วิทยานิพนธ์

อนุกรมวธิ านของแมลงวนั ตวั เบียน (Diptera: Phoridae) ของปลวกทหาร สกลุ Macrotermes (Termitidae: Macrotermitinae)

TAXONOMY OF PARASITIC FLIES (DIPTERA: PHORIDAE) ON SOLDIER TERMITE GENUS MACROTERMES (TERMITIDAE: MACROTERMITINAE)

นายร้อยโท นกน้อย

บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์

ปีการศึกษา ๒๕๖๒

ใบรับรองวิทยานิพนธ์

บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์

ปริญญา วทิ ยาศาสตรมหาบณั ฑิต (กีฏวทิ ยา) สาขาวิชา กีฏวทิ ยา ภาควิชา กีฏวทิ ยา

เรื่อง อนุกรมวิธานของแมลงวันตัวเบียน (Diptera: Phoridae) ของปลวกทหาร สกุล Macrotermes (Termitidae: Macrotermitinae) Taxonomy of Parasitic Flies (Diptera: Phoridae) on Soldier Termite Genus Macrotermes (Termitidae: Macrotermitinae)

นามผู้วจิ ัย นายร้อยโท นกน้อย

ได้พิจารณาเห็นชอบโดย อาจารย์ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์หลัก (ผชู้ ่วยศาสตราจารยส์ ุนิศา สงวนทรัพย,์ Ph.D.) อาจารย์ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์ร่วม (ศาสตราจารย์เผด็จ สิริยะเสถียร, Ph.D.) หัวหน้าภาควิชา (ผชู้ ่วยศาสตราจารยร์ ุ่งทิพย ์ มาศเมธาทิพย,์ ปร.ด.)

บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์รับรองแล้ว

(รองศาสตราจารย์ศรีจิตรา เจริญลาภนพรัตน์, Ph.D.) คณบดีบัณฑิตวิทยาลัย

วันที่ เดือน พ.ศ.

วิทยานิพนธ์

เรื่อง

อนุกรมวิธานของแมลงวันตัวเบียน (Diptera: Phoridae) ของปลวกทหาร สกุล Macrotermes (Termitidae: Macrotermitinae)

Taxonomy of Parasitic Flies (Diptera: Phoridae) on Soldier Termite Genus Macrotermes (Termitidae: Macrotermitinae)

โดย

นายร้อยโท นกน้อย

เสนอ

บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ เพื่อความสมบูรณ์แห่งปริญญาวทิ ยาศาสตรมหาบณั ฑิต (กีฏวทิ ยา) ปีการศึกษา 2562

ค

บทคัดย่อภาษาไทย ร้อยโท นกน้อย : อนุกรมวิธานของแมลงวันตัวเบียน (Diptera: Phoridae) ของปลวกทหาร สกุล Macrotermes (Termitidae: Macrotermitinae) ปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต (กีฏวทิ ยา) สาขาวชิ ากีฏวทิ ยา ภาควชิ ากีฏวทิ ยา อาจารย์ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์หลัก: ผชู้ ่วยศาสตราจารยส์ ุ นิศา สงวนทรัพย์, Ph.D. ปีการศึกษา 2562

ปลวกสกุล Macrotermes (Termitidae: Macrotermitinae) พบแพร่กระจายทว่ั ภูมิภาค เอเชียตะวันออกเฉียงใต้ เป็นท้งั ศตั รูทางการเกษตรและโครงสร้างอาคารบา้ นเรือน มีรายงาน ตรวจพบการเบียนอาศัยของหนอนแมลงวันในปลวกทหาร แต่ขอ้ มูลความสัมพนั ธ์ดงั กล่าวยงั คง มีจา กดั การวิจยั คร้ังน้ีมีวตั ถุประสงคเ์ พื่อระบุชนิดและศึกษานิเวศวิทยาของแมลงวนั เบียนปลวก ในมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ วิทยาเขตกา แพงแสน จ.นครปฐม ประเทศไทย จากการสุ่มเก็บ ตวั อยา่ งปลวก Macrotermes gilvus (Hagen) ท้งั หมด 25 จอม พบหนอนแมลงวันเบียนภายในหัว กบั ลา ตวั ของปลวกทหารจา นวน 4 จอม และพบแมลงวันตัวเต็มวัยจากดินจอมปลวก 3 จอม หนอนบางส่วนสามารถเขา้ ดกั แดภ้ ายใตส้ ภาพห้องปฏิบตั ิการ ปลวกทหารขนาดใหญ่และปลวก ทหารขนาดเล็กที่ถูกเบียนไม่มีความเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาและไม่แสดงพฤติกรรมดุร้าย จา แนกตวั อยา่ งหนอน ดักแด้ ตัวเต็มวัยด้วยลักษณะทางสัณฐานวิทยาและอณูชีววิทยา โดยเทคนิค ทางอณูชีววิทยาใช้ล าดับนิวคลีโอไทด์บางส่วนของยีน cytochrome c oxidase I (COI) ใน mitochondria จาก 23 ตวั อยา่ ง (หนอน 11 ตัว ดักแด้ 7 ตัว และตัวเต็มวัย 5 ตัว) ผลการจาแนก ท้งั สองวิธีพบว่าแมลงวนั ตวั เบียนในปลวกคือ Megaselia scalaris (Loew) (Diptera: Phoridae) นอกจากน้ี พบหนอนและตัวเต็มวัยของแมลงวัน Dohrniphora cornuta (Bigot) (Diptera: Phoridae) เป็ นแมลงร่วมอาศัยในจอมปลวกที่ถูกเบียน แต่ไม่พบการเบียนอาศัยใน ปลวก การศึกษาน้ีเป็นการคน้ พบแมลงวนั M. scalaris เบียนอาศัยในปลวก M. gilvus คร้ังแรก การตรวจสอบการเบียนปลวกของแมลงวัน M. scalaris จึงมีความส าคัญและอาจประยุกต์ใช้เป็น biological control agent สา หรับควบคุมทางชีวภาพของปลวกในอนาคตตอ่ ไป

______/ ____ / ____ ลายมือชื่อนิสิต ลายมือชื่ออาจารย์ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์หลัก

ง

บทคัดย่อภาษาอังกฤษ Royto Noknoy : Taxonomy of Parasitic Flies (Diptera: Phoridae) on Soldier Termite Genus Macrotermes (Termitidae: Macrotermitinae). Master of Science (Entomology), Major Field: Entomology, Department of Entomology. Thesis Advisor: Assistant Professor Sunisa Sanguansub, Ph.D. Academic Year 2019

Termites of the genus Macrotermes (Termitidae: Macrotermitinae) are widely distributed mainly in Southeast Asian countries. They can be both agricultural and structural pests. Many studies have demonstrated the parasitism of Diptera larva in soldier termites, however, the information of this association still limited. This research was conducted to identify the species and study the ecology of the parasitoids of termites at Kasetsart University, Kamphaeng Saen Campus, Nakhon Pathom, Thailand. Macrotermes gilvus (Hagen) termites were collected from 25 mounds. Four of the 25 mounds were found to have scuttle fly larvae inside the head and body of the soldier termites, and adult flies were found in three mounds. Some larvae successfully developed to pupae under laboratory conditions. The parasitized major and minor soldier termites did not show morphological changes and aggressive behavior. Larvae, pupae, and adult flies were identified using both morphological and molecular characteristics. Molecular identification used the partial nucleotide sequences of the mitochondrial cytochrome c oxidase I (COI) gene from the 23 specimens (11 larvae, seven pupae, and five adults). The results of both identification methods identified the parasitic Diptera as the scuttle fly, Megaselia scalaris (Loew) (Diptera: Phoridae). Moreover, the larvae and adults of the fly Dohrniphora cornuta (Bigot) (Diptera: Phoridae) were found from parasitized termite mounds, but they were not found as the parasitic Diptera of termites. This is the first discovery of M. scalaris in M. gilvus. Further investigation of termite parasitism by M. scalaris is needed, and its possible use as biological control agent for termites.

______/ ____ / ____ Student's signature Thesis Advisor's signature

จ

กิตติกรรมประกาศ

กิตติกรรมประกาศ

วิทยานิ พนธ์ฉบับน้ี ได้รับทุนวิจัยระดับบัณฑิตศึกษา จากบัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ ผู้วิจัยขอขอบพระคุณ ผศ.ดร.สุนิศา สงวนทรัพย์ กรรมการที่ปรึกษา วิทยานิพนธ์หลัก ศ.ดร.นพ.เผด็จ สิริยะเสถียร กรรมการที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์ร่วม ที่ให้คาปรึกษาใน การศึกษาค้นคว้าวิจัย การตรวจแกไ้ ขวิทยานิพนธ์จนเสร็จสมบูรณ์ และขอขอบพระคุณ รศ.ดร.อามร อินทร์สังข์ ผู้ทรงคุณวุฒิภายนอก อ.ดร.สุรเดช บุตทชน ประธานกรรมการที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์ ที่ให้ ความกรุณาตรวจแกไ้ ขวทิ ยานิพนธ์ใหส้ มบูรณ์มากยง่ิ ข้ึน

ขอขอบพระคุณ Prof. Dr. Ronald Henry Lambert Disney (Department of Zoology, University of Cambridge, United Kingdom) ที่กรุณาตรวจสอบยืนยันผล เอ้ือเฟ้ื อข้อมูลค าแนะน า เกี่ยวกบั แมลงวนั ตวั เบียนอนั มีค่าย่ิงแก่งานวิจยั ขอขอบคุณ นายสกล สุนันทราภรณ์ ดร.อัจฉรา ภูมี และคณะบุคลากรภาควิชาปรสิตวิทยา คณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย ทุกท่านที่เอ้ือเฟ้ือ เวลา สถานที่ วัสดุอุปกรณ์ส าหรับทางานวิจัย ให้ความรู้คาปรึกษาแนะน า ความช่วยเหลือแกไ้ ขปัญหา ตา่ ง ๆ ดา้ นเทคนิคทางอณูชีววทิ ยาจนสา เร็จลุล่วง

ข อ ข อ บ พ ร ะ คุ ณ ค ณ า จ า ร ย์ภ า ค วิ ช า กี ฏ วิ ท ย า ค ณ ะ เ ก ษ ต ร ก า แ พ ง แ ส น มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ วิทยาเขตกา แพงแสน ทุกท่านที่ได้อบรมส่ังสอนมอบความรู้อันเป็ น ประโยชน์อย่างย่ิงต่องานวิจยั และ การนา ไปใช้ประโยชน์ต่อไป ขอขอบคุณหน่วยงานต่าง ๆ ของ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ วิทยาเขตกา แพงแสน ที่ให้อนุญาตส าหรับส ารวจเก็บตวั อยา่ งปลวกภายใน พ้ืนที่

สุดทา้ ยน้ี ด้วยประโยชน์ หรือ คุณความดีใด ๆ อนั เนื่องมาจากวทิ ยานิพนธ์ฉบบั น้ี ผูว้ จิ ยั ใคร่ ขอมอบท้งั หมดแด่บิดา มารดา น้องชาย ญาติสนิทมิตรสหาย จนถึงทุกท่านที่มิไดเ้ อ่ยนามที่กรุณาให้ ความช่วยเหลือ คาแนะน าสนับสนุน และ กา ลงั ใจอนั มีคา่ มาโดยตลอดไว ้ ณ โอกาสน้ี

ร้อยโท นกน้อย

สารบัญ

หน้า บทคดั ยอ่ ภาษาไทย ...... ค

บทคดั ยอ่ ภาษาองั กฤษ ...... ง

กิตติกรรมประกาศ ...... จ

สารบัญ ...... ฉ

สารบัญตาราง ...... ฌ

สารบัญภาพ ...... ญ

คาน า ...... 1

วัตถุประสงค์ ...... 5

การตรวจเอกสาร ...... 6

ปลวก ...... 6

การแบง่ ประเภทของปลวก ...... 7

บทบาทและความสาคัญของปลวก ...... 9

ปลวกสกุล Macrotermes ...... 10

ปลวก Macrotermes gilvus ...... 11

ปลวก Macrotermes carbonarius ...... 12

แมลงวันตัวเบียนในปลวก ...... 13

แมลงวันตัวเบียนวงศ์ Phoridae ...... 15

แมลงวันตัวเบียนวงศ์ Calliphoridae ...... 20

การจาแนกแมลงด้วยเทคนิคทาง อณูชีววิทยา ...... 22

เทคนิคทางอณูชีววิทยา ...... 22

ความสา คญั ต่อการจดั จา แนกส่ิงมีชีวติ ...... 23 ช

การจัดจาแนกแมลงอันดับ Diptera ด้วยเทคนิคทางอณูชีววิทยา ...... 24

DNA marker สาหรับการศึกษาด้านพันธุกรรม ...... 25

เทคนิคสาหรับการศึกษาทางอณูชีววิทยา ...... 27

การเพ่ิมปริมาณ DNA เป้าหมายด้วยเทคนิค polymerase chain reaction (PCR) ...... 27

การศึกษาลาดับนิวคลีโอไทด์ด้วยเทคนิค Sequence ...... 28

การศึกษาววิ ฒั นาการของส่ิงมีชีวติ ดว้ ยแผนภูมิตน้ ไม ้ (Phylogenetic tree)...... 29

อุปกรณ์และวิธีการทดลอง ...... 31

วัสดุอุปกรณ์ ...... 31

โปรแกรมวิเคราะห์ข้อมูล ...... 32

วิธีการ ...... 33

วธิ ีการเกบ็ ตวั อยา่ ง จา แนกชนิดปลวก และทดสอบพฤติกรรมดุร้าย ...... 33

วธิ ีการเกบ็ ตวั อยา่ งแมลงวนั เบียนปลวก ...... 33

การจาแนกชนิดแมลงวันเบียนปลวก จาแนกโดยลักษณะทางสัณฐานวิทยา ...... 35

การจาแนกชนิดโดยวิเคราะห์ล าดับนิวคลีโอไทด์ของยีน mitochondrial COI ...... 35

การสกดั DNA ...... 35

การเพ่ิมปริมาณ DNA ...... 36

การตรวจสอบขนาดของ PCR product ของยีน COI ...... 37

การสร้างพลาสมิด DNA ลูกผสม ...... 38

การวิเคราะห์ลาดับนิวคลีโอไทด์ ...... 38

การสร้างและวิเคราะห์แผนภูมิวิวัฒนาการ (phylogenetic tree) ...... 39

ผลและวิจารณ์การทดลอง ...... 40

การเกบ็ ตวั อยา่ งปลวกและทดสอบพฤติกรรมดุร้าย ...... 40

การเกบ็ ตวั อยา่ งแมลงวนั ตวั เบียนปลวก ...... 45

การจาแนกชนิดโดยลักษณะทางสัณฐานวิทยา ...... 55 ซ

การจาแนกชนิดโดยวิเคราะห์ล าดับนิวคลีโอไทด์ของยีน mitochondrial COI ...... 67

ผลการเพ่ิมจา นวนชิ้นส่วนยีน COI โดยเทคนิค PCR ...... 67

ผลการสร้างพลาสมิด DNA ลูกผสม โดยเทคนิค Colony PCR ...... 69

ผลการวิเคราะห์ลาดับนิวคลีโอไทด์ ...... 71 ผลการเปรียบเทียบลาดับนิวคลีโอไทด์ของยีน COI ในตวั อยา่ งกบั ฐานขอ้ มูล GenBank ...... 74

ผลการวิเคราะห์ความเหมือนและความแตกตา่ งของลา ดบั นิวคลีโอไทดภ์ ายในชนิด 78

ผลการสร้างและวิเคราะห์แผนภูมิต้นไม้วิวัฒนาการ ...... 79

สรุปและข้อเสนอแนะ ...... 84

เอกสารและส่ิงอา้ งอิง ...... 86

ภาคผนวก ...... 98

ประวัติการศึกษา และการทางาน ...... 101

สารบัญตาราง

หน้า ตารางที่ 1 รายชื่อส่ิงมีชีวติ อาศยั (host) ของแมลงวันวงศ์ Phoridae ...... 16

ตารางที่ 2 รายชื่อแมลงวันวงศ์ Phoridae ที่มีรายงานเป็นตัวเบียนในปลวก ...... 17

ตารางที่ 3 จา นวนตวั อยา่ งแมลงวนั ตวั เบียน 3 ระยะจากจอมปลวก 4 จอมก่อนหนอนเขา้ ดกั แด ้.... 47

ตารางที่ 4 จา นวนตวั อยา่ งแมลงวนั ตวั เบียน 3 ระยะจากจอมปลวก 4 จอมหลังหนอนเข้าดักแด้ .... 47

ตารางที่ 5 จานวนปลวกทหารถูกเบียนและร้อยละการเบียนจากจอมปลวก 4 จอม ...... 50

ตารางที่ 6 รายชื่อส่ิงมีชีวติ อาศยั ของแมลงวนั ตวั เบียน Megaselia scalaris ...... 64

ตารางที่ 7 ขอ้ มูลพ้ืนฐานของตวั อยา่ งที่จา แนกชนิดดว้ ยเทคนิคทางอณูชีววทิ ยา ...... 72 ตารางที่ 8 ผลการเปรียบเทียบความคล้ายคลึงของลาดับนิวคลีโอไทด์ของยีน COI ของตวั อยา่ ง แมลงวนั กบั ฐานขอ้ มูล GenBank ...... 75 ตารางที่ 9 ผลการข้ึนทะเบียนขอหมายเลขลา ดบั นิวคลีโอไทดข์ องยนี COI ของตวั อยา่ งแมลงวัน เบียนปลวก ...... 77

สารบัญภาพ

หน้า ภาพที่ 1 แผนผงั ข้นั ตอนการเกบ็ ตวั อยา่ งปลวกและแมลงวนั ตวั เบียน...... 34 ภาพที่ 2 แผนที่แสดงการกระจายตัวของจอมปลวก Macrotermes gilvus (วงกลมสีเหลือง) ปลวก ปกติ (วงกลมสีแดง) ปลวกถูกเบียน ...... 41

ภาพที่ 3 ลักษณะภายนอกของจอมปลวก Macrotermes gilvus ...... 42

ภาพที่ 4 จอมปลวก Macrotermes gilvus (4A) สภาพภายในจอมขณะขุด (4B) fungus comb ...... 42

ภาพที่ 5 ด้านบน (dorsal view) ส่วนหวั ของปลวกทหารขนาดใหญ ่ Macrotermes gilvus ...... 44

ภาพที่ 6 ลกั ษณะทางสัณฐานวทิ ยาสา คญั ของปลวกทหารขนาดใหญ ่ Macrotermes gilvus ...... 44

ภาพที่ 7 จอมปลวกที่สมาชิกถูกแมลงวันเบียน (7A) จอม 1 (7B) จอม 2 (7C) จอม 3 (7D) จอม 4 . 46

ภาพที่ 8 ปลวกทหารขนาดใหญ ่ Macrotermes gilvus พบหนอนแมลงวันเบียน 5 ตัวภายใน 1 หัว 48

ภาพที่ 9 ปลวกทหารขนาดเล็ก Macrotermes gilvus พบหนอนแมลงวันเบียนภายในหัว ...... 48

ภาพที่ 10 หนอนแมลงวัน (ในวงกลม) เจาะออกจากส่วนทอ้ งของปลวกทหารขนาดเล็ก ...... 49

ภาพที่ 11 แผนผังสรุปจานวนปลวกทหารที่พบแมลงวันเบียนอาศัย ...... 49

ภาพที่ 12 แผนผงั สรุปผลการเกบ็ ตวั อยา่ งหนอนและดกั แดแ้ มลงวนั เบียนปลวก ...... 52 ภาพที่ 13 ตวั อยา่ งจากการแบง่ หนอนบางส่วนเพื่อตรวจสอบวงจรชีวติ (13A) ดักแด้ (13B) หนอน ระยะเตรียมเข้าดักแด้ (pre-pupa) ...... 53 ภาพที่ 14 ดกั แดแ้ มลงวนั จากส่วนหวั ของปลวกทหารขนาดใหญ ่ (14A) ขณะพบภายในส่วนหวั (14B) ภายหลงั นา ออกจากส่วนหวั ...... 54

ภาพที่ 15 หนอน Megaselia scalaris วัยที่ 1 ...... 56

ภาพที่ 16 หนอน Megaselia scalaris วัยที่ 2 ...... 56

ภาพที่ 17 หนอน Megaselia scalaris วัยที่ 3 ...... 57 ภาพที่ 18 หนอน Megaselia scalaris ระยะเตรียมเข้าดักแด้ (pre-pupa) (18A-18C) เรียงตาม ข้นั ตอนการเปลี่ยนแปลงรูปร่าง ...... 57 ฎ

ภาพที่ 19 ส่วนหวั ของหนอน Megaselia scalaris (19A) ด้านบน (19B) ดา้ นล่าง ...... 58

ภาพที่ 20 ส่วนทา้ ยลา ตวั ของหนอน Megaselia scalaris (20A) ด้านบน (20B) ดา้ นล่าง ...... 58

ภาพที่ 21 ดักแด้ Megaselia scalaris ...... 59 ภาพที่ 22 ลักษณะจาแนกของดักแด้ Megaselia scalaris (22A) anterior spiracle และ respiratory horn (22B) posterior spiracle ...... 59

ภาพที่ 23 แมลงวันตัวเบียน Megaselia scalaris ตัวเต็มวัยเพศผู้ ...... 61

ภาพที่ 24 แมลงวันตัวเบียน Megaselia scalaris ตัวเต็มวัยเพศเมีย...... 61

ภาพที่ 25 เส้นปีกแมลงวัน Megaselia scalaris ตัวเต็มวัย ...... 62

ภาพที่ 26 ดา้ นบนส่วนทอ้ งแมลงวนั Megaselia scalaris ตัวเต็มวัย (26A) เพศผู้ (26B) เพศเมีย ..... 62

ภาพที่ 27 หนอนแมลงวัน Dohrniphora cornuta วัยที่ 3 (27A) ด้านบน (27B) ดา้ นล่าง ...... 65

ภาพที่ 28 แมลงวัน Dohrniphora cornuta ตัวเต็มวัย...... 66 ภาพที่ 29 PCR product จากการเพ่ิมจา นวนยนี COI ของแมลงวัน Dohrniphora cornuta ขนาด ประมาณ 373 bp ด้วย forward primer 5'- GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G -3' และ reward primer 5'- TAG ACT TCT GGG TGG CCA AAG AAT CA -3' ...... 68 ภาพที่ 30 PCR product จากการเพ่ิมจา นวนยนี COI ของแมลงวัน Megaselia scalaris ขนาด ประมาณ 709 bp ด้วย forward primer 5'- GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G -3' และ reward primer 5'- TAG ACT TCT GGG TGG CCA AAG AAT CA -3' ...... 68 ภาพที่ 31 Semi-Nested PCR product จากการเพ่ิมจา นวนยนี COI ของแมลงวัน Megaselia scalaris ขนาดประมาณ 634 bp ด้วย forward primer 5'- GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G -3' และ reward primer 5'- AAT GAT GTA TTA AAA TTT CG -3' ...... 69

ภาพที่ 32 colony สีขาวของแบคทีเรีย เกิดจากยนี COI เข้าแทนที่ยีน lacZ ...... 70

ภาพที่ 33 ผลจาก sequencing ในรูปกราฟ chromatogram ของยีน COI ของแมลงวันเบียนปลวก . 71 ภาพที่ 34 ผล multiple sequence alignment จากลาดับนิวคลีโอไทด์ของยีน COI ของตวั อยา่ ง แมลงวัน Megaselia scalaris เบียนปลวก ...... 73

ภาพที่ 35 ผลการวเิ คราะห์คา่ ร้อยละความเหมือนภายในชนิดของ Megaselia scalaris เบียนปลวก 78 ฏ

ภาพที่ 36 ผลการวเิ คราะห์ค่าร้อยละความแตกตา่ งภายในชนิดของ Megaselia scalaris เบียนปลวก ...... 79 ภาพที่ 37 ผล phylogenetic tree จากยีน COI เพื่อจาแนกชนิดของแมลงวัน Megaselia scalaris เบียน ปลวกจากการใช้ maximum likelihood method แบบ general time reversible model โดยกา หนดคา่ bootstrap test จานวน 1,000 รอบ ...... 80 ภาพที่ 38 ผล phylogenetic tree จากยีน COI เพื่อจาแนกชนิดของแมลงวัน Dohrniphora cornuta จากการใช้ maximum likelihood method แบบ Tamura-Nei model โดยกา หนดคา่ bootstrap test จานวน 1,000 รอบ ...... 82

อนุกรมวธิ านของแมลงวันตัวเบียน (Diptera: Phoridae) ของปลวกทหาร สกลุ Macrotermes (Termitidae: Macrotermitinae)

Taxonomy of Parasitic Flies (Diptera: Phoridae) on Soldier Termite Genus Macrotermes (Termitidae: Macrotermitinae)

คาน า

ปลวก เป็นแมลงที่พบการแพร่กระจายทว่ั เขตร้อนกบั ก่ึงเขตร้อน มีบทบาทท้งั โทษและ ประโยชน์ต่อมนุษยจน์ ถึงระบบนิเวศน์ บทบาทตอ่ มนุษยคือ์ บางชนิดเป็นศัตรูทา ลายไม้ที่มนุษย์ นามาใช้ประโยชน์ ท้งั พืชมีชีวิตและพืชตายแล้ว บทบาทศตั รูอาจแตกตา่ งกนั ตามเขตพ้ืนที่อาศัย (Lewis, 2009) บางชนิดเพาะเล้ียงเห็ดโคนใช้เป็นอาหารสาหรับมนุษย์ ส่วนความสาคัญใน ระบบ นิเวศน์น้นั ปลวกคือผยู้ อ่ ยสลายอินทรียวตั ถุตา่ ง ๆ ให้กลายเป็นฮิวมัส (humus) ในดิน เกิดการ หมุนเวยี นธาตุอาหารจากพืชสู่ดินทาให้ดินอุดมสมบูรณ์ (ยุพาพร และ สุรางค์, 2548; วีรยุทธ และ คณะ, 2552) เนื่องจากประเทศไทยต้งั อยเู่ ขตภูมิอากาศโซนร้อน ประกอบด้วยระบบนิเวศน์ป่าไม้ หลากหลายจึงเหมาะสมตอ่ การดา รงชีวติ ของปลวก ส่งผลให้ความหลากชนิดของปลวกมาก ประมาณร้อยละ 6.79 ของชนิดปลวกท้งั หมด พบได้ทว่ั ไปจากหลายพ้ืนที่ ท้งั ป่า พ้ืนที่การเกษตร ที่ พักอาศัยตามชนบทถึงอาคารบ้านเรือนในเมือง จากการสารวจชนิด ปลวกในประเทศไทยพบ ท้งั หมด 4 วงศ์ คือ Archotermopsidae Kalotermitidae Rhinotermitidae และ Termitidae ประกอบด้วย 10 วงศย์ อ่ ย 37 สกุล และ 199 ชนิด โดยวงศ์ Termitidae มีความหลากชนิดมากที่สุด ซึ่ง เป็นกลุ่มปลวกช้นั สูง ระบบทางเดินอาหารพบแบคทีเรีย (bacteria) กบั รา (fungi) ช่วยยอ่ ย cellulose แทนโปรโตซัว (protozoa) ที่พบเฉพาะปลวกช้นั ต่า (Brune, 2009) ปลวกวงศน์ ้ีประกอบด้วย 4 วงศ์ ยอ่ ย โดยวงศย์ อ่ ยสา คญั คือ Macrotermitinae ประกอบด้วยสกุล Ancistrotermes Hypotermes Macrotermes Microtermes และ Odontotermes สามารถพบทุกสกุลได้ทว่ั เขตภูมิศาสตร์ท้งั 4 ภาค คือ ภาคเหนือ ภาคตะวันออกเฉียงเหนือ ภาคกลาง และภาคใต้ (Sornnuwat et al., 2004) 2

ปลวกสกุล Macrotermes มีขนาดลาตัว ใหญท่ ี่สุด ทุกชนิดเพาะเล้ียงเช้ือรา ส่วนมากสร้าง จอมหลายขนาดบนพ้ืนดินต้งั แตต่ ่า กวา่ 1 ฟุต จนถึงสูง 30 ฟุต หรือ 9 เมตร พบเพียงส่วนนอ้ ยที่สร้าง รังใต้ดิน มีการแพร่กระจายทว่ั ทวีปแอฟริกากบั เอเชีย โดยชนิดสาคัญของ ภูมิภาคเอเชียตะวันออก เฉียงใต้ คือ Macrotermes gilvus (Hagen) และ Macrotermes carbonarius (Hagen) (Brandl et al., 2007; Neoh, 2014; Neoh and Lee, 2009c) โดยปลวกวรรณะทหารของท้งั 2 ชนิดน้ีพบหนอน แมลงวัน 2 วงศ์เป็นตัวเบียนภายในร่างกาย ไดแ้ ก่ วงศ ์ Phoridae เบียนปลวก M. gilvus (Neoh and Lee, 2010) ส่วนวงศ์ Calliphoridae เบียนปลวก M. carbonarius (Neoh and Lee, 2011)

การเบียน (parasitoidism) เป็นความสัมพันธ์ก้า ก่ึงระหวา่ งการล่า (predation) กบั ปรสิต (parasitism) ปัจจุบันมีความสา คญั ตอ่ การศึกษาด้านนิเวศวิทยา รวมถึงการควบคุมประชากรของ ส่ิงมีชีวติ อาศยั (host) (Zhang et al., 2017) สาหรับ แมลงวันตัวเบียนวงศ์ Phoridae ระยะหนอนกิน อาหารหลากหลาย เดิมจัดอยกู่ ลุ่มกินซากอินทรียวตั ถุ ตอ่ มาววิ ฒั นาการกลายเป็นกลุ่มตวั เบียน/ ปรสิตของพืชกบั เห็ดรา ตวั ห้า ไข ่ หนอนของแมลง และแมลงร่วมอาศยั ของแมลงสังคม ปัจจุบันพบ หนอนแมลงวันวงศ์น้ีประมาณ 300 ชนิดจากท้งั หมดราว 3,000 ชนิดทว่ั โลกแสดงพฤติกรรมตัว เบียนภายในหรือปรสิตของส่ิงมีชีวติ กลุ่มสัตว์ขาปล้อง (arthropod) ในดิน มีท้งั ประเภทตัวเบียนเดี่ยว (solitary) และตวั เบียนกลุ่ม (gregarious) หลายชนิดเบียนปลวกโดยเฉพาะปลวก M. gilvus ถูกเบียน โดยหนอนแมลงวัน Misotermes mindeni Disney & Neoh มากที่สุด หนอนเจริญเติบโตในส่วนหวั ของปลวกทหารขนาดใหญ ่ (major soldier) ทาให้ปลวก หัวกลม กราม (mandible) ส้ัน ความดุร้าย ลดลง และจะเข้าดักแด้ภายในลาตัวปลวก (Neoh and Lee, 2010) ส่วนแมลงวันวงศ์ Calliphoridae พบรายงาน 1 ชนิด ไดแ้ ก่ Verticia fasciventris Malloch เบียนในปลวก M. carbonarius ท้งั ปลวก ทหารขนาดใหญ่และขนาดเล็ก (minor soldier) ทาให้ หัวปลวกเป็นรูปสี่เหลี่ยมจตั ุรัส กรามส้ัน เขา้ ดักแด้ภายนอกตัวปลวก แตย่ งั พบขอ้ ขดั แยง้ เรื่องการเพ่ิมข้ึนหรือลดลงของความดุร้ายของปลวกที่ ถูกเบียน (Neoh and Lee, 2011)

3

การศึกษาเรื่องปลวกในประเทศไทยพบรายงานจากกรมป่าไมแ้ ละโครงการความร่วมมือ ระหวา่ งประเทศกบั มหาวทิ ยาลยั เกษตรศาสตร์ซ่ึงส่วนใหญ่ศึกษาในเขตพ้ืนที่อุทยานแห่งชาติ แตย่ งั ไมพ่ บการศึกษามากในพ้ืนที่ธรรมชาติที่ถูกแบง่ แยกตามกิจกรรมตา่ ง ๆ (habitat fragmentation) หรือ การเปลี่ยนแปลงภูมิทัศน์ (landscape structure) ตามกิจกรรมของมนุษย ์ ภาคตะวันตกเป็นหนึ่งใน ภูมิภาคที่อุดมสมบูรณ์ความหลากหลายทางชีวภาพสูงเหมาะสมตอ่ การดา รงชีวติ ของปลวก พบ ปลวกแพร่กระจายหลายชนิดโดยเฉพาะกลุ่มปลวกเพาะเล้ียงเช้ือราซ่ึงไดร้ ับความสนใจศึกษาอยา่ ง มาก ท้งั น้ีมหาวทิ ยาลยั เกษตรศาสตร์ วทิ ยาเขตกา แพงแสน จ.นครปฐม ต้งั อยเู่ ขตภาคกลางทางฝ่ัง ตะวันตกของประเทศ พ้ืนที่ประมาณ 7,951.75 ไร่ ประกอบดว้ ยสภาพพ้ืนที่หลากหลาย ท้งั ดงต้นไม้ ใหญ ่ พ้ืนที่เล้ียงสัตว ์ ประมง เพาะปลูกทางการเกษตร แหล่งน้า อาคารส่ิงก่อสร้าง พ้ืนที่อาศยั พ้ืนที่ รกร้าง แตล่ ะพ้ืนที่ถูกแบง่ สัดส่วนคอ่ นขา้ งแสดงความแตกตา่ งชัดเจน พบจอมปลวกจานวนมากใน มหาวิทยาลัยรวมท้งั ปลวกสกุล Macrotermes จากการสารวจ เบ้ืองตน้ พบหนอนแมลงวันท้งั อาศัยใน ส่วนหวั และออกมาจากลาตัว ของปลวกทหารขนาดใหญ่ M. gilvus โดยปลวกถูกเบียนไมเ่ กิดการ เปลี่ยนแปลงลักษณะทางสัณฐานวิทยา ซึ่งจากการตรวจเอกสาร แมลงวนั เบียนปลวกส่วนใหญ่มี การศึกษาในประเทศมาเลเซีย สาหรับประเทศไทย พบแมลงวันเบียนปลวกเพียงชนิดเดียว คือ Misotermes vicinus Borgmeier เบียนปลวกทหาร M. gilvus เมื่อปี ค.ศ. 1967 (Neoh and Lee, 2010) โดยพบตวั อยา่ งจากจังหวัดลาพูน ปราจีนบุรีและตรัง ตามรายงานของ Global access to knowledge about life on Earth (https://eol.org/pages/812964/names) และไมม่ ีรายงานอื่นอีกจนถึงปัจจุบัน

วัตถุประสงค์ของวิทยานิพนธ์ฉบับน้ีเพื่อจาแนกชนิด และศึกษาชีววิทยากบั นิเวศวทิ ยาบาง ประการของแมลงวันตัวเบียนปลวกทหารสกุล Macrotermes เช่น การเปลี่ยนแปลงของลักษณะทาง สัณฐานวิทยา พฤติกรรม สภาพแวดล้อมรอบจอมของปลวกที่ถูกเบียน รวมถึงลาดับนิวคลีโอไทด์ ของแมลงวันตัวเบียน อยา่ งไรกต็ าม การจาแนกชนิดของหนอนแมลงวัน โดยอาศัยลักษณะทาง สัณฐานวิทยาภายนอกเพียงวิธีเดียวใหไ้ ดผ้ ลแน่ชดั น้นั กระทา ไดย้ าก เนื่องจากแมลงอันดับ Diptera มี ความหลากชนิดสูง ลักษณะภายนอกของระยะตวั ออ่ นใกล้เคียงกนั มาก ตวั อยา่ งแมลงอาจอยใู่ น สภาพที่ไมส่ ามารถจา แนกได ้ รวมท้งั ตอ้ งอาศยั ผเู้ชี่ยวชาญเฉพาะทางซ่ึงมีจา นวนไมม่ ากนกั สาหรับ ยืนยันจาแนกชนิดที่แท้จริง จากการเล้ียงระยะตวั อ่อนใหเ้ ขา้ สู่ตวั เตม็ วยั น้นั คอ่ นขา้ งยงุ่ ยาก ล่าชา้ จึงมี โอกาสล้มเหลวสูง (รัชฎาภรณ์, 2552) ด้วยปัญหาเหล่าน้ีทาให้จ าเป็นต้อง มีการใช้เทคนิคทางอณู 4

ชีววิทยาเพื่อจาแนกชนิดแมลงวัน ร่วมดว้ ย ผลของการศึกษาสามารถเสริมข้อมูลความสัมพันธ์ของ แมลงวันเบียนอาศัยในปลวกในหลายด้าน รวมถึงการนาไปใช้ประโยชน์ ในด้านตา่ ง ๆ เช่น การนา ส่ิงมีชีวติ ควบคุมทางชีวภาพ (biological control agent) เพื่อการควบคุมปลวกสกุล Macrotermes หรือปลวกสกุลอื่น ๆ ต่อไป

5

วตั ถุประสงค์

1. เพื่อจาแนก ชนิดของแมลงวันตัวเบียนในปลวกทหารสกุล Macrotermes 2. เพื่อศึกษาชีววิทยาและนิเวศวิทยาบางประการของปลวกสกุล Macrotermes ที่ถูกเบียน

6

การตรวจเอกสาร

ปลวก

ปลวก (termites, white ant) (Blattodea: Termitoidae) เป็นแมลงขนาดเล็ก เดิมอยใู่ นอนั ดบั (order) Isoptera ซึ่งชื่อมีรากศพั ทจ์ ากภาษากรีก โดยคา วา่ Isos- แปลวา่ เทา่ กนั (equal) หรือ เหมือนกนั (similar/same) ส่วนคา วา่ ptera แปลวา่ ปีก (wing) มาจากปีกคูห่ นา้ และคูห่ ลงั ของวรรณะ สืบพันธุ์ยาวเทา่ กนั (Coulson and Witter, 1984; Lewis, 2009; Šobotník and Dahlsjö, 2017; Trigunayat, 2016) ลา ตวั ออ่ นนุ่ม พบต้งั แต่สีขาวถึงสีดา การเจริญเติบโตแบบไมส่ มบูรณ์ (hemimetabolous หรือ incomplete metamorphosis) เป็นแมลงสังคมแท้ (eusocial) สมาชิก ประกอบด้วยหลายวรรณะ (caste) ไดแ้ ก่ วรรณะสืบพนั ธุ์ (alate/imago/reproductive) วรรณะ กรรมกร (worker) และวรรณะทหาร (soldier) ปลวกแตกตา่ งจากมดไดแ้ ก่ หนวดมี 2 แบบ คือ แบบ ลูกปัดกบั แบบเส้นด้าย ส่วนระหวา่ งอกกบั ทอ้ งกวา้ ง ไมค่ อด ปีกท้งั 2 คูของวรรณะสืบพันธุ์่ ลักษณะ คล้ายกนั ขณะที่มดมีหนวดแบบหกั ศอก ส่วนเอวคอด ปีก 2 คูของวรรณะสืบพันธุ์่ แตกตา่ งกนั (Cranston and Gullan, 2009; Lewis, 2009; จารุณี และ ยุพาพร, 2547; วีรยุทธ และคณะ, 2552) ส่วน ปากแบบกดั กิน (mandibulate) พบความแตกตา่ งกนั ในวรรณะทหารของปลวกบางชนิดมีการ ดดั แปลงส่วนเข้ียว (mandible) หรือจงอย (nasus/snout) (Cranston and Gullan, 2009)

หลักฐานการกา เนิดเก่าแก่ที่สุดของปลวกอยใู่ นช่วงยคุ Cretaceous หรือประมาณ 130 ล้านปี ก่อน พบจานวนชนิด สูงมากกวา่ 1,000 ชนิดที่ทวีปแอฟริกา พบปานกลางในเขตอเมริกาเหนือ (50 ชนิด) กบั ยุโรป (10 ชนิด) ไมพ่ บในเขตข้วั โลก มีความสัมพนั ธ์ใกลช้ ิดกบั แมลงสาบ (อันดับ Blattodea) และตก๊ั แตนตา ขา้ ว (อันดับ Mantodea) (Lewis, 2009) แตความสัมพันธ์ของ่ แมลงกลุ่มน้ี ยังคงไมช่ ดั เจน ปลวกเคยถูกพิจารณาอยใู่ นกลุ่มอันดับ (superorder) (หรืออันดับ) Dictyoptera ใกลช้ ิดกบั อนั ดบั (หรืออนั ดบั ยอ่ ย) Blattodea จากการศึกษาโครงสร้างของก๋ึน (proventriculus) อวัยวะสืบพันธุ์เพศผู้ (male genitalia) การลดรูปของอวยั วะวางไขเ่ พศเมีย (ovipositor) การสร้างฝัก ไข ่ (ootheca) (Krishna et al., 2013) ร่วมกบั ลาดับทาง อณูชีววิทยา แสดงให้เห็นวา่ จุดกา เนิดของกลุ่ม 7

ปลวกเกิดข้ึนภายในกลุ่มแมลงสาบ ตอ่ มาวิวัฒนาการแยกเป็นวงศว์ านคูข่ นาน (paraphyletic group) โดยปลวกจัดเป็นกลุ่มพี่นอ้ งหรือสายววิ ฒั นาการคู่ขนาน (sister group) กบั แมลงสาบไม ้ (woodroache) สกุล Cryptocercus (Blattodea: Cryptocercidae) ซ่ึงอาศยั อยแถบู่ อเมริกาเหนือกบั เอเชียตะวนั ออก แมลงสาบสกุลดงั กล่าวแสดงพฤติกรรมแมลงก่ึงสังคม (semisocial) คือสมาชิกรุ่น หนึ่งปกป้องดูแลลูกหลาน (parental care) และถ่ายทอดจุลินทรีย์ในระบบทางเดินอาหารไปสู่ สมาชิกรุ่นถดั ไปโดยการสารอก อาหาร (trophallaxis) ใกลเ้ คียงกบั ปลวก รวมถึงปลวกสกุล Mastotermes มีระบบสังคม ลกั ษณะทางสัณฐานวทิ ยาพ้ืนฐานของวรรณะสืบพันธุ์และการสร้างฝัก ไข่คอ่ นขา้ งคล้ายแมลงสาบไม้ ทาให้ ถูกจัดเป็นกลุ่มพี่นอ้ งในปัจจุบัน (Cranston and Gullan, 2009; Nalepa and Lenz, 2000)

จากเหตุผลดงั กล่าวไดแ้ ก่ ลกั ษณะทางสัณฐานวทิ ยาบางประการ เทคนิคทางอณูชีววิทยา ลกั ษณะที่พฒั นาร่วมกนั (synapomorphy) บางประการ เช่น กินไม ้ (xylophagy) เล้ียงดูลูกหลาน พบ จุลินทรียก์ ลุ่มที่มี flagella (flagellate) ภายในทางเดินอาหารส่วนท้าย (hindgut) จานวนมาก หลากหลายชนิดและส่งผา่ นจุลินทรียน์ ้นั สู่รุ่นถดั ไป ทาให้ ปัจจุบันมีหลายรายงานที่พิจารณาให้ ปลวกเป็นส่วนหน่ึงของอนั ดบั Blattodea กลุ่มวงศ์ (superfamily) Blattoidea กลุ่มวงศ์ยอ่ ย (epifamily) Termitoidae ประกอบด้วย 9 วงศ์ โดยเมื่อปี ค.ศ. 2013 พบปลวกรวมท้งั สิ้น 2,929 ชนิด ทวโลก่ั (Beccaloni and Eggleton, 2013; Inward et al., 2007; Wang et al., 2017) ในการจาแนกปลวก ระดับวงศ์และสกุลด้วยลักษณะทางสัณฐานวิทยาใช้วรรณะทหารกบั วรรณะสืบพันธุ์ มีบางชนิด เทา่ น้นั จาแนกโดย ใช้วรรณะกรรมกร (Lewis, 2009)

การแบ่งประเภทของปลวก

1. แบง่ ประเภทปลวกตามแหล่งที่อยอู่ าศยั ได้ 2 ประเภทคือ ปลวกอาศัยในไม้และปลวก อาศัยในดิน โดยปลวกอาศัยในไม้อาศัยกดั กินอยภู่ ายในเน้ือไมตลอดชีวิต้ ไมพ่ บทางเดินเชื่อมตอ่ กบั พ้ืนดิน มักพบเศษมูลแข็งเม็ดกลมรีภายในเน้ือไมท้ ี่ถูกกินเป็นโพรงหรือร่วงหล่นออกมาตามรูที่ผวิ ไม้ จาแนก เป็นกลุ่มยอ่ ยตามความช้ืนของไมท้ ี่ปลวกอาศัย ประเภทที่ 1 คือ ปลวกไม้แห้ง (dry-wood 8

termites) อาศัยในไม้แห้งที่มีอายุการใช้งานนาน ความช้ืนต่า มกั ไม่พบตวั ปลวกอยนู่ อกไม ้ แตพ่ บ เศษมูลกลมรีขนาดเล็กอยบู่ นพ้ืนบริเวณโครงสร้างไมท้ ี่ถูกทา ลาย และมักทาลายเฉพาะ เน้ือไมภาย้ ใน เหลือแผน่ บาง ๆ อยภายนอกู่ ทา ให้ไม้เหมือนยงั อยใู่ นสภาพดี ประเภทที่ 2 คือ ปลวกไม้เปียก (damp- wood termites) อาศัยภายในเน้ือไมย้ นื ตน้ หรือซากไมท้ ี่ความช้ืนสูง (จารุณี และ ยุพาพร, 2547; สุชน มา และคณะ, 2561)

ส่วนปลวกอาศยั ในดิน ออกหาอาหารที่อยบนู่ พ้ืนดินหรือเหนือพ้ืนดินข้ึนไป มักทาทางเดิน ดินห่อหุม้ ตวั เพื่อป้องกนั การสูญเสียความช้ืนและหลีกเลี่ยงการรบกวนจากศัตรู จาแนกเป็น กลุ่มยอ่ ย คือ ประเภทที่ 1 ปลวกใต้ดิน (subterranean termites) สร้างรังอยใู่ ตด้ ิน เช่น ปลวกสกลุ Ancistrotermes Hypotermes และ Microtermes ประเภทที่ 2 ปลวกสร้างจอมปลวก (mound-building termites) สร้างรังขนาดกลางถึงขนาดใหญ่อยบู่ นพ้ืนดิน เช่น ปลวกสกุล Globitermes และ Macrotermes ประเภทที่ 3 ปลวกสร้างรังขนาดเล็ก (carton nest termites) สร้างรังขนาดเล็กอยบู่ น หรือเหนือพ้ืนดิน เช่น ก่ิงไม ้ ตน้ ไม ้ เสาไฟฟ้า หรือโครงสร้างภายในอาคาร เช่น ปลวกสกลุ Dicuspiditermes Hospitalitermes Microcerotermes Nasutitermes และ Termes (จารุณี และ ยุพาพร, 2547; ลีลา และ อภิชัย, 2552; สุชนมา และคณะ, 2561)

2. แบง่ ประเภทตามการกินอาหารได้ 4 ประเภทไดแ้ ก่ ประเภทที่ 1 กลุ่มกินดิน (soil feeders) ประเภทที่ 2 กลุ่มดินและไม ้ (wood-soil feeders) ประเภทที่ 3 กลุ่มกินไม ้ (wood feeders) และ ประเภทที่ 4 กลุ่มกินเศษใบไมแ้ ละหญา้ (litter and grass feeders) (Bignell and Eggleton, 2000) ส่วน การแบง่ ตามวิธีของ Donovan ได้ 4 ประเภทไดแ้ ก่ ประเภทที่ 1 ปลวกช้นั ต่า ทุกวงศท์ ี่ไมใ่ ช่วงศ ์ Termitidae กินพืชตาย หญา้ เศษใบไม ้ ประเภทที่ 2 ปลวกวงศ์ Termitidae กลุ่มกินพืชตาย หญา้ เศษ ใบไม้ พืชอิงอาศัย (epiphyte) ขนาดเล็ก ประเภทที่ 3 ปลวกวงศ์ Termitidae กลุ่มกินอินทรียวัตถุตาม ช้นั บนของผิวดิน และประเภทที่ 4 ปลวกวงศ์ Termitidae กลุ่มกินดินที่แทจ้ ริง (true soil-feeder) โดย กินส่วนแร่ธาตุดินโดยตรง (Donovan et al., 2001; Eggleton and Tayasu, 2001)

9

3. แบง่ ประเภทตามวิวัฒนาการได้ 2 ประเภทคือ ปลวกช้นั ต่า (lower termite) มีวิวัฒนาการ ต่า จาเป็นต้องอาศัย โปรโตซัวกลุ่ม flagellate บางชนิด เช่น Oxymonad Trichomonad และ Hypermastigote ซ่ึงอาศยั อยบริเวณู่ กระเปาะส่วนหนา้ (fermentation pouch) ของทางเดินอาหาร ส่วนทา้ ยช่วยยอ่ ย cellulose ในไม้ ส่วนทอ้ งของปลวกราชินีขยายไมม่ าก (O'Brien and Slaytor, 1982; วัฒนชัย, 2562) ไดแ้ ก่ วงศ ์ Archotermopsidae (Tokuda, 2019) Hodotermitidae Kalotermitidae Mastotermitidae Rhinotermitidae (O'Brien and Slaytor, 1982; Tokuda, 2019) Serritermitidae (O'Brien and Slaytor, 1982; Radek et al., 2017; Tokuda, 2019) Stolotermitidae (Radek et al., 2019; Reid et al., 2014; Tokuda, 2019) และ Stylotermitidae (Rahman et al., 2017; Tokuda, 2019)

ส่วนปลวกช้นั สูง (higher termite) ไดแ้ ก่ วงศ ์ Termitidae วิวัฒนาการและความหลากชนิด สูง รูปแบบการดารงชีวิตหลากหลาย ระบบทางเดินอาหารของปลวกงานมีจุลินทรียก์ ลุ่มแบคทีเรีย (bacteria) กบั รา (fungi) โดยไมปรากฏ่ โปรโตซัวแต่หากปรากฏจะพบจานวน น้อยมากรวมถึงยงั ไม่ ทราบบทบาทแน่ชดั แบคทีเรียบางชนิดแสดงบทบาทเกี่ยวกบั การตรึง dinitrogen ในลาไส้ แตไ่ มม่ ี บทบาทเกี่ยวกบั การยอ่ ยสลาย cellulose ส่วนกลุ่มราพบในปลวกบางชนิดเทา่ น้นั ตวั อยา่ งราสกุล สาคัญ คือ Termitomyces ซึ่งปลวกวงศย์ อ่ ย Macrotermitinae เพาะเล้ียงบนรังเห็ดรา (fungus comb) ท้องของปลวกราชินีขยายใหญม่ ากเรียกวา่ physogastry บางชนิดอาจขยายได้มากถึง 500 – 1,000 เทา่ ของขนาดท้องเดิม (O'Brien and Slaytor, 1982; Tokuda, 2019; วัฒนชัย, 2562)

บทบาทและความส าคัญของปลวก

ปลวกมีบทบาทสา คญั ท้งั โทษและประโยชน์ โดยสร้างความเสียหายทางเศรษฐกิจในหลาย ดา้ น เช่น กดั กินวสั ดุอุปกรณ์ ส่ิงของเครื่องใช ้ ส่ิงปลูกสร้างจากไม้ ไม้แปรรูป ไม้ซุง ไม้สาหรับใช้ ประโยชน์ในที่แจ้ง กล้าไม้ พืชผลทางการเกษตร ไม้ยืนต้นท้งั ในป่าธรรมชาติและป่าปลูก อยา่ งไรก็ ตามปลวกมีประโยชน์ในเชิงนิเวศวิทยาโดยเฉพาะระบบนิเวศป่าไม้เกี่ยวกบั วัฏจักรคาร์บอน (carbon cycle) โดยยอ่ ยสลายอินทรียวตั ถุตา่ ง ๆ หรือสารประกอบคาร์บอนในเน้ือไม ้ เปลี่ยนเป็น ฮิวมัสหรือธาตุอาหารในดิน รวมท้งั ปลดปล่อยแกส๊ คาร์บอนไดออกไซดก์ ลบั คืนสู่ส่ิงแวดลอ้ ม 10

(จันทิยา, 2559) กระบวนการดงั กล่าวก่อใหเ้ กิดการหมุนเวียนแร่ธาตุกลบั สู่ดินทาให้ดินอุดมสมบูรณ์ ส่งเสริมการเจริญเติบโตของพืชทุกระดบั ในป่า ลดปริมาณขยะไมใ่ หท้ บั ถมมากเกินไปจนเกิดผลเสีย ตอ่ ระบบนิเวศ (สุชนมา และคณะ, 2561) นอกจากน้ีการสร้างทางเดินของปลวกช่วยใหด้ ินเป็นรู พรุนระบายอากาศ เพ่ิมธาตุสารอาหารส่งผลดีต่อการเจริญเติบโตของพืช พบรายงานวา่ กิจกรรมของ ปลวกมีส่วนช่วยฟ้ืนฟูสภาพดินที่เสื่อมโทรมจากการทา ปศุสัตวม์ ากเกินไปในเขตทะเลทรายของ แอฟริกาเหนือและตะวันตก ขณะที่จอมปลวกหรือต้นไม้ที่ถูกปลวกทาลาย เป็นแหล่งอาศยั เพาะพันธุ์ ของนก สัตวเ์ ล้ียงลูกดว้ ยนม และแมลงชนิดอื่น ๆ (Lewis, 2009)

ตัวปลวกเป็นแหล่งอาหารโปรตีนสูงสาหรับ มนุษย์และสัตว์หลายชนิด เช่น นก ไก่ กบ คางคก สัตวเ์ ล้ือยคลานตา่ ง ๆ ปลวกบางชนิดเพาะเล้ียงเห็ดโคนภายในรัง ซึ่งมนุษย์นามาประกอบ อาหาร หายาก ราคาแพง ไมส่ ามารถเพาะเล้ียงภายใต้สภาพห้องปฏิบัติการได้เหมือนเห็ดอื่น ๆ (สุชน มา และคณะ, 2561; อิสระ, 2530) ปัจจุบันมีแนวคิดเกี่ยวกบั การนา จุลินทรีย์จากระบบทางเดินอาหาร ปลวกมาใช้ประโยชน์เชิงพาณิชย์ท้งั ด้านการเกษตร อุตสาหกรรม และควบคุมมลภาวะส่ิงแวดลอ้ ม เช่น การยอ่ ยสลายสารป้องกนั กา จดั ศตั รูพืชตกคา้ งในพ้ืนที่ทางการเกษตร การบา บดั น้า เสียจาก โรงงานอุตสาหกรรม รวมถึงพลังงานทางเลือกทดแทนพลังงานฟอสซิล (สุชนมา และคณะ, 2561)

แม้พบรายงานวา่ รังปลวกปลดปล่อยแกส๊ methane (CH4) ออกมาก่อใหเ้ กิดภาวะเรือนกระจกอยา่ งมี นัยสาคัญ (Nauer et al., 2018; สุชนมา และคณะ, 2561)

ปลวกสกุล Macrotermes

ปลวกสกุล Macrotermes (Termitidae: Macrotermitinae) คือกลุ่มปลวกเพาะเล้ียงเห็ดรา แพร่กระจายทว่ั ทวีปแอฟริกาและเอเชีย เป็นศตั รูของพืชไร่และโครงสร้างตา่ ง ๆ ที่สร้างดว้ ยไม ้ เชื่อ วา่ ถือกา เนิดในป่าฝนของแอฟริกาตอ่ มาแพร่กระจายไปยงั ทุง่ สะวนั นา (ราวยคุ Miocene) มาดากสั การ์ ทวปี เอเชีย (ราวยคุ Tertiary ช่วงตน้ ) พบราว 47 ชนิด (Lee et al., 2012; Neoh, 2014; Neoh and Lee, 2009c) ลักษณะสาคัญ ไดแ้ ก่ ขนาดใหญท่ ี่สุดในบรรดาปลวกท้งั หมด วรรณะทหาร หวั รูปค่อนขา้ งสี่เหลี่ยม ริมฝีปากบน (labrum) มีเยื่อหุ้มปลาย (hyaline tip) และโคนฐานด้านในของ 11

กรามซา้ ยปรากฏตุม่ เล็ก ๆ (Ahmad, 1965; อิสระ, 2530) ท้งั ปลวกงานและปลวกทหารมีสองรูปแบบ หรือทวิสัณฐาน (dimorphism) โดยปลวกงานไดแ้ ก่ ปลวกงานขนาดใหญ ่ (major workers) กบั ปลวก งานขนาดเล็ก (minor workers) ส่วนปลวกทหารไดแ้ ก่ ปลวกทหารขนาดใหญ่ (major soldiers) กบั ปลวกทหารขนาดเล็ก (minor soldiers) วรรณะที่นามาใช้ในการจ าแนก ชนิด คือ วรรณะสืบพันธุ์ ปลวกทหารขนาดใหญ ่ และปลวกทหารขนาดเล็ก (Ahmad, 1965) ชนิดสาคัญ ในเขตเอเชีย ตะวันออกเฉียงใต้ คือ M. gilvus กบั M. carbonarius พบทว่ั ไปในประเทศไทย กมั พูชา มาเลเซีย ท้งั บริเวณป่า ที่ราบลุ่ม พ้ืนที่ทางการเกษตร ที่อยอู่ าศยั ของมนุษยใ์ นชนบทถึงชานเมือง ท้งั คูส่ ร้างจอม ขนาดใหญก่ ่ึงทรงกรวยสูงข้ึนมาเหนือพ้ืนดิน อาจสูงไดถ้ ึง 4 เมตร เส้นผา่ ศูนยก์ ลางถึง 5 เมตร (Neoh, 2014; Neoh and Lee, 2009c)

ปลวก Macrotermes gilvus

Macrotermes gilvus ลกั ษณะเด่นคือ อกปล้องแรก (pronotum) ของวรรณะทหารมีขอบ ด้านบนและล่างเวา้ เขา้ ไปชดั เจน คน้ พบคร้ังแรกในปี ค.ศ. 1853 ถูกต้งั ชื่อวา่ Termes taprobanes Walker, 1853 ก่อนถูกพบและต้งั ชื่ออื่นอีกหลายคร้ังแตย่ งั คงอยใู่ นสกุล Termes ช่วงปี ค.ศ. 1858 – 1921 เช่น Termes gilvus Hagen, 1858 ถูกจดั ลงสกลุ ยอ่ ย Macrotermes ในชื่อ Termes (Macrotermes) gilvus: Holmgren, 1913b และ Termes (Macrotermes) gilvus: Holmgren, 1914 ตามลาดับ และ เปลี่ยนสกุลใหมใช้ชื่อ่ Macrotermes gilvus คร้ังแรกเมื่อปี ค.ศ. 1925 จนปัจจุบัน (Ahmad, 1965; อิสระ, 2530) เป็นศตั รูของโครงสร้างที่สร้างจากไม ้พืชทางการเกษตร เช่น ยาง ปาลม์ น้า มนั ออ้ ย พบ อยตู่ ามรอบนอกของอาคารส่ิงก่อสร้างไมจ่ ดั เป็นศตั รูหลกั ของอาคารส่ิงก่อสร้าง (เขา้ ทา ลายอาคาร บ้านเรือนในไทยเพียงร้อยละ 2 จากปลวกที่เขา้ ทา ลายท้งั หมด) แต่อาจเป็นศัตรูรอง (secondary pest) เข้าทาลาย อาคารหลงั กา จดั ปลวกศัตรูชนิดสาคัญ Coptotermes spp. ดว้ ยกบั ดกั เหยอื่ ล่อแลว้ เนื่องจาก ปลวกสกุล Macrotermes เป็นปลวกช้นั สูงจึงไมได้รับผลกระทบจาก่ การกา จดั ดว้ ยวธิ ีใชเ้ หยอื่ ล่อมาก นักนอกจากตวั อ่อนบางส่วน การควบคุมปลวก M. gilvus ใช้วิธีใส่ยาป้องกนั กา จดั ปลวกลงดิน (Foo et al., 2015; Lee et al., 2012; Neoh and Lee, 2010) หรือฉีดพน่ สารเคมี (Neoh and Lee, 2009a) ได้ผล มากกวา่ วธิ ีอื่น จอมปลวกสร้างจากดินเหนียวปนทรายสีน้า ตาลเหลืองเหนือพ้ืนดินบริเวณโคน ตน้ ไม ้ ออกหาอาหารจากแหล่งอื่น อาจพบอาศัยใต้ดิน จอมมีเส้นรอบวงบริเวณจากยอดลงมา 12.7 12

เซนติเมตร (5 นิ้ว) ประมาณ 135 - 380 เซนติเมตร เส้นรอบวงบริเวณโคนติดพ้ืนดินประมาณ 75 - 147 เซนติเมตร และความสูงประมาณ 165 - 284 เซนติเมตร (วีรยุทธ และคณะ, 2552)

ข้นั การเจริญเติบโตของแตล่ ะวรรณะไดแ้ ก่ วรรณะสืบพนั ธุ์ประกอบดว้ ยตวั ออ่ น (larva) 1 วยั ตวั ออ่ นคลา้ ยตวั เตม็ วยั (nymph) 5 วัย (ลอกคราบ 5 คร้ัง) และตวั เตม็ วยั วรรณะทหารท้งั ปลวก ทหารขนาดใหญ่และขนาดเล็กประกอบดว้ ยตวั ออ่ น 4 วยั ระยะก่อนตวั เตม็ วยั (presoldier) และตัว เตม็ วยั ซ่ึงทุกตวั คือเพศเมียที่เป็นหมนั ตวั ออ่ นลกั ษณะคลา้ ยปลวกทหารขนาดเล็กแตส่ ีจางกวา่ วรรณะกรรมกรท้งั ปลวกงานขนาดใหญ่และขนาดเล็กประกอบดว้ ยตวั ออ่ น 3 วัย และตัวเต็มวัย ตัว ออ่ นวยั แรกพบท้งั เพศผูแ้ ละเพศเมียที่มีขนาดเทา่ กนั เร่ิมแสดงความแตกตา่ งในวยั ที่ 2 โดยเพศผู้ ขนาดใหญก่ วา่ เพศเมีย (Neoh and Lee, 2009a)

ปลวก Macrotermes carbonarius

Macrotermes carbonarius ลกั ษณะเด่นคือ วรรณะทหารส่วนหวั สีดา อกปล้องแรกรูป พระจันทร์ครึ่งดวง พบคร้ังแรกในปี ค.ศ. 1858 ถูกต้งั ชื่อวา่ Termes carbonarius: Hagen, 1858 และ พบอีกคร้ังปี ค.ศ. 1898 ถูกต้งั ชื่อ Termes carbonarius: Haviland, 1898 ตอ่ มาจดั ในสกุลยอ่ ย Macrotermes ใช้ชื่อ Termes (Macrotermes) carbonarius: Holmgren, 1913b ก่อนเปลี่ยนสกุลใหม ่ คือ Macrotermes carbonarius คร้ังแรกเมื่อปี ค.ศ. 1925 จนปัจจุบัน (Ahmad, 1965; อิสระ, 2530) แพร่กระจายทว่ั บริเวณคาบสมุทรมลาย ู ไทย กมั พูชา หมูเ่ กาะบอร์เนียว สร้างทางเดินจากฐานจอม เปิดออกสู่พ้ืนดินสาหรับหาอาหาร (Inoue et al., 2001; Neoh et al., 2010) จอมรูปกรวยฐานกว้างสี น้า ตาลเหลืองหรือสีเดียวกบั ดินรอบจอม บางคร้ังต้งั บริเวณโคนตน้ ไม ้(อิสระ, 2530) ขนาดใหญก่ วา่ จอมปลวก M. gilvus จอมมีเส้นรอบวงบริเวณจากยอดลงมา 12.7 เซนติเมตร (5 นิ้ว) ประมาณ 152 - 156 เซนติเมตร เส้นรอบวงบริเวณโคนติดพ้ืนดินประมาณ 75 - 79 เซนติเมตร และความสูงประมาณ 275 - 279 เซนติเมตร (วีรยุทธ และคณะ, 2552)

13

แมลงวันตัวเบียนในปลวก

แมลงกลุ่มตวั เบียน (parasitoid) คือแมลงที่ระยะหนอนดารงชีวิต กินอาหารภายในเหยื่อหรือ host 1 ตัวและทาให้ host ตาย ส่วนตวั เตม็ วยั อาศยั แบบอิสระ (free-living) จดั อยกู่ ่ึงกลางระหวา่ งตวั ห้า /ผลู้ ่า (predator) กบั ปรสิต (parasite) โดยตัวเบียนทาให้ host ตายเช่นเดียวกบั ตวั ห้า โดยฆา่ ในระยะ สุดท้ายของการเจริญ แตต่ อ้ งการ host เพียง 1 ตัวสา หรับเจริญเติบโตเช่นเดียวกบั ปรสิต พบแมลง ประมาณร้อยละ 10 เป็นตัวเบียน อยา่ งไรกต็ ามเนื่องจากข้อมูลของแมลงกลุ่มน้ีคอ่ นขา้ งจา กดั จึง ประมาณการวา่ มีแมลงตวั เบียนร้อยละ 20 – 25 จากท้งั หมด ต้งั แตถ่ ูกคน้ พบคร้ังแรกเมื่อตน้ ศตวรรษ ที่ 18 จนถึงปัจจุบันได้รับความสนใจในฐานะตัวควบคุมปริมาณของ host ท้งั โดยธรรมชาติและการ ชักนาของมนุษย์ ซึ่งนา มาใชค้ วบคุมส่ิงมีชีวติ ศตั รูของมนุษย ์ (pest) ทว่ั โลก ท้งั ยงั มีบทบาทสา คญั ตอ่ การศึกษานิเวศวิทยา พฤติกรรม และววิ ฒั นาการของส่ิงมีชีวติ (Mills, 2009)

ตวั เบียนสามารถแบง่ ประเภทไดห้ ลายเกณฑ์ ไดแ้ ก่

1. แบง่ ตามระยะเจริญเติบโตของ host แบง่ เป็นตวั เบียนไข ่ (egg parasitoid) ตัวเบียนหนอน (larval parasitoid) ตวั เบียนตวั ออ่ น (nymphal parasitoid) ตัวเบียนดักแด้ (pupal parasitoid) หากเร่ิม เบียนระยะไข ่ และเจริญครบวงจรชีวิตที่ระยะหนอน เรียกวา่ ตวั เบียนไขแ่ ละหนอน (egg-larval parasitoid) ถ้าเข้าทาลายระยะหนอน แตพ่ ฒั นาครบวงจรในระยะดกั แด ้ เรียกวา่ ตัวเบียนหนอนและ ดักแด้ (larval-pupal parasitoid) (บรรพต, 2525)

2. แบง่ ตามที่อยอู่ าศยั และการมองเห็นได้ 2 แบบ คือ ตัวเบียนอาศัยกินและพฒั นาอยูบน่ พ้ืนผวิ ของตัว host สามารถมองเห็นไดด้ ว้ ยตาเปล่าเรียกวา่ ตวั เบียนภายนอก (ectoparasitoid) ขณะที่ อีกประเภทอาศัยกินและเจริญเติบโตอยภายู่ ในร่างกายของ host ไมส่ ามารถมองเห็นไดด้ ว้ ยตาเปล่า เรียกวา่ ตวั เบียนภายใน (endoparasitoid) (Mills, 2009; บรรพต, 2525; บัณฑิกา, 2558)

14

3. แบง่ ตามจา นวนตวั เบียนต่อ host ได้ 2 แบบ คือ ตัวเบียน 1 ตัวเบียนอาศัย host 1 ตัวเรียกวา่ ตัวเบียนเดี่ยว (solitary) กบั ตัวเบียนหลายตัวเข้าเบียน host 1 ตัวเรียกวา่ ตวั เบียนกลุ่ม (gregarious) (Mills, 2009; บรรพต, 2525; บัณฑิกา, 2558)

4. แบง่ ตามกลไกการดารงชีวิตและ ทาลาย host ของตัวเบียนได้ 2 ประเภท คือ แบบทาให้ เหยื่อหยุดเคลื่อนไหว (idiobiont) และไมท่ า ใหเ้ หยอื่ หยดุ การเคลื่อนไหว (koinobiont) โดย idiobiont เข้าจับ host หรือทาให้เป็นอัมพาต จากน้นั วางไขใ่ ส่ host เนื่องจากตอ้ งการใหส้ ภาพแวดลอ้ มคงที่ ไม่ เกิดการเคลื่อนไหวรบกวนการกิน/เจริญเติบโตของหนอน ส่วน koinobiont ปล่อยให ้ host เจริญเติบโตดา รงชีวติ ตอ่ ไปหลงั ถูกวางไขแ่ ลว้ เมื่อหนอนกินจนเจริญเติบโตสมบูรณ์ จึงทาให้ host ตายเมื่อเขา้ สู่ระยะตอ่ ไป หนอนตัวเบียนของอันดับ Diptera ท้งั หมดจดั อยใู่ นกลุ่ม koinobiont อยา่ งไรกต็ ามเกณฑ์น้ียงั คงไมช่ ดั เจน เหมาะสา หรับจาแนก กรณีเบียน host ระยะที่เกิดการ เคลื่อนไหว คือ หนอน ตวั อ่อน ตวั เตม็ วยั หรือช่วงระยะเปลี่ยนสัณฐานวทิ ยา เช่น จากไขส่ ู่หนอน หนอนสู่ระยะเตรียมเขา้ ดกั แด ้ (pre-pupa) ดกั แดส้ ู่ตวั เตม็ วยั ส่วนกรณีเบียน host ระยะที่ไม่ เคลื่อนไหว ไดแ้ ก่ ไข ่ ดกั แด ้ ไม่สามารถแสดงความแตกต่างไดอ้ ยา่ งชดั เจน (Mills, 2009)

Feener and Brown (1997) และ Coupland and Barker (2004) รายงานวา่ แมลงในอันดับ Diptera ประมาณ 16,000 ชนิด (ร้อยละ 10.67) จากท้งั หมดราว 150,000 ชนิด (Merritt et al., 2009) เป็นปรสิตหรือตัวเบียน มีความหลากหลายทางพฤติกรรมและสายวิวัฒนาการ วงศ์ที่รายงานเป็น ปรสิต/ตัวเบียนท้งั หมด 21 วงศ ์ เช่น Bombyliidae Calliphoridae Phoridae Rhinophoridae Sarcophagidae Sciomyzidae และ Tachinidae แมม้ ีความหลากหลายนอ้ ยกวา่ ตวั เบียนของอันดับ Hymenoptera แตแ่ มลงวนั มี host หลากชนิดกวา่ โดยเฉพาะในกลุ่มแมลงรวมท้งแมงมุมั ตะขาบ ไส้เดือน ทาก และหอยทาก พบรายงานเกี่ยวกบั หนอนแมลงวนั ที่เป็นตัวเบียนในปลวกท้งั หมด 2 วงศ์ ไดแ้ ก่ วงศ์ Phoridae และ Calliphoridae

15

แมลงวันตัวเบียนวงศ์ Phoridae

แมลงวันกลุ่ม Phorid flies หรือ scuttle flies (Diptera: Phoridae) ถูกคน้ พบคร้ังแรกปี ค.ศ. 1763 แตถ่ ูกเขา้ ใจผดิ วา่ คือแมลงวัน Musca festinans Scopoli, 1763 ตอ่ มาปี ค.ศ. 1794 มีรายงานการ ค้นพบแมลงวัน Musca aterrima Fabricius ก่อนถูกแยกออกมาต้งั เป็นสกุลใหมคือ่ Phora ในปี ค.ศ. 1796 (ปัจจุบันคือ Phora aterrima (Fabricius, 1794)) ชื่อวงศ์ Phoridae ถูกต้งั ข้ึนเมื่อปี ค.ศ. 1833 ให้แก่แมลงวันสกุล Phora โดยคา วา่ “Phora” มาจากภาษากรีกแปลวา่ เคลื่อนไหวรวดเร็ว (rapid motion) เนื่องจากพฤติกรรมของแมลงวนั ดงั กล่าว อยา่ งไรกต็ ามมกั เกิดความเขา้ ใจผดิ วา่ ชื่อดงั กล่าว มาจากภาษากรีกคา วา่ “Phor” อันหมายถึง ขโมย (thief) (Disney, 1994)

หนอนแมลงวันวงศ์ Phoridae ดารงชีวิต กินเฉพาะเช้ือรา (fungivorous) หรือเศษซาก (saprophagous) โดยชนิดที่อาศยั ร่วมในรังปลวก (termitophilous) ชนิดกินเช้ือราไดแ้ ก่ Dohrniphora diminuens Schmitz พบบริเวณรังเห็ดรา ส่วนชนิดกินเศษซากพบบริเวณกองของเสีย ซากแมลงตาย ซากอินทรียวตั ถุเน่าเปื่อย เช่น Megaselia scalaris (Loew) Megaselia giraudii (Egger) และ Megaselia rufipes (F.) มีรายงานวา่ M. scalaris เป็นปรสิตไม่เจาะจง (facultative parasite) ของมนุษย์ โดยกินเน้ือเยื่อที่มีชีวติ หรือตายแลว้ บางส่วน รวมท้งั ก่อใหเ้ กิดภาวะโรคแผลหนอนแมลงวัน (myiasis) (Disney, 2008; Foo et al., 2011a)

ปัจจุบันหนอนแมลงวันวงศ์ Phoridae หลายชนิดถูกรายงานเป็นตัวเบียนในส่ิงมีชีวิตจา นวน มาก แสดงดังตารางที่ 1 คาดวา่ 2 กลไกหลักที่ก่อใหเ้ กิดการววิ ฒั นาการจากแมลงกินเช้ือราหรือเศษ ซากไปเป็นตวั ห้า ตัวเบียนคือ การแขง่ ขนั ระหวา่ งหนอนต่างชนิด (interspecific competition) และ การรับกล่ินที่จา เพาะตอ่ ส่ิงดึงดูด/ส่ิงเร้าจากส่ิงมีชีวติ ที่ยงั มีชีวติ ท้งั สภาพปกติหรือมีบาดแผล (Foo et al., 2011a) รายชื่อชนิดแมลงวันเบียนในปลวกแสดงในตารางที่ 2

16

ตารางที่ 1 รายชื่อส่ิงมีชีวติ อาศยั (host) ของแมลงวันวงศ์ Phoridae

สิ่งมีชีวิตอาศัย ที่มา: ปลวก Foo et al. (2011a) มด Brown et al. (2017); Foo et al. (2011a); McCorquodale et al. (2017); Morrison (2000); Morrison et al. (1997); Zacaro and Porter (2003) ผ้งึ Brown (2004); Debnath and Roy (2019); Foo et al. (2011a); Gonzalez and Brown (2004); Ricchiuti et al. (2016) ชันโรง Costa et al. (2007) ตอ่ Lutz and Brown (2013); Somavilla et al. (2015) มวนเพชฌฆาต Costa et al. (2007) ตก๊ั แตนตา ขา้ ว Koch et al. (2013) ตก๊ั แตนวงศ ์ Pyrgomorphidae Costa et al. (2007); Quesada-Béjar et al. (2017) ด้วงวงศ์ Scarabaeidae Costa et al. (2007) ด้วงงวงวงศ์ Curculionidae Costa et al. (2007) ดว้ งเตา่ Disney and Chazeau (1990); Durska et al. (2003) แมลงวันวงศ์ Calliphoridae Batista-Da-Silva (2012) ดักแด้แมลงวันวงศ์ Sepsidae Marchiori (2018) หนอนผเี ส้ือวงศ ์ Noctuidae Costa et al. (2007); Ruíz-Nájera et al. (2007) เห็บ Andreotti et al. (2003); Diyes et al. (2015); Miranda-Miranda et al. (2010) แมงมุมทาแรนทูลา Machkour-M'Rabet et al. (2015) แมงป่อง Zhang et al. (2017) กิ้งกือ Foo et al. (2011a); Hash and Brown (2015); Hash et al. (2017) ไส้เดือน Coupland and Barker (2004) สัตวก์ ลุ่มหอยและหอยทาก Coupland and Barker (2004); Disney (1982, 1983); Foo et al. (2011a)

17

ตารางที่ 2 รายชื่อแมลงวันวงศ์ Phoridae ที่มีรายงานเป็นตัวเบียนในปลวก

แมลงวันตัวเบียน ที่มา: Misotermes mindeni Disney & Neoh Foo et al. (2011a) Misotermes vicinus Borgmeier Neoh and Lee (2010) Misotermes exenterans Schmitz Disney et al. (2009) Palpiclavina kistneri Disney Disney et al. (2009) Dicranopteron philotermes Schmitz Disney et al. (2009) (ตอ่ มา Hash et al. (2013) เปลี่ยนสกุลเป็น Dohrniphora philotermes) Dicranopteron setipennis Disney & Kistner Disney and Kistnek (1990) (ตอ่ มา Hash et al. (2013) เปลี่ยนสกุลเป็น Dohrniphora setipennis) Diplonevra mortimeri Disney Disney (1986) Diplonevra watsoni Disney Disney (1986)

Misotermes mindeni เป็นตัวเบียนภายในของปลวก M. gilvus คน้ พบคร้ังแรกที่ประเทศ มาเลเซียเมื่อปี ค.ศ. 2009 พบหนอนแมลงวนั เจริญเติบโตอยภู่ ายในส่วนหวั (head capsule) ของ ปลวกทหารขนาดใหญ ่ ทา ใหห้ วั กลมผดิ ปกติมีความกวา้ งมากข้ึน กรามส้ันลง หนวดยาวข้ึน แตส่ ้ัน กวา่ ขาคูห่ ลงั ปล้องที่ 4 (tibia) จานวนปล้อง หนวด 17 ปลอ้ งเทา่ เดิม เชื่อวา่ การที่หวั ใหญ่กรามส้ันผดิ รูปส่งผลตอ่ ประสิทธิภาพในการตอ่ สู้ปกป้องรังลดลงไมส่ ามารถยกส่วนหวั หลบหลีกส่ิงรบกวนได ้ พฤติกรรมหลีกเลี่ยงแสง ความดุร้ายลดลง ท้งั หมดน้ีส่งผลดีตอ่ การดารง ชีวิตของหนอนแมลงวัน เนื่องจากปลวกลดการเผชิญหนา้ กบั ศตั รูหรืออนั ตรายตา่ ง ๆ แลว้ หลบไปอยใู่ นหอ้ งวา่ งที่ซ่อนอยู่ บริเวณข้างจอมแทน เมื่อใกล้เข้าดักแด้หนอนจะเคลื่อนที่ไปยงั ส่วนทอ้ ง เร่ิมหดตวั จากน้นั ใชรู้ หายใจ (spiracle) เจาะผนงั ช่องท้องของปลวกส่งแรงดนั ไปไล่ของเหลวภายในร่างกายให้ไหลซึม ออกจนช่องทอ้ งแหง้ เหมาะสมตอ่ การเขา้ ดกั แด ้ ปลวกเร่ิมตายด้วยอาการบาดเจบ็ หรือสูญเสียน้า หลงั จากหนอนเร่ิมเขา้ ดกั แด ้ (Foo et al., 2011a; Neoh and Lee, 2009b, 2010)

18

Foo et al. (2011a) ศึกษาวงจรชีวิตของ M. mindeni ในสภาพห้องปฏิบัติการพบวา่ ระยะไข ่ มีขนาดเล็กสีขาว รูปร่างยาว ปลายดา้ นหน่ึงกลมมนปลายอีกด้านหนึ่งแหลมสอบ ความยาวประมาณ 0.39 – 0.47 มิลลิเมตร ความกว้างประมาณ 0.10 – 0.15 มิลลิเมตร เพศเมียสามารถวางไขไ่ ดต้ ้งั แต ่ 64 – 794 ฟองตอ่ ตวั จา นวนเฉลี่ย 271 ± 157 ฟองต่อตวั บางทฤษฎีเชื่อวา่ ไขเ่ ขา้ ไปในตวั ปลวกผา่ น ทางการกินเขา้ ไปโดยบงั เอิญ ซ่ึงแมลงวันจะไมว่ างไขท่ ี่ตวั ปลวกโดยตรงเพื่อหลีกเลี่ยงการโจมตี ป้องกนั ตวั ของปลวก เมื่อหนอนฟักออกมาภายในลาไส้ จะแทรกผา่ นผนงั ลา ไส้เขา้ สู่กระแสเลือด (hemolymph) ต่อไป แตบ่ างทฤษฎีเชื่อวา่ หนอนอาจฟักจากภายนอกร่างกายแลว้ แทรกผา่ นผนงั ช่อง ท้องของปลวกเขา้ สู่กระแสเลือด อยา่ งไรกต็ ามกระบวนการเขา้ สู่ร่างกายปลวกของหนอนแมลงวัน ตวั เบียนยงั ไมเ่ ป็นที่ทราบแน่ชดั รวมท้งั เงื่อนไขสภาพแวดลอ้ มที่เหมาะสมตอ่ การฟักของไข่

ระยะหนอนจาแนก วัยตามระยะการเจริญเติบโตของปลวกที่ถูกเบียนเป็นหลักได้ 3 วัย ทุก วยั สีขาว ผวิ หนงั โปร่งแสง โดยวยั ที่ 1 เคลื่อนที่อยา่ งอิสระอยภู่ ายในตวั อ่อนปลวกทหารขนาดใหญ่ วัยที่ 4 และก่อนตวั เตม็ วยั ลา ตวั ก่ึงทรงกระบอกยาว ปลอ้ งลา ตวั ไมช่ ดั เจน ใชเ้ วลาการพัฒนาสู่วัยที่ 2 ประมาณ 19.00 ± 2.28 วัน วัยที่ 2 อยใู่ นส่วนหวั ของปลวกทหารขนาดใหญ ่ ลา ตวั รูปไข ่ เร่ิมปรากฏ ฐานรูหายใจด้านท้ายลาตัว (posterior spiracular base) จา นวนปลอ้ งมากข้ึน ใชเ้ วลาพัฒนาเข้าวัยที่ 3 ประมาณ 36.88 ± 5.17 วัน วัยที่ 3 อยใู่ นส่วนทอ้ ง เร่ิมปรากฏทอ่ หายใจคลา้ ยเขาสัตว ์ (respiratory horn) มี posterior spiracular base เด่นชดั ใชเ้ วลาพัฒนาเป็นดักแด้ประมาณ 0.53 ± 0.08 วนั ท้งั น้ี ขนาดลาตัวของหนอน อาจแตกตา่ งกนั ตามกิจกรรมของต่อมไร้ท่อในตวั ปลวก ดกั แดแบบ้ ปลอกหุ้ม (coarctate) ทรงกระบอก ระยะแรกมีสีแดง รูหายใจด้านท้ายลาตัว (posterior spiracle) สีดา จากน้นั ประมาณ 1 วันจึงเปลี่ยนเป็นสีดา ผนงั ลา ตวั แขง็ ข้ึน (sclerotize) มีแผน่ แขง็ สา หรับฟักตวั เตม็ วยั (eclosion plate) 1 แผน่ ส่วน respiratory horn ยนื่ ออกมาเป็นทอ่ ส้ันตรง พบมีฝาเปิด (anterior cap) สามารถหลุดออกได้สาหรับให้ตัวเต็มวัยฟักออกมา ใช้เวลาพัฒนาเขา้ สู่ตัวเต็มวัยเฉลี่ยประมาณ 13.51 ± 0.74 วัน ตัวเต็มวัยเพศผู้และเพศเมียมีอายุขัยเฉลี่ยประมาณ 3.00 ± 0.98 วัน และ 1.47 ± 0.57 วัน ตามลา ดบั ตวั เตม็ วยั เร่ิมผสมพนั ธุ์วนั แรกที่ออกจากดกั แด ้ ระยะเวลาการพฒั นาของแตล่ ะระยะที่ แทจ้ ริงยงั ไมแ่ น่ชดั (Foo et al., 2011a)

19

Neoh and Lee (2010) รายงานความเปลี่ยนแปลงด้านพฤติกรรมวา่ ปลวกถูกเบียนแสดง ความดุร้ายต่อส่ิงมีชีวติ ชนิดอื่นนอ้ ยกวา่ ปลวกไมถ่ ูกเบียน รวมท้งั ต้องการห้องแยกเดี่ยวภายในรัง สันนิษฐานวา่ เป็นการปรับตัวเพื่อปกป้องตัวเบียนจากอันตราย หรือลดความเสี่ยงการระบาดสู่ สมาชิกตวั อื่นภายในรัง การเบียนอาจเร่ิมต้งั แต่ตวั อ่อนปลวกทหารวัยที่ 4 หรือก่อนตวั เตม็ วยั หนอน เจริญเติบโตอยใู่ นส่วนหวั เข้าดักแด้ภายในลาตัวปลวก Foo et al. (2012) พบวา่ ปลวกทหารถูกเบียน แสดงพฤติกรรมป้อนอาหารและทา ความสะอาดร่างกายของสมาชิกในรัง (allogrooming) กบั ปลวก งานถี่กวา่ ปลวกทหารปกติ ท้งั ยังทา ให้ปลวกงานมีพฤติกรรมทา ความสะอาดร่างกายสมาชิกตัวอื่น ในรังเพ่ิมข้ึนดว้ ย ส่วน Foo et al. (2011b) กล่าววา่ มักพบปลวกถูกเบียนจานวน มากจากจอมปลวก ขนาดสูงใหญ ่ พร้อมต้งั ขอ้ สังเกตวา่ จอมปลวกที่สมาชิกถูกเบียนส่วนใหญมัก่ ต้งั อยใู่ นพ้ืนที่ที่มีร่มเงา ความเขม้ แสงนอ้ ย ความช้ืนสูง พืชปกคลุมหนาทึบ ปลวกส่วนใหญใ่ นจอมมีจานวนมากและ แข็งแรง

แมลงวัน M. exenterans เป็นตัวเบียนในปลวกทหาร M. gilvus เช่นเดียวกนั มีรายงานพบ หนอนจากปลวกคร้ังแรกที่ฟิลิปปินส์เมื่อปี ค.ศ. 1926 และชวา ปี ค.ศ. 1938 แตข่ ณะน้นั เชื่อวา่ อยวู่ งศ ์ Conopidae (Diptera: Brachycera) ก่อนถูกจดั อยใู่ นวงศ ์ Phoridae สกุล Misotermes ภายหลงั ตอ่ มา Disney et al. (2009) จาแนกแมลง วันชนิดน้ีที่พบจากมาเลเซียเป็นชนิดใหม ่ มีรายงานวา่ เพศเมีย วางไขจ่ า นวนมากกระจายทว่ั จอมปลวก ส่วน M. vicinus พบจากประเทศไทย (Neoh and Lee, 2010) แมลงวันชนิดอื่นนอกจากแมลงวันสกุล Misotermes ที่มีรายงานเป็นตัวเบียนปลวก M. gilvus คือ D. philotermes และ P. kistneri

นอกจากน้ีพบแมลงวันสกุล Dicranopteron เบียนปลวกสกุล Odontotermes โดย D. setipennis วางไขใ่ นส่วนทอ้ งของตวั ออ่ นปลวก Odontotermes takensis Ahmad แตไ่ มพ่ บวา่ ปลวก แสดงพฤติกรรมดุร้ายต่อแมลงวนั (Disney and Kistnek, 1990) และพบแมลงวัน Megaselia nigrifinis Liu & Chen กบั Megaselia setidifferitatis Liu & Chen ในซากปลวก Odontotermes formosanus (Shiraki) ที่นานกิง ประเทศจีน (Liu and Chen, 2019)

20

ขณะที่ D. mortimeri และ D. watsoni คน้ พบคร้ังแรกโดย Disney (1986) เป็นตัวเบียนใน ปลวกวงศย์ อ่ ย Nasutitermitinae โดยแมลงวนั เพศเมียท้งั สองชนิดมีพฤติกรรมล่อปลวกงานออกจาก กลุ่ม จากน้นั จึงวางไขใ่ นทอ้ งของปลวก จากการวางไขแ่ ตล่ ะคร้ังมีไขเ่ พียงฟองเดียวเทา่ น้นั ที่ไดฟ้ ัก หนอนเข้าดักแด้ภายในส่วนทอ้ งของซากปลวก เพศเมียเหล่าน้ีอาจคอยปกป้องดูแลปลวกที่ถูก วางไข ่ ระหวา่ งช่วงตวั อ่อนเจริญเติบโตดว้ ย

ปัจจุบันเร่ิมมีแนวคิดนา แมลงวนั วงศ ์ Phoridae สกุล Pseudacteon มาใช้ควบคุมแมลง รุกรานตา่ งถ่ินศัตรูของมนุษย ์ เช่น มดคนั ไฟสกุล Solenopsis (Morrison, 2012; Porter and Gilbert, 2004; Wuellner et al., 2002) กรณีของปลวก M. gilvus แมย้ งั ไมป่ ฏิเสธความเป็นไปไดใ้ นการใช้ แมลงวันควบคุม รวมถึงมีรายงานการเล้ียงแมลงวนั ภายใตสภาพห้องปฏิบัติการ้ นา ไปปลดปล่อยสู่ กลุ่มปลวกไมถ่ ูกเบียนไดแ้ ลว้ แตย่ งั พบอตั ราการเบียนปลวกจากแตล่ ะรังต่า ส่วนข้อมูลเกี่ยวกบั ปัจจยั แวดลอ้ มที่ส่งผลต่อการเบียนของแมลงวนั ยังคงจา กดั (Foo et al., 2011b)

แมลงวันตัวเบียนวงศ์ Calliphoridae

Verticia fasciventris Malloch (oriental bengaline blow fly) เป็นแมลงวนั กลุ่ม blow flies หรือ Calliphorid flies จดั อยใู่ นวงศ ์ Calliphoridae กระจายตัวอยบู่ างประเทศแถบเอเชียตะวันออก เฉียงใต้ (To et al., 2016) พบเป็นตัวเบียนภายในของปลวกสกุล Macrotermes หลายชนิด เช่น M. carbonarius และ Macrotermes malaccensis (Havilandi) พบที่ประเทศมาเลเซีย (Neoh and Lee, 2011; To et al., 2016) Macrotermes barneyi (Light) พบที่ Hong Kong country park (Sze et al., 2008) และ Macrotermes subhyalinus (Rambur) (Geigy et al., 1964; Neoh and Lee, 2009b) โดย เจริญเติบโตอดั แน่นอยภู่ ายในหวั ของปลวกทหาร ทา ให้หวั เป็นรูปสี่เหลี่ยมจตั ุรัส กรามส้ัน (To et al., 2016) มีหนวด 18 ปล้อง (Neoh and Lee, 2011) เบียนท้งั ปลวกทหารขนาดใหญ่และปลวกทหาร ขนาดเล็ก เมื่อเจริญเต็มที่จะออกจากส่วนหวั ผา่ นทางช่องเปิด (foramen) ที่คอ เคลื่อนผา่ นลา ตวั เพื่อ ออกทางช่องเปิดระหวา่ งแพนหาง (cerci) ที่ปลายท้อง โดยใช้ส่วนปากคลา้ ยตะขอ (mouth hook) ก่อนฝังตัวลงในช้นั ดิน vermiculite เพื่อเข้าดักแด้ (Neoh and Lee, 2009b; Sze et al., 2008) 21

เดิมหนอนแมลงวนั กลุ่มน้ีเป็นปรสิตหรือตวั ห้า ของส่ิงมีชีวติ บางชนิด เช่น ไส้เดือนดิน หอย ทาก เหาไม้ ฝักไขต่ ก๊ั แตน (Merritt et al., 2009; Rognes, 1991; Sze et al., 2008) ก่อภาวะโรคแผล หนอนแมลงวันกบั สัตว์มีกระดูกสันหลัง ดูดเลือดของนก สัตวเ์ ล้ียงลูกดว้ ยนม กินมูลสัตว์ ศพ ซาก สัตว์ในจอมปลวกจนถึงหมอ้ ขา้ วหมอ้ แกงลิง แตไ่ มม่ ีรายงานตวั เบียนแมลงมาก่อนกระทง่ั พบหนอน แมลงวันวงศ์ Calliphoridae จากหัวของปลวกทหารคร้ังแรกโดย Carl Aurivillius นกั กีฏวทิ ยา ชาว สวีเดน เมื่อปี ค.ศ. 1899 พบตวั อยา่ งปลวก M. malaccensis ส่วนหัวบวมมากผิดปกติ 2 ตัวจากเกาะ Biliton ประเทศอินโดนีเซีย ก่อนที่ 1 ทศวรรษถัดมา N. A. Kemner ชาวสวเี ดน พบวา่ สาเหตุเกิดจาก หนอนแมลงวนั ขนาดใหญ่อาศยั อยภายในู่ ส่วนหวั ของปลวกท้งั สองน้นั (Sze et al., 2008) จากน้นั พบปลวก M. barneyi และ M. carbonarius ถูกหนอนแมลงวนั เบียนที่ฮ่องกงและมาเลเซีย ตามลาดับ นอกจากน้ี พบหนอนแมลงวนั blow flies เป็นตวั ห้า ไมเ่ จาะจง (facultative predator) ของหนอน แมลงวันชนิดอื่นรวมท้งั blow flies ชนิดอื่นเช่นกนั (Faria et al., 2004)

Neoh and Lee (2011) รายงานวา่ เป็นตัวเบียนเดี่ยว อาจเร่ิมเบียนปลวกทหารต้งั แตช่ ่วงตัว ออ่ นแตย่ งั ไมส่ ามารถระบุช่วงระยะที่แน่ชดั ได ้ ปลวกที่ถูกเบียนแสดงพฤติกรรมดุร้ายในหลายระดับ เช่น จากรายงานน้ีพบวา่ ความดุร้ายนอ้ ยกวา่ ปลวกไมถ่ ูกเบียนอยา่ งชดั เจน แตบ่ างรายงานเช่น Neoh and Lee (2009b) ระบุวา่ มีความดุร้ายสูงเมื่อถูกรบกวน แตไ่ มแ่ สดงพฤติกรรมต่อต้านการเบียนของ หนอน

22

การจ าแนกแมลงด้วยเทคนิคทางอณูชีววิทยา

เทคนิคทางอณูชีววทิ ยา

อณูชีววิทยา (Molecular biology) คือการศึกษาเกี่ยวกบั โครงสร้าง คุณสมบัติ กลไกหน้าที่ ของสารชีวโมเลกุล (biomolecules หรือ macromolecules) ในส่ิงมีชีวติ อนั เป็นส่วนประกอบพ้ืนฐาน ของเซลล์ เช่น ยนี ต้งั แตล่ กั ษณะโครงสร้างในระดบั โมเลกุล กลไกการจาลองตัวเอง (replication) การแสดงออก (expression) และการกลายพันธุ์ (mutation) ของยีนจนถึงการใช้สารชีวโมเลกุลเพื่อ อธิบายตรวจสอบกลไกตา่ ง ๆ นา ไปสู่การกา หนดกฎเกณฑข์ องกระบวนการทางชีววทิ ยาที่จา เป็นต่อ การรักษาสมดุลภายในเซลล ์ เน้ือเยอื่ อวยั วะของร่างกายส่ิงมีชีวติ รวมถึงการตอบสนองต่อ ส่ิงรบกวนท้งั จากภายนอกและภายในร่างกาย (Tabery et al., 2019; Vitale, 2017)

ตวั อยา่ งเทคนิคพ้ืนฐานทางอณูชีววิทยาที่สาคัญ ไดแ้ ก่ เทคนิคสกดั แยกกรดนิวคลีอิก (DNA และ RNA) เทคนิค electrophoresis สาหรับแยกโมเลกุลของกรดนิวคลีอิกตามขนาด โมเลกุลบน agarose หรือ polyacrylamide gel เทคนิคการทา แผนที่จุดตัดของเอนไซม์ตัดจาเพาะ (restriction enzyme) บนชิ้นส่วน DNA (restriction mapping) เทคนิควิเคราะห์กรดนิวคลีอิกประกอบด้วย หลากหลายกรรมวิธี ตวั อยา่ งเช่น เทคนิคถ่ายซบั (blotting) เป็นการเคลื่อนย้ายกรดนิวคลีอิกจาก gel สู่แผน่ nitrocellulose หรือ nylon เทคนิคการสร้าง ตรวจสอบแหล่งที่มาและสภาพก่อนใชง้ านของ ยีนตรวจติดตาม (gene probe) การติดฉลากกมั มนั ตรังสีบน DNA ของยีนตรวจติดตามอาจใช้วิธี เช่น ติดบนส่วนปลายเส้น DNA ติดแบบสุ่มบนไพรเมอร์ (primer) ติดโดยเขา้ แทนที่ช่องวา่ งจากการ แตกหักฉีกขาดในลาดับนิวคลีโอไทด์ (Nick translation) และเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่ polymerase (polymerase chain reaction; PCR) (Rapley, 2009)

23

ความสาคัญ ต่อการจัดจา แนกส่ิงมีชีวติ

เนื่องจากการจดั จา แนกส่ิงมีชีวิตโดยใช้ลักษณะทางสัณฐานวิทยามีขอ้ จา กดั คือ ส่ิงมีชีวติ อาจเกิดการเปลี่ยนแปลงลักษณะภายนอกไปตามสภาพแวดล้อม (phenotypic plasticity) หรือความ ผันแปรทางพันธุกรรม (genetic variability) ส่ิงมีชีวติ หลายชนิดอาจมีรูปร่างลกั ษณะภายนอก คลา้ ยกนั (cryptic species) บางชนิดสามารถใช้ลักษณะภายนอกในการจาแนก ได้เพียงบางระยะการ เจริญเติบโตหรือบางเพศ บางชนิดตอ้ งใชล้ กั ษณะที่มีความละเอียดออ่ น แสดงความแตกตา่ งกนั เพียง เล็กนอ้ ยเทา่ น้นั รวมท้งั จา เป็นตอ้ งใชผ้ ูเ้ชี่ยวชาญผู้มีประสบการณ์เฉพาะด้านมาอยา่ งยาวนาน และแม้ จะจาแนกโดย ใช้ผู้เชี่ยวชาญแล้วยังอาจเกิดอัตราความผิดพลาดได้ถึงร้อยละ 7.5 - 9 ท้งั หมดดังกล่าว ล้วนเป็นปัจจัยที่ทาให้จ าแนก ชนิดของส่ิงมีชีวิตผดิ พลาดหรือไมส่ ามารถจา แนกได ้ (ภรณี, 2555) ดงั น้นั การจัดจาแนก ชนิดของส่ิงมีชีวติ ในปัจจุบนั จึงนิยมใช้เทคนิคทางอณูชีววทิ ยาร่วมดว้ ย

การจดั จา แนกส่ิงมีชีวติ โดยเทคนิคทางอณูชีววิทยาคือการวิเคราะห์สารพันธุกรรม (DNA) ซ่ึงแสดงความแตกตา่ งระหวา่ งส่ิงมีชีวติ ในระดบั ชนิด (species) หรือระดับบุคคล (individual) แม้ รูปร่างลกั ษณะภายนอกเหมือน/คลา้ ยคลึงกนั จึงถูกใชเพื่อ้ จาแนก ชนิดรวมถึงสร้างสายวิวัฒนาการ ของส่ิงมีชีวติ มกั ใชร้ ่วมกบั ลกั ษณะทางสัณฐานวทิ ยา ตวั อยา่ งส่ิงมีชีวติ ที่โดดเด่นจากการสร้างสาย วิวัฒนาการโดยการวิเคราะห์ DNA ร่วมกบั ลกั ษณะทางสณั ฐานวทิ ยาคือ แมลง (Gurney et al., 2000) เทคนิคทางอณูชีววิทยาที่นา มาประยกุ ตใ์ ชม้ ีหลายวธิ ี เช่น isozyme analysis DNA probe และ random amplified polymorphic DNA (RAPD) เป็นต้น หนึ่งในวิธีที่นิยมใชจ้ ดั จา แนกกลุ่มสัตวข์ าปลอ้ งคือ DNA barcode (เกศรินทร์ และคณะ, 2561)

การจา แนกส่ิงมีชีวติ ด้วยเทคนิค DNA barcode ใช้การเปรียบเทียบลาดับนิวคลีโอไทด์ บางส่วนใน DNA ที่จา เพาะตอ่ ส่ิงมีชีวติ แตล่ ะชนิดเทา่ น้นั ดงั น้นั พ้ืนฐานสา คญั คือการหาลาดับและ ความยาวของนิวคลีโอไทดท์ ี่ถูกตอ้ ง เนื่องจากลา ดบั บางส่วนอาจแตกตา่ งกนั มากเกินกวาจะน่ ามา เปรียบเทียบได้ หรือบางส่วนอาจคลา้ ยคลึงกนั มากเกินกวา่ จะแสดงให้เห็นความแตกตา่ งระหวา่ ง ชนิด รวมท้งั ส่ิงมีชีวติ แตล่ ะชนิดอาจมีลา ดบั นิวคลีโอไทดห์ ลายช่วงที่สามารถใช้เป็นตัวเปรียบเทียบ 24

ได้ (Gurney et al., 2000) นักวิทยาศาสตร์จึงคิดนาล าดับนิวคลีโอไทด์มาสร้าง DNA barcode สาหรับ ระบุชนิดของส่ิงมีชีวติ โดยกา หนดใหล้ า ดบั นิวคลีโอไทด์ที่นา มาตรวจสอบต้องมีขนาดส้ัน สะดวก เหมาะสมตอ่ การใชง้ านแสดงความแตกตา่ งระหวา่ งชนิดของส่ิงมีชีวติ สูง แตแสดง่ ความแตกตา่ ง ระหวา่ งส่ิงมีชีวติ ชนิดเดียวกนั ต่า โดย DNA barcode มาตรฐานของสัตว์มาจากลาดับนิวคลีโอไทด์ บางส่วนของยนี cytochrome c oxidase I (COI) ใน mitochondria สามารถนา มาเปรียบเทียบกนั ได้ โดยตรง เกิดการแทรกเข้าหรือหลุดหายของนิวคลีโอไทด์น้อย (พรณรงค์ และ อรุณรัตน์, 2554)

การจัดจาแนกแมลงอันดับ Diptera ด้วยเทคนิคทางอณูชีววิทยา

กนก และคณะ (2553) ศึกษาการจาแนก หนอนแมลงวันจากข้อมูลลาดับนิวคลีโอไทด์ใน ตา แหน่งยนี COI และ/หรือ COII ของ mitochondrial DNA (mtDNA) ขนาด 351 bp เนื่องจากยนี ส่วน น้ีพบความแปรผันทางพันธุกรรมมาก ทา ใหท้ ราบความแตกตา่ งของแมลงวนั แตล่ ะชนิดได้อยา่ ง รวดเร็ว เหมาะสาหรับศึกษาวิวัฒนาการและ พันธุศาสตร์ประชากร ส่วนเกศรินทร์ และคณะ (2561) กล่าววา่ ลา ดบั นิวคลีโอไทด์ที่ใชท้ า DNA barcode โดยทว่ั ไปมกั มีช่วงส้ัน ๆ ประมาณ 150 - 800 bp ของยีนที่มีความจาเพาะ ยีนที่นิยมนามาท า DNA barcode ของแมลงอันดับ Diptera ไดแ้ ก่ COI COII cytochrome b (cyt b) ความยาวประมาณ 1,140 bp และ 28S ribosomal RNA (28S rRNA) ความยาว ประมาณ 4,718 bp แตน่ ิยมใชย้ นี COI มากที่สุดเนื่องจากปรากฏรายงานในฐานข้อมูลจานวนมาก และแสดงความแตกตา่ งในการจา แนกชนิดได้ค่อนขา้ งเหมาะสม ในประเทศไทยเร่ิมใช้เทคนิค DNA barcode จาแนกชนิดแมลงในอันดับ Diptera บางกลุ่ม เช่น กลุ่มที่มีความสาคัญทางการแพทย์ และนิติเวชศาสตร์

ข้นั ตอนการสร้าง DNA barcode ประกอบด้วยการเกบ็ ตวั อยา่ งและจัดจาแนก ชนิดตวั อยา่ ง แมลง การสกดั DNA จากตวั อยา่ งแมลง การเพ่ิมปริมาณ DNA มาตรฐานด้วยเทคนิค PCR การหา ลาดับนิวคลีโอไทด์ (sequencing) การวิเคราะห์ลาดับนิวคลีโอไทด์ (sequences analysis) จนถึง บันทึกข้อมูลลงฐานข้อมูล สามารถทาได้ ท้งั ตวั อยา่ งสดและตวั อยา่ งแหง้ ที่เกบ็ ในพิพิธภณั ฑ ์ ตวั อยา่ ง เกบ็ ในตูแ้ ช่อุณหภูมิ - 20 องศาเซลเซียส จนถึงตวั อยา่ งในน้า ยาตรึงสภาพ ส่วนของแมลงตวั เตม็ วยั ที่ 25

นิยมนา มาสกดั DNA คือ ขา ปีก เนื่องจากพบเซลล์ที่มี metabolism สูงและ mitochondria จานวนมาก ส่วนขอ้ จา กดั ของการทา DNA barcode คือ ขอ้ มูลลา ดบั นิวคลีโอไทดใ์ นฐานขอ้ มูลต่าง ๆ คอ่ นขา้ ง นอ้ ย บางส่วนไมไ่ ดร้ ับการยอมรับ ในประเทศไทยยงั พบรายงานการทา DNA barcode ไมม่ ากนกั (เกศรินทร์ และคณะ, 2561)

ปัจจุบันเทคนิคทางอณูชีววิทยาเร่ิมมีบทบาทต่อการจดั จา แนกส่ิงมีชีวติ ระดบั ชนิดมากข้ึน แตล่ า ดบั ยนี ของส่ิงมีชีวิตจา นวนมากอาจใช้ไมได้ในฐานข้อมูล่ ทา ใหไ้ มส่ ามารถจา แนกส่ิงมีชีวติ ได้ ดว้ ยการเปรียบเทียบลา ดบั ยนี ของส่ิงมีชีวติ ที่ตอ้ งการทราบชนิดกบั ที่ปรากฏในฐานขอ้ มูลเทา่ น้นั แต่ ตอ้ งใชก้ ารจา แนกดว้ ยลกั ษณะทางสัณฐานวทิ ยาร่วมดว้ ย และเนื่องจากแมลงวนั วงศ ์ Phoridae เป็น แมลงวนั กลุ่มใหญ ่ เฉพาะสกุล Megaselia พบมากราว 1,400 ชนิดในเขตร้อนและก่ึงเขตร้อนแต่ ปรากฏในฐานข้อมูลเพียงไมก่ ี่ชนิดเทา่ น้นั การจาแนกด้วยลักษณะทางสัณฐานวิทยา จึงมีความสาคัญ มากข้ึนตามไปดว้ ย (Alam et al., 2016)

DNA marker สาหรับ การศึกษาด้านพันธุกรรม

การใช้เครื่องหมายจาก DNA เรียกวา่ DNA marker สามารถศึกษาไดท้ ้งั ส่วนที่เป็นยนี (coding sequence) และส่วนที่ไมใ่ ช่ยีน (non-coding sequence) ท้งั สองส่วนรวมกนั เรียกวา่ ชุดข้อมูล ทางพันธุกรรมหรือชุดของ DNA (genome) ใชศ้ ึกษาต้งั แตก่ ารจดั เรียงลา ดบั DNA ตรวจสอบความ หลากหลายทางพันธุกรรมและวเิ คราะห์ความสัมพนั ธ์ทางววิ ฒั นาการของส่ิงมีชีวิต แบ่งประเภทยนี ที่ใชศ้ ึกษาตามตา แหน่งที่อยขู่ องยนี บน DNA ได้แก่ ยีนบน DNA ในนิวเคลียส (nuclear DNA gene) กบั ยีนบน DNA ใน mitochondria (mitochondrial DNA gene) (สกล, 2557)

ชุดข้อมูลทางพันธุกรรมในนิวเคลียส (nuclear genome) พบที่ส่วนนิวเคลียสของเซลล์ เทา่ น้นั การถ่ายทอดลกั ษณะสู่รุ่นลูกหลานดาเนิน ตามกฎของ Mendel สารพันธุกรรมภายใน genome จดั รวมตวั กนั ขดแน่นเกาะติดกบั โปรตีน histone ส่วนระบบการซ่อมแซม DNA (repairing system) ระหวา่ งกระบวนการถ่ายแบบหรือจาลองตัวเอง (replication) ของสารพันธุกรรมมีประสิทธิภาพ 26

คอ่ นขา้ งสูง หนึ่งเซลลร์ ่างกาย (somatic cell) พบ DNA เพียง 2 ชุด (copies) ต่อเซลลเ์ ทา่ น้นั นอกจากน้ีวิวัฒนาการของ DNA ในนิวเคลียสคอ่ นขา้ งซบั ซอ้ นยากตอ่ การวเิ คราะห์ทางสถิติมากกวา่ DNA ใน mitochondria (รัชฎาภรณ์, 2552)

ชุดข้อมูลทางพันธุกรรมใน mitochondria (mitochondrial genome หรือ mtDNA) พบที่ ส่วนประกอบของเซลล์ภายใต้เยื่อหุ้มเซลล์แตอ่ ยนู่ อกนิวเคลียส (cytoplasm) เทา่ น้นั การถ่ายทอด ลกั ษณะสู่รุ่นลูกหลานกระทา ผา่ นทางมารดา แมลงพบประมาณ 16,000 bp ลกั ษณะเป็นสายเกลียวคู ่ (double-strand) ล่องลอยปะปนกบั ส่วนของเหลว (matrix) ภายในเยื่อหุ้มของ mitochondria ไมพ่ บ การจัดรวมตัวหรือเกาะติดกบั โปรตีนใด ๆ หนึ่ง mitochondria ประกอบด้วย mitochondrial genome ประมาณ 5 – 10 ชุดสามารถถอดรหัสแก่ยนี ท้งั หมด 37 ยนี แบง่ เป็นยนี ที่ถอดรหสั ให ้ transfer RNA จานวน 22 ยีน ribosomal RNA จานวน 2 ยีน และโปรตีนจานวน 13 ยนี โดยโปรตีนท้งั 13 ชนิดเป็น หน่วยยอ่ ยของเอนไซมเ์ ชิงซ้อน 5 ตัวในกระบวนการ oxidative phosphorylation ไดแ้ ก่ cytochrome oxidase ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase NADH-ubiquinone oxidoreductase succinate- ubiquinone oxidoreductase และ ATP synthase ท้งั น้ียีนใน mitochondria ที่ถอดรหัสเป็นโปรตีน หน่วยยอ่ ยของเอนไซมเ์ ชิงซ้อนตวั ที่ 1 (cytochrome oxidase) จานวน 3 ยีน คือ COI COII และ COIII เอนไซม์เชิงซ้อนตัวที่ 2 (ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase) จานวน 1 ยีน คือ cytb เอนไซม์ เชิงซ้อนตัวที่ 3 (NADH-ubiquinone oxidoreductase) จานวน 7 ยีน คือ ND1 ND2 ND3 ND4 ND4L ND5 และ ND6 เอนไซม์เชิงซ้อนตัวที่ 5 (ATP synthase) จานวน 2 ยีน คือ ATP6 และ ATP8 (รัชฎา ภรณ์, 2552)

นอกจากน้ีไมพ่ บระบบซ่อมแซม DNA ระหวา่ งกระบวนการถ่ายแบบหรือจาลองตัวเองของ สารพันธุกรรมใน genome ทา ใหโ้ อกาสเกิดความผดิ พลาดระหวา่ งกระบวนการและอัตราการกลาย พนั ธุ์สูงกวา่ ยนี ของนิวเคลียสมากถึง 10 – 20 เทา่ เนื่องจากล่องลอยปะปนกบั ส่วน matrix ของ mitochondria เกิดแนวโนม้ สัมผสั กบั อนุมูลอิสระจากกระบวนการ oxidative phosphorylation สูง มากตลอดเวลาโดยไมม่ ีโปรตีน histone ช่วยปกป้องลอ้ มรอบ ด้วยคุณสมบัติอัตราการกลายพันธุ์สูง กบั การถ่ายทอดทางพนั ธุกรรมเฉพาะทางสายมารดาดงั กล่าวส่งผลให้ mitochondrial genome เหมาะสมตอ่ การศึกษาววิ ฒั นาการของส่ิงมีชีวติ เพราะเมื่อเวลาผา่ นไปเทา่ กนั พบวา่ mitochondrial 27

genome สะสมการกลายพนั ธุ์ใหมไ่ ดม้ ากกวา่ nuclear genome เหมาะสาหรับเป็นเครื่องมือวัดการ เปลี่ยนแปลงทางวิวัฒนาการที่ละเอียดรวดเร็วกวา่ จากคุณสมบัติหนึ่งเซลล์ปกติสามารถพบ DNA ได้จานวน นับพันชุดตอ่ เซลล์ทาให้สามารถตรว จพบและสกดั DNA ไดง้ ่ายในปริมาณมากกวา่ สกดั จากนิวเคลียสแม้ปริมาณหรือขนาดของตวั อยา่ งเซลล/์ เน้ือเยอื่ สา หรับวเิ คราะห์นอ้ ยมาก รวมท้งั คอ่ นขา้ งทนตอ่ สภาพเป็นกรดเพ่ิมโอกาสการคงสภาพของ DNA หลังเกบ็ ตวั อยา่ งคอ่ นขา้ งนานได ้ อยา่ งไรกต็ ามขอ้ จา กดั ของ mitochondrial genome คือขนาดเล็กมากราว 0.00006 ของ nuclear genome ทา ใหอ้ าจไม่เหมาะสาหรับการศึกษาวิวัฒนาการในภาพรวม เทา่ ที่ควร (รัชฎาภรณ์, 2552)

เทคนิคส าหรับการศึกษาทางอณูชีววทิ ยา

การเพ่ิมปริมาณ DNA เป้าหมายด้วยเทคนิค polymerase chain reaction (PCR)

เทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่ polymerase (PCR) คือเทคนิคสา หรับเพ่ิมจา นวนชิ้นส่วน DNA ที่มี ความจาเพาะในหลอดทดลอง ด้วยการเลียนแบบกระบวนการเพ่ิมจา นวน DNA ของเซลลก์ ่อนการ แบง่ เซลลต์ ามธรรมชาติ โดยเร่ิมตน้ จากเซลลต์ น้ แบบหรือ DNA เป้าหมายเพียงเซลล์/ชิ้นเดียว สามารถเพ่ิมจา นวนไดป้ ริมาณมากคอ่ นขา้ งง่ายภายในระยะเวลาไมน่ าน การทา PCR ต้องทราบ ลา ดบั เบสที่ตา แหน่งปลายท้งั สองขา้ งของยีนเป้าหมายที่ต้องการเพ่ิมจา นวนเพื่อนามาสร้างสาย primer หรือนิวคลีโอไทดส์ ายส้ันขนาดประมาณ 18 – 30 bp จานวน 2 เส้นซ่ึงจา เพาะต่อยนี เป้าหมาย ใช้เอนไซม์ DNA polymerase ช่วยในกระบวนการสร้างสาย DNA ใหม ่ เอนไซมด์ งั กล่าวตอ้ งทนต่อ ความร้อนจึงนิยมนามาจากแบคทีเรีย Thermus aquaticus Brock & Freeze ซ่ึงพบบริเวณน้า พุร้อน เรียกเอนไซมน์ ้ีวา่ Taq polymerase ใช้นิวคลีโอไทด์ 4 ชนิดไดแ้ ก่ dATP dCTP dGTP และ dTTP เป็น สารต้งั ตน้ Mg2+ เป็นสารประกอบร่วมทา ปฏิกิริยา (cofactor) และบัฟเฟอร์ (buffer) เป็นสารควบคุม ปฏิกิริยาให้อยใู่ นสภาวะเหมาะสม (สกล, 2557)

28

ปฏิกิริยา PCR เกิดข้ึนเป็นรอบ (cycle) โดยผสม DNA ต้นแบบและองคป์ ระกอบท้งั หมด ดงั กล่าวขา้ งตน้ ลงในหลอดทดลองนา ไปใส่ในเครื่อง thermocycler จากน้นั ปรับอุณหภูมิและ ระยะเวลาตามที่ตอ้ งการ แตล่ ะรอบของปฏิกิริยาประกอบดว้ ย 3 ข้นั ตอน ไดแ้ ก่ denaturation คือการ ใช้ความร้อนประมาณ 95 องศาเซลเซียสทาลายโครงสร้างของ DNA เพื่อแยกสายคูข่ อง DNA ออก จากกนั เกิดสาย DNA ต้นแบบสาหรับการเข้าเกาะของ primer ตามด้วย annealing คือการเข้าเกาะ DNA สายตน้ แบบท้งั สองเส้นของ primer โดยลดอุณหภูมิลงเหลือประมาณ 50 – 60 องศาเซลเซียส ข้ึนกบั องค์ประกอบและความยาวของเส้น primer เนื่องจาก primer เป็นสายคูส่ ม (complementary) ที่ขนาดเล็กกวา่ แตป่ ริมาณมากกวา่ สาย DNA ต้นแบบ ทาให้ มีโอกาสจบั คูก่ นั ไดก้ ่อน DNA สาย ตน้ แบบกลบั มาจบั คูก่ นั ใหม ่ (reannealing) อีกคร้ัง ข้นั ตอนสุดทา้ ย extension คือนิวคลีโอไทด์ตัว

สุดท้ายตรงด้านปลาย 3´ ท้งั 2 ข้างของเส้น primer เร่ิมสร้างตอ่ สายใหมจ่ ากทิศทาง 5´  3´ ที่ อุณหภูมิประมาณ 72 องศาเซลเซียสซ่ึงเหมาะสมตอ่ การทา งานของเอนไซม ์ Taq polymerase เมื่อ ครบท้งั 3 ข้นั ตอนปฏิกิริยาจะเร่ิมตน้ วนซ้า ใหมประมาณ่ 30 – 40 รอบ สุดท้ายจึงได้ยีนเป้าหมายส่วน ที่ต้องการ (สกล, 2557)

การศึกษาลาดับนิวคลีโอไทด์ด้วยเทคนิค Sequence

เทคนิค sequence คือเทคนิคตรวจสอบลาดับนิวคลีโอไทด์ในสาย DNA ใช้หลักการทางาน ของเอนไซม์ DNA polymerase เติมนิวคลีโอไทด์ในรูป deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) เข้าสาย DNA สร้างใหม่ทีละตัว ๆ เกิดการต่อสายเขา้ คูก่ บั DNA สายต้นแบบไปเรื่อย ๆ จนกระทง่ั เติม dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP) เข้าไประงับการเติมนิวคลีโอไทด์ตัวถัดไปของ DNA polymerase เนื่องจากน้า ตาล deoxyribose ไมม่ ีหมู ่ OH ตรงตา แหน่ง 3´ สาหรับสร้างพันธะ phosphodiester กบั dNTP ตัวตอ่ ไปทาให้การสร้าง DNA สายใหมห่ ยดุ ลง กระบวนการหาลาดับนิ วคลีโอไทด์โดยใช้ ddNTP เรียกวา่ การอา่ นลา ดบั นิวคลีโอไทด์แบบ Sanger (Sanger sequencing หรือ dideoxy chain termination DNA sequencing) (สกล, 2557)

29

กระบวนการ Sanger sequencing ประกอบด้วย 4 ปฏิกิริยาแตกตา่ งกนั ตามเบส 4 ชนิด คือ A C G และ T ในอดีตทาแยก เป็น 4 หลอด องค์ประกอบของทุกหลอดเหมือนกนั คือ DNA ต้นแบบสาย เดี่ยว primer เอนไซม์ DNA polymerase นิวคลีโอไทด์ dNTP (มี 4 ชนิดไดแ้ ก่ dATP dCTP dGTP และ dTTP) และนิวคลีโอไทด์ ddNTP (มี 4 ชนิดไดแ้ ก่ ddATP ddCTP ddGTP และ ddTTP) เร่ิมการ สังเคราะห์ DNA สายใหม่โดยเติมนิวคลีโอไทด์ตรง primer ด้านปลาย 3' จนหยุดการสังเคราะห์เมื่อ ถึงตา แหน่งที่เอนไซม ์ DNA polymerase สุ่มนาเข้านิวคลีโอไทด์ ddNTP ตรวจสอบสาย DNA ที่ได้ ด้วยเทคนิค polyacrylamide gel electrophoresis จากน้นั ถ่ายภาพวดั รังสี (autoradiography) ซึ่งใน อดีต ddNTP ติดฉลากดว้ ยสารกมั มนั ตภาพรังสีเมื่อตรวจด้วยฟิล์ม X-ray จะปรากฏแถบสีดา เร่ิมอา่ น

ลาดับ นิวคลีโอไทด์จากดา้ นล่างของแผน่ ในทิศทาง 5´  3´ ของสาย DNA แต่เนื่องจากสาร กมั มนั ตภาพรังสีค่อนขา้ งอนั ตราย ปัจจุบันจึงเปลี่ยนเป็นติดฉลากด้วยสาร fluorescence แทน เบสแต่ ละชนิดติดฉลากสีแตกตา่ งกนั สามารถทา ปฏิกิริยาท้งั หมดได้ภายในหลอดเดียว ตรวจสอบได้ด้วยวิธี polyacrylamide gel electrophoresis หรือ capillary electrophoresis โดยใช้เครื่องวิเคราะห์ผลจากการ อา่ นสีฉลาก fluorescence ของเบสตา่ งชนิดกนั เรียกเทคนิคน้ีวา่ automate DNA sequencing ซึ่งใช้ เวลาวเิ คราะห์นอ้ ยกวา่ รวดเร็วกวา่ และปลอดภยั กวา่ วธิ ีด้งั เดิม (สกล, 2557)

การศึกษาววิ ฒั นาการของส่ิงมีชีวติ ดว้ ยแผนภูมิตน้ ไม ้ (Phylogenetic tree)

แผนภูมิต้นไม้ (phylogenetic tree) สร้างโดยอาศัยข้อมูลลาดับ โปรตีนหรือนิวคลีโอไทด์จาก ยนี ตา่ ง ๆ เพื่อศึกษาวเิ คราะห์ประวตั ิวิวฒั นาการของส่ิงมีชีวติ ส่วนประกอบสา คญั ไดแ้ ก่ ก่ิง/กา้ น/ แขนง (branch) แบง่ ตามจานวน ทิศทางการแตกก่ิงได้ 2 ประเภทคือ แตกก่ิงออก 2 ทาง (bifurcation) กบั แตกก่ิงออกหลายทาง (multifurcation) จุดที่ก่ิงแตกออกเป็นก่ิงยอ่ ยเรียกวา่ node และส่วนปลาย สุดของก่ิงคือลาดับ โปรตีนหรือนิวคลีโอไทด์ของชนิด (species) เรียกวา่ taxon โดยกลุ่มของ taxon ซ่ึงเกิดจากบรรพบุรุษเดียวกนั หรือร่วมกนั เรียกวา่ clade อาจมีเพียง clade เดียว (monophyletic tree) หรือหลาย clade (polyphyletic tree) กไ็ ด ้ (สกล, 2557)

30

กรณี polyphyletic tree สามารถแบง่ ประเภทตามการแสดงจุดกา เนิดร่วมได ้ 2 ประเภท คือ แบบมีรากหรือจุดกา เนิดร่วม (rooted tree) ซ่ึงเป็นตา แหน่งรวมของ taxon ท้งั หมดสามารถบอกไดว้ า่ จุดใดคือบรรพบุรุษจุดใดคือลูกหลานสืบสายตระกูล กบั แบบไมม่ ีราก (unrooted tree) ไมท่ ราบ ตา แหน่งจุดเร่ิมตน้ ของววัฒนาการิ ทาให้ ไมส่ ามารถบอกไดว้ า่ จุดใดคือบรรพบุรุษหรือลูกหลาน รวมถึงความสัมพันธ์หรือความใกลช้ ิดกนั ด้วย นอกจากน้ียงั สามารถแบง่ ประเภทตามการแสดง ระยะเวลาการเกิดววิ ฒั นาการได้ 2 ประเภท คือ แผนภูมิต้นไม้ (phylogram) ความยาวก่ิงไมเ่ ทา่ กนั แสดงถึงระยะเวลาการเกิดววิ ฒั นาการที่แตกตา่ งกนั และแผนภูมิลา ดบั ข้นั (cladogram) ซึ่งบอกเพียง ลาดับของ taxon แตไ่ มแ่ สดงระยะเวลาการเกิดววิ ฒั นาการ (สกล, 2557)

31

อปุ กรณ์และวิธีการทดลอง

วสั ดุอุปกรณ์

1. ถัง จอบ ชะแลง มีด สาหรับขุดจอมปลวก 2. แอลกอฮอล์ ความเข้มข้นร้อยละ 75 3. ขวดแกว้ 4. ปากคีบ มีดผา่ เขม็ ฉีดยา พูก่ นั สา หรับผา่ ปลวก 5. จานเพาะเล้ียงเช้ือ 6. กล้องจุลทรรศน์สเตอริโอ 7. กลอ้ งจุลทรรศน์สเตอริโอ สา หรับถ่ายรูป 8. หลอด microcentrifuge ขนาด 1.5 มิลลิลิตร 9. หลอด PCR ขนาด 0.2 มิลลิลิตร 10. ไมโครปิเปต ขนาด 0.1-10, 2-20, 20-200 และ 100-1,000 ไมโครลิตร 11. ปิเปตทิป ขนาด 0.1-10, 200 และ 1,000 ไมโครลิตร 12. หลอด centrifuge ขนาด 15 และ 50 มิลลิลิตร 13. เครื่องเพ่ิมปริมาณสารพนั ธุกรรม (PCR) รุ่น Veriti 14. ตู้เย็นอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส รุ่น LG 15. ตู้เย็นอุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส รุ่น Whirlpool 16. เครื่องเขยา่ ควบคุมอุณหภูมิ Incubator shaker รุ่น Innova®43 17. เครื่องป่ันเหวยี่ งควบคุมอุณหภูมิ รุ่น Centrifuge 5417 R 18. เครื่องป่ันเหวยี่ งควบคุมอุณหภูมิ รุ่น Centrifuge 5430 R 19. เครื่องไมโครเวฟ 20. เครื่องเขยา่ ผสมสาร Vortex รุ่น FINEVORTEX (FinePCR) 21. เครื่อง gel electrophoresis รุ่น Biorad sub-cell® RT 22. เครื่องถ่ายรูป gel documentation รุ่น Gel DocTM XR 32

23. เครื่องวัดปริมาณสารพันธุกรรม spectrophotometer รุ่น Nanodrop 2000c 24. ชุดสกดั DNA จากเน้ือเยอื่ สา เร็จรูป Invisorb® Spin Tissue Mini Kit 25. ชุดสกดั พลาสมิด DNA จากเน้ือเยื่อสา เร็จรูป Invisorb® Spin Plasmid Mini Two 26. ชุดโคลน สาหรับ PCR Product 27. ชุดสารเคมี สา หรับข้นั ตอนการทา ปฏิกิริยา PCR 28. สารเคมี สาหรับเตรียม gel electrophoresis 29. ถุงมือยาง 30. นาฬิกาจับเวลา 31. พาราฟิล์ม (parafilm) 32. กล่องโฟม 33. กระดาษทิชชู่

โปรแกรมวิเคราะห์ข้อมูล

1. โปรแกรม BioEdit Sequence Alignment Editor Program Version 7.1.9 สาหรับรวบรวม ขอ้ มูล วเิ คราะห์เปรียบเทียบลา ดบั นิวคลีโอไทด ์ อา่ นกราฟ chromatogram จากผล sequencing วิเคราะห์ความเหมือนและความแตกตา่ งภายในชนิดตวั อยา่ ง (Hall, 1999) 2. โปรแกรม Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version X (MEGAX) สาหรับ วิเคราะห์และสร้างแผนภูมิวิวัฒนาการ (Kumar et al., 2018) 3. โปรแกรมออนไลน์ nucleotide blast (BLASTN) สาหรับวิเคราะห์ความเหมือน ของลาดับนิ วคลีโอไทด์ในฐานข้อมูล GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 4. โปรแกรมออนไลน์ Banklt สา หรับส่งลา ดบั นิวคลีโอไทดเพื่อขอเลขทะเบียน์ (accession number) ในฐานข้อมูล GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/)

33

วิธีการ

วิธีการเก็บตัวอย่าง จ าแนกชนิดปลวก และทดสอบพฤติกรรมดุร้าย

สุ่มสา รวจเกบ็ ตวั อยา่ งปลวกสกุล Macrotermes จากมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ วิทยาเขต กา แพงแสน ต. กา แพงแสน อ. กา แพงแสน จ. นครปฐม (ละติจูด 14˚ 01´ 16.08´´ N; ลองจิจูด 99˚ 58´ 53.63´´ E) ระหวา่ งเดือนสิงหาคม พ.ศ. 2561 ถึงเดือนสิงหาคม พ.ศ. 2562 จา นวนตวั อยา่ งปลวกจาก การเกบ็ ข้ึนอยกู่ บั ขนาดและจานวนปลวก ที่พบของแตล่ ะจอม ตรวจหาปลวกทหารที่ปรากฏลักษณะ ทางสัณฐานวิทยาผิดปกติตามรายงานก่อนหนา้ เช่น Foo et al. (2011a) และ Neoh and Lee (2010) นา ปลวกทหารขนาดใหญ่กบั ปลวกทหารขนาดเล็กใส่จานเพาะเล้ียงเช้ือต้งั ที่อุณหภูมิห้อง ใช้ปากคีบ เขี่ยรบกวนปลวกเพื่อสังเกตพฤติกรรมความดุร้าย เมื่อปลวกตายทิ้งซากไว้ 24 ชว่ั โมง สังเกตการ ปรากฏของหนอนแมลงวันจากซากปลวก เกบ็ รักษาตวั อยา่ งในแอลกอฮอลเข้มข้น์ ร้อยละ 75 โดย แยกเกบ็ ปลวกที่พบและไมพ่ บหนอนแมลงวนั ออกจากกนั จาแนก ชนิดของปลวกภายใต้กล้อง จุลทรรศน์สเตอริโอด้วยลักษณะทางสัณฐานวิทยาของปลวกทหารขนาดใหญ่รวมถึงลักษณะจอม ปลวกตามรายงานของ Ahmad (1965) และ อิสระ (2530)

วิธีการเก็บตัวอย่างแมลงวันเบียนปลวก

เกบ็ ตวั อยา่ งแมลงวนั ตวั เบียน 3 ระยะ ไดแ้ ก่ หนอน ดกั แด ้และตัวเต็มวัย เนื่องจากขนาดของ ไขเ่ ล็กมากทาให้ อุปกรณ์เทคนิควธิ ีของผวู้ ิจยั ไมม่ ีประสิทธิภาพเพียงพอสาหรับ ตรวจเกบ็ ไข ่ ระยะ หนอนเกบ็ โดย 2 วิธี วิธีที่ 1 เกบ็ หนอนที่ปรากฎออกจากส่วนหวั /ลาตัวของปลวกทหาร ที่ใส่ในจาน เพาะเล้ียงเช้ือ วิธีที่ 2 ผา่ ส่วนหวั ของตวั อยา่ งปลวกที่เกบ็ ไวใ้ นแอลกอฮอลเข้มข้น์ ร้อยละ 75 เปรียบเทียบลักษณะทางสัณฐานวิทยาของปลวกที่พบหนอนแมลงวันกบั ปลวกทหารที่ถูกเบียนตาม รายงานก่อนหนา้ อีกคร้ัง

34

แบง่ ตวั อยา่ งหนอนบางส่วนจากการเกบ็ ดว้ ยวธิ ีแรกเกบ็ ในแอลกอฮอล์เข้มข้นร้อยละ 75 อีก ส่วนใส่ในขวดแกว้ ปิดดว้ ยผา้ ขาวบาง ต้งั ที่อุณหภูมิห้องเพื่อให้หนอนเข้าดักแด้ แบง่ ดักแด้บางส่วน เกบ็ ในแอลกอฮอล์ร้อยละ 75 อีกส่วนใส่ลงในขวดแกว้ ปิดด้วยผ้าขาวบาง 2 ช้นั ต้งั ที่อุณหภูมิห้อง 30 วันจนตัวเต็มวัยฟักออกมา เกบ็ ตวั อยา่ งแมลงวนั ลงในแอลกอฮอลเข้มข้น์ ร้อยละ 75 (ภาพที่ 1)

ภาพที่ 1 แผนผังข้นั ตอนการเกบ็ ตวั อยา่ งปลวกและแมลงวันตัวเบียน

35

การจ าแนกชนิดแมลงวันเบียนปลวก จ าแนกโดยลักษณะทางสัณฐานวิทยา

ตรวจสอบลักษณะทางสัณฐานวิทยาของหนอน ดักแด้ ตัวเต็มวัยด้วยกล้องจุลทรรศน์สเตอริ โอ หนอนจาแนก ตามรายงานของ Bostock (2015) Solgi et al. (2017) และ Thyssen (2010) ดักแด้ จาแนกตามรายงานของ Bostock (2015) Braga et al. (2015) และ Solgi et al. (2017) ส่วนตวั เตม็ วยั จาแนกตามรายงานของ Alam et al. (2016) Bostock (2015) Brown and Oliver (2007) Disney (1983, 1989) และ Solgi et al. (2017) แบง่ ตวั อยา่ งท้งั 3 ระยะบางส่วนส่งไปยืนยันชนิดด้วยลักษณะทาง สัณฐานวิทยาโดย Prof. Dr. Ronald Henry Lambert Disney (Department of Zoology, University of Cambridge, United Kingdom)

การจ าแนกชนิดโดยวิเคราะห์ลาดับนิวคลีโอไทด์ของยีน mitochondrial COI

นา ตวั อยา่ งหนอน ดักแด้ ตัวเต็มวัยจานวน 11 7 และ 7 ตวั อยา่ ง ตามลา ดบั จาแนก ด้วยเทคนิค ทางอณูชีววิทยาที่ภาควชิ าปรสิตวทิ ยา คณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวทิ ยาลยั โดยแยกตวั อยา่ ง ใส่ในหลอด microcentrifuge ขนาด 1.5 มิลลิลิตร หลอดละ 1 ตวั อยา่ ง นา มาสกดั DNA ออกจาก ตวั อยา่ ง

การสกดั DNA

สกดั mitochondrial DNA ดว้ ยชุดสกดั DNA จากเน้ือเยอื่ สา เร็จรูป Invisorb® Spin Tissue Mini Kit (STRASTEC Molecular GmbH, Germany) เร่ิมตน้ โดยการใส่สาร 1X PBS (Phosephate- buffered saline) เพื่อล้างแอลกอฮอล์ออก ใส่ lysis buffer G ปริมาตร 200 ไมโครลิตร ใช้ไม้บด ตวั อยา่ งใหล้ ะเอียด ใส่ proteinase S ปริมาตร 40 ไมโครลิตร นา ไปเขยา่ บนเครื่อง Vortex บม่ ไวท้ ี่ อุณหภูมิ 52 องศาเซลเซียส เวลา 2 ชว่ั โมง นา มาป่ันตกตะกอนที่ความเร็ว 11,000 rpm เวลา 2 นาที ยา้ ยส่วนใส (supernatant) ใส่หลอด microcentrifuge ใหม ่ ใส่สารละลาย binding buffer A ปริมาตร 36

200 ไมโครลิตร ผสมใหเ้ ขา้ กนั ยา้ ยใส่หลอดขนาด 2 มิลลิลิตร ที่มี spin filter บม่ ที่อุณหภูมิหอ้ งเป็น เวลา 1 นาที ป่ันตกตะกอนที่ความเร็ว 11,000 rpm เวลา 2 นาที ทิ้งส่วนใสที่ป่ันตกได ้ ใส่สารละลาย wash buffer ปริมาตร 550 ไมโครลิตร ป่ันลา้ งที่ความเร็ว 11,000 rpm เวลา 1 นาที ทิ้งส่วนใสที่ป่ันตก ได ้ ทา ข้นั ตอนป่ันลา้ งดว้ ย wash buffer ซ้า อีกคร้ัง ป่ันลา้ งแอลกอฮอลท์ ี่ความเร็ว 11,000 rpm เวลา 4 นาที ย้าย spin filter ใส่ microcentrifuge จากน้นั ใส่ elution buffer ปริมาตร 40 ไมโครลิตร (บม่ elution buffer ที่อุณหภูมิ 52 องศาเซลเซียสก่อนนา มาใช)้ บม่ ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาที ป่ันตก ที่ความเร็ว 11,000 rpm เวลา 1 นาที ทิ้ง spin filter นาสารละลาย DNA ที่สกดั ไดม้ าตรวจวดั ความ เข้มข้นโดยวดั คา่ การดูดกลืนแสงดว้ ยเครื่อง Nanodrop 2000c spectrophotometer (Thermo scientific®, USA) ที่ความยาวคลื่น 260 และ 280 นาโนเมตร เกบ็ ตวั อยา่ งสารละลายไวท้ ี่อุณหภูมิ - 20 องศาเซลเซียสเพื่อนา ไปเพ่ิมปริมาณ DNA ตอ่ ไป

การเพ่ิมปริมาณ DNA

เพ่ิมปริมาณ DNA ในยีน mitochondrial COI ด้วยวิธี polymerase chain reaction (PCR) โดย ใช้ DNA ที่สกดั ขา้ งตน้ เป็นแมพ่ ิมพ ์ (template) ใช้ forward primer และ reverse primer (5´ → 3´) คือ GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G และ TAG ACT TCT GGG TGG CCA AAG AAT CA ตามลาดับ อ้างอิงจาก primer ตรวจสอบแมลงวัน M. scalaris (Alam et al., 2016; Solgi et al., 2017; Zhang et al., 2017) ทา การเพ่ิมปริมาณ DNA ดว้ ยเครื่องเพ่ิมปริมาณสารพนั ธุกรรม (PCR) รุ่น Veriti (GenPlus®, USA) โดย initial denaturation ที่ 95 องศาเซลเซียส เวลา 3 นาที ตามด้วย amplification อยา่ งละ 35 รอบ ไดแ้ ก่ denaturation ที่ 95 องศาเซลเซียส เวลา 1 นาที annealing ที่ 57 องศาเซลเซียส เวลา 1 นาที และ extension ที่ 72 องศาเซลเซียส เวลา 1 นาที 30 วินาที สุดท้ายนาไป final extension ที่ 72 องศาเซลเซียส เวลา 7 นาที (ดัดแปลงจาก Alam et al. (2016))

เนื่องจากตวั อยา่ งแมลงวนั ท้งั 3 ระยะมีขนาดเล็ก ประกอบกบั ระยะห่างระหวา่ งการเกบ็ ตวั อยา่ งกบั การจา แนกตวั อยา่ งดว้ ยเทคนิคทางอณูชีววทิ ยาคอ่ นขา้ งนานทาให้ DNA ของตวั อยา่ งอาจ เสื่อมคุณภาพจนไมส่ ามารถตรวจสอบขนาดของ PCR product ได้จึงเพ่ิมปริมาณ DNA ของ PCR 37

product ดงั กล่าวด้วยเทคนิค Semi-Nested PCR ใช้ forward primer เส้นเดียวกบั เทคนิค PCR แต่ ออกแบบเส้น reverse primer ข้ึนใหมโดย่ คัดลา ดบั นิวคลีโอไทดข์ องตวั อยา่ งที่แสดงผลจากเทคนิค PCR ข้างต้นเปรียบเทียบร่วมกบั ลา ดบั นิวคลีโอไทดข์ องยนี COI ของ M. scalaris ในฐานข้อมูล GenBank (accession no. AB907181.1 JQ941746.1 KC407773.1 KU949579.1 KX266963.1 - KX266968.1 KX832630.1 - KX832638.1) เพื่อเลือกหาช่วงลา ดบั นิวคลีโอไทดท์ ี่เหมาะสมสา หรับ สร้าง primer ใหแ้ สดงความจา เพาะตอ่ ชนิดของตวั อยา่ งมากข้ึน ผลได้ reverse primer เส้นใหมค่ ือ 5´- AAT GAT GTA TTA AAA TTT CG -3´ เพ่ิมปริมาณ DNA ภายใต้สภาวะเหมาะสมไดแ้ ก่ initial denaturation ที่ 95 องศาเซลเซียส เวลา 2 นาที ตามด้วย amplification อยา่ งละ 30 รอบประกอบด้วย denaturation ที่ 95 องศาเซลเซียส เวลา 2 นาที annealing ที่ 57 องศาเซลเซียส เวลา 1 นาที และ extension ที่ 72 องศาเซลเซียส เวลา 1 นาที สุดท้ายนาไป final extension ที่ 72 องศาเซลเซียส เวลา 5 นาที ตรวจสอบขนาดของ Semi-Nested PCR product ตอ่ ไป

การตรวจสอบขนาดของ PCR product ของยีน COI

ตรวจสอบขนาดของ PCR product ของยีน COI ที่ได้ด้วยวิธี agarose gel electrophoresis เร่ิม เตรียม gel สาหรับรัน PCR product โดยใช้วุ้น agarose ความเข้มข้นร้อยละ 1.5 ละลายด้วย 1X TAE buffer ตามปริมาตรของถาดวุน้ อุ่นในตู้ไมโครเวฟ 3 นาทีจนสารละลายวุ้นใส เทลงถาดซ่ึงใส่แถบซี่ ฟันสร้างช่องหยอดสาร ต้งั ทิ้งไวใ้ หว้ นุ้ แขง็ ตวั จากน้นั ใส่วุ้นในอา่ งบรรจุ 1X TAE buffer ของเครื่อง รัน gel ผสม PCR product กบั loading buffer ด้วยไมโครปิเปตหยอดลงในช่องวนุ้ จนครบทุกตวั อยา่ ง ช่องวนุ้ ที่เหลือใส่ negative control positive control และ DNA marker ขนาด 100 bp ตามลา ดบั ต้งั คา่ รัน gel ดว้ ยความตา่ งศกั ยไฟฟ้า์ 100 โวลต์ประมาณ 35 - 40 นาที สุดท้ายแช่ gel ที่ได้ในสารละลาย ethidium bromide เวลา 10 นาที ลา้ งดว้ ยน้า กลน่ั 3 คร้ัง บันทึกภาพ gel ด้วยเครื่องถ่ายรูป gel documentation รุ่น Gel DocTM XR (Bio-Rad®, USA) โดยคาดวา่ PCR product มีขนาดประมาณ 600 - 700 bp เมื่อเทียบกบั แถบ DNA marker ขนาด 100 bp ส่วน Semi-Nested PCR product มีขนาด ประมาณ 500 - 600 bp นา DNA ที่ได้เขา้ สู่กระบวนการเชื่อมต่อกบั DNA พาหะตอ่ ไป

38

การสร้างพลาสมิด DNA ลูกผสม

นา PCR product ที่เพ่ิมจา นวนแลว้ มาสร้างพลาสมิด DNA ลูกผสม (recombinant DNA) โดยเชื่อมกบั DNA พาหะชนิด pGEM®-T easy (Promega, USA) ด้วยวิธี DNA ligation โดยใช้ Rapid DNA ligation kit (Promega) ผสมสารส่วนประกอบเขา้ ดว้ ยกนั ไดแ้ ก่ 2x Rapid ligation buffer ปริมาตร 2.5 ไมโครลิตร pGEM®-T easy vector ปริมาตร 0.5 ไมโครลิตร T4 ligase enzyme ปริมาตร 0.5 ไมโครลิตร และ PCR product ปริมาตร 1.5 ไมโครลิตร บม่ ที่อุณหภูมิหอ้ ง 1 ชว่ั โมง ถ่ายโอน (transform) พลาสมิด DNA ลูกผสมที่ไดเ้ ขา้ สู่ competent cell ของแบคทีเรีย Escherichia coli สาย พันธุ์ DH5α โดยวิธีกระตุ้นด้วยความร้อน (heat shock) นา มาเล้ียงบนจานเพาะเล้ียงเช้ือที่ ประกอบด้วย Luria-Bertani (LB) agar 50 μg/mL Ampicillin 100 mM IPTG และ 50 μg/mL X-Gal บม่ ไวท้ ี่ 37 องศาเซลเซียสประมาณ 16 ชว่ั โมง เขี่ยเช้ือคดั เลือก colony ที่มีสีขาวตวั อยา่ งละ 10 โคโลนี (colony) มาเล้ียงบนจานเพาะเล้ียงเช้ือที่ 37 องศาเซลเซียส นาน 5 ชว่ั โมง พร้อมทดสอบโดย เทคนิค colony PCR ดว้ ยสารและสภาวะเช่นเดียวกบั ข้นั ตอนการเพ่ิมปริมาณยนี COI แตใ่ ช ้ colony ของแบคทีเรียแทน DNA ต้นแบบ เลือกเขี่ย colony ที่แสดงผล colony PCR product แยกใส่ในหลอด

อาหารเหลว LB ที่มี 50 μg/mL Ampicillin บม่ ที่ 37 องศาเซลเซียสจานวน 200 รอบตอ่ นาทีเป็นเวลา 16 ชว่ั โมง สกดั พลาสมิด DNA ลูกผสมดว้ ยชุดสกดั QIA Spin Miniprep Kit (QIAGEN) คัดเลือก พลาสมิด DNA ลูกผสมซึ่งมีชิ้นส่วน DNA ที่สนใจเพื่อนา ไปวเิ คราะห์หาลา ดบั นิวคลีโอไทดต์ ่อไป

การวิเคราะห์ลาดับนิวคลีโอไทด์

นาพลาสมิด DNA ลูกผสมที่มีชิ้นส่วน DNA ที่สนใจตวั อยา่ งละ 2 โคลนมาหาลาดับนิวคลี โอไทด์จากการตรวจวิเคราะห์ของบริษัท Macrogen Inc. ประเทศเกาหลีใต้ โดยตวั อยา่ งที่ส่งมีความ เข้มข้นของพลาสมิด DNA อยา่ งนอ้ ย 100-150 ไมโครกรัม/ไมโครลิตร และปริมาตรอยา่ งนอ้ ย 10 ไมโครลิตร แสดงผลในรูปกราฟ chromatogram ด้วยโปรแกรม BioEdit Sequence Alignment Editor Program Version 7.1.9. (http://www.mbio.ncsu.edu.bioedit) (Hall, 1999) ตดั ส่วนพาหะออกท้งั ด้าน หัวและท้ายของยีน COI บันทึกในรูปแบบ fasta format ในโปรแกรม notepad นาล าดับนิวคลีโอไทด์ ที่ได้มาวิเคราะห์เปรียบเทียบความเหมือนหรือคลา้ ยคลึงกบั ลา ดบั นิวคลีโอไทดข์ องแมลงวนั วงศ ์ 39

Phoridae จากฐานข้อมูล National Center for Biotechnology Information (NCBI หรือ GenBank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) ด้วยโปรแกรม nucleotide blast (BLASTN) แสดงผลเป็นคา่ ร้อยละ ความเหมือนหรือความคล้ายคลึง (percentage identities) จากน้นั เปรียบเทียบ (alignment) หาคา่ ร้อย ละความเหมือนภายในชนิดเดียวกนั (percentage identity matrix) กบั ร้อยละความแตกตา่ งภายใน ชนิดเดียวกนั (percentage intraspecific variations) ของแตล่ ะตวั อยา่ งดว้ ยชุดคา ส่ัง clustal W ใน โปรแกรม BioEdit Sequence Alignment Editor Program Version 7.1.9. ตอ่ ไป

การสร้างและวิเคราะห์แผนภูมิวิวัฒนาการ (phylogenetic tree)

นาข้อมูลล าดับนิวคลีโอไทด์ของยีน COI ของแมลงวันตัวเบียนปลวกมาสร้างแผนภูมิ วิวัฒนาการ (phylogenetic tree) โดยเปรียบเทียบกบั ลา ดบั นิวคลีโอไทดข์ องยนี COI (reference sequence) ของแมลงชนิดเดียวกนั และแมลงวันชนิดอื่นที่มีรายงานในฐานข้อมูล GenBank ด้วย โปรแกรม Molecular Evolutionary Genetics Analysis version X (MEGAX) (Kumar et al., 2018) ใช้มอดแป้ง Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) accession no. KU913057.1 เป็น out group เปรียบเทียบ เตรียมยื่นขอเลขทะเบียนลาดับนิวคลีโอไทด์ (accession number) ที่ได้ด้วย โปรแกรมออนไลน์ Banklt เพื่อเพ่ิมและเผยแพร่ขอ้ มูลลา ดบั นิวคลีโอไทดข์ องยนี COI ของตวั อยา่ ง แมลงวันเบียนปลวกจากประเทศไทยลงฐานข้อมูล GenBank ตอ่ ไป

40

ผลและวิจารณ์การทดลอง

การเก็บตัวอย่างปลวกและทดสอบพฤติกรรมดุร้าย

ผลสารวจพบจอมปลวกสกุล Macrotermes จานวน 75 จอมกระจายตวั อยหู่ ลายพ้ืนที่ของ มหาวทิ ยาลยั เกษตรศาสตร์ วิทยาเขตกา แพงแสน พ้ืนที่ 7,951.75 ไร่ ซึ่งประกอบด้วยสภาพแวดล้อม และการจัดการหลากหลาย ส่วนที่กระจายตัวมากสุดคือดงต้นไม้ต้งั แตอ่ ุทยานแมลงเฉลิมพระเกียรติ ฯ กลุ่มอาคารของภาควิชากีฏวทิ ยา คณะเกษตร กา แพงแสนถึงรอบอา่ งเกบ็ น้า บ่อ 1 รองลงมาคือรอบ พ้ืนที่เพาะปลูกทางการเกษตรบางส่วนของศูนย์วิจัยและพัฒนาพืชผักเขตร้อน ภาควิชาพืชสวน คณะ เกษตร กา แพงแสน จอมอื่นกระจดั กระจายในพ้ืนที่หลากหลายรูปแบบ โดยเฉพาะสภาพก่ึง ธรรมชาติที่ถูกเปลี่ยนเป็นพ้ืนที่กิจกรรมใชป้ ระโยชน์ของมนุษย ์ แตค่ อ่ นขา้ งเงียบสงบส่ิงรบกวน น้อย ท้งั ดงต้นไม้ พ้ืนที่ทางการเกษตร ประมง รอบแปลงผัก สวนผลไม้ คลองชลประทาน พ้ืนที่ กิจกรรม อาคาร สอดคล้องตามรายงานของยุพาพร และ สุรางค์ (2548) กบั อิสระ (2530) ไมพ่ บปลวก สกุล Macrotermes เฉพาะบางพ้ืนที่เทา่ น้นั คือพ้ืนที่ทุง่ หญา้ เล้ียงสัตวต์ ้งั แตป่ ระตูพระแทน่ ภาควชิ า สัตวบาล จนถึงบางส่วนของภาควชิ าพืชสวน บริเวณดงั กล่าวมีแหล่งความช้ืนนอ้ ย ไมพ่ บการร่วง หล่นของก่ิงไมใ้ บไมซ้ ่ึงเป็นแหล่งอาหารของปลวกกลุ่มน้ี แผนที่การกระจายตัวของปลวกแสดงดัง ภาพที่ 2

สุ่มขดุ จอมปลวกจานวน 25 จอม (ร้อยละ 33.33) จากที่พบท้งั หมด 75 จอม เกบปลวกทหาร็ ขนาดใหญ่และปลวกทหารขนาดเล็กต้งั แต ่ 50 - 300 และ 100 - 500 ตวั ตอ่ จอม ตามลา ดบั ข้ึนกบั จานวน ปลวกของแตล่ ะจอม จอมที่เกบ็ ตวั อยา่ งไดน้ อ้ ยประมาณ 50 – 100 ตวั ตอ่ จอมเป็นจอมที่ถูก ขดุ ทา ลายมาก่อน ผลการจาแนกชนิดด้วยลักษณะจอมปลวกและ ลักษณะทางสัณฐานวิทยาปลวก ทหารขนาดใหญ ่ พบวา่ ปลวกทุกจอมคือปลวก Macrotermes gilvus

41

ภาพที่ 2 แผนที่แสดงการกระจายตัวของจอมปลวก Macrotermes gilvus (วงกลมสีเหลือง) ปลวก ปกติ (วงกลมสีแดง) ปลวกถูกเบียน

ลักษณะจอมปลวก M. gilvus (ภาพที่ 3) รูปทรงคล้ายระฆังคว่า ฐานกว้าง ยอดรูปกรวย ขนาดคอ่ นขา้ งหลากหลาย สีน้า ตาลเหลืองหรือสีเดียวกบั สีดินบริเวณรอบจอม ดินส่วนนอกรัง เหนียวแข็งอดั ตวั กนั แน่น ส่วนดินภายในถึงกลางรังค่อนขา้ งช้ืนออ่ นนุ่มเรียงเป็นช้นั ๆ ระหวา่ งช้นั พบ fungus comb กระจายอยคู่ อ่ นขา้ งหนาแน่น (ภาพที่ 4A) ลักษณะ fungus comb เป็นกอ้ นแขง็ ดา้ นบนปรากฏร่องยาวลึกไมห่ นามาก ตามร่องพบตุม่ กอ้ นราสีขาวเม็ดเล็ก ๆ (mycotêtes) กระจาย ทว่ั ไป ดา้ นล่างโคง้ นูน (ภาพที่ 4B) ต้งั อยภู่ ายในช่อง พ้ืนผวิ ดา้ นบนของช่องคอ่ นขา้ งเรียบมีรูเล็ก ๆ สา หรับเป็นทางเดินของปลวก ไมพ่ บรูทางเข้าออกหรือรูถ่ายเทอากาศบริเวณรอบจอม นอกจากน้ี บริเวณรอบขอบจอมมักพบปลวกเพาะเล้ียงเห็ดราชนิดอื่นสร้าง fungus comb ที่ต้งั ของทุกจอมอยู่ บริเวณโคนหรือใตร้ ่มเงาของไม้ยืนต้นถูกหญา้ ปกคลุมหนาทึบ อาจอยใู่ นสภาพแวดลอ้ มแหง้ แลง้ อากาศร้อน แสงแดดส่องถึงมาก หรือสภาพป่ารกมืดทึบ แสงแดดส่องถึงนอ้ ย ความช้ืนสูงสอดคล้อง ตามรายงานของอิสระ (2530) 42

ภาพที่ 3 ลักษณะภายนอกของจอมปลวก Macrotermes gilvus

ภาพที่ 4 จอมปลวก Macrotermes gilvus (4A) สภาพภายในจอมขณะขุด (4B) fungus comb

43

ลักษณะทางสัณฐานวิทยาสาคัญ ของปลวกทหารขนาดใหญ ่ M. gilvus ไดแ้ ก่ ส่วนหวั รูป สี่เหลี่ยมผืนผ้าสีน้า ตาลแดงหรือน้า ตาลเหลือง ขอบดา้ นขา้ งนูนออก ฐานโคง้ เขา้ หากนั เล็กนอ้ ย ก่ึงกลางหวั กวา้ งมากที่สุด รูเปิดดา้ นบนหวั (fontanelle) เล็กสีน้า ตาลแดงออ่ น หวั ส่วนบนสีเขม้ กวา่ มีขนออ่ นเล็กนอ้ ย ไมพ่ บขนที่ส่วนอื่น (ภาพที่ 5) ริมฝีปากบน (labrum) คล้ายสามเหลี่ยม ฐานแตล่ ะ ขา้ งมน ความยาวมากกวา่ ความกวา้ งเล็กนอ้ ย ดา้ นขา้ งมีขนแขง็ (bristle) เรียงเป็นแถวข้างละ 1 แถว ปลายยอดเล็กไมแ่ หลมคล้ายใบพาย 3 อัน เยื่อหุ้มปลาย (hyaline tip) ใสคล้ายสามเหลี่ยม โคนฐานมี ขนแข็งเล็กน้อยประปราย (ภาพที่ 6A) กรามใหญ่ส้ันฐานหนา ส่วนปลายโคง้ ข้ึนเล็กนอ้ ยสีน้า ตาล แดงเขม้ ส่วนฐานสีอ่อนกวา่ ส่วนปลาย ฐานกรามซา้ ยมีตุ่มหรือรอยหยกั เล็ก ๆ ขณะที่กรามขวาไมม่ ี (ภาพที่ 6B) ฐานริมฝีปากล่าง (postmentum) ยาว ส่วนปลายกวา้ งที่สุด ส่วนกลางแคบที่สุด และขอบ ดา้ นขา้ งเวา้ เขา้ มา ส่วนฐานนูนออก (ภาพที่ 6D) หนวด 17 ปล้องสีน้า ตาล ส่วนปลายของแตล่ ะปลอ้ ง คอ่ นขา้ งซีด ปลอ้ งที่ 3 ยาวกวา่ ปลอ้ งที่ 2 ประมาณ 3/2 หรือ 1 เทา่ คร่ึง และปล้องที่ 4 ส้ันกวา่ ปลอ้ งที่ 3 (ภาพที่ 6C) อกปล้องแรก (pronotum) รูปอานม้า กลางขอบด้านบนและดา้ นล่างเวา้ เขา้ ไปชดั เจน ขอบดา้ นบนมีขนออ่ นส้ัน ๆ ส่วนขอบดานข้างกว้าง้ กลมมนแป้น ความกวา้ งมากกวา่ ความยาว ชดั เจน ขอบดา้ นล่างของอกปลอ้ งที่ 2 (mesonotum) กบั อกปล้องที่ 3 (metanotum) โค้งนูน เว้าเข้า ตรงกลาง ขอบด้านข้างกว้างกลมมนแป้นเช่นเดียวกบั pronotum (ภาพที่ 6E) ปลวกทุกตัวมีลักษณะ ทางสัณฐานวิทยาปกติ ไม่พบปลวกมีส่วนหวั เป็นทรงกลมหรือสี่เหลี่ยมจัตุรัส ขนาดกรามและ จานวนปล้องหนวดปกติ

44

ภาพที่ 5 ด้านบน (dorsal view) ส่วนหวั ของปลวกทหารขนาดใหญ่ Macrotermes gilvus

ภาพที่ 6 ลักษณะทางสัณฐานวิทยาสาคัญ ของปลวกทหารขนาดใหญ ่ Macrotermes gilvus (6A) ริมฝีปากบนและเยื่อหุ้มปลาย (6B) กราม (6C) หนวด (6D) ฐานริมฝีปากล่าง (postmentum) (6E) แผน่ แขง็ ดา้ นบนส่วนอก (notum) 45

ผลการทดสอบพฤติกรรมดุร้ายของปลวกทหารจากการสังเกตขณะขุดจอมปลวกและใช้ ปากคีบรบกวนปลวกแบง่ ปลวกได ้ 2 กลุ่มคือ ปลวกแสดงพฤติกรรมดุร้ายกบั ปลวกไมแ่ สดง พฤติกรรมดุร้าย โดยปลวกพฤติกรรมดุร้าย ท้งั ปลวกทหารขนาดใหญแ่ ละปลวกทหารขนาดเล็กเดิน เร็วออกมาตอ่ สู้ปกป้องรังจานวนมาก ทันทีที่จอมปลวกถูกทาลาย รุมกดั ศตั รูไมป่ ล่อย เมื่อรบกวน ปลวกด้วยปากคีบจะแสดงอาการสู้ตอบโต้ชัดเจน ในขณะที่ปลวกไมด่ ุร้ายคอ่ นขา้ งสงบน่ิงเชื่องช้า ไมอ่ อกมาปกป้องรังขณะจอมถูกทาลาย เมื่อทดสอบรบกวนปลวกไมแ่ สดงอาการตอ่ ตา้ นหรือแสดง อาการน้อย ผลทดสอบพบจอมปลวกที่สมาชิกส่วนใหญ่แสดงพฤติกรรมดุร้าย 22 จอมมีจอมที่ สมาชิกถูกเบียน 3 จอม ส่วนจอมปลวกที่สมาชิกส่วนใหญ่ไมแ่ สดงพฤติกรรมดุร้ายพบ 3 จอมมีจอม ที่สมาชิกถูกเบียน 1 จอม ปลวกถูกเบียนทุกตวั ไมแ่ สดงพฤติกรรมดุร้ายหรือแสดงในระดับต่า แตพ่ บ ปลวกปกติไมด่ ุร้ายเช่นกนั ทา ใหไ้ มส่ ามารถใชพ้ ฤติกรรมความดุร้ายสา หรับจา แนกไดอ้ ยา่ งชดั เจน

การเก็บตัวอย่างแมลงวันตัวเบียนปลวก

ผลการสุ่มเกบ็ ปลวก 25 จอมจากสภาพแวดล้อมหลากหลาย พบปลวกถูกเบียน 4 จอม (ร้อย ละ 16) โดย 3 จอมแรกขุดจอมละ 2 คร้ัง แตล่ ะคร้ังห่างกนั 1 สัปดาห์ จอมที่ 4 ขุด 1 คร้ัง เกบ็ ตวั อยา่ ง หนอนได้จากท้งั 4 จอม ดักแด้จาก 2 จอม และแมลงวันตัวเต็มวัยจาก 3 จอม จอมที่พบปลวกสมาชิก ถูกเบียนท้งั 4 จอม (ภาพที่ 7) ต้งั อยบู่ ริเวณความช้ืนสูงใกลแ้ หล่งน้า ดินช้ืนแฉะ แสงแดดส่องถึงนอ้ ย มี 1 จอมขนาดสูงใหญ่ผนังหนา (ภาพที่ 7B) 2 จอมเดิมขนาดสูงใหญแ่ ตถ่ ูกขดุ ทา ลายก่อนการสา รวจ เกบ็ ตวั อยา่ ง (ภาพที่ 7A และ 7C) สอดคล้องตามรายงานของ Foo et al. (2011b) และ Neoh and Lee (2010) ขณะที่อีก 1 จอมขนาดเล็กไมส่ ูง (ภาพที่ 7D)

ตา แหน่งของจอมปลวกถูกเบียน (ภาพที่ 2) จอมที่ 1 (ภาพที่ 7A) อยบริเวณู่ ข้างพงไม้ติดริม ถนนเลียบคลองชลประทาน อา่ งเกบ็ น้า บ่อ 1 สภาพถูกขุดทาลาย จนเป็นหลุมมาก่อน เก็บแมลงวันได้ ท้งั 3 ระยะ จอมที่ 2 (ภาพที่ 7B) จอมสูงใหญ่อยโคนู่ ต้นขนุนติดคลองขนาดเล็กด้านหลังศูนย์ความ เป็นเลิศทางวิชาการด้านไหม ภาควชิ ากีฏวทิ ยา คณะเกษตร กา แพงแสน เกบแมลงวัน็ ได้ 3 ระยะ จอม ที่ 3 (ภาพที่ 7C) อยใู่ ตร้ ่มเงาไม้ยืนต้นมีวัชพืชปกคลุมใกล้แปลงปลูกพืชข้างเรือนปฏิบตั ิการกีฏวทิ ยา 46

ภาควชิ ากีฏวทิ ยา คณะเกษตร กา แพงแสน สภาพถูกขดุ ทา ลายเหลือแตฐ่ านมาก่อน เกบ็ ตวั อยา่ งได ้ 2 ระยะคือ หนอนกบั ตัวเต็มวัย จอมที่ 4 (ภาพที่ 7D) ขนาดเล็กอยใู่ ตร้ ่มเงาไมย้ นื ตน้ ด้านหลังอุทยาน แมลงเฉลิมพระเกียรติฯ เก็บไดเ้ ฉพาะระยะหนอน จานวน ตวั อยา่ งแตล่ ะระยะจากแตล่ ะจอมก่อน หนอนเข้าดักแด้ซึ่งเป็นจานวนที่พบ เบ้ืองตน้ จากการสารวจ แสดงในตารางที่ 3 ส่วนจา นวนตวั อยา่ ง แตล่ ะระยะจากแตล่ ะจอมหลงั หนอนเขา้ ดกั แดซ้ ่ึงเป็นจา นวนตวั อยา่ งที่เกบ็ รักษาและนา มาจา แนก ชนิดแสดงในตารางที่ 4 อยา่ งไรกต็ าม Braga et al. (2015) กล่าวถึงความจา เป็นของการเกบ็ ตวั อยา่ ง ส่ิงมีชีวติ แตล่ ะชนิดจากหลายพ้ืนที่ที่แตกตา่ งกนั ดงั น้นั ในอนาคตควรขยายขอบเขตเพ่ิมจา นวน สถานที่สารวจเป็นระดับภูมิภาค หรือระดับประเทศเพื่อใหไ้ ดข้ อ้ มูลรอบดา้ นมากข้ึน

ภาพที่ 7 จอมปลวกที่สมาชิกถูกแมลงวันเบียน (7A) จอม 1 (7B) จอม 2 (7C) จอม 3 (7D) จอม 4

47

ตารางที่ 3 จานวน ตวั อยา่ งแมลงวันตัวเบียน 3 ระยะจากจอมปลวก 4 จอมก่อนหนอนเข้าดักแด้

จ านวนตัวอย่าง (ตัว) ระยะ จอมที่ 1 2 3 4 รวม ขุดคร้ังที่ 1 2 1 2 1 2 1 หนอน 58 15 154 2 3 1 6 239 ดักแด้ - - 23 1 - - - 24 ตัวเต็มวัย 2 - 68 - - 5 - 75

ตารางที่ 4 จา นวนตวั อยา่ งแมลงวนั ตัวเบียน 3 ระยะจากจอมปลวก 4 จอมหลังหนอนเข้าดักแด้

จ านวนตัวอย่าง (ตัว) ระยะ จอมที่ 1 2 3 4 รวม ขุดคร้ังที่ 1 2 1 2 1 2 1 หนอน 54 10 96 2 3 1 6 172 ดักแด้ 4 5 81 1 - - - 91 ตัวเต็มวัย 2 - 68 - - 5 - 75

ปลวกทหารถูกเบียนท้งั หมด 236 ตัวแบง่ ตามระยะของแมลงวันที่พบภายในตัวปลวกคือ ปลวกที่พบหนอน 235 ตัว (ร้อยละ 99.58) และพบดักแด้ 1 ตัว (ร้อยละ 0.42) เมื่อแบ่งตามจา นวน หนอนแมลงวนั ตวั เบียนตอ่ ปลวก 1 ตัวพบหนอนแมลงวันเป็นตัวเบียนเดี่ยว (solitary) ของปลวก ทหาร 235 ตัว (ร้อยละ 99.58) โดยมีปลวกทหารขนาดใหญ่เพียง 1 ตัว (ร้อยละ 0.42) ที่ถูกหนอน เบียนแบบกลุ่ม (gregarious) 5 ตัวภายในหัว (ภาพที่ 8) ส่วนการแบง่ ตามสัณฐานวิทยาของปลวกที่ ถูกเบียนไดแ้ ก่ ปลวกทหารขนาดใหญถูกเบียน่ 233 ตัว (ร้อยละ 98.73) กบั ปลวกทหารขนาดเล็กถูก เบียน 3 ตัว (ร้อยละ 1.27) โดยปลวกทหารขนาดเล็กพบท้งั หนอนอยภายในหัวปลวกู่ (ภาพที่ 9) และ หนอนเจาะออกมาจากท้องปลวก (ภาพที่ 10) สรุปผลจานวนปลวกถูกเบียนดังภาพที่ 11 48

ภาพที่ 8 ปลวกทหารขนาดใหญ ่ Macrotermes gilvus พบหนอนแมลงวันเบียน 5 ตัวภายใน 1 หัว

ภาพที่ 9 ปลวกทหารขนาดเล็ก Macrotermes gilvus พบหนอนแมลงวันเบียนภายในหัว

49

ภาพที่ 10 หนอนแมลงวัน (ในวงกลม) เจาะออกจากส่วนทอ้ งของปลวกทหารขนาดเล็ก

ภาพที่ 11 แผนผังสรุปจานวนปลวกทหารที่พบแมลงวันเบียนอาศัย

ผลแสดงใหเ้ ห็นวา่ หนอนตัวเบียนที่พบมีความสามารถการเบียนหลากหลาย สามารถเบียน ไดท้ ้งั ปลวกทหารขนาดใหญ่กบั ปลวกทหารขนาดเล็กโดยไมถ่ ูกจา กดั ดว้ ยขนาดของ host จึงอาจ พัฒนาให้เข้าเบียนปลวกงานซึ่งมีขนาดเล็กได้ ส่วนใหญเ่ ป็นการเบียนเดี่ยวทาให้ มีโอกาสที่หนอน หลายตวั แก่งแยง่ host เพียง 1 ตัวต่า จึงค่อนขา้ งเหมาะตอ่ การศึกษาเพื่อนา มาใชค้ วบคุมทางชีววทิ ยา ในอนาคต ส่วนจา นวนปลวกทหารที่เกบ็ ท้งั หมด ปลวกทหารถูกเบียนร้อยละการเบียนปลวกแตล่ ะ จอมแสดงในตารางที่ 5 50

ตารางที่ 5 จานวนปลวกทหารถูกเบียนและ ร้อยละการเบียนจากจอมปลวก 4 จอม

จ านวนปลวก จ านวนปลวกถูกเบียน ร้อยละ จอมที่ ขุดคร้ังที่ ปลวกทหาร (ตัว) (ตัว) การเบียน ขนาดใหญ่ 94 54 57.45 1 ขนาดเล็ก 153 - - 1 ขนาดใหญ่ 59 13 22.03 2 ขนาดเล็ก 312 2 0.64 ขนาดใหญ่ 270 154 57.04 1 2 ขนาดเล็ก 458 - - ขนาดใหญ่ 61 3 4.92 2 ขนาดเล็ก 331 - - ขนาดใหญ่ 290 2 0.69 1 3 ขนาดเล็ก 490 1 0.20 ขนาดใหญ่ 60 1 1.67 2 ขนาดเล็ก 350 - - 4 ขนาดใหญ่ 172 6 3.49 1 ขนาดเล็ก 356 - -

จากตารางที่ 5 กรณีปลวกทหารขนาดใหญถ่ ูกเบียนพบวา่ จอมที่ขุด 2 คร้ังมีการขดุ คร้ังที่ 1 เกบ็ ตวั อยา่ งปลวกทหารขนาดใหญแ่ ละพบปลวกถูกเบียนจานวน มากกวา่ การขุดคร้ังที่ 2 เมื่อคิดเป็น คา่ ร้อยละ การขุดจอมที่ 1 กบั 2 คร้ังที่ 1 (ร้อยละ 57.45 กบั 57.04 ตามลาดับ) พบร้อยละการเบียน มากกวา่ ขดุ คร้ังที่ 2 (ร้อยละ 22.03 กบั 4.92 ตามลาดับ) ยกเว้นจอมที่ 3 ร้อยละการเบียนจากการขุด คร้ังที่ 2 (ร้อยละ 1.67) มากกวา่ คร้ังที่ 1 (ร้อยละ 0.69) เล็กน้อย เนื่องจากการขุด 2 คร้ังตา่ งกนั เพียง 1 สัปดาห์ทาให้ ระยะเวลาไมเ่ พียงพอสา หรับแมลงวันปรับตัวเข้าเบียนปลวกทา ใหเ้ กบ็ ไดเ้ พียงตวั อยา่ ง หนอนเบียนปลวกที่หลงเหลือจากการขดุ คร้ังที่ 1 เทา่ น้นั โดยไมเ่ กิดการเบียนคร้ังใหม่ ส่วนปลวก ทหารขนาดเล็กถูกเบียนพบจาก 2 จอมคือจอมที่ 1 และ 3 ซ่ึงถูกขดุ ทา ลายมาก่อนการเกบ็ ตวั อยา่ ง 51

โดยจอมที่ 1 จานวนปลวกถูกเบียน และร้อยละการเบียน (2 ตัว คิดเป็นร้อยละ 0.64) มากกวา่ จอมที่ 3 (1 ตัว คิดเป็นร้อยละ 0.20)

สุ่มวดั ขนาดหวั ปลวกทหารขนาดใหญถ่ ูกเบียน 35 ตัวมีความกว้างสูงสุดประมาณ 3.38 – 3.50 มิลลิเมตร ความยาวถึงด้านข้างกรามประมาณ 3.50 – 4.40 มิลลิเมตร ขณะที่ปลวกทหารขนาด ใหญป่ กติมีความกว้างสูงสุดประมาณ 2.40 - 3.34 มิลลิเมตร ความยาวถึงด้านข้างกรามประมาณ 3.34 – 4.46 มิลลิเมตร ปลวกทหาร M. gilvus ถูกเบียนทุกตัวไมเ่ กิดความผดิ ปกติที่รูปทรงหวั แตกตา่ งจาก รายงานของ Foo et al. (2011a) กบั Neoh and Lee (2010) แตพ่ บวา่ กลา้ มเน้ือกบั อวัยวะภายในส่วน หวั ถูกทา ลายจนหมด/เกือบหมดคลา้ ยกรณีแมลงวัน M. scalaris เบียนส่ิงมีชีวติ ชนิดอื่น เช่น มวน เพชฒฆาต (Costa et al., 2007) ตก๊ั แตนตา ขา้ ว (Koch et al., 2013) ซึ่งหนอนกินทา ลายกลา้ มเน้ือกบั อวัยวะภายในช่องอกถึงช่องทอ้ งทาให้ host เคลื่อนไหวช้าหรือไม่เคลื่อนที่

เกบ็ ตวั อยา่ งหนอนแมลงวนั เบียนท้งั หมด 239 ตัวจากปลวก 235 ตัว จาแนก หนอนตาม วิธีการค้นพบไดแ้ ก่ วธิ ีที่ 1 หนอน 226 ตัว (ร้อยละ 94.56) ออกมาจากส่วนหวั หรือท้องของปลวก ทหารขนาดใหญท่ ี่ตาย/ใกลต้ าย จากน้นั แยกหนอนบางส่วน 171 ตัวสาหรับ เข้าดักแด้ เกบ็ หนอนที่ เหลือ 55 ตัวลงในแอลกอฮอล์เข้มข้นร้อยละ 75 ส่วนวธิ ีที่ 2 พบหนอน 13 ตัว (ร้อยละ 5.44) จากการ ใชป้ ากคีบ มีดผา่ เขม็ ฉีดยาผา่ หวั ปลวกทหารที่ไมพ่ บหนอนจากวธิ ีที่ 1 จานวนหนอนจากจอมที่ 1 - 4 คือ 2 3 2 และ 6 ตัวตามลา ดบั สรุปผลการเกบ็ ตวั อยา่ งแสดงดงั ภาพที่ 12

52

ภาพที่ 12 แผนผังสรุปผลการเกบ็ ตวั อยา่ งหนอนและดักแด้แมลงวันเบียนปลวก

ตวั อยา่ งดกั แดรวม้ ท้งั หมด 91 ตัวอยา่ งจากจอมที่ 1 กบั 2 จา แนกตามวธิ ีการเกบ็ ได ้ 3 วิธี วิธี ที่ 1 แยกหนอน 171 ตัวใส่ขวดแกว้ ปิดผา้ ขาวบาง หนอนเปลี่ยนสัณฐาน (metamorphosis) ช่วง 24 ชว่ั โมงหลังออกจากตัวปลวก โดยเข้าดกั แดอ้ ยา่ งสมบูรณ์ 67 ตัว (ร้อยละ 73.63) (ภาพที่ 13A) ส่วนที่ เหลือ 104 ตัวชะงักการเปลี่ยนสัณฐานที่ระยะเตรียมเข้าดักแด้ (pre-pupa) (ภาพที่ 13B) อาจเกิดจาก สภาพแวดลอ้ มบางประการไมเ่ หมาะสม เช่น อุณหภูมิ ความช้ืน รวมถึง host ออ่ นแอหรือตายทาให้ หนอนออกมาเขา้ ดกั แดก้ ่อนเวลาเหมาะสม ระยะน้ีจัดอยใู่ นระยะหนอน วิธีที่ 2 พบดักแด้ 1 ตัว (ร้อย ละ 1.10) จากการผา่ ส่วนหวั ของปลวกทหารขนาดใหญ่ 1 ตัว (ภาพที่ 14) และวิธีที่ 3 พบดักแด้ 23 ตัว (ร้อยละ 25.28) ปะปนกบั ดินจอมปลวกที่ 2 สรุปผลการเกบ็ ตวั อยา่ งแสดงดงั ภาพที่ 12

53

ดักแด้ทุกตัวไมส่ ามารถเขา้ สู่ตัวเต็มวัยหลังเล้ียงไว้นาน 30 วัน แตพบ่ แมลงวันวงศ์ Phoridae จานวนหนึ่ง ออกมาจากดินจอมปลวกถูกเบียน 3 จอมแรกหลังขุดจอมปลวก 2 - 4 วัน แมลงวัน ดงั กล่าวเคลื่อนไหวรวดเร็วสลบั กบั หยดุ เกาะพกั เป็นระยะ ๆ คลา้ ยการกระโดด เกบ็ ตวั อยา่ งได้ ท้งั หมด 75 ตัว จา แนกชนิดตวั อยา่ งแมลงวนั ดงั กล่าวเนื่องจากพบดกั แดบ้ างส่วนปะปนกบั ดินจึงมี โอกาสที่หนอนแมลงวันตัวเบียนอาจเข้าดักแด้ภายในดินหรือซากปลวกที่หลงเหลือในดิน และด้วย สภาพดินเหมาะสมทา ใหด้ กั แดพ้ ฒั นาเป็นตวั เตม็ วยั อยา่ งสมบูรณ์

ภาพที่ 13 ตวั อยา่ งจากการแบง่ หนอนบางส่วนเพื่อตรวจสอบวงจรชีวิต (13A) ดักแด้ (13B) หนอน ระยะเตรียมเข้าดักแด้ (pre-pupa)

54

ภาพที่ 14 ดักแด้แมลงวันจากส่วนหวั ของปลวกทหารขนาดใหญ่ (14A) ขณะพบภายในส่วนหวั (14B) ภายหลงั นา ออกจากส่วนหวั

การพบตวั อยา่ งดกั แดแ้ มลงวนั ในหวั ปลวก M. gilvus สอดคล้องกบั กรณีแมลงวนั ตวั เบียน Misotermes mindeni เบียนปลวก M. gilvus ของ Neoh and Lee (2010) ซ่ึงหนอนเขา้ ดกั แดภ้ ายในช่อง ทอ้ งของปลวก จึงสันนิษฐานวา่ เป็นการพฒั นาวงจรชีวติ ที่แทจ้ ริงโดยแมลงวันตัวเบียนที่พบอาจเข้า ดกั แดใ้ นส่วนที่เบียนและไมอ่ อกมานอกตวั ปลวก การพบหนอนออกมาเขา้ ดกั แดเ้ กิดจากปลวก อ่อนแอหรือตายก่อนหนอนจึงออกมาเขา้ ดกั แดก้ ่อนเวลาเหมาะสม ทา ใหก้ ารเล้ียงหนอนเขา้ ดกั แด้ ส่วนใหญไ่ มป่ ระสบผลสา เร็จ และส่วนที่เขา้ ดกั แดส้ า เร็จไมส่ ามารถพฒั นาถึงระยะตวั เตม็ วยั

สุ่มวดั ขนาดหนอนแมลงวนั 45 ตัวมีความกว้างสูงสุดประมาณ 0.30 – 1.20 มิลลิเมตร ความ ยาวประมาณ 1.22 – 4.30 มิลลิเมตร วัดหนอนระยะเตรียมเข้าดักแด้ 100 ตัวพบความกว้างสูงสุด ประมาณ 0.50 – 1.05 มิลลิเมตร ความยาวประมาณ 1.00 – 2.80 มิลลิเมตร และวัดดักแด้ 60 ตัวที่ความ กว้างสูงสุดประมาณ 0.70 – 1.47 มิลลิเมตร ความยาวประมาณ 2.20 - 3.20 มิลลิเมตร 55

การจ าแนกชนิดโดยลักษณะทางสัณฐานวิทยา

ผลการจาแนก ชนิดของตวั อยา่ งแมลงวันตวั เบียนดว้ ยลกั ษณะทางสัณฐานวทิ ยาร่วมกบั ผล ยืนยันชนิดตวั อยา่ งแมลงวัน 3 ระยะ ไดแ้ ก่ หนอน ดักแด้ ตัวเต็มวัยจานวน 7 14 และ 11 ตวั อยา่ ง ตามลาดับ โดย Prof. Dr. Ronald Henry Lambert Disney สรุปวา่ แมลงวันตัวเบียนปลวกทหาร M. gilvus ท้งั 4 จอมคือแมลงวัน Megaselia scalaris

หนอน M. scalaris (ภาพที่ 15 - 20) ลาตัวทรงกระบอกขนาดเล็ก แบนเล็กน้อย แบง่ ตาม ระยะการเจริญเติบโตไดท้ ้งั หมด 3 วัย หนอนวัยที่ 1 (ภาพที่ 15) ขนาดเล็กเรียวยาวสีขาวคอ่ นขา้ ง โปร่งใส ลกั ษณะจา แนกตา่ ง ๆ ยงั ไมป่ รากฏชดั เจน เมื่อเขา้ สู่วยั ที่ 2 (ภาพที่ 16) ลา ตวั เร่ิมใหญ่หนา และสีทึบมากข้ึน วยั ที่ 3 (ภาพที่ 17) ลาตัวทรงกระบอกโดยสมบูรณ์ ทุกวัยส่วนหวั เรียวแหลมแยก จากลา ตวั ไมช่ ดั เจนหรือรวมเขา้ กบั ส่วนลา ตวั ที่เหลือ แตส่ ามารถมองเห็นส่วนปากไดอ้ ยา่ งเด่นชดั (ภาพที่ 19) ท้อง 12 ปล้อง พ้ืนผวิ ดา้ นบนกบั ดา้ นขา้ งลา ตวั ปรากฎส่วนยนื่ (process) ส้ัน ๆ ออกมา ชัดเจน โดยส่วนยนื่ ทางสองข้างลาตัว ต้งั แตอ่ กปลอ้ งที่ 3 จนถึงท้องปล้องสุดท้ายลักษณะคล้ายหนาม (spine) ส้ัน (ภาพที่ 19) ท้องปล้องสุดท้ายปรากฏปุ่มแข็ง (tubercle) สีน้า ตาลยนื่ ออกมาเป็นที่ต้งั ของ รูหายใจท้ายลาตัว (posterior spiracle) โดยช่องเปิดแตล่ ะช่องคอ่ นขา้ งแคบ (ภาพที่ 20A) เมื่อเขา้ สู่ ระยะเตรียมเข้าดักแด้ (pre-pupa) หนอนจะหยดุ การเคลื่อนไหว ช่วงแรกมีสีขาวลา ตวั อ่อนนุ่ม หดตัว ส้ันลงจากทรงกระบอก (ภาพที่ 18A) กลายเป็นรูปไขห่ รือรูปหยดน้า (ภาพที่ 18B) ตอ่ มาสีเร่ิมเขม้ ข้ึน เป็นสีเหลืองเขม้ จนถึงน้า ตาลออ่ น ลาตัวแบน ปลอ้ งลา ตวั บีบอดั กนั แน่น ลกั ษณะคลา้ ยดกั แดม้ ากข้ึน (ภาพที่ 18C)

56

ภาพที่ 15 หนอน Megaselia scalaris วัยที่ 1

ภาพที่ 16 หนอน Megaselia scalaris วัยที่ 2

57

ภาพที่ 17 หนอน Megaselia scalaris วัยที่ 3

ภาพที่ 18 หนอน Megaselia scalaris ระยะเตรียมเข้าดักแด้ (pre-pupa) (18A-18C) เรียงตาม ข้นั ตอนการเปลี่ยนแปลงรูปร่าง

58

ภาพที่ 19 ส่วนหวั ของหนอน Megaselia scalaris (19A) ด้านบน (19B) ดา้ นล่าง

ภาพที่ 20 ส่วนทา้ ยลา ตวั ของหนอน Megaselia scalaris (20A) ด้านบน (20B) ดา้ นล่าง

ดักแด้ M. scalaris (ภาพที่ 21 - 22) ลาตัว ที่แท้จริงรูปไข่ ทรงโดม สีขาวพฒั นาอยภู่ ายใน ปลอกหุม้ รูปไขหรือ่ รูปหยดน้า สีน้า ตาลปนเหลืองคอ่ นขา้ งโปร่งใส แบนบางท้งั ดา้ นบนและด้านล่าง (dorsoventrally flattened) พบหนามเรียวเล็กตามลาตัว รวมท้งั แถวปุ่มแข็งเล็กเรียงท้งั ด้านบนและ 59

ด้านข้าง มี respiratory horn เรียวยาวปลายโค้งยื่นออกมา 1 คู ่ พ้ืนผวิ ปรากฏตุม่ เล็ก ๆ (papillae) จัดเรียงตัวเป็นเกลียว (ภาพที่ 22A) พบท้งั รูหายใจหน้าลาตัว (anterior spiracle) (ภาพที่ 22A) และรู หายใจท้ายลาตัว (ภาพที่ 22B) โดย anterior spiracle ปรากฏเส้นตรงยาวลากออกมาขนานตามยาว ลาตัว ข้างละ 1 เส้น

ภาพที่ 21 ดักแด้ Megaselia scalaris

ภาพที่ 22 ลักษณะจาแนกของดักแด้ Megaselia scalaris (22A) anterior spiracle และ respiratory horn (22B) posterior spiracle

60

แมลงวัน M. scalaris ตัวเต็มวัย (ภาพที่ 23 - 26) จาแนก ในระดับวงศ์ สกุล และชนิด โดย แมลงวันวงศ์ Phoridae ขนาดเล็กหลงั คอ่ ม (humpback) ท้องโค้ง ขายาว ส่วนหวั คอ่ นขา้ งแบน หนวด ปลอ้ งแรกกลมใหญ ่ เพศผู้ (ภาพที่ 23) ขนาดลา ตวั เล็กกวา่ เพศเมีย (ภาพที่ 24) ปีกคูแ่ รกขนาดใหญ่ เส้นปีกปรากฎเส้นตามขวาง humeral (h) (หรือบางรายงานเรียกวา่ เส้น subcosta (Sc)) ชัดเจน ปลาย เส้น radial sector (Rs) แยกเป็นง่าม (ภาพที่ 25) การจาแนกระดับสกุล แมลงวันสกุล Megaselia ตัว เต็มวัย ปีกคูแ่ รกปรากฏเส้น radius (R1) ส่วนเส้น media 4 (M4) ไมโ่ คง้ งอ (ภาพที่ 25) ตุม่ ปีกคูท่ ี่ 2 (halter) สีเหลือง แผน่ แขง็ ดา้ นขา้ งอกปลอ้ งกลาง (mesopleuron) ไมม่ ีเส้นขน (hair) หรือขนแข็งแต่ ปรากฏร่อง (mesopleural furrow) ลากยาวตามขวางจากส่วนทา้ ยของแผน่ แขง็ ดา้ นขา้ งอกปลอ้ งแรก (propleuron) ถึงตรงกลางแผน่ และหกั ศอกลากลงดา้ นล่าง ขาปลอ้ งที่ 4 (tibia) มีขนแข็งอยา่ งนอ้ ย 1 เส้นบริเวณปลายปล้องโดยไมม่ ีขนแขง็ ที่ส่วนอื่นของปลอ้ ง ขาคูห่ ลงั ปล้องที่ 4 พบแผงเส้นขนหนา เรียงเป็นแถวตามสันดา้ นบนอยา่ งนอ้ ย 1 แถวกบั เส้นขนคลา้ ยขนแขง็ (bristle-like hair) เรียงแถว ดา้ นบนส่วนทา้ ยของปล้อง แตไ่ มพ่ บที่ส่วนหนา้

การจาแนกระดับชนิด แมลงวัน M. scalaris ตัวเต็มวัย ปีกคูแ่ รกมีเส้น Rs เล็กแตก่ วา้ งกวา่ เส้น costa (C) (ภาพที่ 25) ส่วนปาก (proboscis) ปกติโดยแผน่ ซบั ดูดอาหาร (labella) ไมข่ ยายใหญ ่ ขา้ งใตแ้ ผน่ มีหนาม (spine) สีซีดประปรายเล็กน้อย ขาคู่หลงั ปล้องที่ 4 ไมพ่ บเส้นขนคลา้ ยหนาม (spine-like hair) เรียงแถวตรงดา้ นบนส่วนหนา้ แตป่ ลอ้ งที่ 3 (femur) ของเพศผพู้ บวา่ เส้นขน 4 – 5 เส้นที่เรียงแถวบริเวณดา้ นล่างของครึ่งฐานส้ันกวา่ เส้นขนที่เรียงแถวบริเวณดา้ นล่างของคร่ึงปลาย รู หายใจของปล้องท้องขนาดปกติไมข่ ยายใหญ ่ ทอ้ งปลอ้ งสุดทา้ ยของเพศผูดัดแปลงเป็นปุ่ม้ (proctiger) เส้นขนปกคลุม โดยเส้นขนคล้ายขนหนาม (seta-like hair) หรือเส้นขนคล้ายขนแข็งเส้น ยาวที่สุดของกลีบบน (epandrium) แตกตา่ งจากเส้นขนอื่นชดั เจน ปุ่มดงั กล่าวเป็นที่ต้งั ของทอ่ ทวาร หนัก (anal tube) ซึ่งปกคลุมด้วยเส้นขน ปลายสุดปรากฏขนแข็งยาวหนา 1 เส้น ประดับด้วยขนเส้น เล็กจา นวนมากแบบพูข่ นนก (feathered bristle) และยาวกวา่ เส้นขนที่ยาวที่สุดของ epandrium (ภาพ ที่ 26A) ทอ้ งของเพศเมีย แผน่ แขง็ ดา้ นบน (tergite) ปล้องที่ 6 ส้ันแผก่ วา้ งออกทางดา้ นขา้ งมาก ส่วน แผน่ แขง็ ดา้ นบนของทอ้ งปลอ้ งที่ 5 แคบกวา่ ของปลอ้ งที่ 3 4 และ 6 (ภาพที่ 26B)

61

ภาพที่ 23 แมลงวันตัวเบียน Megaselia scalaris ตัวเต็มวัยเพศผู้

ภาพที่ 24 แมลงวันตัวเบียน Megaselia scalaris ตัวเต็มวัยเพศเมีย

62

ภาพที่ 25 เส้นปีกแมลงวัน Megaselia scalaris ตัวเต็มวัย คา ยอ่ : C: costa; Sc: subcosta; R: radius; M: media; Cu: cubitus; A: anal; h: humeral; br: 1th basal cell; bm: 2th basal cell; cup: cell cup

ภาพที่ 26 ด้านบนส่วนทอ้ งแมลงวัน Megaselia scalaris ตัวเต็มวัย (26A) เพศผู้ (26B) เพศเมีย

63

Megaselia scalaris เป็นแมลงวนั ชนิดที่พบไดท้ ว่ั ไป (common specie) แพร่กระจายอยทู่ ว่ั โลก หนอนจดั อยใู่ นกลุ่มกินอาหารหลากหลายประเภท (polyphagous) กินซากอินทรียวตั ถุเน่าเปื่อย (saprophagous) กินเน้ือเยอื่ สด (sarcophagous) และกินซากศพ (necrophagous) ของท้งั พืชท้งั สัตว ์ (Costa et al., 2007; Miranda-Miranda et al., 2010) จนถึงมนุษย์ (Feng and Liu, 2012) เดิมพบรายงาน เป็นแมลงร่วมอาศยั ในจอมปลวก (Foo et al., 2011a) รวมท้งจอมปลวกั M. gilvus (Neoh and Lee, 2010) กบั ตัวเบียน/ปรสิตของส่ิงมีชีวติ จา นวนมาก (ตารางที่ 6) แตไ่ มพ่ บเบียนปลวกมาก่อน หลาย กรณีพบในลกั ษณะตวั เบียนกลุ่ม การเบียนบางกรณี เช่น แมลงวนั แมลงสาบ ตก๊ั แตนตา ขา้ ว (Koch et al., 2013) มวนเพชฌฆาต (Costa et al., 2007) เกิดภายใตส้ ภาพหอ้ งปฏิบตั ิการ สันนิษฐานวา่ เกิด จากการรวมกลุ่มของ host หนาแน่นมากเกินไปประกอบกบั สภาพแวดลอ้ มเหมาะสมตอ่ วงจรชีวิต เช่น ความช้ืนสูง ทา ให ้ M. scalaris ที่เกิดตามธรรมชาติบริเวณรอบห้องปฏิบัติการเขา้ รุกรานกลุ่ม ส่ิงมีชีวติ เหล่าน้นั

เนื่องจากหนอน M. scalaris มีขนาดเล็กโปร่งใส อ่อนนุ่มบอบบาง ปราศจากอวยั วะตอ่ สู้ ป้องกนั ตวั ทา ใหป้ ระสิทธิภาพการแขง่ ขนั ระหวา่ งส่ิงมีชีวิตตา่ งชนิด (interspecific competition) เพื่อ แก่งแยง่ ปัจจยั การดา รงชีวติ ภายในบริเวณเดียวกนั ค่อนขา้ งต่า แตม่ ีความสามารถในการปรับตวั เพ่ิม รูปแบบทางเลือกการดารงชีวิตสูง เพื่อหลีกเลี่ยงความสูญเสียเมื่อโอกาสการแยง่ ชิงอาหารได้สาเร็จ ต่า รวมถึงกรณีแหล่งอาหารหลกั ขาดแคลน เมื่อพิจารณาจากลักษณะของจอมปลวกถูกเบียนจอมที่ 1 และ 3 ถูกขดุ ทา ลายจนเป็นหลุมหรือเหลือแตฐ่ านเป็นเวลานานอยา่ งนอ้ ย 6 เดือนก่อนการสา รวจซ่ึง เพียงพอให้หนอนแมลงวันปรับตัวเข้าเบียนปลวก จอมที่ 2 พบหนอนชนิดอื่นร่วมอาศยั ในจอม ส่วน จอมที่ 4 มีขนาดเล็ก ปัจจัยเหล่าน้ีอาจทา ใหแ้ หล่งอาหารไมเ่ พียงพอส่งผลตอ่ การปรับตัวจากหนอน กินเศษซากอินทรียวตั ถุภายในจอมปลวก M. gilvus กลายเป็นตัวเบียนปลวกทหาร แตเ่ หตุผลที่ แทจ้ ริงยงั ไมท่ ราบแน่ชดั

64

ตารางที่ 6 รายชื่อส่ิงมีชีวติ อาศยั ของแมลงวันตัวเบียน Megaselia scalaris

สิ่งมีชีวิตอาศัย ที่มา: ผ้ึง (Hymenoptera: Apidae) Andreotti et al. (2003); Cham et al. (2018); Debnath and Roy (2019); Ricchiuti et al. (2016) ชันโรง (Hymenoptera: Apidae) Costa et al. (2007) ตอ่ Mischocyttarus cassununga Von Ihering และ Somavilla et al. (2015) Polybia jurinei de Saussure (Hymenoptera: Vespidae) มวนเพชฌฆาต Triatoma brasiliensis Neiva Costa et al. (2007); Miranda-Miranda et al. (2010) (Hemiptera: Reduviidae) ตก๊ั แตนตา ขา้ ว Parastagmatoptera tessellata Koch et al. (2013) Saussure & Zehntner (Mantodea: Mantidae) ตก๊ั แตนวงศ ์ Pyrgomorphidae Costa et al. (2007) ด้วงงวง Curculio caryae (Coleoptera: Costa et al. (2007) Curculionidae) ด้วงเจาะข้าวโพด Macrodactylus murinus Costa et al. (2007); Miranda-Miranda et al. (2010) (Coleoptera: Scarabaeidae) แมลงวันหัวเขียว (Diptera: Calliphoridae) Batista-Da-Silva (2012) ดักแด้ของ Palaeosepsis sp. (Diptera: Sepsidae) Marchiori (2018) หนอน Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) Costa et al. (2007); Ruíz-Nájera et al. (2007) (Lepidoptera: Noctuidae) แมงป่อง Mesobuthus eupeus mongolicus (Birula) Zhang et al. (2017) (Scorpiones: Buthidae) แมงมุมทาแรนทูลา Brachypelma vagans (Ausserer) Machkour-M'Rabet et al. (2015) (Araneae: Theraphosidae) เห็บ Andreotti et al. (2003); Diyes et al. (2015); Miranda- Miranda et al. (2010) หอยทาก Bradybaena similaris (Ferussac) Miranda-Miranda et al. (2010) (Stylommatophora: Bradybaenidae)

65

นอกจากน้ีช่วง 2 – 3 วันหลงั เกบ็ ปลวกจอมที่ 2 พบหนอนแมลงวัน Dohrniphora cornuta ใกลก้ บั ปลวกตาย รวมท้งั แมลงวันตัวเต็มวัยออกจากดินจอมปลวกร่วมกบั M. scalaris เกบ็ ตวั อยา่ ง หนอนได้ 10 ตัว และตัวเต็มวัย 37 ตัว แตไ่ มพ่ บหนอนออกจากปลวกขณะมีชีวิตหรือจากการผา่ หวั ปลวกที่เกบ็ ในแอลกอฮอล ์ ลักษณะของหนอนอ้างอิงตามรายงานของ Barnes (1990) กบั Feng and Liu (2012) ส่วนตวั เตม็ วยั อ้างอิงตามรายงานของ Barnes (1990)

หนอน D. cornuta (ภาพที่ 27) ลาตัว สีขาวเหลือง บริเวณด้านบน ด้านข้าง และขอบระหวา่ ง ดา้ นบนกบั ดา้ นขา้ งของอกปล้องที่ 2 – 3 ถึงท้องปล้องที่ 1 - 7 พบปุ่มแขง็ แบบพ ู่ (plumose tubercle) เรียวเล็ก 6 ชิ้นเรียงเป็นแถวตามขวาง ส่วนขอบระหวา่ งดา้ นล่างกบั ดา้ นขา้ งของท้องแตล่ ะปลอ้ ง ปรากฏ tubercle ขนาดเล็ก 1 คู ่ หนอนวัยที่ 2 กบั 3 พบแผน่ แขง็ สีเข้มขนาดใหญป่ กคลุมดา้ นบนอก ปล้องแรก ขอบท้องปล้องสุดท้ายล้อมรอบด้วย plumose tubercle ยาวหนาสีเข้มท้งั หมด 6 ชิ้น แตล่ ะ ชิ้นถูกปกคลุมดว้ ยขนแขง็ จา นวนมากตลอดท้งั เส้น กลางท้องปล้องสุดท้ายเป็นที่ต้งั ของ posterior spiracle สีน้า ตาลเขม้ 1 คูยื่นออกมาจากฐานรูปกรวย่ เชื่อมติดกนั

ภาพที่ 27 หนอนแมลงวัน Dohrniphora cornuta วัยที่ 3 (27A) ด้านบน (27B) ด้านล่าง

66

ไมพ่ บดกั แดจ้ ากการสา รวจ

แมลงวันสกุล Dohrniphora ตัวเต็มวัย ขาคูห่ ลงั ปล้องที่ 4 พบขนหนาม (seta) เรียงเป็นแถว ตามยาวด้านบน 1 แถว พ้ืนผวิ ดา้ นหลงั บริเวณฐานขาคูห่ ลงั ปล้องที่ 3 ของเพศผู้ปรากฎขนหนามส้ัน หนา แผน่ แขง็ ดา้ นบนของด้านข้างอกปล้องกลาง (anepisternum) ปรากฏขนหนาม ส่วนลักษณะ จาแนก ระดับชนิด D. cornuta (ภาพที่ 28) ขาคูห่ ลงั ปล้องที่ 4 ไมมี่ ขนแข็ง เพศเมียไม่ปรากฏแผน่ แขง็ ด้านบนท้องปล้องที่ 5 ส่วนเพศผู้พบขนหนามรับความรู้สึก (sensorial seta) เรียงตัวประมาณ 5 เส้น บนขาคูห่ ลงั ปล้องที่ 3

ภาพที่ 28 แมลงวัน Dohrniphora cornuta ตัวเต็มวัย

Dohrniphora cornuta แพร่กระจายเกือบทว่ั โลกผา่ นทางกิจกรรมของมนุษย ์ (Liu, 2015) แหล่งอาศยั กวา้ ง พบอาศยั ร่วมในรังแมลงสังคม เช่น รังต่อ จอมปลวก (Barnes, 1990) แตไ่ มป่ รากฏ รายงานเป็นปรสิต/ตวั เบียนของส่ิงมีชีวติ ตวั เต็มวัยเพศผู้กินเฉพาะน้า หวานจากดอกไม้ (nectar) เทา่ น้นั ขณะที่หนอนกบั ตัวเต็มวัยเพศเมียกินอาหารหลากชนิดโดยเฉพาะอินทรียวัตถุ (Barnes, 67

1990) ซากศพส่ิงมีชีวติ เช่น แมลง หอย โดยไขไ่ มฟ่ ักจนกวา่ host ตาย (Brues, 1925) มักเข้าถึงซาก ลาดับที่ 2 หลังจากหนอน M. scalaris แมลงวันวงศ์ Sarcophagidae และ Calliphoridae เขา้ กินศพแลว้ (Feng and Liu, 2012) แต ่ Barnes (1990) รายงานวา่ หากเกิดภาวะอาหารขาดแคลน หนอนสามารถ กลายเป็นตวั ห้า แมลงหลายชนิดได ้ โดยยนื่ ส่วนปากไปทางดา้ นทา้ ยลา ตวั จากน้นั ใช้อวัยวะรูปใบ พายขอบคล้ายซี่หยัก (sternal spatula) ยดึ จบั เหยอื่ อยา่ งไรกต็ าม สมาชิกร่วมสกุล Dohrniphora บาง ชนิดสามารถเป็นตวั เบียนไม่เจาะจงในส่ิงมีชีวิตชนิดอื่น (Liu, 2015) รวมถึงปลวก M. gilvus (Disney et al., 2009) เดิมชนิดที่พบเบียนปลวกถูกจัดไว้สกุล Dicranopteron แตจ่ ากการศึกษาดว้ ยเทคนิคทาง อณูชีววิทยาของ Hash et al. (2013) ทา ใหต้ อ่ มาเปลี่ยนสกุล คือ Dohrniphora จากคุณสมบตั ิดงั กล่าว แสดงถึงโอกาสที่หนอน D. cornuta อาจพฒั นาจากกลุ่มกินซากสู่กลุ่มปรสิต/ตวั เบียนไมเ่ จาะจงได้ เช่นกนั แตป่ ัจจุบนั ยงั ไม่พบรายงาน ข้อมูลข้างต้นแสดงให้เห็นวา่ หนอน D. cornuta มีประสิทธิภาพ ในการแขง่ ขนั ระหวา่ งส่ิงมีชีวติ ตา่ งชนิดมากกวา่ หนอน M. scalaris

การจ าแนกชนิดโดยวิเคราะห์ลาดับนิวคลีโอไทด์ของยี น mitochondrial COI

ผลการเพิ่มจ านวนชิ้นส่วนยีน COI โดยเทคนิค PCR

ผลการศึกษายีน COI ของแมลงวันเบียนปลวกท้งั 3 ระยะคือ หนอน ดักแด้ ตัวเต็มวัย ความ เข้มข้นของ DNA ที่สกดั ไดจาก้ 25 ตวั อยา่ งอยรู่ ะหวา่ ง 40 - 200 ng/µl. ขนาดของ PCR product อย ู่ 2 ช่วงขนาดเมื่อเปรียบเทียบกบั แถบ DNA มาตราฐานขนาด 100 bp ไดแ้ ก่ 373 bp จานวน 2 ตวั อยา่ ง (ภาพที่ 29) เป็นตัวเต็มวัยที่พบจากดินจอมปลวก และ 709 bp จานวน 10 ตวั อยา่ ง (ภาพที่ 30) คือ หนอนกบั ดักแด้

68

ภาพที่ 29 PCR product จากการเพ่ิมจา นวนยนี COI ของแมลงวัน Dohrniphora cornuta ขนาด ประมาณ 373 bp ด้วย forward primer 5'- GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G -3' และ reward primer 5'- TAG ACT TCT GGG TGG CCA AAG AAT CA -3'

ภาพที่ 30 PCR product จากการเพ่ิมจา นวนยนี COI ของแมลงวัน Megaselia scalaris ขนาด ประมาณ 709 bp ด้วย forward primer 5'- GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G -3' และ reward primer 5'- TAG ACT TCT GGG TGG CCA AAG AAT CA -3' 69

ผลจากการเกบ็ ตวั อยา่ งคอ่ นขา้ งนานประมาณ 8 – 10 เดือนก่อนนา มาจา แนกชนิดดว้ ย เทคนิคทางอณูชีววทิ ยา พบวา่ DNA ของ 13 ตวั อยา่ งไมแ่ สดงผลจากเทคนิค PCR การแกไ้ ขปัญหา โดยอาศัยเทคนิค Semi-Nested PCR ซึ่งออกแบบเส้น reverse primer ข้ึนใหม่ทาให้ primer เกิด ความจา เพาะต่อช่วงลา ดบั นิวคลีโอไทดท์ ี่ตอ้ งการมากข้ึน ผล Semi-Nested PCR product ของ 13 ตวั อยา่ งไดข้ นาดคูเ่ บสส้ันลง คือ 634 bp (ภาพที่ 31)

ภาพที่ 31 Semi-Nested PCR product จากการเพ่ิมจา นวนยนี COI ของแมลงวัน Megaselia scalaris ขนาดประมาณ 634 bp ด้วย forward primer 5'- GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G -3' และ reward primer 5'- AAT GAT GTA TTA AAA TTT CG -3'

ผลการสร้างพลาสมิด DNA ลูกผสม โดยเทคนิค Colony PCR

หลงั จากเพ่ิมจา นวนยนี COI ผลการเชื่อมตอ่ (ligation) PCR product หรือ Semi-Nested PCR product ที่มียีน COI ซ่ึงหลงั สิ้นสุดปฏิกิริยาเอนไซม ์ Taq polymerase ในข้นั ตอน PCR เกิดการเติม เบส A (adenine) บริเวณด้านปลาย 3´ กบั pGEM-T® easy vector ที่มีเบส T (thymine) ตรงส่วนปลาย ท้งั 2 ขา้ ง เร่ิมตน้ โดยเอนไซม์ DNA ligase เชื่อมต่อปลายเบส T ของพาหะเขา้ กบั ส่วนปลายเบส A ของ PCR product ได้พลาสมิด DNA ที่มียีน COI ภายใน หลังถ่ายโอนพลาสมิด DNA เขา้ สู่ competent cell (E. coli DH5α) จึงตรวจสอบโคลนโดยเลือก colony สีขาวของแบคทีเรียซ่ึงคาดวา่ มี 70

insert gene (ยีน COI) เนื่องจากพาหะชนิด pGEM-T® easy vector เป็นพลาสมิดประกอบด้วยยีน lacZ

สามารถสร้างเอนไซม์ β-galactosidase ออกมายอ่ ยสาร X-gal ทา ใหแ้ บคทีเรียเกิด colony สีฟ้า แต่ เมื่อยีน COI แทรกเขา้ ไปในส่วน clone insert ของยีน lacZ ทาให้ยีน lacZ ไมท่ า งาน ไมส่ ามารถสร้าง เอนไซมอ์ อกมายอ่ ย X-gal ได ้ ดงั น้นั colony ของแบคทีเรียจึงเป็นสีขาว (ภาพที่ 32) ผลทดสอบ colony สีขาวด้วยเทคนิค colony PCR พบโคลนขนาด 373 และ 709 bp ส่วนตวั อยา่ งจากการทา Semi-Nested PCR พบโคลนขนาด 634 bp เช่นเดียวกบั ข้นั ตอนเพ่ิมปริมาณยนี COI เมื่อเปรียบเทียบ ขนาดของยีนกบั แถบ DNA มาตรฐานขนาด 100 bp

ภาพที่ 32 colony สีขาวของแบคทีเรีย เกิดจากยนี COI เข้าแทนที่ยีน lacZ

71

ผลการวิเคราะห์ลาดับนิวคลีโอไทด์

หลังการเล้ียง colony ที่มีชิ้นส่วนยนี COI ในอาหารเล้ียงเช้ือ ผลการสกดั พลาสมิด DNA ดว้ ยชุดสกดั สา เร็จรูปได้ปริมาณความเข้มข้นของพลาสมิด DNA ประมาณ 150 - 450 µg/µl. ผลการ ทา sequencing โดยบริษัท Macrogen Inc. แสดงลาดับนิวคลีโอไทด์ที่ได้ ในรูปกราฟ chromatogram (ภาพที่ 33) ผลการตดั แตง่ วิเคราะห์ลา ดบั นิวคลีโอไทด์ด้วยโปรแกรม BioEdit Sequence Alignment Editor Program Version 7.1.9. พบวา่ ขนาดลา ดับนิวคลีโอไทด์ของยีน COI ในแมลงวันเบียนปลวก ไดแ้ ก่ 373 bp จานวน 2 ตวั อยา่ ง 709 bp จานวน 10 ตวั อยา่ งและ 634 bp จานวน 13 ตวั อยา่ ง นามา วิเคราะห์เปรียบเทียบโดยการทา multiple sequence alignment เมื่อเทียบกบั ลา ดบั นิวคลีโอไทดใ์ น ฐานข้อมูล GenBank พบวา่ ตวั อยา่ งขนาด 709 และ 634 bp รวม 23 ตวั อยา่ ง ไดแ้ ก่ 1.1 1.2 2.1 2.3 3.1 3.2 4.1 4.2 5.1 5.2 6.1 6.3 7.3 7.4 7.5 7.6 10.4 10.6 10.7 10.9 10.10 12.1 และ 12.10 แสดงความ ใกล้เคียงกบั แมลงวนั M. scalaris มากที่สุด (ภาพที่ 34) ส่วนตวั อยา่ งขนาด 373 bp คือ 8.5 กบั 8.6 เหมือนกบั แมลงวนั D. cornuta ท้งั หมดสอดคลอ้ งตามลกั ษณะทางสัณฐานวทิ ยา ขอ้ มูลวัยและจอมที่ พบของแตล่ ะตวั อยา่ งแสดงในตารางที่ 7

ภาพที่ 33 ผลจาก sequencing ในรูปกราฟ chromatogram ของยีน COI ของแมลงวันเบียนปลวก

72

ตารางที่ 7 ข้อมูลพ้ืนฐานของตวั อยา่ งที่จา แนกชนิดดว้ ยเทคนิคทางอณูชีววทิ ยา

ตัวอย่าง ระยะ จอมที่พบ 1.1 หนอน 1 1.2 ดักแด้ 1 2.1 หนอน 1 2.3 หนอน 1 3.1 หนอน 2 3.2 หนอน 2 4.1 ดักแด้ 3 4.2 หนอน 3 5.1 หนอน 4 5.2 หนอน 4 6.1 ดักแด้ 1 6.3 ดักแด้ 1 7.3 หนอน 2 7.4 หนอน 2 7.5 ดักแด้ 2 7.6 หนอน 2 8.5 ตัวเต็มวัย 2 8.6 ตัวเต็มวัย 2 10.4 ตัวเต็มวัย 2 10.6 ตัวเต็มวัย 2 10.7 ตัวเต็มวัย 2 10.9 ตัวเต็มวัย 3 10.10 ตัวเต็มวัย 3 12.1 ดักแด้ 2 12.10 ดักแด้ 2

73

ภาพที่ 34 ผล multiple sequence alignment จากลาดับนิวคลีโอไทด์ของยีน COI ของตวั อยา่ ง แมลงวัน Megaselia scalaris เบียนปลวก 74

ผลการเปรียบเทียบลาดับนิวคลีโอไทด์ของยีน COI ในตวั อยา่ งกบั ฐานขอ้ มูล GenBank

ผลเปรียบเทียบความเหมือนหรือความคลา้ ยคลึงระหวา่ งลา ดบั นิวคลีโอไทดข์ องยนี COI จากตวั อยา่ งแมลงวนั เบียนปลวกที่ตดั แตง่ เรียบร้อยแลว้ กบั ตวั อยา่ งแมลงวันในฐานข้อมูล GenBank ด้วยโปรแกรมออนไลน์ nucleotide blast (BLASTN) แสดงเป็นคา่ ร้อยละความเหมือนหรือความ คล้ายคลึง (percentage identities) ดังตารางที่ 8

ผลการเปรียบเทียบลาดับนิวคลีโอไทด์ของยีน COI ของตวั อยา่ งกบั ฐานข้อมูล GenBank พบวา่ ตวั อยา่ ง 1.1 1.2 2.1 2.3 3.1 3.2 4.2 5.1 5.2 6.1 6.3 7.3 7.4 7.5 7.6 10.4 10.6 10.9 10.10 และ 12.10 ใกลเ้ คียงกบั ตวั อยา่ ง accession no. AB907181.1 จากการศึกษายีน COI ของแมลงอันดับ Diptera ในพ้ืนที่ทางการเกษตรรัฐทมิฬนาฑู (Tamilnadu) ประเทศอินเดียของ Veeramani et al. (ได้รับเลขทะเบียน ปี 2014) มากที่สุด ตวั อยา่ ง 4.1 ใกลเ้ คียงกบั ตวั อยา่ ง accession no. KX266963.1 จากการศึกษา M. scalaris ตัวเบียนฉวยโอกาส (opportunist parasitoid) ของผ้งึ ที่ประเทศแคเมอรูน ของ Cham et al. (2018) มากที่สุด ตวั อยา่ ง 10.7 ใกลเ้ คียงกบั ตวั อยา่ ง accession no. JQ941745.1 จาก ประเทศจีนของ Wang et al. (2013) และตวั อยา่ ง 12.1 ใกลเ้ คียงกบั ตวั อยา่ ง accession no. HM399352.1 จากประเทศออสเตรเลียของ International Barcode of Life (iBOL) (ได้รับเลขทะเบียน ปี 2010) ส่วนตวั อยา่ ง 8.5 และ 8.6 ท้งั 2 ตวั อยา่ งแสดงความใกลเ้ คียงกบั ตวั อยา่ ง accession no. JQ941749.1 จากการศึกษาของ Wang et al. (2013) กบั MG947378.1 จากการศึกษาของ Moskowitz et al. (2018) มากที่สุด

75

ตารางที่ 8 ผลการเปรียบเทียบความคล้ายคลึงของลาดับนิวคลีโอไทด์ของยีน COI ของตวั อยา่ ง แมลงวนั กบั ฐานขอ้ มูล GenBank

รหัส ขนาด PCR ชนิดตัวอย่าง ร้อยละความ เลขทะเบียน ตัวอย่าง product (bp) เหมือน ตัวอย่างอ้างอิง 1.1 709 M. scalaris: COI10 98.38 AB907181.1 1.2 634 M. scalaris: COI10 98.84 AB907181.1 2.1 709 M. scalaris: COI10 98.38 AB907181.1 2.3 709 M. scalaris: COI10 98.08 AB907181.1 3.1 709 M. scalaris: COI10 98.23 AB907181.1 3.2 709 M. scalaris: COI10 98.23 AB907181.1 4.1 709 M. scalaris isolate KBA1 99.39 KX266963.1 4.2 634 M. scalaris: COI10 98.84 AB907181.1 5.1 634 M. scalaris: COI10 98.84 AB907181.1 5.2 634 M. scalaris: COI10 98.84 AB907181.1 6.1 634 M. scalaris: COI10 98.84 AB907181.1 6.3 634 M. scalaris: COI10 98.84 AB907181.1 7.3 709 M. scalaris: COI10 99.11 AB907181.1 7.4 709 M. scalaris: COI10 99.11 AB907181.1 7.5 709 M. scalaris: COI10 98.38 AB907181.1 7.6 709 M. scalaris: COI10 99.11 AB907181.1 8.5 373 D. cornuta isolate 49 91.30 JQ941749.1 8.6 373 D. cornuta isolate 49 95.33 JQ941749.1 10.4 634 M. scalaris: COI10 99.01 AB907181.1 10.6 634 M. scalaris: COI10 98.68 AB907181.1 10.7 634 M. scalaris isolate 01 99.84 JQ941745.1 10.9 634 M. scalaris: COI10 99.01 AB907181.1 10.10 634 M. scalaris: COI10 98.84 AB907181.1 12.1 634 M. scalaris voucher gvc13323-1L 99.67 HM399352.1 12.10 634 M. scalaris: COI10 98.84 AB907181.1

76

นอกจากน้ีพบวา่ ตวั อยา่ ง M. scalaris เบียนปลวกคอ่ นขา้ งใกลช้ ิดกบั M. scalaris ที่แสดง พฤติกรรมตวั เบียนมากกวา่ M. scalaris ปกติ โดยท้งั 23 ตวั อยา่ งคลา้ ยคลึงกบั M. scalaris ตัวเบียน ไม่เจาะจงของแมงป่องทะเลทรายจากการศึกษาของ Zhang et al. (2017) ร้อยละ 97.51 – 99.20 และ คลา้ ยคลึงกบั M. scalaris ตวั เบียนฉวยโอกาสของผ้งึ ตามการศึกษาของ Cham et al. (2018) ร้อยละ 97.87 – 99.39 ผลดงั กล่าวแสดงความเป็นไปไดว้ า่ แมลงวนั ชนิดเดียวกนั ที่มีพฤติกรรมรูปแบบ เดียวกนั อาจเกิดจากลา ดบั นิวคลีโอไทดท์ ี่ใกลเ้ คียงกนั หรือ DNA อาจส่งผลตอ่ การเกิดความผนั แปร ดา้ นพฤติกรรมภายในส่ิงมีชีวิตชนิดเดียวกนั ซ่ึงเป็นพ้ืนฐานสา คญั ต่อการชกนั าให้แมลงวันแสดง พฤติกรรมหรือความจา เพาะตอ่ host ที่ต้องการ อยา่ งไรกต็ าม แมพ้ นั ธุกรรมจะมีบทบาทในการ กา หนดลกั ษณะและพฤติกรรมของส่ิงมีชีวติ แตถ่ ือเป็นเพียงปัจจยั หน่ึงร่วมกบั ปัจจยั อื่น ๆ อีกมาก เทา่ น้นั โดยเฉพาะปัจจยั ส่ิงแวดลอ้ มรอบตวั ส่ิงมีชีวติ น้นั ๆ

Zhang et al. (2017) กล่าวถึงความสา คญั ของการศึกษาความสัมพนั ธ์ระหวา่ งแมลงวนั ตวั เบียนกบั แมงป่องในระดบั พนั ธุกรรมวา่ อาจแสดงให้เห็นความเกี่ยวเนื่องเชื่อมโยงบางประการที่ขาด หายไปในสายใยอาหารของส่ิงมีชีวติ กลุ่มสัตวข์ าปลอ้ ง (arthropod) ได้ในอนาคต ยืนยันถึง ความสาคัญของการศึกษาความสัมพันธ์รูปแบบเดี ยวกนั ระหวา่ งแมลงวนั ตวั เบียนกบั ปลวกในระดับ พนั ธุกรรมเช่นกนั

ผลการยื่นขอเลขทะเบียน (accession number) ลาดับนิวคลีโอไทด์ของยีน COI ในแมลงวัน เบียนปลวก 23 ตวั อยา่ งด้วยโปรแกรมออนไลน์ Banklt ลงฐานข้อมูล GenBank ได้เลขทะเบียนคือ MN933769 - MN933778 และ MT111881 - MT111893 เลขทะเบียนของแตล่ ะตวั อยา่ งแสดงดัง ตารางที่ 9

77

ตารางที่ 9 ผลการข้ึนทะเบียนขอหมายเลขลา ดบั นิวคลีโอไทดข์ องยนี COI ของตวั อยา่ งแมลงวัน เบียนปลวก

รหัสตัวอย่าง ชนิดตัวอย่าง เลขทะเบียน 1.1 Megaselia scalaris MN933769 1.2 M. scalaris MT111881 2.1 M. scalaris MN933770 2.3 M. scalaris MN933771 3.1 M. scalaris MN933772 3.2 M. scalaris MN933773 4.1 M. scalaris MN933774 4.2 M. scalaris MT111882 5.1 M. scalaris MT111883 5.2 M. scalaris MT111884 6.1 M. scalaris MT111885 6.3 M. scalaris MT111886 7.3 M. scalaris MN933775 7.4 M. scalaris MN933776 7.5 M. scalaris MN933777 7.6 M. scalaris MN933778 10.4 M. scalaris MT111887 10.6 M. scalaris MT111888 10.7 M. scalaris MT111889 10.9 M. scalaris MT111890 10.10 M. scalaris MT111891 12.1 M. scalaris MT111892 12.10 M. scalaris MT111893

78

ผลการวิเคราะห์ความเหมือนและความแตกตา่ งของลา ดบั นิวคลีโอไทดภ์ ายในชนิด

ผลการวิเคราะห์ความเหมือน (identity matrix) กบั ความแตกตา่ งภายในชนิด (intraspecific variation) ด้วยชุดคา ส่ัง clustal W ในโปรแกรม BioEdit Sequence Alignment Editor Program Version 7.1.9. แสดงบางส่วนดังภาพที่ 35 และ 36 ตามลา ดบั พบวา่ ร้อยละความเหมือนกบั ร้อยละ ความแตกตา่ งภายในชนิดของ M. scalaris จา นวน 23 ตวั อยา่ งมีคา่ ระหวา่ งร้อยละ 96.8 – 100.0 และ 0.0 – 3.2 ตามลา ดับ บางตวั อยา่ งไมพ่ บความแตกตา่ งภายในชนิดจากจอมเดียวกนั หรือระหวา่ งตา่ ง จอม ส่วนคา่ ร้อยละความเหมือนกบั ร้อยละความแตกตา่ งภายในชนิดของ D. cornuta จานวน 2 ตวั อยา่ งไดแ้ ก่ ร้อยละ 98.9 และ 1.1 ตามลาดับ

ภาพที่ 35 ผลการวเิ คราะห์ค่าร้อยละความเหมือนภายในชนิดของ Megaselia scalaris เบียนปลวก

79

ภาพที่ 36 ผลการวเิ คราะห์ค่าร้อยละความแตกตา่ งภายในชนิดของ Megaselia scalaris เบียนปลวก

ผลการสร้างและวเิ คราะห์แผนภูมิต้นไม้ววิ ฒั นาการ

ผลการสร้างแผนภูมิวิวัฒนาการจากข้อมูลลาดับนิวคลีโอไทด์ของยีน COI ในตวั อยา่ ง แมลงวันเบียนปลวก M. scalaris 23 ตวั อยา่ ง (วงกลมสีแดง) โดยเปรียบเทียบกบั ลา ดบั นิวคลีโอไทด์ ของยีน COI (reference sequence) ของ M. scalaris จากจีน (KX832635.1) เกาหลีใต้ (KC407773.1) อินเดีย (AB907181.1 และ KT879896.1) แคเมอรูน (KX266963.1 KX266965.1 KX266966.1 และ KX266967.1) แมลงวันสกุล Megaselia ชนิดอื่นที่มีรายงานในฐานข้อมูล GenBank ไดแ้ ก่ Megaselia arcticae (HQ583037.1 KT088770.1 และ KT090123.1) Megaselia berndseni (KX774797.1) Megaselia giraudii (MG108115.1 และ MG108957.1) Megaselia infraposita (KX774911.1) Megaselia lata (KP693337.1) Megaselia longicostalis (GU656958.1) Megaselia rufipes (KT088038.1 และ KT090058.1) Megaselia spiracularis (JQ941752.1) และ Megaselia sp. (KX774791.1 และ KX774932.1) ด้วยโปรแกรม MEGAX โดยวิธี maximum likelihood method (ML) กา หนดแบบจา ลองของการแทนที่ลา ดบั นิวคลีโอไทดแ์ บบ general time reversible model 80

(GTR) เพื่อพิจารณาการผันแปรของลาดับนิวคลีโอไทด์ (nucleotide substitution) ตรวจสอบความ น่าเชื่อถือดว้ ย bootstrap test จานวน 1,000 รอบ และใช้มอดแป้ง Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae) (KU913057.1) เป็น out group เปรียบเทียบ แสดงผลดังภาพที่ 37

ภาพที่ 37 ผล phylogenetic tree จากยีน COI เพื่อจาแนกชนิดของแมลงวัน Megaselia scalaris เบียนปลวกจากการใช้ maximum likelihood method แบบ general time reversible model โดยกา หนดคา่ bootstrap test จานวน 1,000 รอบ

81

แผนภูมิวิวัฒนาการแบง่ แมลงวนั 23 ตวั อยา่ งออกเป็น 2 กลุ่ม (clade) โดย clade I จานวน 20 ตวั อยา่ งมีความใกลช้ ิดกบั ตวั อยา่ ง M. scalaris (accession no. AB907181.1) จากพ้ืนที่ทางการเกษตร ประเทศอินเดียมากที่สุด ภายใน clade I แบง่ เป็น 2 กลุ่มยอ่ ย (subclade) คือ subclade I ประกอบด้วย ตวั อยา่ งจากการศึกษาน้ีจา นวน 17 ตวั อยา่ งกบั subclade II มี 3 ตวั อยา่ งคือ ตวั อยา่ ง 7.3 7.4 และ 7.6 (หนอนจอมที่ 2) แสดงความใกลช้ ิดกบั ตวั อยา่ งจากประเทศอินเดียดงั กล่าว ส่วน clade II จานวน 3 ตวั อยา่ ง ใกลเ้ คียงกบั M. scalaris ในทวีปเอเชียและแอฟริกาไดแ้ ก่ อินเดีย จีน เกาหลีใต ้ แคเมอรูน โดยตัวอยา่ ง 12.1 (ดักแด้จอมที่ 2) ใกลเ้ คียงกบั ตวั อยา่ ง accession no. KT879896.1 จากประเทศ อินเดีย รวมถึงใกลช้ ิดกบั clade I ขณะที่ตวั อยา่ ง 4.1 (ดักแด้จอมที่ 3) กบั 10.7 (ตัวเต็มวัยจอมที่ 2) ใกลเ้ คียงกบั ตวั อยา่ งจากประเทศแคเมอรูน (accession no. KX266963.1 กบั KX266965.1) มากที่สุด ผลแสดงใหเ้ ห็นวา่ ลา ดบั นิวคลีโอไทดข์ องตวั อยา่ งแมลงวนั M. scalaris เบียนปลวกจากประเทศไทย ใกลเ้ คียงกบั แมลงวัน M. scalaris ของประเทศอินเดียมากที่สุด โดยเฉพาะตวั อยา่ งจอมที่ 2 ซึ่งแสดง ความหลากหลายมากที่สุดประกอบดว้ ยตวั อยา่ งที่คลา้ ย M. scalaris ของ subclade I จากประเทศไทย subclade II จากประเทศอินเดีย และ M. scalaris จากประเทศอินเดียกบั แคเมอรูนของ clade II

ปัจจุบันรายงานศึกษาแมลงวัน M. scalaris รวมถึง Phorid flies ชนิดอื่นด้วยเทคนิคทางอณู ชีววทิ ยาจากภูมิภาคเอเชียตะวนั ออกเฉียงใตค้ อ่ นขา้ งมีจา กดั ข้อมูลลาดับนิวคลีโอไทด์ ปรากฎใน ฐานข้อมูลค่อนขา้ งนอ้ ย ไม่พบลาดับนิวคลีโอไทด์ของ M. scalaris จากประเทศไทยและประเทศอื่น ในเอเชียตะวันออกเฉียงใต้จากฐานข้อมูล GenBank ขณะที่อินเดียปรากฏเพียง 2 ตวั อยา่ งซึ่งแสดงใน แผนภูมิวิวัฒนาการเทา่ น้นั ดงั น้นั รายงานฉบบั น้ีเป็นการศึกษาลาดับนิวคลีโอไทด์ของแมลงวัน M. scalaris คร้ังแรกของประเทศไทยและภูมิภาคเอเชียตะวนั ออกเฉียงใตท้ า ใหไ้ มส่ ามารถเปรียบเทียบ ผลกบั แมลงวนั M. scalaris ของการศึกษาอื่น ๆ จากประเทศไทยและประเทศแถบภูมิภาคเอเชีย ตะวันออกเฉียงใต้เพื่อตรวจสอบการแพร่กระจายหรือสายวิวัฒนาการไดอ้ ยา่ งชดั เจน

ส่วนผลการสร้างแผนภูมิววิ ฒั นาการจากขอ้ มูลลา ดบั นิวคลีโอไทดข์ องยนี COI ในตวั อยา่ ง แมลงวัน D. cornuta ที่พบร่วมอาศยั ในจอมปลวก 2 ตวั อยา่ ง (วงกลมสีแดง) โดยการเปรียบเทียบกบั ลาดับนิวคลีโอไทด์ของยีน COI ของแมลงชนิดเดียวกนั และแมลงวันสกุล Dohrniphora ชนิดอื่นที่มี รายงานในฐานข้อมูล GenBank โดยวิธี maximum likelihood method (ML) กา หนดแบบจา ลองของ 82

การแทนที่ลาดับนิวคลีโอไทด์แบบ Tamura-Nei model (TN93) เพื่อพิจารณาการผันแปรของลาดับนิ วคลีโอไทด ์ ตรวจสอบความน่าเชื่อถือดว้ ย bootstrap test จานวน 1,000 รอบ แสดงผลดังภาพที่ 37

ภาพที่ 38 ผล phylogenetic tree จากยีน COI เพื่อจาแนกชนิดของแมลงวัน Dohrniphora cornuta จากการใช้ maximum likelihood method แบบ Tamura-Nei model โดยกา หนดคา่ bootstrap test จานวน 1,000 รอบ

การเบียนเป็นความสัมพนั ธ์ที่มีบทบาทสา คญั ตอ่ การรักษาความหลากหลายทางชีวภาพใน ระบบนิเวศโดยปรับลดพลวตั ประชากรของส่ิงมีชีวติ อาศยั ท้งั ในฐานะส่ิงมีชีวติ ควบคุมทางชีวภาพ หรือศัตรูรบกวน (pest) ของมนุษย์ (Zhang et al., 2017) ปัจจุบันมีแนวคิดพัฒนาแมลงวันตัวเบียน วงศ์ Phoridae สา หรับควบคุมส่ิงมีชีวิตศัตรูของมนุษย์หลายกรณี เช่น แมลงวนั สกุล Pseudacteon ควบคุมมดคันไฟสกุล Solenopsis (Morrison, 2012; Wuellner et al., 2002) M. scalaris ควบคุมเห็บ โค Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini) (Bautista-Garfias and Martínez-Ibañez, 2012; Miranda-Miranda et al., 2010) รวมท้งั M. mindeni ควบคุมปลวก M. gilvus ที่ประเทศมาเลเซีย (Foo et al., 2011b)

83

กรณี M. scalaris เกิดการเบียนเฉพาะปลวกทหารในธรรมชาติต่า เช่นเดียวกบั M. mindeni (Foo et al., 2011b) ท้งั ยงั เป็นปรสิตหรือตวั เบียนไมเ่ จาะจง (Debnath and Roy, 2019; Somavilla et al., 2015; Zhang et al., 2017) ซ่ึงดา รงชีวติ ไดท้ ้งั แบบปรสิตภายในตวั host (parasitic form) และแบบ อิสระนอกตัว host (free living form) ทา ใหค้ วามจา เพาะต่อ host คอ่ นขา้ งนอ้ ยยากตอ่ การควบคุมให้ เขา้ ทา ลายเฉพาะปลวกเทา่ น้นั อยา่ งไรกต็ าม M. scalaris มีเขตภูมิศาสตร์การกระจายตัว ความ หลากหลายของแหล่งอาศยั และแหล่งอาหารสูง พบอาศัยอยทู่ ว่ั ไปโดยเฉพาะเขตร้อนกบั ก่ึงเขตร้อน (Costa et al., 2007; Koch et al., 2013; Miranda-Miranda et al., 2010) ข้อมูลการศึกษาชีวประวัติ วงจรชีวิตมากกวา่ M. mindeni บางงานวิจัยสามารถเล้ียงในหอ้ งปฏิบตั ิการมาก่อน เช่น นิติกีฏวทิ ยา การกา จดั สารประกอบจากอุตสาหกรรม (Alcaine-Colet et al., 2015) ส่วน Miranda-Miranda et al. (2010) ทดสอบเพาะเล้ียง M. scalaris บนเห็บ R. microplus ภายใต้สภาพห้องปฏิบัติการประสบ ผลสา เร็จ ท้งั ยงั เสนอแนวคิดการปรับปรุงสายพันธุ์ M. scalaris ที่ต้องการเพื่อชกั นา ใหเ้ กิดการ ปรับตวั จนแสดงความจา เพาะตอ่ host ตอ่ ไป

ปัจจุบันการศึกษาแมลงวนั เบียนส่ิงมีชีวติ บางชนิด เช่น แมลงวนั M. scalaris ในแมงป่อง M. eupeus mongolicus (Zhang et al., 2017) กบั M. mindeni ในปลวก M. gilvus (Foo et al., 2011a, 2011b, 2012, 2015; Neoh and Lee, 2010) เร่ิมเขา้ สู่ข้นั ตอนการเล้ียงและศึกษาความสัมพันธ์บาง ประการระหวา่ ง host กบั แมลงวนั ภายใต้สภาพห้องปฏิบัติการสาหรับท าความเข้าใจวงจรชีวิต กลไก การเขา้ เบียนอาศยั อิทธิพลของแมลงวนั ต่อ host การดา รงชีวติ ของแมลงวนั ภายในร่างกายของ host เพื่อเป็นขอ้ มูลพ้ืนฐานต่อการพฒั นานา ไปใชป้ ระโยชน์ดา้ นตา่ ง ๆ ท้งั น้ีเทคนิควธิ ีการเล้ียง M. scalaris อยา่ งถูกตอ้ งมีความสา คญั มากตอ่ การศึกษาในอนาคต

84

สรุปและข้อเสนอแนะ

ผลสา รวจปลวกภายในมหาวิทยาลยั เกษตรศาสตร์ วทิ ยาเขตกา แพงแสน พบปลวกสกลุ Macrotermes จานวน 75 จอม สุ่มเกบ็ ปลวกทหารจา นวน 25 จอม ผลจาแนกชนิดคือ ปลวก Macrotermes gilvus (Hagen) พบปลวกทหารถูกหนอนแมลงวันเบียน 4 จอม เกบ็ ตวั อยา่ ง 3 ระยะ ไดแ้ ก่ หนอน ดกั แด ้ ตวั เตม็ วยั ผลจา แนกชนิดด้วยลักษณะสัณฐานวิทยาร่วมกบั เทคนิคทางอณู ชีววิทยาคือแมลงวัน Megaselia scalaris (Loew) ขนาดลาดับนิวคลีโอไทด์ของยีน COI ที่ได้ คือ 709 bp จากเทคนิค PCR กบั 634 bp จากเทคนิค Semi-Nested PCR ผลการสร้างแผนภูมิวิวัฒนาการ ตวั อยา่ งส่วนใหญม่ ีความใกลชิด้ กบั M. scalaris ของประเทศอินเดีย บางตวั อยา่ งเทา่ น้นั ที่ใกลเ้ คียง กบั ประเทศอื่นในทวปี เอเชียกบั แอฟริกา รวมท้งั เกบ็ ตวั อยา่ งแมลงวนั ร่วมอาศัยในจอมปลวกได้ 1 ชนิดแตไ่ มพ่ บการเบียนในปลวก จาแนก ชนิดได้เป็นแมลงวัน Dohrniphora cornuta (Bigot) มีลาดับ นิวคลีโอไทด์ของยีน COI ขนาด 373 bp จากเทคนิค PCR

ปัญหาระหวา่ งการศึกษาไดแ้ ก่ ปัญหาการเล้ียงแมลงวนั เขา้ สู่ตวั เตม็ วยั ไมส่ า เร็จ การจาแนก ชนิดตัวเบียนด้วยลักษณะทางสัณฐานวิทยาให้ถูกต้องชัดเจนได้ยากโดยเฉพาะระยะตวั ออ่ น เฉพาะ แมลงวันสกุล Megaselia ประกอบด้วยสมาชิกจานวนมาก ซึ่งลักษณะภายนอกของแตล่ ะชนิด คล้ายคลึงกนั มาก นอกจากน้ีระหวา่ งข้นั ตอนการเกบ็ ตวั อยา่ ง การเกบ็ รักษา หรือตรวจสอบลกั ษณะ ก่อความเสียหายตอ่ ลกั ษณะจา แนกบางอยา่ งคอ่ นขา้ งมากทา ใหส้ ภาพตวั อยา่ งไมส่ มบูรณ์ การทิ้ง ระยะห่างระหวา่ งการเกบ็ ตวั อยา่ งกบั การสกดั DNA คอ่ นขา้ งนานส่งผลให ้ DNA ของบางตวั อยา่ ง อาจเสื่อมคุณภาพจนไมส่ ามารถสกดั DNA ออกมาได้หรือไมแ่ สดงผลจากเทคนิค PCR รายงาน การศึกษาและข้อมูลลาดับนิวคลีโอไทด์ในฐานข้อมูลยังคงน้อยมาก

ตวั อยา่ งหัวข้อศึกษาที่สามารถตอ่ ยอดจากงานวจิ ยั ในอนาคต ไดแ้ ก่ การศึกษาแมลงวันเบียน ปลวกจากพ้ืนที่อื่นทว่ั ประเทศดว้ ยลกั ษณะทางสัณฐานวิทยาและเทคนิคทางอณูชีววิทยา การศึกษา ลาดับนิวคลีโอไทด์ ของ M. scalaris หรือแมลงวันเบียนปลวกชนิดอื่นจากประเทศไทยกบั ประเทศ แถบภูมิภาคเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ วงจรชีวิตของแมลงวันภายในตัวปลวก กลไกกบั อัตราการเข้า 85

เบียนอาศัยของแมลงวันเข้าสู่ปลวกภายใต้สภาพธรรมชาติและห้องปฏิบัติการ ผลกระทบหรือความ เปลี่ยนแปลงที่หนอนแมลงวนั ส่งผลตอ่ ปลวกรวมท้งั สาเหตุของความเปลี่ยนแปลง เทคนิคการเล้ียง แมลงวันในตัวปลวก และอิทธิพลของลา ดบั นิวคลีโอไทดต์ อ่ พฤติกรรมของส่ิงมีชีวติ ท้งั หมดเพื่อ ประโยชน์ในการชกั นา ใหจ้ า เพาะตอ่ การควบคุมประชากรปลวกเพื่อใช้เป็น biological control agent สาหรับ ควบคุมทางชีวภาพท้งั ปลวก M. gilvus และปลวกชนิดอื่น ๆ ตอ่ ไป

เอกสารและสิ่งอ้างอิง

เอกสารและสิ่งอ้างอิง

Ahmad, M. (1965). Termites (Isoptera) of Thailand. Bull. Am. Mus. Nat. Hist., 131, 1-113. Alam, M. S., Ahmed, K. A., Begum, R. A., & Shahjahan, R. M. (2016). Identification of Megaselia species based on mitochondrial 16s rRNA and CO1 gene sequences. Dhaka Univ. J. Biol. Sci., 25(2), 149‐159. Alcaine-Colet, A., Wotton, K. R., & Jimenez-Guri, E. (2015). Rearing the scuttle fly Megaselia scalaris (Diptera: Phoridae) on industrial compounds: implications on size and lifespan. PeerJ, 3, 1-13. Andreotti, R., Koller, W. W., Tadei, W. J., Do Prado, Â. P., Barros, J. C., Dos Santos, F., & Gomes, A. (2003). Ocurrence of the Megaselia scalaris as a parasitoid of Boophilus microplus in Campo Grande, MS, Brazil. Rev. Bras. Parasitol. Vet., 12(1), 46-47. Barnes, J. K. (1990). Life history of Dohrniphora cornuta (Bigot) (Diptera: Phoridae), a filth- inhabiting humpbacked fly. J. New York Entomol. Soc., 98(4), 474-483. Batista-Da-Silva, J. A. (2012). Phoretic association and facultative parasitoidism between Megaselia scalaris and blowflies, under natural conditions. OnLine J. Biol. Sci., 12(1), 34-37. Bautista-Garfias, C. R., & Martínez-Ibañez, F. (2012). Experiences on the control of cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus in Mexico. In M. Woldemeskel (Ed.), Ticks: Disease, Management and Control (pp. 205-216). United Kingdom: Nova Science Pub Inc. Beccaloni, G., & Eggleton, P. (2013). Order Blattodea. Zootaxa, 3703(1), 46-48. Bignell, D., & Eggleton, P. (2000). Termites in ecosystems. In T. Abe, D. Bignell, & M. Higashi (Eds.), Termites: evolution, sociality, symbioses, ecology (pp. 363-387). Netherlands: Springer. Bostock, E. (2015). Megaselia scalaris (Diptera: Phoridae), a Fly of Forensic Interest: Advances in Chronobiology and Biology. (Ph.D. Thesis), University of Huddersfield, Braga, M. V., Mendonça, P. M., Barbosa, R. R., Blomquist, G. J., Novo, S. P. C., Dutra, J. d. M. F., . . . Queiroz, M. M. d. C. (2015). Identification of Megaselia scalaris (Loew, 1866) (Diptera: Phoridae) in mummified human body from Itacambira (MG), Brazil, using scanning electron microscopy and cuticular hydrocarbons. J. Nat. Hist., 51, 1-8.

87

Brandl, R., Hyodo, F., Korff-Schmising, M. v., Maekawa, K., Miura, T., Takematsu, Y., . . . Kaib, M. (2007). Divergence times in the termite genus Macrotermes (Isoptera: Termitidae). Mol. Phylogenetics Evol., 45(1), 239-250. Brown, B. V. (2004). Revision of the subgenus Udamochiras of Melaloncha bee-killing flies (Diptera: Phoridae: Metopininae). Zool. J. Linn. Soc., 140(1), 1-42. Brown, B. V., Hash, J. M., Hartop, E. A., Porras, W., & Amorim, D. d. S. (2017). Baby killers: documentation and evolution of scuttle fly (Diptera: Phoridae) parasitism of ant (Hymenoptera: Formicidae) Brood. Biodivers. Data J., 5, 1-9. Brown, B. V., & Oliver, H. (2007). First records of Megaselia scalaris (Loew) and M. spiracularis Schmitz (Diptera: Phoridae) from New Zealand, with additional information on other worldwide species. N. Z. Entomol., 30, 85-87. Brues, C. T. (1925). A Japanese Dohrniphora bred from dead snails (Diptera: Phoridae). Psyche, 32(6), 313. Brune, A. (2009). Symbionts aiding digestion. In V. H. Resh & R. T. Cardé (Eds.), Encyclopedia of Insects (Second Edition) (pp. 978-983). San Diego: Academic Press. Cham, D. T., Fombong, A. T., Ndegwa, P. N., Irungu, L. W., Nguku, E., & Raina, S. K. (2018). Megaselia scalaris (Diptera: Phoridae), an opportunist parasitoid of honey bees in Cameroon. Afr. Entomol., 26(1), 254-258. Costa, J., Almeida, C. E., Esperanca, G. M., Morales, N., Dos S. Mallet, J. R., Goncalves, T. C., & Do Prado, A. P. (2007). First record of Megaselia scalaris (Loew) (Diptera: Phoridae) infesting laboratory colonies of Triatoma brasiliensis Neiva (Hemiptera: Reduviidae). Neotrop. Entomol., 36(6), 987-989. Coulson, R. N., & Witter, J. A. (1984). Insect orders: Isoptera. In Forest Entomology: Ecology and Management (pp. 67). New York: John Wiley & Sons, Inc. Coupland, J. B., & Barker, G. M. (2004). Diptera as predators and parasitoids of terrestrial gastropods, with emphasis on Phoridae, Calliphoridae, Sarcophagidae, Muscidae and Fanniidae. In G. M. Barker (Ed.), Natural Enemies of Terrestrial Molluscs (pp. 85-158). Wallingford: CABI Publishing. Cranston, P. S., & Gullan, P. J. (2009). Phylogeny of insects. In V. H. Resh & R. T. Cardé (Eds.), Encyclopedia of Insects (Second Edition) (pp. 780-793). San Diego: Academic Press.

88

Debnath, P., & Roy, D. (2019). First record of Megaselia scalaris (Loew) as a potential facultative parasitoid of Apis mellifera in India. Asian J. Biol., 7(1), 1-9. Disney, R. H. L. (1982). A scuttle fly (Diptera: Phoridae) that appears to be a parasitoid of a snail (Stylommatophora: Zonitidae) and is itself parasitised by a Braconid (Hymenoptera). Entomol.’s Rec. J. Var., 94, 151-154. Disney, R. H. L. (1983). Scuttle Flies: Diptera, Phoridae (Except Megaselia): Handbooks for the Identification of British Insects Vol. 10, Part 6. London: Royal Entomological Society of London. Disney, R. H. L. (1986). Two remarkable new species of scuttle-fly (Diptera: Phoridae) that parasitize termites (Isoptera) in Sulawesi. Syst. Entomol., 11(4), 413-422. Disney, R. H. L. (1989). Scuttle Flies: Diptera, Phoridae (Genus Megaselia): Handbooks for the Identification of British Insects Vol.10, Part 8. London: Royal Entomological Society of London. Disney, R. H. L. (1994). Scuttle Flies: The Phoridae. Netherlands: Springer. Disney, R. H. L. (2008). Natural history of the scuttle fly, Megaselia scalaris. Annu. Rev. Entomol., 53, 39-60. Disney, R. H. L., & Chazeau, J. (1990). The recognition and biology of Phalacrotophora quadrimaculata (Diptera: Phoridae) parasitising Olla v-nigrum (Coleoptera: Coccinellidae) used in attempts to control the Leucaena psyllid. Ann. Parasitol. Hum. Comp., 65(2), 98- 100. Disney, R. H. L., & Kistnek, D. H. (1990). Revision of the termite-parasitizing genus Dicranopteron (Diptera: Phoridae). Zool. J. Linn. Soc., 98(2), 111-122. Disney, R. H. L., Neoh, K. B., & Lee, C. Y. (2009). A new species of scuttle fly (Diptera: Phoridae) parasitizing a termite (Isoptera: Termitidae) in Malaysia. Sociobiology, 54(1), 89-94. Diyes, G. C. P., Karunaratne, W. A. I. P., Tomberlin, J. K., & Rajakaruna, R. S. (2015). First record of Megaselia scalaris (Loew) (Diptera: Phoridae) infesting a spinose ear tick, Otobius megnini, colony in Sri Lanka. Trop. Biomed., 32(4), 791-795. Donovan, S. E., Eggleton, P., & Bignell, D. E. (2001). Gut content analysis and a new feeding group classification of termites. Ecol Entomol., 26, 356-366.

89

Durska, E., Ceryngier, P., & Disney, R. H. L. (2003). Phalacrotophora beuki (Diptera: Phoridae), a parasitoid of ladybird pupae (Coleoptera: Coccinellidae). Eur. J. Entomol., 100(4), 627-630. Eggleton, P., & Tayasu, I. (2001). Feeding groups, lifetypes and the global ecology of termites. Ecol. Res., 16, 941-960. Faria, L. D. B., Godoy, W. A. C., & Dos Reis, S. F. (2004). Larval predation on different instars in blowfly populations. Braz. Arch. Biol. Technol., 47(6), 887-894. Feener, D. H., Jr., & Brown, B. V. (1997). Diptera as parasitoids. Annu. Rev. Entomol., 42(1), 73- 97. Feng, D. X., & Liu, G. C. (2012). Morphology of immature stages of Dohrniphora cornuta (Bigot) (Diptera: Phoridae). Microscopy Research and Technique, 75(11), 1528-1533. Foo, F. K., Othman, A. S., & Lee, C. Y. (2011). Morphology and development of a termite endoparasitoid Misotermes mindeni (Diptera: Phoridae). Ann. Entomol. Soc. Am., 104(2), 233-240. Foo, F. K., Othman, A. S., & Lee, C. Y. (2012). Parasitism by parasitoid Misotermes mindeni (Diptera: Phoridae) increases frequencies of trophallaxis and allogrooming in Macrotermes gilvus (Blattodea: Termitidae). Paper presented at the Proceedings of the 9th Pacific-Rim Termite Research Group Conference (27 – 28 February 2012), Hanoi, Vietnam. Foo, F. K., Othman, A. S., & Lee, C. Y. (2015). Longevity, trophallaxis, and allogrooming in Macrotermes gilvus soldiers infected by the parasitoid fly Misotermes mindeni. Entomol. Exp. Appl., 155(2), 154-161. Foo, F. K., Singham, G. V., Othman, A. S., & Lee, C. Y. (2011). Prevalence of a koinobiont endoparasitoid Misotermes mindeni (Diptera: Phoridae) in colonies of the fungus-growing termite Macrotermes gilvus (Blattodea: Termitidae) in Malaysia. J. Econ. Entomol., 104(5), 1675-1679. Geigy, R., Hecker, H., & Keiser, F. (1964). Parasitische dipterenlarven in soldaten von Bellicositermes bellicosus (Smeath) (Isoptera). Acta Tropica., 21, 280–286. Gonzalez, L., & Brown, B. V. (2004). New species and records of Melaloncha (Udamochiras) bee- killing flies (Diptera: Phoridae). Zootaxa, 730, 1–14.

90

Gurney jr., T., Elbel, R., Ratnapradipa, D., & Brossard, R. (2000). Introduction to the molecular phylogeny of insects. In S. J. Karcher (Ed.), Tested Studies for Laboratory Teaching, Volume 21: Proceedings of the 21st Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE) (pp. 63-79). Lincoln, Nebraska: The University of Nebraska- Lincoln. Hall, T. A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for 349 Windows 95/98/NT. Nucleic. Acids. Symp. Ser., 41, 95–98. Hash, J. M., & Brown, B. V. (2015). Revision of the new world species of the millipede-parasitic genus Myriophora Brown (Diptera: Phoridae). Zootaxa, 4035(1), 1-79. Hash, J. M., Brown, B. V., Smith, P. T., & Kanao, T. (2013). A molecular phylogenetic analysis of the genus Dohrniphora (Diptera: Phoridae). Ann. Entomol. Soc. Am., 106(4), 401-409. Hash, J. M., Millar, J. G., Heraty, J. M., Harwood, J. F., & Brown, B. V. (2017). Millipede defensive compounds are a double-edged sword: natural history of the millipede-parasitic genus Myriophora Brown (Diptera: Phoridae). J. Chem. Ecol., 43(2), 198-206. Inoue, T., Kirtibutr, N., & Abe, T. (2001). Underground passage system of Macrotermes carbonarius (Isoptera, Termitidae) in a dry evergreen forest of northeast Thailand. Insectes soc., 48(4), 372-377. Inward, D., Beccaloni, G., & Eggleton, P. (2007). Death of an order: a comprehensive molecular phylogenetic study confirms that termites are eusocial cockroaches. Biol. Lett., 3(3), 331- 335. Koch, N. M., Fontanarrosa, P., Padró, J., & Soto, I. M. (2013). First record of Megaselia scalaris (Loew) (Diptera: Phoridae) infesting laboratory stocks of mantids (Parastagmatoptera tessellata, Saussure). Arthropods, 2(1), 1-6. Krishna, K., Grimaldi, D. A., Krishna, V., & Engel, M. S. (2013). Treatise on the Isoptera of the world. Bull. Am. Mus. Nat. Hist., 377(7), 1-200. Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., & Tamura, K. (2018). MEGA X: molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Mol. Biol. Evol., 35(6), 1547-1549. Lee, C. C., Neoh, K. B., & Lee, C. Y. (2012). Caste composition and mound size of the subterranean termite Macrotermes gilvus (Isoptera: Termitidae: Macrotermitinae). Ann. Entomol. Soc. Am., 105(3), 427-433.

91

Lewis, V. R. (2009). Isoptera: (Termites). In V. H. Resh & R. T. Cardé (Eds.), Encyclopedia of Insects (Second Edition) (pp. 535-538). San Diego: Academic Press. Liu, G. C. (2015). Revision of the genus Dohrniphora Dahl (Diptera: Phoridae) from China. Zootaxa, 3986(3), 307-331. Liu, G. C., & Chen, G. (2019). New scuttle flies (Diptera: Phoridae) reared from dead Termite, Odontotermes formosanus (Shiraki, 1909) (Isoptera: Termitidae) in China. Zootaxa, 4551(2), 237-243. Lutz, M. A., & Brown, B. V. (2013). New host association: Polybia scutellaris (Hymenoptera, Vespidae) parasitized by Melaloncha (Diptera, Phoridae). Rev. Bras. Entomol., 57(2), 238– 239. Machkour-M'Rabet, S., Dor, A., & Hénaut, Y. (2015). Megaselia scalaris (Diptera: Phoridae): an opportunistic endoparasitoid of the endangered Mexican redrump tarantula, Brachypelma vagans (Araneae: Theraphosidae). J. Arachnol., 43, 115-119. Marchiori, C. H. (2018). First occurrence of Megaselia scalaris (Loew) (Diptera: Phoridae) in pupae of Palaeosepsis sp. (Diptera: Sepsidae) in Brazil. International Journal of Research in Pharmacy and Biosciences, 5(3), 7-9. McCorquodale, A., Cuda, J. P., & Porter, S. D. (Producer). (2017, January 15, 2019). Fire Ant Decapitating Flies - Pseudacteon spp. (Insecta: Diptera: Phoridae). Retrieved from http://entnemdept.ufl.edu/creatures/beneficial/flies/ant_decapitating_phorids.htm Merritt, R. W., Courtney, G. W., & Keiper, J. B. (2009). Diptera (Flies, Mosquitoes, Midges, Gnats). In V. H. Resh & R. T. Cardé (Eds.), Encyclopedia of Insects (Second Edition) (pp. 284-297). San Diego: Academic Press. Mills, N. (2009). Parasitoids. In V. H. Resh & R. T. Cardé (Eds.), Encyclopedia of Insects (Second Edition) (pp. 748-751). San Diego: Academic Press. Miranda-Miranda, E., Cossío-Bayúgar, R., Martinez-Ibañez, F., & Bautista-Garfias, C. R. (2010). Megaselia scalaris reared on Rhipicephalus (Boophilus) microplus laboratory cultures. Med. Vet. Entomol., 25(3), 344-347. Morrison, L. W. (2000). Mechanisms of Pseudacteon parasitoid (Diptera: Phoridae) effects on exploitative and interference competition in host Solenopsis ants (Hymenoptera: Formicidae). Ann. Entomol. Soc. Am., 93(4), 841-849.

92

Morrison, L. W. (2012). Biological control of Solenopsis fire ants by Pseudacteon parasitoids: theory and practice. Psyche, 2012, 1-11. Morrison, L. W., Dall'Aglio-Holvorcem, C. G., & Gilbert, L. E. (1997). Oviposition behavior and development of Pseudacteon flies (Diptera: Phoridae), parasitoids of Solenopsis fire ants (Hymenoptera: Formicidae). Environ. Entomol., 26(3), 716-724. Moskowitz, N. A., Roland, A. B., Fischer, E. K., Ranaivorazo, N., Vidoudez, C., Aguilar, M. T., . . . O’Connell, L. A. (2018). Seasonal changes in diet and chemical defense in the climbing mantella frog (Mantella laevigata). PLOS ONE, 13(12), 1-20. Nalepa, C. A., & Lenz, M. (2000). The ootheca of Mastotermes darwiniensis Froggatt (Isoptera: Mastotermitidae): homology with cockroach oothecae. Proc. R. Soc. Lond. B, 267, 1809- 1813. Nauer, P. A., Hutley, L. B., & Arndt, S. K. (2018). Termite mounds mitigate half of termite methane emissions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 115(52), 13306-13311. Neoh, K. B. (2014). Ecological adaptation success of the sympatric higher termites, Macrotermes gilvus and Macrotermes carbonarius. Paper presented at the Proceedings of the 10th Pacific-Termite Research Group Conference, Kuala Lumpur, Malaysia. Neoh, K. B., & Lee, C. Y. (2009a). Developmental stages and castes of two sympatric subterranean termites Macrotermes gilvus and Macrotermes carbonarius (Blattodea: Termitidae). Ann. Entomol. Soc. Am., 102(6), 1091-1098. Neoh, K. B., & Lee, C. Y. (2009b). Dipteran parasitism of subterranean termite soldiers, Macrotermes gilvus (Hagen) and Macrotermes carbonarius (Hagen) (Termitidae: Macrotermitinae). Paper presented at the Proceedings of the 6th Conference of the Pacific- Rim Termite Research Group, Kyoto, Japan. Neoh, K. B., & Lee, C. Y. (2009c). Flight activity of two sympatric termite species, Macrotermes gilvus and Macrotermes carbonarius (Termitidae: Macrotermitinae). Environ. Entomol., 38(6), 1697-1706. Neoh, K. B., & Lee, C. Y. (2010). Behavioral and morphological changes in soldiers of Macrotermes gilvus (Termitidae: Macrotermitinae) parasitized by Misotermes mindeni (Diptera: Phoridae). Environ. Entomol., 39(3), 835-840.

93

Neoh, K. B., & Lee, C. Y. (2011). The parasitoid, Verticia fasciventris causes morphological and behavioral changes in infected soldiers of the fungus-growing termite, Macrotermes carbonarius. J. Insect Sci., 11(47), 1-11. Neoh, K. B., Lenz, M., & Lee, C. Y. (2010). Impact of orphaning on field colonies of Southeast Asian Macrotermes gilvus (Hagen) and M. carbonarius (Hagen) (Termitidae, Macrotermitinae). Insect. Soc., 57(4), 431-439. O'Brien, R. W., & Slaytor, M. (1982). Role of microorganisms in the metabolism of termites. Aust. J. Bioi. Sci., 35, 239-262. Porter, S. D., & Gilbert, L. E. (2004). Assessing host specificity and field release potential of fire ant decapitating flies (Phoridae: Pseudacteon). In R. G. Van Driesche, T. Murray, & R. Reardon (Eds.), Assessing Host Ranges for Parasitoids and Predators Used for Classical Biological Control: A Guide to Best Practice (pp. 152-176). Morgantown, West Virginia: USDA Forest Service. Quesada-Béjar, V., Nájera-Rincón, M. B., Reyes-Novelo, E., & González-Esquivel, C. E. (2017). Primer registro de Megaselia sp. (Diptera: Phoridae) como parasitoide de Sphenarium purpurascens purpurascens (Orthoptera: Pyrgomorphidae). Acta Zoológica Mexicana (Nueva Serie), 33(2), 407-410. Radek, R., Meuser, K., Altinay, S., Lo, N., & Brune, A. (2019). Novel lineages of oxymonad flagellates from the termite Porotermes adamsoni (Stolotermitidae): the genera Oxynympha and Termitimonas. Protist, 170(6), 125683. Radek, R., Meuser, K., Strassert, J., Arslan, O., Teßmer, A., Šobotník, J., . . . Brune, A. (2017). Exclusive gut flagellates of Serritermitidae suggest a major transfaunation event in lower termites: description of Heliconympha glossotermitis gen. nov. spec. nov. J. Eukaryot. Microbiol., 65(1), 77-92. Rahman, H., Fernandez, K., & Arumugam, N. (2017). Termites of Sabah. In M. A. Khan & W. Ahmad (Eds.), Termites and Sustainable Management: Volume 2 - Economic Losses and Management (pp. 101-104). Cham, Switzerland: Springer Nature. Rapley, R. (2009). Basic techniques in molecular biology. In J. M. Walker & R. Rapley (Eds.), Molecular Biology and Biotechnology (5th ed. ed., pp. 1-19). London: Royal Society of Chemistry.

94

Reid, N. M., Addison, S. L., West, M. A., & Lloyd-Jones, G. (2014). The bacterial microbiota of Stolotermes ruficeps (Stolotermitidae), a phylogenetically basal termite endemic to New Zealand. FEMS Microbiol. Ecol., 90(3), 678-688. Ricchiuti, L., Miranda, M., Venti, R., Bosi, F., Marino, L., & Mutinelli, F. (2016). Infestation of Apis mellifera colonies by Megaselia scalaris (Loew, 1866) in Abruzzo and Molise regions, central-southern Italy. J. Apic. Res., 55(2), 187-192. Rognes, K. (1991). Biology. In Fauna Entomologica Scandinavica Volume 24: Blowflies (Diptera, Calliphoridae) of Fennoscandia and Denmark (pp. 272). Leiden, Netherlands: E. J. Brill. Ruíz-Nájera, R. E., Molina-Ochoa, J., Carpenter, J. E., Espinosa-Moreno, J. A., Ruíz-Nájera, J. A., Lezama-Gutiérrez, R., & Foster, J. E. (2007). Survey for Hymenopteran and Dipteran parasitoids of the fall armyworm (Lepidoptera: Noctuidae) in Chiapas, Mexico. J. Agric. Urban Entomol., 24(1), 35-42. Šobotník, J., & Dahlsjö, C. A. (2017). Isoptera. In Reference Module in Life Sciences (pp. 1-32): Elsevier. Solgi, R., Djadid, N. D., Eslamifar, A., Raz, A., & Zakeri, S. (2017). Morphological and molecular characteristic of Megaselia scalaris (Diptera: Phoridae) larvae as the cause of urinary myiasis. J. Med. Entomol., 54(3), 781-784. Somavilla, A., Schoeninger, K., Carvalho, A. F., Menezes, R. S. T., Del Lama, M. A., Costa, M. A., & Oliveira, M. L. (2015). Record of parasitoids in nests of social wasps (Hymenoptera: Vespidae: Polistinae). Sociobiology, 62(1), 92-98. Sornnuwat, Y., Vongkaluang, C., & Takematsu, Y. (2004). A systematic key to termites of Thailand. Kasetsart J. (Nat. Sci.). 38(3), 349-368. Sze, T. W., Pape, T., & Toole, D. K. (2008). The first blow fly parasitoid takes a head start in its termite host (Diptera: Calliphoridae, Bengaliinae; Isoptera: Macrotermitidae). Syst. Biodivers., 6(1), 25-30. Tabery, J., Piotrowska, M., & Darden, L. (2019). Molecular Biology. The Stanford Encyclopedia of Philosophy. Jun 27, 2019. Retrieved from https://plato.stanford.edu/archives/fall2019/entries/molecular-biology/

95

Thyssen, P. J. (2010). Keys for identification of immature insects. In J. Amendt, M. L. Goff, C. P. Campobasso, & M. Grassberger (Eds.), Current Concepts in Forensic Entomology (pp. 25- 42). Dordrecht: Springer. To, T. M. D., Lee, C. C., & Lee, C. Y. (2016). A survey of the prevalence of endoparasitism by Vertica fasciventris Malloch (Diptera: Calliphoridae) in colonies of Macrotermes carbonarius (Hagen) (Blattodea: Termitidae) in Penang Island, Malaysia. Paper presented at the Proceedings of the 11th Pacific Rim Termite Research Group Conference (18 – 19 April 2016), Kunming, China. Tokuda, G. (2019). Digestion of plant cell walls by termites. In R. Jurenka (Ed.), Advances in Insect Physiology (Vol. 57, pp. 103-112). London: Academic Press. Trigunayat, M. M. (2016). Classification of insects. In A Manual of Practical Entomology (Field and Laboratory Guide), 3rd Ed. (pp. 26-28). Jodhpur: Scientific Publishers (India). Vitale, I. (2017). Molecular biology. In Reference Module in Life Sciences (pp. 1-2). Amsterdam: Elsevier. Wang, J. F., Shen, X. X., Feng, D. X., & Liu, G. C. (2013). DNA-based identification of sexual dimorphism in the Phoridae (Diptera). Chinese Journal of Applied Entomology, 50(1), 86- 92. Wang, Z., Shi, Y., Qiu, Z., Che, Y., & Lo, N. (2017). Reconstructing the phylogeny of Blattodea: robust support for interfamilial relationships and major clades. Sci. Rep., 7(3903), 1-8. Wuellner, C. T., Dall'Aglio-Holvorcem, C. G., Benson, W. W., & Gilbert, L. E. (2002). Phorid fly (Diptera: Phoridae) oviposition behavior and fire ant (Hymenoptera: Formicidae) reaction to attack differ according to Phorid species. Ann. Entomol. Soc. Am., 95(2), 257-266. Zacaro, A. A., & Porter, S. D. (2003). Female reproductive system of the decapitating fly Pseudacteon wasmanni Schmitz (Diptera: Phoridae). Arthropod Struct. Dev., 31(4), 329- 337. Zhang, X. S., Liu, G. C., Zhang, D. X., & Shi, C. M. (2017). Novel trophic interaction: the scuttle fly Megaselia scalaris (Diptera: Phoridae) is a facultative parasitoid of the desert scorpion Mesobuthus eupeus mongolicus (Scorpiones: Buthidae). J. Nat. Hist., 51(1-2), 1-15.

96

กนก พฤฒิวทัญญู, นนทชัย เอกชัยวรวุฒิ, ภาณุวัฒน์ ชุติวงศ์, นันทนา ศิริทรัพย์, & เผด็จ สิริยะเสถียร. (2553). การจา แนกสปีชีส์ของหนอนแมลงวนั ที่เกบ็ จากศพโดยใชเ้ ทคนิคทางอณูชีววทิ ยา. จุฬาลงกรณ์เวชสาร, 54(6), 637-647. เกศรินทร์ ทิพย์เพ็ชร์, ณรงค์ จัตุรัส, & นพวรรณ บุญชู. (2561). ดีเอ็นเอบาร์โค้ดสาหรับการระบุชนิด แมลงที่มีความสาคัญทางการแพทย์ขอ งประเทศไทย. วารสารวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี, 26(2), 313-328. จันทิยา อิสณพงษ์. (2559). บทบาทของ Verrucomicrobia ในลา ไส้ปลวกช้นั ต่า . วารสารวิทยาศาสตร์ ประยุกต์, 15(2), 103-119. จารุณี วงศ์ข้าหลวง, & ยุพาพร สรนุวัตร. (2547). ความรู้ทว่ั ไปเกี่ยวกบั ปลวก และการป้องกนั กา จดั . กรุงเทพฯ: สา นกั วิจยั เศรษฐกิจและผลิตผลป่าไม ้ กรมป่าไม.้ บรรพต ณ ป้อมเพชร. (2525). การควบคุมแมลงศัตรูพืชและวัชพืชโดยชีววิธี. กรุงเทพฯ: ศูนย์วิจัย ควบคุมศตั รูพืชโดยชีวนิ ทรียแ์ ห่งชาติ มหาวทิ ยาลยั เกษตรศาสตร์ / สา นกั งานคณะกรรมการ วจิ ยั แห่งชาติ. บัณฑิกา อารีย์กุล บุทเชอร์. (2558). ความหลากหลาย และความสัมพันธ์ทางวิวัฒนาการของแตนเบียน Superfamily Ichneumonoidea บนหมูเ่ กาะแสมสาร จงั หวดั ชลบุรี. Paper presented at the รายงานวจิ ยั ทุนอุดหนุนการวจิ ยั จากงบประมาณแผน่ ดินปี 2558 โครงการอนุรักษ์พันธุกรรม พืชอันเนื่องมาจากพระราชดาริ สมเด็จพระเทพรัตนราชสุดาฯ สยามบรมราชกุมาร, กรุงเทพฯ. พรณรงค์ สิริปิยะสิงห์, & อรุณรัตน์ ฉวีราช. (2554). ดีเอ็นเอบาร์โคด้ เพื่อการระบุชนิดของส่ิงมีชีวติ กรณีศึกษา: จีน Cytochrome c Oxidase I (COI) ในสัตว์. วารสารมหาวิทยาลัยราชภัฏ มหาสารคาม, 5(2), 205-210. ภรณี อุทโยภาศ. (2555). การจาแนกหนอนแดงโดยเทคนิคทางชีวโมเลกุล. วารสารวิทยาศาสตร์และ เทคโนโลยี, 20(4), 269-278. ยุพาพร สรนุวัตร, & สุรางค์ เธียรหิรัญ. (2548). ปลวกเพาะเล้ียงเช้ือราชนิดที่มีศกั ยภาพในการผลิต เห็ดโคนในประเทศไทย. Paper presented at the การประชุมทางวิชาการของ มหาวทิ ยาลยั เกษตรศาสตร์ คร้ังที่ 43, กรุงเทพฯ. รัชฎาภรณ์ จันทร. (2552). การจา แนกชนิดของแมลงวนั หวั เขียวที่สา คญั ทางนิติกีฏวทิ ยาในประเทศ ไทยจากบริเวณ second internal transcribed spacer ของ ribosomal DNA และยีน NADH dehydrogenase subunit 5. (วิทยานิพนธ์ปริญญาโท), จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, ลีลา กญิกนันท์, & อภิชยั หมูก่ อ้ น. (2552). เห็ดโคนกบั ปลวกและการเพาะเล้ียงเห็ดโคน. กรุงเทพฯ: สานักวิจัยและพัฒนาการป่าไม้ กรมป่าไม้

97

วัฒนชัย ตาเสน. (2562). Order Isoptera. In ลักษณะสัณฐานที่สาคัญของอันดับแ มลงในป่าเขตร้อน (pp. 45-46). กรุงเทพฯ: กองทุนจัดพิมพ์ตาราป่าไม้ คณะวนศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. วีรยุทธ ทองคง, สุรไกร เพ่ิมคา , & อรัญ งามผอ่ งใส. (2552). ปลวกในระบบนิเวศสวนยางพารา. วารสารมหาวิทยาลัยทักษิณ, 12(2), 34-42. สกล สุนันทราภรณ์. (2557). การวิเคราะห์ความผันแปรของยีน Cytochrome C Oxidase subunit I ใน ไมโตคอนเดรียดีเอ็นเอ ของเหาศีรษะ (Pediculus humanus capitis) ในประเทศไทย. (วิทยานิพนธ์ปริญญาโท), จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, สุชนมา สุขรักษาวงศ์, กุณฑิกา เวชกลาง, Garcia, L. E. G., กฤษณา ชายกวด, & นภาลัย เสมอใจ. (2561). ความหลากหลาย และบทบาทของปลวก ในป่าเต็งรัง และป่าเบญจพรรณ ในศูนย์ หนองระเวียง จังหวัดนครราชสีมา. Retrieved from นครราชสีมา: อิสระ อินตะนัย. (2530). อนุกรมวิธานและปัจจัยทางนิเวศบางประการของปลวกในจังหวัดจันทบุรี - ตราด. (วิทยานิพนธ์ปริญญาโท), จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย,

ภาคผนวก

ชุดสารเคมี และ การเตรียมสารส าหรับการศึกษาทางอณูชีววทิ ยา

ชุดสกดั DNA จากเนื้อเยื่อส าเร็จรูป Invisorb® Spin Tissue Mini Kit (STRASTEC Molecular GmbH, Germany) ประกอบด้วย

Lysis buffer G Binding buffer A Proteinase K Wash buffer Elution buffer

ชุดสกดั พลาสมิด DNA ส าเร็จรูป Invisorb® Spin Plasmid Mini Two (STRASTEC Molecular GmbH, Germany) ประกอบด้วย

Solution A Solution B Solution C Wash solution Elution solution

ชุดสารส าหรับการโคลน PCR product (DNA ligation) ประกอบด้วย

2X Rapid ligation buffer pGEM – T easy vector T4 DNA ligase Deionized water

99

ชุดสารส าหรับข้ันตอนการท า PCR ประกอบด้วย

10X NH4 buffer

50mM MgCl2 10mM dNTPs Taq DNA polymerase (5U/µl.)

การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อแบคทีเรีย Luria – bertani (LB agar) ปริมาตร 1 ลิตร

Bacto-trypton 10 กรัม Yeast extracts 5 กรัม 1M NaCl 10 กรัม Agar 10 กรัม

วิธีการเตรียม

ชง่ั สารท้งั หมดใส่ขวดขนาด 1 ลิตร ละลายดว้ ยน้า กลน่ั ปรับปริมาณใหไ้ ดป้ ริมาตร 1 ลิตร น่ึงฆา่ เช้ือ (autoclave) ที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนดต์ ่อตารางนิ้ว เวลา 20 นาที จากน้นั ต้งั ให้อุน่ ที่อุณหภูมิห้อง ใส่ยา ampicillin ความเข้มข้น 100 mg/µl. ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ผสม ใหเ้ ขา้ กนั เทลงจานเพาะเล้ียงเช้ือดว้ ยเทคนิคปลอดเช้ือ เก็บไวท้ ี่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส

กรณีอาหารเหลว (LB broth) เตรียมดว้ ยวธิ ีการเดียวกนั แต่ไมใ่ ส่ agar และ เติมยา ampicillin เมื่อต้องการนาไปใช้

การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อแบคทีเรีย SOB ปริมาตร 100 มิลลิลิตร และ SOC solution

Bacto-trypton 5 กรัม Yeast extracts 1.25 กรัม 1M NaCl 0.125 กรัม

100

วิธีการเตรียม SOB

ละลายสารท้งั หมดดว้ ยน้า กลน่ั ปริมาตร 90 มิลลิลิตร จากน้นั ใส่สารละลาย KCl ปริมาตร 625 ไมโครลิตร ปรับปริมาตรเป็น 100 มิลลิลิตร นา ไปน่ึงฆา่ เช้ือ (autoclave) ที่อุณหภูมิ 121 องศา เซลเซียส ความดัน 15 ปอนดต์ อ่ ตารางนิ้ว เวลา 20 นาที ทิ้งไวใ้ หเ้ ยน็ เกบ็ ไวท้ ี่อุณหภูมิ 4 องศา เซลเซียส

วิธีการเตรียม SOC

เติมสารละลาย 2M glucose, 1M Mgcl2 และ 1M MgSO4 ลงในอาหารเล้ียงเช้ือ SOB อตั ราส่วน 970: 10: 10: 10 ได้ปริมาตรรวม 1,000 ไมโครลิตร

การเตรียมสารละลาย 10X TAE buffer ปริมาตร 1 ลิตร

Tris base 48.4 กรัม

Na2EDTA·2H2O 3.7 กรัม Glacial acetic acid 11.4 มิลลิลิตร

น้า กลน่ั (ddH2O) 1 ลิตร

วิธีการเตรียม

ละลายสารเคมี tris base และ Na2EDTA·2H2O เขา้ ดว้ ยกนั ดว้ ยน้า กลน่ั ปรับ pH ให้ได้ 7.8 ด้วย glacial acetic acid ปรับปริมาตรให้ได้ 1 ลิตรดว้ ยน้า กลน่ั นา ไปน่ึงฆา่ เช้ือ (autoclave) ที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด์ตอ่ ตารางนิ้ว เวลา 20 นาที ก่อนใช ้

เมื่อจะนามาใช้ ให้เจือจางความเข้มข้นของ 10X TAE buffer โดยนา 10X TAE buffer ปริมาตร 100 มิลลิลิตร ผสมน้า กลน่ั ปริมาตร 900 มิลลิลิตร ได้สาร 1X TAE buffer สาหรับการใช้ งานตอ่ ไป

ประว ัติการศึกษา และการท างาน

ประวัติการศึกษา และการทางาน

ชื่อ-นามสกุล ร้อยโท นกน้อย วัน เดือน ปี เกิด 29 มกราคม 2539 สถานที่เกิด อา่ งทอง ทอี่ ยู่ปัจจุบัน 26/153 ม.เกษมทอง ซ.เพชรเกษม 114 ถ.เพชรเกษม แขวงหนองค้างพลู เขตหนองแขม กรุงเทพมหานคร 10160 ประวัติการศึกษา วท.บ. (เกษตรศาสตร์) เกียรตินิยมอนั ดบั หน่ึง สาขาวชิ ากีฏวทิ ยา มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ ทุนการศึกษา ทุนวิจัยระดับบัณฑิตศึกษา เพื่อการตีพิมพ์ผลงานในวารสารวิชาการระดับ นานาชาติ บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ ประจาปีงบประมาณ พ.ศ.2561