Eduardo Maffud Cilli
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Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Química de Araraquara Síntese de Peptídeos em fase sólida de “seqüências difíceis” e estudos estrutura-função de peptídeos bioativos. Eduardo Maffud Cilli Araraquara 2007 À Deus, que nos momentos mais difíceis, sempre me orientou e me deu forças para continuar. À minha família, Lucimar, Sabrina e Dudu, que sempre me encheram de amor, compreensão e apoio. Aos meus pais, João Baptista e Bayja, obrigado pela educação e apoio. Ao meu primeiro e eterno orientador Clovis, sempre um grande professor e amigo. “Não bastam estrelas brilhando, se não tivermos olhos para alcancá-las” AGRADECIMENTOS Ao Companheiro e amigo Reinaldo Marchetto pelo convívio e apoio. A Dra. Shirley Schreier pelos inúmeros ensinamentos. A Dra. Vanderlan da Silva Bolzani pelo apoio e convite para participar do NuBBE. Aos colaboradores do IQ e da UNIFESP, que de alguma forma, direta ou indiretamente, colaboraram para a concretização deste trabalho. Aos meus estudantes de iniciação científica, mestrado e doutorado, que com suas energias e inquietudes, tornaram o árduo trabalho mais agradável, aumentando nosso interesse de aprender sempre mais e mais. Em especial ao Edson Crusca Júnior sempre uma mão pronta para auxiliar no que for preciso. Ao CNPq, CAPES e FAPESP pelos auxílios financeiros. ABREVIAÇÕES AA - Aminoácido AAA - Análise de aminoácidos ACN - Acetonitrila AN - Receptor eletrônico BAR - Benzidrilamino-resina Boc - terc-Butiloxicarbonil BOP - hexafluorfosfato de benzotriazolil-N-oxi-tris(dimetilamino)fosfônio Bzl - Benzil DCC - Diciclohexilcarbodiimida DCM - Diclorometano DIC - Diisopropilcarbodiimida DIEA - Diisopropiletilamina DMF - Dimetilformamida DMSO - Dimetilsulfóxido DN - Doador eletrônico EtOH - Etanol Fmoc - 9-fluorenilmetiloxicarbonil HAc - Ácido acético HATU - 1,1,3,3-tetrametiluroniohexafluorfosfato de O-(7-azabenzotri-azol-1-il) HFIP - 1,1,1,3,3,3-Hexafluorisopropanol HOAt - 1-hidroxi-7-azabenzotriazol HOBt - 1-hidroxibenzotriazol IV - Espectroscopia no infravermelho MBAR - Metilbenzidrilamino-resina MeOH - Metanol PIP - piperidina RMN - Ressonância magnética nuclear RPE - Ressonância paramagnética eletrônica SPFS - Síntese de peptídeos em fase sólida TFA - Ácido trifluoracético Toac - Ácido 4-amino-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-N-óxido-4-carboxílico 1. Apresentação A nossa vida científica pode ser dividida em duas etapas, uma ligada propriamente ao estudo da metodologia da “Síntese de Peptídeos em Fase Sólida - SPPS”, e outra aos estudos estrutura/atividade de peptídeos e proteínas. Desta forma, esta tese de livre docência está também separada nestas duas vertentes. No estudo da SPPS avaliamos os fatores envolvidos nas etapas de acoplamento e de clivagem. A etapa de acoplamento, a mais problemática desta metodologia, permitiu a análise dos fatores que afetam a solvatação (inchamento) do grão de resina, bem como o uso de resinas com elevado grau de substituição, enquanto a etapa de clivagem foi direcionada ao uso de diferentes resinas e meios reacionais. A segunda parte desta tese apresenta estudos envolvendo a dualidade estrutura/função de peptídeos. Entre os diversos estudos realizados, destaque foi dado a citolisina “esticolisina II”. Nesta parte o objetivo principal é a determinação do mecanismo de ação destas moléculas bem como a obtenção de substâncias mais ativas. Finalizando, estamos incluindo nesta tese os trabalhos científicos publicados, relacionados ao texto aqui exposto. 1 2. Síntese de Peptídeos em Fase Sólida – SPPS. As proteínas podem ser consideradas como as biomoléculas mais importantes dos processos celulares, participando de quase todas as etapas do ciclo celular. Entre as funções que as proteínas participam podemos citar: 1) o controle das etapas de replicação e expressão gênica; 2) a atuação como catalisadores; 3) a regulação do metabolismo energético através das enzimas reguladoras; 4) em animais, a identificação e destruição de moléculas invasoras, fazendo parte do sistema imune; e 5) estrutural: como o colágeno, fibras musculares; entre miríades de outras. Moléculas com a mesma estrutura química das proteínas, mas de tamanho menor, são chamadas de peptídeos. O ponto de divisão entre estas duas classes de moléculas é dúbio, podendo um peptídeo possuir de 30 até 100 moléculas de aminoácidos antes de ser denominado como sendo uma proteína, no entanto, o valor médio de 50 é o mais comumente encontrado. Os peptídeos apresentam por si só atividade biológica, agindo como hormônios e sinalizadores moleculares, entre outros. Atualmente uma grande quantidade de peptídeos é encontrada como toxinas em animais e bactérias. O fato de as proteínas e peptídeos possuírem estrutura química parecida – resíduos de aminoácidos ligados por ligação amida, diferindo apenas no número de aminoácidos que os compõem, torna a síntese química destas moléculas semelhante para ambas. O primeiro pesquisador que estudou a síntese peptídica foi Emil Fisher, em 1901, que descreveu a obtenção do primeiro dipeptídeo, sendo creditado a ele a origem do termo peptídeo. Durante as décadas seguintes, a química de peptídeos teve grande avanço, sendo introduzidos grupos protetores e métodos de acoplamentos mais eficazes. Apesar destes avanços, e a obtenção de peptídeos como a oxitocina, vasopressina, entre outros, a síntese destas seqüências era um processo complexo e altamente laborioso, durando de semanas a meses. Visando obter peptídeos de maneira mais rápida e eficiente, e aproveitando a grande quantidade de informação obtida sobre a estrutura e composição dos polímeros no início da década de 50, Bruce Merrifield desenvolveu a síntese de peptídeo em fase sólida, publicando o primeiro artigo sobre esta técnica em 1963 (MERRIFIELD, 1963). Esta técnica nos anos posteriores a sua introdução teve um grande avanço, com a introdução de novos protetores, agentes acoplantes, procedimentos de clivagem e, finalmente, automação, proporcionando um grande avanço nos estudos biológicos nos últimos trinta anos. 2 Esse método de síntese encontra-se publicado em diversas revisões (ALBERICIO, 2000; ATHERTON.E.; SHEPPARD, 1989; BARANY; MERRIFIELD, 1980; GREGG, 1997; STEWART; YOUNG, 1984) e baseia-se no crescimento, resíduo por resíduo, da cadeia peptídica presa covalentemente pelo seu aminoácido carboxi- terminal a sítios reativos existentes em um suporte sólido (resina). O método da fase sólida compõe-se basicamente de duas estratégias principais: uma emprega o grupamento ácido-lábil terc-butiloxicarbonila (Boc) como protetor do -amino grupo e derivados benzílicos (Bzl) para a proteção da maioria das cadeias laterais de resíduos de aminoácidos tri-funcionais. Alternativamente, a segunda opção utiliza os grupamentos 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc-base lábil) e terc-butílicos (tBu), respectivamente. Tanto na estratégia Boc/Bzl quanto na Fmoc/tBu, o aminoácido carboxi-terminal é ligado covalentemente à resina através de uma ligação éster para obtenção de peptídeos com carboxilatos livres, ou de uma ligação amida para a obtenção de peptídeos com extremidade -carboxamida após a clivagem final em fluoreto de hidrogênio anidro (HF) ou em ácido trifluoroacético (TFA), respectivamente. O método da fase sólida apresenta, como principal vantagem, a obtenção de uma grande quantidade de seqüências peptídicas diferentes em um curto espaço de tempo. Isso ocorre principalmente devido a dois fatores: 1. Automação do processo de síntese, que permite, principalmente pela insolubilidade da resina em todos os solventes utilizados na química de peptídeos, que todos os ciclos sintéticos ocorram em um único frasco de reação contendo uma placa porosa filtrante. Essa placa irá reter a resina desde o início até o final da síntese da seqüência desejada, evitando-se, portanto, a troca do frasco de reação, simplificando bastante o processo e evitando perdas do produto. 2. Eliminação de todos os solventes, reagentes e subprodutos, das diversas etapas do ciclo sintético, por simples filtração, permitindo o uso de excesso de solventes e reagentes. Apesar destas vantagens, muitas dificuldades ainda são encontradas na SPPS. Um dos problemas ainda encontrado é a síntese dos chamados “peptídeos difíceis” (Kent, 1988). Estes peptídeos possuem a característica de se agregarem entre si ou com outras cadeias peptídicas, dificultando a difusão de reagentes e solventes no interior do grão causando a ocorrência de seqüências com uma ou mais deleções (sem 1 ou mais 3 aminoácidos). Este efeito parece ser dependente de problemas conformacionais e/ou agregações inter- e intra-moleculares das cadeias peptídicas em crescimento ancoradas à estrutura polimérica. Estas agregações são seqüência-dependente, sendo que a extremidade N-terminal reativa do peptídeo pode ficar impedida momentaneamente, dificultando a reação de acoplamento do aminoácido seguinte (PENNINGTON; BYRNES, 1994). Acoplamentos com 96% de eficiência podem gerar na síntese de um peptídeo com 31 resíduos uma queda no rendimento de 79%, sendo que este valor diminui para 6% quando esta etapa ocorre com eficácia de 99,8%. Apesar de serem seqüência-dependente, tem sido observado que a maior parte dos acoplamentos incompletos ocorre entre os resíduos 12 a 20 da seqüência. Este fenômeno é atribuído a propensão da formação de -estruturas entre as cadeias peptídicas no interior do grão de resina em peptídeos com este tamanho (BARON e LOZE, 1978; KENT, 1985; PILLAI e MUTTER, 1981). Desta forma, um fator que é fundamental não só para a etapa de acoplamento, mas para todas as etapas envolvidas