Universidade Estadual Do Ceará Faculdade De Veterinária Programa De Pós-Graduação Em Ciências Veterinárias Mestrado Acadêmico Em Ciências Vaterinárias

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS VATERINÁRIAS

YASMIM MAIA FERREIRA

EFEITO DA OSMOLALIDADE DE DIFERENTES SOLUÇÕES ATIVADORAS SOBRE A CINÉTICA ESPERMÁTICA DO SÊMEN FRESCO, RESFRIADO E DESCONGELADO DE Prochilodus brevis (ACTINOPTERYGII:PROCHILODONTIDAE)

FORTALEZA – CEARÁ 2019 1

YASMIM MAIA FERREIRA

EFEITO DA OSMOLALIDADE DE DIFERENTES SOLUÇÕES ATIVADORAS SOBRE A CINÉTICA ESPERMÁTICA DO SÊMEN FRESCO, RESFRIADO E DESCONGELADO DE Prochilodus brevis (ACTINOPTERYGII:PROCHILODONTIDAE)

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para à obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal.

Orientador: Dr. José Ferreira Nunes Coorientadora: Prof.ª Dr.ª Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley

FORTALEZA – CEARÁ 2019 2

YASMIM MAIA FERREIRA

EFEITO DA OSMOLALIDADE DE DIFERENTES SOLUÇÕES ATIVADORAS SOBRE A CINÉTICA ESPERMÁTICA DO SÊMEN FRESCO, RESFRIADO E DESCONGELADO DE Prochilodus brevis (ACTINOPTERYGII:PROCHILODONTIDAE)

Aprovada em: 10 de dezembro de 2019.

Dedico este trabalho aos meus pais, meus queridos irmãos e ao meu eterno e amado avô, Valdir Maia. 5

AGRADECIMENTOS

À Deus, por me permitir realizar mais este sonho e por ter concedido luz e sabedoria para a conclusão desta etapa. Ao meu avô, Valdir Maia, que viverá eternamente em meu coração. Aos meus pais Valdilene Maia e Francisco Fernandes e irmãos Ingrid Maia, Mayara Maia e Marcus Wilson, por todo o amor, carinho, proteção, paciência e apoio nestes anos dedicados à vida acadêmica. Aos meus amores, André Siqueira, Vitório e Django por todo cuidado, amor e parceria. À Universidade Estadual do Ceará (UECE), por todo o suporte durante minha caminhada acadêmica, e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), pelo ensino de excelência. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro. Ao meu orientador, Dr. José Ferreira Nunes e coorientadora Dra. Carminda Sandra Brito Salmito Vanderley, pela oportunidade e confiança na realização deste trabalho. Aos membros da banca Dra. Caroline Vieira Feitosa, Dr. César Carneiro Linhares Fernandes e Dra. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro pela disposição em contribuir com este trabalho. Ao Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes (LBRP) e ao Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB) pela oportunidade de ensino e aprendizado. A todos os amigos de laboratório: Júlia Trugilio, Mayara Setúbal, Larissa Teixeira, Renata Vieira, Vanessa Alves, Priscila Almeida, Edna Raquel, Pedro Emídio Leite, Thais Maia, Hiago Gadelha, Jessica Lobato, Yara Silvino, Levi Kalil, Guilherme Melo, Carla Pamela, Carla Tatiana, Samuel Victor, Vitória Correia e Karen Karoline. Agradeço à todos pela grande parceria, disponibilidade em ajudar, companhia e amizade. Aos amigos queridos Pedro Arruda, Jonas Felipe, Kalil Mubarac, Matheus Magalhães e Lucas Abreu, por todos os momentos descontraídos e de felicidade que tornaram a vida, acadêmica e pessoal, mais leve e feliz.

“São as nossas escolhas que revelam o que realmente somos, muito mais do que as nossas qualidades.” (Albus Dumbledore)

RESUMO

Prochilodus brevis é uma espécie de peixe reofílica de importância econômica e ecológica no nordeste brasileiro. No entanto, ações antrópicas tornaram sua população vulnerável, sendo necessário realizar estudos sobre sua biologia reprodutiva para aperfeiçoar sua reprodução em cativeiro. Sendo assim, objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos das soluções ativadoras ACP-104, Frutose e NaCl em três diferentes osmolalidades (100, 160 e 220 mOsm Kg-1) na cinética espermática e na duração da motilidade em sêmen de P. brevis in natura, resfriado e criopreservado. Os machos receberam duas doses de extrato hipofisário de carpa (0,4 e 4 mg kg-1 peso corporal) com um intervalo de 9 horas entre as aplicações. Após 14 h, os animais foram sedados, tiveram o sêmen coletado e foram formados oito pools de sêmen. Amostras de sêmen in natura foram ativadas e analisadas; posteriormente, foram resfriadas e criopreservadas, com base em metodologia padronizada para esta espécie. ACP-104 e NaCl (P> 0,05) a 100 e 160 mOsm Kg-1 registraram resultados cinéticos satisfatórios para o sêmen fresco, enquanto o ativador NaCl obteve resultados cinéticos satisfatórios para espermatozoides resfriados nas três concentrações de osmolalidade (P <0,05). NaCl a 220 mOsm Kg-1 obteve os melhores resultados para espermatozoides descongelados (P <0,05). O ACP-104 a 100 mOsm Kg-1 manteve durações de motilidade espermática mais longas no sêmen submetido às três condições experimentais adotadas no presente estudo. Sendo assim, é possível concluir que o sêmen fresco de P. brevis ativado com ACP-104 ou Frutose em baixos níveis de osmolalidade permite altas taxas de motilidade espermática. Espermatozoides resfriados e descongelados podem ser ativados com NaCl em níveis mais altos de osmolalidade. Para todas as condições seminais, indica-se ACP-104 a 100 mOsm kg-1, por proporcionar uma maior duração da motilidade.

Palavras-chave: Characiformes. CASA. Criopreservação seminal. ACP-104. Ativadores espermáticos.

ABSTRACT

Prochilodus brevis is a rheophilic fish species of economic and ecological importance. However, anthropic actions have made its population vulnerable; therefore, it is necessary conducting studies about its reproductive biology to help improving its reproduction in captivity. The aim of the current study is to evaluate osmolality effects (100, 160 and 220 mOsm Kg-1) of activated solutions such as ACP-104, Fructose and NaCl on sperm kinetics and motility duration in fresh, cooled and thawed P. brevis semen. Fresh sperm samples were analyzed; subsequently, they were cooled and cryopreserved, based on standardized methodology for this species. ACP-104 and NaCl (P >0.05) at 100 and 160 mOsm Kg-1 recorded satisfactory kinetic results for fresh semen, whereas NaCl recorded satisfactory kinetic results for cooled sperm at all three osmolality levels (P <0, 05). NaCl at 220 mOsm Kg-1 recorded the best results for thawed sperm (P <0.05). ACP-104 at 100 mOsm Kg-1 maintained longer sperm motility durations in semen subjected to the three experimental conditions adopted in the current study. It is possible concluding that fresh P. brevis semen activated with ACP-104 or Fructose at low osmolality levels enables high sperm mobility rates. Cooled and thawed sperm can be activated with NaCl at higher osmolality levels. In addition, ACP-104 at 100 mOsm Kg-1 enables longer sperm mobility duration in fresh, cooled and cryopreserved semen.

Palavras-chave: Characiformes. SCA. Sperm cryopreservation. ACP-104. Sperm activators.

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1 - OSMOLALITY OF DIFFERENT ACTIVATING SOLUTIONS INFLUENCES THE MOTILITY DURATION AND SPERMATIC KINETICS OF Prochilodus brevis FRESH, COOLED AND CRYOPRESERVED SPERM. Figura 1 - The percentage of motile Prochilodus brevis fresh sperm activated in ACP- 104, Fructose and NaCl at different osmolalities. Different letters indicate significant differences (P < 0.05) between solutions and osmolalities...... 47

Figura 2 - The duration of sperm motility in P. brevis fresh sperm activated in ACP-104, Fructose and NaCl. Different letters indicate significant differences (P < 0.05) between solutions…………………………………...... 48

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1 - OSMOLALITY OF DIFFERENT ACTIVATING SOLUTIONS INFLUENCES THE MOTILITY DURATION AND SPERMATIC KINETICS OF Prochilodus brevis FRESH, COOLED AND CRYOPRESERVED SPERM. Tabela 1 - Motility rate and velocities (curvilinear = VCL, straight line = VSL, average path = VAP) of fresh sperm of P. brevis activated with ACP-104, Fructose and NaCl, with osmolalities of 100, 160 and 220 mOsm Kg-1. Data are expressed as mean ± standard deviation…………………………………………...... 49

Tabela 2 - Motility rate, velocities (curvilinear = VCL, straight line = VSL, average path = VAP) and duration of motility of cooled sperm of P. brevis activated with ACP-104, Fructose and NaCl, with osmolalities of 100, 160 and 220 mOsm Kg-1. Data are expressed as mean ± standard deviation.……………………...... 50

Tabela 3 - Motility rate, velocities (curvilinear = VCL, straight line = VSL, average path = VAP) and duration of motility of frozen sperm of P. brevis activated with ACP-104, Fructose and NaCl, with osmolalities of 100, 160 and 220 mOsm Kg-1. Data are expressed as mean ± standard deviation. .……………………...... 51

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACP Água de coco em pó AIA Ácido indol acético AMPc Monofosfato cíclico de adenosina ANOVA Análise de variância CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CASA Computer assisted sperm analysis CE Ceará CEUA Comissão de Ética para Uso Animal DMSO Dimetilsulfóxido DP Desvio padrão EHC Extrato hipofisário de Carpa FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations GLM General Linear Models Procedure KCl Cloreto de potássio LBRP Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes NaCl Cloreto de sódio pH Potencial hidrogeniônico PPGCV Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias SCA Sperm Class Analyzer SPTZ Espermatozoide UECE Universidade Estadual do Ceará VAP Velocidade média do percurso (average trajectory velocity) VCL Velocidade curvilinear (curvilinear velocity) VSL Velocidade em linha reta (straight line velocity)

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...... 13 2 REVISÃO DE LITERATURA ...... 15 2.1 TAXONOMIA (FISHBASE, 2018) ...... 15 2.2 ESPÉCIE E SUA REPRODUÇÃO ...... 15 2.3 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO SÊMEN DE PEIXES CHARACIFORMES .16 2.3.1 Metabolismo espermático ...... 17 2.3.2 Motilidade espermática de peixes ...... 17 2.3.3 Análise da cinética espermática ...... 18 2.4 SOLUÇÕES ATIVADORAS DA MOTILIDADE ESPERMÁTICA DE PEIXES 19 2.4.1 Frutose ...... 19 2.4.2 ACP-104 ...... 20 2.5 CONSERVAÇÃO SEMINAL ...... 21 2.5.1 Criopreservação seminal ...... 21 2.5.2 Refrigeração seminal ...... 22 3 JUSTIFICATIVA ...... 24 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA ...... 25 5 OBJETIVOS ...... 26 5.1 OBJETIVO GERAL ...... 26 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 26 6 CAPÍTULO 1 ...... 27 7 CONCLUSÕES ...... 53 8 PERSPECTIVAS ...... 54 REFERÊNCIAS ...... 55 13

1 INTRODUÇÃO

O Prochilodus brevis é uma espécie de peixe conhecida popularmente como curimatã comum, pertence à ordem dos Characiformes e é endêmica do semiárido brasileiro, possuindo importância ecológica e econômica nas bacias cearenses (ROSA et al., 2005). O curimatã possui o hábito reprodutivo reofílico, migrando durante a estação chuvosa por vários quilômetros até as cabeceiras dos rios para desovar (NELSON, 1994). No entanto, a construção de barragens e a pesca predatória da espécie, principalmente durante a época de desova, estão colocando a sua sobrevivência em risco, o que poderá afetar o funcionamento dos ecossistemas no futuro (NASCIMENTO et al., 2012). Além disso, mudanças climáticas globais têm modificado o regime de chuvas das regiões semiáridas, alterando o processo reprodutivo das espécies de peixes. Uma forma de contribuir para a conservação do curimatã é a preservação de suas células reprodutivas, o que oferece benefícios tanto ambientais quanto econômicos. Dentre as técnicas, têm-se a refrigeração e a criopreservação seminal. A primeira objetiva preservar os espermatozoides viáveis, em temperatura próxima a 4 ºC, por um período de horas ou dias (MURGAS et al., 2004). Por outro lado, a congelação seminal consiste na conservação dos gametas por meio da imersão em nitrogênio líquido (-196 ºC), mantendo sua viabilidade estrutural e funcional por tempo indeterminado (Felizardo et al., 2011). Ambas as técnicas têm como vantagens: estabelecer programas de melhoramento genético, eliminar o problema de assincronia da atividade reprodutiva e reduzir o número de reprodutores machos mantidos na estação de piscicultura, com consequente redução dos custos (GODINHO, 2007). Apesar dos benefícios destas técnicas de conservação, ainda há a perda da viabilidade espermática em decorrência de danos celulares, dificultando a consolidação destes bancos genéticos para uso em larga escala. Os danos celulares podem estar associados ao inchaço e a ruptura das células espermáticas, a perda da permeabilidade seletiva da membrana ou a mudança na sua fluidez e ainda redução da atividade enzimática (THUNDATHIL et al., 1999). Estes danos refletem na motilidade e a velocidade espermática, levando ao consequente prejuízo em fertilizações. O uso de soluções ativadoras em osmolalidades adequadas pode contribuir para o sucesso destas técnicas, pois é possível que os processos de refrigeração, congelação e descongelação afetem a permeabilidade da membrana de tal forma que 14 alteram a faixa de osmolalidade em que a motilidade é acionada (VIVEIROS et al., 2016). Pesquisas evidenciaram que utilização de ativadores espermáticos após a descongelação, como a cafeína para a truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) (ROBLES et al., 2003; VALDEBENITO, 2007) e a frutose para o surubim do Iguaçu (Steindachneridion melanodermatum) (NEUMANN, 2012), promovem aumento das taxas de motilidade e de velocidade espermática. Assim, estudos que investigam a influência das soluções ativadoras na modulação da motilidade espermática são de suma importância, uma vez que este é um dos parâmetros mais importantes na análise da qualidade seminal. Entre as soluções ativadoras mais empregadas pelos pesquisadores, podem ser destacadas o cloreto de sódio (NaCl) (GONÇALVES et al., 2013) o bicarbonato de sódio (NaHCO3) (SILVEIRA et al., 1990; MILIORINI; MURGAS; PEREIRA, 2005), o cloreto de potássio (KCl) (LAHNSTEINER; PATZNERL; WEISMANN, 1992; RAVINDER et al., 1997) ureia (CAROLSFELD et al., 2003) e a frutose (ADAMES et al., 2015; BERNARDES-JÚNIOR et al., 2019; NEUMANN, 2012). A utilização do meio ativador à base de água de coco em pó (ACP-104) e frutose ainda não foram testadas como soluções ativadoras para o sêmen de P. brevis. Diante disto, foram necessários estudos para a definição da melhor osmolalidade das soluções ativadoras utilizadas para o sêmen de P. brevis.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 TAXONOMIA (FISHBASE, 2018)

Reino: Animalia Filo: Chordata Classe: Actinopterygii Ordem: Characiformes Família: Prochilodontidae Gênero: Prochilodus Espécie: Prochilodus brevis (Steindachner, 1875)

2.2 ESPÉCIE E SUA REPRODUÇÃO

A espécie Prochilodus brevis (STEINDACHNER, 1875), regionalmente conhecida como curimatã comum, é uma espécie de peixe teleósteo pertencente à ordem dos Characiformes e nativo do semiárido nordestino brasileiro (CE, PI, RN) sendo introduzida em alguns Estados da região sudeste (DOURADO, 1981). Essa espécie possui grande valor biológico e econômico, ocupando lugar de destaque pela precocidade, prolificidade, regime alimentar e grande aceitação pelos habitantes do Nordeste (FONTENELE, 1982). A curimatã comum é um peixe gregário, que habita as zonas mais profundas da coluna d’água. Na fase juvenil alimenta-se de plâncton e quando adulto, passa a ingerir matéria orgânica e microrganismos associados à lama do fundo de lagos e margens de rios, caracterizando regime alimentar iliófago, também se alimenta de restos de animais e vegetais (DOURADO, 1981). Os adultos dessa espécie apresentam, em média, 23 a 30 centímetros de comprimento; seu peso pode variar entre 215 a 513 gramas (NASCIMENTO et al., 2012). Embora as fêmeas sejam ligeiramente maiores que os machos, principalmente durante o período reprodutivo, não se observa dimorfismo sexual para P. brevis (GURGEL; VERANI; CHELLAPPA, 2012; NASCIMENTO et al., 2012). Com relação aos seus hábitos reprodutivos, o P. brevis é um peixe reofílico que migra durante a estação chuvosa, que corresponde à estação reprodutiva, por vários quilômetros até as nascentes do rio para procriar (CHELLAPPA et al., 2009), sendo conhecido como um “peixe de piracema” (ARAÚJO, 1998; GURGEL et al., 2012). Essa 16

é uma estratégia evolutiva fundamental no sucesso reprodutivo da espécie (JIMÉNEZ- SEGURA; PALACIO; LEITE, 2010). Os animais migram em busca de um ambiente favorável à fertilização dos ovos e desenvolvimento dos juvenis, tais como locais de águas mais movimentadas com maior oxigenação e disponibilidade de alimento, além de maior turbidez. Estes fatores garantem menores taxas de predação natural e maior sobrevivência (AGOSTINHO; GOMES; PELICICE, 2007). Quando não ocorrem as chuvas ou quando o animal está em cativeiro, a migração para a reprodução é impedida, sendo, portanto, necessária à realização da indução hormonal para a maturação final e reprodução assistida. Um dos preparados hormonais mais utilizados em espécies nativas brasileiras é o extrato bruto hipofisário de carpa (EHC) (ZANIBONI-FILHO; WEINGARTNER, 2007), que atua induzindo essa maturação final, com consequente liberação dos gametas. Além das secas, a pesca predatória de P. brevis, principalmente no período que antecede a desova, quando as fêmeas se encontram maduras, e o barramento dos rios que impedem as migrações da espécie, põe em risco a sobrevivência da espécie (NASCIMENTO et al., 2012).

2.3 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO SÊMEN DE PEIXES CHARACIFORMES

Estudos sobre a biologia do sêmen de peixes foram iniciados no século XIX, onde várias características foram rapidamente identificadas: a imobilidade do espermatozoide no sêmen in natura, a curta duração de sua motilidade após sua ativação e a necessidade de diluição em um meio hiposmótico para a iniciação do movimento espermático (BILLARD; COSSON, 1992). A produção espermática de peixes é muito alta, devido ao grande número de divisões espermatogoniais (BILLARD, 1986), e muito variada. Em algumas espécies o macho produz 100 bilhões de espermatozoides/ano/kg do peso corporal ou mais de 1 x 109 espermatozoides/g de testículo/dia, o que é 10 vezes maior do que a produção relatada para mamíferos (BILLARD; COSSON, 1992). Em curimatã comum, Lopes et al. (2014) relataram uma concentração média de 22,26 x 109 espermatozoides/ml. Na maioria dos peixes, os espermatozoides não possuem estrutura acrossomal, fato compensado pela presença de um orifício para a entrada do gameta masculino no ovócito, denominado micrópila. A micrópila permanece pouco tempo 17 aberta, se fechando em poucos minutos, ao hidratar-se no momento em que entra em contato com a água (NAKATANI et al., 2001). A osmolalidade espermática é de aproximadamente 300 mOsmol/kg e a quiescência é mantida até o momento em que o sêmen entra em contato com uma solução hipotônica (< 300 mOsmol/kg), no caso dos peixes de água doce, ou com uma solução hipertônica (> 300 mOsmol/kg) para os peixes de água salgada (COSSON, 2004). Para P. brevis, a osmolalidade média do sêmen é de 276,18 mOsmol/kg (LOPES et al., 2015).

2.3.1 Metabolismo espermático

O trifosfato de adenosina (ATP) é a maior fonte de energia durante o curto período de motilidade dos espermatozoides; porém, é hidrolisado rapidamente na fase ativa da motilidade (BILLARD et al., 1995). Segundo Gwo et al. (1995), a mitocôndria é o reservatório endógeno de fonte de energia para a motilidade espermática de peixes ovulíparos. Uma vez que 50-80% das moléculas de ATP armazenadas sejam consumidas, a motilidade do sêmen é interrompida. Entretanto, Cosson (2004) observou que espermatozoides que perderam a motilidade, após algum tempo, têm restaurada sua capacidade de motilidade, sugerindo uma resposta à reposição dos estoques de ATP por meio da via oxidativa do metabolismo mitocondrial. Cosson et al. (1999), por sua vez, afirmam que a diminuição das reservas intracelulares de ATP responde parcialmente e não integralmente à redução da capacidade de movimentação dos espermatozoides.

2.3.2 Motilidade espermática de peixes

Conforme Carolsfeld e Harvey (1999) e Godinho (2000), a motilidade espermática é um dos principais parâmetros a serem considerados na análise da qualidade do sêmen de peixes. Para tanto, deve-se levar em conta que a mesma é influenciada por inúmeros fatores como temperatura, estado nutricional, estado sanitário, condições de análise e soluções ativadoras empregadas. Os espermatozoides de peixes são imóveis nos testículos e no plasma seminal de espécies de água doce. A motilidade é ativada quando o meio em que os espermatozoides se encontram se torna hiposmótico, como a água do ambiente externo (COSSON, 2004). A motilidade dos espermatozoides de salmonídeos é suprimida pelo potássio (K+) seminal contido no ducto espermático e é iniciada pela redução da sua 18 concentração na água doce onde ele é liberado (MORISAWA et al., 1983). Com a diminuição da concentração externa de íons K+, ocorre o efluxo deste cátion para o meio extracelular, estimulando a abertura de canais de cálcio (Ca++) e seu influxo para o interior do espermatozoide. O aumento da concentração intracelular de Ca++ participa decisivamente na iniciação da motilidade (COSSON, 2004). Fatores, como o pH ou outros íons presentes, podem polarizar a membrana celular e estimular a motilidade dos espermatozoides dos peixes (MORISAWA, 1999). Como descrito por Takai e Morisawa (1995), a isotonicidade do meio impede a ativação da motilidade espermática; diferentemente de teleósteos dulcícolas, é a hipertonicidade da solução em redor dos espermatozoides que proporciona a ativação da motilidade espermática em teleósteos de água salgada (BEDORE, 1999).

2.3.3 Análise da cinética espermática

A qualidade espermática está diretamente relacionada com a motilidade dos gametas masculinos, uma vez que esta característica constitui um pré-requisito para a fertilização dos ovócitos (RURANGWA et al., 2004). Viveiros et al. (2011) relataram que a taxa de motilidade do sêmen descongelado de dourado (Salminus brasiliensis) revelava o número de espermatozoides com membranas intactas, demonstrado a íntima relação da motilidade com a viabilidade espermática e com a capacidade fertilizante do sêmen de peixes. Geralmente essa avaliação é feita de forma subjetiva, na qual o avaliador deve estimar uma taxa de espermatozoides móveis numa escala de 0 a 100% (TAITSON; CHAMI; GODINHO, 2008). A técnica convencional, baseada na observação através de microscópio óptico, é utilizada pela maioria dos laboratórios para realizar análise seminal. Embora sujeita a distintos graus de imprecisão, devido à subjetividade da avaliação a partir de escalas arbitrárias (CHAMBEYRON; ZOHAR, 1990), já foi demonstrado que este método é tão confiável quanto à análise objetiva (VIVEIROS et al., 2010). Um dos métodos utilizados em análises objetivas da motilidade é o Computer-assisted Sperm Analyser (CASA), um sistema automático (hardware e software Sperm Class Analyser - SCA®) utilizado para visualizar, digitalizar e analisar imagens sucessivas, gerando informações precisas e significativas do movimento individual de cada célula e de subpopulações de células espermáticas (AMANN; KATZ, 2004). 19

Com o auxílio do programa é possível avaliar a porcentagem de espermatozoides móveis (ou taxa de motilidade), além da porcentagem de espermatozoides com velocidade rápida, média ou lenta; assim como analisar as propriedades de trajetória e velocidade dos espermatozoides, sendo algumas delas: Velocidade curvilínea (VCL- μm/s-1), velocidade linear progressiva (VSL- μm/s-1), velocidade média da trajetória (VAP- μm/s-1), retilinearidade (STR - %) e linearidade (LIN - %). Em Characiformes, o CASA já foi utilizado para analisar a motilidade espermática pós-descongelação de pirapitinga (Piaractus brachypomus), piabanha (Brycon insignis), curimba (Prochilodus lineatus) e tambaqui (Colossoma macropomum) (LEITE et al., 2012; MELO, 2010; NASCIMENTO et al., 2010; SHIMODA, 2004; VIVEIROS et al., 2010).

2.4 SOLUÇÕES ATIVADORAS DA MOTILIDADE ESPERMÁTICA DE PEIXES

A vida dos espermatozoides de muitas espécies de peixes após a ativação é muito curta, aproximadamente 60 segundos (BILLARD; COSSON, 1992). Devido a isso, a determinação da solução adequada à ativação da motilidade espermática, sem comprometer a qualidade seminal, torna-se uma questão importante em trabalhos de criopreservação em peixes (BEDORE, 1999). Alguns autores têm testado diferentes ativadores, como a água (LINHART; BILLARD; PROTEAU, 1993), o bicarbonato de sódio (MILIORINI, 2006; MURGAS; FRANCISCATTO; SANTOS, 2003), o cloreto de sódio (CRUZ, 2001), o cloreto de potássio (RAVINDER et al., 1997) e a ureia (CAROLSFELD et al., 2003). Um fator importante no momento da ativação espermática é a osmolaridade do ativador. Murgas et al. (2003) obtiveram taxas de motilidade acima de 70% utilizando 1% de NaHCO3 em sêmen de piracanjuba (Brycon orbignyanus) descongelado. Murgas et al. (2007) obtiveram maiores durações de motilidade em sêmen de curimba (Prochilodus lineatus) utilizando 0,5% de NaHCO3 em relação a 1,0% de NaHCO3 e à água destilada.

2.4.1 Frutose

A utilização de outras opções de moduladores da ativação espermática, como a frutose, mostrou importantes resultados nas taxas de motilidade espermática em Rhamdia quelen, confirmados pelas taxas de fertilização. Adames et al. (2015) afirma 20 que a frutose possivelmente serve como fonte de precursores metabólicos para o metabolismo energético das células, refletindo sobre as maiores velocidades e tempo de duração da ativação espermática. Essa hipótese pode ser sustentada quando se faz a analogia aos espermatozoides de mamíferos, onde a frutose extracelular pode ser utilizada via fosforilação oxidativa (RIGAU et al., 2001) para fornecer energia para o movimento espermático. A frutose é um monossacarídeo encontrado principalmente nas frutas e vegetais, desempenha importante papel na regulação da glicólise em vários tipos de células e controla a gliconeogênese. Em mamíferos, a frutose, pela via do sorbitol, é produzida na próstata e vesícula seminal, a partir da glicose, tendo papel importante no suprimento de energia e mobilidade dos espermatozoides (BARREIROS; BOSSOLAN; TRINDADE, 2005). Estudos reportam que ao menos em alguns teleósteos os espermatozoides possuem a capacidade de metabolizar nutrientes exógenos como piruvato, acetato, lactato, glioxilato e em menor grau a glicose (BOBE; LABBÉ, 2010; INGERMANN et al., 2011). Além disso, durante o movimento espermático os níveis de ATP podem ser mantidos em parte pela fosforilação de monossacarídeos (BOBE; LABBÉ, 2010), como relatado para o escalo (Leuciscus cephalus) (LAHNSTEINER; PATZNERL; WEISMANN, 1992) e a dourada (Sparus aurata) (LAHNSTEINER; CABERLOTTO, 2012).

2.4.2 ACP-104

A água de coco é uma solução natural e estéril, composta de sais, proteínas, açúcares, vitaminas, gorduras neutras, além de indutores da divisão celular e eletrólitos diversos, fornecendo os nutrientes necessários para a conservação de células espermáticas (BLUME; MARQUES JR., 1994). Pesquisadores da Universidade Estadual do Ceará desenvolveram a água de coco sob a forma de pó (ACP® – ACP Biotecnologia, Fortaleza, Ceará, Brasil), apresentando os mesmos constituintes bioquímicos da forma in natura, com formulação padronizada e maior capacidade de armazenamento, o que facilita sua comercialização para regiões onde o fruto não existe, e mais recentemente, na criopreservação de sêmen de peixes (VIVEIROS et al., 2008). A formulação do meio de conservação para sêmen de peixes recebe a denominação de ACP-104. A avaliação da motilidade espermática pós-descongelação de sêmen criopreservado utilizando ACP-104 como diluente, para Prochilodus lineatus, Leporinus 21 obtusidens e Brycon orbignyanus apresentou resultado similar ao controle (CARVALHO et al., 2014; LEITE et al., 2012; MELO, 2010; NASCIMENTO et al., 2017; SALMITO- VANDERLEY et al., 2012). O ACP-104 constitui-se numa alternativa tecnológica inovadora para a conservação dos recursos aquáticos (VIEIRA, 2010) e produção aquícola do Nordeste do Brasil. Em estudos recentes com P. lineatus, Viveiros et al. (2010) verificaram que o sêmen criopreservado em ACP-104 apresentou maior motilidade de espermatozoides do que aqueles criopreservados em mistura com glicose. No entanto, são poucos os estudos existentes sobre o comportamento cinético de espermatozoides de peixes, de fertilização externa, utilizando o ACP-104 como meio ativador. Utilizar o ACP-104 como ativador espermático pode ser uma alternativa inovadora, visto que, o ACP possui compostos essenciais ao metabolismo espermático, dando suporte energético na motilidade durante o processo de ativação espermática.

2.5 CONSERVAÇÃO SEMINAL

A conservação de sêmen tornou-se uma alternativa indispensável na seleção de peixes e na sincronização da disponibilidade de gametas. Dentre as técnicas de conservação seminal destacam-se: refrigeração e congelação seminal. Essas biotécnicas reprodutivas são importantes ferramentas na obtenção de um manejo mais fácil dos reprodutores, pois dispensa a presença do macho no momento da fertilização, promove a troca de material genético entre fazendas produtoras de pescado e auxilia nos programas de preservação de espécies ameaçadas de extinção (ISAÚ, 2006).

2.5.1 Criopreservação seminal

A criopreservação envolve procedimentos que permitem o armazenamento de espermatozoides em nitrogênio líquido, a uma temperatura aproximada de -196 °C, mantendo-se a viabilidade dos gametas por tempo indefinido. Mins, Tsvetkova e Brown (2000) verificaram que a percentagem de espermatozoides móveis, contidos no sêmen criopreservado de esturjão, não diminuiu ao longo de cinco anos de armazenamento. Para a criopreservação, é necessário que o sêmen seja diluído em um meio de congelação composto por um diluente e por um crioprotetor. Esse meio mantém a viabilidade espermática e previne as crioinjúrias ocasionadas durante a congelação- descongelação seminal (SALMITO-VANDERLEY et al., 2012). 22

O diluente é, geralmente, uma solução rica em sais e/ou carboidratos, que promove o aumento do volume seminal, facilitando sua distribuição em doses, e atua como fonte de energia para os espermatozoides pós-descongelação. Salmito-Vanderley et al. (2014) lista os diluentes mais utilizados para a ordem dos Characiformes, dentre eles destacam-se a glicose e a água de coco em pó (ACP-104). A glicose já é um diluente bastante utilizado na congelação seminal de peixes, uma vez que trata-se de uma solução de fácil aquisição e que já foi testada para a congelação seminal de diversas espécies (CARNEIRO et al., 2012; CIERESZKO et al., 2013; GWO et al., 2005; MARTÍNEZ et al., 2012; PSENICKA et al., 2008; VIVEIROS et al., 2010; VIVEIROS et al. 2012; VIVEIROS et al., 2015). Além disso, especificamente para P. brevis já foram realizados estudos, que demonstraram a boa interação, pré e pós-descongelação, do sêmen com a glicose (LOPES et al., 2015; NUNES et al., 2016; PINHEIRO et al., 2016). O ACP-104 é um diluente que vem sendo muito utilizado no desenvolvimento de biotécnicas reprodutivas, que apresenta resultados satisfatórios para algumas espécies de mamíferos (SILVA et al., 2011) e peixes (CARVALHO et al., 2014), inclusive P. brevis (CAJADO, 2014). Acredita-se que o ACP-104 seja um diluente promissor devido à sua rica composição em sais minerais, aminoácidos, proteínas e fatores de crescimento vitaminas, antioxidantes e baixo teor em fosfolipídios (AROUCHA; VIANNI, 2002).

2.5.2 Refrigeração seminal

A refrigeração seminal é uma técnica que mantém a viabilidade espermática por um período de horas ou dias, em temperaturas de refrigeração (~ 4 °C), sendo indicada por facilitar o manejo, dispensar a presença do macho no ato da fecundação e aumentar a eficiência da reprodução artificial nas estações de piscicultura (MURGAS et al., 2004). Por serem estáticos dentro da gônada, a refrigeração é bastante apropriada para a conservação do sêmen de peixes, visto que não há gasto de energia dos espermatozoides (MARIA, 2005). Para a aplicação dessa técnica, é necessária a determinação do diluente ideal, pois este irá diminuir a concorrência dos espermatozoides por oxigênio e espaço e reduzirá a taxa metabólica dos espermatozoides (CAROLSFELD; HARVEY, 1999). Por outro lado, para a refrigeração seminal, normalmente, não há adição de crioprotetor, uma vez que este não é recomendada a exposição prolongada dos espermatozoides nessa solução devido a sua alta toxicidade (OLIVEIRA, 2012). 23

Stoss e Donaldson (1982) relatam em seus estudos que os fatores que determinam o sucesso da técnica de refrigeração é a redução da temperatura, o fornecimento e a troca de gases com o meio, a prevenção do desenvolvimento bacteriano e da dessecação. Com isso, a refrigeração seminal é possível, mas avaliações devem ser realizadas nos diluentes e nas condições de estocagem, pois isso associado ao tempo de armazenamento pode interferir na qualidade seminal, uma vez que as condições anaeróbicas unidas a contaminação microbiana diminuem a motilidade e a viabilidade espermática (RURANGWA et al., 2004). Estudos sobre a conservação do sêmen de P. lineatus, demonstraram que o sêmen não diluído, quando refrigerado a 6-8 °C, permanece viável por até dois dias. Sendo isso considerado fora das expectativas, devido a fatores que podem fazer com que a motilidade chegue 0% em pouco tempo, como o envelhecimento celular, competição por espaço e oxigênio e crescimento bacteriano (VIVEIROS et al., 2014). Na literatura, podem ser encontrados estudos sobre a refrigeração seminal por meio da utilização de glicose, como diluente. Órfão et al. (2010) relatam que o sêmen de P. lineatus quando diluído em glicose apresentou 26% de motilidade espermática após quatro dias de refrigeração. Oliveira (2006) encontrou em seus estudos, uma motilidade média de 30% no sêmen de dourado (Salminus maxillosus) quando refrigerado por 48 horas no diluente supracitado. Poucas pesquisas sobre refrigeração seminal envolvem o ACP-104 como diluente, existindo apenas estudos com P. lineatus (VIVEIROS et al., 2014) e Colossoma macropomum (OLIVEIRA, 2012). Para P. lineatus e C. macropomum após dois dias de refrigeração, observou-se 20% e 31% de motilidade, respectivamente.

3 JUSTIFICATIVA

O P. brevis possui potencial econômico e importância ecológica na região nordeste do Brasil, principalmente por sua ova ser considerada o “caviar do sertão”. Entretanto, em virtude da pesca predatória que antecede a desova, o curimatã encontra-se como uma das espécies com sobrevivência ameaçada. Estudos com resultados satisfatórios já foram observados envolvendo a criopreservação e resfriamento seminal da espécie, com protocolos de criodiluentes já testados e que possuem um certo sucesso na viabilidade seminal após a descongelação. No entanto, a viabilidade seminal após a descongelação não garante uma boa motilidade espermática, sendo um grande impasse para programas de fertilização in vitro. Além do mais, o sêmen submetido às diferentes técnicas pode responder de forma diferente aos ativadores. Diante disso, procedimentos que visem a melhora da motilidade espermática podem ser positivos para o melhoramento de técnicas de reprodução in vitro da espécie, como determinação de soluções ativadoras espermáticas adequadas. Portanto, faz-se necessário o aprofundamento de estudos sobre as composições, concentrações e quais melhores soluções devem ser empregadas como ativadores da motilidade espermática em curimatã. Para isso, é preciso investigar qual melhor osmolalidade a ser utilizada nos ativadores seminais, tais como água de coco em pó (ACP- 104), frutose e cloreto de sódio (NaCl) que garantam uma melhor cinética e duração da motilidade espermática de P. brevis.

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA

A cinética espermática, após a refrigeração e após a descongelação, de P. brevis é influenciada pelo ativador e osmolalidade do meio, havendo interação entre essas variáveis. Sendo o ACP-104 a 100 mOsm kg-1 o ativador mais adequado para o sêmen de P. brevis.

5 OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GERAL:

Avaliar o efeito de três soluções ativadoras, em diferentes osmolalidades, sobre a ativação da motilidade espermática do sêmen in natura, resfriado e criopreservado de P. brevis.

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

• Avaliar morfologia e integridade de membrana do sêmen in natura, resfriado e criopreservado de P. brevis; • Testar ACP-104, Frutose e NaCl como soluções ativadoras, em diferentes osmolalidades (100, 160 e 220 mOsm kg-1) sobre a ativação espermática do sêmen in natura, resfriado e criopreservado de P. brevis; • Analisar a cinética espermática e duração da motilidade, de P. brevis utilizando diferentes ativadores; • Definir a melhor solução ativadora e a osmolalidade ideal para a ativação da motilidade espermática do sêmen in natura, resfriado e criopreservado de P. brevis.

6 CAPÍTULO 1

THE OSMOLALITY OF DIFFERENT ACTIVATING SOLUTIONS INFLUENCES MOTILITY DURATION AND KINETICS OF FRESH, COOLED AND CRYOPRESERVED Prochilodus brevis SPERMATOZOA

Submetido ao Periódico: Animal Reproduction Science em 07/11/2019. Qualis A2 – Medicina Veterinária. Fator de impacto: 1.817. 28

The osmolality of different activator solutions influences motility duration and

kinetics of fresh, cooled and cryopreserved Prochilodus brevis spermatozoa

Yasmim Maia Ferreira*a, Renata Vieira do Nascimentoa, Vanessa Alves Pereiraa,

Priscila Silva de Almeida-Monteiroa, Mayara Setúbal Oliveira Araújoa, Edna Raquel

Paiva Teodoziaa, Assis Rubens Montenegrob, Carminda Sandra Brito Salmito-

Vanderleyc & José Ferreira Nunesc

a Postgraduate Program in Veterinary Science, Biotechnology Laboratory of Fish

Reproduction, Universidade Estadual do Ceará, UECE, Fortaleza, CE, Brazil.

bNortheast Biotechnology Network (RENORBIO), Universidade Estadual do Ceará,

UECE, Fortaleza, CE, Brazil

c Veterinary Medicine School, Universidade Estadual do Ceará, UECE, Fortaleza, CE,

Brazil.

Corresponding author: Postgraduate Program in Veterinary Science, Universidade

Estadual do Ceará, UECE, Silas Munguba Avenue, 1700, Fortaleza, CE, Brazil

E-mail: [email protected] (Y.M. Ferreira)

ABSTRACT

Prochilodus brevis is a rheophilic fish species of economic and ecological importance.

However, anthropic actions have made its population vulnerable; therefore, it is necessary conducting studies about its reproductive biology to help improving its reproduction in captivity. The aim of the current study is to evaluate osmolality effects (100, 160 and 220 mOsm Kg-1) of activated solutions such as ACP-104, Fructose and NaCl on sperm kinetics and motility duration in fresh, cooled and thawed P. brevis semen. Fresh sperm samples were analyzed; subsequently, they were cooled and cryopreserved, based on 29 standardized methodology for this species. ACP-104 and NaCl (P >0.05) at 100 and 160 mOsm Kg-1 recorded satisfactory kinetic results for fresh semen, whereas NaCl recorded satisfactory kinetic results for cooled sperm at all three osmolality levels (P <0, 05). NaCl at 220 mOsm Kg-1 recorded the best results for thawed sperm (P <0.05). ACP-104 at 100 mOsm Kg-1 maintained longer sperm motility durations in semen subjected to the three experimental conditions adopted in the current study. It is possible concluding that fresh

P. brevis semen activated with ACP-104 or Fructose at low osmolality levels enables high sperm mobility rates. Cooled and thawed sperm can be activated with NaCl at higher osmolality levels. In addition, ACP-104 at 100 mOsm Kg-1 enables longer sperm mobility duration in fresh, cooled and cryopreserved semen.

Keywords: Characiforms; CASA; Osmotic pressure; Semen

Introduction

Global aquaculture expansion has encouraged studies about the reproductive biology of different aquatic species (Fish Yearbook BR, 2019), based on biotechniques such as cryopreservation and seminal cooling, which are valuable tools to help improving fish production and preserving genetic material in conservation programs (Carolsfeld et al., 2003). Thus, although the artificial fish reproduction technology is relatively advanced (Zaniboni-Filho and Weingartner, 2007), it is necessary conducting in-depth studies to help optimizing and standardizing such techniques.

Prochilodus brevis, also known as Brazilian bocachico, is a rheophilic fish species native to Brazilian Northeastern river basins, where it has great ecological importance because its detritivorous diet enables organic matter cycling in rivers (Taylor et al., 2006).

In addition, it has high economic potential because consumers appreciate its roe, which is regionally known as “backwoods caviar” (Bomfim et al., 2015; Costa et al., 2016). The 30 species is also socially important because its consumption is linked to artisanal fishing

(Costa et al., 2016); however, its survival may be affected by environmental factors and anthropic actions such as dam construction and predatory fishing (Moore et al., 2004;

Oliveira-Silva et al., 2018).

Important actions have already been taken to enable P. brevis cryopreservation

(freezing media, dilution and thawing rates; Lopes et al., 2014; Nunes et al., 2016) and semen cooling (dilution media and cooling time; Nascimento et al., 2017). Thus, sperm kinetics is the main parameter used to evaluate pre- and post-thaw semen quality, since it is directly associated with fertilization capacity and, consequently, it is a relevant criterion to be adopted for the successful reproduction of fish species (Viveiros et al., 2010).

P. brevis spermatozoa, like most teleosts, remain immobile in the male genital tract; they are activated after semen gets in contact with water in natural reproduction processes, or with an activator solution in the artificial reproduction ones (Cosson, 2004;

Viveiros et al., 2016). The main factor triggering sperm motility in freshwater fish lies on the contact with osmolality solution concentrations lower than that of seminal plasma, since the osmotic pressure induces the inflow of ions capable of activating cAMP and generates energy for sperm movement processes (Bernardes- Junior et al., 2018).

Thus, several activating solution types have already been tested to evaluate seminal quality in Characiforms; some of them are composed of salts such as NaCl, KCl,

NaHCO3 (Gonçalves et al., 2013; Carneiro et al., 2013), or of sugars such as Glucose and

Fructose (Martínez et al., 2011; Neumann et al., 2012; Gonçalves et al., 2013; Adames et al., 2015). These seminal activators have great impact on sperm motility when they are used at osmolality levels suitable for the species. Coconut water powder (ACPTM, ACP

Technological Services Ltd., ACP Biotechnology, Fortaleza, Ceará, Brazil) is a compound rich in salts, sugars and electrolytes, and it provides adequate nutrients for 31 sperm (Barros and Toniolli, 2011). Thus, fish-specific powdered coconut water (ACP-

104) is an innovative alternative to well-known activator solutions, since it provides energy to support motility during sperm activation processes.

However, the literature lacks studies about the use of activators at different osmolality levels in P. brevis semen. Thus, it is necessary taking into consideration that cooling, freezing and thawing processes can affect membrane permeability to the point that the osmolality range capable of triggering sperm motility can be changed (Viveiros et al., 2016). It is necessary investigating the way spermatozoa respond to different osmotic pressures generated by activating solutions to help better understanding sperm behavior and improving the efficiency of artificial reproduction techniques. Thus, the aim of the current study was to evaluate the effect of three activating solutions (NaCl, Fructose and ACP-104) at different osmolality levels (100, 160 and 220 mOsm Kg-1) on P. brevis sperm kinetics.

Materials and Methods

2.1 Activating media

NaCl (Vetec®), Fructose (Dinamica®) and ACP-104 (pH 8.02 - 310 mOsm Kg-

1) were used to prepare the activator solutions. Solutes were diluted in distilled water and prepared at 100, 160 and 220 mOsm Kg-1 osmolality levels. Samples were measured with the aid of an automatic osmometer (Micro-Osmomette, Precision Systems, USA).

2.2 Study site and animal selection

The experiment was carried out in February 2019 at the Fish Reproduction

Biotechnology Laboratory of Ceará State University (3 ° 47'36.2 "S; 38 ° 33'30.1" W) in

Fortaleza County, Ceará State, Brazil. The research project was approved by the animal 32 research ethics committee of Ceará State University (UECE), under protocol n. 9298138-

2018.

Animals were kept in 7100-L fiberglass tanks under constant aeration and fed on commercial feed containing 28% crude protein, on a daily basis – the feed was supplied at the rate of 3% live weight and divided into two daily meals.

2.3 Hypophysation and sperm collection

Selected animals (n = 24; 147.14 ± 38.71 g and 17.76 ± 5.58 cm) were hormonally induced to reproduce with application of two pituitary carp extract (EHC) doses (0.4 mg

EHC / kg body weight and 4.0 mg EHC / kg body weight) with an 8-hour interval between applications. Doses were delivered through intracellomatic applications at the basis of the pectoral fin; semen was collected 16 hours after the application of the second hormonal dose.

Before semen collection, each animal was sedated with clove oil-based solution

(Eugenol, Sigma-Aldrich®) at eugenol: absolute alcohol: tank water ratio of 1: 10: 10000.

Semen was collected in sterile 3-mL syringes, transferred to polyethylene tubes and kept in thermal box at 4 ºC, until sample processing time.

2.4 Pool Formation and Sperm Analysis

Eight pools were formed; individual aliquots of each pool were subjected to the following sperm analyses: kinetics, motility time, morphology and plasma membrane integrity.

Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) was conducted in the Sperm Class

Analyzer (SCA, Microptics - Barcelona - Spain, version 3.2) software, which was configured to evaluate fish sperm kinetics. A semen aliquot (1 µL) was deposited in a

Makler chamber and activated with 100 µL of nine activator solutions, namely: 1) NaCl

100 mOsm Kg-1; 2) NaCl 160 mOsm Kg-1; 3) NaCl 220 mOsm Kg-1; 4) Fructose 100 33 mOsm Kg-1; 5) Fructose 160 mOsm Kg-1; 6) Fructose 220 mOsm Kg-1; 7) ACP-104 100 mOsm Kg-1; 8) ACP-104 160 mOsm Kg-1; and 9) ACP-104 220 mOsm kg-1.

The following parameters were evaluated: total motility (%), curvilinear velocity

(VCL - μm s-1), straight line velocity (VSL - μm s-1) and mean path velocity (VAP - μm s-1) - the minimum number of 2000 spermatozoa was used in each analysis. Sperm motility duration was determined based on the time (expressed in seconds) between sperm activation and full sperm activity cessation (Aramli et al., 2013).

Semen samples were fixed in 4% formaldehyde citrate solution (1: 100; semen: fixative solution) and stained with Rose Bengal at dye: fixed semen ratio of 3:20 for sperm morphology analysis. Two slides per sample were prepared and 100 cells were evaluated in each slide with the aid of optical microscope (400x). Sperm classification was performed based on Miliorini et al., (2011).

Sperm membrane integrity was assessed based on the eosin-nigrosin staining method - one slide per sample was prepared at semen: eosin: nigrosin ratio of 1: 2: 2. Two hundred (200) spermatozoa were analyzed under light microscope (400x); colorless sperm had intact membrane, while red or pink stained sperm were considered with ruptured membrane.

2.5 Semen cryopreservation and cooling

Aliquots of the 8 previously formed pools were subjected to cooling and cryopreservation processes.

Samples were cooled for 48h using ACP-104 (Nascimento et al., 2017), cryopreserved based on the association between 5% Glucose and 10% DMSO, and thawed after 15 days (Nunes et al., 2016). The same seminal analyses were applied to both cooled and cryopreserved semen, as described for fresh semen.

2.6 Statistical analysis 34

Data were initially subjected to Shapiro-Wilk and Bartlett tests to check the normal distribution of residues and homoscedasticity, respectively. They underwent logarithmic transformation, whenever necessary, in order to fit the analysis of variance

(ANOVA), which was performed in the PROC GLM by SAS (2002), based on a completely randomized experimental design, at 3 x 3 factorial arrangement (activating solution x osmolality). Tukey test was used to compare means. Data were expressed as mean ± standard deviation of means, at 5% significance level.

Results

3.1 Sperm morphology and membrane integrity

Mean values recorded for fresh semen membrane integrity were 99.00 ± 0.03%

(intact membrane) and 92.43 ± 0.03% (spermatozoa presenting normal morphology).

Mean values recorded for cooled semen membrane integrity were 92.60 ± 0.03% and

92.60 ± 0.02% (normal spermatozoa). Means recorded for cryopreserved semen were

84.60 ± 0.02% (intact spermatozoa) and 84.90 ± 0.05% (normal spermatozoa).

3.2 Fresh sperm motility rate, duration and velocity

Fresh semen motility rate and duration parameters did not show interaction between activating solution and osmolality levels.

ACP-104 and NaCl enabled higher total motility indices (P <0.05) - 97.82 ±

1.45% and 97.01 ± 2.51%, respectively (Fig. 1). Fructose presented lower results (94.28

± 3.98%) than ACP-104 (P <0.05), but it did not differ from NaCl (P >0.05), regardless of the osmolality level. Osmolality level 100 mOsm Kg-1 recorded higher results of total motility (97.65 ± 1.99%) than the 220 mOsm Kg-1 one (95.23 ± 3.83%); however, osmolality level 160 mOsm Kg-1. 1 (96.36 ± 2.98%) did not differ from the other levels

(P >0.05; Fig. 1), regardless of the used activator. 35

ACP-104 enabled longer (99.59 ± 30.77 s) sperm motility duration (P <0.05) than

Fructose (82.35 ± 20.22 s) and NaCl (77.73 ± 12.68 s) activators, regardless of osmolality

(Fig. 2).

Sperm velocity has shown interaction between activating solutions and osmolality levels (Table 1). Thus, ACP-104 at 100 mOsm Kg-1 osmolality level presented better

VCL results than NaCl (P <0.05); however, neither ACP-104 nor NaCl results differed from that of Fructose (P >0.05). There was not difference between activators at 160 and

220 mOsm Kg-1 (P >0.05). Fructose at 100 mOsm Kg-1 recorded higher VCL results than

160 mOsm Kg-1 (P <0.05); however, VCL results recorded for these osmolality levels did not differ from that of 220 mOsm Kg-1.

ACP-104 at 100 mOsm Kg-1 recorded better VSL results (P <0.05) than the other activating solutions (Table 1), whereas ACP -104 at 160 and 220 mOsm Kg-1 osmolality levels did not differ from NaCl (P >0.05) - both ACP -104 and NaCl were superior to fructose. If one takes into consideration the adopted activator solutions, ACP-104 recorded similar results at 100 and 160 mOsm Kg-1 osmolality levels (P >0.05), whereas osmolality level 220 mOsm Kg-1, which recorded inferior results, did not differ from 160 mOsm kg-1. NaCl did not show significant differences among the osmolality levels tested in the current study. However, Fructose at 160 and 220 mOsm Kg-1 recorded lower results of VSL than 100 mOsm Kg-1 (P <0.05).

ACP-104 at 100 mOsm Kg-1 osmolality level recorded higher VAP results than

NaCl (P <0.05), as shown in Table 1; however, neither ACP-104 nor NaCl differed from

Fructose (P >0.05). Significant differences between activators were not observed at 160 and 220 mOsm Kg-1 osmolality levels (P >0.05). With respect to the used activator,

Fructose at 100 mOsm Kg-1 recorded higher VAP results than 160 mOsm Kg-1; results recorded for these two osmolality levels did not differ from that of 220 mOsm Kg-1. The 36 other activating solutions did not show significant difference (P >0.05) between the tested osmolality levels.

3.3 Cooled sperm motility rate, duration and velocity

Cooled semen has shown interaction between activators and osmolality levels in all kinetic and duration of sperm motility parameters (Table 2). NaCl enabled higher total motility results than the other activators in all tested osmolality levels (P <0.05). Activator solutions such as fructose and NaCl did not show significant differences (P >0.05) between osmolality levels; however, ACP-104 at 100 mOsm kg-1 osmolality level recorded higher values for total motility (P <0.05) than osmolality levels 160 and 220 mOsm Kg-1.

The different osmolality levels tested in the current study recorded superior VCL results for the NaCl activator (P <0.05). However, if one takes into consideration the tested activators, ACP-104 recorded superior results at osmolality levels 100 and 160 mOsm Kg-1 (P <0.05). Fructose at 100 mOsm Kg-1 presented better results (P <0.05) than at 160 mOsm Kg-1, whereas osmolality level 220 mOsm Kg-1 did not differ from the first two levels (P >0.05). Results recorded for the NaCl activator did not show significant differences (P >0.05) between osmolality levels.

NaCl at 100 mOsm Kg-1 osmolality level recorded higher VSL results than

Fructose (P <0.05), but it did not differ from ACP-104 (P >0.05). NaCl at 160 and 220 mOsm Kg-1 osmolality levels recorded better VSL results (P <0.05). With respect to activator solutions, ACP-104 at 100 and 160 mOsm Kg-1 osmolality levels recorded higher VSL than 220 mOsm Kg-1, whereas the other solutions did not show significant difference between osmolality levels (P >0.05).

NaCl at all tested osmolality levels presented higher VAP results (P <0.05) than the other activator solutions. ACP-104 at 100 mOsm Kg-1 recorded higher VAP results 37 than at 220 mOsm Kg-1 – results recorded for these two osmolality levels did not differ from that of 160 mOsm Kg-1. Fructose and NaCl did not show significant differences (P

>0.05) between osmolality levels.

ACP-104 at 100 mOsm Kg-1 osmolality level recorded longer sperm motility duration than the others (P <0.05), whereas ACP-104 at 160 mOsm Kg-1 did not differ from NaCl (P >0.05 ) - both ACP-104 and NaCl recorded longer sperm motility duration than fructose (P <0.05). There were not significant differences between activator solutions at 220 mOsm Kg-1 osmolality level. ACP-104 at 100 mOsm Kg-1 recorded longer sperm motility duration (P <0.05) than the other osmolality levels, whereas results recorded for Fructose at 100 mOsm Kg-1 did not differ from the ones observed for

Fructose at 220 mOsm Kg-1; NaCl at different osmolality levels did not present significantly different sperm motility duration results (P >0.05).

3.4 Frozen sperm motility rate, duration and velocity

Cryopreserved semen also showed interaction between activating solutions and osmolality levels in kinetic and duration of sperm motility parameters (Table 3). Total motility did not show significant difference between activating solutions at 100 mOsm

Kg-1. NaCl at 160 mOsm Kg-1 osmolality level recorded higher results than Fructose (P

<0.05) - neither NaCl nor Fructose differed from ACP-104 (P >0.05). NaCl at 220 mOsm

Kg-1 osmolality level recorded better results for total motilitythan the other activating solutions (P <0.05). The activating solutions tested in the current study did not show significant difference between osmolality levels (P >0.05).

VCL results did not show significant differences between activators at 100 and

160 mOsm Kg-1 osmolality levels (P >0.05). However, NaCl at 220 mOsm Kg-1 osmolality level recorded better VCL results than the other activators (P <0.05). ACP-

104 and Fructose did not present significant differences (P >0.05) in VCL results at 38 different osmolality levels. However, NaCl at 220 mOsm Kg-1 recorded higher VCL than at 100 mOsm Kg-1 (P <0.05) – these NaCl osmolality levels did not differ from the 160 mOsm Kg-1 one (P >0.05).

Fructose at 100 mOsm Kg-1 osmolality level recorded higher VSL and VAP results than NaCl (P <0.05) - results recorded for Fructose and NaCl did not differ from that of ACP-104 (P >0.05). Osmolality levels 160 and 220 mOsm Kg-1 did not show significant differences between activating solutions (P >0.05). The activating solutions did not show significant differences (P >0.05) between osmolality levels.

Activator solution ACP-104 at 100 mOsm Kg-1 osmolality level recorded longer sperm motility duration than NaCl (P <0.05) – these activator solutions did not significantly differ from Fructose (P >0.05). NaCl at 160 and 220 mOsm Kg-1 osmolality levels enabled longer sperm motility duration (P <0.05) than at 100 mOsm Kg-1. ACP-

104 and Fructose did not show significant differences between osmolality levels (P

>0.05).

Discussion

The current study was the first to report the influence of different activator solution osmolality levels on kinetic and sperm motility duration parameters in fresh, cooled and cryopreserved Prochilodus brevis semen. Results have shown that activator solutions at different osmolality levels can act differently depending on the adopted semen storage method.

Fish spermatozoa remain immobile in fish due to high seminal plasma ion concentrations; osmolality is the main factor for sperm activation (Viveiros et al., 2016).

Freshwater fish sperm motility is activated in hyposmotic medium in comparison to seminal plasma (Takai and Morisawa, 1995). Seminal osmolality in P. brevis reached 39

287.50 ± 26.51 mOsm kg-1 (Nunes et al., 2016); this value corroborates studies conducted with other freshwater fish species whose osmolality ranged from 230 mOsm Kg-1 to 346 mOsm Kg-1 (Dzyuba and Cosson, 2014).

The NaCl, Fructose and ACP-104 were tested in the current study as activator solutions at three different osmolality levels (100, 160 and 220 mOsm Kg-1); all solutions

(ionic and nonionic) at all tested osmolality levels induced P. brevis sperm motility.

Semen subjected to the herein adopted different conditions showed motility variations depending on the used activator: ACP-104 at lower osmolality levels was the best sperm activator for fresh semen, whereas NaCl at higher osmolality levels was the best activator for cooled and thawed semen. This variation can be explained by changes in membrane permeability, which may be affected by sperm freezing and thawing processes (Viveiros et al., 2016).

Studies focused on evaluating the use of different ionic compound osmolality levels (NaCl and NaHCO3 solutions) for sperm motility activation in some Characiform species have reported the best osmolality levels as follows: 180 mOsm Kg–1 for Brycon orthotaeniae (Melo and Godinho, 2006) and Brycon orbignyanus (Gonçalves et al.,

2013), and 280 mOsm Kg-1 for Brycon insignis (Shimoda et al., 2007), Colossoma macropomum (Carneiro et al., 2012) and Prochilodus lineatus (Gonçalves et al., 2013).

Similarly, sperm activation conducted with solutions based on organic compounds such as glucose and fructose triggers sperm motility at 180 mOsm Kg-1 osmolality level in B. orbignyanus (Gonçalves et al., 2013), at 265 mOsm Kg-1 in Megaleporinus obtusidens

(Bernardes-Junior et al., 2018) and at 310 mOsm Kg-1 in Prochilodus magdalenae

(Martínez et al., 2011).

Ion-free activator solutions such as fructose, glucose, sucrose and mannitol, at different osmolality levels, enabled sperm activation in fish species such as Esox lucius 40

(Alavi et al., 2009a), Barbus barbus (Alavi et al., 2009b ), Perca fluviatilis (Alavi et al.,

2010), Vimba vimba (Alavi et al., 2010), Brycon opalinus (Órfão et al., 2011), P. magdalenae (Martínez et al., 2011), B. orbignyanus (Gonçalves et al., 2013), Clinostomus elongatus (Butts et al., 2013), Rhamdia quelen (Adames et al., 2015) and P. lineatus

(Gonçalves et al., 2013; Viveiros et al., 2016). This outcome turns fructose, glucose, sucrose and mannitol into important activator solutions for fertilization processes in vitro.

Sperm velocity in fresh semen recorded better results when ACP-104 and Fructose at 100 mOsm Kg-1 were used in the current study. In contrast, Bernardes-Junior et al.

(2018) have compared NaCl to Fructose and found that both were ideal for M. obtusidens sperm activation. This outcome suggests that the action of activator solutions has species- specific influence.

The sperm plasma membrane is of fundamental importance for the spermatic cell because it has ion channels, aquaporins and receptors that regulate cellular activities and signaling pathways linked to sperm activation (Tabares et al., 2005; Dzyuba and Cosson,

2014). Cells subjected to high osmotic pressure can present ruptured membrane.

Extremely low osmolality solutions, such as distilled water (0 mOsm), lead to sperm flagella damage and immediate energy expenditure. Such energy expenditure decreases

ATP concentrations; consequently, it ceases sperm motility in a shorter period of time

(Cosson, 2004; Alavi et al., 2009a; Gonçalves et al., 2013). Moreover, extremely hyposmotic activator solutions should not be applied to semen, since spermatozoa exposed to extremely low osmolality levels experience plasma membrane damage due to rapid water influx (Cosson, 2010).

Freshwater teleosts present short sperm motility duration (Legendre et al, 1996;

Cosson et al., 1999), which can vary in other fish species, namely: 300 s in Salminus maxillosus, 612 s in P. lineatus (Koser et al., 1984) and 30 s in Oncorhynchus mykiss 41

(Perchec et al., 1993). The longest sperm mobility duration in the current study was observed when ACP-104 at 100 mOsm Kg-1 osmolality level was used, regardless of the semen condition. These satisfactory results may be associated with the complex ACP-

104 composition, which comprises amino acids, vitamins, minerals and electrolytes

(Nunes and Salgueiro, 2009; Carvalho et al., 2014). ACP-104 at low osmolality levels has the potential to provide enough power to enable spermatozoa to remain mobile for longer periods. In addition, ACP-104 has indole-3-acetic acid (IAA); studies have shown that IAA increases sperm motility in goat and sheep semen (Nunes and Salgueiro, 2009).

Besides, it has protective action on sperm cell and enables a larger number of spermatozoa with normal morphology (Azevedo et al., 1999).

The literature has already proven that solutions containing ions (K +, Na + and Ca

+ 2) at lower osmolality levels can increase sperm motility duration (Alavi et al., 2009).

With respect to activators used at high osmolality levels, the higher the osmolality level, the shorter the motility duration, as observed in P. lineatus (Felizardo et al., 2011;

Carvalho et al., 2014). Sperm motility duration plays a key role in fertilization processes, since sperm must find and penetrate the oocyte microbe before it is closed by hydration

(Coll-Morales, 1986).

Results in the present study open perspectives for further research focused on investigating the use of new activator solutions in fish semen. These studies can help improving the knowledge in the field, as well as validating the applicability of activator solution use in Prochilodus brevis fertilization in vitro, in order to improve fertilization outcomes and to assure good embryonic quality.

Conclusion 42

Fresh P. brevis semen can be activated with ACP-104 at 100 and 160 mOsm Kg-

1 osmolality levels, whereas cooled and cryopreserved semen can be activated with NaCl at 160 and 220 mOsm Kg-1. ACP-104 at 100 mOsm Kg-1 osmolality level is indicated to enable longer sperm motility duration under all seminal conditions.

Conflict of interest

The authors declare no conflict of financial, personal or institutional interest associated with the current study. The authors alone are responsible for manuscript content and writing.

Acknowledgment

The author would especially like to thank all the laboratory colleagues and co- authors who helped performing the study and writing the article. We express special gratitude towards ACP Biotechnology - UECE.

Funding

The authors are grateful to the Coordination for the Improvement of Higher

Education Personnel, for the financial support.

References

Adames, M.S., de Toledo, C.P.R., Neumann, G., Buzzi., 2015. Optimization of the sperm:

Oocyte ratio and sperm economy in the artificial reproduction of Rhamdia quelen

using fructose as a sperm motility modulator. Anim. Reprod. Sci. 161, 119–128.

https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2015.08.014

Alavi, S.M.H., Kozak, P., Hatef, A., Hamackova, J., Linhart, O., 2010. Relationships 43

between reproductive characteristics in male Vimba vimba L. and the effects of

osmolality on sperm motility. Theriogenology 74, 317–325.

https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2010.02.017

Alavi, S.M.H., Rodina, M., Policar, T., Linhart, O., 2009. Relationship between semen

characteristics and body size in Barbus barbus L. (Teleostei: Cyprinidae) and effects

of ions and osmolality on sperm motility. Comp. Biochem. Physiol. - A Mol. Integr.

Physiol. 153, 430–437. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2009.04.001

Barros, T.B., Toniolli, R., 2011. Potential use of coconut water in the semen technology.

Rev Bras Reprod Anim 35, 400–407.

Bernardes Júnior, J.J., Jimenez, J.E., Bombardelli, R.A., Nuñer, A.P. de O., 2018.

Changes in external osmolality and ionic composition affect Megaleporinus

obtusidens sperm motility. Anim. Reprod. Sci. 190, 63–74.

https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2018.01.008

Bezerra da Costa, R., de Abreu, K., Marques de Carvalho, M., 2016. Participação do

pescador(a) artesanal no policultivo da curimatã comum (Prochilodus cearaensis)

com tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). Rev. Bras. Hig. e Sanidade Anim.

RBHSA 10, 556–571. https://doi.org/10.5935/rbhsa.v10i3.337

Blume, H., Marques Jr, A. P., 1994. Evaluation of coconut water on the culture and

cryopreservation of mouse embryos. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.

18, p. 97-104.

Bomfim, A.C., Peretti, D., Camillo, C.S., Costa, S.A.G.L., Nascimento, R.S.S., 2015.

Reproductive Biology and Variations in the Gonadal Development of the Fish

Curimatã (Prochilodus brevis Steindachner, 1875) in Captivity. Biota Amaz. 5, 65–

70. https://doi.org/10.18561/2179-5746/biotaamazonia.v5n2p65-70

Butts, I.A.E., Alavi, S.M.H., Mokdad, A., Pitcher, T.E., 2013. Physiological functions of 44

osmolality and calcium ions on the initiation of sperm motility and swimming

performance in redside dace, Clinostomus elongatus. Comp. Biochem. Physiol. - A

Mol. Integr. Physiol. 166, 147–157. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2013.05.011

Carneiro, P.C.F., Azevedo, H.C., Santos, J.P., Maria, A.N., 2012. Cryopreservation of

tambaqui (colossoma macropomum) semen: Extenders, cryoprotectants, dilution

ratios and freezing methods. Cryo-Letters 33, 385–393.

Carolsfeld, J., Godinho, H.P., Zaniboni Filho, E., Harvey, B.J., 2003. Cryopreservation

of sperm in Brazilian migratory fish conservation. J. Fish Biol. 63, 472–489.

https://doi.org/10.1046/j.1095-8649.2003.00170.x

Carvalho, A.F.S., Machado, M.R.F., Andrade, E.S., Murgas, L.D.S., Zangeronimo, M.G.,

Barros, T.C., Paula, F.G., 2014. Effect of caffeine added to the activating solution

on sperm motility of fresh and thawed semen of pacu, piaractus mesopotamicus, and

curimba, prochilodus lineatus. J. World Aquac. Soc. 45, 75–81.

https://doi.org/10.1111/jwas.12091

Coll-Morales, J., 1982. Acuacultura Marina Animal.

Coser, A.M., Godinho, H., Ribeiro, D., 1984. Cryogenic preservation of spermatozoa

from Prochilodus scrofa and Salminus maxillosus. Aquaculture 37, 387–390.

https://doi.org/10.1016/0044-8486(84)90303-X

Cosson, J., 2010. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term

motility, portending their precocious decadence. J. Fish Biol. 76, 240–279.

https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.2009.02504.x

Cosson, J., Billard, R., Cibert, C., Dreanno, C., Suquet, M., 1998. Ionic factors regulating

the motility of fish sperm. 8th Int. Symp. Spermatol. 161–186.

Dzyuba, V., Cosson, J., 2014. Motility of fish spermatozoa: From external signaling to

flagella response. Reprod. Biol. 14, 165–175. 45

https://doi.org/10.1016/j.repbio.2013.12.005

Felizardo, V.O., Murgas, L.D.S., Navarro, R.D., Gonçalves, A.C.S., Paulino, M.S., 2010.

Osmolaridade e taxa de diluição na ativação do sêmen criopreservado de

Prochilodus lineatus. Arch. Zootec. 60, 1255–1262.

https://doi.org/10.21071/az.v60i232.4009

Gonçalves, A.C., Nascimento, A., Costa, A., Leal, M., Viveiros, A.T., 2013. Initiation

and s uppression of sperm motility is osmolality dependent in two South American

fish species: streaked prochilod (Prochilodus lineatus) and piracanjuba (Brycon

orbignyanus). Anim. Reprod. 10, 62–70.

Hadi Alavi, S.M., Rodina, M., Viveiros, A.T.M., Cosson, J., Gela, D., Boryshpolets, S.,

Linhart, O., 2009. Effects of osmolality on sperm morphology, motility and flagellar

wave parameters in Northern pike (Esox lucius L.). Theriogenology 72, 32–43.

https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2009.01.015

Legendre, M., Linhart, O., Billard, R., 1996. Spawning and management of gametes,

fertilized eggs and embryos in Siluroidei. Aquat. Living Resour. 9, 59–80.

https://doi.org/10.1051/alr:1996042

Lopes, J.T., Nunes, L.T., Almeida, P.S., Nascimento, R. V, Campello, C.C., 2015.

Avaliação de diferentes crioprotetores e taxas de diluição na criopreservação seminal

de Prochilodus brevis. Rev. Bras. Reprodução Anim. 38, 170–175.

Martínez, G., Víctor Atencio, G., Sandra Pardo, C., 2011. Effect of glucose concentration

on sperm motility activation in bocachico Prochilodus magdalenae (Pisces,

Characiformes). Rev. MVZ Cordoba 16, 2554–2563.

https://doi.org/10.21897/rmvz.1020

Miliorini, A.B., Murgas, L.D.S., Rosa, P.V., Oberlender, G., Pereira, G.J.M., Da Costa,

D.V., 2011. A morphological classification proposal for curimba (Prochilodus 46

lineatus) sperm damages after cryopreservation. Aquac. Res. 42, 177–187.

https://doi.org/10.1111/j.1365-2109.2010.02575.x

Moore, J.C., Berlow, E.L., Coleman, D.C., De Suiter, P.C., Dong, Q., Hastings, A.,

Johnson, N.C., McCann, K.S., Melville, K., Morin, P.J., Nadelhoffer, K., Rosemond,

A.D., Post, D.M., Sabo, J.L., Scow, K.M., Vanni, M.J., Wall, D.H., 2004. Detritus,

trophic dynamics and biodiversity. Ecol. Lett. 7, 584–600.

https://doi.org/10.1111/j.1461-0248.2004.00606.x

Nascimento, R.V., Leite-castro, L.V., Montenegro, A.R., Almeida-monteiro, P.S. De,

Ferreira, Y.M., Salmito-vanderley, C.S.B., 2017. Influência do tempo de

resfriamento e soluções diluentes sobre a congelabilidade do sêmen de Prochilodus

brevis. Acta Scie. Vet. 55, 1–9.

Neumann, G., 2012. Frutose como ativador e crioprotetor espermático do Surubim do

Iguaçu, (Steindachneridion melanodermatum). Monografía – Curso de Engenharia

de Pesca – Universidade Estadual do Oeste do Paraná, 38 pp.

Nunes, J.F., Clemente, C., Salgueiro, D.M., 2009. Utilização da Água de Coco como

Diluidor de Sêmen de Caprinos e Ovinos. Rev. Científica Produção Anim. 1.

https://doi.org/10.15528/7

Nunes, L.T., Oliveira, M.S., Lopes, J.T., De Souza, M.E.M., Pinheiro, R.R.R., Campello,

C.C., Vanderley, C.S.B.S., 2016. Cryopreservation of Prochilodus brevis semen:

Freezing media and thawing rates. Semin. Agrar. 37, 1643–1654.

https://doi.org/10.5433/1679-0359.2016v37n3p1643

Oliveira-Silva, L., Ramos, T.P.A., Carvalho-Rocha, Y.G.P., Viana, K.M.P., Avellar, R.

da C., Ramos, R.T. da C., 2018. Ichthyofauna of the mamanguape river basin,

Northeastern, Brazil. Biota Neotrop. 18. https://doi.org/10.1590/1676-0611-bn-

2017-0452 47

Orfão, L.H., Nascimento, A.F., Corrêa, F.M., Cosson, J., Viveiros, A.T.M., 2011.

Extender composition, osmolality and cryoprotectant effects on the motility of

sperm in the Brazilian endangered species Brycon opalinus (Characiformes).

Aquaculture 311, 241–247. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2010.11.041

Peixe, B. R., 2019. Anuário Peixe BR da piscicultura 2018. São Paulo: Associação

Brasileira de Piscicultura.

Perchec, P.G., Cosson,J., Billars, F.A., 1995. La motilité des spermatozoïdes de truite

(Oncorhynchus mykiss) et de carpe (Cyprinus carpio). Journal of Applied

Ichthyology. 9, 129–149. https://doi:10.1111/j.1439-0426.1993.tb00389.x

Shimoda, E., Andrade, D., Ricardo, D., Júnior, V.V., Yasui, S., 2007. osmolarity effects

on sperm motility of piabanha Brycon insignis.. Rev. Ceres 54, 430–433.

Tabares, C., Tarazona Morales, A., Olivera Ángel, M., 2005. Fisiología de la activación

del espermatozoide en peces de agua dulce. Rev. Colomb. Ciencias Pecu. 18, 149–

161.

Takai, H., Morisawa, M., 1995. Change in intracellular K+concentration caused by

external osmolality change regulates sperm motility of marine and freshwater

teleosts. J. Cell Sci. 108, 1175–1181.

Taylor, B.W., Flecker, A.S., Hall, R.O., 2006. Loss of a harvested fish species disrupts

carbon flow in a diverse tropical river. Science (80-. ). 313, 833–836.

https://doi.org/10.1126/science.1128223

Viveiros, A.T.M., Leal, M.C., França, T.S., Almeida, I.L.G., Isaú, Z.A., 2016. Osmolality

and composition of the activating solution affects motility of fresh and frozen

Prochilodus lineatus sperm differently. Anim. Reprod. Sci. 173, 73–79.

https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2016.08.014

Viveiros, A.T.M., Nascimento, A.F., Orfão, L.H., Isaú, Z.A., 2010. Motility and fertility 48

of the subtropical freshwater fish streaked prochilod (Prochilodus lineatus) sperm

cryopreserved in powdered coconut water. Theriogenology 74, 551–556.

https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2010.03.018

Zaniboni-Filho, E. and Weingartner, M. (2007). Técnicas de indução da reprodução de

peixes migradores. Rev. Bras. Rep. Ani. 31, 367-73.

Carvalho, M.A.M., Linhares, F.R.A., Nunes, J.F., 2010. Água de coco como diluente para

o sêmen de peixes de água doce de fertilização externa. Revista Brasileira de Higiene

e Sanidade Animal, v. 8, n. 4, p. 203-222.

Table and figure legends:

Fig 1. Percentage of motile fresh Prochilodus brevis sperm activated with ACP-104,

Fructose and NaCl at different osmolality levels. Different letters indicate significant differences (P < 0.05) between activator solutions and osmolality levels.

Fig 2. Sperm motility duration fresh in P. brevis sperm activated with ACP-104, Fructose and NaCl. Different letters indicate significant differences (P < 0.05) between activator solutions. 50

Table 1.

Motility rate and velocities (curvilinear = VCL, straight line = VSL, average path = VAP)

of fresh P. brevis sperm activated with ACP-104, Fructose and NaCl at 100, 160 and 220

mOsm Kg-1 osmolality levels. Data are expressed as mean ± standard deviation.

Parâmetro Solução ativadora Osmolalidade

100 mOsm Kg-1 160 mOsm Kg-1 220 mOsm Kg-1

ACP-104 144.03 ± 15.60Aa 123.46 ± 26.92Aa 128.91 ± 18.14Aa

VCL (µm s-1) Frutose 140.21 ± 16.08ABa 112.63± 31.03Ab 119.05 ± 15.53Aab

NaCl 116.73 ± 18.01Ba 124.75 ± 15.93Aa 118.42 ± 12.71Aa

ACP-104 76.69 ± 6.59Aa 66.49 ± 15.51Aab 61.32 ± 8.87Ab

VSL (µm s-1) Frutose 50.58 ± 6.65Ba 37.43 ± 10.20Bb 39.22 ± 6.23Bb

NaCl 52.00 ± 9.47Ba 55.43 ± 7.42Aa 58.41 ± 6.41Aa

ACP-104 123.46 ± 15.67Aa 93.71 ± 19.69Aa 106.77 ± 14.94Aa

VAP (µm s-1) Frutose 113.72 ± 12.32ABa 87.2125 ± 25.31Ab 93.79 ± 19.69Aab

NaCl 93.71 ± 19.69Ba 100.475 ± 13.77Aa 98.38 ± 12.50Aa

A'B indicates statistical difference between activators at the same osmolality level.

a'b indicates statistical difference between osmolality levels in the same activator.

Table 2.

Motility rate, velocities (curvilinear = VCL, straight line = VSL, average path = VAP) and motility duration of cooled P. brevis spermatozoa activated with ACP-104, Fructose and NaCl, at 100, 160 and 220 mOsm Kg-1 osmolality levels. Data are expressed as mean

± standard deviation.

Parâmetro Solução ativadora Osmolalidade

100 mOsm Kg-1 160 mOsm Kg-1 220 mOsm Kg-1

ACP-104 41.00 ± 7.78Ba 29.18 ± 7,79Bb 26.52 ± 6.97Cb

Motilidade (%) Frutose 36.86 ± 6.79Ba 30.23 ± 7,24Ba 34.37 ± 3.95Ba

NaCl 53.35 ± 7.41Aa 53.96 ± 6.19Aa 55.38 ± 7.97Aa

ACP-104 30.98 ± 3.53Ba 28.35 ± 7.34Ba 22.87 ± 6.15Bb

VCL (µm/s-1) Frutose 29.11 ± 3.63Ba 23.70 ± 8.67Bb 27.87 ± 3.79Bab

NaCl 42.70 ± 4.79Aa 44.72 ± 4.54Aa 41.72 ± 4.43Aa

ACP-104 11.71 ± 1.89ABa 11.35 ± 6,02Ba 6.45 ± 3.93Bb

VSL (µm/s-1) Frutose 10.28 ± 3.22Ba 6.53 ± 4,91Ba 8.75 ± 2.03Ba

NaCl 17.7 2 ± 3.30Aa 21.96 ± 4.88Aa 22.41 ± 5.79Aa

ACP-104 21.08 ± 3.44Ba 18.40 ± 6.44Bab 12.95 ± 5.98Bb

VAP (µm/s-1) Frutose 17.17 ± 4.49Ba 13.32 ± 8.48Ba 17.07 ± 3.84Ba

NaCl 30.00 ± 4.30Aa 32.37 ± 4.95Aa 29.81 ± 4.06Aa

ACP-104 125.74 ± 16.02Aa 81.27 ± 21.05Ab 75.44 ± 28.39Ab

Tempo (s) Frutose 69.35 ± 21.54Ba 56.39 ± 15.67Bb 68.80 ± 15.21Aa

NaCl 90.41 ± 19.89Ca 85.84 ± 14.22Aa 79.48 ± 10.45Aa

A'B indicates statistical difference between activators at the same osmolality level. a'b indicates statistical difference between osmolality levels in the same activator.

Table 3.

Motility rate, velocities (curvilinear = VCL, straight line = VSL, average path = VAP) and motility duration of frozen P. brevis sperm activated with ACP-104, Fructose and

NaCl, at 100, 160 and 220 mOsm Kg-1 osmolality levels. Data are expressed as mean ± standard deviation.

Parâmetro Solução ativadora Osmolalidade

100 mOsm Kg -1 160 mOsm Kg -1 220 mOsm Kg -1

ACP-104 40.37 ± 7,21Aa 38.23 ± 8.72ABa 33.00 ± 9.63Ba

Motilidade (%) Frutose 40.97 ± 9.15Aa 31.31 ± 6.64Ba 35.96 ± 4.40Bba

NaCl 36.15 ± 6.01Aa 42.30 ± 9.79Aa 43.68 ± 6.73Aa

ACP-104 29.28 ± 3.73Aa 29.20 ± 4.99Aa 25.45 ± 3.53Aa

VCL (µm/s-1) Frutose 32.33 ± 3.47Aa 29.15 ± 4.42Aa 29.96 ± 3.33Aa

NaCl 27.80 ± 2.27Ab 32.25 ± 5.64Aab 35.72 ± 3.86Ba

ACP-104 15.33 ± 4.39ABa 14.23 ± 4.96Aa 12.00 ± 7.16Aa

VSL (µm/s-1) Frutose 17.91 ± 3.36Aa 12.22 ± 3.70Aa 14.68 ± 2.82Aa

NaCl 11.53 ± 2.11Ba 14.31 ± 5.79Aa 14.9 ± 4.52Aa

ACP-104 20.77 ± 4.81ABa 20.01 ± 5.82Aa 15.21 ± 3.47Aa

VAP (µm/s-1) Frutose 24.33 ± 4.04Aa 18.72 ± 4.87Aa 20.96 ± 3.58Aa

NaCl 16.92 ± 2.33Ba 20.40 ± 6.433Aa 21.40 ± 4.80Aa

ACP-104 77.57 ± 5.95Aa 65.98 ± 10.8Aa 56.97 ± 23.45Aa

Tempo (s) Frutose 56.31 ± 6.64ABa 53.92 ± 18.47Aa 62.33 ± 11.26Aa

NaCl 39.48 ± 6.75Bb 61.21 ± 12.64Aa 73.07 ± 15.19Aa

A'B indicates statistical difference between activators at the same osmolality levels. a'b indicates statistical difference between osmolality levels in the same activator. 53

7 CONCLUSÃO

A partir dos resultados obtidos no presente estudo, conclui-se que o sêmen de curimatã comum (P. brevis) tem sua cinética influenciada pela solução ativadora utilizada. Além disso, nas condições nas quais este trabalho foi realizado, observou-se que houve interação dos ativadores e das osmolalidade, influenciando diretamente nas taxas de motilidade, velocidades e duração da motilidade. Sob as condições metodológicas empregadas, recomenda-se a ativação do sêmen in natura com ACP-104 ou NaCl a 100 ou 160 mOsm kg-1. Para o sêmen resfriado e criopreservado, indica-se o ativador NaCl a 220 mOsm kg-1. Para todas as condições seminais indica-se ACP-104 a 100 mOsm kg-1, por proporcionar uma maior duração da motilidade.

8 PERSPECTIVAS

Utilizar o conhecimento gerado a partir deste trabalho para otimizar o protocolo das técnicas de reprodução in vitro sugerido para a espécie, possibilitando o repovoamento de locais onde as populações de P. brevis encontram-se vulneráveis. Avaliar outros parâmetros indicadores da qualidade seminal pós-resfriamento e descongelação, como atividade mitocondrial e taxas de fertilização, a fim de verificar a viabilidade larval nos diferentes protocolos de ativação para sêmen in natura, resfriado e criopreservado. Realizar experimentos para aprofundar o conhecimento sobre os fatores bioquímicos da iniciação da motilidade espermática de P. brevis, bem como estudar amplas faixas de osmolalidades na ativação seminal P. brevis.

REFERÊNCIAS

ADAMES, M. S.; DE TOLEDO, C. P. R.; NEUMANN, G.; BUZZI, A. H.; BURATTO, C. N.; PIANA, P. A.; BOMBARDELLI, R. A. Optimization of the sperm: oocyte ratio and sperm economy in the artificial reproduction of Rhamdia quelen using fructose as a sperm motility modulator. Animal reproduction science, v. 161, p. 119- 128, 2015.

AGOSTINHO, A. A.; GOMES, L. C.; PELICICE, F. M. Ecologia e Manejo de Recursos Pesqueiros em Reservatórios do Brasil. Maringá: Eduem. p. 501, 2007.

AMANN, R. P.; KATZ, D. F. Andrology lab corner*: Reflections on casa after 25 years. Journal of andrology, v. 25, n. 3, p. 317-325, 2004.

ARAÚJO, Sandra Amaral. Variação temporal da frequência de captura e sazonalidade reprodutiva de Prochilodus cearensis Steindachener, 1911 (Characiformes, Prochilodontidae) no açude Itans, Caíco/RN. 1998. 86 f. Dissertação (Mestrado em Psicobiologia) - Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Rio grande do Norte, Natal, 1998.

AROUCHA, E. M. M.; VIANNI, R. Determinação de ácido ascórbico na água de coco (Cocos nucifera L.) por cromatografia líquida e pelo método titulométrico. Revista Ceres, v. 49, n. 283, p. 245-251, 2002.

AZEVEDO, D. M. M. R.; TONIOLLI, Ricardo. Água de coco estabilizada suplementada com antibióticos e ácido 3-indol acético na conservação de sêmen de caprinos marota. Ciência Animal, v. 9, n. 1, p. 37-42, 1999.

BARREIROS, R. C.; BOSSOLAN, G.; TRINDADE, C. E. P. Frutose em humanos: efeitos metabólicos, utilização clínica e erros inatos associados. Revista de Nutrição, p. 377-389, 2005.

BEDORE, A. G. Características criopreservação do sêmen de pacu-caranha (Piaractus mesopotamicus) e de piracanjuba (Brycon orbignyanus). 1999. 53 p. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular) - Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte.

BERNARDES JÚNIOR, J.J., JIMENEZ, J.E., BOMBARDELLI, R.A., NUÑER, A.P. DE O. Changes in external osmolality and ionic composition affect Megaleporinus obtusidens sperm motility. Anim. Reprod. Sci., v.190, p.63-74, 2018.

BILLARD, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reproduction Nutrition Développement, v. 26, n. 4, p. 877-920, 1986.

BILLARD, R.; COSSON, M. P. Some problems related to the assessment of sperm motility in freshwater fish. Journal of Experimental Zoology, v. 261, n. 2, p. 122-131, 1992.

BILLARD, R.; COSSON, J.; CRIM, L. W.; SUQUET, M. Sperm physiology and quality. BroodStock Management and Egg and Larval Quality. Eds: N.R. Bromage; R.J. Roberts, Blackwell Science, Oxford. pp. 25 – 52, 1995.

BLUME, H.; MARQUES JR, A. P. Avaliação da água de coco no cultivo e criopreservação de embriões murídeos. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 18, p. 97-104, 1994.

BOBE, J.; LABBÉ, C. Egg and sperm quality in fish. General and comparative endocrinology, v. 165, n. 3, p. 535-548, 2010.

CAJADO, Francisco José Lopes. Utilização do extrato liofilizado de palma forrageira gigante, (Opuntia ficus indica) e água de coco em pó (ACP-104) para a criopresevação do sêmen de curimatã (Prochilodus brevis). 2014. 101 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Rede Norte e Nordeste de Biotecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014.

CARNEIRO, P. C. F.; AZEVEDO, H. C.; SANTOS, J. P.; MARIA, A. N. Cryopreservation of tambaqui (Colossoma macropomum) semen: extenders, cryoprotectants, dilution ratios and freezing methods. CryoLetters, v. 33, n. 5, p. 385- 393, 2012.

CAROLSFELD, J.; HARVEY, B. J. Conservação de recursos genéticos em peixes: teoria e prática. Tradução de H. P. Godinho. Victória, Canadá: World Fisheries Trust, 1999. p. 47. (Curso de Treinamento Brasileiro).

CAROLSFELD, J.; GODINHO, H. P.; ZANIBONI-FILHO, E.; HARVEY, B. J. Cryopreservation of sperm in Brazilian migratory fish conservation. Journal of Fish Biology, n. 63. p. 472–489, 2003.

CARVALHO, M. A. M.; LINHARES, F. R. A.; NUNES, J. F.; DE MELO- SALGUEIRO, C. C.; DA COSTA, R. B.; DE OLIVEIRA-SALES, R. Água de coco como diluente para o sêmen de peixes de água doce de fertilização externa. Revista Brasileira de Higiene e Sanidade Animal, v. 8, n. 4, p. 203-222, 2014.

CHAMBEYRON, Francois; ZOHAR, Yonathan. A diluent for sperm cryopreservation of gilthead seabream, Sparus aurata. Aquaculture, v. 90, n. 3-4, p. 345-352, 1990.

CHELLAPPA, S.; BUENO, R. M. X.; CHELLAPPA, T.; CHELLAPPA, N. T.; VAL, V. M. F. A. Reproductive seasonality of the fish fauna and limnoecology of semi-arid Brazilian reservoirs. Limnologica, v. 39, n. 4, p. 325-329, 2009.

CIERESZKO, A.; DIETRICH, G. J.; NYNCA, J.; LISZEWSKA, E.; KAROL, H.; DOBOSZ, S. The use of concentrated extenders to improve the efficacy of cryopreservation in whitefish spermatozoa. Aquaculture, v. 408, p. 30-33, 2013.

COSSON, J.; BILLARD, R.; CIBERT, C.; DRÉANNO, C.; SUQUET, M. Ionic factors regulating the motility of fish sperm. The male gamete: from basic science to clinical applications, p. 161-186, 1999.

COSSON, Jacky. The ionic and osmotic factors controlling motility of fish spermatozoa. Aquaculture International, v. 12, p. 69–85, 2004.

CRUZ, Vânia Lúcia Bicalho. Criopreservação de sêmen de curimbatá (Prochilodus lineatus =scrofa) (Characiformes, Prochilodontidade). 2001. 59 p. Dissertação (Mestrado em Zoologia) - Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, Belo Horizonte.

DOURADO, Odio Freire. Principais peixes e crustáceos dos açudes controlados pelo DNOCS. Fortaleza, Convênio SUDENE/DNOCS, 1981. 40p.

FELIZARDO, V. O.; MURGAS L. D. S.; NAVARRO R. D.; GONÇALVES A. C. S.; PAULINO, M. S. Osmolaridade e taxa de diluição na ativação do sêmen criopreservado de curimba (Prochilodus lineatus). Archivos de zootecnia, v. 60, n. 232, p. 1255-1262, 2011.

FISHBASE, 2018. Anuário Peixe BR da piscicultura 2018. São Paulo: Associação Brasileira de Piscicultura.

FONTENELE, O. Contribuição para o conhecimento da biologia da Curimatã pacu, Prochilodus argenteus Spix in Spix & Agassiz (Pisces: Characidae, Prochilodontinae). Coletânea de Trabalhos Técnicos. Pesca e Piscicultura. Ministério do Interior. DNOCS. p. 215-231, 1982.

GODINHO, Hugo Pereira. Criopreservação de sêmen de peixes. Informe Agropecuária, Belo Horizonte, v. 21, n. 203, p.16-20, mar./abr. 2000.

GODINHO, Hugo Pereira. Estratégias reprodutivas de peixes aplicadas à aquicultura: bases para o desenvolvimento de tecnologias de produção. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 31, n. 3, p. 351-360, 2007.

GONÇALVES, A. C. S.; NASCIMENTO, A. F.; COSTA, A. C.; LEAL, M. C.; VIVEIROS, A. T. M. Initiation and suppression of sperm motility is osmolality dependent in two South American fish species: streaked prochilod Prochilodus lineatus and piracanjuba Brycon orbignyanus. Animal Reproduction, v. 10, n. 1, p. 62-70, 2013.

GURGEL, L. L.; VERANI, J. R.; CHELLAPPA, S. Reproductive ecology of Prochilodus brevis an endemic fish from the semiarid region of Brazil. The Scientific World Journal (Ecology Domain). p. 1-7, 2012.

GWO, J. P.; JARDINE, P. M.; WILSON, G. V.; YEH, G. T. A multiple-pore-region concept to modeling mass transfer in subsurface media. Journal of Hydrology, v. 164, n. 1-4, p. 217-237, 1995.

GWO, H. H.; WENG, T. S.; FAN, L. S.; LEE, Y. H. Development of cryopreservation procedures for semen of Pacific bluefin tuna Thunnus orientalis. Aquaculture, v. 249, n. 1, p. 205-211, 2005.

INGERMANN, R. L.; SCHULTZ, C. L. F.; KANUGA, M. K.; WILSON-LEEDY, J. G. Metabolism of motile zebrafish sperm. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, v. 158, n. 4, p. 461-467, 2011.

ISAÚ, Ziara Aparecida. População bacteriana, motilidade espermática e fertilidade de semen de piracanjuba Brycon orbignyanus (VALENCIENNES, 1849) submetido ao resfriamento. 2006. 95 f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) - Universidade Federal de Lavras, Minas Gerais, 2006.

JIMÉNEZ-SEGURA, L. F.; PALACIO, J; LEITE, R. River flooding and reproduction of migratory fish species in the Magdalena River basin, Colombia. Ecology of Freshwater Fish, v. 19, p. 178–186, 2010.

JÚNIOR, J. J. B.; JIMENEZ, J. E.; BOMBARDELLI, R. A.; de OLIVEIRA NUÑER, A. P. Changes in external osmolality and ionic composition affect Megaleporinus obtusidens sperm motility. Animal reproduction science, v. 190, p. 63-74, 2018.

NELSON, J. S., Fishes of theWorld, JohnWiley & Sons, New York, NY, USA, 1994.

LAHNSTEINER, F.; PATZNERL, R. A.; WEISMANN, T. Monosaccharides as energy resources during motility of spermatozoa in Leuciscus cephalus (Cyprinidae, Teleostei). Fish Physiol and Biochem, v. 10. p. 283–89, 1992.

LAHNSTEINER, Franz; CABERLOTTO, Stefano. Motility of gilthead seabream Sparus aurata spermatozoa and its relation to temperature, energy metabolism and oxidative stress. Aquaculture, v. 370, p. 76-83, 2012.

LEITE, L. V.; DE OLIVEIRA, F. D. C. E.; NUNES L. T.; NUNES, J. F.; SALMITO- VANDERLEY, C. S. B. Criopreservação de sêmen de tambaqui (colossoma macropomum) com ACP® adicionado de gema de ovo. Revista Brasileira de Engenharia de Pesca, v. 6, n. 2, p. 23-29, 2012.

LINHART, O.; BILLARD, R.; PROTEAU, J. P. Cryopreservation of European catfish (Silurus glanis L.) spermatozoa. Aquaculture, Amsterdam, v. 115, n. 3/4, p. 347-359, Sept. 1993.

LOPES, J. T.; PINHEIRO, J. P. S.; NUNES, L. T.; PINHEIRO, R. R. R.; SOUZA, M. E. M.; ALMEIDA, P. S.; NASCIMENTO, R. V.; CAMPELLO, C. C.; SALMITO- VANDERLEY, C. S. B. Avaliação de diferentes crioprotetores e taxas de diluição na criopreservação seminal de Prochilodus brevis. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 38, n. 3, p. 170-175, 2014.

MARIA, Alexandre Nizio. Diluidores e crioprotetores no resfriamento e congelamento do sêmen de Piracanjuba (Brycon orbignyanus). 2005. 71 f. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG, 2005.

MARTÍNEZ, J. G.; TARAZONA-MORALES, A. M.; PARDO-CARRASCO, S. C. Sperm cryopreservation of freshwater fish bocachico (Prochilodus magdalenae) in 59

DMSO and glucose and its effects on fertilization and hatching efficiency. Animal Reproduction, v. 9, p. 19-26, 2012.

MELO, Mônica Aline Parente. Água de coco em pó (ACP-104) adicionada de crioprotetores sobre a morfometria da cabeça de espermatozoides de pirapitinga (Piaractus brachypomus) pós-descongelamento. 2010. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) - Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CE, 2010.

MILIORINI, A. B.; MURGAS, L. D. S.; PEREIRA, G. J. M. Taxas de fertilização do sêmen de curimba (Prochilodus lineatus) após congelamento. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL, 16., 2005, Goiânia, Goiás. Resumos… Goiânia, Goiás: Colégio Brasileiro de Reprodução Animal, 2005.

MILIORINI, Aléssio Batista. Ativadores e concentrações de metanol e dimetilsulfóxido na qualidade do sêmen criopreservado de curimba (Prochilodus lineatus). Unpublished Master's Degree Dissertation, Universidade Federal de Lavras, Lavras, 99p. 2006.

MILIORINI, A. B.; MURGAS, L. D. S.; ROSA, P. V.; OBERLENDER, G.; PEREIRA, G. J. M.; DA COSTA, D. V. A morphological classification proposal for curimba (Prochilodus lineatus) sperm damages after cryopreservation. Aquaculture Research, v. 42, n. 2, p. 177-187, 2011.

MINS, S. D.; TSVETKOVA, L. I.; BROWN, G. G. Cryopreservation of sperm of sturgeon and paddlefish. In: TIERSCH, T. R.; MAZIK, P. M. (Ed.) Cryopreservation in Aquatic Species. Lousiana: World Aquaculture Society, Baton Rouge, 2000. p.123- 129.

MORISAWA, M.; SUZUKI, K.; SHIMIZU, H.; MORISAWA, S.; YASUDA, K. Effect of osmolality and potassium on motility of spermatozoa from freshwater cyprinid fishes. Journal of Experimental Biology, v. 107, n. 1, p. 95-103, 1983.

MORISAWA, Sachiko. Fine structure of micropylar region during late oogenesis in eggs of the hagfish Eptatretus burgeri (Agnatha). Development, growth & differentiation, v. 41, n. 5, p. 611-618, 1999.

MURGAS, L. D. S.; FRANCISCATTO, R. T.; SANTOS, A. G. O. Avaliação espermática pós-descongelamento em piracanjuba (Brycon orbignyanus, Vallenciennes, 1849). Revista Brasileira de Zootecnia, v. 32, n. 6, p. 1810-1814, 2003.

MURGAS, L. D. S.; MILIORINI, A. B.; FRANCISCATTO, R. T.; MARIA, A. N. Viabilidade espermática do sêmen de Piracanjuba (Brycon orbignyanus) resfriado a 4ºC. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 33, n. 6, p. 1361-1365, 2004.

MURGAS, L. D. S.; MILIORINI, A. B.; FREITAS, R. T. F.; PEREIRA, G. J. M. Criopreservação do sêmen de curimba (Prochilodus lineatus) mediante adição de diferentes diluidores, ativadores e crioprotetores. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 36, n. 3, p. 526-531, 2007.

NAKATANI, H. K.; AGOSTINHO, A. A.; BAUMGARTNER, G.; BIALETZKI, A.; SANCHES, P. V.; MAKRAKIS, M. C.; PAVANELLI, C. S. Ovos e larvas de peixes de 60

água doce: desenvolvimento e manual de identificação. Maringá. EDUEM, p. 378, 2001.

NASCIMENTO, A. F.; MARIA, A. N.; PESSOA, N. O.; CARVALHO, M. A. M; VIVEIROS, A. T. M. Out-of-season sperm cryopreservation in different media of the Amazonian freshwater fish pirapitinga (Piaractus brachypomus). Animal Reprodution Science, v. 118, p. 324-329, 2010.

NASCIMENTO, M. M.; NASCIMENTO, W. S.; CHELLAPPA, N. T.; CHELLAPPA, S. Biologia reprodutiva do curimatã comum, Prochilodus brevis (Characiformes: Prochilodontidae) no açude Marechal Dutra, Rio Grande do Norte, Brasil. Biota Amazônia, n. 2, p. 31 – 43, 2012.

NASCIMENTO, R. V.; LEITE-CASTRO, L. V.; MONTENEGRO, A. R.; OLIVEIRA- ARAÚJO, M. S.; LOPES, J. T.; DE ALMEIDA-MONTEIRO P. S.; FERREIRA, Y. M.; SALMITO-VANDERLEY, C. S. B. Influência do tempo de resfriamento e soluções diluentes sobre a congelabilidade do sêmen de Prochilodus brevis. Acta Scientiae Veterinariae, v. 45, p. 1-9, 2017.

NELSON, J. S., Fishes of theWorld, JohnWiley & Sons, New York, NY, USA, 1994.

NEUMANN, Giovano. Frutose como ativador e crioprotetor espermático do Surubim do Iguaçu (Steindachneridion melanodermatum). 2012. Monografia – Curso de Engenharia de Pesca – Universidade Estadual do Oeste do Paraná, 38p, 2012.

NUNES, L. T.; OLIVEIRA, M. S.; LOPES, J. T.; SOUZA, M. E. M.; PINHEIRO, R. R. R.; CAMPELLO, C. C.; SALMITO-VANDERLEY, C. S. B. Cryopreservation of Prochilodus brevis semen: freezing media and thawing rates. Semina. Ciências Agrárias (Online), v. 37, p. 1643-1653, 2016.

OLIVEIRA, Alexmiliano Vogel de. Resfriamento e criopreservação do sêmen de dourado Salminus maxillosus e de pirapitinga Brycon nattereri. 2006. 94 f. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG, 2006.

OLIVEIRA, Fátima de Cássia Evangelista de. Resfriamento do sêmen de Colossoma macropomum em água de coco em pó (ACP-104) associada à crioprotetores - estudo de toxicidade. 2012. 66 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) - Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, 2012.

ORFÃO, L. H.; MARIA, A. N.; NASCIMENTO, A. F.; ISAÚ, Z. A.; VIVEIROS, A. T. M. Sperm fertility of the subtropical freshwater streaked prochilod Prochilodus lineatus (Characiformes) improved after dilution and cold storage. Aquaculture Research, v. 41, p. 679–687, 2010.

PINHEIRO J. P. S.; MELO-MACIEL M. A. P.; LINHARES F. R. A.; LOPES J. T.; ALMEIDA-MONTEIRO P. S.; PINHEIRO R. R. R.; SALMITO-VANDERLEY, C. S. B. Use of glucose or BTS™ combined with DMSO or methylglycol under two different freezing protocols for the cryopreservation of sperm from the common curimatã (Prochilodus brevis). Animal Reproduction, v. 13, n. 4, p. 779-786, 2016. 61

PSENICKA, M.; DIETRICH, G.J.; WOJTCZAK, M.; NYNCA, J.; RODINA, M.; LINHART, O.; COSSON, J.; CIERESZKO, A. Acrosome staining and motility characteristics of sterlet spermatozoa after cryopreservation with use of methanol and DMSO. Cryobiology, v. 56, n. 3, p. 251-253, 2008.

RAVINDER, K.; NASARUNDDIN, K.; MAJUMDAR, K. C.; SHIVAJI, S. Computerized analysis of motility, motility patterns and motility parameters of spermatozoa of carp following short-term storage of semen. Journal of Fish Biology, London, v. 50, n. 6, p. 1309-1328, June 1997.

RIGAU, T. FARRÉ, M.; BALLESTER, J.; MOGAS, T.; PEÑA, A.; RODRÍGUEZ- GIL, J. E. Effects of glucose and fructose on motility patterns of dog spermatozoa from fresh ejaculates. Theriogenology, v. 56, n. 5, p. 801-815, 2001.

ROBLES, V.; CABRITA, E.; CUÑADO, S.; HERRAÉZ, M. P. Sperm cryopreservation of sex-reversed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): parameters that affect its ability for freezing. Aquaculture, v. 224, n. 1-4, p. 203-212, 2003.

ROSA, R. S.; MENEZES, N. A.; BRITSKI, H. A.; COSTA, W. J. E. M.; GROTH, F. Diversidade, padrões de distribuição e conservação dos peixes da caatinga. Ecologia e Conservação da Caatinga. Recife. Editora Universitária da Universidade Federal de Pernambuco, p.135-181, 2005

RURANGWA, E.; KIME, D. E.; OLIVEIRA, F.; NASH, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture, v. 234, n. 1, p. 1- 28, 2004.

SALMITO-VANDERLEY, C. S. B.; VIEIRA, M. J. A. F.; LEITE, L. V.; OLIVEIRA, F. C. E.; LINHARES, F. R. A.; SALGUEIRO, C. C. M.; NUNES, J. F. Meios de congelação para conservação de sêmen de peixes da família Characidae. Ciência Animal, v. 22, n. 1, p. 255-268, 2012.

SALMITO-VANDERLEY, C. S. B.; PINHEIRO, J. P. S.; ALMEIDA, P. S.; LOPES, J. T.; LEITE, L. V. Metodologias para criopreservação e mecanismos de avaliação do sêmen de peixes Characiformes. Acta Veterinaria Brasilica, v. 8, n. 2, p. 343-350, 2014.

SHIMODA, Eduardo. Análise e criopreservação do sêmen da piabanha Brycon insignis Steindachner, 1877 (Pisces, Characidae). 2004. 121 p. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes, RJ, Brasil, 2004.

SILVA, M. A.; PEIXOTO, G. C. X.; SANTOS, E. A. A.; CASTELO, T. S.; OLIVEIRA, M. F.; SILVA, A. R. Recovery and cryopreservation of epididymal sperm from agouti (Dasiprocta aguti) using powdered coconut water (ACP-109c) and Tris extenders. Theriogenology, v.76, p. 1084-1089, 2011.

SILVEIRA, W. F. F.; KAVAMOTO, E. T.; CESTAROLLI, M. A.; GODINHO, H. P.; RAMOS, S. M.; SILVEIRA, A. N. Avaliação espermática, preservação criogênica e 62 fertilidade do sêmen do pacu, Piaractus mesopotamicus (HOLMBERG, 1887), proveniente de reprodução induzida. Boletim Instituto de Pesca, São Paulo, v. 17, p. 1- 13, 1990. Único.

STOSS, Joachim; DONALDSON, Edward M. Preservation of fish gametes. In: International Symposium Reproduction Physiology Fish, 1982, Wageningen. Proceedings... Wageningen, 1982. p. 114-122.

TAITSON, P. F.; CHAMI, E.; GODINHO, H. P. Gene banking of the neotropical fish Leporinus obtusidens (Valenciennes, 1836): a protocol to freeze its sperm in the field. Animal reproduction science, v. 105, n. 3-4, p. 283-291, 2008.

TAKAI, Hiroyuki; MORISAWA, Masaaki. Change in intracellular K+ concentration caused by external osmolatity change regulates sperm motility of marine and freshwater teleosts. Journal of Cell Science, Cambridge, v. 108, n. 3, p. 1175-1181, Mar. 1995.

THUNDATHIL, J.; GIL, J.; JANUSKAUSKAS, A.; LARSSON, B.; SODERQUIST, L.; MAPLETOFT, R.; RODRÍGUEZ-MARTINEZ, H. Relationship between the proportion of capacitated spermatozoa present in frozen–thawed bull semen and fertility with artificial insemination, Journal of Andrology, v. 22, n. 6, p. 366-373, 1999.

VALDEBENITO, Nemesio I. Efecto de la Cafeína en la Motilidad y Fertilidad Espermática de Trucha Arcoiris (Oncorhynchus mykiss). Información tecnológica, v. 18, n. 2, p. 61-65, 2007.

VIEIRA, M. J. A. F. Caracterização do sêmen de tambaqui Colossoma macropomum (CUVIER, 1818) e criopreservação em diluente a base de água de coco em pó (ACP-104). 2010. 114f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) - Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, 2010.

VIVEIROS, A. T. M.; ORFÃO, L. H.; MARIA, A. N.; ALLAMAN, I. B. A simple, inexpensive and successful freezing method for curimba (Prochilodus lineatus) (Characiformes) sêmen. Animal Reproduction Science, Amsterdam, v. 105, n. 3-4, p. 283-291, Mar. 2008.

VIVEIROS, A. T. M.; NASCIMENTO, A. F.; ORFÃO, L. H.; ISAÚ, Z. A. Motility and fertility of the subtropical freshwater fish streaked prochilod (Prochilodus lineatus) sperm cryopreserved in powdered coconut water. Theriogenology, v.74, p.551-556, 2010.

VIVEIROS, A. T. M.; AMARAL, T. B.; ORFÃO, L. H.; ISAÚ, Z. A.; CANEPPEL, D.; LEAL, M. C. Sperm cryopreservation of tiete tetra Brycon insignis (Characiformes): effects of cryoprotectants, extenders, thawing temperatures and activating agents on motility features. Aquaculture Research, v. 42, p. 858-865, 2011.

VIVEIROS, A. T. M.; ORFÃO, L. H.; NASCIMENTO, A. F.; CORRÊA, F. M.; CANEPPELE, D. Effects of extenders, cryoprotectants and freezing methods on sperm quality of the threatened Brazilian freshwater fish pirapitinga-do-sul Brycon opalinus (Characiformes). Theriogenology, v. 78, n. 2, p. 361-368, 2012. 63

VIVEIROS, A. T. M.; TAFFAREL, T. R.; LEAL, MARCELO C. L. Osmolality and composition of the extender during the cold storage of Prochilodus lineatus (Characiformes: Prochilodontidae) sperm. Neotropical Ichthyology, v. 12, n. 3, p. 643- 648, 2014.

VIVEIROS, A. T. M.; NASCIMENTO, A. F.; LEAL, M. C.; GONÇALVES, A. C. S.; ORFÃO, L. H.; COSSON, J. Methyl glycol, methanol and DMSO effects on post-thaw motility, velocities, membrane integrity and mitochondrial function of Brycon orbignyanus and Prochilodus lineatus (Characiformes) sperm. Fish physiology and biochemistry, v. 41, n. 1, p. 193-201, 2015.

VIVEIROS, A. T.; LEAL, M. C.; FRANÇA, T. S.; ALMEIDA, I. L.; ISAÚ, Z. A. Osmolality and composition of the activating solution affects motility of fresh and frozen Prochilodus lineatus sperm differently. Animal reproduction science, v. 173, p. 73-79, 2016.

ZANIBONI-FILHO, E.; WEINGARTNER, M. Técnicas de indução da reprodução de peixes migradores. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 31, p. 367-373, 2007.