Mikroskopické vláknité houby jako producenti mykotoxinů Izoláty z mykologické laboratoře a sbírky mikroorganismů Ústavu biochemie a mikrobiologie

Dana Savická, Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha Houby (Fungi) : eukaryotní, heterotrofní organismy. Samostatná vývojová větev v rámci Opisthokonta

Okruhy přednášky: - Makromycety x mikromycety x plísně - Systematické členění, monofyletické a polyfyletické taxony - Taxonomické zdroje, depozitáře jmen, schválené databáze - Řazení hub do celkového systému živých organismů - Nejvýznamnější mikroskopické houby z hlediska potravinářského průmyslu a produkce mykotoxinů Zygomycety, kvasinky, Eurotium, Neosartorya, Byssochlamys, , , Fusarium, Alternaria, Cladosporium, Phoma, Epicoccum, Trichoderma, Stachybotrys, Chaetomium, Claviceps, Wallemia aj. SYSTEMATIKA Makromycety x mikromycety x plísně Cíl: vyjádřit přehledně a komplexně současný stav znalostí o jednotlivých skupinách organismů včetně možných vývojových Makromycety – houby jejichž plodnice souvislostí. jsou viditelné pouhým okem Taxon monofyletický: zahrnuje výlučného předka tohoto Mikromycety – jejich struktury je nutno taxonu a všechny jeho potomky pozorovat mikroskopem Plísně – kryje se především s termínem Taxon polyfyletický: je jen seskupením podobných organismů mikromycety. Není to taxonomická bez vývojových souvislostí kategorie, hojně používáno aplikovanými obory

Nejvýznamnější depozitáře jmen:

Mycobank (www.mycobank.org) Index Fungorum (www.indexfungorum.org)

Monofyletický taxon Polyfyletický taxon Whittaker Řazení hub do celkového 1969 systému živých organismů

Houby jsou vyčleněny do Houby jako vlastní říše součást říše rostlin

Současné pojetí: Houby jako samostatná vývojová větev v rámci Opisthokonta Např. Pythium oligandrum nebo Phytophthora infestans

Phytophthora infestans (plíseň hlenky bramborová)

Vývojová větev Fungi Zjednodušené schéma pro základní orientaci:

Vývojová větev (říše) Fungi Oddělení: Chytridiomycota Microsporidiomycota Např. Nosema apis Zygomycota (hmyzomorka včelí) Glomeromycota Např.: Rakovina brambor – Synchytrium endobioticum (Chytridiomycota) Basidiomycota Vývojová větev (říše): Fungi Deštníkovitě obrácená kolumela po prasnutí (Opisthokonta) sporangia - u rodu Rhizopus Oddělení: Zygomycota Oddělení: Zygomycety, houby spájivé

Chytridiomycota sporangium Microsporidiomycota Glomeromycota sporangiospory Zygomycota Ascomycota Basidiomycota Rhizopus stolonifer

sporangiofor

Mucor sp. Mucor wosnessenskii Mucor wosnessenskii

Rhizopus stolonifer Častý substrát: sladké a přezrálé plody

U zygomycetů izolovaných z potravin a krmiv nebyla prokázána žádná významná produkce mykotoxinů (s vyjímkou Rhizopus microsporus, který je schopen produkce mykotoxinu rhizoninu)

Rhizopus stolonifer Mucor mucedo Izolace DS-DBM Taphrina deformans Oddělení:

Chytridiomycota Oddělení ASCOMYCOTA Microsporidiomycota Glomeromycota • Pododdělení: Taphrinomycotina (syn. ARCHIASCOMYCOTINA) Zygomycota Třída: Schizosaccharomycetes Ascomycota Třída: Taphrinomycetes Basidiomycota • Pododdělení Saccharomycotina Třída: Saccharomycetes • Pododdělení Pezizomycotina (syn. ASCOMYCOTINA) KVASINKY Třída: Laboulbeniomycetes Třída: Třída: Pezizomycetes Třída: Leotiomycetes Třída: Lecanoromycetes Třída: Sordariomycetes Yarrowia lipolytica Saccharomycodes ludwigii Třída: Dothideomycetes Kvasinkové kontaminace potravin - výběr z izolací DS-DBM

Debaryomyces hansenii

Hyphopichia burtonii Zygosaccharomyces sýr baillii Plátkový sýr

askus

Žitná mouka, Penicillium, Eurotium a Hyphopichia burtonii Majonéza v plastu Majonéza ve skle Velká produkce plynu

Čaj (sladká limonáda)

Saccharomyces cerevisiae Candida parapsilosis limonáda

zákal

Tonik – Dekkera bruxellensis Bezinková šťáva Saccharomycodes ludwigii

Třída Eurotiomycetes, řád Oddělení ASCOMYCOTA -Pro potravináře velmi důležitá třída a řád

• Pododdělení: Taphrinomycotina (syn. ARCHIASCOMYCOTINA) Třída: Schizosaccharomycetes -Saprotrofové v půdě, na rostlinných Třída: Taphrinomycetes zbytcích a jiných organických materiálech • Pododdělení Saccharomycotina Třída: Saccharomycetes -Tvorba charakteristických kulovitých • Pododdělení Pezizomycotina (syn. ASCOMYCOTINA) plodnic (kleistothecií) Třída: Laboulbeniomycetes Třída: Eurotiomycetes -Velmi významné anamorfy (Aspergillus, Třída: Pezizomycetes Penicillium…) Třída: Leotiomycetes Třída: Lecanoromycetes -Řada zástupců je xerofilních nebo Třída: Sordariomycetes xerotolerantních Třída: Dothideomycetes -Produkce závažných mykotoxinů Rod Eurotium Turimed s mandlemi

Vlašský ořech čaj rýže Žlutozelené kolonie (zelené části – anamorfa Aspergillus, žluté části – plodnice), některé kmeny výrazně xerofilní; Kleistothecia mají jednovrstvou peridii, askospory hladké nebo mají většinou 2 obvodové hřebínky Klobása zatavená v obalu

Anamorfa Aspergillus

Produkce mykotoxinů: physcion, Plodnice (kleistothecium) fazole echinulin (nízká toxicita) kleistothecium Kokosové tyčinky

Roláda

Asky s askosporami

Pita chléb

Zralé askospory se 2 Piškotová roláda obvodovými hřebínky kleistothecium Jablečný mošt v lahvích z Nealkoholický nápoj s bylinnými malé moštárny extrakty (plechovka)

produkce mykotoxinů: fumitremorgin A, B a C verruculogen

Kusy mycelia

Anamorfa Aspergillus Rod Neosartorya Kleistothecia s vícevrstvou Zelené mycelium – anamorfa peridií, termotolerantní až Aspergillus termofilní rod, anamorfa Aspergillus (sekce Fumigati)

Bílá „krupička“ – plodnice rodu Neosartorya kleistothecia Rod Byssochlamys

Paecilomyces varioti

Termotolerantní houby, askospory snáší Škrobárna – materiál k analýze teploty nad 80 °C, rostou dobře i při 37 – Produkce mykotoxinů: 40°C, výskyt v půdě, Byssochlamys nivea, B.fulva časté napadání ovoce – patulin Paecilomyces variotii – patulin, viriditoxin Další významné teleomorfy z řádu Eurotiales kontaminující potraviny

Monascus Monascus ruber Produkce mykotoxinů: Talaromyces citrinin Emericella Xeromyces

Xeromyces bisporus (syn. Monascus bisporus) – extrémní xerofil, schopný růst Stopkatá askomata při a 0,61 w Monascus (an. Basipetospora) (kleistothecia)

Talaromyces flavus Hülle cells

Plodnice Emericella nidulans (kleistothecium)

Plodnice bez peridie Produkce mykotoxinů: (gymnothecium) sterigmatocystin, nidulotoxin Významné anamorfy řádu Eurotiales Hlavní mykotoxiny Rod Aspergillus 1.Aflatoxiny B a G

2.Aflatoxin M1 = hydroxyaflatoxin B1 3.Patulin 4.Ochratoxin A 5.Deoxynivalenol (DON) 6.Zearalenon Aspergily sekce Nigri 7.Fumonisiny Aspergillus carbonarius Aspergillus foetidus 8.T-2 toxin Aspergily sekce Circumdati Aspergillus lacticoffeatus Aspergillus ochraceus Aspergillus niger 9.Citrinin Aspergillus westerdijkiae Aspergillus sclerotioniger Aspergillus steynii Aspergillus tubingensis

Producenti ochratoxinu A Producenti ochratoxinu A Aspergillus ochraceus 4084 Aspergily sekce Flavi Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Aspergillus nomius Aspergillus arachidicola Aspergillus minisclerotigenes

Producenti aflatoxinů Aspergillus niger 4257 a 4258 Aspergillus flavus 4056 Aspergillus clavatus Produkce dalších významných mykotoxinů (rod Aspergillus): Hlavní mykotoxiny Kyselina cyklopiazonová Aspergillus terreus Kyselina kojová 1.Aflatoxiny B a G Kyselina nitropropionová Aspergillus longivesica Kyselina aspergilová 2.Aflatoxin M1 = hydroxyaflatoxin B1 aj. Citreoviridin Sterigmatocystin Aspergillus sekce Nigri 3.Patulin Xanthomegnin Producenti patulinu Gliotoxin 4.Ochratoxin A Fumonisiny Aspergillus clavatus 4268 5.Deoxynivalenol (DON) Viomellein Vioxanthin aj. 6.Zearalenon 7.Fumonisiny 8.T-2 toxin Aspergillus terreus 4058 9.Citrinin Aspergillus sekce Flavi

Cibule - Aspergillus sekce Nigri Naklíčené mungo – Aspergillus sekce Flavi rozinky Zelená nepražená káva Raw tyčika

Zelená nepražená káva Černý čaj Diagnostické médium AFPA

Raw tyčinka

Rod Aspergillus – česky kropidlák; saprotrofní houba s výskytem na řadě substrátů -Hojnější v tropech a subtropech -Konidiofor je rozšířený v měchýřek, konidie s alergenním potenciálem -Produkce nejzávažnějších mykotoxinů – aflatoxinů a řady dalších – ochratoxin A, patulin, sterigmatocystin, fumitremorgeny A a B, gliotoxin aj. -Využití k výrobě organických kyselin a východoasijských specialit Izolace DS-DBM Významné anamorfy řádu Eurotiales P.citrinum 4060 Hlavní mykotoxiny 1.Aflatoxiny B a G Rod Penicillium

2.Aflatoxin M1 = hydroxyaflatoxin B1 Penicillium verrucosum 3.Patulin Penicillium nordicum Penicillium citrinum 4.Ochratoxin A Penicillium expansum Producenti ochratoxinu A 5.Deoxynivalenol (DON) Penicillium radicicola Penicillium verrucosum 6.Zearalenon 7.Fumonisiny Producenti citrininu Další významné mykotoxiny Penicillium expansum 8.T-2 toxin produkované zástupci rodu Penicillium carneum Penicillium: Penicillium glandicola 9.Citrinin Kyselina penicilová Penicillium coprobium Kyselina cyklopiazonová Kyselina mykofenolová Penicillium vulpinum Kyselina sekalová Penicillium clavigerum Roquefortin C Penicillium concentricum Nefrotoxické glykopeptidy Xanthomegnin Penicillium griseofulvum Viomellein PR-toxin Producenti patulinu Griseofulvin Luteoskyrin Rubratoxin aj. Penicillium expansum 4061 Citrusové plody Jablko - hniloba

pečivo sýry

olivy jogurt -Rod Penicillium – česky štětičkovec -Všudepřítomná konidiální houba -Štětcovitý konidiofor, lehké, snadno se šířící spory -Mikromycet s významným alergenním potenciálem -Kontaminant řady substrátů včetně potravin a krmiv -Významná produkce mykotoxinů – patulin, ochratoxin A, citrinin, luteoskyrin, citreoviridin, rubratoxin, kys. cyklopiazonová aj. -Řada druhů je využívána v potravinářství a ve farmacii Oddělení ASCOMYCOTA

• Pododdělení: Taphrinomycotina (syn. ARCHIASCOMYCOTINA) Třída: Neolectomycetes Třída: Pneumocystidomycetes Třída: Schizosaccharomycetes Třída: Taphrinomycetes • Pododdělení Saccharomycotina Nejvýznamnější řády: Třída: Saccharomycetes Erysiphales Pezizales • Pododdělení Pezizomycotina (syn. ASCOMYCOTINA) Helotiales Třída: Laboulbeniomycetes Rhytismatales Třída: Eurotiomycetes Hypocreales Třída: Pezizomycetes Sordariales Třída: Leotiomycetes Ophiostomathales Microascales Třída: Lecanoromycetes Diatrypales Třída: Sordariomycetes Xylariales Třída: Dothideomycetes Capnodiales Dothideales -Významný toxinogenní rod; česky srpatka Rod Fusarium -Produkce charakteristických rohlíčkovitě zakřivených konidií (u některých druhů i mikrokonidie a chlamydospory) Hlavní mykotoxiny -Teleomorfní stádia – Nectria, Gibberella 1.Aflatoxiny B a G -Výskyt v půdě, na rostlinných zbytcích, parazit rostlin, oportunní patogen 2.Aflatoxin M1 = hydroxyaflatoxin B1 -Produkce mykotoxinů: deoxynivalenol, 3.Patulin zearalenon, fumonisiny, T-2 toxin, moniliformin, naphtochinony, kys. fusariová aj. 4.Ochratoxin A

5.Deoxynivalenol (DON) Fusarium jako endofyt ječmene 6.Zearalenon 7.Fumonisiny 8.T-2 toxin Jádřincová hniloba 9.Citrinin -Významný anamorfní rod Rod Alternaria -Saprotrofní druhy (půda, rostlinné zbytky, povrch rostlin, vlhké zdi, ovzduší…) i parazitičtí zástupci (listové skvrnitosti, hniloby); oportunní patogen -Produkce mykotoxinů: alternariol, altertoxin, kyselina tenuazonová -Spolu s rodem Cladosporium je jedním z hlavních alergenů -Sametové, tmavé kolonie s tmavým rubem; vícebuněčné, zďovité konidie

Alternaria sp. 4325, PCA

Vícebuněčné konidie

Alternaria alternata Alternaria sp. 4305, PCA rajčata Izolace DS-DBM Semena slunečnice určená do chleba – pražská pekárna

Máslo (kolonie č.2) paprika zelí

Alternaria helianthi Hroznové víno (spolu s rodem Cladosporium) (povrchová sterilace zrn, endofyt) líc rub Jádřincové Rod Cladosporium hniloby

Cladosporium herbarum

Hadičky, membrány, pufry....téměř vždy→ -Anamorfní rod s kosmopolitním rozšířením -Široká škála substrátů (tzv. černě, rostlinný opad, Cladosporium sp. dřevo, půda, ovzduší, potraviny, listové Promývací hlava imunochemického analyzátoru, skvrnitosti,…) prochází 1% roztok HCl -Tmavě pigmentované konidiofory, ramokonidie (vrcholové části konidioforu, které se oddělují a přejímají funkci konidií). -Spory s velkým alergenním potenciálem -Produkce žádných významných mykotoxinů není známa pečivo Sladké limonády, častá kontaminace

Puding se šlehačkou paprika

Hroznové víno Vlašský ořech Rod Phoma Morfologická rozmanitost Potrubí potravinářského závodu

ostiolum

Vodovodní potrubí, voda – možný zdroj kontaminace v Pyknidy potravinářském průmyslu

-Rod tvořící pyknidy -Široká škála substrátů -Kosmopolitní rozšíření -Žádná významná produkce mykotoxinů (kromě P.sorgina – kyselina tenuazonová, P.terrestris – kys.sekalonová) Sýry z české mlékárny

proti světlu jsou patrné jednotlivé pyknidy Rod Epicoccum

Izoláty z ovzduší Žlutooranžové, růžové až červenohnědé kolonie, velmi intenzivní zbarvení spodní části kolonie – pigment často proniká do agaru. Některé kmeny jsou sterilní, jiné vytváří černá sporodochia.

Tvorba žádných významných mykotoxinů není známa Rub s barevným pigmentem Máslo A

Mladá kultura

Epicoccum nigrum

Kmen č.1.: Cladosporium sp. Kmen č.2.: Alternaria sp. Velmi výrazná tvorba sporodochií Kmen č. 3,4,7: Epicoccum nigrum konidie

Máslo B Kolonie: rychle rostoucí, zpočátku bělavé, později zeleně sporulující mycelium Rod Trichoderma

Trichoderma sp. DS 228, izolát z limonády kolového typu

-celulolytická houba Trichoderma atroviride DS 110 – -častý výskyt v půdě, na izolace na Ústavu konzervárenství rostlinných zbytcích, vlhkém VŠCHT (dr. Čeřovský) z džemů – dřevu. Dosti často izolována kontaminace v plechových z nápojů nádobách -produkce méně významných mykotoxinů (trichodermin, trichodermol) Rod Chaetomium Rod Stachybotrys

Plodnice na umělém živném médiu -Chaetomium je významný celulolytický rod s kosmopolitním rozšířením. Jeho zástupci se nachází na rostlinném opadu, v půdě, na dřevě apod. -Tvorba perithecií s trichomy -Produkce mykotoxinů: chaetoglobosin A a C

Chaetomuim globosum -Rod Stachybotrys je rovněž významným producentem celuláz. -Výskyt na materiálu obsahujícím celulózu – vlhký papír, tapety, seno, trichomy sláma aj. Častý na vlhkých zdech. -Na konci konidioforu se nachází svazek fialid, produkce tmavých konidií -Produkce mykotoxinů: satratoxin, askospory roridin, griseofulvin, trichodermin, trichodermol… Stachybotrys chartarum 4187 Plodnice typu perithecium Rod Aureobasidium a řád Chaetothyriales Sladké limonády, 2016 - 2017

Produkce žádných významných mykotoxinů není známa Zupančič J, Novak Babič M, Zalar P, Gunde-Cimerman N (2016) The Black Yeast Exophiala dermatitidis and Other Selected Opportunistic Human Fungal Pathogens Spread from Dishwashers to Kitchens. PLOS ONE 11(2): e0148166. doi:10.1371/journal.pone.0148166 http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0148166

Cladophialophora Exophiala Rhinocladiella Rod Claviceps Paličkovice nachová Rod Phomopsis Data z RASFF

http://www.bezpecnostpotravin.cz/kategorie/hlaseni-v-systemu-rasff.aspx Producent: Phomopsis leptostromiformis (tel. Životní cyklus: askospory této houby se zachytí na bliznách Diaporthe woodii), fytopatogenní coelomycet (např. žita), prorostou do semeníku. Celý semeník se promění vytvářející černé pyknidy na stoncích lupinu na tuhé sklerócium – NÁMEL. Produkce alkaloidů: ergotamin, ergotoxin Vývojová větev (říše) Fungi Oddělení: Chytridiomycota Microsporidiomycota Zygomycota Glomeromycota Ascomycota Basidiomycota

Roláda A

arthrokonidie

Wallemia sebi – bazidiomycetní xerofilní mikromycet -Tvorba malých hnědých kolonií - Produce mykotoxinů: walleminol A a B (nízká toxicita) Roláda B Další mikromycety významné z potravinářského hlediska Chrysonilia Phialophora verrucosa 4347 Acremonium

Mykotoxiny: Botrytis

Trichothecin, Scopulariopsis trichothecolon Trichothecium

Chrysonilia sitophila 4172 Ulocladium Scopulariopsis brevicaulis 4225 Botrytis cinerea 11 Stemhylium Acremonium sclerotigenum 4293 Geomyces Doratomyces Moniliella Xeromyces Phialophora aj. Geomyces sp. 4319

Děkuji za pozornost