Methanobrevibacter Smithii

AIX-MARSEILLE UNIVERSITE FACULTE DE MEDECINE DE MARSEILLE ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE

THESE DE DOCTORAT Présentée par

Sory Ibrahima TRAORE

En vue de l'obtention du grade de D2&725$7G¶$,;-MARSEILLE UNIVERSITÉ Spécialité Pathologie Humaine

Etude de microbiote digestif Africain par culturomics et nouvelle technique d'isolement et de culture de Methanobrevibacter smithii

Soutenue le 2 Novembre 2018

COMPOSITION DU JURY

Mme le Professeur Florence Fenollar Président du jury Mr le Professeur Mahamadou Ali Théra Rapporteur Mr le Professeur Max Maurin Rapporteur Mr le Professeur Didier Raoult Directeur de thèse

MEPHI, Aix Marseille Université, IRD, IHU - Méditerranée Infection, 19-21 Boulevard Jean Moulin, 13005 Marseille Prof – Didier Raoult 2018 1

Avant-propos

Le format de présentation de cette thèse correspond à une recommandation de la spécialité Maladies Infectieuses et

Microbiologie du Master des Sciences de la Vie et de OD6DQWpTXL

GpSHQGGHO¶(FROH'RFWRUDOHGHV6FLHQFHVGHOD9LHGH0DUVHLOOH/H

FDQGLGDWest amené à respecter des règles qui lui sont imposées et qui comportent un format de WKqVHXWLOLVpGDQVOH1RUGGHO¶(XURSH

Ht qui permet un meilleur rangement que les thèses traditionnelles.

Par ailleurs, la partie introduction et bibliographie est remplacée par une revue publiée dans un journal scientifique afin de permettre une

évaluation extérieure de la qualité de la revue HW GH SHUPHWWUH j

O¶pWXGLDQW GH FRPPHQFHU OH SOXV W{W SRVVLEOH XQH bibliographie exhaustive sur le domaine de cette thèse. Par ailleurs, la thèse est présentée VXU DUWLFOH SXEOLp DFFHSWp RX VRXPLV DVVRFLp G¶XQ EUHI

FRPPHQWDLUH GRQQDQW OH VHQVgénéral du travail. Cette forme de présentation a paru plus en adéquation avec les exigences de la compétition internationale et permet de se concentrer sur des travaux qui EpQpILFLHURQWG¶XQHGLIIXVLRQLQWHUQDWLRQDOH

Prof. Didier Raoult 3

Dédicaces

Je dédie ce travail à : ¾ Mon père Lassana TRAORE qui nous a quitté le 21 décembre 2017. Face à toi je suis empli d’un sentiment d’humilité. Seul compte ton enthousiasme à vouloir propulser tes enfants. Dors en paix cher papa ! ¾ Professeur Ogobara K Doumbo qui nous a quitté le 9 juin 2018. Ce que je ressens pour vous est indicible. Vous avez laissé des empreintes à ma vie qui font que dans un souffle je vous appellerai toujours papa. Dors en paix Grand Professeur ! ¾ Ma mère, pour tout l’amour que j’ai pour toi, pour tous les sacrifices que tu as réalisés. Longue vie avec une parfaite sante ! ¾ Mes frères et sœurs, pour le regard que nous portons ensemble au delà de nos souffrances et de nos différends. Que nos différences ne nous séparent jamais ! ¾ Ma femme, pour sa patience et l’entente qu’elle cultive dans notre couple.

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier le Professeur Didier RAOULT qui, au delà de m’avoir donné l’opportunité de faire cette thèse, m’a assisté tout au long de ce travail, m’a relevé les nombreuses fois où j’ai trébuché. Ce travail est le résultat de votre patience et de votre souci constant d’accompagner vos

étudiants dans les bons comme les pires moments de leur formation. Vous avez forcé mon admiration pour vous à travers votre équité et votre amour pour science. C’est un grand honneur pour moi d’avoir évolué à vos côtés.

Je remercie le Professeur Florence FENOLLAR pour avoir accepté de présider ce jury de thèse.

Je remercie sincèrement le Professeur Max MAURIN et le

Professeur Mahamadou Ali THERA pour avoir accepté d’être les rapporteurs de ce travail.

Je remercie le Professeur Jean Christophe LAGIER pour son co-encadrement.

Ce travail a été possible grâce à la participation et au soutien de toute l’équipe culturomics.

Je remercie ainsi mes séniors : Docteur Saber Khelaifia,

Docteur Gregory Dubourg et Docteur Matthieu Million pour leurs conseils scientifiques et leur soutien durant toute cette thèse.

Mes remerciements vont également à l’endroit de mes collègues de travail: Amadou Togo, Melhem Bilen, Maxim

Descartes, Ami Diakité, Fatima Zaara, Pamela Afouda, Thao

Pam, Guillaume Durand, Aurélie Morand, Morgane Maihe,

Davidé Ricaboni, Sophie Amrane, El hadji Seck, Elodie

Guillot, Issa Isaac, Ngom, Camille Vales, Maryam Tidjiani

Alou, Khoudia Diop, Awa Diop, Sokhna Ndongo, Elodie

Neau, Sabrina Naud, Amael Fadlane . Merci à tous pour votre bonne collaboration.

Je remercie aussi le Professeur Pierre-Edouard Fournier pour sa gentillesse et sa sympathie.

Je remercie mes amis maliens de Marseille pour le soutien et l’entraide que nous cultivons : Adama Diarra, Aly Kodjo, Issa

Diarra, Cheick Khounta, Aminata Camara, Cheick Guindo,

Bamoussa Fofana, Abdoulaye Guindo, Elisabeth Sogodogo,

Ami Diakité, Mme Khounta, Amadou Togo.

Je remercie tout le personnel de l’IHU Méditerranée infection et l’URMITE, en particulier Valérie Filosa, qui m’a accueilli et soutenu durant mes premiers jours à Marseille. Francine Verin,

Fatma Zaourar, Annick, Veronick Roux. Merci aux ingénieurs de spectrométrie de mass Christophe, Carine, Philippe, Nicolas et Luc pour leur aide ainsi que Frédéric Cadoret et Claudia

Andrieu.

Merci à la fondation Méditerranée infection, à son directeur le

Pr. Didier RAOULT et à sa gestionnaire Micheline Pitaccolo pour le rôle d’une mère qu’elle nous remplit.

Sommaire

Résumé««««««««««««««««««««««««««««««« p.15

Abstract«««««««««««««««««««««««««««««««.p. 19

Introduction«««««««««««««««««««««««««««««S23

Chapitre 1 : Etude bibliographique du microbiote digestif humain africain....««.p.31

1.1.Etude du microbiote digestif humain Africain

Chapitre 2 : Etude du microbiote Africain par culturomics...... «««S53

2.1. Beduinella massiliensis, gen. nov., sp. nov. a new genus representing a new family in the phylum Firmicutes, and proposal of Beduinellaceae fam. nov.

2.2. Noncontiguous finished genome sequence and description of Bacillus andreraoultii strain SIT1T sp. nov.

Chapitre 3 : Isolement et culture de Methanobrevibacter smithii par co-culture avec des bactéries SURGXFWULFHVG¶K\GURJqQH ««««««««««««««««««p.75

3.1. Isolation and culture of Methanobrevibacter smithii by co-culturing with hydrogen producing bacteria

Conclusion««««««««««««««««««««««.«««««««....S95

Liste des références...... p.99

Annexe««««««««««««««««««««««...«««««««« S105

Résumé

/¶pWXGH GX PLFURELRWH GLJHVWLI D FRQQX XQ UHJDLQ G¶LQWpUrW au début des années 2000,

DYHF O¶DYqQHPHQW GHV WHFKQLTXHV PROpFXODLUHV HQ SDUWLFXOLHU OD métagénomique. La culturomics (culture microbienne à haut débit avec identification des colonies par

MALDI-TOF) a démontré sa complémentarité depuis 2010 en réduisant une partie des biais des méthodes moléculaires.

Dans la première partie de mon travail de thèse, M¶DLUpDOLVpXQHUHYXHGHODOLWWpUDWXUHVXU

OHVSULQFLSDOHVWHFKQLTXHVG¶pWXGHGXPLFURELRWHGLJHVWLIHWG¶DXWUHSDUWVXUO¶DQDO\VHGX

PLFURELRWH GHV VXMHWV G¶RULJLQH $IULFDLQH Les principales études de métagénomique réalisées sur des prélèvemenWV G¶RULJLQH $IULFDLQH ont révélé une augmentation de la biodiversité, avec en particulier une augmentation des Spirochaetes et des Prevotella

FKH]OHVVXMHWVG¶RULJLQH$IULFDLQHSDUUDSSRUWDX[VXMHWVRFFLGHQWDX[/HVpWXGHVSRUWDQW sur la malnutrition onW GpPRQWUp XQH UpGXFWLRQ GH O¶HQVHPEOH GHV EDFWpULHV HW HQ particulier des bactéries anaérobies et des archaea méthanogènes. Sur les 1162 bactéries

LVROpHVSDUpWXGHGHFXOWXURPLFVRQWpWpLVROpHVVHXOHPHQWGHSUpOqYHPHQWVG¶RULJLQH

DXWUH TXH G¶$IULTXH RQW pWp LVROpHV HQ FRPPXQ HW EDFWpULHV Q¶RQW pWp LVROpHV

TX¶jSDUWLUGHSUpOqYHPHQWVG¶RULJLQH$IULFDLQHGRQWQRXYHOOHVHVSqFHV

'DQVXQHVHFRQGHSDUWLHM¶DLH[SRVpPDSDUWLFLSDWLRQDXWUDYDLOGHFXOWXURPLFV qui a consisté HQ O¶LVROHPHQW HW OH WHVW de 102 750 colonies bactériennes par MALDI-

TOF, et qui ont donné lieu à O¶LGHQWLILFDWLRQ GH HVSqFHV EDFWpULHQQHV GLIIpUHQWHV incluant 40 nouvelles espèces, 17 nouveaux genres et 2 nouvelles familles. -¶DLHIIHFWXp la description complète par taxonogenomics (incluant le spectre MALDI-TOF et le

17 VpTXHQoDJHGXJpQRPH HWRXO¶DQQRQFHGHODFXOWXUH QHZVSHFLHVDQQRXQFHPHQW GHFHV nouvelles espèces.

(QILQ GDQV XQH WURLVLqPH SDUWLH MH GpFULUDL OD GpFRXYHUWH HW OD PLVH DX SRLQW G¶Xne

QRXYHOOHWHFKQLTXHG¶LVROHPHQWGHVDUFKDHDPpWKDQRJqQHVHWTXLDSHUPLVO¶LVROHPHQWGH

Methanobrevibacter smithii, archaea méthanogène appartenant au phylum Euryarchaeota.

Les archaea méthanogènes sont de plus en plus rencontrés dans la population humaine avec une prévalence de 97,4% pour Methanobrevibacter smithii et associés à des

SDWKRORJLHV FRPPH O¶DEFqV GX FHUYHDX OHV SDURGRQWLWHV HWF« /D FXOWXUH GH FHV

PLFURRUJDQLVPHV H[WUrPHPHQW VHQVLEOHV j O¶R[\JqQH HVW IDVWLGLHXVH HW QpFHVVLWDLW XQH source exWpULHXUHG¶K\GURJqQH Dans ce travail de thèse, sous enceinte anaérobie, nous avons cultivé avec succès M. smithii j SDUWLU G¶XQ PLOLHX GH FXOWXUH OLTXLGH LQRFXOp

G¶pFKDQWLOORQGHVHOOHFROOHFWpHFKH]XQGRQQHXUVDLQW/¶LVROHPHQWHQFXOWXUHSXUH a été un succès sur milieu gélosé en réalisant une coculture avec Bacteroides thetaiotaomicron.

Nous avons aussi testé avec succès la coculture de M. smithii DYHF G¶DXWUHV EDFWpULHV

SURGXFWULFHV G¶K\GURJqQH FRQQXHV /HV WHVWV GH FKURPDWRJUDSKLH HQ SKDVH JD]HXVH

PRQWUDLHQW TXH FHV VRXFKHV SURGXLVDLHQW GH O¶K\GURJqQH HQ TXDQWLWpV GLIIpUHQWHV /HV colonies isolées sur gélose étaient bien viables et observables et la production de méthane

était mesurée par spectrométrie de masse.

Mots-clés : Microbiote humain, microbiote africain, microbial culturomics, Archaea méthanogènes, Methanobrevibacter smithii.

18 Abstract

Abstract

The study of the digestive microbiota was renewed in the early 2000s, with the advent of molecular techniques, particularly metagenomics. The culturomics (high throughput microbial culture with identification of colonies by MALDI-TOF) has demonstrated its complementarity since 2010 by reducing some of the biases of molecular methods.

In the first part of my thesis work, I realized a review of the literature on the main techniques of study of the digestive microbiota and on the other hand on the analysis of the microbiota of subjects of African origin. The main metagenomic studies carried out on samples of African origin have revealed an increase in biodiversity, with in particular an increase in Spirochaetes and Prevotella in subjects of African origin compared to

Western subjects. Malnutrition studies have shown a reduction of all bacteria, especially anaerobic bacteria and archaea methanogens. Of the 1162 bacteria isolated by culturomics study, 476 were isolated only from non-African samples, 445 were isolated in common and 241 bacteria were isolated from samples of African origin, of which 68 were new species.

In a second part, I exposed my participation in the work of culturomics, which consisted in the isolation and the test of 102 750 bacterial colonies by MALDI-TOF, which resulted in the identification of 377 different bacterial species, including 40 new species, 17 new genera and 2 new families. I performed the complete description by taxonogenomics

(including the MALDI-TOF spectrum and genome sequencing) and / or the new species announcement of these new species.

21 Finally, in a third part, I will describe the discovery and the development of a new technique for the isolation of methanogenic archaea and which allowed the isolation of

Methanobrevibacter smithii, a methanogenic archaea belonging to the phylum

Euryarchaeota. Methanogenic archaea are more often encountered in the human population with a prevalence of 97.4% for Methanobrevibacter smithii and associated with pathologies such as brain abscess, periodontitis. Cultivation of these extremely oxygen-sensitive microorganisms is fastidious and requires an external source of hydrogen. In this thesis work, under anaerobic chamber, we successfully cultivated M. smithii from a liquid culture medium inoculated with a stool sample collected from a healthy donor. The isolation in pure culture was a success on agar medium by performing a co-culture with Bacteroides thetaiotaomicron. We have also successfully tested the co- culture of M. smithii with other known hydrogen-producing bacteria. Gas chromatographic tests showed that these strains produced hydrogen in different amounts.

Isolated colonies on agar were well viable and observable and methane production was measured by mass spectrometry.

Keywords: Human microbiota, African microbiota, microbial culturomics, methanogenic

Archaea, Methanobrevibacter smithii.

22 Introduction

INTRODUCTION

/D FXOWXUH HVW OD SUHPLqUH PpWKRGH FRQQXH SRXU O¶H[SORUDWLRQ G¶XQ pFRV\VWqPH bactérien [1] /¶DYqQHPHQW GHV WHFKQLTXHV LQGpSHQGDQWHV GH OD FXOWXUH QRWDPPHQW OHV techniques de séquençage à haut débit a suscité une recruGHVFHQFH G¶LQWpUrWV GHV microbiologistes pour le microbiote digestif. Ses relations avec la santé et les maladies

RQWIDLWO¶REMHWG¶XQQRPEUHFURLVVDQWGHSXEOLFDWLRQVGDQVODOLWWpUDWXUHLQWHUQDWLRQDOH [2].

Le microbLRWH GLJHVWLI VH WUDGXLW SDU O¶HQVHPEOH GHV PLFUR-organismes bactéries, virus, archaea, parasites et champignons qui colonisent le tractus digestif. Ce microbiote est en

SDUWLFXOLHUHVVHQWLHOSRXUODUpJXODWLRQO¶KRPRHRVWDVLHpQHUJpWLTXH[3;4], la maturation de la réponse immune [5;6], la protection contre les pathogènes [7], la perméabilité intestinale [8], la synthèse des vitamines [9], la conversion des substrats comme les sels biliaires, la mucine et les stéroïdes [4;10;11], ou encore la digestion des carbohydrates et

SRO\SKpQROVG¶RULJLQHDOLPHQWDLUHV[12;13]. Certaines études ont suggéré une association

HQWUH O¶DOWpUDWLRQ GH OD IORUH PLFURELHQQH LQWHVWLQDOH HW FHUWDLQV pWDWV SDWKRORJLTXHV comme le diabète de type 2 [14], la malnutrition [15;16]O¶REpVLWp[17;18]O¶DVWKPH[19],

OHVPDODGLHVLQIODPPDWRLUHVFKURQLTXHVGHO¶LQWHVWLQ[18], ou la cirrhose alcoolique [20].

'¶DXWUHV pWXGHV RQW UpYpOp O¶LQWpUrW GX PLFURELRWe intestinal dans les thérapies anticancéreuses [21-23] et dans le traitement des diarrhées à Clostridium difficile [24;25].

Vers les années 60-ODFXOWXUHDFRQQXXQUHERQGDYHFO¶DPpOLRUDWLRQGHVWHFKQLTXHVGH

FXOWXUH G¶DQDpURELHV SDU +XQJDWH [26]. Plusieurs espèces du tractus digestif étaient cultivées incluant les genres Bacteroides, Clostridium, Eubacterium, Veillonella,

Ruminococcus, Bifidobacterium, Fusobacterium, Lactobacillus, Peptostreptococcus et

Peptococcus. /¶DYqQHPHQW GH WHFKQLTXH GH VpTXHQoDJH j KDXW GpELW D SHUPLV GH

25 révolutionner la connaissance sur la composition du microbiote humain [27-30]. En

O¶HVSDFH GH GL[ DQV SOXVLHXUV SK\ODV EDFWpULHQV pWDLHQW découverts sans représentant en culture SURPHWWDQW PrPH GH GpFRXYULU O¶LQFXOWLYDEOH. En parallèle de ces études de

PpWDJpQRPLTXHOHVPLFURELRORJLVWHVGHO¶HQYLURQQHPHQWRQWdéveloppé des méthodes de cultures mimant le milieu naturel des microorganismes en utilisant des mélanges de composés organiques et inorganiques [31], des chambres à diffusion [32] , la méthode

Ichip composée de centaines de miniature de chambres à diffusion [33]. En utilisant ces techniques, LOV pWDLHQW FDSDEOHV G¶LVROHU SOXV GH IRLV SOXV GH PLFURRUJDQLVPHV TXH ceux obtenus par ensemencement direct sur gélose [32].

Microbial culturomics est une nouvelle méthode de culture à haut débit débutée en

2010, qui prend appui sur la diversification des conditions de culture à travers la conception de plusieurs milieux de culture qui favorisent la croissance des espèces fastidieuses et minoritaires au détriment des espèces majoritaires [34;35]. Les conditions de culture étaient basées sur de multiples conditions physicochimiques différentes (pH, salinité, températures G¶LQFXEDWLRQFKRFWKHUPLTXH G¶DWPRVSKqUHVGLIIpUHQWHV Aérobie, micro-aérophile et anaérobie VXU O¶XWLOLVDWLRQ G¶DQWLELRWLTXHV GH EDFWpULRSKDJHV lytiques, de filtration passive et filtration actives (5 à 0.2 m) ; de plus la pré-incubation

G¶pFKDQWLOORQVGDQVOHVIODFRQVG¶KpPRFXOWXUH DpURELHHWDQDpURELH DYHFGXVDQJRXGX jus de rumen stérile, de la selle fraiche stérilisée. [34]. Cette culture à haut débit est couplée avec XQHPpWKRGHG¶LGHQWLILFDWLRQSDU spectrométrie de masse de type MALDI

TOF des colonies ou par séquençage dH O¶$51 6 SRXU OHV FRORQLHV QRQ LGHQWLILpHV

[34;36;37].

Les archaea, anciennement nommées les archaebactéries, ont été classées en premier lieu parmi les bactéries dans le groupe des procaryotes. Néanmoins, certains

FDUDFWqUHVRQWDPHQpjUHFRQVLGpUHUFHFODVVHPHQW'¶XQHSDUWODVWUXFWXUHOLSLGLTXHGH leur membrane est complètement différente de celle des autres organismes; les lipides membranaires des archaea consistent en de longues chaînes d'alcool isopréniques attachées au glycérol par des liaisons éther, alors que les autres organismes fabriquent les lipides de leurs membranes en assemblant deux chaînes d'acides gras avec une molécule de glycérol par l'intermédiaire d'une liaison ester [38]. '¶DXWUHSDUWODWUDQVFULSWLRQHWOD traduction sont plus proches chez les archaea de celles des eucaryotes que de celles des bactéries.

/D FODVVLILFDWLRQ SK\ORJpQpWLTXH EDVpH VXU OD VpTXHQFH GH O¶$'1 ULERVRPDO 6 D

FRQILUPpO¶DSSDUWHQDQFHGHVDUFKDHDjXQGRPDLQHGHODYLHGLIIpUHQWGHVEDFWpULHVGHV eucaryotes et des virus géants à ADN [39;40]. Ce domaine a été divisé en quatre phyla :

Euryarchaeota et Crenarchaeota qui incluent la plupart des archaea cultivées, ainsi que deux nouveau phyla Nanoarchaeota et Korarchaeota qui comporte chacun une seule espèce cultivée (Figure 2). Dans cette grande diversité, les archaea méthanogènes qui appartiennent au phylum Euryarchaeota sont associées à des hôtes, y compris les

PDPPLIqUHVGRQWO¶+RPPH

Les archaea méthanogènes font partie du microbiote intestinal, vaginal et oral de

O¶KRPPH[41]. Methanobrevibacter smithii était le premier archaea méthanogène détecté et isolé de l'intestin humain [42]. Par la suite, Methanosphaera stadtmanae [43] et

Methanomassiliicoccus luminyensis [44] ont été isolés à partir de matières fécales humaines. Methanobrevibacter oralis a été isolé de la plaque sous-gingivale humaine

[45] puis de l'intestin humain [46]. Récemment, de nouveaux isolats de

Methanobrevibacter arboriphilicus et Methanobrevibacter millerae ont également été isolés dans l'intestin humain [47]. De plus, le génome de deux nouveaux archées méthanogènes, Candidatus Methanomethylophilus alvus et Candidatus

Methanomassiliicoccus intestinalis, a été récemment séquencé à partir de cultures enrichies [48;49] 'H SOXV DSUqV OD GpWHFWLRQ GH VpTXHQFHV G¶$'1 DSSDUWHQDQW j GHV archées halophiles par Oxley et al [50], nous avons réussi dans notre laboratoire à isoler

GHX[HVSqFHVG¶DUFKDHDKDORSKLOHVGRQWXQHQRXYHOOHHVSqFHHaloferax massiliense [51].

M. smithii est l'archaea méthanogène dominant dans l'intestin humain avec une prévalence de 95,7% chez l'individu [52]. En fait, les techniques basées sur la culture pour l'identification des archées méthanogènes utilisent principalement la technique de culture dans les tubes Hungate développée par Hungate et al 1969 [26]. Cette technique reste fastidieuse et inaccessible à certains laboratoires de microbiologie clinique qui ne disposent pas de l'équipement nécessaire à son application malgré des preuves de présence d'archaea dans certaines interventions cliniques, comme des abcès cérébraux ont récemment été démontrés [53]. Récemment, nous avons développé dans notre laboratoire une nouvelle technique de culture en double chambre, dans laquelle les archaea méthanogènes sont co-cultivés avec Bacteroides thetaiotaomicron qui produit de l'hydrogène nécessaire à leur croissance [54]. Cette technique nous a ensuite permis

G¶LVROHU XQ JUDQG QRPEUH GH VRXFKHV GH M. smithii de différents échantillons prélevés dans différentes muqueuses (données non présentées). Dans ce travail, et grâce à

O¶DFTXLVLWLRQ GH QRXYHOOHV FKDPEUHV DQDpURELHV GDQV QRWUH ODERUDWRLUH QRXV SURSRVRQV une nouvelle approche pour isoler et cultiver une nouvelle souche de M. smithii. Cette

28 approche basée sur la co-culture peut faciliter et rendre disponible l'isolement de nouvelles souches d'archaea méthanogènes dans les laboratoires de microbiologie clinique.

Chapitre 1

Etude du microbiote digestif humain Africain

Key words: Human microbiota, African microbiota, microbial culturomics.

Chapitre 1 : Préambule

Au cours de cette thèse, nous avons fait le point sur les connaissances actuelles concernant les méthodes et techniques utilisé pour étudier la biodiversité du tube digestif humain et en particulier le microbiote G¶LQGLYLGXV DIULFDLQ $LQVL OHV techniques

PROpFXODLUHVHQSDUWLFXOLHUODPpWDJpQRPLTXHDUpLWpUpO¶LQWpUrWTXHOHVPLFURELRORJLVWHV

DYDLHQWSRXUOHPLFURELRWHGLJHVWLI8QHQRXYHOOHPpWKRGHG¶pWXGHGXPLFURELRWHEDVpH sur la culture a été aussi largement utilisée ces huit dernières années. En effet la culturomics, un ensemble de techniques de culture microbienne à haut débit avec identification des colonies par MALDI-TOF, a démontré sa complémentarité.

Récemment, les principales études de métagénomique ont révélé une augmentation de la biodiversité, avec en particulier une augmentation des Spirochaetes et des Prevotella chez les sujets Africain par rapport aux sujets occidentaux. Les études portant sur la

PDOQXWULWLRQRQWGpPRQWUpXQHUpGXFWLRQGHO¶HQVemble des bactéries et en particulier des bactéries anaérobies et des archaea méthanogènes.

3HQGDQWO¶étude de la biodiversité du tube digestif par culturomics mené ces huit dernières années dans le laboratoire du Professeur Raoult, nous avons pu constater que sur les 1162 bactéries isolées par étude de culturomics, 686 ont été isolées de

SUpOqYHPHQWVG¶RULJLQH$IULFDLQHRQWpWpLVROpHVHQFRPPXQHWEDFWpULHVQ¶RQW pWpLVROpHVTX¶jSDUWLUGHSUpOqYHPHQWVG¶RULJLQH$IULFDLQHGRQWQRXYHOOHVHVSqces. Ces

études particulières réalisées sur le microbiote Africain, permettront de démontrer si une particularité existe au niveau de ce microbiote et si un quelconque rôle pourra lui être attribué dans certaines pathologies telles que la malnutrition.

Chapitre 1

Etude du microbiote digestif humain Africain

Sory Ibrahima Trarore1, Melhem Bilen1, Frédéric Cadoret1, Saber Khelaifia1, Matthieu

Million1, Didier Raoult1 and Jean-Christophe Lagier1

1 Aix Marseille Univ., IRD, MEPHI, IHU Méditerranée Infection, Marseille, France

* Corresponding author. E-mail address: [email protected],

Tel.: (33) 413 73 24 01, Fax: (33) 413 73 24 02

MEPHI, Aix Marseille Université, IRD, IHU - Méditerranée Infection, 19-21 Boulevard

Jean Moulin, 13005 Marseille

Mots-clés : Human microbiota, African microbiota, microbial culturomics.

Soumis à la revue Médecine et Santé Tropicale

Résumé

L’étude du microbiote digestif a connu un regain d’intérêt avec l’avènement des techniques moléculaires, en particulier la métagénomique. La culturomics (culture microbienne à haut débit avec identification des colonies par MALDI-TOF a démontré sa complémentarité.

Les principales études de métagénomique ont révélé une augmentation de la biodiversité, avec en particulier une augmentation des Spirochaetes et des Prevotella chez les sujets d’origine

Africaine par rapport aux sujets occidentaux. Les études portant sur la malnutrition ont démontré une réduction de l’ensemble des bactéries et en particulier des bactéries anaérobies et des archées méthanogènes. Sur les 1162 bactéries isolées par étude de culturomics, 476 ont été isolées seulement de prélèvements d’origine autre que d’Afrique, 445 ont été isolées en commun et 241 bactéries n’ont été isolées qu’à partir de prélèvements d’origine Africaine dont 68 nouvelles espèces.

La poursuite d’études du microbiote Africain par culturomics et métagénomique permettront d’élucider s’il existe une spécificité de certaines bactéries et qu’elles peuvent avoir un rôle dans certaines pathologies telles que la malnutrition.

INTRODUCTION Le microbiote digestif et de façon générale l’étude des bactéries commensales associées à l’homme, font l’objet de recherches croissantes depuis 20 ans [1]. Tout d’abord en raison de l’avènement des méthodes moléculaires et du séquençage à haut débit, ces études ont permis de mettre en évidence des associations entre la composition du microbiote et la santé humaine [2]. En parallèle de ces études de métagénomique, les microbiologistes de l’environnement ont été les premiers à favoriser le renouveau de la culture microbienne au travers de méthodes permettant de mimer le milieu naturel des microorganismes pour favoriser leur croissance [3]. Depuis environ 8 ans, une méthode de culture à haut débit, la culturomics, a été développée et a permis d’étendre considérablement le répertoire des bactéries cultivées associées à l’homme [4;5]. Au travers de cette revue, après avoir rapidement décrit ces nouvelles méthodes d’études, nous proposons de nous focaliser sur les particularités du microbiote des sujets Africains.

METHODES D’ETUDE DU MICROBIOTE DIGESTIF Métagénomique La métagénomique a été utilisée pour la première fois pour décrire la composition d’environnements complexes tels que les populations microbiennes dans l'eau de mer. Chez l’homme, les premiers travaux ont décrit la diversité du microbiote digestif à partir d'échantillons de selles ou de biopsies coliques de sujets sains. Rapidement des travaux ont analysé les relations entre le microbiote intestinal et l'obésité, le diabète sucré, les maladies intestinales inflammatoires et le cancer colorectal [6-9]. La métagénomique a permis de très rapidement pouvoir analyser un grand nombre de prélèvements, a permis d’accroitre significativement la connaissance notamment quant à la détection d’espèces non encore cultivées et de réaliser des analyses fonctionnelles. En revanche ses résultats se sont avérés souvent non reproductibles en raison de biais d’extraction, de primers, de profondeur (la métagénomique détecte principalement les espèces majoritaires) et de biais bioinformatiques [4]. Enfin, elle n’a pas la capacité de différentier les espèces vivantes des espèces mortes dont on ne détecte que l’ADN [4].

Culturomics Les microbiologistes de l’environnement ont permis, en reproduisant le milieu naturel des bactéries à l’aide de dispositifs à type de chambres à diffusion, d’isoler plus de 300 fois plus de microorganismes que ceux obtenus par ensemencement direct sur gélose [3]. Microbial culturomics est une nouvelle méthode de culture à haut débit débutée en 2010, qui a multiplié les conditions de

41 cultures en utilisant une méthode d’isolement rapide par MALDI-TOF [4;5;10]. Les conditions de culture étaient basées sur l’utilisation de multiples conditions physicochimiques différentes, d’atmosphères différentes, sur l’utilisation d’inhibiteurs (antibiotiques, de bactériophages lytiques, de filtration passive et filtration actives) afin de sélectionner les populations minoritaires et de préincubation des échantillons dans les flacons d’hémoculture en présence de sang ou du jus de rumen stérile et/ou d’anti-oxydants [5;11]. Cette technique a permis de cultiver plus de 1,200 espèces bactériennes du tube digestif humain incluant plus de 250 nouvelles espèces tandis que seules 688 espèces étaient cultivées du tube digestif humain avant l’avènement de la culturomics [4]. De plus des travaux récents ont permis de démontrer que plusieurs de ces espèces ont été secondairement détectées dans des prélèvements humains prélevés en situation pathologique [12]. En parallèle il a été démontré que la culturomics était complémentaire de la métagénomique [4]. En cultivant pour la première fois des espèces dont seules les séquences avaient été précédemment détectées dans des études de métagnomique, la culturomics a permis de combler en partie la dark matter de la métagénomique qui correspond à des séquences non encore assignées [4]. En parallèle, la découverte de ce grand nombre de nouvelle espèces a nécessité d’adapter la capacité à décrire ces nouveaux microorganismes. Dans un premier temps, la taxonogenomique a proposé d’ajouter à la description habituelle des nouvelles espèces, le spectre MALDI-TOF et le séquençage du génome [13-15]. De plus, le délai entre la première culture et la publication d’une nouvelle espèce étant parfois considérable, afin de permettre un accès plus rapide à la connaissance, un nouveau format dénommé « new species announcement » et incluant les numéros de dépôts de la souche, l’arbre phylogénétique et le spectre MALDI-TOF [16].

MICROBIOTE DIGESTIF ET AFRIQUE Géographie et microbiote digestif Les différences entre la composition du microbiote peuvent être liées à de multiples facteurs dépendant de la génétique, du style de vie, de l’alimentation, de l’hygiène et de l’environnement [1]. Les avancées récentes dans l’étude du microbiote humain ont révélé une corrélation entre la composition du microbiote et l’appartenance ethnique. Récemment, plusieurs études ont été réalisées sur le continent africain et ont démontré des modifications du microbiote liées à la provenance géographique [17]. De façon générale, une diversité plus élevée du microbiote digestif est observée chez les sujets Africains et plus généralement vivants en zone intertropicale. Ainsi une étude ayant porté sur le microbiote digestif des populations de chasseurs et cueilleurs de Hadza en Tanzanie avait observé une forte abondance de Spirochaetes, Prevotella, Clostridiales, Ruminobacter, Proteobacteria, etc., comparé à celui des populations urbaines où les Firmicutes, 42 Bacteroides et Bifidobacterium prédominent. Ce travail a démontré une divergence dans le rapport Prevotella et Bacteroides, qui pourrait être liée au régime alimentaire [8;18;19]. Une autre étude ciblant la population de Hadza a révélé une forte présence de Treponema dans le microbiome intestinal des femmes et une augmentation des Eubacterium et des Blautia dans celui des hommes en raison de multiples facteurs, essentiellement liés à leur mode de vie [20]. Une étude s’intéressant à la composition du microbiote d’enfants africains vivant dans en zone rurale en Afrique du Sud, comparée à des Américains vivant dans la région de Pittsburgh en Pennsylvanie a là encore démontré un enrichissement en Prevotella, Succinivibrio et Treponema en Afrique [21]. Dans un travail portant sur le microbiome intestinal des Pygmées, des populations bantoues et d'éleveurs, Morton et al., en 2015, ont suggéré une forte corrélation entre le parasite intestinal, le système immunitaire et la composition bactérienne du microbiote [22]. L'étude des modifications du microbiote intestinal chez les enfants africains (Burkina Faso, villes de Nanoro et Ouagadougou) par rapport aux enfants vivant en Italie a été faite par de Filipo et al. par pyroséquençage ciblant les régions hyper variables V5 et V6 du gène de l'ARNr 16S. Les auteurs ont rapporté un enrichissement en Bacteroidetes, Actinobacteria et Enterobacteriaceae (Shigella et Escherichia) chez les enfants vivant au Burkina Faso, alors que les Firmicutes étaient les plus présents le microbiote des enfants italiens. De plus, les genres Prevotella, Xylanibacter (Bacteroidetes) et Treponema (Spirochaetes) ont été trouvés seulement au Burkina Faso [23]. De plus, une étude ayant inclus des échantillons de selles de nouveau-nés au Gabon et en République du Congo visant à déterminer la composition bactérienne durant leur premier mois de vie a montré une grande diversité bactérienne aux premiers jours de la vie avec la domination de Prevotella et sa diminution à l’âge de 28 jours [24]. Dans une autre étude, la composition du microbiote des enfants et des adultes américains étaient comparé à ceux des Malawiens et des Amérindiens (Vénézuélien). La diversité des microbiotes des Malawiens et des Vénézuéliens était significativement plus élevée que ceux vivant aux États-Unis [25]. Grzeskowiak et al. ont comparé les différences dans la composition du microbiote intestinal d’enfants finlandais et malawiens. La numération des groupes Bifidobacterium, Bacteroides-Prevotella, C. histolyticum et le nombre total de bactéries détectées par FCM-FISH était significativement plus élevé chez les enfants du Malawi que chez les Finlandais. Les résultats de la qPCR ont montré des quantités plus élevées de Bifidobacterium longum et B. bifidum chez les enfants habitant au Malawi comparés aux enfants finlandais. B. catenulatum, C. difficile et A. muciniphila étaient rares chez les nourrissons malawiens. Enfin, Bifidobacterium adolescentis, C. perfringens et Staphylococcus aureus n'étaient détectables que chez les nourrissons finlandais [26].

43 Alimentation, malnutrition et microbiote digestif L’alimentation est un facteur majeur qui participe à la composition et à l’établissement de la diversité microbienne du microbiote digestif humain. La flore intestinale à son tour joue un rôle important dans la récolte, le stockage et la dépense de l’énergie extraite des aliments [27;28]. Six mois après la naissance, avec l’ajout d’aliments solides au régime alimentaire de l’enfant, le microbiote digestif se diversifie et devient riche en Bacteroides, Clostridium; les bactéries anaérobies augmentent rapidement tandis que la proportion de Bifidobacteria se stabilise [28]. L’abondance et la diversité des bactéries de la flore intestinale sont fonctions du type et de l’importance de macronutriments (carbohydrates, protéines, matières grasses) contenus dans les aliments ingérés. Un régime alimentaire riche en polysaccharides dérivés de plante et de fibres, aussi bien chez l’enfant comme chez l’adulte est assossié à un microbiote digestif enrichi en Bacteroidetes comparés aux Firmicutes [23]. L’'âge et la provenance géographique sont des acteurs majeurs de la modification du microbiote digestif. [25;29]. En plus de ces deux éléments, les apports nutritionnels sont le principal déterminant de la composition et de la maturation du microbiote intestinal. La malnutrition aiguë sévère est associée à une immaturité globale du microbiote intestinal [30] et à un appauvrissement de l’ensemble des bactéries et en particulier des bactéries anaérobies et des archées méthanogènes [29;31]. Le stress environnemental entraînant une malnutrition aiguë sévère altère principalement les bactéries dépourvues de mécanisme de résistance au stress oxydatif [29]. De plus, différentes souches de la même espèce peuvent être appauvries ou enrichies dans les cas de malnutrition et bénéfiques ou délétères lorsqu'elles sont inoculées dans des modèles expérimentaux [32]. Ceci est cohérent avec le fait que la résistance au stress oxydatif différencie les souches bénéfiques et délétères dans l'intestin [33]. Une hypothèse récente est que la malnutrition infantile, qui commence toujours par un apport insuffisant en nourriture et en eau chez la mère et / ou le nourrisson, peut entraîner la perte irréversible de microbes intestinaux mais vulnérables. Cela peut expliquer l'échec thérapeutique de 10% et les cas réfractaires et le taux de mortalité de 4% malgré le régime thérapeutique et les antibiotiques [34;35]. En conséquence, d'autres options thérapeutiques devraient inclure des bactéries manquantes (souches bien caractérisées) en plus du régime thérapeutique et des antibiotiques optimisés [31;34]. La culturomics couplée à la métagénomique a permis de proposer un cocktail de bactéries manquantes chez les enfants souffrant de malnutrition sévère (Kwashiorkor ou marasme) ayant potentiellement un impact thérapeutique [31].

44 Culturomics et microbiote digestif Africain Parmi les 973 prélèvements analysés par culturomics, 1162 bactéries ont été isolées. L’analyse détaillée de la provenance des prélèvements permet de voir que 373 prélèvements étaient d’origine Africaine et 600 provenaient de sujets d’autres origines. Parmi ces 1162 bactéries, 476 ont été isolées seulement de prélèvements d’origine autre que d’Afrique, 445 ont été isolées en commun et 241 bactéries n’ont été isolées qu’à partir de prélèvements d’origine Africaine. Dans le détail il s’agissait, de 68 nouvelles espèces, 89 espèces isolées pour la première fois chez l’homme, 54 espèces connues chez l’homme mais isolées pour la première fois du tube digestif et 30 bactéries déjà connues du tube digestif (Figure 1A). La répartition par phyla est résumée dans la figure 1B. Il n’y a pas de différence significative dans la répartition quand on la rapporte au nombre de prélèvements testés. Une analyse plus approfondie et sur un plus long terme permettra de confirmer ou d’infirmer la spécificité de certains genre bactériens en fonction de la provenance géographique de la même façon qu’il sera intéressant de comparer les résultats en fonction d’éventuelles pathologies (malnutrition, diarrhée, sujets sains….). Une étude préliminaire par culturomics et métagénomique a permis de proposer un cocktail de bactéries manquantes dans une situation clinique de malnutrition sévère (Kwashiorkor) [31]. La poursuite de telles études du microbiote Africain par culturomics et métagénomique de façon concomitante dans certaines situations pathologiques (marasme) et chez des sujets sains permettra d’élucider exhaustivement les bactéries manquantes dont la supplémentation pourrait être à l’avenir une piste de traitement comme cela est actuellement le cas dans les infections à Clostridium difficile [4].

45 Figure 1:

A : Nombre total de bactéries isolées par culturomics selon 4 catégories : H(GUT) : bactéries déjà connues du gut ; H : bactéries déjà connues chez l’homme mais jamais du microbiote digestif ; NH : bactéries connues de l’environnement mais isolées pour la première fois chez l’homme ; newspe : nouvelles espèces bactériennes. En bleu : bactéries isolées uniquement à partir de prélèvements d’origine africaine ; en jaune : bactéries isolées uniquement dans des prélèvements d’origine non Africaine, en rayé vert et blanc : bactéries isolées à la fois dans des prélèvements d’origine Africaine et non Africaine. 450 400 30 350 300 250 236 54 200 89 68 46 150 92 67 50 100 50 136 103 109 128 0 H(GUT) H NH newspe Non african Common African B : Représentation par phyla bactériens (seuls les 4 phyla les plus représentés figurent ici). Parmi les autres phyla : Deinococcus Thermus (1 espèce d’un prélèvement Africain) ; Fusobacterium (6 espèces non Africain ; 1 Africain ; 3 communes) ; Lentispherae (1 espèce non Africaine) ; Synergistetes (3 non Africaine, 1 commune) ; Verrucomicrobia (1 non Africiaine)

700

600 140 500

400 266 300 47 200 42 47 76 10 100 229 60 101 39 53 81 0 Actinobacteria Bacteroidetes Firmicutes Proteobacteria Non african Common African

Figure 2: 48 Reference List

(1) Lagier J C, Million M, Hugon P, Armougom F, Raoult D. Human gut microbiota: repertoire and variations. Front Cell Infect Microbiol 2012; 2:136.

(2) Eckburg P B, Bik E M, Bernstein C N, Purdom E, Dethlefsen L, Sargent M et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science 2005; 308(5728):1635- 1638.

(3) Kaeberlein T, Lewis K, Epstein S S. Isolating "uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science 2002; 296(5570):1127- 1129.

(4) Lagier J C, Dubourg G, Million M, Cadoret F, Bilen M, Fenollar F et al. Culturing the human microbiota and culturomics. Nat Rev Microbiol 2018;540-550.

(5) Lagier J C, Hugon P, Khelaifia S, Fournier P E, La S B, Raoult D. The rebirth of culture in microbiology through the example of culturomics to study human gut microbiota. Clin Microbiol Rev 2015; 28(1):237-264.

(6) Ley R E, Backhed F, Turnbaugh P, Lozupone C A, Knight R D, Gordon J I. Obesity alters gut microbial ecology. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102(31):11070-11075.

(7) Kootte R S, Vrieze A, Holleman F, Dallinga-Thie G M, Zoetendal E G, de Vos W M et al. The therapeutic potential of manipulating gut microbiota in obesity and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Obes Metab 2012; 14(2):112-120.

(8) Ou J, Carbonero F, Zoetendal E G, DeLany J P, Wang M, Newton K et al. Diet, microbiota, and microbial metabolites in colon cancer risk in rural Africans and African Americans. Am J Clin Nutr 2013; 98(1):111-120.

(9) Shanahan F. The colonic microbiota and colonic disease. Curr Gastroenterol Rep 2012; 14(5):446-452.

(10) Lagier J C, Armougom F, Million M, Hugon P, Pagnier I, Robert C et al. Microbial culturomics: paradigm shift in the human gut microbiome study. Clin Microbiol Infect 2012; 18(12):1185-1193.

(11) Lagier J C, Edouard S, Pagnier I, Mediannikov O, Drancourt M, Raoult D. Current and past strategies for bacterial culture in clinical microbiology. Clin Microbiol Rev 2015; 28(1):208-236.

(12) Dubourg G, Baron S, Cadoret F, Couderc C, Fournier P E, Lagier J C et al. From Culturomics to Clinical Microbiology and Forward. Emerg Infect Dis 2018; 24(9):1683-1690.

(13) Ramasamy D, Lagier J C, Nguyen T T, Raoult D, Fournier P E. Non contiguous- finished genome sequence and description of Dielma fastidiosa gen. nov., sp. nov., a new member of the Family Erysipelotrichaceae. Stand Genomic Sci 2013; 8(2):336- 351.

49 (14) Ramasamy D, Mishra A K, Lagier J C, Padhmanabhan R, Rossi M, Sentausa E et al. A polyphasic strategy incorporating genomic data for the taxonomic description of novel bacterial species. Int J Syst Evol Microbiol 2014; 64(Pt 2):384-391.

(15) Hugon P, Mishra A K, Lagier J C, Nguyen T T, Couderc C, Raoult D et al. Non- contiguous finished genome sequence and description of Brevibacillus massiliensis sp. nov. Stand Genomic Sci 2013; 8(1):1-14.

(16) Fournier P E, Raoult D, Drancourt M. New Species Announcement: a new format to prompt the description of new human microbial species. New Microbes New Infect 2017; 15:136-137.

(17) Gupta V K, Paul S, Dutta C. Geography, Ethnicity or Subsistence-Specific Variations in Human Microbiome Composition and Diversity. Front Microbiol 2017; 8:1162.

(18) Gomez A, Petrzelkova K J, Burns M B, Yeoman C J, Amato K R, Vlckova K et al. Gut Microbiome of Coexisting BaAka Pygmies and Bantu Reflects Gradients of Traditional Subsistence Patterns. Cell Rep 2016; 14(9):2142-2153.

(19) O'Keefe S J, Chung D, Mahmoud N, Sepulveda A R, Manafe M, Arch J et al. Why do African Americans get more colon cancer than Native Africans? J Nutr 2007; 137(1 Suppl):175S-182S.

(20) Schnorr S L, Candela M, Rampelli S, Centanni M, Consolandi C, Basaglia G et al. Gut microbiome of the Hadza hunter-gatherers. Nat Commun 2014; 5:3654.

(21) Obregon-Tito A J, Tito R Y, Metcalf J, Sankaranarayanan K, Clemente J C, Ursell L K et al. Subsistence strategies in traditional societies distinguish gut microbiomes. Nat Commun 2015; 6:6505.

(22) Morton E R, Lynch J, Froment A, Lafosse S, Heyer E, Przeworski M et al. Variation in Rural African Gut Microbiota Is Strongly Correlated with Colonization by Entamoeba and Subsistence. PLoS Genet 2015; 11(11):e1005658.

(23) De F C, Di P M, Ramazzotti M, Albanese D, Pieraccini G, Banci E et al. Diet, Environments, and Gut Microbiota. A Preliminary Investigation in Children Living in Rural and Urban Burkina Faso and Italy. Front Microbiol 2017; 8:1979.

(24) Brazier L, Elguero E, Koumavor C K, Renaud N, Prugnolle F, Thomas F et al. Evolution in fecal bacterial/viral composition in infants of two central African countries (Gabon and Republic of the Congo) during their first month of life. PLoS One 2017; 12(10):e0185569.

(25) Yatsunenko T, Rey F E, Manary M J, Trehan I, Dominguez-Bello M G, Contreras M et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature 2012; 486(7402):222-227.

(26) Grzeskowiak L, Collado M C, Mangani C, Maleta K, Laitinen K, Ashorn P et al. Distinct gut microbiota in southeastern African and northern European infants. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2012; 54(6):812-816.

50 (27) Angelakis E, Merhej V, Raoult D. Related actions of probiotics and antibiotics on gut microbiota and weight modification. Lancet Infect Dis 2013; 13(10):889-899.

(28) Angelakis E, Raoult D. Gut microbiota modifications and weight gain in early life. Human Microbiome Journal 2018.

(29) Million M, Tidjani A M, Khelaifia S, Bachar D, Lagier J C, Dione N et al. Increased Gut Redox and Depletion of Anaerobic and Methanogenic Prokaryotes in Severe Acute Malnutrition. Sci Rep 2016; 6:26051.

(30) Subramanian S, Huq S, Yatsunenko T, Haque R, Mahfuz M, Alam M A et al. Persistent gut microbiota immaturity in malnourished Bangladeshi children. Nature 2014; 510(7505):417-421.

(31) Tidjani A M, Million M, Traore S I, Mouelhi D, Khelaifia S, Bachar D et al. Gut Bacteria Missing in Severe Acute Malnutrition, Can We Identify Potential Probiotics by Culturomics? Front Microbiol 2017; 8:899.

(32) Wagner V E, Dey N, Guruge J, Hsiao A, Ahern P P, Semenkovich N P et al. Effects of a gut pathobiont in a gnotobiotic mouse model of childhood undernutrition. Sci Transl Med 2016; 8(366):366ra164.

(33) Sun J, Qiao Y, Qi C, Jiang W, Xiao H, Shi Y et al. High-fat-diet-induced obesity is associated with decreased antiinflammatory Lactobacillus reuteri sensitive to oxidative stress in mouse Peyer's patches. Nutrition 2016; 32(2):265-272.

(34) Trehan I, Goldbach H S, LaGrone L N, Meuli G J, Wang R J, Maleta K M et al. Antibiotics as part of the management of severe acute malnutrition. N Engl J Med 2013; 368(5):425-435.

(35) Million M, Diallo A, Raoult D. Gut microbiota and malnutrition. Microb Pathog 2017; 106:127-138.

Chapitre 2

Etude du microbiote Africain par culturomics

Préambule Chapitre 2:

Culturomics est une approche de culture à haut débit permettant de tester au MALDI TOF des milliers de colonies par semaine. Dans ce travail de thèse, nous avons appliqué cette approche

SRXU pWXGLHU OD ELRGLYHUVLWp EDFWpULHQQH GDQV GHV SUpOqYHPHQWV GH VHOOHV KXPDLQH G¶RULJLQH

DIULFDLQH &HWWH pWXGH DYDLW SRXU EXW G¶pODUJLU OHV FRQQDLVVDQFHV FRQFHUQDQW OHV HVSqFHV bactériennes colonisant le tube digestif humain et en particulier dans ce travail le microbiote africain et ainsi agrémenter le répertoire de ce microbiote par de nouvelles espèces qui sont resté jusqu'à présent non cultivées.

Ma participation à culturomics a consisté à tester 102 750 colonies bactériennes par MALDI-

TOF, qui ont donné lieu à O¶LGHQWLILFDWLRQGHHVSqFHVEDFWpULHQQHVGLIIpUHQWHVLQFOXDQW nouvelles espèces, 17 nouveaux genres et 2 nouvelles familles. Ces nouvelles espèces ont été décrites ou en cours de description par taxonogenomics ou par new species announcement.

En effet, il est apparu durant ces travaux de culturomics que la technique de description habituelle des nouvelles espèces basées HVVHQWLHOOHPHQW VXU O¶K\EULGDWLRQ $'1-ADN était inadaptée car souvent non reproductible et utilisable seulement par un nombre très limité de laboratoires. Nous avons donc proposé une nouvelle approche de description des nouvelles espèces incluant outre les principales caractéristiques phénotypiques, le spectre MALDI-TOF et le génome complet de la bactérie (ainsi que la comparaison avec les génomes les plus proches [90].

(Q SDUDOOqOH O¶DIIOX[ FRQVLGpUDEOH GH QRXYHOOHV HVSqFHV DVVRFLpHV O¶KRPPH D QpFHssité de considérer un nouveau format de publication (le délai étant parfois de plusieurs années entre la 1ère culture et la publication) de façon à ce que la communauté scientifique soit informée rapidement de la découverte de nouveaux isolats bactériens. Ce nouveau format intitulé New species announcement » comprend le numéro Genbank de la séquence 16S, le numéro de

GpS{W j XQH FROOHFWLRQ GH VRXFKH LQWHUQDWLRQDOH O¶DUEUH SK\ORJpQpWLTXH HW TXHOTXHV informations phénotypiques. Nous avons choisi d¶LQFOXUHdans cette partie deux exemples de papier de description de nouvelles espèces bactériennes décrites soit par taxonogenomics ou par new species announcement. En parallèle le listing complet de mes publications de nouvelles espèces publiées dans la littérature internationale est disponible en annexe.

58 NEW SPECIES

‘Beduinella massiliensis’, gen. nov., sp. nov. a new genus representing a new family in the phylum Firmicutes, and proposal of Beduinellaceae fam. nov.

S. I. Traore1, E. I. Azhar2,3, M. Yasir2, F. Bibi2, J. Delerce1, P.-E. Fournier1, A. A. Jiman-Fatani4, J.-C. Lagier1 and D. Raoult1,2 1) Aix-Marseille Université, URMITE, UM63, CNRS7278, IRD198, Inserm 1095, Institut Hospitalo-Universitaire Méditerranée-Infection, Faculté de médecine, Marseille, France, 2) Special Infectious Agents Unit, King Fahd Medical Research Centre, King Abdulaziz University, Jeddah, Saudi Arabia, 3) Medical Laboratory Technology Department, Faculty of Applied Medical Sciences and 4) Department of Medical Microbiology and Parasitology, Faculty of Medicine, King Abdulaziz University, Jeddah, Saudi Arabia

Abstract

We report here the main characteristics of a new bacterium named ‘Beduinella massiliensis’ strain Marseille-P2846T (CSURP2846P) that was isolated from a faecal specimen of a 50-year-old Saudi Bedouin female and propose the creation of a new family ‘Beduinellaceae’. © 2016 The Authors. Published by Elsevier Ltd on behalf of European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases.

Keywords: Beduinella massiliensis, culturomics, genomics, taxono-genomics, taxonomy Original Submission: 30 June 2016; Accepted: 25 July 2016 Article published online: 29 July 2016

Yvette, France) and 2 mL of sheep blood (bioMérieux, Marcy Corresponding author: D. Raoult, Aix-Marseille Université, l’Etoile, France). After 2 days of pre-incubation, the sample was URMITE, UM63, CNRS7278, IRD198, Inserm 1095, Institut Hospitalo-Universitaire Méditerranée-Infection, Faculté de médecine, inoculated on 5% sheep blood agar that was incubated at 37°C 27 Boulevard Jean Moulin, 13385, Marseille cedex 05, France in anaerobic conditions generated using AnaeroGen TM (bio- E-mail: [email protected] Mérieux). The strain Marseille-P2846T was isolated after a 72- hour incubation. Agar-grown colonies were transparent with a diameter from As a part of culturomics [1], we isolated in 2016, a bacterial 0.2 to 0.5 mm. Bacterial cells were non-motile, non-spore- strain that could not be identified by our systematic matrix- forming, Gram-negative and rod-shaped with pointed ends, assisted laser desorption–ionization time-of-flight mass spec- ranging in length from 2.6 to 4 μm and in width from 0.4 to trometry (MALDI-TOF MS) screening on a Microflex spec- 0.6 μm. Strain Marseille-P2846T was catalase-negative and trometer (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) [2,3]. This oxidase-negative. To identify this strain as Marseille-P2846T, the strain (Marseille-P2846T) was isolated from the stool sample of complete 16S rRNA gene was sequenced using fD1-rP2 a 50-year-old healthy Bedouin female living in the Jazan region primers as previously described [4], using a 3130-XL sequencer of Saudi Arabia. This healthy individual gave an informed con- (Applied Biosciences, Saint Aubin, France). Strain Marseille- sent. This study was performed in Saudi Arabia with approval P2846T exhibited an 86.6% sequence identity with Christense- from the Ethical Committee of the King Abdulaziz University nella minuta strain YIT 12065T (GenBank Accession number (Saudi Arabia), and the local ethics committee of the IFR48 NR_112900.1), the phylogenetically closest species with (Marseille, France) under the numbers 014-CEGMR-2-ETH-P standing nomenclature (Fig. 1), which putatively classifies it as a and 09-022, respectively. member of the new family ‘Beduinellaceae’ within the order The stool sample was pre-incubated for 3 days at 37°C in a Clostridiales in the phylum Firmicutes. Christensenella minuta strain blood culture bottle (BD Diagnostics, Le Pont-de-Claix, France) YIT 12065T is a strictly anaerobic, non-motile, non-spore- supplemented with 2 mL of rumen fluid filter-sterilized through forming, Gram-negative rod that was first isolated from human a 0.2-μm pore filter (Thermo Fisher Scientific, Villebon sur faeces [5].

New Microbe and New Infect 2016; 14: 10–12 © 2016 The Authors. Published by Elsevier Ltd on behalf of European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/) http://dx.doi.org/10.1016/j.nmni.2016.07.012 59 NMNI Traore et al. Beduinella massiliensis 11

FIG. 1. Phylogenetic tree showing the position of ‘Beduinella massiliensis’ strain Marseille P2846T relative to other phylogenetically close neighbours. Sequences were aligned using CLUSTALW, and phylogenetic inferences obtained using the maximum-likelihood method within the MEGA software. Numbers at the nodes are percentages of bootstrap values obtained by repeating the analysis 500 times to generate a majority consensus tree. Only the bootstraps score at least 95% were retained. The scale bar indicates a 2% nucleotide sequence divergence.

Strain Marseille P2846P exhibited a 16S rRNA sequence Conflict of interest divergence >12% with its phylogenetically closest species with standing in nomenclature [6]; hence, we propose the creation of None to declare. the new family ‘Beduinellaceae’ fam. nov., of the new genus ‘Bed- uinella’ fam. nov., gen. nov., and of the strain Marseille-P2846T as the type strain of ‘Beduinella massiliensis’ fam. nov, gen. nov, sp. Funding sources nov., the first representative species of this new family. ‘Beduinella massiliensis’ fam. nov., gen. nov., sp. nov. (Be.dui.nel.’la. N.L fem.n. This work was funded by the Mediterrannée-Infection Foun- Beduinella from the Latin name of nomadic Bedouin population dation. This project was also funded by the Deanship of Sci- from Saudi Arabia where the strain was collected), (mas.si.- entific Research (DSR), King Abdulaziz University, Jeddah, li.en’sis, L., fem. adj., massiliensis for Massilia, the Roman name of under Grant No. (3-140-1434-HiCi). The authors, therefore, Marseille, where strain Marseille-P2846T was isolated). acknowledge DSR for technical and financial support. MALDI-TOF-MS spectrum accession number. The MALDI-TOF-MS spectrum of ‘B. massiliensis’ is available at: http://mediterranee-infection.com/article.php?laref=256&titre= References urms-database Nucleotide sequence accession number. The 16S [1] Lagier JC, Armougom F, Million M, Hugon P, Pagnier I, Robert C, et al. rRNA gene sequence was deposited in GenBank under Microbial culturomics: paradigm shift in the human gut microbiome Accession number LT576387. study. Clin Microbiol Infect 2012;18:1185–93. Deposit in a culture collection. Strain Marseille-P2846T [2] Seng P, Abat C, Rolain JM, Colson P, Lagier JC, Gouriet F, et al. Iden- tification of rare pathogenic bacteria in a clinical microbiology labora- ’ was deposited in the Collection de Souches de l Unité des tory: impact of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight Rickettsies (CSUR, WDCM 875) under number P2846P. mass spectrometry. J Clin Microbiol 2013;51:2182–94.

© 2016 The Authors. Published by Elsevier Ltd on behalf of European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, NMNI, 14,10–12 This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

60 12 New Microbes and New Infections, Volume 14 Number C, November 2016 NMNI

[3] Lagier JC, Hugon P, Khelaiﬁa S, Fournier PE, La SB, Raoult D. The [5] Morotomi M, Nagai F, Watanabe Y. Description of Christensenella min- rebirth of culture in microbiology through the example of culturomics uta gen. nov., sp. nov., isolated from human faeces, which forms a to study human gut microbiota. Clin Microbiol Rev 2015;28:237–64. distinct branch in the order Clostridiales, and proposal of Christense- [4] Drancourt M, Bollet C, Carlioz A, Martelin R, Gayral JP, Raoult D. 16S nellaceae fam. nov. Int J Syst Evol Microbiol 2012;62:144–9. ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental [6] Huson DH, Auch AF, Qi J, Schuster SC. MEGAN analysis of meta- and clinical unidentiﬁable bacterial isolates. J Clin Microbiol 2000;38: genomic data. Genome Res 2007;17:377–86. 3623–30.

TAXONOGENOMICS: GENOME OF A NEW ORGANISM

Noncontiguous ﬁnished genome sequence and description of Bacillus andreraoultii strain SIT1T sp. nov.

S. I. Traore1,2, T. Cimmino1, J.-C. Lagier1, S. Khelaiﬁa1, S. Brah3, C. Michelle1, A. Caputo1, B. A. Diallo4, P.-E. Fournier1, D. Raoult1,5 and J. M. Rolain1 1) Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses et Tropicales Emergentes, UM 63, CNRS 7278, IRD 198, Inserm U1095, Institut Hospitalo-Universitaire Méditerranée-Infection, Faculté de médecine, Aix-Marseille Université, Marseille, France, 2) Département d’Epidémiologie des Affections Parasitaires, Faculté de médecine et de pharmacie de Bamako, Mali, 3) Hôpital National de Niamey, 4) Laboratoire de Microbiologie, Département de Biologie, Université Abdou Moumouni de Niamey, Niamey, Niger and 5) Special Infectious Agents Unit, King Fahd Medical Research Center, King Abdulaziz University, Jeddah, Saudi Arabia

Abstract

Bacillus andreraoultii strain SIT1T (= CSUR P1162 = DSM 29078) is the type strain of B. andreraoultii sp. nov. This bacterium was isolated from the stool of a 2-year-old Nigerian boy with a severe form of kwashiorkor. Bacillus andreraoultii is an aerobic, Gram-positive rod. We describe here the features of this bacterium, together with the complete genome sequencing and annotation. The 4 092 130 bp long genome contains 3718 protein-coding and 116 RNA genes. New Microbes and New Infections © 2015 The Authors. Published by Elsevier Ltd on behalf of European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases.

Keywords: Culturomics, genome Original Submission: 14 September 2015; Revised Submission: 15 December 2015; Accepted: 16 December 2015 Article published online: 23 December 2015

gene-based phylogeny [5], G+C content and DNA-DNA hy- Corresponding author: J. M. Rolain, Unité de Recherche sur les bridization (DDH)) [3,6] exhibit several drawbacks. The num- Maladies Infectieuses et Tropicales Emergentes, UM 63, CNRS 7278, IRD 198, Inserm U1095, Institut Hospitalo-Universitaire Médi- ber of sequenced bacterial genomes has rapidly increased due terranée-Infection, Faculté de médecine, Aix-Marseille Université, 27 to the decrease in cost of sequencing (to date, almost 40 000 Boulevard Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05, France bacterial genomes have been sequenced). Therefore, the E-mail: [email protected] genomic data, the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-ﬂight mass spectrometry (MALDI-TOF) spectrum [7] and phenotypic criteria have been proposed for the descrip- Introduction tion of new bacterial species [8,9]. The genus Bacillus was discovered in 1872 (Cohn, 1872) [10]. The genus is composed of 331 species with validly published Bacillus andreraoultii strain SIT1T (= CSUR P1162 = DSM 29078) names (Bacillus, http://www.doi.namesforlife.com/). Species of the is the type strain of B. andreraoultii sp. nov. This bacterium was genus Bacillus are ubiquitous bacteria isolated from various en- isolated from the stool of a 2-year-old Nigerian boy with vironments including soil, gastrointestinal tracts of various insects kwashiorkor, a severe form of acute malnutrition, and is part of and animals, vegetation, fresh- and seawater and food [11].In an effort called culturomics to cultivate all bacterial species human beings, the Bacillus species may exist in opportunistic form from the human gut [1,2]. This is a Gram-positive, aerobic or in immunocompromised patients [12] or in pathogenic form, facultatively anaerobic, motile, spore-forming, indole-negative such as B. cereus (food poisoning) and B. anthracis (anthrax) [13]. and rod-shaped bacillus. Other species may also be found in various human infections, The ruling taxonomic classiﬁcation of prokaryotes is based including pneumonia, endocarditis, and ocular, cutaneous, bone on a combination of phenotypic and genotypic criteria [3,4]. or central nervous system infections and bacteraemia [14]. However, the three essential criteria that are used (16S rRNA

New Microbe and New Infect 2016; 10: 25–35 New Microbes and New Infections © 2015 The Authors. Published by Elsevier Ltd on behalf of European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/) http://dx.doi.org/10.1016/j.nmni.2015.12.005 63 26 New Microbes and New Infections, Volume 10 Number C, March 2016 NMNI

The following is a summary classification and a set of features bacteria. The method of identification included the m/z from for Bacillus andreraoultii sp. nov. strain SIT1T together with the 3000 to 15 000 Da. For every spectrum, a maximum of 100 description of the complete genomic sequencing and annota- peaks were compared with spectra in the database. The tion. These particularities support the circumscription of the resulting score enabled the identification of species whether species Bacillus andreraoultii. tested or not: a score of 2 with a validly published species enabled identification at the species level, a score of 1.7 but <2 enabled identification at the genus level and a score of <1.7 Materials and methods did not enable any identification. Identification of bacteria continued with a 16S rRNA stan- Sample collection, strain isolation and culture dard PCR coupled with sequencing. That was performed using condition GeneAmp PCR System 2720 thermal cyclers (Applied Bio- A stool sample was obtained from a 2-year-old Nigerian boy systems, Bedford, MA, USA) and ABI Prism 3130xl Genetic with kwashiorkor, a severe form of acute malnutrition, who Analyser capillary sequencer (Applied Biosystems) respectively was admitted to the emergency room in the national hospital [16]. The 16S rRNA nucleotides sequence was corrected using in Niamey, the capital city of Niger, in October 2013 [2].The Chromas Pro 1.34 software (Technelysium, Tewantin, study was approved by the local ethics committee of the Australia), and the BLASTn searches were performed in the Institut Fédératif de Recherche IFR48, Faculty of Medicine, online PubMed National Center for Biotechnology Information Marseille, France, under agreement 09-022. The fecal specimen (NCBI) database (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.gate1.inist.fr/ was preserved at 4°C after collection. Then the stool was sent Blast.cgi). to Marseille, where it was kept at −80°C until laboratory culture isolation. Strain SIT1T was isolated in March 2014 by Morphologic, biochemical and antibiotic susceptibility cultivation on 5% sheep’sblood–enriched Columbia agar tests T (bioMérieux, Marcy l’Étoile, France) in an anaerobic atmo- Bacillus andreraoultii strain SIT1 was observed, after negative sphere at 37°C after 10 days of stool specimen incubation in a colouration, using a Morgani 268D (Philips, Amsterdam, The culture bottle containing a blood-enriched Columbia agar Netherlands) transmission electron microscope at an operating liquid medium (bioMérieux). Growth of the strain was tested voltage of 60 kV. The Gram colouration was performed using under anaerobic conditions using GENbag anaer system (bio- Color Gram 2 Kit (bioMérieux) and observed by using the Mérieux), and under aerobic conditions, with or without 5% DM1000 photonic microscope (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) with a 100× oil-immersion objective lens. The CO2. Different growth temperatures (25, 30, 37, 45, 55°C) were also tested. sporulation test was done doing a thermic shock (80°C during 30 minutes). To evaluate the motility of Bacillus andreraoultii, MALDI-TOF and 16S sequencing fresh colonies were observed between blades and slats using a MALDI-TOF protein analysis was carried out as previously DM1000 photonic microscope (Leica) with a 40× objective described [15] using a Microflex spectrometer (Bruker Dal- lens. tonics, Leipzig, Germany). In brief, a pipette tip was used to API ZYM, API 20 NE and API 50 CH (bioMérieux) gallery pick one isolated bacterial colony from a culture agar plate and systems were used to perform biochemical assays. Oxidase spread it as a thin film on an MSP 96 MALDI-TOF target plate (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) and catalase assays (Bruker). Twenty distinct deposits from 20 isolated colonies (bioMérieux) were done separately. The antibiotic susceptibility were tested for strain SIT1T. Each smear was overlaid with 2 was tested using SirScan Discs antibiotics (i2a, Montpellier, μL of matrix solution (saturated solution of alpha-cyano-4- France). hydroxycinnamic acid in 50% acetonitrile and 2.5% trifluor- acetic acid) and allowed to dry for 5 minutes. Spectra were Genome sequencing T recorded in the positive linear mode for the mass range of Genomic DNA extraction of Bacillus andreraoultii strain SIT1 2000 to 20 000 Da (parameter settings: ion source 1 (ISI), 20 was performed according to the method previously described kV; IS2, 18.5 kV; lens, 7 kV). A spectrum was obtained after [17]. The DNA was resuspended in 205 μL TE buffer. The 240 shots with variable laser power. The time of acquisition DNA concentration was 401.63 ng/μL as measured by a Qubit fl was between 30 seconds and 1 minute per spot. The 20 SIT1T uorometer using the high-sensitivity kit (Life Technologies, spectra were imported into MALDI BioTyper 3.0 software Carlsbad, CA, USA). (Bruker) and analysed by standard pattern matching (with Genomic DNA of B. andreraoultii was sequenced on the default parameter settings) against the main spectra of 7379 MiSeq Technology (Illumina, San Diego, CA, USA) with the

New Microbes and New Infections © 2015 The Authors. Published by Elsevier Ltd on behalf of European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, NMNI, 10,25–35 This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)

64 NMNI Traore et al. Genome of Bacillus andreraoultii 27

mate pair strategy. The gDNA was barcoded in order to be were identified if all the BLASTP performed did not retrieve mixed with 11 other projects with the Nextera Mate Pair positive results. Such parameter thresholds have already been sample prep kit (Illumina). used in previous works to define ORFans. Genomes were The gDNA was quantified by a Qubit assay with the high- automatically retrieved from the 16s RNA tree using Phylo- sensitivity kit (Life Technologies) to 87.67 ng/μL. The mate pattern software [22]. For each selected genome, complete pair library was prepared with 1 μgofgenomicDNAusingthe genome sequences, proteome genome sequences and Nextera mate pair Illumina guide. The genomic DNA sample Orfeome genome sequences were retrieved from the FTP site was simultaneously fragmented and tagged with a mate pair of NCBI. All proteomes were analysed with Proteinortho [23]. junction adapter. The pattern of fragmentation was validated Then for each couple of genomes a similarity score was on an Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies, Santa computed. This score is the mean value of nucleotide similarity Clara, CA, USA) with a DNA 7500 lab chip. The DNA frag- between all couple of orthologues in the two genomes studied ments ranged in size from 1 to 11 kb, with an optimal size of (average genomic identity of orthologous gene sequences, 4.851 kb. No size selection was performed, and 432.1 ng of AGIOS) [9]. The resistome was analysed with the ARG- tagmented fragments were circularized. The circularized DNA ANNOT (Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation) data- was mechanically sheared into small fragments with an optimal base and BLASTp in GenBank [24]. The exhaustive bacteriocin size of 684 bp on the Covaris device S2 in microtubes database available in our laboratories (Bacteriocins from the (Covaris, Woburn, MA, USA). The library profile was visual- URMITE database) (http://drissifatima.wix.com/bacteriocins) ized on a High Sensitivity Bioanalyzer LabChip (Agilent), and was performed by collecting all currently available sequences the final concentration library was measured at 64.49 nmol/L. from the databases and from NCBI. Protein sequences from The libraries were normalized at 2 nM and pooled. After this database allowed putative bacteriocins from human gut denaturation and dilution at 15 pM, the pool of libraries was microbiota to be identified using BLASTp methodology [25]. loaded onto the reagent cartridge and then onto the instrument PHAST (PHAge search tool) was used to identify phage se- along with the flow cell. Automated cluster generation and a quences [26]. single 39-hour sequencing run were performed at a 2 × 251 bp An annotation of the entire proteome was performed to read length. define the distribution of functional classes of predicted genes All 8.2 Gb of information was obtained from a 947K/mm2 according to the clusters of orthologous groups of proteins cluster density, with a cluster passing quality control filters with using the same method as for the genome annotation. 99% (18 111 784 clusters). Within this run, the index repre- sentation for Bacillus andreraoultii was determined to 9.27%. The Results 1 513 908 paired reads were filtered according to the read qualities. The reads obtained from applications were trimmed, and an optimal assembly of 14 scaffolds and 58 contigs was Strain identification and phylogenetic analyses obtained through the SOAPdenovo software, which generated No significant MALDI-TOF score was obtained for strain SIT1T a genome size of 4.09 Mb. against the Bruker database, suggesting that our isolate was not a member of a known species. We added the spectrum from Genome annotation and comparison strain SIT1T to our database (Figure 1). Then a gel view was Open reading frames (ORFs) were predicted using Prodigal performed to show the spectral differences with other mem- [18] with default parameters, but the predicted ORFs were bers of the genus Bacillus (Figure 2). excluded if they spanned a sequencing gap region (contain N). Using 16S rRNA phylogeny analyses, we demonstrated that The predicted bacterial protein sequences were searched strain SIT1T exhibited a 96% 16S rRNA sequence identity with against the Clusters of Orthologous Groups (COGs) database Bacillus thermoamylovorans (GenBank accession no. HM030742), using BLASTP (e-value 1e-03, coverage of 0.7, and an identity the phylogenetically closest bacterial species with standing in percentage of 30%). If no hit was found, it search against the nomenclature (Figure 3). Its 16S rRNA sequence was deposited NR database using BLASTP with an e-value of 1e-03, coverage in GenBank under accession no. LK021120. This value was of 0.7 and an identity percentage of 30%. If sequence lengths lower than the 98.7% 16S rRNA gene sequence threshold were smaller than 80 amino acids, we used an e-value of 1e-05. recommended by Stackebrandt and Ebers [5] to delineate a fi The tRNAScanSE tool [19] was used to nd tRNA genes, new species without carrying out DNA-DNA hybridization. whereas ribosomal RNAs were found by using RNAmmer Thus, this bacterium was considered as a new species called [20]. Lipoprotein signal peptides and the number of trans- Bacillus andreraoultii strain SIT1T belonging family Bacillaceae membrane helices were predicted using Phobius [21]. ORFans (Table 1).

65 28 New Microbes and New Infections, Volume 10 Number C, March 2016 NMNI

8000

6000

4000 Intens. [a.u.]

2000

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000

FIG. 1. Reference mass spectrum from Bacillus andreraoultii strain SIT1T. Spectra from 20 individual colonies were compared and reference spectrum generated.

FIG. 2. Gel view comparing Bacillus andreraoultii SIT1T to other Bacillus species. Gel view displays raw spectra of loaded spectrum ﬁles arranged in pseudo-gel-like look. x-axis records m/z value. Left y-axis displays running spectrum number originating from subsequent spectra loading. Peak intensity is expressed in arbitrary units by greyscale scheme code, as indicated on right y-axis. Displayed species are indicated at left.

66 NMNI Traore et al. Genome of Bacillus andreraoultii 29

TABLE 1. Classiﬁcation and general features of Bacillus andreraoultii strain SIT1T according to MIGS recommendations [27].

MIGS ID Property Term Evidence codea

Domain: Bacteria TAS [28] Phylum: Firmicutes TAS [29–31] Class: Bacilli TAS [32,33] Current classification Order: Bacillales TAS [34,35] Family: Bacillaceae TAS [35,36] Genus: Bacillus TAS [10,35] Species: Bacillus IDA andreraoultii Type strain SIT1T IDA Gram stain Positive IDA Cell shape Rod-shaped IDA Motility Motile IDA Sporulation Sporulating IDA Temperature range Mesophile IDA FIG. 3. Phylogenetic tree highlighting position of Bacillus andreraoultii sp. Optimum temperature 37–45°C IDA T MIGS-6.3 Salinity 0 nov. strain SIT1 (= CSUR P1162 = DSM 29078) relative to other type MIGS-22 Oxygen requirement Aerobic or facultative IDA strains within Bacillus genus. Strains and their corresponding GenBank anaerobic Carbon source Unknown IDA accession numbers for 16S rRNA genes are (type = T): B. infantis strain Energy source Unknown IDA MIGS-6 Habitat Human gut IDA NRRL B-14911, NR121756; B. firmus strain 5695m-D2, AJ509007; MIGS-15 Biotic relationship Free-living IDA MIGS-14 Pathogenicity Unknown B. subterraneus strain COOI3B, NR104749; B. niacini strain Et9/1, Biosafety level 2 Isolation Human faeces KJ722425; B. fumarioli strain R-14705, AJ581126; B. thermolactis strain R- MIGS-4 Geographic location Marseille, France IDA MIGS-5 Sample collection time March 2013 IDA 33520, AM910339; B. thermoamylovorans strain N12-2, HM030742; MIGS-4.1 Latitude 43.296482 IDA MIGS-4.1 Longitude 5.36978 IDA B. circulans strain WSBC20059, Y13063; B. coagulans strain 36D1, MIGS-4.3 Depth Surface IDA DQ297926; B. oleronius strain ATCC700005, NR043325; Flaviflexus MIGS-4.4 Altitude 0 m above sea level IDA huanghaiensis strain H5, JN815236. Sequences were aligned using MIGS, minimum information about a genome sequence. aEvidence codes are as follows: IDA, inferred from direct assay; TAS, traceable CLUSTALW, and phylogenetic inferences were obtained using author statement (i.e. a direct report exists in the literature); NAS, nontraceable author statement (i.e. not directly observed for the living, isolated sample, but based maximum likelihood method within MEGA6. Numbers at nodes are on a generally accepted property for the species or anecdotal evidence). These evidence codes are from the Gene Ontology project (http://www.geneontology. percentages of bootstrap values obtained by repeating analysis 1000 org/GO.evidence.shtml). If the evidence code is IDA, then the property should have been directly observed, for the purpose of this specific publication, for a live isolate times to generate majority consensus tree. Flaviflexus huanghaiensis by one of the authors, or by an expert or reputable institution mentioned in the strain H5 (JN815236) was used as outgroup. Scale bar = 2% nucleotide acknowledgements. sequence divergence.

Phenotypic and biochemical characteristics nitrate reductase–hydrolysis reaction (β-glucosidase, esculine), B. andreraoultii growth occurred at all temperatures tested; and β-galactosidase and assimilation reaction (potassium gluco- however, optimal growth was observed between 37 and 45°C nate) were also positive. Negative reactions were found for after 24 hours of incubation. Colonies were 0.1 to 0.3 μm urease, indole, arginine dihydrolase and fermentation (glucose). diameter on blood-enriched Columbia agar. Growth was ach- Using an API 50 CH strip, positive reactions were recorded for ieved aerobically and weak growth anaerobically. Gram staining L-arabinose, D-ribose, D-xylose, D-glucose, D-fructose, D- showed rod-shaped, Gram-positive bacilli (Figure 4). Cells were mannose, N-acetylglucosamine, arbutine, esculine, salicine, D- grown on agar sporulate. A motility test was positive. Cells celiobiose, D-maltose, D-saccharose, D-trehalose and amidon. grown on agar are smooth and greyish after 24 hours of incubation, and they have an average width and length of 0.5 μm and 3 μm, respectively, and exhibited ﬂagella (Figure 5). Strain SIT1T showed catalase activity but was negative for oxidase. Using an API ZYM strip, positive reactions were observed for alkaline phosphatase, esterase (C4), esterase lipase (C8), acid phosphatase, naphthol-AS-BI-phosphohydrolase, α-galactosidase, β-galactosidase, α-glucosidase and β-glucosidase. Negative reactions were observed for lipase (C14), leucine arylamidase, valine arylamidase, cystine arylamidase, trypsin, α-chymotrypsin, β-glucuronidase, N-acetyl- β-glucosaminidase, α-mannosidase and α-fucosidase. Using an API 20 NE strip, the FIG. 4. Gram staining of B. andreraoultii strain SIT1T.

67 30 New Microbes and New Infections, Volume 10 Number C, March 2016 NMNI

Negative reactions were recorded for glycerol, erythritol, D- arabinose, L-xylose, D-adonitol, methyl-βD-xylopyranoside, D- galactose, L-sorbose, L-rhamnose, dulcitol, inositol, D-mannitol, D-sorbitol, methyl-αD-mannopyranoside, methyl-αD-glucopyr- anoside, amygdalin, D-lactose, D-melibiose, inulin, D-melezitose, D-rafﬁnose, glycogen, xylitol, gentiobiose, D-turanose, D-lyxose, D-tagatose, D-fucose, L-fucose, D-arabitol, L-arabitol, potassium gluconate, potassium 2-ketogluconate and potassium 5- ketogluconate. Bacillus andreraoultii SIT1 was resistant to trimethroprim- sulphamethoxazole, macrolide (erythromycin), vancomycin and the third generation of cephalosporin (ceftriaxone) but was susceptible to fosfomycin, imipenem, penicillin, amoxicillin, gentamicin, ciproﬂoxacin, doxycycline and rifampicin. Five species with validly published names in the Bacillus genus were FIG. 5. Transmission electron microscopy of B. andreraoultii strain selected to make a phenotypic comparison with B. andreraoultii SIT1T using Morgani 268D (Philips) at operating voltage of 60kV. Scale (Table 2). bar = 500 nm.

Genomic characteristics and genome comparison Bacillus andreraoultii SIT1T was selected for sequencing on the basis of its phenotypic differences, phylogenetic position and

TABLE 2. Differential characteristics of Bacillus andreraoultii SIT1T; B. thermoamylovorans strain LMG 18084T; B. thermolactis strain R-6488T; B. circulans strain LMG 13261T; B. subterraneus strain COO13BT; and B. niacin 2923T

B. Property B. andreraoultii B. thermoamylovorans B. thermolactis circulans B. subterraneus B. niacini

Cell diameter (μm) 0.1–0.3 0.5–41–41–3 0.5–12 3–5 Mean length (μm) 3 5 10 4.2 25 5.6 Oxygen requirement F/anaerobic F/anaerobic F/anaerobic F/anaerobic F/anaerobic Aerobic Gram stain + + + −− + Motility + + − ++ − Flagella + NA + + + − Endospore formation + + + + − + Production of: Alkaline phosphatase + NA NA NA NA NA Acid phosphatase + NA NA NA NA NA Catalase + + + NA + NA Oxidase − ++−− + Nitrate reductase + + + v + + Indole −− −−−− Urease −− −−−− α-Galactosidase + NA NA NA NA NA β-Galactosidase + NA NA NA − NA β-Glucuronidase − NA NA NA − NA α-Glucosidase + NA NA NA + NA β-Glucosidase + NA NA NA + NA Esterase + NA NA NA NA NA Esterase lipase + NA NA NA NA NA Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase + NA NA NA NA NA N-acetyl-β-glucosaminidase − NA NA NA NA NA Pyrazinamidase NA NA NA NA NA NA α-Mannosidase − NA NA NA NA − α-Fucosidase − NA NA NA NA NA Leucine arylamidase − NA NA NA NA NA Valine arylamidase − NA NA NA NA NA Cystine arylamidase − NA NA NA NA NA α-Chemotrypsin − NA NA NA NA NA Trypsin − NA NA NA NA NA Utilization of: 5-Keto-gluconate −− −vNANA D-Xylose + + + + + − D-Fructose + + + + + + D-Glucose + + + + + + D-Mannose + + − + − NA Habitat Human gut Wine, grass . . . Raw milk Bee larvae Subterranean water Soil

+, positive result; −, negative result; v, variable result; NA, data not available.

68 NMNI Traore et al. Genome of Bacillus andreraoultii 31

FIG. 6. Graphical circular map of genome. From outside to center: Contigs (red/grey), COGs category of genes on forward strand (three circles), genes on forward strand (blue circle), genes on reverse strand (red circle), COGs category on reverse strand (three circles), GC content.

16S rRNA sequence similarity to other members of the Bacillus The genome is 4 092 130 bp long with 35.42% G+C content. genus. It was part of a culturomics study aimed at isolating all On the 3843 predicted genes, 3718 were protein-coding genes bacterial species from human digestive flora in patients with and 116 were RNAs genes. The remaining genes were anno- kwashiorkor, an acute form of malnutrition. It is the first tated as hypothetical proteins (712 genes, >19.15%). The sequenced genome from B. andreraoultii sp. nov. The European properties and statistics of the genome are summarized in Molecular Biology Laboratory (EMBL) accession number of Table 4. The distribution of genes into functional COGs cate- B. andreraoultii genome is CCFJ00000000 and consists of 14 gories is presented in Table 5. The draft genome sequence of scaffolds and 58 contigs (Figure 6). Table 3 shows the project Bacillus andreraoultii was smaller than those of Bacillus halodurans information and its association with minimum information C-125, Bacillus pseudofirmus OF4 and Lysinibacillus sphaericus about a genome sequence (MIGS) version 2.0 compliance [27].

TABLE 4. Nucleotide content and gene count levels of genome TABLE 3. Project information Attribute Value % of totala MIGS ID Property Term Size (bp) 4 092 130 100 MIGS-31 Finishing quality High-quality draft G+C content (bp) 1 434 521 35.42 MIGS-28 Libraries used Mate pair Coding region (bp) 3 248 339 79.38 MIGS-29 Sequencing platform Illumina MiSeq Total genes 3834 100 MIGS- Fold coverage 185× RNA genes 116 3.0 31.2 Protein-coding genes 3718 100 MIGS-30 Assemblers SOAPdenovo Genes with function prediction 2505 67.37 MIGS-32 Gene calling method Prodigal Genes assigned to COGs 2420 65.08 GenBank date of release is 8-07-2015 Genes with peptide signals 308 8.26 NCBI project ID PRJEB6477 Genes with transmembrane helices 918 24.69 EMBL accession CCFJ00000000 MIGS-13 Project relevance Study of human gut microbiome COGs, Clusters of Orthologous Groups database. aTotal is based on either the size of genome in base pairs or total number of EMBL, European Molecular Biology Laboratory; MIGS, minimum information about protein-coding genes in annotated genome. a genome sequence; NCBI, National Center for Biotechnology Information.

69 32 New Microbes and New Infections, Volume 10 Number C, March 2016 NMNI

TABLE 5. Number of genes associated with 25 general COGs Bacillus andreraoultii contained a bacteriocin (colicin) con- functional categories sisting of 175 amino acids harboured with the bacteriocins of

Code Value % Value Description Paenibacillus and Lactobacillus (Figure 8) and sharing 62% of the homology of Bacillus vireti. The results did not indicate the J 163 4.3840775 Translation A 0 0 RNA processing and modification presence of nonribosomal peptide synthetases and polyketide K 192 5.164067 Transcription L 233 6.26681 Replication, recombination and repair synthases and phage. We performed the analysis of the resis- B 1 0.02689618 Chromatin structure and dynamics T D 31 0.8337816 Cell cycle control, mitosis and meiosis tome of Bacillus andreraoultii SIT1 antibiotic classes of the Y 0 0 Nuclear structure macrolide–lincosamide–streptogramin B (MLSB) antibiotics, V 62 1.6675632 Defense mechanisms T 118 3.1737492 Signal transduction mechanisms such as ATP-binding transporters (ABC) lsaB and msrD, major M 107 2.8778913 Cell wall/membrane biogenesis N 65 1.7482517 Cell motility facilitator transporters mefA, transferases (vatA) and two- Z 0 0 Cytoskeleton W 0 0 Extracellular structures component system vancomycin resistance vanS/vanR, norA U 41 1.1027434 Intracellular trafficking and secretion O 105 2.824099 Posttranslational modification, (Table 7). protein turnover, chaperones C 145 3.899946 Energy production and conversion G 172 4.626143 Carbohydrate transport and metabolism E 255 6.858526 Amino acid transport and metabolism F 71 1.9096289 Nucleotide transport and metabolism Conclusion H 95 2.5551372 Coenzyme transport and metabolism I 116 3.119957 Lipid transport and metabolism P 181 4.8682084 Inorganic ion transport and metabolism Q 47 1.2641205 Secondary metabolites biosynthesis, On the basis of phenotypic, phylogenetic and genomic analyses transport and catabolism R 344 9.252286 General function prediction only (taxonogenomics), we formally propose the creation of Bacillus S 245 6.589564 Function unknown T — 1298 34.911243 Not in COGs andreraoultii sp. nov. that contains the strain SIT1 . This bac- COGs, Clusters of Orthologous Groups database. terium was isolated from the stool of a 2-year-old Nigerian boy with kwashiorkor, a severe form of acute malnutrition.

Description of Bacillus andreraoultii sp. nov. C3-41 (4.09, 4.20, 4.25 and 4.82 MB respectively) but larger than those of Solibacillus silvestris StLB046, Bacillus pumilus SAFR- 032 and Bacillus coagulans 2-6 WK1 (3.98, 3.70 and 3.07 MB, The Bacillus andreraoultii name come from André Raoult, who respectively). The G+C content of Bacillus andreraoultii was was a military doctor who worked with malnutrition and smaller than those of Bacillus pumilus SAFR-032, Bacillus coagu- kwashiorkor in Senegal and who described its specific features lans 2-6, Bacillus halodurans C-125, Bacillus pseudofirmus OF4 and [37]. Lysinibacillus sphaericus C3-41 (35.42, 41.29, 47.29, 43.69, 39.86 Strain SIT1T is aerobic, Gram positive, endospore forming, and 37.13% respectively). The gene content of Bacillus andrer- motile and rod shaped. Growth was achieved aerobically be- aoultii was smaller than those of Bacillus halodurans C-125, Ba- tween 25 and 55°C (optimum 37 to 45°C). After 24 hours of cillus pseudofirmus OF4 and Lysinibacillus sphaericus C3-41 (3718, growth on 5% sheep’s blood–enriched Columbia agar at 37°C, 4052, 4335 and 4771, respectively) but larger than those of bacterial colonies were smooth and greyish with a diameter of Bacillus pumilus SAFR-032 and Bacillus coagulans 2-6 (3681 and 0.1 to 0.3 mm. The cells had a mean width and length of 0.5 μm 2971 respectively) (Table 6). The distribution of genes into and 3 μm, respectively, and exhibited flagella. They were COGs categories in the genomes from all seven compared catalase positive and oxidase negative. Bacillus species, Anoxybacillus flavithermus, Lysinibacillus sphaericus Bacillus andreraoultii SIT1T was resistant to trimethroprim- and solibacillus silvestris (Figure 7). sulphamethoxazole, macrolide (erythromycin), vancomycin

TABLE 6. Numbers of orthologous proteins shared between genomes (upper right) and AGIOS values obtained (lower left)

Bacillus Bacillus Bacillus Lysinibacillus Bacillus Bacillus halodurans pseudoﬁrmus coagulans sphaericus pumilus andreraoultii

B. halodurans 4052a 1819 1293 1360 1603 1429 B. pseudoﬁrmus 68.7% 4335a 1300 1388 1577 1452 B. coagulans 63.5% 63.2% 2971a 1166 1366 1362 L. sphaericus 63.2% 63.9% 62.4% 4771a 1409 1317 B. pumilus 64.8% 65.4% 64.4% 64% 3681a 1472 B. andreraoultii 64.4% 65.2% 64.1% 65.6% 65.6% 3718a

AGIOS, average genomic identity of orthologous gene sequences. aNumbers of proteins per genome. Percentage 0.660 = 6.

70 NMNI Traore et al. Genome of Bacillus andreraoultii 33

FIG. 7. Distribution of functional classes of predicted genes in genomes from Bacillus andreraoultii, Anoxybacillus ﬂavithermus, Bacillus atrophaeus, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus halodurans, Bacillus pseudoﬁrmus, Bacillus pumilus, Lysinibacillus sphaericus and Solibacillus silvestris chromosomes according to clusters of orthologous groups of proteins.

FIG. 8. Molecular phylogenetic analysis by maximum likelihood method of representatives of genus Bacillus andreraoultii SIT1T inferred from 16S rRNA gene sequence. Tree with highest log likelihood (−2930.4905) is shown. Percentage of trees in which associated taxa clustered together is shown next to branches. Initial trees for heuristic search were obtained automatically by applying neighbour-joining and BioNJ algorithms to matrix of pairwise distances estimated using JTT model, then selecting topology with superior log likelihood value. Tree is drawn to scale, with branch lengths measured in number of substitutions per site. Analysis involved 14 amino acid sequences. There 155 positions in ﬁnal data set. Evolutionary analyses were conducted in MEGA5.

71 34 New Microbes and New Infections, Volume 10 Number C, March 2016 NMNI

TABLE 7. List of genes associated with antibiotic resistance in Bacillus andreraoultii SIT-1

Gene function ORF Gene name GC Size (aa) Function Best BLAST hit, GenBank % Coverage % Identity

MLSB 328 lsaB 32.7 494 ABC transporter Bacilli 100 94 Glycopeptide 395 van S 34.7 378 Sensor histidine kinase VanS Bacillus sp. J37 99 82 Glycopeptide 396 vanR 36.6 232 Vancomycin response regulator VanR Clostridium clariﬂavum 100 96 MLSB 431 vatA 35 213 Chloramphenicol acetyltransferase Paucisalibacillus globulus 100 99 MLSB 572 msrd 38.7 487 ABC transporters Clostridium kluyveri NBRC 12016 100 100 MLSB 573 mefA 37.2 408 Macrolide-efﬂux protein Clostridium kluyveri 100 100 MLS 583 msrd 35.8 177 ABC-F type ribosomal protection protein Bacteroides 100 91

ORF, open reading frame; MLSB, macrolide–lincosamide–streptogramin B.

and the third generation of cephalosporin (ceftriaxone). It [9] Ramasamy D, Mishra AK, Lagier JC, Padhmanabhan R, Rossi M, contained a bacteriocin. Sentausa E, et al. A polyphasic strategy incorporating genomic data for the taxonomic description of novel bacterial species. Int J Syst Evol The genome is 4 092 130 bp long, and the G+C content is Microbiol 2014;64(pt 2):384–91. 35.42%. The 16S rRNA gene sequence and whole-genome [10] Cohn F. Untersuchungen über Bakterien. Beitrage zur Biologie der shotgun sequence of B. andreraoultii strain SIT1T are deposited Pflanzen Heft 1872;1:127–224. [11] Nicholson WL. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell in GenBank under accession nos. LK021120 and Mol Life Sci 2002;59:410–6. T CCFJ00000000, respectively. The type strain SIT1 (= CSUR [12] Logan NA. Bacillus species of medical and veterinary importance. P1162 = DSM 29078) was isolated from the stool of a 2-year- J Med Microbiol 1988;25:157–65. [13] Jernigan JA, Stephens DS, Ashford DA, Omenaca C, Topiel MS, old Nigerien boy with kwashiorkor, a severe form of acute Galbraith M, et al. Bioterrorism-related inhalational anthrax: the first malnutrition. 10 cases reported in the United States. Emerg Infect Dis 2001;7: 933–44. [14] Bottone EJ. Bacillus cereus, a volatile human pathogen. Clin Microbiol Conflict of Interest Rev 2010;23:382–98. [15] Seng P, Drancourt M, Gouriet F, La Scola B, Fournier PE, Rolain JM, et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of fl None declared. bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of- ight mass spectrometry. Clin Infect Dis 2009;49:543–51. [16] Nkamga VD, Huynh HT, Aboudharam G, Ruimy R, Drancourt M. Diversity of human-associated Methanobrevibacter smithii isolates References revealed by multispacer sequence typing. Curr Microbiol 2015;70: 810–5. [17] Padmanabhan R, Dubourg G, Lagier JC, Couderc C, Michelle C, [1] Dubourg G, Lagier JC, Robert C, Armougom F, Hugon P, Metidji S, Raoult D, et al. Genome sequence and description of Corynebacterium et al. Culturomics and pyrosequencing evidence of the reduction in gut ihumii sp. nov. Stand Genomic Sci 2014;9:1128–43. microbiota diversity in patients with broad-spectrum antibiotics. Int J [18] Hyatt D, Chen GL, Locascio PF, Land ML, Larimer FW, Hauser LJ. Antimicrob Agents 2014;44:117–24. Prodigal: prokaryotic gene recognition and translation initiation site [2] Lagier JC, Armougom F, Million M, Hugon P, Pagnier I, Robert C, et al. identification. BMC Bioinformatics 2010;11:119. Microbial culturomics: paradigm shift in the human gut microbiome [19] Lowe TM, Eddy SR. tRNAscan-SE: a program for improved detection study. Clin Microbiol Infect 2012;18:1185–93. of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res [3] Tindall BJ, Rossello-Mora R, Busse HJ, Ludwig W, Kampfer P. Notes on 1997;25:955–64. the characterization of prokaryote strains for taxonomic purposes. Int [20] Lagesen K, Hallin P, Rodland EA, Staerfeldt HH, Rognes T, Ussery DW. J Syst Evol Microbiol 2010;60(pt 1):249–66. RNAmmer: consistent and rapid annotation of ribosomal RNA genes. [4] Stackebrandt E, Frederiksen W, Garrity GM, Grimont PA, Kämpfer P, Nucleic Acids Res 2007;35:3100–8. Maiden MC, et al. Report of the ad hoc committee for the re- [21] Kall L, Krogh A, Sonnhammer EL. A combined transmembrane to- evaluation of the species definition in bacteriology. Int J Syst Evol pology and signal peptide prediction method. J Mol Biol 2004;338: Microbiol 2002;52(pt 3):1043–7. 1027–36. [5] Stackebrandt E, Ebers J. Taxonomic parameters revisited: tarnished [22] Gouret P, Thompson JD, Pontarotti P. PhyloPattern: regular expres- gold standards. Microbial Today 2006;33:152–5. sions to identify complex patterns in phylogenetic trees. BMC Bioin- [6] Rossello-Mora R. DNA-DNA reassociation methods applied to mi- formatics 2009;10:298. crobial taxonomy and their critical evaluation. In: Stackebrandt E, ed- [23] Lechner M, Findeiss S, Steiner L, Marz M, Stadler PF, Prohaska SJ. itor. Molecular identification, systematics, and population structure of Proteinortho: detection of (co-)orthologs in large-scale analysis. BMC Prokaryotes. Berlin: Springer; 2006. p. 23–50. Bioinformatics 2011;12:124. [7] Welker M, Moore ER. Applications of whole-cell matrix-assisted laser- [24] Aziz RK, Bartels D, Best AA, DeJongh M, Disz T, Edwards RA, et al. desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in systematic The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology. microbiology. Syst Appl Microbiol 2011;34:2–11. BMC Genomics 2008;9:75. [8] Kokcha S, Mishra AK, Lagier JC, Million M, Leroy Q, Raoult D, et al. [25] Drissi F, Buffet S, Raoult D, Merhej V. Common occurrence of anti- Non contiguous-finished genome sequence and description of Bacillus bacterial agents in human intestinal microbiota. Front Microbiol timonensis sp. nov. Stand Genomic Sci 2012;6:346–55. 2015;6:441.

72 NMNI Traore et al. Genome of Bacillus andreraoultii 35

[26] Zhou Y, Liang Y, Lynch KH, Dennis JJ, Wishart DS. PHAST: a fast [32] Oren A, Garrity GM. List of new names and new combinations pre- phage search tool. Nucleic Acids Res 2011;39(Web Server issue): viously effectively, but not validly, published. Int J Syst Evol Microbiol W347–52. 2015;65:3763–7. [27] Field D, Garrity G, Gray T, Morrison N, Selengut J, Sterk P, et al. The [33] Ludwig W, Schleifer KH, Whitman WB. Class I. Bacilli class nov. In: De minimum information about a genome sequence (MIGS) speciﬁcation. Vos P, Garrity G, Jones D, et al., editors. Bergey’s manual of systematic Nat Biotechnol 2008;26:541–7. bacteriology. 2nd ed.vol. 3. New York: Springer-Verlag; 2009. p. [28] Woese CR, Kandler O, Wheelis ML. Towards a natural system of 19–20. organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. [34] Prévot AR. Dictionnaire des bactéries pathogens. In: Hauduroy P, Proc Natl Acad Sci U S A 1990;87:4576–9. Ehringer G, Guillot G, et al., editors. Paris: Masson; 1953. p. 1–692. [29] Gibbons NE, Murray RGE. Proposals concerning the higher taxa of [35] Skerman VBD, McGowan V, Sneath PHA. Approved list of bacterial bacteria. Int J Syst Bacteriol 1978;28:1–6. names. Int J Syst Bacteriol 1980;30:225–420. [30] Garrity GM, Holt JG. The road map to the manual. In: Garrity GM, [36] Fischer A. Untersuchungen über bakterien. Jahrbücher für Wissen- Boone DR, Castenholz RW, editors. Bergey’s manual of systematic schaftliche Botanik 1895;27:1–163. bacteriology. 2nd ed.vol. 1. New York: Springer; 2001. p. 119–69. [37] Raoult A. Aspects of malnutrition in a big child in French East Africa; [31] Murray RGE. The higher taxa, or A place for everything... ? In: Holt JG, data from liver puncture biopsy. I. Bull Soc Pathol Exot Filiales 1959;52: editor. Bergey’s manual of systematic bacteriologyVol. 1. Baltimore: 97–114. Williams & Wilkins; 1984. p. 31–4.

Chapitre 3

Isolation and culture of Methanobrevibacter smithii by co-culturing with hydrogen

producing bacteria

To be submitted to Journal of clinical microbiology

Préambule Chapitre 3:

La culture des méthanogènes est réputée GLIILFLOH HW D H[LJp MXVTX¶j XQ SDVVp UpFHQW OD

SUpVHQFHG¶équipée hautement spécifique ; jODIRLVG¶XQH VRXUFHG¶K\GURJqQHHWD\DQWpYDFXp

O¶R[\JqQH /¶DEVHQFHG¶R[\JqQHHWODSUpVHQFHG¶K\GURJqQHpWDQWQpFHVVDLUHVjODFXOWXUHGHV méthanogènes. Récemment, nous avons pu montrer que les anaérobies en réalité étaient aéro-

LQWROHUDQWV HW TXH OD FXOWXUH HQ SUpVHQFH G¶DQWLR[\GDQW SHUPHWWDLW OD PLVH HQ FXOWXUH GH OD plupart de bactéries anaérobies. La culture de certaines de ces bactéries anaérobies génère

WRXWHIRLVGHO¶Kydrogène, en particulier, pour Bacteroides comme ceci est bien connu et a été démontré par Samuel et Gordon en 2006. Cette particularité des anaérobies nous a permis de

PHWWUH DX SRLQW XQ V\VWqPH SHUPHWWDQW G¶REWHQLU OD FXOWXUH GH Péthanogène en utilisant un système de culture en double chambre comprenant un milieu contenant des antioxydants, permettant la culture à la fois des méthanogènes et des bactéries anaérobies. Un cocktail

G¶DQWLELRWLTXHDHQVXLWHpWpDMRXWpdans la gélose destinés à cultiver Methanobrevibacter afin

G¶inhiber les bactéries associées aux méthanogènes dans des prélèvements multi-microbiens comme les prélèvements fécaux. Récemment, dans une hôte anaérobie, dans le cadre de notre travail sur O¶LVROHPHQW GHV EDFWpUies anaérobies par culturomics, nous avons été surpris de

GpFRXYULU SDU KDVDUG TX¶XQH GHs colonies identifiées sur gélose était un méthanogène

(Methanobrevibacter smithii) sans que nous ayons pris de conditions particulières pour sa culture. Cette découverte surprenante nous a amené à penser que dans cette hôte qui contenait

SDUDLOOHXUVGHVFXOWXUHVGHEDFWpULHVDQDpURELHODSUpVHQFHG¶K\GURJqQHDYDLWpWpVXIILVDQWH pour permettre la culture de M. smithii.

Dans ce travail, nous avons voulu voir si ces conditions pouvaient permettre dans une hôte

DQDpURELHEDQDOHVDQVLQWURGXFWLRQG¶K\GURJqQHGHFXOWLYHUDXVVLIDFLOHPHQW M. smithii.

Isolation and culture of Methanobrevibacter smithii by co-culturing with hydrogen

producing bacteria

Sory Ibrahima TRAORE1, Saber KHELAIFIA1, Nicholas ARMSTRONG1, Jean Christophe

LAGIER1, Didier RAOULT1*

1. Aix Marseille Univ, IRD, APHM, MEPHI, IHU-Méditerranée Infection, 19-21

Boulevard Jean Moulin, 13385, Marseille cedex 05, France

*Corresponding author: Prof. Didier RAOULT, Aix Marseille Univ, IRD, APHM, MEPHI,

IHU-Méditerranée Infection 19-21 Bd Jean Moulin 13005 Marseille, France. Tel: +33 (0)4 13

73 24 01 fax: + 33 (0) 13 73 24 02.

Email: [email protected]

Keywords: Methanobrevibacter smithii, co-culture, hydrogen, anaerobic bacteria, anaerobic chamber.

Abstract

Methanogenic archaea are considered as an extremely oxygen sensitive organism and their culture is fastidious requiring specific equipment. Under anaerobic chamber, we successfully cultured Methanobrevibacter smithii from a liquid culture medium inoculated with a stool collected from a healthy donor. The isolation in pure culture was then a success on agar medium by performing a co-culture with Bacteroides thetaiotaomicron. We have also successfully tested the co-cultivation of M. smithii with other known hydrogen-producing bacteria. Gas chromatographic tests showed that these strains produced hydrogen in different amounts and agar colonies were obtained by co-culture with these bacteria well viable and observable and methane production was measured by mass spectrometry. In this work, we propose a new approach to isolate and cultivate new strain of M. smithii by co-culture-based technic can facilitate and make available the isolation of new methagenic archaea strains in clinical microbiology laboratories.

83 Introduction

The cultivation of methanogens is considered difficult and has required until recently the presence of highly specific equipment; both a source of hydrogen and having evacuated oxygen [1]. The absence of oxygen and the presence of hydrogen are required for the methanogens culture. Recently, we have been able to show that anaerobes in reality were aero-intolerant and that the culture in the presence of antioxidant allowed culturing most of anaerobic bacteria [2]. The cultivation of some of these anaerobic bacteria, however, generates hydrogen, especially for Bacteroides as is well known [3]. This particularity of the anaerobes allowed us to develop a new system culture for methanogens using a double chamber culture system comprising a medium containing antioxidants, allowing the culture of both methanogens and anaerobes [4]. An antibiotic cocktail was added to the agar medium for growing Methanobrevibacter to inhibit methanogen-associated bacteria in multi-microbial specimens such as stool specimens. This work was the subject of a publication that allowed us to isolate a series of methanogens [4]. Recently, in an anaerobic host, as part of our work on the isolation of anaerobic bacteria by culturomics, we were surprised to discover by chance that one of the colonies identified on agar was a methanogen (Methanobrevibacter smithii) without having taken special conditions for its cultivation.This surprising discovery led us to believe that in this host, which also contained cultures of anaerobic bacteria, the presence of hydrogen had been sufficient to allow the cultivation of M. smithii. In this work, we wanted to see if these conditions could allow in an ordinary anaerobic host without introduction of hydrogen to cultivate M. smithii so easily.

84 Materiel and Methods

Ethics and sample collection

Stool specimen was collected from a healthy 26-year old Malian female living in France since three months. Prior to collection, the donor has signed informed consent and the study has been validated by the Ethics Committee of the IHU Méditerranée Infection under number

2016-011. Fecal specimen was collected in a recipient including a small anaerobic generator bag GENbag anaer (bioMérieux) immediately introduced to eliminate all the oxygen from the recipient. Thirty minutes after the sampling, the stool sample was transported to the anaerobic chamber where we proceeded to its culture.

Culture procedure

One gram of stool specimen was suspended in 2 mL of phosphate buffered saline (PBS) (Life

Technologies, Carlsbad, CA, USA) and inoculated in a blood culture bottle (Becton

Dickinson, Pont de Claix, France) supplemented with 5% of a mircofiltered (0.2ȝm) rumen.

After 72 hours of incubation at 37 ° C, we carried out 10 decreasing serial dilutions using

PBS, then 50ȝL were seeded on 5% sheep blood-enriched Columbia agar (bioMérieux, Marcy l'Etoile, France). Agar plates were then incubated at 37 ° C inside of the anaerobic chamber

(Don Whitley Scientific, France). After 4 days of incubation, the growing colonies were subcultured onto sterile agar plates for purification. The agar plate was divided into 8 equal parts and each isolated colony was subcultured onto one part of the agar (Figure 1) and then incubated at 37 ° C for 96 hours.

Co-culture of Methanobrevibacter smithii and Bacteroides thetaiotaomicron

In order to co-cultivate M. smithii with B. thetaiotaomicron on solid medium, we divided the agar plats in two compartments, then we seeded M. smithii on one compartment and B.

85 thetaiotaomicron on the second. The agar plates were then incubated for 72 hours at 37 ° C in a sealed plastic bag with an anaerobiosis generator GENbag anaer (bioMérieux). After 72 hours of incubation, the gas atmosphere was analyzed by gas chromatography (Figure 1) and the growing colonies were identified by Maldi TOF-MS as previously described [5].

We also realized the co-culture of M. smithii with B. thetaiotaomicron in liquid medium; an anaerobic blood culture flask containing M. smithii and B. thetaiotaomicron was prepared and incubated at 37 ° C for 5 days. Then, we proceeded to the measurement of hydrogen and methane contained in the blood culture flasks by mass spectrometry. The anaerobic blood culture flask inoculated with M. smithii alone was introduced as negative control.

Co-culture of M. smithii with hydrogen producing bacteria

The co-culture of M. smithii with hydrogen producing bacteria was realized in the anaerobic chamber on 5% sheep blood-enriched Columbia agar medium with the following bacterial species: Bacteroides fragilis, Bacteroides vulgatus, Parabacteroides distasonis,

Marseillibacter massiliensis, Allisonella histaminiformansas and Desulfovibrio piger. The agar plates, after seeding the strains, were contained in a plastic bag with anaerobic generator

GENbag anaer (bioMérieux) and incubated at 37 ° C for 72 hours.

MALDI-TOF MS identification

MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization Time-Of-Flight Mass

Spectrometry) identification was adapted for isolated colonies as previously described [5].

Isolated colonies were deposited in duplicate on a MALDI-TOF target to be analyzed. Then, a

Matrix solution enables the ionization and desorption of the archaeal or bacterial colonies was deposited on it. A score above 1.9 was considered as proper identification [6].

Hydrogen and methane measurements 86 Hydrogen and methane were measured using a Clarus 580 gas chromatography system

(Perkin Elmer, Villebon-sur-Yvette, France). 100 L of gas was sampled from Blood culture bottle or airtight bags with a gastight syringe, then directly injected (split 10 mL/min) onto a

Shincarbon ST 80/100 micropacked column (2 m x 0.53 mm; Restek, Lisses, France). Injector and oven were maintained at 110 and 70 ° C respectively. Gases were eluted using either

Helium or Argon depending on the compound detected by a Thermal Conductivity Detector maintained at 100 ° C. Hydrogen was detected in the negative polarity at 40 mA using Argon as elution/reference gas, whereas methane was detected in the positive polarity at 160 mA using Helium. Data recording and processing was performed using Totalchrom 6.3.2 (Perkin

Elmer).

Results:

Isolation procedure

Here, a co-culture based procedure was used to isolate and cultivate M. smithii from stool specimen of a 26 year old Malian healthy female.

The anaerobic Blood culture bottle inoculated by the stool specimen was methane positive after 72 hour of incubation at 37 ° C. Then, after serial dilutions, colonies appeared on the agar medium after four days of incubation at 37 ° C inside of the anaerobic chamber. The growing colonies were then subcultured onto sterile agar plates for purification (Figure 1).

Among the growing colonies, the agar plates were strewn with numerous micro colonies that could not be distinguished from each other with the naked eye (Figure 1). These colonies were recovered thanks to a magnifying glass at X10 magnification. The purification step based on subculturing isolated colonies on eighth compartments divided agar plates (Figure 2) allowed isolation of different bacterial and species one archaeal species including:

87 Methanobrevibacter smithii, Allisonella histaminiformans, Marseillibacter massiliensis,

Bacteroides fragilis, Bacteroides vulgatus, Parabacteroides distasonis and Desulfovibrio piger. These bacteria have all grown on the same plat as M. smithii.

Co-culture of Methanobrevibacter smithii and Bacteroides thetaiotaomicron

Here, B. thetaiotaomicron, was used as hydrogen generator required for M. smithii growth as previously described [91]. After 72 hours of incubation, colonies grew on the two agar plates compartments. Analysis of the gas atmosphere by mass spectrometry revealed the presence of methane, characteristic of methanogenic archaea growth (Figure 1). Identification by

MALDI-TOF MS then confirmed the authenticity of the two cultivated microorganisms. M. smithii colonies were DERXWȝPLQGLDPHWHUZLWKRFKHUDSSHDUDQFH )LJXUH).

Methane was detected in the blood culture bottle when M. smithii was co-cultured with B. thetaiotaomicron. The quantity of detected methane increased if microfiltred rumen was added (data not shown). No methane was detected when M. smithii was cultivated alone in a blood culture bottle.

Co-culture of M. smithii with hydrogen producing bacteria

In order to determine which strain was able to induce the growth of M. smithii, each of these strains (Bacteroides fragilis, Bacteroides vulgatus, Parabacteroides distasonis, Desulfovibrio piger Marseillibacter massiliensis and Allisonella histaminiformans) was subcultured on agar plate with M. smithii using the same method as the co-culture with B. thetaiotaomicron. Then, methane and hydrogen production was measured by gas chromatography and the authenticity of the growing colonies was confirmed by MALDI-TOF MS. Growth was observed after three days of incubation at 37 ° C when M. smithii was co-cultivated with B. fragilis, B. vulgatus, P. distasonis and D. piger and methane was produced (Figure 2). No growth was observed when M. smithii was co-cultured with M. massiliensis and A. histaminiformans. 88 DISCUSSION

Here, we successfully cultivated M. smithii in liquid enrichment and then in pure culture on solid medium without the need for an external supply of hydrogen. This success is due to the effectiveness of a culture technique based on a co-culture carried out between a hydrogen- consuming methanogens strain (M. smithii) and a hydrogen producing bacteria (B. thetaiotaomicron). M. smithii is known to colonize 97.4% of human population [7]. After an accidental culture of M. smithii on agar medium without any addition of hydrogen, we successfully cultivated this methanogenic archaea in a liquid medium by culture enrichment of stool specimen collected from a healthy donor, to which we added B. thetaiotaomicron as hydrogen generating bacteria. This enrichment was methane positive after three days of incubation, indicating the growth of methanogenic archaea [8]. The isolation in pure culture was then successfully obtained on agar medium still in co-culture with B. thetaiotaomicron.

Subsequently, we were able to subculture this isolate in co-culture with other known hydrogen producing bacteria isolated at the same time and on the same agar plate as M. smithii. We then tested the effect of each of these strains on the growth of M. smithii by performing co-culture on solid medium. Growth of M. smithii was observed with each of these strains and gas chromatography tests showed that these strains produced hydrogen in different amounts (Figure3). Viability and growth were confirmed by observing colony formation on solid medium as well as methane production measured by mass spectrometry.

Actually, culture-based techniques for the identification of methanogenic archaea use mainly the culture technique in Hungate tubes developed by Hungate et al 1969 [2][92]. This technique remains fastidious and not accessible to some clinical microbiology laboratories that do not have the necessary equipment for its application despite evidence of presence of archaea in some clinical involvement as brain abscesses has been recently demonstrated [9].

89 Recently, we have developed in our laboratory a new culture technique in a double chamber, where methanogenic archaea are co-cultured with Bacteroides thetaiotaomicron which produces hydrogen necessary for their growth [4]. This technique subsequently allowed us to isolate a large number of M. smithii strains from different samples collected from different mucosae (Data not shown). In this work, and thanks to the acquisition of new anaerobic chamber in our laboratory, we propose a new approach to isolate and cultivate new strain of

M. smithii. The simplicity of this technique and the limited means necessary to put it into practice make the cultivation of methanogenic archaea within the reach of all clinical microbiology laboratories that do not have specific equipment enabling them to study the methanogenic archaea.

90 Acknowledgments

7KLVZRUNKDVEHQHILWHGIURPWKH)UHQFK6WDWHVXSSRUWPDQDJHGE\WKHµ$JHQFH1DWLRQDOH

SRXUOD5HFKHUFKH¶LQFOXGLQJWKH3URJUDPPHG¶,QYHVWLVVHPHQWG¶DYHQLUXQGHUWKHUHIHUHQFH

Méditerranée Infection 10-IAHU-03.

7KLV ZRUN ZDV VXSSRUWHG E\ 5pJLRQ 3URYHQFH $OSHV &{WH G¶$]XU DQG (XURSHDQ IXQGLQJ

FEDER PRIMI.

Figure 1: Illustration of the different steps of the isolation procedure and the cultivation of M. smithii by co-culturing with B. thetaiotaomicron.

Figure 2: Methane and hydrogen production measured by a Clarus 580 gas chromatography system.

93 Reference List

1 Dridi B, Raoult D, Drancourt M. Archaea as emerging organisms in complex human microbiomes. Anaerobe 2011;17(2):56-63.

2 Hungate RE. Chapter IV A Roll Tube Method for Cultivation of Strict Anaerobes. In: Norris JR, Ribbons DW, editors. Methods in Microbiology. 3 ed. Academic Press; 1969. p. 117-32.

3 Samuel BS1, Gordon JI. A humanized gnotobiotic mouse model of host-archaeal- bacterial mutualism. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(26):10011-6.

4 Khelaifia S, Lagier JC, Nkamga VD, Guilhot E, Drancourt M, Raoult D. Aerobic culture of methanogenic archaea without an external source of hydrogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases 2016;35(6):985-91.

5 Seng P, Abat C, Rolain JM, Colson P, Lagier JC, Gouriet Fdr, et al. Identification of Rare Pathogenic Bacteria in a Clinical Microbiology Laboratory: Impact of Matrix- Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry. Journal of Clinical Microbiology 2013 Jul 1;51(7):2182-94.

6 Elsawi Z, Togo AH, Beye M, Dubourg Gg, Andrieu C, Armsrtong N, et al. Hugonella massiliensis gen. nov., sp. nov., genome sequence, and description of a new strictly anaerobic bacterium isolated from the human gut. MicrobiologyOpen 2017 Mar 21;6(4):e00458.

7 Dridi B, Henry M, El Khechine A, Raoult D, Drancourt M. High Prevalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae Detected in the Human Gut Using an Improved DNA Detection Protocol. PLOS ONE 2009 Sep 17;4(9):e7063.

8 Khelaifia S, Raoult D, Drancourt M. A Versatile Medium for Cultivating Methanogenic Archaea. PLOS ONE 2013 Apr 17;8(4):e61563.

9 Drancourt M, Nkamga VD, Lakhe NA, Régis JM, Dufour H, Fournier PE, Bechah Y, Scheld WM, Raoult D. Evidence of Archaeal Methanogens in Brain Abscess. Clin Infect Dis. 2017 1; 65(1):1-5.

94 &RQFOXVLRQ

Conclusion

Dans ce travail de thèse portant sur l’étude par culture du microbiote digestif de sujets Africains, j’ai pu démontrer dans une revue de la littérature les spécificités de ce microbiote Africain (augmentation de la biodiversité, augmentation des Spirochaetes et des Prevotella). Sur les 1162 bactéries isolées par étude de culturomics, 476 ont été isolées seulement de prélèvements d’origine autre que d’Afrique, 445 ont été isolées en commun et 241 bactéries n’ont été isolées qu’à partir de prélèvements d’origine Africaine dont 68 nouvelles espèces. Ma participation au travail de culturomics a consisté en l’isolement et le test de 102 750 colonies bactériennes par MALDI-TOF, qui ont donné lieu à l’identification de 377 espèces bactériennes différentes incluant 59 nouveaux microorganismes dont 40 nouvelles espèces, 17 nouveaux genres et 2 nouvelles familles ; nouveaux isolats que j’ai décrits par taxonogenomics ou « new species announcement ». Enfin dans une troisième partie, j’ai mis au point une nouvelle technique d’isolement des archaea méthanogènes (Methanobrevibacter smithii) qui sont des microorganismes fastidieux qui nécessitaient jusqu’à peu, une source extérieure d’hydrogène pour être cultivés. L’isolement en culture pure a été un succès sur milieu gélosé en réalisant une co-culture avec Bacteroides thetaiotaomicron que ce soit en enceinte anaérobie ou dans un sachet avec générateur d’anaérobiose. Ces archaea méthanogènes étant retrouvées en pathologie humaine (abcès cérébraux…) mais étant très certainement sous-estimées, cette nouvelle technique permettra aux laboratoires de microbiologie clinique de cultiver les archaea méthanogènes de façon simple. En conclusion, mon travail a consisté d’une part à accroitre significativement le répertoire des espèces bactériennes connues du tube digestif et d’autre part à mettre au point une technique simple, peu couteuse et applicable dans les laboratoires de microbiologie clinique pour cultiver les archaea méthanogènes.

Liste des références

(1) Finegold S M, Attebery H R, Sutter V L. Effect of diet on human fecal flora: comparison of Japanese and American diets. Am J Clin Nutr 1974; 27(12):1456- 1469.

(2) Lynch S V, Pedersen O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. N Engl J Med 2016; 375(24):2369-2379.

(3) Backhed F, Ding H, Wang T, Hooper L V, Koh G Y, Nagy A et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101(44):15718-15723.

(4) Devlin A S, Fischbach M A. A biosynthetic pathway for a prominent class of microbiota-derived bile acids. Nat Chem Biol 2015; 11(9):685-690.

(5) Fulde M, Hornef M W. Maturation of the enteric mucosal innate immune system during the postnatal period. Immunol Rev 2014; 260(1):21-34.

(6) Hormannsperger G, Clavel T, Haller D. Gut matters: microbe-host interactions in allergic diseases. J Allergy Clin Immunol 2012; 129(6):1452-1459.

(7) Kamada N, Chen G Y, Inohara N, Nunez G. Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota. Nat Immunol 2013; 14(7):685-690.

(8) Neuman H, Debelius J W, Knight R, Koren O. Microbial endocrinology: the interplay between the microbiota and the endocrine system. FEMS Microbiol Rev 2015; 39(4):509-521.

(9) Yatsunenko T, Rey F E, Manary M J, Trehan I, Dominguez-Bello M G, Contreras M et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature 2012; 486(7402):222-227.

(10) Bokkenheuser V D, Winter J, Dehazya P, Kelly W G. Isolation and characterization of human fecal bacteria capable of 21-dehydroxylating corticoids. Appl Environ Microbiol 1977; 34(5):571-575.

(11) Derrien M, Vaughan E E, Plugge C M, de Vos W M. Akkermansia muciniphila gen. nov., sp. nov., a human intestinal mucin-degrading bacterium. Int J Syst Evol Microbiol 2004; 54(Pt 5):1469-1476.

(12) Clavel T, Dore J, Blaut M. Bioavailability of lignans in human subjects. Nutr Res Rev 2006; 19(2):187-196.

(13) Roberfroid M. Prebiotics: the concept revisited. J Nutr 2007; 137(3 Suppl 2):830S- 837S.

(14) Larsen N, Vogensen F K, van den Berg F W, Nielsen D S, Andreasen A S, Pedersen B K et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non- diabetic adults. PLoS One 2010; 5(2):e9085.

(15) Subramanian S, Huq S, Yatsunenko T, Haque R, Mahfuz M, Alam M A et al. Persistent gut microbiota immaturity in malnourished Bangladeshi children. Nature 2014; 510(7505):417-421.

(16) Tidjani A M, Million M, Traore S I, Mouelhi D, Khelaifia S, Bachar D et al. Gut Bacteria Missing in Severe Acute Malnutrition, Can We Identify Potential Probiotics by Culturomics? Front Microbiol 2017; 8:899.

(17) Ridaura V K, Faith J J, Rey F E, Cheng J, Duncan A E, Kau A L et al. Gut microbiota from twins discordant for obesity modulate metabolism in mice. Science 2013; 341(6150):1241214.

(18) Round J L, Mazmanian S K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol 2009; 9(5):313-323.

(19) Fujimura K E, Sitarik A R, Havstad S, Lin D L, Levan S, Fadrosh D et al. Neonatal gut microbiota associates with childhood multisensitized atopy and T cell differentiation. Nat Med 2016; 22(10):1187-1191.

(20) Bajaj J S, Heuman D M, Hylemon P B, Sanyal A J, White M B, Monteith P et al. Altered profile of human gut microbiome is associated with cirrhosis and its complications. J Hepatol 2014; 60(5):940-947.

(21) Iida N, Dzutsev A, Stewart C A, Smith L, Bouladoux N, Weingarten R A et al. Commensal bacteria control cancer response to therapy by modulating the tumor microenvironment. Science 2013; 342(6161):967-970.

(22) Sivan A, Corrales L, Hubert N, Williams J B, Aquino-Michaels K, Earley Z M et al. Commensal Bifidobacterium promotes antitumor immunity and facilitates anti-PD- L1 efficacy. Science 2015; 350(6264):1084-1089.

(23) Viaud S, Saccheri F, Mignot G, Yamazaki T, Daillere R, Hannani D et al. The intestinal microbiota modulates the anticancer immune effects of cyclophosphamide. Science 2013; 342(6161):971-976.

(24) Buffie C G, Bucci V, Stein R R, McKenney P T, Ling L, Gobourne A et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature 2015; 517(7533):205-208.

(25) Kassam Z, Lee C H, Yuan Y, Hunt R H. Fecal microbiota transplantation for Clostridium difficile infection: systematic review and meta-analysis. Am J Gastroenterol 2013; 108(4):500-508.

(26) Hungate RE. Chapter IV A Roll Tube Method for Cultivation of Strict Anaerobes. 1969.

100

(27) Brown J, de Vos W M, DiStefano P S, Dore J, Huttenhower C, Knight R et al. Translating the human microbiome. Nat Biotechnol 2013; 31(4):304-308.

(28) Nelson K E, Weinstock G M, Highlander S K, Worley K C, Creasy H H, Wortman J R et al. A catalog of reference genomes from the human microbiome. Science 2010; 328(5981):994-999.

(29) Qin J, Li R, Raes J, Arumugam M, Burgdorf K S, Manichanh C et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature 2010; 464(7285):59-65.

(30) Zoetendal E G, Rajilic-Stojanovic M, de Vos W M. High-throughput diversity and functionality analysis of the gastrointestinal tract microbiota. Gut 2008; 57(11):1605-1615.

(31) Rappe M S, Connon S A, Vergin K L, Giovannoni S J. Cultivation of the ubiquitous SAR11 marine bacterioplankton clade. Nature 2002; 418(6898):630-633.

(32) Kaeberlein T, Lewis K, Epstein S S. Isolating "uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science 2002; 296(5570):1127-1129.

(33) Nichols D, Cahoon N, Trakhtenberg E M, Pham L, Mehta A, Belanger A et al. Use of ichip for high-throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Appl Environ Microbiol 2010; 76(8):2445-2450.

(34) Lagier J C, Armougom F, Million M, Hugon P, Pagnier I, Robert C et al. Microbial culturomics: paradigm shift in the human gut microbiome study. Clin Microbiol Infect 2012; 18(12):1185-1193.

(35) Lagier J C, Hugon P, Khelaifia S, Fournier P E, La S B, Raoult D. The rebirth of culture in microbiology through the example of culturomics to study human gut microbiota. Clin Microbiol Rev 2015; 28(1):237-264.

(36) Dubourg G, Lagier J C, Armougom F, Robert C, Hamad I, Brouqui P et al. The gut microbiota of a patient with resistant tuberculosis is more comprehensively studied by culturomics than by metagenomics. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2013; 32(5):637-645.

(37) Pfleiderer A, Lagier J C, Armougom F, Robert C, Vialettes B, Raoult D. Culturomics identified 11 new bacterial species from a single anorexia nervosa stool sample. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2013; 32(11):1471-1481.

(38) Woese C R, Kandler O, Wheelis M L. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. Proc Natl Acad Sci U S A 1990; 87(12):4576-4579.

(39) Balch W E, Fox G E, Magrum L J, Woese C R, Wolfe R S. Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbiol Rev 1979; 43(2):260-296.

101

(40) Boyer M, Madoui M A, Gimenez G, La S B, Raoult D. Phylogenetic and phyletic studies of informational genes in genomes highlight existence of a 4 domain of life including giant viruses. PLoS One 2010; 5(12):e15530.

(41) Dridi B, Raoult D, Drancourt M. Archaea as emerging organisms in complex human microbiomes. Anaerobe 2011; 17(2):56-63.

(42) Miller T L, Wolin M J, Conway de M E, Macario A J. Isolation of Methanobrevibacter smithii from human feces. Appl Environ Microbiol 1982; 43(1):227-232.

(43) Miller T L, Wolin M J. Methanosphaera stadtmaniae gen. nov., sp. nov.: a species that forms methane by reducing methanol with hydrogen. Arch Microbiol 1985; 141(2):116-122.

(44) Dridi B, Fardeau M L, Ollivier B, Raoult D, Drancourt M. Methanomassiliicoccus luminyensis gen. nov., sp. nov., a methanogenic archaeon isolated from human faeces. Int J Syst Evol Microbiol 2012; 62(Pt 8):1902-1907.

(45) Ferrari A B T R A C E B B. Isolation and characterization ofMethanobrevibacter oralis sp. nov. Current Microbiology 1994; 129(1):7-12.

(46) Khelaifia S, Garibal M, Robert C, Raoult D, Drancourt M. Draft Genome Sequencing of Methanobrevibacter oralis Strain JMR01, Isolated from the Human Intestinal Microbiota. Genome Announc 2014; 2(1).

(47) Khelaifia S, Garibal M, Robert C, Raoult D, Drancourt M. Draft Genome Sequence of a Human-Associated Isolate of Methanobrevibacter arboriphilicus, the Lowest- G+C-Content Archaeon. Genome Announc 2014; 2(1).

(48) Borrel G, Harris H M, Tottey W, Mihajlovski A, Parisot N, Peyretaillade E et al. Genome sequence of "Candidatus Methanomethylophilus alvus" Mx1201, a methanogenic archaeon from the human gut belonging to a seventh order of methanogens. J Bacteriol 2012; 194(24):6944-6945.

(49) Borrel G, Harris H M, Parisot N, Gaci N, Tottey W, Mihajlovski A et al. Genome Sequence of "Candidatus Methanomassiliicoccus intestinalis" Issoire-Mx1, a Third Thermoplasmatales-Related Methanogenic Archaeon from Human Feces. Genome Announc 2013; 1(4).

(50) Oxley A P, Lanfranconi M P, Wurdemann D, Ott S, Schreiber S, McGenity T J et al. Halophilic archaea in the human intestinal mucosa. Environ Microbiol 2010; 12(9):2398-2410.

(51) Khelaifia S, Caputo A, Andrieu C, Cadoret F, Armstrong N, Michelle C et al. Genome sequence and description of Haloferax massiliense sp. nov., a new halophilic archaeon isolated from the human gut. Extremophiles 2018; 22(3):485- 498.

102

(52) Dridi B, Henry M, El K A, Raoult D, Drancourt M. High prevalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PLoS One 2009; 4(9):e7063.

(53) Drancourt M, Nkamga V D, Lakhe N A, Regis J M, Dufour H, Fournier P E et al. Evidence of Archaeal Methanogens in Brain Abscess. Clin Infect Dis 2017; 65(1):1- 5.

(54) Khelaifia S, Lagier J C, Nkamga V D, Guilhot E, Drancourt M, Raoult D. Aerobic culture of methanogenic archaea without an external source of hydrogen. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2016; 35(6):985-991.

103

Annexe

105

Annexe :

Liste de mes publications de nouvelles espèces :

- New species annoucement :

1. S. I. Traore, E. I. Azhar, M. Yasir, F. Bibi, P.-E. Fournier, A. A. Jiman-Fatani, J. Delerce, F. Cadoret, J.-C. Lagier and D. Raoult. 'HVFULSWLRQRIµArabia massiliensis¶ JHQQRYVSQRYµGordonibacter massiliensis¶VSQRYDQGµBacilliculturomica massiliensis¶JHQQRYVSQRYLsolated from a faecal specimen of a 50-year-old Saudi Bedouin woman. New Microbe and New Infect 2017 May; 19: 87±90

2. S. I. Traore, E. I. Azhar, M. Yasir, F. Bibi, J. Delerce, P.-E. Fournier, A. A. Jiman- Fatani, J.-C. Lagier and D. Raoult. µBeduinella massiliensis¶JHQQRYVSQRYDQHZ genus representing a new family in the phylum Firmicutes, and proposal of Beduinellaceae fam. nov. New Microbe and New Infect 2016 July; 14: 10±12

3. S. I. Traore, S. Khelaifia, P.-E. Fournier and D. RaoultµFlaviflexus massiliensis¶D new bacterial species isolated from the human gut. New Microbe and New Infect 2016 July; 14: 8±9

4. S. I. Traore, E. I. Azhar, M. Yasir, F. Bibi, P.-E. Fournier, A. A. Jiman-Fatani, J. Delerce, F. Cadoret, J.-C. Lagier and D. Raoult. Description of ‘Blautia phocaeensis’ VSQRYDQGµLachnoclostridium edouardi’ sp. nov., isolated from healthy fresh stools of Saudi Arabia Bedouins by culturomics New Microbe and New Infect 2017 June; 19: 129±131

5. S. I. Traore, S. Khelaifia, G. Dubourg, C. Sokhna, D. Raoult and P.-E. Fournier. ³Lagierella massiliensis´DQHZEDFWHULXPGHWHFWHGLQKXPDQIHFHV1HZ0LFUREHDQG New Infect 2016 July; 14: 53±55

6. S. I. Traore, M. Yasir, E. I. Azhar, F. Bibi, F. Bittar, A. A. Jiman-Fatani, P.-E. Fournier and S. Edouard³Raoultibacter massiliensis´JHQQRYVSQRYDQHZ bacterium isolated from the human gut of a Saudi Bedouin. New Microbe and New Infect 2016 July; 14: 1±3

7. S. I. Traore, F. Cadoret, P. E. Fournier and D. Raoult³Senegalia massiliensis´DQHZ bacterium isolated from the human gastrointestinal tract. New Microbe and New Infect 2016 May; 12: 88±89

8. S. I. Traore, E. I. Azhar, M. Yasir, F. Bibi, P.-E. Fournier, A. A. Jiman-Fatani, J. Delerce, F. Cadoret, J.-C. Lagier and D. Raoult. DescriptiRQRIµBeduinibacterium massiliense¶JHQQRYVSQRYµMassilimaliae massiliensis¶JHQQRYVSQRY µProvencibacterium massiliense¶JHQQRYVSQRYDQG‘Oscilibacter massiliensis¶VS nov., isolated from a faecal specimen of a 19-year-old healthy Saudi Arabian Bedouin by culturomics. New Microbe and New Infect 2017 May; 19: 78±82

107

9. Sory Ibrahima Traore , Souleymane Brah , Jeremy Delerce , Pierre Edouard Fournier , Didier Raoult , Sophie Edouard³Nigerium massiliense´JHQQRYVSQRYDQHZ bacterium isolated from the gut from a patient with acute malnutrition. Human Microbiome Journal 2016 August

Taxonogenomique

10. S. I. Traore, T. Cimmino, J.-C. Lagier, S. Khelaifia, S. Brah, C. Michelle, A. Caputo, B. A. Diallo, P.-E. Fournier, D. Raoult and J. M. Rolain. Noncontiguous finished genome sequence and description of Bacillus andreraoultii strain SIT1T sp. nov. New Microbe and New Infect 2015 December; 10: 25±35

11. T. Cimmino, S. I. Traore, C. Valentini, S. le Page, C. Sokhna,4, A. Diallo, D. Raoult and J. M. Rolain. Noncontiguous finished genome sequence and description of Bacillus testis strain SIT10 sp. nov. New Microbe and New Infect 2016 April; 12: 18±23

12. E. Vicino, S. I. Traore, T. Cimmino, G. Dubourg, N. Labas, C. Andrieu, F. Di Pinto, C. Sokhna, A. Diallo, D. Raoult and J. M. Rolain. Noncontiguous finished genome sequence and description of Murdochiella massiliensis strain SIT12 sp. nov. New Microbe and New Infect 2016 August; 14: 31±35

13. G. Mourembou, S. I. Traore, J. Rathored, S. Khelaifia, J. C. Lagier, C. Michelle, D. Raoult and M. Million,VRODWLRQRIQHZVSHFLHV³Peptoniphilus phoceensis´IURP human gut. New Microbe and New Infect 2016 April; 12: 52±53

14. E. Seck, S. I. Traore, S. Khelaifia, M. Beye, C. Michelle, C. Couderc, S. Brah, P.-E. Fournier, D. Raoult and G. Dubourg. Tessaracoccus massiliensis sp. nov., a new bacterial species isolated from the human gut. New Microbe and New Infect 2016 May; 13: 3±12

15. Mathlouthi N, Traore SI, Cimmino T, Khelaifia S, Nguyen TT, Cadoret F, Couderc C, Raoult D, Rolain JM. Genome sequence and description of Mobilicoccus massiliensis sp. nov. isolated from the stool of a Nigerian boy with kwashiorkor. New Microbes New Infect. 2017 Sep 6 : 20:18-24

16. M. Tidjani Alou, J. Rathored, S. I. Traore, S. Khelaifia, C. Michelle, S. Brah, B. A. Diallo, D. Raoult and J.-C. Lagier. Bacillus niameyensis sp. nov., a new bacterial species isolated from human gut. New Microbe and New Infect 2015 September; 8: 61±69

17. T.P.T. Pham, M. Tidjani Alou, S. I. Traore, Brah, B. Ali Diallo, A. Diallo, C. Sokhna, E. Baptiste, A. Levasseur, PE. Fournier, F. Cadoret and D. Raoult. Noncontiguous ILQLVKHGJHQRPHVHTXHQFHVDQGGHVFULSWLRQVRIµPaenibacillus bouchesdurhonensis¶ µPaenibacillus rubinfantis¶µPaenibacillus senegalimassiliensis¶DQGµPaenibacillus tuaregi¶LGHQWLILHGE\FXOWXURPLFVNew Microbe and New Infect 2017 July; 20: 1±13

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18. Guillaume A. Durand, Thao Pham, Sokhna Ndongo, Sory Ibrahima Traore, Grégory Dubourg, Jean-Christophe Lagier, Caroline Michelle, Nicholas Armstrong, Pierre- Edouard Fournier, Didier Raoult, Matthieu Million. Blautia massiliensis sp. nov., isolated from a fresh human fecal sample and emended description of the genus Blautia. Anaerobe 43 (2017) 47-55

19. Bacillus kwashiorkori sp. nov., a new bacterial species isolated from a malnourished child using culturomics. El hadji Seck, Mamadou Beye, Sory Ibrahima Traore, Saber Khelaifia, Caroline Michelle, Carine Couderc, Souleymane Brah, Pierre Edouard Fournier, Didier Raoult, Fadi Bittar Ǧ Microbiologyopen. 2018 Feb; 7(1): e00535. Published online 2017 Oct 27. doi: 10.1002/mbo3.535 PMCID: PMC5822343

20. Sory Ibrahima Traore, Melhem Bolen, Mamadou Beye, Awa Diop, Maxime Descartes Mbogning Fonfou, Mamadou Lamine Tall, Caroline Michelle, Muhammad Yasir, Esam Ibraheem Azhar, Fehmida Bibi, Fadi Bittar, Asif Ahmad Jiman-Fatani, Ziad Daoud, Fréderic Cadort, Pierre-Edouard Fournier, Sophie Edouard. Non- contiguous finished genome sequence and description of Raoultibacter massiliensis gen. nov., sp. nov. and Raoultibacter timonensis sp. nov, two new bacterial species isolated from the human gut. Microbiologyopen. In press.

21. Draft genome sequence of Fermentimonas caenicola strain SIT8, isolated from the human gut. Mamadou Beye, Sofiane Bakour, Sory Ibrahima Traore, Jaishriram Rathored, Noémie Labas, Didier Raoult, Pierre-Edouard Fournier. Stand Genomic Sci. 2018; 13: 8. Published online 2018 Apr 11. doi: 10.1186/s40793-018-0310-6

Autres

22. Maryam Tidjani Alou, Matthieu Million, Sory Ibrahima Traore, Donia Mouelhi, Saber Khelaifia, Dipankar Bachar , Aurelia Caputo, Jeremy Delerce, Souleymane Brah, Daouda Alhousseini, Cheikh Sokhna, Catherine Robert, Bouli A. Diallo, Aldiouma Diallo, Philippe Parola, Michael Golden, Jean-Christophe Lagier and Didier Raoult. Gut Bacteria Missing in Severe Acute Malnutrition, Can We Identify Potential Probiotics by Culturomics? Frontiers in Microbiology 2017 May; 8:899.

Je suis 3ème auteur de ce travail publié en 2017 dans la revue Frontiers in Microbiology. Ce travail a permis de mettre en évidence une diminution voire une quasi disparition des bactéries anaérobies et des archaea méthanogènes et un enrichissement en bactéries potentiellement pathogènes telles que certaines Proteobacteria et Fusobacteria chez des enfants Africains atteints de Kwashiorkor. En

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outre, a permis de proposer un cocktail de 12 bactéries manquantes qui pourraient être proposées en tant que bactériothérapie en adjonction du traitement habituellement proposé de renutrition.

23. Lagier JC, Khelaifia S, Alou MT, Ndongo S, Dione N, Hugon P, Caputo A, Cadoret F, Traore SI, Seck EH, Dubourg G, Durand G, Mourembou G, Guilhot E, Togo A, Bellali S, Bachar D, Cassir N, Bittar F, Delerce J, Mailhe M, Ricaboni D, Bilen M, Dangui Nieko NP, Dia Badiane NM, Valles C, Mouelhi D, Diop K, Million M, Musso D, Abrahão J, Azhar EI, Bibi F, Yasir M, Diallo A, Sokhna C, Djossou F, Vitton V, Robert C, Rolain JM, La Scola B, Fournier PE, Levasseur A, Raoult D. Culture of previously uncultured members of the human gut microbiota by culturomics. Nat Microbiol. 2016 Nov 7;1:16203

0DSDUWLFLSDWLRQjFHWUDYDLOFRPPXQGHO¶pTXLSHGHFXOWXURPLFVSXEOLpHQGDQV la revue Nature Micriobiology est résumée dans le préambule de la seconde partie de mon travail de thèse.

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Résumé L’étude du microbiote digestif a connu un regain d’intérêt au début des années 2000, avec l’avènement des techniques moléculaires, en particulier la métagénomique. La culturomics (culture microbienne à haut débit avec identification des colonies par MALDI-TOF) a démontré sa complémentarité depuis 2010 en réduisant une partie des biais des méthodes moléculaires. Dans la première partie de mon travail de thèse, j’ai réalisé une revue de la littérature sur les principales techniques d’étude du microbiote digestif et d’autre part sur l’analyse du microbiote des sujets d’origine Africaine. Les principales études de métagénomique réalisées sur des prélèvements d’origine Africaine ont révélé une augmentation de la biodiversité, avec en particulier une augmentation des Spirochaetes et des Prevotella chez les sujets d’origine Africaine par rapport aux sujets occidentaux. Les études portant sur la malnutrition ont démontré une réduction de l’ensemble des bactéries et en particulier des bactéries anaérobies et des archaea méthanogènes. Sur les 1162 bactéries isolées par étude de culturomics, 476 ont été isolées seulement de prélèvements d’origine autre que d’Afrique, 445 ont été isolées en commun et 241 bactéries n’ont été isolées qu’à partir de prélèvements d’origine Africaine dont 68 nouvelles espèces. Dans une seconde partie, j’ai exposé ma participation au travail de culturomics, qui a consisté en l’isolement et le test de 102 750 colonies bactériennes par MALDI- TOF, et qui ont donné lieu à l’identification de 377 espèces bactériennes différentes incluant 40 nouvelles espèces, 17 nouveaux genres et 2 nouvelles familles. J’ai effectué la description complète par taxonogenomics (incluant le spectre MALDI-TOF et le séquençage du génome) et/ou l’annonce de la culture (new species announcement) de ces nouvelles espèces. Enfin dans une troisième partie, je décrirai la découverte et la mise au point d’une nouvelle technique d’isolement des archaea méthanogènes et qui a permis l’isolement de Methanobrevibacter smithii, archaea méthanogène appartenant au phylum Euryarchaeota. Les archaea méthanogènes sont de plus en plus rencontrés dans la population humaine avec une prévalence de 97,4% pour Methanobrevibacter smithii et associés à des pathologies comme l’abcès du cerveau, les parodontites etc…. La culture de ces microorganismes extrêmement sensibles à l’oxygène est fastidieuse et nécessitait une source extérieure d’hydrogène. Dans ce travail de thèse, sous enceinte anaérobie, nous avons cultivé avec succès M. smithii à partir d’un milieu de culture liquide inoculé d’échantillon de selle collectée chez un donneur saint. L’isolement en culture pure a été un succès sur milieu gélosé en réalisant une coculture avec Bacteroides thetaiotaomicron. Nous avons aussi testé avec succès la coculture de M. smithii avec d’autres bactéries productrices d’hydrogène connues. Les tests de chromatographie en phase gazeuse montraient que ces souches produisaient de l’hydrogène en quantités différentes. Les colonies isolées sur gélose étaient bien viables et observables et la production de méthane était mesurée par spectrométrie de masse.

Mots-clés : Microbiote humain, microbiote africain, microbial culturomics, Archaea méthanogènes, Methanobrevibacter smithii.

Abstract The study of the digestive microbiota was renewed in the early 2000s, with the advent of molecular techniques, particularly metagenomics. The culturomics (high throughput microbial culture with identification of colonies by MALDI-TOF) has demonstrated its complementarity since 2010 by reducing some of the biases of molecular methods. In the first part of my thesis work, I realized a review of the literature on the main techniques of study of the digestive microbiota and on the other hand on the analysis of the microbiota of subjects of African origin. The main metagenomic studies carried out on samples of African origin have revealed an increase in biodiversity, with in particular an increase in Spirochaetes and Prevotella in subjects of African origin compared to Western subjects. Malnutrition studies have shown a reduction of all bacteria, especially anaerobic bacteria and archaea methanogens. Of the 1162 bacteria isolated by culturomics study, 476 were isolated only from non-African samples, 445 were isolated in common and 241 bacteria were isolated from samples of African origin, of which 68 were new species. In a second part, I exposed my participation in the work of culturomics, which consisted in the isolation and the test of 102 750 bacterial colonies by MALDI-TOF, which resulted in the identification of 377 different bacterial species, including 40 new species, 17 new genera and 2 new families. I performed the complete description by taxonogenomics (including the MALDI-TOF spectrum and genome sequencing) and / or the new species announcement of these new species. Finally, in a third part, I will describe the discovery and the development of a new technique for the isolation of methanogenic archaea and which allowed the isolation of Methanobrevibacter smithii, a methanogenic archaea belonging to the phylum Euryarchaeota. Methanogenic archaea are more often encountered in the human population with a prevalence of 97.4% for Methanobrevibacter smithii and associated with pathologies such as brain abscess, periodontitis. Cultivation of these extremely oxygen-sensitive microorganisms is fastidious and requires an external source of hydrogen. In this thesis work, under anaerobic chamber, we successfully cultivated M. smithii from a liquid culture medium inoculated with a stool sample collected from a healthy donor. The isolation in pure culture was a success on agar medium by performing a co- culture with Bacteroides thetaiotaomicron. We have also successfully tested the co- culture of M. smithii with other known hydrogen-producing bacteria. Gas chromatographic tests showed that these strains produced hydrogen in different amounts. Isolated colonies on agar were well viable and observable and methane production was measured by mass spectrometry. Keywords: Human microbiota, African microbiota, microbial culturomics, methanogenic Archaea, Methanobrevibacter smithii.