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CARACTERISATION DE LA FAMILLE DES MAPKs ET DES MAP2Ks CHEZ LE PEUPLIER (POPULUS TRICHOCARPA) ET EVALUATION DE LEURS IMPLICATIONS EN DEFENSE par Louis-Philippe Hamel These presentee au Departement de biologie en vue de l'obtention du grade de docteur es sciences (Ph.D.) FACULTE DES SCIENCES UNIVERSITE DE SHERBROOKE Sherbrooke, Quebec, Canada, juin 2008 Library and Bibliotheque et 1*1 Archives Canada Archives Canada Published Heritage Direction du Branch Patrimoine de I'edition 395 Wellington Street 395, rue Wellington Ottawa ON K1A0N4 Ottawa ON K1A0N4 Canada Canada Your file Votre reference ISBN: 978-0-494-48555-2 Our file Notre reference ISBN: 978-0-494-48555-2 NOTICE: AVIS: The author has granted a non­ L'auteur a accorde une licence non exclusive exclusive license allowing Library permettant a la Bibliotheque et Archives and Archives Canada to reproduce, Canada de reproduire, publier, archiver, publish, archive, preserve, conserve, sauvegarder, conserver, transmettre au public communicate to the public by par telecommunication ou par Plntemet, prefer, telecommunication or on the Internet, distribuer et vendre des theses partout dans loan, distribute and sell theses le monde, a des fins commerciales ou autres, worldwide, for commercial or non­ sur support microforme, papier, electronique commercial purposes, in microform, et/ou autres formats. paper, electronic and/or any other formats. The author retains copyright L'auteur conserve la propriete du droit d'auteur ownership and moral rights in et des droits moraux qui protege cette these. this thesis. Neither the thesis Ni la these ni des extraits substantiels de nor substantial extracts from it celle-ci ne doivent etre imprimes ou autrement may be printed or otherwise reproduits sans son autorisation. reproduced without the author's permission. In compliance with the Canadian Conformement a la loi canadienne Privacy Act some supporting sur la protection de la vie privee, forms may have been removed quelques formulaires secondaires from this thesis. ont ete enleves de cette these. While these forms may be included Bien que ces formulaires in the document page count, aient inclus dans la pagination, their removal does not represent il n'y aura aucun contenu manquant. any loss of content from the thesis. Canada Le 29 aout 2008 lejury a accepte la these de M. Louis-Philippe Hamel dans sa version finale. Membres dujury Mme Nathalie Beaudoin Directrice Departement de biologie M. Armand Seguin Codirecteur Centre de foresterie des Laurentides M. Ryszard Brzezinski Membre Departement de biologie M. Peter Moffet Membre externe Boyce Thomson Institute for Plant Research M. Richard Blouin President-rapporteur Departement de biologie SOMMAIRE Pour demeurer competitifs, les organismes multicellulaires se doivent de developper des precedes leur permettant de s'adapter aux conditions de leur environnement. A plus petite echelle, ces mecanismes d'adaptation passent par la differenciation de types cellulaires varies et par la creation de reponses assurant le maintien de l'integrite de ces cellules. Evidemment, pour etre profitables, les modifications mises en place se doivent d'etre finement regulees en intensite et en temps. Selon les conditions, les cellules arrivent a ce niveau de precision en utilisant la signalisation intracellulaire, un processus pourvu de multiples avenues et assurant une transition optimale d'un etat cellulaire a un autre. Chez les mammiferes, des efforts de recherche importants ont permis d'elucider une gamme complexe et diversifiee de voies de signalisation. Au sein de ces dernieres, les proteines kinases sont frequemment retrouvees en tant que mediateurs clefs. Les Mitogen- Activated Protein Kinases (MAPKs) font par exemple partie de ces acteurs fondamentaux qui regulent une foule de reponses distinctes au sein de divers types cellulaires. Certaines MAPKs ont en effet ete associees a la proliferation et a la differenciation des cellules, alors que d'autres promouvoient l'etablissement des mecanismes de reponse face aux stress. De maniere interessante, les MAPKs fonctionnent en cascades et dependent done de l'activite d'autres proteine kinases appellees les MAPK Kinases (MAP2Ks). Ces dernieres sont retrouvees en amont dans la voie de signalisation et dependent elles memes de l'activite d'une autre classe de proteine kinases soient les MAPKK Kinases (MAP3Ks). Vexistence de ces differents echelons assure une multiplicite et une specificite des signaux emis par ces modules proteiques complexes. Chez les plantes, l'existence des MAPKs a ete demontree des 1993, mais e'est seulement avec le sequen?age complet du genome de la plante annuelle Arabidopis thaliana qu'on a obtenu un portrait global de cette famille de proteine chez les vegetaux. Avec l'achevement recent du sequen?age du genome du peuplier (Populus trichocarpa), notre objectif etait de decouvrir et de caracteriser l'ensemble des genes codant pour les MAPKs et ii les MAP2Ks chez une espece vegetale perenne. Les 32 sequences obtenues (21 MAPKs et 11 MAP2Ks) ont ete comparees avec celles d'A. thaliana et avec celles du riz {Oryza sativa), ce qui a permis de mieux definir la classification phylogenetique en quatre groupes (A, B, C et D) pour chaque famille. De plus, en se basant sur l'homologie de sequence proteique, ces travaux ont permis de pointer les orthologues susceptibles de partager des roles fonctionnels au sein de leur systeme vegetal respectif. Une nomenclature refletant ces aspects et respectant les appellations prealablement etablies pour A. thaliana a ete suggeree pour les genes de peuplier et de riz. Cette nomenclature «consolidee» est maintenant largement acceptee au sein de la communaute scientifique. L'etude de la famille des MAPKs et des MAP2Ks de peuplier {PtMPKs et PtMKKs respectivement) a par la suite ete approfondie avec revaluation de la distribution genomique et de la structure genetique des membres. Ces travaux confirment 1'importance des evenements de duplication genomique dans la generation de paires de genes paralogues chez le peuplier. Ces travaux ont aussi permis de demontrer l'importance de la conservation au sein de ces deux families de genes. Cette derniere s'etend en effet bien au-dela de la sequence proteique primaire des differents membres de la famille. Ainsi, des elements tels le nombre, la position et la phase des introns sont strictement conserves a l'interieur des membres d'un meme groupe phylogeletique. Cette conservation outrepasse meme les barrieres de revolution et est parfaitement retouvee chez d'autres especes de plantes comme A. thaliana. Une approche de reactions de polymerisation en chaine en temps reel (RTqPCR) a enfin permis de quantifier le nombre de transcrits pour chaque gene et done d'effectuer un survol global des niveaux d'expression tissulaire et organellaire pour toutes les PtMPKs et les PtMKKs. Ces experiences montrent que la grande majorite des membres de ces deux families s'expriment a differents niveaux dans les diverses parties de l'arbre. Plusieurs couples de genes paralogues possedent des membres s'exprimant au sein des memes tissus et organes, ce qui suggere une possible redondance fonctionelle. Dans certains cas, notre demarche confirme tout de meme l'existence de differences d'expression au sein des membres de paires de genes paralogues. Ces decouvertes suggerent fortement que ces paralogues pourraient remplir des fonctions distinctes, malgre la tres grande proximite de sequence qui les caracterisent. iii Apres avoir initie la caracterisation de tous les membres de nos deux families de proteines kinases, nos travaux se sont concentres sur l'etude du role des MAPKs de stress dans l'etablissement des mecanismes de defense du peuplier. Pour ce faire, nous avons d'abord utilise des cellules en suspension de cette espece. Ces cellules ont permis de demontrer l'activation rapide et transitoire de MAPKs, suivant l'application de stress biotiques ou abiotiques. Ce systeme en milieu liquide a aussi facilite Pemploi de divers inhibiteurs pharmacologiques permettant de positionner ces cascades en aval de l'activite de recepteurs membrannaires, de la signalisation par le calcium et de la generation des especes activees de l'oxygene. L'etude du role des MAPKs de stress s'est aussi accomplie en regard d'une maladie majeure appellee la rouille foliaire du peuplier. Cette maladie est causee par un champignon biotrophe obligatoire appelle Melampsora spp. L'infection de tissus de peuplier avec certaines formes de cet agent pathogene a permis de demontrer la mobilisation tardive et soutenue des MAPKs du groupe A. La construction d'une banque d'ADNc et l'utilisation de la technique du double hybride chez la levure a par la suite permis d'isoler des interacteurs potentiels situes en amont et en aval de nos MAPKs. L'interacteur le plus prometteur ayant ete isole a ete baptise PtZFPl (Populus trichocarpa Zinc Finger Protein 1), et consiste en un facteur de transcription (FT) possedant deux domaines a doigt de zinc. Ces domaines fondamentaux permettent la liaison sequence specifique a l'ADN, ce qui permet a la proteine de moduler la transcription de genes cibles. PtZFPl fait partie de la sous-classe Cl-2i de la famille des proteines a deux doigts de zinc (Cys2/His2-type two-zinc fingered proteins). Plusieurs facteurs de transcription de ce groupe ont pu etre associes a la reponse de defense face aux stress biotiques et abiotiques. En plus de ces domaines de liaison a l'ADN, la region C-terminale de PtZFPl contient un motif EAR (ERF-Amphiphilic Repression motif), lui conferant une activite de repression de la transcription. Des experiences de deletion confirment que la portion proteique responsable de 1'interaction avec les MAPKs comprend ce court motif de repression de la transcription. En etudiant plus en details cette region, on constate qu'elle renferme deux determinants clefs creant un site consensus de liaison aux MAPKs. Ces IV determinants consistent en un enrichissement en acides amines basiques (lysines et/ou arginines) et en une succession de leucines separees par un seul residu.

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