Schnelle Identifizierung von oralen Actinomyces-Arten des subgingivalen Biofilms mittels MALDI-TOF-MS

Publikationspromotion

zur Erlangung des akademischen Grades

Dr. med. dent.

an der Medizinischen Fakultät

der Universität Leipzig

eingereicht von: Toralf Harald Borgmann geboren am 14.04.1988 in Dresden

angefertigt am: Institut für Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der Universität Leipzig

Betreuer: Prof. Dr. med. A. C. Rodloff, OÄ Dr. medic. Catalina-Suzana Stingu, Prof. Dr. K. Eschrich

Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 17.11.2015. Inhaltsverzeichnis

1. Bibliographische Beschreibung 3

2. Einführung 5

2.1. Einleitung 5

2.2. MALDI-TOF-MS-Analyse von Bakterien 6

2.3. Actinomyces 9

2.4. Grundlagen zur Bearbeitung und Auswertung der Spektren mit Klassifikation und Clusteranalyse 14

2.4.1. Zentroide 14

2.4.2. Ähnlichkeitsanalyse 14

2.4.3. Hierarchisch-agglomeratives Verfahren und Darstellung der Ergebnisse 15

2.4.4. Klassifikation 16

3. Publikation 19

4. Zusammenfassung 26

5. Literaturverzeichnis 30

6. Anlagen 39

Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 39

Lebenslauf 40

Danksagung 42 1. Bibliographische Beschreibung

Name: Borgmann, Toralf Harald

Titel: Schnelle Identifizierung von oralen Actinomyces-Arten des subgingivalen Biofilms mittels MALDI-TOF-MS

Universität Leipzig, Publikationspromotion 42 S1, 116 Lit.2, 5 Abbildungen, 1 Tabelle , 3 Anlagen

Referat: Aktinomyzeten sind ein Teil der residenten Flora des menschlichen Verdauungstraktes, des Urogenitalsystems und der Haut. Die zeitraubende Isolation und Identifikation der Aktinomyzeten durch konventionelle Methoden stellt sich häufig als sehr schwierig dar. In den letzten Jahren hat sich jedoch die Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation- Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) als Alternative zu etablierten Verfahren entwickelt und stellt heutzutage eine schnelle und simple Methode zur Bakterien- identifikation dar. Unsere Studie untersucht den Nutzen dieser Methode für eine schnelle und zuverlässige Identifizierung von oralen Aktinomyzeten, die aus dem subgingivalen Biofilm parodontal erkrankter Patienten isoliert wurden. In dieser Studie wurden elf verschiedene Referenzstämme aus den Stammsammlungen ATCC und DSMZ und 674 klinische Stämme untersucht. Alle Stämme wurden durch biochemische Methoden vorab identifiziert und anschließend ausgehend von den erhobenen MALDI-TOF-MS-Daten durch Ähnlichkeitsanalysen und Klassifikationsmethoden identifiziert und klassifiziert. Der Genotyp der Referenzstämme und von 232 klinischen Stämmen wurde durch Sequenzierung der 16S rDNA bestimmt. Die Sequenzierung bestätigte die Identifizierung der Referenzstämme. Diese und die zweifelsfrei durch 16S rDNA Sequenzierung identifizierten Aktinomyzeten wurden verwendet, um eine MALDI-TOF-MS-Datenbank zu erstellen. Methoden der Klassifikation wurden angewandt, um eine Differenzierung und Identifikation zu ermöglichen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine Kombination aus Datenerhebung mittels MALDI-TOF-MS und deren Verarbeitung mittels SVM-Algorithmen

1 Seitenzahl insgesamt

2 Zahl der im Literaturverzeichnis ausgewiesenen Literaturangaben 3 eine gute Möglichkeit für die Identifikation und Differenzierung von oralen Aktinomyzeten darstellt.

4 2. Einführung

2.1. Einleitung Bakterien stellen nach heutigem Erkenntnisstand neben den Archeae und Eukaryoten die kleinsten und ältesten Lebewesen unseres Planten dar (1). Auch für unseren Organismus, der etwa zehnmal mehr Bakterienzellen enthält als menschliche Körperzellen, spielen sie eine wichtige Rolle. Ohne Bakterien wäre unser Leben nicht annähernd so vielseitig wie wir es kennen (2). Dabei ist bis heute wahrscheinlich nur ein Bruchteil der tatsächlich existierenden Bakterienspezies bekannt oder phylogenetisch korrekt eingeordnet (3). Deshalb ist es besonders wichtig, auch wenig erforschte Bakterienarten in die aktuelle Forschung mit einzubeziehen, um immer wieder neue Horizonte im Bereich der Mikrobiologie zu erschließen, denn auch unscheinbare Spezies können eine für den Menschen bedeutende Rolle spielen (4). In der Vergangenheit hat sich immer wieder gezeigt, dass die Identifizierung und Klassifizierung von Bakterien eine schwierige Aufgabe darstellt (5). Bereits mehrfach wurden bestehende Systeme geändert und im Laufe der jüngeren Geschichte revolutioniert. Nach der Entdeckung der Bakterien im 17. Jahrhundert war man mehrere Jahrhunderte lang auf eine Unterscheidung durch morphologische Kriterien angewiesen, bis sich Mitte des 19. Jahrhunderts die Biochemie als eigenständige Disziplin entwickelte und die Grundlagen für elementare Vorgänge und Reaktionen in Lebewesen entdeckte und nachweisbar machte. Dieses Wissen wurde auch in Methoden für die Bakterienidentifizierung umgesetzt und veränderte dadurch die Mikrobiologie bis heute von Grund auf (6). Eine spezifische Behandlung mit Antibiotika auf Grundlage einer genauen phänotypischen Keimklassifizierung ist aus Sicht der klinischen Behandlung unentbehrlich geworden und rettet täglich unzähligen Menschen das Leben (7). Mit der Entdeckung der DNA als Träger der Erbinformation und nach der Entwicklung experimenteller DNA-Analyseverfahren ergaben sich völlig neue Möglichkeiten einer genotypischen Charakterisierung von Bakterien (8). Inzwischen hat sich für die Identifizierung von Bakterien das Verfahren der DNA-Sequenzierung zum Goldstandard entwickelt und bildet heute die solide Grundlage einer phylogenetischen Zuordnung von Bakterienarten auf Grundlage ihrer Erbinformationen (9). Auch für einzelne Identifizierungen im Rahmen von Forschungsarbeiten oder der klinischen Diagnostik stellt diese Methode eine gute Möglichkeit dar. Eine flächendeckende Diagnostik ist damit jedoch meistens nicht möglich, da bisher der Zeit- und Kostenaufwand zu hoch und die dafür nötigen Geräten oftmals nur speziellen Laboren zugänglich sind.

5 Parallel zur Genotypisierung wurden aber auch die auf dem Phänotyp basierenden Identifizierungs- und Differenzierungsmethoden für Bakterien weiterentwickelt. In vielen Laboren weltweit hat in den letzten Jahren die Matrix-unterstützte Laser-Desorption/ Ionisation-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) Einzug gehalten. Dieses Verfahren erlaubt eine genaue, günstige und zeitsparende Routineuntersuchung, nachdem es bereits seit längerem in der Proteomforschung zur Bestimmung von Proteinmassen eingesetzt wird (10,11,12). Die Grundlage für gute Identifizierungs- ergebnisse sind valide Datenbanken, die durch die Gerätehersteller und auch durch die Benutzer selbst bereitgestellt werden können. Eine simple, gleichbleibende und wenig benutzerabhängige Bedienung in Form von unveränderlichen Verfahrensparametern erlaubt somit eine nachvollziehbare und vertrauensvolle Auswertung.

2.2. MALDI-TOF-MS-Analyse von Bakterien Auf einen Probenträger wird die zu untersuchende Probe aufgetragen und mit einer organischen Matrix vermischt. Als Probe dienen entweder die Zellen, wie sie nach Kultur erhalten wurden, oder Zelllysate, die nach einem einfachen Aufschlussprotokoll erhalten wurden. Nach dem Einschleusen des Probenträgers in eine Vakuumkammer wird die Probe mit einem Laser beschossen, um sie zu verdampfen und gleichzeitig Ionen der in der Probe vorhandenen Moleküle zu erzeugen. Zur Ionisation der Probenmoleküle werden verschiedenartige Laser eingesetzt, die im UV- (N2 oder Nd:YAG) oder im Infrarot-Bereich (Er:YAG und CO2) arbeiten. Im UV-Bereich werden dabei die Elektronen des aromatischen π-Systems angeregt, bei IR-Lasern die O-H-Bindungen der Matrices. Die Ionisierung der Moleküle erfolgt durch Protonierung, Aufnahme und Abgabe eines Elektrons, Anlagerung eines Metall-Kations oder durch Photoionisation. Dadurch werden in Abhängigkeit von Analyt, Matrix und Zusätzen unterschiedliche Molekülionen gebildet. Durch Beschuss des Matrix-Analyt-Gemischs werden Teile des Matrixgitters schlagartig verdampft und gleichzeitig sowohl Matrix- als auch Analytmoleküle aus ihrem Verband gelöst. Die am häufigsten verwendeten Matrices bestehen aus HCCA (α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure) oder DHB (2,5-Dihydroxy- benzoesäure). Auf diese Weise entstehen neutrale Moleküle und auch verschiedenartig angeregte Teilchen, die sowohl von der Matrix als auch von den Analytmolekülen stammen. Für die weitere Analyse werden überwiegend einfach geladene und hauptsächlich unfragmentierte Moleküle, sogenannte „lucky survivors“, durch ein elektrisches Feld innerhalb des Vakuums in Richtung des Detektors geleitet (13,14). Dabei handelt es sich hauptsächlich um Peptide und Proteine. Daher ist es kaum verwunderlich, 6 dass genetisch sehr nah verwandte Bakterien auch nur schwer unterschieden werden können (15). Standardmäßig werden die gleichen Proben zumindest im Doppelansatz mehrfach gepulst, um damit das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern und Verunreinigungen und dem Verfälschen der Ergebnisse vorzubeugen. Die massenspektrometrische Analyse erfolgt danach über die Flugzeit. Nach der initialen Beschleunigung im elektrischen Feld fliegen die geladenen Teilchen im feldfreien Raum zum Detektor. Schwere Teilchen erreichen den Detektor später als leichte. Die Flugzeit beträgt dabei nur wenige Mikrosekunden (Abb. 1) (16).

Abb. 1 Schematische Darstellung des MALDI-TOF-MS-Verfahrens

Das Ergebnis wird graphisch in Form eines Spektrogramms mit der relativen oder absoluten Intensität auf der Y-Achse und dem Quotienten von Masse zu Ladung auf der X- Achse dargestellt. Besonders im Bereich zwischen m/z 2500 und 7000 treten die für Bakterien charakteristischen und stabilen Peaks auf (Abb. 2). Diese Peaks repräsentieren abundante Proteine, wie z. B. ribosomale Proteine. Bei manchen Bakterienspezies werden auch im höheren Massenbereich bis m/z 20 000 noch deutliche Peaks beobachtet (15). Die aufgenommenen Spektren werden durch unterschiedliche mathematische Algorithmen im Nachgang angepasst. Dabei kann z.B. automatisch eine Glättung und Subtraktion der Grundlinie der Spektren vorgenommen werden und es werden Peaks markiert. Eine zusätzliche manuelle Bearbeitung der Spektren kann im Forschungsbetrieb von Vorteil sein, eignet sich jedoch für die klinische Routinediagnostik nicht (17).

7 Abb. 2 Darstellung eines in unserer Studie aufgezeichneten Spektrogramms

Aus diesem Grunde sind die meisten MALDI-TOF-MS-Geräte mit einem unterschiedlichen Benutzerinterface für die klinische Routinediagnostik und die Forschung ausgestattet. Hier unterscheiden sich auch die Datenbanken zum Abgleich der generierten Spektren deutlich (18). Welche mathematischen Berechnungen in der Software des jeweiligen Herstellers ablaufen, ist nicht nachvollziehbar, da dies das Firmengeheimnis eines jeden Herstellers darstellt (17). Unter den gegebenen Umständen stellen bereits etablierte Systeme wie das Biotyper- System von Bruker oder das Vitek-MS / Saramis-System von bioMérieux zur Routinediagnostik und Forschung für viele Anwender ein geeignetes System dar (15,19,20). Da jedoch in kommerziell erhältlichen Datenbanken vor allem wenig untersuchte Bakterienarten unterrepräsentiert sind, können diese nur bedingt analysiert werden. Beispielhaft beinhalten die aktuellen MALDI-TOF-MS-Datenbanken der kommerziellen Systeme von Bruker 30 von 39 und bioMérieux lediglich 10 von 39 Actinomyces Spezies (21,22). Wenn es auch mit der erhältlichen Forschungsdatenbank und -software nicht möglich ist, interessierende Bakterienspezies zu identifizieren, sind alternative Lösungsansätze in Form der Erstellung einer eigenen Datenbank und

8 Auswertungsmethodik nötig. Dazu werden normalerweise die Rohdaten in Form von Exceltabellen ausgelesen und Listen erstellt, die die Peakverteilung darstellen. Auf Basis dieser Peaks können Ähnlichkeitsanalysen durchgeführt und Klassifikations- methoden angewendet werden (17).

2.3. Actinomyces Bei den Aktinomyzeten handelt es sich um eine Gruppe von gram-positiven, obligat oder fakultativ anaeroben, kurzen und pleomorphen Stäbchen, die sowohl echte als auch filamentöse Verzweigungen aufweisen können und deren heterogene Morphologie bis zu kokkobazillären Formen reicht. Sie können eine glatte Oberfläche oder auch zahlreiche Fimbrien aufweisen und bilden Bernsteinsäure als wichtiges Abbauprodukt des Glucosestoffwechsels. Ein großer Teil der oralen Standortflora wird durch Aktinomyzeten bestimmt. Daneben finden sich im gesamten Verdauungstrakt und Urogenitalbereich Vertreter dieser Spezies (23,24). Die Bezeichnung der Aktinomyzeten wurde das erste Mal 1877 von Carl Otto Harz eingeführt, als er den auslösenden Keim für die bovine Aktinomykose als Actinomyces bovis bezeichnete. Der Ursprung dieses Namens gründet sich in der morphologischen Beschreibung von filamentösen Strukturen, die durch A. bovis produziert werden. Auch die Entdeckung von Actinomyces israelii als Leitkeim der humanen Aktinomykose änderte an diesem Hauptkriterium der Beschreibung der Aktinomyzeten nichts (25,26). Seit 1920 wird der Begriff Actinomyces als eine eigenständige Bakteriengattung verwendet (27,28) und erst ab 1965 änderte sich die Beschreibung dieser Art durch Pine und Georg (29,30), indem sie weitere phänotypische Merkmale, wie die Zellwandmorphologie und Stoffwechselprodukte benutzten, um einer moderneren Klassifizierung gerecht zu werden. Die Taxonomie änderte sich danach weiterhin stetig. Neue Bakterienspezies wurden hinzugefügt und fälschlicherweise enthaltene Spezies wie z.B. Propionibacterium propionicum entfernt (31,32). Bis heute ist die genaue Taxonomie und Unterscheidung der sehr heterogenen Gruppe der Aktinomyzeten nicht abgeschlossen. Exemplarisch stellt sich die Differenzierung der heterogenen Gruppe von Actinomyces naeslundii und Actinomyces viscosus dar. Nachdem Carl Naeslund A. naeslundii bereits 1925 das erste Mal beschrieb, wurde 1951 die Zuordnung zur Art der Aktinomyzeten aufgrund morphologischer Kriterien vorgeschlagen (33,34). Ein 1965 ursprünglich als Odontomyces eingeführtes Bakterium wies eine große Ähnlichkeit zu A. naeslundii auf und wurde 1969 als A. viscosus in die Nomenklatur aufgenommen (35,36). Aufgrund der Ähnlichkeit bezüglich ihrer Antigenstruktur und physiologischen Charakteristik wurde sogar 9 vorgeschlagen, sie als Variation einer Spezies zu betrachten (37,38,39,40,41). Zwischen 1979 und 2009 wurden Studien mittels DNA-DNA-Hybridisierung und 16S rDNA Sequenzierung durchgeführt und teilten den Actinomyces naeslundii/viscosus Komplex letztlich in vier verschiedene Spezies auf (42,43,44). Die aktuelle Taxonomie sieht damit eine Unterteilung in A. naeslundii sensu stricto, Actinomyces oris und Actinomyces johnsonii für die humanen Vertreter vor. A. viscosus sensu stricto bezeichnet nun die Vertreter der tierischen Isolate. Vor allem aufgrund molekularbiologischer Untersuchungen konnten bis heute mindestens 39 Bakterienspezies den Aktinomyzeten zugeordnet werden, wohingegen 1986 im zweiten Band von Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology erst zehn bekannt waren. Sie gehören zur Familie der Actinomycetaceae innerhalb der Ordnung der Actinomycetales und der Unterordnung der Actinomycineae, die ebenso noch die Arten Arcanobacterium, Actinobaculum,Varibaculum und Mobiluncus beinhaltet (24). Aktinomyzeten spielen vor allem bei dentogenen Erkrankungen (Karies, Parodontitis, Pulpitiden, Abszesse) und okulären Infektionen (Konjunktivitis, Canaliculitis des Ductus lacrimalis, Keratitis oder bei intraokulären Infektionen) eine Rolle (45,46,47,48,49,50,51, 52,53,54,55). Die Virulenz ist dabei von Spezies zu Spezies verschieden. Die zerviko- faciale Aktinomykose ist dabei die am weitesten bekannte Erkrankung und wird hauptsächlich durch A. israelii und A. gerencseriae oder auch durch Propionibacterium propionicum und seltener durch Bifidobacterium dentium ausgelöst (56). Es handelt sich dabei um eine chronisch-granulomatöse Erkrankung, die durch eine Keimverschleppung von Aktinomyzeten als ein Bestandteil der natürlichen Haut- und Schleimhautflora in tiefe Hautschichten ausgelöst wird. Verschiedene andere Bakterienspezies verstärken außerdem die pathogene Wirkung von Aktinomyzeten. Oft sind sie hierbei mit Aggregatibacter actinomycetemcomitans assoziiert (57,58,59). Die Zusammensetzung der jeweiligen Mischinfektion ist dabei von Fall zu Fall verschieden. Durch die anatomische Nähe vom bevorzugt betroffenen Kopf- und Halsbereich zum Gehirn kann sich in seltenen Fällen eine Infektion des zentralen Nervensystems anschließen. Auch eine hämatogene Streuung von weiter entfernten Infektionsherden ist möglich und verursacht Meningitiden, Abszesse und Empyeme (60,61,62,63.64). Die thorakale Aktinomykose kann sich sowohl ausgehend von einer zerviko-facialen Aktinomykose, durch Aspiration oder durch eine hämatogene Weiterleitung ausbilden (65,66,67). Die abdominale Aktinomykose tritt häufig nach Appendizitiden, Traumata oder abdominalen Verletzungen auf und betrifft das jeweils verletzte Segment des Verdauungstraktes (68,69,70,71). Insbesondere die kontinuierlich erhöhte Anzahl von Actinomyces-assoziierten Infektionen des Beckens ist in den letzten 10 Jahren festgestellt worden (72,73,74,75). Im Bereich der Mund-Kiefer-Gesichtschirurgie stehen Aktinomyzeten außerdem seit kurzem im Verdacht, stärker als bisher vermutet mit Osteoradionekrosen und Bisphosphonat-assoziierten Knochennekrosen in Verbindung zu stehen. Der Wirt muss dabei nicht zwingend immunkompromittiert sein (76,77,78,79, 80,81,82). Weitere in Verbindung mit den in unserer Studie untersuchten Aktinomyzeten stehende Erkrankungen sind exemplarisch in Tab. 1 dargestellt (83).

Actinomyces dentalis (2005) Abszesse der Mundhöhle

Actinomyces europaeus (1997) Dekubitusgeschwüre, subkutane Fisteln

Actinomyces georgiae (1990) Endokarditis

Actinomyces gerencseriae (1990) Canaliculitis des Ductus lacrimalis,

Actinomyces graevenitzii (1997) Ostitis, Bronchialsekret, Koinfektion mit Mycobacterium tuberculosis

Actinomyces israelii (1896/1990) Aktinomykose, Cervicitis, Endometritis,Canaliculitis des Ductus lacrimalis

Actinomyces johnsonii (2009)

Actinomyces massiliensis (2009) Abszesse der Mundhöhle

Actinomyces meyeri (1938/1984) Hirn- und zerviko-faciale Abszesse, Lungen- und Brustabszesse, Abszesse der Hüfte, der Symphysis pubica, der Beine und Füße sowohl mit als auch ohne Osteomyelitis; Nierenentzündung, Leberentzündung, starke Streuungstendenz zu Niere, Herzklappen oder Gehirn Actinomyces naeslundii (1951/2009) Infektionen der Gallenblase, von Totalendoprothesen des Knies und der Hüfte sowie des Kniegelenks; Plaque und Kariesentstehung, Augenentzündungen Actinomyces neuii (1994) infizierte Atherome, infizierte Brustimplantate, chronische Osteomyelitis, Endokarditis

Actinomyces odontolyticus (1958) Geschwüre der oralen Mucosa, Peritonsillarabszess, Enterokutane Fisteln, Leberabszesse, Lungenentzündung mit Ausbreitung in die Pleura, das Mediastinum und das Pericard, Sepsis, Plaque und Kariesentstehung, Augenentzündungen

11 Actinomyces oris (2009) Plaque- und Kariesentstehung

Actinomyces radicidentis (2000) infizierte Wurzelkanäle

Actinomyces timonensis (2010)

Actinomyces urogenitalis (2000) Penisgeschwüre, Beckenaktinomykose

Actinomyces viscosus (1965) Abzsess ausgehend von einem Hundebiss und in Blutproben eines Endokarditispatienten isoliert, Augenentzündungen

Tab. 1 In unserer Studie identifizierte Actinomyces-Arten mit dem Jahr ihrer Erstbeschreibung und den korrespondierenden Erkrankungen

Die Therapieempfehlung für Aktinomyzeteninfektionen ist die primäre chirurgische Behandlung mit unterstützender ß-Laktam-Antibiose (84). Aktinomyzeten sind darüber hinaus oft sensibel gegenüber Tetrazyklinen, Clindamycin, Rifampicin, Linezolid und Cefoxitin (85,86,87). Bei Isolaten einiger Spezies wurden Resistenzen gegenüber Erythromycin, Ciprofloxacin und Mupirocin festgestellt (88, 89). Eine folgerichtige und zuverlässige Taxonomie der Aktinomyzeten zu definieren ist immer noch sehr schwierig (90,91). Um Verwandtschaftsbeziehungen darzustellen, werden oft phylogenetische Bäume auf Grundlage ihrer 16S rDNA Sequenzen erstellt. Ein großes Problem stellt das Festlegen einer genauen Abgrenzung zwischen den einzelnen Spezies dar. Der Grund dafür sind die geringen „bootstrap values“ im phylogenetischen Baum der neueren Aktinomyzeten (meint meistens Actinomyces Spezies, die nach 1990 entdeckt wurden oder die Vertreter des „core cluster 2“) (92) und damit die Grundlage zur Festlegung, wann sich Spezies voneinander unterscheiden. Sowohl die für die Analyse der Gensequenzen zugrundeliegenden Algorithmen und Parameter der phylogenetischen Analysen als auch die Anzahl der für den Vergleich zugrundeliegenden Spezies (und wiederum die Anzahl der Proben pro Spezies) können die Anordnung der Äste stark beeinflussen. Bei der nicht monophyletischen Gruppe (93) der Aktinomyzeten ist davon auszugehen, dass sich deren Topologie durch die Einführung neuer Spezies weiterhin ändert. Die bisherige Zuordnung der Aktinomyzeten aufgrund ihrer Gensequenzen stößt damit an ihre Grenzen. Deshalb wird vorgeschlagen, dass weitere Kriterien wie z.B. 12 physiologische, morphologische und chemotaxonomische Kriterien in die Topologie mit einfließen. Diese Kriterien fehlen momentan oft und müssen den neueren Spezies erst noch zugeordnet werden, weshalb die Bakterienart der Aktinomyzeten auch manchmal als „Abstellplatz“ für unklare Bakterienspezies bezeichnet wird (92). Für die Aktinomyzeten wurde anhand solcher Dendrogramme die Einteilung in zwei sogenannte „core cluster“ vorgeschlagen (92,93). In der Veröffentlichung unserer Studie ist eine solche Analyse ausgehend von unseren mittels MALDI-TOF-MS ermittelten Daten für die Referenz- stämme der Datenbank enthalten (Abb. 3). Uns diente das von Schaal 2006 erstellte Dendrogramm über die Verwandtschaftsbeziehungen der Actinomycetaceae als Vergleich für unsere Datenbank (92).

Abb. 3 Dendrogramm auf Grundlage der Referenzdatenbankzentroide (94)

13 2.4. Grundlagen zur Bearbeitung und Auswertung der Spektren mit Klassifikation und Clusteranalyse

2.4.1. Zentroide Für jedes Isolat einer Spezies wurden 10 Spektren aufgenommen. Um den Datenbestand weiter bearbeiten zu können, müssen die aufgenommenen Spektren in eine miteinander vergleichbare Form überführt werden. Um identische Peaks in den Datensätzen zu erkennen, wird ein gleitendes Massefenster verwendet. Allen Peaks, die in ein Massefenster fallen, wird der mittlere m/z-Wert der Peaks in diesem Fenster und eine mittlere Peakintensität zugeordnet. Peaks, die nur in einem oder wenigen Spektren auftreten, werden für die weiteren Untersuchungen nicht berücksichtigt. Auf diese Weise werden Peaks, die in der Mehrzahl der Spektren auftreten, in ein gemeinsames, übergeordnetes „Isolat-Spektrum“ überführt. Waren mehrere Isolate für eine Spezies vorhanden, wurde diese Vorgehensweise wiederholt und ein speziesspezifisches Spektrum („Spezies-Zentroid“ oder „Zentroid- spektrum“) erzeugt, das mit dem Schwerpunkt eines vieldimensionalen ungleichmäßigen geometrischen Körpers verglichen werden kann. Diese Zentroidspektren, die Informationen vieler einzelner Spektren enthalten, können nun mit bekannten oder unbekannten Spektren verglichen werden. Für den Vergleich von Spektren und Zentroidspektren müssen zunächst die Merkmale der Objekte festgelegt werden, die miteinander verglichen werden sollen und das Maß, welches die Ähnlichkeit oder Proximität ausdrückt. Normalerweise werden die Merkmale eines Objektes numerisch angegeben und stellen deshalb Punkte in einem n- dimensionalen Raum dar. In dieser Arbeit wird das binäre Jaccard-Distanzmaß genutzt (95,96). Dabei handelt es sich um eines der Token-basierten Distanzmaße, wobei Teilstücke (sogenannte Token) der zu vergleichenden Zeichenkette in einem Vektorraum miteinander verglichen werden. Die so als gleich bewerteten Token werden anschließend mit der Anzahl aller Token der Zeichenkette verglichen, wobei der Wert eine Zahl zwischen 0 (Identität) und 1 (keine Ähnlichkeit) annehmen kann (97).

2.4.2. Ähnlichkeitsanalyse Die Clusteranalyse dient dem Auffinden von Ähnlichkeitsbeziehungen in großen Datenbeständen. Als Cluster werden dabei Gruppen von in Bezug auf das gewählte Distanzmaß „ähnlichen“ Zentroidspektren bezeichnet. Im Gegensatz zu der unten beschriebenen Klassifikation, bei der die Daten bestehenden Klassen zugeordnet werden, 14 werden hier Gruppen in den Daten auf der Grundlage von Distanzmaßen gebildet. Das Ziel der Clusteranalyse besteht darin, neue Gruppen in einem Datenbestand zu identifizieren. Dabei sollten Objekte innerhalb einer Gruppe idealerweise die größtmögliche Identität und Objekte anderer Gruppen hingegen einen größtmöglichen Unterschied aufweisen. In diesem Zusammenhang wird die Clusteranalyse häufig für die Typologie von Bakterien eingesetzt. Die Clusteralgorithmen gehören zu den unüberwachten Lernverfahren, da keine bekannten Merkmale der Daten für die Einteilung genutzt werden. Dies trifft vor allem auf experimentelle Fragestellungen zu, wenn deren Datenbestand noch nicht klassifiziert wurde. Die Konstruktion der Cluster geht dabei von einer Ähnlichkeitsmatrix aus und kann grundsätzlich auf verschiedenen Wegen erfolgen (98). Die partitionierenden und hierarchischen Verfahren stellen neben der graphentheoretischen und optimierenden Verfahrensweise die klassischen Methoden dar. Bei hierarchischen Systemen bestehen die Cluster aus Objekten, die zueinander eine größere Ähnlichkeit aufweisen als zu den Objekten anderer Cluster. Es wird eine Hierarchie aufgestellt, bei der auf der einen Seite ein Cluster entsteht, der alle Objekte enthält und auf der anderen Seite eine maximale Auftrennung der Objekte erfolgt. Diese Hierarchie kann divisiv oder agglomerativ erfolgen. Beim divisiven Clusterverfahren („Top- down-Verfahren“) werden aus einem Cluster schrittweise mehrere kleinere Cluster gebildet. Beim agglomerativen Verfahren („Bottom-up-Verfahren“) erfolgt die Clusterbildung in umgekehrter Reihenfolge ausgehend von einzelnen Objekten bis hin zur Vereinigung der Objekte in einen gemeinsamen Cluster (99,100).

2.4.3. Hierarchisch-agglomeratives Verfahren und Darstellung der Ergebnisse Bei diesem verbreiteten Verfahren werden ausgehend von einzelnen Objekten Gruppen gebildet und diese weiter zu größeren Gruppen fusioniert. Es existieren veschiedene Verfahren, die dieses Fusionskriterium definieren, wie z.B. das „single linkage“-, „complete linkage“-, „average linkage“-, „centroid clustering“- oder das Ward´sche Verfahren. Das von uns benutzte „complete linkage“-Verfahren wird vor allem verwendet, um Cluster mit möglichst geringem Durchmesser zu erzeugen, da sich der Abstand der beiden Gruppen aus dem maximalen Abstand zweier Objekte aus jeweils einer der Gruppen ergibt. Die Heterogenität der Gruppen wächst damit im Laufe des Verfahrens an. Nach jeder Fusion werden neue Abstände zwischen den Gruppen ermittelt und iterierend verarbeitet. Das Ergebnis wird in einem Dendrogramm dargestellt (101). Dabei stellen die Knotenpunkte die Gruppen dar. Die Inklusionsbeziehungen werden durch die waagerechten Linien dargestellt. Abstandsrelationen werden anhand der Länge der waagerechten Linie und 15 damit deren Fusionreihenfolge angezeigt. Je näher die Knotenpunkte dabei an den ursprünglichen Objekten oder Gruppen liegen, desto näher sind sie miteinander verwandt. Die Länge der vereinigten Klammer in Richtung der X-Achse gibt die Kompaktheit des Clusters an (102). Die Clusteranalyse kann mittels Computerprogrammen wie SPSS (103) oder mit Hilfe von Algorithmen, wie sie z.B. in Matlab (104) bereit gestellt werden, erfolgen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bioinformatics-Toolbox von Matlab verwendet. Komplexe Distanzbeziehungen einer großen Anzahl von Objekten werden dabei übersichtlich dargestellt. Die Zuordnung der Objekte hängt stark vom verwendeten Verfahren ab (105). Auch haben oft kleine Veränderungen des Datensatzes (Einfügen oder Weglassen einer Probe) drastische Effekte auf die Struktur des Dendrogramms.

2.4.4. Klassifikation Support-Vektor-Maschinen (SVM, „support vector machines“) gehören zu den überwachten Lernverfahren, da hier markierte Trainingsdaten verwendet werden. Die Zentroide der Referenzspektren unserer Datenbank, die bereits einer Klasse, in unserem Falle einer Spezies, zugeordnet sind, stellen dabei die Trainingsmenge mit ihren charakteristischen Merkmalen in Form der bereits beschriebenen zusammengefassten Peaklisten dar. Mit dieser Trainingsmenge wird ein Klassifikator erstellt, der in der Lage ist, Objekte anhand ihrer Merkmale einer Kategorie zuzuordnen. Der Vorteil von SVM besteht in ihrer Transparenz und leichten Handhabung (106). Sie stellen darüber hinaus eine solide Grundlage für unsere Arbeit dar, da sie bereits sehr gute Ergebnisse, u.a. auch im Bereich der Bakterienidentifizierung, gezeigt haben (107,108,109). Bei dem „support vector“ als „large margin classifier“ wird eine Menge von Objekten so in Klassen eingeteilt, dass zwischen ihnen ein möglichst großer Bereich frei bleibt. Jedes Objekt stellt dabei einen Vektor in einem Vektorraum dar. Der Klassifikator fügt in diesen Raum eine Hyperebene ein, die als Trennfläche fungiert und die bekannten Objekte in zwei Gruppen aufteilt. Diese Trennfläche liegt so, dass der Abstand der Vektoren, die der Trennebene am dichtesten anliegen, maximal wird (Abb. 4).

16

Abb. 4 lineare Trennung Abb. 5 nicht-lineare Trennung

Der Nutzen der maximierten Trennebene liegt darin, dass auch Objekte, die nicht genau die Werte der Trainingsobjekte annehmen, trotzdem einer Klasse zugeordnet werden können. Eine Trennung kann hierbei nur durch eine lineare Trennebene erfolgen (Abb. 4), die für die meisten Anwendungsbeispiele nicht existiert (110). Deshalb wird der sogenannte Kernel-Trick angewandt, bei dem der Vektorraum in einen höher- dimensionalen Raum überführt wird, bis eine lineare Trennung möglich ist. Bei der Rücktransformation in den ursprünglichen Raum entsteht eine nichtlineare Trennebene (Abb. 5), die in der Lage ist, die zwei Klassen voneinander zu unterscheiden. Im Rahmen unserer Arbeit wurde jedoch lediglich eine lineare Trennung verwendet. Das beschriebene SVM-Verfahren wird typischerweise für 2-Klassen-Probleme („binary-class SVM“) genutzt. Moderne Weiterentwicklungen der Programme können jedoch auch wie in unserem Fall für n-Klassen-Probleme („multi-class SVM“) angewandt werden. Dabei werden verschiedene Ansätze unterschieden, die entweder mehrere „binary-class SVM“ kombinieren oder direkt alle Daten innerhalb eines optimierten „multi-class SVM“ verarbeiten (111). Für den Vergleich zwischen den klinischen Isolaten und den Spezies der Referenzdatenbank wurde die „one-versus-one“-Methode als „multi-class-SVM“ verwendet. Dabei werden die zu vergleichenden Objekte paarweise analysiert und einer Klasse zugeordnet. Die Klasse, welche die meisten Übereinstimmungen mit der untersuchten Probe zeigt, wird als Identifikationsergebnis bestimmt. Genaue Beschreibungen über Kernelfunktionen und „support vector machines“ sind in zahlreichen Fachbüchern zu finden (112,113). In dieser Arbeit wurde das MATLAB-Interface der LIBSVM-Toolbox genutzt (114). Weitere Klassifikationsmethoden wie „random forest“-

17 Algorithmen oder „kernel matching pursuits“ (115,116) wurden in dieser Arbeit nicht genutzt.

18 3. Publikation

Rapid identification of oral Actinomyces species cultivated from subgingival biofilm by MALDI-TOF-MS

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Datenbank bekannter Bakterienspezies mittels MALDI-TOF-MS-Analyse angelegt und mit einem SVM-Algorithmus ausgewertet. Es wurde keine kommerziell erhältliche Identifizierungssoftware benutzt. Das Differenzierungspotential der MALDI-TOF-MS auf Grundlage der eigens angelegten Datenbank und der Identifizierungsalgorithmen wurde mit jeweils 20 Bakterienstämmen der sehr nah verwandten Spezies A. naeslundii und A. oris überprüft. Es konnte in 100 % der Fälle eine korrekte Identifizierung erzielt werden.

C.-S. Stingu und T. Borgmann haben gleichberechtigt zur Arbeit beigetragen.

19 ournal of ralr æ icrobiologyi

ORIGINAL ARTICLE Rapid identification of oral Actinomyces species cultivated from subgingival biofilm by MALDI-TOF-MS

Catalina S. Stingu1$*, Toralf Borgmann1$, Arne C. Rodloff1, Paul Vielkind1, Holger Jentsch2, Wolfgang Schellenberger3 and Klaus Eschrich3

1Institute for Medical Microbiology and Epidemiology of Infectious Diseases, University Hospital of Leipzig, Leipzig, Germany; 2Centre of Periodontology, Department for Cariology, Endodontology and Periodontology, University Hospital of Leipzig, Leipzig, Germany; 3Institute of Biochemistry, University of Leipzig, Leipzig, Germany

Background: Actinomyces are a common part of the residential flora of the human intestinal tract, genitourinary system and skin. Isolation and identification of Actinomyces by conventional methods is often difficult and time consuming. In recent years, matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) has become a rapid and simple method to identify bacteria. Objective: The present study evaluated a new in-house algorithm using MALDI-TOF-MS for rapid identification of different species of oral Actinomyces cultivated from subgingival biofilm. Design: Eleven reference strains and 674 clinical strains were used in this study. All the strains were preliminarily identified using biochemical methods and then subjected to MALDI-TOF-MS analysis using both similarity-based analysis and classification methods (support vector machine [SVM]). The genotype of the reference strains and of 232 clinical strains was identified by sequence analysis of the 16S ribosomal RNA (rRNA). Results: The sequence analysis of the 16S rRNA gene of all references strains confirmed their previous identification. The MALDI-TOF-MS spectra obtained from the reference strains and the other clinical strains undoubtedly identified as Actinomyces by 16S rRNA sequencing were used to create the mass spectra reference database. Already a visual inspection of the mass spectra of different species reveals both similarities and differences. However, the differences between them are not large enough to allow a reliable differentia- tion by similarity analysis. Therefore, classification methods were applied as an alternative approach for differentiation and identification of Actinomyces at the species level. A cross-validation of the reference database representing 14 Actinomyces species yielded correct results for all species which were represented by more than two strains in the database. Conclusions: Our results suggest that a combination of MALDI-TOF-MS with powerful classification algorithms, such as SVMs, provide a useful tool for the differentiation and identification of oral Actinomyces. Keywords: MALDI-TOF-MS; oral Actinomyces; support vector machine

*Correspondence to: Catalina S. Stingu, Institute for Medical Microbiology and Epidemiology of Infectious Diseases, University Hospital of Leipzig, Liebigstrasse 21, DE-04103 Leipzig, Germany, Email: [email protected]

Received: 26 September 2014; Revised: 9 December 2014; Accepted: 12 December 2014; Published: 16 January 2015

ctinomyces are a common part of the residential quite recently. Although in 1986 only 10 species were flora of the human intestinal tract as well as recognized as Actinomyces (1), the number has increased Aother habitats such as the genitourinary tract to at least 36 by now (2), 20 of them being relevant for system and the skin. They are gram-positive, anaerobic, human medicine. Actinomyces species are mainly asso- and aerotolerant, non-spore-forming, non-motile pleo- ciated with cervicofacial actinomycosis, oral or cerebral morphic rods. Although the genus Actinomyces was abscesses, caries, and periodontitis (1, 3, 4). They seem already described in 1919, many new species were found to play a bigger role than expected in the pathogenesis

$Both authors had contributed equally to this work.

Journal of Oral Microbiology 2015. # 2015 Catalina S. Stingu et al. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons 1 Attribution-Noncommercial 3.0 Unported License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/), permitting all non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Citation: Journal of Oral Microbiology 2015, 7: 26110 - http://dx.doi.org/10.3402/jom.v7.26110 (page number not for citation purpose)

20 Catalina S. Stingu et al.

of osteoradionecrosis- and bisphosphonate-related osteo- identified using the diagnostic traits of the type strains necrosis of the jaw (5, 6), and can cause lethal infection (16Á18). such as mediastinitis (7). As a consequence, fast and The genotypes of all the reference strains and of 232 reliable identification methods for Actinomyces species clinical isolates were identified by sequence analysis of have become increasingly important. the 16S rRNA gene. The strain sequences were compared Isolation and identification of Actinomyces by con- with sequences deposited in GenBank using the program ventional methods is often difficult and time consum- BLAST through the NCBI server and with the sequences ing. Many studies have been performed to characterize deposited in the Human Oral Microbiome Database Actinomyces species using phenotypic (8Á10) and mole- (HOMD) using the program HOMD 16S rRNA Sequence cular (11, 12) approaches. Most of the available commer- Identification (19). We included in the reference database cial identification kits (Rapid ID 32 A, API Coryne, only the strains with percent identities of at least 99% VITEK 2, ANC ID Card, bioMerieux, and VITEK-MS, in both programs. bioMerieux) do not include the majority of newer species The similarity in 16S rRNA gene sequence analysis was in their database and the sophisticated molecular meth- very similar for A. odontolyticus and Actinomyces meyeri ods, such as chromosomal DNA fingerprinting, arbitra- in both programs that we used. Biochemical character- rily primed PCR, polymerase chain reaction-restriction istics cannot separate them either, so we pooled the two species and attempted using MALDI-TOF-MS only to fragment length polymorphism (PCR-RFLP) (13), and differentiate this group from other Actinomyces species. 16S ribosomal RNA (rRNA) sequencing, are still avail- able only in research and reference laboratories. MALDI-TOF-MS sample preparation In recent years, matrix-assisted laser desorption/ioniza- Individual colonies of each isolate or reference strain were tion time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) subcultured on Columbia blood agar for 4 days at 378C in has become a rapid and simple method to identify bacteria. an anaerobic chamber (Whitley MG1000 anaerobic work- However, this method can be used for routine detection station, Meintrup DWS Laborgera¨te, GmbH, Germany). only if high quality reference spectra databases are avail- Colonies from the half surface of plates were suspended in able (14, 15). Moreover, if phenotypically similar bacterial 1 ml DNase-free water (SIGMA, Taufkirchen, Germany) species are to be discriminated, powerful algorithms for and then centrifuged at 8,500 g for 15 min. The further spectra analysis are critical for success. processing of the samples was done according to Frie- The present study aimed to evaluate a new in-house drichs et al. (15). For each strain, 10 consecutive spots identification algorithm using MALDI-TOF-MS for rapid were prepared. In order to demonstrate reproducibility, identification of different species of oral Actinomyces the sample preparation was repeated for each strain, cultivated from subgingival biofilm. starting with a new culture.

Material and methods MALDI-TOF-MS analysis The MALDI-TOF-MS procedures have been described in Bacterial strains detail elsewhere (15). Briefly, we used a MALDI-TOF In total, 685 bacterial strains were used in this study. mass spectrometer, Autoflex II (Bruker Daltonics) with Eleven were reference strains: Actinomyces dentalis (DSM a nitrogen laser (337 nm) operated in positive linear mode 19115), Actinomyces georgiae (DSM 6843), Actinomyces (delay 150 ns, voltage 20 kV, mass range 3Á20 kDa), and we used a Flexcontrol software version 2.4 (Bruker gerencseriae (ATCC 23860), Actinomyces graevenitzii Daltonics). Each spectrum was automatically obtained (DSM 15540), Actinomyces neuii (DSM 8576), Actino- (average of 500 laser shots). The spectra were calibrated myces odontolyticus (DSM 43331), Actinomyces radici- externally using the Escherichia coli DH 5 alpha strain dentis (DSM 15433), Actinomyces viscosus (DSM 43798), prepared the same way as the clinical samples. The data Actinomyces naeslundii (DSM 17233), Actinomyces oris files were transferred to Flexanalysis version 2.4 (Bruker (DSM 23056), and Actinomyces israelii ATCC 12107. Daltonics) for automated peak extraction. Sixty peaks The other 674 strains were fresh clinical isolates from were automatically labeled in each spectrum according to the subgingival biofilm of patients with chronic period- their appearance above the background (threshold ratio ontitis. The presumptive identification of the clinical 1.5). We controlled manually the correct labeling. Peak strains was performed by established biochemical meth- lists containing masses and intensities were exported as ods: colony morphology, pigmentation, gram stain mor- Excel files. phology, catalase test, CAMP test, and Rapid ID 32 A. Flowcharts for preliminary identification of Actinomyces Cluster formation of the mass peaks species proposed from Sarkonen et al. were also used (9). To refine spectra accuracy, peak lists were aligned for The newly described species (Actinomyces timonensis, Acti- mass drift adjustment (15). Briefly, a mass-dependent nomyces massiliensis, and A. dentalis) were preliminarily size of the mass window was used according to window

2 Citation: Journal of Oral Microbiology 2015, 7: 26110 - http://dx.doi.org/10.3402/jom.v7.26110 (page number not for citation purpose)

21 Identification of oral Actinomyces with MALDI-TOF-MS

sizesizeabs(sizerel * peak mass) with sizeabs 0.8 m/z Results and discussion and sizerel 0.001. Thus, for each bacterial species we Many scientific and clinical investigations have been arrived at a mean spectrum containing common m/z hampered by problems in the identification of Actinomyces values. All spectra obtained for this species were aligned species. The laboratory growth of these organisms is individually to the peaks of the mean spectrum by linear challenging, so identification of Actinomyces species is mass adjustment of the peaks (20). Subsequently, peak often based on histopathology and biopsy material. This clusters were formed which contained all peaks originating has led to an empirical treatment rather than a true from different individual spectra, however, occurring in diagnosis of actinomycotic infections. Therefore, efficient, the same window. All peaks assigned to one cluster are reliable, and rapid methods for the identification of represented by the respective mean cluster mass. In this Actinomyces at the species level would be of considerable study, each sample was analyzed 10 times (see MALDI- clinical value. TOF-MS sample preparation). The aligned m/z values of The sequence analysis of the 16S rRNA gene of all cluster peaks occurring in one sample and the respective references strains confirmed their previous identification. mean peak intensities are used for further analysis and One hundred and forty clinical strains were identified as denoted sample centroid. To set up the mass spectra Actinomyces species by sequence analysis of 16S rRNA reference database all sample centroids of a species were genes showing percent identities of at least 99% in both combined to species centroids. the NCBI BLAST and the HOMD Blast. The sample Similarity analysis centroids calculated from the MALDI-TOF-MS spectra A hierarchical clustering procedure performed with the obtained from the reference strains and 100 confirmed MatLab software (R2013b; the Math-Works Inc., Natick, Actinomyces were used to create the Actinomyces mass MA) (21) was used for both characterization of the simi- spectra reference database (Table 1). The other 40 larity relations between the species centroids of the mass well-identified clinical strains (20 A. naeslundii and 20 spectra reference database and identification of samples A. oris) were used as a test group. For each Actinomyces by finding the species centroid of the data base which species of the reference database a species centroid was is most similar to the sample centroid. The similarity calculated from all sample centroids available from between centroids was determined by pairwise compar- strains of this species. The species centroids were used ison. The Jaccard similarity measure was applied to the for quality assessment of the reference database and for similarity of the sample centroids. From the Jaccard simi- identification of unknown clinical samples. Actinomyces larity coefficients distances were calculated (1-Jaccard johnsonii, formerly known as A. naeslundii serotype WVA similarity coefficient), which are the percentages of non- 963, with only four entries proved to be very similar with zero cluster mass peaks that differ between the sample A. naeslundii strains. That was the reason for pooling centroids (21). The number of clusters to which the two these two species in one group when we used the database centroids contributed was counted. By this procedure, to identify the unknown clinical strains. a symmetric matrix of pairwise similarities (peak mass- based similarity matrix) was formed. Distance matrices Table 1. Species of Actinomyces which were included in the were calculated from normalized similarity matrices and reference database dendrograms were calculated on the basis of the distance matrices by using a complete linkage function. Species No. of strains Classification analysis Actinomyces dentalis 6 A machine learning method was used as an alternative to Actinomyces gerencseriae 15 similarity analysis in order to better identify Actinomyces Actinomyes georgiae 2 species. Sample centroids were classified using the support Actinomyces graevenitzii 1 vector machine (SVM) tool implemented in the Bioinfor- Actinomyces urogenitalis 1 matic toolbox of MatLab (21). The SVM algorithm was Actinomyces europaeus 1 trained with the reference database sample centroids Actinomyces israelii 15 of bacteria of known identity using a ‘one against one’ Actinomyces meyeri/odontolyticus 6 approach. To estimate the class prediction a 10-fold cross- Actinomyces oris 20 validation error was calculated for the training group. Actinomyces radicidentis 1 The training set was first divided into 10 subsets of equal Actinomyces timonensis 4 size. Sequentially, one subset was tested by using the Actinomyces naeslundii/johnsonii 24 classifier trained on the remaining nine subsets. Conse- Actinomyces neuii 3 quently, each probe of the training set was predicted Actinomyces massiliensis 11 once. The cross-validation accuracy is the percentage of Actinomyces viscosus 1 data which were correctly classified (15).

Citation: Journal of Oral Microbiology 2015, 7: 26110 - http://dx.doi.org/10.3402/jom.v7.26110 3 (page number not for citation purpose)

22 Catalina S. Stingu et al.

Fig. 1. Phenotypic relation between the species centroids of the Actinomyces reference database. The dendrogram was generated by similarity analysis. 1. A. dentalis, 2. A. gerencseriae, 3. A. georgiae, 4. A. graevenitzii, 5. A. urogenitalis, 6. A. europaeus, 7. A. israelii, 8. A. meyeri/odontolyticus, 9. A. oris, 10. A. radicidentis, 11. A. timonensis, 12. A. naeslundii/johnsonii, 13. A. neuii, 14. A. massiliensis, 15. S. sanguinis.

Already a visual inspection of the species centroids of Actinomyces than is Streptococcus sanguinis, which was different Actinomyces species reveals both similarities and included as an external reference. With only one reference differences. The results of a computational similarity spectrum created, one could wonder if the strains are good analysis are shown in Fig. 1. The dendrogram consists of representatives for these species. The species within each three significantly different main branches of Actinomyces. main branch show different degrees of similarity. However, Remarkably, the one represented by A. graevenitzii and the differences between them are not large enough to allow Actinomyces urogenitalis is more dissimilar to the other a reliable differentiation. This is mainly caused by the

Fig. 2. Similarity of the test group of 20 A. naeslundii strains on the x-axis with the centroids of the Actinomyces reference database on the y-axis. Black indicates identity while white indicates maximum dissimilarity. 1. A. dentalis, 2. A. gerencseriae, 3. A. georgiae,4.A. graevenitzii,5.A. urogenitalis,6.A. europaeus,7. A. israelii,8.A. meyeri/odontolyticus,9.A. oris,10. A. radicidentis, 11. A. timonensis, 12. A. naeslundii/johnsonii, 13. A. neuii, 14. A. massiliensis.

4 Citation: Journal of Oral Microbiology 2015, 7: 26110 - http://dx.doi.org/10.3402/jom.v7.26110 (page number not for citation purpose)

23 Identification of oral Actinomyces with MALDI-TOF-MS

inhomogeneity of the sample centroids of each species rRNA sequencing. The performance of the classification due to biological variation of strains and in some cases analysis was tested by two test groups of 20 samples each also due to a small number of samples contributing to the of confirmed A. naeslundii and A. oris. All of them were respective species. Both effects hamper the species identi- correctly identified (correct rate100%, sensitivity1, fication of unknown samples by similarity analysis. For specificity1). Taken into account that A. oris, formerly illustration, the results of a similarity analysis of a test known as A. naeslundii genotype 2, is closely related to group of 20 confirmed A. naeslundii samples are shown A. naeslundii, this result is encouraging. in Fig. 2. The sample centroids of each sample were The results of the identification of the unknown compared pairwise with the species centroids of the re- clinical samples by classification analysis are given in ference database. Black indicates identity, whereas white Table 2. indicates maximum dissimilarity. For a reliable species The quality and reliability of the identification depends identification, each sample should reveal a high degree on the quality and the amount of reference spectra pres- of similarity to the reference database species centroid of ent in the database (22). A higher number of entries for A. naeslundii and much less similarity to all other species the same species will better reflect the diversity within centroids. As can be seen, this is true only for some the species. Although obvious differences between spectra samples, for example, S1309, whereas other samples show were observed, only tentative identification can be made comparable similarities to different species centroids, for for the species which were not very well represented in example, S1397. our collection: A. georgiae, A. radicidentis, A. urogenitalis, Therefore, classification based on a SVM algorithm was A. europaeus, A. neuii, and A. graevenitzii. applied as an alternative approach for differentiation and identification of Actinomyces at the species level. A cross- Conclusions validation of the reference database represented by the Our results suggest that a combination of MALDI-TOF- sample centroids of the 14 Actinomyces species yielded MS with powerful classification algorithms, such as correct results (accuracy 100%) for all species which SVMs, provide a useful tool for the differentiation and were represented by more than two strains in the database. identification of oral Actinomyces, provided that the This provides a sound basis for an assignment of unknown database contains enough entries for one species to reflect Actinomyces strains to those species which are represented biological intra-species heterogeneity. in the reference database by a sufficient number of different strains to reflect the biological heterogeneity Acknowledgements within a species. Identification results pointing to species The authors appreciate the laboratory work of Angela Po¨schel and which are represented by less than 10 samples (A. georgiae, Annett Hennig-Rolle. A. radicidentis, A. urogenitalis, Actinomyces europaeus, A. neuii, and A. graevenitzii) may be correct but have to Conflict of interest and finding be interpreted with caution and should be verified by 16S The authors declare no conflict of interest in this study.

Table 2. Identification of unknown Actinomyces species References using classification by pattern recognition 1. Funke G. Actinomyces spp. und verwandte fakultativ anaerobe Bacterial strains No. of clinical strains grampositive Sta¨bchen. In: Neumeister B, Geiss HK, Braun R, Kimmig P, eds. Mikrobiologische diagnostik. Stuttgart: Georg Actinomyces dentalis 44 Thieme Verlag KG; 2009, p. 533Á8. Actinomyces gerencseriae 58 2. Schaal KP, Yassin AF., Stackebrandt E. The family Actinomyces georgiae 16 Actinomycetaceae: the Genera Actinomyces, Actinobaculum, Arcanobacterium, Varibaculum, and Mobiluncus. In: Dworkin Actinomyces graevenitzii 1 M, Falkow S, Rosenberg E, Schleifer K-H, Stackebrandt E, eds. Actinomyces urogenitalis 17 The prokaryotes Á a handbook on the biology of bacteria, 3rd Actinomyces europaeus 0 ed. New York: Springer Verlag; 2006, p. 430Á537. Actinomyces israelii 57 3. Marsh P, Martin MV. Oral microbiology, fourth edn. Oxford: Actinomyces meyeri/odontolyticus 8 Reed Educational and Professional Publishing; 1999. Actinomyces oris 58 4. Brailsford SR, Tregaskis RB, Leftwich HS, Beighton D. The predominant Actinomyces spp. isolated from infected dentin of Actinomyces radicidentis 0 active root canal lesions. J Dent Res 1999; 78: 1525Á34. Actinomyces timonensis 7 5. Hansen T, Kunkel M, Kirkpatrick CJ, Weber A. Actinomyces Actinomyces naeslundii/johnsonii 291 in infected osteoradionecrosis Á underestimated? Hum Pathol Actinomyces neuii 3 2006; 37: 61Á7. Actinomyces massiliensis 14 6. De Ceulaer J, Tacconelli E, Vandecasteele SJ. Actinomyces osteomyelitis in bisphosphonate-related osteonecrosis of the

Citation: Journal of Oral Microbiology 2015, 7: 26110 - http://dx.doi.org/10.3402/jom.v7.26110 5 (page number not for citation purpose)

24 Catalina S. Stingu et al.

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6 Citation: Journal of Oral Microbiology 2015, 7: 26110 - http://dx.doi.org/10.3402/jom.v7.26110 (page number not for citation purpose)

25 4. Zusammenfassung

Publikationspromotion zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. dent.

Titel: Schnelle Identifizierung von oralen Actinomyces-Arten des subgingivalen Biofilms mittels MALDI-TOF-MS

eingereicht von: Toralf Harald Borgmann

geboren am 14.04.1988 in Dresden

angefertigt am: Institut für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der Universität Leipzig und Institut für Biochemie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig

betreut von: Prof. Dr. med. Arne C. Rodloff

OÄ Dr. medic. Catalina-Suzana Stingu

Prof. Dr. Klaus Eschrich

16. Juni 2015

26 Die Studie zielte darauf ab, einen eigenen Klassifikationsalgorithmus für die Identifikation oraler Aktinomyzeten zu entwickeln und diesen zu evaluieren. In diesem Rahmen wurden 11 verschiedene Referenzstämme (Actinomyces dentalis (DSM 19115), Actinomyces georgiae (DSM 6843), Actinomyces gerencseriae (ATCC 23860), Actinomyces graevenitzii (DSM 15540), Actinomyces neuii (DSM 8576), Actinomyces odontolyticus (DSM 43331), Actinomyces radicidentis (DSM 15433), Actinomyces viscosus (DSM 43798), Actinomyces naeslundii (DSM 17233), Actinomyces oris (DSM 23056), Actinomyces israelii (ATCC 12107) und 674 klinische Stämme untersucht, die aus dem subgingivalen Biofilm parodontal erkrankter Patienten isoliert wurden. Alle Stämme wurden mittels Koloniemorphologie, Pigmentierung, Gramfärbung, Katalase- und CAMP-Test und Rapid API 32 A vorläufig identifiziert, um Fremdstämme von der Untersuchung auszuschließen. Der Genotyp der Referenzstämme und von 232 klinischen Isolaten wurde durch Sequenzierung der 16S rDNA bestimmt. Die Sequenzierung bestätigte die Identifizierung der Referenzstämme. Die 16S rDNA Sequenzen von 140 klinischen Stämmen wiesen sowohl in der Human Oral Microbiome Database (HOMD) als spezielle Datenbank für Bakterien aus dem oralen Milieu als auch in der wesentlich bekannteren Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) als Referenzgendatenbanken eine Ähnlichkeit von mindestens 99,9 % auf. Die Referenzstämme und 100 zweifelsfrei durch DNA-Sequenzierung identifizierte, klinisch gewonnene Aktinomyzeten wurden verwendet, um eine Maldi-TOF- Massenspektren-Datenbank zu erstellen. Weitere 40 sicher identifizierte Aktinomyzeten- isolate wurden verwendet, um eine Kontrollgruppe zu bilden. Diese bestand aus 20 Actinomyces naeslundii und 20 Actinomyces oris Stämmen. Die Stämme wurden unter anaeroben Bedingungen bei 37 ℃ für 4 Tage auf Columbia-Blutagar kultiviert und dem Protokoll von Friedrichs et al. (2007) folgend für die MALDI-TOF-MS-Analyse vorbereitet. Mit einem Bruker Autoflex II (Bruker Daltonics) wurden zehn Spots pro Bakterienstamm im Doppelansatz gemessen und mit der Flexanalysis 2.4 Software ausgelesen. Vor jeder Messung wurde das Gerät mit einem E. coli Standard (DH 5 alpha) kalibriert. In jedem Spektrum wurden maximal 60 Peaks identifiziert. Die Peakauswahl verlief automatisch, wurde jedoch manuell kontrolliert. Die ermittelten Peaks mit ihren Intensitäten und m/z- Werten wurden in Exceltabellen exportiert. Für jede Spezies wurden ausgehend von den gemessenen MALDI-TOF-MS-Daten speziesspezifische Zentroide gebildet, die sich aus den Zentroiden der Referenzstämme und klinischen Stämme der jeweiligen Spezies zusammensetzen. 27 Diese Zentroide wurden im weiteren Verlauf verwendet, um die Datenbank qualitativ zu überprüfen und die unbekannten Bakterienspezies zu identifizieren. Actinomyces odontolyticus und Actinomyces meyeri wurden ebenso wie Actinomyces naeslundii und Actinomyces johnsonii aufgrund zu starker Ähnlichkeit in jeweils eine Gruppe innerhalb der Datenbank zusammengefasst. Eine Kreuzvalidierung der aus 14 unterschiedlichen Aktinomyzetenspezies bestehenden Datenbank ergab korrekte Ergebnisse für alle Spezies, die mehr als zwei Vertreter innerhalb der Datenbank besaßen. Die Auswertung mittels Ähnlichkeitsanalysen auf Grundlage eines hierarchischen Clusterverfahrens wurde sowohl für die Erstellung der Verwandtschaftsbeziehungen der Spektren der Referenzdatenbank als auch für die Identifizierung von Spektren unbekannter Proben verwendet. Dabei wurden die Zentroide der Referenzstämme paarweise mit den Spektren der unbekannten Stämme verglichen und ermittelt, zu welchen sie die meiste Ähnlichkeit aufweisen. Diese Methode war geeignet für die Erstellung eines Dendrogramms, ausgehend von speziesspezifischen Zentroiden der Referenzdatenbank, zeigte jedoch erhebliche Schwächen bei der Identifizierung der Isolate der Kontrollgruppe. Deshalb wurde für die endgültige Identifizierung ein Klassifikator aus dem Gebiet des maschinellen Lernens eingesetzt, eine sogenannte „support vector machine“ (SVM). Die Kontrollgruppe wurde zu 100 % richtig identifiziert. Die Sensitivität und Spezifität der „support vector machine“ lag damit bei 1. Besonders erfreulich ist die Tatsache, dass es sich bei der Kontrollgruppe um Stämme der Spezies Actinomyces naeslundii und Actinomyces oris handelt, welche eine große Verwandtschaft aufweisen und vormals nur durch die Sequenzierung von Housekeeping-Genen unterschieden werden konnten (44). Um eine verlässliche Identifikation der oralen Aktinomyzeten zu ermöglichen, muss sich deren Heterogenität in der Referenzdatenbank widerspiegeln. Dazu sollten pro Spezies fünf bis zehn Vertreter in den Zentroidcluster der Referenzdatenbank aufgenommen werden. Die Ergebnisse für Aktinomyzetenspezies, die nur mit wenigen Stämmen in der Datenbank vertreten sind (Actinomyces georgiae, Actinomyces radicidentis, Actinomyces urogenitalis, Actinomyces europaeus, Actinomyces neuii und Actinomyces graevenitzii) sollten zurückhaltend interpretiert werden und gegebenenfalls mittels 16S rDNA Sequenzierung überprüft werden. Die 16S rDNA Sequenzierung hat für einen Fall eine Übereinstimmung mit einer bisher nicht identifizierten Aktinomyzetenspezies gezeigt. Dieses Isolat kann nun weitergehenden Analysen unterzogen werden und eventuell zur Beschreibung einer neuen Actinomyces Spezies dienen.

28 Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine Kombination aus der Datenerhebung mittels MALDI- TOF-MS und deren Verarbeitung durch SVM-Algorithmen eine gute Möglichkeit für die Identifikation und Differenzierung oraler Aktinomyzeten darstellt.

29 5. Literaturverzeichnis

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38 6. Anlagen

Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne unzulässige Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwertige Leistungen für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, und dass die vorgelegte Arbeit weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommene Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.

16.06.2015

Datum Unterschrift

39 Lebenslauf

Toralf Harald Borgmann geboren am: 14.04.1988 in Dresden Familienstand: ledig, keine Kinder

Schulische Ausbildung & Studium seit Oktober 2014 Vorbereitungsassistent in oralchirurgischer Praxis Fr. Essig in Delitzsch

September 2013 Vorbereitungsassistent in Gemeinschaftspraxis Dr. Schneider bis August 2014 in Elsterwerda

November 2012 ganztägige Forschung und Bearbeitung der am 26.10.2011 bis August 2013 begonnenen Dissertation am Institut für Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie Leipzig und am Institut für Biochemie in Leipzig seit 26.10. 2011 Dissertation am Institut für Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie mit dem Arbeitsthema „Untersuchung mittels MALDI-TOF-MS, PFGE und Nachweis von Resistenzen bei oralen Actinomyceten“

Oktober 2007 Zahnmedizinstudium an der Universität Leipzig mit bis Oktober 2012 bestandenem Staatsexamen vom 01.10.2012 und Verleihung der Approbationsurkunde als Zahnarzt vom 17.10.2012

Juni 2007 einwöchige Famulatur in der Mund-, Kiefer-, bis September 2007 Gesichtschirurgischen Praxis Dr. Dr. Reichert und Praktikum im Dentallabor André und May in Radebeul

Oktober 2006 Zivildienst in der Notfallaufnahme an den Elblandkliniken bis Mai 2007 Standort Radebeul

40 1998 - 2006 Gymnasium Luisenstift in Radebeul mit Abschluss der Allgemeinen Hochschulreife

1994 - 1998 Grundschule Am Waldpark in Radebeul

Leipzig, den 16.06.2015

41 Danksagung Zunächst möchte ich Herrn Prof. Dr. med. Arne C. Rodloff, Direktor des Institutes für Medizinische Mikrobiologie und Infektionsepidemiologie der Universität Leipzig, für die jederzeit gewährte Unterstützung danken.

Ich möchte mich darüber hinaus herzlich bei Frau Dr. Catalina-Suzana Stingu für die Bereitstellung der Thematik der Arbeit und die stets vorhandene Hilfsbereitschaft bei praktischen und theoretischen Fragen bei der gesamten Dissertationsschrift bedanken.

Ebenso gilt mein besonderer Dank Herrn Prof. Dr. Klaus Eschrich, der diese Arbeit mit viel Zeit- und Energieeinsatz begleitete und immer ein offenes Ohr für meine Fragen und Probleme hatte.

Auch Herrn Dr. Jochen Frenzel gilt mein Dank für die praktische Unterstützung der massenspektrometrischen Versuche.

Vielen Dank an Frau Andrea Böhme aus dem Institut für Biochemie der Universität Leipzig, die mich bis zuletzt mit viel Einsatz bei der Bakterienidentifizierung unterstützte.

Des Weiteren möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Institutes für Mikrobiologie und des Institutes für Biochemie für die dauerhafte und immer freundliche Unterstützung bedanken. Mein Dank gilt daher Frau Annett Hennig-Rolle und Frau Angela Pöschel, die ebenso einen großen Anteil zu meiner Arbeit beigetragen haben.

Am meisten möchte ich jedoch meinen Eltern danken, die mir durch ihre Unterstützung den Rückhalt zur Durchführung dieser Arbeit gegeben haben.

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