New Insights Into the Regulation of NADPH Oxidase Dependent Reactive Oxygen Species Signaling During the Plant Immune Response
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UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS New insights into the regulation of NADPH oxidase dependent reactive oxygen species signaling during the plant immune response PhD Thesis JORGE MORALES BELLO Bachelor in Biology, MSc in Agricultural and Forestry Biotechnology 2015 UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS Departamento de Biotecnología y Biología Vegetal Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (UPM-INIA) New insights into the regulation of NADPH oxidase dependent reactive oxygen species signaling during the plant immune response PhD Thesis JORGE MORALES BELLO Bachelor in Biology, MSc in Agricultural and Forestry Biotechnology 2015 i ii UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS Departamento de Biotecnología y Biología Vegetal Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (UPM-INIA) PhD Thesis: New insights into the regulation of NADPH oxidase dependent reactive oxygen species signaling during the plant immune response Author: Jorge Morales Bello Bachelor in Biology, MSc in Agricultural and Forestry Biotechnology Supervisor: Miguel Ángel Torres Lacruz Bachelor in Sciences (section Biology) PhD in Biology Madrid, 2015 iii iv ACKNOWLEDGEMENTS This Philosophy Doctorate (PhD) Thesis has been carried out at Dr. Antonio Molina Fernandez´s laboratory, associated to the Biotechnology department of the Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos (Universidad Politénica de Madrid) located at the Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (UPM-INIA). The work performed has been supervised by Dr. Miguel Angel Torres Lacruz. The following people have contributed to the results obtained: Dr. Miguel Ángel Torres Lacruz has directed this research work and my scientific predoctoral training. He was also directly involved in the generation of the promoter-Rboh::GUS, promoter-swap genetic constructs employed in chapter 1, and the 35S::YFP::RbohD genetic construct employed in chapter 2. Moreover, he generated the combinatorial mutant lines: agb1 gpa1, agb1 rbohD rbohF and agb1 gpa1 rbohD rbohF by genetic crosses and collaborated in the experimental work to obtain the results presented in figures: 1, 4 and 5 (chapter 2). Dr. Antonio Molina Fernández has contributed to the attainment of this PhD Thesis with useful comments and discussion of the results obtained, allowing me to use all the resources in his laboratory and co- funding the second half of my PhD. Dr. Cyril Zipfel advised me during the EMBO proposal writing and in the experimental design of the biochemical work carried out to test the potential association between RBOHs, BIK1 and AGB1. He also allowed me to use the resources in his laboratory to carry out the experiments shown in figures 3B, 4 and 9A (chapter 1) and figures 8 and 10, (chapter 2). Begoña Prieto, former laboratory technician, contributed to the generation of promoter-Rboh:GUS, promoter-swap transgenic lines and the 35S::YFP::RbohD genetic construct. Gemma López, laboratory technician at Dr. Antonio Molina´s group, was in charge of the generation and storage of the Plectosphaerella cucumerina monosporic cultures employed. Dr. Clara Shánchez Rodríguez, former postdoctoral researcher at Dr. Staffan Persson’s group at the Max Planck Institute, contributed to the pathotests of the combinatorial mutants between heterotrimeric G proteins and NADPH oxidases in response to Plectosphaerella cucumerina. Dr. Shuta Asai, postdoctoral researcher at Dr. Jonathan Jones group at TSL, generated and shared the 35S::FLAG::RbohF construct employed in the co-immunoprecipitation assays on figure 10 chapter 2. Dr. Brisa Ramos and Dr. Beatríz Nuñez, former postdoctoral researchers at Dr. Antonio Molina´s group, and Dr. Alberto Macho, Dr. Yasuhiro Kadota and Dr. Rosa Lozano, former postdoctoral researchers at Dr. Cyril Zipfel´s group, have made useful comments and suggestions critical to the advancement of this research work. Dr. Yasuhiro Kadota generated the 35S::FLAG::RbohD and 35S::Bik1::HA genetic constructs used in the co-immunoprecipitation assays on figure 10 chapter 2 and, together with Dr. Alberto Macho, have technically advised me during the performance of these experiments. v Dr. Christoph Bücherl, postdoctoral researcher at Dr. Cyril Zipfel´s group, technically assisted me at the confocal microscope to detect the transient expression of YFP-AGB1. The Universidad Politécnica de Madrid (UPM) has funded my PhD with a co-fund UPM predoctoral fellowship associated to the European Reintegration Grant 0/562971 granted to Dr. Miguel Angel Torres Lacruz. The European Molecular Biology Organization (EMBO) and the UPM have funded my stays at The Sainsbury Laboratory in Norwich (UK). vi AGRADECIMIENTOS PERSONALES Si algo he aprendido durante este periodo es que para llevar un proyecto a cabo, tan importantes son las ideas, los medios y la financiación como las personas que te rodean. Por ello no puedo dejar pasar la oportunidad de dar las gracias a la gente que ha estado a mi lado durante este proceso: To Cyril and “his crew” for making me feel at home during my stays at TSL, specially to: Daniel Couto Diewertje Van der Does, Yasuhiro Kadota, Martin Stegman, Lena Strandsfeld and Christoph Bücherl. Mención a parte merecen Rosa y Alberto. Vaya dos IPs que se está perdiendo España... Sin duda uno de los mejores aspectos de esta Tesis ha sido poder compartir camino y ciencia con vosotros. Simplemente muchas gracias. Nos vemos en Shanghai! A Fernando por sus ánimos durante la aplicación para EMBO, su apoyo en momentos de flaqueza y por compartir conmigo útiles y sinceros consejos sobre la vida y la ciencia. A mis compañeros del 227, especialmente a Manu, Jim y Nils: habéis hecho del lugar de trabajo un sitio mucho más agradable. También a Livia e Israel que desinteresadamente han tenido siempre su puerta abierta para resolver mis incordiosas dudas. A Isa, Virginia y Alfonso, compañeros de Master y de precariedad, gracias por vuestra complicidad. Sin esos tés, cafés y cervezas la Tesis se habría hecho realmente cuesta arriba. A mis compañeros del 232-234 y muy especialmente a Mada, Bego, Bea, Brisa y Gemma. En pocas palabras: calma, humor, amabilidad, locura y conexión cómplice, id preparando la pamela! Por supuesto un guiño a la gente de la primera planta, Mar, Miguel Angel, Laura, Inma, Jan e Iván con quien he compartido menús y tuppers a discreción. Definitivamente las penas con palmeras de chocolate son menos (y las alegrías más!). A Pilar, Ramiro y Suso, gracias por vuestra amistad y por ser una fuente de motivación y energía positiva desde los inicios de la carrera. Mención especial para Miguel, que ha compartido conmigo prácticamente cada paso del camino desde hace 11 años, ya son historias… facturas, sangre, sudor y lágrimas, pero también muchas risas, viajes y alegrías. Mike, mil gracias por estar ahí siempre aportándome cosas positivas. Gracias también a “mi artista preferido”, Andrés Pachón, por sus consejos express sobre edición de imagen y por ayudarme a fotografiar la Arabidopsis que aparece en la portada de esta Tesis. Espero que sigamos celebrando grandes éxitos y fracasos. A mis padres, quienes me han apoyado siempre. Sois las mejores personas que uno puede tener cerca, tanto si el viento sopla a favor como si vienen mal dadas. Y por supuesto a mein Bruder, compartir contigo escaladas, riscos recónditos, noches de pizza y cine, tontunas y elucubraciones cósmicas tiene un valor incalculable para mí y ha sido crucial para desconectar del lab. Y por supuesto a Julia, por alumbrarme en la oscuridad y hacerme mantener el equilibrio en la cuerda floja tantas veces. Eres una fuente de alegría y la vida compartida contigo es mucho mejor. vii viii INDEX ACKNOWLEDGEMENTS ........................................................................................................................... v INDEX ...................................................................................................................................................... viii ABSTRACT.............................................................................................................................................. xiii RESUMEN ............................................................................................................................................... xiv ABREVIATIONS…………………………………………………………………………………………………..xvii 1. GENERAL INTRODUCTION ...................................................................................................... 1 1.1 GENERATION AND FUNCTIONS OF REACTIVE OXYGEN SPECIES IN PLANTS ...................... 4 1.1.1 Generation of the main Reactive Oxygen Species ..................................................................... 4 1.1.2 Metabolic and enzymatic sources of ROS in plants.................................................................... 5 1.1.3 ROS: key signaling molecules to integrate and adapt to the environment.................................. 6 1.2 THE PLANT DEFENSE RESPONSE AGAINST PATHOGENS: CONSTITUTIVE AND INDUCIBLE MECHANISMS ................................................................................................................... 7 1.2.1 Pattern recognition receptors triggered immunity ....................................................................... 9 1.2.2 Effector triggered immunity ....................................................................................................... 11 1.2.3 Cell death ................................................................................................................................