Campus Veterinaire De Lyon

VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2016 - Thèse n°019

LE DIAGNOSTIC DE LA DICTYOCAULOSE BOVINE PAR LAVAGE BRONCHO-ALVEOLAIRE : ETUDE COMPARATIVE

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 19 juillet 2016 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

LURIER Thibaut Né le 04 septembre 1991 à Clamecy

VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Année 2016 - Thèse n°019

LE DIAGNOSTIC DE LA DICTYOCAULOSE BOVINE PAR LAVAGE BRONCHO-ALVEOLAIRE : ETUDE COMPARATIVE

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Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 19 juillet 2016 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

LURIER Thibaut Né le 04 septembre 1991 à Clamecy

LISTE DES ENSEIGNANTS DU CAMPUS VÉTÉRINAIRE DE LYON Mise à jour le 09 juin 2015

Civilité Nom Prénom Unités pédagogiques Grade M. ALOGNINOUWA Théodore UP Pathologie du bétail Professeur M. ALVES-DE-OLIVEIRA Laurent UP Gestion des élevages Maître de conférences Mme ARCANGIOLI Marie-Anne UP Pathologie du bétail Maître de conférences M. ARTOIS Marc UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur M. BARTHELEMY Anthony UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Contractuel Mme BECKER Claire UP Pathologie du bétail Maître de conférences Mme BELLUCO Sara UP Pathologie morphologique et clinique des animaux de compagnie Maître de conférences Mme BENAMOU-SMITH Agnès UP Equine Maître de conférences M. BENOIT Etienne UP Biologie fonctionnelle Professeur M. BERNY Philippe UP Biologie fonctionnelle Professeur Mme BERTHELET Marie-Anne UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Mme BONNET-GARIN Jeanne-Marie UP Biologie fonctionnelle Professeur Mme BOULOCHER Caroline UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences M. BOURDOISEAU Gilles UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur M. BOURGOIN Gilles UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences M. BRUYERE Pierre UP Biotechnologies et pathologie de la reproduction Maître de conférences M. BUFF Samuel UP Biotechnologies et pathologie de la reproduction Maître de conférences M. BURONFOSSE Thierry UP Biologie fonctionnelle Professeur M. CACHON Thibaut UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences M. CADORE Jean-Luc UP Pathologie médicale des animaux de compagnie Professeur Mme CALLAIT-CARDINAL Marie-Pierre UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences M. CAROZZO Claude UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences M. CHABANNE Luc UP Pathologie médicale des animaux de compagnie Professeur Mme CHALVET-MONFRAY Karine UP Biologie fonctionnelle Professeur M. COMMUN Loic UP Gestion des élevages Maître de conférences Mme DE BOYER DES ROCHES Alice UP Gestion des élevages Maître de conférences Mme DELIGNETTE-MULLER Marie-Laure UP Biologie fonctionnelle Professeur M. DEMONT Pierre UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur Mme DESJARDINS PESSON Isabelle UP Equine Maître de conférences Contractuel Mme DJELOUADJI Zorée UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences Mme ESCRIOU Catherine UP Pathologie médicale des animaux de compagnie Maître de conférences M. FAU Didier UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur Mme FOURNEL Corinne UP Pathologie morphologique et clinique des animaux de compagnie Professeur M. FREYBURGER Ludovic UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences M. FRIKHA Mohamed-Ridha UP Pathologie du bétail Maître de conférences Mme GILOT-FROMONT Emmanuelle UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur M. GONTHIER Alain UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences Mme GRAIN Françoise UP Gestion des élevages Professeur M. GRANCHER Denis UP Gestion des élevages Maître de conférences Mme GREZEL Delphine UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences M. GUERIN Pierre UP Biotechnologies et pathologie de la reproduction Professeur Mme HUGONNARD Marine UP Pathologie médicale des animaux de compagnie Maître de conférences M. JUNOT Stéphane UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences M. KECK Gérard UP Biologie fonctionnelle Professeur M. KODJO Angeli UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur Mme LAABERKI Maria-Halima UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences M. LACHERETZ Antoine UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur Mme LAMBERT Véronique UP Gestion des élevages Maître de conférences Mme LATTARD Virginie UP Biologie fonctionnelle Maître de conférences Mme LE GRAND Dominique UP Pathologie du bétail Professeur Mme LEBLOND Agnès UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur Mme LEFRANC-POHL Anne-Cécile UP Equine Maître de conférences M. LEPAGE Olivier UP Equine Professeur Mme LOUZIER Vanessa UP Biologie fonctionnelle Maître de conférences M. MARCHAL Thierry UP Pathologie morphologique et clinique des animaux de compagnie Professeur M. MOUNIER Luc UP Gestion des élevages Maître de conférences M. PEPIN Michel UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur M. PIN Didier UP Pathologie morphologique et clinique des animaux de compagnie Maître de conférences Mme PONCE Frédérique UP Pathologie médicale des animaux de compagnie Maître de conférences Mme PORTIER Karine UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Mme POUZOT-NEVORET Céline UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Mme PROUILLAC Caroline UP Biologie fonctionnelle Maître de conférences Mme REMY Denise UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur Mme RENE MARTELLET Magalie UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences stagiaire M. ROGER Thierry UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur M. SABATIER Philippe UP Biologie fonctionnelle Professeur M. SAWAYA Serge UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences M. SCHRAMME Serge UP Equine Professeur associé Mme SEGARD Emilie UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Contractuel Mme SERGENTET Delphine UP Santé Publique et Vétérinaire Maître de conférences Mme SONET Juliette UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Maître de conférences Contractuel M. THIEBAULT Jean-Jacques UP Biologie fonctionnelle Maître de conférences M. TORTEREAU Antonin UP Pathologie morphologique et clinique des animaux de compagnie Maître de conférences stagiaire M. VIGUIER Eric UP Anatomie Chirurgie (ACSAI) Professeur Mme VIRIEUX-WATRELOT Dorothée UP Pathologie morphologique et clinique des animaux de compagnie Maître de conférences Contractuel M. ZENNER Lionel UP Santé Publique et Vétérinaire Professeur

4 A Monsieur Jean François MORNEX Professeur à la Faculté de Médecine de Lyon Pour nous avoir fait l’honneur d’accepter la présidence de notre jury de thèse. Sincères remerciements A Monsieur Giles BOURGOIN Maître de conférences en parasitologie à VetAgro Sup Pour m’avoir proposé ce sujet, pour m’avoir co-encadré pendant ce travail, pour votre réactivité et votre engagement et pour le soutien et la confiance que vous avez su m’accorder. Sincères remerciements A Madame Marie-Anne ARCANGIOLI Maître de conférences en pathologie du bétail à VetAgro Sup Pour m’avoir proposé ce sujet, pour m’avoir co-encadré pendant ce travail, pour votre disponibilité et l’appui que vous m’avez apporté à la fois pour ce travail et pour mon projet professionnel. Sincères remerciements A Madame Marie-Laure DELIGNETTE-MULLER Professeur en bio statistique à VetAgro Sup Pour votre travail et votre écoute, pour l’intérêt montré envers ma problématique et mon sujet de thèse. Sincères remerciements A Monsieur Benoit RANNOU Service de Biochimie et Biophysique à VetAgro Sup Pour la mise à disposition du cytocentrifugeur, pour votre disponibilité et votre aide dans l’analyse cytologique des prélèvements. Sincères remerciements A Madame Christina STRUBE Professeur à la Faculté de Médecine Vétérinaire de Hanovre Pour la réalisation des analyses sérologiques. Sincères remerciements A Mesdames Marie-Thérèse POIREL et Slimania BENABED Pour l’aide à la réalisation des coproscopies et pour votre disponibilité. Sincères remerciements A Mesdames Chantal FOURNIER et Catherine MOTTET Pour la réalisation des numérations formules et pour votre aide au traitement des prélèvements. Sincères remerciements A Madame Elodie MOISSONIER Pour l’aide précieuse et la compagnie lors de la réalisation des analyses cytologiques. Sincères remerciements Aux docteurs Roland VAN UNEN, Jacques DEVOS, Norbert GIRAUD et Pauline OTZ Pour le recrutement des éleveurs, l’intérêt envers notre projet et la disponibilité dont vous avez fait preuve. Sincères remerciements Aux éleveurs ayant participé à l’étude Pour votre disponibilité, votre enthousiasme et votre compréhension. Sincères remerciements

6 A ma famille, A mes amis, A la Coloc’scopie,

A Caroline

8 TABLE DES MATIERES INTRODUCTION ...... 19 PARTIE 1 : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ...... 21 A. LA DICTYOCAULOSE BOVINE ...... 22 I. Un peu d’histoire ...... 22 II. La maladie et son importance ...... 24 a. Description rapide et prévalence ...... 24 b. Importance économique ...... 25 III. Etiologie : Dictyocaulus viviparus ...... 26 a. Taxinomie ...... 26 b. Biologie du parasite ...... 26 i. Morphologie et anatomie ...... 26 ii. Habitat et nutrition...... 27 iii. Reproduction ...... 27 c. Cycle évolutif ...... 28 i. Phase endogène ...... 28 ii. Phase exogène ...... 29 iii. Survie dans le milieu extérieur ...... 29 iv. Dissémination ...... 30 B. LA MALADIE ET SON DEVELOPPEMENT ...... 32 I. Epidémiologie ...... 32 a. Une atteinte par « vague » : les cycles parasitaires ...... 32 b. Influence des conditions météorologiques ...... 32 c. Epidémiologie au sein du troupeau ...... 33 d. Interaction avec les parasites gastro-intestinaux ...... 34 e. Facteurs favorisants ...... 34 i. Facteurs environnementaux ...... 34 ii. Facteurs liés à l’introduction ...... 35 iii. Facteurs liés à la conduite d’élevage ...... 35 II. Physiopathologie et expression clinique de la dictyocaulose ...... 36 a. La dictyocaulose imaginale ...... 36 i. Période prépatente ...... 36 ii. Période patente ...... 37 iii. Période post-patente ...... 39 b. Le syndrome pulmonaire aigu ...... 39 c. Relation entre l’expression des signes cliniques et la dose infestante ...... 39 d. Association avec d’autres pathogènes ...... 40 i. Relation avec les pathogènes opportunistes ...... 40 ii. Dictyocaulus viviparus et le virus respiratoire syncytial bovin (RSVB) ...... 40 iii. Dictyocaulus viviparus et le virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine (IBR) ...... 41 9 III. Immunité ...... 42 a. Cinétique et mécanisme de l’immunité contre D. viviparus ...... 42 i. Cinétique ...... 42 ii. Mécanismes ...... 43 iii. Stimulation antigénique ...... 43 b. Immunité et traitement...... 43 C. DIAGNOSTICS ET TRAITEMENT DE LA DICTYOCAULOSE ...... 46 I. Diagnostics épidémiologique, clinique et différentiel ...... 46 a. Diagnostics épidémiologique et clinique...... 46 b. Diagnostic différentiel ...... 46 II. Diagnostic par coproscopie ...... 48 a. Description des méthodes ...... 48 i. Méthode de Baermann ...... 48 ii. Méthode de McKenna ...... 49 b. Intérêts et limites ...... 50 i. Coût du matériel et contraintes de réalisation ...... 50 ii. Spécificité ...... 50 iii. Sensibilité ...... 50 c. Comparaison des deux techniques ...... 51 d. Coproscopie de mélange ...... 52 e. Synthèse ...... 52 III. Diagnostic sérologique ...... 52 a. MSP simple ...... 53 b. MSPr et GST-MSP ...... 53 c. BTM ELISA ...... 54 d. Résultats sur le terrain ...... 54 i. Sérum individuel ...... 54 ii. Mélange de sérums ...... 54 iii. Lait ...... 55 IV. Diagnostic par lavage broncho-alvéolaire ...... 56 a. Modalités de prélèvement et conditionnement ...... 56 i. Matériels...... 56 i. Méthodes ...... 57 ii. Effets indésirables ...... 57 b. Analyse du prélèvement et conditionnement ...... 57 i. Microbiologie...... 57 ii. Cytologie ...... 57 c. Caractéristiques du liquide de LBA chez un individu sain ...... 58 i. Aspect ...... 58 ii. Cytologie ...... 58 10 d. Modifications associées à des pathologies microbiennes ...... 59 i. Modifications associées à une maladie bactérienne ...... 59 ii. Modifications associées à une maladie virale ...... 60 iii. Modifications associées à une réaction d’hypersensibilité ...... 60 e. Modifications associées à la dictyocaulose ...... 61 i. Aspect ...... 61 ii. Mise en évidence du parasite ...... 61 iii. Modifications de la cytologie du liquide de LBA ...... 62 iv. Diagnostic ...... 62 V. Comparaison des différentes méthodes diagnostiques ...... 64 VI. Traitement et stratégie de contrôle ...... 66 a. Traitement médical ...... 66 b. Vaccination ...... 67 c. Mesure agronomique et conduite de pâturage ...... 67 PARTIE 2 : ETUDE EXPERIMENTALE ...... 69 PREAMBULE ...... 71 A. INTRODUCTION ...... 71 B. MATERIELS ET METHODES ...... 73 I. Présentation des élevages ...... 73 a. Sélection des élevages ...... 73 b. Description des élevages ...... 73 i. Signes d’appel ...... 73 ii. Antécédents de dictyocaulose ...... 73 iii. Conduite d’élevage et de pâturage ...... 74 II. Réalisation des prélèvements ...... 74 a. Sélection des animaux ...... 74 b. Séries de prélèvements ...... 74 c. Types de prélèvements et leur réalisation ...... 75 i. Fèces ...... 75 ii. Lavage broncho-alvéolaire ...... 75 iii. Sanguin ...... 75 III. Analyses de laboratoire ...... 75 a. Coproscopie ...... 75 b. Analyses du liquide de LBA ...... 75 i. Analyse macroscopique ...... 75 ii. Cytologie ...... 76 c. Sérologie ...... 76 d. Numération formule sanguine ...... 76 IV. Analyses statistiques ...... 76 C. RESULTATS ...... 77 11 I. Mise en évidence du parasite...... 77 a. Echelle individuelle ...... 77 b. Echelle du troupeau ...... 78 II. Analyse multivariée ...... 78 a. Description de l’échantillon étudié ...... 78 b. Résultats de l’analyse de composante principale ...... 79 i. Analyse d’inertie ...... 79 ii. Qualité de représentation des variables ...... 80 iii. Relation entre les variables et le statut ...... 81 III. Analyse descriptive ...... 82 a. Eosinophilie pulmonaire ...... 82 i. Echelle individuelle ...... 82 ii. Echelle troupeau ...... 83 b. Sérologie ...... 84 i. Echelle individuelle ...... 84 ii. Echelle troupeau ...... 85 IV. Analyse bayésienne ...... 86 a. Descriptions des données ...... 86 b. Modèle statistique ...... 86 c. Résultats ...... 88 i. Estimation des paramètres du modèle ...... 88 ii. Estimation des seuils de positivités ...... 90 iii. Représentation globale des données ...... 91 V. Application de l’éosinophilie pulmonaire sur le terrain ...... 92 a. Seuil réel ...... 92 b. Mode de lecture des cytologies ...... 92 VI. Prélèvement préclinique ...... 93 D. DISCUSSION ...... 95 CONCLUSION ...... 99 BIBLIOGRAPHIE ...... 101 ANNEXES ...... 112

TABLE DES ANNEXES

Annexe I : Données ...... 112 Annexe II : Script R ...... 115 Annexe III : Avis du comité d’éthique ...... 119

13 TABLE DES FIGURES

Figure 1 : Les « vers de Campers » : figure et légende extraites de « Essai sur l’histoire naturelle des vers intestinaux des animaux » écrit par A.C.Goeze en 1782 (Source : [68])...... 22 Figure 2 : Illustration de Strongle micrure par A.Railliet extrait de « Éléments de zoologie médicale et agricole » (Source : [146])...... 23 Figure 3 : Vulve dans la partie proximale d’une femelle Dictyocaulus viviparus observée au microscope optique grossissement x10 à gauche et x40 à droite (Source : photos personnelles)...... 26 Figure 4 : Extrémité antérieure de Dictyocaulus viviparus, observée au microscope optique, grossissement : A : x10 , B : x40 (source : photos personelles) ...... 27 Figure 5 : Extrémité postérieure de Dictyocaulus viviparus observée au microscope optique x10, A : Femelle ; B : Mâle (Source : photos personnelles)...... 27 Figure 6 : Œufs embryonnés de Dictyocaulus viviparus, A : Observés dans l’utérus d’une femelle au microscope optique x10 ; B : observés au microscope optique x40 (Source : photos personnelles). .. 27 Figure 7 : Cycle évolutif de Dictyocaulus viviparus (Source : schéma personnel, photo : vache[46]). . 28 Figure 8 : A : Larve de D.viviparus grimpant sur le sporangiophore de Pilobus spp.; B : larve sur le sommet du sporange ; C : larve sur la vésicule sous-sporangiale (Source : [148])...... 30 Figure 9 : Photo de Pilobus kleinii, le sporange est en noir (Source : [16])...... 31 Figure 10 : Pilobus kleinii sur une bouse de vache (Source : [122])...... 31 Figure 11 : Pilobus kleinii statique (en haut) et 0,8ms après le début de l’éjection du chapeau de spores (bas à droite) (Source : [186])...... 31 Figure 12 : Distribution des cas cliniques en fonction du mois de l’année en % du total par mois (Source : [40])...... 33 Figure 13 : Jetage séreux sur une vache charolaise atteinte de dictyocaulose (Source : Service pathologie du bétail VetAgro Sup)...... 36 Figure 14 : Autopsie d’un bovin adulte atteint de dictyocaulose, A : Présence de nombreux adultes et de liquide spumeux dans une bronche ; B : Bouchon de muco-pus dans une bronchiole (Source : Service de pathologie du bétail, VetAgro Sup)...... 37 Figure 15 : Coupe d’un poumon de bovin mort en détresse respiratoire de dictyocaulose. On observe une pneumonie interstitielle (Source : M.A Arcangioli)...... 38 Figure 16 : Vache charolaise en orthopnée, les membres sont écartés, la tête est étendue et la langue est pendante (Source : [124])...... 38 Figure 17 : Protection contre D. viviparus en fonction du temps chez des veaux jersiais (Source : Michel 1962 [113])...... 42 Figure 18 : Schéma du montage de Baermann (Source : [112])...... 48 Figure 19 : Schéma du montage de McKenna (Source :[112])...... 49 Figure 20 : Schéma de la chambre de comptage de la méthode de McKenna (Source : [112])...... 49 Figure 21 : Larve 1 de Dictyocaulus viviparus obtenue par coproscopie de Baermann (Source : VetAgro Sup)...... 50 Figure 22 : Photo du matériel et de la réalisation d’un LBA sur un bovin non tranquillisé au cornadis (Source : M. A. Arcangioli)...... 56 Figure 23 : Longueurs des dictyocaules retrouvés par LBA entre 2 et 5 semaines post-inoculation (Source : [72])...... 61 Figure 24 : Moyennes des taux cellulaires du liquide de LBA chez des bovins au cours de l’infestation par D. viviparus (Source : [158])...... 62 Figure 25 : Mise en évidence d’adultes macroscopiques dans le liquide de LBA chez trois bovins différents. (Source : photo personnelle)...... 63

14 Figure 26 : Mise en évidence de D.viviparus après coloration au RAL 555 du culot de centrifugation du LBA. A : œufs, B : larves 1, C : Fragment d’adulte (Source : photos personnelles)...... 63 Figure 27 : Cytologie du LBA d’un bovin atteint de dictyocaulose après cytocentrifugation et coloration au MGG (Source : Photo personnelle)...... 63 Figure 28 : Pourcentage d’inertie associé à chaque dimension, la flèche rouge met en évidence la marche entre les dimensions 3 et 4...... 79 Figure 29 : Cercles de corrélations de l’ACP ...... 80 Figure 30 : Nuage de points de l’ACP avec les sous-classes d’individus en fonction du statut...... 81 Figure 31 : Distribution du taux d’éosinophiles (en %) en fonction du statut...... 82 Figure 32 : Distribution du taux d’éosinophiles (en logit) en fonction du statut ...... 83 Figure 33 : Distribution du taux d’éosinophiles pulmonaires (en Logit) dans chaque élevage...... 84 Figure 34 : Distribution des résultats de la sérologie en fonction du statut en ratio de densité optique à gauche et transformé en Log à droite...... 84 Figure 35 : Distribution du logarithme décimal des ratios de densité optique dans chaque élevage, la ligne en pointillé représente le seuil proposé par Van Holtum et al...... 85

Figure 36 : DAG du modèle, N est le numéro de l’élevage (1 à 12), ni est le numéro de l’individu prélevé dans l’élevage i (1 à 6)...... 87 Figure 37 : Courbe ROC pour la sérologie ...... 90 Figure 38 : Courbe ROC de l’éosinophilie pulmonaire...... 90 Figure 39 : Nuage de points des données observées pour la sérologie et l’éosinophilie pulmonaire.. 91 Figure 40 : Nuage de point du taux d’éosinophiles pulmonaires(en logit) en fonction des deux méthodes d’analyse ...... 93 Figure 41 : Evolution de l’éosinophilie pulmonaire (en %) et de la sérologie (en ODR) des vaches de l’élevage J au cours de différentes visites réalisées à un mois d’intervalle...... 94

15 TABLE DES TABLEAUX

Tableau I : Présentation des dernières études sur la prévalence de Dictyocaulus viviparus dans le monde...... 24 Tableau II : Gains de poids 32 jours après contamination par des doses différentes de L3 de Dictyocaulus viviparus d’après Ploeger non publié (Source : [176])...... 25 Tableau III : Résumé des pertes économiques liées à deux épidémies de dictyocaulose estimées par l’étude de Holzhauer et al. en 2011 (Source : [79])...... 25 Tableau IV : Taxinomie résumée de Dictyocaulus viviparus (Source : [6], [21], [59])...... 26 Tableau V : Résumé des résultats de l’étude de Taylor et al. en 2000 (Source : [169])...... 44 Tableau VI : Diagnostic différentiel de la dictyocaulose...... 47 Tableau VII : Sensibilité et spécificité estimées en fonction de la période de prélèvements par Ploeger en 2014 (Source : [139])...... 54 Tableau VIII : Sensibilité et spécifité des ELISA sur lait de tank en fonction de 3 critères de positivité des troupeaux (Source : [139])...... 55 Tableau IX : Cytologies pulmonaires à partir de lavages pulmonaires chez des bovins sains ...... 58 Tableau X : Résumé des résultats l’étude de Beugnet et al. (source : [11])...... 64 Tableau XI : Principales molécules utilisables contre D.viviparus chez les bovins (Source : Med’vet 2016 [58])...... 66 Tableau XII : Synthèse des prélèvements réalisés en fonction des différentes visites faites dans chaque élevage, les chiffres entre parenthèses correspondent aux séries de prélèvements incomplètes...... 74 Tableau XIII : Table de concordance du diagnostic par coproscopie de Baermann et par lavage broncho-alvéolaire...... 77 Tableau XIV : Mise en évidence de D. viviparus par LBA, coproscopie de Baermann individuelle et de mélange au cours de l’étude...... 78 Tableau XV : Table de concordance du diagnostic de troupeau par coproscopie individuelle et par coproscopie de mélange...... 78 Tableau XVI : Paramètres du modèle avec la correspondance entre la distribution a priori et la distribution estimée a posteriori...... 89 Tableau XVII : Estimation des sensibilités et des spécificités de l’éosinophilie pulmonaire à partir des données de distribution a posteriori pour des seuils réellement observables sur le terrain...... 92 Tableau XVIII : Table de concordance de l’estimation du taux d’éosinophile après cytocentrifugation et frottis...... 92 Tableau XIX : Résultats des prélèvements réalisés dans l’élevage J avant l’apparition des premiers signes cliniques...... 93

16 TABLE DES ABREVIATIONS

ACP : Analyse de Composante Principale ATT : Aspiration Trans-Trachéale BTM : lait de tank (Bull Tank Milk) DAG : Directed Acyclic Graph EDTA : Acide éthylène-diamine-tétra-acétique ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay ENP : Ecouvillage Nasal Profond GST : Glutathione S Transférase IBR : Rhinotrachéite Infectieuse Bovine IC : Intervalle de Confiance ou de Crédibilité (pour l’analyse bayésienne) IgA, IgE… : Immunoglobuline A, Immunoglobuline E … L1, L2, L3 : Larve 1, Larve 2, Larve 3 LBA : Lavage Broncho-Alvéolaire LPG : Larve Par Gramme MCMC : Monte Carlo Markov Chain MGG : coloration de May-Grünwald Giemsa MSP : Major Sperm Protein MSPr : Major Sperm Protein recombinante NF : Numération Formule ODR : Ratio de Densité Optique (Optical Density Ratio) PCR : Polymérase Chain Reaction ROC : Receiver Operating Characteristic RSVB : virus respiratoire syncytial bovin

18 INTRODUCTION

La dictyocaulose bovine, ou bronchite vermineuse, est une maladie parasitaire majeure des bovins en France et en Europe. Elle est causée par Dictyocaulus viviparus, un nématode de la famille des trichostrongylidés, dont la répartition est cosmopolite. Cette maladie se traduit par de la toux, des écoulements nasaux et une dyspnée sévère pouvant conduire à la mort des individus atteints. Elle entraine aussi des pertes financières importantes pour l’éleveur. Historiquement, les jeunes animaux de première saison de pâturage étaient les plus touchés par la maladie, mais depuis les années 1990, la majorité des cas cliniques se déclare chez les adultes.

La méthode diagnostique de routine est la coproscopie de Baermann qui repose sur la mise en évidence des larves 1 dans les fèces. Néanmoins, de nombreux vétérinaires rapportent un manque de sensibilité de cette technique sur le terrain, et c’est souvent l’essai thérapeutique qui leur permet de confirmer le diagnostic de la maladie.

Des méthodes sérologiques ont été développées récemment, mais elles n’ont pas encore été suffisamment étudiées et on connait mal leur spécificité et leur sensibilité sur le terrain. Le lavage broncho-alvéolaire (LBA), déjà utilisé pour caractériser la réponse inflammatoire pulmonaire contre D. viviparus chez les bovins, n’a encore jamais été étudié en tant que méthode diagnostique de la maladie. Cette dernière technique pourrait permettre un diagnostic de certitude par la mise en évidence de dictyocaules adultes dans le liquide de LBA. De plus, l’analyse cytologique du liquide de LBA pourrait permettre une suspicion de dictyocaulose en mettant en évidence une réaction pulmonaire de type éosinophilique qui semble attachée à cette affection.

Après avoir fait le point sur l’état des connaissances actuelles disponibles sur la dictyocaulose bovine, nous présenterons notre étude expérimentale. Elle a été développée afin d’évaluer et de comparer les différentes méthodes diagnostiques de la maladie que sont la coproscopie, le lavage broncho- alvéolaire et la sérologie. Cette étude a été réalisée au cours de la saison de pâturage 2014-2015, dans 11 élevages présentant une toux d’aspect enzootique au pâturage aux alentours du campus vétérinaire de VetAgro Sup. Etant donné qu’aucune des méthodes ne peut être considérée comme un Gold Standard, les prévalences de la maladie et les caractéristiques de chacun des tests sont déterminées à partir d’inférences bayésiennes en utilisant un modèle à variables latentes et l’ajustement de mélanges de distributions.

PARTIE 1 : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

21 A. LA DICTYOCAULOSE BOVINE

I. Un peu d’histoire

La bronchite vermineuse est connue depuis le XVIIIe siècle. Le premier auteur à la mentionner est Franck Nicholls. Il observe en 1755 une maladie qui fait périr les jeunes bœufs principalement âgés de moins d’un an. A l’autopsie, il trouve des petits vers blanchâtres d’environ deux pouces de longueur (4-5cm) [123].

Campers observe en 1776, une maladie similaire qui touche les veaux au pâturage. Elle est caractérisée par la présence de toux, d’écoulement nasal et d’anorexie. Il décrit qu’un de ses voisins a perdu plus de trente veaux sur cinquante qui pâturaient sur une prairie avec plusieurs vaches, génisses, chevaux et moutons qui ne présentaient aucun signe de maladie. En autopsiant plusieurs des veaux morts, il trouve des milliers de vers filiformes blanchâtres longs d’un pouce et demi à deux pouces (3,5 à 5cm) dans l’arbre bronchique (Figure 1). En tentant de conserver les adultes qui meurent au bout de trois jours, il s’aperçoit que leur corps se met à fourmiller de petits vers semblables aux vers adultes. Il conclut donc que ces vers sont vivipares. Cependant, il pense que les veaux se contaminent au pâturage par l’eau qu’ils boivent et que ces vers s’introduisent par la glotte dans l’ « arrière trachée » où ils se multiplient à l’infini et produisent des myriades de petits. Il rapporte aussi le caractère « périodique » de la maladie, c’est-à-dire (selon lui) qu’elle se déclare une année dans tel endroit où elle n’est pas encore connue et où elle ne revient plus pendant plusieurs années [24].

Figure 1 : Les « vers de Campers » : figure et légende extraites de « Essai sur l’histoire naturelle des vers intestinaux des animaux » écrit par A.C.Goeze en 1782 (Source : [68]).

Dictyocaulus viviparus est ensuite décrit par Bloch en 1782 sous le nom de Gordius viviparus [13] puis par Rudolphi en 1808 sous le nom de Strongilus vitulorum [150], et en 1831 par Gurlt sous le nom de Strongilus micrurus mehlis [37].

Davaine, dans son « Traité des entozoaires et des maladies vermineuses de l’homme et des animaux domestiques » [38] publié pour la première fois en 1860, rappelle de nombreux cas décrits en Europe, principalement chez des veaux, mais parfois aussi chez des vaches adultes. Il rapporte que l’humidité des pâtures est mise en cause par de nombreux auteurs même si personne n’a réussi à le démontrer. Il montre la saisonnalité de la maladie avec un développement des vers essentiellement en été ou en automne. Il souligne l’importance de séparer les animaux atteints des animaux malades, mais il pense que la transmission des larves se fait par « les baves abondantes que rendent les animaux infestés sur l’herbe des prairies » [38].

En 1879, Spencer Cobbold publie les premières informations sur le cycle de vie de Dictyocaulus viviparus dans le livre « Parasite : a treatise on the entozoa of man and animals including some

22 account of the ectozoa » [30]. Il fait référence à ses expériences menées en 1875 dans lesquelles il évalue la survie et le développement, dans la terre humide, d’œufs de « Strongilus micrurus » récupérés à partir d’adultes présents dans les bronches d’un veau malade. Il observe l’éclosion des œufs et décrit les embryons et les larves de D. viviparus. Il mentionne la présence d’un œsophage simple et de granulations noires dans les larves. Il montre qu’elles sont sensibles à la dessiccation et au froid et il met en évidence la transmission passive des larves au ver de terre qui constitue selon lui un hôte intermédiaire du cycle évolutif de D. viviparus.

La première description complète faite en français des adultes est due à Louis-Joseph Alcide Railliet en 1885, professeur à l’Ecole vétérinaire d’Alfort. Il décrit alors Strongle micrure : « Espèce analogue au strongle filaire (i.e., Dictyocaulus filaria), mais plus petite. Le mâle mesure environ 4cm de long ; sa bourse caudale est petite, entière et soutenue de chaque côté par 5 côtes : la postérieure trilobée, l’antérieure dédoublée, les autres simples ; spicules courts et forts (Figure 2). La femelle est longue de 6 à 8cm, sa queue est pointue, mais assez courte ; sa vulve s’ouvre vers le 6e postérieur du corps. Ovovivipare. » [146]. C’est lui et A. Henry qui donneront à ce parasite son nom définitif, Dictyocaulus viviparus, en 1907 [37].

Figure 2 : Illustration de Strongle micrure par A.Railliet extrait de « Éléments de zoologie médicale et agricole » (Source : [146]).

Enfin, c’est R. Daubney qui présente en 1920 l’ensemble des connaissances acquises sur Dictyocaulus viviparus dans le « Journal of comparative pathology and therapeutics » [37]. Il décrit l’ensemble des différents stades de son cycle ainsi que les principaux éléments concernant sa transmission et son développement, même s’il les déduit principalement des données trouvées sur Dictyocaulus filaria. Il réalise la première étude en laboratoire sur l’influence de la température sur l’éclosion et le développement des stades larvaires de D. viviparus. Il montre ainsi que la température optimale se situe entre 21 et 27°C, alors qu’à 37°C l’ensemble des larves meurt, et qu’à 8°C leur développement est ralenti. On peut donc dire que la dictyocaulose, l’agent qui en est responsable et son cycle de vie étaient déjà bien connus dès le début du XXe siècle.

23 II. La maladie et son importance

Dans les paragraphes suivants, nous présenterons les prévalences actuelles à l’échelle régionale, européenne et mondiale, puis l’impact économique de cette maladie, afin de démontrer l’importance tant épidémiologique qu’économique de la dictyocaulose.

a. Description rapide et prévalence La dictyocaulose, aussi appelée bronchite vermineuse des bovins, est une helminthose respiratoire due au développement, dans la trachée et les grosses bronches des bovins, de nématodes de l’espèce Dictyocaulus viviparus. Elle est responsable d’épidémies sporadiques de troubles respiratoires sévères, surtout chez les animaux adultes pendant la période de pâture [28].

Cette maladie a une répartition cosmopolite (Tableau I). En France, elle touche plus particulièrement les zones humides avec un climat océanique. De nombreuses études évaluent sa prévalence en abattoir ou sur le terrain par coproscopie, sérologie ou par perfusion bronchique, à l’échelle individuelle ou du troupeau.

Tableau I : Présentation des dernières études sur la prévalence de Dictyocaulus viviparus dans le monde.

Année de Localisation Méthode Echelle Résultats (IC à 95%) publication Irlande [14] 2015 Sérologie sur lait de tank Troupeau 64,4% (58,6–70,3) Pakistan [105] 2014 Coproscopie Individuelle 4,88% Allemagne [160] 2013 Sérologie sur lait de tank Troupeau 17,1% (16,5–17,6) Allemagne [92] 2012 Sérologie sur lait de tank Troupeau 21,9% France (Cholet 49) [132] 2011 Perfusion bronchique Individuelle 13,75% (6,25-21,25) Malaisie [98] 2010 Coproscopie Individuelle 4,7% Suède [73] 18% Elevage biologique 2010 Sérologie sur lait de tank Troupeau Elevage conventionnel 9% Belgique [10] 2009 Sérologie sur lait de tank Troupeau 19,6% (17,7–21,6) Individuelle 17,5% Costa Rica [84] 2008 Sérologie sur sérum Troupeau 93% Irlande [121] 2006 Coproscopie Individuelle 14% Individuelle 11,8% Suède [76] 2004 Sérologie sur sérum Troupeau 39,5% Pays-Bas [136] 2000 Sérologie sur sérum Troupeau 41% Pays-Bas [19] 2000 Sérologie sur sérum Individuelle 6% Belgique [1] 2000 Sérologie sur sérum Individuelle 7%

24 L’ensemble des études souligne l’importance de la dictyocaulose à l’échelle mondiale avec une prévalence individuelle de 6% à 17,5% et une prévalence au niveau des troupeaux de 17,1% à 93%. Les grands écarts de prévalence troupeau de la dictyocaulose peuvent en partie s’expliquer par la méthode de détection et d’échantillonnage. En effet, les sensibilités des différentes méthodes sont différentes et le nombre d’animaux prélevés dans chaque étude n’est pas toujours le même (par exemple, toutes les femelles de plus de 6 mois soit 19 à 85 animaux prélevés selon les élevages pour l’étude de Jiménez et al. [84] au Costa Rica, et 10 par élevage pour Ploeger et al. [136] en Suède).

En France, une seule étude est disponible à notre connaissance. Elle a été réalisée par M. Pellerin en 2011 et elle présente la prévalence de la dictyocaulose à partir de 80 vaches laitières d’au moins 3,5 ans abattues à l’abattoir de Cholet (Maine-et-Loire 49). Les dictyocaules étaient recherchés avec la méthode de perfusion bronchique d’Inderbitzen modifiée par Oakley [127]. La prévalence observée était de 13,75%. Aucune étude à l’échelle nationale ou à celle des troupeaux n’est à ce jour disponible.

b. Importance économique Bien que parfois asymptomatique, la dictyocaulose a un impact économique non négligeable. Elle est responsable de baisse de production laitière, de gain moyen quotidien [88], de fertilité et aussi de hausse de mortalité [28]. Lors de contaminations modérées à sévères, la baisse de production laitière peut aller jusqu’à 4 à 5 litres de lait par jour et la mortalité peut atteindre 1 à 7% du lot [179]. Ploeger (résultats non publiés) montre que chez des veaux expérimentalement infestés, le gain de poids, 32 jours après l’infestation, est inférieur à celui de veaux sains, même en l’absence de signes cliniques [176] (Tableau II). Tableau II : Gains de poids 32 jours après contamination par des doses différentes de L3 de Dictyocaulus viviparus d’après Ploeger non publié (Source : [176]).

Nombre de larves L3 infestantes 0 30 60 120 Gain de poids 32 jours après la 25kg 17,5kg 13kg 12,5kg contamination

De même, Boon et al. ont montré en 1984 chez des veaux expérimentalement infestés que le gain de poids était négativement corrélé avec la dose infestante [17]. Concernant les adultes, la dernière étude publiée par Holzhauer et al. [79] sur les coûts relatifs à la dictyocaulose date de 2011. Elle présente deux cas d’épidémie de dictyocaulose dans deux troupeaux laitiers ainsi que les coûts financiers qui en ont résulté pour les éleveurs. Les résultats sont résumés dans le Tableau III.

Tableau III : Résumé des pertes économiques liées à deux épidémies de dictyocaulose estimées par l’étude de Holzhauer et al. en 2011 (Source : [79]).

Troupeau 1 (110 vaches) Troupeau 2 (95 vaches) Total 159€/vaches 167€/vaches Baisse de la production laitière 51,7% des pertes économiques 36,3% des pertes économiques (15 à 20%) 5 animaux = 33,1% des pertes 7 animaux = 50,9% des pertes Mortalité économiques économiques Inséminations supplémentaires 15,2% des pertes économiques 12,8% des pertes économiques et frais vétérinaires

Cette étude surévalue certainement les coûts liés à l’épisode clinique de dictyocaulose, car elle considère que toutes les variations de production pendant les 5 mois autour de l’endémie sont dues uniquement à la dictyocaulose. Cependant, elle montre tout de même que les formes cliniques de

25 dictyocaulose ont un impact économique fort. Malheureusement, aucune étude n’a été réalisée à notre connaissance sur l’impact économique du portage asymptomatique de Dictyocaulus viviparus.

Quoi qu’il en soit, la dictyocaulose peut avoir un impact économique important. En tant que vétérinaire, il est donc nécessaire de s’y intéresser pour proposer aux éleveurs les meilleures solutions possibles.

III. Etiologie : Dictyocaulus viviparus

a. Taxinomie Dictyocaulus viviparus est un nématode, sa taxinomie est résumée dans le Tableau IV. C’est un parasite des bovins, cerfs, rennes et dromadaires, mais une spécificité d’hôte est supposée [142], [168]. Tableau IV : Taxinomie résumée de Dictyocaulus viviparus (Source : [6], [21], [59]).

Taxon Nom Caractéristiques Phylum Nématoda Vers ronds Classe Secernentea Plasmides et appareil excréteur présents, papilles caudales chez les mâles Bouche non trilabiée, œsophage simple, appareil génital femelle normal Ordre Strongylida mâles avec des bourses caudales très développées Super Trichostrongyloidea Rayures longitudinales, bourses caudales avec lobes latéraux, cycle famille monoxène Famille Dictyocaulidae L1 souvent rhabditoïde avec une extrémité postérieure en pointe Genre Dictyocaulus Parasites respiratoires des bovins, ovins et équidés Espèce Viviparus Bovins, cerfs, rennes et dromadaires

b. Biologie du parasite i. Morphologie et anatomie Le mâle mesure 5 cm et la femelle 5 à 8 cm, pour un diamètre de 0,5 mm. Il est effilé à ses extrémités. C’est un ver blanc laiteux (Figure 3). L’extrémité antérieure du ver porte une petite cavité buccale entourée de quatre lèvres, et présente un anneau chitineux dans sa partie postérieure (Figure 4). Outre sa plus petite taille, le mâle se distingue de la femelle par la présence d’une bourse copulatrice et de deux spicules bruns, courts, trapus, coniques et alvéolés (Figure 5). Chez la femelle, sa vulve s’ouvre en partie à environ 1/6 de l’extrémité (Figure 3) et des ovules peuvent être observés dans les ovaires et des œufs dans l’utérus (Figure 6) [175].

Figure 3 : Vulve dans la partie proximale d’une femelle Dictyocaulus viviparus observée au microscope optique grossissement x10 à gauche et x40 à droite (Source : photos personnelles).

Figure 4 : Extrémité antérieure de Dictyocaulus viviparus, observée au microscope optique, grossissement : A : x10, B : x40 (Source : photos personnelles).

Figure 5 : Extrémité postérieure de Dictyocaulus viviparus observée au microscope optique x10, A : Femelle ; B : Mâle (Source : photos personnelles). ii. Habitat et nutrition Les adultes ne sont pas fixés à la muqueuse trachéale. Les œufs éclosent dans les alvéoles pulmonaires. Les stades larvaires L1 à L3 survivent dans le milieu extérieur. Les adultes se nourrissent de sécrétions bronchiques. Les stades larvaires ne se nourrissent pas, car ils ont des réserves de glycogène suffisantes [168].

iii. Reproduction La femelle est ovovivipare et pond des œufs larvés de 82-88 µm par 33-38 µm (Figure 6). Les femelles à maturité peuvent pondre 25 000 œufs par jour pendant 40 à 60 jours [137].

Figure 6 : Œufs embryonnés de Dictyocaulus viviparus, A : Observés dans l’utérus d’une femelle au microscope optique x10 ; B : observés au microscope optique x40 (Source : photos personnelles).

27 c. Cycle évolutif Le cycle de Dictyocaulus viviparus (Erreur ! Source du renvoi introuvable.) est un cycle homoxène (il ne fait intervenir qu’un seul hôte obligatoire). Il peut être divisé en deux phases : la phase endogène qui se déroule entièrement dans l’hôte (de l’infestation par les larves 3 (L3) à la présence d’adultes dans les cavités aérifères puis la ponte et le passage des L1 dans le tube digestif) et la phase exogène, principalement dans le milieu extérieur, de l’élimination des L1 dans le milieu extérieur à l’obtention de L3 infestantes.

Figure 7 : Cycle évolutif de Dictyocaulus viviparus (Source : schéma personnel, photo : vache[46]).

i. Phase endogène L’infestation se fait par voie orale par ingestion de larves 3 avec la nourriture, principalement. Les exuvies dans lesquelles sont enveloppées les larves 3 sont digérées par les sucs gastriques. Elles traversent ensuite la paroi du tube digestif et gagnent les ganglions mésentériques de l’iléon, du cæcum et du colon où elles muent en larves 4 trois à huit jours après l’ingestion [165]. Cette mue s’accompagne d’une stimulation antigénique qui permet le développement d’une réponse immunitaire.

Les larves 4 passent dans le sang et migrent jusqu’au cœur droit, puis dans l’artère pulmonaire où le flux sanguin est ralenti. Elles traversent les parois vasculaires et alvéolaires. Cette migration jusqu’aux poumons dure entre 1 et 7 jours. Les larves passent ensuite des alvéoles pulmonaires aux bronchioles où elles subissent leur dernière mue environ 15 jours après l’ingestion. Ce 5e stade (L5), correspond à un stade d’adulte immature. La maturité sexuelle est atteinte 21 à 25 jours après l’ingestion [137]. Le taux d’installation du parasite est de 20 à 30% des larves ingérées lors de primo- infestation [138].

Les femelles pondent les œufs directement dans les voies aérifères. Les œufs éclosent presque immédiatement après la ponte pour donner des larves 1 strongyloïdes (L1). Celles-ci remontent jusqu’au pharynx avec les expectorations et sont dégluties. Les larves passent ainsi dans le tube digestif et sont évacuées dans les selles de l’animal.

La période prépatente, le temps qui sépare l’infestation du moment où les formes de dissémination (œufs, larves…) sont retrouvées dans le milieu extérieur [49], dure généralement 30 jours, mais elle peut atteindre jusqu’à 150 jours lors d’hypobiose (phénomène biologique consistant en l’arrêt du 28 développement endogène des larves en stade L5 pour D.viviparus qui mènent alors une vie ralentie) [166]. Ce stade constitue une forme de résistance. Le parasite (stade L5) reste « en sommeil » dans les voies aérifères de l’hôte [166] où il peut survivre tout l’hiver. Au printemps, le parasite reprendra son évolution jusqu’à atteindre sa maturité sexuelle. Cette forme de survie est la source la plus importante de réinfestation des pâtures au printemps [57], [151].

ii. Phase exogène On retrouve des L1 dans les fèces des ruminants à partir de 3 à 4 semaines après le début de l’infestation [57], [17], [72] et jusqu’à 8 semaines après l’inoculation (sans recontamination ultérieure) [72], [158]. Lors de primo-infestation, l’excrétion fécale de L1 est positivement et linéairement corrélée avec la dose infestante [17],[158].

Une fois dans le milieu extérieur, les larves subissent deux mues pour aboutir au stade L3 infestant. Les larves 3 restent encapsulées dans les exuvies de L1 et L2. Ce développement est possible entre 4 et 37°C. Dans les conditions optimales d’oxygène, d’humidité et de température (21-27°C), le passage du stade L1 à L3 dure 5 jours. Le développement est donc plus rapide au printemps [7]. Sur le terrain, la charge en larves 3 des pâtures évolue parallèlement à l’excrétion fécale en larves 1 des individus présents sur la pâture avec un décalage d’une à deux semaines lors de conditions environnementales permettant le développement larvaire [88].

iii. Survie dans le milieu extérieur Seuls les stades larvaires 1, 2 et 3 sont présents dans le milieu extérieur. Contrairement à la plupart des nématodes, les larves de Dictyocaulus viviparus ne se nourrissent pas dans le milieu extérieur [36]. Les réserves de glycogènes accumulées au stade embryonnaire sont leurs seules sources d’énergie. Ces réserves sont visibles au microscope optique sous forme de granulations noires. Les principaux facteurs limitant la survie et le développement des dictyocaules sont les conditions environnementales (température, hygrométrie et oxygénation).

Le stade 3 correspond au stade de résistance dans le milieu extérieur. En effet, les L3 sont encapsulées dans les exuvies de L1 et L2 ce qui leur confère une relative résistance à la dessiccation [175]. Néanmoins, les L3 ne peuvent survivre que dans les zones humides et dans les bouses. Et, bien que peu mobiles, les larves 3 migrent vers les zones sombres et humides. Cela a été montré in vitro par Jørgensen et al. [86].

Le nombre de larves vivantes dans les bouses décroit dès leur émission, à des vitesses différentes en fonction des conditions climatiques. Par exemple, les L3 survivent 4 semaines en mai et jusqu’à 13 semaines d’octobre à janvier [117]. Les températures négatives ponctuelles (-9°C) sont létales pour les L1, mais pas pour les L2 [7]. Des L3 peuvent aussi être retrouvées vivantes dans des bouses restées sur les pâtures pendant tout l’hiver [126]. Les larves L3 peuvent donc survivre à l’hiver et être une source de réinfestation au printemps. Ce résultat est confirmé par plusieurs études comme celle de Jørgensen et al. en 1980 qui met en évidence des L3 dans les pâtures après l’hiver [88].

La dernière forme de résistance est celle qui fait intervenir le ver de terre en tant qu’hôte paraténique (hôte facultatif non essentiel au cycle). Les larves ingérées par le ver de terre permettent la survie et la dissémination du parasite dans l’environnement [128].

29 iv. Dissémination Les larves de Dictyocaulus viviparus sont très peu mobiles et survivent mieux dans les bouses. Comme les vaches broutent peu autour de leurs bouses (sauf en cas de surpâturage), les dictyocaules seraient dans une impasse s’ils n’avaient pas plusieurs moyens de dissémination des larves. Nous avons évoqué précédemment le rôle du ver de terre. Les ruissellements et les piétinements jouent aussi un rôle non négligeable dans la dissémination des larves dans la pâture, mais le rôle du champignon Pilobus spp. est probablement le plus remarquable et le plus important. Il a été décrit pour la première fois en 1962 par Robinson [148] (Figure 8) .

Figure 8 : A : Larve de D.viviparus grimpant sur le sporangiophore de Pilobus spp.; B : larve sur le sommet du sporange ; C : larve sur la vésicule sous-sporangiale (Source : [148]).

Pilobus spp. est un champignon qui se développe sur les fèces des bovins (Figure 9 et Figure 10). Il pousse naturellement dans 50% des prélèvements rectaux selon Gronvøld et al. au Danemark [70] et dans 100% des prélèvements au sol selon Foos dans le parc de Yellowstone (Etats-Unis) [62]. Il se développe en moins d’une semaine sur les bouses [148] et son sporange est éjecté jusqu’à 2,9m [186] (Figure 11). La larve s’accole au sporange et peut donc se retrouver projetée à 2 ou 3 mètres de la bouse initiale et peut ainsi contaminer l’ensemble de la pâture et même les prairies voisines. Le rôle de Pilobus dans la dissémination de D. viviparus a été confirmé dans de nombreuses études en laboratoire et sur le terrain.

En 1980, Jørgensen et al. montrent qu’un nombre plus important de larves est trouvé dans l’environnement en fin de matinée, juste après que l’activité de dispersion des spores de Pilobus soit la plus importante [88]. En 1982, ils disposent manuellement dans deux prés différents des fèces issues de deux paires de veaux préalablement infestés par D. viviparus, « décontaminés » de Pilobus (par des mesures hygiéniques et une alimentation stérilisée) et expérimentalement infestés ou non par des spores de Pilobus spp. Ils montrent que le nombre de larves trouvées dans le pré sans Pilobus à moins de 5 cm, à 100 cm ou à plus de 100 cm était respectivement réduit de 94,8%, 97% et 91,5% [87]. En 1991, Eysker dénombre la quantité de larves projetées par Pilobus en recouvrant les bouses dans un pré expérimental avec une boite de pétri de 13 cm de diamètre. Il rapporte une dispersion allant jusqu’à 50% des L1 présentes dans les fèces par la sporulation de Pilobus spp. dans des conditions naturelles [50]. Ces études démontrent le rôle majeur de Pilobolus spp. dans la dispersion des stades larvaires de Dictyocaulus.

En 1987, Grønvold et al. placent des fèces contenant des larves de D. viviparus et des spores viables de Pilobus kleinii dans une étable à 45 cm de la mangeoire. Ils rapportent une sporulation avec

30 présence de larves de D. viviparus dans les échantillons récupérés de 5 à 10 jours après le dépôt des fèces. Les veaux présents dans l’étable commencent à excréter des larves de dictyocaules 40 jours après le dépôt des fèces [71]. Des contaminations sont donc théoriquement possibles même à l’étable en absence de pâturage.

Figure 9 : Photo de Pilobus kleinii, le sporange est en noir (Source : [16]).

Figure 10 : Pilobus kleinii sur une bouse de vache (Source : [122]).

Figure 11 : Pilobus kleinii statique (en haut) et 0,8ms après le début de l’éjection du chapeau de spores (bas à droite) Image tirée d’une vidéo filmée en 50000 images par seconde. Echelle : 1mm. (Source : [186]).

31 B. LA MALADIE ET SON DEVELOPPEMENT

Après avoir décrit le parasite, nous pouvons désormais aborder plus précisément la maladie dont il est l’agent. Nous présenterons dans un premier temps la dictyocaulose bovine du point de vue épidémiologique au niveau du troupeau, puis nous nous intéresserons à sa physiopathologie et son expression clinique pour finir par l’immunité des bovins face à la dictyocaulose.

I. Epidémiologie Comme nous l’avons vu dans le Tableau I, la dictyocaulose est une maladie cosmopolite. Elle est particulièrement importante dans les zones à climat tempéré comme le nord de l’Europe où les précipitations et les températures sont favorables au développement des larves.

a. Une atteinte par « vague » : les cycles parasitaires

Les sources de larves sont diverses. Soit elles survivent à l’hiver dans le milieu extérieur, et les pâtures sont alors à l’origine d’une contamination résiduelle [126], [88]. Soit, et c’est le cas le plus fréquent [151], il existe des porteurs latents qui contamineront les pâtures précocement dès la sortie aux pâturages. Ces individus sont porteurs de quelques vers adultes ou de stades inhibés dans leurs poumons. D’après Eysker et al., dès la fin de l’hiver, 15% des troupeaux étudiés présentent déjà des coproscopies de mélange positives (prélèvements réalisés dans 40 élevages autour de l’Université d’Utrecht (Pays-Bas) entre le 11 février et le 31 mars) [55].

Lorsqu’un individu est porteur, il va contaminer l’environnement avec 25 000 larves par jour et par femelle. Si elles sont ingérées après évolution dans l’environnement et que les conditions sont bonnes, elles aboutiront à N adultes qui, une fois leur maturité sexuelle atteinte, libéreront 25 000 larves par jour et femelle. Une nouvelle génération de parasite apparait toutes les 5 à 6 semaines (cf. 0.III.c.), et si les cycles parasitaires s’enchainent sur une même parcelle, il y a un recyclage parasitaire important qui aboutit à une très forte contamination de la pâture. La survie des larves dans le milieu extérieur est alors conditionnée par les conditions climatiques.

Si on se place dans le cas d’une mise au pâturage en début de printemps, les conditions climatiques sont généralement favorables au développement des dictyocaules jusqu’au début de l’automne (hors sècheresse estivale importante). Et, bien qu’un épisode clinique soit possible dès le premier cycle si la charge initiale des pâtures est très élevée, la plupart des symptômes apparaissent lors du deuxième ou du troisième cycle soit 10 à 15 semaines après la mise au pâturage, lorsque les pâtures sont suffisamment infestées pour contaminer massivement les bovins [114]. Par contre, compte tenu de la mise en place d’une immunité vis-à-vis de D. viviparus, la survenue d’un épisode clinique après le quatrième cycle est peu probable.

b. Influence des conditions météorologiques Les conditions météorologiques ont une grande influence sur la survenue d’épisodes cliniques. En effet, la durée du développement des stades larvaires et la survie des larves dans le milieu extérieur sont conditionnées par les conditions climatiques. A des températures inférieures à 10°C, les larves survivent dans le milieu extérieur, mais leur développement est ralenti. Elles sont assez sensibles à la dessiccation et ne survivent que 2 à 3 semaines dans des conditions chaudes et sèches [114].

Néanmoins, malgré la sensibilité des larves à la dessiccation, la chaleur semble être un facteur prépondérant. Schneider et al.(1993) ont montré, en analysant les relevés météorologiques et la séropositivité chez des animaux en première saison de pâturage, que les troupeaux étaient significativement plus séropositifs quand il y avait eu plus de 50 jours entre mai et septembre, ou plus de 26 jours entre mai et juillet, avec une température moyenne au-dessus de 15°C [157]. 32 De même, selon Van Dijk (2004), entre 1980 et 2002, 80% des cas du Royaume-Uni ont eu lieu entre début juillet et fin octobre (Figure 12)[40]. Plus récemment, Schunn et al. (2012), en suivant les taux d’anticorps individuels dans le lait de fermes conventionnelles allemandes, tous les mois, de mars 2009 à février 2010, rapportent que le taux d’anticorps des prélèvements individuels de lait est plus haut en fin d’été et en début d’automne que le reste de l’année [161].

Figure 12 : Distribution des cas cliniques en fonction du mois de l’année en % du total par mois (Source : [40]).

Inversement, selon l’étude d’Eddi et al. (1989) en Louisiane où le climat est subtropical, les cas cliniques de dictyocauloses sont observés entre janvier et avril en 1986 et entre janvier et février en 1987. Cela correspond à la période où l’on trouve le plus de dictyocaules à la fois à l’autopsie, sur les coproscopies et dans la pâture. Il faut noter alors que l’excrétion fécale commence à augmenter à partir de novembre [45].

Jimenez et al. montrent que les zones tropicales de haute altitude permettent aussi le développement des dictyocaules et ce développement est accru pendant la saison des pluies [85].

La température a donc une forte influence sur la clinique et l’épidémiologie des parasites : si les conditions climatiques ralentissent le développement des dictyocaules, les individus du troupeau s’immunisent et ils présenteront peu ou pas de signes cliniques pendant la saison de pâturage. Inversement, si les conditions climatiques sont optimales, la pression infectieuse augmente très rapidement et les individus n’ont pas le temps de s’immuniser suffisamment contre D. viviparus. Cela peut expliquer pourquoi certains élevages atteints de dictyocaulose ne manifestent pas de signes cliniques tous les ans.

c. Epidémiologie au sein du troupeau Historiquement, la dictyocaulose est responsable de signes cliniques principalement chez les animaux en première saison ou seconde saison de pâturage. Le schéma classique commence avec des pauci-infestations sur quelques veaux. Puis grâce à des conditions climatiques favorables et à la forte prolificité des Dictyocaulus viviparus adultes femelles, l’infestation des pâtures augmente rapidement (à partir d’un mois après le début de l’infestation). Cela entraine alors une auto- infestation des premiers veaux excréteurs partiellement immunisés et des primo-infestations massives sur le reste du troupeau naïf. Cette forme clinique est responsable d’une maladie sévère, c’est la dictyocaulose imaginale [138]. 33 L’autre forme clinique, moins fréquente, est la forme asthmatiforme. Elle touche des bovins plus âgés lors de réinfestation massive. Elle est liée à un phénomène d’hypersensibilité [103].

Depuis les années 90, ce schéma épidémiologique est remis en cause. La dictyocaulose ne touche plus autant les animaux de première et deuxième années de pâturage, mais plutôt les adultes. Ainsi, alors que de 1980 à 1992 la prévalence de la dictyocaulose est de 47% chez les animaux de 2 ans et plus, entre 1992 et 2002 elle est de 76% chez les animaux de plus de 2 ans et entre 2002 et 2003, 83% des cas de dictyocaulose diagnostiqués par the Veterinary Laboratory Agency au Royaume-Uni concernent des vaches adultes [40]. Ces résultats sont confirmés par de nombreuses études de prévalence réalisées chez des animaux adultes (Tableau I) notamment en France avec les thèses de F.Pellerin (2011) [132], de G.Murigneux (2012) [120] et d’E. Louvet (2014) qui rapportent que 80% des cas de dictyocaulose concernaient les adultes dans les 142 élevages inclus dans l’étude [102].

Cette atteinte de plus en plus importante peut être expliquée par plusieurs phénomènes, notamment la vermifugation accrue des jeunes. En effet, l’emploi d’anthelminthiques à forte rémanence s’est généralisé depuis les années 90 particulièrement chez les jeunes [135]. Cela induit un temps de contact avec le parasite moins long et ne permet pas de développer une bonne immunité [136]. Les jeunes devenus adultes seront plus sujets à développer un épisode clinique.

d. Interaction avec les parasites gastro-intestinaux Dans les conditions naturelles, les bovins sont simultanément exposés à plusieurs parasites différents lors du pâturage. Ostertagia ostertagi et Cooperia oncophora sont les deux parasites gastro- intestinaux les plus fréquents en Europe, présents sur presque toutes les pâtures. De nombreux auteurs ont constaté des interactions négatives ou positives entre ces différents parasites [42] et généralement, l’infestation par un parasite gastro-intestinal limite les infestations ultérieures par d’autres parasites gastro-intestinaux [93]. Au contraire, selon Kloosterman et al. [94–96], la dictyocaulose est favorisée par une infestation préalable par O. ostertagi et par C. oncophora. Cette interaction n’est possible que si les individus sont préalablement infestés par les deux parasites O. ostertagi et C. oncophora. Quand les individus ne sont préalablement infestés que par l’un ou l’autre des deux parasites, on ne retrouve plus de différence avec les individus naïfs [96].

Les mécanismes mis en jeu ne sont pas connus et il serait intéressant de savoir si ces observations se retrouvent avec d’autres parasites gastro-intestinaux. Quoi qu’il en soit, la pression parasitaire des pâtures semble être un facteur favorisant important à prendre en compte. Elle pourrait expliquer certaines différences d’infestation par Dictyocaulus viviparus observées aussi bien à l’échelle individuelle, qu’à l’échelle des lots d’un élevage ou de différents élevages.

e. Facteurs favorisants Trois types de facteurs favorisent l’apparition de signes cliniques de la maladie : les facteurs favorisant le développement des larves dans le milieu extérieur, appelés facteurs environnementaux, ceux permettant l’apparition de la maladie dans un troupeau et enfin ceux liés à la conduite d’élevage en tant que telle.

i. Facteurs environnementaux Différents facteurs de risque environnementaux ont été appréciés dans l’étude de Schunn et al. publiée en 2013 [160] à partir de 19 910 échantillons de lait de tank en Allemagne (soit 20% des élevages bovins allemands).

Une corrélation positive de 2,3 a été mise en évidence entre la séropositivité pour D. viviparus dans le lait de tank et la proportion de pâturages dans la commune de l’élevage. De même, la présence de plans d’eau lentiques (marécages, mares, étangs…) dans la commune augmente le risque de 34 séropositivité de 4,3. La relation entre la proportion de pâturages reflète le fait que la dictyocaulose est une maladie du pâturage. La corrélation avec les plans d’eau est probablement liée à des sols retenant mieux l’humidité favorable à la survie du parasite.

Une corrélation positive a aussi été mise en évidence avec la densité de fermes et la densité de vaches par commune, et une corrélation négative avec la part de céréaliculture, mais les coefficients de risque ont été jugés trop faibles. Enfin, l’influence des précipitations n’a pas été mise en évidence, mais les auteurs rapportent de faibles variations de ce paramètre en fonction des régions en Allemagne cette année-là, ce qui a pu en masquer l’effet [160].

ii. Facteurs liés à l’introduction L’introduction de nouveaux animaux est un facteur de risque important : soit par l’introduction d’un individu porteur asymptomatique dans un troupeau naïf, soit par l’introduction d’individus naïfs dans un troupeau atteint. Dans le premier cas, l’individu introduit va contaminer des individus non immunisés, et permettre des cycles parasitaires très rapides avec une infestation majeure du troupeau. Dans le deuxième cas, l’individu naïf se contamine au sein du troupeau, et sans immunité, il permet un relargage massif de larves qui peut alors surpasser les capacités immunitaires des individus du troupeau. Dans les deux cas, l’introduction d’un nouvel individu peut entrainer une atteinte globale du troupeau. Cela concernait 12 des 16 cas étudiés dans l’ouest de la France par Camuset en 2008 [134].

iii. Facteurs liés à la conduite d’élevage En 1993, Schnieder et al. [157] étudient la séroprévalence de la dictyocaulose chez 258 animaux de première saison de pâturage. Ils montrent que les élevages avec un temps de pâturage supérieur à 150 jours, et une charge au pâturage élevée sont plus séropositifs vis-à-vis de la dictyocaulose. De même, les élevages dans lesquels les pâtures sont supplémentées en foin ou en ensilage par manque d’herbe sont plus séropositifs. Ainsi, un temps de pâturage plus long et un surpâturage sont des facteurs de risque pour la dictyocaulose.

Dans la même étude, les troupeaux dont les veaux pâturaient sur des prairies différentes de celles des adultes avaient moins de chance d’être séropositifs [157]. En effet, ce sont souvent les adultes qui sont porteurs de la maladie et qui contaminent les pâtures puis les jeunes peu ou pas immunisés. Cela peut alors entrainer un relargage massif de larves dans l’environnement qui peut alors entrainer des signes cliniques à la fois sur les jeunes et les adultes s’ils reviennent sur cette parcelle.

Enfin, la prévalence de la dictyocaulose semble plus élevée dans les élevages biologiques. Cela a été mis en évidence par Hoglund et al. en 2001 avec 11/15 (73,3%) fermes séropositives [75] et en 2010, avec 18% des fermes biologiques séropositives contre 9% des fermes conventionnelles avec un échantillon de 105 fermes biologiques et 105 fermes conventionnelles voisines. Néanmoins, la différence n’est pas tout à fait significative avec une p-value de 0,055 [73]. On notera toutefois qu’en 2004, aucune des 10 fermes biologiques incluses dans l’étude d’Hoglund et al., n’était séropositive [76]. Même si les chiffres sont très variables d’une étude à l’autre, on peut suspecter une prévalence plus importante dans les élevages biologiques, qui peut être mise en relation avec un pâturage plus important malgré des densités plus faibles et un emploi d’anthelminthiques en routine moins important.

La dictyocaulose reste une maladie difficilement prévisible. De nombreux facteurs de risques ont été mis en évidence par des enquêtes sérologiques, mais la survenue d’un épisode clinique est très dépendante des conditions environnementales et de l’immunité du troupeau.

35 II. Physiopathologie et expression clinique de la dictyocaulose

Nous avons précédemment décrit l’existence de deux formes cliniques de dictyocaulose : la dictyocaulose imaginale (bronchopneumopathie vermineuse), et le syndrome pulmonaire aigu (crise asthmatiforme). Nous allons en expliquer la genèse lésionnelle et ainsi la clinique observée.

a. La dictyocaulose imaginale

La dictyocaulose imaginale, ou bronchopneumopathie vermineuse, touche les animaux non immunisés contre la dictyocaulose, généralement les veaux de première ou seconde années de pâture. Selon le cycle de développement de Dictyocaulus viviparus (Erreur ! Source du renvoi introuvable.), on peut la séparer en trois périodes différentes :

- la période prépatente (ou phase d’invasion), - la période patente (ou phase d’état), - la période post-patente (ou phase de guérison).

i. Période prépatente Les parasites immatures ne déclenchent pas de signes cliniques avant leur passage dans les alvéoles pulmonaires une à deux semaines après leur ingestion [17]. Le passage des L4 des capillaires sanguins vers les alvéoles pulmonaires cause un emphysème interstitiel. Les L4 induisent aussi une infiltration alvéolaire par des cellules immunitaires (polynucléaires neutrophiles et éosinophiles, macrophages…) qui entraine un épaississement de leur paroi et une nécrose [159]. La migration des L4 vers les bronchioles et leur développement en adultes provoque une augmentation de la réaction éosinophilique. Les débris d’éosinophiles et de larves génèrent un exsudat alvéolaire et une atélectasie pulmonaire.

Ces lésions sont généralement microscopiques et lors d’infestation modérée, le poumon semble normal à l’autopsie. Lors d’infestation majeure, le poumon apparait diffusément rouge et des lésions de pneumonie interstitielle (zones petites et multifocales d’atélectasie et d’œdème pulmonaire) peuvent être observées dès ce stade [26], [130]. A l’histologie, on peut observer des larves immatures dans les poumons [26].

Les signes cliniques observés sont une augmentation de la fréquence respiratoire et une dyspnée, puis, dans un second temps, une toux intermittente [17]. On peut aussi observer un jetage séreux (Figure 13). L’appétit peut être diminué.

Figure 13 : Jetage séreux sur une vache charolaise atteinte de dictyocaulose (Source : Service pathologie du bétail VetAgro Sup).

ii. Période patente La période patente correspond à la phase d’état, les signes cliniques sont causés par les adultes présents dans les bronches et la trachée. C’est véritablement une bronchopneumopathie vermineuse qui se traduit par une bronchite variant d’éosinophilique à muco-purulente. Les adultes provoquent un catarrhe bronchique et une infiltration inflammatoire profonde de l’épithélium bronchique, avec une prolifération épithéliale et une perte de fonctionnalité de l’appareil muco-ciliaire. La clairance muco-ciliaire est très affectée et conduit à une obstruction bronchique avec la formation de bouchons muco-vermineux dans les bronchioles (Figure 14). Les œufs et L1 produits par les adultes sont aspirés dans les alvéoles pulmonaires des lobes caudaux, ce qui accentue l’inflammation alvéolaire et l’accumulation de macrophages et de polynucléaires. Cela entraine une pneumonie inflammatoire. Il peut y avoir une épithélialisation du revêtement alvéolaire, qui est irréversible et qui entraine une altération fonctionnelle du poumon [159].

Figure 14 : Autopsie d’un bovin adulte atteint de dictyocaulose, A : Présence de nombreux adultes et de liquide spumeux dans une bronche ; B : Bouchon de muco-pus dans une bronchiole (Source : Service de pathologie du bétail, VetAgro Sup).

A l’autopsie, on trouve des lésions de pneumonie vermineuse, d’atélectasie et d’emphysème (Figure 15). Elles sont bilatérales et concernent dans un premier temps les lobes caudaux. Elles se traduisent par des zones de densité modérément diminuée sur les régions dorso-caudales des lobes caudaux et sur l’ensemble du poumon lors d’atteinte sévère. Les lésions varient de rouge et atélectasiées à gris pâle. Dans les cas les plus sévères, il peut y avoir des lésions d’emphysème pulmonaire dues aux expirations forcées. Ces lésions d’emphysème peuvent masquer les lésions de bronchite vermineuse et orienter le clinicien vers une pneumonie interstitielle aiguë. Il convient de bien suivre le trajet des bronches qui contiennent un liquide spumeux et des dictyocaules adultes de 4 à 8 cm de long (Figure 14) [130], [26].

Figure 15 : Coupe d’un poumon de bovin mort en détresse respiratoire de dictyocaulose. On observe une pneumonie interstitielle (flèche pointillée) et un emphysème pulmonaire marqué (flèche pleine). (Source : M.A Arcangioli).

Cliniquement, l’augmentation de l’amplitude et de la fréquence respiratoire peut aller jusqu’à 80 à 100 mouvements par minute. La respiration est difficile et on constate une dyspnée marquée jusqu’à de l’orthopnée (animal debout, membres écartés, tête et cou étendus vers l’avant et langue pendante) (Figure 16). La toux est permanente, mais plus marquée à l’effort. Elle est d’abord quinteuse et sèche puis elle devient grasse. Les animaux présentent un catarrhe oculo-nasal (écoulements muqueux et fluides, nasaux et oculaires). Des crépitements et des sifflements constants peuvent être présents sur l’ensemble de l’aire d’auscultation.

Figure 16 : Vache charolaise en orthopnée, les membres sont écartés, la tête est étendue et la langue est pendante (Source : [124]).

38 iii. Période post-patente Lors de la phase post-patente, concomitamment à expulsion des adultes, les signes cliniques disparaissent progressivement en quelques mois après l’infestation initiale. Cependant, dans un quart des cas, les signes cliniques s’aggravent au bout de 7 à 9 semaines après l’infestation. Il s’agit alors d’une complication de la dictyocaulose, soit suite à une surinfection bactérienne comme une pasteurellose, soit par aggravation de l’épithélialisation alvéolaire. Les échanges gazeux très diminués entrainent l’apparition d’un emphysème et d’un œdème pulmonaire, sévères et fatals pour l’animal. A l’autopsie, on ne retrouve plus de dictyocaules dans les poumons, mais de larges zones pulmonaires de consistances augmentées de couleurs roses à rouges [83]. D’autres animaux peuvent rester des non-valeurs économiques à cause de la persistance d’une fibrose pulmonaire entrainant une réduction de leur capacité pulmonaire. b. Le syndrome pulmonaire aigu Le syndrome pulmonaire aigu (crise asthmatiforme) s’observe chez les animaux déjà immunisés contre la dictyocaulose, lors de réinfestation massive. Il correspond à un phénomène d’hypersensibilité de type 3. Malgré l’immunité de l’hôte, toutes les L3 ingérées sur des pâtures contaminées ne sont pas détruites au niveau digestif. Les signes cliniques apparaissent environ 14 jours après le passage sur la prairie contaminée, lorsque les L4 arrivent dans les poumons. Elles sont rapidement détruites dans le parenchyme pulmonaire par le système immunitaire de l’individu immunisé. Néanmoins, autour des larves détruites, il se forme des granulomes inflammatoires. Cela entraine une congestion des capillaires, un œdème alvéolaire et le dépôt d’une membrane hyaline à la surface des alvéoles pulmonaires.

A l’autopsie, les poumons ont un aspect détrempé dû à l’œdème aigu des poumons. On trouve des nodules verdâtres de 5 mm de diamètre et des concrétions verdâtres dans les bronchioles qui correspondent à une infiltration lymphocyto-éosinophilique.

Le signe clinique principal est de la dyspnée associée à une augmentation de la fréquence respiratoire et une diminution de son amplitude. La toux est faible à absente. L’animal présente une hyperthermie, un amaigrissement rapide et une chute de la production laitière. La guérison a lieu dans la plupart des cas en 2 à 3 semaines et peu d’animaux en meurent.

c. Relation entre l’expression des signes cliniques et la dose infestante En 1984, Boon et al. montrent que, lors de primo-infestation, plus la dose infestante est importante, plus les signes cliniques sont importants. Dès trois semaines post-infestation, elle est positivement corrélée avec la fréquence respiratoire, la présence d’une respiration abdominale, de crépitements à l’auscultation et la perte d’appétit [17].

En 1993, Schneider et Daugschies ont suivi trois groupes de 5 veaux expérimentalement infestés à haute dose (30 larves/kg ; groupe 1), basse dose (3 larves/kg ; groupe 2) et non infestés (groupe 3). Ils ont montré une diminution du gain de poids, une augmentation des signes cliniques, une augmentation de l’excrétion larvaire, une diminution de la pO2 et une augmentation de la concentration en protéine totale (associée à une augmentation des anticorps anti-dictyocaules chez le groupe hautement infesté par rapport au groupe contrôle), alors qu’aucune différence n’a été constatée entre le groupe faiblement infesté et le groupe contrôle. Par ailleurs, une augmentation significative du nombre d’éosinophiles sanguins a été mise en évidence dans les deux groupes « infestés » à partir de 10 jours post-infestation par rapport au contrôle (avec un maximum d’éosinophile de 2,375 x 109/L chez les groupes infestés et de 0,685 x 109/L) [158].

Ainsi, lors de primo-infestation, il semble que seule une infestation importante entraine des signes cliniques et des modifications de certains paramètres sanguins. Cependant, l’article souligne que 39 dans le groupe 2, qui peut être considéré comme subclinique, l’excrétion larvaire n’est pas négligeable (1,5 million de larves excrétées dans le milieu extérieur par individu du groupe subclinique contre 13,5 millions par individu groupe clinique sur l’ensemble de la période d’étude (90 jours)) [158].

Malheureusement, aucune donnée n’est disponible à notre connaissance lors de réinfestation. De plus, toutes ces études ont été réalisées chez des veaux, aucune donnée n’est donc disponible chez les vaches adultes.

Il apparait donc délicat d’étendre ces résultats obtenus à des vaches au moins partiellement immunisées, donc de savoir si les signes cliniques observés chez les adultes sont liés à une présence plus ou moins importante du parasite.

d. Association avec d’autres pathogènes Dans les paragraphes précédents, l’essentiel des données exposées a été déduit à partir d’observations réalisées dans des conditions expérimentales. Cependant, sur le terrain, les pathologies respiratoires sont rarement monofactorielles. Peu d’études ont été menées sur le sujet, mais elles soulignent l’importance des relations et des associations entre Dictyocaulus et les autres pathogènes. i. Relation avec les pathogènes opportunistes Il existe des agents pathogènes dits opportunistes qui font partie de la flore commensale des individus sains. Lors d’atteinte de l’épithélium pulmonaire ou de baisse de l’immunité, ces pathogènes commensaux se multiplient et peuvent entrainer une pathologie respiratoire. Ce mécanisme a été mis en évidence par Schnieder et al. en 1993 qui montrent une augmentation importante du nombre de pathogènes opportunistes comme Mycoplasma sp. et Pasteurella sp. dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire [158]. Cette multiplication bactérienne pourrait être responsable d’une partie des signes cliniques lors de dictyocaulose. Elle pourrait aussi expliquer la persistance de signes cliniques après un traitement antiparasitaire seul.

ii. Dictyocaulus viviparus et le virus respiratoire syncytial bovin (RSVB) Chez les veaux, les signes cliniques de dictyocaulose et d’une atteinte par le virus respiratoire syncytial sont très proches (perte d’appétit, toux, écoulements nasaux, augmentation des bruits et de la fréquence respiratoire…). Néanmoins, les signes cliniques associés à une atteinte par le RSVB semblent plus précoces et moins persistants que ceux associés à une dictyocaulose. Par ailleurs, Verhoeff et al., en 1988 [178], ont suivi trois groupes de veaux, contrôle, non infestés et infestés à basse ou à haute dose, hébergés séparément dans un même bâtiment, subissant une infection secondaire par le RSVB. Il a été considéré que, lorsque le groupe non infesté a présenté des signes cliniques d’infection par le RSVB, les autres groupes étaient aussi infectés. Les signes cliniques sur le lot témoin ont été observés à partir du 29e jour, concomitamment à une augmentation des signes sur les groupes infestés (perte d’appétit, écoulement nasal, respiration abdominale, tachypnée, fièvre et apparition de bruit bronchique à l’auscultation pulmonaire). De plus, l’infection seule par le RSVB n’a pas entrainé l’apparition de signes cliniques chez tous les sujets du groupe témoin. L’infestation par Dictyocaulus viviparus serait donc un terrain favorable pour le RSVB, qui entraine une augmentation des signes cliniques chez tous les individus infestées par D. viviparus quel que soit le niveau d’infestation.

40 iii. Dictyocaulus viviparus et le virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine (IBR) La persistance d’une infection latente chez les animaux rétablis est fréquente pour les herpesviroses comme la rhinotrachéite infectieuse des bovins. Et, lors de dictyocaulose, tout comme lors de stress important ou lors de traitement aux glucocorticoïdes, une réactivation et une excrétion du virus peuvent avoir lieu. Cela a été mis en évidence par Msolla et al. [119], qui montrent une excrétion virale comprise entre 7 et 20 jours post-infestation chez tous les bœufs hautement infestés (4/4) et chez un bœuf faiblement infesté (1/4). Cette excrétion virale a été associée à des signes cliniques et des lésions nécropsiques spécifiques de la rhinotrachéite infectieuse bovine.

Ainsi, D. viviparus apparait comme un pathogène aggravant, dont la présence facilite le développement d’autres agents pathogènes. Cette interaction est probablement permise grâce aux lésions causées par D. viviparus qui fragilisent l’épithélium respiratoire, mais aussi possible grâce à une réorientation de l’immunité pulmonaire contre D. viviparus.

41 III. Immunité

Dans les paragraphes précédents, les deux formes cliniques de la dictyocaulose ont été décrites. L’immunité, ses mécanismes de développement ainsi que son lien avec un traitement préventif sont donc des éléments de compréhension de l’expression clinique.

a. Cinétique et mécanisme de l’immunité contre D. viviparus

Les premières preuves de l’existence d’une immunité contre D. viviparus chez les bovins ont été apportées par Michel en 1955 [116]. Il montre que, lors de réinfestation chez les individus ayant récupéré d’une infestation par D. viviparus, il n’y a pas d’excrétion larvaire et les vers retrouvés dans l’appareil pulmonaire ont une taille inférieure à ceux retrouvés chez des individus naïfs.

i. Cinétique En 1962 [113], Michel réalise la première étude évaluant l’immunité contre D. viviparus au cours du temps. L’étude est réalisée à partir de 29 paires de veaux jersiais dont un de chaque paire a été expérimentalement infesté au début de l’étude (à l’âge de 90j) avec 3 200 à 3 500 larves infestantes de D. viviparus. Puis, à différents intervalles de temps, les deux individus de chaque paire reçoivent 35 000 à 40000 larves infestantes. Les veaux sont autopsiés 10 jours après ce challenge et la protection (P) est définie par : 푛표푚푏푟푒 푑′푎푑푢푙푡푒푠 푟푒푡푟표푢푣é푠 푐ℎ푒푧 푙푒 푣푒푎푢 𝑖푚푚푢푛𝑖푠é 푃 = 100 ( 1 − ) 푛표푚푏푟푒 푑′푎푑푢푙푡푒푠 푟푒푡푟표푢푣é푠 푐ℎ푒푧 푙푒 푣푒푎푢 푛푎ï푓

En observant l’évolution de la protection en fonction du temps (Figure 17), Michel définit trois phases du développement de l’immunité contre D. viviparus chez les bovins :

- Une phase d’induction (J10 à J15) : mise en place de l’immunité 8-10 jours après la première exposition, - Une phase de consolidation et de renforcement de l’immunité (J15 à J80) : l’immunité est stimulée par la présence d’immatures et d’adultes dans l’organisme de l’individu, - Une phase de diminution (à partir de J80) : à la fin de la période patente, quand tous les adultes ont été éliminés, le système immunitaire n’est plus stimulé et la protection diminue.

Figure 17 : Protection contre D. viviparus en fonction du temps chez des veaux jersiais, chaque point correspond à un couple de veaux sacrifiés dont la protection a été calculée selon la formule ci-dessus (Source : Michel 1962 [113]).

42 ii. Mécanismes Les mécanismes de l’immunité font intervenir une réponse humorale et cellulaire. La réponse humorale implique les immunoglobulines A (IgA) et G (IgG). Les premières augmentent rapidement après la primo-infestation et après chaque réinfestation ultérieure. La production d’IgA serait stimulée dès le passage de la muqueuse digestive par les L3. Les IgA sont sécrétées en grand nombre dans le mucus et se retrouvent à la fois dans le mucus digestif et pulmonaire. Leur rôle semble important tant par la diminution du pouvoir infestant des larves que par la réduction de l’établissement des adultes dans les poumons. Le taux d’IgG augmente principalement dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire lors du troisième contact avec le parasite. Ce pic d’IgG est associé à une absence d’excrétion larvaire fécale. Les IgG auraient donc un rôle important dans l’immunité pulmonaire locale contre les adultes [162].

L’immunité cellulaire fait intervenir les cellules exprimant γ/δ TCR, la voie Th2 et les éosinophiles [72], [77]. Les cellules exprimant γ/δ TCR auraient un rôle dans le recrutement des éosinophiles en primo- infestation, et d’activation des cellules Th2 [77]. L’activation de la voie Th2 est confirmée par la présence d’une hausse du taux d’interleukine 4 dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire lors de dictyocaulose. Les éosinophiles ont un rôle cytotoxique en libérant des IgE [97]. La proportion d’éosinophiles pulmonaires augmente de 1 à 20% lors de dictyocaulose [72], [77], [158].

iii. Stimulation antigénique Lors de la phase d’induction, l’immunité se met en place rapidement. Elle est déclenchée par les antigènes de surface présents sur la gaine des stades larvaires lors du passage dans les ganglions mésentériques des L3 [111].

La phase de renforcement de l’immunité est probablement due à la stimulation antigénique par les adultes présents dans les poumons. Cette phase de l’immunité est plus longue à se mettre en place, mais elle est présente même lorsque la dose d’inoculation est faible (30 L3 par veau) [56]. L’individu développe alors son immunité contre les adultes (y compris contre la major sperm protein (MSP) servant d’antigène au test ELISA (cf. 0.III.) à l’origine d’une inhibition de leur développement. Lors de réinfestation, les adultes sont nanifiés et le nombre d’œufs produits par chaque femelle diminue. Dans l’étude d’Eysker et al. [56], l’excrétion fécale est diminuée de 80 %, le nombre d’adultes retrouvés dans les poumons baisse de 70%, et la taille et la fécondité des adultes sont aussi réduites.

Une fois tous les adultes éliminés, et en l’absence de réinfestation, l’immunité des bovins diminue à partir de trois mois après l’infestation pour devenir nulle au bout d’un an [115].

b. Immunité et traitement De nombreuses études démontrent le développement d’une immunité contre D. viviparus (en mesurant le nombre taux d’implantation et/ou le taux d’anticorps) avec l’utilisation séquentielle de molécules non rémanentes (bolus ruminal à relargage séquentiel) [43], [54], [82], [177]. Ces stratégies de traitements permettent une immunisation classique pendant les périodes entre deux doses, alors que le traitement limite les conséquences de la maladie en éliminant régulièrement les adultes qui auraient pu s’installer. Néanmoins, l’immunité reste plus faible que chez des individus exposés et non traités et elle n’empêche pas l’excrétion fécale et donc la contamination des pâtures lors du challenge.

En 2003, Höglund et al.[74] étudient l’effet d’un traitement rémanent en début de période patente sur la mise en place de l’immunité contre D.viviparus. Deux groupes de 6 veaux naïfs sont inoculés avec 100 L3 pendant 5 jours consécutifs. Puis un des deux groupes est traité 24 jours post infestation. Enfin, sept semaines après le traitement, les deux premiers groupes et un troisième groupe naïfs

43 sont infestés avec 1500 L3 puis sacrifiés quatre semaines après l’inoculation. L’excrétion larvaire, l’expression clinique et le gain de poids ne sont pas différents pour les deux groupes « immunisés » au contraire du groupe naïf. Néanmoins, le nombre d’adultes retrouvés à l’autopsie chez le groupe traité est 7 fois plus important que chez le groupe non traité. L’immunité conférée est donc de moins bonne qualité quand le traitement est administré en début de période patente, probablement parce que l’immunité du groupe traité n’a pas été renforcée par les adultes présents dans les poumons [74]. Il souligne néanmoins que sur l’ensemble de la période le nombre de larves excrétées dans le milieu extérieur, est 43 fois plus important pour le groupe non traité que pour le groupe traité. Ainsi, pour limiter la contamination des pâtures, le traitement des jeunes en début de période patente est plus efficace même si l’immunité est de moins bonne qualité [74].

Des résultats similaires ont été obtenus par Taylor et al. en 1988 [170] qui ont étudié toute la saison de pâture d’un groupe traité (après trois semaines, treize semaines et à la rentrée en stabulation), pâturant sur des pâtures infestées par D.viviparus par rapport à celle d’un groupe de veaux non exposés restant à l’intérieur. L’immunité du groupe traité et exposé est meilleure que celle du groupe non exposé.

En 2000, Taylor et al. [169] s’intéressent au développement de l’immunité contre D. viviparus chez des veaux continuellement traités avec des anthelminthiques rémanents. Quinze veaux de 6 mois et sans contact précédent avec des parasites sont séparés en trois groupes. Le groupe 1 est traité à J0 et J28 avec de la Doramectine (rémanence de 28 jours) puis infesté avec 2 000 larves par jour de J1 à J19 et de J33 à J41, soit 56 000 larves en 2 mois. A J81, chaque individu reçoit 20 larves par kg de poids vifs. Le groupe 2 est vacciné par voie orale avec des larves irradiées de dictyocaules (Huskvac, Intervet Ltd.) à J0 et J28 puis chaque veau reçoit 20 larves par kg à J81. Le groupe 3 est le groupe contrôle, avec 20 larves par kg à J81. Des coproscopies sont réalisées toutes les semaines, et des prises de sang pour sérologie tous les 21 jours chez tous les individus. A J110, le nombre d’adultes présents dans les poumons est dénombré avec la méthode d’Inderbitzen [127]. Après le jour 81, des signes cliniques modérés (toux et augmentation de la fréquence respiratoire) apparaissent dans tous les groupes.

Tableau V : Résumé des résultats de l’étude de Taylor et al. en 2000 (Source : [169]).

Groupe 1 Groupe 2 Groupe 3 modérés : toux et augmentation de la fréquence Signes cliniques respiratoire Excrétion fécale sur la période d’étude 0/5 ¼ 5/5 Nombre de dictyocaules retrouvés à l’abattoir par 17,4 31 ,3 228 individu en moyenne

Il n’y a pas de différence significative entre les groupes vacciné et traité. Le groupe 1 est donc bien immunisé. Selon les auteurs, cela serait possible parce que les anthelminthiques ne seraient efficaces qu’après le franchissement de la paroi intestinale par les larves, ce qui permet au système immunitaire de reconnaitre les antigènes de leur gaine et d’induire l’immunité. Néanmoins, l’immunité n’est pas très efficace, car tous les groupes présentent des signes cliniques après le challenge à J81.

La principale limite de l’étude vient du fait que les veaux ont été sensibilisés pendant toute la saison de pâture avec des doses très importantes de larves dont il est difficile de savoir si elles sont comparables à ce qui se passe en condition naturelle. Enfin, on ne compare pas cette immunité à

44 celle d’individus non traités infestés avec des dictyocaules vivants. L’immunisation est donc possible en condition expérimentale, mais elle n’est que partielle, sans phase de renforcement, et implique que les veaux soient sur des pâtures fortement contaminées.

L’immunité des bovins contre D. viviparus peut donc être suffisante pour limiter l’expression des signes cliniques et l’excrétion larvaire. Néanmoins, la protection est d’assez courte durée, car elle diminue à partir de trois mois sans contact avec le parasite. C’est ce qui explique les limites du vaccin Dictol®. La persistance d’adultes dans l’appareil pulmonaire et la stimulation du système immunitaire sur des pâtures légèrement infestées sont autant de facteurs qui permettent de maintenir une bonne protection du troupeau. L’utilisation d’un traitement rémanent n’empêche pas la mise en place d’une immunité, mais elle reste probablement limitée sur le terrain et son efficacité est à apprécier en fonction du risque de survenue d’un cas clinique.

De manière générale, il vaut mieux éviter les situations qui empêchent un contact répété entre l’hôte et le parasite et même si le troupeau est considéré comme immunisé, la protection reste relative et n’empêchera pas la survenue de cas cliniques lors de très fortes infestations.

45 C. DIAGNOSTICS ET TRAITEMENT DE LA DICTYOCAULOSE

Actuellement, le diagnostic ante mortem de la dictyocaulose repose sur la mise en évidence directe de D. viviparus dans les fèces des animaux suspects ou sur la mise en évidence indirecte de son infestation par sérologie. Nous en ferons un rappel avant de présenter la technique du lavage broncho-alvéolaire dont nous avons voulu évaluer les possibilités pour diagnostiquer cette maladie (cf. partie 2.).

I. Diagnostics épidémiologique, clinique et différentiel

a. Diagnostics épidémiologique et clinique

Sur le terrain, la suspicion d’une dictyocaulose a lieu lors de l’observation d’un bovin présentant une atteinte respiratoire au pâturage sans hyperthermie. Le caractère enzootique est à retenir : quelques animaux ou la totalité du troupeau peuvent être touchés.

Comme nous l’avons dit dans l’étude épidémiologique, les signes cliniques n’apparaissent généralement pas avant 2 mois de pâturage (sauf contamination initiale très importante de la pâture). Ce délai est une indication diagnostique pour le clinicien, mais il est très variable d’une région, voire d’un élevage à l’autre. Les épisodes de bronchite vermineuse ont lieu en France en été ou en automne en fonction du climat, des pratiques de pâturage et des antécédents de chaque élevage.

La présence d’antécédent de dictyocaulose dans l’élevage au cours des 5 dernières années est un argument convaincant, mais son absence ne permet pas de l’exclure. Des D. viviparus ont pu être introduits par le voisinage, l’achat d’une pâture ou lors de l’introduction d’un nouvel animal dans l’élevage. Enfin, la maladie peut être présente dans l’élevage depuis plusieurs années sans entrainer de signes cliniques ou sans que l’éleveur y ait prêté attention.

La maladie peut évoluer à bas bruit pendant tout une partie de la saison de pâturage et se déclarer lorsque le recyclage parasitaire est suffisant ou que les conditions météorologiques permettent une meilleure survie des larves dans le milieu extérieur.

b. Diagnostic différentiel La bronchite vermineuse n’est pas la seule maladie respiratoire des bovins au pâturage et trois autres maladies peuvent entrainer des symptômes relativement similaires : les bronchopneumopathies bactériennes ou virales, l’ehrlichiose granulocytaire bovine et l’emphysème des regains [153]. Les caractéristiques de ces maladies sont présentées dans le Tableau VI.

Tableau VI : Diagnostic différentiel de la dictyocaulose.

Bronchopneumopathie infectieuse Emphysème des Dictyocaulose Bactérienne Ehrlichiose Virale regains Maladie Chronique Aiguë Mycoplasm Mannheimia Anaplasma a bovis, haemolytica, RSV, PI3, phagocytophi- Composé Dictyocaulus Trueperella Pasteurella BVD, BHV1, lum pneumotoxique viviparus pyogenes multocida, Coronavirus,

Etiologie (transmission d’origine végétal Pasteurella Mycoplasma Adenovirus par les tiques) multocida bovis,

Adultes Jeunes bovins et Adultes (jeunes Veaux et jeunes bovins adultes (jeunes bovins

adultes bovins possible) atteints

Animaux Animaux possible)

+/- élevée et +/- élevée au limitée dans le élevée et limitée +/- élevée selon l’exposition et le statut cours de la saison temps, dans le temps immunitaire du troupeau

de pâturage Saisonnalité (automne) Incidence (tiques) Toux, tachypnée, dyspnée, bruits Tachypnée Toux, (autres Toux, jetage, tachypnée, respiratoires modérée, symptômes dyspnée, bruits Toux, tachypnée, augmentés, œdème des +/- respiratoires anormaux orthopnée possible, anorexie, perte articulations détectables (crépitements, emphysème sous- de poids, chute inconstant, selon sifflements), chute de la cutané possible,

Symptômes de la production toux, apathie, l’étendue des production laitière, normothermie laitière, anorexie, lésions) hyperthermie hyperthermie si hyperthermie surinfection Létalité Augmentation Létalité exceptionnelle progressive des possible ,

Létalité symptômes et de Létalité même immunodépre Létalité jusqu’à 30%, possible, mais la morbidité, possible, sans ssion évolution aiguë vers tardive, létalité possible chronicité ou surinfecti favorisant les une guérison en 1 à évolution très Evolution sinon diminution guérison on, surinfections, 2 semaines lente progressive et évolution guérison lente, lente aiguë avortements possible Gestion de

pâturage, Gites à tiques Changement d’un Changement de conditions climatiques, introduction, (pâture avec pâturage pauvre vers microbisme et ambiance de l’élevage risque prévention ronciers, etc.) un pâturage riche

Facteurs de de Facteurs anthelminthique

Frottis Coproscopie, Sérologie, Histologie (œdème Bactériologie sanguin, PCR, sérologie, LBA virologie et emphysème)

Sérologie Diagnostic

47 II. Diagnostic par coproscopie

Le diagnostic de la dictyocaulose par coproscopie repose sur la mise en évidence du premier stade larvaire L1 (cf. 0.III.c.ii.) dans les fèces des animaux. Dans tous les cas, on place un échantillon de fèces en affleurement d’un récipient contenant de l’eau. Les L1, ayant un tropisme positif pour l’eau, migrent des fèces dans le récipient au fond duquel elles se déposent par gravité. Le dépôt est alors examiné au microscope au grossissement x10 à la recherche de L1.

Les deux méthodes les plus utilisées sont :

- Méthode de Baermann, plus traditionnelle, décrite pour la première fois en 1917 - Méthode de McKenna, plus récente, décrite en 1999 [112]

a. Description des méthodes

i. Méthode de Baermann La méthode de Baermann est la technique traditionnelle. Elle est utilisée depuis 1917 pour mettre en évidence des larves à partir de fèces, d’échantillons de sol ou d’herbe.

L’échantillon est empaqueté dans une compresse, puis placé dans un entonnoir en verre de 15 cm de diamètre préalablement rempli d’eau (Figure 18). Il est alors maintenu à l’affleurement de la surface d’eau, généralement grâce à une passoire.

Figure 18 : Schéma du montage de Baermann (Source : [112]).

Après un temps de repos de 12 à 24h nécessaire à la migration des larves de l’échantillon dans l’eau, 5 mL de liquide sont récupérés à l’extrémité libre du montage en ouvrant le fermoir. Les 5 mL de liquide sont ensuite centrifugés à 5000t/min pendant 5 minutes, le culot est alors examiné au microscope.

48 ii. Méthode de McKenna La méthode de McKenna repose sur les mêmes principes que ceux de la méthode de Baermann. Néanmoins, le matériel nécessaire à sa réalisation est moins spécifique et elle est donc plus facilement réalisable en cabinet.

Les fèces sont empaquetées dans une compresse qui est maintenue en suspension à l’aide d’un bâtonnet, dans un verre à pied rempli d’eau (Figure 19). L’utilisation d’un tissu de tamis 31µm à la place d’une compresse standard permettrait de limiter le passage de nombreux débris tout en laissant passer les larves.

Figure 19 : Schéma du montage de McKenna (Source :[112]).

Après une période de repos de 12 à 24h, le surnageant est éliminé délicatement à l’aide d’une seringue de 50mL ou d’un pistolet drogueur, puis les 5mL restant dans le fond du verre à pied sont, soit centrifugés pour examiner le culot au microscope, soit placés directement dans une chambre de comptage (Figure 20) pour la recherche des L1.

Figure 20 : Schéma de la chambre de comptage de la méthode de McKenna (Source : [112]).

49 b. Intérêts et limites

i. Coût du matériel et contraintes de réalisation Ces techniques ne nécessitent pas un matériel très coûteux et sont donc réalisables facilement en cabinet, particulièrement pour la technique de McKenna. Néanmoins, comme elles reposent sur la migration des larves, elles imposent une mise en place rapide des montages. En effet, après 24h à 20°C, seulement 40% des larves sont encore capables de migrer dans l’eau. Si la mise en place du montage n’est pas réalisable rapidement après les prélèvements, les échantillons doivent être conservés à 4°C, et dans ce cas, 80% des larves sont récupérées au bout de 24h [149].

Le montage doit être laissé en place suffisamment longtemps, car, dans les 10 premières heures, seulement quelques larves ont migré, alors qu’après 12h, 50% des larves ont migré. Le taux de migration est le plus important entre 12 et 24h [149]. Le montage doit donc être laissé en place entre 12 et 24h. Les méthodes de diagnostic par coproscopie ne permettent donc pas d’avoir un diagnostic avant 24h.

ii. Spécificité La spécificité de technique par coproscopie est de 100% pour un opérateur expérimenté, car les larves 1 de D. viviparus sont assez caractéristiques (Figure 21). De type strongyloïde, elles mesurent 300 à 360 µm et sont rectilignes et assez épaisses. L’extrémité antérieure est arrondie tandis que l’extrémité postérieure est effilée. On observe aussi des granules de réserves en grand nombre[12]. Néanmoins, une confusion est possible si les prélèvements n’ont pas été analysés dans les 24h. En effet, dans ce cas, il est possible que certains œufs d’autres nématodes parasites éclosent et que les larves migrent dans le culot. Les seules larves qui ont un aspect assez proche sont celles des autres strongylidés, mais elles sont plus grandes (de 500 à 580 µm pour les larves de Bunostomum sp. à 1095 à 1142 µm pour Nematodirus sp.) [187].

Figure 21 : Larve 1 de Dictyocaulus viviparus obtenue par coproscopie de Baermann (Source : VetAgro Sup).

iii. Sensibilité Théoriquement, si le prélèvement est réalisé pendant la période patente (4 à 8 semaines après l’infestation), la coproscopie de Baermann est sensible à 100%. Ploeger et Eysker ont calculé, en prenant en compte la prolificité des femelles de D. viviparus et la quantité de fèces produite par un veau de 100kg (8kg), que le nombre de larves émises par une femelle dans 10g de fèces est de 14. La coproscopie de Baermann permettrait théoriquement de détecter les larves émises par une seule femelle [137]. Ce résultat avait été vérifié en condition expérimentale par Eysker en 1997, avec des inoculations de 20 L3 par veaux chez 20 veaux [51].

50 En revanche, la sensibilité de ces techniques est bien moins bonne sur le terrain. Même si elle reste proche de 100% chez les veaux à partir de 3-4 semaines post-infestation (20-300L1/30g de fèces) [137], [51], elle est beaucoup plus faible lors de réinfestation et chez les adultes. En effet, chez les adultes, le volume de matière fécale est plus grand, les larves sont donc diluées et plus difficiles à mettre en évidence. De plus, la réaction immunitaire des individus immuns freine le développement des parasites dans les poumons, notamment lors de syndrome asthmatiforme. Les femelles acquièrent leur maturité sexuelle plus tardivement, lorsqu’elles l’atteignent, et elles pondent peu ou pas, ce qui explique le faible nombre de larves retrouvées chez les vaches adultes (1-4L1/30g) [55] et l’observation de signes cliniques sans excrétion fécale de L1.

Ainsi, dans l’étude de Ploeger et al. [140] en 2014, les auteurs montrent que 11,9% des adultes excrètent des larves de D. viviparus, et pour plus de la moitié d’entre eux, le nombre de larves par gramme (LPG) est inférieur à 0,4 LPG. Ils montrent aussi que les génisses sont plus souvent excrétrices que les multipares même si l’excrétion est plus importante en LPG chez les multipares. Dans la même étude, dans 19% des élevages avec des signes cliniques de dictyocaulose, aucune larve n’est retrouvée alors que des coproscopies individuelles sont réalisées sur 20 multipares et 20 primipares. Ils calculent aussi que pour trouver au moins une vache laitière excrétrice de larves dans un troupeau théorique de 73 vaches en lactation avec des signes cliniques, il faut réaliser au moins 14 coproscopies individuelles dans le troupeau.

La coproscopie individuelle apparait donc clairement limitée pour réaliser un diagnostic de troupeau à moins de réaliser les analyses sur de nombreuses vaches.

c. Comparaison des deux techniques En comparant les deux techniques, McKenna dénombre en moyenne 2,5 fois plus de larves avec sa technique qu’avec celle de Baermann. De plus, à partir d’échantillons de fèces contenant des larves, sa sensibilité est de 100% (30/30) alors qu’elle est de 83% (25/30) pour celle de Baermann (p-value = 0,062) [112]. Des résultats similaires ont été mis en évidence par Camuset en 2007 [25]. Grâce à la technique de McKenna, il met en évidence des larves de D. viviparus dans 9 troupeaux sur 23 avec une moyenne de 36,8 larves par échantillon et seulement 5 élevages avec une moyenne de 18,6 pour la technique de Baermann. La technique de McKenna est donc plus sensible que la technique de Baermann. L’explication de cette différence est donnée par les auteurs suivants :

- Todd et al. (1970) mettent en évidence qu’avec un diamètre de l’entonnoir plus grand (i.e. plus la pente est faible,) moins de larves sont récupérées (83% des larves récupérées pour un diamètre de 7 cm contre 27% pour un diamètre de 30 cm) [173]. - Sean et al. (1997) montrent, après observation avec un « stéréo-microscope », que deux tiers des larves restent sur les pentes de l’entonnoir au lieu de tomber dans sa partie cylindrique pour être récupérés [63] .

La technique de McKenna est donc la technique la plus appropriée pour mettre en évidence des L1 dans les fèces des animaux. Cependant, cette technique n’est réalisable que pendant la période patente du cycle (à partir du moment où les femelles commencent à pondre des œufs soit 3 à 8 semaines après l’infestation) et elle manque de sensibilité chez les animaux adultes, d’autant plus s’ils ont déjà été en contact avec le parasite.

51 d. Coproscopie de mélange Tous les animaux d’un troupeau infecté n’excrètent pas de larves. Pour réaliser un diagnostic de troupeau, il est donc important de réaliser des prélèvements sur un grand nombre d’animaux, particulièrement chez les adultes où l’excrétion est plus faible. Dans ce contexte, la coproscopie de mélange permettrait d’évaluer l’infestation de plusieurs individus en ne réalisant qu’un seul montage et qu’une seule analyse.

La coproscopie de mélange est recommandée par Beugnet et al. en 1999 pour établir un diagnostic de troupeau. Sur 27 fermes, il trouve 18,5% des troupeaux positifs en réalisant une coproscopie individuelle sur les deux animaux les plus cliniques du troupeau alors qu’il en trouve dans 37% des troupeaux lorsqu’il réalise une coproscopie de mélange sur 5 individus [11].

En 2014, E. Louvet, dans sa thèse de doctorat vétérinaire, montre l’intérêt de cette technique. En effet, dans les 15 élevages de son étude longitudinale, tous ceux avec des signes cliniques ont été associés à une coproscopie de mélange positive et un des élevages sans signes cliniques a présenté une coproscopie positive. Les coproscopies de mélange ont été réalisées à partir de 10x3g de fèces prélevées sur des primipares de l’élevage [102].

e. Synthèse Le diagnostic direct par coproscopie est donc une méthode très spécifique et sensible chez les jeunes animaux lors de primo-infestation. Chez les animaux adultes, elle est beaucoup plus limitée et les résultats sont souvent décevants. De plus, cette méthode, bien que peu coûteuse, est relativement longue à mettre en œuvre (au moins 24h) et elle doit être réalisée le plus rapidement possible après les prélèvements sous peine de diminuer la sensibilité de l’examen. Ce dernier point est souvent mis en défaut sur le terrain où les prélèvements restent à température ambiante jusqu’au retour au cabinet pendant parfois plusieurs heures.

III. Diagnostic sérologique

Depuis les années 1950 et les premiers travaux sur l’immunité des bovins contre Dictyocaulus viviparus, de nombreuses méthodes immunologiques ont été développées pour diagnostiquer la maladie. Elles reposent sur la mise en évidence d’anticorps dirigés contre le parasite chez les animaux atteints. La plupart de ces méthodes nécessitent un prélèvement sanguin sur l’animal suspect. Différentes méthodes pour mettre en contact les anticorps avec les antigènes et pour mettre en évidence les complexes formés avec ces derniers ont été élaborées :

- Test de fixation du complément : Weber, 1958 [181]; Cornwell and Michel, 1960 [33–35] - Test d’hémagglutination indirecte : Bokhout et al., 1979 [15] - Test immuno-chromatographique : Schnieder, 1993 [155] Certains de ces tests ont été utilisés jusque dans les années 2000 comme celui d’hémagglutination indirecte, mais ils n’offraient qu’une sensibilité modérée (78,1%) et présentaient des faux positifs. Les premiers tests ELISA ont été développés en 1982 par Boon et al. [18] et en 1993 par De leuw et al. [100].

Les tests ELISA s’appuient sur les mêmes mécanismes, mais les complexes anticorps-antigène sont mis en évidence par colorimétrie, en mesurant la densité optique des solutions de complexe anticorps-antigène. Leur reproductibilité est meilleure et leur automatisation est plus facile. De plus, dans le cas du diagnostic de la dictyocaulose, ils ont une meilleure spécificité que le test d’hémagglutination [32]. Trois types de test ELISA ont été évalués depuis les années 1990. Ils reposent tous sur la mise en évidence d’un antigène somatique de D. viviparus de faible poids moléculaire (17kdalton) très conservé chez l’ensemble des individus de l’espèce D. viviparus : la MSP 52 (Major Sperm Protein) [99]. La MSP n’est présente que chez l’adulte. On distingue les différents tests en fonction du mode de production de la MSP et du substrat utilisé pour réaliser le test ELISA.

a. MSP simple Il s’agit du test Ceditest® lungworm, élaboré à partir de l’étude de De leuw et al. [100]. et commercialisé par le laboratoire GD Animal Health®. Il permet de détecter des anticorps dirigés contre D. viviparus de 6 à 24 semaines après l’infestation (contre 3 à 8 semaines pour la coproscopie) avec une sensibilité de 100% et une spécificité de 99,2%. Le résultat est donné en Ratio de Densité Optique (ODR par rapport à un sérum positif de référence) et un animal est considéré séropositif si l’ODR est supérieur à 30% [139]. La MSP est produite « in vivo ». Elle est purifiée à partir de D. viviparus adulte et nécessite d’avoir un stock d’adultes. En outre, l’extraction et la purification de cette protéine à partir des adultes ont de faibles rendements et d’autres antigènes que celui recherché peuvent se retrouver dans la fraction enrichie. Cela entraine des réactions croisées avec d’autres nématodes parasites, notamment gastro- intestinaux [99], [171].

b. MSPr et GST-MSP Pour pallier ces écueils, des tests ELISA ont été développés à partir de protéine recombinante (MSPr), par Schneider en 1992 [154]. La séquence d’ADN codante pour la MSP a été identifiée par Schneider en 1993 sur le fragment de gène Dv3-14 de 471 paires de base [156]. Le gène est cloné dans un plasmide bactérien puis exprimé par une Escherichia coli comme une glutathion S-transférase (GST) fusionnée avec la MSP (GST-MPS). La GST-MSP est alors purifiée par chromatographie et peut être utilisée comme antigène pour le test ELISA, même si la GST n’intervient pas directement dans la fixation des anticorps. On peut encore séparer la GST et la MSP pour utiliser la MSP recombinante (MSPr) pure lors de la fixation des anticorps. Bien que cette technique paraisse plus compliquée, elle permet de produire des antigènes en grande quantité et à faible coût. La protéine obtenue est plus pure et elle est moins dénaturée lors de sa purification que lors d’une extraction à partir d’adultes vivants [78].

En 1992, Schneider teste les performances d’un test ELISA utilisant la GST-MSP et la MSPr. Il constate qu’il n’y a plus de réaction croisée avec les autres nématodes des bovins, mais la densité optique des sérums positifs reste trop faible (<0,7), et il est difficile de définir un seuil permettant d’avoir une sensibilité et une spécificité suffisante [154]. Il développe en 1993 un test rapide sur bandelette avec de très bons résultats, mais qui n’a, à notre connaissance, jamais été commercialisé [155].

C’est en 2008, et grâce à l’utilisation de plaques de micro-titration, que Von Holtum et al.[78] réussissent à augmenter les écarts de densité optique entre les sérums positifs et négatifs. Ces plaques de micro-titration (ImmobilizerTM amino-plates) fixent l’antigène (GST-MSP) grâce à des liaisons covalentes. Elles augmentent ainsi la « coloration » des antigènes et donc la densité optique des sérums positifs. Ils obtiennent ainsi une sensibilité et une spécificité supérieures à 99% de leur test ELISA dans un essai de reproduction expérimental. Les anticorps peuvent être détectés à partir du 28e jour post-infestation et jusqu’au 168e jour post-infestation [78].

53 c. BTM ELISA Pour faciliter l’utilisation de cette méthode sur le terrain et pour faciliter les enquêtes épidémiologiques, certains auteurs ont étudié la faisabilité des ELISA sur le lait de tank. C’est la BTM (Bull Milk Tank) ELISA [60].

Fiedor et al. en 2009 valident l’utilisation du test de Von Holtum et al. sur lait individuel avec une sensibilité de 100% et une spécificité de 97,5% au seuil de 0,493 [60]. Ainsi, lors d’infestations expérimentales avec 2 000 larves de D. viviparus, le lait des vaches laitières passe au-dessus du seuil 30 à 32 jours après, et persiste positif jusqu’à 112 à 138 jours post-infestation. Les résultats restent similaires avec ce seuil de 0,493 après dilution au 1/5ème des échantillons de lait. Cela suggère que la sensibilité et la spécificité de l’ELISA sur lait de tank restent les mêmes si au moins 20% des vaches laitières sont atteintes [60].

d. Résultats sur le terrain

i. Sérum individuel Ploeger et al. [140] en 2012, ont essayé en situation réelle le test ELISA MSP simple. Dans 33 fermes dont 15 avec des animaux présentant des signes cliniques, seulement 50% des primipares et 74,4% des multipares excrétrices de larves de D. viviparus ont été testées aussi séropositives. Et d’après la thèse de Murigneux en 2012 [120], 38% des vaches excrétrices sont séronégatives.

En 2014, Ploeger et al. [139] ont comparé les deux tests ELISA MSP simple et recombinante sur les mêmes bases de sérum. Ils ont estimé les sensibilités et spécificités en fonction de l’excrétion larvaire (ce qui est discutable quand on connait la sensibilité de la coproscopie de Baermann) en fonction de la période de prélèvement. Les données sont résumées dans le Tableau VII.

Tableau VII : Sensibilité et spécificité estimées en fonction de la période de prélèvements par Ploeger en 2014 (Source : [139]).

MSP simple MSP recombinante Période Sensibilité Spécificité Sensibilité Spécificité Aout à octobre 90 [71,4 ; 100] 55,1 [41,2 ; 70] 80 [59,6 ; 100] 83,7 [73,4 ; 94]

Mai à juin 28,3 [15,3 ; 41,3] 94,9 [90,9 ; 98,9] 58,7 [44,5 ; 72,9] 94,9 [90,9 ; 98,9]

On remarque que les résultats sont très variables en fonction de la méthode utilisée et de la période de prélèvement. Pourtant, les deux tests ont une bonne reproductibilité [139]. Les sensibilités des deux tests sont faibles d’autant plus que le nombre d’individus réellement atteints est probablement sous-estimé, car seuls les animaux copropositifs sont considérés comme infestés. Pour les deux tests, on est très loin des sensibilités et spécificités annoncées par le fabricant. D’autres études de terrain doivent être menées pour confirmer ou non ces résultats et préciser l’utilité des sérologies.

ii. Mélange de sérums Dans sa thèse de doctorat vétérinaire en 2014 [102], E. Louvet évalue l’intérêt de la réalisation d’une sérologie par MSP recombinante sur des mélanges de sérums. Elle montre qu’au seuil de 0,493, la spécificité est moyenne, mais la sensibilité est bonne pour détecter les élevages présentant des signes cliniques. Autrement dit, pour des valeurs au-dessus du seuil de 0,493 sur un mélange de sérums, on ne peut pas de conclure à un épisode de bronchite vermineuse, mais l’obtention d’un mélange inférieur au seuil permet de l’exclure.

iii. Lait En 2012, Schunn et al. [161], lors d’un suivi longitudinal d’un an dans 15 fermes, observent une sensibilité de 100% et une spécificité de 97,32% pour la BTM simple si au moins 20% des individus sont séropositifs.

Ploeger et al. en 2012 [140] ont également testé l’utilisation du kit de MSP recombinante sur lait de tank au seuil de Fiedor [60] soit 0,493. Ils ont montré une bonne corrélation entre l’ODR du lait de tank et la moyenne des ODR des sérums du troupeau et ils ont calculé une sensibilité de 75% et une spécificité de 95% pour détecter les troupeaux au sein desquels au moins 20% des vaches sont séropositives.

En 2014, Ploeger [139] compare la sensibilité de la MSP simple sur lait de tank (BTM-MSP), au seuil de 10% et de la BTM-MSPr au seuil de 0,41. Les résultats sont synthétisés dans le Tableau VIII.

Tableau VIII : Sensibilité et spécifité des ELISA sur lait de tank en fonction de 3 critères de positivité des troupeaux (Source : [139]).

BTM-MSP simple (seuil BTM-MSP recombinante (seuil Critère de positivité vraie 0,10) 0,41) Sensibilité Spécificité Sensibilité Spécificité 20% des animaux du troupeau 100 38,1 83,3 95,2 séropositifs 20% des animaux présentant des 100 30,8 85,7 80,8 signes cliniques Au moins un animal du troupeau 95,0 53,8 55 100 excrétant des larves

Les résultats sont assez variables en fonction des deux méthodes. Comme dit précédemment, la MSP n’est présente que chez les adultes de D. viviparus et elle n’est pas totalement pure dans la MSP simple. La MSP simple pourrait contenir d’autres antigènes présents chez les immatures ce qui augmenterait la sensibilité de cette méthode par rapport à l’autre. D’autant plus que chez certains individus, les D. viviparus n’arrivent jamais à maturité. La présence d’autres antigènes pourrait aussi entrainer des réactions croisées avec d’autres nématodes ce qui pourrait expliquer les faibles spécificités de la BTM-MSP simple.

Des résultats similaires sont retrouvés par E. Louvet [102] avec un manque de sensibilité de l’ELISA BTM-MSPr (seulement 4 des 6 élevages avec des signes cliniques dépassent le seuil de 0,41), mais une bonne spécificité (aucun des élevages sans signes cliniques ne dépasse le seuil de 0,41).

Le diagnostic de la dictyocaulose par sérologie semble prometteur dans les conditions expérimentales, mais les premières études de terrains semblent montrer de sérieuses limites à son utilisation. Les résultats sont variables d’une étude à l’autre et d’une méthode à l’autre. D’autres études doivent être menées pour préciser ces résultats et pour en valider éventuellement son utilisation sur le terrain.

55 IV. Diagnostic par lavage broncho-alvéolaire

La première description d’une technique de lavage broncho-alvéolaire chez les bovins a été publiée par Fox et al. en 1973 à partir de poumons isolés [65]. Puis d’autres techniques ont été décrites à l’aide d’un fibroscope [184] ou en aveugle [61]. Cette procédure est connue et utilisée relativement souvent en recherche ou dans un cadre hospitalier, mais elle est assez peu usitée sur le terrain. L’intérêt du LBA pour diagnostiquer la dictyocaulose n’a encore jamais été étudié à notre connaissance. Cependant, trois articles ont étudié les modifications observées sur le liquide prélevé lors de dictyocaulose. Ces données ainsi que la technique de LBA sont présentées ci-dessous.

a. Modalités de prélèvement et conditionnement

Le LBA permet de collecter les sécrétions bronchiques ainsi que des cellules bronchiques et alvéolaires. Il peut être réalisé à l’aide d’un endoscope et guidé par vidéo, ou à l’aide d’une sonde naso-trachéale à l’aveugle. Contrairement au LBA à l’aveugle, les prélèvements par endoscopie permettent de visualiser les lésions pulmonaires et de cibler le lieu de réalisation du LBA. Néanmoins, l’endoscopie chez les bovins n’est disponible que dans les centres universitaires et elle est généralement inaccessible sur le terrain. C’est pourquoi la technique du LBA à l’aveugle est décrite ci- dessous. Elle est adaptée de la technique de Fogarty décrite en 1983 [61].

i. Matériels Le matériel nécessaire à la réalisation du LBA à l’aveugle est peu coûteux, en dehors de la sonde naso-trachéale (environ 100€) qui est réutilisable :

- Cornadis et licol pour la contention - Un seau de solution de Chlorhexidine à 0,05% et une lingette désinfectante pour nettoyer les narines du bovin - Une sonde naso-trachéale en silicone (Figure 22) - Une seringue de 50mL - Une poche de sérum physiologique stérile (NaCl 0,9%) (500 mL)

Figure 22 : Photo du matériel et de la réalisation d’un LBA sur un bovin non tranquillisé au cornadis (Source : M. A. Arcangioli).

56 i. Méthodes La contention est réalisée au cornadis avec un licol et aucune tranquillisation n’est nécessaire.

Après avoir préalablement nettoyé les naseaux de l’animal, l’opérateur maintient la tête du bovin en extension avec une main. Avec l’autre main, il insère délicatement la sonde naso-trachéale dans le méat ventral des cavités nasales jusqu’au larynx. En profitant d’une toux (spontanée ou déclenchée), la sonde naso-trachéale est introduite dans la trachée de l’animal. La sonde est alors poussée jusqu’à sentir une résistance s’opposant à sa progression. La sonde est généralement dans le lobe caudal droit [61].

Le sérum physiologique est alors introduit à l’aide d’une seringue de 50 mL puis immédiatement réaspiré. Le taux de récupération étant de 50 à 70%, il n’est pas nécessaire d’introduire un trop grand volume de liquide (50-60mL pour une recherche microbiologique/150 à 200 mL pour une analyse cytologique [152]), [106].

D’après Fogarty, le site de prélèvement est presque toujours le lobe caudal droit. Ce serait dû au fait que la bronche principale droite serait plus large et en continuité avec la trachée contrairement à la bronche principale gauche qui quitte la trachée en formant un angle plus important [61]. Cependant, selon Barone, c’est la bronche principale droite qui est moins large que la gauche [8].

ii. Effets indésirables La technique de LBA à l’aveugle est assez simple à réaliser y compris pour un opérateur inexpérimenté. Très peu d’effets indésirables notables sont rapportés suite à la réalisation d’un LBA chez les bovins, même lors de réalisations répétées. Une toux passagère d’encombrement est fréquemment observée et une épistaxis modérée est rapportée dans quelques cas, sans incidence sur la santé [39], [61].

b. Analyse du prélèvement et conditionnement Le liquide récupéré permet la recherche d’agents infectieux (viraux, bactériens, et fongiques) et des examens cytologiques, biochimiques et immunologiques [106].

i. Microbiologie Pour effectuer la recherche d’agents infectieux, le liquide doit être placé dans un récipient stérile, puis l’analyse est réalisée en fonction de l’agent recherché (bactériologie, virologie, PCR…). Cependant, à moins de mettre en place des mesures de protection particulières (gaine de plastique…), les prélèvements sont souvent contaminés lors du passage dans les voies nasales et au carrefour laryngé. Ainsi, lors d’infection par le BRSV, la concordance intra-individuelle entre le LBA et l’écouvillonnage nasal profond (ENP) est bonne (>80%) [152]. Le LBA reste plus intéressant qu’un ENP lors d’affection bactérienne, car dans ce cas, les résultats entre les deux tests concordent peu au niveau individuel [5]. La réalisation d’un LBA dans le seul but d’une recherche microbienne reste remise en question par rapport à une aspiration trans-trachéale, qui ne passe pas par les cavités nasales ce qui évite les contaminations par la flore microbienne de l’appareil respiratoire supérieur [23], mais il peut être tout de même intéressant de réaliser une culture dans un second temps après l’analyse cytologique.

ii. Cytologie Pour préserver l’intégrité des cellules, le liquide est placé dans un tube EDTA conservé à 4°C. L’analyse doit être réalisée dans les 24h après le prélèvement pour une conservation optimale, voire 48h après le prélèvement (observation personnelle).

Après un étalement des cellules par cytocentrifugation, une formule cellulaire est réalisée par comptage visuel au microscope optique. 57 Lors de LBA à l’aveugle, bien que le prélèvement soit réalisé dans un seul lobe (cf. 0.IV.i.), la cytologie du liquide de lavage reste représentative de l’ensemble des lobes pulmonaires. En effet, les formules sont très proches dans les 4 lobes pulmonaires (crânial droit et gauche, caudal droit et gauche) [61], [143] et les changements dans la cytologie lors d’infections virales sont présents même lorsque le lieu de lavage ne présente aucune lésion macroscopique [91].

c. Caractéristiques du liquide de LBA chez un individu sain

i. Aspect Chez un individu sain, le liquide de LBA est clair, avec très peu d’éléments macroscopiques. Il est mousseux en raison du surfactant récupéré au contact des alvéoles pulmonaires.

En cas de fausse route lors de la réalisation du prélèvement et de la réalisation d’un « lavage ruminal », le liquide prend une couleur verdâtre et des fibres d’aliments sont visibles dans le liquide.

ii. Cytologie La première description des cellules du liquide de lavage broncho-alvéolaire chez l’Homme a été publiée par A. Donne en 1845 [41].

Les liquides de LBA chez des bovins normaux sont similaires à ceux des autres espèces [90]. Le Tableau IX suivant montre les pourcentages de chaque type cellulaire obtenus à partir des LBA de veaux sains.

Tableau IX : Cytologies pulmonaires à partir de lavages pulmonaires chez des bovins sains, lorsque c’est possible, l’intervalle de confiance à 95% est donné et les taux non précisés par l’étude sont notés NP.

Macrophages Lymphocytes Polynucléaires (%) Auteur (%) (%) Neutrophiles Eosinophiles FOX (1973) [65] 90 NP Peu NP MAHESWARAN et al. (1980) [104] 78-95 2-17 2-8,0 NP WILKIE et al. (1981) [185] 44,2-74,2 19,3-36,7 1,3-24,3 NP RICHARDS et al. (1981) [147] 85,2 5,3 0,4 NP FOGARTY et al. (1983) [61] 94,2-95 3-3,95 1-2,8 NP TRIGO et al. (1984) [174] 87,5 10,3 1,7 0,5 DEDIEU (1984) [39] 86,5 8.7 4 rares KIMMAN et al. (1986) [91] 84,4-91 0-4,6 4,5-12,7 NP LOPEZ et al. (1986) [101] >=90 0* <=10 NP PRINGLE et al. (1988) [143] 90,5-92,5 3,1-4,3 2,4-3,4 NP TATLOR et al. (1989) [167] 84 6 2,5 0,9 MATHY et al. (1997) [108] 85,7-94,5 1,2-4,2 2,7-11,7 NP MC BRIDE et al. (1997) [109] 74,6-87,4 2,3-11,7 4,3-15,7 NP HAGBERG(2005) [72] 92,1-100 0-2,6 0-6,9 0-0 SINGH et al. (2012) [164] 75–89 1.5–44.9 5,7–25 rares

Les cellules majoritaires des LBA chez les bovins sains sont donc les macrophages qui représentent entre 82 et 95% des cellules. Puis, en fonction des études, ce sont les lymphocytes et les neutrophiles dont les taux sont plus variables, mais compris entre 0 et 10%. Enfin, les éosinophiles n’ont été dénombrés que dans deux études, où ils représentent moins de 0,5% des cellules.

Seule l’étude de Wiljie et al. [185] se démarque des autres, mais un des veaux de l’étude présentait une majorité de neutrophiles sans présenter de signes cliniques et l’intervalle de confiance autour

58 des moyennes est très grand. On peut donc considérer qu’elle ne correspond pas aux valeurs usuelles des bovins sains.

Aucune de ces études ne concerne des bovins de plus de 2 ans. La plupart ont été réalisées sur des veaux de moins d’un an, et seules trois études (Dedieu et al. [39], Richards et al. [147], Mathy et al.[108]), ont été réalisées avec des animaux âgés entre 1 et 2 ans. L’essentiel des données sur les cytologies pulmonaires chez les bovins est donc issu de LBA réalisés chez des veaux.

Si toutes les études concernent les macrophages, lymphocytes et neutrophiles, presque aucune ne mentionne le taux d’éosinophiles dans les LBA. Cela souligne leur rareté, mais ne fournit aucun pourcentage de comparaison. Néanmoins, on peut logiquement penser que leur proportion n’excède pas 1% de l’ensemble des cellules des lavages broncho-alvéolaires sinon elles auraient été mentionnées dans les comptages de ces études.

d. Modifications associées à des pathologies microbiennes

i. Modifications associées à une maladie bactérienne Deux types d’études caractérisent les changements de cytologie pulmonaire chez des veaux souffrant d’infections bactériennes pulmonaires. Les premières inoculent, en général par aérosolisation des individus, des souches bactériennes spécifiques. Le nombre d’individus étudiés est généralement limité, mais ces études s’affranchissent des pathogènes concomitants et le suivi mis en place permet d’observer l’évolution des différents paramètres au cours de l’infection. Les secondes s’appuient sur des observations cliniques, les animaux sont recrutés sur le terrain en fonction de l’expression de signes cliniques. Les effectifs sont en général plus grands, mais les résultats sont plus difficiles à interpréter en raison des variabilités individuelles d’expression des signes cliniques.

Lors d’aérosolisation de Pasteurella haemolytica chez des veaux, les auteurs rapportent une augmentation du taux de neutrophiles et de lymphocytes à partir de 4h après l’aérosolisation [2], [101]. Ils constatent une inversion du rapport neutrophile/macrophage (N/M) valant 1/9 chez les individus sains et 9/1 chez les individus atteints [101]. Les résultats sont similaires dans d’autres études [110], [164] et avec d’autres bactéries pathogènes comme Chlamydia psittaci [144]. Les taux de neutrophiles augmentent ainsi jusqu’à 75% [2]. De même, l’augmentation du taux de neutrophiles est constatée chez des individus préalablement vaccinés avant l’inoculation [107]. Néanmoins, la réponse à une injection intratrachéale de Mycobacterium bovis est mixte. Elle se traduit par une augmentation à la fois des macrophages et des neutrophiles, ce qui n’entraine presque aucune modification du rapport N/M [101].

Sur le terrain, les résultats sont similaires et les veaux qui expriment des signes cliniques de pathologies respiratoires associées à la mise en évidence de Pasteurella multocida ou de Mycoplasma bovis ont un taux de neutrophiles d’en moyenne 50%. L’auteur montre que le rapport du taux de neutrophiles / taux de macrophages est de 1/2 chez les veaux sains alors qu’il est de 1/1 chez les veaux exprimant des signes cliniques [4], [3].

Ainsi, lors d’infection pulmonaire bactérienne, on remarque une augmentation des taux de neutrophiles et de lymphocytes. Cette augmentation peut être présente en l’absence de signes cliniques de pathologie respiratoire. Une telle formule lors de la réalisation de la cytologie du LBA peut donc conduire à la réalisation d’une bactériologie. L’identification et l’isolement de la bactérie peuvent permettre d’adapter le traitement, de réaliser un antibiogramme et/ou de mettre en place une stratégie vaccinale adaptée aux agents pathogènes présents dans l’élevage.

59 ii. Modifications associées à une maladie virale Les modifications de la cytologie du LBA ont été étudiées avec seulement deux virus à notre connaissance :

- Le Virus Syncytial Respiratoire Bovin (RSVB) [91], [167] - Le virus de la Diarrhée Virale Bovine (BVD) [101], [163] Lors d’inoculation du RSVB chez des veaux, Kimman et al.[91] observent une augmentation des neutrophiles jusqu’à un taux de 50 à 60% en moyenne (maximum 80%) avec le rapport neutrophiles/macrophages qui passe de 0,1 à 5 en 24h. Aucun autre changement n’est observé sur les autres populations cellulaires. L’étude de Taylor et al. [167] montre des résultats similaires chez des individus vaccinés ou non contre le RSV, mais les modifications des cytologies sont un peu moins marquées chez les individus vaccinés. En effet, au 8e jour post-inoculation lorsque les modifications sont les plus importantes, le taux de neutrophiles atteint 45% chez les individus vaccinés ou non. Néanmoins, le nombre de neutrophiles total est multiplié par 15 (par rapport au nombre de neutrophiles avant l’inoculation) chez les veaux non vaccinés alors qu’il n’est multiplié que par 5 chez les individus vaccinés.

Concernant le virus de la BVD, les résultats sont contradictoires. Silflow et al. [163] montrent une augmentation du nombre de macrophages (x3), de neutrophiles (x5 à 100) et de lymphocytes (x10), 10 jours après l’aérosolisation du virus chez des veaux. Cela entraine une augmentation du taux de neutrophiles et de lymphocytes et une diminution relative du taux de macrophages.

A l’opposé, Lopez et al. [101] ne montrent aucune modification des ratios neutrophiles/macrophages après l’inoculation de BVD. Ils ne trouvent pas non plus de lésions pulmonaires à l’autopsie. Cette différence est selon eux due à la virulence des souches utilisées et à la voie d’administration du virus.

Ainsi, même si les résultats semblent plus mitigés lors d’infection virale, on retrouve des modifications de cytologies assez similaires à celles observées lors d’infection bactérienne : une augmentation du taux de neutrophiles qui pourrait être associée à une augmentation du taux de lymphocytes. Il est donc difficile de distinguer une affection pulmonaire virale d’une infection bactérienne lors de la réalisation d’une cytologie à partir du LBA. La virologie et la bactériologie seront nécessaires pour trancher entre les deux étiologies.

iii. Modifications associées à une réaction d’hypersensibilité Chez les bovins, la seule maladie pulmonaire due à une hypersensibilité décrite est la maladie du poumon fermier. Elle est aussi appelée alvéolite allergique extrinsèque ou alvéolite fibrosante. Elle est due à l’inhalation de spores de champignon (principalement Micropolyspora faeni mais aussi plus rarement Thermoactinomyces vulgaris) présentes dans des foins moisis [81]. A notre connaissance, aucune étude n’a étudié les modifications du LBA chez les bovins au cours de cette pathologie.

Les seules données trouvées chez les bovins sont des données histologiques. Elles montrent une infiltration alvéolaire éosinophilique dans les deux cas aigus rapportés par Wilkie en 1978. Néanmoins, dans les cas chroniques, l’infiltration est lymphocytaire et non éosinophilique [183]. Et, selon, Gershwin en 1990 [67], chez seulement 4 des 7 veaux exposés pendant 3 semaines à des aérosols de Micropolyspora faeni, on trouve des éosinophiles et des neutrophiles en petit nombre dans la lumière des alvéoles pulmonaires.

On retrouve des résultats similaires dans les travaux de Kalina et al. en 2006 [89]. Lors d’aérosolisation chronique pendant 2 mois avec Alternaria alternata (un allergène fongique commun) avec ou sans infection par le BRSV, on trouve à l’histologie une infiltration

60 lymphoplasmocytaire chez tous les veaux étudiés et, dans 6 cas sur 9, une pneumonie interstitielle éosinophilique une bronchite focale éosinophilique ou une trachéobronchite éosinophilique focale.

En médecine humaine, dans le cadre des pneumonies d’hypersensibilité comme la maladie du poumon fermier, le lavage broncho alvéolaire est un outil important pour le diagnostic. En effet, les pneumonies d’hypersensibilité sont toujours associées à une alvéolite lymphocytaire [172]. Ainsi, dans l’étude de Cormier et al. en 1986 [31], les 12 fermiers atteints par la maladie du poumon du fermier présentent une lymphocytose pulmonaire supérieure à 22%. Cette alvéolite lymphocytaire peut perdurer pendant des mois voire des années [31].

Néanmoins, dans les quelques heures qui suivent l’exposition, on observe une augmentation du taux de neutrophiles dans le LBA [64] puis du taux d’éosinophiles pendant une semaine. Cette augmentation des éosinophiles est significative, mais modérée de 0,44% chez les contrôles à 3,55% (+/- 1,14%) 24h après l’exposition alors que les neutrophiles augmentent de 1,3 à 18% sur la même période). Le taux d’éosinophile diminue ensuite progressivement pendant un mois alors que l’augmentation du taux de lymphocyte reste significative pendant un an [44].

En conclusion, on dispose d’assez peu d’information sur les modifications pathologiques de la cytologie du liquide de LBA associées à des hypersensibilités et des maladies fongiques. On cherchera prioritairement une augmentation du taux de lymphocytes, qui perdure probablement longtemps après l’exposition. Il est probable que l’on retrouve une éosinophilie et une neutrophilie pulmonaires dans les phases aiguës de ces maladies, mais il est difficile de déterminer son amplitude et sa persistance dans le temps.

e. Modifications associées à la dictyocaulose Les résultats présentés ci-dessous proviennent de trois études réalisées à partir de veaux expérimentalement infectés par D. viviparus. L’objectif de ces études était de caractériser la réponse immunitaire locale contre D.viviparus. Dans deux d’entre elles, une réinfestation était réalisée 10 semaines après la première infestation pour évaluer les différences de réponse immunitaire lors de primo-infestations et de réinfestations.

i. Aspect Le liquide présente une quantité plus importante de mucus et de débris. Il reste cependant clair et mousseux. ii. Mise en évidence du parasite Deux semaines après l’infestation et la réinfestation, des adultes macroscopiques sont mis en évidence dans le liquide de LBA [75], [80]. Ils sont significativement plus petits lors de la réinfestation par rapport à la primo-infestation (Figure 23) [72].

Figure 23 : Longueurs des dictyocaules retrouvés par LBA entre 2 et 5 semaines post-inoculation (Noir et blanc : Primo-infestation, gris : réinfestation) (Source : [72]).

61 Lors de l’examen du culot du LBA, des œufs de D. viviparus peuvent être mis en évidence. Ils témoignent de la présence d’au moins une femelle adulte dans les poumons de l’individu. On rappelle qu’une femelle pond en continu et jusqu’à 25 000 œufs par jour.

La mise en évidence du parasite en visualisant les adultes ou les œufs, permet de réaliser un diagnostic de certitude de dictyocaulose.

iii. Modifications de la cytologie du liquide de LBA Pendant la 2e semaine après la primo-infestation, les taux de neutrophiles et d’éosinophiles augmentent pour atteindre respectivement 50% et 20-30% à partir de la 3e semaine [77], [158].

L’augmentation du taux d’éosinophiles est significative au moins une semaine avant l’excrétion des premières larves [158], et le reste jusqu’à 9 semaines après la primo-infestation [72] et au moins deux semaines après l’excrétion des dernières larves [158].

Figure 24 : Moyennes des taux cellulaires du liquide de LBA chez des bovins au cours de l’infestation par D.viviparus (Source : [158]).

Lors de réinfestation, le taux d’éosinophiles augmente jusqu’à 70-80% à partir de la 3e semaine [72], [77]. Cette augmentation est toujours accompagnée d’une augmentation du taux de neutrophiles, mais moins marquée que lors de primo-infestation. Elle est probablement masquée par l’intensité de l’augmentation du taux d’éosinophiles [72].

iv. Diagnostic Le diagnostic de la dictyocaulose par LBA n’a encore jamais étudié, mais d’après les résultats ci- dessus, il pourrait s’appuyer sur la mise en évidence directe de vers macroscopiques (Figure 25) au moins une semaine avant l’émission des premières larves et jusqu’à la fin de la période patente.

La cytologie permettrait de réaliser un diagnostic à partir de la 2e semaine post-infestation et au moins jusqu’à 2 semaines après la fin de la période patente. Les différentes cellules sont facilement identifiables à la cytologie et le comptage est relativement aisé à faire (Figure 27).

Cette méthode pourrait ainsi permettre un diagnostic en dehors de la période patente de la maladie, contrairement à la coproscopie. De plus, alors que lors de ré infestation, l’excrétion larvaire est plus faible, l’augmentation du taux d’éosinophiles pulmonaires est plus importante. Le diagnostic par LBA pourrait ainsi être facilité alors que le diagnostic par la coproscopie devient insuffisant.

Figure 25 : Mise en évidence d’adultes macroscopiques dans le liquide de LBA chez trois bovins différents. On peut trouver de nombreux vers de grandes tailles à seulement quelques vers de petites tailles parfois masqués dans le mucus (Source : photo personnelle).

Figure 26 : Mise en évidence de D.viviparus après coloration au RAL 555 du culot de centrifugation du LBA. A : œufs, B : larves 1, C : Fragment d’adulte (Source : photos personnelles).

Figure 27 : Cytologie du LBA d’un bovin atteint de dictyocaulose après cytocentrifugation et coloration au MGG ; M : Macrophage, E: Polynucléaire éosinophile, N : Polynucléaire neutrophile (Source : Photo personnelle).

63 V. Comparaison des différentes méthodes diagnostiques

Il existe donc de nombreuses possibilités pour diagnostiquer la dictyocaulose. Néanmoins, peu d’études les ont comparées à notre connaissance sur le terrain.

Nous présenterons celle de Beugnet et al. en 1997, dans chacun des 27 élevages bretons présentant une toux d’été au pâturage de l’étude, des coproscopies individuelles, des coproscopies de mélange, des sérologies, des ATT et des NF ont été réalisées. Le Tableau X résume les résultats de l’article.

Tableau X : Résumé des résultats l’étude de Beugnet et al. (source : [11]).

Coproscopie de Coproscopie Méthode Sérologie ATT mélange individuelle Nombre d’animaux prélevés par 7 5 2 1 élevage Nombre de tests réalisés 189 27 54 27

Proportion de résultats positifs 25,4% 37% 9,3% 3,7% Proportion d’élevages positifs [IC 74% [57,5 ; 3,7% 37% [18,4 ; 55,6] 18,5% [3,5 ; 33,5] à 95%] 90,5] [0 ; 11] Proportion d’animaux positifs au 25,4% [19,2 ; 50% [27,5 ; 72,4] 12,5% [2,1 ; 22,9] 5% sein des élevages séropositifs 31,6]

La première chose à noter est l’absence de méthode de référence (ie : Gold Standard) ayant une sensibilité et une spécificité de 100%. On ne connait pas le statut individuel de chaque élevage ou de chaque individu. C’est pour cela qu’on parle de proportion de résultats positifs et pas de sensibilité et de spécificité.

Ainsi, les auteurs mettent en évidence des larves de dictyocaules dans 40,7% des élevages avec une toux d’été apyrétique alors que 74% des élevages sont séropositifs. On est donc certain que D. viviparus est impliqué dans 40,7% des élevages avec toux d’été au pâturage. Le parasite a circulé dans 74% des élevages au cours des six derniers mois et il est donc probable que D. viviparus soit impliqué dans les signes cliniques observés, mais on ne sait pas si le parasite est toujours présent ou non. Enfin, on ne peut rien dire des six derniers élevages. Il en est de même à l’échelle individuelle, et dans chacun des élevages positifs, il est difficile de connaitre le statut des individus d’autant plus pour les individus négatifs. On ne peut donc pas calculer de sensibilité et de spécificité, ni à l’échelle du troupeau ni à l’échelle individuelle pour chacune des différentes méthodes.

Néanmoins, l’étude semble montrer que la sérologie est la meilleure méthode pour réaliser un diagnostic de troupeau, et la coproscopie de mélange apparait plus sensible au niveau du troupeau que la réalisation de deux coproscopies individuelles sur les animaux les plus atteints.

De nombreux biais nous incitent à être prudents. En effet, les tests n’ont pas tous été réalisés sur le même nombre d’animaux et/ou sur des individus identiques. Ainsi, la coproscopie individuelle était réalisée sur les deux individus les plus atteints et la coproscopie de mélange sur 5 autres individus de l’élevage présentant une toux alors que les sérologies étaient réalisées sur l’ensemble de ces 7 animaux. Cela a pu diminuer la sensibilité troupeau de la coproscopie de mélange par rapport à celle de la sérologie. Néanmoins, selon cette étude, la sérologie reste la méthode la plus sensible même si deux individus à coproscopie individuelle positive étaient séronégatifs ce qui souligne un manque de sensibilité de cette méthode.

64 Des résultats similaires ont été retrouvés par Ploeger et al. en 2012 [140] aux Pays-Bas. Dans les 33 élevages avec ou sans signes cliniques de dictyocaulose, des coproscopies individuelles et des sérologies ont été réalisées sur 20 génisses et 20 vaches (au moins deux lactations). Ainsi, dans 20% (3/15) des fermes avec des signes cliniques, aucune larve n’a été mise en évidence et dans 7% (1/15) aucun animal n’a été trouvé séropositif. A l’inverse, dans les fermes sans signes cliniques, seulement 22% (4/18) se sont révélés négatives en coproscopie et en sérologie, et 41% de celles où au moins un animal excrète des larves. Cela souligne la forte circulation du parasite aux Pays-Bas sans que la présence du parasite soit systématiquement associée à des signes cliniques. De plus, cette étude souligne que même en réalisant des prélèvements sur un grand nombre d’animaux, la sensibilité de la coproscopie reste insuffisante par rapport à la sérologie. Elle remet aussi en question l’importance des tests diagnostiques. Ce n’est pas parce que le troupeau est séropositif ou « copropositif » qu’il présente des signes cliniques. Cela nous amène à nous questionner sur la pertinence d’un traitement uniquement basé sur les signes cliniques ou à l’inverse uniquement basé sur des diagnostics sérologique ou coproscopique.

Enfin, d’après la thèse d’Elsa Louvet en 2014, la coproscopie de mélange, sur 10 primipares présentes dans le troupeau depuis au moins deux mois, présente un intérêt diagnostic, car les symptômes sont toujours associés à une coproscopie positive, l’ELISA sur lait de tank manque de sensibilité et l’ELISA sur mélange de sérum manque de spécificité [102].

Ainsi, chacune de ces quatre méthodes présente des intérêts et des limites. La sérologie semble être la plus sensible, mais elle ne permet pas de préciser si le parasite circule toujours dans l’élevage et on dispose de trop peu d’études de terrain pour valider son utilisation. Les coproscopies souffrent d’un manque de sensibilité, mais elles permettent d’affirmer que le parasite est toujours présent. La coproscopie de mélange apparait comme une méthode très intéressante par rapport aux coproscopies individuelles, moins longues à réaliser, elle permet d’évaluer l’infestation de plusieurs individus simultanément, elle présente donc une sensibilité de troupeau bien meilleure par rapport à la coproscopie individuelle qui est généralement réalisée sur moins d’individus.

L’ATT apparait très limitée tant du point de vue de sa spécificité que de sa sensibilité. Le LBA, grâce au diamètre plus important de la sonde, à une zone d’irrigation plus grande et à son meilleur rendement, pourrait être un meilleur moyen diagnostique. De plus, contrairement aux coproscopies, la réalisation de la cytologie du LBA permet un diagnostic au-delà de la période patente tout en restant spécifique d’une maladie parasitaire pulmonaire des bovins au pâturage.

Dans tous les cas, chacun de ces tests devra être utilisé avec parcimonie et la question du traitement après un résultat positif devra être abordée avec l’éleveur en fonction des signes cliniques présents sur le troupeau et de sa volonté à contrôler les infestations par D. viviparus.

65 VI. Traitement et stratégie de contrôle

a. Traitement médical

De nombreuses molécules sont efficaces contre D. viviparus. Cependant, certaines ne sont pas utilisables sur les vaches laitières en lactation. Les mécanismes et les délais d’action sont différents en fonction des molécules. Les principales molécules ainsi que leurs caractéristiques sont présentées dans le Tableau XI [58].

Tableau XI : Principales molécules utilisables contre D.viviparus chez les bovins (Source : Med’vet 2016 [58]).

Voie Cible Action Rémanence Dose Temps d’administration Principe actif Mode vis-à-vis de d’attente (mg/kg) Adulte L5 Œufs Vitesse D. viviparus lait

PO 85- Lyse cellulaire

Fenbendazole 7,5 95-100% 0 95% par inhibition de la Oxfendazole 5 PO 95-100% Lent 0 polymérisation PO des

Benzimidazole Albendazole 7,5 95-100% 0 microtubules Non utilisable PO, IM, Pour On sur les (dose 10mg/kg) vaches Rapide Paralysie Lévamisole 7,5 95-100% 0 laitières (6h) spastique en

lactation Imidazothiazoles (NUVL) SC, Pour on (0,5 28j en pour Ivermectine 0,2 mg/kg), PO 95-100% on (ovin)

SC, Pour on 35 j (42 en Doramectine 0,2 95-100% (0,5mg/kg) pour on)

Avermectines Paralysie SC, Pour on (0,5 Lent 14j (28j en Eprinomectine 0,2 95-100% flasque 0j mg/kg) Pour on)

SC, Pour on SC : (0,5mg/kg) NUVL Moxidectine 0,2 95-100% 42jours Pour on :

6 jours Milbémycines

66 Toutes les molécules disponibles sont très efficaces sur D. viviparus et très peu de résistances sont rapportées pour ce parasite (un cas suspecté par Jacques Devos en France (communication personnelle) lors de très forte infestation avec de l’éprinomectine et une autre publication peu relayée avec l’abamectine et la moxidectine en 2006 au Brésil [118]).

Seul le lévamisole agit rapidement. De plus, cette molécule induit une paralysie spastique des parasites, ce qui facilite leur élimination, alors que les avermectines entrainent une paralysie flasque.

Seules l’éprinomectine et la moxidectine sont utilisables sur les vaches laitières en lactation, avec un temps d’attente pour la moxidectine. L’utilisation d’anthelminthiques sur les vaches en lactation est donc assez restreinte et les éleveurs sont généralement réticents à les utiliser sur les vaches productrices en raison des temps d’attente.

Les avermectines et les milbémycines ont une action rémanente qui permet de protéger les animaux contre les réinfestations tout au long de la période de rémanence. L’utilisation de molécules rémanentes est conseillée si le troupeau pâture sur un nombre limité de parcelles fortement contaminées. Sinon, on conseille de placer le troupeau sur une pâture faiblement contaminée 48h après le traitement ce qui permet d’éviter de contaminer la nouvelle pâture tout en limitant les ré- infestations [114]. Cette stratégie présente deux limites, d’une part elle limite le développement d’une immunité protectrice du troupeau [53], (cf. III.), et d’autre part, si les conditions climatiques sont favorables, elle conserve une forte pression parasitaire sur la parcelle.

b. Vaccination Un vaccin a été développé dans les années 1950 au Royaume-Uni [33]. Il est élaboré à partir de L3 irradiées et chaque dose contient entre 200 et 4000 larves. Il peut être administré à partir de deux mois et est efficace 15 jours après le premier rappel. Ce sont les antigènes qui entrainent une immunité protectrice lors de la vaccination, car les vaccins disponibles ne contiennent que des larves irradiées. Elle nécessite une forte dose d’inoculation [113], [115], [138].

De plus, étant donné que les larves du vaccin ne deviennent pas adultes, il n’y a pas de renforcement de l’immunité (cf. III.). L’immunité conférée par le vaccin est donc d’assez courte durée et de moins bonne qualité qu’un contact naturel avec D.viviparus. Les animaux doivent entrer et rester en contact avec le parasite pendant la saison de pâturage pour que la vaccination reste efficace. Ce vaccin est commercialisé au Royaume-Uni sous le nom de Bovilis Husvac® par MSD Santé Animale, mais il n’est pas disponible en France [20].

c. Mesure agronomique et conduite de pâturage La mesure principale pour limiter la survenue de cas cliniques de dictyocaulose est la rotation de pâture. Eysker et al. en 1997 [52] ont montré que la rotation du lot de veaux toutes les semaines sur six pâtures sans utiliser d’anthelminthique permet d’éviter la survenue d’épisode clinique de dictyocaulose alors que des signes cliniques sont observés si les veaux changent de pâture toutes les deux semaines sur trois parcelles. Cependant, cette stratégie n’est pas suffisante pour assurer le contrôle des parasitoses gastro-intestinales [52].

L’autre mesure importante est la séparation des classes d’âge au pâturage. En effet, les animaux de première saison de pâturage ne sont pas du tout immunisés contre la dictyocaulose. S’ils sont introduits dans un troupeau déjà immunisé et même si les pâtures sont faiblement infestées, ils seront fortement excréteurs de L3. Cela risque de surpasser l’immunité du troupeau et d’entrainer des cas cliniques chez les individus immunisés. Il est donc important de regrouper les classes d’âges et d’éviter de placer les animaux non immunisés sur des pâtures fortement contaminées.

PARTIE 2 : ETUDE EXPERIMENTALE

70 PREAMBULE

La partie expérimentale a préalablement reçu un avis favorable du comité d’éthique de VetAgro Sup (n°1539 annexe III). Un article scientifique en cours de rédaction sera prochainement soumis dans la revue internationale Preventive Veterinary Medicine. Cette partie a donc été rédigée selon le plan d’un article scientifique, l’introduction revient sur les points importants de la bibliographie. Les parties résultats et discussions ont été voulues assez complètes dans cette thèse pour exposer la démarche scientifique dans son ensemble et pour faciliter la compréhension et la visualisation des résultats même si elles n’ont pas la concision souhaitée pour le futur article scientifique.

A. INTRODUCTION

La bronchite vermineuse causée par Dictyocaulus viviparus est une des maladies parasitaires les plus importantes chez les bovins. Elle est présente dans toutes les zones à climat tempéré, particulièrement en Europe de l’Ouest. Par exemple, une étude en Bretagne a montré que 13,75% des bovins adultes étaient porteurs du parasite à l’abattoir [29]. Cette maladie entraine d’importantes pertes financières pour l’éleveur [79] et elle se traduit par de la toux, des écoulements nasaux et une dyspnée sévère pouvant conduire à la mort des individus atteints. Dictyocaulus viviparus a un cycle direct et les animaux s’infestent en ingérant les larves 3 (L3) au pâturage. Une fois ingérées, les L3 traversent la paroi du tube digestif jusqu’aux ganglions mésentériques où elles se transforment en larves 4, qui gagnent le parenchyme pulmonaire par voie sanguine. Elles se transforment ensuite en larves 5, puis en adultes qui vivent dans les bronches et se nourrissent des sécrétions bronchiques. Les œufs pondus par les adultes dans les voies aérifères éclosent puis les larves 1 remontent la trachée jusqu’au pharynx où elles sont dégluties puis évacuées dans les bouses des ruminants. Dans le milieu extérieur et avec des conditions météorologiques optimales, les L1 muent successivement en 5 à 10 jours en L2, puis en L3, qui peuvent à nouveau infester d’autres individus [6]. Historiquement, les jeunes animaux de première saison de pâturage étaient les plus touchés par la maladie, mais depuis les années 1990, la majorité des cas cliniques se déclare chez les adultes [40], [135].

La méthode diagnostique de routine est la coproscopie de Baermann qui repose sur la mise en évidence des L1 dans les fèces. Malgré une spécificité maximale (100 %) et une très bonne sensibilité (100%) lors de primo-infestation chez les veaux [51], cette méthode manque de sensibilité chez les adultes à cause de la dilution des larves dans un volume plus important de fèces et de l’immunité des adultes qui ralentit le développement et réduit la ponte des dictyocaules [51], [140]. De plus, les échantillons doivent être examinés le plus vite possible ou conservés à 4°C jusqu’à ce que la sédimentation de Baermann soit réalisée afin d’éviter la mort des larves dans les fèces et une perte importante de sensibilité [149]. Cette méthode présente donc à la fois des limites dans sa réalisation sur le terrain et sur la fiabilité des résultats, particulièrement en ce qui concerne la sensibilité chez les adultes.

Depuis 1993, deux tests sérologiques ont été développés [78], [100]. Ils reposent sur la détection d’anticorps spécifiques des dictyocaules adultes par la méthode ELISA et les résultats sont donnés en ratio de densité optique (ODR). Pour ces deux tests, le seuil de positivité ainsi que la sensibilité et la spécificité ont été déterminés à partir d’animaux infestés expérimentalement ou dont les infestations étaient fortement monitorées. Dans ces conditions, ces deux tests ont une sensibilité et une spécificité supérieures à 99% [78], [100]. Cependant, les performances de ces tests sur le terrain sont plus faibles [139], [140]. Ainsi, pour la MSP recombinante développée par Van Holtum et al. [78],

71 Ploeger et al. en 2014 [139] estiment une sensibilité entre 58,7 et 80% et une spécificité entre 94,9 et 83,7%. Ces valeurs sont variables en fonction de la période de prélèvement (respectivement au printemps et à l’automne) et l’excrétion fécale est considérée comme le Gold Standard. Avant de pouvoir utiliser ces tests en clientèle, ils doivent donc encore être testés sur le terrain pour réévaluer les seuils de positivité et mieux connaitre leur spécificité et leur sensibilité réelle. Outre cette incertitude sur les seuils, ces méthodes sérologiques réalisées en laboratoire requièrent plusieurs jours pour l’obtention des résultats, ce qui retarde le diagnostic alors qu’un traitement rapide est souhaitable lors d’infestation majeure.

Du fait de la localisation pulmonaire de plusieurs stades du parasite, une autre méthode diagnostique que l’on peut envisager est le lavage broncho-alvéolaire (LBA). Cette technique n’a encore jamais été évaluée pour diagnostiquer la maladie, mais elle a permis de caractériser la réponse inflammatoire pulmonaire face à Dictyocaulus viviparus chez les bovins [72], [77], [158]. La méthode de lavage broncho-alvéolaire à l’aveugle, adaptée de celle de Fogarty et al. [61], est facilement réalisable sur le terrain et ne nécessite pas de matériel coûteux. Selon ces trois études, chez un individu atteint de bronchite vermineuse, la méthode du LBA pourrait permettre de mettre en évidence des vers macroscopiques [72], [77] ou des œufs de dictyocaules permettant ainsi un diagnostic direct de la dictyocaulose. De plus, on observe une éosinophilie pulmonaire liée au parasite. Chez les bovins sains, les éosinophiles pulmonaires représentent moins de 1% des leucocytes totaux [39], [72], [167], [174], mais lors de primo-infestation, les éosinophiles représentent 20 à 50% des leucocytes récupérés dans le liquide de LBA [72], [77], [158] et jusqu’à 70 à 80% lors de réinfestation [72], [77]. Cette éosinophilie pulmonaire apparait dès 2 semaines après l’infestation et persisterait au moins 12 semaines après une l’infestation ponctuelle sans nouvelle recontamination [72], [77], [158]. A notre connaissance, il n’existe pas d’autre affection associée à une éosinophilie pulmonaire chez les bovins excepté, éventuellement, les réactions d’hypersensibilité à des allergènes fongiques comme Micropolyspora faeni pour la maladie du poumon fermier [67], [183], mais qui s’observent en dehors des périodes de pâturage. Ainsi, l’éosinophilie pulmonaire, une fois un seuil de positivité fixé, pourrait permettre un diagnostic de la maladie à la fois sensible et spécifique.

Aucune de ces méthodes ne permet de déterminer avec certitude le statut de l’animal. En effet, la coproscopie, comme la mise en évidence du parasite lors du LBA, sont totalement spécifiques mais de sensibilité inconnue. La sérologie et l’éosinophilie pulmonaire donnent des résultats quantitatifs dont les seuils de positivité doivent être (ré)évalués pour les cas d’infestations naturelles. Aucun des tests ne peut être considéré comme un Gold Standard et leurs caractéristiques ne peuvent être calculées directement [9]. Dans ce contexte, lorsque ces tests sont appliqués à des populations de prévalences différentes, l’estimation des prévalences dans chaque population et de la sensibilité et la spécificité de chacun des tests est possible grâce à l’utilisation de modèles à variables latentes. Cela a été proposé dans un premier temps par l’approche du maximum de vraisemblance proposée par Hui et Walter en 1980 [80], puis par l’approche bayésienne. Cette dernière est de plus en plus utilisée notamment en médecine vétérinaire [27], [47], [182] et elle permet de fournir une estimation plus précise à partir de moins d’individus que la méthode de Hui et Walter [47]. Pour les tests donnant des résultats quantitatifs, il faut fixer un seuil de positivité avant d’estimer les sensibilités et spécificités. Pour ce faire, on ajuste le mélange des distributions de la réponse au test des individus atteints et non atteints. Ces approches ont été largement utilisées pour la sérologie notamment par Greiner en 1994 [69] et Gay en 1996 [66] pour l’approche du maximum de vraisemblance et Nielsen en 2007 [125], Opsteegh en 2010 [129] et Peel en 2013 [131] pour l’approche bayésienne.

72 Cette étude est une étude prospective dans différents élevages, qui évalue et compare quatre méthodes de diagnostic de la bronchite vermineuse des bovins tout en fixant les seuils de positivité pour les deux tests quantitatifs (sérologie et éosinophilie pulmonaire). L’analyse à variable latente et l’analyse du mélange de distribution ont été réalisées simultanément grâce à l’approche bayésienne.

B. MATERIELS ET METHODES

I. Présentation des élevages

a. Sélection des élevages

L’étude a été conduite sur la saison de pâture 2015, soit de mai à décembre 2015. Le périmètre d’étude comporte les clientèles rurales de Saint-Symphorien-sur-Coise (69), Sainte-Foy-l’Argentière (69), Panissières (42), Saint-Germain-Laval (42), Saint-Martin-d’en-Haut (69) et de l’Arbresle (69). Sur la base du volontariat de l’éleveur, les lots de bovins (d’au moins 10 individus) avec une suspicion clinique de dictyocaulose (c’est-à-dire une toux enzootique au pâturage) ont été sélectionnés, quels que soient l’âge ou la race. Les seuls critères d’exclusions étaient une impossibilité à réaliser une contention adaptée (c’est-à-dire absence de cornadis ou de cage de contention à proximité du lot) et l’administration d’un traitement antiparasitaire au cours des 6 mois précédents.

b. Description des élevages

Des prélèvements ont été réalisés dans 11 élevages différents (8 élevages laitiers, 2 mixtes et un allaitant limousin) répartis dans quatre clientèles différentes : à Sainte-Foy-l’Argentière (2 élevages), Panissières (2 élevages), Saint-Germain-Laval (6 élevages) et à l’Arbresle (1 élevage). Sur les 63 prélèvements réalisés en élevage, 51 proviennent de vaches laitières (Prim’holstein et Montbéliarde) et 12 de vaches allaitantes (salers et limousine). La majorité des prélèvements a été réalisée en début d’été (juin et juillet) à Sainte-Foy-l’Argentière, Saint-Germain-Laval et à l’Arbresle, tandis qu’à Panissières les premiers cas cliniques sont apparus au mois de novembre. La taille des élevages variait de 25 à 130 vaches adultes.

Des prélèvements ont aussi été réalisés sur 10 vaches de travaux pratiques (TP) de VetAgro Sup de races Prim’holstein et Montbéliarde. Elles ont accès à des pâtures isolées et indemnes de dictyocaulose. Néanmoins, nous ne connaissons pas leur historique et nous ne pouvons pas les considérer comme des témoins négatifs. Elles seront considérées comme des individus non exposés.

i. Signes d’appel Le signe d’appel principal a été une toux d’aspect enzootique affectant apparemment l’ensemble du troupeau. Les premiers signes cliniques ont été rapportés au moins 1 mois avant de faire appel au vétérinaire dans 80% des cas et la maladie inquiétait assez peu les éleveurs tant que l’ensemble du troupeau ou l’état général des vaches n’étaient pas atteints.

Chez un éleveur, les premiers prélèvements ont été réalisés avant les premiers signes cliniques en raison d’antécédents récurrents (tous les ans depuis au moins cinq ans), les signes cliniques sont apparus un mois après notre visite et ont motivé une seconde visite.

ii. Antécédents de dictyocaulose Dans 36% des élevages, aucun antécédent n’est rapporté par l’éleveur ou le vétérinaire. Lorsque des antécédents sont rapportés, dans 71% des cas, aucun diagnostic n’a été réalisé lors des épisodes précédents.

iii. Conduite d’élevage et de pâturage La période de pâturage s’étendait des mois d’avril à décembre sur l’étude. Seul un élevage est en pâturage continu toute l’année (salers).

Le système de pâturage était un système de rotation sur plusieurs parcelles dans 9 élevages et un système de pâturage continu sur la même parcelle dans 2 élevages.

Dans tous les élevages, aucun traitement anthelminthique n’a été administré dans les 6 mois précédant la réalisation des prélèvements et chez 2 éleveurs, aucun traitement anthelminthique n’a été administré sur l’ensemble du troupeau depuis plusieurs années.

II. Réalisation des prélèvements

a. Sélection des animaux

Dans chaque élevage, six vaches ont été sélectionnées par l’éleveur en fonction de leur caractère sans tenir compte de leurs signes cliniques.

b. Séries de prélèvements

Si aucun diagnostic de certitude (mise en évidence directe du parasite par LBA ou coproscopie de Baermann) n’a été établi lors de la première visite, aucun traitement n’a été préconisé et, si possible, une seconde série de prélèvement a été réalisée un mois après (c’est le cas dans 4 élevages dont 1 ayant accepté la seconde série de prélèvements).

Lorsqu’un traitement a été réalisé (suite à un diagnostic parasitologique positif), une autre série de prélèvement a été réalisée, avec l’accord de l’éleveur, au moins un mois après le traitement (4 élevages).

Le tableau ci-dessous présente le nombre de prélèvements réalisés dans chaque élevage en fonction des différentes visites réalisées.

Tableau XII : Synthèse des prélèvements réalisés en fonction des différentes visites faites dans chaque élevage, les chiffres entre parenthèses correspondent aux séries de prélèvements incomplètes.

Nombre d’animaux prélevés (+nombre de séries de prélèvement incomplètes) Elevage Visite préclinique Visite « clinique » Visite de confirmation Visite après traitement A 6 6 4 B 4 C 6 D 5(+2) F 5 G 5 6 H 6 I 6 5 J 6 5 5 K 6(+1) L 6 TP « 10 » (non clinique) Total 6 70 (+3) 6 20

74 Dans la mesure du possible, les prélèvements ont été réalisés sur les mêmes individus d’une visite à l’autre. On peut diviser les individus et séries de prélèvements en quatre catégories :

- les individus précliniques - les individus cliniques c’est-à-dire ceux prélevés lors des visites cliniques ou de confirmation, - les individus traités, - les individus non exposés (vaches de TP).

On obtient donc des prélèvements complets pour 6 individus précliniques, 66 individus cliniques (60 + 6), 10 individus non exposés (vaches de TP) et 20 individus traités.

c. Types de prélèvements et leur réalisation

Les prélèvements ont été identifiés par le numéro de travail de l’animal et une lettre par élevage. Ils ont été conservés au froid positif dans une glacière pour le transport ou au réfrigérateur dans l’attente de leur examen en laboratoire.

i. Fèces Un prélèvement de fèces intrarectal individuel d’au moins 100 g a été réalisé sur chacun des 6 individus sélectionnés.

ii. Lavage broncho-alvéolaire Le LBA a été réalisé selon la technique de Fogarty et al. [61]. Deux rinçages successifs ont été réalisés puis le liquide récolté a été distribué dans 2 tubes EDTA de 4 mL pour la cytologie pulmonaire. Le reste du prélèvement a été conservé dans un flacon stérile pour la parasitologie et une éventuelle analyse bactériologique.

iii. Sanguin Deux prises de sang à la jugulaire ont été réalisées pour chaque animal : sur un tube EDTA de 4mL pour une numération formule et sur un tube sec de 4mL pour une sérologie dictyocaulose.

III. Analyses de laboratoire

a. Coproscopie

Les coproscopies ont été réalisées au service de parasitologie de VetAgro Sup en utilisant la technique de Baermann (cf. Partie 1.0.II.a.i.). Pour chaque vache, une coproscopie individuelle a été réalisée. Une coproscopie de mélange a aussi été réalisée à partir d’un mélange homogénéisé de 60 g de fèces issu de 10 g de chaque individu prélevé dans l’élevage. La lecture des culots a été réalisée entre 16 et 24h après la mise en flottaison.

b. Analyses du liquide de LBA

i. Analyse macroscopique Les liquides ont été observés une première fois macroscopiquement directement dans l’élevage pour rechercher des adultes, puis une seconde fois, de la même manière, à l’école vétérinaire pour vérifier cette inspection.

75 ii. Cytologie L’analyse cytologique a été réalisée selon deux méthodes de centrifugation différentes pour chacun des prélèvements réalisés :

- Une cytocentrifugation par cytospin :

Un échantillon de 200 µL est placé dans les puits du cytocentrifugeur (Aerospray Hematology® Stainer/Cytocentrifuge model 7150, Wescor®) qui répartit les cellules de l’échantillon sur une « pastille » de 1 cm² d’une lame de verre classique. Puis l’automate réalise une coloration de May- Grünwald Giemsa. Cette méthode présente une très bonne reproductibilité et une grande facilité de lecture de la cytologie. Un comptage cellulaire différentiel est réalisé ultérieurement sur un total de 400 cellules au microscope optique (grossissement x100).

- Une centrifugation classique avec étalement par frottis du culot de centrifugation :

Le 2e tube EDTA est centrifugé 10 minutes à 2500 tours/minute. Le surnageant est éliminé à l’aide d’une pipette de 1 mL. Le culot de centrifugation est récupéré puis placé sur une lame de verre et un étalement est réalisé de façon similaire à la réalisation d’un frottis sanguin. Une coloration rapide RAL 555 (RAL diagnostics ®) est alors réalisée sur les étalements secs. Le comptage cellulaire différentiel est réalisé ultérieurement sur un total de 100 cellules au microscope optique (grossissement x100).

c. Sérologie

Les échantillons de sang total ont été centrifugés au laboratoire puis les sérums obtenus ont été congelés dans l’attente de leur analyse. Seuls les échantillons des vaches non traitées (vaches de TP et vaches suspectes) ont été envoyés pour analyse.

La technique de sérologie utilisée est la MSP recombinante (cf. 0.III.b.) réalisée à Hanovre par l’équipe de Christina Strube.

d. Numération formule sanguine

Des numérations sanguines ont été réalisées par un automate (MS4s® MELET SCHLOESING laboratoire®). La formule a été obtenue après un comptage différentiel de 100 cellules après étalement d’un frottis sanguin et coloration RAL (ND). La concentration en protéines totales de chaque échantillon a été évaluée grâce à un réfractomètre classique après centrifugation du tube EDTA ayant servi à réaliser la numération formule.

IV. Analyses statistiques

Dans un premier temps, nous avons réalisé une analyse de composantes principales [48] dans un but exploratoire afin d’examiner les relations entre les différentes variables et de sélectionner celles qui étaient les plus pertinentes pour diagnostiquer la dictyocaulose. Nous avons ensuite réalisé une analyse descriptive des variables sélectionnées.

Dans un deuxième temps, les différents moyens diagnostiques sont évalués et comparés grâce à un modèle global en utilisant les inférences bayésiennes. Seule cette partie fait partie de l’article en cours de rédaction. Le modèle statistique est détaillé dans la partie résultat afin de faciliter la compréhension de cette analyse.

76 C. RESULTATS

L’ensemble des données est disponible en annexe I.

Pour faciliter la lecture et l’interprétation des résultats, l’ensemble des observations a été regroupé en différentes catégories.

A l’échelle « élevage », les différentes séries de prélèvements ont été regroupées en 4 catégories :

- Préclinique : série de prélèvements réalisée pendant la visite « préclinique » (1 série de 6 animaux) - Clinique : séries de prélèvements réalisées pendant les visites « cliniques » et « de confirmation » (12 séries, 66 animaux) - Traité : séries de prélèvements réalisées pendant la visite « après traitement » (4 séries, 20 animaux) - TP : pour l’ensemble des vaches de travaux pratiques (1 série, 10 animaux)

De plus, afin de correspondre aux prélèvements réalisés lors d’une visite de suspicion de dictyocaulose, les prélèvements précliniques ont été étudiés séparément du reste des individus exposés dans la partie 0.VI.

A l’échelle individuelle, on a d’une part les animaux exposés (issus des visites « cliniques » et « de confirmation ») et d’autre part, les individus non exposés (vaches de travaux pratiques et vaches traitées). De plus, ces animaux ont été regroupés en 4 catégories en fonction de leur statut :

- Positif : animaux chez qui le parasite a été mis en évidence (par coproscopie ou LBA) - Inconnu : animaux a priori exposés au parasite, mais chez qui le parasite n’a pas été mis en évidence - Traité : animaux traités - TP : vaches de travaux pratiques de VetAgro Sup

I. Mise en évidence du parasite

a. Echelle individuelle

Aucun parasite n’a été mis en évidence parmi les vaches de TP ou les individus traités (ni par LBA ni par coproscopie)

Le Tableau XIII présente les résultats de mise en évidence individuelle des parasites chez les individus exposés par lavage broncho-alvéolaire (observation des adultes à l’œil nu) ou par coproscopie de Baermann (observation des L1 au microscope).

Tableau XIII : Table de concordance du diagnostic par coproscopie de Baermann et par lavage broncho- alvéolaire.

Coproscopie individuelle + Coproscopie individuelle - Totaux LBA+ 1 8 9 LBA - 2 55 57 Totaux 3 63 66

Au total, 3 coproscopies individuelles ont été positives soit 4,5% des individus exposés. Les adultes ont été mis en évidence par lavage broncho-alvéolaire chez 10 individus soit 13,6% des animaux exposés.

77 b. Echelle du troupeau

Les résultats à l’échelle de chaque élevage (toutes séries de prélèvement confondues) sont donnés dans les Tableau XIV et Tableau XV.

Tableau XIV : Mise en évidence de D. viviparus par LBA, coproscopie de Baermann individuelle et de mélange au cours de l’étude.

Au moins un Au moins une coproscopie Une coproscopie de mélange Elevage LBA positif individuelle positive positive F, G, J + + + A + + - C, I, L + - - B, D, H, K, TP - - -

Dans 4 élevages, aucun parasite n’a été mis en évidence, alors que dans l’élevage K, l’appel faisait suite à l’autopsie d’une vache décédée des suites d’une détresse respiratoire due à Dictyocaulus viviparus. Le lavage broncho-alvéolaire a permis la mise en évidence d’adultes dans 7 élevages soit 63% des élevages. Les coproscopies ont permis la mise en évidence de larves dans 4 élevages soit 36% des élevages de l’étude. Le tableau suivant présente les résultats des coproscopies pour l’ensemble des 13 séries de prélèvements réalisées dans les 11 élevages au cours de l’étude.

Tableau XV : Table de concordance du diagnostic de troupeau par coproscopie individuelle et par coproscopie de mélange.

Au moins une coproscopie Aucune coproscopie individuelle Totaux individuelle positive positive Coproscopie de 3 0 3 mélange + Coproscopie de 1 9 10 mélange - Totaux 4 9 13

Dans 75% des cas, si la coproscopie d’un individu de la série est positive, alors la coproscopie de mélange est, elle aussi, positive.

II. Analyse multivariée

L’analyse multivariée est ici utilisée comme une étape exploratoire afin d’évaluer les relations entre les différentes variables et de déterminer lesquelles permettent de différencier les individus positifs des autres. a. Description de l’échantillon étudié

L’analyse est réalisée sur les données des catégories cliniques et TP (on ne dispose pas des analyses sérologiques sur les animaux traités).

La variable sérologie est transformée en logarithme décimale et les variables de taux de leucocytes pulmonaires, étant des proportions, ont été transformées en log ratio (logit). Le détail de ces transformations est expliqué dans la partie descriptive (cf. C.III.) afin d’en faciliter la 78 compréhension en visualisant la distribution des variable. Les 11 variables analysées sont donc les suivantes : - Sérologie, notée « séro » et exprimé en log(ODR) - Taux d’éosinophiles pulmonaires, noté « EP » et exprimé en logit - Taux de neutrophiles pulmonaires, noté « NP » et exprimé en logit - Taux de macrophages pulmonaires, noté « MP » et exprimé en logit - Taux de lymphocytes pulmonaires « LP » et exprimé en logit - Taux de protéines plasmatique, noté « pt » et est exprimé en g/L - Nombres de leucocytes sanguin, noté « GB » et exprimé en 103/mm3 - Nombres de éosinophiles sanguin, noté « E_nf » et exprimé en 103/mm3 - Nombres de neutrophiles sanguin, noté « N_nf » et exprimé en 103/mm3 - Nombres de monocytes sanguin, noté « M_nf » et exprimé en 103/mm3 - Nombres de lymphocytes sanguin, noté « L_nf » et exprimé en 103/mm3

b. Résultats de l’analyse de composante principale

L’analyse de composante principale (ACP, ici normée et centrée) permet de ré-exprimer les 11 variables et les observations de l’étude dans un nouveau système de coordonnées à 10 dimensions. Les 10 dimensions sont construites successivement par logiciel de façon à expliquer un maximum de la variabilité du nuage de points résiduel après sa projection dans l’espace par rapport à la dimension précédente. Ainsi, on peut étudier les relations entre les variables en fonction des différentes dimensions selon leur contribution respective à chaque dimension et leur coefficient de corrélation à chaque dimension.

i. Analyse d’inertie Etant donné la rupture de pente et la marche entre le pourcentage d’inertie de la 3e et la 4e dimension (flèche rouge) (Figure 28), seulement trois dimensions de variations ont été retenues et elles représentent respectivement 23,3 ; 19,5 et 15,1% de la variabilité totale du nuage de points (soit un total de 57,9% de la variation du nuage de points).

Figure 28 : Pourcentage d’inertie associé à chaque dimension, la flèche rouge met en évidence la marche entre les dimensions 3 et 4. 79 ii. Qualité de représentation des variables Avant de s’intéresser aux résultats de l’ACP, il est important de juger la qualité de représentation des variables. En effet, il est inutile de réaliser des interprétations sur les variables qui contribuent peu à un plan factoriel, car la variabilité du nuage de points projetés dans ce plan factoriel est peu liée à ces variables. Ainsi, dans la Figure 29, en fonction de la couleur de chaque variable, on peut observer leur contribution au plan factoriel.

Figure 29 : Cercles de corrélations de l’ACP, à gauche en fonction des dimensions 1 et 2 et à droite en fonction des dimensions 1 et 3, en abscisse et en ordonnée, respectivement. Le gradient de couleur représente les contributions de chacune des variables aux dimensions de l’ACP (du blanc, au bleu puis au rouge respectivement pour les valeurs basses, moyennes et hautes de contribution).

Seules les variables dont la somme des cos² en fonction des deux dimensions est supérieure à 0,5 sont considérées ici comme pertinentes. Ainsi, pour le plan factoriel de dimensions 1 et 2 (à gauche), on ne retient que les nombres de leucocytes ( cos2 = 0,88) et de neutrophiles ( =0,67) sanguins et les taux de macrophages ( = 0,88) et de neutrophiles ( = 0,7) pulmonaires. Pour le plan factoriel de dimensions 1 et 3 (à droite), on ne retient que les nombres de lymphocytes sanguins ( = 0,61), la sérologie ( =0,51) et les taux de macrophages ( = 0,6) et d’éosinophiles ( = 0,69) pulmonaires.

Ainsi, selon le plan factoriel de dimensions 1 et 2, on observe d’une part que le nombre de leucocytes sanguins totaux est associé au nombre de neutrophiles sanguins (les individus en leucocytose sanguine seront aussi en neutrophilie). Et d’autre part, le taux de macrophages est opposé au taux de neutrophiles pulmonaires, donc les individus à haut taux de macrophages auront un taux de neutrophiles bas. De plus, ces deux groupes de variables étant projetés de façon perpendiculaire dans le plan factoriel, il n’y a pas de relation entre ces deux groupes de variables.

Selon le plan factoriel de dimensions 1 et 3, on observe d’une part que la sérologie est associée au taux d’éosinophiles pulmonaires et que ces deux variables sont plutôt opposées au taux de macrophages pulmonaires (les individus à hautes valeurs de sérologies ont des hautes valeurs d’éosinophilie pulmonaire et plutôt des valeurs basses de taux de macrophages). Et d’autre part, le nombre de lymphocytes sanguins est projeté de façon perpendiculaire aux variables sérologie et éosinophilie pulmonaire, il n’y a donc pas de relation entre ces deux groupes de variables. 80 Dans le plan factoriel de dimensions 2 et 3, peu de variables sont correctement représentées et son interprétation n’apporte pas plus d’informations.

iii. Relation entre les variables et le statut Dans la Figure 30, on remarque que les individus positifs sont excentrés par rapport aux origines respectives des deux plans factoriels. Dans le plan factoriel de dimensions 1 et 2, ils sont dans le cadrant supérieur gauche où se trouve la projection du taux de neutrophiles pulmonaires et donc dans le cadrant opposé à celui où se trouve la projection du taux de macrophages. De même, dans le plan factoriel de dimensions 1 et 3, les individus positifs sont dans le cadrant où se trouvent les projections du taux d’éosinophiles pulmonaires et de la sérologie et dans la moitié de plan opposé à celle où se trouve la projection du taux de macrophage.

Au contraire, le barycentre de l’ellipse représentant les individus de statuts inconnus est très proche de l’origine des deux plans factoriels.

Le groupe des vaches de TP est assez mal individualisé dans le premier plan factoriel, et leur barycentre se trouve dans la moitié supérieure du plan, avec le barycentre des individus positifs et la projection du taux de neutrophiles pulmonaires. Par contre, ce groupe est beaucoup mieux individualisé dans le deuxième plan factoriel où son barycentre est dans le cadrant opposé à celui où se trouvent les individus positifs et la projection de l’éosinophilie pulmonaire et de la sérologie.

Figure 30 : Nuage de points de l’ACP avec les sous-classes d’individus en fonction du statut, à gauche en fonction des dimensions 1 et 2 et à droite en fonction des dimensions 1 et 3, en abscisse et en ordonnée, respectivement ; les couleurs représentent le statut de chaque individu et chaque ellipse représente la zone dans laquelle se trouve 67% des points de statut correspondant, le barycentre de chacune des ellipses est représenté par une croix jaune.

81 Ainsi, on peut dire que les individus positifs ont globalement des valeurs hautes de sérologies, de taux d’éosinophiles et de neutrophiles pulmonaires et des valeurs basses de taux de macrophages. Néanmoins, les vaches de TP, qui sont considérées comme non exposées, n’ont pas forcément des taux de neutrophiles bas et des taux de macrophages hauts alors qu’elles ont généralement une éosinophilie pulmonaire et une sérologie basse. Le taux d’éosinophiles pulmonaires et la sérologie sont donc les deux variables qui semblent les plus pertinentes pour distinguer les individus positifs des autres.

Dans leur plan factoriel d’interprétation respectifs, les variables du nombre de leucocytes, de neutrophiles et de lymphocytes sanguins semblent plus liées à des variations intra-groupe, et particulièrement au sein des vaches de TP dont l’ellipse est étirée en fonction de ces variables. Ces variables semblent donc peu pertinentes dans le but de diagnostiquer la dictyocaulose.

III. Analyse descriptive

a. Eosinophilie pulmonaire

i. Echelle individuelle Les Figure 31 et Figure 32 donnent la distribution du taux d’éosinophiles pulmonaires en fonction du 푝 statut. Le premier graphique est en pourcentage alors que le second est en logit (log ( ) où p est le 1−푝 taux d’éosinophiles). Les données d’éosinophilies pulmonaires sont des données de comptage sur 400 leucocytes. Il s’agit donc d’un échantillonnage de 400 leucocytes qui fournit une estimation du pourcentage réel d’éosinophiles pulmonaires. Il y a donc un seuil de détection (1/400) et cette estimation peut égaler 0 (aucun éosinophile détecté). Or, le logit de 0 est égale à moins l’infini, pour pouvoir représenter et traiter les données, le logit du taux d’éosinophiles nul est fixé à -7 (le logit du seuil de détection (1/400) vaut -5,98). Ici, cette transformation permet de mieux visualiser la distribution des taux d’éosinophiles (notamment entre 0 et 3%).

Figure 31 : Distribution du taux d’éosinophiles (en %) en fonction du statut. La ligne pleine correspond au seuil de détection, la ligne en pointillé aux valeurs censurées, les points sont arbitrairement dispersés horizontalement pour mieux les visualiser.

82 Sur la Figure 32, on remarque bien une surreprésentation des observations aux valeurs du seuil de détection et en dessous. Ainsi, même si la distribution semble plus normale dans son ensemble, elle reste biaisée par les données censurées. Les distributions de l’éosinophilie pulmonaire des vaches positives sont très différentes de celle des vaches traitées ou de TP avec la médiane significativement supérieure (les p-value du test non paramétrique de comparaison des médianes de Mann-Whitney- Wilcoxon sont respectivement 3,941e-06 et 7,591e-05). On retrouve tout de même un à deux individus dont les taux d’éosinophiles sont proches de ceux des vaches traitées. Pour les individus dont le statut est inconnu, on retrouve une distribution beaucoup plus large avec à la fois des individus à taux d’éosinophiles faibles et des individus à taux d’éosinophiles élevés.

Figure 32 : Distribution du taux d’éosinophiles (en logit) en fonction du statut. La ligne pleine correspond au seuil de détection, la ligne en pointillé aux valeurs censurées, les points sont arbitrairement dispersés horizontalement pour mieux les visualiser.

ii. Echelle troupeau La Figure 33 (ci-contre) représente la distribution du taux d’éosinophiles pulmonaires dans chaque élevage en fonction du statut clinique des animaux prélevés.

Figure 33 : Distribution du taux d’éosinophiles pulmonaires (en Logit) dans chaque élevage. Les couleurs correspondent aux 3 catégories de séries de prélèvements définies au début de la partie résultats (0), la ligne pleine correspond au seuil de détection, la ligne en pointillé aux valeurs censurées.

L’élevage H est le seul élevage (avec les vaches de TP) où aucune vache n’a eu un taux d’éosinophiles supérieur à 2,5%. Dans tous les autres élevages, sur les prélèvements réalisés pendant la phase clinique, des individus avec des taux d’éosinophiles élevés (>10%) ont été détectés. Les taux d’éosinophiles des vaches traitées sont très faibles dans les 4 élevages où les prélèvements ont été réalisés.

b. Sérologie

i. Echelle individuelle Les résultats des sérologies en fonction du statut sont présentés dans la Figure 34. Une transformation en logarithme décimal permet de répartir correctement les observations et d’obtenir une distribution plus proche d’une loi normale. Les statuts sont définis de la même façon que pour la partie cytologie, mais les analyses n’ont pas été réalisées que sur les individus traités.

Figure 34 : Distribution des résultats de la sérologie en fonction du statut en ratio de densité optique à gauche et transformé en Log à droite. La ligne en pointillé représente le seuil proposé par Van Holtum et al.

84 On observe ici aussi une différence significative (7,2x104 test MWW) entre la distribution des vaches positives et de celles de TP. Comme pour le taux d’éosinophiles pulmonaires, chez les animaux de statut inconnu, on retrouve à la fois des individus à valeur haute et basse de sérologie.

Enfin, trois des neuf individus positifs en parasitologie sont négatifs en sérologie selon le seuil de Von Holtum et al. [78].

ii. Echelle troupeau

En observant les distributions à l’échelle de chaque élevage (Figure 35), on remarque qu’elles sont très variables en fonction des élevages. Dans certains élevages (F, G, I et J), les individus ont généralement des valeurs d’ODR hautes, d’autres (A, B, H et L) ont des valeurs d’ODR majoritairement basses (plus basses que celle des vaches de TP) et enfin, les élevages C, D et K sont dans une situation intermédiaire. Aucune des vaches de TP n’est positive selon le seuil proposé par Van Holtum et al. [78]. On retrouve des vaches positives dans les presque tous les élevages de l’étude sauf dans les élevages B et L qui avaient des individus avec des taux d’éosinophiles élevés. Il y a une vache positive dans l’élevage H alors qu’aucune n’avait de taux d’éosinophiles élevés.

Figure 35 : Distribution du logarithme décimal des ratios de densité optique dans chaque élevage, la ligne en pointillé représente le seuil proposé par Van Holtum et al.

85 IV. Analyse bayésienne

a. Descriptions des données

Dans l’analyse bayésienne, seules les données récupérées lors de la visite « clinique » ont été considérées afin de correspondre au mieux à la situation dans laquelle ces prélèvements pourraient être réalisés sur le terrain, c’est-à-dire lors d’une suspicion clinique de dictyocaulose. Seules les données parasitologiques (coproscopies individuelles et mise en évidence de dictyocaules dans le LBA), d’éosinophilie pulmonaire et de sérologie sont considérées dans l’étude.

b. Modèle statistique

Un modèle global a été construit afin de décrire l’ensemble des données disponibles pour chaque animal des douze troupeaux, il est schématisé par un DAG (directed acyclic graph) dans la Figure 36. ème ème Le statut infectieux inconnu du j animal prélevé dans le i troupeau, noté Sij , est égale à 1 pour les infestés et 0 pour les non infestés. On suppose que suit une loi de Bernoulli de paramètre Pi , où est la prévalence de la dictyocaulose dans le troupeau . La spécificité des deux tests parasitologiques (la coproscopie de Baermann et la mise en évidence des dictyocaules dans le BS BAL liquide de LBA) est supposée égale à 1 et leur sensibilité respective est notée Se et Se . Les résultats de ces tests notés BSij et BALij (1 si le test est positif et 0 sinon) peuvent être exprimés simplement en fonction du statut infectieux et de la sensibilité du test :

BS BAL BSij BernSe ij S ij  et BALij BernSe ij S ij 

Pour le résultat de l’analyse sérologique, exprimé en ratio de densité optique (ODR) et noté ODRij , conditionné par le statut infectieux , le modèle suppose que le logarithme décimal de l’ODR suit une loi normale où la moyenne ij et l’écart type  ij ne sont dépendants que du statut infectieux :

logODRij N  ij , ij 

La moyenne de la loi normale des animaux infestés est supposée supérieure à celle des animaux non infestés ( noninf ), et paramétrée par  , la différence positive entre ces deux moyennes

( inf non inf  ). Ce paramétrage est choisi pour éviter le doute classique de tout mélange de distribution (le groupe 1 est-il le groupe atteint ou non atteint ?). Les écarts types des groupes infestés ( inf ) et non infestés ( non inf ) ne sont pas supposés égaux.

Le résultat des comptages d’éosinophiles pulmonaires est modélisé de la même façon par un mélange de deux distributions gaussiennes représentées par les animaux infestés et non infestés, caractérisées comme précédemment par les paramètres  'noninf ,  ' ,  'inf et  'non inf . Ce mélange gaussien de distribution est utilisé pour décrire la distribution du logit de la proportion d’éosinophiles pulmonaires notée ( EPij ). Cette variable n’est pas directement mesurée sur chaque animal, mais elle est estimée à partir du comptage des éosinophiles ( ECij ) et du nombre total de leucocytes pulmonaires TCij (le comptage total de leucocyte est indexé par i et j et il est considéré comme une covariable dans le modèle, car il n’est pas exactement égal à 400 pour chaque animal). Le comptage d’éosinophiles de chaque animal est donc modélisé par une loi binomiale de 86 paramètres nombre de tirage TCij et probabilité de succès EPij dont le logit est défini par le mélange de distributions gaussien :

ECij Binom TC ij, EP ij  avec logitEPij N  ' ij , ' ij 

Figure 36 : DAG du modèle, N est le numéro de l’élevage (1 à 12), ni est le numéro de l’individu prélevé dans l’élevage i (1 à 6).

BS BS Sij BernP i  ; BSij BernSe ij S ij  et BALij BernSe ij S ij  ;

Si Sij  0 , ij  non  inf et''ij  non  inf

Sinon, ij  inf et''ij  inf , ij  non inf    S ij et '''ij  non inf    S ij ;

logODRij N  ij , ij  ; logitEPij N  ' ij , ' ij  et .

87 On donne une information a priori vaguement informative permettant une variation dans un BS BAL intervalle cohérent en forçant les paramètres de probabilité ( Se , Se et Pi ) à être compris entre 0 et 1 et,  et  ' à être positifs (

Tableau XVI). La technique des chaines de Monte Carlo Markov (MCMC) est utilisée pour estimer la distribution jointe a posteriori des paramètres à partir des distributions a priori et des données.

Les calculs ont été réalisés en utilisant l’interface JAGS sur R grâce au package rjags [141]. Trois chaines MCMC indépendantes ont été conduites en parallèle. Pour chaque chaine, 110 000 tirages ont été produits. Les 10 000 premiers ont été éliminés pour atteindre la convergence et, pour éviter l’autocorrélation, les 100 000 tirages restants ont été affinés en ne conservant qu’un tirage sur vingt. On a donc conservé 5 000 tirages par chaine. La convergence a été vérifiée en examinant la trace des chaines MCMC et l’autocorrélation en calculant la statistique de Gelman et Rubin modifiée par Brooks et Gelman (1998) [22]. L’estimation ponctuelle de chaque paramètre a été définie comme la médiane de sa distribution marginale a posteriori associée à un intervalle de crédibilité à 95% définie comme les 2,5 et 97,5 percentiles de cette distribution.

Pour les deux mélanges de distribution, des courbes ROC ainsi que leurs bandes de crédibilité à 95% ont été construites à partir des distributions jointes a posteriori pour chacun des 15 000 MCMC tirages obtenus en rassemblant les 5 000 tirages de chaque chaine. Pour chacune des 15 000 courbes ROC obtenues, un seuil de positivité optimal a été estimé en minimisant la distance jusqu’au point de sensibilité et de spécificité égale à 1 [133]. Le seuil de positivité optimal a été estimé comme étant la médiane des 15 000 seuils de positivité obtenus. La sensibilité et la spécificité de chacun des tests à son seuil de positivité ont été obtenues en utilisant la distribution jointe a posteriori. La probabilité d’être infesté pour chaque animal a, elle aussi, été calculée en utilisant les 15 000 tirages de la variable latente Sij du modèle.

c. Résultats

i. Estimation des paramètres du modèle Le Tableau XVI présente les distributions a priori et a posteriori pour chacun des paramètres du modèle. Etant donné que les distributions a posteriori sont peu informatives, les distributions a posteriori ont été fortement influencées par les données observées. Pour chaque paramètre, on donne la médiane de sa distribution a posteriori et son intervalle de crédibilité (IC) à 95% associé.

La sensibilité de la coproscopie de Baermann est estimée à 8,7 % (IC à 95 % [2 ; 22,2]) et la sensibilité de détection des adultes dans le LBA à 28,1 % (IC à 95 % [13,7 ; 47,1]).

Les prévalences de chaque troupeau varient de 10,2 % (IC à 95 % [0,4 ; 44,1]) dans l’élevage H à 90,3 % (IC à 95 % [57,1 ; 99,6]) 0.903 [0.571; 0.996] dans l’élevage I. La prévalence parmi les vaches de TP est estimée à 6,1 % (IC à 95 % [0,2 ; 28,4]).

La moyenne des ODR en sérologie est estimée à 0,255 (IC à 95 % [0,224 ; 292]) chez les individus sains et à 0.589 (IC à 95 % [0,519 ; 0,675]) chez les individus atteints. La moyenne des taux d’éosinophiles des vaches saines est de 1,05 % (IC à 95 % [0,996 ; 2,15]) et celle des individus atteints est de 16,8 %(IC à 95 % [7,18 ; 29,5]).

88 Tableau XVI : Paramètres du modèle avec la correspondance entre la distribution a priori et la distribution estimée a posteriori.

Paramètre Distribution a Estimation a posteriori priori Médiane [intervalle de crédibilité à 95%] BS Sensibilité des tests Se Unif(0, 1) 0.087 [0.020; 0.222] BAL Se Unif(0, 1) 0.281 [0.137; 0.471] Prévalences troupeaux Unif(0, 1) 0.279 [0.020; 0.747] P1 Unif(0, 1) 0.157 [0.006; 0.684] P2 Unif(0, 1) 0.636 [0.199; 0.977] P3 Unif(0, 1) 0.522 [0.093; 0.961] P4 Unif(0, 1) 0.889 [0.534; 0.996] P5 Unif(0, 1) 0.729 [0.335; 0.955] P6 Unif(0, 1) 0.102 [0.004; 0.441] P7 Unif(0, 1) 0.903 [0.571; 0.996] P8 Unif(0, 1) 0.606 [0.178; 0.927] P9 Unif(0, 1) 0.364 [0.079; 0.732] P10 Unif(0, 1) 0.250 [0.041; 0.642] P11 Unif(0, 1) 0.061 [0.002; 0.284] P12 Paramètres du mélange Unif(-10, 10) -0.594 [-0.649; -0.535] noninf des ODR  Unif(0, 10) 0.364 [0.231; 0.452] Unif(0, 5) 0.161 [0.126; 0.212]  non inf Unif(0, 5) 0.168 [0.118; 0.268]  inf Paramètres du mélange Unif(-10, 10) -4.55 [-5.51; -3.82]  'noninf des taux d’éosinophilies  ' Unif(0, 10) 2.95 [2.10; 3.89] Unif(0, 5) 1.97 [1.31; 2.70]  'non inf Unif(0, 5) 1.11 [0.84; 1.54]  'inf

89 ii. Estimation des seuils de positivités Les deux courbes ROC (Figure 37 et Figure 38) présentent la sensibilité et la spécificité de chacune des deux méthodes de diagnostic quantitatives en fonction des différents seuils. Le seuil optimal a été choisi comme le point de la courbe le plus près du point de sensibilité et spécificité égale à 1. Le seuil optimal pour la sérologie est de 0,398 avec une sensibilité de 0,868 (IC à 95 % [0,605 ; 0,973]) et une spécificité de 0,867 (IC à 95 % [0,738 ; 0,945]). Le seuil optimal pour le taux d’éosinophiles pulmonaires est de 5,48% avec une sensibilité de 0,865 (IC à 95 % [0,722 ; 0,954]) et une spécificité de 0,804 (IC à 95 % [0,675 ; 0,964]).

Figure 37 : Courbe ROC pour la sérologie. Les lignes en pointillé représentent l’intervalle de crédibilité à 95 % autour de la courbe ROC et le point sur la courbe ROC correspond au seuil de positivité estimé à 0,398 pour le ratio de densité optique (-0,40 en logarithme décimal).

Figure 38 : Courbe ROC de l’éosinophilie pulmonaire. Les lignes en pointillé représentent l’intervalle de crédibilité à 95 % autour de la courbe ROC et le point sur la courbe ROC correspond au seuil de positivité estimé à 0,585 % pour le taux d’éosinophiles pulmonaires (- 2,85 en échelle logit).

90 iii. Représentation globale des données La Figure 39 représente les données observées de sérologie et d’éosinophilie pulmonaire, représentées avec un gradient de coloration fonction de la probabilité pour une vache d’être infestée du bleu pour une probabilité de 0 au rouge pour une probabilité de 1 pour chaque animal. Les fonctions de densité des deux composantes de chaque mélange de distribution sont aussi représentées de façon ponctuelle sans l’incertitude autour de ces fonctions de densité.

On observe un taux de concordance de 70% entre les deux méthodes. La majorité des discordances observées entre les deux méthodes est constituée d’individus à cytologie positive mais sérologie négative (57% des discordances). Parmi ces discordances, 83% des individus sont plus souvent considérés comme sain par le modèle (individu de bleu à violet en bas à droite de la figure). De plus, la fonction de densité de l’éosinophilie pulmonaire des individus considérés comme sains par le modèle est très étalée et on a 15,73% des individus « sains » qui ont une éosinophilie pulmonaire supérieure ou égale à 7% (correspondant à seuil de  'noninf + 'non inf ).

Figure 39 : Nuage de points des données observées pour la sérologie et l’éosinophilie pulmonaire. La couleur des points est fixée selon leur probabilité a posteriori d’être infestée et calculée à partir du modèle (gradient de couleurs du bleu pour les non infestés au rouge pour les infestés). Les courbes rouges et bleues représentent l’estimation de la fonction de densité des deux composantes du mélange gaussien pour chaque test (les rouges pour les infestés et les bleues pour les non infestés). Les lignes pleines verticales et horizontales indiquent respectivement les seuils de positivité pour l’éosinophilie pulmonaire et la sérologie. La ligne en pointillé verticale représente le seuil de détection pour le taux d’éosinophiles pulmonaires (une éosinophile sur 400 cellules comptées au total).

V. Application de l’éosinophilie pulmonaire sur le terrain

a. Seuil réel

Etant donné que le taux d’éosinophiles pulmonaires est estimé à partir d’un comptage cellulaire (sur un nombre total limité de cellules), le seuil optimal de 5,48 % ne correspond pas à la réalité du terrain. Si les comptages sont réalisés sur 400 cellules, le seuil le plus proche que l’on peut réellement compter est 5,5 %, soit 22 éosinophiles sur 400 cellules comptées. Si seulement 100 cellules sont comptées, ce qui est assez souvent réalisé sur le terrain, le seuil devient alors 5%. Les valeurs des sensibilité et spécificité à ces seuils sont données dans le Tableau XVII. Pour le comptage réalisé sur 100 cellules, cette estimation ne tient pas compte des erreurs d’échantillonnage dues au plus petit nombre de cellules comptées, ce qui risque d’influencer fortement ces valeurs.

Tableau XVII : Estimation des sensibilités et des spécificités de l’éosinophilie pulmonaire à partir des données de distribution a posteriori pour des seuils réellement observables sur le terrain.

Seuil Sensibilité [IC à 95%] Spécificité [IC à 95%] 5,48% (21,92/400 cellules) 0,866 [0,727 ; 0,953] 0,804 [0,677 ; 0,965] 5,5% (22/400) 0,865 [0,726 ; 0,953] 0,804 [0,677 ; 0,965] 5% (5/100) 0,884 [0,750 ; 0,963] 0,790 [0,661 ; 0,959]

b. Mode de lecture des cytologies

Toute l’analyse statistique a été réalisée à partir des valeurs d’éosinophilie pulmonaire estimées après cytocentrifugation. Cette méthode est plus reproductible et plus fiable que la lecture sur frottis après étalement du culot de centrifugation, mais la plupart des vétérinaires ne possèdent pas l’appareil nécessaire à sa réalisation au cabinet. L’examen du frottis du culot de centrifugation est une méthode facile à réaliser et peu coûteuse. Elle permettrait au vétérinaire praticien d’estimer l’éosinophilie pulmonaire directement au cabinet. Pour des raisons pratiques, les comptages sur frottis sont réalisés sur 100 cellules contre 400 cellules lors de cytocentrifugation.

La Figure 40 représente le nuage de points (82 observations) de l’éosinophilie pulmonaire estimée par les deux méthodes citées. Les individus en rouge sont les individus où des adultes ont été mis en évidence dans le LBA et les points triangulaires, ceux dont la coproscopie de Baermann était positive. On remarque que tous les individus chez qui des parasites ont été mis en évidence sont correctement classés par la cytocentrifugation contrairement au frottis où un individu LBA positif à un taux d’éosinophiles inférieur au seuil par frottis. On retrouve beaucoup plus de données censurées avec la lecture par frottis (à cause du plus faible échantillonnage) qu’avec la cytocentrifugation, mais seulement 2 des 38 données censurées par le frottis (5,3 %) ont une valeur d’éosinophilie estimée par cytocentrifugation supérieure à 5,5 %. Au total, d’après le Tableau XVIII, on a 87,8 % d’observations concordantes entre les deux méthodes et 12,2 % non concordantes. Parmi les observations non concordantes, 70 % sont positives par cytocentrifugation, mais négatives par frottis.

Tableau XVIII : Table de concordance de l’estimation du taux d’éosinophile après cytocentrifugation et frottis.

Cytocentrifugation négative Cytocentrifugation positive Frottis négatif 47 (57,3%) 7 (8,5%) Frottis positif 3 (3,7%) 25 (30,5%) 92

Figure 40 : Nuage de point du taux d’éosinophiles pulmonaires(en logit) en fonction des deux méthodes d’analyse : la cytocentrifugation avec comptage sur 400 cellules en abscisse, et le frottis sur 100 cellules en ordonnée. Les points triangulaires sont les individus copropositifs et les points rouges ceux pour lesquels des adultes ont été mis en évidence dans le LBA, les lignes pleines représentent les seuils de positivité des deux méthodes (5,5 % pour la cytocentrifugation et 5 % pour le frottis) et les lignes en pointillé représentent les seuils de détection de chacune des deux méthodes (respectivement 1/400 et 1/100), les points superposés sont représentés par des étoiles rouges avec la fonction « sunflower » de R.

VI. Prélèvement préclinique

Le Tableau XIX présente les résultats obtenus dans l’élevage J avant l’apparition des premiers signes cliniques. La visite avait été réalisée dans cet élevage, car il y avait des antécédents récurrents de dictyocaulose et que le troupeau n’avait pas encore été traité cette année. Des parasites ont été mis en évidence à la fois à la coproscopie et lors de la réalisation du LBA.

Tableau XIX : Résultats des prélèvements réalisés dans l’élevage J avant l’apparition des premiers signes cliniques.

N° Sérologie Taux d’éosinophiles Coproscopie Coproscopie LBA d’identification pulmonaires (%) individuelle de mélange Nombreux 0,59 16 ,75 9300J 4 larves adultes (+30) 3329J 0 0,453 47,9 0 6600J 0 0,353 7 0 1 larve 6388J 0 0,22 3,25 0 9939J 0 0,763 0,75 0 3333J 0 0,163 <0,25 0 93 De plus, quatre vaches étaient positives en sérologie ou en cytologie (2 positives avec les deux méthodes et deux à une des deux) (Figure 41).Ainsi, le diagnostic précoce est réalisable avec les quatre méthodes dans cet élevage. Néanmoins, les méthodes parasitologiques n’ont permis le diagnostic chez une seule des 6 vaches alors que la sérologie ou l’éosinophilie pulmonaire ont permis un diagnostic chez 3 des 6 vaches.

Lors de la visite réalisée un mois plus tard, les vaches présentaient des signes cliniques de bronchite vermineuse, et une nouvelle série de prélèvements a été réalisée. Des adultes ont de nouveau été mis en évidence chez la vache 9300J, mais sa coproscopie était négative. Deux animaux sont alors positifs pour l’éosinophilie pulmonaire et 4 pour la sérologie (Figure 41).

Immédiatement après cette visite, l’ensemble du troupeau a été traité avec de l’éprinomectine et une nouvelle visite a été réalisée 1 mois après. La Figure 41 présente l’évolution de l’éosinophilie pulmonaire au cours des trois visites et de la sérologie au cours des deux premières visites. Lors de la première visite, 3 vaches étaient positives par cytologie et par sérologie. Et lors de la seconde visite, 3 vaches étaient positives par cytologie et 4 par sérologie. Pour chacun de ces deux paramètres, deux individus sont en augmentation et deux en diminution d’une visite à l’autre.

Enfin, lors de la troisième visite, un mois après l’administration du traitement, aucun parasite n’a été mis en évidence (ni par coproscopie, ni par LBA) et l’ensemble des taux d’éosinophiles pulmonaires était inférieur à 0,3%.

Figure 41 : Evolution de l’éosinophilie pulmonaire(en %) et de la sérologie (en ODR) des vaches de l’élevage J au cours de différentes visites réalisées à un mois d’intervalle, les lignes noires représentent les seuils respectifs de chacune des deux méthodes estimés dans la partie 0.a., chaque individu est représenté par une couleur et les triangles représentent les animaux chez qui le parasite a été mis en évidence par LBA.

94 D. DISCUSSION

Cette étude comporte deux parties, la première est une analyse exploratoire et descriptive des différentes variables étudiées dans un contexte de suspicion de dictyocaulose, et la seconde consiste à caractériser les différentes méthodes diagnostiques envisagées en l’absence de Gold Standard à la fois en utilisant un modèle à variables latentes et en ajustant des mélanges de distributions grâce à l’approche bayésienne. Dans la première partie, l’analyse de composantes principales nous a autorisés à centrer l’étude descriptive sur la sérologie et l’éosinophilie pulmonaire. L’analyse descriptive a, quant à elle, permis de mieux comprendre la distribution de ces deux variables en fonction des différents statuts individuels et des différents troupeaux de l’étude. Dans la seconde partie, nous avons estimé la prévalence de la maladie dans les différents élevages, et la sensibilité et spécificité de chacune des méthodes diagnostiques de la dictyocaulose.

Le premier résultat intéressant est le faible nombre de coproscopies de Baermann positives lors de l’étude. Seulement 4,5 % des individus issus de troupeaux présentant des signes cliniques de dictyocaulose sont positifs en coproscopie et les niveaux d’excrétion sont faibles (inférieur à 1 larve pour 10 g de fèces). Dans l’étude Ploeger et al. en 2012 [140], ce taux était bien supérieur avec 20,1 % des individus issus de troupeaux présentant des signes cliniques de dictyocaulose qui sont positifs en coproscopie. On peut expliquer cette différence par le choix de la méthode de coproscopie et par les conditions climatiques particulières. En effet, la coproscopie de Baermann que nous avons choisie est moins sensible que celle de McKenna (sur des échantillons de fèces contenant des larves, elles ont respectivement une sensibilité de 83% et 100%) [112]. Par ailleurs, l’année 2015 a connu un printemps et un été très secs qui a pu ralentir le développement des larves dans l’environnement et limiter les infestations chez les bovins adultes. De ce fait, les animaux ont pu développer une immunité de meilleure qualité avant que la pression d’infestation ne devienne trop importante et limiter l’excrétion larvaire. Dans l’analyse bayésienne, la sensibilité de la coproscopie est estimée à 8,7 % (IC à 95% [2 ; 22,2]). Il est possible que dans des conditions climatiques plus favorables au développement des dictyocaules la sensibilité de la coproscopie de Baermann soit meilleure que celle estimée par le modèle. De même, en utilisant la méthode de McKenna [112], la sensibilité de détection des larves dans les fèces aurait probablement été meilleure. La mise en évidence d’adultes dans le LBA semble être plus sensible que la coproscopie de Baermann, car elle a permis de diagnostiquer la maladie chez 13,9% des individus issus d’élevage présentant des signes cliniques de l’étude, néanmoins, elle n’est estimée qu’à 28,1% (IC à 95% [13,7 ; 47,1]), donc non significativement supérieure à la coproscopie.

L’éosinophilie pulmonaire et la sérologie sont les deux variables les plus pertinentes pour distinguer les individus positifs des autres (Figure 30). Elles sont augmentées chez les individus positifs (Figure 32 et Figure 34). Pour l’éosinophilie pulmonaire, les moyennes du mélange de distribution estimées a posteriori (1,05 % (IC à 95% [0,996 ; 2,15]) pour les non infestés et 16,8 %(IC à 95% [7,18 ; 29,5]) pour les infestés (Tableau XV)), sont assez proches des données bibliographiques où le taux est inférieur à 1% chez les individus sains [39], [72], [167], [174] et autour de 20% chez les infestés [72], [77], [158]. Néanmoins, et bien qu’il y ait peu de données bibliographiques sur la distribution du taux d’éosinophiles des vaches saines, cette dernière semble trop large (Figure 39) avec 15,73% des individus sains qui ont une éosinophilie pulmonaire supérieure ou égale à 7% selon notre étude. De même, on remarque que la plupart des individus à éosinophilie pulmonaire élevée, mais à valeur de sérologie faible ont une probabilité d’être atteints basse à très basse (les points représentés en bleu en bas à droite de la Figure 39). Biologiquement parlant, c’est assez contradictoire, car aucune données bibliographiques ne permet à notre connaissance d’expliquer des taux d’éosinophiles si élevés en dehors de la dictyocaulose. Alors qu’étant donné que l’afflux d’éosinophiles pulmonaires 95 est plus précoce que l’augmentation du taux d’anticorps (à partir de 2 semaines après l’infestation pour l’éosinophilie pulmonaire et 6 pour la sérologie[72], [100], [158]), ces individus ont pu entrer en contact récemment (depuis 2 à 6 semaines) avec le parasite. Dans ce cas, ils peuvent présenter une éosinophilie pulmonaire en réaction à l’infestation sans que l’on puisse détecter encore la présence d’anticorps, et le modèle surestime donc la sensibilité de la sérologie. Par ailleurs, la persistance des anticorps après l’élimination du parasite entraine une baisse de la spécificité de la MSPr ELISA comme pour toute méthode sérologique. Le modèle appliqué en phase clinique sous-estimerait alors la Se et la Sp de l’éosinophilie pulmonaire du fait de ce décalage temporel et du poids accordé à la sérologie. Le modèle construit et présenté ici manque d’information a priori, et il serait intéressant de mieux connaitre la distribution du taux d’éosinophiles pulmonaires chez des bovins adultes sains, ou bien d’intégrer des témoins négatifs dans l’étude. Cela permettrait de mieux caractériser la distribution a posteriori de l’éosinophilie pulmonaire des vaches non-infestées. De plus, cette étude devrait aussi être reconduite avec des méthodes de diagnostic parasitologiques plus sensibles comme la coproscopie de McKenna sur le terrain ou en réalisant de perfusions bronchiques à l’abattoir [127]. La technique de la perfusion bronchique permet de récupérer un maximum de dictyocaules pulmonaires, mais elle doit être réalisée sur des poumons isolés. En incluant cette technique dans un protocole expérimental, elle pourrait être comparée à la sérologie et au LBA, ce qui permettrait d’évaluer ces deux techniques en ayant moins de faux négatifs en parasitologie.

Pour la sérologie, le seuil de positivité optimal (0,398) est différent de celui proposé par Van Holtum et al. [78] (0,5), mais la méthode de sélection du seuil (en minimisant la distance jusqu’au point de sensibilité et de spécificité égale à 1) a été choisie de façon à favoriser à la fois la sensibilité et la spécificité. Cela peut être discuté en fonction de l’intérêt du test pour le praticien (s’il est utilisé dans le but de diagnostiquer ou d’exclure la maladie). Par ailleurs, dans notre modèle, au seuil proposé par Von Holtum et al., la sensibilité est de 66,8 % (IC à 95 % [42 ; 84,8]) et la spécificité de 96,6 % (IC à 95 % [88,8 ; 99,3]), donc inférieures, notamment en terme de sensibilité, aux valeurs estimées à partir d’infestations contrôlées (Se et Sp > 99 % [78]). D’autre part, au seuil de 0,398 on obtient une Se de 86,8% (IC à 95 % [60,5 ; 97,3]) et une Sp de 86,7 % (IC à 95 % [73,8 ; 94,5]). Pour l’éosinophilie pulmonaire, on estime une Se 86,5 %(IC à 95 % [72,2 ; 95,4]) et une Sp à 80,4 % (IC à 95 % [67,5 ; 96,4]) au seuil de 5,48 %. Ces deux estimations sont assez proches l’une de l’autre, mais, comme dit précédemment, il est probable que le modèle surestime la Se et Sp de la sérologie et qu’il sous- estime la Se et la Sp de l’éosinophilie pulmonaire.

En clientèle, la plupart du temps, lors de suspicion de dictyocaulose, on cherche à réaliser un diagnostic de troupeau. Ainsi, à partir des sensibilités de chacun des tests, on peut calculer le nombre de prélèvements à réaliser pour avoir une probabilité d’au moins 95% de diagnostiquer la maladie : pour la coproscopie de Baermann il faut réaliser au moins 33 coproscopies individuelles (IC à 95 % [12 ; 149]); pour la mise en évidence d’adulte dans le LBA, il faut réaliser 9 prélèvements (IC à 95 % [5 ; 21]); pour la sérologie (au seuil de 0,398); il faut en réaliser 2 (IC à 95 % [1 ; 4]), mais la spécificité troupeau diminue à 75,1 % (IC à 95 % [36,6 ; 94,6]). De même, pour l’éosinophilie pulmonaire, il faut réaliser au moins 2 prélèvements (IC à 95 % [1 ; 3]), mais la spécificité troupeau diminue à 64,6 % (IC à 95 % [45,5 ; 92,9]). La sérologie et l’éosinophilie pulmonaire sont donc intéressantes pour diagnostiquer la maladie au sein d’un troupeau, car elles peuvent être réalisées sur seulement 2 animaux, néanmoins, dans ce cas leur spécificité diminue. Les méthodes parasitaires semblent être assez limitées, car les prélèvements doivent être réalisés sur un grand nombre d’animaux. En revanche, en réalisant des coproscopies de mélange, il est possible d’analyser un grand nombre d’individus sans perdre trop de sensibilité, il est donc possible de réaliser 3 coproscopies de mélange à partir de 10 individus chacune pour s’approcher des 33 coproscopies à réaliser. Enfin, pour la mise

96 en évidence du parasite, lorsque le prélèvement par LBA est fait pour la cytologie sur 2 individus, la probabilité de mettre en évidence le parasite en même temps est de 48% (IC de à 95% [25 ; 72]).

Dans nos troupeaux, la prévalence de la dictyocaulose estimée par le modèle varie de 10,2 % (IC à 95% [0,4 ; 44,1]) dans l’élevage H à 90,3 % (IC à 95% [57,1 ; 99,6]) dans l’élevage I, ce qui traduit une situation épidémiologique très variable d’un élevage à l’autre. Ces résultats doivent être interprétés avec précaution en raison de la sélection des individus au sein des élevages qui n’a pas été rigoureusement aléatoire et qui a pu influencer les prévalences. Néanmoins, au vu des différences observées, dans les élevages à très basse prévalence, le parasite est probablement assez peu responsable des signes cliniques observés sur l’ensemble des animaux alors que dans d’autres, il est probablement à l’origine de la majeure partie des signes cliniques observés (on rappelle que dans tous les élevages étudiés, les éleveurs rapportent une toux qui touche plus de 80% des animaux du troupeau). De plus, dans 5 des 11 élevages la prévalence estimée est inférieure à 50%. L’intérêt d’un traitement de l’ensemble des animaux de ces troupeaux peut donc aussi être remis en question. La grande variabilité des prévalences estimées par le modèle souligne l’épidémiologie variable en fonction des élevages de la maladie et l’intérêt de la mise en place de traitements sélectifs. Des études visant à étudier ces deux aspects peuvent être envisagées, en sélectionnant plus rigoureusement les individus au sein des élevages (en fonction de leur parité ou alors de façon réellement aléatoire) et en évaluant l’intérêt de protocoles de traitement sélectifs.

L’application sur le terrain de l’estimation du taux d’éosinophiles pulmonaires par lecture du frottis après étalement du culot de centrifugation du LBA peut être envisagée malgré une perte de sensibilité par rapport à la cytocentrifugation (Figure 40) (12,2% de discordance dont 70% où le frottis est négatif (Tableau XVIII)). En effet, cette méthode d’analyse est beaucoup moins bien reproductible : le culot de centrifugation est parfois difficile à identifier, l’étalement n’est pas toujours simple à réaliser et la coloration manuelle rapide est parfois hasardeuse. Il faut absolument une bonne rigueur dans la réalisation de l’étalement et de la coloration pour pouvoir analyser correctement la cytologie du liquide de lavages broncho-alvéolaires. Néanmoins, cette méthode devrait être évaluée à part entière dans l’analyse bayésienne pour pouvoir estimer sa sensibilité et sa spécificité réelle, car elle pourrait permettre un diagnostic rapide et simple par le praticien au cabinet.

Enfin, avec les résultats de l’élevage J, on montre que le portage asymptomatique de dictyocaules est possible y compris pour des infestations importantes (plus de 30 adultes récupérés dans le LBA (Tableau XIX)). Néanmoins, avec si peu d’observations, il semble difficile de prédire une cinétique de la réponse sérologique et de l’éosinophilie pulmonaire au cours du temps et du développement des signes cliniques (Figure 40et Figure 41). D’autres études ont essayé de trouver des indicateurs permettant de prédire la survenue d’épisodes clinique dans un élevage, que ce soit par coproscopie [120] ou par sérologie [102], sans trouver d’indicateur pertinent. Il serait intéressant de réaliser un suivi longitudinal de l’infestation par D. viviparus par LBA pour déterminer si son utilisation plus précoce peut présenter un intérêt par rapport à la coproscopie et à la sérologie pour une détection précoce de la maladie.

98 CONCLUSION

L’objectif de cette étude était de comparer quatre méthodes diagnostiques de la dictyocaulose bovine chez les adultes : la coproscopie de Baermann, la sérologie par MSPr ELISA, et, pour la première fois, la mise en évidence des adultes et l’analyse de l’éosinophilie pulmonaire à partir de prélèvements du lavage broncho-alvéolaire. En l’absence de Gold Standard et grâce à un modèle à variable latente et à l’ajustement de mélanges de distribution, l’approche bayésienne nous a permis d’estimer la prévalence de la maladie, la sensibilité et la spécificité de chacune de ces méthodes et de fixer des seuils de positivité pour la sérologie et l’éosinophilie. Cette approche statistique n’a, à notre connaissance, jamais été réalisée pour la plupart des méthodes diagnostiques de la dictyocaulose sur le terrain, y compris pour la coproscopie de Baermann, qui est pourtant la méthode de routine utilisée en cabinet.

A partir de nos 105 prélèvements réalisés, dont 95 dans 11 élevages présentant des signes évocateu1rs de dictyocaulose et 10 sur les vaches non cliniques de TP de VetAgro Sup, le parasite a été mis en évidence dans 7 élevages, toutes méthodes diagnostiques confondues. La prévalence estimée de la maladie dans les 11 élevages cliniques varie de 10 à 90% (6% pour les vaches de TP), les valeurs les plus faibles étant généralement observées dans les élevages où nous n’avons pas pu mettre en évidence le parasite. Néanmoins, le diagnostic de la dictyocaulose chez les bovins adultes reste assez difficile à réaliser avec les méthodes parasitologiques, car, malgré une spécificité de 100%, leur sensibilité est très faible (8,7% pour la coproscopie de Baermann dans cette étude et 28,3% pour la mise en évidence d’adultes dans le LBA). Elles doivent donc être réalisées sur de nombreux individus (33 pour la coproscopie) au sein du troupeau pour permettre un diagnostic, ce qui souligne l’intérêt de réaliser des coproscopies de mélange. Des valeurs relativement bonnes de sensibilité et de spécificité sont obtenues pour la sérologie et l’éosinophilie pulmonaire (Sesero= 86,8% Spsero=

86,7% et SeEP= 86,5%, SpEP= 80,4%). Ainsi, il suffit de réaliser les prélèvements sur deux animaux pour avoir une sensibilité troupeau de 95%, au détriment cependant de la spécificité troupeau qui chute à 75% pour la sérologie et 65% pour l’éosinophilie pulmonaire.

L’intérêt du lavage broncho-alvéolaire est qu’il permet de combiner à la fois une technique parasitologique (la mise en évidence des adultes dans le LBA) et un test plus sensible (l’éosinophilie pulmonaire) à partir du prélèvement réalisé. Réalisé sur deux animaux présentant des signes cliniques de dictyocaulose dans un élevage, le LBA peut donc permettre soit un diagnostic de certitude au chevet du patient dans 48% des cas positifs, soit un diagnostic différé au cabinet après examen cytologique avec une sensibilité de troupeau supérieure à 95%. Sa réalisation et son analyse sont aisées, y compris pour un opérateur peu expérimenté.

En raison du peu d’information a priori, notamment sur l’éosinophilie pulmonaire des vaches saines, le modèle et les distributions a posteriori sous-estiment probablement la sensibilité et la spécificité de l’éosinophilie pulmonaire. Il serait intéressant de préciser les informations a priori ou de réaliser l’étude avec des témoins négatifs pour mieux évaluer les caractéristiques de chacun des tests.

Enfin, la grande variabilité de la prévalence entre troupeaux souligne l’importance de mieux caractériser cette maladie et son évolution au sein des lots afin de proposer des traitements adaptés à chaque situation. Elle souligne l’intérêt d’envisager des traitements sélectifs dans certains troupeaux où la prévalence est inférieure à 50%, ce qui permettrait de réduire l’utilisation des vermifuges et les coûts associés.

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111 ANNEXES

ANNEXE I : DONNEES

parasitologie Cytologie pulmonaire Numération formule

V classe CoproM C LBA macro_p neutro_p eosino_p lympho_p sérologie Leucocyte tneutro_nf teosino_nf tlympho_nf tmono_nf pt

opro ache

8518A C 0 0 0 369 22 5 4 0,204 7,22 0,45 0,09 0,46 0 60 7958A C 0 0 0 392 4 1 3 0,18 11,1 0,25 0,11 0,63 0,01 60 7536A C 0 0 0 265 102 31 2 0,338 11 0,48 0,18 0,34 0 78 8185A C 0 0 0 336 9 50 5 0,538 9,78 0,32 0,15 0,53 0 62 8008A C 0 0 0 369 13 18 0 0,409 9,13 0,22 0,05 0,72 0,01 72 2611A C 0 0 0 277 10 112 1 0,142 7,73 0,45 0,11 0,44 0 76 3078B C 0 0 0 249 47 7 97 0,411 7,51 0,34 0,15 0,5 0,01 72 2680B C 0 0 0 344 36 4 16 0,177 8,68 0,36 0,09 0,55 0 72 0079B C 0 0 0 268 30 94 8 0,168 8,8 0,37 0,07 0,55 0,01 74 6629B C 0 0 0 259 33 88 20 0,113 6,6 0,26 0,18 0,56 0 76 3379C C 0 0 0 336 19 25 20 0,226 7,97 0,29 0,3 0,41 0 76 6113C C 0 0 0 286 31 60 23 0,238 10,5 0,3 0,19 0,51 0 82 2328C C 0 0 0 322 49 25 4 0,563 10,8 0,26 0,11 0,62 0,01 74 2334C C 0 0 1 237 95 60 8 0,677 10,4 0,53 0,14 0,31 0,02 82 2335C C 0 0 0 341 17 34 8 0,36 7,93 0,19 0,19 0,61 0,01 64 6850C C 0 0 0 32 357 11 0 0,937 6,99 0,3 0,14 0,56 0 66 6111D C 0 0 0 313 24 53 10 0,519 9,53 0,32 0,15 0,52 0,01 78 6811D C 0 0 0 365 24 11 0 0,325 6,98 0,47 0,32 0,21 0 82 8931D C 0 0 0 194 124 76 6 0,249 8,68 0,43 0,06 0,51 0 68 8935D C 0 0 0 130 178 82 10 0,546 13 0,26 0,21 0,51 0,02 76 8942D C 0 0 0 275 85 34 6 0,294 9,22 0,41 0,14 0,44 0,01 78 5574F C 1 0 0 34 52 311 3 0,865 7,21 0,2 0,22 0,57 0,01 70 5577F C 1 0 0 253 75 62 10 0,546 5,41 0,14 0,21 0,64 0,01 66 5606F C 1 0 0 121 199 79 1 0,991 9,48 0,2 0,17 0,63 0 70 8180F C 1 1 1 181 135 82 2 0,882 7,87 0,21 0,09 0,7 0 70 8184F C 1 0 0 122 126 147 5 0,726 8,44 0,16 0,16 0,67 0,01 82 0167G T 1 0 0 393 6 0 1 NA 11,4 0,5 0,08 0,34 0,08 NA 2132G C 1 0 1 327 52 17 4 0,821 6,99 0,23 0,16 0,52 0,09 NA 1999G C 1 1 0 152 164 84 0 0,932 7,59 0,32 0,13 0,45 0,1 NA 2001G C 1 0 0 349 30 21 0 0,591 8,33 0,49 0,01 0,42 0,08 NA 0542G C 1 0 0 259 18 114 9 0,633 6,85 0,3 0,18 0,45 0,07 NA 3288G C 1 0 0 325 73 0 2 0,268 6,95 0,49 0,13 0,32 0,06 NA 8518A2 C 0 1 0 374 19 7 0 NA 7,25 0,29 0,14 0,49 0,08 NA 7958A2 C 0 0 0 382 12 2 4 NA 7,56 0,34 0,03 0,59 0,04 NA 7536A2 C 0 0 0 370 25 4 1 NA 7,71 0,29 0,07 0,59 0,05 NA

112 8185A2 C 0 0 0 370 14 10 6 NA 8,91 0,31 0,06 0,57 0,06 NA 8008A2 C 0 0 1 277 80 38 5 NA 11 0,27 0,08 0,59 0,06 NA 2611A2 C 0 0 0 160 7 233 0 NA 7,28 0,39 0,07 0,47 0,07 NA 9242TP TP 0 0 0 380 11 2 7 0,318 6,41 0,51 0,05 0,44 0 NA 9252TP TP 0 0 0 377 18 1 4 0,307 14,3 0,49 0,14 0,37 0 70 3988TP TP 0 0 0 347 48 1 4 0,38 17,9 0,44 0,17 0,37 0,02 76 2527TP TP 0 0 0 81 119 0 0 0,154 11,2 0,64 0,05 0,31 0 82 4852H C 0 0 0 342 49 2 7 0,184 8,37 0,38 0,01 0,59 0,02 88 5334H C 0 0 0 357 29 7 7 0,296 6,82 0,46 0,09 0,44 0,01 84 5346H C 0 0 0 345 41 1 13 0,182 6,8 0,45 0,12 0,4 0,03 82 3680H C 0 0 0 194 196 2 8 0,338 19 0,7 0,05 0,25 0 100 2562H C 0 0 0 299 94 3 4 0,563 10,1 0,38 0,03 0,59 0 88 1180H C 0 0 0 325 68 5 2 0,258 7,25 0,25 0,67 0,07 0,01 86 1556I C 0 0 0 300 60 36 4 0,563 6,98 0,29 0,08 0,6 0,03 78 4731I C 0 0 0 188 134 178 4 0,498 7,93 0,29 0,07 0,64 0 78 1557I C 0 0 0 338 21 39 2 0,644 5,6 0,38 0,15 0,47 0 74 9859I C 0 0 1 149 100 143 8 0,746 10,6 0,14 0,16 0,7 0 82 6579I C 0 0 1 42 151 206 1 0,806 7,55 0,33 0,11 0,55 0,01 78 4737I C 0 0 1 61 181 153 5 0,45 9,63 0,24 0,13 0,63 0 80 8518A3 T 0 0 0 386 12 9 2 NA 7,97 0,59 0,08 0,33 0 88 7546A3 T 0 0 0 312 84 0 4 NA 9,63 0,33 0,09 0,58 0 80 2611A3 T 0 0 0 351 33 0 16 NA 7,86 0,19 0,16 0,65 0 76 8008A3 T 0 0 0 332 59 3 6 NA 8,84 0,38 0,18 0,44 0 72 0542G2 T 0 0 0 377 21 2 0 NA 6,44 0,38 0,09 0,53 0 72 0167G2 T 0 0 0 388 11 1 0 NA 8,78 0,37 0,18 0,45 0 76 1999G2 T 0 0 0 386 13 1 0 NA 7,75 0,49 0,11 0,4 0 74 2132G2 T 0 0 0 326 73 1 0 NA 5,03 0,34 0,04 0,62 0 92 2001G2 T 0 0 0 378 22 0 0 NA 7,52 0,55 0,04 0,41 0 74 8073TP TP 0 0 0 303 77 1 19 0,317 9,56 0,48 0,04 0,46 0,02 80 6142TP TP 0 0 0 224 172 0 4 0,451 5,05 0,33 0 0,66 0,01 84 1966TP TP 0 0 0 228 33 0 139 0,299 NA NA NA NA NA NA 1646TP TP 0 0 0 222 130 1 47 0,238 13,5 0,55 0,07 0,37 0,01 74 5341TP TP 0 0 0 175 161 1 63 0,313 5,18 0,46 0,14 0,4 0 70 3942TP TP 0 0 0 252 116 0 32 0,224 NA NA NA NA NA NA 1361I2 T 0 0 0 376 15 4 5 NA 11,4 0,52 0,04 0,44 0 78 1557I2 T 0 0 0 386 11 2 1 NA 5,91 0,32 0,09 0,58 0,01 74 1367I2 T 0 0 0 367 22 8 3 NA 5,97 0,47 0,12 0,4 0,01 76 4737I2 T 0 0 0 381 14 3 2 NA 8,17 0,3 0,11 0,57 0,02 74 1556I2 T 0 0 0 359 39 0 2 NA 8,6 0,47 0,07 0,45 0,01 80 9939J A 1 0 0 385 4 3 8 0,763 7,17 0,35 0,04 0,59 0,02 70 9300J A 1 1 1 69 264 67 0 0,59 12,7 0,62 0,11 0,27 0 68 6600J A 1 0 0 341 19 28 12 0,353 7,76 0,39 0,15 0,46 0 80 3329J A 1 0 0 198 109 283 0 0,453 6,65 0,36 0,08 0,56 0 70 6388J A 1 0 0 357 21 13 9 0,22 7,89 0,32 0,09 0,58 0,01 68 3333J A 1 0 0 363 48 0 11 0,163 9,13 0,34 0,09 0,54 0,03 72 5883K C 0 0 0 273 26 98 3 1,012 13,8 0,4 0,13 0,46 0,01 90 5277K C 0 0 0 331 19 2 48 0,323 9,06 0,2 0,1 0,69 0,01 78

113 0789K C 0 0 0 284 99 1 16 0,238 10,1 0,22 0,14 0,64 0 76 7217K C 0 0 0 218 183 34 0 0,27 9,78 0,23 0,13 0,62 0,02 80 7723K C 0 0 0 155 244 1 0 0,173 7,01 0,24 0,12 0,63 0,01 80 0503K C 0 0 0 254 113 52 10 0,51 10,5 0,19 0,18 0,62 0,01 74 9939J2 C 0 0 0 425 5 23 6 0,502 7,9 0,32 0 0,65 0,03 68 9300J2 C 0 0 1 228 138 121 3 0,482 8,84 0,43 0,1 0,46 0,01 72 6600J2 C 0 0 0 381 5 12 2 0,4 8,13 0,33 0,12 0,54 0,01 80 3329J2 C 0 0 0 419 21 39 2 0,623 7,52 0,29 0,1 0,61 0 70 3333J2 C 0 0 0 370 30 0 0 0,143 8 0,34 0,11 0,53 0,02 70 0099L C 0 0 0 359 78 7 0 0,194 8,28 0,23 0,09 0,67 0,01 80 3354L C 0 0 0 365 6 45 1 0,255 11,4 0,23 0,13 0,6 0,04 84 3365L C 0 0 0 386 3 11 0 0,225 11,3 0,18 0,07 0,71 0,04 86 3357L C 0 0 0 494 5 24 0 0,205 10,1 0,12 0,1 0,78 0 82 0102L C 0 0 0 381 9 8 2 0,216 8,81 0,18 0,13 0,65 0,04 82 0101L C 0 0 1 189 89 135 1 0,246 8,44 0,3 0,1 0,6 0 82 9939J3 T 0 0 0 291 107 1 1 NA 6,64 0,46 0,03 0 0,01 72 9300J3 T 0 0 0 244 54 1 1 NA 7,12 0,55 0,1 0,33 0,02 74 4782J3 T 0 0 0 349 47 0 4 NA 9,03 0,35 0,06 0,57 0,02 70 3329J3 T 0 0 0 325 72 0 3 NA 6,67 0,33 0,12 0,54 0,01 72 3333J3 T 0 0 0 223 176 0 1 NA 7,47 0,37 0,8 0,53 0,02 72

114 ANNEXE II : SCRIPT R Script R : Le diagnostic de la dictyocaulose par lavage broncho-alvéolaire : Etude comparative. M.L. Delignette-Muller Récupération des données rawdata <- read.table("data.txt", header = TRUE)

# tableau des données, une ligne par individu et une colonne par variable str(rawdata) ## 'data.frame': 70 obs. of 6 variables: ## $ herd: int 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 ... ## $ BS : int 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ... ## $ BAL : int 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ... ## $ ODR : num 0.204 0.18 0.338 0.538 0.409 0.142 0.411 0.177 0.168 0.11 3 ... ## $ EC : int 5 1 31 50 18 112 7 4 94 88 ... ## $ TC : int 400 400 400 400 400 400 400 400 400 400 ... Codage des données pour le modèle JAGS data4jags <- list(N = nrow(rawdata), # nombre d’animaux BS = rawdata$BS, # résultat de la coproscopie BAL = rawdata$BAL, # résultat parasitologiques sur LBA numherd = rawdata$herd, # numéro de troupeau Nherd = max(rawdata$herd), # nombre de troupeaux log10ODR = log10(rawdata$ODR), # ODR en log10 EC = rawdata$EC, # nombre de cellules éosinophiles TC = rawdata$TC)# nombre total de cellules observées Analyse bayésienne avec JAGS # description du modèle en langage JAGS model <- "model { for(i in 1:N) { status[i] ~ dbern(P[numherd[i]])

# parasitological results BS[i] ~ dbern(status[i]*SeBS) BAL[i] ~ dbern(status[i]*SeBAL)

# results of serology mu[i] <- munoninf + status[i] * theta sdsero[i] <- status[i]*sdinf + (1 - status[i])*sdnoninf log10ODR[i] ~ dnorm(mu[i], 1/sdsero[i]^2)

# results of cytology muprime[i] <- munoninfprime + status[i] * thetaprime sd[i] <- status[i]*sdinfprime + (1 - status[i])*sdnoninfprime logitEP[i] ~ dnorm(muprime[i], 1/sd[i]^2) EP[i] <- exp(logitEP[i]) /(1 + exp(logitEP[i])) EC[i] ~ dbin(EP[i], TC[i])

115 }

# priors for(e in 1:Nherd) { P[e] ~ dbeta(1, 1) } SeBS ~ dbeta(1, 1) SeBAL ~ dbeta(1, 1) sdnoninf ~ dunif(0,5) sdinf ~ dunif(0,5) munoninf ~ dunif(-10, 10) theta ~ dunif(0, 10) sdnoninfprime ~ dunif(0,5) sdinfprime ~ dunif(0,5) munoninfprime ~ dunif(-10, 10) thetaprime ~ dunif(0, 10)

}" Initialisation du statut des individus # 1 pour un animal avec un résultat positif à la coproscopie de Baermann (BS) ou au LBA (BAL) et une valeur aléatoire (1 ou 0) pour les autres individus. Cette étape est nécessaire, car les individus ayant un résultat positif à la coproscopie ou au LBA ont en fait un statut connu (infesté). status <- rbinom(n = nrow(rawdata), size = 1, prob = 0.5) infected <- (rawdata$BS == 1) | (rawdata$BAL == 1) status <- infected + (1 - infected)*status inits <- list(list(status = status), list(status = status), list(status = status)) Inférence en utilisant l’algorithme MCMC m <- jags.model(file = textConnection(model), data = data4jags, inits = inits, n.chains = 3) ## Compiling model graph ## Resolving undeclared variables ## Allocating nodes ## Graph information: ## Observed stochastic nodes: 280 ## Unobserved stochastic nodes: 162 ## Total graph size: 3429 ## ## Initializing model update(m, n.iter = 10000) # burnin mcmc <- coda.samples(m, c("SeBS", "SeBAL", "P", "munoninf", "theta", "sdnoninf", "sdinf", "munoninfprime", "thetaprime", "sdnoninfprime", "sdinfprime" ), n.iter = 100000, thin = 20)

116 Vérification de la convergence gelman.diag(mcmc) ## Potential scale reduction factors: ## ## Point est. Upper C.I. ## P[1] 1 1 ## P[2] 1 1 ## P[3] 1 1 ## P[4] 1 1 ## P[5] 1 1 ## P[6] 1 1 ## P[7] 1 1 ## P[8] 1 1 ## P[9] 1 1 ## P[10] 1 1 ## P[11] 1 1 ## P[12] 1 1 ## SeBAL 1 1 ## SeBS 1 1 ## munoninf 1 1 ## munoninfprime 1 1 ## sdinf 1 1 ## sdinfprime 1 1 ## sdnoninf 1 1 ## sdnoninfprime 1 1 ## theta 1 1 ## thetaprime 1 1 ## ## Multivariate psrf ## ## 1 Estimation des paramètres densityplot(mcmc)

117 summary(mcmc) ## Iterations = 11020:111000 ## Thinning interval = 20 ## Number of chains = 3 ## Sample size per chain = 5000 ## ## 1. Empirical mean and standard deviation for each variable, ## plus standard error of the mean: ## Mean SD Naive SE Time-series SE ## P[1] 0.3147 0.2018 0.001648 0.001842 ## P[2] 0.2110 0.1837 0.001500 0.001656 ## P[3] 0.6320 0.2128 0.001738 0.001888 ## P[4] 0.5306 0.2380 0.001943 0.002137 ## P[5] 0.8545 0.1254 0.001024 0.001002 ## P[6] 0.7072 0.1639 0.001338 0.001349 ## P[7] 0.1366 0.1186 0.000968 0.000968 ## P[8] 0.8723 0.1127 0.000920 0.000920 ## P[9] 0.5894 0.2020 0.001650 0.001663 ## P[10] 0.3773 0.1739 0.001420 0.001430 ## P[11] 0.2762 0.1631 0.001332 0.001356 ## P[12] 0.0832 0.0766 0.000625 0.000625 ## SeBAL 0.2873 0.0868 0.000709 0.000749 ## SeBS 0.0952 0.0528 0.000431 0.000442 ## munoninf -0.5933 0.0289 0.000236 0.000239 ## munoninfprime -4.5919 0.4370 0.003568 0.004629 ## sdinf 0.1757 0.0393 0.000321 0.000408 ## sdinfprime 1.1292 0.1724 0.001408 0.001424 ## sdnoninf 0.1629 0.0219 0.000179 0.000181 ## sdnoninfprime 1.9819 0.3403 0.002779 0.003033 ## theta 0.3579 0.0556 0.000454 0.000532 ## thetaprime 2.9692 0.4540 0.003707 0.004386 ## ## 2. Quantiles for each variable: ## 2.5% 25% 50% 75% 97.5% ## P[1] 0.02111 0.1504 0.2860 0.449 0.764 ## P[2] 0.00651 0.0697 0.1583 0.303 0.692 ## P[3] 0.19966 0.4767 0.6455 0.803 0.978 ## P[4] 0.10104 0.3466 0.5229 0.714 0.962 ## P[5] 0.53304 0.7898 0.8885 0.952 0.996 ## P[6] 0.34718 0.5984 0.7281 0.836 0.956 ## P[7] 0.00371 0.0451 0.1045 0.197 0.437 ## P[8] 0.58173 0.8161 0.9035 0.959 0.996 ## P[9] 0.18083 0.4451 0.6022 0.748 0.927 ## P[10] 0.08115 0.2450 0.3647 0.499 0.735 ## P[11] 0.04144 0.1502 0.2486 0.377 0.653 ## P[12] 0.00218 0.0260 0.0605 0.118 0.287 ## SeBAL 0.13912 0.2236 0.2805 0.344 0.471 ## SeBS 0.02041 0.0564 0.0855 0.124 0.223 ## munoninf -0.64940 -0.6129 -0.5938 -0.574 -0.535 ## munoninfprime -5.55758 -4.8636 -4.5564 -4.287 -3.823 ## sdinf 0.11865 0.1471 0.1685 0.197 0.271 ## sdinfprime 0.85068 1.0067 1.1094 1.229 1.526 ## sdnoninf 0.12591 0.1476 0.1609 0.176 0.212 ## sdnoninfprime 1.31274 1.7649 1.9660 2.185 2.702 ## theta 0.22908 0.3266 0.3635 0.396 0.452 ## thetaprime 2.12754 2.6619 2.9555 3.268 3.901

118 ANNEXE III : AVIS DU COMITE D’ETHIQUE

119

LURIER Thibaut

LE DIAGNOSTIC DE LA DICTYOCAULOSE BOVINE PAR LAVAGE BRONCHO-ALVEOLAIRE : ETUDE COMPARATIVE

Thèse d’Etat de Doctorat Vétérinaire : Lyon, le 19 juillet 2016

RESUME : La dictyocaulose bovine est une maladie parasitaire pulmonaire des bovins dont le diagnostic de routine, la coproscopie de Baermann, manque de sensibilité chez les adultes. Une étude comparative du diagnostic de la dictyocaulose par lavage broncho-alvéolaire, coproscopie de Baermann et sérologie a été réalisée sur 105 bovins adultes dans 11 élevages suspects de dictyocaulose pendant la saison de pâturage 2015. En l’absence de Gold Standard, l’analyse des données a été réalisée par analyse bayésienne grâce à l’utilisation d’un modèle à variable latente et à l’ajustement de mélanges de distributions. La prévalence de la dictyocaulose dans les différents élevages de l’étude varie de 10 à 90%. Les sensibilités de la coproscopie de Baermann et de la mise en évidence du parasite par LBA sont respectivement estimées à 8,7 et 28,3%. Les sensibilités et spécificités de la sérologie et l’éosinophilie pulmonaire sont estimées à : Sesero= 86,8% Spsero= 86,7% et SeEP= 86,5%, SpEP= 80,4%. Ainsi, avec les méthodes parasitologiques, pour obtenir une sensibilité troupeau de 95%, il faut réaliser 33 coproscopies ou 9 LBA tandis qu’il ne faut en réaliser que 2 avec la sérologie ou l’éosinophilie pulmonaire, mais dans ce cas, la spécificité troupeau chute respectivement à 75 et 65%. Le LBA permet à la fois un diagnostic spécifique, par mise en évidence du parasite, et sensible, par estimation du taux d’éosinophile pulmonaire.

MOTS CLES : - Bovins - Sérologie - Helminthiase - Lavage bronchoalvéolaire - Diagnostic - Poumon -- Maladies - Trichostrongyloïdes - Statistique bayésienne

JURY : Président : Monsieur le Professeur Jean-François MORNEX

1e Assesseur : Monsieur le Maître de conférences Gilles BOURGOIN 2e Assesseur : Madame le Maître de conférences Marie-Anne ARCANGIOLI Membre invité : Madame le Professeur Marie-Laure DELIGNETTE-MULLER

DATE DE SOUTENANCE : 19 juillet 2016

ADRESSE DE L’AUTEUR : Malicorne 58350 COLMERY