UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto De Biologia

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Instituto de Biologia

PAOLA VISNARDI FASSINA

REDESCOBERTA DOS TARDÍGRADOS LIMNOTERRESTRES BRASILEIROS: REDESCRIÇÃO DE PSEUDECHINISCUS JUANITAE DE BARROS, 1939 E COMENTÁRIOS SOBRE PSEUDECHINISCUS NOVAEZEELANDIAE MARINAE BARTOŠ, 1934 SENSU DE BARROS (1942)

REDISCOVERY OF BRAZILIAN LIMNOTERRESTRIAL TARDIGRADES: REDESCRIPTION OF PSEUDECHINISCUS JUANITAE DE BARROS, 1939 AND REMARKS OF PSEUDECHINISCUS NOVAEZEELANDIAE MARINAE BARTOŠ, 1934 SENSU DE BARROS (1942)

CAMPINAS 2020

PAOLA VISNARDI FASSINA

Dissertation presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master in Animal Biology, in the area of Animal Biodiversity.

Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Biologia Animal, na Área de Biodiversidade Animal.

Orientador: PROF. DR. ANDRÉ RINALDO SENNA GARRAFFONI

ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO/TESE DEFENDIDA PELO ALUNA PAOLA VISNARDI FASSINA, E ORIENTADA PELO PROF. DR. ANDRÉ RINALDO SENNA GARRAFFONI.

CAMPINAS 2020

Campinas, 8 de Setembro de 2020.

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. André Rinaldo Senna Garraffoni

Profa. Dra. Clélia Márcia Cavalcanti da Rocha

Prof. Dr. Flavio Dias Passos

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Pós Graduação em Biologia Animal da Unidade Instituto de Biologia.

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho primeiramente а Deus, ао mеυ pai Mauro, minha mãе Silvana, minha irmã e melhor amiga Roberta e ao meu noivo Victor que, cоm muito carinho е apoio, nãо mediram esforços para qυе еυ chegasse аté esta etapa dе minha vida.

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) pela infraestrutura oferecida durante o desenvolvimento da pesquisa e durante meus anos de graduação. Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal da UNICAMP, por colaborar com a minha qualificação profissional e crescimento pessoal. À Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo (FAPESP- 2014/23856-0; 2018/10313-0) pelo apoio financeiro ao projeto. Ao Prof. Dr. André R. S. Garraffoni pela orientação, apoio, confiança, paciência e todo o conhecimento passado para que eu pudesse realizar o meu projeto. Aos meus pai, Mauro Fassina, que apesar de seu silêncio sempre foi um grande incentivador de todas as minhas conquistas pessoais e profissionais. À minha mãe, Silvana Visnardi Fassina que me ensinou o amor pelo conhecimento e pelo ensinar. À minha irmã Roberta Visnardi Fassina por ser uma grande incentivadora do meu mestrado e das minhas decisões. Ao meu noivo, Victor de Backer Moura, que foi um grande apoiador na minha decisão de voltar a Unicamp depois de 3 anos de formada e seguir o meu sonho de ser mestre. Aos amigos do LEOM (Laboratório de Evolução de Organismos Meiofaunais) pelo companheirismo e apoio, e por me fazer sentir parte deste grupo mesmo estando longe fisicamente. Aos pesquisadores Dr. Rodolfo Corrêa de Barros, Dra. Cláudia M.L. Assunção e Érika Cavalcante Leite dos Santos por aceitarem o convite para serem a pré-banca desta dissertação e pelas valiosas contribuições ao texto. À amiga Ariane Campos que foi a maior incentivadora da minha volta à vida acadêmica e esteve presente em todos os momentos desta jornada. Aos pesquisadores in memoriam Ernest Gustav Gotthelf Marcus, Eveline du Bois-Reymond Marcus e Rosina de Barros que, devido ao seu esforço e perseverança colocaram a pedra fundamental da tardigradologia brasileira e nos possibilitam "ver mais longe, por estar sobre os ombros de gigantes". À Deus, por me dar saúde e força para superar todas as dificuldades.

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.

I am among those who think that science has great beauty.

(Marie Curie)

If I have seen further it is by standing on the shoulders of Giants.

(Isaac Newton)

RESUMO

O filo Tardigrada é caracterizado por conter espécimes diminutos (70 a 1000 μm), possuírem um corpo robusto em forma de barril coberto por uma cutícula proteica, quatro pares de patas, garras no formato de gancho ou discos adesivos e um aparato buco-faringeano complexo. Os representantes desse grupo são comumente reconhecidos pela alta resistência em condições extremas de temperatura e pressão. O filo é composto por quase 1300 espécies, encontradas nos mais diversos ecossistemas terrestres, marinhos e de água doce no mundo todo. O estudo dos tardígrados está concentrado nas regiões Neártica e Paleoártica, pois, historicamente, foi onde estavam alocados os principais pesquisadores e em outras regiões biogeográficas os estudos são mais pontuais. Os tardígrados limnoterrestres brasileiros foram estudados de forma pioneira e intensa nas décadas de 30 a 50, por Rosina de Barros, Eveline Du Bois-Reymond Marcus e Ernest Marcus. Apesar desse pioneirismo, com mais de 10 artigos publicados em poucos anos, os pesquisadores não designaram nenhum material tipo e os trabalhos apresentam desenhos e descrições morfológicas pertinentes à época. A partir da utilização de técnicas modernas de obtenção de informação da morfologia externa e da anatomia (microscopia óptica de luz com contraste de interferência diferencial- DIC e microscopia eletrônica de varredura), moleculares (extração de genes 18S e COI) e coletas realizadas nas localidades tipo (Campos do Jordão, São Paulo) o presente estudo apresenta a redescrição da espécie Pseudechiniscus juanitae De Barros 1939 e analisa a identidade da espécie Pseudechiniscus novaezeelandiae marinae Bartoš, 1934 registrada e brevemente descrita por De Barros (1942).

ABSTRACT

Tardigrada is characterized by small individuals (70 a 1000 μm) and a robust barrel-shaped body, covered by a proteic cuticle. Representatives of this group are famous for their resistance to extreme conditions of temperature and pressure. The phylum is composed by more than 1300 species, found in several terrestrial, marine and freshwater ecosystems worldwide. The study of the group is concentrated in the Nearctic and Palearctic regions, once it is where the main researchers are allocated. The limnoterrestrial brazilian tardigrades were extensively studied between the 1930s and 1950s by the researchers Rosina de Barros, Eveline Du Bois-Reymond Marcus and Ernest Marcus. Despite over 10 articles published in a few years, the researchers did not designate any type of material and the descriptions present only drawings and limited morphological information. Using modern techniques for obtaining information on external morphology and anatomy (DIC- differential interference contrast and SEM-Scanning Electron Microscopy), molecular studies (18S and COI) and sampling in the type location, this study presents a redescription of the species Pseudechiniscus juanitae De Barros 1939 and analyses the identity of the species Pseudechiniscus novaezeelandiae Bartoš, 1934 registered and briefly described by De Barros (1942).

SUMÁRIO

I- INTRODUÇÃO 12

1.O filo Tardigrada 12

2. Resistência dos tardígrados 13

3. Biodiversidade e sistemática 14

4. Filogenética e registros fósseis 19

5. Dificuldades Taxonômicas 21

6. Taxonomia Integrativa e o conhecimento do grupo no Brasil 21

II- OBJETIVOS 23

III- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 24

IV- CAPÍTULO 1 32

Redescription of Pseudechiniscus juanitae de Barros, 1939 and comments on the

identity of Pseudechiniscus novaezeelandiae marinae Bartoš, 1934 sensu De

Barros (1942) (Echiniscidae, Heterotardigrada)* 32

V- APÊNDICE 66

I- INTRODUÇÃO

1.O filo Tardigrada

O filo Tardigrada é composto por microinvertebrados aquáticos (de 70 até aproximadamente que 1000 μm), distribuídos mundialmente e comumente encontrados em habitats terrestres e no mesobentos de ambientes aquáticos, de zonas tropicais a desertos áridos polares, de topos de montanhas a profundidades abissais nos oceanos (Kaczmarek et al. 2015; Nelson 2002). Apesar de serem encontrados no solo ou em musgos e liquens existentes na casca das árvores, esses organismos são considerados animais aquáticos independentemente de seu habitat, uma vez que necessitam de um filme d’água ao redor do corpo para realizar sua locomoção e respiração (Marley et al. 2011).

O corpo diminuto e robusto dos tardígrados apresenta uma complexa morfologia, dividido em 5 segmentos com segmentação externamente indistinta: o segmento cefálico (cabeça), três segmentos torácicos e um segmento terminal. Cada segmento, com exceção do cefálico, possui um par de lobópodes (pernas sem articulação) com garras ou dedos com discos adesivos e o segmento caudal possui o quarto par de pernas voltadas posteriormente (Nelson 2002).

A parede do corpo consiste em três camadas, sendo a mais externa uma cutícula acelular com α-quitina podendo formar escleritos articulados, seguida por uma epiderme espessa e eutélica e internamente uma camada extremamente fina de colágeno (Bacetti & Rosati 1971; Ramazzotti & Maucci 1983; Greven 1984; Greven et al. 2016).

Por apresentarem cutícula quitinosa, os tardígrados realizam ecdises periódicas que continuam após atingirem a maturidade sexual (Nelson 2002; Nelson et al. 2015). Durante a muda o aparato buco-faringeano, incluindo o tubo bucal, estiletes e suportes dos estiletes, são ejetados pela abertura da boca e glândulas

13 bucais e faringeanas produzem novas estruturas. Também são produzidas novas garras por glândulas presentes nos lobópodes. A muda termina com o abandono da exúvia que pode conter ovos ou estar associada com a defecação. O animal pode aumentar de tamanho ou diminuir após a ecdise, se as condições ambientais de disponibilidade de alimento forem desfavoráveis (Nelson et at. 2015).

O aparato buco-faringeano é uma característica morfológica com valor taxonômico em alguns grupos de tardígrados, uma vez que não é sujeito a mudanças por fatores externos e apresenta relativa variabilidade entre as espécies (Pilato 1972). Os estiletes, suportes dos estiletes, tubo bucal e bulbo faringeano são as estruturas observadas (Kristensen 1987; Nelson et al. 2015).

Os tardígrados são animais dióicos, com gônadas não pareadas posicionadas na região dorsal (Ramazzotti & Maucci, 1983). Nos heterotardígrados os sexos são definidos pela posição e aparência do gonóporo: nas fêmeas com formato de roseta e nos machos com uma abertura saliente em formato tubular, mais próxima ao ânus do que o das fêmeas. Foram observadas populações partenogenéticas nas três classes de Tardigrada. Os ovos são postos livremente no ambiente ou dentro de exúvias, podendo ser lisos ou ornamentados (Miller 1997).

O primeiro registro da observação de tardígrados é de Johann August Ephraim Goeze em 1773 que atribuiu a esses animais o nome “Kleiner Wasser Bär” (pequenos ursos d’água). O nome “il Tardigrado” foi introduzido por Lazzaro Spallanzani em 1776, e faz alusão a lenta movimentação dos apêndices locomotores (do latim, tardus = “lento”; gradus = “passos”) (Ramazzotti & Maucci 1983; Miller 1997; Artois et al. 2011; Nelson et al. 2015).

2. Resistência dos tardígrados

Os tardígrados são muito populares por sua notável capacidade de anabiose (estado de dormência com grande redução da atividade metabólica) e criptobiose (estado extremo de anabiose, na qual os sinais externos de atividade metabólica estão ausentes), ambas estratégias de dormência quando as condições ambientais são desfavoráveis, como baixas temperaturas (criobiose), dessecação

(anidrobiose), baixa concentração de oxigênio (anoxibiose) e variações de salinidade (osmobiose) (Nelson et al. 2015). O estado latente de cisto ou tonel (do alemão tonnchen, que significa pequeno barril) tem um impacto significativo no papel ecológico destes organismos e em sua dispersão (Nelson 2002; Artois et al. 2011). Em laboratório, tardígrados desidratados podem ser conservados a -80 °C sem perda de sua viabilidade e em Hélio líquido (-272 °C) por 8 horas, recebendo o título de “animais mais resistentes da Terra”. Devido a essa capacidade, esses animais começaram a ser considerados como organismos modelo multicelular para a exploração espacial. O projeto TARDIS (Tardigrada In Space) foi pioneiro no uso desses organismos para esse fim (Jönsson et al. 2008; Guidetti et al. 2012).

O conhecimento dos mecanismos de tolerância à dessecação e radiação em tardígrados possui um grande potencial para contribuir com o campo da medicina. Assim como os organismos modelo Caenorhabditis elegans e Drosophila melanogaster por muitos anos desempenharam um importante papel no entendimento do câncer, a biologia molecular de invertebrados criptobióticos como tardígrados podem oferecer novas perspectivas sobre os mecanismos relacionados a integridade genética e proteção celular, especialmente respostas antioxidativas e reparo do DNA (Jönsson 2019).

3. Biodiversidade e sistemática

Segundo o checklist das espécies e tardígrados, existem atualmente 31 famílias, 150 gêneros, 1339 espécies e 34 subspécies descritas para o filo Tardigrada (Degma et al. 2020).

Tabela 1- Sistemática atualizada de Tardigrada segundo Guil et al. (2018). Redesenhado de Miller (1997).

Classes Diagnose Ordens

Mesotardigrada Rahm, 1937 Cirro A presente. Possui espinhos e garras Thermozodia Ramazzotti & Maucci, nomen dubium semelhantes a Heterotardigrada sem 1983 diferenciação entre ramos primários e secundários. Bulbo da faringe semelhante a Eutardigrada (com placóides)

Apotardigrada (Schuster et Papila o redor da boca (papila peribucal) e Apochela Schuster et al., 1980 al., 1980) duas papilas laterais na cabeça (papilas cefálicas).

Garras com ramos primários e secundários separados. bulbo da faringe alongado e sem placóides.

Eutardigrada Marcus, 1927 Apêndices cefálicos ausentes. garras com Eohypsibioidea Bertolani & ramos primários e secundários fundidos Kristensen, 1987 (raramente reduzidas ou ausentes). Bulbo da Hypsibioidea Pilato, 1969 faringe possui placóides (raramente reduzidos ou ausentes). Macrobiotoidea Thulin, 1928 Isohypsibioidea Sands et al., 2008

Heterotardigrada Marcus, Possuem apêndices cefálicos, no tronco e nas Arthrotardigrada Marcus, 1927 1927 pernas. Gonóporo separado do ânus. Túbulos de Marpighi ausentes. Placóides de CaC03 e Echiniscoidea Richters, 1926 estruturas cuticulares em formato de barra.

Atualmente são reconhecidas 4 classes mas apenas 3 são válidas (tabela 1): Heterotardigrada Marcus, 1927, Eutardigrada Marcus, 1927 e Apotardigrada Schuster et al. 1980 (Nelson et al. 2015; Guil et al. 2018). A quarta classe, Mesotardigrada Rahm, 1937, foi descrita baseada em uma única espécie, Thermozodium esakii Rahm, 1937, que supostamente possuiria características intermediárias entre as classes Heterotardigrada e Eutardigrada. No entanto, devido a falta de material tipo e a impossibilidade de se encontrar exemplares, o status de nomen dubium foi designado (Ramazzotti & Maucci 1983; Jorgensen et al. 2010; Grothman et al. 2017).

As classes Eutardigrada Marcus, 1927 e Heterotardigrada Marcus, 1927, foram baseadas nos dois primeiros gêneros descritos: Echiniscus Schultze, 1840 e Macrobiotus Schultze, 1834 (Marley et al. 2011). Estes constituem a maioria dos tardígrados descritos e a classificação é baseada principalmente na presença de um gonóporo separado do ânus ou presença de uma cloaca, túbulos de Malpighi e em diferenças no formato e natureza das estruturas esclerotizadas da faringe e da cutícula externa (Guidetti & Bertolani 2005; Jorgensen et al. 2010).

Eutardigrada até recentemente era composto por duas ordens: Apochela e Parachela, no entanto, estudos moleculares e morfológicos apontaram Apochela como uma nova classe e a classe Apotardigrada foi erigida (Guil et al. 2018). Os eutardígrados remanescentes são caracterizados pela ausência de apêndices cefálicos, garras com ramos primários e secundários fundidos que raramente são reduzidas ou perdidas. O bulbo parafaringeal possui micro e macroplacóides (Guil et al. 2018). O grupo, anteriormente conhecido como Parachela Schuster, Nelson, Grigarick & Christenberry, 1980, contempla aproximadamente 68% das espécies de tardígrados conhecidas e é atualmente dividido nas ordens Eohypsibioidea Bertolani & Kristensen, 1987, Hypsibioidea Pilato, 1969, Macrobiotoidea Thulin, 1928 e Isohypsibioidea Sands, McInnes, Marley, Goodall-Copestake, Convey & Linse, 2008 (Marley et al. 2011).

Os eutardígrados possuem poucos caracteres morfológicos que permitem a identificação taxonômica, entre eles estão a morfologia e simetria das garras

(possuem 2 garras em cada perna, com ramos primários e secundários em cada garra) com alguns gêneros com garras ausentes em todas as pernas (Apodibius e Necopinatum) ou apenas no último par de pernas (Hexapodibius). Outras características importantes são a morfologia da faringe, como a presença, número, tamanho e formato dos placóides e do tubo bucal (se possui uma região flexível ou não) e papilas na região oral (Pilato 1972; Bingemer & Hohberg 2017).

A classe Apotardigrada Guil, Jørgensen & Kristensen, 2019 é caracterizada morfologicamente pela presença de apêndices cefálicos, garras possuindo dois ramos separados e um longo aparato buco-faringeano com ausência de placóides, além de ser suportada por evidências moleculares (Guil et al. 2018).

Conhecidos como “armoured tardigrades” – tardígrados com carapaça, os Heterotardigrada possuem uma cutícula dorsal espessada que podem apresentar natureza calcária, dividida em placas individuais, que diferem em número e formato entre os gêneros e espécies, gonóporo separado do ânus e ausência de túbulos de Malpighi. São divididos em Arthrotardigrada (marinhos em sua maioria) e Echiniscoidea (marinhos, água doce e limnoterrestres), este com quatro famílias: Echiniscoididae, Oreellidae, Carphaniidae e Echiniscidae (Nelson 2002).

O gênero Pseudechiniscus Thulin, 1911, é o segundo mais numeroso em espécies dentro da classe Heterotardigrada, família Echiniscidae, com atualmente 40 espécies (Cesari et al. 2019). São limnoterrestres e caracterizados morfologicamente por possuírem uma placa adicional (pseudosegmentar), se comparados com Echiniscus, posicionada entre a terceira placa mediana e a placa terminal, ausência de espinhos no primeiro par de patas, clava em formato de cúpula e dimorfismo do gonóporo (fig.1) (Tumanov 2019). Com o advento das técnicas moleculares molecular o grupo foi rapidamente apontado como polifilético em diversas análises (Jørgensen et al. 2011; Guil & Giribet 2012) e mais recentemente como monofilético (Tumanov 2019).

Figura 1- Representação esquemática da morfologia externa e anatomia do aparato bucal de um heterotardígrado (Pseudechiniscus) em posição dorsal (esquerda) e ventral (direita). Escala= 20µm.

Os caracteres morfológicos utilizados na identificação dos Heterotardigrada, especialmente Echiniscoidea, são os apêndices laterais e cefálicos, formato e número das placas dorsais, ventrais e nas pernas, escultura cuticular, dígitos, garras e formato do aparato bucal (Kristensen 1987; Nelson 2002; Guidetti & Bertolani, 2005).

4. Filogenética e registros fósseis

Tardigrada é um grupo monofilético pertencente ao clado Ecdysozoa que inclui todos os animais que fazem mudas periódicas de sua cutícula para o crescimento e é suportado por diversas evidências moleculares (Greven et al. 2016). O grupo é monofilético e em alguns estudos aparece dentro do clado Panarthropoda, no entanto sua posição e de Onychophora em relação a Arthropoda é incerta (Mallatt et al. 2004; Telford et al. 2008; Dunn et al. 2008; Dunn et al. 2014; Giribet 2016).

Por outro lado, análises de dados ESTs (expressed sequence tags) e transcriptômicas posicionam Tardigrada como grupo irmão de Nematoda ou do clado Cycloneuralia (Nematoda e Nematomorpha) (Borner et al. 2014; Dunn et al. 2008; Hejnol et al. 2009; Laumer et al. 2015).

Dentro do filo Tardigrada os três clados que possuem suporte morfológico (especialmente da morfologia das garras) e molecular são as classes Apotardigrada, Eutardigrada e Heterotardigrada (Guil et al. 2018).

Os registros fósseis possuem um grande valor na elucidação das relações filogenéticas do grupo. Apenas alguns tardígrados fósseis foram descritos, entre eles, dois foram descobertos em âmbar do período Cretáceo: Beorn leggi (Cooper 1964) e Milnesium sp. (Bertolani & Grimaldi 2000) e possuem características morfológicas muito semelhantes aos tardígrados atuais. Quatro exemplares foram

20 recuperados de uma amostra de 530 milhões de anos, do Médio Cambriano, de uma rocha tipo "Orsten" na Sibéria (Müller et al. 1995) e também mostram uma grande semelhança com os tardígrados atuais com a exceção de possuírem apenas três pares de patas e, assumindo que estes fósseis sejam de fato tardígrados, o grupo como conhecemos existe desde o Cambriano (Schmidt-Rhaesa 2001).

A condição de miniaturização do corpo dos tardígrados pode ser considerada plesiomórfica ou apomórfica dependendo do grupo externo escolhido para Panarthropoda (Schmidt-Rhaesa 2001). Segundo a hipótese Articulata (Annelida como grupo irmão de Panarthropoda) é sugerido que os tardígrados foram miniaturizados e perderam caracteres que seus ancestrais possuíram como cavidade celomática e metanefrídeos. No entanto, segundo a hipótese Ecdysozoa (Cycloneuralia como grupo irmão de Panarthropoda) seu tamanho diminuto pode ser explicado como característica plesiomórfica (Schmidt-Rhaesa et al. 1998; Schmidt-Rhaesa 2001).

5. Dificuldades Taxonômicas

De acordo com o Teorema da Ubiquidade organismos microscópicos são mais amplamente distribuídos do que os maiores, sendo a biodiversidade das espécies globais inversamente proporcional ao tamanho corpóreo (Fenchel & Finlay 2004; Curini-Galletti et al. 2012). Não obstante, a biodiversidade de organismos meiofaunais é frequentemente subestimada devido ao tamanho extremamente pequeno e corpos delicados (Miller 1997). Portanto, estimar a biodiversidade de grupos com alta incidência de espécies crípticas e pseudocrípticas como Tardigrada é uma tarefa árdua e um único estimador de biodiversidade parece não funcionar, pois eles ocorrem em muitos habitats diferentes e é necessária a utilização de diferentes estimadores para diferentes habitats (Bartels & Nelson 2007; Artois et al. 2011; Fonseca et al. 2017).

Segundo Guill & Cabrero-Sañudo (2006), com a taxa de descrição de espécies atualmente não será possível conhecer em curto ou médio prazo todas as espécies deste grupo. Alguns dos fatores que contribuem são os insuficientes esforços econômicos e tempo dedicado a descrições sistemáticas, além de existir um limitado número de especialistas trabalhando com esse grupo em toda região Neotropical.

6. Taxonomia Integrativa e o conhecimento do grupo no Brasil

A delimitação e a classificação de espécies de uma maneira integrativa é o futuro da taxonomia e visa integrar informações de várias fontes de dados disponíveis para delimitar as espécies. Esses dados podem ser de filogeografia, morfologia, genética de populações, ecologia, desenvolvimento, comportamento, etc. Os vários sistemas de identificação são, portanto usados de maneira complementar, e não exclusiva (Dayrat 2005).

A redescrição de espécies de maneira integrativa é uma tendência que vem sendo observada nos estudos mais recentes com espécies das classe Heterotardigrada e Eutardigrada (Bertolani et al. 2011a; 2011b; Vicente et al. 2013; Gasiorek et al. 2017; Stec et al. 2018). Uma vez que a descrição de espécies é feita

22 de maneira integrativa, existe uma maior confiabilidade nos limites interespecíficos, pois são suportados por mais de uma evidência (Yeates et al. 2011).

Os tardígrados, assim como em outros grupos meiofaunais como por exemplo Gastrotricha (Garraffoni & Balsamo, 2017), possuem um maior número de registros no Hemisfério Norte, uma vez que, a maioria dos especialistas estão alocados nesta região e o esforço de coleta foi maior.

O primeiro registro de um tardígrado no Brasil foi do naturalista escocês James Murray (1913), que reportou a ocorrência da espécie Macrobiotus occidentalis Murray, 1910 sem especificar a localidade. Posteriormente o zoologista alemão Gilbert Rahm reportou entre 1931 e 1932 a ocorrência de 12 espécies limnoterrestres nos estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Pernambuco (Rahm

1931; 1932).

O casal alemão Ernest Gustav Gotthelf Marcus e Eveline du Bois-Reymond Marcus foram os primeiros a estudar tardígrados em uma instituição brasileira e juntamente com Rosina de Barros, a primeira pesquisadora brasileira a se dedicar ao estudo dos tardígrados, realizaram numerosas coletas na capital, litoral e interior do Estado de São Paulo (De Barros 1938; 1939a; 1939b; 1942a; 1942b; 1943; Marcus 1937; Bois-Reymond 1944; 1952). Nesses mais de 10 trabalhos, com pelo menos 23 registros de ocorrências para o estado de São Paulo, foram descritos um gênero, oito novas espécies e quatro novas variedades (Assunção 1999). Os trabalhos de Ernest e Eveline Marcus e Rosita de Barros representam o nascimento da tardigradologia brasileira (Barros 2020).

Um novo trabalho de descrição de espécies limnoterrestres só foi realizado 55 anos depois, em que a espécie Isohypsibius sabellai Pilato et al. (2002), foi descrita com localidade tipo em Foz do Iguaçu, Paraná.

Apesar do grande esforço realizado por Rosita De Barros, Ernest Marcus e Eveline du Bois-Reymond na descrição dos tardígrados limnoterrestres brasileiros, as informações morfólogicas contidas nos trabalhos não são mais adequadas se comparadas com o atual estágio de conhecimento da diversidade biológica dos

23 tardígrados (Kaczmarek et al. 2015). Assim, tais descrições apresentam um número limitado de caracteres como tamanho, coloração, textura da cutícula, posição das placas dorsais, ornamentação dos ovos e garras. As figuras das descrições originais são desenhos baseados em observações em microscópios que não possuíam as inovações tecnológicas atuais. Esta questão é tão relevante que é mencionada no catálogo de espécies de tardígrados não marinhos da América do Sul feito por Kaczmarek et al. (2015). Neste trabalho, os autores consideram que praticamente todas as espécies cujo o local tipo é o Brasil necessitam de novas coletas nos locais tipos para esclarecer seu status taxonômico.

Em um novo estudo recente, foram registradas para o Brasil 30 espécies marinhas e 70 espécies limnoterrestres e de água doce, sendo que dessas 40% para o estado de São Paulo (n=64), 14,1% em Pernambuco (n=22), 12,7% no Ceará (n=20), 12,1 % no Rio grande do Norte (n=19),10,8% no Paraná (n=17), 5,7% no Rio de Janeiro (n=9), 2,5% em Alagoas (n=4) e 0,6% igualmente nos estados de Minas Gerais e Amazonas (n=1) (Barros 2020).

II- OBJETIVOS

O objetivo geral deste trabalho foi redescrever espécies do gênero Pseudechiniscus descritas para o Brasil entre as décadas de 1930 e 1950 e registrar novas ocorrências.

Objetivos específicos:

1) Designar neótipos da espécie Pseudechiniscus juanitae De Barros, 1939 , seguindo as regras do Código Internacional de Nomenclatura Zoológicas (ICZN, 1999), artigo 75.

2) Iniciar uma coleção de referência de lâminas permanentes de Tardigrada no Museu de Zoologia da Unicamp (ZUEC).

III- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ARTOIS, T.; FONTANETO, D.; HUMMON, W.D.; MCINNES, S.J.; TODARO, M.A.; SØRENSEN, M.V.; ZULLINI, A. 2011. Ubiquity of microscopic animals? Evidence from the morphological approach in species identification. In D. Fontaneto (Ed.) Biogeography of Microscopic Organisms: Is Everything Small Everywhere? New York: Cambridge University Press. pp. 245-249.

ASSUNÇÃO, C.M.L. 1999. Tardígrados. In: Ismael, D. Valenti, W.C.; Matsumura-Tundisi, T.; Rocha, O, Biodiversidade do estado de São Paulo. Editora Fapesp, São Paulo, pp-59-65.

BACCETTI, B.; ROSATI, F.; 1971. Electron microscopy on tardigrades. III. The integument. J. Ultrastruct. Res. 34, 214–243.

BARROS, R.C. 2020. Tardigrades Research in Brazil: an overview and updated checklist. Arq. Zool., 51(1): 1-11. DOI: 10.11606/2176-7793/2020.51.01

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IV- CAPÍTULO 1

Redescription of Pseudechiniscus juanitae de Barros, 1939 and comments on the identity of Pseudechiniscus novaezeelandiae marinae Bartoš, 1934 sensu De Barros (1942) (Echiniscidae, Heterotardigrada)*

1 2 PAOLA VISNARDI FASSINA , EMILIANA BROTTO GUIDETTI , ŁUKASZ 3 4 KACZMAREK , ANDRÉ RINALDO SENNA GARRAFFONI 1,2,4 Laboratory of Evolutionary Meiofauna, Department of Animal Biology, Institute of Biology; University of Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil 3 Department of Animal Taxonomy and Ecology A. Mickiewicz University Umultowska 89 61-614 Poznań- Poland Correspondence: [email protected] (A.R.S. Garraffoni)

Abstract: Tardigrades are aquatic microinvertebrates with wide distribution. However the intensity of the spatial variation of the sampling effort is heterogeneous and taxonomy of many species lacks information about morphological characteristics for their diagnosis and determination. Thus, the distribution patterns of many species sampled in some biogeographic regions are poorly known and their taxonomic status needs to be confirmed. Using comprehensive morphological investigations, we herein redescribe the species Pseudechiniscus juanitae de Barros, 1939 based on material recently collected in the type locality and comment on the status of the species Pseudechiniscus novaezeelandiae marinae Bartoš, 1934 reported by De Barros (1942). The present study is the first of a series of articles that intends to redescribe all limnoterrestrial tardigrades originally described in the 1930's and 1950’s, in which the type locality is the State of São Paulo.

Keywords: Tardigrada; Heterotardigrada; Echiniscidae; integrative morphology; taxonomy

*Artigo será submetido para a revista Zootaxa

1. Introduction Known as water bears, the phylum Tardigrada is composed by micrometazoans (from 70 µm up to exceptionally more than 1000 µm in length),worldwide distributed, commonly found in aquatic environments and in terrestrial environments where water is at least temporarily present (Kaczamarek et al. 2015). Despite their miniature size, tardigrades have a complex morphology (Nelson 2002). Their robust body is divided into five segments: the head, three thoracic segments, and one terminal segment. Each segment (except the head) has a pair of lobopods which are placed in a lateroventral position. The first three pairs are directed forward while the fourth pair is directed backward. The cuticle covers the body and may or may not have plates, the number and arrangement of which constitute important taxonomic characteristics (Ramazzotti & Maucci 1983; Marley et al. 2011; Nelson et al. 2015). According to the current checklist of Tardigrada species, there are currently 31 families, 150 genera, 1339 species and 34 subspecies described for Tardigrada (Degma et al. 2020). There are four classes but only three are valid: Heterotardigrada Marcus, 1927, Eutardigrada Marcus, 1927 and Apotardigrada Schuster et al., 1980 (Nelson et al. 2015; Guil et al. 2019). A fourth class, Mesotardigrada Rahm, 1937, was described based on a single species, Thermozodium esakii Rahm, 1937, and because of the lack of type material and impossibility to find the species at the type locality, the taxonomic status of nomen dubium was applied to the species and to the class Mesotardigrada (Grothman et al. 2017). According to Guil & Cabrero-Sañudo, 2007, at the current description rate, we will not get to know all the species of tardigrades in the short- or midterm. The study also revealed that the economic and time spent to systematic descriptions for the Neotropical region is insufficient where there were only 2 specialists working with this group, compared to 17 in the Neartic and 62 at the Paleartic regions. For Brazil, the first record of tardigrades is from James Murray, 1913, that reported the species Macrobiotus occidentalis Murray, 1910 but without specifying the location (Murray 1913). Almost 20 years later, Gilbert Rahm reported 12 species,

34 originally described for Europe in the states of São Paulo, Rio de Janeiro and Pernambuco (Rahm 1931; Rahm 1932). Between the 30’s and 50’s, the researchers Rosina de Barros, Eveline Du Bois-Reymond Marcus and Ernest Marcus were dedicated to describe and report the Brazilian tardigrade diversity (De Barros 1938; 1939a; 1939b; 1942a; 1942b; Marcus 1937; Bois-Reymond Marcus 1944; Bois-Reymond Marcus 1952). Together they published over 10 papers with at least 23 new records for the state of São Paulo, one new genus, 8 new species and 4 new subspecies (Assunção, 1999). The majority of these papers have succinct descriptions illustrated only with hand drawings and lack type material. Practically all the species in which the type locality is Brazil need further investigation and revision of the taxonomic status (Kaczamarek 2015). After a 50 years’ hiatus in the Brazilian limnoterrestrial tardigrade reports, Pilato et al. (2000) described Macrobiotus centesimus (now Paramacrobiotus centesimus) and later the species Isohypsibius sabellai for Foz do Iguaçu, Paraná (Pilato et al. 2004). The most recent checklist of Brazilian tardigrades reports 30 marine and 70 limnoterrestrial and freshwater species (in which 40% are registered from São Paulo state) (Barros 2020). For this paper we carried out an integrative taxonomy study with a more detailed morphological analysis and have added molecular data in order to redescribe Pseudechiniscus juanitae De Barros, 1939 based on specimens collected from the type locality and discuss the identity of the specimens identified as Pseudechiniscus novaezeelandiae marinae Bartoš, 1934 by De Barros (1942b) in the state of São Paulo, Brazil. This is the first of a series of articles that will redescribe the diversity of Brazilian limnoterrestrial tardigrades, that is part of the the remarkable work of Rosina de Barros, Eveline Eveline Du Bois-Reymond Marcus and Ernest Marcus in 1930’s and 1950’s.

2. Materials and Methods

2.1. Sample collection and processing

Moss samples were collected from the city of Campos do Jordão, São Paulo, Brazil. The original description of Pseudechiniscus juanitae (De Barros 1939a) did not provide geographical coordinates, so it was chosen 7 sampling spots, both in urban perimeter and Atlantic forest. The coordinates and sampling dates are the following: 22°44'41"S 45°33’18"W (05/07/2017), 22°44'00.0"S 45°35’00.0”W, 22°43'00.0"S 45°34’00.0” W, 22°43'00.0"S 45°36’00.0” W, 22°42'17.0"S 45°35’49.7” W, 22°42'47.8"S 45°35’24.2” W, 22°43'18.1"S 45°34’06.4”W (23/04/2018). The sampling method consisted of removing the moss from the surface of rocks, trees or sidewalks using a spatula. Later, placed in paper bags, dried and kept in an air-conditioned room (Miller 1997). In order to break the dormancy of the tardigrades, the collected moss samples were immersed in room temperature distilled water for about one hour. They were then sieved (mesh 42 µm) to separate tardigrades and their eggs from the substrate. The sieve was washed on a petri dish with distilled water. The tardigrades found were isolated using a glass pipette under a Zeiss Stemi 508 stereomicroscope (Ramazzotti & Maucci 1983).

2.2. Thermal relaxation

Before mounting the permanent slides or separating specimens for SEM, the alive individuals were subjected to thermal relaxation (Stec & Smolak 2015), that is, the embryo dish containing water and the specimens was placed on a thermoblock for 30 minutes at 60°C. After this procedure, the static and relaxed individuals were fixed with 70% ethyl alcohol.

2.3. Light Microscopy

After fixation, specimens for light microscopy and morphometry were mounted on microscope slides in a small drop of Fluoromount™ Aqueous Mounting Medium (Sigma Aldrich) and examined under a Zeiss Axioskop 2 with DIC (Differential Interference Contrast) and imagining software AxioCam 105 colour camera. Photomicrographs were taken using Zeiss ZEN Blue Edition software.

2.4. Scanning electron Microscopy

The fixed individuals were submitted to a water/ethanol dehydration series of 80%, 90%, 95%, and twice with 100%. After they were submitted to and CO critical 2 point drying (CPD). Lastly, the specimens were mounted in stubs and sputter-coated with gold (Mitchell & Miller 2008). The specimens were observed and photographed using the Jeol- JSM 5800LV scanning electron microscope (10kV) and photomicrographs were taken using SemAfore at the Laboratory of Electron Microscopy (LME), University of Campinas-Unicamp.

2.5. Morphometry

The permanent slides and SEM photographs were measured using the software AxioCam MRc5 and Photoshop CC 2019. The structures were selected for measurements according to Fontoura et al. (2010). Structures were measured only if the orientation was suitable. The body length was measured from the anterior to the posterior end of the body, excluding the hind legs. The %sp ratio is the percentage of the given structure to the scapular plate length and the %bo is the ratio of the given structure to the total length of the body (Fontoura & Morais 2011; Dastych 1999). Besides the measurements of the species analyzed in this study, it was also included individuals from P. juanitae reported to Mexico (Pilato & Lisi 2006), P. santomensis (Fontoura et al. 2010) and P. suillus (Grobys et al. 2020) with measurements values extracted from the literature. The measurements were analyzed using the linear discriminant analysis (LDA) in the R environment according to Alitto et al. 2019.

2.6 DNA extraction and amplification DNA was extracted from two specimens of Pseudechiniscus juanitae and three of P. novaezeelandiae marinae sensu De Barros (1942) using a QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen), following the manufacturer’s instructions. PCR amplifications were performed in a reaction mixture containing 5 mL of genomic DNA, 12.5 mL Qiagen Multiplex Pcr Plus Kit (Qiagen), 3 mL of water, 2.5 mL of Q Solution (Qiagen) and 1 mL (4 pmol) of specific primers. The primer sequences used were 18S a2.0 (5’-ATG GTT GCA AAG CTG AAA-3’ )(Vicente et al. 2013) for 18S rDNA and LCO

(5’-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′) (Cesari et al. 2019) and HCOout (5´-CCA GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACTTC-3’) for COI mtDNA. PCR regime used for both amplifications was: 5 min at 95°C, 40 cycles with 30 sec at 95°C, 90 sec at 60°C and 90 sec at 72°C, with a final elongation step at 68°C for 10 min. The amplification products were analysed by electrophoresis in 1% agarose gels containing SYBR Green (Life Technologies). The DNA fragments were sequenced using BigDye Terminator reactions in a 3500xL Genetic Analyzer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) in the CBMEG laboratory (Campinas, Brazil). The 18S rDNA and COI mtDNA sequences of both Pseudechiniscus species were deposited in GenBank (Table 3).

2.7 Alignments and data analysis 18S rDNA and COI mtDNA sequences were aligned separately with the multiple sequence alignment service T-COFFEE using Mafft v.7.215. The sequences were then edited using BioEdit 7.2.5 (Hall 1999). The concatenated dataset (18S rDNA and COI mtDNA) was analysed by Maximum Likelihood (RAxML- GTRGAMMA model) with 1000 bootstrap replicates-CIPRES Science Gateway, San Diego Supercomputer Center (Stamatakis et al. 2008; Miller et al. 2010) and Bayesian analysis. In both analyses, we used individuals of the unconfirmed species Pseudechiniscus aff. suillus and Pseudechiniscus aff. xiai proposed by Cesari et al. 2019 and other Pseudechiniscus sequences obtained in GenBank (table 3). Due to the close relationship between Pseudechiniscus and Echiniscus, the latter taxon was selected as outgroup (Kristensen 1987; Jørgensen et al. 2011; Guil & Giribet 2012).

3. Results

3.1. Pseudechiniscus juanitae De Barros, 1939 Phylum: Tardigrada Class: Heterotardigrada Marcus 1927 Order: Echiniscoidea Richters 1926

Family: Echiniscidae Thulin 1928 Genus: Pseudechiniscus Thulin 1911 Synonym - Pseudechiniscus suillus franciscae n. var. (De Barros, 1942) Figures 1-2. Material examined: 34 specimens

3.1.2 Neotype locality and series Gruta dos Crioulos. Campos do Jordão, São Paulo, Brazil (22°42'47.8"S 45°35'24.2"W). Slide no. ZUEC TAR 33. Additional material examined: 33 individuals (16 on slides ZUEC TAR 34 - 47 and 17 on SEM stubs) are deposited in the Museum of Natural History "Adão José Cardoso”, University of Campinas, São Paulo, Brazil.

3.1.3 Redescription of Pseudechiniscus juanitae De Barros, 1939 Pseudechiniscus orange in color with round black eyespots. Larger specimen´s length is 132 μm and smallest is 68 μm (tab.1). Internal, external buccal cirrus and cirrus A present; cephalic papilla and clava cone-shaped (fig. 1E, 2C). Other lateral, dorsal filaments or projections are absent. Cephalic plate with a W- shaped pattern (fig. 2A). Neck plate weakly sclerified with a central U-shaped figure (fig. 2A). Scapular plate divided by a transverse ridge. The anterior portion is divided into four parts by three short longitudinal ridges. Median plate 1 is divided by a transverse fold. The anterior portion is wide and trapezium shaped. The posterior part is slightly smaller and also trapezium shaped. Median plate 2 also has the anterior and posterior portion trapezium shaped, but the anterior is wider than the posterior. Medium plate 3 is undivided and diamond-shaped. The anterior portion of the plate has a slightly bigger angle compared to the posterior. Paired segmental plates 1 and 2 are divided by a longitudinal crest. Additional short longitudinal ridges of the paired segmental plates 1 and 2 are present but poorly developed and only visible in SEM (fig. 2A). Pseudosegmental plate with a median longitudinal crest (fig. 2E). Absence of dorsal processes on the posterior margin. Poorly developed transversal ridge.

Terminal plate with Y-shaped folding (or indentations) that were described by De Barros (1939a) as cloverleaf groove (sulco em folha de trevo). Sculpture of the dorsal plates consists of pillars joined by striae that are also present on the cuticle between and around the plates and on the base of the legs, but in a smaller size (fig. 1C). Density of the pillars of the terminal plate is 26 pillars/100 μm² (n=3). Ventral patterns are present and are composed of five sets of convex elevations and transverse folds (visible in SEM) (fig. 2B) separated by patches of fine granulation (fig.5). Only females were observed Females have a gonopore with the typical six-petal rosette shape (fig. 2F) and males with a small protruding tubular gonopore (fig.1D). Any other type of sexual dimorphism was not observed. Internal claws with a small and straight spur oriented towards the claw base (fig. 1F, 2D). Cone-shaped papilla on hind legs present (fig. 2D); dentate collar, absent. The neotype was deposited in the Museum of Natural History "Adão José Cardoso” - University of Campinas, São Paulo, Brazil.

Table 1. Measurements (in μm) of the largest and the smallest specimens, and mean values (mean; standard deviation; the number of specimens (n); minimum and maximum) of Pseudechiniscus juanitae (% bo = percentage of the given structure to the body length; % sp = percentage of the given structure to the scapular plate length).

Smallest Largest specimen Mean values and range specimen

µm % bo % sp µm % bo % sp µm % bo % sp

105,5±19,24( Body length 132 - - 68 - - 12) - - (d1) 67,62-131,6

Scapular plate 14,13±4,13 12,78±3,63(1 length ------(12) 0) - (d2) 5,05-17,99 5,05-17,99

Internal Bucal 4,37±0,7(6) 4,11±0,97(6) 31,25±8,53(6) cirrus ------3,08-5,89 3,8-5,89 19,94-43,07 (d3)

External bucal 28,3 6,08±2,27(8) 6,12±2,34(8) 54,47±22,83(7) cirrus - - - 2,07 3,06 5 3,06-9,60 3,06-9,60 28,35-97,35 (d4)

Cephalic Papilla 2,38±1,05 (4) 2,58±1,20(4) 20,62±5,51(4) ------(d5) 0,91-3,71 0,91-3,71 14,55-27,12

Clava 79,0 1,8±0,88(7) 1,42±0,86(7) 24,67±24,76(7) 1,75 2,94 - - - (d6) 4 0,00-2,94 0-2,94 10,21-79,04

12,18±4,44(1 112,54±78,37(1 Cirrus A 18,5 12,21±4,4(11) - - - 8,56 2,40 0) 0) (d7) 4 2,40-16,87 2,4-16,87 18,54-310,75

Internal claws I 33,8 25,7 4,07±1,4(7) 4,18±1,01(6) 29,61±3,89(5) 5,36 5,22 1,72 2,54 (d9) 6 5 2,54-5,22 2,54-5,22 25,75-33,86

External claws I 82,0 23,2 3,86±1,33(8) 4,02±0,71(7) 35,57±22,96(6) 6,23 4,73 1,95 2,88 (d9) 2 0 2,88-4,73 2,88-4,73 23,20-82,02

Internal claws II 34,8 4,36±1,4(4) 4,17±1,16(3) 27,96±6,21(3) 5,31 5,40 - - - (d10) 8 3,08-5,40 3,08-5,40 22,87-34,88

External claws II 79,3 3,77±1,1(5) 3,68±0,87(4) 37,74±28,12(4) 4,91 4,52 - - - (d10) 9 2,47-4,52 2,47-4,52 18,29-79,39

Internal claws III 29,8 4,05±1,04 (5) 3,82±0,71(4) 26,01±3,14(4) 5,34 4,62 - - - (d11) 5 2,92-4,62 2,92-4,62 22,56-29,85

External claws 106, 3,83±0,91(5) 3,90±1,04(4) 44,85±40,89(4) 4,29 5,36 - - - III (d11) 14 3,07-5,36 3,07-5,36 22,44-106,14

Internal claws 37,5 4,77±0,87(5) 4,84±0,41(3) 30,31±5,38(4) 5,76 5,14 - - - IV (d12) 6 4,38-5,14 4,38-5,14 25,12-37,56

External claws 61,1 4,1±1,18(7) 4,20±0,7(5) 32,23±15,19(6) 5,52 5,00 - - - IV (d12) 8 3,09-5,00 3,09-5,00 19,00-61,18

Figure 1. Pseudechiniscus juanitae DIC. A- habitus of neotype , B - habitus; C- dorsal sculpture; D-ventral sculpture and male gonopore (arrow); E- head and appendages, F- claws on leg IV (arrow indicates spur). A= 20μm; B, C, D, E=50 μm; F=25 μm.

Figure 2. Pseudechiniscus juanitae SEM. A - habitus; B- Ventral sculpture of a female; C-head and appendages; D-legs III and IV (arrow indicates spur); E-pseudosegmental plate (arrow on transversal ridge); F- detail of the gonopore (arrow) and anus of a female. Scale A, B, E=10 μm; C,D,F=5 μm.

3.1.4. Remarks Pseudechiniscus juanitae De Barros, 1939 differs from the other species of Pseudechiniscus by having the pseudosegmental plate longitudinally divided by a crest and no processes on the posterior margin of the pseudosegmental plate, together with the presence of spur on internal claws and ventral pattern. The dome-like cephalic papilla points to its belonging to the "suillus-facetallis group" (Peterson 1951). P. juanitae is part of the Pseudechiniscus suillus-facetallis complex and is similar to the species Pseudechiniscus suillus (Ehrenberg, 1853) and Pseudechiniscus novaezeelandiae marinae Bartoš, 1934. However, according to De Barros, it can be distinguished from the former by the shape of the eyes, elongation of the body and the sculpture of the dorsal plates, being heavily dense in P. juanitae and a fine punctuation in P. suillus (De Barros 1939a, 1942a). P. suillus also has a more complex ventral patterns, comprised by numerous convex elevations when compared to P. juanitae (fig.5) (Grobys et al. 2020) and a pseudosegmental plate not divided by any crest or fold (Ramazzotti & Maucci 1983). P. juanitae can be easily distinguished from P. novaezeelandiae marinae by the process on the posterior margin of the pseudosegmental plate absent in P. juanitae (fig. 1A,B 2A,E) and the longitudinal crest on the pseudosegmental plate present in P. juanitae and absent in P. novaezeelandiae marinae. They do not show much variation in body length, being P. juanitae 105±19 and P. novaezeelandiae marinae 130±24 (tables 1,2 and fig. 8) but the shape is different, being the first one slender and the second more robust. The ventral pattern also differs: P. novaezeelandiae marinae has a more convex elevations than P. juanitae (fig.5)

3.1.5.Phenotypic variation

In the original description, De Barros described the claws as without spurs (desprovidas de ganchos acessórios). In the specimens examined there are spurs in the two internal claws of each leg. The spur is a plesiomorphic characteristic in Echiniscidae family (Kristensen 1987) and we hypothesize that the author missed the presence of this characteristic. The author also did not describe the longitudinal crest on the pseudosegmental plate. This characteristic was only observable in DIC and SEM pictures so we hypothesize that she missed this characteristic. De Barros (1939a; 1942a) might have seen it in some specimens and described them as Pseudechiniscus suillus franciscae, which justify the sinominization of these two species (Ramazzotti & Maucci 1983).

3.1.6. Distribution

In Brazil, state of São Paulo, this species was also registered in other localities: in the city of Santa Bárbara d′Oeste (22° 45' 17'' S, 47° 24' 52'' W), São Vicente (22° 45' 17'' S, 47° 24' 52'' W) and São Paulo ( 23° 32′ 56″ S, 46° 38′ 20″ W)(De Barros 1939a; 1942a; Bois-Reymond Marcus 1944).

3.2. Pseudechiniscus novaezeelandiae marinae Bartoš, 1934 sensu de Barros (1942)

Figures 5-6 Material examined: 33 specimens

Diagnosis Pseudechiniscus orange in color with round black eyespots. Larger specimen´s length is 184 μm and the smallest is 82 μm (table 2). Internal, external buccal cirrus and cirrus A present; cephalic papilla is clava cone-shaped. All other lateral, dorsal filaments, or projections, absent (fig. 3C). Cephalic plate with a W-shaped pattern. Neck plate weakly sclerified without central U-shaped figure. Scapular plate divided by a transverse ridge. The posterior portion is divided into four parts by three short longitudinal ridges (fig. 3A).

A transverse fold divides median plate 1. The anterior portion is small and rectangular shaped (fig. 4B). The posterior part is triangular and bigger. Median plate 2 has the anterior portion triangular shaped and the posterior portion pentagonal, the anterior is shorter than the posterior. Medium plate 3 is undivided and diamond-shaped with the anterior portion slightly bigger angled when compared to the posterior. A longitudinal crest divides paired plates 1 and 2. Pseudosegmental plate without a median longitudinal crest. Presence of two triangular dorsal processes on the posterior margin (fig. 3A,D, fig.4A). Terminal plate with two indentations, but without Y-shaped folds. Ornamentation of the dorsal plates comprised by pillars joined by striae that are also present on the cuticle between and around the plates and on the base of the legs, but in a smaller size (fig. 3D,E). The density of pillars on the terminal plate is 59 pillars/100 μm² (n=3). Ventral patterns are present and comprised by six sets of convex elevations and transverse folds with four smaller elevations on each segment (visible in SEM) (fig. 4E) separated by patches of fine granulation (fig.5). Females show granulations all around the gonopore and males two patches, one on each side of the gonopore. Females have a gonopore with the typical six-petal rosette shape (fig. 4F) and males with a small protruding tubular gonopore (fig.3B). Any other type of sexual dimorphism was not observed. Internal claws with a small spur oriented towards the claw base. Small and round papilla on hind legs present; dentate collar, absent (fig. 4C).

3.2.1. Phenotypic variation This subspecies has the type locality for the Czech Republic (Europe) (Bartoš 1934) and 4 registers from distinct cities of the state of São Paulo, Brazil: undefined localities (Marcus 1939), Campos do Jordão, Santos (Bois-Reymond 1944) and Eldorado (De Barros 1942a) but only De Barros (1939a; 1942a) provided a succinct description and a simple illustration of the dorsal view. After collecting samples in one of the localities where the authors found specimens (Bois-Reymond 1944) (Campos do Jordão), we found individuals very similar to the description provided by De Barros (1939a).

It is important to highlight that we were able to noticed several morphological differences between the original description of Pseudechiniscus novaezeelandiae marinae done by Bartoš (1934) and those reported by de Barros (1942a). P. n. marinae was originally described with short conical projections laterally to the paired and pseudosegmental plates that are absent in our specimens, and terminal plate with two pointed processes elongated that was also not observed in our specimens. Another significant difference is that the species was described with bigger projections on the pseudosegmental plate, that form two large lobes, each one ending with a small spine or with a tooth, which is different than the small triangular projections observed on our specimens (Bartoš 1934; Ramazzotti & Maucci 1983). The process on the pseudosegmental plate as a taxonomic characteristic can be argued once some authors recognize the intraspecific variability of this characteristic (Fontoura et al. 2010), however, we believe that Pseudechiniscus novaezeelandiae marinae sensu de Barros (1942a) is not the same species described by Bartoš 1934. The specimens found in Campos do Jordão resembles Pseudechiniscus santomensis Fontoura, Pilato and Lisi, 2010, due to the presence of the triangular process on the pseudosegmental plate, dorsal ornamentation comprised by pillars joined by striae and measurements (table 2, fig.8). Some differences between the Brazilian and São Tomé and Príncipe's populations were also noticed, such as the lateral margins of the median plates, that in our specimens are well marked and in P. santomensis are continuous with the sculptured lateral cuticle, and the eyes spots, that in our specimens are black oval and very visible and in P. santomensis, in the description of the holotype are mentioned as “not observed either in slide mounted specimens or in live specimens”. The density of pillars in the terminal plate of the two species is similar: in P. santomensis the density calculated based on the pictures in the description is 50 pillars/100 μm² (n=1) and in the specimens collected in Campos do Jordão it is 59 pillars/100 μm² (n=3).

Figure 3. Pseudechiniscus novaezeelandiae marinae Bartoš, 1934 sensu Barros (1942) DIC. A -habitus (arrow on the dorsal process) B- ventral and male gonopore (arrow); C- head, appendages and legs I and II (arrow on spur); D, E- dorsal sculpture. A, C= 40μm; B, D, E= 20μm. .

Figure 4. Pseudechiniscus novaezeelandiae marinae Bartoš, 1934 sensu Barros (1942) SEM. A- lateral view (arrow on pseudosegmental process); B- dorsal view (arrow on pseudosegmental process); C-head and appendages; D- claws of leg III, (arrow on spur); E-ventral view of a female; F-detail of the gonopore (arrow) and anus of a female. Scale A, B, E=20μm; C=10μm; D, F= 5μm.

Table 2. Measurements (in μm) of the largest and the smallest specimens, and mean values (mean; standard deviation; the number of specimens (n); minimum and maximum) of Pseudechiniscus. novaezeelandiae marinae sensu de Barros (1942a) (% bo = percentage of the given structure to the body length; % sp = percentage of the given structure to the scapular plate length).

Smallest Largest specimen Mean values and range specimen

µm % bo % sp µm % bo % sp µm % bo % sp

130,6±23,6 Body length 184 - - 92 - - (21) - - (d1) 92,1-184,2

Scapular plate 17,5 19,1 19,1±4,2 (16) 14,1±2,5(16) 24,47 13,28 - - - length (d2) 9 0 12,1-25,3 10,9-19,1

Internal Bucal 37,0 32,4 5,7±1,8 (15) 4,4±1,2(15 33,4±6,2(11) 9,07 4,92 5,70 6,20 cirrus (d3) 7 5 2,8-9,1 2,3-6,5) 22,9-44,2

External bucal 54,1 42,9 8,5±2,6 (15) 6,6±1,7(15 49,3±8,8(12) 13,25 7,19 7,56 8,21 cirrus (d4) 6 8 4,0-13,3 3,0-8,7) 33,8-62,2

Cephalic 21,7 21,2 3,5±0,9 (16) 2,2±0,7(16) 18,9±4,6(12) 5,33 2,89 3,74 4,06 Papilla (d5) 9 7 1,8-5,3 1,3-4,1 10,6-31,0

16,5 3,1±0,9 (18) 2,2±0,6(18) 15,1±5,4(13) Clava (d6) 4,04 2,19 - - - 1 1,2-4,5 1,3-3,6 8,0-29,4

90,9 12,0 13,0 68,3 14,2±2,8 (18 11,1±1,3(18) 76,6±12,3(14) Cirrus A (d7) 22,25 12,08 2 1 5 0 9,4-22,3) 9,1-13,3 62,3-99,3

Process of pseudo- 13,7 10,6 2,5±0,9 (14) 1,1±0,5(14) 13,4±3,7(13) 3,35 1,82 1,86 2,03 segmental plate 0 2 1,2-4,0 1,2-2,7 7,5-21,0 (d8)

Internal claws I 39,4 25,8 6,9±1,6 (15) 5,5±0,9(15) 35,0±9,2(11) 9,64 5,23 4,55 4,94 (d9) 2 9 4,5-9,6 3,7-7,3 23,3-51,2

External claws I 27,5 28,3 6,3±1,2 (16) 4,4±0,9(16) 32,7±5,3(11) 6,73 3,65 4,97 5,40 (d9) 2 0 4,1-8,1 3,7-6,8 25,5-46,0

Internal claws II 25,6 6,3±1,1 (10) 4,4±1,0(1 32,3±9,8(7 - - - 4,51 4,89 (d10) 3 4,5-8,1 3,4-6,6 22,1-53,6)

External claws 20,8 6,2±1,2 (10) 4,4±0,9(10) 31,6±12,4(6) - - - 3,67 3,99 II (d10) 9 3,7-8,0 3,7-7,0 19,5-56,6

Internal claws 40,1 6,8±1,1 (9) 5,5±1,1(9) 36,7±7,9(6) - - - 7,06 7,66 III (d11) 3 5,4-9,2 4,1-7,7 25,2-51,1

External claws 35,3 6,5±1,0 (13) 5,5±1,1(13) 35,5±7,1(8) - - - 6,21 6,74 III (d11) 0 5,1-9,1 4,0-7,6 21,8-48,8

Internal claws 39,6 34,1 7,7±1,4 (12) 5,5±0,5(12) 39,7±4,4(8) 9,71 5,27 6,00 6,52 IV (d12) 9 5 5,5-9,7 5,2-6,7 34,2-47,2

External claws 40,8 33,8 7,0±1,5 (13) 5,5±0,8(13) 34,1±3,6(9) 9,98 5,42 5,95 6,47 IV (d12) 0 6 4,3-10,0 3,2-6,5 29,3-40,8

Figure 5- A schematic illustration of ventral patterns of Pseudechiniscus novazeelandiae marinae sensu De Barros (1942) (female and male) and Pseudechiniscus juanitae showing the patch of granulation (PG), convex elevations (CE), gonopore (GO) and anus (A).

3.3 Molecular analysis

The final alignment of the 18S rDNA yielded 692 positions, COI mtDNA 553 and combined dataset 1248 and included 18 species (13 from the genbank, 3 P. novazeelandiae marinae and 2 P. juanitae from the present study) (table 3). P. novaezeelandiae marinae sensu De Barros (1942) nested together in a clade in both analysis with P. facetallis as the sister group. Although the relations inside the clade change in the analysis, the clade has good support in both (ML-bootstrap 96; Bayesian- posterior probability 1) with P. novaezeelandiae in a sister group clade of P. novaezeelandiae marinae sensu De Barros (1942)(fig.6, fig.7). P. juanitae did not nest in a clade in the Bayesian analysis (fig.6), appearing in polyphyly with the clade formed by the species P. aff xiai, P. suillus among others. In the ML (fig.6) it forms a clade with low support (bootstrap 51) and has P. aff suillus (Italy) as a sister group.

Table 3. Taxa included in the present study, with GenBank accession numbers of 18S rDNA and COI mtDNA sequences.

Specimens 18S COI Reference

Echiniscus blumi HM193374 HM193407 [46]

Echiniscus testudo GQ849022 EF620378 [46]

Pseudechiniscus aff. suillus/ MK804928 MK804908 [41] Mongolia C2595 V06

Pseudechiniscus aff. suillus/ - MK804907 [41] Mongolia C2595 V04

Pseudechiniscus aff. suillus/ MK804926 MK804906 [41] Mongolia C2592 V06

Pseudechiniscus aff. suillus/ MK804924 MK804904 [41] Mongolia C2592 V04

Pseudechiniscus aff. suillus/ MK804922 MK804902 [41] Mongolia C2592 V02

Pseudechiniscus aff. suillus/ MK804919 MK804900 [41] Italy C3842 V04

Pseudechiniscus aff. - MK804898 [41] facettalis/ Portugal C3039 V06

Pseudechiniscus aff. xiai/ MK804912 MK804897 [41] Slovakia C3019 V07

Pseudechiniscus facettalis/ HM193382 HM193415 [46] Pf1

Pseudechiniscus islandicus/ HM193383 HM193417 [46] PiI1

Pseudechiniscus HM193384 HM193418 [46] novaezelandiae/ Pn1

Pseudechiniscus juanitae/ 1 SUB6936280 - Present study

Pseudechiniscus juanitae/ 2 SUB6936282 - Present study

Pseudechiniscus SUB6936292 SUB6936387 Present study novaezeelandiae marinae/ 1

Pseudechiniscus SUB6936294 - Present study novaezeelandiae marinae/ 2

Pseudechiniscus SUB6936298 - Present study novaezeelandiae marinae/ 3

Figure 6. Phylogenetic reconstruction (Maximum Likelihood) based on combined dataset (18S+COI). Values in bold show bootstrap. The species added in the study are evidenced by colorful areas.

Figure 7. Phylogenetic reconstruction (Bayesian analysis) based on combined dataset (18S+COI). Values in bold show posterior probability. The species added in the study are evidenced by colorful areas.

3.4 Morphometry

The morphometric analysis (fig.8) shows that there is no difference in morphometry between the P. juanitae specimens reported from Mexico (Pilato & Lisi 2006) (I and J) and the ones collected in the type locality. There is a separation between P. juanitae and P. n. marinae sensu De Barros (1942) and it is mainly because of the character d8 (pseudosegmental plate projection) that is absent in the first species and present in the later. Apart from this

57 character, the characters d5 (cephalic papilla) and d6 (clava) also influenced the morphometric separation of the species. The species P. suillus is very distinct from the other species and this might be due to the small number of specimens with measurements available in the literature. De Barros (1939) uses the length size of P. suillus to distinguish the species from P. juanitae in which she described the first species as narrow with long legs when compared with P. juanitae. P. santomensis does not distinguish morphometrically from P.n. marinae sensu De Barros (1942) and P. juanitae and this might be due the small number of individuals in the analysis.

Figure 8- Morphometric analysis. Axes 1 and 2 from linear discriminant analysis (LDA) based on 12 characters. See Table 1 and 2 for definitions of the morphological characters used for the morphometric analysis of. P. juanitae from type locality (a-l) and from Mexico (I-J) in dark green, P. novaezeelandiae marinae sensu De Barros 1942 (o-z, A-H) in light green, P. suillus. (K-M) in orange, P. santomensis (N-O) in brown.

4. Discussion

For Brazil, it is registered 70 species of limnoterrestrial and freshwater tardigrades, being almost 30 originally described (Assunção 1999; Da Rocha et al. 2016; Barros 2020). Among these Brazilian records, 22 species were sampled in the city of Campos do Jordão, and six of them have this city as their locus typicus (Kaczamarek et al. 2015; Miller & Perry 2016). The reconstruction showed that the species analyzed can be identified by both morphological and molecular approaches and that P. novaezeelandiae marinae sensu Barros (1942) and P. juanitae are two clearly separated lineages. P. juanitae shows particular morphological characteristics, like the longitudinal crest on the pseudosegmental plate and the and the density of the pillars of the terminal plate (26 pillars/100 μm²) and the ventral patterns. Pilato & Lisi (2006) recorded this species for Mexico and, compared to our specimens collected on the type locality we believe that it is P. juanitae. The authors noticed the presence of spur in the internal claws and the ventral ornamentation and the measurements provided are not significantly different than the specimens collected in the type locality (fig. 8). Their specimens are slightly bigger (body length- 160-175 µm) than the ones collected in the type locality (68-132 µm) but this difference might be due to the small number of specimens with measurements available. The density of the pillars of the pseudosegmental plate was calculated based on the photos provided on the article an they show sime difference: P. juanitae from the type locality has 26 pillars/100 μm² (n=3) while the ones from Mexico have 41 pillars/100 μm² (n=1). The species also has records in the Galapagos Islands (Schuster & Grigarick 1966) described with a variation in the posterior margin of the pseudosegmental plate (“this plate showed variation from a simple margin, to a narrow transverse flap, to 2 small triangular teeth, to 2 large rounded or acute processes”). In the original description of the species (De Barros 1939a) the author does not mention such

59 variation. Du Bois-Reymond Marcus (Bois-Reymond 1944) reported the species Pseudechiniscus novaezeelandiae marinae Bartoš, 1934 for the same locality as P. juanitae, and this species possess a posterior margin of the pseudosegmental plate with projections, so the specimens reported for Galapagos are probably another species or multiple species and further investigation on the collected material need to be held. Most probably, the species P. juanitae is not endemic to Brazil but some records need revaluation, with possible description of new species. The polyphyly that P. juanitae nested in can be explained by the low number of molecular sequences available, specially from a group like Pseudechiniscus in which the species boundaries are not clear and many studies try to elucidate these relations (Cesari 2019). P. novaezeelandiae marinae sensu Barros (1942) nested in a clade in both molecular approaches (ML and Bayesian). This information combined with the morphological differences between the specimens observed and the original description suggests that, what De Barros identified as P. novaezeelandiae marinae was actually a new species, yet to be described. According to Tumanov (2019) only New Zealand specimens conforming to the original description of Richters (1908) (with corrections by Pilato, 2005) should be considered as nominal P. novaezeelandiae.

Funding: This research was funded by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (2014/23856-0; 2018/10313-0), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) Finance Code 001.

Acknowledgments: We are thankful for all the support from the staff of the LME- Laboratório de Microscopia Eletrônica/IB at the University of Campinas (UNICAMP) and LabEsC- Laboratório de Estudos Cromossômicos. We also thank Prof Dr. André Victor Lucci Freitas for collecting the first moss samples, Prof. Dra. Cláudia Maria Leite Assunção for sharing her references and supporting the start of our research group and Prof. Dr. Giovanni Pilato for his inputs on the identity of the species. Conflicts of Interest: “The authors declare no conflict of interest”

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V- APÊNDICE

Considerações Finais

Este estudo, desde a sua idealização, trata-se de um primeiro passo em direção a melhora no conhecimento da diversidade dos tardígrados limnoterrestres brasileiros, principalmente do estado de São Paulo. A fauna foi inicialmente explorada pelos pesquisadores Rosita de Barros, Eveline du Bois- Reymond Marcus e Ernest Marcus nas décadas de 30 a 50. No entanto, devido à limitações tecnológicas e o baixo conhecimento da diversidade morfológica dos tardígrados como um todo naquele período, as descrições apresentam apenas esquemas do contorno do corpo, pouca ou nenhuma representação de outras estruturas (p.ex. garras, textura dos placóides), além de descrever pouca informação morfológica. Hoje, por meio de microscópio óptico com conjuntos especiais de lentes ou micróscopio eletrônico de varredura é possível acrescentar muito mais informação sobre a morfologia dos organismos. Além disso, nas últimas 2 décadas avanços nos estudos moleculares também passaram a ser usados rotineiramente para resolver problemas taxonômicos atribuídos às descrições mais antigas. Com a utilização dessas técnicas pudemos observar características que De Barros não descreveu na espécie Pseudechiniscus juanitae em 1939, como a espora nas garras internas e detalhes na ornamentação dorsal e ventral que atualmente são considerados caracteres importantes para a definição de espécies. A observação de novas características nos permitiu também discutir a identidade do registro de P. novaezeelandiae marinae sensu Barros (1942), que possivelmente se trata de uma espécie ainda não descrita uma vez que sua descrição original e morfologia observada não coincide com nenhuma espécie descrita. Além disso foi possível extrair os genes 18S e COI de exemplares das duas espécies e em comparação com sequências disponíveis do GenBank, criar uma hipótese filogenética adicionou novas informações à discussão. Ainda há muito o que se avançar no conhecimento dos tardígrados limnoterrestres brasileiros, principalmente em Campos do Jordão, uma vez que

67 neste trabalho são descritos apenas dois morfotipos e um elevado número de espécies possui essa cidade como locus typicus. Dessa forma, acreditamos que este seja um primeiro passo importante na direção de consolidar a taxonomia que servirá de base para futuros estudos de filogenia e distribuição dos tardígrados brasileiros.

Declaração

As cópias de artigos de minha autoria ou de minha co-autoria, já publicados ou submetidos para publicação em revistas científicas ou anais de congressos sujeitos a arbitragem, que constam da minha Dissertação/Tese de Mestrado/ Doutorado, intitulada “Redescoberta dos tardígrados limnoterrestres brasileiros: Redescrição de Pseudechiniscus juanitae De Barros, 1939 e comentários sobre Pseudechiniscus novaezeelandiae marinae Bartos, 1934 sensu Barros (1942)”, não infringem os dispositivos da Lei n.° 9.610/98, nem o direito autoral de qualquer editora.

Campinas, 15 de Dezembro de 2020

Assinatura : ______Nome do(a) autor(a): Paola Visnardi Fassina RG n.° 46.293.470-6

Assinatura : ______Nome do(a) orientador(a): André Rinaldo Senna Garraffoni RG n.° 24.707.631-4

COORDENADORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO INSTITUTO DE BIOLOGIA Universidade Estadual de Campinas Caixa Postal 6109. 13083-970, Campinas, SP, Brasil

Fone (19) 3521-6378. email: [email protected] !

DECLARAÇÃO

Em observância ao §5º do Artigo 1º da Informação CCPG-UNICAMP/001/15, referente a Bioética e Biossegurança, declaro que o conteúdo de minha , intitulada “Redescoberta dos tardígrados limnoterrestres brasileiros: Redescrição de Pseudechiniscus juanitae De Barros, 1939 e comentários sobre Pseudechiniscus novaezeelandiae marinae Bartos, 1934 sensu Barros (1942) ”, desenvolvida no Programa de Pós-Graduação em do Instituto de Biologia da Unicamp, não versa sobre pesquisa envolvendo seres humanos, animais ou temas afetos a Biossegurança.

Assinatura: ______Nome do(a) aluno(a): Paola Visnardi Fassina

Assinatura: ______Nome do(a) orientador(a): André Rinaldo Senna Garraffoni

Data: 15 de Dezembro de 2020