(Impatiens Noli-Tangere L.) Lietuvos Populiacijų Genetinė Įvairovė, Įvertinta Pagal Appd Žymenis

VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS

GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS

BIOLOGIJOS KATEDRA

Julija Petkevičiūtė

PAPRASTOSIOS SPRIGĖS (IMPATIENS NOLI-TANGERE L.) LIETUVOS POPULIACIJŲ GENETINĖ ĮVAIROVĖ, ĮVERTINTA PAGAL APPD ŽYMENIS

Magistro baigiamasis darbas

Molekulinės biologijos studijų programa, valstybinis kodas 621C1001 Molekulinės biologijos, biofizikos ir biochemijos studijų kryptis

Vadovė: prof. habil. dr. E. Kupčinskienė ______

(Parašas) (Data) Apginta: prof. habil. dr. A. Paulauskas ______

(Parašas) (Data)

Kaunas, 2013

PADĖKA

Esu dėkinga už nuoširdžią pagalbą ir visokeriopą palaikymą: prof. habil. dr. E. Kupčinskienei

L. Zybartaitei

R. Vilčinskui

TURINYS SANTRUMPOS 3 SANTRAUKA 4 SUMMARY 5 ĮVADAS 6 1. LITERATŪROS APŽVALGA 7 1.1 Svetimkraščių rūšių invazija 8 1.1.1 Pasaulio klimato kaitos poveikis natūralių ir svetimkraščių augalų plitimui 8 1.1.2 Invazinių rūšių poveikis aplinkai 9 1.1.2.1 Lietuvos invaziniai augalai ir jų keliama grėsmė vietinei florai 10 1.1.2.2 Invazinių rūšių kontrolės priemonės 11 1.2 Sprigių genties biologija 12 1.2.1 Sprigių genties morfologija, ekologija ir geografinis paplitimas 13 1.2.2. Lietuvos natūralios ir invazinės sprigių genties rūšys 19 1.3. Metodai, naudojami tiriant natūralius ir invazinius augalus 22 1.3.1 Molekuliniai metodai, naudojami tiriant augalus 22 1.3.2 Sprigių genties molekuliniai tyrimai 25 2. TYRIMŲ OBJEKTAS, VIETOS IR METODAI 28 2.1 Augalinės medžiagos rinkimas 28 2.2. Genominės DNR išskyrimas 30 2.3. Išskirtos genominės DNR koncentracijos ir švarumo nustatymas 32 2.4. APPD metodo pritaikymas paprastajai sprigei 32 2.5. APPD PGR produktų elektroforezė 34 2.6. Duomenų statistinė analizė 35 3. REZULTATAI 36 3.1. Paprastosios sprigės genetinės įvairovės pagal APPD žymenis 36 IŠVADOS 43 LITERATŪROS SĄRAŠAS 44 PRIEDAI 52

SANTRUMPOS AFLP – amplifikuotų fragmentų ilgio polimorfizmas (angl. Amplified Fragment Length Polymorphism) SNP – vieno nukleotido polimorfizmas (angl. Single nucleotide polymorphism) APPD – atsitiktinai pagausinta polimorfinė DNR (angl. Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) SSR – mikrosatelitai, kartotinių sekų atkarpos (ang. simple sequence repeats) PGR – polimerazinė grandininė reakcija (angl. Polymerase Chain Reaction, PCR) SNP – vieno nukleotido polimorfizmo tyrimas (angl. Single nucleotide polymorphism) bp – bazių pora (angl. base pair) DNR – deoksiribonukleorūgštis (angl. Deoxyribonucleic acid, DNA) dNTP – deoksiribonukleotidai cDNR – chromosominė DNR QTL – kiekybinių lokusų požymiai (angl. Quantitative trait loci) EST – išreikštų sekų žymenys (angl. Expressed sequence tag) AMOVA – molekulinės genetinės įvairovės analizė (angl. Analysis of Molecular Variance) UPGMA – porų grupavimo pagal aritmetinius vidurkius metodas su vienodais svoriais (angl. Unweighted Pair-Group Method of arithmetic Averages) PKA – principinių koordinačių analizė (angl. Principal Coordinates Analysis, PCA)

GDxy – genetinis atstumas tarp x ir y genotipų (angl. Genetic Distance)

Gst – genetinės diferenciacijos koeficientas (Nei, 1973) H – genetinė įvairovė (Nei, 1973) I – Šenono (Shannon’s) informacinis indeksas

Na – stebimas alelių skaičius lokuse

Ne – efektyvių alelių skaičius lokuse

Nm – genų srautas tarp populiacijų (angl. Gene flow) P – polimorfinių lokusų procentas SDS – natrio dodecilsulfatas (angl. Sodium dodecyl sulphate) SN – standartinis nuokrypis V – vidurkis

SANTRAUKA

Autorius: Julija Petkevičiūtė Pavadinimas: Paprastosios sprigės (Impatiens noli-tangere L.) Lietuvos populiacijų genetinė įvairovė, įvertinta pagal APPD žymenis Vadovas: prof. habil. dr. Eugenija Kupčinskienė Pristatyta: Vytauto Didžiojo Universitetas, Gamtos mokslų fakultetas, Kaunas, 2013, birželis. Puslapių skaičius: 54 (įskaitant priedus) Lentelių skaičius: 9 Paveikslų skaičius: 10 Priedų skaičius: 3 Literatūros nuorodų skaičius: 95 Balsaminaceae šeimai priklauso daugiau nei 1000 sprigių rūšių, penkios iš jų yra randamos Europoje. Lietuvoje auga 4 rūšys, iš jų 1 auginama balzamininė sprigė (Impatiens balsamina L.), 2 sulaukėjusios smulkiažiedė sprigė (Impatiens parviflora DC.), bitinė sprigė (Impatiens glandulifera L.) ir 1 natūraliai auganti - paprastoji sprigė (Impatiens noli-tangere L.). Lyginant skirtingų sprigių rūšių prisitaikymo ir kintamumo duomenis, galima gauti daug vertingos informacijos. Lietuvoje molekuliniai tyrimai buvo atliekami tik invazinių rūšių, todėl šio darbo tikslas buvo įvertinti paprastosios sprigės genetinį kintamumą pagal Lietuvos geografiškai skirtingas populiacijas, naudojant atsitiktinai pagausintos polimorfinės DNR (APPD) metodą. Augalai buvo surinkti iš 15 Lietuvoje geografiškai skirtingų vietovių. Išbandžius kitų sprigių rūšių tyrimuose naudotus APPD oligonukleotidinius pradmenis iš jų paprastajai sprigei tiko aštuoni oligonukleotidiniai pradmenys: OPA-20, OPD-20, 222, 250, 269, 340, 474, 516. Tarp paprastosios sprigės populiacijų genetiniai duomenys svyravo tokiuose intervaluose: 3–15 % polimorfinių fragmentų skaičius, 0.005–0.049 Nei genetinė įvairovė, 0.009–0.074 Shannon’o indeksas. UPGMA dendograma pagal individus parodo, kad skirtingų populiacijų individai nesimaišė, sudarė atskiras šakas. Dendogramoje individai suskirstyti į 7 klasterius Genetiniai atstumai tarp populiacijų svyravo 0.185–0.467. Genetinių atstumų dendrograma pagal 220 individus, išsiskirstė į 7 populiacijų grupes. Pagal APPD žymenis UPGMA individų ir populiacijų dendrogramose genetinių ir geografinių atstumų ryšys nebuvo nustatytas Lietuvos paprastosios sprigės populiacijoms, tą patį galima teigti ir apie principinių koordinačių analizę. 5

SUMMARY

Author: Julija Petkevičiūtė Title: RAPD analyses of genetis diversity among Lithuania population of Impatiens noli- tangere L. Supervisor: prof. hab. dr. Eugenija Kupčinskienė Presentation: Vytautas Magnus University, Faculty of Nature Sciences, June, 2013, Kaunas. Number of pages: 54 (including appendices) Number of tables: 9 Number of figures: 10 Number of Appendices: 3 Number of references: 95 Balsaminaceae family comprises more than 1000 species, among them five species are present in Europe. There are 4 species in Lithuania, one of them is cultivated – Impatiens balsamina L., two species are known as aliens – Impatiens parviflora DC., Impatiens glandulifera L. and only one is growing naturally – Impatiens noli-tangere L. Valuable information might be obtained comparing adaptation level and variability of alien species and native ones. In Lithuania, molecular studies have been carried out only for invasive species of Impatiens, so the objective of this study was to evaluate the genetic variability of populations of Impatiens noli-tangere differing in geography or habitats by the randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). Plants were collected from Lithuania 15 different locations. For I. noli-tangere studies eight different oligonucleotide primers (OPA-20, OPD-20, 222, 250, 269, 340, 474, 516) were used. Among populations of I. noli- tangere genetic parameters ranged in the following intervals: 3–15 % of polymorphic DNA bands, 0.005–0.049 for Nei’s gene diversity, 0.009–0.074 for Shannon’s information index. Pairwise genetic distances between populations ranged in the interval 0.185–0.467. Genetic distance-based cluster analyses for 220 individuals indicated 7 major groups of populations, among which there was no clear geographical pattern. On the bases of RAPD markers prepared UPGMA dendrogram of individuals and populations did not show tight relation between population geography and geographical distances. The same was true when principal component analyses were done for genetical data.

ĮVADAS

Antropogeninė veikla, kuri lemia pasaulinę klimato kaitą, melioraciją, taršą ir prekybą, įtakoja svetimkarščių augalų rūšių invazivumą, kurios daro poveikį vietinei augmenijai. Svarbiausi invazinių rūšių poveikiai vietinėms rūšims kyla dėl greito invazinių rūšių prisitaikymo prie pasikeitusių sąlygų ir dauginimosi. Biologinės invazijos yra svarbiausias faktorius veikiantis ekosistemų degradacijos priežastis ir biologinę įvairovę, todėl svarbu tirti ir įvertinti dabartinę padėtį Lietuvoje, tam, kad būtų galima imtis atitinkamų veiksmų biologinei įvairovei palaikyti. Invazinių augalų morfologijos, fiziologijos, ypač fenologijos ir genetikos pažinojimas, įskaitant žinias apie paprastąją sprigę yra būtinos vietinių rūšių išsaugojimui. Lietuvoje atliekami vietinių rūšių tyrimai, tačiau molekuliniais metodais dažniau tyrinėjami invaziniai augalai, o vietinių rūšių tyrimai atliekami neadvekačiai. Norint, pateikti kuo tikslesnius rezultatus reikia ištirti vietines rūšis ir gautus rezultatus lyginti su svetimkraštėmis rūšimis. Neigiamai invazijai Lietuvoje mažinti yra genetiniai molekuliniai tyrimai, kuriuos reikia naudoti atliekant vietinės paprastosios sprigės tyrimą. Siekiant rezultatų, remiantis užsienyje ir Lietuvoje darytais augalų morfologiniais, fiziologiniais, filogenetiniais, molekuliniais tyrimais, skirtais augalų populiacinės genetikos ir sistematikos analizei, atliksiu vietinės paprastosios sprigės tyrimą atsitiktinai pagaustintos polimorfinės DNR (APPD) metodu.

Norint išsaugoti Lietuvos biologinę įvairovę reikia išsamiai pažinti vietines rūšis, todėl svarbu ištirti jų molekulinę įvairovę, kad būtų galima palyginti su svetimkraščių sprigių giminingų rūšių genetine įvairove. Todėl darbo tikslu buvo ištirti Lietuvos paprastosios sprigės 15 populiacijų genetinę įvairovę pagal APPD žymenis.

Tikslui įgyvendinti iškeliami tokie uždaviniai:  pritaikyti Impatiens genties kitų rūšių tyrimams naudojamą APPD metodą, parinkti pradmenų pagausinimo sąlygas paprastosios sprigės tyrimams;  nustatyti Lietuvos paprastosios sprigės populiacijų geografinių ir genetinių atstumų ryšį;  palyginti paprastosios sprigės genetinę įvairovę su kitų Impatiens rūšių anksčiau VDU genetikos ir imunologijos laboratorijoje gautais duomenimis.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Svetimkraščių rūšių invazija Atskirų rūšių augalų arealai nėra nulemti vien tik klimato ar dirvožemio sąlygų, dažnai tolimesnį, rūšies paplitimą sulaiko mechaninės kliūtys: kalnai, dykumos, arba kitų augalų konkurencija. Dėl žmogaus veiklos, nugalėję tokias kliūtis, augalai gali augti už savo arealo ribų. Tokį procesą vadiname natūralizacija ir dėl to, be natūralių arealų, susidariusių dėl augalų paplitimo natūralių veiksnių pagalba, atsiranda dirbtiniai arealai (Natkevičaitė-Ivanauskienė, 1971). Svetimžemės rūšys visame pasaulyje sukelia didelių biologinių, ekonominių ir socialinių problemų. Prie visų šių neigiamų aplinkoje vykstančių procesų dar prisideda aplinkos tarša, globalus klimato atšilimas. Klimato pasikeitimai dažniausiai sudaro palankias sąlygas invazinėms rūšim naujoje teritorijoje įsitvirtinti ir sparčiai plisti (Mooney, Hobbs, 2000). Invazinės rūšys neigiamai veikia vietines rūšis, jų populiacijas, individų gausumą, dėl to keičiasi biologinė įvairovė, vietos bendrijos, ekosistemos ir tai yra reikšminga žmogaus socialiniam ekonominiam gyvenimui. Dėl invazinių rūšių kyla poveikis vietinėms rūšims, nes jos greitai prisitaiko prie pasikeitusių sąlygų ir sparčiai dauginasi (Pimentel et al., 2001). 1.1.1 Pasaulio klimato kaitos poveikis natūralių ir svetimkraščių augalų plitimui Baltijos regiono geologinė ir paleogeografinė raida kvartero metu lėmė didelę gamtinių sąlygų įvairovę atskirose šio didelio regiono dalyse, ir tai susiję su globaliu fiziniu geografiniu zoniškumu bei žemyninio ir jūrinio klimato sandūros nulemtais bent trimis klimatiniais rajonais regione. Ledynų tirpimo po paskutiniojo apledėjimo (Lietuvoje prieš 24–13 tūkst. m.) zoniškumas, lėmęs savitą ežeringųjų moreninių aukštumų ir žemumų paplitimą Lietuvoje ir gretimuose kraštuose, paviršiaus litologinę sudėtį ir gruntinio vandens gylį ir hidrografinio (upių) tinklo ypatybes, taip pat sudarė savitas sąlygas globaliniams klimato pokyčiams pasireikšti atskirose regiono dalyse (Rimkus ir kt., 2007). Žmogaus veiklos padariniai tapo akivaizdžiai matomi ir klimato kaitos modeliai, trimatis atmosferos, sausumos, vandenyno, ežerų ir ledynų atvaizdavimas, prognozuoja temperatūros kilimą

1,8 – 6,4 ºC iki 2100 m. Didėjantis CO2 kiekis atmosferoje veikia Žemės temperatūrą, kritulių pobūdį, kritulių rūgštingumą, vandens lygį, klimato kaitą regionuose. Net ir vidutinio klimato zonoje, kurioje yra Lietuva, vis dažnesnės tampa karščio bangos, ypač antroje vasaros pusėje ir ankstyvąjį rudenį, nebūdingai pasiskirsto kritulių kiekis, kuomet kyla potvyniai ar užklumpa sausra. Aukšta žiemos ir pavasario temperatūra gali prailginti vegetacinį laikotarpį, pakeisti augalų augimo 8

ciklus ir sumažins jų atsparumą. Vietinė augmenija patirs didesnį neigiamą aplinkos poveikį ir bus lengviau pažeidžiama kenkėjų bei ligų. Temperatūros įtaka augalų augimui ir fenologinių fazių kaitai yra labai didelė. Klimato kaita paveikia natūralių augalų bioįvairovę, rūšių nykimą, augalijos pokyčius, augalų ir vabzdžių tarpusavio santykiu, egzotinių kenkėjų ir ligų paplitimą, jų sunkumą, augalų rūšių migraciją, vegetacijos laikotarpio pokyčius (Araus et al., 2002; Balevičius ir kt., 2007). Klimato zonų paslinkimas gali paveikti ekosistemų sudėties, gyvūnų ir augalų paplitimo pokyčius. Kintantis klimatas gali sukelti augalų migraciją. Augalų rūšys jautrios temperatūrai, reaguodamos į temperatūros pakilimą, gali plisti į vėsesnes vietoves, link ašigalių arba į kalnus (Coviella, Trumble, 1999; Balevičius ir kt., 2007).

Klimato kaita pakeis ryšius tarp augalų ir jų apdulkintojų. Didėjanti CO2 koncentracija aplinkoje ir sausros keičia augalų ir vabzdžių tarpusavio santykius, ypač sąveikoms tarp žydinčių augalų ir jų apdulkintojų, nes augalo išskiriamo nektaro kiekis priklauso nuo rūšies, paros laiko, žiedų prasiskleidimo, oro temperatūros. Augalų įvairovė yra glaudžiai susijusi su apdulkintojų įvairove (Kearns et al., 1998; Piechulla et al., 2003; Ghazoul, 2005). Didesni atmosferos anglies dvideginio kiekiai kartu su aukštesne temperatūra gali pakeisti vandens garinimą – transpiracijos procesą. Kartu pasikeis sausumos hidrologinis ciklas ir sausumos augalijos tipai (Apšegaitė ir kt., 2007). Per paskutinį amžių Vidurio Aliaskoje augimo sezonas pailgėjo 50–100 %. Žydėjimas, ramybės pabaiga vyksta vidutiniškai 5,1 dienos ankščiau nei prieš dešimtmetį. Šiaurėje pavasaris ateina savaite ankščiau nei prieš 20 metų. Skirtinguose geografiniuose regionuose temperatūrų ir kritulių kiekio pokyčiai gali sukelti ilgesnes, dažnesnes sausras arba potvynius, kurie sudarys palankias sąlygas šaknų puviniui ir amarui (Romanovskaja, Bakšienė, 2007). Svetimkraščių rūšių invazijos gali tapti globalių klimato pokyčių priežastimi. Pavyzdžiui, Afrikos tropinių žolinių augalų tikslinga introdukcija į Amazonės baseiną kelia pavojų, dėl augalijos pakitimo gaisrų dažnumui ir mažina miškų atsikūrimo galimybę. Tokiu būdu gali susidaryti savanos tipo bendrijos, mažėti bendra augalijos biomasė, lėtėti anglies dvideginio asimiliacija, o regiono klimatas šiltėti ir sausėti (Mack et al., 2000). Kintantis klimatas mažina biologinę įvairovę. Dėl sausrų vietinės rūšys, tokios kaip paprastoji sprigė gali išnykti, nes invazinės sprigių rūšys, kurios atsparesnės aukštai temperatūrai, išliks. Mokslinių tyrimų rezultatai, sprendžiant augalų apsaugos klausimus, naudojami parenkant biologinės kontrolės priemones skirtas nykstančių augalų izoliavimui, atsparumui ir tausojančiam augalų produktų naudojimui (Weiss, McLaren, 2002). Į globalizacijos, klimato kaitos ir kitų veiksnių keliamus poreikius atsižvelgiama bendradarbiaujant Europos institucijoms ir tarnyboms, 9

nacionalinėms institucijoms, mokslinių tyrimų bendruomenei ir kitoms suinteresuotosioms šalims. Europos Sąjunga siekia ne tik užtikrinti žemdirbytės ir sodininkystės apsaugą nuo svetimų žalingų organizmų, bet ir saugoti gamtinės aplinkos sveikatą, natūralias buveines, miškus ir Europos kraštovaizdį. Vertinami galiojantys bendrijos augalų sveikatos teisės aktai, kuriuose nagrinėjama, kaip užtikrinti geresnę parengtį naujiems iššūkiams, įskaitant klimato kaitą (Balevičius ir kt., 2007) 1.1.2. Invazinių rūšių poveikis aplinkai Išplitusios invazinės rūšys keičia vietovės organizmus, populiacijas, rūšių biologinę įvairovę, vietos bendrijas, ekosistemas, mažina vietinių rūšių gausumą, jas naikina ir paveikia socialinius ekonominius aspektus. Tokie poveikiai neabejotinai yra kenksmingi gamtosauginiu požiūriu, nes natūrali biologinė įvairovė yra pripažįstama kaip vertybė (Weiss, McLaren, 2002). Svarbiausi invazinių rūšių poveikiai vietinėms rūšims kyla dėl žmogaus veiklos, greito invazinių rūšių prisitaikymo prie pasikeitusių sąlygų ir dauginimosi. Žmogaus veiklos į naujas vietas perkėlusių svetimkraščių rūšių bendras kiekis artėja prie pusės milijono, o jų plitimo mastai didėja. Prekyba pagrindinis invazinių rūšių introdukcijos būdas. Sparčiai auganti prekybos ir transporto veikla padidina invazinių rūšių introdukcijos galimybes. Viena iš svarbiausių būtinybių invazijai – gebėjimas naujomis edafinėmis ir klimatinėmis sąlygomis išlikti ir augti. Augalai netiesiogiai paveikia savo kaimynus keičiant dirvožemio biotines, fizikines ir chemines charakteristikas. Poveikį augalų populiacijai daro kompleksas ryšių tarp augalų ir dirvožemio mikroorganizmų biocenozių, sąveika tarp augalų rūšių ir augalų bendrijų sandaros (Weiss, McLaren, 2002). Invazinės rūšys naujoje teritorijoje prisitaiko prie joms nebūdingos aplinkos. Pasikeičia alelopatiniai ryšiai su supančiais augalais, gimsta antagonistiniai santykiai su kai kuriais iš jų, atsiranda ligos, nauji augalais mintantys vabzdžiai, žvėrys arba jie išnyksta. Sėkmę invazinėms rūšims įsitvirtinti dažnai lemia mažas kenkėjų gausumas naujoje vietoje (Keane, Crawley, 2002). Dirvožemio biocenozė keičiama konkuruojant augalams, atsiradus patogenams, palankiau veikiant mikorizines rūšis, keičiant dirvožemio biotines ir abiotines charakteristikas. Paveikta dirvožemio biocenozė keičia augalų populiacijas ir bendrijas (Marozas, 2008). 2009 m. DAISIE projektu, remiamu pagal šeštąją ES mokslinių tyrimų bendrąją programą, nustatyta, kad Europoje yra 10 822 nevietinių rūšių ir manoma, kad 10–15 % iš jų darys neigiamą ekonominį arba ekologinį poveikį. Šveicarijos mieste Ciuriche augalai sukėlė daugiau kaip 150 vietinių išnykimą (Landolt, 1993). Australijoje sukurta plačiai problemos mastą apimanti metodologija, kuri leidžia apibūdinti kiekvienos rūšies invazijos intensyvumo laipsnį, esamą ir

galimą paplitimą, poveikį žemės ūkiui, supančiai aplinkai, kokie kaštai reikalingi kontroliuoti paplitimą (Weiss, McLaren, 2002). 1.1.2.1 Lietuvos invaziniai augalai ir jų keliama grėsmė vietinei florai Lietuvoje yra apie 550 rūšių svetimkraščių (adventyvinių) augalų, į šalį patekusių Naujaisiais amžiais, t.y. po 1500 m. ir apie 90 rūšių archeofitų, dėl žmonių veiklos Lietuvoje atsiradusių iki 1500 m. Iš visų svetimkraščių rūšių apie 40 yra invazinės ir dar apie 70 rūšių – potencialiai invazinės, ateityje galinčios kelti rimtų ekologinių problemų, nes invaziniai augalai keičia gamtinę ekosistemos struktūrą išstumdami laukines retas augalų rūšis, sudaro tankius sąžalynus, neleisdami įsikurti kitoms augalų rūšims, nes pasižymi konkurencinėmis savybėmis (Elton, 1958; Gudžinskas, 2000). Pavojingiausi Lietuvos svetimkraščiai augalai yra Sosnovskio barštis (Heracleum sosnowskyi Manden.), smulkiažiedė sprigė (Impatiens parviflora), raukšlėtalapis erškėtis (Rosa rugosa), baltažiedė robinija (Robinia pseudoacacia), varpinė medlieva (Amelanchier spicata), gausialapis lubinas (Lupinus polyphyllus), uosialapis klevas (Acer negundo), kanadinė elodėja (Elodea canadensis), dvimetė nakviša (Oenothera biennis). Įsiveržę augalai gali natūralizuotis ir apie 10 % invazinių augalų tampa piktžolėmis (Natkevičaitė-Ivanauskienė, 1971; Balevičius ir kt., 2007). Lietuvoje sparčiai plinta Sosnovskio barštis (Heracleum sosnowskyi Manden.). Ši rūšis yra pavojinga natūralioms vietinėms augalų bendrijoms ir žmonėms. Sosnovskio barštis agresyviai plinta, užimdamas vis naujus plotus bei išstumdamas vietinius augalus, įsikurdami dykvietėse, kultūrinėse pievose, pamiškėse, upių pakrantėse, šie aukštaūgiai augalai labai pakeičia kraštovaizdį. Sosnovskio barščio sultys pasižymi fotocheminiu poveikiu, sukelia fototoksines odos ir gleivinių reakcijas, gali skatinti odos ir kitų organų vėžinius susirgimus (Gudžinskas, Lančickas, 2007). Lietuvoje dėl sparčiai gausėjančios smulkiažiedė sprigės (Impatiens parviflora) mažėja greta natūraliai auganti paprastoji sprigė. XIX a. pradžioje smulkiažiedės sprigės populiacijos pradėtos auginti Europos botanikos soduose pavirto laukiniu augalu ir smarkiai paplito, tapo sunkiai išnaikinama sodų pikžole. Smulkiažiedė sprigė kilusi iš Pietų Sibiro ir Vidurinės Azijos, Lietuvoje įsikūrė ir susiformavo dėl intensyvios antropogeninės veiklos. Vilniuje smulkiažiedė sprigė pirmą kartą pastebėta 1934 m., paplitus sulaukėjus iš universiteto Botanikos sodelio, Čiurlionio g. 23. Įėjo į natūralias fitocenozes išstumdama vietinės kilmės jai giminingą paprastą sprigę (Impatiens noli- tangere L.) (Natkevičaitė-Ivanauskienė, 1971). Generatyvinės fazės smulkiažiedės sprigės individai sudaro beveik ištisas vejas. Jeigu yra nestipri aukštesnių augalų, krūmų ar medžių konkurencija, užtenka apšvietimo ir maisto medžiagų, augalai augina šoninius ūglius, todėl padidina antžeminę 11

masę, sukrauna daugiau žiedų, išaugina sėklų ir susidaro gausesnis sėklų bankas ir sudaro konkurenciją smulkesniems miško augalams. Smulkiažiedė sprigė gausiai auga gatvių pakraščiuose, prie sodų, darželių, ant šiukšlynų, vingio medžiais apaugusiame pavėsingame šlaite (Snarskis, 1954). Invazinės augalų rūšys keičia augalų bendrijų rūšių sudėtį, smulkiažiedė sprigė patekus į naują aplinką, greitai dauginasi, auga ir nukonkuruoja vietinę paprastąją sprigę. Dėl to invazinės sprigės vis labiau įsigali ir mūsų krašte, užimdamos vietinės paprastosios sprigės augavietes bei sukeldamos kitų neigiamų padarinių. Aplinkos problemos kaip didėjanti CO2 koncentracija, aukštesnė temperatūra, gausesnis azotas, pasikeitęs ekstremalių klimato reiškinių periodiškumas ir paspartėjęs buveinių irimas dar labiau skatina invazijas (Priede, 2008). 1.1.2.2 Invazinių rūšių kontrolės priemonės Norint spręsti invazinių rūšių problemas, būtina sukurti efektyvią jų kontrolės sistemą, kuri užkirstų kelią panašių problemų atsiradimui (Rašomavičius, 2008). Kultūros valdymas, šienaujant, padeda pievose mažinti invazinių augalų plitimą. Mechaninis invazinių augalų valdymas yra lengviau kontroliuojamas nei daugiamečių augalų ir kontrolė gali užkirsti kelią plitimui. Mechaninio valdymo geriausi rezultatai pasiekiami, sezono pabaigoje, kai augalai žydi arba pradeda mesti žiedlapius, kadangi ankstyvas augalų pjovimo veda prie naujų ataugų. Augalinės medžiagos pjovimas, mulčiavimas arba dirvos dirbimas, naudojami Vokietijoje (Hartmann et al, 1995). Drėgname ir minkštame dirvožemyje nenaudoti sunkios žemės ūkio technikos, nes jos sugadina dirvožemį, padaro atvirų erdvių, kurios tinka atsikurti rūšims. Kelias savaites po priemonės taikymo plotas turi būti stebimas, dėl naujo ataugimo (Weiss et al., 2002). Cheminių medžiagų kontrolės priemonės selektyvūs herbicidai (2,4-D; triklopiras) ir neselektyvūs herbicidai (glifosatas) tinka kontroliuoti I. glandulifera. Biologinės kontrolės priemonės naudojamos Europoje. 1967 m. Europoje pirmą kartą užregistruotas amaras I. asiaticum, jis rastas tose vietovėse, kur natūraliai augo I. glandulifera ir dabar amaras yra plačiai paplitęs vidurio ir šiaurės Europoje. I. glandulifera ir Impatientinum asiaticum greitai dauginasi ir stelbia kitus augalus (Prowse, 1998). Integruoto valdymo srityje turi būti siekiama maksimaliai padidinti kontrolės poveikį, tuo pačiu mažinti šalutinį aplinkos poveikį. Dėl vartotojų sėklų transportavimo, kontrolės priemonės Baltijos jūros baseine, turi prasidėti upių aukštupyje ir pereiti pasroviui. Visiškai kontroliuojant tam tikrą sritį būtina keletą metų stebėti ir nuolat valdyti paplitimą (Weiss, McLaren,, 2002). Invazijai mažinti atliekami genetiniai invazinių ir vietinių augalų tyrimai (Prowse, 1998). 12

Invazinių rūšių kontrolė reikalauja ypatingų priemonių ir kartais labai skubių sprendimų. Jau esančių invazinių rūšių kontrolei vykdyti būtinos išsamios žinios apie kiekvienos rūšies populiacijų sudėtį, dinamiką, buveines, poveikį aplinkai ir plitimo būdus bei kelius (Rašomavičius, 2008). Svetimkraščių augalų invazingumui Lietuvoje nustatyti ir mažinti, buvo rengiamas invazinių augalų rūšių populiacijų dinamikos ir plitimo tyrimai: smulkiažiedės sprigės, sosnovskio barščio, gausialapio lubino, šluotinio sausakrūmio, ilgakočio lakišiaus, tankiažiedės rūgštynės, rytinės engros, muilinės gubojos rūšių, remiantis tyrimo metodika, atsižvelgiant į svarbiausius biologijos ir morfologijos bruožus, kurie parodo augalo gyvybingumą, vaisingumą, dauginimosi ir plitimo spartą (Gudžinskas, 2007). Atlikti laukų (segetalinės) augmenijos rūšių ir bendrijų įvairovės kaitos pagrindinių tendencijų vertinimai ir prognozės (Rašomavičius, 2008). Invaziniai ir vietiniai augalai tyrinėjami genetiniais molekuliniais tyrimais, todėl norint rasti Lietuvos invazinių augalų plitimo priežastis, mechanizmus, individų genetinį panašumą, reikia Lietuvoje atlikti genetinius vietinių augalų tyrimus ir gautus rezultatus lyginti su svetimkraščių rūšimių tyrimų rezultatais. 1.2 Sprigių genties biologija Šeima: balzamininiai – Balsaminaceae Lindl. Gentis: sprigė – Impatiens L. Sp. Pl. Rūšis: Impatiens noli-tangere L. Sp. pl. Sprigė priklauso balzamininių (Balsaminaceae) šeimai, kurioje yra iš viso iki tūkstančio plačiai šiauriniame pusrutulyje ir atogrąžose paplitusių augalų rūšių. Balsaminaceae sudaro 2 gentys: Hydrocera and Impatiens. Impatiens yra didesnės genetinės įvairovės ir laikoma viena iš taksonomiškai sudėtingiausių gaubtasėklių genčių (Janssens, 2006). Genties pavadinimas iš lotynų kalbos žodžio impatiens – reiškia nepakenčiąs, prinokę vaisiai nuo menkiausio prisilietimo sprogsta ir sąvaros, spirališkai susisukdamos, išsviedžia sėklas (Snarskis, 1954). Lietuvoje balsaminaceae vienamečiai žoliniai augalai su stačiais stiebais, žydi nuo ankstyvos vasaros iki pirmųjų šalnų, kitose šalyse balsaminaceae rūšys yra daugiametės, auga šiltesniame klimate ir žydi visus metus. Lapai be prielapių, pražanginiai, kartais menturiniai arba priešiniai. Žiedai pavieniai arba susitelkę pažastiniuose žiedynuose, be pažiedžių, dvilyčiai, zigomorfiniai, penkianariai. Taurelė iš trijų lapelių, nes vienas taurėlapis didelis, su pentinu, panašus į vainiklapį, ir du nepastebimi. Vainiklapiai 5, šoniniai suaugę po 2. Kuokeliai 5, sulipę

dulkinėmis ir prisiglaudę prie mezginės. Mezginė viršutinė, penkializdė, lizde daug sėklapradžių, purka bekotė, penkiaskiaute. Vaisius – pailga dėžutė, atsidaranti 5 sąvaromis, sąvaros tampriai atšoksta, išsklaidydamos sėklas, kartais jos sultingos, ir dėžutė tampa panaši į uogą. Dauguma jų auga kalnuose – nuo atogrąžų bei paatogrąžų regionų Indijoje iki pietryčių Azijos (Natkevičaitė- Ivanauskienė, 1971). 1.2.1 Sprigių genties morfologija, ekologija ir geografinis paplitimas Pasaulyje Impatiens genties augalai yra intensyviai tyrinėjami dėl savo skvarbumo ir konkurencingumo užimant augavietes svetimose žemėse, tuo pačiu išstumiant vietines augalų rūšis (Hejda et al., 2009). Iš Kinijos buvo pernešta apie 240 rūšių, tai sudaro apytiksliai 25 % Impatiens rūšių visame pasaulyje, Kinijoje dauguma sprigių rūšių yra endeminės (Snarskis, 1954). Europoje natūraliai auga vietinė paprastoji sprigė (Impatiens noli-tangere L.) ir keturios svetimkraštės sprigių rūšys: bitinė sprigė (Impatiens glandulifera R.) atvežta iš Indijos; smulkiažiedė sprigė (Impatiens parviflora DC) 19-ąjame šimtmetyje iš centrinės Azijos ir išplito po visą Europą, dabar yra labai gausi; Impatiens capensis M. išplitusi iš Šiaurės Amerikos, centrinėje Europoje nustatyta nuo 1990-ųjų; azijinė Impatiens balfourii centrinėje ir rytų Europoje. Tyrimai parodė, kad yra tendencija šiai sprigių rūšiai Impatiens balfourii natūralizuoti ir Pietų bei Vakarų Europos dalyse (Pyšek, Prach, 1995). Anglijoje Ežerų rajone ir vidurio Velse paprastoji sprigė natūralizavosi pabėgdama iš sodų, tačiau pasiskirstymo ir būklės tyrimai iki galo neatlikti. 1950–1987 m. paprastoji sprigė buvo laikoma natūraliai auganti Ežerų rajone ir vidurio Velse, tačiau svetimkraštė pietinėje Ežerų rajono dalyje ir pusiaukelėje tarp vidurio Velso ir Ežerų rajono (Preston et al., 2002). 1933–1974 m. paprastoji sprigė rasta pietrytinėje Anglijoje šalia Surrey tvenkinio (Lousley,1976) ji buvo laikoma kaip natūrali rūšis Jungtinėse valstijose Nortumberlende (Swan, 1993) ir Vakarų Jorkšyro grafystėje (Lees, 1888). Paprastaja sprige minta drugys (Eustroma sp.), todėl pagal jo buvimą galima nustatyti, kur sprigė natūraliai augantis augalas, jei Eustroma nerandamas galima spręsti, kad sprigė invazinė. Anglijoje (Eustroma sp.) drugio buvimas buvo nustatytas Ežerų rajone ir Velse (Coombe,1956b). 1990 m. Anglijos Ežerų rajone 26 vietose augo 7650 augalų. Pakartotinai 2000 m. atlikus skaičiavimus 55 vietose augo 25655 augalai, 29 vietose iš šių populiacijų sudarė 20245 augalai, taigi sumažėjo 2000 m. 16 % palyginus su 1990 m. Ežerų rajone 1991 m. ši rūšis sutelkta 9 vietose, 3295 augalai buvo septyniolikoje Velso vietovių (Hatcher, Alexander, 1994). Šiaurės Amerikoje remiantis iki šiol darytais tyrimais, negalime spręsti, kad paprastoji sprigė yra natūraliai auganti rūšis. 1803 m. pirmą kartą aprašyta paprastoji sprigė Šiaurės 14

Amerikoje, tačiau Rytberg manė, kad tai blogai apibūdinta kita rūšis vilkdagis (Iris pallida). 1890 m. paprastoji sprigė buvo aprašyta šiaurės vakarų Vašingtone, bet 1910 m. Rytberg ją palaikė atskira nauja rūšimi – I. occidentalis ir tokia rūšimi ji minima 1951 m. (Rydberg, 1910). Kai kuriose vietovėse paprastoji sprigė buvo pavadinta cirkumpoliarine rūšimi kaip ir I. capensis (Hultén, 1971; Jouret, 1977). 1980 m. Austrijoje Alpių kalnų centrinėje dalyje užregistruota bitinė sprigė, tačiau nuo to laiko ji nevaldomai išplito ir pradėjo stelbti vietinius augalus, taip pat ir paprastąją sprigę. Dar didesnė plėtra prognozuojama ateityje (Pagitz, 2011). 2010 m. Austrijoje Traisen upės pakraščiuose atliktas augalų rūšių gausumo tyrimas. 135 Traisen upės pakraščių plotai įvertinti naudojant 200 m2 rėmus. Buvo aptiktos 27 neofitų augalų rūšys. 7 iš jų – invazinės arba potencialiai invazinės, tarp kurių aptikta ir I. parviflora bei I. glandulifera (Lapin, Bernhardt, 2011). Anglijoje paprastosios spirgės gausumo/tankio tyrimas atliktas naudojant metinius stebėjimus ir skaičiavimus. Atskiros paprastos sprigės populiacijos Anglijos Ežerų rajone paprastai sudarytos iš 1–6000 augalų / m2 plotelyje (Hatcher, 2001). Populiacijų skaitlingumas svyruoja iš metų į metus. Nuo laiko priklausantys svyravimai nustatyti Lenkijos, Galavežo natūraliuose miškuose: stebint 7 metus paprastąją sprigę viename 10 augalų / m2 plotelyje individų skaičius svyravo 377–1625, o kitame 10 augalų / m2 plotelyje 590–2055 individų, per tą patį laiką (Falinski, 1986). 1993–2000 m. paprastoji sprigė išnyko 23 Anglijos Ežerų rajono vietose, sekančiais metais nenustatytas ryšys tarp vietovių ir populiacijos pakitimo. Augalai retai pasirodydavo tose vietose kuriose jau jie buvo išnykę. 1990–2000 m. Anglijos Ežerų rajone vėl atsiradusių augalų buvo dešimtyje vietų, bet tik dviejose iš jų vyko atsistatymas (Hatcher, 2001).1966–1996 m. paprastoji sprigė išnyko Čekijos miškuose, kuriose ji buvo labai gausi (Tichy, 1997). Didžiojoje Britanijoje paprastoji sprigė retai auga tankumu didesniu nei 100 augalų / m2, tačiau kontinentinėje Europoje daigų tankis siekia 995 daigų / m2. Kontinentinės Europos paprastosios sprigės populiacijos tankis alksnynuose svyravo nuo 29 daigų m2 (27,9 g / m2 žaliosios masės, 0,997 g sausosios masės / m2) (Elias, 1987) iki 64±21,5 (Falinska, 1979) ir net iki 125–167 daigų m2 (Falinska, 1979; Falenska, 1983). Kontinentinėje Europoje ąžuolynuose- skroblynuose tankis buvo nuo 3 iki 130 augalų / m2 (Falinska, 1979; Falinski, 1986; Eliaš, 1986). Belovežo natūraliuose miškuose augalų tankis retai viršydavo 10–50 individų / m2, bet labiau apšviestose ir miško pakelėse prie miško takų tankis svyravo 100–200 augalų / m2 (Falinski, 1986). Slovakijoje, Kosice regione buvo aptikti 34 svetimšaliai augalai, tarp kurių dominavimu pasižymėjo I. glandulifera bei I. parviflora (Sitasova, 2011). Rusijoje, Maskvoje, pagrindinio botanikos sodo teritorijoje buvo tiriamas I. glandulifera ir I. noli-tangere tankis: a) ties Lihoborka upės pakrantėmis; b) gluosnių pavėsyje; c) pelkėje prie nendrių. 2006 m. gauti rezultatai parodė, kad I. 15

glandulifera ir I. parviflora tankio skirtumai buvo nereikšmingi (200–350 augalų / m2), priklausomai nuo augaviečių charakteristikos. Augavietėse, kur šie invaziniai augalai buvo pašalinti, metai po metų jų tankumas vis didėjo ir 2008 m. buvo jau apytiksliai 700 augalų / m2 (Vinogradova, 2011). Čekijoje ištirta konkurencija tarp sprigių rūšių, I. noli-tangere yra labai priklausoma nuo aukštos dirvožemio drėgmės bei medžių sudaromo pavėsio, o kitoms sprigių rūšims tokios sąlygos nebūdingos. Tyrimas atliktas iš vietovės pašalinant kurią nors sprigių rūšį ir stebint kitos rūšies gausėjimą. I. noli-tangere labiausiai pagausėja, kai pašalinama I. glandulifera rūšis ir mažiau, kai pašalinama I. parviflora. Natūralios I. rūšies – I. noli-tangere konkurencingumas nėra didelis (Čuda et al., 2011). Anglijoje atlikti tyrimai palyginant paprastosios sprigės augimą skirtingose augavietėse. Paprastoji sprigė tam pačiame miške gyvybingesnė sausesnėse nei drėgnose vietose, bet augalai labiau įvairuoja ir išaugina didesnę šaknų masę šlapiose vietose (Markov, 1991). Kiti tyrimai rodo, kad paprastoji sprigė geriau auga drėgnuose alksnynuose, nei sausuose skroblynuose- ąžuolynuose. Paprastosios sprigės populiacijos alksnynuose tankesnės ir geriau užpildė visą erdvę negu sausuose skroblynuose-ąžuolynuose, be to alksnynų augalai buvo 3–5 kartus sunkesni ir įvairesni, tačiau skroblynuose-ąžuolynuose ir uosynuose populiacijos buvo tankesnės ir sudarytos iš žemesnių ir mažesnės masės augalų negu alksnynų populiacijose (Falenska, 1981; Elias, 1987). Alksnynų dirvožemis yra derlingesnis, apšvietimo sąlygos geresnės ir aukštesnis vandens lygis negu uosynų ir skroblynų. Augalai augantys prie miško kelių Belovežo miške buvo aukštesni, sunkesni, tankesni ir išaugindavo dvigubai daugiau sėklų negu užmirkusiuose alksnynuose (salpose) ar sausuose skroblynuose-ąžuolynuose. Kleistogaminiai žiedai buvo retesni pakelių populiacijose, augalai dažnai buvo šluotiški su lapuota viršūne ir gausiai šakoti, tokie augalai retai sutinkami kitose vietovėse (Falenska, 1981, 1983; Eliaš, 1987). Nuo vietos sąlygų priklauso žydinčių augalų ir kleistogaminių žiedų dalys. Belovežo miškuose 60 % augalų žydėdavo, kur medžių padengimas 70–90 %. Miškose augančios paprastosios sprigės 90–96 % žiedų kleistogaminiai, bet augalus perkėlus į sodą kur buvo daug šviesos tik 18–26 % žiedų buvo kleistogaminiai (Falinska, 1979). Paprastoji sprigė auga laikinai apsemtose vietose, suardytoje miško žolinėje dangoje, kur pasireiškia nors nedidelė žmogaus įtaka (Markov, 1991). Paprastąją sprigę galima apibūdinti kaip rūšį kuriai įsikurti nereikia medžių lajos ženklesnio sunykimo, tačiau augalas geriau dauginasi ir auga šernų ar bizonų suardytoje žemėje, kurioje mažiau konkurencijos su kitais augalais ir medžiais (Jankowska-Blaszczuk, Grub, 1997). Tačiau, ąžuolynuose-skroblynuose, kur žemė išrausta šernų, kai kur nustatyta 8 kartus sumažėjas sėklų tankis palyginus su nepaliestomis vietomis, tačiau ir šiuo atveju daigai dažniau pasirodo 16

suardytose vietose. Paprastąją sprigę taip pat galima rasti plynų kirtimų vietose Ukrainos Karpatų apsauginių juostų bukynuose (Gorshenin et al., 1972). Paprastąją sprigę galima apibūdinti kaip rūšį, kuriai įsikurti nereikia medžio lajos ženklesnio sunykimo, augalui padeda įsikurti šernų ar bizonų suardyta žemė, kurioje sumažėja medžių ir žolių konkurencingumas (Jankowska-Blaszczuk, Grub, 1997). Lenkijoje, rezultatai parodė, kad bitinė sprigė (I. glandulifera) yra daug stipriau įsigalėjusi žmogaus veiklos paveiktose augavietėse nei natūraliose (Chmura, 2006). Kitas tyrimas, atliktas Lenkijoje, Krokuvoje rado netipišką taksonominę struktūrą. I. glandulifera populiacijos daugiausia buvo surastos šalikelėse, kur jos buvo dominantinės vietinių augalų rūšių atžvilgiu, taip pat gluosnių tankymėse, ir miško kelių pakraščiuose (Kostrakiewicz, Zając, 2011). Centrinėje Europoje (Čekijoje) atlikti filogenetiniai ir augaviečių tyrimai Impatiens rūšims (I. noli-tangere I. glandulifera I. parviflora I. capensis). Buvo ištirtos augavietės, sėklų sudygimo laikas, atsparumas šalčiui, reakcijos į aplinkos veiksnius (maistinių medžiagų prieinamumas, vandens gausumas ir apšvietimo intensyvumas). Gauta, kad I. glandulifera yra skvarbesnė už kitas sprigių rūšis, dėl ankstyvo daigų sudygimo ir didelio suaugėlių dydžio. Nors natūraliai auganti I. noli-tangere sukuria sėklų banką, yra atspari šalčiui, sugeba įsisavinti giliau ir sekliau esančias dirvožemio maistingas medžiagas bei vandenį, invazinės Impatiens rūšys ją stelbia (Skálová et al., 2011). Anglijoje atlikti šalnos ar sausros poveikio paprastosios sprigės augimui tyrimai. Sausuose dirvožemiuose paprastoji sprigė išaugino mažai arba visai neišaugino sunokusių vaisių (Ellenberg, 1988). Sumažėjusi dirvožemio drėgmė buvo pagrindinė priežastis paprastosios sprigės sunykimui Čekijos miškuose per 30 metų. Paprastoji sprigė yra jautri šalnoms: vėlyva pavasari ir ankstyva rudeni šalnos gali sunaikinti daigus ir subrendusius augalus (Tichy, 1997). Anglijos Ežerų rajone buvo išmatuotos minimalios ir maksimalios temperatūros ir kritulių kiekis atskirais sprigės gyvavimo tarpsniais: dygimas (balandis-birželis); augimas (liepa-rugpjūtis); sėklų brendimas (liepa- rugsėjis); žiemojimas (spalis-kovas) (Hatcker, 2003). 1990–2001m. buvo suskaičiuotas dienų skaičius su temperatūra žemesne 00C, rodikliai (žiemojimo temperatūra, krituliai balandžio-birželio mėn. ir minimali temperatūra liepos – rugsėjo mėn.) palyginti naudojant regresinę analizę su populiacijų dydžiais, gautas 84–81 % populiacijų dydžio kintamumas. Tirtų dviejų paprastosios sprigės populiacijų dydžiai tiesiogiai priklausė nuo aukščiausių ir minimalių temperatūrų sėklų brendimo metu, žemų žiemojimo temperatūrų ir atvirkščiai proporcingas krituliams dygimo metu ir po jo sekančiu tarpsniu. Vienoje populiacijos buvo teigiamas ryšys tarp blogo sėklų subrendimo ir maksimalios temperatūros, o kitoje populiacijoje buvo teigiama koreliacija tarp maksimalios temperatūros ir kritulių, sėklų dygimo metu ir augant suaugusiam augalui (Hatcker, 2003). 17

Austrijoje tiriamos invazinių rūšių aleliopatinės savybės I. balfourii, I. glandulifera, I. parviflora augalų rūšys daugiausiai viršijo Juglone indeksą, o tai reiškia, kad šios augalų rūšys yra potencialiai dominantinės (Csiszár, et al., 2011). Anglijoje atliktas paprastosios sprigės sandaros ir fiziologijos tyrimas. Daigų tyrimas Reading universite parodė, kad ūglių ir šaknų masė taip pat lapų plotas auga eksponentiškai 15–99 dienomis nuo sudygimo per šį tarpsnį santykinio augimo greičio vidurkis 0,0895±0,0028 diena -1, o lapų ploto santykis 0,433±0,126cm mg-1 diena-1. Auginant augalus universiteto laboratorijoje pirmi tikrieji lapai buvo prisegti priešiniu būdu, bet subrendę buvo skirtingo dydžio. Vidutinis lapo ilgis 43: 29,3±0,5 mm ir 31,2±0,5 mm, plotis po 43: 26.5 ir 29,4 mm. Sekantys du tikri lapai taip pat išsiskleidė kaip priešiniai, bet vėliau vystėsi atskirai ir tapo ženkliai pražangiais. Pirmieji šoniniai ūgliai pasirodė 40 diena ir jų skaičius pastoviai didėjo. Šoninių bamblių skaičius iš kurių neišaugo pumpurai mažėjo vystymosi eigoje. 61–69 dienomis šoninių ūglių bendras lapų plotas didėjo nuo 12,5 % iki 73,6 %. Atviros vietos augalų subrendusiuose lapuose apatinis lapo paviršius turėjo žiotelių / m2 261±15mm-2 (n = 19). 14 lapų viršutinėje pusėje nebuvo žiotelių, o 8 lapų buvo 12±7 žiotelių / mm2. Priešingai paprastajai sprigei buvo nustatyta bitinei sprigei, kurios apatinėje lapų pusėje buvo 134 žiotelės / mm2 (atvira vieta), o didesnis žiotelių skaičius buvo viršutiniame paviršiuje 97 / mm2 (Beerling, Perrins, 1993). Kiti smulkiažiedės sprigės tyrimų rezultatai rodo, kad saulės apšviestuose lapuose viršutiniame paviršiuje buvo 46 žiotelės / mm2 (Coombe, 1956a). Anglijos ežerų rajone paprastosios sprigės šaknų sistema yra negili ir neišsikerojusi. Paprastosios sprigės 6-10 individai turi sugleivėjusi hipokotilio pamatą su minkštu, mėsingu sustorėjimu, stiebo diametras 3-5 mm ir baigiasi šaknimis. Vidutinio dydžio augalų hipokotilis yra daugiau ar mažiau gulsčias ties žemės paviršiumi su skaitlingais stiebiškais sustorėjimais. Tokiuose augaluose hipokotilis pereina arba nepereina į pagrindinę šaknį. Šoninės šaknys paprastai išauga didesnės negu bet kuri pirminė šaknis. Pirmos eilės šoninės šaknys yra dažnesnės, nei antros eilės šoninės šaknys. Tarp 18 augalų, kurių stiebo skersmuo yra 3,9 mm ir auga 5 cm aukštyje virš žemės, šaknys retai nusidriekia į šonus 10 cm ir į žemę įauga ne daugiau kai 5 cm. Tokiose augaluose 45 % šaknų sausos masės sutelkta 1 cm spinduliu apie stiebo pamatą, 74,5 % 2 cm spinduliu, 86 % 3cm spinduliu, 92,6 % 4 cm spinduliu, 96,1 % 5 cm spinduliu, 99,9 % 10 cm spinduliu. Didžiausias šaknų ilgis augintų Reading universitete yra 35,3 mm 15 dienų nuo sudygimo, 70,1 mm 26 dienų nuo sudygimo ir 136 mm 40 dienų nuo sudygimo, kai subręsta paprastosios sprigės šaknys panašios į bitinės sprigės, (> 50) mėsingomis šaknimis išaugančiomis iš stiebo pamato ir su šaknimis išaugančiomis netaisyklingai virš stiebo pamato. Ūglių masės procentas didėja nuo 73,7 % 15 dienų nuo sudygimo iki 85,9 % 99 dienų nuo sudygimo (Ennos et al., 1993). Kai kuriais tyrimais nustatyta, kad šaknų sistema sudaro 18

10 % viso augalo masės. Iš stiebo bamblių gali išaugti pridėtinės šaknys jei augalas yra nulinkęs (Falencka, 1981). 2001m. Anglijoje Reading universitete ištirti paprastosios sprigės fiziologiniai duomenys. Subrendusios paprastosios sprigės lapijos viršūniniuose lapuose maksimalus fotosintezės greitis -2 -1 buvo 13,0±0,42μmol CO2 m s , greičio konstanta 0,00214, šviesos kompensacijos konstanta 58,3 μmol PAR (eng. PAR fotosintetiškai aktyvi spinduliuotė). Pradinis nuolydis (kvanto efektyvumas) -2 -1 467 μmol CO2 / μmol PAR ir tamsinis kvėpavimas – 1,7±0,39 μmol CO2 m s kambario temperatūroje (18 – 200C). Paprastoji sprigė vysta net drėgname dirvožemyje jei augalą saulė apšviečia ilgiau nei kelias minutes (Ellenberg, 1988). Saulėje vandens prarandama 4,73 g sausosios masės per dieną (Coombe, 1956a). Vidutinis kutikulinės transpiracijos greitis yra 70 ml / g (minimalus 48 maksimalus 100) esant prisotintai masei nukirstų ūglių (Pisek, Berger 1938). Paprastoji sprigė vasariniai vienamečiai terofitai besidauginantys tiktai sėklomis. Chromosomos 2n = 20, 40 (Chinnappa, Gill, 1974). Europos žemyne paprastosios sprigės buvo nustatyta tetraploidinė forma (Skalinska et al., 1959). Ištirta, kad Anglijos ežerų rajone paprastosios sprigės mikorezė buvo silpnai išsivysčiusi (Harley, Harley, 1987). Paprastosios sprigės biocheminiai duomenys. Ryški geltona dėmė ant vainiklapių susidaro iš nepoliarinių karotenoidų (44–55% acilinto violaksantino, 35–45 % liuteino epoksido) kaupiamų dideliais kiekiais chloroplastuose (Wrischer et al., 1999). Šios rūšies chloroplastai yra vamzdeliniai arba rutuliški, kurių forma atspindi lipidų kiekį (Sitte et al., 1980; Emter et al., 1990). Kriptoksantinas, kriptoksantino epoksidas ir neoksantinas buvo izuoliuoti iš paprastosios sprigės. Šie pigmentai yra susijungia su prisotintomis, ilgagrandėmis riebalų rūgštimis – miristine, palmitino, teatrino rūgštimis (Kleinig, Nietsche, 1968). Lavsonas (2-hidroksi-1,4-naftochinonas) – svarbiausias (Lawsonia alba) lapų dažomasis komponentas ir 2-metoksi-1,4-naftochinonas buvo nustatyti antžeminėse žydinčių augalų dalyse ir sudarė atitinkamai 0,185 % ir 0,03 % sausosios masės (Lobstein et al., 2001). 2-metoksi-1,4-naftochinonas pasižymi antimikrobinėmis savybėmis (Yang et al., 2001). Anglijoje atliktas paprastosios sprigės augimo ir žydėjimo tyrimas priklausomai nuo metų laikų. Pietų Anglijoje paprastoji sprigė pradeda dykti nuo ankstyvo kovo, o Ežerų rajone keliais mėnesiais vėliau. Pietų Anglijoje augalai dažnai sunyksta anksti rugsėji (po žydėjimo, bet prieš pirmąsias šalnas). Bet Ežerų rajone augalai išlieka iki vėlyvo spalio ar ankstyvo lapkričio, kol pirmosios šalnos numarina augalus. Centrinės Europos skroblyne – ąžuolyne paprastoji sprigė dygsta nuo vėlyvo vasario ir išlieka iki vėlyvo lapkričio išaugindama žiedus nuo ankstyvos liepos iki vėlyvo rugpjūčio, augalai nežiemoja (Falinski, 1986; Ellenberg, 1988). Japonijoje daigai 19

išdygsta nuo ankstyvo balandžio iki ankstyvos gegužės, išgyvena iki 70 % iki birželio vidurio ir populiacijos išnyksta per ankstyva rugpjūti rugsėjo vidurį (Masuda, Yahara, 1994). Paprastoji sprigė nepasižymi pastoviu sėklų banku, nes visos sėklos dygsta kartu sekančiais metais po jų išbyrėjimo ir nėra naujų daigų po pagrindinio dygimo periodo (Horwood, 1919; Markov, 1991). Šiuos duomenis palaiko tai, kad išnykus paprastajai sprigei Anglijos Ežerų rajone iš naujo augalai nepasirodo, tačiau paėmus 50 dirvožemio bandinių (31 – 31 ant 5cm.) iš Belovežo natūralių miškų, 1993 m. sudygo 1917 paprastosios sprigės sėklų, 145 sekančiais metais ir 1995 m nei viena. (Jankowska-Blaszczuk, Grubb, 1997). Norvegijos miške rugpjūčio mėnesį perneštas dirvožemis, su paprastosios sprigės sėklomis, neapsaugojo nuo pakartotinių išdygimų sekančiais metais (Austad, Skogen, 1990). Šie tyrimai rodo, kad paprastosios sprigės sėklų bankas panašus į bitinės sprigės, esant tam tikrom aplinkybėm sėklų bankas gali išlikti iki 18 mėnesių (Beerling, Perrins, 1993). Sėklų banko tankis yra nuo 24 sėklų m2 5cm paviršiniame dirvožemio sluoksnyje iki 90m2 sėklų apleistoje pievoje ir net iki 451m2 sėklų natūraliame ąžuolyno – skroblyno dirvožemyje (Centrinėje Europoje) (Markov, 1991; Falinska, 1999; Jankowska-Blaszczuk, 1998). 1.2.2. Lietuvos natūralios ir invazinės sprigių genties rūšys Lietuvoje augančios sprigių rūšys yra vienamečiai žoliniai augalai su stačiais, kartais net peršviečiamais stiebais, šakotais ir neretai šiek tiek sustorėjusiais bambliuose. Lapkočiai ekstrafloralinėmis liaukutėmis. Lapai paprasti, pražanginiai, priešiniai arba menturiniai, pliki arba apaugę retais plaukeliais. Iš 3 taurėlapių 2 šoniniai maži, žoliniai, trečias didesnis, panašus į vainiklapį, su pentinu, ne ilgesniu už patį žiedą. Vainiklapis, esantis prieš pentinuotą taurėlapį, dažniausiai apskritas. Kuokeliai su plačiais koteliais, sulipę dulkinėmis. Mezginė pailga. Vaisius – pailgai kiaušiniška arba cilindriška dėžutė; ji staigiai atsidaro spirališkai susisukant tamprioms sąvaroms, ir sėklos išvaistomos. Sėklos lygios arba smulkiai karpotos, be endospermo. Kai kurios rūšys turi smulkius, kleistogaminius žiedus (Natkevičaitė-Ivanauskienė, 1971). Gentyje iš viso 750 rušių. Lietuvoje auga 4 rūšys, iš jų 1 savaiminė, 2 sulaukėjusios ir 1 auginama. Smulkiažiedė sprigė (Impatiens parviflora DC.). Žiedai smulkesni, iki 1 cm ilgio, blyškiai geltoni; pentinas tiesus. Lapai smulkiai dantyti. Stiebo bambliai nesustorėję (1.1 pav.). Iš Centrinės Azijos kilusi rūšis. Lietuvoje ėmė plisti nuo XX a. 4-ojo dešimtmečio, bet ypač išplito per paskutinius 30 metų. Miškuose sudaro ištisus sąžalynus ir stelbia daugelį vietinių augalų. Patikimų ir saugių naikinimo būdų kol kas nėra (Snarskis, 1954, Natkevičaitė-Ivanauskienė, 1971). Bitinė sprigė (Impatiens glandulifera L.). Visi arba bent viršutiniai lapai menturiniai arba priešiniai; lapkočiai pamate su stambiomis liaukutėmis (1.1 pav.). Augalas kilęs iš centrinės Azijos. 20

Į Europą įvežtas kaip išvaizdus dekoratyvinis augalas, stipriai išplitęs natūralioje gamtoje. Stiprus konkurentas, išstumiantis svarbius vietinius augalus, kurie šaknimis sutvirtina dirvos paviršių (Snarskis 1954, Natkevičaitė-Ivanauskienė 1971). Balzamininė sprigė (Impatiens balsamina L.). Žiedai balti, rausvi, violetiniai ar margi, pavieniai ar po kelis lancetiškų lapų pažastyse; vaisiai plaukuoti. Kilusi iš Indijos. Auginama gėlynuose, kapinėse, balkonuose. Paprastoji sprigė (Impatiens noli-tangere L.). Vienametis, plikas, 30–110 cm aukščio augalas. Šaknys kuokštinės. Stiebas stačias, šakotas, su sustorėjusiais bambukais. Lapai pražanginiai, kiaušiniškis arba elipsiški, trumpai nusmailėję, stambiai bukai dantyti, 5–10 cm, ilgio ir 2–5 cm pločio, apatiniai kotuoti, 2–4 cm ilgio, pamate plačiai pleištiški, viršutiniai beveik bekočiai, pamate apskriti. Kekes trumpesnės už lapus, su 3–5 žiedais. Žiedynkočiai 2–3 cm ilgio, pažastiniai, prisegti po lapais, už juos trumpesni (Snarskis, 1954). Žiedai iš 3 taurėlapių ir 5 vainiklapių. Apatinis taurėlapis platus 7–13 mm piltuvelio pavidalo, jo ilgis didesnis už plotį ir laipsniškai siaurėja į pentiną, kurio galas pripildytas nektaro, pentinas 6–12 mm, kreivas, išlenktas pakabintas 90 ° ir daugiau kampu. Du išoriniai priešiniai taurėlapiai yra plokšti ir nusvirę, žali.Viršutinis vainiktapis atskiras, mažas, platus, su anga ir mėlynai žalia neryškia gysla viršuje, likę keturi vainiklapiai susiskirstę į dvišonines poras nusvirę ir netaisyklingai skiautėti. Viršutinis nugarinis vainikapis sudaro kabliuką virš androcėjaus ir susijungusio šoninio vainiklapio, susidaro pastebima lūpa skrendantiems vabzdžiams. Kuokelių penki, suaugę, arti mezginės, pražangiai išsidėstę vainiklapių atžvilgiu. Kuokelių koteliai trumpi, dulkinės trumpos ir lipnios, suaugusios aplink purką. Ginacėjus iš penkių suaugusių vaislapėlių su dviem ir daugiau mezginių kiekviename segmente, po žydėjimo visas vainikėlis nubyra nuo augalo. Dėžutė su penkiom talpom, 1,5 cm ilgio, 1–9 sėklomis, kurių masė 2–6 mg. Sėklos kiaušiniškos keturbriaunės skerpjuvyje 3,3–4,6 mm ilgio, 1,4–2.2 mm pločio, 0,8–1,5 mm storio. Sėklos atvirkščiai kiaušiniškos, atvirkščiai piramidiškos, su 5 kampais skerspjūvyje (1.1 pav.; Anderberg, 1994). Žydi nuo birželio iki rugsėjo mėn. Vaisiai atsiranda liepos mėn. Paprastoji sprigė dažnai sudaro tankius sąžalynus susidedančius iš vienos rūšies, tai atsiranda dėl vienu metu dygstančių sėklų pavasari. Daigai pasirodantys dygimo tarpsnio pradžioje turi daugiau galimybių išgyventi, tuo tarpu daigai pasiekiantys dirvožemio paviršių dygimo tarpsnio trečios savaitės pabaigoje paprastai miršta po kelių dienų. Auga miškų daubose, drėgnų spygliuočių ir mišrių miškų bei krūmų tankmėje, paupiuose, pelkėse, pagrioviuose, puveningame, drėgname dirvožemyje. Priklauso euraziniam floros elementui (Snarskis, 1954; Falencka, 1983).

Miškų tipai, kur labiausiai paplitus paprastoji sprigė – palieknis, juodgiris, lieknas, šlapgiris, baltmiškis, paraistis, žaliagiris, sausgiris, mėlyngiris, šilagiris. Dažniausiai randama paprastoji sprigė pelkinio tipo miškuose, jame sprigės sutinkamumas 38 %, pastovumas 71 %, vidutinis projekcinis padengimas 2,3 %, Pirsono sąsajos koeficientas 0,034. Pagrindinis miško tipas – vingiorykštinis – įvairiažolis juodalksnynas su egle ir uosiu. Trakas paprastai retas (Karazija, 1988).

1.1 pav. 1. Paprastoji sprigė (Impatiens noli-tangere L.). 2. Smulkiažiedė sprigė (Impatiens parviflora). 3. Bitinė sprigė (Impatiens glandulifera) pakelėje prie Vaišvydavos (autorės nuotrauka)

Paprastoji sprigė įvardinta, kaip vidutinio klimato rūšis (Prestono, Chilo, 1997). Paprastoji sprigė yra terofitas auga drėgnokose, šlapiose vietose, kai kada užmirkusiose vietose, šlapiuose miškuose, upių, upelių pakraščiuose (pagal Ellenberg drėgmės vertė – 7; Ellenberg, 1988). Paprastoji sprigė laikoma azotamėge rūšimi (azoto vertė – 6). Ji auga miškuose prie upių, daliniame pavėsyje, kur apšvietimas didesnis nei 5 % (šviesos vertė – 4) ir gana šiltose vietose (temperatūros vertė – 4; Ellenberg, 1988). Jos pasiskirstymas rodo, kad visi šie veiksniai, ypač krituliai yra labai svarbūs (Hacker, 2003). Paprastoji sprigė priklauso euraziniam floros elementui (Snarskis, 1954). Ji paplitus visuose Lietuvos rajonuose, taip pat randama Didžiosios Britanijos Lberijos pusesalyje, Prancūzijoje (išskyrus pietuose), išilgai Europos, Rusijos Sibire, Japonijos Kamčiatkoje, šiaurės Amerikoje, nuo pietų Aliaskos iki Britų Kolumbijos, Švedijoje. Paprastosios sprigės arealas centrinėje Europoje yra 1400–1500 m. aukštumoje, Prancūzijoje iki 1500 m., Norvegijoje iki 700 m, Kinijos kalnuose iki 2000 m aukštumos. Velse ir Anglijos Ežerų rajone ji yra randama iki 210 m aukštumos, 89 % paprastosios sprigės auga žemiau nei 100 m aukštumos (Hatcher, 2003).

1.3. Metodai, naudojami tiriant natūralius ir invazinius augalus Didelis vertingų augalų rūšių praradimas praeituose šimtmečiuose buvo priežastis augalų resursų apsaugai atsirasti. Tinkama augalinės medžiagos identifikacija ir charakterizavimas yra svarbūs sėkmingai augalų resursų apsaugai garantuoti ir jos išlaikymui užtikrinti (Weiss, McLaren, 2002). Analizuojant natūralius ir invazinius augalus atsižvelgiant į svarbiausius bruožus, kurie parodo augalo gyvybingumą, vaisingumą, dauginimosi ir plitimo spartą atliekami – genetikos ir morfologijos tyrimai. Augalų morfologinei įvairovei vertinti, atliekami įvairūs augalo matavimai (žiedynai, lapai, sėklos, vaisius) (Baghalian et al., 2002). Augalų genetinės įvairovės tyrimai parodo biologinių rūšių (taksonomijos statuso, gyvybės formų, dauginimosi sistemų ir sėklų paplitimo) geografinės padėties ryšį su genetine įvairove viduje ir tarp populiacijų (Hamrick, Godt 1996). Atsižvelgiant į skirtingą kiekvienos rūšies evoliucijos istoriją (gyvenamos vietos fragmentacija, populiacijos izoliacija, genų dreifą, mutacijas, natūralią atranką ir ekologines sąlygas) genetinė vidupopuliacinė rūšies įvairovė gali skirtis (Schaal et al., 1998). Skirtumai tarp kloninių augalų genetinės įvairovės, taip pat gali būti paaiškinti ir remiantis taksonominiais statusais (gaubtasėkliai ar plikasėkliai) dauginimosi sistema, sėklų platinimo būdais, koloninio plitimo būdas. Aptikti išoriniai morfologiniai skirtumai augaluose, ne visada gali reikšti ir genetinę augalo įvairovę. Kartais morfologiniai skirtumai gali būti įtakoti skirtingų aplinkos sąlygų (Nybom, Bartish, 2000). Šiuolaikinė molekulinė biologija gali pasiūlyti daug ir įvairių genomo tyrimų metodų, tinkamų visų taksonominių grupių organizmų DNR genetinei analizei ir apsaugai. Molekuliniai metodai sudaro puikias galimybes įvairių rūšių augalų, gyvūnų, grybų bei mikroorganizmų genetinių „pasų“ sukūrimui. Genetinis „pasas“ leidžia atskirti ne tik tolimų, bet ir artimų skirtingų rūšių individus, išryškinti vidurūšinius atskirų individų genetinius skirtumus, sužinoti žinomų ir nežinomų augalų taksonus, o ankščiau buvo naudojami vien tik fenotipiniai metodai (Ambrasienė, 2008). 1.3.1 Molekuliniai metodai, naudojami tiriant augalus Molekuliniai metodai, tokie kaip DNR barkodingas, atsitiktinai pagaustinta polimorfinė DNR (APPD), amplifikuotų fragmentų ilgio polimorfizmas (AFLP), mikrosatelitai ir vieno nukleotido polimorfizmas (SNP) yra naudojami augalų įvairovės studijoms, tiriant natūralius ir invazinius augalus. Kiekvienas metodas turi savo privalumų ir trūkumų. Šie metodai skiriasi savo skirties geba (rezoliucija) aptikti genetinius skirtumus, generuojamų duomenų tipu ir pritaikomumu įvairiems taksonams (Ambrasienė, 2008; Arif, 2010).

Polimerazinės grandininės reakcijos (PGR, angl. Polymerase Chain Reaction, PCR) atradimas ir pritaikymas praktikoje sąlygojo naujų molekulinių žymenų metodų sukūrimą. PGR buvo tinkamai įvertintas mokslo pasaulyje ir šiuo metu yra daugelio molekulinių metodų pagrindas (Williams et al., 1990; Arif et al., 2010). PGR metu padauginama DNR sekos dalis, esanti tarp pradmenų prisijungimo vietų (Williams et al., 1990). PGR polimerazinė grandininė reakcija – tikslus, greitas ir jautrus metodas, nes jam reikia labai mažai tiriamosios medžiagos, pakanka kelių ląstelių. Kitas metodo privalumas – didelis specifiškumas. Reakcijos sąlygos sumodeliuojamos taip, kad būtų dauginamas tik ieškomas DNR fragmentas. Didžiulis metodo jautrumas kelia ir problemų: reikia labai saugotis, kad į reakcijos mišinį nepatektų šalutinės DNR priemaišos, todėl laboratorijoms, kuriose taikomas šis metodas, keliami labai aukšti reikalavimai (atskiros zonos skirtingiems darbo etapams, specialūs oro filtrai, UV lempos ir kt.). Kad reakcija vyktų sklandžiai reikia labai tiksliai parinkti reakcijos sąlygas (temperatūrą, koncentracijas, ciklų kiekį ir trukmę), visi reagentai turi būti labai švarūs (Ambrasienė, 2008). Atsitiktinai pagausinta polimorfinė DNR (APPD, angl. Randomly amplified polymorhic DNA (RAPD)) tai polimerinės grandininės reakcijos būdu pagausinti DNR fragmentai, naudojant 10 bp dydžio atsitiktinės sekos pradmenį (naudojamas vienas pradmuo – vienos grandinės trumpa DNR atkarpa) (Tingey, Tufo, 1993). Pradmuo prisitvirtina prie tam tikrų DNR sekų, jei du pradmenys prisitvirtina tinkamu atstumu vienas priešais kitą, tada DNR seka tarp jų yra pagausinama. Amplifikuotų fragmentų dydis 500–5000 pb (vidutinio dydžio genomuose pagausinama 5–10 skirtingo dydžio DNR fragmentų). PGR produktai atskiriami agarozės ar poliakrilamido gelyje, fragmentus nudažomi etidžio bromidu (kuris šviečia UV šviesoje) ir matomi polimorfiniai DNR fragmentai (Williams et al., 1990; Ambrasienė, 2008). Naudojant APPD metodą galima nustatyti genetinę įvairovę ar įvertinti giminingumą net neturint jokios informacijos apie tiriamų objektų genominės DNR nukleotidų sekas. Metodas tinka genotipavimui, filogenetinei analizei ir molekulinei selekcijai. Tiriamų individų genetinis panašumas nustatomas vertinant jų genominės DNR pagausinimo spektru. Lyginant su kitais metodais APPD naudojimas yra paprastas, greitas ir pigesnis, nereikia iš anksto žinoti pradmens sekų (galima įsigyti pradmenis iš komercinių įmonių), pakanka palyginti nedidelio DNR kiekio (5 – 20 mg), darbo ir kaštų požiūriu efektyvi polimorfizmo paieška, nereikia darbo su radioaktyviomis medžiagomis (Ambrasienė, 2008). Kaip ir kiekvienas metodas, APPD turi savų trūkumų. Jis gana jautrus eksperimento sąlygoms, todėl nukenčia rezultatų atsikartojamumas (dėl jautrumo DNR kokybei, PGR sąlygoms – gaunami skirtingi fragmentai). Rezultatus sunku įvertinti, nes APPD fragmentai yra 24

dominuojantys žymenys, vienodai matomi tiek homozigotinėje ir heterozigotinėje būsenoje. APPD fragmentų buvimo/nebuvimo vertinimas taip pat labai priklauso nuo tyrėjo patyrimo. Ekspermentai turi būti kartojami toje pačioje laboratorijoje, to pačio personalo, įrangos ir su tais pačiais tirpalais (Tingey, Del Tufo, 1993). Nepaisant trūkumų šis metodas tinkamas populiacinės genetikos ir sistematikos tyrimams, sėkmingai plėtojamas filogenetiniuose tyrinėjimuose nustatant ryšius rūšies viduje, todėl jis naudojams natūralių ir invazinių augalų sąveikai nustatyti (Arif et al., 2010). Amplifikuotų fragmentų ilgio polimorfizmas (ang. Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) tai DNR žymenų sistema, leidžianti nustatyti nukleotidų sekų skirtumus tarp DNR molekulių (genetinius skirtumus), pagal specialiais enzimais sukarpytų, specialių žymenų atrinktų ir polimerinės grandinės reakcijos pagausintų DNR fragmentų dydį. Amplifikuotų fragmentų ilgio polimorfizmo tyrimas yra naudingas, nes geba atskleisti polimorfizmą (generuoja daug fragmentų), yra geras rezultatų pakartojamumas, nereikia iš anksto žinoti fragmentų sekų, naudingas norint greitai sukurti genolapius ir nustatyti tikslius cDNR polimorfizmus. Tačiau, turi keletą trūkumų, generuoja daug fragmentų, kurių analizei gali reikėti kompiuterizuotos sistemos, pagrinde dominantiniai žymenys, aukštos darbo sąnaudos ir sudėtinga techninė įranga. AFLP yra naudojama genetinės įvairovės, QTL (ang. Quantitative trait loci) žymenų paieškos tyrimuose (genotipo-fenotipų ryšiai ir genolapiai), cDNR polimorfizme, populiacijų skirtumų, genotipų (genospaudžių) identifikacijoje, nustatant nykstančių ir saugomų augalų rūšių genetinę įvairovę (Parker et al., 1998). Mikrosatelitai – kartotinių sekų atkarpos (angl. simple sequence repeats, SSR), tai trumpos DNR atkarpos, sudarytos iš viena po kitos pakartotų kelių nukleotidų dydžio sekų. Augaluose labiausiai paplitę mikrosatelitai, sudaryti iš (A)n, (AT)n, (GA)n ir (GAA)n motyvų. Mikrosatelitai yra telomerų ir centromerų sudėtinės dalys. Mikrosatelitai atlieka reguliacinių ir koduojančių elementų funkciją. Mikrosatelitai randami daugelyje promotorinių regionų, atliekančių stiprintuvų funkciją ekspresijos vektoriuose. Daugelyje baltymų mikrosatelitai koduoja homopolimerinius aminorūgščių ruožus, kurių ilgis susijęs su funkciniais efektais. Didelė alelių įvairovė lemia platų šių lokusų panaudojimą įvairiuose tyrimuose. Šis metodas, dažnai naudojamas, nes pakanka sąlyginai nedaug ir ne aukštos kokybės DNR, parodo paprastų sekų pasikartojimo skaičiaus skirtumus tarp lyginamų genotipų (kartotinių sekų atkarpos ilgio polimorfizmą), pakartojimų skaičius gali siekti 50, polimorfinis, kodominantinis, tinkantis giminingų rūšių analizei, efektyvus ir automatizuotas darbas, aiškiai atskiriamos segmentų bangos. Mikrosatelitai yra paprastas, bet ilgalaikis ir brangus procesas. Mikrosatelitai gali būti naudojami daugelio augalų rūšių genolapių sudarymui, genų paieškai, genotipų identifikavimui, populiacijų genetinės įvairovės ir filogenijos 25

tyrimams. Mikrosatelitų metodas naudojamas atliekant nykstančių rūšių analizę (Wunsch, Hormaza 2002). Vieno nukleotido polimorfizmo tyrimas (SNP, angl. Single nucleotide polymorphism), pats gausiausias žymenų skaičiumi tiek augalų, tiek gyvūnų genomui. SNP, žymenų sistema galinti nustatyti vieno nukleotido pokyčius tarp homologinių DNR sekų (homologinės: panašios pagal struktūrą, vietą ir funkciją alternatyvios geno formos). Ir skirtingai nuo mikrosatelitų vertina ne alelių, o lokusų skaičių. SNP žymenys naudojami genetinės įvairovės paieškose (Arif, 2010). Augaluose, DNR polimorfizmas randamas dėl vieno nukleotido vietos pokyčio tikslinėje DNR sekoje. Žinomų genų alternatyvių formų paieška atliekama SNP metodu. SNP ir juos žyminčios specifinės gretimos DNR nukleotidų atkarpos randamos: sekvenuojant (ar hibridizuojant mikro gardelėse) polimorfinius PGR fragmentus, pagausintus naudojant EST žymenis polimorfinėse populiacijose (kilmės, klonų archyvai); analizuojant cDNR sekų duomenų bazėse esančias genų sekas. Paprastai SNP randamas kas 1000–2000 nukleotidų. SNP yra didelio našumo, automatinis, leidžiantis greitą ir efektyvų genotipavimą iš didelio pavyzdžių skaičiaus. Žinant SNP vietą žyminčias DNR atkarpų sekas, tolesnis SNP taikymas palengvėja naudojant DNR mirko sekas ar PGR ir automatinį sekoskaitą (Ge et. al., 2013). Lietuvoje naudojant molekulinius metodus atliktas tyrimas genetinio pakitimo ir populiacijos struktūros svetimkraštės vienametės šiušelės (Erigeron annuus, Žvingila et al., 2011). Įvertinta VU Botanikos sodo paprastosios avietės gamtinių pavyzdžių kolekcijos genetinė įvairovė molekulinių ir morfologinių žymenų metodais ir palyginta su gamtinėse populiacijose aptinkama genetine įvairove. Nustatyta, kad paprastosios avietės, kaip ir kitų kryžmadulkių augalų, populiacijose didžiausia dalis tenka vidupopuliacinei genetinei įvairovei, tačiau kartu stebimas ir didelis genetinės diferenciacijos lygis tarp populiacijų (Patamsytė, 2010). Genetiniams skirtumams tarp keturių Lietuvos raktažolės pelenėlės (Primula farinosa L.) populiacijų nustatyti buvo panaudotas APPD metodas (Augėnaitė ir kt., 2009). Keturbriaunės jonažolės (Hypericum maculatum C.) Lietuvos populiacijų genetinės įvairovės tyrimams atliktas pritaikius APPD metodo sąlygas (Zybartaitė et al., 2011).

1.3.2 Sprigių genties molekuliniai tyrimai SSR metodu ištirta genetinės įvairovės pasiskirstymas Impatiens glandulifera upės pakrantėje. Taip pat nustatyta natūraliai ar antropogeninės veiklos pagalba išplito augalas. Antropogeninė veikla bei kiti procesai, upės struktūra, genetinis dreifas suformuoja šią populiaciją per trumpą laiką. Gauti rezultai parodo, kad įvairovės pasiskirstymas tarp upės populiacijų gali 26

keistis dėl mažų populiacijų atsiradimo ir jų greito išplytimo, tai pabrėžia dinamišką pakrantės augalų pasiskirstymą (Walker et al., 2009). Impatiens noli-tangere yra vienintelis maistinis augalas Eustroma reticulatum. Impatiens nol- tangere laikoma vietine rūšimi Ežerų rajone ir Velse, tačiau populiacijų tankio kitimas kitose Didžiojosios Britanijos vietose, kelia pavojų kandies Eustroma reticulatum išnykimui. 1998m. Anglijos Ežerų rajone ir Velse daryti Impatiens noli-tangere dydžio kintamumo tyrimai. 1999m. Šveicarijos atlikti Impatiens noli-tangere molekuliniai tyrimai naudojant APPD ir iSSR analizės metodus. UPGMA dendrograma ir PCO grafikai parodė populiacijų papsiskirstymą Velse ir Ežero Rajone. Populiacijų kintamumas rastas tarp populiacijų, o ne populiacijų viduje. Rezulatai parodė, kad Anglijos Ežerų rajone Impatiens nol- tangere yra jautrūs ir greit paveikiami aplinkos veiksnių ir gali greit išnykti, tai didina išnykimo pavojų Eustroma reticulatum (Hatcher et al., 2004). Impatiens glandulifera yra invazinis pakrantės augalas, kuri gali nustelbti natūralius daugiamečius augalus. Populiacijos genetiniai duomenys gali padėti valdyti rūšiesis paplitimą, todėl Impatiens glandulifera genetinės įvairovės tyrimams buvo sukurtas ir panaudotas iSSR metodas, naudoti aštuoni polimorfiniai žymenys (Provan et al., 2007). Lietuvoje APPD metodu atliktas smulkiažiedė sprigė (Impatiens parviflora DC.) genetinės įvairovės tyrimas. Palyginta prie Lietuvos vakarinės, pietinės, šiaurinės ir rytinės sienų (Karklė, Ratnyčia, Žagarės, Švenčionių) augančios smulkiažiedės sprigės populiacijų genetinė įvairovė su geografine padėtimi. I. parviflora populiacijų genetinės įvairovės vertinimui buvo pasirinktas APPD metodas. Atrinkta ir ištirta dvidešimt individų populiacijoje. Keturiose I. parviflora populiacijose su dešimčia pradmenų susidarė 21–27 % polimorfinių fragmentų, o jų skaičius siekė nuo 40 iki 50. Tarppopuliacinė genetinė įvairovė buvo daug didesnė (82 %) nei populiacijos viduje. Genetinis atstumas tarp populiacijų svyravo nuo 0,349 iki 0,583. Geografiškai skirtingų vietų populiacijų tarpusavio skirtumai atsispindėjo pagal APPD metodą susiformavusiose UPGMA dendrogramose, taip pat analizuojant principines koordinates. Gauti duomenys parodė, kad plintant svetimžemėms, invazinėms rūšims galimi genetinės įvairovės pokyčiai (Janulionienė et al., 2011). Įvertintas Impatiens glandulifera Lietuvos populiacijų genetinis kintamumas atsitiktinai pagausintos polimorfinės DNR (APPD) metodu. Panaudojus 8 APPD pradmenis išanalizuota 20 bitinės sprigės populiacijų (kiekvienoje po 20 individų), besiskiriančių geografine padėtimi arba augavietės ypatumais. Nustatyta, kad polimorfinių DNR atkarpų skaičius svyravo 40–56 %; Nei genetinės įvairovės rodiklis prilygo 0,115–0,165; Šanono informacijos indeksas 0,183–0,255. Tarppopuliacinė įvairovė buvo didesnė už vidupopuliacinę. Populiacijų polimorfinių atkarpų 27

procentas didėjo, mažėjant vidutinei vietovės vegetacijos sezono temperatūrai. Genetinio panašumo dendrogramoje ryšys tarppopuliacijų ir Lietuvos geografinių atstumų nebuvo nustatytas. Molekuline genetika (APPD metodu) paremti Lietuvos bitinės sprigės tyrimų duomenys rodo, kad į mūsų kraštą ji buvo įvežta ne vieną kartą. Šios rūšies plitimas vyksta keliais būdais: gamtiniu, kurį gali įvairiai keisti tikslingai ir netikslingai žmonių platinamos arba pernešamos sėklos (Zybartaitė et al., 2011). Lietuvoje molekuliniai tyrimai atliekami invazinėms sprigių rūšims, o vietinės paprastosios sprigės tyrimas nebuvo atliktas. Norint, pateikti kuo tikslesnius rezultatus reikia ištirti vietines rūšis ir gautus rezultatus lyginti su svetimkraštėmis rūšimis. Norint išsaugoti Lietuvos biologinę įvairovę reikia išsamiai pažinti vietines rūšis, todėl svarbu ištirti jų molekulinę įvairovę, kad būtų galima palyginti su svetimkraščių sprigių giminingų rūšių genetine įvairove, todėl neigiamai invazijai Lietuvoje mažinti yra genetiniai molekuliniai tyrimai, kuriuos reikia naudoti atliekant vietinės paprastosios sprigės tyrimą.

2. TYRIMŲ OBJEKTAS, VIETOS IR METODAI Remiantis sprigių rūšies atliekamais molekuliniais tyrimai buvo įvertinta paprastosios sprigės (Impatiens noli-tangere L.) Lietuvos populiacijų genetinė įvairovė, pagal APPD žymenis. 2.1 Augalinės medžiagos rinkimas Atkreiptas dėmesys į tai, kad renkami augalai būtų iš geografiškai skirtingų Lietuvos vietovių (Kaunas-Grabučiškiai, Kaunas-Marvelė, Kaunas-Raudondvaris, Kaunas-Romainiai, Varėna-Puvočiai, Seredžius, Rusnė, Juodkrantė, Palanga-Plazė, Plateliai, Kelmė-Šventragis, Kryžkalnis, Rokiškis-Panemunėlis, Jonava-Upininkai, Anykščiai). Darbe vietovės yra pavadintos santrumpomis (2.1 pav.). Paprastosios sprigės (Impatiens noli-tangere L.) populiacijos buvo renkamos 2011 m. liepos mėn. pirmoje pusėje. Augalai buvo renkami pirmąją dienos pusę, kad neprarastų drėgmės. Skinami jauni, be matomų mechaninių pažeidimų ir nedeformuoti vabzdžių bei grybų, viršūniniai lapeliai. Audiniai suvynioti į popierių ir sudėti į plastmasinius maišelius, pervežti šaltkrepšiais į laboratoriją ir iki DNR išskyrimo laikyti užšaldyti – 20°C temperatūroje. Iš viso DNR analizei surinkta 15 skirtingų populiacijų, po 15 individų kiekvienoje, išskyrus Juokrantės populiaciją, joje 10 individų (viso 220 individų; 2.1 pav.).

2.1 pav. Tirtų Lietuvos paprastosios sprigės populiacijų vietovės ir santumpos: 1 – Kaunas-Grabučiškiai (KGr); 2 – Kaunas-Marvelė (KMa); 3 – Kaunas-Raudondvaris (KRa); 4 – Kaunas-Romainiai (KRo); 5 – Varėna- Puvočiai (VaP); 6 – Seredžius (Ser); 7 – Rusnė (Rus); 8 – Juodkrantė (Juo); 9 – Palanga-Plazė (PPl); 10 – Plateliai (Pla); 11 – Kelmė-Šventragis (KeŠ); 12 – Kryžkalnis (Kry); 13 – Rokiškis-Panemunėlis (RPa); 14 – Jonava-Upininkai (JUp); 15 – Anykščiai (Any)

Naudojant Maps.lt programą sudaryta geografinių atstumų lentelė, kuri bus lyginama su genetiniais atstumais. Paprastoji sprigė buvo renkama visoje Lietuvoje, artimiausios radavietės KRa ir KRo, o kitos buvo renkamos didesniu atstumu. Labiausiai nutolusios radavietės PPl ir VaP (294 km; 2.1 lentelė). 2.1 lentelė. Geografiniai atstumai (km) tarp ištirtų Lietuvos paprastosios sprigės populiacijų

Vietovės Geografiniai atstumai (km) KGr* KMa 27 KRa 26 21 KRo 22 20 3 VaP 86 121 121 93 Ser 50 44 26 26 127 Rus 171 164 153 168 240 131 Juo 199 185 184 191 276 154 36 PPl 210 120 179 178 294 153 68 31 Pla 189 201 183 179 275 156 82 69 54 KeS 51 26 43 49 74 60 165 196 196 211 Kry 109 105 26 90 188 62 89 99 97 100 191 RPa 142 159 143 142 206 156 269 277 273 235 190 183 JUp 30 59 51 50 112 70 202 223 217 207 82 120 100 Any 95 121 110 108 169 120 235 252 246 220 145 151 44 64 KGr KMa KRa KRo VaP Ser Rus Juo PPL Pla KeS Kry RPa JuP *Kaunas-Grabučiškiai (KGr); Kaunas-Marvelė (KMa); Kaunas-Raudondvaris (KRa); Kaunas-Romainiai (KRo); Varėna- Puvočiai (VaP); Seredžius (Ser); Rusnė (Rus); Juodkrantė (Juo); Palanga-Plazė (PPl); Plateliai (Pla); Kelmė-Šventragis (KeŠ); Kryžkalnis (Kry); Rokiškis-Panemunėlis (RPa); Jonava-Upininkai (JUp); Anykščiai (Any).

Viso molekulinės genetikos metodu (APPD) ištirta 15 paprastosios sprigės populiacijų. Tirtų populiacijų geografinė padėtis svyravo nuo šiaurės (56°02') iki pietų (54°06') platumos (Š), bei nuo rytų (25°23') iki vakarų (21°04′) ilgumos (R). Aukštuma virš jūros lygio svyravo nuo 1 (m) iki 150 (m) (2.2 lentelė). Didžiausia metinė temperatūra buvo Juo (9,3 °C), o vegetacijos periodu JUp (18,6 °C) ir Any (18,6 °C). Mažiausia metinė temperatūra buvo Ser (8,3 °C) ir Kry (8,3 °C), ten pat buvo ir mažiausia temperatūra vegetacijos periodu Ser (17,6 °C), Kry (17,6 °C). Daugiausiai kritulių iškrito PPl (86,0 mm), o vegetacijos periodu Ser (153 mm) ir Kry (153 mm), mažiausiai kritulių iškrito RPa (55,0 mm), ten pat ir vegetacijos periodu RPa (86,0 mm) (2.2 lentelė).

2.2 lentelė. Lietuvos paprastosios sprigės (Impatiens noli-tangere L.) geografinės vietovės ir klimato charakteristikos (metereologiniai duomenys, 2011 m.). Vidutinė Vidutinis Vidutinis kritulių Šiaurės Rytų Aukštuma Vidutinė T (°C) krituliu kiekis platuma ilguma virš jūros metinė vegetacijos kiekis vegetacijos Radavietė (Š) (R) lygio (m) T (°C) periodu (mm) periodu (mm) KGr* 54°53' 24°09' 70 8,9 18,4 72 123 KMa 54°53′ 23°51′ 38 8,9 18,4 72 123 KRa 54°56′ 23° 46′ 70 8,9 18,4 72 123 KRo 54°55' 23°53' 29 8,9 18,4 72 123 VaP 54°06′ 24°18′ 102 8,7 18,1 79 131 Ser 55°04′ 23°24′ 37 8,3 17,6 81 153 Rus 55°17′ 21°22′ 1 9 17,9 73 103 Juo 55°32′ 21°07′ 6 9,3 18,3 74 102 PPl 55°50′ 21°04′ 4 9,1 18,1 86 137 Pla 56°02' 21°48' 157 8,4 17,6 84 144 KeŠ 54°32′ 23°39′ 103 8,6 18,1 83 151 Kry 55°28′ 22°51′ 150 8,3 17,6 81 153 RPa 55°54′ 25°23′ 101 8,9 18,5 55 86 JUp 55°04′ 24°32′ 81 8,9 18,6 68 108 Any 55°31′ 25°06′ 72 8,4 18,6 72 105 *Kaunas-Grabučiškiai (KGr); Kaunas-Marvelė (KMa); Kaunas-Raudondvaris (KRa); Kaunas-Romainiai (KRo); Varėna- Puvočiai (VaP); Seredžius (Ser); Rusnė (Rus); Juodkrantė (Juo); Palanga-Plazė (PPl); Plateliai (Pla); Kelmė-Šventragis (KeŠ); Kryžkalnis (Kry); Rokiškis-Panemunėlis (RPa); Jonava-Upininkai (JUp); Anykščiai (Any).

2.2. Genominės DNR išskyrimas DNR išskyrimo metodai iš augalų gali būti skirtingi pagal audinių suardymo techniką, lizavimo ir ekstrahavimo buferio sudėtį ar DNR valymo nuo priemaišų etapus, tačiau visi taikomi skyrimo metodai susideda iš trijų pagrindinių etapų: ląstelių sienelių tirpinimo, baltymų ir likusių priemaišų pašalinimo ir DNR iškrisdinimo (Parker, 1998). Prieš DNR skyrimą lapai atšildomi, nuplaunami distiliuotu vandeniu ir 95 % etanoliu, nusausinami. Paprastosios sprigės DNR buvo skiriama naudojant genominės DNR skyrimo rinkinį #K0512 (,,Fermentas‘‘). Darbo eiga:

1. Paruošiama 200 μl TE buferio (200 μl TRIS + 40 μl EDTA + H2O). 2. Pasveriama 100 mg lapo audinio ir trinama skystame azote, naudojant grūstuvėlį ir piestelę. Skiriamas didelis dėmesys lapo audinio visiškam sutrynimui, nes šis etapas yra labai

svarbus, norint gauti didesnę DNR išeigą, tuo tikslu būtina visiškai suardyti audinio ląstelių sieneles ir membranas. 3. Sumalti augalo lapai miltelių pavidalo nedelsiant supilami į 1,5 ml mėgintuvėlius su 200 μl TE buferio ir 400 μl lizės tirpalo mišiniu. 4. Mėginėliai gerai sumaišomi ir laikomi 15 min +65 °C temperatūros termostate. Taip suardomos ne tik ląstelių membranos, bet ir denatūruojami baltymai. 5. Į atvėsintus mėgintuvėlius įpilama 600 μl chloroformo, mėginys gerai sumaišomas ir centrifuguojamas 3 min 10000 aps./min centrifugoje. Chloroformu pašalinamos ištirpusios baltymų molekulės, kurios centrifuguojant atsiskyrė iš lizės tirpalo. DNR išliko vandeninėje fazėje, o denatūruoti baltymai – tarpinėje ir organinio tirpiklio fazėje (2.2 pav.).

2.2 pav. Mėginys po pirmo valymo chloroformu. Mėginyje po pirmo valymo chloroformu matomi trys sluoksniai: 1) chloroformas su įvairiomis priemaišomis (apačioje); 2) ląstelių ir augalo audinių nuolaužos; 3) vandeninis DNR tirpalas (viršutinis sluoksnis; autorės nuotr.) 6. 500 μl viršutinės mėginio fazės perkeliama į naują mėgintuvėlį, įpilama 500 μl chloroformo. 7. Sandariai uždaryti mėgintuvėliai intensyviai pavartomi ir centrifuguojami 2 min 10000 aps./min centrifugoje. 8. Po centrifugavivo supernatantas buvo perkeltas į mėgintuvėlius su nusodinimo tirpalu (720 μl sterilaus dejonizuoto vandens ir 80 μl nusodinimo tirpalo iš DNR skyrimo rinkinio) ir centrifuguojamas 3 min 10000 aps./min greičiu. 9. Supernantas pašalintas nupilant, mėgintuvėliai nusausinami į popierinę servetėlę, o nuosėdos ištirpintos maišant su 100 μl NaCl tirpalo iš DNR skyrimo rinkinio. 10. Į ištirpusias nuosėdas įlašinama po 0,5 μl ribonukleazės A (Rnase A/T1 Mix) ir inkubuojama termostate 30 min esant +37 °C temperatūrai.

11. Po inkubacijos į kiekvieną mėgintuvėlį pilama po 10 μl natrio acetato (20 ml H2O 8,1648 g natrio acetato) ir po 350 μl 96 % šalto (-20 °C) etanolio. Mėginiai sumaišomi ir laikomi 30 min -20 °C temperatūtoje, kad iškristų DNR.

12. Atšaldyti mėginiai centrifuguojami 3 min 10000 aps./min greičiu, atsargiai nupilamas supernatantas, DNR nuplaunama 300 μl 70 % etanolio ir centrifuguojama 3 min 10000 aps./min greičiu. 13. Nupilant pašalinami etanolio likučiai ir DNR išdžiovinama steriliame bokse. 14. Į kiekviena mėgintuvėlį su išdžiovinta DNR pilama po 100 μl TE buferio, DNR ištirpinama, atsargiai ją maišant.

2.3. Išskirtos genominės DNR koncentracijos ir švarumo nustatymas DNR koncentracija ir švarumas nulemia PGR produktų elektroforezės kokybę, todėl svarbu yra įvertinti šiuos rodiklius. Paprastoios sprigės DNR koncentracija ir švarumas buvo matuojami spektrofotometru (NanoDROP 2000, USA). Švarių DNR tirpalų optinių tankių santykis, esant 260 nm ir 280 nm ilgio bangoms yra 1,8–2. DNR tirpale baltymų ir fenolių priemaišų nėra, jeigu A260 / A280 > 1,8, jei santykis mažesnis tirpale yra baltymų ir fenolių priemaišų. Tirpaluose nebuvo daug priemaišų, todėl pakartotinai genominės DNR valyti nereikėjo. Išmatavus DNR koncentracijas, tirpalas buvo praskiestas iki 20 ng / μl. Tolimesniam saugojimui originali DNR buvo laikoma šaldiklyje (-20 °C temperatūroje), o iki darbinės koncentracijos praskiesta DNR naudojama atlikti polimerazinei grandininei reakcijai.

2.4. APPD metodo pritaikymas paprastajai sprigei Paprastosios sprigės populiacijų polimorfizmui ištirti naudojome atsitiktinai pagausintos polimorfinės DNR metodą (APPD; Williams et al., 1990). APPD mišinys ir reakcijos sąlygos pateiktos lentelėse. DNR buvo gausinima termocikleriuose (2.3 lentelė). 2.3 lentelė. APPD tyrimo PGR mišinio sudedamosios dalys vienam DNR pavyzdžiui. PGR reakcijos mišinio sudedamosios dalys μl Dejonizuotas vanduo 14,55 Taq buferis (100 mM Tris-HCl, pH 8,8; 25 °C, 500 mM 2,5 dNTP mišinys (25 nM kiekvieno dNTP) (Fermentas) 0,2 MgCl2 (Fermentas) 1,5 Oligonukleotidinis pradmuo 2 Taq polimerazė (5u/μl; ‚Fermentas‘) 0,25 DNR (10 ng / μl) 4 Visas reakcijos mišinio tūris 25

Kiekvienas mėginys supurtomas ir centrifuguojamas, dedamas į termociklerį DNR pagausinimui pagal programą OPA-1 (2.4 lentelė). 2.4 lentelė. APPD tyrimo PGR paprastosios sprigės DNR pagausinimo režimo programa OPA-1 Etapas Temperatūra Laikas Pradinė DNR denatūracija 94°C 2 min DNR denatūracija 94°C 30 s Pradmenų prisijungimas X°C 35 s 40 ciklų DNR sintezė 72°C 1 min Galutinė sintezė 72°C 2 min

APPD tyrimai buvo atliekami su 8 oligonukleotidiniais APPD pradmenimis: 222, 250, 269, 340, 474, 516, OP-A20, OPD-20 (2.5 lentelė). Kiekvienam oligonukleotidiniam pradmeniui termocikleryje taikyta specifinė pradmenų prisijungimo temperatūra PGR produktų pagausinimo programoje (2. 5 lentelė). 2.5 lentelė. APPD analizei naudoti oligonukleotidinai pradmenys, su jų pagausintų DNR fragmentų kiekiu ir dydžiu.

DNR atkarpų dydis, Pradmuo Pradmens seka Temperatūra bp OPA-20 5' - GTT GCG ATC C - 3' 32 °C 450-270 OPD-20 5' - GTT GCG ATC C - 3' 32°C 150-2100 222 5'- AAG CCT CC C - 3' 34°C 150-2500 250 5'- CGA CAG TCC C - 3' 34°C 150-2050 269 5' - CCA GTT CGC C - 3' 34°C 150-1800 340 5 '- GAG AGG CAC C - 3' 34°C 150-2100 474 5' - AGG CGG GAA C - 3' 34°C 150-2100 516 5' - AGC GCC GAC C - 3' 36°C 200-1800

Remiantis literatūra, kurioje aprašyti APPD tyrimai daryti su kitomis sprigių rūšimis, buvo atlikti paprastosios sprigės tyrimai APPD metodu (Zybartaitė et al, 2011). APPD bitinės sprigės tyrime buvo naudoti pradmenys: OPD-20, OPA-20, 222, 250, 269, 340, 474, 516, o smulkiažiedės sprigės tyrime šie pradmenys: 474, 222, 269, 516, 340, OPA-20, OPD-20, OPB-7, OPQ-11 (Zybartaitė ir kt., 2011; Janulionienė ir kt., 2011). Patikrinus kitų sprigių rūšių tyrimuose naudotus oligonukleotidinius pradmenis iš jų paprastajai sprigei tiko aštuoni skirtingi oligonukleotidiniai pradmenys: 222, 250, 269, 340, 474, OPD-20, 516, OPA-20, o netiko OPB-7, OPQ-11. APPD metodu buvo ištirta paprastosios sprigės 220 individų iš penkiolikos geografiškai skirtingų Lietuvos vietų. 34

2.5. APPD PGR produktų elektroforezė Pagausintos DNR atkarpos buvo atskiriamos elektroforezės eigoje, 1,5 % agarozės gelyje (Agarozė Top VisionTM LE GQ, ,,Fermentas“, Lietuva), pavyzdžiams išryškinti naudotas etidžio bromidas, koncentracija 5 mg/ml (Roth, Vokietija).

2.3 pav. Paprastosios sprigės Panemunėlio populiacijos penkiolikos individų tyrimo, atlikto APPD metodu naudojant 269 oligonukleotidinį pradmenį, rezultatas. DNR pagausinimo produktai atskirti 1,5 % agarozės gelyje. Nuo 1 iki 15 sunumeruoti Panemunėlio populiacijos individai. M standartiniai (,,Fermentas‘‘) DNR atkarpų dydžio žymenys. Nurodytas keleto iš jų dydis bazių poromis (bp) Darbo eiga: 1. Ruošiant 1,5 % agarozės gelį, agarozės milteliai ištirpinami 0,5 x TBE buferyje (,,Fermentas“, Lietuva). 2. Kaitinama mikrobangų krosnelėje, kol tirpalas pasidaro skaidrus ir vientisos išvaizdos. 3. Agarozės tirpalas supilamas į paruoštą formą, įstatomos „šukutės“, laukiama, kol sustings. 4. Sustingus geliui ,,šukutės“ ištraukiamos. 5. Paruoštas gelis įstatomas į elektroforezės vonelę, pripildytą 0,5 x TBE buferio. 6. Į šulinėlius įnešoma 25 μl APPD PGR produkto, sumaišyto su 2 μl bromfenolio mėlio dažais. Į kraštinius šulinėlius įlašinama po 3 μl DNR atkarpų dydžio standarto GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder Plus (,,Fermentas“, Lietuva). 7. Prieš paleidžiant elektros srovę į buferį įpilama 10 μl etidžio bromido. 8. Nustatoma 110 V elektros srovė. 9. Elektroforezė vykdoma apie 3 val.

10. Geliai fotografuoti UV - transliuminatoriuje (Herolab transliuminator, Vokietija), naudojant Win 32 sistemą (2.3 pav.).

2.4 pav. UV - transliuminatorius (Herolab transliuminator, Vokietija; aut. nuotr.)

2.6. Duomenų statistinė analizė Elektroforezės rezultatai fotografuojami ir analizuojami. Fragmentų ilgis išmatuotas pagal 1 kb DNR ilgio standartus (Gene ruler DNA Ladder Plus, ,,Fermentas”, Lietuva). Kiekvieno pavyzdžio DNR APPD analizė atliekama 2–3 kartus. Palyginant pakartotiniuose eksperimentuose gautus APPD fenotipus, tolesnei analizei buvo atrenkamos tik aiškios, lengvai atskiriamos ir patikimai atsikartojančios juostos. Vienodo dydžio DNR fragmentai laikomi identiškais (Williams, 1990). Neatsikartojantys, neaiškūs ar blogai gelyje elektroforezės metu atsiskyrę DNR fragmentai – nevertinami. Naudojant Popgen 1.32 (angl. Population genetic analysis) kompiuterinę programą tarprūšinei ir vidurūšinei genetinei įvairovei įvertinti buvo apskaičiuotas DNR polimorfizmo lygis

(P), Na – stebimų alelių skaičius, Ne – efektyvių alelių skaičius pagal Kimura ir Crow (1964), H – genetinė įvairovė pagal Nei (1973), I – Shannon‘o indeksas (1972), apskaičiuoti genetiniai atstumai pagal Nei (1978). Genetiniai atstumai įvertinti atlikus UPGMA (angl. Unweight Pair Group Method with Arithmetic Mean) klasterinę analizę pagal M. Nei ir W. Li algoritmus (1979). Dendrogramos nubraižytos naudojant MEGA 5.03 kompiuterinę programą (Tamura et. al., 2007). GenaAIEx 6 (Genetic Analysis in Exel; Peakall, Smouse, 2006) kompiuterine programa buvo atlikta principinių koordinačių analizė (angl. Principal Coordinates Analysis), molekulinės genetinės įvairovės analizė AMOVA (angl. Analysis of Molecular Variance; Excoffier et al., 1992; Mengoni and Bazzicalupo, 2002), buvo apskaičiuotas tarppopuliacinę genetinę įvairovė apibrėžiantis komponentas ΦPT bei fiksacijos indeksas FST.

3. REZULTATAI

3.1. Paprastosios sprigės genetinės įvairovės pagal APPD žymenis

DNR pagausinimui atrinkti informatyviausi aštuonių (8) nukleotidų ilgio pradmenys, generuojantys aiškius, gausius ir atsikartojančius fragmentus, ir su jais atlikta 15 populiacijų (15 individų kiekvienoje) genetinė analizė. Paprastosios sprigės trumpiausi DNR fragmentai gauti su OPA-20 pradmeniu, ilgiausi – su 222 pradmeniu (3.1 lentelė). DNR fragmentų skaičius gautas su pavieniu pradmeniu svyravo nuo 28 iki 44, mažiausiai fragmentų gauta su OPA-20 pradmeniu. Rūšies lygmenyje su visais pradmenimis gauta 297 DNR fragmentų. Pavieniai APPD pradmenys pasižymėjo įvairių generuojamų fragmentų ilgiu bei fragmentų skaičiumi, skirtingose populiacijose. I. glandulifera populiacijos mažiausias DNR atkarpų dydis gautas su OPD-20 žymeniu (1700 bazinių porų), I. parviflora su 516 (1400 bazių porų), I Noli- tangere taip pat 516 (1800 bazių porų). Daugiausia DNR fragmentų populiacijose gauta I. glandulifera su 516 (30 fragmentų), I parviflora su 222 (43 fragmentų), I. Noli-tangere taip pat su 222 (40 fragmentų).

3.1 lentelė. APPD pradmenys, naudoti paprastosios sprigės populiacijų analizėje ir su jais nustatytas DNR fragmentų ilgis ir skaičius

DNR DNR fragmentų Bendras DNR DNR atkarpų dydis, fragmentų skaičius vidurkis Pradmuo fragmentų bp skaičius populiacijoje skaičius populiacijoje (vidurkis±PI) OPA-20 270-450 28 3–15 6,4±1,8 OPD-20 150-2100 38 5–13 10,3±1,5 222 150-2500 44 4–14 9,2±1,6 250 150-2050 36 4–12 7,5±1,2 269 150-1800 32 5–12 9,2±1,1 340 150-2100 42 3–16 7,7±1,8 474 150-2100 40 5–15 8,3±1,1 516 200-1800 37 3–9 7,0±1,2

Rūšies lygmenyje visi fragmentai buvo polimorfiniai. Mažiausias pagal visus pasirinktus žymenis polimorfizmas, gautas Kry ir RPa populiacijoje (3 %), didžiausias – Pla populiacijoje (15 %), vidutinis polimorfizmo lygis visose populiacijose buvo 7 % (3.2 lentelė). Mažiausia Nei

genetinė įvairovė nustatyta VaP populiacijoje (0,005±0,018), didžiausia JUp populiacijoje (0,049±0,066), vidutinė visų populiacijų Nei genetinė įvairovė buvo 0,023±0,045. Mažiausias Shanono indeksas nustatytas VaP populiacijoje (0,009±0,028), didžiausias JUp populiacijoje (0,074±0,096) (3.2 lentelė). Paprastosios sprigės vidutinis polimorfinių lokusų skaičius (7 %) buvo mažesnis už smulkiažiedės sprigės (23 %) ir bitinės sprigės (41,6 %; Zybartaitė et all, 2011). 3.2 lentelė. Paprastosios sprigės populiacijų genetinės įvairovės rodikliai pagal APPD analizę, atliktą su 8 žymenimis

Nėjaus Shannon‘o genetinė indeksas Procentinis įvairovė (h) (I) Polimorfinių polimorfinių Populiacijos fragmentų skaičius fragmentų skaičius Vidurkis±PI* Vidurkis±PI* KGr** 31 10 0,040±0,063 0,059±0,091 KMa 11 7 0,011±0,031 0,017±0,048 KRa 19 13 0,021±0,047 0,032±0,067 KRo 23 8 0,025±0,051 0,037±0,073 VaP 8 5 0,005±0,018 0,009±0,028 Ser 11 7 0,012±0,035 0,018±0,051 Rus 22 4 0,027±0,052 0,041±0,075 Juo 12 4 0,015±0,037 0,022±0,056 PPl 20 4 0,021±0,046 0,032±0,066 Pla 10 15 0,009±0,027 0,014±0,042 KeS 21 6 0,025±0,048 0,037±0,071 Kry 15 3 0,012±0,032 0,019±0,048 RPa 19 3 0,025±0,050 0,037±0,071 JUp 44 7 0,049±0,066 0,074±0,096 Any 37 6 0,047±00166 0,069±0,096 Vidurkis± PI 30 7 0,023±0,045 0.034±0,065 *PI – pasikliautinas intervalas; n = 8, p ≤ 0.05, h – Nei genetinė įvairovė; I – Shannon indeksas ** Kaunas-Grabučiškiai (KGr); Kaunas-Marvelė (KMa); Kaunas-Raudondvaris (KRa); Kaunas-Romainiai (KRo); Varėna-Puvočiai (VaP); Seredžius (Ser); Rusnė (Rus); Juodkrantė (Juo); Palanga-Plazė (PPl); Plateliai (Pla); Kelmė-Šventragis (KeŠ); Kryžkalnis (Kry); Rokiškis-Panemunėlis (RPa); Jonava-Upininkai (JUp); Anykščiai (Any).

Lietuvoje rinktų populiacijų genetinė įvairovė buvo įvertinta molekuline kintamumo analize AMOVA (angl. Analysis of molecular variance). Pagal procentinį molekulinės įvairovės pasiskirstymą, vidupopuliacinė genetinė įvairovė siekė 7 %, ir buvo labai maža, palyginus su tarppopuliacine – 93 % (3.1 pav.). Tarppopuliacinė paprastosios sprigės įvairovė pagal APPD žymenis buvo (93 %) didesnė už bitinės sprigės (51 %) ir smulkiažiedės sprigės (79 %).

Vidupopuliacinė genetinė įvairovė paprastosios sprigės (7 %) mažesnė už smulkiažiedės sprigės (21 %) ir bitinės sprigės (49 %; Janulionienė et al., 2011, Zybartaitė et al, 2011).

3.1 pav. Lietuvos populiacijų tarppopuliacinė ir vidupopuliacinė įvairovė. UPGMA programa paskaičiuotas paprastosios sprigės genetiniai atstumai. Mažiausias genetinis panašumas gautas tarp RPa ir Kry populiacijų (0,467), didžiausias tarp KMa ir Ser populiacijų (0,185). Bitinės sprigės genetiniai atstumai svyravo 0,088–0,259, smulkežiedės sprigės 0,135–0,426, o paprastosios sprigės 0,189–0,467. Artimesni genetiniai atstumai gauti paprastosios ir smulkiažiedės sprigės, o bitinės sprigės genetiniai atstumai skyrėsi nuo kitų sprigių rūšių (3.3 lentelė). Tarp geografinių ir genetinių atstumų statistiškai reikšmingos koreliacijos nerasta. 3.3 lentelė. Paprastosios sprigės genetiniai atstumai tarp populiacijų pagal 8 APPD pradmenis (Nei, 1978)

KGr KMa KRa Kro VaP Ser Rus PPl Pla KeS Kry RPa Jup Any

KMa* 0,349 0,349 0,352 KRa 0,325 0,35 0,312 Kro 0,383 0,307 0,237 0,298 VaP 0,372 0,185 0,359 0,374 0,351 Ser 0,384 0,348 0,305 0,378 0,279 0,309 Rus 0,309 0,269 0,335 0,25 0,303 0,276 0,331 PPl 0,381 0,285 0,251 0,369 0,214 0,311 0,27 0,306 Pla 0,338 0,315 0,357 0,327 0,342 0,331 0,342 0,293 0,334 KeS 0,353 0,318 0,412 0,294 0,398 0,321 0,414 0,205 0,405 0,343 Kry 0,384 0,374 0,329 0,388 0,309 0,394 0,275 0,361 0,321 0,347 0,467 RPa 0,378 0,288 0,265 0,312 0,198 0,335 0,254 0,28 0,254 0,296 0,400 0,295 Jup 0,27 0,265 0,382 0,29 0,33 0,279 0,344 0,278 0,313 0,226 0,313 0,352 0,304 Any Juo 0,366 0,309 0,299 0,336 0,259 0,314 0,271 0,27 0,189 0,298 0,378 0,333 0,243 0,291 *Kaunas-Grabučiškiai (KGr); Kaunas-Marvelė (KMa); Kaunas-Raudondvaris (KRa); Kaunas-Romainiai (KRo); Varėna-Puvočiai (VaP); Seredžius (Ser); Rusnė (Rus); Juodkrantė (Juo); Palanga-Plazė (PPl); Plateliai (Pla); Kelmė-Šventragis (KeŠ); Kryžkalnis (Kry); Rokiškis- Panemunėlis (RPa); Jonava-Upininkai (JUp); Anykščiai (Any).

Remiantis genetiniais atstumais ir panaudojant UPGMA (angl. Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) grupavimo metodą nustatytas populiacijų giminingumas. Genetinio panašumo dendrogramoje išsiskiria 4 pagrindiniai klasteriai, pirmąjį klasterį A sudaro: KGr, KMa, Ser, KeS, Any; B klasterį sudaro: KRo, PPl, Kry; C klasterį sudaro KRa, VaP, JUp, Pla, Juo, o D klasterį sudaro Rus ir RPa. Paprastosios sprigės, kaip bitinės ir smulkežiedės sprigių genetinio panašumo dendrogramoje ryšys tarppopuliacijų ir Lietuvos geografinių atstumų nebuvo nustatytas ( 3.2 pav.).

3.2 pav. Paprastosios sprigės tarppopuliacinio panašumo UPGMA dendrograma (Nei, 1978). *Kaunas-Grabučiškiai (KGr); Kaunas-Marvelė (KMa); Kaunas-Raudondvaris (KRa); Kaunas-Romainiai (KRo); Varėna-Puvočiai (VaP); Seredžius (Ser); Rusnė (Rus); Juodkrantė (Juo); Palanga-Plazė (PPl); Plateliai (Pla); Kelmė-Šventragis (KeŠ); Kryžkalnis (Kry); Rokiškis- Panemunėlis (RPa); Jonava-Upininkai (JUp); Anykščiai (Any).

3.3 pav. Paprastosios sprigės 220 individų tarppopuliacinio panašumo UPGMA dendrograma (Nei, 1978) *Kaunas-Grabučiškiai (KGr); Kaunas-Marvelė (KMa); Kaunas-Raudondvaris (KRa); Kaunas-Romainiai (KRo); Varėna-Puvočiai (VaP); Seredžius (Ser); Rusnė (Rus); Juodkrantė (Juo); Palanga-Plazė (PPl); Plateliai (Pla); Kelmė-Šventragis (KeŠ); Kryžkalnis (Kry); Rokiškis- Panemunėlis (RPa); Jonava-Upininkai (JUp); Anykščiai (Any).

3.4 lentelė. Paprastosios sprigės Lietuvos populiacijų genotipai pagal UPGMA dendrogramą. 41

Individų skaičius Populiacija Genotipai populiacijoje KGr* 15 15 KMa 15 12 KRa 15 13 KRo 15 12 VaP 15 4 Ser 15 14 Rus 15 14 Juo 10 10 PPl 15 15 Pla 15 7 KeS 15 14 Kry 15 9 RPa 15 12 JUp 15 15 Any 15 15 *Kaunas-Grabučiškiai (KGr); Kaunas-Marvelė (KMa); Kaunas-Raudondvaris (KRa); Kaunas-Romainiai (KRo); Varėna-Puvočiai (VaP); Seredžius (Ser); Rusnė (Rus); Juodkrantė (Juo); Palanga-Plazė (PPl); Plateliai (Pla); Kelmė-Šventragis (KeŠ); Kryžkalnis (Kry); Rokiškis- Panemunėlis (RPa); Jonava-Upininkai (JUp); Anykščiai (Any).

UPGMA dendograma pagal individus parodo, kad skirtingų populiacijų individai nesimaišė, sudarė atskiras šakas. Dendogramoje individai suskirstyti į 7 klasterius (A-O): Kaune rinktos populiacijos išsidėstė skirtinguose klasteriuose A (KGr), B (KRa, Kry, PPl), F (KRa) ir C klasteryje, kuriame dauguma populiacijų yra vidurio Lietuvos (KMa, Ser, KeŠ, Any); G klasteris atstovauja vidurio ir pietų Lietuvos dalis (JUp ir VaP); E – vakarų dalį (Juo ir Pla); D – šiaurės ir vakarų dalis (RPa, Rus). Individų dendrograma neparodė genetinių duomenų ryšio su geografine padėtimi (3.3 pav). Paskaičiavus kiekvienos populiacijos individų genotipus, skirtingi genotipai visų individų buvo KGra, PPl, JUp ir Any populiacijose. Daugiausiai indentiškų individų buvo VaP populiacijoje (3.4 lentelė). Genotipų įvairovė nepriklausė nuo geografinės padėties.

Principinių koordinačių grafikai neparodė paprastosios sprigės genetinių duomenų ryšio su geografine padėtimi, pagal 15 Lietuvoje surinktų, populiacijų grafikus (3.4 pav.).

3.4 pav. Paprastosios sprigės APPD metodo pagrindinių koordinačių analizė pagal 15 Lietuvos populiacijų. *Kaunas-Grabučiškiai (KGr); Kaunas-Marvelė (KMa); Kaunas-Raudondvaris (KRa); Kaunas-Romainiai (KRo); Varėna-Puvočiai (VaP); Seredžius (Ser); Rusnė (Rus); Juodkrantė (Juo); Palanga-Plazė (PPl); Plateliai (Pla); Kelmė-Šventragis (KeŠ); Kryžkalnis (Kry); Rokiškis- Panemunėlis (RPa); Jonava-Upininkai (JUp); Anykščiai (Any). Principinių koordinačių grafikai paprastosios sprigės genetinių duomenų ryšio su geografine padėtimi, pagal 15 Lietuvos populiacijų individus, grafikus (3.5 pav.).

3.5 pav. Paprastosios sprigės APPD metodo pagrindinių koordinačių analizė pagal 15 Lietuvos populiacijų individus. *Kaunas-Grabučiškiai (KGr); Kaunas-Marvelė (KMa); Kaunas-Raudondvaris (KRa); Kaunas-Romainiai (KRo); Varėna-Puvočiai (VaP); Seredžius (Ser); Rusnė (Rus); Juodkrantė (Juo); Palanga-Plazė (PPl); Plateliai (Pla); Kelmė-Šventragis (KeŠ); Kryžkalnis (Kry); Rokiškis- Panemunėlis (RPa); Jonava-Upininkai (JUp); Anykščiai (Any). Principinių koordinačių grafikai kaip ir paprastosios sprigės genetiniai atstumai tarp populiacijų pagal 8 APPD pradmenis (3.4 ir 3.5 lentelės), neparodė genetinių duomenų ryšio su geografine padėtimi.

IŠVADOS  Paprastosios sprigės APPD tyrimui buvo pritaikyti tie patys oligonukleotidiniai pradmenys bei PGR sąlygos kaip ir smulkiažiedės sprigės ar bitinės sprigės;  Pagal APPD žymenis UPGMA individų ir populiacijų dendrogramoje sugrupavus paprastosios sprigės populiacijas, genetinių ir geografinių atstumų ryšys nebuvo nustatytas; tą patį galima teigti ir apie principinių koordinačių analizę.  Palyginus Lietuvoje augančios paprastosios sprigės genetinę įvairovę, įvertintą pagal APPD žymenis, su kitų sprigių genties rūšių gautais duomenimis, nustatyta, kad: a) vidutinis populiacijos polimorfinių fragmentų skaičius pagal APPD žymenis yra mažiausias paprastosios sprigės ir tarp 3 sprigių rūšių išsidėsto tokia tvarka: 7 – paprastoji sprigė < 21 – smulkiažiedė sprigė < 46 – bitinė sprigė b) pagal APPD žymenis, vidupopuliacinė įvairovė paprastosios sprigės buvo mažiausia – 7 %, smulkiažiedės sprigės – 21 %, bitinės sprigės – 49 % c) vidutinis genetinis atstumas tarp populiacijų paprastosios sprigės buvo didžiausias – 0,32, smulkiažiedės – mažesnis – 0,29, bitinės sprigės – 0,18

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Ambrasienė D., 2008. Molekulinės biologijos praktikumas. Morkūnas ir Ko, Kaunas. 2. Anderberg A. L., 1994. Atlas of seeds and small fruits of northwest-European plant species with morphological descriptions, part 4. Resedaceae–Umbelliferae. Swedish museum of Natural history, Stockholm, Sweden. 3. Apšegaitė V., Binkienė R., Plažytė – Čereškienė L., Būda V., Grikienienė J., Karalius V., Komisrovas J., Krizanauskienė A., Kutkienė L., Lekevičius E., Petkevičiūtė R., Radžiutė S., Repečka R., Stanevičiūtė G., Stunžėnas V., Vaitkevičienė G., Valkiūnas G. 2007. Biota ir aplinkos kaita. Vilniaus universiteto Ekologijos institutas. Vilnius, 239 p. 4. Araus J. L., Slafer G. A., Reynolds M. P., Royo C., 2002. Plant breeding and drought in C3 cereals: what should we breed for? Annals of Botany, 89 (7): 925–940. 5. Arif I. A., Mohammad A. Bakir, Haseeb A. Khan, Ahmad H. Al Farhan, Ali A. Al Homaidan, Ali H. Bahkali, Mohammad Al Sadoon and Mohammad Shobrak. 2010. A brief review of molecular techniques to assess plant diversity. International journal of Molecular Sciences, 11: 2079–2096. 6. Augėnaitė V., Žvingila D., Meškauskaitė E., Naujalis J. R., 2009. Raktažolės pelenėlės (Primula farinosa L.) genetiniai tyrimai Lietuvoje. ISSN, 1392-3714 7. Austad I., Skogen A., 1990. Restoration of a deciduouswoodland in Western Norway formerly used for fodderproduction: effects on tree canopy and ﬁeld layer. Vegetatio, 88: 1–20. 8. Baghalian, K., Sanei, M.R., Naghavi, M.R., Khalighi, A. and Naghdi Badi, H.A. 2005. Post–custure evaluation of morhological devergence ir Iranian Garlic ecotypes. Acta Hort. ISHS, 688: 123–128. 9. Balevičius A., Bukantis A., Bukelskis E., Ignatavičius G., Kutorga E., Mierauskas P., Rimkus R., Rukšėnienė J., Sinkevičius S., Stankūnavičius G., Valiuškevičius G., Zemlys P., Žaromskis R. P., 2007. Globali aplinkos kaita. Vilniaus universitetas. Vilnius, 300 p. 10. Beerling DJ., Perrins JM., 1993. Impatiens glandulifera Royle (Impatiens Roylei Walp.). Journal of Ecology, 81: 367–382. 11. Chinnappa C.C., Gill L.S., 1974. Chromosome numbersfrom pollen in some North American Impatiens (Balsaminaceae). Canadian Journal of Botany, 52: 2637–2639. 12. Coombe D.E., 1956a. Biological Flora of the British Isles: Impatiens parviﬂora DC. Journal of Ecology, 44: 701–713.

13. Coombe D.E., 1956b. Notes on some British plants seen inAustria. Veröffentlichungen des Geobotanischen Instituts, Eidgenössiche technische Hochschule Rübel in Zürich, 35:128–137. 14. Coviella C. E., Trumple J. T., 1999. Effect of elevated atmospheric carbon dioxide on insect – plant interactions. Conservation biology, 13 (4): 700–712. 15. Chmura D., Sierka E., 2006. Relation between invasive plant and species richness of forest floor vegetation: a study of Impatiens parviflora DC. Polish Journal of Ecology, 54 (3): 417– 428. 16. Csiszár Á., Korda M., Schmidt D., Šporčić D., Teleki B., Tiborcz V., Zagyvai G., Bartha D., 2011. Allelopathic potential of some invqsive or potentially invasive neophytes occurring in Hungary. Program abstracts list of participants. 11th International Conference on the Ecology and Management of Alien Plant Invasions. Bridging the gap between scientific knowledge and management practice. 30th August – 3rd September. 17. Čuda J., Skálová H., Janovsky Z., 2011. Ecological requirements, short-term dynamics and competition of native and invasive Impatiens species in the field. Program abstracts list of participants. 11th International Conference on the Ecology and Management of Alien Plant Invasions. Bridging the gap between scientific knowledge and management practice. 30th August – 3rd September. 18. Emter O., Falk H., Sitte P., 1990. Speciﬁc carotenoids andproteins as prerequisites for chromoplast tubule formation.Protoplasma, 157: 128–135. 19. Ennos A.R., Crook M.J., Grimshaw C.,1993. A comparative study of the anchorage systems of Himalayan balsam Impatiens glandulifera and mature sunflower Helianthus annuus. Journal of Experimental Botany, 44: 133–146. 20. Eliás P., 1987. Size inequality in coenopopulations of a woodland annual Impatiens noli-tangere L. Biologia. Bratislava, 42, 881–891. 21. Elton C.S., 1958. The ecology of invasions by animals and plants. Universuty of Chicago Press, 196 p. 22. Ellenberg H., 1988. Vegetation Ecology of Central Europe, 4th ed. G.K. Strutt. Cambridge University Press, Cambridge. 23. Falencka M., 1981. Home range as a measure of space filling by Impatiens noli- tangere L. populations. Bulletin de l’Academie Polonaise des Sciences, Série des Sciences Biologiques, 29: 249–256.

24. Falencka M., 1983. The effect of the size of cotyledons on the development of individuals in Impatiens noli-tangere L. population. Ekologia Polska, 31: 123–143. 25. Falinska K., 1979. Modifications of plant populations in forest ecosystems and their ecotones. Polish Ecological Studies, 5: 89–150. 26. Falinski J. B., 1986. Vegetation dynamics in temperate lowland primeval forests. Geobotany, 8, I–XVII, 1–537. Junk, Dordrecht, The Netherlands. 27. Ge A. J., Han J., Li X.D., Zhao M.Z, Liu H., Dong Q.H., Fang J.G., 2013. Characterization of SNPs in strawberry cultivars in China. 12(1): 639–45. 28. Gorshenin M.M., Krinitsukii G.T., Savich I.P., 1972. Development of the dominant species of the herbaceous vegetation on felled areas in the Carpathian beech forest. Ukrainskii Botanichnii Zhurnal, 29: 463–467. 29. Ghazoul J., 2005. Business as usual? Questionind the global pollination cris. Trends in Ecology, Evolution, 20: 367–373. 30. Gudžinskas Z., 2000. Conspectus of alien plant species of Lithuania. 16. Rosaceae. Lithuanica, 6(4): 307–318. 31. Gudžinskas Z., Lančickas R. (2007). Pavojingo svetimžemio augalo Sosnovskio barščio (Heracleum sosnovskyi) invazijos stabdymo ir naikinimo problemos Lietuvoje. Vadyba. Mokslo tiriamieji darbai. Klaipėdos universiteto leidykla. Klaipėda, 2 (11): 91-95. 32. Hamrick J. L., Godt M. J. W., 1996. Philosophical Transactions. Biological Sciences, 351: 1291–8. 2. 33. Hatcher P.E., Alexander K.N.A., 1994. The status andconservation of the netted carpet Eustroma reticulatum, a threatened moth species in Britain. Biological Conservation, 67: 41–47. 34. Hatcher L. P. E., 2003. Impatiens noli-tangere. Ecology, 91: 147–167. 35. Hatcher P. E, Wilkinsona M. J., Albania M. C., Hebbernb C. A., 2004. Conserving marginal populations of the food plant (Impatiens noli-tangere) of an endangered moth (Eustroma reticulatum) in a changing climate. Biological Conservation, 116: 305–317. 36. Hejda M., Pyšek P., Jarošík V., 2009. Impact of invasive plants on the species richness, diversity and composition of invaded communities. Journal of Ecology, 23: 393–403. 37. Horwood A.R., 1919. A New British Flora: British Wild Flowers in their Natural. Haunts, Gresham, London, UK. 38. Hultén E., 1971. The circumpolar plants. II. Dicotyledons. Kungliga Svenska Vetenskapsakademiens Handlingar, 13: 1–463. 47

39. Yang X.L., Summerhurst D.K., Koval S.F., Ficker C., Smith, M.L., Bernards M.A., 2001. Isolation of an antimicrobial compound from Impatiens balsamina L. using bioassay-guided fractionation. Phytotherapy Research, 15: 676–680. 40. Jankowska-Blaszczuk, M., Grubb P.J., 1997. Soil seed banks in primary and secondary deciduous forest in Bia8owieza, Poland. Seed Science Research, 7: 281–292. 41. Janulionienė R., Žukauskienė J., Jodinskienė M., Ambrasienė D., Paulauskas A., Kupčinskienė E. 2011. Selection of RAPD primers for geographically most distinct Lithuanian populations of Impatiens parviflora. Lietuvos mokslų akademija, 130–136. 42. Jouret M.F., 1977. Relation entre la dormance séminale et la chorologie de diverses espèces du genre Impatiens L. Bulletin de la Société Royale de Botanique de Belgique, 110: 119– 128. 43. Karazija S., 1988. Lietuvos miškų tipai. Mokslas. Vilnius, 212 p. 44. Kostrakiewicz K., Zając M., 2011. Phenotypic plasticity of the chosen reproductive traits within Impatiens glandulifera Royle and Bidens frondosa L. populations. Program abstracts list of participants. 11th International Conference on the Ecology and Management of Alien Plant Invasions. Briding the gap between scientific knowledge and management practice. 30th August – 3rd September. 45. Kreans C. A., Inouye D. W., Waser N. M., 1998. Endangered mutualisms: the conservation of plant – pollinator interactions. Annual Review of Ecology and Systematics, 29: 83– 112. 46. Keane R. M., Crawley M. J., 2002. Exotic plant invasions and the enemy release hypothesis. Trends in Ecology and Evolution, 17 (4): 164–170 47. Kleinig H., Nietsche H., 1968. Carotinoidester-muster in gelben Blütenblättern. Phytochemistry, 7: 1171–1175. 48. Kuusk V., Tabaka L., Jankevičienė R., 1996. Flora of the Baltic Countries. Compendium of Vascular Plants. Eesti Loodusfoto AS, Tartu. 49. Landot E., 1993. Uber Pfanzenarten, die sich in der letzten 150 Jahren in der Stadt Zurich stark ausgebreitet haben. Phytoccoenologia, 23: 651–663. 50. Lapin K., Bernhardt K. G., 2011. Management of invasive plants in a riparian landscape within the restorian programme of the river Traisen, Lower Austria. Program abstracts list of participants. 11th International Conference on the Ecology and Management of Alien Plant Invasions. Briding the gap between scientific knowledge and management practice. 30th August – 3rd September. 48

51. Lees F.A., 1888. The Flora of West Yorkshire. Lovell Reeve, London, UK. 52. Li J.J., Pei G.L., Pang H.X., Bilderbeck A., Chen S.S., Tao S.H., 2006. A new method for RAPD primers selection based on primer bias in nucleotide sequence data. Journal of Biotechnology, 126: 415–423. 53. Lobstein A., Brenne X., Feist E., Metz N., Weniger B., Anton R., 2001. Quantitative determination of naphthoquinones of Impatiens species. Phytochemical Analysis, 12: 202–205. 54. Lousley J.E., 1976. Flora of Surrey. David, Charles, Newton Abbot, UK. 55. Mack R. N., Simberloff D., Lonsdale W. M., Evans H., Clout M., Bazzar F. A., 2000. Biotic invasions: causes, epidemiology, global consequencies, and control. Ecological Applications, 10: 689-710. 56. Markov M.V., 1991. Population biology of touch-me-not Impatiens noli-tangere L. Soviet Journal of Ecology, 22: 12–20. 57. Marozas V., 2008.Sausumos ekosistemų įvairovė ir apsauga. Akedemija, 61–77 p. 58. Masuda M., Yahara, T., 1994. Reproductive ecology of a cleistogamous annual, Impatiens noli-tangere L., occurring under different environmental conditions. Ecological Research, 9: 67–75. 59. Mooney H. A., Hobbs R. J., 2000. Invasive Species in a Changing World. – Washington. 1–439 p. 60. Natkevičaitė-Ivanauskienė M., 1971. Lietuvos TSR flora IV, Lietuvos TSR Mokslų akademija, Botanikos institutas. Vilnius, 627 p. 61. Nei M., 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics, 89: 583–590. 62. Nybom, H., Bartish I.V., 2000. Effects of life history traits and sampling strategies on genetic diversity estimates obtained with RAPD markers in plants. Perspectives in Plant Ecology, Evolution, and Systematics, 3: 93–114. 63. Pagitz K., 2011. Solidago canadensis, Impatiens glandulifera and Fallopia japonica – invasion scenarios north- and southward the main chain of the Alps. Program abstracts list of participants. 11th International Conference on the Ecology and Management of Alien Plant Invasions. Briding the gap between scientific knowledge and management practice. 30th August – 3rd September. 64. Parker P. G., Snow A.A., Schug M. D., Booton G.C., Fuerst P., 1998. What molecules can tell us about populations: choosing and using a molecular marker. Ecology, 79(2): 361–382.

65. Piechulla B., Pott M., 2003. Plant scents – mediators of inter – and intraorganismic communication. Planta, 217: 687–689. 66. Pimentel D., McNair S., Janecka J., Wightman J., Simmonds C., O’Connell C., Wong E., Russel L.,. Zern J, Aquino T., Tsomondo T., 2001. Economic and environmental threats of alien plant, animal, and microbe invasions. Agriculture, Ecosystems and Environment 84: 1–20 67. Pisek, A., Berger, E., 1938. Kutikuläre Transpiration und Trockenresistenz isolierter Blätter und Sprosse. Planta, 28: 124–155. 68. Pyšek P., Prach K., 1995. Invasion dynamics of Impatiens glandulifera – a century of spreading reconstructed. Biological Conservation, 74: 41–48. 69. Preston C.D., Hill M.O., 1997. The geographical relationships of British and Irish vascular plants. Botanical Journal of the Linnean Society, 124: 1–120. 70. Preston, C.D., Pearman, D.A., Dines, T.D., 2002. New Atlasof the British and Irish Flora. Oxford University Press, Oxford, UK. 71. Priede A., 2008. Invasive non-native Solidago Species in Latvia: expasion history and current distribution. Proceedings of the Latvian Academy of Sciences, 62: 78–83. 72. Provan J., Love H.M., Maggs C.A., 2007. Development of microsatellites for the invasive riparian plant Impatiens glandulifera (Himalayan balsam) using intersimple sequence repeat cloning. Molecular Ecology Notes, 7: 451–453. 73. Rašomavičius V., 2008. Invazinių augalų rūšių populiacijų dinamikos ir plitimo tyrimai. Botanikos institutas. Vilnius. 74. Rimkus E., Kažys J., Junevičūtė J., Stonevičius E., 2007. Lietuvos klimato pokyčių XXI a. prognozė. Geografija, 43 (2): 37–47. 75. Romanovskaja D., Bakštytė E., 2007. Lietuvos sodininkystės ir daržininkystės instituto Lietuvos Žemės Ūkio universiteto darbai. Sodininkystė ir daržininkystė. Klimato kaitos įtaka obelių žydėjimo pradžiai Lietuvos teritorijoje, 26 (2). 76. Rydberg P.A., 1910. Family–Balsaminaceae. North American Flora, 25: 93–96. 77. Skalinska, M., Piotrowicz, M., Czapik, R. et al. 1959: Further studies in chromosome numbers of Polish angiosperms (Dicotyledons). - Acta Soc. Bot. Polon, 28: 487-529. 78. Skálová H., Moravcová L., Čuda J., Pešyk P., 2011. Role of species traits, plasticity, and local differentiation in plant invasions: four Impatiens species in Central Europe. Program abstracts list of participants. 11th International Conference on the Ecology and Management of Alien Plant Invasions. Briding the gap between scientific knowledge and management practice. 30th August – 3rd September. 50

79. Schaal B. A., Hayworth D. A., Olsen K. M., Rauscher J. T., Smith W. A., 1998. Phylogeographic studies in plants: problems and prospects. Molecular Ecology, 7: 465–74. 80. Sitasova E., 2011. Invasive botanical species in the Kosice region (Eastern Slovakia), problems, associated with the occurrence and proposals for solution. Program abstracts list of participants. 11th International Conference on the Ecology and Management of Alien Plant Invasions. Briding the gap between scientific knowledge and management practice. 30th August – 3rd September. 81. Sitte P., Falk H., Liedvogel B., 1980. Chromoplasts. Pigments in Plants (ed. F.C. Czygan). Fischer, Stuttgart, Germany, p. 117–148. 82. Snarskis P., 1954. Vadovas Lietuvos TSR augalams pažinti, Valstybinė politinės ir mokslinės literatūros leidykla. Vilnius, 530 p. 83. Swan G.A., 1993. Flora of Northumberland. Natural History Society of Northumbria, Newcastle-upon-Tyne, UK. 84. Tichy, J., 1997. Changes in forest vegetation on Ondrejník permanent plot after thirty years. Lesnictví-Forestry, 43: 363–373. 85. Tingey S.V., del Tufo J.P. 1993. Genetic analysis with random amplified polymorphic DNA markers. Plant Physiology, 101 (3): 349–352. 86. Zybartaitė L., Žukauskienė J., Jodinskienė M., Janssens B. S., Paulauskas A., Kupčinskienė E., 2011. RAPD analysis of genetic diversity among Lithuanian populations of Impatiens glandulifera. Molecular Ecology Notes. Agriculture, 391–398. 87. Zybartaitė L., Žukauskienė J., Kupčinskienė E., Paulauskas A., 2011. Adoption of RAPD-related methodology for analyses of Hypericum maculatum Crantz growing wild in Lithuania. Biologija, 57 (3): 115–120. 88. Žvingila D., Patamsytė J., Česnienė T., Kleizaitė V., Naugžmys D., Rančelis V., 2011. Genetic variation and population structure of invasive plant species Erigeron annuus in Lithuania. Environmental Weeds and Invasive Plants, 3rd International Symposium. Monte Verita, Ascona, Switzerland, p. 45. 89. Walker N. F., Hulme P. E., Hoelzel A. R., 2009.Population genetics of an invasive riparian species, Impatiens glandulifera. Plant Ecol, 203: 243–252 90. Williams J.G.K., Kubelic, A. R., Livak, K. J., Rafalski, J. A., Tingey, S. V., 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acdis Resource, 18: 6231–6235.

91. Weiss J., McLaren D., 2002. Victoria’s Pest Plant Prioritisation Process. Proceedings of the 13th Australian Weeds Conference, eds. H. Spafford Jacob, J. Dodd, J.H. Moore, pp. 509- 512. Plant Protection Society of Western Australia, Perth. 92. Wunsch A., Hormaza J. I., 2002. Cultivar identification and genetic fingerprinting of temperate fruit tree species using DNA markers. Euphytica, 125: 59–67. 93. Walker N. F., Hulme P. E., Hoelzel A. R., 2008. Population genetics of an invasive riparian species, Impatiens glandulifera. Plant Ecol, 243–252. 94. Williams J. G. K., Kubelic A. R., Livak K. J., Rafalski J. A., Tingey S. V., 1990. DNA polymorphisms amplified by arbirtrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Resource 18: 6231–6235. 95. Wrischer M., Ljubesi N., Prebeg T., Magnus V., 1999. The succession of chromoplast structures in Impatiens noli-tangere ﬂowers. Phyton, 39: 49–59.

Priedas Nr. 1

The Vital Nature Sign 2013 International Scientific Conference

RAPD ANALYSIS OF GENETIC DIVERSITY AMONG LITHUANIA POPULATION OF IMPATIENS NOLI TANGERE L. Julija Petkevičiūtė, Lina Zybartaite, Ramūnas Vilčinskas, Algimantas Paulauskas, Eugenija Kupcinskiene Vytautas Magnus University, Department of Biology, Vileikos 8, LT-44404 Kaunas, Lithuania

Balsaminaceae family comprises more than 1000 species, among them five species are present in Europe. There are 4 species in Lithuania, one of them is cultivated – Impatiens balsamina L., two species are known as aliens – Impatiens parviflora DC., Impatiens glandulifera L. and only one is growing naturally – Impatiens noli-tangere L. Valuable information might be obtained comparing adaptation level and variability of alien species and native ones. In Lithuania, molecular studies have been carried out only for invasive species of Impatiens, so the objective of this study was to evaluate the genetic variability of populations of Impatiens noli-tangere differing in geography or habitats by the randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). Plants were collected from – Kaunas-Grabučiškiai, Kaunas-Marvelė, Kaunas-Raudondvaris, Kaunas-Romainiai, Varėna- Puvočiai, Seredžius, Rusnė, Juodkrantė, Palanga-Plazė, Plateliai, Kelmė-Šventragis, Kryžkalnis, Rokiškis-Panemunėlis, Jonava-Upininkai, Anykščiai. For I. noli-tangere studies eight different oligonucleotide primers (OPA-20, OPD-20, 222, 250, 269, 340, 474, 516) were used. Among populations of I. noli-tangere genetic parameters ranged in the following intervals: 3–15 % of polymorphic DNA bands, 0.005–0.049 for Nei’s gene diversity, 0.009–0.074 for Shannon’s information index. Pairwise genetic distances between populations ranged in the interval 0.185– 0.467. Genetic distance-based cluster analyses for 220 individuals indicated 7 major groups of populations (A – Kaunas-Grabučiškiai; B – Palanga-Plazė, Kryžkalnis, Kaunas-Raudondvaris; C – Anykščiai, Kelmė-Šventragis, Seredžius, Kaunas-Marvelė; D – Rokiškis-Panemunėlis, Rusnė; E – Juodkrantė, Plateliai; F – Kaunas-Raudondvaris; G – Jonava-Upininkai, Varėna-Puvočiai) among which there was no clear geographical pattern. On the bases of RAPD markers prepared UPGMA dendrogram of individuals and populations did not show tight relation between population geography and geographical distances. The same was true when principal component analyses were done for genetical data.

Priedas Nr. 3

Priedas Nr. 3 VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS

GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS

Molekulinės biologijos ir biotechnologijų studijų programa

STUDENTĖS Julijos Petkevičiūtės

PARENGUSIO BAIGIAMĄJĮ MAGISTRO DARBĄ

PAPRASTOSIOS SPRIGĖS (IMPATIENS NOLI-TANGERE L.) LIETUVOS POPULIACIJŲ GENETINĖ ĮVAIROVĖ, ĮVERTINTA PAGAL APPD ŽYMENIS

DEKLARACIJA

Garantuoju, kad baigiamąjį darbą parengiau savarankiškai, nepažeidžiant kitų asmenų autorinių teisių.

Baigiamajame darbe tiesiogiai ar netiesiogiai panaudotos kitų autorių mintys yra pažymėtos, pateikiant nuorodas į šaltinius.

Garantuoju, kad darbe nėra neskelbtinos informacijos arba informacijos, kuriai būtų taikomi teisės aktuose numatyti skelbimo apribojimai.

Studentas......

(Parašas) (vardas, pavardė)