Department of Animal Morphology, Physiology and Genetics Faculty of Agronomy Mendel University in Brno

ANIMAL PHYSIOLOGY 2012

Proceedings of International Conference

May 24-25th 2012 Lednice, Czech Republic Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

ISBN 978-80-7375-616-1

2 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Scientific Program Committe: prof. MVDr. Zbyšek Sládek, Ph.D. Mendel University in Brno doc. MVDr. Karel Jelínek, CSc. Mendel University in Brno doc. Ing. Ji ří Dosko čil, CSc. Mendel University in Brno prof. Ing. RNDr. Vlasta Kroupová, CSc. University of South Bohemia in České Bud ějovice prof. MVDr. Ing. Pavel Suchý, CSc. University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno prof. MVDr. Jaroslav Doubek, CSc. University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno doc. MVDr. Alena Pechová, CSc. University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno doc. Ing. Václav Kotrbá ček, CSc. University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno doc. Ing. Ji ří Skládanka, Ph.D. Mendel University in Brno dr. hab. Robert Stawarz, prof. Pedagogical University of Cracow prof. MVDr. Ing. František Jílek, DrSc. Czech University of Life Sciences Pratur prof. MVDr. Imrich Mara ček, DrSc. University of Veterinary Medicine and Pharmacy in Košice prof. RNDR. Michal Zeman, DrSc. Comenius University in Bratislava prof. MVDr. Peter Massányi, Ph.D. Slovak University of Agriculture in Nitra doc. Ing. Norbert Luká č, Ph.D. Slovak University of Agriculture in Nitra prof. Ing. Jan Trávní ček, CSc. University of South Bohemia in České Bud ějovice prof. MVDr. Ing. Petr Doležal, CSc. Mendel University in Brno

Organising Committee: Ing. Aleš Pavlík, Ph.D. Ing. Petr Sláma, Ph.D.

Reviewers: Ing. Aleš Pavlík, Ph.D. Ing. Petr Sláma, Ph.D. Dr. Ing. Zden ěk Havlí ček Prof. MVDr. Zbyšek Sládek, Ph.D.

3 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

4 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

CONTENT

INFLUENCE OF OXYTOCIN ON RABBIT REPRODUCTIVE FUNCTIONS Balazi, A.et al...... 10 CONCENTRATIONS OF MONITORING INDICATORS IN THE BLOOD SERUM OF HORSES AND THEIR CORRELATION DEPENDENCY Čupka, P. et al...... 15 EFFECT OF YEAST CULTURE ADDITION IN THE TMR OF PREGNANT COWS ON QUALITY OF COLOSTRUM Doležal, P. et al...... 20 THE EFFECT OF INCREASED IODINE INTAKE ON THE LEVEL OF GLOBULINS IN SHEEP Dušová, H. et al...... 28 THE EVALUATION OF SPERM BULL MOTILITY Filip čík R., Hanuláková Š...... 34

ENDOMETRIAL POTENTIAL FOR CONVERSION OF T TO E 2 IN PREGNANT AND CYCLIC PIGS Franczak, A. et al...... 40 EXPRESSION OF 3 Β-HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE (3 Β-HSD) AND ANDROSTENDIONE PRODUCTION IN PORCINE ENDOMETRIUM Franczak, A. et al...... 42 DETECTION OF TILMICOSIN EFFECT ON CELL CULTURES IN VITRO Fülopová, D., et al...... 43 ELECTRICAL CONDUCTIVITY AND DYNAMIC VISCOSITY OF STALLION EJACULATE IN THE DEPENDENCE TO QUALITATIVE AND QUANTITATIVE INDICATORS Hanuláková, Š. et al...... 49 THE EFFECT OF ZINC SUPPLEMENTATION ON RUMINAL METABOLISM IN SHEEP Hauptmanová, K. et al...... 56 EFFECT OF HETEROTROPHIC CHLORELLA ON CONTENT OF AND LUTEIN ZEAXANTHIN ISOFORMS IN EGG YOLKS Hložková, J. et al...... 60

5 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE EFFECT OF WELL MANAGED EARLY PUERPERIUM ON HOLSTEIN COW REPRODUCTION AND MILK PERFORMANCE Hošek, M. et al...... 61 EFFECT OF FEED RESTRICTION ON DIGESTIBILITY OF NUTRIENTS AND DEVELOPMENT OF SMALL INTESTINE IN BROILER RABBITS Chodová, D., T ůmová, E...... 66 FOOD RESTRICTION POSITIVELY INFLUENCED CELL MEDIATED IMMUNITY OF JAPANESE QUAIL SELECTED FOR HIGH AND LOW TESTOSTERONE CONTENT IN EGG YOLK Ka ňková, Z. et al...... 72 THE EFFECT OF COPPER IONS ON THE MOTILITY AND SURVIVAL OF BULL SPERMATOZOA IN DIFFERENT CULTURE MEDIA Kňažická, Z. et al...... 79 EVALUATION OF BIOCHEMICAL PARAMETERS OF EUROPEAN BROWN HARE (LEPUS EUROPAEUS) Ková čik, A. et al...... 87 EVALUATION OF FATTY ACID COMPOSITION IN ORGANIC GOAT MILK DURING THE LACTATION PERIOD Králí čková, Š., Kuchtík, J...... 92 METAL CONTENTS IN CANCER OF HUMAN UTERINE CORPUS Kraska K. et al...... 98 DETERMINATION OF MORPHOLOGICALLY ALTERED SPERMATOZOA OF BULLS, RAMS AND STALLIONS Kro čková, J., Massányi, P...... 103 THE EFFECT OF DIFFERENT PREPERATIONS FOR THE QUALITY PARAMETERS OF CLOVER SILAGES Kubát, V. et al...... 109 EFFECT OF RABBIT SPERMIOPHAGES ON SEMEN PARAMETERS Kuželová, L...... 115 EFFECT OF NONYLPHENOL AS ENDOCRINE DISRUPTOR ON THE MOTILITY OF BOVINE SPERMATOZOA IN VITRO Luká čová, J. et al...... 120 EXPOSURE OF GRANULOSA CELLS TO THE FUSARIUM TOXINS Medve ďová, M. et al...... 127

6 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

HUMAN UMBILICAL VEIN ENDOTHELIAL CELLS IN PHYSIOLOGY RESEARCH Morav čík, R. et al...... 133 DIFFERENTIAL DEPOSITION OF YOLK TESTOSTERONE IN THE SECOND LAYING CYCLE DEPENDS ON FEMALE QUALITY IN JAPANESE QUAIL Okuliarová, M. et al...... 139 THE EFFECT OF SUPPLEMENTATION OF DIFFERENT FORMS OF COPPER ON THE GROWTH INTENSITY AND THE CONCENTRATION OF COPPER AND ZINC IN THE BODY OF KIDS Pechová, A. et al...... 145 MORPHOMETRIC PARAMETERS OF OVINE THYROID GLAND WITH DIFFERENT IODINE FOODBORNE INTAKE Peksa Z. et al...... 151 EFFECT OF T-2 TOXIN ON SOME PARAMETERS OF ANTIOXIDANT STATUS OF PORCINE BLOOD IN VITRO Petruška, P., Capcarová, M...... 157 THE EFFECT OF LOW DOSES OF 2,3,7,8-TETRACHLORODIBENZO-P-DIOXIN (TCDD) AND GENISTEIN ON EXPRESSION OF ARYL HYDROCARBON RECEPTOR PROTEIN IN PORCINE GRANULOSA CELLS Piasecka J. et al...... 162 THE LENGTH OF PREGNANCY IN WARMBLOOD MARES Pospíšilová, D. et al...... 164 CANINE BEHAVIOR IN OPEN SPACES Řezá č, P. et al...... 167 INFLUENCE OF THE SPECIES AND CONSERVATION ADDITIVES ON THE QUALITY AND SAFETY OF SILAGES Skládanka, J. et al...... 170 EXPRESSION OF CD14 SURFACE RECEPTOR ON APOPTOTIC RESIDENT AND INFLAMMATORY MACROPHAGES FROM BOVINE MAMMARY GLAND Sladek Z., Rysanek D...... 176 THE EFFECT OF DIOSMECTITE SUPPLEMENTATION ON IMMUNE RESPONSE IN WEANED PIGLETS Slámová, R. et al...... 181 THE EFFECT OF GLYCEROL ON RABBIT SPERMATOZOA MOTILITY Slanina, T. et al...... 187

7 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

DIFFERENCES IN CHARACTERISTICS OF CALCIUM METABOLISM AND EGGSHELL QUALITY IN CZECH HEN AND HYBRID LOHMANN WHITE Svobodová J., T ůmová E...... 192 FUNCTIONAL PARAMETERS OF BULL SEMEN IN RELATION TO THE BODY CONDITION SCORE Špaleková, E. et al...... 196 THE PRENATAL APPLICATION OF RETINOIC ACID AND EMOTIONAL BEHAVIOUR Tomášová, L. et al...... 203 THE EFFECT OF INCREASED IODINE INTAKE ON THYROID ACTIVITY IN SHEEP Trávní ček, J. et al...... 206 THE RELATIONSHIP OF FAT CONTENT IN CARCASS, THIGH MEAT AND BLOOD BIOCHEMICAL PARAMETERS IN CZECH RABBIT GENETIC RESOURCES Tůmová, E. et al...... 212 SELECTED SPERMATOZOA MOTILITY PARAMETERS VERSUS CATALASE AND GLUTATHIONE CONTENT IN BOVINE SEMINAL PLASMA Tvrdá, E. et al...... 217 INFLUENCE OF FACTORS INVOLVED IN THE REGULATION OF PROLACTIN SECRETION ON THE EXPRESSION OF GENES – CODING FOR OPIOID PRECURSORS – IN ANTERIOR PITUITARY CELLS OF THE LATE FOLLICULAR - PHASE GILTS IN VITRO Tworus, K. et al...... 225 THE EVALUATION OF SEMEN COLLECTION AND EJACULATE QUALITY OF HUNTING DOGS Vágenknechtová, M. et al...... 226 FLOW-CYTOMETRIC DETECTION OF THE RABBIT HEMATOPOIETIC STEM CELLS Vaší ček, J. et al...... 232 EFFECT OF CATTLE PRODUCTION TYPE ON BLOOD PLASMA BIOCHEMICAL PARAMETERS Vošterová, I. et al...... 238

8 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE EFFECT OF NUMBER OF LACTATION ON INCIDENCE OF CALF TWIN’S PARTURITION AND STILLBIRTH OF CZECH FLECKVIEH – SIMENTAL DAIRY COWS Zejdová, P. et al...... 245 SELECTION APPROACH TO EVALUATION OF EFFECTS OF MATERNAL HORMONES ON PROGENY IN PRECOCIAL BIRDS Zeman, M. et al...... 250 THE MONITORING OF MANGANESSE CONCENTRATION IN GOAT COLOSTRUM AND MILK BY SUPPLEMENTATION OF DIFFERENT FORMS Zvonareva E. et al...... 255

9 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

INFLUENCE OF OXYTOCIN ON RABBIT REPRODUCTIVE FUNCTIONS

Balazi, A. 1,2 , Sirotkin, A. V. 1,3 , Pivko, J. 1 , Chrenek, P. 1,2 1 Animal Production Research Centre Nitra, Slovak Republic, 2 Faculty of Biotechnology and Food Sciences, University of Agriculture in Nitra, Slovak Republic, 3 Constantine the Philosopher University, Nitra, Slovak Republic

Abstract The aim of our study was to examine the influence of oxytocin (OT) administration on rabbit reproductive efficiency, as well as on ovarian folliculogenesis and atresia in rabbits, whose ovarian cycle and ovulation was induced by gonadotropins. Ovarian cycle and ovulation of control rabbits were induced by eCG (equine chorionic gonadotropin, 80IU/female), after 72 hours followed hCG (human chorionic gonadotropin, 150IU/female) administration. Experimental animals received eCG and hCG together with OT (at 50 g/animal). The animals were euthanized 18-19 hours after artificial insemination. Histological sections of ovaries were prepared and the presence of not ovulated follicles in different stages of atresia was evaluated by light microscopy. The eggs were flushed from the oviducts and cultured up to blastocyst cell stage. Numbers of ovarian Corpora lutea , ovulated oocytes, oocyte-derived zygotes and embryos reaching hatched blastocyst stage were determined. Administration of oxytocin was able to increase the proportion of atretic follicles with luteinisation (34.6% vs. control 18.7%). Furthermore, oxytocin not increased/decreased number of corpora lutea , number of harvested oocytes, zygotes, embryos at morula and blastocyst stage derived from these zygotes after culture. These data demonstrate that oxytocin can stimulate rabbit ovarian follicle atresia, but not ovulation, oocyte, zygote and embryo yield and development.

Key words : oxytocin, follicular atresia, ovarian folliculogenesis, embryo development

Introduction In mammalian ovaries, more than 99% follicles degenerate at various stages of follicular growth and development (Kaipia et al. 1997). Atresia of antral follicles initially involves death of granulosa cells and subsequently thecal cells and oocytes and it involves apoptosis, autophagy and later necrosis and resorption of cell debris by macrophages. Development and atresia of mammalian ovarian follicles and oocytes is therefore a complex

10 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 process involving extensive tissue growth and remodelling, fluid accumulation, replication, specialization, differentiation and death of cells (Hatzirodos et al. 2012). Oxytocin belongs to the nonapeptide hormones group. Nonapeptide hormones are important autocrine, paracrine and endocrine regulators of ovarian secretory functions (Wathes and Denning-Kendall, 1992). In the ovary cells of pigs, cattle, rabbits, mice and humans they regulate the secretion of progesterone, estradiol, IGF-I (insulin-like growth factors), prolactin-like substances, prostaglandin F2 α, cAMP and cGMP and ovarian autocrine mechanism that regulates folliculogenesis and luteogenesis (Schaeffer and Sirotkin, 1995; Makarevich et al., 2004). In addition, ovarian oxytocin plays a role in the ovulatory process through the formation of PGF2 alpha, which strengthen the contraction of smooth ovarian muscle (Viggiano et al., 1989; Makarevich et al., 2004). Oxytocin was shown to promote ovarian cell proliferation (Makarevich et al., 2004) suggesting their potential stimulatory action on ovarian follicular growth and development, therefore, on fecundity. Oxytocin can not only promote cAMP production, but effects of oxytocin can be mediated by cAMP/protein kinase A-dependent intracellular mechanisms (Makarevich et al., 2004). Therefore, it is possible, that oxytocin, like pharmacological activators of protein kinase A, can be used for stimulation of reproductive processes. Nevertheless, the data concerning effect of cAMP/protein kinase A-dependent mechanisms activators on reproductive efficiency are insufficient, whilst the effect of oxytocin on fecundity seems has not been studied yet. The aim of our study was to examine the influence of administration of oxytocin on reproductive efficiency, fertility and follicular atresia in female rabbits whose ovarian cycle and ovulation was induced by gonadotropins.

Materials and methods

Manipulations with animals New Zeland White rabbits, 3.5 month – 2 years old were bred in individual cages at the local rabbit farm of Animal Production Research Centre Nitra. Female rabbits in the control group were treated 3 days before artificial insemination with eCG ( Werfaser, Alvetra und Werfft AG, Vienna, Austria, at dose 80 IU/doe) followed after 72 hours by hCG (Werfachor, Alvetra und Werfft AG, Vienna, Austria at dose 150 IU/doe). Gonadotropins were dissolved in phosphate-buffered solution (PBS). Control animals were intramuscularly injected only with these gonadotropins (in 0.5 ml saline per doe), whilst experimental females received gonadotropins with oxytocin (Sigma, St. Louis, MI, USA, 50µg/doe in 0.5 ml PBS).

11 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Immediately before administration of hCG females were inseminated by freshly diluted sperm (0.5 ml/female). The animals were euthanized 19-20 hours after artificial insemination. The ovaries were collected, numbers of corpora lutea in both ovaries were determinate by visual inspection and the ovaries were subjected to histological analysis. The pronuclear-stage eggs were flushed from the oviducts with PBS and washed in CIM medium + 10% FBS (Fetal bovine serum, Gibco BRL/Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA). The eggs were cultured in k-DMEM (knock out dulbecco modified eagle´s medium) + 10% FBS at 5% CO 2 39°C up to the blastocyst cell stage. Stages of embryogenesis were determined at different time points of culture under a stereomicroscope at 40- or 100-fold magnification.

Histological analysis The ovaries were fixed in 10% formalin for 24 h, washed in flowing tap water for 2 h, dehydratedin 70%, 96% and 100% ethanol (2 h each) and embedded in paraffin or Technovit 7100 (Heraeus Kulzer GmbH&CoKG, Wehrheim/Ts., Germany) according to the manufacturer´s instructions. Thereafter, the ovaries were serially sectioned by using a standard rotation microtome at 5 µm thickness. The sections were subsequently dewaxed, rehydrated and stained with eosin-haematoxylin (Edward Gurr Ltd., London, UK) and embedded to entelan (Merck, Darmstadt, Germany) according Hayat (1993). All tertiary non- ovulated follicles, as well as luteinized follicles present on the slides were examined and counted using a Jenaval (Carl Zeiss, Jena, Germany) light microscope. The following stages of their atresia were identified: (1) no or small atresia (no visible pathological changes or some disappearance of mitosis and appearance of nuclear vacuolization), (2) obliteral atresia (degeneration of granulosa layer and dominance of fibrocytes in theca layer), (3) cystic atresia (disappearance of epithelial cells in both granulose and theca layers) and (4) luteinization and atresia associated with luteinization (hypertrophy of both granulose and theca cells and their transformation to corpus luteum ).

Statistics Differences between the experimental and control group by follicular atresia were evaluated by chi-square test. Differences of average number of corpora lutea , ovulated oocytes, zygotes, embryos at morula and hatching blastocyst stage per doe were statistically evaluated using t-test in SigmaPlot 11 (Systat Software Inc., Germany). Differences at p< 0.05 were considered as significant. Results are expressed in % or as means ± SEM.

12 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Results Micromorfometric analysis of ovarian slices showed the influence of oxytocin treatment on the follicles occurrence of different classes in the ovary (Table. 1). There were occurred following signs (reduced cell proliferation and appearance of nuclear vacuolization, piknosis of nuclei, degeneration an disappearance of cells by obliteral and cystic atresia, degeneration the follicular wall, light cytoplasm, cell hypertrophy and intensive multiplication of cells by luteinisation and luteinisation-associated atresia), on which base the follicles were classified into four categories (material and methods). The histological data demonstrate that injections of gonadotropins with oxytocin addition significantly increased percentage of follicles with atresia-associated with luteinisation (34.6% vs. control 18.7%). Oxytocin reduced the proportion of healthy or follicles with small atresia, increased percentage of follicles with cystic atresia. On the other hand OT decreased percentage of follicles with obliteral atresia, but this data were insignificant.

Tab. 1 : Histopathological changes of rabbit antral follicles after administration of oxytocin Non- No or small Obliteral Cystic Atresia with ovulated atresia atresia atresia luteinisation follicles n/% n/% n/% n/% n/% Control 181/100 59/32.6 38/21.0 16/8.8 34/18.8 Oxytocin 205/100 48/23.4 37/18.1 26/12.7 71/34.6* Values are means±SEM. *- Significant (p ≤0,001) differences with control

A treatment of females with gonadotropins and subsequent artificial insemination resulted in ovulation of ovarian follicles, formation of corpora lutea , expulsion of oocytes into the oviduct, and subsequent embryo development in vitro . Administration of gonadotropins with OT did not significantly affect female reproductive parameters. Although OT increased number of zygotes, number of embryos at the morula and hatching blastocyst stage (18.34±0.89 vs. 18.00±1.09; 18.34±0.89 vs. 18.00±1.09 and 18.34±0.89 17.86±1.08 respectively) in comparison to control group, the data were not significant (Table. 2).

13 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 2 Effect of oxytocin on rabbit embryo yield and development Corpora Flushed Zygotes/♀ Morula/ ♀ Hatching lutea/♀ eggs/♀ blastocyst/♀ n n n n n

Control 23.06±0.95 19.74±1.01 18.00±1.09 18.00±1.09 17.86±1.08 Oxytocin 21.66±1.23 18.34±0.89 18.34±0.89 18.34±0.89 18.34±0.89 Values are means±SEM. – without significant differences with control

Since positive effect of oxytocin on ovarian cell proliferation and ovarian hormones release has been well documented (see Introduction), it is not to be excluded, that further studies could show effect of oxytocin on reproductive efficiency.

Conclusion Administration of oxytocin was able to increase the proportion of atretic follicles with luteinisation, but not significantly affects embryos yield. However, it is possible that the effect of OT on reproductive parameters depends on its origin (endogenous or exogenous) and/or from its site of action (intraovarial or administered intramuscularly). Therefore, further examination of oxytocin effect on fecundity is required.

Acknowledgement: This work was supported from the grants of Slovak Research and Development Agency: (APVV) LPP-0119-09. References Hatzirodos, N., Nigro, J., Irving-Rodgers, H.F., Vashi, A.V., Hummitzsch, K., Caterson, B., Sullivan, T.R., Rodgers, R.J. Glycomic analyses of ovarian follicles during development and atresia. Matrix Biol , 2012, 31, 45-56. Hayat, M.A. Chapter 7. Staining of Semithin Resin Section, Stains and Cytochemical Methods , Plenum Press, New York and London, 1993, 57-58, ISBN 0-304-44294-9. Kaipia, A., Hsueh, A.J. Regulation of ovarian follicle atresia. Annu Rev Physiol , 1997, 59, 349-363. Makarewich, A.V., Sirotkin, A.V., Franek, J., Kwon, H.B., Bulla, J. The role of oxytocin, protein kinase A, and ERK-related MAP-kinase in the control of porcine ovarian follicle functions, Exp Clin Endocrinol Diabetes , 2004, 112, 108-114. Schaeffer, H.J., Sirotkin A.V. The release of insulin-like growht factor-I by luteinized human granulosa cells in vitro : Regulation by growth hormone, oxytocin, steroids and cAMP- dependent intracellular mechanisms, Exp Clin Endocrinol Diabetes , 1995, 103, 361-366. Viggiano, M., Franchi, A.M., Zicari, J.L., Rettori, V., Gimeno, M.A., Kozlowski, G.P., Gimeno, A.L. The involvement of oxytocin in ovulation and in the outputs of cyclo- oxygenase and 5-lipoxygenase products from isolated rat ovaries, Prostaglandins , 1989, 37 (3), 367-378. Wathes, D.C., Denning-Kendall, P.A. Control of synthesis and secretion of ovarian oxytocin in ruminants. J Reprod Fertil Suppl , 1992, 45, 39-52.

14 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

CONCENTRATIONS OF MONITORING INDICATORS IN THE BLOOD SERUM OF HORSES AND THEIR CORRELATION DEPENDENCY

Čupka, P. 1, Halo, M. 2, Stawarz, R. 3, Formicki, G. 3, Massányi, P. 1

1Katedra fyziológie živo číchov, SPU Nitra, 2Katedra špeciálnej zootechniky, SPU Nitra, 3 Pedagogical University in Krakow

Abstract In this study 26 sport horses (14 mares and 12 stallions) were included in the trial. The content of Ca, P, Mg, Na, K, Cl, Cu, Cd, Zn, Pb was determined in the blood serum. Levels of monitoring indicators in stallions and mares were balanced. Significant difference (P<0.05) was recorded only in chloride content between stallions and mares. Other differences were statistically non significant. Medium correlation was found between Cl:Cu (stallions, total), Cl:Cd (stallions), Cl:Pb (stallions), Cl:P (mares), Cl:Na (stallions), K:Cu (stallions, total), K:Zn (stallions, total), K:Pb (stallions), K:Ca (stallions, mares), K:P (mares), Na:Pb (stallions, mares), Na:Ca (mares, total), Na:Mg (stallions), Mg:Cd (mares), Mg:Zn (stallions), Mg:Pb (mares), Mg:Ca (stallions), Mg:P (mares, total), Ca:Cu (stallions), Ca:Cd (stallions), Ca:Zn (stallions), Ca:Pb (stallions), Pb:Cu (total), Pb:Cd (stallions), Zn:Cu (mares, total), Zn:Cd (mares, stallions, total), Cd:Cu (stallions, total). A high correlation was found between Cl:Na (mares, total), Pb:Cu (stallions) and Cd:Cu (mare).

Úvod Biochemické ukazovatele sa bežne stanovujú u koní z mnohých dôvodov. Slúžia jednak ako skríningové testy u klinicky zdravých zvierat, na diagnostiku choroby a posúdenia jej závažnosti a dôsledkov. Ich klinický význam a interpretácia je niekedy ťažká a zložitá. Na jednotlivé parametre môže významne vplýva ť ve ľa faktorov, ako napríklad pohlavie, vek, plemeno, výživa, fyzická aktivita a podobne. U koní významnú úlohu zohráva minerálny metabolizmus a zásobenie makroprvkami najmä po čas tréningovej zá ťaže. Goš čík (1994) uvádza, že počas zá ťaže dochádza k vyplavovaniu minerálnych látok z tela ko ňa formou potu. Zvýšeniu strát napomáha teplé a vlhké prostredie. Liter konského potu obsahuje 7,5 – 10,5 g NaCl a 1,5 – 3,5 g KCl. V období intenzívnej zá ťaže je športovým ko ňom potrebné zabezpe čiť adekvátnu výživu s doplnkami elektrolytov a dostatok vody. Nako ľko sa v krmive vo vyššej miere nachádza draslík, treba dodrža ť pomer Na:K, ktorý je 4:1.

15 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Cie ľom našej práce bolo sledovanie zmien vybraných ukazovate ľov v krvnom sére u žrebcov a kobýl, ako aj ich vzájomných korela čných závislostí.

Materiál a metodika Do pokusu bolo zaradených 26 športových koní, z toho 14 kobýl a 12 žrebcov. Od koní sme odoberali krv z v. jugularis 2 hodiny po rannom k ŕmení. Krvné sérum sme získali centrifugáciou zrazenej krvi pri 3000 otá čkach za minútu po čas 30 minút. Z krvného séra sme stanovili nasledovné parametre : Ca, P, Mg – spektrofotometricky Microlab (DiaSys); Na, K, Cl – ión selektívne – EasyLyte; Cu, Cd, Zn, Pb – atómová absorp čná fotometria. Zo získaných výsledkov sme vypo čítali základnú štatistiku, t–test a korela čné závislosti.

Výsledky Priemerné hladiny sledovaných ukazovate ľov uvádzame na obrázku 1. Obsah vápnika sa pohyboval od 3,39 (kobyly) do 3,43 (žrebce) mmol.l -1, fosforu od 1,20 (žrebce) do 1,25 (kobyly) mmol.l -1, hor číka 0,83 mmol.l -1 (vo všetkých skupinách), sodíka od 137,32 (žrebce) do 138,19 (kobyly) mmol.l -1, draslíka 4,01 mmol.l -1 (vo všetkých skupinách), chloridov od 101,27 (žrebce) do 102,99 (kobyly) mmol.l -1, medi od 12,59 (žrebce) do 14,16 (kobyly) mol.l -1, kadmia od 1,87 (kobyly) do 1,96 (žrebce) mol.l -1, zinku od 33,96 (kobyly) do 34,57 (žrebce) mol.l -1 a olova od 8,16 (kobyly) do 12,11 (žrebce) mol.l -1. Preukazný rozdiel (P<0,05) sme zaznamenali len pri obsahu chloridov medzi žrebcami a kobylami. Ostatné rozdiely boli štatisticky nepreukazné. V skupine 11 športových koní Hallo a kol. (2009) sledovali vplyv výživy a tréningu na ich metabolický profil. Tréning koní bol rozdelený na štyri obdobia: I. prípravné obdobie, II. za čiatok športovej sezóny, III. koniec športovej sezóny, IV. aktívny odpo činok. Uvádzajú, že po čas celého sledovaného obdobia sa obsah sodíka, draslíka a vápnika pohyboval v rámci referen čného rozpätia (Na 140,7 – 143,11, K 4,41 – 4,76, Ca 2,51 – 2,66, P 0,88 – 1,08), čo je v súlade s našimi zisteniami. Pri hor číku zaznamenali hodnoty pod referen čným rozpätím (0,26 – 0,68), čo je v rozpore s našimi zisteniami. El-Deeb a El-Bahr (2010) sledovali u 30 koní rozdelených do dvoch skupín zmeny v hladinách keratín kinázy, AST, LDH, triacylglycerolu, glukózy, celkových bielkovín, albumínu, globulínu, mo čoviny, kreatinínu, T3, Ca, Na, K, P, Cl u zdravých koní a koní chorých na rabdomyolýzu. U zdravých koní zistili nasledovné hladiny biochemických ukazovate ľov: Ca (3,12 ± 0,23 mmol.l -1), Na (144,8 ± mmol.l -1), P (1,30 ± 0,11 mmol.l -1), K

16 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

(4,16 ± 0,12 mmol.l -1), Cl (107,50 ± 8,21 mmol.l -1). Nimi zistené údaje sú v plnom rozsahu zhodné s našimi zisteniami.

Obrázok 1 Obsah sledovaných ukazovate ľov v sére koní (The content of the parameters in the serum of horses)

Asano et al. (2005) študovali vplyv atrioventrikulárneho bloku (AV blok) na stopové prvky sére koní u dvadsa ť pä ť prvkov. Zistili nasledovné hladiny ukazovate ľov Ca (2,97 mmol.l -1), Cl (88,4 mmol.l -1), Cu (15,37 mmol.l -1), K (4,3 mmol.l -1), Mg (1,187 mmol.l -1), Na (132,8 mmol.l -1), P (1,15 mmol.l -1), Pb (0,47 mmol.l -1). Nezaznamenali žiadne významné rozdiely v obsahu prvkov v sére sledovaných skupín. Naše údaje sú v súlade s ich zisteniami, len pri chloridoch zaznamenali nižšie údaje v porovnaní s našimi údajmi. Noah et al. (1993) sledovali acidobázický stav, bilanciu tekutín a elektrolytov u plnokrvných dostihových koní po namáhavom výkone. Hladiny sodíka sa pohybovali od 140,4 do 144,8 mmol.l -1, draslíka od 4,06 do 4,18 mmol.l -1 a chloridov od 102,4 do 104,0 mmol.l -1, čo je v súlade s našimi zisteniami. Korela čné závislosti sledovaných ukazovate ľov uvádzame na obrázku 2. Medzi Cl:Cu sme zaznamenali stredne silnú závislos ť (žrebce 0,378, spolu 0,373), Cl:Cd stredne silnú závislos ť (žrebce 0,512), Cl:Pb stredne silnú preukaznú závislos ť (žrebce 0,577), Cl:P stredne silnú závislos ť (kobyly –0,345), Cl:Na stredne silnú (žrebce 0,552) až silnú preukaznú závislos ť (kobyly 0,692, spolu 0,695), K:Cu stredne silnú závislos ť (žrebce 0,470; spolu 0,344), K:Zn stredne silnú (žrebce 0,339), stredne silnú preukaznú (spolu 0,382), K:Pb stredne silnú (žrebce 0,515), K:Ca stredne silnú (kobyly 0,420), negatívnu stredne silnú

17 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

(žrebce 0,474), K:P negatívnu stredne silnú (žrebce –0,358), Na:Pb stredne silnú (kobyly 0,416; žrebce 0,333), Na:Ca negatívnu stredne silnú (kobyly –0,362; spolu –0,333), Na:Mg stredne silnú (žrebce 0,571), Mg:Cd negatívnu stredne silnú (kobyly –0,441), Mg:Zn stredne silnú (žrebce 0,360), Mg:Pb stredne silnú (kobyly 0,416), Mg:Ca stredne silnú negatívnu (žrebce –0,352), Mg:P stredne silnú preukaznú (kobyly 0,663); stredne silnú vysoko preukaznú (spolu 0,510), Ca:Cu negatívnu stredne silnú (žrebce 0,350), Ca:Cd negatívnu stredne silnú (žrebce 0,447), Ca:Zn negatívnu stredne silnú preukaznú (žrebce –0,637), Ca:Pb negatívnu stredne silnú (žrebce –0,423), Pb:Cu silnú vysokopreukaznú (žrebce 0,798); stredne silnú preukaznú (spolu 0,486), Pb:Cd stredne silnú (žrebce 0,447), Zn:Cu stredne silnú preukaznú (kobyly 0,570; spolu 0,407), Zn:Cd stredne silnú preukaznú (kobyly 0,657; žrebce 0,571); stredne silnú vysokopreukaznú (spolu 0,627), Cd:Cu silnú vysokopreukaznú (kobyly 0,775); stredne silnú preukaznú (žrebce 0,613) a stredne silnú vysokopreukaznú závislos ť (spolu 0,650). Ostatné korela čné závislosti boli slabé.

Obrázok 2 Korela čné závislosti medzi ukazovate ľmi (The correlation dependence between the variables)

Cu Cd Zn Pb Ca P Mg Na K Cl m 0,290 -0,099 -0,183 0,221 -0,217 -0,345 0,058 0,692 ++ -0,111 s 0,378 0,512 0,035 0,577 + -0,156 0,103 0,035 0,552 0,263 t 0,373 0,078 -0,107 0,222 -0,205 -0,110 0,045 0,695 +++ 0,033 K m 0,218 0,197 0,243 -0,314 0,420 0,252 0,128 -0,293 s 0,470 0,308 0,339 0,515 -0,474 -0,358 -0,330 -0,212 t 0,344 0,242 0,382 + 0,234 0,013 -0,015 -0,090 -0,242 Na m 0,283 0,047 0,093 0,416 -0,362 -0,080 0,110 s -0,064 0,325 0,055 0,333 -0,263 0,221 0,571 t 0,199 0,098 0,069 0,169 -0,333 0,061 0,241 Mg m -0,107 -0,441 -0,276 0,416 -0,256 0,663 + s -0,122 0,300 0,360 0,072 -0,352 0,304 t -0,111 -0,144 -0,025 0,167 -0,296 0,510 ++ P m -0,111 -0,115 0,317 -0,015 -0,271 s 0,238 0,227 -0,039 0,029 0,026 t 0,083 -0,001 0,185 -0,030 -0,163 Ca m -0,240 -0,222 -0,019 -0,220 s -0,350 -0,456 -0,637 + -0,423 t -0,296 -0,306 -0,250 -0,286 Pb m 0,106 -0,167 -0,164 s 0,798 ++ 0,447 0,254 t 0,486 + 0,197 0,082 Zn m 0,570 + 0,657 + s 0,277 0,571 + t 0,407 + 0,627 +++ Cd m 0,775 ++ s 0,613 + t 0,650 +++ m = kobyly (mares); s = žrebce (stallions); t = spolu (total)

18 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Záver Hladiny sledovaných ukazovate ľov boli u žrebcov a kobýl vyrovnané. Preukazný rozdiel (P<0,05) sme zaznamenali len v obsahu chloridov medzi žrebcami a kobylami. Ostatné rozdiely boli štatisticky nepreukazné. Stredne silné korela čné závislosti sme zistili medzi Cl:Cu (žrebce, spolu), Cl:Cd (žrebce), Cl:Pb (žrebce), Cl:P (kobyly), Cl:Na (žrebce), K:Cu (žrebce, spolu), K:Zn (žrebce, spolu), K:Pb (žrebce), K:Ca (žrebce, kobyly), K:P (kobyly), Na:Pb (žrebce, kobyly), Na:Ca (kobyly, spolu), Na:Mg (žrebce)Mg:Cd (kobyly), Mg:Zn (žrebce), Mg:Pb (kobyly), Mg:Ca (žrebce), Mg:P (kobyly, spolu), Ca:Cu (žrebce), Ca:Cd (žrebce), Ca:Zn (žrebce), Ca:Pb (žrebce), Pb:Cu (spolu), Pb:Cd (žrebce), Zn:Cu (kobyly, spolu), Zn:Cd (kobyly, žrebce, spolu), Cd:Cu (žrebce, spolu). Silné korela čné závislosti sme zistili medzi Cl:Na (kobyly, spolu), Pb:Cu (žrebce), Cd:Cu (kobyly).

Po ďakovanie. Práca bola realizovaná s podporou projektu VEGA 1/0532/11

Použitá literatúra Goš čík, Z.: Fyziologický základ tréningu ko ňa - Atléta. Nitra, Dominant s.r.o., 1994, 70 s. Halo, M., Hollý, A., Mlyneková, E., Polyaková, L., Horný, M., Koval čík, E.: Vplyv výživy a tréningu na metabolický profil športových koní. J. Central Europ. Agriculture, 10, 2009, 4, 411–416. Wael, M., El-Deeb, A., Sabry M., El-Bahr, B.: Investigation of selected biochemical indicators of equine rhabdomyolysis in Arabian horses: pro-inflammatory cytokines and oxidative stress markers. Vet. Res. Commun., 34, 2010, 677–689 Asano, K., Suzuki, K., Chiba, M., Sera, K., Matsumoto, T., Asano, R., Sakai, T.: Correlation between 25 element contents in mane hair in riding horses and atrioventricular block. Biol. Trace Elem. Res., 108, 2005, 127–135. Noah, D., Cohen, A.J., Roussel, J.H., Lumsden, A., Cohen, C., Grift, E., Lewis, C.: Alterations of fluid and electrolyte balance in thoroughbred racehorses following strenuous exercise during training. Can. J. Vet. Res., 57, 1993, 9–13.

19 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

EFFECT OF YEAST CULTURE ADDITION IN THE TMR OF PREGNANT COWS ON QUALITY OF COLOSTRUM

Doležal, P. 1, Doležal, J. 1, Zeman, L. 1, Szwedziak, K. 3, Fröhdeová, M. 1, Tukiendorf, M. 3,

Havlí ček, Z. 2, Skládanka, J. 1.

1Department of Animal Nutrition and Forage Production; 2Department of Animal Morphoplogy, Physiology and Genetics, Agronomy Faculty, Mendel University in Brno; 3Opole University of Technology, Faculty of Engineering, Poland

Keywords: cows, Saccharomyces cerevisiae culture, rumen fluid, colostrum quality

Abstrakt The results can be stated that in our experiment were carried out confirmed the results of other authors, because the addition of yeast to the diet formulation cow had a positive effect on the density and overall quality of colostrum. The cause was apparently a better stabilization of the ruminal environment in experimental pregnant cows and better use of forage nutrient diet. There was no publication that would show a negative effect on the quality of colostrum, yeast, milk or animal health.

Keywords: cows, Saccharomyces cerevisiae culture, rumen fluid, colostrum quality

Úvod Úsp ěšný odchov telat je možný pouze tehdy, pokud je zaru čena jednota v systému: kráva tele prost ředí. Vzhledem k tomu, že telata se na sv ět rodí bez výbavy imunitních látek, nejsou tudíž chrán ěna proti p ůvodc ům nejr ůzn ější infekce nap ř. nákazy ch řipkou, zápalu plic, zán ětu gastrointestinálního traktu aj. Tele se totiž rodí bez jakékoliv imunity, protože plemenice p řežvýkavc ů mají kotyledonovou syndesmochoriální placentu, která je charakterizována tím, že choriové klky vyr ůstají pouze na ur čitých okrscích choria – kotyledonech, a to vždy proti bezžlázovým okrsk ům d ěložní sliznice – karunkulech, narušují povrchový slizni ční epitel a pronikají do vaziva d ěložní sliznice. Místa spojení kotyledon ů s karunkuly se ozna čují jako placentomy. Krev matky je odd ělena od krve plodu p ěti bariérami. Tento typ placenty neumož ňuje p řechod imunoglobulin ů z krve matky do plodu a mlá ďata se proto rodí bez protilátek (Marvan,1998).

20 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Ochranné protilátky mohou telata získat po narození pouze v časným p řijetím kvalitního mleziva. Zabezpe čení dostate čného množství kvalitního mleziva již v prvních hodinách po narození je proto základním p ředpokladem budoucího úsp ěšného odchovu mlá ďat. Doba prvního zkrmování mleziva po narození je rozhodující, zda tele získá odpovídající pasivní imunitu a schopnost tak odolávat nemocem. Správné na časování zkrmování mleziva je podle Robinsona (1989) d ůležité ze dvou d ůvod ů: 1) ztráty absorp ční schopnosti st řeva, 2) bakteriální kolonizace st řeva. Z mleziva získané protilátky pak mohou telata chránit i p řed specifickými stájovými nemocemi. Složení vlastního mleziva je ovlivn ěno řadou faktor ů, zejména pak v ěkem plemenice, plemenem, technologií chovu a výživou b řezích plemenic, délkou stání na sucho, kvalitou krmiv a složením krmné diety, jakož i zdravotním stavem plemenice. Zvlášt ě negativn ě na kvalitu a složení mleziva p ůsobí zkrmování nekvalitních siláží (plesnivé, aerobn ě nestabilní, s neúsp ěšným fermenta čním procesem), nekvalitní seno, nevyvážená dieta z hlediska pom ěru NL a energie, podávané zejména v dob ě stání na sucho. Mlezivo je první sekret mlé čné žlázy vylu čovaný t ěsn ě p řed porodem a první 2 – 3 dny po porodu. Mlezivo je žlut ě až hn ědo červené barvy, lepkavé až šlemovité konzistence, mdlého zápachu a ho řkoslané chuti. Žluté zbarvení vzniká vyšším obsahem beta-karotenu. Od zralého mléka se mlezivo liší vysokým obsahem bílkovin, beta-karotenu, vitaminu A, E, riboflavinu, niacinu, sodíku, ho řč íku a draslíku. Zvýšený obsah solí, zejména ho řečnatých, má mírn ě projímavý ú činek. P ři varu se sráží vlivem vysokého obsahu albumin ů a globulin ů. Kolostrum je významným zdrojem také mnoha dalších d ůležitých biologických složek, komponent imunitního systému, r ůstových látek, protizán ětlivých složek a dalších hodnotných substancí (lysosym, blíže nespecifické faktory, hormony aj.). Obsažené vitaminy a minerální látky jsou d ůležité pro rozvoj funkce imunitního a nervového systému a zvýšení odolnosti v ůč i chorobám, kde p ůsobí jako ú činné antioxidans. Nejvýznamn ější složkou mleziva jsou imunoglobuliny (Ig), nebo také protilátky, což jsou proteiny nezbytné pro identifikaci a zni čení patogen ů zví řete. V mlezivu skotu se vyskytují 3 typy Ig: Ig G, Ig M a

Ig A. Dodate čně tam jsou 2 isotypy Ig G: Ig G 1 a Ig G 2 (Burton, 1989 ). Tyto Ig se spolupodílejí na vytvá ření pasivní imunity telete, to je imunity zajiš ťované matkou a nikoliv samotným teletem, dokud si tele nevytvo ří svou vlastní aktivní imunitu. Mlezivo dále obsahuje 70 – 80 % Ig G, 10 – 15% Ig M a 10 – 15% Ig A. V ětšinu Ig G v bovinním mlezivu představuje isotop Ig G 1 (Burton,1989). Ig G 1 a Ig G 2 jsou transportovány z krve do mleziva vysoce specifickým transportním mechanismem (Thatcher,1989). Tento mechanismus přemís ťuje velká množství Ig G (zejména Ig G 1 ) z krve do vemene. V důsledku toho,

21 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 dochází dva až t ři týdny p řed otelením k velmi prudkému poklesu koncentrace Ig G v séru matky. Dojnice pot řebují n ěkolik týdn ů pro resyntézu chyb ějícího Ig G. Ig M a Ig A jsou syntetizovány plazmacyty v mlé čné žláze. Mlezivo obsahuje velké množství Ig G a mén ě Ig M a Ig A. Všechny 3 imunoglobuliny jsou pro tele d ůležité a jsou nezbytné pro minimalizaci chorob nebo úhyn ů telat. V časný p řechod na zaprahnutí v délce 8 týdn ů p řed otelením umož ňuje nahromad ění ochranných látek ve vemeni (Doležal, 2006). Trvale dojené krávy nebo pozdní zaprahnutí plemenic zp ůsobuje, že krávy nemohou vytvá řet mlezivo požadovaném množství a p ředevším s odpovídajícím obsahem Ig. Také věk matek hraje významnou roli, mlezivo od starších krav vykazuje zvlášt ě vysoký obsah Ig, zatímco u jalovic-prvotelek je tento obsah významn ě nižší. V neposlední řad ě d ůležitým faktorem je také krmivo umož ňující p řežvykování a posiluje rovn ěž tvorbu Ig. Jednou z hlavních d ůvod ů je problematika samotné pr ůchodnosti st řevní sliznice a prostupnost Ig do krevního řečišt ě. Je potvrzeno, že hned po narození telat dochází k pronikání E. coli bakterií z tlustého st řeva do tenkého st řeva, které je tém ěř do 5 hodin doslova kolonizováno. Kolonizace vede rovn ěž k tvorb ě a uvol ňování bakteriálních toxin ů a zán ětům st řevní sliznice. Molekuly imunoglobulin ů snadn ěji pronikají sliznicí tenkého st řeva a v případ ě v časného podání mohou aktivn ě inhibovat činnost bakteriální mikroflóry. Schopnost pr ůniku imunoglobulin ů st řevní sliznicí výrazn ě klesá hodinu po hodin ě, stejn ě jako klesá jejich obsah v samotném mlezivu. Dnes je známo p řes 37 r ůzných faktor ů imunity bovinního kolostra, mezi které pat ří 5 základních imunoglobulin ů, dále laktoferin, peptid bohatý na peroxidázy, leukocyty, interferon, cytokiny, lysosym, inhibitory trypsinu a proteáz a řada dalších. Obsažené r ůstové faktory v kolostru podporují mimo jiné rozvoj svalstva, r ůst kostí a d ělení bun ěk. R ůstové faktory kolostra jsou zcela nezbytné pro vývoj a regulaci imunitního systému, nebo se p římo podílí na obranných reakcích proti patogenním mikroorganism ům. Těsn ě po porodu se u telat resorbuje z mleziva kolem 50 % protilátek, za následujících 20 hodin jen 15 % a za 36 hodin po porodu jen zanedbatelné množství. Asi po 24 hodinách je st řevní sliznice a st ěna tém ěř uzav řena a obranné protilátky nemají schopnost se dostávat do krevního ob ěhu. Obsah životn ě d ůležitých látek se v mlezivu od narození postupn ě snižuje. Z tohoto hlediska je proto vysoké nebezpe čí vyšší kolonizace zažívacího traktu E. coli při pozdním zkrmování prvního podání kolostra. Koncentrace imunoglobulin ů v mlezivu velmi rychle klesá, snižuje se i propustnost sliznice tenkého st řeva pro tyto látky. K vytvo ření účinné pasivní imunity telat je nutné, aby tele p řijalo nejmén ě 250 g t ěchto imunoglobulin ů. První napojení telete by z t ěchto d ůvod ů m ělo být provedeno do dvou hodin po narození.

22 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Telata jsou krmena mlezivem od vlastní matky minimáln ě první dva dny života. Další t ři až čty ři dny a více m ůže být tele krmeno sm ěsným mlezivem, na které navazuje nezralé pop ř. zralé mléko, které je vhodné krmit do v ěku p ěti až sedmi dn ů. B ěhem 3–5 dn ů p řechází mlezivo v normální, tzv. ,,zralé mléko" (JELÍNEK a kol., 2003). Tele by m ělo v prvých 24 hodinách p řijmout do krve alespo ň 60 g Ig. Kvalitn ější mlezivo (s pest řejší skladbou imunoglobulin ů) produkují v ětšinou starší dojnice, protože mají stájov ě specifické protilátky.

Materiál a metody V n ěkterých studiích se konstatuje také pozitivní vliv podávané kvasinkové kultury v dietách zaprahlých krav na kvalitu mleziva. Objektivnost této teorie jsme ov ěř ovali v pokusu v praktických podmínkách. V našem pokusu jsme sledovali zm ěnu hustoty mleziva v závislosti na p řidání kvasinkového preparátu obsahující jako ú činnou látku Saccharomyces cerevisce , kmen SC 47 do krmné dávky v množství 5 g na kus a den zamíchaný v jejich obvyklé krmné dávce. Pokus byl proveden na skupin ě suchostojných dojnic dva týdny p řed otelením a dále v mlezivovém období po porodu na dojnicích plemene Holštýn. Dojnice byly rozd ěleny do dvou skupin (kontrolní a pokusná) po šesti kusech. Výsledky jsme porovnávali s kontrolní skupinou, která byla krmena stejnou krmnou dávkou, ale již bez kvasinkového přípravku. Krmná dávka pro suchostojné dojnice obsahovala kuku řičnou siláž, jetelotravní senáž, lu ční seno a jadrnou sm ěs. B řezím kravám byl 3 týdny p řed porodem podán intramuskulárn ě Combinal selevit v dávce 20 ml. V našem pokusu jsme v praktických podmínkách studovali vliv p řídavku kvasinkové kultury na kvalitu mleziva m ěř ené zm ěnou specifické hmotnosti a množstvím imunoglobulin ů. Mlezivo bylo odebíráno ru čně p řed napojením telete v časovém sledu 0, 2, 6, 12 a 24 hodin po porodu. Mlezivo nebylo nikdy zcela vydojeno. Krmná dávka pro dojnice v prvních 100 dnech laktace obsahovala kuku řičnou siláž s vyšším obsahem sušiny, jetelotravní siláž s vyšším obsahem sušiny, LKS siláž kuku řice, lu ční seno a produk ční sm ěs. P řípravek Biosaf (SC–47) byl homogenn ě zamíchán do krmné sm ěsi v míchacím za řízení. Sm ěsná krmná dávka byla p řipravena v mobilním míchacím krmném voze. Celý pokus trval 74 dní. Bachorové tekutiny byly odebrány p řed zahájením pokusu (2 týdny p řed porodem) a následn ě po 30ti denním zkrmování krmné dávky. Výsledky byly porovnány s kontrolní skupinou, která byla krmena shodnou krmnou dávkou, ale již bez kvasinkového p řípravku.

23 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Výsledky a diskuse

Složení krmné dávky pro suchostojné dojnice dva týdny p řed o čekávaným porodem dokumentuje tabulka 1. Tab 1 . Krmná dávka pro suchostojné krávy složení kg (p ův. hm.) Kuku řičná siláž 5 Jetelotravní senáž 12 Seno 5 Sůl krmná 0,02 Mikrop M3 0,18 Jadrná sm ěs – (0,5 kg + 5 g Rumex – Pokus) je čmen 35% oves 35% otruby 18% soja 11% kvasinky 1%

Kvalitativní ukazatele sm ěsné krmné dávky jsou uvedeny v tabulce 2. Z výsledků vyplývá, že obsah sušiny je nižší (46,27 %), než doporu čují jiní auto ři. DOLEŽAL a kol. (2006) doporu čují za optimální rozp ětí sušiny TMR 50 – 60 %. KUDRNA a kol.,(1998) upozor ňují, že celková spot řeba TMR zna čně závisí na její vlhkosti a za optimální rozp ětí obsahu sušiny TMR považují 50 – 65 %. Podle n ěkterých amerických materiál ů TMR se sušinou nižší, než 50 % omezuje její spot řebu. Obsah sušiny TMR, pokud je veškerá píce v krmné dávce ze siláží, by m ěl být udržován okolo 60 % (DOLEŽAL a kol., 2006). Zkušenosti z Dánska poukazují na to, že již 60% obsah sušiny v TMR omezoval p říjem krmiva a tím se snižovala i užitkovost dojnic. Jako pozitivní zásah se v tomto p řípad ě ukázalo kropení krmiva vodou (KUDRNA a kol.,1998) Tento problém se vyskytuje v podnicích, kde se produkce píce s vysokým obsahem sušiny stala rutinní záležitostí. Hodnotu pH (5,01) lze hodnotit jako vyhovující. Obsah etanolu (0,21 %) je vyšší, než je doporu čováno. P říčinou byla z řejm ě kuku řičná siláž o pr ůměrné kvalit ě Pom ěr kyseliny mlé čné k octové je 1,07. Pom ěr N – NH 3 z celkového N byl vyšší (11,82 %) a byl zp ůsoben jetelotravní siláží.

24 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 2 Kvalitativní ukazatele TMR (v 1 kg sušiny) Ukazatele Hodnota Jednotky Sušina 46,27 % pH 5,01 - KVV 580 mg KOH/100g Kyselina mlé čná 2,96 % Kyselina octová 2,76 % Σ kyselin 5,72 % KM/KO 1,07 - Etanol 0,21 % LRC 0,10 %

N-NH 3 celkového N 11,82 %

Pr ůměrné chemické složení a výživná hodnota zkrmovaných dávek uvádí tabulka 3. Z výsledk ů je patrné, že pr ůměrný obsah NL v 1 kg sušiny diety byl 11,6 % což je v doporu čeném rozmezí uvád ěném McCULLOUGH (1994). Bachorový metabolismus bílkovin krav je mimo jiné ovliv ňován také úrovní bachorové degradovatelnosti proteinu, ale také podílem nedegradovatelného podílu. Bachorová degradovatelnost NL byla podle McCULLOUGH (1994) na horní hranici (66,52 %) jím doporu čovaného rozmezí. Koncentrace vlákniny (28 %) leží v pásmu fyziologického rozmezí (SOMMER a PETRIKOVI Č, 2003). Obsah strukturální vlákniny byl 11,37 %. Hodnota ADF byla vyšší (31,9 %), než doporu čuje McCULLOUGH (1994). Pro NDF doporu čuje nejmén ě 37 % v 1 kg sušiny KD, což TMR spl ňuje (48,65 %). V krmných dávkách pro dojnice p řed otelením se doporu čuje, aby obsah ADF byl mezi 25–28 % a NDF v rozmezí 37–40 %. Každá frakce vlákniny je degradována odlišnou rychlostí. Rychlost hydrolýzy je základním faktorem, který omezuje trávení vlákniny v bachoru. Vlastní rozsah trávení vlákniny v bachoru závisí na velikosti nestravitelných frakcí a na výsledku procesu degradace spole čně s pasáží tráveniny do dvanácterníku z bachoru (VARGA a WHITSEL, 1991). Naproti tomu je nezbytné vždy obsah NDF zvýšit až o 4 %, pokud je v krmné dávce použita siláž velmi jemn ě po řezána (T ŘINÁCTÝ a kol., 2000). Tab. 3 Chemické složení a výživná hodnota TMR pro suchostojné krávy (v 1 kg sušiny)

Degr. Σ Degr. Ukazatele Sušina NL NL St. VL ADF NDF BNLV škrobu škrob NEL Hodnoty 462,7 11,6 66,52 11,37 31,9 48,7 48,90 5,14 52,33 6,76 Jednotky g/kg % % % % % % % % MJ/kg

TŘINÁCTÝ a kol. (2000) v této souvislosti konstatují a doporu čují zvýšit obsah NDF v krmné dávce o 2 %, pokud jsou zkrmována krmiva lehce stravitelná (mladé pícniny), nebo 25 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 pokud je stravitelnost škrobu v bachoru vyšší než 80 %. Vzhledem k tomu, že bachorová degradovatelnost škrobu byla nízká (52,33 %), nebyly nutné žádné úpravy obsahu NDF v krmné dávce. V četných studiích se auto ři zmi ňují o pozitivním vlivu podávané kvasinkové kultury v dietách zaprahlých krav na kvalitu mleziva (KINAL a kol., 2007; PAVLATA a kol. (2005). Vliv p řídavku kvasinkové kultury kravám stojícím na sucho na kvalitu mleziva je uvedena v tabulkách 4 a 5 a grafech 3 a 4. Z uvedených výsledk ů (graf 3) je z řejmé, že p řídavek kvasinkové kultury m ěl pozitivní vliv na hustotu mleziva, tedy na kvalitu mleziva skupiny pokusných dojnic po porodu. Ihned po porodu m ělo mlezivo u pokusné skupiny hustotu vyšší (1055±0,003) oproti kontrole (1050±0,009). Hustota mleziva u pokusné skupiny byla vyhovující. Naopak hodnota specifické hmotnosti mleziva kontrolní skupiny leží na spodní hranici doporu čované hodnoty. K podobným záv ěrům dosp ěl také KINAL a kol. (2007). PAVLATA a kol. (2005) ve své práci uvád ějí, že za kvalitativn ě vyhovující mlezivo je považováno takové, které má m ěrnou hmotnost v ětší než 1050 g/l . Po 24 hodinách klesla hustota mleziva na hodnotu 1035±0,003 g/l u pokusné skupiny a na 1032±0,001 g/l u kontrolní skupiny. Zm ěny specifické hmotnosti mleziva v jednotlivých časových intervalech jsou uvedeny v tabulce 4. Tab. 4 Zm ěna specifické hmotnosti mleziva ve sledovaných intervalech (g/l)

Skupina Po porodu Po 2 hod. Po 6 hod. Po 12 hod. Po 24 hod. Pokusná 1055±0,003 1050±0,004 1048±0,003 1038±0,005 1035±0,003 Kontrolní 1050±0,009 1048±0,003 1045±0,002 1036±0,001 1032±0,001

Dalším d ůležitým kvalitativním faktorem je množství celkové bílkoviny, které by mělo p řesahovat 120 g/l (PAVLATA a kol., 2005) a množství imunoglobulin ů. Množství celkové bílkoviny u pokusné skupiny (109 g/l) bylo vyšší, než u kontrolní skupiny (104 g/l), ale neodpovídá doporu čenému množství. Nižší hladina celkové bílkoviny v mlezivu je v korelaci s nižší hladinou imunoglobulin ů.

Tab. 5 Zm ěny množství imunoglobulin ů v mlezivu v časových intervalech

Skupina Období Po porodu Po 2 Po 6 Po 12 Po 24 hod. Pokusná 60±0,82 49±2,77 27±1,53 16±1,29 8±1,53 Ig (g/l) Kontrolní 57±0,82 46±2,08 25±2,31 14±2 6±1,63

Z výsledk ů uvedených v grafu 1 je z řejmé, že p řídavek kvasinkové kultury m ěl pozitivní vliv na množství imunoglobulin ů v mlezivu, tedy i na kvalitu mleziva krav pokusné skupiny po porodu. Hladina imunoglobulin ů ihned po porodu byla u pokusné skupiny vyšší (60±0,82 g/l) oproti kontrole (57±0,82 g/l). Po 24 hodinách klesla hladina imunoglobulin ů na

26 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 hodnotu 8±1,53 g/l u pokusné skupiny a na 6±1,63 g/l u kontrolní skupiny. V tabulce 13 jsou uvedeny zm ěny množství imunoglobulin ů v jednotlivých časových intervalech. Koncentrace imunoglobulin ů v mlezivu dosahuje hodnoty až 100 g/l. Za minimální je považována koncentrace 60 g/l (PAULÍK, 2006). PAULÍK (2006) dále uvádí, že se množství imunoglobulin ů u jalovic po porodu pobybuje v rozmezí 20 – 40 g/l. Proto je vhodn ější řídké mlezivo prvotelek rad ěji v ůbec nepoužívat a použít čerstvé nebo zamražené mlezivo starších krav. Graf 1 Zm ěny množství imunoglobulin ů v mlezivu v časových intervalech

70 60

50 Pokusná 40 Kontrolní 30 Lineární (Pokusná) Ig (g/l) 20 Lineární (Kontrolní)

10 y = -13,7x + 73,1 r = 0,9861 0 y = -13,4x + 69,8 Po Po 2 Po 6 Po 12 Po 24 r = 0,9875 porodu hod. Období (hodiny)

Záv ěr Teleti musíme podávat pouze kvalitní mlezivo s obsahem imunoglobulin ů vyšším jak 35 g/l. Imunoglobuliny zvyšují specifickou hmotnost mleziva, což umož ňuje rychle zjistit jeho kvalitu. Kvalitní mlezivo má mít hustotu vyšší než 1,047, zatímco b ěžné mléko má hustotu nižší a to v rozmezí 1,028–1,032. Z výsledků lze konstatovat, že v námi provedeném experimentu byly potvrzeny výsledky jiných autor ů, nebo ť p řídavek kvasinkového preparátu do krmné dávky krav m ěl pozitivní ú činek na hustotu a celkovou kvalitu mleziva. P říčinou byla z řejm ě lepší stabilizace bachorového prost ředí u pokusných b řezích krav a lepší využívání živin krmné diety. Nebyla nalezena žádná publikace, která by dokazovala negativní vliv kvasinek na kvalitu mleziva, mléka či zdravotní stav zví řat.

Přísp ěvek vznikl s podporou VZ MSM 621 564 8905

Použitá literatura u autor ů

27 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE EFFECT OF INCREASED IODINE INTAKE ON THE LEVEL OF GLOBULINS IN SHEEP

Dušová, H., Trávní ček, J., Kroupová, V., Peksa, Z., Sta ňková, M., Richterová, J.

Department of veterinary disciplines and quality of products, Agriculture Faculty, JU in České Bud ějovice

Abstract

The paper is focused on the definition of immunity risks connected with increased iodine supplementation in ewes and their newborn lambs. The feed ration in control group (K) of ewes (n = 5) contained for 8 months 3.1 mg iodine per kg of dietary dry matter and for experimental group (P) of ewes (n = 5) 5.1 mg iodine per kg of dietary dry matter. Parallelly with different iodine supplementation the level of immunoglobulin G and gamma globulins in blood serum was examined in ewes and their lambs until 60 days after parturition. The significant decrease of immunoglobulin G of ewes until 60 days after parturition was more pronounced in the experimental group. The significant lower level (P<0.01) of gamma globulins until 60 days after parturition was found only in the group with iodine intake of 5.1 mg/kg dry matter of diet. The concentration of immunoglobulin G and gamma globulins in lambs of dams from experimental group was continually significantly lower for the entire period of 1-30 days only and demonstrated immunological risks of the excessive intake of iodine. The above results call for the need of more profound research and revision of immunity risks connected with the permitted upper limit of iodine supplementation in ruminants 5 mg per kg of 88% dry matter defined by Commission Regulation /EC/ No. 1459/2005.

Úvod Rozvoj biochemických metod pro stanovení parametr ů imunity umož ňuje podrobné vymezení rizik nadbyte čného p říjmu jódu (Paulíková et al., 2002). Doporu čovaný denní příjem jódu pro krávy o hmotnosti 600 kg byl dle Convey et al., (1978) 10 mg na kus. V sou časnosti je maximální povolená hranice koncentrace jódu pro p řežvýkavce 5 mg v kg 88 % sušiny krmné dávky (Na řízení komise ES č. 1459/2005). V posledním desetiletí se uplatn ění vysokého p říjmu jódu na koncentraci IgG v ěnuje zvýšená pozornost. Podle Boland et al., (2008) a Rose et al., (2007) dochází p ři vysokém p říjmu jódu u gravidních bahnic ke snížení koncentrace IgG u jeh ňat ovlivn ěném poklesem jejich intestinální resorpce z kolostra. Po podávání vysokých dávek jódu (5,5-21 mg/kg sušiny krmné dávky) došlo u jeh ňat po narození do 24 hodin po porodu k významnému poklesu koncentrace IgG v krevní plazm ě. 28 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

V zájmu zajišt ění dostate čného množství IgG v krevní plazm ě jeh ňat do 24 hodin po narození by proto nem ěl denní p říjem jódu u bahnic p řesahovat 9 mg na kus a den (Rose et al., 2007). V záv ěru 20. a od po čátku 21. století se zajišt ění optimálního p říjmu jódu a zajišt ění likvidace patofyziologických forem jeho nedostatku da ří úsp ěšn ě řešit v rámci programu WHO /ICCIDD. K řešení jodového deficitu u lidí p řispívá i suplementace jodu u hospodá řských zví řat (Trávní ček et al., 2006) a to především v mléce (Trávní ček et al., 2010). Vzhledem k extrathyreoidálnímu uplatn ění jódu v imunit ě je vhodné v ěnovat vyšší pozornost patofyziologickému dopadu vysokého p říjmu jódu jak v období březosti a porodu u matek tak postnatálnímu období u mlá ďat. Cílem práce bylo ov ěř it, zda dlouhodobé podávání zvýšených dávek jódu (nad úrovni horní hranice povolené normy 5 mg/kg 88 % sušiny krmné dávky) ovlivní koncentraci IgG a procentické zastoupení gamaglobulin ů v krevním séru bahnic a novorozených jeh ňat.

Materiál a metodika Vliv nadbyte čného p říjmu jódu v množství 3,1 a 5,1 mg/kg sušiny krmné dávky na koncentraci IgG a procentické zastoupení gamaglobulin ů byl sledován po dobu 8 m ěsíc ů u kontrolní skupiny bahnic K (n = 5) a u pokusné skupiny bahnic P (n = 5) a jejich narozených jeh ňat (ve skupin ě K 7 jeh ňat, ve skupin ě P 6 jeh ňat do šedesáti dn ů v ěku). Do pokusu byly vybrány ovce na 5. laktaci o hmotnosti 48-53 kg plemene ovce šumavská. Složení základní krmné dávky v dob ě p řed i v pr ůběhu pokusu bylo totožné pro ob ě skupiny bahnic a základní krmná dávka p řed pokusem nebyla o jod obohacována. V dob ě pokusu od 1-2 m ěsíce gravidity do 120-140 dn ů po porodu bahnic se p říjem jodu u kontrolní a pokusné skupiny lišil. Základní složky krmné dávky: 1 500 g lu ční seno, 240 g vojt ěška granule, 270 g ovesná krupice, 9 g minerální dopln ěk byly pro ob ě skupiny bahnic stejné. Obsah jodu na 1 kg sušiny krmné dávky v dob ě experimentu byl: skupina K 3.1 mg I, skupina P 5.1 mg I. Jód byl podáván ve form ě jodi čnanu vápenatého. Krev bahnic a jeh ňat pro stanovení sledovaných parametr ů byla odebrána z hrdelní žíly mezi 7-9 hodinou ráno do zkumavek. Krevní sérum se použilo ke stanovení koncentrace IgG kdy byl využit ELISA Test, od firmy ELISA development, s.r.o. Pro výpo čet procentuálního zastoupení gamaglobulin ů bylo využito elektroforetické d ělení krevních bílkovin na p řístroji firmy Sebia Electrophorèse. Před experimentem byly krevní vzorky odebrány u bahnic 2 krát v intervalu 30 a 60 dní před jeho zahájením (tabulka 1 ukazuje pr ůměr z těchto 2 odb ěrů) a den 1, 10, 30 po porodu

29 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 v pr ůběhu pokusu (tabulka 2 ukazuje pr ůměr z těchto 3 odb ěrů) a 60. den po porodu. Vzorky krve od jeh ňat byly odebírány pro všechna stanovení 1, 3, 10, 30 a 60 den po narození.. Data byla analyzována pomocí programu Statistica 6.0 Cz software (ANOVA test, Tukey test). Hodnoty P<0,05 a nižší byly považovány za významné. Výsledky jsou vyjád řeny v pr ůměrných hodnotách ± sm ěrodatné odchylky.

Výsledky Před zahájením pokusu (tabulka 1) pr ůměrná koncentrace IgG v krevním séru bahnic (mg/ml) a pr ůměrné procentuální zastoupení gamaglobulin ů v krevním séru nevykazovala významné rozdíly mezi skupinami K a P. U bahnic skupiny P došlo (tabulka 2) k významnému (P<0.01) snížení koncentrace IgG z 19.6 mg/ml p řed pokusem na 13.0 (1-30 dní po porodu) a na 9.8 mg/ml (60 dní po porodu) v pr ůběhu experimentu. Rozdíl mezi pr ůměrnou koncentrací IgG mezi skupinami K a P nebyl významný po celou dobu pokusu. Pr ůměrná koncentrace gamaglobulin ů v období po porodu byla nižší (P<0.01) ve skupin ě P v porovnání se skupinou K. Tab. 1 Úrove ň globulin ů v krevním séru bahnic p řed zahájením suplementace jodu (pr ůměr ± SD) (Globulins in blood serum in ewes before (mean ± SD) Před experimentem Parametr bez suplementace jodu n K P IgG mg/ml 10 18.2 ± 5.0 19.6 ± 3.9 e Gamaglobuliny % 10 17.2 ± 3.3 16.8 ± 3.0

Tab. 2 Úrove ň (pr ůměr ± SD) globulin ů v krevním séru bahnic b ěhem suplementace jodu (The level (mean ± SD) of globulins in blood serum of ewes during supplementation of iodine) Dny po porodu Parametr 1-30 dní po porodu 60 dní po porodu n K P n K P IgG mg/ml 15 14.7 ± 5.8 13.0 ± 5.3 f 5 11.4 ± 2.9 9.8 ± 3.8 g Gamaglobuliny % 15 15.7 ± 1.5 a 12.7 ± 2.5 b 5 17.2 ± 1.8 c 11.3 ± 1.6 d a:b; c:d; e:c,g P<0.01 K - kontrolní skupina 3.1 mg I/kg sušiny krmné dávky P - pokusná skupina 5.1 mg I/kg sušiny krmné dávky

Průměrná koncentrace IgG u jeh ňat (graf 1) byla významn ě nižší (P<0.01) u jeh ňat skupiny P (jeh ňata od matek s vyšším p říjmem jodu - skupina P) v 1, 3, 10 a 30 dni po narození v porovnání se skupinou K (jeh ňata od matek skupiny K). Nejvyšší pr ůměrná

30 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 koncentrace IgG (22.6 ± 6.0) byla zjišt ěna u jeh ňat skupiny K (od matek s nižším p říjmem jodu) 3. den po narození. Tomuto nálezu odpovídalo i procentuální zastoupení gamaglobulin ů (graf 2) u jeh ňat. Jeh ňata ve skupin ě P (matek s vyšším p říjmem jodu) vykazovaly již od narození trvale nižší (P<0,01) procentuální zastoupení gamaglobulin ů a to až do 30. dne po narození než skupina K.

Graf 1 Koncentrace IgG v krevním séru u jeh ňat (IgG concentrations in blood serum of lambs)

30 skupina C skupina E c 25

20 a h e 15 b

10 f ch d 5

IgG (mg/ml krevního séra) krevního (mg/ml IgG 0 1 3 10 30 60 Den po narození a:b, c:d, e:f, h:ch P < 0.01

Graf 2 Procentuální zastoupení gamaglobulin ů v krevním séru u jeh ňat (The percentage of gamma globulins in blood serum of lambs)

skupina C skupina E 40 a 35 30 c 25 e 20 g 15 h 10 f b d 5 0

Gama globuliny (% krevního séra) krevního (% globuliny Gama 1 3 10 30 60 Den po narození a:b; c:d; e:f; g:h; i:j P< 0.01

Diskuze Koncentrace IgG a procentické zastoupení gamaglobulin ů u bahnic (tabulka 1) p řed zahájením definované suplementace jódu 3 mg/kg sušiny v kontrolní skupin ě K a 5 mg I/kg sušiny v pokusné skupin ě P se nelišily. Rámcov ě se zjišt ěné výsledky pohybují ve fyziologickém rozmezí (Jagoš a Bouda 1981). Teprve po opakovaném vyšet ření t ěchto parametr ů po dobu 60 dn ů po porodu (tabulka 2) byl na úrovni koncentrace IgG a procentuálního zastoupení gamaglobulin ů (P<0.01)

31 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 zaznamenán pokles p ři suplementaci 5 mg jódu na kilogram sušiny krmné dávky. Na tomto poklesu IgG a gamaglobulin ů (P<0.05) se p ředevším podílely jejich snížené koncentrace do 30 dn ů po porodu (tabulka 2). K podobnému poklesu IgG p ři vysokém p říjmu jódu u bahnic a jejich jeh ňat dosp ěli Rose et al., (2007) a Boland et al., (2008). Koncentrace IgG (graf 1) byl u jeh ňat skupiny P (jeh ňata matek s vyšším p říjmem jodu 5 mg/kg sušiny) nižší (P<0.01) v 1, 3, 10 a 30 dni po narození v porovnání se skupinou K (jeh ňata matek s nižším p říjmem jodu 3 mg/kg sušiny). Soub ěžn ě byly statisticky významné zm ěny zaznamenány u procentického zastoupení gamaglobulin ů (graf 2). Koncentrace IgG v krevním séru jeh ňat (graf 1) odpovídala dynamice zastoupení gama globulin ů (graf 2) a poukazuje na imunologická rizika nadbyte čného p říjmu jódu po čínaje již při intrauterinním vývoji plodu a v ranném postnatálním období (Haggard et al., 1980). Podrobné dlouhodobé sledování výše uvedených parametr ů v období funk ční zát ěže organismu, kterou mimo jiné p ředstavuje finální období gravidity a postnatální vývoj jedince. Plošná suplementace jódu u hospodá řských zví řat v rámci řešení jeho nedostatku vyžaduje soub ěžn ě vymezení rizik jeho nadbytku. Dle na řízení komise ES č. 1459/2005 p ředstavuje 5 mg jódu v kg 88% sušiny horní povolenou hranici jeho denního p říjmu. V předložené práci byly u bahnic v peripartálním období a u jejich jeh ňat zjišt ěny v souladu s nálezy jiných autor ů rizikové zm ěny v koncentraci IgG a procentickém zastoupení gamaglobulin ů. U bahnic se p ři suplementaci 5 mg I na kg sušiny jednalo o statisticky nevýznamný pokles koncentrace IgG a nižší zastoupení gamaglobulin ů (P<0.01) do 60. dne po porodu. U jeh ňat skupiny P došlo k významnému poklesu IgG (P<0.01) až do 30. dne po narození. Zastoupení gamaglobulin ů bylo významn ě nižší od 1. až do 30. dne po narození u jeh ňat skupiny P. Zm ěny koncentrace IgG a procentického zastoupení gamaglobulin ů u bahnic a jejich jeh ňat zjišt ěné p ři p říjmu 5,1 mg I/kg sušiny krmné dávky (p ředevším významný pokles koncentrace imunoglobulinu G a zastoupení gamaglobulin ů u jeh ňat po narození) upozor ňují v souladu s aktuálními a významnými nálezy Rose et al. (2007) a Boland et al. (2006, 2008) na významné snížení imunity v časném postnatálním období u matek a zvlášt ě u narozených mlá ďat v souvislosti s dlouhodobým nadm ěrným příjmem jódu.

Pod ěkování Tato studie byla podporována z grantu NAZV QH 81 105 Ministerstva zem ědělství a z projektu 022/2010/Z Grantové agentury Jiho české univerzity v Českých Bud ějovicích.

32 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Použitá literatura Boland, T.M., Callan, J.J., Brophy, P.O., Quinn, P.J., Crosby, T.F. Lamb serum vitamin E and immunoglobulin G concentrations in response to various maternal mineral and iodinesupplementation regiment. Anim. Sci. , 2006, 82, 319-325. Boland, T.M., Hayes, L., Sweeney, T., Callan, J.J., Baird, A.W., Keely, S,, Crosby, T.F. Theeffects of cobalt and iodine supplementation of the pregnant ewe diet on Ig G, vitamin E, T 3 and T 4 levels in the progeny . Animal ., 2008, 2, 197-206. Haggard, D.L., Stowe, H.D., Conner, G.H., Johnson, D.W. Immunologic effects of experimental iodine toxicosis in young cattle. Am. J. Vet. Res ., 1980, 41, 539-543. Jagoš, P., Bouda, J. Základní biochemické a hematologické hodnoty u domácích zví řat a nové zp ůsoby vyjad řování výsledk ů laboratorních vyšet ření. SVS, Odd ělení Veterinární Osv ěty, Pardubice, 1981. Na řízení Komise (ES) č. 1459/2005 ze dne 8. zá ří 2005, kterým se m ění podmínky pro povolení n ěkterých dopl ňkových látek v krmivech, které pat ří do skupiny stopových prvk ů. OJEU ., 2005. Paulíková, I., Ková č, G., Bíreš, J., Paulík, Š., Seidel, H., Nagy, O. Iodine toxicity in ruminants. Vet. Med-Czech ., 2002, 12, 343-350. Rose, M.T., Wolf, B.T., Haresign, W. Effect of the level of iodine in the diet of pregnant ewes on the concentration of immunoglobulin G in the plasma of neonatal lambs following the consumption of colostrum. Br. J. Nutr., 2007, 97, 315-320. Trávní ček, J., Herzig, I., Kursa, J., Kroupová, V., Navrátilová, M. Iodine content in raw milk. Vet. Med. – Czech. , 2006, 51, 448-453. Trávní ček, J., Kroupová, V., Kone čný, R., Sta ňková, M., Š ťastná, J., Haso ňová, L., Mikulová, M. Iodine status in ewes with the intake of iodine enriched alga Chlorella . Czech J. Anim. Sci. , 2010, 55, 58-65.

33 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE EVALUATION OF SPERM BULL MOTILITY

Filip čík R., Hanuláková Š.

Department of Animal Breeding, Agronomy Faculty, Mendel University in Brno

Abstract The aim of this work was to compare the thawing methods of a cattle insemination dose in relation to bull sperm motility and patomorfological changes of sperm. The highest ratio of sperm motility immediately after the thawing was found at the standard preparation method for insemination doses (32. 9 %). The sperm motility ratio after the thawing and leaving in cold was 31. 3 %. The least suitable method was the straw defrosting in a palm where the sperm motility was just 23. 8 %. The evaluation 30 minutes post thawing established nearly comparable figures like at the evaluation done immediately after the thawing of the insemination doses. The highest active sperm number was found 60 minutes post thawing. (36. 3; 35. 7, respectively 23. 4 % at thawing in a palm). The second part of this experiment was to evaluated on the structure of sperm. Significant change was not found.

Key words : bull sperm, sperm survival, sperm motility, Czech Fleckvieh

Úvod U skotu se k inseminaci používá insemina ční dávka dlouhodob ě konzervovaná v tekutém dusíku p ři teplot ě -196 ºC. Semeno ur čené ke zpracování musí odpovídat ČSN 46 7111. Zralé a integritní spermie se prezentují v ejakulátu pohybem, který ozna čujeme jako souosý dop ředný – progresivní (V ĚŽNÍK et al., 2004). ŘÍHA a kol., (2004) dopl ňuje, že s prodlužující se dobou po odb ěru dochází u ejakulátu k tzv. vitální degeneraci spermií, p ři které se rychlost p římo čarého pohybu zpomaluje a ten se m ění na pohyb kruhový, postupn ě následuje pohyb p řerušovaný a trhavý, pozd ěji pohyb ustává. U nativních ejakulát ů ur čených k přímé inseminaci nebo ur čených ke konzervaci se požaduje minimální aktivita 70 %. Aktivita spermií v rozmražené insemina ční dávce musí být minimáln ě 30 %. Cílem práce bylo vyhodnotit aktivitu a morfologickou stavbu bý čích spermií ve vztahu ke zp ůsobu rozmrazování insemina ční dávky a závislosti na dob ě ponechání rozmražené insemina ční dávky v laboratorních podmínkách.

34 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Materiál a metodika K analýze byly použity insemina ční dávky deseti býk ů českého strakatého skotu. Od každého býka bylo hodnoceno 60 hluboce zmrazených insemina čních dávek vyrobených z jednoho odebraného ejakulátu. Pro pokus byly zvoleny t ři metody rozmrazování insemina čních dávek. První metodou bylo standardní rozmrazení pejety ve vodní lázni p ři teplot ě 38 ºC. Doba rozmražení byla 20 sekund. Po vyjmutí z lázn ě byla pejeta osušena buni čitou vatou, byl odst řižen zatavený konec a dávka byla vložena do zavad ěč e. Následn ě byla p řekryta plastovou krytkou, což byla finální úprava dávky p řed jejím následným hodnocením. Druhým zp ůsobem bylo rozmrazení insemina ční dávky v sev řené dlani. Doba rozmrazování byla 20 sekund. Poté byla pejeta vložena do zavad ěč e. U t řetího zp ůsobu bylo použito standardního zp ůsobu rozmražení pejety ve vodní lázni o teplot ě 38 ºC. Následn ě byl zavad ěč s insemina ční dávkou vložen na dobu 5 minut do chladni čky, kde byla teplota 0 °C. Tímto zp ůsobem byla simulována situace, kdy chovatel rozmrazí v zim ě více insemina čních dávek sou časn ě, a než prob ěhne vlastní inseminace, tak dojde k ochlazení rozmražené pejety, což je nežádoucí. Od každého býka bylo použito vždy 20 insemina čních dávek pro každou metodu p řípravy. Aktivita spermií byla posuzována mikroskopicky p ři 200 – 300 násobném zv ětšení s využitím výh řevné desti čky (teplota 39 ºC ± 1 ºC). Aktivita byla hodnocena vždy ze 3 zorných polí a odhadem se stanovilo procentické zastoupení spermií pohybujících se přímo čaře vp řed za hlavi čkou. Aktivita byla hodnocena ve t řech časech, aby bylo zjišt ěno, jak dlouho po rozmražení bude zachována p ředepsaná minimální 30% aktivita spermií po rozmražení. Poprvé bylo provedeno hodnocení ihned po rozmražení ( čas t 0). Druhé hodnocení prob ěhlo po 30 minutách ( čas t 30 ). T řetí hodnocení prob ěhlo po jedné hodin ě od rozmražení

(čas t 60 ). Po dobu čekání na další hodnocení byly katetry s insemina čními dávkami odloženy v laborato ři p ři teplot ě 20 ºC ± 3 ºC. P řestože tato teplota neodpovídá standardnímu testování aktivity spermií, byla touto teplotou simulována situace, kdy chovatel ponechá ležet delší dobu zavad ěč s rozmraženou insemina ční dávkou ve stáji, kde se teplota prost ředí pohybuje okolo 20 °C. Po rozmražení každé pejety byl zhotoven nát ěr na podložní sklí čko, který byl obarven metodou podle B. T. Farellyho. Následn ě prob ěhlo morfologické vyšet ření jednotlivých preparát ů, kdy byl sledován po čet normálních (nezm ěněných) spermií, zm ěny na hlavi čce, akrozomu, degenerativní zm ěny, poruchy bi číku, poruchy spojovací části a výskyt nezralých spermií. U každého preparátu bylo hodnoceno vždy 200 spermií. Procenticky byl vyjád řen po čet morfologických zm ěn na p říslušném hodnoceném oddílu spermie.

35 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Statistické vyhodnocení bylo provedeno pomocí statistického balíku STATISTICA 9.0. s využitím analýzy variance. K ur čení pr ůkazností mezi metodami byl použit Scheffeho test.

Výsledky a diskuse

Nejvyšší aktivita spermií ihned po rozmražení insemina ční dávky (t 0 = 32,9 ± 10,9 %) byla zjišt ěna u insemina čních dávek rozmražených standardní metodou p řípravy (tab. 1). Obdobný podíl aktivních spermií byl stanoven u t řetí metody p řípravy insemina ční dávky, kdy po standardním rozmražení byl vložen zavad ěč s pejetou po dobu 5 min. do chladni čky

(t 0 = 31,3 ± 7,9 %). V případ ě obou t ěchto metod byly dodrženy p ředepsané požadavky na aktivitu spermií (min. 30% podíl aktivních spermií) po rozmražení insemina ční dávky. Tento kvalitativní parametr ovšem nespl ňovaly insemina ční dávky rozmrazované v dlani, kde byla zjišt ěna pr ůkazn ě (p < 0,01) nižší aktivita spermií (23,8 ± 9,7 %). BALLESTER et al., (2007) hodnotili aktivitu spermií u býk ů švédského červeného skotu. Pejety byly rozmraženy ve vodní lázni o teplot ě 35 °C po dobu 12 s. Sperma bylo analyzováno ihned po rozmražení, kde auto ři zjistili hodnotu motilních spermií 49,5 ± 13,9 %. Experiment založený na r ůzných zp ůsobech rozmražení insemina ční dávky provedl také CONTRI et al., (2010). Insemina ční dávky býk ů švýcarského hn ědého skotu rozmrazoval po dobu 10 min ve vodní lázni o teplot ě 37 °C (standardní metoda p řípravy insemina ční dávky v Itálii). Druhým zp ůsobem bylo rozmrazení pejety ve vod ě o teplot ě 37 °C po dobu 1 min, a jako t řetí zp ůsob rozmrazoval 5 sekund p ři teplot ě 70 °C. P ři standardní metod ě rozmrazení nam ěř il pr ůměrnou hodnotu motilních spermií 48,1 ± 7,6 %. U druhé metody zaznamenal podíl progresivn ě pohybujících se spermií 45,0 ± 5,0 %. U t řetí metody zaznamenal hodnotu (45,5 % ± 8,1 %). MEHMOOD et al., (2009) publikovali aktivitu bý čích spermií ihned po rozmrazení ve výši 38,5 ± 4,9 %. Při hodnocení motility spermií v dob ě 30 minut od rozmrazení insemina ční dávky byla zjišt ěna nejvyšší aktivita (31,5 ± 11,7 %) u insemina čních dávek rozmražených standardní metodou p řípravy insemina ční dávky. U metody, kdy pejety byly rozmrazovány v dlani, nebylo zvýšení po čtu aktivních spermií tak výrazné jako u p ředchozí metody (+1,2 %). U t řetí metody p řípravy insemina ční dávky byla zjišt ěna aktivita 30,9 % s variabilitou 8,5 %. P ři vyhodnocování aktivity spermií, kdy rozmražené insemina ční dávky byly 60 minut ponechány v laboratorních podmínkách p ři teplot ě 20 ºC ± 3 ºC, bylo zjišt ěno výrazné (+ 4,8 %) zvýšení po čtu aktivních spermií u insemina čních dávek rozmrazovaných standardní metodou (t 60 = 36,3 ± 14,7 %) a u metody p řípravy, kdy byly pejety po rozmrazení vloženy do chladni čky (t 60 = 35,7 ± 9,2 %). Nejhorší (p < 0,01) výsledky byly prokázány p ři

36 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

rozmrazování insemina čních dávek v dlani, kdy se aktivita spermií zvýšila pouze o 0,3% (t 60 = 23,4 %) v porovnání s motilitou spermií v čase 30 minut po rozmrazení insemina ční dávky.

Tab. 1 Aktivita spermií v závislosti na zp ůsobu p řípravy insemina ční dávky (Effect of preparation of insemination dose on sperm activity) METODA PŘÍPRAVY INSEMINA ČNÍ DÁVKY Standardní Inkubace ČAS (min) Rozmražení v dlani rozmražení v chladni čce (%) (%) (%) 32,9 A 23,8 B 31,3 A t0

sx 10,9 9,7 7,9

A B A 31,5 23,1 30,9 t30 sx 11,7 8,8 8,5

C B C 36,3 23,4 35,7 t60 sx 14,7 10,0 9,2

A, B, C = signifikantní diference (p < 0,01) mezi metodami rozmrazování a mezi časy hodnocení aktivity

Statisticky pr ůkazné diference (p < 0,01) byly prokázány mezi aktivitou spermií hodnocenou v čase t 0, t30 a hodnocením v čase t 60 u metody standardní p řípravy insemina ční dávky a u metody, kdy po rozmrazení byly pejety vloženy do chladni čky. U obou t ěchto metod byly také prokázány signifikantní diference v jednotlivých časech v ůč i aktivit ě spermií v insemina čních dávkách rozmazovaných v dlani. UNDERWOOD et al., (2009) vyhodnocovali aktivitu spermií v hodinových intervalech od rozmrazení. V čase 60 minut od přípravy insemina ční dávky uvádí podíl progresivn ě pohybujících se spermií na úrovni 20 %. Tento výsledek je srovnatelný s našimi výsledky, respektive s aktivitou spermií, kdy insemina ční dávky byly rozmrazovány v dlani. BERAN et al., (2010) publikovali obdobné výsledky aktivity spermií (37,2 %) v čase t 60 , p řestože insemina ční dávky uchovával v termoboxu p ři vyšší teplot ě (38 °C). Výsledky morfologického hodnocení stavby spermií jsou uvedeny v tabulce 2. Z výsledk ů je patrné, že vlivem odlišné p řípravy insemina ční dávky nedošlo k výrazné zm ěně ve výskytu morfologických vad ve stavb ě spermií, kdy všechny hodnocené parametry odpovídaly norm ě, pouze byl zjišt ěn zvýšený výskyt vad v utvá ření bi čík ů, což však mohlo být zp ůsobeno p ři výrob ě nát ěru na podložní sklí čko. Výrazných rozdíl ů dosáhl ve svém experimentu V ĚŽNÍK et al., (2000), který uvádí výrazn ě nižší hodnoty poškození bi čík ů

37 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

(sto čení bi číku = 0,33 % ± 0,61 %, svinutí bi číku = 0,55 % ± 0,94 %) . AL-MAKHZOOMI et al., (2008) uvádí podíl vad ve stavb ě bi číku na úrovni 0,9 % ± 0,4 %.

Tab. 2 Hodnocení morfologické stavby bý čích spermií (The evaluation on morphological structure of sperm)

Normální Patologické zm ěny ve stavb ě spermií (%) Metoda spermie Deg. nezralé (%) Hlavi čka Akrozóm Spoj. část Bi čík zm ěny spermie Standard 86,12 ± 4,7 1,28 ± 0,8 0,06 ± 0,09 1,34 ± 1,2 9,78 ± 3,3 0,6 ± 0,4 0,82 ± 0,6

Dla ň 86,56 ± 7,0 1,3 ± 0,7 0,22 ± 0,3 1,18 ± 1,1 9,2 ± 5 0,68 ± 0,5 0,88 ± 0,8 5 min v 88,12 ± 5,8 0,92 ± 0,4 0,1 ± 0,1 0,98 ± 0,6 8,36 ± 4,8 0,6 ± 0,3 0,94 ± 0,8 0°C

Záv ěr Z výsledk ů práce vyplývá, že je nutné používat pouze standardní zp ůsob p řípravy insemina ční dávky skotu, kdy je zajišt ěn nejvyšší podíl aktivních spermií. Ponechání správn ě rozmražené insemina ční dávky v chladu nezp ůsobuje výrazný (signifikantní) pokles aktivity bý čích spermií. V žádném p řípad ě nesmí být použit k rozmražení insemina ční dávky zp ůsob rozmrazování pejet v sev řené dlani, kdy nedojte k dostate čnému rozmrazení ejakulátu, ve spermiích neza čnou probíhat v požadované mí ře biochemické procesy vedoucí k jejich progresivnímu pohybu, což v kone čném d ůsledku povede ke zhoršení zab řezávání plemenic. Zp ůsob rozmražení insemina ční dávky nemá vliv na patomorfologické vyšet ření ejakulátu. Pod ěkování Práce byla vytvo řena s podporou grantu Interní grantové agentury AF Mendelu v Brn ě TP1/2012. Použitá literatura Al-Makhzoomi, A., Lundeheim, N., Haard, M., Rodríguez-Martínez, H. Sperm morphology and fertility of prognen – tested AI dairy bulls in Sweden. Theriogenology , 2008, 70, 682 – 691. Ballaster, J., Johannisson, A., Saravia, F., Haard, M., – Gustafsson, H., Bajramovic, D., Rodríguez-Martínez, H. Post-thaw viability of bull AI –doses with low-sperm numbers. Theriogenology , 2007, 68, 934 – 943. Beran, J., Stádník, L., Duchá ček, J., Louda, F. Comparison of four diluents for cry conservation of bull semen and their effect on sperm survival. In: Mezinárodní v ědecká konference “MendelNet 2010”, Mendelova univerzita v Brn ě, 2010, 204 - 210. Contri, A., Valorz, C., Faustini, M., Wegher, L., Carluccio, A. Effect of semen preparation on casa motility results in cryopreserved bull spermatozoa. Theriogenology , 2010, 74, 424 - 435.

38 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Mehmood, A., Anwara, M., Saqlan Naqvib, S.M. Motility, acrosome integrity, membrane integrity and oocyte cleavage rate of sperm separated by swim-up or Percoll gradient method from frozen–thawed buffalo semen. Anim. Reprod. Sci , 2009, 111, 171 - 148. Říha, J., Jakubec, V., Jílek, F., Illek, J., Kvapilík, J., Hanuš, O., Čermák, V. Reprodukce v procesu šlecht ění skotu. Asociace chovatel ů masných plemen Rapotín, 2004, ISBN 80- 903143-5-X. Underwood, S.L., Bathgate, R., Maxwell, W.M.C., Evans, G. In vitro characteristics of frozen-thawed, sex-sorted bull sperm after refreezing or incubation at 15 or 37 °C. Theriogenology , 2009, 72, 1001 - 1008. Věžník, Z., Švecová, D., Zajícová, A., P řinosilová, P. Repetitorium spermatologie a andrologie, metodiky spermatoanalýzy. Výzkumný ústav veterinárního léka řství, Brno, 2004, 258 s. Věžník, Z., Švecová, D., Zajícová, A., Bendová, J., Faldíková, L., Zralý, Z., Netolická, S., Pospíšil, L., Diblíková, I., Zudová, D., Matoušková, O. Hodnocení semene pro asistovanou reprodukci a výb ěr plemeník ů. Výzkumný ústav veterinárního léka řství, Brno, 2000, 141 s.

39 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

ENDOMETRIAL POTENTIAL FOR CONVERSION OF T TO E 2 IN PREGNANT AND CYCLIC PIGS

Franczak, A., Wojciechowicz, B., Kołakowska, J., Kotwica, G.

Department of Animal Physiology, University of Warmia and Mazury in Olsztyn, Oczapowskiego 1 A, 10-718 Olsztyn, Poland

Abstract Steroid hormones are produced by porcine endometrium during early pregnancy and the estrous cycle. It is hypothesized, that uterine-derived steroids are involved in the regulation of processes leading to the maternal recognition of pregnancy, maintenance of corpus luteum, successful implantation of embryos and upholding of gestation. The regulation of steroidogenesis pathway in the porcine uterus remains unknown, therefore the aim of presented study was to describe the endometrial potential for conversion of T to E 2 in pregnant and cyclic pigs. The slices of endometrium were dissected from pregnant (n = 4) and cyclic (n = 4) gilts on days 15 to 16 of both period, immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C until total RNA isolation. Extracted RNA was designed to examine genomic profiles of pregnant and cyclic porcine endometrium with use of Agilent’s Porcine (V2) Gene Expression Two-color microarrays. After extraction of differentially expressed genes involved in steroidogenesis process, the expression changes of chosen ones were confirmed with qPCR. In the next experiment, the fresh slices (200-210 mg) of endometrium were placed in M199 medium, preincubated for 18 h and incubated for the next 6 h in 37°C and in -5 an atmosphere of 95% O 2 and 5% CO 2 with or without (control) progesterone (10 M). The 17 β-estradiol and testosterone (T) concentrations were measured with RIA in collected medium. Microarrays data analysis revealed, that the gene CYP19A3 encoding P450 aromatase isoform 3, the enzyme converting T into E2, is down-regulated (2.67 fold) in endometrium obtained from pregnant pigs when comparing to cyclic ones. This result was subsequently confirmed with qPCR. The production of T by pregnant endometrium was significantly lower than production by cyclic tissue (p < 0.05). This trend was reversed after supplementation with progesterone (P 4). The higher (p < 0.05) T concentration was measured in medium after incubation of pregnant tissues with P 4. The pregnant endometrium produced more E 2 than the cyclic one both during incubation without and with progesterone (p < 0.05). Presented results provide novel evidences supporting our concept about endometrial production of T and E 2. The lower expression of CYP19A3 gene in pregnant tissue may suggest that instead of testosterone aromatization, the conversion of estrone into E 2 may be 40 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

predominant mechanism of endometrial E 2 synthesis. Further studies need to be conceived to confirm this hypothesis. The study was supported by National Science Centre within the grant No. N N311 526940 (2011-2013).

41 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

EXPRESSION OF 3 Β-HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE (3 Β-HSD) AND ANDROSTENDIONE PRODUCTION IN PORCINE ENDOMETRIUM

Franczak, A., Kołakowska, J., Wojciechowicz, B., Kotwica, G.

Department of Animal Physiology, University of Warmia and Mazury in Olsztyn, Oczapowskiego 1 A, 10-718 Olsztyn, Poland

Abstract During early pregnancy and the estrous cycle the porcine uterine tissues (endometrium and myometrium) possess potential to synthesize and secrete sex steroids. Steroids of uterine origin may help to ensure the optimal local environment for developing embryos and support the maintenance of early pregnancy in pigs. The aim of the study was to examine the potential for androstenedione (A 4) production by endometrium on days 15 to 16 of pregnancy and the estrous cycle. The slices of endometrium were dissected from pregnant (n = 4) and cyclic (n = 4) gilts on days 15 to 16 of both period, immediately frozen in liquid nitrogen and stored at - 80°C until total RNA isolation. Extracted RNA was used to examine genomic profiles of pregnant and cyclic porcine endometrium with use of Agilent’s Porcine (V2) Gene Expression Two-color microarrays. After appointment of differentially expressed genes involved in steroidogenesis process, the expression changes of chosen ones were confirmed with qPCR and at protein level with immunofluorescence. Moreover, the fresh slices (200- 210 mg) of endometrium were placed in M199 medium and incubated in vitro. After 18 h of preincubation and 6 h of incubation in 37°C and in an atmosphere of 95% O 2 and 5% CO 2 with or without (control) progesterone (10 -5 M). Androstendione concentration in collected medium was measured with RIA. Microarrays data analysis revealed, that the gene encoding 3β-hydroxysteroid dehydrogenase ( HSD3B1 ) is significantly up-regulated in endometrium obtained from pregnant pigs when comparing to cyclic ones (1.3 fold). The up-regulation of HSD3B1 was confirmed with qPCR. Additionally, when comparing the areas of immunofluorescent reaction, the 3 βHSD protein was more abundant in pregnant endometrium. Pregnant endometrium was higher source of A 4 than tissue obtained during the estrous cycle both after incubation with and without progesterone (p < 0.05). Presented results support our concept of endometrial steroidogenesis in pigs. The higher endometrial HSD3B1 expression , 3βHSD quantity and A 4 production during early pregnancy suggest the induction of steroid hormones biosynthesis pathway in this tissue at initial stages of gestation. The study was supported by National Science Centre within the grant No. N N311 526940 (2011-2013).

42 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

DETECTION OF TILMICOSIN EFFECT ON CELL CULTURES IN VITRO

Fülopová, D., 1,2 Ková čik, A., 1 Ková čová, R., 1,2 Čupka, P., 1 Tušimová, E., 1 Massányi, P. 1

1Slovenská po ľnohospodárska univerzita v Nitre, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Katedra fyziológie živo číchov, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra 2Ústav štátnej kontroly veterinárnych biopreparátov a lie čiv Nitra, Biovetská 34, 949 01 Nitra

Abstract Tilmicosin is in veterinary practice indicated for treatment of various diseases. In this study the effect of various concentration of tilmicosin (50 – 2000 g.ml -1) was analyzed in 3 cell types (BHK, FE, VERO) in vitro. The effect was evaluated after 24 hours of culture. Results clearly describe negative effect which is dose and cell dependent. BHK cells are most sensitive and a significant decrease of vital cells was detected in the lowest concentration of tilmicosin. Similar tendency was detected for FE cells. The most resistant were VERO cells, with a significant decrease of vital cells at the concentration 300 g.ml -1. In BHK cells biochemical analysis showed significant decrease in the concentration of chlorides and total proteins in almost all experimental groups. For FE cells no significant differences were found. At the highest concentrations of tilmicosin in VERO cells significant increase of all analyzed elements and total proteins in medium was detected, suggesting negative effect of tilmicosin. Key words: tilmicosin, cell cultures, mineral profile, total proteins, cholesterol

Úvod Životné prostredie buniek musí dosahova ť ur čité chemické a biochemické parametre, aby bunka mohla ži ť a plni ť svoju funkciu. Prostredie eukaryotických buniek v mnohobunkovom organizme môže by ť narušené prítomnos ťou niektorých baktérií, ktoré narušia rovnovážny stav a môže dôjs ť k deštrukcii buniek. Antibiotiká sú chemické substancie, ktoré sú toxické pre bunky rôznym spôsobom. Boli vyvinuté na zabíjanie baktérií, ale sná ď neexistuje terapeutická látka, ktorá zabije len bakteriálnu alebo anomálnu bunku bez nežiaduceho vplyvu na zdravú bunku. Toxický vplyv antibiotík na zdravé eukaryotické bunky je často závislý od ich koncentrácie, teda od dávky, ktorá je do tela vpravená. Pod pojmom „mechanizmus ú činku látky“ rozumieme biochemické a biofyzikálne celulárne pochody, ktoré sú podkladom ú činku. Mechanizmus ú činku objasní ú činok látky na základe jej zásahu do známych fyziologických alebo biochemických pochodov (Lüllmanne et al., 2003). Rozdiel medzi enzýmami používaných na syntézu nukleových kyselín u prokaryotov a eukaryotov dáva význam selektívnemu pôsobeniu antibiotík, ktoré inhibujú syntézu nukleových kyselín,

43 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 napr. rifampicín, sulfonamidy, trimethoprim, sulfóny, pyrimethamín, ciprofloxacín, norofloxacín, kyselina nalidixová (Mayer, 2010).

Prirodzené makrolidové antibiotiká boli predpisované v podobných indikáciách ako penicilín, pretože majú skoro rovnaké spektrum ú činku. Prirodzené antibiotiká sa musia podáva ť vo vysokých dávkach a ostávajú ú činné len nieko ľko hodín. Tieto vysoké dávky majú ve ľa sprievodných nežiaducich ú činkov, ktoré môžu by ť letálne. Makrolidy obsahujú 14, 15, 16 – členný laktónový kruh doplnený nieko ľkými amino– alebo neutrálnymi cukrami. 14 členný kruh Erythromycínu je si najznámejší makrolid. Josamycín a spiramcín zastupujú 16 členné makrolidy (Kaiser, 2009). Na ich priamy inhibi čný ú činok na mikroorganizmy makrolidy uplat ňujú rôzne druhy ú činku subinhibi čných koncentrácií (sub–MIC), ktoré za čínajú by ť stále viac považované za dôležité faktory ich terapeutického ú činku (Krist, 1997). Sú to inhibítory syntézy proteínov. Ich mechanizmus ú činku spo číva v inhibícii syntézy bakteriálnych proteínov zabra ňovaním peptidyltransferáze prida ť peptidyl pripojený k tRNA k ďalšej aminokyseline (Kaiser, 2009). Táto inhibícia je spôsobená väzbou na 50S subjednotku ribozómu. Väzba je reverzibilná, vedie k nahromadeniu di– a tri– peptidov v bunke, ktorá nie je schopná ich syntetizova ť na potrebnú bielkovinu a hynie. Ďalším potenciálnym mechanizmom ú činku je pred časné oddelenie, disociácia, peptidyl– tRNA od ribozómu (Tenson et al., 2003). Vzájomné pôsobenie makrolidov a statínov (používaných na znižovanie cholestreolu) nie je odporú čané, pretože môže vies ť k oslabujúcej myopatii. Je to tak preto, lebo makrolidy sú inhibítormi cytochrómu P450, konkrétne CYP 3A4. Makrolidy, hlavne erythromycín a clarithromycín predlžujú interval QT, čo môže vies ť k torsade de pointes t.j typickej forme ventrikulárnej tachykardie. Vykazujú enterohepatálnu recykláciu, čo znemená, že látka je absorbovaná v čreve, poslaná do pe čene, následne vylú čená do duodena v žl či. Toto môže vies ť ku kumulácii ú činnej látky a spôsobi ť nauzeu (Sathsivam a Lecky, 2008). Základným cie ľom našej práce bolo zhodnoti ť cytotoxicitu tilmikozínu na troch rozli čných bunkových kultúrach in vitro.

Materiál a metódy Použili sme bunkové línie BHK 21, FE a VERO, ktorých pasáže sú uskladnené v tekutom dusíku na oddelení biopreparátov ÚŠKVBL Nitra. Bunky sme oživili pod ľa ŠPP ÚŠKVBL Nitra 007. Po oživení sme bunky preniesli do sterilných Roux fliaš a uložili ich do termostatu pri teplote 37°C. Po 24 hodinách sme kontrolovali intenzitu prichytenia o dno a množenie buniek. Pod ľa intenzity rastu buniek a tvorby jednovrstvy sme bunky spracovali ďalej alebo nechali ešte rás ť v médiu na Roux f ľaši. Ke ď bola jednovrstva buniek súvislá,

44 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 oddelili sme bunky do dna po ľa postupu ŠPP 007. Stanovili sme denzitu buniek. Pod ľa po čtu buniek sme nariedili suspenziu buniek na kone čnú hodnotu: BHK – 1,7 x 10 6 v 1 ml, VERO – 7,6 x 10 5 v 1 ml a FE 3,6 x 10 5 v 1 ml. Suspenziu sme získali zriedením uvo ľnených buniek kultiva čným médiom obohateným bovinným fetálnym sérom. Po stanovení denzity buniek sme stanovili koncentráciu potrebnú na získanie jednovrstvy po adekvátnej dobe kultivácie. Získanú suspenziu sme rozpipetovali do 48 jamkových platni čiek v objeme 500 µl na jamku. Platni čky sme vložili spä ť do termostatu nastaveného na 37°C. Na hodnotenie toxicity antibiotík sme použili bunkové línie zo zvieracích tkanív: VERO bunky, t.j. bunky z obli čky druhu Makak Rhesus, FE bunky, ma čacie embryonálne bunky a BHK 21 bunkovú líniu z obli čiek mladých chr čkov. Po inkubácii buniek v živnom médiu s obsahom fetálneho séra sme bunky skontrolovali mikroskopicky. Ke ď bola jednovrstva súvislá, v závislosti od druhu buniek a ich nárokov na rast, toto médium sme zliali a na bunky sme navrstvili čerstvo pripravené antibiotiká. Z makrolidovej skupiny sme vybrali tilmikozín, ktorý je používaný vo veterinárskej medicíne (Elanco). Koncentrácie, ktoré sme použili v pokuse sme získali na základe poznatkov o minimálnych inhibi čných koncentráciách vybraných antibiotík ú činných na baktérie a LD 50 pre laboratórne zvieratá. Tieto koncentrácie sú pre eukaryotické bunky netoxické, preto sme ich zvýšili 1000 krát. Potom sme ich upravili na koncentráciu, ktorá bola toxická pre všetky bunky, LD 100 . Takto získané koncentrácie sme použili ako nulté riedenie. V titrácii sme pokra čovali desiatkovým riedením. Na to, aby sme získali širšiu škálu, pokra čovali sme dvojkovým riedením. Nakoniec sme vybrali koncentrácie, ktoré pokrývali rozsah od minimálnej, takmer nulovej toxicity, po koncentráciu, ktorá zabila do 24 hodín takmer 100% buniek. Tento postup sme opakovali pre všetky bunkové línie, pretože každý typ buniek je citlivý na inú koncentráciu. Kone čné riedenia antibiotík sme získali riedením nultej koncentrácie ATB v živnom médiu bez pridania bovinného fetálneho séra. V práci boli použité nasledovné koncentrácie tilmikozínu: Koncentrácia µg.ml -1 Vitalita Biochémia BHK 50; 100; 200; 300; 500 50; 100; 125; 200; 250; 300; 500; 1000; 2000 FE 50; 75; 100; 200; 500 50; 75; 100; 200 VERO 125; 250; 300; 350; 400; 450; 500 300; 350; 400; 450 Po aplikácii rôznych koncentrácií tilmikozínu sme kontrolovali stav buniek v jamkách pod mikroskopom pri zvä čšení 25x a 40x. Na základe štruktúry buniek sme hodnotili zastúpenie vitálnych, subvitálnych a mŕtvych buniek. Po 24 hodinovom pôsobení na bunky sme pipetou odsali kultiva čné médium a v eppendorfových skúmavkách sme ho zamrazili na -

45 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

20 °C. Zamrazené médium sme použili na biochemické skúšky, ktorými sme chceli zisti ť vplyv antibiotík na metabolizmus buniek. Sledovali sme koncentráciu Ca, Mg, Na, K, Cl, celkových bielkovín a cholesterolu (Massányi et al., 2009). Na analýzu sodíka, draslíka a chloridov sme použili automatický analyzátor EasyLyte (Medica, Bedford, USA), ostatné sledované parametre sme zis ťovali poloautomatickým analyzátorom Microlab 300 (Vilat Scientific, Dieren, The Netherlands). Na porovnanie výsledkov sme použili štatistický Scheffeho test a štandardný štatistický Studentov t–test. Preukaznos ť rozdielov sme hodnotili na hladine preukaznosti p<0,05; 0,01 a 0,001.

Výsledky a diskusia Tilmikozín vo veterinárskej medicíne je indikovaný na liečbu ochorení spôsobených rôznymi patogénmi ( Pasteurella multocida, P. haemolytica, Mycoplasma sp., Actinobacilllus pleuropneumoniae a pod.). Analyzovali sme ú činok koncentrácií v rozsahu 50 – 2000 g.ml -1. Hrani čné koncentrácie sú extrémy so 100% prežívate ľnos ťou alebo úmrtnos ťou. Z výsledkov (Grafy 1 – 3) je zrejmé, že tilmikozín negatívne ovplyv ňuje životné podmienky buniek. Bunky v priebehu 24 hodín menia morfológiu a za čínajú umiera ť. Z grafov je zjavné, aké množstvo buniek prežilo pôsobenie jednotlivých koncentrácií tilmikozínu. Došlo však k ve ľmi odlišným tendenciám v odpovediach, ktoré sú závislé od typu buniek. BMK bunky sú najsenzitívnejšie a k preukaznému poklesu vitálnych buniek dochádza už pri koncentrácii 50 g.ml -1. Podobná, ale miernejší ú činok bol sledovaný aj u FE buniek. Najodolnejšie boli VERO bunky, kde preukazný pokles vitálnych buniek sme zaznamenali až pri koncentrácii 300 g.ml -1. Pri BHK bunkách sme zistili sledovaním biochemických ukazovate ľov v médiu pokles koncentrácie chloridov a celkových bielkovín takmer pri všetkých použitých koncentráciách tilmikozínu. U ďalšieho typu buniek – FE, sme však nezistili žiadne preukazné odchýlky sledovaných parametrov v porovnaní s kontrolnou skupinou. Pri najvyšších použitých koncentráciách tilmikozínu u buniek VERO sme zistili preukazné zvýšenie všetkých elementov (Ca, Mg, Na, K, Cl) a celkových bielkovín v médiu, čo potvrdzuje negatívny účinok sledovaného antibiotika a koreluje s výsledkami cytomorfológie. Graf 1 Hodnotenie kvality buniek a biochemických ukazovate ľov v médiu – BHK (Evaluation of cell quality and biochemical parameters in the medium – BHK)

46 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

100 2,5 90 80 2 70 60 1,5 50 40 1 30 20 0,5 10 0 0 0 50 100 200 300 500 0 50 100 125 200 250 300 500 1000 2000

vitálne subvitálne mŕtve Ca Mg Na (:100) K (:10) Cl (:100) CB (:10) Chol

Graf 2 Hodnotenie kvality buniek a biochemických ukazovate ľov v médiu – FE (Evaluation of cell quality and biochemical parameters in the medium – F E)

100 2,5

80 2

60 1,5

40 1

20 0,5

0 0 0 50 75 100 200 500 0 50 75 100 200

vitálne subvitálne mŕtve Ca Mg Na (:100) K (:10) Cl (:100) CB (:10) Chol

Graf 3 Hodnotenie kvality buniek a biochemických ukazovate ľov v médiu – VERO (Evaluation of cell quality and biochemical parameters in the medium – VERO)

100 2,5

80 2

60 1,5

40 1

20 0,5

0 0 0 125 250 300 350 400 450 500 K 300 350 400 450

vitálne subvitálne mŕtve Ca Mg Na (:100) K (:10) Cl (:100) CB (:10) Chol

Makrolidové antibiotiká sú klinicky užito čné antibiotiká, ktoré sa všetky viažu na ve ľkú podjednotku ribozómu blízko jadra peptidyl tansferázy. Toto jadro sa tvorí blízko RNA a katalyzuje tvorbu peptidových väzieb po čas predlžovania proteínu (Tenson et al., 2003). Najnovšie, ketolidy (telithromycín) so širším spektrom aktivity proti patogénom boli vyvinuté z makrolidov so 14 členným kruhom. Tieto látky obsahujú keto– skupinu namiesto kladinózy na pozícii 3 laktónového kruhu a majú alkyl–aryl–ové bo čné re ťazce. Makrolidy erytrhromycínovej skupiny neinhibujú reakciu per se (cez seba), skôr blokujú vstup do tunela

47 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 vo ve ľkej podjednotke ribozómu, cez ktorú, ve ľa, ak nie všetky novovzniknuté peptidy opúš ťajú ribozóm. Blokovanie východu z tunela makrolidmi vyvolá pred časné oddelenie peptidyl–tRNA od ribozómu. Takáto zhoršená (drop–off) situácia nastáva po za čatí syntézy proteínu, ke ď je vzniknutý polypeptidový re ťazec krátky. Naproti tomu ribozómy, do ktorých vstúpili polyzómy sú pre lie čivo neprístupné (Tenson et al., 2003). Spoznanie chemickej štruktúry prirodzených antibiotík umožnilo ich modifikáciu, vä čšinou naviazaním postranných re ťazcov, aby sa získali látky s menej nežiaducimi účinkami. Takto pozmenené semisyntetické antibiotiká vrátane makrolidov už nemajú mnohé z nevýhod prirodzeného erythromycínu, ktorý spôsobuje nevo ľnos ť, zvracanie a interferuje s niektorými inými lie čivými látkami (Havlík, 2008). Makrolidové antibiotiká pôsobia bakteriostaticky, sú rýchlo absorbované z tráviaceho traktu, sú slabo toxické, neprenikajú do mozgovomiešnej tekutiny a sú ú činné aj na atypické mikróby bez bunkovej steny.

Po ďakovanie Táto práca bola riešená v rámci grantového projektu VEGA 1/0532/11.

Použitá literatúra Havlík, J. Význam makrolidových antibiotik. Léka řské listy , 5, 2008, 7–9. Kaiser, G. Protein synthesis inhibitors: macrolidesmechanism of action animation. Classification of agents. Lippincott´s Illustrated Reviews: Pharmacology , LWW 2008. Krist, H.A. Informa healthcare. In Expert opinion on investigational drugs, http://informahealthcare.com/doi/abs/10.1517/14712598.2010.510510, 1997. Lüllmann, H., Mohr, K., Wehling, M. Farmakologie a toxikologie . Vydavate ľstvo GRADA, 2004, pp. 728. Massányi, P., Slame čka, J., Lukáč, N., Capcarová, M., Mertin, D., Jur čík, R. Seasonal variations in the blood biochemistry in brown hare. Med. Wet ., 2009, 65, 389–393. Mayer, G. Bacteriology – Chapter six antibiotics: Protein synthesis, nucleic acid synthesis and metabolism. The Board of Trustees of the University of South Carolina, 2010. Sathasivam, S., Lecky, B. Statin induced myopathy. Br. Med. J. , 337, 2008, 979–982. Tenson, T., Lovmar, M., Ehrenberg, M. The mechanism of action of macrolides, lincosamides and streptogramin B reveals the nascent peptide exit path in the ribosome. J. Mol. Biol. , 330, 2003, 1005–1014.

48 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

ELECTRICAL CONDUCTIVITY AND DYNAMIC VISCOSITY OF STALLION EJACULATE IN THE DEPENDENCE TO QUALITATIVE AND QUANTITATIVE INDICATORS

Hanuláková, Š., Mamica, O., Filip čík, R., Hošek, M., Vágenknechtová, M., Máchal, L., Chládek, G.

Department of Animal Breeding, Agronomy Faculty, Mendel University in Brno

Abstract The basic precondition of the artificial insemination in horse breeding is the selection of quality stallions that produce enough of ejaculate of a good quality. Many methods of ejaculate quality evaluation have been developed for this purpose. One of possible methods, additional examination of stallion sperm, is the object of this dissertation. Monitoring of physical qualities of ejaculate was performed in 11 clinically healthy breeding stallions that are employed within breeding program of Czech warmblood. 95 samples were collected for further examination of the electrical conductivity and the dynamic viscosity measurement and assesment of basic qualitative and quantitative indicators. Measured electrical conductivity of stallion ejaculate varied from 0,32 S.m -1 to 0,55 S.m -1. The mean value for whole experiment was 0,38 S.m -1. The dynamic viscosity showed range from 88 mPa.s to 189 mPa with the mean value of 130,19 mPa.s. Highly statistically significant positive linear dependence between the electrical conductivity of ejaculate and sperm concentration (; rp = 0,69; P ≤ 0,01) is evident from the results. The results also showed significant negative correlation between the electrical conductivity of ejaculate and its volume (r p = -0,38 P; ≤ 0,05). Positive linear correlation was proved between the electrical conductivity of ejaculate and sperm motility (r p = 0,42; P ≤ 0,05). Concerning the dependence between the dynamic viscosity and the basic indicators of ejaculate, only the concentration of hydrogen inos showed significant negative correlation (r p = - 0,46; P ≤ 0,05)..

Úvod Jedním ze základních p ředpoklad ů úsp ěšné inseminace v chovu koní je výb ěr kvalitních plemenných h řebc ů, kte ří produkují dostate čné množství ejakulátu v dobré kvalit ě. Stále se zvyšující po čet dostupných diagnostických metod nám dává možnost přesn ějšího hodnocení spermatu plemeník ů (Ball et al., 2008; Brito et al., 2007). Stanovení základních parametr ů ejakulátu jako je nap ř. objem ejakulátu, koncentrace spermií, motilita spermií aj. a

49 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

šetrné vyšet ření zdravotního stavu samotných h řebc ů, jsou stále nejd ůležit ější sou částí hodnocení plemenných h řebc ů ( Morrell et al., 2008; Quientero-Moreno., 2002; Angela et al., 2002). Otázkou elektrické vodivosti a dynamické viskozity ejakulátu se ve svých studiích zabývalo pouze n ěkolik autor ů (Bravo et al., 2000; Garnica et al., 1993; Andrade-Rocha, 2005; Esfandiari et al., 2006). Elektrická vodivost biologického materiálu je netriviální funkcí kmito čtu. Tato funkce umož ňuje vyšet řovat strukturu a složení bun ěč ných tkání. Přitom je t řeba zam ěř it svou pozornost p ředevším na oblasti vyšších kmito čtů – radiovln a mikrovln, ve kterých vznikají dielektrické vlastnosti biologických materiál ů (Milion a Blahovec, 1984). Viskozita kapaliny je charakteristickou vlastností reálné kapaliny. Je důsledkem smykového nap ětí, vznikajícího mezi jednotlivými vrstvami kapaliny p ři jejím toku. (Máchal a K řivánek., 2002; Máchal et al., 1977). Tento experiment si kladl za cíl zjistit vztah vybraných kvalitativních a kvantitativních ukazatel ů ejakulátu k elektrické vodivosti ejakulátu a k dynamické viskozit ě ejakulátu. Lze uvažovat o možnosti využití t ěchto metod v praxi jako dalšího eventuálního zp ůsobu dopl ňujícího vyšet ření ejakulátu plemenných hřebc ů.

Materiál a metodika

Biologický materiál a experimentální prost ředí Experiment byl proveden na 11 klinicky zdravých plemenných h řebcích p ůsobících v reproduk ční stanici Zemského h řeb čince Tluma čov s.p. v rámci šlechtitelského programu českého teplokrevníka. H řebci byli r ůzné plemenné p říslušnosti ve v ěku od 10 do 26 let. Po celou dobu experimentu byli plemeníci ustájeni ve stejných podmínkách. Krmná dávka obsahovala objemnou složku, kterou bylo lu ční seno a vojt ěškotravní senáž a část jadrnou, která se skládala z ovsa a granulované krmné sm ěsi obohacené o minerální látky a vitamíny. Podíl jadrné složky byl závislý na pohybové aktivitě plemenných h řebc ů

Odb ěr spermatu Hřebci byli odebíráni na fantom do um ělé vagína typu Missoury, vyrobené firmou Minitüb. Pro odb ěr každého plemenného h řebce byla do vnit řního prostoru um ělé vagíny použita jednorázová vložka z PVC. Um ělá vagína byla p řed odb ěrem temperována na teplotu v rozmezí 40 °C až 42 °C. Pro p řirozenou kluzkost vnit řního prostoru byla použita bílá vazelína.

50 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Kvalitativní a kvantitativní vyšet ření ejakulátu Bezprost ředn ě po odb ěru ejakulátu od h řebce bylo provedeno základní vyšet ření ejakulátu. Objem spermatu byl stanoven v kalibrované kádince, která byla temperována na tělesnou teplou 39º C ± 1º C. Koncentrace vodíkových iont ů ve spermatu h řebc ů byla m ěř ena pomocí stolního p řístroje CyberScan Ion 510 se sondou Polilyte Lab. K měř ící sond ě byl vložen teplotní senzor, který zaznamenával teplotu vzorku a hodnota pH vzorku byla automaticky kompenzována. Hodnocení motility spermií bylo provedeno subjektivní metodou pozorování vzorku ejakulátu pod mikroskopem. Hodnocena byla minimáln ě 3 zorná pole p ři 200 – 300 násobném zv ětšení. Stanovení koncentrace spermií v ejakulátu bylo provedeno hemocytometrickou metodou po čítáním v Bürkerov ě kom ůrce.

Stanovení m ěrné vodivosti ejakulátu Měrná vodivost ejakulátu h řebc ů byla stanovena bioimpedan čním spektroskopickým analyzátorem, který umož ňuje m ěř it elektrickou vodivost jako funkci frekvence o rozsah měř ení 10 Hz až 100 kHz. Je tedy možné stanovit i p řípadný fázový posuv elektrického signálu uvnit ř vzorku a kapacitní složku vodivosti. Pro vylou čení chyby z přechodové impedance, byla pro m ěř ení použita speciální čty řkontaktní sonda. Pro čty řkontaktní m ěř ení byly použity dv ě napájecí a dv ě snímací elektrody. U vzork ů byla zjiš ťována frekven ční závislost vodivosti pomocí vnit řní elektroniky, přístroje Z01, který je schopen p řela ďovat frekvenci automaticky s krokem 10 s.

Stanovení dynamické viskozity ejakulátu Dynamická viskozita ejakulátu h řebc ů byla stanovena pomocí rota čního viskozimetru TR9. V případ ě rota čního viskozimetru je vzorek podrobován smyku mezi dv ěma definovanými plochami, z nichž jedna vykonává otá čivý pohyb, p řičemž se vyhodnocuje brzdný ú činek vzorku p ři r ůzných rychlostech otá čení. Otá čky viskozimetru se pohybovaly v rozp ětí od 0,3 do 200 ot./min.

Statistická analýza Získané hodnoty byly vyhodnocené pomocí statistického balíku STATISTICA 9.0

51 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Výsledky Podkladem pro zpracování výsledk ů bylo 95 vzork ů nativního ejakulátu získaného odb ěrem od 11 klinicky zdravých plemenných h řebc ů, kte ří p ůsobili v rámci šlechtitelského programu českého teplokrevníka. Kvalitativní a kvantitativní ukazatele ejakulátu Pr ůměrné hodnoty nam ěř ené p ři laboratorním vyšet ření vzork ů ejakulátu jsou uvedeny v Tabulce 1. Objem získaného ejakulátu kolísal v rozp ětí hodnot od 10 cm 3 – 160 cm 3. Pr ůměrná hodnota ejakulátu za celé sledované období byla 50,39 cm 3 ± 25,5 cm 3. Motilita spermií se pohybovala v rozmezí hodnot od 50 % do 85 %. Za celé sledované období byla zjišt ěná pr ůměrná hodnota 68,4 % ± 7,92 %. Koncentrace vodíkových iont ů vykazovala rozp ětí hodnot od 6,64 do 7,43 s pr ůměrnou hodnotou 7,04 ± 0,13. Koncentrace spermií v ejakulátu byla v rozmezí od 0,02.10 9.cm -3 do 0,4.10 9.cm -3s pr ůměrnou hodnotou 0,11.10 9.cm -3 ± 0,08.10 9.cm -3. Celkový zjišt ěný po čet spermií v ejakulátu charakterizuje rozp ětí od 0,49.10 9 do 15,60.10 9. Pr ůměrná hodnota za sledované období byla 4,65.10 9 spermií ± 2,87.10 9 spermií. Celkový po čet aktivních spermií se v ejakulátu pohyboval v rozmezí od 0,29.10 9 do 10,92.10 9. Pr ůměrná hodnota celkového po čtu aktivních spermií v ejakulátu byla 3,21.10 9 ± 2,05. 10 9 aktivních spermií.

Fyzikální vlastnosti ejakulátu V Tabulce 1 jsou uvedeny pr ůměrné hodnoty zjišt ěné p ři hodnocení elektrické vodivosti a dynamické viskozity h řeb čího ejakulátu. Nam ěř ená elektrická vodivost byla v rozp ětí hodnot od 0,32 S.m -1 do 0,55 S.m -1. Pr ůměrná hodnota za celé sledované období byla 0,38 S.m -1 ± 0,04 S.m -1. Dynamická viskozita ejakulátu h řebc ů se pohybovala v rozmezí hodnot od 88 mPa.s do 189 mPa.s. Zjišt ěná hodnota dynamické viskozity ejakulátu hřebc ů byla za celé sledované období v pr ůměru 130,19 mPa.s -1 ± 37,3 mPa.s -1.

Vztah fyzikálních vlastností ejakulátu ke kvalitativním a kvantitativním ukazatel ům Vztahy mezi zjišt ěnými kvalitativními, kvantitativními ukazateli a fyzikálními vlastnostmi ejakulátu byly vyjád řeny pomocí Pearsonových korela čních koeficient ů a jsou uvedeny v Tabulce 2. Z výsledk ů je patrná vysoce statisticky významná kladná lineární závislost mezi elektrickou vodivostí ejakulátu a koncentrací spermií v ejakulátu (rp = 0,69; P ≤ 0,01). Statisticky významné záporné korelace byly vypo čteny mezi elektrickou vodivostí ejakulátu a objemem ejakulátu (rp = -0,38 P; ≤ 0,05). Pozitivní, statisticky významná, lineární

52 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

závislost byla prokázána mezi elektrickou vodivostí ejakulátu a motilitou spermií ( rp = 0,42; P ≤ 0,05 ). Mezi dynamickou viskozitou ejakulátu a základními ukazateli ejakulátu byl zjišt ěn statisticky významný záporný vztah pouze v p řípad ě vztahu ke koncentraci vodíkových iont ů

( rp = - 0,46; P ≤ 0,05 ).

Diskuze Problematikou základního vyšet řením spermatu se zabývala celá řada autor ů (Morrell et al., 2008; Sieme et al., 2003; Angela et al., 2002; Parlevliet et al., 1991; Gam čík, Kozumplík et al., 1992; Kliment, 1989). Otázkou fyzikálních vlastností ejakulátu se ve svých publikacích zabývalo pouze n ěkolik autor ů (Bravo et al., 2000; Garnica et al., 1993; Andrade-Rocha, 2005; Esfandiari et al., 2006). Máchal a K řivánek (2000) sledovali m ěrnou elektrickou vodivost ejakulátu býk ů a dosp ěli k záv ěru, že její pr ůměrná hodnota za sledované období byla 0,84 S·m -1. Stejnou problematikou se zabývali i ve svém druhém experimentu kdy hodnotili fyzikální vlastnosti spermatu kohout ů a zjistili, že hodnota m ěrné elektrické vodivosti ejakulátu kohout ů se pohybovala v rozp ětí od 0,84 S·m -1 do 1,02 S·m -1 (Máchal a Křivánek, 2002). V předkládané diserta ční práci byla hodnocena m ěrná elektrická vodivost ejakulátu h řebc ů. Její pr ůměrná hodnota byla 0,38 S.m -1 ± 0,04 S.m -1, tato hodnota je nižší než v případ ě ejakulátu býk ů a kohout ů, kte ří vykazují vyšší koncentraci spermií. Pr ůměrná hodnota dynamické viskozity ejakulátu h řebc ů byla za sledované období 130,19 mPa.s -1 ± 37,3 mPa. -1

Záv ěr Výsledky, které jsou prezentovány v p ředložené práci, jsou výsledky prvotní studie, zabývající se fyzikálními vlastnostmi ejakulát ů h řebc ů. Z tohoto d ůvodu byla komparace s jinými autory jen velmi omezená. Dosavadní výsledky otevírají možnost orienta čního odhadu kvalitativních a kvantitativních ukazatel ů ejakulátu na základ ě zjišt ěných fyzikálních vlastností. P řed zavedením tohoto dopl ňujícího vyšet ření h řeb čího spermatu do praxe je však nutné ov ěř ení dalšími experiment.

Pod ěkování Práce byla vytvo řena s podporou grantu Interní grantové agentury AF Mendelu v Brn ě TP1/2012.

53 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab.1 Pr ůměrné hodnoty kvalitativních, kvantitativních a fyzikálních ukazatel ů ejakulátu (Average values of qualitative, quantitative and physical sperm parameters) OBJEM MOTILITA pH KONCENTRACE CPS CPAS VODIVOST VISKOZITA 3 9 -3 9 9 [cm ] [%] [10 ·cm ] [·10 ] [·10 ] [S·m -1] [mPa ·s-1] µ 50,39 68,4 7,04 0,11 4,65 3,21 0,38 130,19 SX 25,50 7,92 0,13 0,08 2,87 2,05 0,04 37,30 CPS – celkový po čet spermií, CPSA – celkový po čet aktivních spermií

Tab. 2 Fenotypové korelace zjišt ěných hodnot h řeb čího ejakulátu (Correlation dependences of stallion sperm parameters)

objem motilita pH Koncentr. CPS CPSA vodivost viskozita

-0,05 0,13 -0,42 + 0,35 0,34 -0,38 + 0,14 objem

-0,03 0,44 + 0,16 0,33 0,42 + -0,38 motilita

-0,34 -0,19 -0,19 -0,21 -0,46 + pH

0,50 ++ 0,56 ++ 0,69 ++ -0,14 koncentrace ++ CPS 0,98 0,28 0,15

CPSA 0,34 0,09

vodivost -0,24

viskozita CPS – celkový po čet spermií, CPSA – celkový po čet aktivních spermií

Použitá literatura Andrade-Rocha, F.T. Physical analysis of ejaculate to evaluate the secretory activity of the seminal vesicles and prostate. Clin. Chem. Lab. Med ., 2005, 43, 1203 ‒1210. Angela, C., Pommer, J., Rutllant, J., Meyers, S.A. The role of osmotic resistance on equine spermatozoal function. Theriogenology , 2002, 58, 1373−1384. Ball, B.A. Diagnostic Methods for Evaluation of Stallion Subfertility: A Review. J . Equine Vet. Sci ., 2008, 11, 650−665. Bravo, P.W., Ccallo, M., Garnica, J. The effect enzymes on semen viscosity in Liamas and Alpacas. Small Ruminant Res ., 2000, 38, 91−95. Brito, L.F.C. Evaluation of Stallion Sperm Morphology. Clin. Tech. Equine Pract ., 2007, 6, 249−264. Esfandiarri, N., Gotlieb, L., Casper, R.F. Seminal hyperviscosity is associated with poor outcome of controlled ovarian stimulation and intrauterine insemination. Int. J. Fertil Womens Med ., 2006, 51, 21−27. Gam čík, P., Kozumplík, J. et al. Andrológia a umelá inseminácia hospodárskych zvierat. Príroda Bratislava. 1992, 299 s., ISBN 80-07-00540-4. Garnica, J., Achata, R., Bravo, P.W. Physical and biochemical characteristics of alpaca semen. Anim. Reprod. Sci ., 1993, 32, 85−90. Kliment, J. et al. Reprodukcia hospodárskych zvierat. Príroda Bratislava. 2.vyd., 1989, 378 s. ISBN 80-070-0027-5.

54 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Máchal, L., K řivánek, I., Chládek, G., Doležal, P. Korelace mezi relativní permitivitou, konduktivitou a kvantitativními indikátory bý čího a kan čího ejakulátu. J. Anim. Feed Sci ., 1977, 6, 13–22. Máchal, L., K řivánek, I. Dielektrické vlastnosti ejakulátu a semenné plazmy býk ů. Acta univ. agric.et silvic. Mendel. Brun ., 2000, 48, 7−13. Máchal, L., K řivánek, I. Indicators of semen quality of roosters of three parental layer lines and specific conductivity of the semen. Acta Vet. Brno , 2002, 71, 109−116. Milion, J., Blahovec, J. P řísp ěvek ke studiu elektrických vlastností hlíz brambor. Sborník mechaniza ční fakulty, VŠZ Praha, 1984. Morrell, J.M., Johannisson, A., Dalin, A.M., Hammar, L., Sandebert, T., Rodriguez- Martinez, H. Sperm morphology and chromatin integrity in Swedish warmblood stallions and their relationship to pregnancy rates. Acta Vet. Scand ., 2008, 50, 1–7. Parlevliet, J.M., Kemp, B., Colenbrander, B. Reproductive characteristics and semen quality in maiden Deutch Warmblood stallions. J. Am. Vet. Med. Assoc ., 1991, 199(6), 753−754. Sieme, H., Katila, T., Klug, E. Effect of semen collection practices on sperm characteristics before and after storage and on fertility of stallions. Reprod. Domest. Anim ., 2003, 38(4), 305−311. Quientero-Moreno, A., Miró, J., Teresa, Rigau, A., Rodríguez-Gil, J.E. Identification of sperm subpopulations with specific motility characteristics in stallion ejaculates. Biol. Reprod ., 2002, 67 (2), 648−654.

55 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE EFFECT OF ZINC SUPPLEMENTATION ON RUMINAL METABOLISM IN SHEEP

Hauptmanová, K., 1 Panev, A., 1 Dvo řák, R., 1 Pavlata, L., 1 Pechová, A., 1 Filípek, J. 2

1 Klinika chorob p řežvýkavc ů a prasat, 2 Laborato ř pro velká zví řata, Fakulta veterinární medicíny, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Abstract Pokus byl provád ěn na dvou skupinách ovcí po osmi zví řatech. První skupin ě (A) byla podávána krmná sm ěs s organickou formou zinku (Bioplex, Alltech, USA), druhé skupin ě (B) krmná sm ěs s anorganickou formou zinku (ZnO) v dávce 0.3 kg sm ěsi na kus a den. Nejprve byla zví řata krmena po dobu dvou týdn ů krmnou sm ěsí s optimální dávkou zinku (180 mg/kg sušiny sm ěsi). Poté byla krmena po dobu čty ř týdn ů krmnou dávkou se sníženou koncentrací zinku (30 mg/kg sušiny sm ěsi). V druhé polovin ě experimentu byla po dobu čty ř týdn ů krmena krmná sm ěs se zvýšeným obsahem zinku (500 mg/kg sušiny sm ěsi). V pr ůběhu experimentu byla 14., 42., 43. a 70. den odebírána a vyšet řována bachorová tekutina. Aktuální p říjem zinku makroorganismem se parciáln ě odrážel v koncentraci v bachorové tekutin ě a výrazn ě v koncentraci v bachorové biomase. Vliv na obsah zinku v bachoru m ěla forma, v jaké byl zinek podáván. Po podávání bioplexu zinku došlo k většímu nár ůstu koncentrace zinku jak v bachorové tekutin ě, tak v biomase, oproti oxidu zine čnatému. V bachorové biomase byly zjišt ěny p ři aplikaci jak organické, tak anorganické formy Zn mnohonásobn ě vyšší koncentrace Zn než v bachorové tekutin ě. Podávání zinku nem ělo na bachorový metabolismus negativní dopad.

Úvod Zinek je v organismu všech zví řat jedním z esenciálních mikroprvk ů. Má mnoho r ůzných funkcí, hlavn ě je sou částí metaloenzym ů a metaloprotein ů. D ůležitý je také pro bachorovou mikroflóru (Eryavuz a Dehority 2009). Dietetické faktory, které ovliv ňují biologickou dostupnost zinku pro p řežvýkavce, nejsou zcela objasn ěny (Spears et al. 2004, Pavlata et al. 2005). Vst řebávání organické a anorganické formy zinku je obdobné, zvlášt ě u deficitních zví řat. Nicmén ě vylu čování zinku je nižší p ři dotaci v organické form ě (Rojas et al. 1995, Spears 2003). P ři podávání organické formy zinku byly zjišt ěny vyšší koncentrace zinku v orgánech (Henry et al. 1997, Gressley 2009). Tato práce má za cíl zhodnotit vliv množství a formy zinku na vybrané ukazatele bachorové tekutiny u ovcí.

56 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Materiál a metodika Pokus byl provád ěn na dvou skupinách ovcí po osmi zví řatech. P řed pokusem byly všechny ovce krmeny stejn ě, pouze senem a napájeny vodou. Ovce byly ustájeny spole čně ve dvou výb ězích podle skupin. První skupin ě (A) byla podávána krmná sm ěs s organickou formou zinku (Bioplex, Alltech, USA), druhé skupin ě (B) krmná sm ěs s anorganickou formou zinku (ZnO). Nejprve byla zví řata krmena po dobu dvou týdn ů krmnou sm ěsí s optimální dávkou zinku (180 mg/kg sušiny sm ěsi), aby došlo k adaptaci bachorové mikroflóry na nové krmivo (adapta ční fáze). Poté byla krmena po dobu čty ř týdn ů krmnou dávkou se sníženou koncentrací zinku (30 mg/kg sušiny sm ěsi). Jednalo se pouze o přirozený obsah Zn v jednotlivých krmivech obsažených v krmné sm ěsi (fáze I). V druhé polovin ě experimentu (fáze II) byla po dobu čty ř týdn ů krmena krmná sm ěs se zvýšeným obsahem zinku (500 mg/kg sušiny sm ěsi). Krmná dávka na jednoho skopce a den se skládala ze dvou kilogram ů lu čního sena (zinek 11 mg/kg sušiny) a 0.3 kg dopl ňkové krmné sm ěsi s přídavkem zinku (Biosta s.r.o., Blu čina). V pr ůběhu pokusu byly provád ěny odb ěry bachorové tekutiny 14., 42., 43. a 70. den. Byly vyšet řovány následující parametry: pH, celková acidita, po čet nálevník ů, koncentrace kyseliny mlé čné, amoniaku, t ěkavých mastných kyselin, zastoupení jednotlivých kyselin, aktivity ALP, ALT, AST, LDH a amylázy a koncentrace zinku v tekutin ě a v bachorové biomase.

Výsledky a diskuse Výsledky vyšet ření obsahu zinku v bachorové tekutin ě u obou skupin v pr ůběhu celého pokusu jsou uvedeny v tabulce 1. Vyšet řované biochemické parametry bachorové tekutiny se pohybovaly bez ohledu na množství nebo formu podávaného zinku v referen čních rozmezích. Námi podávané množství zinku v organické nebo v anorganické form ě nem ělo negativní vliv na bachorový metabolismus ovcí. Podobných výsledk ů dosáhli Eryavuz et al. (2002) i Froetschel et al. (1990). Naprostá v ětšina zinku se nacházela v bachorové biomase, v tekutin ě se nacházelo asi pětsetkrát mén ě zinku než v biomase. K podobným výsledk ům dosp ěli u býk ů i Kennedy et al. (1993), což nazna čuje rychlý přesun zinku do mikrobiálního prostoru nebo jeho vysrážení. Výsledky našeho experimentu neprokázaly statisticky významnou korelaci mezi obsahem zinku v bachorové tekutin ě a v bachorové biomase (n=64, r=0.32, p>0.05), pravd ěpodobn ě

57 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 v důsledku toho, že koncentrace zinku v tekutin ě byla po dobu celého pokusu pom ěrn ě stabilní a koncentrace zinku v bachorové biomase citliv ě reagovala na p říjem zinku. Koncentrace zinku v bachorové tekutin ě byly vyšší po podávání organické formy zinku než po podávání anorganické formy. Stejn ě i v biomase po podávání zvýšené dávky zinku se u skopc ů, kte ří dostávali organickou formu zinku, zjistila vyšší koncentrace zinku než u skopc ů, kterým jsme podávali anorganickou formu zinku (tab. 1). Také Kennedy et al. (1993) zjistili u býk ů, že po podávání organické formy zinku (polysacharidový komplex zinku) došlo k výrazn ějšímu zvýšení koncentrace zinku jak v bachorové tekutin ě, tak v biomase, než po podávání anorganické formy (ZnO). Spears et al. (2004) u skotu zjistili podobn ě jako my, že p ři použití anorganické formy zinku je koncentrace zinku v bachorové tekutin ě nižší než p ři dotaci organickými formami. Metabolické procesy v bachoru nebyly významným zp ůsobem ovlivn ěny. Všechny zjiš ťované parametry se pohybovaly ve fyziologickém rozmezí (tab. 1), nedošlo ani ke zvýšení aktivity enzym ů následkem p říjmu zvýšeného množství zinku (ALP 0.39±0.22, ALT 0.06±0.05, GMT 0.11±0.04, LDH 0.24±0.22, amyláza 0.16±0.12 µkat/l). Vyšší koncentrace anorganické formy zinku podávaného p římo do bachoru bachorovou kanylou zp ůsobilo zvýšení zastoupení kyseliny propionové a snížení pom ěru mezi kyselinou octovou a propionovou (Arelovich et al., 2000). Naše výsledky ukazují mírný nár ůst zastoupení kyseliny propionové v pr ůběhu celého pokusu u obou skupin (tab. 1), pravd ěpodobn ě se jedná o d ůsledek krmení jadrným krmivem, protože k nár ůstu došlo i v dob ě krmení nejnižší dávkou zinku.

Pod ěkování Tato práce vznikla za finan ční podpory MŠMT ČR v rámci řešení výzkumného zám ěru č. MSM 6215712403.

Použitá lLiteratura Arelovich, H.M., Owens, F.N., Horn, G.W., Vizcarra, J.A. Effects of supplemental zinc and manganese on ruminal fermentation, forage intake, and digestion by cattle fed prairie hay and urea. J. Anim. Sci. , 2000, 78, 2972-2979. Eryavuz, A., Dehority, B.A. Effect of supplemental zinc concentration on celulose digestion and cellulolytic and total bacterial numbers in vitro. Anim. Feed Sci. Technol. , 2009, 151,175-183. Eryavuz, A., Durgun, Z., Keskin, E. Effects of ration supplemented with zinc on some rumen and blood parameters mohair production and quality in faunated and defaunated Angora goats (Turkish). Turk. J. Vet. Anim. Sci. , 2002, 26, 753-760.

58 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Froetschel, M.A., Martin, A.C., Amos, H.E., Evans, J.J. Effects of zinc sulfate concentration and feeding frequency on ruminal protozoaa numbers, fermentation patterns and amino acid passage in steers. J. Anim. Sci. , 1990, 68, 2874-2884. Gressley, T.F. Zinc, copper, manganese, and selenium in dairy cattle rations. Proc. 7th Annual Mid-Atlantic Nutr. Conf. , 2009, 65-71. Henry, P.R., Littell, R.C., Ammerman, C.B. Effect of high dietary concentration and lenght of zinc feeding on feed intake and tissue zinc concentration in sheep. Anim. Feed Sci. Technol. , 1997, 66, 237-345. Kennedy, D.W., Craig, W.M., Southern, L.L. Ruminal distribution of zinc in steers fed a polysaccharide-zinc complex or zinc oxide. J. Anim. Sci. , 1993, 71, 1281-1287. Pavlata, L., Podhorský, A., Pechová, A., Chomat, P. Differences in the occurrence of selenum, copper and zinc deficiencies in dairy cows, calves, heifers and bulls. Vet. Med. – Czech , 2005, 50, 390-400. Rojas, L.X., McDowell, L.R., Cousins, R.J., Martin, F.G., Wilkinson, N.S., Johnson, A.B., Velasquez, J.B. Relative bioavailability of two organic and two inorganic zinc sources fed to sheep. J. Anim. Sci. , 1995, 73, 1202-1207. Spears, J.W. Trace mineral bioavailability in ruminants. J. Nutr. , 2003, 133, 1506S-1509S. Spears, J.W., Schlegel, P., Seal, M.C., Lloyd, K.E. Bioavailability of zinc sulfate and different organic zinc sources and their effects on ruminal volatile fatty acid proportions. Livestock Prod. Sci. , 2004, 90, 211-217.

59 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

EFFECT OF HETEROTROPHIC CHLORELLA ON CONTENT OF AND LUTEIN ZEAXANTHIN ISOFORMS IN EGG YOLKS

Hložková, J. 1, Kotrbá ček, V. 1, Kopecký, J. 2, Hude čková, P. 3, Uhríková, I. 1, Doubek, J. 1

1Department of Physiology, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno 2 Institute of microbiology, Academy of Sciences of the Czech Republic 3 Department of nutrition, animal husbandry and hygiene, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno

Abstract

Background: Carotenoids are known for their positive effects on the body. The spatial arrangement of their trans and cis molecules affects the mechanism of action and has various biological effects such as absorption, bioavailability, ability to absorb UV radiation, etc. Material and Methods: The aim of the study was to assess the effect of chlorella as a feed supplement on the concentration of lutein and zeaxanthin isoforms in egg yolks. 24 laying hens (Hisex Brown) were devided into 3 groups. Control group (K) was fed complete feed mixtures for laying hens (KS). KS for the experimental groups was supplemented with 1% (P1) or 2% (P2) of disintegrated fresh water algae chlorella. The dietary treatment was kept for 8 weeks, eggs were collected daily. The levels of total carotenoids were measured spectrophotometrically and different types of lutein and zeaxanthin stereoisomers were determined by HPLC. The data were statistically evaluated by F and T test. Results: Concentrations of total carotenoids in the egg yolks of hens supplemented with chlorella were significantly increased at the end of the first (P2) and the second week (P1) of the trial. The concentrations culminated in the 4th week, when they were 1.5 times (P1) and twice (P2) higher in comparison with K. More than 90% of carotenoids were xanthophylls - lutein and zeaxanthin, mainly in their trans forms. A smaller proportion of cis forms was found. The ratio of cis to the trans-zeaxanthin was significantly lower in P2 group after one week of chlorella supplementation in comparison with K (P2 11.3 : 1.8 g/g yolk, K 7.0 : 0.6 g/g yolk). The ratios did not significantly differ between groups at the end of the trial. The ratio of trans to the cis-lutein forms had predominantly upward trend in P1 and P2 groups, whilst it was declined in K. Conclusion: Supplementation of the feed mixture with heterotrophic chlorella significantly increased deposition of xanthophylls - lutein and zeaxanthin in egg yolks, without any clear effect on their trans and cis forms ratio.

60 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE EFFECT OF WELL MANAGED EARLY PUERPERIUM ON HOLSTEIN COW REPRODUCTION AND MILK PERFORMANCE

Hošek, M., 1 Vágenknechtová, M., 1 Filip čík, R., 1 Máchal, L., 1 Hošková, Š. 2

1Department of Animal Breeding, Agronomy Faculty, Mendel University in Brno 2Department of Animal Nutrition and Forage Production, Agronomy Faculty, Mendel University in Brno

Abstract The aim of this work is focused on management of early puerperium, which is reducing problematic reproduction of cows and its future infertility or sterility. Our results shows, that veterinarian help was need only in 6 cases from 592 cows in evaluation, other 452 cows was calved without men help or with slightly men help. Is visible, that difficult calving have bad impact on postpartum status of reproduction organs and can affect somatic cells count in milk too. Foot, finger, hoof and udder health after parturition have impact on somatic cells too. Increased body temperature have totally 9% animals, and it is still time first and excellent indicator of complete health status of individuum. The systhematic, long term management of puerperium bring less problems with return cows to succesfull reproduction process and can bring more money for farmer.

Key words: holstein cow, puerperium, problematic reproduction, body temperature

Material and methods The 592 holstein cows from Uhercice farm (Agrofert Group, a.s.) on first and second and other lactations was in our evaluation, which was done from November 2009 to December 2010. Each cow was evaluated and diagnostics was targeted on collection lot of information about cow reproduction health and status. The farm management has great interest on uterus involution and multilevel heat detection as way for fast and effective cow return to reproduction proces. On each cow was measured morning rectal body temperature regularly in interval 3 th and 5 th day after parturition. On each Wednesday veterinarian make control all of these cows and evaluate their total health status. For other evaluations is collected urine and pH, ketons and proteins are detected by orientation paper strips tests as metabolic profile of cow. Results are:0 – without problem, normal; 1 – 1. worst level, 2 – 2. worst level; 3 a 4 – infection, retentio secundin, antibiotics (antibiotics without save protection time in animals with milk production). Simultanously is collected milk on orientation NK-test and somatic cell number (SCN), evaluated is number of problematic udder quarters 1- 4 too. When is cow in fixation

61 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 box, is judged foot and hoof status and if is necessary correct it or vet intervention to hoofs. Foots are judged: 0 – correct foots; 1 – functional correction is necessary; 2 – problem, edema, functional correction; 3 – edema, antibiotics. On each cow are vaginally, rectally and or ultrasonogrphically detected reproduction organs: 0 – physiological status; 1 – 1x antibiotics application – slight smell in vagina; 2 – vaginal issue smell, nonphysiological status, antibiotics, 4 uterus boluses two time; 3 – retentio secundin, without decay tissue, antibiotics; 4 – temperature increased, retentio secundin, strong decay smell, antibiotics. In Czech has each cow for central evidention of animal evaluated its parturition. Parturition is evaluated in three steps: 1 – without help or with slight help one person; 2 – parturition with help more persons or with parturition helps – lever; 3 – parturition with help of veterinarian – repositions, ceasars cuts etc. As next information was collect about each cow calving interval (from parturition to parturition) and milk performance in normal lactation (305 days).

Results and discussion The evaluation of parturition difficulty shows, that hepl of veterinarian was necessary only in 6 cases from 592 cows (Sch. I). Parturitions with more helpers and with help of parturition lever was on 134 cows and normal physiological parturitions with slight help or without man help was in 452 cows. On our results is visible, that parturition complications directly correlate with postpartal status of cow reproduction organs in early puerperium, when body temperature increasing was not so intensive. Between groups of cows with problematic reproduction organs was found statistic significant (P ≤0,01) differences. Calving interval was not affected. Difficult course of parturition is reason for selection 10,9% all cows from farms (Kvapilik et al., 2006). The trend for decreasing of SCN was supported by decreasing trend for average status of udder health. Cows was divided to groups based on SCN – over 1 million in 1 ml, SCN over 400 thousands in 1 ml and SCN under 400 thousands in 1 ml. Is excelent, that 2/3 of cows has SCN under 400 thousands per 1 ml and milk is saleable to milk factory. Very important fact is, that udder health status, calving interval and milk performance was not by SCN affected. From this reason is important, that highest chance for long producing live have cows with SCN in milk 200 – 400 thousands in 1ml of milk ( Říha, 2000). Reproduction organs health status after parturition is directly affected by parturition difficulty. This is dirrectly visible on results of parturition course after sorting cows depend on health status reproduction organs in early puerperium, when from worst organ statuses

62 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 numbers decreased on better levels, it is mean in parturitions on easier parturition courses. This trends are strong supported by statistic significant (P ≤0,01, P ≤0,05) differences between groups for parturition course (Sch. III). Thanks intensive care about cows in early puerperium was in evaluation find only 7 cases of strong infections with decay tissue in uterus. With status of reproduction organs is connected its different strong inflammation processes with increased body temperature. Between nonproblematic and problematic groups of cows was found statistic significant (P ≤0,01) differences for body temperature in 3 th and 5 th day after parturition. Říha (2003) find out, that increasing milk performance leads in more reproduction problematic cows in herd. In sooner paper Říha (2000) find out higher SCN in first half of lactation with higher frequency endometritis of reproduction organs, ovarial cysts and luteal cysts on ovaries. Increased body temperature shows in animals on health problem. Increased body temperature had in our evaluation 3 th day after parturition 53 cows. Other animals had body temperature physiological normal – 37,5 – 39,5 °C. 5 th day after parturition had increased temperature 55 cows. Difference between this groups of cows was statistic significant (P ≤0,01) (Sch. IV). Very important is, that there are signs on reproduction organs and in parturition difficulties too.

Conclussions We have evaluated on standard lowland farm in Czech on holstein cows with well managed systhematic control of early puerperium possibilities how to fast detect problematic cow reproduction as method for saving later infertility. Is strong visible, that only systhematic fast help in cows after parturition can lead in 40 days after parturition in first heat and in 60 days after parturition in insemination and pregnancy. Cooperation between veterinarians and zootechnics, owen artefitial insemination cows by zootechnics can leads in increasing reproduction and production parameters of holstein cow herd. Problematic reproduction affect milk performance only in some cases.

Acknowledgements The research was supported by IGA TP 1/2012.

63 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 1 Hodnocení časného puerperia dle obtížnosti porodu (The early puerperium evaluation by course of parturition) Evaluated parameters Cows Temp 3.d Temp 5.d SCN Udder Rep org Part Calving n (ks) (°C) (°C) (thnds) status course interval 6 x 39,03 a 38,93 1593,66 0,33 2,83 A 3 374,33 sx 0,38 0,58 1157,95 0,47 1,21 0 24,31 134 x 38,93 38,95 A 921,88 0,73 1,54 B 2 415,12 sx 0,67 0,55 1413,60 1,08 1,19 0 66,16 a A AB 452 x 38,77 38,77 707,87 0,66 0,35 1 403,95 sx 0,56 0,53 1203,10 1,06 0,69 0 61,56 a, b, c – (P ≤0,05); A, B, C – (P ≤0,01)

Tab. 2 Hodnocení časného puerperia dle hodnot somatických bun ěk mléka (The early puerperium evaluation by SCN) Evaluated parameters Cows Temp Temp SCN Udder Part Calving Milk perf Rep org interval n (ks) 3.d (°C) 5.d (°C) (thnds) status course (days) (kg) 38,81 38,85 2855,42 AB 1,66 AB 0,79 1,31 a 401,75 9192,01 119 x sx 0,52 0,56 1486,01 1,33 1,13 0,51 64,78 1398,82 x 38,79 38,79 642,04 AC 1,06 AC 0,73 1,35 b 406,69 9491,18 92 sx 0,59 0,43 184,85 1,17 1,10 0,52 61,01 1888,11 38,81 38,80 142,23 BC 0,27 BC 0,58 1,20 ab 406,35 9302,13 381 x sx 0,56 0,56 100,66 0,61 0,92 0,40 61,92 1536,16 a, b, c – (P ≤0,05); A, B, C – (P ≤0,01)

Tab. 3 Hodnocení časného puerperia dle stavu reproduk čních orgán ů (The early puerperium evaluation by reproduction organs status) Evaluated parameters Cows n (ks)

Temp 3.d (°C) Temp 5.d (°C) SCN (thnds) Udder status Rep org Calving interval (days) Part Part course Milk perf (kg) 7 x 38,93 38,96 1804,28 0 4 2,28 abC 412,00 8082,14 sx 0,29 0,48 2083,81 0 0 0,69 58,84 2302,07 35 x 39,18 A 39,09 A 1050,51 0,85 3 1,88 DF 447,00 8703,94 sx 0,72 0,53 1182,47 1,31 0 0,32 69,09 1434,36 82 x 38,97 B 38,91 b 809,66 0,73 2 1,53 aDEGH 401,63 9165,13 sx 0,66 0,69 1330,19 1,15 0 0,55 59,53 1370,70 86 x 38,92 C 38,96 C 791,45 0,68 1 1,28 bEGI 419,13 9196,08 sx 0,57 0,62 1312,01 1,10 0 0,47 69,32 1476,55 382 x 38,71 ABC 38,73 AbC 704,71 0,63 0 1,09 CFHI 401,87 9432,01 sx 0,48 0,47 1204,78 1,02 0 0,30 60,32 1588,43 a, b, c – (P ≤0,05); A, B, C – (P ≤0,01)

64 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 4 Hodnocení časného puerperia dle t ělesné teploty krav 3. a 5. den po otelení (The early puerperium evaluation by body temperature 3 th and 5 th day) Evaluated parameters Cows Temp Temp SCN Udder Part Calving Milk perf Rep org interval n (ks) 3.d (°C) 5.d (°C) (thnds) status course (days) (kg) 40,02 A 39,28 A 746,30 0,47 1,38 A 1,42 a 425,25 9401,15 53 x sx 0,34 0,61 1272,31 0,83 1,12 0,49 62,19 1537,45 x 38,69 A 38,77 A 767,16 0,69 0,57 A 1,23 a 404,55 9301,97 539 sx 0,41 0,51 1258,11 1,08 0,96 0,44 62,21 1575,78 x 39,28 B 39,92 B 790,11 0,65 1,09 B 1,38 b 408,88 8835,42 55 sx 0,62 0,32 1231,25 1,18 1,05 0,52 54,29 1518,12 x 38,76 B 38,69 B 762,75 0,67 0,60 B 1,23 b 405,56 9358,99 537 sx 0,52 0,42 1262,22 1,05 0,98 0,44 62,72 1570,27 a, b, c – (P ≤0,05); A, B, C – (P ≤0,01)

References

Kvapilík, J., Pytloun, J., Bucek, P. Ro čenka 2005 – Chov skotu v České republice, Praha, 2006, 110 s. ISBN 80-239-7080-1 Říha, J. Plemenitba hospodá řských zví řat. Výzkumný ústav chovu skotu Rapotín, 2003. 151 s. ISBN 80-903143-4-1 Říha, J. Reprodukce v procesu šlecht ění skotu. Výzkumný ústav chovu skotu Rapotín, 2000. 144 s.

65 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

EFFECT OF FEED RESTRICTION ON DIGESTIBILITY OF NUTRIENTS AND DEVELOPMENT OF SMALL INTESTINE IN BROILER RABBITS

Chodová, D., T ůmová, E.

Katedra speciální zootechniky, Fakulta agrobiologie, potravinových a p řírodních zdroj ů, Česká zem ědělská univerzita v Praze

Abstract The aim of this study was to evaluate the effect of quantitative feed restriction on digestibility of nutrients, length and histological parameters of small intestine in broiler rabbits. After weaning (35 days of age), rabbits were divided into three groups: ADL – ad libitum fed, R50 was restricted on 50 g feed per rabbit per day and group R65 was restricted on 65 g per rabbit per day. Restriction was applied from 42 nd to 49 th days of age. Before and following of restriction, rabbits were fed ad libitum . Digestibility of nutrients was detected by a quantitative method. First balance period was from 42 nd to 49 th day of age (feed restriction) and second balance period was from 49 th to 56 th day of age (realimentation). Nutrient composition of feed and faeces was defined according to AOAC methods. At 49, 56 and 70 days of age, 8 rabbits from each group were slaughtered for determination of small intestine characteristics. The digestibility of nutrients was not affected by feeding technique, but by age. Digestibility of crude protein, fat and NDF was better in time of feed restriction. The length of small intestine significantly increased with age. The longest intestine was measured at 70 days of age (331 – 340 cm). There was determined interaction group × age in height of villi and depth of crypts. The biggest (P ≤0.001) villi height had R65 group at 56 days of age (630.98 m) and ADL at 70 days of age (614.46 m). But these groups had the lowest villi height at 49 days of age. The greatest villi depth was determined in R65 group at 56 th and 70 th day (150.4 m and 148.8 m). Restricted groups had significantly (P ≤0.001) highest depth of crypts at 70 days of age.

Úvod U brojlerových králík ů se restrikce krmiva využívá p ředevším z důvodu zlepšení konverze krmiva, omezení množství tuku v jate čně upraveném trupu a také omezení trávicích obtíží u králí čat v období odstavu. Poruchy trávicí trubice bývají častou p říčinou vysoké mortality. Restrikce krmiva m ůže být kvalitativní nebo kvantitativní, pop řípad ě časová. Ovlivn ění r ůstových schopností a s nimi spjatých dalších parametr ů závisí na dob ě za čátku a

66 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 intenzit ě restrikce a na délce trvání restrik čního období. Na intenzit ě a délce restrikce závisí také spot řeba krmiva. Spolu se vzr ůstající intenzitou restrikce klesá spot řeba a konverze krmiva. Zlepšení konverze krmiva pozorovali nap říklad Matics et al. (2008) a Metzger et al. (2011) u časov ě restringovaných králík ů. Nižší spot řeba krmiva byla i p ři intenzivn ější restrikci (T ůmová et al., 2003; Gidenne et al., 2009). V dob ě realimentace je srovnatelná spot řeba krmiva. Zlepšení stravitelnosti živin u restringovaných králík ů je zejména kv ůli delšímu reten čnímu času tráveniny v trávicí soustav ě. Spolu s růstem a spot řebou krmiva je ovlivn ěn také zdravotní stav králík ů. Boisot et al. (2003) prokázali snížení epizootického st řevního onemocn ění králík ů vlivem restrikce. Podobn ě Gidenne et al. (2009) uvád ějí snížení morbidity u intenzivn ě restringovaných králík ů v dob ě restrikce. Cílem práce bylo zjistit vliv krátkodobé kvantitativní restrikce na stravitelnost živin, délku tenkého st řeva a histologické parametry sliznice tenkého st řeva.

Materiál a metodika D o pokusu bylo za řazeno 192 brojlerových králík ů Hyplus. Po odstavu v 35. dni v ěku byli králíci rozd ěleni do t řech skupin: skupina ADL byla krmena po celou dobu pokusu ad libitum , skupina R50 byla restringována na 50 g krmiva/ks/den a skupina R65 na 65 g krmiva/ks/den. Restrikce byla aplikována od 42. do 49. dne v ěku. P řed a po skon čení restrikce byly všechny skupiny krmeny ad libitum . Králíci byli ustájeni v klecovém systému po t řech kusech (0,16 m 2/ks) a krmeni granulovanou krmnou sm ěsí (18,1 % N-látek, 16,7 % vlákniny a 3,6 % tuku). Podmínky mikroklimatu odpovídaly b ěžným požadavk ům pro ustájení králík ů. Konec pokusu byl realizován v 70-ti dnech v ěku porážkou. Stravitelnost živin byla zjiš ťována bilan čním pokusem rozd ěleným na dv ě etapy. Bilance 1 v období restrikce (42. – 49. den v ěku) a bilance 2 v dob ě realimentace (49. – 56. den v ěku). B ěhem bilancí byla denn ě zaznamenávána spot řeba krmiva a odebírány výkaly, jež byly skladovány p ři teplot ě 18 °C až do analýz. Živinové složení krmné sm ěsi a výkal ů bylo zjišt ěno pomocí metod AOAC. Sušina a popeloviny byly stanoveny dle AOAC (1995), dusíkaté látky pomocí Kjeltec Auto A1030 Analyser (Tecator AB, Švédsko), tuk p řístrojem Soxtec (Tecator AB, Švédsko) a vláknina byla stanovena dle metody Van Soest a Wine (1967). Koeficienty stravitelnosti byly vypo čítány dle následujícího vzorce:

[(množství krmiva x množství živin v krmivu) – (množství výkal ů x množství živin ve výkalech)]×100 (množství krmiva x množství živin v krmivu)

67 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Po porážce byla zm ěř ena délka tenkého st řeva a byly odebrány vzorky sliznice tenkého st řeva (dvanáctníku) vždy od osmi králík ů z každé skupiny, tj. celkem od 72 králík ů pro pozd ější histologické stanovení hloubky a výšky st řevních klk ů. P ři stanovení byly na řezány na 5 m silné řezy, které byly obarveny hematoxylin-eosinem. Pomocí programu Nis-Elements byla vyhodnocena výška klk ů a hloubka krypt. Výška klk ů byla m ěř ena od vrcholu klk ů po p řechod v kryptu a hloubka krypt byla vyjád řena dle invaginací mezi dv ěma klky. Ke statistickému vyhodnocení výsledk ů byla použita analýza variance – metoda ANOVA s interakcí skupina × v ěk programu SAS (SAS Institute Inc., 2003).

Výsledky a diskuze Výsledky stravitelnosti živin jsou uvedeny v tabulce 1. U stravitelnosti živin nebyly zjišt ěny pr ůkazné interakce mezi skupinou a bilancí. Stravitelnost byla ovlivn ěna p ředevším bilancí, tj. v ěkem králík ů. Na stravitelnost dusíkatých látek m ěla vliv pouze doba bilance. V období restrikce byla stravitelnost dusíkatých látek pr ůkazn ě (P ≤0,007) vyšší než v dob ě realimentace. Podobné výsledky byly zaznamenány také u stravitelnosti tuku a bezdusíkatých látek výtažkových (BNLV). Naproti tomu acidodetergentní vláknina (ADF) nebyla ovlivn ěna technikou krmení ani dobou bilance. Stravitelnost neutráln ě detergentní vlákniny (NDF) byla signifikantn ě (P ≤0,009) ovlivn ěna pouze bila čním obdobím. V dob ě restrikce byla stravitelnost NDF vyšší než v týdnu následujícím po restrikci. P řestože stravitelnost jednotlivých živin nebyla pr ůkazn ě ovlivn ěna technikou krmení, restringované skupiny m ěly vyšší stravitelnost t ěchto živin. Rovn ěž T ůmová et al. (2003, 2007) zjistili nejlepší stravitelnost živin v dob ě restrikce. Na rozdíl od našich výsledk ů ovšem uvád ějí pr ůkazn ě lepší stravitelnost živin u skupin s restrikcí na dobu 1 – 2 týdn ů. V dob ě realimentace již nezaznamenali rozdíly mezi jednotlivými skupinami. Také Gidenne et al. (2009) nezjistili pr ůkazné rozdíly mezi králíky s odlišnou technikou krmení, pouze stravitelnost dusíkatých látek byla mírn ě vyšší u skupin s intenzivn ější restrikcí. Naproti tomu Di Meo et al. (2007) zaznamenali zlepšení stravitelnosti sušiny, NDF a ADF u kvantitativn ě restringovaných králík ů ve srovnání s ad libitn ě krmenými.

68 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 1 Vliv restrikce a bilan čního období na stravitelnost živin (The effect of feed restriction and balance period on digestibility of nutrients) Doba Skupina Pr ůkaznost Živiny bilance Skupina × ADL R50 R65 Skupina Bilance (dny) bilance Sušina 42 – 49 56,95 58,91 58,53 0,971 0,099 0,363 (%) 49 – 56 54,97 56,32 56,82 N-látky 42 – 49 73,54 77,69 77,14 0,123 0,007 0,084 (%) 49 – 56 70,13 74,02 75,09 42 – 49 89,95 91,9 91,2 Tuk (%) 0,368 0,001 0,54 49 – 56 89,23 89,88 89,92 BNLV 42 – 49 95,04 95,41 95,23 0,279 0,046 0,314 (%) 49 – 56 90,38 94,98 95,33 42 – 49 22,02 23,44 21,69 ADF (%) 0,608 0,112 0,394 49 – 56 18,58 19,2 20,67 42 – 49 26,01 26,43 25,75 NDF (%) 0,691 0,009 0,379 49 – 56 22,22 24,5 24,56

Délka tenkého st řeva byla pr ůkazn ě (P ≤0,001) ovlivn ěna pouze v ěkem. Se stoupajícím věkem se délka tenkého st řeva prodlužovala. Tenké st řevo restringovaných králík ů bylo nepr ůkazn ě delší než u ad libitn ě krmené skupiny, což je v souladu s Sabatakou et al. (2007), kte ří uvád ějí prodlužování délky tenkého st řeva s rostoucím v ěkem. Histologické parametry tenkého st řeva byly ovlivn ěny technikou krmení, v ěkem a byly zaznamenány také interakce mezi technikou krmení a v ěkem. Pr ůkazn ě (P<0,001) nejvyšší výška klku sliznice tenkého st řeva byla zaznamenána u králík ů R65 56. den v ěku (630,98 m) a u ad libitn ě krmených králík ů 70. den v ěku (614,46 m). Naproti tomu pr ůkazn ě nejnižší výšku klk ů m ěly tyto dv ě skupiny 49. den v ěku (448,01 m u R65, 466,89 m u ADL). Na konci pokusu se restringované skupiny nelišily od ad libitum krmených králík ů. Na rozdíl od našich výsledk ů, Martignon et al. (2010) nezaznamenali vliv restrikce na vývoj st řevní sliznice králík ů. Rovn ěž hloubka krypt byla pr ůkazn ě ovlivn ěna technikou krmení, v ěkem a byly také zaznamenány interakce skupina×v ěk. Pr ůkazn ě nejv ětší hloubku krypt m ěli králíci s restrikcí na 65 g krmiva 56. a 70. den v ěku (150,4 m a 148,8 m). Avšak na za čátku pokusu byla hloubka krypt u této skupiny pr ůkazn ě nejnižší (115,38 m). Restringované skupiny m ěly v 70-ti dnech pr ůkazn ě v ětší hloubku krypt než ad libitn ě krmená skupina. Martignon et al. (2010) nezaznamenali pr ůkazné rozdíly mezi restringovanými a ad libitum krmenými králíky. Tito auto ři uvád ějí pouze zvyšující se hloubku krypt s věkem králík ů.

69 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 2 Vliv restrikce a v ěku na parametry tenkého st řeva (The effect of feed restriction and age on small intestine characteristics) Délka tenkého Hloubka krypt Skupina Věk Výška klku ( m) st řeva (cm) (m) 49 264 466,89 d 123,11 d ADL 56 312 516,37 c 126,36 d 70 340 614,46 ab 121,43 de 49 266 506,01 c 120,09 de R50 56 340 501,57 c 142,36 b 70 337 601,91 b 134,31 c 49 273 448,01 d 115,38 e R65 56 346 630,98 a 150,40 a 70 331 601,14 b 148,80 ab SEM 8 128 49 Pr ůkaznost skupina 0,19 <0,001 0,001 věk <0,001 <0,001 <0,001 skupina*v ěk 0,599 <0,001 <0,001 a,b,c,d,e P≤0,05

Záv ěr Na stravitelnost živin nem ěla restrikce krmiva pr ůkazný vliv. Stravitelnost dusíkatých látek, tuku, bezdusíkatých látek výtažkových a neutráln ě detergentní vlákniny byla pr ůkazn ě lepší v dob ě restrikce. Délka tenkého st řeva se pr ůkazn ě zv ětšovala pouze s věkem. U histologických parametr ů sliznice tenkého st řeva byly zaznamenány pr ůkazné interakce. Po skon čení restrikce m ěly restringované skupiny pr ůkazn ě vyšší st řevní klky, ovšem s přibývajícím v ěkem se rozdíly mezi jednotlivými skupinami vyrovnaly. Naproti tomu hloubka klk ů byla i na konci pokusu vyšší u restringovaných králík ů. Pomocí zvýšení profilu st řevní sliznice v dob ě restrikce se zv ětšila plocha pro resorpci živin.

Pod ěkování Přísp ěvek byl zpracován za podpory výzkumného zám ěru MSM 6046070901.

Použitá literatura AOAC. Official Methods of Analysis. Association of Official Analytical Chemists, 16th ed., Arlington, Virginia, USA, 1995. Boisot, P., Licois, D., Gidenne, T. Feed restriction reduces the sanitary impact of an experimental reproduction of Epizootic Rabbit Enteropathy syndrome (ERE) in the

70 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

growing rabbit. In: Proceedings of the 10 th French Rabbit Days, 19-20 November 2003, Paris, France, pp: 267-270. Di Meo, C., Bovera, F., Marono, S., Vella, N., Nizza, A. Effect of feed restriction on performance and feed digestibility in rabbits. Ital. J. Anim. Sci. , 2007, 6, 765–767. Gidenne, T., Feugier, A. Feed restriction strategy in the growing rabbit. 1. Impact on digestion, rate of passage and microbial activity. Animal , 2009, 3, 501–508. Martignon, M. A., Combes, S., Gidenne, T. Digestive physiology and hindgut bacterial community of the young rabbit (Oryctolagus cuniculus): Effect of age and short-term intake limitation . Comp. Biochem. Phys . A, 2010, 156, 156–162. Matics, Zs., Dalle Zotte, A., Radnai, I., Kovács, M., Metzger, Sz., Szendrö, Zs. Effect of restricted feeding after weaning on the productive and carcass traits of growing rabbits. In: Proceedings 9th World Rabbit Congress, Verona – Italy, June 10-13 2008, 741–746. Metzger, Sz., Bianchi, M., Cavani, C., Petracci, M., Szabó, A., Gyovai, M., Biró-Németh, E., Radnai, I., Szendrö, Zs. Effect of nutritional status of rabbit kits on their productive performance, carcass and meat quality traits. Livest. Sci., 2011, 137, 210–218. Sabatakou, A. O., Xylouri, M. E., Sotirakoglou, A. K., Fragkiadakis, G. M., Noikokyris, N. P. Histochemical and biochemical characteristics of weaning rabbit intestine. World Rabbit Sci. , 2007, 15, 173–178. SAS Institute Inc. The SAS System for Windows. Release 9.1, 2003. Tůmová, E., Sk řivanová, V., Sk řivan, M. Effect of restricted feeding time and quantitative restriction in growing rabbits. Arch. Geflügelkd., 2003, 67, 182–190. Tůmová, E., Zita, L., Sk řivanová, V., Fu číková, A., Sk řivan, M., Burešová, M. Digestibility of nutrients, organ development and blood picture in restricted and ad libitum fed broiler rabbits. Arch. Geflügelkd ., 2007, 71, 6–12. Van Soest, P. J., Wine, R. H. Use of detergents in the analysis of fibrous feeds. IV. Determination of plant cell wall constituents. J. Assoc. Off. Agric. Chem., 1967, 50, 50–55.

71 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

FOOD RESTRICTION POSITIVELY INFLUENCED CELL MEDIATED IMMUNITY OF JAPANESE QUAIL SELECTED FOR HIGH AND LOW TESTOSTERONE CONTENT IN EGG YOLK

Ka ňková, Z. 1, Okuliarová, M. 1, Zeman, M. 1,2

1Katedra živo číšnej fyziológie a etológie, Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava, Slovensko, 2Ústav biochémie a genetiky živo číchov, SAV, Ivanka pri Dunaji, Slovensko

Abstract Transfer of information from the mother to her offspring by maternal androgens is a part of adaptation processes enabling organisms to cope with constantly changing environment. Maternal testosterone offers young individuals an advantage in the form of stimulation of body growth and different behavioural effects. However, some negative effects of testosterone on the immune system were suggested and these negative influences may constrain the increase of maternal testosterone levels in an egg yolk, keeping them in distinct limits. Somatic growth stimulated by testosterone, as well as development and stimulation of the immune response, is energetically costly and can lead to a suppression of one of these mechanisms in the environment with limited food resources. Therefore, our experiments focussed on consequences of high and low maternal testosterone content on the immune response of Japanese quail exposed to the qualitative food restriction. We did not observed any detrimental effects of the food restriction or elevated yolk testosterone content on immunoreactivity of the chicks. Both factors even stimulated the immune response to phytohemagglutinine, indicating an improved cell mediated immunity.

Úvod Maternálne androgény môžu významne prispieva ť k transgenera čnému prenosu informácii o aktuálnych podmienkach prostredia. Depozíciou rozdielnych množstiev maternálnych androgénov môže by ť vytváraná široká fenotypická variabilita, ktorá umož ňuje živo číchom pružne reagova ť na rýchlo sa meniace prostredie (Groothuis a Schwabl, 2008). Depozícia maternálneho testosterónu sa stala atraktívnou témou, pretože gonadálne steroidy sú schopné ovplyv ňova ť nielen samotnú pohlavnú diferenciáciu mladých jedincov (Arnold, 1996), ale zohrávajú dôležitú úlohu v ovplyv ňovaní vývinu organizmu, či už prostredníctvom aktiva čných alebo organiza čných ú činkov (Duffy a kol., 2002). Ideálny model pre štúdium maternálnych efektov predstavujú vtá čie embryá, ktorých vývin mimo tela

72 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 matky poskytuje excelentné možnosti priameho ovplyvnenia vajcového obsahu pôsobiaceho na vývin embrya, bez ďalšieho ovplyvnenia zo strany matky. Po četné experimentálne skupiny sa zaoberajú vplyvom maternálnych androgénov na rast (Navara a kol., 2005) a správanie (Eising a Groothuis, 2003), ako aj manifestáciu sekundárnych pohlavných znakov (Eising a kol., 2006). Mnohé z uvedených experimentov potvrdili pozitívne ú činky týchto hormónov na vývin mlá ďat, hoci na druhej strane existujú štúdie, ktoré podávajú dôkazy o ich negatívnom pôsobením napríklad v podobe potla čenia imunitného systému (Müller a kol., 2005). Výsledky v tejto oblasti sú však často nejednotné, v rozmedzí od negatívnych až po pozitívne (Cucco a kol., 2008). Táto rôznorodá manifestácia ú činkov maternálneho testosterónu môže by ť dôsledkom jednak medzidruhovej špecificity a rôznorodosti experimentálnych prístupov, ale môže by ť daná aj napríklad podmienkami prostredia, ktorým je mladý jedinec v skorých postnatálnych štádiách vystavený. Pod ľa teórie prerozdelenia zdrojov môže dochádza ť k potla čeniu vývinu a reaktivity imunitného systému v prostredí, ktoré nie je schopné poskytnú ť dostatok zdrojov na uspokojene požiadaviek organizmu na zrýchlený rast, výraznejšie pohlavné znaky a prípadnú aktiváciu imunitného systému mlá ďat, nako ľko sú všetky uvedené procesy pre vyvíjajúci sa organizmus ve ľmi energeticky náro čné (Lochmiller a Deerenberg, 2000). V našej predošlej experimentálnej práci sme nezaznamenali na nami vypracovanom modeli prepelíc japonských divergentne selektovaných na vysoký a nízky obsah testosterónu vo vajcovom ž ĺtku (Okuliarova a kol., 2011), negatívne pôsobenie maternálneho testosterónu na imunitný systém mlá ďat (Kankova a kol., 2012). Preto sme sa rozhodli sledova ť schopnos ť aktivácie imunitného systému u týchto dvoch línií v podmienkach potravovej reštrikcie, aby sme odhalili prípadné interakcie medzi pôsobením maternálneho testosterónu a nepriaznivých podmienok prostredia.

Materiál a metodika Experimentálnym modelom bola F5 generácia prepelíc japonských (Coturnixjaponica ), selektovaných na vysoký (HET) a nízky (LET) obsah testosterónu vo vajcovom ž ĺtku z chovu Ústavu biochémie a genetiky živo číchov SAV (ÚBGŽ SAV) v Ivanke pri Dunaji (Okuliarova a kol., 2011). Vajcia boli inkubované za štandardných podmienok v liahni BIOSKA (Sedl čany, ČR). Po vyliahnutí boli mlá ďatá premiestnené do chovných boxov pod ľa príslušnosti k chovnej línii a potravovej skupine (HET: n = 40; LET: n = 40). Prvé tri dni mali všetky zvieratá neobmedzený prístup k vode a krmivu (HYD 13 - kompletná k ŕmna zmes na výkrm

73 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 moriek). Štvrtý de ň po vyliahnutí bola u polovice mlá ďat zavedená potravová reštrikcia (30% piliny z tvrdého dreva + 70% HYD 13). Zvieratá boli po čas experimentu pravidelne vážené. Imunokompetentnos ť mlá ďat bola testovaná v dvoch nezávislých experimentoch. Experiment 1: V prvom experimente bola pozorovaná imunokompetentnos ť dvoch línií vo či fytohemaglutínu (PHA), látke stimulujúcej bunkovú imunitnú odpove ď. Vo veku 14 dní bol u 20 zvierat HET línie a 20 zvierat LET línie vykonaný test PHA-indukovaného opuchu kožnej blany na krídle mlá ďat. Pred po čiato čným meraním hrúbky patágia mikrometrom (Vogel, Nemecko, 5 meraní na krídlo) bola kožná blana oboch krídel zbavená peria. Následne bolo do pravého krídla subkutánne aplikovaných 100 µg PHA (Sigma, USA) v 20 µl sterilného fyziologického roztoku (PBS) a do ľavého krídla 20 µl čistého PBS. Opakované meranie hrúbky krídla bolo vykonané 24 hodín od aplikácie PHA. Miera schopnosti odpoveda ť na tento stimul bola vypo čítaná pod ľa nasledujúceho vzorca: PostPHA − postPBS PHAindex = ( prePBS + prePHA 2/) [I.] PostPHA - hrúbka blany po aplikácii fytohemaglutinínu (PHA), postPBS - hrúbka blany po aplikácii PBS, prePBS - hrúbka blany pred aplikáciou PBS, prePHA - hrúbka blany pred aplikáciou PHA. (PostPHA – thickness of the wing after phytohemagglutinine (PHA) administration, postPBS - thickness of the wing after PBS administration, prePBS - thickness of the wing before PBS administration, prePHA - thickness of the wing before PHA administration).

Experiment 2: Akútna odpove ď mlá ďat na stimuláciu imunitného systému lipopolysacharidom (LPS), bola testovaná 14. až 15. de ň veku mlá ďat. Zvieratám bolo intraperitoneáulne podaných 1,5 mg LPS (LPS, Sigma USA) na 1 kg živej váhy v 100 µl PBS. Kontrolná skupina pozostávala s jedincov, ktorým bol rovnakým spôsobom podaný čistý PBS (100 µl na jedinca). Konkrétna dávka LPS bola vybraná s úmyslom vyvola ť imunitnú reakciu organizmu, bez vážnejších patologických prejavov (Kautsos a Klasing, 1992). Pokusné zvieratá boli usmrtené tri hodiny po podaní LPS rýchlou dekapitáciou, pri čom bola odobraná krv do heparinizovaných skúmaviek (Heparin, Lé číva Praha, ČR). Zvieratá boli podrobené anatomickej pitve, po čas ktorej bolo zistené pohlavie zvierat a bola vypreparovaná Fabríciova burza. Z časti krvi boli vytvorené krvné preparáty, na základe ktorých sme stanovili pomocou diferenciálneho po čtu bielych krviniek pomer heterofilov a lymfocytov. Krvné nátery boli fixované a farbené Pappenheimovou panoptickou metódou a následne vyhodnocované pod svetelným mikroskopom (CARL ZEISS, Jena, Nemecko), pri 1000-násobnom zvä čšení s použitím imerzného oleja. Zvyšok krvi bol centrifugovaný pri 2500 ot/min, 4 oC, 10 minút a uskladnený pri -20 oC až do doby vykonania merania obsahu kortikosterónu. Hladiny kortikosterónu v krvnej plazme boli stanovené pomocou komer čnej súpravy na meranie kortikosterónu (DRG RatCorticosterone 125I) pod ľa pokynov výrobcu.

74 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Výsledky Experiment 1: Potravová reštrikcia mala preukázate ľný ú činok na hmotnosti experimentálnych zvierat (F 3,354 =18,54; p<0,001), čo sa prejavilo nižšími hmotnos ťami reštringovaných zvierat, v porovnaní s kontrolnou skupinou od ôsmeho d ňa veku zvierat (8. de ň: p<0,001; 14. de ň: p<0,001) (Obr. 1b). Faktor línie nemal v tomto prípade signifikantný vplyv na sledovaný parameter (F 3,354 =0,88; p=0,450). Ku koncu experimentu sa za čali medzi jedinca prejavova ť pohlavné rozdiely v hmotnosti tela (F 3,354 =8,23; p<0,001) (Obr. 1a). V de ň ukon čenia pokusu boli samice ťažšie v porovnaní so samcami (samice: 48,37±0,58 g; samce: 46,27±0,58 g). Opakovaná analýza rozptylu nepreukázala signifikantný vplyv interakcie faktorov línie a reštrikcie na hmotnosti zvierat (F3,354 =0,67; p=0,574).

70 a b 60 LET Kontrola HET Potravová reštrikcia 50 ***

40 tela (g) ť

30 *** 20 Hmotnos

10

0 1. de ň 4. de ň 8. de ň 14. de ň 1. de ň 4. de ň 8. de ň 14. de ň

Obrázok 2 Hmotnosti prepelíc japonských selektovaných na vysoký (HET) a nízky (LET) obsah testosterónu vo vajcovom ž ĺtku po čas trvania prvého experimentu s podaním fytohemaglutinínu; (a) rozdiely medzi líniami, (b) rozdiely medzi potravovými skupinami. *** p<0,001. (Body mass of Japanese quail selected for high and low yolk testosterone content during the first experiment with phytohemaglutinine administration; (a) differences between lines, (b) differences between food groups. *** p<0.001).

U mlá ďat vystavených potravovej reštrikcii sme zaznamenali výraznejšiu odpove ď na stimuláciu imunitného systému fytohemaglutinínom (F1,74 =11,374; p<0,01; PHA index kontrola: 1,143±0,06; PHA index reštrikcia: 1,433±0,07). Vä čší opuch krídlovej blany sme taktiež zaznamenali u zvierat HET línie (F1,74 =11,592; p<0,01; PHA index HET línia: 1,427±0,06; PHA index LET línia: 1,141±0,06). Interakcie týchto dvoch faktorov (línia × reštrikcia) však nebola signifikantná (F1,74 =0,471; p<0,49). Experiment 2: Opakovaná analýza rozptylu aj v tomto prípade potvrdila signifikantný

účinok potravovej reštrikcie na hmotnosti mlá ďat (Obr. 2b) (F3,216 =7,13; p<0,001). Ku koncu pokusu sa prejavili rozdiely medzi líniami, ktoré sa manifestovali vo forme vyšších hmotností zvierat selektovaných na vysoký obsah testosterónu (F 3,216 =5,45; p<0,01) (Obr. 2a).

75 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

80 LET a Kontrola b HET Potravová reštrikcia 60 *** * *** tela (g) tela ť 40 * ** 20 Hmotnos

0 1. de ň 4. de ň 8. de ň 14. de ň 1. de ň 4. de ň 8. de ň 14. de ň

Obrázok 3 Hmotnosti prepelíc japonských selektovaných na vysoký (HET) a nízky (LET) obsah testosterónu vo vajcovom ž ĺtku po čas trvania druhého experimentu s podaním lipopolysacharidu; (a) rozdiely medzi líniami, (b) rozdiely medzi potravovými skupinami. ** p<0,01; *** p<0,001. ( Figure 2: Body mass of Japanese quail selected for high and low yolk testosterone content during the second experiment with lipopolysaccharide administration; (a) differences between lines, (b) differences between food groups. ** p<0,01; *** p<0.001).

Interakcia faktorov línie a reštrikcie neovplyvnila signifikantne sledovaný parameter

(F3,216 =0,61; p=0,611). Vplyv pohlavia na hmotnosti bol v tomto prípade tesne nad hranicou signifikantnosti s podobným trendom ako bol preukázaný v prvom experimente (F3,216 =2,33; p=0,075; samice: 49,47±0,63 g; samce: 48,07 g v 14. de ň experimentu). Hmotnosti Fabríciovej burzy korigované na hmotnos ť tela vykazovali signifikantné rozdiely medzi líniami (F1,72 =5,42; p<0,05) aj medzi potravovými skupinami (F1,72 =4,34; p<0,05). Jedince HET línie mali po prepo čte na hmotnos ť tela signifikantne ľahšiu burzu v porovnaní s LET líniou (HET: 0,87±0,04 mg/g hmotnosti tela; LET: 0,98±0,05 mg/g hmotnosti tela). Reštrikcia spôsobila u oboch línií nárast v hmotnostiach tohto lymfatického orgánu (Obr. 3).Pohlavie sledovaných zvierat (F1,72 =2,73; p=0,103), ani interakcia medzi líniou a reštrikciou neovplyvnila hmotnosti Fabríciovej burzy (F1,72 =1,63; p=0,206).

2,0 LET HET 1,5 *

1,0

0,5

2020 20 20 0,0

Fabríciova burza (mg/g burza hmotnosti tela) Fabríciova Kontrola Potravová reštrikcia

Obrázok 4: Hmotsnosti Fabríciovej burzy upravené vzh ľadom na telesnú hmotnos ť prepelíc japonských selektovaných na vysoký (HET) a nízky (LET) obsah testosterónu vo vajcovom ž ĺtku. * p<0,05. ( Figure 4: Weight of bursa of Fabricius corected for body mass of Japanese quail selected for high and low yolk testosterone content. * p<0.05).

76 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tri hodiny po podaní LPS sme nezaznamenali vplyv potravovej reštrikcie (F1,72 =0,40; p=0,527; kontrola: 10,12±2,60 ng/ml; reštrikcia 7,44±1,60 ng/ml), línie (F1,72 =1,74; p=0,192;

HET: 8,42±1,44 ng/ml; LET: 9,14±2,71 ng/ml), ani ich vzájomnej interakcie (F1,72 =0,04; p=0,834) na hladiny kortikosterónu v plazme. Podanie LPS zvýšilo hladiny kortikosterónu v plazme, avšak tento rozdiel nebol štatisticky signifikantný (F1,72 =3,03; p=0,086). Podanie LPS výrazne zvýšilo pomer heterofilov k lymfocytom, ale tento parameter nebol ovplyvnený ďalšími faktormi zahrnutými do celkovej štatistickej analýzy (línia:

F1,72 =0,68; p=0,412; reštrikcia: F1,72 =0,95; p=0,331), ani ich vzájomnými interakciami.

Záver Hoci mala použitá potravová reštrikcia signifikantný vplyv na hmotnosti mlá ďat, nepredstavovala limitujúci faktor pre vývin ich imunitného systému. Výsledky dokonca poukazujú na pozitívny ú činok reštrikcie a zvýšeného obsahu maternálneho testosterónu v žĺtku na odpove ď mlá ďat na podanie PHA, aj ke ď ich interakcia nebola signifikantná.

Po ďakovanie

Práca bola podporená grantmi: APVV 0047-10 a VEGA 1/0686/12.

Zoznam použitej literatúry Arnold, A.P. Genetically triggered sexual differentiation of brain and behavior. Horm. Behav., 1996, 30, 495–505. Cucco, M., Guasco, B., Malacarne, G., Ottonelli, R., Tanvez, A. Yolk testosterone levels and dietary carotenoids influence growth and immunity of grey partridge chicks. Gen. Comp. Endocrinol., 2008, 156, 418-425. Dufty, A.M., Clobert, .J, Moller, A.P. Hormones, developmental plasticity and adaptation. TREE, 2002, 17, 190–196. Eising, C.M., Groothuis, T.G.G. Yolk androgens and begging behaviour in black-headed gull chicks: and experimental field study. Anim Behav , 2003, 66, 1027–1034. Eising, C.M., Muller, W., Groothuis, T.G.G. Avian mothers create different phenotypes by hormone deposition in their eggs. Biol. Lett ., 2006, 2, 20–22. Groothuis, T.G.G., Schwabl, H. Hormone-mediatedmaternal effects in birds: mechanisms mater but what do we know of them? Philosophical Transactions of the Royal Society B- Biological Sciences, 2008, 363, 1647-1661. Kankova, Z., Zeman, M., Okuliarova, M. Growth and innateimmunity are notlimited by selection for high egg testosterone content in Japanese quail. J. Exp. Biol ., 2012, 215, 617-622. Koutsos, E.A., Klasing, K.C. The acute phase response in Japanese quail (Coturnix coturnix japonica). Comp. Biochem. Physiol ., 2001, 128C, 255-263. Lochmiller R.L., Deerenberg C. Trade-offs in evolutionary immunology: just what is the cost of immunity? Oikos, 2000, 88, 87–98. Mousseau, T.A., Fox, C.W. The adaptive significance of maternal effects. Trends Ecol. Evol ., 1998, 13, 403-407. Müller, W., Groothuis, T.G.G., Dijkstra, C., Kasprzik, A., Alatalo, R.V., Siitari, H. Prenatal androgen exposure modulates cellular and humoral immune function of black-headed gull chicks. Proc. R. Soc. Lond., B, Biol. Sci ., 2005, 272, 1971–1977. 77 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Navara, K.J., Mendonça, M.T., Hill, G.E. Variable effects of yolk androgens on growth and immunity in eastern bluebird nestlings. Physiol. Biochem. Zool., 2005, 78, 570–578. Okuliarova, M., Groothuis, T.G.G., Skrobanek, P., Zeman, M. Experimental evidence for genetic heritability of maternal hormone transfer to offspring. Am. Nat ., 2011, 177, 824- 834.

78 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE EFFECT OF COPPER IONS ON THE MOTILITY AND SURVIVAL OF BULL SPERMATOZOA IN DIFFERENT CULTURE MEDIA

Kňažická, Z., 1 Luká č, N., 1 Luká čová, J., 1 Tvrdá, E., 1 Hashim, F., 1 Gre ń, A., 2 Massanyi, P. 1

1Department of Animal Physiology, Faculty of Biotechnology and Food Sciences, Slovak University of Agriculture, Nitra, Slovak Republic 2Department of Animal Physiology and Toxicology, Faculty of Biology and Geography, Pedagogical University, Cracow, Poland

Abstract The target of this in vitro study was to determine the effect of copper (Cu) on the motility and viability of spermatozoa in the presence of different culture media. The percentage of motile spermatozoa was determined after exposure to concentrations of 3.9; 7.8; 15.6; 31.2; 62.5; 125; 250; 500; 1000 µM/L of Cu 2+ using the Sperm Vision TM CASA system during different time periods (0h, 1h, 24h). The cell viability was measured by the MTT (metabolic activity) assay after 1h. The initial spermatozoa motility in the presence of Cu 2+ in physiological saline solution (PS) showed slightly increased values at doses ≤ 31.20 µM/L of Cu 2+ compared to the control group. The long-term cultivation (Time 24h) reduced the average motility values in all experimental groups ( P<0.001). The cell viability was decreased significantly ( P<0.001) in all experimental groups with added of Cu2+ . The culture medium containing 20% bovine serum albumin (BSA), triladyl and 5% glucose increased the overall percentage of spermatozoa motility after 1h of cultivation. A concurrently BSA maintained motility of spermatozoa (≤ 62.50 µM/L of Cu 2+ ) during Time 24h, which confirms the protective effect of albumin binding to the Cu 2+ . The obtained data point out that Cu 2+ at high doses is a toxic element on the spermatozoa motility, which subsequently disrupts the viability of cells. However, using a suitable culture medium containing an energy component and protein rich substrate, the spermatozoa motility could increase. Key words: copper, culture media, bovine spermatozoa, motility, viability

INTRODUCTION Copper (Cu) is an important microelement for the animal and human organism, because it has a great positive role in physiological and regulatory processes (Dobrzanski et al., 1996). Copper plays in important role in male and female reproduction system (Wong et al., 2001). The excessive Cu intake has a negative effect on the organs of reproduction

79 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

(Katayose et al., 2004). The high concentrations of copper ions (Cu 2+ ) have a toxic effect on the epididymis (Xu et al., 1985), testes, scrotum of mammals (Eidi et al., 2010) as well as spermatozoa function (Machal et al., 2002). The negative effect on the reproductive organs of males and females may ultimately lead to a reduced fertility (Pesch et al., 2006). Spermatozoa are extremely sensible to ex vivo conditions and on the loss of exogenous energy sources therefore different culture media are used on the viability prolongation of spermatozoa (Knazicka et al., 2012). Semen culture media usually contain glucose or fructose as the dominant energy substrate (Matsuoka et al., 2006) and bovine serum albumin (BSA) as a protein alternative to egg yolk (Peters et al., 1975). Recently several researchers investigated interactions between Cu 2+ with serum albumin, due to the importance of Cu for various biological and chemical processes (Pinto et al., 2008). Therefore, the purpose of this in vitro study was to provide additional information on the impact of Cu 2+ on the spermatogenesis in the presence of different media. Specifically, we evaluated the dose- and time-dependent effects of this trace metal on the motility and viability of spermatozoa during different time periods. Furthermore, it was also necessary to examine the possible cytotoxicity effect of Cu 2+ on these cells.

Materials and methods Semen samples and in vitro culture Bull semen samples were obtained from 8 adult breeding bulls (Slovak Biological Services, Nitra, Slovak Republic). After collecting the samples, they were stored in the laboratory at room temperature (22-25°C). Each sample was diluted in physiological saline solution (PS) (sodium chloride 0.9% w/v, Bieffe Medital, Italia), using a dilution ratio of 1:40, depending on the original spermatozoa concentration. The cells were incubated in different culture media (Table 1) with various concentrations of copper (3.9; 7.8; 15.6; 31.2; 62.5; 125;

250; 500; 1000 µM/L), in the form of copper sulphate (CuSO 4.5H 2O; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Spermatozoa were cultivated in the laboratory at room temperature (22-25°C). We compared the control (Ctrl) group (medium without Cu 2+ ) with the experimental groups (exposed to different concentrations of Cu 2+ ).

Tab. 1 Culture media used for the experiment.

Medium Composition 1. physiological saline solution (sodium chloride 0.9% w/v, Bieffe Medital, Italia) 2. 20% BSA (bovine serum albumin, Sigma-Aldrich, USA), triladyl (MiniTüb, Germany), 5% glucose (D-glukosa monohydrat p.a, Penta, Chrudim, Czech Republic) and redistilled water

80 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Spermatozoa motility The motility analysis was carried out using a CASA (Computer Assisted Semen Analyzer) system – SpermVisionTM program (MiniT őb, Tiefenbach, Germany) with the Olympus BX 51 microscope (Olympus, Japan) at cultivation Times 0h, 1h and 24h. Each sample was placed into the Makler Counting Chamber (deph 10 µm, Sefi-Medical Instruments, Izrael) and was evaluated percentage of motile spermatozoa (motility > 5 µm/s; MOT). This study was performed in eight replicates at each concentration (n = 8).

Cytotoxicity evaluation The viability of the cells exposed to Cu 2+ in vitro was evaluated by the metabolic activity (MTT) assay (Mosmann, 1983; Byun et al., 2008). In brief, the cultured 10 9 cells/mL (in 200 µL medium per well) in 96-well plates (MTP, Greiner, Germany) were stained with MTT tetrazolium salt (Sigma, St. Louis, USA). MTT was dissolved in PBS (Dulbecco´s Phosphate Buffer Saline, Sigma, St. Louis, USA) at 5 mg/mL and added to the cells (in 20 µL per well). After 1h incubation (37 ºC), the cells and the formazan crystals were dissolved in 80 µL of isopropanol (2-propanol, p.a. CentralChem, Bratislava, Slovak Republic). The optical density was determined at a measuring wavelength of 570 nm against 620 nm as reference by a microplate ELISA reader (Multiskan FC, ThermoFisher Scientific, Finland). The data were expressed in percentage of control (i.e., optical density of formazan from cells not exposed to Cu 2+ ) (Knazicka et al., 2012). Results from the analysis were collected during two repeated experiments at each concentration.

Statistical analysis Obtained data were statistically analysed by PC program GraphPad Prism 3.02 (GraphPad Software Incorporated, San Diego, California, USA). One-way analysis of variance (ANOVA) and the Dunnett´s multiple comparison test were used for statistical evaluations. The level of significance was set at *** ( P<0.001); ** (P<0.01); * ( P<0.05).

Results Evaluation of spermatozoa motility in the presence of Cu 2+ in PS culture medium The initial (Time 0h) the percentage of spermatozoa motility showed slightly increased values at doses ≤ 31.20 µM/L of Cu 2+ compared to the control group (Table 2). The

81 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 long-term cultivation (Time 24h) reduced the average motility values in all experimental groups ( P<0.001) in comparison to the control group.

Tab. 2 Spermatozoa motility (%) in the presence of copper in PS culture medium during different time periods.

Groups Ctrl 3.9 7.8 15.6 31.2 62.5 125 250 500 1000 K I H G F E D C B A µM/L Cu 2+ Time 0h x 92.45 96.13 96.42 96.36 96.82 85.59 82.75 78.48 A 65.55 A 62.44 A minimum 81.94 92.85 92.44 91.53 93.68 63.15 35.00 30.43 18.18 17.02 maximum 97.47 98.44 98.39 99.30 98.50 99.37 99.08 99.26 97.43 98.70 S.D. 4.28 1.69 1.67 2.19 1.12 11.55 20.35 18.72 29.62 29.43 CV (%) 4.63 1.76 1.74 2.20 1.16 13.50 24.59 23.85 45.18 47.13 Time 1h x 83.13 86.11 95.64 C 89.46 81.80 73.30 C 71.12 C 59.47 A 32.82 A 22.93 A minimum 40.00 57.14 87.58 73.33 50.70 40.00 45.45 16.21 10.38 10.00 maximum 98.42 98.49 100.0 98.03 96.62 98.62 98.90 97.93 66.50 59.09 S.D. 14.33 11.88 3.02 7.67 16.18 16.47 18.48 28.86 19.37 14.20 CV (%) 17.24 13.80 3.16 8.57 19.79 22.47 25.99 48.54 59.02 61.93 Time 24h x 27.32 11.41 A 6.88 A 4.64 A 2.56 A 2.45 A 2.22 A 1.73 A 1.15 A 0.91 A minimum 11.78 3.63 1.65 1.44 1.01 0.85 0.50 0.00 0.00 0.00 maximum 55.60 15.35 14.86 9.41 5.20 4.61 8.33 5.88 3.38 2.56 S.D. 13.04 3.22 4.13 2.22 1.26 1.05 1.59 1.49 1.04 0.87 CV (%) 47.72 28.21 59.97 47.80 49.26 42.96 71.78 86.12 90.14 96.20 Legend: x – mean, SD – standard deviation, CV (%) – coefficient of variation, AP<0.001; BP<0.01; CP<0.05.

Evaluation of spermatozoa motility in the presence of Cu 2+ in BSA culture medium The spermatozoa motility showed similar values in all experimental groups but no significant differences were found between these groups and the control group (Time 0h). The percentage of motile spermatozoa increased after 1h of cultivation in all groups with Cu 2+ added compared to the control group (Table 3). A concurrently BSA maintained motility of spermatozoa at doses ≤ 62.50 µM/L of Cu 2+ during the long-term in vitro cultivation.

Evaluation of viability spermatozoa in PS culture medium After 1h cultivation we recorded that doses ( ≤ 15.60 µM/L of Cu 2+ ) significantly increased the spermatozoa motility, but have negative effect on viability of cells. The lowest survival of spermatozoa was determined after the addition of dose 62.50 µM/L of Cu 2+ (Figure 1).

82 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab 3 Spermatozoa motility (%) in the presence of copper in BSA culture medium during different time periods.

Groups Ctrl 3.9 7.8 15.6 31.2 62.5 125 250 500 1000 K I H G F E D C B A µM/L Cu 2+ Time 0h x 90.21 88.23 86.70 88.61 90.20 89.15 89.66 90.96 93.38 93.68 minimum 71.05 65.38 65.88 76.29 80.89 66.27 77.68 76.47 87.50 84.61 maximum 98.94 96.03 97.26 94.83 97.65 98.91 96.89 96.80 99.14 98.49 S.D. 5.50 7.12 7.27 4.65 4.67 8.02 5.53 4.28 2.80 2.59 CV (%) 6.10 8.07 8.38 5.25 5.18 9.00 6.17 4.70 3.00 2.77 Time 1h x 79.89 83.30 87.31 A 84.49 C 81.68 83.92 85.51 A 83.11 A 87.21 A 86.60 A minimum 62.22 68.75 76.31 59.18 63.63 75.55 73.46 71.05 73.63 69.23 maximum 97.87 96.66 94.44 98.14 92.80 92.10 96.55 96.93 96.96 96.15 S.D. 8.63 6.46 5.38 8.80 7.23 4.22 6.06 6.45 5.00 6.90 CV (%) 10.81 7.76 6.16 10.41 8.85 5.03 7.08 7.75 5.73 7.96 Time 24h x 70.10 76.81 74.91 76.02 74.40 76.28 61.65 A 41.78 A 34.32 A 23.92 A minimum 37.25 52.83 62.50 53.96 63.24 61.94 55.66 16.45 0.00 7.69 maximum 93.75 90.90 82.22 86.66 86.13 85.52 77.92 62.31 74.44 52.50 S.D. 15.41 9.48 5.94 7.19 6.65 6.60 5.76 13.92 23.24 13.04 CV (%) 21.98 12.34 7.94 9.46 8.93 8.65 9.34 33.33 67.72 54.51 Legend: x – mean, SD – standard deviation, CV (%) – coefficient of variation, AP<0.001; BP<0.01; CP<0.05.

Figure 1 Effect of various doses of copper on the viability of spermatozoa (in PS culture medium) after 1h.

Discussion Currently, trace elements are a highly discussed topic, because they significantly affect the reproductive system, which can be strongly reflected in the process of spermatogenesis (Knazicka et al., 2012). Several experimental studies demonstrated the adverse effects of Cu 2+ on spermatozoa motility (Wong et al., 2001; Machal et al., 2002; Sakhaee et al., 2011). Katayose et al. (2004) claimed that higher concentrations of Cu had significant adverse effects

83 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 on the spermatozoa motility. Our experiment indicates similar results and also confirms that Cu 2+ is a toxic element on spermatogenesis. The high doses of Cu ( ≥ 62.50 µM/L) in PS culture medium reduced the spermatozoa motility, but also had a negative effect on the survival of these cells. These concentrations decreased the mitochondrial activity or enzymatic complex, which includes the production of ATP. In the present study we evaluated also the percentage of spermatozoa motility in the presence of Cu 2+ with culture medium addition in composition of 20% BSA, triladyl and 5% glucose. This culture medium increased the bovine spermatozoa motility during the short- term of cultivation in spite of the presence of high doses of Cu 2+ . This observation could be explained binding of copper ions to albumin, which confirms previous experimental studies (Bradshaw et al., 1968; Masuoka and Saltman, 1994). The role of albumin is protective as a result of its ability to trap toxic substances in the culture media (Yamane et al., 1976). The binding of metals to proteins is a defense to reduce toxicity by preventing availability of the metals (Davidson et al., 2007). Several authors consider bovine serum albumin as a suitable protein supplement for the long-term spermatozoa cultivation, because it has protective functions (Yamane et al., 1976) and in addition a good essential amino acid profile (Peters et al., 1975). Regarding our results we can confirm, that the percentage of motile spermatozoa at doses ≤ 62.50 µM/L of Cu 2+ was maintained during the long-term of in vitro cultivation. It could be explained by a high concentration of energy and protein substrates in the medium. From our study, the highest sensitivity of spermatozoa to Cu was found when activating in BSA containing the highest doses (500 M; 1000 M) of Cu 2+ . An appropriate energy substrate (Knazicka et al., 2010), protein supply, as well as optimal laboratory conditions are important factors for a successful in vitro spermatozoa motility and viability (Tvrda et al., 2010).

Conclusions Our results support the idea that Cu at high doses ( ≥ 62.50 µM/L of Cu 2+ ) cause s a significant reduction of motility spermatozoa. However, adding an energy and protein substrate (20% BSA, triladyl, 5% glucose) to the culture medium increases the spermatozoa motility despite the presence of Cu at higher doses. A concurrently BSA maintained motility of spermatozoa at doses ≤ 62.50 µM/L of Cu 2+ during 24 h, which confirms the protective effect of albumin binding to the copper ions. Findings of the present study demonstrate that Cu at high concentrations acts as a toxic element on the spermatozoa motility and it has a destructive effect on the mitochondrial complex.

84 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Acknowledgments This work was supported by the SPP Foundation (The Scholarship Programme Smart Heads).

References Bradshaw, R.A., Shearer, W.T., Gurd, F.R.N. Sites of binding of copper (II) ion by peptid (1- 24) of bovine serum albumin. J. Biol. Chem., 1968, 243(14), 3817-3825. Byun, J.W., Choo, S.H., Kim, H.H., Kim, Y.J., Hwang, Y.J., Kim, D.Y. Evaluation of boar sperm viability by MTT reduction assay in beltsville thawing solution extender. Asian- Aust. J. Anim. Sci,. 2008, 21(4), 494-498. Davidson, T., Ke, Q., Costa, M. Selected molecular mechanisms of metal toxicity and carcinogenity. In: Handbook on the toxicology of metals (Nordberg, G.F., Fowler, B.A., Nordberg, M., Friberg, L.T., eds.). Amsterdam: Academic Press, 2007, pp. 529-546. Dobrzanski, Z.; Kołacz, R.; Bodak, E. Heavy metals in animal environment. Medycyna Wet. 1996, 52 , 570-574. Eidi, M., Eidi, A., Pouyan, O., Shahmohammadi, P., Fazaeli, R., Bahar, M. Seminal plasma levels of copper and its relationship with seminal parameters. Iran J. Reprod. Med ., 2010, 8(2), 60-65. Katayose, H., Shinohara, A., Chiba, M., Yamada, H., Tominaga, K., Sato, A. Effects of various elements in seminal plasma on semen profiles. J. Mam. Ova. Res ., 2004, 21, 141- 148. Knazicka, Z., Tvrda, E., Bardos, L., Lukac, N. Dose- and time-dependent effect of copper ions on the viability of bull spermatozoa in different media. In Journal of Environmental Science and Health, Part A , 2012, 47, ISS 9 (in press). Knazicka, Z., Tvrda, E., Kerti, A., Bulla, J., Massanyi, P., Lukac, N. Influence of energy components to culture media on the bovine spermatozoa motility parameters in vitro . Acta fytotechnica et zootechnica ., 2010, 13(1), 1-6. Machal, L., Chladek, G., Strakova, E. Copper, phosphorus and calcium in bovine blood and seminal plasma in relation to semen quality. Journal Anim. Feed Sci., 2002, 11, 425-435. Masuoka, J., Saltman, P. Zinc (II) and Copper (II) binding to serum albumin: A comparative study of dog, bovine and human albumin. J. Biol. Chem., 1994, 269(41), 2557-2561. Matsuoka, T., Imai, H., Kohno, H., Fukui, Y. Effects of bovine serum albumin and trehalose in semen diluents for improvement of frozen-thawed ram spermatozoa. J. Reprod. Dev., 2006, 52, 675-683. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and surrival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal Immunol. Methods , 1983, 65, 55–63. Pesch, S., Bergmann, M., Bostedt, H. Determination of some enzymes and macro- and microelements in stallion seminal plasma and their correlations to semen quality. Theriogenology , 2006, 66, 307-313. Peters, T. Jr., Feldhoff, R.C., Reed, R.G. Immunochemical studies of fragments of bovine serum albumin. J. Biol. Chem ., 1975, 252(23), 8464-8468. Pinto, E.M., Soares, D.M., Brett, CH.M.A. Interaction of BSA protein with copper evaluated by electrochemical impedance spectroscopy and quartz crystal microbalance. Electrochimica Acta , 2008, 53, 7460-7466. Sakhaee, E., Emadi, L., Abshenas, J., Kheirandish, R., Azari, O., Amiri, E. Evaluation of epididymal sperm quality following experimentally induced copper poisoning in male rats. Andrologia , 2011, 44(1):1-7.

85 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tvrda, E., Knazicka, Z., Massanyi, P., Stawarz, R., Formicki, G., Lukac, N. Bovine serum albumin as a potential protein supplement for in vitro cultivation of spermatozoa. MendelNet 2010. Brno, 2010, 964-969. Wong, W.Y., Flik, G., Groenen, P.M., Swinkels, D.M., Thomas, C.M., Copius-Peereboom, J.H., Merkus, H.M., Steegers-Theunissen, R.P. The impact of calcium, magnesium, zinc and copper in blood and seminal plasma on semen parameters in men. Reproductive Toxicology , 2001, 15, 131-136. Xu, Y., Xiao, F.L., Xu, N., Qian, S.Z. Effect of intra-epididymal injection of copper particles on fertility, spermatogenesis and tissue copper levels in rats. Int. J. Androl ., 1985, 8(2), 168-174. Yamane, I., Murakami, O., Kato, M. „Serum-free“ culture of various mammalian cells and the role of bovine albumin. Cell Structure and Function . 1976, 1, 279-284.

86 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

EVALUATION OF BIOCHEMICAL PARAMETERS OF EUROPEAN BROWN HARE (LEPUS EUROPAEUS)

Ková čik, A., 1Trusinová, M., 2Gašparík, J., 2Slame čka, J., 3Jur čík, R., 3Čupka, P., 1 Tušimová, E., 1Bulla,J. 1

1 Department of Animal Physiology, Faculty of Biotechnology and Food Sciences, 2 Department of Poultry Science and Small Animal Husbandry, Faculty of Agrobiology and Food Resources, Slovak University of Agriculture in Nitra, 3Animal Production Research Centre, Nitra, Slovak Republic

Abstract The aim of this study was to determine blood serum biochemical values for a population of free-living European brown hares ( Lepus europaeus ) and to investigate differences related to sex and age. The blood samples were collected from 17 hares that were caught in the West Slovak Lowland. The serum was used for the evaluation of selected parameters of mineral profile (Ca, P, Na, K, Cl) and other biochemical parameters (urea, total proteins, glucose, cholesterol, and bilirubin). Concentration of phosphorus was significantly higher and concentration of potassium was significantly lower in adults than in young hares. Concentrations of chloride, urea, total protein and total bilirubin were also higher in adults than in young hares and glucose and cholesterol concentrations were lower in comparison to young hares. Concentrations of Ca, Na, Cl and bilirubin were higher in male compared to female hares and P, K, urea, glucose and cholesterol concentration were lower. Concentration of total proteins was significantly higher in females than in male hares.

Key words: biochemical parameters, blood serum, European brown hare, Lepus europaeus.

Introduction The European brown hare (Lepus europaeus ) is a species of hare naturally occurring in northern, central and western Europe and southwestern Asia. It is a mammal adapted to temperate, open country. The hare likes warm and dry parts of plains and hills (Slame čka et al., 1997). The brown hares are very important for their economic and hunting aspects. Populations of European brown hares ( Lepus europaeus ) have declined dramatically over the past 50 years (Wintzen Jensen, 2009). Biochemical and mineral values can be useful for evaluating the health of free-living European brown hares populations, but information about these parameters is fragmented and incomplete (Marco et al. 2003).

87 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

The study of the metabolic profile, a good indicator of the physiological and nutritional condition of the reared animals and wild hares during the winter season, but winter food availability is probably not a limiting factor (Paci et al., 2007). The aim of this study was to determine blood serum biochemical values for a population of free-living European brown hares and to investigate differences related to sex and age. Deviation between old and young hares may be the result of worse health status.

Material and methods The blood samples were collected from 17 hares ( Lepus europaeus ) that were caught in the West Slovak Lowland ( Čataj, Ve ľká Ma ča, Pieš ťany, Lehnice). In our experiments we used 12 adult (9 males and 3 females) and 5 young (3 males and 2 females) brown hares. Animals were caught in December 2011. Blood samples were obtained by heart tap. Blood was left to clot at room temperature (21°C). The blood serum was separated using centrifugation at 3000 rpm for 20 minutes and kept at 4°C until arrival at the laboratory, where it was stored at -20°C until analysis. The serum was used for the evaluation of selected parameters of mineral profile (calcium, phosphorus, sodium, potassium, chloride) and other biochemical parameters (urea, total proteins, glucose, cholesterol, and bilirubin). Sodium, potassium and chloride were measured by the automated analyzer EasyLyte (Medica, Bedford, USA), other parameters were measured by the semi-automated analyzer Microlab 300 (Vilat Scientific, Dieren, The Netherlands). Statistical analysis was performed with statistical software SAS. To compare results, the analysis of variance Student´s t-test was used.

Results and discussion In this study, we evaluated blood serum biochemical values in a single group of animals, with the same methodologies and at the same time. Baseline data are necessary to assess the health of wildlife hares. Comparison of selected biochemical parameters in brown hare by age is given in Table 1. The higher calcium concentration in blood serum was observed in the adult hares (3.25mmol/l). Similar findings were indicated by Massányi et al. (2009) (3.22 mmol/l), who analyzed the brown hare seasonally. Significant differences (p < 0.01) between juvenile (1.85mmol/l) and adult hares (2.67 mmol/l) were determined in phosphorus concentrations. The concentration of sodium was also higher in the adult hares (135.93mmol/l). Significantly

88 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 higher (p < 0.01) concentration of potassium in blood serum was measured in juvenile hares (12.26 mmol/l) compared to adult hares (8.82 mmol/l). Concentrations of chloride, urea, total protein and total bilirubin were also higher in adults than in young hares and glucose and cholesterol concentrations were lower in comparison to young hares.

Tab. 1 Selected biochemical blood serum parameters of brown hare by age Young Hares (n=5) Adult Hares (n=12) Parameter Mean ± SD Reference Interval Mean ± SD Reference Interval

Calcium (mmol/l) 3.18± 0.31 2.85-3.56 3.25± 1.01 1.76-4.87 Phosphorus (mmol/l) 1.85± 0.49** 1.23-2.60 2.67± 0.55** 1.76-3.46 Sodium (mmol/l) 132.34± 5.97 124.00-139.80 135.93± 11.82 113.30-157.90 Potassium (mmol/l) 12.26± 1.09** 10.59-13.51 8.82± 2.28** 5.44-13.44 Chloride (mmol/l) 107.58± 3.53 104.10-112.30 109.23± 3.99 102.10-114.60 Urea (mmol/l) 5.06± 2.11 1.90-7.70 6.79± 2.29 4.40-12.00 Total protein (g/l) 65.31± 11.78 56.07-85.90 67.77± 13.83 55.22-96.26 Glucose (mmol/l) 10.62± 2.77 8.10-15.20 9.02± 2.36 5.20-12.30 Cholesterol (mmol/l) 1.18± 0.57 0.81-2.16 1.04± 0.55 0.32-1.92 Bilirubin (mmol/l) 4.03± 0.57 3.54-4.90 4.91± 1.62 2.73-8.20

Paci et al. (2007) observed brown hares ( Lepus europaeus Pallas) in several areas by age and sex. No significant influence of age on mineral profile was determined. These findings correspond to ours, except of phosphorus and potassium concentrations, which were slightly higher. The higher concentrations of total proteins in the adult brown hares compared to young hares were described by Marco et al. (2003). Increase of total proteins level is associated with adolescence (Kaneko et al., 1997), which corresponds to our findings. In our study, concentrations of glucose in the brown hares were higher than previously published values (Slame čka et al., 1997, Massányi et al., 2009). Marco et al. (2003) observed higher glucose concentration in adult hares in comparison to young hares, which does not correspond to our results. The same author indicated higher concentration of cholesterol and bilirubin in infantile hares. Comparison of selected biochemical parameters in brown hare by sex is given in Table 2. Concentrations of calcium, sodium, chloride and bilirubin were higher in male compared to female hares and potassium, urea, glucose and cholesterol concentration were lower. Slightly higher concentration of phosphorus was found in female hares. After statistical comparison

89 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 we found significant differences (p < 0.01) in total proteins, where higher level in female hares was observed (78.88 g/l).

Tab. 2 Selected biochemical blood serum parameters of brown hare by sex. Female Hares (n=5) Male Hares (n=12) Parameter Mean ± SD Reference Interval Mean ± SD Reference Interval

Calcium (mmol/l) 3.16 ± 0.37 2.69-3.59 3.26 ± 1.01 1.76-4.87 Phosphorus (mmol/l) 2.48 ± 0.92 1.23-3.46 2.41 ± 0.54 1.70-3.29 Sodium (mmol/l) 133.24 ± 10.05 120.30-145.50 135.56 ± 10.87 113.30-157.90 Potassium (mmol/l) 10.68 ± 2.39 8.11-13.51 9.48 ± 2.63 5.44-13.44 Chloride (mmol/l) 107.36 ± 3.02 104.10-110.30 109.33 ± 4.10 102.10-114.60 Urea (mmol/l) 6.90 ± 3.74 1.90-12.00 6.03 ± 1.58 4.40-9.40 Total protein (g/l) 78.88 ± 18.75** 55.22-96.26 62.12 ± 5.05** 55.72-73.59 Glucose (mmol/l) 9.62 ± 4.05 5.20-15.20 9.43 ±1.80 5.30-11.70 Cholesterol (mmol/l) 1.28 ± 0.56 0.56-2.19 1.00 ± 0.54 0.32-1.92 Bilirubin (mmol/l) 4.33 ± 0.88 3.55-5.42 4.79 ± 1.63 2.73-8.20

Our mineral profile results by sex correspond to findings of Paci et al. (2007). Author did not find out any significant difference. Levels of mineral parameters were slightly higher in comparison to results of Nicpon et al. (2007), who indicated average values: calcium 2.55 mmol/l, phosphorus 1.37 mmol/l, sodium 146.5 mmol/l, potassium 3.77 mmol/l, chloride 108 mmol/l. Paci et al. (2007) determined significant (p < 0.01) differences in glucose concentration by age and sex in Lepus europaeus Pallas, while higher concentration was observed in the adult hares, what corresponds to our findings. Authors Marco et al. (2003) and Paci et al. (2007) indicated level of cholesterol 0.40 mmol/l and 0.50 mmol/l. Our results are similar to findings of Slame čka et al. (1997), who observed average cholesterol concentrations of 1.34 mmol/l and Massányi et al.(2009) (1.22 mmol/l). The different cholesterol concentrations in the hares of our study, compared to other studies results, could be related to diet, seasonality and stress.

Conclusion All evaluated blood biochemical parameters of brown hares were within the physiological range with relatively low differences. These differences might be explained by the different grasslands, meadows, and crops in the various areas. It would be appropriate to

90 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 verify observed results on more free-living hares of various areas, as well as on subjects bred in captivity.

Acknowledgement This work was supported by projects APVV 0368-10, VEGA No. 1/0790/11, VEGA No. 1/1101/11 and KEGA 035 Spu-4/2012.

References Marco, I., Cuenca, R., Pastor, J., Velarde, R., Lavin, S. Hematology and Serum Chemistry Values of the European Brown Hare. Veterinary Clinical Pathology , 2003, 32 (4), 195-198. Massányi, P., Slame čka, J., Luká č, N., Capcarová, M., Mertin, D., Jur čík, R. Seasonal variations in the blood biochemistry of brown hare.Medycyna Wet ., 2009, 65 (6), 389-393. Nicpon, J.; Sławuta, P.; Nicpon, J.; Noszczyk-Nowak, A. Hematological, biochemical and acid-base equilibrium parameters of the European Brown Hare . Medycyna Wet., 2007, 63 (10), 1239-1241. Paci, G., Lavazza, A., Ferretti, M., Bagliacca, M. Relationship between habitat, densities and metabolic profile in brown hares ( Lepus europaeus Pallas), Ital. J. Anim. Sci. , 2007, 6, 241- 255 Slame čka, J., Hell, P., Jur čík, R. Brown hare in the West Slovak lowland. Acta Sci. Nat. Brno , 1997, 31, 115 pp. Wintzen Jensen, T. L., Identifying causes for population decline of the brown hare ( Lepus europaeus ) in agricultural landscapes in Denmark. Aarhus University, Denmark, 2009, 193 pp. ISBN: 978-87-7073-105-8

91 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

EVALUATION OF FATTY ACID COMPOSITION IN ORGANIC GOAT MILK DURING THE LACTATION PERIOD

Králí čková, Š., Kuchtík, J.

Ústav chovu a šlecht ění hospodá řských zví řat, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zem ědělská 1, 630 00 Brno

Abstract The aim of this study was to evaluate the effect of stage of lactation on the content of individual fatty acids, also on the most important gorups of fatty acids in goat milk. The study was carried out on organic farm Olešenka during the year 2011. The experiment involved 9 goats of Brown short-haired breed, all goats were on the second lastation and gave birth to twins. Daily feeding ration was based on pasture ( ad libitum) with the addition of organic oat (0.5 kg per goat) and mineral lick (ad libitum) . Fatty acids were determinated using gass chromatography. Under the study it was found that the stage of lactation had a significant effect on contents of all monitored individual fatty acids. Also all interpolated groups of fatty acids were significantly affected by stage of lactation. In goat milk fat were the most represented palmitic acid (34,49 %) and oleic acid (26,24 %). CLA content was highest (1,01 %) in the middle of the monitoring.

Úvod Sou časný životní styl klade velký d ůraz na zdravou výživu. Tento tlak m ěl v nedávné minulosti na konzumenty zásadní vliv vedoucí k omezení konzumace mléka a mlé čných výrobk ů. Našt ěstí mnohé studie dokázaly, že mléko a mlé čné výrobky obsahují řadu zdraví prosp ěšných a nenahraditelných látek. Mlé čný tuk je nejen nositelem chuti, ale obsahuje řadu mastných kyselin (MK), jejichž vliv na lidské zdraví je v poslední dob ě velmi diskutován. Mezi významné MK pat ří zvlášt ě ty esenciální, které si lidský organismus neumí sám syntetizovat a je nutno je p řijímat potravou. Konkrétn ě se jedná o kyselinu linolovou, α-linolenovou a konjugovanou kyselinu linolovou (CLA), které je p řisuzován pozitivní protirakovinný vliv, vliv na snižování hladiny cholesterolu nebo pozitivní vliv p ři lé čbě diabetes (Keresteš, 2009 a Podsední ček et al. , 2010).

Materiál a matodika Sledování bylo realizováno na ekologické farm ě Olešenka na vyso čin ě v pr ůběhu roku 2011. Do pokusu bylo zapojeno 9 koz plemene hn ědá krátkosrstá, p řičemž všechny kozy byly

92 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 na druhé laktaci a z pohledu četnosti vrhu porodily dvoj čata. Základem denní krmné dávky byla od dubna do konce zá ří pastva na trvalých travních porostech, dále seno (ad libitum), ma čkaný oves (1 kg/kus), minerální liz a s ůl (ad libitum). B ěhem dojení byly kozy přikrmovány Bio sm ěsí pro kozy dojící (VK Drcman) v množství cca 0,5 kg/kus. V zim ě byly kozy krmeny senem a senáží (ad libitum), minerálním lizem a solí (ad libitum). Všechny kozy byly po celou dobu sledování chovány v identických podmínkách. S dojením koz se zapo čalo na za čátku dubna, p řičemž individuální vzorky kozího mléka byly odebrány sedmkrát v pr ůběhu m ěsíc ů duben až říjen 2011. Jednotlivé odb ěry odpovídaly pr ůměrnému 61., 89., 124., 160., 187., 222. a 257. dni laktace. Vzorky mléka byly ihned po odebrání zchlazeny na ± 5 °C a v termoboxu p řevezeny do rozborových laborato ří MENDELU. Obsahy sušiny a tuku (%) byly stanoveny na Ústavu technologie potravin dle ČSN ISO 6731 a 2446. Tuk pro stanovení mastných kyselin (MK) byl získán odst řed ěním cca 10 ml kozího mléka v chlazené odst ředivce p ři 4000 otá čkách po dobu 15 minut. Analýza jednotlivých MK prob ěhla po p řevedení vyextrahovaného tuku (50 mg) na FAME ‒s (fatty acid methyl esters), po p řídavku NaCl byly FAME ‒s vyt řepány do isooktanu a analyzovány metodou kapilární plynové chromatografie. V rámci analýz na Ústavu chemie a biochemie byly stanoveny obsahy následujících MK (%): dodekanová (C12:0), tetradekanová (C14:0), tetradecenová (C14:1), pentadekanová (C15:0), hexadekanová (C16:0), hexadecenová (C16:1), oktadekanová (C18:0), trans-oktadecenová (C18:1n9t), cis- oktadecenová (C18:1n9c), trans-oktadeka-9,12-dienová (C18:2n6t), cis-oktadeka-9,12- dienová (C18:2n6c), oktadeka-9,12,15-trienová (C18:3n3), oktadeka-9,11-dienová (C18:2/9,11/), oktadeka-10,12-dienová (C18:2/10,12/). Po skon čení analýz byly dopo čítány celkové obsahy t ěchto skupin MK: nasycené ∑SFA (C12:0 + C14:0 + C15:0 + C16:0 + C18:0); mononenasycené ∑MUFA (C14:1 + C16:1 + C18:1n9t + C18:1n9c); polynenasycené ∑PUFA (C18:2n6t + C18:2n6c + C18:3n3 + C18:2/9,11/ + C18:2/10,12/); n-3 ΣPUFAn3 (C18:3n3), n-6 ΣPUFAn6 (C18:2n6t + C18:2n6c), celkové nenasycené ∑UFA ( ∑MUFA + ∑PUFA) a celkový obsah konjugované kyseliny linolové ΣCLA (C18:2/9,11/ + C18:2/10,12/). Zjišt ěné údaje byly statisticky analyzovány s pomocí metody nejmenších čtverc ů (SAS; PROC GLM variant ss4), p řičemž byl zohledn ěn systematický efekt fáze laktace (7 tříd). Pro výpo čty byl použit matematicko-statistický program Statistica 9.0.

93 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Výsledky a diskuze Zhodnocení vlivu fáze laktace na obsah a zastoupení mastných kyselin znázor ňuje Tab. 1. Z výsledk ů naší studie p ředevším vyplývá, že fáze laktace m ěla statisticky pr ůkazný vliv na obsahy všech sledovaných mastných kyselin (MK), což je v souladu s výsledky studie Talpura et al. (2008). Také Nudda et al. (2003) zaznamenal statisticky pr ůkazný vliv fáze laktace na kyseliny C18:0, C18:1, C18:2, C18:3 a C18:2/9,11/.

Tab. 1 Vliv fáze laktace na obsahy mastných kyselinv kozím mléce (v % veškerých MK) (Effect of the stage of lactation on contents of fatty acids in goat milk (% of total FA)

F 1. odb ěr 2. odb ěr 3. odb ěr 4. odb ěr 5. odb ěr 6. odb ěr 7. odb ěr Ø SD test Sušina 12,40 A 11,62 AB 10,88 B 11,22 AB 11,71 AB 11,32 AB 14,18 C 11,90 1,028 ** Tuk 3,90 3,60 2,92 3,57 3,65 3,39 3,39 3,49 0,282 NS C12:0 3,86 AC 3,90 AC 5,60 AB 3,42 C 4,02 AC 7,03 B 6,52 B 4,91 1,347 ** C14:0 10,28 A 10,52 A 13,03 B 9,30 A 10,63 A 14,82 B 14,44 B 11,86 2,040 ** C14:1 0,12 A 0,14 AB 0,24 B 0,14 AB 0,21 AB 0,38 C 0,44 C 0,24 0,116 ** C15:0 1,22 ac 1,40 ac 1,91 b 0,99 a 1,19ac 1,45 c 1,49 c 1,38 0,270 * C16:0 31,58 A 32,90 AC 38,30 B 29,35 A 31,75 A 40,30 B 37,26 BC 34,49 3,796 ** C16:1 0,57 A 0,66 A 1,05 BC 0,68 A 0,87 AB 1,29 C 1,38 C 1,34 0,296 ** C18:0 16,70 A 15,79 A 11,63 B 18,34 A 15,91 A 8,75 B 9,27 B 13,77 3,545 ** C18:1n9t 1,16 A 0,92 AB 0,55 BC 1,21 A 0,75 BC 0,46 C 0,55 BC 0,80 0,282 ** C18:1n9c 25,79 ac 27,13 abe 22,78 c 30,57 bd 30,04 ad 21,68 c 25,68 ce 26,24 3,100 * C18:2n6t 0,63 A 0,45 B 0,25 CD 0,62 A 0,36 BC 0,23 CD 0,21 D 0,39 0,166 ** C18:2n6c 5,76 A 4,54 AC 3,70 BC 3,69 BC 3,10 BD 2,56 BD 1,94 D 3,61 1,174 ** C18:2/9,11/ 0,62 abc 0,51 bc 0,39 bc 0,98 a 0,70 ac 0,50 bc 0,19 b 0,56 0,230 * C18:2/10,12/ 0,05 A 0,01 BC 0,01 BC 0,03 AB 0,01 BC 0,01 BC 0,00 C 0,02 0,016 ** C18:3n3 1,66 A 1,12 B 0,54 C 0,67 C 0,45 C 0,54 C 0,62 C 0,80 0,405 ** ∑SFA 63,65 A 64,52 A 70,48 B 61,41 A 63,49 A 72,34 B 68,98 B 66,41 3,837 ** ∑MUFA 27,64 ac 28,86 bc 24,63 ae 32,60 b 31,88 bd 23,82 a 28,06 cde 28,21 3,061 * ∑PUFA 8,72 a 6,62 b 4,90 cd 5,99 bc 4,63 cd 3,84 de 2,96 e 5,38 1,776 * ∑PUFAn3 1,66 A 1,12 B 0,54 C 0,67 C 0,45 C 0,54 C 0,62 C 0,80 0,405 ** ∑PUFAn6 6,39 A 4,99 AC 3,95 BC 4,31 BC 3,46 BD 2,79 BD 2,15 D 4,01 1,308 ** ∑UFA 36,35 A 35,48 A 29,52 B 38,59 A 36,51 A 27,66 B 31,02 B 33,59 3,837 ** ∑CLA 0,67 ab 0,52 ac 0,39 ac 1,01 b 0,71 ab 0,51 ac 0,19 c 0,57 0,241 * Mezi hodnotami v řádcích s rozdílnými písmeny (A, B, C, D) je statisticky vysoce pr ůkazný (P ≤0,01) rozdíl; (a, b, c, d, e) statisticky pr ůkazný (P ≤0,05) rozdíl, ** P ≤0,01; * P ≤0,05; NS nesignifikantní.

Z tabulky 1 je také patrný pr ůkazný vliv fáze laktace na všechny dopo čítané skupiny MK. Nap ř. ve studiích, které uskute čnili Tsiplakou et al. (2006) a Ata oğlu et al. (2009) byl zjišt ěn také pr ůkazný vliv tohoto faktoru na obsahy MK nasycených (SFA), mononenasycených (MUFA), celkových nenasycených (UFA) a n-3 kyselin. Naproti tomu

94 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 v obou výše zmi ňovaných zahrani čních studiích nebyl zjišt ěn pr ůkazný vliv fáze laktace na CLA, což je v rozporu s výsledky naší studie. U řady MK byl jejich nejnižší obsah ve čtvrtém odb ěru a nejvyšší obsah v šestém odb ěru, konkrétn ě se jednalo o nasycené kyseliny dodekanovou (C12:0), tetradekanovou (C14:0) a hexadekanovou (C16:0). Naproti tomu opa čný trend, kdy ve čtvrtém odb ěru byla zjišt ěna nejvyšší hodnota a v šestém odb ěru nejnižší hodnota, byl zaznamenán u kyseliny oktadekanové (C18:0), trans-oktadecenové (C18:1n9t) a cis-oktadecenové (C18:1n9c). Nejvyšší obsahy v sedmém odb ěru, tedy na konci sledování, byly zjišt ěny u kyselin tetradecenová (C14:1) a hexadecenová (C16:1), zatímco Talpur et al. (2008) zaznamenali ve své studii nejvyšší obsahy t ěchto kyselin uprost řed sledování. Obecn ě lze konstatovat, dle výsledk ů uvedených v Tab. 1, že kyseliny C12:0, C14:0, C14:1, C16:0 a C16:1 vykazovaly b ěhem sledování podobný trend, když od po čátku do konce sledování pr ůměrné hodnoty t ěchto MK rostly, s výjimkou čtvrtého a pátého odb ěru, kdy byl zaznamenán pokles jejich hodnot. Naopak u kyselin C18:0, C18:1n9t, C18:2n6t a C18:2/9,11/ byl zaznamenán opa čný trend. Pr ůměrné obsahy t ěchto MK v pr ůběhu laktace klesaly s výjimkou čtvrtého a pátého odb ěru, kdy byl zaznamenán jejich výrazn ější nár ůst. Pom ěrn ě vyrovnaný trend hodnot v pr ůběhu celé laktace byl zaznamenán v p řípad ě kyseliny oktadeka- 10,12-dienová (C18:2/10,12/). Kyselina linolová (C18:2n6c) vykazovala v pr ůběhu laktace klesající trend hodnot, zatímco v případ ě studie Talpura et al. (2008) byl zaznamenán naopak vzr ůstající trend hodnot ve stejném časovém období, tedy od jara do podzimu. Park et al. (2007) uvád ějí, že u kozího mléka je velmi nízký obsah linolové kyseliny, která je z výživového hlediska velmi významná. To potvrzuje nap říklad studie Talpura et al. (2008), kde byl zaznamenán opravdu nízký pr ůměrný obsah této kyseliny za celou laktaci (0,70 %). Ve studii Baroše a Števonkové (1990) byla zaznamenána mírn ě vyšší pr ůměrná hodnota C18:2n6c za celou laktaci (1,12 %) a ve studiích Nuddy et al. (2003) a Podsední čka et al. (2010) se hodnoty kyseliny linolové v pr ůběhu laktace pohybovaly kolem 2 %. Tudisco et al. (2010) zjistil ve své studii, že mléko koz chovaných v ekologickém systému má vyšší pr ůměrný obsah kyseliny linolové (2,77 %) oproti mléku koz získaného z konven čního hospodá řství (2,07 %). Co se týká naší studie, obsahy kyseliny linolové byly v pr ůběhu laktace pom ěrn ě vysoké, nejvyšší obsah byl zjišt ěn v prvním odb ěru 5,76 % a nejnižší v sedmém odb ěru (1,94 %). Hlavní charakteristikou mlé čného tuku malých p řežvýkavc ů je vysoký obsah MK s krátkým a st ředn ě dlouhým řet ězcem, obzvlášt ě v mlé čném tuku koz, který má nejmén ě dvakrát takový obsah C 6-C10 MK, než tuk kravského mléka (Chilliard et al. , 2007).

95 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Dopo čtený obsah SFA byl nejnižší ve čtvrtém odb ěru a nejvyšší v šestém odb ěru, stejn ě jako u v ětšiny jednotlivých nasycených MK (C10:0 až C16:0). Obsah MUFA kolísal v pr ůběhu celého sledování. Co se týká obsahu polynenasycených MK (PUFA), zde byl zaznamenán podobn ě klesající trend hodnot jako u jednotlivých kyselin C18:2n6t, C18:2n6c a C18:2/10,12/. Nejvyšší obsah UFA v mlé čném kozím tuku je dle Parka et al. (2007) v letních m ěsících. Také v rámci naší studie byl obsah UFA nejvyšší v m ěsíci červenci. Obsah CLA byl pom ěrn ě vyrovnaný v pr ůběhu laktace, s výjimkou 4. odb ěru, kdy se obsah CLA výrazn ěji zvýšil (1,01 %) a naopak v 7. odb ěru, tedy na konci laktace, byl obsah CLA nejnižší (0,19 %). Ata oğlu et al. (2009) ve své studii zaznamenali také pom ěrn ě vyrovnaný trend hodnot, ovšem jimi zjišt ěné obsahy CLA byly v porovnání s našimi údaji vyšší; v pr ůběhu celé laktace se pohybovaly v rozmezí 1,15 % až 1,40 %, p řičemž nejvyšší obsah CLA byl zaznamenán na konci laktace. Park et al. (2007) uvád ějí celkový obsah CLA nejvyšší v mlé čném tuku ovcí (1,08 %), krav (1,01 %) a koz (0,65 %), p řičemž obsah CLA u pasoucích se zví řat je výrazn ě zvýšený b ěhem dubna a kv ětna (Tsiplakou et al. , 2006). V případ ě naší studie bylo výrazn ější zvýšení obsahu CLA zaznamenáno ve čtvrtém odb ěru, tedy až v měsíci červenci.

Záv ěr Ze studie p ředevším vyplývá, že fáze laktace m ěla statisticky vysoce pr ůkazný vliv na obsahy všech sledovaných mastných kyselin (MK), stejn ě jako na dopo čtené obsahy jednotlivých skupin mastných kyselin. Živo čišné tuky obsahují velké množství nasycených mastných kyselin (SFA) a mnohem mén ě zdraví prosp ěšných nenasycených mastných kyselin (UFA), což potvrdila také naše studie, kdy obsah SFA činil 66,41 % a UFA 33,59 %. Ze všech nenasycených MK jsou pak pro zdraví nepostradatelné n ěkteré polynenasycené MK, zvlášt ě n-3, jejichž množství bylo v případ ě kozího mléka mírn ě nižší, než uvádí zahrani ční studie. Nejvyšší obsah CLA byl zaznamenán uprost řed sledování, tzn. b ěhem letních m ěsíc ů (1,01 %).

Pod ěkování Sledování bylo realizováno s podporou interního grantového projektu AF MENDELU, TP 1/2012 a s podporou projektu MZe QH91271.

Použitá literatura Ata oğlu, C., Çi ğdem, U., Yonca, K. Changes in milk fatty acid composition of goats during lactation in a semi-intensive production system. Arch. Tierzucht , 2009, 52 (6), 627−636.

96 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Baroš, V., Števonková, E. Obsah mastných kyselín v tuku kozieho mlieka a jeho zmeny v priebehu laktácie. Živo č. Výr. , 1990, 35, č. 9, 825−831. Chilliard, Y., Glasser, F., Ferlay, A., Bernard, L., Rouel, J., Doreau, M. Diet, rumen biohydrogenation and nutritional quality of cow and goat milk fat. Eur. J. Lipid. Sci. and Technol. , 2007, 109, 828−855. ČSN ISO 2446. Mléko – Stanovení obsahu tuku (Rutinní metoda). Český normaliza ční institut, Praha, 2010, 16 str. ČSN ISO 6731. Mléko, smetana a zahušt ěné mléko – Stanovení obsahu sušiny (Referen ční metoda). Český normaliza ční institut, Praha, 1998, 8 str. Keresteš, J., et al. Biotechnológie, výživa a zdravie . Považská Bystrica, 2009. ISBN 978-80- 970205-9-0. Nudda, A., Mele, M., Battacone, G., Usai, M.G., Macciotta, N.P.P. Comparasion of conjugated linoleic acid (CLA) content in milk of ewes and goats with the same dietary regimen. Ital. J. Anim. Sci. , 2003, 2 (1), 515−517. Park, Y.W., Juaréz, M., Ramos, M., Haenlein, G.F.W. Physico-chemical characteristics of goat and sheep milk. Small Ruminant Res. , 2007, 68, 88−113. Podsední ček, M., Čermák, B., Král, V., Vondrášková, B. Vliv výživy na obsah mastných kyselin v mlé čném tuku koz. Náš chov , 2010, 1, 44−47. Talpur, F.N., Bhanger, M.I., Khooharo, A.A., Zuhra Memon, G. Seasonal variation in fatty acid composition of milk from ruminants reared under the traditional feeding systém of Sindh, Pakistan. Livest. Sci. , 2008, 118, 166−172. Tsiplakou, E., Mountzouris, K.C., Zervas, G. Concentration of Conjugated Linoleic Acid in Grazing Sheep and Goat Milk Fat. Livest. Sci., 2006, 103, 74−84. Tudisco, R., Cutrignelli, M.I., Calabró, S., Piccolo, G., Bovera, F., Guglielmelli, A., Moniello, G., Infascelli, F. Influence of organic systems on milk fatty acid profilr and CLA in goats. Small Ruminant Res. , 2010, 88, 151−155.

97 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

METAL CONTENTS IN CANCER OF HUMAN UTERINE CORPUS

Kraska K. 1, Supeł M. 2, Formicki G. 1, Stawarz R. 3, Gre ń A. 1, Głogowska M. 3, Kopa ńska M. 1

1Department of Animal Physysiology and Toxicology; Cracow Pedagogical University, ul. Podbrzezie 3, 31-054 Kraków 2Piotrków Trybunalski Viovodeship Hospital 3Department of Zoology of Vertebrates and Human Biology, Cracow Pedagogical University, ul. Podbrzezie 3, 31-054 Kraków

Abstract We aimed at determination of cadmium, lead, magnesium, zinc, calcium, copper, iron and nickel in cancer of human uterine corpus of patients from Piotrków Trybunalski Viovodeship Hospital. Cancerous and healthy fragments of uterine corpus were taken from 47-85 women. Our results did not indicate significant differences in metal content between cancerous and normal uterine. Thus it seems that the metabolism of metals in cancerous cells was not changed significantly. The obtained results should be interpreted as bio-monitoring data indicating exposure of human populations to heavy metals. Introduction Heavy metals pose a serious risk to human health. They accumulate in different tissues all life, on the other hand depuration of toxic metals in human is a very slow process (Lach i Bany, 2001). Accumulation of metals may result in enzyme inhibition, disturbances in mineral content balance, disturbances in pro-oxidant/antioxidant balance, signal transduction, mutation. Of all the harmful results of heavy metals mutations leading to cancer induction belong to the most dangerous. It is suggested that mechanisms of cancer induction by heavy metals are very complex. Generally disturbances in signal transduction and oxidative stress induced by metals seem to play main role in carcinogenesis (Waalkes, 2003). Tumour development is a very slow process. Some kinds of tumours reach detectable size more than 20 years after induction. This, makes cancerous tissues interesting material for monitoring of metal accumulation. Additionally the changed metabolism of cancerous cells may have influence of the concentration of essential metals. Taking above into consideration we aimed at determination of cadmium, lead, magnesium, zinc, calcium, copper, iron and nickel in cancer of human uterine corpus.

Material and methods

98 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Cancerous and healthy fragments of uterine corpus were taken from 47-85 women in Piotrków Trybunalski Viovodeship Hospital. Total number of the studied patients was 10. All the tissues were submitted to pathomorphological studies. Before the metal content analysis the tissues were dried at 105˚C until dry mass was stabilised. Then the material was mineralised in 65% HNO 3 at 90˚C for 120 min using VELP Scientifica device. The mineralised tissues were filled with deionised water to the volume of 10 ml. Metal analysis was performed in so prepared dilutions using Cole-Parmer BUCK 200A atomic absorption spectrometer. Standards and reference material were provided by BUCK Scientific. The distribution of the results was checked with Shapiro-Wilk test. Homogeneity of variances was estimated with Levene ANOVA. The results were compared with one way ANOVA. Statistical significance was defined at p<0.05. Results Mean cadmium content in healthy uterus was 0.62±0.25 µg·g -1 d.m (dry mass). Higher concentration of cadmium was found in cancerous tissues – 0.98±0.27 µg·g -1 d.m. On the other hand the differences in cadmium content were insignificant (F=2.76; p=0.17). Insignificant differences between healthy and changed tissues occurred in Pb content too (F=0.38; p=0.57). Lead content was higher in normal tissue (5.77±2.70 µg·g -1 d.m) comparing to cancer tissue (4.65±1.59 µg·g -1 d.m). Zinc, iron, magnesium, copper and calcium contents were higher in cancerous tissue than in normal uterus. On the other hand the studied differences were statistically insignificant. Table 1 Metal content in cancer of human uterine in comparison to healthy tissues. Metal Uterin Corpus Cancer Normal tissue tissue Zn Average 60,48 54,00 Standard deviation 10,92 8,32 Cu Average 13,18 5,06 Standard deviation 5,96 1,17 Fe Average 70,83 50,39 Standard deviation 22,93 28,43 Cd Average 0,98 0,62 Standard deviation 0,27 0,25 Mg Average 410,89 228,33 Standard deviation 80,30 105,13 Ca Average 269,76 183,68 Standard deviation 119,58 29,82 Pb Average 4,65 5,77 Standard deviation 1,59 2,70

99 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Figure 1 Content of cadmium in normal tissues and cancer tissues in uterin corpus (µg·g -1 s.m.)

Figure 2 Content of lead in normal tissues and cancer tissues in uterin corpus (µg·g -1 s.m.)

Discussion All the tested metals were present in healthy tissues as well as in cancerous tissues. The presence of essential metals in the studied material was predictable. All the more so, there was no differences in essential metals between normal and cancerous uterus. More interesting was the presence of trace elements. Nowadays, heavy metals are often indicated in human organism (Dró ŜdŜ, 2005). Cadmium and lead are taken up through respiratory and digestive systems in human. Both metal can bind to metallothionein and other peptides, such as GSH or aminoacids such as methionine (Lach and Bany, 2001). On the other hand their distribution in organs is different. Cadmium accumulates in liver and kidneys in the highest concentrations. Kidneys may accumulate about 50% of total cadmium content in human organism (Lach and Bany, 2001). Lead occurs both in soft tissues and bones. The highest lead content is often indicated in bones which can accumulate up to 90% of total lead content in human organism (Jakubowski et al., 1997). It is clear that the presence of heavy metals in human organism is related to environmental pollution, and especially to the presence of trace elements in food. Some highly processed food may contain as much as 0.03 mg Cd per kg (Dziadkiewicz et al.,

100 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

2011). It was also indicated that significant amounts of heavy metals may be introduced to human organism with drinks such a tea or coffee (Dziadkiewicz et al., 2011). These concentrations seem to be significant taking into consideration that accumulation of metals proceeds all the life, and their removal is very slow (Lach i Bany, 2001). Toxic metals such as cadmium and lead can induce carcinogenesis (Oli ński, 1993). There are several mechanisms engaged in metal related formation of cancerous cells. Most important are enzyme inhibition, oxidative stress, antagonistic interactions with essential metals , disturbances in signal transduction in cells, and direct or indirect damage to DNA (Waalkes, 2003). It is impossible to state whether, metals present in cancer tissue of uterus took part in cancer induction. Nonetheless, cadmium concentrations were somewhat higher in tumours than in normal tissues. Its higher content in tumours may be related to changed metabolism of cancerous cells most probably (Lorenc-Koci, 2003). For instance it was found that reduced glutathione concentrations (GSH) are significantly higher in carcinoma tissue compared to normal tissues (Wong et al., 1994). Taking into consideration GSH role in metal distribution, it is possible that one of the reasons of higher Cd content in tumours was related to increased GSH content. All the more so, there are some information that methallothionein gene expression is down- regulated in cancerous cells (Ariaga et al., 2012). On the other hand such interpretation does not fit to lead distribution between normal and cancerous cells. In conclusion, our results indicate that concentration of metals differs insignificantly between cancerous and normal parts of uterus in human. Somewhat higher concentrations of cadmium in cancerous tissue may be related to abnormal metabolism of cancerous cells. On the other hand our results should be interpreted as bio-monitoring data indicating exposure of human populations to heavy metals.

References Ariaga J.N., Levy E.M., Bravo A.I., Bayo S.M., Amat M., Aris M., Hannois A., Bruna L., Roberti M.P., Loria F.S., Pairola A., Huertas E., Mordoh J., Bianchini M. 2012. Metallothionein expression in colorectal cancer: relevance of different isoforms for tumor progression and patient survival. Hum. Pathol ., 43, 197-208. Dro ŜdŜ R., Tworzenie reaktywnych form tlenu jako wyraz zaburzenia dynamicznej równowagi systemu antyoksydacyjnego transferyny i ceruloplazminy, Śląska Akademia Medyczna, Katowice, 2005. Dziadkiewicz K., Formicki G., Gre ń A., Stawarz R.,2011. Metals In different kinds of human diet. Xenobiotics, Enviromental exposure, toxicity and physiological response, 60-73. Jakubowski M., Marek K., Piotrowski J.K., I Ŝycki J., Zalecenia dotycz ące rozpoznawania i profilaktyki medycznej ołowicy, Instytut Medycyny Pracy im. prof. dra med. Jerzego Nofera w Łodzi Instytut Medycyny Pracy i Zdrowia Środowiskowego, Sosnowiec, 1997. Lach J., Bany J. red., Metale ci ęŜ kie a zdrowie, Polskie Towarzystwo Higieniczne, Warszawa, 2001.

101 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Lorenc-Koci E., Czy stres oksydacyjny i deplecja glutationu mog ą stanowi ć wspólne podło Ŝe schorze ń neurologicznych?, Instytut Farmakologii PAN, Kraków, 2003. Oli ński R., Molekularne podstawy i środowiskowe uwarunkowania transformacji nowotworowej komórki, Wydawnictwo Uczelniane AM, Bydgoszcz, 1993. Waalkes M. P. 2003. Cadmium carcinogenesis. Mutation research, 533, 107-120. Wong D.Y.K., Hsiao Y.L., Poon C.K., Kwan P.C., Chao S.Y., Chou S.T., Yang C.S. 1994. Glutathione concentration in oral cancer tissues. Cancer Lett., 81, 11-116.

102 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

DETERMINATION OF MORPHOLOGICALLY ALTERED SPERMATOZOA OF BULLS, RAMS AND STALLIONS

Kro čková, J., Massányi, P.

Department of Animal Physiology, Faculty of biotechnology and food sciences in Nitra

Abstract Artificial insemination in the world fulfills its role in improving the performance of the animal genetic resources and veterinary care of the reproductive process. Spermatogenesis is sensitive "barometer" for the manifestation of the effects of various agents and factors that may not manifest in other organs or tissues of the body. The aim of our study was to determine the incidence of morphologically altered spermatozoa in bull, stallion and ram semen. For microscopic evaluation, we stained semen preparations with Giemsa solution. For each sire, we evaluated 1,000 spermatozoa. Our results show that most morphologically altered spermatozoa were in bulls (10.98%), then in rams (10.56%) and in stallions (11.19%). Of all the head changes the most frequently occurred small heads. The most frequently flagellum changes were head without flagellum in bulls and rams and the knob twisted flagellum in stallions. Second most numerous change was flagellum torso in bulls, knob twisted flagellum in rams and head without flagellum in stallions. Furthermore, we observed a broken flagellum and other malformations. According to our results we can conclude that monitored dam are quality and suitable for inclusion in the insemination process.

Úvod Umelá inseminácia na celom svete plní svoju úlohu pri zlepšovaní genofondu úžitkových vlastností zvierat a veterinárnej starostlivosti o reproduk čný proces. Spermatogenéza je citlivým „barometrom“ na prejavenie sa ú činkov rôznych látok a faktorov, ktoré sa nemusia prejavi ť na iných orgánoch alebo tkanivách tela. Pod ľa Goulda et al. (1975) spermie býka, barana, kanca a žrebca sa zara ďujú do tretej skupiny cicav čích spermií charakteristických pravidelne oválnou, sploštenou a rovnako hrubou hlavi čkou. Akáko ľvek odchýlka od normálneho tvaru a štruktúry sa pokladá za anomáliu. Pri vzniku defektných spermií sa uplat ňuje vplyv celého radu činite ľov toxicko-infek čného, fyzikálno- chemického, alimentárneho a genetického pôvodu. Príkladom môžu by ť práce viacerých autorov ako Courtens et al. (1980), ktoré dokazujú poškodenie morfogenézy spermatíd býkov po podávaní etyléndibromidu. Dokázalo sa, že kadmium vyvoláva nekrózu parenchýmu

103 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 semenníka ako dôsledok ischémie, poškodením krvného rie čiš ťa semenníka (Massányi et al., 1991). Pri niektorých vírusových pohlavných chorobách možno pozorova ť vyššie percento malformácií hlavi čiek spermií. Prí činou rôznych zmien na spermiách môže by ť aj chronický zápal semenníka a prisemenníka (Massányi, 1988). Staršie akrozómy sa uvo ľň ujú a praskajú, najmä ak sú nesprávne konzervované alebo sú spermie hlboko zmrazené (Salah et al., 1992). Belokar et al. (1990) uvádzajú, že sezóna výrazne ovplyv ňuje percento abnormálnych a mŕtvych spermií. Zmeny v morfológii spermií delíme na primárne a sekundárne. Primárne vznikajú po čas spermiogenetického cyklu až po príchod spermií do chvosta prisemenníka (degeneratívne formy spermií, zmeny tvaru hlavi čky, zmeny v nukleoplazme, na akrozóme, vývojové anomálie). Sekundárne zmeny vznikajú napríklad pri dlhšom pobyte spermií v chvoste prisemenníka, v momente ejakula čného reflexu až po posúdenie ejakulátu a artefakty vyvolané nesprávnym zhotovením preparátu (napu čiavanie, uvo ľnenie, roztrhanie akrozómu a hlavi čky, roztrhaný bi čík, torzie bi číka rozli čného stup ňa a nezrelé formy spermií). Degeneratívne (teratoidné) spermie nemajú vyvinutý typický tvar hlavi čky a bi číka (Lin et al., 2012). Objavujú sa ako odpad (nepodarok), ktorý vzniká pri produkcii spermií (Gam čík a Kozumplík et al., 1984). Diploidné spermie - s hrubšou hlavi čkou a dvoma bi číkmi sa nachádzajú v ejakuláte normálne fertilných býkov. Prí činou vzniku týchto defektov je nerovnomerné rozdelenie jadrovej hmoty po čas spermatogenézy. Anomália, pri ktorej sa hlavi čky oddelia od bi číka, sa nazýva dezintegrácia spermií (dekapitácia). Vzniká ako následok zápalových procesov prisemenníkov alebo jako genetická chyba. Anomáliu Dag defekt, charakterizuje oto čenie bi číka rôzneho stup ňa. Do tvarových zmien patria zdvojené, ztrojené bi číky. Torzie, flexie rôzneho stup ňa sú tiež dôležitou zmenou spermií, kľučkovite oto čený bi čík, nalomený bi čík. Do skupiny nezrelých foriem patria spermie so zadržanou protoplazmatickou kvapkou, ktoré pochádzajú z vývojového štádia spermiogenetického cyklu (Weiss et al., 2010).

Materiál a metodika V práci sme použili ejakuláty od 20 býkov, 10 baranov a 7 žrebcov. Odber ejakulátov sa vykonal pomocou umelej vagíny, pri čom jej teplota bola 38 až 40 °C. Po získaní ejakulátu do zbera ča sa posúdila aktivita, koncentrácia a vzh ľad. Po čas spracovania ejakulátu sa v laboratóriu udržiavala teplota 20 – 25 °C. Ejakulát sme riedili pomocou laktózového riedidla. Množstvo glycerínu sme upravili pod ľa individuálnych vlastností ejakulátu, hlavne pod ľa hustoty. Sú časne s riedením dochádzalo k ochladzovaniu. Po zriedeni sme ejakuláty umiestnili do chladni čky s teplotou 1 – 3 °C po dobu 90 minút. Ejakulát bol zmrazený na hranoloch suchého ľadu, pri čom doba zmrazovania bola 7 minút. Rozmrazovanie peliet sme 104 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 uskuto čnili v 1 cm 3 roztoku citrátu sodného s teplotou 39 °C po čas 15 – 30 sekúnd. U baranov a žrebcov sme zmrazovali nakvapkaním do jamôk. Nakvapkávali sme 0,1 cm 3 do jednej jamky, pri rozmrazovaní sme pilulku vybrali pinzetou, vložili do skúmavky predhriatej na 40 °C a vo vodnom kúpeli sme ju rozmrazili „na sucho“. K rozmrazenej pilulke sme pridali asi 1,5 cm 3 citrátu sodného o teplote 39 °C. Jednu kvapku z rozmrazenej insemina čnej dávky sme rozotreli na podložnom sklí čku a nechali usuši ť na ohrievacej doske (38 °C). Suchý preparát sme fixovali 30 minút Hancockovým roztokom a nátery sme premyli destilovanou vodou. Farbenie sme vykonávali Giemsovým roztokom 3 hodiny a opláchli sme nátery destilovanou vodou. Preparáty sme posudzovali na optickom mikroskope pri 1500-násobnom zvä čšení. Po čet hodnotených spermií u jedného samca bol 1000.

Výsledky Z našich výsledkov vyplýva, že najviac morfologicky zmenených spermií bolo u býkov (10,98 %), potom u baranov (10,56 %) a najmenej u žrebcov (11,19 %). Zo zmien na hlavi čke sa naj častejšie vyskytovali malé hlavi čky. Z celkového po čtu hodnotených spermií býkov malo zmeny na hlavičke 0,98 %, u baranov tvorili zmeny na hlavi čke 0,43 % a u žrebcov 0,43%. V práci Sekoniho a Gustavsona (1987) sa uvádza, že abnormality hlavi čiek býkov predstavovali 1,34 – 3,72 % z celkového po čtu všetkých hodnotených spermií. Zmeny na bi číku tvorili u býkov 8,83 %, u baranov 9,8 % a u žrebcov 10,49 % z celkového po čtu hodnotených spermií. Malformácie na bičíku spermií býkov sa pohybovali v rozmedzí 2,91 % na jar a 4,60 % v lete (Sekoni a Gustavson, 1987). Percento spermií s abnormalitami kr čku, stredovej a koncovej časti bi číka u holsteinského dobytka bolo priemerne 3,1; 4,2 a 3,0 (Terawaki et al., 1991). Najmenej sa vyskytovali veľké hlavi čky u býkov aj baranov, kým u žrebcov sa najmenej vyskytovali akrozomálne zmeny v množstve. Naj častejšie zmeny na bi číku boli hlavi čka bez bi číka u býkov aj u baranov. U žrebcov to bolo k ľučkovité stočenie bi číka. Druhou najpo četnejšou zmenou bolo u býkov torzo bi číka, u baranov k ľučkovité sto čenie bi číka a u žrebcov hlavi čka bez bi číka. Ďalšou častou zmenou bol zlomený bi čík. Najmenej po četnou zmenou bolo u žrebcov torzo bi číka, u baranov zvinutie bi číka a u býkov retencia cytoplazmatickej kvapky. Z iných patologických zmien to boli naj častejšie spermie s viacerými bi číkmi, napu čaný akrozóm, zhrubnutie bi číka a pri ľnutie bi číka k hlavi čke. Soderguist et al. (1991) poukazujú na to, že zmeny na hlavi čke spermií predstavovali 3,8 % zo všetkých zmien pozorovaných u 47 býkov čiernostrakatých švédskych, ale predstavovali iba 1 % zo všetkých spermií.

105 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 1 Percento morfologicky zmenených spermií u jednotlivých druhov zvierat

Po čet spermií Druh morfologicky Percento zmien hodnotených zmenených Býk 20 000 2 196 10,98 Baran 10 000 1 056 10,56 Žrebec 7 000 783 11,19

Tab. 2 Výskyt jednotlivých malformácií spermií v %

AZ HBB KĽ T KB ZB RC MH VH I Spolu Priemer 0,40 3,35 1,82 1,98 0,61 0,61 0,47 0,54 0,04 1,18 10,98 Sd 0,24 2,21 1,54 1,08 0,84 0,38 0,40 0,37 0,06 0,84 6,11 Vc 59,69 66,03 84,63 54,55 137,73 61,75 84,87 68,24 145,77 71,35 55,64 Minimum 0,00 0,50 0,40 0,60 0,00 0,00 0,00 0,20 0,00 0,30 4,50 BÝCI Maximum 1,00 9,90 7,10 5,20 3,60 1,50 1,50 1,70 0,20 3,80 34,40 Medián 0,40 2,80 1,40 1,85 0,30 0,55 0,45 0,40 0,00 0,90 10,10 Priemer 0,21 4,77 2,45 1,66 0,10 0,64 0,18 0,15 0,07 0,33 10,56 Sd 0,22 2,68 2,05 1,06 0,12 0,40 0,18 0,10 0,11 0,17 4,26 Vc 105,30 56,11 83,61 63,82 118,32 62,97 98,76 68,31 157,14 50,80 40,31 Minimum 0,00 1,80 0,50 0,30 0,00 0,10 0,00 0,00 0,00 0,10 4,80 Maximum 0,60 11,20 7,90 3,40 0,30 1,30 0,50 0,30 0,30 0,60 19,20 BARANI Medián 0,10 4,35 1,75 1,25 0,05 0,55 0,15 0,15 0,00 0,35 9,90 Priemer 0,01 2,80 4,59 0,49 1,21 0,90 0,50 0,24 0,17 0,27 11,19 Sd 0,03 2,23 1,92 0,48 0,89 0,70 0,40 0,18 0,17 0,20 5,09 Vc 244,95 79,47 41,79 98,69 73,45 77,89 80,71 75,79 97,18 72,93 45,52 Minimum 0,00 0,10 2,00 0,10 0,30 0,00 0,10 0,00 0,00 0,00 5,00 Maximum 0,10 7,00 6,80 1,60 3,10 2,10 1,30 0,40 0,50 0,60 18,30 ŽREBCI Medián 0,00 2,00 4,10 0,30 0,80 0,60 0,40 0,40 0,10 0,20 8,60 Legenda: AZ – akrozomálne zmeny na hlavi čke, HBB – hlavi čka bez bi číka, K Ľ – k ľučkovité sto čenie bi číka, T – torzo bi číka, KB – zvinutie bi číka, ZB – zlomený bi čík, RC – retencia cytoplazmatickej kvapky, MH – malá hlavi čka, VH – ve ľká hlavi čka, I – iné morfologicky zmenené spermie, Sd – smerodajná odchýlka, Vc – varia čný koeficient.

Petac a Kosec (1989) uvádzajú, že z 9,8 % všetkých abnormálnych spermií malformácie hlavi čky predstavovali 4 %. Naj častejšie zmeny boli pozorované na hlavi čke 1,4 %, kr čku 3,1 %, stredovej časti 4,2 % a koncovej časti bi číka 3,0 %. Salah et al. (1992) uvádzajú, že naj častejšie zmeny sa vyskytli na bi číkoch a to zvinuté a nalomené bi číky. U kancov Wekerle (1987) zistil naj častejšiu abnormalitu spermií na proximálnej a distálnej

106 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

časti bi číka, pri čom výskyt týchto zmien sa pohyboval od 10 do 30 %. Kraj ňák (1983) pri pozorovaní kancov zistil percentuálny výskyt abnormálnych spermií 18,3; 13,5; 15,55 a spermií s excentricky nasadeným bi číkom 34,51; 22,4; 32,25. Massanyi et al. (1992) zistili u býkov priemerné percento výskytu morfologicky abnormálnych spermií 7,21. Medzi hlavné zmeny patrili dezintegrácie hlavi čky 31,02 %, k ľučkovité sto čenie bi číka 12,39 % a torzo 7,39 % z celkového po čtu zmien. Luká č et al. (2003) analyzovali výskyt patologických foriem spermií kancov. Autori uvádzajú, že z celkového po čtu patologicky zmenených spermií bolo v sledovaných ejakulátoch najviac hlavi čiek bez bi číka (39,21 %), k ľučkovitého sto čenia bi číka (27,86 %) a torza bi číka (10,85%).

Graf 1, 2, 3 Zastúpenie naj častejších morfologicky zmenených spermií z celkového po čtu hodnotených spermií u býkov (1), baranov (2) a žrebcov (3) 1 2 3

Legenda: VP – všetky patologické spermie; HBB – hlavi čka bez bi číka; T – torzo bi číka; KĽ – kľučkovité sto čenie bi číka; I – iné patologické zmeny; ZB – zlomený bi čík; KB – zvinutie (klbko) bi číka; MH – malá hlavi čka; RC – retencia cytoplazmatickej kvapky; AZ – akrozomálne zmeny; VH – ve ľká hlavi čka.

Massányi et al. (2004) pozorovali výskyt patologických spermií v insemina čných dávkach býkov v spojitosti so zastúpením Cd, Cu, Pb a Zn v týchto vzorkách. Pozorovali 9,83 % patologicky zmenených spermií. Z celkového po čtu patologických spermií zistili, že 29,79 % tvoria hlavi čky bez bi číka, 28,97 % torzo bi číka, 17,69 % k ľučkovité sto čenia bi číka, 5,33 % malé hlavi čky, 4,48 % zvinutia bi číka, 3,98 % retencia cytoplazmatickej kvapky, 3,71 % ve ľká hlavička, 2,12 % akrozomálne zmeny, 2,03 % zlomené bi číky a 1,90 % tvorili iné formy patologických spermií.

Záver Z dosiahnutých výsledkov vyplýva, že percentuálny výskyt patologických spermií sa pohyboval v priemere 10,98 % u býkov, 10,56 % u baranov a 11,19 % u žrebcov. Najvyššie

107 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 percento teda bolo u žrebcov a najnižšie u býkov. Za fyziologický výskyt možno považova ť množstvo zmien do 20 %. Morfologické zmeny vyvolávajú poruchy plodnosti vtedy, ke ď sa vyskytujú vo ve ľkom množstve trvale pri tom istom plemenníkovi. Podľa našich výsledkov zistených možno zaradi ť sledovaných býkov, baranov a žrebcov medzi kvalitných.

Použitá literatúra Belokar, P.M. et al. 1990. Studies on seminal and mensurational characteristics of spermatozoa and their interrelationships with freezability and fertility in crossbred bulls. J. PVK-Research , 1990, 2, 14, 165-173. Courtens, J.L. et al. Abnormal spermiogenesis in bulls treated with ethylene dibromine. An ultrastructural and ultrachemical study. J. Ultrastr. Res ., 1980, 71, 103-115. Goulda, K.G. et al. Mammalian spermatozoon. In : Hafez, E.S.E. Scanning electron microscopis atlas of mammalian reproduction, Stuttgart, Georg Thieme, 1975. Gam čík, P., Kozumlík, J. et al. Andrológia a inseminácia hospodárskych zvierat, Bratislava, Príroda, 1984. Kraj ňák, P. Morfologické zmeny spermií kancov a ich vplyv na plodnos ť ošípaných. Kandidátska dizerta čná práca. VŠP Nitra, 1983. Lin, Y.H., Wang, Y.Y., Chen H.I. et al. 2012. SEPTIN12 Genetic Variants Confer Susceptibility to Teratozoospermia. PLoS One. 2012, 7, 3, 34011. Luká č, N., Massányi, P., Trandžík, J. et al. 2003. Vybrané stopové rizikové prvky v ejakulátoch kancov. Rizikové faktory potravového re ťazca III, Nitra, SPU Nitra, 2003. Massányi, L. Morfogenéza flexie bi číka bovnnej spermie v oblasti cytoplazmatickej kvapy. Živo číšna výroba , 1988, 33, 417-426. Massányi, L. et al. Rizikové faktory prostredia pôsobiace na spermatogenézu - Kadmium. Po ľnohospodárstvo, 1991, 9-10, 830-848. Massányi, P., Maretta, M., Trandžík, J. et al. 2004. Kontaminácia insemina čných dávok býkov kadmiom, me ďou, olovom a zinkom a jej vz ťah ku kvalite spermií. Rizikové faktory potravového re ťazca IV, Nitra, SPU Nitra, 2004. Petac, D., Kosec, M. Some morphological charakcers of bull spermatozoa and their effect on fertility. Veterinárstvo , 1989, 1, 65-72. Salah, M.S. et al. 1992. Efect of water sprinkling during the hot-dry summer season on semen quality of Holstein bulls in Saudi Arabia. Animal Reprod ., 1992, 1, 59-63. Sekoni, V.O., Gustafsson, B.K. Seasonal variations in the incidence of sperm morphological abnormalities indairy bulls regulary used for artifical insemination. British Veter. J ., 1987, 4, 312-317. Soderguist, L. et al. Sperm morphology and fertility in Al bulls. J. Veter. Medic ., 1991, 7, 534-543. Terawaki, Y. et al. Repeatability of morphologically abnormal spermatozoa with cytoplasmic droplets in Holstein bulls in Hokkaido. Anim. Sci. & Technol ., 1991, 11, 1069-1073. Weiss, P., Brichcín, S., Čepická, B. et al. Sexuologie, Praha, Grada Publishing a.s. 2010, 142.

108 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE EFFECT OF DIFFERENT PREPERATIONS FOR THE QUALITY PARAMETERS OF CLOVER SILAGES

Kubát, V., 1, 2 Petrášková, E., 1 Jan čík, F., 2 Čermák, B., 1 Hnisová, J., 1 Homolka, P., 2 Lád F. 1

1 Department of Genetics, Animal Breeding and Nutrition, Faculty of Agriculture, University of South Bohemia, Studentská 13, 370 05 České Bud ějovice, Czech Republic,

2) Department of Nutrition and Feeding of Farm Animals, Institute of Animal Science, Přátelství 815, 104 00 Praha Uh řín ěves, Czech Republic

Abstract The set of samples of red clover silages from the second cut was divided into seven groups; each of them had 4 samples. First group of the samples was untreated (K); no preservations were used on these samples. Into the second group of the samples were included the silages treated with BIOSTABIL (BIOS) preparations. The dosage of BIOPOLYM was recommended 0.02 l BIOPOLYM + 2 l water. m -3 (1 : 100). The third group contained the silage samples treated with combination of BIOSTABIL and BIOPOLYM 1 : 100 (BIOS + B) preparations. The fourth group contained the silage samples treated with BIOPOLYM 1 : 10 (B 10), fifth group BIOPOLYM 1 : 100 (B 100), sixth group BIOPOLYM 1 : 200 (B 200) and seventh BIOPOLYM 1 : 500 (B 500). In the second cut were achieved the best results in the group BIOS. Very high statistical significance (P < 0.001) was found for pH in group BIOS compared with B 10, B 100, B 200 and B 500. The lowest value of pH showed of group BIOS (4.26).

Key words – silage, red clover, seaweed, Ascophyllum nodosum , rumen

Úvod Silážování je v sou časné dob ě nejužívan ější metodou konzervace jetelovin. Tímto zp ůsobem se konzervuje více než 75 % objemných krmiv. D ůvodem je, že tento proces konzervace je v porovnání se sušením rychlejší, což je v dob ě nejistoty po časí velmi d ůležitý faktor. V dnešní dob ě krmných dávek založených na bázi sm ěsných krmných dávek (TMR) dostává tento zp ůsob konzervace p řednost p řed zeleným krmením. D ůvodem je stálá kvalita siláže v čase. Konzervovaná objemná krmiva, která tvo ří hlavní podíl sušiny krmné dávky přežvýkavc ů, rozhodují výraznou m ěrou o výši užitkovosti.

109 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tyto skute čnosti se mj. promítly do sou časného náhledu na hodnocení kvality silážovaných krmiv. Dnes už krmiva neposuzujeme pouze podle obsahu energie a živin, ale zam ěř ujeme se také na kvalitu fermenta čního procesu. Cílem práce je hodnocení kvalitativních ukazatel ů jetelových siláží ze 2. se če a vyhodnocení ú čink ů p řípravkem BIOPOLYM na kvalitu silážního procesu. Pozornost je věnována hodnocení fermenta čního procesu na základ ě vybraných ukazatel ů (sušina, pH, kyselina mlé čná, kyselina octová, kyselina propionová, kyselina máselná a NH 3).

Materiál a metodika Sklize ň druhé se če jetele červeného ( Trifolium pratense ) se uskute čnila 7. 9. 2010. Na podzim a v zim ě roku 2010 bylo provedeno vyhodnocení faktor ů, které ovliv ňují kvalitativní ukazatele jetelových siláží. Ve druhé se či byla pr ůměrná skliz ňová sušina 45 %. Délka řezanky byla mezi 40 – 80 mm. Vzorky byly odebrány v provozních podmínkách, ošet řeny přípravkem BIOPOLYM – extrakt hn ědé mo řské řasy Ascophyllum nodosum a/nebo přípravkem BIOSTABIL – konzerva ční p řípravek na bázi homofermentativních a heterofermentativních bakterií mlé čného kvašení. Následn ě byly vzorky zasilážovány do sklen ěných lahvích o objemu cca 3,7 l. Výchozí dávkování bylo doporu čeno 0,02 l BIOPOLYMu + 2 l vody . m -3 (1 : 100). Ve 20., 22., 24. a 26. týdnu byly tyto vzorky vyhodnoceny. Analýzy vzork ů byly provedeny v laborato ři katedry genetiky, šlecht ění a výživy zví řat v Českých Bud ějovicích. Vzorky krmiv byly odebrány dle vyhlášky Mze č. 415/2009 Sb., kterou se provádí zákon o krmivech. Analýza siláží byla provedena dle metodik ÚKZÚZ ,,Metody laboratorního zkoušení krmiv“. Kyseliny v siláži byly stanoveny pomocí izotachoforetického analyzátoru. Smyslové posouzení siláží bylo hodnoceno Normou 2004, kterou doporu čuje AgroKonzulta Žamberk a EKO-LAB Žamberk (Doležal et al., 2006; Pozdíšek et al., 2008). Kvalitativní ukazatele silážovaných krmiv byly sledovány na 28 vzorcích jetelových siláží. Tyto vzorky byly rozd ěleny do 7 skupin po 4 vzorcích. Rozd ělení vzork ů bylo následující: • skupina (kontrolní) neošet řená – K • skupina ošet řená BIOSTABILem – BIOS • skupina ošet řená BIOSTABILem a BIOPOLYMem v koncentraci 1 : 10 – BIOS + B • skupina ošet řená BIOPOLYMem v koncentraci 1 : 10 – B 10 • skupina ošet řená BIOPOLYMem v koncentraci 1 : 100 – B 100 • skupina ošet řená BIOPOLYMem v koncentraci 1 : 200 – B 200

110 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

• skupina ošet řená BIOPOLYMem v koncentraci 1 : 500 – B 500 U každé skupiny byly sledovány následující ukazatele: obsah sušiny, pH, obsah kyseliny mlé čné, kyseliny octové, kyseliny propionové, kyseliny máselné a NH 3. Skupiny byly porovnány mezi sebou. Byl použit Levenův test homogenity rozptyl ů. U n ěkterých ukazatel ů byla provedena analýza rozptylu a nakonec test homogenních skupin pomocí Tukey HSD test. Výsledky práce byly zpracovány pomocí po číta čového programu STATISTICA 9.1.

Výsledky a diskuze Při smyslovém posouzení bylo ve 2. se či ve všech p řípadech silážím zapo čítáno 6 b za pach, 3 b za barvu a 3 b za strukturu a konzistenci. U skupiny siláží BIOS byla ve dvou případech makroskopicky zjišt ěna p řítomnost plísn ě (cca 2 – 5 cm na povrchu). Plíse ň se dále vyskytovala dvakrát ve skupin ě BIOS + B (cca 6 – 8 cm), jednou ve skupin ě B 100 (cca 3 cm) a jednou ve skupin ě B 500 (cca 5 cm). Tato vrstva byla odstran ěna. Posouzení a analýzy byly provedeny ze zbylé kvalitní části.

U hodnot pH byl spln ěn p ředpoklad homogenity rozptyl ů (F (6, 21) = 16,5, p = 0,000001). Hodnoty vykazují normální rozd ělení. Výsledky jsou znázorn ěny na obr. 1. V provozním pokusu se silážovaným jetelem uvád ějí Dewhurst a kol. (2003) hodnotu pH 4,24 p ři sušin ě 37,6 %. S hodnotou 4,26 je možno uvést skupinu siláží BIOS p ři obsahu sušiny 46,26 %. V ostatních p řípadech byly námi zjišt ěné hodnoty vyšší. Siláže skupiny B 100 (pH 4,46) tak p ředstavovaly více než 5 % nár ůst oproti uvedenému autorovi. V pokuse s plastovými sily Narasimhali a Sanderson (1993) prezentovali hodnotu pH dokonce 4,8.

111 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Obrázek 1 Porovnání pH podle jednotlivých skupin ve 2. se či (Comparison of pH values in the different groups in the 2nd cut (F (6, 21) = 16.5, p = 0.000001)

Zárove ň byly prokázány statisticky velmi vysoce významné rozdíly (P < 0,001) u siláží skupiny BIOS proti skupinám B 10, B 100, B 200 a B 500. Nižším pH se vyzna čovala skupina BIOS. Na stejné hladin ě významnosti (P < 0,001) vykazovala nižší pH i skupina siláží BIOS + B v porovnání se skupinou B 500. Mezi hodnotami kyseliny mlé čné byl spln ěn p ředpoklad homogenity rozptyl ů. Mezi skupinami siláží ovšem nebylo zjišt ěno statisticky významných rozdíl ů. Pro porovnání hodnot bylo užito neparametrické statistické hodnocení. Nejvyšší hodnoty vykazovala skupina BIOS (30,27 g . kg -1) a dále BIOS + B (29,90 g . kg -1), K (29,38 g . kg -1), B 200 (27,69 g . kg -1), B 500 (23,35 g . kg -1) a B 10 (23,13 g . kg -1). Nejnižšími hodnotami se prezentovaly siláže s ozna čením B 100 (21,59 g . kg -1). Pr ůměrná hodnota kyseliny mlé čné byla v experimentu Narasimhali a Sanderson (1993) 24 g . kg -1. Námi nam ěř ené hodnoty tak byly vyšší o více než 26 % (BIOS), na druhou stranu i nižší o 11 % (B 100). Dewhurst a kol. (2003) uvád ějí koncentraci kyseliny mlé čné 19,68 g . kg -1. Porovnáním s našimi pr ůměrnými hodnotami

112 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 zjistíme, že všechny skupiny vykazovaly vyšší hodnoty. Obrázek 2 dokumentuje vývoj sušiny a kyseliny mlé čné ve 2. se či. Obsah kyseliny mlé čné roste s obsahem sušiny.

Obrázek 2 Vývoj obsahu sušiny a kyseliny mlé čné ve 2. se či (Development of dry matter and lactic acid in the 2nd cut)

U hodnot kyseliny octové byl spln ěn p ředpoklad homogenity variancí. P ři porovnání jednotlivých skupin však nebylo zjišt ěno statisticky významných rozdíl ů. Pro stanovení po řadí bylo využito neparametrické statistiké hodnocení. Po řadí jednotlivých skupin siláží podle klesající koncentrace bylo následující: K (12,31 g . kg -1), B 200 (11,96 g . kg -1), BIOS (11,24 g . kg -1), BIOS + B (10,91 g . kg -1), B 10 (9,78 g . kg -1), B 500 (9,06 g . kg -1) a B 100 (8,75 g . kg -1). Narasimhali a Sanderson (1993) uvád ějí pr ůměrnou hodnotu kyseliny octové 25 g . kg -1. Skupina siláží K tak tvo ří tém ěř 50 % uvedené hodnoty. Hodnoty kyseliny propionové a máselné nevykazují normální rozd ělení. Výskyt kyseliny propinové byl zaznamenán pouze jednou v siláži s ozna čením B 10 (1,13 g . kg -1). Tentýž vzorek obsahoval 1,44 g . kg -1 kyseliny máselné. Vzorek nejevil žádné známky makroskopického poškození. V ostatních p řípadech nebyl výskyt t ěchto kyselin zaznamenán. Dewhurst a kol. (2003) uvád ějí ve svém experimentu pr ůměrný obsah kyseliny máselné 1,36 g . kg -1.

Mezi hodnotami NH 3 byl spln ěn p ředpoklad homogenity rozptyl ů. Mezi skupinami siláží nebylo zjišt ěno statisticky významných rozdíl ů, proto bylo k porovnání hodnot užito

113 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 neparametrické statistiky. Nejnižší hodnoty vykazovala skupina BIOS + B (v pr ůměru 0,046 %), následn ě B 500 (0,051 %), BIOS (0,055 %), B 10 (0,055 %), B 100 (0,056 %) a K (0,057 %). Nejvyšší pr ůměrné hodnoty byly zaznamenány u skupiny siláží B 200 a to 0,060 %. Všechny námi zjišt ěné hodnoty amoniaku se nachází v bezpe čné hladin ě, která je podle Doležala a kol. (2006) mezi 0,03 a 0,07 %.

Záv ěr Ve 2. se či bylo nejlepších výsledk ů dosaženo ve skupin ě BIOS. S ohledem na výskyt kyseliny máselné ve skupin ě B 10 je možné tuto skupinu ozna čit jako nejmén ě p říznivou.

Pod ěkování Přísp ěvek vznikl za finan ční podpory projektu NAZV č. QH 92252 a výzkumného zám ěru č. MZe 0002701404.

Použitá literatura Dewhurst, R.J., Fischer, W.J., Tweed, J.K.S., Wilkins, R.J. Comparison of grass and legume silages for milk production. 1. Production responses with different levels of concentrate. J. Dairy Sci , 2003, 86, 2598-2611. Doležal, P., Doležal, J., Mikyska, F., Mrkvicová, E., Zeman, L. Konzervace, skladování a úprava objemných krmiv (P řednášky). MZLU, Brno, 2006, 247 s. Narasimhalu, P., Anderson, J.B. Composition and utilization in sheep of unwilted and wilted silages prepared from seeding year red clover ( Triforium pratense L.) cut at two maturity stages. Canadian Journal of Plant Science , 1993, 87-91. Pozdíšek, J., Mikyska, F., Lou čka, R., Bjelka M. Metodická p říru čka pro chovatele k výrob ě konzervovaných krmiv (siláží) z víceletých pícnin a trvalých travních porost ů. Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o., Rapotín, 2008, 38 s. StatSoft. STATISTICA (data analysis software system). 2010, Version 9.1. www.statsoft.com ÚKZÚZ. Metody laboratorního zkoušení krmiv. 2009, [online]. [cit. 10. 1. 2011]. Dostupný na WWW: . Vyhláška č. 415/2009 Sb. o stanovení požadavk ů na odb ěr vzork ů a zp ůsobu zve řejn ění metod laboratorního zkoušení produkt ů ke krmení. [online]. [cit. 10. 1. 2011]. Dostupný na WWW: .

114 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

EFFECT OF RABBIT SPERMIOPHAGES ON SEMEN PARAMETERS

Kuželová, L.1,2 , Makarevich, A. V. 2 , Chrenek, P.1,2

1Slovak University of Agriculture, Faculty of Biotechnology and Food Science, Nitra, Slovak Republic, 2Institute of Farm Animal Genetics and Reproduction, Animal Production Research Centre Nitra, Lužianky, Slovak Republic

Abstract The aim of this study was analysis of spermiophages in rabbit ejaculate and effect of spermiophages on selected rabbit reproductive parameters. Activated macrophages, engaging in sperm phagocytosis (spermiophages), might represent a marker of innate immunosystem activation. Semen samples from rabbit males were collected using an artificial vagina and spermiophages were analysed with fluorescent dye Alexa-AcLDL (L-23380, Molecular Probes product). Semen samples were evaluated using the CASA system for concentration and motility. Our results show that the percentage concentration, total motility and progressive motility of the spermatozoa was lower in group with less than 20% contain of spermiophages within the sperm samples than in group with 40% contain of spermiophages within the sperm samples (0.886 x 10 9/ml vs. 2.023 x 10 9/ml of concentration, 74.78% vs. 86.64% of motile spermatozoa and 63.02% vs. 79.02% of progressive motile spermatozoa).

Key words : rabbit, spermatozoa, spermiophages, concentration, motility

Introduction Phagocytosis, the process by which cells engulf foreign particles, occurs in eukaryotes ranging from unicellular organisms, which use it for nutrition, to mammals, where it plays a key role in innate immunity (Gagnon et al., 2002). Leukocytes are present throughout the male reproductive tract, are found in most ejaculates, and are thought to play an important role in immunesurveillance and phagocytic clearance of abnormal sperm (Gallegos-Avila et al., 2010). Polymorphonuclear (PMN) granulocytes account for 50% to 60% of all white blood cells (WBC) in semen, macrophages (MF) account for 20% to 30% and T-lymphocytes for 5% (Smith et al., 1989; Wolff, 1995). Macrophages belong to the mononuclear phagocyte system and they represent a mechanism to remove senescent, malformed or degenerative sperm. They appear to be involved in immunologic surveillance, immunoregulation, and tissue remodeling. Concerning human testis, early morphological studies described the presence of macrophages in the interstitium and occasionally in the lamina propria of

115 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 seminiferous tubules (Hermo et al., 1978; Pollanen et al., 1987; Frungieri et al., 2002). Phagocytosis of sperm by epithelial cells has been descripted previously in ductal tubules testis of various species animals (Dym 1974; Goyal 1982; Holstein 1978; Hoffer and Hamilton 1974; Hoffer et al., 1975; Riva et al., 1981). Spermiophagy by macrophage has been described either in the male extragonadal ductal system (Holstein, 1978), in prostate and in boar ejaculate (Hrudka and Post, 1983) and male ejaculat (Riedel, 1980). Little informations are about occurrence spermiophages in rabbit ejaculate and effect of spermiophages on female reproduction. Aim of study was analysis of spermiophagy in rabbit ejaculate with fluorescent staining and evaluation of spermatozoa motility and concentration using CASA method.

Materials and methods Semen collection and analysis Semen samples were obtained from sexually mature (4 – 5 months old) and clinically healthy rabbit males of M91 and P91 lines from breeding in Institute of Small Farm Animals APRC (Animal Production Research Centre Nitra) and they were collected using an artificial vagina. Each semen collection was analyzed using a CASA (Computer Assisted Semen Analysis) system – SpermVision (Minitüb, Tiefenbach, Germany) combined with Olympus BX 51 microscope (Olympus, Japan) and following parameters were evaluated: concentration (x 10 9 cells per ml); percentage of motile spermatozoa (motility >5 m/s) and percentage of progressively motile spermatozoa (motility >20 m/s).

Analysis of spermiophagy Ejaculates of sperms were washed in saline solution. There was added 1% FCS and samples were centrifuged at 1000 g for 3 min from the rest of the seminal fluid. Pellets were resuspended in solution Alexa-AcLDL (L-23380, Molecular Probes product), 2 µg.ml -1 saline solution of FCS and incubated in the incubator for 2 – 4 hours. Cells were subsequently centrifuged at 1000 g for 3 min and resuspended in cold saline solution. The suspension was afterwards placed on a glass microscope slide, mixed in Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) antifade medium containing DAPI fluorescent dye and the drop was covered with cover slid. Samples were evaluated in a Leica fluorescent microscope (Leica Microsystem, Germany). If the LDL (Low-Density Lipoprotein Complexes) has been acetylated, the LDL complex no longer binds to the LDL receptor, but rather is taken up by spermiophages

116 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

(macrophages) that possess “scavenger” receptors specific for modified LDL. The superior fluorescence output by Alexa Fluor AcLDL (L-23380) provides easier identification of spermiophages and endothelial cells in mixed cell population.

Statistical analysis Obtained data were statistically analyzed using Excel software and χ2 –test.

Results The semen samples were divided into two groups on the basis of contains spermiophages, which we found with fluorescent analysis. Ejaculates with the occurrence of spermiophages (SP) less 20% of all cells belong to the group R1 and ejaculates with the occurrence of spermiophages about 40% belong to the group R2. Computer assisted semen analysis showed that the average spermatozoa concentration in the group R1 was 0.886 x 10 9 per ml and in the group R2 was 2.023 x 10 9 per ml. Figure 1 shows the basic CASA parameters of rabbit semen collected from rabbit males. The total motility and progressive motility of spermatozoa was lower in group with lower occurrence spermiophages (74.78% vs. 86.64% of motile spermatozoa and 63.02% vs. 79.02% of progressive motile spermatozoa).

Figure 1: Effect of spermiophages on female reproductive traits in vitro

90

80

70

60

50

40 R1 (<20% SP) 30 R2 ( ≈40% SP)

20

10 R2 ( ≈40% SP) 0 R1 (<20% SP) % of motile spermatozoa % of progressive motile spermatozoa Discussion Present work evaluates effect of rabbit spermiophages on selected sperm parameters. The possibility that macrophages may play a positive role in the control of semen quality was suggested by the interesting studies of Tomlinson et al. (1992). Specifically, the authors postulated that phagocytes might shape the quality of the human ejaculate by phagocytosing morphologically abnormal spermatozoa. These authors identified three types of seminal phagocytic cells: small PMN leukocytes, monocytes of similar size, and much larger

117 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 macrophages capable of engulfing multiple sperm heads. These authors suggested that the quality of sperm morphology is directly correlated with the size of the seminal leukocyte population (Gallegos-Avila et al., 2010). However, other authors reported a significant positive correlation between leukocyte counts in semen and sperm tail defects, acrosome damage and high sperm deformity index. The presence of spermiophages was associated with a lower total sperm count and sperm concentration, a lower forward motility and a high percentage of disrupted sperm compared to ejaculates without spermiophages (Pelliccione et al., 2008). Our results show that the concentration, percentage total motility and progressive motility of spermatozoa were increased in group with more occurrence spermiophages.

Conclusion Our data and those of others suggest that spermiophages might have a biological impact on some semen parameters. Clearly, more research is needed to evaluation effect of rabbit spermiophages on female reproduction.

Acknowledgement This work was supported from the grants of Slovak Research and Development Agency: LPP-0119-09.

References Dym, M. The fine structure of monkey Sertoli cells in the transitional zone at the junction of the seminiferous tubules with the tubuli recti. Am. J. Anat., 1974, 140, 1-26. Frungieri, M.B., Calandra, R.S., Lustig, L., Meineke, V., K ıhn, F.M., Vogt, H., Mayerhofer, A. Number, distribution pattern, and identification of macrophages in the testes of infertile men. Fertil . Steril., 2002, 78, 298-306. Gagnon, E., Duclos, S., Rondeau, Ch., Chevet, E., Cameron, P.H., Steele-Mortimer, O. Paiement, J., Bergeron, J.J.M., Desjardins, M. Endoplasmic Reticulum-Mediated Phagocytosis Is a Mechanism of Entry into Macrophages. Cell , 2002, 110, 119-131. Gallegos-Avila, G., Ancer-Rodríguez, J., Ortega-Martínez, M., Jaramillo-Rangel, G. Infection and phagocytosis: analysis in semen with transmission electron microscopy. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education , 2010, 3, 85-92. Goyal, H.O. Light microscopic and ultrastructural evidence of epithelial phagocytosis of sperm in the rete testis and ductuli efferentes in the bull. Am. J. Vet. Res ., 1982, 43, 785- 790. Hermo, L., Lalli, M. Monocytes and mast cells in the limiting membrane of human seminiferous tubules. Biol. Reprod., 1978, 19, 92–100. Hoffer, A.P., HAMILTON, D.W. Phagocytosis of sperm by the epithelial cells in ductuli efferentes of experimental rats. Anat. Rec. , 1974, 178, 376- 377. Hoffer, A.P., Hamilton, D.W., Fawcett, D.W. Phagocytosis of spermatozoa by the epithelial cells of the ductuli efferentes after epididymal obstruction in the rat. J. Reprod. Fertil ., 1975, 44, 1-9.

118 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Holstein, A.F. Spermiophagy in the seminiferous tubules and excurrent ducts of the testis in rhesus monkey and man. Andrologia , 1987, 10, 331-352. Hrudka, F., Post K. Leukophages in canine semen. Andrologia , 1983, 15, 26-33. Pelliccione, F., D’Angeli, A., Cordeschi, G., Mihalca, R., Bocchio, M., Ciociola, F., Mancini, M., Necozione, S., Francavilla, F., Francavilla, S. Seminal macrophages in ejaculates from men with couple Infertility. Int. J. Androl. , 2008, 32, 623–628. Pollanen, P., Niemi, M. Immunohistochemical identification of macrophages, lymphoid cells and HLA antigens in the human testis. Int. J. Androl. , 1987, 10, 37–42. Riedel, H.H. Uber den Nachweis einer speziellen Art von Spermophatogen in menschlichen Ejakulat. Andrologia , 1980, 12, 232-244. Riva, A.,Cossu, M., Esao, E., Testa-Riva, F. Spermiophagy by epithelial cells of the seminal vesicle and of the ampulla dustus deferentis in man: A scanning and transmission EM study. New York, Raven, 1981. Smith, D.C., Barratt, C.L., Williams, M.A. The characterisation of non-sperm cells in the ejaculates of fertile men using transmission electron microscopy. Andrologia , 1989, 2, 319–333. Tomlinson, M.J., White, A., Barratt, C.L.R., Bolton, A.E., Cooke, I.D. The removal of morphologically abnormal sperm forms by phagocytes: a positive role for seminal leukocytes? Hum . Reprod., 1992, 7, 517-522. Wolff, H. The biological significance of white blood cells in semen. Fertil . Steril ., 1995, 63, 1143–1157.

119 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

EFFECT OF NONYLPHENOL AS ENDOCRINE DISRUPTOR ON THE MOTILITY OF BOVINE SPERMATOZOA IN VITRO

Luká čová, J., Kňažická, Z., Tvrdá, E., Luká č, N.

Department of Animal Physiology, Faculty of Biotechnology and Food Sciences, Slovak University of Agriculture in Nitra

Abstract Nonylphenol (NP) is a toxic environment contaminant that causes endocrine disruption. NP is widely used surfactants in domestic and industrial products. NP can affect male reproductive system and result a decline of spermatozoa count and motility. The target of this study was to determine the effect of NP as an endocrine disruptor on the motility of bovine spermatozoa. Specifically, we examined the dose- and time-dependent effect of nonylphenol (1, 10, 100 and 200 µg NP/ml) dissolved either in 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO) or 0.1% ethanol (ETOH) on the spermatozoa motility during several time periods (0 h, 2 h, 4 h and 6 h). The motility of spermatozoa was determined the Sperm Vision TM CASA (Computer Assisted Semen Analyzer) system. The results showed a decreased spermatozoa motility in all experimental groups with the addition of NP dissolved in 0.1% DMSO and 0.1% ETOH. Significant differences ( P<0.001 and P<0.05) between the control group and all experimental groups were recorded. The lowest spermatozoa motility was found at doses > 100 µg NP/ml in comparison with the control group. The obtained data indicate that the negative effect of NP on spermatozoa motility must be seriously considered in the case of exposure to NP in animals and humans.

Key words: nonylphenol, motility, spermatozoa, CASA, in vitro

Introduction The modern human life is dependent on a variety of man-made chemicals. Some of the chemicals and their degradation products in the environment can be hazardous to animal as well as human health (Miyaura and Iwata, 2002). Currently, risk to human health is represented by different consumer products of a wide and heterogenous group of compounds, namely endocrine disruptors chemicals (EDCs) that can act at several sites, mimicking the occurrence of natural hormones, blocking their production or by inhibiting/stimulating the endocrine system (White at al., 1994).

120 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

A well known class of environmental endocrine disruptors is the group of compounds known as alkylphenolpolyethoxylates (APEs), which are used in variety of products, including detergents, pesticides, cosmetics and plastic ware (White et al., 1994). Nonylphenol (NP) is one of the most abundant alkylphenolpolyethoxylates (APEs) derivates and is able to act as endocrine disruptor and cause adverse reproductive effects in mammals (Hughes et al., 2000). NP profoundly impairs testicular function as evidenced by reduced testis size, low circulating testosterone, disturbed testicular structure and suppressed spermatogenesis (Nagao et al., 2001; Tan et al., 2003; Cardinali et al., 2004). Gong et al. (2009) reported that NP induces apoptosis in rat testicular cells, particularly in Sertoli cells by inhibiting the Ca 2+ pump in the endoplasmic reticulum. The target of this study was to analyze the effect of various concentrations of nonylphenol dissolved in either 0.1% ethanol (ETOH) or 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO) on the motility of bovine spermatozoa.

Materials and methods Semen samples and in vitro culture Bovine semen samples were obtained from 8 adult breeding bulls (Slovak Biological Services, Nitra, Slovak Republic). The samples had to accomplish the basic criteria given for the corresponding breed. The semen was obtained on a regular collection schedule using an artificial vagina. After collecting the samples were stored in the laboratory at room temperature (22-25°C). Each sample was diluted in physiological saline solution (PS) (sodium chloride 0.9% w/v, Bieffe Medital, Italia), using a dilution ratio of 1:40, depending on the original spermatozoa concentration. Spermatozoa were incubated with various concentrations of nonylphenol (4-n-NP; Fluka, Buchs, Switzerland) dissolved in 0.1% ethanol (ETOH, Sigma-Aldrich Co.) (group A – 1; B – 10; C – 100; D – 200 µg NP/ml) and in 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma- Aldrich Co.) (group A – 1; B – 10; C – 100; D – 200 µg NP/ml). Spermatozoa were cultivated in the laboratory at room temperature (22-25°C). The control (Ctrl) group (medium without NP) was compared to the experimental groups (exposed to different concentrations of NP).

Computer-assisted semen analysis (CASA) The motility analysis was carried out using a CASA (Computer Assisted Semen Analyzer) system – SpermVision TM program (MiniT őb, Tiefenbach, Germany) with the Olympus BX 51 microscope (Olympus, Japan) at cultivation Times 0 h, 2 h, 4 h and 6 h. Each

121 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 sample was placed into the Makler Counting Chamber (deph 10 µm, Sefi-Medical Instruments, Izrael) and the following parameters were evaluated: percentage of motile spermatozoa (motility > 5 µm/s; MOT) and percentage of progressive motile spermatozoa (motility > 20 µm/s; PROG). This study was performed in eight replicates at each concentration (n = 8). At least 1000 spermatozoa were analyzed in each sample (Slivkova et al., 2010; Lukac et al., 2011).

Statistical analysis Obtained data were statistically analyzed using PC program GraphPad Prism 3.02 (GraphPad Software Incorporated, San Diego, California, USA). Descriptive statistical characteristics (mean, minimum, maximum, standard deviation and coefficient of variation) were evaluated. One-way analysis of variance (ANOVA) and the Dunnett´s multiple comparison test were used for statistical evaluations. The level of significance was set at *** (P<0.001); ** (P<0.01) and * ( P<0.05).

Results Evaluation of bovine spermatozoa motility exposed to NP dissolved in 0.1% DMSO Evaluation of the percentage of spermatozoa motility showed slightly decreased values in all doses of NP dissolved in 0.1% DMSO compared to the control group during Time 0 h of in vitro cultivation (Table 1). In this time, the lowest spermatozoa motility was recorded in the groups C (P<0.001) and D ( P<0.001) using the highest doses of NP in comparison with the control group (95.58% and 92.69% versus 101.20%). After 2 h of cultivation the dose 1 µg NP/ml and 10 µg NP/ml caused a slightly increased spermatozoa motility in comparison with control at 0 h of in vitro cultivation (104.0% versus 100.20%; 101.5% versus 100.20%). Experimental administration of 100 µg NP/ml significantly decreased ( P<0.05) the motility parameter. The lowest spermatozoa motility was detected in group D ( P<0.001) with the highest dose of NP (81.82 ± 11.62%). After 4 h and 6 h of cultivation a decrease of motility was recorded in all experimental groups in comparison to the control group. An identical decrease of spermatozoa motility was detected also for the percentage of progressive motile spermatozoa in all time periods.

122 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab 1 Bovine spermatozoa motility (MOT; %) exposed to NP dissolved in 0.1% DMSO in various time periods.

Parameter Time Ctrl A B C D (h) µg NP/ml x 101.20 99.83 97.51 95.58 A 92.69 A minimum 90.56 90.56 83.35 80.07 74.43 maximum 0 105.70 106.80 105.30 105.90 104.50 S.D. 3.80 4.62 5.76 7.01 7.61 CV (%) 3.79 4.63 5.91 7.33 8.21 x 100.20 104.00 101.50 94.42 C 81.82 A minimum 87.27 92.95 88,.30 84.59 63.20 maximum 2 111.70 114.30 112.60 100.00 96.10 S.D. 7.09 6.01 7.47 4.15 11.62 CV (%) 7.08 5.78 7.37 4.39 14.22 x 97.60 97.21 94.83 88.68 A 74.77 A minimum 82.76 90.49 82.23 76.04 62.73 maximum 4 110.40 102.70 106.50 100.00 93.86 S.D. 9.67 3.90 6.83 7.66 10.38 CV (%) 9.91 4.01 7.20 8.64 13.88 x 94.77 86.27 C 82.64 A 70.58 A 61.73 A minimum 90.47 56.85 55.99 52.49 45.80 maximum 6 98.87 98.32 95.29 94.98 86.97 S.D. 2.33 10.36 12.58 14.59 14.68 CV (%) 2.46 12.01 15.22 20.68 23.78 Legend: x – mean, SD – standard deviation, CV (%) – coefficient of variation, AP<0.001 ; BP<0.01; CP<0.05.

Evaluation of bovine spermatozoa motility exposed to NP dissolved in 0.1% ETOH The initial spermatozoa motility showed slightly decreased values in all groups of NP dissolved in 0.1% ETOH in comparison to NP dissolved in 0.1% DMSO. The average values of spermatozoa motility in all experimental groups were lower in comparison to the control group during time 0 h of in vitro cultivation (Table 2). Similarly, the lowest spermatozoa motility was also observed in the groups C (P<0.001) and D ( P<0.001) with the highest doses of NP in comparison to the control group (95.38% and 91.55% versus 99.62%). High NP concentrations (100 µg/ml; 200 µg/ml) decreased the average motility values also after 2 h and significant differences ( P<0.001) were found between these groups and the control group (90.62% versus 97.71%; 81.06% versus 97.71%). After 4 h of in vitro cultivation the spermatozoa motility was significantly decreased in group B, C and D ( P<0.001). After 6 h of culture a decrease of motility in all experimental groups in comparison to the control group was found. A significant decrease of spermatozoa 123 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 motility ( P<0.001) was found in groups B, C and D. An identical decrease of spermatozoa motility was detected also for the percentage of progressive motile spermatozoa in all time periods.

Tab 2 Bovine spermatozoa motility (MOT; %) exposed to NP dissolved in 0.1% ETOH in various time periods.

Parameter Time Ctrl A B C D (h) µg NP/ml x 99.62 99.91 97.14 95.38 A 91.55 A minimum 93.46 89.98 61.66 80.96 89.07 maximum 0 105.90 104.40 106.00 102.00 98.95 S.D. 3.26 4.06 8.87 5.74 2.68 CV (%) 3.27 4.06 9.13 6.02 2.92 x 97.71 98.54 95.87 90.62 A 81.06 A minimum 83.99 87.42 79.49 60.42 70.42 maximum 2 109.40 108.50 103.70 99.26 89.21 S.D. 6.64 6.07 5.23 6.78 5.28 CV (%) 6.79 6.16 5.45 7.48 6.51 x 96.15 95.27 92.23 A 83.40 A 72.74 A minimum 89.28 86.17 80.15 65.37 61.22 maximum 4 109.60 110.00 101.50 96.90 80.46 S.D. 4.27 5.10 5.76 8.10 5.13 CV (%) 4.44 5.34 6.24 9.71 7.05 x 90.30 87.35 81.33 A 69.66 A 61.05 A minimum 81.54 74.00 58.66 56.12 47.27 maximum 6 98.37 99.48 94.91 86.56 80.72 S.D. 4.76 5.85 11.58 8.61 7.06 CV (%) 5.27 6.69 14.24 12.36 11.56 Legend: x – mean, SD – standard deviation, CV (%) – coefficient of variation, AP<0.001 ; BP<0.01; CP<0.05.

Discussion Nonylphenol (NP) is one of the most abundant alkylphenolpolyethoxylates (APE) derivates that can induce cell death in gonads and changes to other reproductive parameters (Cardinali et al., 2004). The data obtained from this study indicate that NP dissolved in ETOH has a higher inhibitory effect on spermatozoa motility than NP dissolved in DMSO. This indicates that a combination of NP and ETOH have a higher toxic effect than a combination of NP and DMSO. These findings are in accordance with the studies of Uguz et al. (2009).

124 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Gong and Han (2006) investigated the effect of NP (10, 20, 30 and 40 M) for 12 h and 24 h, they observed an increase of the oxidative stress in those doses of NP in rat Sertoli cells. Dakdoky and El-Helal (2007) found that a daily dose of 21.25 mg/kg of nonylphenol decreased significantly mouse spermatozoa motility for 35 days. Uguz et al. (2009) examined effect of NP (1, 10, 100, 250 and 500 µg/ml) on epididymal rat spermatozoa during different time periods (0 h, 1 h, 2 h, 3 h and 4 h) and recorded that exposure to a dose 250 µg NP/ml has detrimental effect on motility of rat spermatozoa. Our experiment indicates similar results at doses 200 µg NP/ml and a negative influence on spermatozoa motility.

Conclusion Recent researchers have hypothesized that environmental exposure to nonylphenol poses adverse effects on reproductive system of humans and wildlife species. The data obtained from this in vitro study describe the dose- and time-dependent effect of NP on the motility of bovine spermatozoa. Our results support the idea that higher doses of NP (>100 µg NP/ml) dissolved in 0.1% DMSO and in 0.1% ETOH negatively influence the spermatozoa motility.

Acknowledgments This work was supported by the Scientific Agency of the Slovak Republic VEGA No. 1/0532/11.

Refferences Cardinali M., Maradonna F., Olivotto I., Bortoluzzi G., Mosconi G., Polzonetti-Magni A.M., Carnevali O. Temporary impairment of reproduction in freshwater teleost exposed to nonylphenol. Reprod. Toxicol., 2004, 18, 597-604. El-Dakdoky, M.H. – Helal, M.A. Reproductive toxicity of male mice after exposure to nonyphenol. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 2007, 79, 188-191. Gong Y., Han X.D. Nonylphenol-induced oxidative stress and cytotoxicity in testicular Sertoli cells. Reprod. Toxicol., 2006, 22, 623-630. Gong, Y., Wu, J., Huang, Y., Shen, S., Han, X.D. Nonylphenol induces apoptosis in rat testicular Sertoli cells via endoplasmatic reticulum stress. Toxicol. Lett., 2009, 186, 84-95. Hughes P.J., McLellan H., Lowes D.A., Kahn S.Z., Bilmen J.G., Tovey S.C., Godfrey R.E., Michell R.H., Kirk C.J., Michelangeli F. Estrogenic alkylphenols induce cell death by inhibiting testis endoplasmic reticulum Ca(2+) pumps. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 277, 568-574. Lukac, N., Massanyi, P., Roychoudhury, S., Capcarova, M., Tvrda, E., Knazicka, Z., Kolesarova, A., Danko J. In vitro effects of radiofrequency electromagnetic waves on bovine spermatozoa motility. J. Eenviron.l Sci. Heal. A, Toxic/hazardous substances & environmental engineering, 2011, 46, 1417-1423.

125 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Miyaura, H., Iwata, M. Direct and indirect inhibition of Th1 development by progesterone and glucocorticoids. J. Immunol., 2002, 168, 1048-1094. Nagao, T., Wada, K., Marumo, H., Yoshimura, S., Ono, H. 2001. Reproductive effects of nonylphenol in rats after gavage administration: a two-generation study. Reprod. Toxicol., 2001, 15, 293-315. Slivkova, J., Massanyi, P., Pizzi, F., Trandzik, J,, Roychoudhury, S., Lukac, N., Dankova, M., Almasiova, V. In vitro toxicity of mercuric chloride on rabbit spermatozoa motility and cell membrane integrity. . Eenviron.l Sci. Heal. A, Toxic/hazardous substances & environmental engineering, 2010, 45, 767-774. Tan, B.L., Kassim, N.M., Mohd, M.A. Assessment of pubertal development in juvenile male rats after sub-acute exposure to bisphenol A and nonylphenol. Toxicol. Lett., 2003, 143, 261-270. Uguz, C., Varisli, O., Agca, C., Agca, Y. Effects of nonylphenol on motility and subcellular elements of epididymal rat sperm. Reprod. Toxicol., 2009, 28, 542-549. White, R., Jobling, S., Hoare, S.A., Sumpter, J.P., Parker, M.G. Environmentally persistent alkylphenolic compounds are estrogenic. Endocrin., 1994, 135, 175-182.

126 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

EXPOSURE OF GRANULOSA CELLS TO THE FUSARIUM TOXINS

Medve ďová, M., 1 Maruniaková, N., 1, Ciereszko, R., 2 Kolesárová, A., 1

1 Slovak University of Agriculture in Nitra, Faculty of Biotechnology & Food Sciences, Department of Animal Physiology 2 Department of Animal Physiology, Faculty of Biology, University of Warmia and Mazury in Olsztyn

Abstract The aim of this in vitro study was to examine the secretory activity of a porcine ovarian granulosa cells (GCs) after deoxynivalenol (DON), T-2 toxin, HT-2 toxin and zearalenone (ZEA) addition. Ovarian granulosa cells were incubated with DON, T-2 toxin, HT-2 toxin and ZEA for 24h: 0, 10, 100 and 1000 ng/ml. The secretion of estradiol was determined by RIA. We found no significant differences between control group without mycotoxins addition and experimental groups, accordingly there is a continued need to elucidate detailed explanation of mechanisms of action these mycotoxins on steroidogenesis.

Key words: Deoxynivalenol, T-2 toxin, HT-2 toxin, zearalenone, estradiol, granulosa cells.

Úvod Mykotoxíny sú produkované rôznymi druhmi mikroskopických húb a môžu by ť už v nízkych dávkach toxické pre stavovce a iné skupiny živo číchov. Medzi mykotoxíny produkované Fuzáriami zah ŕň ame nemakrocyklické trichotecény, ako je deoxynivalenol (DON), T2 toxín (T2), metabolit T2 toxínu HT-2 toxín (HT-2), ako aj zearalenon (ZEA), ktoré môžu ovplyv ňova ť reproduk čné parametre ošípaných (Caloni et al., 2009; Pestka, 2010). Trichotecény zah ŕň ajú skupinu viac ako 60 sesquiterpenoidných metabolitov produkovaných množstvom rodov mikroskopických húb, medzi ktoré patrí aj rod Fusarium spp. Všetky trochotecény majú spolo čnú 12,13-epoxytrichoténovú kostru a olefínickú väzbu s po četnými bo čnými re ťazcami. Sú oby čajne zastúpené ako krmivové a potravinové kontaminanty, a požitie týchto mykotoxínov môže ma ť za následok alimentárne krvácania a zvracanie; priamy kontakt spôsobil dermatitídu (Bennett a Klich, 2003). Deoxynivalenol, hovorovo známy ako „vomitoxín“ (spôsobujúci zvracanie), je z trichotecénov B-typu naj častejšie detekovaný v potravinách (Pestka, 2007). Rôzne dávky DON-u môžu ma ť, paradoxne, aj podporujúci aj tlmivý ú činok na živo číšne bunky pri implementácii bunkových metabolických dráh. U ošípaných, ktoré sa zatia ľ zdajú by ť najcitlivejším živo číšnym

127 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 druhom, sa prejavili ú činky DON-u ako zápalové reakcie gastrointenstinálneho traktu, blokácie transportu živín a výsledné redukcie pri priberaní hmotnosti zvierat (Pestka, 2010). Všetky živo číšne druhy, ktoré boli zatia ľ preskúmané sú citlivé na DON v nasledovnom poradí: ošípané > myši > potkany > hydina ≈ prežúvavce (Prelusky et al., 1994). Bolo dokázané, že DON v granulóznych bunkách ošípaných podporoval produkciu progesterónu a expresiu prolifera čných (cyklín B1, PCNA) peptidov (Medvedova et al., 2011). Aktivita enzýmu steroidogenézy (aromatáza) bola vysoko citlivá na vplyv DON-u v granulóznych bunkách, kým presný mechanizmus pôsobenia zatia ľ nebol popísaný (Ranzenigo et al., 2008). T-2 a HT-2 toxíny sú trichotecény typu-A. Základná cesta biotransformácie je deacetylácia C- 4 acetylovej skupiny T-2 toxínu, ktorá vedie k formovaniu metabolitu HT-2 (Bennett a Klich, 2003). V pokusoch na myšiach a potkanoch sa zistila ich cytotoxicita a zmeny v proliferácii buniek epitelu pažeráka a žalúdka. T-2 toxín indukoval hepatocelulárne a pľúcne adenómy u samcov myší. Po četné bežné testy na genotoxicitu in vitro a in vivo , najmä pre klastogénny vplyv, boli pozitívne na T-2 a HT-2 toxín (Larsen et al., 2004). Z pokusov na granulóznych bunkách ošípaných bol zistený priamy vplyv T-2 toxínu na steroidogenézu a proliferáciu (Caloni et al., 2009), ako aj spomalenie dozrievania folikulov a ovuláciu (Huszenicza et al., 2000). Zearalenon (ZEA) je klasifikovaný ako nesteroidný estrogén alebo mykoestrogén, kvôli jeho štruktúre podobnej hormónu produkovanému vaje čníkmi – 17 β-estradiolu. Jeho špecifická štruktúra mu umožnila viazanie sa na receptory estrogénu v bunkách vaje čníkov, maternice, mlie čnej ž ľazy, hypofýzy a adenohypofýzy, čím spôsoboval výrazné klinické príznaky hyperestrogenizmu (Minervini et al., 2001). ZEA v luteinizovaných granulóznych bunkách redukoval aktivitu aromatázy, čo spôsobilo zníženie produkcie estradiolu z androsténdiolu (Whitehead a Lacey, 2003), kým v granulóznch bunkách bol zaznamenaný dávkovo-závislý efekt (Ranzenigo et al., 2008). Cie ľom in vitro štúdii bolo skúmanie vplyvu vybraných fuzáriových mykotoxínov (DON-u, T-2 toxínu, HT-2 toxínu a ZEA-u) na sekréciu estradiolu granulóznymi bunkami vaje čníkov ošípaných.

Materiál a metódy Príprava, Spracovanie A Kultivácia Granulóznych Buniek Vaje čníky získané pri zabití zvierat (n=12) sme individuálne uskladnili v termoske s fyziologickým roztokom pri izbovej teplote a spracovali maximálne do 6 hodín od zabitia zvierat. ovariálne granulózne bunky sme izolovali metódou aspirácie zo stredne ve ľkých

128 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 folikulov (2–5 mm). suspenziu granulóznych buniek sme odstre ďovali (1500 ot/min, 10 minút) za ú čelom oddelenia od folikulovej tekutiny s následným premývaním pomocou sterilného kultiva čného média dmem/f12 1:1 (biowhittaker™, verviers, belgium) doplneného 10 % fetálnym te ľacím sérom (biowhittaker™) a antibiotikom – antimykotikom (sigma, st. louis, mo, usa). pomocou hemocytometra sme po čítali bunky a upravili koncentráciu buniek na potrebnú (106 buniek/ml média). Bunkovú suspenziu zriedenú kultiva čným médiom sme kultivovali (37 oc, 5 % co2) na 24 jamkových kultiva čných platni čkách (1 ml/jamka). po 5-7 dňoch kultivácie, ke ď bunky vytvorili na 75 % súvislú monovrstvu, sme médium nahradili čerstvým, s rovnakými doplnkami média ako bolo pôvodné 1. bez pridania mykotoxínov (0 ng mykotoxínov) a 2. s pridaním rôznych koncentrácií mykotoxínov – don, t-2, ht-2 a zea (experimentálne skupiny): dávky 10 ng, 100 ng a 1000 NG. PO 24-HODINOVEJ kultivácii sme injek čnou strieka čkou odobrali médium z kultiva čných platni čiek a uskladnili pri teplote –20 oc až do doby ria analýzy.

Ria analýza Koncentrácie e2 boli stanovené metódou rádioimunoanalýzy (3h-RIA) V 150-200 µL inkuba čného média, pod ľa inštrukcií výrobcu (ciereszko et al., 1998). intra- a inter- koeficienty variácie pre e2 boli 1,64 and 0,87%.

Štatistické analýzy

Štatistické analýzy E 2 v inkuba čnom médiu bola vykonaná duplicitne. Štatistické rozdiely medzi skupinami boli hodnotené t-testom použitím štatistického programu Sigma Plot 11.0 (Jandel, Corte Madera, USA).

Výsledky a diskusia Po aplikácii mykotoxínov (DON, T-2 toxín, HT-2 toxín a ZEA) na granulózne bunky vaje čníkov ošípaných neboli zaznamenané preukazné ( P<0,05) rozdiely medzi kontrolnou skupinou bez pridania mykotoxínov a pokusnými skupinami (10, 100 a 1000 ng/ml) (Obrázok 1).

129 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

A C 35 120

30 100

25 80

20 60

15

40 10 Estradiol release (pg/ml) release Estradiol Estradiol (pg/ml) release

20 5

0 0 0 ng 10 ng 100 ng 1000 ng 0 ng 10 ng 100 ng 1000 ng DON HT-2

B D 80 80

60 60

40 40

Estradiol (pg/ml) release 20 Estradiol (pg/ml) release 20

0 0 0 ng 10 ng 100 ng 1000 ng 0 ng 10 ng 100 ng 1000 ng T-2 ZEA

Obrázok 1 Vplyv DON-u (A), T-2 toxínu (B), HT-2 toxínu (C) a ZEA-u (D) na uvo ľň ovanie estradiolu granulóznymi bunkami vaje čníkov ošípaných (ng/ml). Kontrola bez prítomnosti mykotoxínov v médiu (0 ng) a pokusné skupiny: 10 ng, 100 ng, 1000 ng DON-u. RIA metóda. Figure 1: Effect of DON (A), T-2 toxin (B), HT-2 toxin (C) and ZEA (D) on estradiol release by porcine ovarian granulosa cells (ng/ml). Control group without mycotoxin addition (0 ng) and experimental groups: 10 ng, 100 ng, 1000 ng DON-u. RIA method.

Tento experiment bol vykonaný pre ur čenie ú činku rôznych dávok DON-u, T-2 toxínu, HT-2 toxínu a ZEA-u na sekréciu estradiolu granulóznymi bunkami vaje čníkov ošípaných. Pri všetkých dávkach podávaných mykotoxínov sme nezistili signifikantné rozdiely v uvo ľnení estradiolu medzi pokusnými skupinami s prídavkom 10, 100 a 1000 ng/ml príslušného mykotoxínu a kontrolnou skupinou bez pridania mykotoxínov. Ranzenigo et al. (2008) zistili, že vysoké dávky DON-u (100 a 1000 ng/ml) inhibovali produkciu estradiolu, kým nižšie dávky (10 ng/ml) stimulovali produkciu estradiolu ( P<0,05) indukovanú IGF-I a FSH. Dávkovo-závislý toxický efekt na steroidogenézu granulóznych buniek ošípaných zaznamenali predchádzajúci autori v prípade ťažkých kovov (Kolesarova et al, 2010). T-2 toxín a HT-2 toxín v našej štúdii nevykázali výrazné rozdiely pri uvo ľň ovaní

130 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 estradiolu medzi kontrolnou skupinou bez pridania mykotoxínov a pokusnými skupinami s prídavkami vybraných mykotoxínov: 10, 100 a 1000 ng/ml. V predchádzajúcej štúdii HT-2 toxín v dávkach 100 ng/ml a 1000 ng/ml signifikantne stimuloval ( P<0,05) sekréciu progesterónu (Maruniaková et al., 2010). Caloni et al. (2009) zistili pri nižších dávkach T-2 toxínu (3, 30 a 300 ng/ml) výraznú inhibíciu uvo ľň ovania estradiolu granulóznymi bunkami (P<0,05) indukovanú IGF-I a FSH. Maruniaková et al. (2010) uvádzajú zvýšenú sekréciu progesterónu pri dávke 1000 ng/ml T-2 toxínu. V predchádzajúcich štúdiách bolo zaznamenané zvýšené uvo ľň ovanie estradiolu v granulóznych bunkách po podaní ZEA-u v dávkach 30 a 300 ng/ml (Ranzenigo et al., 2008). Vplyv rôznych dávok mykotoxínov (DON, T-2 toxín, HT-2 toxín a ZEA) na granulózne bunky je doposia ľ nedostato čne preskúmaný a nie sú dostato čne vysvetlené bunkové a molekulárne mechanizmy vstupu týchto mykotoxínov do živo číšnych tkanív. Na základe tejto skuto čnosti je potrebné realizova ť ďalšie experimenty v smere steroidogenézy v ovariálnych bunkách pre detailnejšie objasnenie mechanizmu ú činkov vybraných mykotoxínov.

Záver Na záver, výsledky našej práce nenazna čujú priamy vplyv vybraných mykotoxínov (DON, T-2 toxín, HT-2 toxín a ZEA) v dávkach 10, 100 a 1000 ng/ml na uvo ľň ovanie estradiolu granulóznymi bunkami ošípaných. Z predchádzajúcich štúdií vyplýva, že purifikované mykotoxíny môžu by ť menej toxické ako prírodne sa vyskytujúce v potravinách, čo nazna čuje ich synergické pôsobenie. Otázne je, či príjem kombinácií mykotoxínov môže predstavova ť podstatne vyššie riziko ako príjem každého z týchto mykotoxínov osobitne. Z tohto dôvodu by prítomnos ť mykotoxínov mala by ť prísne monitorovaná v krmivách a potravinách, lebo škodlivé ú činky DON-u, T-2 toxínu, HT-2 toxínu a ZEA-u môžu ovplyv ňova ť reproduk čné procesy ovplyv ňovaním folikulogenézy ošípaných.

Použitá literatúra Bennett, J.W., Klich, M. Mycotoxins. C. M. R., 2003, 16 (3), 497-516. Caloni, F., Ranzenigo, g., Cremonesi, F., Spicer, J.L. Effects of a trichothecene, T-2 toxin, on proliferation and steroid production by porcine granulosa cells. Toxicon , 2009, 54, 337- 344. Ciereszko, R.E., Petroff, B.K., Ottobre, A.C., Guan, Z., Stokes, B.T., Ottobre, J.S. Assesment of the mechanism by which prolactin stimulates progesterone production by early corpora lutea of pigs. J. Endocrinol., 1998, 159, 201-209.

131 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Huszenicza, G., Fekete, S., Szigeti, G., Kulcsar, M., Febel, H., Kellems, R.O., Nagy, P., Cseh, S., Veresegyhazy, T., Huilar, I. Ovarian consequences of low dose peroral fusarium (T-2) toxin in a ewe and heifer model. Theriogenology , 2000, 53, 1631-1639. Kolesarova, A., Roychoudhury, S., Slivkova, J., Sirotkin, A.V., Capcarova, M., Massanyi, P. In vitro study on the effect of lead and mercury on porcine ovarian granulosa cells. J. Environ. Sci. Health B , 2010, 45, 320-331. Larsen, J.Ch., Hunt, J., Perrin, I., Ruckenbauer, P. Workshop on trichothecenes with a focus on DON: summary report. Toxicol. Lett., 2004,153, 1-22. Maruniaková, N., Medve ďová, M., Kolesárová, A., Capcarová, M., Sirotkin, A.V., Bulla, J. The effect of T-2 toxin, HT-2 toxin and deoxynivalenol of the secretion activity of porcine ovarian granulosa cells. Proceedings of International Ph.D. Students Conference, November 24th, 2010, Brno. - Brno : Mendelova univerzita, 2010. - ISBN 978-80-7375- 453-2. - S. 917-924 Medvedova, M., Kolesarova, A., Capcarova, M., Labuda, R., Sirotkin A.V. Kovacik, J., Bulla, J. the effect of deoxynivalenol on the secretory activity, proliferation and apoptosis of porcine ovarian granulosa cells in vitro . J. Environ. Sci. Health B , 2011, 46 (3), 213- 219. Minervini, F., Dell’ Aquila, M.E., Maritato, F., Minoia, P. Visconti, A. Toxic effects of the mycotoxin zearalenone and its derivates on in vitro maturation of bovine oocytes and 17 β- estradiol levels in mural granulosa cell cultures. Toxicol. In Vitro , 2001, 15, 489-495. Pestka, J.J. Deoxynivalenol: mechanisms of action, human exposure, and toxicological relevance. Arch. Toxicol. , 2010, 84, 664-679. Pestka, J.J. Deoxynivalenol: Toxicity, mechanisms and animal health risks. Anim. Feed Sci. Technol. , 2007, 137, 283-298. Prelusky, D.B., Gerdes, R.G., Underhill, K.L. Rotter, B.A., Jui, P.Y., Trenholm, H.L. Effects of low-level dietary deoxynivalenol on haematological and clinical parameters of the pig. Nat. Toxins , 1994, 2, 97-104. Ranzenigo, G., Caloni, F., Cremonesi, F., Aad, Z.P., Spicer, J.L. Effects of Fusarium mycotoxins on steroid production by porcine granulosa cells. Anim. Reprod. Sci., 2008, 107, 115-130. Whitehead, S.A., Lacey, M. Phytoestrogens inhibit aromatase but not 17 β-hydroxisteroid dehydrogenase (HSD) type 1 in human granulosa-lutheal cells: evidence for FSH induction of 17 β-HSD. Hum. Reprod. , 2003, 18 (3), 487-494.

132 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

HUMAN UMBILICAL VEIN ENDOTHELIAL CELLS IN PHYSIOLOGY RESEARCH

Morav čík, R., Ková čová, E., Zeman, M.

Department of Animal Physiology and Ethology, Faculty of Natural Sciences, Comenius University in Bratislava

Abstract The vascular system is a highly branched network of endothelium-lined tubes that provides all tissues with crucial nutrients and respiratory gasses. Most of the vasculature is formed by the process known as angiogensis. In adults, the process is stimulated mainly by tissue hypoxia via activation of hypoxia inducible factor 1 α (HIF-1α). Peroxizome proliferator activated receptors (PPARs) are implicated in most molecular mechanisms that control angiogensis. PPARs belong to a group of three nuclear receptor isoforms consisting of PPAR α, PPAR β/δ and PPAR γ. These isoforms have important roles in the control of glucose and fatty acid metabolism and were found to be expressed in endothelial cells. In our experiments the selective PPAR α agonist WY-14 643 inhibited migration and proliferaton of human endothelial cells in the wound healing assay. The inhibition was dose dependent, suggesting specificity of this substance. Molecular mechanisms of inhibition will be analysed in further experiments.

Úvod Vaskulárny systém je vysoko rozvetvená sie ť endotelom potiahnutých tubulov, ktoré zabezpe čujú rozvádzanie živín a respira čných plynov do všetkých tkanív a odvádzanie metabolitov z organizmu. Ve ľká čas ť vaskulatúry je tvorená procesom zvaným angiogenéza (Wacker a Gerhardt, 2011). Je to fyziologický proces zah ŕň ajúci rast nových ciev z preexistujúcej vaskulatúry (Carmeliet, 2005). U dospelých jedincov je angiogenéza stimulovaná najmä tkanivovou hypoxiou prostredníctvom hypoxiou indukovaného faktora 1 (HIF-1), ktorý slúži ako transkrip čný faktor pre množstvo génov podie ľajúcich sa na angiogenéze a prežívaní buniek. Medzi najvýznamnejšie patria gény pre vaskulárny endotelový faktor (VEGF), pre VEGF receptory 1 a 2 (VEGFR-1,-2) a angiopoetín 2 (Conway et al., 2001). V posledných rokoch stúpa množstvo poznatkov o zapojení peroxizómovým proliferátorom aktivovaných receptorov (PPAR) do molekulárnych mechanizmov, ktoré

133 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 regulujú angiogenézu prostredníctvom stimulácie rastových faktorov a cytokínov. Tie stimulujú migráciu, proliferáciu a prežívanie endotelových buniek (Biscetti et al., 2008; Goetze et al., 2002). Peroxizómovým proliferátorom aktivované receptory (PPAR) patria do superrodiny jadrových receptorov, ktoré pozostávajú z troch izoforiem PPAR α, β/δ a γ (Kliewer et al., 2001). PPAR α je prednostne exprimovaný v metabolicky aktívnych tkanivách ako je pe čeň, srdce, obli čky, kostrové svalstvo, ale vo ve ľkej miere sa nachádza aj vo vaskulárnom endotelovom tkanive a hladkej svalovine ciev. Zú čast ňuje sa na β-oxidácii mastných kyselín (Biscetti et al., 2009). PPAR β/δ je všadeprítomný, ale vo vä čšej miere sa tvorí v črevách, epidermis, placente, kostrovom svalstve a tukovom tkanive. Posledná izoforma PPAR γ sa tvorí najmä v tukovom tkanive a podie ľa sa na adipogenéze a glukózovej homeostáze (Wang et al., 2011). Všetky tri PPAR α, PPAR β/δ aj PPAR γ izoformy sú zna čne exprimované v endotelových bunkách, kde regulujú ich proliferáciu, angiogenézu, zápalové procesy či trombózu a koaguláciu (Bishop-Bailey, 2011). Všetky PPAR izoformy majú ve ľkú a flexibilnú ligand viažucu doménu, ktorá umož ňuje ich aktiváciu ve ľkým množstvom mastných kyselín a eikosanoidov in vitro. Okrem nich sú PPAR aktivované aj množstvo synteticky pripravených ligandov. Medzi ne patria napríklad klinicky používané dislipidemické lie čivá, fibráty (gemfibrozil, fenofibrát, bezafibrát a ciprofibrát), alebo thiazolidinediony (rosiglitazon, pioglitazón a troglitazon), používané ako inzulín senzitizujúce lie čivá. Sú to vysoko selektívni PPAR α, PPAR γ agonisti (Bishop-Bailey, 2000). Fenofibrát ako klinicky používaný PPAR α agonista spôsobuje inhibíciu angiogenézy v in vitro podmienkach. Inhibuje proliferáciu, migráciu a tvorbu kapiláram podobných štruktúr ľudských dermálnych endotelových buniek in vitro prostrednístvom disrupcie cytoskeletu a inhibície faktora Akt významného pre prežívanie endotelových buniek (Varet et al., 2003). Okrem fenofibrátu aj selektívny PPAR α agonista WY 14 643 preukázal význam inhibície, proliferácie, migrácie a tvorbe kapiláram podobných štruktúr (Varet et al., 2003). Po aplikácii PPAR agonistov bola navyše pozorovaná inhibícia VEGF indukovanej aktivácie Akt u ľudských pupo čníkových endotelových buniek (HUVEC) in vitro (Goetze et al., 2002). Predpokladá sa, že aktivácia PPAR γ znižuje proangiogénnu odpove ď na pôsobenie VEGF prostredníctvom zníženie transkripcie receptoru VEGFR-2 (Sassa et al., 2004). Okrem toho agonisti PPAR γ môžu inhibova ť angiogenézu aj indukciou apoptózy endotelových buniek (Bishop-Bailey a Hla, 1999).

134 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Niektoré štúdie nazna čujú, že PPAR môžu ma ť okrem antiangiogénnych, aj proangiogénne vlastnosti. Obe izoformy PPAR α aj PPAR γ môžu by ť zapojené do molekulárnych mechanizmov, ktoré regulujú angiogenézu prostredníctvom stimulácie rastových faktorov a cytokínov, ktoré stimulujú migráciu, proliferáciu a prežívanie endotelových buniek (Biscetti et al.,2008). Preto cie ľom našej práce bolo študova ť vplyv selektívneho PPAR α agonistu WY 14 643 na migra čnú a prolifera čnú aktivitu ľudských endotelových buniek metódou obnovy poškodenej monovrstvy (wound healing).

Materiál a metódy V experimentoch sme používali primárne kultúry ľudských pupo čníkových endotelových buniek (HUVEC), izolovaných z ciev ľudských pupo čníkov, ktoré nám v rámci spolupráce poskytla firma Eurocord Bratislava. Bunky sme izolovali modifikovanou metódou pod ľa Jaffe et al., 1979 natrávením umbilikálnej vény pomocou kolagenázy NB 4 (7 mg/ml; Serva, Nemecko). Vyizolované bunky sme pestovali v kultiva čných f ľašiach v komer čne dostupnom médiu pre endotelové bunky (ECGM-Endothelial Cell Growth Medium; PromoCell, Nemecko) obsahujúcom suplementy (SupplementMix) a antibiotiká: gentamicín (5 g/ml), penicilín (100 U/ml)

a streptomycín (100 g/ml). Kultivácia prebiehala v programovate ľnom CO 2 termostate

Heareus B 5060 (Heraeus, Nemecko) so zvlh čenou atmosférou obsahujúcou 5% CO 2 pri teplote 37°C. Migra čnú a prolifera čnú aktivitu HUVEC buniek sme testovali sledovaním obnovy poškodenej monovrstvy buniek pod ľa Martinez-Poveda et al., 2005. Suspenziu endotelových buniek v kompletnom ECGM (pasáž 2-7) sme nanášali na 24 jamkové platni čky (TPP, Švaj čiarsko) potiahnuté 1,5% želatínou v objeme 500 µl na jamku (100000 buniek/ml) a kultivovali v termostate do dosiahnutia 80% konfluencie. Po vyrastení monovrstvy sme na 17 hodín vymenili kompletné ECGM za hladovacie médiu, pozostávajúce z ECGM bez suplementov len s 2% obsahom inaktivovaného te ľacieho séra (ITS; PAA Laboratories, Rakúsko), 5 IU/ml heparínu (Serva, Nemecko) a antibiotikami. Následne sme monovrstvu buniek poškodili sterilnou špi čkou pipety, odstránili hladovacie médium a poškodenú monovrstvu premyli v PBS. K premytým bunkám sme pridávali v hladovacom médiu rozpustenú testovanú látku (WY 14 643) v koncentráciách 10 -3, 10 -4 a 10 -5 mol.l -1 v prítomnosti alebo neprítomnosti VEGF (40 ng/ml). Kontrolu predstavovali bunky kultivované v hladovacom médiu s 0,08% dimetylsulfoxidom (rozpúš ťadlo pre WY-14 643)

135 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 v prítomnosti alebo neprítomnosti VEGF (40 ng/ml). Sledované zmeny obnovy poškodenej monovrstvy s rastúcim časovým interevalom v závislosti od koncentrácie sledovanej látky sme pozorovali invertovaným optickým mikroskopom Olympus IMT 2 (Olympus, Japonsko) a fotografovali kamerovým systémom Moticam 1000 (Motic Incorporation, Hong Kong) v časovách intervaloch 0, 6, 9 a 24 hodín. Získané fotografie sme vyhodnocovali v programe Motic Images plus 2.0 ML (Motic Incorporation) a štatisticky spracovali pomocou t-testu.

Výsledky a diskusia Intenzita zarastania poškodenej monovrstvy endotelových buniek je znázornená na obr. 1. Selektívny agonista PPAR α WY-14 643 najvýraznejšie inhibuje migráciu a proliferáciu HUVEC buniek v koncentrácii 10 -3 mol.l -1 a to aj napriek stimula čnému ú činku VEGF v koncentrácii 40 ng/ml. Koncentra čnú závislos ť inhibície WY-14 643 môžeme sledova ť aj v bunkách, ktoré neboli stimulované pomocou VEGF.

Obrázok 1 The intensity of HUVEC migration and proliferation after 9 hours . Intenzita zarastania poškodenej monovrstvy HUVEC buniek v časovom intervale 9 hodín po poškodení. Bunky boli predkultivované v kompletnom ECGM a následne na 17 hodín hladované v ECGM bez suplementov s 2% obsahom ITS a 5 IU/ml heparínu. Do hladovacieho média bola pridaná aj testovaná látka WY-14 643 v koncentráciách 10 -3, 10 -4 a 10 -5 mol.l -1 v prítomnosti alebo neprítomnosti VEGF (40 ng/ml). Kontrolu predstavovalo hladovacie médium s 0,08% obsahom dimetylulfoxidu v prítomnosti alebo neprítomnosti VEGF (40 ng/ml). (*, ◦ p ‒ 0,05).

Z obrázku taktiež vyplýva, že WY-14 643 v koncentráciách 10 -4 a 10 -5 mol.l -1 neinhibuje bunky stimulované pomocou VEGF (obr. 2). To môže by ť spôsobené tým, že VEGF dokáže obís ť signálne dráhy, ktoré sú inhibované pomocou WY-14 643.

136 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

300 µm 300 µm

A B Obrázok 2 Migration and proliferation of HUVEC in time 9 hours after scratching . Zarastanie poškodenej monovrstvy HUVEC buniek v čase 9 hodín od poškodenia po pôsobení WT-14 643 v koncentrácii (A) 10 -3 mol.l -1, (B) 10 -4 mol.l -1. Bunky boli stimulované 40 ng/ml VEGF. Vzorky boli pozorované optickým mikroskopom Olympus IMT 2 s fázovým kontrastom a kamerovým systémom Moticam 1000 pri zvä čšení (40x).

Záver Selektívny agonista PPAR α WY-14 643 inhiboval migráciu a proliferáciu ľudských endotelových buniek na modeli zarastania poškodenej monovrstvy. Inhibícia bola závislá od dávky, čo nazna čuje špecifickos ť ú činku tejto látky. Molekulové mechanizmy účinku budú podrobnejšie analyzované v ďalších experimentoch. Po ďakovanie: Práca bola podporená grantom VEGA 1/0686/12.

Použitá literatúra Biscetti, F., Gaetani, E., Flex, A., Aprahamian, T., Hopkins, T., Straface, G., Pecorini, G., Stigliano, E., Smith, R.C., Angelini, F., Castellot, J.J. Jr., Pola, R. Selective activation of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)alpha and PPAR gamma induces neoangiogenesis through a vascular endothelial growth factor-dependent mechanism. Diabetes. 2008, 57, 1394-404. Biscetti, F., Straface, G., Pitocco, D., Zaccardi, F., Ghirlanda, G., Flex, A. Peroxisome proliferator-activated receptors and angiogenesis. Nutr. Meta. Cardiovasc. Dis . 2009, 19, 751-9. Bishop-Bailey, D. Peroxisome proliferator-activated receptors in the cardiovascular system. Br. J. Pharmacol . 2000, 129, 823-34. Bishop-Bailey, D. PPARs and angiogenesis. Biochem. Soc. Trans . 2011, 39, 1601-5. Bishop-Bailey, D., Hla, T. Endothelial cell apoptosis induced by the peroxisome proliferator- activated receptor (PPAR) ligand 15-deoxy-Delta12, 14-prostaglandin J2. J. Biol. Chem . 1999, 274, 17042-8. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 2005, 38, 932-6. Conway, E.M., Collen, D., Carmeliet, P. Molecular mechanisms of blood vessel growth. Cardiovasc. Res. 2001, 49, 507-21. Goetze, S., Eilers, F., Bungenstock, A., Kintscher, U., Stawowy, P., Blaschke, F., Graf, K., Law, R.E., Fleck, E., Gräfe, M. PPAR activators inhibit endothelial cell migration by targeting Akt . Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 293, 1431-7.

137 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Jaffe, E.A., Nachman, R.L., Becker, C.G., Minick, C.R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. The J. Clin. Invest . 1973, 52, 2745-2756. Kliwier, S.A., Xu, H.E., Lambert, M.H., Willson, T.M. Peroxisome proliferator-activated receptors: from genes to physiology. Recen.t Prog. Horm. Res. 2001, 56, 239-263. Martinez-Poveda, B. Quesada, A.R. Medina, M.A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Eur. J. Pharmacol . 516, 97-103. Sassa, Y., Hata, Y., Aiello, L.P., Taniguchi, Y., Kohno, K., Ishibashi, T. Bifunctional properties of peroxisome proliferator-activated receptor gamma1 in KDR gene regulation mediated via interaction with both Sp1 and Sp3. Diabetes . 2004, 53, 1222-9. Varet, J., Vincent, L., Mirshahi, P., Pille, J.V., Legrand, E., Opolon, P., Mishal, Z., Soria, J., Li, H., Soria, C. Fenofibrate inhibits angiogenesis in vitro and in vivo. Cell. Mol. Life Sci. 2003 Apr;60(4):810-9. Wacker, A., Gerhardt, H. Endothelial development taking shape. Curr. Opin. Cell Biol . 2011, 23, 676-85. Wang, N., Yin, R., Liu, Y., Mao, G., Xi, F. Role of peroxisome proliferator-activated receptor-γ in atherosclerosis: an update. Circ. J. 2011, 75, 528-35.

138 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

DIFFERENTIAL DEPOSITION OF YOLK TESTOSTERONE IN THE SECOND LAYING CYCLE DEPENDS ON FEMALE QUALITY IN JAPANESE QUAIL

Okuliarová, M., 1 Škrobánek, P., 2 Zeman, M. 1,2

1 Katedra živo číšnej fyziológie a etológie, Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava 2 Ústav biochémie a genetiky živo číchov, SAV, Ivanka pri Dunaji, Slovenská republika

Abstract Egg yolk contains diverse maternally-derived signal compounds, among which yolk androgens have been shown to produce distinct inter- and intra- female variations. As most studies deal with maternal hormone deposition over one breeding season, limited data refer to inter-seasonal changes of yolk hormones. In the current study, we investigated the deposition of yolk testosterone (T) across two laying cycles in Japanese quail divergently selected low (LET line) and high (HET line) egg T concentrations. We measured yolk and plasma T levels and egg quality characteristics at the end of the first and at the beginning of the second laying cycle after the induced moult. Our results demonstrated consistent line differences in egg T in both cycles. The increase of yolk T deposition in the HET but not LET quail in the second laying cycle suggests that genetically-determined differences in maternal hormones can influence the responsiveness to rejuvenation processes and an ability of mothers to program development of their progeny over two reproductive seasons.

Úvod Embryonálny vývin vtákov prebieha mimo tela matky v prostredí chránenom vajcovou škrupinou a s vopred definovaným zložením, ktoré zah ŕň a nielen esenciálne živiny, ale aj po četné signálne molekuly. Z tohto dôvodu predstavujú vtáky ideálny model na štúdium trans-genera čných maternálnych ú činkov sprostredkovaných depozíciou biologicky aktívnych látok do ž ĺtka, predovšetkým hormónov, vitamínov, antioxidantov a protilátok (Schwabl, 1993; Grindstaff et al., 2003). Pod ľa jednej z východiskových predikcií samica môže týmto spôsobom ovplyv ňova ť fenotypovú plasticitu svojho potomstva v zmysle adaptívneho prispôsobenia podmienkam prostredia o čakávaným po vyliahnutí (Mousseau a Fox, 1998). Koncentrácie androgénov v žĺtku sa vyzna čujú výraznou vnútrodruhovou variabilitou, ktorej zdrojom je pôsobenie viacerých environmentálnych a sociálnych faktorov prostredia (Gil, 2008), ako aj samotný genotyp samice (Okuliarova et al., 2009; Tschirren et al., 2009). Divergentná selekcia prepelice japonskej ( Coturnix japonica ) na obsah testosterónu vo vajci

139 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 experimentálne dokázala na základe vysokej heritability, že gény vysvet ľujú najmenej polovicu celkovej fenotypovej variability v hladinách ž ĺtkových androgénov (Okuliarova et al., 2011). Popri vysokých inter-individuálnych rozdieloch však existuje aj nezanedbate ľná intra-individuálna variabilita v depozícii maternálnych androgénov do vajca, ktorá bola popísaná najmä u altriciálnych vtákov v súvislosti s pozíciou vajca v násade (Schwabl, 1993) a s poradím násady v rámci hniezdnej sezóny (Tobler et al., 2007). U prekociálnej prepelice japonskej koncentrácie testosterónu v žĺtku klesajú s narastajúcim vekom samice, respektíve po čas prvého znáškového cyklu (Okuliarova et al., 2009), čo pravdepodobne súvisí s poklesom hladín luteiniza čného hormónu a citlivosti adenohypofýzy na gonádotropín uvo ľň ujúci hormón (Ciccone et al., 2005). V doposia ľ publikovanej literatúre sú iba okrajové údaje týkajúce sa variability maternálnych hormónov vo vajci medzi dvoma reproduk čnými sezónami, aj ke ď tieto poznatky môžu by ť dôležité nielen z ekologického h ľadiska pre dlho žijúce vtáky, ale aj z hľadiska praxe v komer čných chovoch hydiny. Preto cie ľom našej štúdie bolo analyzova ť zmeny v depozícii maternálneho testosterónu do ž ĺtka medzi dvoma znáškovými cyklami prepelice japonskej. Túto medzisezónnu variabilitu sme hodnotili aj v závislosti od geneticky podmienených rozdielov v depozícii maternálnych hormónov do vajca s využitím dvoch línií prepelíc selektovaných na nízke (LET) a vysoké (HET) koncentrácie testosterónu v žĺtku. Okrem ž ĺtkového testosterónu sme merali hladiny testosterónu v plazme samíc, ako aj základné charakteristiky kvality vajec (hmotnosti, vajca, ž ĺtka a škrupiny) na konci prvého a na za čiatku druhého znáškového cyklu.

Materiál a metodika Zvieratá a priebeh experimentu Použili sme dospelé prepelice japonské zo štvrtej filiálnej generácie LET a HET línií selektovaných na obsah testosterónu vo vajcovom ž ĺtku (Okuliarova et al., 2011). Do pokusu bolo zaradených 8 LET a 8 HET samíc, ktoré boli umiestnené v individuálnych klietkach so samcom z rovnakej línie. Prepelice boli chované pri svetelnom režime 14 hodín svetlo (L) a 10 hodín tma (D), s vo ľným prístupom k vode a krmivu. Na konci prvého znáškového cyklu (vek 46 týžd ňov) vykazovali prepelice pravidelnú znášku vajec, pri čom od každej samice sme použili 2 vajcia na analýzy. Druhý znáškový cyklus sme indukovali núteným p ŕchnutím prepelíc. Samice boli vystavené inhibi čnej fotoperióde 8L:16D po dobu 2 týžd ňov. Zárove ň sme zvieratám odobrali krmivo na prvých 24 hodín. Táto procedúra prerušila znášku vajec u 6 LET a 7 HET samíc.

140 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Následne boli prepelice opätovne vystavené režimu 14L:10D. Šes ť samíc z každej línie obnovilo pravidelnú znášku vajec po 4 týžd ňoch od vystavenia stimula čnej fotoperióde. Vajcia znesené po čas nasledovných 6 dní druhého znáškového cyklu sme použili na analýzy. Najskôr sme odmerali základné parametre kvality vajec (hmotnosti vajca, ž ĺtka a škrupiny). Žĺtka sme po odvážení zhomogenizovali a uskladnili pri -20°C do analýzy testosterónu. Krv na analýzu testosterónu sme odoberali z podkrídlovej žily po čas prvého znáškového cyklu (vek 38 týžd ňov), 11 de ň vystavenia prepelíc inhibi čnej fotoperióde a po čas druhého znáškového cyklu (5 týžd ňov po obnovení stimula čnej fotoperiódy).

Stanovenie koncentrácií testosterónu Testosterón sme najskôr extrahovali zo ž ĺtka zmesou rozpúš ťadiel dietyléter/petroléter (7:3) na kolónkach vyplnených absorp čným materiálom Extrelut® NT (Merck, Darmstadt, Nemecko) pod ľa postupu Okuliarova et al., (2009). Koncentrácie T v extraktoch a plazme sme stanovili rádioimunologickou metódou validovanou v našom laboratóriu (Zeman et al., 1986). Použili sme [1,2,6,7-3H]-testosterón (3,52 TBq/mmol, 95,0 Ci/mmol, Amersham Biosciences, Ve ľká Británia) a špecifickú protilátku pripravenú imunizáciou králika testosterónom naviazaným v pozícii 3 cez karboxymetyloxím na hovädzí sérový albumín. Všetky vzorky boli odmerané v 4 stanoveniach s priemerným varia čným koeficientom v rámci stanovenia 4,0 % a varia čným koeficientom medzi stanoveniami 5,2%. Citlivos ť merania predstavovala 2,16 pg na skúmavku.

Štatistická analýza Získané údaje o parametroch kvality vajec a hladinách testosterónu v žĺtku sme spriemerovali pre jednotlivé samice samostatne pre prvý a druhý znáškový cyklus. Dáta pre koncentráciu a obsah testosterónu v žĺtku sme upravili logaritmickou transformáciou, aby sp ĺň ali podmienku normálneho rozdelenia a homogenity rozptylov. Dáta sme štatisticky vyhodnotili analýzou rozptylu s opakovaním, v ktorej sme použili medziskupinový faktor línia (LET/ HET), vnútroskupinový faktor znáškový cyklus (prvý/druhý) a ich vzájomnú interakciu. Rozdiely medzi skupinami sme analyzovali pomocou LSD post hoc testov.

Výsledky

Koncentrácie testosterónu v plazme samíc neboli ovplyvnené líniou ( F(1,10) =0.14; p=0.713), znáškovým cyklom ( F(1,10) =1.09; p=0.322) ani interakciou medzi faktormi

(F(1,10) =0.70; p=0.422). Priemerné hodnoty plazmatických hladín testosterónu sa pre LET

141 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 a HET samice pohybovali na úrovni 523 ± 61 a 754 ± 178 pg/ml v prvom znáškovom cykle a 497 ± 48 a 582 ± 175 pg/ml v druhom znáškovom cykle. Koncentrácie testosterónu v ž ĺtku boli pod ľa o čakávania vyššie v HET ako v LET línii

(F(1,10) =29.14; p<0.001). Ďalej sme zistili signifikantnú interakciu medzi líniou a znáškovým cyklom (F(1,10) =14.64; p<0.01). Post hoc analýza ukázala, že koncentrácie testosterónu v žĺtku sa zvýšili medzi prvým a druhým znáškovým cyklom v HET línii (p<0.01), zatia ľ čo skôr opa čný trend sme zaznamenali v LET línii (Tab. 1). Rovnaký výsledok ako pre koncentrácie žĺtkového testosterónu sme zistili aj analýzou celkového obsahu testosterónu v ž ĺtku (línia:

F(1,10) =36.21, p<0.001; znáškový cyklus: F(1,10) =1.21, p=0.298 a interakcia: F(1,10) =12.99, p<0.01) (Tab. 1).

Tab 1 Koncentrácie a obsah testosterónu v ž ĺtku (priemer ± SEM) po čas prvého a druhého znáškového cyklu 2 línií prepelíc japonských selektovaných na nízke (LET, n=6) a vysoké (HET, n=6) koncentrácie testosterónu v žĺtku. Vertikálne p-hodnoty vyjadrujú post hoc porovnanie medzi cyklami, horizontálne p-hodnoty porovnanie medzi líniami. (Yolk testosterone concentrations and content (mean ± SEM) during the first and second laying cycle in 2 lines of Japanese quail selected for low (LET, n=6) and high (HET, n=6) yolk testosterone concentrations. Differences between laying cycles and lines are expressed by vertical and horizontal p-values, respectively.)

Koncentrácie testosterónu [pg/ mg ž ĺtka] Obsah testosterónu [ng/ ž ĺtok] Prvý cyklus Druhý cyklus p-hodnota Prvý cyklus Druhý cyklus p-hodnota LET línia 8,1 ± 0,5 7,2 ± 0,7 ns 22,1 ± 1,7 18,7 ± 2,1 ns HET línia 15,1 ± 2,0 21,7 ± 3,9 p < 0.01 41,1 ± 3,7 60,8 ± 10,2 p < 0.01 p-hodnota p < 0.05 p < 0.001 p < 0.05 p < 0.001

Hmotnos ť vajca aj hmotnos ť ž ĺtka sa nezmenili v druhom znáškovom cykle v oboch

líniách (F(1,10) =0.01; p=0.935; F(1,10) =0.11; p=0.752) (Tab. 2) a rovnako sme v týchto

parametroch nezaznamenali ani rozdiely medzi líniami ( F(1,10) =2.01; p=0.186; F(1,10) =1.25; p=0.290) (Tab. 2). Hmotnos ť škrupiny sa znížila medzi prvým a druhým znáškovým cyklom v oboch líniách (F(1,9) =9.01; p<0.05; Tab. 2), pri čom HET prepelice znášali vajcia s ťažšou

škrupinou v porovnaní s LET samicami ( F(1,9) =7.90; p<0.05) bez interakcie so znáškovým cyklom.

Tabu ľka 2 Parametre kvality vajec (priemer ± SEM) po čas prvého a druhého znáškového cyklu 2 línií prepelíc japonských selektovaných na nízke (LET, n=6) a vysoké (HET, n=6)

142 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 koncentrácie testosterónu v žĺtku. ( Table 2 Egg quality parameters (mean ± SEM) during the first and second laying cycle in 2 lines of Japanese quail selected for low (LET, n=6) and high (HET, n=6) yolk testosterone concentrations.)

Hmotnos ť vajca [ g] Hmotnos ť ž ĺtka [ g] Hmotnos ť škrupiny [ g] Prvý cyklus Druhý cyklus Prvý cyklus Druhý cyklus Prvý cyklus Druhý cyklus LET línia 8,92 ± 0,30 8,91 ± 0,24 2,72 ± 0,13 2,59 ± 0,06 0,774 ± 0,020 0,734 ± 0,017 HET línia 9,50 ± 0,34 9,47 ± 0,40 2,80 ± 0,17 2,85 ± 0,15 0,874 ± 0,028 0,821 ± 0,029

Záver Prezentované výsledky demonštrujú vysoko konzistentné rozdiely v hladinách žĺtkového testosterónu medzi LET a HET líniami prepelíc pretrvávajúce v druhom znáškovom cykle. Obdobie reproduk čnej inaktivity po čas vystavenia inhibi čnej fotoperióde je spojené s rejuvenáciou hypotalamo-hypofýzo-gonadálnej (HPG) osi, ktorá vedie po opätovnom vystavení stimula čnej fotoperióde k zvýšeniu gonádotropínov v plazme a obnoveniu produkcie vajec v druhom znáškovom cykle (Sharp et al., 1992). Preto zvýšenie koncentrácií ž ĺtkového testosterónu v druhom cykle HET samíc môže odráža ť ich vyššiu odpovedate ľnos ť HPG osi v porovnaní s LET samicami. Navyše, geneticky determinovaná variabilita v depozícii maternálnych hormónov do vajca môže ovplyv ňova ť reproduk čnú úspešnos ť samice a jej schopnos ť prispôsobi ť vývin potomstva medzi dvoma reproduk čnými sezónami.

Po ďakovanie Práca bola podporená grantmi APVV 0047-10 a VEGA 1/0686/12.

Použitá literatúra Ciccone, N.A., Sharp, P.J., Wilson, P.W., Dunn, I.C. Changes in reproductive neuroendocrine mRNAs with decreasing ovarian function in ageing hens. Gen. Comp. Endocr. , 2005, 144, 20-27. Gil, D. Hormones in avian eggs: Physiology, ecology and behavior. Adv. Stud. Behav. , 2008, 38, 337-398. Grindstaff, J.L., Brodie, E.D., Ketterson, E.D. Immune function across generations: integrating mechanism and evolutionary process in maternal antibody transmission. P. Roy. Soc. Lond. B Bio. , 2003, 270, 2309-2319. Mousseau, T.A., Fox, C.W. The adaptive significance of maternal effects. Trends Ecol. Evol. , 1998, 13, 403-407. Okuliarova, M., Groothuis, T.G.G., Skrobanek, P., Zeman, M. Experimental evidence for genetic heritability of maternal hormone transfer to offspring. Am. Nat. , 2011, 177, 824- 834. Okuliarova, M., Skrobanek, P., Zeman, M. Variability of yolk testosterone concentrations during the reproductive cycle of Japanese quail. Comp. Biochem. Physiol. A , 2009, 154, 530-534.

143 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Sharp, P.J., Dunn, I.C., Cerolini, S. Neuroendocrine control of reduced persistence of egg laying in domestic hens: evidence for the development of photorefractoriness. J. Reprod. Fertil. , 1992, 94, 221-235. Schwabl, H. Yolk is a source of maternal testosterone for developing birds. P. Natl. Acad. Sci. USA , 1993, 90, 11446-11450. Tobler, M., Granbom, M., Sandell, M. Maternal androgens in the pied flycatcher: timing of breeding and within female consistency. Oecologia , 2007, 151, 731-740. Tschirren, B., Sendecka, J., Groothuis, T.G.G., Gustafsson, L., Doligez, B. Heritable variation in maternal yolk hormone transfer in a wild bird population. Am. Nat. , 2009, 174, 557-564. Zeman, M., Kosutzky, J., Bobakova, E. Testosterone concentration in the seminal plasma of cocks. Brit. Poultry Sci. , 1986, 27, 261-266.

144 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE EFFECT OF SUPPLEMENTATION OF DIFFERENT FORMS OF COPPER ON THE GROWTH INTENSITY AND THE CONCENTRATION OF COPPER AND ZINC IN THE BODY OF KIDS

Pechová, A., Pavlata, L., Hauptmanová, K., Zvonareva, E., Husáková, T., Dvo řák, R.

Ruminant and Swine Clinic, Faculty of Veterinary Medicine, University of Veterinary and Pharmaceutical Scinces Brno

Abstract The aim of this trial was to compare the effect of supplementation of kids with different forms of copper on growth intensity and body reserves of copper and zinc in the body after 2 month of supplementation. In this trial we used 26 kids that were divided into 3 groups. Group C (n=10) was control, group Cu-I (n=10) was given inorganic form (copper sulfate CuSO4.5H2O) and group Cu-O (n=6) was given organic form (Bioplex Cu, Alltech). Different number of the kids in individual groups was due to different count of kids from goats. Mothers were supplemented during pregnancy till the time of weaning with the same form of copper. After weaning the kids from groups Cu-I and Cu-O were supplemented with copper for 2 month with daily dose 7.5 – 10.5 mg per day. The amounts of Cu was increased during the experiment according the body weight; in average kids received 0.4 mg/kg BW daily. The natural content of the copper in the feed mixture was 5 mg/kg and supplemented Cu in different forms was 30 mg/kg of feed mixture. After 2 month of supplementation kids were slaughtered and the samples of liver, pancreas, spleen, myocardium, lungs, kidney, thigh muscle and tongue were taken for the assessment of Cu and Zn, which was measured by AAS after microwave digestion of samples. Concentration of Cu and Zn was determined in mg/kg of fresh tissue. The supplementation of kids with organic and inorganic form of Cu influenced significantly Cu concentration only in the liver, where were the concentrations in both experimental groups significantly higher than in control group (p ≤ 0.0001): group C: 45.73 ± 12.31 mg/kg; group Cu-I: 109.17 ± 27.13 mg/kg and group Cu-O: 110.16 ± 7.08 mg/kg. Similar concentrations of Zn was significantly influenced only in the liver, where were in experimental groups lower in comparison with control (p ≤ 0.01): group C: 42.20 ± 7.03

145 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 mg/kg; group Cu-I: 33.71 ± 3.13 mg/kg and group Cu-O: 32.25 ± 5.24 mg/kg. The Cu supplementation influenced significantly growth of kids. The average daily gain of kids from the time of weaning was highest in the group Cu-I (143 ± 21 g/day) in comparison with group C (105 ± 33 g/day, p ≤ 0.01) and group Cu-O (111 ± 38 g/day, p ≤ 0.05). Significant differences between supplementation of organic and inorganic forms of copper were found only in daily growth which was higher in group supplemented with inorganic form.

Úvod Měď je jedním ze stopových prvk ů, které jsou nezbytné pro zdraví, produkci a reproduk ční funkce zví řat. Významnou roli má m ěď jako sou část molekul s regula ční funkcí jako je cytochromoxidáza C, lyziloxidáza, dopaminoxidáza, tyrozináza, monoaminooxidáza, superoxidizmutáza apod. Vedle dalších funkcí je m ěď významná pro embryogenezi, r ůst a vývoj savc ů. V pr ůběhu b řezosti je m ěď p řenášena p řes placentu z mate řského organismu do plodu ( McArdle a Erlich 1989) . V plodu jsou ukládány zásoby m ědi p ředevším v jaterní tkáni, odkud se pozd ěji uvol ňují a jsou využívány p ři r ůstu plodu a dále v první fázi postpartálního vývoje (Linder a kol. 1999). V posledních letech je výzkum v ěnován vlivu mědi na denní p řír ůstky, konverzi krmiv a ovlivn ění tukového metabolismu u p řežvýkavc ů. Solaiman a kol. (2007) zjistili p ři suplementaci Cu 100 mg/den po dobu n ěkolika týdn ů zvýšení p řír ůstk ů a zlepšení konverze krmiv. Naopak Engle a Spears (2000) zjistili p ři suplementaci Cu snížení p řír ůstk ů i konverze krmiva u výkrmových býk ů. K suplementaci mědi do krmné dávky jsou v sou časné dob ě využívány dv ě základní skupiny preparát ů, které obsahují m ěď anorganicky vázanou (CuSO 4, CuO, CuCO 3) a nebo m ěď organicky vázanou ve form ě chelát ů (proteinát, glycinát apod.). Výsledky výzkum ů porovnávající organické a anorganické formy m ědi nejsou jednotné. Významným faktorem, který ovlivňuje využitelnost mědi je složení krmné dávky. U organických preparát ů m ědi je popisována lepší využitelnost, protože Cu je chrán ěna chelátovou vazbou p řed ionizací a následnou reakcí s dalšími látkami (železo, molybden, síra, fytáty) v trávicím traktu (Spears 2003). Cílem pokusu bylo vyhodnocení vlivu suplementace anorganické a organické formy mědi od embryonálního vývoje až do 4 m ěsíc ů stá ří k ůzlat na intenzitu r ůstu a koncentraci mědi a zinku v těle k ůzlat.

Materiál a metodika Do pokusu bylo za řazeno 26 k ůzlat, která byla rozd ělena do 3 skupin. Skupina C (n = 10) byla kontrolní, skupina Cu-I (n = 10) byla suplementována anorganickou formou Cu

146 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

(síran m ěď natý CuSO 4.H 2O) a skupina Cu-O (n = 6) byla suplementována organickou formou mědi (Bioplex Cu, Alltech). R ůzné po čty k ůzlat v jednotlivých experimentálních skupinách byly z d ůvodu r ůzného po čtu mlá ďat. Matky byly suplementovány od druhého m ěsíce březosti až do odstavu mlá ďat stejnými formami m ědi jako mlá ďata po odstavu. Po odstavu kůzlata pokusných skupin Cu-I a Cu-O dostávala po dobu 2 m ěsíc ů denní dávku 7,5 – 10,8 mg Cu v p říslušné form ě. Množství m ědi se v pr ůběhu pokusu postupn ě zvyšovalo podle tělesné hmotnosti k ůzlat; v pr ůměru k ůzlata p řijímala 0,4 mg/kg t ělesné hmotnosti. P řirozený obsah m ědi v krmné sm ěsi byl 5 mg/kg a p řídavek Cu v odpovídající form ě byl ve výši 30 mg/kg sm ěsi. Po 2 m ěsících suplementace byla k ůzlata odporažena a byly odebrány vzorky jater, pankreatu, sleziny, myokardu, plic a stehenní svaloviny na stanovení Cu a Zn. Laboratorní analýzy byly realizovány v klinicko-biochemické laborato ři na Klinice chorob p řežvýkavc ů FVL VFU Brno. Koncentrace Zn a Cu byla stanovena po mikrovlnné mineralizaci vzork ů plamenovou atomovou absorp ční spektrofotometrií na p řístroji SOLAAR 939 (Unicam, Great Britain). Koncentrace Cu a Zn je uvád ěna v mg/kg čerstvé tkán ě.

Výsledky a diskuse Suplementace m ědi signifikantn ě ovlivnila r ůst k ůzlat (tabulka 1). Vyšší intenzita růstu byla zjišt ěna ve skupin ě Cu-I, dotované anorganickou formou m ědi ve srovnání s kontrolou i se skupinou Cu-O, dostávají m ěď v organické form ě. Pozitivní vliv suplementace mědi na p řír ůstek u k ůzlat zjistili rovn ěž Solaiman a kol. (2006) p ři dávce 100 mg/kus/den, což je však n ěkolikanásobn ě vyšší než námi použité množství Cu. Tito auto ři však p ři zvýšení Cu na 200 mg/kus/den již zjistili depresi r ůstu. Suplementace m ědi se odrazila rovn ěž v koncentraci m ědi a zinku v jednotlivých orgánech a tkáních (tabulka 2 a 3). Signifikantn ě vyšší koncentrace Cu byly zjišt ěny v játrech u obou pokusných skupin ve srovnání s kontrolou, ale mezi použitými formami nebyly zjišt ěny rozdíly v žádné ze sledovaných tkání. Ve skupin ě Cu-I došlo ke zvýšení koncentrace Cu v játrech na 239 % a ve skupin ě Cu-O na 241 % ve srovnání s kontrolou. Zvýšená suplementace m ědi negativn ě ovlivnila koncentraci zinku v jaterní tkáni. U skupiny Cu-I se pr ůměrná koncentrace Zn snížila o 20,1 % a ve skupin ě Cu-O o 23,6 % ve srovnání s kontrolní skupinou. Tyto výsledky potvrzují negativní interakci mezi Cu a Zn bez ohledu na formu ve které je m ěď podávána.

147 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 1 Pr ůměrné hmotnosti a p řír ůstky u k ůzlat z jednotlivých pokusných skupin (C- kontrola; Cu-I suplementace CuSO4; Cu-O suplementace bioplexu Cu) od narození do konce experimentu (The average daily gain and weight of kids form individual experimental groups

from the day of birth till the end of experiment (C- control; Cu-I supplementation of CuSO4; Cu-O supplementation of bioplex Cu)) Hmotnost Přír ůstek věk p ři konec narození odstav odstavu od porodu od odstavu pokusu C x 3,67 17,19 23,18 a 68,20 0,105 aa 0,127 aa s 0,59 3,78 4,34 11,22 0,033 0,025 Cu-I x 3,99 19,17 27,33 a 64,70 aa 0,143 aa,b 0,156 aa,b s 0,53 1,48 2,25 1,77 0,021 0,013 Cu-O x 3,53 18,37 24,67 69,00 aa 0,111 b 0,137 b s 0,44 1,76 2,72 3,16 0,038 0,017 a p<0,05 aa p<0,01 (signifikantní rozdíl mezi skupinami ozna čenými stejnými písmeny v jednom sloupci)

Tab. 2 Koncentrace m ědi (mg/kg) a zinku (mg/kg) ve vybraných orgánech k ůzlat jednotlivých pokusných skupin (C- kontrola; Cu-I suplementace CuSO 4; Cu-O suplementace bioplexu Cu) (The concentration of copper (mg/kg) and zinc in organs of kids from individual

groups (C- control; Cu-I supplementation of CuSO 4; Cu-O supplementation of bioplex Cu) ) plíce pankreas myokard slezina Zn Cu Zn Cu Zn Cu Zn Cu C x 16,98 2,16 17,04 0,96 15,36 3,19 21,27 0,89 s 1,12 0,20 3,60 0,09 1,03 0,21 1,90 0,04 Cu-I x 16,53 2,16 17,11 1,02 15,16 3,20 22,12 0,89 s 0,88 0,18 1,51 0,07 0,99 0,18 0,79 0,06 Cu-O x 16,28 2,05 18,37 1,04 15,04 3,25 21,82 0,89 s 1,01 0,10 2,65 0,07 0,88 0,19 0,93 0,05

148 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 3 Koncentrace m ědi (mg/kg) a zinku (mg/kg) ve vybraných orgánech a tkáních k ůzlat jednotlivých pokusných skupin (C- kontrola; Cu-I suplementace CuSO 4; Cu-O suplementace bioplexu Cu) (The concentration of copper (mg/kg) and zinc in organs of kids from individual groups (C- control; Cu-I supplementation of CuSO 4; Cu-O supplementation of bioplex Cu)) s t e h e n n í j a z y k j á t r a l e d v i n y sval Zn Cu Zn Cu Zn Cu Zn Cu C x 24,97 0,60 28,03 0,74 42,20 aa,bb 45,73 A,B 16,94 2,30 s 4,45 0,11 4,95 0,14 7,03 12,31 1,19 0,13 Cu-I x 30,68 0,67 27,42 0,75 33,71 aa 109,17 A 16,39 2,39 aa s 14,78 0,15 3,19 0,09 3,13 27,13 0,60 0,08 Cu-O x 26,16 0,68 26,92 0,69 32,25 bb 110,16 B 15,94 2,22 aa s 5,67 0,17 5,86 0,15 5,24 7,08 0,75 0,09 aa p<0,01 A p<0,001 (signifikantní rozdíl mezi skupinami ozna čenými stejnými písmeny v jednom sloupci)

V naší studii jsme nezjistili rozdíly ve tká ňových koncentracích p ři suplementaci organické nebo anorganické m ědi. Obdobn ě Ward a kol. (1996) u skotu nepotvrdili vyšší využitelnost m ědi z organických zdroj ů u skotu p ři srovnání s anorganickými zdroji. Tito auto ři testovali rovn ěž r ůzné formy Cu p ři zvýšeném obsahu molybdenu v krmné dávce a v tomto pokuse již zvýšenou dostupnost Cu proteinátu oproti CuSO 4 zjistili. Vyšší koncentraci m ědi v játrech k ůzlat o 26 % zjistili p ři suplementaci síranu m ěď natého ve srovnání s proteinátem Mondal a kol. (2007). Tito auto ři sledovali rovn ěž koncentraci zinku

v játrech p ři r ůzných dávkách CuSO 4. P ři zvýšení suplementace z 10 mg/kg na 20 mg/kg došlo ke snížení koncentrace Zn v játrech, ale p ři zvýšení suplementace na 30 mg/kg byla zjišt ěna naopak nejvyšší koncentrace Zn v játrech. V našem pokuse jsme potvrdili negativní vliv suplementace Cu bez ohledu na formu na koncentraci Zn v játrech.

Záv ěr Suplementace m ědi od období b řezosti matek až do 2 m ěsíc ů po odstavu u k ůzlat zvýšila koncentraci m ědi v játrech, ale v ostatních orgánech a tkáních nebyla koncentrace mědi signifikantn ě ovlivn ěna. Suplementace Cu se negativn ě projevila na koncentraci zinku v

149 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 játrech. Mezi organickou a anorganickou formou nebyly zjišt ěny signifikantní rozdíly v koncentraci Cu a Zn v t ěle k ůzlat. Suplementace anorganické formy m ědi m ěla pozitivní vliv na intenzitu r ůstu, která byla signifikantn ě zvýšena ve srovnání jak s kontrolou tak i se skupinou dotovanou Cu-glycinátem (Cu-O).

Pod ěkování Práce byla realizována s podporou Výzkumného zám ěru MŠMT č. MSM 6215712402 a č. MSM 6215712403.

References Engle, T. E., Spears, J.W. Performance, carcass characteristics, and lipid metabolism in growing and finishing Simmental steers fed varying concentrations of copper. J. Anim. Sci., 2001, 79, 2920–2925. Linder, M. C., Donley, S., Dominiguez, D., Woooten, L., Mehrbod, F., Cerevza, P. a kol.: Copper transport and ceruloplasmin during lactation and pregnancy. In: Metals and genetics (Sarkar, B., ed.), Kluwer Academic/ Plenum, New York, pp 117–129 McArdle, H. J., Erlich, R. 1989: Copper uptake and transfer to the mouse fetus during pregnancy. J. Nutr ., 1989, 121, 208–214. Mondal, M. K., Biswas, P., Roy, B., Mazumdar, D., Effect of copper sources and levels on serum lipid profiles in Black Bengal (Capra hircus) kids. Small Rum. Res ., 2007, 67, 28- 35. Solaiman, S. G., Craig Jr., T. J., Reddy, G., Shoemaker, C. E. Effect of high levels of Cu supplement on growth performance, rumen fermentation, and immune responses in goat kids. Small Rum. Res., 2007, 69, 115-123. Solaiman, S. G., Shoemaker, C. E., D´Andrea G. H. The effect of high dietary Cu on health, growth performance, and Cu status in young goats. Small Rum. Res., 2006, 66, 85-91. Spears, J. W. Trace mineral bioavailability in ruminants, J. Nutr., 2003, 133, 1506-1509. Ward, J. D., Spears, J. W., Kegley, E. B. Bioavailability of Copper Proteinate and Copper Carbonate Relative to Copper Sulfate in Cattle. J. Dairy Sci., 1996, 97, 127-132.

150 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

MORPHOMETRIC PARAMETERS OF OVINE THYROID GLAND WITH DIFFERENT IODINE FOODBORNE INTAKE

1 Peksa Z. 1, Trávní ček J. 1 , Kone čný R. 1 , Jelínek F. 2 , Dušová H.

1University of South Bohemia, Faculty of Agriculture, Department of Veterinary Sciences and Quality of Products, Studentská 13, 370 05 České Bud ějovice, Czech Republic 2Veterinary Histopathological Laboratory, Sojovická 16, 197 00 Prague 19, Czech Republic

Abstract In years 2010 and 2011 were performed two experiments on young sheep of breed Šumavská ovce. Experimental feed mixtures with different iodine concentration (3, 5 and 10 mg I*kg DM) were fed for 11 months. The group with intake 10 mg I*kg DM received goiter causing substance too. The animals were slaughtered at the slaughterhouse after experiment and the thyroid gland was sampled. Samples were adjusted with classic method (in paraffin), colored with hematoxylin and eosin and histometric analysis was performed. Significant differents in thyroid weight were found. In group with the lowest iodine intake (3 mg) was found the lowest thyroid weight (3.74±0.37 g). The biggest thyroid weight (5.10±1.12 g) was found in group with iodine intake 5 mg. Between groups with intake 10 mg I (res. 10 mg and goiter causing substance) weren´t detected different in thyroid weight. The thyroid weight (4.89±0.79 g res. 4.60±1.10 g) was similar as in group with iodine intake 5 mg. Correlations between percentage behalf of follicular size categories and iodine foodborne intake were very hard.

Key words: histometry, follicle, epithelium, tyreocytes

Úvod Základními funkcemi štítné žlázy je tvorba, zadržování a následné uvol ňování hormon ů (tyroxinu a trijodtyroninu) do vnit řního prost ředí. Tyto hormony zásadním zp ůsobem ovliv ňují prakticky veškerý metabolismus organismu. Pro správnou funkci štítné žlázy je d ůležitý optimální p říjem jódu z prost ředí. Dlouhodobý nedostate čný nebo nadbyte čný p říjem se m ůže odrazit jak na zdravotním stavu zví řat ( či jejich mlá ďat), tak i na produkci.

151 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Při dlouhodob ě vysokém p říjmu dochází k snížení tvorby TSH. Následkem čehož dochází v po čátku ke zm ěnám v morfologii tyreocyt ů (snižování výšky epitelu), posléze dochází k hromad ění koloidu v luminu folikul ů, zv ětšování jejich rozm ěrů, a následn ě ke zvyšování hmotnosti celé štítné žlázy (Cunningham, 2002). V posledních letech byl zjišt ěn enormní vzestup obsahu jódu v mléce dojnic (Trávní ček et al, 2006; Hejtmánková et al., 2006), který byl zp ůsoben zvýšením koncentrace jódu v minerálních krmných dopl ňcích. Tento stav m ůže p řinášet pro n ěkteré konzumenty ur čitá riziky, byla zjišt ěna souvislost mezi nadm ěrným p říjmem jódu a rizikem vzniku některých onemocn ění štítné žlázy u lidí (Burgi, 2010; Guan et al., 2009; Dal Maso et al., 2009; Knobel et Medeiros-Neto, 2007). Naším cílem bylo experimentáln ě ov ěř it dopad diferencovaného alimentárního p říjmu jódu na morfometrické parametry štítné žlázy ovcí.

Materiál a metodika V roce 2010 a 2011 byly uskute čněny dva pokusy na jehnicích plemene Šumavská ovce. V obou pokusech byla zví řat ům podávána pokusná krmná sm ěs a ad libitum seno. V roce 2010 byla odebrána štítná žláza celkem od deseti jalových jehnic. Tato zví řata byla po dobu 11 m ěsíc ů experimentáln ě zatížena vysokou dávkou jódu. Pokusná skupina přijímala dávku 5 mg I na kg sušiny krmné dávky a kontrolní 3 mg I na kg sušiny krmné dávky. Pr ůměrná hmotnost jehnic byla 74-88 kg a pr ůměrný v ěk p ři porážce byl 24 m ěsíc ů. Do pokusu v roce 2011 bylo celkem za řazeno12 zví řat. Kontrolní skupina p řijímala v krmné dávce 10 mg I/kg sušiny KD, pokusné skupin ě byla podávána krmná sm ěs se stejným obsahem jódu, mimo to ješt ě obsahovala řepkový extrahovaný šrot a dusi čnan sodný (v dávce 1g/ks a den). Cílem experimentu bylo zjišt ění dopad p říjmu strumigenních látek (glykosinolát ů a dusi čnanu sodného) p ři sou časn ě vysokém p říjmu jódu na strukturu štítné žlázy jehnic. Po ukon čení obou pokus ů byla zví řata poražena, byla zjišt ěna hmotnost štítné žlázy a byl odebrán vzorek ze st ředu laloku štítné žlázy pro histologické zpracování, které bylo provedeno klasickou parafínovou metodou a následným barvením hematoxylinem a vodným eosinem. Histometrické m ěř ení bylo uskute čněno v programu pro obrazovou analýzu Leica IM 500 Version 4.0., kamera Leica DC 320 v kombinaci s mikroskopem Leica DM 2500. Ve třech zorných polích z různých částí řezu bylo zm ěř eno celkem 60 folikul ů (délka, ší řka, plocha). Sou časn ě byla zm ěř ena výška 20 tyreocyt ů. Následn ě byly zm ěř ené folikuly dle

152 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Jelínka et al. (2003) rozd ěleny do t ří kategorií podle velikosti na velké (175,1– 615,0 m), st řední (80,1–175,0 m) a malé (15,0–80,0 m) a vyhodnoceno jejich zastoupení. Výsledky byly zpracovány v programu STATISTICA 7.0. (StatSoft, Inc.) pomocí Anova a regresní a korela ční analýzy.

Výsledky a diskuze Zřeteln ě nejnižší hmotnost štítné žlázy byla zjišt ěna u skupiny jehnic p řijímajících v krmné dávce 3 mg jódu (3,74±0,37 g) (obr. 1). Naopak nejvyšší hmotnosti (5,10±1,12g) dosáhly štítné žlázy jehnic p řijímajících 5 mg jódu. Skupiny jehnic, které p řijímaly 10 mg jódu (res. 10 mg a řepkový extrahovaný šrot) se vzájemn ě nelišily (4,89±0,79 g res. 4,60±1,10 g). Byly zjišt ěny signifikantní rozdíly mezi skupinami jehnic p řijímajících 10 mg a skupinou, která p řijímaly 3 mg I (p<0,05). Hmotnost štítné žlázy u všech skupin odpovídala údaj ům Sovy (1981) či Kratochvíla (1998).

Obrázek 1 Pr ůměrná hmotnost štítné žlázy u jednotlivých skupin. (Average thyroid weight in experimental groups.)

a:b p<0,05

Nejnižší zastoupení velkých folikul ů bylo zjišt ěno u skupiny jehnic p řijímajících 3 mg I a to v porovnání se skupinami jehnic p řijímajících 5 mg i 10 mg jódu (res. 10 mg a strumigeny) (obr 2). V zastoupení st ředních folikul ů nebyly zjišt ěny mezi skupinami

153 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 výrazn ější rozdíly. Jen mezi skupinami s příjmem jódu 3 a 5 mg byl zjišt ěn statisticky významný rozdíl (p<0,01). Nejnižší zastoupení malých folikul ů bylo zjišt ěno u skupin, které p řijímaly 10 mg jódu (res. 10 mg a strumigeny). Mezi t ěmito skupinami nebyl zjišt ěn rozdíl. Vyšší hodnoty byly prokázány u skupin s příjmem 3 a 5 mg. Byly zjišt ěny statisticky významné rozdíly (p<0,01) a to jak mezi t ěmito dv ěma skupinami, tak i v porovnání s jehnicemi p řijímajícími 10 mg (10 mg a strumigeny). Jelínek et al. (2003) uvádí, že zvýšená metabolická aktivita je histologicky manifestována p řítomností malých folikul ů a zvýšením rozm ěrů tyreocyt ů. V tabulce 1 jsou uvedeny korela ční koeficienty mezi procentickým zastoupením jednotlivých kategorií folikul ů a alimentárním p říjmem jódu. Kó ňová et al. (1999) zjistila u jeh ňat p řijímajících dlouhodob ě chloridy v napájecí vod ě výrazné zvýšení po čtu malých folikul ů, v našem p řípad ě se alimentární p říjem strumigeních látek na tomto zvýšení neodrazil, naopak se projevilo statisticky nevýznamné snížení po čtu malých folikul ů.

Obrázek 2 Procentické zastoupení jednotlivých velikostních kategorií folikul ů. (Percentages representation of follicular size categories.)

a:b,c p<0,01; b:c; d:e p<0,05

154 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 1 Korela ční koeficienty mezi procentickým zastoupením jednotlivých velikostních kategorií folikul ů a alimentárním p říjmem jódu. (Correlation between follicular size categories percentages representation and foodborne iodine intake.) Závisle prom ěnná Nezávisle prom ěnná R2 Procento velkých folikul ů (%) Příjem jódu (mg I*kg -1 DM) 0,98 Procento st ředních folikul ů (%) Příjem jódu (mg I*kg -1 DM) 0,43 Procento malých folikul ů (%) Příjem jódu (mg I*kg -1 DM) -0,64

U skupiny jehnic p řijímající 3 mg jódu byly zjišt ěny menší rozměry folikul ů ve všech velikostních kategorií folikul ů. Rozdíl oproti ostatním skupinám zví řat byly statisticky významné (p<0,05). Nejv ětší folikuly v jednotlivých velikostních kategoriích folikul ů byly u skupin p řijímající 10 mg I (res. 10 mg a strumigeny) (mezi skupinami nebyl zjišt ěn žádný rozdíl). Nejv ětší rozdíly se projevily u skupin v rozm ěrech velkých a malých folikul ů v porovnání s dalšími skupinami.

Záv ěr Byly zjišt ěny rozdíly v pr ůměrné hmotnosti štítné žlázy zví řat mezi jednotlivými skupinami. Nejnižší hmotnost byla zjišt ěna u zví řat p řijímající 3 mg jódu na kg sušiny krmné dávky. Naopak nejvyšší hmotnosti dosáhly štítné žlázy u zví řat, která p řijímala 5 mg. U obou skupin, které p řijímaly 10 mg I (res. 10 mg I a strumigeny) dosáhla hmotnost štítné nižších hodnot oproti skupin ě p řijímající 5 mg, nebyl však zjišt ěn signifikantní rozdíl. Byly zjišt ěny významné rozdíly v zastoupení jednotlivých velikostních kategorií folikul ů mezi pokusnými skupinami, které siln ě korelovali s alimentárním p říjmem jódu. Nebyl zjišt ěn dopad strumigenních látek na procentické zastoupení jednotlivých velikostních kategorií u zví řat, které p řijímaly 10 mg I.

Pod ěkování Tento p řísp ěvek byl podpo řen granty NAZV QH 81 105 a GAJU 022/2010/Z.

Použitá literatura Burgi, H. Iodine exess. Best. Pract. Res. Cl. En ., 2010, 24(1), 107-115. Cunningham, J. G. Textbook of Veterinary physiology, 3rd edition, Saunders, 575 s, 2002. Dal Maso, L., Bosetti, C., La Vecchia, C., Franceschi, S. Risk factors for thyroid cancer: an epidemiological review focused on nutritional factors. Cancer Cause Control, 2009, 20(1), 75-86.

155 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Guan, H.X., Ji M., Bao R., Yu, H.Y., Wang, Y.G., Hou, P., Zhang, Y., Shan, Z.Y., Teng, W.P., Xing, M. Z. Association of High Iodine Intake With the T1799A BRAF Mutation in Papilary Thyroid Cancer. J. Clin. Endocr. Metab ., 2009, 94(5), 1612-1617. Hejtmánková, A., Kuklík, L., Trnková, E., Dragounová, H. Iodine concetrations in cow´s milk in Central and Northern Bohemia. Czech J. Anim. Sci ., 2006, 51(5), 189-195. Jelínek, F., Kraba čová, I., Kroupová, V. Assessment of functional activity of the bovine thyroid gland using morphometry and two markers of cellular proliferation. Acta Vet. Brno , 2003, 72(1), 11-16. Ko ňová, M., Békeová, E., Levkut, M. The effects of chlorine intake on some morphometric parameters of the thyroid gland in lambs. Acta Vet. Brno , 1999, 68, 191-195. Knobel, M., Medeiros-Neto, G. Relevance of Iodine Inatake as a Reputed Predisposing Factor for Thyroid Cancer. Arq. Bras. Endocrinol. Metab ., 2007, 51(5), 701-712. Kratochvíl, P. Morfological changes in the thyroid gland of livestock under different breeding conditions. (In Czech). Disertation, South Bohemia University, Faculty of Agriculture, České Bud ějovice, 175, 1998. Sova, Z. a kol. Fyziologie hospodá řských zví řat, 1. vyd., Praha, SZN, 511 s, 1981. Trávní ček, J., Herzig, I., Kurza, V., Kroupová, V., Navrátilová, M. Iodine content in raw milk, Vet. Med. Czech , 2006, 51(9), 448-453.

156 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

EFFECT OF T-2 TOXIN ON SOME PARAMETERS OF ANTIOXIDANT STATUS OF PORCINE BLOOD IN VITRO

Petruška, P.,Capcarová, M. Department of Animal Physiology, Faculty of Biotechnology and Food Sciences, Slovak University of Agriculture in Nitra

Abstract T-2 toxin, a trichothecene mycotoxin, is considered to be a one of the most toxic compounds that is produced by molds, particularly the Fusarium species. Mycotoxins can contaminate a large variety of feed mixtures, and could cause serious health problems to domestic livestock and humans when consumed. The aim of the present study was to investigate the effect of T-2 toxin on some antioxidants parameters (superoxide dismutase - SOD, glutathione peroxidase - GPx, bilirubin - BIL, albumins - ALB) in whole blood of porcine in vitro .Application of different dosage of T-2 toxin (10, 100 and 1000 mg.ml -1) has caused no significantdifference (P>0.05)inall following parameters compared with the control group.

Key words: T-2 toxin, antioxidants, SOD, GPx, albumins, bilirubin, porcine, blood.

Introduction Mycotoxins are natural and very stable toxins, with relatively low-molecular weight secondary metabolites of fungal origin, which can contaminate a large variety of feed mixtures (Labuda et al., 2009; Tan činová and Labuda, 2009) grains and foodstuffs worldwide, a variety of foods and beverages, including both plant-based products and animal products (Schollenberger et al., 2007; Ranzenigo et al., 2008). Trichotecenemycotoxins are very large family of chemically related toxins produced by various species of Fusarium, Myrotecium, Trichoderma, Cephalosporiu, etc.(Wannemacher and Neufeld, 1991). T-2 toxin is some of the most important and toxic trichothecenemycotoxinoccurring in various agriculture products (Iwahashi et al. 2008). Lipophilic nature of T-2 toxin suggests that they are easily absorbed through skin, gut, and pulmonary mucosa (Bunner and Morris, 1988). Trichotecene causes multiorgan effect including emesis, and diarrhea, weight loss, nervous disorders, cardiovascular alterations,

157 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 immunodepression, hemostaticderangements, skin toxicity, and bone marrow damage (Ueno, 1984; Wannemacher and Neufeld, 1991). The aim of the present study was to investigate the effect of T-2 toxin on antioxidants parameters (superoxide dismutase - SOD, glutathione peroxidase - GPx, bilirubin - BIL, albumins - ALB) in whole blood of porcine in vitro .

Materials and methods The blood was obtained from sexually mature porcineLarge white (APRC, Nitra). T-2 toxin (RomerLabsDivision Holding GmbH, Tulln, Austria) was added to blood samples at doses10, 100 and 1000 ng.ml -1(Table 1). The blood samples without addition of T-2 toxin served as control group (C).

Tab. 1 Application ofT-2 toxin in toblood in vitro Group T-2 toxin (ng.ml -1)

C 0 E1 10 E2 100 E3 1000

The blood was incubated for 5 hours at 37 oC.Enzyme activity (SOD – superoxide dismutase and GPx – glutathione peroxidase) was assayed by spectrophotometric analysis (Genesys 10, ThermoFisherScientificInc., USA), using commercial assay kit (Randox, Bratislava). Blood plasma was separated from whole blood by centrifugation at 3000 g for 10 min. Concentration of bilirubin (BIL) and albumins (ALB) were determined by automatic analyzer Microlab 300 (Merck®, Germany) and spectrophotometric analysis (Genesys 10, Thermo Fisher Scientific Inc., USA). SAS software and Sigma Plot 11.0 (Jandel, Corte Madera, USA) were used to conduct statistical analyses. One-way ANOVA was used to calculate basic statistic characteristics and to determine significant differences among experimental and control groups. Data presented were given as mean and standard deviation (SD). Differences were compared for statistical significance at the level P<0,05.

158 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Results and Discussion It is know that in general mycotoxins causeoxidative stress (Sehata et al., 2005) and this leads to peroxidation of membrane lipids and β-oxidation of fatty acids(Jaeschke et al., 2002).It has been shown that the administration of T-2 toxin caused a significant increase in respiratory burst of macrophages, which lead to the release of reactive oxygen species into the blood stream (Cooray and Johnsson, 1990). In this study we found no significant ( P>0.05) differences in all observed parameters (SOD, GPx, BIL and ALB) in comparison with control group. The activity of SOD was slightly higher in all experimental groups (E1,E2 and E3) in comparison with control group (C), however without statistical significance ( P>0.05). GPx was slightly higher in E1 and E3 group in comparison with control group, in E2 was activity of GPx lower when compared with control group (C) and experimental groups (E1 and E3) but this differences was not significantly. Content of BIL was higher in all experimental groups (E1, E2, E3). The highest content of BIL was observed in E3 group in comparison with control group (C) and experimental groups (E1, E2) but without statistical significance ( P>0.05).The content of ALB was slightly higher in all experimental groups (E1, E2 and E3) in comparison with control group (C), however without statistical significance ( P>0.05). In our previous research (Petruška et al., 2012)with T-2 toxin in a combination withresveratrol we found significantly( P<0.05)higher activity of SOD in experimental groups with compared to control group. Concentration of ALB and BILwere also significantly( P<0.05) higher in experimental groups. Damianaky et al.(2000) andHiroyuki et al. (2001)found that low concentrations of resveratrol showedhigh biological activity, hindering platelet aggregation and it has antioxidant activity.In this paper the application of T-2 toxin has not caused the significants differences in observed parameters in contrast with the previous study. Natural antioxidant like resveratrol has probably supportive effect and is able to maintain the antioxidant status of animal cells.In another in vitro study Medvedova et al. (2011) found that DON () has direct effect on secretion of growth factor IGF-I and steroid hormone progesterone in porcine granulosa cells. In different study Vilà et al.(2002)found that α-tocopherol was significantly lower for the T-2 toxin treated mice. The interaction between T-2 toxin and vitamin E suggests that toxin affects plasma vitamin E levels to a greater degree at low concentration compared with high dietary concentrations of the vitamin.These different results could be affected by different animals, concentration of doses and conditions of research.

159 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Figure 1 The activity of SOD of porcine Figure 2 The activity of GPx of porcine blood after/withoutActivity T-2 of toxin SOD exposure in blood after/withoutActivity T-2 of toxinGPx exposure in vitro vitro 10 1400

1200 8

1000

6 800

600 4 GPx in U/l SOD in U/ml SOD

400

2 200

0 0 C E1 E2 E3 C E1 E2 E3 C – control group Groups C – control group Groups E1 - 10 ng.ml -1, E2 – 100 ng.ml -1, E1 - 10 ng.ml -1, E2 – 100 ng.ml -1, E3 – 1000 ng.ml -1, Values are means ± SD E3 – 1000 ng.ml -1, Values are means ± SD

Figure 3 The content of BILof porcine Figure 4 The content of ALBof porcine blood after/withoutConcentration T-2 toxinof BIL exposure in blood after/withoutConcantration T-2 toxinof ALB exposure in vitro vitro 140 60

120 50

100 40

80 30 60 ALB in g/l in ALB BIL in µmol/l 20 40

10 20

0 0 C E1 E2 E3 C E1 E2 E3 C – control group Groups C – control group Groups E1 - 10 ng.ml -1, E2 – 100 ng.ml -1, E1 - 10 ng.ml -1, E2 – 100 ng.ml -1, E3 – 1000 ng.ml -1, Values are means ± SD E3 – 1000 ng.ml -1, Values are means ± SD

Conclusion In this paper the additions of T-2 toxin in different doses tothe porcine blood in in vitro caused no significantly differences in observed parameters of antioxidant status. To our knowledge there are not a lot of similar studies on effect of T-2 toxin in various doses given to the blood in vivo and its effect on antioxidant profile. Further investigation with different doses of T-2 toxinand combination with other substances will be worthy of further investigation.

Acknowledgments This work is financially supported by VEGA scientific grant 1/0790/11 and Vega 1/0084/12.

160 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

References Cooray, R., Johnsson, P. Modulation of resistence to mastitis pathogens by pretreatment of mice with T-2 toxin. Food Chem. Toxic. 28, 1990, 687-692. Damianaki, A., Bakogeorgou, E., Kampa, M., Notas, G., Hatzoglou, A., Panagiotou, S., Gemetzi, C., Kouroumalis, E., Martin, P.M., Castanas, E. Potent inhibitory action of red wine polyphenols on human breast cancer cells. J. Cell. Biochem. 78, 2000, 429–441. Hiroyuki, N., Yasuhiko, K., Yoshiko, U., Hideto, S., Nobuaki, S., Koshiro, H., Airo, T. Resveratrol inhibits human breast cancer cell growthand may mitigate the effect of linoleic acid, a potent breast cancer cell stimulator. J. Can. Res.and Clin. Oncol . 127,2001, 258-264. Jaeschke, H., Gores, G.J., Cederbaum, A.I., Hinson, J.A., Pessayre, D., Lemasters, J.J. Mechanisms of Hepatotoxicity. Toxicol. Sci . 2002, 65, 166-176. Labuda, R., Parich, A., Vekiru, E., Tan činová, D. Incident of fuminosis, moniliformin and Fusarium species in poultry feed mixtures from Slovakia. Ann. Agric. Environ. Med . 2009, 12, 81-86. Medvedova, M., Kolesarova, A., Capcarova, M., Labuda, R., Sirotkin, V.A., Kovacik, J., Bulla, J. The effect of deoxynivalenol on the secretion activity, proliferation and apoptosis of porcine ovarian granulosa cells in vitro. J. of Environ. Sci. Health, Part B. 46, 2011, 213-219. Petruška, P., Tušimová, E., Capcarová, M. Effect of resveratrol and T-2 toxin on antioxidant parameters of porcine blood. VI. Vedecká konferencia doktorandov s medzinárodnou účas ťou . Nitra : SPU v Nitre, 2012, 66-70. Ranzenigo, G., Caloni, F., Cremonesi, F., Aad, P.Y., Spicer, L.J. Effect of Fusarium mycotoxins on steroid production by porcine granulose cells. Anim. Reprod. Sci. 2008, 107, 115-130. Sehata, S., Kiyosawa, N., Atsumi, F., Ito, K., Yamoto, T., Teranishi, M., Uetsuka, K., Nakayama, H., Doi, K. MicroarrayAnalysisof T-2 Toxin-induced Liver, Placenta and Fetal Liver Lesions in Pregnant Rats. Exp.Toxic. Path . 57, 2005, 15-28. Schollenberger, M., Muller, H.M., Rufle, M., Terry-jara, H., Suchy, S., Plank, S., Drochner, W. Natural occurrence of Fusarium toxins in soy food marketed in Germany. Int. J. Food Microbiol . 2007, 113, 142-146. Tan činová, D., Labuda, R. Fungi on wheat bran and their toxinogenity. Ann. Agric. Environ. Med . 2009, 16, 325-331. Vila, B., Jaradat, Z.W., Marquard, R.R., Frohlich, A.A. Effect of T-2 toxin on in vivo lipid peroxidation and vitamin E status in mice. Food Chem. Tox. 40, 2002, 479-486.

161 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE EFFECT OF LOW DOSES OF 2,3,7,8-TETRACHLORODIBENZO-P-DIOXIN (TCDD) AND GENISTEIN ON EXPRESSION OF ARYL HYDROCARBON RECEPTOR PROTEIN IN PORCINE GRANULOSA CELLS

Piasecka J., 1 Kolomycka A., 1 Maruniakova N., 2 Bakova Z., 2 Ciereszko R. 1

1Department of Animal Physiology, University of Warmia and Mazury in Olsztyn, Poland 2Department of Animal Physiology, Slovak University of Agriculture in Nitra, Slovak Republic

Abstract Introduction: Endocrine disrupting chemicals (EDCs; e.g. dioxins, phytoestrogens) are present in the environment and influence reproduction by interfering with steroid hormone biosynthesis/secretion and/or receptor signaling and gene regulation. Dioxins and phytoestrogens are known to activate aryl hydrocarbon receptor (AhR) and estrogen receptor β (ER β), respectively. However, our preliminary data indicate that both dioxins and phytoestrogens may influence AhR mRNA expression. Additionally, a cross-talk between intracellular pathways activated by dioxins and phytoestrogens may occur in cells expressing both AhR and ER β. Therefore, the aim of the study was to examine the effect of low, environmentally relevant doses of dioxin (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin; TCDD) and/or phytoestrogen (genistein; GEN) on dynamic changes in AhR protein expression in porcine GCs isolated from medium (3-6 mm) and large, preovulatory ( ≥8 mm) follicles.

Methods: To determine changes in AhR protein expression, the cells (2×10 5/ 0.3 ml Eagle’s medium, 5% calf serum, 0.05 mg/ml gentamycin, 60 U/ml nystatin) were first pre- cultured for 40 hours, and then cultured with TCDD (100 pM) and/or GEN (500 nM) for additional 1, 3 or 24 hours. Following culture, cells were fixed in 4% paraformaldehyde and AhR protein expression was determined by fluorescence immunocytochemistry. Cells were analyzed by fluorescence microscopy and the intensity of the fluorescence was measured using NIS-Elements 3.0. One-way ANOVA followed by the least significant difference (LSD) post hoc test was used to compare the AhR protein expression among treatment groups.

Results: TCDD and GEN alone did not affect AhR protein expression in granulosa cells from medium follicles. However, the combined treatment of TCDD and GEN decreased (p ≤0.05) the intensity of AhR immunostaining in the cells after one hour of culture. In cells isolated from large follicles only GEN alone increased (p ≤0.05) AhR immunostaining after

162 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 one hour of culture. CONCLUSIONS: Changes in AhR protein expression appeared to be rapid and occurred shortly after cells exposition to TCDD and GEN. The Ah receptor pathway may be involved in the intracellular action of TCDD and GEN in porcine granulosa cells.

Supported by grants No. N N311 542040; N N303 815240; UWM 528.0206.0805.

163 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE LENGTH OF PREGNANCY IN WARMBLOOD MARES

Pospíšilová, D., Julínková, E., Sláma, P., Řezá č P.

Department of Animal Morphology, Physiology and Genetics, Agronomy Faculty, Mendel University in Brno

Abstract The study was aimed on the duration of pregnancy in mares in Czech Republic. The main part of this work was focused on the effect of mare age, the month of conceiving and the gender of the foal on the length of pregnancy. The age of mares and the month of conceiving had an effect on the length of pregnancy.

Key words: Pregnancy, Horse

Úvod Délka b řezosti klisen je významná z celé řady d ůvod ů. Jedním z nejd ůležit ějších je, že znalost variability trvání b řezosti je klí čová z hlediska p ředvídání nástupu porodu. U koní je prom ěnlivost délky b řezosti v ětší v porovnání s dalšími druhy hospodá řských zví řat (Bos a Van Der May, 1980). Jedním z důvod ů m ůže být, že délka b řezosti je pravd ěpodobn ě ovlivn ěna faktory, které neovliv ňují délku b řezosti u dalších druh ů. Zna čná variabilita délky březosti byla pozorována i u r ůzných plemen koní (Pérez et al., 2003). Faktor ů, které ovliv ňují délku b řezosti u koní, je celá řada. Bylo zjišt ěno, že m ůže být ovlivn ěna v ěkem klisen, po čtem oh řebení, výživou a pohlavím narozeného h říb ěte (Panchal, 1995; Davies- Morel et al., 2002; Vassilev et al., 2002). Cílem práce bylo zjištění vlivu v ěku klisen, m ěsíce zab řeznutí a pohlaví narozeného hříb ěte na délku b řezosti.

Materiál a metodika Práce byla provád ěna v letech 2007 až 2010. Bylo sledováno 430 klisen plemene český teplokrevník. Klisny pocházely od r ůzných majitel ů z ČR. Klisny m ěly pr ůměrný v ěk 11 rok ů, s rozmezím od 3 let do 23 let. V ětšina sledovaných klisen již v minulosti m ěla h říb ě, některé klisny však dosud nebyly b řezí. Po čet oh řebení u pokusných klisen se pohyboval v rozmezí 1 – 12. Diagnostika říje byla provád ěna u všech klisen za použití pohlavn ě dosp ělého h řebce. Klisny byly inseminovány veterinárním léka řem nebo insemina čním

164 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 technikem. Po inseminaci byla provád ěna raná diagnostika gravidity. U klisen, které se oh řebily, byla diagnostika říje provád ěna od 9. dne po porodu.

Výsledky Klisny, které m ěly 3 - 6 let, byly b řezí v pr ůměru 337 dní, s rozmezím od 320 do 358 dní. S věkem klisen se pr ůměrná délka b řezosti lineárn ě prodlužovala. Klisny ve v ěkovém rozmezí 16 - 23 let byly b řezí v pr ůměru 343 dní, s rozmezím od 316 do 381 dní. U klisen, které m ěly 3 - 6 let, byla zjišt ěna pr ůkazn ě kratší délka b řezosti oproti klisnám, které m ěly 16 - 23 let (P < 0,05). Byla zjišt ěna kladná korelace mezi v ěkem klisen dobou b řezosti (r = 0,16; P < 0,05). U klisen, které zab řezly v únoru, byla pr ůměrná délka b řezosti 346 dní, s rozmezím od 335 do 376 dní. Klisny, které zab řezly v b řeznu, byly b řezí v pr ůměrná 342 dní, s rozmezím od 316 do 365 dní. S přibývajícími dalšími m ěsíci se délka b řezosti postupn ě zkracovala. Nejkratší pr ůměrná délka b řezosti byla zaznamenána v červenci a to 333 dní, s rozmezím od 305 do 359 dní. V srpnu byla pr ůměrná délka b řezosti rovn ěž 333 dní, s rozmezím od 309 do 348 dní. U klisen, které zab řezly v únoru, byla pr ůměrná délka b řezosti pr ůkazn ě v ětší oproti klisnám, které zab řezly v červenci a srpnu (P < 0,05). V p řípad ě narození h řebe čků byla pr ůměrná délka b řezosti 340 dní, s rozmezím od 309 do 392 dní. V p řípad ě narození klisni ček činila pr ůměrná délka gravidity 339 dní, s rozmezím od 305 do 381 dní.

Záv ěr Na délku březosti teplokrevných klisen m ěl významný vliv m ěsíc zab řeznutí a v ěk klisen. S věkem klisen se prodlužovala délka b řezosti a s pokra čujícími m ěsíci od února do července až srpna se byla zaznamenána tendence k lineárnímu zkracování délky březosti.

Pod ěkování Práce byla zpracována za podpory výzkumného zám ěru č. MSM 6215648905.

Použitá literatura Bos, H., Van Der Mey, G.J.W., 1980. Length of gestation periods of horses and ponies belonging to different breeds. Livest. Prod. Sci . 7, 181–187. Davies-Morel, D.M.C., Newcombe, J.R., Holland, S.J., 2002. Factors affecting gestation length in the thoroughbred mare. Anim. Reprod. Sci . 74, 175–185.

165 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Panchal, M.T., Gujarati, M.L., Kavani, F.S., 1995. Some of the reproductive traits in Kathimares in Gujarat State. Indian J. Anim. Reprod . 16, 1. Pérez, C., Rodrýguez, J., Mota, J., Dorado, M., Hidalgo, M., Felipe, J., Sanz, G., 2003. Gestation length in Carthusian Spanish bred mares. Livest. Prod. Sci . 82, 181–187. Vassilev, D., Dimov, G., Tsankov, T., 2002. Direct, maternal and uncorrelated (co)variances for gestation length in Pleven Warmblood mares. In: 7th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, Montpellier, France.

166 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

CANINE BEHAVIOR IN OPEN SPACES

Řezá č, P., Šedivá, M., Sláma, P, Havlí ček, Z., Pospíšilová, D.

Deparment of Animal Morphology, Physiology and Genetics, Mendel University, Zemedelska 1, 61300 Brno, Czech Republic

Abstract The aim of the study was to analyze the dog behavior in public places. It was observed 412 dogs. Interactions were more frequently observed between puppies than between adult dogs. Male dogs more often interested in the interaction with female dogs than vice versa. Interactions were more frequently found between dogs which were led by women than men. Further research is needed to understand the behavior of dogs on walks.

Úvod Nedostatek pohybu je jednou z hlavních příčin nár ůstu civiliza čních chorob spojených s obezitou (Bauman, 2004). Procházky jsou nenáro čnou fyzickou aktivitou, která může kladn ě ovlivnit lidské zdraví. Bylo zjišt ěno, že vlastníci ps ů v porovnání s ostatními lidmi tráví více času formou mírné fyzické aktivity (Brown and Rhodes, 2006). Existuje řada faktor ů, které stimulují majitele k procházkám se svými psy. Sou časn ě je však i celá řada faktor ů, které na n ě p ůsobí zcela opa čně. Psi na procházkách se svými majiteli totiž p řicházejí do kontaktu s cizími psy. S tím souvisí fakt, že řada majitel ů se bojí útoku cizích ps ů na jejich psa (Cutt et al., 2007). Poznatky o tom, jak se chovají psi p ři vzájemných setkáních na procházkách v parcích a dalších ve řejn ě p řístupných místech, jsou dosud útržkovité (Westgarth et al., 2008). Práce je zam ěř ena na nej čast ější interakce mezi psy na ve řejných prostranstvích.

Materiál a metody Pozorování bylo uskute čněno na 412 psech r ůzných plemen. Sledování ps ů probíhalo v pr ůběhu roku 2011. Pozorování bylo provád ěno v Brn ě v oblastech s vyšší frekvencí výskytu ps ů. Místem pozorování byly parky, které jsou často využívány k procházkám se psy. Dále bylo sledování uskute čněno v dalších vhodných lokalitách pro vycházky se psy. Chování ps ů bylo pozorováno od okamžiku, kdy si jeden pes všimnul druhého psa, a probíhalo až do okamžiku, kdy psi nebo majitelé setkání ukon čili nebo si psi za čali hrát. Bylo sledováno vzájemné o čichávání a rovn ěž reakce ps ů na o čichávání. Pozorován byl také zájem

167 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 o hru. Zaznamenáno bylo také zna čení mo čí, které prob ěhlo v souvislosti se vzájemným setkáním. Všechna pozorování byla provád ěna pozorovatelem, který žádným zp ůsobem neovliv ňoval chování sledovaných ps ů a ani jejich majitel ů. Informace byly shromaž ďovány písemn ě a následn ě p řepsány do Excelu. P ři analýze faktor ů ovliv ňujících chování pozorovaných dvojic ps ů byly vyhodnoceny následující vlivy: zp ůsob vedení psa, v ěk a pohlaví psa a pohlaví majitele. Vliv jednotlivých faktor ů byl testován chí-kvadrát testem.

Výsledky Při setkání dvou ps ů vedených na vodítku bylo vzájemné o čichávání čast ěji pozorováno mezi psy opa čného než stejného pohlaví (P < 0,05). Tento rozdíl však nebyl zaznamenám mezi jedinci vedenými na volno. V ěk ps ů nem ěl pr ůkazný vliv na o čichávání ps ů vedených na vodítku ani na volno. P ři setkání dvou ps ů vedených na volno dv ěma ženami bylo o čichávání pozorováno čast ěji než p ři setkání dvou ps ů vedených muži (P < 0,05). Při setkání dvou ps ů vedených na vodítku čast ěji zna čil pes, když potkal fenu (P < 0,01), než naopak. V ěk ps ů nem ěl pr ůkazný vliv na zna čení ps ů vedených na vodítku ani na volno. P ři setkání dvou ps ů vedených na volno nebyl zjišt ěn vliv pohlaví majitele na zna čení ps ů. Podobné zjišt ění bylo dosaženo i u ps ů vedených na vodítku. Při setkání dvou ps ů vedených na vodítku si jedinci r ůzného pohlaví hráli čast ěji než jedinci stejného pohlaví (P < 0,001). Št ěň ata vedená na vodítku i na volno si hrála čast ěji než dosp ělí a sta ří psi (P < 0,01). P ři setkání dvou ps ů vedených na volno dv ěma ženami byla hra pozorována čast ěji než p ři setkání dvou ps ů vedených muži (P < 0,01).

Záv ěr Interakcím mezi psy v parcích a dalších ve řejných prostranstvích byla dosud v ěnována malá pozornost. Znalost p řirozených projev ů ps ů p ři vzájemných komunikujících na ve řejných prostranstvích m ůže kladn ě ovlivnit rozhodovací proces majitel ů ps ů, zda chodit či nechodit se psem na procházky.

Pod ěkování Práce byla zpracována za podpory výzkumného zám ěru č. MSM 6215648905.

168 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Použitá literatura Bauman, A.E. Updating the evidence that physical activity is good for health: an epidemiological review 2000-2003. J . Sci. Med. Sport , 2004, 7, 6-19. Brown, S.G., Rhodes, R.E. Relationships among dog ownership and leisure-time walking in Western Canadian adults. Am. J. Prev. Med ., 2006, 30, 131-136. Cutt, H., Giles-Corti, B., Knuiman, M., Burke, V. Dog ownership, health and physical activity: a critical review of the literature. Health Place , 2007, 13, 261-272. Westgarth, C., Pinchbeck, G.L., Bradshaw, J.W., Dawson, S., Gaskell, R.M., Christley, R.M. Dog-human and dog-dog interactions of 260 dog-owning households in a community in Cheshire. Ve t. Rec ., 2008, 162, 436-442.

169 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

INFLUENCE OF THE SPECIES AND CONSERVATION ADDITIVES ON THE QUALITY AND SAFETY OF SILAGES

Skládanka, J. 1, Ned ělník, J. 2, Doležal, P. 1, Lindušková, H. 2, Nawrath, A. 1.

1Ústav výživy zví řat a pícniná řství. Mendelova univerzita v Brn ě, 2Výzkumný ústav pícniná řský , s. r. o. Troubsko

Abstract The work evaluate occurrence of ergosterol and mycotoxins in green matter of grasses and their silages. A higher occurrence of mycotoxins in the feed may be expected and the related damage to animal metabolism may affect the number of diseased animals and/or diagnostics of animal diseases with consequent impact on animal production efficiency, health of animals and breeding economics. Mycotoxins were detected in all evaluated samples. Deoxynivalenol, zeralenone and T2 toxin were detected in green matter and silages. Increase of ergosterol content (P<0.05) over the year is indicative growing contamination of matter with mold. However between of ergosterol content and mycotoxins content was not correlation. Lower content of ergosterol (P<0.05) was at Festulolium pabulare . Use of silage additives did not decrease content of mycotoxins.

Úvod Zimní krmná dávka m ůže být založena na konzervované píci z travních porost ů. Ve srovnání s výrobou sena je výroba siláží spojena s nižšími ztrátami a není tak závislá na pov ětrnostních podmínkách (Achilles et al., 2002). Využití biologických inkulant ů m ůže přisp ět ke zvýšení kvality fermenta čního procesu (Jatkauskas et al., 2010). Silážní aditiva ovšem ne řeší všechny problémy. P ředpokladem výroby zdravotn ě bezpe čných siláží je čistá a zdravá fytomasa (Holubek et al., 2007). Rozvoj mikrokopických hub m ůže souviset s tvorbou mykotoxin ů (Opitz von Boberfeld et al., 2006). Sekundární metabolity hub jsou p říčinou ekonomických ztrát a poklesu kvality živo čišných produkt ů, v neposlední řad ě negativn ě ovliv ňují zdravotní stav zví řat (Opitz von Boberfeld, 1996). V zelené píci z travních porost ů může být detekován zearalenon nebo deoxynivalenol (Skládanka et al., 2011). Z pole přechází tyto mykotoxiny do siláží. Zvýšená tvorba nastává za chladn ějšího a vlh čího po časí ve vegeta čním období (Thalmann, 1986). Vedle p římého p ůsobení na p řežvýkavce ovliv ňuje kontaminovaná píce také mikroorganismy v bachoru (Wolf, 2002). P řítomnost plísní je možné detekovat prost řednictvím ergosterolu. Ergosterol pat ří mezi hlavní steroly

170 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 produkované nižšími i vyššími houbami. Jeho výskyt v jiných organismech je velmi omezený, pouze v n ěkterých bakteriích a kvasinkách byly nalezeny zanedbatelné koncentrace ergosterolu v sušin ě. Díky tomuto specifickému výskytu je prakticky možné spojit nález tohoto sterolu s p řítomností plísní ve zkoumaném vzorku (Marin et al., 2007). Cílem práce je posoudit obsah ergosterolu a mykotoxin ů v zelené píci a silážích ošet řených r ůznými silážními aditivy.

Materiál a metody Prvním hodnoceným faktorem byl travní druh (TD): Lolium perenne (cv. Kentaur), Festulolium pabulare (cv. Felina), Festulolium braunii (cv. Perseus) a sm ěsi t ěchto druh ů s Festuca rubra (cv. Gondolin) nebo Poa pratensis (Slezanka). Travní porosty byly využívány jako t říse čné, termíny odb ěru (TA) byly po čátkem června, po čátkem července a koncem vegeta čního období (postupné odb ěry v říjnu, listopadu a prosinci). Píce z první se če byla využita pro výrobu siláží. Trávy zavadaly po dobu 20 – 30 hodin. V této souvislosti bylo dalším hodnoceným faktorem použité silážní aditivum (SA): kontrolní neošet řené siláže, chemický konzervant (kyselina mraven čí, kyselina propionová) a probioenzymatický inokulant ( Enterococcus faecium , Lactobacillus plantarum , Pediococcus acidilactici, Lactobacillus salivarius , celuláza. Hemiceluláza a amyláza), (1x10 11 CFU; 10 g.t -1). Dávka chemického aditiva byla 4 l.t -1 a dávka biologického aditiva byla 10 g.t -1. Biomasa byla konzervována v kontejnerech o pr ůměru 0,15 m a výšce 0,64 m. Mykotoxiny byly stanoveny metodou ELISA, hodnocen byl obsah deoxynivalenolu (DON), zearalenonu (ZEA), fumonisinu (FUM), aflatoxinu (AFL) a T2 toxinu (T2), (Ned ělník a Moravcová, 2006). Ergosterol byl stanoven na HPLC podle Dohnala et al. (2007). Data byla vyhodnocena statistickým softwarem STATISTICA.CZ, verze 8.0. Výsledky jsou vyjád řeny jako pr ůměrné hodnoty (x). Rozdíl mezi pr ůměry byl hodnocen metodou ANOVA a následným testováním Tukeyovým testem.

Výsledky a diskuse Festulolium pabulare m ělo ve srovnání s ostatními druhy nižší obsah ZEA (Tab. 1). Odolnost tohoto druhu v ůč i houbovým chorobám dokazuje obsah ergosterolu. Jeho obsah byl u Festulolium pabulare nižší (P<0,05) než u Festulolium braunii . Obsah ergosterolu se postupn ě zvyšoval (P<0,05) od června až do prosince. Naproti tomu v případ ě mykotoxin ů je zřejmý vysoký (P<0,05) obsah DON v červenci a vysoký (P<0,05) obsah ZEA v červenci a

171 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

říjnu. I p řes vysoký (P<0,05) obsah ergosterolu v listopadu a prosinci byl v těchto m ěsících zaznamenán nízký (P<0,05) obsah ZEA. Tato skute čnost m ůže souviset s poklesem teplot, kdy se u plísní snižuje produkce mykotoxin ů, které jsou obecn ě reakcí na stres související s vyššími teplotami. V zelené píci z první se če (Tab. 2) byly detekovány mykotoxiny deoxynivalenol a T2 toxin. Ostatní hodnocené mykotoxiny fumonisiny, aflatoxiny a zearalenon byly pod hranicí detekce (

Druh (TD) Lolium perenne 46,02 34,06 76,61 ab Festulolium pabulare 37,78 9,82 35,65 a Festulolium braunii 33,83 72,85 82,53 b Mixture with Festuca rubra 46,60 91,81 71,71 ab Mixture with Poa pratensis 45,55 96,24 68,05 ab Termín odb ěru (TA) Červen 12,34 a 0,0 a 3,84 a Červenec 71,43b 122,3 ab 13,07 a Říjen 52,95 bc 173,0 b 31,87 a Listopad 51,71 bc 3,7 a 94,94 b Prosinec 21,35 ac 5,8 a 190,82 c Rok (R) 2008 37,63 115,76 a 68,50 2009 46,28 6,15 b 65,31 Pr ůměrné hodnoty ve sloupcích s různými horními indexy ( a,b,c )jsou pr ůkazné na hladin ě P<0,05

172 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 2 Obsah deoxynivalenolu (DON), fumonisinu (FUM), aflatoxinu (AFL), zearalenonu (ZEA), T-2 toxinu (T2) a ergosterolu (ERGO) v zelené píci trav (Contents of deoxynivalenol (DON), fumonisin (FUM), aflatoxin (AFL), zearalenone (ZEA) and ergosterol (ERGO) in green matters of grasses) Faktor DON FUM AFL ZEA T2 ERGO (ppb) (ppb) (ppb) (ppb) (ppb) (mg.kg -1 suš.) Druh (TD) Lolium perenne 19,80

Tab. 3 Obsah deoxynivalenolu (DON), fumonisinu (FUM), aflatoxinu (AFL), zearalenonu (ZEA), T-2 toxinu (T2) a ergosterolu (ERGO) v silážích (Content of deoxynivalenol (DON), fumonisin (FUM), aflatoxin (AFL), zearalenon (ZEA), T-2 toxin (T2) and ergosterol (ERGO) in grass silages) Faktor DM DON FUM AFL ZEA T2 ERGO (%) (ppb) (ppb) (ppb) (ppb) (ppb) (mg.kg -1 suš.) Druh (TD) Lolium perenne 30,17 141,39

173 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Záv ěr Již p ři hodnocení zelené píce byl na poli zaznamenán výskyt mykotoxin ů. Jednalo se zejména o deoxynivalenol a T2 toxin. Obsah zearalenonu byl v období sklizn ě po čátkem června pod hranicí detekce (

Pod ěkování Práce byla zpracována s podporou grantu Národní agentury pro zem ědělský výzkum č. QH71041 „Vliv patogenních mikroorganism ů a jejich sekundárních metabolit ů na kvalitu a hygienickou nezávadnost objemných krmiv“.

Použitá literatura Achilles, W., M. Golze, H. J. Herrmann, W. Opitz von Boberfeld, R. Wassmuth a K. Zeeb. Ganzjährige Freilandhaltung von Fleischrindern, Darmstadt, KTBL, 2002. Dohnal, V., Kaderová, I., Ježková, A., Skládanka, J. Obsah ergosterolu u vybraných druh ů trav na konci vegeta čního období. Acta univ. Agric. et silvic. Mendel. Brun., 2007, 55, 9 - 14. Holúbek, R, J. Jan čovi č, H. Gregorová, J. Novák, E. Ďurková a L. Vozár. Forages - management of forage growing and utilization, Nitra, SPU Nitra, 2007. (In Slovak) JATKAUSKAS, J., Vrotniakiene, V., Aragón, Y.A. Fermentation quality and nutritive value of grass-legume silage treated with inoculant BioStabil Plus. In 14th International Symposium Forage Conservation, Brno, Mendel University in Brno, 2010, 45–47. Marin, S., Vinaixa, M., Brezmes, J., Llobet, E., Vilanova, X., Correig, X., Ramos, A. J., Sanchis, V. Use of a MS-electronic nose for prediction of early fungal spoilage of bakery products. Int. J. Food Microbiol., 2007, 114, 10-16.

174 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Ned ělník, J., Moravcová, H. Mycotoxins and forage crops . Problems of the occurrence of mycotoxins in animal feeds. In 12th International Symposium Forage Conservation, Brno, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 2006, 15–25. Opitz von Boberfeld, W., K. Banzhaf, F. Hrab ě, J. Skládanka, S. Kozlowski, P. Golinsky, L. Szeman a J. Tasi. Effect of different agronomical measures on yield and quality of autumn saved herbage during winter grazing – 2nd communication: Crude protein, energy and ergosterol concentration. Czech J. Anim. Sci., 2006, 51, 271–277 Opitz von Boberfeld, W. Changes of the quality including mycotoxin problems of the primary growth of a hay meadow – Arrhenatherion elatioris . Agribiol. Res., 1996, 49, 52–62. Skládanka, J., Ned ělník, J., Adam, V., Doležal, P., Moravcová, H., Dohanl, V. Forage as a primary source of mycotoxins in animal diets. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2011, 8, 37-50. Thalmann, A. Fusarientoxine in Futtermitteln und Lebensmittelrohstoffen. Agrar- und Umweltforschung in Baden-Württemberg. Stuttgart, Verl. Eugen Ulmer Stuttgart, Bd. 14, 1986. Wolf, D. On the effect of stand, pre-utilization and date of winter harvest on quality and yield of winter pasture. PhD. Thesis, Justus Liebig University, Giessen, 2002.

175 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

EXPRESSION OF CD14 SURFACE RECEPTOR ON APOPTOTIC RESIDENT AND INFLAMMATORY MACROPHAGES FROM BOVINE MAMMARY GLAND

Sladek Z. 1, Rysanek D. 2

1 Department of Animal Morphology, Physiology and Genetics, Mendel University in Brno 2 Department of Immunology, Veterinary Research Institute in Brno

Abstract This paper investigates the association between expression of CD14 and occurrence of apoptosis in resident ( RES MAC) and inflammatory ( INF MAC) macrophages (MAC) from heifer mammary glands. Our experiments confirmed that the expression of CD14 in bovine mammary gland macrophages is strongly associated with cell vitality. The higher CD14 expression is equal to the higher proportion of dead cells. Further studies will be needed in order to establish a cause and exact effect of CD14 expression on apoptosis, particularly in situ during inflammatory response.

Introduction In the healthy mammary gland of heifers, macrophages are the predominant cell type (Wardley et al., 1976). These cells are generally known to be critical mediators both of innate and adaptive immunity against bacterial infections. CD14, a glycosylphosphatidylinositol- linked receptor, serves as a key receptor for Gram-negative and Gram-positive bacteria. In blood mononuclear cells, the expression of CD14 is strongly associated with cell vitality. It was observed that the activating stimuli (IL-1, TNF-α, LPS) which are able to enhance CD14 expression, rescue blood monocytes from programmed cell death - apoptosis (Haidenreich et al., 1997). However, the question is whether we can expect anti-apoptotic effects of CD14 also in mammary gland macrophages in situ in comparison to blood monocytes in vitro. Therefore, the aim of the presented study was to evaluate a possible relationship between the apoptosis and CD14 expression in different types of macrophages obtained before and after the inflammatory response induced by CD14 dependent and independent agents.

Materials and methods The experiments were carried out on eight virgin, clinically healthy, Holstein x Bohemian Red Pied crossbred heifers, aged 15 to 18 months. Three samples of mammary

176 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 gland macrophages were obtained. The first sample was obtained from untreated mammary glands of heifers (resident - RES MAC), the second sample from mammary gland following

PBS infusion, and the third sample following LPS infusion (inflammatory - INF MAC). A modified urethral catheter (AC5306CH06, Porges S.A., France) was inserted into the teat canal of each quarter after thorough disinfection of the teat orifice with 70% ethanol. Each mammary quarter was infused with 20 mL of PBS, massaged and containing resident cell population was retrieved through the catheter. Immediately after harvesting resident cells, the mammary glands were infused as before with 20 mL of PBS or 10 µg of LPS (LPS of Escherichia coli serotype O128:B12, Sigma, St. Louis, Mo., USA) diluted in 20 mL of PBS. Samples of the mammary gland inflammatory cell populations were obtained by lavage 24 h after treatment. Immediately after harvesting, macrophages were divided into two parts. The first one was immediately analyzed as a fresh population. The reminder samples were incubated in vitro . The blood and mammary gland cells adjusted suspensions were inserted into Corning microplates (Costar Ultraplates, Myriad Industries, CA, USA) and were incubated at 37°C in thermostat with a

5% CO 2 atmosphere for up to 6 h in accordance with Newman et al. (1982). Flow cytometry (FCM) analysis was used for determination of the differential counts, for detection of apoptosis and necrosis in cells, and for detection of CD14 expression in apoptotic and necrotic cells. Instrument setting for FCM was set to analyze 20,000 cells per sample. Final dot plots were evaluated qualitatively and quantitatively using the CellQuest software analysis (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Apoptotic and necrotic macrophages were analyzed after being simultaneously stained with Annexin-V labeled with FITC and propidium iodide (PI) as described by Vermes et al. (1995). Moreover, we used tricolor labeling for detection of CD14 expression in apoptotic and necrotic monocytes and macrophages. The FCM analysis strategy for identifying one color positive - living cells (CD14 +/AnnexinV -/PI -), two color positive - apoptotic (CD14 +/AnnexinV +/PI -), and three color positive - necrotic cells (CD14 +/AnnexinV +/PI +) is illustrated in Figure 1.

177 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Figure 1.

Results The proportions of macrophages, CD14+, apoptotic and necrotic cells in all fresh macrophage populations (Tab. 1).

Tabl. 1 The differential count and proportion of CD14 +, apoptotic and necrotic cells in fresh

population of RES MAC and INF MAC Fresh cell populations Differential CD14+ Apoptotic Necrotic cells count a cells b cells b cells b Monocyte- 27.3 ± 7.6 57.9 ± 12.1 6.2 ± 2.2 2.3 ± 1.2 MAC like cells RES Vacuolized 29.7 ± 5.5 77.4 ± 17.1 22.9 ± 5.1 16.5 ± 7.3 cells Monocyte- INF MAC 15.5 ± 4.2 59.6 ± 14.1 3.2 ± 1.2 3.8 ± 1.2 after PBS like cells Vacuolized 5.5 ± 2.2 56.3 ± 9.6 3.1 ± 1.1 11.1 ± 4.6 cells Monocyte- INF MAC 3.1 ± 1.1 39.2 ± 8.1 5.3 ± 2.1 10.3 ± 4.4 after LPS like cells Vacuolized 2.7 ± 1.7 44.3 ± 6.3 5.5 ± 1.7 15.3 ± 3.8 cells aThe differential cell count was set from all cell types presented in mammary gland (macrophages, neutrophils and lymphocytes). bThe proportions of CD14+, apoptotic and necrotic cells were determined from macrophage populations only.

178 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 2 In vitro time-dependent proportion of live, apoptotic and necrotic cells in population of CD14+ macrophages measured by tricolor immunofluorescence in flow cytometry.

Live cells Apoptotic cells Necrotic cells

Monocyte-like 85.1 → 77.4* 11.2 → 18.1* 3.7 → 4.5 CD14+ cells

RES MAC Vacuolized cells 80.5 → 74.6 13.2 → 13.3 6.3 → 12.1*

Monocyte-like 86.4 → 71.8* 10.5 → 15.5* 3.1 → 12.7 * CD14+ cells

INF MAC - PBS

Vacuolized cells 57.9 → 43.7 28.5 → 37.9 13.6 - 18.4

Monocyte-like 54.3 → 38.4 23.3 → 26.1 22.4 → 35.5 cells CD14+

INF MAC - LPS

Vacuolized cells 25.2 → 14.2* 12.5 → 14.3 62.3 → 71.5

Data are mean in percentages and significant differences are marked by asterisks (* P < 0.05, ** P < 0.01, Scheffé´s method). The comparisons were made among 0 hour samples relative to 6 hour samples during cultivation in vitro .

As is evident from the results of tricolor labeling (Tab. 2), in population of CD14+ macrophages were observed differing proportions of living, apoptotic and necrotic cells. While in population of CD14- macrophages we were observed mostly living cells. In CD14+ macrophages, the highest proportion of living cells was observed in monocyte-like INF MAC after PBS and the smallest in vacuolizated INF MAC after LPS. In vitro cultivation leads to decrease the proportion of living cells in all categories of macrophages. However, significant differences were observed only in monocyte like RES MAC ( P < 0.05), monocyte like INF MAC after PBS ( P < 0.01) and finally in vacuolized INF MAC after LPS ( P < 0.05). In CD14+ macrophages, the highest proportion of apoptotic cells was observed in vacuolized INF MAC after PBS. In contrast to living cells, in vitro cultivation leads to increase the proportion of apoptotic cells in all categories of macrophages. Interestingly, this increase was significant

only in monocyte like RES MAC ( P < 0.05). In CD14+ macrophages, the highest proportion of necrotic cells was observed in vacuolized INF MAC after LPS. Similarly to apoptotic cells, in vitro cultivation leads to leads to increase the proportion of necrotic cells in all categories of

179 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

macrophages, except vacuolized INF MAC after PBS. However, the increase was significant only in vacuolized RES MAC ( P < 0.05) and in monocyte like INF MAC after PBS (P < 0.05).

Conclusion The analysis of CD14+ macrophages revealed that almost all apoptotic and necrotic macrophages were CD14+ cells. In all categories of CD14+ macrophages, proportion of live cells decreased, and proportion of apoptotic and necrotic cells was increased during cultivation. This is very interesting situation, because it suggests that the increase of CD14 expression is due to the increase of apoptotic and necrotic cells. Thus, our experiments confirmed that the expression of CD14 in bovine mammary gland macrophages is strongly associated with cell vitality. The higher CD14 expression is equal to the higher proportion of dead cells. Further studies will be needed in order to establish a cause and exact effect of CD14 expression on apoptosis, particularly in situ during inflammatory response.

Acknowledgements This study was supported by the Ministry of Agriculture of the Czech Republic (MZE 0002716201).

References

Heidenreich, S. M., Schmidt, C., August, P,. Cullen, A., Rademaekers, Pauels, H. P. Regulation of human monocyte apoptosis by the CD14 molecule. J. Immunol ., 1997, 159, 3178-3188. Wardley R.C., Rouse B.T., Babiuk L.A. The mammary gland of the ox: a convenient source for the repeated collection of neutrophils and macrophages. J. Reticuloendothel. Soc . 19, 29-36.

180 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE EFFECT OF DIOSMECTITE SUPPLEMENTATION ON IMMUNE RESPONSE IN WEANED PIGLETS

Slámová, R., 1 Sláma, P., 2 Přikrylová -Vondrušková, H., 1 Tr čková, M., 1 Zralý, Z., 1 Pavlík, 2 A. , Pavlík , I. 1 1 Department of Food and Feed Safety, Veterinary Research Institute, Brno, Czech Republic 2 Department of Animal Morphology, Physiology and Genetics, Mendel University in Brno, Czech Republic

Abstract The aim of this study was to assess the effect of diosmectite supplementation on the course of post-weaning diarrhoeal infection in piglets. Twenty four weaned piglets at the age of 28 days were divided into two dietary treatments: control (C) and smectite (S). Piglets were fed a basal starter diet without (C) or with (S) 2% of diosmectite for 20 days. At the end of the trial, 2 piglets from each group were slaughtered and samples of blood and small intestine were taken. In our trial diosmectite was not effective in alleviation or shortening of diarrhoea in weaned piglets. However, diosmectite supplementation had a positive effect on intensity and course of intestinal inflammation. There were no observations of enteritis or only light chronic form of enteritis in the smectite group contrary to the control group with sub-acute or chronic enteritis. The influence of diosmectite supplementation on the inflammatory response (production of TNF-α and TGF-β1) was recorded.

Introduction The weaning period is one of the most important and crucial period in pig breeding. The transition from mother’s milk to dry feed and stress factors of weaning result in development of diarrhoeal diseases. In weaning pigs diarrhoeal diseases are mainly caused by enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) and they are by far the most common diseases in weaning period and considered as a major economic problem (Melin et al., 2004; Vondruskova et al., 2010). Dioctahedral smectite (diosmectite) is a natural aluminomagnesium silicate clay effectively used in the treatment of infectious diarrhoea (Gonzalez et al., 2004; Slamova et al., 2011). Its anti-diarrhoeal properties involve the adhesion to digestive mucus and absorption of toxins. Diosmectite has the capacity to absorb endotoxins, exotoxins, bacteria and rotaviruses (Szajewska et al., 2006). A multifactorial effect of this mineral is supposed, however, the mechanism of action of diosmectite has not been fully explained yet (Dupont

181 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 and Vernisse, 2009). Clinical studies demonstrated that diosmectite alleviated the symptoms of acute diarrhoea and shortened its duration (Szajewska et al., 2006), reduced the frequency of liquid stools and long-lasting diarrhoeal episodes (Gonzalez et al., 2004). Smectite also alters the activity of bile salts and physical properties of gastric mucus, which prevents mucolysis induced by bacteria (Szajewska et al., 2006). Pathogenic bacteria that penetrate the intestinal epithelial barrier stimulate an inflammatory response in the intestinal mucosa. A number of different cell types produce cytokines that play an essential role in intercellular communication (Jung et al., 1995). This coordinate regulation of specific groups of cytokines has important consequences for the host response to microbial pathogens since resistance or susceptibility can correlate closely with the specific group of cytokines expressed. The levels of inflammatory cytokines may suggest the course of inflammation. Cytokines can be categorized based on their major activities. For example, the cytokines TNF-α, IL-1 and GM-CSF can activate a spectrum of proinflammatory effects, whereas cytokines such as TGF-β1 and IL-10 can mediate effects that down-regulate inflammatory responses (Wahl, 1992; Slama et al., 2011). Gonzalez et al. (2004) presented that diosmectite was effective in controlling hapten-induced colonic inflammation, through a mechanism that may involve adsorption of proteins, mucus protection and possibly a direct modulation of the production of proinflammatory mediators by the colonic mucosa. Therefore the present study deals with immune response after diosmectite supplementation during the diarrhoeal infection caused by ETEC.

Material and Methods The effect of diosmectite and diarrhoeal infection on immune response was evaluated by the estimation of cytokines TNF-α as the pro-inflammatory cytokine, and TGF-β1 cytokine that represents anti-inflammatory cytokine group. Twenty four weaned piglets of the breed Pietrain x (Large White x Landrace) were bought from a conventional herd with animals often affected by diarrhoea. Piglets weaned on day 28 of life were allocated according to their body weight into two dietary treatments: control (C) and smectite (S), with 12 animals in each group. Piglets with the initial average live body weight of 9.4 kg (C) and 9.22 kg (S), respectively, were fed a basal starter diet without (C) or with (S) 2% of diosmectite (Beaufour Ipsen Pharma, France) for 20 days. Piglets were fed twice a day ad libitum , water was provided by automatic waterers. At the end of the trial, blood samples from each piglet were taken and two piglets from each group were slaughtered for the histopathological examination and gut samples.

182 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

For the TNF α and TGF-β1 assay, samples of duodenum, jejunum, ileum and blood were taken. Blood samples were drawn from vena cava cranialis and cytokine concentrations were measured in the blood serum. The samples of duodenum, jejunum and ileum (10 cm fragments) were removed after abdominal dissection of the slaughtered pigs (aged 48 days). The intestinal fragments were staple fixed to prevent chyme evacuation. Then they were placed into the tubes with 20 ml cold PBS. The fragments were longitudinally opened and together with the chyme, they were incubated for 10 min in shaking bath. The samples were centrifuged at 3000 x g for 5 min and the supernatants were kept at -80°C until assay. Cytokines concentrations were quantified by ELISA (eBioscience, San Diego, CA, USA).

Results TNF-α production corresponded with immune responses on bacterial colonization and inflammation in the guts but no significant differences among groups were determined. The TNF-α contents differed in the individual segments of the small intestines and there was measured no concentration of TNF-α in the blood (Table 1).

Tab. 1 Concentration levels of TNF-α and TGF-ß1 in small intestines and blood serum TNF-α (pg/ml) C S duodenum 3069.15 3339.11 jejunum 146.44 below detection limit ileum 646.24 664.67 blood serum 0 0 TGF-ß1(pg/ml) duodenum 204.96 0 jejunum 142.45 0 ileum 0 0 blood serum 1737.05 4692.1

The highest concentration of TNF-α was measured in duodenum whereas the lowest content of TNF-α was in jejunum and ileal concentration of TNF-α was similar for both groups. Concentrations of TGF-β1 in intestinal samples were low opposite to blood values and they did not show such variability in individual segments as TNF-α (Table 1). There were measured no concentrations of TGF-β1 in duodenum (S), jejunum (S) and ileum (C). Intestinal TNF-α concentration were similar for both groups and were not affected by the diet. There was measured no TNF-α in the blood. TGF-β1 concentration was low or not detected in intestinal samples whereas its values were high in the blood. It seems that concentration of TGF-β1 tented to be higher in blood samples of smectite group.

183 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Discussion Clinical studies demonstrated that diosmectite alleviated the symptoms of acute diarrhoea and shortened its duration (Szajewska et al., 2006), and reduced the frequency of liquid stools and long-lasting diarrhoeal episodes (Gonzalez et al., 2004). Despite results noted above, we did not observe any effect on duration of diarrhoea and/or reduction of liquid stools in our experiment. These discrepancies could be explained by poor feed intake by piglets during the infection that resulted in the insufficient diosmectite ingestion. The insufficient intake of diosmectite pointed on the dose-dependent effect of this clay mineral. There is an ability of clay minerals to bind bacteria and some studies documented that some clay minerals may have an antibacterial effect on various microorganisms (Haydel et al., 2008). As the shedding of ETEC in piglet faeces was not affected by the diet, it seems that diosmectite did not show any bactericide effect on ETEC in piglets. However this could be also associated with poor feed intake of piglets. There was a sooner start and sooner relief of ETEC infection in smectite group contrary to control group. The differences between smectite and control group could be caused by different infectious pressure in the pens. Despite the lack of diosmectite impact on the clinical course of diarrhoea in piglets, diosmectite improved the morphological structure of the intestines and had a positive effect on the reparation of intestinal mucosa. Also Gonzalez et al. (2004) proved the positive effect of diosmectite on the morphological structure of the intestines such as intestinal weight, macroscopic damage, necrotic area and histology administered as a post-treatment in rats with induced chronic colitis . There are some mechanisms of action of diosmectite that were presented to explain the diosmectite effects. There has been demonstrated that diosmectite protects intestinal mucosa by interactions with digestive mucus. Mucoprotective properties and increased production of mucus were observed. The study of Szajewska et al. (2006) presented that smectite alters the activity of bile salts and physical properties of gastric mucus, which prevents mucolysis induced by bacteria. Some authors point out potential of diosmectite play a role in the modulation of immune response. Cytokine concentration is widely used to assess the response to pathogens and antigens, both in experimental animal models and in human. Cytokines play an important role in the mucosal immune response. They are involved in regulation of metabolism and nutrient absorption (Zhao et al., 2008). Cytokines are also important agents that modulate inflammation. In our experiments, we focused on analysis of one pro-inflammatory cytokine (TNF-α) and one anti-inflammatory cytokine (TGF β1) in blood serum and small intestine. Course of inflammation depends on balance between pro-inflammatory and anti-

184 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 inflammatory cytokines. In our trial, TNF-α concentration did not differ in the smectite and control group however the histological examination showed better intestinal structure in smectite group which is in agreement with the information above. The intestinal barrier is weakened by the release of proinflammatory cytokines in many digestive diseases. It has been demonstrated that TNF-α weakens the intestinal barrier through the tight junctions and increases its permeability, and diosmectite counteracts this disruption (Gonzalez et al., 2004). Also Szajewska et al. (2006) observed that smectite enhances the absorption of water and electrolytes and restores the barrier of human intestinal cell monolayers after exposure to TNF-α. We measured these cytokines in three different parts of small intestine (duodenum, jejunum and ileum). TNF-α was not found in blood serum, but it was measured in small intestine. There were significant differences between concentration of TNF-α in different part of small intestine with no significant differences between control and smectite group of weaned piglets. On the other hand, TGF β1 was measured in blood serum, but not in small intestine. The concentration of TGF β1 in control group was significant differ from pigs fed with diosmectite. Gonzalez et al., (2004) demonstrated that diosmectite restored the epithelial barrier defect induced by the TNF in the intestinal cell line FT29-19A. These were demonstrated by the significant decrease in ionic conductance and the decreases in mannitol and horseradish peroxidase permeabilities. The mechanism of that is unknown, but those authors suggest that diosmectite may reduce the consequences of intestinal inflammation by acting from luminal side of the epithelium.

Acknowledgements This study was supported by grants of the Ministry of Agriculture of the Czech Republic (Grants No. MZe 0002716202 and MZE QJ 1210112) and the Ministry of Education, Youth and Sports (AdmireVet; Grant No. CZ 1.05/2.1.00/01.0006-ED006/01/01).

References Dupont, C., Vernisse, B. Anti-diarrheal effects of diosmectite in the treatment of acute diarrhea in children: a review. Paediatr. Drugs , 2009, 11, 89–99. Gonzalez, R., Sanchez de Medina, F., Martinez-Augustin, O., Nieto, A., Gálvez, J., Risco, S., Zarzuelo, A. Anti-inflammatory effect of diosmectite in hapten-induced colitis in the rat. Br. J. Pharmacol. , 2004, 141, 951–960.

185 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Haydel, S.E., Remenih, C.M., Williams, L.B. Broad-spectrum in vitro antibacterial activities of clay minerals against antibiotic-susceptible and antibiotic-resistant bacterial pathogens. J. Antimicrob. Chemother. , 2008, 61, 353–361. Melin, L., Mattsson, S., Katouli, M., Wallgren, P. Development of post-weaning diarrhoea in piglets. Relation to presence of Escherichia coli strains and rotavirus. J. Vet. Med. B – Infect. Dis. Vet. Pub. Health , 2004, 51, 12–22. Slama, P., Sladek, Z., Slamova, R., Pavlik, A. Production of bovine IL-10 following stimulation with lipopolysaccharide and muramyl dipeptide. FEBS J. , 2011, 278, 304- 304. Slamova, R., Trckova, M., Vondruskova, H., Zraly, Z., Pavlik, I. Clay minerals in animal nutrition. Appl. Clay Sci., 2011, 51, 395-398. Szajewska, H., Dziechciarz, P., Mrukowicz, J. Meta-analysis: Smectite in the treatment of acute infectious diarrhoea in children. Aliment. Pharmacol. Ther. , 2006, 23, 217–227. Vondruskova, H, Slamova, R., Trckova, M., Zraly, Z., Pavlik, I. Alternatives to antibiotic growth promoters in prevention of diarrhoea in weaned piglets: a review. Vet. Med., 2010, 55, 199-224. Wahl, S.M. Transforming growth factor beta (TGF-beta) in inflammation: a cause and a cure. J. Clin. Immunol. , 1992, 12, 61–74. Zhao, J., Harper, A.F., Webb, K.E., Jr., Kuehn, L.A., Gilbert, E., Xiao, X., Wong, E.A. Cytokine mRNA expression in the small intestine of weanling pigs fed diets supplemented with specialized protein or peptide sources. Asian-Aust. J. Anim. Sci. , 2008, 21, 1800–1806.

186 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE EFFECT OF GLYCEROL ON RABBIT SPERMATOZOA MOTILITY

Slanina, T., Bíziková, K., Massányi, P.

Slovenská po ľnohospodárska univerzita v Nitra, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Katedra fyziológie živo číchov, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovenská Republika, email: [email protected]

Abstract The target of our study was to evaluate the effect of crude and pure glycerol on rabbit spermatozoa motility parameters in vitro. Semen samples of New Zealand White rabbit breed were used in the experiment. After processing, the semen samples were stored in the laboratory at 37˚C in thermostat. For in vitro culture, crude (GC) and pure (PG) glycerol (2, 5, 10%) diluted in physiological saline were used. Each of prepared samples was evaluated using Computer Assisted Semen Analyzer (CASA) system. The total spermatozoa motility ranged in experimental groups in range 18.70 – 52.60% (CG group) and 22.82 – 57.09% (PG group), and these values were significantly lower compared to control group (74.51 – 84.94%). This decrease was dependent on glycerol concentration used in the study as well as on the period of culture. The percentage of progressive motile spermatozoa was significantly lower in group CG (minimum 5.46%) and exactly in group of addition of 10% of crude glycerol. The values in groups with pure glycerol showed time and dose dependent decrease mainly after 3 hours of culture. The percentage of progressive spermatozoa was lower in group CG compared to PG. Results of our study clearly demonstrate negative effect of glycerol in higher concentrations on spermatozoa motility parameters.

Key words: rabbit, spermatozoa motility, CASA, glycerol

Úvod Glycerol (glycerín, propán–1,2,3–triol) je hygroskopická bezfarebná viskózna kvapalina bez zápachu, sladkej chuti. Je dôležitou biogénnou organickou zlú čeninou, ke ďže je vo forme svojich esterov sú čas ťou tukov. Glycerol je slabo jedovatý. V menších dávkach spôsobuje bolesti hlavy, žalúdo čné problémy a zvracanie. Vo vä čších dávkach môže spôsobi ť poškodenie pe čene. Najnižšia toxická dávka podaná orálne u človeka činí približne 1,5 g.kg -1 živej hmotnosti, čo znamená, že priemerný človek by ho musel poži ť najmenej 90 až 120 g, aby sa u neho prejavili symptómy otravy. V nízkych koncentráciách je prakticky neškodný (Qoja et al., 2011).

187 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Glycerol je využívaný ako kryoprotektant pre rôzne bunky, vrátane cicav čích spermií a embryí v ďaka svojím kryopretektívnym vlastnostiam. Hoci glycerol bol úspešne použitý pri kryokonzervácii spermií mnohých druhov, nebol efektívny pri zmrazovaní králi čích spermií. Z výsledkov novších výskumov vyplýva, že použitie glycerolu pri zmrazovaní spermií králikov malo za následok extrémne nízku fertilitu (Kashiwazaki at al., 2006). Cie ľom tejto práce bolo analyzova ť účinok surového a čistého glycerolu na pohybové parametre spermií králikov po čas kultivácie in vitro pri teplote 37˚C.

Materiál a metodika V experimente sme hodnotili ejakulát získaný od pohlavne dospelých samcov králikov plemena biely Novozélandský. Po prenose do laboratória boli vzorky riedené pomerom 1 diel ejakulátu a 5 dielov roztoku (glycerol, fyziologický roztok). Ejakuláty boli riedené dvoma formami glycerolu: čistý – PG a surový glycerol – CG, v troch koncentráciách zriedených fyziologickým roztokom: 10, 5 a 2%. Kontrolnú vzorku – K predstavoval ejakulát zriedený čistým fyziologickým roztokom. Pohyblivos ť sa hodnotila a porovnávala pri teplote 37°C (termostat) v štyroch časových intervaloch 0, 1, 2 a 3 hodín. Charakteristika použitých glycerolov: Surový glycerol (crude glycerol – CG) o hmotnostný podiel glycerolu 80,06%; obsah NaCl 7,15%; obsah vody 8,0%; obsah metanolu 0,001%; Cd < 0,01 mg.l -1; Pb < 0,1 mg.l -1; Cu < 0,04 mg.l -1; Mn < 0,03 mg.l -1; Zn – 2,5 mg.l -1; Fe – 15 mg.l -1; Ni – 2,5 mg.l -1; Co – 12,5 mg.l -1; Cr – 7,5 mg.l -1. Čistý glycerol (pure glycerol – PG) o obsah minimálne 99,5%; síranový popol maximálne 0,01%; chloridy maximálne 0,001%; ťažké kovy (Pb) maximálne 0,0005%; voda maximálne 0,5%; index lomu 1,470 – 1,474. Na hodnotenie pohyblivosti spermií sme použili CASA systém SpermVision (Minitub, Tiefenbach, SRN) s mikroskopom Olympus BX 51 (Olympus, Japonsko). Každá vzorka sa umiestni do po čítacej komôrky Makler Counting Chamber s hĺbkou 10µm (Sefi – Medical Instrumenst, SRN) a následne umiestnili do zorného po ľa mikroskopu. V každej vzorke sa sledovalo percento pohyblivých spermií (%) a percento progresívne pohyblivých spermií (%). V rámci každého merania systém CASA vyhodnotil parametre pohyblivosti z minimálne 7 polí komôrky Makler Counting Chamber.

188 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Na porovnanie výsledkov CASA analýzy v jednotlivých časových obdobiach pri sledovaní vplyvu riedidiel bol použitý štatistický Scheffeho test a štandardný štatistický Studentov t–test. Preukaznos ť rozdielov bola hodnotená na hladine preukaznosti p<0,05.

Výsledky a diskusia Po zriedení ejakulátu surovým glycerolom boli pri sledovaní pohyblivosti spermií zaznamenané preukazne nižšie hodnoty oproti kontrolnej vzorke vo všetkých sledovaných vzorkách (CG10, CG5 a CG2) po čas celej doby in vitro kultivácie (Graf 1). Motilita spermií sa výrazne znížila v skupinách s prídavkom surového glycerolu (CG10 – 22,98; CG5 – 36,82 a CG2 – 52,60%) v porovnaní s kontrolou skupinou (K – 84,94%) už v čase 0. Tento trend sa zachoval aj po čas 1, 2 a 3 hodinovej kultivácii. Rovnaké tendencie boli zistené aj pri meraní percenta progresívne pohyblivých spermií, kde taktiež kontrolná vzorka vykazovala preukazne vyššie hodnoty oproti sledovaným vzorkám (Graf 2).

Graf 1 a 2 Pohyblivos ť spermií a progresívna pohyblivos ť (%) v testovaných skupinách s prídavkom surového glycerolu (Figure 1 and 2 – Spermatozoa motility and progressive motility (%) in experimental groups with addition of crude glycerol – CG)

Motility [%] 100 80 60 Progressive motility [%] 40 20 100 0 80 0 1 2 3 h. 60 K CG2 CG5 CG10 40 20 0 Už v čase 0 bol rozdiel v progresívnej 0 1 2 3 h. pohyblivosti medzi kontrolou (77,70%) K CG2 CG5 CG10 a najvyššou hodnotou nameranou u vzorky CG2 (38,77%) až 38,93%, čo poukazuje na negatívny vplyv surového glycerolu na pohyblivos ť i progresívnu pohyblivos ť spermií králikov. Výsledky našej práce sú ve ľmi podobné ako predošlé popisované autormi Qoja a kol. (2011). V tejto práci popisujú negatívny efekt surového glycerolu riedeného citrátom sodným (v koncentráciách 5 – 20%) na pohyblivos ť spermií králikov. Už hne ď po pridaní glycerolu

189 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 došlo k preukaznému poklesu pohyblivosti a podobné tendencie boli sledované aj po 60, 120 a 180 minútach kultivácie. Podobne aj ostatné parametre pohyblivosti spermií boli nižšie, čo potvrdzuje negatívny ú činok glycerolu vo vyšších koncentráciách na pohyblivos ť spermií (Qoja a kol., 2011). V rámci hodnotenia vplyvu čistého glycerolu (PG) na pohyblivos ť spermií bola taktiež najvyššia hodnota 84,94 % nameraná u kontrolnej vzorky v čase 0 (Graf 3). Po čas celej doby kultivácie boli zaznamenané preukazne vyššie hodnoty u kontrolnej vzorky v porovnaní so všetkými sledovanými vzorkami (PG2, PG5, PG10). Najvyššia pohyblivos ť 57,09% v rámci sledovaných skupín bola nameraná vo vzorke PG5. Obdobné tendencie boli zistené taktiež pri progresívnej pohyblivosti, kde taktiež u všetkých sledovaných vzorkách boli zaznamenané preukazne nižšie hodnoty (Graf 4).

Graf 3 a 4 Pohyblivos ť spermií a progresívna pohyblivos ť (%) v testovaných skupinách s prídavkom čistého glycerolu – PG (Figure 3 and 4 – Spermatozoa motility and progressive motility (%) in experimental groups with addition of pure glycerol – PG)

Motility [%] Dosiahnuté výsledky nazna čujú 100 negatívny ú činok glycerolu na pohybové 80 60 Progressive motility [%] 40 20 100 0 80 0 1 2 3 h. 60

K PG2 PG5 PG10 40 20 parametre spermií in vitro . Toxický ú činok 0 glycerolu na spermiách zaznamenali už Fahy a 0 1 2 3 h. kol. (1990). Hammerstedt a Graham (1992) K PG2 PG5 PG10 informovali o účinkoch glycerolu, ktorý zah ŕň al zmeny v cytoplazmatických bunkách, kvôli zvýšenej viskozite a zmenenej polymerizácii tubulínu. Mocé a kol. (2003) porovnávali čerstvé a zmrazené spermie králika z hľadiska ich fertiliza čnej schopnosti. Výsledky poukazujú na fakt, že inseminácia samíc čerstvými spermiami sa preukázali lepšie výsledky ako pri inseminácii samíc zmrazenými spermiami. Po oplodnení čerstvými spermiami 79% samíc ostalo oplodnených a po inseminácii

190 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 zmrazenými spermiami ostalo oplodnených 61%. Tieto výsledky sú zaujímavé, nako ľko sa glycerol používa pri riedení spermií ur čených na kryokonzerváciu.

Záver Namerané hodnoty pohyblivosti i progresívnej pohyblivosti boli u oboch sledovaných skupinách (CG, PG) preukazne nižšie ako u kontrolnej vzorky. Môžeme teda zhodnoti ť, že pridaním glycerolu do ejakulátov došlo k zna čnému poklesu pohyblivosti i progresívnej pohyblivosti spermií. V rámci porovnania jednotlivých rozdielnych koncentrácií glycerolu, preukazne najnižšie hodnoty vo či kontrolnej vzorke boli namerané u vzoriek CG10 a PG10, teda u vzoriek s najvyššou koncentráciou glycerolu (10%). Oproti kontrolnej skupine bol dosiahnutý významne klesajúci charakter s postupným časom in vitro kultivácii. Na záver môžeme skonštatova ť, že aj ke ď je glycerol využívaný v rôznych odvetviach priemyslu, výsledky nášho experimentu nazna čujú, že jeho vyššie koncentrácie majú na živo číšne bunky, akými sú spermie, negatívny ú činok, ktorý má za následok zníženie pohyblivosti spermií.

Po ďakovanie Táto práca bola podporená projektom VEGA č. 1/0532/11.

Použitá literatúra Fahy, G.M., Lilley, T.H., Linsdell, H., Douglas, M.S.J., Meryman, H.T. Cryoprotectant toxicity and cryoprotectant toxicity reduction: Search of molecular mechanisms. Cryobiol., 1990, 27, 247– 268. Hammerstedt, R.H., Graham, J.K. Cryopreservation of poultry sperm: the enigma of glycerol. Cryobiol., 1992, 29, 26–38. Kashiwazaki, N., Okuda, Y., Seita, Y., Hisamatsu, S., Sonoki, S., Shino, M., Masaoka, T., Inomata, T. Comparison of glycerol, lactamide, acetamide and dimethylsulfoxide as cryoprotectants of Japanese white rabbit spermatozoa. J. Reprod. Develop., 2006, 52, 511–516. Mocé, E., Lavara, R., Vicente, J.S. Effect of an asynchrony between ovulation and insemination on the results obtained after insemination with fresh of frozen sperm in rabbits. Anim. Reprod. Sci., 2003, 75, 107–118. Qoja, A.O., Rafajová, M., Massányi, P. The effect of crude glycerol on rabbit spermatozoa motility in vitro. Animal Physiology 2011 : proceedings of scientific publication, Nitra 2011, 457–462.

191 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

DIFFERENCES IN CHARACTERISTICS OF CALCIUM METABOLISM AND EGGSHELL QUALITY IN CZECH HEN AND HYBRID LOHMANN WHITE

Svobodová J., T ůmová E.

Katedra speciální zootechniky, Fakulta agrobiologie, potravinových a p řírodních zdroj ů, Česká zem ědělská univerzita v Praze

Abstract The aim of the study was to determine differences in eggshell quality, calcium concentration in serum, tibia and eggshell of two white shelled genotypes. In this experiment were included 66 hens Lohmann white and 66 Czech hen housed on litter. Significantly higher eggshell strength (P ≤ 0.002), shell thickness (P ≤ 0.001), calcium content in the shell (P ≤ 0.005) and the serum (P ≤ 0.02) were in Lohmann white. In Czech hen was significantly higher tibia weight (P ≤ 0.02) and tibia strength (P ≤ 0.001). There were no significantly differences in calcium content in tibia.

Úvod Vápník pat ří mezi základní prvky uplat ňující se p ři mnoha metabolických procesech v organismu. Velký význam je u dr ůbeže p řikládán zejména metabolismu vápníku, a to především ve spojitosti s tvorbou vaje čné sko řápky. Metabolismus vápníku je úzce propojen s fosforem a jejich vzájemný chybný pom ěr m ůže negativn ě ovlivnit retenci vápníku (Kebreab a Vitti, 2005). Vápník je p řijímán spole čně s potravou, p řes tenké st řevo se dostává do krve a odtud je využit pro tvorbu vaje čné sko řápky. Dalším zdrojem vápníku jsou medulární kosti, které fungují jako do časný zdroj vápníku v dob ě, kdy není zajišt ěné dostate čné zásobování vápníku krmivem (Etches, 1987). Informace o metabolismu vápníku lze získat z koncentrace Ca v krvi, ale je t řeba brát v úvahu genotypové rozdíly. Suchý et al. (2004) zjistili významn ě nižší koncentraci Ca v krvi u masných slepic v porovnání s nosnými. Podobn ě m ůže být ovlivn ěn i obsah Ca v tibii. Cílem práce bylo zjistit rozdíly v kvalit ě sko řápky, koncentrace Ca v krevním séru, tibii a ve sko řápce dvou b ělovaje čných genotyp ů.

Materiál a metodika Pokus byl realizován se slepicemi Lohmann bílý (66 ks) a Česká slepice (66 ks) ustájených na podestýlce (7 ks/m 2). Snáška byla hodnocena b ěhem celého snáškového cyklu

192 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 mezi 20. a 50. týdnem v ěku ve dvoutýdenním intervalu. Vejce se vážila pravideln ě ve čty řtýdenním intervalu. Rozbory vajec pro stanovení charakteristik kvality sko řápky byly provád ěny rovn ěž v intervalu 28 dn ů, celkem bylo analyzováno 300 vajec od slepic Lohmann bílý a 150 vajec od České slepice. Stanovoval se podíl sko řápky z vejce, tlouš ťka sko řápky (mikrometr QCT, TSS England), pevnost sko řápky (p řístroj QC-SPA, TSS England). Ve druhé polovin ě snášky, v 50 týdnech v ěku bylo analyzováno 10 vajec od každého genotypu na obsah popelovin a vápníku ve sko řápce. V tomto v ěku bylo 24 slepic od každého genotypu zabito, p ři porážce byla odebírána krev pro stanovení koncentrace Ca v krevním séru. Pro analýzu v krevním séru byly využity komer ční standardní kity (Randox Laboratories Ltd., Crumlin, UK) a spektrofotometr Libra S 22 (Biochrom Ltd., UK). Po zabití byla vypreparována tibie, zvážena, a stanovena pevnost na p řístroji QC-SPA (TSS England). Dále v tibii byly stanoveny popeloviny a obsah Ca. Obsah vápníku ve sko řápce a v tibii byl stanoven po spálení v 550 °C, za použití vanado-molybdenového reagentu (metoda AOAC 965.17). Obsah Ca byl analyzován atomovou absorp ční spektrometrií p ři využití za řízení Solaar M6 (TJA Solutions, Cambridge, UK). Výsledky byly zpracovány analýzou variance, metodou Anova, programem SAS. Pr ůkaznost rozdíl ů byla hodnocena t-testem.

Výsledky a diskuze Dle o čekávání byly užitkovost slepic a hmotnost vajec signifikantn ě (P ≤0,001) vyšší u hybrida Lohman ve srovnání s Českou slepicí, což souviselo s prošlecht ěností. Také kvalitativní ukazatele sko řápky jako je pevnost, tlouš ťka a podíl sko řápky z vejce byly u Lohmanna bílého signifikantn ě vyšší. To koresponduje nap říklad s výsledky Tůmové et al. (2009), kte ří uvád ějí rozdíly v kvalit ě sko řápky v závislosti na genotypu s horšími hodnotami u genotyp ů s nižší prošlecht ěností.

193 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 1 Ukazatelé kvality sko řápky a metabolismu vápníku (Parameters of eggshell quality and calcium metabolism)

Lohmann bílý Česká slepice Pr ůkaznost

Snáška (ks) 255 a 96 b 0,001

Hmotnost vejce (g) 60 a 49,2 b 0,001

Pevnost sko řápky 4541 4347 0,002 (g/cm 2) Tlouš ťka sko řápky 0,36 0,34 0,001 (mm)

Podíl sko řápky (%) 12,3 11,8 0,001

Obsah Ca ve sko řápce 344 321 0,005 (g/kg) Obsah Ca v krvi 10,45 5,59 0,02 (mmol/l)

Hmotnost tibie (g) 4,9 6,1 0,02

Pevnost tibie (N) 429 499 0,001

Obsah Ca v tibii (%) 33,8 35,7 NS

Horší kvalitativní ukazatele sko řápky mohly souviset s vápníkem ve sko řápce, který u hybrida Lohmann bílý dosahoval hodnot 344 g/kg oproti 321 g/kg u České slepice. Tyto výsledky nejsou porovnatelné, protože rozdíly v obsahu Ca ve sko řápce podle genotypu v literatu ře chyb ějí. Z dalších sledovaných ukazatel ů byl hodnocen obsah vápníku v krvi. Až dvojnásobn ě vyšší (P ≤ 0,02) byl u nosnic Lohmanna bílého (10,45 mmol/l) ve srovnání s Českou slepicí (5,59 mmol/l). Tyto rozdíly jsou v souladu s údaji Suchého et al. (2004), kte ří zjistili nižší koncentraci Ca v séru masných slepic než u nosných. Lze se domnívat, že koncentrace Ca v krvi je závislá na úrovni metabolismu Ca. Ve srovnání s nosnicemi genotypu Lohmann bílý m ěla Česká slepice signifikantn ě vyšší hodnoty hmotnosti (6,1 g vs. 4,9 g u Lohmana) a pevnosti (499 N vs 429 N u Lohmana) tibie. Rovn ěž Vits et al (2005) zjistili pr ůkazné rozdíly v pevnosti tibie u Lohmana LSL a

194 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Lohmana hn ědého. Je možné, že pevnost tibie mohla souviset i s obsahem Ca v tibii, který dosahoval nepr ůkazn ě vyšších hodnot u České slepice (35,7 %) proti Lohmanovi (33,8 %).

Záv ěr Mezi Českou slepicí a hybridem Lohmann bílý byly nalezeny prokazatelné rozdíly v ukazatelích metabolismu vápníku a kvality sko řápky. Na základ ě získaných výsledk ů můžeme konstatovat, že ukazatele kvality sko řápky, obsah vápníku ve sko řápce a obsah vápníku v krvi vykazovaly pr ůkazně vyšší hodnoty u hybrida Lohman bílý. Naproti tomu vyšší hodnoty hmotnosti, pevnosti a obsahu vápníku v tibii byly zaznamenány u nosnic České slepice.

Pod ěkování Přísp ěvek byl zpracován p ři řešení grantu NAZV QI101A164.

Použitá literatura AOAC. Official Methods of Analysis. 18th ed., AOAC International, Gaithersburg, MD, USA, 2005. Etches, R. J. Calcium logistics in the laying hen. J. Nutr ., 1987, 117: 619 – 628. Kebreab, E., Vitti, D. M. S. S. Mineral metabolism. Pages 469 – 486 in Quantitative Aspects of Ruminant Digestion and Metabolism. Ed. CAB Int., Walingford, UK, 2005. Suchý, P., Straková, E., Jarka, B., Thiemel, J., Večerek, V. Differences between metabolic profiles of egg-type and meat-type hybrid hens. Czech J. Anim. Sci ., 2004, 49: 323-328. Tůmová, E., Sk řivan, M., Englmaierová, M., Zita, L. The effect of genotype, housing system and egg collection time on egg quality in egg type hens. Czech J. Anim. Sci ., 2009, 54 (1): 17 – 23. Vits A., Weitzenburger D., Hamann H., Distl O. Production, egg quality, bone strength, claw length, and keel bone deformities of laying hens housed in furnished cages with different group sizes. Poultry Sci ., 2005, 84, 1511–1519.

195 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

FUNCTIONAL PARAMETERS OF BULL SEMEN IN RELATION TO THE BODY CONDITION SCORE.

Špaleková, E., 1, 2 Makarevich, V.A., 1Kubovi čová, E., 1 Stadnik, L., 3 Louda, F. 3

1Institute of Animal Genetics and Reproduction, Animal Production Research Centre Nitra, Slovak Republic 2Department of Animal Physiology, Faculty of Biotechnology and Food Sciences, Slovak University of Agriculture in Nitra, Slovak Republic 3Czech University of Agriculture in Prague, Czech Republic

Abstract The goal of this study was to examine the effect of body condition score (BCS) of breeding bulls on functional parameters of sperm in particular effect of BSC on sperm total motility and progressive movement (PM) and on viability parameters of sperm. Motility parameters of thawed semen were analyzed using CASA system at the time intervals of 0, 0.5h or 2h. Viability parameters of sperm were analyzed using fluorescent microscopy. The spermatozoa were stained for a plasma membrane integrity ( peanut agglutinin , PNA-FITC), occurrence dead/necrotic sperm (PI) and apoptosis (Yo-Pro-1). Our results point out on a minor difference between adjoins groups of BCS 2 and 3. However significant difference in sperm viability between bulls with BCS 2 and 4 were noted. Bulls with BCS 4 had significantly (P<0,05) lower total motility and progressive movement than bulls with BCS 2. Similarly significantly higher (P<0,05) proportion of sperm with disturbed plasma membrane and increased proportion of dead/necrotic sperm was recorded in BCS 4 compared to bulls with BCS 2. These results indicate that higher level of BCS may have negative effect on quality of ejaculates of breeding bulls.

Key words: bull, BCS, sperm, viability, motility

Introduction

The evaluation of body condition score (BCS) is used mainly to gain economic profit through improved reproductive parameters and more cost-effective feeding. Body condition scoring is an assessment of proportion of muscle and of body fat which the male has and is determined on a scale of 1 to 5 (1 being very thin and 5 being overweight). Previous studies showed that many factors affect semen quality, including abnormal scrotal thermoregulation

196 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

(Coulter et al., 1997), stress, age, testicle size and body condition (Barth, 1995). BCS, or degree of fatness, seems to be the most reliable indicator of well-being of an animal, and, when coupled with changes in body weight, provides a useful method to assess reproductive potential (Dunn - Moss, 1992). If the animal is too thin or overweight, breeding stamina and quality of ejaculate may be affected (Neary, M. - Yager, A., 2002). The quality of bull semen may be positively affected by quality of livestock feed. In particular, feeding moldy or poor- quality feed or silage may elicit loss of sperm motility and could have caused temporary or permanent infertility of bulls (Louda et al., 2007). Production of quality ejaculate requires a diet which ensures adequate nutrition levels and the corresponding amount of essential vitamins and mineral substances. Bulls in poor body condition have lower fertilizing ability (Louda et al., 2007). It is only few reports about effect of BCS on sperm characteristics and fertility ability of beef bulls (Addass, 2011; Barth – Waldner, 2002; Dunn - Moss, 1992). But there are no reports about effect of BCS on the sperm viability in regards to cell death, membrane status and motility. The aim of this study was to evaluate effect of body condition score of breeding bulls on several functional parameters of spermatozoa.

Material and methods Semen collection The semen was collected once weekly from 8 Holstein and 8 Czech Fleckvieh bulls. The BCS of selected bulls was evaluated by a five point scale with an accuracy of 0.25 points at the time of ejaculate collecting according to methodology of body condition scoring. Only fresh semen with required quality (min PM 70% and concentration 0,7x10 6 ml -1) was used for producing artificial insemination doses. The samples of semen were frozen in a programmable freezing device (IMV-Digitcool, L’Aigle, France) then plunged into liquid nitrogen for storage. Analysis of sperm motility Straws were thawed in a water bath at 37 ± 1°C for 1min. Motility parameters of semen were analyzed immediately after thaw at time intervals of 0, 0.5h or 2h, using computer assisted semen analysis (CASA) – Sperm Vision TM 3.5. Between these time points the samples were incubated at 37 ˚C. Fluorescent assays Sperm membrane integrity was evaluated using fluorescently labelled lectin PNA- FITC (( Arachis hypogaea peanut agglutinin; Molecular Probes, Lucerne, Switzerland) in combination with propidium iodide (PI) which detected dead/necrotic sperm in samples (red

197 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 signal) and DAPI (blue signal). Sperm samples were unfixed; therefore, PNA marked only the sperm with disturbed plasma membrane (green signal) while the sperm with intact membranes remained unstained. Staining was done in a solution containing 2.5 l PNA and 10 l PI in 250 l saline-FCS solutions for 20 minutes at room temperature. After the incubation, 4 l of sperm samples were mixed with 4 l of Vectashield mounting medium with DAPI (H-1200, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA). Samples were observed under a Leica fluorescent microscope (MIKRO spol. s r.o., Bratislava, Slovak Republic) with respective filters for green, red and blue fluorescence. Apoptotic cells were detected using specific nuclear green fluorochrome, Yo-Pro-1 in combination with PI. The staining solution contained 1 l of Yo-Pro-1 and 10 l of PI in 200 l of saline-FCS solution. Sperm cells with bright green fluorescent signal were regarded as apoptotic. The cells colored red were considered as dead or necrotic. Statistical analysis The experiments have been done in two replications. For sperm motility analysis (CASA), 7 view fields per each group were evaluated (at least 750 sperm cells per one experiment were counted). Average values were calculated from three measurements during the day. For fluorescent markers, more than 800 sperm cells per each group were evaluated. The results were statistically evaluated by repeated measure ANOVA test and t-test.

Results Average motility of all tested bulls (n=16) after thawing was 42,47±2,08%, progressive movement (PM) was 39,62±2,08%. The bulls were divided into the 3 groups according to their body condition score (BCS). The high average motility and progressive movement was observed in the group of bulls with BCS 2, where motility and progressive movement were significantly higher (P<0,05), when compared with the group of bulls with BCS 4. In the group of BCS 3 bulls average whole motility was 42,21±2,06% and PM was 39,31±2,02%. The lowest sperm total motility and progressive movement was determined in the BCS 4 group (Tab 1). Similar trends were observed in evaluation of viability characteristics of sperm. The proportion of sperm with disturbed plasma membrane (PNA positive) was significantly lower in the BCS 2 than in the group with BCS 4 (P<0,05). Similarly, presence of dead/necrotic sperm cells was the lowest in the BCS 2. The highest proportion of apoptotic sperm was detected in the group with BCS 3. In group BCS 3, proportion of sperm with disturbed plasma membrane, dead/necrotic and apoptotic sperm was higher that in the group with BCS

198 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

2. The highest proportion of dead/necrotic sperm and PNA positive sperm was detected in the group with BCS 4 (Tab 2). Tab. 1 Average values of motility parameters of bull sperm. BCS category Motility Progressive movement –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bulls together 42,47±2,08 39,62±2,08 BCS 2 56,26±2,21 a 52,93 ±2,37 a BCS 3 42,21±2,06 39,31±2,02 BCS 4 28,94±1,98 b 26,61±1,86 b a , b P<0,05 – significant difference between BCS groups (t-test)

Tab. 2 Average values of selected viability parameters of bull sperm according to bull’s body condition score

BCS category PNA Yo-Pro-1 PI –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– BCS 2 24,03±2,30 a 15,62±1,83 12,63±1,49 BCS 3 27,07±2,08 18,85±1,66 15,22±1,62 BCS 4 35,06±2,72 b 15,37±1,56 20,25±1,85 a, b P<0,05 – significant difference between groups (t-test) High significant positive (P<0,0001) correlation was observed between total motility and progressive movement in a whole population of bulls (irrespective to BCS). Medium negative correlation was observed between motility and sperm viability parameters (PNA, PI, Yo-Pro- 1 positive sperm) (Tab 3). Tab. 3 Correlation coefficients of a whole group of bulls and correlation between total motility and selected sperm parameters according to BCS of bulls

M/PM M/PNA M/Yo-Pro-1 M/PI r r r r ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Bulls together 0,998* - 0,634 - 0,491 - 0,584 BCS 2 0,996* - 0,358 - 0,746 - 0,213 BCS 3 0,997* - 0,626 - 0,530 - 0,702 BCS 4 N/D N/D N/D N/D r – Pearson correlation coefficient (t-test); no correlation 0,111 ± 0,333; moderate correlation 0,334 ± 0,666; high correlation 0,667±0,999; * P<0,0001; N/D – not determined When BCS was taken into consideration, highly significant positive (P<0,0001) correlation was noted between total motility and progressive motility in the BCS 2 and the BCS 3 bulls. High negative correlation between total motility and apoptotic sperm cells was observed in the BCS 2 (r = -0,7458). In the group with BCS 3, high negative correlation was observed between total motility and dead/necrotic sperm (r = - 0,7019) (Tab 3). In the group

199 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 with BCS 4 correlation was not determined due to low numbers of animals available in this group.

Discussion This study investigated the impact of BCS of breeding bulls on motility and viability of spermatozoa. Motility of sperm is a most important indicator of ejaculate quality. The results of this study demonstrated possible negative effect of high body condition score of bulls on sperm total motility as well as progressive movement. Bulls with BCS 4 have considerably lower motility and progressive movement than bulls with BCS 2 and 3. Similarly, the others authors indicate that bulls fed high-energy diet (high BCS) had decreased proportion of progressively motile sperm and very poor progressive movement than bulls fed moderate-energy diet (lower BCS) (Coulter et al., 1997). Except good motility parameters, low content of apoptotic and dead/necrotic sperm in ejaculate is also important for good fertilizing ability. Presence of apoptotic spermatozoa in the sperm dose could be one of the reasons for poor fertility of breeding bulls (Anzar et al., 2002). High negative correlation was found between total motility and proportion of apoptotic sperm in the BCS 2. Similarly, Hao-Bo Zhang (2008) confirmed negative correlations between motility and rate of apoptotic sperm in human. No large difference in proportion of apoptotic sperm was recorded between tested groups. Proportion of apoptotic sperm was the highest in the BCS 3. For successful fertilization, high proportion of sperm with intact membrane is necessary, because intact plasma membrane is an essential requirement for sperm cell function (Makarevich et al., 2011). Significantly higher proportion of sperm with damaged membrane was detected in the BCS 4 compared with the BCS 2 group. Spermatozoa with damaged or inactive membranes will have limited viability and fertilization potential (Correa - Zavos, 1994). Only moderate negative correlations were confirmed between PNA positive sperm and motility in the BCS 2 and the BCS 3 groups. Alm et al. (2001) found low but significant correlation between proportion of viable cells and fertility, suggesting that the plasma membrane integrity evaluation can serve as a quality control method for frozen-thawed spermatozoa in breeding bulls. These results imply that overfeeding could adversely affect ejaculate, because overfed bulls have lower semen quality than underfed bulls . Bulls with BCS 4 has higher occurrence of dead/necrotic sperm than bulls with BCS 2 and 3. Similarly studies other on beef bulls confirm, that significantly fewer bulls with a BCS 2 and BCS of 4 or greater had satisfactory semen quality than bulls with a BCS of 3.0 (where satisfactory semen quality comprise 70%

200 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 of morphological normal sperm and PM of spermatozoa is at minimum 60%) (Barth - Waldner, 2002). Bulls fed high-energy diet (high BCS) had decreased proportion of morphologically normal and progressively motile sperm (Coulter et al. 1997) and also greater proportion of sperm with defects (Swanepoel et al., 2008) than bulls fed moderate-energy diet (lower BCS). Body condition, or degree of fatness, seems to be the most reliable indicator of well- being of an animal, and, when coupled with changes in body weight provides a useful method to assess reproductive potential (Dunn et al., 1992). Our results support an idea, that high BCS has negative effect on quality from ejaculates from breeding bulls.

Acknowledgement The study was supported from the grants APVV-0137-10 (Slovak Republic) and QI91A061 (Czech Republic).

References Addass, P. A. Effect of age and body condition score on sperm production potential among some indegenous bull cattle in Mubi Adamawa State, Nigeria. Agric. Biol. J. N. Am., 2011, 2, 203-206. Alm, K., Taponen, J., Dahlbom, M., Tuunainen, E., et al. A novel automated fluorometric assay to evaluate sperm viability and fertility in dairy bulls. Theriogenology , 2001, 56, 677-684. Anzar, M., He, L., Buhr, M. M., Kroetsch, T. G., Pauls, K. P. Sperm apoptosis in fresh and cryopreserved bull semen detected by flow cytometry and its relationship with fertility. Biol. Reprod., 2002, 66, 354-360. Barth, A. D. - Waldner, Ch. L. Factors affecting breeding soundness classification of beef bulls examined at the Western College of Veterinary Medicine. Can. Vet. J., 2002, 43, 274-284. Barth, A.D., Cates, W. F, Harland, R. J. The effect of amount of body fat and loss of fat on breeding soundness classification of bulls. Can. Vet. J., 1995, 36, 758–763. Correa, J. R. - Zavos, P. M. The hypoosmotic swelling test: Its employment as an assay to evaluate the functional integrity of the frozen-thawed bovine sperm membrane. Theriogenology , 1994, 42, 351-360. Coulter, G. H, Cook, R. B., Kastelic, J. P. Effects of dietary energy on scrotal surface temperature seminal quality, and sperm production in young beef bulls. J. Anim. Sci., 1997, 75, 1048–1052. Dunn, T. G. - Moss, G. E. Effects of nutrient deficiencies and excesses on reproductive efficiency of livestock. J. Anim. Sci., 1992, 70, 1580-1593. Hao-Bo Zhang, Shao-Ming Lu, Chun-Ya Ma, Li Wang, Xiao Li, Zi-Jiang Chen. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation. Asian J. Androl., 2008, 10, 227-235. Louda, F. et al. Zásady využívaní plemenných býk ů v podmínkách p řirozené plemenitby. 2007. Vydal: Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o., Šumperk: KartoTISK, s.r.o., ISBN: 978-80-87144-01-5.

201 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Makarevich, A., Špaleková, E., Olexíková, L., Luká č, N., Kubovi čová, E., Hegedušová, Z. Functional characteristics of ram cooling-stored spermatozoa under the influence of epidermal growth factor. General Physiology and Biophysics , 2011, 30, 36-43. Neary, M., - Yager, A. Body Condition Scoring in Farm Animals. Farm Animals Management and Purdue , 2002, 9, 1-8. Swanepoel, F. J. C., Taylor, G. J., Webb, E. C., Stroebel, A. Effect of nutrition on testicular traits of tropically adapted yearling beef bulls. Aust. J. Exp. Agric., 2008, 48, 950-953.

202 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE PRENATAL APPLICATION OF RETINOIC ACID AND EMOTIONAL BEHAVIOUR

Tomášová, L., 1 Hvizdošová, N., 1 Špakovská, T., 1 Kokošová, N., 2 Boleková, A., 1 Kluchová, D. 1

1 Ústav anatómie, Lekárska fakulta Univerzity P. J. Šafárika v Košiciach 2 Katedra fyziológie živo číchov, Ústav biologických a ekologických vied, Prírodovedecká fakulta Univerzity P. J. Šafárika v Košiciach

Abstract Vitamin A plays an important role in embryonal development of central nervous system (CNS). Its insufficiency, but also the excess intake during pregnancy can lead to the various defects of CNS, from various malformations, which are sometimes incompatible with life, to the less intensive damages, that can express behavioral disorders. The aim of our work was to study changes of emotional behaviour after prenatal application of all-trans retinoic acid (a metabolit of vitamin A). We found out a significant increase of anxiety in 3-weeks old rats prenatally exposed to RA. This result indicates, that application of retinoids during pregnancy can produce changes of emotional behavior in the offspring.

Key words: retinoic acid, prenatal development, emotional behavior

Úvod Vyvíjajúci sa centrálny nervový systém (CNS) je veľmi zranite ľný, pri čom táto jeho zranite ľnos ť závisí od viacerých faktorov. K ľúčovú úlohu tu zohráva stupe ň maturácie CNS (Rice a Barone, 2000). Čím sú nervové bunky viac diferencované, tým sú odolnejšie vo či pôsobeniu rôznych faktorov. Obzvláš ť citlivou fázou vývinu CNS je prenatálne obdobie, kedy dochádza k proliferácií, diferenciácií, myelinizácií a migrácií nervových buniek a k tvorbe nervových spojení. Dôležitú úlohu v týchto procesoch zohráva vitamín A (retinoidy). Ovplyv ňuje diferenciáciu buniek a formovanie neurálnej trubice (Maden, 2007). Nadmerný prísun retinoidov po čas embryonálneho vývinu môže vies ť k rôznym vrodeným defektom nervovej rúry (NTD´s - neural tube defects, napr. anencefália, spina bifida at ď.) (Frey a Hauser, 2003), malformáciam predného a zadného mozgu (Holson a kol., 1997), resp. môže poškodi ť proces proliferácie a diferenciácie nervových buniek, čo sa môže prejavi ť poruchami pamä ťových funkcií, ale aj iných foriem správania (Adams, 1993). Cie ľom našej

203 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 práce bolo zisti ť aký vplyv má zvýšený prísun vitamínu A po čas prenatálneho vývinu na emo čné správanie.

Materiál a metodika

Zvieratá . V experimente boli použité laboratórne potkany kme ňa Wistar, ktoré boli chované za štandardných podmienok s použitím umelého svetelného režimu LD 12/12. Zvieratá mali prístup k štandardizovanej potrave a vodovodnej vode. Trojmesa čné samice boli pripustené k samcom toho istého veku. Gravidným samiciam bola na 14. – 16. de ň gravidity podaná i. p. kyselina all-trans retinová (RA), metabolit vitamínu A, o dávke 1mg/kg hmotnosti. Narodené mláďatá boli chované za štandardných podmienok a veku 3 týžd ňov boli testované vo vyvýšenom krížovom labyrinte. Vyvýšený krížový labyrint . V tomto teste bola použitá aparatúra pozostávajúca z dvoch otvorených a dvoch uzavretých ramien o dĺžke 50 cm, ve ľkos ť centrálneho štvorca bola 15x15 cm. Ramená aparatúry boli vo výške 75 cm nad zemou. Zvieratá boli vložené do stredu aparatúry a po čas 5 min sa zaznamenávalo ich správanie. Získané výsledky boli spracované nepárovým T-testom.

Výsledky Výsledky testu vo vyvýšenom krížovom labyrinte ukázali, že prenatálne aplikované retinoidy výrazne ovplyvnili emocionálne správanie potkanov. Mlá ďatá vystavené pôsobeniu RA zriedkavejšie vstupovali do otvorených ramien aparatúry a trávili tu kratší čas v porovnaní s kontrolami (Obr. 1). Tento rozdiel sme pozorovali u obidvoch pohlaví, pri čom u samcov bol štatisticky významný.

Obrázek 1 Emocionálne správanie zvierat v teste vo vyvýšenom krížovom labyrinte vyjadrené ako priemerný čas strávený v otvorených ramenách labyrintu +/- SEM; * P < 0,05. (The emotional behavior of rats in elevated plus maze test expressed as average time spent in the open arms of maze +/- SEM; * P < 0,05)

204 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Záver

Výsledky našej práce nazna čujú, že zvýšený prísun vitamín A po čas gravidity môže vies ť k zmenám emo čného správania. Jedinci vystavený pôsobeniu retinoidov majú zvýšenú mieru úzkosti a strachu a častejšie sa u nich vyskytujú depresívne stavy. Behaviourálne zmeny, ktoré sme zistili môžu predstavova ť doposia ľ neznámy syndróm vyskytujúci sa po vysokých dávkach vitamínu A po čas embryonálneho vývinu, ktorý bol zaznamenaný v klinickej literatúre, ale doposia ľ nebol dôkladne popísaný. Aj z toho dôvodu je potrebné sa danej problematike i na ďalej venova ť a dôkladne ju preskúma ť.

Použitá literatúra Frey, L., Hauser, W.A. Epidemiology of neural tube defects. Epilepsia, 2003, 44, 4-13 Holson, R.R., Gazzara, R.A., Ferguson, S.A., Adams, J. Behavioral effects of low-dose gestational day 11-13 retinoic acid exposure. Neurotoxicol. Teratol., 1997, 19, 355-362 Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Neuroscience, 2007, 8, 755-765 Rice, D., Barone, S. Jr. Critical periods of vulnerability for the developing nervous system: evidence from humans and animal models. Environ. Health. Perspect, 2000,108, 511–33

205 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE EFFECT OF INCREASED IODINE INTAKE ON THYROID ACTIVITY IN SHEEP

Trávní ček, J., Kroupová, V., Dušová, H., Peksa, Z., Cimb ůrková, P.

Department of Veterinary Disciplines and Quality of Products, Agriculture Faculty, JU in České Bud ějovice

Abstract

The paper is focused on the contemporary issue of excess iodine in farm animals. The monitoring was performed in ewes. The feed ration in control group (K) of ewes (n = 6) contained for 8 months 3.1 mg iodine per kg of dietary dry matter (DM) and for experimental group (P) of ewes (n = 6) 5.1 mg iodine per kg of dietary DM. Simultaneously with different iodine supplementation the level of Total Triiodothyronine (TT3), Total Thyroxine (TT4), Free Triiodothyronine (fT3), Free Thyroxine (fT4) in blood plasma was examined in ewes before and until 60 days after parturition. The significant decrease of fT3 in group K before parturition was observed. The significant increase of TT3 and TT4 from day 1 to 10 after parturition was found in group K. The significant lower level (P<0.05) of fT3 on the day 30 after parturition was found in the group with iodine intake of 5.1 mg/kg dry matter of diet compared with the group K. In group P was observed lower values (not significantly) of thyroid hormons, especially fT3 and fT4. The above results call for the need of more profound research and revision of thyroid activity connected with the permitted upper limit of iodine supplementation in ruminants 5 mg per kg of 88% DM defined by Commission Regulation /EC/ No. 1459/2005.

Úvod Suplementace jódu u hospodá řských zví řat p ředstavuje významný prvek v celosv ětovém řešení jeho nedostatku u obyvatel Sv ětovou zdravotnickou organizací v rámci činnosti International Council for the Control of Iodine Deficiency Disorders. V oblastech s úsp ěšnou živo čišnou produkcí podmín ěnou vysokou úrovní suplementace stopových prvk ů včetn ě jodu se pozornost soust řeďuje i na rizika jeho p řípadného nadbytku na která upozorňují Huszenica et al., (2002), Pavlata et al., (2005), Mühlberg a Paschke (2009) a Nobukuni (2009). Koncentrace thyroidních hormon ů (T3 a T4) jsou obvykle využívány jako indikátory funkce štítné žlázy u lidí a experimentálních zvířat (Kelly, 2000). Podle NRC

206 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

(2001) je doporu čený denní p říjem jodu pro masný skot jen 0,3-0,6 mg/kg sušiny krmné dávky (KD), ale horní povolená hranice p říjmu jodu podle sm ěrnice EU je 5 mg/kg 88% sušiny krmné dávky (Na řízení komise ES č. 1459/2005).

Materiál a metodika Vliv nadbyte čného p říjmu jódu 3,1 mg/kg sušiny u skupiny kontrolní -K (n = 6) a 5,1 mg/kg sušiny u skupiny pokusné - P (n = 6) byl sledován od 1-2 m ěsíce gravidity do 120-140 dn ů po porodu na úrove ň hormon ů štítné žlázy (celkový trijodthyronin - TT3, celkový thyroxin - TT4, volný trijodthyronin - fT3, volný thyroxin - fT4) v krevní plazm ě. Do pokusu byly vybrány ovce plemene ovce šumavská na 5. laktaci. Základní složky krmné dávky pro skupinu K a P: 1,5 kg lu ční seno, 0,24 kg vojt ěška granule, 0,27 kg ovesná krupice, 9 g minerální dopln ěk. Obsah jodu na 1 kg sušiny krmné dávky v dob ě experimentu byl: skupina K 3,1 mg, skupina P 5,1 mg. Jód byl podáván jako jodi čnan vápenatý. Krev bahnic pro stanovení sledovaných parametr ů byla odebrána z hrdelní žíly. Koncentrace TT3, TT4, fT3 a fT4 byla stanovena v krevní plazm ě metodou radioimunoanalýzy s využitím komer čních kit ů firmy IMMUNOTECH a.s. (Praha). Před experimentem byly krevní vzorky odebrány u bahnic 2 krát v intervalu 30 a 60 dní před jeho zahájením, v pr ůběhu pokusu ve 100-120 dnech gravidity a 1, 10, 30 a 60 den po porodu. Pro statistické vyhodnocení byl použit program Statistica 6.0 Cz software (ANOVA test, Tukey test). Hodnoty P<0,05 byly považovány za významné.

Výsledky a diskuse V předložené studii byl sledován vliv nadbyte čného p říjmu jodu na hormony štítné žlázy bahnic p řijímajících 3 a 5 mg jodu na kg sušiny krmné dávky (KD). P říjem 5 mg na kg sušiny KD p ředstavuje dle Na řízení komise ES č. 1459/2005 horní hranici povolené normy. V poslední dob ě se v ěnuje dopadu vysoké koncentrace jodu v krmných dávkách zvýšená pozornost zam ěř ená na zdravotní stav mlá ďat (Boland et al., 2008; Rose et al., 2007). Z tabulky 1 je patrné, že úrove ň TT3 se mezi skupinou K a P nezm ěnila ani po 60 dnech suplementace jodu ve t řech m ěsících b řezosti. Na úrovni TT4 došlo po 60-ti denní suplementaci jodu k jeho poklesu u obou skupin. Tento pokles byl mén ě výrazný u skupiny P. Z tabulky 1 je patrné, že po 60-ti denním podávání 5 mg jodu na kg sušiny KD byly hodnoty fT3 a fT4 u pokusné skupiny nižší. Ve skupin ě K došlo k významnému snížení fT3 v období před porodem. Zjišt ěné koncentrace TT3 u bahnic v pr ůběhu celého pokusu jsou obdobné jako uvádí Nazifi et al. (2008) u ovcí. Postupné snížení hormon ů štítné žlázy bahnic (tabulka

207 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

1) s postupující graviditou udává i Yildiz et al., (2005). Manalu et al., (1997) vysv ětluje toto snížení zvýšenou spot řebou jodu plodem, který ho využívá pro syntézu hormon ů štítné žlázy.

Tab. 1 Dopad suplementace jodu na koncentraci hormon ů štítné žlázy v krevní plazm ě v peripartálním období bahnic (The impact of iodine supplementation on the concentration of thyroid hormones in blood plasma in peripartum period of ewes)

Před pokusem Během pokusu Parametr 30-60 dn ů gravidity 100-120 dní gravidity bez suplementace I suplementace I – 60-90 dní K P K P TT3 (nmol/l) 2.4 ± 0.3 2.4 ± 0.2 2.2 ± 0.3 2.3 ± 0.4 TT4 (nmol/l) 75.6 ± 14.6 69.2 ± 9.2 56.6 ± 11.8 62.1 ± 12.1 fT3 (pmol/l) 4.7 ± 0.7 a 4.2 ± 0.6 3.8 ± 0.4 b 3.5 ± 0.4 fT4 (pmol/l) 13.6 ± 3.3 12.5 ± 3.1 13.4 ± 3.5 12.2 ± 2.9 a:b P<0,05 Skupina K – suplementace jodu 3 mg/kg sušiny krmné dávky Skupina P – suplementace jodu 5 mg/kg sušiny krmné dávky

V porovnání s obdobím p řed porodem (tabulka 1) se 1. den po porodu stav TT3 významn ě mezi skupinami nelišil (tabulka 2). Z 1. na 10. den po porodu došlo ve skupin ě K k významnému zvýšení úrovn ě TT3. Naproti tomu úrove ň TT4 byla již 1. den po porodu (tabulka 2) u skupiny P významn ě vyšší (P<0,01) zatímco 10. den se hodnoty TT4 významn ě od sebe nelišily a pohybovaly se u obou skupin na stejné úrovni. V porovnání mezi skupinami se p ředevším hodnoty fT4 v pr ůběhu laktace snížily u obou skupin a obdobn ě jako u fT3 byly nejnižší hodnoty zaznamenány 10. den po porodu v pokusné skupin ě p řijímající 5 mg jodu na kg sušiny KD. Pokles fT4 u skupiny P z 1. na 10. den byl významný (tabulka 2).

208 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 2 Dopad suplementace I na koncentraci hormon ů štítné žlázy v krevní plazm ě bahnic 1. a 10. den po porodu (The impact of iodine supplementation on the concentration of thyroid hormones in blood plasma of ewes in the 1 st and the 10 th day after parturition)

Dny po porodu Parametr 1 10 K P K P TT3 (nmol/l) 2.0 ± 0.1 c 2.8 ± 1.2 2.5 ± 0.3 d 2,4 ± 0.7 TT4 (nmol/l) 47.8 ± 6.8 a 78.2 ± 11.7 b 61.7 ± 7.4 e 64,7 ± 13,7 fT3 (pmol/l) 4.4 ± 0.3 4.2 ± 1.1 4.0 ± 0.5 3,6 ± 0.3 fT4 (pmol/l) 12.0 ± 1.8 13.1 ± 1.6 f 10.9 ± 2.8 9.9 ± 0.7 g

a:b; c:d; f:g P<0,01 a:e P<0,05 V porovnání s bezprost ředním obdobím po porodu (tabulka 2) v následujícím lakta čním období (tabulka 3) zůstávaly hodnoty TT3 bez rozdílu mezi skupinami na nižší úrovni (tabulka 3). Ve skupin ě P a K v 60. dnu laktace došlo v porovnání s 30. dnem k statisticky významnému poklesu TT4. Koncentrace TT4 u bahnic v pr ůběhu celého pokusu byly krom ě 30. dne po porodu u obou skupin bahnic nižší než udává Nazifi et al. (2008) u ovcí (91. 60 ± 2.95 nmol/l). Volný trijodthyronin byl významn ě nižší (P<0,05) 30. den ve skupin ě P. Zatímco hodnoty fT4 se 30. den po porodu v obou skupinách nelišily mezi sebou a nelišily se od hodnot fT4 do 10. dne po porodu (tabulka 2). Pokles fT4 u skupiny P z 30. na 60. den byl významný. Výrazný vliv na koncentraci thyreoidálních hormon ů po porodu má laktace. V našem pokusu koncentrace TT 3 a TT 4 u bahnic byla nejnižší 1. den po porodu u skupiny K a poté se postupn ě zvyšovala až na hodnoty p řed porodem, což odpovídá nález ům Huszenica et al. (2001). Tento poporodní pokles má klí čové postavení v homeostatické a metabolické adaptaci organizmu na zvýšenou energetickou spot řebu (Huszenica et al. 2001).

209 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 3 Dopad suplementace jodu na koncentraci hormon ů štítné žlázy v krevní plazm ě bahnic po porodu (The impact of iodine supplementation on the concentration of thyroid hormones in blood plasma of ewes in the 30 th and the 60 th day after parturition) Dny po porodu Parametr 30 60 K P K P TT3 (nmol/l) 2.3 ± 0.3 2.3 ± 0.2 2.2 ± 0.1 2.0 ± 0.4 TT4 (nmol/l) 94.7 ± 20.4 a 91.0 ± 17.5 c 54.1 ± 7.6 b 62.0 ± 9.6 d fT3 (pmol/l) 4.2 ± 0.3 e 3.6 ± 0.3 f 3.0 ± 0.1g 2.7 ± 0.3 h fT4 (pmol/l) 13.8 ± 1.8 13.6 ± 1.3 ch 12.3 ± 1.5 11.9 ± 0.4 i a:b; e:g; f:h P<0,01 c:d; e:f; ch:i P<0,05 Ze souhrnného sledování zm ěn úrovn ě hormon ů štítné žlázy v pr ůběhu laktace p ři vysoké zát ěži jodem vyplývá tendence k nižší koncentraci hormon ů štítné žlázy (p ředevším fT3 a fT4) p ři suplementaci 5 mg jodu na kg sušiny KD.

Pod ěkování Tato studie byla podporována z grantu QH 81 105 Ministerstva zem ědělství a z projektu 022/2010/Z Grantové agentury Jiho české univerzity v Českých Bud ějovicích.

Použitá literatura Boland, T.M., Hayes, L., Sweeney, T., Callan, J.J., Baird, A.W., Keely, S., Crosby, T.F. T.effects of cobalt and iodine supplementation of the pregnant ewe diet on immunoglobulin G, vitamin E, T3 and T4 levels in the progeny. Animal , 2008, 2, 197- 206. Huszenica, G.Y., Kulcsar, M., Nikoli, J.A., Schmidt, J., Korodi, P., Katai, L. Plasma leptin concentration and its interrelation with some blood metabolites, metabolic hormones and the resumption of cyclic ovarian function in postpartum dairy cows supplemented with monensin or inert fat in feed, In: Diskin, M.G., editor, Fertility in the High-producing Dairy Cow, Br. Soc. Anim. Sci. , 2001, 2, 405-409. Huszenica, G.Y., Kulcsar, M., Rudas, P. Clinical endocrinology of thyroid gland function in ruminants. Vet. Med.-Czech ., 2002, 47, 199-210. Kelly, G. Peripheral metabolism of thyroid hormones: a review. Altern. Med. Rev ., 2000, 5, 306–333. Manalu, W., Sumaryadi, M.Y., Kusumorini, N. Maternal serum concentrations of total triiodothyronine, tetraiodothyronine and cortisol indifferent status of pregnancy during late pregnancy in Ettawah-cross does. A. Aust. J. Anim. Sci. , 1997, 10, 385–390. Mühlberg, K.S., Paschke, R. Frequency, Pathogenesis, Prevention and Treatment of Iodine- Induced Hyperthyroidism. In: Preedy, V.R., Burrow, G.N., Watson, R.R. Comprehensive

210 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Handbook of Iodine: Nutritional, Biochemical, Pathological and Therapeutic Aspects, Academic Press, 2009, 887-896. Na řízení Komise (ES) č. 1459/2005 ze dne 8. zá ří 2005, kterým se m ění podmínky pro povolení n ěkterých dopl ňkových látek v krmivech, které pat ří do skupiny stopových prvk ů. OJEU ., 2005. Nazifi, S., Saeb, M., Abangah, E., Karimi, T. Studies on the relationship between thyroid hormones and some trace elements in the blood serum of Iranian fat-tailed sheep. Vet. Archiv. , 2008, 78, 159-165. NRC (National Research Council). Nutrient Requirements of Dairy Cattle. National Academies Press, 174 Washington, DC, USA, 2001. Nobukuni, K. Influence of Iodine-Containing Pharmaceuticals on Iodine Status and Thyroid Function: Iodine Induced Hyperthyroidism and Hypothyroidism. In: Preedy, V.R., Burrow, G.N., Watson, R.R. Comprehensive Handbook of Iodine: Nutritional, Biochemical, Pathological and Therapeutic Aspects, Academic Press, 2009, 927-936. Pavlata, I., Šlosárková, S., Fleischer, P., Pechová, A. Effects of increased iodine supply on the selenium status of kids. Vet. Med.-Czech. , 2005, 186-194. Rose, M.T., Wolf, B.T., Haresign, W. Effect of the level of iodine in the diet of pregnant ewes on the concentration of immunoglobulin G in the plasma of neonatal lambs following the consumption of colostrum. Br. J. Nutr., 2007, 97, 315-320. Yildiz, A., Balikci, E., Gurdogan, F. Changes in some serum hormonal profiles during pregnancy in single- and twin-foetus-bearing Akkaraman sheep. Med. Wet.-Pl. , 2005, 61, 1138- 1141.

211 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE RELATIONSHIP OF FAT CONTENT IN CARCASS, THIGH MEAT AND BLOOD BIOCHEMICAL PARAMETERS IN CZECH RABBIT GENETIC RESOURCES

Tůmová, E. 1, Härtlová, H. 2, Chodová, D. 1

1 Katedra speciální zootechniky FAPPZ, ČZU v Praze, 2 Katedra veterinárních disciplín FAPPZ, ČZU v Praze

Abstract In the experiment, correlations between growth, renal fat content, fat, cholesterol content in thigh meat and blood biochemical fat characteristics in rabbit genetic resources were evaluated. There were used giant breed Moravian Blue (Mm), medium breeds Czech Spotted (CS), Czech Solver (CL), Czech White (CA), Moravian White of brown eye (Mbh) and small breeds Czech Black Guard Hair (Ccp) and Czech Gold (Cc). There were significant medium correlations (P ≤ 0.01) between daily weight gain and serum cholesterol concentration (0.40) and (P ≤ 0.01) between renal fat and serum NEFA (0.39).

Úvod Genové zdroje králík ů jsou významnou sou částí biodiverzity zví řat, protože v ětšina produkce se uskute čň uje využíváním hybridních zví řat, která mají velmi úzký genetický základ. Genové zdroje mohou být nositeli znak ů, které mohou být využity p ři šlecht ění nových populací. U genových zdroj ů králík ů jsou známé hmotnosti dosp ělých zví řat, zbarvení a kvalita srsti, ale minimum informací o užitkovosti a genetickém polymorfismu (Bolet et al. 2000). V ČR je v programu ochrany genových zdroj ů registrováno sedm plemen, u kterých se teprve získávají první údaje o populacích a užitkovosti (T ůmová et al., 2011). Biochemické parametry krve charakterizují homeostázu vnit řního prost ředí organismu zví řat, která se odráží v produk čních ukazatelích. V definovaných podmínkách biochemické ukazatele krevního séra mají úzký vztah k metabolismu tuk ů, což je důležité p ředevším z hlediska produkce masa králík ů. Cílem práce bylo zjišt ění korelací mezi koncentrací triacylglycerol ů, neesterifikovaných mastných kyselin a cholesterolu k obsahu ledvinového tuku, obsahu tuku a cholesterolu ve stehenním svalstvu sedmi plemen genových zdroj ů králík ů.

212 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Materiál a metodika Do sledování bylo za řazeno celkem 49 králík ů sedmi čistokrevných plemen, velké plemeno moravský modrý (Mm), st řední plemena český lušti č ( ČL), český straká č ( ČS), český albín ( ČA), moravský bílý hn ědooký (Mbh) a malá plemena český červený ( Čč ) a český černopesíkatý ( Čč p). Ve skupin ě bylo sedm králík ů od každého genotypu vykrmovaných od 42 do 91 dn ů v ěku v identických podmínkách. Králí čata byla ustájena v individuálních klecích (0,2 m2/ks), dostávala komerční typ krmné sm ěsi s 18,8 % N-látek, 16,3 % vlákniny a 3,7 % tuku. Používal se 12 hodinový sv ětelný režim. Růst králí čat byl sledován individuálním vážením v týdenním intervalu. V 91 dnech v ěku bylo 6 králík ů od každého plemene poraženo pro zjišt ění obsahu ledvinového tuku. Sou časn ě byly odebrány vzorky stehenního svalstva pro stanovení obsahu tuku a cholesterolu v mase. Obsah intramuskulárního tuku byl zjiš ťován ze sušiny extrakcí petroéterem, obsah cholesterolu byl stanoven fotometrickou metodou. Biochemické parametry krevního séra králík ů byly analyzovány p ři porážce králík ů v 91 dnech věku. Triacylglyceroly (TAG), neesterifikované mastné kyseliny (NEFA) a cholesterol byly stanoveny fotometricky na spektrofotometru Libra S 22 (Biochrom Ltd., UK) za použití komer čních set ů (Randox Laboratories Ltd., Crumlin, UK). Výsledky pokusu byly zpracovány jednoduchou analýzou variance programem SAS (SAS Institute Inc., 2003), metoda ANOVA. Statisticky pr ůkazné rozdíly byly hodnoceny Duncanovým testem. Pr ůkaznost rozdíl ů je zna čena r ůznými písmeny na hladin ě významnosti P≤0,05. Korelace mezi sledovanými parametry byly hodnoceny Pearsnovým korela čním koeficientem.

Výsledky a diskuse V živé hmotnosti králík ů v 91 dnech v ěku, stejn ě jako v pr ůměrném denním p řír ůstku byly zjišt ěny vysoce pr ůkazné rozdíly (P ≤ 0,001) mezi plemeny. Nejvyšší živá hmotnost i přír ůstek byly u velkého plemene Mm a dále u st ředního plemene ČA. Naopak nejnižší hodnoty byly u malých plemen Čč a Čč p. Tyto výsledky odpovídají i p ředpoklad ům o r ůstu králík ů ve vztahu k tělesnému rámci a korespondují s našimi p ředchozími údaji (T ůmová et al., 2011). Obsah ledvinového tuku byl signifikantně (P ≤ 0,001) nejvyšší u plemene ČS. Toto plemeno m ělo i pr ůkazn ě nejvyšší obsah tuku ve stehenním svalstvu (P ≤ 0,017) a nevýznamn ě nejvyšší obsah cholesterolu ve stehenním svalstvu.

213 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 1 Výsledky r ůstu, obsahu tuku v jate čném trupu a stehnech, obsahu cholesterolu ve stehnech (Results of growth, renal fat, fat and cholesterol content in thigh meat) Plemeno Živá Pr ůměrný Obsah Obsah tuku Obsah hmotnost denní ledvinového ve stehenním cholesterolu v 91 dnech přír ůstek (g) tuku (%) svalstvu (%) ve stehenním (g) svalstvu (%) Mm 3217 a 42,6 a 1,86 abc 2,55 b 0,93 ČS 2190 dc 30,7 bc 2,98 a 3,59 a 1,01 ČA 2804 ab 39,6 ab 1,48 bc 2,84 ab 0,92 ČL 2024 cd 29,9 bc 1,90 abc 2,27 b 0,95 Čč 1933 d 26,6 bc 2,69 ab 2,26 b 0,89 Mbh 2520 bc 25,9 c 1,90 abc 2,20 b 0,91 Čč p 2000 cd 23,9 c 1,25 c 2,33 b 0,93 SEM 325 1,2 0,84 0,01 0,11 Pr ůkaznost 0,001 0,001 0,001 0,017 0,641 a,b,c,d P ≤ 0,05

Koncentrace TAG a NEFA v krevním séru nebyla genotypem králík ů ovlivn ěna, nejvyšší koncentrace TAG byla u ČA a NEFA u Mm, v obou p řípadech u plemen s nejvyšší intenzitou r ůstu. Vliv genotypu na koncentraci TAG a NEFA v krevním séru není v literatu ře uvád ěn. Koncentrace cholesterolu byly signifikantn ě nejvyšší (P ≤ 0,041) u velkého plemene Mm a dále u ČA, u kterého se koncentrace cholesterolu významn ě nelišila od Mm a ostatních plemen, která m ěla pr ůkazn ě nižší koncentrace. Tyto výsledky jsou v souladu s údaji Atkinsona et al. (1989), kte ří zjistili vliv genotypu na koncentraci cholesterolu v krvi.

214 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 2 Biochemické parametry tukového metabolismu v krevním séru (Biochemical parameters of fat metabolism in blood serum) Plemeno Triacylglyceroly Cholesterol (mmol/l) NEFA (mmol/l) (mmol/l) Mm 0,91 3,16 a 1 ČS 0,89 1,81 b 0,83 ČA 1,3 2,36 ab 0,79 ČL 1,19 2,00 b 0,73 Čč 1,08 1,46 b 0,84 Mbh 0,75 1,87 b 0,81 Čč p 1,12 1,90 b 0,69 SEM 0,42 1,47 0,41 Pr ůkaznost 0,652 0,041 0,645

Korelace mezi p řír ůstkem živé hmotnosti a parametry krevního séra byly pr ůkazné pouze u cholesterolu ((P ≤ 0,01) a dosahovaly st ředních hodnot. Výsledky jsou v souladu s Hernandez et al. (2008), kte ří zjistili, že koncentrace cholesterolu je ovlivn ěna genotypem, zejména však velikostí t ělesného rámce. Významná korelace byla (P ≤ 0,02) mezi podílem ledvinového tuku a NEFA. Také u t ěchto parametr ů byly zjišt ěny st řední hodnoty korelací. Korelace mezi obsahem tuku ve stehenním svalstvu a charakteristikami krevního séra nebyly významné a pohybovaly se v nízkých negativních hodnotách. Podobné vztahy byly zaznamenány i u obsahu cholesterolu v mase a hodnotami krevního séra.

Tab 3 Korelace mezi sledovanými parametry (Correlations between evaluated parameters). Ukazatelr Pr ůkaznost Ukazatel r Pr ůkaznost Přír ůstek TAG 0,16 0,31Obsah tuku TAG -0,08 0,68 živé ve stehenním hmotnosti Chol. 0,4 0,01svalstvu Chol. -0,22 0,71 NEFA 0,12 0,43 NEFA -0,06 0,71 Podíl TAG -0,06 0,71Obsah TAG -0,03 0,98 ledvinového Chol. -0,18 0,32cholesterolu Chol. -0,08 0,65 tuku NEFA 0,39 0,02ve stehenním NEFA -0,22 0,23 svalstvu

215 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Záv ěr Z výsledk ů je z řejmý vliv genotypu na r ůst králík ů i obsah ledvinového tuku. Mén ě genotyp ovlivnil obsah tuku ve stehenním svalstvu, vliv na obsah cholesterolu ve stehenním svalstvu byl nevýznamný. Z biochemických ukazatel ů byla signifikantn ě ovlivn ěna koncentrace cholesterolu. U korelací je z řejmé, že k růstu králík ů m ěla vztah koncentrace cholesterolu a k podílu ledvinového tuku koncentrace neesterifikovaných mastných kyselin. Vztah mezi parametry krve a obsahem tuku či cholesterolu ve stehenním svalstvu nebyl zjišt ěn, korelace byly velmi nízké a negativní.

Pod ěkování Přísp ěvek byl zpracován p ři řešení projektu NAZV QI101A164.

Použitá literatura

Atkinson, J.B., Hoover, R.L., Berry, K.K., Swift, L.L. Cholesterol-fed heterozygous Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits: a new model for atherosclerosis. Atherosclerosis , 1989, 78, 123-136. Bolet, G., Brun, J. M., Monnerot, M., Abeni, F., Arnal, C., Arnold, J., Bell, D., Bergoglio, G., Besenfelder, U., Bosze, S., Boucher, S., Chanteloup, N., Ducourouble, M. C., Durand- Tardif, M., Esteves, P. J., Ferrand, N., Haas, C., Hewitt, G., Jehl, N., Joly, T., Koehl, P. F., Laube, T., Lechestrier, S., Lopez, M., Masoero, G., Menigoz, J. J., Piccinin, R., Querney, G., Vincente, J. S., Saleil, G., Surrdge, A., Van Der Loo, W., Virag, J. S., Viudes de Castro, M. P., Zimmermann, J. M.: Evaluation and utilisation of European rabbit (Oryctolagus cuniculus) genetic resources. In: Proc. 7 th World Rabbit Congr., Valencia, Spain, 4-7 July 2000, pp. 1-32. Hernandez P, Cesari V, Blasco A Effect of genetic rabbit lines on lipid content, lypolytic activities and fatty acid composition of hind leg meat and perirenal fat. Meat Sci., 2008, 78, 485-491 Tůmová, E., Martinec, M., Chodová, D. Analysis of Czech rabbit genetic resources. Scientia Agric. Bohemica , 2011, 42, s. 113 – 118.

216 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

SELECTED SPERMATOZOA MOTILITY PARAMETERS VERSUS CATALASE AND GLUTATHIONE CONTENT IN BOVINE SEMINAL PLASMA

Tvrdá, E., 1 K ňažická, Z., 1 Luká čová, J., 1 Massányi, P., 1 Goc, Z., 2 Kilian, K., 2 Formicki, G., 2 Stawarz, R., 2 Luká č, N. 1

1Department of Animal Physiology, Faculty of Biotechnology and Food Sciences, Slovak University of Agriculture, Nitra, Slovakia, 2Institute of Biology, Faculty of Geography and Biology, Pedagogical University, Krakow, Poland

Abstract To investigate the relationships between basic motility characteristics (motility, progressive motility) and selected antioxidant parameters (catalase-CAT, glutathione-GLH) in the bovine seminal plasma semen samples were collected from breeding bulls and used in the study. Motility analysis was carried out using the Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) system. Subsequently, the samples were centrifuged and fractions of seminal plasma were collected. Antioxidant parameters were analyzed by UV/VIS spectrophotometry. The correlation analysis revealed that both antioxidants were positively correlated with motility (r = 0.521; p < 0.05 for CAT and r = 0.525; p < 0.05 for GLH), progressive motility (r = 0.521; p < 0.05 for CAT and r = 0.520; p < 0.05 for GLH). Moreover the samples were categorized in three quality groups (Excellent, Good, Medium) according to their motility values. The the best antioxidant characteristics were found in samples of excellent quality, medium quality samples were described by the worst antioxidant power. Our findings suggest a protective role of seminal plasma catalase and glutathione against oxidative stress development in bovine semen.

Key words: bulls, CASA, catalase, glutathione, oxidative stress, semen.

Introduction Oxygen is essential to sustain life as physiological levels of reactive oxygen species (ROS) are necessary to maintain normal cell functions. Conversely, ROS can prove to be detrimental to cell function and survival (Makker et al., 2009). Excessive ROS production in farm animal diseases has been mainly associated with infectious

217 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 diseases, such as pneumonia, enteritis, mastitis, endometritis, arthritis, intestinal strangulation and sepsis (Lykkesfeldt and Svendsen, 2007). Regarding male fertility, increased levels of ROS have been correlated with decreased sperm motility, increased sperm DNA damage, sperm cellular membrane lipid peroxidation and decreased efficacy of oocyte–sperm fusion (Aitken, 1995; Eskenazi et al., 2003; Agarwal et al., 2007). Antioxidants, in general, are compounds or enzymes that dispose, scavenge and inhibit the formation of ROS, or oppose their actions (Sikka et al., 1995). They can be divided into two main categories: • Enzymatic (e.g. superoxide dismutases, catalase and glutathione peroxidases), • Non-enzymatic (e.g. vitamin C, vitamin E, vitamin A, carotenoids, albumin, glutathione, uric acid, pyruvate, etc.; Agarwal and Prabakaran, 2005). Due to the size and small volume of cytoplasm, as well as the low concentrations of scavenging enzymes, spermatozoa have limited antioxidant defence properties. Mammalian sperm mainly contain enzymatic antioxidants, which are mainly present in the midpiece. A few nonenzymatic antioxidants are present in the plasma membrane of spermatozoa and act as preventive antioxidants. Under normal conditions, the seminal plasma is an important protectant of sperm cells against possible free radical formation and distribution. It contains both enzymatic antioxidants, as well as an array of non-enzymatic antioxidants (e.g. ascorbate, urate, vitamin E, vitamin A, pyruvate, glutathione, albumin, taurine and hypotaurine; Agarwal et al., 2004; Tvrda et al., 2011). This study was carried out to: determine selected basic motility characteristics and antioxidant parameters of bovine semen, test whether any correlation exists between these markers in bovine seminal plasma. The motility and antioxidant parameters were as follows: • Motility (MOT): percentage of motile spermatozoa (motility > 5µm/s), • Progressive motility (PROG): percentage of progressive motile spermatozoa (motility > 20µm/s), • Catalase (CAT): a major antioxidant enzyme produced by the organism, which catalyzes the decomposition of hydrogen peroxide to water and oxygen, • Glutathione (GLH): an important non-enzymatic protein with antioxidant properties preventing damage to important cellular components caused by ROS.

Material and Methods 20 bovine semen samples were obtained from adult breeding bulls (Slovak Biological

218 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Services, Nitra, Slovakia) on a regular collection schedule using an artificial vagina. After collecting the samples were stored in the laboratory at room temperature (22-25°C) for further analysis. Spermatozoa motility and progressive motility analysis was carried out using the Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) system – SpermVision (MiniTüb, Tiefenbach, Germany) with Olympus BX 51 phase contrast microscope (Olympus, Japan). Each sample was placed into Makler Counting Chamber (depth 10 µm, 37±1°C; Sefi–Medical Instruments, Haifa, Israel), motility and progressive motility parameters were evaluated. 1000 cells were examined for each sample (Massanyi et al., 2008). The samples were centrifuged (15 min, 12 718 x g, 4°C) to obtain the cell sediment and seminal plasma fraction. The fractions were separated, seminal plasma was transferred into 1.5 mL tubes and kept frozen (-80°C) until analysis (Tvrda et al., 2012). All of the measurements were based on a colorimetric reaction of the target substance and a subsequent UV/VIS spectrophotometric detection at a specific wavelength. TAS, SOD and ALB were measured using the Genesys 10 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc, USA). Reduced glutathione was determined by the Ellman method (1959). 1 mL of supernatant was treated with 0,5 mL of Ellmans reagent (19.8 mg of 5,5´dithiobisnitro benzoic acid in 100 mL of 0.1 % sodium citrate) and 3.0 ml of phosphate buffer (0.2 M, pH 8.0). The absorbance was read at 412 nm. Activity measurements of catalase were performed by the Beers and Sizer method

(1952) monitoring the decrease of H2O2 at 240 nm. The reaction mixture contained 1.7 mL of 50 mmol/L of potassium phosphate buffer solution (pH 7.0), 30 uL of the sample and 0.5 mL of 54 mmol/L H 2O2 solution. The activity was calculated based on the rate of decomposition of H 2O2, which is proportional to the reduction of the absorbance at λ = 240 nm during 1 min. Statistical analysis was carried out using the statistical program GraphPad Prism 3.02 (Graphpad Software incorporated, San Diego, California, USA). Results are quoted as arithmetic mean±standard deviation (SD). Additionally, the samples were categorized in three quality groups according to their motility rates. The comparison of semen parameters in the quality groups was carried out by the Tukey's Multiple Comparison Test. Pearson’s correlation coefficient (two tailed) test was used to examine correlations between all the analyzed parameters. The level of significance for the comparison test as well as for the correlation analysis was set at *** (p < 0.001); ** (p < 0.01); * (p < 0.05).

219 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Results and Discussion Tab. 1 Semen characteristics of bovine semen and seminal plasma (n=15). PARAMETER MEAN MIN MAX SD CV VOLUME (mL) 5.55 3.00 9.00 1.64 19.51

pH 6.57 6.25 7.04 0.21 3.22

CONCENTRATION (10 9) 2.69 1.48 4.12 0.80 19.78

MOTILITY (%) 81.61 14.93 95.96 9.86 14.33

PROGRESSIVE MOTILITY (%) 78.48 14.07 93.68 10.15 15.67 CATALASE (U/mg proteins) 2.39 0.42 6.13 1.91 13.61

GLUTATHIONE (mg/100mL) 26.52 6.59 81.92 6.87 19.95

SD – standard deviation; CV – coefficient of variation

The total catalase content of the bovine seminal plasma was recorded as 2.39±1.91 U/mg (Table 1) which was positively correlated with sperm motility (p<0.05) and progressive motility (p<0.05; Table 2). Alavi-Shoushtari et al. (2009) observed that the catalase activity of water buffalo bulls was 32.00±0.42 U/mL and was highly associated with sperm motility, viability and sperm gross motility. Additionally, we recorded a significant decrease of the catalase activity in the good quality group (p < 0.05) and moderate quality group (p < 0.001) when compared to the excellent group (Table 3). The findings of other authors are however controversial. Sanocka et al. (1996) showed a decrase of catalase activity in infertile samples. Lapointe et al. (2000) reported that catalase had a significant positive effect on the maintenance of bovine sperm motility. Verberckmoes et al. (2005) observed that addition of catalase to the semen diluents had no effect on sperm quality in bulls. Marti et al. (2007) suggested that catalase activity was higher in the first ejaculate of rams during all months of the year and higher in non-breeding season and finally, DeGraaf et al. (2007) found that in vitro addition of catalase had no effect on the post-thawn sperm motility in rams.

220 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 2 Correlations between selected spermatozoa motility and antioxidant parameters of bovine seminal plasma evaluated by the Pearson’s correlation coefficient test (n=15).

MOT PROG CAT GLH VOL pH [10 9] MOT 1 PROG 0.996*** 1 CAT 0.521* 0.521* 1 GLH 0.525* 0.520* 0.312 1 VOL -0.034 -0.046 -0.261 -0.304 1 pH -0.346 -0.311 -0.290 -0.039 -0.013 1 [10 9] -0.0301 -0.053 -0.113 -0.226 0.153 -0.362 1 The correlation analysis was correlation based on the value of the correlation coefficient: ±0.667 - ±0.999: high correlation; ±0.334 – ±0.666: moderate correlation; ±0.111 - ±0.333: low correlation;
- p < 0.05;

- p < 0.01;


- p < 0.001.

The total GLH content of bovine seminal plasma detected in our experiment was 26.52±6.87 mg/100mL. The total GLH content of bovine spermatozoa detected by Stradaioli et al. (2007) in the raw semen was 566.9±75.0 pmoles/mg protein and it was very close to that reported by Bilodeau et al. (2000). Sperm GLH levels vary widely between species, from 0.1 nmol/10 9 spermatozoa in rabbit to 90 nmol/10 8 spermatozoa in mouse Ochsendorf (1998). Agarwal and Vanha-Perttula (1988) state that the total content of GLH in the bovine semen is 1.3 mM. In our case, the GLH concentration was positively correlated with both motility (p<0.05) and progressive motility (p<0.05). Additionally we observed a similar decrease in its content according to a decreased quality of semen, as we did in the case of catalase (p<0.05; p<0.001). According to Ochsendorf et al. (1998) no association between sperm GLH concentration to any parameter of the routine ejaculate analysis was found. Also, only a small but still significant association was found between the intracellular glutathione concentration and the fertilization ability of human spermatozoa was found. Furthermore, there was no statistical difference (p>0.05) between the GLH concentrations in the samples of fertile or infertile patients or associations to parameters of the spermiogram. However, in a double- blind study of Lenzi et al. (1993) GLH therapy improved spermatozoa motility. Moreover, supplementation of GLH in the extender has been shown to provide a protective role in maintaining the quality of bovine (Bilodeau et al., 2000) and buck semen (Sinha et al., 1996).

221 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 3 Average values of observed motility and antioxidant parameters in the quality groups (mean±SD) and the Tukey’s Multiple Comparisson Test (n=15).

MOT PROG CAT GLH Ex 93.87±1.79 91.02±1.80 2.73± 1.86 33.79±12.02 Go 85.95±2.13 *a 83.33±3.31 *a 2.39± 2.39 *a 24.35±12.60 *a Mo 59.62±14.92 ***b,***c 55.63±14.40 ***b,***c 1.74±1.56 ***b,***c 21.70±5.61 ***b Quality groups are based on the motility values: Excellent quality (Ex): > 90% motile (n=9); Good quality (Go): 80-90 % motile (n=5); Moderate quality (Mo): < 80% motile (n=6). Mean ± SD. MOT – motility, PROG – progressive motility, CAT – catalase (U/mg proteins), GLH – glutathione (mg/100 mL). *** (p < 0.001); ** (p < 0.01); * (p < 0.05). a – Ex vs. Go; b – Ex vs. Mo; c – Go vs. Mo.

Despite our expectations to find a significant relationship between catalase and glutathione, a positive, nut no significant correlation (p>0.05) was found. This observation may suggest that each of these antioxidants protects semen on a different level. CAT catalyzes the reduction of H 2O2 and protects the tissues from highly reactive hydroxyle radicals (Chance et al., 1952), meanwhile GLH functions as free radical scavenger and in the repair of radical cause biological damage (Meister, 1984). Both of these antioxidants

participate in the elimination of toxic H 2O2, however actions of GLH are not limited on hydrogen peroxide only. Therefore we may assume that even though there is collaboration between all of the antioxidant mechanisms in order to protect spermatozoa against oxidative stress, the pathways and exact mechanisms are specific for enzymatic and non-enzymatic antioxidants.

Conclusions In conclusion, our findings indicate a protective role of seminal plasma catalase and glutathione against oxidative stress development in bovine semen. Both antioxidants are positively correlated with basic parameters of spermatozoa viability and their decrease is associated with a lower quality of ejaculates. As both are part of a crucial defence mechanism to protect sperm cells from oxidative damage, further studies on both proteins and their possible therapeutic assessment in male infertility are requested.

222 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Acknowledgment This study was supported by the Scientific Grand of the Slovak republic VEGA no. 1/0532/11 and by the Cultural and Educational Grant of the Slovak Republic KEGA no. 101- 001SPU-4/2010.

References Agarwal, Y.P., Vanha-Perttula, T. Glutathione, L-glutamic acid and γ-glutamyl transpeptidase in the bull reproductive tissues. Int. J. Androl. , 1988, 11 (2), 123–131. Agarwal, A., Nallella, K. P., Allamaneni, S. S., Said, T. M. Role of antioxidants in treatment of male infertility: an overview of the literature. Reprod. Biomed. Online , 2004, 8, 616– 627. Agarwal, A., Prabakaran, S. A. Mechanism, measurement, and prevention of oxidative stress in male reproductive physiology. Indian J. Exp. Biol., 2005, 43, 963–974. Agarwal, A., Prabakaran, S. A., Sikka, S. C. Clinical relevance of oxidative stress in patients with male factor infertility: evidence-based analysis. AUA Update Series , 2007, 26, 1–12. Aitken, R. J. Free radicals, lipid peroxidation, sperm function. Reprod. Fertil. Dev. , 1995, 7, 659–668. Alavi-Shoushtari, S.M., Asri Rezai, S., Ansari, M.H.Kh., Khaki, A. Effects of the seminal plasma zinc content and catalase activity on the semen quality of water buffalo (Bubalus bubalis) bulls. Pak. J. Biol. Sci. , 2009, 12 (2), 134-139. Beers, R.F. Jr., Sizer, I.W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J. Biol. Chem., 1952, 195, 133-140. Bilodeau, J.F., Chatterjee, S., Sirard, M.A., Gagnon, C. Levels of antioxidant defenses are decreased in bovine spermatozoa after a cycle of freezing and thawing. Mol. Reprod. Dev., 2000, 55, 282–288. Chance, B. Effect of pH upon the reaction kinetics of the enzyme-substrate compounds of catalase. J. Biol. Chem. , 1952, 194, 471-481. De Graaf, S.P., Evans, G., Gillan, L., Guerra, M.M., Maxwell, W.M., O'Brien, J.K. The influence of antioxidant, cholesterol and seminal plasma on the in vitro quality of sorted and non-sorted ram spermatozoa. Theriogenology , 2007, 67 (2), 217-27. Ellman, G.L. Tissue sulfhydrl groups. Arch. Biochem. Biophys ., 1959, 82, 70–77. Eskenazi, B., Wyrobek, A. J., Sloter, E., Kidd, S. A., Moore, L., Young, S., Moore, D. The association of age and semen quality in healthy men. Hum. Reprod., 2003, 18, 447–454. Lapointe, S., Bilodeau, J.F., Lemieux, D., Asselin, E., Sirard, M.A. Epithelial and stromal uterine cells cultured in vitro protect bovine sperm from hydrogen peroxide. Theriogenology , 2000, 54 (3), 355-369. Lenzi, A., Cualosso, F., Gandini, L., Lombardo, F., Dondero, F. Placebo controlled, double- blind, cross-over trial of glutathione therapy, in male infertility. Hum. Reprod. , 1993, 9, 2044-2050. Lykkesfeldt, J., Svendsen, O. Oxidants and antioxidants in disease: Oxidative stress in farm animals. Vet. J., 2007, 173, 502–511. Makker, K., Agarwal, A., Sharma, R. Oxidative stress & male infertility. Ind. J. Med. Res. , 2009, 129, 357–367. Marti, E., Mara, L., Marti, J.I., Muiño-Blanco, T., Cebrián-Pérez , J.A. Seasonal variations in antioxidant enzyme activity in ram seminal plasma. Theriogenology , 2007, 67 (9), 1446- 1454.

223 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Massanyi, P., Chrenek, P., Lukac, N., Makarevich, A.V., Ostro, A., Zivcak, J., Bulla, J. Comparison of different evaluation chambers for analysis of rabbit spermatozoa moility using CASA system. Slovak J. Anim. Sci . 2008, 41(2), 60-66. Meister A. New aspects of glutathione biochemistry and transport--selective alteration of glutathione metabolism. Nutr. Rev. , 1984, 42 (12), 397-410. Ochsendorf, F.R., Buhl, R., Bastlein, A., Beschmann, H. Glutathione in spermatozoa and seminal plasma of infertile men. Hum. Reprod., 1998, 13, 353–359. Sanocka, D., Miesel, R., Jedrzejczak, P., Kurpisz, M.K. Oxidative stress and male infertility. J. Androl. , 1996, 17 (4), 449-454. Sikka, S. C., Rajasekaran, M., Hellstrom, W. J. Role of oxidative stress and antioxidants in male infertility. J. Androl ., 1995, 16, 464–468. Sinha, M.P., Sinha, A.K., Singh, B.K., Prasad, R.L. The effect of glutathione on the motility, enzyme leakage and fertility of frozen goat semen. Anim. Reprod. Sci. , 1996, 41 (3-4), 237-243. Stradaioli, G., Noro, T., Sylla, L., Monaci, M. Decrease in glutathione (GSH) content in bovine sperm after cryopreservation: Comparison between two extenders. Theriogenology , 2007, 67, 1249–1255. Tvrda, E., Knazicka, Z., Bardos, L., Massanyi, P., Lukac, N. Impact of oxidative stress on male fertility – a review. Acta Vet. Hung. , 2011, 59 (4), 465–484. Tvrda, E., Knazicka, Z., Lukac, N. Selected heavy metals versus antioxidant parameters in bull seminal plasma – a comparative study. J. Env. Sci. Health A , 2012, 47 (9), 1261- 1266. Verberckmoes, S., Van Soom, A., Dewulf, J., de Kruif A. Comparison of three diluents for the storage of fresh bovine semen. Theriogenology , 2005, 63 (3), 912-922.

224 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

INFLUENCE OF FACTORS INVOLVED IN THE REGULATION OF PROLACTIN SECRETION ON THE EXPRESSION OF GENES – CODING FOR OPIOID PRECURSORS – IN ANTERIOR PITUITARY CELLS OF THE LATE FOLLICULAR - PHASE GILTS IN VITRO

Tworus, K., Tworus, D., Okrasa, S.

Department of Animal Physiology, University of Warmia and Mazury in Olsztyn; Oczapowski Street 1A, 10- 719 Olsztyn-Kortowo

Abstract Endogenous opioid peptides deriving from proopiomelanocortin (POMC), proenkephalin (PENK) and prodynorphin (PDYN) are, among others, involved in the modulation of prolactin secretion in females. However, data concerning factors modulating the activity of pituitary opioid systems are scarce. The aim of the study was to test whether pituitary opioid systems are affected by factors engaged in the regulation of prolactin secretion, such as: dopamine, tyreoliberin, salsolinol, kisspeptin, corticotropin and oxytocin. Anterior pituitaries were collected from gilts on days 20-21 of the estrous cycle. Isolated cells were incubated (N=7) with dopamine (10 -7 and 10 -6M), tyreoliberin (10 -8 and 10 -7M), kisspeptin (10 -8 and 10 -7M), oxytocin (10 -8 and 10 -7M), salsolinol (10 -8 and 10 -7M), prostaglandin E (10 -8 and 10 -7M) and corticotrophin (10 -8 and 10 -7M). The expression of endogenous opioid genes was determined by a Real-Time RT-PCR technique. The expression of POMC, PENK and PDYN genes significantly increased in response to treatments with kisspeptin, corticotropin and dopamine. In addition, the expression of PENK and PDYN genes was significantly elevated by oxytocin and prostaglandin E, but that of PDYN gene was increased by salsolinol. These results indicate that factors potentially involved in the regulation/modulation of prolactin secretion, tested herein, may influence the pituitary expression of genes coding for opioid precursors in gilts during follicular late phase of the estrous cycle. Thereby, it is suggested that EOP may be incorporated in the network of factors regulating prolactin secretion at the pituitary level.

225 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE EVALUATION OF SEMEN COLLECTION AND EJACULATE QUALITY OF HUNTING DOGS

Vágenknechtová, M., Hošek, M., Filip čík, R., Máchal, L.

Department of Animal Breeding, Agronomy Faculty, Mendel University in Brno

Abstract Hunting dogs works with men for thousands years. Game law proceses without well trained dogs are not possible. To take well hunting dog is long term proces, for it is need long term progeny, breeding and kennel rights, training and ability for succesfull reproduction. The aim of this work was evaluate semen quality of ten hunting dogs of six different breeds dividend in FCI group. We evaluate time of semen collection, semen quality and sperm morphology. Highest semen volume, motility and sperm concentration was found in group FCI 3 – Terriers, neverthles worst semen parameters had dogs from group FCI 7 – Setters. Best results in evaluation of pathomorphological changes on sperms was observed in FCI group 4 – Dachshund.

Key words : dog semen collection, ejaculate quality, sperm morphology, FCI groups

Introduction In Czech Republic is hold approximately 1 million dogs of many breeds. Most important prerequisite of breeding work is successful dog reproduction. The important part of reproduction is dog ejaculate collection and evaluation. This is reason of great interest from breeders for qualitative dog semen evaluation, because lots of male dogs can to be sub fertile (V ěžník et al., 2004). Gunay et al., (2003) collected 5 weeks spermatic fraction of ejaculate from 7 German shepherds, weekly two time in 60 minutes frequency. Between first and second ejaculate was found significant difference in volume and semen concentration, sperm motility, number of live sperm and morphological changes was not affected. Similar results found England (1999), but he found breed effect, when German shepherds have greater volume of ejaculate and total sperm number then other breeds. England (1999) evaluated effect of short frequency between collections too. Conclude, that two ejaculates collected in 60 minutes frequency can result in gain more 70% sperm than from one semen collection. Schafer et al., (1997) collected Beagle dogs two time a week for six month. In evaluated period was not affected libido and qualitative ejaculate parameters, but only spermatic

226 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 fraction volume decreased from 1,2 (January) on 0,5 ml (June). Gam čík et al., (1992) presents, that minimal motility dog semen for insemination can not decreased under 70% and number of morphologicaly normal sperms must to be 80%. V ěžník et al., (2004) presents like sufficient number of morphologicaly normal sperms in ejaculate for insemination 70 %.

Material and methods The ejaculates was collected from 10 dogs of six different breeds (3 Dachshunds rough, Jagdterrier, Bulterrier, Foxterrier, 2 German shorthaired setter and 2 Irish setter). Dogs was in evaluation divided on FCI groups (FCI 3 – Terriers, FCI 4 – Dachshunds, FCI 7 – Setters). The whole ejaculates (all three fractions) was collected in three month period and 30 day frequency by manual stimulation in presence of bitch in estrus. Measurements of prepare time for collection and time of ejaculate collection was done. Immediately after semen collection was done macroscopical and microscopical evaluations of semen quality – semen volume, motility and concentration. Semen volume was measured in calibration container (ml), motility subjectively in native preparate on microscope (%) and concentration hemocytometricaly in Bürker cells (10 3 x mm -3). For morphological evaluation of semen was used colouring method by Farelly (in Věžník et. al. 2004). Was count percent of morphologicaly normal, abnormal and immature sperms.

Results and discussion Start, course and time of collection

Tab. 1 Čas p řípravy a doba odb ěru ejakulátu dle skupin FCI (Prepare time and time of semen collection by FCI group )

Prepare time (s) Time of collection (s) FFactor n

x ± sx x ± sx Total 30 157,0 ± 316,3 282,0 ± 192,2

FCI 3 9 63,3 A ± 22,5 120,0 AB ± 57,6 FCI group FCI 4 9 370,0 AB ± 523,2 313,3 A ± 254,2 FCI 7 12 67,5 B ± 25,2 380,0 B ± 112,0 A,B – between numbers in columns was found statistical differences (P ≤ 0,01) Group FCI 3 Terriers, group FCI 4Dachshunds, group FCI 7 Setters.

227 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

How shows table 1, prepare time of collection was longest in dogs of FCI 4 – 370s. Dogs of FCI groups 3 and 7 had prepare time distinct shorter (63,3s in FCI 3 and 67,5s in FCI 7), than FCI 4 dogs. Between groups FCI 4 and FCI 3 was find out significant difference (P ≤ 0,01), between groups FCI 4 and FCI 7 was find too. How present Vagenknechtova (2010), average preparation time for dog collection is 3,7 minutes and time ranged from 0,5 to 23,7 minutes. Our measurements range in similar values.

Time of collection was longest in dogs of FCI 7 group - 380s, when dogs of group FCI 4 had time of semen collection slightly shorter (313,3s). Shortest collection time was measured in dogs of FCI 3, only 120s. High statistical difference (P ≤ 0,01) was find between FCI group 3 and FCI group 4 and between FCI group 3 and FCI group 7 too. Vagenknechtova (2010) present, that average time of dog semen collection is 6,4 minutes. In our evaluation results range from 2,0 to 6.3 minutes, average time of collection was only 4,7 minutes, what is slightly shorter time of dog semen collection and reason of this difference is home place of semen collection in comparison with Vagenknechtova (2010), which collect semen in different environments (home vs. laboratory).

Semen volume, motility and concentration

Tab. 2 Hodnocení objemu, aktivity a koncentrace spermií (Volume, motility and concentration)

Semen volume (ml) Motility (%) Concentration (in ths) Factor n

x ± sx x ± sx x ± sx Total 30 6,0 ± 2,3 68,3 ± 20,1 168,1 ± 97,3

FCI 3 9 7,0 A ± 0,6 76,7 A ± 11,8 186,7 ± 19,2 FCI group FCI 4 9 6,4 a ± 3,0 74,4 B ± 8,5 177,4 ± 75,1 FCI 7 12 4,9 Aa ± 2,1 57,5 AB ± 25,8 147,1 ± 137,3 A,B -– between numbers in columns was found statistical differences (P ≤ 0,01) a,b - – between numbers in columns was found statistical differences (P ≤ 0,05) Group FCI 3 Terriers, group FCI4 Dachshunds, group FCI 7 Setters.

The highest volume of whole collected ejaculate was find in dogs of group FCI 3, which volume was 7,0 ml. Relatively higher semen volume was in dogs of FCI group 4 (6,4 ml). Lowest volume of whole ejaculate was find in dogs of group FCI 7 - 4,9 ml. Between groups FCI 3 and FCI 7 was find significant difference (P ≤ 0,01), between group FCI 4 and FCI 7 significant difference (P ≤ 0,05). Gamčík, et al. (1992) present average dog semen

228 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 volume 7,0 ml, Jelínek et al. (2003) 6,0 ml and V ěžník et al. (2004)) volume of dog semen only 2,0 ml. In our measurements we have average whole dog ejaculate volume, depend on FCI group, 6,0 ml in range 2,3 ml. Best results in motility we find out in dog semen of group FCI 3 and FCI 4 (76,7 % in FCI 3 and 74,4 % in FCI 4 respectively). Worst motility was find out in dogs group FCI 7 (57,5 %). High significant difference (P ≤ 0,01) was between dogs of group FCI 3 and FCI 7 and between groups FCI 4 and FCI 7 too. Svoboda, Senior et al. (2001) and V ěžník et al. (2004) present as minimal dog sperm motility for normal health dog 70%. On this percent in our evaluation reach dogs from group FCI 3 (Terriers) and FCI 4 (Dachshunds). The dogs of FCI group 7 (Setters) had only 57,5% motility and in next evaluations is necessary target attention on this group of dogs. Table 2 present, that highest sperm concentration had dogs from group FCI 3 (186,7 x 10 3 x mm -3). In dogs of group FCI 4 was concentration very similar to group FCI 3 (177,4 x 10 3 x mm -3). Lowest sperm concentration had dogs of FCI 7 (147,1 x 10 3 x mm -3). Between groups for sperm concentration was not find out significant differences. The average sperm concentration for all dogs of FCI groups was (168,1 x 10 3 mm -3). Jelínek et al. (2003) present as average sperm concentration for all dog population 120,1 x 10 3 mm -3. Opposite Věžník et. al. (2004) present as average dog sperm concentration 200,1 x 10 3 mm -3, our concentrations are between cited authors.

Evaluation of morphologicaly normal, immature and abnormal sperms.

Tab. 3 Hodnocení morfologických zm ěn na spermiích (Morphologicaly normal, immature and abnormal sperms)

Morphologicaly abnormal Morphologicaly normal (%) Immature sperms (%) Factor n (%)

x ± sx x ± sx x ± sx 41,3 15,9 Total 30 58,6 ± 15,9 7,9 ± 8,5 ±

FCI 3 9 58,4 ± 9,3 10,0 ± 13,2 41,6 ± 9,3 FCI group FCI 4 9 64,4 ± 5,9 8,0 ± 6,4 35,5 a ± 5,9 FCI 7 12 54,4 ± 22,5 6,4 ± 4,3 45,6 a ± 22,5 a,b - between numbers in columns was found statistical differences (P ≤ 0,05) Group FCI 3 Terriers, group FCI4 Dachshunds, group FCI 7 Setters.

Table 3 present, that best percent of morphologicaly normal sperms (64,4 %) in ejaculate had group FCI 4, following by group FCI 3 with 58,4 % morphologicaly normal

229 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 sperms. Lowest percent of morphologicaly normal sperms had dogs of group FCI 7 (54,4%). Because low differences between all groups in morphologicaly normal sperms, was not found significant difference between groups. For dogs is 70% morphologicaly normal sperms standard value (Věžník et. al., 2004). Vagenknechtova et al. (2011) in previous study find out normal sperm morphology in average 64,3%. In our study was find out average morphologicaly normal sperms 58,6%, immature sperms was 7,9% and morphologicaly abnormal sperms 41,3%. Any of evaluated FCI groups have percent of morphologicaly normal sperm, which are present for example in Věžník et. al. (2004).

Conclusion The aim of this study was collection and evaluation of ejaculates three groups of hunting dogs (FCI 3 – Terriers, FCI 4 – Dachshunds, FCI 7 – Setters). The ejaculates was collected from ten dogs of six breeds (3 Dachshund rough, Jagdterrier, Bulterrier, Foxterrier, 2 German shorthaired setters and 2 Irish setters). The dogs of group FCI 3 (Terriers) had shortest time of preparetion for collection (63,3s) and time of collection - ejaculation (120s), but greatest whole semen volume (7,0 ml), highest sperm motility (76,7%) and sperm concentration (186,7 x 10 3 x mm -3) too. Only in percent of morphologicaly normal sperms was Terriers on second position (58,4%). Highest percent immature sperms in ejaculate was find out in this group (10,0 %). The dogs of group FCI 4 (Dachshunds) needs for preparation on semen collection (start of sexual reflexes) longest time (370s), time of ejaculation was in average 313,3s. Volume of whole ejaculate was 6,4ml, motility and sperm concentration was very good (74,4 %, 177,4 x 10 3 x mm -3). In morphological sperm evaluation had this group of dogs best result - 64,4% morphologicaly normal sperms. The group of dogs FCI 7 (Setters) had longest time of semen collection (380s), whole semen volume only (4,9 ml), sperm motility 57,7 % and concentration 147,1 x 10 3 x mm -3. Dogs of this group had higher percent morphological abnormal sperms too. Dog breeders can increase their efforts and can more evaluate dogs reproduction functions. We can recommend to breeders before breeding of each dog complete screening of ejaculate qualitative parameters.

Acknowledgements Work was supported by IGA AF MENDELU TP 1/2012.

230 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

References England, G. C. W. Semen quality in dogs and the influence of short-interval second ejaculation. Theriogenology , 1999, 52, 6, 981-986. Gam čík, P., Kozumplík, J.: Andrológia a umelá inseminícia hospodá řských zvierat, Príroda, 1992, s290 Gunay, U., Polat, U., Gunes, N., Soylu, M., K., Kil, F. The effects of short-interval ejaculation on semen quality and some biochemical parameters in dogs. Revue de Medicine Vetrinaire, 2003, 154, 7, 459-462 Jelínek, P., Koudela, K., et al. Fyziologie hospodářských zví řat, MZLU v Brn ě, 2003, 351s, Schafer, S., Holzmann, A., Arbiter, K. The influence of frequent semen collection on the semen quality of beagle-dogs. Deutsche tierarztliche wochenschrift, 1997, 104, 1, 26-29 Svoboda, M., Senior, D. Nemoci psa a ko čky II. díl, Brno, Noviko, 2001. Vagenknechtová, M. Vliv vybraných faktor ů na odb ěr semene a kvalitu ejakulátu ps ů. In Animal Physiology 2010: Proceedings of International Conference. Brno: Mendelova univerzita, 2010. Vagenknechtová, M., Hošek, M., Máchal, L. Vliv v ěku na kvalitu spermatu u ps ů. In Animal Bredeeding, Brno Mendelova univerzita, 2011 Věžník, Z., Švecová, D., et al. Repetitorium spermatologie a andrologie a metodiky spermatoanalýzy, Brno, 2004

231 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

FLOW-CYTOMETRIC DETECTION OF THE RABBIT HEMATOPOIETIC STEM CELLS

Vaší ček, J., 1,2 Shehata, M., 3 Chrenek, P. 1,2

1Animal Production Research Centre Nitra, Lužianky, Slovak Republic, 2Department of Biochemistry and Biotechnology, Faculty of Biotechnology and Food Science, Slovak University of Agriculture, Nitra, Slovak Republic, 3Division of Hematology and Hemostaseology, Department of Internal Medicine I, Medical University of Vienna, Vienna, Austria

Abstract The aim of this preliminary study was to detect the CD133 + and CD34 + cells within human and rabbit peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using flow cytometry and different clones of CD133 and CD34 antibodies. Young (3 – 8 month old) and clinically health rabbits of New Zealand White (NZW) line (n = 3) were used in the experiment. PBMCs from the blood samples of human volunteer and humanely sacrificed rabbits were isolated using Ficoll centrifugation and stained with different clones of anti-human monoclonal antibodies: PE-conjugated CD133 (AC133 and 293 C3), FITC-conjugated CD34 (AC136 and 581), Alexa Fluor 488-conjugated rabbit polyclonal CD34 and unconjugated mouse anti-rabbit CD45 according to the producer’s manual. We observed the highest percentage of CD34 + rabbit cells using the clone AC136 (0.43 ± 0.13%). The highest percentage of CD133 + rabbit cells was noticed using clone 293 C3 (0.50 ± 0.06%). We assumed that these clones of the anti-human antibodies could be efficient for rabbit HSCs flow-cytometric detection, but other experiments are required to prove this hypothesis.

Introduction The hematopoietic system is resourced by stem cells that are capable of both self- renewal and differentiation into progenitor and mature blood cells of all hematopoietic lineages. Thus, it contains cells at various stages of maturation, including primitive hematopoietic stem cells (HSCs) that give rise to identical daughter cells as well as possessing mulitlineage differentiation capacity. Human CD34 was the first differentiation marker recognized on hematopoietic stem and progenitor cells from hematopoietic sources, such as fetal liver, cord blood, peripheral blood, and bone marrow. It is therefore the classical marker used to obtain enriched

232 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 populations of human hematopoietic stem and progenitor cells (HSCs/HPCs) for research and clinical use. CD34 is expressed on approximately 1 – 3% of the nucleated cells in normal human bone marrow (BM) and on 0.1 – 0.5% of the nucleated cells in human peripheral blood. The majority of human cells capable of producing multilineage hematopoietic engraftment in myeloablated recipients express CD34. The engraftment potential of enriched populations of human CD34 + cells has also been demonstrated clinically in numerous autologous and allogeneic transplantation trials. The CD34 + subset also includes hematopoietic stem cells and more committed progenitor cells, such as lymphocyte progenitor cells, but is not expressed on the majority of terminally differentiated cells (Bosio et al., 2009). The usefulness of CD34 as a hematopoietic stem and progenitor cell marker for human cells is well established. There is evidence, however, of the existence of a very primitive population of CD34 + cells with HSC and lymphopoietic potential in human cord blood and adult hematopoietic sources. Thus far, the phenotype of primitive CD34 + HSCs has been characterized by the concurrent absence of CD38 and the positive expression of CD133 (Buhring et al., 1999). CD133 has been described as a marker of more primitive hematopoietic stem and progenitor cells. It was originally found on HSCs and HPCs deriving from human fetal liver, bone marrow, and peripheral blood (Yin et al., 1997). Phenotypical analysis of CD133-expressing cells (CD133 + cells) revealed a high expression on primitive hematopoietic and myeloid progenitor cells (Freund et al., 2006). The presence of CD133 + cells in different hematopoietic sources is similarly low as in case of CD34 + cells. For example de Wynter et al. (1998) observed these values of CD133 + cells: 1.75 ± 0.7% in cord blood, 0.98 ± 0.2% mobilized peripheral blood and 2.3 ± 0.9% in bone marrow. Till now many studies about human HSCs have been published, but there are really rare information about the presence of HSCs in the rabbit hematopoietic system (peripheral blood or bone marrow) and about the identification of rabbit HSCs on the basis of the hematopoietic stem cell markers, such as CD133 (Garbade et al. 2009; Martınez-Lorenzo et al., 2009) and CD34 (Gómez-Ochoa et al. 2005; Shi et al. 2010; Gao et al., 2011; Zhao et al., 2011) using mainly anti-human CD133 and CD34 antibodies, since there is any specific anti- rabbit CD133 or CD34 antibody available on the market. Therefore the aim of our preliminary study was to detect the CD133 + and CD34 + cells within human and rabbit peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using flow cytometry and different clones of CD133 and CD34 antibodies.

233 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Materials and Methods Animals Young (3 – 8 month old) and clinically health rabbits of New Zealand White (NZW) line (n = 3) reared in a partially air-conditioned hall of a local rabbit farm at APRC Nitra were used in the experiment. The animals were housed in individual cages, under a constant photoperiod of 14 h of light day. Temperature and humidity in the building were recorded continuously by means of a thermograph positioned at the same level as the cages (average relative humidity and temperature during the year was maintained at 60 ± 5% and 17 ± 3°C). The rabbits were fed ad libitum with a commercial diet (KV; TEKRO Nitra, s.r.o.) and water was provided ad libitum with nipple drinkers. PBMCs isolation and phenotyping PBMCs from the blood samples of human volunteer and humanely sacrificed rabbits were isolated using Ficoll centrifugation according to the original protocol: Isolation of mononuclear cells from human peripheral blood by density gradient centrifugation (Miltenyi Biotec, 2008). Fresh human blood and three frozen rabbit samples were used for the experiment. Cell count was evaluated using the Z1 Automated Cell Counter (Beckman- Coulter, Germany). The cells were then divided into prepared tubes and stained with different clones of anti-human monoclonal antibodies: PE-conjugated CD133 (AC133 and 293 C3; both Miltenyi Biotec, Germany), FITC-conjugated CD34 (AC136, Miltenyi Biotec, Germany; and 581, BD Pharmingen, USA), Alexa Fluor 488-conjugated rabbit polyclonal CD34 (Bioss, USA) and unconjugated mouse anti-rabbit CD45 (VMRD, USA) according to the producer’s manual. As a secondary antibody APC-conjugated goat anti mouse Ig (BD Pharmingen, USA) was used. Besides double staining (CD34/CD45 or CD133/CD45), also triple staining (different antibody combinations CD34/CD45/CD133) was performed. Labelled cells were evaluated using the flow cytometer FACSCalibur (BD Biosciences, USA). Statistics The data obtained using flow cytometry from three different rabbit blood samples were evaluated statistically using a one-way ANOVA (Duncan's multiple range test) in SigmaPlot software (Systat Software Inc., Germany) and expressed as means ± SE. P-values at P<0.05 were considered as statistically significant.

Results and discussion Table 1 shows the percentage of CD133 + and CD34 + cells within the human and rabbit PBMCs. Insignificant antibody interference was observed between double and triple staining

234 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

of human cells using monoclonal CD34 (clones 581 and AC136), polyclonal CD34 (KLH) (0.18% vs. 0.22%, 0.23% vs. 0.24% and 0.15% vs. 0.09%, respectively) and monoclonal CD133 clones (293 C3 and AC133) (0.25% vs. 0.24% and 0.21% vs. 0.15%, respectively). Similarly, insignificant antibody interference was observed between double and triple staining of rabbit cells using monoclonal CD34 (clones 581 and AC136), polyclonal CD34 (KLH) (0.22 ± 0.14% vs. 0.19 ± 0.11%, 0.47 ± 0.14% vs. 0.43 ± 0.13% and 0.04 ± 0.01% vs. 0.05 ± 0.01%, respectively) and monoclonal CD133 clones (293 C3 and AC133) (0.55 ± 0.04% vs. 0.50 ± 0.06% and 0.53 ± 0.12% vs. 0.44 ± 0.08%, respectively). CD45 + cells proved the origin of rabbit cells in comparison to human cells (94.66% vs. 0.34%; Fig. 1).

Tab. 1 CD133 + and CD34 + cells within the human and rabbit PBMCs

Double staining PBMCs Double staining CD45/CD34 Triple staining CD45/CD34/CD133 CD45/CD133 CD45 CD34 CD34 CD34 CD133/2 CD133/1 CD34 CD34 CD34 CD133/2 CD133/1 (rabbit) (581) (AC136) (KLH) (293 C3) (AC133) (581) (AC136) (KLH) (293 C3) (AC133) % of % of % of % of % of CD34 + CD34 + CD34 + CD133 + CD133 + % of % of % of % of % of in in in in in CD34 + CD34 + CD34 + CD133 + CD133 + Sample Neg % of Neg double double double Neg double double in triple in triple in triple in triple in triple # Control CD45 + Control staining staining staining Control staining staining staining staining staining staining staining Human 0 0.34 0.01 0.18 0.23 0.15 0.01 0.25 0.21 0.22 0.24 0.09 0.24 0.15 (fresh) Rabbit 1 0.08 94.90 0 0.01 0.25 0.02 0.01 0.57 0.37 0.03 0.27 0.03 0.55 0.29 (frozen) Rabbit 2 0.07 95.62 0 0.49 0.72 0.05 0 0.61 0.77 0.40 0.69 0.07 0.58 0.58 (frozen) Rabbit 3 0.20 93.45 0.01 0.17 0.44 0.05 0 0.48 0.45 0.14 0.33 0.04 0.38 0.44 (frozen) 0.12 94.66 0.22 0.47 0.04 0.55 0.53 0.19 0.43 0.05 0.50 0.44 Average ± ± 0b ± ± ± 0d ± ± ± ± ± ± ± values 0.04 0.64 0.14 0.14 0.01 0.04 0.12 0.11 0.13 a 0.01 b 0.06 c 0.08 Average values from rabbit samples are expressed as means ± SE; a vs. b and c vs. d were statistically significant at P<0.05 .

We noticed slightly higher percentage of CD34 + human cells labelled by clone AC136 (0.24%) in comparison to clone 581 (0.22%), but evidently higher percentage of CD34 + cells in comparison to those labelled by polyclonal CD34 (KLH; 0.09%) used in triple staining with CD133 and CD45, or in comparison to negative control (0.01%) without staining. We also observed higher percentage of CD133 + human cells labelled by clone 293 C3 (0.24%) in comparison to clone AC133 (0.15%) used in triple staining with CD34 and CD45, or in comparison to negative control (0.01%) without staining. Uniformly, there was insignificantly higher percentage of CD34 + rabbit cells labelled by clone AC136 (0.43 ± 0.13%) in comparison to clone 581 (0.19 ± 0.11%), but significantly higher ( P<0.050 ) percentage of CD34 + cells in comparison to those labelled by polyclonal CD34 (KLH; 0.05 ± 0.01%) used in triple staining with CD133 and CD45, or in comparison to negative control (0%). The

235 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 percentage of CD133 + rabbit cells labelled by clone 293 C3 (0.50 ± 0.06%) was insignificantly higher in comparison to clone AC133 (0.44 ± 0.08%) used in triple staining with CD34 and CD45, but on the other hand in comparison to negative control (0%) without staining the percentage of the CD133 + cells labelled by clone 293 C3 was significantly higher (P<0.050 ).

Figure 1 The illustrative comparison of CD34 +, CD45 + and CD133 + cells within the human and rabbit PBMCs

Although we obtained low percentage of CD34 + (AC136) and CD133 + (293 C3) cells within the rabbit PBMCs (0.43 ± 0.13% and 0.50 ± 0.06%, respectively), these results are similar to values mentioned in the literature: 0.1 – 0.5% of CD34 + cells in human peripheral blood (Bosio et al., 2009) and 0.98 ± 0.2% of CD133+ cells in mobilized peripheral blood (de Wynter et al., 1998).

Conclusion Anti-human CD34 (clone AC136) and CD133 (clone 293 C3) antibodies seems to be more suitable for detection HSCs within human peripheral blood than the other mentioned antibody clones. Since similar observations were achieved within the rabbit peripheral blood, we assumed that these clones of anti-human antibodies could be efficient for rabbit HSCs flow-cytometric detection, but other experiments are required to prove this hypothesis.

Acknowledgement This work was supported from the grants of Slovak Research and Development Agency: LPP-0119-09 and also by the supervision of Dr. Medhat Shehata from the Medical University of Vienna, who provides facilities and expert advices for our experiment.

236 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

References Bosio, A., Huppert, V., Donath, S., Hennemann, P., Malchow, M., Heinlein, U.A.O. Isolation and Enrichment of Stem Cells. Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. , 2009, 114, 23 – 72. Buhring, H.J., Seiffert, M., Bock, T.A., Scheding, S., Thiel, A., Scheffold, A., Kanz, L., Brugger, W. Expression of novel surface antigens on early hematopoietic cells. Ann. NY Acad. Sci. , 1999, 872, 25 – 38. Yin, A.H., Miraglia, S., Zanjani, E.D., Almeida-Porada, G., Ogawa, M., Leary, A.G., Olweus, J., Kearney, J., Buck, D.W. AC133, a Novel Marker for Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Blood , 1997, 90, 5002 – 5012. Freund, D., Oswald, J., Feldmann, S., Ehninger, G., Corbeil, D., Bornhauser, M. Comparative analysis of proliferative potential and clonogenicity of MACS-immunomagnetic isolated CD34 + and CD133 + blood stem cells derived from a single donor. Cell. Prolif. , 2006, 39, 325 – 332. de Wynter, E.A., Buck, D., Hart, C., Heywood, R., Coutinho, L.H., Clayton, A., Rafferty, J.A., Burt, D., Guenechea, G., Bueren, J.A., Gagen, D., Fairbairn, L.J., Lord, B.I., Testa, N.G. CD34+AC133+ Cells Isolated from Cord Blood are Highly Enriched in Long-Term Culture-Initiating Cells, NOD/SCID-Repopulating Cells and Dendritic Cell Progenitors. Stem Cells , 1998, 16, 387 – 396. Garbade, J., Dhein, S., Lipinski, C., Aupperle, H., Arsalan, M., Borger, M.A., Barten, M.J., Lehmann, S., Walther, T., Mohr, F.W. Bone Marrow-Derived Stem Cells Attenuate Impaired Contractility and Enhance Capillary Density in a Rabbit Model of Doxorubicin- Induced Failing Hearts, J. Card. Surg , 2009, 24, 591 – 599. Martínez-Lorenz, M.J., Royo-Cañas, M., Alegre-Aguarón, E., Desportes, P., Castiella, T., García-Alvarez, F., Larrad, L. J. Orthop. Res., 2009, 27, 1499 – 1508. Gómez-Ochoa, P., Miana-Mena, F.J., Muñoz, M.J., Cativiela, E., Gómez, F. An in vitro study of hematopoietic progenitor cells from peripheral blood of rabbits. Can J. Vet. Res., 2005, 69, 309 – 312. Zhao, Q., Sun, C., Xu, X., Zhou, J., Wu, Y., Tian, Y., Yuan, Z., Liu, Z. CD34 + cell mobilization and upregulation of myocardial cytokines in a rabbit model of myocardial ischemia, Int. J. Cardiol., 2011, 152, 18 – 23. Gao, X., Chen, W., Liang, Z., Chen, L. Autotransplantation of circulating endothelial progenitor cells protects against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rabbit. Int. Immunopharmacol., 2011, 11, 1584 – 1590. Shi, Z.B., Wang, K.Z. Effects of recombinant adeno-associated viral vectors on angiopoiesis and osteogenesis in cultured rabbit bone marrow stem cells via co-expressing hVEGF and hBMP genes. Tissue and Cell , 2010, 42, 314 – 321.

237 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

EFFECT OF CATTLE PRODUCTION TYPE ON BLOOD PLASMA BIOCHEMICAL PARAMETERS

Vošterová, I., 1 Pavlík, A., 1 Mat ějí ček, M., 2 Sláma, P. 1

1 Department of Animal Morphology, Physiology and Genetics, Mendel University in Brno, Czech Republic 2 Vetlabfarm s.r.o., Dolní Dobrou č, Czech Republic

Abstract The aim of this work was to evaluate effect of cattle production type on biochemical parameters of blood plasma. In experiment two breed of cattle was used, beef cattle Aberdeen Angus (10 animals) and dual purpose breed type that in our conditions, however, mainly used for milkproduction – Czech Pied cattle (10 animals). Blood was collected from calving cows during lactation, specifically 94th day, 133rd day, 164th day, 194th day and 235th day of lactation. Blood was drawn from vena coccygea media at regular intervals by sampling system HEMOS. The result is a marked difference between the levels of blood plasma of the parameters studied breeds. Statistically significant difference in total protein concentration was detected 164th day, the 204th day and 235th day of the experiment, the growing tendency of this parameter was observed in beef breeds, which also reached higher values. The difference in urea concentration was found to 94th day, 133rd day and 164th day of the experiment. Dairy breed showed generally higher values of urea in blood plasma. The maximum value was achieved 133rd day (8.36 ± 1.32 mmol l-1) on the contrary cholesterol concentration was higher in individuals belonging to a beef cattle. Statistically significant difference was observed 94th day, 164th day and 204th day. Glucose levels were examined in both breeds similar trend. Significantly different concentrations were measured up to the end of the experiment when values reached higher meat breed. Statistically significant difference was found 133rd day and 235 day of the experiment. Statistically significant difference was found even in one of the enzymes studied. Alanine aminotransferase levels are monitored at different type of animal, commercial 94th day, 164th day and 204th day. Higher values of his parameter reached Aberdeen Angus breed. Statistically significant difference in concentration of aspartate aminotransferase in blood plasma was not found.

Key words : milk production, beef, blood plasma, production type

238 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Úvod Chovatelé v české republice se zam ěř ují p ředevším na chov skotu s mlé čnou užitkovostí, ale disponují i stády zví řat se zam ěř ením masným. Mezi plemena chovaná v ČR můžeme za řadit 5, resp. 3 mlé čná plemena a 21 masných plemen. Jednotlivá plemena a užitkové typy mají odlišné nároky na výživu a podmínky prost ředí. Zárove ň však m ůžeme v rámci jednoho užitkového typu, který je tvo řen více r ůznými plemeny, sledovat do ur čité míry podobné nároky, a ť už na výživu či podmínky prost ředí. Tyto optimální podmínky je pot řeba zajistit, protože správná výživa a zvolená technologie ovliv ňuje produkci a tím pádem i zisky podniku. Parametry vnit řního prost ředí jsou ukazatele, které poukazují na úrove ň výživy, chovu a na celkový stav zví řete. Dle koncentrace jednotlivých látek v krvi m ůžeme zjistit, které komponenty v krmné dávce chybí, kterých je p řebytek a ze získaných údaj ů m ůžeme zví řeti krmnou dávku p řizp ůsobit dle pot řeby. Hladina t ěchto látek v krvi samoz řejm ě závisí také na pohlaví, v ěku, na fázi reproduk čního cyklu, ve kterém se jedinec nachází, či výše zmín ěném užitkovém zam ěř ení zví řat. Úrove ň jednotlivých parametr ů v krevní plazm ě rovn ěž hraje důležitou roli p ři hodnocení zdravotního stavu zví řat. Proto by nem ěla být opomíjena důležitost provád ění metabolických test ů. V této práci je poukázáno na problematiku udávaných referen čních rozmezí, která jsou v literatu ře v ětšinou uvád ěna obecn ě pro skot. Bylo by však vhodné zam ěř it se práv ě i na plemeno, resp. užitkové zam ěř ení zví řat, protože jejich produk ční využití ovliv ňuje metabolismus a jeho hospoda ření s živinami.

Materiál a metodika Dojnice Českého strakatého plemene byly chovány v produk ční stáji s volným boxovým ustájení. Dojení probíhalo pravideln ě dvakrát denn ě, ve dvanáctihodinových intervalech. Živinové složení krmné dávky je popsáno v tabulce 1. Zví řat plemene Aberdeen Angus byla chována v systému bez tržní produkce mléka. P řevážnou část roku (od jara do podzimu) byla tato zví řata na pastv ě. Do zimovišt ě byla p řesunuta v pr ůběhu roku n ěkolikrát z důvod ů od červení, úpravy pazneht ů a také odb ěru vzork ů krve. Také na zimní období byla tato zví řata p řesunuta do zimovišt ě. V období po porodu byli sledovaní jedinci v zimovišti krmeni travní senáží a senem ad-libitum a jadrnou sm ěsí. Po p řechodu na pastvu tvo řil majoritní podíl krmné dávky pastevní porost, p říkrm sena a minerální sm ěsi (vše ad-libitum). Pr ůměrné živinové složení krmné dávky uvádí tabulka 1.

239 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 1 Pr ůměrné živinové složení krmných dávek sledovaných zví řat

Český strakatý skot Abrdeen Angus Parametr Jednotka Obsah Obsah ve vehmotě v sušin ě hmot ě v sušině sušina % 40,10 100,00 43,31 100 N-látky % 7,25 18,05 8,93 20,63 tuk % 1,23 3,06 0,98 2,26 vláknina % 6,54 16,28 11,96 27,62 NEL MJ/kg 6,70 16,67 4,42 10,20 PDIN g/kg 38,60 96,11 46,21 106,69 PDIE g/kg 45,60 113,54 53,78 124,75 Ca g/kg 3,50 8,72 3,14 7,25 P g/kg 1,90 4,73 2,16 4,99 Mg g/kg 1,20 2,99 1,12 2,60

U obou plemen byly vybrány krávy v přibližn ě stejném termínu telení, v tomto případě krávy otelené v pr ůběhu února (± 13 dní). Sledováno bylo 10 zví řat od každého plemene. Z podocasní žíly byl, pomocí odb ěrového sytému HEMOS ® (Gama Group a.s), v daných intervalech (94, 133, 164, 204 a 235 dní po porodu) odebírán vzorek krve, který byl ošet řen antikoagula čním prost ředkem (heparin) a uchován v chladícím boxu do dalšího zpracování. Bezprost ředn ě po odběrech byla separována krevní plazma, a uchována do analýzy p ři 4 ºC. V laborato ři bylo provedeno stanovení koncentrací vybraných parametr ů vnit řního prost ředí (celkový protein, glukóza, močovina, celkový cholesterol, alaninaminotransferáza a aspartátaminotransferáza), spektrometricky na automatickém analyzátoru XT 20 I (Siemens), za použití b ěžně dostupných komer čních set ů od firmy Biovendor-Laboratorní medicína, a.s. Data získána v pr ůběhu sledovaného období byla set říd ěna pomocí editoru MS Office Excel a byly sestaveny soubory pro statistické testování. Data byla analyzována v programu Statistica 8.0 (StatSoft ®). Normalita souboru byla testována pomocí Shapiro-Wilkova testu a na základ ě jeho výsledku byla vybrána pro hodnocení dvoufaktorová analýza rozptylu (ANOVA) p ři opakovaném m ěř ení, s následným testováním dle Fishera na hladinách významnosti p < 0,05 a p < 0,01.

Výsledky Koncentrace celkových bílkovin v krevní plazm ě se pohybovala mezi hodnotami 64,57 ± 9,41 a 86,4 ± 4,94 gl-1 (Graf 1). Kolísav ější tendence parametru byla v pr ůběhu experimentu zaznamenána u plemene České strakaté. Statisticky pr ůkazný rozdíl na hladin ě p

240 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

< 0,01 byl u mlé čného plemene ve srovnání s masným plemenem zaznamenán ve 164. a 235. dnu, na hladin ě p < 0,05 to bylo ve 204. dnu. Na po čátku sledovaného období byla koncentrace celkových protein ů v krevní plazm ě u obou plemen obdobná, ovšem v pr ůběhu experimentu byly zaznamenány vyšší koncentrace tohoto parametru u masného plemene.

Hladina mo čoviny se pohybovala v rozmezí od 4,55 ± 0,46 mmol l-1 do 8,36 ± 1,32 mmol l-1. Tendence parametru byla u sledovaných plemen rozdílná. U mlé čného plemene převažovala spíše tendence klesající s ob časným mírným nár ůstem, kdežto u masného plemene byla tendence p řevážn ě rostoucí s jednorázovým poklesem. Mezi sledovanými plemeny byl zaznamenán statisticky pr ůkazný rozdíl na hladin ě p < 0,01, a to v 94. a 133. dnu. Statisticky pr ůkazný rozdíl na hladin ě p < 0,05 byl zjišt ěn ve 164. dnu. Vyšší hodnoty mo čoviny v krevní plazm ě byly nam ěř eny u plemene České strakaté. Množství glukózy v pr ůběhu sledovaného období kolísalo mezi 3,36 ± 0,3 mmoll-1 a 4,96 ± 1,04 mmol l-1. U obou plemen bylo zaznamenáno mírné kolísání pr ůměrných hodnot,

241 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 zna čný rozdíl se projevil až v na konci sledovaného období, kdy u mlé čného plemene došlo k náhlému poklesu hladiny glukózy a naopak u plemene masného ke zvýšení úrovn ě glukózy v krevní plazm ě. I u tohoto parametru byl zaznamenán statisticky pr ůkazný rozdíl mezi sledovanými plemeny, a to na hladin ě p < 0,01 ve 235. dnu a na hladin ě p < 0,05 ve 133. dnu. Hladina glukózy v krevní plazm ě m ěla u obou zkoumaných plemen podobnou tendenci, ovšem mírn ě vyšší hodnoty byly zaznamenány u masného plemene. Koncentrace cholesterolu v krevní plazm ě sledovaných zví řat se pohybovala mezi 3,19 ± 0,76 mmol l-1 a 5,75 ± 1,27 mmol l-1. Zárove ň byl z řejmý zna čný rozdíl ve vývoji úrovn ě parametru v pr ůběhu experimentálního období. Statisticky pr ůkazný rozdíl byl mezi sledovanými plemeny zjišt ěn v 94. dnu ( p < 0,01), 164. dnu ( p < 0,01) a 204. dnu ( p < 0,01). Koncentrace plazmatického cholesterolu dosahovala během experimentálního období výrazn ě vyšších hodnot u plemene Aberdeen Argus. Pr ůměrné hodnoty katalytické koncentrace alaninaminotransferázy kolísaly mezi 0,246 ± 0,09 µkat l-1 a 0,635 ± 0,14 µkat l-1. Nejnižší i nejvyšší hodnota a zárove ň nejv ětší kolísání bylo zaznamenáno u plemene s masnou užitkovostí. Vliv užitkového zam ěř ení na množství ALT v krevní plazm ě byl statisticky prokázán. Konkrétn ě na hladin ě p < 0,01 v 94. dnu, 164. dnu a 204. dnu. V po čátku experimentu byla zaznamenána vyšší katalytická koncentrace ALT u plemene mlé čného, ovšem v pr ůběhu testu se koncentrace ALT výrazn ě zvýšila u masného plemene, které nakonec dosáhlo vyšších hodnot, než České strakaté. Katalytická aktivita v pr ůběhu sledovaného období dosáhla hodnot mezi 1,163 ± 0,46 µkat l-1 a 1,566 ± 0,31 µkat l-1. Mezi jednotlivými užitkovými typy zví řat se neprojevily výrazné rozdíly v aktivit ě AST. V pr ůběhu experimentálního období nebyl dokázán statisticky pr ůkazný rozdíl mezi katalytickou aktivitou aspartátaminotransferázy u pozorovaných plemen s rozdílným užitkovým zam ěř ením.

Diskuse Jagoš et Bouda (1980) uvád ějí u dojnic tradi čního českého kombinovaného plemene hodnotu 76,4 gl-1 p řed porodem a hodnotu 73,1 g l-1 po porodu, což poukazuje na skute čnost, kterou publikovali i Klebaniuk et al. (2009), a to, že hladina celkových protein ů klesá v pr ůběhu prvních týdn ů laktace. Tato skute čnost z řejm ě souvisí s produkcí mléka a tudíž se zvýšenou pot řebou bílkovin. Uvád ějí, že ke snížení hladiny celkových bílkovin na fyziologickou úrove ň dochází v pozdní fázi b řezosti a v prvních týdnech laktace. V pozd ějším období byl u dojených plemen zaznamenán nár ůst hladiny celkových bílkovin Šamanc et al. (2011).

242 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Taylor et al. (2003) zjistili jednozna čně jednorázový propad koncentrace mo čoviny těsně po porodu, a poté na pozvolný nár ůst koncentrace parametru v krevní plazm ě. Bojkovski et al. (2011) zaznamenali u dojeného skotu hladinu glukózy mezi 3,54 a 4,52 mmol l-1, což koresponduje s našimi výsledky, ovšem auto ři ve své publikaci také konstatují, že hladina glukózy má v pr ůběhu laktace klesající tendenci, což se v našem testu nepotvrdilo. Zaznamenali jsme spíše kolísavý charakter parametru. K zajímavým záv ěrům dosp ěli Klebaniuk et al. (2009), kte ří ve své práci zmínili fakt, že po porodu dochází k nár ůstu aktivity ALT, a to až o 30 %. V jejich konkrétním p řípadě to byl nár ůst z pr ůměrných hodnot p řed porodem 0,69 až 0,82 µkat l-1 až na hodnotu 1,12 µkat l- 1 po porodu. Ovšem v publikaci Ruginosu et al. (2011) se auto ři zmi ňují o opa čné tendenci parametru. U dojnic v období 0 až 2 m ěsíce po porodu zjistili katalytickou aktivitu 0,59 µkat l-1 a v období 3 až 6 m ěsíc ů po porodu aktivitu 0,44 µkat l-1, tudíž zaznamenali jednozna čný pokles úrovn ě ALT v krevní plazm ě. V našem p řípad ě došlo u dojeného plemene primárn ě k nár ůstu katalytické koncentrace enzymu, ovšem následn ě k pozvolnému poklesu. Klebaniuk et al. (2009) ve své práci také konstatovali, že katalytická aktivita AST má zna čně nejednozna čný pr ůběh, tedy kolísá, což je možné z výsledk ů našeho experimentu potvrdit.

Záv ěr Z výsledk ů experimentu je patrné, že v některých parametrech metabolického profilu krevní plazmy se daná plemena, ve stejném v ěku a p řibližn ě ve stejném období laktace, lišila. Předpokládám, že tyto rozdíly do jisté míry odráží odchylky ve složení krmné dávky masného a dojeného skotu, ale také rozdíly v metabolickém založení daných jedinc ů, v závislosti na požadavcích na produkci. Na základ ě t ěchto zjišt ění se domnívám, že by hodnocení metabolického profilu krve masných plemen skotu nemělo vycházet čist ě z referen čních rozmezí biochemických parametr ů, která zahrnují, jak je v literárním p řehledu patrné, většinou hodnoty stanovené u skotu dojeného. Pod ěkování Tato práce vznikla v rámci projektu NAZV č. QH 71156 Použitá literatura Taylor, V.J., Beever, D.E., Bryant, M.J., a Wathes D. Metabolic profiles and progesterone cycles in first lactation dairy cows. Theriogenology, 2003, 59, 1661-1677. Šamanc, H., Kirovski, D. Stoji ć, V., Stojanovi ć, D., Vujanac, I., Prodanovi ć, R. Bojkovi ć-Kova čevi ć, S. Application of the metabolic profile test in the prediction and diagnosis of fatty liver in Holstein cows. Acta Vet. Beograd , 2011, 5-6, 543-553.

243 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Ruginosu, E., Creanga, S., Sofronie M., Malancus R., Boghian, V. Solcan, G. The biochemical profile in cows with reproductive disorders. Cercetari Agronomice in Moldova . 2011, 44. Klebaniuk, R., et al. Blood metabolic profile parameters of cows fed diet with glucogenic additive. Medycyna weterynaryjna. 2009, 65, 765–770. Jagoš, P., Bouda, J. Protein metabolism in cows and their calves fed from buckets. Acta Vet. Brno. 1980, 49, 59–66. Bojkovski, J., Reli ć, R., Savi ć, B., Petrujki ć, T. Metabolic parameters and welfare of dairy cows. Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj- Napoca Veterinary medicín ě, 2011, 68.

244 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE EFFECT OF NUMBER OF LACTATION ON INCIDENCE OF CALF TWIN’S PARTURITION AND STILLBIRTH OF CZECH FLECKVIEH – SIMENTAL DAIRY COWS

Zejdová, P.; Falta, D.; Ve čeřa, M.; Polák, O.; Kopec, T.; Chládek, G.

Ústav chovu a šlecht ění zví řat, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita Zem ědělská 1, 613 00 Brno, Czech Republic

Abstract The effect of number of lactation on incidence of calf twin‘s parturition and stillbirth was evaluated in this experiment. The database of 62,237 parturitions observed between years 2005 – 2008 was used. All cows were Czech Fleckvieh – Simental breed (pure breed) originated in Czech Republic. Dairy cows were divided into three groups according to number of lactation (1st, 2nd, 3rd). Records of the occurence of live calve’s parturition, stillbirth calves and twin calves (dead or alive) were used for evaluation. Statistical data evaluation was performed by X2 test. It was found statistically high significant effect (p < 0,01) of number of lactation on incidence of calf twin‘s parturition and stillbirth (single calves and twin calves). The live twining rate was the lowest in cases of primiparous (0,73 %), higher for dairy cows on 2nd lactation (2,72 %) and the highest on 3rd lactation (3,41 %). Conversely, incidence of single calve stillbirth had an opposite trend (8,23 % vs. 4,23 % vs. 3,51 % 1st vs. 2nd vs. 3rd lactation, resp.). The rates of twin calves (one calve as dead) were 0,11 % vs. 0,30 % vs. 0,37 % (1st vs. 2nd vs. 3rd lactation, resp.). The same trend was in cases of twin calves (both calves as dead) - 0,10 % vs. 0,22 % vs. 0,29 % (1st vs. 2nd vs. 3rd lactation, resp.).

Key words : dairy cows, number of lactation, calf twin, abort.

Úvod Porody mrtvých telat – a ť už jediná čků, či dvoj čat – jsou nep říjemnou událostí se kterou se setkal tém ěř každý chovatel skotu. Bos taurus je uniparní druh, což znamená, že samicím se ve v ětšin ě p řípad ů narodí jedno mlád ě. Na druhou stranu, p řirozený výskyt vícenásobných porod ů je vysoký a pohybuje se na úrovni 1 – 5 % - v závislosti na plemeni, parit ě a environmentálních podmínkách (Gregory et al., 1990). Mezi možná rizika, doprovázející narození více mlá ďat pat ří pokles p řežitelnosti telat, zhoršení ukazatel ů

245 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 reprodukce dojnic (Bicalho et al., 2007), menší porodní hmotnost telat (Hossein-Zadeh, N. G., 2010a), v ětší riziko retence placenty, horší poporodní kondice, vyšší výskyt obtížných porod ů a abort ů, v ětší po čet dní od otelení do nástupu první pozorovatelné říje a delší mezib řezost (Bell, Roberts, 2007). Krávy po dvoj čatech mají také 3,2 krát v ětší šanci na vy řazení ze stáda, než krávy po jednom teleti (Bell, Robertse, 2007) a vyskytuje se u nich horší energetická rovnováha (del Río et al., 2010). Porod dvoj čat ovliv ňuje i výši mlé čné užitkovosti b ěhem nastalé laktace (Hossein–Zadeh, 2010a; Hossein–Zadeh et al., 2008) a množství tuku v mléce (Hossein–Zadeh, 2010b). Podle Zejdové et al. (2012) se dokonce projeví rozdíl ve výši mlé čné užitkovosti v závislosti na pohlaví narozených telat U dojnic je s porody dvoj čat spojeno více negativních efekt ů. Na druhou stranu, ve stádech masného skotu mohou dvoj čata zlepšit produk ční výkonnost – pokud je zajišt ěna adekvátní výživa a management (Çobano ğlu, 2010). Problematika dvoj čat a abort ů je tedy nepochybn ě aktuální a proto jsme se na ní také zam ěř ili v naší studii. Stanovili jsme následující hypotézy: H1 – výskyt porod ů mrtvých telat bude vyšší u krav na 1. laktaci., než u krav na vyšších laktacích. H2 – výskyt porod ů živých dvoj čat bude vyšší u krav na 2. a 3. laktaci, než u krav na 1. laktaci. H3 – výskyt abort ů p ři porodech dvoj čat bude vyšší u krav na 1. laktaci, než u krav na vyšších laktacích.

Materiál a metodika Pro ú čely experimentu byla využita databáze (poskytnuta Svazem chovatel ů českého strakatého skotu) 62 237 porod ů z období 2005 – 2008. Všechny dojnice byly plemene české strakaté (C 90 – C 100) a pouze s kodexem CZ (tzn. žádná zví řata nebyla z dovozu). Dojnice byly rozd ěleny do t ří skupin podle po řadí laktace (1., 2., 3.). Hodnocena byla incidence porod ů živých a mrtvých jediná čků, živých dvoj čat a abort ů dvoj čat (jak v případ ě jednoho z narozených telat, tak i pokud se narodila ob ě telata mrtvá). Statistické zpracování dat bylo provedeno pomocí Chí kvadrát – testu (X2).

Výsledky a diskuze Celkem bylo hodnoceno 62 237 porod ů. Z toho bylo 37 064 porod ů na 1. laktaci, 18 652 porod ů na 2. laktaci a 6 521 záznam ů o otelení u krav na t řetí laktaci (viz. Tab 1). Ve výskytu porod ů živých jediná čků nebyl mezi hodnocenými laktacemi statisticky pr ůkazný

246 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 rozdíl (p ři p > 0,05). V po čtech abort ů jediná čků je však patrný statisticky vysoce pr ůkazný rozdíl (p ři p < 0,01) mezi laktacemi. Výskyt t ěchto potrat ů byl nejvyšší u prvotelek a s přibývajícím po řadím laktace m ěl klesavou tendenci (viz. Tab. 2). H1 – výskyt porod ů mrtvých telat bude vyšší u krav na 1. laktaci., než u krav na vyšších laktacích – byla potvrzena.

Tab. 1 Incidence porod ů a abort ů na jednotlivých laktacích (ks telat) (Incidence of parturitions and stillbirths on individual lactations (heads of calves)) po řadí porody jediná čci jediná čci dvoj čata dvoj čata 1 dvoj čata laktace celkem živí mrtví živá mrtvé ob ě mrtvá 1. 37 064 33 637 3 074 274 41 38 2. 18 652 17 246 796 511 57 42 3. 6 521 6023 231 224 24 19 celkem 62 237 56 906 4 101 1 009 122 99 pr ůkaznost N.S. ** ** ** ** N.S. = statisticky nepr ůkazné (p ři p > 0,05) rozdíly mezi jednotlivými laktacemi ** = statisticky vysoce pr ůkazné (p ři p < 0,01) rozdíly mezi jednotlivými laktacemi

Zjišt ěná frekvence abort ů je o n ěco vyšší než popisuje Hossein-Zadeh et al. (2008). Autor udává 2,9 % porod ů mrtvých telat u holštýnských dojnic - multipar a 6,6 % u primipar. Ovšem del Río et al. (2007) provád ěl sledování na tomtéž plemeni a popisuje úmrtnost telat u prvorodi ček 10,4 % a u dojnic na vyšších laktacích 7,2 %. Co se týká výskytu porod ů mrtvých telat, zdá se, že nesouvisí pouze s paritou, ale významným faktorem je i v ěk p ři 1. otelení (Ettema, Santos, 2004). Porody živých dvoj čat se nejvíce vyskytovaly u dojnic na 3. laktaci a nejmén ě u primipar (viz. Tab. 1., Tab. 2.). H2 – výskyt porod ů živých dvoj čat bude vyšší u krav na 2. a 3. laktaci, než u krav na 1. laktaci – byla potvrzena. Námi zjišt ěná zvyšující se tendence výskytu více četných porod ů zárove ň se stoupajícím po řadím laktace souhlasí s výsledky ostatních autor ů (Hossein-Zaddeh et al., 2008; Fricke, 2000; del Río et al., 2007). Auto ři se tém ěř shodují i ve zjišt ěné frekvenci, s jakou se vyskytují. Hossein-Zaddeh et al. (2008) popisuje celkový podíl dvoj čat u holštýnských krav 3,9 % a tento pom ěr se zvyšoval s paritou (1,1 % pro primipary vs. 5,7 % u krav na čtvrté nebo vyšší laktaci). Del Río et al. (2007) uvádí u stejného plemene celkový podíl dvoj čat 4,2 % a tento pom ěr se zvyšoval s paritou (1,2 % pro prvorodi čky vs. 5,8 pro multiparní krávy). Podle Frickeho (2000) kolísá incidence dvoj čat od 1 % u primipar do tém ěř 10 % u vyšších parit (5. laktace). V našem sledování jsme zjistili nižší frekvenci

247 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 výskytu porodu živých dvoj čat, než je popsáno v uvedených studiích – to nejspíše souvisí s plemennou p říslušností sledovaných krav – zatímco naše sledování probíhalo u českého strakatého skotu, tak zmi ňovaní auto ři sledovali holštýnské dojnice. Práv ě plemeno je dle Gregoryho et al. (1990) a Frickeho (2000) významným faktorem p ůsobícím na četnost výskytu dvoj čat.

Tab. 2 Incidence porod ů a abort ů na jednotlivých laktacích (v %) (Incidence of parturitions and stillbirths on individual lactations (in %)) po řadí porody jediná čci jediná čci dvoj čata dvoj čata 1 dvoj čata laktace celkem živí mrtví živá mrtvé ob ě mrtvá 1. 100,00 90,09 8,23 0,73 0,11 0,10 2. 100,00 91,68 4,23 2,72 0,30 0,22 3. 100,00 91,63 3,51 3,41 0,37 0,29 celkem 100,00 90,73 6,54 1,61 0,19 0,16 pr ůkaznost N.S. ** ** ** ** N.S. = statisticky nepr ůkazné (p ři p > 0,05) rozdíly mezi jednotlivými laktacemi ** = statisticky vysoce pr ůkazné (p ři p < 0,01) rozdíly mezi jednotlivými laktacemi

Při hodnocení abort ů u porod ů dvoj čat se - navzdory p ředpokladu – projevila rostoucí tendence zárove ň s nar ůstajícím po řadím laktace (viz. Tab. 1, Tab. 2). H3 – výskyt abort ů p ři porodech dvoj čat bude vyšší u krav na 1. laktaci, než u krav na vyšších laktacích – byla vyvrácena. Nár ůst po čtu t ěchto potrat ů zárove ň se stoupajícím po řadím laktace bude s nejv ětší pravd ěpodobností souviset s celkov ě vyšším po čtem porod ů dvoj čat u krav na vyšších laktacích. Vliv parity na výskyt více četných porod ů není pln ě objasn ěn, ale m ůže souviset se zvýšenou schopností starších krav vyživovat dva plody po celou b řezost, s vyšším výskytem dvojnásobné ovulace nebo interakcí mezi t ěmito faktory (Fricke, 2000).

Záv ěr Náš experiment prokázal, že existuje statisticky vysoce pr ůkazný rozdíl (p ři p < 0,01) ve výskytu porod ů dvoj čat a abort ů (jediná čků i dvoj čat) v závislosti na po řadí laktace krav. Porody živých dvoj čat se nejmén ě vyskytovaly u prvotelek, více u krav na 2. laktaci a nejvíce u dojnic na 3. laktaci. Naopak, incidence abort ů jediná čků m ěla opa čný trend (nejvíce u krav na 1. laktaci, nejmén ě na 3. laktaci). P ři sledování porod ů dvoj čat, kdy se jedno z telat narodilo mrtvé a druhé živé, bylo nejmén ě takových p řípad ů u prvotelek, více u krav na 2. laktaci a nejvíce u dojnic na t řetí laktaci. Naprosto stejný trend se projevil i v případ ě hodnocení abort ů dvoj čat (ob ě telata mrtvá).

248 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Pod ěkování Přísp ěvek byl zpracován s podporou interního grantového projektu AF MENDELU, TP 1/2012 a s podporou Výzkumného zám ěru č. MSM6215648905 „Biologické a technologické aspekty udržitelnosti řízených ekosystém ů a jejich adaptace na zm ěnu klimatu“ ud ěleného Ministerstvem školství, mládeže a t ělovýchovy České republiky.

Použitá literatura Bell, M. J., Roberts, D. J. Effect of twinning on the feed intake, performance and health of dairy cows. Liv. Sci., 2 – 3, 2007, 107, 274–281 Bicalho, R. C., Cheong, S. H., Galvao, K. N., Warnick, L.D., Guard, C. L. Effect of twin birth calvings on milk production, reproductive performance, and survival of lactating cows. Jav.-j. Am. Vet. Med. Assoc., 9, 2007, 231, 1390 – 1397. Çobano ğlu, Ö. Twinning in Cattle: Desirable or Undesirable? J. Biol. Environ. Sci., 2010, 4, 2010, 10, 1-8. Ettema, J.F., Santos, J. E. P. Impact of Age at Calving on Lactation, Reproduction, Health, and Income in First-Parity Holsteins on Commercial Farms. J. Dairy Sci.,87, 2004, 8, 2703-2742. Fricke, P.M. Review: Twinning in Dairy Cattle. Prof. Anim. Sci., 2000, 17, 61-67. Gregory, K. E., Echternkamp, S.E., Dickerson, G. E., Cundiff, L.V., Koch, R.M., Van Vleck, L. D. Twinning in cattle: I. Foundation animals and genetic and environmental effects on twinning rate. J. Anim. Sci., 1990, 68, 1867– 876. Hossein-Zadeh, N. G., Nejati-Javaremi, A., Miraei-Ashtiani, S. R., Kohram, H. n Observational Analysis of Twin Births, Calf Stillbirth, Calf Sex Ratio, and Abortion in Iranian Holsteins. J. Dairy Sci., 11, 2008, 91, 4198-4205. Hossein-Zadeh, N. G. The effect of twinning on milk yield, dystocia, calf birth weight and open days in Holstein dairy cows of Iran. J. Anim. Phys. Anim. Nut., 6, 2010a, 94, 780– 787. Hossein-Zadeh, N. G. Evaluation of the effect of twin births on the perinatal calf mortality and productive performance of Holstein dairy cows. Archiv fur tierzucht-archives of animal breeding, 3, 2010b, 53, 256-265. del Río, N. S., Fricke, P.M., Grummer, R.R.Effects of twin pregnancy and dry period feeding strategy on milk production, energy balance, and metabolic profiles in dairy cows. J. Dairy Sci., 3, 2010, 88. del Río, N. S., Stewart, S., Rapnicky, P., Chang, Y. M., Fricke, P.M. Observational Analysis of Twin Births, Calf Sex Ratio, and Calf Mortality in Holstein Dairy Cattle. J. Dairy Sci., American Dairy Science Association, 2007, 90, 1255–1264. Zejdová, P., Falta, D., Ve čeřa, M.; Polák, O.; Kopec, T., Chládek, G. Vliv pohlaví u telat dvoj čat na mlé čnou užitkovost jejich matek. Animal Breeding 2012, 2012, 72-78.

249 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

SELECTION APPROACH TO EVALUATION OF EFFECTS OF MATERNAL HORMONES ON PROGENY IN PRECOCIAL BIRDS

Zeman, M., 1,2 Ka ňková, Z., 1 Koš ťál, Ľ., 2 Okuliarová, M, 1

1Katedra živo číšnej fyziológie a etológie, Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava 2Ústav biochémie a genetiky živo číchov, SAV, Ivanka pri Dunaji, Slovenská republika

Abstract Testosterone (T) transfer into the egg yolk can mediate epigenetic maternal effects on the phenotype of offspring in many avian species. Lines of Japanese quail divergently selected for low (LET) and high (HET) yolk T concentrations represent our unique approach to study physiological mechanisms, by which maternal hormones exert their action. Using this model, we can address mechanisms, how maternal steroids are deposited into the yolk and which environmental and socio-ecological variables determine their deposition. Moreover, we can quantify consequences of different egg steroid content on growth and development of progeny as well as its immune and behavioural phenotype.

Úvod Fenotyp jedinca je výsledkom spolupôsobenia genotypu a prostredia, pri čom ich vzájomná interakcia prebieha na rôznych stup ňoch ontogenézy. Z tohto h ľadiska je dôležité embryonálne a skoré postnatálne obdobie, po čas ktorého sa formujú základné fyziologické a neurobehaviorálne systémy, ktoré sú v tomto čase najcitlivejšie na pôsobenie epigenetických maternálnych signálov. Faktory prostredia sa môžu manifestova ť prostredníctvom maternálnych vplyvov, kedy matka „programuje“ svoje potomstvo na podmienky prostredia, do ktorých sa majú mlá ďatá narodi ť (Mousseau a Fox, 1998). Schopnos ť samice ovplyv ňova ť potomstvo popri genetickej výbave aj epigeneticky je všeobecne známa, no iba v posledných desa ťro čiach sa za čal rozsiahly výskum mechanizmov, ktorými môže matka modifikova ť expresiu génov nasledovnej generácie. Motivácia takéhoto výskumu vyplýva najmä zo skuto čnosti, že epigenetické zmeny sú podstatne rýchlejšie ako genetické a umož ňujú organizmom efektívnejšie reagova ť a prispôsobi ť sa na rýchlo sa meniace podmienky prostredia. Matka má viacero možností, prostredníctvom ktorých môže modifikova ť fyziologický a behaviorálny fenotyp svojho potomstva, aby zvýšila jeho reproduk čnú úspešnos ť v neustále

250 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 sa meniacich podmienkach prostredia. Okrem behaviorálnych prejavov matky sa v venuje ve ľká pozornos ť maternálnym hormónom, ktoré môžu prostredníctvom svojich organiza čných ú činkov permanentne zmeni ť fenotyp jedinca (Groothuis et al., 2005). Tento mechanizmus je významný z evolu čného h ľadiska v rámci rýchlej reakcie na nepredvídate ľné zmeny v prostredí, ale aj z hľadiska bezprostredných negatívnych dôsledkov takýchto adaptácií pre vývin mlá ďaťa a jeho nesprávne naprogramovanie. Napriek tomu, že vplyvy matky na sociálne správanie najmä u cicavcov a človeka sú známe už dlho (napríklad negatívne dôsledky separovania mlá ďat od matky po čas skorých vývinových období po narodení), mechanizmy, akými sa tieto dôsledky manifestujú, sa za čínajú spoznáva ť až v sú časnosti. V tomto smere hrajú dominantnú úlohu maternálne steroidné hormóny, ktoré môžu prechádza ť cez placentárnu alebo chorioalantoickú bariéru a svojimi organiza čnými ú činkami permanentne modifikova ť fyziologické a behaviorálne charakteristiky potomstva (Groothuis a Schwabl, 2008). Tento problém sa v sú časnosti stáva aktuálnejším aj z hľadiska zvyšujúcej sa kontaminácie prostredia endokrinnými disruptantami, ktoré okrem priamych a ľahko vidite ľných negatívnych ú činkov môžu pôsobi ť aj nepriamo, modifikáciou epigenetických adapta čných mechanizmov.

Divergentná selekcia prepelíc japonských na obsah testosterónu vo vajci Selekcia bola založená na znáškovej línii prepelíc japonských chovaných na Ústave biochémie a genetiky živo číchov SAV v Ivanke pri Dunaji. Významnú heritabilitu tohto znaku sme o čakávali na základe vysokej opakovate ľnosti hodnôt koncentrácie a obsahu testosterónu v žĺtku jednotlivých samíc po čas reproduk čného cyklu (Okuliarova et al., 2009). Signifikantné rozdiely v obsahu i koncentráciách testosterónu v žĺtku sme pozorovali už v F1 generácii a maximálnu odpove ď na selekciu sme zaznamenali v F2 generácii (Tab. 1). Koeficient heritability predstavoval h 2 = 0,42, čo znamená, že až polovicu individuálnej variability obsahu testosterónu je možné vysvetli ť geneticky, kým druhá polovica je spôsobená akútnymi socio-environmentálnymi podmienkami. Okrem výrazných a očakávaných rozdielov v koncentráciách a obsahu testosterónu sme zistili odpove ď aj v ostatných steroidných hormónov prítomných v žĺtku. Vo vajciach HET línie sme pozorovali výrazný vzostup v koncentráciách a obsahu androstendiónu v porovnaní v LET líniou a opa čné zmeny pri estradiole (Okuliarova et al., 2011a). Androstendión je prekurzorom testosterónu, ale má aj slabé androgénové ú činky demonštrované po jeho injek čnom podaní (Hegyi a Schwabl, 2010). Naopak, estradiol predstavuje dominantný estrogén a vo vajci sa nachádza v nízkych koncentráciách, pretože vo vysokých

251 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 koncentráciách má výrazné feminiza čné a demaskuliniza čné ú činky (Adkins-Regan et al., 1995). V koncentráciách progesterónu, ako univerzálneho prekurzora pre androgény a estrogény sme medzi líniami rozdiely nepozorovali. Naše výsledky teda nazna čujú, že selekcia na obsah testosterónu vo vajci zasahuje selektívne do biosyntézy steroidov pravdepodobne na viacerých, minimálne na dvoch stupňoch. Paralelnos ť zmien v koncentrácii a obsahu testosterónu po čas 4 generácii dokazuje, že tento zásah je špecifický, uskuto čň uje sa pravdepodobne na úrovni enzýmov zapojených do biosyntézy steroidov a neodráža iba nešpecifický transport lipidických komponentov z pe čeni do ž ĺtka.

Tab. 1 Dynamika zmien koncentrácií a obsahu testosterónu v žĺtku prepelíc japonských divergentne selektovaných na vysoký (HET) a nízky (LET) testosterón vo vajci v priebehu selekcie (Changes in concentrations and content of egg testosterone in Japanese quail selected divergently on high (HET) and low (LET) egg testosterone during the selection process) Testosterón [pg/mg ž ĺtka] Testosterón [ng/mg ž ĺtok] LET línia HET línia LET línia HET línia F1 generácia priemer ± SE 6,15 ± 0,41 8,69 ± 0,77 17,55 ± 1,19 24,63 ± 2,13 N 33 24 33 24 rozsah 3.03 – 13,63 3.66 – 18,25 7.20 – 34,47 11.15 – 47,76 F2 generácia priemer ± SE 5,60 ± 0,27 11,95 ± 1,17 14,49 ± 0,75 31,21 ± 3,28 N 35 33 35 33 rozsah 3.11 – 9,68 5.35 – 43,33 7.62 – 24,49 11.08 – 114,48 F3 generácia priemer ± SE 6,95 ± 0,23 15,58 ± 0,86 19,00 ± 0,76 42,51 ± 2,84 N 25 29 25 29 rozsah 4.50 – 8,93 8.38 – 25,63 11.84 – 24,27 22.33 – 75,59 F4 generácia priemer ± SE 8,95 ± 0,42 14,39 ± 0,89 22,36 ± 1,10 38,84 ± 2,35 N 29 29 29 29 rozsah 4.63 – 13,15 6.41 – 25,68 11.98 – 31,98 16.27 – 65,58 F5 generácia priemer ± SE 9,26 ± 0,50 19,39 ± 0,86 23,66 ± 1,33 51,38 ± 2,60 N 29 33 29 33 rozsah 4.70 – 16,17 9.74 – 34,06 11.76 – 44,44 25.79 – 97,67

Významným výstupom nášho selek čného experimentu je zistenie, že ve ľmi výrazný vzostup obsahu testosterónu vo vajci nemal za následok vzostup hladín v organizme matky, ktorý by mohol negatívne ovplyv ňova ť jej fyziologické procesy a správanie. Bola tým vyvrátená jedna z hypotéz, ako môže by ť obsah maternálneho testosterónu limitovaný z evolu čného h ľadiska. Na druhej strane, tento nález otvára ďalšie otázky o mechanizmoch, ktoré umož ňujú selektívne zvýšenie obsahu testosterónu pre mláďa bez negatívnych efektov na materský organizmus. Naše doterajšie výsledky demonštrujú, že zvýšené maternálne androgény vo vajci majú pozitívny vplyv na intenzitu rastu, pri čom finálna hmotnos ť sa

252 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 medzi líniami nelíši (Okuliarova et al., 2011b). Predpokladáme, že vyššia intenzita rastu môže by ť významná z evolu čného h ľadiska, pretože môže predstavova ť výhodu v kompetícii o potravné zdroje. Nepotvrdili sme o čakávanú supresiu imunitných odpovedí u HET v porovnaní s LET líniou, minimálne na úrovni bunkovej imunity v reakcii na podanie phytohemaglutinínu, ani v skorej reakcii na podanie lipopolysacharidu (Kankova et al., 2012). Tejto problematike budeme preto venova ť ďalšiu pozornos ť.

Záver Prezentované výsledky demonštrujú, že divergentne selektované línie prepelíc japonských na obsah testosterónu vo vajcovom ž ĺtku sa líšia v intenzite rastu, ktorá je vyššia v HET ako LET línii vo všetkých študovaných generáciách. Na druhej strane, niektoré parametre, ktoré boli pripisované vplyvu maternálnych androgénov sa medzi generáciami konzistentne nelíšia, čo nazna čuje absenciu kauzálnych vz ťahov. Z tohto h ľadiska je zaujímavý najmä vz ťah k aktivite imunitného systému, ktorému venujeme významnú pozornos ť. Genetické línie predstavujú efektívny model, ktorý môže prispie ť k objasneniu mechanizmov diferenciálneho transportu maternálneho testosterónu do ž ĺtka a jeho dôsledkov pre potomstvo.

Po ďakovanie Práca bola podporená grantmi APVV 0047-10 a VEGA 1/0686/12.

Použitá literatúra Adkins-Regan, E., Ottinger, M.A., Park, J. Maternal transfer of estradiol to egg yolks alters sexual differentiation of avian offspring. J. Exp. Zool. , 1995, 271, 466-470. Groothuis, T.G.G., Muller, W., von Engelhardt, N., Carere, C., Eising, C. Maternal hormones as a tool to adjust offspring phenotype in avian species. Neurosci. Biobehav. Rev. , 2005, 29, 329-352. Groothuis, T.G.G., Schwabl, H. Hormone-mediated maternal effects in birds: mechanisms matter but what do we know of them? Philos. Trans. R. Soc. B , 2008, 363, 1647-1661. Hegyi, G., Schwabl, H. Do different yolk androgens exert similar effects on the morphology or behaviour of Japanese quail hatchlings Coturnix japonica ? J. Avian Biol. , 2010, 41, 258-265. Kankova, Z., Zeman, M., Okuliarova, M. Growth and innate immunity are not limited by selection for high egg testosterone content in Japanese quail. J. Exp. Biol. , 2012, 215, 617- 622. Mousseau, T.A., Fox, C.W. The adaptive significance of maternal effects. Trends Ecol. Evol. , 1998, 13, 403-407. Okuliarova, M., Groothuis, T.G.G., Skrobanek, P., Zeman, M. Experimental evidence for genetic heritability of maternal hormone transfer to offspring. Am. Nat. , 2011a, 177, 824- 834.

253 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Okuliarova, M., Kostal, L., Zeman, M. Effects of divergent selection for yolk testosterone content on growth characteristics of Japanese quail. Comp. Biochem. Physiol. A , 2011b, 160, 81-86. Okuliarova, M., Skrobanek, P., Zeman, M. Variability of yolk testosterone concentrations during the reproductive cycle of Japanese quail. Comp. Biochem. Physiol. A , 2009, 154, 530-534.

254 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

THE MONITORING OF MANGANESSE CONCENTRATION IN GOAT COLOSTRUM AND MILK BY SUPPLEMENTATION OF DIFFERENT FORMS

Zvonareva E., Pechová A. , Mišurová L. , Hauptmanová K. , Pavlata L.

Ruminant and Swine Clinic, Faculty of Veterinary Medicine, University of Veterinary and Pharmaceutical Scinces Brno.

Abstract The objective of the study was to monitor manganese concentration in goat colostrum and milk during a long-term oral supplementation in different forms. The study was performed in the Ruminant’s clinic of VFU FVL. The experiment involved 31 goats divided into 4 groups. The first group (A; n = 9) served as a control group, the second group (B; n = 8) received inorganic manganese (MnSO4), the other groups received Mn in organic forms – group C (n = 6) Bioplex Mn, group D (n = 8) B-Traxim 2C Mn. The supplementation of Mn was performed by feed mixture which was fed to goats before parturition in the doses 0.5 kg/day and after parturition 1 kg/day. The concentration of Mn in the mixture was 20 mg/kg for control and 160 mg/kg for experimental groups. Colostrum was taken after parturition before first milk feeding of kids. Next samples were taken in 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 15, 30, 60 days post partum. The samples were mineralized, Mn content were measured via electrothermic atomic absorption spectrophotometry. The long-term manganese supplementation of goats influenced the concentration of manganese in colostrum/milk only in some samplings, but in general we did not find long- lasting influence on the manganese concentration after supplementation of different forms of Mn. The concentration of Mn in colostrum and milk show high individual variability within individual experimental groups. The highest Mn concentration were found in first colostrum (A: 20,78 µg/l; B: 32,3 µg/l; C: 23,47 µg/l ; D: 38,31 µg/l), significant difference (p ≤ 0.05) was between A and D. During colostral period Mn concentration in colostrum decreased, but from the second week of lactation Mn concentration in milk increased till the end of the experiment.

Key words: manganese, Mn proteinate, Mn chelate, MnSO4, goat colostrum and milk

Mangan je jedním z nejmén ě zastoupených stopových prvk ů v mléce, jeho koncentrace většinou není vyšší než 0,1 mg/l u r ůzných druh ů zví řat, s výjimkou mleziva (Grace a

255 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 kol.,1973). Koncentrace Mn v mléce a mlezivu je popisována pouze v malém po čtu vědeckých prací. Publikovaná data se však liší s ohledem na sledovaný druh zví řat a fázi laktace. Hladina manganu v mléce je podle výsledk ů n ěkterých autor ů (Merian a kol., 2004; Underwood a Suttle, 1999) ovliv ňována množstvím Mn v krmné dávce. Cílem této práce bylo sledování koncentrace manganu v mlezivu a mléce koz p ři perorální suplementaci r ůznými formami manganu.

Materiál a metodika Experiment byl realizován na Klinice chorob p řežvýkavc ů FVL VFU Brno v roce 2009 - 2010. Do pokusu bylo za řazeno 31 b řezích krátkosrstých bílých koz, které byly rozd ěleny do 4 samostatn ě ustájených skupin. Všechny kozy byly krmeny shodnou krmnou dávkou, která sestávala z dopl ňkové krmné sm ěsi (DKS) 0,5 kg/kus/den p řed porodem, a 1,0 kg/kus/den po porodu. Dále m ěly všechny kozy ad libitní p řístup k lu čnímu senu, vod ě a minerálním liz ům bez obsahu manganu. Pr ůměrný p říjem sena se pohyboval kolem 2,5 kg na kus a den. Koncentrace Mn v senu byla v pr ůměru 87,53 mg/kg. Kontrolní skupina A (n = 9) dostávala dopl ňkovou sm ěs bez p řídavku Mn (p řirozený obsah Mn byl 20 mg/kg). Kozy pokusných skupin dostávaly dopl ňkovou sm ěs, která byla obohacena Mn v různých formách v koncentraci 140 mg/kg (celkem DKS obsahovalo 160 mg/kg Mn). Suplementace pokusných skupin byla zahájena ve druhém m ěsíci gravidity. Skupina B (n = 8) dostávala

krmnou směs obohacenou anorganickým Mn ve form ě MnSO 4, v dalších pokusných skupinách byly použity organické formy manganu: skupina C (n = 6) dostávala DKS supplementovanou 15 % Mn proteinátu (BioplexMn, Alltech), skupina D (n = 8) dostávala DKS suplementovanou 21 % Mn chelát glycinu (B-Traxim 2C Mn, Pancosma). V den porodu bylo odebráno mlezivo p řed prvním napitím k ůzlat a dále byly odebírány vzorky 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7., 15., 30. a 60. den po porodu. Mlezivo/mléko bylo po odb ěru zamraženo až do zpracování v laborato ři. Analýzy vzork ů byly realizovány v biochemické laborato ři Kliniky chorob p řežvýkavc ů. Koncentrace Mn v mléce byla stanovena po mikrovlnné mineralizaci v uzav řeném systému s p řídavkem peroxidu vodíku a kyseliny dusi čné (2 ml mleziva/mléka +1 ml H 2O2 + 2 ml HNO 3) na p řístroji MLS-1200 (Milestone, Itálie). Vlastní stanovení Mn bylo provedeno elektrotermickou atomovou absorp ční spektrofotometrií na p řístroji Solaar 939 (Unicam, Velká Británie). Výsledky byly statisticky zpracovány za použití F-testu pro zhodnocení variability jednotlivých soubor ů a na základ ě jeho výsledku byl použit Student ův t-test pro soubory se shodnými/r ůznými rozptyly. Výsledky jsou uvedeny jako pr ůměry se sm ěrodatnými

256 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 odchylkami. Statistické zpracování bylo provedeno v programu Excel (Microsoft Windows 97).

Výsledky a diskuse Koncentrace manganu v kolostru koz vykazovala pom ěrn ě vysokou variabilitu v rámci jednotlivých pokusných skupin. Nejv ětší rozdíly mezi jednotlivými zví řaty byly zjišt ěny v den porodu (tabulka 1).

Tab. 1 Koncentrace Mn (µg/l) v mlezivu u jednotlivých pokusných skupin koz (A – kontrola, B – MnSO 4, C – Mn proteinát, D – Mn glycinát) v den porodu. Skupiny x s MAX MIN A 20,78 a 8,53 34,65 9,87 B 32,30 19,85 70,73 10,04 C 23,47 10,56 44,53 12,31 D 38,31 a 17,47 80,50 24,04 ap ≤ 0,05(signifikantní rozdíl mezi skupinami ozna čenými stejnými písmeny)

V kontrolní skupin ě byla v den porodu zjišt ěna nejnižší koncentrace Mn, ale signifikantní rozdíl byl pouze ve srovnání se skupinou D, která dostávala Mn-glycinát. U koz kontrolní skupiny koncentrace manganu v kolostru mírn ě stoupala do 4. dne po porodu. Naopak u pokusných skupin koncentrace manganu od porodu mírn ě klesala. Koncentrace Mn v kolostru u jednotlivých skupin v prvních 5 dnech po porodu je uvedena v tabulce 2. Na rozdíl od výsledk ů Weisse a kol. (2005) jsme zjistili signifikantní rozdíly v kolostrální koncentraci manganu mezi jednotlivými pokusnými skupinami. V den porodu byly zjišt ěny signifikantn ě nižší koncentrace Mn v mlezivu koz u skupiny A ve srovnání se skupinou D (p<0,05) suplementovanou Mn- glycinátem a naopak signifikantn ě vyšší koncentrace byly zjišt ěny 3. den po porodu u skupiny A ve srovnání se skupinou C (p<0,05) suplementovanou Mn-proteinátem.

Tab. 2 Pr ůměrná koncentrace Mn (µg/l) v mlezivu u jednotlivých pokusných skupin koz (A – kontrola, B – MnSO 4, C – Mnproteinát, D – Mnglycinát) Dny laktace A B C D Porod 20,78 ± 8,53 a 32,30 ± 19,85 23,47 ± 10,56 38,31 ± 17,47 a 1 20,44 ± 8,67 28,33 ± 17,61 20,68 ± 9,44 28,15 ± 10,24 2 17,55 ± 7,04 17,75 ± 6,87 20,50 ± 7,40 14,77 ± 3,40* 3 17,75 ± 5,20 a 15,22 ± 8,63 11,65 ± 5,98 a, * 12,81 ± 4,69 4 21,54 ± 7,37 * 15,33 ± 6,95 11,39 ± 3,45 16,51 ± 10,09 5 19,06± 9,75 15,28± 7,10 15,07± 5,19 14,65± 7,82 ap ≤ 0,05(signifikantní rozdíl mezi skupinami ozna čenými stejnými písmeny v jednom řádku) *p ≤ 0,05(signifikantní rozdíl ve srovnání s předchozím odb ěrem v jednom sloupci)

257 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

V dostupné literatu ře jsme nenašli informace o koncentraci Mn v kolostru a mléce koz. Námi zjišt ěné koncentrace Mn v mlezivu jsou nižší, než uvádí Weiss a kol. (2005) u krav.

Tito auto ři sledovali koncentrace Mn v mlezivu dojnic p ři suplementaci MnSO 4 a Mn-Met (200 mg Mn/kus/den). Pr ůměrná koncentrace Mn v mlezivu dojnic kontrolní skupiny byla

34,7 µg/l, u dojnic suplementovaných MnSO 4 - 33,1 Mn µg/l, a ve skupin ě suplementovaných Mn-Met - 35,8 Mn µg/l. Výrazn ě vyšší koncentrace Mn mlezivu dojnic (130-160 µg/l) však uvádí Underwood a Suttle (1999). Pr ůměrné koncentrace manganu v kolostru koz bez ohledu na suplementaci jsou uvedeny v grafu 1.

Graf 1 Koncentrace manganu (µg/l) v mlezivu koz bez ohledu na suplementaci

Koncentrace manganu v mléce koz od 6. dne po porodu do konce 2. m ěsíce v jednotlivých pokusných skupinách jsou uvedeny v tabulce 3. Nejnižší koncentrace manganu u koz skupiny A, B i C byly 6. den laktace, pouze u skupiny D až 15. den po porodu. U všech skupin koz byla zjíšt ěna tendence zvyšování koncentrace manganu v mléce ke konci druhého měsíce laktace, p řičemž se pr ůměrné koncentrace pohybovaly od 21,52 až do 29,40 µg/l, což jsou hodnoty blížící se koncentraci v prvním mlezivu. Signifikantní rozdíly mezi jednotlivými pokusnými skupinami byly vzhledem k pom ěrn ě vysoké variabilit ě v rámci jednotlivých skupin zjišt ěny pouze na konci prvního týdne laktace. Signifikantn ě vyšší hodnoty byly 6. den laktace u skupiny D, suplementované Mn-glycinátem ve srovnání se skupinami B a C. Dále byl signifikantní rozdíl zjišt ěn 7. den laktace mezi skupinami D a C. P řestože ur čité rozdíly mezi pokusnými skupinami byly v pr ůběhu našeho experimentu zjišt ěny, nelze jednozna čně říci, že suplementace n ěkteré z použitých forem manganu dlouhodob ě zvýšila koncentraci Mn v mléce dané skupiny koz. Vliv suplementace Mn-glycinátu a Mn oxidu u dojnic sledovali Hall a kol. (2007). Tito auto ři zjistili signifikantn ě vyšší hodnoty Mn v mléce u dojnic suplementovaných Mn-glycinátem ve srovnání s kontrolní skupinou.

258 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Tab. 3 Pr ůměrná koncentrace Mn (µg/l) v mléce u jednotlivých pokusných skupin koz (A – kontrola, B – MnSO 4, C – Mn proteinát, D – Mn glycinát) v prvních dvou m ěsících laktace. Dny laktace A B C D a b a b 6 16,76 ± 8,96 9,68 ± 3,49 10,03 ± 3,12 20,16 ± 9,40 a a 7 13,30 ± 5,76 10,95 ± 4,86 9,53 ± 2,07 15,16 ± 5,32 * 15 17,34 ± 6,05 21,10 ± 12,17 21,75 ± 12,27 14,00 ± 5,82 * * 30 28,14 ± 10,53 21,70 ± 3,25 22,28 ± 3,32 24,57 ± 7,62

60 29,40 ± 6,75 21,52 ± 12,29 22,37 ± 6,78 26,29 ± 6,65 ap ≤ 0,05(signifikantní rozdíl mezi skupinami ozna čenými stejnými písmeny v jednom řádku) *p ≤ 0,05(signifikantní rozdíl ve srovnání s předchozím odb ěrem v jednom sloupci)

Pr ůměrná koncentrace Mn v mléce koz bez ohledu na pokusné skupiny se pohybovala od 15 do 25 µg/l, p řičemž s postupující laktací se zvyšovala (graf 2). Naše výsledky jsou obdobné jako údaje uvád ěné v literatu ře pro kravské mléko: 20- 40 µg/l (Underwood a Suttle, 1999); 20,07 ± 8,26 µg/l (Pechová a kol., 2008); 20 – 50 µg/l (Knowles a kol., 2006); 32 – 52 µg/l (McLeod a Robinson, 1972). Nicmén ě naše výsledky jsou výrazn ě nižší, než uvádí Anke a kol. (1999) – 620 a 120 µg/l v kravském a v lidském mléce jednotliv ě (citováno z Merian a kol., 2004). Domníváme se, že tyto velké rozdíly mohou být zp ůsobeny rozdíly v metodice stanovení a p ředevším pak p řístrojovém vybavení.

Graf 2 Koncentrace manganu (µg/l) v mléce koz od 6. do 60. dne laktace bez ohledu na suplementaci

Z grafu 2 je patrné postupné zvyšování koncentrace Mn v mléce s postupující laktací. Nejvyšší hodnoty byly zjišt ěny 60. den laktace, kdy byla pr ůměrná koncentrace Mn v mléce 25,20 ± 9,11µg/l. Naopak minimální koncentrace Mn 12,44 ± 5,31µg/l byla stanovena 7. den

259 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012 laktace. Obdobn ě zjistili tendenci zvýšení koncentrace Mn v mléce s postupující laktací Pechová a kol. (2008) Záv ěr Suplementace b řezích koz r ůznými formami Mn ovlivnila koncentraci Mn v kolostru/mléce pouze p ři n ěkterých odb ěrech, ale p ři celkovém zhodnocení nebyl zjišt ěn dlouhodobý vliv suplementace n ěkteré z použitých forem Mn na koncentraci tohoto prvku v kolostru ani v mléce. Koncentrace manganu v kolostru i v mléce koz vykazovala vysokou individuální variabilitu v rámci jednotlivých pokusných skupin. V prvních dnech po porodu docházelo k poklesu koncentrace Mn v mlezivu, ale s postupující laktací se koncentrace Mn u většiny koz zvyšovala.

Pod ěkování Práce byla realizována s podporou Výzkumného zám ěru MŠMT č. 6215714203.

Použitá literatury Grace, N.D. Effect of high dietary Mn levels on the growth rate and the level of mineral elements in the plasma and soft tissues of sheep. New Zealand Journal of agricultural research , 1973, 16, 177–180 Hall, J., Winger, H., Hole, P., Samord, R. Investigation of the bioavailability of manganese from organic vs. inorganic supplements. 2007, 58, 358–363. Knowles, S.O., Grace, N.D., Knight, T.W., Mcnabb, W.C., Lee, J. Reasons and means for manipulating the micronutrient composition of milk from grazing dairy cattle. Anim. Feed Sci. Technol., 2006, 131, 154–167 Mcleod, B., Robinson, M. Dietary intake of manganese by New Zealand infants during the first six months of life. Br. J. Nutr . 1972, 27, 229–232 Merian, E., Anke M., Ihnat, M., Stoeppler, M. Elements and their Compounds in the Environment. 2 nd Edition, Wienheim: Copyright WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2004, 1245 Pechová, A., Pavlata, L., Dvožák, R., Lokajová, E. Contents of Zn, Cu and Se in milk in relation to their concentrations in blood, milk yield and stage of lactation in dairy cattle. Acta Vet. Brno, 2008, 77, 523–531 Underwood, E.J., Suttle, N.F. The mineral nutrition of Livestock, 3 rd ed . 3.vyd. Oxon: CABI Publishing, 1999, 614 Weiss, W., Socha, T. Dietary manganese for dry and lactating Holstein cows. J. Dairy Sci. , 2005, 88, 2517–2523

260 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

VYTVO ŘENÍ PARTNERSKÉ SÍT Ě VZD ĚLÁVÁNÍ A VÝZKUMU V OBLASTI MASTITID

CZ.1.07/2.4.00/17.0026 Dota ční titul: OP Vzd ělávání pro konkurenceschopnost Prioritní osa: 7.2 Terciární vzd ělávání, výzkum a vývoj Oblast podpory: 7.2.4 Partnerství a sít ě Doba řešení: 1.1.2012 – 31.12.2014 Přid ělené finan ční prost ředky: 6 918 878 K č Koordinátor projektu: Ing. Petr Sláma, Ph.D. Partne ři projetu: Jiho česká univerzita v Českých Bud ějovicích Spole čnost mladých agrárník ů České republiky Bentley Czech s.r.o. Anotace projektu: Hlavním cílem projektu je vytvo ření partnerské sít ě mezi institucemi terciárního vzd ělávání, výzkumnými organizacemi a subjekty soukromého sektoru, které se zabývají vzd ěláváním a výzkumem v oblasti mastitid. Dalším cílem je prohloubit vzájemnou spolupráci mezi jednotlivými subjekty a p řisp ět tak k lepšímu p řenosu poznatk ů. Do projektu budou zapojeny také zahrani ční univerzity a výzkumné instituce, které jsou p ředpokladem zkvalitn ění vzd ělávání cílové skupiny. Tyto cíle budou napl ňovány prost řednictvím následujících klí čových aktivit: 1. Komunika ční a interaktivní platformy 2. Vzd ělávací a tréninkové moduly 3. Stáže a odborné praxe 4. Odborná stáž na Kasetsart University, Thajsko 5. Odborná stáž na National Institute of Animal Health, Japonsko 6. Odborná stáž na Slovenskej po ľnohospodárskej univerzite v Nitre, Slovensko 7. Odborná stáž v Centru výskumu živo číšnej výroby Nitra, Slovensko

Tento projekt je spolufinancován z Evropského sociálního fondu a státního rozpo čtu České republiky

261 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Partnerství a sít ě Mendelu

Zden ěk Havlí ček, Ji ří Skládanka – Mendelu v Brn ě

Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zví řat je spolu s Ústavem výživy zví řat a pícniná řství koordinátorem projektu CZ 1.07./2.4.01/12.0045 „ Posílení spolupráce mezi MZLU v Brn ě a dalšími institucemi v terciárním vzd ělávání a výzkumu“, jehož hlavní podstatou je cílené seskupování univerzit a v ědeckých institucí do celk ů, které jsou ozna čovány jako partnerství. Projekt spolufinancovaný z Evropského sociálního lidí fondu umožní vým ěnu informací mezi jednotlivými subjekty. Primárn ě bude kladen d ůraz na vým ěnu informací a prohlubování spolupráce mezi jednotlivými partnery vytvo řené sít ě. Na projektu se krom ě zmi ňované Agronomické fakulty Mendelu v Brn ě podílejí také další čty ři instituce – Zem ědělská fakulta Jiho české univerzity v Českých Bud ějovicích, AgroKonzulta – poradenství s.r.o. Žamberk, Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i Praha a Zem ědělský výzkum, spol. s r.o. v Troubsko.

Co je možné o čekávat? V následujících 36 m ěsících budou pro jednotlivé cílové skupiny, které jsou představovány akademickými i neakademickými pracovníky univerzit, stejn ě jako v ědeckými i nev ědeckými pracovníky jednotlivých partnerských pracoviš ť organizovány workshopy s praktickými ukázkami jednotlivých laboratorních, experimentálních a modelových postup ů, u kterých bude nedílnou sou částí i aktivita spojená s interpretací výsledk ů. D ůraz bude kladen na interdisciplinární využitelnost. V sou časné dob ě probíhají seminá ře s názvem Interaktivní informa ční platformy, kde se presentují jednotlivá pracovišt ě partnerských organizací.

Co s toho budou mít studenti? Výsadní postavení a d ůraz v aktivitách projektu je kladen p ředevším na vysokoškolské studenty, kte ří svou znalostí fungujících činností a mechanism ů od výzkumné až po aplikaci jednotlivých poznatk ů získají výhodn ější postavení na trhu práce. Pro studenty je cílen ě ur čena aktivita Podpora pracovních a studijních pobyt ů, kdy budou mít studenty u partner ů projektu možnost poznat specifické vybavení institucí partner ů, budou mít možnost praktického vyzkoušení n ěkterých experiment ů s vyjasn ěním jejich podstaty a p řínosu tak, aby je studenti mohli v budoucnu využít nejen pro své

Jaké to bude mít d ůsledky pro budoucnost? Projekt p řisp ěje ke zvýšení vzájemné spolupráce a p řisp ěje k lepšímu p řenosu poznatk ů z univerzitní do aplika ční sféry. Tato část zahajovaného projektu je ur čena pro akademické a neakademické v ědecké pracovníky. Projekt svými klí čovými aktivitami napom ůže budoucímu efektivn ějšímu a spole čnému využívání výzkumných a vývojových kapacit, v četn ě konzulta ční činnosti p ři vyúst ění do spole čně řešených, komplexn ě pojatých projekt ů na úrovni základního i aplika čního výzkumu. Navázaná spolupráce bude finalizována vytvo řením kontaktního místa na Mendelov ě univerzit ě v Brn ě, které bude též zam ěř eno na poskytnutí relevantních informací v ůč i aplika ční sfé ře a zam ěstnavatelskému sektoru.

262 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Inovace studijních program ů AF MENDELU sm ěrem k internacionalizaci studia CZ.1.07/2.2.00/28.0020 Doba řešení: 1.6.2012 – 31.5.2015 Koordinátor projektu: Ji ří Skládanka Žadatel projektu: Mendelova univerzita v Brn ě Partner projektu: AgroKonzulta – poradenství, s.r.o. Obsah projektu: Projekt p řispívá k tvorb ě studijních materiál ů oboru Všeobecné zem ědělství, který je na AF MENDELU akreditován v češtin ě a angli čtin ě. Pro anglickou výuky nejsou k dispozici didaktické pom ůcky nutné pro dosažení požadovaných znalostí a dovedností absolvent ů. U čební texty v angli čtin ě jsou také nutné pro další akreditace. Projekt je dále zam ěř en na inovaci obor ů fytotechnických a zootechnických, jejichž p ředm ěty se prolínají v mezioborovém Všeobecném zem ědělství. Vytvo řené studijní texty budou reagovat na aktuální m ěnící se ekonomické podmínky a na environmentální problematiku, zejména zm ěny klimatu. Pro vyšší uplatn ění absolvent ů na trhu práce budou realizovány stáže u budoucích zam ěstnavatel ů. Projekt je ur čen pro u čitele VŠ a studenty AF MENDELU. Cíl ů projektu bude dosaženo tvorbou e-learningových prezentací, skript, poster ů, DVD nahrávek, atlas ů a dalším jazykovým vzd ěláváním u čitel ů. Plánované aktivity bude realizovat tým VŠ učitel ů z AF MENDELU a odborník ů z firmy AgroKonzulta – poradenství, s.r.o. Klí čové aktivity: KA1 Inovace fytotechnických program ů sm ěrem k modernizaci didaktických metod KA2 Inovace zootechnických program ů sm ěrem k modernizaci didaktických metod KA3 Inovace studijních program ů s možností mezioborových studií sm ěrem k výuce v AJ KA4 Zvyšování jazykových kompetencí akademických pracovník ů KA5 Zapojení odborník ů ze zahrani čí do p řípravy studijních program ů v anglickém jazyce KA6 Podpora stáží student ů u budoucích zam ěstnavatel ů KA7 Inovace p ředm ětů v cizích jazycích nap říč obory AF Rozpo čet projektu: celkové náklady 20 092 755,20 K č

Tento projekt je spolufinancován z Evropského sociálního fondu a státního rozpo čtu České

263 | P a g e Animal Physiology 2012 May 24-25th 2012

Name of publication: Animal Physiology 2012 – Proceedings of International Conference Author: Collective of Authors Editors: Ing. Aleš Pavlík, Ph.D., Ing. Petr. Sláma, Ph.D., Ing. Petr Škarpa, Ph.D. Number of pages: 264 Number of copies: 90 Publisher: Mendel University in Brno, Zem ědělská 1, 613 00, Czech Republic

ISBN: 978-80-7375-616-1

Contributions are published in original version, without any language correction

264 | P a g e