Instituto Nacional De Pesquisas Da Amazônia-Inpa Programa De Pós-Graduação Em Genética Conservação E Biologia Evolutiva

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA-INPA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA CONSERVAÇÃO E BIOLOGIA EVOLUTIVA

IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DE BACTÉRIAS PATOGÊNICAS ASSOCIADAS À CRIAÇÃO DE PEIXES AMAZÔNICOS

ELIANE CARDOSO CARVALHO

Manaus, Amazonas Junho, 2012

ELIANE CARDOSO CARVALHO

IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DE BACTÉRIAS PATOGÊNICAS ASSOCIADAS À CRIAÇÃO DE PEIXES AMAZÔNICOS

ORIENTADOR: JORGE IVAN REBELO PORTO CO-ORIENTADORA: ANDRÉA BELÉM COSTA

Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética Conservação e Biologia Evolutiva.

Manaus, Amazonas Junho, 2012

FICHA CATALOGRÁFICA

C331 Carvalho, Eliane Cardoso

Identificação fenotípica e molecular de bactérias patogênicas associadas à

criação de peixes amazônicos / Eliane Cardoso Carvalho.--- Manaus : [s.n.],

2012.

xiii, 134 f. : il. color.

Dissertação (mestrado) --- INPA, Manaus, 2012

Orientador : Jorge Ivan Rebelo Porto

Coorientador : Andréa Belém Costa

Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

1. Peixes – Amazõnia. 2. Bacterias. 3. Colossoma macropomum. Sinopse: 4. Arapaima gigas. 5. Brycon amazonicus. 6. Criação de animais. 7. 16SrRNA. A identificação bacteriana foi realizada em isolados de Colossoma macropomum, Arapaima gigas e Brycon amazonicus, cultivados em estações de piscicultura do Estado do I. Título. Amazonas. Foram realizadas caracterização bacteriana fenotípica clássica e molecular, com sequenciamento da região parcial do gene 16S rRNA, e análise filogenética por Neighbor- joining. As análises evidenciaram a ocorrência de 35 espécies bacterianas agrupadas em 17 gêneros e nove famílias. Registra - se nesta dissertação CDD a 19. ocorrência ed. 597.5042 de espécies bacterianas com primeiro relato da ocorrência em peixes de cultivo do Amazonas.

Palavras-chave: 16S rRNA, bacteriana, Colossoma macropomum, Arapaima gigas, Brycon amazonicus.

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Dedico este trabalho, Ao meu marido Alex Maia Minha mãe Helinay Carvalho Minha tia Joveci Carvalho

Agradecimentos

Em primeiro lugar, agradeço meu maravilho Deus, que ao longo de toda minha jornada esteve comigo guiando meus caminhos e me concedendo forças em todos os obstáculos, permitindo a realização de mais um sonho. A Caminhada foi longa, mas, uma vida sem desafios não vale a pena ser vivida. Ao meu marido Alex Maia, por todo seu amor, amizade, dedicação e companheirismo. Por ter entendido todos os momentos que fiquei ausente e por sempre ter me ajudado em tudo que precisei. Tenho certeza que sem todo seu amor eu não teria conseguido! À minha mãe Helinay Carvalho, que mesmo longe me deu todo seu amor, conselhos sempre, não me deixando ficar triste por nada. À minha querida tia Joveci Carvalho, que sempre foi meu anjo da guarda e inspiração que sempre me deu forças e me fez trilhar esse caminho. Aos meus amados irmãos Alberto Jr. e Andreza Carvalho e ao meu primo Felipe, que me fazem querer seguir em frente sempre, e torcem por mim em tudo. À minha amada avó Helena Carvalho, por todo seu amor e conselhos, me ensinando a nunca desistir dos meus sonhos. À minha tia Leila Carvalho e minha prima Aline, por estarem comigo sempre oferecendo suas mãos amigas. À minha melhor e mais companheira amiga Suélen Dias que passou tudo isso junto comigo, me fazendo rir, aconselhando, ajudando nos momentos mais tensos das análises no laboratório, estando comigo desde o ínicio da vida científica em Santarém, torcendo e oferencendo sua amizade nos momentos mais tristes. Susu valeu por tudo! Ao meu orientador Jorge Porto, que me abriu as portas do INPA oferecendo o primeiro estágio em genética molecular, estendeu a mão quando eu precisei, tirou minhas dúvidas e me ensinou a base de Biologia Molecular. Que não só foi um orientador de mestrado, mas também de vida, em muitos conselhos que deu em vários momentos difíceis ao longo desta jornada. À minha co-orientadora Andréa Belém, que me ensinou muito sobre microbiologia, me ensinando toda base da maneira mais metódica possível. Me oferecendo todas os ferramentas possíveis para conclusão da parte fenotípica deste trabalho. Por todos os seus conselhos e por toda confiança que depositou em mim, me dando a oportunidade de aprender muito mais. À Dra. Eliana Feldberg, pelo seu axílio na compra de materiais, por todos os conselhos e por toda sua solicitude em inúmeras vezes que precisei.

Ao Dr. Spartaco Astolfi, por ter permitido realizar a parte molecular no Laboratório de DNA, e por todas minhas dúvidas que tirou. À Dina que sempre esteve disposta a me ajudar, tirando minhas dúvidas e cedendo seu tempo pra me ajudar quando por muitas vezes fiquei altas horas no laboratório finalizando experimentos. Ao Edson, que sempre que podia tirava minhas dúvidas me ensinando muito sobre biologia molecular e me fazendo rir, discondraindo os dias corridos. Ao Dheims Araújo, que me ajudou muito no ínicio das análises fenotípicas bacterianas, no preparo dos meios de cultivo que não foram poucos. A Mirna Myamoto, por ter me ajudado nos momentos de correria no Laboratório, principalmente nas PCRs que não funcioram. Ao Elson, Henriette, Luciana, Hugo, Hélber, Anita e Júnior, pelas boas horas de discontração, ao Thiago pelas todas as dúvidas tiradas, à Ivanete e a dona Elza pelo auxílio no preparo reagentes. À equipe do Laboratório de Genética Animal do Inpa. Ao Carlos e a Leandra, que muitas vezes me ajudaram tirando minhas dúvidas, principalmente me ensinando o preparo de reagentes. À Denise, que em inúmeras vezes me ajudou no laboratório. Aos amigos do LTBM, Giselle, que muitas vezes me ajudou no que precisei, e ao Saulo por ter me ajudado no sequenciamento e a Dra Jackeline Batista por cedido permitido a realização do sequenciamento no laboratório. À Gisele Torres, por toda sua amizade e conselhos. À Dra Luciana Leomil por ter me ajudado a interpretar os dados da identificação molecular bacteriana. Dr. Edmar Vaz, que me por muitas vezes tirou minhas dúvidas me ensinando os processos de biologia molecular. Ao Dr. Daniel Saito, por ter cedido seu tempo em me ensinar a usar os programas de bioinformática e me ajudar a interpretar análises filogenéticas. Ao PPG GCBEV e seu corpo administrativo (Alessandra, Tamara, Elci) pelo apoio incondicional. À Capes e a Fapeam pela bolsa concedida.

"Confia no Senhor de todo o seu coração e não se apóie na sua própria inteligência. Lembre-se de Deus em tudo o que fizer, e ele lhe mostrará o caminho certo" (Prov. 3:5-6).

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Resumo

Com a intensificação do cultivo de peixes em condições artificiais são observadas mortalidades causadas por bactérias patogênicas oportunistas, o que pode levar a grandes perdas econômicas. Essas mortalidades podem ser observadas em cultivos de espécies regionais como o pirarucu, o tambaqui e a matrinxã. Os principais objetivos desta dissertação foram realizar análises fenotípicas e moleculares para identificar bactérias patogênicas nas espécies Arapaima gigas (pirarucu), Colossoma macropomum (tambaqui) e Brycon amazonicus (matrinxã), bem como estabelecer relações evolutivas entre as espécies. Foram analisados 72 isolados bacterianos da coleção de cultura de bactérias patogênicas em peixes (Universidade Federal do Amazonas - UFAM), provenientes de pirarucu, tambaqui e matrinxã oriundos de pisciculturas. As identificações fenotípicas foram feitas utilizando 19 testes bioquímicos (Gram, teste KOH, oxidase, catalase, oxidação, fermentação, motilidade, H2S, indol, gás, glucose, uréase, lactose, citrato, arabinose, dulcitol, inositol, rafinose, trealose). As identificações moleculares foram realizadas por meio do sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. Nas abordagens fenotípicas e moleculares foram identificadas 35 espécies agrupadas em 17 gêneros e nove famílias bacterianas: Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae, Flavobacteriaceae, Microbacteriaceae, Moroxellaceae, Paenibacillaceae, Staphylococcaceae, Streptococcaceae. Os maiores grupos foram formados pelas famílias (Enterobacteriaceae e Bacillaceae) as quais mostraram-se claramente polifiléticos, tendo em vista que os gêneros e as espécies dentro destas famílias agruparam-se com gêneros e espécies distintas. Pode-se concluir que as abordagens utilizadas permitiram a identificação, classificação e reconstrução filogenética dos isolados bacterianos estudados.

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Abstract

The intensification of fish breeding in artificial conditions has led to mortalities caused by opportunistic pathogenic bacteria, leading to huge economic losses. These mortalities can be observed in cultures of regional species such as: pirarucu, tambaqui and matrinxã. The main objectives of this dissertation was to conduct molecular and phenotypic analyzes to identify pathogenic bacteria in Arapaima gigas (pirarucu), Colossoma macropomum (tambaqui) and Brycon amazonicus (matrinxã), and to establish evolutionary relationships between bacteria species. We analyzed 72 bacterial isolates from the culture collection of pathogenic bacteria in fish (Universidade Federal do Amazonas- UFAM), from pirarucu, tambaqui and matrinxã from fish farms. The phenotypic identifications were made using 19 biochemical tests (Gram staining, KOH test, oxidase, catalase, oxidation, fermentation, motility, H2S, indole, gas, glucose, urease, lactose, citrate, arabinose, dulcitol, inositol, raffinose, trehalose). The molecular identifications were performed using partial sequencing of 16S rRNA. Phenotypic and molecular approaches identified 35 bacteria species grouped in 17 genera and nine families: Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae, Flavobacteriaceae, Microbacteriaceae, Moroxellaceae, Paenibacillaceae, Staphylococcaceae and Streptococcaceae. The largest groups were formed by the families (Enterobacteriaceae and Bacillaceae) which were clearly polyphyletic since genera and species within these families were grouped with different genus and species. It can be concluded that the approaches used allow the identification, classification and phylogenetic reconstruction of bacterial isolates studied.

Sumário

1- Introdução ...... 14

2-Revisão Bibliográfica ...... 15

2.1-Aquicultura no Brasil ...... 15

2.2-Piscicultura na Amazônia ...... 16

2.3-Espécies de peixes de interesse comercial na Amazônia ...... 17

2.4-Bacteriose em Peixes ...... 19

2.5-Métodos de identificação fenotípica e molecular de microrganismos ...... 21

2.6-Taxonomia e Filogenia Molecular Bacteriana ...... 23

2.7-RNA ribossômico 16S ...... 25

3-Objetivos ...... 27

3.1-Geral ...... 27

3.2-Específicos ...... 27

4-Material e Métodos ...... 28

4.1-Coleta ...... 28

4.1-Reativação e purificação de Bactérias ...... 31

4.2-Identificação fenotípica bacteriana ...... 31

4.3-Coloração Gram ...... 31

4.4-Teste KOH ...... 32

4.5-Teste de catalase e oxidase ...... 32

4.6-Teste em meio ágar MacConkey ...... 33

4.7-Teste em ágar citrato de Simmons ...... 33

4.8-Teste em meio SIM (sulfato/indol/motilidade ágar) ...... 34

4.9-Teste em meio OF (oxidação e fermentação) ...... 34

4.10-Teste de Urease ...... 35

4.11-Produção de gás e fermentação de carboidratos ...... 35

4.12-Hemólise bacteriana ...... 36

4.13-Identificação molecular bacteriana ...... 37

4.14-Extração do DNA genômico bacteriano ...... 37

4.15-Reação em cadeia de polimerase (PCR) para amplificação do gene 16S rRNA ...... 38

4.16-Purificação das amostras ...... 39

4.17-Sequenciamento e análise das sequências...... 39

4.18-Análises por Bioinformática ...... 40

4.19-Análises filogenéticas das sequências ...... 40

5-Resultados ...... 42

5.1-Caracterização fenotípica bacteriana ...... 42

5.2-Coloração Gram e teste KOH ...... 42

5.3-Testes bioquímicos ...... 43

5.4-Extração de DNA genômico e amplificação do 16S rRNA ...... 47

5.5-Identificação molecular das bactérias ...... 48

5.6-Análises Filogenéticas ...... 57

6-Discussão ...... 60

6.1-Identificações das espécies bacterianas ...... 60

6.1.1- Identificações fenotípicas das famílias e espécies bacterianas ...... 60 6.1.2- Identificações moleculares de famílias e espécies bacterianas ...... 66

6.1.3- Análises filogenéticas dos isolados bacterianos ...... 75

6.1.4- Identificações gerais dos isolados bacterianos ...... 78

6.1.5- Espécies identificadas patogênicas em peixes ...... 81

7-Conclusões ...... 84

8-Referências ...... 85

Anexo ...... 104

Lista de Tabelas

Tabela 01-Isolados bacterianos de tambaqui...... 28

Tabela 02-Isolados bacterianos de matrinxã...... 29

Tabela 03-Isolados bacterianos de pirarucu...... 30

Tabela 04-Resultado do teste Gram para cada isolado bacteriano...... 42

Tabela 05-Testes bioquímicos realizados em isolados bacterianos de tambaqui...... 44

Tabela 06-Testes bioquímicos realizados em isolados bacterianos de matrinxã...... 45

Tabela 07-Testes bioquímicos realizados em isolados bacterianos de pirarucu...... 46

Tabela 08- Taxonomia molecular dos isolados PPUFAM...... 52

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Lista de Figuras

Figura 01- Esquema da localização aproximada do anelamento dos iniciadores 530F e 1492R (Borneman e Triplett 1997), de acordo com o tamanho do gene 16S rRNA (Clarridge, 2004). V3-V9: regiões conservadas de anelamento dos iniciadores...... 39 Figura 02: Método de coloração de Gram...... 42 Figura 03- Beta () hemólise em isolados PPUFAM 54 (a) e PPUFAM 63(b). Placas em ágar sangue de carneiro desfibrinado a 7%...... 44 Figura 04- Foto da extração de DNA genômico bacteriano em gel de agarose 0,8%. (M)- Marcador de peso molecular lâmbida (λ)...... 47 Figura 05- Foto da amplificação do gene 16S rRNA por PCR em gel de agarose 0,8%.Marcador molecular (M) Ladder de 1Kb (Promega).(C-) controle negativo da reação...... 47 Figura 06- Famílias bacterianas identificadas e o percentual de amostras encontradas...... 49 Figura 07- Dendograma filogenético (Neighbor-Joining) do 16S rRNA de isolados bacterianos amazônicos (PPUFAM) e de estirpes de referência (ATCC)...... 59

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1- Introdução

O conhecimento sobre a variedade de espécies bacterianas patogênicas em peixes de interesse comercial é de extrema importância uma vez que as infecções bacterianas são responsáveis por grandes perdas em criações intensivas as quais podem apresentar índice elevado de mortalidade, apesar de não haver dados oficiais sobre os prejuízos econômicos causados em pisciculturas brasileiras. A identificação dos pátogenos causadores de doenças em peixes é de extrema importância, pricipalmente para determinar medidas profiláticas que reduzam os índices de mortalidade em cultivos de peixes bem como para classificar espécies bacterianas (Costa, 2004). As técnicas de biologia molecular, juntamente com os métodos clássicos empregados para identificação de espécies patogênicas, têm propiciado um importante desenvolvimento na eficiência e na qualidade do diagnóstico das enfermidades bacterianas (Vandamme et al. 1996; Ludwig e Klenk, 2001, Figueiredo e Leal, 2008), principalmente para doenças em peixes causadas por bactérias de difícil isolamento e cultivo em laboratório (Figueiredo e Leal, 2008). Novas espécies têm sido reconhecidas e reclassificadas pelo sequenciamento do gene 16S rRNA propiciando uma alternativa rápida e eficiente na identificação de bactérias e sendo importante para obtenção de informações sobre a filogenia e a sistemática bacteriana (Tanner et al., 2000; Ludwig e Klenk, 2001; Ahmed et al., 2007). Sabe-se que a biodiversidade microbiana da região Amazônica é muito grande, porém poucos são os trabalhos para investigar a complexa microbiota (Benner et al. 1995; Borneman e Triplett, 1997), principalmente dos microrganismos causadores de patogenias em peixes. Nesse trabalho foram utilizadas abordagens fenotípicas e moleculares as quais propiciaram uma alternativa rápida e eficiente na identificação de bactérias patogênicas em peixes. Este trabalho é pioneiro na determinação fenotípica e molecular de bactérias causadoras de epizootias em peixes de cultivo do Amazonas.

2- Revisão Bibliográfica

2.1- Aquicultura no Brasil

O Brasil é um país que possui 12% das reservas disponíveis de água doce do mundo, com mais de dois milhões de hectares de zonas úmidas, estuários e reservatórios adequados para a aquicultura (FAO, 2010). Possui a maior fauna de peixes de água doce do mundo, com cerca de 2590 espécies, existindo muitas ainda desconhecidas (Buckup et al., 2007; Godinho 2007). Por apresentar um imenso complexo hidrográfico e clima favorável o Brasil possui dentre estas, inúmeras vantagens para o desenvolvimento de organismos aquáticos cultivados (Ferreira, 2007). Com o cultivo de espécies aquáticas surgiu à prática de aquicultura que é o cultivo ou criação de organismos aquáticos cujo ciclo de vida se desenvolve em condições naturais, total ou parcialmente em meio aquático (Eler e Milani 2007; Oliveira 2009; FAO, 2012). De acordo com Figueiredo et al. (2008) a aquicultura é o setor da agropecuária brasileira com maior expansão nos últimos anos, o crescimento da atividade no Brasil superou a média mundial. Sua atividade vem crescendo sensivelmente em relação à pesca, tornando-se uma importante alternativa para a produção de pescado, tanto em área continental como marinha (Santos, 2009). O aumento da exploração indiscriminada dos estoques pesqueiros naturais tornou a aquicultura uma alternativa importante para regularizar a oferta de matéria-prima e com este desenvolvimento a atividade entrou em franca expansão (Camargo e Pouey, 2005). A partir de 1990, ocorreu a expansão da aquicultura comercial brasileira, inluindo a piscicultura, como uma atividade econômica no cenário nacional da produção de alimentos (Ferreira, 2007). Entre 1994 e 2003 a piscicultura brasileira teve um aumento significativo pulando de 4,3% para 28,1% de toda a produção pesqueira do país (FAO, 2012). Cabendo destacar que dentre as principais espécies nativas cultivadas foram: tambaqui (Colossoma macropomum), pacu (Mylossoma spp.) e matrinxã (Brycon amazonicus) (Castagnolli, 2004). Segundo Ostrensky et al. (2008), o Brasil é o segundo país em importância na produção aquícola na América do Sul, ficando abaixo do Chile. A maior parte da produção da aquicultura brasileira é proveniente da produção em território continental alcançando cerca de 70%. Essa preferência é decorrente da disponibilidade de grandes extensões de terra passíveis de serem destinadas ao cultivo; a abundância de água doce e limpa e a boa adaptabilidade das espécies destinadas à criação (Oliveira, 2009). Atualmente, a aquicultura é praticada em todos

os Estados brasileiros e abrange, principalmente, as modalidades de piscicultura, carcinicultura, ranicultura e malacocultura (Santos, 2009). Na região Norte várias espécies de peixes são cultivadas, porém apenas 14 espécies são espécies nativas, o que em relação à diversidade ictiológica da região é um número extremamente reduzido (Santos, 2009).

2.2- Piscicultura na Amazônia

A bacia amazônica configura-se como um imenso complexo de rios, igarapés, lagos, canais e furos (Santos e Santos, 2005) e possui cerca de 20% dos recursos de água doce dos rios do planeta, que encerram cerca de 2.500 espécies de peixes (Valois, 2003) e detém a maior biodiversidade sendo considerado um dos ecossistemas mais íntegros e produtivos do mundo (Santos e Santos, 2005). Essa complexa diversidade dos estoques pesqueiros na Amazônia é explicada devido a fatores tão diversos como a idade e tamanho do sistema de drenagem, habitat e diversidade de nichos disponibilizados pelos rios, lagos e áreas alagadas, a alta proporção de terras baixas com condições ambientais estáveis, capazes de suportar uma grande abundância de peixes, e a incorporação de outros rios e bacias, através de uma diversidade de eventos geológicos, provocando uma mistura de faunas de peixe de diferentes origens (Carvalho et al., 2007). A grande diversidade ictiológica torna a Amazônia uma importante fonte de recursos pesqueiros, e a piscicultura é como uma importante atividade para regular o abastecimento do pescado regional, especialmente no período de defeso e nos períodos de “cheia e seca” amazônica, períodos em que os valores do pescado oscilam, propiciando melhor equilíbrio entre oferta e demanda no mercado regional e estabilizando os valores do pescado ao longo do ano. Essa crescente atividade na Amazônia Ocidental vem sendo testada de diferentes maneiras, incluindo uso de tanques artificiais, represamento de nascentes, fechamento de trechos de igarapés, gaiolas flutuantes e até repovoamento de lagos e lagoas (EMBRAPA, 2003; Santos e Santos, 2005). A prática de piscicultura é o empreendimento do setor primário que mais gera lucros para os produtores da Amazônia (Valois, 2003). Na periferia Amazônica, a piscicultura progrediu bastante nos últimos vinte anos, principalmente nos Estados de Roraima, Mato Grosso e Tocantins (Barthem e Goulding, 2007). No Amazonas é uma área do agronegócio que vem crescendo em ritmo acelerado nos últimos cinco anos (Cavero et al., 2009). Segundo Lima (2005), o Amazonas dispõe de todos os recursos necessários para o desenvolvimento

dessa atividade devido aos parâmetros ecológicos e biológicos altamente favoráveis para essa prática, abrangendo as condições climáticas e a biodiversidade necessária para criação de peixes. A piscicultura é considerada de grande importância para o desenvolvimento econômico do Estado, assim como de toda região amazônica (Santos et al., 2006). No Amazonas, em 2005 estimou-se a existência de 800 piscicultores, e uma produção anual de pescado em torno de 1.000 a 1.500 toneladas particularmente devido às quatro estações de piscicultura em produção, destacando-se a estação de Balbina, no município de Presidente Figueiredo, Manaus, Manacapuru e Itacoatiara (SUFRAMA, 2003; Lima, 2005).

2.3- Espécies de peixes de interesse comercial na Amazônia

A Região Norte do país e a Amazônia Ocidental, em particular, têm no consumo do peixe uma das suas principais fontes de abastecimento alimentar (Santos et al., 2006). Sendo procedente do pescado a principal fonte de proteína na alimentação das populações amazônicas (Ferreira et al.,1998). Apesar da diversidade da ictiofauna amazônica, estimada entre 1500 e 3000 espécies, apenas uma parcela muito reduzida dessa diversidade é explorada comercialmente (Santos et al., 2006). Existem aproximadamente 200 espécies de peixes explorados para o consumo e os principais grupos incluem os caracídeos, bagres e ciclídeos (Barthem e Goulding, 2007). Seis famílias agrupam os caracídeos mais importantes, como o tambaqui. Os bagres para consumos são a dourada, piramutaba e acari, e dos grupos de peixes estritamente de água doce, estão inseridos o pirarucu e os aruanãs. As espécies que mais se destacam para o comércio na Amazônia Central são: tambaqui (Colossoma macropomum), matrinxã (Brycon amazonicus), curimatá (Prochilodus nigricans), jaraqui (Semaprochilodus insignis), pirarucu (Arapaima gigas), pirapitinga (Piaractus brachyponuis), acará-açu (Astronotus ocellatus) e aracu (Leporinus spp) (Barthem e Gouding, 2007). As espécies C. macropomum, B. amazonicus e A. gigas destacam-se no comércio de peixes da cidade de Manaus (Santos et al., 2006; Santos, 2009) e também na alimentação das populações amazônicas (Santos et al., 2006). O tambaqui, C. macropomum é um caracídeo onívoro nativo da bacia Amazônica e Orinoco é o segundo maior peixe de escamas do rio Solimões (Ferreira et al., 1998). Esta espécie de grande porte chega 100 cm de comprimento e pesando mais de 30 quilos, consome principalmente frutos e sementes. É a espécie com maior importância comercial na pesca e na piscicultura da região amazônica e devido a isso é o peixe mais cultivado no

Estado do Amazonas (Castagnolli e Cyrino 1986; Cantelmo, 1989; Santos et al., 2006), com produções oriundas de piscicultura de 3.000 e 3.500 toneladas anuais (Santos et al., 2006). O potencial de produção do tambaqui foi estimado em 15.500 toneladas e sua produção concentra-se na Amazônia Central, que representa 91% do total (Barthem e Goulding, 2007). Um dos principais problemas relacionados à criação dessa espécie é a ocorrência de doenças parasitárias e bacterianas (Araújo-Lima e Golding, 1998). A espécie B. amazonicus (matrinxã) é integrante da subfamília Bryconinae, que inclui 40 espécies, está distribuída na América do sul na bacia do rio Amazonas no Peru e na Bolívia (Reis et al., 2003), caracteriza-se por ser de grande porte, alcançando cerca de 40 cm, é onívoro e consome basicamente frutos, sementes, insetos e outros invertebrados, é um dos peixes mais utilizados na aquicultura comercial (Santos et al., 2006). O potencial da produção de seu cultivo foi estimado em 6.040 toneladas e a região da Amazônia Central é responsável por 74% do total (Barthem e Goulding, 2007), vem se destacando na exploração comercial na região amazônica por ser uma das espécies mais promissoras para a piscicultura por apresentar enorme potencial de crescimento e carne nobre (Frascá-Scorvo et al., 2001). O pirarucu (A.gigas) peixe da família Arapaimatidae, com características plesiomórficas e confinadas a água doce da América do sul, é caracterizado pela língua óssea e espinhosa, escamas grandes e imbicadas em forma de mosaico, nadadeiras dorsal e anal muito alongadas. É uma espécie de grande porte chegando a mais de 2 metros e pesando aproximadamente 200 quilos, é carnívoro e consome basicamente peixes, camarões, caranguejos e insetos. Tem preferência por lagos e não realiza migrações consideráveis (Santos et al., 2006), o que é de grande importância para seu cultivo. O potencial de sua produção foi estimado em 1800 toneladas e três importantes regiões pesqueiras são responsáveis por 93% de seu potencial: Amazônia Peruana, Fronteira Brasil-Peru-Colômbia e Amazônia Central (Barthem e Goulding, 2007). Devido ao aumento da demanda dessas espécies para abastecer o comércio regional à medida que ocorre o crescimento da produção intensiva de espécies de peixes em cativeiro, muitas vezes em condições de superpopulação segundo Shama, et al. (2000) acarretam variações na qualidade da água, aumentando o número de doenças nos animais causadas muitas vezes principalmente por bactérias oportunistas.

2.4- Bacteriose em Peixes

O Domínio Bacteria contém uma enorme variedade de procariotos e todas as espécies conhecidas causadoras de enfermidades (patógenos) pertencem a esse domínio (Madigan et al., 2004). As bactérias são microrganismos classificadas quanto a sua forma, estruturas e tamanho, podendo ser variado ou não, devido a sua estrutura química as bactérias são classificadas em Gram-positivas e Gram-negativas, essa determinação é feita através do método Gram de coloração bacteriana (Junqueira e Carneiro, 2005; Trabulsi e Alterthum, 2008). Bactérias patogênicas podem causar doenças em humanos, plantas e animais. Em peixes, todas as espécies são suscetíveis às infecções causadas por esses microrganismos (Frerichs e Millar, 1993; Costa, 2003). No meio aquático as bactérias fazem parte da microbiota normal da água, podendo ser encontradas na superfície corporal e nas brânquias dos peixes em seu habitat natural (Pavanelli et al., 2002) e são consideradas como patógenos oportunistas, visto que só se manifestam provocando infecções bacterianas quando os animais estão em condições ambientais adversas (Boijink e Brandão, 2004). As enfermidades bacterianas em peixes ocorrem muitas vezes devido ao manejo não adequado excessivo, que leva a perda do muco e danos na superfície corporal do animal, deixando a pele suscetível às invasões bacterianas (Harvey e Hoar, 1979). A pele e as brânquias são a primeira linha de defesa dos peixes contra agentes infecciosos, atuam como barreira física e química, e o muco presente nessas estruturas contêm mucopolissacarídeos e enzimas bacteriolíticas que imobilizam e destróem patógenos invasores (Urbinate e Carneiro, 2004). Vários fatores são considerados para determinar as enfermidades bacterianas em peixes, e na maioria das vezes são causadas por situações de estresse dos animais, as quais podem não provocar mortalidade ou manifestação de doenças, representando uma ameaça sanitária para a saúde humana (Boijink e Brandão, 2004). O estresse é um conjunto de respostas não específicas do organismo a situações que ameaçam desequilibrar sua homeostase (Guelhardo e Oliveira, 2006) e essas respostas impostas por um sistema intensivo de criação são determinantes para desequilibrar o sistema imunológico animal. Os agentes de estresse ou estressores em peixes podem ser de inúmeros tipos, biológicos, como microrganismos patogênicos e não patogênicos, os de natureza física, como o transporte, o confinamento ou o manuseio e os de natureza química, como os contaminantes e o baixo teor de oxigênio ou o pH reduzido (Val et al., 2004; Oba et al., 2009). O entendimento básico da 19

fisiologia da resposta ao estresse e das alterações ambientais a que o peixe pode se adaptar por meio dessa resposta, possibilita a identificação de condições de estresse e favorece o desenvolvimento de métodos que mitiguem os seus efeitos adversos na saúde de peixes cultivados (Lima et al., 2006). Algumas bactérias, como espécies dos gêneros: Aeromonas, Cytophaga, Mycobacterium e Pseudomonas estão sempre presentes nos tanques, sendo que a presença de fatores estressantes pode desencadear o aparecimento de doenças (Shama et al., 2000). Os patógenos mais frequentes envolvidos em doenças de peixes brasileiros são as espécies Flavobacterium spp., Yersinia spp., Aeromonas spp., Pseudomonas spp., Edwardsiella spp. e Streptococcus spp. (Barja e Esteves, 1988; Brown, 1993; Pavanelli et al., 1998). A espécie Yersenia ruckeri, nunca antes citada em peixes do Brasil, foi relata pela primeira vez em jundiás (Ramdhia quelen) (Shama et al., 2000). Bactérias da espécie Aeromonas hydrophila embora faça parte da microbiota dos peixes (Barja e Esteves, 1988; Brown, 1993; Costa, 2003; Klinger et al., 2003) produz a toxina acetilcolinesterase que, em grande quantidade, é letal para estes organismos (Boijink e Brandão, 1992; Rodriguez et al., 1992). O gênero Aeromonas faz parte do complexo de Aeromonas móveis, e tem sido a causa de doenças em peixes como a hemorragia septicêmica (Austin e Austin, 2007) e a doença ulcerativa dos peixes (Karunasagar et al., 1995). Bactérias podem estar associadas a diversos fenômenos patogênicos em peixes, segundo Pavanelli et al., (2002), esses fenômenos costumam ser divididos em três principais aspectos: respostas septicêmicas, necroses dos tegumentos e músculos, provocando ulcerações, e resposta crônica proliferativa. Na Amazônia, particularmente no estado do Amazonas, alguns trabalhos foram realizados com estudos de doenças bacterianas em tambaqui (Silva, 2001; Costa, 2004). Segundo Costa (2004) foram feitos isolamentos e a identificações primárias de bactérias Gram-negativas das famílias Enterobacteriaceae, Vibrionaceae e Pseudomonadaceae. Dentro dessas famílias identificou-se as espécies de Enterobacter sp., Escherichia sp., Aeromonas sp., e Pseudomonas sp., esta é uma bactéria Gram negativa encontrada na água e microbiota bacteriana de peixes, algumas espécies desse gênero como P. fluorescens causam septicemias, hemorragias na pele, nadadeiras e na boca de peixes (Frerichs e Millar, 1993; Costa, 2004). Dentre as bactérias Gram-positivas foram identificadas Streptococcus sp., Aerococcus sp. e Nocardia sp. Desse gênero a espécie N. asteróides é identificada como principal agente causador de doenças crônicas e condições granulomatosas em peixes tropicais de água doce (Frerichs e Millar, 1993).

Silva (2001) isolou e identificou, por métodos fenotípicos, 22 bactérias em tambaqui de piscicultura do Amazonas sendo que as principais espécies foram: E. coli, Flavobacterium sp., Yersinia sp., Chromobacterium violaceum e Aeromonas spp. Flavobacterium sp. é a principal causadora de surtos de doença bacteriana branquial (Frerichs e Millar, 1993). Yersinia rukeri é o patógeno causador da doença enterite da boca vermelha (ERM-enterich redmouth) (Frerichs & Millar, 1993; Costa, 2004). As espécies do gênero Aeromonas são responsáveis pela maioria das enfermidades em peixes e perdas em piscicultura intensiva (Costa, 2004) e um dos patógenos causadores de infecções alimentares nos seres humanos (Austin e Austin, 2007). Bactérias podem causar elevada taxa de mortalidade, tanto em peixes da natureza, quanto aqueles mantidos em cultivo. Os surtos de doenças estão sendo cada vez mais reconhecidos como uma restrição significativa na produção de aquicultura e comércio, que afetam o desenvolvimento econômico do setor em muitos países (Verschuere et al., 2000). As infecções em peixes são responsáveis por grandes perdas em criações intensivas as quais muitas vezes apresentam índice elevado de mortalidade, que podem em certos casos chegar a 100%. A correta caracterização e identificação dos problemas de enfermidades e seus agentes causais é necessária para que se possa conhecer adequadamente seu comportamento, estabelecer o ciclo epidemiológico e definir os métodos de controle e profilaxia de doenças em peixes de cultivo, pois muitos problemas ainda não foram identificados e os processos mórbidos que causam são poucos estudados (Costa, 2004). No Brasil as autoridades estaduais e DFAs (Delegacia Federal de Agricultura), são responsáveis pela saúde animal. Em nível federal, o DDA (Departamento de Defesa Animal), é responsável pela coordenação, padronização e implantação do programa de saúde animal. Todos os estabelecimentos de aquicultura estão sujeitas à supervisão do Serviço Veterinário Oficial e a notificação obrigatória é necessária em caso de suspeita de surto de doença exótica, ou quando a doença é uma ameaça à economia pública, saúde pública ou o meio ambiente (FAO, 2012).

2.5- Métodos de identificação fenotípica e molecular de microrganismos

As identificações fenotípicas bacterianas são baseadas em uma série de testes bioquímicos (Bando, 2008), verificação de reações metabólicas, características de colônias e morfologia celular em esfregaços corados pelo método de Gram. Inicialmente é necessário fazer exame direto das amostras isoladas, com principal objetivo de revelar e enumerar

microrganismos (Martinez e Taddei, 2008). Porém, as provas bioquímicas são importantes para verificação de enzimas estruturais, pesquisas de produtos metabólicos e catabólicos (acetoína, indol, ácidos orgânicos) e verificação da sensibilidade dos microrganismos em diferentes compostos (Martinez e Taddei, 2008). Os meios empregados na identificação bioquímica microbiana: EPM, MILi (motilidades, indol e lisina) e citrato fornecem sete reações bioquímicas, que possibilitam identificar a maioria das enterobactérias (Franzolin, 2008). Essas técnicas juntamente com as técnicas moleculares são de fundamental importância para contribuir com a identificação de espécies bacterianas. A utilização de diversas técnicas moleculares entre elas a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), tem permitido grande evolução nas análises de rotina de laboratórios clínicos e industriais. Organismos não adaptados ao cultivo tornaram-se passíveis de ser analisados (Nilsson e Strom, 2002). Em poucos anos, o diagnóstico molecular evoluiu de uma mera curiosidade tecnológica para um campo vasto e complexo, com o potencial para revolucionar a ciência e a prática da medicina e áreas correlatas. O método mais utilizado para fazer a identificação de sequências de bases do DNA de um organismo é o método de terminação em cadeia, também conhecido como método de Sanger (Sanger et al., 1977). Esse método é baseado na capacidade da enzima DNA Polimerase estender a cadeia polinucleotídica a partir de um iniciador, ancorado por complementaridade em uma das fitas (fita molde). Como as fitas de DNA são complementares (A=T e C≡G), a partir do molde, a enzima adiciona nucleotídeos complementares necessitando do grupo hidroxila livre (OH) na posição 3’ da fita de DNA componente do desoxinucleotídeo anterior (dNTP) (Carraro e Kitajima, 2002). Os métodos moleculares tornaram-se aceitos para a detecção de agentes causadores de infecções (vírus, bactérias, fungos e protozoários). Em particular, o uso de uma combinação de genes rRNA de microganismos tornou-se popular para essa detecção (Millar et al., 2002). Os rRNAs são os mais úteis e mais precisos cronômetros moleculares, mostrando um elevado grau de regularidade funcional, o que determina relativamente um corportamento de relógio molecular. Ocorrem em todos os organismos e posições diferentes de suas sequências mudam em taxas muito diferentes, permitindo a medida da maioria das relações filogenéticas. Os rRNAs são moléculas grandes e consistem de muitos domínios. Há aproximadamente 50 hélices na estrutura secundária do 16S rRNA e aproximadamente o dobro na estrutura

secundária do 23S rRNA, fazendo destas moléculas relógios moleculares precisos (Woese, 1987). O gene 16S rRNA é universal em bactérias e a partir deste é possível distinguir linhagens bacterianas, por permitir identificações mais robustas, reprodutíveis e precisas do que as obtidas por meio de testes fenotípicos tornando-o como principal objeto de estudo para inferências taxonômicas e filogenéticas em bactérias (Clarridge, 2004).

2.6- Taxonomia e Filogenia Molecular Bacteriana

A taxonomia molecular, também chamada de quimiotaxonomia, utiliza as análises moleculares de várias biomoléculas da célula. Entre os principais métodos taxonômicos estão a hibridação DNA-DNA, as análises proteicas e o sequenciamento de ácidos nucleicos (Madigam et al., 2004; Bando 2008). Na hibridação DNA-DNA (DDH), a relação de bases GC descreve a porcentagem de cada nucleotídeo presente no DNA genômico de uma espécie bacteriana determinada, mas não fornece dados sobre o arranjo linear das bases no DNA. É o arranjo de bases que determina as características de um organismo, se dois organismos compartilham muitas sequências nucleotídicas em seus DNAs é provável que possuam muitos genes altamente similares ou idênticos (Madigam et al., 2004, Bando, 2008). Nessa técnica é possível verificar o grau de similaridades entre sequências, geralmente uma das moléculas comparadas é marcada com radioisótopo e hibridada, os fragmentos de fitas simples que não sofrem hibridação são removidos, a radiação é medida e comparada com uma reação-controle na qual a quantidade de reaçã é considerada 100% (Bando, 2008). Se o percentual de hibridação verificado for maior ou igual a 70% representam a mesma espécie (Stackebrandt e Goebel, 1994; Bando, 2008; Kämpfer e Glaeser, 2012). Nas análises proteicas é possível fazer a comparação de proteínas de diferentes microrganismos, pois a sequência de aminoácidos de uma proteína reflete a sequência de ácidos nucleicos do gene. Dessa forma as análises proteicas tornam-se úteis em taxonomia (Madigam et al., 2004, Bando, 2008). O sequenciamento do gene 16S RNA é o método mais direto para comparar a estrutura genômica de diferentes microrganismos, moléculas como RNA ribossômico ou proteínas que sofreram pouca variabilidade no curso evolutivo, são utilizados como marcadores taxonômicos. O gene 16S rRNA é considerado o mais adequado para definição de espécies bacterianas, o nível de identidade da sequência gênica entre duas cepas deve ser superior a

96% para chegar a um valor de similaridade de DDH superior a 70%, definindo assim um grau de identidade confiável (Stackebrandt e Goebel, 1994; Madigam et al., 2004, Bando, 2008; Stackebrandt, 2011). A taxonomia bacteriana compreende as áreas inter-relacionadas de classificação, nomenclatura e identificação e é a base para gerar hipóteses filogenéticas e evolutivas (Gillis et al., 2001; Kampfer e Glaeser, 2012). A classificação taxonômica dos organismos é baseada nas características similares e seguindo diferentes níveis hierárquicos (grupos pequenos que compartilham propriedades comuns que, por sua vez, fazem parte de grupos maiores). As bactérias seguem uma nomenclatura regulamentada pelo “Código Internacional de Nomenclatura de Procariontes”, e compreendem as regras, os princípios e as recomendações para a descrição de uma nova unidade de classificação de espécie, gênero ou família (Bando, 2008). Tradicionalmente, a taxonomia bacteriana é baseada em análises fenotípicas que incluem o aspecto de um organismo, seu metabolismo energético bem como suas enzimas (Madigam et al., 2004). Porém, esta abordagem, que fornece informações úteis para diferenciar táxons, nem sempre permite uma visão abrangente sobre as relações genéticas e filogenéticas dos organismos (Ludwig e Klen, 2001). A taxonomia bacteriana pode ser determinada por métodos genotípicos. Com o surgimento das técnicas moleculares a partir da década de 70, tornou-se possível sua utilização, na reconstrução da filogenia dos maiores grupos bacterianos. Ao nível molecular, similaridades gênicas de sequências indicam uma origem comum, pois táxons com sequências similares podem ser filogeneticamente relacionadas (Madigam et al., 2004; Bando, 2008). A partir da década de 1980, os estudos com genes ribossomais passaram a ser desenvolvidos como um novo método de identificação bacteriana. Foi mostrado que todas as relações filogenéticas e todas as formas de vida podem ser determinadas comparando partes estáveis do código genético. Regiões codificantes como 5S, 16S e 23S rRNA, e os espaços intergênicos foram usados para determinações filogenéticas. Porém, o gene 16S rRNA, também designado de 16S rDNA, tornou-se a região mais utilizada para propósitos taxonômicos em bactérias. O gene 16S rRNA pode ser comparado não só entre todas as bactérias, mas também com o gene 16S rRNA de Archea e o gene 18S rRNA de eucariotos (Clarridge, 2004). A pequena subunidade ribossomal 16S rRNA, é atualmente a molécula de escolha para a identificação de bactérias e outros microrganismos ao nível de espécie. As informações

obtidas a partir da comparação de sequências do 16S rRNA podem ser usadas para deduzir as relações filogenéticas detalhadas baseadas em evolução. Um mapa de distância evolutiva gerada a partir de dados de sequências do 16S rRNA realça as linhagens principais de Bacteria e Archaea. As porções altamente conservadas nos genes de rRNA são ideais para desenhar primers que amplificam as subunidades dos genes 16S rRNA de Bacteria e Archaea e de 18S RNA em Eucarya (Tanner et al., 2000). Com base nas informações das análises do gene 16S rRNA atualmente são reconhecidos pelo menos 12 grupos filogenéticos diferentes de bactérias, cada um deles contém regiões ou sequências específicas dentro do ribossomo. Essa região que distingue cada grupo é designada “sequência assinatura”, as quais são utilizadas como um código de barras bacteriano (Bando, 2008).

2.7- RNA ribossômico 16S

Os ribossomos são as maquinarias onde as proteínas são sintetizadas, possuindo sua estrutura altamente conservada em todas as espécies. Em bactérias são compostos de duas subunidades: uma subunidade grande 50S e uma subunidade pequena 30S. A subunidade 50S contém o rRNA 23S, um RNA 5S e mais de 30 proteínas. A subunidade 30S contém o rRNA 16S e mais 20 proteínas (Pei et al., 2009). As bactérias possuem os três genes de rRNA organizados em um agrupamento de genes que são expressos como único operon, que pode estar presente em múltiplas cópias no genoma (Pei et al., 2010). Sabe-se no entanto que os genes de rRNA são essenciais para a sobrevivência de todos os organismos e são altamente conservadas entre todas espécies. Consequentemente a caracterização do gene 16S rRNA está bem estabelecida como um método padrão para a identificação de espécies, gêneros e famílias de bactérias (Woose, 1987; Gurtler e Stanisich, 1996). A sequência do gene 16S rRNA tem tamanho de 1550 pares de bases (pb) de extensão e é composta de regiões variáveis e conservadas (Clarridge, 2004; Chakravorty et al., 2007) pois limitações funcionais sobre a estrutura de sequências gênicas do rRNA fazem com que certas regiões no gene sejam conservadas, enquanto as sequências entre estas regiões conservadas mutam em taxas mais rápidas, sendo assim denominadas regiões variáveis. As regiões conservadas são úteis para determinar as relações de distância, enquanto que as regiões variáveis que mutam mais rapidamente são úteis para distinguir organismos estreitamente relacionados (Pei et al., 2009).

Em geral, o 16S rRNA contém nove "regiões hipervariáveis" que demonstram a diversidade de sequências entre diferentes espécies bacterianas e pode ser usado para sua identificação (Chakravorty et al., 2007). Gray (1984) demonstrou que o 16S rRNA possui tanto regiões com alta quanto com baixa variabilidade, as quais são denominadas de regiões universais (U) e regiões variáveis (V), totalizando 8 regiões universais (U1-U8) e 9 regiões variáveis (V1-V9). Essas regiões hipervariáveis por serem ladeadas por trechos conservados na maioria das bactérias, permitem a amplificação de sequências-alvo utilizando primers universais (Chakravorty et al., 2007). A estrutura primária do 16S rRNA é altamente conservada, e espécies com mais de 70% de similaridade de DNA na hibridação têm geralmente mais de 97% de seus nucleotídeos idênticos. Os 3% diferentes não estão uniformemente espalhados ao longo da estrutura primária da molécula, mas concentram-se principalmente em certas regiões hipervariáveis. Pode-se argumentar que essas diferenças poderiam ser usadas como uma medida de distância filogenética entre estirpes, e que para a determinação deste nível de parentesco análise de sequência podem ser restritas a estas regiões, nas quais pode-se verificar este nível estreito de relacionamentos. Porém, existem pelo menos dois argumentos contra esta conclusão: 1) a quantidade de diferença não concentrada nas regiões hipervariáveis é substancial, e por omissão ocorreriam perdas de informações que já são baixas em quantidade a partir de um ponto de vista estatístico; 2) as posições das regiões hipervariáveis parecem ser táxons específicos mas necessitam ser determinadas para novos organismos por análise da sequência completa da molécula (Stackebrandt e Goebel, 1994; Kampfer e Glaeser, 2012).

3- Objetivos 3.1- Geral

 Identificar bactérias patogênicas isoladas de três espécies de peixes amazônicos,

Arapaima gigas (pirarucu), Colossoma macropomum (tambaqui) e Brycon amazonicus

(matrinxã), utilizando métodos fenotípicos e moleculares.

3.2- Específicos

 Determinar o perfil fenotípico dos isolados bacterianos utilizando métodos

microbiológicos convencionais.

 Sequenciar a região parcial dos gene 16S para determinação das sequências

nucleotídicas dos isolados bacterianos.

 Comparar os resultados das identificações bioquímicas e molecular.

 Utilizar os dados obtidos com o sequenciamento em análises que permitam a

identificação, classificação e reconstrução filogenética dos isolados bacterianos.

4- Material e Métodos

4.1- Coleta

No presente trabalho foram analisados 72 isolados bacterianos de peixes. Estas amostras estavam armazenadas na Coleção de Culturas de Bactérias Patogênicas de Peixes, depositada no Centro de Apoio Multidisciplinar - CAM, da Universidade Federal do Amazonas - UFAM em Manaus e cedidas pela Dra. Andréa Belém Costa. O material coletado de peixes cultivados em pisciculturas comerciais no estado do Amazonas foi isolado nos anos de 2006, 2008 e 2009. A cultura das amostras foi feita a partir de fígado, rim e baço dos animais que apresentavam sinais característicos de bacteriose. Foram analisados 18 isolados bacterianos de tambaqui (Tabela 01), 26 de matrinxã (Tabela 02) e 28 de pirarucu (Tabela 03).

Tabela 01- Isolados bacterianos de tambaqui.

Isolado PPUFAM* Local Órgão 25 Fazenda Três Irmãos/Manacapuru-Am fígado 26 Fazenda Três Irmãos/Manacapuru-Am Rim 27 Fazenda Três Irmãos/Manacapuru-Am Fígado 28 Fazenda Três Irmãos/Manacapuru-Am Rim 72 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Fígado 74 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Fígado 228 Setor de Aquicultura do INPA- AM n/d 229 Setor de Aquicultura do INPA- AM n/d 232 Setor de Aquicultura do INPA- AM n/d 233 Setor de Aquicultura do INPA- AM n/d 234 Setor de Aquicultura do INPA- AM n/d 236 Setor de Aquicultura do INPA- AM n/d 238 Setor de Aquicultura do INPA- AM n/d 239 Setor de Aquicultura do INPA- AM n/d 246 Setor de Aquicultura do INPA- AM Fígado 250 Fazenda UFAM/Manaus- AM Fígado 251 Fazenda UFAM/Manaus- AM Fígado 252 Fazenda UFAM/Manaus- AM Rim

*PPUFAM= Patologia de Peixes-Universidade Federal do Amazonas; n/d= não definido.

Tabela 02- Isolados bacterianos de matrinxã.

Isolado PPUFAM* Local Órgão 255 Fazenda UFAM/Manaus- AM Fígado 256 Fazenda UFAM/Manaus- AM Fígado 258 Fazenda UFAM/Manaus- AM Rim 260 Fazenda UFAM/Manaus- AM Rim 262 Fazenda UFAM/Manaus- AM n/d 263 Fazenda UFAM/Manaus- AM n/d 264 Fazenda UFAM/Manaus- AM n/d 265 Fazenda UFAM/Manaus- AM n/d 266 Fazenda UFAM/Manaus- AM n/d 267 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d 268 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d 269 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d 271 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d 272 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d 273 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d 274 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d 275 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d 276 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d 277 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d 278 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d 279 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d 282 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d 284 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d 285 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d 286 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d 288 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM n/d

*PPUFAM= Patologia de Peixes-Universidade Federal do Amazonas; n/d= não definido.

Tabela 03- Isolados bacterianos de pirarucu.

Isolado PPUFAM* Local Órgão

01 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Fígado 03 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Fígado 05 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Fígado 07 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Fígado

12 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Rim 13 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Fígado 16 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Rim 22 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Rim 34 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Baço 37 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Baço 38 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Fígado 40 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Baço 43 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Baço 44 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Fígado 45 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Rim 46 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Baço 51 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Rim

52 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Baço 53 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Fígado 54 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Rim 55 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Baço 57 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Rim 58 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Baço 59 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Fígado 63 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Fígado 64 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Fígado 70 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Fígado 71 Fazenda Águas Claras. Manacapuru-AM Fígado

*PPUFAM= Patologia de Peixes-Universidade Federal do Amazonas; n/d= não definido.

4.1- Reativação e purificação de Bactérias

Os isolados bacterianos estavam estocados em palhetas plásticas, contendo caldo de crescimento, extrato de levedura (Caldo YE) (Costa et al., 1998), suplementado com glicerol 10% mantidos à temperatura de -20º C para preservação das células bacterianas. A reativação dessas amostras foi realizada por semeadura do material em tubos de ensaio contendo caldo Nutriente comercial padrão. O material foi deixado para crescimento em estufa bacteriológica a 30oC durante 24 horas. Para purificação das colônias bacterianas, após o crescimento, foi feita semeadura por esgotamento em placas de Petri contendo meio ágar Nutriente e o material foi incubado mantendo-se nas mesmas condições anteriores e período de crescimento.

4.2- Identificação fenotípica bacteriana

A identificação fenotípica bacteriana presuntiva foi realizada de acordo com o Manual de Identificação de Bactérias Patogênicas em Peixes (Frericks e Millar, 2003), Manual Bergey de Sistemática Bacteriológica (Vos et al., 2009), Bacterial fish diseases (Austin e Austin, 2007) e o V Manual de Microbiologia Clínica para Controle de Infecções de Serviços de Saúde, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Levy, 2004). Foram realizados 20 testes para caracterização dos isolados bacterianos, como descritos a seguir:

4.3- Coloração Gram

Inicialmente às colônias crescidas e purificadas foram submetidas à coloração pelo método Gram. Através da coloração de Gram as bactérias podem ser classificadas em dois grandes grupos, Gram-positivas ou Gram-negativas. Os microrganismos Gram-positivos são aqueles que retêm o corante cristal violeta devido ao aumento na quantidade de ácido teicóico e a diminuição da permeabilidade da parede celular aos solventes orgânicos, por conterem menos lipídeos na parede celular. A parede celular de bactérias Gram-negativas possui grande quantidade de lipídeos (Althertum, 2008; Martinez e Tadei, 2008), que aumenta a permeabilidade aos solventes orgânicos permitindo a descoloração. Perdem, portanto, o cristal violeta, corando-se com o corante de fundo, safranina ou fucsina (Martinez e Tadei, 2008). Para realização do método Gram foi adicionada uma gota de 10µL de água deionizada em lâminas de vidro, com auxílio de uma alça bacteriológica foi retirada uma colônia bacteriana de culturas crescidas em placa de Petri e em seguida cada colônia foi friccionada 31

para homogeneização sobre uma lâmina com água. Posteriormente foi feita a fixação por aquecimento do material em bico de Bunsen. Após a fixação do material em lâmina foi feito o procedimento de coloração de Gram, inicialmente cada lâmina foi coberta por 1 minuto com o reagente cristal violeta de genciana sendo imersas rapidamente em água corrente, na segunda etapa do processo as lâminas foram novamente cobertas por 1 minuto com o reagente lugol, o qual foi removido adicionando sobre a lâmina um descolorante de solução álcool-acetona por aproximadamente 15 segundo seguido de lavagens em água corrente. Após o processo de descoloração, foi adicionada solução de fuccina sobre as lâminas durante 30 segundos, novamente as lâminas foram lavadas em água corrente e deixadas para secar em posição vertical em temperatura ambiente. Após secas as lâminas foram visualizadas em microscópio óptico.

4.4- Teste KOH

Além do teste de Gram para verificação de características bacterianas também é utilizado o teste KOH para confirmação do método Gram, de acordo com a metodologia de Buck (1982). Esse método foi feito adicionando 10µL de KOH 40% em lâmina com uma colônia bacteriana. O resultado positivo para KOH foi visualizado quando ocorreu formação de viscosidade na colônia com as gotículas de KOH, assim o resultado é confirmado Gram- negativo, quando não verificada a viscosidade o resultado é Gram-positivo.

4.5- Teste de catalase e oxidase

O teste de catalase é verificado observando a reação da enzima catalase, que decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) em oxigênio e água. Excluindo o gênero Streptococcus, a maioria das bactérias aeróbias e as facultativas possuem essa enzima (Franzolin, 2008). Para realização deste teste, com auxílio de uma alça de platina foram coletadas colônias isoladas de culturas bacterianas crescidas em placas de Petri. Em seguida foi feita fricção do material em lâminas de vidro e sobre o esfregaço foi adicionada uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%, o resultado foi considerado positivo ao ser imediatamente observado formação de bolhas na reação.

O teste de oxidase verifica as hemoproteínas que contém ferro e funcionam como a última molécula na ligação da cadeia respiratória aeróbica, transferindo elétrons (hidrogênio) ao oxigênio com a formação de água. Esse sistema é encontrado em aeróbios e anaeróbios facultativos, este teste é importante na identificação de organismos que não possuem a enzima ou são anaeróbios obrigatórios é útil na identificação de colônias da família Enterobacteriaceae (todas negativas) e identificação de outros gêneros não fermentadores, como Aeromonas, Pseudomonas e Pasteurella (positiva) (Franzolin, 2008). Para este procedimento foi feito um esfregaço de colônias bacterianas em papel filtro com auxílio de um bastão de vidro e posteriormente foi adicionada uma gota de reagente Kovacs para verificação da reação de oxidase. Colônias positivas indicam uma coloração rosada neste teste.

4.6- Teste em meio ágar MacConkey

O meio ágar MacConkey é um meio de cultura seletivo e diferencial, que possibilita diferenciar bactérias fermentadoras e não fermentadoras de lactose, selecionando também bacilos Gram-negativos. Pela presença de sais biliares e cristal violeta inibe o crescimento da maioria das bactérias Gram-positivas, contém vermelho neutro que cora bactérias fermentadoras de lactose, bactérias não fermentadoras de lactose não são coradas, ficando transparentes ou incolores no meio (Flournoy et al., 1990). Neste teste células bacterianas purificadas e crescidas em meio líquido, foram inoculadas em placas de Petri contendo meio ágar MacConkey, preparado de acordo com as instruções do fabricante, em seguida o material foi incubado em estufa bacteriológica com temperatura de 30o C por 24 horas.

4.7- Teste em ágar citrato de Simmons

Para o teste bacteriológico em citrato de Simmons, culturas bacterianas foram repicadas, com o auxílio de alça de platina, para tubos contendo meio ágar citrato de Simmons. Após a inoculação os tubos foram deixados em estufa bacteriológica durante 24 horas em temperatura de 30oC. Em seguida foi observado se ocorreu crescimento bacteriano. Como resultado positivo para bactérias que utilizam citrato como única fonte de carbono foi seguido o protocolo padrão do fabricante, o qual determina que os tubos contendo bactérias citrato positivo, mudam a coloração normal do meio de verde para a tonalidade azul.

Bactérias produtoras da enzima citratase conseguem utilizar o citrato como única fonte de carbono e utilizam o nitrogênio do sal de amônio produzindo amônia, alcalinizando o meio. O indicador utilizado é o azul de bromotinol, que em pH ácido é amarelo e em pH alcalino é azul (Franzolin 2008).

4.8- Teste em meio SIM (sulfato/indol/motilidade ágar)

Este teste é utilizado para verificação de motilidade bacteriana, por ser um meio semi- sólido que permite o crescimento bacteriano no interior do meio, produção de sulfato de hidrogênio (H2S) e reação de indol. O indol é verificado se a enzima triptofanase liberada pelas bactérias agir sobre o triptofano contido no meio de cultura. É possível verificar a reação de indol quando adicionado um reativo (Kovacs ou Ehrlish) ao tubo com o inóculo bacteriano, o resultado é positivo se visível coloração vermelha no tubo (Franzolin, 2008). Para verificação destas três importantes características bacterianas foram preparados meios de cultivo Sim em tubos de ensaio, de acordo com as recomendações do fabricante. Com a utilização de agulha bacteriológica foi feito inóculo por punção central de colônias bacterianas crescidas em meio líquido, em seguida esse material foi armazenado em estufa o bacteriológica durante 24 horas com temperatura de 30 C. A produção de H2S foi positiva nos tubos onde houve a formação de um precipitado de coloração preta e a motilidade bacteriana foi positiva nos tubos com aspecto turvo, negativa, nos quais foi observado crescimento bacteriano somente na linha de inoculação. Para a reação de indol, foram adicionadas vagarosamente cinco gotas do reativo Kovacs sob a parede dos tubos contendo crescimento bacteriano, os tubos foram então agitados suavemente para observação da reação, para provas positivas foi observada a formação de um anel vermelho na superfície da cultura nos tubos.

4.9- Teste em meio OF (oxidação e fermentação)

Para verificação de oxidação e fermentação bacteriana, é necessário que a reação possa ser feita em meio Hugh e Leifson (meio OF), o qual verifica se uma bactéria pode utilizar determinado carboidrato na forma fermentativa ou oxidativa. O teste foi feito adicionando-se em meio OF autoclavado a quantidade de 5-10 gramas de glicose, filtrada em filtros millipore 0,45 µm, posteriormente o meio de cultura foi distribuído em tubos de ensaio com rosca e deixados secar em fluxo laminar. Utilizando-se

culturas bacterianas com crescimento de 24 horas em meio sólido, foi realizada a inoculação do material até o fundo dos tubos com auxílio de agulha bacteriológica. Para verificação das reações de oxidação e fermentação é necessário que sejam feitas duplicatas do material. Cada reação é verificada separadamente, nos tubos para verificação de fermentação foi adicionado óleo mineral sobre a superfície do meio. Em seguida os tubos foram incubados em estufa bacteriológica durante 48 horas em 30oC. Para as bactérias que foram positivas na reação de oxidação ocorreu alteração na coloração do meio de cultivo nos tubos, de verde escuro passou a ser amarelo, e para bactérias fermentativas, os tubos contendo meio de cultivo com óleo mineral na superfície também mudaram a coloração de verde escuro para amarelo.

4.10- Teste de Urease

Em 1946, Christensen introduziu um meio que detecta a presença da enzima urease em espécies bacterianas. Utilizando esse meio é possível determinar a habilidade do microrganismos em degradar a uréia em duas moléculas de amônia pela ação da enzima urease, resultando na alcalinização do meio e em conseqüência disto ocorre à mudança da coloração do meio (Christensen, 1946; Franzolin, 2008). A partir desta reação é possível verificar a coloração rosa nas colônias crescidas no meio, indicando resultado positivo para urease. A preparação do meio ágar urea Christensen se deu através da adição de urea 40% no meio ágar urea base autoclavado, de acordo com as recomendações do fabricante, o meio foi distribuído em tubos com rosca, na quantidade de 3mL em cada tubo. Em seguida os tubos foram inclinados em um suporte dentro de fluxo, aproximadamente com ângulo de 45°, até a solidificação do meio.

4.11- Produção de gás e fermentação de carboidratos

Para a verificação da produção de gases bacterianos, o método utilizado foi através da adição de tubos de Durhan invertidos em meio líquido vermelho de fenol. O material foi autoclavado durante 15 minutos a 121oC. A partir de colônias puras crescidas em 24 horas foram feitas inoculações nos tubos, utilizando-se alça de platina. A produção de gás foi evidenciada através das formações de bolhas no interior dos tubos de Durhan invertidos.

A fermentação de carboidratos é observada através do processo metabólico de oxidação-redução que ocorre em anaerobiose, e em vez do oxigênio. Um substrato orgânico serve como aceptor final de hidrogênio. Na reação de fermentação de açúcares, ocorre a formação de ácidos orgânicos como metabólitos. A produção desses ácidos provoca uma diminuição do pH do meio. O teste consiste na detecção da acidificação do meio de cultura, utilizando um indicador de pH, o vermelho fenol, que em pH ácido se torna amarelo. As bactérias são diferenciadas pelos carboidratos que metabolizam, devido a diferenças de atividades enzimáticas, e através dos tipos e quantidades de ácidos produzidos (Franzolin, 2008). Para a caracterização bacteriana na fermentação de carboidratos foram utilizadas seis diferentes fontes: glicose, arabinose, dulcitol, inositol, rafinose e trealose. O meio de cultivo utilizado nesta prova bioquímica foi o indicador vermelho de fenol, preparado de acordo com as especificações do fabricante. Como cada reação é verificada separadamente, foram preparados seis diferentes reações, adicionando separadamente cada carboidrato no meio de cultivo vermelho de fenol, na proporção de cinco gramas de carboidrato para cada litro de meio, após a preparação os tubos foram autoclavados durante 15 minutos a 121oC. As colônias bacterianas purificadas e crescidas durante 24 horas foram inoculadas em cada tubo com auxílio da alça de platina, ao término do processo o material foi incubado em estufa bacteriológica durante 24 horas a 30oC.

4.12- Hemólise bacteriana

Vários patógenos sintetizam proteínas que atuam na membrana citoplasmática das células animais provocando lise celular, conseqüentemente a morte celular. É fácil detectar a ação destas toxinas, hemolisinas, com glóbulos vermelhos (eritrócitos e hemácias), esta verificação de hemólise pode ser observada através do inóculo bacteriano em placa de ágar sangue. Durante o crescimento das colônias certas quantidades de hemolisina são produzidas a partir da lise dos eritrócitos próximos, originando assim uma zona clara (halo) típica de hemólise, de acordo com o tipo de halo formado é possível distinguir os diferentes tipos de hemólises: alfa hemólise ()- halo de hemólise parcial, observa-se a coloração esverdeada ao redor das colônias em decorrência da perda massiva de potássio por parte do heritrócitos do ágar sangue, beta hemólise ()- halo de hemólise completo, observa-se a zona transparente

formada ao redor das colônias. Bactérias não hemolíticas são denominadas gama hemolíticas () (Madigan et al., 2004). A atividade hemolítica foi verificada através da reação bacteriana após inoculação de colônias no meio ágar sangue. Algumas culturas bacterianas puras, crescidas em meio líquido, foram semeadas, por esgotamento, em placas contendo meio ágar sangue de carneiro desfibrinado a 7% (pronto para uso), o material foi incubado durante 24 horas à 30oC. A leitura da reação foi realizada através da observação do tipo de hemólise visível no meio de cultura, através da observação da formação de halo ao redor das colônias bacterianas.

4.13- Identificação molecular bacteriana

Para identificação molecular bacteriana foi realizada as etapas de extração de DNA genômico, amplificação por PCR do gene 16S rRNA, sequenciamento do gene 16S rRNA dos isolados bacterianos e comparação das sequências obtidas com banco de dados públicos, realizados como descrito a seguir:

4.14- Extração do DNA genômico bacteriano

A partir das amostras previamente isoladas e identificadas, foi realizada extração de DNA genômico, utilizando o método de extração por fenol/clorofórmio (Sambrook e Russel, 2001) com algumas modificações. Seguindo o protocolo, células bacterianas foram inoculadas em 3mL de caldo Luria-Bertani (LB), e deixadas para crescimento, em incubador com agitação durante 24 horas a 30oC e 150 rpm. Após crescimento celular o material foi centrifugado a 12.000g durante 2 minutos, para concentração de células em sedimento (esta etapa foi realizada duas vezes para concentração de 3mL de cultivo). Para a etapa de lise celular o sedimento foi ressuspendido em 1mL de tampão de extração (NaCl 100mM; EDTA 50nM; Tris-HCl 50mM com pH 8,0), e centrifugado por 12.000g durante 2 minutos. Em seguida o material foi ressuspendido em 300µL de tampão de extração, 30 µL de enzima lisozima (10mg/mL), e 10µL de RNAse (10mg/mL), para remoção de RNAs da reação, incubado durante 10 minutos em temperatura ambiente, foi adicionado 50 µL de Triton X-100 10% e 30µL de NaCl 3M e incubado em banho seco a 60oC por 5 minutos.

Após a incubação, foi acrescentado 20µL de SDS 10% e 3mL proteinase K (10mg/mL), para remoção proteica, o material o qual foi homogeneizado e incubado durante 30 minutos a 37oC. Para o procedimento de lavagens das amostras, foi adicionado 450µL de fenol, visando à desnaturação de proteínas tornando-as insolúveis à fase aquosa, onde se encontram os ácidos nucleicos. O material foi agitado manualmente por 5 minutos e centrifugado em 12.000g por 2 minutos. Neste processo formou-se duas fases, sendo que apenas a fase aquosa foi recuperada onde foi adicionado 450µL de clorofórmio, para remoção de resíduos fenólicos, e novamente centrifugado por 12.000g por 2 minutos. A fase aquosa formada na lavagem com clorofórmio foi recuperada para a etapa de precipitação do DNA, na qual foi adicionada 30µL de NaCl 3M e vagarosamente 1mL de etanol absoluto a -20oC, novamente centrifugado a 12.000g durante 2 minutos. O precipitado foi hidratado com 1mL de etanol 70%, novamente centrifugado nas mesmas condições anteriores e foi deixado em repouso em fluxo laminar para secagem final por aproximadamente 15 minutos. Após secagem, foi ressuspendido com 100µL de tampão TE (Tris-HCl 10mM pH 7.5; EDTA 1mM), incubado a 56 oC por 15 minutos e logo em seguida armazenado por 24 horas a -20oC. Para visualização do DNA foi feita eletroforese em gel de agarose 0,8% em seguida o gel foi corado com brometo de etídio (0,5µg/mL).

4.15- Reação em cadeia de polimerase (PCR) para amplificação do gene 16S rRNA

Para amplificação do gene 16S rRNA, foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores: 530 F (5ʹ-TGA CTG ACT GAG TGC CAG CMG CCG CGG -3´ e 1492R (5´- TGA CTG ACT GAG AGC TCT ACC TTG TTA CGM YTT-3´) recomendados por Borneman e Triplett (1997), e destacados esquematicamente na figura 01 para visualização das regiões aproximadas de anelamento dos iniciadores. A reação de PCR foi feita com volume de 25µL (dNTPs de 2,5mM; tampão 10x com MgCl2; iniciadores (5pmoles/µL, Taq DNA polimerase 5U/µL) e DNA bacteriano na concentração entre (10-30ng). O sistema de amplificação foi realizado em aparelho termociclador Biocycle, com perfil de desnaturação a 95oC por 2 minutos, seguido por 35 ciclos com desnaturação do template a 95oC por 1:40 segundos; anelamento dos iniciadores a 58oC por 40segundos e extensão a 72 oC por 2 minutos, seguido de extensão final de 72 oC por 5 minutos. Após a reação de amplificação, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,8% (por aproximadamente 40 min.), coradas com 0,5 μg/ mL de brometo de etídeo e fotografadas sob luz UV em

fotodocumentador (Bio Agency 302 nm UV) para verificação dos fragmentos 16S rRNA amplificados, tamanho e concentração aproximada.

4.16- Purificação das amostras

Os fragmentos de DNA amplificados na reação de PCR, foram purificados utilizando kit GFX PCR DNA Kit (GE HealthCare), de acordo com as recomendações do fabricante. Foram utilizados para purificação 50 µL de produto de PCR e, ao final da purificação o precipitado foi ressuspendido em 20 μL de água. O material obtido neste experimento foi utilizado na reação de sequenciamento.

4.17- Sequenciamento e análise das sequências

Na reação de sequenciamento foram utilizados 2 μL de DNA purificado (50ng), em seguida para preparação do master mix da reação, adicionou-se 2μL de cada oligonucleotídeo iniciador, 2 μL de tampão 5X (Tris-HCl 1M; MgCl2 1M) e 0,3μL de ABI BigDye (do kit de reação BigDye Terminator Cycle Sequencing Applied Biosystems). O volume final da reação de seqüenciamento foi de 10μL. A reação de sequenciamento foi realizada em termociclador (Applied Biosystems, 96 Well) com o seguinte perfil de temperatura: 25 ciclos de desnaturação a 96oC por 10 segundos; anelamento a 50 oC por 15 segundos e extensão a 60 oC por 1:20 segundos. Após a reação de sequenciamento foi feita a precipitação dos produtos seguindo o protocolo de etanol/EDTA, adicionando-se sobre este 32,5 μL de mix Etanol/EDTA (2.5 μL EDTA 125mM; 30μL de Etanol 100%), em seguida o material foi agitado gentilmente por 39

inversão e centrifugado durante 25 minutos em 2500 rcf a 4oC, em seguida foi secado para retirada do etanol e posteriormente foi adicionado 30μL de etanol 70%, novamente o material foi centrifugado por 15 minutos em 1450 rcf a 4oC em seguida foi deixado em estufa para incubação de 15 minutos a 37oC após a incubação foi ressuspendido em 10 μL de formamida e foi gentimente vortexado, em seguida o DNA foi desnaturado em termociclador a 95oC durante 1 minuto. Ao final as amostras foram submetidas à eletroforese capilar em seqüenciador (ABI 3130- Applied Byosistems DNA sequence).

4.18- Análises por Bioinformática

As sequências obtidas na reação de sequenciamento (Anexo) foram trimadas, para atribuição de qualidade, utilizando o programa PHRED disponível no endereço (http://helix.biomol.unb.br/phph/index.html). O consenso das sequências 5´-3´ de cada isolado bacteriano foi feito utilizando a ferramenta CAP3, este programa realiza a montagem de sequência contíguas a partir dos arquivos.fasta.screen., está disponível no programa Bioedit 7.0.5. Após a obtenção do consenso das seqências foi feita uma busca comparativa com no banco de genomas bacterianos depositados no “GeneBank” utilizando a ferramenta BLASTn do “National Center for Biotecnology Information”(NCBI) e também foram comparadas com o banco de dados do “Ribossomal Database Project”(RDP).

Para avaliar a proximidade dos isolados deste trabalho com outros grupos bacterianos, foi feito um alinhamento em conjunto das sequências dos isolados obtidos juntamente com sequências de estirpes de referência obtidas no site RDP. O alinhamento destas sequências foi realizado utilizando o programa BioEdit 7.0.5.3 (Hall, 1999) através da ferramenta ClustalW.

4.19- Análises filogenéticas das sequências

Inicialmente as sequências alinhadas foram utilizadas para as análises filogenéticas. A árvore filogenética dos isolados bacterianos foi montada através do programa Mega 5.05 (Tamura et al. 2011), utilizando-se o método de distância Neighbor-joining, o qual gera uma árvore a partir de matrizes de distâncias, agrupando sequências vizinhas, este é um método próprio para avaliar grandes quantidades de dados, e as montagens de árvores são relativamente precisas em comparações com outros métodos heurísticos de agrupamentos, e é mais robusto contra pequenos erros na matriz de distância entre as sequências (Hoyle e Higgs, 2003). Para a análise dos dados obtidos foi utilizado o modelo de substituição nucleotídica

Jukes-Cantor, o qual gera uma matriz de distância com o número de diferenças entre os pares de sequências alinhadas.

O teste de confiaça da topologia da ávore foi com um mínimo de 500 amostras bootstrap. Este é um método estatístico para estimar limites de confiança em análises filogenéticas, o qual basea-se na construção de subamostras a partir de uma amostra inicial da população calculando-se as estatísticas, o programa de inicialização gera inumeras copias da amostra original para criar uma pseudopopulação, o que gera várias árvores-réplicas, após gerar todas as réplicas a árvore consenso final é obtida. Os valores presente na árvore indicam a topologia de consenso das árvores-réplicas (Hillis e Bull, 2003).

5- Resultados 5.1- Caracterização fenotípica bacteriana

Todos os isolados estudados foram classificados de acordo com a morfologia celular e as características bioquímicas apresentadas. As características celulares de cada isolado foram observadas após a coloração pelo método Gram de colônias bacterianas com crescimento de 24/48horas, esse método também foi confirmado pelo teste de KOH das colônias.

5.2- Coloração Gram e teste KOH

Para visualização da morfologia bacteriana foi realizada a técnica de coloração de Gram (Figura). Foram analisadas no total 72 amostras bacterianas, sendo identificados: 41 bacilos Gram-negativos, 23 bacilos Gram-positivos e 7 cocos Gram-positivos, na (Tabela 04) são mostrados os resultados do teste Gram para cada isolado bacteriano. A reação de KOH confirmou a reação de Gram para todas as amostras estudas.

Figura 02: Método de coloração de Gram. Fotos: Eliane Carvalho

Tabela 04- Resultado do teste Gram para cada isolado bacteriano

Bacilos Gram Bacilos Gram Cocos Gram Total de amostras Isolados bacterianos positivo negativos positivos bacterianas

Pirarucu 13 12 3 28

Tambaqui 7 9 2 18

Matrinxã 3 20 3 26

5.3- Testes bioquímicos

Foram realizados 19 testes para os 72 isolados bacterianos, os resultados obtidos nas provas bioquímicas estão caracterizados nas (Tabelas 05; 06 e 07), em duas amostras de bacilos Gram-positivos foi realizado o teste de reação de hemólise, para confirmação fenotípica das espécies bacterianas. Através das caracterizações bioquímicas dos isolados foram identificadas espécies pertencentes a sete famílias bacterianas. Da família Enterobacteriacea foram encontrados 31 isolados (43%), sendo identificados: 7 (10%) em tambaqui; 19 (26%) em matrinxã e 5 (7%) em pirarucu. Os gêneros e as espécies bacterianas encontradas foram: Citrobacter sp. (4), Enterobacter sp. (7), Escherichia coli (1), Hafnia alvei (1), Plesiomonas shigelloides (2), Salmonella sp. (5) e Shigella sp. (1). Desta família não foi possível à identificação em (10) isolados PPUFAM 239; PPUFAM 255; PPUFAM 256; PPUFAM 264; PPUFAM267; PPUFAM 268; PPUFAM 269; PUFAM 271; PPUFAM 272; PPUFAM 276. Os isolados identificados como bacilos Gram positivos foram caracterizados como pertencentes à família Bacillaceae sendo identificados 23 (32%) isolados de Bacillus sp. Pertencente à família Flavobacteriaceae foi obtido apenas 1 (2%) isolado, não sendo possível a identificação do gênero. Compondo à família Moraxellaceae, foram identificados 3 (4%) isolados de Acinetobacter sp. Da família Vibrionaceae foram identificadas 5 (7%) espécies do gênero Aeromonas. No grupo de cocos Gram-positivos foram identificadas duas famílias, Staphylococcaceae e Streptococcaceae, com 6 (8%) isolados de Staphylococcus spp. e 3 (4%) isolados de Streptococcus spp, respectivamente. Na determinação da identidade fenotípica dos isolados bacterianos foram identificadas 6 espécies bacterianas, 11 gêneros e sete famílias, as espécies foram: Acinetobacter sp., Bacillus cereus, E. coli, Hafnia alvei, Plesiomonas shigelloides, Salmonella sp. Nos isolados bacterianos identificados como PPUFAM 54 e PPUFAM 63 foi realizado o teste de hemólise em meio de cultivo ágar sangue, no qual foi evidenciada hemólise do tipo beta () (Figura 03). Esta característica juntamente com as com as reações observadas nos 19 testes bioquímicos realizados foi possível caracterizar estes isolados pertencentes à espécie Bacillus cereus.

a b

Figura 03- Beta () hemólise em isolados PPUFAM 54 (a) e PPUFAM 63(b). Placas em ágar sangue de carneiro desfibrinado a 7%. Fotos: Eliane Carvalho

Tabela 05- Testes bioquímicos realizados em isolados bacterianos de tambaqui.

ISOLADOS BACTERIANOS DE TAMBAQUI- PPUFAM TESTES 25 26 27 28 72 74 228 229 232 233 234 236 238 239 246 250 251 252 forma celular B B B B B B B B B B B B B B B C C B col. Gram + - + - + - + + - + + - + - - + + - teste KOH - + - + - + - + + - - + - + + - - + oxidase - - - - + - + ------+ catalase + + + + + + + + + + + + + + + - - + oxidação - + - + - + - + + - - + - + + + - + fermentação - + - + - + - + + - - + - + - - - + motilidade - + - + - + - + + - + + - + - - - +

H2S - - - + - + - + + - - + ------indol ------+ Gás - - - + - + - + + - - + ------glucose - + - + + + + + + + - + + + - + + + urease + - - - + + + - + + - + - - - - + + lactose - +R - + - +R - +R +R - - +R - + - - - + citrato - - - + - + - + + - - + ------arabinose - + - + - + - + + - + + - - - - - + dulcitol + + + + + + - + + - + + - + - - - + inositol - + + + - + - + + - + + - + - - - + rafinose - + - + + + - + + - - + - + - + - +

trealose - + - + - + - + + - + + - + - + - +

spp. spp. spp. spp. spp. spp.

. . .

spp

spp.

ace

spp. spp. spp. spp. spp spp. spp spp us

espécies cus

Salmonella Salmonella

Citrobacter Citrobacter Citrobacter Citrobacter

shigelloides

Staphylococ Staphylococ

Plesiomonas Plesiomonas

Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus

Enterobacter Enterobacter

Staphylococc

Enterobacteri

Streptococcus Streptococcus Streptococcus Acinetobacter +R= Lactose positiva é observada devido coloração rosa em meio MacConkey. B=bacilo; C= coco

Tabela 06- Testes bioquímicos realizados em isolados bacterianos de matrinxã.

ISOLADOS BACTERIANOS DE MATRINXÃ- PPUFAM TESTES 255 256 258 260 262 263 264 265 266 267 268 269 271 272 273 274 275 276 277 278 279 282 284 285 286 288 forma celular B B B C B B B C B B B B B B B B B B B B B B B B C B col. Gram - - - + - - - + ------+ - + + - teste KOH + + + - + + + - + + + + + + + + + + + + + - + - - + oxidase ------+ + ------catalase + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + oxidação + + - - - - + + + + + + - + + + + + + + + - + - + + fermentação + + + + - - + + + + - - + + + + + + + + + + + - + + motilidade + + - - - - + - + + + + + + + + + - + - + - + + - +

H2S ------+ - + - - - + - + + + - - - - - indol ------+ - + ------+ gás + + - + - + + + - - + + + + + - + + + + - - + - - + glucose + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + - + - - + urease + - - - - + + + + - + + - + - + - + - - + + + + + - lactose + + + - - - + - + + - + + + +R +R + +R + + +R - +R - - +R citrato - + - - - - + ------+ + + - + + + + - - - - + arabinose - - - - - + + - - - + - + + + + + + + + + - + + + + dulcitol ------+ - - - + - + + + + + + + + + - + + + + inositol - + - - - + + - + + + - + + + + + + + + + - + + + + rafinose - + - - - + + - - - - - + - + + + + + - + - + + - +

trealose ------+ + - + - - - - + + + -

spp. spp.

. . .

spp. spp. spp.

spp. spp. spp. spp. spp s spp. spp. spp. spp. spp spp.

tarda tarda

aceae aceae aceae aceae aceae

gella spp. gella

cus cus

espécies cus

Klebsiella Klebsiella

dwardsiella dwardsiella dwardsiella

Salmonella Salmonella Salmonella Salmonella

Citrobacter Citrobacter Citrobacter

shigelloides

Staphylococ Staphylococ Staphylococ Staphylococ

Plesiomonas Plesiomonas

Shi Bacillus Bacillus

Acinetobacte Acinetobacte Acinetobacte

Enterobacter Enterobacter Enterobacter Enterobacter

E E

Enterobacteri Enterobacteri Enterobacteri Enterobacteri Enterobacteri Acinetobacter +R= Lactose positiva é observada devido coloração rosa em meio MacConkey. B=bacilo; C= coco

Tabela 07- Testes bioquímicos realizados em isolados bacterianos de pirarucu.

ISOLADOS BACTERIANOS DE PIRARUCU- PPUFAM TESTES 01 03 05 07 12 13 16 22 34 37 38 40 43 44 45 46 51 52 53 54 55 57 58 59 63 64 70 71 forma celular B B B B B B B B B B B B B B B B B C B B C B B B B B C C Col. Gram ------+ - + + + + + - - + + + + + - + + + + + + teste KOH + + + + + + + - + - - - - - + + - - - - - + ------oxidase + + + + + - - - - + + + + - - - - - + + - + - - - - - + catalase + + + + + + + + + + + + - - + + + - + + + + + + + + + + oxidação + + + + + + + - + - + + + + + + - + + - + + + - - - + + fermentação + + + + + + + - + - - - + + + + + + + - + - + - - - + + motilidade + + + + + + + - + - - + + - + + + + ------+ + - - H2S - + ------+ ------indol + + + + + - + - + ------gás + + + + + + + - + - - + - - - + ------glicose + + + + + + + + + - - + - + + + + + + + + + + + + + + + urease + - + + + + + + - + + + ------+ + + + + + + + - + lactose +R +R +R +R +R +R +R - + +R - - - +R + + - - - - - + + - - - - - citrato - + + + - + + + - + + - - - - + + + + + + + - - - + - - arabinose + + + + + + + + + - - + + + + + - + + + - - + + + + - - dulcitol + + + + + - + - + - - + - + + + + - + + + + + + + + + - inositol - - + + - + + - + - - - + + - + + + + + + + + - + + + - rafinose + + + + + + + - + - - + + + + + + + + + + - + + + + + -

trealose + + + + + + + + + + - + + + + + + + - + + + + - + + + +

spp. spp. spp.

spp. spp.

a alvei a spp.

coli

spp. spp. spp. spp. spp. spp. spp. spp. spp.

riu

cereus

cus cus

espécie Bacillus

Flavobacte

Salmonella Salmonella

Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas

Escherichia Escherichia

Staphylococ Staphylococ Staphylococ Staphylococ

Hafni

Bacillus spp. Bacillus spp. Bacillus spp. Bacillus spp. Bacillus spp. Bacillus spp. Bacillus spp. Bacillus spp. Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus

Enterobacter Enterobacter Enterobacter

Streptococcus Streptococcus ereus Bacillus +R= Lactose positiva é observada devido coloração rosa em meio MacConkey. B=bacilo; C= coco 46

5.4- Extração de DNA genômico e amplificação do 16S rRNA

A extração de DNA para as amostras foi realizada via fenol/ clorofórmio como descrito no item 3.15, as amostras foram visualizadas em gel de agarose 0,8% e coradas com brometo de etídio (Figura 04). Para comparação na identificação dos fragmentos de DNA extraídos foi utilizado marcador de peso molecular lâmbida (λ).

Figura 04- Foto da extração de DNA genômico bacteriano em gel de agarose 0,8%. (M)- Marcador de peso molecular lâmbida (λ). Foto: Eliane Carvalho

O DNA genômico bacteriano extraído foi amplificado por PCR para amplificação do gene 16S rRNA, o fragmento molecular de 1000pb (pares de bases) (Figura 05) foi comparado com marcador de peso molecular Ladder de 1Kb (Promega). Após, as amostras foram purificadas e utilizadas na a reação de sequenciamento.

1000pb

Figura 05- Foto da amplificação do gene 16S rRNA por PCR em gel de agarose 0,8%. Marcador molecular (M) Ladder de 1Kb (Promega).( C-) controle negativo da reação. Foto: Eliane Carvalho.

5.5- Identificação molecular das bactérias

A partir de 28 isolados de pirarucu, 17 isolados de tambaqui e 26 isolados de matrinxã foram identificadas 35 espécies bacterianas (das quais 11 ainda não foram descritas) representativas de 18 gêneros e nove famílias (Quadro 01 e 02, Tabela 08). A taxonomia molecular bacteriana foi realizada nos 72 isolados do Banco de Bactérias Patogênicas em Peixes – UFAM. O parâmetro de decisão para proceder com a identificação molecular derivou do alinhamento comparativo entre espécies obtidos no BLAST e no RDP assumindo- se o percentual de confiança para identidade bacteriana (ID) a partir de 97% (Tabela 08). Na identificação molecular foi possível caracterizar nove famílias bacterianas: Bacillaceae; Enterobacteriaceae; Enterococcaceae; Flavobacteriaceae, Microbacteriaceae, Moraxellaceae, Paenibacillaceae; Staphylococcaceae e Streptococcaceae (Figura 06). Bacillaceae foi a mais representativa dentre todas as famílias, uma vez que foram identificadas 13 espécies correspondendo a 37,14% do total. Em matrinxã ocorreram duas espécies não descritas de Bacillus (Bacillus sp.1 e Bacillus sp.2). Em pirarucu ocorreram oito espécies (Bacillus cereus, Bacillus sp.3, Bacillus sp.4, Bacillus sp.5, Bacillus sp.6, Bacillus sp.7, Bacillus sp.8 e Lysinibacillus fusiformes). Em tambaqui foram encontradas quatro espécies (B. aquimaris, B. pumillus, Bacillus sp.9, Lysinibacillus fusiformes). Pertecentes à família Enterobacteriaceae foram identificadas 12 espécies, correspondendo 34,29% do total. Em pirarucu ocorreram cinco espécies (Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Hafnia alvei, Kluyvera georgiana e Pantoea sp.). Em tambaqui foram encontradas cinco espécies (Citrobacter sp.1, Edwardsiella tarda, Enterobacter asburiae, Plesiomonas shigelloides e Salmonella sp. enterica). Em matrinxã sete espécies (Edwardsiella tarda, Enterobacter asburiae, Enterobacter sp.1, Klebsiella pneumoniae; K. georgiana, Plesiomonas shigelloides e Salmonella enterica). Compondo a família Staphylococcaceae foram identificadas três espécies, correspondendo a 8,57% do total. Em pirarucu foram encontrados Staphylococcus saprophyticus e S. aureus. Em matrinxã, S. pasteuri e S. saprophyticus. Na família Streptococcaceae foram identificadas duas espécies, correspondendo à 5,71% do total, onde Lactococcus garviae foi encontrada em tambaqui e L. lactis em pirarucu. As famílias Enterococacceae, Flavobacteriaceae, Microbacteriaceae, Moraxellaceae, Paenibacillaceae foram as menos representativas, correspondendo a 2,86% do total, respectivamente. Em cada uma dessas famílias foi identificada apenas uma espécie 48

(Enterococcus raffinosus, Myroides odoratimus, Microbacterium terrae, Acinetobacter calcoaceticus e Paenibacillus sp., respectivamente).

Figura 06- Representação das famílias com base nas espécies bacterianas identificadas

Quadro 01- Espécies identificadas nos isolados de pirarucu, tambaqui e matrinxã. O número entre parênteses corresponde ao total de isolados encontrados.

Espécies isoladas Espécies isoladas Espécies isoladas de pirarucu de tambaqui de matrinxã

Bacillus cereus Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter calcoaceticus (2) Bacillus sp. 3 B. pumillus Bacillus sp. 1 Bacillus sp. 4 Bacillus aquimaris Bacillus sp. 2 Bacillus sp. 5 Bacillus sp.9 Edwardsiella tarda (8) Bacillus sp. 6 Citrobacter sp. (3) Enterobacter asburiae (2) Bacillus sp. 7 Edwardsiella tarda Enterobacter sp. 1 Bacillus sp. 8 Enterobacter asburiae Klebsiella pneumoniae (2) Enterobacter aerogenes (2) Lactococcus garviae (2) Kluyvera georgiana (2) Enterococcus raffinosus. Lysinibacillus fusiformis (3) Plesiomonas shigelloides Escherichia coli Microbacterium terrae S. saprophyticus Hafnia alvei Paenibacillus sp. Salmonella enterica (3) Kluyvera georgiana (5) Plesiomonas shigelloides Staphylococcus pausteuri (2) Lactococcus lactis Salmonella entérica Lysinibacillus fusiformes (4) Microbacterium terrae Myroides odoratimus Pantoea sp. Staphylococcus aureus Staphylococcus saprophyticus (2)

Quadro 2- Espécies bacterianas identificadas nos isolados PPUFAM. O número entre parênteses corresponde ao total de isolados encontrados. 50

Acinetobacter calcoaceticus (3) Enterococcus raffinosus B. pumillus Escherichia coli Bacillus aquimaris Hafnia alvei Bacillus cereus Klebsiella pneumoniae (2) Bacillus sp. 1 Kluyvera georgiana (7) Bacillus sp.2 Lactococcus garviae (2) Bacillus sp.3 Lactococcus lactis Bacillus sp.4 Lysinibacillus fusiformis (7) Bacillus sp.5 Microbacterium terrae (2) Bacillus sp.6 Myroides odoratimus Bacillus sp.7 Paenibacillus sp. Bacillus sp.8 Pantoea agglomerans Bacillus sp. 9 Plesiomonas shigelloides (2) Citrobacter sp. 1 (3) Salmonella entérica (4) Edwardsiella tarda (9) Staphylococcus aureus Enterobacter aerogenes (2) Staphylococcus pausteuri (2) Enterobacter asburiae (3) Staphylococcus saprophyticus (3) Enterobacter sp.1

Tabela 08- Taxonomia molecular dos isolados PPUFAM.

ORIGEM ISOLADOS FAMÍLIA GÊNERO ESPÉCIE % de cobertura % de ID Tambaqui PPUFAM 238 Bacillaceae Bacillus Bacillus aquimaris 97 99

Pirarucu PPUFAM 51 Bacillaceae Bacillus Bacillus cereus 97 97

Tambaqui PPUFAM 27 Bacillaceae Bacillus Bacillus pumilus 97 98

Matrinxã PPUFAM 282 Bacillaceae Bacillus Bacillus sp. 1 97 98

Matrinxã PPUFAM 285 Bacillaceae Bacillus Bacillus sp. 2 99 95

Pirarucu PPUFAM 43 Bacillaceae Bacillus Bacillus sp. 3 97 98

Pirarucu PPUFAM 54 Bacillaceae Bacillus Bacillus sp. 4 99 89

Pirarucu PPUFAM 58 Bacillaceae Bacillus Bacillus sp. 5 98 91

Pirarucu PPUFAM 59 Bacillaceae Bacillus Bacillus sp. 6 99 88

Pirarucu PPUFAM 63 Bacillaceae Bacillus Bacillus sp. 7 99 90

Pirarucu PPUFAM 64 Bacillaceae Bacillus Bacillus sp. 8 98 87

Tambaqui PPUFAM 233 Bacillaceae Bacillus Bacillus sp. 9 97 87

Pirarucu PPUFAM 37 Bacillaceae Lysinibacillus Lysinibacillus fusiformes 97 97

Pirarucu PPUFAM 38 Bacillaceae Lysinibacillus Lysinibacillus fusiformes 97 97

Tambaqui PPUFAM 228 Bacillaceae Lysinibacillus Lysinibacillus fusiformes 98 97

Tambaqui PPUFAM 25 Bacillaceae Lysinibacillus Lysinibacillus fusiformis 99 98

Tambaqui PPUFAM 72 Bacillaceae Lysinibacillus Lysinibacillus fusiformis 98 98

Pirarucu PPUFAM 40 Bacillaceae Lysinibacillus Lysinibacillus fusiformis 100 98

Pirarucu PPUFAM 53 Bacillaceae Lysinibacillus Lysinibacillus fusiformis 98 99

Tambaqui PPUFAM 74 Enterobacteriaceae Citrobacter Citrobacter sp.1 97 99

Tambaqui PPUFAM 232 Enterobacteriaceae Citrobacter Citrobacter sp.1 99 95

Tambaqui PPUFAM 236 Enterobacteriaceae Citrobacter Citrobacter sp.1 98 91

Matrinxã PPUFAM 269 Enterobacteriaceae Edwardsiella Edwardisiella tarda 95 97

Matrinxã PPUFAM 267 Enterobacteriaceae Edwardsiella Edwardsiella tarda 99 98

Matrinxã PPUFAM 255 Enterobacteriaceae Edwardsiella Edwardsiella tarda 94 99

Matrinxã PPUFAM 256 Enterobacteriaceae Edwardsiella Edwardsiella tarda 97 99

Matrinxã PPUFAM 258 Enterobacteriaceae Edwardsiella Edwardsiella tarda 97 99

Matrinxã PPUFAM 268 Enterobacteriaceae Edwardsiella Edwardsiella tarda 100 99

Matrinxã PPUFAM 272 Enterobacteriaceae Edwardsiella Edwardsiella tarda 98 98

Matrinxã PPUFAM 271 Enterobacteriaceae Edwardsiella Edwardsiella tarda 98 98

Tambaqui PPUFAM 239 Enterobacteriaceae Edwardsiella Edwardsiella tarda 97 99

Tambaqui PPUFAM 26 Enterobacteriaceae Enterobacter Enterobacter asburiae 98 98

Matrinxã PPUFAM 274 Enterobacteriaceae Enterobacter Enterobacter sp.1 98 99

Matrinxã PPUFAM 284 Enterobacteriaceae Enterobacter Enterobacter asburiae 98 98

Matrinxã PPUFAM 288 Enterobacteriaceae Enterobacter Enterobacter asburiae 97 97

Pirarucu PPUFAM 13 Enterobacteriaceae Enterobacter Enterobacter aerogenes 99 97

Pirarucu PPUFAM 16 Enterobacteriaceae Enterobacter Enterobacter aerogenes 99 96

Pirarucu PPUFAM 34 Enterobacteriaceae Escherichia Escherichia coli 97 98

Pirarucu PPUFAM 45 Enterobacteriaceae Hafnia Hafnia alvei 98 98

Matrinxã PPUFAM 276 Enterobacteriaceae Klebsiella Klebsiella pneumoniae 98 97

Matrinxã PPUFAM 279 Enterobacteriaceae Klebsiella Klebsiella pneumoniae 95 97

Matrinxã PPUFAM 273 Enterobacteriaceae Kluyvera Kluyvera georgiana 98 98

Pirarucu PPUFAM 01 Enterobacteriaceae Kluyvera Kluyvera georgiana 97 98

Pirarucu PPUFAM 05 Enterobacteriaceae Kluyvera Kluyvera georgiana 97 99

Matrinxã PPUFAM 264 Enterobacteriaceae Kluyvera Kluyvera georgiana 97 98

Pirarucu PPUFAM 03 Enterobacteriaceae Kluyvera Kluyvera georgiana 99 93

Pirarucu PPUFAM 07 Enterobacteriaceae Kluyvera Kluyvera georgiana 97 95

Pirarucu PPUFAM 12 Enterobacteriaceae Kluyvera Kluyvera georgiana 96 95

Pirarucu PPUFAM 46 Enterobacteriaceae Pantoea Pantoea agglomerans 94 93

Matrinxã PPUFAM 266 Enterobacteriaceae Plesiomonas Plesiomonas shigelloides 98 98

Tambaqui PPUFAM 252 Enterobacteriaceae Plesiomonas Plesiomonas shigelloides 99 97

Matrinxã PPUFAM 275 Enterobacteriaceae Salmonella Salmonella entérica 98 99

Matrinxã PPUFAM 277 Enterobacteriaceae Salmonella Salmonella entérica 99 99

Matrinxã PPUFAM 278 Enterobacteriaceae Salmonella Salmonella entérica 96 99

Tambaqui PPUFAM 28 Enterobacteriaceae Salmonella Salmonella entérica 98 99

Pirarucu PPUFAM 44 Enterococcaceae Enterococcus Enterococcus raffinosus 98 97

Pirarucu PPUFAM 57 Flavobacteriaceae Myroides Myroides odoratimus 97 97

Pirarucu PPUFAM 22 Microbacteriaceae Microbacterium Microbacterium terrae 97 97

Tambaqui PPUFAM 229 Microbacteriaceae Microbacterium Microbacterium terrae 99 97

Matrinxã PPUFAM 263 Moraxellaceae Acinetobacter Acinetobacter calcoaceticus 98 97

Tambaqui PPUFAM 246 Moraxellaceae Acinetobacter Acinetobacter calcoaceticus 98 98

Matrinxã PPUFAM 262 Moraxellaceae Acinetobacter Acinetobacter calcoaceticus. 98 98

Tambaqui PPUFAM 234 Paenibacillaceae Paenibacillus Paenibacillus sp. 98 99

Matrinxã PPUFAM 286 Staphylococcaceae Staphylococcus Staphylococcus pasteuri 100 99

Matrinxã PPUFAM 265 Staphylococcaceae Staphylococcus Staphylococcus saprophyticus 100 99

Pirarucu PPUFAM 55 Staphylococcaceae Staphylococcus Staphylococcus saprophyticus 97 99

Pirarucu PPUFAM 70 Staphylococcaceae Staphylococcus Staphylococcus saprophyticus 99 98

Matrinxã PPUFAM 260 Staphylococcaceae Staphylococcus Staphylococcus pasteuri 98 98

Pirarucu PPUFAM 71 Staphylococcaceae Staphylococcus Staphylococcus aureus 99 97

Tambaqui PPUFAM 250 Streptococcaceae Lactococcus Lactococcus garvieae 99 98

Tambaqui PPUFAM 251 Streptococcaceae Lactococcus Lactococcus garvieae 97 98

Pirarucu PPUFAM 52 Streptococcaceae Lactococcus Lactococcus lactis 97 98

% de cobertura- valor percentual da cobertura de consulta de sequências no banco de dados BLAST. % de ID- valor percentual da identidade de sequências.

5.6- Análises Filogenéticas

Nas análises filogenéticas a proximidade de parentesco dos isolados utilizados neste trabalho foi avaliada com outros grupos bacterianos, sendo utilizadas para esta comparação sequências obtidas no RDP a partir de estirpes de referência (ATCC) de cada grupo bacteriano identificado. Alguns isolados identificados apresentaram sequências com similaridades próximas de 100%, indicando que todos são representantes da mesma espécie. Para estes isolados altamente similares foi utilizada apenas uma sequência representativa para a construção da árvore filogenética. A montagem da árvore filogenética foi feita utilizando-se somente sequências reversas, pois em alguns isolados não foi possível obter sequências consenso e através da verificação qualitativa, utilizando programa PHRED, foi observado que as sequências reversas apresentaram melhores resoluções, os níveis mínimos de exigências estimados foram de 250 bases, com qualidade PHRED acima de 20. No dendograma filogenético (Figura-07) é possível verificar as espécies identificadas ou unidades taxonômicas (Operational Taxonomic Units - OTUs) juntamente com os rerspectivos grupos de famílias nas quais pertencem. Os grupos bacterianos ou clusters estão representados pela ordem numérica de I-IX, onde I é Enterobacteriaceae; II- Moraxellaceae; III- Flavobacteriaceae; IV- Microbacteriaceae; V- Staphylococcaceae; VI- Enterococcaceae; VII- Streptococcaceae; VIII- Bacillaceae e IX- Paenibacillaceae A árvore filogenética apresentada corresponde ao agrupamento filogenético de 35 espécies de bactérias isoladas de pirarucu, tambaqui e matrinxã. Com base no alinhamento das sequências nucleotídicas foi gerada uma árvore de Neighbor-Joining a qual revelou a existência de pelo menos nove agrupamentos correspondentes às famílias: Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae, Flavobacteriaceae, Microbacteriaceae, Moraxellaceae, Paenibacillaceae, Staphylococcaceae e Streptococcaceae. As duas famílias mais representativas (Enterobacteriaceae e Bacillaceae) mostraram-se claramente polifiléticas, tendo em vista que os gêneros e as espécies dentro destas famílias agruparam-se com gêneros e espécies distintas. No caso da família Enterobacteriaceae observa-se que os gêneros Escherichia e Salmonella são grupos irmãos. Porém, na nossa filogenia, PPUFAM 275 (S. entérica) não se agrupou com as estirpes de referência de E. coli + S. enterica + PPUFAM 34 (E. coli). Enterobacter mostrou-se polifilético, uma vez que a espécie Enterobacter asburiae ficou mais 57

próxima de Pantoea agglomerans enquanto Enterobacter aerogenes agrupou-se mais proximamente de Kluyvera georgiana. Citrobacter freundii agrupou-se com Edwardsiella tarda. Os gêneros Hafnia e Plesiomonas mostraram-se monofiléticos. No grupamento formado pela família Bacillaceae, observa-se que Lysinibacillus fusiformis agrupou-se mais proximamente da família Paenibacillaceae, formando um clado irmão. Bacillus pumillus, Bacillus aquimaris e PPUFAM 282 (Bacillus sp.1), formaram um grupamento monofilético. Bacillus cereus formou clado monofilético com PPUFAM 285 (Bacillus sp.2). Bacillus sp. 4, Bacillus sp. 5, Bacillus sp. 3, Bacillus sp. 9, Bacillus sp. 7, Bacillus sp. 6 e Bacillus sp. 8, formaram um grupo monofilético separado. Porém próximo à Bacillus cereus. A família Staphylococcaceae (grupo V) formou um grupamento monofilético. E observou-se neste grupo que as espécies S. saprophyticus e S. pasteuri, formaram um clado monofilético separado de S. aureus. Os grupos VI e VII representados pelas famílias Enterococcaceae e Streptococcaceae são monofilético e formam um grupo irmão.

III

VII

VIII

Figura 07- Dendograma filogenético (Neighbor-Joining) do 16S rRNA de isolados bacterianos amazônicos (PPUFAM) e de estirpes de referência (ATCC). As famílias bacterianas são representadas de I-IX, onde: I- Enterobacteriaceae; II-Moraxellaceae; III- Flavobacteriaceae; IV- Microbacteriaceae; V-Staphylococcaceae; VI- Enterococcaceae; VII- Streptococcaceae; VIII- Bacillaceae e IX- Paenibacillaceae. A matriz de distância foi calculada pelo algoritmo Jukes-Cantor, com bootstrap de 500 repetições. 59

6- Discussão

6.1- Identificações das espécies bacterianas

Todos os tipos de peixes são propensos à infecções bacterianas, as quais podem ser responsáveis por surtos graves de doenças e mortalidade em espécies selvagens e cultivadas. Embora os sinais de doenças e a história clínica forneçam informações valiosas sobre os prováveis agentes etiológicos, a caracterização taxonômica é geralmente necessária para identificar um patógeno específico (Frerichs e Millar, 2003). A interação entre o conjunto de dados genéticos e fenotípicos fornecem uma base sólida para a descrição da diversidade em procariotos (Kampfer e Glaeser, 2011; Kampfer e Glaeser, 2012). As identificações das espécies bacterianas foram feitas utilizando-se três abordagens distintas, através de testes bioquímicos, análises das sequências parciais do gene 16S rRNA e perfil filogenético. Utilizando estas metodologias, foi possível identificar gêneros e espécies bacterianas. Nos isolados em que ocorreram divergências de resultados entre os testes bioquímicos e testes moleculares foram utilizados os resultados da análise molecular, devido o maior percentual de confiança.

6.1.1- Identificações fenotípicas das famílias e espécies bacterianas

As identificações bacterianas classicamente são baseadas nas similaridades das características fenotípicas observadas. Através da observação destas características todas as amostras obtidas na coleção de cultura de bactérias patogênicas em peixes, foram identificadas seguindo padrões citados na literatura. Os resultados obtidos na identificação fenotípica dos 72 isolados analisados nesse estudo, evidenciaram características similares com sete famílias bacterianas Enterobacteriaceae; Bacillaceae; Flavobacteriaceae; Moraxelaceae; Vibrionaceae; Staphylococcaceae e Streptococcaceae, sendo possível a identificação de seis (06) espécies.

Enterobacteriaceae

Pertencendo a maior e mais abrangente família bacteriana, Enterobacteriaceae, foram encontrados 31 isolados. A classificação bacteriana seguiu o padrão das principais características que distinguem essa família, as quais determinam que todas as bactérias desse grupo são pequenos bacilos Gram-negativos e oxidase negativos, exceto a espécie Plesiomonas shigelloides que possui oxidade positiva, todas as espécies crescem em meio 60

seletivo ágar MacConkey, são anaeróbios facultativos (crescem em aerobiose e anaerobiose), fermentam glicose com ou sem produção de gás e todos são catalase positivos (Ewing et al., 1980; Paradis et al., 2005). Estes fatores foram determinantes na classificação dos isolados desse grupo, sendo possível a caracterização fenotípica de 07 espécies, Citrobacter sp.; Enterobacter spp.; Escherichia coli; Klebsiella sp.; Plesiomonas shigelloides; Salmonella spp e Shigella spp. O gênero Citrobacter identificado nos isolados PPUFAM 74; PPUFAM 232; PPUFAM 236 e PPUFAM 279, foi um gênero bastante complexo em sua identificação primária devido algumas semelhanças fenotípicas com E. coli, Klebsiella e Enterobacter, porém algumas características únicas determinaram sua identificação. São estabelecidas nas literaturas algumas características que permitem distinguir, Citrobacter dos demais grupos.

Dentre estas podem ser destacadas que este é um gênero bacteriano com reação de H2S positivo (Booth e McDonald, 1971); exceto em C. koseri, e são bactérias móveis, distinguindo de Klebsiella que é um gênero não móvel (Martinez e Trabulsi, 2008). Segundo o Levy (2004) genêros como Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter apresentam baixo poder de discriminação, neste caso a identificação segue o maior percentual de probabilidade das chaves utilizadas. Em decorrência das principais características observadas compatíveis com Citrobacter, determinamos os isolados estudados como Citrobacter spp. Enterobacter foi identificado nos isolados PPUFAM 13; PPUFAM 16; PPUFAM 26; PPUFAM 273, PPUFAM 274, PPUFAM 284 e PPUFAM 288. De acordo com as reações metabólicas evidenciadas estes isolados foram nomeados como Enterobacter sp., sendo que as principais características que definiram esta espécie foram evidenciadas nas reações de indol, citrato de Simmons, ureaese e motilidade. Estas reações possibitam separar Enterobacter das espécie de E. coli e Klebsiella. Na reação de indol Enterobacter é sempre negativo (Levy, 2004), enquanto E. coli é positiva. Em meio citrato de Simmons, E. coli tem reação negativa enquanto que na maioria das espécies em Enterobacter observa-se reação positiva. A prova de urease também foi determinante, pois, em E. coli é negativa, enquanto Enterobacter tem reação positiva. A distinção de Enterobacter para Klebsiella, é verificada principalmente na prova de motilidade, pois Klebsiella é uma bactéria não móvel e todas as espécies de Enterobacter são móveis (Levy, 2004; Martinez e Trabulsi, 2008). A espécie E. coli foi identificada somente no isolado, PPUFAM 34, segundo Breed et al. (1957), as principais reações típicas desta espécies são: as reações de indol positiva, urease negativa, reação negativa em citrato de Simmons e lactose positiva em meio seletivo ágar

MacConkey. Através observação destas características, produção de gás e fermentação de carboidratos confirmamos a identificação do isolado PPUFAM 34 pertencendo a esta espécie. PPUFAM 276 foi identificado como Klebsiella spp., de acordo com o Levy (2004), bactérias deste gênero são bacilos Gram-negativos não móveis e fermentadores de lactose em meio MacConkey. Apesar de características semelhantes com E.coli e Enterobacter esta espécie difere por não ser móvel. Os isolados PPUFAM 252, 266 e PPUFAM 267 foram identificados como Plesiomonas shigelloides, esta bactéria é a única da família Enterobacteriacea a apresentar oxidase positiva (Falcão et al., 2007), esta característica é extremamente importante na distinção desta espécie com outras da família de enterobactérias, o nome da espécie foi definido devido esta ser a única pertencente ao gênero Plesiomonas (Falcão et al., 2007). Para confirmação da taxonomia foi observado nos isolados as reações de oxidase positiva, indol e motilidade, confirmando os padrões nas chaves taxônomica para a espécie Plesiomonas shigelloides. Os isolados PPUFAM 28, PPUFAM 46, PPUFAM 275, PPUFAM 277 e PPFAM 278, foram identificados como Salmonella spp.. Ao contrário de muitas espécies da família Enterobacteriaceae, as salmonelas clinicamente importantes não fermentam lactose, fator que contribui na identificação das espécies (Ferreira e Campos, 2008). Além desta prova, as evidências observadas indicando esta espécie, foram através das reações positivas em citrato de Simmons, confirmação de motilidade e a produção de H2S, estas características são as principais que definem este gênero excluindo possíveis gêneros, como Shigella, o qual observou-se, de acordo com as chaves utilizadas, que apresenta algumas reações com os resultados semelhantes à Salmonella. Apesar da semelhança com Salmonella, o gênero Shigella foi identificado no isolado PPUFAM 258. Para diferenciação dos gêneros semelhantes fenotipicamente com Shigella, os principais testes observados foram as reações em citrato de Simmons, urease, e motilidade. Bactérias do gênero Shigella não utilizam citrato como única fonte de carbono, no entando a reação em citrato de Simmons é negativa, não produzem a enzima urease, e são espécies não móveis, enquanto que a maior parte das espécies da família Enterobacteriaceae são bactérias móveis (Campos et al., 2008). Em contrapartida os resultados para o teste de indol nos isolados estudados foi negativo, divergindo das chaves de identificação utilizadas que determinam resultado positivo para esta gênero, porém de acordo com Martinez e Trabulsi (2008), o teste de indol é variável neste gênero. Seguindo os padrões dos manuais de

identificações e as comparações por similaridades de reações com o gênero Shigella, confirmamos os isolados pertencendo a espécie Shigella spp. É notório que na família Enterobacteriaceae existam centenas de espécies. Esta família é uma das mais importantes famílias bacterianas, incluindo muitos patógenos isolados de homens e animais, existem aproximadamente 30 gêneros e mais de 100 espécies (Martinez e Trabulsi, 2008), com base nas reações metabólicas, conseguimos distinguir diferentes espécies que compõem esta família, incluindo patógenos não associados às infecções em peixes.

Bacillaceae

A identificação da família Bacillaceae foi realizada de acordo com os padrões descritos por Vos et al. (2009), os quais definem que os membros desta família são geralmente células em forma de bastonetes, capazes de produzirem endósporos, cilíndricos, elipsoidais ou esféricos, podendo ocorrer em células únicas, em pares ou em cadeias (que podem ser grandes comprimentos). Bactérias desta família podem ser móveis e imóveis, podendo ser tanto aeróbias quanto anaeróbias facultativas. Geralmente são Gram-positivas, podendo haver algumas espécies Gram-variáveis ou Gram-negativas, fermentam geralmente todos os tipos de carboidratos, em algumas espécies as produções de gases são visíveis, na maior parte são bactérias saprófitas, comumente encontradas no solo. Desta família foram identificados 23 isolados das espécies Bacillus spp. e Bacillus cereus. O gênero Bacillus compreende cerca de 50 espécies de bacilos anaeróbios facultativos que podem exibir a forma esporulada, todos são móveis, exceto o B. anthracis e B. mycoides (Levy, 2004). Os isolados PPUFAM 54 e 63 apresentaram resultado negativo para o teste de motilidade e resultados similares com B. cereus e B. anthracis. Devido estas características foi realizado teste para verificação de hemólise em meio ágar sangue de carneiro para confirmação da espécie, os resultados neste teste foram positivos, com verificação de hemólise do tipo β (figura), confirmando a espécies B. cereus e descartando a possibilidade de B. anthracis por ser não hemolítico. A reação negativa para motilidade pode ter ocorrido devido exposição bacteriana no meio de cultivo utilizado, possivelmente ocorrendo à formação de endósporos, os quais ocorrem como resposta a uma situação desfavorável no meio no qual a bactéria foi exposta como a carência de água ou de algum nutriente essencial (Alterthum, 2008). Nos demais isolados identificados no gênero Bacillus não foi possível caracterizar fenotipicamente as espécies, sendo estes classificados como Bacillus spp.

Flavobacteriaceae

Pentencente à família Flavobacteriaceae foi identificado o isolado PPUFAM 57, através da identificação fenotípica o isolado foi identificado como Flavobacterium, neste gênero estão incluídas bactérias não móveis com formato de curtos bacilos Gram-negativos, aeróbios estritos, com reação positiva de oxidase e crescimento com reação oxidativa no meio O-F com glicose (Frerichs e Millar, 2003), estas características observadas no isolado analisado corroboraram para identificação somente do gênero bacteriano, não sendo possível a identificação de espécies em decorrência das poucas descrições nas chaves taxonômicas utilizadas.

Moraxelaceae

Da família Moraxelaceae foram identificados três isolados, PPUFAM 246, PPUFAM 262 e PPUFAM 263, a identificação primária seguiu a chave de identificação proposta por Frerichs e Millar (2003), a diferenciação dos demais gêneros bacterianos ocorreu devido verificação de reações negativas para o teste de oxidase e teste em meio O-F com glicose, somente o gênero Acinetobacter possui reação negativa nestes ensaios, possibilitando a confirmação dos isolados como Acinetobacter spp.

Vibrionaceae

Vibrionaceae foi identificada em cinco isolados, PPUFAM 01; PPUFAM 03; PPUFAM 05; PPUFAM 07; PPUFAM 12. Esta família inclui dois gêneros, Aeromonas e Vibrio, distribuídos mundialmente, sendo as espécies destes gêneros consideradas as mais importantes espécies patogênicas em peixes (Frerichs e Millar, 2003). Através da verificação de bacilos Gram-negativos oxidase positiva e fermentadores, foram feitas as identificações primárias da família bacteriana Vibrionaceae seguindo as chaves taxonômicas utilizadas (Frerichs e Millar, 2003; Levy, 2004). De acordo com as características observadas na fermentação de carboidratos, utilização de citrato e produção de H2S, foram feitas as separações entre gêneros bacterianos desta família, algumas reações foram observadas para exclusão do gênero Vibrio, espécies bacterianas pertencentes a este gênero não são capazes de fermentar o carboidrato arabinose, não utilizam citrato de Simmons como única fonte de carbono, exceto a espécie V. cholerae, e não produzem H2S, estas características típicas de Aeromonas foram observadas nos isolados estudados.

O gênero Aeromonas inclui espécies móveis, exceto A. salmonicida, oxidase e catalase positivas (Frerichs e Millar, 2003). Apesar da maioria das reações evidenciadas nos isolados corresponderem em grande parte com características similares com Aeromonas, algumas reações observadas não foram compatíveis com nenhuma espécie descrita neste gênero, como por exemplo, a reação positiva de urease, exceto em PPUFAM 03, e fermentação de lactose em meio MacConkey, devido a estas distinções da maioria das espécies do gênero Aeromonas, para identificação fenotípica os isolados bacterianos foram identificados como Aeromonas spp. O gênero Aeromonas é dividido em bactérias móveis e não-móveis, todas as espécies móveis são isoladas de peixes, a espécie A. hydrophila é a mais frequentemente isolada (Frerichs e Millar, 2003) e considerada como um significante agente patogênico em peixes de água doce (Austin e Austin, 2007).

Staphylococcaceae

Espécies da família Staphylococcaceae (Schleifer e Bell 2010) foram evidenciadas nos isolados PPUFAM 55; PPUFAM 70; PPUFAM 71; PPUFAM 260; PPUFAM 265 e PPUFAM 286. De acordo com as características moleculares evidenciadas por 16S rRNA esta família agrupa cinco gêneros, Staphylococcus, Jeotgalicoccus, Macrococcus, Salinicoccus (Vos et al., 2009). Baseando-se em caracteres fenotípicos primários para identificação do gênero, os isolados estudados foram identificados como Staphylococcus spp, somente o gênero Staphylococcus agrupa bactérias Gram-positivas em cocos formando clusters, características que permitiram distinguir Staphylococcus dos demais gêneros. Staphylococcus é um gênero que compõe 32 espécies e 14 subespécies, sendo que somente 15 espécies são encontradas em amostras humanas, são bactérias Gram-positivas não móveis em forma de cocos em cachos, anaeróbios facultativos, com exceção de S. aureus subsp. anaerobius e S. saccharolyticus que crescem mais rápido e abundante em condições aeróbias, são geralmente catalase positivos e oxidase negativas, não esporulados que mais resistem no meio ambiente. Podem sobreviver por meses em amostras clínicas secas, são relativamente resistentes ao calor e podem tolerar altas concentrações de sais (Levy, 2004; Vos et al., 2009). Este gênero é geralmente considerado como potencial patógeno em peixes, embora existam poucos relatos publicados de surtos de doenças (Frerichs e Millar, 2003). Em 1998, foram descritas várias epizootias por S. epidermidis em tilápias cultivadas em Taiwan (Huang et al., 1999), o primeiro relato evidenciando patogenias em peixes causadas por esta

bactéria foi descrita por Kusuda and Sugiyama em 1981 em culturas de truta amarela (Frerichs e Millar, 2003; Huang et al., 1999).

Streptococcaceae

Na família Streptococcaceae identificada em três isolados, PPUFAM 52; PPUFAM 250 e PPUFAM 251 estão incluídos três gêneros bacterianos, todas as espécies desta família são bacilos Gram-positivos em formato de cocos em cadeias (Frerichs e Millar, 2003; Vos et al., 2009), a principal característica que diferencia esta família de Micrococcacea, é a reação negativa na prova de catalase (Vos et al.,2009). De acordo com estes critérios fenotípicos, os isolados foram identificados como Streptococcus spp. Nesta família espécies de Streptococcus iniae e Lactococcus garvie, são importantes patógenos em peixes (Austin e Austin, 2007).

6.1.2- Identificações moleculares de famílias e espécies bacterianas

As identificações moleculares de espécies bacterianas são importantes ferramentas que corroboram com métodos fenotípicos clássicos para caracterização de microrganismos, que geralmente não são tão precisos quanto à identificação com base em métodos genotípicos (Clarrige, 2004). Pelo sequenciamento da região gênica 16S rRNA foi possível obter a identidade genotípica dos 72 isolados bacterianos estudados, como demostrado na (Tabela 08), o percentual de identidade para as espécies foi considerado confiável entre sequências similares com valor ≥97% de identidade quando comparadas com o banco de dados BLASTN, similaridades inferiores indicam que representam diferentes espécies (Brenner et al., 2005). Alguns autores sugerem estes valores acima de 97% para definição de gênero e 99% para definição de espécies, porém não é possível atribuir um valor definitivo para definição de gênero ou espécies bacterianas utilizando o gene 16S rRNA, devido a variação dos valores percentuais gerados, essa diferença pode variar se calculada somente as primeiras 500 pb ou todo o fragmento de 1500 pb, e também ocorrem variações no porcentual de acordo com o programa de cálculo utilizado (Clarrige, 2004). As análises parciais do gene 16S rRNA permitiram a identicação de 35 espécies bacterianas, como destacado no Quadro 02, distribuídas em nove famílias: Bacillaceae; Enterobacteriaceae; Enterococcacea; Flavobacteriaceae; Microbacteriaceae; Moraxelaceae; Paenibacillaceae; Staphylococcaceae e Streptococcaceae (Figura 06), segue abaixo a caracterização cada família, bem como das espécies identificadas:

Família Bacillaceae

Bactérias da família Bacillaceae foram identificadas em grande número nos isolados bacterianos estudados, com ocorrência de 37,14% (Figura 06), totalizando 13 espécies identificadas. Esta família inclui 19 gêneros bacterianos, com mais de 142 espécies. Bacillus é o gênero em que ocorrem o maior número de espécies (Logan e Vos, 2009). Neste gênero foram identificadas 12 espécies: B. aquimaris, B. cereus, B.pumillus e Bacillus sp. 1, Bacillus sp. 2, Bacillus sp. 3, Bacillus sp. 4, Bacillus sp. 5, Bacillus sp. 6, Bacillus sp. 7, Bacillus sp. 8 e Bacillus sp.9. No gênero Lysinibacillus, somente a espécie L. fusiformes foi identificada, em isolados de piraru e tambaqui. Bacillus é um gênero extremamente heterogêneo, as bactérias deste grupo possuem capacidade de formação de esporos inertes ambientalmente e metabolicamente resistentes, a maioria das espécies são isoladas principalmente a partir do solo, ou de ambientes que podem ter sido contaminados diretamente ou indiretamente por solo, também são encontrados na água, alimentos e amostras clínicas (Logan e Vos, 2009; Schmidt et al., 2011), Baciilus spp. estão associados à patogenias em peixes, algumas espécies como B. mycoides foram registradas como causa de infeções em bagres cultivados (Goodwin et al., 1994; Austin e Austin, 2007). B. cereus identificado no isolado PPUFAM 51, é uma bactéria que produz endosporos que podem ser disseminados no solo, leite e outros alimentos, bem como em diversos ambientes. Esta espécie pode multiplicar-se rapidamente em diversos alimentos causando intoxicação alimentar, ocasionalmente causa infecções oportunistas em homens e animais (Logan e Vos, 2009), em peixes exitem alguns registros de sua associação causando necrose de brânquias em carpa comum e robalo listrado, porém não há registros de patogênias impactantes causados por esta espécie em cutivo de peixes (Austin e Austin, 2007). Outras espécies de Bacillus foram identificadas nas análises moleculares: B. pumillus isolado em PPUFAM 27 e B. aquimaris em PPUFAM 238. Várias espécies de Bacillus habitam zonas costeiras e ambientes marinhos, porém B. pumilus é considerado como o mais importante componente da comunidade bacteriana marinha, é uma bactéria altamente resistente à condições ambientais extremas, tais como baixo nutrientes ou nenhuma disponibilidade, UV, dessecação, irradiação, H2O2, e desinfecção química. O papel ecológico de B. pumilus é enfatizada pelo fato de que eles produzem compostos antagônicos de agentes patogênicos fúngicos e bacterianos, estas características tornam esta espécie de grande interesse para pesquisas (Gioia et al., 2007; Parvathi et al., 2009). O isolado PPUFAM 238 67

apresentou similaridade de 99% com a espécies B. aquimaris, esta espécies é isolada principalmente de ambientes marinhos, foi identificada por Yoon et al. (2003) este utilizou combinações de dados fenotípicos, análise filogenética do gene completo 16S rRNA e relacionamento genômico diferenciou e propôs esta espécies para integrar o grupo Bacillus. No gênero Lysinibacillus ocorreu a espécie Lysinibacillus fusiformis, com percentual de identidade entre sequências ≥ 97% nos isolados analisados. O gênero inclui três espécies Lysinibacillus boronitolerans; Lysinibacillus fusiformis e Lysinibacillus sphaericus (Ahmed et al. 2007; Miwa et al., 2009), comuns no solo e ambientes aquáticos (Ahmed et al., 2007). L. fusiformis faz parte do grupo de bactérias descritas como potencial para degradação do biodiesel (Vaz, 2010). Espécies componentes do gênero Lysinibacillus foram isoladas pela primeira vez de solo no Japão, e devido à observação da presença de lisina e aspartato no peptidoglicano da parede celular, receberam essa denominação (Ahmed et al., 2007). As espécies de Bacillus identificadas como Baccilus sp., agruparam-se com similaridade próxima com a espécies Bacillus cereus, porém com percentual baixo de identidade por isso não receberam nomeação de B. cereus, possivelmente o sequenciamento completo do gene 16S rRNA destas espécies, pode permitir a identificação e reconstrução filogenética destas espécies.

Família Enterobacteriaceae

A família Enterobacteriaceae representou total de 44,29% com 12 espécies bacterianas identificadas, sendo que três espécies foram evidenciadas somente em pirarucu, E. coli; Hafnia alvei e Pantoea agglomerans A espécie de Citrobacter sp.1 foi isolada somente em tambaqui. E somente em matrinxã ocorreu a espécie Klebsiella pneumoniae (Quadro 1). As espécies Klebsiella pneumoniae, Citrobacter spp., Pantoea agglomerans são descritas como bactérias causadoras de patogênias em peixes cultivados (Austin e Austin, 2007). Os gêneros Escherichia; Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella são considerados de maior importância na contaminação alimentar, pertencem ao grupo denominado coliformes (Hobbs e Roberts, 1999). Na contagem de coliformes pode-se diferenciar dois grupos: os coliformes totais, utilizados para avaliar as condições higiênicas, limpeza e sanificação, e os coliformes termotolerantes que são indicadores de contaminação fecal (Siqueira, 1995). Em países de clima tropical bactérias do grupo coliforme mesmo que introduzidas na água por poluição fecal, podem adaptar-se ao meio aquático (Lopez-Torrez et al., 1977).

A espécie E. coli ainda que presente em pirarucu não é considerada como patógeno em peixes, sua ocorrência reflete os níveis de poluição causados por outros animais na água. Cepas de E. coli que contem enterotoxinas ou fatores virulentos estão entre as principais responsáveis por infecções do trato urinário humano, podendo ainda provocar diarréias, e ainda estar relacionadas com sepse e meningite (Muratori, 2007), esta ocorrência é de grande importância uma vez que E. coli pode revelar-se como a principal causa de surtos de intoxicação ou infecção alimentar após ficar em condições favoráveis para seu crescimento e produção de toxinas. K. pneumoniae tem sido isolada de solo, vegetais e ambientes aquáticos, é um patógeno oportunista e está associada várias infecções em humanos, dentre estas, diarréia e intoxicação alimentar (Brisse et al., 2006). Em peixes K. pneumoniae foi isolada pela primeira vez a partir de truta arco-íris na Escócia em 1998, os peixes apresentavam sinais de podridão na cauda e nadadeiras (Austin e Austin, 2007). As evidencias da presença de K. pneumoniae isoladas a partir de peixes de água doce, já são descritas na literatura (Kumari et al., 2001; Sharma et al., 2006), porém a causa de patogenias associadas a esta espécie ainda são incipientes. A espécie de Citrobacter é um patógeno emergente em peixes, é Citrobacter freundii, existem vários relatos do surto de doenças causados por esta bactéria, principalmente da causa de doenças em salmão e truta na Espanha e nos E.U.A respectivamente (Austin e Austin, 2007). As espécies Hafnia alvei e Pantoea agglomerans são descritos como causadores de patogenias em peixes (Austin e Autin, 2007). P. agglomerans é uma bactéria que habita plantas, solo, água, essa espécie é relatada como comensal e patógena de homens e animais, é claramente um patógeno oportunista e raramente causam doença em indivíduos saudáveis (Liberto et al., 2009). Em peixes infectados com a espécie P. agglomerans foram observadas hemorragias acentuadas nos olhos de animais mortos e moribundos, as hemorragias também foram registrados na musculatura (Austin e Autin, 2007). Assim como P. agglomerans a espécie Hafnia alvei tem ocorrência principalmente no solo e na água, é considerada como patógeno causador de hemorragia septicêmica em truta arco-íris, esta espécie não é considerada como patógeno emergente em sistemas de cultivo (Austin e Austin, 2007). A espécie com maior ocorrência foi Edwardsiella tarda com registro de 9 isolados, esta bactéria é um importante patógeno em peixes e a principal causa de surtos em sistemas de

cultivos, pode acometer cultivos tanto em água marinha quanto em água doce (Abbott e Janda, 2006; Alexandrino et al., 2009). No Brasil, as espécies mais acometidas são o dourado (Salminus sp.), a carpa comum (Cyprinus carpio) e a tilápia (Oreochromis niloticus), quando mantidos em cultivo intensivo (Albinati et al. 2006; Pavanelli et al., 2008; Alexandrino et al., 1999). Embora seja comumente classificada como oportunista, E. tarda é considerada um agente patogênico grave de peixe. Este bactéria também é importante devido a sua aspectos zoonóticos (Lima el at., 2008). E. tarda pode provocar doenças em muitos outros hospedeiros como répteis, mamíferos e aves, no homem pode causar gastroenterite e meningite (Pavanelli et al., 2008). No estado do Amazonas esta ocorrência é pioneira em espécies de matrinxã cultivados. E possivelmente deve-se ao fato dessa espécie fazer parte do ambiente aquático e acometer animais de sangue frio, quando os animais estão principalmente em situações de estresse (Pavanelli et al., 2008). A ocorrência de doenças é observada principalmente em temperaturas altas e está associada à poluição orgânica (Albinati et al. 2006). As espécies de Enterobacter, têm habitat em diversos ambientes, incluindo solo, plantas e água. As espécies E. asburiae e E. aerogenes são isoladas principalmente de amostras clínicas, causam principalmente infecções no trato respiratório de humanos, a significancia clínica desses patógenos ainda não é bem conhecida (Grimont e Grimont, 2005). As ocorrências de patogenias espécies em peixes por estas espécies ainda são pouco conhecidas, porém por serem bactérias com ambiente aquático podem ser patógenos oportunistas de espécies cultivadas. A espécie Kluyvera georgiana ocorreu em isolados de pirarucu e matrinxã, foram 7 isolados pertencentes a esta espécie. Sabe-se que K. georgiana assim como grande parte da família Enterobacteriaceae, é distribuida em diversos ambientes, incluindo solo e água (Farmer, 2006), também tem sido isolada de materiais clínicos, os primeiros relatos de infecções foram em 1980, mas apesar de causar infecções foi considerada como um organismo saprófita benigno que predominantemente colonizava principalmente o trato respiratório, urinário, ou trato gastrintestinal, atualmente raramente está associada com infecções clinicamente significativas em humanos (Sarria et al., 2001; Carter e Evans, 2005). Em peixes não há descrição de infecções significativas, por ter habitat típicamente aquático está presente em intestinos de caracóis, lesmas e outros moluscos (Muller et al., 1996). Registra neste trabalho o primeiro registro desta espécie acometendo peixes cultivados de água doce.

Foram identificados quatro isolados de Salmonella enterica com 99% de identidade. Bactérias do gênero Salmonella são causas de doenças em humanos e animais, através do consumo e da ingestão de alimentos contaminados (Shinohara et al., 2008). Em peixes, a descrição de mortes causadas pela espécie S. entérica sp.arizonae foram relatas pela primeira vez em culturas de pirarucus no Japão em 1982. Porém apesar desse fato, espécies de Salmonella não são consideradas como patógenos importantes em peixes (Austin e Austin, 2007). As espécies de Enterobacteriaceae identificadas: Enterobacter, Citrobacter, Hafnia alvei, Pantoea agglomerans, Citrobacter, K. pneumoniae, Edwardsiella tarda e Kluyvera georgiana, como verificado fazem parte do ambiente aquático, e geralmente entram no hospedeiro através do sistema digestivo ou lesões na pele e brânquias. Entretanto, quando ocorre algum desequilíbrio ambiental e os peixes são submetidos a alguma situação de estresse, estes microrganismos podem ocasionar infecções oportunistas, ocasionando a mortalidade em peixes e trazendo prejuízos consideráveis em sistemas de cultivos (Sarria et al., 2001; Austin e Austin 2007; Pavanelli et al., 2008). As espécies de Salmonella têm habitat limitado ao trato digestivo dos seres humanos e animais como aves. Assim, é determinante que a presença de Salmonella em outros habitats (água, alimentação, ambiente natural) possa ser explicado devido a contaminação fecal principalmente por aves (Wray e Wray, 2000).

Família Streptococcaceae

O percentual de ocorrência da família Streptococcaceae foi de 5,71%, com ocorrência de duas espécies de Lactococcus garvie e uma de Lactococcus lactis, em tambaqui e pirarucu respectivamente. Durante a última década, cocos Gram-positivos tornam-se importantes patógenos causadores de doenças em peixes. Isto inclui espécies de estreptococos, lactococcos e vagococcos (Bekker et al., 2011). O gênero Lactococcus é um grupo heterogênero de bactérias ácido lacticas (BAL) que têm a capacidade de converter carboidratos em ácido láctico (Teuber e Geis, 2006). É composto por sete espécies, porém L. lactis tem sido intensamente estudada, principalmente devido ao seu interesse na indústria de laticínios por: atuar na fermentação inicial do queijo, rápido crescimento e produção rápida de ácido láctico no leite, tornando-se um modelo excelente para pesquisas sobre metabolismo, fisiologia e genética. O nicho desta espécie inclui, plantas e superfícies e trato gastrointestinal de animais,

acredita-se que na superficie de plantas permanecem em estado de latência e multiplica-se no trato gastrointestinal de ruminantes após ser engolida (Teuber e Geis, 2006; Bolotin et al., 2001). A ocorrência de patogenias incluindo espécies da família Streptococcoceae foram descritas pela primeira vez em peixes no Japão, quando Kusuda et al. (1991), tentaram esclarecer o status taxonômico dos agentes causadores de streptococcicosis com 12 isolados a partir de truta-amarela (Austin e Austin, 2007). O gênero Lactococcus foi criado em 1985 para acomodar microrganismos que eram incluídos no gênero Streptococcus conhecidos como “estreptococos do grupo do ácido lático”, devido à capacidade de produzirem tal ácido a partir da fermentação de carboidratos (Teixeira et al., 2009). L. garvie é um agente patogênico zoonótico emergente, podendo ser isolado a partir de gado, várias espécies de peixes e seres humanos (Zlotkin et al., 1998).

Família Staphylococcaceae

A família Staphylococcacea teve ocorrência de 8,57%, foram identificadas três espécies, Staphylococcus aureus, S. pausteri e S. saprophyticus. O gênero Staphylococcus inclui 37 espécies. As populações naturais do gênero Staphylococcus são encontradas principalmente nas glândulas da pele e membranas mucosas de animais de sangue quente, podem ter uma gama de hospedeiros ou de nichos sendo de estreita ou ampla distribuição, dependendo particularmente da espécie ou das subespécies deste gênero, alguns organismos podem ser isolados de uma variedade de produtos animais ou de fontes ambientais como solo, água, poeira e ar, algumas espécies podem ser patógenos oportunistas de humanos e animais (Schleifer e Bell, 2009). S. aureus embora encontrado como relativa frequência como membro da microbiota normal do corpo humano (Gava et al., 2008; Teixeira et al., 2008), S. aureus é uma das mais importantes bactérias patogênicas, uma vez que atua como agente de uma gama de infecções. Pode ser encontrado em várias partes do corpo humano, como fossas nasais, garganta, trato intestinal e pele, produz várias toxinas que atuam através de diferentes mecanismos. Pode causar intoxições alimentares, uma vez que são causadas pela ingestão de alimentos contaminados, essas contaminações são provenientes de manuseio inadequado nos alimentos (Teixeira et al., 2008). Em peixes os primeiros relatos de infecções causadas pelo gênero Staphylococcus foram em 1982 e 1983, quando ocorreram mortalidades em culturas de carpa prateada, (Hypophthalmichthys molitrix) na Índia. Essas mortalidades foram associadas com

doença ocular, e verificados que a doença era causada por cocos Gram-positivos identificadas como S. aureus (Austin & Austin, 2007). A espécie S. pausteri é uma bactéria principalmente isolada de humanos, animais e alimentos, foi primeiramente descrita em Chesneau et al. (1993) (Schleifer e Bell, 2009), não é causadora de patogênias em peixes, em humanos é considerado um patógeno oportunista(Schleifer e Bell, 2009). S. saprophyticus assim como diversos membros de Staphylococcus, é um habitante comum da flora normal da pele e da região periuretral de homens e mulheres, depois de E. coli é o agente mais comum de infecções urinárias em mulheres. A patogenicidade está relacionada à sua capacidade de aderir às células do epitélio urinário (Milagres e Melles, 1992; Bueris et al., 2008). Espécies de Staphylococcus podem surgir em peixes como conseqüência direta da manipulação inadequada, uma vez que a maioria das espécies representam bactérias de origem humana (Galvão et al., 2006).

Famílias Enterococcacea, Flavobacteriaceae, Microbacteriaceae, Moraxellaceae e Paenibacillaceae.

Estas famílias apresentaram percentual de 2,86% do total de famílias identificadas respectivamente, com ocorrência de uma espécie representante de cada família. A espécie indetificada em PPUFAM 44 representante da família Enterococcaceae foi Enterococcus raffinosus. Fazem parte de Enterococcaceae quatro gêneros bacterianos incluindo Enterococcus. Este gênero anteriormente nomeado de Streptococcus, foi reclassificado a partir de resultados observados em hibridação DNA-DNA mostrando a diferença entre gêneros. Subsequentemente estudos com 16S rRNA não só confirmaram esta afirmação como também demonstraram a diferença entre Enterococcus e o gênero Lactococcus e também outros cocos Gram-positivos (Hardie e Whiley, 1997; Svec e Dvriese, 2009). E. raffinosus é uma bactéria Gram-positiva, com formato celular de coco ovóide ocorrendo em cadeias, muitas espécies do gênero Enterococcus são comensais do aparelho aparelho digestivo (intestino) e urinário de mamíferos e pássaros, outras são isoladas de plantas e de água como E. raffinosus, são bactérias tolerantes em condições ambientais diversas, incluindo temperaturas extremas e altas concentrações salinas (Hardie e Whiley, 1997; Svec e Devriese, 2009). A ocorrência do gênero em ambientes aquáticos e trato intestinal de aves explica a ocorrência desta Enterococcus raffinosus em pirarucu cultivado.

A família Flavobacteriaceae inclui muitas espécies marinhas que se agrupam em uma árvore filogenética da sequência gênica 16S rRNA formando um "clado marinho" bem definido (Bowman e Nichols, 2005). A espécie Myroides odoratimus anteriormente conhecida como Flavobacterium odoratum, é uma bactéria Gram-negativa que tem sido comumente isolada a partir de urina humana, fezes e sangue (Motwani et al., 2004). Gêneros da família Flavobacteriaceae como Flavobacterium são organismos amplamente distribuídas no solo e habitats de água doce, e alguns são considerados patogênicos para peixes. Por sequeciamento do gene 16S rRNA foi verificado que Myroides odoratimus agrupa-se independentemente das demais espécies, não possuindo estas características típicas do gênero por isso ocorreu a reclassificação deste grupo (Vancanneyt et al., 1996). Atualmente não há registros desta espécie causadora de patogenias em peixes. Nesta dissertação destaca-se o primeiro registro desta espécie ocorrendo em sistemas de cultivo de pirarucu no estado do Amazonas. Da família Microbacteriaceae foram identificadas duas espécies de Microbacterium terrae, as sequências dos isolados apresentaram 97% de similaridade com esta espécie. Esta espécie foi redefinida em 1998, anteriormente nomeada Aureobacterium terrae, passou a ser Microbacterium terrae (Takeuchi e Hatano, 1998a). A família Microbacteriaceae foi criada baseada em sequências de 5S rRNA para agrupar bactérias com alto padrão de G+C. As bactérias deste grupo variam em morfologia celular, estendendo de formas cocoides, pequenas bacilos irregulares para fragmentar em hifas ramificadas. Estão distribuídos em vários ecossistemas terrestres e aquáticos e pode ser associada com plantas, fungos, animais e amostras clínicas (Evtushenko e Takeuchi, 2006; Stackebrandt et al., 2007). A espécie M. terrae está comumente associada ao solo e ambientes aquáticos (Takeuchi e Hatano, 1998b). Não há qualquer evidência desta bactéria causadora de doenças em peixes, uma vez que presente na água podem ocasionalmente tornar-se hospedeira em peixes. Na família Moraxellaceae os isolados PPUFAM 246; 262 e 263 foram identificados como Acinetobacter calcoaceticus, esta bactéria foi originalmente isolada a partir de águas residuais industriais na China sendo evidenciada sua capacidade para usar fenol como a única fonte de carbono, teve seu genoma sequenciado devido sua importância para biorremediação de águas com poluentes fenólicos e também pela suas relações filogenéticas com a espécies patogenica humana A. baumannii (Zahn et al., 2011). Os membros de Acinetobacter são comumente encontrados no solo, água e isolados de materia clínicos (Zahn et al.,2011). A. calcoaceticus é comum da microbiota normal da pele e da garganta de seres humanos.

Juntamente com outros saprófitas, é considerada uma bactéria não patogênica em seres humanos e em animais (Pal e Kale, 1981). Porém sabe-se que as bactérias saprófitas são responsáveis por infecções secundárias ou oportunistas, quando os peixes estão debilitados pelo estresse ou por alguma enfermidade prévia, especialmente quando há solução de continuidade (Albinati et al. 2006). Acinetobacter spp. estão associadas à doenças ulcerativas e hemorragias em peixes (Austin e Austin, 2007). Paenibacillus sp. foi identificada nos isolado PPUFAM 234 presente em tambaqui. As espécies da família Paeniacillaceae são comumentes isoladas do solo, raizes, sangue e outras fontes (Vos et al., 2009), o gênero Paenibacillus, é amplamente distribuído no ambiente, sendo encontrado em diferentes tipos de solos, rizosfera, tecidos internos de diversas plantas, água, sedimentos marinhos (Maheshawari, 2010). Esta bactéria não está associada com doenças em peixes.

6.1.3- Análises filogenéticas dos isolados bacterianos

As análises filogenéticas foram realizadas para auxiliar na correta identificação e posicionamento dos isolados bacterianos estudados nas respectivas famílias e foram feitas a partir das sequências parciais de regiões conservadas e variáveis do 16S rRNA, como recomendado por vários autores (Woese 1987; Weisburg et al.,1991; Clarrige, 2004) A árvore filogenética das espécies e os grupos das famílias bacterianas identificadas com as respectivas sequências padrões obtidas no banco de dados RDP demonstra que os isolados PPUFAM 34, 275, 46, 284, 239, 74, 276, 13, 273, 274, 45 e 252 fazem parte da família Enterobacteriaceae, constituída por gêneros claramente polifiléticos. Neste grupo, os isolados PPUFAM 34, 284, 239, 13, 273, 45 e 252 agruparam-se com as estirpes de referência classificadas como E. coli, Enterobacter asburiae, Edwardisiella tarda, Enterobacter aerogenes, Kluyvera georgiana, Hafnia alvei e Plesiomonas shigelloides, respectivamente. Os valores de bootstrap representados em cada nó da árvore indicam que o valor de confiança dos agrupamentos é significativo, (Hillis e Bull, 1993), exceto nos isolados PPUFAM 13, 239, 273, 276, que ficaram abaixo de 60. Na família Enterobacteriaceae o gênero mais complexo é Enterobacter visto que sua taxonomia gera muitas controvérsias e está constantemente em revisão (Janda e Abbott, 2006). Deste gênero foram identificadas três espécies: E. asburiae (PPUFAM 284), E. aerogenes (PPUFAM 13) e Enterobacter sp. (PPUFAM 274).

E. asburiae formou um clado com Pantoea agglomerans. Esta espécie anteriormente era denominada E. agglomerans. Este agrupamento entre estes gêneros já são esperados, visto que possuem parentesco próximo (Gavini et al., 1989;Grimont e Grimont, 2005; Janda e Abbott, 2006). E. aerogenes e Enterobacter sp. agrupou-se com Kluyvera georgiana. A espécie E. aerogenes ainda tem uma posição taxonômica incerta (Grimont e Grimont, 2005). A ocorrência de membros do gênero Enterobacter associados com outros gêneros da família Enterobacteriaceae são comuns (Parvan et al., 2005). O gênero Enterobacter forma um grupo claramente polifilético, ou seja, consiste de espécies que descendem de dois ou mais ancestrais (Francino e Ochman, 2006), o que indica que Enterobacter precisa passar por uma extensiva revisão taxonômica para classificação de espécies deste gênero (Parvan et al., 2005). Isto pode ser observado na topologia de nossa árvore e é reforçado com a observação de agrupamentos polifiléticos que incluem espécies de Enterobacter, Klebsiella e Kluyvera (Paradis et al., 2005; Grimont e Grimont, 2005, Parvan et al., 2005; Francino e Ochman, 2006; Janda e Abbott, 2006). A abordagem filogenética usando sequência do gene 16S rRNA não fornecem resoluções suficientes quando espécies estreitamente relacionadas da família Enterobacteriaceae são estudadas, as ramificação são muitas vezes pouco confiáveis (Grimont e Grimont, 2005). Na família Bacillaceae a observação do grupamento irmão entre a espécie Lysinibacillus fusiformis (PPUAM 25) e a família Paenibacillaceae demostra a relativa semelhança genética entre estas famílias. O gênero Paenibacillus anteriormente estava classificado na família Bacillaceae. Em 1993, Ash et al. com base em análises filogenéticas do gene 16SrRNA, verificaram a formação monofilética desse gênero, quando agrupado com outras espécies de Bacillus, devido a isto propuseram a criação do gênero Paenibacillus para agrupar espécies até então classificadas como Bacillus (Fergust, 2009; Vos et al., 2009). Apesar da verificação da formação de grupo irmão com Lysinibacillus, o grupo formado por Paenibacillus (PPUFAM 234 e Paenibacillus cookii (T)), mostra-se claramente um grupo monofilético como proposto por Ash et al. (1993). A formação de um grupamento monofilético envolvendo amostras de espécie Bacillus pumilus já são descritas. B. pumillus faz parte do grupo 1 de B.subtilis (B. subitilis, B. pumilus e B. amyloliquefaciens) agrupando-se separadamente das demais espécies de Bacillus (Parvathi et al.,2009; Porwal et al., 2009; Vos et al.,2009) apenas formando grupamento irmão com Bacillus aquimaris (Yoon, 2003), esta concordância também foi evidenciada pela análise topológica da árvore filogenética descrita nesse trabalho (Figura 07).

A formação de grupamento monofilético também foi verificada entre B. aquimaris e Bacillus sp.1 (PPUFAM 282), cabendo destacar que Bacillus sp.1 (PPUFAM 282), possui característcas filogenéticas semelhantes à B. aquimaris, porém sendo de diferente espécie, não sendo possível sua definição por análises fenotípicas, moleculares e filogenéticas. O grupo formado por Bacillus cereus formou clado monofilético com PPUFAM 285 (Bacillus sp.2) e formou grupo irmão com todas as espécies não definidas de Bacillus sp. Podemos destacar que o gênero Bacillus é um grupo muito complexo e que consequentemente espécies deste grupo estão sendo redefinidas, muitas vezes a caracterização de Bacillus através do gene 16S rRNA são incertas (Xu e Cotè, 2003; Porwal et al., 2009; Logan e Vos, 2009; Schmidt et al., 2011). Apesar da diferenciação de espécies através do gene 16S rRNA muitas vezes ser rápida e informativa para definir espécies, espécies estreitamente relacionadas como B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis que possuem altos níveis de similaridade entre sequências do gene 16SrRNA, com até 99% identidade entre estas espécies, são complexas nesta identicação (Mohamed et al., 2007). O gênero Bacillus é classificado em seis grupos filogenéticos (Freitas et al., 2008; Vos et al., 2009). O grupo formado por B. cereus inclui as espécies (B. anthracis, B. cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides e Bacillus weihenstephanensis) (Freitas et al., 2008; Logan e Vos, 2009; Schmidt et al., 2011). Podemos destacar que os isolados bacterianos definidos como Bacillus sp., podem fazer parte do grupo de B. cereus, e que possivelmente através do sequenciamento total do gene 16SrRNA estas espécies podem ser definidas. Na família Staphylococcaceae a observação do grupamento monofilético e a separação das espécies S. saprophyticus e S. pasteuri, de S. aureus já são estabelecidas filogenéticamente (Schleifer e Bell, 2009). No grupo de famílias VI e VII de Enterococcaceae e Streptococcaceae, respectivamente, a observação de um clado monofilético, demostra como estas famílias estão relacionandas geneticamente. Embora muitos trabalhos demonstrem a formação de um grupamento monofilético para estas famílias, suas espécies são bem separadas filogenéticamente (Hardie e Whiley, 1997; Svec e Devriese, 2009). Através da análise filogenética conseguimos determinar com maior clareza o agrupamento filogenético dos isolados bacterianos e com isto determinamos que o sequenciamento mesmo que parcial do gene 16S rRNA foi uma importante ferramenta para construção da filogenia da maior parte dos grupos bacterianos identificados.

6.1.4- Identificações gerais dos isolados bacterianos

As abordagens fenotípicas e moleculares permitiram definir a taxonomia dos 72 isolados estudados. A partir das caracterizações fenotípicas os isolados bacterianos estudados foram classificados em 12 espécies bacterianas distribuídas em cinco famílias. Nas análises moleculares foram classificados em 31 espécies em nove famílias bacterianas, na árvore filogenética (Figura 07) podem ser observados estes táxons e o agrupamento das famílias bacterianas estudadas. O sequenciamento e a classificação filogenética bacteriana a partir do gene 16S rRNA permitiu definir a taxonomia definitiva dos isolados, auxiliando dessa forma, a identificação fenotípica. Com isto podemos observar que os testes moleculares e as construções evolutivas são importantes para corroborar com análises fenotípicas que por vezes não são suficientes para determinação de espécies bacterianas, sendo, no entanto mais confiáveis para essa determinação (Young, 2001; Kampfer e Glaeser, 2012). Utilizando estas abordagens foram obtidos resultados para definição de espécies que não foram obtidos por métodos fenotípicos. A partir de caracteríticas fenotípicas alguns resultados obtidos foram divergentes das análises moleculares. As espécies da família Vibrionaceae identificadas no gênero Aeromonas por testes fenotípicos, foram identificadas, por análises moleculares do sequenciamento da região parcial do gene 16S rRNA como pertencente à família Enterobacteriaceae da espécie Kluyvera georgina, com 97 e 98%, as características bioquímicas observadas para determinação do gênero Aeromonas nos isolados estudados não foram compatíveis com as descrições literárias para o gênero Kluyvera, principalmente pelo isolado apresentar reação oxidase positiva, esta reação é negativa em todas as espécies descritas de Kluyvera e em todos os membros da família Enterobacteriaceae (Müller et al., 1996; Janda e Abbott, 2006; Martinez e Trabulsi, 2008). De acordo com este resultado observado pode-se definir duas hipóteses: 1- o resultado obtido no teste de oxidase pode ser falso positivo; 2- o isolado bacteriano pode apresentar metabolismo distinto das demais espécies de Kluyvera georgiana descritas. O gênero Kluyvera foi descrito por Kluver e van Niel em 1936 e Asai et al.(1956), porém estudos moleculares com esta espécie só foram realizados por Farmer et al. em 1981 (Farmer et al., 1981; Carter e Evans, 2005; Janda e Abbott, 2006) as principais espécies conhecidas são K. ascorbata, K. cryocrescens, K. cochleae e K. georgiana (Farmer et al., 1981, Müller et al., 1996). São geralmente encontradas no solo, água, amostras clínicas e frequente e abundantemente nos intestinos de caracóis, lesmas, e outros moluscos (Müller et 78

al., 1996; Janda e Abbott, 2006). Devido a algumas características comuns com Aeromonas, Kluyvera foi primeiramente classificada no gênero Aeromonas, e em 1956 Asai et al. propuseram o gênero Kluyvera, mas por apresentar reação fermentativa como Aeromonas ambos gêneros permaneceram classificados na mesma tribo (Farmer et al., 1981). Em 1981 Farmer et al., classificaram o gênero Kluyvera na família Enterobacteriaceae. Kluyvera tem habitat em diversos ambientes como solo e ambiente aquáticos. Porém, apesar de presente em ambientes aquáticos, não há descrições de impactos causados como pátogenos emergentes em peixes. Alguns resultados obtidos nos testes fenotípicos também foram divergentes dos dados moleculares no grupo de Enterobacteriaceae tais diferenças ocorreram, nos isolado PPUFAM 46 e PPUFAM 258. O isolado PPUFAM 46 embora similar fenotipicamente com Salmonella, obteve 93% de similaridade com a espécie Pantoea agglomerans; apesar do percentual de identidade ser considerado baixo para definição de espécies (Brenner et al., 2005). Em PPUFAM 258 identificado como Shigella, obteve identidade de 99% com Edwardisiella tarda, PPUFAM 271 identificado como Citrobacter sp., obteve 98% de similaridade com a espécies E. tarda e o isolado PPUFAM 273 fenotipicamente Enterobacter sp. obteve identidade de 98% com Kluyvera georgiana, as relações entre algumas espécies de Kluyvera e Enterobacter já foram descritas (Pavan et al., 2005), isto no entanto pode justificar tais semelhanças fenotípicas. Nas abordagens fenotípicas, moleculares e filogenéticas a família Bacillaceae mostrou-se mais heterogenea das famílias identificadas. Devido a verificação desta complexidade vários autores sugerem que determinação taxonômica atual de muitos membros da Bacillaceae devem ser reconsideradas (Schmidt et al., 2011; Logan e Vos, 2009) Nos testes fenotípicos foram observadas variações nos resultados obtidos e baixa resolução para distinguir espécies do gênero Bacillus e diferenciar este gênero de espécies das famílias Paenibacillaceae e Microbacteriaceae, as quais apresentam reações fenotípicas semelhantes com as principais características que definem espécies do grupo Bacillus. O gênero Bacillus é considerado um grupo altamente heterogêneo de bactérias Gram- positivas o que gera muita complexidade em sua classificação taxonômica, com recentes estudos da sistemática bacteriana muitas espécies desse grupo foram reclassificadas, principalmente com uso do gene completo 16S rRNA (Yoon et al., 2003; Logan e Vos, 2009;

Schmidt et al., 2011), porém devido a elevada variabilidade genética muitas espécies de Bacillus continuam sem classificações (Logan e Vos, 2009). Nos testes fenotípicos o gênero Lysinibacillus, foi classificado como Bacillus sp. por apresentar características comuns à Bacillus. Lysinibacillus inclui espécies de pequenos bacilos Gram-positivos que apresentam oxidase e catalase positivos (Ahmed et al., 2007). O gênero Lysinibacillus inicialmente nomeado como Bacillus, foi criado para agrupar bactérias que apresentavam características distintas de outras espécies do grupo Bacillus, classificado por Ahmed et al. em 2007 (Ahmed et al. 2007; Josic et al., 2008). A espécie L. fusiformis identificada nos isolados analisados neste trabalho, apesar de pertencer ao ambiente aquático não há registro como causadoras de patogenias em peixes. Os isolados PPUFAM 54 e PPUFAm 63 embora fenotipicamente semelhante à B. cereus, não obtiveram percentual de identidade compatível com B. cereus sendo agrupados no grupo de Bacillus sp. Somente o isolado PPUFAM 51, identificado como Bacillus sp. nos testes fenotípicos, apresentou 97% de identidade com B. cereus. O isolado PPUFAM 234 também foi fenotipicamente identificado com Bacillus sp., porém por caracterização molecular foi 99% semelhante com a espécie Paenibacillus sp. O gênero Paenibacillus foi transferido de Bacillus por Ash et al.(1994), formando um novo gênero com mais de 80 espécies, alguns membros deste gênero estão associados com patogenicidade em humanos, animais e tamém em insetos, o habitat natural inclui o solo com ocorrência de algumas espécies fixadoras de nitrogênio (Priest, 2009). No sequenciamento da região parcial do 16S rRNA os isolados PPUFAM 58, 59, 63, 64, 233, 282 e 285 foram identificados como Bacillus sp. e através de comparações na ferramenta Blast com várias espécies do gênero, os isolados obtiveram baixa identidade com espécies de Bacillus conhecidas, alguns com maior proxidade a Bacillus cereus, porém com percentual abaixo de 95%, isto já é esperado em decorrência da complexidade do gênero (Logan e Vos, 2009). A espécie Microbacterium terrae identificada em PPFAM 22 e PPUFAM 229 também foram similares em reações fenotípicas com Bacillus como, por exemplo, por agrupar pequenos bacilos Gram-positivos. O gênero Microbacterium foi descrito em 1919 por Orla- Jensen, e corrigido por Collins et al. em 1983, agrupa seis espécies (Takeuchi e Hatano, 1998a) que estão dispersas em ecossistemas aquáticos e terrestres e podem estar associados com plantas, fungos, animais e espécimes clínicas (Evtushenko e Takeuchi, 2006).

Na família Streptococcaceae, as caracterizações fenotípicas também não foram suficientes para definição de espécies. Isto pode ser verficado nos isolados PPUFAM 52, 250 e 251, caracterizados fenotipicamente como Streptococcus spp., foram identificados nas análises moleculares nas espécies L. lactis e L. garviae, respectivamente, com 98% de identidade. O gênero Lactococcus foi criado em 1985 para acomodar microrganismos até então incluídos no gênero Streptococcus e que eram conhecidos como “estreptococos do grupo do ácido lático”, devido à capacidade de produzirem tal ácido a partir da fermentação de carboidratos (Teixeira et al., 2009). PPUFAM 250 e 251 foram identicados como L. garviae, esta espécie um dos principais cocos Gram-positivos patogênicos para peixes (Eldar et al., 1999). As classificações fenotípicas realizados foram suficientes para caracterização da maior parte das famílias bacterianas, no entanto algumas contradições foram evidenciadas, devido a reclassificações de gêneros e espécies bacterianas. Por isso as abordagens moleculares e filogenéticas foram importantes para corroborarem na definição final de espécies bacterianas que não foram confirmadas por testes fenotípicos. Esse conjunto de abordagens fenotípicas, moleculares de filogenéticas, cada vez mais estão sendo consideradas para classificação de microrganismos. Muitos autores sugerem que os métodos de taxonomia bacteriana devem passar intensas reformulações, substituindo a taxonomia monofásica (baseada em uma ou poucas características) pela taxonomia polifásica, em que vários critérios fenotípicos, genéticos e evolutivos são combinados para melhor classificação de espécies (Vandamme, 1996; Young, 2001). Dentre os isolados identificados foi possível identificar e inferir filogenia em muitas espécies causadoras de patogênias em peixes, sendo algumas importantes patógenos emergentes em cultivos em todo o mundo.

6.1.5- Espécies identificadas patogênicas em peixes

Peixes cultivados em sistemas de aquicultura são continuamente expostos aos agentes patogênicos presentes na água, solo, ar. Os peixes são enfraquecidos por condições de estresse, incluindo aumento da densidade de peixes e água de má qualidade, ferimentos durante o manuseio, alimentação inadequada, falta de saneamento e aumento da temperatura da água (Bekker et al., 2011). Muitas espécies identificadas nos isolados estudados são descritas por Austin e Austin (2007) como causadoras de patogenias em peixes, como:

Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Pantoea agglomerans, Plesiomonas shigelloides, Salmonella entérica e espécies da família Enterococcaceae, como Enterococcus sp. Porém os principais patógenos causadores de perdas em sistemas de cultivo são Edwardsiella tarda, Hafnia alvei e Lactococcus garviae. A espécie Edwardsiella tarda foi descrita por Erwin et al. (1965) (Erwin et al., 1965; Evans et al., 2006), é caracterizada por ser um curto bacilo Gram-negativo, móvel da família Enterobacteriaceae, E.tarda é comumente isolada de uma variedade de espécies de peixes, répteis, anfíbios, pássaros e mamíferos, habita também em invertebrados aquáticos, como o caracol de água doce e ouriço do mar, podendo qualquer um destes hospedeiros servir como um reservatório para infecções em peixes (Evans et al., 2006; Austin e Austin, 2007; Castro et al., 2012). Em anos recentes tem sido a causa de sérios impactos na cultura de peixes em muitos países (Castro et al., 2012). Os sinais clínicos de infecções por E. tarda, pode diferir nos peixes de espécie para espécie (Lima et al., 2008), porém os principais sinais provocados por esta espécie são: septicemia com lesões cutâneas extensas, afeta órgãos internos e leva a perdas extensas tanto na aquicultura de água doce quanto na marinha. Tem sido relatada em seres humanos como a causa de infecções como gastroenterite, principalmente entre os indivíduos com comprometimento do sistema imune (Austin e Austin, 2007; Lan et al., 2008). Em peixes algumas descrições sugerem que as infecções ocorrem principalmente em águas com temperaturas quentes (Pavanelli et al., 2002; Castro et al., 2012), especialmente quando há grande quantidade de matéria orgânica na água e os hospedeiros estão em situação de estresse, considera-se que pode atingir todos os peixes de água quente, provoca septicemias em peixes, causando pequenas lesões cutâneas que podem originar abscessos de maiores dimensões nos músculos laterais e na cauda (Pavanelli et al., 2002). No entanto, não está claro se E. tarda é um patógeno primário ou oportunista em peixes (Austin e Austin, 2007). A espécie Hafnia alvei faz parte dos mais de 40 gêneros componentes da família Enterobacteriaceae, com formato de pequena célula cocóides ou bacilos ligeiramente alongados (Janda e Abbott, 2006; Austin e Austin, 2007). Esta bactéria é comumente isolada de solo, água, esgoto, mamíferos, aves, répteis e peixes (Austin e Austin, 2007). Está associada a uma série de patogenias em animais, em peixes foi descrita como causa de septicemias hemorrágica em truta arco-íris na Bulgaria. A doença apareceu em peixes após o transporte ou durante o cultivo em condições inadequadas, e salmão em fazendas de cultivo

japonesas. Os principais sintomas foram melanose, abdômen inchado e nadeiras lentas (Janda e Abbott, 2006; Austin e Austin, 2007). Lactococcus garviae é considerado um problema sério na cultura de espécies de peixes marinhos e de água doce, tais como a truta amarela (Seriola quinqueradiata) no Japão e truta arco-íris (Onchorynchus mykiss) na Europa e Austrália (Eldar et al., 1999). Na Espanha, esta doença tem aparecido em fazendas de truta arco-íris desde 1991 e atualmente é considerado um dos fatores de risco mais importante na indústria de trutas durante os meses de verão. No Brasil a primeira identificação e caracterização de L. garvieae, foi feita por Evans et al. em 2009, isoladas a partir de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) e pintado (Pseudoplathystoma corruscans). Cepas de L. garvieae também já foram isolados de seres humanos, e recentemente de camarões doentes de água doce (Macrobrachium rosembergii), em Taiwan. Todos esses fatos indicam a importância crescente de L. garvieae no cultivo de peixes (Eldar et al., 1999). A utilização a região gênica 16S rRNA, permitiu a identificação de bactérias patogênicas em peixes ainda não descritas nesse ambiente e a presença de bactérias não conhecidas. Os resultados obtidos neste trabalho ampliaram o conhecimento sobre a variedade de microrganismos amazônicos e deverá guiar futuros estudos acerca dos microrganismos causadores de patogenias em peixes.

7- Conclusões

1- As análises fenotípicas proporcionaram a caracterização de 7 famílias, 11 gêneros e 06 espécies isoladas do fígado, baço e rim de Arapaima gigas (pirarucu), Colossoma macropomum (tambaqui) e Brycon amazonicus (matrinxã), acometidos de patologia em estações de piscicultura. Contudo dos 72 isolados não foi possível identificar até o nível de espécie 92% dos isolados.

2- As análises moleculares proporcionaram a caracterização de 9 famílias, 18 gêneros e 24 espécies isoladas do fígado, baço e rim de Arapaima gigas (pirarucu), Colossoma macropomum (tambaqui) e Brycon amazonicus (matrinxã), acometidos de patologia em estações de piscicultura. Contudo dos 72 isolados não foi possível identificar até o nível de espécie 15% dos isolados.

3- As análises fenotípicas e moleculares mostraram-se totalmente divergentes quanto a eficiência na identificação taxonômica do patógeno bacteriano, pois, a primeira identificou 8% e a segunda 85% dos isolados.

4- A reconstrução filogenética obtida com o gene 16S rRNA proporcionou um resultado similar com a literatura disponível corroborando em alguns casos polifilia (ex., Bacillaceae) e uma riqueza específica bacteriana ainda não descrita até o nível de espécie.

5- Além do ineditismo da abordagem conjunta (fenotípica e molecular) de epizootias em peixes de cultivo do Amazonas destaca-se o registro de espécies bacterianas até então não isoladas em peixes (p. ex., Kluyvera georgiana, Acinetobacter calcoacetucus, Myroides odoratus).

8- Referências

Abbott, Sharon L.; Janda, J. Michael. 2006. The Genus Edwardsiella. In: Dworkin Martin; Falkon, Stanley; Rosenberg, Eugene; Schleifer, Karl-Heiz; Stackebrandt, Erko. (Eds). The Prokaryotes: A Handbook on the Biology of Bacteria: Proteobacteria: Gamma Subclass New York: USA: Springer-Verlag. p. 72-89.

Ahmed, Iftikhar; Yokota, Akira; Yamazoe, Atsushi; Fujiwara, Toru. 2007. Proposal of Lysinibaci llus boronitolerans gen. nov. sp. nov., and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus fusiformis comb. nov. and Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 57:1117- 1125.

Albinati, A. C. L.; Albinati, R. C. B.; Oliveira, E. M. D.; Laborda, S. S.; Vidal, L. V. O. 2006. Edwardsielose em Tilápias do Nilo (Oreochromis Niloticus). Revista Brasileira de Saúde Produção Animal, 7(2):164-168.

Alexandrino, Agar Costa; Okumura, Maria Paula Martinez; Baldassi, Lúcia; Tabata, Yara Aiko; Pauli, André Otávio Santiago de; Araujo; Ana Paula de; Rosa, Marcelo Bignardi. 1998. Ocorrência de infecção por Edwardsiella tarda em truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) em cultivo intensivo. Boletim do Instituto de Pesca, São Paulo, 25: 121-123.

Alterthum, Flávio. 2008. Morfologia e Estrutura da Célula Bacteriana. In: Trabulsi, Luiz Rachid; Alterthum, F. (Eds). Microbiologia. Atheneu, São Paulo. p. 7-19.

Araujo-Lima, C.A.R.M.; Goulding, M. 1998. Os frutos do Tambaqui: ecologia, conservação e cultivo na Amazônia. Sociedade Civil Mamirauá/ CNPq. 186.

Austin, B.; Austin, A. 2007. Bacterial Fish Pathogens Disease of Farmed and Wild Fish. Ellis Horwood, Chichester, UK, (4): 196-224.

Ash, Carol; Priest, Fergus G.; Collins, M. David. 2003. Molecular identification of rRNA group 3 bacilli (Ash, Farrow, Wallbranks and Collins) using PCR probetest. Antoniae van Leeuwenhoek, 64:253-260.

Bando, Silvia Yumi. 2008. Taxonomia Bacteriana. In: Trabulsi, Luiz Rachid, Alterthum, F. Microbiologia. Atheneu, São Paulo. p. 51-55. 85

Barja, J.L.; Esteves, A.T. 1988. Patologia en acuicultura. Espanha: Caicyt, 550 pp

Barthem, Ronaldo; Goulding, Michael. 2007. Um ecossistema inesperado. A Amazônia revelada pela pesca. Peru: Amazon Conservation Association, ACA, Civil Society Mamirauá. 241pp.

Bekker, A.; Hugo, C.; Albertyn, J.; Boucher, C.E.; Bragg, R.R. 2011. Pathogenic Gram- positive cocci in South African rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Journal of Fish Diseases, 34:483-487.

Bekker, A.; Hugo, C; Albertyn, J.; Boucherand, C. E.; Bragg, R. R. 2011. Pathogenic Gram- positive cocci in South African rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Journal of Fish Diseases, 34: 483-487.

Benner, Ronald; Opsahl, Stephen; Chin-Leo, Gerardo. 1995. Bacterial carbon metabolism in the Amazon River system. Lyminology and Oceanography. 40(7): 1262-1270.

BLASTN. National Center for Biotecnology Information (NCBI). (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.). Acesso: 20/10/2011.

Boijink, Cheila de Lima; Brandão, Deodoro Atlante. 2004. Avaliação da inoculação de suspensões bacterianas de Aeromonas hydrophyla, em juvenis de jundiá, Rhamdia quelen (Teleostei, Pimelodidae). Biodiversidade Pampeana. PUCRS, Uruguaiana. 2:3-8 pp.

Bolotin, Alexander; Wincker, Patrick; Mauger, Stéphane; et al. 2001. The Complete Genome Sequence of the Lactic Acid Bacterium lactis ssp. Lactococcus lactis spp. lactis IL1403. Genome Reseach, 11: 731-753.

Borneman, James; Triplett, Eric W. 1997. Molecular Microbial Diversity in Soils from Eastern Amazonia: Evidence for Unusual Microorganisms and Microbial Population Shifts Associated with Deforestation. Brock Institute for Environmental Microbiology and the Department of Agronomy, University of Wisconsin-Madison, Madison. 63: 2647-2653 pp.

Brenner, Don J.; Staley, James T.; Krieg, Noel R.2005. Classiﬁcation of Procaryotic Organisms and the Concept of Bacterial Speciation. In: Garrity, George. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology-The Proteobacteria Vol. 2.p. 27-32.

Brisse, Sylvain; Grimont, Francine; Grimont, Patrick A.D. 2006. The Genus Klebsiella. In: Dworkin Martin; Falkon, Stanley; Rosenberg, Eugene; Schleifer, Karl-Heiz; Stackebrandt, Erko. (Eds). The Prokaryotes: A Handbook on the Biology of Bacteria: Proteobacteria: Gamma Subclass. New York: USA: Springer-Verlag. p. 159- 196.

Boot, E. Valerie; Mcdonal, Sheila. 1971. A new group of Enterobacteria, possibly a new Citrobacter sp. Journal of Medical Microbiology. 4 (3): 329-336.

Bowman; John P.; Nichols; David S. 2005. Novel members of the family Flavobacteriaceae from Antarctic maritime habitats including Subsaximicrobium wynnwilliamsii gen. nov., sp. nov., Subsaximicrobium saxinquilinus sp. nov., Subsaxibacter broadyi gen. nov., sp. nov., Lacinutrix copepodicola gen. nov., sp. nov., and novel species of the genera Bizionia, Gelidibacter and Gillisia. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 55:1471–1486.

Brown, L. 1993. Aquaculture for veterinarians: fish husbandry and medicine. Pergamon Press. New York. 447pp.

Buck, J. D. 1982. Nonstaining (KOH) Method for Determination of Gram Reactions of Marine Bacteria. Applied And Environmental Microbiology. 44(4): 992-993.

Buckup P.A, Menezes N.A, Ghazzi M.S. 2007. Catálogo das espécies de peixes de água doce do Brasil. Rio de Janeiro: Museu Nacional. 195 pp

Bueris, Vanessa; Moreira, Cristiano Gallina; Teixeira, Lúcia Martins; Santos, Katia Regina Netto dos; Trabulsi, Luiz Rachid. 2008. Staphylococcus epidermidis e outras espécies de Staphylococcus, Micrococcus e Rothia (Stomacoccus). In: Trabulsi, Luiz Rachid; Alterthum, F. (Eds). Microbiologia. Atheneu, São Paulo. p. 183- 187.

Campos, Leila Carvalho; Ferreira, Eliane de Oliveira; Silva, Deyse Christina Vallim da. 2008. In: Trabulsi, Luiz Rachid; Alterthum, F (Eds). Microbiologia. Atheneu, São Paulo. p.321- 327.

Camargo, Sabrina G. O. de1; Pouey, Juvêncio L. O. F. 2005. Aquicultura - Um mercado em expansão. Revista Brasileira de Agrociência. Pelotas, 11 (4): 393-396.

Cantelmo, O.A. 1989. Nutrição. In: Hernàndez, A.R (Ed.). Cultivo de Colossoma. Ed. Guadalupe, Bogotá, Colômbia. p.333-338.

Carraro. Dirce Maria; Kitajima. João Paulo. 2002. Estratégia para sequenciamento completo de genomas bacterianos. Ciência e Desenvolvimento, 28: 16-20.

Carter, J. Elliot; Evans, Tara N. 2005. Clinically Significant Kluyvera Infections-A Report of Seven Cases. American Society for Clinical Pathology,123:334-338.

Carvalho, Lucelia Nobre; Zuanon, Jansen; Sazima, Ivan. 2007. Natural History of Amazon Fishes. In: Claro, Kleber Del; Oliveira, Paulo S.; Rico-Gray,Victor; Ramirez,Alonso; Barbosa, Ana Angelica Almeida; Bonet, Arturo; Scarano, Fabio Rubio; et al. (Eds) Encyclopedia of Life Support Systems (EOLSS). International Commision on Tropical Biology and Natural Resources. Developed under the Auspices of the UNESCO, Eolss Publishers, Oxford, UK.p.1-32

Castagnolli, N.; Cyrino, J.E.P.1986. Piscicultura nos trópicos. Magnole, São Paulo, Brasil.152pp.

Castro, N.; Toranzo, A. E.; Devesa,S.; González, A.;Nuñez, S.; Magariños, B. 2012. First description of Edwardsiella tarda in Senegalese sole Solea senegalensis (Kaup). Journal of Fish Diseases, 35:79-82.

Cavero, Bruno Adan Sagratzki; Rubim, Maria Anete Leite; Pereira, Tiago Marinho. 2009. Criação comercial de tambaqui Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) in Tavares-Dias, Marcos (Ed). Manejo e Sanidade de Peixes em Cultivo. Embrapa Amapá. 723.

Chakravorty, Soumitesh; Helb, Danica; Burday, Michele; Connell, Nancy; Allan, David. 2007. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. Journal Microbiological Methods. 69 (2): 330–339.

Christensen, W. Blake. 1946. Urea decomposition as a means of differentiating Proteus and Paracolon cultures from each other and from Salmonella and Shigella types. Journal Bacteriology. 52: 461-466.

Clarridge, Jill E. 2004 Impact of 16S rRNA gene sequence Analysis for Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Clinical Microbiology Reviews. 17: 840-862 pp.

Costa, A.B. 2003. Caracterização de bactérias do complexo Aeromonas isoladas de peixes de água doce e sua atividade patogênica. Tese de Doutorado. Escola Superior de Agricultura “Luis de Queiroz”, Universidade de São Paulo. São Paulo.54 pp

Costa, A.B.; 2004. Estratégias para o estudo de bactérias potencialmente patogênicas na piscicultura. In: Cyrino, J.E; Urbinati, E.C.;Fracolossi, D.M.; Castognoli,N. (Eds). Tópicos especiais em piscicultura de água doce tropical intensiva. São Paulo, São Paulo.p. 387- 403.

Costa, Andrea Belém; Kanai, Kinya; Yoshikoshi, Kazuma. 1998. Serological Characterization of Atypical Strains of Edwardsiella tarda Isolated from Sea Breams. Fish Pathology. 33 (4), 265-274.

Eldar, A.; Goria, M.; Ghittino, M.; Zlotkin, Amir. 1999. Biodiversity of Lactococcus garvieae Strains Isolated from Fish in Europe, Asia, and Australia. Applied and Environmental Microbiology, p. 1005–1008.

Eler, Márcia Noélia; Millani, Thiago José. 2007. Métodos de estudos de sustentabilidade aplicados a aqüicultura. Revista Brasileira de Zootecnia. (36): 33-44.

EMBRAPA, Superintendência da Zona Franca de Manaus. 2003. Potencialidades- Estudo de Viabilidade Econômica. Piscicultura (8):16.

Evans, J.J.; Klesius, P H; C A Shoemaker. 2009. First isolation and characterization of Lactococcus garvieae from Brazilian Nile tilapia, Oreochromis niloticus (L.), and pintado, Pseudoplathystoma corruscans (Spix & Agassiz). Journal of Fish Diseases, 32:943-951.

Evans, Joyce; Klesius, Phillips H.; Plumb, John A.; Shoemaker, Craig A. 2006. Edwardsiella Septicaemias. In: Woo, Patrick T.K.; Bruno, David W. Fish Disease and Disorders. Vol.3. British Library, London. UK.p. 512-568.

Evtushenko, Lyudmila I.; Takeuschi, Mariko. 2006. The Family microbacteriaceae. In: Dworkin Martin; Falkon, Stanley; Rosenberg, Eugene; Schleifer, Karl-Heiz; Stackebrandt,

Erko. (Eds). The Prokaryotes: A Handbook on the Biology of Bacteria: Proteobacteria: Gamma Subclass. New York: USA: Springer. p.1020-1098.

Ewing, W. H.; McWhorter, A. C.; Escobar, M. R.; Lubin, A. H.1965. Edwardsiella, a new genus of Enterobacteriaceae based on a new species, E. tarda. International Bulletin of Bacteriological Nomenclature and Taxonomy, 15:33-38.

Falcão, J.P.; Gibotti, A.A.; Souza, R.A.; Campioni, F.; Falcão, D.P. 2007. Plesiomonas shigelloides: um enteropatógeno emergente?. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada. 28 (2): 141-15.

FAO. 2005-2012. National Aquaculture Sector Overview. Brazil. National Aquaculture Sector Overview Fact Sheets. Text by Suplicy, F.M. In: FAO Departamento de Pesca e da Aquicultura. Disponível em http://www.fao.org/fishery/countrysector/naso_brazil/en. Acesso: 23/02/2012.

FAO. 2010. Sector Overview National Aquaculture- Brazil. Texto de Suplicy, F.M. In: FAO Departamento de Pesca e da Aquicultura. Roma. Itália. Disponível em http://www.fao.org/fishery/countrysector/naso_brazil. Acesso: 20/11/2011

Farmer, J. J. III.; Fanning, G. R.; Huntley-Carter,G. P.; Holmes, Barry. 1981. Kluyvera, a New (Redefined) Genus in the Family Enterobacteriaceae: Identification of Kluyvera ascorbata sp.nov. and Kluyvera cryocrescens sp. nov. in Clinical Specimens. Journal of Clinical Microbiology, 13 (5): 919-933.

Ferreira, Aloísio Caetano, 2007. Modelo de Avaliação da Economia Hídrica de Reservatórios Hidrelétricos em Operação. Dissertação de Mestrado,Universidade Federal de Itajubá. 307 pp.

Ferreira, Eliane de Oliveira; Campos, Leila Carvalho. 2008. In: Trabulsi, Luiz Rachid ; Alterthum, F (Eds). Microbiologia. Atheneu, São Paulo. p.329-338.

Ferreira, Efrem J.G; Zuanon, Jansen A.S; Santos, Geraldo M. dos; 1998. Peixes comerciais do médio Amazonas: Região de Santarém, Pará. Brasília: Edições IBAMA.141 pp.

Figueiredo, Henrique César Pereira; Leal, Carlos Augusto Gomes. 2008. Tecnologias aplicadas em sanidade de peixes. Revista Brasileira de Zootecnia. Brazilian Journal of Animal Science. 37: 08-14.

Flournoy, D. J.; Wongpradit, S.; Silberg, S.L. 1990. Facilitating Identification of Lactose- Fermenting Enterobacteriaceae on MacConkey Agar. Proceeding of the Oklahoma Academy Science 70:5-8.

Francino, M.P.; Ochman, H. 2006. The Phylogeny of the Enterobacteriaceae Phylogenetic Relationships of Bacteria with Special Reference to Endosymbionts and Enteric Species. In: Dworkin Martin; Falkon, Stanley; Rosenberg, Eugene; Schleifer, Karl-Heiz; Stackebrandt, Erko. (Eds). The Prokaryotes: A Handbook on the Biology of Bacteria: Proteobacteria: Gamma Subclass. New York: USA: Springer-Verlag. p. 41-59.

Franzolin, Marcia Regina. 2008. Fundamentos da Identificação Bioquímica das Bactérias. In: Trabulsi, Luiz Rachid ; Alterthum, F (Eds). Microbiologia. Atheneu, São Paulo. p. 463- 476.

Frascá-Scorvo, Célia M. D.; Carneiro, Dalton José ; Malheiros, Euclides Braga. 2001. Comportamento alimentar do matrinxã (Brycon cephalus) no período de temperaturas mais baixas. Boletim do Instituto de Pesca, São Paulo, 27 (1): 1-5.

Freitas, Dulcecleide B; Reis, Mariana P.; Lima-Bittencourt, Cláudia I; Costa, Patrícia S.; Assis, Paulo S.; Chartone-Souza, Edmar; Nascimento Andréa MA. 2008. Genotypic and phenotypic diversity of Bacillus spp. isolated from steel plant waste. BMC Research Notes, 1(92):1-11.

Frerichs, G. Nicolas; Millar, Stuart D.; 2003. Manual for the Isolation & Identification of fish bacterial pathogens, Press in association and Institute of Aquaculture, University of Stirling, 60 pp.

Galhardo, Leonor; Oliveira. Rui. 2006. Bem-estar Animal: um Conceito Legítimo para Peixes?. Revista de Etologia. Instituto Superior de Psicologia Aplicada, Lisboa, Portugal, 8: 51-61.

Galvão, Juliana Antunes; Furlan, Érika Fabiane; Salán, Eduardo de O.; Porto, Ernani; Oetterer, Marília. 2006. Características Físico-Químicas e Microbiológicas 91

(Staphylococcus aureus e Bacillus cereus) da água e dos mexilhões cultivados na região de Ubatuba, Sp, Ciência e Agrotecnologia, 30(6) 1124-1129.

Gava, Altanir Jaime; Silva, Carlos Alberto Bento da; Frias, Jenifer Ribeiro Gava. 2008. Tecnologia de Alimentos Princípios e Aplicações. Nobel, São Paulo-SP. 664pp.

Gavini, Francoise; Mergaert, Joris; Amor, Bej I; Mielcarek, Christine; Izard, Daniel; Kersters, Karel; Ley, Jozef De. 1989. Transfer of Enterobacter agglomerans (Beijerinck 1888) Ewing and Fife 1972 to Pantoea gen. nov. as Pantoea agglornerans comb. nov. and Description of Pantoea dispersa sp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 337-345.

Gillis, Monique; Vandamme,Peter; Vos, Paul De; Swings, Jean; Kersters, Karel. 2001. Polyphasic Taxonomy. In: Garrity, George M.; Boone, David R.; Castenholz, Richard W. (Eds.). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. p. 43-48.

Gioia, Jason; Yerrapragada, Shailaja; Qin, Xiang; Jiang H, Igboeli OC; et.al. 2007. Paradoxical DNA Repair and Peroxide Resistance Gene Conservation in Bacillus pumilus. Plos One, 2(9): e928.

Godinho, Hugo Pereira, 2007. Estratégias reprodutivas de peixes aplicadas aquicultura: bases para o desenvolvimento de tecnologias de produção1. Revista Brasileira de Reprodução Animal, Belo Horizonte, (31): 351-360.

Goodwin, Andrew E.; Roy, J. Spencer; Jr, John M. Grizzle; Jr M. Terrell Goldsby. 1994. Bacillus mycoides: a bacterial pathogen of channel catfish. Diseases of Aquatic Organisms,18:173-179.

Gray, Michael W.; Sankoff, David; Cedergren, Robert J. 1984. On the evolutionary descent of o and organeUes: a global phylogeny based on a highly conserved structural core in small subunit ribosomal RNA. Nucleic Acids Reseach. 12 (14): 5837-5852.

Grimont, Patrick A. D.; Grimont, Francine. 2005. Genus XII. Enterobacter Hormaeche and Edwards 1960b, 72 Nom. Cons. Opin. 28. Jud. Comm. 1963,38. In Garrity, George Brenner, Don J.; Krieg, Noel R.; Staley, James R. (Eds.). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, The Proteobacteria, Part B: The Gammaproteobacteria. p 661-669.

Gurtler, Volker; Stanisich, Vilma A. 1996. New approaches to typing and identification of bacteria using the 16s-23s rDNA spacer region. Microbiology.142: 3-16.

Hall, T. A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/96/NT. Nucleic Acids Symposium Series, 41:95-98.

Hans E. Muller; Don J. Brenner; G. Richard Fanning; Patrick A. D. Grimont, Peter Kampfer. 1996. Emended Description of Buttiamella agrestis with Recognition of Six New Species of Buttiamella and Two New Species of Kluyvera: Buttiamella ferragutiae sp. nov., Buttiamella gaviniae sp. nov., Buttiamella brennerae sp. nov., Buttiamella izardii sp. nov., Buttiamella noackiae sp. nov., Buttiamella warmboldiae sp. nov., Kluyvera cochleae sp. nov., and Kluyvera georgiana sp. nov. InternationaL Journal of Systematic Bacteriology, 46: 50-63.

Hardie, J.M.; Whiley, R.A.1997. Classiﬁcation and overview of the genera Streptococcus and Enterococcus. Journal of Applied Microbiology Symposium Supplement, 83: 1S-11S.

Harvey, Brian J.; Hoar, William S.1979. Theory and practice of induced breeding in fish. IDRC, Ottawa, Ont. 48pp.

Hillis, David M.; Bull, James J. 1993. An Empirical Test of Bootstrapping as a Method for Assessing Confidence in Phylogenetic Analysis. Systematic Biology, 42 (2): 182-192.

Hobbs, B.C.; Roberts, D. 1999. Toxinfeções e Controle Higienico-sanitario de Alimentos. São Paulo: Varela. 376pp.

Hoyle, D. C.; Higgs, P. G. 2003. Factors Affecting the Errors in the Estimation of Evolutionary Distances Between Sequences. Molecular Biology Evolution, 20 (1):1-9.

Huang, Shih-Ling; Chen; Wei-Cheng; Shei; Mei-Chuan; Liao, I-Chiu; Chen; Shiu-Nan. 1999. Studies on Epizootiology and Pathogenicity of Staphylococcus epidermidis in Tilapia (Oreochromis spp.) Cultured in Taiwan. Zoological Studies 38(2): 178-188.

Janda, J. Michael; Abbott, Sharon L. 2006. The Enterobacteria. ASM Press ; Oxford. 411pp.

Josic, Dragana; Porobic, Milan; Milicevic, Mitra; Vukovic, Dragoslav; Pivic, Radmila; Zdravkovic, Mirjana; Coric, Tatjana. 2008. RAPD Fingerprinting of Indigenous Lysinibacillus fusiformis Isolates from Stabilized Sludge and Oil-Polluted Soil. International Meeting on Soil Fertility Land Management and Agroclimatology. Turkey, 927-933.

Junqueira, Luiz C.; Carneiro, José. 2005. Biologia Celular e Molecular. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro.350 pp.

Kämpfer, Peter; Glaeser, Stefanie P. 2011. Prokaryotic taxonomy in the sequencing era and the role of MLSA in classification. Microbiology Australia, 66-70.

Kämpfer, Peter; Glaeser, Stefanie P. 2012. Prokaryotic taxonomy in the sequencing era– the polyphasic approach revisited. Environmental Microbiology, 14(2):291–317.

Karunasagar, I.; Sugumar, G.; Karunasagar, I. 1995. Virulence characters of Aeromonas sp. isolated from EUS-affected fish. In: Sharif, M.; Arthur J.R.; Subasinghe, R.P. Diseases in Asian aquaculture II. Manila: Asian Fisheries Society, Fish Health Section. p. 307-314.

Klinger, R. E., Ruth Francis-Floyd M.S., Riggs, A.; Reed, P., 2003. Use of Blood Culture as a Nonlethal Method for Isolating Bacteria from Fish. Journal of Zoo and Wildlife Medicine 34(2):206–207.

Kumari, S., B.N. Prasad, G. Kumari, A. Quasim, B.K. Singh and J.N. Singh 2001.

Lan, J.; Zhang, X.-H.; Wang, Y.; Chen, J.; Han, Y. 2008. Isolation of an unusual strain of Edwardsiella tarda from turbot and establish a PCR detection technique with the gyrB gene. Journal of Applied Microbiology 105: 644-651.

Levy, C.E. 2004. V Manual de Microbiologia Clínica para Controle de Infecções de Serviços de Saúde, ANVISA.Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Ed). Disponível em: < http://www.anvisa.gov.br>. Acesso: 15 Junho de 2011.

Liberto, Maria Carla; Matera, Giovanni; Puccio, Rossana; Russo, Teresa Lo; Colosimo, Elena; Focà, Emanuele. 2009. Six cases of sepsis caused by Pantoea agglomerans in a teaching hospital. New Microbiologica, 18: 173-179. 94

Lima, L.C.; Fernandes A.A.; Costa, A.A.P.; Velasco, F.O.; Leite, R.C.; Hackett, J.L. 2008. Isolation and characterizaton of Edwardsiella tarda from pacu Myleus micans. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, 60: 275-277.

Lima, Luciene Correa; Ribeiro; Lincoln Pimentel; Leite, Rômulo Cerqueira; Melo, Daniela Chemim. 2006. Estresse em peixes. Revista Brasileira de Reprodrodução Animal. Belo Horizonte. 30(3/4): 113-117.

Lima, M. S. 2005. Os fluxos de conhecimentos na piscicultura do Estado do Amazonas. ConTexto Porto Alegre, 5( 8): 1-20.

Logan, Niall A.; Vos, Paul De. 2009. Genus I Bacillus Cohn 1872, 174Al. In: Vos, P.; Garrity, G.; Jones, D.; Krieg, N.R.; Ludwig, W.; Rainey, F.A.; Schleifer, K.-H.; Whitman, W.B. (Eds.). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology: The Firmicutes.Vol.3.p. 21-127.

Lopez-Torrez, A.J., Hazen, T.C., Toranzos, G.A. 1987. Distribution in situ, survival and activity of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in a tropical rainforest watershed. Current Microbiology.15: 213-218.

Ludwig, Wolfgang; Klenk, Hans-Peter. 2001. A Phylogenetic Backbone and Taxonomic Framework for Procaryotic Systematics. In: Garrity, George M.; Boone, David R.; Castenholz, Richard W. (Eds.). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. p.49-65.

Madigan, Michael T, Martinko, John M.; Parker, Jack; Brook. 2004. Biologia dos microrganismos. 1011 pp.

Madigan, Michael T.; Martinko, John M.; Parker, Jack. 2004. Brock- Biología de los Microorganismos. Pearson Education. Madri 1089 pp.

Maheshawari, Dinesh K. 2010. Plant Grouth and Health Promoting Bacteria.Springer, Heidelberg Dordrecht London, New York. 445pp.

Martinez, Marina Baquerizo; Taddei, Carla Romano. Métodos de diagnóstico. 2008. In: Trabulsi, Luiz Rachid Alterthum (Eds). Microbiologia. Atheneu, São Paulo. p. 117-125. Martinez, Marina Baquerizo; Trabulsi, Luiz Rachid. 2008. Enterocateriaceae. In: Trabulsi, Luiz Rachid Alterthum (Eds). Microbiologia. Atheneu, São Paulo. p. 271-279.

Microbiological quality of fish, Rohumarketed in Patna and its public health significance. Journal of Food Science Technology, 38: 242-243.

Milagres, Lucimar Gonçalves; Melles, Carmo E. A.1992. Diferenças nas propriedas adesivas de Staphylococcus saprophyticus a células HEp-2 e eritrócitos. Revista do Instituto de Medicina Tropical, São Paulo. 34(4): 315-321.

Millar, B. Cherie; Xu, Jiru; Moore, John E. 2002. Risk Assessment Models and Contamination Management: Implications for Broad-Range Ribosomal DNA PCR as a Diagnostic Tool in Medical Bacteriology. Journal of Clinical Microbiology. 40 (5): 1575– 1580.

Miwa, Hiroki; Ahmed, Iftikhar;Yokota, Akira; Fujiwara, Toru. 2009. Lysinibacillus parviboronicapiens sp. nov., a low-boron-containing bacterium isolated from soil. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 59:1427-1432.

Motwani, Bharat; Krezolek, Dorota; Symeonides, Simon; Khayr, Walid. 2004. Myroides odoratum Cellulitis and Bacteremia. A Case Report. Infectious Diseases in Clinical Practice. 12(6):343-342.

Mohamed, Eman A. H.; Abe, Mikiko; Ghanem, Khaled M.; Abdel-Fattah,Yasser R.; Nakagawa, Yasuyoshi; El-Helow, Ehab R. 2007. Diversity of Bacillus genotypes in soil samples from El-Omayed biosphere reserve in Egypt. Journal of Culture Collections,5:78- 84.

Muratori, Maria Christina Sanches; Filho, Cristovão Colombo Couto de Carvalho; Araripe, Maria de Nazaré Bona de Alencar; Lopes, João Batista; Costa, Amilton Paulo Raposo. 2007. Escherichia coli e Staphylococcus aureus em manipuladores de Piscicultura. Revista Cientifica de Produção Animal. 9(2): 120-126.

Nilsson, W.; Strom, M.; S., 2002. Detection and identification of bacterial pathogens of fish in kidney tissue using terminal restriction fragments length polymorphism (T-RFLP) analysis of 16S rRNA genes. Diseses of Aquatic Organisms, 43:175-185.

Oba, Eliane Tie; Mariano, Wagner dos Santos; Santos, Laila Romagueira Bichara dos. 2009. Estresse em peixes cultivados: agravantes e atenuantes para o manejo rentável. In: Dias, Tavares. Manejo e Sanidade de Peixes em Cultivo. EMBRAPA-Macapá. p. 226-247. 96

Oetterer, Marília. 2006. Características físico-químicas e microbiológicas (Staphylococcus aureus e Bacillus cereus) da água e dos mexilhões cultivados na região de Ubatuba, SP. Ciência Agrotecnica, Lavras, 30 (6): 1124-1129.

Oliveira, Rafael. C.2009. O Panorama da Aquicultura no Brasil: A prática com foco na sustentabilidade. Revista Intertox de Toxicologia, Risco Ambiental e Sociedade. 2 (1): 71- 89.

Ostrensky, Antonio; Borghetti, José Roberto; Soto, Doris. 2008. Aquicultura no Brasil o desafio é crescer. Brasília. 276pp.

Pal, RB; Kale, VV. 1981.Acinetobacter calcoaceticus-an opportunistic pathogen. Journal of postgraduate medicine, 27:218- 221.

Paradis, Sonia; Boissinot, Maurice; Paquette, Nancy; Bélanger, Simon D.; Martel, Eric A.; Boudreau, Dominique K.; Picard, François J.; Ouellette, Marc; Roy, Paul H.; Bergeron, Michel G. 2005. Phylogeny of the Enterobacteriaceae based on genes encoding elongation factor Tu and F-ATPase β-subunit. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55: 2013-2025.

Parvan, María E.; Franco, Raúl J.; Rodriguez, Juan M.; Gadaleta, Patrícia; Abbott, Sharon L.; Janda, J.Michael; Zorzópulos, Jorge. 2005. Phylogenetic relationships of the genus Kluyvera : transfer of Enterobacter intermedius Izard et al. 1980 to the genus Kluyvera as Kluyvera intermedia comb. nov. and reclassiﬁcation of Kluyvera cochleae as a later synonym of K. intermedia. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55: 437–442.

Parvathi, Ammini; Krishna, Kiran; Jose, Jiya; Joseph, Neetha; Nair, Santha. 2009. Biochemical and Molecular Characterization of Bacillus pumilus Isolated from Coastal Environment in Cochin, India. Brazilian Journal of Microbiology, 40:269-275.

Pavanelli, G.C.; Eiras, J.C; Takemoto, R.M. 1998. Fish Diseases: Prevention, diagnosis and treatment.Maringá, Brasil. 264 pp.

Pavanelli, Gilberto C.; Eiras, Jorge C.; Takemoto, Ricardo M.; 2002. Fish Diseases: Prevention, diagnosis and treatment. Maringá, Brasil. 305pp.

Pei, Anna; Nossa, Carlos W.; Choks, Pooja; Blaser, Martin.J; Yang, Liying; Rosmarin, David M.; Pei, Zhiheng. (2009) Diversity of 23S rRNA Genes within Individua l Prokaryotic Genomes. Plos One. 4(5): 1-9 e5437.

Pei, Anna; Oberdorf, William E.;Nossa, Carlos W.; Agarwal, Ankush; Choks, Pooja; Gerz, Erika A.; Jin, Zhida; Lee, Peng; Yang, Liying; Poles, Michael; Brown, Stuart M.; Sotero, Steven; DeSantis, Todd; Brodie, Eoin; Nelson, Karen; Pei, Zhiheng. 2010. Diversity of 16S rRNA Genes within Individual Prokaryotic Genomes. Applied and Environmental Microbiology. 76 (12): 3886–3897.

PHRED, (http://helix.biomol.unb.br/phph/index.html). Acesso: 20/10/2011.

Porwal, Shalini; Lal, Sadhana; Cheema, Simrita; Kalia,Vipin Chandra. 2009. Phylogeny in aid of the present and novel microbial lineages: Diversity in Bacillus. PlosOne, 4(4438e): 1-27.

Priest, Fergus G.2009. Genus I. Paenibacillus Ash, Priest and Collins 1994. In: Vos, P.; Garrity, G.; Jones, D.; Krieg, N.R.; Ludwig, W.; Rainey, F.A.; Schleifer, K.-H.; Whitman, W.B. (Eds.). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology: The Firmicutes.Vol.3. Springer. p. 269-295.

RDP, Ribossomal Database Project. (http://rdp.cme.msu.edu/) Acesso: 21/10/2011.

Reis, Roberto E; Kullander, Sven O; Jr., Carl J. Ferraris; 2003. Check list oh the freshwater fishes of South and Central Amarican. EDIPUCS. Porto Alegre. 742pp.

Rodriguez, L.A.; Ellis, A.E.; Nieto, T.P. 1992. Effects of the acetylcholinesterase toxina of Aeromonas hydrophila on the central nervous system of fish. Microbial Pathogenesis, 14:19-24.

Sambrook, J; Russell DW (2001) Rapid isolation of yeast DNA. In: Sambrook J e Russell, DW, (Eds). Molecular Cloning, a Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. p. 631–632.

Sanger, F.; Nicklen, S.; Coulson, A. R. 1977. DNA Sequencing with chain terminating inhibitors. Proceedings of National Academy of Science. USA, 74: 5463-5467.

Santos, Cesar. 2009. Aquicultura e pesca a mudança do modelo exploratório. p. 13-32 In: Dias, Marcos Tavares; Manejo e Sanidade de peixes em cultivo. EMBRAPA Amapá. 724 pp

Santos, Geraldo Mendes dos; Ferreira, Efrem Jorge G; Zuanon, Jansen A.S. 2006. Peixes Comerciais de Manaus. MANAUS. IBAMA/AM, Provárzea. 141 pp.

Santos, Geraldo Mendes dos; Santos, Ana Carolina Mendes dos. 2005. Sustentabilidade da pesca na Amazônia. Estudos Avançados. São Paulo, 19 (54): 165-182.

Sarria, Juan C.; Vidal Ana M.; Kimbrough, Robert C. 2001. Infections Caused by Kluyvera Species in Humans. Clinical Infectious Diseases, 33: e69-74.

Schleifer, Karl-Heinz; Bell, Julia A. 2009. Family Staphylococcaceae fam.nov. In: Vos, P.D.; Garrity, G.; Jones, D.; Krieg, N.R.; Ludwing, W; Rainey, F.A.; Schleifer, K-H; Whitman, W.B. Bergey of Sistematic Bacteriology, The Firmicutes. V.3. Springer.p 392-426.

Schmidt, Timothy R; Scott, Edgar J II; Dyer, David W. 2011.Whole-genome phylogenies of the family Bacillaceae and expansion of the sigma factor gene family in the Bacillus cereus species-group. BMC Genomics, 12(430): 1-16.

Shama, Sabha Deodoro Atlante Brandão; Vargas, Agueda Castagna; Costa, Mateus Matiuzzi; Pedrozo, Andreia Foletto. 2000. Bactérias com potencial patogênico nos rins e lesões externas de jundiás (Rhamdia quelen) cultivados em sistema semi-intensivo. Ciência Rural, Santa Maria, 30: 293-298.

Sharma, C.S.; Bedi, S.K.; Gill, J.P.S.; Aulakh, R.S. A; Sharma, J.K. 2006. Prevalence of enteropathogens of zoonotic significance in fish and fish products from Ludhiana Department of Veterinary Public Health, College of Veterinary Science, Punjab Indian Journal Fish, 53(3): 341-344.

Shinohara, Neide Kazue Sakugawa; Barros, Viviane Bezerra de; Jimenez, Stella Maris Castro; Machado, Erilane de Castro Lima; Dutra, Rosa Amália Fireman; Filho, José Luiz de Lima. 2008. Salmonella spp., importante agente patogênico veiculado em alimentos. Ciência & Saúde Coletiva, 13(5):1675-1683.

Silva, Cristiany de M. A. 2001. Bactérias Gram-negativas do tambaqui, Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) criados em cativeiro, Amazonas-Brasil. Dissertação de Mestrado, Manaus: INPA/UFAM. 66 pp.

Siqueira, R.S. 1995. Manual de microbiologia de alimentos. Embrapa. Centro Nacional de Pesquisa de Tecnologia Agroindustrial de Alimentos (Rio de Janeiro, RJ). Brasília, Embrapa-SPI, Rio de Janeiro, Embrapa-CTAA. 159 pp

Stackebrandt, Erko.2011. Molecular taxonomic parameters. Microbiology Australia, 59-61.

Stackebrandt, Erko; Brambilla, Evelyne; Richert, Rathrin. 2007. Gene Sequence Phylogenies of the Family Microbacteriaceae. Current Microbiology. 55: 42-46.

Stackebrandt, E.; Goebel, B.M. 1994. Taxonomic Note: A Place for DNA-DNA Reassociation and 16s rRNA Sequence Analysis in the Present Species Definition in Bacteriology. International Journal of Systematic Bacteriology, 44(4): 846-849.

Svec, Pavel; Devriese, Luc A.; 2009. Genus I Enterococcus (ec Thiercelin and Jouhaud 1903) Schleifer and Kilpper-Balz 1984, 32vp. In: Vos, P.; Garrity, G.; Jones, D.; Krieg, N.R.; Ludwig, W.; Rainey, F.A.; Schleifer, K.-H.; Whitman, W.B. (Eds.). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol 3. The Firmicutes. p. 594- 600.

Takeuchi, Mariko; Hatano, Kazunori. 1998a. Union of the genera Microbacterium Orla- Jensen and Aureobacterium Collins et al. in a redefined genus Microbacterium. International Journal of Systematic Bacteriology, 48: 739-747.

Takeuchi, Mariko; Hatano, Kazunori. 1998b. Proposal of six new species in the genus Microbacterium and transfer of Flavobacterium marinotypicum ZoBell and Upham to the genus Microbacterium as Microbacterium maritypicum comb. nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 48: 973-982.

100

Tamura, K.; Peterson, D.; Peterson, N.; Stecher, G.; Nei, M. ; Kumar, S. 2011. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution, 28: 2731- 2739.

Tanner, M.A., Coleman, W.J., Everett, C.L., Robles, S.J., Dilworth, M.R.;Yang, M.M., Youvan, D.C.; 2000. Multispectral Bacterial Identification. Biotechnology. Biotechnology et alia, (6): 1-9.

Teixeira, Camilla Dellatorre; Neves, Felipe Piedade Gonçalves; Rocha, Filomena Soares Pereira da; Mondino, Silvia Susana Bona de. 2009. Lactococcus garvieae: isolamento e caracterização fenotípica. Revista Brasileira de Análises Clínicas, 41(3): 205-207.

Teixeira, Lúcia Martins; Santos, Katia Regina Netto dos; Bueris, Vanessa; Trabulsi, Luiz Rachid. 2008. Staphylococcus aureus. In: Trabulsi, Luiz Rachid; Alterthum, F. (Eds). Microbiologia. Atheneu, São Paulo. p. 175- 182.

Teuber, Michael; Geis, Arnold. 2006. The Genus Lactococcus. In: Dworkin Martin; Falkon, Stanley; Rosenberg, Eugene; Schleifer, Karl-Heiz; Stackebrandt, Erko. (Eds). The Prokaryotes: A Handbook on the Biology of Bacteria: Proteobacteria: Gamma Subclass. New York: USA: Springer. p. 205-228.

Trabulsi, Luiz Rachid; Alterthum, F. 2008. Microbiologia. Atheneu, São Paulo. 760 pp.

Urbinate, Criscuolo Elisabeth; Carneiro, Paulo César Falanghe. 2004. Praticas de manejo e estresse dos peixes em piscicultura. In: Cyrino, J.E; Urbinati, E.C.;Fracolossi, D.M.; Castognoli,N. (Eds). Tópicos especiais em piscicultura de água doce tropical intensiva. São Paulo, São Paulo. p. 171-193.

Val,A. L; Silva, M.N.P; Almeida-Val, V.M.F. 2004. Estresse em peixes- Ajustes Fisiológicos e Distúrbios Orgânicos. In: Razani-Paiva, Maria José Tavares; Takemoto, Ricardo Massato; Peres Lizama, Maria de los Angeles. Sanidade de Organismos aquáticos. São Paulo. p. 51-55.

Valois, Afonso Celso Candeira. 2003.Benefícios e Estratégias de Utilização Sustentável da Amazônia. Embrapa- Brasília. 75 pp.

101

Vandamme, P.; Pot, B.; Gillis,M.;Vos, P. de; Kersters, K.; Swings. J. 1996. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiological Reviews, 60 (2): 407–438.

Vancanneyt, M.; Segers P.; Torck, U.; Hoste B.; Bernardet, J.-F.; P. Vandamme; Kersters, K. 1996. Reclassification of Flavobacterium odoraturn (Stutzer 1929) Strains to a New Genus, Myroides, as Myroides odoratus comb. nov. and Myroides odoratimimus sp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 46 (4): 926-932.

Vaz, Fernando de Souza.2010. Bactérias Degradadoras de Biodiesel, Diesel e Misturas em Tanques de Armazenamento. Dissertação de Mestrado, Universidade Federal de Goiás. Goiânia, Goiás.46pp.

Verschuere, Laurent; Rombaut, Geert; Sorgeloos, Patrick; Verstraete, Willy. 2000. Probiotic Bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64: 655–671.

Vos, P.; Garrity, G.; Jones, D.; Krieg, N.R.; Ludwig, W.; Rainey, F.A.; Schleifer, K.-H.; Whitman, W.B. (Eds.). 2009. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol 3. The Firmicutes.1450 pp

Xu, Dong; Cotè, Jean-Charles.2003. Phylogenetic relationships between Bacillus species and related genera inferred from comparison of 39 end 16S rDNA and 59 end 16S–23S ITS nucleotide sequences. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 53:695–704.

Weisburg, William G.; Barns, Susan M.; Pelletier, Dale A.; Lane; David J. 1991. 16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic Study. Journal of Bacteriology, 173 (2): 2697-703.

Woese, Carl R. 1987. Bacterial Evolution. Microbiological Reviews, 51(2): 221-271.

Wray, C.; Wray,A.2000. Salmonella in Domestic Animals. British Library,London, UK. 463pp.

102

Yoon, Jung-Hoon; Kim, In-Gi; Kang, Kook Hee; Oh, Tae-Kwang; Park,Yong-Ha. 2003. Bacillus marisﬂavi sp. nov. and Bacillus aquimaris sp. nov., isolated from sea water of a tidal ﬂat of the Yellow Sea in Korea. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 53:1297-1303.

Young, J.M. 2001. Implications of alternative classications and horizontal gene transfer for bacterial taxonomy. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51: 945-953.

Zhan,Yuhua; Yan, Yongliang; Zhang, Wei; Zhang; Yu, Haiying; Chen,Ming; Lu, Wei; Ping, Shuzhen; Peng, Zixin; Yuan, Menglong; Zhou, Zhengfu; Elmerich, Claudine; Lin, Min. 2011. Genome Sequence of Acinetobacter calcoaceticus PHEA-2, Isolated from Industry Wastewater. Journal of Bacteriology, 193(10): 2672-2673.

Zlotkin, Amir; Eldar, Avi; Ghittino, Claudio; Bercovier, Herve. 1998. Identiﬁcation of Lactococcus garvieae by PCR. Journal of Clinical Microbiology, 36 (4): 983–985

103

Anexo

>PPUFAM 01

TCCCTGGGGAGGGGAAATACCCGTTGCGAAACGCCGCCCCTTGACGGAGACTGACCGTTC AGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCTTGGTAGTCCACGCCGTAAACG ATGTCTATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATAG ACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACA AGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACAT CCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATG GCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTA TCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAG GAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTAC AATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCG TAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGA TCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG AGTTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTTAACCTTCGGGAGGGCCCTTACCCAACTTTG TGAATTCAATTTAACT

>PPUFAM 03

GATAGAGCGGTGAATTGCGTAAGAATCGAGATACGTGGCAAGCGACCCTGACGAAGACTG ACGTCCAGTGCGAAAGCTGGGGAGCAACAGATAGATACTGTAGTCAACGCCGTAAACGAT GTCTATTTGGAGTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATAGACCGC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAG AACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTC GTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTT GTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGT GGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGC ATATATACAAAGAGAAGGGACCTTCGGAGCACGCGGGCGCCTTTCATAGTTTTGGTAGTC CGGATTGGAGTTTGGAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGA ATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGG GTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAAACCTTCGGGAGGGCGCCTTACCCAACTTTTGTGAA

>PPUFAM 05

ATCATCGGAGGGGAAATACCTGTGTGGCGAATGGCCGGCCCCCTGACGGAGGACTGACGT CAAGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAACAGGATTAGATACCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGA TGTCTATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATAGAC CGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAG CGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCC AGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGC TGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATC CTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGA AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAA TGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTA GTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATC AGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAG TGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTTGGACTT CCAGAACT

>PPUFAM 07

GCCCTTGCAGAAGTACTCAGCTCATTAGGGTGGGGGCAACGGATAGATCCTGGTAGTTCA CACGCGTAGAAGTTATTGAGGGTTGTGCCTTGAGGCGTGGCCTCCGAACTAACGGGTTAA ATAAGACCCGCCTGGGGGAGTACGCCGCATGTTAAACTCAAATGAAATGGACGGGGCCCG CACAAGCGGTGGGAGCATGTGTTTTATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTTACTCTG GACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCT GCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC CCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAAC TGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGT GCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTA TGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATC GTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACC ATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTT GTGATTCATGACC 104

>PPUFAM 12

CGTGCCCAAGCTCGCCCTTGACGAGACCTGAGCTCAGTCGAAGCTGGGGAGCATCGGATC AGATACTGTAGTCAGCGGTACCGAAGTCTATTTGAGTTGTGCCTGAGCGTGGCTCGAGCT AACGCGTTAAATAGACGCTGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGG GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTTACC TACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGAC AGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA GCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGT GATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTA CACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCA TAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCT AGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCG TCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTA CCACCTTTGTGATTTCAATTAGCT

>PPUFAM 13

ACACCGCGTGTGGGCGCGAAGGGCGGTCCCCCTTGGACCAAGATCTGACGGTCAGTTGCG CGATGGCTGTGGGGAGGTCAACATGAATAGGATACCTTGGTAGTCACCGCGTAACGATGT CGACTTGGAGGGTTGTGCCCTTGAGGGCGTGGCTTCCGGAGCTAAACGCGTTAAAGTCGA CCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAA GCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATC CAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGG CTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAT CCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGG AAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACA ATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGT AGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGAT CAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGA GTGGGTTGCAAAAGAAGTTAGGTAGCTTTAACCTTCGGGAAGGGCGCTTACCAACTTTTT TGATTTTCCATTTGACCC

>PPUFAM 16

TTAACGCGTTAAAGTTGGACCGCCCTTGGGGAGTTTCGGCCCGCAAGGTTTAAAACTCAA AATGATTTGACGGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACG CGAAGAACCTTTCCTTACTCTTGACATCTAGAGAAATTAGCAGAGATGTTTTGGTGCCTT CGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGT TAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCA AAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCC TTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAG AGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCAT GAAGTCGGAATCGCTAGTAATTGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCT TGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAATGGGTTTCAAAAGAAGTAGGTAGTTAACCTT CGGGAGGGCGCTTACCCACTTGTGATTTCATGACCG

>PPUFAM 22

TCAGGATCGGGAGACGACAGTATTGCCGTAGGCAGATCTGTTCGCCGTAACTGACGTGAA GTACCGAAAAGGGATGGGAGGCGAACCAGACTTAGATACATAGCTAGTGCAGTCAGTACA CGATAGGGAAGTAGTTGTGGGGTTCTTTCCACGGATTCTGTGATGCAGATAACGCATTAA GTTCCGCGCGCGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTATAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCG CACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTTGATGCAACGCGAAGAACCCTACCAAGGCTTG ACATACACGAGAACGGGCCAGAAATGGTCAACTCTTTGTACACTAGTGAACAGGTGGTGC ATGGTGGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAAGATGGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCC TCGTTATATGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCATGGGATACTGCCGGGGTCAACTC GGAGGAAGGTGGGGAGGAGGTCAAATCATCATGCCCCCTATGTCTTGGGCTTCACGCATG CTACAATGGCCGGTACAAAGGGATGCAATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCAAAAAGCCG GTCCCAGTTTGGATTGAGGTCTGCAACTCGACCTCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCG CAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTC ACGAAAGACGGGGACACCAAAGCCGGGGCCTAACCCTTGGGAGGGAGCCGTAGAAGGTGG ATTGGAAAAAA

>PPUFAM 25

CACCCCCAGGTGGGGCGAATGGCGAACTATCTGTCCTGTACTGACATTGAGGCGGCGAAA 105

GCGTGGAGCAACAGGATAGATACCTGGTAGTCCACGCCGTAACGATGAGTGCTAAGTGTT AGGGGGTTTCCGCCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTA CGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT GGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGTTGACCACTGT AGAGATATGGTTTCCCCTTCGGGGGCAACGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCT CGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCA TCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGA CGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGATACAA ACGGTTGCCAACTCGCGAGAGGGAGCTAATCCGATAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATTGTA GGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGG TGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCC GAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGGTGGGATAGGATGAAG

>PPUFAM 26

ATTCTGGAGGAATACCGTTGGCGATGCCGGCCCCCTGACCAAGACTGACGCTCAGTGCGA AAGCGTGGGGAGGCAAACAGGATTAGATACCTGGTAGTCCACGCGTAACGATGTCGACTT GGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGG AGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGC ATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACGGAATTT AGCAGAGATGCCTTAGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAG CTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGC CAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGA TGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATA CAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATT GGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCA CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCA AAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTGGGATTTCCATGAACT

>PPUFAM 27

GTGTGATGGGAACCACCAGGTTGGCGAAAGGCGGAACTTCTCTGATCGTACCTGACGCTG AGGAGGCGAAAGCGTTGGGGAGGCGACAGGATTTAGATACCTTGGTAGTCCACGCCGTAA ACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAG CACTCCGCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCA CAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGAC ATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCA TGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCT TGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGA GGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTA CAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTC TCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGG ATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGA GAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGG GGCAAGAATGAAT

>PPUFAM 28

AGGAAATTATCCGGGTTGGCGAAGGCGGTCCCCCTTGACAAGGACTGACGCTCAGGTGGC GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGATTAGATACCTTGGTAGTCACGCAGTAAACGATGTCTAC TTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTG GGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGG AGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAA CTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGT CAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGT TGCCAGCGATTAGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGG GGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGC ATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGG ATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATG CCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTT GCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCCAATAA CT

>PPUFAM 34

CGCAAGGGAATACCCGGGTGGGGAACGTCGCCCCCTGACCGAGACTGACGGTCAGGTGCG AAAGCGTGGGAGCAACAAGGATTAGATACCTGGTAGTCCACGCCGTAACGATGTCGACTT GGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGG 106

AGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGC ATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACGGAAGTT TTCAGAGATGAGAATGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAG CTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGC CAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGA TGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATA CAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATT GGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCA CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCA AAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTTGGGATTTTCAAAGGA CG

>PPUFAM 37

ATGATTTTGGGAAGGGAAACACCAGTGGCGAGTCGACTATTCTGTCCTGTACCTGACCAT TGAGCGCGAAGGCGTGGGGAGCAAACAGGGATTAGATACCTGGTAGTCACGCGTAAACGA TGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACT CCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGGCCCGCACA AGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACAT CCCGTTGACCACTGTAGAGATATGGTTTCCCCTTCGGGGGCAACGGTGACAGGTGGTGCA TGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCT TGATCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGA GGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTA CAATGGACGATACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGAGGGAGCTAATCCGATAAAGTCGTTC TCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGG ATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGA GAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTTAACCTTTTGGAGCCCAGCCCGCCCGGAAGG GGTGGGGAAT

>PPUFAM 38

ACATCACCCCGATCGCGAAAGAGAGGGACATATTTTTGATCTGAGATCGCCTCCTCTCAA GGCGTGGAAAAGCCCGGGTGTGTGCTAAGTCCGATTTTAATACCCTGGGTAGTACCCCCG CCGTAAAACGATGGAGTACTAATTTGTTAAGGGGGTTTTCCCCCCCCCTTACGGCTGTAG CACACGCAATTAAGCATTCAGCTCCCCGAGTAAAGTCGCCAGCTTGAATCTCAAGTTACT CTCGTGGGGGGCTCAACCCGGCATCTCAAGGTTGAACTGAAGGCAACCATGAGACACCTG TCAGCGTTTCCCCCCAAGTGGACACTATATGTAGAACAGTGGTCCCACCCTAGGCAACAC TGGTTAAAGGTTGGTGCATTGTTGTCGTATTCTCGTGTGGGGAGACGGTGTTTGAAGTCC CGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTATAAGGTGAC TGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACC TGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGATACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGAGGGAGCT AATCCGATAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGG AATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACA CCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGC CAGCCGCCGAAGGTGGGATAGATGATG

>PPUFAM 40

AGATTTTGGAAGGAAACACCCCAGTGGCGAAAGGCGACTATCTGTCTGTACTGACACTGA GCGCGAAAGCGTGGGAGCAACAGGATTAGATACCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAG TGCTAAGTGTTAGGGGGTTCCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGC CTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGG TGGAGCATGTGGTTTAATTAGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGT TGACCACTGCACACATACGGTTTCCCCTTCGGGGGCAACGGTGACAGGTGGTGCATGGTT GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATC TTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAG GTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATG GACGATACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGAGGGAGCTAATCCGATAAAGTCGTTCTCAGT TCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAG CATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTT TGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGATAGGA TGAT

>PPUFAM 43

TGATGTAAACACCCCATGTTGGCGAAGCCGACCTTTCTGTTCTGTTAACTTGACACTGAG GCTCGGAAAGCGTGGGAGCCAAACAGGATTTAGATATCCTTGTTAGTTCCAACGCCCGTA AACCGATGAGATGCTAAAGTGTTTAGAAGGGGTTTCCCGCCCTTTAGTGGCTGGAAGCTA 107

AACGCCATAAAGCAATTCCGCCCTGGGGAGTTACGGCCGGCAAGGTTGAAAATCTAAAAG AATTGACGGGGGCCCCGCACCAGCGGTTGAGCCTGTGGTTTAATTTGAAGCAACGCGAAG AACCTTACCAGGTTTTGACATCCTTTGACCACCCTAGAGATAGGGGTTTCCCTTTGGGGG CAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTTGTCAGCTTGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAATC CCGCAACGAGGGCAACCCTTTATTTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTTTAAGGGGA CTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGGGGGGAAGAAGTCAAATCATCATGCCCCTTATGAC CTGGGGTACCCACGTGGTACAATGGGAAGTACAAAGAGGTGCCAAGTCGGGAGGGTGAGG TAATTTCCTAAAACCTTTTTCAGTTTGGATTGTAGGGTGCAAATTGCCTACCTGAAACCG GAATCGGTTGTAATTGGGGATCAGCCAGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACAC CCCCCCCGTCACCCCCCGAGAATTTGGAACCCCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTTGGA GCCAGCCGCCTAAGGTGGACAGATGAAT

>PPUFAM 44

TGATAAAACTGAGACTGCGGAAGGGCTCTGGAAAAGCGTTGGGAAGCCAAACAGGAACTA AGATACCTGGTAAGTTCCATGCCGTAACGAATGAAGTAGCTTAAGTGTTGGAGGGTTTGC GGCCCTTCAGTGCTGCAAGCTAACGGCAATAAAGCACTCCGCCTTGGGAAGTTACGAACG CAAGGTTGAAAACTCAAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAAGCGGTGGAGCATGTGGT TTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAG ATAGAGCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGT CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATT TAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCA AATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGT CGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTG CAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAAT ACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGT CGGTGAGGTAACCTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATTAGGAATGAATT

>PPUFAM 45

CTCGGGACGAAATACCCGGTTGCGCACGCGGCACCTGGACAAGGATCTGACGTTCAGTGC GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATAACTTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCG ACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCT GGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG GAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGA ATTTGCTAGAGATAGCTTAGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCG TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTG TTGCCAGCAAGTAATGGTGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGT GGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGC ATATACAAAGAGAAGCGAACTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCC GGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAA TGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGG TTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGGCTTTACCACTTTGGGGAC

>PPUFAM 46

GGGGGGGGTCTGGGGAGACTCGTATAGTGACCGCCGGGGATTCGGCCGCATGTTAATTTA AATTATTTAGGGGCCCCCAACGGTTGGAGCATGGGTATAATGTGTGCAACGCGAAGAACC TTACCAACTTTTGCCTCCGAGAAATTGTTAGAAAAAGCTTAGTCCTTCGGGGACTTTGAG ACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAAGTTGGTTAAAGTCCCGCAACG AGCGCCAACCTTATTCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAG TGATAAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGC TACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCT CATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCG CTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCC CGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCT TACCACCTTGGTGATTCCAAGAACG

>PPUFAM 51

GTACTGGACACCTGAGGGCGCGAAGCGTGGGAGCAACAGGATAGATACTGTAGTCAGCGG TAACGATGAGTGCTAGTGTAGAGGGTTCCGCCTTAGTGCTGAGGTACGCATTAAGCACTC CGCTGGGGGAGTACGGCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAG CGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCC TCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGT TGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGAT CTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAA GGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAAT 108

GGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAG TTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCA GCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGT TTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAG AAGAT

>PPUFAM 52

TGACATAATACTGCTGAGGAGGCGTCCTCAGAAGAAGACGTGCTGAGGCAGAGCACACAC CATATGTATAGAGTATCCCCCCTCTGTGATGTCCCCCTCCGCTCTAATAACATGGAGAGA TTCATAATATAGAGAGGGGTATTATATATTTTTTTTTGATTATGCGCAAAAAACACAAAA ACCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGCCCCCCCCAAGGGTTAAAAACTAAAAAAAAATTGGGGG GGGGCCCCCCCCACAAGGGGGGGGGCCCTGGGTTTTTTTTTTTTGAAAAAAAACGGAAAA AACCCCTTTCCCGGTTTTTAAAAAAATTCTGGTTTTTTTTCAAAAAAAAAGGGAAATTTC CTTTGGGGGCCCGGGGGAAAACGGGGGGGGCCAGGGGTTTTTCTTCAGGCTCGGTTTCGG AAAAATTTTGGGGTTAAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTTTTTGTTAGTTGCCATCAT TAAGTTGGGCACTCTAACGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTC AAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAG TCGCGAGACAGTGATGTTTAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCT GCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAA TACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTTGGGAGTACCCGAAG TAGGTTGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTCCTAAGGTAAGGACCCGAATGAACT

>PPUFAM 53

ATTTGACATTGGAGGGGGCGAAAGCGTGGGGGAGCAAACAGGGATTAGATACCTGGTAGT CCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGGTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGC TAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAAGACTGAAACTCAAAGGGAAT TGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACC TTACCAGGTCTTGACATCCCGTTGACCACTGTAGAGATATGGTTTCCCCTTCGGGGGCAA CGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCC GCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACT GCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCT GGGCTACACACGTGCTACAATGGACGATACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGAGGGAGCTA ATCCGATAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGA ATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACAC CGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCC AGCCGCCGAAGGTGGGATAAGAAGGATT

>PPUFAM 54

GTAGAGAAACCACCCAAGGTGGCGAGGCGGACTTTCTGGTCTGTAACTGACCTTGAAGCG CGAAAGCCGTGGAAGCAAACAGGATTTAGATACCTTGGTAAGTCCCACGCCGTAACCGAT GAGTGCTAAGTTGTAGGAGGGTTTCCCGCCCCTTTAGGTGCTGAAAGTTAACGCATTAAG CACTCCCCTGGGGAAGTCGGCCGCCAAGGCTGAAATTCAAAGAATTTGCGGGGGCCCCGC CCAAGCGGTGGAGCATTGGTTAAATTGGAAGCAACCGAAAGAACTTACCCAGTTCTGGAC TCCTTCGACCAACCCAGAGGAAAGGGTTTCTCTTTGGGGACCAGAGTGCAAGGTGGGCCA TGGTGTTGTTCAGTTGGTTTCGTGAGATGTTGGGTTAATTCCGGCAAGGAGCCCAACCCT TGTTTTTAGTTGCCTCCATTCAGTTGGCCATTTTAAGGTGACTGCCGGGGACAAACCGGA GGAAGGTGGGGAGGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGCCTTGGGCTACACACGTGTTC CAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGCCCGCGAGGGGGAGTTATTTCCATAAACCCGTTT TCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAATTCGCCTCCAGGAAGCGGGAATCGTTAGTAATCGGGG ATCACCATGCCGCGGGGAATAGGTTCCCGGCCCTTGTACACCCCCCCCGTCCCACCACGA AAGTTGGAACCACCGGAAGTCGGTGGGGTACCCTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGGGGGAC AAGAGTAT

>PPUFAM 55

AGTAAACACCCCAGGTGGGCGAATGCCGACTTTCTGTTCCTGTACTGACGCTGATGTGCG AAAGCGTGGGGATCAACAAGATTAGATACCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCT AAGTGTTAGGGGGTTCCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGG GGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGA GCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGAAA ACTCTAGAGATAGAGCCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCG TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAG TTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGG GGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACA ATACAAAGGGCAGCTAAACCGCGAGGTCATGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGG 109

ATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATG CTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTA ACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTTATGGAGCTAGCCGTCGAAAGGTGGGACAAAAA TAAC

>PPUFAM 57

TTCACGATGAGCTTGGATATAATATGGAGTACTAGAAATTATGTAGTGTAGCGGTGGAAT GCTAGATATTACATTGAATCCAATTGCGAAGGCAGGTTACTACGTATTTATGACGCTGAT GAACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTTAGATACCCTTGGTAGTCACGCGTAAACGAT GGATACTAGCTGTTCGGTTTTTCGGTCTGAGTGGCTAAGCGAAAGTGATAAGTATCCCAC CTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGG TGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAGGGCTTAAATGTAGAT TGACAGATTTGGAAACAGATTTTTCTTCGGACAATTTACAAGGTGCTGCATGGTTGTCGT CAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCAGGTTAAGTCCTATAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGT TACCATCGCGTAGTGGCGGGGACTCTAGCAAGACTGCCGGTGCAAACCGTGAGGAAGGTG GGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCA AGTACAGAAAGCAGCTACCTGGCAACAGGATGCGAATCTCCAAAGCTTGTCTCAGTTCGG ATTGGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGGATATCAGCCAT GATCCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCTGTTCTAAAAAATTGGAAT

>PPUFAM 58

TTGGCGTGATAGAGAATATTGAGGGAAACACCAGGTGGCGAGCGACTTCTGGTCTGTAAA CTGAACATTGAAGGCGCGAAGCGTGGGGAGGCAAACAGGATTAGATACCTTGGTAGTTCA ACGCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTAGAAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGTTGAAGTTAAC GCATTAAGCATTCGCCTGGGGGAGTACGCCGGCAAGGCTGAAATTCAAAGGATTTGACGG GGGCCCGAACAAGGGGTGAAGCATGTGTTTTATTTGGAAGCAAGCGGAAGACCCTTACCA GTTCTGAACTTCTTCGGACAACCTTAGAGATAGGGTTCTTCTTTCGGGAGCAGAGTGCAA GGTGGGGCATGGTGGTCTTCAGTTGGGTTCGTGAGATGTTGGGTTAATTCCCGCAACGAG CGCAACCCTTGTTTTTAGTTGCCTTCATTCAGTTGGCCATTTTAAGGGGACTGCCGGTGC CAACCCGGAGGAAGGTGGGGAGGAGGTCAATTCTTCATCCCCCTTATGCCCTGGGTTCCA CACGTGTTCCAATGGACGGTACAAAGAGTTGCAAGACCGGGAGGGGGAGTTATTTTCATA AACCCGTTTTCAGTTGGGATGGTAGGTTGCAATTGGCTTCCAGGAAGCGGGAATCGTTGG TAATCGGGGATCACCATGCCGCGGTGAATAGGTTCCCGGCCCTTGTACACCCCCCCCGTC CCACCACGAAAGTTGGGACCACCGGAAGTCGGTGGGGTACCCTTTTGGAGCCAGCCGCCT TAAGGGTGGG

>PPUFAM 59

TGGAAGGAAACCACCCAGTGCGAAGCCGACTTTCTGTCGTACTGACATTGAGGCGCGGAA AGCGGTGGGAGCAACAGATTTAGGATTACCCTGGTAGTTCCACGCCGTTAACGATGAGGT GCTAAGTGTTAAGAAGGGGTTTTCCCGCCCCTTTAGTTGCTGAAAGTAACGCCATTAAGC ACTCCGCCTTGGGAGTAAGGCCGCAAGGCTGGAAATCAAAAGAAATGACGGGGGCCCCCA CCAGCCGGTGAGCCAGTTGTTTAATTCGGAACCAACCGAAGAAACCTACCCAGTTCTTAC ATCCTTCGACCACCCTAAAGATAAGGCTTTTCCCTTCGGAACCGAATGACCGGTGGGGCC AGGTTGTTGTTCAGTTGGTTTGTGAGAAGGTGGGGTAAATTCCGCAAAGAGGGCCACCCC TGATTCTAGTTGCCCTCCATTAATTGGGCCATTTAAGGGGAACGCCGGGGGCCAACCGGA GGAAGGGGGGGAAGAAGTCAAATTCTCCTTCCCCTTATGACCTGGGGTACCCCCCTGGTT CAAAGGGCGGTACAAAGAAGTGCAAGGCCCGGAGGGGGAAGTAATTTTATAAAACCCTTT TCCATTTGGAATGTAGGGTGCAAATTGCCTACCAGAAAGCGGAATTGGTTGTAATTGGGG ATCAGCCAGCCGCGGGGAAAAAGTTTCCCGGCCTTGGACCCCCCCCCCGTCCCCCCCCGA GAAATTGGAACCCCCGAAGTTGGTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGA CAAGATGGAT

>PPUFAM 63

AAGAGAAGATATATTGGGAGGAAACACCCAAGTGGCGAGCCGACCTTTCTGGTCGTAACT GACAACTGAGGCGCGGAAAGCGTGGGAGCCAAACAAGGATTAGAATAACCTTGTAGTCCA CGCCGTTAAACGATGAAGTGGCTAAAGTGGTAGAGGGTTTCCGCCCTTTTAGTGGCTGAA AGTTAAACGCAATAAAGCAACTCCGCCTGGGGAGGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTTCAA GGAAATGACGGGGGGCCCGCACCAAGGGGGGGACATGGGGTTTTATTCGGAGGCAACCGG AAGAACTTACCCGGTTCTTACATCCTTCTGCAACCCCAGAGATAGGGGTTCTTCTTTGGG AGCAGAATGACCGGTGGGGCAAGGTTGTTGTCAGGTTGGGTTGTGAGATGTTGGGTTAAG TCCCGCAACGAGGGCCACCCTTGATTTTAGTTGCCCTCCTTAAATTGGGCCATTTAAGGT GAACGCCGGTGACCAACCGGAGGAAGGTGGGGAAGAAGTCAAATTCTCCTGCCCCTTATG ACCTGGGGTACCCCCCTGGTTCAAAGGGCGGTACAAAGAAGTGCAAGGCCCGGAGGGGGA GGTAATTTTATAAAACCGTTTTCCATTTGGATTGTAGGGTGCAAATTGCCTACCAGAAAG 110

CGGAATTGGTTGTAATTGGGGATCAGCCAGCCGCGGTGAATAAGTTTCCGGGCCTTGTAC CCCCCCCCCGTCCCCCCCCGGGAATTTGGAACCCCCGAAGTTGGTGGGGTAACCTTTTTG GAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGAT

>PPUFAM 64

TCATGGAGGGAAAACACCCAGTGGCGAAAGCGACCTTTCTGGTCGTAACTGACACTGAGG CGCCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAATAATCCCTTGGTTAGTCCCACGGCCGT TAAACCGAATGAGGTGGCTTAAGTGGTTAGAAGGGTTTCCCGCCCCTTTAGTGCTTGAAA GTTAACGCCAATAAAGCATTCCGCCCGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAAATCAAAGGA ATTGACGGGGGCCCGCACCAGCGGTTGAACCAGTGGTTTAAATCCAAACAACGGGAAGAA CCTTACCCGGTCTTGACCTTCTTCGACAACCCTAGAGAAAAGGGTTTTCCTTTGGGAACA GAATGACCGGTGGGGCAAGGTTGTTGTCAGGTTGGGTTGTGAGAAGGTGGGTTAAGTTCC GCAACGAGGGCCACCCCTGATTTTAGTTGCCCTCCATAAATTGGGCCATTTAAGGTGACT GCCGGGGACCAACCGGAGGAAGGTGGGGAAGAAGTCAAATTCTCCTGCCCCTTATGACCT GGGGTACCCCCGTGGTACAAAGGGCGGTACAAAGAAGTGCAAGGCCCGGAGGGGGAAGTA ATTTTATAAAACCGTTTTCCATTTGGATTGTAGGGTGCAAATTGCCTACCAGAAAGCGGA ATTGGTTGTAATTGGGGATCAGCCAGCCGCGGGGAATAAGTTCCCGGGCCTTGTACCCCC CCCCCGTCCCCCCCCGAGAATTTGGAACCCCCGAAGTTGGTGGGGTAACCTTTTTGGAGC CAGCCGCCTAAGGTGGACAGATGAAT

>PPUFAM 70

TCTACCGCCGTGGTTAAAATGGGCGCGAGAGAGGAATATTGGAAGGAAACACCCAGTGGG CGAATGGCGACTTTCTGTTCTTTAACTGACGCTGATGTGGCGAAAGCGGGGGATCAAACA GGGATTAGATACCTGGTAGTCACGCAGTAAACCGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTC CGCCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAG GTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC GAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGAAAACTCTAGAGATAGAGC CTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAGTTGCCATCATTAAGTT GGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCA TCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAATACAAAGGGCAGCTA AACCGCGAGGTCATGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACT CGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACGTT CCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTG GAGTAACCATTTATGGAGCTAGCCGTCGAAGGTGGGACAAATGACTG

>PPUFAM 71

TGTCGCAAAAGGGCCGACTTTCTGTTCTGTAACCTTGACGCTTGAATGTGCGAAGCGTGG GAATCCAAACAGAATTAGGATACCCTGGGTAGTTCACGCCCGTAACGATGAGTGCTAAGT GTTTAGGGGGGTTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG GAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACACAGCGGTGGA GCATGTGGTTTAATTTGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACA ACTCTAGAGATAGAGCCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCG TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAG TTGCCATCATTAAGTTGGGCACTTTAAGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGG GGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACA ATACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTCAAGCAAATCCCATAAAGTTGTTTTCAGTTCGG ATTGTAGTGTGCAACTTGACTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATTGTAGATCAGCATG CTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAATTTGGA ACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCTTTTAGGAGCTAGCCGTCGGAAAGGGTGGGAAA

>PPUFAM 72

CGACGTAGGATCGTCGTTGAAGATCACTACAGAGATAGTGTATCCCTGCGTATCCACGCC TAAAAGAGTAGTGTTAAAGTGTGTTAGGGGGTTCGCCCCTTAATCGTGTGCAGTAAAGCC TCTAACCACTCTCGCCGGGGGGATACGGTGCCAAGACGAAACTAAAAGGAATTACCGGGG GGCCGCACAAAGGGGTGGGCACAGTGGGTTAATTTGGAAGCAACGGGAAAAACCTTACCA AGTTTTGACTTCCCGTTGAACCACTGAGAAAATATGGTTTCCCCTTTGGGGGAAACGGGA CCGGTGGGGCCAGGGTGTTGGTCAGCTGGTTTGTAAATGTTGGGTAAAGTCCCCGCAAAG AGGCGCACCCCTTGATTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGGCACTTTAAGGTGACTGCCGG TGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCT ACACACGTGCTACAATGGACGATACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGAGGGAGCTAATCCG ATAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGC TAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC GTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCG 111

CCGAAGGTGGGAATAAGATGAAT

>PPUFAM 74

CGTCATGCATCATAATATTCCCCGGTGTGGGCGAAAGGACGGTCCCCCTGGAACCAAAGG ACTGACGCTCCCAGGGTGCGGAAATGCGTGGGGGAGCAATACAGGAATTAGAATACCCCT GGTAGTTCAACGCGTAAACGATGTCGGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCC GGAGCTAACGCGTTAAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAT GAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAG AACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAA CTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTC CCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAG ACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGA GTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAG CGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTC GGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACA CACCGCCCGTCACACCATGGTTTTGAGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTGGGGA GGGCGCTTACCCACTTTGGGGACTCCAAGGAGG

>PPUFAM 228

AGTGTGGAACTTTTAGGTTCGTACTGACCTTAGGCGAAGCTTGGAGCAACTGATCAGTAC CTGCTAAGTTCAGCGTAACGAATGAGTGCTAAGTGTTTAGGGGGGTTTTCGCCCCTTTAG TGCTGCAGCTAACGCAATTAAGCACTCCGGCTGGGAGTACGGTCGCAAAGACTGAAACTC AAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGC GAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGTTGACCACTGTAGAGATATAGTTTCCCCTTC GGGGGCAACGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGT TAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTA AGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCT TATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGATACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGA GGGAGCTAATCCGATAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATG AAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTT GTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTT TTGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGAATAGGAGGAAA

>PPUFAM 229

GGAATGGCGCAAGTATCATGAAGAACACCTGATTGCGATGCAGATCTCGGCGTAACTGAA CGCTGAGGAGCGAAAGGGTGCGTAGCCAACAAGCTTAGATACCCTGGTAGTCACCCCGTA AACGTTGGGAAACTAGTTGTGGGTCCATTCCACGGATTCCCGTGACGCAGCTAACGCATT AAGTTCCCCGCGTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACC CGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCT TGACATATACGAGAACGCTGCAGAAATGTAGAACTCTTTGGACACTCGTAAACAGGTGGT GCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC CCTCGTTCTATGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCATGGGATACTGCCGGGGTCAAC TCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCA TGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCAATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCAAAAAGC CGGTCCCAGTTCGGATTGAGGTCTGCAACTCGACCTCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAAT CGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAG TCATGAAAGTCGGTAACACCTGAAGCCGGTGGCCCAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAA GGGGGGCATCCGGAAATTTT

>PPUFAM 232

TCGAGAATATCCGTGGCAGCGCCTGACAAGCTGACTCAGTGGGAGCTGGAGCACAGGATT AGATACTTGTAGTCAGCGTACGAAGTCGACTGAGTTGTGCCTGAGCGTTGCTCCGAGCTA ACGCGTTAAGTCGACGCTGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGG GGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTA CTCTTGACATCCAGGGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAG GTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC GCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGA TAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGGGTAC ACCACCTGCTTCAATGGCATATACAAAAAGGAAAGGCCCCCCCGGGGGGCCCAGGGGCCT TCTTAAAGTAGGTGTTGTTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATC GCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC CCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGC TTACCACCTTTTTGAATTCAATAACC

112

>PPUFAM 233

CAACGGCGTCGAGCTCTCTCCGTGTGCATGAATACTGATCACTTGAGGCGTCGAAAGCTG TGGGAGAGCCAAACCAGGATAGATACCTTGGTAAGTCACAGCCCGTAAACGATGATGGTA AGGGTTTATGGGCTTCCGGCCCTTTAGTGCTGAAGTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG GAGTACGGCCGCAAGGGTGAAAATTCAAAGAAATGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAG CATGTGGTTTAATTTGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGAAAA CCCCAGAGATAGGGGTTTTCCTTTGGGAACAGAAGACAGGGGGTGCATGGTTGTTGTCAG CTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATTTTTGTTGC CATCATTTAGTTGGGCAATTTAAAGGGGACGCCCGGGGCAAACCGGGAGGAAGGGGGGGA GGAGTCAAATTCTTCATCCCCCTTTGGCCTGGGGTACCCCACGTGTTCCATGGGCGGTTA AAAAAAGGGGGCAAACCCCCGGGGGGGAAGTAATCTTCTTAAACCGTTTTCAATTCGGGA TGTAGGTTGCCAATTGCCCTCCAGGAAGTGGAAATGGTTGTAATCGCGGGTTCGCAATCC CCGGTGAAATAGTTTCCCGGCCTTGGACCCCCCCCCCGTCACACCACGGGAATTTGGACC CCCGAAGTTGGGGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAAGAGGAAT

>PPUFAM 234

AACGCGAAGAAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCCTCTGACCGGTACAGAGATGTACCTT TCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCTAGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGT TGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTCGGATGGGC ACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCAT GCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGCCGCGAAGCC GCGAGGTGGAGCTAATCCTAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCC TGCATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCG GGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTATAACACCCGAAGTCGGTGGGGT AACCGCAAGGAGCCAGCCGCCGAAGGGGGAAAAGAGAT

>PPUFAM 236

GCGTTTAAGTCGCTCGCCTTGGGGGGAGTTCGTCCCTCAAGCTTTAAAATTCAAAATGAA TTGATGGGGGCCCGCCACAAGTGGGGAAAAAAAGAGGTTTAAAATAAGATGCAACGCGAA GAACTTTACCTTCTTTTGACATCCAGGGAATTTTGGCAGAGATGTTTTAGTGCCTTTGGG AACTGTAAGACAGGTGCTGCAGGGCTGTCGTCAGCCGTGTGTGAAATGTTGGGTTAAGTC CCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGTGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAG ACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGA GTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAG CGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTGGACTCCCGAAGTCG GAATCGTTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACAGTAAATACTTTCCCGGCCCTTGTACAC ACCCCCCGTCACCCCATGGGAAGGGGTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGG GGCCCTTCCCCACTTTGTGGTTTCAAGGGGC

>PPUFAM 238

GAGCATGTGGTTTAATTTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG ACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTG TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCT TAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGATGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG TGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGG ACGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTTTAGCCAATCCCATAAAACCGTTCTCAGTT CGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGC ATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGATT TGTAACACCCGAAGTCCGTGTGGAGGTTAAAACCCCTTT

>PPUFAM 239

TAATTGGCGGTTAAGAGAAGATTCTGGAGGAAATACCCGGTGGCGAGCCGCTTCTGGACG AAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCTGGTAGTCA CGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGAAGCTAACG CGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGG GGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTA CTCTTGACATCCAGCGAATCCTGTAGAGATACGGGAGTGCCTTCGGGAACGCTGAGACAG GTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC GCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGA TAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACA CACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATA AAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAG TAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTC 113

ACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACC ACTTTGTGATCATGAC

>PPUFAM 246

GAAATTACCGATGGCGAAGGGCAGTCAATCTGCTTATTACCTGACACTGAGGTGCGAAAG CATGGGGAGCAACAGATTAGATACCTGGTAGTCCATGCGTAAACGATGTCTACTAGCCGT TGGGGCCCTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTAC GGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG GTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATACAGAGAACTTTCCAG AGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGT GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTATTTGCCAGCA CTTTGGGTGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACG TCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAG GGTTGCTACTGCGCGAGCAGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGT CTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTG AATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGA AGTAGGTAGTCTAACCTTAGGGAGGACGCTTACCACGGTGTGGCCGGATGAACCT

>PPUFAM 250

GAAGCACCCGAGGGCGAAAGCGGCTCTTCTGCCTGTACCTGACACTGAGGCTCGAAAGCG TGGGAGCAACAAGATTAGATACCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTA GGGAGCTATAAGTTCTCTGTAGCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACG ACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG TTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCGTGCTATCCTTAG AGATAAGGAGTTCCTTCGGGACACGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTG TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTAGTTGCCATCAT TAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTC AAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAG TCGCCAACCCGCGAGGGTGCGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCT GCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAA TACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGAAGTTGGGAGTACCCAAAG TAGGTTGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTCCTAAGGTAAGACCGATTGACCT

>PPUFAM 251

TGACGTCAAATCCACCTGGGAGGCGGAAAGCTGCTCTCTTGTCTGTACTGACATTGAGGC TCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCTGGTAGTCCACGCTGTAAACCGATGA GTGCTAGCTGTAGGGAGCTATAAGTTCTCTGTAGCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGC TGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCGT GCTATCCTTAGAGATAAGGAGTTCCTTCGGGACACGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTC GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTA GTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTG GGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGAT GGTACAACGAGTCGCCAACCCGCGAGGGTGCGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCG GATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAC GCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGAAGTTGGG AGTACCCAAAGTAGGTTGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTTCCTAAAGGTAAGGACCCGAT GAACC

>PPUFAM 252

GATGTAGTACATCTCGCAAGGAGTGAGTCGGTGGAATTGCGTAGAGCATTCTGCAGGATG ACGGCTGGCGAACGGCTGGCACCTGGTACAAAGTACTGACGCTCAGGTGGCGGAAGGCGT GAGGAGCATATCAGGATCCGATATCTCGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGA GGTCGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGT ACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATG TGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCC AGAGATGGATGGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTC GTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAG CGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGA CGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAA AGGGCGGCAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGA GTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGG TGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAA GAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTTACCCACTT 114

>PPUFAM 255

AGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCT TACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGA GCAAGCGGACCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATG AAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTT GTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTT TCGGGGGAGGGGCCGGCTTTAACT

>PPUFAM 256

GTAAGCGCGCGTGGAATTGCGTAAGAGAATCTGAGATATGTGGCGATGCGCTCTTGACGA AGACTGACGCTCAGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCTGGTAGTGCAC GCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCCTGAGGCGTGGCTTCCGAAGCTAACGC GTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGG GCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTAC TCTTGACATCCAGCGAATCCTGTAGAGATACGGGAGTGCCTTCGGGAACGCTGAGACAGG TGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG CAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGAT AAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACAC ACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAA AGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGT AATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCA CACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCA CTTTGTGATCATGCCG

>PPUFAM 258

GGGGAGGACGGCCCGCAAGGTTAATATTTAAATGAAATGGACGGGGGCCCGCACAAGCGG TGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTTACCTACTTCTTGACATCCA GCGAATCCTGTAGAGATACGGGAGTGCCTTCGGGAACGCTGAGACAGGTGCTGCATGGCT GTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCC TTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAA GGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAAT GGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTACGTCGTAG TCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCA GAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGT GGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTTACTTACTTTTGTTGA T

>PPUFAM 260

TGGAGAGATAGATTCTTTCCGTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGTTTATGGTTGTAGTCA GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAGTTG CCATCATTAAGTTGGGCACTATAAGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGA TGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAATA CAAAGGGCAGCTAAACCGCGAGGTCAAGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGATT GTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTA CGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACA CCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTTATGGAGCTAGCCGTCGAAGGTGGACAAATGACTG

>PPUFAM 262

AGCAAACCATGATTAGATACCCCTGTTGTCCTTGCGTAACGATGTCTAATTAGCCGTTGG GGCCCTGAGGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGG TCGCAAGACTAAAACTCAAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG TTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCCTTGACATACAGAGAACTTTCCAG AGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGT GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTATTTGCCAGCA CTTTGGGTGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACG TCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAG GGTTGCTACTGCGCGAGCAGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGT CTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTG AATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGA AGTAGGTAGTCTAACCTTAGGGAGGACGCTTTGCCCACCGG

>PPUFAM 263 115

ATTGTTGCGTGATGAGGATCTGAGATTACCCGATTGCGAATGGCCAGCCATCGGCCTAAT ACTGACATTGAGGTGCGAAGCATGGGGGAGCAACAGGATTAGATACCTGGTAGTACATGC CAGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGCCCTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCG ATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGG GCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGG CCTTGACATACAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGG TGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG CAACCCTTTTCCTTATTTGCCAGCACTTTGGGTGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGAC AAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACAC ACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCTACTGCGCGAGCAGATGCTAATCTCAAAA AGCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGT AATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCA CACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGTAGGTAGTCTAACCTTAGGGAGGACCGCTTAAC CCCCAC

>PPUFAM 264

AAAGCGTGGGGAGCAAACATGGATTAGATACCCTTGTTAGTTCACCCCGTAACGAAGTTC GACTGAGGTTGGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTAAGTCGACCGCCTGGG GAGTACGGCCGCAAGGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGA GCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAAC TTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTC AGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTT GCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGG GATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATA TACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGA TTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGC TACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGTTTAGAAAGG GGGGTTTG

>PPUFAM 265

TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGAAAACTCTAGAGATAGA GCCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGT GAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAGTTGCCATCATTAAG TTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAAT CATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAATACAAAGGGCAGC TAAACCGCGAGGTCATGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAA CTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACG TTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGG TGGAGTAACCATTTATGGAGCTAGCCGTCGAAAAGGGGGG

>PPUFAM 266

CTCGAGGTCGTGGCTTCCGGGAGGTAACGTTTAAATGGACCGCTTGGGTGATACGGGCTG CATGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA ATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATG GATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGT GAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCG GTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAG TCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGGGCGG CAAGCTAGCGATAGTGAGCGAATCCCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCA ACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATAC GTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAG GTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCCAACG

>PPUFAM 267

ACGATTTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGGCGTTGGCTTCCGAAGTTAAACGCTTAA AATCGACCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAAGGTTAAAACTCAAAATGAATTGACGGGGG CCCGCACAAGCGGTGGGAGCATGTGGTTTTAATTTCGATGCAACGCGAAGAACCTTTACC TACTCTTGACATCCAGCGAATCCTGTAGAGATACGGGAGTGCCTTCGGGAACGCTGAGAC AGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA GCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGT GATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTA CACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCA TAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCT 116

AGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCG TCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTAC CACTTTGGATTCAGAAT

>PPUFAM 268

TGCAACGCGAAGAACCTGTACTTACTCTTGACATCCAGCGAATCCTGTAGAGATACGGGA GTGCCTTCGGGAACGCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAAT GTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGG GAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATC ATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACC TCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCG ACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCC CGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGC TTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACCTTTGTGAT

>PPUFAM 269

CCATCATGCTGCCAGAAGAATTCTCGAGACGGAATTCCGGTGGGCGCAGGGCGCTTCTGG ACGAAGACCTGACCGCTCAAGTTGTGAAAGCGTGGGAGCAAACCAGGATTAGATAACCTT GGTAGTCACGCTGTAAACGATGTGGATTGGAGGGTTGTGCCCTGAGGCGTGGCTTCCGAA GCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAA TTGACGGGGGCCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAA CCTTACCTACTCTTGACATCCAGCGAATCCTGTAGAGATACGGGAGTGCCTTCGGGAACG CTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCC GCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGAC TGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGT AGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCG GACCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGG AATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACA CCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGG GCGCTACCACTTGGATTCAAGACT

>PPUFAM 271

CCCACACACAGTTGTAAGCGGTGAATTGCGTAGAGATTCCGGAGGAATACGTTGCGATGC GCTCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATAGATACC TGGTAGTGCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCC GAAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATG AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGA ACCTTACCTACTCTTGACATCCAGCGAATCCTGTAGAGATACGGGAGTGCCTTCGGGAAC GCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCC CGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGA CTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAG TAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGC GGACCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCG GAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACAC ACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAG GGCGCTTACCACTTTGTGATCATGACG

>PPUFAM 272

ACAAGGGTGTATAAGCGGGTGGAAATGGCGTAGGAAGATTCTGAGAATACGGTGGCGATG CGCCTTCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG ATACCTGGTAGTGCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGG CTTCCGAAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTC AAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGC GAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGCGAATCCTGTAGAGATACGGGAGTGCCTTCG GGAACGCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTA AGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAA GGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTT ACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAG CAAGCGGACCTCATAAAGTACGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGA AGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG TACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTC GGGAGGGCGCTACCACTTTGTGATCATGACG

117

>PPUFAM 273

AAAGGGTGTGTAAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAGATACGTTGCGATCGCACCTGGA CAAAGACTGACGCTCAGTGCGAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATAGATACCTGGTAGTCCA CGCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGC GTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGG GCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTAC TCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGG TGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG CAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGAT AAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACAC ACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAA AGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGT AATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCA CACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTGAGGTGAGCTTACACGCTTGCGGGAGGGAGCG CACCACTTTGTGATCATAC

>PPUFAM 274

TGTACGGCCGCAAGGTAAAAACTCAAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAG CATGTGGTTTAATTTGGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAAC TTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTC AGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTT GCCAGCGGTTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGG GATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATA TACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGA TTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGC TACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTG CAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATACAAGAATG

>PPUFAM 275

GCTTTCCGGAGTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAAC TCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTTGGAGCATGTGGTTTAATTTCGATGCA ACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCC TTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGG GTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTAGGTCGGGAACT CAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGC CCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCG AGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCC ATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGC CTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAAC CTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTTGTGATTTCAGAATT

>PPUFAM 276

TAAGGCCGCGTGAAATGGCGTAGGAGATCTGAGAATACGGTGGCGAATGCGCTCTGAACA AATGACTGACGTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGGCAAACAGGATTAGATACCTGGTAGTC ACGCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACG CGTTAAATCGACCGCGTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGG GGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTG GTCTTGACATCCACAGAACTTAGCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAG GTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC GCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGA TAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACA CACGTGCTACAATGGCGTATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATA AAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAG TAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTC ACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACC ACTTTGTGAATTCCATGAACA

>PPUFAM 277

AGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGTTGGAG CATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACT TTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATAGCTGTCGTCA GCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTG CCAGCGATTAGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGG 118

ATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCAT ACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGAT TGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCC ACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGC AAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATCATAAT

>PPUFAM 278

AATTTGTGCAACGGAAGAACCTTACTTGGTCTTTACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGG ATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTG AAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTAGG TCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGT CATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGC GACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAA CTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACG TTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGTTGTAAATAAAAAAGGTTT

>PPUFAM 279

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>PPUFAM 282

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>PPUFAM 284

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>PPUFAM 285

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>PPUFAM 286

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>PPUFAM 288

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