Universidade Federal Do Tocantins Programa De Pós-Graduação Em Ciência Animal Tropical

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL TROPICAL

TOXICIDADE SUBCRÔNICA E REPRODUTIVA DE EXTRATOS DE BUCHENAVIA TOMENTOSA EM RATOS WISTAR

Daiene Isabel da Silva Lopes

Tese apresentada como requisito para obtenção do título de Doutor, junto ao programa de Pós- graduação em Ciência Animal Tropical da Universidade Federal do Tocantins.

Área de Concentração: Produção Animal

Orientadora: Profa. Dra. Viviane Mayumi Maruo

ARAGUAÍNA – TO 2013 1

DAIENE ISABEL DA SILVA LOPES

Toxidade subcrônica e reprodutiva de extratos de Buchenavia tomentosa em ratos Wistar

Tese apresentada para a obtenção do título de Doutor, junto ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal Tropical, da Universidade Federal do Tocantins.

Área de Concentração: Produção Animal

Orientadora: Prof. (a) Dr. (a) Viviane Mayumi Maruo

Linha de pesquisa: Patologia Aplicada a Toxicologia

ARAGUAÍNA – TO 2013

“Ter a consciência de que tudo que fizemos nunca ficou aquém de nossa capacidade e ter a certeza de que tudo que foi feito ainda pode ser melhorado, talvez seja uma das maneiras de dizer: Obrigada Senhor, pelo dom da vida”.

Sérgio Rosto 6

Tem calma contigo mesmo e olha aonde vais Espera um minuto, pensa no que farás No meio da tormenta é duro navegar E uma escolha incerta pode caro custar Nem todo mau momento te faz fracassar E em caminhos de pedras haverás de passar Pois nem tudo na vida é como a gente quer Mesmo em sombras na terra o sol brilha no céu Segue adiante, sem olhar atrás Vive cada dia e nada mais E o que vier tu vencerás Só tu tens a chave: abres ou fecharás Tem calma na vida o jogo é de verdade Pra ganhar a partida vai com força e coragem São as regras do jogo é bom sempre lembrar Diante dos desafios é preciso tentar ... E assim como o ouro pelo fogo vais passar E o que tens de melhor o fogo vai revelar Ainda que chores, tu vencerás Só aquele que perde sabe também ganhar Segue adiante, sem olhar atrás Vive cada dia e nada mais E o que vier tu vencerás Só tu tens a chave: abres ou fecharás Tem calma... tem calma... tem calma...

Pe Fábio de Melo - Tem Calma

Dedico,

Aos meus pais, Florisvaldo Ribeiro Lopes e Ivani Isabel da Silva Lopes pelo amor e desprendimento, bem como pela sabedoria com que sempre me aconselharam e acima de tudo pelos exemplos de família, otimismo. Aqui deixo meu respeito, amor e eterna admiração. Vocês são meu tesouro mais precioso!

Agradecimentos

Não foi fácil chegar até aqui, por isso agradeço a Deus, por ter me dado toda a força necessária, por me iluminar nos momentos difíceis, por não me deixar desistir, Obrigada senhor!! Aos meus pais Florisvaldo e Ivani por me incentivarem sempre e por me ajudarem em todos os momentos da minha vida, eu devo tudo a vocês! Aos meus irmãos Katiane, Hanna e Gabriel por suportarem o dia- a- dia comigo, meus humores e por serem meus amigos em todos os momentos. Ao meu noivo, Durval Nolasco que nunca deixou de me incentivar, que esteve presente nos melhores e piores momentos e que além de todo apoio ainda me ajuda de todas as formas... te amo muito!! A minha orientadora Professora Viviane Mayumi Maruo por todos os ensinamentos e por me fazer crescer profissionalmente, o conhecimento que aqui adquiri nunca me será esquecido. Aos professores (as) do programa de Pós-Graduação em Ciência Animal Tropical pelos ensinamentos em especial aos professores, Adriano, Clarissa, Domenica e Paiva. As garotas do laboratório de Patologia Animal e Biotério (Benta, Elis, Gil, Laiane, Obede, Nahuria) por todos os momentos de descontração, trabalho, incentivo e força de vontade, o que teria sido esse doutorado sem vocês.... As alunas de graduação Juliana, Marcela, Naysa, Camila e Layla obrigada por tudo meninas, vocês me ajudaram muito!!! Espero ter ensinado algo a vocês. Aos colegas da Pós Graduação, por todos os momentos de conversas e incentivos, obrigada. A CAPES pela concessão da bolsa de estudo (Doutorado); Aos guardas, e aos funcionários da Fênix pelas colaborações. A todos que direta e indiretamente tenham contribuído para a minha formação. Meu muito obrigada!

SUMÁRIO RESUMO ...... 12 ABSTRACT ...... 13 LISTA DE TABELAS ...... 14 LISTA DE FIGURAS ...... 17 LISTA DE QUADROS ...... 19

CAPÍTULO I – Revisão de literatura

RESUMO ...... 21 ABSTRACT ...... 21 1 REVISÃO DE LITERATURA...... 22 1.2 Família Combretaceae ...... 22 1.2.1 Gênero Buchenavia ...... 23 1.2.2 Buchenavia tomentosa ...... 24 1.3 Principais constituintes químicos ...... 26 1.3.1 Compostos Fenólicos ...... 26 1.3.2 Flavonoides ...... 27 1.3.2.1. Toxicidade de flavonoides ...... 29 1.3.2.2. Propriedades fitoestrógenas dos flavonoides ...... 29 1.3.3 Taninos ...... 32 1.3.3.1 Propriedades farmacológicas ...... 34 1.3.4 Lignanas ...... 35 1.3.4.1 Propriedades farmacológicas ...... 35 1.4 Toxicidade ...... 36 2 REFERÊNCIAS ...... 36 OBJETIVOS...... 43 1.Objetivo geral...... 43 1.1 Objetivo específico...... 43

CAPÍTULO II – Estudo fitoquímico e toxicidade dos extratos de Buchenavia tomentosa em Artemia salina

RESUMO ...... 45 10

ABSTRACT...... 45 1. INTRODUÇÃO ...... 46 2. MATERIAL E MÉTODOS ...... 47 2.1 Coleta e identificação da Buchenavia tomentosa ...... 47 2.2 Preparação dos extratos ...... 47 2.4 Ensaio de citotoxicidade frente à A. salina ...... 50 3. RESULTADOS ...... 51 4. DISCUSSÃO ...... 53 5. REFERÊNCIAS ...... 55

CAPÍTULO III – Toxicidade subcrônica e reprodutiva do extrato bruto de Buchenavia tomentosa em ratos Wistar

RESUMO ...... 60 ABSTRACT ...... 60 1. INTRODUÇÃO ...... 61 2. MATERIAL E MÉTODOS ...... 62 2.1 Material vegetal...... 62 2.2 Obtenção do extrato bruto (EB) de B. tomentosa ...... 62 2.3 Animais ...... 63 2.4 Administração do extrato bruto de B. tomentosa ...... 63 2.5 Avaliação do ciclo estral ...... 63 2.6 Estudos de desempenho reprodutivo fêmeas ...... 64 2.7 Estudo reprodutivo macho ...... 64 2.8 Análise hematológica e bioquímica ...... 65 2.9 Análise Hormonal ...... 65 2.10 Peso dos órgãos e determinação do peso relativo ...... 65 2.11 Avaliação macroscópica e histopatológica ...... 65 2.12 Análise estatística ...... 66 3. RESULTADOS ...... 66 4. DISCUSSÃO ...... 77 5. REFERÊNCIAS ...... 79

CAPÍTULO IV – Toxicidade subcrônica e reprodutiva dos extratos butanólico e aquoso de Buchenavia tomentosa em ratos Wistar

1. INTRODUÇÃO ...... 84 2. MATERIAL E MÉTODOS ...... 85 2.1 Material vegetal...... 85 2.2 Obtenção do extrato bruto (EB) de B. tomentosa ...... 85 2.3 Particionamento por polaridade de solventes ...... 86 2.4 Animais ...... 87 2.5 Administração dos extratos butanólico e aquoso de B. tomentosa ...... 87 2.6 Avaliação do ciclo estral ...... 87 2.7 Estudos de desempenho reprodutivo fêmeas ...... 88 2.8 Estudo reprodutivo macho ...... 88 2.9 Análise bioquímica ...... 89 2.10 Análise Hormonal ...... 89 2.11 Peso dos órgãos e determinação do peso relativo ...... 89 2.12 Avaliação macroscópica e histopatológica ...... 89 2.13 Análise estatística ...... 90 3. RESULTADOS ...... 90 4. DISCUSSÃO ...... 102 5. REFERÊNCIAS ...... 105

RESUMO

Buchenavia tomentosa, popularmente conhecida como mirindiba, pertence à família Combretaceae. Segundo produtores de gado a ingestão da planta por vacas prenhes estaria associada à ocorrência de abortamento. Assim, o objetivo do estudo foi realizar análise fitoquímica das frutos de B. tomentosa e avaliar a toxicidade do extrato hexânico (EH), acetático (EAC), butanólico (EBU) e aquoso (EAQ) em Artemia salina, investigar a toxicidade subcrônica e reprodutiva do extrato bruto (EBR), EBU e EAQ de B. tomentosa em ratos machos e fêmeas. Casca e polpa de B. tomentosa foram percoladas em etanol e concentradas em rotaevaporador para obtenção do EBR, a partir do qual, obtiveram-se os EH, EAC, EBU e EAQ para identificação de taninos, fenóis, saponinas, alcaloides, flavonoides, esteroides, triterpenoides, açúcares redutores e polissacarídeos. Dez exemplares de náuplios de A. salina foram colocados em tubos de ensaio contendo 10 mL de solução salina com frações do EH, EAC, EBU e EAQ nas concentrações de 104, 103, 102, 101, 10-1, 10-2, 10-3 e 10-4 µg/mL em triplicata. Os tubos foram mantidos sob luz artificial por um período de 24 horas e posteriormente foi realizada a contagem do número de náuplios sobreviventes e o cálculo da CL50. No estudo de toxicidade subcrônica e reprodutiva do EBR, EBU e EAQ os animais foram divididos de forma inteiramente casualizada o primeiro em dois grupos: 30 animais no grupo controle (veículo) e 30 animais no grupo experimental. E os seguintes em três grupos: 45 animais no grupo controle (veículo) e 90 animais no grupo experimental (extrato butanólico e aquoso). A administração ocorreu via gavagem e a dose dos extratos foram correspondentes àquela consumida se o fruto fresco fosse a única fonte de alimentação. Nas fêmeas foi realizada durante 30 dias, na fase de coabitação e nos dias de gestação (GD) 0 a 20, nos machos, durante 30 dias e na fase de coabitação. Os testes fitoquímicos demonstraram a presença de taninos, saponinas, flavonoides, esteroides, triterpenos e açúcares redutores. A CL50 do extrato hexânico foi de 14,26µg/mL, extrato acetático 6,93µg/mL, extrato butanólico 0,14 µg/mL e do extrato aquoso 0,09µg/mL. A administração do EBR de B. tomentosa para fêmeas e machos não produziu diferenças significativas nos parâmetros avaliados. A administração subcrônica dos EBU E EAQ para ratas produziu alterações nos parâmetros reprodutivos, apresentando aumento nos números de pontos de reabsorção e nas porcentagens de perdas pós-implantação e diminuição das porcentagens de fetos vivos. Nos machos a administração dos EBU e EAQ produziram reduções no consumo de ração e no ganho de peso. Os demais parâmetros avaliados não apresentaram diferenças significantes.Dessa forma, conclui-se que o EBU e EAQ foram tóxicos no bioensaio com A. salina possivelmente, devido à ação dos flavonoides e saponinas encontrados nestes extratos. O EBR nas condições de administração não apresentou toxicidade sobre ratos e não alterou os parâmetros reprodutivos. A administração dos EBU e EAQ as fêmeas férteis promoveu toxicidade direta sobre parâmetros reprodutivos. Em machos não promoveu alterações reprodutivas, porém o tratamento prolongado induz diminuição no ganho de peso.

Palavras-chave: planta tóxica, Buchenavia, reprodução, toxicidade

ABSTRACT

Buchenavia tomentosa, popularly known as mirindiba, belongs to the family Combretaceae. According to cattle producers to ingestion of the plant by pregnant cows would be associated with occurrence of abortion. So, the aim of this study was to perform phytochemical analysis of fruits of B. tomentosa and assess toxicity of hexane extract (EH), acetático (EAC), butanolic (EBU) and aqueous (EAQ) in Artemia salina, investigate subchronic and reproductive toxicity of the crude extract (ECR), EBU e EAQ of B. tomentosa in male and female rats. Peel and pulp of B. tomentosa were percolated in ethanol and concentrated in rotary obtain (ECR), from which was obtained extracts EH, EAC, EBU e EAQ for identification classes of tannins, phenols, saponins, alkaloids, flavonoids, steroids, triterpenoid, reducing sugars and polysaccharides.Ten specimens of nauplii of A. saline were placed in test tubes containing 10 ml of saline fractions from EH, EAC, EBU and EAQat concentrations of 104, 103, 102, 101, 10-1, 10-2, 10-3 and 10-4 µg/mL in triplicate. The tubes were kept under artificial light for a period of 24 hours and after this period counts of survivors’ nauplii were performed and LC50 was calculated. In the study of subchronic toxicity and reproductive EBR, EBU and EAQ animals were divided completely random in the first two groups: 30 animals in the control group (vehicle) and 30 animals in the experimental group. And the following three groups: 45 animals in the control group (vehicle) and 90 animals in the experimental group (butanolic and aqueous extract). The administration was by gavage and the dose of the extracts was corresponding to that is consumed fresh fruit were the only source of nutrition. Males were treated for 30 days and during cohabitation and females for 30 days and during cohabitation and gestational periods (GD20). The phytochemicals study revealed the presence of tannins, saponins, flavonoids, steroids, triterpenes and reducing sugars. The LC50 of the hexane extract was 14.26 µg/mL, extract acetate 6.93 µg/mL, butanol extract 0.14 µg/mL of the aqueous extract 0.09 µg/mL. The administration of ECR of B. tomentosa for female and male produced no significant differences in the evaluated parameters. The subchronic administration of EBU and EAQ to female produced changes in reproductive parameters, an increase in the numbers of points in the percentages of resorption and post-implantation loss and decreased percentages of live fetuses.In males the administration of the EBU and EAQ produced reductions in food consumption and weight gain. Other parameters evaluated showed no significant differences.Thus, it is concluded that EBU and EAQ extracts were cytotoxic in bioassay with A. saline, possibly due to the action of flavonoids and saponins found on these extracts. ECR of B. tomentosa under the conditions of administration presented no toxicity on rats and did not alter reproductive parameters.The administration of EBU and EAQ to fertile rats promotes direct toxicity on reproductive parameters. In males does not promote reproductive changes, however prolonged treatment induces a decrease in weight gain.

Keywords: toxic plant, Buchenavia, reproduction, toxicity.

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO II Tabela 1– Média da mortalidade (%) de A. salina frente os extratos testados e suas respectivas concentrações...... 52 Tabela 2 – Concentrações letais de 50% (CL50) dos extratos de B. tomentosa sobre Artemia salina...... 52

CAPÍTULO III Tabela 1 - Avaliação do ciclo estral em fêmeas tratadas com extrato bruto (EBR) de B. tomentosa durante 30 dias...... 69 Tabela 2 – Parâmetros hematológicos de ratas controles e experimentais tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional com extrato bruto de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões...... 71 Tabela 3 – Avaliação bioquímica de ratas controles e experimentais tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional com extrato bruto de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros- padrões ...... 71 Tabela 4 - Valores de hormônio de ratas controles e experimentais tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional com extrato bruto de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros- padrões...... 71 Tabela 5 - Peso relativo dos órgãos de ratas controles e experimentais tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional com extrato bruto de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões...... 72 Tabela 6 - Parâmetros reprodutivos de ratas controles e experimentais tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional com extrato bruto de Buchenavia tomentosa...... 721 Tabela 7 - Parâmetros hematológicos de ratos controle e experimental tratados durante 30 dias e no período de acasalamento com extrato bruto de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões...... 754 15

Tabela 8 – Avaliação bioquímica de ratos controle e experimental tratados durante 30 dias e no período de acasalamento com extrato bruto de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões...... 754 Tabela 9 - Peso relativo de órgãos de ratos controle e experimental tratados durante 30 dias e no período de acasalamento com extrato bruto de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões...... 765 Tabela 10 - Parâmetros reprodutivos de fêmeas não tratadas acasaladas com machos tratados durante 30 dias e no período de acasalamento com extrato bruto (EBR) de Buchenavia tomentosa e seu respectivo controle...... 776

CAPÍTULO IV Tabela 1 - Avaliação do ciclo estral em fêmeas tratadas com extrato butanólico (EBU), aquoso (EAQ) de Buchenavia tomentosa durante 30 dias...... 922 Tabela 2 - Avaliação bioquímica de ratas controles e experimentais tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional com extrato butanólico (EBU) e aquoso (EAQ) de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões (n=15)...... 96 Tabela 3 - Valores de hormônio de ratas controle e experimentais tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional com extrato butanólico (EBU) e aquoso (EAQ) de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões (n=15)...... 96 Tabela 4 - Pesos relativos dos órgãos de ratas controles e experimentais tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional com extrato butanólico e aquoso de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e respectivos erros-padrões (n=15)...... 96 Tabela 5 - Parâmetros reprodutivos de fêmeas tratadas durante 20 dias de gestação com o extrato butanólico (EBU), aquoso (EAQ) de Buchenavia tomentosa ou veículo (n=15)...... 97 Tabela 6 - Média de ganho de peso total (g) de ratos tratados durante 30 dias com veículo, extrato bruto, butanólico e aquoso de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões (n=15)...... 99 Tabela 7 - Avaliação bioquímica de ratos controles e experimentais tratados durante 30 dias e na fase de coabitação com extrato butanólico (EBU) e aquoso (EAQ) de 16

Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões (n=15)...... 100 Tabela 8 - Peso relativo dos órgãos de ratos controles e experimentais tratados durante 30 dias e na fase de coabitação com extrato butanólico (EBU) e aquoso (EAQ) de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros- padrões (n=15)...... 101 Tabela 9 - Parâmetros reprodutivos de fêmeas não tratadas acasaladas com machos que foram tratados durante 30 dias com extrato bruto (EBR), butanólico (EBU) e aquoso (EAQ) de Buchenavia tomentosa e seu respectivo controle...... 102

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO I Figura 1 - Buchenavia tomentosa, à esquerda a folha, no centro uma visão geral de um exemplar da espécie no município de Araguaína-TO, à direita frutos frescos. . 254 Figura 2 - Estrutura química de alguns flavonoides de ocorrência natural em plantas ...... 287 Figura 3 - Estrutura e numeração básica de flavonoides...... 28 Figura 4 - Estruturas químicas dos principais esteroides sexuais e fitoesteroides. ... 29 Figura 5 - Estrutura de taninos hidrolisáveis...... 332 Figura 6 - Estrutura química de taninos condensados...... 332

CAPÍTULO II Figura 1 - Particionamento do extrato bruto de B. tomentosa por polaridade de solventes...... 47 Figura 2 - Mortalidade x logaritmos das concentrações dos extratos hexânico, acetático, butanólico e aquoso...... 52

CAPÍTULO III Figura 1 - Consumo de água (A), consumo de ração (B) e peso (C) de ratas tratadas durante 30 dias com veículo, extrato bruto, de Buchenavia tomentosa. Foram utilizados 15 animais por grupo. São apresentados as médias e os respectivos erros- padrões...... 67 Figura 2 - Consumo de água (A), consumo de ração (B) e peso (C) de ratas tratadas durante o período de gestação com veículo e extrato bruto de Buchenavia tomentosa. Foram utilizados 15 animais por grupo. São apresentados as médias e os respectivos erros- padrões...... 68 Figura 3 - Consumo de água (A), consumo de ração (B) e peso (C) de ratos tratadas durante 30 dias com veículo, extrato bruto, de Buchenavia tomentosa. Foram utilizados 15 animais por grupo. São apresentados as médias e os respectivos erros- padrões...... 743

CAPÍTULO IV

Figura 1 – Particionamento do extrato bruto de B. tomentosa por polaridade de solventes...... 85 Figura 2 - Consumo de água (A), consumo de ração (B) e peso (C) de ratas tratadas durante 30 dias com veículo, extrato butanólico e aquoso de Buchenavia tomentosa. Foram utilizados 15 animais por grupo. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões...... 91 Figura 3 - Consumo de água (A), consumo de ração (B) e peso (C) de ratas tratadas durante 20 dias com veículo, extrato butanólico e aquoso de Buchenavia tomentosa. Foram utilizados 15 animais por grupo. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões...... 92 Figura 4 - Consumo de ração (A) e peso (B) de ratos tratados durante 30 dias com veículo, butanólico e aquoso de Buchenavia tomentosa. Foram utilizados 15 animais por grupo. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões...... 98 Figura 5 - Consumo de água (A) de ratos tratados durante 30 dias com veículo, extrato bruto, butanólico e aquoso de Buchenavia tomentosa. Foram utilizados 15 animais por grupo. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões...... 99

LISTA DE QUADROS

CAPÍTULO II Quadro 1– Rendimento dos extratos (hexânico, acetático, butanólico e aquoso) de B. tomentosa...... 51 Quadro 2 – Estudo fitoquímico de extratos B. tomentosa...... 52

CAPÍTULO III Quadro 1 - Monitoramento do ciclo estral de ratas controles (C) e experimentais tratadas com extrato bruto (EB) de B. tomentosa durante 30 dias. D : diestro, p: proestro, e: estro e m: metaestro...... 700

CAPÍTULO IV Quadro 1 – Monitoramento do ciclo estral de ratas controles (C) D: diestro, p: proestro, e: estro e m: metaestro...... 94 Quadro 2 – Acompanhamento do ciclo estral de ratas experimentais tratadas com extrato butanólico (EBU) e aquoso (EAQ) de B. tomentosa durante 30 dias. D: diestro, p: proestro, e: estro e m: Metaestro...... 95

CAPÍTULO I

RESUMO

Produtores de bovinos criados em sistema extensivo afirmam que o consumo de frutos da mirindiba, Buchenavia tomentosa Eichler, causa abortos em vacas. A B. tomentosa é uma planta arbórea comumente encontrada na caatinga e cerrado brasileiro. A identificação de B. tomentosa demostrou a presença de compostos fenólicos como flavonoides, lignanas e taninos. Os flavonoides são substâncias que estão inclusas dentro do grupo de fitoestrógenos que são compostos capazes de desempenhar atividades semelhantes a dos hormônios naturais, alterando o funcionamento do sistema endócrino. Os taninos são antioxidantes, inibidores de enzimas e influenciam negativamente a digestibilidade de proteínas. As lignanas apresentam promissores efeitos benéficos para a saúde humana como atividade estrogênica, anti-inflamatória e antitumoral. A inclusão de 10% do fruto de mirindiba na ração de fêmeas no período gestacional induz aumento do peso materno e retardo no desenvolvimento físico de filhotes machos. Na avaliação da fertilidade em ratos a ingestão dos frutos da planta causou efeito deletério nas fêmeas e toxicidade moderada em machos. Assim, considerando que a B. tomentosa pode ser ingerida por animais de produção em idade fértil e em condições naturais torna-se importante avaliar seus efeitos sobre a reprodução.

Palavras-chave: Buchenavia tomentosa, ratos, toxicologia, fitoestrógenos, reprodução.

ABSTRACT

Producers of cattle raised on extensive state that the consumption of fruits mirindiba, Eichler Buchenavia tomentosa, causes abortions in cows. B. tomentosa is a tree species commonly found in the Brazilian cerrado and caatinga. The identification of B. tomentosa demonstrated the presence of phenolic compounds such as flavonoids, lignans and tannins. Flavonoids are substances that are included within the group of phytoestrogens which are compounds capable of performing activities similar to natural hormones, altering the functioning of the endocrine system. The tannins are antioxidants, enzyme inhibitors and negatively influence the digestibility of proteins. The lignans exhibit promising beneficial effects for human health as estrogenic, antiinflammatory and antitumor activities. The inclusion of 10% of the fruit of the mirindiba ration of females during pregnancy induces increased maternal weight and delayed physical development of male offspring.To evaluate fertility in rats eating the fruit of the plant caused deleterious effects in females and moderate toxicity in males. Thus, whereas B. tomentosa may be ingested by animals and production of fertile age under normal conditions it is important to evaluate its effects on reproduction.

Keywords: Buchenavia tomentosa, rats, toxicology, phytoestrogens, reproduction.

1 REVISÃO DE LITERATURA

1.2 Família Combretaceae

Plantas da família Combretaceae ocorrem nas regiões tropicais e subtropicais do mundo e possui 20 gêneros. O número de espécies pode variar, de acordo com a literatura, sendo descritas entre 300 e 475. Estas espécies possuem características evolutivas avançadas, ocorrendo em diversos biomas, incluindo os ambientes especiais, como mangues e regiões áridas. No Brasil, ocorrem cinco gêneros nativos Buchenavia, Crombretum, Conocarpus, Terminalia e Thiloa e dois exóticos Bucida e Quisqualis (SOUZA; LORENZI, 2005) com aproximadamente 60 espécies. Em países do continente Africano e Asiático algumas espécies da família Combretaceae são usadas na medicina popular para tratamento de dor nas costas, febre, infecções bacterianas como lepra, gonorreia, pneumonia, gengivites, tuberculose, sífilis e cárie, tratamento de hipertensão, cânceres, parasitoses, problemas do trato gastrointestinal e, por esta razão, há vários estudos sobre as mesmas a fim de confirmar suas propriedades medicinais (BURKHILL, 1985 apud ELOFF; KATERERE; McGAW, 2008). O potencial medicinal de sete espécies de Combretaceae Combretum glutinosum, C. hispidum, C. molle, C. nigricans, Pteleopsis suberosa, Terminalia avennioides e T. mollis foi avaliado quanto à atividade antifúngica e todos os exemplares mostraram-se ativos frente às cepas testadas (BABA-MOUSSA; AKPAGANA; BOUCHET, 1999). Seis espécies dos gêneros Combretum e Terminalia C. fragans, C. molle, C. psidioides, C. zeyheri, T. kaiserana, T. sericea usadas na Tanzânia e em outros países africanos no tratamento de doenças como gonorreia, sífilis, diarreia, hipertensão e câncer demonstraram atividade antibacteriana (FYHRQUIST et al., 2002). Do ponto de vista científico, já foram isolados diversos componentes bioativos de plantas da família Combretaceae, pertencentes ao grupo dos polifenóis, como flavonoides (MARTINI et al., 2004), ao grupo dos terpenoides, como triterpenos glicosídeos (ADNYANA et al., 2000) e triterpenoides (ANGEH et al., 2007) e ao grupo dos alcaloides, como flavonoides-alcaloides (BEUTLER et al., 1992) e beta-carbolina (FIOT et al., 2006), além de taninos e stibenoides (ELOFF; KATERERE; McGAW, 23

2008). Essas moléculas podem ter atividade antimicrobiana, anti-inflamatória e antioxidante (MARTINI et al., 2004; MASOKO; ELOFF, 2006). O efeito antibacteriano e antifúngico de plantas da família Combretaceae, principalmente dos gêneros Combretum e Terminalia vêm sendo demonstrado na literatura. Martini et al. (2004) demonstraram a atividade antibacteriana de moléculas extraídas de Combretum erythrophyllum contra Vibrio cholerae, Enteroccus faecalis, Micrococcus luteus e Shigella sonei. O poder antifúngico de Combretum spp. e Terminalia spp. contra Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Microsporum canis e Sporothrix schenkii, de diversos tipos de extratos de Terminalia e Combretum também foi descrito (MASOKO; ELOFF, 2006; MASOKO; PICARD; ELOFF, 2005).

1.2.1 Gênero Buchenavia O gênero Buchenavia (Reino: Plantae; Divisão: Magnoliophyta; Classe: Magnoliopsida; Ordem: Myrtales; Família: Combretaceae) com cerca de 25 espécies, está distribuído na América Tropical, desde a América Central, em Cuba,Trinidad, Panamá, Índias Ocidentais, até Venezuela, Colômbia, Guianas, Brasil, Peru e Bolívia. Na região amazônica, há a maior concentração de espécies, vinte ao todo, no sudeste do Brasil ocorrem seis e uma atinge a região sul. O gênero é caracterizado por porte arbustivo, de folhas alternas, aglomeradas no ápice, presença somente de tricomas combretáceo-compartimentados. As inflorescências possuem formato em espigas. As flores não possuem pétalas, estames com anteras adnatas aos filetes. Os frutos são drupoides, arredondados e sementes apresentam cotilédones convolutos (MARQUETE; VALENTE, 2005). Muitas espécies são conhecidas como tanimbuca [B. capitada (Eichler), B. huberi (Ducke), B. macrophylla (Eichler), B. grandes (Ducke), B. ochropurumna (Eichler)], e têm grande importância econômica porque possuem madeira resistente ao ataque de cupins, com cheiro agradável quando verde e imperceptível após a secagem. Por este motivo têm utilidade na construção civil. A madeira de B. ochroprumna também é usada na produção de energia (PAULA, 1999). Pouco se conhece sobre as propriedades químicas e farmacológicas das espécies do gênero Buchenavia, contudo, gêneros da mesma família taxonômica já foram estudados. Sob o aspecto químico sabe-se que espécies do mesmo gênero possuem compostos como taninos, saponinas, triterpenos, flavonas, isoflavonas, 24

biflavonoides e alcaloides os quais são substâncias sabidamente tóxicas (HERNES; HEDGES, 2004; LI et al., 2002). Os alcaloides flavonoidais buchenavianina e N- Dimetilbuchenavianine foram isolados de folhas e frutos de Buchenavia macrophylla; O- Demetilbuchenavianine, O, N-Demetilbuchenavianine, N-Demetilcapitavina, 5,7- Dihydroxi-6-(N-metil-20- piperidinil) flavanona em frutos de B. macrophylla e capitavina e 5,7,49-Trihidroxi-6- (N-metil-20-piperidinil) flavona em sementes de B. capitata Eichler (HOUGHTON, 2002). O uso medicinal de plantas desse gênero ainda não está completamente estabelecido. Todavia, foram relatados na literatura alguns trabalhos que tentaram isolar moléculas bioativas de plantas desse gênero para fins terapêuticos. Beutler et al. (1992) verificaram que alguns alcaloides flavonoides isolados das folhas de Buchenavia capitata apresentaram moderada atividade anti-HIV, entretanto, também apresentaram alta citotoxidade. Li et al. (2002) verificaram que componentes isolados de extrato etanólico da raiz de Buchenavia parviflora apresentaram atividade contra a enzima ácido graxo sintase, uma importante enzima na biossíntese de lipídeos de células eucarióticas.

1.2.2 Buchenavia tomentosa A Buchenavia tomentosa, (Figura 1) conhecida vulgarmente com o nome de mirindiba, embiridiba, tarumarana ou tanimbuca, nativa dos cerradões e de mata semidecíduas, também encontrada em florestas neotropicais, florestas atlânticas, caatinga e cerrado brasileiro constitui-se numa espécie vegetal com altura média de 26 metros, 21-35 cm de diâmetro com tronco cilíndrico com sapopemas e ramos superiores acinzentados. No ápice da árvore se inserem as folhas que são do tipo ferrugíneas ou rubiginosas pubescentes, elípticas ou obovadas, tomentosas com as nervuras primária e secundária vilosas na face abaxial, com nervação do tipo broquidódromo, nervuras secundárias proeminentes, formando um ângulo obtuso com a nervura primária e também pecíolo de 0,4 a 0,6 cm de comprimento. Os ápices dessas folhas são arredondados a levemente emarginado (LORENZI, 2009; MARQUETE; VALENTE, 2005). Produz fruto nos meses de junho, julho agosto e setembro, seu fruto é comestível e ácido, suas folhas são utilizadas para preparo de chá e sua casca é popularmente utilizada no tratamento de tosse, como anti- 25

hiperlipidêmicas e anorexígenas (LORENZI, 2009; POTT; POTT; SOBRINHO, 2004; SILVA et al.; 2010).

Figura 1 - Buchenavia tomentosa, à esquerda a folha, no centro uma visão geral de um exemplar da espécie no município de Araguaína-TO, à direita frutos frescos.

Produtores de bovinos criados em sistema extensivo no Tocantins afirmam que o consumo de frutos da Buchenavia tomentosa Eichler, causa abortos em vacas gestantes, alegando-se a perda da cria em qualquer fase da gestação e podendo levar a morte dos animais que a ingerem (COSTA et al., 2011). A planta foi citada como tóxica para caprinos, ovinos e bovinos em entrevistas no estado do Piauí, sendo a responsável pelo maior número de abortamentos mencionado no estudo. De acordo com os entrevistados os animais se alimentam avidamente dos frutos que caem de agosto a outubro. Os sinais clínicos relatados foram diarreia, focinho seco, fraqueza, perda de peso, nascimento de animais fracos e abortamento e óbitos (MELLO et al., 2010). Experimentalmente foi demonstrado que a inclusão de 10% dos frutos de B. tomentosa na ração de ratas fêmeas durante toda a prenhez produziu diminuição do peso materno e retardo no desenvolvimento físico de filhotes machos, a toxicidade apresentada está possivelmente relacionada à presença de compostos químicos de ação estrogênica presentes na planta (NUNES et al., 2010). Na avaliação da fertilidade a ingestão dos frutos da planta causou efeito deletério nas ratas fêmeas como reduções significativas no número de implantação, número total de fetos vivos, peso do útero gravídico, peso dos fetos e peso das placentas e toxicidade moderada em ratos machos, traduzida por diminuição progressiva de peso e menor ganho de peso quando comparados ao grupo controle (MAZZINGHY; ADAMS; MARUO, 2009). A análise fitoquímica de B. tomentosa apresentou nos frutos compostos fenólicos como galato de etila, galato de metila e ácido gálico; taninos hidrolisáveis 26

como corilagina e buchenavina; lignanas em mistura de pinoresinol com epipinoresinol (BATISTA, 2011). Em folhas foi encontrado, compostos fenólicos como ácido gálico; flavonoides como kaempferol e vitexina, taninos hidrolisáveis como corilagina e terpenos como combregenina e eschweilenol B (TEODORO, 2011).

1.3 Principais constituintes químicos 1.3.1 Compostos Fenólicos Quimicamente, os fenólicos são definidos como substâncias que possuem anel aromático com um ou mais substituintes hidroxílicos, incluindo seus grupos funcionais, possuem estrutura variável e com isso, são multifuncionais. Existem cerca de cinco mil fenóis, dentre eles, destacam-se os flavonoides, ácidos fenólicos, fenóis simples, cumarinas, taninos, ligninas e tocoferóis. Os fenólicos englobam desde moléculas simples até moléculas com alto grau de polimerização. Estão presentes nos vegetais na forma livre ou ligados a açúcares (glicosídios) e proteínas (ANGELO; JORGE, 2006). Ribéreau-Gayon (1968) adotou a seguinte classificação para estes compostos: pouco distribuídos na natureza, polímeros e largamente distribuídos na natureza. Na família dos compostos fenólicos pouco distribuídos estão os fenóis simples, o pirocatecol, a hidroquinona e o resorcinol. A esta família também pertencem os aldeídos derivados dos ácidos benzoicos, que são constituintes dos óleos essenciais como a vanilina. Alguns compostos fenólicos não se apresentam em forma livre nos tecidos vegetais. São aqueles presentes sob a forma de polímeros, na qual estão os taninos e as ligninas. Os taninos são compostos de alto peso molecular, que conferem ao alimento a sensação de adstringência, e classificam-se em dois grupos, baseados em seu tipo estrutural: taninos hidrolisáveis e taninos condensados. As ligninas são polímeros complexos de grande rigidez e resistência mecânica, e sua hidrólise alcalina libera uma grande variedade de derivados dos ácidos benzóico e cinâmico. Na família dos compostos largamente distribuídos na natureza estão os fenólicos encontrados geralmente em todo o reino vegetal, mas às vezes podem estar localizados em uma só planta. Estes fenólicos estão divididos em dois grandes grupos: os flavonoides e derivados e os ácidos fenólicos (ácidos benzóico, cinâmico e seus derivados) e cumarinas (RIBÉREAU-GAYON, 1968). Os compostos fenólicos são incluídos na categoria de interruptores de radicais livres, sendo muito eficientes na prevenção da autoxidação. Os antioxidantes fenólicos 27

interagem, preferencialmente, com o radical peroxil por ser este mais prevalente na etapa da autoxidação e por possuir menor energia do que outros radicais (SOARES, 2002).

1.3.2 Flavonoides Os flavonoides compõem uma ampla classe de substâncias de origem natural, cuja síntese não ocorre na espécie humana. Entretanto, tais compostos possuem uma série de propriedades farmacológicas que os fazem atuarem sobre sistemas biológicos, segundo pesquisadores, os flavonoides podem apresentar atividade antioxidante, antiinflamatória e anticancerígena entre outras (ERLUND, 2004; JIN; YIN, 2012; LIU; KANJAS; MIZUTANI, 2010; TAPAS; SAKARKAR; KAKDE, 2008). Atualmente, já foram identificadas mais de quatro mil substâncias pertencentes ao grupo dos flavonoides sendo suas maiores classes os flavonois, flavonas, flavanonas, catequinas, antocianinas, isoflavonas, diidroflavonois e chalconas (figura 2) (MACHADO, 1998; PETERSON; DWYER, 1998).

Formula estrutural Flavonoides Características Eriodictiol Podem apresentar Hesperitina sabor amargo

Catechina Co-pigmentação em Gallocatechina flores

Apigenina Co-pigmentação em Crisina flores; protetores Leteolina contra raios UV nas folhas

Kamiferol Presente em tecidos de

Miricetina madeira

Quercetina

Flavonol

Daidazina Propriedades

Genistéina estrogênicas e/ou Glicidéina antifúngicas Formononetina

Isoflavona

Fonte: Zuanazzi; Montanha, 2007 Figura 2 - Estruturas químicas de alguns flavonoides de ocorrência natural em plantas. 29

Estruturalmente, os flavonoides constituem substâncias aromáticas com 15 átomos de carbono (C15) no seu esqueleto básico, sendo compostos fenólicos, que possuem nessa estrutura anéis aromáticos (Figura 3). O esqueleto C15 dos flavonoides é biogeneticamente derivado do fenilpropano e três unidades de acetato. Portanto, flavonoides são derivados de benzo gama-pirona de origem vegetal, podendo haver facilmente interconversão entre eles. A explicação para a existência de uma grande diversidade estrutural dos flavonoides é explicada pelas modificações que tais compostos podem sofrer, tais como: hidroxilação, metilação, acilação, glicosilação, entre outras (PETERSON; DWYER, 1998).

Fonte Zuanazzi; Montanha, 2007 Figura 3 - Estrutura e numeração básica de flavonoides.

1.3.2.1. Toxicidade de flavonoides Doses elevadas podem induzir danos no DNA. Isto mostra que, embora os flavonoides constituam um dos grupos de metabólitos secundários com grande potencial terapêutico curativo e preventivo de várias enfermidades, ainda são necessários estudos clínicos e toxicológicos que permitam o emprego destas substâncias com maior segurança (ZUANAZZI; MONTANHA, 2007).

1.3.2.2. Propriedades fitoestrógenas dos flavonoides Flavonoides como a isoflavona estão inclusos dentro do grupo de fitoestrógenos que são substâncias químicas contidas nas plantas capazes de desempenhar atividades semelhantes a dos hormônios naturais quando ingeridos por um determinado organismo, os fitoestrógenos podem alterar o funcionamento do sistema endócrino no corpo humano e nos animais. Quimicamente as estruturas dos 30

flavonoides são bastante semelhantes aos dos hormônios, conforme pode ser observado na figura 4 (GHISELLI; JARDIM, 2007).

Fonte: Ghiselli; Jardim, 2007 Figura 4 - Estruturas químicas dos principais esteroides sexuais e fitoesteroides.

Durante a última década têm sido levantadas questões relacionadas com certas substâncias químicas naturais ou sintéticas, que são capazes de modular ou desregular o sistema endócrino por mimetizar ou inibir as ações dos hormônios endógenos (WITORSCH, 2002). A alteração no sistema endócrino ocorre quando o interferente endócrino interage com os receptores hormonais, modificando a sua resposta natural. Dois processos distintos podem ser desencadeados, a substância química pode se ligar ao receptor hormonal e produzir uma resposta, atuando então como um mimetizador, ou seja, imitando a ação de um determinado hormônio. Este processo é denominado de efeito agonista. Se a substância química se ligar ao receptor, mas nenhuma resposta for produzida, ela estará agindo como um bloqueador, ou seja, estará impedindo a interação entre um hormônio natural e seu respectivo receptor, este processo é denominado de efeito antagonista (GHISELLI; JARDIM, 2007). Muitos interferentes endócrinos competem com o estradiol (hormônio sexual feminino produzido naturalmente pelo organismo) pelos receptores de estrogênio. Outros competem com a diidrotestosterona (hormônio sexual masculino produzido naturalmente pelo organismo) pelos receptores de androgênio (GHISELLI; JARDIM, 2007). A propriedade agonista e antagonista dos fitoestrógenos dependem da concentração dos mesmos, da concentração dos esteroides sexuais endógenos e do órgão alvo específico envolvido na interação com os receptores de estrogênios (RE). Esse efeito pode ser explicado pela existência de dois tipos de RE: α e β (CLAPAUCH, 2002). A primeira etapa na ação de um hormônio é sua ligação a receptores específicos na célula- alvo, as células que não tem receptores para esses hormônios não respondem. Os receptores de alguns hormônios localizam-se na membrana da célula- alvo, enquanto outros receptores são encontrados no citoplasma, ou no núcleo. A combinação do hormônio com seus receptores desencadeia habitualmente, cascata de reações na célula, em que cada etapa torna-se ativada mais poderosamente de modo que até mesmo pequenas concentrações do hormônio podem exercer grande efeito (CLAPAUCH, 2002). Receptor de estrogênio (RE) refere-se a um grupo de receptores que são ativados pelo hormônio 17β-estradiol (estrogênio). Os dois subtipos de RE mais conhecidos são o receptor de estrogênio α (REα) e o receptor de estrogênio β (REβ). Os α-receptores são os principais receptores encontrados na mama e no útero, e os 32

β-receptores no osso e no sistema cardiovascular. Esses dois subtipos variam quanto a estrutura e seus genes codificantes se encontram em diferentes cromossomos. O gene do REα foi mapeado a partir do braço longo do cromossomo 6, enquanto o REβ está localizado na banda q22-24 do cromossomo 14. Além disso, ambos subtipos apresentam diferenças de expressão nos vários tecidos e também diferentes afinidades por ligantes (GRUBER et al., 2002) Os flavonoides agem sobre a enzima estrogênio sintetase do citocromo P-450, que catalisa a conversão de androgênios para estrogênios (formados a partir do colesterol). O flavonoide quercetina tem ação inibidora sobre a transformação da androstenodiona para estrona e de testosterona para estradiol. Assim, os flavonoides podem competir com os esteroides, e a interação dos flavonoides com certas monoxigenases alteram a sua atividade e consequentemente o metabolismo dos hormônios esteroidais (LIMA et al., 2001). Estudos realizados em roedores expostos a fitoestrógenos como a genisteína, durante o período fetal e pós-natal descreveram uma série de alterações de desenvolvimento como baixo peso corporal e distância ano-genital acima do normal (BECKER et al., 2005). Estudos in vivo da estrogenicidade de flavonoides mostraram a capacidade destes produtos químicos em aumentar o número de receptores de estrogênio alfa (ERα) no útero de ratos, sendo que este aumento pode potencializar o efeito estrogênico sobre o organismo, assim fêmeas prenhes poderão sofrer disfunções endócrinas no período gestacional (BREINHOLT et al., 2000).

1.3.3 Taninos Os taninos são divididos de acordo com a estrutura química em dois grandes grupos: taninos hidrolisáveis e taninos condensados. Taninos hidrolisáveis (figura 5) possuem um grupo poliol central (em sua maioria, é β-d- glicose, mas também o ácido quínico, outros fenóis e outros glicósidos) e hidroxilas esterificadas pelo ácido gálico (parte fenólica). Os taninos hidrolisáveis são ainda classificados em galotaninos e elagitaninos (KHANBABAEE; REE, 2001). 33

Fonte: Nakamura et al., 2003 Figura 5 - Estrutura de taninos hidrolisáveis. Os taninos condensados ou proantocianidinas estão distribuídos por diversas famílias do reino vegetal, em geral, em plantas lenhosas. São polímeros de flavan-3- ol e/ou flavan-3,4-diol (figura 6), produtos do metabolismo do fenilpropanol (HEIL et al., 2002).

Fonte: Santos; Mello, 2007. Figura 6 - Estrutura química de taninos condensados.

A ligação entre taninos e proteínas ocorre, provavelmente, através de pontes de hidrogênio entre os grupos fenólicos dos taninos e determinados sítios das proteínas. Na formação dessas ligações é necessário que o peso molecular dos taninos esteja compreendido entre limites bem definidos; se este é demasiadamente elevado, a molécula não pode se intercalar entre os espaços interfibrilares das proteínas ou macromoléculas; se é muito baixo, a molécula fenólica se intercala, mas 34

não forma número suficiente de ligações que assegure a estabilidade da combinação (SANTOS; MELLO, 2007). Por serem fenólicos, os taninos são muito reativos quimicamente, formam pontes de hidrogênio, intra e intermoleculares. Um mol de taninos pode ligar-se a doze moles de proteínas; e com base nessa propriedade pode-se identificar taninos por teste de precipitação de gelatinas. Estes compostos são facilmente oxidáveis, tanto pelas enzimas vegetais específicas quanto por influência de metais, como cloreto férrico, o que ocasiona o escurecimento de suas soluções (SANTOS; MELLO, 2007).

1.3.3.1 Propriedades farmacológicas Diversos estudos sobre atividade dos taninos evidenciaram importante ação antibacteriana, antifúngica, ação sobre protozoários, na reparação de tecidos, regulação enzimática e proteica, entre outros. Estes efeitos dependem da dose, tipo de tanino ingerido e período de ingestão (BUZZINI et al., 2008; OKUDA, 2005; SERRANO et al., 2009). O uso de medicamentos com taninos está relacionado à suas propriedades adstringentes, sendo empregado como antidiarreico, antisséptico; cicatrizante na proteção da pele e mucosas (MONTEIRO et al., 2005) Ao precipitar proteínas, os taninos propiciam efeito antimicrobiano e antifúngico. Ainda são hemostáticos e, como precipitam alcaloides, pode servir de antídoto em casos de intoxicações. Em processos de cura de feridas, queimaduras e inflamações, os taninos auxiliam formando camada protetora (complexo tanino- proteína e/ ou polissacarídeo) sobre tecidos epiteliais lesionados (SANTOS; MELLO, 2007). Provavelmente, devido à habilidade de ligar-se às proteínas e outras macromoléculas, os taninos têm atividades tóxicas. AYRES et al (1997) verificaram que a rápida mortalidade de insetos tratados com taninos condensados parece ser devido à atividade tóxica destes compostos e não pela inibição da digestibilidade. Associa-se a alta toxicidade ao maior peso da molécula. Outro mecanismo de toxicidade com taninos deve-se ao fato desses complexarem-se com facilidade a íons metálicos. Sistemas biológicos, incluindo microrganismos, necessitam de íons metálicos como cofatores enzimáticos (MONTEIRO et al., 2005). 35

Os taninos são considerados nutricionalmente indesejáveis, pois precipitam proteínas, inibem enzimas digestivas e afetam a utilização de vitaminas e minerais podendo, ainda, em alta concentração, desenvolver câncer de boca (mucosa) e esôfago (CHUNG; WEI; JOHNSON, 1998; SINGH et al., 2001).

1.3.4 Lignanas As lignanas são substancias que se depositam nas paredes das células vegetais, conferindo a esta notável rigidez. As lignanas são macromoléculas, polímeros de unidades básicas C6-C3, abrangendo, usualmente, muitas unidades fenilpropânicas. Lignanas (o latim lignum= madeira, lenho) são dímeros formados através de acoplamento oxidativo de álcoois cinamílicos entre si ou destes com ácidos cinâmicos. As lignanas são amplamente distribuídas no reino vegetal, encontra-se principalmente em as plantas lenhosas (BARBOSA FILHO, 2007). Pode-se dizer que não existem reações químicas gerais, de coloração ou de precipitação, para detectar lignoides em extratos vegetais. Quanto à polaridade dos mesmos, pode-se generalizar e dizer que seus precursores biogenéticos são bons indicadores do comportamento dessas substâncias junto aos solventes usuais. Assim, as neolignanas, que são dímeros fenilpropanoídicos, são solúveis em solventes apolares, as lignanas são extraídas efetivamente com álcoois como metanol, etanol e butanol (BARBOSA FILHO, 2007).

1.3.4.1 Propriedades farmacológicas

O elevado número de lignanas e neolignanas distribuídas no reino vegetal leva a suposição de que as propriedades biológicas dessas substâncias sejam essenciais ao desenvolvimento do próprio vegetal e ao controle deste sobre a vida circunjacente. Por isso não é de se admirar que também essas substâncias possam ser aproveitadas diretamente pelo homem servindo de modelo para a síntese de fármacos. Nesse sentido, existem dezenas de relatos na literatura sobre atividades biológicas comprovadas desse grupo (BARBOSA FILHO, 2007). Lignanas têm atraído muito interesse ao longo dos anos em conta de sua ampla gama de atividades biológicas. Dentro delas podem ser citada atividade leishmanicida, antimaláricos, atividade estrogênicas, anti-inflamatória e 36

antitumoral (BARATA et al., 2000; DURING, et al., 2012; HUI; ZHAO; ZHU, 2012; PIANJING et al., 2011).

1.4 Toxicidade

A utilização indiscriminada de plantas pela população pode ser considerada como um risco, uma vez que estas não são inócuas e podem apresentar efeitos adversos à saúde. A utilização de doses extremamente altas ou por períodos prolongados, ou ainda por via de administração incorreta, aumenta a probabilidade de causar efeitos tóxicos nos seres humanos e nos animais (GÓRNIAK, 2008). Buchenavia tomentosa foi relatada pelos produtores como causadora de abortamentos em bovinos no estado do Tocantins. De fato, a inclusão de 10% de frutos de B. tomentosa na ração de ratas fêmeas prenhes (1º ao 21º dia de gestação) produziu diminuição do peso materno e retardo no desenvolvimento físico de filhotes machos, tais alterações estão possivelmente relacionadas à presença de compostos químicos de ação estrogênica presentes na planta (NUNES et al., 2010). Na avaliação da fertilidade em ratos a ingestão dos frutos da planta causou efeito deletério nas fêmeas como reduções significativas no número de implantação, número total de fetos vivos, peso do útero gravídico, peso dos fetos e peso das placentas e toxicidade moderada em machos, traduzida por diminuição progressiva de peso durante os últimos dias do tratamento assim como também apresentaram um menor ganho de peso durante o período de tratamento quando comparados ao grupo controle (MAZZINGHY; ADAMS; MARUO, 2009). Assim, considerando que a B. tomentosa pode ser ingerida por animais de produção em idade fértil e em condições naturais torna-se importante avaliar seus efeitos sobre a reprodução bem como isolar e identificar seus princípios tóxicos por meio de estudos fitoquímicos.

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OBJETIVOS

1. Objetivo geral Avaliar a toxicidade subcrônica e reprodutiva de extratos de B. tomentosa em ratos Wistar.

1.1 Objetivo específico Avaliar o perfil fitoquímico dos extratos dos frutos de Buchenavia tomentosa da região do Tocantins e determinar toxicidade dos extratos frente a Artemia salina. Avaliar os possíveis efeitos tóxicos da administração subcrônica e reprodutiva do extrato bruto de B. tomentosa em ratos Wistar. Avaliar os possíveis efeitos tóxicos da administração subcrônica e reprodutiva dos extratos butanólico e aquoso de B. tomentosa em ratos Wistar.

CAPÍTULO II

Estudo fitoquímico e toxicidade dos extratos de Buchenavia tomentosa em Artemia salina

Phytochemical study and toxicity of Buchenavia tomentosa extracts in Artemia salina

RESUMO Buchenavia tomentosa, planta da família Combretaceae, popularmente conhecida como mirindiba, tem ocorrência em diversos biomas brasileiros, com predominância no amazônico. A ingestão dos frutos por ruminantes está associada à ocorrência de abortos, nascimento de animais fracos e morte. Objetivou-se realizar a análise fitoquímica os extratos obtidos de B. tomentosa a partir de tratamento fitoquímico e avaliar a toxicidade destes extratos em larvas de Artemia salina. O extrato bruto foi obtido por percolação em etanol e rotaevaporado, do qual, obteve-se o extrato hexânico, acetático, butanólico e aquoso para identificação de classes de taninos, fenóis, saponinas, alcaloides, flavonoides, esteroides, triterpenoides, açúcares redutores e polissacarídeos. Dez exemplares de náuplios de A. salina foram colocados em tubos de ensaio contendo 10 mL de solução salina com frações dos extratos hexânico, acetático, butanólico e aquoso, (nas concentrações de 104 a 10-4 µg/mL) em triplicata. Os tubos foram mantidos sob luz artificial por um período de 24 horas e após esse período foi realizada a contagem do número de náuplios sobreviventes e o cálculo da CL50. Os testes fitoquímicos demonstraram a presença de taninos, saponinas, flavonoides, esteroides, triterpenos e açúcares redutores. A CL50 do extrato hexânico foi de 14,26µg/mL, extrato acetático 6,93µg/mL, extrato butanólico 0,14 µg/mL e do extrato aquoso 0,09µg/mL. O extrato butanólico e aquoso são os extratos que apresentaram maior atividade sobre a A. salina e possivelmente os compostos encontrados nesses extratos (taninos, flavonoides e saponinas) podem provocar as alterações reprodutivas encontradas em mamíferos. Em conclusão, o trabalho demostrou que os extratos com maior toxicidade para Artemia salina são os que apresentam compostos que podem causar alterações reprodutivas, mostrando assim a importância de estudar o perfil fitoquímico dos frutos de B. tomentosa.

Palavras chaves: Mirindiba, intoxicação, toxicologia.

ABSTRACT Buchenavia tomentosa plant Combretaceae family, popularly known as mirindiba has occurrence in several biomes, predominantly in the Amazon.The fruit ingestion by ruminants is associated with the occurrence of abortions, birth of weak calves and death.This study aimed to perform phytochemical analysis of The extracts obtained B. tomentosa and to evaluate the toxicity of these extracts on larvae of Artemia salina. The crude extract was obtained from percolation in ethanol and rotaevaporado, to which was obtained hexane, acetate, butanolic and aqueous extract, the extracts was subjected to preliminary phytochemical analysis to identify the main classes of secondary metabolites, tannins, phenols, saponins, alkaloids, flavonoids, steroids, triterpenoid, reducing sugars and polysaccharides. Ten specimens of nauplii of A. saline were placed in test tubes containing 10 ml of saline fractions from hexane extracts acetático, aqueous and butanolic (at concentrations of 10-4 to 104 µg/mL) in 46

triplicate. The tubes were kept under artificial light for a period of 24 hours and after this period counts of survivor’s nauplii were performed and LC50 was calculated. The tests phytochemicals showed the presence of tannins, saponins, flavonoids, steroids, triterpenes and reducing sugars. The LC50 of the hexane extract was 14.26 µg/mL, extract acetate 6.93 µg/mL, butanol extract 0.14 µg/mL of the aqueous extract 0.09 µg/mL.The butanolic and aqueous extracts are extracts that showed greater activity on A. saline and possibly the compounds found in these extracts (tannins, flavonoids and saponins) may cause reproductive alterations found in mammals. In conclusion, the work demonstrated that the extracts with higher toxicity to Artemia salina are those with compounds that may cause reproductive disturbances, thus demonstrating the importance of studying the phytochemical profile of the fruits of B. tomentosa.

Keywords: Mirindiba, poisoning, toxicology.

1. INTRODUÇÃO

Buchenavia tomentosa é uma planta pertencente à família Combretaceae, conhecida popularmente como mirindiba. Esta árvore arbórea pode chegar a 30 metros de altura, é encontrada nos biomas de Caatinga, Cerrado, Pantanal, Mata Atlântica e principalmente Amazônia, onde apresenta maior concentração (LORENZI, 2009; MARQUETE; VALENTE, 2005). Os frutos da mirindiba são consumidos por pantaneiros e sua casca é utilizada para o tratamento de afecções pulmonares (POTT; POTT, 1986; POTT; POTT; SOBRINHO, 2004). Por outro lado há relatos de produtores de gado que a ingestão de frutos da planta está associada à ocorrência de abortos, nascimento de animais fracos e morte (COSTA et al., 2011; MELLO et al., 2010). Experimentalmente estudo conduzido em nossos laboratórios demostrou que a inclusão de 10% do fruto de mirindiba na ração de fêmeas no período gestacional induz aumento do peso materno e retardo no desenvolvimento físico de filhotes machos (NUNES et al., 2010). Em estudo de fertilidade em ratos machos e fêmeas, foi verificado efeitos deletérios nas fêmeas, tais como: diminuição no número de implantação, número total de fetos vivos, no peso do útero gravídico, dos fetos e da placenta. Nos machos ocorreu diminuição no peso e no ganho de peso. Tais alterações possivelmente estão relacionadas à presença de compostos químicos de ação estrogênica presentes na planta (MAZZINGHY; ADAMS; MARUO, 2009). A análise fitoquímica de frutos de B. tomentosa do estado do Mato Grosso do Sul apresentou compostos fenólicos como galato de etila, galato de metila e ácido gálico, taninos hidrolisáveis como corilagina e buchenavina; lignanas em mistura de 47

pinoresinol com epipinoresinol (BATISTA, 2011). Porém, sabe-se, que a morfo- fisiológia das plantas são influenciadas pelos fatores edafoclimáticos do ambiente o qual se desenvolvem o que consequentemente, promovem alterações nos metabólitos secundários (GOBBO NETO; LOPES, 2007). A toxicidade geral de compostos químicos obtidos de produtos naturais tem sido amplamente investigada por meio de bioensaio com micro crustáceo Artemia salina (MACIEL; PINTO; VIEGAS JUNIOR, 2002; PIMENTA et al., 2003). Além disso, o teste com A. salina tem sido útil para predizer a toxicidade in vivo, já que os testes com extratos de plantas apresentaram alta correlação entre os estudos em A. salina e ratos (PARRA et al., 2001). Assim, objetivou-se avaliar o perfil fitoquímico dos extratos hexânico, acetático, butanólico e aquosos obtidos dos frutos de Buchenavia tomentosa do estado do Tocantins e a toxicidade desses extratos em larvas de Artemia salina para predizer quais possíveis classes de componentes podem causar alterações reprodutivas.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Coleta e identificação da Buchenavia tomentosa Os frutos de Buchenavia tomentosa foram coletados em propriedades rurais na região de Araguaína - TO, Brasil (07º11'28" Sul 48º12'26" Oeste) nos meses de julho e agosto de 2011, período de frutificação da planta. Exsicata da planta foi identificada no herbário da Universidade Federal do Tocantins - UFT, Campus Universitário de Porto Nacional e receberam o registro HTO-9765. As sementes dos frutos foram removidas, sendo aproveitada a casca e a polpa, as quais foram acondicionadas em sacos plásticos e mantidas em freezer -20ºC até o momento de utilização.

2.2 Preparação dos extratos A casca e a polpa do fruto foram percoladas durante duas semanas utilizou-se 1L de solução etanólica (92%) para cada quilograma de fruto. Ao término desse período, o material foi filtrado em papel filtro e rotaevaporado sob pressão reduzida (Fisatom® Mod. 801), obtendo-se o extrato bruto (EB). O EB foi pesado em balança analítica e o seu rendimento calculado considerando a massa do extrato obtida após a rotaevaporação do solvente e a massa inicial do material vegetal. 48

O EB da planta foi submetido ao particionamento por polaridade com solventes (Figura 1). Para isso, 10 g do EB foi ressuspendido em 150 mL de água destilada e extraído por três vezes com 150 mL de hexano. Separada a solução hexânica, procedeu-se a extração por três vezes da fase hidroalcóolica com 150 mL de acetato de etila, dando origem à solução acetática. A obtenção da solução butanólica ocorreu dá extração por três vezes da fase hidroalcoólica com 150 mL de butanol. A solução residual obtida das sucessivas lavagens por solventes orgânicos deu origem ao extrato aquoso (EA). Ao final da etapa de partição cada fração foi concentrada em evaporador rotativo e foram obtidos quatro extratos, a saber: hexânico, acetático, butanólico e aquoso. Subsequentemente todos os extratos foram identificados e mantidos em freezer a -20ºC até o momento de sua utilização.

10g de Extrato bruto de B. tomentosa (diluído em 150 ml de água destilada)

1º Partição 3 lavagens utilizando 150mL de hexano Rotaevaporação

Extrato hexânico Extrato aquoso 2º Partição 3 lavagens utilizando 150mL de acetato

Rotaevaporação

Extrato acetático Extrato aquoso 3º Partição 3 lavagens utilizando 150mL de butanol

Rotaevaporação Rotaevaporação

Extrato butanólico Extrato aquoso

Figura 1 – Particionamento do extrato bruto de B. tomentosa por polaridade de solventes.

2.3 Marcha analítica de identificação de classes de metabólito secundário Os extratos hexânico, acetático, butanólico e aquoso foram submetidos à triagem fitoquímica para detecção de alcaloides, taninos, flavonoides, saponinas, 49

esteroides e açúcares por meio de reações químicas que resultam no desenvolvimento de coloração e/ou precipitado, característico para cada classe de substância (FALKENBERG; SANTOS; SIMÕES, 2007; MATOS, 1997).

2.3.1 Teste para Taninos e Fenóis Em tubo de ensaio contendo 4 mL de solução (água destilada e extrato na proporção 1:1) dos extratos hexânico, acetático, butanólico ou aquoso de B. tomentosa adicionou-se três gotas de solução de cloreto férrico (FeCl3) a 10%, agitando o tubo por alguns instantes. Foi feito o branco com água destilada e cloreto férrico para comparação. Coloração variável entre azul e vermelho foi indicativo da presença de fenóis, formação de precipitado escuro com tonalidade azul indicou a presença de taninos hidrolisáveis e coloração verde, taninos condensados.

2.3.2 Teste para Saponinas Em 2 mL dos extratos hexânico, acetático, butanólico ou aquoso foi adicionado 2 mL de clorofórmio e 4 mL de água destilada. A solução foi filtrada para tubo de ensaio, o qual foi agitado por 3 minutos e observou-se a formação de espuma. A presença de espuma abundante e persistente (colarinho) indicou a presença de saponinas.

2.3.3 Teste para Flavonoides O teste de cianidina ou Shinoda (ácido clorídrico e magnésio) foi empregado para detecção de flavonoides. Em tubo de ensaio contendo 4 mL de solução (água destilada e extrato na proporção 1:1) dos extratos hexânico, acetático, butanólico e aquoso adicionou 0,5 mL de HCl e 0,5 cm de Mg em fita. O surgimento de coloração laranja a vermelha na solução indicou reação positiva.

2.3.4 Teste para Alcaloides Para cada extrato foram utilizados dois tubos de ensaio, cada um 4 mL de solução (água destilada e extrato na proporção 1:1) do extrato. Foram adicionados a cada tubo três gotas de reagente para alcaloides: Hager (solução saturada de ácido pícrico) e ou Dragendorff (iodo-bismutato de potássio). O aparecimento de precipitado 50

de coloração vermelho tijolo é positivo no reagente Dragendorff e a formação de precipitado amarelo, positivo no reagente Hager.

2.3.5 Teste para Esteroides e Triterpenoides 0,1 g dos extratos secos (hexânico, acetático, butanólico e aquoso) foram dissolvidos em 10 mL de clorofórmio. O conteúdo foi filtrado e transferido para tubo de ensaio, no qual foi adicionado 1 mL de anidrido acético, sendo agitado suavemente, e em seguida, adicionadas 3 gotas de ácido sulfúrico. O tubo foi novamente agitado, o desenvolvimento de coloração azul ao verde persistente indicou resultado positivo.

2.3.6 Teste para Açúcares redutores 0,1g dos extratos (hexânico, acetático, butanólico e aquoso) foram dissolvidos em 5mL de água destilada. A seguir foi adicionado 2 mL do reativo de FEHLING A (sulfato de cobre e água destilada) e 2 mL do reativo de FEHLING B (tartarato de sódio e potássio, permanganato de potássio e água destilada) a solução foi aquecida em banho maria a 100ºC durante 5 minutos. O aparecimento de precipitado de coloração vermelho tijolo, indicou presença de açúcares redutores. Quando não houve formação de precipitado procedeu-se da seguinte forma: 0,1 g do extrato foi dissolvido em 5 mL de água destilada. A seguir adicionado 1 mL de HCl, fervido em banho maria durante 10 minutos. Após resfriamento, neutralizou com solução de NaOH a 20%. O conteúdo foi filtrado e adicionado 2 mL do reativo de FEHLING A e 2 mL de FEHLING B, sendo a solução aquecida em banho maria por 5 minutos. O aparecimento de precipitado de coloração vermelho, indicou reação positiva para açúcares não redutores ou heterosídios.

2.3.7 Teste para Polissacarídeos 0,1g dos extratos (hexânico, acetático, butanólico e aquoso) foram dissolvidos em 5 mL de água destilada, quando necessário o conteúdo foi filtrado. Depois foram adicionadas 2 gotas de lugol (iodeto de potássio e iodo). O aparecimento de coloração azul indicou resultado positivo.

2.4 Ensaio de citotoxicidade frente à A. salina A avaliação da citotoxicidade frente à A. salina foi realizada segundo metodologia adaptada, descrita por McLaughlin; Rogers; Anderson (1998). 51

Inicialmente foi preparado 1litro de solução de sal marinho artificial (30g de sal marinho sintético MarineMix® em 1 litro de água destilada) para incubação dos ovos de A. salina Maramar® (10 mg), os quais foram expostos à luz artificial (lâmpada incandescente de 100W) durante 24 horas para eclosão das larvas. O ensaio foi realizado em triplicatas, dez exemplares de náuplios em tubos de ensaio contendo 10 mL de solução salina, com os extratos hexânico, acetático, butanólico e aquoso, nas concentrações de 10000, 1000, 100, 10, 1, 0,1 0,01, 0,001 e 0,0001 μg/mL. Foi utilizado um grupo controle preparado nas mesmas condições somente com solução de sal marinho nos tubos de ensaio. Os tubos foram mantidos sob luz artificial por período de 24 horas. Após esse período, foi realizada a contagem do número de náuplios sobreviventes do grupo controle e dos grupos expostos aos extratos. O percentual de mortos foi calculado pela fórmula: % de mortos = ((total de náuplios–náuplios vivos) x100 /total de náuplios) em seguida calculou-se a CL50 por meio da análise de regressão linear.

3. RESULTADOS

O rendimento do extrato bruto (EB) dos frutos frescos sem semente foi de 10%. Durante, o particionamento por solventes com diferentes polaridades os melhores rendimentos foram os obtidos nos extratos: Butanólico (EBU), Aquoso (EA), Acetático (EAE) e Hexânico (EH) (Quadro 1).

Quadro 1 – Rendimento dos extratos (hexânico, acetático, butanólico e aquoso) de B. tomentosa. Extrato Rendimento Extrato hexânico 1% Extrato acetático 4% Extrato butanólico 59% Extrato aquoso 36%

O estudo fitoquímico dos extratos hexânico, acetático, butanólico e aquoso do fruto de B. tomentosa revelou a presença de taninos, saponinas, flavonoides, esteroides e terpenoides e açúcares redutores (Quadro 2). 52

Quadro 2 – Estudo fitoquímico de extratos B. tomentosa.

Classe de Metabólito Extratos B. tomentosa Pesquisada Hexânico Acetático Butanólico Aquoso Alcaloides - - - - Taninos - + + - Saponinas - + + + Flavonoides - - + + Esteroides e + + - - triterpenoides Açúcares redutores - + + - Açúcares não - - - - redutores Polissacarídeos - - - - + Presença; - Ausência.

A Tabela 1 apresenta a média de óbitos de A. salina ocorridos na presença das diferentes concentrações dos extratos testados. A Tabela 2 apresenta as CL50 dos extratos e a Figura 2 o logaritmo das concentrações x mortalidade das Artemia. Tabela 1– Média da mortalidade (%) de A. salina frente os extratos testados e suas respectivas concentrações.

Concentração Hexânico Acetático Butanólico Aquoso Controle (µg/mL) 0,0001 3,3 3,3 13 13 0 0,001 6,7 6,7 23 30 0 0,01 10 13,3 33 40 0 0,1 13 23,3 40 46 0 1 26 33 60 63 0 10 40 40 80 80 0 100 56 60 93 86 0 1000 73 80 100 100 0 10000 100 100 100 100 0

Tabela 2 – Concentrações letais de 50% (CL50) dos extratos de B. tomentosa sobre Artemia salina.

Extrato CL50 Equação da reta Valor de R µg/ mL

Hexânico 14,26 y = 11,745x + 36,444 R² = 0,9083 Acetático 6,93 y = 11,947x + 39,956 R² = 0,9414 Butanólico 0,14 y = 12,317x + 60,222 R² = 0,9688 Aquoso 0,09 y = 11,4x + 62 R² = 0,9803

100 90 80

mortalidade % de 60 50 40 30 20 10 0 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 Log da concentração Extrato hexânico Extrato Acetático Extrato butanólico Extrato aquoso

Figura 2 – Mortalidade x logaritmos das concentrações dos extratos hexânico, acetático, butanólico e aquoso. 4. DISCUSSÃO

Os maiores rendimentos foram observados nos extrato butanólico e aquoso (Quadro 1). O solvente butanol possui afinidade por compostos químicos de alta polaridade como taninos, saponinas e flavonoides. O solvente acetato de etila possui afinidade por compostos de média polaridade como xantonas, ácidos triterpênicos e alcaloides e o solvente hexânico (EH) por compostos químicos de baixa polaridade como isopropenos, alcaloides e esteroides, terpenos e acetofenonas (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998). A pesquisa fitoquímica tem como objetivo identificar os constituintes químicos de espécies vegetais ou determinar sua presença, indicando assim a relevância de classes de metabolismo secundário, que constituem os princípios ativos vegetais (FALKENBERG; SANTOS; SIMÕES, 2007). Através da investigação fitoquímica dos extratos dos frutos de Buchenavia tomentosa observou a presença de importantes classes de metabólitos secundários como taninos, saponinas, esteroides, flavonoides além de açúcares redutores (Quadro 2). Esses dados assemelham-se ao perfil fitoquímico encontrado na família Combretaceae e com o gênero Buchenavia (ELOFF; KATERERE; MCGAW, 2008; OLIVEIRA, et.al.; 2012). O estudo de Batista (2011) levou ao isolamento de seis 54

compostos fenólicos (três ácidos fenólicos, dois taninos e uma lignana). Compostos fenólicos são substâncias amplamente distribuídas no reino vegetal, em particular nos frutos e folhas e englobam uma gama enorme de substâncias (fenóis simples, ácidos fenólicos, cumarinas, flavonoides, taninos e ligninas) (SOARES, 2002). Assim, os compostos isolados dos frutos no estado do Tocantins possui perfil semelhante aos compostos isolados no estado do Mato Grosso do Sul e as diferenças encontradas podem ser relacionadas à sazonalidade, ritmo circadiano, desenvolvimento vegetal, temperatura, disponibilidade hídrica, fotoperíodo, altitude e ambiente edáfico que são fatores que influenciam a produção dos metabólitos secundários das plantas (GOBBO NETO; LOPES, 2007). Os extratos de B. tomentosa submetidos ao bioensaio de citotoxicidade sobre Artemia salina demonstram que o extrato dos frutos possui quantidade elevada de substâncias ativas (CL50 < 1000 µg/mL) (Tabela 2). CL50 superior a 500 μg /mL são classificadas como substâncias de baixa toxicidade; moderada para CL50 entre 100 a

500 µg / mL e muito tóxico quando a CL50 foi inferior 100 µg / mL (MEYER et al., 1982). O teste da A. salina tem sido útil para predizer a toxicidade in vivo, já que os testes com extratos de plantas apresentam alta correlação entre os estudos em A. salina e ratos, evidenciando que extratos com maiores atividades in vitro são aqueles que apresentam maior atividade in vivo (PARRA et al., 2001; SAHGAL et al., 2010). A correlação é de tal forma que a CL50 na Artemia <10 µg/ml corresponderia na DL50 entre 100 e 1000 mg/kg; CL50 <20 µg/ml na DL50 corresponderia entre 1000 e 2500 mg/kg, e CL50> 25 µg/mL, possui DL50 entre 2500 e 8000 mg/kg (PARRA et al., 2001). Baseado nos dados encontrados no estudo o extrato butanólico e aquoso são os extratos que apresentaram maior atividade sobre a A. salina, possivelmente os compostos encontrados nesses extratos (taninos, flavonoides e saponinas), podem acarretar as possíveis alterações reprodutivas encontradas nos estudos com ratos (MAZZINGHY; ADAMS; MARUO, 2009; NUNES et al., 2010). Sabe-se que os flavonoides demonstraram ter afinidade por receptores estrogenicos α (HAVSTEEN, 2002) que estão presentes em todas as células do endométrio e também nas células envolvidas no processo de decidualização (LI; DAVIS, 2007). Estudos in vivo da estrogenicidade de flavonoides mostraram a capacidade destes em aumentar o número de receptores de estrogênio alfa (ERα) no útero de ratas, sendo que este aumento pode potencializar o efeito estrogênico sobre o 55

organismo, assim fêmeas prenhes poderão sofrer disfunções endócrinas no período gestacional (BREINHOLT et al., 2000). Propriedades abortivas, anti- zigoticas e anti-implantação têm sido atribuídas à ação das saponinas (TEWARY; CHATURVEDI; PANDEY, 1973; STOLZENBERG; PARKHURST, 1976; FRANCIS et al., 2002; PADMASHALI et al, 2006; YAKUBU et al, 2010; DABHADKAR; ZADE, 2012). A estrutura química das saponinas é semelhante à de alguns hormônios esteroides (tais como progesterona e testosterona), podendo influenciar na atividade ou no nível de diversos hormônios, provocando alterações reprodutivas (WINA et al.,2005). A partir dos resultados observados pode-se explanar que, devido a alta correlação conhecida entre os ensaios toxicológicos in vitro e in vivo, os extratos de maior toxicidade em Artemia salina são os mais plausíveis de apresentarem compostos promotores de alterações deletérias na reprodução em mamíferos, tornando essencial o estudo fitoquímico dos frutos da mirindiba do estado do Tocantins.

5. REFERÊNCIAS

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CAPÍTULO III

Toxicidade subcrônica e reprodutiva do extrato bruto de Buchenavia tomentosa em ratos Wistar.

Subchronic and reproductive toxicity of the crude extract of Buchenavia tomentosa in Wistar rats.

RESUMO Buchenavia tomentosa, é uma planta arbórea comumente encontrada em florestas neotropicais e atlânticas, caatinga e cerrado brasileiro tendo sua maior concentração na região amazônica. Surtos de intoxicação espontânea dos frutos de B. tomentosa já foram descritos em caprinos, ovinos e bovinos. Segundo produtores de gado, a ingestão da planta por vacas prenhes estaria associada à ocorrência de abortamento. Assim, objetivou-se, avaliar os possíveis efeitos tóxicos da administração do extrato bruto de B. tomentosa sobre os parâmetros sistêmicos e reprodutivos de ratos Wistar. As cascas e polpas do fruto foram percoladas em etanol e concentradas em rotaevaporador para obtenção do extrato bruto (EB). Os animais foram divididos de forma inteiramente casualizada em dois grupos: 30 animais no grupo controle (veículo) e 30 animais no grupo experimental. A administração ocorreu via gavagem e a dose do extrato foi correspondente àquela consumida se o fruto fresco fosse a única fonte de alimentação. Nas fêmeas foi realizada durante 30 dias, na fase de coabitação e nos dias de gestação (GD) 0 a 20, nos machos, durante 30 dias e na fase de coabitação. Após o acasalamento, ou no final do período de coabitação, os machos foram anestesiados para a coleta de sangue, eutanasiados e necropsiados para a coleta de órgãos. No DG21 as fêmeas foram anestesiadas, para a coleta de sangue, eutanasiadas e necropsiadas para avaliação dos parâmetros reprodutivos, foi realizada a coleta de órgãos para avaliação histopatológica. A administração do extrato bruto de B. tomentosa para ratos fêmeas e machos não produziu diferenças significativas nos consumos de água, ração e no peso diário. Não foram observadas diferenças significativas nas análises hematológicas, bioquímicas, hormonais, peso relativo, avaliação anatomohistopatologica e os parâmetros reprodutivos. Conclui-se que o extrato de B. tomentosa nessas condições de administração não apresentou toxicidade sobre ratos e não alterou os parâmetros reprodutivos.

Palavras chaves: Mirindiba, toxicologia reprodutiva, intoxicação, toxicidade.

ABSTRACT Buchenavia tomentosa is an arboreal plant commonly found over in neotropical forests, Atlantic, caatinga, Brazilian cerrado has its largest concentration in the Amazon region. Spontaneous outbreaks of intoxication the fruits of B. tomentosa already been described in goats, sheep and cattle. According to producers the cattle, the plant ingested by pregnant cows would be associated with occurrence of abortion. So, this study aimed to evaluate the possible toxic effects of the administration of the crude extract of B. tomentosa on systemic and reproductive parameters of Wistar rats. Peel and pulp of B. tomentosa were percolated in ethanol and concentrated in rotary 61

evaporator at 45° C to obtain crude extract (EC). The animals were divided randomly into two groups: 30 animals in the control group (vehicle) and 30 animals the experimental group. The administration was by gavage and the dose of the extracts was corresponding to that is consumed fresh fruit were the only source of nutrition. Males were treated for 30 days and during cohabitation and females for 30 days and during cohabitation and gestational periods (GD20).After mating, or at the end of the period of cohabitation, males were anesthetized for blood collection, euthanized and necropsied to collect organs. In GD 21 females were anesthetized for blood collection, necropsied for reproductive parameters evaluation, and were collected organs for histopathological evaluation. The administration of the crude extract of B. tomentosa for male and female rats produced no significant difference in water consumption, feed consumption and daily weight. There were no significant differences in analysis of hematological parameters, biochemistry, hormonal, relative weight and there was no alteration in the evaluation anatomohistopatologica and reproductive parameters were not affected. It is concluded that the extract of B. tomentosa in these conditions of administration showed no toxicity on rats and did not change reproductive parameters.

Keywords: Mirindiba, reproductive toxicology, poisoning, toxicity.

1. INTRODUÇÃO

Buchenavia tomentosa (Combretaceae), conhecida popularmente como mirindiba, é uma planta arbórea comumente encontrada em florestas neotropicais e atlânticas, caatinga e cerrado brasileiro tendo sua maior concentração na região amazônica (LORENZI, 2009; MARQUETE; VALENTE, 2005). Surtos de intoxicação espontânea dos frutos de B. tomentosa já foram descritos em caprinos, ovinos e bovinos. Os sinais clínicos observados nessas intoxicações foram diarreia, focinho seco, fraqueza, perda de peso, nascimento de animais fracos, abortamento e morte (COSTA et al., 2011; MELLO et al., 2010). Análise fitoquímica dos frutos de B. tomentosa revelou a presença de: compostos fenólicos como galato de etila, galato de metila e ácido gálico; taninos hidrolisáveis como corilagina e buchenavina; lignanas em mistura de pinoresinol com epipinoresinol (BATISTA, 2011). Substâncias fenólicas como os flavonoides têm sido relatados em possuir atividade estrogênica e propriedades antioxidantes, antibacteriana e antifúngica (ERLUND, 2004; JIN; YIN, 2012; LIU; KANJAS; MIZUTANI, 2010; STROHEKER et al., 2003). As lignanas possuem atividades estrogênicas, anti-inflamatória e antitumoral (DURING, et al., 2012; HUI; ZHAO; ZHU, 2012; PIANJING et al., 2011). 62

Os taninos são descritos por possuírem atividade antibacteriana e antifúngica (BUZZINI et al., 2008; OKUDA, 2005; SERRANO et al., 2009). Experimentalmente a inclusão de 10% do fruto de mirindiba na ração de fêmeas no período gestacional induziu diminuição do peso materno e retardo no desenvolvimento físico de filhotes machos (NUNES et al., 2010). Adicionalmente, em estudo de fertilidade em ratos machos e fêmeas, a inclusão de 10% do fruto provocou efeitos deletérios nas fêmeas, tais como: diminuição no número de implantação, número total de fetos vivos, no peso do útero gravídico, dos fetos e da placenta. Nos machos houve diminuição no peso e no ganho de peso. Tais alterações possivelmente estão relacionadas à presença de compostos químicos de ação estrogênica presentes na planta (MAZZINGHY; ADAMS; MARUO, 2009). Considerando, os relatos de intoxicação espontânea pela B. tomentosa associados às desordens reprodutivas observadas em animais de produção e em modelos experimentais, objetivou-se com o estudo, avaliar os possíveis efeitos tóxicos da administração do extrato bruto de B. tomentosa sobre os parâmetros reprodutivos de ratos Wistar.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Material vegetal Os frutos de Buchenavia tomentosa foram coletados em propriedades rurais na região de Araguaína - TO, Brasil (07º11'28" Sul 48º12'26" Oeste) nos meses de julho e agosto de 2011. Exsicata da planta foram identificadas no herbário da Universidade Federal do Tocantins - UFT, Campus Universitário de Porto Nacional e receberam o registro HTO-9765. As sementes dos frutos foram removidas, sendo aproveitada a casca e a polpa, as quais foram acondicionadas em sacos plásticos e mantidas em freezer -20ºC até o momento de utilização.

2.2 Obtenção do extrato bruto (EB) de B. tomentosa As amostras do fruto foram percoladas durante duas semanas utilizou 1 litro de solução etanólica (92%) para cada quilograma de fruto. Ao término desse período, o material foi filtrado em papel filtro e rotaevaporado A solução etanólica obtida foi evaporada sob pressão reduzida em rotaevaporador (Fisatom® Mod. 801), com temperatura controlada de 45 oC para que não houvesse degradação dos possíveis 63

componentes termolábeis do extrato. Por meio deste procedimento foi obtido o extrato etanólico bruto (EB). O EB foi pesado em balança analítica e o seu rendimento calculado considerando a massa do extrato obtida após a rotaevaporação do solvente e a massa inicial do material vegetal.

2.3 Animais Foram utilizados 60 ratas e 60 ratos, Wistar, com 2 meses de idade, provenientes do Biotério da Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Universitário de Araguaína da Universidade Federal do Tocantins. Os animais foram alojados individualmente em gaiolas de plástico (40x50x20cm), à temperatura ambiente (20 ± 3ºC) e umidade (45-65%) controlada, ciclo de luz claro/escuro de 12 horas com acesso livre a ração e água durante todo o período experimental. Os projetos foram aprovados pela Comissão de Ética no uso de animais (CEUA) da Universidade Federal do Tocantins nº 23101.0022901-2012-45.

2.4 Administração do extrato bruto de B. tomentosa As fêmeas foram divididas aleatoriamente em dois grupos (n=15) controle e experimental. Foram tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação (máximo 2 semanas) e nos dias de gestação (GD) 0 a 20, via gavagem com o extrato bruto de B. tomentosa e o grupo controle: água destilada. Os machos foram distribuídos aleatoriamente dois grupos (n=15) controle e experimental. Tratados diariamente, durante 30 dias e na fase de coabitação (máximo 2 semanas), via gavagem com o extrato bruto de B. tomentosa e o grupo controle: água destilada. A dose do extrato bruto foi correspondente àquela consumida se o fruto fresco fosse a única fonte de alimentação, para simular as condições naturais de ingestão. O consumo de ração e água e peso corporal foram avaliados diariamente.

2.5 Avaliação do ciclo estral As fêmeas tiveram o ciclo estral acompanhado fazendo-se observações microscópicas do lavado vaginal, durante os 30 dias de tratamento. Os lavados foram realizados pela manhã, sendo obtidos pela introdução e aspiração de 0,5 mL de solução de cloreto de sódio a 0,9% na vagina, com o auxílio de uma pipeta automática com ponteiras plásticas descartáveis. O material obtido foi colocado em lâminas de 64

vidro para observação sob o microscópio de luz. Os intervalos entre diestro e o número de dias em diestro, proestro, estro e metaestro durante o período foram registrados.

2.6 Estudos de desempenho reprodutivo fêmeas A partir do 30º dia de tratamento, fêmeas em proestro foram coabitadas durante a noite com machos não tratados e machos tratados foram coabitados com fêmeas não tratadas. Na manhã seguinte os machos e as fêmeas foram separados e os esfregaços vaginais foram realizados. A presença de espermatozoides no esfregaço vaginal foi considerado como evidência de acasalamento e no dia da ocorrência designado como dia de gestação (DG) 0. As fêmeas foram mantidas em gaiolas separadas, contendo água e ração ad libitum até o DG 20, quando os estudos de reprodução foram realizados. No DG20 as fêmeas foram anestesiadas com injeções intraperitoneais de associação de cetamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) (SILVA; NETO; GUIMARÃES, 2010) para a coleta de sangue e posteriormente eutanasiados através da perfuração do diafragma e necropsiados para as avaliações reprodutivas e coleta de órgãos. Os ovários foram retirados e os números de corpos lúteos foram contados. Os cornos uterinos foram pesados e o número de fetos vivos, fetos mortos, número de implantes e reabsorções fetais nos cornos uterinos foram registrados. O número de filhotes machos e fêmeas, peso dos fetos e comprimento foram obtidos. Placenta e peso corporal de cada feto foram registrados e comprimento fetal da cabeça a cauda foi medido. A partir dos resultados foram determinadas as taxas de perdas pré- implantação ((nº de corpos lúteos- nº de implantações) / nº de corpos lúteos) x 100, perda pós-implantação ((nº de implantações- nº de fetos vivos) / nº de implantações) x 100, índice de implantação (nº de implantações/ nº de corpos lúteos) x 100, porcentagem de fetos vivos (nº de fetos vivos/nº de implantações) x100 e número de fetos por ninhada (filhotes nascidos vivos e mortos/ número de fêmeas que pariram) (PARKER, 2006).

2.7 Estudo reprodutivo macho Após o acasalamento, ou no final do período de co-habitação, os machos foram anestesiados com injeções intraperitoneais de associação de cetamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) (SILVA; NETO; GUIMARÃES, 2010) para a coleta de sangue e 65

posteriormente eutanasiados através da perfuração do diafragma e necropsiados para a coleta de órgãos.

2.8 Análise hematológica e bioquímica Amostras de sangue (1 mL) com anticoagulante EDTA foram encaminhadas para a contagem de glóbulos vermelhos, concentração de hemoglobina (Hb), volume corpuscular médio (VCM), hematócrito, hemoglobina corpuscular média (HCM) e concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM). O material encaminhado (2 mL) à sorologia foi centrifugado para obtenção do soro e em seguida, armazenado em tubos tipo eppendorf identificados e mantido sob refrigeração a -20ºC até a realização dos ensaios laboratoriais. Ácido úrico, albumina, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), bilirrubina direta, indireta e total, fosfatase alcalina, glicose, proteínas totais, ureia e triglicerídeos foram analisadas usando kits disponíveis comercialmente (Labtest ®, Lagoa Santa, Minas Gerais, Brasil).

2.9 Análise Hormonal As concentrações 17β-estradiol (E2), progesterona (P4) foram medidas através de kits comerciais de EIA (Enzo ® Life Science, Farmingdale, NY; EIA kits, Nº ADI- 900-174, Nº ADI-900-011, Nº 582701). Os soros foram descongeladas e procedeu-se a análise conforme a orientação do fabricante. As placas foram lidas a 405 nm num leitor de microplacas, ASYS ®, UVM 340 Microplate Reader. O ensaio de progesterona apresenta 6,5 pg / ml sensibilidade, 4,4% intra-ensaio e inter-ensaio de 2,7% CV. O doseamento do estradiol apresentou 10,5 pg / ml sensibilidade, 2,1% intra-ensaio e inter-ensaio de 8,3% CV.

2.10 Peso dos órgãos e determinação do peso relativo Durante a realização da necropsia os órgãos: encéfalo, coração, pulmão, timo, fígado, rins direito e esquerdo foram pesados e a peso relativo de cada órgão foi calculada (peso relativo= (peso do órgão/ peso do animal) x 100).

2.11 Avaliação macroscópica e histopatológica Amostras do sistema nervoso central (SNC), timo, coração, pulmões, fígado, baço, intestino delgado e grosso, rins, glândulas adrenais e linfonodos mesentéricos 66

foram obtidos a partir de todos os animais para exame histológico. As amostras foram fixadas em formol tamponado 10%, processados rotineiramente em parafina, cortado em 5μm de espessura e corados com hematoxilina e eosina (HE) para exame microscópico de luz.

2.12 Análise estatística Os dados foram submetidos á verificação pelos Testes de normalidade Kolmogorov e Smirnov. Nos dados paramétricos foi utilizado Teste t não pareado, enquanto que nas análises dos dados não paramétricos foi utilizado teste de Mann- Whitney. O nível de significância crítico para todas as análises estatísticas realizadas foi de p<0,05 (5%). As análises estatísticas foram realizadas por GraphPad Instat (versão 3.02).

3. RESULTADOS O extrato bruto administrado para ratas fêmeas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional não produziu diferenças significativas nos consumos de água, ração e no peso diário (Figuras 1, 2). As fases do ciclo estral não foram afetadas pelo consumo da planta (Quadro 1 e Tabela 1). Não foram observadas diferenças significativas nas análises hematológicas, (Tabela 2) bioquímicas (Tabela 3), hormonais (Tabela 4), peso relativo (Tabela 5) e anátomo- histopatológica nos órgãos analisados. Os parâmetros reprodutivos não foram afetados pela administração do extrato bruto da planta (Tabela 6).

80 (A) Consumo de água 70

( mL) 40

10 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Dias

40 (B) Consumo de ração

( g)

10 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Dias

300 (C) Peso

250

(g)

200

150 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Dias

Controle Extrato Bruto

Figura 1 - Consumo de água (A), consumo de ração (B) e peso (C) de ratas tratadas durante 30 dias com veículo, extrato bruto, de Buchenavia tomentosa. Foram utilizados 15 animais por grupo. São apresentados as médias e os respectivos erros- padrões. 68

80 (A) Consumo de água 70

( mL) 30

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dias

40 (B) Consumo de ração

(g)

10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dias

350

300

(g) 250

200

150 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dias

Controle Extrato Bruto

Figura 2 - Consumo de água (A), consumo de ração (B) e peso (C) de ratas tratadas durante o período de gestação com veículo e extrato bruto de Buchenavia tomentosa. Foram utilizados 15 animais por grupo. São apresentados as médias e os respectivos erros- padrões. 69

Tabela 1 - Avaliação do ciclo estral em fêmeas tratadas com extrato bruto (EBR) de B. tomentosa durante 30 dias. Ciclo estral Controle (n=15) Extrato Bruto (n=15) Intervalo entre diestro 4,30 ± 0,10 4,43 ± 0,07 Dias em estro 5,13 ± 0,32 5,80 ± 0,20 Dias em metaestro 6,73 ± 0,15 6,66 ± 0,13 Dias em diestro 11,26 ± 0,30 10,8 ± 0,33 Dias em proestro 6,73 ± 0,25 6,60 ± 0,13

Quadro 1 - Monitoramento do ciclo estral de ratas controles (C) e experimentais tratadas com extrato bruto (EB) de B. tomentosa durante 30 dias. D: diestro, p: proestro, e: estro e m: metaestro. Dias de tratamento Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1C D P E D P E M D P M D D P M D D P E M D P E M D P M D D P M 2C D P M D D P M D D P E M D P M D D P E M D D P E M D P M D P 3C P E D P M D D P E M D D P M D D P E M D P M D D P D D D P M 4C E M D P E M D D P E M D D D P E M D P M D D P E M D P M D D 5C E D P M D D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M 6C M D P E M D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D 7C D P M D P M D P E M D D P E M D D P E M D P E M D D P E M D 8C P M D D P E M D D P M D D P E M D D P E M D P E M D D P E M 9C E M D P E M D P M D P E M D P M D D P E M D P E M D P E M D 10C D P E M D D P M D P E M D D P M D D P E M D D P E M D D P E 11C E M D D E M D D P E M D P E M D D P E M D P E M D P E M D D 12C M D D P E M D D P E M D P E M D D P E M D D P E D D P E M D 13C D D P E M D D P E M D D M D D P E M D D P E M D D P E M D P 14C E M D P E M D D P E M D P E M D D P E M D P E M D D P E M D 15C D P E M D D P M D P E M D P E D P M D P M D P E M D P E M D 1B D D P M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D 2B D P E M D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D P 3B D D P E M D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D P E M D D 4B M D D P E M D D P E M D D P E M D P E M D D P E M D D P E M 5B D D P E M D P E M D D P E M D D P E M D P E M D P E M D D P 6B D D P E M D P M D D P E M D P E M D D P M D D P E M D D P E 7B E M D D P M D D P E M D P E M D D P E M D E M D P E M D D P 8B D P E M D P E M D P E M D P E M D D P M D D P M D P E M D D 9B P E M D D P M D P E M D D P M D D P E M D D P E M D D P E M 10B E M D D P E M D P E M D P E M D P E M D P E M D P E M D P E 11B E M D P E M D P E M D P E M D D D P E M D D P E M D D P E M 12B E M D D P E M D P E M D P E M D D P E M D P M D P E M D D P 13B D P E M D P E M D D P E M D P E M D P E M D P E M D D P E M 14B D P E M D D P E M D P E D P E D D P E M D D E M D D P E M D 15B P E M D D P E M D D P M D P E M D D P E M D P E M D P E M D 71

Tabela 2 – Parâmetros hematológicos de ratas controles e experimentais tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional com extrato bruto de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões. Parâmetros Controle (n=15) Extrato Bruto (n=15) Eritrócitos (x106µl) 6,12 ± 0,21 6,11 ± 0,850 Hematócrito (%) 30,00 ± 1,48 32,13 ± 1,91 Hemoglobina (g/dL) 12,88 ± 0,67 12,30 ± 0,49 VCM (µ3) 50,51± 4,10 56,35 ± 4,93 HCM (pg) 21,41 ± 1,40 21,45 ± 1,51 Leucócitos (x103µl) 7,77 ± 1,812 8,52 ± 2,759 Eosinófilos (%) 1,60 ± 0,499 1,33 ± 0,333 Neutrófilo (%) 28,22 ± 1,812 34,50 ± 2,759 Linfócitos (%) 68,70 ± 2,310 62,6 ± 2,930 Monócitos (%) 1,40 ± 0,305 1,88 ± 0,389

Tabela 3 – Avaliação bioquímica de ratas controles e experimentais tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional com extrato bruto de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros- padrões Controle (n=15) Extrato Bruto (n=15) Ácido Úrico (mg/dL) 1,99 ± 0,18 1,98 ± 0,10 Albumina (g/dL) 3,76 ± 0,13 4,02 ± 0,21 ALT (U/L) 55,07 ± 1,30 52,37 ± 1,31 AST (U/L), 102,25 ± 3,31 100,66 ± 2,80 Bilirrubina total (g/dL) 0,04 ± 0,004 0,03 ± 0,001 Bilirrubina direta (g/dL) 0,04 ± 0,004 0,03 ± 0,002 Bilirrubina indireta (g/dL) 0,00 ± 0,004 0,00 ± 0,003 Colesterol (mg/dL) 44,16 ± 2,23 46,62 ± 2,78 Creatinina (mg/dL) 0,63 ± 0,08 0,65 ± 0,11 Fosfatase alcalina (U/L) 55,12 ± 2,52 58,43 ± 1,70 Glicose (mg/dL) 135,12 ± 6,49 142,91 ± 4,39 Proteínas Totais (g/dL) 7,99 ± 0,57 7,08 ± 0,49 Ureia (mg/dL) 43,96 ± 1,64 45,63 ± 2,87 Triglicerídeos (mg/dL) 88,86 ± 9,50 99,13 ± 6,72

Tabela 4 - Valores de hormônio progesterona e estradiol de ratas controles e experimentais tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional com extrato bruto de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões. Parâmetros Controle (n=15) EBR (n=15) Progesterona (ng.mL-1) 3,12 ± 0,07 3,09 ± 0,06 Estradiol (ng.mL-1) 2,10 ± 0,08 2,09 ± 0,07 72

Tabela 5 - Peso relativo dos órgãos de ratas controles e experimentais tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional com extrato bruto de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões. Parâmetros Controle (n=15) Extrato Bruto (n=15) Adrenal direita (%) 0,014 ± 0,001 0,015 ± 0,001 Adrenal esquerda (%) 0,015 ± 0,001 0,016 ± 0,001 Baço (%) 0,254± 0,006 0,260 ± 0,018 Coração (%) 0,277± 0,008 0,260 ± 0,013 Encéfalo (%) 0,582 ± 0,018 0,581 ± 0,019 Fígado (%) 3,906 ± 0,139 4,269 ± 0,125 Pulmão (%) 0,925 ± 0,020 0,982 ± 0,105 Rim direito (%) 0,359 ± 0,016 0,348 ± 0,022 Rim esquerdo (%) 0,358 ± 0,015 0,330 ± 0,013 Timo (%) 0,144 ± 0,020 0,161 ± 0,021

Tabela 6 - Parâmetros reprodutivos de ratas controles e experimentais tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional com extrato bruto de Buchenavia tomentosa. Parâmetros Controle (n=15) Extrato Bruto (n=15) Desempenho Reprodutivo Nº de fêmeas examinadas 15 15 Index de acasalamento (%)a 100 100 Index de fertilidade (%) a 100 100 Index de fecundidade (%) a 100 100 Fêmeas Index de gestação (%) a 100 100 Index de implantação (%) a 87,30 ± 4,55 86,22 ± 5,05 Peso materno a 353,34 ± 5,74 348,16 ± 4,93 Número de corpos lúteos a 14,33 ± 0,64 14,20 ± 0,55 Número de implantações a 12,33 ± 0,64 12,20 ± 0,81 Peso da placenta a 0,47 ± 0,01 0,45 ± 0,01 Perdas pré-implantação (%) b 12,70 ± 4,56 (8) 13,78 ± 5,05 (11) Perdas pós-implantação (%) b 3,71 ± 1,98 (4) 5,65 ±1,78 (7) Nº total de fetos mortos/ninhada 0,13 ± 0,09 (2) 0,13± 0,09 (2) Nº total de fetos vivos/ninhada 11,80 ± 0,65 (15) 11,53 ± 0,80 (15) Sítios de reabsorção a 0,20± 0,14 (2) 0,46 ± 0,17 (6) Fetos Nº de fetos por ninhada a 12,00 ± 0,61 11,67 ± 0,80 Nº de fetos machos a 7,40 ± 0,72 7,06 ± 0,54 Nº de fetos fêmeas a 4,60 ± 0,40 4,61 ± 0,42 Peso dos fetos (g) a 3,93 ± 0,03 3,87 ± 0,03 Peso fetos machos a 3,96 ± 0,03 3,90 ± 0,02 Peso fetos fêmeas a 3,90 ± 0,04 3,85 ± 0,02 Comprimento coroa-cauda (cm) a 4,33 ± 0,05 4,27 ± 0,05 Comprimento coroa-cauda machos a 4,33 ± 0,03 4,25 ± 0,03 Comprimento coroa-cauda fêmeas a 4,33 ± 0,04 4,28 ± 0,05

Os dados são expressos como Média ± erro padrão, quando apropriado. ( ): Quantidade de ninhadas atingidas a Teste t Student não pareado. b Teste de Mann-Whitney 73

A administração do extrato bruto de B. tomentosa para ratos durante 30 dias, não produziram diferenças significativas nos consumos de água, ração e no peso diário (Figura 3). Não foram observadas diferenças significativas nas análises hematológicas (Tabela 7), bioquímicas (Tabela 8), peso relativo (Tabela 9), nem alterações nos níveis séricos de testosterona nos animais tratados com extrato bruto (bruto= 3,07 ± 0,11 ng.mL-1) quando comparados aos animais pertencentes ao grupo controle (3,03 ± 0,09 ng.mL-1) e nem nos órgãos analisados pelo anátomo-histopatológica. As fêmeas acasaladas com machos experimentais não apresentaram alterações nos parâmetros reprodutivos (Tabela 10).

(A) Consumo de água 80

(mL) 30

0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Dias

(B) Consumo de Ração

15 (g)

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Dias

450 (C) Peso

400

(g)

350

300 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Dias

Controle Extrato Bruto

Figura 3 - Consumo de água (A), consumo de ração (B) e peso (C) de ratos tratadas durante 30 dias com veículo, extrato bruto, de Buchenavia tomentosa. Foram utilizados 15 animais por grupo. São apresentados as médias e os respectivos erros- padrões. 75

Tabela 7 - Parâmetros hematológicos de ratos controle e experimental tratados durante 30 dias e no período de acasalamento com extrato bruto de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões. Parâmetros Controle (n=15) Extrato Bruto (n=15) Eritrócitos (x106µl) 7,60 ± 0,65 8,00 ± 0,71 Hematócrito (%) 45,73 ± 2,61 41,00 ± 1,51 Hemoglobina (g/dL) 11,86 ± 0,91 11,20 ± 0,95 VCM (µ3) 66,16 ± 7,20 56,13 ± 4,27 HCM (pg) 17,30 ± 2,13 15,89 ± 2,33 Leucócitos (x103µl) 9,64 ± 0,60 9,32 ± 0,59 Eosinófilos (%) 1,33 ± 0,34 1,06 ± 0,22 Neutrófilo (%) 30,26 ± 1,39 31,60 ± 2,15 Linfócitos (%) 66,26 ± 2,13 65,2 ± 2,64 Monócitos (%) 1,13 ± 0,09 1,26 ± 0,15

Tabela 8 – Avaliação bioquímica de ratos controle e experimental tratados durante 30 dias e no período de acasalamento com extrato bruto de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões. Parâmetros Controle (n=15) EBR (n=15) Ácido Úrico (mg/dL) 2,28 ± 0,21 2,21 ± 0,12 Albumina (g/dL) 3, 77 ± 0,01 3,77 ± 0,004 ALT (U/L) 47,33 ± 1,86 48,44 ± 0,55 AST (U/L), 82,92 ± 2,49 81,04 ± 3,35 Bilirrubina Total (g/dL) 0,05 ± 0,008 0,05 ± 0,012 Bilirrubina Direta (g/dL) 0,04 ± 0,006 0,03 ± 0,002 Bilirrubina Indireta (g/dL) 0,01 ± 0,007 0,02 ± 0,010 Colesterol (mg/dL) 57,37 ± 4,84 53,80 ± 3,10 Creatinina (mg/dL) 0,74 ± 0,18 0,86 ± 0,18 Fosfatase alcalina (U/L) 133,61, ± 2,54 133,89 ± 2,77 Glicose (mg/dL) 195,03 ± 14,6 183,61 ± 15,2 Proteínas Totais (g/dL) 6,76 ± 0,33 6,13 ± 0,27 Ureia (mg/dL) 66,05 ± 0,96 63,79 ± 0,89 Triglicerídeos (mg/dL) 138,63 ± 5,69 130,13 ± 5,95

Tabela 9 - Peso relativo de órgãos de ratos controle e experimental tratados durante 30 dias e no período de acasalamento com extrato bruto de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões. Parâmetros Controle (n=15) EBR (n=15) Adrenal direita (%) 0,010 ± 0,0007 0,010 ± 0,0008 Adrenal esquerda (%) 0,010 ± 0,0005 0,011 ± 0,0009 Baço (%) 0,258 ± 0,009 0,268 ± 0,012 Coração (%) 0,297 ± 0,006 0,279 ± 0,008 Encéfalo (%) 0,500 ± 0,014 0,516 ± 0,011 Epidídimo direito (%) 0,162 ± 0,003 0,168 ± 0,005 Epidídimo esquerdo (%) 0,164 ± 0,003 0,170 ± 0,006 Fígado (%) 3,824 ± 0,130 4,804 ± 0,114 Pulmão (%) 0,842 ± 0,044 1,001 ± 0,052 Rim direito (%) 0,357 ± 0,012 0,386 ± 0,009 Rim esquerdo (%) 0,359 ± 0,013 0,362 ± 0,008 Testículo direito (%) 0,441 ± 0,011 0,446 ± 0,008 Testículo esquerdo (%) 0,447 ± 0,010 0,454 ± 0,008 Timo (%) 0,163 ± 0,012 0,151 ± 0,014

Tabela 10 - Parâmetros reprodutivos de fêmeas não tratadas acasaladas com machos tratados durante 30 dias e no período de acasalamento com extrato bruto (EBR) de Buchenavia tomentosa e seu respectivo controle. Parâmetros Controle (n=15) EB (n=15) Desempenho Reprodutivo Machos Índice de acasalamento (%) a 100 100 Índice Fertilidade (%)a 100 100 Fêmeas Nº de fêmeas 15 15 Índice de gestação (%)a 100 100 Índice de implantação (%)a 89,45 ± 2,62 89,50± 2,36 Peso materno a 339,78 ± 6,28 341,84 ± 4,22 Nº de corpos lúteos a 13,46 ± 0,54 14,13 ± 0,37 Nº de implantações a 11,93 ± 0,40 12,66 ± 0,36 Peso placenta a 0,463 ± 0,006 0,462 ± 0,008 Perdas pré-implantação (%) b 10,54 ± 2,62(10) 10,04 ± 2,18 (11) Perdas pós-implantação (%)b 7,31 ± 2,20 (8) 10,45 ± 3,49 (9) Nº total de fetos mortos 0,13 ± 0,13 (1) 0,06 ± 0,06 (1) Nº total de fetos vivos 11,0 ±0,33 (15) 11,4 ± 0,57 (15) Sítios de reabsorção (%)b 0,80 ± 0,24 (8) 1,20 ± 0,39 (8) Fetos Nº fetos por ninhadaa 11,13 ± 0,30 11,46 ± 0,57 Nº de fetos machos a 6,73 ± 0,64 5,53 ± 0,42 Nº de fetos fêmeas a 4,40 ± 0,44 5,93 ± 0,42 Peso dos fetos (g) a 3,04 ± 0,10 3,10 ± 0,06 Peso fetos machos a 3,06 ± 0,05 3,16 ± 0,04 3,04 Peso fetos fêmeas a 3,02 ± 0,08 ± 0,04 Comprimento coroa-cauda (cm) a 4,62 ± 0,07 4,62 ± 0,07 Comprimento coroa-cauda machos a 4,64 ± 0,09 4,63 ± 0,08 Comprimento coroa-cauda fêmeas a 4,63 ± 0,08 4,61 ± 0,07 Os dados são expressos como Média ± erro padrão, quando apropriado. ( ): Quantidade de ninhadas atingidas a Teste ANOVA, seguida de Dunnett. b Teste de Kruskall-Wallis

4. DISCUSSÃO Os resultados obtidos no estudo, em que o extrato bruto não promoveu alterações deletérias aos animais avaliados diferem do comumente encontrado na literatura. Em trabalhos utilizando o fruto de mirindiba na ração de rato Mazzinghy; Adams; Maruo (2009); Nunes et al. (2010) observaram alterações reprodutivas e de fertilidade nos animais. 78

A não ocorrência de desordens reprodutivas nos ratos tratados com o extrato bruto de B. tomentosa pode estar associada à maior concentração dos seus constituintes químicos. Devido ao aumento na concentração dos compostos químicos, no extrato em relação a planta, esses podem exercer efeitos sinérgico ou antagônico entre os princípios ativos, pois compostos com classes ou estruturas diferentes podem desempenhar a mesma atividade ou atividade antagônica, no qual um composto pode inibir a ação de outro (MACIEL; PINTO; VEIGA JUNIOR, 2002). Outro fato que deve ser levado em consideração, é que a ação conjunta dos metabólitos secundários, taninos, saponinas, esteroides, flavonoides e lignanas encontrados nos frutos de Buchenavia tomentosa (Dados não publicados; BATISTA, 2011) possam ter promovido alterações do comportamento celular, sem, no entanto, alterar significativamente a atividade reprodutiva dos animais. Os flavonoides e as lignanas estão inclusos dentro do grupo de fitoestrógenos que são substâncias químicas contidas nas plantas capazes de desempenhar atividades semelhantes a dos hormônios naturais quando ingeridos por um determinado organismo (SANIN et al., 2010). O mecanismo de ação dos fitoestrógenos é complexo, via interação com os receptores nucleares para estrógeno, isoformas ER-α e ER-β (HWANG, et al., 2006). A alteração no sistema endócrino ocorre quando os fitoestrógenos interagem com os receptores hormonais, modificando a sua resposta natural. Dois processos distintos podem ser desencadeados, a substância química pode se ligar ao receptor hormonal e produzir uma resposta, atuando então como um mimetizador, ou seja, imitando a ação de um determinado hormônio. Este processo é denominado de efeito agonista. Se a substância química se ligar ao receptor, mas nenhuma resposta for produzida, ela estará agindo como um bloqueador, ou seja, estará impedindo a interação entre um hormônio natural e seu respectivo receptor, este processo é denominado de efeito antagonista (TAPIERO; BA; TEW, 2002). A propriedade estrogênica e antiestrogênica dos fitoestrógenos depende da concentração dos mesmos, da concentração dos esteroides sexuais endógenos e do órgão alvo específico envolvido na interação com os receptores de estrogênios (RE). Esse efeito pode ser explicado pela existência de dois tipos de RE: α e β. Os α- receptores (RE-α) são os principais receptores encontrados na mama e no útero, e os β-receptores (RE-b) no osso e no sistema cardiovascular (MOUTSATSOU, 2007). 79

Sabe-se também que o mecanismo de ação do estrógeno não é sempre dose- dependente. Estimulação constante de receptor por um agonista causa progressiva dessensibilização e os efeito se tornam cada vez menor. Quando a dose dos hormônios são aumentadas demasiadamente, pode ocorrer inibição dos efeitos (KENDING; LE; BELCHER, 2010). Dessa forma o extrato bruto de B. tomentosa pode ter atuado como um mimetizador, imitando a ação de um hormônio produzido naturalmente pelo organismo, como o estrogênio ou a testosterona, desencadeando deste modo reações químicas semelhantes no corpo. Fato que pode ter ocorrido devido à dose administrada, que é considerada alta, pois simulava o consumo natural dos animais. Novas doses devem ser testadas para verificar a ausência de efeitos e outros extratos devem ser reproduzidos para tentar isolar os princípios ativos. Tomados em conjunto, os dados acima mencionados parecem indicar ausência de efeitos tóxicos e reprodutivos do extrato bruto dos frutos de B. tomentosa, em ratos na dose realizada, novos estudos devem ser conduzidos para verificar se realmente os fitoestrógenos encontrados na planta apresentam a mesma ação encontrada no estudo em questão.

5. REFERÊNCIAS

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TAPIERO, H.; BA, G.N.; TEW, K. D. Estrogens and environmental estrogens. Biomedicine & Pharmacotherapy, v. 56 p. 36-44, 2002.

CAPÍTULO IV

Toxicidade subcrônica e reprodutiva dos extratos butanólico e aquoso de Buchenavia tomentosa em ratos Wistar

Subchronic and reproductive toxicity of butanol and aqueous extracts of Buchenavia tomentosa in Wistar rats.

RESUMO

A ingestão dos frutos Buchenavia tomentosa por ruminantes está associada à ocorrência de abortos e morte. Assim, objetivou-se, avaliar os possíveis efeitos tóxicos da administração do extrato butanólico e aquoso de B. tomentosa sobre os parâmetros reprodutivos de ratos Wistar. As cascas e polpas do fruto foram percoladas em etanol e concentradas em rotaevaporador para obtenção do extrato bruto (EB) este foi particionado para obtenção dos extratos hexânico, acetático, butanólico e aquoso, sendo os extratos butanólico e aquoso utilizado no bioensaio. Os animais foram divididos de forma inteiramente casualizada em três grupos: 45 animais no grupo controle (veículo) e 90 animais no grupo experimental (extrato butanólico e aquoso). A administração ocorreu via gavagem e realizadas nas fêmeas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos dias de gestação 0 a 20, nos machos durante 30 dias e na fase de coabitação, a dose dos extratos foi correspondente àquela consumida se o fruto fresco fosse a única fonte de alimentação. A coleta de sangue e órgãos dos machos foi efetuada após o acasalamento ou no final do período de coabitação. Nas fêmeas a coleta de sangue, órgãos e avaliação dos parâmetros reprodutivos foram feitas no 21º dia de gestação. A administração subcrônica dos extratos butanólico e aquoso para ratas fêmeas não produziu diferenças significativas nos consumos de água, ração, peso diário e relativo, nem alterações nas análises bioquímicas, hormonais, e avaliação anatomohistopatologica. No entanto, os parâmetros reprodutivos das fêmeas foram alterados, apresentando aumento nos números de pontos de reabsorção e nas porcentagens de perdas pós-implantação e diminuição das porcentagens de fetos vivos. Nos machos a administração dos extratos butanólico e aquoso produziram reduções no consumo de ração e no ganho de peso. Os demais parâmetros avaliados não apresentaram diferenças significantes. A administração subcrônica dos extratos butanólico e aquoso a ratas férteis promove toxicidade direta sobre parâmetros reprodutivos. Em machos não promove alterações reprodutivas, porém o tratamento prolongado induz diminuição do ganho de peso.

Palavras chaves: Buchenavia, toxicidade, reabsorção, perda pós-implantação.

ABSCTRACT

The ingestion of fruits Buchenavia tomentosa by ruminants is associated with the occurrence of abortions and death. So, it was aimed to evaluate the possible toxic effects of the administration butanolic and aqueous extract of B. tomentosa on reproductive parameters of Wistar rats The peels and squashes of the fruit have been percolated in ethanol and concentrated in rotaevaporator for obtaining crude extract (CE) this was partitioned to obtaining the hexane, acetate, butanol and aqueous 84

extracts being aqueous and butanol extracts used in the bioassay.The animals were divided randomly into three groups: 45 animals in the control group (vehicle) and 90 animals in the experimental group (butanolic and aqueous extract). The administration occurred performed by gavage in females during 30 days, cohabitation and days of gestation (GD) 0-20, for males during 30 days and cohabitation, the dose of the extract was corresponding to that is consumed fresh fruit it were the only source of nutrition.The collection of blood and organs of males was performed after mating or at the end of the period of cohabitation. In females the collection of blood, organs and reproductive parameters evaluation were performed on day 21 of gestation.The subchronic administration of the extracts to female rats produced no significant difference in water consumption, feed consumption, daily weight and relative weight, nor alterations in biochemical, hormonal, and evaluation anatomohistopatologica. However, the female the reproductive parameters were changed, an increase in the number of points of resorption and in the percentages post-implantation losses and a decrease of the percentage of live fetuses. In males the administration of butanolic and aqueous extracts produced reductions in feed consumption and weight gain. Other parameters did not show significant differences. The subchronic administration of butanolic and aqueous extracts to fertile rats promotes direct toxicity on reproductive parameters. In male not promotes changes reproductive, but long-term treatment induces a decrease in weight gain.

Keywords: Buchenavia, toxicity, resoption, post-implantation loss.

1. INTRODUÇÃO

Buchenavia tomentosa pertencente à família Combretaceae é conhecida popularmente como mirindiba, embiridima e tarumarana. Esta árvore arbórea nativa dos cerradões e de mata semidecíduas pode chegar a 30 metros de altura. Seu fruto é comestível e ácido, sua casca é popularmente utilizada no tratamento de tosse, como anti-hiperlipidêmicas e anorexígenas (LORENZI, 2009; MARQUETE; VALENTE, 2005; POTT, POTT, SOBRINHO, 2004; SILVA et al.; 2010). Na análise fitoquímica do extrato etanólico dos frutos de B. tomentosa foram identificados compostos fenólicos: galato etila, galato de metila, ácido gálico, lignanas e taninos hidrolisáveis (BATISTA, 2011). Há relatos de criadores de gado de que a ingestão de frutos da planta estaria de alguma forma associada à ocorrência de abortos, diarreia, focinho seco, fraqueza, perda de peso, nascimento de animais fracos, abortamento e até a morte de animais (COSTA, et al., 2011; MELLO et al., 2010). Experimentalmente foi demonstrado que a inclusão de 10% dos frutos de B. tomentosa na ração de ratas fêmeas durante toda a prenhez produziu aumento do peso materno e retardo no desenvolvimento físico de filhotes machos, sendo sugerido 85

que a toxicidade poderia estar relacionada à compostos químicos de ação estrogênica presentes no fruto da planta (NUNES et al., 2010). Na avaliação da fertilidade, a ingestão dos frutos da planta causou efeito deletério nas ratas fêmeas como reduções significativas no número de implantação, número total de fetos vivos, peso do útero gravídico, peso dos fetos e peso das placentas. Na avaliação de efeito sistêmico foi demostrada toxicidade moderada em ratos machos, traduzida por diminuição progressiva de peso e menor ganho de peso quando comparados ao grupo controle (MAZZINGHY; ADAMS; MARUO, 2009). Em estudo avaliando os extrato hexanico, acetático, butanólico e aquoso de B. tomentosa sobre a citotoxicidade em Artemias salina os extratos que apresentaram maior atividade, foram os extratos butanólico e aquoso (Dados não publicados). Considerando, a presença de substâncias que podem implicar em desordens reprodutivas e os relatos de intoxicação espontânea pelo fruto de B. tomentosa em animais de produção, o objetivo do presente trabalho foi avaliar os possíveis efeitos tóxicos da administração dos extratos butanólico e aquoso de B. tomentosa sobre a toxidade sistêmica e parâmetros reprodutivos de ratos Wistar.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Material vegetal Os frutos maduros de Buchenavia tomentosa foram coletados em propriedades rurais na região de Araguaína - TO, Brasil (07º11'28" Sul 48º12'26" Oeste) nos meses de julho e agosto de 2011. As sementes dos frutos foram removidas, aproveitando-se a casca e a polpa, as quais foram acondicionadas em sacos plásticos e mantidas a - 20ºC até o momento de utilização. Amostras da planta foram identificadas no herbário da Universidade Federal do Tocantins, Campus Universitário de Porto e receberam o registro de HTO-9765.

2.2 Obtenção do extrato bruto (EB) de B. tomentosa As amostras do fruto foram percoladas durante duas semanas utilizou 1 litro de solução etanólica (92%) para cada quilograma de fruto. Ao término desse período, o material foi filtrado em papel filtro e rotaevaporado sob pressão reduzida (Fisatom® Mod. 801), obtendo-se o extrato bruto (EB). O EB foi pesado em balança analítica e o 86

seu rendimento calculado considerando a massa do extrato obtida após a rotaevaporação do solvente e a massa inicial do material vegetal.

2.3 Particionamento por polaridade de solventes O EB da planta foi submetido à particionamento por polaridade com solventes (Figura 1). Para isso, 10g do EB foi ressuspendido em 150 mL de água destilada e realizada a extração por três vezes com 150 mL de hexano. Separada a solução hexânica, procedeu-se a extração por três vezes da fase hidroalcóolica com 150 mL de acetato de etila, dando origem a solução acetática. Para a obtenção da solução butanólica procedeu-se a extração por três vezes da fase hidroalcoólica com 150 mL de butanol. A solução residual obtida das sucessivas lavagens por solventes orgânicos deu origem ao extrato aquoso (EA). Ao final da etapa de partição cada fração foi concentrada em rotaevaporador e foram obtidos quatro extratos, a saber: hexânico, acetático, butanólico e aquoso. Subsequentemente os extratos butanólico e aquoso foram identificados e mantidos a -20ºC até o momento de sua utilização nos bioensaios. 10g de Extrato bruto de B. tomentosa (diluído em 150 ml de água destilada)

1º Partição 3 lavagens utilizando 150mL de hexano Rotaevaporação

Extrato hexânico Extrato aquoso 2º Partição 3 lavagens utilizando 150mL de acetato

Rotaevaporação

Extrato acetático Extrato aquoso 3º Partição 3 lavagens utilizando 150mL de butanol

Rotaevaporação Rotaevaporação

Extrato butanólico Extrato aquoso Figura 1 – Particionamento do extrato bruto de B. tomentosa por polaridade de solventes. 87

2.4 Animais Foram utilizados 90 ratas e 90 ratos, Wistar, com 2 meses de idade, provenientes do Biotério da Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Universitário de Araguaína da Universidade Federal do Tocantins. Os animais foram alojados individualmente em gaiolas de plástico (40x50x20cm), à temperatura ambiente (20 ± 3ºC) e umidade (45-65%) controlada, ciclo de luz claro/escuro de 12 horas com acesso livre a ração e água durante todo o período experimental. Os projetos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da Universidade Federal do Tocantins nº 23101.0022901-2012-45.

2.5 Administração dos extratos butanólico e aquoso de B. tomentosa As fêmeas foram divididas aleatoriamente em três grupos (n=15) controle e experimentais Foram tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação (máximo 2 semanas) e nos dias de gestação (GD) 0 a 20, via gavagem com o extrato butanólico e aquoso de B. tomentosa e o grupo controle: água destilada. Os machos foram distribuídos aleatoriamente três grupos (n=15) controle e experimentais. Tratados diariamente, durante 30 dias e na fase de coabitação (máximo 2 semanas), via gavagem com o extrato butanólico e aquoso de B. tomentosa e o grupo controle: água destilada. A dose do extrato butanólico e aquoso foi correspondente àquela consumida se o fruto fresco fosse a única fonte de alimentação, para simular as condições naturais de ingestão. O consumo de ração e água e peso corporal foram avaliados diariamente.

2.6 Avaliação do ciclo estral As fêmeas tiveram o ciclo estral acompanhado fazendo-se observações microscópicas do lavado vaginal, durante os 30 dias de tratamento. Os lavados foram realizados pela manhã, sendo obtidos pela introdução e aspiração de 0,5 mL de solução de cloreto de sódio a 0,9% na vagina, com o auxílio de uma pipeta automática com ponteiras plásticas descartáveis. O material obtido foi colocado em lâminas de vidro para observação sob o microscópio de luz. Os intervalos entre diestro e o número de dias em diestro, proestro, estro e metaestro durante o período foram registrados.

2.7 Estudos de desempenho reprodutivo fêmeas A partir do 30º dia de tratamento, fêmeas em proestro foram coabitadas durante a noite com machos não tratados e machos tratados foram coabitados com fêmeas não tratadas. Na manhã seguinte os machos e as fêmeas foram separados e os esfregaços vaginais foram realizados. A presença de espermatozoides no esfregaço vaginal foi considerado como evidência de acasalamento e no dia da ocorrência designado como dia de gestação (DG) 0. As fêmeas foram mantidas em gaiolas separadas, contendo água e ração ad libitum até o DG 20, quando os estudos de reprodução foram realizados. No DG20 as fêmeas foram anestesiadas com injeções intraperitoneais de associação de cetamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) (SILVA; NETO; GUIMARÃES, 2010) para a coleta de sangue e posteriormente eutanasiados através da perfuração do diafragma e necropsiados para as avaliações reprodutivas e coleta de órgãos. Os ovários foram retirados e os números de corpos lúteos foram contados. Os cornos uterinos foram pesados e o número de fetos vivos, fetos mortos, número de implantes e reabsorções fetais nos cornos uterinos foram registrados. O número de filhotes machos e fêmeas, peso dos fetos e comprimento foi obtido. Placenta e peso corporal de cada feto foram registrados e comprimento fetal da cabeça a cauda foi medido. A partir dos resultados foram determinadas as taxas de perdas pré - implantação ((nº de corpos lúteos- nº de implantações) / nº de corpos lúteos) x 100, perda pós-implantação ((nº de implantações- nº de fetos vivos) / nº de implantações) x 100, índice de implantação (nº de implantações/ nº de corpos lúteos) x 100, porcentagem de fetos vivos (nº de fetos vivos/nº de implantações) x100 e tamanho da ninhada (filhotes nascidos vivos e mortos/ número de fêmeas que pariram) (PARKER, 2006).

2.8 Estudo reprodutivo macho Após o acasalamento, ou no final do período de co-habitação, os machos foram anestesiados com injeções intraperitoneais de associação de cetamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) (SILVA; NETO; GUIMARÃES, 2010) para a coleta de sangue e posteriormente eutanasiados através da perfuração do diafragma e necropsiados para a coleta de órgãos.

2.9 Análise bioquímica O material encaminhado (2mL) à sorologia foi centrifugado para obtenção do soro e em seguida, armazenado em tubos tipo eppendorf identificados e mantido sob refrigeração a -20ºC até a realização dos ensaios laboratoriais. Ácido úrico, albumina, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), bilirrubina direta, indireta e total, colesterol, creatinina, fosfatase alcalina, glicose, proteínas totais, ureia e triglicerídeos foram analisadas usando kits disponíveis comercialmente (Labtest ®, Lagoa Santa, Minas Gerais, Brasil).

2.10 Análise Hormonal As concentrações 17β-estradiol (E2), progesterona (P4) e testosterona foram medidas através de kits comerciais de EIA (Enzo ® Life Science, Farmingdale, NY; EIA kits, Nº ADI-900-174, Nº ADI-900-011, Nº 582701). Os soros foram descongeladas e procedeu-se a análise conforme a orientação do fabricante. As placas foram lidas a 405 nm num leitor de microplacas, ASYS ®, UVM 340 Microplate Reader. O ensaio de testosterona apresentaram 5,0 pg/mL de sensibilidade, 10,8% coeficiente de intra- ensaio de variação (CV) e 9,3% CV inter-ensaios. O ensaio de progesterona apresenta 6,5 pg/ml sensibilidade, 4,4% intra-ensaio e inter-ensaio de 2,7% CV. O doseamento do estradiol apresentou 10,5 pg / ml sensibilidade, 2,1% intra-ensaio e inter-ensaio de 8,3% CV.

2.11 Peso dos órgãos e determinação do peso relativo Durante a realização da necropsia os órgãos: encéfalo, coração, pulmão, timo, fígado, rins direito e esquerdo, adrenais direitas e esquerdas foram pesados e a massa relativa de cada órgão foi calculada (peso relativo= (peso do órgão/ peso do animal) x 100).

2.12 Avaliação macroscópica e histopatológica Amostras do sistema nervoso central (SNC), timo, coração, pulmões, fígado, baço, intestino delgado e grosso, rins, glândulas adrenais e linfonodos mesentéricos foram obtidos a partir de todos os animais para exame histológico. As amostras foram fixadas em formol tamponado 10%, processados rotineiramente em parafina, cortado em 5μm de espessura e corados com hematoxilina e eosina (HE) para exame microscópico de luz. 90

2.13 Análise estatística Os dados foram submetidos à verificação de homocedasticidade pelo teste de Bartellet. A análise de variância de uma via (ANOVA), seguida do teste de Dunnett foi utilizada nos dados paramétricos, para a comparação entre as médias obtidas dos animais tratados em relação ao controle. Os dados não paramétricos foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis. O nível de significância crítico para todas as análises estatísticas realizadas foi de p<0,05 (5%). As análises estatísticas foram realizadas por GraphPad Instat (versão 3.02).

3. RESULTADOS

A administração do extrato butanólico e aquoso de B. tomentosa para ratas fêmeas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional não produziram diferenças significativas nos consumos de água, ração e no peso diário (Figura 2 e 3). As fases do ciclo estral não foram afetadas pelo consumo da planta (Quadro 1 e 2 e Tabela 1). Não foram observadas diferenças significativas nas análises bioquímicas (Tabela 2), hormonais (Tabela 3), peso relativo (Tabela 4) e anátomo-histopatológica nos órgãos analisados. Os extratos butanólico e aquoso promoveram alterações deletérias sobre a reprodução, evidenciadas pelos aumentos do número de pontos de reabsorção e porcentagem de perdas pós-implantação e diminuição das porcentagens de fetos vivos (Tabela 5).

(A) Consumo água 80

(mL) 30

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Dias

30 (B) Consumo de ração

(g)

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Dias

350 (C) Peso

300

(g)

250

200 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Dias Controle Extrato butanólico Extrato Aquoso

Figura 2 - Consumo de água (A), consumo de ração (B) e peso (C) de ratas tratadas durante 30 dias com veículo, extrato butanólico e aquoso de Buchenavia tomentosa. Foram utilizados 15 animais por grupo. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões. 92

80 (A) Consumo água 70

(mL) 30

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dias

30 (B) Consumo de ração

(g)

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dias

350

300

(g)

250

200 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dias Controle Extrato butanólico Extrato Aquoso

Figura 3 - Consumo de água (A), consumo de ração (B) e peso (C) de ratas tratadas durante 20 dias com veículo, extrato butanólico e aquoso de Buchenavia tomentosa. Foram utilizados 15 animais por grupo. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões. 93

Tabela 1 - Avaliação do ciclo estral em fêmeas tratadas com extrato butanólico (EBU), aquoso (EAQ) de B. tomentosa durante 30 dias.

Ciclo estral Controle (n=15) Extrato Butanólico Extrato Aquoso (n=15) (n=15) Intervalo entre diestro 4,30 ± 0,10 4,12 ± 0,06 4,24 ± 0,66 Dias em estro 5,13 ± 0,32 5,66 ± 0,25 5,73 ± 0,25 Dias em metaestro 6,73 ± 0,15 7,00 ± 0,24 6,66 ± 0,21 Dias em diestro 11,26 ± 0,30 10,26 ± 0,34 10,53 ± 0,35 Dias em proestro 6,73 ± 0,25 7,00 ± 0,17 7,13 ± 0,16

Quadro 1 – Monitoramento do ciclo estral de ratas controles (C) D: diestro, p: proestro, e: estro e m: metaestro.

Animais Dias de tratamento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1C D P E D P E M D P M D D P M D D P E M D P E M D P M D D P M 2C D P M D D P M D D P E M D P M D D P E M D D P E M D P M D P 3C P E D P M D D P E M D D P M D D P E M D P M D D P D D D P M 4C E M D P E M D D P E M D D D P E M D P M D D P E M D P M D D 5C E D P M D D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M 6C M D P E M D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D 7C D P M D P M D P E M D D P E M D D P E M D P E M D D P E M D 8C P M D D P E M D D P M D D P E M D D P E M D P E M D D P E M 9C E M D P E M D P M D P E M D P M D D P E M D P E M D P E M D 10C D P E M D D P M D P E M D D P M D D P E M D D P E M D D P E 11C E M D D E M D D P E M D P E M D D P E M D P E M D P E M D D 12C M D D P E M D D P E M D P E M D D P E M D D P E D D P E M D 13C D D P E M D D P E M D D M D D P E M D D P E M D D P E M D P 14C E M D P E M D D P E M D P E M D D P E M D P E M D D P E M D 15C D P E M D D P M D P E M D P E D P M D P M D P E M D P E M D

Quadro 2 – Acompanhamento do ciclo estral de ratas experimentais tratadas com extrato butanólico (EBU) e aquoso (EAQ) de B. tomentosa durante 30 dias. D: diestro, p: proestro, e: estro e m: Metaestro. Animais Dias de tratamento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1EBU P E M D P E M D D P E M D D P M D P E M D P M D P E M D P E 2EBU E M D P E M D D P M D P E M D P E M D P E M D D P M D P E M 3EBU M D P E M D P E M D P E M D P E M D D P E M D P E M D P E M 4EBU P E M D P E M D D P M D P E M D P E M D D P E M D P E M D D 5EBU M D P E M D D P E M D P E M D P M D D P E M D D P E M D D P 6EBU D D P E M D D P E M D P E D P E M D P E M D D P E M D P E D 7EBU M D D P M D P E M D D P E M D P M D P M D P E M D D P E M D 8EBU M D D P E M D P M D P E M D D P E M D P E M D P M D P E M D 9EBU E M D P E M D P E M D D P E M D D P E M D P M D D P E M D P 10EBU E M D D P E M D P E M D P E M D P E M D P E M D P E M D P E 11EBU P E D P E M D P M D D P E M D P E M D D P M D D P E M D P E 12EBU E M D P E M D D P E M D D D P E M D P M D D P E M D P M D D 13EBU P E M D P E M D D P M D D P M D D P E M D D P E M D P E M D 14EBU D P E M D P M D D P E M D P M D P E M D P E M D P E M D D P 15EBU D D P M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D 1EAQ P E M D D P E M D D P M D D P E M D D P E M D D P E M D P E 2EAQ P E M D D P M D P E M D D P M D P E M D P E M D D P M D D P 3EQA E M D D P E M D P E M D P E M D P E M D P E M D P E M D P E 4EQA D P M D P E M D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D P E M 5EQA P E M D P E M D P E M D P E M D D P E M D P M D P E M D P E 6EAQ D P E M D D P M D P E M D D P M D D P E M D D P E M D D P E 7EAQ D D P E M D D P E M D P E M D D P E M D P E M D D P M D D P 8EAQ E D P M D D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M 9EAQ M D P E M D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D D P E M D 10EAQ D P M D D P M D D P M D P E M D P E M D D P M D P E M D D P 11EAQ M D P E M D D P E M D P E M D P E M D P E M D P M D P E M D 12EAQ M D D P E M D P M D P E M D D P E M D P E M D P M D P E M D 13EAQ E M D P E M D P E M D D P E M D D P E M D P M D D P E M D P 14EAQ P E D P E M D D P E D D P M D P E M D P E M D D P E M D D P 15EAQ M D P E M D D P E M D P E M D P M D D P E M D D P E M D D P 96

Tabela 2 - Avaliação bioquímica de ratas controles e experimentais tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional com extrato butanólico (EBU) e aquoso (EAQ) de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões (n=15). Parâmetros Controle EBU EAQ Ácido Úrico (mg/dL) 1,98 ± 0,19 2,58 ± 0,32 2,29 ± 0,22 Albumina (g/dL) 3,66 ± 0,01 3,83 ± 0,01 3,82 ± 0,01 ALT (U/L) 23,07 ± 0,55 24,23 ± 0,61 23,07 ± 0,64 AST (U/L), 56,90 ± 1,65 51,03 ± 2,37 51,35 ± 2,06 Bilirrubina total (g/dL) 0,05 ± 0,010 0,07 ± 0,008 0,06 ± 0,009 Bilirrubina direta (g/dL) 0,05 ± 0,009 0,06 ± 0,006 0,05 ± 0,007 Bilirrubina indireta (g/dL) 0,00 ± 0,003 0,01 ± 0,005 0,01 ± 0,004 Colesterol (mg/dL) 49,60 ± 4,18 58,85 ± 3,36 55,88 ± 3,28 Creatinina (mg/dL) 0,47 ± 0,02 0,46 ± 0,02 0,51 ± 0,02 Fosfatase alcalina (U/L) 55,12 ± 2,53 57,19 ± 2,30 57,45 ± 2,64 Glicose (mg/dL) 132,40 ± 9,19 118,94 ± 13,09 140,17 ± 14,90 Proteínas Totais (g/dL) 8,84 ± 0,77 7,65 ± 0,50 7,39 ± 0,61 Ureia (mg/dL) 67,08 ± 3,61 58,89 ± 3,10 59,05 ± 2,23 Triglicerídeos (mg/dL) 115,47 ± 12,57 106,56 ± 12,72 92,26 ± 10,51

Tabela 3 - Valores de hormônio progesterona e estradiol de ratas controle e experimentais tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional com extrato butanólico (EBU) e aquoso (EAQ) de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões (n=15). Parâmetros Controle EBU EAQ Progesterona (ng.mL-1) 3,07 ± 0,02 3,11 ± 0,01 3,11 ± 0,02 Estradiol (ng.mL-1) 1,87 ± 0,15 2,09 ± 0,18 1,91 ± 0,16

Tabela 4 - Pesos relativos dos órgãos de ratas controles e experimentais tratadas durante 30 dias, na fase de coabitação e nos 20 dias no período gestacional com extrato butanólico e aquoso de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e respectivos erros-padrões (n=15). Parâmetros Controle EBU EAQ Adrenal direita (%) 0,016 ± 0,001 0,021 ± 0,002 0,022 ± 0,007 Adrenal esquerda (%) 0,015 ± 0,001 0,015 ± 0,002 0,022 ± 0,003 Baço (%) 0,246 ± 0,007 0,243 ± 0,012 0,251 ± 0,010 Coração (%) 0,260 ± 0,008 0,312 ± 0,013 0,302 ± 0,002 Encéfalo (%) 0,552 ± 0,024 0,665 ± 0,058 0,601 ± 0,033 Fígado (%) 3,982 ± 0,160 4,192 ± 0,158 4,007 ± 0,114 Pulmão (%) 0,954 ± 0,094 1,109 ± 0,103 1,212 ± 0,166 Rim direito (%) 0,288 ± 0,008 0,351 ± 0,021 0,330 ± 0,017 Rim esquerdo (%) 0,283 ± 0,012 0,319 ± 0,023 0,299 ± 0,020 Timo (%) 0,169 ± 0,016 0,183 ± 0,022 0,176 ± 0,021

Tabela 5 - Parâmetros reprodutivos de fêmeas tratadas durante 20 dias de gestação com o extrato butanólico (EBU), aquoso (EAQ) de Buchenavia tomentosa ou veículo (n=15). Parâmetros Controle (n=15) EBU (n=15) EAQ (n=15) Desempenho Reprodutivo Nº de fêmeas examinadas 15 15 15 Index de acasalamento (%)a 100 100 100 Index de fertilidade (%) a 100 100 100 Index de fecundidade (%) a 100 100 100 Fêmeas Index de gestação (%) a 100 100 100 Index de implantação (%) a 86,95 ± 4,33 79,92 ± 3,67 81,90 ± 3,03 Peso materno a 354,38 ± 5,68 338,00 ± 5,89 352,57 ± 4,46 Número de corpos lúteos a 13,60 ± 0,52 13,80 ± 0,49 14,20 ± 0,44 Número de implantações a 11,80 ± 0,69 11,00 ± 0,60 11,60 ± 0,49 Peso da placenta a 0,46 ± 0,01 0,50 ± 0,02 0,47 ± 0,01 Perdas pré-implantação (%) b 18,10 ± 3,03 13,05 ± 4,3 (9) 20,08 ± 3,67 (14) (14) Perdas pós-implantação (%) b 24,56 ± 3,36 * 21,00 ± 3,93 * 4,65 ± 2,06(6) (14) (12) Nº total de fetos mortos 0,13 ± 0,09 (2) 0,27 ± 0,11 (4) 0,27 ± 0,15 (3) Nº total de fetos vivos 11,2 ± 0,63 (15) 8,3 ± 0,61* (15) 9,1 ± 0,70 * (15) Sítios de reabsorção (%) b 0,40 ± 0,19 (4) 2,4 ± 0,36 * (14) 2,20 ± 0,35 * (12) Fetos Nº de Ninhada a 11,40 ± 0,68 8,60 ± 0,64 9,53 ± 0,67 Nº de fetos machos a 7,00 ± 0,76 4,46 ± 0,52 4,73 ± 0,62 Nº de fetos fêmeas a 4,40 ± 0,40 4,13 ± 0,63 4,80 ± 0,55 Peso dos fetos (g) a 3,47 ± 0,06 3,50 ± 0,06 3,52 ± 0,06 Peso fetos machos a 3,58 ± 0,06 3,54 ± 0,06 3,71 ± 0,05 Peso fetos fêmeas a 3,36 ± 0,05 3,46 ± 0,06 3,32 ± 0,06 Comprimento coroa-cauda (cm) a 4,63 ± 0,08 4,68 ± 0,07 4,64 ± 0,08 Comprimento Coroa-cauda machos a 4,78 ± 0,08 4,71 ± 0,07 4,74 ± 0,08 Comprimento Coroa-cauda fêmeas a 4,48 ± 0,09 4,65 ± 0,09 4,54 ± 0,07 Os dados são expressos como Média ± erro padrão, quando apropriado. ( ): Quantidade de ninhadas atingidas a Teste ANOVA, seguida de Dunnett. b Teste de Kruskall-Wallis *p<0,05

O tratamento com extrato butanólico e aquoso nos machos produziu redução no consumo de ração a partir do 18º dia até 30º de tratamento (Figura 4A); o peso diário do 11º ao 30º de experimentação foi menor do que o peso dos animais controle (Figura 4B) e ocorreu redução no ganho de peso (Tabela 6). No consumo de água 98

dos animais tratados com todos os extratos não ocorreu nenhuma alteração quando comparado ao controle (Figura 5).

(A) Consumo de Ração

a a a a a a a a 20 a b a a a b a b b b b b b b b b b b 15

(g)

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Dias

450 (B) Peso

400

(g)

350 a a a a a a a a a a a a b b b b b b a a b b b b a a a a a a b b b b b b b b b b 300 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Dias

a Extrato Butanólico; b Extrato Aquoso; difere significantemente (p<0,05) em relação ao controle (ANOVA, seguida de Dunnett). Controle Extrato Butanólico Extrato Aquoso

Figura 4 - Consumo de ração (A) e peso (B) de ratos tratados durante 30 dias com veículo, butanólico e aquoso de Buchenavia tomentosa. Foram utilizados 15 animais por grupo. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões.

Tabela 6 - Média de ganho de peso total (g) de ratos tratados durante 30 dias com veículo, extrato bruto, butanólico e aquoso de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões (n=15). Tratamentos Ganho de peso total Controle 62,69 ± 3,18 Extrato Butanólico 46,96 ± 3,59a Extrato Aquoso 41,58 ± 4,88a Média ± erro padrão. a Difere significantemente (p<0,05) em relação ao controle (ANOVA, seguida de Dunnett).

(A) Consumo de água 80

(mL) 30

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Consumo Extrato Butanólico Dias Extrato Aquoso

Figura 5 - Consumo de água (A) de ratos tratados durante 30 dias com veículo, extrato bruto, butanólico e aquoso de Buchenavia tomentosa. Foram utilizados 15 animais por grupo. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões.

Não foram observadas diferenças significativas nas análises bioquímicas (Tabela 7), nem alterações nos níveis séricos de testosterona nos animais tratados com os diferentes extratos (butanólico=3,14 ± 0,09 e aquoso=2,83 ± 0,14 ng.mL-1) quando comparados aos animais pertencentes ao grupo controle (3,03 ± 0,09 ng.mL- 1).

100

Tabela 7 - Avaliação bioquímica de ratos controles e experimentais tratados durante 30 dias e na fase de coabitação com extrato butanólico (EBU) e aquoso (EAQ) de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros-padrões (n=15). Parâmetros Controle EBU EAQ Ácido Úrico (mg/dL) 2,28 ± 0,21 1,89 ± 0,10 2,15 ± 0,12 Albumina (g/dL) 3, 77 ± 0,01 3,78 ± 0,01 3,76 ± 0,01 ALT (U/L) 47,33 ± 1,86 46,76 ± 0,63 48,20 ± 0,80 AST (U/L), 82,92 ± 2,49 81,37 ± 3,41 87,51 ± 2,84 Bilirrubina total (g/dL) 0,05 ± 0,008 0,04 ± 0,010 0,03 ± 0,004 Bilirrubina direta (g/dL) 0,04 ± 0,006 0,03 ± 0,002 0,03 ± 0,003 Bilirrubina indireta (g/dL) 0,01 ± 0,007 0,01 ± 0,010 0,00 ± 0,002 Colesterol (mg/dL) 57,37 ± 4,84 56,19 ± 5,62 55,41 ± 3,33 Creatinina (mg/dL) 0,74 ± 0,18 0,81 ± 0,09 0,74 ± 0,18 Fosfatase alcalina (U/L) 133,61 ± 2,54 130,63 ± 2,77 137,30 ± 1,61 Glicose (mg/dL) 195,03 ± 14,6 174,83 ± 14,2 204,34 ± 14,3 Proteínas Totais (g/dL) 6,76 ± 0,33 6,19 ± 0,39 6,14 ± 0,38 Ureia (mg/dL) 66,05 ± 0,96 62,83 ± 0,78 63,41 ± 0,78 Triglicerídeos (mg/dL) 138,63 ± 5,69 131,7 ± 4,55 141,7 ± 5,01

Os ratos tratados com o extrato aquoso apresentaram aumento no peso relativo do encéfalo (Tabela 8). Demais parâmetros avaliados não apresentaram diferenças estaticamente significantes.

101

Tabela 8 - Peso relativo dos órgãos de ratos controles e experimentais tratados durante 30 dias e na fase de coabitação com extrato butanólico (EBU) e aquoso (EAQ) de Buchenavia tomentosa. São apresentados as médias e os respectivos erros- padrões (n=15). Parâmetros Controle (n=15) EBU (n=15) EAQ (n=15) Adrenal direita (%) 0,010 ± 0,0007 0,011 ± 0,0006 0,011 ± 0,0010 Adrenal esquerda (%) 0,010 ± 0,0005 0,011 ± 0,0010 0,012 ± 0,0005 Baço (%) 0,258 ± 0,009 0,269 ± 0,007 0,272 ± 0,008 Coração (%) 0,297 ± 0,006 0,291 ± 0,007 0,3034 ± 0,008 Encéfalo (%) 0,500 ± 0,014 0,482 ± 0,016 0,560 ± 0,015a Epidídimo direito (%) 0,162 ± 0,003 0,177 ± 0,005 0,176 ± 0,004 Epidídimo esquerdo (%) 0,164 ± 0,003 0,165 ± 0,007 0,175 ± 0,006 Fígado (%) 3,824 ± 0,130 3,779 ± 0,133 3,515 ± 0,075 Pulmão (%) 0,842 ± 0,044 0,965 ± 0,055 1,039 ± 0,062 Rim direito(%) 0,357 ± 0,012 0,3703 ± 0,010 0,359 ± 0,009 Rim esquerdo(%) 0,359 ± 0,013 0,356 ± 0,008 0,353 ± 0,006 Testículo direito(%) 0,441 ± 0,011 0,431 ± 0,009 0,466 ± 0,008 Testículo esquerdo (%) 0,447 ± 0,010 0,435 ± 0,011 0,466 ± 0,012 Timo (%) 0,163 ± 0,012 0,174 ± 0,010 0,152 ± 0,008 Média ± erro padrão. a Difere significantemente (p<0,05) em relação ao controle (ANOVA, seguida de Dunnett).

As fêmeas acasaladas com machos experimentais não apresentaram alterações nos parâmetros reprodutivos (Tabela 9).

102

Tabela 9 - Parâmetros reprodutivos de fêmeas não tratadas acasaladas com machos que foram tratados durante 30 dias com extrato bruto (EBR), butanólico (EBU) e aquoso (EAQ) de Buchenavia tomentosa e seu respectivo controle. Parâmetros Controle (n=15) EBU (n=15) EAQ (n=15) Desempenho Reprodutivo Machos Index de acasalamento (%) a 100 100 100 Index Fertilidade (%)a 100 100 100 Fêmeas Nº de fêmeas 15 14 14 Index de gestação (%)a 100 100 100 Index de implantação (%)a 89,45 ± 2,62 83,95 ±3,65 90,70 ± 2,66 Peso materno a 339,78 ± 6,28 328,46 ± 5,13 340,55 ± 6,35 Nº de corpos lúteos a 13,46 ± 0,54 14,07 ± 0,43 13,42 ± 0,37 Nº de implantações a 11,93 ± 0,40 11,64 ± 0,35 12,14 ± 0,41 Peso placenta a 0,463 ± 0,006 0,467 ± 0,010 0,471 ± 0,010 Perdas pré-implantação (%) b 10,54 ± 2,62 (10) 16,04 ± 3,65 (12) 9,29 ± 2,66 (9) Perdas pós-implantação (%)b 7,31 ± 2,20 (8) 16,47 ± 4,53 (11) 8,36 ± 2,84 (7) Nº total de fetos mortos 0,13 ± 0,13 (1) 0 ± 0 (0) 0 ± 0 (0) Nº total de fetos vivos 11,0 ±0,33 (15) 9,64 ± 0,53 (15) 11,21 ± 0,62 (15) Sítios de reabsorção (%)b 0,80 ± 0,24 (8) 2,00 ± 0,58 (11) 0,92 ±0,30 (7) Fetos Nº ninhadaa 11,13 ± 0,30 9,64 ± 0,50 11,21 ± 0,62 Nº de fetos machos a 6,73 ± 0,64 5,07 ± 0,44 6,21 ± 0,56 Nº de fetos fêmeas a 4,40 ± 0,44 4,57 ± 0,34 5,00 ± 0,61 Peso dos fetos (g) a 3,27 ± 0,07 3,32 ± 0,07 3,28 ± 0,07 Peso fetos machos a 3,36 ± 0,07 3,33 ± 0,07 3,37 ± 0,07 Peso fetos fêmeas a 3,18 ± 0,09 3,31 ± 0,08 3,19 ± 0,08 Comprimento coroa-cauda (cm) a 4,63 ± 0,07 4,71 ± 0,07 4,69 ± 0,05 Comprimento coroa-cauda machos a 4,64 ± 0,09 4,72± 0,08 4,69 ± 0,08 Comprimento coroa-cauda fêmeas a 4,63 ± 0,08 4,70 ± 0,06 4,69 ± 0,07 Os dados são expressos como Média ± erro padrão, quando apropriado. ( ): Quantidade de ninhadas atingidas a Teste ANOVA, seguida de Dunnett. b Teste de Kruskall-Wallis

4. DISCUSSÃO

Os resultados obtidos no estudo demostram que o extrato butanólico e aquoso de B. tomentosa provocaram toxicidade reprodutiva em ratas sugerindo ação deletéria dos fitocompostos da B. tomentosa. A investigação fitoquímica nos frutos de Buchenavia tomentosa da região de ecótono Amazônia – Cerrado apresentou metabólitos secundários como taninos, saponinas, esteroides e flavonoides (Dados não publicados). 103

O aumento no número de pontos de reabsorções em fêmeas tratadas sugerem falhas no desenvolvimento do embrião, considerando que o índice de reabsorção e perda pós-implantação estabelece correlação entre o nº de blastocistos implantados e aqueles que não se desenvolveram (ALMEIDA; LEMONICA, 2000; CHANG; FELICIO; REIS, 2002). Sabe-se que agentes citotóxicos administrados antes ou depois do processo de implantação podem resultar em perda pré e pós-implantação, possivelmente interferindo com a divisão mitótica do feto necessária para seu desenvolvimento. Atividades antifertilidade e atividades abortivas de compostos fenólicos, fitoestrogenos e saponinas tem sido relatadas em modelos animais (DABHADKAR; ZADE, 2012). Portanto, presença de compostos fenólicos e saponinas nos extrato de B. tomentosa atuando sozinhos ou em combinação podem ser em parte responsáveis pelas alterações reprodutivas apresentadas no estudo. Sabe-se que os flavonoides demonstraram ter afinidade por receptores estrogenicos α (HAVSTEEN, 2002) que estão presentes em todas as células do endométrio e também nas células envolvidas no processo de decidualização e consequentemente no desenvolvimento embrionário, além disso, a variação no equilibrio hormonal que pode ocorrer devido a sua propriedade estrogenica, pode interferir com o zigoto/embrião no transito do corno uterino podendo prejudicar seu desenvolvimento, aumentando a reabsorção e reduzindo o número de fetos (CROXATTO et al., 1991 LI; DAVIS, 2007). Os terpenoides induzem aumento da apoptose de células- tronco embrionárias para gerar radicais livres provocando danos ao DNA embrionário, além de provocar perda do potencial de membrana mitocondrial, provocando assim aumento do número de reabsorção embrionária (CHAN, 2006; SKIBOLA ; SMITH, 2000) Dano mitocondrial e formação de radicais livres podem provocar danos ao embrião em desenvolvimento e indução de mutações ou consequentemente malformações fetais, bem como redução de peso fetal, esses efeitos já foram descritos em flavonoides principalmente a quercetina (SKIBOLA ; SMITH, 2000) um flavonoide encontrado em grande quantidade no gênero Buchenavia (HERNES; HEDGES, 2004; LI et al., 2002). Propriedades abortivas, anti- zigoticas e anti-implantação têm sido atribuídas à ação das saponinas (DABHADKAR; ZADE, 2012; FRANCIS et al., 2002; PADMASHALI et al, 2006; STOLZENBERG; PARKHURST, 1976; TEWARY; 104

CHATURVEDI; PANDEY, 1973; YAKUBU et al, 2010). A estrutura química das saponinas é semelhante à de alguns hormônios esteroides (tais como progesterona e testosterona), podendo influenciar na atividade ou no nível de diversos hormônios, provocando alterações reprodutivas (WINA et al.,2005). Nos machos a diminuição do ganho de peso e a redução do consumo de ração nos ratos tratados com o extrato butanólico e aquoso indicam que substâncias bioativas contidas no extrato de B. tomentosa são capazes de desencadear toxicidade sobre o organismo animal (JAHN; GÜNZEL, 1997). O menor ganho de peso possivelmente pode ter se dado em virtude da presença de flavonoides nesses extratos. Estudos mostraram o efeito de flavonoides também sobre a enzima estrogênio sintetase citocromo P-450, que catalisa a conversão de androgênios para estrogênios (formados a partir do colesterol). Os flavonoides têm ação inibidora sobre a transformação da androstenediona para estrona e de testosterona para estradiol. Os flavonoides podem competir com os esteroides, e a interação dos flavonoides com certas monoxigenases alteram a sua atividade e consequentemente o metabolismo dos hormônios esteroides. Esta ação é relevante, tendo em vista que os glicocorticoides aumentam a taxa de mobilização de gordura pelo aumento da permeabilidade da membrana celular e diminuem a entrada de lipídeos para o interior das células (LIMA et al., 2001). Além dos flavonoides as saponinas presentes nos frutos de B. tomentosa podem diminuir a absorção e transporte de nutrientes, motilidade intestinal, e inibir enzimas pancreáticas (FRANCIS, et al., 2002; PANG; CHOI; PARK, 2008). O mecanismo de ação biológica das saponinas no organismo animal tem sido atribuído à capacidade dessa substância em formar complexos com esteroides, proteínas e fosfolipídeos, podendo causar alteração na permeabilidade e até mesmo destruição das membranas celulares (SCHENKEL et al., 2007). Tais efeitos podem ter sido minimizados nas fêmeas, fato que explica o resultado observado, em que fêmeas tratadas com B. tomentosa não apresentaram alteração no ganho de peso. Pois se sabe que nesses animais, o peso corporal flutua normalmente em decorrência do estado fisiológico, este associado ao estrogênio e progesterona, os quais influenciam a ingestão de alimentos e consumo energético, que, consequentemente, influem sobre a taxa de retenção de água e deposição de gordura (EPA, 1996). 105

Mediante os resultados nota-se que a administração subcrônica dos extratos butanólico e aquoso de B. tomentosa a ratas férteis promovem toxicidade reprodutiva, com consequente reabsorção embrionária. Nos machos o tratamento prolongado com os extratos butanólico e aquoso dos frutos de mirindiba, induziram a um quadro de toxicidade sistêmica, promovendo diminuição do ganho peso. Estas ações deletérias foram desencadeadas pelos metabolitos secundários presentes nos extratos de Buchenavia tomentosa.

5. REFERÊNCIAS

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