PRISCILA FERREIRA PAPA CARACTERIZAÇÃO DAS PROTEÍNAS Hnek5 E Hnek10 NO CONTEXTO DA RESPOSTA DO DANO NO DNA: UMA ABORDAGEM FUNC

! !!!!!!!!!!! !!!!!!PRISCILA FERREIRA PAPA! !

CARACTERIZAÇÃO DAS PROTEêNAS hNEK5 E hNEK10 NO CONTEXTO DA RESPOSTA DO DANO NO DNA: UMA ABORDAGEM FUNCIONAL E INTERACTÔMICA

Characterization of the hNEK5 and hNEK10 proteins in the DNA damage response context: a functional and interactomic approach

CAMPINAS 2015

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA

PRISCILA FERREIRA PAPA

CARACTERIZAÇÃO DAS PROTEêNAS hNEK5 E hNEK10 NO CONTEXTO DA RESPOSTA DO DANO NO DNA: UMA ABORDAGEM FUNCIONAL E INTERACTÔMICA

Characterization of the hNEK5 and hNEK10 proteins in the DNA damage response context: a functional and interactomic approach

Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Genética e Biologia Molecular, na área de Genética Animal e Evolução.

Thesis presented to the Institute of Biology of University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Genetics and Molecular Biology, in the Animal Genetics and Evolution area.

ORIENTADOR/SUPERVISOR: Prof. Dr. Jörg Kobarg

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Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972

Papa, Priscila Ferreira, 1987- P197c PapCaracterização das proteínas hNek5 e hNek10 no contexto da resposta do dano no DNA : uma abordagem funcional e interactômica / Priscila Ferreira Papa. Ð Campinas, SP : [s.n.], 2015.

PapOrientador: Jörg Kobarg. PapTese (doutorado) Ð Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.

Pap1. Proteina Nek5 humana. 2. Proteina Nek10 humana. 3. Interatoma. 4. Dano ao DNA. I. Kobarg, Jörg,1965-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Characterization of the hNek5 and hNek10 proteins in the DNA damage response context : a functional and interatomic approach Palavras-chave em inglês: Nek5 protein, human Nek10 protein, human Interactome DNA damage Área de concentração: Genética Animal e Evolução Titulação: Doutora em Genética e Biologia Molecular Banca examinadora: Jörg Kobarg [Orientador] Jenifer Saffi Guido Lenz Adriana Franco Paes Leme Aline Mara dos Santos Data de defesa: 07-08-2015 Programa de Pós-Graduação: Genética e Biologia Molecular

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Resumo A família de proteínas serina/treonina cinases Nek (NIMA related kinases) são similares ao seu homólogo NIMA (never in mitosis, gene A), uma proteína altamente conservada e crítica para a progressão do ciclo celular em Aspergillus nidulans. O interactoma e as funções dos 11 membros das Neks (1-11) em mamíferos permitiu associá-los à tríade funcional (1) mitose/centrossomo, (2) cílio primário/ciliopatias e (3) resposta ao dano no DNA, em revisão publicada por nosso grupo (Artigo I). Dentre eles, hNek5 e hNek10 são as menos caracterizadas quanto ao seu papel biológico. Assim, ensaios de duplo híbrido para Nek5 identificaram proteínas relacionadas à processos mitocondriais, dentre elas BCLAF1, Cox11 e MTX2, e ao dano no DNA, como BCLAF1 e TOPIIβ. Ensaios de colocalização e fracionamento subcelular indicaram a localização mitocondrial de hNek5 e seus efeitos na resistência à morte celular através de ensaios de apoptose e viabilidade celular (Artigo II). hNek5 pode ainda estar envolvida na resposta ao dano ao DNA à diversas drogas genotóxicas causando efeitos na parada do ciclo celular, estresse replicativo e desregulação na ativação de proteínas importantes para as respostas do dano no DNA (Artigo III). O interactoma de hNek10 foi analisado através de duas abordagens: (1) Screening de duplo híbrido indicando 12 interactores e (2) Espectrometria de massas identificando 58 e 117 proteínas interactoras sem e com indução de dano no DNA, respectivamente, associadas à processos biológicos como ciclo celular mitótico, proliferação celular, expressão gênica, processamento de RNA. Dentre as proteínas, confirmamos a interação com dois membros do complexo de coesinas, SMC1 e SMC3 e a depleção de hNek10 causou multinucleação, multilobulação nuclear, acúmulo na fase G1/S do ciclo celular, foci de γ-H2AX e aumento da morte celular; sugerindo que o silenciamento de hNek10 pode sensibilizar a célula à danos endógenos de DNA (Artigo IV). Isto posto, os estudos funcionais e interactômicos de hNek5 e hNek10 presentes neste trabalho permitiram caracterizá-las em novos processos biológicos, em especial, na resposta do dano no DNA.

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Abstract The Nek (NIMA related kinases) family of serine/threonine protein kinases is similar to its homolog NIMA (never in mitosis, gene A), a highly conserved and critical protein for the cell cycle progression in Aspergillus nidulans. The eleven members of the Neks (1-11) in mammals share biological functions grouped by the analysis of their interactomes in a functional triad, (1) mitosis/centrossome (2) primary cilia/ciliopathies (3) DNA damage response, in a review published by our group (Article I). Among them, hNek5 and hNek10 are least characterized as their biological roles. Therefore, a yeast-two hybrid screening identified Nek5 interactors related to mitochondria processes, such as BCLAF1, Cox11 and MTX2, and to DNA damage, BCLAF1 and TOPIIβ. Confocal microscopy images and subcellular fractionation indicated hNek5 mitochondrial localization and, by apoptosis assay and cell viability, its effects in cellular death resistance (Article II). Also, in response to genotoxic agents, hNek5 may cause effects in cell cycle arrest, replicative stress and deregulation in the activation of crucial proteins for the correct DNA damage response (Article III). hNek10 interactome was accessed by two approaches: (1) yeast-two hybrid screening indicating 12 interactors and (2) Mass Spectrometry identifying 117 and 58 interacting partners with or without DNA damage induction, respectively, associated to several biological processes, such as mitotic cell cycle, cell proliferation, genic expression, RNA processing. Among the interacting proteins, hNek10 interacted with SMC1 and SMC3, members of the cohesin complex, by immunoprecipitation assay and hNek10 depletion caused multinucleation, nuclear multilobulation, cell accumulation in G1/S, γ-H2AX foci and cell death increased levels, suggesting that hNek10 depletion may sensitize cells to internal genotoxic effects (Article IV). Taken together, the functional and interactomic results presented here for hNek5 and hNek10 characterized or corroborated their role in biological processes already related to other hNeks, especially in DNA damage response.

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Sumário Resumo………………………………………………………………………………….vii Abstract…………………………………………………………………………………..ix Lista de Figuras……………………………………………………...………...…...... xix Lista de Tabelas………………………………………………………………...……..xxi Lista de Abreviações………………………………………………………...... xxiii Introdução……………………………………………………………………………....01 Proteínas Cinases……………………………………………………………….03 Proteína cinase NIMA ...……………………………………………………...... 04 Família de proteínas cinases Nek humanas………………………………….05 Organização estrutural ...……………………………………………………….05 Biologia funcional das hNeks ……………………………………………...…..07 O Dano no DNA ………………………………………………………...……....07 Respostas ao Dano no DNA…………………………………………………...08 As vias de reparo do dano no DNA……………………………………………08 Ativação dos checkpoints do ciclo celular…………………………………….11 Relação funcional das hNeks no ciclo celular e na resposta do dano no DNA…………………………………………………………………………………...... 13 Relação funcional das Neks no cílio primário e na resposta do dano no DNA………………………………………………………...………...………...... …....17 A função das Neks nos processos apoptóticos mitocondriais………...... 24 A função das Neks no processamento de RNA……………………………...26 Nek5 ……………………………………………………...………………...... 27 Nek10.…...…………………………………………………………………...... 29 Objetivos………………………………………………………………………………..33 Objetivo geral…………………………………………………………………….35 Objetivo específico………………………………………………………………35 Resultados……………………………………………………………………………...37 Artigo I………………………………………………………………………...... 41 "Stop Ne(c)king around": How interactomics contributes to functionally characterize Nek family kinases…………………………………………………...... 43

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Artigo II………………………………………………………………………….63 Nek5 interacts with mitochondrial proteins and interferes negatively in mitochondrial mediated cell death and respiration…………………………………65 Artigo III…………………………………………………………………………75 hNek5 interacts with an anticancer target, Topoisomerase IIβ, and is involved in the DNA Damage Response …………………………………………...77 Artigo IV……………………………………………………………………….113 hNek10 depletion and interactome suggest its role in DNA Damage Response, apoptosis and nuclear integrity………………………………………..115 Discussão……………………………………………………………………………..157 Conclusões……………………………………………………………………………167 Referências Bibliográficas………………………………………………………...... 171 Anexos………………………………………………………………………………...183 Tabela 03……………………………………………………………………...185 Ensaios estruturais do domínio cinase da família das Neks...... 189 Declarações………………………………………………………………………...... 197

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“Os gregos usavam uma palavra evocativa para descrever tumores, onkos, que significa “massa” ou “fardo”. (...) O câncer é, de fato, um fardo construído em nosso genoma, o contrapeso de chumbo das nossas aspirações de imortalidade. Mas se olharmos para além dos gregos, para a ancestral da língua indo-europeia, a etimologia da palavra onkos se altera. Onkos vem de nek. E nek, diferentemente da estática onkos, é a forma ativa da palavra carregar. Significa transportar, mover o fardo de um lugar para outro, suportar algo através de longa distância e deixá-lo noutro lugar. É uma imagem que captura não apenas a capacidade de viajar da célula cancerígena -metástase-, mas também a viagem de Atossa, o longo arco da descoberta científica- e embutido nessa jornada o ânimo, tão inextricavelmente humano de superar e sobreviver. “ (“O imperador de todos os males”, Siddhartha Mukherjee)

Mares calmos não fazem bons marinheiros. (Desconhecido)

Se quiser ir rápido, vá sozinho.

Mas se quiser ir longe, vá em grupo. (Provérbio Africano)

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Agradecimentos. ! Agradeço humildemente à Deus, que na sua sapiência me guiou de mãos dadas nos caminhos que, para mim, pareciam impossíveis e pelas grandes conquistas concedidas à mim. Agradeço cegamente à minha Mãe, Kelly Rangel, que me ensinou a ser forte, a enfrentar, a lutar. Por ser meu chão e por nunca ter me abandonado. Obrigada por me criticar, por me empurrar sempre, por acreditar em mim, por me deixar voar. Obrigada por tudo e absolutamente tudo o que você faz por mim. Eu tentei e espero que tenha te orgulhado! Ao Marco, por me adotar como filha, por me ensinar o amor à Deus, por me ajudar a crescer como pessoa, por me ouvir, por seu meu professor. Obrigada pelas palavras mesmo no seu silêncio quando chorei no seu colo. Obrigada por estar sempre comigo. Eu também tentei te orgulhar! Ao Hugo...meu amor! Sem sombra de dúvida você é co-autor desta tese. Obrigada pelas horas extras no laboratório, pelo enorme incentivo, pela sua curiosidade que me fazia questionar meu próprio trabalho. Agradeço por rir comigo, mas também por enxugar as minhas lágrimas, por superar à distância, pelo amor, pelos sonhos realizados, por estar comigo e por me fazer sorrir diariamente... Ë você tenho meu infinito agradecimento. Eu amo você! Ë minha avó, por seu todo seu amor, carinho, sapiência e ensinamentos. Ë Lilica, pelas lambidas e pela companhia na escrita dessa tese. Você é minha eterna “godinha”, minha bebê.

Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Jörg Kobarg por ter me aceitado como aluna e aprendiz por duas vezes, pela contínua motivação pessoal e profissional, por todas as oportunidades nacionais e internacionais. Obrigada pelos fortes abraços de apoio, por entender os meus erros, e, mesmo assim, garantir minha liberdade ao longo do meu trabalho. Simplesmente, obrigada! Ë SGC pela infraestrutura incrível e acolhida, ao Prof. Dr. Stephan Knapp pela oportunidade, ao Jon Elkins pela orientação e ao Eidarus e à Leela, pela ótima amizade e pelo apoio quando minha saúde falhou.

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Ao IRB, em especial ao Prof. Dr. Joan Roig, que me ensinou a (tentar) ser mais calma ao longo do meu dia de trabalho, à entender as adversidades do dia- a-dia, pela oportunidade e à Susana, Paula e Cristina pela companhia. Aos colegas de Barcelona, em especial ao (Kisarum) Alexandre Tomasoni, que tornou os dias ainda mais agradáveis. Aproveito e agradeço à própria cidade de Barcelona (tão viva que quase parece um organismo próprio) por tantos descobrimentos pessoais, acolhida e pelos dias de sol mais lindos. Aos membros da banca de defesa de doutorado, pela contribuição e pelo tempo dedicado à este trabalho. Aos membros da banca de qualificação e pré-banca pelo tempo dedicado e pela avaliação desde o início do meu projeto até os resultados centrais deste trabalho. Ë Pós-Graduação, em especial, à Lourdes, secretária da PGGBM, por toda ajuda burocrática e pela oportunidade em continuar meus estudos no querido Instituto de Biologia da UNICAMP. Ao Prof. Dr. Kleber Franchini, ao LNBio e ao CNPEM, por toda a infraestrutura de facilities, financeira, eventos cientifícos, por ter garantido boas amizades e 5 anos e meio de aprendizado científico fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho e para minha formação. Ës todas as técnicas (os) e ex-técnicas (os) do LNBio, por terem facilitado o dia a dia deste trabalho. Ao Prof. Dr. Lúcio, Kaliandra, Juliana Smetana e Tereza pelo grande auxílio nos experimentos de high throughput de imunofluorescência no Operetta. Ao Laboratório de Microscopia do LNBio pela contribuição em parte dos experimentos de microscopia confocal e, em especial, ao Silvio Consonni por ser sempre muito solícito e pelas ótimas indicações de restaurante japonês. Ao Laboratório de Espectrometria de Massas, Romênia, Bianca e Profa. Dra. Adriana Paes Leme pelo acompanhamento nos experimentos de Espectrometria de massas.

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Ë Maria Eugênia por todo o seu trabalho, dedicação como técnica do nosso grupo e pelas boas memórias, afinal só a gente sabe o que é um verdadeiro Talento! Aos colegas de trabalho do grupo: Edmárcia, pela colaboração no trabalho da Nek10. Ë Mariana, pelas perguntas que sempre me faziam refletir. Ao Bruno, pela paciência em ser meu vizinho de bancada todos os dias. Ë Vanessa, por ser amiga de duplo híbrido, ótima vizinha e pelas gírias baianesas. Ë Arina Perez, por tudo o que fez por mim naqueles dias em Barcelona e ainda faz! Ë Fernanda Basei, por todas as suas idéias e conselhos geniais. Ë Talita Hanchuk, por ouvir meu contínuo falatório, por caminhar comigo ao longo desses 4 anos e meio, ter acreditado no meu trabalho e por ter estendido a mão quando eu já não tinha mais esperança. Ë Ângela Saito, por ser uma amiga do peito durante a faculdade, pelos 10 anos de convívio (pacíficos ou, por vezes, nem tanto), pelas boas memórias de Interbio, de festas, provas e trabalhos. Aos antigos alunos do grupo que me ajudaram e entenderam quando eu ainda engatinhava durante a Iniciação Científica e no início do doutorado: Gustavo Bressan, Gabriela Meirelles, Marcos Alborghetti, Marcos Toty, Daniel Lanza, Daniel Saito, Eduardo Moraes, Diogo Lovato, Fernanda Costa, Germanna, Deivid, Bárbara Godoy, Gustavo Camacho, Jessica Bernachi. Ë Kaliandra de Almeida Gonçalves que mesmo após a Iniciação Científica, continuou me orientando e colaborando nos trabalhos do doutorado. Serei sempre grata por todo o conhecimento que você me ensinou (e ainda ensina). Ës meninas do grupo do LEC. Vocês foram essenciais no final dessa jornada! Obrigada pelas discussões científicas e por serem tão afáveis comigo: Aline Bridi, Jéssica, Michele Assis, Tábata, Nathalia V., Natalia L., Izabel e à "chefa", Ana Figueira, por entender uma intrusa sempre no meio do seu grupo. Ao grupo de Espectrometria de Massas, em especial para a animada Sami, a delicada Carol Moreto, à menina-da-praia Flávia e à doce Johanna. Vocês fizeram meus dias mais felizes!!!!!

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Ë Roméria que me fez relembrar dos meandros do duplo híbrido e por ter garantido boas risadas naquele dezembro de 2014. Ë Alessandra Luiza Pelegrini, por ter sido uma grande colaboradora nos ensaios de dano no DNA (cometa). Obrigada por todo o apoio profissional. Ao Daniel MT, que mais do que "oráculo" para os problemas experimentais foi um grande amigo. Obrigada pelas risadas, mochas e lattes, pelo carinho, pelos puxões de orelha e por praticamente ter me carregado no colo quando eu precisei. Ao meu grupo de amigas da faculdade. Por vezes distante (ou muito distante geograficamente), obrigada pela torcida e por entenderem as minhas peculiaridades. Ë vocês, minhas queridas: Ana Luiza, Aneci, Ângela Saito, Ariane Saldanha, Ariane Furlan, Izabel, Larissa e Milena. Aos meus amigos de organização do CAEB (e agregados). Obrigada por entenderem meus horários loucos e ensinado tanto sobre planejamento. Em especial, à Ciça minha grande amiga e "filha". E também à Suzana (Suzi) que se tornou uma referência de bravura e inteligência na ciência pra mim. Você me ensinou que sempre podemos ir muito além, basta enfrentar. Ë Maraliza, minha amiga de adolescência que sempre me ouve e entende minha ausência. Ao meu amigo Alexandre Machado de Andrade, que após 21 anos ainda mantém nossa amizade. Obrigada por sempre me encher de orgulho das suas novidades. Ao CNPq e à FAPESP pelo suporte financeiro, segundo projeto de doutorado direto com processo FAPESP número 2010/15262-2. Ë UNICAMP eu agradeço por todo o conhecimento que aprendi, pelos excelentes professores durante o curso da graduação e na pós-graduação, pelas vivências culturais e acadêmicas. Obrigada por toda a acolhida e pelo grande empurrão profissional e pessoal. Após 9 anos e meio, estou me desligando da Universidade que me traz tanto orgulho e em que tanto sonhei estudar. Espero que esta não seja uma despedida, mas apenas um até logo...

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Lista de Figuras

Figura 01: Ilustração da estrutura secundária dos 11 membros da família das Neks e das regiões de interação com alguns de seus interactores...... 06

Figura 02: Relação entre os agentes de dano, tipos de lesões no DNA e as vias de reparo envolvidas...... 10

Figura 03: Esquema representativo do ciclo celular mitótico ...... 13

Figura 04: Ilustração esquemática do envolvimento de membros das Neks nos processos mitóticos e resposta de dano no DNA...... 15

Figura 05: Representação esquemática do cílio primário e sua fomação durante a progressão do ciclo celular...... 18

Figura 06: Ilustração esquemática representando a relação entre as Neks na resposta do dano no DNA e ciliopatias...... 23

Figure 07: Ilustração esquemática dos papéis funcionais de Nek5 descrito até o momento para A. thaliana e humanos...... 29

Figura 08: Ilustração do papel de Nek10 na via de MAPKs em resposta ao estresse genotóxico de radiação UV...... 32

Figura 09: Rede de interações de hNek5 com primeiros vizinhos, BCLAF1 e TOPIIβ, e segundos vizinhos com destaque para os processos biológicos enriquecidos...... 160

Figura 10: Ilustração esquemática da via de reparo por recombinação homóloga...... 164

Figura 11: Ilustração de novos processos biológicos associados para as Neks e de processos já descritos...... 166

Figura 12: Géis de SDS-PAGE da primeira purificação por afinidade dos clones hNEK11KD-G03, hNEK9KD-G03 e hNEK9KD-H06...... 191

Figura 13: Gráficos e géis de SDS-PAGE da purificação por gel filtração e de rebinding por afinidade à resina enriquecida com níquel...... 192

Figura 14: Gráfico referente às curvas de desnovelamento de hNEK9KD diante de um gradiente de temperatura...... 193

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Lista de Tabelas Tabela 01: Genes das proteínas envolvidas nas principais vias de reparo de dano no DNA...... 11

Tabela 02: Mutações de Nek10 encontradas em tumores pulmonares, metastáticos e de ovário...... 31

Tabela 03: Descrição dos processos biológicos dos primeiros vizinhos, BCLAF1 e TOPIIB, e segundos vizinhos, proteínas já identificadas como interactoras de BCLAF1 e TOPIIB, de hNek5 representadas na Figura 09...... 185

Tabela 04: Construções dos domínios cinases das Neks testadas para expressão bacteriana ou em célula de inseto...... 190

Tabela 05: Compostos potenciais obtidos nas reações de deslocamento térmico da proteína hNEK9KD...... 194

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Lista de Abreviações

γ-H2AX: gama-H2AX ou serina 139 de H2AX fosforilada 53BP1: p53 binding protein 1 aa: aminoácidos AGC: grupo de proteínas cinases A, G e C AIF: Allograft inflammatory factor 1 protein AIFM-1: Apoptosis-inducing factor 1, mitochondrial protein ANXA5: Annexin-5 protein ATM: Ataxia telangiectasia mutated protein ATP: Adenosine trhiphosphate ATR: Ataxia telangiectasia-mutated and Rad3-related homolog protein ATRIP: ATR-interacting protein Bad: Bcl2-associated agonist of cell death protein Bak: Bcl-2 homologous antagonist/killer protein BER: Base excison repair Bcl-2: B-cell lymphoma 2 protein BCLAF1: Bcl-2-associated transcription factor 1 protein Bid: BH3-interacting domain death agonist protein BLM: Bloom syndrome protein BRCA1: Breast Cancer 1 protein BUBR1: Bub1- related kinase protein CAMK: classe de enzimas Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase CDC2: Cell division control protein 2 CDC25A: Cell division cycle 25A protein Cdk2: Cyclin-dependent kinase 2 protein CENP-E: Centromere protein E CEP164: Centrossomal Protein 164 kDa Chk1, 2: Checkpoint kinase 1 e 2 CKI: grupo Casein Kinase I protein

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CMGC: grupo incluíndo cyclin-dependent kinases (CDKs), mitogen-activated protein kinases (MAP kinases), glycogen synthase kinases (GSK) and CDK-like protein kinases COX11: Cytochrome c oxidase assembly protein COX11, mitochondrial DHX36: DEAH-Box protein polypeptide 36 DNA: ácido desoxirribonucleico DNA-PKcs: DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit DYNLL/LC8: dynein light chain 8 protein EGFR: Epidermal growth factor receptor ERK1: Extracellular signal-regulated kinase 1 EXO1: Exonuclease 1 FA: Fanconi Anaemia FGF: Fibroblast growth factor G0, 1 e 2: Gap 1, 2 e 3 Hec1: Highly expressed in cancer protein 1 Hek293T: Human Embrionyc Kidney 293 Cell line constitutivamente expressando o antigeno T do SV40 HeLa:!Human epithelial cervical cancer cell line HER-2: human epidermal growth factor receptor 2 HR: Homologous recombination hTERT-RPE1: Linhagem epitelial de retina normal humano IFT: Intraflagelar transport IP: Imunoprecipitação IR: Ionizing irradiation Jck:!Juvenile cystic kidneys kDa: kilodaltons Kif11, 3A:!kinesin family member 11 e 3A MAPKs: Mitogen Activated Protein Kinases MCF10A: Linhagem cellular epitelial de glândula mamária humana MCF7: Linhagem cellular de adenocarcinoma mamário humano McI-1: Myeloid cell leukemia 1 protein

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MDA-MB-231: Linhagem cellular de adenocarcinoma mamário humano MEK1: MAPK/ERK kinase 1 MMR: Mismatch repair Mps1: Monopolar spindle 1 protein MRE11: Meiotic recombination 11 protein mRNA: RNA mensageiro MTX2: Metaxin 2 N4BP2L2:!NEDD4-binding protein 2-like 2 isoform 2 NBS1: Nucleotide-binding site protein 1 NEK: NIMA-related kinases NER: Nucleotide excision repair NF-kB: Nuclear factor-!kappaB NHEJ: Non-Homologous End Joining NIMA: Never in mitosis, gene A p21: Tumor protein 21kDa p53:!Tumor protein 53kDa PARP-1: Poly [ADP-ribose] polymerase1 PDGF:!Platelet-derived growth factor PEST: região rica nos resíduos Prolina, Ácido Glutâmico, Serina, Treonina PKD: Policystic Kidney Disease. PLK1: Polo-like kinase 1 PP1: Protein phosphatase 1 PRPF4B: Serin/theornine-protein kinase PRP4 homolog PUMA: p53 upregulated modulator of apoptosis RB: Retinoblastoma protein RCC: Renal Cell Carcinoma RCC1: Regulator of Chromosome Condensation protein 1 RECQ: RecQ-mediated repair RGC: grupo Receptor Guanylate Cyclases proteins RNA: Ácido ribonucleico RPA: Replication protein A

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RPGRIP1: RPGR-interacting protein 1 RPGRIP1L: RPGR-interacting protein 1-like RPLs:!50S ribosomal proteins L19 RPSs:!40S ribosomal proteins S16 S-Phase: Fase S do ciclo celular SCC1, 3: Sister Chromatid Cohesion 1 e 3 SDCCAG8:!Serologically defined colon cancer antigen 8 protein SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis SGC: Structural Genomics Consortium SMC1, 3: Structural Maintenance of Chromossome 1 e 3 SNRPs: U1 small nuclear ribonucleoprotein SRPK1: SRSF protein kinase 1 SRRM2: Serine/arginine repetitive matrix protein 2 SRSF1, 2: Serine/arginine-rich splicing fator 1 e 2 SSBR: DNA single-strand break repair STE:!grupo&de&proteínas&homólogas&à&STE7,&STE11&e&STE20&em&levedura T47D: Linhagem cellular de carcinoma ductal mamário TEV:!Tobacco Etch Virus nuclear inclusion a endopeptidase TIP60: Tat-interactive protein 60kDa TK: grupo Tyrosine Kinases TKL: grupo Tyrosine Kinases-Like TLS: translesion synthesis Tm: Temperatura de melting TOPIIβ: Topoisomerase IIβ TRAP-1: Tumor necrosis factor type 1 receptor-associated protein 1 TXNL1: thioredoxin-like protein 1 UK: United Kingdom UV: Ultraviolet irradiation VDAC1: Voltage-Dependent Annion Channel 1 XRCC1:!X-ray repair cross-complementing protein 1 ZNF423: Zinc finger protein 423

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Introdução

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Proteínas Cinases As cinases são proteínas com capacidade enzimática de transferir um grupo fosfato de moléculas com alta energia, como o ATP, para resíduos de serina, tirosina e/ou treonina de seus substratos. Esse tipo de proteína apresenta um domínio cinase semelhante estruturalmente ao formato de um grão de feijão. De modo geral e simplificado, é composto por dois subdomínios ou lobos sendo o lobo N- (aminoterminal) menor e rico em folhas-β, enquanto o lobo C- (carboxiterminal) é maior e predominantemente formado por hélices. Entre esses subdomínios encontra-se um bolsão onde o ATP fica posicionado. Quando o loop de ativação, localizado na fenda ente os lobos, é fosforilado, pode ocorrer uma mudança conformacional a qual permite a transferência do grupamento fosfato de alta energia do ATP para o substrato da cinase. No entanto, a presença de um resíduo de lisina no lobo N- é crucial para a correta organização estrutural do loop. Eventualmente, a ativação desses domínios pode ser dependente de uma região regulatória da mesma proteína e de suas interações e modificações (Huse & Kurivan, 2002). Em conjunto, a informação estrutural dos domínios cinases favorece o desenvolvimento de inibidores dessas proteínas auxiliando no desenvolvimento de fármacos para o tratamento de doenças relacionadas. As cinases somam aproximadamente 2% dos genes do genoma eucarioto e apresentam-se conservadas evolutivamente nos metazoários sendo algumas também encontradas em leveduras. Isto reflete a relevância em papéis funcionais também conservados e mediados por estas macromoléculas. A similaridade dos domínios cinases deduzida através de alinhamentos de múltiplas sequências de S. cerevisiae, C. Elegans, D. Melanogaster e H. Sapiens permitiu agrupar ortólogos destas proteínas em 8 grupos principais: CMGC, AGC, CAMK, CKI, RGC, STE, TKL, TK (Manning et al., 2002). Compatível com esta grande diversidade de proteínas cinases estão as suas funções intracelulares, localização subcelular no núcleo (NF-κB), citosol (algumas Neks) e membrana (EGFR), nas quais, algumas podem ser expressas de modo tecido específico. Dentre diversas vias e funções das proteínas cinases está a sua participação em processos biológicos a exemplo do ciclo celular, reparo e resposta de

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dano ao DNA, apoptose, regulação do metabolismo, da transcrição e da expressão gênica (Rauch et al., 2011)

Proteína cinase NIMA A proteína NIMA (never in mitosis, gene A) foi identificada e caracterizada funcionalmente em Aspergillus nidulans como uma serina/treonina cinase crítica para a progressão do ciclo celular neste organismo (Bergen et al., 1984). Inicialmente, NIMA foi considerada necessária apenas no início da mitose devido à sua importância no transporte de CDC2 para o núcleo, regulação da fissão da membrana nuclear durante os processos mitóticos (Davies et al., 2004) e da sua capacidade de fosforilação da histona H3 na serina 10 permitindo a condensação do cromossomo mitótico (De Souza et al., 2000). Da mesma forma, os mutantes de NIMA sensíveis à temperatura ou a superexpressão de dominante-negativos causam interrupção do ciclo celular na fase G2, detectando-se DNA não-condensado e microtúbulos na forma encontrada em intérfase (Osmani et al., 1991). Recentemente, a função e atividade de NIMA foi caracterizada não somente na intérfase mas também em diversos pontos do evento mitótico em Aspergillus nidulans como segregação do cinetocóro e cromossomos, separação do pólo do fuso mitótico (equivalente em fungos ao centrossomo) (Govindaraghavan et al., 2014) e saída da mitose (Pu & Osmani, 1995) A superexpressão de NIMA em fungos e em células de mamíferos resultou no desencadeamento precoce de eventos relacionados à mitose, incluindo a condensação da cromatina e a despolimerização dos microtúbulos (Lu & Hunter, 1995). Portanto, a habilidade em regular a mitose em eucariotos superiores sugere a existência de vias de sinalização envolvendo proteínas homólogas à NIMA, conservadas durante a evolução. (Wu et al., 1998) Dentre estas, foram encontradas duas homologias em D. Melanogaster e quatro em C. Elegans. Em mamíferos, onze proteínas foram identificadas com 40% a 50% de identidade com o domínio catalítico de NIMA, as quais correspondem à família das Neks.

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Família de proteínas cinases Nek humanas Organização estrutural Com 40-50% de homologia com o domínio cinase de NIMA, a família de proteínas serina-treonina cinase Nek (Nima related kinases) em humanos é constituída por 11 membros (hNek1-11) (Figura 01). De modo geral, as hNeks apresentam um domínio regulatório e um domínio catalítico, cinase, conservado e reconhecem como sítio de fosforilação de seus substratos a sequência de resíduos de aminoácidos F/LXXS/T. Uma vez que o domínio cinase é responsável pelo papel funcional dessas proteínas, o desenvolvimento de inibidores alvo para essa região pode auxiliar no tratamento de doenças relacionadas à essas proteínas, à exemplo de neoplasias. Análises estruturais permitiram a caracterização da interação entre hNek9 e parceiro de interação DYNLL/LC8 (dynein light chain 8) e revelaram a organização globular e monomérica de hNek6 (Galego et al., 2013, Meirelles et al., 2011). A estrutura cristalográfica de hNek2 e hNek7 foi resolvida e refinada e, recentemente, em colaboração com o Structural Genomics Consortium (SGC/Oxford-UK), nosso grupo também resolveu a estrutura da proteína Nek1 com e sem inibidor. Adicionalmente, experimentos de deslocamento térmico (termal shift) entre 85 compostos e construções das proteínas hNek1, hNek2, hNek6 e hNek7 revelou novos inibidores candidatos para inibição da atividade dessas proteínas (Moraes et al., 2015). A estrutura dos outros membros das Neks e ademais análises estruturais permanecem desconhecidas até o momento devido, majoritariamente, à dificuldade de expressão heteróloga, purificação e cristalização dessas proteínas. Possivelmente, os fatores contribuintes para isso decorrem da instabilidade conformacional ou estruturas desordenadas, em especial dos domínios regulatórios destas proteínas. Além do domínio catalítico, as hNeks são compostas por domínios regulatórios amino-terminais, carboxi-terminais ou em ambas as regiões flanqueando o domínio cinase, como a hNek10 (Figura 01). Esses domínios podem ser compostos por diferentes motivos ou repetições e estão relacionados com funções e interações específicas dessas proteínas, possivelmente sendo este o fator que diferencia as Neks funcionalmente.

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Figura 01: Ilustração da estrutura secundária dos 11 membros da família das Neks e das regiões de interação com alguns de seus interactores (Meirelles et al., 2014).

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As hNeks 1, 2, 5, 9 10 e 11 apresentam regiões coiled coil características de interações entre proteínas (Burkhard et al., 2001). Além destes, hNek10 também apresenta repetições Armadillo que são compostas de aproximadamente 40 resíduos de aminoácidos e formam organização triangular tridimensional de α-hélices capazes de gerar um scaffold para interações entre proteínas (Tewari et al., 2010). Outros motivos ou domínios como o de degradação PEST (região rica nos resíduos Prolina, Ácido Glutâmico, Serina, Treonina) e RCC1 (Regulator of Chromosome Condensation) são específicos para hNek4, 5, 8 e 10 e hNek8 e 9, respectivamente. Ao passo que, apenas hNek5 apresenta o domínio Dead-box helicase domain caracterizado por sua relação com o processamento e metabolismo de mRNA (Rocak & Linder, 2004).

Biologia funcional das hNeks A análise do interactoma das proteínas membros da família das hNeks revelam suas diversas funções biológicas e celulares, no entanto há uma convergência funcional em três principais processos, como publicado na nossa revisão (Artigo I; Meirelles et al., 2014): (1) Mitose (centrossomo), (2) Cílio Primário/Ciliopatias e (3) Resposta do dano no DNA. Além destes, trabalhos recentes têm caracterizado as hNeks também nas funções de regulação do processamento do RNA (splicing) e processos mitocondriais, em especial relacionados à apoptose. O papel das hNeks nestes processos será abordado com foco nas suas relações com à resposta e reparo do dano no DNA.

O Dano no DNA O DNA (Ácido desoxirribonucleico) carrega o material genético e hereditário de praticamente todos os organismos, incluindo os humanos. No entanto, uma mesma célula humana pode sofrer aproximadamente 60.000 lesões no DNA por dia causadas naturalmente (Bernstein et al., 2013). Variações nas vias de sinalização de resposta e de reparo no dano no DNA podem levar a defeitos na reparação da molécula gerando alterações em uma única base ou, de modo mais complexo, deleções, fusões, translocações e aneuploidias (Lazzaro et al., 2009). Isso contribui para o surgimento de mutações, por vezes, severas e para a malignidade da célula. Por isso, as lesões não

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reparadas no DNA podem causar instabilidade genômica e mutações, consideradas uma das hallmarks do câncer (Hanahan et al., 2011). Os danos no DNA são eventos constantes nas células devido à exposição aos agentes endógenos como espécies reativas de oxigênio (ROS) ou através de defeitos na replicação do DNA (Lindahl & Barnes, 2000). No entanto, as células podem ser expostas à agentes exógenos e genotóxicos como radiações (Ultravioleta-UV, Ionizante-IR, Raios X, etc) ou compostos químicos, a exemplo de drogas e inibidores classificados como quimioterápicos no combate ao câncer. Dentre os tipos de dano no DNA encontram-se a oxidação (8-oxoG), alquilação (7-metilguanina, 1-metiladenina, 6- O-metilguanina), desaminação e hidrólise de bases nucleotidicas (depurinação ou depirimidinação), formação de adutos através de inter- ou intra-strand crosslink, incompatibilidade de bases (inserção errônea ou troca de bases), formação de dímeros de pirimidina, quebras de fita simples ou de fita dupla. Além disto, alguns agentes podem atingir o DNA mitocondrial (Alexeyev et al., 2013), porém este aspecto não será abordado neste trabalho.

Respostas ao Dano no DNA O dano no DNA desencadeia a ativação ou recrutamento de diversas proteínas que são divididas nos seguintes grupos: as sensoras ou cinases transdutoras proximais (complexo MRE11) que são proteínas reconhecedoras da lesão do DNA e que, em seguida, recrutam as mediadoras (BRCA1). Subsequentemente, são recrutadas as cinases transdutoras distais (Chk1 ou Chk2), efetoras (Cdc25A, p53) e por fim as reguladores do ciclo celular (Ciclina B, Cdk2) ou de apoptose (ativação de Caspases) (Zhou & Elledge, 2000; Tse et al., 2007). Essas proteínas compõem as diferentes respostas do dano no DNA a exemplo de alterações na resposta transcricional e as três principais, modificações nas vias do reparo do DNA, desencadeamento da apoptose e/ou senescência e ativação dos pontos de checagem ou checkpoints do ciclo celular.

As vias de reparo do dano no DNA Os agentes de dano podem causar tipos diferentes de lesões no DNA acarretando a ativação e recrutamento de vias de reparo. Inicialmente acreditava-se

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que cada tipo de dano recrutava um grupo ou via específica do reparo, no entanto, múltiplas vias podem atuar em sincronia em uma mesma lesão a fim de garantirem um reparo fidedigno (Figura 02). Dentre as principais vias de reparo do DNA encontram-se Base Excision Repair (BER), Nucleotide Excision Repair (NER), Mismatch Repair (MMR), Homologous Recombination Repair (HR), Non-Homologous End Joining (NHEJ) e Fanconi Anemia (FA), resumidas quanto as proteínas envolvidas na Tabela 01. Algumas proteínas relacionadas ao desencadeamento de respostas e reparo do dano no DNA por quebras de fitas dupla foram estudadas no decorrer deste trabalho. De modo geral, mediante quebra de fita dupla direta ou indireta as proteínas sensoras do dano as quais fazem parte do complexo MRN (MRE11, NBS1 e RAD51) em conjunto com TIP60 (tat-interactive protein 60kDa) e 53BP1 (p53-binding protein 1) são capazes de iniciar a ativação de diversas outras proteínas (Sun et al., 2010; Lee et al., 2010). Dentre elas há a ativação de ATM por fosforilação, recrutamento do complexo BRCA1 e ativação de γ-H2AX (Stiff et al., 2004; Cortez et al., 1999). O reparo de fitas duplas pode ser realizado principalmente através da ativação da via NHEJ ou HRR. O processamento da fita dupla danificada pela via HRR ocorre pela retirada de alguns nucleotídeos de uma das fitas por exonuclease 1 (EXO1), BLM e DNA2 (Nimonkar et al., 2011). Então uma das extremidades não extraídas recebe o recrutamento de proteínas RPA, ATRIP e ATR. (Zou & Elledge, 2003). Essas proteínas protegem a então fita simples de degradação e recrutam as DNA polimerases, que irão promover a extensão e reconstituição da fita através da homologia com a cromátide irmã e, assim, garantindo a fidelidade do reparo.

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Tratamento Esquema Tipo de lesão Principais vias de reparo

Radiação e radiomiméticos Quebras de fita dupla e Radiação ionizante simples Bleomicina/Zeocina Dano de base nucleotídica

Alquilantes monofuncionais Lesões na replicação Alquilsulfonatos Adutos Compostos de nitrosourea Dano de base Temozolomidav" nucleotídica

Alquilantes bifuncionais Lesões na replicação Nitrogênio mostarda Adutos Mitomicina C Crosslink de DNA Cisplatina Quebra de fita dupla

Antimetabólitos Não caracterizada 5-Fluorouracil (5FU) Dano de base Tiopurnas nucleotídica Análogos de folatos Lesões na replicação

Inibidores de Topoisomerases Camptotecina Quebra de fita dupla e Etoposideo (VP16) simples Erros de replicação

Inibidores de Replicação Afidicolina Lesões na replicação Hidroxiuréia Quebra de fita dupla

Figura 02: Relação entre os agentes de dano, tipos de lesões no DNA e as vias de reparo envolvidas (Adaptado de Helleday et al., 2008). IR e drogas radiomiméticas induzem quebra de fita dupla predominantemente reparadas por NHEJ ou HR. Agentes alquilantes mono ou bifuncionais causam modificações de base e interferem na síntese de DNA, sendo estas processadas por vias dependentes de MMR (BER e NER). Antimetabolitos interferem no metabolismo e síntese do DNA causando lesões durante a replicação sendo esse tipo de dano ainda pouco estudado e acredita-se que o reparo pode ocorrer pelo recrutamento da via BER. Inibidores de Topoisomerases atuam na manutenção de complexos transientes de clivagem entre enzima-DNA criando quebras no DNA e interferindo na replicação. Esses danos são reparados majoritariamente pelas vias HR ou NHEJ. Por fim, os inibidores de replicação induzem à parada ou colapso da forquilha de replicação resultando em quebras de fita dupla. A contribuição relativa de cada via de reparo para cada tipo de dano está indicada de acordo com o tamanho dos quadrados respectivos. ENDO, endonuclease- mediated repair; FA, Fanconi anaemia repair pathway; HR, homologous recombination; O2G, DNA dioxygenases; RecQ, RecQ-mediated repair; SSBR, DNA single-strand break repair; TLS, translesion synthesis.

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Tabela 01: Genes das proteínas envolvidas nas principais vias de reparo de dano no DNA. Via de reparo do Proteínas envolvidas dano no DNA Base Excision DNA glycosylase, APE1, XRCC1, PNKP, Tdp1, APTX, Repair (BER) DNA polymerase β, δ e ε, FEN1, PCNA-RFC, PARP Nucleotide Excision XPC-Rad23B-CEN2, UV-DDB (DDB1-XPE), CSA, CSB, Repair TFIIH, XPB, XPD, XPA, RPA, XPG, ERCC1- XPF, DNA (NER) polymerase δ or ε Mismatch Repair MutSα (MSH2-MSH6), MutSβ (MSH2-MSH3), (MMR) MutLα (MLH1-PMS2), MutLβ (MLH1-PMS1), MutLγ (MLH1-MLH3), Exo1, PCNA-RFC Homologous CtIP, RPA, Rad51, Rad52, BRCA1, BRCA2, Exo1, BLM- Recombination TopIIIα, GEN1-Yen1, Slx1- Slx4, Mus81/Eme1 (HR) Non-Homologous Ku70-Ku80, DNA-PKc, XRCC4-DNA ligase IV, XLF End-Joining (NHEJ) Fanconi Anaemia FANCA, B, C, D2, E, F, G, L, M, dentre outras e (FA) FAAP24, FAAP100, BRCA1, XPF, ERCC1, MUS81, Eme1

A replicação do DNA e formação das cromátides irmãs ocorre durante a fase S da intérfase do ciclo celular. Desta forma, o recrutamento das proteínas da via HR ocorre após a replicação no final da fase S e durante G2. Sendo assim, o reparo é realizado em lesões (1) que ocorreram no final da fase S ou início de G2 e (2) quando a lesão não é reparada anteriormente à fase S da intérfase mediante defeito no checkpoint de G1/S. Neste sentido, a ativação de ATM e ATR promove a indução de checkpoint pela ativação de Chk1 e Chk2 sinalizando CDC25A/B/C para degradação proteassomal, prevenindo a ativação de CDK1/2 e, consequentemente, evitando a entrada na mitose (Falck et al., 2001; S¿rensen et al., 2003).

Ativação dos checkpoints do ciclo celular O ciclo celular é uma sequência de eventos que ocorrem na célula e conduzem a sua divisão e duplicação (replicação) formando duas células filhas. Este processo é dividido entre dois momentos principais sendo eles a intérfase e a mitose. A intérfase é composta pelas fases (1) G0 (Gap 0) ou quiescente da célula que pode ser permanente ou transitório dependendo do tipo celular e do tecido; (2) G1 (Gap 1) é um estágio preparatório para a divisão da célula uma vez que ocorre o crescimento celular e produção de enzimas atuantes na duplicação do DNA; (3) fase S ocorre a replicação do

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DNA e (4) na fase G2 há a duplicação de organelas e estruturas para serem divididas após a mitose entre as células filhas. Brevemente, a mitose é dividida entre prófase, metáfase, anáfase, telófase e citocinese. Portanto, durante a divisão, a célula passa por uma série de mudanças e regulações, dentre elas modificações no posicionamento de organelas, síntese de proteínas, remodelamento da cromatina, alterações na expressão gênica e modificações pós-traducionais nas proteínas (para revisão Lapenna e Giordano, 2009). A iniciação de cada evento depende da finalização do anterior uma vez que o ciclo ocorre unidireccionalmente. Assim, de modo a evitar o acúmulo de erros ao longo do ciclo celular, os pontos de checagem (checkpoints) são ativados em momentos específicos. Por definição, os checkpoints do ciclo celular são vias de transdução de sinal capazes de controlarem e supervisionarem o ciclo identificando alterações na organização celular como um todo: desde moléculas, metabólitos até no próprio DNA. Com a ativação desses pontos, ou também chamadas etapas de checagem, há um tempo adicional para a correção dos defeitos identificados. Caso ocorram falhas nos pontos de checagem, a célula não obedece o ritmo de divisão celular e apresentam acúmulo de erros, tornando-as potencialmente neoplásicas (para revisão Malumbres e Barbacid, 2007). Durante o ciclo existem quatro checkpoints que ocorrem no final das fases (1) G1/S, (2) Intra-S (3) G2/M e (4) também durante a mitose na transição metáfase-anáfase (Figura 03). Dentre as proteínas que regulam estes processos estão as ciclinas, cinases dependentes de ciclinas (CDKs), Auroras, Polo-like quinases, ATR e ATM (para revisão Malumbres e Barbacid, 2007, Lapenna e Giordano, 2009). Além destas, a degradação proteassomal de CDC25A/B/C previne a ativação de CDK1/2 causando bloqueio da fase G2. Outras proteínas como p53, p21, Wee, 14-3-3 e RB (Retinoblastoma protein) são proteínas chave na regulação dos checkpoints e podem ser ativadas pelas vias de reparo do DNA. (Zhou & Elledge, 2000). Durante a mitose, é checado se o fuso mitótico está associado corretamente ao cinetocóro dos cromossomos proporcionando uma apropriada segregação e evitando aneuploidias. As proteínas associadas corresponde à algumas BUBs, MADs e CENP-E (Holland & Cleveland, 2009).

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M,Checkpoint:% Checagem%da%correta%adesão% do%fuso%mitóBco%nos% cinetocóros.%3% G0#

G2/M,Checkpoint:% Mitose# Checagem%da%replicação%correta%do% G1# DNA%e%idenBﬁcação%de%danos%no% Ciclo&& DNA.%3% Celular& G1/S%Checkpoint:% G2# Checagem%dos% nutrientes,%tamanho% da%célula,%fatores%de% S# crescimento%e%dano%no% DNA.%1,2% IntraGS%Checkpoint:% Checagem%da%replicação%durante%a%sua% ocorrência%(meBlações%no%DNA).%2%

Figura 03: Esquema representativo do ciclo celular mitótico. Nessa ilustração foram destacadas as fases G0, G1, S e G2 da intérfase e a mitose. As barras vermelhas indicam os pontos de checagem ou checkpoints do ciclo celular. Esses encontram-se brevemente resumidos quanto aos erros identificados nesses momentos celulares e que prejudicam uma divisão celular apropriada. (1.Foster et al., 2010; 2 Nojima, 2004; 3 Stark et al., 2004)

Relação funcional das hNeks no ciclo celular e na resposta do dano no DNA Os primeiros indícios do envolvimento de hNek1 com o dano no DNA foi através do seu interactoma obtido através de ensaio de duplo híbrido o qual revelou a interação da região coiled coil de hNek1 com as proteínas de reparo de DNA 14-3-3, 53BP1, ATRX, Mre11 (Surpilli et al., 2003) (Figura 04). A partir de então, diversos trabalhos começaram a ser publicados indicando a relação entre hNek1 e esse processo. Células induzidas ao dano ao DNA apresentam aumento da expressão de hNek1 e sua migração do citosol para o núcleo, especificamente, para as regiões de reparo. Comparativamente, células deficientes na expressão de hNek1 apresentam hipersensibilidade a efeitos letais da radiação ionizante (Polci et al., 2004). A expressão, atividade e localização de Nek1 nos foci de dano no DNA não são dependentes da ativação de ATM e ATR, indicando uma possível atividade dessa proteína de modo independente ou upstream a essas cinases (Chen et al., 2011). Recentemente, a atividade de Nek1 bem como a sua interação com ATR-ATRIP foi

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descrita como necessária para a ativação de Chk1 (Figura 04). A ativação de ATR- ATRIP permite, então, a formação de um microambiente para o recrutamento de outras proteínas em um complexo de ativação. Ainda neste trabalho foi observado que, mesmo na ausência de indução de dano no DNA, hNek1 é importante para manter os níveis basais de ativação destas proteínas (Liu et al., 2013). Em células de camundongo knock out para Nek1 e linhagens celulares humanas Nek1 depletadas apresentaram defeitos na ativação de Chk1 e Chk2 em resposta à radiação ionizante e UV. Assim, a ausência de hNek1 funcional através de defeitos no reparo do DNA e, consequentemente, excessivas quebras cromossômicas (Chen et al., 2008). Para hNek11, apesar de sua expressão apresentar-se maior a partir da fase S até G2/M (Noguchi et al., 2002), a sua atividade é dependente da ativação por ATM e ATR (Melixetianel et al., 2009). Um dos papéis funcionais de hNek11 é relacionado à via de reparo por homologia (HR) anteriormente mencionada. Neste sentido, células expostas à radiação ionizante podem desencadear uma cascata de sinalizações culminando na ativação de hNek11 por Chk1, a qual é capaz de fosforilar CDC25A (Melixetianel et al., 2009) (Figura 04). Desta forma, é iniciada a degradação proteassomal desta proteína evitando a progressão do ciclo celular. Aparentemente, Nek6 pode exercer funções específicas atuando como um substrato para as cinases Chk1 e Chk2, as quais são proteínas efetoras da sinalização de danos causados no DNA. Desta forma, ao ser identificado um dano no DNA, não há ativação de hNek6 e a célula não entra em processo mitótico (Lee et al., 2008) (Figura 04). Dentre os 11 membros da família das hNeks, hNek4 também apresenta papel funcional na resposta ao dano no DNA. Dentre as proteínas identificadas por massas dos imunoprecipitados de FLAG-hNek4, importantes membros da via de reparo NHEJ foram identificados, sendo eles DNA-PKcs, Ku70 e Ku80. Além disso, células hNek4 depletadas reduziram a ativação da histona γ-H2AX, mediante dano causado por etoposideo, provavelmente como resultado da redução do recrutamento de DNA-PKcs (Figura 04). Ademais experimentos conduziram a conclusões de que células com hNek4 depletada podem se tornar resistentes à drogas danificadores do DNA, como etoposideo ou bleomicina e à radiação-γ (Nguyen et al., 2012).

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A Dano&no&DNA&

γH2AX$ 14#3#3,&53BP1,&ATRX,&MRE11&

ATRIP Nek1$ ATR ATM Nek4$

Ku70 DNA-PKc Nek11$ Ku80 Chk2$ Chk1$ Nek6$ Nek9$ Nek1$

Reparo&do&dano&no&DNA& Parada&do&Ciclo&Celular&

B Checkpoint&do&fuso&mitóEco&

MAD$ Nek2$ HEC1$ Nek6$ Nek7$

Nek9$

Defeitos CDK1 PLK1

Mitose&catastróﬁca& Células&mulEnucleadas& Instabilidade&Genômica& Figura 04: Ilustração esquemática do envolvimento de membros das hNeks nos processos mitóticos e resposta de dano no DNA (para revisão Meirelles et al., 2014). A. hNek4 é capaz de interagir com proteínas da via de reparo NHEJ, bem como Nek1 com Ku80 em resposta ao dano no DNA. Ainda, hNek1 é capaz de interagir com as proteínas 14-3-3, 53BP1, ATRX e MRE11 em ensaios de duplo híbrido. hNek1 regula e interage com ATR-ATRIP atuando na regulação de Chk1. Ainda nessa via, a atividade de hNek11 é relacionada à ATM-ATR sendo ativada através de Chk1 e Nek6 pode atuar como substrato para Chk1 e Chk2. Em conjunto, a ativação dessas vias levam a parada do ciclo celular para reparo do DNA danificado. B. Defeitos na correta ativação do checkpoint do fuso mitótico está associado à instabilidade genômica por mitose catastrófica e multinucleação celular. hNek2 regula as proteínas linkers dos microtúbulos do fuso mitótico ao cinetócoro e PLK1 e CDK1 são capazes de ativar hNek9 e, consequentemente, hNek6 e hNek7 regulando a nucleação e formação do fuso (representado pelo tubo composto por esferas verdes claro e escura ou α- e β-Tubulina).

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Comparativamente, hNek1 interage com Ku80 e, mediante seu silenciamento, há baixo recrutamento de Ku80 na cromatina, o que pode ser associado à defeitos no reparo do DNA durante a fase S (Figura 04). Ainda, a depleção de hNek1 resulta em defeitos da proliferação celular devido à acúmulos das células na fase S da intérfase do ciclo celular. Durante a replicação do DNA, Nek1 localiza-se na cromatina e sua atividade leva ao aumento do estresse replicativo (Patil et al., 2013). Adicionalmente, hNek9 recentemente foi descrita como um componente chave para a resposta ao estresse replicativo mantendo a integridade genômica. A depleção de Nek9 causou hipersensibilidade na resposta à este estresse e acúmulo de dano no DNA, ao passo que a sua expressão em complexo com Chk1 aumentou a sobrevivência celular (Smith et al., 2014). Defeitos ao longo da mitose causam o aumento da ploidia cromossomal ou formação de células multinucleadas associadas à instabilidade genômica. Esse fenótipo também está associado à outras hNeks. O silenciamento de Nek8 em embriões de Zebrafish causaram multinucleação celular bem como a sua superexpressão. Em células tumorais mamárias, a superexpressão de hNek2 potencializou a binucleação e amplificação centrossomal e o seu silenciamento, aliviou esse tipo fenótipo, indicando que hNek2 pode ser um alvo nesse tipo de tumor (Harrison Pitner & Saavedra, 2013). A cascata de ativação e interação entre hNek6, 7 e 9 mediante ativação por CDK1 e PLK1 permite a correta nucleação dos microtúbulos do fuso mitótico à partir dos centrossomos. Adicionalmente, hNek6 e 7 são capazes de fosforilar α- e β-tubulina e ainda interagir com Kif11 (Eg5), uma kinesina capaz de movimentar o fuso mitótico (Rapley et al., 2008; O«Regan & Fry, 2009; Bertran et al., 2011) (Figura 04). Dentre os fatores associados à instabilidade cromossômica estão os defeitos na formação e orientação do fuso mitótico. Uma vez que o DNA já está duplicado e, caso seja detectada falha pelo checkpoint de formação do fuso na metáfase/anáfase, pode ocorrer a parada do ciclo celular causando a mitose catastrófica e multinucleação ou multilobulação celular. Este checkpoint também detecta defeitos na correta ligação entre o fuso mitótico e os cinetócoros dos cromossomos. Associações incorretas nessa região pode gerar quebras cromossômicas e aneuploidias. hNek2 permite o recrutamento e ativação de complexos proteicos, a exemplo de Hec1, MAD1 e MAD2,

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nos cinetócoros permitindo o reconhecimento adequado do fuso mitótico nessa região (Fry et al., 1998; Liu et al., 2010; Mardin et al., 2010; Wei et al., 2011) (Figura 04).

Relação funcional das Neks no cílio primário e na resposta do dano no DNA Os cílios, flagelos e corpos basais/centríolos são considerados estruturas ancestrais conservadas evolutivamente na maioria dos grupos que compõem os eucariotos (Carvalho-Santos et al., 2011). Apesar de ainda especulativo, acredita-se que a evolução da complexidade desses organismos está relacionada ao aumento da quantidade de células capazes de produzirem o cílio. Inicialmente, os cílios foram caracterizados como importante para a motilidade de organismos unicelulares ou movimento de fluidos nos tecidos epiteliais humanos ao passo que os cílios imóveis foram considerados organelas vestigiais. No entanto, estes cílios imóveis podem atuar como sensores do microambiente celular, sendo utilizados para detectar osmolaridade, temperatura, luz, gravidade. Desta forma os cílios são importantes para órgãos sensoriais relacionados com audição, visão, olfato e até mesmo, órgãos internos que necessitam dessas informações de microambiente como os rins (Singla & Reiter, 2006). Dentre as patologias associadas com defeitos na formação ou composição molecular do cílio estão o desenvolvimento de tumores e as ciliopatias (Waters & Bales, 2011) das quais destaco a Doença Policística do Rim ou PKD, Policystic Kidney Disease. Esta doença pode causar rins não funcionais com aumento significativo de tamanho gerando falência renal pela formação de rins policísticos. Esta patologia é causada por alterações na morfologia renal uma vez que apresenta proliferação e diferenciação celular anormal, anomalia na membrana basal e extracelular e secreção de fluidos na região trans-epìtélio (Wilson, 2004)

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B" Aumentado* Normal* Reduzido*

Tempo* Figura 05: Representação esquemática do cílio primário e sua fomação durante a progressão do ciclo celular. (A. Carvalho-Santos et al., 2011, B. Adaptado de Basten e Giles 2013) A. Representação geral de um cílio destacando o cílio móvel (composto por braços de dineína, par de centríolos centrais e proteínas Spokes) e de um cílio imóvel (ausência da composição mencionada para cílios móveis). Adicionalmente, ilustração de proteínas de tráfego intra-flagelar. B. A formação do cílio primário ocorre na fase G0 a partir de um centrossomo e, durante o início da intérfase em G1, há a liberação do par de centríolos para sua duplicação, nucleação e formação dos microtúbulos para composição do fuso mitótico e continua divisão celular.

A formação do cílio primário pode ocorrer após a divisão quando a célula entra em período quiescente, ou G0. Esta organela é composta por um corpo basal localizado na parte apical da membrana plasmática e o axonema, uma fina projeção que se estende a partir da membrana. O corpo basal é composto por um centrossomo e uma matriz pericentriolar rica em proteínas, seguido de uma zona de transição, barreira que seleciona a entrada de proteínas a partir do axonema até o citoplasma e vice versa. O axonema pode ser formado por 9 pares de microtúbulos com (cílios móveis) ou sem

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(cílios imóveis) um par central sendo respectivamente, 9+2 ou 9+0, que emergem a partir do centríolo mãe. A relação entre a motilidade ciliar também é intrínseca à presença de braços de dineína motora que permitem a movimentação dos pares de microtúbulos (Basten e Giles, 2013) (Figura 05.A). O Complexo de Golgi também apresenta ligações com essa região devido ao transporte de vesículas como forma de sinalização e que envolvem proteínas motoras (kinesinas) e de tráfego, permitindo o transporte de cargos e sinais para o interior e exterior da célula (Proteínas IFT- Intra- Flagelar Transport) (Hildebrant et al., 2011). Desta forma, a importância funcional dos cílios está na recepção de sinais extracelulares e vias de sinalização intracelulares como de polaridade celular, FGF, Notch, Hedghog, PDGF e Hippo e, especificamente em células multiciliadas, permite a movimentação de fluidos extracelulares (Goetz & Anderson, 2010) Adicionalmente, uma vez que ambos o cílio e o fuso mitótico emergem a partir de centrossomos, especula-se que a formação do cílio primário ocorre não somente para a célula receber sinais do microambiente que garante uma divisão adequada, mas também para o recrutamento do centrossomo evitando uma mitose precoce (Figura 05.B). A instabilidade cromossômica pode ser relacionada com desregulações na organização centrossomal causando alterações nos pólos celulares, formações de fusos mitóticos fracos, sem orientação ou ausentes e, devido a sua importância para a constituição do cílio primário, como mencionado acima, as desregulações nessa organela podem prejudicar também organização ciliar. Desta forma, os defeitos na formação do cílio pode causar mitose precoce, depolarização na orientação da divisão celular e defeitos nas vias de sinalização sensorial das células. Em experimentos realizados com células derivadas de camundongos Pkd (gene codificador da proteína Policistina 2) knock-out e de pacientes com PKD apresentaram fuso mitótico multipolar, anomalias no centrossomo e poliploidias. (Aboualaiwi et al., 2011). Proteínas que são responsáveis por checkpoints do ciclo celular, têm sido relacionadas recentemente com a regulação do cílio primário, dentre elas BUBR1, Mps1 além de proteínas envolvidas também na citocinese a exemplo de Aurora A (Miyamoto et al., 2011; Majumder & Fisk, 2013; Smith et al., 2011, Plotnikova et al., 2008).

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Assim, a ciliagênese se relaciona com os processos mitóticos e pode estar envolvido no controle da estabilidade genômica, também relacionada ao reparo do dano no DNA. Por exemplo, as proteínas SDCCAG8, ZNF423 e CEP164 podem localizar-se nos centrossomos e em foci de dano no DNA, e mutações nessas proteínas estão relacionadas com ciliopatias (Chaki et al., 2012; Otto et al., 2010). Especificamente, CEP164 é importante para a formação do cílio e o seu silenciamento pode acarretar a danos no DNA, induzir respostas à estes danos. Caso as lesões no DNA não sejam reparadas e sejam identificadas nos checkpoints da anáfase, pode ocorrer a indução de mitose catastrófica (Saladino et al., 2009). Adicionalmente, CEP164 é necessária para a ativação de vias de sinalização dependentes de ATR em resposta ao dano no DNA (Chaki et al., 2012). Dentre os membros da família das hNeks, hNek1 e hNek8 são as proteínas mais estudadas na ciliagênese. Em camundongos, duas mutações identificadas como kat e kat2J foram descritas como causadoras de PKD. Nesses modelos, mutações em mNek1 (homólogo de Nek1 em camundongos) foram detectadas e provocaram fenótipos pleiotrópicos relacionados à cistogênese (Upadhya et al., 2000). Curiosamente, hNek1 é expressa em diversos tecidos ciliados, sua localização no corpo basal dos cílios está associada a sua atividade cinase e à domínios coiled coil na região C-terminal desta proteína (White & Quarmby, 2008). Ainda, a superexpressão de hNek1 inibe a ciliagênese em células de epitélio renal canino (Shalom et al., 2008), e seu interactoma revela importantes proteínas relacionadas com a formação e funcionamento do cílio primário (Surpilli et al., 2003). Dentre elas, foi confirmada a interação com Tuberina, proteína que regula a formação dos cílios primários (Hartman et al., 2009), e a kinesina KIF3A, proteína responsável pelo transporte intra-flagelar de sinais ou cargos ao longo do axonema, desta forma, importante para a ciliagênese (Lin et al., 2003; Jones et al., 2008). Outro interactor relacionado à PKD é a proteína TAZ, capaz de recrutar o complexo de ubiquitinação e degradação para a proteína ciliar PKD2 (policistina 2). Nek1 é, então, capaz de ativar por fosforilação TAZ regulando os níveis de PKD e assim, mediante ausência de Nek1, há a desregulação de PKD e indução de ciliopatia (Yim et al., 2011) (Figura 06).

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Uma das proteínas que conectaram funcionalmente Nek1 com ciliopatia e resposta do dano no DNA é a proteína com atividade ATPase SMC3 (Structural Maintenance of Chromossome 3) (Holloway et al., 2011). Em conjunto com SMC1, SCC1 (Sister Chromatid Cohesion 1) e SCC3, formam um complexo proteico heterodimérico chamado coesina que, como o próprio nome suscita, apresenta função biológica de manutenção da coesão do DNA durante a replicação e, após a prófase, dos cinetócoros. Mediante dano no DNA, esse complexo pode ser recrutado pela via HR por fosforilação de SMC3 ou SMC1 por ATM a fim de manter as fitas danificadas próximas fisicamente da cromátide homóloga (Watrin & Peters, 2006; Kim et al., 2002; Luo et al., 2008). Assim, mutações em Nek1 causaram desregulação da localização da coesina causando esterilidade por complicações na progressão da meiose e, consequentemente, na gametogênese (Holloway et al., 2011). Além das ciliopatias, hNek1 pode atuar em papéis funcionais celulares fundamentais para o desenvolvimento de tumores renais. Células de carcinoma renal (RCC) apresentam aumento da expressão de hNek1 que, associado à sua função molecular de interação com VDAC1 (Voltage-Dependent Annion Channel 1), apresenta resistência à drogas genotóxicas (Chen et al., 2009). No entanto, saliento que a importância de Nek1 para as respostas de dano no DNA não se limitam às interações destacadas para ciliopatia mas também às outras mencionadas ao longo desta introdução. Em modelos animais de camundongos pré-estabelecidos para PKD foi identificada mutação em Nek8 as quais causaram alteração na localização da proteína de apical para difusa no citoplasma, o que pode contribuir para defeitos na ciliagênese, e desligamento do epitélio tubular à membrana basal (Liu et al., 2002; Mahjoub et al., 2005). Ainda nesses modelos, a interação anormal entre hNek8 e o complexo de policistina causou PKD devido à distúrbios na dinâmica dos microtúbulos, nos checkpoints de fuso mitótico e citoesqueleto (Sohara et al., 2008). De modo elegante, foi publicado um trabalho que destacou e relacionou o papel funcional da proteína Nek8 com a resposta do dano no DNA e ciliopatias (Choi et al., 2013). Células com atividade reduzida de hNek8 apresentaram dano espontâneo no DNA, defeito na progressão da fase S, defeitos na dinâmica da forquilha de replicação e sensibilidade ao estresse replicativo. Além disso, em modelos de camundongo para doença policística do rim

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(jck), a perda de Nek8, em conjunto com outros fatores, pode contribuir para a perda da arquitetura das camadas de células e defeitos na resposta celular mediante estresse replicativo. O mecanismo molecular envolve a supressão da atividade de CDK1 por hNek8 na fase S e, em conjunto com ATR, suprime o acúmulo de dano no DNA. No entanto, mutantes de hNek8 perdem a interação com proteínas da via de ATR, contribuindo para o surgimento de lesões no DNA e defeitos na ciliagênese (Choi et al., 2013) e, portanto, Nek8 é uma das proteínas que contribui para a associação destes dois processos: formação do cílio primário e do reparo/resposta do dano no DNA (Figura 06). Além da PKD, existem outras ciliopatias como Joubert and Neckel syndrome e Leber Congenital amaurosis associadas com as proteínas RPGR-interacting protein 1 (RPGRIP1) e RPGRIP1-like (RPGRIP1L) identificadas como interactoras de hNek4 (Figura 06) (Coene et al., 2011). Apesar de ser uma cinase, aparentemente hNek4 não fosforila essas proteínas mas pode atuar como um importante scaffold para interações com outras proteínas ciliares. Dentre as 11 hNeks, hNek4 também apresenta papel funcional na resposta ao dano no DNA. Como mencionado anteriormente, esta proteína interagiu com proteínas da via de reparo do DNA por NHEJ e influencia na ativação e recrutamento de γ-H2AX (Nguyen et al., 2012). Um trabalho recente do nosso grupo relacionou o interactoma de isoformas de hNek4 com processos de reparo de dano no DNA, cílio primário e splicing de mRNA, colocando esse membro das hNeks como uma proteína pivô desses processos (Basei et al., 2015).

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Dano(no(DNA(

Bloqueio(da(replicação(( SMC3(( CQNap1/Rootle9n(( Via(NHEJ( PDZ,(Tuberin,( RPGRIP1/ KIF3A(( RPGRIP1L(

(( Nek2%

Nek1% Nek5% Nek4% ATR( CHK1( ATRIP(

Nek8% ((

A9vidade(de(CDK( Rim(policís9co(ou(( outras(ciliopa9as(

Redução(da(estabilidade(da(forquilha( Dano(no(DNA( Figura 06: Ilustração esquemática representando a relação entre as Neks na resposta do dano no DNA e ciliopatias. Mediante bloqueio da replicação do DNA, ATRIP-ATR e CHK1 são capazes de interagir com Nek8 que regulará negativamente CDK1 e, consequentemente, Ciclina A. Assim, com a inibição de CDK1/CiclinaA ocorrerá o bloqueio da progressão do ciclo celular e permitindo que vias de reparo do DNA sejam ativadas. Nek1 interage com proteína do complexo de coesina, SMC3, e defeitos nessa interação podem causar esterilidade por complicações na gametogênese. As proteínas PDZ, Tuberin e KIF3A relacionadas à função ou formação do cílio são interactoras de Nek1 associando também essa proteína à ciliopatias. O interactoma de Nek4 revela sua interação com proteínas da via NHEJ de reparo do dano no DNA e proteínas relacionadas à formação de cílio e ciliopatias. Apesar de ainda em investigação, o papel de Nek2 e Nek5 na resposta do dano no DNA e ciliagênese pode estar relacionada à sua interação/regulação de proteínas de coesão dos centrossomos (indicado pela seta pontilhada). As proteínas nos quadrados verdes estão relacionadas à formação ou função do cílio.

Relacionando o ciclo mitótico e a formação dos cílios primários está o centrossomo, sendo essa organela de comum importância para ambos os processos celulares. Para a manutenção dos pares de centrossomos um complexo proteico envolve C-Nap1 e Rootletin e a sua fosforilação e interação com Nek2 causa dissociação e separação dos centrossomos (Fry et al., 1998). A proteína da via de reparo HR, ATM também é ativada através de autofosforilação mediante radiação

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ionizante sendo capaz de induzir a ativação de PP1 através da inibição de CDKs. O trabalho publicado em 2007 por Jun Mi e colaboradores indicou que PP1 é capaz de manter hNek2 desfosforilada prevenindo a separação dos centrossomos e garantindo que durante a ativação de vias do reparo do DNA, a divisão do centrossomo não prossiga. Apesar de apresentar funções distintas, hNek5 atua em conjunto com hNek2 na regulação das proteínas relacionadas à manutenção da coesão dos centrossomos (Prosser et al., 2015). Mediante lesão no DNA, C-Nap1 e Rootletin, são importantes para conter a separação centrossomal e promover a ciliagênese (Conroy et al., 2012), o que, dentre outros, pode fornecer indícios da atuação funcional de Nek2 e Nek5 na ciliagênese, resposta de dano no DNA e mitose (Figura 06).

A função das Neks nos processos apoptóticos mitocondriais Quando a integridade genômica do DNA é reduzida por lesões no DNA, as vias de reparo e ativações de checkpoints creditam um tempo adicional para as células repararem o dano reduzindo a incidência de mutações e aneuploidias. Caso os danos não sejam corrigidos devido à sua grande extensão ou incapacidade de ativação do reparo, as vias apoptóticas são ativadas, evitando a proliferação destas células mutantes (Wyllie et al., 1980). Essas vias são caracterizadas por ativação de cascatas de sinalização mediante ativação ou modificações pós-traducionais em diversas proteínas. Atualmente, diversas vias são conhecidas como desencadeadoras de apoptose (Danial & Korsmeyer, 2004). Entretanto, inicialmente acreditava-se que a apoptose estava relacionada apenas entre o desbalanço da quantidade de proteínas pró- (Bax, Bak, Bad, Bid, Bim-L, PUMA) e anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W, McI-1) da família de Bcl-2 atuantes na modulação da permeabilidade mitocondrial. Mediante dano no DNA, p53 pode ser ativada e induzir a expressão de Bax acionando os processos apoptóticos (Chipuk et al., 2004). A partir do desencadeamento da abertura dos poros na membrana da mitocôndria, proteínas ou metabólitos internos são liberados no citosol sinalizando a disfunção mitocondrial da célula, dentre eles o citocromo C culminando na ativação vias apoptóticas, como a dependente de caspases 9, 3, 6 e 7 (proteases) e

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desencadeando a morte celular (Liu et al., 1996, Mcllwain et al., 2013; Martinou et al., 2000). Dessa forma, observamos que há uma sincronia entre núcleo (dano no DNA), mitocôndria (poros através da família de Bcl-2) e citosol (controle por caspases) na resposta apoptótica. Outro tipo de modulação da permeabilidade mitocondrial encontra-se na regulação de canais iônicos localizados na membrana externa, a exemplo do VDAC (Voltage-Dependent Annion Channel 1), ou interna desta organela. Mediante exposição à UV, Nek1 interage com VDAC1 permitindo a sua fosforilação na serina 193. Isso leva a alteração da conformação de VDAC1 e, provavelmente, acarretando o fechamento do poro de saída de citocromo C (Chen et al., 2010). No entanto, o desbalanço dos níveis proteicos basais de hNek1 através de silenciamento ou expressão ectópica de mutantes, leva à não fosforilação de VDAC1 e, consequentemente, à ativação de caspases mediante liberação de citocromo C no citosol (Chen et al., 2009). Em resposta ao dano no DNA causado por estresse genotóxico, hNek1 pode apresentar função essencial na sobrevivência celular, uma vez que mutações ou seu silenciamento causaram sensibilidade a estes agentes (Chen et al., 2008; Polci et al., 2004, Pelegrini et al., 2010). Desta forma, além da contribuição do papel funcional de hNek1 na regulação de vias de reparo do DNA mencionadas anteriormente, este membro da família das hNeks parece atuar também na resposta ao dano através de sua mediação na apoptose celular. Sendo uma das respostas do dano no DNA, as vias apoptóticas estão altamente associadas às vias de reparo. PARP1 (Poly [ADP-ribose] polymerase 1) é uma enzima nuclear rapidamente ativada por lesões no DNA atuando como um sensor das quebras de fita desta molécula e sinalizando o dano através da adição de unidades de ADP- Ribose a partir de NAD+ em proteínas associadas à cromatina. A função desta proteína está associada à diversos outros processos biológicos (Weaver et al., 2013), ao recrutamento de proteínas para as regiões de dano da via de reparo BER (Masson et al., 1998; Reynolds et al., 2015) e contribui para a via HR, devido à sua importância em tumores de mama BRCA mutantes (Tutt et al., 2002; Bryant et al., 2005). Na morte celular, PARP1 pode atuar nas vias dependentes de caspase por sua regulação através dessas proteínas, ou nas vias independentes de caspase, através de sua regulação por

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AIF (Soldani & Scovassi, 2002; Hong et al., 2004). Não somente Nek1, como também outros membros da família das Neks estão associados na resposta apoptótica celular. Dentre as proteínas identificadas no interactoma de Nek4 estão as proteínas relacionadas com processo apoptótico PARP1, AIFM1 (Apoptosis-inducing factor 1) e TRAP-1 (Heat shock protein 75 kDa) (Basei et al., 2015). Ademais, hNek8 foi encontrada superexpressa em alguns tumores de mama primário (Bowers & Boylan, 2004). A linhagem celular de carcinoma mamário, T47D, apresentou aumento dos índices apoptóticos mediante superexpressão da versão inativa de hNek3. Sob estímulo com prolactina, hNek3 interage com o com o receptor deste hormônio e com o proto-oncogene Vav; sendo esta uma das vias que provavelmente hNek3 atua nos tumores mamários (Miller et al., 2005). O silenciamento de hNek2 em células MCF7 (Estrogen Receptor, ER-Positivas) e MDA-MB-231 (ER-Negativas) reduziu o perfil tumorigênico em xenógrafos de camundongos (Tsunoda et al., 2009) e promoveu apoptose mediante tratamento com doxorubicina, uma droga genotóxica com atividade inibitória de Topoisomerase II (Lee & Gollahon et al., 2013). Mediante tratamento com a mesma droga, a expressão do dominante negativo de hNek6 promoveu a senescência das células tumorais e redução tumoral em xenógrafos de camundongo (Jee et al., 2013). Adicionalmente, o silenciamento de hNek6 e 7 bem como seus mutantes inativos para sua atividade catalítica, ou kinase dead, induzem ao aumento das taxas de apoptose em diversos tipos de tumores (O«Regan & Fry, 2009; Nassispour et al., 2010; Jee et al., 2013). O interactoma de hNek7 revelou seu possível envolvimento em diversos processos celulares relacionados à mitocôndria como a regulação positiva da morte celular e interactores relacionados com a formação do complexo I da cadeia respiratória (de Souza et al., 2014).

A função das Neks no processamento de RNA O mRNA produzido através do processo de transcrição ainda é considerado imaturo uma vez que possue íntrons e encontra-se desprotegido, sendo sucetivel à ação de enzimas. Desta forma, ocorre o processamento do pré-mRNA a fim de torná-lo maduro e funcional. Para isso, ocorre a adição de uma cauda de poli-adenilação na

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extremidade 3« garantindo a estabilidade do pré-mRNA. Subsequentemente, esta molécula sofre splicing, o qual irá remover os íntrons, ou sequências não codificantes de aminoácidos. De modo geral, o processamento de RNA bem como o splicing alternativo tem sido associado à diversos genes relacionados à apoptose, ciclo celular e dano no DNA (Montecucco & Biamonti, 2013; Moore et al., 2010). Recentemente, hNek2 e hNek4 foram associadas ao processamento de mRNA e splicing. hNek2 colocaliza com SRSF1 e SRSF2 (Serine/Treonine Rich Splicing Factors) em speckles (manchas) de splicing, isto é, regiões de inter-cromatina enriquecidas com fatores de splicing. Ainda, hNek2 em si pode atuar como um fator capaz de regular o splicing alternativo de diversos genes alvo de SRSF1 envolvidos na viabilidade celular, sendo que o seu silenciamento promove a apoptose (Naro et al., 2014). O interactoma de duas isoformas de hNek4 identificou diversas proteínas relacionadas ao processamento de mRNA, a exemplo de SRSF1, SRRM2 (Serine/arginine repetitive matrix protein 2) e PRPF4B (Serine/threonine-protein kinase PRP4 homolog) (Basei et al., 2015). Uma vez que alguns desses interactores foram específicos para cada isoforma e elas diferenciam-se quanto à preferência de regiões de splicing, pode haver uma regulação cruzada entre as isoformas de hNek4 (Basei et al., 2015).

Nek5 Dentre os membros da família das Neks, hNek5 e hNek10 são as proteínas menos caracterizadas funcional e estruturalmente. Recentemente, os primeiros trabalhos publicados revelaram que NEK6 interage e regula a atividade e localização de NEK5 em Arabdopsis thaliana. Esta via de ativação, em conjunto com a interação entre NEK4 e NEK6, está envolvida com a regulação de microtúbulos, possivelmente pela fosforilação de β-tubulina por NEK6, e à expansão celular nesse organismo (Motose et al., 2011). Adicionalmente, mutantes de NEK4, NEK5 e NEK6 apresentaram hipersensibilidade à inibidores de microtúbulos, taxol e propizamida, indicando que essas proteínas podem regular o crescimento celular de modo microtúbulo dependente (Motose et al., 2012) (Figura 07). Humanos e A. thaliana são organismos distantes evolutivamente, entretanto Nek6 apresenta semelhante papel funcional em humanos e, cada vez mais, é demonstrada a coordenação evolutiva entre a função dos membros

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das hNeks em diversos organismos. De modo semelhante, é importante ressaltar que Nek5 desses organismos apresentam aproximadamente 300 aminoácidos de diferença e 40% de identidade aproximadamente. Assim, é necessário destacar a necessidade de futuros experimentos comprobatórios da função identificada em A. thaliana de hNek5 também em humanos. Como ressaltado anteriormente, as hNeks tendem à atuar em três principais processos biológicos, dentre eles a mitose, em especial na biologia dos centrossomos (Meirelles et al., 2014). hNek5 foi inserida recentemente nesse grupo de funções devido a sua caracterização na regulação da organização do centrossomo (Prosser et al., 2015). Neste trabalho foi demonstrado que hNek5 localiza-se na base dos centríolos na região proximal end em centrossomos mitóticos e do cílio primário em células hTERT- RPE1 além de localização no fuso mitótico até a metáfase (Figura 07). O silenciamento de hNek5 causou manutenção da coesão dos centrossomos duplicados mediante retenção das proteínas linkers, C-NAP1, rootletin e hNek2, redução da nucleação dos microtúbulos e no desalinhamento dos pólos do fuso. Provavelmente associado aos defeitos na separação dos centrossomos e na organização do fuso, células depletadas para hNek5 também apresentaram complicações na manutenção da integridade cromossômica devido à formação de células binucleadas ou com micronúcleos (Prosser et al., 2015). Esse fenótipo está associado à cromossomos lagging (retardatários), ao atraso da divisão ao longo da anáfase, formação de pontes cromossômicas na citocinese que conduzem à mitose catastrófica (Vitale et al., 2011). Ainda, a interação entre hNek5 e Caspase-3 foi descrita como importante para a diferenciação muscular (Shimizu & Sawasaki, 2013), uma vez que Nek5 pode atuar como um substrato para esta proteína e potencializar efeitos de morte celular (Figura 07). Além dos diversos papéis na apoptose e diferenciação celular, recentemente alguns trabalhos têm destacado a degradação de proteínas relacionadas às vias de reparo do dano no DNA através de caspase-3. (Brown et al., 2008; Matsuura et al.; 2008; Larsen, 2010).

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Nek5( Caspase&3(

Arabdopsis*thaliana* Homo*sapiens*

* NEK4% Homo*sapiens NEK6% ) ) NEK5% Prófase Prometáfase ) Interfase) Metáfase

Crescimento% celular%dependente% ) Nek5% Anáfase de%microtúbulos% Centrossomo) Telófase)

Figure 07: Ilustração esquemática dos papéis funcionais de Nek5 descrito até o momento para A. thaliana e humanos. Em plantas, Nek5 interage com Nek6, sendo Nek6 também capaz de interagir com Nek4, e essas interações estão associadas ao crescimento celular dependente de microtúbulos. Em humanos, Nek5 localiza-se na base dos centríolos ao longo do ciclo celular, sendo importante para a biologia centrossomal, e no fuso mitótico até a metáfase quando começa a concentrar-se novamente no centríolo (Nek5 está representada por círculos cor-de-rosa escuros e mais claros, indicativo de início de redução de localização). Nek5 é ainda capaz de interagir com Caspase-3 e sua regulação é importante para a diferenciação muscular.

Nek10 A proteína hNek10 é um dos membros mais atípicos da família das Neks, uma vez que apresenta dois domínios regulatórios extensos na região amino e carboxiterminal com o domínio cinase no centro da proteína. Este domínio catalítico é flanqueado por dois subdomínios coiled coil (super-hélice), os quais são descritos por sua importância para interações com outras proteínas. Assim, especula-se que esses subdomínios são responsáveis por aproximar os substratos da hNek10 do domínio catalítico e, possivelmente, serem fosforilados. Adicionalmente, a presença de repetições armadillo pode colaborar para o interactoma de Nek10, uma vez que pode ser um sítio importante para interação proteína-proteína (Figura 01).

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Assim como hNek5, hNek10 é pouco estudada funcionalmente, sendo o primeiro trabalho publicado em 2011 por Moniz e Stambolic o qual revelou o possível papel funcional de hNek10 no controle do checkpoint em G2/M. A sua depleção em Hek293 e MCF10A (linhagem celular normal de glândula mamária) prejudicou a parada em G2/M em resposta à irradiação UV. O mecanismo molecular desta resposta encontra-se na autoativação de MEK1 por hNek10 em resposta ao estímulo de UV, mas não ao estímulo mitogênico (Figura 08). A via de sinalização celular de MAPKs (Mitogen Activated Protein Kinase), Ras-Raf-Mek-ERK, está bem caracterizada como reguladora da expressão de diversas proteínas envolvidas no controle da proliferação, migração, diferenciação celular e apoptose. Adicionalmente, dados da tese da Dra Larissa Moniz indicam que a resposta da hNek10 a UV é um papel conservado, uma vez que seu homólogo em C. elegans, nekl-4, aparentemente medeia a sensibilidade de embriões do verme à radiação. O locus gênico de hNek10 foi considerado suscetível ao desenvolvimento de tumores de mama BRCA mutantes (Ahmed et al.; 2009; Antoniou et al., 2010; Mulligan et al., 2011). Esses são hereditários, agressivos e relacionados à defeitos nas vias de reparo do DNA, a exemplo do reparo por HR. A proteína BRCA é, portanto, um marcador genético utilizado para a detecção e investigação desses tumores. Desta forma, o estudo de alvos específicos contra estes tumores que levem à desaceleração do crescimento ou morte tumoral são altamente relevantes. Adicionalmente, a baixa expressão de hNek10 nesses tumores foi associado com a baixa sobrevida dos pacientes, prognóstico ruim e associado aos tumores triplo negativos (não expressam os três receptores de hormônios estrógeno, progesterona e HER-2 sendo considerados os mais invasivos) (Moniz, 2010). Os tumores pulmonares, metastáticos e de ovário também tiveram mutações nos domínios regulatórios de hNek10 identificadas (Greenman et al., 2007; Davies et al., 2005) (Tabela 02).

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Tabela 02: Mutações de Nek10 encontradas em tumores pulmonares, metastáticos e de ovário. Órgão/ Tipo do tumor Mutação Mutação de Tipo da Referência Tecido de Base aminoácido mutação Pulmão Carcinoma 3344C>T P1115L Missense Greenman et al., 2007 neuroendócrino Pulmão Variado P1115L Davies et al., 2005 Pulmão Carcinoma large cell 2633G>T R878M Missense Greenman et al., 2007 Melanoma Metastático 1135G>A E379K Missense Greenman et al., 2007 Ovário Carcinoma mucinoso 197C>T A66V Missense Greenman et al., 2007 Ovário Carcinoma mucinoso 2556C>T S852S Silenciosa Greenman et al., 2007 Pulmão Variado G2633T Davies et al., 2005 Pulmão Variado R878M Davies et al., 2005 Pulmão Variado C3344T Davies et al., 2005

Em dados da tese da Dra. Larissa Moniz (2010), análises de espectrometria de massas dos sítios de fosforilação e ensaios de imunoprecipitação com mutantes de hNek10 revelaram sua possível dimerização e ativação. Apesar de fazer parte de uma família de serina/treonina cinases, também apresenta atividade de tirosina cinase. Predições de motivos conhecidos por fosforilação de cinases específicas indicaram o sítio S933 como alvo de proteínas 14-3-3 e o sítio S797 para ATM. hNek10 pode ainda ser modificada por SUMO uma vez que foi encontrada sua interação com esta proteína mediante tratamento com peróxido de hidrogênio, capaz de causar danos no DNA pela liberação de ROS (Grant et al., 2010). Semelhante à hNek5, a tese da Dra. Larrisa Moniz ainda aponta a expressão e atividade de hNek10 em índices crescentes ao longo da diferenciação muscular, sendo este um indicativo da sua atuação na miogênese.

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Cyclin'A'

Figura 08: Ilustração do papel de Nek10 na via de MAPKs em resposta ao estresse genotóxico de radiação UV (Adaptado de Fry et al., 2012). Nek10 medeia a interação entre RAF1 e MEK1 em resposta à UV ativando e recrutando ERK1/2, inibindo a atividade de CDK1 e Ciclina A e, consequentemente, ativando a resposta ao dano no DNA de parada do ciclo celular em G2/M.

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Objetivos

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Objetivo Geral O presente trabalho teve como objetivo geral caracterizar as proteínas cinases humanas Nek5 e Nek10 quanto à sua interactômica e seu contexto funcional em especial nas resposta do dano no DNA por meio de estratégias de biologia molecular.

Objetivos específicos • Investigar a localização e colocalização de hNek5 na mitocôndria com parceiros identificados através de duplo híbrido e seus papéis funcionais relacionados nessa organela. (Artigo II) • Confirmação do complexo de interação entre hNek5 e TopoisomeraseIIβ (Artigo III). • Investigar o papel funcional de hNek5 nas respostas do dano no DNA e sua importância para a via de reparo por Recombinação Homóloga (HR) (Artigo III). • Investigar novos parceiros de interação de hNek10 através de duplo híbrido e espectrometria de massas (Artigo IV). • Caracterização funcional de hNek10 na resposta ao dano no DNA e sua importância na biologia celular (Artigo IV).

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Resultados

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Os resultados desta tese serão apresentados sob o formato de 2 artigos publicados, 1 artigo submetido e 1 manuscrito.

Artigo I: neste artigo pude contribuir com a revisão bibliográfica e discussão acerca da proteína hNek10 e auxiliar nas correções finais.

Artigo II: neste trabalho auxiliei nos experimentos de duplo híbrido, confirmação de interações e correções finais do artigo.

Artigo III: realizei o desenho dos experimentos bem como sua execução em conjunto com a Dra. Talita Diniz de Melo Hanchuck e realizei a redação geral deste manuscrito revisada pelo orientador Prof. Dr. Jörg Kobarg.

Artigo IV: nesse manuscrito produzi o desenho geral do trabalho bem como a execução da maioria dos experimentos. Também realizei a análise dos dados e redação do manuscrito revisada pelo orientador Prof. Dr. Jörg Kobarg.

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Artigo I

"Stop Ne(c)king around": How interactomics contributes to functionally characterize Nek family kinases

GABRIELA VAZ MEIRELLES, ARINA MARINA PEREZ, EDMÁRCIA ELISA DE SOUZA, FERNANDA LUISA BASEI, PRISCILA FERREIRA PAPA, TALITA DINIZ MELO HANCHUK, VANESSA BOMFIM CARDOSO AND JÖRG KOBARG

WORLD JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 5(2):141-60, 2014

(doi:10.4331/wjbc.v5.i2.141)

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Artigo II

Nek5 interacts with mitochondrial proteins and interferes negatively in mitochondrial mediated cell death and respiration

TALITA DINIZ MELO HANCHUK, PRISCILA FERREIRA PAPA, PAOLO G. LA GUARDIA, ANIBAL E. VERCESI, JÖRG KOBARG

CELLULAR SIGNALING. 27(6):1168-77. 2015

(doi: 10.1016/j.cellsig.2015.02.021)

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Artigo III

hNek5 interacts with an anticancer target, Topoisomerase IIβ, and is involved in the DNA Damage Response

PRISCILA FERREIRA PAPA, TALITA DINIZ MELO HANCHUK, KALIANDRA DE ALMEIDA GONÇALVES, ALESSANDRA LUIZA PELEGRINI AND JÖRG KOBARG

(Artigo submetido na revista Cellular Signaling)

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hNek5 interacts with an anticancer target, Topoisomerase IIβ, and is involved in the DNA Damage Response.

Priscila Ferreira Papaa,b,f, Talita Diniz Melo Hanchuka,c,f, Kaliandra de Almeida Gonçalvesa, Alessandra Luiza Pelegrinid, Jörg Kobargb,c,e,* aLaboratório Nacional de Biociências, Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais, Campinas, São Paulo, Brazil bPrograma de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil cPrograma de Pós-Graduação em Biologia Funcional e Molecular, Instituto de Biologia, Dep. Bioquímica e Biologia Tecidual, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil dDepartamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazil eUniversidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Campinas, São Paulo, Brazil fThese authors contributed equally to this work.

E-mail addresses: PFP: [email protected] TDMH: [email protected] KAG: [email protected] AP: [email protected] JK: [email protected]

*Corresponding author: Jörg Kobarg, Universidade Estadual de Campinas Ð Inst. de Biologia, Dep. Bioquímica e Biologia Tecidual, Rua Monteiro Lobato 255, CEP 13083-862, Campinas-SP, Brasil, Telephone: (+55)19-3521-1443 Author contributions: PFP, TDMH, KAG, AP and JK performed the literature search and contributed specific parts of the manuscript. PFP conducted all the experiments with TDMH, KAG and AP assistance. PFP and JK elaborated the final version of the text and JK supervised the project. All authors read and approved the final version. Keywords: Nek5, DNA Damage Response, TOPIIβ

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Abstract The dysfunction and deregulation on DNA Damage Repair and Response pathways cause genomic instability, which has been closely associated to tumor development. Until the date, hNek5 has been not related with these processes unlike other members from the same family of protein kinases, the Neks. The Nek family is one of the major families associated with this process, and also with regulation of the cell cycle progression and ciliopathies. Here, we discovered a new and important role for hNek5 in the context of the DNA Damage response and its association with the activation of Homologous Recombination Repair pathway. We confirmed the interacting complex between hNek5 and TOPIIβ in Hek293T and U2OS cells by immunoprecipitation assays and confocal microscopy. Both hNek5 depletion and stable expression altered cell cycle arrest upon DNA damaging drug treatments with Cisplatin, Zeocin and Etoposide, an inhibitor of TOPIIβ. Accordingly, hNek5 depletion affected the replication status and increased the number of cells with γ-H2AX recruitment, suggesting hNek5 importance to sense DNA damage. In response to DNA damage caused by Etoposide, hNek5 protein levels in the nucleus increased and caused subsequently the activation of ATM, Chk2 and γ-H2AX, but not BRCA1. This points to hNek5 importance for the correct activation of the Homologous Recombination Repair pathway. Taken together, these results indicate hNek5 as an important new component for DNA damage response.

Introduction Genomic instability and mutations have been considered as essential hallmarks of cancer [1]. As DNA is not an inert molecule, it is susceptible to environmental influences, such as intern metabolites, UV-radiation, reactive oxygen species (ROS) and several drugs. Therefore, it is necessary to maintain the genome integrity by triggering the correct cellular response, for instance cell cycle arrest, apoptosis, alterations in transcriptional response and the onset of DNA repair [2]. The deregulation of DNA repair pathways can lead not only cancer but also diseases and genetic syndromes like Xeroderma Pigmentosum

! 78! ! and Cockayne Syndrome (defects on Nucleotide Excision Repair - NER), Fanconi Anemia (defects in Intra- or Inter-Strand Crosslink repair) and Ataxia Telangiectasia (mutations in ATM and ATR causing defects in Homologous Recombination Repair -HRR- pathway) [3-5]. Consequently, studies with patients carrying these diseases contributed to the understanding of the relation between the mechanism of action of a broad spectrum of chemotherapeutical drugs and the DNA damage repair. Among them, some are capable to affect preferentially cancer cells such as alkylating agent drugs (Cisplatin, Carboplatin, Mitomycin C), Topoisomerase poisons (Doxorubicin, Etoposide), replication inhibitors (Aphidicolin, Hydroxyurea) and radiomimetics (Bleomycin antibiotic family) [6-12]. Depending on the type of DNA damage, different DNA repair pathways are triggered. In the case of Double-Strand Breaks (DSBs), two major pathways can be activated: 1) Homologous Recombination Repair (HRR) and 2) Non- Homologous End-Joining (NHEJ). HRR is characterized by its fidelity as the homolog chromatid is used as a template, then, this pathway is dependent on the cell cycle phase. The damaged DNA recruits MRN complex, activates ATM, ATR, BRCA and some effector kinases like Chk1 and Chk2, which will regulate the cell cycle arrest for a proper repair. While NHEJ recruits DNA-PKC, Ku70 and Ku80, DNA polymerases and ligases and do not use a template, which is potentially error-prone and mutagenic [13,14]. Among different protein kinases related to the regulation of DNA damage response and repair relies a new class of protein kinases: the Nek (NIMA-related kinases) family. First characterized by its role in the control of cell cycle progression (centrosome function), such as its homolog in Aspergillus nidulans, NIMA (Never in mitosis, gene A), the eleven members of this family also play important roles in DNA repair and primary cilia (ciliopathies) [15]. Composed by a conserved catalytic domain, Neks also have a regulatory domain with peculiarities for each member, with different motifs and interacting partners sites. Their regulation and interaction profile has been recently but not fully described in DNA damage response and repair. For instance, hNek1 deficient cells are hypersensitive to lethal effects of Ionizing Radiation and together with ATRIP,

! 79! ! were capable to activate ATM even before the induction of DNA damage in Homologous Recombination Repair pathway [16,17]. hNek4 depletion reduced the activation of γ-H2AX after Etoposide treatment and caused drug resistance to Etoposide, Bleomycin and γ-radiation [18]. In addition, hNek8 and hNek9 were related to the replication stress as hNek8 reduced activity and hNek9 depletion caused hypersensitivity to this stress and the accumulation of DNA damage [19,20]. Even though little is known about hNek5, Shimizu reported its interaction with Caspase-3 as important for muscle differentiation [21]. A recent work from our group characterized hNek5 as a mitochondrial protein and showed that its stable expression enhances cell viability while reduces cell death through its interaction with, among others, BCLAF1 [22]. BCLAF1 interacts with γ-H2AX in a IR-dependent fashion and this interaction allows H2AX to be activated. Consequently, this promotes the regulation of DNA repair and apoptosis [23]. The hNek relation with DNA damage response and repair associated with the identification of two hNek5 interactors, Topoisomerase II-β (TOPIIβ) and BCLAF1, related these biological processes instigated us to investigate hNek5 role in DDR. Our data indicate both hNek5 depletion and stable expression orchestrate alterations in DNA damage response after different drug treatments, especially for Etoposide, and causes deregulation on Homologous Recombination Repair proteins activation.

Materials and Methods Cell Culture and Reagents Hek293T and U2OS human cell lines were obtained from ATCC while hNek5-WT (Flp-In System - Invitrogen, Carlsbad, CA), Hek293T-shRNA hNek5 and U2OS-shRNA hNek5 (shRNA-hNek5) stable cell lines were produced and described previously in Melo Hanchuk«s work [22]. Cells were maintained in a o humid incubator with 5% CO2 at 37 C and cultivated in high glucose Dulbecco«s modified Eagle«s medium (Gibco) enriched with 10% certified fetal bovine serum (Gibco) and penicillin/streptomycin (100 units/mL, Gibco). In order to maintain

! 80! ! stable cell lines selection, the medium was supplemented with 50 µg/ml hygromycin B (Invitrogen). The expression of hNek5 was induced with 2 µg/ml tetracycline during at least 24 hours. The silenced cells (shRNA-Nek5) were maintained with 3 µg/ml puromycin. Five-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU-Invitrogen) was dissolved in ultrapure water, H6Cl2N2Pt - cis-Diammineplatinum(II) dichloride (Cisplatin; Sigma) in PBS (Phosphate Buffer Saline), Zeocin (Invitrogen) was ready to use and only Etoposide (Sigma) was dissolved in DMSO, which was used as control for the experiments performed with this drug.

Immunoprecipitation assays Immunoprecipitation experiments were performed as described previously in Melo Hanchuk work [22]. Briefly, T-Rex-293 hNek5 (hNek5-WT) induced for hNek5 protein expression with tetracycline and Hek293T cells were lysed with ERB buffer (50 mM Tris, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 10% glycerol and 0.2% NP40) supplemented with protease inhibitor cocktail (Roche Applied Science, Mannhein, Germany), centrifuged at 20,000 x g for 30 minutes at 4¡C. The supernatants were incubated for 16 hours with the resin conjugated with mouse anti-Nek5 (5 µg; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, USA), mouse anti- TOPIIβ (5 µg; Santa Cruz Biotechnology) or with commercial resin pre- conjugated with anti-FLAG, anti-FLAG M1 Agarose Affinity Gel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Immunoprecipitate samples were obtained by boiling samples in sample buffer at 95¡C.

Immunoblot and antibodies Whole-cell lysates, quantified by Bradford’s Method [24], and immunoprecipitates were resolved by SDS-PAGE and blotted onto Nitrocellulose membranes (Amersham). Immunoblot analysis was performed with the primary antibodies: anti-Nek5 (1:500; Santa Cruz Biotechnology), anti-ATM (1:500; Santa Cruz Biotechnology), anti-pATM (1:1000; Cell Signaling), anti-pBRCA1 (1:1000; Cell Signaling), anti-pChk2 (1:1000; Cell Signaling), anti-γH2AX (1:1000,

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Millipore) and anti-βTubulin (1:700; Abcam) diluted in blocking solution (2% bovine serum albumin and 0.02% sodium azide in TBS- Tris-Buffered Saline). Protein bands were detected with peroxidase-conjugated antibodies and blots were developed using an enhanced chemiluminescence kit, ECL Western Blotting System (Amersham).

Cell Viability Assay About 10,000 cells per well of Hek293T, T-Rex-293 hNek5 (hNek5-WT) and Hek293T-shRNA hNek5 (shRNA-hNek5) were seeded in 96-well plate in triplicate and induced with 2 µg/ml tetracycline for 24 hours. Thus, cells were treated with different doses of DMSO, Etoposide, Cisplatin and Zeocin, as specified in the figures, for additional 24 hours. Following the manufacture«s instructions, cell viability was determined by MTS assay (3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) using CellTiter 96¨ AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega). Plates were assayed in a plate reader EnSpire (PerkinElmer Inc, Waltham, MA, USA) at 490 nm in order to measure formazan product. MTS absorbance is expressed as the percentage of 3-5 independent experiments.

Flow cytometry Hek293T, hNek5-WT and shRNA-hNek5 cells were seeded in a density of 1x105 cells/well in 6-well plate and allowed to adhere before induction with 2 µg/ml tetracycline for 24 hours. Thus, cells were treated for 1 hour with Etoposide (5 µM), Cisplatin (16 µM) and Zeocin (65 µM) and DMSO as a control. To check the recovery after 24 and 48 hour of the drug treatment, cells were trypsinized, harvested and centrifuged at 1,500 rpm, washed with PBS (phosphate-buffered saline), fixed with 70% ethanol and stored at 4oC. Prior to flow cytometry analysis, cells were permeabilized and stained for its DNA content using Propidium Iodide solution (0.1%Triton X-100, 2 mg RNAse A- DNAse free - and 50 µg Propidium Iodide). Cell cycle profile was determined by flow cytometry analysis of DNA content by the evaluation of ten thousand events in FACSCanto

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II flow cytometer (BD Biosciences).

Immunofluorescence and confocal microscopy U2OS and U2OS-shRNA hNek5 cells were cultivated in a 384-well Cell Carrier Plate (Perkin Elmer Inc) as previously described. Cells were treated with different concentrations of DMSO, Etoposide, Cisplatin and Zeocin drugs, as specified in the figures, for 24 hours. Thus, cells were fixed and permeabilized with 3.7% formaldehyde, 0.2% Triton-X-100 and PBS for 20 minutes, blocked with Blocking Solution (3% BSA-Bovine Serum Albumine, 0.8% Triton X-100 in PBS) for 30 minutes and incubated with primary antibodies: anti-Nek5 (1:25, Santa Cruz Biotechnologies ), anti-H2AX (1:750, Millipore) and anti-TOPIIβ (1:25, Santa Cruz Biotechnologies) diluted in PBS for 2 hours. Thus, secondary fluorescent-labeled antibodies Chicken anti-Mouse Alexa Fluor 488 (green; Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA) and Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 546 (yellow, color changed to red in the figures; Life Technologies Corporation) were incubated in a concentration of 1:300 in PBS for 1 hour. Nuclei were stained using Hoechst dye. Cells were visualized and image data collection was performed in Operetta High Content Imaging (PerkinElmer Inc) using Harmony Software (PerkinElmer Inc). In order to edit the images, it was used Volocity Demo 6.1.1 software (PerkinElmer Inc). Endogenous hNek5 and TOPIIβ staining of non-synchronized U2OS cells were collected in TCP SP8 Leica Microscope using 63X lenses.

Quantitation of γ-H2AX and hNek5 staining The data image collection of hNek5, γ-H2AX and Hoechst staining were analyzed using Ready-Made Solutions available by Harmony Software (PerkinElmer Inc.). First, it was selected the cell nuclei by Hoechst marker. Thus, the program selected γ-H2AX positive cells based on the nuclei selection and after the adjustment of intensity. The γ-H2AX positive cells were counted and the quantitative results of positive cells for γ-H2AX/Hoechst were plotted in a graph following statistical analyses. For hNek5 intensity quantitation, it was established a mask able to select the nuclei based on Hoechst staining. Therefore, we

! 83! ! determined a threshold for negative hNek5 staining in the nucleus and only the positive cells were quantified. The intensity of more than 1500 U2OS cells no treated or treated with DMSO, Etoposide, Cisplatin and Zeocin were quantified and plotted in a graph following statistical analyses.

EdU Incorporation Assay To monitor DNA synthesis or replication status, U2OS and U2OS-shRNA hNek5 plated in a 384-well Cell Carrier plate (PerkinElmer Inc) were treated for one hour with two different doses of DMSO, Etoposide, Cisplatin and Zeocin, as specified in the figure 5. Subsequently, they were exposed to 30 µM EdU (5- ethynyl-2 -́ deoxyuridine) for two hours. Cells were fixed and permeabilized with 3.7% formaldehyde, 0.2% Triton-X-100 and PBS for 20 minutes and stained for

EdU by the incubation with the cycloaddition reaction (1 mM CuSO4, 100 mM ascorbic acid and 10 µM Alexa Fluor¨ 488 Azide (Life Technologies) for one hour. Nuclei were stained with DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole). Cells were visualized and image data collection was performed in Operetta High Content Imaging (PerkinElmer Inc) using Harmony Software (PerkinElmer Inc) and a 20X lens. Thus, the nuclei were selected based on Hoechst staining by Harmony Software (Perkin Elmer).Also, a threshold for fluorescence intensity of 1000 (a.u.) was established in order to quantify EdU positive cells on the selected Hoechst positive nuclei. The normalized data of EdU positive cells per Hoechst (nuclei) is shown as a plotted graph of three different experiments.

Statistical Analysis Statistical analysis represents the mean of three independent replicates of each experiment. Data were compared using one-way or two-way analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post-tests correction in GraphPad Prism version 5 software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). For all graphs, it

! 84! ! is shown the data as the mean ± S.E.M. and the differences are represented by * and were considered to be significant if p<0.05.

Results hNek5 interacts with TOPIIβ, a target for anticancer drugs hNek5 is one of the 11 members of the Nek (NIMA related kinases) family of protein kinases which has a catalytic domain located in its amino-terminal and a regulatory domain in its carboxy-terminal constituted by coiled-coils regions. Altogether, it is composed by a 708 amino acids long protein. The regulatory regions of hNek family members vary largely and are composed of different domains and motifs, which may give rise to individual functions, mediated through differential interactomes for each member [15]. Even though little is known about hNek5 functional profile, its interaction with Caspase-3 [21] and mitochondrial proteins [22] have been recently described. In the previous yeast two hybrid screen described by our group, a hNek5 regulatory domain cDNA sequence cloned in pGBKT7 was used as bait against the Mate & Plate Library - Universal Human (Normalized), originally cloned in pGADT7-RecAB [22]. Among other proteins, Topoisomerase IIβ (TOPIIβ) and BCL2-associated transcription factor 1 (BCLAF1) were identified as new interactors of hNek5, both of which are related to DNA Damage Response (DDR) and DNA damage repair pathways. The in vivo interaction between endogenous BCLAF1 and both hNek5 endogenous and stably expressed has been already confirmed [22]. Therefore, we investigated here the interaction of TOPIIβ with hNek5. The stable expression of FLAG-Nek5 was induced with tetracycline for 48 hours in hNek5-WT cells (Fig 1A, lane 3), or not induced for control in non-transfected Hek293T (lane 1). The lysates were immunoprecipitated using anti-FLAG pre- conjugated resin. Western blot of lysates and immunoprecipitates revealed a protein band for TOPIIβ in the immunoprecipitation of FLAG-hNek5 from tetracycline induced hNek5-WT Hek293T cells, but not from Hek293T cells (Figure 1A, lane 4 vs. lane 2). Next, western blot detected an endogenous protein band for hNek5 in anti-TOPIIβ but not in IgG control immunoprecipitates

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(Figure 1B, lane 3 vs. 2). Our results did not detect protein bands for hNek5 or TOPIIβ in the total lysates (input), because, as these proteins are expressed in a lower level, they are very diluted in these samples. However, when immunoprecipitation assays are performed, these proteins are concentrated allowing its detection by western blot. Thus, hNek5 and TOPIIβ immunoprecipitate in the same protein complex, which indicates their interaction. Corroborating the interaction study, hNek5 and TOPIIβ should share the same subcellular localization, which can be analyzed by confocal microscopy. The co-localization between endogenous hNek5 and TOPIIβ was confirmed in the nucleus of U2OS cell line, with a Pearson«s Coefficient of 0.6834 (Figure 1C). TOPIIβ is a direct or indirect target of anticancer drugs, such as Etoposide, which is considered a Topoisomerase poison, blocking the protein activity to reconnect de DNA and causing DNA Strand Breaks [25,26]. Thus, as hNek5 interacts with TOPIIβ, we tested if TOPIIβ inhibited by etoposide would be an attractive stimulus to the interaction among hNek5 and TOPIIβ. However, the interaction levels were equivalent as the control (data not shown). Therefore, as TOPIIβ is a target of anticancer drugs and BCLAF1 has been related to play a role on the regulation of γH2AX, the identification of this new hNek5 interactor may give new insights for hNek5 role in the DDR.

Cell viability is enhanced by both hNek5 stable expression and depletion in response to DNA damage drugs In order to access the phenotypes raised by hNek5 in response to DNA damage, we tested several anticancer drugs involved in different types of DNA damage. As mentioned above, Etoposide is considered a Topoisomerase poison, therefore, it is a relevant drug to analyze if the inhibition by TOPIIβ gives rise to a specific cellular phenotype in cells stably expressing or not expressing hNek5. In the case of the antibiotics from the Bleomycin family, such as Zeocin, the DNA Double Strand Breaks (DSB) are caused by the oxidation of the sugar molecule present in the DNA through ROS formation [7]. Cisplatin has been used

! 86! ! combined with other drugs to combat different types of cancer and is a platinated compound that causes an alteration in the DNA structure by intra or inter-strand DNA crosslinks or DNA/protein crosslinks [11]. Given the results from Nek5’s interactome, we also investigated the effect of hNek5 knock down by hRNA interference in cell viability assays in response to the DNA damage drugs. shRNA-hNek5 and hNek5-WT cells, which stably express hNek5, were submitted to different concentrations of Etoposide, Zeocin and Cisplatin for 24 hours. DMSO was used for the control of Etoposide treatment as only this drug was dissolved in DMSO. Next, MTS assay was performed and the relative number of viable cells was determined by absorbance in 490 nm. After Zeocin, Etoposide and Cisplatin treatment, the cell survival was significantly enhanced in cells with hNek5 stable expression in approximately 12%, 10-30% and 10-20%, respectively (Figure 2A, 2C and 2E). However, hNek5 depletion did not alter cell viability for Zeocin treatment (Figure 2B), while for Etoposide and Cisplatin there was also an increase in the levels of cell survival to around 10-30% (Figure 2D and 2F). Although our data show that both hNek5 stable expression as well as its depletion increase cell viability in response to DNA damage drugs, they also provide clear evidence for a new role of hNek5 in the DDR. Most of the drugs used in this work are also considered chemoterapics. Thus, these results may further suggest that an alteration of hNek5 expression levels in cancer could contribute to a higher drug resistance upon chemotherapy. hNek5, together with TOPIIβ functional state, is critical for cell cycle arrest When the DNA is damaged different DDRs can be triggered, such as cell cycle arrest, DNA damage repair or apoptosis. The cell cycle arrest occurs because the checkpoint machinery is responsible to maintain genome integrity by avoiding the accumulated damage to be passed on to the daughter cells [27]. Therefore, the cell cycle can be arrested at different points, but most prominently at the G1, S or G2 phases of the cycle. Since our findings indicate a new role for hNek5 in DDR, we next evaluated by flow cytometry its effect on the cell cycle

! 87! ! index after recovery from DNA damage. For that, we treated Hek293T, shRNA-hNek5 and hNek5-WT cells with Etoposide (5 µM), Cisplatin (16 µM) and Zeocin (65 µM) for 1 hour. The degree of recovery was analyzed by flow cytometry after 24 and 48 hours. Both Zeocin and Etoposide cause DSB, which has the greatest effect on the checkpoint in G2 phase. hNek5 stable expression enhanced significantly the percentage of cells arrested in G2 after both 24 and 48h hours of the treatment with Zeocin (Figure 3A and 3B). However, there was a decrease on the same levels in G2/M phase in the presence of Nek5 compared to the control cells after the treatment with Etoposide, the inhibitor of TOPIIβ (Figure 3C and D), at both time points. Cisplatin treatment causes cell cycle arrest on the S phase, and the percentage of cells halted in S significantly increased from 40 to 80% in hNek5-WT cells (Figure 3E and F) after 24h recovery. In accordance, hNek5 shRNA knock down caused a decrease in the number of cells in G2/M after 24h of Zeocin treatment only, but also again after 24 or 48 h of Etoposide treatment (Supplementary Figure 1). Cisplatin on the other hand caused now a slight decrease in the number of cells in S-phase, only at 24 h, but the effect was much less pronounced in comparison with the stably Nek5 expressing cells (compare Fig 3F and Suppl. fig.S1F). Taken together, our findings indicate that stable expression of hNek5 contributes to increase cell cycle arrest in response to DNA damage, especially after Zeocin and Cisplatin treatment. hNek5 depletion on the other hand decreases cell checkpoint activation after all three treatments, indicating its importance for the maintenance of robust a DNA damage response.

Endogenous hNek5 translocates to the nucleus in response to Etoposide treatment The previous results indicate a role for hNek5 in the DNA Damage Response (DDR) and hNek5 appears to be critical to cell cycle arrest. Therefore, it was relevant to check if hNek5 depletion could affect upstream pathways, such as the sensors of DNA damage sites. The phosphorylation of the histone H2AX

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(γ-H2AX) has been commonly used as a marker for DSB, however its activation may also be related with DNA Damage caused by Cisplatin [28]. Briefly, the damaged DNA is perceived by ATM, which is activated and, together with DNA- PK, promotes the phosphorylation of the Ser119 residue of H2AX (γ-H2AX), localized to the sites of DNA damage [29-31]. Furthermore, γ-H2AX can also be activated by BRCA1 in Homologous recombination Repair pathway [32]. To address the nuclear localization of Nek5 after DNA damage, we treated U2OS cells with DMSO (control), Zeocin (15, 30 65, 95, 200 and 325 µM), Etoposide (1, 5, 10, 15, 45 and 90 µM) and Cisplatin (1, 5, 10, 20, 30 and 50 µM) for 24 hours. The cells were then fixed for immunofluorescence assay and stained with γ-H2AX antibody, hNek5 antibody, and Hoechst as a marker for the nuclei (Figure 4B). hNek5 staining in the nucleus was quantified using a proper mask selected in the Harmony software (Perkin Elmer). There was a statistically significant increase in hNek5 intensity in the nucleus after 5 µM Etoposide treatment (Figure 4A and 4B). However, its cytoplasmic/mitochondrial localization was maintained, suggesting a partial hNek5 translocation. Additionally, the Pearson«s Coefficient for hNek5 and Hoechst after treatment with the drugs were around 0.2, while for Etoposide it was 0.53. Despite of the fact that hNek5 staining in the nucleus increased after Etoposide treatment, it did not colocalize with γ-H2AX, as the Pearson«s Coefficient was 0,341. Hence, hNek5 is recruited to the nucleus when its interactor TOPIIβ is inhibited by Etoposide. hNek5 depletion highly activated γ-H2AX after a long period of exposure to Cisplatin and Etoposide DNA damage drugs Even though hNek5 did not co-localize with γ-H2AX, it is possible that the recruitment of γ-H2AX is altered at DNA damage sites, depending on Nek5 presence or absence. To confirm this idea, we performed the same treatments mentioned above for U2OS and U2OS hNek5-depleted cells. In Figure 4C, there was a statistically significant change in the staining of γ-H2AX only at the highest concentration of Zeocin (325 µM). For both cell types, hNek5 depleted cells increased the recruitment of γ-H2AX on the DNA Damage sites in the nucleus for

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Etoposide and Cisplatin treatments (Figure 4D and 4E). Interestingly, even the lowest tested concentration of both drugs significantly increased γ-H2AX staining for both treatments, especially for Etoposide in which the levels maintained high. Zeocin and Etoposide cause DSBs however by different mechanisms. Briefly, the first is an antibiotic from the same family of Bleomycin, characterized for inducing the formation or liberation of free radicals capable to link in the deoxyriboses or the methyl group of the thymidine nucleotide, thereby causing the DNA damage [8,12]. Etoposide binds to the Topoisomerase II, inhibiting its activity of resealing the DNA strand previously cut to allow DNA supercoiling alleviation [9,24,25]. Since hNek5 interacts with TOPIIβ and may be involved in the regulation of its activity, its depletion may cause the observed increase of γ-H2AX staining levels after Etoposide treatment in comparison with U2OS control cells (Fig.4D). Accordingly, hNek5 depletion also increased γ-H2AX staining after the Cisplatin treatment (Figure 4E). Even though there was a decrease in γ-H2AX staining up to 30 µM of Cisplatin treatment (Figure 4E), most probably, high concentrations of this drug may cause saturated damage to U2OS, during which may be potentialized by hNek5 depletion. hNek5 depletion maintains high levels of cell replication after DNA damage Our results from the cell cycle profiles and viability assays suggested a critical role for hNek5 in cell survival and the DNA Damage Response. Thus, we tested if Nek5 depletion also affects replication stress after DNA damage. For this we analyzed the incorporation of EdU (5-ethynyl-2 -́ deoxyuridine), a thymidine analog, which is incorporated in the DNA during replication. By a covalent reaction between a fluorescent azide and an EdU alkyl group catalyzed by copper, it is then possible to stain cells during active replication. From the obtained images it is possible to interrogate cell replicative stress caused by the treatment with DNA damage drugs, especially Cisplatin that caused S-Phase arrest in cell cycle analyses. The percentage of the EdU positive stained cells was established according to the total nuclei population counted by Hoechst staining (Figure 5A).

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In comparison with the U2OS control cells, hNek5 depletion caused a statistically significant higher incorporation of EdU for all the three tested DNA damaging drugs, especially at the higher drug concentrations (Figure 5A). Together with the results of cell cycle profile (Fig.supplem. S1-B,D and F), it seems that hNek5 depletion may result in a lack of sensitivity to the DNA damage response activation, both in regard to the cell cycle arrest and the stress dependent replication halt. Additionally, it may cause a canalization to a error prone pathway leading to cromossome instalibility and mutation.

Both hNek5 depletion and stable expression influence the activation of important proteins related to DNA Damage Response Our data indicates that hNek5 plays a role in the response triggered by different types of DNA damage. As shown in Figure 1, hNek5 interacts with Topoisomerase IIβ (TOPIIβ), which is a target of Etoposide, an anticancer drug that stabilizes DNA-TOP2 complexes preventing the reattachment of the DNA broken ends. This inhibition promotes therefore single and double strand breaks and the activation of Homologous Recombination Repair (HRR) and Non- Homologous End Joining (NHEJ) repair pathways [33]. In contrast, NHEJ promotes the repair of DSBs without the requirement for a homologous template and, hence, in mammals, this pathway predominates in many stages of cell cycle. Both pathways are high conserved throughout eukaryotic evolution but their relative importance and members involved can differs. Previously, several members of Nek family have been related with both pathways [17,18,34], although HRR is a more efficient and error-free mechanism to repair such DNA damage and it can only operate after completion of the S phase. Therefore, we next analyzed the immediate effect of etoposide treatment in the activation of proteins that trigger a correct DNA damage response, such as the ATM, BRCA1 and Chk2 kinases, for both hNek5-WT and shRNA-hNek5 cells. For that, cell lysates samples from 10 minutes (Figure 5B) recovery after treatment with DMSO and 5 µM Etoposide were analyzed by western blot of the mentioned phosphorylated proteins.

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In comparison to control cells, ATM was highly activated (pATM) in the presence of hNek5 after 10 minutes recovery (Fig. 5B). In the protein extracts from shRNA-hNek5 cells, we detected a slight phosphorylation of ATM similar to the control cells. After the activation of ATM, one of its targets is Chk2, which is phosphorylated in its T68 site by ATM in response to ionizing irradiation (IR), UV- irradiation or hydroxyurea treatment [35,36]. As our results showed a higher phosphorylation of ATM in the presence of hNek5, an increase of pChk2 was also expected. Nonetheless, western blot analysis showed that hNek5 stable expression caused normal activation levels of pChk2. Consistently, hNek5 depletion had the same levels of pATM and pChk2 after 10 minutes recovery (Figure 5B). In fact, hNek5 stable expression increased the levels of pATM however pChk2 was not altered, indicating that this part of the pathway was not completely altered. It has been described that both activation of Chk2 and ATM can cause BRCA phosphorylation in one to three sites [37,38]. Our experiment indicate that hNek5 stable expression may increase pATM levels. Therefore, we checked the activation of pBRCA phosphorylation by ATM using a specific antibody for BRCA-ser1524. Interestingly, stable expression of hNek5 did not show any BRCA activation, while the Hek293T presented slight BRCA phosphorylation after 10 minutes. Curiously, hNek5 depletion samples showed pBRCA protein band in non-treated cells western blot but reduced phosphorylation of BRCA after Etoposide treatment for both the collected times. Our results suggest that hNek5 expression increases the levels of phosphorylation of the proximal kinase ATM but not of pBRCA, while the opposite effect was detected for hNek5-depleted cells. Thus, in response to a genotoxic effect caused by Etoposide, hNek5 may play a role in the DNA damage response pathways most probably in the activation of ATM and BRCA. Altogether, our results indicates that the deregulation on hNek5 protein levels, for instance its stable expression or depletion, may change the activation profile of proteins responsible for DNA damage repair and response, especially in concern to the replication status, cell cycle arrest and cell viability.

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Discussion hNek5 is a protein member of the serine/threonine Nek kinase family. It is composed by a catalytic domain located at its amino-terminal (1- 259 aa) and a regulatory domain at its carboxy-terminal (260-708 aa). In this domain there are 2 coiled coils regions, which have already been described for other hNeks as important sites for protein-protein interaction [39], and a DEAD-Box Helicase-like domain. Members of proteins containing this domain have been related to pre- mRNA processing not only in the nucleus but also in the mitochondria [40-42]. Although the majority of Nek kinase family members play a role in DNA Damage Response [15], no such relation had been shown previously for hNek5. BCLAF1 (BCL2-associated transcription factor 1, regulates functions of mitochondrial proteins) is a protein related to the DNA damage response by its interaction with and regulation of γ-H2AX in response to IR [23]. By a yeast two hybrid screening, we identified TOPIIβ as an hNek5 interactor and confirmed the interacting complex of TOPIIβ-hNek5 by immunoprecipitations of endogenous TOPIIβ and FLAG-hNek5 and endogenous Nek5, respectively (Figure 1B and A). Corroborating these results, they share the same subcellular localization in U2OS nucleus, where they may collaborate functionally. Because of the DNAs plectonemic topology, during DNA replication, recombination or transcription, supercoils are introduced, that may lead to DNA breaks. In order to avoid this, topoisomerases are responsible for the cleavage of one strand (class I) or both strands (class II) of the DNA by an ATP-dependent manner, to release the supercoiling by passing one strand through the other. Afterwards the DNA is resealing [9,12,25,26]. TOPII enzymes are recruited specially during DNA replication, which only occurs during the S and the beginning of G2 phases. Thus, the deregulation of TOPII causes many DSBs capable to activate DNA damage response, including as apoptosis [43]. Among other Topoisomerases poisons, Etoposide is employed as a chemotherapeutic agent against many cancers and acts as a stabilizer of the covalent, intermediate

! 93! ! protein-DNA complex. Collision of polymerases may then lead to the loss of TOPII concomitant with the formation of DSB [44]. As hNek5 forms an interacting complex with a target for anticancer drugs, TOPIIβ, and other Neks have been related to DNA Damage Response, we decided to address the functional role of hNek5 in this process not only for Etoposide, but also for other DNA Damage drug treatments. Similar to Etoposide, Zeocin, alike Bleomycin, also causes SSBs and DSBs however by the formation of ROS in the cell, which oxidize the sugar molecule present in the DNA [7,45]. Additionally, hNek5 was shown to promote increased ROS generation in response to the mitochondrial dysfunctional drug, Thapsigargin [22]. It seems likely that the observed different responses for Zeocin treatment in hNek5- depleted cells (Figure 2B and 4C) may be related to hNek5 regulation of the Complex IV and its role in mitochondria respiration [22]. However, we did not check for the underlying mechanisms related to the mitochondria itself or the mitochondrial dependent DNA Damage Response. We also tested the responses after challenge with the intra- and interstrand Crosslinker, Cisplatin. It has an affinity for nucleophilic atoms, such as Guanine or Adenine Nitrogen 7 (N7), by its alkylating-like action [46,47]. Therefore, the crosslink between Cisplatin and the nucleotides (GpG, ApG or GpC) causes a contortion on the DNA topology (bulk formation), which is sensed by proteins members of different DNA Repair pathways, such as Fanconi Anemia, Mismatch repair and Nucleotide Excision Repair [6,10]. Also, another Nek family member, hNek1 was described to be important for the activation of proteins related to DNA repair, H2AX and Chk1, and cell cycle arrest after Cisplatin treatment [48] When the DNA is damaged, sensor kinases are triggered and cell cycle is arrested in order to guarantee full DNA repair, so that mutations will not be passed to daughter cells. In the normal cellular context, if the DNA suffers damage in abundance, apoptosis is triggered [49]. Our results show that both stable, tetracycline induced hNek5 protein expression and hNek5 depletion increased cell viability after all the drug treatments (Figure 2). In fact, hNek5

! 94! ! endogenous levels are acutely regulated, as it was not possible to detect by western blot its protein levels in input samples (Figure 1.B). Thus, it suggests that slight alterations of the hNek5 protein levels may be sufficient to change DNA Damage sensitivity. Similarly, we questioned if the cell cycle index was also altered in the presence and absence of hNek5 protein. Although Etoposide and Zeocin cause G2/M phase arrest and Cisplatin, S phase arrest, surprisingly, hNek5 caused different responses to each drug (Figure 3). hNek5 stable expression did decrease the levels of G2/M phase after Etoposide (Figure 3C and 3D) compared to the control but increased G2/M cell percentage after Zeocin treatment (Figure 3A and 3B). Additionally, the presence of hNek5 also increased the number of cells in S phase after Cisplatin treatment, in comparison to control cells that were already recovering their cell cycle index (Figure 3E and 3F). The absence of hNek5 on the other hand had opposite effects, causing in the cases of Zeocin and Cisplatin a decrease of the number of cells in G2/M after 24h (Supplementary Figure 1). Therefore, these data indicate that hNek5 stable expression and depletion interfere with the cell cycle progression. However, both conditions caused a quicker recovery, compared to control cells, from the G2/M block caused by Etoposide treatment, most probably, by the influence of TOPIIβ functional inhibition by this drug (Fig. 3 and S1, C, D). An involvement in the regulation of the cell cycle arrest in response to DNA damage was reported before for other members of the Nek family. In contrast to the response observed for hNek5, hNek1 depletion increased the levels of cell cycle arrest after H2O2, MMS and Cisplatin [48]. In response to ionizing Radiation, Nek1-/- fibroblasts cells were defective in activate G1/S and M phase checkpoint and promote DNA repair [50]. Likewise, hNek10 depletion also increased cell cycle arrest in G2/M phase after UV radiation by its mediation on the MEK1 activation [51]. It seems that hNek5 may play an opposite and possibly more specific role when compared to other Neks function in DNA Damage Response.

! 95! !

All three drugs, Etoposide, Cisplatin and Zeocin, can cause replication stress in unsynchronized cells as the replication is impaired while the DNA damage repair takes place (Figure 5A). More specifically, Cisplatin provoke a contortion on the DNA and this may induce a physical blockage during replication. The detailed work of Choi and co-workers [19] described the link of hNek8 role between DNA damage, replication stress and ciliopathies. hNek8 seems to be critical for the replication fork regulation, preventing the fork collapse and, consequently, the DSB accumulation. The molecular mechanisms may be mediated through hNek8 regulation of CDK activity. hNek1, 4 and 9 also regulate the replication stress in response to a proper DNA Damage Repair [18,20,34]. By the analyses of the incorporation of EdU, our data indicate that, even though the cell cycle was not completely arrested for any drug treatment in hNek5-depleted cells, there was a slight stress in the replication for all treatments but in the control cells the stress was higher and less cells continued in division (Figure 5A). This indicates that hNek5 depletion may cause the cells insensitivity to the DNA damage checkpoints, thereby promoting a continuous replication albeit the necessity of DNA repairs. In 2004, Polci and co-workers [16] showed the translocation of hNek1, together with the increase of its expression levels, to the nucleus; specifically to DNA repair sites after ionizing radiation. BRCA1, a critical member for Homologous Recombination Repair pathway, also migrates between cytoplasm and nucleus after UV-irradiation [52]. We therefore checked hNek5 localization after DNA damage drug treatment by confocal microscopy. hNek5 showed a specific translocation to the nucleus as there was an expressive increase on hNek5 nuclear staining in cells treated with Etoposide (Figure 4.A and B). This may indicate that when TOPIIβ is inhibited, some of the cytoplasmic hNek5 is recruited to the nucleus where it may have a role in DNA damage pathways. Altogether, our results point to hNek5 as a significant protein involved in different types of DNA damage responses, specifically for those related with its interactors. One of the most intriguing data was observed in response to Etoposide treatment. DSBs cause the activation of both NHEJ and HR. We

! 96! ! decided to study HR because it repairs DNA with a higher fidelity and also some proteins of Neks have been related also to this pathway [53]. For instance, hNek1 and hNek11 play a role in the regulation and activation of some Homologous Recombination Repair pathway members in response to Ionizing or UV Irradiation. hNek1 interacts and stabilizes the ATR-ATRIP complex upstream Chk1 among others proteins associated to ATR signaling and the absence of hNek1 affect Chk1 and Chk2 kinases activation leading to checkpoint failure [17, 50]. In response to Ionizing Irradiation, Chk1 activated by ATM causes the phosphorylation of hNek11. Thus, the phosphorylation of CDC25A by both Chk1 and Nek11 activated kinases leads to its proteassomal degradation and, consequently, to cell cycle arrest [54]. One of the first kinases triggered in Homologous Recombination Repair pathway is ATM, followed by Chk2 and both kinases then phosphorylate BRCA1 [55-57]. Together with other proteins, BRCA1 activates and recruits γ-H2AX until the DNA damage is fully repaired [58]. hNek5 expression first increased the levels of pATM, in contrast it seems that pChk2 levels remained normal while BRCA1 was not activated (Figure 5B). Interestingly, we observed an increase in γ-H2AX recruitment in DNA damage foci after Etoposide treatment, which may be triggered by the non-activation of pBRCA and continuous DNA damage. Also, in response to Etoposide DNA damage, hNek5 expression did not cause increased levels of G2/M arrest such as for other drugs screened. This may be due to the normal activation of Chk2. BRCA mutations are associated with malignant breast cancer and the regulation of BRCA by phosphorylation and its protein interactome are both related to DNA damage response, repair and cell cycle control pathways, specifically to the G2/M and spindle assembly checkpoints [59]. Furthermore, BRCA is also considered a tumor suppressor by the regulation of the Caspase-3 activation in response to UV [60]. hNek5 interacts with Caspase-3 and it was associated to drug resistance and decrease on cell death [21,22]. In addition, hNek5 stable expression and depletion caused an increase on the levels γ-H2AX, which were maintained high after Etoposide treatment (Figure

! 97! !

4D and E). In contrast, hNek4 presented an opposite effect as its depletion decreased γ-H2AX recruitment after Etoposide treatment [18]. So far, it is ambitious to affirm that hNek5 may cause defects in DNA damage repair, but it seems reasonable that hNek5 plays a role in DNA damage response, specially mediated by the genotoxic effect caused by TOPIIβ inhibition. Taken together, our data indicates for the first time hNek5 protein role in DNA damage response, as its depletion and stable expression both altered the cell cycle arrest and replication status. It may cause a disregulation of the HR pathway by the delay on DNA Damage repair or by the altered regulation of pBRCA activation. Although hNek5 precise mechanism of action was not yet elucidated, our research hallmarks hNek5 as another member of Nek kinase family with crucial functions in the context of the DNA Damage Response. Furthermore hNek5 has a potential as a new target kinase to anti-tumor inhibitor development, since both increase and depletion of hNek5, elevates cells viability after anti-cancer drug exposure (Fig.2 A, C, E). Thereby, an incorrect regulation of hNek5 protein levels may contribute to the development of the tumor cells resistance to chemotherapy.

Conclusion In conclusion, our results indicate a new potential role for hNek5 in DNA Damage Response by its interaction with an anticancer target enzyme, TOPIIβ, hNek5 translocation after Etoposide treatment, deregulation of cell cycle arrest, cell viability increase and alterations on proteins related to DNA damage response by both hNek5 stable expression and depletion.

Acknowledgements The authors gratefully acknowledge the Chemical Biology and Screening Platform facility and Dr. Lúcio H. G. de Freitas Junior, for kind assistance during the assays in Operetta High Content Imaging System (PerkinElmer). We also thank Silvio Roberto Consoni for some of the confocal images using TCS SP8 Leica Microscope and outstanding advices in immunofluorescence protocols. We

! 98! ! thank Prof. Dr. Carlos Frederico Martins Menck for kindly provide some of the antibodies used in this work, helpful discussions and proofreading the manuscript. This work was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado São Paulo (FAPESP) process numbers 2010/15262-2 and 2010/51730-0, Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) and Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM). We declare that we have no conflict of interest.

! 99! ! +293T+ +293T+ +293T+ +293T+ + + Input+

A! Input+

Input+ B! Input+ Input+ Input+ hNek5+WT++ Hek IP+:+FLAG+++++ IP+:+FLAG+++++ hNek5+WT++ Hek IgG kDa IP+:+FLAG+++++ Hek

! IP+:+FLAG+++++ IgG IP+:+TOPIIβ+++++ Hek kDa! IP+:+TOPIIβ+++++ An#$Nek5+ An#$TOPIIβ+ 7!100! *! 7!130! An#$Nek5+ An#$TOPIIβ+ An#$Nek5+ An#$TOPIIβ+ 7!100!! An#$TOPIIβ+ An#$Nek5+ 7!130!! 7!55!! 7!55!! An#$β$Tubulin++ An#$β$Tubulin++ An#$β$Tubulin++ An#$β$Tubulin++

C! !!!!!!!!TOPIIβ!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Hoechst!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Nek5!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Merge!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Figure 1. hNek5 interacts with Topoisomerase IIβ in mammalian cell lines. (A) Hek293T and Hek293 with hNek5 stable expression (hNek5-WT) cells were induced with tetracycline for 48 hours and its lysates were immunoprecipitated with anti-FLAG pre-conjugated resin. Rabbit anti-TOPIIβ reveals a band for immunprecipitates with hNek5 only in cells with stable expression of hNek5-WT. Asterisk shows nonspecific band for TOPIIβ. (B) Endogenous immunoprecipitation of TOPIIβ with Hek293T lysates with the control IgG resin (second lane) and IgG conjugated with anti-TOPIIβ (third lane). Anti-Tubulin was used as loading control. (A and B) Black arrow indicates TOPIIβ protein band. (C) Representative images of non-synchronized U2OS cells co-stained for endogenous TOPIIβ (green), hNek5 (red) and nuclei (Hoechst, blue) in confocal TCP SP8 Leica microscope TCP SP8. The Pearson«s Coefficient for hNek5 and TOPIIβ was analysed only for the nuclear region as indicated by the white arrow. Pearson«s Coefficient was 0,6834 suggesting a co-localization of both proteins. LAS AF Lite (Leica) software was used to measure the Pearson«s Coefficient Scale bars =10 µm.

100! ! !

A" Cell viability B" Cell viability 150 150 Hek293T Hek293T hNek5 WT shRNA-hNek5 *** *** *** ** 100 *** 100 *

50 50

0 0 Normalized Absorbance (a.u.) Absorbance Normalized 0 15 30 65 95 200 (a.u.) Absorbance Normalized 0 15 30 65 95 200 Zeocin (mM) Zeocin (mM) D" C" Cell Viability Cell viability 150 Hek293T DMSO 150 Hek293T DMSO hNek5 WT DMSO shRNA-hNek5 DMSO ** Hek293T Etoposide *** *** ** *** Hek293T Etoposide 100 *** ** hNek5 WT Etoposide 100 *** *** *** shRNA-hNek5 Etoposide ***

50 50

0 Normalized Absorbance (a.u.) Absorbance Normalized 0 0 5 10 15 45 90 (a.u.) Absorbance Normalized 0 5 10 15 45 90 Drug concentration (mM) Drug concentration (mM)

E" Cell viability F" Cell viability 150 150 Hek293T Hek293T hNek5 WT shRNA-hNek5 *** 100 100 *** *** *** *** *** ***

50 50

0 0 (a.u.) Absorbance Normalized Normalized Absorbance (a.u.) Absorbance Normalized 0 7,5 15 45 90 0 7,5 15 45 90 Cisplatin (mM) Cisplatin (mM) Figure 2. Cell viability is increased in both stably hNek5 expressing Hek293T cells and Hek293T cells with hNek5 shRNA knock down in response to DNA damaging reagents. Respectively, ten thousand cells of hNek5-WT (A,C,E) and shRNA-hNek5 (B,D,F) were treated with 0, 15, 30, 65, 95 and 200 µM of Zeocin (A,B); 0, 5, 10, 15, 45 and 90 µM of Etoposide (C,D) or 0, 7.5, 15, 45 and 90 µM of Cisplatin (C,F) for 24 hours. MTS assay was performed and cell viability was measured by the absorbance of formazan product at 490 nm. Means ± SEM of normalized absorbance are shown in the plotted graphs. * = 0.05 < p < 0.01; ** = 0,01 < p < 0.001; *** = p < 0.001, two-way ANOVA and Bonferroni test.

101! ! !

A" B" G2/M Phase 100 Hek293T 80 hNek5WT

60 *** 40 ***

20 Cellpercentage (%)

0 NT 24h 48h

Zeocin C" D" G2/M Phase 100 Hek293T 80 hNek5WT

60 *** 40 ***

20 Cellpercentage (%)

0 NT DMSO Etoposide DMSO Etoposide 24 hours 48 hours

E" F" S Phase

100 Hek293T *** 80 hNek5WT

20 Cellpercentage (%)

0 NT 24h 48h Cisplatin Figure 3. hNek5 stable expression increases number of Hek293T cells arrested in the cell cycle following DNA damaging drug treatments. Hek293T and hNek5-WT cells were treated with 65 µM Zeocin (A,B), DMSO or 5µM Etoposide in DMSO (C,D) 16 µM Cisplatin for 1 hour (E,F). Non-treated (NT) as well treated cells were collected and fixed for Propidium Iodide staining after 24 and 48 hours of recovery. Cells were submitted to flow cytometry analysis of cell cycle index. Cell percentage of G2/M-Phase for Hek293T and hNek5-WT cells after Zeocin or Etoposide treatment are shown as bar plots (B,D). Cell percentage of S-Phase index for Hek293T and hNek5WT cells after Cisplatin treatment is shown as bar plots (F). A total of 10000 events were collected for the measurement, but only cells selected by a gate were considered for the plotted data. *** = p < 0.001, two-way ANOVA test.

102! ! !

C" 400 U2OS A" U2OS shRNA-hNek5 300 *** 600 *

200 400 100

200 H2AXPositive/Hoechst (a.u.) 0 g 0 15 30 65 95 200 325 Zeocin (mM) 0 NT DMSO Etoposide Cisplatin Zeocin U2OS DMSO D" U2OS shRNA-hNek5 DMSO hNek5 Nuclei Staining intensity (a.u.) intensity Staining hNek5Nuclei U2OS Etoposide 800 *** U2OS shRNA-hNek5 Etoposide *** *** B" *** 600 ***

400 )))))))Merge)))))))))))))))))))))))))) )))))))Merge)))))))))))))))))))))))))) )))))))Merge)))))))))))))))))))))))))) )))))))Merge)))))))))))))))))))))))))) )))))))Merge)))))))))))))))))))))))))) 200 ***

H2AXPositive/Hoechst (a.u.) 0 g 0 1 5 10 15 45 90 Nek5 Nek5 Nek5 Nek5 Nek5 Drug concentration (mM) )))))) )))))) )))))) )))))) )))))) E" U2OS U2OS shRNA-hNek5 1000 *** Hoechst) Hoechst)

Hoechst) Hoechst) Hoechst) E" 800 )))) )))) )))) )))) )))) *** *** 600

400 ***

) ) Zeocin Zeocin ) ) ) Zeocin Zeocin Zeocin NT) NT) ) ) Etoposide Etoposide DMSO) DMSO) NT) NT) NT) ) ) ) Etoposide Etoposide Etoposide DMSO) DMSO) DMSO) Cispla1n) Cispla1n) Cispla1n) Cispla1n) )))))γH2AX) )))))γH2AX) Cispla1n) )))))γH2AX) )))))γH2AX) )))))γH2AX) 200

H2AXPositive/Hoechst (a.u.) 0 g 0 1 5 10 20 30 50 Cisplatin (mM) Figure 4. hNek5 is recruited to the nucleus after Etoposide treatment and number of γ-H2AX stained cells is increased in U2OS hNek5 depleted cells after Etoposide and Cisplatin treatment. (A) Quantification of hNek5 staining intensity in U2OS cells confocal microscopy per well treated with the mentioned drugs as follows. * = 0.05 < p < 0.01, One-way ANOVA tests. (B) U2OS co- stained for endogenous γ-H2AX (green), hNek5 (red) and nuclei (Hoechst, blue) in confocal microscope (Operetta High Content Imaging) of non-treated (NT) or continuous treated for 24 hours with DMSO, 5 µM Etoposide, 16 µM Cisplatin and 65 µM Zeocin. Merge represents the overlay of the hNek5, γ-H2AX and Hoechst images. Pearson«s Coefficient for hNek5 and Hoechst were 0.238, 0.193, 0.532, 0.185 and 0.081 for NT, DMSO, Etoposide, Cisplatin and Zeocin treatment, respectively. Black arrow indicates hNek5 representative images used for quantification. Scale bars =10 µm. (C) Quantification of positive γ-H2AX stained cells per Hoechst staining (nucleus) of U2OS and U2OS shRNA-hNek5 after 24 hour treatment with 0, 15, 30, 65, 95, 200, 325 µM Zeocin. (D) Quantification of positive γ-H2AX stained cells per Hoechst staining (nucleus) of U2OS and U2OS shRNA-hNek5 after 24 hour treatment with DMSO and 0, 1, 5, 10, 15, 45, 90 µM Etoposide. (E) Quantification of positive γ-H2AX stained cells per Hoechst staining (nucleus) of U2OS and U2OS shRNA-hNek5 after 24 hour treatment with 0, 1, 5, 10, 20, 30, 50 µM Cisplatin. *** = p < 0.001, two-way ANOVA test.

103! ! !

50 Replication Status A" U2OS U2OS shRNA-hNek5 40

** * *** 30 ** *** **

% EdU Positive cells 10

NT M) M) M) M) M) M) M) M) m m m m m m B"m m

DMSO (5 DMSO (15 Zeocin (65 Zeocin (200Etoposide (5 Cisplatin (16Cisplatin (50 Etoposide (15 Hek293T% hNek5WT% shRNA'hNek5% %% %% B" %% DMSO%% Etoposideo

DMSO%% kDa" Etoposideo Etoposideo DMSO%% %NT%% %NT%% %NT%% %NI%% pATM% $"170""

ATM% $"170""

pChk2% $"55"

pBRCA% pBRCA1" $"170"

β'Tubulin% $"40"

Figure 5. hNek5 depletion increases cell replication status and both stable expression and hNek5 depletion, alter the activation levels of proteins involved in activation of DNA damage response after treatment with Etoposide. (A) Quantification of cells showing EdU incorporation for U2OS and U2OS hNek5-depleted (U2OS shRNA-Nek5) non-treated (NT) or after one hour of treatment with the showed concentrations of DMSO, Etoposide, Cisplatin and Zeocin. Approximately 1500 cells were scored for each triplicate of the tested drugs. Bars represent the percentage of EdU positive cells for each condition. * = 0.05 < p < 0.01; ** = 0,01 < p < 0.001; *** = p < 0.001, two-way ANOVA and Bonferroni post test. (B) Western Blot analysis of Hek293T, Hek293 with hNek5 stable expression (hNek5WT) and knock down (shRNA-hNek5) protein extracts from no-treated cells (NT lanes), non-induced Hek293T hNek5WT (NI) and cells after 10 minutes recovery of treatment with DMSO or 5 µM Etoposide. Proteins associated with Homology Repair pathway were analyzed by Western blotting with specific antibodies indicated in the figure. Protein bands referred as β- Tubulin were used as loading control, as well ATM for a second control in pATM immunoblot.

104! ! !

Supplementary Figure

A" B" G2/M Phase 100 Hek293T 80 shRNA-hNek5

40 *** 20 Cellpercentage (%)

0 NT 24h 48h Recovery C" D" G2/M Phase 100 Hek293T 80 shRNA-Nek5

60 *** *** 40

20 Cellpercentage (%)

0 NT DMSO Etoposide DMSO Etoposide 24 hours 48 hours E" F" S Phase 100 Hek293T 80 shRNA-Nek5

40 ***

20 Cellpercentage (%)

0 NT 24h 48h Recovery Supplementary Figure 1. hNek5-depletion decreases the number of cell cycle arrested cells after DNA damaging drug treatment. Hek293T and Hek293 hNek5-depleted (shRNA-hNek5) cells were treated with 65 µM Zeocin (A,B), DMSO or 5 µM Etoposide in DMSO (C,D) and 16 µM Cisplatin (E,F) for 1 hour. Non-treated (NT) as well treated cells were collected and fixed for Propidium Iodide staining after 24 and 48 hours of recovery. Cells were submitted to flow cytometry analysis of cell cycle index. Cell percentage of G2/M- Phase index for Hek293T and shRNA-hNek5 cells after Zeocin or Etoposide treatment are shown as bar plots (B,D). Cell percentage of S-Phase index for Hek293T and shRNA-hNek5 cells after Cisplatin treatment are shown as bar plots (F). *** = p < 0.001, two-way ANOVA and Bonferroni post test.

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Artigo IV

hNek10 depletion and interactome suggest its role in DNA Damage Response, apoptosis and nuclear integrity

PRISCILA FERREIRA PAPA, EDMARCIA ELISA DE SOUZA, TALITA D. MELO HANCHUK, VANESSA BOMFIM CARDOSO, JOAN ROIG AMORÓS AND JÖRG KOBARG

(Artigo em preparação)

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hNek10 depletion and interactome suggest its role in DNA Damage Response, apoptosis and nuclear integrity

Priscila Ferreira Papa1,2, Edmarcia Elisa de Souza1,Talita D. Melo Hanchuk1,, Vanessa Bomfim Cardoso1,3, Joan Roig Amorós4,Jörg Kobarg2,5,¤

1Laboratório Nacional de Biociências, Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais, Campinas, São Paulo, Brazil. 2Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil. 3Programa de Pós-Graduação em Biologia Funcional e Molecular, Instituto de Biologia, Dep. Bioquímica e Biologia Tecidual, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil 4 Institute for Research in Biomedicine, Barcelona, Spain. 5Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Campinas, São Paulo, Brazil

E-mail addresses: PFP: [email protected] EES:[email protected] TDMH: [email protected] VBC:[email protected] JRA:[email protected] JK: [email protected]

¤Corresponding author: Jörg Kobarg, UNICAMP, Campinas - SP, Brasil, Tel.: (+55)19-3512-1125, Fax: (+55)19-3512-1006.

Author contributions: PFP, TDMH, EES, VBC, JRA and JK performed the literature search or experiments, and contributed specific parts of the manuscript. PFP and JK elaborated the final version of the text and JK supervised the project. All authors read and approved the final version.

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Abstract The interactome profile of the serine/threonine kinase family of Neks (NIMA related kinase) revealed a functional triad in which these proteins can be related: primary cilia/ciliopathies, mitosis and DNA damage response. Recently, hNek1, 2, 8, 10 e 11, members of the human Nek (NIMA related kinases) family, have been functionally associated to different pathways of DDR. hNek10 mediates the response to UV-irradiation triggering a MAPK pathway and its locus genic is susceptible for breast cancer. However, little is know about hNek10 interactome and biological function. Using two approaches, Yeast Two-Hybrid screening and Mass Spectrometry assays, we identified important biological processes in which hNek10 may be related, such as gene expression, metabolism, mitotic cell cycle, spindle assembly checkpoint, microtubule-based processes and apoptotis. Curiously, these processes are also important to the DNA damage response. Our data indicates hNek10 localization together with microtubule staining and it shows both cytosolic and nuclear localization after DNA damage. This indicates its role in both cell compartments. hNek10-depleted cells showed abnormal nuclear phenotypes, G1/S accumulation and elevated cell death status. Surprisingly, it seems that hNek10 is important for cell sensitivity to endogenous DNA damage caused, for instance, by ROS, as γH2AX staining was increased in this cells. Altogether, our results point out hNek10 as an important kinase for the genomic stability and to cancer treatment.

Introduction The protein kinases are key regulators of all cell functions and with over 500 members constitute more than 1.7% of the number of all genes in the human genome (Manning et al., 2002). Their main role is in the signal transduction and the coordination of complex functions such as the cell cycle and the DNA damage response (Rauch et al., 2011). Their genes suffer from somatic mutations that contribute in critical ways to the aging process and the development and progression of cancer (Hoeijmakers, 2009).

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The mammalian Nek (NIMA related kinases) family of serine/threonine protein kinases shares a highly conserved kinase domain with its ortholog NIMA (never in mitosis, gene A), a protein essential for cell cycle progression, from Aspergillus nidulans. In mammals, the eleven members of the Neks (1-11) share core biological functions which can be assorted to at least one of the following contexts: (1) mitosis/centrossome (2) primary cilia/ciliopathies or the (3) DNA damage response (Meirelles et al., 2014). These processes need to be integrated in an orchestrated manner in order to prevent genomic instability, one of the hallmarks of cancer (Hanahan et al., 2011). Cells are susceptible to endogenous and exogenous DNA damage agents that elicite at least one of the three major DNA damage response pathways: activation of cell cycle checkpoints, apoptosis/senescence or DNA damage repair activation (Norbury & Zhivotovsky, 2004; Helleday et al., 2008; Zhou & Elledge, 2000). The first insights about Nek interactome related to DNA damage repair were revealed when proteins, such as 14-3-3, 53BP1, ATRX, Mre11, were described to interact with Nek1 (Surpilli et al, 2003). Thenceforward, this protein has been described as an important kinase in DNA damage response as hNek1 activity may be independent of ATM and ATR and, by hNek1 interaction with ATR-ATRIP, it may coordinate the correct activation of Chk1 and Chk2 checkpoint proteins (Chen et al., 2008; Chen et al., 2011; Liu et al., 2013; Pelegrini et al, 2010). In response to ionizing irradiation, Nek11 activity is ATM and ATR-dependent, which triggers a signaling cascade culminating with the phosphorylation of CDC25A and G2/M arrest. Additionally, Nek4 has been described to interact with NHEJ (Non-Homologous End Joining) repair pathway proteins, to coordinate γH2AX activation and to localize at PML bodies in response to UV-radiation (Nguyen et al., 2012; Basei et al., 2015). Neks may also participate in DNA damage response associated to other biological processes. For instance, Nek8 depletion lead to replication stress and cellular phenotype associated to ciliopathies (Choi et al., 2013). Recently, Nek5 depletion induced centrosome cohesion, reduced microtubule nucleation, spindle pole misalignment and, consequently, it compromised chromosome integrity by

117! ! ! binucleated phenotype (Prosser et al, 2015). Defects in spindle nucleation were also associated to the correct activation of Nek6, -7 and -9 cascade leading to cytokinesis failure, mitosis catastrophe and genomic instability (O«Regan et al., 2009; Kim et al., 2007; Roig et al., 2005; Sdelci et al., 2012). hNek10 is one of the least studied proteins of the Nek family. Mutations in its gene have been found in breast cancer with lack of BRCA function, and mutations in its regulatory domains have also been reported in lung cancer (Antoniou et al., 2010; Ahmed et al., 2009; Davies et al., 2005; Greenman et al., 2007). Moniz and Stambolic (2010) demonstrated the functional role of hNek10 as a regulator of the MAPK (Mitogen-activated protein kinase) pathway in response to UV-radiation. Additionally, hNek10-depleted cells impaired G2/M arrest after UV irradiation and Nek10 activated a MAPK pathway through genotoxic but not by mitogenic stimuli. In this study, we explored the functional and molecular roles of Nek10 by identifying and characterizing its interactome, using both data from Yeast-two Hybrid Screenings (Y2H) and Mass Spectrometry (MS) analyses. The potential hNek10’s interactors, such as 14-3-3 proteins, BUB3, PCNA, SMC1 and SMC3, belong to gene expression, mitotic cell cycle, spindle assembly checkpoint, microtubule-based processes and apoptotic, essential biological processes, especially in response to a DNA damage stimuli. Furthermore we studied phenotypic and functional cellular alterations after depletion of hNek10. We found that Nek10 depletions causes abnormal nuclei shape, such as multi-nucleation or multi-lobulation, promotes cell death and the recruitment of γH2AX in the absence of extrinsic genotoxic stress. Our data indicate that hNek10 loss may sensitize cells to internal genotoxic effects and contribute further evidence for its involvement in the DNA damage response pathway.

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Materials and Methods Yeast Two-Hybrid (Y2H) Screening The MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid System (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) was used for the identification of protein interaction partners of hNek10. Constructs of hNek10 amino-terminus regulatory domain (hNek10NT - 1-518 a.a.) and hNek10 carboxy-terminus regulatory domain (hNek10CT - 786-1125 a.a.) cloned into pGBKT7 vector were used separately as baits against a normalized human universal cDNA Mate&PlateTM library originally cloned in pGADT7 and pre-transformed into Y187 yeast strain. Interactions were analyzed by assessment of reporter gene activation based on growth on minimal medium plates without tryptophan (-W), leucine (-L), histidine (-H) and adenine (-A) aminoacids, supplemented with α-galactosidasefor colorimetric plate assay (MEL1 reporter gene) and Aureobasidin antibiotic survival (AUR1-C reporter gene). The cDNA of the positive interactors (preys) were extracted, sequenced and submitted to the Integrated Interactome System (IIS) platform (http://www.lge.ibi.unicamp.br/lnbio/IIS/) (Carazzolle et al., 2014). The interactions were mapped and confirmed using hNek10 constructs of N- terminus and kinase domains (hNekNT- 1-518 and hNek10KD - 519-785 a.a.) cloned in pGBKT7 vector, co-transformed in Y2HGold yeast strain and selection on the minimal medium.

Cell culture, cell transfection and chemicals Hek293T, HeLa and U2OS human cell lines were obtained from ATCC. o Cells were maintained in a humid incubator with 5% CO2 at 37 C and cultivated in high glucose Dulbecco«s modified Eagle«s medium (Gibco) enriched with 10% certified fetal bovine serum (Gibco) and penicillin/streptomycin (100 units/mL, Gibco). Adherent Hek293T cells were seeded in a concentration of 1x105 cells/well (6-well plate) and transiently transfected for 48 hours with control p3XFLAG-CMV-7.1 (FLAG) or p3XFLAG-CMV-7.1-Nek10 (FLAG-hNek10) using Lipofectaminetransfection agent according to the Manufacturer's instructions. The Zeocin antibiotic (Invitrogen) was purchased ready to use.

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Establishment of hNek10-depleted cells Viral transduction was performed using lentiviral system carrying short- interfering RNAs (shRNAs) designed to target hNek10 (pLKO-shRNA-hNek10.1: 5’-CACAGCAGATTACCATTTATT-3’; pLKO-shRNA-hNek10.2: 5’- GCAGAGTAACCCTTGTAATTT-3’). pLKO scramble was used as a control(pLKO-shRNA), The shRNAs were obtained from The RNAi Consortium (TRC, IRB-Barcelona). Lentiviruses were transduced in HeLa cells in the presence of 1µg/mL polybrene and complete medium for 24 hours and stable HeLahNek10-silenced cell lines were selected with puromycin (Sigma-Aldrich) at 3 mg/mL.

Immunoprecipitation Hek293T cells transfected with p3XFLAG-CMV-7.1 or p3XFLAG-CMV- 7.1-Nek10 for 48 hours were lysed with Lysis buffer (50mM Tris 7,4, 100mM NaCl, 1mM DTT, 1mM EDTA, 30 µg/ml DNase I, 1% Triton X-100) supplemented with protease inhibitor cocktail (Roche Applied Science, Mannhein, Germany) and cleared by centrifugation at 20,000 X g for 30 minutes at 4¡C. The protein G sepharosewas washed twice with TBS (Tris Buffer Saline) and, subsequently, incubated with goat anti-SMC1 or Goat anti-SMC3 antibodies (5 µg, Santa Cruz Biotechnologies) for 1 hour at 4¡C with light agitation. The FLAG and FLAG- hNek10 lysates were incubated with anti-SMC1 or anti-SMC3 conjugated to sepharose and anti-FLAG M1 Agarose Affinity Gel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) during 16 hours at 4¡C under light agitation, and the resins were washed three times with PBS (Phosphate Buffer Saline). Immunoprecipitate samples of anti-SMC1 and anti-SMC3 were obtained by boiling samples in sample buffer (250mM Tris-HCl pH 6,8; 0,8% SDS; 0,2% Bromophenol Blue; 45,5% Glycerol; 20%; 2-β-Mercaptoethanol) at 95¡C and IP complexes using anti-FLAG were eluted with 250ng/µl 3xFLAG peptide after 2 hours of incubation. Lysates and IP samples were resolved in SDS-PAGE gels that were silver stained (Mortz et al., 2001) or immunobloted using anti-FLAG antibody.

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Immunoprecipitation Followed by Mass spectrometry (IP-MS/MS) For proteomic analysis, the total protein extract of three 225 cm2 flasks of Hek293T cells transfected with p3XFLAG-CMV-7.1 and p3XFLAG-CMV-7.1- Nek10, non- (NT) or treated with 300 µg/mL Zeocin for 3 hours were immunoprecipitated as previously described. About 100 µg protein of IP complexes were reduced in 500 µM Dithiothreitol for 30 minutes at 56¡C, alkylated with 4mM Iodoacetamide for 30 minutes at room temperature protected from the light and digested with Trypsin (Promega). The samples were injected in a Sep-Pak column (Millipore) to avoid contaminants. Thus, digested peptides were dried in a vacuum concentrator, reconstituted in 50 µl of 0.1% Formic Acid. 5µl of the suspension was analyzed in ETD enabled LTQ Velos Orbitrap mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) coupled to LC-MS/MS by a NanoLC PROXEON EASY-nLC II (nanoAcquity, Waters). All of the instrument methods for the LTQ VelosOrbitrap were set up in the data-dependent acquisition mode. Peak lists (msf) were generated from the raw data files using Proteome Discoverer version 1.3 (Thermo Fisher Scientific) with Sequest search engine against Swiss-Prot human database (released March 25Th2013), with carbamidomethylation (+57.021 Da) as the fixed modification and methionine oxidation (+15.995 Da) as variable modification, allowing one trypsin missed cleavage site and a tolerance of 10 ppm for precursor and 1 Da for fragment ions. The msf files generated by Proteome Discoverer software were analyzed in ScaffoldQ,+,v.3.3.2 (Proteome Software), with scoring parameters adjusted to obtain a false discovery rate less than 1%. The peptides with a minimum of five amino acids residues and showing a significant threshold (p<0.05) in Mascot-based score were considered in the data. The peptides identified in the mass spectrometry were considered only if identified in at least 2 replicates of FLAG-hNek10 immunoprecipitated samples. Additionally, the peptides were also considered it detected in only one replicate of control-FLAG immunoprecipitates with a low score for this sample and higher for FLAG-hNek10 samples. The MS/MS assays were performed by the Mass

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Spectrometry Facility at Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), CNPEM, Campinas, Brazil.

In silico Protein-Protein Interaction Network Analysis The sequencing data retrieved from Y2H screening and IP-MS/MS were submitted to the Integrated Interactome System (IIS) platform (National Laboratory of Biosciences, Campinas, Brazil) in order to assembly hNek10 interactome network. The enriched biological processes from the Gene Ontology (GO) database were calculated in each network using the hypergeometric distribution (Carazzolle et al., 2014). The network was assembled using Cytoscape 2.8.3 software (Shannon et al., 2003).

Subcellular fractionation About 1x107 cells of Hek293T transfected with p3XFLAG-CMV-7.1or p3XFLAG-CMV-7.1-Nek10 for 48 hours were collected, washed with PBS buffer and submitted to lysis in a Low Salt Buffer (LSB - 10mM TrisHCl pH 7.4; 320mM

Sacarose; 2mM MgCl2; 3mM CaCl2; 0,4% Nonidet P-40and supplemented with protease inhibitors- Roche) for 15 minutes at 4¡C. The suspensions were centrifuged at 800 X g for 5 minutes at 4¼C and the cytosolic fraction (supernatant) were collected. Then, the pellet was washed two times with LSB and incubated with a High Salt Buffer (HSB - 50mMTrisHCl pH 8.0, 250mM NaCl, 0.5% Nonidet P-40, 5mM EDTA, 30 µg/ml DNase I and protease inhibitors) for 10 minutes at 4¼C. Both fractions were clarified by centrifugation at 20.000 X g for 20 minutes at 4¼C. Nuclear and cytosolic fractions were submitted to protein quantification by Bradford’s Method (Bradford, 1976) and, subsequently, to immunoblot analysis.

Immunoblot Whole-cell lysates, quantified by Bradford’s Method (Bradford, 1976), and immunoprecipitates were resolved by SDS-PAGE and blotted onto Nitrocellulose membranes (Amersham). Immunoblot analysis was performed with the primary

122! ! ! antibodies: anti-FLAG (1:5000; Santa Cruz Biotechnology), anti-GAPDH (1:500; Santa Cruz Biotechnology), anti-Lamin A (1:500; Santa Cruz Biotechnology), anti-SMC1 (1:500; Santa Cruz Biotechnology), anti-SMC3 (1:500; Santa Cruz Biotechnology) diluted in blocking solution (2% bovine serum albumin and 0.02% sodium azide in TBS- Tris-Buffered Saline). Protein bands were detected with peroxidase-conjugated antibodies and blots were developed using the enhanced chemiluminescence ECLWestern Blotting System (Amersham).

Immunofluorescence Assays About 5x104 Hek293T cells were cultivated onto coverslips treated with Poly-L-Lysin and transfected with p3XFLAG-CMV-7.1 or p3XFLAG-CMV-7.1- Nek10 as described above. U2OS cells, pLKO-shRNA or hNek10-depleted HeLa cells were also cultivated onto coverslips for immunofluorescence assay of endogenous hNek10. The cells were fixed and permeabilized in a solution containing 3.7% formaldehyde, 0.2% Triton-X-100 and PBS for 20 minutes and quenched with 7.5 mg/mL glycine following rehydratation with PBS at room temperature for 5 min. Fixed specimens were blocked in PBS-AT (3% BSA- Bovine Serum Albumine, 0.8% Triton X-100 into PBS) for 30 minutes at room temperature and incubated with primary antibodies: rabbit anti-Nek10 (1:50, Atlas), mouse anti-β-Tubulin (1:100, ABCAM), mouse anti-α-Tubulin FITC conjugate (1:500, Sigma-Aldrich), rabbit anti-Lamin A (1:500, Santa Cruz Biotechnology) and anti-phospho-histone H2AX (1:250 EMD Millipore) diluted in PBS-AT for 1 hours. Thus, secondary fluorescent-labeled antibody Donkey anti- Rabbit Alexa Fluor-488 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA), chicken anti-mouse Alexa Fluor-488 (Life Technologies Corporation), donkey anti-rabbit Alexa Fluor-546 (Life Technologies Corporation) and chicken anti-mouse AlexaFluor-647 were incubated in a concentration of 1:300 in PBS-AT for 1 hour. Nuclei were stained using Hoechst 33258 dye and coverslips were mounted with ProLong Gold mounting media (Life Technologies) on a microscope slide. Data image of the hNek10 overexpression cells were captured on a confocal TCP SP8 Leica Microscope using 63X lenses and edited in LAS AF Lite software (Leica

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Microsystems). Same software was used to determine Pearson«s correlation coefficients. From the coverslips of hNek10-depleted HeLa cell images, a series of Z stack images of interphase cells were captured from 0.35 µm thick sections using a Confocal Laser Scanning Microscope SP8 Ð Leica. The entire cell volume was imaged and processed for 3-D rendering using Imaris (Bitplane). A hundred cells were counted for each condition.

Cell death assay by AnnexinV-FITC:Propidium Iodide staining About 1x106 of pLKO-shRNA, pLKO-shRNA-Nek10.1 and pLKO-shRNA- Nek10.2 HeLa cells clones were trypsinized, harvested, centrifuged at 1,500 rpm and washed with PBS. The cells were stained with Annexin V-FITC and Propidium Iodide for 15 minutes at room temperature in the dark according to the manufacturer's instructionsusing Annexin-V: FITC Apoptosis Detection Kit from BD Pharmingenª, followed by a FACSCanto II flow cytometer analysis (BD Biosciences). The experiment was performed in triplicate and for for statistical analysis, we considered both necrotic and apoptotic cells.

Cell Cycle analysis by flow cytometry Hek293T and HeLa cells transduced with pLKO-control, pLKO-shRNA- Nek10.1 or pLKO-shRNA-Nek10.1 were seeded in a density of 1x105 cells/well in 6-well plate and allowed to adhere for 48 hours. Thus, cells were trypsinized, harvested and centrifuged at 1,500 rpm, washed with PBS (phosphate-buffered saline), fixed with 70% ethanol and stored at 4oC for at least 4 hours. Cells were permeabilized and stained for its DNA content using Propidium Iodide solution (0.1%Triton X-100, 2 mg RNAse A- DNAse free and 50 µg Propidium Iodide). Cell cycle profile was determined by flow cytometry analysis of DNA content of ten thousand events using FACSCanto II flow cytometer (BD Biosciences). The experiments were performed at least in triplicate.

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Statistical analysis Statistical analysis represents the mean of each experiment. Data were compared using one-way or two-way analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post-tests correction in GraphPad Prism version 5 software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). For all graphs, it is shown the data as the mean ± S.E.M. and the differences are represented by * and were considered to be significant if p<0.05.

Results Identification of hNek10-interacting partners by Yeast-Two Hybrid (Y2H) screen After hNek1 (1258 aa), hNek10 protein is the second largest protein of the Nek family with 1125 aminoacids residues. Uniquely, hNek10 is constituted by two large regulatory domains, that flank the kinase domain (KD- 267a.a.), one at its amino (NT- 518a.a.) and the other at its carboxy-terminus (CT- 339 a.a.) (Figure 1A, upper panel). The catalytic domain of the Neks is very similar to each other. However these proteins have distinguished interactome profiles, which maybe due to the differences in the composition of their regulatory domains (Meirelles et al., 2014). As little is known about hNek10 interactome and due to the fact that the regulatory domain of Nek kinases are the regions most likely for stable interactions with proteins, we performed a Y2H screening using hNek10NT (1- 518 a.a.) and hNek10CT (787-1125 a.a.) as baits, separetly encoded in the pGBKT7 vector. The Y2H screens were performed using a normalized Human Universal cDNA library (Mate&Plate system) and employing a restrictive growth media for positive clone selection. In total, twelve proteins were identified, consisting of partial cDNA sequences (Table S1). hNek10NT bait retrieved nine preys, TXNL1 (Thioredoxin-like protein 1), AFM (Afamin), ELTD1 (EGF, latrophilin and seven transmembrane domain-containing protein 1 precursor), TC2N (Tandem C2 domains nuclear protein), PRPF4B (serine/threonine-protein kinase PRP4 homolog), N4BP2L2 (NEDD4-binding protein 2-like 2 isoform 2),

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DHX36 (Probable ATP-dependent RNA helicase DHX36 isoform 2), ATP1B1 (Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-1), PGM1 (Phosphoglucomutase-1); while for hNek10CT three were obtained, SMC3 (Structural Maintenance of Chromosome 3), SNX6 (Sorting-Nexin 6) and RSPH10B (Radial Spoke Head Homolog 10B) (Figures 1B and 1C; Table S1). Next we set out to map the identified interactors to three contructs spanning the N-, and C-terminal, and central kinase domains of Nek10. Although all interactors confirmed the interaction with Nek10NT, TXNL1, ELTD1, TCN2, DHX36 and PGM1 showed a stronger colony growth and coloration, therefore suggesting also a stronger interaction for these proteins. Aside this, a subset of proteins, including TXNL1, ELTD1, N4BP2L2, DHX36 and PGM1, were also positive with hNek10CT, indicating that this proteins may not have specificity for one or another of hNek10 domains, whereas AFM, TC2N, PRPF4B and ATP1B1 were hNek10NT domain-specific interactors (Figure 1B). Regarding SMC3, SNX6 and RSPH10B preys, they were identified from hNek10CT bait screening and only interacted with this domain, suggesting a higher binding specificity with hNek10CT (Figure 1C). Interestingly, none of the obtained clones showed a positive growth for hNek10KD. This may indicate that the catalytic domain of hNek10 does not participate in these protein-protein interactions or that the interaction with the kinase domains is transitory.

Identification of hNek10-interactors by mass spectrometry The interaction between proteins can be modulated by post-translation modifications, including phosphorylation and depends critically on the cellular compartmentalization (Watanabe & Osada, 2012). Also, most cDNA libraries contain large numbers of partial protein constructs, sometimes excluding the interacting domain. Since other members of the Nek family, including hNek4, hNek6 and hNek7 are considered Hub proteins, with a large number of interactors (Basei et al, 2015; de Souza et al., 2014; Meirelles et al., 2010), we considered the identification of only 12 interactors for hNek10 by the Y2H as likely incomplete. Thenceforward, we performed another interaction screen,

126! ! ! based on immunoprecipitation followed by mass spectrometry analysis (IP- MS/MS), in order to obtain a more complete hNek10 interactome. For that, we performed in triplicate an immunoprecipitation experiment from Hek293T cells expressing FLAG (control) or FLAG-hNek10, after 48 hours of transfection, either treated or not with Zeocin for 3 hours. Zeocin is a member of the antibiotics from Bleomycin family, and it causes DNA Double Strand Breaks (DSB) by the oxidation of the sugar molecule present in the DNA through of Reactive Oxygen Species (ROS) formation (Chen et al., 2008). Since several members of the Nek family (Meirelles et al., 2014), including Nek10 (Moniz & Stambolic, 2011), have been shown to be involved in the DDR, we were interested to identify interactors after challenge with a genotoxic reagent. Samples were loaded into an SDS-PAGE gel and silver stained to check protein quality (Supp. Figure 1). Mass Spectrometry was used to analyze the tryptic-digested peptides from immunoprecipitates in solution. Positive interactors were only considered if identified in two out of three samples and were not detected in any of the three control FLAG immunoprecipitates. The IP-MS/MS retrieved 58 and 117 proteins for non-treated and zeocin- treated samples, respectively, and only 9 interactors were identified for both (Figure 2). Curiously, in terms of the number of interactors, the hNek10 interactome doubled under zeocin treatment, indicating a probable involvement of Nek10 in the DNA damage response (DDR). Furthermore, proteins identified in treated and non-treated immunoprecipitates, such as BUB3 and 14-3-3η (YWHAH) are related to spindle assembly checkpoint and microtubule-based processes, in which other hNeks have been previously reported to participate and are and both are also involved in the DDR (Fry et al., 1998; Rapley et al., 2008; O«Regan & Fry, 2009; Liu et al., 2010; Mardin et al., 2010; Salem et al., 2010; Wei et al., 2011; Bertran et al., 2011; Chen et al., 2011; Nguyen et al., 2012). Interestingly, interactors related to the same function, protein complex or biological processes were obtained using both approaches IP-MS/MS and Y2H. For instance, NEDD8, identified in the IP-MS/MS assay, is a protein member of

127! ! ! the neddylation modification process, similar to ubiquitination, and is functionally related to N4BP2L2, a neddylation bidding protein, identified in the Y2HS as an Nek10 interactor (Rabut & Peter, 2008). Additionally, the identified Nek10 interactors SMC1 (Y2HS) and SMC3 (IP-MS/MS) are members of the same protein complex, cohesin, which is involved in the alignment of chromatids during mitosis and meiosis (Peters & Nishiyama, 2012; Schöckel et al., 2011). Furthermore, other members of the Nek family, including Nek1 (Holloway et al., 2011; de Souza et al., 2014) have been previously shown to interact with SMC proteins. Next, in order to explore hNek10 interactome, we assembled a Protein- Protein Interaction (PPI) network. To this end, data from IP-MS/MS were submitted to the IIS platform (Carazzolle et al, 2014) and a retrieval of diverse biological processes was performed based on the Gene Ontology database (Figure 2, Supp. Table1). The hNek10 PPI network suggested that hNek10 might play a role in processes including cell division, mitotic cell cycle, spindle assembly checkpoint, microtubule-based processes, regulation of the apoptotic process, metabolic processes, gene expression and RNA processing (Table S1, Figure 2). Proteins involved in these processes were found in non-treated cells but the number of proteins attributed to each process was enhanced after DNA damage induction by Zeocin treatment. The majority of the biological processes identified in our analysis of the hNek10 interactome are directly or indirectly related to the DNA damage response, indicating that hNek10 may play an important role in this context. hNek10 interacts with SMC1 and SMC3 in vivo The Y2H and IP-MS/MS assays indicated that SMC1 and SMC3 are potential hNek10-interactors. As members of the Cohesin complex, they are recruited to DNA during S-phase or in response to DNA Double Strand Breaks (DSBs) (Luo et al., 2008; Watrin & Peters, 2006). According to the enriched biological roles enrolled by hNek10 and these proteins, we addressed the

128! ! ! possible interaction between hNek10 and SMC proteins by an independent in vivo method. We carried out immunoprecipitation assays followed by Western blot analysis of lysates from Hek293T expressing FLAG as a control or FLAG- hNek10 and thus, incubated with resin previously conjugated with anti-SMC1 or anti-SMC3 antibodies. In the Western blot, we were able to detect a protein band for hNek10 in the immunoprecipitates of both proteins but not for controls with only IgG resin (Figure 3). We could not detect protein bands for SMC1 or SMC3 in the lysates, however, following immunoprecipitation, the bands were detected. Overall, this indicates that hNek10 forms a protein interacting complex with these proteins. hNek10 migrates to the nucleus after Zeocin treatment. In our results from IP-MS/MS, we identified Nek10 interacting proteins that are related to the microtubule-based transport processes (GO:0007017) including MAP1B (Microtubule-associated protein 1B), MAPRE1 (Microtubule- associated protein RP/EB family member 1), TBCA (Tubulin-specific chaperone A) and, during recovery after Zeocin treatment, TUBB4A (Tubulin beta-4A chain). Furthermore, several other members of the Nek family, especially Nek 6, 7 and 9, are related to spindle assembly and microtubule nucleation (Fry et al., 1998; Liu et al., 2010; Mardin et al., 2010; Wei et al., 2011; Rapley et al., 2008; O«Regan & Fry, 2009; Bertran et al., 2011). These Neks are targets of phosphorylation and activation by PLK1 and CDK1 in a cell cycle stage specific manner and hNek6 and hNek7 ultimately phosphorylates α- and β-Tubulin (O«Regan & Fry, 2009; Bertran et al., 2011). Therefore, we investigated the sub-cellular localization of FLAG-hNek10 over-expressed in Hek293T cells using β-Tubulin as a control for cytosol and microtubule staining. Using confocal microscopy, we confirmed the co- localization of FLAG-hNek10 and β-Tubulin (Figure 4A). Even though a fraction of hNek10 may be localized to the nucleus, it did not co-localize with Hoechst dye under these conditions. These results indicate that hNek10 localizes mostly to the cytosol, especially in association to microtubular structures.

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Some proteins translocate from one sub-cellular location to another in response to DNA damage. For instance, hNek1 translocates from cytosol to the nucleus after DNA damage induction, mostly to DNA repair foci (Polci et al., 2004). Furthermore, some proteins identified here as Nek10 interactors are located in the nucleus such as HIST1H2BK (Histone H2B type 1K). In order to address a more complete characterization of hNek10 dynamic localization after Zeocin treatment, we performed a sub-cellular fractioning of cytoplasmic and nuclear protein lysates from Hek293T cells transfected with FLAG-hNek10. These cells were non-treated or treated with 300µg/ml Zeocin for 1 hour (0 hour samples) and the cells were recovered for 3 and 24 hours after the treatment. As control for the cytosolic and nuclear fractions, GAPDH and Lamin A were respectively employed. First, we compared the cytosolic and nuclear fractions from NT samples the immunofluorescence images, and even though the immunofluorescence above (Figure 4A) suggested that hNek10 is mostly located in the cytosol, we detected some protein band in the nuclear fraction (Figure 4B lane 1 vs. lane 2) of non-treated cells subcellular fractioning. Thus, we analyzed the FLAG-hNek10 in fractionated samples after DNA damaged by Zeocin. Interestingly, there was an increased level of FLAG-hNek10 in the nuclear fraction after 3 hours of recovery (Figure 4B, lane 6). After 24 hours of recovery from zeocin treatment there was a decrease of FLAG-hNek10 nuclear levels (Figure 4B, lane 8) similar to the non-treated fraction levels (Figure 4B, lane 8 vs lane 2). This indicates that the localization of FLAG-hNek10 was reestablished. So far, canonical region of Nuclear Localization Signals (NLSs) have not been identified in hNek10 amino acid sequence and its transition may be due to DNA damage mediated post- transcriptional modification of Nek10 or due to some interacting protein, such as the protein 14-3-3 identified in our screen as an interactor of Nek10 (Figure 2). Taken together, over-expressed hNek10 seems to localize mostly to the cytosol, however, after DNA damage, it migrates to the nucleus, where it may exert important parts of its functions in the context of the DDR.

130! ! ! hNek10 depletion influences cell cycle and promotes cell death The interactome and subcellular fractionation analysis revealed that hNek10 is related to important biological processes, including the DNA damage response or those related to it. To further explore the functional roles of hNek10, we interrogated the effects of its depletion by shRNA knock down (Supp. Figure 2A and 2B). In order to check the rates of hNek10 knock down, we transfected the hNek10-depleted cells with a vector expressing FLAG-hNek10. Since the knock down of clone 1 reduces Flag-Nek10 ratio relative to GAPDH expression to 10%, whereas clone 2 only to 20 %, the effect of clone 1 on endogenous Nek10 expression must be considered as more drastic (Fig S2B). The DNA content of control and hNek10-depleted cells was checked using propidium iodide staining by FACS analysis. In comparison to control cells the shRNA knock out clones of Nek10 showed alterations in the cell cycle profiles, especially in the G1 and S phases. Clone cells 1 results in an accumulation in the S-phase suggesting that hNek10-depletion may cause a stress in cell replication status (Fig 5B). In addition, an assay using annexin V-FITC and propidium iodide staining was employed, to access cell death after hNek10-depletion. After hNek10 depletion, for both clones, the level of cell death was increased in comparison to control cells (Figure 5C). The IP/MS-MS identified important proteins related to the apoptotic process in response to DNA damage such as PDCD5, SPTAN1, ANXA5, TPT1, 14-3-3 proteins (Figure 2). Not only, APEX1 was also retrieved in IP/MS-MS and is an endonuclease recruited to apurinic/apyrimidinic (AP) sites and member of BER (Base Excision Repair) (Prasad et al., 2015), therefore, is associated to a proper G1/S transition (Figure 2). These results are in line with the observed increase in cell numbers in the S-phase after Nek10-depletion (Figures 5A and B) and suggest that hNek10 depletion may cause a replication stress, followed by induction of cell death.

131! ! ! hNek10 depletion induces γH2AX focus formation and abnormal nuclear phenotype As shown above, hNek10-depletion promotes G1/S-phase accumulation and cell death, which most probably are caused by a defect in the replication status and enhanced sensibility to DNA damage caused by endogenous ROS. Thus, we investigated if hNek10 depletion also induces formation of DNA damage foci in the nucleus. The phosphorylation of the histone H2AX (γH2AX) and its recruitment to DNA lesions has been commonly used as a marker for DNA damage foci (Clingen et al., 2008; Bonner et al., 2008). We performed immunofluorescence assays using γH2AX staining in control or Nek10-depleted HeLa cells. hNek10-depletion alone caused an increase of the number of γH2AX-positive cells (~80%) under normal growth conditions, and without the addition of genotoxic reagents (Figure 6).This indicates that hNek10 may be associated with regulation of DNA damage response. Possibly the endogenous cellular genotoxic stress promoted by ROS (radical oxygen species) is sufficient to induce a significant amount of DNA damage, specially DNA breaks, that due to the lack of Nek10 function cannot be cleared, thereby resulting in the accumulation of γH2AX-positive DNA repair foci. Subsequently, we observed and quantified nuclei abnormalities by immunofluorescence of HeLa hNek10-depleted cells. These cells exhibited an increased percentage (80% clone 1, 50% clone 2) of both U- and O-shaped nuclei (Figures 7A and B). Also, we observed an increase of the percentage of multi-nucleated cells (3% clone 1, 2.5% clone 2) (Figures 6A and C). These phenotypes may be associated with cytokinesis failure or the deregulation of the mitotic spindle assembly and may contribute to the genomic instability during tumorigenesis (Li & Li, 2006).

Discussion Protein-protein interaction reveals the relation of a protein to biological processes thus, providing a prospect for its important functional roles (Ge et al., 2003). The Nek family of serine/threonine kinases in mammals has been studied

132! ! ! over the past fifteen years as its interacting profile and functional relation to associated pathologies such as ciliopathies and tumor malignancies. The role of the majority of members of the hNek family of protein kinases has been classically attributed and centered to the mitosis and the primary cilia functions (Meirelles et al. 2014). For instance, hNek8 was recently related to both ciliopathies and the DNA damage response and its depletion was associated to a replication stress (Choi et al., 2013). Moreover, hNek4 interacts with proteins related to cilia formation (RPGRIP1 and RPGRIP1L), DNA damage repair pathways (Ku70/80 and DNA-PK) and mitosis (KIF11 or Eg5) (Basei et al., 2015; Coene et al., 2011; Nguyen et al., 2012). Recent results, especially from the characterization of Nek protein interactomes, suggested new additional biological roles in the contexts of the DNA damage response (reviewed in Meireles et al., 2014), the apoptosis regulation (Melo Hanchuk et al., 2015; Chen et al., 2009; Chen et al., 2010) and in several cell cycle checkpoints (Chen et al., 2008; Chen et al., 2011; Noguchi et al., 2002; Lee et al., 2008; Smith et al., 2014, Melixetianel et a., 2009; Hayes et al 2006; Du et al., 2008; Lou et al., 2004; Wei et al., 2011). Although there is a large body of data about hNeks interactions, the hNek10 interactome do far had remained uncharacterized. As the second largest protein in the Nek family, after Nek1, hNek10 has two major regulatory domains with around 500 and 300 aa residues each (hNek10NT and hNek10CT, respectively) flanking a catalytic domain in the center of the protein (Figure.1). The amino-terminus domain (hNek10NT) is the longest with 518 a.a. and 4 armadillo repeats. Each repeat is forming a segment of a super-helix with three α-helices in a tridimensional triangle shape, which represents a hydrophobic center and apolar exterior (Tewari et al., 2010). The arrangement of these sub- domains constitutes a scaffold for the interaction with other proteins. Furthermore, two coiled coils, one in the hNek10NT and another one in the hNek10CT, flank hNek10KD (519-786) and may be also acting as protein interaction modules, possibly involved in approximate substrates to its catalytic domain. Additionally, in hNek10CT (787-1125) there is a PEST motif (peptide

133! ! ! sequence rich in Proline- P, Glutamic Acid ÐE, Serine ÐS and Threonine Ð T), which likely is involved in the regulation of the protein degradation of Nek10 itself (Rechsteiner & Rogers, 1996). Even though, hNeks are similar in their kinase domain, their interactomes are distinct, most probably because of the divergences in their regulatory domain compositions (Meirelles et al., 2014). Thus, we investigated the interactome of hNek10 by using two different approaches. The yeast-two hybrid screen allowed identifying one-to-one protein interactions and the IP-MS/MS approach is more sensitive, therefore complementing the former. Both hNek10’s regulatory domains were used as baits in Y2H and we identified proteins related to important biological processes such as: RNA processing, metabolic processes, cell redox homeostasis, cell division and retrograde transport. Since more preys were identified for hNek10NT (Figure 1B), the armadillo repeats and/or the coiled coil domain in this region may constitute important regions for protein interaction. Most probably, they may serve as docking domains for Nek10 regulators or even as domains that facilitate the phosphorylation of those interactors that also represent substrates for Nek10 in vivo. However, hNek10CT retrieved very specific interactors, as they were not positive for the other mapped hNek10 domains (Figure 1C). None of the identified proteins interacted with the catalytic domain construct alone, which may indicate the functional importance for the regulatory domains. Interestingly, NEDD8 was identified by IP-MS/MS (Figure 2) and it is related to the neddylation process, an ubiquitin-like post-translational modification (Rabut & Peter, 2008). Another protein related to the same post-translation modification, N4BP1L1, had been detected in the Y2HS, indicating that not only PEST sequences in hNek10CT domain, but also post-translational modifications, may regulate hNek10’s degradation and, consequently, its biological function profile. Another group of proteins, 14-3-3, were enriched in IP-MS/MS experiment under treatment with Zeocin (Figure 2). These proteins are also associated to modify its substrates leading to sub-cellular translocation and/or alteration in function or substrates (Fu et al., 2000). In response to the same treatment,

134! ! ! hNek10 translocated to the nucleus maintaining its levels in the cytosol (Figure 3B). This may indicate that under genotoxic stress hNek10 may have a dubious role in both subcellular regions and acting in related biological processes. By IP-MS/MS, we identified an extensive list of hNek10 protein interactors, pointing to biological processes such as gene expression, small molecule metabolic process, microtubule-based process and cell proliferation (Figure 2, supp. Table2 and 3). Under genotoxic stress caused by Zeocin, all of these processes were enriched and additional proteins were identified to interact with Nek10. This suggest that hNek10 have a functional role in important biological process in response to DNA damage which contributes to its first assigned role in mediate MAPK activation after UV treatment (Moniz & Stambolic, 2010). Among the proteins retrieved from Y2H and IP-MS/MS, SMC1 and SMC3 were confirmed as interacting partners of hNek10 also in vivo by immunoprecipitation assay (Figure 3). Together with SCC1 and SCC3 (Sister Chromatid Cohesion) these proteins form a heterodimer complex named Cohesin. From the same family, SMC1 and SMC3 are elongated or rod shapped proteins formed by an intra-molecular coiled coil domain with 50nm in length that enclose the N- and C-terminal assembling it into a globular ATPase domain. On the other extremity of the protein there is a hinge domain responsible for the heterodimerization of these two proteins. As its own name refers, this complex forms a ring shape structure able to wrap around the DNA and entrapping the sister chromatids during S- and G2-Phase (Nasmyth et al., 2009). Cohesin is also recruited in the case of single or double strand DNA damage in order to maintain physically proximal the broken strands. (Peters & Nishiyama, 2012; Schöckel et al., 2011). Curiously, the interacting region with hNek10 of SMC3 retrieved by Y2H has a phosphorylated site at serine 1083 by ATM in response to DNA damage by ionizing irradiation and it is necessary to intra-S phase checkpoint (Luo et al., 2008). Thus, this region may be also susceptible for hNek10. SMC1 and SMC3, were also detected as interactors of Nek7 (de Souza et al., 2014) and SMC1 as

135! ! ! an interactor of Nek1 (Surpilli et al., 2003). hNek10 amino acid sequences shows higher similarity to a branch including hNek7, hNek6 and hNek9 in the evolutionary tree of Nek family members (Rellos et al., 2007), possibly indicating that these proteins may have ancestral common interactors and superimposed functions. As mutations at the hNek10 genic locus have been associated not only to lung cancer but also to a poor prognosis in breast cancer (Antoniou et al., 2010; Ahmed et al., 2009; Davies et al., 2005; Greenman et al., 2007), we studied further than hNek10 interactome and investigated the phenotypes promoted by hNek10 depletion for a better understanding of its function. We found, for clone 1, an increase of S-phase arrest and cell death (both clones) for hNek10- depleted HeLa cells indicating possible replication stress (Figure 5). Previously, hNek1 was found to be involved in apoptosis regulation (Polci et al., 2004) and both hNek1 and hNek8 depletion have been found to cause replication stress in the absence of genotoxic stress (Patil et al., 2013; Choi et al., 2013), whereas hNek4 and hNek9 knock down caused replication stress in conjunction with genotoxic stress (Nguyen et al., 2012; Smith et al., 2014). All together, hNeks, including hNek10, may play a role in the correct coordination of replication events. Based on the proteins identified as Nek10 interactors, RNA processing and mitochondrial-related processes, including apoptosis, were identified as central biological contexts (Figure 2). Interestingly, several other Nek family members have been recently associated to these functions. hNek2 and hNek4 were recently characterized as novel regulators of splicing factors (Naro et al., 2014; Basei et al., 2015). hNek1-depletion or kinase dead mutants cause opening of VDAC1 channel and exit of cytochrome C which elicits the activation of caspase-3 and cell death (Chen et al., 2009; Chen et al., 2010). Moreover, hNek5 seems to have protective effects in cell death and it was characterized as a mitochondrial protein (Melo-Hanchuk et al., 2015). We also observed increased levels on cell death in hNek10-depleted cells (Figure 5C) suggesting a new role for hNek10 in this process.

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Cells are susceptible to endogenous DNA damage caused, for example, by ROS or stalled fork replication (Cooke et al., 2003; Hyrien, 2000; Branzei &

Foiani, 2007). However, the activation of DNA damage response such as DNA repair and checkpoint arrest allows the cells to restore DNA. By checkpoints, the cell cycle is controlled in a step-by-step fashion and arrested if necessary, like in the case of detection of DNA defects. Recent studies show that, in the case of interphase checkpoints failure, a checkpoint in mitosis, the spindle assembly checkpoint is activated, cytokinesis is delayed and multinucleated or multi- micronucleated cells may be generated in consequence (Duesing et al., 2006; Holland & Cleveland, 2009). This event is called mitotic catastrophe and, may result in associated deleterious phenotypes, which may lead to genomic instability and oncogenic transformation. The cascade consisting of hNek6, 7 and 9 is related to mitotic control and deregulation in any of these proteins may cause mitotic stress such as cell cycle arrest, multinucleation, cytokinesis failure and microtubule disorientation or failures (Salem et al., 2010). The hNek10-depleted cells that survive showed an oddly U- or O shaped nucleus, or to a lesser degree even multi-nucleation, both of which are likely to evolve to defects in mitosis (Figure 7). In order to check if the phenotypes mentioned above are associated to DNA damage, we used γH2AX staining, to detect this protein; which is activated and recruited to DNA damage foci after genotoxic challenges or irradiation of cells (Bonner et al.; 2008; Clingen et al., 2008). Indeed, there is a great increase on the levels of these foci in hNek10-depleted but untreated cells (Figure 6). Therefore, it seems likely that hNek10 depletion causes a genotoxic effect in the cell, most probably because Nek10 function and activation is essential in an adequate and robust DNA damage response and to coordinate events in mitosis from interphase to cytokinesis. Taken together, our work contributes to the characterization of hNek10 interactome and indicates its importance for the maintenance of genomic stability.

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Conclusion In conclusion, our work contributes to characterize the hNek10 interactome profile in absence and presence of a DNA damaging reagent. Our data point to its role biological processes such as cell proliferation, cell cycle, spindle assembly checkpoint, microtubule-based process, regulation of apoptotic process, small molecule metabolic process and gene expression. Among the identified interacting proteins, were SMC1 and SMC3, members of the cohesin complex that also interact in vivo with Nek10. In response to a genotoxic stress, hNek10 translocates to the nucleus. Moreover, hNek10 depletion causes U- or O-shaped nucleus, multilobulation and multinucleation, cell death and cycle arrest in the S-phase, most probably associated to replication stress and indicative of DNA damage. All together, hNek10 seems to play an important role in the DNA damage response, since its depletion may cause genotoxic effects in the cell and, therefore, its lack may lead to genomic instability, strongly linking hNek10 lack of function mutations to breast cancers tumorigenesis.

Acknowledgment The authors gratefully acknowledge Dr. Silvio Roberto Consonni for kind assistance in TCS SP8 Leica Microscope and outstanding advices in immunofluorescence protocols, and Dr. Gabriela Meirelles for assistance with IIS platform and Cytoscape software. We thank Functional Genomics Core Facility (IRB/Barcelona) for provide hNek10-shRNAs, Viral Vector Lab for shRNA viruses production and the Mass Spectrometry Facility at Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), CNPEM, Campinas, Brazil, for their support on mass spectrometry analysis. We also thank Dr. Vuk Stambolic (University of Toronto) for grant p3XFLAG-CMV7.1-hNek10 plasmid. This work was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado São Paulo (FAPESP) process number 2010/15262-2, Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) and Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM). We declare that we have no conflict of interest.

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Nek10NT'''''''''Nek10KD''''''''Nek10CT' A" C' '1'''''''''''''''''''''''''''''''''519' Nek10NT''''''Nek10KD'''''Nek10CT' pGBKT7@' SMC3' ''786'''''''''''''''''''''''''''''''''''1125''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''' pGBKT7@' SNX6' RSPH10B'

B' Nek10NT''''''Nek10KD'''Nek10CT' TXNL1' AFM' ELTD1' TC2N' PRPF4B' N4BP2L2' DHX36'

ATP1B1' PGM1'

Figure 1. Interacting domain mapping of the bait hNek10 with prey proteins retrieved in the Y2H screening. (A) The upper panel shows a schematic illustration of full length hNek10 domain organization (Length: 1125 amino acids residues). The regulatory domain on the amino-terminal (hNek10NT Ð 1-518 aa) is composed of four armadillo repeats (red blocks) and one coiled-coil region (green block). hNek10 kinase domain (hNek10KD Ð 519-786 aa) is represented by a yellow block and the regulatory domain on its carboxy-terminus (hNek10CT- 786-1125) is formed by a coiled-coil region with a PEST sequence (light blue block). hNek10NT and hNek10CT cDNAs were cloned onto pGBKT7 and used as baits. (B, C) Preys (named on the left of the column) obtained from the Y2H screening using as bait hNek10NT (B) or hNek10CT(C). Triplicates of the grown colonies were dropped in a high selective media (SD-WLHA/Aureobasidin/X-α- Gal). Clones showing significant growth and blue color were considered positive.

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Nek10&

IP-LC-MS/MS Zeocin treatment IP-LC-MS/MS Controle

Cell proliferation (GO:0008283) Mitotic cell cycle (GO:0000278) Spindle assembly checkpoint (GO:0007094) Microtubule-based process (GO:0007017) Regulation of apoptotic process (GO:0042981) Small molecule metabolic process (GO:0044281) Gene expression (GO:0040029)

Figure 2. Interaction network of hNek10 partners identified by Y2H and IP- MS/MS. Trypitic-digested peptides from FLAG or FLAG-hNek10 immunoprecipitates were analyzed by mass spectrometry and protein partners were identified. Two major circles represent the interactions retrieved from non- or zeocin-treated cells. Central circle represents 9 proteins identified in both experiments. The highlighted proteins’ color node refers to top enriched Gene Ontology biological processes (p<0.05). The protein-protein interaction network (PPI) was generated and biological process analyzed using Integrated Interactome System (IIS) platform (Carazzolle et al., 2014) and visualized in Cytoscape software (Shannon et al., 2003).

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A" B" Input% Input% Input% Input% % % IP:%SMC3% FLAG%Input% FLAG+hNek10% IP:%SMC3% IP:%SMC1% FLAG+hNek10% IgG FLAG+hNek10% IgG FLAG%Input% FLAG+hNek10% IP:%SMC1% kDa% kDa% +%170% +%170% An9+FLAG% An9+FLAG% +%130% +%130%

+%170%kDa% +%170%kDa% An9+SMC1% An9+SMC3%

Figure 3. hNek10 binds to SMC1 and SMC3. Hek293T cells over-expressing FLAG or FLAG-hNek10 were lyzed and immunoprecipitated with IgG resin (right upper panel) and IgG conjugated with anti-SMC1 (A, left panel) or anti-SMC3 (B, left panel). FLAG-hNek10 immunoprecipitated with anti-SMC antibodies (A and B, right lower panels). The black arrow indicates Immunoprecipitated SMC1 and SMC3. Input controls demonstrate the presence of FLAG-Nek10.

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A" !!!!!!!!!!!!FLAG&hNek10!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!β&Tubulin!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Hoescht!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Merge!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

B" Zeocin#(300μg/ml)#

NT# 0h# 3h# 24h#

C#####N#####C######N#####C#####N#####C#####N## kDa!

&!170! An78FLAG# ! &!130! ! &!70! An78Lamin#A# ! ! An78GAPDH# &!35!

Figure 04. hNek10 localizes mostly in the cytosol but migrates to the nucleus after Zeocin treatment. (A) Representative confocal microscopy images of Hek293T cells transfected and expressing FLAG-hNek10 after 48 hours. Endogenous β-Tubulin and nucleus (Hoechst) were also stained. The Pearson«s Coefficient for hNek10 and β-tubulin staining was 0,835 and was obtained using LAS AF Lite (Leica) software. Scale bars =10 µm. (B) Subcellular fractionation of lysates of Hek293T cells expressing FLAG-hNek10 for 24 hours. Cells non-treated (NT) or treated with 300 µg/ml Zeocin for 1 hour were collected immediately after the treatment (0h) or after 3 (3h) and 24 hours (24h) of recovery. Cytosolic (C) and nuclear (N) protein samples were isolated by subcellular fractionation using buffers with different concentrations of salt and detergent, and immunoblotted with anti-FLAG, anti-GAPDH (Cytosolic loading control) and anti-LaminA (Nuclear loading control) antibodies. The numbers from 1 to 8 indicated bellow the image are referred to each respectively lane.

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A" B"

Cell Cycle 100 pLKO-shRNA *** pLKO-shRNA-Nek10 1 80 *** pLKO-shRNA-Nek10 2 60

40 *** *** 20 *** * Cell percentage (%) 0 G1 S G2/M Phases

C" Cell Death 50

40 ** ** 30

10 Cell Percentage (%) 0

pLKO-shRNA pLKO-shRNA-Nek10pLKO-shRNA-Nek10 1 2

Figure 05. hNek10 depletion induces cell cycle/S-phase arrest and cell death in HeLa cells. (A) Nek10-depleted or control-shRNA HeLa cells were collected, fixed, stained with Propidium Iodide and submitted to cell cycle DNA index analysis by flow cytometry. (B) Cell percentages of G1, S and G2/M-phase in Nek10-depleted and control cells are shown as bar plots. * = 0.05 < p < 0.01; ** = 0,01< p < 0.001; *** = p < 0.001, two-way ANOVA and Bonferroni test. (C) Dead cells were determined by Annexin-V-Fitc and PI staining followed by flow cytometry. The percentages of the dead cells were plotted in a graph and statistical analysis was performed using two way ANOVA and Bonferroni post test. ** = 0,01< p < 0.001.

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A" 1 pLKO%shRNA

B" 100 *** *** 80

60 H2AXfoci g

%Total of 20 pLKO%shRNA%Nek10.21111pLKO%shRNA%Nek10.111111111111

pLKO-shRNA

pLKO-shRNA-hNek10.1pLKO-shRNA-hNek10.2 Figure 06. Nek10 depletion promotes nuclear γH2AX foci formation. (A) Nek10-depleted cells or control cells were stained with anti-γH2AX antibody and the nucleus with Hoechst (B) Graph plot shows the percentage of cells with γH2AX foci from two separate experiments in which at least 100 cells were counted and statistical analysis was performed using one-way ANOVA and Bonferroni post test. *** = p < 0.001.

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B 100 *** *** A" 80

60 TUBA Lamin A Hoescht merge 1 40

20 %Totalofmulti-lobed cells

0 pLKO%shRNA

pLKO-shRNA TUBA Lamin A Hoescht merge

pLKO-shRNA-hNek10.1pLKO-shRNA-hNek10.2 C" 5 * 4

2 TUBA Lamin A Hoescht merge 1

0 %Totalofmulti-nucleated cells

pLKO-shRNA

pLKO-shRNA-hNek10.1pLKO-shRNA-hNek10.2 pLKO%shRNA%Nek10.21111pLKO%shRNA%Nek10.111111111111

Figure 07. hNek10 depletion induces multi-nucleated and multi-lobulated nuclei. (A) Nek10 depleted or control HeLa cells stained with TUBA, Lamin A and Hoechst. The entire fixed cell volume was imaged and processed for 3-D rendering using Imaris (Bitplane). Lamin A around the whole nuclei indicates multi-lobulation (zoomed lower panel, arrowhead) and, if show with separated stain, then indicates multi- or binucleation (zoomed higher panel, arrowhead). Graphs show the percentage of cells with multi-lobulated (B) or multinucleated nuclei (C) from three separate experiments in which at least 200 cells were counted and statistical analysis was performed using one-way ANOVA and Bonferroni post test. * = 0.05 < p < 0.01 and *** = p < 0.001.

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Supplementary Figure

% Control% Zeocin%(300μg/ml)% kDa FLAG%% FLAG+NEK10% FLAG%% FLAG+NEK10%

IP1% IP2% IP3% IP1% IP2% IP3% Marker% IP1% IP2% IP3% IP1% IP2% IP3%

170% 130% 100%

70%

55%

40%

35%

25%

Supplementary figure1. Silver staining of SDS-PAGE gels of FLAG and FLAG-hNek10 immunoprecipitated samples for IP-MS/MS analysis. Approximately 2% of each sample from FLAG and FLAG-hNek10, treated and non-treated with zeocin, were loaded in a SDS-PAGE and stained with silver protocol in order to visualize protein bands and immunoprecipitate quality. Border samples show lower band intensity due to light destain. Black arrows may indicate FLAG-hNek10 protein bands.

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A" FLAG-Nek10 WB: pLKO%shRNApLKO-shRNA+++++pLKO%shRNA%Nek10.1+++pLKO%shRNA%Nek10.2+++ shRNA-Nek10.1 shRNA-Nek10.2 kDakDa +

Anti- FLAG ~130

37 Anti-GAPDH

B" 100

FLAG-hNek10/GAPDHratio 0

pLKO-shRNA

pLKO-shRNA-Nek10.1pLKO-shRNA-Nek10.2

Supplementary figure 2. Overexpression of FLAG-hNek10 to detect hNek10 silencing efficiency. (A) pLKO-shRNA and hNek10-depleted HeLa cells were transfected with vector expressing FLAG-hNek10 for 48 hours. Protein lysates were loaded into a SDS-PAGE and blotted against anti-FLAG to detect hNek10 overexpression (approximately 130 kDa) and anti-GAPDH, as loading control. (B) Protein bands ratio of FLAG-hNek10/GAPDH plotted in a graph showing approximately 92% and 80% reduced hNek10 protein bands.

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Supplementary Table 1. hNek10 interactors obtained from Yeast-Two Hybrid screening using hNek10NT and hNek10CT as baits. Coded protein residues Prey Prey retrieved Uniprot Bait Name Frame Biologicalprocess2 Gene1 Gene1 (complete Acession sequence)

AFM Afamin AFM +2 272-609 (609) P43652 Vitamin Process 104-303, 124-303 Sodium/potassium-transporting ATPase ATP1B1 ATP1B1 +1 and 178-303 P05026 ATP biosynthetic process subunit beta-1 (303) Probable ATP-dependent RNA helicase DHX36 DHX36 +1 3-430 (994) Q9H2U1 RNA processing DHX36 isoform 2 EGF, latrophilin and seven G-protein coupled receptor ELTD1 transmembrane domain-containing ELTD1 +3 133-192 (690) Q9HBW9 signaling pathway hNek10NT protein 1 precursor (1-518aa) Differentiation and regulation NEDD4-binding protein 2-like 2 isoform N4BP2L2 N4BP2L2 +2 421-583 (583) Q92802 of transcription from RNA 2 polymerase II promoter 108-365 and 278- PGM1 Phosphoglucomutase-1 PGM1 +1 P36871 Metabolic processes 365 (365) Serine/threonine-protein kinase PRP4 PRPF4B PRPF4B +1 233-384 (1007) O43172 RNA processing and splicing homolog TC2N Tandem C2 domains nuclear protein TC2N +3 147-490 (490) Q8N9U0 Not defined TXNL1 Thioredoxin-likeprotein 1 TXNL1 +1 150-289 (289) O43396 Cell redox homeostasis Radial Spoke Head 10 homolog B RSPH10B RSPH10B +2 664-857 (870) P0C881 Not defined (RSPH10B) hNek10CT Structural Maintenance of cromossomes (787-1125 aa) SMC3 SMC3 +3 881-1090 (1217) Q9UQE7 Cell division protein 3 SNX6 Sorting Nexin 6 SNX6 +3 9-277(418) Q9UNH7 Retrograde transport 1 Positive clones or proteins were selected from yeast colonies under growth onto restrictive medium without tryptophan, leucine, histidine, adenine and containing Aureobasidin and X-α-Gal. 2 Biological processes enriched in the Integrated Interactome System (IIS) platform (http://www.lge.ibi.unicamp.br/lnbio/IIS/)

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Discussão

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O perfil de interações proteína-proteína tem se revelado uma estratégia poderosa para o entendimento das funções biológicas ainda desconhecidas de algumas proteínas. As cinases, por exemplo, são capazes de interagir e realizar modificações pós-traducionais em seus substratos através de fosforilações e, assim, desencadear cascatas de ativação e regulações de processos biológicos fundamentais para a célula. Dessa forma, a partir da análise de funções descritas para seus parceiros de interação, novos papéis são desenhados para o entendimento de proteínas como as cinases, impulsionando as investigações de seu papel na biologia celular e caracterizando-as em patologias relacionadas. A partir dessa abordagem, o interactoma das proteínas cinases Neks permitiu analisar seus principais papeis relacionados caracterizando-as em uma tríade funcional composta por (1) mitose/centrossomos, (2) cílio primário e (3) resposta ao dano no DNA (Artigo I). Dentre as famílias que compõem o kinoma humano, as Neks apresentam um domínio cinase conservado porém possuem diversidade no tamanho e constituição dos seus domínios regulatórios. Apesar da convergência funcional entre as Neks, há uma ramificação distributiva das proteínas de interação o que pode estar relacionado à divergência dos seus domínios regulatórios, associando diferentes substratos às essas proteínas. Nos últimos anos, os estudos das Neks têm se expandido cada vez mais e revelado seus aspectos biológicos funcionais e estruturais. Um exemplo disso, está em novos papéis associados que estão entrando no centro funcional dessas proteínas, por exemplo, suas relações com o processamento de RNA. hNek2 foi caracterizada como um novo fator de splicing de RNA e seu silenciamento pode promover a expressão de proteínas pró-apoptóticas através da regulação de splicing de RNA (Naro et al., 2014). Além disso, hNek2 é considerada um novo alvo terapêutico no tratamento do câncer de mama (Tsunoda et al., 2009). Associado com sua função de modulação de splicing, acredita-se que hNek2 pode apresentar atividade oncogênica por atuar como um agente regulador da expressão gênica.

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DNA Repair GO:0006281

Gene Expression Transcription, GO:0040029 DNA-Dependent GO:0006351

Posit. Reg. of transc. From Immune RNA pol. II Response promoter GO:0045944 GO:0006955

Mitotic cell cycle ATP-Dependent GO:0000278 chromatin remodelling BCLAF1 TOPIIβ GO:0043044 NEK5 Nek5

Figura 09: Rede de interações de hNek5 com primeiros vizinhos, BCLAF1 e TOPIIβ, e segundos vizinhos com destaque para os processos biológicos enriquecidos. O nó azul escuro refere-se à isca hNek5, nós azul-claro às presas identificadas através de duplo híbrido BCLAF1 e TOPIIβ e os interactores conhecidos dessas proteínas em nós verdes (Tabela 03). Os processos biológicos enriquecidos estão destacados. As linhas cinza referem-se à interação entre as proteínas. A rede de interação foi gerada e seus processos biológicos analisados utilizando a plataforma Integrated Interactome System (IIS) (Carazzolle et al., 2014) e visualizada através do software Cytoscape Versão 3.1.1 (Shannon et al., 2003).

Recentemente, nosso grupo publicou um trabalho caracterizando funcionalmente hNek4 e revelou pela primeira vez o papel dessa proteína no splicing de RNA (Basei et al., 2015). Esta proteína localizou-se em speckles nucleares (estruturas nucleares ricas em proteínas relacionadas à transcrição e splicing RNA) e suas isoformas apresentaram diferentes regulações do processamento de RNA, provavelmente associado à distintos interactores entre elas, a exemplo de SRSF1, SRSF2 e SRPK1. Curiosamente, os peptídios identificados por IP-MS/MS dos imunoprecipitados de FLAG-hNek10 revelaram um enriquecimento dos processos biológicos de expressão gênica e processamento de RNA mediante estimulo genotóxico (Artigo IV, Supp. Tab. 2 e 3). Dentre as proteínas identificadas estão RPLs, RPSs, SNRPs e SRSFs e, por duplo híbrido, DHX36 e PRPF4B, sendo esta última também identificada como interactor de hNek4 (Basei et al., 2015). Isso indica que, bem como hNek2 e

160! ! ! hNek4, hNek10 pode estar relacionada, dentre outros processos, à regulação da transcrição ou expressão gênica associada à splicing de RNA. No entanto, a atuação de hNek10 neste processo pode estar relacionada à efeitos causados pelo dano no DNA. hNek5 apresenta o domínio DEAD-box, o qual é relacionado funcionalmente ao processamento de pré-mRNA. Neste trabalho, as proteínas BCLAF1 e TOPIIβ foram identificadas em screening de duplo híbrido e confirmados como interactores de hNek5 (Artigo II e III). Em conjunto com outras proteínas, a interação entre BCLAF1 e BRCA1, uma proteína importante para o reparo do DNA e associada a tumores severos de câncer de mama, é capaz de formar um complexo de regulação de splicing de pré-mRNA como uma resposta celular ao dano no DNA (Savage et al., 2014). Assim, é possível que hNek5 esteja envolvida também nesse processo biológico. Com o objetivo de entender o envolvimento de hNek5 nas respostas ao dano no DNA e conhecendo o papel de BCLAF1 e TOPIIβ nesses processos, montamos uma rede de interação a partir dessas proteínas (Figura 09). Apenas a análise do interactoma a partir desses primeiros vizinhos já revelou importantes processos biológicos em que hNek5 pode estar envolvida, como por exemplo o aumento da expressão gênica (Figura 09 e anexo 1). Outro aspecto funcional que tem sido revelado para as Neks é o envolvimento em processos mitocondriais. Mediante resposta à algum estímulo ou por suas regulações, membros dessa família de proteínas foram associados com a morte celular por apoptose, um processo celular relacionado a vias mitocondriais (Miller et al., 2005; O«Regan & Fry, 2009; Nassispour et al., 2010; Jee et al., 2013; Lee & Gollahon et al., 2013; de Souza et al., 2014; Naro et al., 2014; Basei et al., 2015). Citando exemplificamente, a depleção ou mutação da função cinase (kinase dead) de hNek1 acarreta a abertura do poro de VDAC1 levando à saída de citocromo C, consequentemente, ativando caspases e iniciando os processos apoptóticos (Chen et al., 2010). Além disso, hNek4 apresenta localização mitocondrial e interagiu com proteínas relacionadas à processos desta organela (Basei et al., 2015).

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No artigo II, demonstramos pela primeira vez a relação entre hNek5 e os processos mitocondriais. Inicialmente, utilizando hNek5 como isca para screening de duplo híbrido contra uma biblioteca universal de cDNA humano, foram identificadas proteínas de localização ou função relacionada à mitocôndria, BCLAF1, COX11 e MTX2. A colocalização e interação com essas proteínas foi confirmada e hNek5 foi identificada também como uma proteína mitocondrial por sua localização e fracionamento nessa organela. hNek5 pode atuar como uma proteína protetora da morte celular mediante, por exemplo, tratamento com tapsigargina, uma droga capaz de desregular a homeostase do cálcio no reticulo endoplasmático causando depolarização da membrana mitocondrial e consequentemente, morte celular. Ademais, sua expressão também pode ser associada como uma proteção à produção de espécies reativas à oxigênio. Até o momento, ainda não foi investigado o papel de Nek10 em processos mitocondriais, no entanto seu silenciamento induziu à morte celular (Artigo IV). Dentre as proteínas interactoras e identificadas por duplo híbrido, TXNL1, está relacionada a homeostase cell redox. Mediante dano no DNA causado por cisplatina, há indução da apoptose através da regulação da proteína XRCC1, via de reparo de dano no DNA por crosslink (Xu et al., 2014). Em resposta ao dano no DNA com Zeocina, o IP-MS/MS revelou proteínas associadas a processos apoptóticos relacionados à mitocôndria como ANXA5, 14-3-3α, η e θ (Artigo IV). Isto posto, os dados de hNek5 do artigo II em conjunto com o interactoma de hNek10 no artigo IV, e de outras proteínas membros desta família indicam que pode haver um novo papel funcional destas nos processos mitocondriais, em especial, na apoptose celular. Como este processo celular é considerado uma das respostas ao dano no DNA possivelmente, tanto hNek5 quanto hNek10 podem estar envolvida na apoptose celular mediante também ao estresse genotóxico. Dentre as respostas celulares desencadeadas pelo dano no DNA está o próprio reparo do DNA, indução a processos apoptóticos ou ativação dos checkpoints causando parada do ciclo celular. A rede de interação de hNek5

162! ! ! com BCLAF1 e TOPIIβ indicou, dentre outros processos biológicos, o reparo de dano no DNA, ciclo celular mitótico e remodelamento da cromatina (Figura 09 e Tabela 03). A proteína topoisomerase II é um alvo de drogas anticâncer como os inibidores etoposídeo e bleomicina. No artigo III, nós confirmamos o complexo de interação entre Nek5 e TOPIIβ o que, junto com a descrição das outras hNeks no reparo do DNA, nos incitou à buscar o papel dessa proteína nas respostas do dano no DNA. O desbalanço dos níveis proteicos de hNek5 através de seu silenciamento ou expressão estável causou o aumento da viabilidade celular perante o tratamento com drogas genotóxicas, incluindo o inibidor de Topoisomerase, Etoposídeo. Curiosamente, apenas em resposta à esta droga hNek5 apresentou translocação para o núcleo e não causou aumento da parada do ciclo celular em G2/M. O seu silenciamento levou à praticamente uma manutenção dos índices replicativos e não causou a parada do ciclo celular. Provavelmente, há uma falha na ativação do checkpoint do DNA e a célula está ultrapassando o estresse replicativo gerado pelo dano no DNA. Desta forma, sem a parada do ciclo celular, o tempo pode ser escasso para o reparo da lesão. Nossos resultados demonstrados no artigo III também evidenciou o papel de hNek5 na ativação de proteínas importantes para o desencadeamento de uma correta resposta ao dano no DNA. Dentre elas a fosforilação de ATM e BRCA, bem como o aumento de focis de γ-H2AX. De modo geral, nosso trabalho indica o papel de hNek5 na ativação de respostas do dano no DNA em especial de modo dependente à inibição de seu interactor Topoisomerase IIβ.

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hNek4" hNek1"

?" hNek5""

P" hNek11" P" P"

DNA Repair ""

Figura 10: Ilustração esquemática de uma das vias de sinalização"" para ativação de vias de resposta do dano no DNA (Adaptado de Sato et al., 2010). Nesta imagem, hNek1, 4 e 11 estão representadas em papéis relacionados a algumas proteínas dessa via. Os dados apresentados nesta tese indicam um possível envolvimento de hNek5 na regulação da ativação de BRCA1 por ATM.

No artigo IV, observamos que o silenciamento de hNek10 causou acúmulo de células em G1/S provavelmente associado à um estresse replicativo mesmo sem a indução de dano de DNA. Curiosamente, nós observamos que o silenciamento de hNek10 recrutou γ-H2AX no núcleo evidenciando focis de danos no DNA (Artigo IV). Considerando o experimento IP-MS/MS, identificamos a proteínas APEX1, associada à transição G1/S, em imunoprecipitados tratados com Zeocina. Mediante tratamento com esta droga, capaz de causar quebras de fita simples e dupla, hNek10 translocou para o núcleo, porém manteve seus níveis citosólicos, indicando seu possível papel nas vias relacionadas nesses dois compartimentos celulares em resposta ao dano. Além disso, o

164! ! ! silenciamento de hNek10 levou à alterações fenotípicas no núcleo como a multinucleação e multilobulação, sendo essa uma anormalidade comumente associada à mitose catastrófica e à defeitos na replicação (Vitale et al., 2011). O fenótipo de multinucleação e multilobulação pode causar ou ser decorrente de danos no DNA levando à poliploidia e aneuploidia. Nesse trabalho nós ainda identificamos a interação entre hNek10 e proteínas membro do complexo de coesinas, SMC1 e SMC3. As coesinas podem ser recrutadas quando há dano por quebra de fita dupla através de fosforilação por ATM e mantendo fisicamente as regiões do DNA próximas (Ström et al., 2004; Kim et al., 2002; Luo et al., 2008). Defeitos na regulação das coesinas podem levar a estresse replicativo e/ou aneuploidias. Estes dados em conjunto com os demais dados do artigo IV indicam um possível papel de hNek10 no ciclo celular, principalmente em resposta ao dano ao DNA. Em sua o interactoma da hNek10 relaciona essa proteína à dois pilares funcionais das hNeks e levanta importantes hipóteses quanto aos aspectos funcionais biológicos de hNek10. Por fim, ainda abordando o interactoma de hNek10 observamos a identificação de proteínas 14-3-3, NEDD8 e, no duplo híbrido, N4BP2L2, capaz de ligar-se à NEDD4 (Artigo IV). De modo geral proteínas NEDD podem causar modificações pós-traducionais em seus substratos semelhantes à ubiquitinação, um processo denominado nedilação (Rabut & Peter, 2008). Adicionalmente, proteínas 14-3-3 ligam-se e podem causar alterações conformacionais ou de localização de seus substratos (Fu et al., 2000). De modo geral, todas essas modificações são comumente envolvidas em diversos processos biológicos como ciclo celular, apoptose, controle do metabolismo, controle da transcrição gênica, dentre outros. Em suma, hNek10 apresentou interação com proteínas desses três processos indicando sua possível regulação através dessas modificações associadas e, consequentemente, exercendo um papel na sua atividade funcional biológica.

165! ! !

Proliferação+ celular+

Regulação+do+ metabolismo+ Expressão+ Gênica+

Processamento+ Mitocôndrias+ de+RNA+

Figura 11: Ilustração de novos processos biológicos associados para as Neks e de processos já descritos (Adaptado de Meirelles et al., 2014).

Através do interactoma de hNek5 e hNek10 e utilizando abordagens de biologia molecular, este trabalho permitiu compreender, associar e incluir essas proteínas em ao menos um dos pontos da tríade funcional das Neks. No entanto, pudemos observar a identificação de novos processos biológicos para essas proteínas e para outros membros desta família (Figura 11). Ainda não há dados suficientes para concluir se estes processos são primários, isto é, irão eventualmente compor a tríade funcional das Neks; ou um processo secundário em decorrência ou em resposta dos papéis centrais dessas proteínas. Isto posto, o estudo das funções das Neks nesses processos permitirá, cada vez mais, o entendimento dessas proteínas nas patologias associadas, à exemplo de tumores.

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Conclusões

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No início do século XXI, começaram os primeiros estudos sobre a família de proteínas hNeks e, nos últimos 15 anos, publicações tem destacado a importância funcional dessas serina/treonina cinases na biologia celular. No entanto, alguns membros dessa família ainda apresentam-se pouco caracterizados, em especial, hNek5 e hNek10. Em linhas gerais, este trabalho empenhou-se na busca do entendimento das interações dessas proteínas e na sua contribuição funcional com enfoque nas respostas de dano no DNA. Em conjunto, os resultados deste trabalho indicam que hNek5 e hNek10 fazem parte da tríade funcional das Neks com seu papel na resposta ao dano no DNA e nos futuros processos biológicos que tem surgido também para essa família de proteínas cinases, as Neks. Assim, este trabalho impulsiona as perspectivas investigações de hNek5 e hNek10 em seus novos processos relacionados e contribui e complementa os estudos funcionais da família da hNeks. Especifico abaixo as principais conclusões dos resultados presentes nos artigos ou manuscritos abordados ao longo desta tese: 1. O artigo de revisão abordou dedicadamente cada um dos membros das hNeks quanto ao seu interactoma e funcionalidade. Assim obtivemos uma tríade funcional em que essa família de cinases está envolvida. 2. A partir de screening de duplo híbrido realizado pela Doutora Talita D. Melo Hanchuk foi possível identificar os interactores COX11, MTX2 e BCLAF1. Essas proteínas tiveram sua interação com Nek5 confirmadas através de ensaios de imunoprecipitação e apresentaram colocalização em componentes subcelulares. Sendo estas proteínas com localização na mitocôndria ou exercendo função relacionada à esta organela, utilizamos duas abordagens contributivas e revelamos pela primeira vez a localização mitocondrial de hNek5. 3. Através de ensaios de apoptose revelamos que a hNek5 apresentou um papel de proteção à morte celular mediante tratamento com tapsigargina e causou redução da liberação de ROS. A superexpressão de hNek5 também diminuiu a atividade da cadeia respiratória mitocondrial. 4. hNek5 teve sua interação confirmada com Topoisomerase IIβ a partir de ensaios de imunoprecipitação e colocalização nuclear.

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5. Mediante dano no DNA com cisplatina e zeocina, hNek5 atua na parada do ciclo celular e no status de estresse replicativo. 6. Através da utilização de um inibidor de topoisomerase, etoposideo, hNek5 apresenta um papel mais especifico, translocando para o núcleo e atuando na ativação de proteínas importantes para a resposta ao dano no DNA. 7. O interactoma de hNek10 revelou sua possível atuação em importantes processos, como expressão gênica, splicing de RNA, ciclo celular mitótico, regulação do processo apoptótico, dentre outros, mediante estresse genotóxico. Dentre essas proteínas, confirmamos a interação in vivo com SMC1 e SMC3. 8. O silenciamento de hNek10 causou multilobulação e multinucleação celular além de índices de foci de dano de DNA através da marcação de γ- H2AX. Ademais, também causou parada do ciclo celular em G1/S, indicando estresse replicativo e aumento da morte celular.

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182! ! !

Anexos

183! ! !

184! ! !

Tabela 03: Descrição dos processos biológicos dos primeiros vizinhos, BCLAF1 e TOPIIβ, e segundos vizinhos, proteínas já identificadas como interactoras de BCLAF1 e TOPIIB, de hNek5 representadas na Figura 09. UNIPROT Gene Name Enriched Biological Process+ *Q6P3R8 NEK5 Serine/threonine-protein kinase Nek5 Q01831 XPC DNA repair protein complementing XP-C cells **Q02880 TOP2B DNA topoisomerase 2-beta ATP catabolic process O94776 MTA2 Metastasis-associated protein MTA2 ATP-dependent chromatin remodeling P51532 SMARCA4 Transcription activator BRG1 ATP-dependent chromatin remodeling Q969G3 SMARCE1 SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of ATP-dependent chromatin remodeling chromatin subfamily E member 1 P49759 CLK1 Dual specificity protein kinase CLK1 cell proliferation Q16181 SEPT7 Septin-7 Cytokinesis Q99728 BARD1 BRCA1-associated RING domain protein 1 DNA repair P43246 MSH2 DNA mismatch repair protein Msh2 DNA repair P27694 RPA1 Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit DNA repair P15927 RPA2 Replication protein A 32 kDa subunit DNA repair P35244 RPA3 Replication protein A 14 kDa subunit DNA repair P63165 SUMO1 Small ubiquitin-related modifier 1 DNA repair P11388 TOP2A DNA topoisomerase 2-alpha DNA repair Q92547 TOPBP1 DNA topoisomerase 2-binding protein 1 DNA repair Q9P2Y5 UVRAG UV radiation resistance-associated gene protein DNA repair P55072 VCP Transitional endoplasmic reticulum ATPase DNA repair P38919 EIF4A3 Eukaryotic initiation factor 4A-III gene expression. P03372 ESR1 Estrogen receptor gene expression. Q92731 ESR2 Estrogen receptor beta gene expression. Q13547 HDAC1 Histone deacetylase 1 gene expression O43390 HNRNPR Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein R gene expression P61326 MAGOH Protein mago nashi homolog gene expression P27361 MAPK3 Mitogen-activated protein kinase 3 gene expression 185 ! ! !

P46531 NOTCH1 Neurogenic locus notch homolog protein 1 gene expression Q504Q3 PAN2 PAB-dependent poly(A)-specific ribonuclease subunit PAN2 gene expression P09874 PARP1 Poly [ADP-ribose] polymerase 1 gene expression Q05655 PRKCD Protein kinase C delta type gene expression P10276 RARA Retinoic acid receptor alpha gene expression Q15287 RNPS1 RNA-binding protein with serine-rich domain 1 gene expression O75643 SNRNP200 U5 small nuclear ribonucleoprotein 200 kDa helicase gene expression P62304 SNRPE Small nuclear ribonucleoprotein E gene expression Q13573 SNW1 SNW domain-containing protein 1 gene expression Q8IYB3 SRRM1 Serine/arginine repetitive matrix protein 1 gene expression P0CG48 UBC Polyubiquitin-C gene expression O14980 XPO1 Exportin-1 gene expression Q13123 IK Protein Red immune response P10415 BCL2 Apoptosis regulator Bcl-2 innate immune response Q07817 BCL2L1 Bcl-2-like protein 1 innate immune response Q92851 CASP10 Caspase-10 innate immune response P62993 GRB2 Growth factor receptor-bound protein 2 innate immune response Q13526 PIN1 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1 innate immune response P06702 S100A9 Protein S100-A9 innate immune response Q96SB4 SRPK1 SRSF protein kinase 1 innate immune response P78362 SRPK2 SRSF protein kinase 2 innate immune response P67870 CSNK2B Casein kinase II subunit beta mitotic cell cycle P50402 EMD Emerin mitotic cell cycle P33993 MCM7 DNA replication licensing factor MCM7 mitotic cell cycle P49792 RANBP2 E3 SUMO-protein ligase RanBP2 mitotic cell cycle P61981 YWHAG 14-3-3 protein gamma mitotic cell cycle O95817 BAG3 BAG family molecular chaperone regulator 3 negative regulation of apoptotic process P34947 GRK5 G protein-coupled receptor kinase 5 negative regulation of apoptotic process 186 ! ! !

Q9Y2K1 ZBTB1 Zinc finger and BTB domain-containing protein 1 negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter Q9Y2U8 LEMD3 Inner nuclear membrane protein Man1 negative regulation of transforming growth factor beta receptor signaling pathway P32121 ARRB2 Beta-arrestin-2 Notch signaling pathway Q92542 NCSTN Nicastrin Notch signaling pathway Q13618 CUL3 Cullin-3 positive regulation of cell proliferation P00533 EGFR Epidermal growth factor receptor positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter Q16656 NRF1 Nuclear respiratory factor 1 positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter P51531 SMARCA2 Probable global transcription activator SNF2L2 positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter Q9Y2W1 THRAP3 Thyroid hormone receptor-associated protein 3 positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter P04637 TP53 Cellular tumor antigen p53 positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter P22415 USF1 Upstream stimulatory factor 1 positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter P49760 CLK2 Dual specificity protein kinase CLK2 protein phosphorylation P49761 CLK3 Dual specificity protein kinase CLK3 protein phosphorylation P61956 SUMO2 Small ubiquitin-related modifier 2 protein sumoylation P55854 SUMO3 Small ubiquitin-related modifier 3 protein sumoylation Q6ZVZ8 ASB18 Ankyrin repeat and SOCS box protein 18 protein ubiquitination Q86VP6 CAND1 Cullin-associated NEDD8-dissociated protein 1 protein ubiquitination P07766 CD3E T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain regulation of apoptotic process Q15020 SART3 Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3 regulation of gene expression P11308 ERG Transcriptional regulator ERG regulation of transcription from RNA polymerase II promoter Q15843 NEDD8 NEDD8 regulation of transcription from RNA polymerase II promoter Q8TAD8 SNIP1 Smad nuclear-interacting protein 1 regulation of transcription, DNA-dependent P56537 EIF6 Eukaryotic translation initiation factor 6 ribosomal subunit export from nucleus 187 ! ! !

Q13148 TARDBP TAR DNA-binding protein 43 RNA splicing Q9UIG0 BAZ1B Tyrosine-protein kinase BAZ1B transcription, DNA-dependent **Q9NYF8 BCLAF1 Bcl-2-associated transcription factor 1 transcription, DNA-dependent Q9HC52 CBX8 Chromobox protein homolog 8 transcription, DNA-dependent Q99459 CDC5L Cell division cycle 5-like protein transcription, DNA-dependent O14646 CHD1 Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 1 transcription, DNA-dependent P68400 CSNK2A1 Casein kinase II subunit alpha transcription, DNA-dependent Q96DB2 HDAC11 Histone deacetylase 11 transcription, DNA-dependent Q92769 HDAC2 Histone deacetylase 2 transcription, DNA-dependent O15379 HDAC3 Histone deacetylase 3 transcription, DNA-dependent Q6ZW49 PAXIP1 PAX-interacting protein 1 transcription, DNA-dependent P29590 PML Protein PML transcription, DNA-dependent Q9H307 PNN Pinin transcription, DNA-dependent Q99496 RNF2 E3 ubiquitin-protein ligase RING2 transcription, DNA-dependent P23246 SFPQ Splicing factor, proline- and glutamine-rich transcription, DNA-dependent Q12824 SMARCB1 SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of transcription, DNA-dependent chromatin subfamily B member 1 Q92922 SMARCC1 SWI/SNF complex subunit SMARCC1 transcription, DNA-dependent Q8TAQ2 SMARCC2 SWI/SNF complex subunit SMARCC2 transcription, DNA-dependent Q92925 SMARCD2 SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of transcription, DNA-dependent chromatin subfamily D member 2 Q15022 SUZ12 Polycomb protein SUZ12 transcription, DNA-dependent O96028 WHSC1 Histone-lysine N-methyltransferase NSD2 transcription, DNA-dependent P13010 XRCC5 X-ray repair cross-complementing protein 5 transcription, DNA-dependent Q9HCE7 SMURF1 E3 ubiquitin-protein ligase SMURF1 transforming growth factor beta receptor signaling pathway Q93034 CUL5 Cullin-5 viral process * Proteina Nek5 utilizada como isca de duplo híbrido contra biblioteca universal de cDNA humano. ** BCLAF1 e TOPIIB, proteínas identificadas como parceiros de interação de hNek5, presas, no duplo híbrido. +Processos biológicos enriquecidos na plataforma Integrated Interactome System (IIS) platform (http://www.lge.ibi.unicamp.br/lnbio/IIS/) 188 ! ! !

Ensaios estruturais do domínio cinase da família das Neks O Structural Genomics Consortium é uma organização público-privada que apoia a descoberta de novas drogas a partir de pesquisa open access de estrutura tridimensional de proteínas com relevância médica. Antes com duas unidades, SGC-Toronto no Canadá e a SGC-Oxford no Reino Unido, agora conta também com uma nova sede na Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) no Brasil. Com o intuito de melhorar a qualidade da expressão e solubilização proteica dos domínios cinases das hNeks pelo nosso laboratório (exceto hNek2KD e hNek7KD), uma parceria foi realizada entre o Prof. Dr. Jörg Kobarg e o Dr. Stephan Knapp, líder do grupo Chemical Biology da SGC na Universidade de Oxford, em Oxford-UK. Esta colaboração permitiu que alunos do nosso grupo realizassem os experimentos de expressão, purificação de proteínas, dentre outros, utilizando os protocolos previamente otimizados pela SGC. Assim, as técnicas de expressão high-throughput foram aplicadas com as diversas construções dos domínio cinases, seguida de expressão e purificação em larga escala daquelas que apresentaram expressão alta ou mediana, além da realização dos ensaios de Thermal shift e cristalografia. Em conjunto foram testadas cerca de 600 construções nos modelos de expressão em células de inseto (Sf9) utilizando o sistema de baculovírus e cepas bacterianas (E. coli Ð BL21-Rosetta e BL21(DE3)-λ-Phosphatase) (Tabela 04).

189! ! !

Tabela 04: Construções dos domínios cinases das Neks testadas para expressão bacteriana ou em célula de inseto. Células de Inseto Total de E. coli Sistema de Baculovírus Nek Construções Testadas Expressas Testadas Expressas

Nek1 33 67 26 - -

Nek3 89 150 3 33 8

Nek4 88 91 1 39 19

Nek5 38 26 3 14 7

Nek6 26 47 12 - -

Nek8 54 44 5 32 11

Nek9 84 130 0 17 5

Nek10 59 34 1 - -

Nek11 102 101 1 43 33

Ao longo da colaboração, a estrutura cristalográfica do domínio cinase da proteína Nek1 na presença e ausência de inibidor foi refinada e resolvida (PBD ID: 4APC e 4B9D) e novas construções foram desenhadas baseado nos testes realizados pelos outros alunos. Durante o período do mês de março à maio de 2012, realizei os screenings finais dos testes de expressão desses domínios no sistema de baculovirus e no sistema de expressão em BL21(DE3)-λ- Phosphatase. Em geral, a expressão proteica no sistema de E. coli não apresentou um aumento significativo quando comparado com os testes realizados em baculovirus, Apesar de terem sido realizados testes de expressão em larga escala com até 12L de expressão para construções da Nek10 em BL21(DE3)-λ-Phosphatase, a qualidade e quantidade da amostra não foram suficientes para a realização dos testes de cristalização. Dentre os potenciais candidatos obtidos no sistema baculovirus, três clones apresentaram níveis mais elevados sendo um para Nek11 e dois para Nek9. Estes foram submetidos à expressão em larga escala, seguido de lise por sonificação e purificação por afinidade com resina de níquel (Figura 12).

190! ! !

Nek11% Nek9%(G03)% Nek9%(H06)%

Figura 12. Géis de SDS-PAGE da primeira purificação por afinidade dos clones hNEK11KD-G03, hNEK9KD-G03 e hNEK9KD-H06. A primeira coluna da purificação de cada clone encontra-se o marcador, seguido do lisado total (Input), a primeira passagem da amostra pela resina de purificação ou Flow Tthrough e das lavagens para remoção de contaminantes. Na eluição esperava-se encontrar bandas proteicas com melhor pureza. As setas vermelhas, indicam a banda referente à proteína de interesse de cada purificação.

A proteína hNEK11KD sofreu precipitação durante as tentativas de diálise e concentração, então, segui os experimentos com as construções de Nek9. Assim, a amostra de lavagem 2 foi misturada com a respectiva amostra de eluição de cada uma das construções hNEK9KD-G03 e hNEK9KD-H06. Em seguida, receberam a adição de protease TEV para clivagem da cauda de histidina e foram concentradas até alcançarem um volume final de 4ml. Assim, foi possível injetá-las nas colunas de gel filtração para retirada de contaminantes com peso molecular diferente do fragmento almejado. Desta forma, o pico observado indica a saída da proteína (Figura 13A e 13B) em que as amostras referentes à este pico foram corridas em gel SDS-PAGE, onde foi constatado para hNEK9KD-G03 poucos contaminantes (Figura 13A). A banda foi cortada e enviada para análise por espectrometria de massas através de digestão tríptica e análise de peptídeos por MALD-TOF confirmando a proteína. Enquanto isso, a proteína foi concentrada até alcançar 8mg/ml em volume de 1mL e armazenada em -80¡C.

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Figura 12. Gráficos e géis de SDS-PAGE da purificação por gel filtração e de rebinding por afinidade à resina enriquecida com níquel. (A) Gráfico da purificação de gel filtração utilizando coluna S200 16/60 GF (GE Healthcare) previamente equilibrada com tampão de gel filtração. A seta indica o pico referente à saída da proteína hNEK9KD-G03 na amostra referente. (B) Gráfico da purificação por gel filtração utilizando as mesmas condições do item A, com o pico da proteína hNEK9KD-H06 indicado pela seta preta. (C) Amostras referentes ao pico da gel filtração em (B), sendo uma das amostras com a banda cortada para digestão tríptica e identificação por espectrometria de massas. (D) Purificação por afinidade em resina enriquecida com níquel, para coleta de hNEK9KD-H06 no flow through, devido a retirada da cauda de histidina por clivagem por protease TEV. As lavagens com um gradiente de imidazol permitiu a retirada de possíveis contaminantes da amostra. Na amostra flow through e lavagem 1, as bandas referentes à proteína foram cortadas para digestão tríptica e identificação por espectrometria de massas.

Para hNEK9KD-H06, após a purificação por gel filtração (Figura 13B e 13C), ainda haviam contaminantes nas amostras, as quais passaram por uma segunda purificação por afinidade à resina enriquecida com níquel (Figura 13D). Devido à presença de uma concentração relevante da proteína mediante a alta quantidade de volume (20mL), a amostra passou por diálise para redução da concentração de imidazol seguida de processo de concentração proteica. A partir disso, foi possível obter uma concentração de 10mg/ml suficiente para os experimentos de deslocamento térmico e de cristalografia.

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Figura 14. Gráfico referente às curvas de desnovelamento de hNEK9KD diante de um gradiente de temperatura. A partir da medida da fluorescência do SYPRO Orange adicionado nas reações foi possível formar curvas referentes ao desnovelamento de hNEK9KD (na curva azul, à esquerda) e na adição de compostos de uma biblioteca testada (demais curvas do gráfico). A seta indica a Tm aproximada de 47¡C para a proteína pura. Este gráfico representa apenas os melhores compostos de uma das placas testadas.

Após a obtenção da proteína pura, foi possível testar uma biblioteca de compostos contra as construções hNEK9KD-G03 e hNEK9KD-H06. A ligação entre um potencial inibidor com a proteína pode estabilizar a sua conformação e evitar a formação de agregados. Essa estabilização pode ser medida pela alteração da temperatura de melting (Tm) proteico. Ao serem testadas 5 placas contendo aproximadamente 96 inibidores cada, a medida da fluorescência do SYPRO Orange, adicionado como marcador da reação, permitiu a geração de gráficos capazes de avaliar a alteração da Tm mediante a presença do inibidor e aumento gradiente da temperatura de 20¡C até 100¡C (Figure 14).

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Tabela 05: Compostos potenciais obtidos nas reações de deslocamento térmico da proteína hNEK9KD. Os compostos a serem adicionados na montagem das placas para cristalografia de hNEK9KD apresentavam alteração da Tm entre 4¡C até 6¡C. Estes compostos estão marcados em azul. Alteração Concentração da Tm Composto do composto (¡C) (mM) 9,07 ASC24 50 8,97 ASC85 10 8,69 ASC67 10 8,62 ASC72 10 6,55 Aminopurvalanol 50 6,24 Cdk1/2 inhibitor III 50 6,04 Quercetin; 3,3,4,5,7-pentahidroxiflavonóide 250 5,82 Indirubin E904 50 5,42 Dovitinib 50 5,22 Asc29 25 4,56 Cdk2/9 inhibitor 50 4,78 Purvalanol A 50 4,70 Wee1/Chk1 inhibitor 50 4,68 Compound 52 50 4,41 JAK Inhibitor I 50 4,10 (Z,E)-3-(Imidazol-4-ylmethylene)-1,3-dihydroindol-2-one 50 3,60 IKK Inhibitor VII 50 3,60 Oxindole 50 3,52 SU9516 50 3,46 PF573228 50 3,32 229_6307_0279 10 3,31 IKK-2-InhibitorVI 50 3,22 4,5,6,7-Tetrabromobenzotriazole 50 3,19 Isogranulatimide 50 3,02 PDK/AKT inhibitor 50 2,86 CVM-OS-143 10 2,77 JNK Inhibitor II 50 2,74 BAY 62-3606 50 2,65 PI3-K inhibitor VIII 50 2,56 FG041 50 2,52 MRT00055931 0,5 2,39 AZ26 50 2,29 TPCA-1 50 2,19 052_0099_0280 10 2,14 229_0236_0196 10 2,13 Curcumin 50

Para hNEK9KD, a Tm era de aproximadamente 47¡C porém, com a adição dos compostos, a alteração ocorreu para 2¡C a 9¡C (à exemplo da figura 13 e Tabela 05). A escolha dos compostos envolveu a análise daqueles que apresentaram alteração da Tm entre 4¡C à 6¡C. Isso destacou a importância da utilização de 5 destes (marcados em azul na tabela 05) para a montagem de

194! ! ! placas com a proteína purificada, à fim de facilitar a cristalização por estabilização da molécula.

As placas de cristalografia foram montadas e a observação das condições ocorreu ao longo de 2 meses. No entanto, não houve a observação de cristais, apenas a formação de precipitados proteicos e dos sais presentes nas condições. Diante disto, as construções de hNEK9KD foram trazidas para o nosso laboratório, onde novas tentativas de expressão, através da co-expressão com presas já conhecidas serão realizadas a fim de analisar a co-cristalização do complexo proteico. Além disto, uma vez que a proteína encontra-se estável em solução, poderão ser feitas análises espectroscópicas como dicroísmo circular (para determinação de estruturas secundárias) e Espalhamento de Luz Dinâmica (determinar monodispersidade da amostra e medida aproximada de peso molecular) além de modelagem por Small-Angle X-Ray Scattering. De modo geral, a colaboração com o Structural Genomics Consortium agregou uma experiência internacional aliada com grande conhecimento científico acerca das técnicas de high throughput de expressão e purificação de proteínas. Além disso, todas as construções testadas foram trazidas ao Brasil a fim de realizar novas tentativas de padronização em outras condições de expressão e, assim, abrindo uma nova perspectiva para a obtenção das estruturas destas cinases.

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Declarações

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