Chapter I – Natural Environment

Micropropagação e Germinação das Espécies Endémicas da Ilha da Berlenga Inês Maria De Almeida Franco 2019 Micropropagação e Germinação das Espécies Endémicas da ilha da Berlenga Inês Maria De Almeida Franco Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia dos Recursos Marinhos Dissertação de Mestrado realizada sob a orientação da Doutora Clélia Paulete Correia Neves Afonso e coorientação da Doutora Teresa Margarida Lopes da Silva Mouga 2019 II Micropropagação e germinação de Espécies Endémicas da ilha da Berlenga Copyright Inês Maria De Almeida Franco / Escola Superior de Turismo e Tecnologia do Mar e Instituto Politécnico de Leiria. A Escola Superior de Turismo e Tecnologia do Mar e o Instituto Politécnico de Leiria têm o direito, perpétuo e sem limites geográficos, de arquivar e publicar esta dissertação através de exemplares impressos reproduzidos em papel ou de forma digital, ou por qualquer outro meio conhecido ou que venha a ser inventado, e de a divulgar através de repositórios científicos e de admitir a sua cópia e distribuição com objetivos educacionais ou de investigação, não comerciais, desde que seja dado crédito ao autor e editor. III IV Resumo O decréscimo do número de exemplares de algumas das espécies vegetais endémicas da ilha da Berlenga é resultado do impacto exercido pelo Homem, sendo um cenário preocupante. A conservação destas espécies ainda é possível a partir de técnicas de cultura in vitro. O objetivo principal deste trabalho foi o estabelecimento de protocolos que permitam a multiplicação por micropropagação ou por germinação de sementes, de três espécies endémicas da ilha da Berlenga, Pulicaria microcephala, Armeria berlengensis e Herniaria berlengiana, que se encontram categorizadas como espécies em risco de extinção ou criticamente ameaçadas. No estabelecimento de novos cultivos, foi determinada a taxa de sucesso na desinfeção das três espécies, sendo que os melhores resultados obtidos foram de 24,4% para P. microcephala, 15,79% para A. berlengensis e 18,2% para H. berlengiana, com diferentes processos de desinfeção. Avaliou-se igualmente, a taxa de sucesso na germinação de P. microcephala, que variou entre 6,19 e 73,02%. Em A. berlengensis obtiveram-se valores inferiores de germinação (20%), facto que, em conjunto com uma taxa de fecundidade de 3,5%, corrobora a necessidade da micropropagação como estratégia para a recuperação desta espécie. Foram realizados ainda ensaios de aclimatização com P. microcephala e A. berlengensis e estudadas as taxas de sucesso dos mesmos. Em P. microcephala a taxa de sucesso chegou aos 90,90%, quando realizada com uma luminosidade de 5790 lux, no entanto, e apesar da taxa de sucesso é apenas de 63,64% em plantas que foram aclimatizadas no exterior com luminosidade, humidade e temperatura não controladas, natural, estas apresentaram maior quantidade de flores. As plantas de A. berlengensis de menores dimensões registaram os melhores resultados de aclimatização, com 80% de sucesso. Foi ainda estudada a adição ao meio de cultura para o desenvolvimento de P. microcephala, de hormonas de crescimento e NaCl, bem como testados diferentes valores de pH. Este estudo demonstra que a micropropagação, seguida de aclimatização, é a melhor solução até agora encontrada para contribuir na conservação destas três espécies. Palavras-chave: Cultura in vitro; Conservação; Berlenga; Pulicaria microcephala; Armeria berlengensis; Herniaria berlengiana V VI Abstract The decrease in the number of specimens of some of the endemic plant species of Berlenga Island is a result of the impact exerted by man, being a worrying scenario. The conservation of this species it’s still possible using in vitro techniques. The main objective of this work was the establishment of protocols that allow micropropagation or seed germination of three endemic species of Berlenga Island, Pulicaria microcephala, Armeria berlengensis and Herniaria berlengiana, which are categorized as endangered species or critically endangered. In the establishment of new cultures, the disinfection success rate of the three species was determined, and the best results were 24.4% for P. microcephala, 15.79% for A. berlengensis and 18.2% for H. berlengiana, with different disinfection processes. The success rate of P. microcephala germination, which ranged from 6.19 to 73.02%, was also evaluated. In A. berlengensis, lower germination values were obtained (20%), which, together with a fertility rate of 3.5%, corroborates the need for micropropagation as a strategy for the recovery of this species. Acclimatization assays were also performed with P. microcephala and A. berlengensis and their success rates were studied. In P. microcephala the success rate reached 90.90% when performed with a luminosity of 5790 lux, however, the success rate is only 63.64% in plants which were acclimatized outdoors with uncontrolled luminosity, humidity and temperature, but it presented a larger number of flowers. The smaller A. berlengensis plants had the best acclimatization results, 80% success. The addition to culture medium for the development of P. microcephala, of growth hormones and NaCl, as well as different pH values were also studied. This study demonstrates that micropropagation followed by acclimatization is the best solution found so far to contribute to the conservation of these three species. Keywords: In vitro culture; Nature conservation; Berlenga; Pulicaria microcephala; Armeria berlengensis; Herniaria berlengiana VII VIII Índice 1 Introdução Geral 1 1.1 Reserva Natural das Berlengas 3 1.2 Caso de Estudo: Pulicaria microcephala 4 1.3 Caso de Estudo: Armeria berlengensis 5 1.4 Caso de Estudo: Herniaria berlengiana 6 1.5 Ações de melhoramento – Projeto Life+Berlengas 7 1.6 Micropropagação e germinação de sementes 8 1.7 Objetivos 10 2 Materiais e Metodologia Geral 13 2.1 Preparação de Meios de Cultura 15 MS.1 15 MS.2 15 MS.3 15 MS.4 15 2.2 Recolha de explantes 15 2.3 Desinfeção e estabelecimento in vitro 16 2.4 Condições de cultura in vitro 16 2.5 Aclimatização a condições ex vitro 17 2.6 Análise estatística 17 2.7 Local de recolha dos explantes 18 2.8 Local de recolha das amostras de solo 19 3 Desinfeção e germinação de sementes 21 3.1 Introdução 23 3.2 Materiais e Metodologias 24 Recolha e recuperação dos frutos de Pulicaria microcephala 24 Desinfeção dos frutos de Pulicaria microcephala 24 Recolha e recuperação de sementes de Armeria berlengensis 25 Desinfeção de sementes de Armeria berlengensis 26 3.3 Resultados e Discussão 26 4 Pulicaria microcephala 37 4.1 Introdução 39 4.2 Materiais e Metodologia 40 Recolha de explantes 40 Desinfeção e estabelecimento 40 Ação de hormonas vegetais no crescimento de Pulicaria microcephala 40 Aclimatização a condições ex vitro 41 4.3 Resultados e Discussão 41 5 Armeria berlengensis 47 5.1 Introdução 49 5.2 Materiais e Metodologias 50 IX Recolha de Material 50 Desinfeção de Armeria berlengensis 50 Aclimatização 50 Indução de calli 51 5.3 Resultados e Discussão 51 6 Herniaria berlengiana 61 6.1 Introdução 63 6.2 Materiais e Metodologias 63 Recolha de Material 63 Desinfeção de Herniaria berlengiana 63 6.3 Resultados e Discussão 64 7 Impacto do pH, salinidade e fonte de nutrientes em Pulicaria microcephala 67 7.1 Introdução 69 7.2 Material e Metodologia 71 Análise de amostras de solo da Berlenga 71 Recolha de material 71 Tratamento inicial das amostras 72 Textura de Campo 73 Quantificação da matéria orgânica 73 Determinação do pH 74 Determinação da Salinidade 74 Influência do pH e da Salinidade no crescimento de Pulicaria microcephala 75 7.3 Resultados e Discussão 75 Influência do pH e da Salinidade no crescimento de Pulicaria microcephala 82 8 Discussão e Conclusões Gerais 85 8.1 Discussão e conclusões gerais 87 8.2 Perspetivas futuras 89 9 Bibliografia 91 10 Anexos 101 X Índice de Figuras Figura 2.1 Plantas adultas de Pulicaria microcephala (a), Armeria berlengensis (b) e Herniaria berlengiana (c) e respetivos explantes (d, e, f) 16 Figura 2.2 Demonstração das intensidades luminosas observadas durante o processo de aclimatização para estudo do impacto da luz com diferentes intensidades luminosas (Lux ): 3650 Lux (a), 5640 Lux (b), 5790 Lux (c), intensidade luminosa não controlada (d); fotos do estado inicial das plantas antes de se iniciar o processo de aclimatização ((a), (b), (c), (d)) foto do estado de desenvolvimento após um mês de aclimatização no exterior, sem intensidade luminosa e parametros de temperatura controlados. 17 Figura 2.3 Mapa da zona de recolha do material biológico vegetal, explantes e infrutescências, de cada um dos casos de estudo: Pulicaria microcephala, Armeria berlengensis e Herniaria berlengiana. Adaptado do INCF (ICNF, 2019). 18 Figura 2.4 Mapa da zona de recolha das amostras de solo de diversas zonas de interesse das ilhas da Berlenga. Adaptado do INCF (ICNF, 2019). 19 Figura 3.1 Valores percentuais das Taxas de Germinação (cor verde), Taxa de Inviabilidade (cor cinza) e Taxa de Contaminação (cor laranja) para os vários processos de desinfeção aplicados a sementes de Pulicaria microcephala. 27 Figura 3.2 Fruto de Pulicaria microcephala (lupa binocular com escala de 500µm) (a), plântula e sementeira (lupa binocular com ampliação de 32x) (b) e plântulas com 2 semanas (c). 30 Figura 3.3 Valores percentuais das Taxas de Germinação (cor verde), Taxa de Inviabilidade (cor cinza) e Taxa de Contaminação (cor laranja) para os vários processos de desinfeção aplicados a diversos conjuntos de sementes de Armeria berlengensis em germinação em placa de Petri; 34 Figura

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