Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Bioquímica Médica

MICHELLE LOPES RIBEIRO GUIMARÃES

Estudo das de micobactérias: clonagem, expressão e caracterização da

recombinante HtrA2 produzida in vivo pelo Mycobacterium leprae

V. I

Rio de Janeiro

*2007*

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LOMBADA

GUIMARÃES RIBEIRO MICHELLELOPES

micobactérias: clonagem, expressão expressão clonagem, micobactérias:

recombinante HtrA2 produzida in in produzida HtrA2 recombinante vivo pelo Myco pelo vivo e caracterização da protease protease da caracterização e

de proteases das Estudo

bacterium leprae bacterium

UFRJ

V. I

Michelle Lopes Ribeiro Guimarães

Estudo das proteases de micobactérias: clonagem, expressão e caracterização da protease recombinante HtrA2 produzida in vivo pelo Mycobacterium leprae

Número de volumes: 1

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Química Biológica, Instituto de Bioquímica

Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em

Química Biológica.

Orientador: Maria Cristina Vidal Pessolani

Rio de Janeiro

*2007* FICHA CATALOGRÁFICA

Guimarães, Michelle Lopes Ribeiro.G.. Estudo das proteases de micobactérias: clonagem, expressão e caracterização da protease recombinante HtrA2 produzida in vivo pelo Mycobacterium leprae / Michelle Lopes Ribeiro Guimarães. Rio de Janeiro, 2007. x, 128 f.: il.

Tese (Doutorado em Química Biológica) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, 2007.

Orientador: Maria Cristina Vidal Pessolani

1. Mycobacterium leprae . 2. Genômica Comparativa. 3. Proteases. 4. HtrAs – Teses. I.Pessolani, Maria Cristina Vidal (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Bioquímica Médica. III. Título.

Michelle Lopes Ribeiro Guimarães

Estudo das proteases de micobactérias: clonagem, expressão e caracterização da protease recombinante HtrA2 produzida in vivo pelo Mycobacterium leprae

Tese submetida ao corpo docente do Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Química Biológica.

Rio de Janeiro, 23 de Julho de 2007.

______Dra. Maria Cristina Vidal Pessolani, Chefe do Laboratório de Microbiologia Celular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ. (Orientador)

______Dr. Robson de Queiroz Monteiro, Professor Adjunto, Instituto de Bioquímica Médica /ICB/UFRJ.

______Dr. Flavio Alves Lara, Pesquisador Assistente, Laboratório de Microbiologia Celular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ.

______Dr. Carlos Roberto Alves, Pesquisador Associado, Laboratório de Biologia Molecular de Doenças Endêmicas Manguinhos, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ.

______Dr. Orlando Bonifácio Martins, Professor Adjunto, Instituto de Bioquímica Médica/ICB/UFRJ. (Suplente Interno)

______Dra. Maria Helena Feres Saad, Pesquisador Titular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ. (Suplente Externo)

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Microbiologia Celular, do Instituto Oswaldo

Cruz da Fundação Oswaldo Cruz, sob a orientação da Doutora Maria Cristina Vidal

Pessolani.

Este trabalho foi financiado pelo CNPq e FAPERJ.

Ao meu amado esposo Hugo

Aos meus pais, Vitorino e Cleusa

AGRADECIMENTOS

O reconhecimento – substantivo e o reconhecer – verbo, ambos se constroem, primeiro com a desconstrução de realidades aparentemente reais e depois com o tempo – irremediável.

Aprendi durante este trajeto, muitas técnicas, formas para tornar respostas, perguntas que nos pareciam mistérios aprendi que Ciência paradoxalmente é intuição, instinto, que conflitam com a razão e os protocolos. Qual não é nossa emoção e realização quando nos deparamos frente a um resultado próspero? No entanto, acredito que nosso maior aprendizado vem das pessoas que se deparam e passam por nosso caminho, é para todas estas pessoas que agradeço, pois participaram de forma inquestionável deste trabalho.

♦ Àquele que tudo criou e a nós não nos cabe definir, apenas crer em sua providência que sempre nos provê o necessário;

♦ Ao meu amor Hugo, sem você sou um ser incompleto, pela metade. Sou uma mulher plenamente realizada ao teu lado. Obrigada pela sua incondicional doação e amor. Paciência e confiança num futuro de felicidade;

♦ Ao meu pai, Vitorino, que sempre me incentivou e apoiou. Sem a sua participação em minha vida eu não estaria vivendo este momento agora;

♦ À minha mãe, Cleusa, por sempre ter me dado apoio em minhas decisões e, principalmente, por ser minha melhor amiga;

♦ Este é um agradecimento mais que especial à minha orientadora e amiga, Dra. Maria Cristina

Vidal Pessolani por me acompanhar há mais de oito anos e formar meu caráter científico. Neste período, sempre se empenhou em apoiar, elogiar, aconselhar e repreender minhas atitudes equivocadas. Obrigada pela amizade, confiança, paciência, dedicação, e por ser um grande exemplo pra mim. Obrigada pela ajuda em todas as etapas desse trabalho;

♦ À Dra. Fernanda Portaro, do laboratório de Imunoquímica, Instituto Butantã, São Paulo, pela inestimável amizade, disponibilidade, incentivo. Obrigada por me acolher nas duas ocasiões em que estive em Sampa. Obrigada por abrir as portas do seu laboratório, disponibilizando recursos e pessoal, para agilizar meus experimentos. Minha tese não seria a mesma sem sua participação;

♦ À Eliana Blini Marengo, também do Instituto Butantã, por ser tão amiga e prestativa. Por me abrigar e me fazer sentir em casa. Por colaborar, participar e acreditar no meu trabalho;

♦ À Natália Pieranfeli dos Santos , aluna de iniciação científica da Dra. Fernanda Portaro, por sua dedicação, ajuda e eficiência;

♦ A todos do Centro Aplicado de Toxinologia, CAT, que me receberam tão bem e tornaram minha estada em São Paulo muito agradável. Obrigada a todos os que contribuíram para este trabalho se tornar realidade, de forma direta ou indireta;

♦ À Dra. Euzenir Nunes Sarno, pelo incentivo e amizade, tão importantes nesta jornada;

♦ À Dra. Eugênia Galo, pela generosidade e colaboração;

♦ Ao Dr. Sergio Antunes, pelas conversas e sugestões, ajuda e colaboração; ♦ À Dra. Maria Helena Saad, e aos demais chefes de laboratório, por sempre serem tão gentis e prestativos comigo;

♦ Ao professor Dr. Orlando O. Martins, pela revisão cuidadosa da minha tese, pelas sugestões sempre relevantes e pela amizade;

♦ Aos meus amigos de sala e cervejas, Elisa (Rock Balboa), Julio, Leonardo, descobri em vocês o valor da verdadeira amizade, minha jornada foi muito menos árdua pela companhia de vocês;

♦ Ás minhas amigas Luciana, Tatiana (minha amiga, ainda bronquinha), por sua ajuda em vários momentos e incentivo;

♦ Aos meus queridos amigos de labuta, que estão distantes apenas fisicamente, Cristiana e

Renato, vocês são pessoas de fibra e merecem todo o sucesso e felicidade possível;

♦ À Patrícia, minha querida ex-aluna, pois sem a sua participação esta tese não teria sido a mesma;

♦ Aos colegas da sala 27, Adriano, André, Érika, Lucinéia, Márcia, Michel, a Érika (que o duende escondeu) pelos inúmeros momentos agradáveis de convivência;

♦ Aos meus colegas e amigos Milton, Adalberto, Harrison, Sidra, Viviane, Amanda, Mara, pelo companheirismo, carinho e ajudas;

♦ Ao Dr. José Augusto médico do Ambulatório Souza Araújo/Fiocruz/RJ, pela amizade, prestabilidade e gentilezas. Enfermeira Denise e demais componentes do ambulatório Souza

Araújo/FIOCRUZ;

♦ Aos meus sogros, Sr. Agripino e Sra. Marlene, que deram a vida ao ser que mais amo, e por darem tanto apoio e carinho sempre. Eu ganhei não um sogro e uma sogra, mais sim, um pai e uma mãe;

♦ Aos meus avós maternos, Arnaldo e Izaura, em sua memória, e a toda a minha família pelo suporte carinhoso de sempre;

♦ Aos meus avós paternos, Vitorino, in memorian , e Luzia, pelo carinho, amor e exemplo de luta e amor pela vida;

♦ Ao meu gato Azinho, ou Zen gatinho, meu gato de guarda por toda a alegria e bem estar que causa e pela inseparável companhia durante esses 12 anos em que estamos juntos;

♦ Ao Sr. Salles, que sempre me socorreu com seu carinho fraternal e amizade;

♦ Aos funcionários da secretaria do programa de pós-graduação em Química Biológica, IBMQ,

UFRJ, em especial para a Teresa, pelo apoio sempre solícito em todos os momentos;

♦ A todos os professores do Instituto de Bioquímica Médica, a coordenação do programa de pós- graduação, por formarem verdadeiros doutores e mestres e em particular pela solicitude sempre presente durante toda minha estada neste instituto;

♦ A todos os que trabalham na secretaria da hanseníase, pelas xérox e outros favores que me foram de grande valia;

♦ À Bené, Sr. Paulo, Solange, e todos os outros colaboradores, porque sem vocês este laboratório não funcionaria;

♦ A todos os outros amigos, que eu não citei aqui, mas que fazem parte do meu coração;

♦ Ao Instituto Pasteur, France, por ter financiado minha participação no curso “First Joint

Pasteur Institute/Wellcome Trust Course on Genomics in South América”, realizado no Uruguai e a todos os que de alguma forma contribuíram para minha introdução ao mundo da Bioinformática;

♦ Ao LNCC por ter financiado minha participação na “ Conferência em Bioinformática: Global dialogues on emerging science and technology”, realizado em Petrópolis, Rio de Janeiro;

♦ Ao CNPq, por terem financiado este projeto, minha bolsa, além de outros benefícios;

♦ A FAPERJ por ter financiado este projeto.

"Toda a nossa ciência, comparada com a realidade, é primitiva e infantil - e, no entanto, é a

coisa mais preciosa que temos."

Albert Einstein

RESUMO

GUIMARÃES, Michelle Lopes Ribeiro. Estudo das proteases de micobactérias: clonagem, expressão e caracterização da protease recombinante HtrA2 produzida in vivo pelo Mycobacterium leprae . Rio de Janeiro, 2007. Tese (Doutorado em Química Biológica) - Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007.

Embora as proteases sejam reconhecidas como importantes fatores de virulência em microorganismos patogênicos, pouca informação está disponível na literatura a respeito do papel potencial destas enzimas nas doenças causadas por micobactérias. Neste trabalho, nós utilizamos ferramentas de bioinformática para comparar os genes que codificam para proteases presentes nos genomas de Mycobacterium leprae , Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium bovis e Mycobacterium avium paratuberculosis . Esta análise nos permitiu realizar uma revisão da nomenclatura das famílias de proteases presentes nas micobactérias. Devotamos especial atenção ao “depauperado genoma” do M. leprae onde observamos um relativo grau de conservação desta classe, quando comparado com outras famílias de genes. Um total de 39 genes dos 49 encontrados em M. bovis foram identificados em M. leprae . Definimos um grupo bem conservado de 38 genes que codificam para proteases, compartilhadas pelas quatro espécies. Este conjunto é provavelmente essencial para a sobrevivência no hospedeiro e para o desenvolvimento da doença, podendo representar um relevante alvo para o desenvolvimento de drogas que resultem em um melhor controle das doenças provocadas por micobactérias. Cinco destes genes, três codificando para putativas proteases secretadas, foram então selecionados a fim de investigarmos sua expressão em M. leprae isolado de biópsias de tecido epitelial de pacientes com a forma multibacilar da hanseníase. Através da técnica de RT-PCR, demonstramos que mycP1 , htrA2 , htrA4 , gcp e clpC foram expressos durante o curso da infecção humana, sugerindo seu envolvimento na patogênese. Adicionalmente, a expressão de Gcp nas lesões de pacientes com hanseníase foi confirmada por imunohistoquímica utilizando anticorpo produzido contra esta proteína. Esta observação reforça o potencial papel das proteases de micobactérias no contexto da hanseníase. Finalmente, selecionamos a protease HtrA2 de M. leprae para caracterizar as propriedades bioquímicas desta enzima. As proteínas HtrA têm sido relacionadas com a patogênese ocasionada por diversas bactérias, no entanto, pouca informação existe acerca destas proteases em micobactérias. A HtrA2 partilha 70% de identidade com a Rv0983, uma proteína secretada pelo M. tuberculosis , e previamente identificada em bactérias cultivadas em meio axenico. Produzimos a forma recombinante da HtrA2 e a sua atividade enzimática foi analisada utilizando um conjunto de peptídeos sintéticos com fluorescência apagada (FRET). A HtrA2 recombinante de M. leprae mostrou atividade proteolítica contra tais peptídeos revelando uma especificidade de clivagem após resíduos básicos e atividade máxima em temperaturas superiores a 40 °C. Esta especificidade difere da descrita para DegP e DegS, enzimas homólogas em Escherichia coli que clivam preferencialmente após resíduos hidrofóbicos. Em conjunto, esses resultados demonstram que o M. leprae produz in vivo uma protease da família HtrA e indica esta proteína como potencial alvo para intervenções profiláticas e terapêuticas nas doenças provocadas por micobactérias.

ABSTRACT

GUIMARÃES, Michelle Lopes Ribeiro. Estudo das proteases de micobactérias: clonagem, expressão e caracterização da protease recombinante HtrA2 produzida in vivo pelo Mycobacterium leprae . Rio de Janeiro, 2007. Tese (Doutorado em Química Biológica) - Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007.

Although proteases are recognized as important virulent factors in pathogenic microorganisms, little information is available so far regarding the potential role of these in diseases caused by mycobacteria. Here we use bioinformatic tools to compare the protease-coding genes present in the of Mycobacterium leprae , Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium bovis and Mycobacterium avium paratuberculosis . This analysis allowed a review of the nomenclature of the protease families present in mycobacteria. A special attention was devoted to the `decaying genome` of M. leprae where a relatively high level of conservation of protease-coding genes was observed when compared to other genes families. A total of 39 genes out of the 49 found in M. bovis were identified in M. leprae . Of relevance, a core of well-conserved 38 protease genes shared by the four species was defined. This set of proteases is probably essential for survival in the host and disease outcome and may constitute novel targets for drug development leading to a more effective control of mycobacterial diseases. Five of these genes, three coding for putative secreted proteases, were then selected to investigate their expression in M. leprae isolated from skin biopsies of multibacillary leprosy patients. Via nested-PCR, it was demonstrated that mycP1 , htrA2 , htrA4 , gcp and clpC were expressed in vivo during the course of human infection, suggesting their involvement in leprosy pathogenesis. Moreover, the expression of Gcp in leprosy lesions was further confirmed by imunohistochemistry using a specific hyperimmune serum. This observation reinforces the potential role of mycobacterial proteases in the context of leprosy pathogenesis. Finally we obtained the recombinant HtrA2 protease of M. leprae for further enzymatic characterization. HtrA proteins have been shown to play a role in bacterial pathogenesis, but the mycobacterial counterparts have not been studied. M. leprae HtrA2 shares 70 % identity with Rv0983, a protein secreted by M. tuberculosis , and previously identified in conditioned medium of grown in axenic medium. The recombinant HtrA2 protein was produced and its enzymatic activity analyzed using a collection of fluorescence resonance energy transfer (FRET) synthetic peptides. The M. leprae recombinant HtrA2 displayed proteolytic activity toward the FRET peptides, revealing a specificity of cleavage after Arg residues and maximum activity at temperatures over 40 °C. Together, our data demonstrate that M. leprae produces in vivo an HtrA2 like- protease, and indicates this protein as a new potential target for prophylaxis and therapeutic interventions in mycobacterial diseases.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura Página

Figura 1: Mapa mostrando a distribuição da hanseníase no mundo em 2005. 4

Figura 2: Espectro clínico da hanseníase. 6

Figura 3: Esquema da parede celular de micobactérias. 9

Figura 4: Árvore filogenética para o gênero Mycobacterium . 13

Figura 5: Nomenclatura para descrever a interação do substrato com a protease. 17

Figura 6: Estrutura do sítio S1 da tripsina com um resíduo de lisina ligado a 19 cadeia.

Figura 7: Organização dos domínios moleculares dos membros da família HtrA. 21

Figura 8: Esquema da ativação das DegS. 22

Figura 9: Modelo anêmona para o mecanismo de ativação das HtrAs. 23

Figura 10: Regulação do promotor do gene degP em E. coli . 25

LISTA DE TABELAS

Tabela Página

Tabela 1: Análise das características gerais dos genomas. 12

Tabela 2: Clãs de serina proteases. 19

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

% - Porcentagem.

µg/mL - Microgramas por mililitro.

µg – Micrograma.

µL – Microlitro.

µM – Micromolar.

0C Grau Celsius.

A Adenosina.

BAAR Bacilo álcool ácido resistente.

BCG Bacilo de Calmette-Guérin.

BSA Albumina sérica bovina.

C Citidina.

cDNA DNA complementar.

CDS Seqüência codificante.

Degs Proteases que degradam proteínas mal formadas.

DFP Diisopropilfluorofosfato.

DNA Ácido desoxirribonuclêico.

dNTP Desoxirribonucleotídeos (N= A, C, G ou T).

eV Elétron volt.

FRET “fluorescence resonance energy transfer”.

g Grama (s).

G Guanosina.

g/L - Gramas por litro.

h - Hora. HCl - Ácido clorídrico.

HtrAs Proteases com requerimento de elevadas tempetraturas para

sua atividade.

IB Índice baciloscópico.

IPTG Isopropil-D-galactosídeo. kb Quilobases – 1 kb = 1 000 bases nucleotídicas. kDa Quilodaltons – 1 kDa = 1 000 Daltons.

LAM Lipoarabinomanana.

LB Lura-Bertani – meio para cultura bacteriana.

LM Lipomanana.

M - Molar.

MAC Complexo Mycobacterium avium .

MCA Metilcoumarina. mg Miligramas. min. Minuto (s). mL - Mililitro. mm Milímetros. mM - Milimolar. ng Nanogramas. nm Nanometros.

OMS Organização Mundial de Saúde.

PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida. pb - Par (es) de base (s).

PBS Tampão fosfato salino.

PCR Reação da polimerase em cadeia. PDIM Fiotiocerol dimicocerosato.

PDZ Proteína densa pós-sináptica.

PGL-1 Glicolipídeo fenólico 1.

PIM Fosfatidilinositol manosídeo.

PMSF Fenilmetilsulfonil fluorido.

PQT Poliquiomioterapia. rHtrAs Forma recombinante da protease com requerimento de

elevadas tempetraturas para sua atividade.

RNA Ácido ribonucleíco.

RNAm Molécula de RNA mensageiro.

RNAr Molécula de RNA ribossômico.

Rv0000 Código de duas letras e quatro números para a cepa H37Rv

de Mycobacterium tuberculosis .

RT Transcriptase reversa. s Segundo (s).

SDS - Dodecil-sulfato de sódio.

T Timidina.

TBS Tampão Tris salina.

TBS/T Tween.

TMM Trealose monomicolato.

Tris - Trishidroximetilamino metano.

U Unidade.

V Volts.

X g - Velocidade de sedimentação em unidade gravitacional.

LISTA DE TRÊS E UMA LETRAS PARA OS AMINOÁCIDOS

Aminoácido Código de três letras Código de uma letra

Alanina Ala A

Arginina Arg R

Asparagina Asn N

Ácido aspártico Asp D

Ácido Glutâmico Glu E

Cisteína Cys C

Fenilalanina Phe F

Glicina Gly G

Glutamina Gln Q

Histidina His H

Isoleucina Ile I

Leucina Leu L

Lisina Lys K

Metionina Met M

Prolina Pro P

Serina Ser S

Tirosina Tyr Y

Treonina Thr T

Triptofano Trp W

Valina Val V

SUMÁRIO

1 Introdução 1

1.1 O gênero Mycobacterium 1

1.2 Epidemiologia das Micobactérias 2

1.3 Hanseníase 4

1.4 Características do Mycobacterium leprae 7

1.5 Genômica comparativa 10

1.6 Papel de proteases bacterianas na interação patógeno-hospedeiro 13

1.7 As famílias de proteases 15

1.8 Serina-proteases 17

1.9 A família das proteases com requerimento de elevadas 20 temperaturas, tipo A (HtrAs)

1.9.1 Regulação da atividade das HtrAs 23

2 Objetivos 27

2.1 Objetivo geral 27

2.2 Objetivos específicos 27

3 Resultados 29

Manuscrito 1 31

Manuscrito 2 33

Manuscrito 3 35

4 Discussão 37

5 Conclusão 49

6 Referência 52

7. Apêndice 62

Estudo das proteases de micobactérias 1

1 Introdução

1.1 O gênero Mycobacterium

O gênero Mycobacterium inclui mais de 70 espécies, a maioria saprófitas de vida livre e apenas uma pequena proporção destas bactérias causam doenças crônicas em humanos e animais. Juntamente com os gêneros Corynebacterium, Nocardia e Rhodococcus pertencem à ordem dos Actinomycetales e família Mycobacteriacea, tendo em comum o fato de serem bactérias aeróbicas com a parede celular rica em ácidos micólicos, Gram-positivas, álcool-

ácido resistentes e não formarem esporos (VAN SOOLINGEN, 2001).

Doenças como a tuberculose, a lepra, e uma gama de infecções oportunistas provocadas por diversas espécies de micobactérias são consideradas extremamente importantes no cenário da saúde pública mundial. Indivíduos imunodeprimidos podem ser acometidos por infecções causadas por micobactérias oportunistas como o Mycobacterium avium e Mycobacterium intracellulare integrantes do complexo Mycobacterium avium

(MAC). Estas infecções são difíceis de controlar devido à resistência natural destas espécies aos antibióticos que são eficientes contra Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae (BIET, et al., 2005).

A tuberculose em humanos é causada principalmente pelo M. tuberculosis , no entanto, o Mycobacterium bovis , agente etiológico da tuberculose bovina também pode ser responsável pela doença. Dentre as medidas de combate às infecções micobacterianas estão à vacinação com BCG (cepa atenuada do M. bovis ) para controle da tuberculose e tratamento com coquetéis antibióticos, medidas comuns a todas as infecções micobacterianas. Em 1921, Estudo das proteases de micobactérias 2

a vacina BCG passou a ser administrada na França onde se mostrou extremamente eficiente, reduzindo em 90% a mortalidade em crianças. A utilização desta vacina então, foi difundida mundialmente e apesar do sucesso inicial, a vacinação com BCG não foi capaz de eliminar a epidemia de tuberculose no mundo (DOHERTY & ANDERSEN, 2005). O mesmo cenário pode ser visualizado para o tratamento com a utilização de antibióticos. Diante desse panorama de insucesso, torna-se evidente a necessidade em desenvolver ferramentas para o controle da dispersão destas doenças, ou mesmo formas terapêuticas mais eficientes.

1.2 Epidemiologia das Micobacterioses

Doenças como a tuberculose e a hanseníase são responsáveis por milhões de casos novos detectados anualmente. A tuberculose é uma doença infecciosa crônica. O M. tuberculosis inicialmente replica-se dentro das células do trato respiratório superior e depois nos macrófagos alveolares de onde ocorre a sua disseminação. Uma vez que o sistema imune inicie a resposta à infecção, as bactérias passam a se acumular em regiões restritas, os granulomas. A tuberculose é uma doença rica em paradoxos, foi a primeira para a qual houve vacina desenvolvida, além da disponibilidade de antibióticos efetivos contra a infecção desde a metade do século. Tais medidas não foram suficientes para deter o status de grande número de mortes ocasionadas pelo M. tuberculosis . Estima-se que anualmente provoque 2 - 3 milhões de mortes entre indivíduos com idade entre 15 - 49 anos e que nos próximos 20 anos, um terço da população estará infectada com o M. tuberculosis e aproximadamente 200 milhões de indivíduos terão risco de desenvolver a doença. O impacto da severidade da doença tem aumentado em parte pela epidemia de HIV. Estatisticamente a elevação da Estudo das proteases de micobactérias 3

mortalidade pelo vírus HIV torna-se acentuada em casos de co-infecção com o M. tuberculosis . Outro ponto relevante é resistência deste microorganismo às drogas utilizadas em seu tratamento (GARCÍA, et al., 2005). Tal resistência é causada pela inexistência ou pela interrupção do tratamento dos indivíduos acometidos

(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/index.html).

A hanseníase é considerada uma das mais antigas doenças que acomete o homem. As referências mais remotas datam de 600 A.C e procedem da Índia, que, juntamente com a África, podem ser consideradas o berço da doença. Como pode ser observado na Figura 1, os países mais atingidos pela doença se encontram no sudoeste da

Ásia, América do Sul e África. Dentre os países representantes das Américas, o Brasil é o que apresenta maior número de casos com 38.410 em 2005 com uma taxa de prevalência de

30.7 por 10.000 indivíduos. Seguido pela República do Congo com 20.737 casos e prevalência de 10.5 por 10.000 indivíduos (www.who.int/lep) .

Diferentemente da taxa de prevalência que vem drasticamente decaindo desde 1985 com a implementação pela Organização Mundial de Saúde (OMS) da poliquimioterapia

(PQT), o número de casos novos detectados anualmente permanece elevado. Em 2005,

296.499 casos novos de hanseníase foram detectados contra 407.791 em 2004 e 514.718 em

2003. Esta persistência na taxa de incidência da doença, apesar da implementação maciça da

PQT nos países endêmicos, pode ser atribuída a vários fatores, tais como a intensidade na busca de novos casos, a alta transmissão em certas áreas proveniente de indivíduos assintomáticos transmissores, ou a recidiva de casos previamente tratados (www.who.int/lep) .

Estudo das proteases de micobactérias 4

Figura 1 - Mapa mostrando a distribuição da hanseníase no mundo em 2005. (http://www.who.int/lep/situation/en/)

1.3 Hanseníase

A hanseníase ou lepra é uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae que afeta principalmente a pele e o sistema nervoso periférico. Esta enfermidade dificilmente leva à morte, mas constitui a principal causa de neuropatia periférica infecciosa.

As deformidades e incapacidade físicas presentes em aproximadamente 30% dos indivíduos afetados são responsáveis pelo forte estigma observado contra a doença até os dias atuais.

A via de transmissão da hanseníase não está totalmente esclarecida, mas acredita-se que a via respiratória seja a mais provável, ainda que a infecção através de lesão na pele permaneça uma possibilidade. O trato respiratório superior dos pacientes multibacilares é a principal fonte de M. leprae encontrada no meio ambiente. O tempo de incubação varia de 2 Estudo das proteases de micobactérias 5

a 5 anos. Os tecidos primariamente infectados pelo M. leprae são usualmente os sítios superficiais da pele e nervos devido à preferência deste por temperaturas mais baixas.

Entretanto órgãos internos também podem ser infectados nas formas disseminadas da doença

(revisto por VIDAL PESSOLANI, et al., 2003).

A severidade e patologia da hanseníase dependem da imunidade do indivíduo infectado e foi descrita por Ridley e Jopling como um espectro contínuo de estados da doença

(RIDLEY & JOPLING, 1966) (Figura 2). Em um polo do espectro encontramos pacientes com vigorosa resposta celular, mediada por células T (tipo Th1) que exibem a forma clínica tuberculóide (TT), uma doença localizada, com poucos bacilos e lesões limitadas. No outro polo observa-se uma resposta celular pobre e forte resposta humoral (anticorpos anti-M. leprae ) manifestando a forma clínica lepromatosa (LL). Este polo reflete extrema suscetibilidade ao M. leprae , no qual a proliferação disseminada do bacilo (em torno de 10 10 por grama de tecido) resulta em lesões de pele difusamente distribuídas. Borderline tuberculoíde (BT), borderline-borderline (BB) e borderline lepromatoso (BL) são considerados estados intermediários entre os dois polos, onde a progressiva redução da resposta imune mediada por célula é acompanhada por lesões de pele e nervos mais numerosas, aumento da carga bacilar e dos níveis de anticorpos. Alterações na imunidade ou a própria terapia podem acarretar mudança no espectro da doença. O dano neural ocorre na maioria dos pacientes e em todas as formas clínicas da doença (GANAPATI & REVANKAR,

1989), sendo, contudo mais severa em pacientes TT e BT do que em pacientes LL. Na forma

TT os nervos sensores abaixo da pele são afetados, resultando na perda da sensação a estímulos como o toque e calor, enquanto que os danos nos nervos motores levam a perda da função muscular (paralisias) na forma LL. Perda dos dedos das mãos e pés e desfigurações, característica presente nos pacientes com hanseníase, são devido à osteoporose, inflamação, trauma e infecções bacterianas secundárias. A lesão neurológica na hanseníase é Estudo das proteases de micobactérias 6

principalmente agravada pela ocorrência de episódios de inflamação aguda que ocorrem antes, durante ou mesmo após o término da PQT. Estes são chamados de reação reversa (RR) ou do tipo I e eritema nodoso leproso (ENL) ou reação do tipo II. Os fatores que desencadeiam as reações ainda não são conhecidos e o tratamento das mesmas se faz com corticoides e talidomida. Nos piores casos de doentes não tratados, a inflamação causa necrose dos nervos e paralisias irreversíveis.

Figura 2 – Espectro clínico da hanseníase. A imunidade mediada por células, medida pelo teste de Mitsuda, é inversamente proporcional à carga bacilar, medida pelo índice baciloscópico (IB). TT- forma polar (estável); LL – forma polar Virchowiana ou lepromatosa (estável), BT, BB e BL – grupo Borderline (instável). (Adaptado de HARBOE, 1985).

Quando diagnosticada e tratada precocemente a hanseníase é uma doença que não deixa seqüelas neurológicas. A utilização de quimioterápicos no tratamento da hanseníase remonta do século VI, com a utilização na Birmânia do óleo de hydnocarpus, difundindo-se esta prática por toda a Europa no século passado. A partir da década de 40, a monoterapia com sulfonas foi adotada, causando um grande impacto no tratamento da doença. O surgimento de casos sulfono resistentes, a persistência bacilar e o abandono ao tratamento devido a sua longa duração levaram a OMS a recomendar em 1982 um tratamento Estudo das proteases de micobactérias 7

poliquimioterápico (PQT) baseado na associação das drogas dapsona, rifampicina e clofazemina. O tratamento para os pacientes multibacilares (formas LL e BL) tem duração de

12 meses com administração mensal de rifampicina (600 mg) e clofazamina (300 mg) e diária de dapsona (100 mg) e clofazamina (50 mg). Para os pacientes paucibacilares (formas TT,

BT e BB) o tratamento tem duração de 6 meses com administração mensal de rifampicina e diária de dapsona (OMS, 1982). Este regime de tratamento é utilizado com bastante eficácia.

As enzimas alvo para rifampicina e dapsona são a sub-unidade β da enzima RNA polimerase e di-hidropteroato sintase (folP1), respectivamente. O alvo da clofazamina ainda não foi determinado, mas pode estar ligado ao metabolismo dos ácidos nucléicos (WINDER, 1982).

A PQT tem obtido sucesso na redução da taxa de prevalência na situação global da hanseníase de 12 casos por 10.000 indivíduos em 1985 para pouco mais de 1 caso por 10.000 no fim de

2000. O número de casos registrados tem declinado de 5.351.408 casos em 1985 para

298.626 em 2005. Contudo, permanece o incentivo para a busca de novas drogas que causem menos efeitos colaterais e que permitam um tratamento de mais curta duração.

1.4 Características do Mycobacterium leprae

O M. leprae foi o primeiro microorganismo a ser identificado como agente etiológico de uma doença humana por Gerhard Amauer Hansen, em 1873. O bacilo de Hansen, como também é chamado, é um patógeno intracelular obrigatório não cultivável in vitro até os dias atuais. No seu hospedeiro natural, o homem, é encontrado preferencialmente em células do sistema de fagócitos mononucleares e células de Schwann (CS) do nervo periférico onde se multiplica muito lentamente com um tempo de geração estimado em 14 dias. Estudo das proteases de micobactérias 8

A morfologia do M. leprae é de um bastonete reto ou ligeiramente encurvado, de 1,5 a

8 micra de comprimento por 0,2 a 0,5 micra de largura. Cora-se de vermelho pela fucsina e não se descora pela lavagem com solução álcool-ácida, sendo, portanto, um bacilo álcool-

ácido resistente (BAAR). É considerado Gram-positivo quando corado pelo método de Gram.

Nos esfregaços de pele e nos cortes histopatológicos os bacilos são vistos isolados ou em agrupamentos com tamanhos variados (RESS, 1985). À semelhança das outras micobactérias, o M. leprae , apresenta um envoltório de composição muito singular, rico em lipídios complexos e distintos daqueles normalmente observados em outras bactérias Gram- positivas e Gram-negativas. Os lipídios mais característicos do seu envelope celular são

ácidos graxos de 60 a 90 átomos de carbono, também denominados de ácidos micólicos

Figura 3. Muitas das propriedades relativas à virulência e à sobrevivência do M. leprae dentro da célula hospedeira parecem estar associadas à estrutura peculiar do seu envelope.

Além disso, este envoltório é responsável pela baixa permeabilidade e consequentemente grande resistência a agentes terapêuticos normalmente eficazes contra outras bactérias

(BRENNAN & NAKAIDO, 1995).

Estudo das proteases de micobactérias 9

Figura 3 – Esquema da parede celular de micobactérias. A membrana plasmática é coberta por uma parede celular feita de peptídeoglicana covalentemente ligada a galactana. Três cadeias de arabinana estão ligadas a galactana. A camada de peptídeoglicana-arabinogalactana forma a zona eletro-densa. Ácidos micólicos são ligados a região terminal da cadeia arabinana. A camada exterior é formada por ácidos micólicos e micoserosóicos de fitiocerol dimicocerosato (PDIMs) e glicolipídeo fenólico (PGLs) como indicado na figura. Esta pseudo-bicamada forma a zona eletro-transparente. A cápsula é composta de PGLs e outras moléculas como PDIMs, fosfatidilinositol manosídeo (PIMs) e fosfolipídeos, que envolvem a bactéria (VISSA & BRENNAN, 2001).

Até pouco tempo acreditava-se que o homem era o único hospedeiro natural do M. leprae . Sua multiplicação em outro mamífero foi conseguida pela primeira vez por Shepard, em 1960 após inoculação no coxim plantar de camundongos Balb/c, observando-se uma lesão localizada de hanseníase que regredia após o bacilo atingir o número de um milhão de células bacterianas na lesão. O mesmo autor mostrou posteriormente que camundongos timectomizados apresentavam uma infecção generalizada quando inoculados com M. leprae

(SHEPARD, 1962). Em 1971, Kirchheimer & Storrs demonstraram a ocorrência de tatus naturalmente infectados capturados no Estado da Louisiana nos Estados Unidos da América. Estudo das proteases de micobactérias 10

Estes tatus, da espécie Dasypus novemcinctus , apresentavam uma forma disseminada da doença com comprometimento de pele, medula óssea, fígado, baço, linfonodos, pulmões, meninges e olhos. A partir desta descoberta, estes animais vem sendo mantidos em cativeiro para inoculação experimental de M. leprae , representando as principais fontes de bactéria para estudos bioquímicos e imunológicos. Além do tatu de nove bandas, somente macacos mangabei e chimpanzés foram encontrados naturalmente infectados com o M. leprae (revisto por VIDAL PESSOLANI, et al., 2003).

Os mecanismos que permitem ao M. leprae infectar o homem e causar doença ainda são pouco conhecidos. Os principais fatores que tem dificultado este entendimento são a incapacidade de cultivo in vitro do bacilo e a ausência de um modelo que mimetize a doença humana.

1.5 Genômica comparativa

Desde que o primeiro genoma procariótico foi finalizado, o número de projetos para sequenciamento de genomas de micobactérias vem crescendo constantemente. Atualmente existem 13 genomas completamente seqüenciados e outros 8 estão em progresso. Dentro deste cenário, as micobactérias patogênicas foram as primeiras a serem seqüenciadas, sendo assim, o genoma do M. tuberculosis foi finalizado em 1998 (COLE, et al., 1998; CAMUS, et al ., 2002) e do M. leprae em 2001 (COLE, et al. , 2001). A comparação entre genomas proporciona um melhor entendimento da biologia destas espécies quanto às características bioquímicas, genéticas, fisiológicas e uma melhor compreensão sobre os mecanismos patogênicos. Dentre as características mais marcantes encontradas, ressaltamos a extensiva Estudo das proteases de micobactérias 11

deleção e inativação de genes observada no cromossomo do bacilo de hansen, um processo denominado – evolução por redução, o que resultou no menor genoma dentre as micobactérias (ANDERSSON & ANDERSSON, 1999; VISSA & BRENNAN, 2001;

MARRI, et al., 2006). Acredita-se que esta perda se deva ao ambiente extremamente estável, rico em metabólitos, e que, portanto exige pouca versatilidade metabólica para a sobrevivência do bacilo. Esta característica poderia explicar a taxa de crescimento lenta, assim como a incapacidade M. leprae de crescer in vitro . Somente 49.5% do genoma do M. leprae contém genes que codificam para proteínas, característica não observada em nenhum outro genoma bacteriano até hoje seqüenciado. O genoma do M. leprae contém 1.116 pseudogenes ou genes degenerados, assim denominados devido à perda de regiões necessárias para sua transcrição e/ou tradução. Uma análise funcional dos genes preservados em M. leprae revela a integridade da maioria das vias anabólicas, mas deleções em algumas vias catabólicas essenciais. Os genes perdidos na maioria dos casos constituem cópias de enzimas essenciais presentes em duplicidade (isoenzimas) em M. tuberculosis cujo genoma apresenta uma grande redundância. Acredita-se que o genoma degenerado do M. leprae seja resultado de erros na replicação combinado a uma redução na capacidade de reparo do DNA (revisto por VISSA & BRENNAN, 2002). Estes processos provocariam um acúmulo de mutações em genes não mais essenciais para sobrevivência no ambiente intracelular. Este mecanismo altera permanentemente o genótipo e resulta na adaptação ao ambiente em que a bactéria vive

(DOBRINDT & HACKER, 2001) . A tabela 1 mostra a análise das características gerais dos genomas das principais micobactérias patogênicas: M. leprae (COLE, et al., 2001), M. tuberculosis H37Rv (COLE, et al., 1998; CAMUS, et al., 2002), M. bovis AF2122

(GARNIER, et al., 2003) e M. avium paratuberculosis str. K.10 (LINGLING, et al., 2005). A característica comum a todas as micobactérias, é seu elevado percentual de GC no DNA.

Estudo das proteases de micobactérias 12

Tabela 1 – Análise das características gerais dos genomas

Característica M. leprae M. tuberculosis M. bovis M. avium

H37Rv AF2122 paratuberculosis str. k10

Tamanho do Genoma (MB) 3.27 4.41 4.35 4.83

Conteúdo GC (%) 57.79 65.61 65.63 69.30

Proteínas codificadas (%) 49.50 90.80 90.59 91.30

Genes (no.) 1.604 3.959 3.951 4.539

Pseudogenes 1.116 6 ~ 20 none

A definição das moléculas envolvidas no processo de patogênese de micobactérias poderá nos auxiliar no controle ou mesmo na profilaxia destas doenças. A análise filogenética baseada na região 16s do RNA ribossômico revela que a distância evolutiva existente entre M. leprae e o M. avium paratuberculosis é menor que a observada entre este e as outras micobactérias patogênicas (Figura 4), sugerindo uma explicação para as diferenças nas formas de infecção, colonização e sobrevivência nos respectivos hospedeiros.

Estudo das proteases de micobactérias 13

M. smegmatis

M. marinum

M. bovis BCG

M. paratuberculosis M. avium

Figura 4 – Árvore filogenética para o gênero Mycobacterium . Baseada na seqüência do RNAr 16s. Em verde, estão representadas as espécies que na finalização deste trabalho tinham o sequenciamento do genoma em progresso. Em vermelho, estão representados os genomas já finalizados. (Adaptado de BROSCH, et al ., 2001).

1.6 Papel de proteases bacterianas na interação patógeno-hospedeiro

Os microorganismos patogênicos expressam uma variedade de moléculas que permitem sua sobrevivência e multiplicação no hospedeiro. Dentre os fatores de virulência mais difundidos, as proteases têm sido implicadas na patogênese de variadas doenças causadas por microorganismos. As peptidases bacterianas são predominantemente extracelulares e foram primeiramente consideradas como enzimas importantes para a aquisição de nutrientes pelo patógeno através da degradação de moléculas do hospedeiro

(revisado por TRAVIS, et al ., 1995). Estudo das proteases de micobactérias 14

Proteases exercem um importante papel na regulação dos níveis de muitas proteínas intracelulares. A proteólise é requerida nos processos de secreção e degradação de proteínas mal enoveladas e na sobrevivência em condições de estresse, como a exposição a altas temperaturas ou privação de nutrientes (WALLER & SAUER, 1996). Apresentam, contudo, características bioquímicas e funcionais diferentes daquelas oriundas do hospedeiro. As peptidases virais e bacterianas são, por exemplo, insensíveis aos inibidores de proteases presentes em abundância no plasma e tecidos de mamíferos, sendo esta uma propriedade da maior relevância na sua atuação como fatores de virulência. Por diferirem das enzimas do hospedeiro, as proteases de microorganismos patogênicos constituem bons alvos para o desenvolvimento de drogas alternativas para o tratamento de doenças infecciosas (TRAVIS &

POTEMPA, 2000). Um exemplo clássico constitui o tratamento da AIDS na qual a utilização de inibidores sintéticos de proteases virais vem proporcionando excelentes resultados terapêuticos.

A maioria das evidências relatadas implicando proteases microbianas como fatores de virulência derivam de estudos que sugerem que mutantes deficientes de proteases são menos virulentos nos modelos de infecções animais que as cepas selvagens. Dados da literatura indicam que estas enzimas podem contribuir para a patogênese das doenças infecciosas através de diversos mecanismos. Proteases microbianas podem, assim, atuar: 1)- Inativando inibidores de proteases ou ativando pro-enzimas do hospedeiro, como por exemplo as prometaloproteinases, estimulando a degradação indireta de moléculas da matriz extracelular;

2)- Degradando diretamente componentes da matriz extracelular; 3)- Desregulando o sistema imune; 4)- Desregulando cascatas de proteases do hospedeiro tais como o sistema calicreína/cinina, sistema complemento, a cascata de coagulação e a cascata fibrinolítica

(TRAVIS, et al., 1995). A literatura apresenta um destaque crescente para o envolvimento de proteases com função relevante na patogenicidade de microorganismos intracelulares, como Estudo das proteases de micobactérias 15

por exemplo, os gêneros: Yersinia (WILLIAMS, et al., 2000; HEUSIPP, et al., 2006),

Streptococcus (IBRAHIM, et al ., 2004; LYON & CAPARON, 2004; BIWAS & BIWAS,

2005), Chlamydia (SHAW, et al., 2002; SHARMA, et al ., 2005; MURTHY, et al ., 2006) e nas espécies: Legionella pneumophyla (PEDERSEN, et al., 2001), Vibrio cholerae (BEHARI, et al ., 2001), Listeria monocytogenes (WONDERLING, et al ., 2004; STACK, et al ., 2005) e

Campylobacter jejuni (BRONDSTED, et al ., 2005) .

1.7 As famílias de proteases

As proteases, peptidases, proteinases ou hidrolases são enzimas que clivam ligações peptídicas. A classificação das proteases é feita de acordo com três principais critérios: (1) a reação que catalizam, (2) a natureza química do sítio catalítico e (3) a relação evolutiva baseada nas estruturas tridimensionais. De acordo com estes três critérios, as proteases podem ser divididas em famílias que são agrupadas de acordo com o tipo catalítico da enzima representado por uma letra maiúscula, assim: A, aspártico; C, cisteína; G , ácido glutâmico;

M, metalo; S, serina; T, treonina e U, desconhecido. Considerando ainda a divisão em famílias, podem ser classificadas em ou . As exopeptidases clivam as ligações peptídicas nas extremidades amino ou carboxi terminal do substrato. As endopeptidases, por outro lado, clivam as regiões internas do substrato. Outra divisão aceita é o agrupamento em clãs, que são formados por grupos de famílias para as quais existem evidências de parentesco. Um clã que contém mais de um tipo de família é descrito com a inicial P (RAWLINGS, et al., 2006). Estudo das proteases de micobactérias 16

O mecanismo de catálise das cisteínas e serinas peptidases é muito semelhante. O resíduo de cisteína é ativado pela histidina, exercendo o papel de nucleófilo que ataca a ligação peptídica, modo semelhante ao resíduo de serina nas serina proteases. No caso das aspartil proteases a característica principal é que o sítio ativo é formado por um par de resíduos de ácido aspártico que atuam em conjunto para permitir que a molécula de água ataque a ligação peptídica. As metaloproteases contêm um íon metálico ligado, em sua maioria zinco, que ativa a molécula de água atuando então como o nucleófilo para atacar o grupo carbonil do peptídeo. As glutamil proteases também têm a molécula de água atuando como nucleófilo durante seu mecanismo de catálise (RAWLINGS, et al., 2006).

Na descrição da especificidade de uma peptidase utiliza-se um modelo em que o sítio catalítico é flanqueado por um ou nos dois lados por subsítios específicos, cada um capaz de acomodar a cadeia lateral de um único resíduo de aminoácido. Estes sítios são numerados

S1....S n em direção a porção N-terminal da enzima e S1’....S n’ em direção à porção C- terminal. Os resíduos do substrato são numerados P1....P n em direção à porção N-terminal e

P1’....P n’ em direção à porção C-terminal, como indicado na Figura 5 (SCHECHTER &

BERGER, 1967).

Estudo das proteases de micobactérias 17

Sítio de Clivagem

+ - H3N COO

P4 P3 P2 P1 P’1 P’2 P’3

S4 S3 S2 S1 S’1 S’2 S’3

Figura 5 – Nomenclatura para descrever a interação do substrato com a protease. Neste sistema, é considerado que os resíduos de aminoácidos da cadeia polipeptídica do substrato se ligam ao subsítios do sítio ativo da enzima. Por convenção, os subsítios da protease são chamados S e os resíduos de aminoácido do substrato são chamados P. Os resíduos de aminoácido voltados para a região N-terminal até o ponto de hidrólise da ligação peptídica são numerados Pn....P1 e os resíduos voltados para o lado C-terminal são numerados P1’....P n’ . Os subsítios da protease são numerados de forma complementar aos sítios de ligação para o substrato e são numerados: S1....S n em direção a região N-terminal da protease e S1’....S n’ em direção a sua porção C-terminal (SCHECHTER & BERGER, 1967).

1.8 Serina-proteases

As enzimas proteolíticas que utilizam resíduos de serina na atividade catalítica têm distribuição ubíqua. Existem mais de vinte famílias destas enzimas que são agrupadas em clãs, conforme indicado na tabela 2. Embora com diferentes origens evolutivas, existem similaridades quanto ao seu mecanismo de ação. As quimiotripsinas, subtilisinas e carboxipeptidases possuem em comum a tríade catalítica formada por resíduos de Serina, aspartato e histidina, onde a serina atua como o nucleófilo, o aspartato como eletrófilo e a histidina como a base (ver figura 6). O arranjo linear dos resíduos que participam da tríade catalítica sofre alteração dentro dos clãs (ver tabela 2). Considerando por exemplo a estrutura Estudo das proteases de micobactérias 18

do sítio S1 de especificidade de peptidases com enovelamento semelhante à tripsina, é possível observar que possuem uma fenda catalítica tendo em sua base o resíduo de Asp. As paredes da bolsa são formadas por três folhas-beta conectadas por duas pontes Cys. A especificidade é usualmente determinada pelos resíduos das posições 189, 216 e 226. A especificidade de hidrólise das peptidases está correlacionada com a hidrofobicidade do resíduo P1. Asp189, Gly216 e Gly226 criam uma carga negativa no sítio S1 que torna as peptidases semelhantes à quimiotripsina altamente específicas para substratos com resíduos de Arg ou Lys na posição P1 (HUBER & BODE, 1978; BARRETT & RAWLINGS, 1995;

PERONA & CRAIK, 1995; PERONA & CRAIK, 1997; HEDSTROM, 2002).

Outra semelhança apresentada pelo grupo é a inibição da atividade catalítica por diisopropilfluorofosfato (DFP). As proteases semelhantes à quimiotripsina estão envolvidas em muitos processos fisiológicos, incluindo a digestão, homeostase, apoptose, transdução de sinal, reprodução e na resposta imune. Participam da cascata de coagulação sanguínea, fixação de complemento, fibrinólise e no desenvolvimento, modelagem e diferenciação da matriz extracelular. Com tamanha diversidade de funções, as generalizações acerca deste grupo devem ser feitas com cautela.

Estudo das proteases de micobactérias 19

Tabela 2 - Clãs de serina proteases

Clã Exemplos Resíduos Distribuição Catalíticos Tríade Catalítica “Clássica” PA(S) Quimiotripsina His-Asp-Ser B,Ar,F,Pl,An,V SB Subtilisina Asp-His-Ser B,Ar,Pr,F,Pl,An,V SC Carboxipeptidase Y Ser-Asp-His B,Ar,Pr,F,Pl,An SK Protease Clp Ser-His-Asp B,Ar,Pr,F,Pl,An,V “Novas” Serina Proteases SE D-Ala-D-Ala carboxipeptidase A Ser-Lys B,Ar,Pl,An SF Peptidase sinal I Ser-Lys/His B,Ar,F,Pl,An,V SH Citomegalovirus assemblina His-Ser-His V SM “C-terminal processing protease-I” Ser-Lys B,Ar,Pl SN E Ser-His-Glu B,An PB(S) Precursor amidohidrolase penicilina Ser N-terminal B,Ar,Pr

Legenda: B, bactéria; Ar, arquea; Pr, protozoários; F, fungos; Pl, plantas; An, animais; V, vírus. (HEDSTROM, 2002)

Cys191

Ser190 Gly216

Cys220 Asp189 Tyr172

Figura 6 - Estrutura do sítio S1 da tripsina com um resíduo de lisina ligado a cadeia (representado em verde). Os resíduos em evidência representam: Ser 195 , His 57 e Asp 102 (representado em vermelho), os aminoácidos chave (azul) e os elementos estruturais distais (folhas vermelhas), que determinam a especificidade ao substrato e consistem dos resíduos 169-175, 184-195 e 213-228 (PERONA & CRAIK, 1995).

Estudo das proteases de micobactérias 20

1.9 A família das proteases com requerimento de elevadas temperaturas, tipo A (HtrAs)

Devido a natureza do trabalho apresentado, merece especial destaque um grupo de serino proteases que são induzidas pelo calor, as HtrAs ou proteases que degradam proteínas mal formadas no periplasma (DegP), um grupo de chaperonas com atividade independente de

ATP. Este grupo pertence a família S1 e clã PA(S) das quimiotripsinas. Os representantes deste grupo incluem as peptidases DegP, DegQ e DegS de Escherichia coli . A HtrA ou DegP foi primeiro caracterizada por Lipinska et al ., (LIPINSKA, et al ., 1988; LIPINSKA, et al.,

1990), como sendo uma serina protease associada ao envelope bacteriano responsável por degradar proteínas mal formadas no periplasma. Seus representantes também são descritos como essenciais para a sobrevivência a temperaturas acima de 42 0C (KIM & KIM, 2005).

Atualmente sabe-se que esta família possui homólogos em outras bactérias, fungos, plantas e até mesmo em humanos (CLAUSEN, et al. , 2002). Homólogos em humanos têm sido associados a processos como artrite, crescimento celular, resposta a condições de estresse, morte celular programada e envelhecimento.

A família HtrA possui uma arquitetura molecular composta de um domínio “tripsina- like” conservado e um ou mais domínios PDZ (“post-synaptic density protein, disc large and zo-1 proteins”) na região C-terminal, que medeia a interação específica proteína-proteína (ver figura 7). O número de domínios PDZ pode variar de um único na DegS de E. coli , a quatro domínios na YNM3 de Saccharomyces cerevisae , por exemplo . O domínio PDZ também é chamado de DHR ou GLGF, possui cerca de 80 – 100 resíduos de aminoácidos e foi primeiro caracterizado em eucariotos. As HtrAs possuem duas estruturas dominantes onde cada uma forma um barril com seis folhas beta pregueadas. O sítio ativo está localizado na interface dos dois arranjos perpendiculares do domínio em forma de barril (PALLEN & PONTING, Estudo das proteases de micobactérias 21

1997; SASSOON, et al., 1999; SPIERS, et al., 2002; MURWANTOKO, et al., 2004;

SCHLIEKER, et al., 2004).

Figura 7 – Organização dos domínios moleculares dos membros da família HtrA. Neste esquema estão representados o nome da proteína, seguido do nome da espécie, o número de aminoácidos que compõem a enzima, a seqüência do peptídeo sinal (SS), segmentos transmembrana (TM), domínio de ligação para fator de crescimento insulina (IGFBP) em azul, domínio inibitório para a protease Kazal (KI) em laranja, o domínio tripsina (em verde) e o domínio PDZ (em amarelo). (CLAUSEN, et al. , 2002).

O reconhecimento da proteína como um alvo para a protease é diferente do reconhecimento dos sítios de clivagem na proteína alvo. Estes processos são realizados de maneira independente e em porções distintas da protease. O domínio PDZ medeia a interação proteína alvo-protease e se liga preferencialmente através de três ou quatro resíduos de aminoácido na região C-terminal da proteína alvo. A ligação do substrato ao domínio PDZ altera a conformação da protease e então os resíduos do peptídeo interagem com o domínio tripsina da enzima, provocando um rearranjo do sítio catalítico tornando-o exposto. A Estudo das proteases de micobactérias 22

unidade funcional das HtrAs parece ser um trímero, que é estabilizado exclusivamente pelos resíduos presentes no domínio protease (PALLEN & WREN, 1997; EHRMANN &

CLAUSEN, 2004; KIM & KIM, 2005). A estrutura básica do trímero tem a forma semelhante a um funil com os domínios catalíticos localizados no topo e o domínio PDZ estendidos para o lado de fora (figura 8).

Figura 8 – Esquema da ativação das DegS. Nas DegS o domínio PDZ possui uma função regulatória, oferecendo um sítio de ligação para um ativador alostérico. O quadro superior direito ressalta a ligação do ativador ao domínio PDZ da protease. Enquanto o ativador estiver ancorado ao domínio PDZ, ocorre a interação do domínio PDZ com o sítio ativo da protease. Esta interação dispara um rearranjo do domínio catalítico e a formação de um domínio catalítico ativo (EHRMANN & CLAUSEN, 2004).

Dados da literatura demonstram que a baixas temperaturas (em torno de 20 0C) o domínio protease das HtrAs apresenta-se em uma conformação completamente inativada, Estudo das proteases de micobactérias 23

onde a ligação do substrato, bem como, sua catálise são evitadas. Nesta situação, o acesso do substrato ao sítio catalítico da protease parece estar completamente bloqueado pelo domínio

PDZ, que desta forma atua como o principal regulador da atividade das HtrAs (figura 9). Este modelo de ativação foi denominado anêmona (PALLEN & WREN, 1997; KIM & KIM,

2005).

Figura 9 – Modelo anêmona para o mecanismo de ativação das HtrAs. HtrA2 de humano. O domínio PDZ bloqueia o acesso ao sítio ativo da protease. (Retirado de KIM & KIM, 2005).

1.9.1 Regulação da atividade das HtrAs

Duas vias de transdução de sinal controlam a atividade do promotor da DegP de E. coli , são elas a Cpx e a δE (figura 10). As duas vias respondem à presença de proteínas mal enoveladas e transmitem sinais através da membrana citoplasmática estimulando a transcrição de degP . As duas vias convergem para um fator sigma-E alternativo, RpoE. RpoE interage com a RNA polimerase e ocorre a transcrição de degP . A via Cpx é sistema clássico que possui dois componentes regulatórios. A CpxA que é uma proteína transmembrana que funciona como um sensor e CpxR que é um elemento regulador. CpxR estimula a transcrição o promotor de degP apenas quando está fosforilado. A fosforilação de CpxR é controlada por

CpxA que pode atuar tanto como uma proteína fosfatase quanto como proteína kinase. A Estudo das proteases de micobactérias 24

alternância entre os dois estados de CpxA é regulada pela concentração de proteínas mal enoveladas. Este controle é mediado por outra proteína, CpxP, que interage diretamente com as proteínas mal enoveladas e a ligação deste com a CpxA é interrompida, sendo este o sinal para CpxA fosforilar CpxR. A via δE é composta do fator alternativo RpoE e três proteínas

RseABC que são reguladores da atividade de RpoE. RpoE interage diretamente com o fator anti-δ RseA que é uma proteína integral de membrana com uma porção citoplasmática. Sem a presença de proteínas mal formadas RseA e RseB formam um complexo com RpoE associado a ele, e desse modo não há transcrição de degP . Sob condições de estresse, RseB se liga as proteínas com conformação alterada e em seqüência RseA é clivada por outra protease da família HtrA, a DegS. Após a clivagem de RseA, RpoE estará livre para ativar o promotor de degP (ALBA, et al. , 2001; CLAUSEN, et al. , 2002; ALBA & GROSS, 2004; ISAAC, et al. ,

2005; BUELOW & RAIVIO, 2005).

Em M. tuberculosis , a identificação e caracterização da via equivalente a CpX de E. coli foi estabelecida. A expressão do sistema regulatório mprA e mprB são essenciais para a manutenção e persistência da infecção latente causada por M. tuberculosis (HE & ZAHRT,

2005). Através do alinhamento de seqüências é possível determinar que MprA (Rv0981) corresponde ao regulador citoplasmático CpxR e MprB (Rv0982) compreende um sensor histidina kinase semelhante a CpxA. A organização molecular deste grupo apresenta ainda a protease HtrA2 (Rv0983) que tem sua expressão regulada por este sistema. A via δE não está esclarecida, no entanto a busca de seqüências homólogas no genoma de M. tuberculosis revela a possível existência desta via de regulação. Quando comparado com E. coli, o genoma de M. tuberculosis apresenta um fator sigma alternativo a RNA polimerase, sigE (Rv1221) que apresenta 32% de similaridade com o fator alternativo rpoE e Rv2480, descrita como uma proteína hipotética conservada apresenta 37% de similaridade com rseB . Outro aspecto que corrobora a teoria da existência desta via em M. tuberculosis , é a proximidade de htrA3 Estudo das proteases de micobactérias 25

(Rv1223) e um gene Rv1222, anotado como uma proteína hipotética, que estaria exercendo um papel semelhante a rseA de E. coli . Em M. leprae , nenhuma destas vias foram caracterizadas. Entretanto a organização molecular, responsável pelo controle da expressão de htrA2, é exatamente a mesma que a encontrada em M. tuberculosis , sugerindo que estas vias estão ativas em M. leprae (RIBEIRO-GUIMARÃES, resultado não publicado).

(ML0193) (ML1557)

(HtrA3)

(MprB) (ML1077)

(MprA) (SigE)

(HtrA2)

Figura 10 – Regulação do promotor do gene degP em E. coli . Duas vias de transdução de sinal (Cpx e RpoE) estão envolvidas na regulação da transcrição de degP . Proteínas mal enoveladas são detectadas tanto por CpxP quanto por RseB, que por sua vez, interagem com CpxA ou RseA, respectivamente. Após a detecção de proteínas com conformação alterada, CpxA ativa CpxR, que então induz o promotor de degP enquanto que RseA pode ser degradada por DegS antes que o RpoE possa atuar como fator δ. CM significa membrana citoplasmática (Adaptado de CLAUSEN, et al. , 2002) .

A determinação dos mecanismos de virulência e patogenicidade envolvidos na hanseníase, constituem alvo importante para o controle e prevenção da doença. Os esforços não se limitam a busca de novos medicamentos ou testes que permitam um diagnóstico Estudo das proteases de micobactérias 26

precoce da patologia. A obtenção de uma vacina eficiente tem sido alvo de constantes pesquisas e esforços. Dentro desta perspectiva, a proteína Rv0125 ou HtrA4 (também chamada MTB32A) de M. tuberculosis está sendo utilizada como complemento de vacina para a tuberculose em fusão com Rv1196 que codifica uma proteína da família PPE (também chamada MTB39), formando uma poliproteína denominada Mtb72F (SKEIKY, et al., 1999;

SKEIKY, et al., 2004; BRANDT, et al., 2004).

Estudo das proteases de micobactérias 27

2 Objetivos

2.1 Objetivo geral

Um número cada vez maior de proteases vem sendo descrito como importantes fatores de virulência de microorganismos patogênicos. Estas enzimas foram, contudo, pouco estudadas no gênero Mycobacterium e o papel das mesmas como fatores de virulência é desconhecido. Este trabalho é parte integrante de um projeto que visa em longo prazo determinar os fatores de virulência envolvidos na patogenicidade da hanseníase. Este trabalho visa à caracterização bioquímica e funcional de proteases do M. leprae , enzimas estas, que poderão contribuir no processo de identificação de moléculas candidatas ao desenvolvimento de novas ferramentas para o controle da hanseníase.

2.2 Objetivos específicos

 Analisar detalhadamente, através de ferramentas de bioinformática, as proteases descritas e anotadas como tais, nos bancos de dados genômicos de micobactérias. Buscamos também novas proteases não anotadas através de análises de homólogos.

 Avaliar a expressão de proteases secretadas pelo M.leprae na infecção humana.

Estudo das proteases de micobactérias 28

 Clonar, expressar o gene ML0176 ou htrA2 no vetor pET32a e purificar a forma recombinante da proteína para:

 Produzir anticorpo específico contra a protease recombinante – rHtrA2.

 Realizar imunohistoquímica de biópsias de pele e nervo de pacientes.

 Caracterizar a atividade enzimática da protease recombinante – rHtrA2 do M. leprae , utilizando substratos biológicos e através de ensaios fluorimétricos com peptídeos sintéticos.

Estudo das proteases de micobactérias 29

3 Resultados

Nesta seção estão representados e discutidos os resultados que foram submetidos para publicação ou redigidos na forma de manuscrito durante o desenvolvimento do projeto de doutorado. Os resultados serão apresentados diretamente na forma de artigos.

A seqüência de apresentação dos trabalhos não apresentará ordem cronológica, mas serão ordenados de acordo com o tema de estudo.

Os resultados serão divididos em 3 seções distintas. Na primeira parte faremos uma análise de genomas das micobactérias no contexto de uma família de proteínas intimamente relacionadas com a patogênese de inúmeras doenças, as proteases. A análise foi realizada através da construção de bancos de dados para cada espécie analisada. Estes bancos foram cruzados e a validação dos resultados foi feita por reconhecimento de domínios característicos de proteases, utilizando plataformas como , Prosite, Merops e InterPro.

Na segunda seção avaliaremos a presença nas lesões de pacientes multibacilares de algumas proteases que foram previamente selecionadas. Três dos genes selecionados codificam para proteases secretadas, tendo assim maior probabilidade de interagirem com moléculas do hospedeiro e desenvolverem algum papel na patogenia do M. leprae. Os outros dois apresentam homologia com fatores de virulência encontrados em outras bactérias. Esta presença foi confirmada tanto pela detecção de moléculas de RNAm, quanto pela presença das proteínas. Estas características aumentam a probabilidade de que o produto destes genes possa interagir com moléculas do hospedeiro e desempenhar algum papel na patogenia do M. leprae .

Uma vez demonstrada a transcrição dos genes acima mencionados, decidimos clonar e expressar a forma recombinante da proteína HtrA2. Devido ao potencial envolvimento na Estudo das proteases de micobactérias 30

patogênese relacionada a outras bactérias, partimos então para a avaliação bioquímica e funcional da serino protease HtrA2 de M. leprae . A partir da forma recombinante desta proteína, mostramos que a HtrA2 apresenta atividade catalítica contra oligopeptídeos sintéticos e seqüências de peptídeos biologicamente ativos, clivando preferencialmente após resíduos básicos e determinamos também as condições de temperatura e pH ótimos de atividade.

Estudo das proteases de micobactérias 31

Manuscrito 1

“Comparative genomics of mycobacterial proteases ”

Micro. path. (2007), http://dx.doi.org/10.1016/j.micpath.2007.05.010 .

Este artigo foi submetido e aceito pela revista Microbial Pathogenesis . Feitas as devidas correções, se encontra agora em fase de publicação e está disponível on-line no endereço http://dx.doi.org/10.1016/j.micpath.2007.05.010 .

As proteases são reconhecidamente importantes fatores de virulência. No contexto de doenças causadas por micobactérias, no entanto, o nível de informação acerca dos possíveis papéis que estas proteínas desempenham na doença é extremamente reduzido.

Neste trabalho realizamos uma extensa revisão e análise de genomas de micobactérias utilizando a bioinformática como ferramenta para comparar os genes que codificam para proteases nos genomas de Mycobacterium leprae , Mycobacterium tuberculosis ,

Mycobacterium bovis e Mycobacterium avium paratuberculosis . Esta análise nos permitiu atualizar a nomenclatura das famílias de proteases presentes em micobactérias. Dedicamos especial atenção ao genoma do M. leprae. Apesar de ser apresentado como um genoma que sofreu evolução por redução do número de genes, observamos um elevado nível de conservação da família de proteases. Um total de 39 genes dos 49 encontrados em M. bovis encontram-se conservados em M. leprae . Foi possível identificar também um conjunto conservado de 38 proteases que são partilhadas por todas as espécies analisadas. Este grupo de proteínas é provavelmente essencial para a sobrevivência no hospedeiro e pode representar Estudo das proteases de micobactérias 32

um alvo para o desenho de novas drogas, que possibilitem um controle mais efetivo destas doenças.

Um dado surpreendente nos foi revelado quando realizamos uma comparação do número de proteases encontradas no genoma do M. leprae com outras famílias de genes.

Existe um elevado nível de preservação nesta classe. É importante ressaltar que o genoma do

M. leprae constitui um dos mais degenerados dentre todos os genomas até o momento seqüenciados. Preservar as proteases demonstra claramente o importante papel que estas proteínas desempenham na sobrevivência, manutenção e possivelmente na patogenia relacionada a esta bactéria. Nossos dados corroboram as análises filogenéticas que indicam a proximidade existente entre o M. leprae e o M. avium paratuberculosis , visto que, o grupo de proteases encontrado nas duas espécies foi bastante similar. As proteases perdidas pelo M. leprae podem ser explicadas como casos de genes duplicados e que provavelmente exercem funções muito semelhantes no contexto da sua sobrevivência. Estudo das proteases de micobactérias 33

Manuscrito 2

“Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human skin lesions ”

Micro. path. (2007), http://dx.doi.org/10.1016/j.micpath.2007.05.011 .

Este artigo foi submetido e aceito pela revista Microbial Pathogenesis . Feitas as devidas correções, se encontra agora em fase de publicação e está disponível on-line no endereço: http://dx.doi.org/10.1016/j.micpath.2007.05.011 .

Um número crescente de proteases produzidas por microorganismos patogênicos tem sido descrito como fatores de virulência, contribuindo muitas vezes de maneira essencial para o estabelecimento de um variado número de manifestações clínicas da infecção. A primeira questão a ser considerada em nosso estudo foi a transcrição durante a infecção de cinco putativas proteases do bacilo de Hansen. Verificamos através da técnica de RT-PCR, a presença de moléculas de RNAm para genes que codificam para putativas proteases do M. leprae , sendo eles: mycP1 , htrA2 , htrA4 , gcp e clpC em bacilo isolado de lesões de pacientes com hanseníase.

A segunda etapa deste trabalho foi a produção de anticorpos policlonais contra duas proteases selecionadas, a HtrA2 e Gcp. O anticorpo contra a proteína Gcp foi produzido pelo aluno de Mestrado Julio Jablonski Amaral. Após purificarmos os dois anticorpos e verificarmos as especificidades, realizamos imunohistoquímica em cortes de pacientes com a forma multibacilar da doença. Até o momento da submissão deste trabalho, apenas os anticorpos contra a Gcp apresentaram marcação positiva nas lesões. Estes resultados nos sugerem uma possível regulação pós-transcripicional destas proteases e a provável produção Estudo das proteases de micobactérias 34

pelo microorganismo durante o longo período de incubação no hospedeiro, desta forma podem desempenhar algum papel relevante na patogenia. Estudo das proteases de micobactérias 35

Manuscrito 3

“Cloning, expression and characterization of a HtrA-like protease produced in vivo by Mycobacterium leprae”

Este Manuscrito foi submetido a revista Biochimica et Biophysica Acta (BBA).

Este manuscrito é fruto da nossa colaboração com o grupo de pesquisa da Dra.

Fernanda Portaro, pesquisadora do Centro de Toxinologia Aplicada (CAT-CEPID), do

Instituto Butantã, São Paulo. Todos os experimentos que envolvem a caracterização funcional e bioquímica da forma recombinante da protease HtrA2 de M. leprae foram realizados em seu laboratório, com o auxílio de Eliana Blini Marengo, que foi aluna de

Mestrado do Dr. Antonio Carlos Martins de Camargo, Diretor do Laboratório Especial de toxinologia aplicada - CAT-CEPID e Natalia Pieranfeli dos Santos , aluna de iniciação científica da Dra. Fernanda Portaro, além da participação do grupo de espectrometria de massa, sob supervisão do Dr. Daniel Carvalho Pimenta, do CAT-CEPID.

Através deste trabalho mostramos pela primeira vez que a rHtrA2 de M. leprae apresenta atividade catalítica quando incubada com oligopeptídeos. Utilizamos peptídeos sintéticos com flourescência apagada (FRETs), flanqueados por Abz ( ortho -aminobenzoic acid) e EDDnp ([N-ethylenediamine-(2,4-dinitrophenyl)]). O peptídeo Abz-GFSPRRQ-

EDDnp (FRET-1) foi hidrolisado pela rHtrA2 e então foi tomado por base para a construção de peptídeos modificados nas posições P2, P3 e P4. A HtrA2 revelou atividade de serina protease confirmando os dados provenientes do sequenciamento do genoma do M. leprae que prediziam a função serina protease desta enzima. Realizamos também ensaios com substratos Estudo das proteases de micobactérias 36

com seqüências de peptídeos biologicamente ativos: neurotensina1-13, dinorfina A, oxitocina, angiotensina I e bradicinina a fim de caracterizar os seus potenciais substratos.

Determinamos também as condições ótimas de temperatura e pH, além de verificar a inibição desta enzima utilizando inibidores específicos de serina proteases. A partir destes ensaios verificamos a especificidade desta enzima, que se mostrou altamente seletiva quando clivou os peptídeos predominantemente com resíduos básicos, diferentemente das homólogas DegP e DegQ de E.coli que clivam preferencialmente após resíduos hidrofóbicos.

As HtrAs são uma família amplamente estudada, no entanto, não existe nenhuma caracterização destas enzimas em M. leprae . Estes resultados evidenciam a presença de um sítio estendido (S4-S1) na rHtrA2 necessário para a atividade catalítica. A relação da clivagem da dinorfina e neurotensina com a rHtrA2 de M. leprae não está clara, estes achados estão sendo investigados em nosso laboratório.

Estudo das proteases de micobactérias 37

4 Discussão

A hanseníase ainda constitui um problema de saúde pública no Brasil. O programa nacional para o controle desta endemia se baseia atualmente na detecção e tratamento dos indivíduos afetados, com PQT e na vacinação dos contatos domiciliares dos doentes com a vacina BCG. Apesar da implementação destas medidas, a incidência anual da hanseníase no país na última década conta com a detecção persistente de trinta e cinco a quarenta mil novos casos por ano (http://portal.saude.gov.br/portal/saude/visualizar_texto.cfm?idtxt=26961 ). Um outro dado preocupante são as seqüelas neurológicas observadas em aproximadamente 30% dos doentes, mesmo naqueles em que a cura bacteriológica foi obtida, e cujo grau de severidade é na maioria das vezes dependente de quão precocemente a hanseníase é tratada.

Dessa forma, a busca de novas medidas de controle é fortemente recomendada, e para tal, um melhor entendimento dos mecanismos de patogênese envolvidos na infecção pelo M. leprae constitui um pré-requisito essencial. Estas novas medidas incluem a utilização de drogas de segunda geração que causem menos efeitos colaterais e que permitam um tratamento de menor duração, medicamentos alternativos para os episódios reacionais, novos testes para o diagnóstico precoce da infecção, bem como a aplicação de uma vacina mais eficaz contra a doença (http://www.who.int/lep/stat2002/global02.htm ).

A genômica comparativa permite estabelecer uma sólida relação filogenética entre grupos, ajudando, sobretudo a identificar similaridades e dicotomias entre vias metabólicas e fisiológicas antes impossíveis de determinar. A comparação dos genomas de micobactérias consiste de um excelente meio para identificar as bases genéticas das diferenças entre os fenótipos existentes no grupo. Sobretudo no contexto de micobactérias, a análise de genomas torna-se uma importante ferramenta para um melhor entendimento da biologia e mecanismos Estudo das proteases de micobactérias 38

de patogenicidade em espécies de difícil manipulação como o M. leprae que não cresce in vitro (COLE, et al., 2001).

O atual conhecimento dos mecanismos patogênicos e a determinação dos fatores de virulência que causam a hanseníase são limitados. Os patógenos possuem um arsenal de fatores de virulência que participam de processos como a colonização, evasão das defesas do hospedeiro, disseminação e sobrevivência. Dentre esses fatores, as enzimas proteolíticas, são muito importantes em processos como proliferação e degradação de tecidos do hospedeiro, além da participação em muitas outras vias (PAYNE, 1976).

Realizamos uma análise comparativa in silico para as proteases de micobactérias que apresentam seu genoma seqüenciado. Utilizamos para esta análise os genomas de M. avium paratuberculosis str. K10 (LINGLING, et al., 2005), M. tuberculosis H37Rv (COLE, et al.,

1998; CAMUS, et al., 2002), M. tuberculosis CDC1555 (http://cmr.tigr.org/tigr- scripts/CMR/GenomePage.cgi?database=gmt ), M. bovis AF2122 (GARNIER, et al., 2003),

M. bovis BCG (http://www.pasteur.fr/recherche/unites/Lgmb/mycogenomics.html#bovis) , que foram comparados com o genoma do M. leprae (COLE, et al., 2001). Construímos bancos de dados de proteases para cada espécie e realizamos análise de seqüências entre eles.

Dedicamos especial atenção ao M. leprae tomando por base o paradigma de que a característica mais marcante deste genoma é a extensiva deleção e inativação do número de genes, fenômeno denominado evolução por redução. Através desta análise fomos capazes de identificar proteínas não categorizadas como proteases em todas as espécies analisadas, realizar uma atualização na nomenclatura de diversos genes e especialmente identificar um grupo homogêneo de proteases conservadas em todas as micobactérias estudadas. O número de genes que codificam para proteases em M. leprae e M. avium paratuberculosis foi semelhante. Nossos dados recebem suporte de estudo filogenético realizado por BROSCH, et al., 2001, que analisa a região 16s do RNA ribossômico e revela um ancestral comum que Estudo das proteases de micobactérias 39

evoluiu diferentemente, originando dois ramos, um onde encontramos M. leprae e M. avium paratuberculosis e o outro onde estão as micobactérias do complexo tuberculose. Esta separação pode representar uma possível explicação para as diferenças nas formas de infecção, colonização e sobrevivência nos respectivos hospedeiros.

O genoma do M. leprae contém cerca de 1130 pseudogenes e o menor conjunto de genes de todas as espécies de micobactérias até o momento seqüenciadas. A perda de vias metabólicas pelo M. leprae parece ter resultado na impossibilidade de cultivar esse microorganismo in vitro (COLE, et al ., 2001, EIGLMEIER, et al ., 2001) e o estabelecimento intrínseco de um nicho colonizado apenas por esta bactéria, o nervo periférico. Nosso estudo revela, então, um aspecto de fundamental importância dentro deste cenário, onde observamos um elevado grau de preservação de genes que codificam para proteases no genoma de M. leprae, quando comparada com outras famílias de genes. Podemos inferir que este grupo é essencial para a sobrevivência e patogenicidade nesta bactéria.

Um número crescente de proteases produzidas por microorganismos patogênicos tem sido descrito como fatores de virulência, contribuindo muitas vezes de maneira essencial para o estabelecimento de um variado número de manifestações clínicas da infecção. As proteases podem participar de forma efetiva nos processos de invasão e colonização dos tecidos alvo e degradação tecidual, na modulação e inativação das defesas do hospedeiro, inativando fatores de transcrição envolvidos com a síntese de proteínas responsáveis pela resposta imune

(Brown, et al., 2000), entre outros (revisto por Travis, et al., 1995; Travis & Potempa, 2000).

Em espécies de bactérias de gêneros como Yersinia (WILLIAMS, et al., 2000; HEUSIPP, et al., 2006), Streptococcus (IBRAHIM, et al ., 2004; LYON & CAPARON, 2004; BIWAS &

BIWAS, 2005), Chlamydia (SHAW, et al., 2002; SHARMA, et al ., 2005; MURTHY, et al .,

2006) e nas espécies: Legionella pneumophyla (PEDERSEN, et al., 2001), Vibrio cholerae

(BEHARI, et al ., 2001), Listeria monocytogenes (WONDERLING, et al ., 2004; STACK, et Estudo das proteases de micobactérias 40

al ., 2005) e Campylobacter jejuni (BRONDSTED, et al ., 2005) , a correlação das proteases com a patogênese decorrente destes organismos está bem estabelecida.

Em micobactérias, a descrição da atividade de proteases relacionadas com a patogênese é bastante restrita. Poderíamos considerar as proteases expressas pelo M. leprae como boas candidatas a desempenharem um papel importante na sua interação com o hospedeiro. Estas enzimas poderiam, por exemplo, auxiliar na disseminação da bactéria no hospedeiro a partir do trato respiratório, provável porta de entrada do M. leprae . Durante sua trajetória até a célula de Schwann, presume-se que o M. leprae tenha que atravessar diversas lâminas basais, como as que servem de suporte ao endotélio vascular e à própria membrana basal que recobre cada célula de Schwann, e proteases produzidas pela bactéria poderiam contribuir neste processo. Também é razoável assumir que existe uma contribuição similar de proteases na disseminação de M. tuberculosis, visto que cepas avirulentas possuem capacidade proteolítica reduzida, quando comparadas com cepas virulentas (MASSÓ, et al.,

1999).

A etapa seguinte do nosso trabalho foi investigar então a expressão de proteases em pacientes com hanseníase. Do conjunto de proteases encontradas em M. leprae , selecionamos os genes ML0041 ou mycP1 , ML0176 ou htrA2 , ML2659 ou htrA4 , ML0235 ou clp C e

ML0379 ou gcp . Os três primeiros estão descritos como proteases possivelmente secretadas, considerados desta forma moléculas de interface na interação patógeno-hospedeiro. O gene que codifica para gcp uma o-sialoglicoproteina tem evidência experimental em

Pseudomonas de que é secretada (ABDULLAH, et al ., 1992; MELLORS & LO, 1995;

SUTHERLAND, et al ., 1992). A ATP-dependente clp protease teve sua expressão indireta detectada através de ELISA utilizando soro de pacientes infectados com M. leprae (MISRA, et al ., 1996). Desta forma, isolamos bactérias provenientes de lesões de indivíduos com a forma multibacilar da doença, onde o número de bactérias por lesão é relativamente alto. Estudo das proteases de micobactérias 41

Optamos por esta fonte de bacilos, descartando o M. leprae isolado de tatu, a fim de buscar um melhor entendimento acerca do possível envolvimento destas proteases no decurso da infecção humana. No processo de isolamento dos bacilos não houve a remoção completa de contaminantes de tecidos do hospedeiro. A escolha desta metodologia foi proposital, visando uma recuperação de um número maior de bactérias em detrimento de sua pureza, visto que, as reações de RT-PCR eram realizadas com iniciadores específicos para os genes selecionados.

A não amplificação do DNA humano contaminante nestas preparações foi confirmada pela inclusão deste DNA em reações incluídas como controle negativo. As tentativas iniciais de amplificação da região codificante para as proteases selecionadas não se mostraram bem sucedidas observando apenas a amplificação de clpC. Para aumentar a sensibilidade das reações desenhamos oligonucleotídeos que permitiam a amplificação de fragmentos internos dos genes mycP1 , htrA2 , htrA4 e gcp . Desta forma, conduzimos novas reações de RT-PCR tendo como molde os produtos gerados nas reações iniciais. A presença de RNAm para mycP1 , htrA2 , htrA4 e gcp foi claramente evidenciada após reações de reamplificação. A utilização de dois pares de iniciadores para cada gene representou uma garantia de especificidade das nossas reações.

O grau de dificuldade em observar a presença de RNAm nas reações realizadas pode ser um reflexo do grau de expressão in vivo de cada gene em questão. Até o presente momento não está estabelecido o papel e o envolvimento de cada uma destas proteases na patogênese causada pelo M. leprae . É possível, entretanto, supor que possam existir diferentes mecanismos de interação e regulação destas proteases ou mesmo que a transcrição das moléculas de RNAm seja diferenciada entre elas.

Uma vez demonstrada a transcrição dos genes acima mencionados, partimos para a etapa de clonagem e expressão da forma recombinante da proteína HtrA2. Depois de purificada, esta proteína foi inoculada em camundongos para a posterior obtenção de Estudo das proteases de micobactérias 42

anticorpos policlonais. O gene que codifica para a HtrA2 foi clonado no sistema pET32a-c(+) que produz uma proteína recombinante fusionada a tireodoxina e uma cauda de histidina.

Desta forma, após a obtenção dos anticorpos policlonais contra a HtrA2, realizamos cromatografia de afinidade para retirar os anticorpos produzidos contra a porção tireodoxina/histidina, utilizando uma HiTrap NHS que interage com grupos amina.

Incubamos a coluna com tireodoxina/histidina previamente produzidas e então passamos o soro proveniente dos camundongos imunizados com a rHtrA2. Desta forma, obtivemos um soro enriquecido apenas com anticorpos contra HtrA2. Os anticorpos contra a proteína HtrA2 foram então utilizados para a realização de imunohistoquímica em pacientes com hanseníase.

Até o momento da publicação do artigo que apresenta os resultados equivalentes a esta etapa do trabalho, a marcação para HtrA2 não foi observada. Consideramos que a HtrA2 tem sua expressão regulada por várias vias de transdução de sinal e desta forma a presença da proteína esteja limitada a momentos específicos da infecção. Os experimentos de RT-PCR para avaliar a presença de moléculas de RNA mensageiro e imunohistoquímica para detectar a presença de proteínas foram realizados a partir de diferentes amostras de pacientes. Desta forma, é possível que estando os pacientes em etapas distintas do processo de infecção, a expressão destas proteínas também seja diferenciada.

Estes resultados são consistentes com dados recentes da literatura que mostram a expressão destes genes no modelo experimental de infecção pelo M. leprae em camundongos atímicos nu/nu. A avaliação por RT-PCR em bacilos isolados destes animais mostrou a presença de RNAm para as cinco proteases em estudo, indicando que também neste modelo experimental as proteases mycP1 , htrA2 , htrA4, clpC e gcp são possivelmente produzidas pelo

M. leprae (WILLIAMS, et al., 2004). Mais recentemente, a expressão das proteínas ClpC e

Gcp foi confirmada pela análise de proteoma de M. leprae derivado de tatu (MARQUES, et al ., resultado não publicado). Estudo das proteases de micobactérias 43

A função específica destas proteases na biologia e patogênese ocasionadas pelo M. leprae não está totalmente esclarecida. ML0235 mostra homologia com membros do complexo clp (“Caseinolytic protein”), uma classe de proteínas altamente conservadas implicadas na tolerância ao estresse de muitos organismos, tanto em procariotos como em eucariotos (GOTTESMAN, et al., 1990; KRÜGER, et al., 2000). Membros desta família incluem ATPases que apresentam atividade de chaperona e proteínas que têm atividade de serino protease (DOUGAN, et al., 2002). O complexo protéico clpC/ClpP é encontrado nas bactérias, a subunidade clpC possui atividade de chaperona, enquanto a clpP, constitui o módulo catalítico. Em bactérias, assim como em células eucarióticas, as proteínas de choque térmico fazem parte da maquinaria celular responsável pela verificação da conformação, reparo e degradação de moléculas. A família de proteínas Clp ATP-dependentes pode atuar como proteases e como chaperoninas em condições de estresse prevenindo agregação protéica e garantindo a manutenção das proteínas celulares em sua conformação nativa. A clp C constitui o único gene selecionado previamente descrito em M. leprae (MISRA, et al., 1996).

Nesse trabalho, os autores mostraram a presença de anticorpos contra esta proteína em pacientes com hanseníase. Estudos recentes desta família de proteínas de choque térmico sugerem sua atuação essencial na adaptação e sobrevivência de L. monocytogenes ao ambiente intracelular (GAILLOT, et al., 2000). O gene c lp C, por exemplo, é essencial para o escape da bactéria do compartimento fagossomal para o citoplasma da célula hospedeira

(ROUQUETTE, et al ., 1996), além de estar envolvido em eventos de adesão e invasão celular demonstradas pela redução significativa na infecção de hepatócitos de camundongos infectados (NAIR, et al., 2000). Entre as chaperoninas presentes em grande abundância no M. leprae está a gro EL. Portaro et al., 2002 mostraram pela primeira vez que esta chaperonina tem atividade proteolítica em M. leprae . Estudo das proteases de micobactérias 44

A protease ML0379 possui homologia com uma o-sialoglicoprotease de Pasteurella haemolytica . Esta enzima é uma metaloprotease dependente de zinco e cliva preferencialmente substratos protéicos ricos em o-sialoglicanas ligadas a resíduos de treonina e serina (MELLORS & LO, 1995). A diferenciação e crescimento de células hematopoiéticas em leucócitos maduros é acompanhada pela aquisição ou perda de glicoproteínas de superfície celular que assim delineiam as formas de associação, interação e resposta a estímulos ambientais. Uma grande variedade de glicoproteínas, dentre elas CD34, CD43,

CD44 e CD45, os ligantes para P- e L- selectinas, a proteína de adesão vascular VAP-1, glicoproteína Iβ e cranina, uma O-sialoglicoproteína encontrada no cérebro (JIANG &

MELLORS, 1998) são clivadas pela o-sialoglicoprotease de Pasteurella haemolytica , atuando assim, de forma direta na modulação da resposta imune do hospedeiro (SUTHERLAND, et al., 1992; ABDULLAH, et al., 1992).

Por outro lado, ML2659 e ML0176 codificam para uma provável serina protease que possui homologia com a protease HtrA4 do M. tuberculosis e com a protease DegS de E. coli .

As proteases DegS, DegP e DegQ presentes em E. coli são constituintes da família HtrA

(WALLER & SAUER, 1996). Nesta família encontram-se serino proteases periplasmáticas requeridas para o crescimento de cepas de E. coli em temperaturas elevadas (MEESAS, et al.,

1993). Em Salmonella typhimurium , entretanto, HtrA é essencial para a resistência ao estresse oxidativo e sobrevivência dentro de macrófagos (WILLIAMS, et al., 2000).

MycP1 pertence a um grupo interessante de proteases, chamadas micosinas. O genoma do M. tuberculosis H37Rv codifica para 5 micosinas designadas micosinas 1 a 5

(MycP1- MycP5) e anotadas como Rv3883c, Rv3886, Rv0291, Rv3449 e Rv1796, respectivamente (BROWN, et al., 2000). A identidade entre essas proteínas varia entre 40

47% sugerindo um caso de duplicação gênica. Dois destes genes foram perdidos pelo M. leprae: myc P2 (ML0037) que compreende um pseudogene e myc P4 que foi deletado Estudo das proteases de micobactérias 45

(http://www.sanger.ac.uk/Projects ). mycP1 pertence a região RD1 que inclui o gene que codifica para “the 6 kDa early-secreted antigenic target” (ESAT-6) e “10KDa culture filtrate protein” (CFP-10) que são eficientemente secretadas por via alternativa de secreção em micobactérias, snm . Os genes que participam da via snm situam-se próximos a esat -6 e cfp -10 na região RD1 (SKJOT, et al., 2000) e myc P1 ( snm8) é parte desta via. Toda esta região foi preservada no genoma de M. leprae exceto pelo gene snm 5 (ML0057) que é um pseudogene.

A análise genética deste locus em Mycobacterium smegmatis revelou que a secreção de

ESAT-6 e CFP-10 requerem o gene mycP1 (CONVERSE & COX, 2005). A correlação da região RD1 e a virulência em M. tuberculosis foi demonstrada experimentalmente. Deleções nesta região resultam em atenuação nas culturas de macrófagos e camundongos (BRODIN, et al., 2006). Em pacientes com hanseníase, a expressão in vivo de ESAT-6 e CFP-10 foi indiretamente demonstrada pela presença de resposta imune específica contra essas proteínas

(GELUK, et al., 2004). Os dados da literatura estão de acordo com as nossas evidências de que MycP1 é expressa na hanseníase.

Depois de demonstrada a presença das proteases analisadas nas lesões de pacientes hansenianos, passamos a uma etapa de avaliação da atividade catalítica e mecanismos enzimáticos da rHtrA2. A proteína recombinante Gcp constitui tema de estudo da dissertação de Mestrado de Julio Jablonski Amaral, aluno do Instituto de Bioquímica Médica/UFRJ, também sob a orientação da Dra. Maria Cristina V. Pessolani.

As HtrAs são uma família amplamente estudada. No entanto, não existe nenhuma caracterização das HtrAs de M. leprae . A rHtrA2 de M. leprae foi purificada utilizando-se resina Ni-NTA em uma única etapa e a ausência de proteínas contaminantes foi avaliada através de SDS-PAGE e imunobloting realizado com anticorpo anti-6x His-tag, que é capaz de detectar a cauda de seis histidinas presente apenas na forma recombinante da proteína. A análise desta purificação foi verificada também através de cromatografia de filtração em gel Estudo das proteases de micobactérias 46

em coluna Shepadex G.75. As análises de homologia da seqüência da HtrA2 de M. leprae revelam que esta proteína possui um domínio tripsina (resíduos 96-249) que contém a tríade catalítica formada por H182, D224, S305, um domínio PDZ (resíduos 297-382), além de uma seqüência consenso para peptídeo sinal na região N-terminal (resíduos 1-36), indicando a possibilidade de ser secretada. A análise primária de sua seqüência sugere que esta proteína pertence a família S1, composta de serina proteases com atividade “quimiotripsina-like”

(RAWLINGS, et al., 2006).

Iniciamos a caracterização da rHtrA2 de M. leprae testando uma série de peptídeos sintéticos com flourescência apagada (FRETs), flanqueados por Abz ( ortho -aminobenzoic acid) e EDDnp ([N-ethylenediamine-(2,4-dinitrophenyl)]) que mudavam a composição dos aminoácidos em diferentes posições. Nestes ensaios fomos capazes de determinar a eficiência catalítica, algumas informações acerca dos subsítios P4-P1, confirmar a preferência de clivagem após resíduos R, indicarmos que a enzima reconhece seu substrato não apenas através da interação P1-S1, mas também por outros aminoácidos no substrato que interagem com o sítio estendido de ligação da enzima. Os resultados obtidos indicam que rHtrA2 de M. leprae possui uma especificidade diferenciada entre os substratos quando comparada com outras HtrAs. A descrição para a atividade desta família retrata seus membros como possuindo uma variabilidade grande e dependente somente da posição P1. Majoritariamente a literatura indica que estas proteases clivam após resíduos hidrofóbicos. Em contraste, nossos resultados indicam uma maior seletividade da rHtrA2 de M. leprae e a necessidade de resíduos de Arg para haver clivagem. Cabe ressaltar, entretanto, que tais descrições são baseadas em enzimas que apresentam similaridade em torno de 40% com a rHtrA2 de M. leprae , e provavelmente estas diferenças refletem na especificidade da rHtrA2. Utilizamos em seguida, um substrato flourescente, metilcoumarina (MCA) que possui um único sítio de clivagem R-R. Os resultados revelaram a excelente hidrólise do MCA e quando tentamos Estudo das proteases de micobactérias 47

inibir sua atividade com inibidores clássicos de serina protease, observamos que somente a aprotinina foi capaz de tal efeito. Ainda durante a investigação dos mecanismos enzimáticos para a melhor atividade da rHtrA2, realizamos testes para verificar a temperatura ótima de atividade, bem como pH. Conforme descrito, a atividade da enzima foi ótima numa faixa de temperatura entre 37 0C a 55 0C e o pH entre 6,0 e 10,0, indicando uma grande plasticidade. É possível que assim como seus homólogos, a rHtrA2 de M. leprae possua uma variação de atividade de acordo com a temperatura. A literatura indica que ensaios in vitro , realizados em baixas temperaturas (em torno de 20 0C) prevaleça a atividade chaperona e em temperaturas mais elevadas atue como protease.

Realizamos também ensaios com porções peptídicas derivados de moléculas biologicamente ativas, a fim de verificar potenciais substratos para a HtrA2, monitorando a hidrólise dos mesmos por HPLC. A hidrólise de dinorfina e neurotensina indicam que rHtrA2 de M. leprae tem real preferência por aminoácidos básicos na posição P1. Até o presente momento não há descrição de substratos naturais para rHtrA2 de M. leprae. As HtrA2 de mamíferos estão envolvidas na proteção contra o estresse celular e a sua deleção resulta em uma perda seletiva da população de neurônios estriatais (MARTINS, et al ., 2004). A relação da clivagem da dinorfina e neurotensina com a rHtrA2 de M. leprae não está clara, estes achados estão sendo investigados em nosso laboratório.

Vale a pena ressaltar que a hanseníase é uma doença que apresenta um longo período de incubação, podendo variar de 5 a 10 anos. Determinar o exato papel de cada molécula expressa pelo M. leprae no processo de colonização e dispersão até a chegada do bacilo ao nervo periférico, pode ser uma tarefa impossível de se realizar. Certamente dentro do hospedeiro a HtrA2 deve exercer seu papel biológico associada a várias outras moléculas.

Dessa forma baseados nas evidências experimentais, podemos supor o envolvimento da

HtrA2 em alguma etapa do processo infeccioso. Por exemplo, a entrada do patógeno no Estudo das proteases de micobactérias 48

sistema circulatório do hospedeiro é usualmente acompanhada por uma elevação da temperatura corporal. É esperado então que genes que codificam para proteínas de choque térmico exerçam um importante papel na infecção bacteriana. É importante ressaltar que os soros de pacientes apresentam elevados títulos contra essas proteínas. De fato, HtrA4 ou

Rv0125 tem sido utilizada como complemento de vacina para a tuberculose. A elevação de temperatura pode gerar agregação protéica. A expressão da HtrA2 em M. leprae provavelmente é regulada pelo sistema Cpx ou o RpoE, cujos genes estão presentes no genoma, logo a presença de proteínas mal formadas pode representar o sinal para a expressão da HtrA2.

Através da literatura é possível verificar que mutações nos genes htrAs de Salmonella ,

Brucella e Yersinia causam diminuição da taxa de sobrevivência em camundongos e que os mutantes htrA podem atuar como vacinas. Os resultados apresentados propiciam novas possibilidades para o envolvimento desta protease em inúmeros processos patofiosiológicos na hanseníase.

Estudo das proteases de micobactérias 49

5 Conclusão

Os resultados desta tese de Doutorado nos permitiram chegar às seguintes conclusões:

 Realizamos uma análise comparativa in silico para as proteases de micobactérias que apresentavam seu genoma seqüenciado. Através desta análise identificamos proteínas não categorizadas como proteases em todas as espécies analisadas, atualizamos a nomenclatura de diversos genes e especialmente identificamos um grupo homogêneo de proteases conservadas em todas as micobactérias estudadas. Encontramos um número semelhante de genes que codificam para proteases em M. leprae e M. avium paratuberculosis . Nossos dados recebem suporte de estudo filogenético realizado, que analisa a região 16s do RNA ribossômico, revelando um ancestral comum que evoluiu diferentemente, originando dois ramos, um onde encontramos M. leprae e M. avium paratuberculosis e o outro onde estão as micobactérias do complexo tuberculose. Esta separação pode representar uma possível explicação para as diferenças nas formas de infecção, colonização e sobrevivência nos respectivos hospedeiros.

 Neste trabalho verificamos, através da técnica de RT-PCR, a presença de RNAm para as proteases mycP1 , htrA2 , htrA4 e gcp e clpC em M. leprae isolado de lesões de pacientes com hanseníase. A não amplificação do DNA humano contaminante nestas preparações foi confirmada pela inclusão deste DNA em reações incluídas como controle negativo. Estes resultados sugerem que estas proteases são produzidas pelo microorganismo durante a infecção e podem, portanto, desempenhar algum papel na sua patogenia.

Estudo das proteases de micobactérias 50

 Analisando a seqüência da HtrA2 de M. leprae por homologia fomos capazes de identificar um domínio tripsina (resíduos 96-249) que contém a tríade catalítica formada por H182,

D224, S305, domínio PDZ (resíduos 297-382), além de uma seqüência consenso para peptídeo sinal na região N-terminal (resíduos 1-36), indicando a possibilidade de ser secretada. Estes achados sugerem que esta proteína pertence a família S1, composta de serina proteases com atividade “quimiotripsina-like”.

 Utilizamos peptídeos sintéticos com flourescência apagada (FRETs), flanqueados por Abz

(ortho -aminobenzoic acid) e EDDnp ([N-ethylenediamine-(2,4-dinitrophenyl)]) para confirmar a preferência de clivagem após resíduos de R da rHtrA2 de M. leprae , utilizando um conjunto de substratos FRET que mudavam a composição dos aminoácidos em diferentes posições. Nestes ensaios fomos capazes de determinar a eficiência catalítica, algumas informações acerca dos subsítios P4-P1, confirmar a preferência de resíduos R, indicarmos que a enzima reconhece seu substrato não apenas através da interação P1-S1, mas também por outros aminoácidos no substrato que interagem com o sítio estendido de ligação da enzima.

Os resultados obtidos indicam que rHtrA2 de M. leprae possui uma especificidade diferenciada entre os substratos quando comparada com outras HtrAs.

 Testamos a hipótese de atividade “quimiotripsina-like” para a HtrA2 de M. leprae utilizando o substrato fluorescente metilcoumarina (MCA) que possui um único sítio de clivagem R-R a fim de caracterizar a atividade catalítica da HtrA2 de M. leprae . Os Estudo das proteases de micobactérias 51

resultados revelaram a excelente hidrólise do MCA, confirmando a preferência por resíduos básicos para clivagem.

 Realizamos também ensaios que visavam a caracterização inicial dos potenciais substratos da rHtrA2. Utilizamos peptídeos biologicamente ativos e monitoramos a sua hidrólise por

HPLC. A hidrólise de dinorfina e neurotensina indicam que rHtrA2 de M. leprae tem real preferência por aminoácidos básicos na posição P1. Até o presente momento não há descrição de substratos naturais para rHtrA2 de M. leprae. As HtrA2 de mamíferos estão envolvidas na proteção contra o estresse celular e a sua deleção resulta em uma perda seletiva da população de neurônios estriatais. A relação da clivagem da dinorfina e neurotensina com a rHtrA2 de M. leprae não está clara, estes achados estão sendo investigados em nosso laboratório.

 Realizamos ensaios com a rHtrA2 de M. leprae a fim de determinar os mecanismos enzimáticos para a inibição sua atividade, bem como, pH e temperatura ótimos de atividade.

Utilizando inibidores clássicos de serina protease, observamos que somente a aprotinina foi capaz de tal efeito. Ainda durante a investigação dos mecanismos enzimáticos para a melhor atividade da rHtrA2, realizamos testes para verificar a temperatura ótima de atividade e verificamos que a faixa ótima é de 37 0C a 55 0C e o pH entre 6,0 e 10,0, indicando uma grande plasticidade. A literatura indica que em baixas temperaturas (em torno de 20 0C) prevaleça a atividade chaperona e em temperaturas mais elevadas atue como protease.

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7 Apêndice

ARTICLE IN PRESS

MICROBIAL PATHOGENESIS Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]] www.elsevier.com/locate/micpath Mini review Comparative genomics of mycobacterial proteases

Michelle Lopes Ribeiro-Guimara˜esa,b, Maria Cristina Vidal Pessolania,Ã

aLaboratory of Cellular Microbiology, Department of Mycobacterioses - Oswaldo Cruz Institute, Oswaldo Cruz Foundation – FIOCRUZ, Av. Brasil 4365 – Manguinhos, 21040-900 Rio de Janeiro, RJ, Brazil bInstituto de Bioquı´mica Me´dica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ 21941-590, Brazil

Received 20 November 2006; received in revised form 5 May 2007; accepted 12 May 2007

Abstract

Although proteases are recognized as important virulent factors in pathogenic microorganisms, little information is available so far regarding the potential role of these enzymes in diseases caused by mycobacteria. Here we use bioinformatic tools to compare the protease-coding genes present in the genome of Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis and Mycobacterium avium paratuberculosis. This analysis allowed a review of the nomenclature of the protease family present in mycobacteria. A special attention was devoted to the ‘decaying genome’ of M. leprae where a relatively high level of conservation of protease-coding genes was observed when compared to other genes families. A total of 39 genes out of the 49 found in M. bovis were identified in M. leprae. Of relevance, a core of well-conserved 38 protease genes shared by the four species was defined. This set of proteases is probably essential for survival in the host and disease outcome and may constitute novel targets for drug development leading to a more effective control of mycobacterial diseases. r 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Keyword: Mycobacteria; Proteases; Bioinformatics; Comparative genomics; Pathogenesis

Contents

Acknowledgments ...... 6 References ...... 6

Infections caused by species of the genus Mycobacterium that together account for 64% of the leprosy prevalence still adversely affect the life of millions worldwide. rate and 78% of annual new cases [2]. Additionally, Tuberculosis alone, caused by Mycobacterium tuberculosis, infections in immunocompromised individuals caused by is responsible for 2–3 million deaths annually. Efforts to opportunistic mycobacterial species such as Mycobacter- control it have been faced with a variety of obstacles ium avium and Mycobacterium intracellulare belonging to including the inefficiency of the BCG vaccine in preventing the M. avium complex have gained epidemiological tuberculosis and the emergence of multidrug resistant importance since the emergence of AIDS [3]. These strains [1]. At the same time, leprosy, caused by Myco- infections are difficult to control due to the natural bacterium leprae, is still a major public health concern, resistance of these mycobacterial species to antibiotics that particularly in countries such as Brazil, Ethiopia, and India are effective against M. tuberculosis and M. leprae. Likewise, tuberculosis in bovines, caused by Mycobacter- ÃCorresponding author. Tel.: +55 21 2598 4467; fax: +55 21 2270 9997. ium bovis, capable of provoking the disease in humans as E-mail address: cpessola@ioc.fiocruz.br (M.C.V. Pessolani). well, remains a major health challenge in the international

0882-4010/$ - see front matter r 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.micpath.2007.05.010

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara˜es ML, Pessolani MCV. Comparative genomics of mycobacterial proteases. Microb Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.010 ARTICLE IN PRESS 2 M.L. Ribeiro-Guimara˜es, M.C.V. Pessolani / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]] trade of and animal products, causing significant pepB, ML0997—hflX, ML1486—pepN, ML1538—mycP5, economic loss to the industry as a whole [4]. This and ML2528—mycP3. The nomination of the three genes discouraging scenario urgently demands short-term but encoding predicted HtrA-like proteases was also revised effective tools for controlling the spread of mycobacterial based on further bioinformatics analysis using the site infections as quickly as possible. Merops—the peptidase database [18]. ML0176, ML1078 In this review, a comparative genomics analysis of the and ML2659, which homologs in M. tuberculosis were protease-coding genes predicted in the sequenced myco- originally designated as pepD, htrA and pepA, respectively, bacterial was performed. The idea was to generate were now more appropriately designated as htrA2, htrA3 a useful data for those working on proteases. We focused and htrA4. Actually, recent experimental data on the on proteases based on their critical roles in bacterial recombinant ML0176 product indicate an optimal enzy- pathogenesis [5], and the absent of a detail comparison of matic activity at 45–55 1C, reinforcing the idea that this protease-coding genes across mycobacterial genomes. constitutes a HtrA-like protease (M. L. Ribeiro- Moreover, proteases constitute potential good targets for Guimara˜es, unpublished results). the development of novel anti-mycobacterial drugs, an The complete group of protease genes found in each urgent need in the mycobacterial field. of the mycobacterial genomes here analyzed is listed in So far the entire genome sequences of M. leprae [6], Table 1. These genes were grouped according to their M. tuberculosis [7,8], M. bovis [9],andM. avium paratuber- function. A summary of the differences in protease genes culosis str. K10 [10] have been deciphered, and of another found across the four mycobacterial species are better 11 are at various stages of completion [11]. By comparing visualized in Fig. 1. When compared to other gene families, general genome features, the most striking feature found a relatively high level of preservation of protease-coding was the extensive deletion and inactivation of genes genes was observed in the genome of M. leprae [13]. A total observed in the leprosy bacillus chromosome, a process of 39 genes were identified in M. leprae, 38 of them termed reductive evolution [12]. Since diverging from the constituting a core of conserved protease genes found last common mycobacterial ancestor, the leprosy bacillus across all four species with homology ranging from 63% to may have lost over 2000 genes, defining the minimal gene 97%. A quite similar set of proteases composed of 43 genes set for a pathogenic mycobacteria [13]. Thus, the precise was found in M. avium paratuberculosis, reinforcing analysis of the M. leprae protease-coding genes could previous analysis indicating a closer phylogenetic proxi- provide clues about the group of essential genes necessary mity between M. leprae and M. avium paratuberculosis as for intracellular survival and disease outcome. compared to the M. tuberculosis complex [21]. All the genes A comparative analysis of the protease-coding genes was present in M. leprae and M. avium paratuberculosis were performed using the Basic Local Alignment Search Tool shared with M. tuberculosis and M. bovis. One gene present (BLAST) [14]. M. leprae, M. tuberculosis H37Rv, and in M. leprae, ML2613—a probable metalloprotease, was M. bovis AF2122 CDS were predicted and annotated by not found in M. avium paratuberculosis. The Welcome Trust Sanger Institute [15]. The sequence of Forty-nine genes were found in M. bovis, all shared M. avium paratuberculosis str. K10 chromosome has been with M. tuberculosis (Fig. 1). Rv1977, a gene coding completed by the University of Minnesota [16]. A search was for a putative iminopeptidase that probably acts as a initiated at the mycobacterial databases of the Pasteur Zn-dependent enzyme with chaperone function, was found Institute (Paris, France) [17] by way of protease, peptidase, only in M. tuberculosis. Another feature only found in the and inputs. Databases were constructed with these M. tuberculosis H37Rv strain was related to the ptrB gene output results, which were used as templates to identify the coding for the oligopeptidase B, a gene first characterized homologues present in M. avium paratuberculosis str. K10 in Escherichia coli and probably involved in host cell genome using the BLASTP program in conjunction with the invasion [22]. A single ptrB gene coding for a protein with BLOSUM-62 weight matrix. Validation of the results was around 700 amino acids was found in M. leprae, M. avium based on predictors of the protein domain/motif Pfam, paratuberculosis, M. tuberculosis CDC 1555 strain and InterPro, and Prosite. Gene products were considered M. bovis. In contrast, this gene was split into two open homologs when their identity was equal or over 60%. reading frames in the genome of M. tuberculosis H37Rv We examined closely the genome of M. leprae and a strain, Rv0781 and Rv0782, and denominated ptrBa and review of the genes annotated as proteases was performed. ptrBb, respectively. In fact, this was the only difference Besides the 32 protease genes originally grouped into the found between M. tuberculosis H37Rv and M. tuberculosis functional sub-class II.B.3—proteins, peptides and glyco- CDC 1555 strains in the context of protease-coding genes. peptides, 12 additional protease genes were found. These The protease genes missing in at least one of the genes were ML0222 or ftsH, ML0691 or dacB1, ML1199 mycobacterial genomes analyzed probably play redundant or lspA, ML1339, ML1582, ML1612 or lepB, ML1632, roles or are responsible for differences in the pathogenesis ML1633, ML2278 or htpX, ML2295, ML2490 or clpB between the species. One example is the family of mycosin and ML2704. Additionally, an update of gene nomination (myc) genes. Five myc genes are found in M. tuberculosis was performed based on the nomenclature used for with identity ranging from 40% to 47%, suggesting that M. tuberculosis, as followed: ML0041—mycP1, ML0864— they probably arose through gene duplication. Individual

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara˜es ML, Pessolani MCV. Comparative genomics of mycobacterial proteases. Microb Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.010 ARTICLE IN PRESS M.L. Ribeiro-Guimara˜es, M.C.V. Pessolani / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]] 3

Table 1 Protease-coding genes in M. tuberculosis, M. bovis, M. avium paratuberculosis and M. leprae genomes

Protein name M. leprae Sanger M. tuberculosis M. bovis AF2122 M. avium Comments about function IDa H37Rv Sanger Sanger IDa paratuberculosis str. IDa k10 UM IDb

Aminohydrolases AmiA1 ML0709 Rv3305c Mb3333c – Involved in cellular metabolism. It hydrolyses (P) 77%c 77%c l-amino acid and amides AmiB1 ML0708 Rv3306c Mb3334c (P) 73% 73% – MapA ML1831c Rv0734 Mb0755 MAP4200 Removes the amino-terminal methionine from 72% 72% 80%c nascent proteins MapB ML1576cd Rv2861c Mb2886c MAP2934c 89% 89% 92% Probable (penicillin-binding protein) DacB1 ML0691c Rv3330 Mb3363 MAP3448 Involved in peptidoglycan synthesis (at final 77% 77% 80% stages). It hydrolyzes the bound D-alanyl-D- DacB2 – Rv2911 Mb2935 MAP2979 alanine Metalloproteases FtsH ML0222 Rv3610c Mb3640c MAP0448 FtsH is a probable membrane-bound protease 86% 86% 91% (cell division protein). Thought to act as an Gcp ML0379e Rv3419c Mb3453c MAP4263 ATP-dependent Zn2+ metallopeptidase. 80% 80% 88% Probably it has a regulatory role in stress – ML2613c Rv0198c Mb0204c – response and specific protein secretion for 79% 79% adaptation to host environment. Gcp is probable a O-sialoglycoprotein endopeptidase. It hydrolyzes O- sialoglycoproteins

Chaperonins ClpB ML2490c htpM, Rv0384c Mb0391c MAP3853 Clp family cleaves peptides in various proteins 85% 85% 90% in a process that requires ATP hydrolysis. It ClpC ML0235d,e Rv3596c Mb3627c MAP0461 plays a major role in the degradation of 91% 91% 96% misfolded proteins. It shows a chymotrypsin- ClpX ML1477c Rv2457c Mb2484c MAP2278c like activity. ClpB—thought to be an ATPase 94% 94% 96% subunit of an intracellular ATP-dependent ClpX0 – Rv2667 Mb2686 MAP2787 protease. It seems to be regulated positively by ClpP2 ML1479cd Rv2460c Mb2487c MAP0426c sigH (Rv3223c product) and negatively by 92% 92% 97% hspR (Rv0353 product) ClpP1 ML1480c Rv2461c Mb2488c MAP2281c 95% 95% 90% Probable GTP-binding protein HflX ML0997 Rv2725c Mb2744c MAP2839c Possibly a putative GTPase, modulating 76% 76% 83% activity of HflK and HflC proteins Mycosins MycP1 ML0041e Rv3883c Mb3913c MAP4239c 69% 69% 41% MycP2 ML0037 Rv3886c Mb3916c – Probable membrane-anchored proteins. (P) 83% 83% Thought to have proteolytic activity. They are expressed during infection of macrophages MycP3 ML2528c Rv0291 Mb0299 MAP3787 68% 68% 67% MycP4 – Rv3449 Mb3479 MAP4239c MycP5 ML1538c Rv1796 Mb1824 MAP1511 63% 63% 67% HtrAs HtrA3 ML1078 Rv1223 Mb1255 MAP2555c HtrA or DegP is a family of heat-shock 72% 72% 80% proteins that is required for growth at elevated HtrA4 ML2659e MTB32A, Mb0130 MAP3527 temperatures, probably functioning in the Rv0125 degradation of unfolded proteins. 69% 69% 72%

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara˜es ML, Pessolani MCV. Comparative genomics of mycobacterial proteases. Microb Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.010 ARTICLE IN PRESS 4 M.L. Ribeiro-Guimara˜es, M.C.V. Pessolani / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]]

Table 1 (continued )

Protein name M. leprae Sanger M. tuberculosis M. bovis AF2122 M. avium Comments about function IDa H37Rv Sanger Sanger IDa paratuberculosis str. IDa k10 UM IDb

HtrA2 ML0176e MTB32B, Mb1009 MAP0918 Rv0983 70% 70% 79% Peps PepB ML0864c Rv2213 Mb2236 MAP1953 PepB, PepC and PepN are probable 76% 76% 78% . They hydrolyze peptides and/ PepC ML2213c Rv0800 Mb0823 MAP0632 or proteins. PepE and PepQ are probable 76% 76% 79% peptidases. PepR is a probable zinc protease. PepE ML1136 Rv2089c Mb2116c MAP1823c (P) 73% 73% 75% PepN ML1486 Rv2467 Mb2494 MAP2287 76% 76% 82% PepQ ML0521e Rv2535c Mb2564c MAP1096 77% 77% 77% PepR ML0855 Rv2782c Mb2805c MAP2890 74% 74% 83% Proteasomes PrcA ML1323f Rv2109c Mb2133c MAP1834c Proteasome subunits 86% 86% 86% PrcB ML1322f Rv2110c Mb2134c MAP1835c 73% 73% 81% Probable protease II (oligopeptidase B) PtrB ML2226 PtrBa, Rv0781 Mb0804 MAP0615 Cleaves peptide bonds on the C-terminal side PtrBb, Rv0782 of lysyl and argininyl residues 77% 77% 75% Possible protease IV (endopeptidase IV) signal peptide peptidase SppA ML1839cd Rv0724 Mb0745 MAP4188 Involved in the of the cleaved signal 72% 72% 72% peptide. This activity is necessary to maintain proper secretion of mature proteins across the membrane

Probable protease – ML2704 Rv3915 Mb3946 MAP4341 86% 86% 85% – ML2295c Rv3668c Mb3692c MAP0406 80% 80% 77% – ML1288 Rv2141c Mb2165c MAP1886c 85% 85% 85% – ML2382c Rv0457c Mb0466c – (P) 73% 73%

Probable SsrA-binding protein SmpB ML0671 Rv3100c Mb3127c MAP3170c 84% 84% 84% Possible membrane-associated serine protease – ML2298c Rv3671c Mb3695c MAP0403 Probable hydrolyses peptides and/or proteins 63% 63% 82% (possibly cleaved preferentially after serine residue) Possible intermembrane cleaving protease – ML1582c Rv2869c Mb2894c MAP2939c 80% 84% 83% Probable protease transmembrane heat shock protein Htpx HtpX ML2278 Rv0563 Mb0578 MAP4059 Possibly involved in adaptation. It hydrolyzes 83% 83% 89% specific peptides and/or proteins Iminopeptidases Pip – Rv0840c Mb0863c MAP0684c – – Rv1977 – –

Pyrrolidone-carboxylate peptidase Pcp – Rv0319 Mb0327 –

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara˜es ML, Pessolani MCV. Comparative genomics of mycobacterial proteases. Microb Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.010 ARTICLE IN PRESS M.L. Ribeiro-Guimara˜es, M.C.V. Pessolani / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]] 5

Table 1 (continued )

Protein name M. leprae Sanger M. tuberculosis M. bovis AF2122 M. avium Comments about function IDa H37Rv Sanger Sanger IDa paratuberculosis str. IDa k10 UM IDb

Protein and peptide secretion LepB ML1612c Rv2903c Mb2927c MAP2971c LepB is probable a signal peptidase I (Spase I 70% 70% 71% or leader peptidase I). It cleaves the N- LspA ML1199 Rv1539 Mb1566 MAP1250 terminal leader sequences from secreted 69% 69% 90% protein precursors. LspA is probable a signal peptidase II. It specifically catalyzes the removal of signal peptides from prolipoproteins Probable secreted protease – ML1339c Rv2672 Mb2691 MAP2792 67% 67% 78% – ML1632c Rv2223c Mb2247c MAP1967c 72% 72% 78% – ML1633cd Rv2224c Mb2248c MAP1968c 80% 80% 85%

Proteases in bold are conserved across the species. P, pseudogene. aThe Sanger ID refers to (http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_leprae [15]). bThe UM ID refers to (http://www.cbc.umn.edu/ResearchProjects/AGAC/Mptb/Mptbhome.html [16]). cPercentages refer to protein sequence identity related to the M. leprae homologue. dIdentified in M. leprae by proteomic studies (unpublished results). eExpression shown in M.leprae by transcription analysis [19]. fIdentified in M. leprae by proteomic studies [20].

M. bovis DacB2 PepE Pcp (11) MycP2 AmiA1 MB0204c AmiB1 Pip MB0466c MycP4 ClpX’

ClpX’ ML2613A 38 PepE MycP4 DacB2 Pip M. leprae (1) M. avium paratuberculosis (5) Pip PepE Rv0198 Rv1977 ClpX’PtrBa DacB2 MycP4 MycP2 Rv0457 AmiA1 Pcp AmiB1 M. tuberculosis (13)

Fig. 1. Comparative analyses of mycobacterial protease-coding genes. The diagram shows a central circle that represents the core of preserved proteases shared by M. leprae, M. tuberculosis, M. bovis and M. avium paratuberculosis. The protease genes found in individual genomes that are not conserved across the species are represented in the peripheral triangles. Their sizes are related to the number of these genes indicated in parenthesis. The codes for the genes are: Underline—genes shares by M. tuberculosis, M. bovis and M. avium paratuberculosis, and absent in M. leprae. Italics—common genes between M. tuberculosis and M. bovis and absent in M. leprae and M. avium paratuberculosis. Bold—specific gene of M. tuberculosis. A—gene present in M. leprae, but not shared with M. avium paratuberculosis.

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara˜es ML, Pessolani MCV. Comparative genomics of mycobacterial proteases. Microb Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.010 ARTICLE IN PRESS 6 M.L. Ribeiro-Guimara˜es, M.C.V. Pessolani / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]] myc genes are part of five RD (region of difference) found [5] Travis J, Potempa J, Maeda H. Are bacterial proteinases pathogenic in the bacterial chromosome [23]. Two of these genes factors? Trends Microbiol 1995;3:405–7. are missing in M. leprae: mycP2 (ML0037) is a pseudogene [6] Cole ST, Eiglmeier K, Parkhill J, James KD, Thomson NR, Wheeler PR. Massive gene decay in the leprosy bacillus. Nature 2001;409: and mycP4 is deleted. Actually, the complete set of 1007–11. genes constituting the RD2 region is missing, and in the [7] Cole ST, Brosch R, Parkhill J, Garnier T, Churcher C, Harris D. RD4 region only one gene (ML0363) is present in M. leprae Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the [24]. Another gene absent in M. leprae, but present in complete genome sequence. Nature 1998;393:537–44. M. tuberculosis, clpX0, shares significant homology with [8] Camus JC, Pryor MJ, Medigue C, Cole ST. Re-annotation of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Microbiol- clpC, suggesting that is also a case of gene duplication. The ogy 2002;148:2967–73. 0 protease ClpX requires ATP and seems to play a major [9] Garnier T, Eiglmeier K, Camus JC, et al. The complete genome role in the degradation of misfolded proteins showing a sequence of Mycobacterium bovis. Proc Natl Acad Sci USA chymotrypsin-like activity. 2003;100:7877–82. The comparison of the genomes of mycobacterial species [10] Lingling L, Bannantine JP, Zhang Q, Amonsin A, May BJ, Alt D, et al. The complete genome sequence of Mycobacterium avium provides an efficient mean of identifying the genetic basis subspecies paratuberculosis. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102: of the differences in host range, phenotype and pathogeni- 12344–9. city of these inherently difficult to manipulate bacteria [13]. [11] /http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgiS In this work, for the first time, a comparison of protease- [12] Vissa VD, Brennan PJ. The genome of Mycobacterium leprae:a coding genes present in the genomes of four species of minimal Mycobacterial gene set. Genome Biol 2001;28:10231–8 [Review]. mycobacteria was performed, including the most relevant [13] Eiglmeier K, Parkhill J, Honore´N, et al. The decaying genome of pathogenic species M. leprae and M. tuberculosis. This Mycobacterium leprae. Lepr Rev 2001;72:387–98. comparison allowed the identification of a group of 38 [14] Altschul SF, Gish W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment well-conserved proteases shared by the four species and search tool. J Mol Biol 1999;215:403–10. / S probably essential for in vivo survival and pathogenecity. [15] http://www.sanger.ac.uk/Projects . [16] /http://www.cbc.umn.edu/ResearchProjects/AGAC/Mptb/Mptbhome. In order to further clarify the role of proteases in htmlS. mycobacterial diseases, in a companion article, we focused [17] /http://www.pasteur.fr/recherche/unites/Lgmb/mycogenomics.htmlS. on five of these genes and showed that they are expressed in [18] Rawlings ND, Morton FR, Barrett AJ. MEROPS: the peptidase human leprosy lesions [25]. database. Nucleic Acids Res 2006;34:D270–2. [19] Williams DL, Torrero M, Wheeler PR, Truman RW, Yoder M, Morrison N, et al. Biological implications of Mycobacterium leprae Acknowledgments gene expression during infection. J Mol Microbiol Biotechnol 2004;8: 58–72. We are most grateful to the Fundac-a˜o Carlos Chagas [20] Marques MA, Espinosa BJ, Xavier da Silveira EK, Pessolani MC, Filho de Amparo a` Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Chapeaurouge A, Perales J, et al. Continued proteomic analysis of Mycobacterium leprae subcellular fractions. Proteomics 2004;4: (FAPERJ) for supporting this study. M.L.R.G was a 2942–53. recipient of a fellowship from the Conselho Nacional de [21] Brosch R, Pym AS, Gordon SV, Cole ST. The evolution of Desenvolvimento Cientı´fico e Tecnolo´gico (CNPq). We mycobacterial pathogenicity: clues from comparative genomics. would also like to thank Judy Grevan for editing the text. Trends Microbiol 2001;9:452–8. [22] Pacaud M, Richaud C. Protease II from Escherichia coli. J Biol Chem 1975;250:7771–9. References [23] Brown GD, Dave JA, Gey van Pittius NC, Stevens L, Ehlers MRW, Beyers AD. The mycosins of Mycobacterium tuberculosis H37Rv: [1] /http://www.who.int/topics/tuberculosis/en/S. a family of subtilisin-like serine proteases. Gene 2000;254: [2] Lockwood DN, Suneetha S. Leprosy: too complex a disease for a 147–55. simple elimination paradigm. Bull World Health Organ [24] Gey Van Pittius NC, Gamieldien J, Hide W, Brown GD, Siezen RJ, 2005;83:230–5 [Review]. Beyers AD. The ESAT-6 gene cluster of Mycobacterium tuberculosis [3] Garcı´a Garcı´a JM, Palacios Gutierrez JJ, Sanchez Antuna˜AA. and other high G+C Gram-positive bacteria. Genome Biology Respiratory infections caused by environmental mycobacteria. Arch 2001;2:0044.1–0044.18. Bronconeumol 2005;41:206–19. [25] Ribeiro-Guimara˜es ML, Tempone AJ, Amaral JJ, Nery JA, Antunes [4] Biet F, Boschiroli ML, Thorel MF, Guilloteau LA. Zoonotic aspects SLG, Pessolani MCV. Expression analysis of proteases of Myco- of Mycobacterium bovis and Mycobacterium avium—intracellulare bacterium leprae in human skin lesions. Microb Pathlog 2007; in complex (MAC). Vet Res 2005;36:411–36 [Review]. press, doi:10.1016/j.micpath.2007.05.011.

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara˜es ML, Pessolani MCV. Comparative genomics of mycobacterial proteases. Microb Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.010 ARTICLE IN PRESS

MICROBIAL PATHOGENESIS Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]] www.elsevier.com/locate/micpath Short communication Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human skin lesions

Michelle Lopes Ribeiro-Guimara˜esa,b, Antonio Jorge Temponea, Julio Jablonski Amarala,b, Jose Augusto Nerya, Sergio Luiz Gomes Antunesa, Maria Cristina Vidal Pessolania,Ã

aLaboratory of Cellular Microbiology, Department of Mycobacterioses-Oswaldo Cruz Institute, Oswaldo Cruz Foundation – FIOCRUZ, Av. Brasil 4365 – Manguinhos, 21040-900 Rio de Janeiro, RJ, Brazil bInstituto de Bioquı´mica Me´dica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ 21941-590, Brazil

Received 20 November 2006; received in revised form 5 May 2007; accepted 12 May 2007

Abstract

Proteases are commonly involved in bacterial pathogenesis and their inhibition has represented a successful therapeutic approach to treat infectious diseases. However, there is little information on the role of proteases in the pathogenesis of Mycobacteria. Five of these genes, three coding for putative secreted proteases, were selected in the present study to investigate their expression in Mycobacterium leprae isolated from skin biopsies of multibacillary leprosy patients. Via nested-PCR, it was demonstrated that mycP1 or ML0041, htrA2 or ML0176, htrA4 or ML2659, gcp or ML0379 and clpC or ML0235 are transcribed in vivo during the course of human infection. Moreover, the expression of Gcp in leprosy lesions was further confirmed by immunohistochemistry using a specific hyperimmune serum. This observation reinforces the potential role of mycobacterial proteases in the context of leprosy pathogenesis. r 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Keywords: Mycobacterium leprae; Proteases; Leprosy; Expression; Lesion; RT-PCR

1. Introduction Leprosy, one of the oldest recorded diseases, remains an important cause of morbidity with approximately 219,826 Proteases are commonly involved in bacterial pathogen- new cases per year (www.who.int/lep). Mycobacterium esis and their inhibition has represented a successful leprae, the causative agent of leprosy, is a slow growing, therapeutic approach against several microorganisms. For obligate, intracellular pathogen that is unique among many years, it was believed that their main function was bacterial pathogens in its ability to invade the peripheral the acquisition of nutrients for growth and proliferation in nervous system. This unique tissue tropism is the basis of the host tissue. However, recent observations have the characteristic nerve damage associated with leprosy, indicated that pathogen-derived proteolytic enzymes may often leading to peripheral neuropathy, a serious sequel of also play important roles as virulent factors to ensure leprosy and common in endemic countries. Treatment of successful colonization of microbes within a hostile host patients with multidrug therapy, a combination of the environment [1]. These roles include the deregulation of antibiotics rifampicine, dapsone and clofazimine, success- critical host processes such as activation of cascade fully achieves bacteriological sterility, but only partially pathways, disruption of cytokine networks, excision of cell reverses or prevents loss of nerve-function in patients. surface receptors, turnover and modification of cellular Thus, a better understanding of the disease mechanisms is proteins, and inactivation of host proteinase inhibitors [2]. needed to develop new tools for prevention and treatment Even so, it is surprising that to date only a few proteases in of nerve damage in leprosy (www.who.int/lep). Mycobacteria have been investigated [3]. Although M. leprae was the first bacterium to be described as a causing agent of a human infectious ÃCorresponding author. Tel.: +55 21 2598 4467; fax: +55 21 2270 9997. disease in 1873, deciphering the biology of this bacterium E-mail address: cpessola@ioc.fiocruz.br (M.C.V. Pessolani). has constituted one of the greatest challenges for

0882-4010/$ - see front matter r 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.micpath.2007.05.011

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara˜es ML, et al. Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human skin lesions. Microb Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.011 ARTICLE IN PRESS 2 M.L. Ribeiro-Guimara˜es et al. / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]] microbiologist over time due to its unique features. other hand, codes for a probable glycoprotease, which Recently, the sequence of the M. leprae chromosome was orthologue in Pasteurella spp. has been implicated in completed [4]. By comparing general genome features, the virulence [7]. And, lastly, analysis of the clpC gene was most striking feature observed in the leprosy bacillus included as a positive control in view of a previous study chromosome was the extensive deletion and inactivation of demonstrating the presence of specific antibodies to this genes, a process termed reductive evolution. Since diver- protein in serum samples of leprosy patients, suggesting ging from the last common mycobacterial ancestor, the that M. leprae expresses this gene during infection [8]. The leprosy bacillus may have lost over 2000 genes, defining the expression of these genes was investigated by RT-PCR in minimal gene set for a pathogenic mycobacteria [5]. Thus, M. leprae derived from a pool of leprosy skin lesions. Total the precise analysis of M. leprae functional genes could bacterial RNA was isolated and converted into cDNA. provide clues about the group of essential genes necessary PCR reactions were conducted in the presence of protease- for intracellular survival and disease outcome. specific primers designed to amplify the full open reading In an accompanying review [6], a comparative genomics frame of the selected genes. Fig. 1A shows that only the revealed a high degree of preservation of the protease- clpC transcript was detected after the first round of coding genes found in Mycobacterium tuberculosis in the amplification. Nested-PCR with internal primers was then degenerate chromossome of M. leprae. Looking for a conducted using the PCR products allowing the detection better definition of the roles of these enzymes in of mycP1, htrA2, htrA4 and gcp transcripts, which mycobacterial pathogenesis, in the present study we confirmed their in vivo transcription (Fig. 1B). These investigated the expression of five of these genes during results are consistent with recent data showing that these the course of leprosy. ORFs are also transcribed during M. leprae infection in nude mouse foot pads as detected by cross-species DNA 2. Results and discussion microarray and RT-PCR analyses [9]. More recently, the expression of ClpC and Gcp proteins was confirmed 2.1. Expression of M. leprae putative proteases in infected by proteome analysis of armadillo-derived M. leprae human tissue (Marques et al., unpublished results). We were able to go further and confirm the expression of We evaluated the expression in human leprosy lesions of one of these genes at the protein level during the course of five protease-coding genes, namely: mycP1 (ML0041), leprosy. For this purpose, the gcp gene was cloned, and the htrA2 (ML0176), htrA4 (ML2659), gcp (ML0379), and recombinant protein was produced in Escherichia coli using clpC (ML0235). These genes were selected on the basis of the Gateway cloning and expression system. The His- their potential role in leprosy pathogenesis. The genes tagged recombinant Gcp (rGcp) was purified in a Ni-NTA mycP1, htrA2,andhtrA4 code for putative secreted column and the purified protein was used to generate a proteases since their ORFs include typical signal sequences specific hyperimmune serum in mice. Fig. 2A shows the (http://genolist.pasteur.fr/M_leprae), and as such are at the specificity of the anti-rGcp serum, monitored by western site of the host–pathogen interface. The gene gcp, on the blot. A single band with the expected Mw of 35.5 kDa was

ML0235 Kb ML0041 ML0176 ML2659 ML0379 Kb 3,054 2,036 1,018

1,636 1,018 506

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Fig. 1. Transcription of the protease-coding genes clpC, mycP1, htrA2, htrA4, and gcp by M. leprae during the course of human infection monitored by RT-PCR. Products of RT-PCR from bacterial RNA isolated from biopsies of leprosy patients were analyzed in an ethidium bromide-stained agarose gel. (A) Lane 1: molecular-size marker; lane 2: amplification of clpC from M. leprae cDNA; lane 3: amplification of clpC from mock M. leprae cDNA; lane 4: amplification of clpC from human DNA; and lane 5: negative control reaction without template. (B) Lanes 1, 6, 11, and 16—molecular-size markers; lanes 2, 7, 12, and 17—first amplification reaction of ML0041, ML0176, ML2659, and ML0379, respectively from M. leprae cDNA; lanes 3, 8, 13, and 18— nested-PCR from products of the first amplification of ML0041, ML0176, ML2659, and ML0379, respectively; lanes 4, 9, 14, and 19—nested-PCR from mock M. leprae cDNA; and, finally, lanes 5, 10, 15, and 20—RT-PCR of ML0041, ML0176, ML2659, and ML0379, respectively from human DNA.

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara˜es ML, et al. Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human skin lesions. Microb Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.011 ARTICLE IN PRESS M.L. Ribeiro-Guimara˜es et al. / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]] 3

pathway. The snm genes are located in the neighborhood KD 12 1 2 of the esat-6 and cfp-10 genes in the RD1 region [10]; and mycP1 (snm8) is part of the snm pathway. This whole region is preserved in the M. leprae genome, except for the snm5 gene (ML0057)—a pseudogene. A genetic analysis of this locus in Mycobacterium smegmatis revealed that ESAT-6 and CFP-10 secretion requires the gene mycP1 rGcp [11]. The link between RD1 and M. tuberculosis virulence has been demonstrated experimentally. Deletions in this region result in an attenuation in cultured macrophages and mice [12]. In leprosy patients, the in vivo expression of sgd sgd ESAT-6 and CFP-10 has been indirectly demonstrated by the presence of a specific immune response against these proteins [13]. This observation is in agreement with our Fig. 2. In situ immunohistochemical expression of the Gcp protease on a demonstration that MycP1 is expressed during the course multibacillary cutaneous leprosy lesion. (A) Crude extracts of uninduced of leprosy, making possible the secretion of ESAT-6 and (lane 1) or arabinose-induced cells (lane 2) were prepared and analyzed by CFP-10, which probably contribute to the pathogenesis of SDS-15% PAGE stained with Coomassie blue (left panel) or transferred to a nitrocellulose membrane and blot was incubated with a anti-Gcp the disease. specific antibody (right panel). (B) Granular Gcp-immunoreactivity A functional class of proteases that are conserved in (brownish red color, arrows) was observed in the cytoplasm of M. leprae despite an extreme reduction in number of genes macrophages infiltrating the perianexial space, among sweat gland ducts are the heat shock-induced serine proteases HtrAs or Deg. (sgd). Streptavidin-biotin immunoperoxidase staining of a cryostat section This class includes the proteins ML0176, ML1078 and of skin biopsy with polyclonal anti-Gcp. Scale bar ¼ 25 mm. ML2659, originally designated as pepD, htrA and pepA, respectively. In the accompanying review, the nomination detected in total lysates of the recombinant E. coli BL21- of the three genes encoding predicted HtrA-like proteases AITM clone expressing M. leprae rGcp upon induction with was revised based on bioinformatics and more appro- 0.2% L(+)-arabinose, but not in the uninduced clone. priately designated as htrA2, htrA3 and htrA4, respectively. Tissue sections from biopsies of three lepromatous leprosy These proteases are considerably similar sharing over 30% patients and one borderline tuberculoid were then im- identity. Required for E. coli growth at elevated tempera- munostained with the specific anti-rGcp serum. Fig. 2B tures, HtrA proteases are involved in the degradation of shows the Gcp-immunoreactivity in one of these biopsies. abnormal periplasmic proteins. The HtrA family shares a Expression of Gcp protease could be detected on the modular architecture composed of an N-terminal segment bacilli-loaded macrophages of the borderline lepromatous believed to have regulatory functions, a conserved trypsin- lesions. Instead, the borderline tuberculoid leprosy lesion like protease domain, and one or two PDZ domains that was not immunopositive, probably because tuberculoid mediate specific protein–protein interactions and preferen- patients can clear M. leprae more effectively, so that bacilli tially bind three to four residues of the target protein to its are rarely found in this clinical form. The biopsy with C-terminal region (http://www.expasy.org/sprot). Muta- normal histological appearance showed no immunoreac- tions in the htrA gene may cause susceptibility to heat and tive pattern on its sections. These results demonstrate that oxidative stress, as in E. coli, Brucella abortus, and the Gcp protease is expressed by M. leprae in inflammatory B. melitensis, or loss of virulence, as in Salmonella macrophages of lepromatous cutaneous lesions. typhimurium [14]. Moreover, Flannagan et al., 2007. [15] The specific functions of these proteases in the biology defined HtrA protease in Burkholderia cenocepacia that is and pathogenesis of M. leprae remain obscure. MycP1 is required for bacterial survival in vivo and for growth under part of an interesting group of proteases, designated osmotic and long-term thermal stress. Added to this aspect, mycosins. The M. tuberculosis H37Rv genome codes for the M. tuberculosis HtrA4 (so-called MTB32A) has been five mycosins, designated mycosin-1 to 5 (MycP1–MycP5) used as a vaccine complement for tuberculosis in a fusion and annotated as Rv3883c, Rv3886, Rv0291, Rv3449, and of this protein with the MTB39 or Rv1196 that codifies for Rv1796, respectively. The identity of these proteins ranged a protein of the PPE family [16]. from 40% to 47%, suggesting that they probably arose Gcp is the O-sialoglycoprotein endopeptidase (glycopro- through gene duplication. Two of these genes are missing tease), an enzyme conserved within the bacteria. It was first in M. leprae: mycP2 (ML0037) is a pseudogene and mycP4 characterized in Pasteurella haemolytica as secreted pro- is deleted (http://www.sanger.ac.uk/Projects). In the same tease [7]. The host molecules that work as substrates vein, mycP1 belongs to the RD1 region that includes the include the human cell surface glycoproteins glycophorin gene for the 6 kDa early-secreted antigenic target (ESAT-6) A, CD34, CD43, CD44, and CD45; the ligands for P- and and 10 kDa cultured filtrate protein (CFP-10). ESAT-6 and L-selectins; the tumor antigen epitectin; the vascular CFP-10 are efficiently secreted by an alternative secretion adhesion protein VAP-1; platelet glycoprotein Ib; and pathway termed the snm (secretion in mycobacteria) cranin, a brain O-sialoglycoprotein [17].

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara˜es ML, et al. Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human skin lesions. Microb Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.011 ARTICLE IN PRESS 4 M.L. Ribeiro-Guimara˜es et al. / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]]

In conclusion, the data herein described contribute to the 1 min at 72 1C elongation with a final extension step of study of mycobacterial proteases about which so little is 7 min at 72 1C. Fifteen mL of the amplified PCR products known. The extension of this type of research to the entire were applied on 1.5% agarose gel. After electrophoresis the class of proteases would surely lead to the clarification of gel was stained with 0.5 mg/mL ethidium bromide and the their possible involvement in the course of mycobacterial image acquired via Image Masters VDS (Amersham infection, and the potential identification of targets for the Pharmacia Biotech). A 1-kb DNA ladder standard development of new tools in controlling the dissemination (Invitrogen) was used as a size marker. A second round of both M. tuberculosis and M. leprae. of re-amplification was performed using new primers corresponding to an internal nucleotide sequence of the 3. Experimental/materials and methods PCR products generated in the first reaction (Table 1). The PCR reaction mixture and cycling conditions in this round 3.1. Isolation of M. leprae from human skin lesions of nested-PCR reactions (nPCR) were the same, except that 2.5 mL of the PCR product from the first round was Biopsies were collected from four patients with a used as a template. bacteriologic index (BI) of+3.0,+2.0,+4.9 and+4.0 before treatment, and M. leprae was isolated as described 3.3. Preparation of recombinant M. leprae Gcp previously [18]. The procedures described in this study were approved by the Ethics Committee of the Oswaldo Cruz The primers for the gcp gene were constructed to Foundation and all volunteers were required to sign a correspond to the 50 and 30 ends of the open reading frame written consent. previously identified. The sequences of 50 and 30 primers were 50-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT- 3.2. RNA extraction and RT-PCR TCGAAGGAGATAGAACCATGACGATCTCTGCTG- TGCCC-30 and 50-GGGGACCACTTTGTACAAGAAA- Total bacterial RNA was extracted using guanidinium GCTGGGTCTCAATTAATCTGCCTTTT-30, respectively. isothiocyanate–phenol–chloroform (Invitrogen, Carlsbad, The underlined sequences represent the attB1 and attB2 CA, USA). Total amount of RNA was quantified by recombination sites, respectively, incorporated into the ultraviolet absorvance at 260 nm. First-strand cDNA was primers for subsequent cloning. The gene was PCR synthesized by using the total RNA (2–10 mg) as a template amplified from M. leprae genomic DNA with Deep Vent with random hexamers primers (Amersham Pharmacia DNA polymerase. The PCR method was performed as Biotech, Piscataway, USA) with (‘‘good cDNA’’) or described above, except for the annealing temperature that without Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) was 551C. PCR products were gel purified, cloned into the (‘‘mock cDNA’’) according to the manufacturer’s instruc- vector pDONRTM201 and subcloned into the vectors tions. For PCR, the cDNA (1 mL) was amplidied using a pDESTTM17 and pDESTTM14 (Gateway Technology- PTC 100-thermocycler (MJ Research Inc.) in a final Invitrogen), both by site-specific recombination reactions. volume of 25 mL containing 1 mM of each specific primer Recombinant vectors were transformed into electrocompe- for each protease, 0.1 mM dNTPs, and 1 U Taq DNA tent E. coli BL21-AITM. polymerase (Biotools, Edmonton, Alta., Canada). Controls Overexpression and purification of the M. leprae Gcp for PCR consisted of reactions using human DNA, mock protein were performed according to the QIAexpressionist cDNA, and water as a template. The sequences of the manual (QIAGEN). Briefly, E. coli BL21-AITM harboring primers are listed in Table 1. PCR was performed as the plasmid constructs was grown up to an OD600 0.8 in follows: 94 1C for 5 min, followed by 35 thermal cycles of ampicillin-containing Luria–Bertani medium. L(+)-arabi- 1 min at 95 1C denaturing, 1 min at 58 1C annealing, and nose was added to a final concentration of 0.2% and grown

Table 1 Sequences of primers used for amplification of M. leprae protease-coding genes

Sanger IDa/gene Primer’s Sequences (first amplification) Primer’s sequences (second amplification)

ML0041/mycP1 U50AGTAGAATTCGTGCACCGTATCTTG30 U50 TTCATCGAGCGGCTTATTTGC 30 R50ACGTACTCGAGCTGGATTCCTCA30 R50 GCAAATAAGCCGCTCGATGAA 30 ML0176/htrA2 U50GTTGGAATTCATGATTCCGCCCGGT30 U50 CCCCGATTACGATGGGCTCT 30 R50ACAACTCGAGCTCTCGATTATTAAT30 R50 AGAGCCCATCGTAATCGGGG 30 ML2659/htrA4 U50AGATGAATTCATGAGCAGACAACCC30 U50 TCCACCCTGGCCGCCCGTGTT 30 R50GGCCCTCGAGACTATCCGACCGGATG30 R50 AACACGGGCGGCCAGGGTGGA 30 ML0379/gcp U50GGGACTGCAGATGACGATCTCTGCT30 U50 GCAGGTGCGTTCACTTGGG 30 R50CCTGCTCGAGGGCGTCTCTAGCTCA30 R50 CCCAAGTGAACGCACCTGC 30 ML0235/clpCU50GTAAGAATTCATGTTCGAAAGATTT3’ R50CGTTCTCGAGGCTGGATGGCTTGGC3’

aThe Sanger ID refers to (http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_leprae).

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara˜es ML, et al. Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human skin lesions. Microb Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.011 ARTICLE IN PRESS M.L. Ribeiro-Guimara˜es et al. / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]] 5 at 37 1C for another 3 h. Cells were harvested and stored at logarithmic index from 2.7 to 4.7, and from one borderline- 80 1C. For purification, cells were resuspended in 8 M tuberculoid patient were selected for this study. In urea, 0.1 M Na-phosphate, 0.01 M Tris/HCl, pH 8.0 addition, one biopsy from a patient with non-diagnosed (buffer B) and stirred for 1 h at room temperature for cutaneous disease, but whose biopsy had a normal disruption. Debris were removed by centrifugation at histological appearance was collected as a control. The 10,000 g for 15 min at 4 1C and the supernatant was biopsies were conducted at the Souza Arau´jo Outlet Unit, loaded onto a 4 mL Ni-NTA column pre-equilibrated in Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, Brazil. The buffer B. Unbound proteins were removed by washing the skin biopsies were obtained and processed as described column with two column volumes of buffer B, followed by previously [18]. The primary antibody was the anti-rGcp four column volumes of 8 M urea, 0.1 M Na-phosphate, polyclonal antibody (1:50 diluted) obtained from mice 0.01 M Tris/HCl, pH 6.3 (buffer C). The recombinant immunized with M. leprae rGcp as described above. On the protein was eluted with three column volumes of 8 M urea, negative control slides, the primary antibody was replaced 0.1 M Na-phosphate, 0.01 M Tris/HCl, pH 5.9 (buffer D), with normal mouse serum. followed by three column volumes of 8 M urea, 0.1 M Na- phosphate, 0.01 M Tris/HCl, pH 4.5 (buffer E). Purity of Acknowledgments the fractions was checked by SDS-PAGE and western blotting. The purest fractions were pooled and dialyzed We are most grateful to the Fundac-a˜o Carlos Chagas against 0.1 M Na-phosphate, 0.01 M Tris/HCl, pH 8.0 at Filho de Amparo a` Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro 1 4 C to remove urea. The aggregated protein was cen- (FAPERJ) for supporting this study. M.L.R.G. and J.J.A. 1 trifuged at 3200 g for 10 min at 4 C, and the pellet was received fellowships from the Conselho Nacional de resuspended with PBS (10 mM phosphate buffer, pH 7.2, Desenvolvimento Cientı´fico e Tecnolo´gico (CNPq) and 0.15 M NaCl). Protein concentration was measured with - - TM Coordenaca˜o de Aperfeicoamento de Pessoal de Nı´vel the BCA Protein Assay Reagents (Pierce Chemical Superior (CAPES), respectively. We would also like to Company, Rockford, IL, USA) using BSA as standard. thank Judy Grevan for editing the text and Antonio Jose´ da Silva Gonc-alves for technical support. 3.4. Production of anti-Gcp antibodies

To prepare specific antibodies to Gcp, five male Balb/c References mice were injected subcutaneously in the abdomen with [1] Maeda H, Yamammoto T. Pathogenic mechanisms induced by 10–50 mg of rGcp in an emulsion with incomplete Freund’s microbial proteases in microbial infections. Biol Chem Hoppe Seyler adjuvant (0.2 mL per mouse). Three additional injections 1996;377:217–26. were performed in each animal with 15–30 interval days [2] Travis J, Potempa J, Maeda H. Are bacterial proteinases pathogenic between each one. Fifteen days after the last immunization, factors? Trends Microbiol 1995;3:405–7. the sera were examined for antibodies to Gcp by dot blot. [3] Brown GD, Dave JA, Gey van Pittius NC, Stevens L, Ehlers MRW, Beyers AD. The mycosins of Mycobacterium tuberculosis H37Rv: a The mice were boosted again and bled after 10 days. family of subtilisin-like serine proteases. Gene 2000;254:147–55. Antibody specificity was monitored by western blot with [4] Cole ST, Eiglmeier K, Parkhill J, James KD, Thomson NR, Wheeler TM total lisates of recombinant E. coli BL21-AI induced or PR. Massive gene decay in the leprosy bacillus. Nature 2001;409: uninduced with 0.2% L(+)-arabinose. 1007–11. [5] Eiglmeier K, Parkhill J, Honore´N, et al. The decaying genome of Mycobacterium leprae. Lepr Rev 2001;72:387–98. 3.5. SDS-PAGE and immunoblotting analysis [6] Ribeiro-Guimara˜es ML, Pessolani MCV. Comparative genomics of mycobacterial proteases. Microb Pathog (2007), doi:10.1016/j. Proteins were fractionated on SDS-polyacrylamide gel micpath.2007.05.010. electrophoresis [19] and transferred to nitrocellulose as [7] Abdullah KM, Udoh EA, Shewen PE, Mellors A. A neutral described [20]. The membranes were blocked with 2% BSA glycoprotease of Pasteurella haemolytica Al specifically cleaves O-sialoglycoproteins. Infect Immun 1992;60:56–62. in Tris-buffered saline containing Tween 20 (TBS/T) [8] Misra N, Habib S, Ranjan A, Hasnain SE, Nath I. Expression and (10 mM Tris–HCl pH 8.0, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween functional characterisation of the clpC gene of Mycobacterium leprae: 20). Membranes were incubated with the anti-rGcp serum ClpC protein elicits human response antibody response. Gene (1:1000). The membranes were then washed three times 1996;172:99–104. with TBS/T and incubated with appropriate alkaline [9] Williams DL, Torrero M, Wheeler PR, Truman RW, Yoder M, Morrison N, et al. Biological implications of Mycobacterium leprae phosphate-conjugated secondary antibodies. The sub- gene expression during infection. J Mol Microbiol Biotechnol strates nitro blue tetrazolium and 5-bromo-4-chloro-3- 2004;8:58–72. indolyl phosphate were used for color development. [10] Skjot RL, Oettinger T, Rosenkrands I, Ravn P, Brock I, Jacobsen S, et al. Comparative evaluation of low-molecular-mass proteins from 3.6. Immunohistochemistry Mycobacterium tuberculosis identifies members of the ESAT-6 family as immunodominant T-cell antigens. Infect Immun 2000;68:214–20. [11] Converse SE, Cox JS. A protein secretion pathway critical for Cutaneous biopsies from three borderline-lepromatous Mycobacterium tuberculosis virulence is conserved and functional in (BL) patients, presenting nodular lesions with baciloscopic Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol 2005;187:1238–45.

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara˜es ML, et al. Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human skin lesions. Microb Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.011 ARTICLE IN PRESS 6 M.L. Ribeiro-Guimara˜es et al. / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]]

[12] Brodin P, Majlessi L, Marsollier L, de Jonge MI, Bottai D, Demangel bovis BCG vaccine is increased by coadministration with the C, et al. Dissection of ESAT-6 system 1 of Mycobacterium Mycobacterium tuberculosis 72-kilodalton fusion polyprotein Mtb72F tuberculosis and impact on immunogenicity and virulence. Infect in M. tuberculosis-infected Guinea Pigs. Infect Immun 2004;72: Immun 2006;74:88–98. 6622–32. [13] Geluk A, van Meijgaarden KE, Franken KLMC, Wieles B, Arend [17] Jiang P, Mellors A. Membrane protein proteolysis assayed by SM, Faber WR, et al. Immunological crossreactivity of the fluorescence quenching: assay of O-sialoglycoprotein endopeptidase. Mycobacterium leprae CFP-10 with its homologue in Mycobacterium Anal Biochem 1998;259:8–15. tuberculosis. Scand J Immunol 2004;59:66–70. [18] Lima CS, Zulianello L, Marques MA, Kim H, Portugal MI, Antunes [14] Sko´rko-Glonek J, Lipinska B, Krzewski K, Zolese G, Bertoli E, Tanfani SL, et al. Mapping the laminin-binding and adhesive domain of the F. HtrA heat shock protease interacts with phospholipid membranes cell surface-associated Hlp/LBP protein from Mycobacterium leprae. and undergoes conformational changes. J Biol Chem 1997;272:8974–82. Microbes Infect 2005;7:1097–109. [15] Flannagan RS, Aubert D, Kooi C, Sokol PA, Valvanoi MA. [19] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of Burkholderia cenocepacia requires a periplasmic HtrA protease for the head of bacteriophage T4. Nature 1970;227:680–5. growth under thermal and osmotic stress and for survival in vivo. [20] Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of Infect Immun 2007;75:1679–89. proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: proce- [16] Brandt L, Skeiky YAW, Alderson MR, Lobet Y, Dalemans W, dure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 1979;76: Turner OC, et al. The protective effect of the Mycobacterium 4350–4.

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara˜es ML, et al. Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human skin lesions. Microb Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.011 ----- Original Message ----- From: "BBA - Proteins and Proteomics (ELS)" < [email protected] > To: < [email protected] > Sent: Friday, August 10, 2007 2:20 PM Subject: BBA - Proteins and Proteomics Submission: Manuscript Number Assigned:BBAPRO-07-307

> Manuscript No.: BBAPRO-07-307 > Title: Cloning, expression, and characterization of an HtrA-like serine > protease produced in vivo by Mycobacterium leprae > Corresponding Author: Dr. Maria Cristina Vidal Pessolani > All Authors: Michelle L Ribeiro-Guimarães, Ph.D.; Eliana B Marengo, Ms.C; Antonio J Tempone, Ph.D.; Julio J Amaral, Ms.C; Clécio F Klitzke, Ph.D.; Erika K Xavier da Silveira, Ph.D.; Fernanda V Portaro, Ph.D.; Maria Cristina Vidal Pessolani, Ph.D. > > Dear Dr. Pessolani, > > Your submission, referenced above, has been assigned the following > manuscript number: BBAPRO-07-307 > > You will be able to check on the progress of your paper by logging on to > the Elsevier Editorial System as an author: > http://ees.elsevier.com/bbapro/ > > On behalf of the Editors, we thank you for submitting your work to BBA - > Proteins and Proteomics. > > Sincerely, > > Rachel Carpenter > Journal Manager > BBA - Proteins and Proteomics > > > Click here to sign-up for the next issue of the BBA Newsletter > http://www.processrequest.com/quickstart/LeadCapture/Display_LeadCapture.as p?e=XbcbcgceBI-RaA&oid=UdfhiCD > (OVHYLHU(GLWRULDO6\VWHP WP IRU%%$3URWHLQVDQG3URWHRPLFV

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Ministério da Saude Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ Lab de Microbiologia Celular Av. Brasil, 4365 – Manguinhos 21.045-900 Rio de Janeiro, RJ

August 10, 2007 Executive Editors: P.F. Cook, A. Fink, F. Lottspeich Biochimica et Biophysica Acta Proteins and Proteomic Section Dear Editors,

I would like to submit the enclosed manuscript “ Cloning, expression, and characterization of an HtrA-like serine protease produced in vivo by Mycobacterium leprae ” by Ribeiro-Guimarães et al. for publication at Biochimica et Biophysica Acta as a regular paper . This study describes for the first time the characterization of a well conserved HtrA serine protease from Mycobacteria. This class of proteases has been shown to be essential for virulence and survival under environmental stress in a wide range of bacterial species. In a previous study we were able to demonstrate that this protease is expressed by M. leprae in human leprosy lesions, reinforcing its potential role in pathogenesis. Our data contribute to the identification of new targets for the development of novel strategies for controlling the dissemination of both leprosy and tuberculosis.

For correspondence, please contact:

Maria Cristina Vidal Pessolani (Fax: 55-21-2270-9997; Tel.: 55-21-2598-4467; e- mail: [email protected]). Laboratory of Cellular Microbiology Oswaldo Cruz Institute Oswaldo Cruz Foundation – FIOCRUZ Av. Brasil 4365 – Manguinhos Rio de Janeiro, RJ Brazil 21040-900

As to the choice of the referees, please we would like to ask you to forward this study to the following experts:

Dr. Vincent Dive Comissariat à l´Energie Atomique, Departement d’Ingenierie et d’Estudes des Proteines, DSV, Saclay, Gif-sur-Yvette, France, phone: (33) 1 69083585, fax: (33) 1 69089071, e-mail address: [email protected] ;

Dr. László Polgár Institute of Enzymology, Biological Research Center, Hungarian Academy of Sciences, H-1518 Budapest 112, P.O. Box 7, Hungary E-mail address: [email protected] .

Dr. Richard Slyden Rocky Mountain Regional Center of Excellence and Department of Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, Fort Collins, CO 80523-1682, and Department of Chemistry, SUNY Stony Brook, Stony Brook, NY 11794-3400 E-mail address: [email protected]

Dr. Diana Williams Molecular Biology Research Department, Laboratory Research Branch, National Hansen's Disease Programs at LSU-SVM, Rm. 3517W, Skip Bertman Drive, Baton Rouge, LA 70803, USA. E-mail address: [email protected]

Yours Sincerely,

Maria Cristina Vidal Pessolani, Ph.D. * Manuscript

Cloning, expression, and characterization of an HtrA-like serine protease produced in

vivo by Mycobacterium leprae

Michelle Lopes Ribeiro-Guimarães 1,2 , Eliana Blini Marengo 3, Antonio Jorge Tempone 1, Julio

Jablonski Amaral 1,2 , Clécio F. Klitzke 3, Erika K. Xavier da Silveira 1, Fernanda Calheta Vieira

Portaro 3, and Maria Cristina Vidal Pessolani 1

1Laboratory of Cellular Microbiology, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ 21040-900,

Brazil; 2 Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de

Janeiro, RJ 21941-590, Brazil; 3Laboratory of Immunochemistry and LETA (Center for

Applied Toxinology Program), Butantan Institute, São Paulo, SP 05503-900, Brazil.

Corresponding author:

Maria Cristina Vidal Pessolani (Fax: 55-21-2270-9997; Tel.: 55-21-2598-4467; e-

mail: [email protected]).

Laboratory of Cellular Microbiology

Oswaldo Cruz Institute

Oswaldo Cruz Foundation – FIOCRUZ

Av. Brasil 4365 – Manguinhos

Rio de Janeiro, RJ

Brazil 21040-900

1 1 Abstract

2

3

4 While members of the high temperature requirement A (HtrA) family of chaperone

5 proteases have been shown to play a role in bacterial pathogenesis, their mycobacterial

6 counterparts have not yet been studied. In a recent report, we demonstrated that the gene

7 ML0176 coding for a predicted HtrA-like protease is transcribed by Mycobacterium leprae in

8 human leprosy lesions. In the present study, the recombinant ML0176 protein was produced

9 and its enzymatic properties investigated. M. leprae recombinant ML0176 was able to

10 hydrolyze a variety of synthetic and natural peptides. Similarly to other HtrA proteins, this

11 enzyme displayed maximum proteolytic activity at temperatures above 40 C, and was

12 completely inactivated by aprotinin, a protease inhibitor with a high selectivity for serine

13 proteases. Finally, analysis of M. leprae ML0176 specificity suggested a cleavage preference

14 after basic residues, differing in this aspect from Escherichia coli DegP and DegS homologs

15 whose known specificity is directed toward the amino side of hydrophobic residues. In

16 summary, our data demonstrated that M. leprae produces an HtrA-like protease during the

17 course of leprosy with an apparently distinct substrate specificity than E. coli HtrA enzymes.

18

19

20

21 Keywords : Mycobacterium leprae ; HtrA2; protease; enzymatic activity; FRET peptides;

22 pathogenesis.

23

2 1 1. Introduction

2

3

4 Infections caused by species of the genus Mycobacterium continue to adversely affect

5 the lives of millions worldwide. Leprosy, caused by Mycobacterium leprae , remains a public

6 health problem in several developing countries, including Brazil, and is responsible for the

7 legacy of countless numbers of people with permanent physical deformities

8 (http://www.wpro.who.int/sites/leprosy). On the other hand, tuberculosis, caused by

9 Mycobacterium tuberculosis , is responsible for 2–3 million annual deaths

10 (http:///www.who.int/tb/en). Furthermore, infections in immunocompromised individuals

11 caused by opportunistic mycobacterial species such as M. avium and M. intracellulare

12 belonging to the M. avium complex have gained additional epidemiological importance since

13 the emergence of AIDS [1]. Deciphering the mechanisms implicated in mycobacterial

14 pathogenesis is currently a major challenge in leprosy and tuberculosis research that

15 eventually may lead to the development of new prophylactic and/or therapeutic strategies.

16 The envelope-associated serine proteases of the HtrA family are an important, highly

17 conserved class of proteases in bacteria. HtrA proteins perform crucial functions involving

18 protein quality control in the periplasmic space, functioning as both molecular chaperones and

19 proteases [2]. It has been shown that, within a wide range of bacterial species, HtrA proteases

20 are essential for virulence and survival under environmental stress. In fact, mutations in the

21 htr A gene have been seen to affect bacterial tolerance to both thermal and environmental

22 stress, in addition to loss of virulence such as is found in Salmonella typhimurium ,

23 Streptococcus pyogenes , Listeria monocytogenes and Burkhoderia cenocepacia [3-12] .

24 However, to date, their mycobacterial counterparts have not yet been characterized.

25 Biochemical analysis of the three HtrA proteins found in Escherichia coli - DegP, DegQ, and

3 1 DegS - has provided insights into their function and regulation [2]. In contrast to other

2 bacterial quality control proteases, HtrA protein activity is not regulated by ATP while these

3 proteins exhibit a temperature switch mechanism responsible for changing their molecular

4 chaperon function to a protease [13].

5 A recent comparison of the protease-coding genes present in the genomes of M.

6 leprae , M. tuberculosis , Mycobacterium bovis, and Mycobacterium paratuberculosis revealed

7 that three well-conserved putative HtrA-like genes are shared by all four species [14].

8 Moreover, two of these genes, ML0176 and ML2659, coding for probable htrA2 and htrA4 ,

9 respectively, have been found to be transcribed by M. leprae isolated from the skin biopsies of

10 multibacillary leprosy patients [15]. The availability of the M. leprae genome sequence

11 provides an opportunity to study the enzymes of this microorganism, which are inaccessible

12 to direct study. For the first time, the present study demonstrated that the recombinant M.

13 leprae ML0176 exhibited proteolytic activity toward synthetic and naturally-occurring

14 peptides, revealing physicochemical properties of a typical HtrA-like protease.

4 1 2. Materials and Methods

2

3

4 Materials

5

6 The fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptides used in the present study

7 (Table 1) were synthesized and purified, as described elsewhere [16]. The purity and the

8 molecular masses of these peptides were determined by HPLC and by MALDI-TOF mass

9 spectrometry (TofSpec-E, Micromass, UK), respectively. N !-RR-methylcoumarin (MCA),

10 dynorphin A, neurotensin 1-13, bradikinin and angiotensin I peptides and the protease

11 inhibitors phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and aprotinin were purchased from Sigma

12 Co (St. Luis, MO). Trypsin was purchased from Roche Diagnostics (Indianapolis, IN).

13

14

15 2.1. Cloning, expression, and purification of rHtrA2

16

17 The primers for the htrA2 gene were constructed to correspond to the 5’ and 3’ ends of

18 the open reading frame previously identified. The sequences of 5’ and 3’ primers were 5`-

19 GTTGGAATTC ATGATTCCGCCCGGT-3` and 5’-ACAACTCGAG CTCTCGATTAT

20 TAAT-3’, respectively. The underlined sequences represent the sites for the restriction

21 enzymes EcorI and XhoI , respectively, incorporated into the primers for subsequent cloning.

22 The gene was PCR amplified from M. leprae genomic DNA by/with Deep Vent DNA

23 polymerase. The touchdown PCR method was used in a PTC-100 TM (MJ Research, Inc.) at

24 an annealing temperature of 58 oC. The PCR product was gel purified and digested with

25 EcoRI and XhoI followed by cloning into pET32a-c (+) (Novagen, San Diego, CA) previously

5 1 digested with the same enzymes. Overexpression and purification of the M. leprae HtrA2

2 protein were performed according to The QIAexpressionist manual (QIAGEN, Valencia,

3 CA). Briefly, E. coli BL21-AI TM harboring the recombinant plasmid was grown up to an

4 OD 600 0.8 in ampicillin-containing Luria-Bertani medium. Expression of rHtrA2 was then

5 induced by addition of 1 mM IPTG; and cultures were incubated at 37 oC for another 3 h.

. 6 Cells were harvested, ressuspended in lysis buffer (100 mM NaH 2PO 4, 10 mM Tris Cl pH

7 8.0), and disrupted by sonication. Debris was removed by centrifugation at 10,000xg for 15

8 min at 4 oC and rHtrA2 was purified from the supernatant by adding 1 mL of a 50% Ni-NTA

9 slurry (QIAGEN,) pre-equilibrated in lysis buffer to 4 mL of the lysate. After incubation for

10 1 h at 4 0C, the lysate-Ni-NTA mixture was loaded into a column. Unbound proteins were

11 removed by washing the column with 2 column volumes of lysis buffer. The column was

. 12 washed twice with 4 mL of 100 mM NaH 2PO 4, 10 mM Tris Cl, pH 6.3; and the recombinant

13 protein was eluted with 4 column volumes of 100 mM NaH 2PO 4, pH 4.5. Fractions were

14 analyzed by SDS-PAGE and Western Blot. Nitrocellulose membranes were probed with an

15 anti-6xHis tag antibody (New England Biolabs, Ipswich, MA). The purified enzyme was

16 stored in 50% glycerol at -20 0C.

17

18

19 2.2. HPLC analysis of rHtrA2

20

21 The fractions eluted from the Ni-NTA matrix enriched in the rHtrA2 were

22 concentrated and at a flow rate of 1.0 mL/min in a Superdex TM 75 gel filtration column (GE

23 Healthcare Life Science do Brasil, São Paulo, Brazil) pre-equilibrated in 0.05 M sodium

24 phosphate, 0.15 M NaCl, pH 6.8. Protein-containing fractions were analyzed by SDS-PAGE

25 followed by silver staining. Protein concentration was determined according to Bradford [17]

6 1 using BSA as a standard.

2

3

4 2.3. Mass spectrometry analysis of recombinant HtrA2

5

6 The purified recombinant HtrA2 protein was digested with trypsin. The resulting

7 peptides were applied onto a 0.2 x 50 mm C 18 capillary reverse phase column (Michrom

8 BioResources, Auburn, CA) and eluted with an increasing acetonitrile gradient using a

9 MicroPro capillary HPLC system (Eldex Laboratories, Napa, CA). The reverse-phase

10 effluent was introduced directly into a Finnigan LCQ electrospray mass spectrometer

11 (Thermoquest, San Jose, CA). The peptides were analyzed by MS or MS/MS followed by a

12 search in the M. leprae database via Xcalibur, Bioworks 3.1 turbo SEQUEST software

13 (ThermoFinnigan, San Jose, CA) under the conditions and parameters previously described

14 [18].

15

16

17 2.4. Enzyme assays of recombinant HtrA2

18

19 The hydrolyses of the fluorescent substrates (stock solution in 10 % DMSO) were

20 conducted at 37°C in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, containing 20 mM NaCl. The hydrolysis of

21 the N !-RR-MCA and the FRET substrates were monitored by measuring fluorescence at "em

22 = 460 nm and "ex = 380 nm and "em = 420 nm and "ex = 320 nm, respectively, in a Hitachi

23 F-2000 spectrofluorimeter, as previously described [19]. The slope was converted into moles

24 of hydrolyzed substrate per min based on the fluorescence curves of standard peptide

25 solutions before and after total enzymatic hydrolysis with trypsin. The 1 cm path length

7 1 cuvette containing 1 mL of substrate solution was placed in a thermostatically controlled cell

2 compartment prior to adding the enzyme solution. Enzyme concentrations ranged from 10 to

3 100 nM and FRET substrates, from 1/10 to 10 times the K m value. The increase of

4 fluorescence over time was continuously recorded for 5-15 min. The kinetic parameters were

5 calculated according to Wilkinson [20]. One unit (U) of recombinant HtrA2 activity was

6 defined as the amount of enzyme needed to hydrolyze 1 µmoL of N !-RR-MCA in 1 min. As

7 previously described, the inner-filter effect of the FRET substrates was corrected by an

8 empirical equation [19].

9

10

11 2.5. HPLC analysis of peptides hydrolyzed by rHtrA2

12

13 The peptide solutions (50 µM) in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, containing 20 mM NaCl

14 were incubated with rHtrA2 (10 nM) at 37°C for 4 hours. Samples (100 µL) were

15 periodically withdrawn for HPLC analysis. The hydrolysis products were fractionated by

16 reverse-phase HPLC (Class VP, Shimadzu), manually collected, and submitted to mass

17 spectrometry analysis. The HPLC conditions used for the analytical procedure were: 0.1%

18 trifluoroacetic acid in water (solvent A) and acetonitrile-solvent A (9:1) as solvent B. The

19 separations were performed at a flow rate of 1 mL/min using a J.T. Baker C 18 column (4.6 x

20 300 mm) and a 10-80% gradient of B for 30 min. Fractions were monitored for the presence

21 of peptides fragments using an SPD-10AV Shimadzu uv/vis detector (214 nm) and a RF-

22 10Ax fluorescence detector ( "em = 420 nm and "ex = 320 nm).

23

24

25 2.6. Mass spectrometry analysis of peptides substrates hydrolyzed by rHtrA2 8 1

2 The peptide fragments were detected by scanning from a m/z 50 to 2000 at 6s/scan

3 with a 31V cone. Product-ions from the MS/MS experiments were detected during several

4 scannings through the appropriated mass range for each situation, using high energy (25 eV)

5 for single-charged and low-collision energy (15 eV) for multiple-charged precursor ions. No

6 tandem MS was recorded for peptides smaller than four amino acid residues. The scissile

7 bonds were deduced from the amino acid compositions of the fragments.

8

9 10 2.7. Effect of pH, temperature, and inhibitors on peptidase activity

11

12 The pH studies were performed in 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0 - 5.3), 50 mM

13 sodium phosphate buffer (pH 5.2 - 7.5), and 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.3 - 10) containing

14 20 mM NaCl. The stock solutions and the work concentration of the synthetic inhibitors used

15 in the characterization of the HtrA2 proteolytic activity were done as previously described

16 [21]. The pH, temperature effects, and inhibition studies were determined by fluorometric

17 assay using the peptide N !-RR-MCA (10 #M) as a substrate. The temperature range used

18 was 28 to 60 C, and the enzymatic reactions were performed in 50 mM phosphate buffer, pH

19 8.0

9 1 3. Results and Discussion

2

3

4 3.1 Cloning, expression, and purification of M. leprae HtrA2

5

6 The gene coding for a putative HtrA2 protease was amplified from M. leprae genomic

7 DNA and successfully cloned into pET32. E. coli BL21 harboring the recombinant vector

8 was grown in an LB medium containing ampicilin and induced by IPTG. The soluble hexa-

9 histidine-tagged fusion protein was purified in one step by immobilized, metal-affinity

10 chromatography (IMAC) from cell lysates using the Ni-NTA resin. A single band

11 corresponding to the recombinant HtrA2 protein with the expected Mw 52.3 kDa was

12 observed in a silver stained SDS-PAGE (Figure 1A). The purified protein was also

13 transferred to a nitrocellulose membrane and recognized by the anti-6xHis tag antibody

14 (Figure 1A). A high degree of purity of the recombinant ML0176 was ensured by loading the

15 protein onto a Superdex 75 gel filtration column. The elution profile shown in Figure 1B

16 revealed a single homogeneous pick corresponding to the enzyme, as confirmed by SDS-

17 PAGE followed by trypsin digestion and MS/MS analysis. The following peptides, all

18 matching the predicted amino acid sequence of M. leprae ML0176, were sequenced:

19 78 KVVPSVVMLETDLGRQ 91 , 132 KTTVTFFDGRT 140 ,

20 141 RTASFTVVGADPTSDIAVVRV 159 , 160 RVQSISGLPPITMGSSADLLRV 178 ,

21 339 RLISSADALVAAVRS 351 and 359 KVSLTYQDQSGSSRT 371 .

22

23

24 3.2 Primary sequence analysis of M. leprae rHtrA2

25

10 1 Members of the HtrA family share a conserved trypsin-like protease domain and at

2 least one C-terminal PDZ domain, which mediates specific protein-protein interactions, is

3 involved in substrate recognition [22]. Figure 2 shows the amino-acid sequence alignment of

4 HtrA2 from M. leprae , HtrA2 from M. tuberculosis H37Rv, and DegS from E. coli . HtrA2

5 from M. leprae shares a 70% identity with the HtrA2 of M. tuberculosis H37Rv and a 26 %

6 identity with E. coli Deg S. This alignment indicates the conservation of a putative catalytic

7 triad in mycobacterial HtrA2 consisting of the amino acid residues His182, Asp224, and

8 Ser305 and a consensus of the PDZ domain at the C-terminal region.

9

10

11 3.3. Analysis of cleavage specificity and kinetic parameters

12

13 HtrA proteins belong to the PA clan of proteases composed of serine proteases that

14 display three main types of activity: trypsin-like (the cleavage of the amide bond occurs

15 subsequent to Arg or Lys at P1); chymotrypsin-like (cleavage occurs following one of the

16 hydrophobic amino acids at P1; and elastase-like (cleavage following an Ala at P1). A variety

17 of substrates, including synthetic and natural peptides, were then tested for cleavage by the

18 recombinant ML0176 protein.

19 A collection of twelve synthetic fluorescence resonance energy transfer (FRET)

20 peptides of seven amino acid residues derived from the bradykinin sequence was used as

21 substrates. These peptides also conveniently determine kinetic parameters since the

22 hydrolysis of any peptide bond of the FRET substrates can be easily monitored [16]. Table 1

23 displays the Km, k cat , and k cat / K m values that were determined for the hydrolysis of the FRET

24 substrates by M. leprae rHtrA2. All cleaved peptides were hydrolyzed at the R-Q bond,

25 indicating an enzymatic preference for cleavage after Arg residues. Catalytic efficiency (k cat /

11 . -1 1 Km) varied from no hydrolysis of the FRET-2 peptide to 19.90 (s mM) of the FRET-1

2 peptide. Three series of peptides, with Arg in P1 and sequence variations in P2, P3, and P4,

3 respectively, were tested to confirm the preference of M. leprae HtrA2 for cleavage after Arg

4 residues and to obtain information about the P2-P4 subsites. Among the FRET- 1 to - 6

5 peptides with variable amino acid residues at the P2 position, the best substrate was FRET- 1,

6 showing an Arg residue in this position. In contrast, the presence of Asp at position P 2

7 (FRET-2) resulted in a total absence of interaction between the enzyme and the substrate.

8 The FRET-7 to -9 peptides revealed that rHtrA from M. leprae preferred amino acid residues

9 with an aliphatic chain like Ile or Leu instead of Phe at P3. Among the FRET-10 to -15

10 peptides with amino acid residue changes at P4, the best substrate was FRET-12 with an Arg

11 residue at this position. In summary, all peptides were hydrolyzed at the R-Q bond although

12 FRET-1 and FRET-12 presented Arg residues in more than one position. These results

13 suggested that M. leprae HtrA2 possesses a different substrate specificity than E. coli DegP

14 and DegS. Indeed, these enzymes display a cleavage preference after hydrophobic residues

15 [22]. Moreover, the activity of HtrA family members has been predicted to depend solely on

16 what is present in the P1 position [13, 22]. However, the effect of changes in the amino acids

17 at the P2, P3, and P4 positions on HtrA cleavage efficiency suggested that the M. leprae

18 enzyme recognized the substrate not only via P1-S1 interaction but within an extended

19 for interaction with the substrate. The differences found between the specificity

20 for the M. leprae HtrA2 and its homologues to substrate specificity are probably related with

21 the primary dissimilar sequences close to the active site.

22 Five naturally-occurring peptides of various sizes and amino acid sequences were also

23 tested for cleavage by the enzyme. Hydrolysis was monitored by HPLC and the results are

24 summarized in Table 2. Among the substrates utilized in the present study, the most

25 susceptible was neurotensin1-13, which presented one minor (R8 !" ) and two major

12 1 cleavage sites (Y3 #$ and Y11 %&' ). When dynorphin was the substrate, rHtrA2 showed a

2 preference for hydrolysis involving basic amino acid residues in a P 1 position (R6 !()*+,)

3 R7 %-. . M. leprae rHtrA2 failed to hydrolyze oxytocin, angiotensin I, and bradykinin,

4 although the sequences of the last two peptides contain basic residues. This enzymatic profile

5 suggested that the specificity of the recombinant M. leprae HtrA2 displays a narrow

6 selectivity for its substrates in view of the fact that peptides such as oxytocin, angiotensin I,

7 and bradykinin were not significantly hydrolyzed even subsequent to extending incubation

8 times. Moreover, hydrolysis of dynorphin and neurotensin reinforced the notion that M.

9 leprae rHtrA2 has a preference for basic amino acids in the P1 position despite the ability of

10 the enzyme to cleave after Tyr residues.

11

12

13 3.4. Physicochemical properties

14

15 Further characterization of M. leprae rHtrA2 was performed by using the fluorescent

16 methylcoumarin (MCA) derivative of arginine (N !-RR-MCA ), which has only one cleavage

17 site at the R-MCA position, as a substrate. Panel A in Figure 3 shows that N !-RR-MCA was

18 efficiently cleaved by M. leprae rHtrA2.

19 To confirm the class of the protease, tests were performed to determine whether the

20 activity of M. leprae rHtrA2 was affected by PMSF and aprotinin, two classical inhibitors of

21 serine peptidases. The proteolytic activity of M. leprae rHtrA2 was markedly reduced by

22 both inhibitors; and, at 4.2 mU, aprotinin was able to completely inactivate the enzyme

23 (Figure 3A).

24 The effect of pH on the catalytic activity of the enzyme was studied at 37 0C between

25 pH 4.0 and 10.0. The pH curve displayed maximal activity at pH ranging from 7.5 to 9.0, as

13 1 shown in Figure 3B. The activity of the enzyme was also investigated at various temperatures

2 from 28 0C to 60 0C. And as Figure 3C shows, M. leprae rHtrA2 was active at a broad range of

3 temperatures, reaching maximum activity at 45-55 0C. This preference for high temperatures

4 is a typical feature of proteases belonging to the HtrA family [23]. Actually, classical HtrA

5 proteases possess a temperature-dependent, functional switch that makes it possible to

6 transform a formerly chaperone activity to one of protease. At low temperatures, these

7 enzymes exhibit the activity of molecular chaperones while their proteolytic activities rapidly

8 increase between 32 C and 42 C [3; 24].

9 Taken together, our results confirmed that ML0176 codes for a serine protease

10 displaying the physicochemical characteristics typical of an HtrA protein, except for an

11 apparently distinct substrate specificity in comparison to other bacterial HtrA enzymes. The

12 possible role of the proteolytic activity of M. leprae HtrA2 in leprosy disease remains to be

13 studied and is under investigation in our laboratory.

14 1 Acknowledgments

2

3

4 We are most grateful to the Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do

5 Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) for supporting this study. M.L.R.G and J.J.A received

6 fellowships from the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

7 (CNPq) and the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),

8 respectively. We would also like to thank Judy Grevan for editing the text and Natalia

9 Pierangeli dos Santos for her technical assistance

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18 Figure Legends

Fig. 1. Purification of M. leprae rHtrA2. (A) SDS-PAGE and Western blot showing the rHtrA2 (4 µg) obtained after purification by immobilizedmetal-affinity chromatography

(IMAC) on Ni-NTA resin. The gel was stained with silver; and Western blot was developed with anti-His tag antibody. The positions of molecular size markers are shown on the left. (B) Elution profile of the purified rHtrA protein from a Superdex G75 gel filtration column.

Fig. 2. Alignment of the amino acid residues from M. leprae and M. tuberculosis

HtrA2 and E. coli DegS. The signal sequence predicted

(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ) for HtrA2 of M. leprae is double underlined

(residues 1-36). The domain for the trypsin family (IPR001254) is underlined (residues

102-249). The conserved residues that probably compose the are in bold.

The PDZ domain (IPR001478) is indicated by an open box (residues 287-382).

Fig. 3. Physicochemical properties of M. leprae rHtrA2. (A) - Effect of serine protease inhibitors on rHtrA2 activity: Assays were carried out in 500 #l of 50 mM phosphate buffer, pH 8.0, at 37 C; and enzymatic activities were measured by fluorometric assays using 5 #M N !-RR-MCA as substrate. One hundred percent represents HtrA2 hydrolysis of N !-RR-MCA/min in the absence of an inhibitor. Purified rHtrA2 (2 mU) were incubated in the presence of 1 mM PMSF or 4.2 mU aprotinin under the conditions described above. n.h. *- no hydrolysis detected. (B) – Effect of pH upon rHtrA2

19 enzymatic activity: The pH studies were performed at 37 C in 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0 - 5.3), 50mM sodium phosphate buffer (pH 5.2 - 7.5), and 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.3 - 10). The enzymatic activity was determined as in (A). (C) - Effect of temperature on rHtrA2 activity. The experiments were carried out at the stipulated temperatures using the same buffer and substrate as in A. Enzymatic assays were carried out under the same conditions seen in Panel A, except for temperature variation. The data represent the mean of three independent experiments

20 Figure

Table 1 - Kinetic parameters for the degradation of substrates derived from Abz- GFSPFRQ-EDDnp by rHtrA2

Substrates (Abz-…-EDDnp) a b N. P 6 P5 P4 P3 P2 P1 P’ 1 Km kcat kcat / K m ( M) (s -1 ) (s .mM) -1 3.16 ± 0.43 1 G F S P R R Q 63.00 ± 3.0 19.90 n.h. 2 G F S P D RQ n.h. n.h. 6.96 ± 0.64 3 G F S P F R Q 4.80 ± 0.30 0.68 3.40 ± 0.36 4 G F S P A R Q 9.40 ± 0.50 2.76 9.48 ± 0.90 5 G F S P S R Q 27.00 ± 3.00 2.85 4.58 ± 0.90 6 G F S P P R Q 4.20 ± 0.30 0.92 2.09 ± 0.20 7 G F S I FR Q 19.00 ± 1.00 9.13 7.78 ± 0.78 8 G F S F FR Q 26.00 ± 2.00 3.34 2.04 ± 0.19 9 G F S L FR Q 6.60 ± 0.50 3.23 5.30 ± 0.41 10 G F P PFR Q 3.70 ± 0.25 0.70 1.96 ± 0.20 11 G F F PFR Q 10.00 ± 1.00 5.10 3.18 ± 0.30 12 G F R PFR Q 31.00 ± 3.00 9.75 6.96 ± 0.64 13 G F S PFR Q 4.80 ± 0.30 0.69 6.27 ± 0.60 14 G F A PFR Q 5.20 ± 0.40 0.83 2.83 ± 0.28 15 G F E PFR Q 2.00 ± 0.15 0.71 a Cleavage sites, determined by mass spectrometry analysis, are indicated by !" b Assays were carried out in a 50mM phosphate buffer, pH 8.0, at 37 0C. The kinetic parameters were obtained in

the presence of 1/10 to 10 times the K m value of peptide substrate and 10 –100 nM of rHtrA2 , with a substrate consumption of less than 5%. The velocity was recorded for 5 –15 min. and the parameters were calculated as mean value (  SD). All enzymatic assays were performed in triplicate. Table 2 - Hydrolysis of bioactive peptides by rHtrA2

Substrate Rates of hydrolysis Peptide sequence a

(nmol/µg/min)

Dynorphin A 112 YGGFLR R IRPKLK

Neurotensin 1-13 85 ELY ENKPR RPY IL

Angiotensin I n.h. * DRVYIHPFHL

Bradykinin n.h. * RPPGFSPFR

Oxytocin n.h. * CYIQNCPLG a Cleavage sites, determined by mass spectrometry analysis, are indicated by #"$%%&'%" were carried out in 300µL of 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0, at 42°C, using 50µM of each peptide and 5 nM of rHtrA2. Control samples were identical, except for the enzyme that was omitted. After 30 minutes, the reactions were stopped with TFA0.1% and the hydrolysis rates were determined by comparing the peak areas of control samples versus digested ones. The peaks were manually collected and submitted to mass spectrometry analysis to cleavage bond determinations.n.h. *- no hydrolysis detected; , cleavage site. Figure 1.

A 1 2

94.0 67.0 HtrA2 43.0

30.0

B HtrA2 A A nm 280

min Figure 2

A

ML|HtrA2 ------H37Rv|HtrA2 MAKLARVVGLVQEEQPSDMTNHPRYSPPPQQPGTPGYAQGQQQTYSQQFDWRYPPSPPPQ 60 DegS_E.coli ------

ML|HtrA2 ------MIPPGRVADRRPRAGMLAVSALAIAVVSAGIGGVA 35 H37Rv|HtrA2 PTQYRQPYEALGGTRPGLIPGVIPTMTPPPGMVRQRPRAGMLAIGAVTIAVVSAGIGGAA 120 DegS_E.coli ------MKKTTLALSALALSLGLALSPLSATAAETSSATTAQQMPSLAPMLEKVM 49 : . . * * :. ::. : .

ML|HtrA2 ATVVALGTRVAGGNGAGPVTGPAASVPAANMPSGSVEQVAVKVVPSVVMLETDLGRQSE- 94 H37Rv|HtrA2 ASLVGFNRAPAGPSGGPVAASAAPSIPAANMPPGSVEQVAAKVVPSVVMLETDLGRQSE- 179 DegS_E.coli PSVVSINVEGSTTVNTPRMPRNFQQFFGDDSPFCQEGSPFQSSPFCQGGLGGNGGGQQQK 109 . ::*.:. : . . .. . : * . . . . * : * *.:

ML|HtrA2 ---EGSGVILSADG-LILTNN HVVAVAAKPGGGPGGGLSPKTTVTFFDGRTASFTVVGAD 150 H37Rv|HtrA2 ---EGSGIILSAEG-LILTNN HVIAAAAKP---PLGSPPPKTTVTFSDGRTAPFTVVGAD 232 DegS_E.coli FMALGSGVIIDADKGYVVTNN HVVDN------ATVIKVQLSDGRKFDAKMVGKD 157 ***:*:.*: ::*****: .. .* : ***. .:** *

ML|HtrA2 PTS DIAVVRVQSISGLTPITMGSSADLRVGQPVVAVGSPLGLAGTVTSGIVSALNRPVST 210 H37Rv|HtrA2 PTS DIAVVRVQGVSGLTPISLGSSSDLRVGQPVLAIGSPLGLEGTVTTGIVSALNRPVST 292 DegS_E.coli PRS DIALIQIQNPKNLTAIKMADSDALRVGDYTVAIGNPFGLGETVTSGIVSALGR---- 213 * ****::::*. ..**.*.:..* ****: .:*:*.*:** ***:******.*

ML|HtrA2 TGESGNQNTVLDAIQTDAAINPGN SGGALVNMGGQLVGVNSAIATLGADSGDAQSGSIGL 270 H37Rv|HtrA2 TGEAGNQNTVLDAIQTDAAINPGN SGGALVNMNAQLVGVNSAIATLGADSADAQSGSIGL 352 DegS_E.coli --SGLNAENYENFIQTDAAINRGN SGGALVNLNGELIGINTAILAP------DGGNIGI 264 .. * :. : ******** *********:..:*:*: *:** : :.*.**:

ML|HtrA2 GFAIPVDQAKRIADELISTGKATHASLGVQVATD------KGTPGAKVMDVVAGGA 320 H37Rv|HtrA2 GFAIPVDQAKRIADELISTGKASHASLGVQVTND------KDTLGAKIVEVVAGGA 402 DegS_E.coli GFAIPSNMVKNLTSQMVEYGQVKRGELGIMGTELNSDLAKAMKVDAQRGAFVSQVLPNSS 324 ***** : .*.::.:::. *:..:..**: : . ** : :*:...:

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Figure 3

A Inhibitors Velocity (nmol/g -1 .min -1 ) Residual activity (%) Control 0.0861 100 PMSF (1 mM) 0.0115 13 Aprotinin (4.2U) n.h.* 0 Curriculum Vitae

Nome : Michelle Lopes Ribeiro Nascimento : 25/11/1976 Naturalidade : Rio de Janeiro

Formação Acadêmica:

- Faculdade de Biologia – Modalidade Licenciatura em Ciências Biológicas pela Universidade Federal do Rio de Janeiro, de agosto de 1996 a Dezembro de 2000.

- Doutorado em Química Biológica no Instituto de Bioquímica Médica - Universidade Federal do Rio de Janeiro

Orientação de Estudantes:

1 – Nívea Dias dos Santos – Iniciação Científica de Janeiro/2003 a Janeiro/2004.

2 – Patrícia Vieira - Iniciação Científica de Janeiro/2004 a Janeiro/2006.

Comunicações em Congresso:

- 5 Comunicação em congressos Nacionais - 1 Comunicação em congresso Internacional

Publicações:

Lima, C. S., Ribeiro, M. L. , Souza, L. A., Sardella, A. E., Wolf, V. M. A. and Pessolani, M. C. V. 2000. Intracellular signals triggered during association of Mycobacterium leprae and Mycobacterium bovis ECG with human monocytes.

Guimarães MLR , Pessolani MCV. 2007. Comparative genomics of mycobacterial proteases. Microbial Pathogenesis. In press. Disponível no site: http://dx.doi.org/10.1016/j.micpath.2007.05.010

Guimarães MLR , Tempone AJ, Amaral JJ, Nery JA, Antunes SLG, Pessolani MCV. 2007. Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human skin lesions. Microbial Pathogenesis. In press. Disponível no site: http://dx.doi.org/10.1016/j.micpath.2007.05.011

Guimarães MLR , Marengo EB, Portaro FCV, Tempone AJ, Amaral JJ, Klitzke CF, Pessolani MCV. Cloning, expression and characterization of a HtrA2 serine protease produced in vivo by Mycobacterium leprae. Manuscrito será submetido à Biochimica et Biophysica Acta ( BBA ).

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