UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE – UFRN

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

ANA KARINA DE LIMA NASCIMENTO

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ANTIPROLIFERATIVA DE EXTRATOS DE FOLHAS DE Plukenetia volubilis L. (EUPHORBIACEAE)

NATAL

2013 ANA KARINA DE LIMA NASCIMENTO

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ANTIPROLIFERATIVA DE EXTRATOS DE FOLHAS DE Plukenetia volubilis L. (EUPHORBIACEAE)

Orientadora: Prof. Katia Castanho Scortecci

Co-Orientador: Prof. Hugo Alexandre Rocha

Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.

NATAL

2013

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ANA KARINA DE LIMA NASCIMENTO

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ANTIPROLIFERATIVA DE EXTRATOS DE FOLHAS DE Plukenetia volubitis L. (EUPHORBTACEAE)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímlca.

Aprovado em: 1 810312013

BANCA EXAMINADORA

Íe de Oliveira Rocha nto de Bioquímica - UFRN Co-orientador

Profa. Dra. Yara Alves Cursino dos Santos Departamen de Biociências - USP

Prof. Dr. Va Departamento de Mi lbio e Parasitologia - UFRN Exa inador DEDICATÓRIA

Dedico esta obra a minha família, em especial a minha mãe Maria Nazaré de Lima, por todo amor, dedicação e principalmente por ser meu maior exemplo de garra e perseverança. Ao meu namorado João Batista Nóbrega pela paciência e amor. Sem o apoio de vocês teria a batalha teria sido muito mais árdua.

AGRADECIMENTOS AGRADECIMENTOS

À Deus por me conceder paciência e sabedoria para conclusão deste trabalho, a ele devo todas as vitórias alcançadas.

À minha família por todo apoio e confiança, em especial a minha mãe Nazaré Lima por todo seu esforço, pelo apoio e por ser esse exemplo de mulher batalhadora que me incentiva a lutar pelos meus objetivos. Ao meu pai Luís Antônio, pela confiança e orgulho depositados em mim, apesar de não transparecer. A minha vozinha (in memoriam) que mesmo não estando presente entre nós, tenho certeza que de onde estiver continua intercedendo pelas minhas vitórias.

Ao meu namorado João Nóbrega, pelo apoio incondicional, pela paciência e principalmente por permanecer do meu lado nos momentos mais difíceis do mestrado, sempre me encorajando e fazendo com que eu acreditasse na minha capacidade. Sem seu apoio tenho certeza que a batalha teria sido muito mais árdua!

À minha orientadora a Prof. Dr. Kátia Castanho que mesmo sem me conhecer me concedeu a oportunidade de fazer parte do seu grupo de pesquisa. Obrigada Kátia por ter depositado em mim confiança e credibilidade.

Ao Prof. Dr. Hugo Alexandre Rocha, por ter me recebido de portas abertas em seu laboratório epela ajuda incondicional na realização deste projeto.

Ao Programa de Pós-graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte por oferecer as condições necessárias para o desenvolvimento deste trabalho.

À secretária da pós-graduação em Bioquímica Margarita Alexandre Mavromatis por sempre ser prestativa, pelo seu exemplo de competência e organização.

À Coordenação de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo financiamento desta pesquisa.

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Aos integrantes do Grupo de Plantas do LBMG, em especial “Helenas” (Rsrs), amigas que espero levar para o resto da minha vida. À Cris, por compartilhar comigo os momentos de alegrias e também os de estresse durante todo o mestrado, o que seria de mim se não tivesse você pra dividir as lamentações heim amiga? (rsrs). À Amanda, por todos os conselhos, pelas conversas e peloseu jeito alegre de ser que nos contagia, obrigada friend!! À Cecília, minha companheira desde a graduação, obrigada por sempre está disposta a me ajudar, não só a mim, mas a todos do grupo, sei que você tem um coração enorme e te admiro por isso, espero poder sempre contar com sua amizade. À Kellya, pelos momentos de descontração, por nos fazer rir até mesmo no fim de um dia de trabalho cansativo no laboratório. À Renata, por nos transmitir calma com seu jeito paciente de ser. À Ingrid, a última sobrevivente do trio das “Jéssicas” (rs) pelas ajudas nos experimentos.As demais “Jessicas” também, Jéssica Vitória e Nayana que apesar de não fazerem mais parte do grupo, me ajudaram no período das extrações. Aos demais integrantes, Isabel, Nathalia, Sara, Nildiane e Gabriel. Á Naldo e Valeska, que não fazem mais parte do grupo, mas que me ajudaram muito no início da minha vida acadêmica, principalmente Valeska com quem aprendi os primeiros passos no laboratório, obrigada pela sua paciência em ensinar.

Ao pessoal do Biopol, por toda ajuda cedida na realização deste trabalho, tenho muito a agradecer a todos vocês, seja aos que estiveram diretamente me acompanhando nos experimentos ou aqueles que simplesmente estiveram dispostos a esclareceralgumas dúvidas, fica aqui minha eterna gratidão. A Raniere por me acompanhar nos experimentos com células. A Rafael pela ajuda nos testes antioxidantes. À Ruth, Dayane, Karol, Moacir e Cinthia pelos favores na cultura de células. À Jailma uma pessoa que não mede esforços pra ajudar o próximo. E aos demais integrantes do Biopol: Daniel, Max, Vinícus, Rony, Sara, Letícia, Mariana, Joana, Monique, Almino, Pablo, Arthur e Marília por sempre me receberem tão bem no laboratório. Desculpa se esqueci de citar alguém, os agradecimentos se estende a toda essa família que sempre esteve disposta a me ajudar. Acredito que o segredo do

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sucesso de um trabalho em equipe está na união, e isso vocês tem de sobra!

À Nednaldo que apesar de pegar no meu pélogo quando comecei os experimentos no Biopol, com seu jeito metódico, semprecobrandopra eu pesquisasse e lêsse milhares deartigos. Na época confesso que minha vontade era fugir toda vez que o encontrava nos corredores do CB ou do departamento de Bioquímica (rsrs), mas hoje sou grata por toda cobrança, e reconheço que isso me fez amadurecer bastante na pesquisa. Obrigada Ned!

À turma do mestrado por dividir comigo os momentos que julgo terem sido os mais “tensos” (períododas disciplinas). À Richele, minha companheira dos seminários em dupla, pelo seu exemplo de determinação e pela amizade construída, espero que perdure por muito tempo. À Daniel Chaves pelos seus jargões que alegravam a turma (Sucesso!). À Heleni por adoçar nossas vidas e por nos fazer engordar um pouquinho com seus dotes culinários. À Cris pelos milagrosos bolos de cenoura que amolece corações (rsrs). À Larissa e Ivanice por compartilhar as alegrias, angústias e até os choros (rs). À Fernanda pela sua tranquilidade que nos contagia. À Patrícia por ser um exemplo de didática, competência e de elegância (rs). À Tafarel, Thiago Barros, Thiago Costa, Hugo, Anderson e Raphael Russi, por todos os momentos de estudo e de descontração. Enfim a todos da turma do mestrado em Bioquímica (2011).

Aos professores do departamento de Bioquímica por todos os conhecimentos transmitidos.

Á professora Silvana Zucolotto do Departamento de Farmácia (UFRN) pela colaboração na realização dos experimentos de triagem fitoquímica. E à sua aluna Júlia, por ter se disponibilizado a me ajudar com esses experimentos, mesmo em período de TCC. Obrigada pelo apoio!

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Aosprofessores da banca de qualificação (Matheus Pedrosa, Tatjana Keesen e Silvana Zucolotto) pelas sugestões que contribuíram enormemente para conclusão deste trabalho.

À minha amiga de infância Anyelle Palhares, pela ajuda com as regras da ABNT. Obrigada amiga, sei que apesar da distância posso contar sempre com você, saiba que a recíproca é verdadeira!

Aos amigos Kesinho, Pablo, Luciana e Cecília por todo apoio desde a graduação. Pessoas que sempre depositaram em mim confiança e isso foi muito importante nessa trajetória!

Aos meus compadres Glícia e João Paulo pela amizade, confiança e por dividirem comigo momentos felizes.

À minha prima-irmã Ana Catarina por sempre me apoiar e por entender minha ausência quando tinha que me dedicar ao mestrado.

Às minhas afilhadas Ana Beatriz, Maria Clara e Maria Vitória que mesmo sem entender nada, me dão forças pra continuar!

Enfim, a todos que contribuíram de forma direta ou indireta para realização deste trabalho.

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“O que vale na vida não é o ponto de partida e sim a caminhada. Caminhando e semeando, no fim terás o que colher.”

(Cora Coralina)

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RESUMO

Plukenetia volubilis, conhecida popularmente como sacha incha ou amêndoa lopo, é uma planta oleaginosa e trepadeira pertecente a família Euphorbiaceae. Suas sementes apresentam alto valor nutritivo e suas folhas são utilizadas pela população amazônica para tratar doenças de pele, contudo essa ação não é comprovada cientificamente. Dentro deste contexto, no presente trabalho foi realizada uma prospecção química e biológica de diferentes extratos obtidos das folhas de P. volubilis: extrato aquoso (EA), metanólito (EM), etanólico (EE), clorofórmico (EC) e hexânico (EH). A triagem fitoquímica foi realizada por meio de reações químicas de identificação e análise por cromatografia em camada delgada (CCD), utilizando diferentes eluentes e reveladores. Como parte das análises de constituição química dos extratos, foram realizadas dosagens de compostos fenólicos, açúcares totais e proteínas. Em relação às atividades biológicas foi avaliada a capacidade antioxidante dos extratos e seus efeitos sob células tumorais e normais. Com os resultados obtidos foi possível detectar por meio das reações químicas a presença de compostos fenólicos, flavonóides, saponinas e alcalóides. Por meio da análise de CCD foi possível verificar a presença de compostos com estruturas de terpenos, polifenóis e flavonóides. O extrato metanólico (EM) apresentou uma banda de coloração verde e Rf 0,65 similar ao padrão de flavonóide canferol. Com as metodologias de dosagem química foi observada uma elevada quantidade de açúcares totais nos extratos de P. volubilis. Os testes para avaliação da atividade antioxidante revelaram que todos os extratos apresentam capacidade antioxidante. No teste de capacidade antioxidante total (expresso como equivalente em ácido ascórbico, EEA/g), os extratos apresentaram valores que variaram entre 59,31 a 97,76 EAA/g. Para o teste de DPPH os valores de sequestro variaram de 88,3% a 62,8%. O teste de viabilidade celular, verificado por meio da redução do composto MTT possibilitou observar que os extratos foram capazes de diminuir a viabilidade das células cancerígenas HeLa e A549, sendo mais eficientes para linhagem HeLa. Os extratos EM e EH (250 µg/mL) apresentaram redução da proliferação de HeLa para 54,3 e 48,5%, respectivamente. Enquanto que os extratos EH e EA induziram de forma significativa a proliferação de fibroblastos normais 3T3, cerca de 70% a mais que o controle. Resultado semelhante foi observado em macrófagos Raw, onde foi verificado que a proliferação dessas células tratadas com os extratos EM, EC e EA foi a duas vezes mais que o controle. Nenhum efeito foi observado nas células CHO quando tratadas com os extratos. Outra abordagem utilizada foi a de citometria de fluxo de modo a avaliar marcadores de morte celular em células HeLa quando expostas aos extratos de P. volubilis. Os resultados deste ensaio mostraram que os extratos induziram a morte celular via apoptose. Portanto, esses resultados sugerem que os extratos das folhas de P. volubilis são potenciais alvos para serem utilizados futuramente no desenvolvimento de fármacos com ação antioxidante, proliferativa para células normais e antitumoral.

Palavras-chave: Amêndoa lopo, extratos, atividade antioxidante, morte celular, apoptose.

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ABSTRACT

Plukenetia volubilis (or sacha inchi) is an oleaginous plant from Euphorbiaceae family. Seeds have a high nutritional value and its leaves are used to treat skin diseases by Amazonian population. However, this procedure does not have any scientific base yet. Considering this, the aim of this work was to made chemical and biological analysis using different leaf plant extracts: aqueous extract (EA), metanol (EM), ethanol (EE), chloroform (CE) and hexane (EH). The phytochemical screening was done using specific chemical reactions and analysis by thin layer chromatography (TLC). It was also measured the composition phenols, sugars and proteins. The biological activities as antioxidants and its effects on tumor and normal cells were also analyzed. The results showed the presence of phenos, flavonoids, saponins and alkaloids. By TLC analysis, it was observed the presence of terpenes, flavonoids and polyphenols. The methanol extract (EM) showed a green band and Rf 0.65 that was similar to the flavonoid kaempferol pattern. It was also detected high concentration of sugars. The antioxidant assays showed that all extracts had an antioxidant activity. The CAT assay that is expressed as equivalent ascorbic acid (EEA/g), it was observed that the extracts showed values ranging from 59.31 to 97.76 EAA/g. Furthermore, the DPPH assay values rangedfrom 62.8% to 88.3%. The cell viability assay showed that the extracts were able to reduce viability from cancer cells as HeLa and A549. It was verified that the better results were obtained for HeLa lineage. The extracts EM and EH (250µg/mL concentration used) were able to reduce the proliferation from HeLa cell suspension to 54.3 and 48.5%, respectively. On the other hand, the extracts EH and EA were able to induced cell proliferation on normal fibroblasts 3T3 cells, this proliferation was about 70% higher than the control. A similar result was observed for macrophages Raw, where the proliferation from these cells that were treated with EM, EC or EA extracts were two times more than the control. It was not observed any effect on CHO cells. In order to known which was the pathway for the cell death in HeLa cells, it was done flow cytometry. The results showed that extracts induce cell death via apoptosis. Therefore, these results suggest that leaf extracts from Plukenetia volubilis may be a potential targets for the future use as a medicine with antioxidant, antitumor and proliferative.

Keywords: Sacha inchi, extracts, activity antioxidant, cell death, apoptosis.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: O estresse oxidativo resulta do desequilíbrio de antioxidantes (AOX) e espécies reativas de oxigênio (ROS)...... 29

Figura 2. Moléculas que bloqueiam ou suprimem os múltiplos estágios da carcinogênese...... 32

Figura 3. Plukenetia volubilis sob condições de cultivo...... 35

Figura 4. Esquema representativo das análises realizadas com extratos de Plukenetia volubilis...... 38

Figura 5. Comparação da coloração do extrato alocoólico foliar de Plukenetia volubis com e sem adição de solução de cloreto férrico...... 45 Figura 6. Comparação da coloração do extrato aquoso foliar de Plukenetia volubis com e sem adição de gelatina...... 46

Figura 7. Resultado do teste de espuma com extrato aquoso foliar de Plukenetia volubilis...... 46 Figura 8. Comparação da coloração do extrato alcoólico foliar de Plukenetia volubis com e sem adição de HCL e magnésio...... 47

Figura 9. Comparação da coloração do extrato com ácido sulfurico foliar de Plukenetia volubis com e sem adição dos reagentes...... 47

Figura 10. CCD das frações resultantes da extração das folhas da espécie Plukenetia volubilis...... 48

Figura 11. CCD das frações resultantes da extração das folhas da espécie Plukenetia volubilis...... 49

Figura 12. CCD das frações resultantes da extração das folhas da espécie Plukenetia volubilis...... 50

Figura 13. CCD das frações resultantes da extração das folhas da espécie Plukenetia volubilis...... 51

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Figura 14. CCD do extrato MeOH da espécie Plukenetia volubilis em comparação com as agliconas flavonoídicas canferol, apigenina, glicosil-crisina e luteolina...... 51

Figura 15. CCD do extrato MeOH da espécie Plukenetia volubilis em comparação com o padrão canferol...... 52

Figura 16. CCD das frações resultantes da extração das folhas da espécie Plukenetia volubilis...... 52

Figura 17. Atividade antioxidante dos extratos foliares de Plukenetia volubilis medida pelo ensaio da capacidade antioxidante total (CAT)...... 55

Figura 18. Atividade antioxidante dos extratos foliares de Plukenetia volubilis medida pelo ensaio de sequestro do radical DPPH...... 56

Figura 19. Viabilidade celular de diferentes linhagens tratadas com extratos de Plukenetia volubilis...... 59

Figura 20. Viabilidade de células Raw tratadas com extratos de Plukenetia volubilis...... 59

Figura 21. Morfologia de células HeLa tratadas com extratos de P.volubilis...... 61

Figura 22. Distribuição percentual de células apoptóticas...... 62

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Resultado das reações de identificação...... 45

Tabela 2: Resultado das análises por CCD de extratos de P. volubilis...... 53

Tabela 3. Porcentagem relativa dos compostos químicos dosados com os extratos de Plukenetia volubilis...... 54

Tabela 4.Correlação de compostos fenólicos e açúcares dos extratos de Plukenetia volubilis com atividade antioxidante total (CAT) e atividade sequestradora de radicais DPPH...... 56

Tabela 5. Efeito dos extratos de Plukenetia volubilis na concentração de (250 µg/mL) na proliferação de diferentes linhagens celulares, nos tempos de 24, 48 e 72h...... 58

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LISTA DE ABREVIATURAS/SIGLAS

AOX Antioxidante

AP-1 Proteína ativadora 1

BHA ButiladoHidroxianisol

BHT Butil-hidroxitolueno

CAT Capacidade Antioxidante Total

CCD Cromatografia em Camada Delgada

CF Compostos Fenólicos

DAPI 4 ',6-diamidino-2-fenilindol

DMEM Meio de cultura Eagle modificado Dulbecco

DMSO Dimetilsufóxido

DPPH 2,2’-difenil-1-picrilhidrazilo

EA Extrato Aquoso das folhas de Plukenetia volubilis

EC Extrato Clorofórmico das folhas de Plukenetia volubilis

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

EE Extrato Etanólico das folhas de Plukenetia volubilis

EEA Equivalente de ácido ascórbico

EGCG Epigalocatequina Galato

EH Extrato Hexano das folhas de Plukenetia volubilis

EM Extrato Metanólico das folhas de Plukenetia volubilis

ERN Espécies Reativas de Nitrogênio

EROS Espécies Reativas de Oxigênio

FITC Isocianato de fluoresceína

MAPK Proteína quinase ativada por mitógeno

MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio

NBT Nitroazul de tetrazólio

NF-kappa B Fator Nuclear kappa B

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OH- Radical hidroxila

OMS Organização Mundial de Saúde

PBS Tampão fostato salino

PI Iodeto de propídeo

PI3K Fosfatidilinositol3-quinase

PKC Proteína Quinase K

SOD Sódio Peróxido Dismutase

TCA Ácido tricloroacético

VEGF Fator de crescimento endotelial vascular

WHO World Health Organization

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 19

1.1 PLANTAS MEDICINAIS E ETNOBOTÂNICA – BREVE HISTÓRICO 19

1.2 FAMÍLIA EUPHORBIACEAE 23

1.2.1 Espécie Plukenetia volubilis 25

1.3 METABÓLITOS SECUNDÁRIOSE ATIVIDADES BIOLÓGICAS 26

1.4 RADICAIS LIVRES, ESTRESSE OXIDATIVO E DESORDENS CELULARES 28

1.5 CÂNCER 31

2 OBJETIVOS 34

3 MATERIAIS E MÉTODOS 35

3.1 MATERIAL VEGETAL 35

3.2 TRIAGEM FITOQUÍMICA 35

3.2.1 Reações de Identificação 35

3.2.1.1 Pesquisa de compostos fenólicos 36

3.2.1.2 Pesquisa de favonoides 36

3.2.1.3 Pesquisa de taninos 36

3.2.1.4 Pesquisa de saponinas 37

3.2.1.5 Pesquisa de alcaloide 37

3.3 PREPARAÇÃO E FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS 37

3.4 ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA 38

3.5 COMPOSIÇÃO QUÍMICA 39

3.5.1 Dosagem de açucares 39

3.5.2 Dosagem de Proteínas 39

3.5.3 Dosagem de Compostos Fenólicos totais 39

3.6 ATIVIDADES BIOLÓGICAS 39

3.6.1 Atividade Antioxidante 39

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3.6.1.1 Determinação da atividade antioxidante total (CAT) 39

3.6.1.2 Atividade sequestradora de radical hidroxila 40

3.6.1.3 Atividade de quelação de íons metais 40

3.6.1.4 Teste do sequestro de íons superóxido 41

3.6.1.5 Teste do Poder Redutor 41

3.6.1.6 Atividade sequestradora de radicais livres DPPH 41

3.6.2 Atividade antiproliferativa 42

3.6.2.1 Teste de Viabilidade Celular – MTT 42

3.6.2.2Análise morfológica das células 43

3.6.2.4 Citometria de fluxo 43

3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA 44

4 RESULTADOS 45

4.1 TRIAGEM FITOQUÍMICA 45

4.1.1 Reações de identificação 45

4.2ANÁLISES POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) 47

4.3 COMPOSIÇÃO QUÍMICA 52

4.4 ATIVIDADES BIOLÓGICAS 54

4.4.1 Avaliação da Atividade Antioxidante 54

4.4.1.1 Capacidade Antioxidante Total (CAT) 54

4.4.1.2 Sequestro do Radical DPPH 55

4.4.2 Avaliação da Atividade Antiproliferativa 57

4.4.2.1 Avaliação da Viabilidade de células expostas aos extratos 57

4.4.2.2 Avaliação das Alterações Morfológicas de células HeLa 60

4.4.2.3 Citometria de Fluxo 61

5 DISCUSSÃO 63

6 CONCLUSÕES 71

REFERÊNCIAS 72 1. INTRODUÇÃO

1.1. PLANTAS MEDICINAIS E ETNOBOTÂNICA – BREVE HISTÓRICO

O histórico da utilização das plantas medicinais pela população humana data desde as antigas civilizações. Os povos Egípcios, Gregos e Romanos foram os primeiros a acumular os conhecimentos referentes a esta utilização dos vegetais, e essa cultura é mantida até os dias de hoje (ABOELSOUD, 2010; JI; LI; ZHANG, 2009). Além disso, os indígenas também contribuíram de forma significativa com os conhecimentos populares provenientes da exploração das ervas medicinais. O conhecimento tradicional indígena sobre as plantas foi transmitido através de várias gerações desde seu primeiro relato, que data entre 3500 a.C. e 800 a.C. (AYYANAR; IGNACIMUTHU, 2005; IGNACIMUTHU; AYYANAR; SIVARAMAN2006; SAHU; DHAL; MOHANTY, 2010). Dessa forma, percebe-se que a utilização de ervas na medicina caracteriza uma tradição bastante antiga, e isso ocorre principalmente nos países em desenvolvimento. Segundo Sahu (2010) tal fato ocorre devido ao nível de pobreza dos países subdesenvolvidos, bem como a falta de acesso à medicina moderna. No entanto, de acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) em torno de 65 a 80 % da população de todo o mundo dependem essencialmente das plantas para tratamento de diversas doenças (HARVEY, 2008). Com isso, os investimentos em pesquisas e na comercialização nesta área têm movimentado mundialmente US$ 21,7 bilhões por ano. No Brasil, esse dado foi estimado em 270 milhões para o ano 2000, correspondendo a 15,9% do mercado brasileiro de medicamentos (CARVALHO, 2008).

Em meados do século XX, durante as décadas de 1950-1960 houve um declínio na utilização de medicamentos baseados em plantas, e isso ocorreu devido à falta de credibilidade da população, principalmente após a ocorrência de cerca de cem mortes, como resultado da utilização de um solvente tóxico, o etileno-glicol, usado na fabricação de um dos elixires. Diante de tal fato, nos Estados Unidos foi criada uma lei que controlava a qualidade de alimentos, fármacos e cosméticos no intuito de reduzir os riscos desses tipos de medicamentos (CRACKER; GARDNER, 2006). Neste mesmo período deu-se início a chamada era sintética, por meio da introdução dos fármacos baseados

Ana Karina de Lima Nascimento Página 19 em estruturas químicas já estabelecidas e sintetizados por grandes laboratórios mundiais. Contudo, a competição entre as companhias farmacêuticas para encontrar novos tipos de medicamentos, levou ao declínio desse sistema de fabricação. Assim, na década de 1970 os conhecimentos sobre os benefícios da utilização terapêutica das plantas foram reintroduzidos na população, principalmente entre os americanos que buscavam cuidados de saúde alternativos. No entanto, foi somente nos anos de 1990 que se deu início a era Biossintética, onde cerca de 80% de todos os medicamentos comercializados começaram a ser obtidos de raízes, cascas e folhas de plantas (CRAKER; GARDNER, 2006; LAM, 2007).

Todavia, o mercado de produtos naturais ainda apresentava limitações e por esse motivo nesse período houve um declínio no interesse por parte das indústrias farmacêuticas em realizar pesquisas para o descobrimento de novos princípios ativos de origem natural, isso porque encontrar um produto natural promissor para o tratamento de qualquer doença era um desafio, que envolvia gastos dispendiosos de tempo e dinheiro. Além de existirem alguns fatores limitantes, como por exemplo, a disponibilidade de quantidades da substância pura necessária para atender a demanda do mercado e tornar o produto um medicamento comercializado. Essa demanda pode chegar a centenas de milhares de quilograma do composto por ano, o que implicaria em sérios problemas ambientais (MCCHESNEY et al., 2007). Contudo, nessa mesma década, novos avanços tecnológicos e o desenvolvimento de novos métodos de triagem possibilitaram minimizar essas limitações (LAM, 2007; HARVEY, 2008; LI; VEDERAS, 2009). Deste modo, avanços significativos na indústria e na área das ciências têm motivado as pesquisas em busca de novos agentes farmacológicos, e dessa forma o crescente desenvolvimento tecnológico tem promovido nos últimos anos um renascimento na investigação dos produtos naturais. A automatização na tecnologia dos bioensaios tem contribuído de maneira satisfatória para o desenvolvimento de produtos naturais, o desenvolvimento e aperfeiçoamento de técnicas como cromatografia de alta eficiência e espectrometria de massas de alta resolução, são responsáveis pela melhoria na elucidação da estrutura de compostos bioativos isolados a partir de plantas, diante disso a possibilidade de purificação, isolamento e

Ana Karina de Lima Nascimento Página 20 caracterização destes compostos tornaram-se mais viáveis em menor tempo (LAM, 2007; LI; VEDERAS, 2009; MCCHESNEY et al., 2007). A era biossíntetica também trouxe consigo o advento de ferramentas modernas nas áreas de Química e Biologia, em especial os avanços em Química Combinatória e Biologia Molecular. Estas novas ferramentas possibilitaram uma melhor compreensão dos efeitos biológicos dos compostos naturais no corpo humano, além de fornecer metodologias eficazes que tornaram possível a construção de bibliotecas dessas substâncias em laboratório, garantindo a reprodutibilidade da substância natural (HARVEY, 2008). Além disso, a utilização de ferramentas de genômica, proteômica, metabolômica e química combinatória representa um novo caminho para pôr em prática os conhecimentos acumulados durante centenas de anos na prática médica (BALUNAS; KINGHORN, 2005; CRAVOTTO et al., 2010; HARVEY, 2008;JI; LI; ZHANG,2009; LAM, 2007).

É perceptível que a demanda por medicamentos a base de plantas vem crescendo mundialmente, entre os anos 1981e 2006, onde 1.184 novos fámacos foram registrados, dos quais 28% eram produtos naturais ou seus derivados (NEWMAN; CRAGG, 2007; WINK, 2012). Em 2001-2002 aproximadamente um quarto dos medicamentos de todo o mundo foram obtidos de origem natural, destes 60% dos compostos utilizados no tratamento do câncer e 75% dos fármacos utilizados para doenças infecciosas possuem como principal fonte compostos naturais de origem vegetal ou animal (BALUNAS; KINGHORN, 2005; MCCHESNEY et al., 2007). Porém, 12% das plantas comercializadas para fins terapêuticos no mercado ocidental não apresentam estudos científicos publicados que comprovem suas propriedades medicinais, e cerca de uma a cada duzentas dessas plantas possuem compostos tóxicos ou alergênicos (ALVIANO; ALVIANO, 2009; CRAVOTTO et al., 2010). Portanto, para que ocorra a devida comprovação cientifica em relação à utilização dos produtos de origem vegetal é necessário que haja uma interação universidade-indústria, priorizando a utilização sustentável da biodiversidade, bem como atestando a confiabilidade, eficácia e segurança do uso dessas plantas, através de testes laboratoriais e ensaios clínicos (MCCHESNEY et al., 2007).

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Além das novas tecnologias abordadas anteriormente, existe um campo de estudo que apresenta papel imprescindível em pesquisas científicas sobre a utilização das plantas com potenciais farmacológicos, trata-se da etnobotânica. Essa ciência apresenta caráter interdisciplinar, integrando os diversos conhecimentos populares a respeito das plantas e aliando os fatores culturais e ambientais (SHARMA; KUMAR, 2011). Desta forma, a etnobotânica abrange principalmente as subáreas das ciências naturais e sociais, contribuindo de maneira eficaz na busca por recursos naturais de utilização humana, com destaque para utilização na saúde. Os conhecimentos obtidos com a etnobotânicos fornecem dados importantes que servem como embasamento para desenvolvimento de pesquisas relacionadas às atividades farmacológicas de determinados vegetais, além de contribuir com os conhecimentos sobre a preservação destes recursos. Portanto, o passo inicial para uma pesquisa neste âmbito deve ser fundamentado nos conhecimentos populares advindos da pesquisa etnobotânica (IGNACIMUTHU; AYYANAR; SIVARAMAN, 2006; OLIVEIRA et al., 2009; SHARMA; KUMAR, 2011; SRIPATHI; SANKARI, 2010). Alguns dados provenientes de pesquisas científicas e/ou estudos etnobotânicos têm dado subsídio para a utilização de algumas espécies de vegetais com fins terapêuticos. Eis alguns exemplos: espécies da família Anacardiaceae, tanto seus frutos, folhas e caule, são utilizados pela população da Amazônia contra doenças tropicais, dores de estômago e como antidiarreicos. A família Piperaceae por sua vez, apresenta um grande potencial anti-inflamatório, sendo seus extratos também muito utilizados na medicina popular (LIZCANO et al., 2010).

Diversos medicamentos comercializados na indústria farmacêutica de todo o mundo são obtidos a partir de compostos isolados de alguma espécie vegetal. A espécie Ginkgo biloba L. (Ginkgoaceae) é talvez umas das espécies de plantas mais estudadas quanto o potencial terapêutico, sendo amplamente utilizada para tratamento de distúrbios de memória, como a doença de Alzheimer. Atualmente a população faz uso tanto do seu extrato quanto de medicamentos comercializados a base de compostos obtidos a partir dessa espécie (QUINN et al., 2004). Outra espécie que tem valor importante do ponto de vista terapêutico é a espécie Hypericum perforatum L. (Hyperaceae), popularmente conhecida como erva de São João, é uma das plantas mais bem

Ana Karina de Lima Nascimento Página 22 estudadas com relação a sua utilização na medicina, ela é utilizada para o tratamento de formas leves e moderada de depressão (BACH-ROJECKY, 2004). Diante desses aspectos e da biodiversidade de compostos naturais presentes na biosfera, torna-se evidente que a pesquisa por produtos de origem natural é ainda um campo vasto que ainda precisa ser explorado (MCCHESNEY et al., 2007).

1.2. FAMÍLIA EUPHORBIACEAE – GÊNERO PLUKENETIA sp

A família Euphorbiaceae constitui uma das maiores famílias de plantas com flores, com cerca de 300 gêneros e 8.000 espécies. Encontra-se distribuída principalmente em países tropicais e subtropicais, em vários tipos de vegetação e habitat, apresentando papel importante para economia local, como a mamona e o pinhão manso, que são utilizadas para a produção de óleo vegetal e biodiesel, a Manihot esculenta (macaxeira) de valor agronômico e nutricional, e diversas outras que são aplicadas com fins medicinais, para tratamento de diversas patologias. As atividades mais comuns são potencial antimicrobiano, antifúngico, anti-inflamatório, antinociceptivo, antitumoral, contra doenças de pele entre outros efeitos farmacológicos (MWINE; DAMME; VAN, 2011; SAMY; GOPALAKRISHNAKONE, 2008; SECCO et al., 2012).

As espécies desta família são conhecidas pela ampla diversidade química de seus constituintes (SHI et al., 2008). Compostos como os diterpenos são encontrados na maioria de seus gêneros. Outros constituintes bioativos foram isolados a partir de extratos de plantas do gênero Euphorbia, dentre eles encontram-se os sesquiterpenos, cerebrosídeos, gliceróis, flavonoidese esteroides, compostos que estão diretamente relacionados a maioria das funções biológicas desempenhadas por extratos de plantas em organimos vivos (LLANES-CORONEL et al., 2010; MWINE; DAMME; VAN, 2011; SHI et al., 2008). No entanto, devido a esta vasta diversidade de constituintes e a complexidade na variedade de habitat e de características morfológicas e genéticas, a classificação das Euphorbiaceaes tem se tornado uma tarefa difícil. Estudos recentes baseados em resultados de análises de sequencias de DNA tem proposto uma nova classificação para as Euphorbiaceaes, subdividindo-a em cinco novas famílias, nomeadas por: Euphorbiaceae sensu

Ana Karina de Lima Nascimento Página 23 stricto, Pandaceae, Phyllanthaceae, Picrodendraceae, e Putranjivaceae (MWINE; DAMME; VAN, 2011; SECCO et al., 2012). Na literatura existem diversos relatos de espécies pertencentes à essa família que apresentam variadas atividades biológicas, por exemplo, o extrato obtido da casca do caule de Bridelia scleroneura apresenta propriedade antinociceptiva e anti-inflamatória (THÉOPHILE et al., 2006), extratos aquosos e metanólicos de Acalypha fruticosa possuem atividades antioxidantes e sua utilização como precursor na síntese de drogas anti-neoplásicas vem sendo avaliada, já que em pesquisas anteriores foi apresentada uma boa atividade antiproliferativa contra linhagens de células tumorais (RAJKUMAR; GUHA; KUMAR, 2010). Muitas vezes o látex produzido pelas Euphorbiaceaes é extraído e utilizado com fim terapêutico, principalmente na cura de doenças de pele e no processo de cicatrização de feridas, neste âmbito o gênero Euphorbia apresenta diversas espécies que são utilizadas para esses fins, tais como a E. thymifolia, E. nerifolia e E. nivulia, entre outros gêneros e espécies, como o Croton banplandianum que é aplicado contra sarnas e micoses (TRIPATHI; SRIVASTAVA, 2010). Porém, devido a complexidade na constituição e a abrangência de quantidade de espécies pertecentes a família Euphorbiaceae, atualmente ainda existem gêneros e espécies que são pouco explorados do ponto de vista científico, um exemplo é o gênero Plukenetia.

O gênero Plukenetia é representado por dezenove espécies que se caracterizam por serem trepadeiras, lianas ou raramente ervas perene, comum a distribuição pantropical, sendo assim encontradas pricipalmente em florestas tropicais úmidas. O gênero abrange membros da tribo Plukenetieae que apresentam ovário com quatro carpelos, e incluem as sinonimias Tetracarpidium e Pterococcus (GILLESPIE 1993, 2007; RAMIREZ; GORDILLO; DURÁN, 2000). Espécies do gênero Plukenetia não são endêmicas no Brasil, mas apresentam distribuição geográfica na região Norte, nos estado de Roraima, Amapá, Pará, Amazonas, Acre e Rondônia, no Nordeste, no estado da Bahia, Centro-Oeste, no Mato Grosso e Sudeste, nos estados de Minas Gerais, São Paulo e Rio de Janeiro (CORDEIRO; SECCO, 2012). Na literatura existem poucos relatos quanto à caracterização química e biológica de espécies pertencentes a esse gênero, contudo, espécies como Plukenetia conophora (sinônimo de Tetracarpidium conophorum (Mull. Arg) Hutch; Dalziel)

Ana Karina de Lima Nascimento Página 24 e Plukenetia volubilis endêmicas do sul da Nigéria e Amazônia, respectivamente, são utilizadas pela população nativa na medicina popular e como fonte de alimentos, para obtenção de óleos comestíveis e de farinha (AKINTAYO; BAYER, 2002; AMAEZE et al., 2011; GUILLÉN et al., 2003). Portanto, a pesquisa com espécies pertencentes ao gênero em questão se caracteriza de grande importância na elucidação de seus constituintes químicos e na comprovação da utilização popular com fins medicinais.

1.2.1. Plukenetia volubilis

Plukenetia volubilis é uma planta oleaginosa, trepadeira, pertecente a família Euphorbiaceae, endêmica da floresta tropical de altas altitudes, com centro de origem na Amazônia Peruana, estendendo sua ocorrência a Amazônia Colombiana, Venezualena e Brasileira, cresce em regiões com 200 a 1500 m de altitude e é conhecida popularmente como sacha incha, amendoim inca ou amêndoa lopo (BORDIGNON et al., 2012; CORDEIRO; SECCO, 2012; GUILLÉN et al., 2003;HAMAKER et al., 1992). Possui frutos tetralobulares e sementes em forma lenticular, que apresentam em sua composição grande quantidade de óleo, vitaminas A e E, proteínas, além de alto teor de ômega-3, 6 e 9, ácidos graxos essenciais ao metabolismo humano (GUILLÉN et al., 2003; FOLLEGATTI-ROMERO et al., 2009; PRADO et al., 2011). De acordo com Huamàn et al. (2008) esses elevados teores de ácidos graxos poliinsaturados são responsáveis por atuar na redução dos níveis de triglicerídeos pos prandial em adultos. Tem sido consumida por índios do Peru e acredita-se que tenha sido cultivada por pré-incas e incas, já que foram encontradas representações desta planta e de seus frutos em vasos e túmulos incas, daí a explicação para seu nome popular (GUILLÉN et al., 2003; KRIVANKOVA et al., 2007). Estudos de caracterização do óleo produzido pelas sementes de Plukenetia volubilis indicaram que seu valor nutritivo é comparável ao da soja, sendo assim de grande importância nutricional na dieta (FOLLEGATTI-ROMEROet al., 2009; GUILLÉN et al., 2003; HAMAKER et al., 1992; PRADO et al., 2011).

Além disso, o cultivo de Plukenetia volubilis representa alto potencial agrotecnólogico e econômico, tendo em vista que indústrias peruanas estão comercializando um azeite produzido a partir do óleo de suas sementes, o qual

Ana Karina de Lima Nascimento Página 25 apresenta boas propriedades nutracêuticas, e também vêm sendo utilizado na indústria de cosméticos. No Brasil, esse azeite é obtido de forma artesanal, a partir de sementes comercializadas por sites na internet (CÉSPEDES, 2006; BORDIGNON et al., 2012). Nativos da Amazônia consomem tanto as sementes como suas folhas torradas como fonte de alimentação e dados etnobotânicos apontam para utilização das folhas no tratamento de doenças de pele, no entanto não exite nenhuma comprovação científica para esta utilização popular (GUILLÉN et al., 2003). Portanto, apesar da composição e propriedades de sementes de Plukenetia volubilis serem relativamente bem conhecidas, informações acerca do uso tradicional de suas folhas, ainda encontram-se precárias, e desta forma faz-se necessários estudos mais aprofundados sobre sua composição química e ação farmacológica.

1.3. METABÓLITOS SECUNDÁRIOS E ATIVIDADES BIOLÓGICAS

Metabólitos secundários são compostos orgânicos com estrutura química bastante diversificada o que lhe conferem uma gama de atividades biológicas desempenhadas em organismos biológicos. Diversas classes de metabólitos já foram identificadas em frutas, vegetais e grãos, porém grande parte destes compostos mantem-se não identificados e mais estudos são necessários nesta área, tendo em vista os conhecimentos a cerca dos benefícios fornecidos por esta classe de substâncias, principalmente na diminuição dos riscos de desenvolvimentos de diversos tipos de câncer e de doenças crônicas (LIU, 2003, 2004). Metabólitos secundários de plantas são representados, principalmente por: alcaloides, terpenóides, glicosídeos e fenóis (EDEOGA; OKWU; MBAEBIE, 2005).

Tais substâncias possuem como papel biológico nos vegetais a defesa contra ataques de herbívoros, escassez de água, ou a qualquer outro tipo de estresse biótico ou abiótico. Compostos ou agentes físicos que tenham a capacidade de desencadear esse tipo de resposta em organismos vivos, resultando no acúmulo de metabólitos, são denominados elicitores (VASCONSUELO; BOLAND, 2007).

Existem alguns fatores e condições de cultura que interferem juntamente com os elicitores na produção dos metabólitos secundários, como por exemplo,

Ana Karina de Lima Nascimento Página 26 fase do desenvolvimento da planta, composição do meio (presença de hormônios de crescimento) e condições de luminosidade. Alguns autores afirmam que a fase de crescimento exponencial é o melhor momento para síntese de metabólitos, pois é quando a maquinaria enzimática atinge maior pico de atividade. Hormônios como auxina e ácido jasmônico também atuam juntamente com os elicitores para induzir a produção de metabólitos secundários em vegetais (VASCONSUELO, 2003; VASCONSUELO; BOLAND, 2007). Assim, é importante ressaltar que preparações a base de plantas possuem centenas de componentes químicos e sua composição varia em função de diversos fatores ambientais, como luminosidade, temperatura, salinidade, disponibilidade de água, métodos de coleta, entre outros. Os procedimentos de extração utilizados farmaceuticamente envolvem a separação de compostos bioativos dos componentes inativos ou inertes por meio de solventes específicos. Esses solventes se difundem no material vegetal e solubilizam compostos com polaridade similar (TIWARI et al., 2011; VASCONSUELO; BOLAND, 2007).

As variações que interferem na quantidade e qualidade dos metabólitos secundários extraídos são basicamente: tipo e tempo de extração, temperatura e natureza, concentração e polaridade do solvente (TIWARI et al., 2011). Sendo assim, o método de preparação de extratos vegetais também pode interferir diretamente na eficácia de sua atividade biológica, de acordo com os compostos que foram extraídos, portanto, a padronização desses procedimentos é de grande importância, a fim de se obter produtos terapêuticamente ativos, sem componentes indesejáveis (VASCONSUELO; BOLAND, 2007; TIWARI et al., 2011).

Os recentes avanços ocorridos nos processos de isolamento, purificação e elucidação da estrutura de substâncias naturais tornou possível estabelecer estratégias apropriadas para a análise da qualidade, bem como o processo de normalização das preparações vegetais, a fim de manter a homogeneidade e a qualidade dos compostos extraídos de plantas. Com isso, a partir de extrações eficientes de compostos ativos ocorre a viabilização de testes para atividades biológicas e futuros desenvolvimento de fármacos (HUIE, 2002; NCUBE et al., 2008;TIWARI et al., 2011;WANG; WELLER, 2006).

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Diversas evidências sugerem que os benefícios dos metabólitos secundários ou fitonutrientes nos organismos sejam ocasionados pela sua capacidade em inibir danos oxidativos causados por espécies reativas, como os radicais livres (LIU, 2004). Atualmente sabe-se que o estresse oxidativo está envolvido na etiologia de uma gama de doenças crônicas, dessa forma os fitonutrientes são substâncias que podem agir na prevenção e tratamento de diversas enfermidades, como câncer e doenças inflamatórias (SINGH; BHAT; SINGH, 2003). Além disso, as plantas consistem em boa fonte para o desenvolvimento de fármacos, atualmente existem diversos medicamentos derivados de espécies vegetais que são comercializados pela indústria farmacêutica, como exemplos pode-se citar a colchicina e o taxol, ambos utilizados no tratamento do câncer e isolados das plantas Colchium autumnale e Taxus brevifolia, respectivamente (RAO; RAVISHANKAR, 2002).

1.4. RADICAIS LIVRES, ESTRESSE OXIDATIVO E DESORDENS CELULARES.

Atualmente existe uma grande preocupação em se encontrar compostos naturais que desempenhem atividade antioxidante, tendo em vista que diversas doenças são causadas pela toxicidade de componentes químicos capazes de gerar espécies reativas, chamados de compostos pró-oxidantes. Dentre esses compostos econtram-se os radicais livres, que são definidos como todas as moléculas ou átomos comum ou mais elétrons desemparelhados, sendo geralmente instáveis e altamente reativos. Esses são principalmente derivados do metabolismo do oxigênio (Espécies reativas de oxigênio, EROS) e nitrogênio (Espécies reativas de nitrogênio, ERN) (YASHIKAWA; NAITO;KONDO apud ALVIANO; ALVIANO, 2009; DEVASAGAYAM et al., 2004). Essas moléculas são constantemente formadas nos organismos vivos como produtos de reações químicas, como a oxidação e redução, que ocorrem em todas as células. Sendo altamente instáveis, os elétrons desemparelhados dos radicais livres são capazes de reagir com substratos orgânicos, como proteínas, lipídios e DNA, causando danos à função normal destas biomoléculas, podendo desta forma contribuir para o surgimento de uma variedade de doenças, incluindo diversas formas de cancêr, doenças cardiovasculares, desordens neurodegenerativas, doenças inflamatórias,

Ana Karina de Lima Nascimento Página 28 dentre outras (ALVIANO; ALVIANO 2009; SOMOGYI, 2007). Em células normais existe um equilíbrio entre a quantidade de pro-oxidantes e antioxidantes (Figura 1), no entanto, esse equilíbrio pode ser deslocado no sentido dos pró-oxidantes, desencadeando um processo denominado estresse oxidativo, que é causado basicamente por dois mecanismos: a diminuição da concentração de antioxidantes ou pelo aumento de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (Figura 1).

Figura 1. Desequilíbrio na produção de antioxidantes (AOX) e espécies reativas de oxigênio (EROS). As células são normalmente capazes de balancear a produção de oxidantes e antioxidantes para manter o equilíbrio redox (Adaptado de Scandalios, 2005).

Entretanto, os radicais livres também desempenham papéis benéficos aos organismos, eles são essenciais na estabilização da homeostase redox, além de atuarem como modulador em certas vias de transdução de sinal (DEVASAGAYAM et al., 2004; SOMOGYI, 2007). É importante ressaltar que nem todos os compostos reativos que causam danos são radicais livres, o peróxido de hidrogênio, por exemplo, não apresenta elétrons desemparelhados em sua última camada eletrônica, contudo, é considerada uma espécia reativa por fazer parte do metabolismo do oxigênio molecular e desta forma está envolvido na reação de formação do radical hidroxila (OH-), que é considerada a espécie reativa de oxigênio mais danosa aos sistemas biológicos (ANDRADE-JUNIOR et al., 2005). Diante desse aspecto, substâncias antioxidantes são todas aquelas que, mesmo em baixas concentrações, são capazes de atrasar ou inibir a oxidação

Ana Karina de Lima Nascimento Página 29 de substratos orgânicos (Figura 1). Estes podem ser sintetizados pelo próprio organismo (antioxidantes endógenos), ou podem ser consumidos (antioxidantes exógenos). Deste modo, os organismos desenvolveram diferentes sistemas antioxidantes, que conferem proteção contra os danos causados por radicais livres. Estes sistemas consistem de antioxidantes enzimáticos abrangendo, por exemplo, a catalase, a sódio peróxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase e glutationa redutase; e os mecanismos não enzimáticos, representados principalmente por vitaminas (A e C), por carotenoides, alcaloides e por compostos polifenóis, como flavonoides e outros. No entanto, muitas vezes esses sistemas não são suficientes para proteção integral contra estresse oxidativo, sendo necessária a suplementação dos antioxidantes exógenos, principalmente através da alimentação (DEVASAGAYAM et al., 2004; SOMOGYI, 2007).

Com isto, torna-se cada vez mais crescente o interesse sobre os antioxidantes de origem natural, tendo em vista os diversos fatores negativos atribuídos aos antioxidantes sintéticos, um exemplo é o caso do butiladohidroxianisol (BHA) e do butil-hidroxitolueno (BHT), antioxidantes exógenos adicionados a alimentos que atuam inibindo ou atrasando a iniciação ou propagação da reação oxidativa, e que atualmente são suspeitos de serem carcinogênicos para animais (GUO et al., 2011). Por outro lado, percebe-se que a eficácia antioxidante de um determinado composto pode ser demonstrada em um sistema e pode não atuar sobre outro e até mesmo causar danos. Como é o caso do composto BHA, que atua inibindo a peroxidação lipídica, porém não é capaz de proteger contra o estresse oxidativo a molécula de DNA e proteínas, estando inclusive associado a propenção de danos oxidativos ao DNA que apresentam como consequência o desenvolvimento de cânceres, principalmente de estômago (ARUOMA, 2003; GUO et al., 2011). Diante de tais aspectos, torna-se notória a importância da prospecção de antioxidantes naturais oriundos de espécies vegetais na tentativa de substituir os antioxidantes sintéticos e de minimizar os danos causados por espécies reativas nos organismos, bem como prevenir o desenvolvimento de várias doenças.

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1.5. CÂNCER

O câncer é uma das principais causas de morte em todo mundo. Recentes relatos apontam para a ocorrência de cerca de dez milhões de novos casos por ano, e a organização mundial de saúde estima que em 2030 ocorra 27 milhões de casos incidentes da doença, com cerca de 17 milhões de mortes (WHO, 2011). Trata-se de um problema de saúde mundial que afeta tanto países desenvolvidos como subdesenvolvidos. O câncer resulta de múltiplos estágios e mecanismos de carcinogênese, que envolvem processos mutagênicos, morte celular e mecanismos epigenéticos, durante três etapas distintas, que são: iniciação, promoção e progressão (Figura 2) (KARIKAS, 2011; THANGAPAZHAM et al., 2006). A iniciação é um resultado de mutações que ocorrem no DNA da célula, trata-se de um processo rápido e irreparável, que pode ser causado devido à absorção inicial de um agente cancerígeno e subsequente dano genotóxico estável causado pela sua ativação metabólica (THANGAPAZHAM et al., 2006).Outras causas de início do câncer incluem estresse oxidativo, inflamação crônica e desequilíbrio hormonal (LEE; SURH, 2005; SURH,2003). No estágio de promoção as células iniciadas ou pré-transformadas sofrem mudanças para formar células pré-neoplásicas. Esse processo não é rápido como o da iniciação e pode ser reversível, envolve mecanismos inflamatórios e vias de transdução de sinais, tais como serina treonina quinase, Akt quinase/proteína quinase B, proteína ativadora 1 (AP-1), fator nuclear kappa B (NF-kappa B), proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), receptor andrógeno e as vias Raf/Ras. A fase de progressão, último estágio da trasformação neoplásica, é marcada por hipóxia induzindo fator de crescimento endotelial (VEGF) em células tumorais e expressão de metaloproteínases nas células endoteliais, levando a angiogênese, invasão do tumor e potencial metastásico (CROSS; CLAESSON-WELSH, 2001;LEE; SURH, 2005; THANGAPAZHAM et al., 2006). Apesar dos constantes esforços em pesquisas e dos avanços nos tratamentos contra o câncer, a organização mundial de saúde sugere que pelo menos um terço dos casos de morte por câncer podem ser prevenido (LEE; BODE; DONG, 2011). Em meados da década de 70, Michael Sporn e Wattenberg introduziram o conceito de quimioprevenção, que nada mais é do que a utilização de substâncias de origem natural ou sintética que são capazes

Ana Karina de Lima Nascimento Página 31 de prevenir, impedir ou reverter uma doença. De acordo com esses autores, os agentes quimiopreventivos podem ser classificados em duas categorias: os bloqueadores e os supressores (LEE; SURH, 2005; LEE; BODE; DONG, 2011; THANGAPAZHAM et al., 2006). Os agentes bloqueadores previnem que substâncias carcinogênicas entrem em contato com sítios alvo nas células, impedindo a ativação metabólica e subsequente interação com macromoléculas alvos, como DNA, RNA e proteínas. Já os agentes supressores, inibem a transformação maligna de células iniciadas, evitando que essas células avancem para os estágios de promoção e progressão (Figura 2) (LEE; SURH, 2005; SURH, 2003).

Figura 2. Moléculas que bloqueiam ou suprimem os múltiplos estágios da carcinogênese. Carcinogênese é iniciada com a transformação da célula normal em uma célula cancerígena (célula iniciada). Estas células sofrem uma promoção de tumores em células pré-neoplásicas, que evoluem para células neoplásicas. (Adaptado de Surh, 2003).

Muitas das alterações celulares que estão associadas ao processo de carcinogênese ocorrem em vias de sinalização celular que regulam a proliferação e diferenciação de células. Um dos principais componentes dessas vias de sinalização que mantêm a homeostase intracelular é a família de proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPK), além de outras quinases,

Ana Karina de Lima Nascimento Página 32 como a proteína quinase K (PKC) e a fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K), que são alvos moleculares importante de moléculas quimiopreventivas (KARIKAS, 2011; SURH, 2003).

Metabólitos secundários de plantas são conhecidos por serem bons agentes quimiopreventivos contra o câncer (ISSA; VOLATE; WARGOVICH, 2006; YANG et al., 2010). Moléculas como resveratrol, epigalocatequina galato (EGCG), 6-gingerol e miricetina já foram descritos para atuarem modulando várias vias de sinais de transdução que culminam na indução de apoptose em células cancerígenas e inibição da proliferação do câncer (LEE; BODE; DONG, 2011). Dados como esses sugerem que a identificação dos mecanismos de ação dessas moléculas, baseados nos alvos moleculares já descritos, torna-se importante para o desenvolvimento de novos fármacos no tratamento do câncer. Por fim, a triagem de novos compostos vegetais promissores que promovam saúde e previnam doenças, faz-se necessário no âmbito de encontrar novas terapias que aliadas as já existentes possam aprimorar o tratamento de doenças, como o câncer. Baseado no que foi exposto até então, e tendo em vista a escassez de trabalhos científicos que deêm subsídeo a utilização da espécie Plukenetia volubilis na medicina popular e na alimentação, principalmente entre os nativos da região Amazônica, este trabalho tem como objetivo um estudo de prospecção dos constituintes químicos e das possíveis atividades farmacológicas desempenhadas por essa espécie.

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2. OBJETIVOS

2.1. GERAL

O presente trabalho tem como objetivo verificar as atividades antioxidante e antiproliferativa de diferentes extratos obtidos a partir das folhas de Plukenetia volubilis.

2.2. ESPECÍFICOS

 Obter os extratos de folhas da planta Plukenetia volubilis utilizando diferentes solventes de caráter polar e apolar;  Realizar uma triagem fitoquímica das folhas de Plukenetia volubilis por meio de reações químicas de identificação e Cromatografia em Camada Delgada (CCD);  Determinar o teor de açúcares, proteínas e compostos fenólicos;  Analisar o potencial antioxidante dos extratos, utilizando os seguintes testes: Capacidade antioxidante total (CAT), sequestro do radical hidroxila, quelação de íons metais, sequestro de íons superóxido, poder redutor e sequestro do radical DPPH;  Verificar a atividade antiproliferativa dos extratos por meio do ensaio MTT;  Analisar a morfologia de células HeLa tratadas com extratos de Plukenetia volubilis;  Avaliar células HeLa na presença dos extratos com o intuito de caracterizar morte celular via necrose e/ou apoptose, utilizando citometria de fluxo.

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3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. MATERIAL VEGETAL

A espécie Plukenetia volubilis (Figura 3) foi cultivada em vasos contendo terra vegetal e areia (1:1, p/p). Deste material foram coletadas as folhas frescas de plantas com cinco-seis meses de cultivo para preparação dos extratos. Uma amostra do material foi indentificada pelo botânico Dr. Jomar Jardim e depositada no herbário da Universidade Federal do Rio Grande do Nortecom o número 10854. A espécie foi cultivada na cidade de Parnamirim/RN (-05° 47 '42'' 35° 12'34'').

Figura 3. Plukenetia volubilis sob condições de cultivo.

3.2. TRIAGEM FITOQUÍMICA

3.2.1. Reações de identificação

As reações de identificação para triagem fitoquímica foram realizadas por métodos clássicos, segundo Wagner et al.(1996); Matos(1997); Simões, (2004); Zucolotto e Brandt (2011). Os resultados foram observados por meio do desenvolvimento de coloração, formação de precipitado e formação de espuma. Os metabólitos secundários investigados foram: compostos fenólicos, flavonóides, taninos, saponinas e alcalóides.

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Para detecção de compostos fenólicos e flavonoides foram pesados 5 gramas de folhas frescas de Plukentia volubilis e adicionado 50 mL de etanol 70%. O extrato foi aquecido em chapa aquecedora e após atingir fervura foi deixado sob aquecimento por 10 minutos. Posteriormente o extrato foi filtrado e utilizado para as reações de indetificação.

3.2.1.1. Pesquisa de Compostos fenólicos

Uma alíquota de 2 mL do extrato alcoólico foi transferida para um tubo de ensaio, ao qual foram adicionadas 2 gotas de solução etanólica de cloreto férrico a 2,5%. O cloreto férrico atua como agente oxidante, oxidando as hidroxilas fenólicas e resultando em substâncias coradas (ZUCOLOTTO; BRANDT, 2011).

3.2.1.2. Pesquisa de Flavonoides

A presença de flavonóides foi analisada por meio da reação de Schinoda ou Cianidina. Assim, o extrato etanólico (2 mL) foi transferido para uma cápsula de porcelana e evaporado a extrato seco em banho-maria (50 °C). Posteriormente, foram adicionados 0,2 mL de clorofórmio para eliminação da clorofila e o resíduo foi redissolvido em 1 mL de etanol 70%. O extrato foi então transferido para um tubo de ensaio e 1 mL de HCL concentrado foi adicionado e em seguida adicionou-se 200 mg de magnésio em pó. A reação foi identificada através do desenvolvimento de coloração laranja a vermelha caracterizando assim a presença de compostos contendo um núcleo α- benzopirona (ZUCOLOTTO; BRANDT, 2011).

3.2.1.3. Pesquisa de Taninos

Para identificação do metabólito tanino foi preparado um extrato aquoso das folhas de Plukenetia volubilis por decocção. A reação para detecção de taninos baseia-se na sua característica em precipitar proteínas formando complexos irreversíveis ou reversíveis (ZUCOLOTTO; BRANDT, 2011). Desta maneira, o extrato aquoso (2 mL) foi transferido para um tubo de ensaio e adicionado uma solução de gelatina a 2,5%. A presença de taninos foi verificada através da formação de um precipitado na presença da gelatina.

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3.2.1.4. Pesquisa de Saponinas

A presença de saponinas foi analisada utilizando extrato aquoso das folhas de Plukenetia volubilis. Para a reação de identificação, 2 mL do extrato foi transferido para um tubo de ensaio e adicionado 4 mL de água destilada. O tubo foi agitado verticalmente e vigorosamente durante 1 minuto. Após agitação, foi observado o aparecimento de espuma persistente. O teste de formação de espuma se baseia nas características físico-químicas do metabólito tanino, que apresenta a propriedade de diminuição da tensão superficial e formação de espuma persistente (ZUCOLOTTO; BRANDT, 2011).

3.2.1.5. Pesquisa de Alcalóides

Para pesquisa de alcaloides 2 gramas de folhas de Plukenetia volubilis foram pesadas e adicionado 20 mL de ácido sulfúrico 10%. O extrato foi aquecido em uma chapa aquecedora e deixado sob fervura por 5 minutos. Após resfriamento o extrato foi filtrado e misturado em uma placa de vidro duas gotas para cada um dos reagentes utilizados, que foram: Hager, Bertrand, Mayer, Wagner e Drangedorff. As reações positivas possibilitam observar a formação de precipitado amarelo, branco e alaranjado, devido a característicados alcaloides de insolubilidadepor apresentarem conjugados na forma de sal com ácidos orgânicos e aminas livres (ZUCOLOTTO; BRANDT, 2011).

3.3. PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS

Para a preparação dos diferentes extratos foram utilizadas 300 gramas de folhas frescas (dados prévios obtidos pelo grupo indicaram que folhas frescas apresentam melhor resultado quanto a atividade antioxidante e teor de compostos fenólicos quando comparados com as folhas secas) que foram trituradas manualmente e divididas em parte iguais para extração dos compostos com diferentes solventes de caráter polar e apolar, seguindo a proporção de 1:10 (p/v). Os solventes utilizados foram: metanol (MeOH), etanol (EtOH), clorofórmio, hexano, e água.

Estes materiais foram transferidos para erlenmeyers e posteriormente foi adicionado cada solvente, com isso o material foi submetido à agitação em

Ana Karina de Lima Nascimento Página 37 mesa agitadora a 50 rpm por aproximadamente 24h. Em seguida os extratos foram filtrados, em papel filtro whatman nº 1 e colocados para secar em rotavapor a 40 °C. Os extratos obtidos foram pesados e ressuspendidos em DMSO (Dimetilsufóxido) (CRQ/Nuclear) para uma concentração final de 10 mg/mL, solução estoque, e posteriormente foram submetidos as diferentes análises (Figura 4).

Figura 4: Esquema representativo das análises realizadas com os extratos de Plukenetia volubilis. Os extratos foram submetidos a análises químicas e biológicas.

EXTRATOS

ANÁLISES ATIVIDADES QUÍMICAS BIOLÓGICAS

DOSAGENS: ÁÇÚCAR CCD’s PROTEÍNAS ANTIOXIDANTE ANTIPROLIFERATIVA COMPOSTOS FENÓLICOS

3.4. ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

A análise por CCD foi realizada usando como adsorvente cromatoplacas de alumínio de gel de sílica 60 F254. Como fases móveis foram escolhidas sistemas eluentes específicos, de acordo com os metabólitos secundários de interesse, sendo adaptados de acordo com o resultado obtido. O volume de extratos depositados em cada ponto da placa foram os mesmos para cada análise.

Foram selecionadasas seguintes fases móveis, Sistema I: acetato de etila (AcOEt):Ácido fórmico:Água:MeOH (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v), Sistema

II:tolueno:AcOEt:MeOH (5:5:0,5, v/v/v) e Sistema III: Diclorometano (CH2Cl2): MeOH (9:1, v/v). Após desenvolvimento da cromatografia com as duas fases móveis, a CCD foi analisada primeirantena luz UV no comprimento de onda de 254 nm.

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Neste processo foram utilizados quatro tipo de reveladores: Vanilina Sulfúrica, como revelador universal; Cloreto Férrico para a detecção de compostos fenólicos; Reagente Natural A 0,5 % (difenilboriloxietilamina), específico para flavonóides, observação sob luz ultravioleta em 254 nm e 366 nm; e Reagente de Drangendorf, para pesquisa de alcaloides.

A análise por CCD foi realizada usando como padrões amostras autênticas de canferol, apigenina, isorientina, luteolina e quercetina (Sigma®). Esses experimentos foram realizados no laboratório da Prof. Dr. Silvana Zucolotto, no departamento de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

3.5. COMPOSIÇÃO QUÍMICA

3.5.1. Dosagem de Açúcares totais

Os açúcares totais foram estimados pelo método do fenol/ácido súlfurico, usando galactose como padrão, sendo as leituras realizadas a 490 nm (DUBOIS et al., 1956).

3.5.2. Dosagem de Proteínas

O teor total de proteínas foi estimado pelo método de Bradford, utilizando a proteína albumina de soro bovino (Sigma) como padrão. As leituras foram realizadas a 595 nm (BRADFORD, 1976).

3.5.3. Dosagem de Compostos Fenólicos totais

A dosagem de fenólicos totais foi realizada através do método de Folin- Ciocalteau (ATHUKORALA; KIM; JEON, 2006). Foram utilizadas curvas padrão, preparadas utilizando ácido gálico. As leituras foram realizadas a 760 nm e os fenólicos totais foram relatados em mg equivalentes de ácido gálico por grama de tecido.

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3.6. ATIVIDADES BIOLÓGICAS

3.6.1. Atividade Antioxidante

3.6.1.1. Determinação da atividade antioxidante total (CAT)

O ensaio é baseado na redução de Molibdênio+6 para Molibdênio+5 pelos extratos de Plukenetia volubilis e subsequente formação de um complexo verde fosfato / Mo+5 em pH ácido (PRIETO, PINEDA, AGUILAR, 1999). Os tubos contendo os extratos nas concentrações de 100 e 250 µg/mL e a solução reagente (Ácido sulfúrico 0,6 M, fosfato de sódio 28 mM e molibdato de amônio 4 mM) foram incubados a 95 °C por 90 min. Após o resfriamento dos tubos a temperatura ambiente, foi realizada leitura a absorbância de 695nm no espectofotômetro (FEMTO) e os resultados comparados com um branco. A capacidade antioxidante foi expressa em equivalentes de ácido ascórbico (EEA/g).

3.6.1.2. Atividade sequestradora de radical hidroxila

A atividade sequestradora de radical hidroxila foi investigada através 2 + 3 - ∙ da reação de Fenton (Fe +H2O2→Fe ++ OH + OH ). Os resultados são expressos como porcentagem de inibição. Os extratos nas concentrações de 100 µg/mL e 250 µg/mL foram adicionados em 3mL de tampão fosfato

(150 mM pH 7,4) e incubados com FeSO4.7H2O (10mM), saliciliato de sódio (2mM) e H2O2 (200 µL) a 37 °C por 1h. A reação foi detectada por monitoramento da absorbância a 510 nm. Os resultados foram comparados com um branco que foi preparado substituindo-se o H2O2 por tampão fosfato.

3.6.1.3. Atividade de quelação de íons metais

A capacidade de quelação de íons ferrosos pelos extratos de Plukenetia volubilis foi investigada de acordo com métodos anteriormente descritos (DECKER; WELCH, 1990) com algumas modificações (WANG et al., 2008). Resumidamente, a solução contendo os extratos nas concentrações de 100 e 250 µg/mL e os reagentes FeCl2 (0,05 mL, 2 mM) e ferrozina (0,2 mL, 5 mM), foi agitada e incubada por 10 min em temperatura ambiente. A absorbância da mistura foi medida a 562 nm e

Ana Karina de Lima Nascimento Página 40 os resultados comparados com um branco. A capacidade da amostra teste em quelar o íon ferroso foi calculada de acordo com a seguinte equação:

Habilidade de quelação (%) = ((A0– A1)/A0) x 100

Onde: A0 e A1 representam soluções com e sem a amostra teste, respectivamente.

3.6.1.4. Teste do sequestro de íons superóxido

O ensaio é baseado na capacidade dos extratos em inibir a redução fotoquímica do tetrazólio (NBT) no sistema de riboflavina-luz-NBT (DASGUPTA; DE, 2004). Onde, para cada 3 mL da solução reagente contendo tampão fosfato 50 mM (pH 7,8), metionina 13 mM, riboflavina 2 µM, EDTA 100µM e NBT 75 µM foram adicionados a solução de 1 mL dosextratos nas concentrações de 100 e 250 µg/mL. A produção do azul de formazana foi verificada pelo monitoramento através da absorbância a 560 nm após 10 minutos de iluminação com lâmpada fluorescente. Toda reação foi realizadadentro de câmara dissipadora de luz. Para o branco, foram utilizados tubos idênticos contendo os reagentes que foram mantidos no escuro.

3.6.1.5. Teste do Poder Redutor

O poder redutor das amostras foi quantificado conforme métodos anteriormente descritos (ATHUKORALA; KIM; JEON, 2006; WANG et al., 2008). Resumidamente, 4 mL da solução contendo diferentes concentrações dos extratos (100 e 250 µg/mL) em tampão fosfato (0,2 M, pH 6,6), foi incubado com ferricianeto de potássio (1%) a 50 °C por 20 min. A reação foi finalizada pela adiçãoda solução de ácido tricloroacético (TCA) a 10%. A solução foi, então, misturada com água destilada e cloreto férrico (0,1% w/v) e a absorbância foi medida em espectrofotômetro a 700 nm.

3.6.1.6. Atividade sequestradora de radicais livres DPPH

A atividade sequestradora do radical DPPH foi avaliada de acordo com o método de Shimada et al.(1992), com algumas modificações.

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Resumidamente, aos extratos na concentração final de 100 e 250 µg/mL, foi acrescentado 1,5 mL de metanol e posteriormente adicionado 1 mL da solução metanólica de DPPH (Fluka) a 0,1 mM. Em seguida, a absorbância foi medida em 517 nm. A atividade de sequestro do radical (%) foi calculada pela seguinte equação:

Atividade sequestradora (%) = (1 - A1/A0) x 100%

Onde A0 é a absorbância do controle, e A1 é a absorbância das amostras.

3.6.2. Atividade antiproliferativa

3.6.2.1. Teste de Viabilidade Celular – MTT

Foi analisada a capacidade de células tratadas com extratos de Plukenetia volubilis em reduzir o composto MTT (brometo de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) a sais de formazan, a redução é realizada por desidrogenases mitocondriais de células com mitocôndrias íntegras. A redução do composto MTT a formazan foi verificada por espectrofotometria e foi considerada diretamente proporcional a atividade mitocondrial e viabilidade celular. As células de linhagens cancerígenas HeLa e A549, câncer de cólo de útero e pulmão, respectivamente e células não tumorais, fibroblastos 3T3, células de ovério de hamster CHO e macrófagos Raw foram cultivadas em frascos de 75 cm2 com 7 mL meio de cultura Eagle modificado Dulbecco (DMEM). Para o ensaio, as células foram colocadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 x 103 células/poço e permitido aderir overnight em 200 µL do meio, sob incubação a 37 °C e 5% de CO2. Depois desse período, os extratos foram adicionados em diferentes concentrações, que foram padronizadas de acordo com as utilizadas nos testes antioxidantes (100, 250 µg/mL) e foi testada uma concentração maior de 500µg/mL, a fim de verificar se os extratos apresentavam citotoxicidade com aumento da concentração, por períodos de 24, 48 e 72 horas. Após a incubação, os extratos foram removidos e posteriormente foi aplicado o reagente MTT (5mg/mL) (Sigma-M5655) em meio fresco DMEM.As células foram então incubadas por 4 horas a 37 °C e 5% de CO2. Para solubilizar os cristais de formazano, foi adcionado 200 µL de álcool etílico absoluto em cada poço e

Ana Karina de Lima Nascimento Página 42 cuidadosamente misturado, após 15 minutos de agitação em mesa agitadora a absorbância foi lida 562 nm usando o leitor de ELISA (Biotec µQuant). Como controle foram utilizados células tumorais e normais não tratadas, sendo cultivadas somente na presença do meio DMEM, o valor obtido com o controle foi considerado como 100% de proliferação. A porcentagem de proliferação celular foi calculada pela seguinte fórmula:

% de proliferação celular = Abs. da amostra 570 nm x 100 Abs. do controle 570 nm

3.6.2.2. Análise morfológica das células

Para visualização das alterações morfológicas de núcleo celular foi realizado o método de coloração DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol)descrito por Rabelo et al. (2012). Células HeLa foram plaqueadas em lâminas circulares em placas de 24 poços (35.55 × 104 cels/poço). Após 45 min a 37° C, meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino foi adicionado numa atmosfera humidificada com 5% de CO2, para um volume final de 1mL por 24 h. Decorrido este tempo, o meio foi removido e as células foram mantidas em meio sem soro por mais 24h. O tratamento foi realizado durante 48 h com 250 µg/mL dos extratos (o tempo e a concentração foram determinados de acordo com os resultados do ensaio MTT). Após o tratamento, as células foram lavadas com tampão fosfato gelado (PBS), fixadas com paraformaldeído a 4% durante 20 minutos e permeabilizadas com triton 0,1% por cerca de 20 minutos. Subsequentemente, as células foram novamente lavadas com PBS e incubadas com DAPI a uma concentração de 1 mg/mL durante 30 min, protegida da luz e a temperatura ambiente. As células foram visualizadas por microscopia de fluorescência (microscópio de fluorescência Olympus BX41), utilizando os filtros de fluorescência de 330-380 nm.

3.6.2.3. Citometria de fluxo

Células HeLa foram crescidas em placa de 6 poços a uma densidade de 2 x 105 células/mL. Para detecção de células em estágio de morte celular, foi utilizado o Kit da Invitrogen (Catalog No. V13242) para citometria de fluxo. As células foram tratadas com 250 µg/mL dos extratos, por um período de 24h (tratamento determinado de acordo com os resultados do ensaio MTT). Após a

Ana Karina de Lima Nascimento Página 43 exposição, células HeLa foram tratadas com tripsina, coletadas e lavadas com PBS gelado. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em 200 µL de tampão de ligação 1X. Foram adicionados 5 µL de anexina V- FITC e 1 µL de solução iodeto de propídeo (PI) em 100 µL de suspensão de células. As células foram incubadas por 15 minutos, a temperatura ambiente e mantidas sob proteção de luz. Após o período de incubação, 400 µL de tampão de ligação para anexina V 1X foi adicionado às células, que foram analisadas por Citometria de fluxo (Flow cytometer FASCANTO II, BD Biosciences).A emissão de fluorescência foi medida a 530 e 575 nm, para anexina V e PI, respectivamente. Para análise dos dados foi utilizado software FlowJo.

3.7. Análise Estatística

As análises estatísticasforam realizadaspelo teste ANOVA usando o programa Graphpad Prisma 5 (GraphPad Software Inc., San Diego,CA, EUA).Teste de Tukeypós-testefoi realizadopara comparar os grupos diferentes. Diferenças foram consideradas significativas quando o valor de p foi inferior a 0,05.

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4 RESULTADOS

4.1 TRIAGEM FITOQUÍMICA 4.1.1 Reações químicas de identificação

Como pode ser observado na tabela 1, foi detectada a presença de compostos fenólicos, flavonoides, saponinas e alcaloides nas folhas de Plukenetia volubilis. Somente o teste para detecção de taninos apresentou resultado negativo.

Tabela 1. Resultado das reações químicas de identificação.

Metabólitos secundários Resultado Fenóis + Flavonóides + Saponinas + Taninos - Alcalóides +

As figuras de 5 a 9 ilustram o resultado da triagem fitoquímica por reações de identificação. Cabe salientar, que a triagem fitoquímica foi realizada para avaliar a presença dos metabólitos secundários nas folhas de Plukenetia volubilis e não nos diferentes tipos de extratos obtidos.

A figura 5 ilustra o resultado da reação com cloreto férrico para detecção de compostos fenólicos. Como pode ser observado o tubo B que contém o reagente com extrato, apresentou coloração marrom quando comparado como tubo A (controle), sendo, portanto uma evidência da presença de polifenóis.

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Figura 5: Comparação da coloração do extrato alocoólico foliar de Plukenetia volubis com e sem adição de solução de cloreto férrico. Reação positiva (tubo B) em comparação com controle negativo, somente extrato (tubo A).

(A) (B)

Na figura 6 pode ser observado que não houve precipitação na presença de gelatina no tubo B, indicando negatividade para a presença de taninos.

Figura 6: Comparação da coloração do extrato aquosofoliar de Plukenetia volubis com e sem adição de gelatina. Reação negativa (tubo B) em comparação com controle negativo, o extrato (tubo A).

(A) (B)

A figura 7 demonstra resultado positivo para a presença de saponinas, este metabólico foi detectado através da formação de uma espuma abundante e persistente (tubo A).

Figura 7: Resultado do teste de espuma com extrato aquoso foliar de Plukenetia volubilis. Indicativo de presença de saponinas.

(A)

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A reação para verificação de flavonóides é ilustrada na figura 8, na qual se observa uma mudança de coloração entre o controle negativo (tubo B) e o tubo contendo reagente e extrato, indicando a presença do metabólito (tubo A).

Figura 8: Comparação da coloração do extrato alcoólicofoliar de Plukenetia volubis com e sem adição de HCL e magnésio. Reação positiva (tubo A) em comparação com controle negativo, somente extrato (tubo B).

(A) (B)

Na figura 9 estão representadas as reações de precipitação para identificação de alcalóides, onde foi observada a formação de grânulos e precipitados insolúveis, indicando a provável presença de compostos alcaloídicos, que precisa ser confirmada por meio da análise de CCD.

Figura 9: Comparação da coloração do extrato com ácido sulfurico foliar de Plukenetia volubis com e sem adição dos reagentes. Da esquerda para direita: Hager, Bertrand, Mayer, Wagner e Dragendorff.

4.2 ANÁLISES POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

Devido à ocorrência de poucos estudos químicos a respeito da espécie P. volubilis, foi realizada uma triagem dos seus extratos por CCD com diferentes sistemas de solventes (fases móveis) e reveladores, a fim de identificar as classes de compostos presentes na mesma.

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A observação de manchas escuras sob o fundo clarona luz UV a 254 nm indica a presença de substâncias com cromóforos (sistemas conjugados). Como pode serobservado na figura 10a(bandas em destaque), os extratos EM e EE apresentaram bandas para a presença destes sistemas conjugados quando desenvolvidos no Sistema I. Na figura 10b observa-se o extrato EH e o EA também apresentaram bandas características de grupamentos cromóforos quando eluídos no Sistema II (Figura 10b). Com o intutito de caracterizar os metabólitos presentes, foram utilizados diferentes reveladores. Figura 10: CCD dos extratos obtidos das folhas da espécie Plukenetia volubilis. (A) Sistema I: AcOEt:ácido fórmico:água:MeOH (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v) e (B) Sistema II:tolueno:AcOEt:MeOH (5:5:0,5, v/v/v). UV 254 nm.

A partir da visualização da figura 11 foi observado que todas as frações apresentaram bandas de coloração azuis-violeta, sugerindo a presença de terpenos (em destaque em vermelho). Na figura 11a, (Sistema II), observa-se a presença de bandas de coloração violeta e amarelo-marrom, sugerindo a presença de terpenos e saponinas, respectivamente. O extrato EM foi o que apresentou maior diversidade de compostos (aproximadamente 7 bandas). A banda 1, uma das mais polares do extrato, de coloração violeta e Rf 0,2, também foi observada nos extratos EM, EE e EC, sugerindo ser um dos compostos majoritários do extrato, devido a intensidade apresentada. Pode-se observar ainda uma banda bastante intensa de cor amarelo-amarronzada no ponto de aplicação, sugerindo que há uma concentração de compostos com

Ana Karina de Lima Nascimento Página 48 características mais polares. Por isso, foi realizadaoutra análise utilizando o Sistema I (figura 11b).

Na figura 11b (Sistema I), pode-se ainda visualizar, além das bandas de coloração violeta e amarelo-amarronzada, bandas de coloração amarela (3) nos extratos EM e EE, características de saponinas (Rf 0,61). Assim como na figura 11a, o extrato EM foi o mais rico em compostos (6 compostos). Posteriormente, ainda sugere-se que o composto 4 (Rf 0,86) na figura 11b, seja o mesmo composto 1 da figura 11a.

Figura 11: CCD das frações resultantes da extração das folhas da espécie Plukenetia volubilis. (A) Sistema II:tolueno:AcOEt:MeOH (5:5:0,5, v/v/v) e (B) Sistema I: AcOEt:ácido fórmico:0água:MeOH (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v). Revelação: Vanilina Sulfúrica. Visualização: visível.

Na figura 12 pode ser visualizada a presença de bandas de coloração marrom (destacadas em vermelho), sugerindo-se a presença de compostos fenólicos.

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Figura 12: CCD dos extratos obtidos das folhas da espécie Plukenetia volubilis. (A) Sistema II: tolueno:AcOEt:MeOH (5:5:0,5, v/v/v) e (B) Sistema II: AcOEt:ácido fórmico:água:MeOH (10:0,5:0,6:0,2,v/v/v/v). Revelação: Cloreto Férrico. Visualização: visível.

Pode-se observar a presença marcante de bandas características de flavonoides nos extratos analisados (tanto utilizando o Sistema II -13a - quanto no Sistema I - 13b), sugerindo quea espécie possuitanto flavonoides de caráter mais apolar quanto flavonoides glicosilados (ligados a uma ou mais moléculas de açúcar). Na figura 13 a e b ainda é possível perceber que os flavonoides foram observados nos extratos mais polares (EM, EE e EA). As bandas destacadas em vermelho (Rf de 1 – 0,11; 2 – 0,12 e 3 – 0,64) parecem tratar- se de compostos majoritários, devido a intensidade das manchas(Figura 13). Na figura 13a, no extrato EA foi observado que a maioria das bandas apresenta coloração azul fluorescente (circulados em azul).

Foi observado que o extrato EM possui algumas bandas características de flavonoides de menor polaridade, de acordo com o sistema eluente utilizado (Figura 13). Por este motivo, foi realizada uma análise utilizando diferentes padrões (canferol, apigenina, crisina 6,8-di-C-glicosídeo, luteolina) (Figura 14).

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Figura 13: CCD dos extratos obtidos das folhas da espécie Plukenetia volubilis. (A) Sistema II:tolueno:AcOEt:MeOH (5:5:0,5, v/v/v) e (B) Sistema II: AcOEt:ácido fórmico:água:MeOH (10:0,5:0,6:0,2, v/v/v/v/v). Revelação: Reagente Natural A 0,5 %. Visualização: UV 365 nm.

De acordo com a CCD apresentada na figura 14, o extrato EM apresentou uma banda de coloração verde fluorescente e Rf 0,65, similar às características apresentadas pelo padrão docanferol.

Figura 14: CCD do extrado MeOH da espécie Plukenetia volubilis em comparação com as agliconas flavonoídicas canferol, apigenina, crisina 6-8-di-C-glicosídeo e luteolina.Sistema II:tolueno:AcOEt:MeOH (5:5:0,5, v/v/v) Revelação: Reagente Natual A 0,5%. Visualização: UV 365nm.

Desta forma, pelas características de coloração e Rf apresentados, sugere-se a presença de canferol no extrato EM na espécie Plukenetia

Ana Karina de Lima Nascimento Página 51 volubilis. A comparação por CCD entre o extrato EM e o padrão canferol pode ser observada na figura 15.

Figura 15: CCD do extrado MeOH da espécie Plukenetia volubilis em comparação com o padrão canferol. Fase Móvel Tolueno:AcOEt:MeOH (5:5:0,5) Revelação: Reagente Natual A 0,5%. Visualização: UV 365nm.

Como pode ser visualizado na figura 16, não houve detecção de bandas na revelação com reagente de Drangendorff, portanto não foi verificada a presença de alcalóides em nenhum dos extratos com essa fase móvel. Em contraste com o que foi obtido nas reações de identificação de alcalóides, que foram positivas (Figura 9). Isso pode ser explicado, pelo fato de queas reações de triagem clássicas são inespecíficas, podendo ocasionar falsos positivos.

Figura 16: CCD dos extratos obtidos das folhas da espécie Plukenetia volubilis. (A) Sistema III: CH2Cl2:MeOH (9:1, v/v). Revelação: Drangendorff. Visualização: (A) Visível e (B) UV 365 nm.

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A tabela 2 resume os metabólitos que foram analisados por CCD nesta pesquisa e os resultados que foram encontrados.

Tabela 2: Resultado das análises por CCD de extratos de P. volubilis.

Metabólitos secundários Resultado Terpenos + Saponinas + Polifenóis + Flavonoides + Alcaloides -

4.3 COMPOSIÇÃO QUÍMICA

Outra análise realizada com os diferentes extratos obtidos das folhas frescas de P.volubilis foi uma porcentagem relativa para três constituintes químicos dosados: açúcar, proteínas e compostos fenólicos (Tabela 3). Foi observada uma quantidade elevada de açucares quando comparado com os demais compostos. O extrato etanólico (EE), por exemplo, apresentou em sua composição uma concentração de açúcares dezoito vezes maior que a de compostos fenólicos. Seguido dos extratos metanólico (EM) e aquoso (EA) que mostraram 92,88% e 91,49% de açúcar em sua composição, respectivamente. O conteúdo de proteínas de todos os extratos foram inferiores a 5% (Tabela 3) E em relação aos compostos fenólicos a maior concentração encontrada foi no extrato clorofórmico (EC), com 10,8%, seguido pelos extratos hexano com 9,46 % e pelo aquoso com 8,02 % da sua composição. Os outros dois extratos ficaram com a proporção de 5,34 % (EE) e 6,08% (EM), respectivamente. É importante salientar que existem outros constituintes na composição dos extratos que não foram dosados neste trabalho, portanto essa taxa percentual foi determinada levando em consideração apenas os três compostos mencionados.

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Tabela 3: Porcentagem relativa dos compostos químicos dosados com os extratos de Plukenetia volubilis.

Extratos Compostos Fenólicos Áçúcares (%) Proteínas (%) Porcentagem (%) relativa (%) EA 8,02 91,49 0,49 100 EM 6,08 92,88 1,04 100 EE 5,34 93,44 1,23 100 EC 10,85 84,17 4,98 100 EH 9,46 86,94 3,60 100

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5 DISCUSSÃO

A busca por compostos de origem natural para desenvolvimento de novos fármacos tem aumentado significativamente nos últimos anos (ITOKAWA, 2008; JI; LI; ZHANG, 2009). No trabalho aqui apresentado, foi analisada a composição química, atividades antioxidantes e antiproliferativa de cinco extratos obtidos das folhas da planta Plukenetia volubilis.

As Euphorbiaceaes compreendem espécies vegetais com ampla diversidade química. Compostos como alcaloides, terpenos, fenólicos, flavonoides e taninos tem sido identificados e isolados a partir de várias espécies de Euphorbiaceae, bem como suas atividades biológicas têm sido caracterizadas (KOTHALE; ROTHE; PAWADE, 2011; SHI, 2008). As reações de identificação realizadas neste trabalho mostraram-se positivas para a presença da maioria dos compostos avaliados, dos cinco metabólitos secundários que foram testados apenas a classe de taninos não foi detectada nas folhas de P.volubilis, estando presentes compostos fenólicos, flavonoides, alcaloides e saponinas. Dados semelhantes aos apresentados nesta pesquisa foram encontrados em triagem fitoquímica da espécie de mesmo gênero, Plukenetia conophora (sinônimia Tetracarpidium conophorum (Mull. Arg) Hutch; Dalziel) que indicou a presença de flavonoides, compostos fenólicos e alcaloides em suas folhas (ALADEOKIN; UMUKORO, 2011; AMAEZE et al., 2011). Saavedra et al. (2010) ao realizar testes de triagem fitoquímica com folhas de Plukenetia volubilis encontrou a presença de taninos, flavonoides e antocianinas, o mesmo afirmou que seus extratos de folhas não apresentaram esteroides nem alcaloides. Esse resultado contraditório quanto à presença de taninos pode ser explicado a partir de alguns fatores que contribuem para o perfil fitoquímico dentro da mesma espécie vegetal, tais como: modo de preparo dos extratos, estágio de desenvolvimento da planta, período de coleta do material, local de cultivo entre outros (BAGNOITÈ, 2012; VASCONSUELO, 2003; VASCONSUELO; BOLAND, 2007). Sendo assim, tais fatores podem explicar a presença de taninos em folhas de P. volubilis nas análises de Saavedra et al. (2010), enquantonas análises da presente pesquisa não foi detectada essa classe de metabólito (POUTARAUD; GIRARDIN, 2005;

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BAGDONAITÈ et al., 2012). Além disso, no estudo de Saavedra e colaboradores (2010) foi realizado apenas experimentos de triagem fitoquímica clássica, o que torna o resultado de menor confiabilidade, pois essas reações não são específicas, dando margem para o surgimento de falsos positivos. Enquanto que no presente trabalho, foi também realizada a análise por cromatografia de camada delgada (CCD), que confere maior especificidade dos resultados, na qual se observou a presença de compostos fenólicos, flavonoides e saponinas, corroborando com os resultados observados nas reações químicas de identificação, no entanto, não foi observada a presença de alcaloides, resultado contraditório aos das reações de triagem. Sendo a metodologia de CCD uma técnica mais sensível pode-se concluir a ausência de alcaloides nas folhas de P. volubilis.

As análises de CCD permitiram observar nos extratos EM, EE, EH e EA a presença de bandas características de substâncias com sistemas conjugados (cromóforos) compostos que absorvem radiação UV e tornam-se fluorescentes (WAGNER; BLADT; 1996). De acordo com Wagner e Bladt (1996) esses compostos podem ser antraglicosideos, arbutina, cumarina, flavonoides, propilfenóis em óleos essenciais ou alcaloides tipo indólicos, isoquinolínicos, e quinolinícos. A revelação com vanilina sulfúrica, revelador universal, detecta principalmente a presença de compostos amargos (que possuem estrutura de terpenos), saponinas e compostos de óleos essenciais. Os compostos amargos apresentam zonas vermelho-marrom, amarelo-marrom ou verde escura, azul, azul-violeta e amarelada. As saponinas apresentam coloração azul, azul- violeta, e, algumas vezes, vermelho ou amarelo-marrom. Os óleos essenciais apresentam coloração azul, marrom ou vermelha (WAGNER; BLADT 1996). Neste trabalho foram observadas bandas de coloração azul-violeta e amarelo- marrom, sugerindo a presença de compostos terpenos e saponinas. A presença de bandas coradas de marrom na revelação com cloreto férrico são característicasda presença de compostos fenólicos (WAGNER; BLADT, 1996). Na presente pesquisa foi observado bandas de coloração marrom nos extratos EM, EE e EA, sugerindo que esses extratos apresentam compostos fenólicos em sua constituição. O Reagente Natural A 0,5% é um revelador específico para flavonoides. Após revelação com esse reagente e observação sob luz UV 365 nm, os flavonoides apresentam zonas fluorescentes de intensidade

Ana Karina de Lima Nascimento Página 56 amarela, laranja e verde (WAGNER; BLADT, 1996). Neste trabalho foram verificadas bandas de intensidade verde nos extratos EM, EE e EA, indicando a presença do composto fenólico flavonoide.

Os compostos fenólicos são amplamente distribuídos no reino vegetal, sendo o grupo de metabólitos secundários mais abundantes nas plantas. Eles são caracterizados quanto sua estrutura por possuírem um ou mais anéis aromáticos com substituições de um ou mais grupos hidroxilas. De acordo com sua estrutura química os compostos fenólicos são classificados como: ácidos fenólicos, flavonoides, taninos e lignanas. Nas plantas eles são responsáveis por conferir cor e sabor as frutas e vegetais, além de estarem associados a proteção contra estresses, como radiação UV e ataques de patógenos (DAI; MUMPER 2010). Em humanos, os compostos polifenóis atuam desempenhando uma série de atividades biológicas, incluindo antioxidante, antiproliferativa, anti-inflamatória, antimutagênico, entre outras (D’ARCHIVIO et al., 2007; MANACH et al., 2004; MATKOWSKI; WOLNIAK, 2005; SINGH; BHAT; SINGH 2003). A presença de compostos fenólicos nos extratos de P. volubilis corrobora com dados obtidos a partir de outros estudos com a espécie do mesmo gênero Plukentia conophora (AYOOLA et al., 2011).Os extratos de folhas de Plukentia conophora apresentaram em sua composição quantidades de compostos fenólicos que variaram entre 3,5 a 14,4 mg de equivalentes em ácido gálico por grama do material vegetal (AMAEZE et al., 2011). Em outro estudo com raízes da mesma espécie foi observado um teor de fenólicos de 0.215 mg/g (AYOOLA et al., 2011). Enquanto que na presente pesquisa os extratos de folhas de P. volubilisapresentaram valores maiores para composição de compostos fenólicos, variandode 13,1 a 18,6 mg de equivalentes de ácido gálico por grama da planta. Dentre os polifenóis, os flavonoides são considerados os metabólitos secundários mais abundantes da dieta, sua ingestão está associada a diminuição do risco de doenças crônicas, como vários tipos de cânceres (AMAEZE et al., 2011; HEIM et al., 2002; WOLFE; LIU, 2008). Diversas atividades biológicas são atribuídas aos flavonoides, como antioxidante, anti- inflamatória, antimutagênica, efeitos cardioprotetores e inibição de células cancerígenas (HEIM et al., 2002). Nos extratos analisados neste trabalho, foi detectada a presença de flavonoides nas folhas e nos extratos de P. volubilis

Ana Karina de Lima Nascimento Página 57 verificada através das reações de identificação e das análises por CCD, demonstrando assim o potencial terapêutico desta planta.

A possível presença do flavonoide canferol no extrato metanólico possibilita futuras análises, visando a purificação deste e de outros compostos que possam apresentar atividades biológicas. Canferol tem sido identificado como um importante metabólito que apresenta diversos efeitos benéficos à saúde. Esse metabólito foi isolado do chá verde e sua eficiência na ação antioxidante foi comprovada através do teste de sequestro do radical DPPH, onde o mesmo apresentou um IC50 de 59,2 µM (PARK et al., 2006). Zhu e colaboradores (2011) analisaram a atividade antioxidante de dois canferóis glicosilados extraídos de Camellia oleifera. Os resultados demonstraram valores de IC50 para sequestro de DPPH que variaram entre 0,1012 a 0,0850 mg/mL (ZHU et al., 2011). Canferol também tem sido associado à indução de apoptose em células tumorais, apresentando propriedades anticancerígenas (MARFE et al., 2009). Os resultados apresentados aqui mostraram que os valores de DPPH variaram entre 88% a 66%, para concentração 250 µg/mL, indicando um potencial antioxidante interessante. Dessa forma, a atividade antioxidante obtida pelo teste DPPH pode ser considerada como alta, uma vez que foram utilizadas apenas 250 μg/mL dos extratos de P. volubilis para essa análise. No caso do extrato etanólico de Tuber indicum para atingir uma atividade de cerca de 80% foi utilizada uma concentração de 5 mg/mL (GUO, 2011), com extratos 25 vezes mais concentrados do que os utilizados neste trabalho. Além disso, os extratos metanólico e etanólico da espécie de mesmo gênero Plukenetia conophora apresentaram 50% de sequestro do radical DPPH com concentrações de 62 µg/mL e 69 µ/mL, respectivamente, corroborando com o potencial antioxidante das espécies do gênero em questão (AMAEZE et al., 2011).

As análises químicas dos extratos de P. volubilis mostraram alto conteúdo de compostos fenólicos e açúcares. Os testes estatísticos de correlação de Pearson sugerem que estes compostos podem está agindo em sinergia, tendo em vista que os resultados foram similares para ambos, com valores de p de 0,60 e 0,57 para correlação entre quantidade de compostos fenólicos e sequestro de radical DPPH e teor de açúcares e sequestro de

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DPPH, respectivamente. Outros autores já haviam sugerido esse possível mecanismo de sinergia entre açúcares e compostos fenólicos na ação antioxidante. Peinado (2010) observou que a adição de açúcar aos extratos de uva foi capaz de inibir a oxidação catalisada por ferro do flavonoide catequina, desta forma sugerindo que os açúcares podem também desempenhar atividades antioxidantes relevantes. Além disso, quando se trata da utilização de extratos, onde há uma mistura de diversos compostos, o efeito aditivo e sinérgico entre esses compostos podem conferir uma ação mais eficaz do que compostos isolados (PEINADO, 2010; GUIMARÃES et al., 2010). Outra possível explicação para esta correlação similar é que a atividade antioxidante esteja sendo desempenhada por fenólicos glicosilados (ZHANG et al., 2006; ZHU et al., 2011). Zhang e colaboradores (2006) isolaram dez compostos fenólicos com substituições glicosídicas em diferentes posições, obtidos da casca do caule de Populus davidiana e analisaram suas atividades antioxidantes através do teste de sequestro do radical ABTS+. Alguns dos compostos apresentaram atividade em equivalente a trolox melhor que o BHT, utilizado como controle positivo, corroborando para a eficácia deste metabólito nos benefícios a saúde humana (ZHANG et al., 2006).

Muitos desses efeitos benéficos dos polifenóis são atribuídos a sua capacidade de inibir os danos causados por espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, através de sequestro ou quelação dos radicais livres (HEIM et al., 2002). Atualmente existe uma constante busca por compostos de origem natural que minimizem os danos oxidativo em células e sistemas biológicos (AO et al., 2011; SHAHIDI; ZHONG, 2010). Dentro desse contexto, os extratos de P. volubilis apresentaram resultados interessantes quanto sua capacidade antioxidante.

O estresse oxidativo, causado pelo desequilíbrio entre a formação de espécies reativas e o nível de compostos antioxidantes em organismos vivos, é uma das principais causas de desordens celulares, que culmina no aparecimento de diversas doenças, dentre elas o câncer (ISSA et al., 2006). Desta forma, o desenvolvimento de compostos que previnam o aparecimento ou inibam a proliferação de células cancerígenas já existentes, diminuindo os efeitos adversos causados pelos atuais tratamentos para o câncer, é um dos

Ana Karina de Lima Nascimento Página 59 objetivos de vários grupos de pesquisas científicas. He e colaboradores (2012) relataram que frações de saponinas, metabólito secundário de plantas caracterizado pela presença de um grupo hidrofílico e uma parte lipofílica, que foram obtidos da planta Panax notoginseng são eficazes para inibir a proliferação de células de câncer de colo. Neste estudo foi relatado IC50 de 166,8 e 276,9 µg/mL, frente as linhagens Caco-2 e LoVo, respectivamente. Enquanto que o extrato aquoso do cogumelo Lignosus rhinocerus apresenta atividade antiproliferativa para linhagem A549, com uma concentração de 466.7

µg/mL para IC50 (LEE. M, 2012).

Nos diversos tipos de câncer, o processo normal de apoptose responsável por eliminar células indesejáveis ou que apresentem alterações genéticas, é desregulado, levando ao crescimento descontrolado de células mutadas que são resistentes a tratamentos convencionais como quimioterapia e radioterapia (CALL et al., 2008; HE et al., 2012). Por isso, a busca por novos agentes terapêuticos que atuem induzindo o processo apoptótico de células danificadas têm sido alvo de várias pesquisas. Assim extratos vegetais, bem como substâncias puras isoladas de plantas têm sido analisados nesse aspecto. Estudos com extratos de folhas de Croton lechleri (Euphorbiaceae) mostraram uma taxa de 30% na indução da apoptose inicial em células HeLa (ALONSO-CASTRO et al., 2012). Da Mota e colaboradores (2012) ao investigar os efeitos do extrato etanólico de Synadenium umbellatum (Euphorbiaceae) sobre células EAT verificou que na concentração de 250 µg/mL o extrato foi capaz de aumentar a porcentagem de células marcadas positivamente para anexina e PI (An+/PI+) para 29% e apresentou um número de células em necrose (An-/PI+) de 19,3%. Sendo assim, os resultados apresentados aqui mostram que a espécie Plukenetia volubilis apresenta excelente potencial na busca por novos compostos que possuam ação terapêutica, tendo em vista que seus extratos apresentaram bons resultados antioxidantes, de inibição de células cancerígenas e indução da proliferação de fibroblastos e macrófagos.

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6 CONCLUSÕES

Os dados apresentados nesse trabalho indicam que os extratos de folhas de P. volubilis são eficientes antioxidantes, apresentando possível mecanismo de ação por doação de elétrons e/ou íons H+. Dentro desse contexto, os extratos de P. volubilis se apresentam como potencial promissor para a triagem e purificação de novos compostos com ação farmacológicano tratamento do câncer e atividade cicatrizante.

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REFERÊNCIAS

ABOELSOUD, N. H. Herbal medicine in ancient Egypt. Journal Medicinal Plants Research, v. 4, n. 2, p. 82-86, 2010.

ADETUTU, A.; MORGAN, W. A; CORCORAN, O. Antibacterial, antioxidant and fibroblast growth stimulation activity of crude extracts of Bridelia ferruginea leaf, a wound-healing plant of Nigeria. Journal of Ethnopharmacology, v. 133, n. 1, p. 116-9, 2011.

AKINTAYO, E. T.; BAYER, E. Characterisation and some possible uses of Plukenetia conophora and Adenopus breviflorus seeds and seed oils. Bioresource technology, v. 85, n. 1, p. 95-7, 2002.

ALADEOKIN, A. C.; UMUKORO, S. Psychopharmacological properties of an aqueous extract of Tetracarpidium conophorum Hutch. & Dalziel in mice. Journal of natural medicines, v. 65, n. 3-4, p. 411-416, 2011.

ALONSO-CASTRO, A. J. et al. Antitumor effect of Croton lechleri Mull. Arg. (Euphorbiaceae). Journal of Ethnopharmacology, v. 140, n. 2, p. 438-42, 2012.

ALVIANO, D. S.; ALVIANO, C. S. Plant extracts: search for new alternatives to treat microbial diseases. Current Pharmaceutical Biotechnology, v. 10, n. 1, p. 106-121, 2009.

AMAEZE, O. U. et al. Evaluation of antioxidant activity of Tetracarpidium conophorum (Müll. Arg) Hutch & Dalziel leaves. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, v. 2011, p. 1-7, 2011.

ANDRADE JÚNIOR, D. R. et al. Os radicais livres de oxigênio e as doenças pulmonares. Jornal Brasileiro de Pneumologia, v. 31, n. 1, p. 60-68, 2005.

AO, C. et al. Antioxidant phenolic compounds from Smilax sebeana Miq. LWT - Food Science and Technology, v. 44, n. 7, p. 1681-1686, 2011.

ARUOMA, O.I. Methodological considerations for characterizing potential antioxidant actions of bioactive components in plant foods. Mutation Research, v. 523-524, p. 9-20, 2003.

ATHUKORALA, Y.; KIM, K.-N.; JEON, Y.-J. Antiproliferative and antioxidant properties of an enzymatic hydrolysate from brown alga, Ecklonia cava. Food and Chemical Toxicology : an international journal published for the British Industrial Biological Research Association, v. 44, n. 7, p. 1065-74, 2006.

Ana Karina de Lima Nascimento Página 62

AYOOLA, P. B. et al.Phytochemical and nutrient evaluation of Tetracarpidium conophorum ( Nigerian walnut ) root. IJRRAS, v. 7, n. 2, p. 197-202, 2011.

AYYANAR, M.; IGNACIMUTHU, S. Medicinal plants used by the tribals of Tirunelveli hills , Tamil Nadu to treat poisonous bites and skin diseases. Indian Jpurnal of Traditional Knowledge, v. 4, p. 229-236, 2005.

BACH-ROJECKY, L.; KALODERA, Z.; SAMARZIJA, I. The antidepressant activity of Hypericum perforatum L.measured by two experimental methods on mice. Acta Pharmaceutica. v 54, p. 157–162, 2004.

BAGNOITÈ, E. et al. Variation in concentrations of major bioactive compounds in Hypericum perforatum L . from Lithuania. Industrial Crops and Products, v. 35, p. 302-308, 2012.

BALUNAS, M. J.; KINGHORN, A D. Drug discovery from medicinal plants. Life Sciences, v. 78, n. 5, p. 431-441, 2005.

BORDIGNON, S. R. et al. Propagação in vitro de Sacha inchi. Ciência Rural, v. 42, n. 7, p. 1168-1172, 2012.

BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v. 72, p. 248-54, 1976.

CALIXTO, J.B. Efficacy, safety, quality control, marketing and regulatory guidelines for herbal (Phytotherapeutic agents).Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v.33, n. 2, p 179-189, 2000.

CALL, J. A; ECKHARDT, S. G.; CAMIDGE, D. R. Targeted manipulation of apoptosis in cancer treatment. The Lancet Oncology, v. 9, n. 10, p. 1002-11, 2008.

CARVALHO, A. C. B. et al. Situação do registro de medicamentos fitoterápicos no Brasil.pdf. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 18, n. 2, p. 314-319, 2008.

CÉSPEDES, I. E. I. M. Cultivo de Sacha Incha. Instituto Nacional de Investigación y Extensión Agraria, p. 1-11, 2006.

CORDEIRO, I., SECCO, R. PlukenetiainLista de Espécies da Flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de Janeiro, 2012. (http://floradobrasil.jbrj.gov.br/2012/FB017652).

Ana Karina de Lima Nascimento Página 63

COSTA, L. S. et al. Antioxidant and antiproliferative activities of heterofucans from the seaweed Sargassum filipendula. Marine Drugs, v. 9, n. 6, p. 952-66, 2011.

CRAKER, L. E.; GARDNER, Z. O. Ë. E. Medicinal Plants and tomorrow’s Pharmacy: An American perspective. In: [S.l: s.n.]. p. 29-4, 2006.

CRAVOTTO, G. et al. Phytotherapeutics: an evaluation of the potential of 1000 plants. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics, v. 35, n. 1, p. 11-48, 2010.

CROSS, M. J.; CLAESSON-WELSH, L. FGF and VEGF function in angiogenesis: signalling pathways, biological responses and therapeutic inhibition. Trends in Pharmacological Sciences, v. 22, n. 4, p. 201-207, 2001.

D’ARCHIVIO, M. et al. Polyphenols, dietary sources and bioavailability. Annali dell’Istituto superiore di sanità, v. 43, n. 4, p. 348-361, 2007.

DA MOTA, M. F. et al. Investigation of Ehrlich ascites tumor cell death mechanisms induced by Synadenium umbellatum Pax. Journal of Ethnopharmacology, v. 139, n. 2, p. 319-29, 2012.

DAI, J.; MUMPER, R. J. Plant phenolics: extraction, analysis and their antioxidant and anticancer properties. Molecules, v. 15, n. 10, p. 7313-7352, 2010.

DASGUPTA, N.; DE, B. Antioxidant activity of Piper betle L. leaf extract in vitro. Food Chemistry, v. 88, n. 2, p. 219-224, 2004.

DECKER, E. A. Role of Ferritin as a Lipid Oxidation Catalyst in Muscle Food ? Journal Agricultural and Food Chemistry, n. 1972, p. 674-677, 1990.

DEVASAGAYAM, T. P. A.et al. Free radicals and antioxidants in human health: current status and future prospects. The Journal of the Association of Physicians of India, v. 52, p. 794-804, 2004.

DUBOIS, M. et al. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Analytical Chemistry, v. 28, n. 3, p. 350-356, 1956.

EDEOGA, H. O.; OKWU, D. E.; MBAEBIE, B. O. Phytochemical constituents of some Nigerian medicinal plants. Arican Journal of Biotechnology, v. 4, n. 7, p. 685-688, 2005.

FlowJo, version 7.6.3; Tree Star, Inc.: Ashland, OR, USA 1997.

Ana Karina de Lima Nascimento Página 64

FOLLEGATTI-ROMERO, L. A. et al. Supercritical CO2 extraction of omega-3 rich oil from Sacha inchi (Plukenetia volubilis L.) seeds. The Journal of Supercritical Fluids, v. 49, n. 3, p. 323-329, 2009.

GILLESPIE, L. J. A Revision of Paleotropical Plukenetia (Euphorbiaceae) Including Two New Species from Madagascar. Systematic Botany, v. 32, n. 4, p. 780-802, 2007.

GILLESPIE, L. J. A synopsis of neotropical Plukenetia (Euphorbiaceae) including two new species. Systematic Botany 18: 575–592, 1993.

GraphPad Software, Inc. 2007. Prism (data analysis software system), version5. Software e Guia do Usuário. Disponível em:

GUILLÉN, M. D. et al. Characterization of sacha inchi (Plukenetia volubilis L.) oil by FTIR spectroscopy and 1H NMR. Comparison with linseed oil. Journal of the American Oil Chemists’ Society, v. 80, n. 8, p. 762-755, 2003.

GUIMARÃES, R. et al. Targeting excessive free radicals with peels and juices of citrus fruits : Grapefruit , lemon , lime and orange. Food and Chemical Toxicology, v. 48, n. 1, p. 99-106, 2010.

GUO, T. et al. Antioxidant activities of extract and fractions from Tuber indicum Cooke & Massee. Food Chemistry, v. 127, n. 4, p. 1634-1640, 2011.

HAMAKER, B. R. et al. Amino acid fatty acid profiles of the Inca peanute (Plukenetia volubilis). Cereal Chemistry, p. 461-463, 1992.

HARVEY, A. L. Natural products in drug discovery. Drug Discovery Today, v. 13, n. 19-20, p. 894-901, 2008.

HE, N. et al. Antioxidant, Antiproliferative, and Pro-Apoptotic Activities of a Saponin Extract Derived from the Roots of Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen. Journal of Medical Food, v. 15, n. 4, p. 350-359, 2012.

HEIM, K. E.; TAGLIAFERRO, A. R.; BOBILYA, D. J. Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships. The Journal of Nutritional Biochemistry, v. 13, n. 10, p. 572-584, 2002.

HOUGHTON, P. J. et al. In vitro tests and ethnopharmacological investigations: wound healing as an example. Journal of Ethnopharmacology, v. 100, n. 1-2, p. 100-107, 2005.

Ana Karina de Lima Nascimento Página 65

HUAMÁN, J. et al. Efecto de la Plukenetia volubilis Linneo (sacha inchi) en la trigliceridemia posprandial. Anales de la Facultad de Medicina, v. 69, n. 4, p. 263-266, 2008.

HUIE, C. W. A review of modern sample-preparation techniques for the extraction and analysis of medicinal plants. Analytical and bioanalytical chemistry, v. 373, n. 1-2, p. 23-30, 2002.

IGNACIMUTHU, S.; AYYANAR, M.; SIVARAMAN K, S. Ethnobotanical investigations among tribes in Madurai District of Tamil Nadu (India). Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine, v. 2, p. 2-25, 2006.

ISSA, A. Y.; VOLATE, S. R.; WARGOVICH, M. J. The role of phytochemicals in inhibition of cancer and inflammation: New directions and perspectives. Journal of Food Composition and Analysis, v. 19, n. 5, p. 405-419, 2006.

ITOKAWA, H. et al. Plant-derived natural product research aimed at new drug discovery. Journal of Natural Medicines, v. 62, n. 3, p. 263-80, 2008.

JI, H.; LI, X.; ZHANG, H. Natural products and drug discovery. Embo Reports, v. 10, n. 3, p. 194-200, 2009.

KARIKAS, G. A. Chemoprevention molecular and biochemical mechanisms involved in cancer control and management. Health Science Journal, v. 2, p. 149-156, 2011.

KLUWE, J.; MENCIN, A.; SCHWABE, R. F. Toll-like receptors, wound healing, and carcinogenesis. Journal of Molecular Medicine, v. 87, n. 2, p. 125-138, 2009.

KOTHALE, K. V; ROTHE, S. P.; PAWADE, P. N. Phytochemical screening of some Euphorbiaceae members. Journal of Phytology, v. 3, n. 12, p. 60-62, 2011.

KRIVANKOVA, B. et al. Sacha Inchi (Plukenetia volubilis, Euphorbiaceae): A Promising Oilseed Crop from Peruvian Amazon. Tropentag, p. 9-11, 2007.

LAM, K. S. New aspects of natural products in drug discovery. Trends in microbiology, v. 15, n. 6, p. 279-289, 2007.

LEE, J.-S.; SURH, Y.-J. Nrf2 as a novel molecular target for chemoprevention. Cancer letters, v. 224, n. 2, p. 171-184, 2005.

LEE, K. W.; BODE, A. M.; DONG, Z. Molecular targets of phytochemicals for cancer prevention. Nature Reviews. Cancer, v. 11, n. 3, p. 211-218, 2011.

Ana Karina de Lima Nascimento Página 66

LEE, M. L. et al. The Antiproliferative Activity of Sclerotia of Lignosus rhinocerus (Tiger Milk Mushroom). Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine : eCAM, v. 2012, p.1-5, 2012.

LI, J. W.-H.; VEDERAS, J. C. Drug discovery and natural products: end of an era or an endless frontier? Science (New York, N.Y.), v. 325, n. 5937, p. 161- 165, 2009.

LIU, R. H. Health benefits of fruit and vegetables are from additive and synergistic combinations of phytochemicals. The American journal of clinical nutrition, v. 78, n. 3, p. 517S-520S, 2003.

LIU, R. H. Nutrition and Cancer Potential Synergy of Phytochemicals in Cancer Prevention : Mechanism of Action 1. The Journal of Nutrition, p. 3479-3485, 2004.

LIZCANO, L. J. et al. Antioxidant activity and polyphenol content of aqueous extracts from Colombian Amazonian plants with medicinal use. Food Chemistry, v. 119, n. 4, p. 1566-1570, 2010.

LLANES-CORONEL, D. S. et al. New promising Euphorbiaceae extracts with activity in human lymphocytes from primary cell cultures. Immunopharmacology and Immunotoxicology, v. 33, n. 2, p. 279-290, 2011.

MANACH, C. et al. Polyphenols: food sources and bioavailability. The American journal of clinical nutrition, v. 79, n. 5, p. 727-747, 2004.

MARFE, G. et al. Kaempferol induces apoptosis in two different cell lines via Akt inactivation, Bax and SIRT3 activation, and mitochondrial dysfunction. Journal of cellular biochemistry, v. 106, n. 4, p. 643-650, 2009.

MARTIN, P. et al. Wound Healing in the PU1 Null Mouse - Tissue Repair Is Not Dependent on Inflammatory Cells. Current Biology, v. 13, p. 1122-1128, 2003.

MATKOWSKI, A.; WOŁNIAK, D. Plant phenolic metabolites as the free radical scavengers and mutagenesis inhibitors. BMC Plant Biology, v. 5, n. 1, 2005.

MATOS, F.J.A. Introdução à fitoquímica experimental. 2 ed. Fortaleza: UFC, 1997.

MCCHESNEY, J. D.; VENKATARAMAN, S. K.; HENRI, J. T. Plant natural products: back to the future or into extinction? Phytochemistry, v. 68, n. 14, p. 2015-2022, 2007.

MELO-SILVEIRA, R. F. et al. In vitro antioxidant, anticoagulant and antimicrobial activity and in inhibition of cancer cell proliferation by xylan

Ana Karina de Lima Nascimento Página 67 extracted from corn cobs. International Journal of Molecular Sciences, v. 13, n. 1, p. 409-426, 2012.

MWINE, J. T.; DAMME, P. VAN. Why do Euphorbiaceae tick as medicinal plants ? A review of Euphorbiaceae family and its medicinal features. Journal of Medicinal Plants Research, v. 5, n. 5, p. 652-662, 2011.

NCUBE, N. S.; AFOLAYAN, A. J.; OKOH, A. I. Assessment techniques of antimicrobial properties of natural compounds of plant origin : current methods and future trends. African Journal of Biotechnology, v. 7, n. 12, p. 1797- 1806, 2008.

NEWMAN, D. J.; CRAGG, G. M. Natural products as sources of new drugs over the last 25 years. Journal of Natural Products, v. 70, n. 3, p. 461-477, 2007.

OLIVEIRA, F. C. DE; ALBUQUERQUE, U. P. DE; STERN, V. Avanços nas pesquisas etnobotânicas no Brasil. Acta Botanica Brasilica, v. 23, n. 2, p. 590-605, 2009.

PARK, J. S. et al. Enzymatic preparation of kaempferol from green tea seed and its antioxidant activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 54, n. 8, p. 2951-2956, 2006.

PEINADO, J.; LÓPEZ DE LERMA, N.; PEINADO, R. A. Synergistic antioxidant interaction between sugars and phenolics from a sweet wine. European Food Research and Technology, v. 231, n. 3, p. 363-370, 2010.

POUTARAUD, A.; GIRARDIN, P. Improvement of medicinal plant quality: a Hypericum perforatum literature review as an example. Plant Genetic Resources: characterization and utilization, v. 3, n. 2, p. 178-189, 2005.

PRADO, I. M. et al. Phase Equilibrium Measurements of Sacha Inchi Oil

(Plukenetia volubilis) and CO2 at High Pressures. Journal of the American Oil Chemists’ Society, v. 88, n. 8, p. 1263-1269, 2011.

PRIETO, P.; PINEDA, M.; AGUILAR, M. Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex: specific application to the determination of vitamin E. Analytical Biochemistry, v. 269, n. 2, p. 337-41, 1999.

QUINN, J. et al. Phytochemicals in Alzheimer Disease: The Development of Clinical Trials. Archives Of Physiology And Biochemistry, v. 42, n. 1, p. 64- 73, 2004.

Ana Karina de Lima Nascimento Página 68

RABELO, L. et al. A Lactose-Binding Lectin from the Marine Sponge Cinachyrella Apion (Cal) Induces Cell Death in Human Cervical Adenocarcinoma Cells. Marine Drugs, v. 10, n. 4, p. 727-743, 2012.

RAJKUMAR, V.; GUHA, G.; KUMAR, R. A. Therapeutic potential of Acalypha fruticosa. Food and chemical toxicology : an international journal published for the British Industrial Biological Research Association, v. 48, n. 6, p. 1709-1713, 2010.

RAMÍREZ, J. J.; GORDILLO, M. M.; DÚRAN, R. C. Genero Plukenetia. Anales del Instituto de Biologia Nacional Autonoma de Mexico, v. 71, n. 1, p. 11- 18, 2000.

RAO, S. R.; RAVISHANKAR, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology advances, v. 20, n. 2, p. 101-53, 2002.

SAAVEDRA, C. et al. Estudio fitoquímico de Plukenetia volubilis L . y su efecto antioxidante en la lipoperoxidación inducida porFe3+/ascorbato en hígado de Rattus rattus var. albinus.Revista Científica de la Universidad César Vallejo, v. 2, n. 1, p. 11-21, 2010.

SAHU, S. C.; DHAL, N. K.; MOHANTY, R. C. Potential Medicinal Plants Used by the Tribal of Deogarh District , Orissa , India. EthnoMedicine, v. 4, n. 1, p. 53-61, 2010.

SAMY, P. R.; GOPALAKRISHNAKONE, P. Therapeutic Potential of Plants as Anti-microbials for Drug Discovery. Evidence-based complementary and alternative medicine : eCAM, v. 7, n. 3, p. 283-94, 2008.

SCANDALIOS, J. G. Oxidative stress: molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses. Brazilian Journal of Medical and Biological Rsearch, v. 38, n. 7, p. 995-1014, 2005.

SECCO, R. D. S. et al. An overview of recent taxonomic studies on Euphorbiaceae s . l . in Brazil. Rodriguésia: Revista do Jardim Botânico do Rio de Janeiro, v. 63, n. 1, p. 227-242, 2012.

SHAHIDI, F.; ZHONG, Y. Novel antioxidants in food quality preservation and health promotion. European Journal of Lipid Science and Technology, v. 112, n. 9, p. 930-940, 2010.

SHARMA, H.; KUMAR, A. Ethnobotanical studies on medicinal plants of Rajasthan ( India ): A review. Journal of Medicinal Plants Research, v. 5, n. 7, p. 1107-1112, 2011.

Ana Karina de Lima Nascimento Página 69

SHI, Q.-W.; SU, X.-H.; KIYOTA, H. Chemical and pharmacological research of the plants in genus Euphorbia. Chemical Reviews, v. 108, n. 10, p. 4295-4327, 2008.

SHIMADA, K. et al. Antioxidative Properties of Xanthan on the Autoxidation of Soybean Oil in Cyclodextrin Emulsion. Journal Agricultural and Food Chemistry, n. 1990, p. 945-948, 1992.

SIMÓES, C.M.O. et al. Farmacognosia da planta ao medicamento. 5 ed., Porto Alegre/Florianópolis: UFRGS E UFSC, 2004.

SINGH, B.; BHAT, T. K.; SINGH, B. Potential Therapeutic Applications of Some Antinutritional Plant Secondary Metabolites. Journal Agricultural and Food Chemistry, v. 51, p. 5579-5597, 2003.

SMIRNOFF, N.; CUMBES, Q. J. Hydroxyl Radical Scavenging Activity Of Compatible Solutes. Phytochemistry, v. 28, n. 4, p. 1057-1060, 1989.

SOMOGYI, A. et al. Antioxidant measurements. Physiological measurement, v. 28, n. 4, p. 41-55, 2007.

SRIPATHI, S. K.; SANKARI, U. Ethnobotanical Documentation of a Few Medicinal Plants in the Agasthiayamalai Region of Tirunelveli District , India. Ethnobotanical Leaflets, v. 14, p.173-181, 2010.

SURH, Y.J. Cancer chemoprevention with dietary phytochemicals. Nature reviews. Cancer, v. 3, n. 10, p. 768-780, 2003.

THANGAPAZHAM, R. L.; SHARMA, A.; MAHESHWARI, R. K. Multiple molecular targets in cancer chemoprevention by curcumin. The AAPS journal, v. 8, n. 3, p. 443-449, 2006.

THÉOPHILE, D. et al. Antinociceptive and anti-inflammatory effects of the ethyl acetate stem bark extract of Bridelia scleroneura (Euphorbiaceae). Inflammopharmacology, v. 14, n. 1-2, p. 42-47, 2006.

TIWARI, P. et al. Phytochemical screening and extraction: A Review. Internationale Pharmaceutica Sciencia, v. 1, n. 1, 2011.

TRIPATHI, S. C.; SRIVASTAVA, M. Ethnomedicinal flora of Euphorbiaceae used in dermatological problems. India Journal of Traditional Knowledge, v. 9, p. 318-320, 2010.

VASCONSUELO, A. Involvement of the PLC/PKC pathway in Chitosan-induced anthraquinone production by Rubia tinctorum L. cell cultures. Plant Science, v. 165, n. 2, p. 429-436, 2003.

Ana Karina de Lima Nascimento Página 70

VASCONSUELO, A.; BOLAND, R. Molecular aspects of the early stages of elicitation of secondary metabolites in plants. Plant Science, v. 172, n. 5, p. 861-875, 2007.

WAGNER, H.; BLADT, S. Plant Drug Analysis: A thin layer chromatography atlas. 2th. Berlin: Springer, 1996.

WANG, J. et al. Antioxidant activity of sulfated polysaccharide fractions extracted from Laminaria japonica. International Journal of Biological Macromolecules, v. 42, n. 2, p. 127-32. 2008.

WANG, L.; WELLER, C. L. Recent advances in extraction of nutraceuticals from plants. Trends in Food Science & Technology, v. 17, n. 6, p. 300-312, 2006.

WHO. Estimativas em 2011 – Incidências de Câncer no Brasil.Disponível em:http://www.inca.gov.br/estimativa/2012/estimativa20122111.pdf. Acesso em: 23 de jan. 2013.

WINK, M. Medicinal plants: a source of anti-parasitic secondary metabolites. Molecules, v. 17, n. 11, p. 12771-12791, 2012.

WOLFE, K. L.; LIU, R. H. Structure-activity relationships of flavonoids in the cellular antioxidant activity assay. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 56, n. 18, p. 8404-8411, 2008.

YANG, C. S. et al. NIH Public AccessCancer prevention by tea: animal studies, molecular mechanisms and human relevance. Nature Reviews Cancer, v. 9, n. 6, p. 429-439, 2010.

ZHANG, X. et al. Phenolic glycosides with antioxidant activity from the stem bark of Populus davidiana. Journal of Natural Products, v. 69, n. 9, p. 1370- 1373, 2006.

ZHU, X. Y. et al. Mechanochemical-Assisted Extraction and Antioxidant Activities of Kaempferol Glycosides from Camellia oleifera Abel . Meal. Journal Agricultural and Food Chemistry, v. 59, p. 3986-3993, 2011.

ZUCOLLOTO S. M; BRANDT, R. Apostila de Aulas Práticas de Farmacognosia. Disciplina de Farmacognosia. Curso de Farmácia. DFAR, CCS, UFRN. 2011.

Ana Karina de Lima Nascimento Página 71