comme indigène (ou autochtone) à une région donnée ou à un écosystème si sa présence dans cette région est le résultat de processus naturels, sans intervention humaine. Isotype : -Tout spécimen en double de l'holotype Lectotype : -Un spécimen ou une illustration désignée comme type lorsqu'aucun holotype n'était indiqué au moment de la publication. Lectotypification : -Spécimen choisi comme Type d'espèce ou sous-espèce si l'auteur du nom scientifique omet de désigner un type Taxa : -Pluriel du nom taxon Taxon : -C`est une entité conceptuelle (n'importe quel rang, tel qu'une espèce, une famille ou une classe) qui est censée regrouper tous les organismes vivants possédant en commun certains caractères taxonomiques ou diagnostiques bien définis. Taxonomie : - Une branche des sciences naturelles (rebaptisée biologie au XXe siècle), qui ou taxinomie a pour objet de décrire la diversité des organismes vivants et de les regrouper en entités appelées taxons afin de les identifier (notamment grâce aux clés de détermination), les décrire, les nommer et les classer Type : - Une espèce désignée

viii

INTRODUCTION GENERALE

Introduction générale

INTRODUCTION GENERALE

Pendant des décennies, le placement du genre Aloe L. chez les Liliacées est resté incontesté (Perrier de la Bâthie, 1938; Reynolds, 1966). Bien que sa relation avec les genres sud-africains alliés comme Astroloba Uitew., Chortolirion A. Berger, Haworthia Duval, Gasteria Duval et Poellnitzia Uitew soit bien établie et sans controverse (Smith & Steyn, 2004), le placement familial d'Aloe et de ses alliés a fait l’objet d’opinions non réglées fondées sur des études phylogénétiques à la fois morphologiques et moléculaires. L'Aloès a été reconnu comme un membre de sa propre famille, les Aloaceae (Newton, 2001, 2004; Smith & Steyn, 2004), mais il a également été attribué aux Asphodelaceae (Smith & Van Wyk, 1998; Heywood, 2007), la Xanthorrhoeaceae sous-famille des Asphodeloideae (Stevens, 2001; Angiosperm Phylogeny Group III, 2009 ; The Plant List, 2020) et Asphodelaceae selon le système Angiosperm Phylogeny Group APG IV, 2016.

Aloe L., avec 624 taxons (Grace, 2011), est un genre largement africain avec un centre majeur de diversité en Afrique du Sud et à Madagascar (Reynolds, 1966; Mabberley, 2008; Castillon et Castillon 2010; Grâce, 2011). Avec 132 espèces décrites (Dee & Grace, 2018 ; Rakotoarisoa, 2019), le genre Aloe constitue un des grands groupes de plantes à Madagascar. Les Aloès se trouvent dans différents types d’habitat allant des régions humides aux régions arides malgaches. Certaines espèces ont une aire de répartition vaste comme Aloe acutissima, A. capitata, A. deltoideodonta, A. divaricata, A. macroclada (Lavranos in Castillon et Castillon, 2010), mais beaucoup d’espèces ont une distribution très restreinte comme A. suarezensis, A. guillaumetii, A. rauhii, A. bakeri, A. descoingsii, A. analavelonensis, A. beankaensis, A. ivakoanyensis, A. bernadettae (Rauh, 1995 ; Letsara et al. 2012). Trois espèces sont éteintes dans la nature : A. oligophylla, A. schilliana, et A. silicola (Rakotoarisoa et al. 2014). Presque 50% des taxa connus sont représentés seulement par le spécimen type, ce qui mène à conclure que la moitié des espèces malgaches sont rares et les informations sur leur aire de distributions sont encore floues (Letsara et al. 2012). Les pressions qui pèsent sur les Aloès malgaches sont toutes d’origines humaines, mais ils ne peuvent pas également s’échapper à l’actuel effet du changement climatique. Aloe est une des espèces de plantes succulentes malgaches largement collectée de manière illicite à cause de sa vertu médicale

Introduction générale

et son utilisation dans l’horticulture. Par ailleurs à cause des feux de brousses, déforestation, collecte illicite, sècheresse… tous les Aloès malgaches sont menacés de disparition dans leur milieu naturel (Castillon et Castillon, 2010). A cause de leurs vertus médicinales, les Aloès sont très recherchés à Madagascar (Ralamboranto, 1981) mais seules certaines espèces sont régies par la CITES. Les différentes espèces existantes sont en cours d`évaluation dans la liste rouge IUCN. En plus, environ 71 espèces et taxa n’ont pas été récoltés pendant plus de 50 ans à Madagascar et de nouvelles espèces sont en attente de description (Letsara et al. 2012). Jusqu’ici les données sur les Aloès sont dispersées, aucune base de données n’est disponible et les informations sur la plupart des espèces sont encore incomplètes afin de pouvoir ressortir les stratégies d’action pour leur conservation. De nombreux auteurs ont déjà publié des études phytochimiques et pharmacologiques de quelques espèces dÀloe malgache. Les plus étudiées sont Aloe macroclada Baker et Aloe vaombe Decorse & Poiss. Rabarisoa et al. 2017 par exemple ont déjà étudié les propriétés pharmacologiques de lÀloe macroclada ; Ralamboranto (1981) par contre a montré une monographie d’Aloe vaombe ; Randrianarison (2013) a étudié la propriété chimique de quelques espèces dÀloès malgaches. Mais pour les espèces que nous avons choisies, peu dìnformations, voire inexistantes sur la distribution, ni l`étude phytochimique, ni l`étude pharmacologique nònt été publiées. Ce sont des espèces menacées dèxtinction et qui ont un Statut de Conservation en danger Aloe analavelonensis Letsara et Aloe helenae Danguy. Cette étude est intitulée « Aloe analavelonensis Letsara (Vaho) et Aloe helenae Danguy (Vahondrandra) : caractérisations en vue de leurs valorisations à Madagascar ». Elle consiste d’une part à inventorier, avec une mise à jour, la connaissance sur la distribution de deux espèces dÀloe endémiques de Madagascar et dàutre part à faire des études phytochimiques et pharmacognosiques afin d’obtenir des appuis scientifiques solides pour la conservation de ses espèces et de leurs habitats naturels. Les hypothèses suivantes ont été émises et sont à vérifier : 1- Aloe helenae et Aloe analavelonensis ont des préférences écologiques de distribution dans la nature 2- Les extraits de feuilles contiennent des alcaloïdes et des polysaccharides 3- Les extraits bruts de feuilles ont des activités biologiques antioxydantes, antimicrobiennes, larvicides et toxiques.

1ère Partie :

GENERALITES SUR LES ALOES

1ère Partie

1ère Partie : GENERALITES SUR LES ALOES

CHAPITRE 1 : CONSIDERATIONS SUR LES ALOES

1.1.1. INTRODUCTION SUR LES ALOES

Les Aloès ont colonisé tous les principaux habitats de Madagascar, des forêts tropicales aux hauts sommets des hauts plateaux du centre et des forêts sèches du sud (Orlando, 2013). C'est un élément typique de la flore succulente des îles de l'Océan Indien, de Madagascar, des îles des Mascareignes, de Maurice, de la Réunion et des Seychelles (Dee & Grace, 2018). Les mêmes auteurs ont signalé environ 132 Aloe indigènes, qui sont toutes endémiques de Madagascar et menant à considérer l'île comme un centre majeur de diversité d'Aloès. Les Aloès se présentent sous diverses formes de croissance, de petites miniatures aux grands arbres, et tous ceux qui se trouvent entre les deux (Klopper & Smith, 2013). Outre ses hétérogénéités morphologiques et géographiques, les preuves phylogénétiques ont montré (à l'exclusion du groupe morpho Lomatophyllum) une unité non monophylétique chez les Aloe spp malgaches (Dee & Grace, 2018) ce qui conduit à la difficulté de les identifier au niveau des espèces.

L'objectif de notre recherche est donc d`enrichir les connaissances sur la distribution, les niches écologiques favorables pour deux espèces d`Aloe en danger de Madagascar.

On connaît également depuis des années les propriétés pharmacologiques des Aloès dans le monde. En raison de ses composés phytochimiques, un A. vera (L.) Burm.f. non indigène est largement cultivé (syn.: Aloe barbadensis Miller) aurait une propriété antioxydante (Miladi & Damak, 2008). Cette propriété antioxydante est très marquée chez Aloe helenae Danguy (Letsara et al. 2020b).

1.1.2. HISTORIQUE ET UTILISATION DES ALOES DANS LE MONDE

Le mot Aloe vient du grec aloê ; de l`arabe il se dit alloeh, en chinois alo-hei, qui signifie «chose amère», sans doute à cause du goût amer de son jus.

L`utilisation des Aloès est déjà citée dans des régions du monde bien éloignées. Depuis longtemps, cette plante a été utilisée pour prévenir et guérir de nombreuses maladies. Des

1ère Partie preuves archéologiques et historiques en témoignent dans toutes les grandes civilisations. La connaissance de la plante s`est transmise de génération en génération.

1.1.2.1. Civilisation Sumérienne

Découverte au 3ème millénaire avant J.C., à l`époque du roi dÀkkad, dans les ruines de Nippur, les premières utilisations thérapeutiques des Aloès ont été observées sur des tablettes dàrgile gravées en caractères cunéiformes. La plante était préconisée pour le traitement de nausées et des irritations de lèstomac (Morin, 2008).

1.1.2.2. Civilisation Chinoise

Toujours du 3ème millénaire avant J.C., lùn des ouvrages sur les plantes médicinales chinoises est le « Pen T`sao » qui signifie « origine des herbes » et surtout lìllustre Li Shih-Shen (1518-1593) qui a révisé ce traité au XVIe siècle, a classé cette plante parmi celles aux vertus thérapeutiques majeures sous làppellation de « remède d`harmonie » et la considère comme plante spécifique pour le traitement des brûlures, des affections de la peau. Les empereurs chinois considèrent les feuilles pointues des Aloès symbolisant ou traduisant des ongles sacrés dùne divinité (Morin, 2008).

1.1.2.3. Civilisation mésopotamienne

Les anciennes tribus sémitiques de Mésopotamie suspendaient lÀloès au-dessus de la porte de leurs maisons pour éloigner les mauvais esprits. Les Chevaliers du Temple avaient coutume de boire un mélange de vin de palme, de pulpe dÀloès et de chanvre, quìls appelaient « l`élixir de jouvence ». Les femmes ayant des problèmes de fertilité étaient soignées avec des mélanges contenant une bonne proportion dÀloès. La plante est gravée en caractère cunéiforme, remontant au 2ème millénaire avant J.C, découverte dans les ruines de làntique Elba en 1973 (Morin, 2008).

1.1.2.4. Civilisation Égyptienne

C`était une plante cultivée autour des temples, des pyramides et le long des routes menant à la Vallée des Rois. Le plus ancien document de la médecine égyptienne avec le fameux « Papyrus d`Ebers » ou « Livre égyptien des remèdes », découvert dans les ruines de Louksor, a été écrit à Thèbes au cours du 2ème millénaire avant J.C. (env. 1 550 ans). C`est le « Livre de préparation de médicaments pour toutes les parties du corps humain » reproduit en hiéroglyphes

1ère Partie pour de nombreuses formulations à base dÀloès. On a recensé une douzaine de formules, dans lesquelles lÀloès joue un rôle fondamental. La plante a été utilisée pour ses propriétés laxatives (Aloe perfoliata) et était aussi associée à dàutre drogues végétales (les sénés et graines de ricin…), animales ou minérales pour usage par voie interne et/ou externe (Morin, 2008). Des dessins ornant les murs des temples égyptiens montrent que la pulpe dÀloès était utilisée dans le traitement des brûlures, des ulcères et des infections cutanées.

LÀloès possédait pour eux des vertus cosmétiques ; la reine Cléopatre et Néfertiti devaient la beauté de leur peau et la fraicheur de leur teint à des bains de pulpe dÀloès et l`éclat de leur yeux était lié à lìnstillation dùn collyre à base dÀloès. (Morin, 2008).

Les anciens égyptiens appelaient la plante « Plante de lìmmortalité ». Les pharaons la considèrent comme « Elixir de longue vie ». Les grands prêtres associaient la plante à leurs rites en lìncorporant à la composition de la formule de lèmbaumement. Lors des cérémonies funéraires, un plant dÀloès, symbole du renouvellement de la vie, était apporté comme cadeau. Il devait accompagner le défunt dans son passage vers làu-delà afin de le soigner et de le nourrir tout au long de son voyage. Quand il fleurissait, c`était signe que le défunt avait atteint làutre rive.

Figure 01 : Gravure égyptienne, avec des plantes d`Aloès.

1.1.2.5. Civilisation Assyro-babyloniens

Ils étaient très superstitieux ; utiliser et boire du jus dÀloès avaient pour but de se débarrasser des diables, des démons, des fantômes, des vampires, … Cèst une plante considérée comme bénie par les dieux. Ils ont utilisé lÀloès avec làbsinthe contre la paresse intestinale (Morin, 2008).

1.1.2.6. Civilisation arabe

La plante est appelée par les bédouins et les guerriers Touaregs du Sahara comme « Lys du désert » dès le 6ème siècle avant J.C. C`est la civilisation qui fut l`une des premières à produire 5

1ère Partie des extraits commerciaux d’Aloès à base de sève et de pulpe mélangées. Ces extraits servaient surtout de laxatif. Ils servent également à d`autres usages internes et/ou externes (Morin, 2008).

Rhazès (865-925), un des premiers grands médecins arabes, écrivit de nombreux ouvrages et même si les plantes médicinales nònt pas large place dans ses œuvres, il fait référence à làse fétide (Ferula asa-foetida L. Apiaceae), lÀloès (Aloe vera (L.) Burm.f., le lycium (Lycium chinense Mill. Solanaceae) et le fenu grec (Trigonella foenum-graecum L. Fabaceae).

1.1.2.7. Civilisation indienne

Les hindous appelaient les Aloès « les guérisseurs silencieux » qui poussaient dans le jardin dÈden. Cèst une plante qui occupait une place majeure dans les textes fondamentaux de l`hindouisme, lÀrtharvaveda (un recueil de prières destinées à soigner toute sorte de maladies), consacré aux plantes et aux préparations secrètes, destinées à soigner toutes sortes de maladies. Du XIIIème au VIème siècle avant J.C., ils utilisaient lÀloès comme digestif et purgatif.

De nos jours, de nombreuses pratiques traditionnelles sont encore basées sur lÀyurveda qui est une science hindoue de la médecine, considérée comme complémentaire à l` Artharvaveda. Cèst une science qui enseigne que lÀloès rétablit l`équilibre entre les trois Doshas (Kapha, Vata et Pitta). Les Doshas sont des énergies biologiques présentes dans tout le corps et l'esprit. Ils régissent tous les processus physiques et mentaux et fournissent à chaque être vivant un modèle individuel pour la santé et son épanouissement.

1.1.2.8. Civilisation Gréco-Romaine

Pour les Grecs et les Romains, elle fait partie de la « Médecine divine ». Des savants de l`Antiquité (Hippocrate, Aristote, Celsus, Dioscoride…) signalaient tous la vertu des Aloès comme laxatifs, coagulants du sang, soignant les contusions, les blessures, traitant les furoncles et les affections oculaires, soulageant les ulcères génitaux, arrêtant la chute des cheveux, embellissant la peau…

1.1.2.9. Civilisation amérindienne

L`Aloès fait partie des 16 plantes sacrées des Amérindiens. La plante a été utilisée pendant des siècles par les Mayas du Yucatan. Elle fut surnommée « Le médecin du ciel ». Les Indiens séminoles croyaient en son pouvoir régénérateur et l`a nommée « la fontaine de jouvence ». Les Mazahuas considéraient même la plante comme plante magique par excellence.

1ère Partie

Les jeunes Indiennes enduisaient leur visage de jus d`Aloès pour attirer les garçons. Les guerriers et chasseurs frottaient leur corps de sa pulpe avant de partir à la guerre ou à la chasse.

1.1.2.10. Civilisation européenne Au Moyen-âge et pendant la Renaissance, les usages de l’Aloe vera se répandirent dans le monde. Ainsi, Christophe Colomb a appelé la plante : « Le docteur en pot ».

Il écrivit : « quatre plantes sont indispensables pour l’être humain : l’épi, le raisin, l’olivier et l’Aloès. Le premier le nourrit, le deuxième alimente son esprit, le troisième lui donne l’harmonie et le dernier le soigne ». Cette plante est abondante en Espagne, Portugal, Italie où les gens lui accordaient beaucoup de considérations (Schweizer, 2003).

1.1.2.11. Dans la culture malgache

Elle est mentionnée dans les anciens proverbes malgaches. Par exemple : « Tantely amam-bahona ny fiainana » : la vie est faite de miel et d’Aloès c’est à dire de joies et de douleurs s’entremêlant au cours de l’existence. Ceci signifie que nos ancêtres connaissaient bien les Aloès. La pharmacopée malagasy remonte à une tradition ancienne transmise de bouche à oreille de la part des guérisseurs et des tradipraticiens. Au début, ces dernièrs utilisaient les plantes sous leur forme brute : racines, tiges, feuilles, écorces, fruits, et fleurs et les préparaient sous forme de décoction ou tisane, en inhalation ou onguent, c’est le « raokandro » (Perrier de la Bathie, 1938). Son utilisation locale ne se limite pas uniquement à soigner les humains mais s`étend également à soigner les caprins contre les vers parasitaires : observations locales et com. pers. Dr Mbola (2019).

Actuellement, les Aloès sont utilisés dans la pharmacopée malgache. Les sous-produits peuvent même être exploités à des fins de compostage et de production de charbon actif ; cas de Aloe macroclada (Ravalison, 2012).

Effectivement, les connaissances empiriques s’avèrent confirmées par les études scientifiques récentes. L’intérêt des biologistes, des chimistes, des médecins et des industriels n’a jamais cessé de croître.

1ère Partie

1.1.3. LES PLANTES DEJA ETUDIEES PAR L`AUTEUR

Les nouvelles espèces d`Aloès suivantes ont été déjà publiées par l`auteur :

- Aloe analavelonensis Letsara - Aloe beankaensis Letsara - Aloe ivakoanyensis Letsara

Aloe analavelonensis Aloe beankaensis Aloe ivakoanyensis

Figure 02 : Les Aloès décrits par l`auteur

Elles ont fait l`objet d`une publication (Annexe3) dans un journal international : «Malagasy Nature » dont la référence est la suivante :

Letsara, R.; Rakotoarisoa, S. E. & Almeda, F., 2012. Three new Aloe species from Madagascar. Malagasy Nature, Volume 6: p46-55.

Le tableau suivant est une liste des plantes que nous avons déjà étudiées avec les Áloes dans tout Madagascar entre 2008 et 2020. Il sàgit dùne redécouverte, une découverte, une révision et un constat dùne nouvelle distribution de plantes à Madagascar.

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Tableau 01: Liste des études taxonomiques effectuées

Noms scientifiques Activités Equipes Année Redécouverte dùne espèce. Vue pour la dernière fois en 1879 au 01 Memecylon crassinerve Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-California Academy of Sciences 2008 Mont Passot, Nosy Be Redécouverte dùne espèce. 02 Rousseauxia madagascariensis Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-California Academy of Sciences 2009 Vue pour la dernière fois en 1887 à Loholoka Manakara 03 Aloe analavelonensis Découverte dùne nouvelle espèce à Analavelona Sakaraha Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-California Academy of Sciences 2012 04 Aloe beankaensis Découverte dùne nouvelle espèce à Beanka Maintirano Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-California Academy of Sciences 2012 05 Aloe ivakoanyensis Découverte dùne nouvelle espèce Ivakoany Amboasary Sud Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-California Academy of Sciences 2012 06 Anisotes hygroscopicus Découverte dùne nouvelle espèce à Ankarana Ambilobe Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-California Academy of Sciences 2013 07 Anisotes perplexus Découverte dùne nouvelle espèce à Ankaramy Manongarivo Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-California Academy of Sciences 2013 08 Anisotes subcoriaceus Découverte dùne nouvelle espèce à Anjahakely Anivorano Nord Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-California Academy of Sciences 2013 09 Anisotes venosus Découverte dùne nouvelle espèce à Ampijoroa Ankarafantsika NP Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-California Academy of Sciences 2013 10 Tahina spectabilis Découverte dùne nouvelle population à Maromandia Analalava Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-Royal Botanic Gardens KEW 2017 Danguya pulchella 11 Révision : Nouvelle Combinaison et Lectotypification Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-California Academy of Sciences 2019 – Anisotes pulchellus Nouvelle Distribution à Ranomafana NP Madagascar Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-Missouri Botanical Garden et 12 Plagiochila barteri var. valida 2019 (orig. La Réunion) Museum d`Histoire Naturelle Nouvelle Distribution à Kalambatritra, Madagascar Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-Missouri Botanical Garden et 13 Calyptothecium acutifolium 2019 (orig. La Réunion) Museum d`Histoire Naturelle Nouvelle Distribution à Kalambatritra, Madagascar Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-Missouri Botanical Garden et 14 Fissidens pallidinervis 2019 (orig.Centr. et Sud Amer., Afrique trpical) Museum d`Histoire Naturelle Nouvelle Distribution à Namoroka, Madagascar Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-Missouri Botanical Garden et 15 Hyophila nymaniana 2019 (orig. Amer. Centr., Afr. Centr., Asie SE) Museum d`Histoire Naturelle Nouvelle Distribution à Namoroka, Madagascar Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-Missouri Botanical Garden et 16 Luisierella barbula 2019 (orig. Cuba, USA, Asie SE, Japon, Aldabra, Rodrigues) Museum d`Histoire Naturelle Nouvelle Distribution à Analamazava reg. SAVA, Madagascar Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-Missouri Botanical Garden et 17 Neckeropsis foveolata 2019 (orig. Centr. et Sud Amer., Golfe de Guinée) Museum d`Histoire Naturelle Pseudocrossidium Nouvelle Distribution à Beza Mahafaly, Madagascar Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza-Missouri Botanical Garden et 18 2019 porphyreoneurum (orig. Afr. Sud-Saharien) Museum d`Histoire Naturelle

1ère Partie

1.1.4. DESCRIPTION BOTANIQUE DES ALOÈS TESTÉS

1.1.4.1. Aloe analavelonensis Letsara

Nom vernaculaire : Vaho (Bara)

Publiée pour la première fois par :

Letsara, R., Rakotoarisoa, S.E. & Almeda. F., 2012. Three new Aloe species from Madagascar. Malagasy Nature, V 6: p 46-55.

Nom scientifique acceptée par :

- Castillon, J.-B. & Castillon, J.-P. 2010. Les Aloe de Madagascar: 1-400. J.-B. & J.-P. Castillon.

- Govaerts, R. 2019. World Checklist of Vascular Plants (WCVP Database) The Board of Trustees of the Royal Botanic Gardens, Kew.

Type: Madagascar. Toliara: Région Atsimo Andrefana, Sakaraha, Forêt d`Analavelona, 22˚40’S, 44˚10’E, elev. 1,033 m, Letsara, Andriamihajarivo & Rakotonasolo 938 (holotype: TAN; isotypes: CAS, K).

Plante herbacée vivace acaulescente avec des ramifications basales formant des nattes en grappes denses (Figure 2). Feuilles 9 à 12 par plante, en rosette, 12 à 15 cm de long, 2,0 à 2,5 cm de large à la base, étroitement linéaires, s'étalant d'abord horizontalement, devenant légèrement recourbées vers le haut, épiderme lisse, surface supérieure cannelée, surface supérieure et inférieure verte avec 6 à 8 veines parallèles faibles; les bords armés de dents deltoïdes vertes ou brun clair, dressées ou à courbure antérieure, 1,6 mm de long espacées de 3 à 5 mm, les apex des feuilles libres de dents ou différemment bifides; exsudat incolore. Inflorescence dressée, non ramifiée de 18 cm de long; pédoncule brunâtre, de 5 mm de diamètre avec 3 bractées étalées stériles brun pâle; grappes cylindriques, 8,5 cm de long, 4 - 5 cm de large, lâches, 6 - 10 - fleurs, bourgeons dressés, fleurs pendantes à l'anthèse; bractées florales sous-tendant les pédicelles ± deltoïdes, membraneuse, brun pâle, de 2 à 3 mm de large à la base; pédicelles orange rougeâtre, glabres, 14 mm de long. Périanthe: (Figure 4) cylindrique, orange ou rouge orangé à la base, mais jaune-vert distalement et vert foncé où les nerfs se rejoignent vers l'apex, 26 mm de long, 6 mm à travers l'ovaire, rétréci au-dessus de l'ovaire et légèrement évasé vers l'apex; tépales

1ère Partie externes libres, 3 à 5 nerfs devenant vert intense vers l'apex, tépales internes libres, 3 - nervés, sinon comme les tépales externes. Filaments jaunes, de 20 à 25 mm de long, avec des anthères attachées exsertes de 2 à 5 mm au-delà du tube du périanthe. Style et stigmate jaune, 20 mm de long, à peine exserte. Pollen (Figure 5) lisse, elliptique, monosulqué, hétéropolaire, l'exine perforée, axe le plus long 18 - 36 μm. Fruits et graines non observés.

Source: làuteur Source: làuteur Source: làuteur Figure 3 : La plante entière de Aloe Figure 4 : Périanthe de la fleur de Figure 5 : Pollen de analavelonensis Aloe analavelonensis Aloe analavelonensis vu au microscope électronique

Parmi les espèces malgaches décrites, A. analavelonensis ne peut être confondu qu'avec Aloe darainensis J.-P. Castillon de la section Lomatophyllum (Castillon & Castillon, 2010) qui est connue de la Région de SAVA de l`ex-province d'Antsiranana au nord de Madagascar où elle est présente dans les forêts sèches près de la ville de Daraina (Castillon, 2009). Cette dernière est si distinctement caulescente que les plantes développent souvent un aspect rampant. Les feuilles sont pour la plupart plates adaxialement et ne mesurent que 6 à 10 cm de long. Les dents foliaires marginales d’A. darainensis sont blanches (ni verts ni bruns) et plus espacées (5 à 9 cm l'une de l'autre) et son inflorescence a plus de fleurs (15) que A. analavelonensis

1ère Partie

La couleur, la taille et la forme des fleurs chez A. analavelonensis ressemblent beaucoup à A. rauhii Reynolds, une espèce du Sud-ouest de la forêt épineuse sèche du Sud-ouest, mais les grappes de ce dernier sont de 12 à 18 fleurs et les fruits sont de vraies capsules. Cette dernière diffère également nettement en ayant jusqu'à 20 feuilles par plante lancéolées-deltoïdes, plus courtes (7 à 10 cm de long), gris-vert (parfois avec une teinte rougeâtre ou brunâtre), avec de nombreuses taches blanches en forme de H étroites dispersées irrégulièrement sur toute la surface adaxiale.

Lèmplacement dÀ. analavelonensis dans les différentes sections dÀloe est encore incertain car les plantes cultivées à partir desquelles la seule matière florifère est connue n'ont jamais donné de fruits. Des fleurs sont toutefois observées entre le mois de Mai au mois d’Octobre. Les spécimens vivants dans le jardin du PBZT fleurissent entre les mois de Septembre et Octobre.

Parce qu'il partage tant de caractéristiques florales avec A. rauhii, nous soupçonnons qu'il pourrait finalement faire partie du groupe informel 1 que Reynolds (1966) a désigné pour les Aloès malgaches.

Statut de conservation: Aloe analavelonensis nous est connu à partir d'une seule population de quelques individus matures qui formaient un tapis dense (Letsara et al. 2012). Un statut de conservation Vulnérable (VU) a été proposé. La relique forestière du massif d`Analavelona ne bénéficie d'aucune protection gouvernementale officielle, mais elle bénéficie actuellement d'une gestion communautaire avec l'aide du Missouri Botanical Garden (MBG) représenté à Madagascar. La survie continue de cette forêt peut être assurée car elle est considérée comme sacrée par les habitants des villages environnants (Moat & Smith, 2007). Bien qu'il n'y ait pas de coupe d'arbres, la forêt d'Analavelona est utilisée pour cacher le bétail aux voleurs de zébu. Les menaces les plus immédiates semblent être le brûlage des lisières de forêt pour le pâturage du bétail.

Etymologiquement : L'épithète d'espèce « analavelonensis » fait référence au nom de la forêt où cette espèce est évidemment endémique. Il est dérivé de «ala» qui est forêt et « velona » qui est vivante: le tout voulant dire donc lieu de la forêt vivante. Elle est appelée Ala faly et considérée localement comme sacrée par le peuple Bara.

1ère Partie

1.1.4.2. Aloe helenae Danguy

Nom vernaculaire :

Vahondrandra (source : https://www.iucnredlist.org/species/39056/69007588)

Publiée pour la première fois par : Danguy, P. 1929. Un Aloe nouveau de Madagascar. Bulletin du Museum National d`Histoire Naturelle. Paris 2 (1) : 433-434. (p.433). Acceptée par :

- Carter, S., Lavranos, J.J., Newton, L.E. & Walker, C.C. (2011). Aloès. The definitive guide: 1-720. Kew Publishing, Royal Botanic Gardens, Kew. - Castillon, J.-B. & Castillon, J.-P. (2010). Les Aloe de Madagascar: 1-400. J.-B. & J.-P. Castillon. - Govaerts, R. (1995). World Checklist of Seed Plants 1(1, 2): 1-483, 1-529. MIM, Deurne

Type : Madagascar. Province de Toliara. Fort Dauphin, Ambovombe, Est de Mandrare, 25 Octobre 1924 ; Decary. R.3325 (Holotype : P ! ; Isotype : S).

Plante solitaire arborescente atteignant 4 m de haut. (Figure 7). Tige simple, dressée, de 2 à 4 m de haut, 20 cm de diamètre, avec des feuilles séchées persistantes. Feuilles densément en rosette, dressées à recourbées avec des pointes touchant presque la tige, vertes, sans taches, longues- ensiformes, profondément canalisées, au nombre de 15-20, jusqu'à 150 cm de long, 12-15 cm de large à la base; bord avec des épines piquantes, largement deltoïdes, pâles, de 2-3 mm de long, 15 mm de distance ; couleur de l'exsudat des feuilles jaunâtres au début mais devenant rouilles avec le temps. Gout très amère. Inflorescence simple en grappe claviforme très dense, bicolore (rouge et jaune) Figure 6, 7, 8 simultanément, 0,4-0,6 m de haut, dressée, simple. Pédoncule comprimé; à bractées stériles, deltoïdes à lancéolées, jusqu'à 20 mm de long, 20 mm de large. Racème cylindrique claviforme, 15 cm de long, 9 cm de large, dressé, dense; bourgeons dressés à étalés, fleurs très nombreuses (300-400), verdâtre à la base et rougeâtre au sommet, étalées lorsqu'elles sont ouvertes. Bractées florales jaune verdâtre, lancéolées-deltoïdes, aiguës, 12 mm de long, 6 mm de large, à déclenchement rouge, plutôt charnues, obscurément à 5 nerfs. Pédoncule de 20 à 30 mm de long. Fleurs: périanthes écarlates en bouton, jaunâtres à maturité Figure 7, 24-27 mm de long, 4 mm de diamètre, légèrement rétrécies au-dessus de l'ovaire, s'élargissant vers l`ouverture, tubuleuses, droites; segment extérieur libre pour 12-15 mm,

1ère Partie pointes écartées; étamine à filaments filiformes aplatis jaunâtre, dépassant 9 mm; ovaire de 8 mm de long, 3 mm de diamètre; style jaunâtre exserte à 10 mm. Etamines exsertes, les 3 externes plus longues ; filets de couleur crème, plans, atténués au sommet ; anthère jaune, oblongue de 4 mm. Ovaire conique-allongé (8mm), obtus, couleur verte; Style crème, cylindrique. Fruit et graine inconnus.

Les spécimens vivant dans le jardin du PBZT fleurissent aux environs du mois de Septembre au mois d’Octobre.

Source: l`auteur Source: l`auteur .

Source: l`auteur

Figure 6 : Fleurs de Aloe Figure 7 : La plante en fleur de Aloe Figure 8 : Inflorescence de helenae helenae Aloe helenae

Statut de conservation: Rakotoarisoa, 2016 a proposé le Statut En Danger

1ère Partie

Tableau 02: Résumé des cinq critères utilisés de la liste rouge de l’IUCN

A. Réduction de la taille de la population. Réduction (mesurée sur la plus longue des deux durées : 10 ans ou 3 générations) sur la base d’un ou plusieurs des critères A1 à A4 En danger critique En danger Vulnérable A1 ≥ 90% ≥ 70% ≥ 50% A2, A3 & A4 ≥ 80% ≥ 50% ≥ 30% A1 Réduction de la population constatée, estimée, déduite ou supposée, dans le (a)l’observation directe (excepté A3) passé, lorsque les causes de la réduction sont clairement réversibles ET comprises (b) un indice d’abondance adapté au taxon ET ont cessé A2 Réduction de la population constatée, estimée, déduite ou supposée, dans le passé (c) la réduction de la zone d’occupation(AOO), lorsque les causes de la réduction n’ont peut-être pas cessé OU ne sont, de la zone d’occurrence (EOO) et/ou de la peut-être pas comprises OU ne sont peut-être pas réversibles. qualité de l’habitat A3 Réduction de la population prévue, déduite ou supposée dans le futur (sur un (d) les niveaux d’exploitation réels ou maximum de 100 ans) ((a) ne peut pas être utilisé pour A3). potentiels A4 Réduction de la population constatée, estimée, déduite, prévue ou supposée, sur (e)les effets de taxons introduits, de l’hybridation, une période de temps devant inclure à la fois le passé et l’avenir (sur un maximum d’agents pathogènes, de substances polluantes, les causes de la réduction n’ont peut-être pas cessé ou ne d’espèces concurrentes ou parasites sont peut-être pas comprises OU ne sont peut-être pas réversibles.

B. Répartition géographique, qu’il s’agisse de B1 (zone d’occurrence) ET/OU B2 (zone d’occupation) En danger critique En danger Vulnérable B1. Zone d’occurrence (EOO) < 100 km² < 5 000 km² < 20 000 km² B2. Zone d’occupation (AOO) < 10 km² < 500 km² < 2 000 km²

ET au moins 2 des 3 conditions suivantes : (a) Sévèrement fragmentée OU nombre de localités = 1 ≤ 5 ≤ 10 (b) Déclin continu constaté, estimé, déduit ou prévu de l’un des éléments suivants : (i) zone d’occurrence, (ii) zone d’occupation, (iii) superficie, étendue et/ou qualité de l’habitat, (iv) nombre de localités ou de sous-populations, (v) nombre d’individus matures (c) Fluctuations extrêmes de l’un des éléments suivants : (i) zone d’occurrence, (ii) zone d’occupation, (iii) nombre de localités ou de sous- populations, (iv) nombre d’individus matures C. Petite population et déclin En danger critique En danger Vulnérable Nombre d’individus matures < 250 < 2 500 < 10 000 ET au moins un des sous-critères C1 ou C2 : 25% en 3 ans ou 20% en 5 ans ou 10% en 10 ans ou C1. Un déclin continu constaté, estimé ou prévu (sur un 1 génération 2 générations 3 générations maximum de 100 ans dans le futur) d’au moins : (sur la plus longue (sur la plus longue (sur la plus longue des deux durées) des deux durées) des deux durées) C2. Un déclin continu constaté, estimé, prévu ou déduit ET au moins 1 des 3 conditions suivantes : (a) (i) Nombre d’individus matures dans chaque sous-population : ≤ 50 ≤ 250 ≤ 1 000 (ii) % d’individus matures dans une sous-population = 90–100% 95–100% 100% (b) Fluctuations extrêmes du nombre d’individus matures

D. Population très petite ou restreinte En danger critique En danger Vulnérable D. Nombre d’individus matures < 50 < 250 D1. < 1 000 D2. Pour la catégorie VU uniquement Zone d’occupation restreinte ou nombre de localités limité et D2. en règle générale : susceptibles d’être affectées à l’avenir par une menace - - AOO < 20 km² ou vraisemblable pouvant très vite conduire le taxon vers EX ou nombre de localités ≤ 5 CR.

E. Analyse quantitative En danger critique En danger Vulnérable ≥ 50% sur 10 ans ou ≥ 20% sur 20 ans ou 3 générations, sur la plus 5 générations, sur la plus Indiquant que la probabilité d’extinction dans la nature est : ≥ 10% sur 100 ans longue des deux durées longue des deux durées (100 ans max.) (100 ans max.)

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Le Tableau 02 précédent donne un résumé des cinq critères (A-E) utilisés pour évaluer l’appartenance d’un taxon à l’une des catégories du groupe « Menacé » de la liste rouge de l`IUCN (International Union for Conservation of Nature). Ce sont En Danger Critique, En Danger et Vulnérable.

Cette espèce a été évaluée selon les critères suivants :

En Danger B1ab (i,ii,iii,v)+2ab (i,ii,iii,v); C2a(i); D avec

B: critère de répartition géographique ;

C: petite population et déclin ;

D: population très petite ou restreinte.

Cette espèce est menacée car il y a un déclin continu de la zone, de l'étendue et / ou de la qualité de l'habitat à cause de l`expansion de la ville, le système agricole, la carrière et exploitation minière artisanale, le feu et la collecte illicite de plante pour des raisons commerciales.

Malgré toutes ces menaces, aucun plan d'action de rétablissement n`a été signalé.

Les individus matures sont observés parmi des populations gravement fragmentées et la tendance actuelle de la population est décroissante.

Néanmoins, c`est une espèce qui est inscrite dans la liste des appendices I de la CITES (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora). C`est un accord international entre les gouvernements et que Madagascar a signé. Son objectif est de garantir que le commerce international de spécimens d'animaux et de plantes sauvages ne menace pas leur survie.

Etymologiquement : le nom de l`espèce helenae est une dérivation pour commémorer Madame Hélène Decary, épouse de Raymond Decary, administrateur financier français et botaniste à Madagascar, qui a collecté le spécimen type.

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CHAPITRE 2 : LOCALISATION DE Aloe analavelonensis Letsara ET Aloe helenae Danguy

1.2.1. INTRODUCTION

La répartition géographique de ces deux espèces a été calculée à partir dùn outil appelé GeoCAT (Geospatial Conservation Assessment Tool). Cèst un outil open source basé sur un navigateur qui effectue une analyse géospatiale rapide. Il peut être utilisé pour évaluer les Statuts de Conservation dùne espèce (Bachman et al. 2011). A làide de cet outil, on peut utiliser des données dòccurrence primaires référenciées spatialement. Lànalyse se focalise sur deux aspects de làire de répartition géographique dùne espèce donnée. Ce sont la zone d'occurrence (EOO) ou périmètre pointillé et la zone d'occupation (AOO) ou mailles carrées.

L`utilisateur de GeoCAT peut générer des données sur un environnement Google Maps soit par ses propres points soit à partir des accès libres et ouverts aux données sur la biodiversité, de données provenant de plusieurs sources, telles que GBIF (Global Biodiversity Information Facility), Flickr (plate-forme de partage de photos géoréférenciées) ou iNaturalist (un réseau de partage de données en line d`une communauté de scientifiques et naturalistes).

Pour notre cas, nous avons généré nos propres points à partir de notre observation sur terrain et analyses des données de GBIF et iNaturalist.

1.2.2. DISTRIBUTION, HABITAT DE Aloe analavelonensis

Aloe analavelonensis n'est connu que du massif d'Analavelona au Nord-est de Toliara dans le District de Sakaraha (Figure 9): un ilot de forêt humide unique du Sud-ouest de Madagascar à un peu plus de 1000 m d`altitude, entourée de savane anthropique. Il a été collecté (réf. LRK 938) dans les sous-bois sur un substrat rocheux près d'une cascade le long de la rivière Manasay (Letsara et al. 2012). C`est une espèce à aire de distribution très restreinte en une région très restreinte.

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Figure 9: Carte de distribution de Aloe analavelonensis recensés dans la nature établie avec GeoCAT

1.2.3. DISTRIBUTION, HABITAT DE Aloe helenae

Aloe helenae se trouve dans le Sud de Madagascar : parmi les buissons denses dans le sable littoral et le calcaire, à lÈst de Mandrare, aux environs dÀmbovombe, Decary 3372, 3375, 3380, 3397 et 3397 bis ; Andrahomanana, Alluaud sans num. ; Behara, Humbert 3654 ; Vinanibe Decary 10265 et 10300 ; Evondro, Decary 10521 ; E. du lac Anogny, Decary 9260, 9271, 9278 et 9264 ; Ranopiso, Decary 10717 ; Andrahomanana, Decary 10675 ; Fort-Dauphin, Decary 10237. Cèst une espèce à aire de distribution restreinte en une région peu étendue (Figure 10) :

Figure 10 : Carte de distribution de Aloe helenae recensés dans la nature établie avec GeoCAT

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CHAPITRE 3 : MODELISATION DES HABITATS NATURELS ET TYPES ECOLOGIQUES DE Aloe analavelonensis Letsara ET Aloe helenae Danguy

1.3.1. UTILISATION DE MaxEnt

Pour construire des modèles descriptifs et prédictifs de systèmes biologiques, en particulier de réseaux biologiques complexes, à partir de grands ensembles de données expérimentales, nous avons choisi MaxEnt pour notre analyse. MaxEnt ou entropie maximale stipule que la distribution de probabilité qui représente le mieux l'état actuel des connaissances est celle avec la plus grande entropie, dans le contexte de données antérieures précisément énoncées (comme une proposition qui exprime des informations testables).

MaxEnt ou « Maximum Entropy Species Distribution Modeling » est un programme informatique spécialisé en biogeographie. Créé en 2004 par le laboratoire de recherche AT&T Labs-Research, de Princeton University (Etats-Unis), et le Center for Biodiversity and Conservation du Musée d`Histoire Naturelle de lÀmérique. Cèst un logiciel permettant de modéliser la niche écologique dùn taxon, cèst à dire dòbtenir un modèle d`habitat exprimant sa distribution potentielle et de connaître en même temps les facteurs déterminants, son mode de répartition. Sa large applicabilité et le succès qu'il a obtenu dans différents contextes dépendent de sa simplicité conceptuelle et de sa solidité mathématique.

1.3.2. METHODES POUR LA MODELISATION DE L`HABITAT

Avec le programme MaxEnt (Maximum Entropy) (Steven et al. 2006 ; Roger, 2009), on peut élaborer la distribution potentielle et le profil écologique dùne espèce donnée. La fiabilité dùn modèle proposé peut être testée et donnée par la valeur obtenue de lÀUC (Area Under the Curve) (Steven et al 2006). Un modèle généré par MaxEnt atteint le plus haut pouvoir prédictif lorsque l’AUC a une valeur de 1 cèst à dire que plus l'AUC est élevée (près de la valeur 1), meilleure est la performance et la fiabilité du modèle. Ainsi, on distingue les différentes catégories de résultats dànalyse suivantes : Excellente si AUC>0,90 ; Bonne si 0,80

1ère Partie

Pour l`élaboration des modèles de niche écologique pour les deux espèces, les facteurs écologiques suivants ont été considérés (http://www.worldclim.org/bioclim) :

BIO1 = Température moyenne annuelle ;

BIO2 = Ecart diurne moyen (température maximale – température minimale ; moyenne mensuelle) ;

BIO3 = Isothermalité (BIO1/BIO7) * 100 ;

BIO4 = Saisonnalité de la température (Coefficient de variation) ;

BIO5 = Température maximale de la période la plus chaude ;

BIO6 = Température minimale de la période la plus froide ;

BIO7 = Ecart annuel de température (BIO5-BIO6) ;

BIO8 = Température moyenne du trimestre le plus humide ;

BIO9 = Température moyenne du trimestre le plus sec ;

BIO10 = Température moyenne du trimestre le plus chaud ;

BIO11 = Température moyenne du trimestre le plus froid ;

BIO12 = Précipitations annuelles ;

BIO13 = Précipitations de la période la plus humide ;

BIO14 = Précipitations de la période la plus sèche ;

BIO15 = Saisonnalité des précipitations (Coefficient de variation) ;

BIO16 = Précipitations du trimestre le plus humide ;

BIO17 = Précipitations du trimestre le plus sec ;

BIO18 = Précipitations du trimestre le plus chaud ;

BIO19 = Précipitations du trimestre le plus froid ;

pfc2000_vcf = Couverture forestière de Madagascar en 2000.

1.3.2.1. Distribution potentielle

Une carte de làire de répartition de lèspèce examinée est fournie à partir de MaxEnt. Cèst une distribution potentielle où chaque pixel représente la probabilité dòccurrence sur une carte. Lànalyse de MaxEnt donne une valeur de 0 à 100 dont lìmportance augmente avec la

1ère Partie valeur. La signification de ce nombre varie toutefois selon les espèces et dépend de la valeur fixée par MaxEnt appelé « seuil minimal de la présence». Cèst une valeur à partir de laquelle les sites sont considérés comme convenables ou non à lìnstallation de lèspèce donnée.

Une carte de la distribution potentielle sera établie et présentée selon les trois classes suivantes (Roger, 2009):

- Sites non convenables : zones prédites comme non appropriées. Ils seront représentés sur la carte avec une couleur bleue. - Sites convenables : conditions généralement optimales, mais certaines variables peuvent encore représenter des conditions extrêmes. Ils seront représentés sur la carte avec la couleur verte. - Sites très convenables : les facteurs écologiques apportent le meilleur intervalle pour l’espèce, sa fréquence et son abondance devraient être très élevées. Ils seront représentés sur la carte avec la couleur rouge.

1.3.2.2. Le profil écologique

Pour la modélisation de l’habitat, MaxEnt souligne l’importance de chaque facteur écologique sur le mode de distribution de l’espèce examinée. Deux types de profil écologique sont produits : l’un sous forme de pourcentage et l’autre en diagramme.

Le profil écologique en pourcentage permet de déterminer les variables écologiques qui se présentent comme étant les facteurs les plus limitants dans la distribution d’une espèce. Plus une variable contribue à la modélisation de l’habitat, plus son importance pour l’espèce est considérable.

Le profil écologique en diagramme détermine également l’importance de chaque variable mais cette fois sous forme de barres horizontales. La différence repose essentiellement sur le fait que MaxEnt donne ici deux types de résultats :

- les barres en bleu représentent l’importance de chaque paramètre lorsqu’il est inclus dans la modélisation. La longueur de ces barres exprime l’index de la contribution ou « Commission » du paramètre dans l’établissement du modèle. Plus cet index est élevé, plus la variable est indispensable et la barre est plus longue.

1ère Partie

- les barres en vert si les paramètres sont exclus de l’analyse ; les barres les plus courtes possèdent les informations les plus importantes. Leur « omission » de l’analyse aurait un impact considérable dans la modélisation de l’habitat de l’espèce.

1.3.3. CONCLUSION SUR LA MODELISATION

Les analyses de niche écologique d’espèces sauvages et de leurs ressources génétiques s’appliquent à l’aide de points de présence sous différentes conditions, dont les plus importantes sont les suivantes :

- L’espèce devrait être en équilibre avec son environnement ; en d’autres termes, les plages environnementales sont restreintes par la compétition et la prédation, et non par des limitations de dispersion.

- Les variables environnementales disponibles (comme les variables climatiques) utilisées dans la modélisation sont des facteurs abiotiques déterminants de la distribution naturelle de l’espèce.

- On ne doit pas prendre en compte les points de présence d’individus cultivés dans des plantations, ou issus de collecte de terrain ou de jardins botaniques situés dans un environnement étranger à la niche effective de l’espèce.

En pratique, l’une de ces conditions ci-dessus n’est souvent pas satisfaite ; mais la modélisation de la distribution d’espèces n’en reste pas moins utilisable pour approcher la niche effective et la distribution naturelle d’une espèce. En tant que telle, la modélisation de la distribution d’espèces est utile pour établir les priorités dans les activités d`exploitations ou de conservations.

2ème Partie : METHODOLOGIE DE L`ETUDE PHYTOCHIMIQUE ET ACTIVITE BIOLOGIQUE de Aloe analavelonensis Letsara et Aloe helenae Danguy

2ème Partie

2ème Partie : METHODOLOGIE DE L`ETUDE PHYTOCHIMIQUE ET ACTIVITE BIOLOGIQUE SUR Aloe analavelonensis Letsara ET Aloe helenae Danguy

CHAPITRE 4 : LE SCREENING PHYTOCHIMIQUE

D`après l`Organisation Mondiale de la Santé (OMS), 80% de la population sont tributaires de la médecine traditionnelle et des plantes médicinales pour leurs soins de santé primaires (Ngbolua et al., 2011a,b ; Ngbolua et al., 2016a). L'utilisation de plantes médicinales pour divers problèmes de santé n'est pas seulement un choix, mais elle est également liée à la pauvreté ainsi qu` aux coûts élevés des médicaments modernes (Ngbolua et al., 2016b; Inkoto et al., 2018; Ngbolua et al., 2019a). En effet, l'excès de production d'Espèces Réactives à l'Oxygène (SRO) peut devenir toxique pour les composants majeurs de la cellule et donner lieu à un stress oxydatif, qui entraînera de nombreuses pathologies telles que les maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson), le diabète, le cancer, les maladies inflammatoires, le vieillissement, etc. Les cellules utilisent de nombreuses stratégies antioxydantes pour éliminer ou minimiser les dommages oxydatifs (Iteku et al., 2019). Ces plantes contiennent un arsenal de composés bioactifs comme les coumarines, les flavonoïdes, les terpénoïdes, les alcaloïdes, les tanins, etc. qui sont dotés de propriétés pharmacologiques intéressantes et pertinentes, notamment une activité antioxydante (Bongo et al., 2017).

Des découvertes récentes basées sur une étude d'amarrage moléculaire ont révélé que certains composés dérivés d'Aloès sont des inhibiteurs potentiels de la principale protéase (3CLpro) responsable de la réplication des coronavirus (Mpiana et al., 2020a). Ces études ont révélé que la plante du genre Aloe pourrait servir de thérapie anti-oxydante aux patients infectés pour l`amélioration des séquelles laissées par Covid-19. Il a également été signalé que certaines plantes appartenant au genre Aloe ont une activité antibactérienne et une grande activité antivirale (Reynolds, 1966) sur plusieurs types de virus (hémorragie virale, Rhobdavirus septicaemia, virus Herpes simplex type 1, virus Herpes simplex type 2, Varicella-Zoster, virus de l'immunodéficience humaine, virus de la Grippe, Poliovirus, Cytomégalovirus, virus du papillome humain) y compris le coronavirus SARS-CoV-1. Consommés par voie orale sous plusieurs formes et sont sans danger (Mpiana et al. 2020b), les Aloès agissent également par ses 23

2ème Partie composants chimiques en tant que Immunomodulant (Reynolds, 1966) tout en augmentant les monocytes et les macrophages qui circulent dans le sang.

Le but de cette étude est de compléter les connaissances sur les études phytochimiques des deux espèces endémiques de Madagascar, Aloe analavelonensis et Aloe helenae en testant in vitro leurs activités antioxydantes, antimicrobiennes, larvicides ainsi que leurs toxicités.

2.4.1. LES MATERIELS VEGETAUX ANALYSES

Cette étude est une suite logique de la découverte et de la description de trois nouvelles espèces d’Aloès (Letsara et al., 2012) endémiques de Madagascar. Les principes suivants ont été posés comme critères de choix des espèces étudiées :

-La première espèce étudiée Aloe analavelonensis a été choisie. C`est une plante herbacée (Letsara et al., 2012) qui pousse aux bords des ruisseaux dans une Forêt Humide de l`Ouest de Madagascar (Moat & Smith, 2007 ; Letsara et al., 2012).

-La seconde espèce étudiée est Aloe helenae. C`est une espèce arborescente (Danguy, 1929) de la Forêt Sèche épineuse et Forêt Sèche épineuse dégradée du Sud-Ouest de Madagascar (Moat & Smith, 2007).

Des spécimens vivants de ces deux plantes sont conservées dans le Jardin et Serre du Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza (PBZT).

Des matériels biologiques pour les analyses (principalement des feuilles fraîches) ont été fournis par le PBZT (S18o 55’ 56’’, E 47o 31’ 34’’ Alt. 1276m) au mois de Janvier 2019. Ils ont été ajoutés aux collections vivantes personnelles de l'auteur. Pour fabriquer la poudre de feuilles collectées, environ 100 g ont été conservés dans un congélateur à -20 ° C. Puis, ces feuilles ont été séchées par lyophilisation, avec un appareil de marque LABCONCO (Figure 11) avec une température à -40 ° C sous pression 0,850 mBar pendant 24 heures. Ensuite, elles sont broyées pour en faire une poudre fine. Pour chaque espèce, 10 g de poudre ont été utilisés pour l'extraction.

2ème Partie

Figure 11 : Appareil lyophilisateur auprès du CNRE

2.4.2. PREPARATION DES EXTRAITS

Ces matériels ont été extraits avec 100 ml d'éthanol à 80 ° à une température de 70 ° C pendant 1 heure. Après filtration, l'éthanol a été évaporé sous pression à 45 ° C pendant environ 20 minutes. L'extrait obtenu a ensuite été dépigmenté par de l'hexane et la quantité de solvant utilisé dépendait des échantillons. Ensuite, deux phases ont été obtenues à savoir, la fraction n- hexanique et la fraction aqueuse (Figure 12).

Fraction n-hexanique

Fraction aqueuse

Figure 12 : Ballon à décanter auprès du CNRE

2ème Partie

2.4.3. DETECTION DES FAMILLES CHIMIQUES BRUTES

La méthode de criblage pour la détermination des grandes familles chimiques constitutives des végétaux a été utilisée dans cette étude. Ainsi, la détermination des familles chimiques présentes dans l’extrait issu des Aloès a été effectuée selon une analyse qualitative basée sur des réactions de coloration et/ou de précipitation des composés des grandes familles chimiques présentes dans l’extrait éthanolique (Méthode de Fong et al., 1977).

2.4.3.1. Criblage des alcaloïdes

Les tests de caractérisation de leurs présences se font en milieu chlorhydrique au moyen des réactifs de MAYER, de WAGNER et de DRAGENDORFF. Le screening a été effectué en 2 étapes : Test préliminaire : une poudre de 2,5 g a été humectée avec 10 ml de HCl 5%. Après filtration, le filtrat obtenu a été reparti en fractions égales dans 4 tubes à essai soit 2 ml dans chaque tube. Le premier sert de témoin tandis que les trois autres sont utilisés pour les tests, respectivement à l’aide des réactifs de MAYER, de WAGNER et de DRAGENDORFF. Test de MAYER Dans le tube n°2, 4 gouttes de réactif de MAYER y ont été ajoutées. L’apparition d’un précipité blanc ou d’une floculation indique la présence d’alcaloïdes dans l’extrait à analyser. Test de WAGNER Dans le tube n°3, l’apparition d’un précipité blanc ou d’une floculation après ajout de 4 gouttes de réactif de WAGNER, montre la présence d’alcaloïdes dans l’extrait à analyser. Test de DRAGENDORFF Dans le tube n°4 sont additionnées 4 gouttes de réactif de DRAGENDORFF. L’apparition d’un précipité dans ce tube désigne la présence d’alcaloïdes.

2.4.3.2. Criblage des flavonoïdes et des leucoanthocyanes

Les flavonoïdes et les leucoanthocyanes sont mis en évidence selon le test de WILLSTÄTTER et le test de BATE-SMITH. Test de WILLSTÄTTER (à la cyanidine) Une solution hydroalcoolique équivalente de 3g de poudre est dissoute dans 10ml d’éthanol 80%. Dans un tube à essai, 3ml d’extrait éthanolique sont additionnés de 0,5ml d’HCl concentré et de quelques tournures de magnésium. La solution est laissée au repos pendant

2ème Partie

10min. Trois colorations peuvent apparaître si les flavonoïdes sont présents dans l’extrait à tester. Une coloration rouge traduit la présence de flavones, une coloration rouge pourpre témoigne la présence de flavonols et une coloration rouge violacé indique la présence de flavonones et de flavonols. Test de WILLSTÄTTER MODIFIE La préparation précédente est répétée. Après dissolution des tournures de magnésium, 1ml d’eau et 1ml d’alcool isoamylique sont ajoutés. Deux phases se forment, la coloration de la phase supérieure est observée après 10min et le type de flavonoïdes présents dans l’extrait est déduit comme précédemment. Test de BATE-SMITH Trois millilitres d’extrait éthanolique sont mélangés avec 0,5ml d’HCl concentré dans un tube à essai. La solution obtenue est chauffée au bain-marie pendant 30min puis laissée se refroidir. L’apparition d’une coloration rouge violacé indique la présence de leucoanthocyanes.

2.4.3.3. Criblage des tanins et des polyphénols

Une solution hydroalcoolique équivalente de 10 g de poudre est dissoute dans 1,5ml d’eau distillée chaude et de 0,2ml de chlorure de sodium à 10%. La solution obtenue est soumise aux trois tests suivants : Test à la gélatine Dans un tube à hémolyse, 5 gouttes de gélatine à 1% sont ajoutées à 0,5ml de la solution contenant l’extrait à tester. La formation d’un précipité traduit la présence de polyphénols. Test à la gélatine salée Le mode opératoire est le même que précédemment mais cette fois, la gélatine salée a été utilisée. L’apparition d’un précipité montre la présence de tanins.

Test au chlorure ferrique (FeCl3)

A 0,5ml de l’extrait à tester sont ajoutées 5 gouttes de solution méthanolique de FeCl3 10%. L’apparition d’une coloration bleu-vert ou bleu-noir indique la présence de tanins condensés tandis qu’une coloration noire bleuâtre témoigne de la présence de tanins hydrolysables. La réaction négative à la gélatine salée accompagnée d’une coloration verte ou bleu noir au FeCl3 signifie que l’extrait contient d’autres types de composés phénoliques.

2ème Partie

2.4.3.4. Criblage des anthraquinones

La présence de quinones dans l’extrait à tester est démontrée selon le test de BORNTRAGER. L’extrait sec à tester est mis en suspension dans 30ml d’eau distillée. Après filtration, le filtrat obtenu est extrait avec 10ml de benzène dans une ampoule à décanter. La phase benzénique transférée dans un tube à essai, est mélangée avec 5ml de NH4OH (ammoniaque). Après agitation, le virage au rouge de la phase alcaline (phase inférieure) révèle la présence d’anthraquinones.

2.4.3.5. Criblage des stéroïdes et des terpenoïdes

Une solution hydroalcoolique équivalente de 10 g de poudre à analyser est reprise dans

3ml de CHCl3 (chloroforme). Après homogénéisation, le mélange est filtré. Les stéroïdes et les terpènes sont détectés selon les trois tests suivants :

- Test de LIEBERMANN-BURCHARD

Trois gouttes d’anhydride acétique sont ajoutées à 1ml de filtrat, le mélange est agité et additionné d’une goutte de H2SO4 (acide sulfurique) concentré. Après 1h de repos, l’apparition d’une coloration pourpre traduit la présence des triterpènoïdes alors qu’une coloration bleu-vert indique la présence de stéroïdes.

- Test de SALKOWSKI

Dans un tube à essai incliné à 45°C, 1ml de filtrat chloroformique est mélangé avec 1ml de H2SO4 concentré. L’apparition d’un anneau rouge montre la présence de stérols insaturés.

- Test de BADJET-KEDDE

Quelques gouttes d’acide pricrique sont versées dans 1ml de filtrat. L’apparition de la coloration rouge témoigne de la présence de stéroïdes lactoniques.

2.4.3.6. Criblage des saponines Cent mg de poudre à tester sont dissoutes dans 10ml d’eau distillée. La solution aqueuse obtenue est agitée vigoureusement pendant 30s. La formation d’une mousse persistante de 3cm de hauteur pendant 30min révèle la présence de saponines.

2ème Partie

2.4.3.7. Criblage des polysaccharides

Le filtrat de l’extrait à tester est repris dans 3 volumes d’éthanol absolu. La formation d’un précipité indique la présence de polysaccharides.

2.4.4. EXTRACTION ET ISOLEMENT DES COMPOSANTS PRINCIPAUX

2.4.4.1. Extraction et isolement des alcaloïdes totaux

Les alcaloïdes sont des molécules à bases azotées, le plus souvent hétérocycliques, très majoritairement d'origine végétale. Habituellement en chimie biologique, les alcaloïdes sont des dérivés des acides aminés. Sous forme purifiée, ces molécules dévoilent très souvent une toxicité aiguë, même à plus faibles doses, une activité pharmacologique apaisante, non sans effets d'accoutumance ou une toxicité chronique à long terme.

Pour notre expérience, une masse de poudre pulvérisée dégraissée a été soumise à l’extraction à l’éthanol à 80 % pendant une heure. Après filtration et évaporation de l’éthanol, la solution aqueuse restante a été additionnée d’une solution d’acide chlorhydrique 1N jusqu’à ce que le pH soit au voisinage de 4. La solution aqueuse acide est épuisée au chloroforme jusqu’à la réaction de Mayer négative (sans précipitation). La phase chloroformique est ensuite lavée à l’eau puis séchée sur du sulfate de sodium anhydre. Après filtration, on obtient les alcaloïdes primaires, secondaires et tertiaires.

Pour obtenir les alcaloïdes quaternaires et les N-Oxydes, la phase aqueuse précédente est alcalinisée par l’hydroxyde d’ammonium à 33 % jusqu’ à pH égal à 9. La phase alcaline est épuisée avec du chloroforme jusqu’à ce que la réaction de Mayer soit négative. Cette phase chloroformique est aussi lavée à l’eau comme précédemment. Après adduction de sulfate de sodium anhydre, l’ensemble est filtré puis le solvant est évaporé.

Après avoir eu tous les alcaloïdes totaux, on passe en une vérification en faisant un dépôt sur un support à Chromatographie sur Couche Mince (CCM) avec un éluant approprié. La révélation avec le réactif de Dragendorff montre une coloration orangée et qui confirme bien la présence des alcaloïdes dans les fractions. La coloration orangée signifie la présence de la molécule azotée (Raharisololalao, 1977).

Les manipulations de l`extraction des Alcaloïdes sont présentées par la Figure ci-dessous.

2ème Partie

Poudre pulvérisée

Extraction EtOH 80° (1h)

Filtration Sur Büchner Evaporation

Solution aqueuse Résidu

HCl 1N

Filtration

Résidu Solution aqueuse ajustée à pH= 4

Fractionnement liquide-liquide CHCl3

Phase aqueuse Phase CHCl3

NH4OH à 33% Lavage Eau jusqu’à pH=9

Solution basique à pH=9

Phase CHCl3 Phase aqueuse Fractionnement liquide- CHCl3 liquide Séchage Na2SO4. Filtration

Alcaloïdes primaires, secondaires et tertiaires

Phase aqueuse Phase CHCl3

Lavage Eau

Phase aqueuse Phase CHCl3 Séchage Na2SO4.

Alcaloïdes quaternaires et N-Oxyde

Figure 13 : Schéma des différents processus de l`extraction des alcaloïdes

2ème Partie

2.4.4.2. Extraction et isolement des polysaccharides

L`extraction des composants polysaccharidiques a été réalisée suivant les protocoles établis par Pugh et al., (2001) sur Aloe vera et de Randrianarison (2003) sur les Aloès de Madagascar.

Poudre de feuille

Macération ED (4h) 55oC

Filtration Papier no2

Centrifugation 3000 rpm 20 mn n

Surnageant Culot

A récupérer Refrigeration 30 mn Rinçage EtOH 90o

Agitation Temp. ambiante Filtration lamba soga

Séchage

Rinçage EtOH 90o

Rinçage Acétone 2 fois

Acetone Depôt récupéré

Etuve 45o 24 h

Poudre Pesage pour savoir le rendement

Figure 14 : Schéma des différents processus de l`extraction des polysaccharides

2ème Partie

Pour le traitement des extraits, nous avons utilisé un rotavapor pour l`évaporation et séchage des extraits (Figure 15).

Figure 15 : Photo du rotavapor pour l`évaporation et séchage des extraits.

2ème Partie

CHAPITRE 5 : MISE EN EVIDENCE DES ACTIVITES ANTIOXYDANTES DES EXTRAITS

2.5.1. OXYDATION ET LES ANTIOXYDANTS

2.5.1.1. L’oxydation

- Description

Toutes les réactions chimiques dans les cellules végétales se produisent dans l’eau et impliquent des molécules très complexes. Les principaux radicaux libres (et les plus réactifs) comportent des atomes d’oxygène. L’oxygène est fondamental à la vie et il est impliqué dans la majorité des réactions chimiques de l’organisme. Cependant, lorsqu’il est dans un état de radical libre, il devient très instable et peut causer énormément de dommages (oxydation) aux structures sensibles de nos cellules (ADN, ARN, paroi cellulaire,...). Ces dommages sont d’autant plus importants qu’ils créent des réactions en chaîne. Lorsqu’un radical libre attaque une molécule et lui prend un atome ou une charge électrique, cette molécule devient instable et attaque à son tour la voisine, et ainsi de suite. L’effet des radicaux libres peut se comparer à de la rouille intérieure. Dans toutes les maladies chroniques (du cancer à l’arthrite en passant par les maladies cardiaques), la quantité des radicaux libres augmente si par contre une réduction de la capacité de les contrer est notée. Des substances qui provoquent une augmentation des radicaux libres, la plus puissante est sans aucun doute le tabac. Le tabagisme est l’habitude de vie qui engendre le plus d’oxydation et de vieillissement prématuré (Dionne, 2010).

- Les espèces réactives de l’oxygène ou ROS ou radicaux libres Il existe plusieurs sites de production intracellulaire de ROS tels que le réticulum endoplasmique mais le principal site de production des ROS dans la cellule est la mitochondrie (Turrens, 2003) où le taux de production de ROS est directement lié au taux de consommation d’O2 et proportionnel au nombre de mitochondries (Lesser, 2006).

Les espèces réactives de l’oxygène peuvent être radicalaires ou non radicalaires. Une espèce radicalaire R, est une espèce présentant un non appariement d’un ou de plusieurs électrons sur sa couche externe, ce qui lui confère une grande instabilité. Celle-ci peut réagir avec un groupe soufre, oxygène, carbone ou encore azote pour devenir non radicalaire mais va ainsi créer

2ème Partie un nouveau radical libre donnant naissance à une chaîne de propagation du radical libre jusqu’à élimination de celui-ci.

Le radical superoxyde O2- est la première espèce réactive de l’oxygène formée. Il provient du fait que l’oxygène dans son état fondamental possède 2 électrons non appariés et doit recevoir un électron à la fois, ce qui est le cas lors de la fuite d’électrons de la chaîne respiratoire. Le radical superoxyde peut agir comme un oxydant ou un réducteur (Béguel, 2012). Cependant, son taux de réaction avec les lipides, l’ADN ou les protéines est assez lent. En revanche, il est capable de diffuser à travers les membranes et donc son action n’est pas restreinte à la mitochondrie. Le radical superoxyde est capable de réagir avec l’ion ferrique Fe3+ pour donner l’ion ferreux Fe2+ et de l’oxygène (voir réaction 1). D’autre part, il peut se dismuter soit spontanément soit de manière enzymatique (Fridovich, 1975) et mener à la formation du peroxyde d’hydrogène H2O2, une espèce non radicalaire.

3+ - 2+ O2 + Fe + 1e ⇌ Fe + O2 (reaction 1)

Le radical superoxyde est éliminé ou du moins maintenu à un niveau de concentration assez bas par des enzymes antioxydantes appelées superoxydes dismutases (SOD).

Le peroxyde d’hydrogène H2O2 n’est pas une espèce radicalaire, il n’est pas chargé et peut donc diffuser très facilement à travers les membranes. De ce fait, son action n’est pas restreinte à son lieu de production mais peut se dérouler dans différents compartiments cellulaires tel que le noyau ; ce qui en fait un ROS assez toxique. Le peroxyde d’hydrogène est un oxydant impliqué notamment dans la voie de l’apoptose (Halliwel & Gutteridge, 1999). Cependant, il a été montré que les dommages attribués à H2O2 sont en fait causés, pour la plupart, par sa réduction en radical hydroxyle HO• via la réaction de Fenton, par exemple, (Fenton, 1876) qui implique la conversion du fer Fe de sa forme ferreuse à sa forme ferrique :

2+ 3+ – • Fe + H2O2 → Fe + HO + HO (réaction de Fenton)

De plus cette réaction est entretenue par la réaction 1, ce qui donne la réaction de Haber-Weiss (Haber-Weiss, 1934):

2-. - • H2 O2 + O ⇌ O2+ HO + HO (réaction de Haber-Weiss)

2ème Partie

La quantité en eau oxygénée est régulée par des enzymes appelées catalases (à base de fer), qui accélèrent la transformation du peroxyde d'hydrogène en oxygène et en eau.

H2O2 + H2O2 ⇌ 2H2O + O2 Le radical hydroxyle HO, est le radical le plus réactif. Il réagit avec tout type de molécules et est responsable de la peroxydation des lipides (les acides gras polyinsaturés ou AGPI) dans les membranes, de l’oxydation des protéines, de l’ADN nucléaire et mitochondrial mais aussi des ARN. Son implication dans le vieillissement cellulaire par les dommages causés aux protéines et à l’ADN serait majeure. Voici l’ensemble des réactions de production des ROS ou impliquant des ROS et permettant la réduction de l’O2 en H2O :

- 2- ½O2+ 2e = O

2- + O + 2H = H2 O

- + • • - + H2O2 + e + H = H2O + HO HO + e + H = H2 O Les espèces réactives de l’oxygène formées à partir des acides gras polyinsaturés sont issues de la peroxydation lipidique et comprennent trois ROS principaux, les alkyl hydroperoxydes (LOOH), les radicaux alkyl peroxyles (LOO•) et les radicaux alkoxyles (LO•). Ces espèces réagissent avec les acides gras insaturés voisins ; ce qui donne lieu à une chaîne de peroxydation lipidique qui affecte l’intégrité de la membrane, sa perméabilité et peut entraîner sa rupture .

La production excessive des radicaux libres provoque des lésions directes des molécules biologiques : oxydation de l’ADN, des protéines, des lipides et des glucides, mais aussi de lésions secondaires dues au caractère cytotoxique et mutagène des métabolites libérés, notamment lors de l'oxydation des lipides (Favier, 2003).

Les radicaux libres ne sont pas toujours néfastes. En effet, plusieurs fonctions de l’organisme dépendent de l’utilisation des radicaux libres. Au niveau cellulaire, les radicaux libres semblent être impliqués dans la croissance, la différenciation mais aussi la communication entre les cellules. Il ne faut donc pas empêcher à tout prix la formation de radicaux libres, mais plutôt leur comportement désordonné (http://www.lanutrition.fr/).

2ème Partie

- Le stress oxydatif

Le stress oxydatif est défini comme étant le déséquilibre entre la génération des espèces réactives de l’oxygène et la capacité du corps à neutraliser et à réparer les dommages oxydatifs (Boyd et al., 2003). Dans des conditions physiologiques « normales », il existe un équilibre entre la génération et l’élimination de ROS. Les ROS en quantité faible et contrôlés sont nécessaires au bon fonctionnement des cellules et interviennent dans des processus de signalisation cellulaire. En quantité trop importante, les ROS sont nocives pour la cellule et participent au processus de vieillissement cellulaire et à certaines pathologies (Madamanchi et al., 2005). Une régulation fine du métabolisme oxydatif est donc nécessaire au bon fonctionnement cellulaire et à la survie des organismes. Certaines conditions peuvent conduire à une augmentation de la production intracellulaire de ROS.

2.5.1.2. Les antioxydants

Ce sont des réducteurs capables d'interrompre la réaction de peroxydation et d'empêcher la formation des hydropéroxydes et des peroxydes à partir des huiles insaturées en particulier. A l'intérieur de notre corps, les antioxydants garantissent la salubrité des cellules et des tissus, car ils protègent contre les agressions oxydatives, autrement dit, ils possèdent la propriété d’empêcher la réaction en chaîne lancée par les radicaux libres (Martini, 2013). Notre corps a besoin simultanément des 2 types d’antioxydants: hydrosolubles (vitamine C, flavonoïdes et polyphénols) et liposolubles (carotènes, vitamine E).

- Les systèmes non-enzymatiques

Les principaux antioxydants non-enzymatiques sont le glutathion, la vitamine E, la vitamine C, les caroténoïdes et l’acide urique. Ces molécules vont interrompre la chaîne de réaction radicalaire (Cadenas, 1989).

Les caroténoïdes sont également des molécules liposolubles produites par les organismes photoautotrophes et qui doivent être acquis par l’alimentation chez les animaux. Leur potentiel antioxydant pour lutter contre la peroxydation lipidique a été démontré très tôt et ils sont capables de réagir avec les radicaux libres de trois manières : par le transfert d’électrons, d’hydrogène ou la liaison avec le radical. Ils sont également capables de régénérer la vitamine E et sont eux- mêmes régénérés par la vitamine C (Hermes-Lima, 2005).

2ème Partie

L’acide alpha-lipoïque est un acide soufré que le corps peut fabriquer à partir de la cystéine ; cependant la cystéine est l'acide aminé soufré le plus fréquemment déficitaire au sein de l'organisme. L’acide alpha-lipoïque est un antioxydant puissant qui présente l’intérêt d’être à la fois soluble dans l’eau et les graisses. Il a une capacité de régénérer d’autres antioxydants (Vitamine C, Vitamine E, glutathion, coenzyme Q10) sans s’oxyder lui- même. On le connaît aussi et surtout pour son rôle de chélateur des métaux lourds, empêchant ainsi l'intoxication de l'organisme par ces métaux dangereux.

Le gamma-oryzanol une famille de lipides spécifiques ; à l’instar des tocotriénols, les gamma-oryzanols aident à réduire le mauvais cholestérol en inhibant l'activité d'une enzyme, la cholestérol-estérase hépatique. Par ailleurs, il développe une activité anticancéreuse en association avec les tocotriénols, et diminue sensiblement les troubles de la ménopause, d'après certaines études japonaises (Lacoste, 2011).

- Les systèmes enzymatiques

Les principales enzymes antioxydantes sont la superoxyde dismutase (SOD), la catalase (CAT), la glutathion peroxydase (GPX), la glutathion réductase (GR) et la glutathion S- transférase (GST). Ce sont des enzymes dont les séquences sont très conservées au cours de l’évolution et qui agissent de manière coordonnée (Béguel, 2012).

Le superoxyde dismutase ou SOD (Fridovic, 1975) est une métalloprotéine. Elle existe sous plusieurs formes qui diffèrent par le métal contenu dans leurs sites actifs et leurs • localisations cellulaires. La SOD accélère la dismutation du radical O2 en H2O2 permettant ainsi

à l’organisme un contrôle du taux d’O2 intracellulaire. Il existe deux SOD : cuivre/zinc (Cu/Zn SOD), les deux sont des dimères. L’une est une enzyme cytosolique et l’autre est une enzyme extracellulaire. Ces deux formes sont retrouvées aussi bien chez les eucaryotes que chez les bactéries. L’ion cuivre est essentiel dans la réaction de dismutation tandis que l’ion zinc est nécessaire au maintien de la structure protéique. Une troisième forme est la SOD manganèse (Mn-SOD), tétramérique chez les eucaryotes et dimérique chez les bactéries. Chez les eucaryotes, la Mn-SOD est présente dans les mitochondries et permet de protéger celles-ci des radicaux O• qu’elles génèrent. Il est estimé qu’elle représente environ 1 à 10% de l’activité SOD totale chez les mammifères. Une quatrième forme est la Fe-SOD qui est une SOD uniquement procaryotique. Les SOD sont en général les premières défenses enzymatiques contre les ROS.

2ème Partie

La glutathion peroxydase ou GPX est une enzyme tétramérique. Elle agit plus

lentement que la catalase mais elle a une meilleure affinité pour le H2O2 que cette dernière.

La GPX est donc essentielle à la décomposition de l’H2O2 produit de manière continue. Les GPX sont des enzymes sélénium-dépendantes ou sélénium-indépendantes et sont soit cytosoliques, cas de la première GPX identifiée, soit extracellulaires. Les GPX

permettent la décomposition d’H2O2 par l’oxydation de son co-substrat le GSH (glutathion réduit) en GSSG (glutathion oxydé) qui sera réduit par la suite par l’action de la glutathion réductase.

2.5.1.3. Mode d’action des antioxydants

Ce sont des réducteurs capables d'interrompre la réaction de peroxydation et d'empêcher la formation des hydropéroxydes et des peroxydes à partir des huiles insaturées en particulier. A l'intérieur de notre corps, les antioxydants garantissent la salubrité des cellules et des tissus, car ils protègent contre les agressions oxydatives, autrement dit, ils possèdent la propriété d’empêcher la réaction en chaîne lancée par les radicaux libres (Martini M., 2013). Notre corps a besoin simultanément des 2 types d’antioxydants: hydrosolubles (vitamine C, flavonoïdes et polyphénols) et liposolubles (carotènes, vitamine E).

2.5.1.4. Effets des antioxydants sur la santé

Les antioxydants sont utilisés dans le traitement des accidents vasculaires cérébraux (AVC) et des maladies neurodégénératives. Ils sont utilisés également pour l’entretien de la bonne santé et ils aident à prévenir certaines maladies telles que les cancers et les maladies coronariennes (Gupta et al ., 2009).

2.5.2. METHODE D`EVALUATION DES ACTIVITES ANTIOXYDANTES

L’activité antioxydante in vitro des Aloès a été évaluée par la mesure du pouvoir de piégeage du radical DPPH (1,1- Diphenyl-2-picrylhydrazyl).

Le radical DPPH est un radical de couleur violette; l'ajout d'antioxydant réduit ce radical et décolore le mélange. Cette décoloration radicalaire mesurée au spectrophotomètre à 517 nm est proportionnelle à la concentration en antioxydants (Bongo et al., 2017). L'activité antioxydante des extraits séparés a été estimée en termes de capacité de donner de l'hydrogène ou de piégeage des radicaux, en utilisant la méthode au DPPH sur une plaque Chromatographique sur Couche 38

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Mince ou CCM (Brand-Williams, 1995). Un changement de coloration montrera l'activité antioxydante dans la plaque imbibée par le DPPH. La présence d'une capacité antioxydante de l'extrait a été estimée visuellement après CCM à une température ambiante. Les solutions suivantes ont été combinées pour préparer l'éluant: hexane 1, méthane 9, ED 0,2 pour la séparation des extraits.

Les manipulations d`extractions des poudres de feuilles sèches ont permis d`avoir des extraits et poudres selon la Figure 16.

2.5.2.1. Test qualitatif par révélation au DPPH

La méthode consiste à déposer l’extrait à tester sur une plaque de CCM qui a été développée par la suite avec un mélange de solvants (v/v). La plaque chromatographique a été imbibée dans une solution méthanolique de DPPH à 0,004% pendant quelques secondes. Après séchage, les taches de migration relatives aux substances à activité antioxydante apparaissent en jaune-pâle ou jaune sur fond violet.

La CCM est un procédé de microanalyse basé principalement sur la différence de solubilité d’une substance dans deux phases non miscibles qui sont la phase stationnaire et la phase mobile ou éluant. Une substance très soluble dans la phase mobile est entraînée facilement par cette dernière. Généralement, la phase stationnaire est constituée par un adsorbant (silice hydraté), étalé en mince couche sur une plaque de verre ou une feuille semi-rigide de plastique ou une feuille d’aluminium. L’éluant est un solvant ou un mélange de solvants qui progresse par capillarité le long d’une phase stationnaire entraînant ainsi à vitesse inégale suivant une direction déterminée les substances à séparer. Après que l’échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent à une vitesse dépendant de leur nature et de celle du solvant.

2.5.2.2. Effet scavenger du radical DPPH

Il a été mis en évidence selon la compilation des méthodes décrites par Wang et al., (2002) et Kivrak et al., (2009). Une solution de DPPH à 0,004% (0,2 < DO < 0,6 à λ=517 nm) a 39

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été préparée par la solubilisation de 2mg de DPPH dans 50 mL de méthanol. Un volume de 20 µL d’extrait (à différentes concentrations) a été ajouté à 2 mL de la solution de DPPH à 0,004%. Le mélange réactionnel a été agité vigoureusement et incubé 30 min à l’obscurité. Après incubation, les absorbances (DO) ont été mesurées à 517 nm contre le blanc (solution DPPH/méthanol).

L’acide ascorbique a été utilisé comme antioxydant synthétique de référence. Trois essais ont été effectués.

2.5.2.3. Détermination du pourcentage d’inhibition

Selon Sharififar et al., (2007), l’inhibition du radical libre de DPPH en pourcentage (P%) est calculée de la manière suivante :

P% = ((A blanc – A échantillon) / A blanc) x 100

Où : A blanc : Absorbance de la solution méthanolique de DPPH (0,004 %)

A échantillon : Absorbance de prise d'essai.

2.5.2.4. Concentration inhibitrice 50% (IC50)

La valeur de l’IC50 (concentration inhibitrice) a été définie comme étant la concentration de l’Aloe qui cause la perte de 50% de l’activité du DPPH.

La valeur de l’IC50 est déterminée graphiquement par les régressions linéaires sur les trois essais séparés de la relation : P(%) = f (C).

Où : C : concentration de l’Aloe dans l’extrait.

Les extraits d`alcaloïdes et poudre de polysaccharides obtenus sont conservés dans des tubes selon la Figure 16.

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Figure 16 : Extraits d`alcaloïdes et poudre de polysaccharides obtenus à partir des feuilles

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CHAPITRE 6 : TEST DES ACTIVITES ANTIMICROBIENNES

L’activité antimicrobienne des plantes médicinales a fait l’objet d’un grand nombre de publications internationales. Leur spectre d’action est très étendu ; par contre, les études sur les mécanismes d’action de cette activité sont en nombre négligeable. Jusqu’à présent, il n’existe pas d’étude pouvant nous donner une idée claire et précise sur leur mode d’action. Etant donné la complexité de leur composition chimique, il est très probable que chacun des constituants avait son propre mécanisme d’action. De plus, la thérapie des maladies infectieuses se basant principalement sur l’usage des antibiotiques est souvent inappropriée surtout quand il s’agit d’infections virales. L’emploi abusif et le non-respect des doses ont entraîné l’apparition de souches résistantes rendant les traitements inefficaces (Guedes et al., 2012). A cet effet, il est nécessaire d’orienter les recherches vers de nouvelles voies thérapeutiques utilisant les végétaux qui ont toujours constitué une source de nouveaux médicaments à partir de produits du métabolisme secondaire provenant des Aloès.

L’objectif de l’étude présentée dans ce chapitre est d’évaluer l’activité antibactérienne et fongique des Aloès sur huit souches bactériennes, afin de caractériser leur utilisation rationnelle.

2.6.1. MATERIELS ET METHODES POUR LES TESTS MICROBIOLOGIQUES

L’activité antibactérienne des Aloès a été évaluée par la méthode de diffusion en milieu solide.

Ce travail vise à tester l’effet des Aloès sur les germes infectieux et pathogènes, face à la propagation croissante des maladies et des aliments toxiques causés par des bactéries et des champignons.

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Les différents extraits utilisés pour le test microbiologique sont présentés dans le tableau 03 suivant :

Tableau 03 : Les différents extraits utilisés pour les tests microbiologiques.

Code Nom scientifique Nature 1 LRK 2086 B Aloe analavelonensis Extrait Brut de feuille entière 2 LRK 2086 AQ ALC Aloe analavelonensis Extrait Aqueux Alcaloïde de feuille

3 LRK 2086 CHCl3 ALC Aloe analavelonensis Extrait Chloroformique Alcaloïde de feuille 4 LRK 2086 POLYS Aloe analavelonensis Extrait de poudre de polysaccharide de feuille 5 LRK 2068 B Aloe helenae Extrait Brut de feuille entière 6 LRK 2068 AQ ALC Aloe helenae Extrait Aqueux Alcaloïde de feuille

7 LRK 2068 CHCl3 ALC Aloe helenae Extrait Chloroformique Alcaloïde de feuille 8 LRK 2068 POLYS Aloe helenae Extrait de poudre de polysaccharide de feuille

Un milieu de culture de type Mueller-Hinton (MH) a été coulé dans une boite de pétri avant chaque dépôt des extraits. Des inocula ont été préparés à partir des souches microbiennes matures disponibles auprès du laboratoire de Microbiologie du CNRE sous une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination (Figure 17).

Huit disques de dépôt ont été confectionnés à partir dùn papier filtre stérile de 6 mm de diamètre (bioMérieux) pour chaque extrait. Un dépôt de 20 µl de chaque extrait a été réalisé à làide dùne micropipette.

Figure 17 : Hotte à flux laminaire pour l’inoculation des souches microbiennes auprès du CNRE 43

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2.6.2. LES DIFFERENTES SOUCHES MICROBIENNES UTILISEES

L’activité antimicrobienne, antifongique et antivirale des Aloès a fait l’objet d’un grand nombre de publications internationales (Bongo et al., 2017 ; Morin, 2008 ; Mpiana et al., 2020a ; Rabarisoa et al., 2017 ; Reynolds, 1966 ; Schweizer, 2003). Leur spectre d’action est très étendu, car les extraits agissent sur un large éventail de bactéries aussi bien sur les Gram positifs que sur les Gram négatifs ; cette activité est par ailleurs variable d’un extrait à un autre et d’une souche bactérienne à une autre. Cependant, la majorité des travaux cités dans ces publications s’arrêtent au niveau de la mise en évidence de l’activité antimicrobienne. Jusqu’à présent peu d`espèces endémiques de Madagascar a fait l`objet d`études microbiologiques approfondies. Seules quelques espèces comme Aloe macroclada Baker, Aloe vaombe Decorse & Poiss. sont les plus étudiées. Le but de cette partie est donc de faire savoir si les deux espèces étudiées Aloe analavelonensis Letsara et Aloe helenae Danguy ont des effets sur des souches microbiennes.

2.6.2.1. Identification des souches microbiennes utilisées

Des souches microbiennes disponibles au laboratoire Laboratoire de Microbiologie et de l`Environnement du CNRE ont servi de germes-tests. Elles sont données dans le tableau 4 (page suivante) avec leurs références et leurs caractéristiques et les symptômes possibles de la maladie transmise.

2.6.2.2. Revivification des souches

Chaque souche bactérienne ou levure est ensemencée dans 9 mL de bouillon nutritif puis incubée à 37 °C dans une étuve pendant 24 h. La turbidité du bouillon nutritif indique le développement de souches cultivées.

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Tableau 4 : Les différentes souches microbiennes utilisées pour les tests.

Souches Caractéristiques Symptôme Sources

1 Staphylococcus aureus Bactérie à Gram positif, de forme ronde, C'est un membre habituel du microbiote du Masalha et al., 2001 Rosenbach 1884 membre des Firmicutes. C`est un (ATCC 11632) corps, fréquemment trouvé dans les voies anaérobie facultatif qui peut se respiratoires supérieures et sur la peau. développer sans avoir besoin d'oxygène Abcès; Conjonctivites ; Folliculites ; Furoncles ; Otites ; Pneumonies

2 Streptococcus Bactérie à Gram positif (pneumocoque), Cependant, l'infection par le pneumocoque Weiser, 2018 pneumoniae (Klein 1884) anaérobie facultative qui est responsable peut être dangereuse, provoquant non Chester 1901 (ATCC 6301) de la majorité des pneumonies seulement une pneumonie, mais également communautaires. C'est un organisme une bronchite, une otite moyenne, une commensal dans les voies respiratoires septicémie et une méningite. humaines, ce qui signifie qu'il bénéficie du corps humain, sans lui nuire

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Tableau 4 : Les différentes souches microbiennes utilisées pour les tests. (suite)

Souches Caractéristiques Symptôme Sources

3 Bacillus cereus Bactérie Gram positif, en forme de Infection alimentaire toxique. Kotiranta et al., 2000 Frankland & Frankland bâtonnet, facultativement anaérobie, Responsable de maladies d'origine alimentaire 1887 (ATCC 13061) motile, bêta-hémolytique, sporulée, que provoquant de graves nausées, vomissements l'on trouve couramment dans le sol et les et diarrhée. Les maladies d'origine alimentaire aliments. causées par le bacille surviennent en raison de la survie des endospores bactériennes lorsque

les aliments infectés ne sont pas ou mal cuits.

4 Candida albicans Levure pathogène opportuniste qui est un Mycose au niveau de la peau, des appareils Gow, 2017 (C.-P. Robin) Berkhout membre commun de la flore intestinale génitaux, urinaires et respiratoires ; Méningite (1923) humaine. Il peut également survivre en ; Muguet orale et vulvo-vaginale. Principale dehors du corps humain. Il est détecté source d'infections fongiques chez les patients dans le tractus gastro-intestinal et la gravement malades ou immunodéprimés. bouche chez 40 à 60% des adultes en bonne santé.

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Tableau 4 : Les différentes souches microbiennes utilisées pour les tests.(suite)

Souches Caractéristiques Symptôme Sources

5 Escherichia coli Bactérie à Gram négatif, anaérobie Certaines souches peuvent provoquer de la Tenaillon et al., (Migula 1895) 2010 facultative coliforme, en forme de diarrhée si on mange des aliments contaminés Castellani and Chalmers 1919 bâtonnet. On en trouve couramment dans ou boit de l'eau sale. (ATCC 25922) l'intestin inférieur des organismes à sang chaud (endothermes) En général inoffensifs et aident même à garder votre tube digestif en bonne santé.

6 Enterobacter cloacae Bactérie à Gram négatif en forme de Fait partie de la flore intestinale normale de Keller et al., 1998 (Jordán 1890) bâtonnet, facultativement anaérobie. nombreux humains et n'est généralement pas Hormaeche and Edwards 1960 un pathogène primaire. Certaines souches ont (ATCC 700323) été associées à des infections des voies urinaires et des voies respiratoires chez des personnes immunodéprimées.

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Tableau 4 : Les différentes souches microbiennes utilisées pour les tests.(suite)

Souches Caractéristiques Symptôme Sources

7 Salmonella enterica Bactéries Gram négatif en forme de La plupart des personnes infectées par la Patrick et al., 2004 (ex Kauffmann & bâtonnet (bacille) bactérie Salmonella développent de la Edwards 1952) Le Minor & Popoff 1987 Comme espèce hôte : les Humains, diarrhée, de la fièvre et des crampes Serovar enteritidis Rongeurs et Gallinacés abdominales 12 à 72 heures après l'infection. (ATCC13076) La maladie dure généralement de 4 à 7 jours et la plupart des personnes se rétablissent sans traitement. Cependant, chez certaines personnes, la diarrhée peut être si grave que le patient doit être hospitalisé. Fièvre typhoïde

8 Klebsiella oxytoca Bactérie Gram négatif en forme de Infection urinaire ; Septicémie Darby et al., 2004 (Flügge 1886) Lautrop bâtonnet Les symptômes courants d'une infection 1956. (ATCC 8724) comprennent: une fièvre des frissons, courbatures et autres symptômes pseudo-grippaux difficulté à reprendre son souffle ou respiration superficielle une toux remplie de mucus

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2.6.2.3. Rajeunissement des souches

A partir des cultures préparées précédemment, les souches sont repiquées. Pour chaque souche, une ansée de cette culture est ensemencée en stries sur une boîte de Pétri contenant du milieu gélosé nutritif solide. Les cultures sont incubées dans une étuve Figure 18 à 37 °C pendant 24 h afin d’obtenir des colonies jeunes et isolées.

Figure 18 : Etuve pour l`incubation des souches microbiennes

2.6.2.4. Antibiogramme

La méthode de Docteur Jean Valnet et le Docteur Girault (1973) a été utilisée. Contractée sous le nom antibiogramme, cette méthode a été utilisée à l’époque pour analyser des huiles essentielles. C`est une méthode de diffusion par disque (Figure 19). L’apparition et l’importance du diamètre de la zone d’inhibition reflète l’impact des extraits sur les souches microbiennes. Ainsi, ces dernières seront qualifiées de sensibles ou très sensibles, ou résistantes aux extraits.

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Boite de Pétri

Souche test de microbe

Milieu de culture gélosé (Agar)

Disque imbibée d`extrait d`Aloe

Zone d `inhibition

Croissance microbienne

Figure 19 : Méthode de diffusion par disque

Les disques sont imbibés avec 10 µL dèxtrait dÀloe (concentration équivalent à 15µg par 10 µL), un témoin négatif avec de l’eau distillée stérile et un disque d’antibiotique comme témoin positif (Cefotaxime 5 µg par disque). Le tableau 05 suivant illustre lìnterprétation du degré de sensibilité des germes selon la taille du diamètre de halo dìnhibition.

Tableau 05: Lecture des résultats du test antibiogramme selon Ponce et al., 2003

Diamètre d’halo d’inhibition (x) Degré de sensibilité des germes x < 8 mm Insensible ou résistante 9 mm < x < 14 mm Sensible 15 mm < x < 19 mm Très Sensible x > 19 mm Extrêmement sensible

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CHAPITRE 7 : TESTS DE TOXICITE DES EXTRAITS

Les vertus thérapeutiques des plantes médicinales sont connues et utilisées partout, notamment dans les pays en développement comme Madagascar où ces produits naturels constituent la base de la médecine traditionnelle (Turbide, 2010). Plusieurs recherches scientifiques le confirment : certaines peuvent être analgésiques, calmantes, cicatrisantes, alors que d'autres sont bactéricides, fongicides, virucides, antiparasitaires, immunostimulantes ou antioxydantes. Par conséquent, en pharmacie, les extraits sont majoritairement destinés à la phytothérapie sous formes médicamenteuses et à la production d’antiseptiques et antioxydantes. L'utilisation de plantes médicinales pour divers problèmes de santé n'est pas seulement un choix, mais est également liée à la pauvreté : coût élevé des médicaments modernes (Ngbolua et al., 2016b; Inkoto et al., 2018; Ngbolua et al., 2019a). Toutes ces observations ont éveillé la curiosité pour mieux connaître les plantes médicinales et endémiques malgaches sur le plan scientifique vue leur utilisation anarchique en médecine traditionnelle. De plus, la menace de déforestation et la recrudescence des besoins des riverains qui défrichent toute la forêt pour leurs besoins quotidiens afin d’y aménager leur culture concourent à faire disparaitre les plantes. Dans ce contexte, cette étude a pour objectif général de mieux connaitre la plante afin de contribuer à son utilisation rationnelle et à sa conservation. Pour cela, nous allons déterminer ses potentiels thérapeutiques, approfondir les connaissances par l’utilisation de ses feuilles. Les végétaux supérieurs peuvent produire en effet deux sortes de métabolites : les métabolites primaires (protéines, polysaccharides…..) nécessaires à la croissance et au développement de l’organisme ; et les métabolites secondaires dans les extraits bruts. Ces derniers sont synthétisés et employés par les végétaux dans des multitudes fonctions adaptatives notamment en réponse aux stress biotiques et abiotiques qu’ils peuvent subir. Ces substances constituent une source de molécules bioactives, avec des propriétés physico-chimiques diverses et des vertus biologiques multiples (antimicrobienne, antioxydante, anti-tumorale et anti- inflammatoire…). D’où l’intérêt d’effectuer des analyses qualitatives et/ou quantitatives des constituants des métabolites secondaires.

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Une des caractéristiques des extraits bruts est leur aptitude à produire des activités in vitro qu’in vivo. Il est connu que de tous temps, les Aloès ont été utilisées en médecine traditionnelle pour le traitement de nombreuses maladies (Reynolds, 1966).

Les Aloès ne sont pas connus comme des plantes toxiques, même si les glycosides d'anthrone amère rendent certains d'entre eux désagréables au goût (Reynolds, 1966). Cependant, quelques rapports d'effets toxiques peuvent être trouvés dans la littérature. Les espèces suivantes ont été signalées en Afrique: Aloe ortholopha Christian & Milne-Redh, Aloe christianii Reynolds, Aloe chabaudii Schönl. et Aloe globuligemma Pole Evans. (Reynolds, 1966; Nyazema, 1984; Parry and Matambo, 1992; Parry and Wenyika, 1994). C`est ce qui nous a conduit à faire des tests pour les deux espèces d`Aloès sur un modèle animal.

2.7.1. MATERIELS POUR LE TEST DE TOXICITE

L’étude in vivo a été réalisée sur des souris (Mus musculus L.) race Swiss, procurées auprès de l'Institut Malgache des Vaccins Vétérinaires (IMVAVET) et élevées au Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza (PBZT) de Madagascar. C`est une animalerie où sont gardés environs 100 souris et 25 rats utilisés lors des expériences (Septembre 2020). C`est aussi un lieu de stockage de souches d` animaux destinés à l’alimentation des Oiseaux de proie (Rapaces), des Carnivores (Cryptprocta ferox ou Fosa), des Chats sauvages (Felis lybica ocreata) et des Serpents.

Les animaux sont hébergés dans des cages où ils ont accès libre à l’eau et à l’aliment. Les souris de sexes différents, ayant un poids compris entre 22 g et 23 g (6 à 8 semaines) ont été utilisées pendant les tests de toxicité.

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Source: Franck R.

Figure 25 : Gavage de souris dans l`animalerie de PBZT

2.7.2. METHODE D`EVALUATION DE LA TOXICITE AIGUE

La détermination de la toxicité aigüe consiste à savoir la dose unique mortelle de l’extrait en une seule fois pour un temps déterminé (24 h). La méthode de Trevan 1927 a été utilisée pour déterminer la DL50, donnée par la courbe de pourcentage de mortalité des souris en fonction du logarithme décimal des doses administrées. Les valeurs trouvées sont ensuite confirmées par la méthode de calcul de Berhens et Karber 1935 d`après Dr Kedari Aissa (2014) :

DL50 = DL100 – (Σ (a x b) / n)

avec les paramètres suivants:

DL100 : dose létale donnant 100% de mortalité n = nombre d`animaux utilisés par lot a = différence entre deux doses successives b = moyenne de morts entre deux doses successives.

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Ainsi, les limites de confiance qui permettent de situer la toxicité des extraits sur l'échelle de valeur de toxicité des substances chimiques sont proposées par Hodge et Sterner 1943 (Tableau 6).

Une dose 1200 mg/Kg a été testée respectivement sur 2 lots de 3 souris, un autre lot de 3 souris sert de témoin et ne reçoit que de l’eau distillée. Les souris sont mises à jeun pendant 24 h avant administration du produit. Ce dernier a été fait par voie orale (gavage), à raison de 0,3 mL pour une souris de 25 g. L’observation a été faite pendant les 24 h qui ont suivi l’administration. Pendant cette période, le nombre de morts et les signes cliniques observés pour chaque lot sont notés.

Tableau 6 : Classe de toxicité, selon l’échelle de toxicité de Hodge et Sterner (1943)

Indice ou classe de toxicité Terme couramment utilisé Paramètre toxicologique (DL50)

1 Extrêmement toxique DL50 ≤ 1 mg/Kg

2 Hautement toxique 1 mg/Kg ≤ DL50 ≤ 50 mg/Kg

3 Modérément toxique 50 mg/Kg ≤ DL50 ≤ 500 mg/Kg

4 Légèrement toxique 500 mg/Kg ≤ DL50 ≤ 5 g/Kg

5 Presque toxique 5 g/Kg ≤ DL50 ≤ 15 g/Kg

6 Relativement inoffensif DL50 ≥ 15 g/Kg

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CHAPITRE 8 : MISE EN EVIDENCE DES ACTIVITES LARVICIDES DES EXTRAITS

Plus de 2000 espèces végétales possédant une activité insecticide sont déjà identifiées (Jacobson, 1989). Des propriétés insecticides de certaines Aloès ont été testées sur les larves d’insectes vecteurs de maladie. Ainsi, les espèces suivantes ont été étudiées : Aloe vera (Murugan et al., 2012 ; Subramaniam et al., 2012 ; Susheela et al., 2016 ; Yolidjé et al., 2019…), Aloe turkanensis, Aloe ngongensis et Aloe fibrosa (Matasyoh et al. 2008 ; Chore et al., 2014) et Aloe ferox (Soyelu et al., 2019). Ce sont tous des Aloès d`origine africaines.

Les moustiques ont toujours été considérés comme sources de nuisance pour l’homme, principalement en raison du fait qu’ils peuvent être des vecteurs de maladies. Les espèces de moustiques suivantes ont été déjà étudiées : Aedes aegypti (Subramaniam et al., 2012 ; Chore et al., 2014 ; Susheela et al., 2016), Anopheles stephensi (Murugan et al., 2012), Anopheles gambie (Matasyoh et al., 2008, Yolidjé et al., 2019). De même, des tests avec Aloe ferox ont été déjà réalisés par (Soelu et al., 2019) sur d`autres larves parasitaires de type Chrysomya bezziana Villeneuve (Diptera: Calliphoridae), responsables des myiases ou myases (ensemble des troubles provoqués par la présence dans un corps humain ou animal de larves de diptères parasites) qui affectent généralement le bétail.

A Madagascar, les études menées sur l’activité insecticide des extraits végétaux surtout les Aloès vis-à-vis des larves de moustiques sont très rares voire inexistantes.

Notre recherche consiste donc à évaluer l`effet larvicide de Aloe analavelonensis et Aloe helenae sur des larves de moustiques du genre Culex qui peuvent transmettre des maladies parasitaires telles que la filariose et la fièvre jaune. C'est aussi le vecteur de Wuchereria bancrofti, du paludisme aviaire et des arbovirus dont le virus de l'encéphalite de Saint-Louis, le virus de l'encéphalite équine occidentale, le virus Zika et le virus du Nil occidental (Stephanie, 2009 ; Stephanie, 2016).

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2.8.1. MATERIELS UTILISES POUR LE TEST LARVICIDE

Dans le cadre de cette étude, nous avons collecté des larves de moustiques dans son habitat naturel dans lènceinte du Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza (PBZT) (S18o 55’ 56’’, E 47o 31’ 34’’ Alt. 1276m). La collecte a été faite le 13 Octobre 2020 juste après la première pluie de la saison. Les larves proviennent de gîtes larvaires non traités situés dans des dalles dìrrigation dèaux usées semi-recouvertes.

Source: l`auteur Source: l`auteur

Figure 20 : Lieu de récolte des larves Figure 21 : Acclimatation des larves au labo pendant 24 h.

Des larves de Culex quinquefasciatus Say, 1823 ont été identifiées au stade L3. Elles ont été triées et isolées pour éviter les interactions interspécifiques.

C'est une espèce commune qui est souvent un ravageur autour de la maison et a tendance à se reproduire dans les eaux polluées.

2ème Partie

Male Femelle

Figure 22: Photo des adultes de Culex quinquefasciatus

Ce sont des moustiques de taille moyenne d'aspect brunâtre; trompe foncée mais souvent avec quelques écailles pâles à mi-chemin sur la face inférieure; scutum à écailles étroites dorées et bronzées; ailes toutes sombres écailles; pattes postérieures avec le fémur pâle presque jusqu'à la pointe sauf pour les écailles sombres sur la longueur dorsale, le reste des pattes toutes foncées à l'exception de la tache pâle à l'articulation tibio-tarsienne; tergites abdominaux à écailles sombres avec des bandes basales pâles resserrées latéralement et ne se confondant pas avec des taches latérales sauf peut-être sur les segments terminaux, les sternites généralement à écailles pâles mais avec quelques écailles plus sombres dispersées médialement.

Figure 23 : Habitat de Culex quinquefasciatus : Canal Andriantany 57

2ème Partie

Ce sont des moustiques très répandus, généralement étroitement associés à l'habitation humaine, en particulier en milieu urbain. Les adultes sont généralement actifs pendant les mois les plus chauds; ils attaquent généralement les humains vers la nuit à l'intérieur et à l'extérieur, et sont souvent aussi attirés par les oiseaux (par exemple la volaille).

Les Tests sur des larves et observations ont été faites au laboratoire du Centre National de Recherche pour l`Environnement (CNRE).

2.8.2. METHODE D`EVALUATION DES ACTIVITES LARVICIDES

Les extraits utilisés sont ceux obtenus à partir des poudres de feuilles de Aloe analavelonensis et Aloe helenae. Les quantités de matières végétales solubles dans les extraits aqueux ont été estimées par PPM. Cela permet d`exprimer les concentrations létales des résidus secs solubles dans l`eau en mg/l.

- Test larvicide

La méthodologie du test est inspirée de la technique des tests de sensibilité normalisés par l’Organisation Mondiale de la Santé, adoptée pour tester la sensibilité des larves, vis-à-vis des insecticides utilisés en campagnes de lutte (OMS, 1983).

Source: l`auteur

Figure 24 : Tests de propriétés larvicides des extraits

2ème Partie

Pour chacune des concentrations de l’extrait ainsi que pour le témoin, quatre répétitions sont effectuées. Le taux de mortalité est calculé en termes de moyenne des quatre déterminations portant chacune sur 25 individus. L’analyse statistique des moyennes est réalisée à l’aide du test de l’analyse de la variance ANOVA 2. Les moyennes de mortalité ont été traitées et comparées par le test de Scheffe au seuil de P = 0,05 (Sas, 1990). Les Concentrations Létales CL50 sont déterminées après 24 heures d’exposition.

3ème Partie : RESULTATS DES ETUDES ECOLOGIQUES, PHYTOCHIMIQUES ET ACTIVITES BIOLOGIQUES

3ème Partie

3ème Partie : RESULTATS DES ETUDES ECOLOGIQUES, PHYTOCHYMIQUES ET ACTIVITES BIOLOGIQUES

CHAPITRE 9 : MODELES DE NICHE ECOLOGIQUE FAVORABLE POUR LES DEUX ESPECES

3.9.1. MODELE DE NICHE ECOLOGIQUE FAVORABLE POUR Aloe analavelonensis

La courbe suivante montre que la valeur des données d`entrainement a une valeur proche ou égale à 1 : AUC=1. Ceci signifie que le modèle proposé pour Aloe analavelonensis sur MaxEnt tout en considérant les facteurs écologiques proposés est très fiable.

Figure 26 : Courbe représentant la fiabilité du modèle proposé sur MaxEnt de Aloe analavelonensis

Le tableau récapitulatif dans le modèle (Tableau 07) montre que tout pixel ayant une valeur inférieure à 51.905 du « minimum training présence » n`est pas favorable pour l`installation de Aloe analavelonensis.

3ème Partie

Tableau 07: Interprétation du tableau exprimant la probabilité d`occurrence de Aloe analavelonensis par MaxEnt.

Cumulative Logistic Fractional Training Description threshold threshold predicted area omission rate 1.000 0.001 Fixed cumulative value 1 0.006 0.000 5.000 0.022 Fixed cumulative value 5 0.001 0.000 10.000 0.113 Fixed cumulative value 10 0.000 0.000 51.905 0.600 Minimum training presence 0.000 0.000 51.905 0.600 10 percentile training presence 0.000 0.000 Equal training sensitivity and 51.905 0.600 0.000 0.000 specificity Maximum training sensitivity plus 51.905 0.600 0.000 0.000 specificity Balance training omission, predicted 0.261 0.000 0.013 0.000 area and threshold value Equate entropy of thresholded and 10.377 0.113 0.000 0.000 original distributions La carte suivante (Figure 27) représente alors la distribution potentielle d’Aloe analavelonensis sur une carte de Madagascar produite par MaxEnt. Sont représentés en bleu, les pixels non convenables pour la distribution de lèspèce. En jaune sont les pixels où il y a les sites convenables pour lèxistence de lèspèce. Cèst une distribution très restreinte car elle nèst représentée que par une superficie très limitée de pixels. Elle nèst ici recensée que par deux points de couleurs blancs. Cette carte a été détaillée sur une autre carte (Figure 28).

Figure 27 : Carte de distribution potentielle de Aloe analavelonensis

3ème Partie

Figure 28 : Carte des habitats favorables pour Aloe analavelonensis 62

3ème Partie

Les résultats de l`analyse des contributions des variables écologiques sur Aloe analavelonsis sont montrés par le tableau suivant : Tableau 08: Contribution des variables écologiques sur la répartition de Aloe analavelonensis

Variable Percent contribution Permutation importance bio14 26 51.8 pfc2000_vcf 20.3 0 bio2 15.1 1 bio9 11.8 41.4 bio12 9.4 0 bio8 7.3 0 bio6 5.9 0 bio16 3.1 0 bio3 0.8 0 bio11 0.3 0 bio13 0.1 5.8 bio4 0 0 bio7 0 0 bio5 0 0 bio19 0 0 bio18 0 0 bio17 0 0 bio15 0 0 bio10 0 0 bio1 0 0

Ce tableau 08 nous démontre lìmportance des conditions écologiques suivantes sur lèxistence de lèspèce :

- On constate une forte contribution de la quantité des précipitions de la période la plus sèche Bio 14 (26) et la couverture forestière pfc2000_vcf (20.3) sur la présence de la plante à l`état naturelle. - La permutation des variables écologiques a beaucoup plus d`importance sur les quantités de précipitations de la période la plus sèche Bio 14 (51.8) et la température moyenne du trimestre le plus sec Bio 9 (41.4).

Les analyses sur MaxEnt ont montré également le profil écologique en diagramme qui influence la distribution de Aloe analavelonensis.

3ème Partie

Figure 29 : Profil écologique en diagramme de Aloe analavelonensis

La Figure 29 nous montre une forte influence, par sa présence, de la couverture forestière (courbe plus longue de couleur bleue : pfc2000_vcf). Cette espèce est également fortement influencée par l`omission de la couverture forestière et des précipitations de la période la plus sèche (courbes plus courte de couleur verte : pfc2000_vcf et bio14). Ceci est expliqué par la nature de la végétation où pousse cette plante : Forêt Dense Humide de l`Ouest de Madagascar (Moat, & Smith, 2007).

Figure 30: Aloe analavelonensis et son habitat naturel (Forêt d`Analavelona Sakaraha)

3ème Partie

Cèst une forêt dùne superficie de 4.487 ha qui fait partie dùne Nouvelle Aire Protégée créée en 2005. Elle est située sur une face sud-est d’un massif isolé de 1.325 m d’altitude à Mitsinjoriake. Le massif forme « un oasis de brumes » recevant des précipitations et une humidité orographique. Il est seulement accessible à pied via le village dÀmbinanitelo. Ce village est relié à Sakaraha par une route secondaire, praticable entre avril et mi-décembre. Cette forêt est également accessible du village dÀndranoheza à partir de Mahaboboka (RN7- 24 km de Sakaraha) à pieds. Le bioclimat est du type subhumide à saison sèche atténuée : « Etage Humide Hhe » (Cornet, 1974). La saison pluvieuse de novembre à avril ; la saison froide entre Juin et Août avec une température de 7,3 °C et saison chaude de septembre à novembre avec un pic de plus de 32,4 °C (entre décembre et février). La pluviométrie annuelle varie entre 700 et 1 500 mm. La forêt est une mélange de végétations sempervirente et sclérophylle, classée dans « Forêt Humide de lÒuest de Madagascar » (Moat & Smith, 2007). Elle est située dans une « Zone Ecofloristique occidentale de moyenne altitude » (Faramalala, 1988) avec un « Bioclimat Etage humide » Hhe (Cornet, 1974). Sur 400 espèces de plantes identifiées, 73% y sont endémiques. Les arbres atteignent 20 à 30 m aux abords des cours d’eau. (Andriamihajarivo, 2008; Randrianarivony, 2015).

Le sol est constitué principalement sur des laves (52%) et de sable non consolidé (40%). Le calcaire mésozoïque peut également apparaitre pour ce type de végétation (Moat, & Smith, 2007).

3.9.2. MODELE DE NICHE ECOLOGIQUE FAVORABLE POUR Aloe helenae

La courbe suivante (Figure 31) montre que la valeur des données d`entrainement a une valeur proche ou égale à 1 (AUC = 0.997). Ceci signifie que le modèle proposé pour Aloe helenae sur MaxEnt tout en considérant les facteurs écologiques proposés est fiable.

3ème Partie

Figure 31 : Courbe représentant la fiabilité du modèle proposé sur MaxEnt de Aloe helenae

Le tableau récapitulatif du modèle (Tableau 09) montre que tout pixel ayant une valeur inférieure à 10.937 du « minimum training présence » n`est pas favorable à l`installation de Aloe helenae.

Tableau 09: Interprétation du tableau exprimant la probabilité d`occurrence de Aloe helenae par MaxEnt

Cumulative Cloglog Fractional Training Description threshold threshold predicted area omission rate 1.000 0.002 Fixed cumulative value 1 0.077 0.000 5.000 0.027 Fixed cumulative value 5 0.026 0.000 10.000 0.078 Fixed cumulative value 10 0.015 0.000 10.937 0.092 Minimum training presence 0.014 0.000 13.312 0.120 10 percentile training presence 0.011 0.059 Equal training sensitivity and 10.937 0.092 0.014 0.000 specificity Maximum training sensitivity plus 10.937 0.092 0.014 0.000 specificity Balance training omission, predicted 1.477 0.004 0.060 0.000 area and threshold value Equate entropy of thresholded and 13.199 0.120 0.011 0.059 original distributions

3ème Partie

La carte suivante représente alors la distribution potentielle d’Aloe helenae sur une carte de Madagascar. Sont représentés en bleu, les pixels non convenables pour la distribution de lèspèce. En jaune sont les pixels où il y a les sites convenables pour la distribution de lèspèce. En rouge sont les pixels qui représentent les sites très convenables pour lèspèce. Cèst une distribution restreinte car elle nèst représentée que par une superficie très limitée de pixels. Les carrés blancs représentent les endroits où lòn a signalé la présence de la plante dans la nature.

Figure 32 : Carte de distribution favorable pour Aloe helenae

Les résultats de l`analyse des contributions des variables écologiques sur Aloe helenae sont montrés par le tableau 10 suivant :

Tableau 10: Contribution des variables écologiques sur la répartition de Aloe helenae

Variable Percent contribution Permutation importance bio15 64.2 85.5 bio13 16.6 14.0 bio16 16.5 0.0 bio6 2.5 0.0 bio12 0.1 0.1 bio7 0.0 0.1 bio9 0.0 0.2 pfc2000_vcf 0.0 0.0

3ème Partie

Figure 33 : Carte des habitats favorables pour Aloe helenae 68

3ème Partie

Le tableau 10 nous montre lìmportance des conditions écologiques suivantes sur lèxistence de lèspèce :

- La présence de la plante à l`état naturel est fortement sous lìnfluence dùne forte contribution de Bio15 : la Saisonnalité des précipitations (Coefficient de variation) qui est égale à 64, les Précipitations de la période la plus humide Bio 13 (16.6) et les Précipitations du trimestre le plus humide Bio 16 (16.5). - La permutation des variables écologiques a beaucoup plus dìmportance sur Bio15 : la Saisonnalité des précipitations (85.5) et Bio 13: les Précipitations de la période la plus humide (14).

Les analyses sur MaxEnt ont montré également le profil écologique en diagramme qui influence la distribution de Aloe helenae.

Figure 34 : Profil écologique en diagramme de Aloe helenae

Cette figure 34 nous montre une forte influence par sa présence, celle de Bio15 : la Saisonnalité des précipitations (courbe plus longue de couleur bleue) et par son omission

3ème Partie

(courbe plus courte de couleur verte : Bio15). Ceci est expliqué par la nature de la végétation où pousse cette plante : Forêt sèche épineuse dégradée et Fourré sec épineux du Sud-ouest de Madagascar et Foret littorale de Petriky Madagascar (Moat, et Smith, 2007).

Figure 35: Aloe helenae et son habitat naturel (Forêt de Petriky, Fort Dauphin)

Cette végétation se situe dans un « Bioclimat à Etage subaride – sous étage 3 » : SA3c (Cornet, 1974). Le climat est du type Sub-aride avec une moyenne annuelle de pluviométrie de 540 mm (Cornet 1974). La géologie de ces types de végétation est dominée par les sables non consolidés, les plateaux calcaires du Sud-Ouest de Madagascar et le sable récent. Cas de la forêt littorale de Petriky.

L`habitat de cette espèce est inclus dans la « Zone éco-floristique méridionale de basse altitude » : 0 – 300 m (Faramalala, 1995). C`est une végétation qui est de type Forêt-fourré sèche épineuse du Sud-Ouest (Moat, & Smith, 2007) avec une physionomie diversifiée qui varie en fonction de la pluviométrie et du substrat. Elle varie d`une forêt à une fourré impénétrable, à une formation buissonnante et des buissons bas (Moat, & Smith, 2007).

3ème Partie

3.9.3. CONCLUSION SUR LA DISTRIBUTION ET NICHE ECOLOGIQUE DES DEUX ESPECES

Ce chapitre a illustré les caractères généraux des Aloès ainsi que leur utilisation dans le monde. Deux espèces ont été étudiées plus particulièrement: Aloe analavelonensis Letsara et Aloe helenae Danguy. Une répartition géographique, un modèle d`aire de distribution favorable à Madagascar pour ces deux espèces ont été proposés. Les résultats livrés sur MaxEnt ont montré que Aloe analavelonensis et Aloe helenae ont des préférences écologiques de distribution dans la nature.

Aloe analavelonensis pousse favorablement dans une Forêt Humide de l`Ouest de Madagascar tout en considérant la couverture forestière et les précipitations de la période la plus sèche comme facteurs très importants pour sa distribution et sa survie.

Aloe helenae par contre pousse favorablement dans une Foret sèche épineuse dégradée et/ou Fourré sèche épineuse du Sud de Madagascar. La saisonnalité des précipitations est un facteur très important pour la distribution et la survie de cette espèce.

Ces informations sont des outils nécessaires pour la conservation in-situ et ex-situ de ces deux espèces. C`est également un outil en agronomie, en horticulture pour savoir les conditions favorables aux développements de ces deux espèces.

3ème Partie

CHAPITRE 10 : RESULTATS DES SCREENING PHYTOCHIMIQUES

Les tests phytochimiques consistent à détecter les différents composés existants dans les feuilles par des réactions qualitatives. La détection de ces composés chimiques est basée sur des essais de solubilités des constituants, des réactions de précipitation et de turbidité, un changement de couleur spécifique ou un examen sous la lumière ultraviolette.

Les tests de caractérisation phytochimiques, réalisés sur l’extrait de 10g par 130 ml contenant des substances naturelles, ont donné les résultats que nous présentons dans les tableaux ci-dessous.

3.10.1. LES FAMILLES CHIMIQUES DETECTEES DANS Aloe analavelonensis

Le tableau suivant représente les résultats des tests effectués sur les extraits méthanoliques de Aloe analavelonensis.

Tableau 11- Résultats des réactions de caractérisation des contenus dans l'extrait d`Aloes analavelonensis

Famille chimique Observation Résultats Conclusion t =1cm, Saponoside Pas de mousse o Test négatif t30=0cm Test fortement positif avec Ethanol Polysaccharide Floculation blanche +++ absolu Hetéroside Test négatif avec Picro-Sodium de Aucune réaction - cyanogénétique l`extrait chloroformique Tests de Mayer, Wagner, Dragendorff Alcaloïde Floculation blanche +++ fortement positifs Leucoanthocyane Rouge violacée ++ Test de Bate-Smith positif Test de Willstätter positif : Flavonoide Rouge violacée + Flavonone Test négatif de Badjet-Kedde Stéroide lactonique Bleu vert - Test positif de Liebermann-Burchard Stérols insaturés Présence d`anneau rouge ++ Test de Salkowski positif Virage au rouge de la phase Anthraquinone ++ Test de Borntrager positif alcaline Tanin Rouge - Réaction négative Autre composé Coloration bleu-vert ++ Réaction positive avec FeCl phénolé 3 (-) Résultat négatif, (+) Résultat faiblement positif, (++) Résultat positif, (+++) Résultat fortement positif.

3ème Partie

Ces résultats nous mènent à la conclusion suivante : il y a une forte présence des Alcaloïdes et des polysaccharides dans la composition chimique des extraits de Aloe analavelonensis. Ce sont probablement les responsables des activités existantes dans la plante. Les Leucoanthocyane, les Stérols insaturés, les Anthraquinones, les autres composés phénolés et les Flavonoides sont également présents dans les extraits. Les Saponosides, les tanins et les stéroides lactoniques ne sont pas par contre présents.

3.10.2. LES FAMILLES CHIMIQUES DETECTEES DANS Aloe helenae

Le tableau suivant présente les résultats des tests effectués sur les extraits méthanoliques de Aloe helenae.

Tableau 12- Résultats des réactions de caractérisation des contenus dans l'extrait d`Aloes helenae

Famille chimique Observation Résultats Conclusion

Saponoside Un peu de mousse to=1cm, t30=0.5cm Test faiblement positif Test fortement positif avec l`éthanol Polysaccharide Floculation blanche +++ absolu Hetéroside Test négatif avec Picro-Sodium de Pas de réaction - cyanogénétique l`extrait chloroformique Test de Mayer, Wagner, Dragendorff Alcaloïde Floculation blanche +++ fortement positifs Leucoanthocyane Rouge violacée ++ Test de Bate-Smith positif Flavonoide Rouge pourpre + Test de Willstätter positif : Flavonone Test faiblement positif de Badjet- Stéroide lactonique Rouge + Kedde Présence d`anneau Stérols insaturés ++ Test de Salkowski positif rouge Virage au rouge de la Anthraquinone ++ Test de Borntrager positif phase alcaline Tanin Coloration rouge - Réaction négative Autre composé Coloration bleu-vert ++ Réaction positive avec FeCl3 phénolé (-) Résultat négatif, (+) Résultat faiblement positif, (++) Résultat positif, (+++) Résultat fortement positif. 73

3ème Partie

Ces résultats nous mènent à la conclusion suivante : il y a une forte présence des Alcaloïdes et des polysaccharides dans la composition chimique des extraits de Aloe helenae. Ce sont probablement les responsables des activités existantes dans la plante. Les Leucoanthocyane, les Stérols insaturés, les Anthraquinones, les autres composés phénolés et les Flavonoides sont également présents dans les extraits. Après 30 mn a été apparue la présence d`une mousse d`épaisseur de 0.5 cm après agitation. Ceci indique la présence des Saponosides chez Aloe helenae.

Par contre, les hétérosides cyanogénétiques, les tanins et les stéroides lactoniques sont absents.

3.10.3. CONCLUSION SUR LA COMPOSITION PHYTOCHIMIQUE

Les tests de la caractérisation chimique montrent la présence d`une forte quantité d`Alcaloïdes et de Polysaccharides chez les deux espèces. Anthraquinone, leucoanthocyane, Flavonoides, Stérols insaturés et autres composés phénolés sont également présents.

On constate par contre l`absence d`Hétérosides cyanogénétiques, Stéroides et du Tanin.

Une différence entre les deux espèces en termes de compositions phytochimiques est constatée du point de vue présence des Saponosides dans Aloe helenae. Ceci n`est pas constatée chez Aloe analavelonensis.

Les résultats que nous avons obtenus sont conformes avec ceux trouvés par des études ultérieures sur les Aloès de Madagascar (Reynolds, 1966 ; Ralamboranto, 1981 ; Randrianarison, 2003 ; Rabarisoa, 2017). Le taux des composants chimiques dans une plante peut dépendre de deux facteurs principaux : le stade de développement végétatif et les conditions environnementales (Jordán et al. 2013). Leur concentration peut varier considérablement entre les différentes espèces végétales et au sein de la même espèce où elle dépend du degré de maturité, de l’âge des feuilles, des fleurs et de la saison.

3ème Partie

CHAPITRE 11 : RESULTATS DES ACTIVITES ANTIOXYDANTES CHEZ LES DEUX ESPECES

3.11.1. TESTS QUALITATIFS PAR REVELATION AU DPPH DE L`EXTRAIT HYDROALCOLIQUE

Le résultat de la Chromatographie sur Couche Mince avec des extraits hydroalcooliques a donné le résultat illustré avec la figure ci-dessous :

4 5 6 1- Dépôt de lèxtrait de Acide ascorbique 2- Dépôt de lèxtrait de Aloe helenae 3- Dépôt de lèxtrait de Aloe analavelonensis 4- Migration de lèxtrait de Acide ascorbique 5- Migration de lèxtrait de Aloe helenae

6- Migration de l`extrait de Aloe analavelonensis

1 2 3

Figure 36: Migration des extraits sur Chromatographie sur Couche Mince (CCM).

Comme temoin, nous avons utilisé làcide ascorbique. Une migration des depôts temoins et extraits a été observée. Cela signifie que les molécules ont migré. Après révélation avec de la 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), des colorations jaunâtres ont été observées. Ceci signifie quìl y a réaction de réduction cèst à dire activité antioxydante des extraits.

3.11.2. EFFET SCAVENGER DU RADICAL DPPH SUR LES EXTRAITS

Une réaction de réduction va s’établir entre le radical libre DPPH et les composés antioxydants des extraits provoquant le changement de couleur. Cette réaction est représentée par la figure suivante :

3ème Partie

Les photos ci-dessous illustrent la présence d`un effet scavenger du radical DPPH sur des extraits analysés.

Figure 37: Effet scavenger du radical DPPH A une Densité optique de DO = 0.434, on a obtenu les concentrations suivantes : chez Aloe analavelonensis, cet effet est compris entre les concentrations 1 et 2 (0.138 – 0.294). Tandis que pour Aloe helenae, il est situé entre 4 et 5 (0.199 – 0.316).

Les tableaux suivants illustrent le pourcentage d`inhibition des extraits et de l`acide ascorbique.

Tableau 13 : Pourcentage d`inhibition des extraits

LRK LRK Concentration 2068 2086 (mg/ml) (%) (%)

20 95.16 68.2

10 89.86 32.25

5 85.72 14.97

2.5 54.15 7.83

1.25 27.19 3.45

3ème Partie

Tableau 14 : Pourcentage d`inhibition de l`acide ascorbique

Concentration Acide (mg/ml) ascorbique 1.25 92.4

0.625 77.19

0.312 55.07

0.156 31.57

0.078 14.52

D’après tableau 13 et tableau 14, la valeur de Concentration Inhibitrice CI50 varie en fonction des extraits testés. Celle de l’acide ascorbique est de 0.27 mg/ml, le CI50 de Aloe analavelonensis est de 14.99 mg/ml, tandis que celui de Aloe helenae est de 2,18 mg/ml. Cependant, l’acide ascorbique est très actif vis-à-vis du DPPH. L’extrait hydroalcoolique de Aloe helenae possède une activité antioxydante au voisinage de l’acide ascorbique, alors c’est l’extrait plus efficace par rapport à l’extrait de Aloe analavelonensis.

Le tableau 15 illustre la comparaison de la CI50 de l`Acide ascorbique avec les deux extraits étudiés et le résultat est illustré par un diagramme:

Tableau 15: Concentration Inhibitrice à 50% des deux espèces comparée avec de l`acide ascorbique.

CI 50% Concentration (mg/ml)

Acide ascorbique 0.272

Aloe helenae 2.18

Aloe analavelonensis 14.99

3ème Partie

3.11.3. ACTIVITE ANTIOXYDANTE DES EXTRAITS D`ALCALOIDES

Les tests sur des extraits bruts ont permis d`avoir les résultats positifs pour les deux espèces avec apparition de coloration jaune. Cette coloration est très marquée chez Aloe helenae mais avec un effet retard pour Aloe analavelonensis

Les extraits d`alcaloïdes chloroformiques sont tous positifs mais avec des effets retard pour Aloe analavelonensis.

Par contre nous avons noté une réaction négative chez l`extrait d`alcaloïde de la phase acqueuse chez Aloe analavelonensis.

Le tableau 16 suivant illustre les colorations obtenues ainsi que leur interprétation sur une plaque CCM.

Tableau 16: Résultats des tests antioxydants pour les extraits bruts et alcaloïdes

LRK 2086 HA Positif avec effet retard A. analavelonensis Extrait brut

LRK 2086 Alc CHCl3 Positif avec effet retard A. analavelonensis Alcaloïde Chloroformique

LRK 2086 Alc AQ Négatif A. analavelonensis Alcaloïde aqueuse

3ème Partie

LRK 2068 HA Positif couleur jaune très A. helenae évident Extrait brut

LRK 2068 Alc CHCl3 A. helenae Positif couleur jaune Alcaloïde Chloroformique

LRK 2068 Alc AQ A. helenae Positif mais avec effet Alcaloïde aqueuse retard

3.11.4. ACTIVITE ANTIOXYDANTE DES EXTRAITS DE POLYSACCHARIDES

Les extractions de poudre polysaccharidique ont permis d`avoir les rendements suivants :

- pour Aloe analavelonensis : 1g de feuilles sèches a donné 0.0078 g de poudre polysaccharidique

- pour Aloe helenae : 1 g de feuilles sèches a donné 0,0434 g de poudre polysaccharidique. Ce qui signifie que Aloe helenae est plus riche en polysaccharides que Aloe analavelonensis

Sur une plaque de CCM, le test DPPH a révélé les résultats suivants sur les extraits polysaccharidiques :

3ème Partie

Aloe analavelonensis Aloe helenae

Figure 38 : Résultats négatifs des tests sur des polysaccharides

Aucune variation de couleur en jaune n`a été constatée. Ce qui nous amène à conclure que les extraits polysaccaharidiques des deux espèces ne présentent pas d’activité antioxydante.

En conclusion donc, nous avons pu révéler que les extraits bruts des deux espèces contiennent une activité antioxydante. Cette activité est très marquée chez Aloe helenae. Il a été démontré également, la présence de polysaccharides chez les deux espèces. Elle est plus marquée chez Aloe helenae. Les extraits polysaccharidiques ne montrent pas d`activité antioxydante chez les deux espèces. Par contre, les activités antioxydantes résident dans les molécules d`Alcaloïdes.

3ème Partie

CHAPITRE 12 : RESULTATS DES TESTS MICROBIOLOGIQUES

3.12.1. RESULTATS DES TESTS SUR DES SOUCHES BACTERIENNES

Des tests antibactériens ont été effectués. Les résultats des tests antibiogrammes ont tous montré un diamètre de halo dìnhibition inférieur à 8 mm. Ceci sèxplique par lìnsensibilité, voire la résistance des souches microbiennes aux les extraits. Ils sont illustrés par la Figure 29 :

Figure 39 : Résultats de l`aromatogramme sur les extraits testés

3.12.2. RESULTATS DES TESTS SUR DES SOUCHES DE CHAMPIGNONS

Les résultats des tests antibiogrammes des extraits avec Candida albicans, une souche de champignon ont montré un diamètre de halo d`inhibition inférieur à 8 mm. Ceci signifie l`insensibilité voire la résistance des souches de Candida albicans aux extraits testés.

Des activités antibactériennes existent chez les Aloès. Ainsi, le tableau 17 illustre un résumé des tests déjà effectuées sur des souches microbiennes sur des extraits de quelques espèces d`Aloe existantes à Madagascar.

3ème Partie

Tableau 17 : Comparaison des activités antimicrobiennes

Souches A. analavelonensis A. helenae A. macroclada A. vaombe A. vera A. arborescens

Staphylococcus aureus Absence de halo Absence de halo Inhibition Inhibition et bactéricide à Inhibition et Rosenbach 1884 d`inhibition. Négatif d`inhibition. Rabarisoa 2017 70% bactéricide Bactérie à Gram positif Négatif Extrait et gel séché Amallah 2011 Négatif. Agarry et al. 2005 ; Klein 1 Rakotomanana et Penneys, 1988 2012 Karpagam 2011, Renisheya et al. 2012, Kedarnath et al. 2013. Ben Moussa et al. 2019

Streptococcus Absence de halo Absence de halo pneumoniae (Klein d`inhibition. Négatif d`inhibition. 2 1884) Chester 1901 Négatif Bactérie à Gram positif

Bacillus cereus Absence de halo Absence de halo 3 Frankland & Frankland d`inhibition. Négatif d`inhibition. 1887 Négatif Bactérie Gram positif

Candida albicans Absence de halo Absence de halo Inhibition Inhibition Inhibition et fongicide à (C.-P. Robin) Berkhout d`inhibition. Négatif d`inhibition. Rabarisoa 2017 Brossat 1981 90% (1923) Négatif Ralamboranto (Extrait) 4 Levure pathogène Négatif. 1981 Agarry et al. 2005 ; Klein Rakotomanana et Penneys, 1988, 2012 Renisheya et al. 2012 Kedarnath et al. 2013.

3ème Partie

Tableau 17 : Comparaison des activités antimicrobiennes (suite)

Souches A. analavelonensis A. helenae A. macroclada A. vaombe A. vera A. arborescens

Escherichia coli Absence de halo Absence de Inhibition Inhibition et bactéricide à Inhibition et (Migula 1895) d`inhibition. Négatif halo Rabarisoa 2017 80% bactericide Castellani and Chalmers d`inhibition. (Extrait) Amallah 2011 1919 Négatif Négatif. Lorenzetti et al. 1964 ; 5 Bactérie à Gram négatif Rakotomanana Klein et Penneys, 1988. 2012 Karpagam 2011, Renisheya et al. 2012, Kedarnath et al. 2013. Adzitey 2019.

Enterobacter cloacae Absence de halo Absence de (Jordan 1890) d`inhibition. Négatif halo 6 Hormaeche & Edwards d`inhibition. 1960 Négatif Bactérie à Gram négatif

Salmonella enterica Absence de halo Absence de Inhibition (ex Kauffmann & d`inhibition. Négatif halo Adzitey 2019. Edwards 1952) Le d`inhibition. 7 Minor & Popoff 1987 Négatif Serovar enteritidis Bactéries Gram négatif

Klebsiella oxytoca (Flügge 1886) Lautrop Absence de halo Absence de 1956. d`inhibition. Négatif halo 8 Bactérie Gram négatif d`inhibition. Négatif

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3.12.3. DISCUSSIONS SUR L`ACTIVITE ANTIMICROBIENNE

En comparaison avec les études ultérieures, nous pouvons résumer ces résultats des tests avec Aloe analavelonensis et Aloe helenae par le tableau 17.

Des activités antibactériennes existent chez les Aloès. Parmi les espèces déjà étudiées, c`est Aloe vera qui possède une activité la plus marquée chez les mêmes espèces de souches microbiennes. L`activité antimicrobienne chez les espèces endémiques a déjà aussi été démontrée sur Aloe macroclada (Rabarisoa, 2017). Ce qui nous amène à penser que ces activités pourraient encore exister dans nos échantillons.

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CHAPITRE 13 : RESULTATS DES TESTS DE TOXICITE

3.13.1. SIGNES CLINIQUES OBSERVES APRES GAVAGE DES EXTRAITS

Quelques instants après gavage des extraits bruts des plantes à dose 1200 mg/kg, un manque d’appétit, des difficultés motrices et amplitudes de voix respiratoire ont été notés. Une vingtaine de minutes plus tard, tous les animaux ont repris leur habitude normale. En résumé, des modifications de comportement ont été observées, en comparaison au groupe de contrôle. Cette expérience montre que l’extrait de la plante semble exercer, un effet stressant sur les souris.

3.13.2. EFFET DE GAVAGE DE L`EXTRAIT SUR LA MORTALITE DES SOURIS

Durant ces investigations sur les souris, malgré des signes de toxicité par des extraits testés ; administrés à une dose de 1200 mg/kg, les tests n’ont pas provoqué la mort des souris. On observe en général une aptitude de l’organisme à l’extrait. On constate donc un effet dose- dépendant.

3.13.3. DETERMINATION DE LA DL50

La DL50 /24 h qui est la dose causant la mort de 50 % des souris n’a pas pu être déterminée. En effet, aucune souris n’est morte à la dose de 1200 mg/kg ; la DL50 serait donc supérieure à cette dose. Selon Ramade (1979), elle serait largement supérieure à 25 mg/kg : concentration seuil, au-dessous de laquelle toute substance est considérée comme très toxique. Nous pouvons supposer que les échantillons ne sont pas toxiques sur les souris. Il est évident que les résultats obtenus sur les souris ne peuvent pas s’appliquer directement à l’homme, néanmoins, ces résultats rassurent sur l’innocuité de l’extrait.

3.13.4. DISCUSSION SUR LA TOXICITE DES EXTRAITS

L’analyse des résultats obtenus sur les tests de toxicité aigüe par voie orale, à dose unique, indique un effet dose dépendant sur les souris. En effet, la dose maximale tolérée (DMT) est supérieure à 1200 mg/kg et pourrait en conséquence être utilisée potentiellement à titre expérimental dans une étude de toxicité subaiguë ou chronique. Ainsi, la valeur de la dose létale 50 supérieure à 1200 mg/kg de poids corporel chez les souris permet de classer les extraits comme substance légèrement toxique, sur l’échelle de 85

3ème Partie toxicité classifiée de Hodge & Sterner 1943, élaborée par Cotonat (1996). Par ailleurs, pour cette valeur de la DL50, une personne de 50 Kg devrait recevoir au moins 1200 mg/Kg x 50, soit 60 000 mg de produit en une seule dose pour courir les mêmes symptômes d’intoxication. Cette dose de 60g d’extrait sur l’échelle de classification de Gosselin Smith et Hodge (1984), pourrait être classée de substance non toxique pour l’homme.

Ces résultats montrent que les extraits bruts sont inactifs in vivo à des doses inférieures à 1200 mg/Kg de poids corporel et permettent de constater que les extraits administrés à dose unique exerceraient leur action toxique sur une période allant de 20 min à 24 h de temps après injection, selon les données des signes cliniques observés.

3ème Partie

CHAPITRE 14 : RESULTATS DES ACTIVITES LARVICIDES

3.14.1. VARIATION DU TAUX DE MORTALITE

Après avoir exposé des larves au stade 3 de l’espèce Culex quinquefasciatus aux différentes concentrations des deux extraits pendant 24 h, le taux de mortalité varie selon les concentrations (Tableau 18). La mortalité des larves sur Aloe helenae n`atteint un taux maximal de 53% qu`à partir d’une concentration de 200ppm. De l’ensemble de ces résultats, un classement de l’efficacité toxique des extraits testés est mis en évidence, ainsi les extraits les plus toxiques sont ceux des feuilles de Aloe helenae et le moins toxique celui des feuilles de Aloe analavelonenesis.

Tableau 18 : Mortalité (%) de larves testés, stade 3 de Culex quinquefasciatus en fonction de la concentration des extraits (%) des deux espèces après 24 heures d`exposition.

Concentration en ppm 12.5 25 50 100 200 Témoin

Concentration mg/ml 3.1 6.2 12.5 25 50 0

Aloe 0 0 0 5 20 0 Taux de analavelonensis mortalité Aloe helenae 0 12 23 30 53 0

Moyenne de détermination portant chacune sur 25 individus

Les courbes suivantes (Figure 40) illustrent la variation des taux de mortalité des larves en fonction des concentrations utilisées.

3ème Partie

Figure 40 : Variation du taux de mortalité des larves en fonction des concentrations utilisées

D`après cette figure, les courbes ne sont pas les mêmes. On observe une valeur plus élevée du taux de mortalité chez Aloe helenae par rapport à Aloe analavelonensis.

3.14.2. CONCENTRATIONS LETALES CL50

Les CL50 calculées pour des larves du troisième stade (L3) de l’espèce Culex quinquefasciatus (Tableau 19), ont montré que parmi les 2 extraits testés, les extraits de Aloe helenae se sont révélés intéressants en terme de toxicité. Une concentration létale CL50. est obtenue avec une concentration plus basse chez Aloe helenae.

Le tableau 19 regroupe les résultats des tests de toxicité en termes de CL50 qui concernent Culex quinquefasciatus

Tableau 19 : Concentration Létale CL50 pour les deux espèces avec C. quinquefasciatus

Extraits ppm CL50 (24h) (mg/ml) Aloe analavelonensis 446 121.56 Aloe helenae 188 47 Moyenne de 4 répétitions

3ème Partie

La figure 39 représente le diagramme de Concentration Létale CL50 pour les extraits de Aloe analavelonensis et Aloe helenae face aux larves de moustiques Culex quinquefasciatus.

Figure 39 : Diagramme de Concentration Létale CL50 pour les deux espèces

Dans l’ensemble des tests réalisés, cèst Aloe helenae qui présente une activité larvicide plus intéressante. Les CL50 paraissent toujours plus faibles pour le stade larvaire (L3) quelle que soit l’espèce considérée et la concentration de lèxtrait utilisée. Mais ce qui est plus important cèst de trouver une trace dàctivité larvicide. Cette propriété pourrait être exploitée dans la fabrication des produits à effet larvicide après identification des molécules responsables.

3.14.3. DISCUSSIONS ET CONCLUSION

Ces résultats bien que préliminaires, témoignent d’une activité larvicide des extraits hydroalcooliques. Parmi plusieurs extraits testés, ceux de Aloe helenae constituent des larvicides prometteurs pour la lutte contre les moustiques nuisibles, Culex quinquefasciatus. Ils sont en effet plus efficaces sur les larves du troisième stade (L3) avec des CL50 (24 h) plus faibles, oscillant entre 47 mg/mL et 121 mg/mL. Comparés à d’autres extraits déjà testés sur les autres moustiques, à savoir, Aloe vera, les

CL50 (24 h) sont relativement plus faibles et par conséquent plus efficaces chez Aloe vera. Le tableau 20 illustre une synthèse bibliographique des études déjà menées concernant les activités larvicide des Aloès. 89

3ème Partie

Tableau 20: Synthèse bibliographique des effets larvicides des Aloès

Plante Larve Activité Auteurs

Chrysomya bezziana Larvicide mortalité à 30% Aloe ferox Soyelu et al. 2019 (larve de Diptera) à 4mg/100ml

Aloe fibrosa Aedes aegypti Larvicide Chore et al. 2014

Aloe. fibrosa Anopheles gambie Larvicide Matasyoh et al. 2008

Aloe ngongensis Anopheles gambie Larvicide Matasyoh et al. 2008

Larvicide de LC50 Aloe ngongensis Aedes aegypti Chore et al. 2014 1mg/ml

Larvicide très intense 0.2

Aloe turkanensis Anopheles gambie mg/ml LC50 de 0.11 Matasyoh et al. 2008. mg/ml

Aloe turkanensis Aedes aegypti Larvicide Chore et al. 2014

Larvicide de LC50 à 0.08 Aloe vera Aedes sp Lubis et al. 2018 mg/ml

Aloe vera Aedes aegypti Larvicide Subramaniam et al. 2012

Aloe vera Anopheles stephensi Larvicide Murugan et al. 2012

Aloe vera Anopheles gambiae Larvicide faible Yolidjé et al. 2019

Aloe vera melangé avec Aedes aegypti Larvicide Susheela et al 2016 de l`ail et de l`oignon

Les extraits bruts de ces deux plantes devront être soumis à une séparation de manière à isoler et concentrer les substances actives, qui certainement pourront présenter des CL50 beaucoup plus faibles et devraient pouvoir être valorisés en tant qu’insecticides biologiques de remplacement.

3ème Partie

Ce même test est recommandé ultérieurement pour d`autres larves d`insectes parasites et de moustique, par exemple Aedes et Anopheles.

Figure 40 : Photos de quelques espèces d`Aloès cités dans cet ouvrage

Aloe chabaudii Aloe christianii Aloe globuligemma Aloe ortholopha

Aloe ferox Aloe turkanensis Aloe vera Aloe arborescens

Aloe ngongensis Aloe fibrosa Aloe vaombe Aloe macroclada

DISCUSSION GENERALE

Discussion générale

DISCUSSION GENERALE

Sur la distribution et modèle de niche écologique Les études effectuées ont pu montrer l'origine géographique et les facteurs environnementaux favorables pour Aloe analavelonensis et Aloe helenae. Un modèle de niche écologique favorable dans la nature a été proposé pour chaque espèce. Selon Chalchat et al. (1993), Serrano et al. (2002), Sokovic et al. (2006) et Jordán et al. (2013), ces facteurs écologiques peuvent influencer la nature et la composition phytochimique des plantes. Alors, des études phytochimiques, des activités biologiques près de son habitat naturel seraient nécessaires pour évaluer s`il y aurait une différence car nous avons travaillé sur des échantillons provenant des jardins hors de son habitat naturel. Ce modèle de niche écologique favorable pour ces deux espèces est un outil fort pour la conservation ex-situ de ces deux plantes.

Les conditions agronomiques, le rôle des plantes associées, la compétition interspécifique et intraspécifique joueraient un rôle non négligeable dans la production des métabolites des plantes.

Sur la composition phytochimique La matière sèche des Aloès, par exemple le cas des Aloe vera, est composée en majeure partie de polysaccharides 55%, de glucides 17 %, de minéraux, d` oligo-éléments 16%, de protéines 7%, de lipide 4% et de composés phénoliques 1% (Atherton, 1998). Ceci est conforme aux résult