Doctorat en Biotecnologia Departament de Genètica i Microbiologia – Facultat de Biociències Nanophotonic Biosensors for Deciphering Cell Regulation Pathways Doctoral Thesis – 2016 César Sánchez Huertas Author Prof. Laura M. Lechuga Prof. Antoni Villaverde Director Tutor Abstract This Doctoral Thesis focuses on the development of innovative biosensor devices as alternative analytical techniques for the evaluation of different gene regulating pathways in order to obtain a more informative and accurate diagnosis and follow-up therapy of cancer. We propose the use of a novel nanophotonic biosensor for a rapid, highly sensitive and direct analysis of these regulating routes without the need of labeling or amplification steps. Different genetic and epigenetic disorders associated with cancer appearance and progression are studied taking advantage of circulating nucleic acids as target biomarkers. For the label-free detection and evaluation of these biomarkers, we have employed two different optical biosensors: (i) the well-known Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensor, and (ii) a novel nanotechnology-based interferometric device, the Bimodal Waveguide (BiMW) biosensor. First, an in-depth study of different biofunctionalization strategies on both platforms is presented. Several surface chemistry procedures have been optimized for an efficient immobilization of nucleic acids as biorecognition elements that ensure a highly sensitive target detection with maximum selectivity and reproducibility, especially for the direct analysis of complex human samples such as urine or serum. The optimized strategies were applied for the evaluation of specific and clinically relevant gene regulation pathways, such as RNA alternative splicing events, micro-RNA regulation, or DNA methylation processes. All the developed methodologies have been assessed in terms of selectivity, sensitivity and reproducibility, and in some cases, they have been validated with real samples. The obtained results overcome some of the critical drawbacks of the current methodologies employed for the analysis of such processes and offer standardized protocols for a highly sensitive and selective detection with minimal sample manipulation. The work in this Thesis has opened a new Research line in our Group and combines our wide knowledge in the development of powerful photonic biosensor technology with our bioanalytical expertise in order to offer advanced analytical tools for the direct and effective evaluation of gene regulating pathways as new solutions for cancer diagnosis and follow-up therapy. i ii ii Resumen La presente Tesis Doctoral se centra en el desarrollo de metodologías analíticas de carácter innovador para el estudio de diferentes rutas de regulación genética. Éstas nuevas técnicas de análisis se presentan como una atractiva alternativa para conseguir un diagnóstico y seguimiento de terapia del cáncer más precisos e informativos. Se propone el uso de un nuevo biosensor basado en tecnología nanofotónica como una plataforma ideal para el análisis rápido, directo y altamente sensible de dichas rutas, evitando el uso de marcadores o procesos de amplificación. Diferentes trastornos genéticos y epigenéticos asociados con la aparición y el progreso de cáncer han sido estudiados empleando ácidos nucleicos como marcadores biológicos. Para ello, se han empleado dos tipos de biosensores ópticos: (i) el conocido biosensor basado en Resonancia de Plasmón Superficial (SPR), y (ii) una nueva plataforma nanotecnológica altamente sensible basada en señales interferométricas producidas en guías de onda bimodal (biosensor BiMW). En primer lugar se ha llevado a cabo un estudio en profundidad de diversos procesos de biofuncionalización en ambas plataformas biosensoras. Se han optimizado diferentes procedimientos químicos de funcionalización de superficie de tal forma que aseguren una eficiente inmovilización de oligonucleótidos como elementos de biorreconocimiento. Esto ha permitido la detección de las secuencias diana de forma muy selectiva, ofreciendo la máxima sensibilidad y reproducibilidad posibles, especialmente para el análisis de muestras humanas complejas como son la orina o el suero. Una vez optimizadas las estrategias de biofuncionalización, se han evaluado diferentes rutas de regulación genéticas clínicamente relevantes como son los procesos de splicing alternativo, la regulación de micro-ARNs o los procesos de metilación de ADN. Todas las metodologías desarrolladas han sido evaluadas en términos de selectividad, sensibilidad y reproducibilidad, siendo validadas finalmente con el análisis de muestras reales. Las metodologías desarrolladas eluden inconvenientes críticos a los que se enfrentan normalmente las tecnologías convencionales empleadas para el estudio de estos procesos, ofreciendo protocolos más estandarizados que permiten una detección muy sensible, selectiva y con una mínima manipulación de la muestra. Este trabajo constituye el nacimiento de una nueva línea de investigación en nuestro grupo de investigación y combina nuestro amplio conocimiento en el desarrollo de innovadoras tecnologías biosensoras con nuestra gran experiencia en bioanalítica, ofreciendo finalmente herramientas de análisis muy avanzadas para la evaluación directa y efectiva de rutas de regulación genética como nuevas soluciones en el diagnóstico de cáncer y seguimiento de terapias. iii Agradecimientos Después de poco más de cinco meses escribiendo este manuscrito y tantos años de esfuerzo y trabajo, no sería justo cerrar esta etapa sin agradecer a todas esas personas que, de forma directa o indirecta, han ayudado a hacer posible que concluya esta gran experiencia. En primer lugar, me gustaría dar las gracias a Laura Lechuga. Gracias por ofrecerme la oportunidad de realizar el doctorado en tu grupo. Me siento un privilegiado de haber podido trabajar contigo y haber aprendido tanto durante este tiempo. Gracias por tu exigencia, por la gran confianza que has depositado sobre mí y por compartir tus puntos de vista, que me han ayudado a seguir en la buena dirección. Quería agradecer a la gran familia NanoB2A, que sin duda ha sido un lujazo trabajar con todos vosotros y compartir tantos momentos memorables. Aún recuerdo con añoranza recorrer el larguísimo pasillo de la ETSE para hablar de los últimos resultados con Laurita que, aunque fueran desastrosos, siempre me inundaba con nuevas ideas y grandes dosis de motivación. Entrar en el laboratorio y pasar de pies puntillas por la mesa de David Regatos, no vaya a ser que le moviera alguna de sus requeteordenadas piezas de su mesa. Pelearme con Silvia por quién cogía primero la pipeta de 100 cuando aún solo había un juego, o esquivar a Elena porque siempre se le acumulaban experimentos de última hora. Las escapadas al cuarto oscuro, donde estaban Bert y Borja, para evadirme cuando el laboratorio de sensores se convertía en un gallinero. Y ahora, en el nuevo edificio, las risas con Jesús en el laboratorio entre medida y medida. O el verano de locura de experimentos con Daphne, que me dio tantos dolores de cabeza. Me río aun con las genialidades de Ana, sin duda, el alma del grupo, y todas las fiestas que hemos disfrutado en el patio de su casa. Los momentos míticos de algunas NanoB2A productions, como el patinaje artístico sobre ruedas con Sam, la detención de la inocente Blanca, la declaración de amor de Gerardo, o los negocios oscuros de Daniel…¿Y las innumerables veces que Mar y Fari me han sacado de más de un lío arreglándome el sensor? ¡mil gracias! También agradezco a M. Carmen y Sonia, por resolverme las dudas de última hora. A Rebe, por los momentos de terapia bio, y a Toni por tener siempre alguna buena idea que aportar. Ha sido un placer volver a cruzarme con Adrián, que me vio como estudiante de máster y ha vuelto ahora que ¡casi soy doctor! A los que nos han visitado algún tiempo y nos han dejado tan buenos momentos. Siempre recordaré los bomboncillos de café de Jhonattan a los que me he convertí en adicto… Las barbacoas truncadas en casa de Adrián y su encantadora esposa Mane. Y, sobre todo, la eterna sonrisa de mi gran Meli, sin duda una amiga para toda la vida. A mis innumerables alumnos (ya casi pierdo la cuenta…) que he tenido el honor de supervisar a lo largo de todos estos años y que me han hecho crecer como profesional: Alejandra, Marta, Mª Cruz, Sebastian, Anna y Santos. Gracias por vuestra paciencia y esfuerzo y, sobre todo, por ayudarme con mi trabajo. También a mi medio paisana Patricia, que aunque no estabas a mi cargo, me ha encantado ayudarte en lo que he podido y descubrir ese corazón tan gran grande que tienes. A las nuevas incorporaciones, Cristina y a Nuria, aunque no he tenido el placer de compartir mucho con vosotras os doy mucho ánimo y suerte en vuestros proyectos. Me llevo un recuerdo muy especial de mis niñas Stef, Iraís y Maria, a las que quiero con locura y cuyo apoyo ha sido imprescindible. En estos últimos meses he echado de menos los momentos de desahogo en el coffee break o las cervecitas los viernes en el underground para dar la bienvenida al fin de semana. Y en particular, los abrazos de mi Stef, sus prisas por bajar a fumar un cigarrillo y su empeño en hacerme entender los dichosos armónicos… A mi pequeña mexicana, Iraís, muy dura por fuera pero con un corazón inmenso. No habría sido lo mismo sin nuestros momentos de risas por nuestras idas de olla en el despacho. Pero sobre todo a mi inseparable Maria. Sin duda, esto no lo habría conseguido sin ti. Hemos compartido tanto que todo lo que escriba se quedará corto… Has sido una compañera excepcional y una amiga v incondicional que siempre ha estado a mi lado incluso cuando ni me lo he merecido. Gracias por ser así y darme ese huequito tan privilegiado en tu vida. Gracias también a mi grupo adoptivo del CRG por acogerme tan cálidamente durante los meses que estuve allí y hacerme sentir uno más. A Juan Valcárcel por su entrega y compromiso que ha sido imprescindible en el desarrollo de esta tesis. A Villy y sus pastelitos, que echo tanto de menos. Y, sobre todo, a mi ángel de la guarda Elías, que siempre está cuando más lo necesito.