Pdf/Dossier21 Protection.Pdf

Thèse de doctorat

Présentée

Par

Fida Ben Salem

Pour obtenir le grade de Docteur

L’Université de Pau et des Pays de l’Adour Institut Pluridisciplinaire de Recherche sur l'Environnement et les Matériaux Equipe Environnement et Microbiologie

& L’Université de Cathage Faculté des Sciences de Bizerte Laboratoire de Biosurveillance de l’Environnement

Spécialité Biologie Impacts écologiques de la présence de quelques substances prioritaires (pesticides agricoles, hydrocarbures aromatiques polycycliques, polychlorobiphényles, organo-métaux) dans un écosystème littoral anthropisé, le complexe lac Ichkeul- lagune de Bizerte

Soutenue le : 22/07/2015

Devant la commission d'examen formée de :

Robert Duran : Professeur à l’Université de Pau et des Pays de l’Adour, Directeur de thèse

Ezzeddine Mahmoudi : Professeur à la Faculté des Sciences de Bizerte, Directeur de thèse

Mathilde Monperrus : Maître de conférences à l’Université de Pau et des Pays de l’Adour, Co-directrice

Olfa Ben Said : Docteur à la Faculté des Sciences de Bizerte, Co-directrice

Olivier Pringault : Directeur de Recherche à l’Institut de Recherche et Développement, Rapporteur

Sami Sayadi : Professeur au Centre de Biotechnologie de Sfax, Rapporteur

Catherine Gonzalez : Professeur à l’Ecole des mines d’Alès, Examinatrice

Imed Massoudi : Maître de conférences à l’Institut Supérieur de Biotechnologie de Monastir, Examinateur

A mes parents et mes frères

Merci pour votre soutien

Encouragement……

et compréhension…

AVANT – PROPOS

Le présent travail, a été mené au sein de l’Equipe Environnement et Microbiologie, dirigé par

Monsieur le Professeur Robert DURAN, et qui fait partie de l’Institut Pluridisciplinaire de Recherche sur l'Environnement et les Matériaux dirigé par Monsieur Olivier DONARD à l’Université de Pau et des Pays de l’Adour.

Il est en cotutelle avec le Laboratoire de Biosurveillance de l’Environnement, Unité d’Ecologie

Côtière et Ecotoxicologie Marine à la Faculté des Sciences de Bizerte.

Une partie de chimie analytique a été réalisée au Laboratoire de Chimie Analytique Bio-inorganique et Environnement (Anglet), qui fait partie aussi de l’Institut Pluridisciplinaire de Recherche sur l'Environnement et les Matériaux.

Ce projet a été effectué en partenariat socio-économique avec l’Agence Nationale de Protection de l’Environnement de la Tunisie et le Commissariat Régional de Développement Agricole de Bizerte.

Remerciements

Ce travail est le fruit de nombreuses rencontres dans les équipes de recherches en France et en Tunisie que je souhaite remercier ici pour toute l’aide, le soutien, les conseils qu’elles m’ont apportés ou tout simplement pour leur bonne humeur et leur joie de vivre qui ont fait de ces quatre années, une aventure incroyable.

Je tiens à remercier Monsieur Olivier PRINGAULT et Monsieur Sami SAYADI d’avoir accepté d’évaluer mon travail en tant que rapporteurs.

Un grand merci à Madame Catherine GONZALEZ et Monsieur Imed MASSOUDI d’avoir accepté d’assisster à ma soutenance en tant que examinateurs.

Ma gratitude va en premier lieu à Monsieur Robert DURAN, Professeur à l’Université de Pau et des Pays de l’Adour qui fut pour moi un directeur de thèse attentif et disponible malgré ses nombreuses charges. Il a assuré la direction de cette thèse avec beaucoup de patience, il m’a suivie durant toutes les

étapes de mon travail, il n’a épargné ni son temps, ni ses compétences scientifiques. Je suis très heureuse de pouvoir lui exprimer ici l’expression de ma profonde reconnaissance aussi pour ses qualités humaines au laboratoire.

Je suis particulièrement reconnaissante à Madame Mathilde MONPERRUS, Maître de conférences à l’Université de Pau et des Pays de l’Adour, pour son co-encadrement et d’avoir bien voulu m’aider à réaliser la partie chimie de ma thèse qui a donné un plus à mon travail.

J'adresse mes plus sincères remerciements à Madame Patricia AISSA pour m’avoir accueillie au sein du laboratoire de Biosurveillance de l’Environnement et pour ses grandes qualités humaines.

Je tiens à remercier Monsieur Ezzeddine MAHMOUDI, Professeur à la Faculté des Sciences de

Bizerte pour son encadrement, ses conseils ont contribué au bon déroulement de cette thèse.

Mes remerciements les plus chaleureux iront à Madame Olfa BEN SAID, postdoctorale à la faculté des Sciences de Bizerte, pour son co-encadrement, Sa disponibilité, ses conseils et son aide scientifique ont grandement contribué à la réalisation de ces travaux, et à la collaboration entre les différents laboratoires de recherches.

Un grand merci à Mr Olivier DONARD, ainsi que tous les membres de l’Institut Pluridisciplinaire de

Recherche sur l'Environnement et les Matériaux et à Madame Jacqueline PETITBON, ainsi que tous les membres de l’Ecole Doctorale Sciences Exactes et leurs Applications de l’Université de Pau et des Pays de l’Adour.

Il me tient à cœur de remercier mes chers parents Abed Esslem et Naima, mes frères Fedi et Med

Dhia et mon fiancé Adel ainsi que mes grands parents et toute ma grande famille pour l’aide et le soutien qu’ils m’ont toujours témoignés.

Mes remerciements vont également à mes enseignants de la Faculté des Sciences de Bizerte, et tous les membres de l’Unité d’Ecologie et Ecotoxicologie Côtière du Laboratoire de Biosurveillance de l’Environnement, qu’il m’a été donné de rencontrer durant les années de ma thèse : Hamouda, Mohamed,

Naceur, Fehmi, Amor, Rahma, Soumaya, Amel, Ibtihel, Héla, Tkoua, Meriem, Ahmed, Badreddine, Jalila,

Abdelhafidh et mes amis Jihed et Marouen.

J’adresse mes remerciements aux membres de l’Equipe Environnement et Microbiologie (Pau) et ceux du Laboratoire de Chimie Analytique Bio-inorganique et Environnement (Anglet) de l’Université de Pau et des Pays de l’Adour : Habiba, Joana, Jean-Christophe, Christine, Claire, Anne, Hervé, Vanessa, Arantxa,

Mathilde, Fanny, Johanne, Fabien pour leurs encouragements.

Je remercie Mr Olivier GRUMBERGER et Mme Noëlle BRU pour leur aide.

Je tiens aussi à remercier Madame Nabiha MBAREK de l’Agence Nationale de Protection de l’Environnement et Monsieur Taher KAABI du Commissariat Régional de Développement Agricole de

Bizerte pour leur aide.

Sommaire

INTRODUCTION GENERALE………………………………………………………………………… 1 CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE……………….…………………………………… 10 I. CONTAMINATION DES ECOSYSTEMES AQUATIQUES PAR LES POLLUANTS ORGANIQUES…………………………………………………………………………………...... 11 I.1. Polluants d’origine agricole : les pesticides……………………………………………………….……. 11 a. Ecosystème aquatique : Réceptacle des polluants agricoles………………………………….…….…….. 13 b. Propriétés physico-chimique des pesticides………………………………………………….….……….. 15 I.2. Polluant d’origine industrielle : HAP et PCB…………………………………………………………... 16 a. Contamination des écosystèmes par les HAP…………………………………………………………...... 16 b. Contamination des écosystèmes par les PC…………………………………………………………...... 18 I.3. Réglementation et normes………………………………………………………………………………. 19 II. BIOSURVEILLANCE DES ECOSYSTEMES AQUATIQUES………………………………………… 22 II.1. Importance du Benthos dans la biosurveillance des écosystèmes aquatiques……………………...... 22 a. Sédiment………………………………………………………………………………………………….. 22 b. Benthos………………………………………………………………………………………………...... 22 c. Inter-relation : bactérie-nématode libres marins et chaine trophique dans le milieu marin…………...... 25 II.2. Impacts des polluants sur les communautés benthiques………………………………………………. 26 II.3. La biodiversité bactérienne…………………………………………………………………………….. 27 a. Techniques moléculaires en écologie microbienne………………………………………………………. 28 III. METHODE D’ANALYSE CHIMIQUE……………………………………………………………….. 31 IV. PRESENTATION DE L’ECOSYSTEME ETUDIE : COMPLEXE LAC ICHKEUL-LAGUNE DE BIZERTE……………………………………………………………………………………………………. 32 Références bibliographiques………………………………………………………………………………… 38 CHAPITRE II : MATERIELS ET METHODES…………………………..……………………………...... 52 I. STRATEGIE D’ECHANTILLONNAGE...... 53 II. PARAMETRES DESCRIPTEURS DES SITES D’ECHANTILLONNAGES…………………………. 58 II.1. La salinité…………………………………………………………………………………………...... 58 II.2. Le pH…………………………………………………………………………………………………… 58 II.3. L’oxygène…………………………………………………………………………………………...... 58 II.4. Les éléments nutritifs…………………………………………………………………………………… 58 III. ANALYSES CHIMIQUES………………………………………………………………………...... 59 III.1. Adaptation et validation de la méthode QuEChERS………………………………………………….. 59 III.1.1. Optimisation de l’extraction des HAP, PCB et OCP………………………………………...... 59 III.1.2. Extraction et purification des HAP, PCB et OCP……………………………………………………. 59 III.1.3. Dosage des HAP, PCB et OCP………………………………………………………………………. 60 IV. ANALYSES MOLECULAIRES ………………………………………………………………...... 60 IV.1. Extraction de l’ADN génomique………………………………………………………………………. 60 IV.2. Amplification des gènes de l’ARNr 16S………………………………………………………………. 60 IV.3. Analyse TRFLP……………………………………………………………………………………...... 61 IV.4. Pyroséquençage…………………………………………………………………………………...... 61 V. ETUDE DE LA MEIOFAUNE…………………………………………………………….………...... 61 VI. TRAITEMENT STATISTIQUE DES DONNEES……………………………………………...... 62 VI.1. Analyses univariées……………………………………………………………………………………. 62 VI.2. Analyses multivariées…………………………………………………………………………………. 62 Références Bibliographiques………………………………………………………………………………… 63 CHAPITRE III : STRATEGIE DE HIERARCHISATION DES POLLUANTS CHIMIQUES D’INTERET A RECHERCHER DANS LE COMPLEXE LAC ICHKEUL-LAGUNE DE BIZERTE…………………………………………………………………………………………………. 65 Partie A : Premier recensement des pesticides agricoles utilisés en Tunisie : cas du bassin agricole du lac Ichkeul et la lagune de Bizerte…………………………………………………………………… 66 Introduction………………………………………………………………………………………………… 66 Références Bibliographiques………………………………………………………………………………… 67 I. Publication 1 : Premier recensement des pesticides agricoles utilisés en grandes cultures dans le bassin versant du lac Ichkeul et la lagune de Bizerte (Tunisie)………………………………………… 69 Résumé………………………………………………………………………………………………………. 70 Abstract……………………………………………………………………………………………………… 71 Introduction………………………………………………………………………………………………….. 72 Matériels et Méthodes……………………………………………………………………………………… 74 Site d'étude…………………………………………………………………………………………………… 74 Stratégie d’échantillonnage………………………………………………………………………………… 75 Méthode de calcul global……………………………………………………………………………………. 77 Méthode de calcul par agriculteur…………………………………………………………………………… 77 Résultats……………………………………………………………………………………………………… 77 Utilisation des pesticides dans le complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte…………………………………. 77 Estimation des pesticides vendus………………………………………………………………………...... 80 Estimation des pesticides utilisés par les agriculteurs………………………………………………………. 82 Comparaison pesticides vendus et pesticides utilisés………………………………………………………... 82 Discussion…………………………………………………………………………………………………… 83 Conclusion…………………………………………………………………………………………………… 86 Remerciement………………………………………………………………………………………………... 86 Références bibliographiques………………………………………………………………………………… 87 Partie B : Validation et adaptation d’une méthode d’analyse chimique pour la détermination simultanée des HAP, PCB et OCP dans le sédiment du complexe Lac Ichkeul-Lagune de Bizerte par GC-MS……………………………………………………………………………………………...... 90 Introduction………………………………………………………………………………………………….. 90 Références bibliographiques…………………………………………………………………………………. 92 I. Publication 2 : Validation of an adapted quick, easy, cheap, effective, rugged and safe method for the simultaneous analysis of heavy poly-aromatic hydrocarbons, polychlorinated biphenyls and organo-chlorine pesticides in sediment by Gas chromatography–mass spectrometry………………… 94 Abstract……………………………………………………………………………………………………. 95 1. Introduction……………………………………………………………………………………..………… 96 2. Experimental………………………………………………………………………………..…………… 97 2.1. Reagents and chemicals………………………………………………………………………………… 97 2.2. Standard reference material and real samples…………………………………………………………... 98 2.3. QuEchERS extraction/purification procedure…………………………………………………………... 98 2.4. GC-MS Analysis………………………………………………………………………………………… 99 3. Results………………………………………………………………………………………………..……. 101 3.1. Adaptation of the QuEChERS method……………………………………………………………..…… 101 3.2. Analytical performances…………………………………………………………………….………….. 104 3.3. Application to real samples……………………………...……………………………………………… 107 4. Concluding remarks……………………………………..………………………………………………… 108 References………...………………………………………………………………………………………….. 109 II. Publication 3 : Organic contamination of sediments from Ichkeul Lake (protected area) and Bizerta Lagoon (Anthropized ecosystem) watershed (Tunisia)………………………………………….. 113 Abstract………………………………………………………………………………………………………. 114 1. Introduction……………………………………………………………………………………..…………. 115 2. Materials and methods…………………………………………………………………………………….. 117 2.1. Study region and sampling...... 117 2.2. Physical and chemical parameters………………………………………………………………………. 119 2.3. Solvents and chemical standards…………………………...…………………………………………… 120 2.4. Analytical methods……………………………………………………………………………………... 120 QuEchERS extraction/purification procedure………………………...……………………………………... 121 GC-MS Analysis……………………………………………...……………………………………………… 121 2.5. Quality control…………………………………………………………………………………………... 122 3. Results and discussions……………………………………………………………………………………. 122 Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)………………………………………………………………….. 122 Polychlorinated Biphenyls (PCBs)…………………………………………………………………………... 126 Organochlorine pesticides (OCPs)…………………………………………………………………………... 127 Butyltin……………………………………………………………………………………………………… 130 Conclusion…………………………………………………………………………………………………… 130 Acknowledgement…………………………………………………………………………………………… 132 References……………………………………………………………………………………………………. 132 CHAPITRE IV : BIO-SURVEILLANCE DU COMPLEXE LAC ICHKEUL LAGUNE DE 138 BIZERTE : DIVERSITE MICROBIENNE ET DES NEMATODES LIBRES MARINS……………

Partie A : Impacts écologiques de la présence des polluants organiques HAP et OCP sur les communautés bactériennes et les nématodes libres marins du sédiment du complexe Lac Ichkeul- Lagune de Bizerte………………………………………………………………………………………… 139 Introduction………………………………………………………………………………………………….. 139 Références bibliographiques………………………………………………………………………………… 136 I. Publication 4 : Bacterial Community Structure of the sediments from the complex Bizerta Lagoon (Anthropized ecosystem)-Ichkeul lake (RAMSAR site) in Tunisia and pyrosequencing analysis of four interesting sites…………………………………………………………………………… 141 Abstract……………………………………………………………………………………………………. 142 1. Introduction……………………………………………………………………………………..…………. 143 2. Materials and methods…………………………………………………………………………………….. 144 2.1. Site description………………………………………………………………………………………….. 144 2.2. Sampling………………………………………………………………………………………………… 145 2.3. Physical-chemical analyses……………………………………………………………………………... 145 2.4. DNA extraction, PCR, T-RFLP analysis………………………………………………………………... 146 2.5. 454 Pyrosequencing…………………………………………………………………………………….. 147 2.6. Statistical analysis……………………………………………………………………………………….. 148 3. Results and discussions……………………………………………………………………………………. 148 3.1. Bacterial community structure…………………………………………….…………………………….. 148 3.2. Bacterial community composition………………………………………………………………………. 151 3.2.1. Univariate indices……………………………………………………………………………………... 152 3.2.2. Multivariate indices…………………………………………………………………………………… 152 4. Conclusion………………………………………………………………………………………………… 157 References...... 157 II. Publication 5 : Pesticides in Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon Watershed in Tunisia: Use, occurrence, and effects on bacteria and free-living marine nematodes………………………………… 161 Abstract……………………………………………………………………………………………………… 162 Abbreviations list…………………………………………………………………………………………….. 164 Introduction…………………………………………………………………………………………………... 165 Materials and methods……………………………………………………………………………………….. 168 Site description and survey of pesticides use………………………………………………………………... 168 Sediment samples collection………………………………………………………………………………… 169 Physical and chemical parameters…………………………………………………………………………… 170 Analytical methods…………………………………………………………………………………………... 171 QuEchERS extraction/purification procedure……………………………………………………………….. 172 GC-MS Analysis…………………………………………………………………………………………….. 172 Density of free-living marine nematodes……………………………………………………………………. 173 Bacterial community analysis………………………………………………………………………………... 173 Statistical analysis……………………………………………………………………………………………. 174 Results and discussion……………………………………………………………………………………….. 175 Pesticide use…………………………………………………………………………………………………. 175 Pesticides concentrations in sediment……………………………………………………………………….. 177 Nematode abundances……………………………………………………………………………………….. 181 Bacterial communities……………………………………………………………………………………….. 184 Conclusion…………………………………………………………………………………………………… 187 Acknowledgements………………………………………………………………………………………….. 188 References…………………………………………………………………………………………………… 189 CHAPITRE V : CONCLUSIONS GENERALES & PERSPECTIVES………………………………... 199

Liste des abréviations

PCB : Polychlorobiphényles

QuEChERS : Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe

HAP : Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques

ANPE : Agence Nationale de Protection de l’Environnement

UNESCO : Organisation des Nations unies pour l'éducation, la science et la culture

POC : Pesticides organochlorés

HCH : Hexachlorocyclohexanes

DDT : Dichlorodiphényltrichloroéthanes

MOC : Contaminants micro-organiques

Koc : coefficient de partage carbone organique/eau

LMW-HAP : HAP de faible poids moléculaires

HMW-HAP : HAP de haut poids moléculaires

Kow : coefficients de partage octanol/eau

POP : polluants organiques persistants

NOAA : Administration Océanique et Atmosphérique Nationale

TEL : threshold effects level

PEL : Prabable effect level

TRFLP : polymorphisme de longueur des fragments de restriction terminaux

PCR : réaction en chaine par polymérase

ARN : Acide ribonucléique

ADN : Acide désoxyribonucléique ARNr : Acide ribonucléique ribosomique

Pb : paire de base

HTS : high-throughput sequencing

OTU : Unités Opérationnelles Taxonomiques

ADNsb : Acide désoxyribonucléique simple brin

A, T, C, G : adénine, thymine, cytosine, guanine

ATP : Adénosine triphosphate

CRDA : Commissariat Régional de Développement Agricole de Bizerte

NPP : Nombre le plus probable

MES : matière en suspension

GC-MS : chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse

H’ : indice de diversité de Shannon

R : richesse spécifique

SIMPER : similarity percentages

ANOSIM : analyse de similarités

CCA : Analyse des Correspondances Canonique

Liste des figures

Chapitre I : Synthèse bibliographique :

Fig1. Structure chimique de deux organochlorés dérivés du DDT

Fig 2. Mode de transfert des pesticides dans l’environnement

Fig 3. Devenir des pesticides et des contaminants micro-organiques (MOC) dans le milieu aquatique (Warrena et al., 2003)

Fig 4. Structure chimique des 16 HAP prioritaires de la liste de l’Agence Américaine de l’Environnement

Fig 5. Estimation de la consommation mondiale cumulée de PCB (légendes en tonnes) (Breivik et al., 2002)

Fig 6. Réseau complexe de terriers de nématodes rapprochés dans le sédiment, vu à travers la paroi latérale du verre de réservoir aquarium (Cullen, 1973).

Fig 7. Réseau trophique benthique (Leguerrier, 2005)

Fig 8. Carte de la position du complexe Lac Ichkeul-Lagune de Bizerte

Fig 9. Carte du réseau hydrographique (CRDA, 2007)

Fig 10. Carte des pentes de la région de Bizerte

Chapitre II : Matériels et méthodes :

Fig 11. Localisation des stations d’échantillonnage dans le lac Ichkeul et la lagune de Bizerte

Publication 1 :

Fig 1. Carte d’occupation du sol de la région de Bizerte et localisation approximative des terrains des agriculteurs questionnés

Fig 2. Pluviométrie du mois du septembre 2011 au mois d’Août 2012 avec l’horloge d’utilisation des herbicides

Publication 2 :

Fig 1. Comparison of concentrations of the target PAHs, PCBs and OCPsin the different extraction experiments and in the certified reference materials SRM 1941b for PAHs (a) and PCBs (b).

Publication 3:

Fig 1: Map of the Ichkeul Lake-Bizerte Lagoon complex indicating the location of the sampling sites (numbers)

Fig 2: Spatial distribution of total PAHs in superficial sediments of Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex in April 2012.

Fig 3a. Concentrations (ng.g-1dry wt) of PAHs in sediment of different sites from Ichkeul Lake in April (ST1-ST8)

Fig 3b. Concentrations (ng.g-1dry wt) of PAHs in sediment of different sites from Bizerta lagoon in April (ST9-ST20)

Fig 4. Spatial distribution of totals PCBs (ng.g-1) in superficial sediments of complex Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon in April 2012.

Fig 5. Spatial distribution of totals OCPs (ng.g-1) in superficial sediments of complex Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon in September 2011 and April 2012.

Fig 6a. Concentrations (ng.g-1dry wt) of OCPs in sediment of different sites from Lake Ichkeul in April (ST1-ST8)

Fig 6b. Concentrations (ng.g-1dry wt) of OCPs in sediment of different sites from Lake Ichkeul-Bizerta lagoon in April (ST11-ST20)

Publication 4 :

Fig 1. Map of the complex Ichkeul Lake-Bizerte Lagoon indicating the location of the sampling stations

Fig 2. Canonical Correspondence Analysis (CCA) between sediment bacterial communities structure from complex Ichkeul Lake - Bizerta Lagoon in two campaigns characterized by T- RFLP fingerprints and chemical analysis: PAHs and Pesticides Fig 3. Canonical Correspondence Analysis (CCA) between sediment bacterial communities from Ichkeul Lake in two campaigns (September and April) characterized by T-RFLP fingerprints and chemical analysis: PAHs and Pesticides. Fig 4. Canonical Correspondence Analysis (CCA) between sediment bacterial communities from Bizerta Lagoon in two campaigns (September and April) characterized by T-RFLP fingerprints and chemical analysis: PAHs and Pesticides. Fig 5. Comparison of bacterial communities from the different sites of the Ichkeul Lake-

Bizerta Lagoon complex. Venn diagram shows the number of shared OTUs between sites.The specific OTUs for each site are indicated. OTUs were determined at the species level (97%).

Fig 6. Heat map for clustering abundance of OTUs in different sites with replicates.

Fig 7. Canonical Correspondence Analysis (CCA) between sediment bacterial community composition from the complex Ichkeul lake - Bizerta lagoon in four sites in april based on variables and characterized by OTUs and chemical analysis: PAHs and OCPs. Publication 5 :

Fig 1. Aerial map of the complex and location of sampling sites (red circles)

Fig 2. Concentrations of organochlorine pesticides at the different sites (colors). The error bar corresponds to the standard deviation (n=3).

Fig 3. Average densities of nematodes (individuals/10 cm2) in the different sites from the complex Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon. The error bar corresponds to the standard deviation.

Fig 4. Comparison of bacterial communities from the studied sites by heat map with clustering analysis. The circles indicate the specific T-RFs for Site 1 (blue), Site 2 (yellow), Site 3 (green) and Site 4 (red).

Fig 5. Comparison of bacterial communities from the different sites of the Ichkeul Lake- Bizerta Lagoon complex. Venn diagram shows the number of shared T-RFs between sites. The specific T-RFs for each site are indicated.

Chapitre V: Conclusions et perspectives:

Fig 1. L’inter-relation lac-lagune de point de vue écotoxicologique Liste des planches

Chapitre I : Synthèse bibliographique :

Planche 1. Photo de l’écluse de Tinja

Planche 2. Photo d’une vanne de l’écluse de Tinja

Chapitre II : Matériels et méthodes :

Planche 3. Photo de la benne Van Veen

Planche 4. Station située au niveau de l’oued Tinja du coté sud de l’écluse (site 1)

Planche 5 : Station située au niveau de l’embouchure d’un oued (site2)

Planche 6. Station située au centre du lac (site 4)

Planche 7. Station située au niveau de l’embouchure d’un oued (site 3)

Planche 8. Station située au niveau de l’embouchure de l’oued (site 5)

Planche 9. Station située au niveau de l’embouchure de l’oued Sejnane (site 6)

Planche 10. Station située au niveau de l’embouchure de l’oued Douimiss (site 7)

Planche 11. Station localisée en face de la briqueterie (site 8)

Liste des tableaux

Chapitre I : Synthèse bibliographique :

Tableau1. Seuil d’effet TEL (threshold effects level) de quelques HAP et Pesticides selon les normes américaines déterminées par l’Administration Océanique et Atmosphérique Nationale (NOAA). (NOAA, 1999)

Tableau 2. Production halieutique annuelle (kg) au niveau de la lagune de Bizerte (d’après la Direction Générale de la Pêche et de l’Aquaculture Bizerte, 1999 ; Essid, 2001)

Publication 1 :

Tableau 1. La liste des matières actives utilisées dans le bassin versant lac Ichkeul-Lagune de Bizerte

Tableau 2. Estimation des quantités des principales matières actives utilisées dans les zones agricoles concernées après dire des agriculteurs.

Tableau 3. Les quantités des pesticides vendues par an au niveau des délégations concernées (L : Litres, kg)

Tableau 4. Les propriétés physico-chimiques de certaines matières actives

Publication 2 :

Table 1. The different experiments performed for the adaptation of the QuEChERS extraction

Table 2. Retention time and target monitoring of the different compounds analyzed by GCMS

Table 3. Concentrations of the target PAHs, PCBs and OCPs in the certified reference materials SRM 1941b by the different experiments (see Table 1) and comparison with the certified values(CV) (concentration ng.g-1 ± SD standard deviation), na: not available, -: not determined.

Table 4. Analytical performances of the QuEChERS method.na not avalaible, R2=linearity, LOD=Limits of detection, LOQ=Limits of quantification, R%=Recoveries, RSD=reproducibility. Table 5. Concentrations of PAHs, PCBs and OCPs in sediment collected from Bizerta Lagoon and Ichkeul Lake (concentrations ng g-1± SD (n=3)).

Publication 3 :

Table 1. Physicochemical Parameters of water from the complex Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon

Table 2: Threshold effects level (TEL) (ng.g-1dry wt) of OCPs from NOAA screening quick references table

Table 3: Mean and range of detected concentrations of PAHs, PCBs and OCPs (ng.g-1 DW) in September and April

Publication 4 :

Table 1: Means of univariate indices for OTUs assemblages from each site. N = Number of OTUs; H' = Shannon-Wiener index; Margalef’s R= OTUs richness.

Publication 5 :

Table 1. Analytical performances of the QuEChERSmethod.R2, linearity; LOD, Limit of detection; LOQ, Limits of quantification; R%, Recoveries; RSD, reproducibility.na, not available,

Table 2. Estimated quantities of the main active compounds used in the agricultural areas of the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex by farmers’ survey Table 3. Concentrations (ngg-1dry wt sediment) of OCPs in sediment from the four sites studied in Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon. SD are indicated. LOD: limit of detection.

Table 4. Physical-chemical parameters at the sampling sites of the complex Ichkeul Lake- Bizerta Lagoon

INTRODUCTION GENERALE

Le milieu aquatique est un compartiment environnemental très complexe, il est le siège d’un grand nombre de réactions chimiques, physiques et biologiques. Plusieurs modèles ont été construits pour essayer de simplifier et de comprendre le fonctionnement de ces écosystèmes sensibles (Cerepnalkoski et al., 2012 ; Ciric et al., 2012 ; Tashkova et al., 2012). L’introduction de contaminants provenant des activités anthropiques augmente rapidement. Ceci complique la situation par une accumulation importante des xénobiotiques dans l’eau et les sédiments (Ruiz-Fernandez et al., 2012). Les sources de pollutions sont de différentes origines, industrielles, agricoles ou du trafic maritime… mais principalement anthropique. Ainsi la contamination des milieux aquatiques par les pesticides, les hydrocarbures, les PCB et les métaux est devenue un problème environnemental extrêmement important au cours de ces dernières décennies (Li et al., 2014; Guo et al., 2014; Zhang et al., 2014; Wasswa et al., 2011; Schoellhamer et al., 2007; Chang et al., 2006). A cause de leur biodisponibilité élevée les xénobiotiques se retrouvent dans les différents types d’écosystèmes aquatiques : lagunes (Acquavita et al., 2014 ; Pavoni et al., 2003), lacs (Zhi et al., 2015 ; Rasmussen et al., 2014), rivières (Yu et al., 2014 ;Wang et al., 2015 ; Xia et al., 2015), mer (Yancheshmeh et al., 2014 ; Ji et al., 2015), océan (Yunker et al., 2011 ; Aparicio-González et al., 2012). Dans ces écosystèmes les polluants s’accumulent le long de la chaine trophique (Pérez-Ruzafa et al., 2000 ; Verweij et al., 2004 ; Oliveira Ribeiro et al., 2005 ; Miranda et al., 2008). La bioaccumulation et la bioamplification au niveau de la faune et la flore benthiques et pélagiques ont été prouvées par plusieurs travaux (Jantunen et al., 2008 ; Pickard et Clarke, 2008 ; Daley et al., 2009 ; Norwood et al., 2013).

Les produits phytosanitaires sont une solution face aux menaces par les pestes (insectes, champignons, mauvaises herbes…) en agriculture pour essayer de minimiser les pertes en rendement de la production agricole. L’emploi de ces produits chimiques n’a cessé de croître avec l’intensification des cultures (Lakshmi, 1993 ; Temme et Verburg, 2011). Ces produits rejoignent le milieu aquatique par ruissellement menaçant son fonctionnement (Chang et al., 2006, Wen et al., 1994). Les hydrocarbures aromatiques polycycliques proviennent essentiellement du trafic maritime (déballastage) et des industries de raffinage. Ils sont omniprésent dans les différentes matrices des écosystèmes aquatiques (Shu et al., 2000; Ben Said et al., 2010; Opel et al., 2011).

Les polychlorobiphényles proviennent essentiellement des activités industrielles, ils sont utilisés comme des stabilisateurs depuis 1929. L'accumulation de ces composés est principalement liée à leurs fortes propriétés lipophiles et de la résistance à la dégradation (Jaspers et al., 2006). La toxicité des PCB dépend du nombre et la localisation des atomes de chlore sur la structure cyclique. Structurellement, deux classes de PCB sont distinguées, coplanaires (non-ortho-substitué, par exemple 3,3,4,4,5-pentachlorobiphényle; PCB 126) et non-coplanaires (ortho-substituté, par exemple 2,2,4,4,5,5-hexachlorobiphenyle; PCB153) et ses congénères (Katarzynska et al., 2015).

La surveillance des milieux aquatiques est souvent réalisée par la mesure des paramètres physico-chimiques, de polluants organiques et métalliques dans les différentes matrices environnementales (sédiment, eau et matrices biologiques). L’impact environnemental est évalué par l’étude des organismes vivant dans ce milieu. Le choix des méthodes analytiques dépend de plusieurs critères : rentabilité, facile à manipulé et rapidité. Les méthodes d’extraction classiques tel que la méthode soxhlet, par micro-ondes et par ultrasons, utilisées pour doser les polluants organiques dans les matrices environnementales (Boer et Law, 2003; Carvalho et al., 2008; Cueva-Mestanza et al., 2008), sont souvent coûteuses et nécessitent de grands volumes de solvant d’extraction et beaucoup de temps. Une nouvelle méthode est maintenant disponible, consomme beaucoup moins de solvant organique avec une extraction des composés rapide, comme la méthode QuEChERS : quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe (Pinto et al., 2011 ; Satpathy et al., 2011). Mais cette méthode n’est pas encore validée pour toutes les molécules ni pour toutes les matrices environnementales.

La biosurveillance des écosystèmes consiste à utiliser les organismes biologiques pour évaluer l’impact de la pollution sur un milieu donnée. En général la biosurveillance est déterminée soit par des bioindicateurs (qualitatif) ou des biomarqueurs (quantitatif). La bioindication est basée sur la présence et/ou l’absence d’espèces au sein d’un écosystème. Cela nécessite de connaître les paramètres écologiques influençant la répartition de ces espèces, ainsi que leur sensibilité face aux polluants recherchés (Agnan, 2013). Un biomarqueur est une réponse biologique pouvant être reliée à une exposition ou à des effets toxiques de contaminants chimiques présents dans l’environnement cette activité peut être une quantité anormale d’enzymes ou une altération biochimique, physiologiques ou comportementales (Kerambrun, 2011). Le benthos et plus précisément les bactéries et les nématodes libres marins hébergés dans les sédiments jouent un rôle de bioindicateurs de la pollution (Moreno et al., 2011 ; Losi et al., 2013). Les bioindicateurs sont définis comme étant des organismes biologiques utilisés

2 pour évaluer les conditions environnementales dans le milieu qu’ils habitent selon des caractéristiques observées (abondance, biomasse, diversité, co-occurrence…) (Galloway et al., 2004; Brown et al., 2001).

Les travaux de biosurveillance du complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte se sont intéressés aux HAP dans la lagune de Bizerte (Mzoughi et al., 2002 ; Ben Said et al., 2010). Le lac Ichkeul n’a jamais fait l’objet d’étude écotoxicologique en considérant les polluants organiques. Aussi aucune étude ne s’est intéressée aux microorganismes au niveau du lac.

Ce travail de thèse s’intéresse précisément à l’ensemble du complexe hydrologique lac Ichkeul-Lagune de Bizerte, à fin de répondre aux questions écologiques suivantes :

 Recenser les pesticides les plus utilisés dans les zones agricoles entourant le complexe lac Ichkeul-Lagune de Bizerte, par une enquête de terrain.  Investiguer la contamination chimique dans le complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte par les pesticides agricoles, les hydrocarbures aromatiques polycycliques, les polychlorobiphényles et les organo-métaux.  Déterminer les impacts de la présence de ces contaminants dans le complexe sur les communautés bactériennes et la densité des nématodes libres marins indigènes du sédiment  Aider l’ANPE à maîtriser la gestion de l’écluse de Tinja en déterminant la relation lac-lagune: Qui influence l’autre de point de vue écotoxicologique?

La nouveauté dans ce travail réside dans la combinaison des différentes approches mises en œuvre : enquête, analyses chimiques et analyses biologiques. Ainsi que l’investigation chimique et microbiologique du lac Ichkeul qui est une aire protégée et un site de l’UNESCO qui n’a été jamais fait l’objet d’études. L’enquête sur les pesticides est aussi une première en Tunisie où les données sur l’utilisation des pesticides en agriculture dans ce pays sont inexistantes.

Notre travail sera articulé comme suit :

 Le chapitre 1 « Synthèse bibliographique » sera consacré à une analyse sur l’état de l’art de la problématique. Il présentera la contamination des écosystèmes aquatiques par les polluants organiques (Pesticides agricoles, hydrocarbures aromatiques polycycliques et polychlorobiphényles), ainsi la surveillance des écosystèmes

aquatiques par les méthodes d’analyses chimiques et par les organismes biologiques. Enfin le site d’étude, le complexe lac Ichkeul-Lagune de Bizerte, sera présenté.  Le chapitre 2 «Matériels et méthodes » présentera les stratégies d’échantillonnage ainsi que les démarches expérimentales suivies pour les différentes analyses des échantillons.  Le chapitre 3 sera consacré à « Stratégie de hiérarchisation des polluants chimiques d’intérêt à étudier dans le complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte » ce chapitre sera divisé en deux parties. La première partie sera réservée au premier recensement des pesticides agricoles utilisés en grandes cultures dans le bassin versant du lac Ichkeul et la lagune de Bizerte (Tunisie) (Publication 1) et la deuxième partie sera consacrée à la validation et adaptation d’une méthode d’analyse chimique pour la détermination simultanée des HAP, PCB et OCP dans le sédiment du complexe Lac Ichkeul-Lagune de Bizerte par GC-MS (Publication 2&3).  Le chapitre 4 sera consacré à la « Bio-surveillance du complexe lac Ichkeul lagune de Bizerte : biodiversité microbienne et la densité des nématodes libres marins » ce chapitre mettra l’accent sur les impacts écologiques de la présence des polluants organiques HAP et OCP sur les communautés bactériennes et la densité des nématodes libres marins du sédiment du complexe Lac Ichkeul-Lagune de Bizerte (Publication 4 & 5).  Ce mémoire s’achève par une conclusion générale récapitulant nos principaux résultats et présente des perspectives de recherche.

Références bibliographiques

Agnan Y, 2013. Bioaccumulation et bioindication par les lichens de la pollution atmosphérique actuelle et passée en métaux et en azote en France : sources, mécanismes et facteurs d'influence. Thèse de Doctorat, Université de Toulouse, p46.

Acquavita A, Falomo J, Predonzani S, Tamberlich F, Bettoso N, Mattassi G, 2014. The PAH level, distribution and composition in surface sediments from a Mediterranean Lagoon: The Marano and Grado Lagoon (Northern Adriatic Sea, Italy). Marine Pollution Bulletin, 81: 234-241.

Aparicio-González A, Duarte CM, Tovar-Sánchez A, 2012. Trace metals in deep ocean waters: A review.Journal of Marine Systems, 100–101: 26-33.

Ben Said O, Goñi-Urriza M, El Bour M, Aissa P, Duran R, 2010. Bacterial Community Structure of Sediments of the Bizerte Lagoon (Tunisia), a Southern Mediterranean Coastal Anthropized Lagoon. Microbial Ecology, 59: 445-456. de Boer J, Law RJ, 2003. Developments in the use of chromatographic techniques in marine laboratories for the determination of halogenated contaminants and polycyclic aromatic hydrocarbons. Journal of Chromatography A, 1000: 223-251.

Carvalho PN, Rodrigues PNR, Alves F, Evangelista R, Basto MCP, Vasconcelos MTSD, 2008. An expeditious method for the determination of organochlorine pesticides residues in estuarine sediments using microwave assisted pre-extraction and automated headspace solid- phase microextraction coupled to gas chromatography–mass spectrometry. Talanta, 76: 1124- 1129.

Čerepnalkoski D, Taškova K, Todorovski L, Atanasova N, Džeroski S, 2012. The influence of parameter fitting methods on model structure selection in automated modeling of aquatic ecosystems.Ecological Modelling, 245: 136-165.

Ciric C, Ciffroy P, Charles S, 2012.Use of sensitivity analysis to identify influential and non- influential parameters within an aquatic ecosystem model. Ecological Modelling, 246: 119- 130.

Cueva-Mestanza R, Sosa-Ferrera Z, Torres-Padrón M.E., Santana-Rodríguez J.J., 2008. Preconcentration of pharmaceuticals residues in sediment samples using microwave assisted micellar extraction coupled with solid phase extraction and their determination by HPLC–UV. Journal of Chromatography B, 863: 150-157.

Daley JM, Leadley TA, Drouillard KG, 2009. Evidence for bioamplification of nine polychlorinated biphenyl (PCB) congeners in yellow perch (Perca flavascens) eggs during incubation. Chemosphere, 75: 1500-1505.

Ruiz-Fernández AC, Sprovieri M, Piazza R, Frignani M, Sanchez-Cabeza JA, Feo ML, Bellucci LG, Vecchiato M, Pérez-Bernal LH, Páez-Osuna F, 2012. 210Pb-derived history

5 of PAH and PCB accumulation in sediments of a tropical inner lagoon (Las Matas, Gulf of Mexico) near a major oil refinery. Geochimica et Cosmochimica Acta, 82: 136-153.

Galloway TS, Brown RJ, Browne MA, Dissanayake A, Lowe D, Jones MB, Depledge MH, 2004. Ecosystem management bioindicators: the ECOMAN project – a multi-biomarker approach to ecosystem management. Marine Environmental Research, 58: 233-237.

Guo W, Zhang H, Huo S, 2014.Organochlorine pesticides in aquatic hydrophyte tissues and surrounding sediments in Baiyangdian wetland, China. Ecological Engineering, 67: 150-155.

Jantunen APK, Tuikka A, Akkanen J, Kukkonen JVK, 2008. Bioaccumulation of atrazine and chlorpyrifos to Lumbriculus variegatus from lake sediments. Ecotoxicology and Environmental Safety, 71: 860-868.

Ji T, Lin T, Wang F, Li Y, Guo Z, 2015. Seasonal variation of organochlorine pesticides in the gaseous phase and aerosols over the East China Sea. Atmospheric Environment, 109 :31-41.

Kerambrun E, 2011. Evaluation des effets biologiques des contaminants chimiques sur les juvéniles de poisson marin. Thèse de Doctorat. Université du Littoral Cote d’Opal. p22

Lakshmi A, 1993. Pesticides in India: risk assessment to aquatic ecosystems. Science of The Total Environment, 134:243-253.

Li Y, Niu J, Shen Z, Zhang C, Wang Z, He T, 2014. Spatial and seasonal distribution of organochlorine pesticides in the sediments of the Yangtze Estuary. Chemosphere, 114: 233- 240.

LosiV, Moreno M, Gaozza L, Vezzulli L, Fabiano M, Albertelli G, 2013. Nematode biomass and allometric attributes as indicators of environmental quality in a Mediterranean harbour (Ligurian Sea, Italy). Ecological Indicators, 30 : 80-89.

Miranda AL, Roche H, Randi MAF, Menezes ML, Oliveira Ribeiro CA, 2008. Bioaccumulation of chlorinated pesticides and PCBs in the tropical freshwater fish Hoplias malabaricus: Histopathological, physiological, and immunological findings. Environment International, 34 :939-949.

Moreno M, Semprucci F, Vezzulli L, BalsamoM, Fabiano M, Albertelli G, 2011. The use of nematodes in assessing ecological quality status in the Mediterranean coastal ecosystems. Ecological Indicators, 11 :328-336.

Mzoughi N, Lespes G, Bravo M, Dachraoui M, Potin-Gautier M, 2005. Organotin speciation in Bizerte lagoon (Tunisia). Science of The Total Environment, 349: 211-222. Norwood WP, Alaee M, Sverko E, Wang D, Brown M, Galicia M, 2013. Decamethylcyclopentasiloxane (D5) spiked sediment: Bioaccumulation and toxicity to the benthic invertebrate Hyalella azteca. Chemosphere, 93: 805-812.

Oliveira Ribeiro CA, Vollaire Y, Sanchez-Chardi A, Roche H, 2005. Bioaccumulation and the effects of organochlorine pesticides, PAH and heavy metals in the Eel (Anguilla anguilla) at the Camargue Nature Reserve, France. Aquatic Toxicology, 74: 53-69.

Opel O, Palm WU, Steffen D, Ruck WKL, 2011. Inside-sediment partitioning of PAH, PCB and organochlorine compounds and inferences on sampling and normalization methods. Environmental Pollution, 159: 924-931.

Pavoni B, Caliceti M, Sperni L, Sfriso A, 2003. Organic micropollutants (PAHs, PCBs, pesticides) in seaweeds of the lagoon of Venice. Oceanologica Acta, 26: 585-596.

Pérez-Ruzafa A, Navarro S, Barba A, Marcos C, Cámara MA, SalasF, GutiérrezJM, 2000. Presence of Pesticides throughout Trophic Compartments of the Food Web in the Mar Menor Lagoon (SE Spain). Marine Pollution Bulletin, 40: 140-151.

Pickard SW, Clarke JU, 2008. Benthic Bioaccumulation and Bioavailability of Polychlorinated Dibenzo-p-Dioxins/Dibenzofurans from Surficial Lake Ontario Sediments. Journal of Great Lakes Research, 34: 418-433.

Pinto CG, Herrero Martín S, Pérez Pavón JL, Moreno Cordero B, 2011. A simplified Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe approach for the determination of trihalomethanes and benzene, toluene, ethylbenzene and xylenes in soil matrices by fast gas chromatography with mass spectrometry detection. Analytica Chimica Acta, 689: 129-136.

Satpathy G, Tyagi YK, Gupta RK, 2011. A novel optimised and validated method for analysis of multi-residues of pesticides in fruits and vegetables by microwave-assisted extraction (MAE)–dispersive solid-phase extraction (d-SPE)–retention time locked (RTL)–gas chromatography–mass spectrometry with Deconvolution reporting software (DRS). Food Chemistry, 127: 1300-1308.

Jaspers VL, Covaci A, Voorspoels S, Dauwe T, Eens M, Schepens P, 2006. Brominated flame retardants and organochlorine pollutants in aquatic and terrestrial predatory birds of Belgium: 7 levels, patterns, tissue distribution and condition factors. Environmental Pollution, 139: 340- 352.

Katarzynska D, Hrabia A, Kowalik K, Sechman A, 2015. Comparison of the in vitro effects of TCDD, PCB 126 and PCB 153 on thyroid-restricted gene expression and thyroid hormone secretion by the chicken thyroid gland. Environmental toxicology and pharmacology, 39: 496- 503.

Rasmussen PW, Schrank C, Williams MCW, 2014. Trends of PCB concentrations in Lake Michigan coho and chinook salmon, 1975–2010. Journal of Great Lakes Research, 40: 748-754.

Schoellhamer DH, Mumley TE, Leatherbarrow JE, 2007. Suspended sediment and sediment- associated contaminants in San Francisco Bay. Environmental Research, 105: 119-131.

Tashkova K, Šilc J, Atanasova N, Džeroski S, 2012. Parameter estimation in a nonlinear dynamic model of an aquatic ecosystem with meta-heuristic optimization. Ecological Modelling, 226: 36-61.

Temme AJAM, Verburg PH, 2011. Mapping and modelling of changes in agricultural intensity in Europe. Agriculture, Ecosystems & Environment, 140: 46-56.

Verweij F, Booij K, Satumalay K, van der Molen N, van der Oost R, 2004. Assessment of bioavailable PAH, PCB and OCP concentrations in water, using semipermeable membrane devices (SPMDs), sediments and caged carp. Chemosphere, 54: 1675-1689.

Wang J, Liu G, Lu L, Zhang J, Liu H, 2015. Geochemical normalization and assessment of heavy metals (Cu, Pb, Zn, and Ni) in sediments from the Huaihe River, Anhui, China. CATENA, 129: 30-38.

Wen J, Jirka GH, Raggio G, 1994. Linked Sediment/Contaminant Transport Model for Rivers with Application to the Buffalo River, New York. Journal of Great Lakes Research, 20: 671- 682.

Xia X, Xia N, Lai Y, Dong J, Zhao P, Zhu B, Li Z, Ye W, Yuan Y, Huang J, 2015. Response of PAH-degrading genes to PAH bioavailability in the overlying water, suspended sediment, and deposited sediment of the Yangtze River. Chemosphere, 128: 236-244.

Yancheshmeh RA, Bakhtiari AR, Mortazavi S, Savabieasfahani M, 2015. Sediment PAH: Contrasting levels in the Caspian Sea and Anzali Wetland. Marine Pollution Bulletin, 84: 391-400.

Yang Yu, Yingxia Li, Zhenyao Shen, Zhifeng Yang, Li Mo, Yanhong Kong, Inchio Lou, 2014. Occurrence and possible sources of organochlorine pesticides (OCPs) and polychlorinated biphenyls (PCBs) along the Chao River, China. Chemosphere,114: 136-143.

Yunker MB, Macdonald RB, Snowdon LR, Fowler BR, 2011. Alkane and PAH biomarkers as tracers of terrigenous organic carbon in Arctic Ocean sediments.Organic Geochemistry, 42: 1109-1146.

Zhi H, Zhao Z, Zhang L, 2015. The fate of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and organochlorine pesticides (OCPs) in water from Poyang Lake, the largest freshwater lake in China. Chemosphere, 119: 1134-1140.

CHAPITRE I :

SYNTHESE

BIBLIOGRAPHIQUE

CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

I. Contamination des écosystèmes aquatiques par les polluants organiques

I.1. Polluants d’origine agricole : les pesticides

L'intensification de la production agricole, dans le monde, suite à l’explosion démographique est accompagnée par des problèmes d'utilisation excessive et abusive de pesticides (Lakshmi, 1993 ; Temme et Verburg, 2011). Les pesticides appelés aussi produits phytosanitaires ou produits phytopharmaceutiques sont des produits chimiques organiques ou minéraux constitués d’un ou plusieurs substances actives et de composés supplémentaires tels que diluant et adjuvant. Ils sont utilisés par les agriculteurs pour lutter contre les organismes nuisibles aux cultures. Les pesticides sont classifiés selon plusieurs critères :

 La nature de la cible:

 les insecticides pour lutter contre les insectes, ils interviennent en les éliminant ou en empêchant leur reproduction, différent type existent : les neurotoxiques, les régulateurs de croissance et ceux agissant sur la respiration cellulaire.  les herbicides agissent contre les mauvaises herbes, ils possèdent différents modes d’action, ils peuvent être des perturbateurs de la régulation d’une hormone, de la photosynthèse ou encore des inhibiteurs de la division cellulaire, de la synthèse des lipides, de cellulose ou des acides aminés.  les fongicides utilisés pour protéger les plantes contre les champignons, ils interviennent soit en inhibant le système respiratoire ou la division cellulaire soit en perturbant la biosynthèse des acides aminés, des protéines ou le métabolisme des glucides.  Il y’a d’autres groupes moins utilisés que les trois grandes classes cités, comme les rodonticides, les némanticides...

 La nature chimique des substances actives :

 Les pesticides organochlorés (POC) sont des composés organiques comportant au moins un atome de chlore lié à un atome de carbone. Ce sont les premiers pesticides

organiques synthétiques utilisés en agriculture. Ils sont connus pour leur persistance dans l’environnement et leur toxicité très élevée (Totten et al., 2004 ; Jiang et al., 2009). Ils ont des demi-vie allant de 3à 20 ans (Lintellman et al., 2003). Les POC ont un fort potentiel de bioaccumulation et de bioamplification dans les tissus biologiques et peuvent même poser des risques pour les êtres humains par le biais de la chaîne alimentaire (Guo et al., 2014).

Fig1. Structure chimique de deux organochlorés dérivés du DDT

 Les pesticides organophosphorés (OP) sont des composés organiques comportant au moins un atome de phosphore lié directement à un atome de carbone. Ils ont été synthétisés pour remplacer les pesticides de 1ère génération (les organochlorés) vu leurs toxicité très élevée et leurs persistance dans l’environnement. Les pesticides organophosphorés sont liquides, faiblement volatils, légèrement solubles dans l’eau et possèdent des coefficients de partage huile-eau élevés (Who, 1986). Les OP ont une toxicité à court terme contrairement aux pesticides organochlorés persistants. Les OP ont cependant des toxicités aiguës supérieures à celles des pesticides chlorés, mais ils vont être d'avantage dégradés et plus rapidement dans l'environnement. Leurs effets toxicologiques sont pour la plupart due à l'inhibition de l'acétylcholinestérase dans le système nerveux (Goh et al., 1990).  Les pesticides carbamates sont des composés organiques porteurs d'une fonction esters substituée de l'acide carbamique ou d'un amide substitué. Les carbamates sont également des inhibiteurs de cholinestérase avec un mécanisme d'action similaire aux organophosphorés (Fukuto, 1990). Ils sont très biodégradables et donc moins persistants dans l'environnement que les autres classes de pesticides (les pyréthrinoïdes, organophosphorés et organochlorés). Ils sont dangereux pour l'environnement et la santé humaine parce qu’ils sont des toxines du système nerveux

central et perturbateurs endocriniens fortes, affectant les humains et les animaux à faible dose.

 Une nouvelle classification selon les propriétés chimiques (Gevao et al., 2000) :  Pesticides non ioniques tel que les organochlorés, les organophosphorés, les dinitroanilides et les carbanilates…  Pesticides ioniques cationiques basiques acides et autres…

Les pesticides améliorent les profits de l'agriculture par la diminution des pertes de récoltes dues aux menaces phytosanitaires (insectes ravageurs, mauvaises herbes, champignons, rongeurs…). Cependant, les pesticides, sont des poisons, peuvent mettre en danger la santé humaine et des animaux (Fabro et Varca, 2012). En outre, les risques potentiels pour l’Homme et la faune sont causés par des résidus de pesticides persistants, ainsi leur capacité à s'accumuler dans la chaîne alimentaire pose une grande menace pour la santé humaine et l'environnement mondial (Levitan, 2000; Fabro et Varca 2012). L’utilisation excessive de certains pesticides a entrainé le développement de résistances des ravageurs. L’apparition de ces résistances a conduit à la fabrication de nouvelles générations de pesticides, d’où un nombre important de molécule et une grande diversité de matières actives utilisées.

a. Ecosystème aquatique : Réceptacle des polluants agricoles

Après l’application des pesticides sur les champs, et suite au phénomène d’érosion, les résidus restant se retrouvent dans les eaux de ruissellement (Chang et al., 2006), selon différents processus diffusion, désorption, dissolution (Lazartigues, 2010). Un écosystème aquatique, marin ou d’eau douce, abrite des organismes vivants. Ces derniers interagissent entre eux et aussi avec leur milieu. Les écosystèmes aquatiques sont formés d’une colonne d’eau abritant les organismes pélagiques et d’une interface eau/sédiment abritant les organismes benthiques (Lambshead et Schalk, 2001). Au niveau de la colonne d’eau les pesticides sont biodisponibles (Guo et al., 2008 ; Phyu et al., 2006), ils se bioaccumulentdans les organismes pélagiques (Galvao et al., 2012; Szlinder-Richert et al., 2008 ; Miranda et al., 2008). Aussi ils s’adhérent aux particules sédimentaires en suspension dans l’eau (Warren et al., 2003) qui vont ensuite sédimenter et se bioaccumuler dans les sédiments (Choi et al., 2014 ; Masiá et al., 2013 ; Smalling et al., 2013 ; Wang et al., 2013 ; Zhao et al., 2009 ; Darko et al., 2008). Plusieurs travaux ont déterminé la contamination des écosystèmes aquatiques par les

13 pesticides agricoles de part le monde. La concentration et le devenir des pesticides organochlorés dans les sédiments de surface de l'estuaire des rivières Erh-jen et Lan-yang à Taiwan ont été étudiés par Chang et Doong en 2006. Ces travaux ont montré une contamination de ces écosystèmes par les hexachlorocyclohexanes (HCH) et les Dichlorodiphényltrichloroéthanes (DDT) provenant des zones agricoles. Des concentrations significativement élevées des pesticides ont été détectées dans les poissons d’élevage en mer de Chine (Guo et al., 2008). Une contamination élevée a été déterminée chez des espèces de bivalves marins collectés sur les côtes de Rio de Janeiro au Brazil (Galvao et al., 2012). Malgré leur interdiction depuis les années 70, les pesticides organochlorés notamment le DDT et leurs dérivés sont encore omniprésents dans les matrices environnementales (Guo et al., 2008 ; Galvao et al., 2012). Ces derniers sont très connus pour leur toxicité élevée suite à leurs bioconcentration, bioaccumulation et bioaugmentation le long de la chaine trophique des écosystèmes aquatiques (Siriwong et al., 2009, Warrena et al., 2003).

Fig 2. Mode de transfert des pesticides dans l’environnement

La figure 3 montre le devenir des pesticides et des contaminants micro-organiques (MOC) dans le milieu aquatique dés l’introduction des contaminants micro-organiques dans l’eau de mer ils seront biodisponible pour le pélagos. Ensuite ils s’adhèrent au sédiment en suspension. Enfin ils arrivent au fond et se diffusent dans le sédiment de fond (Warrena et al., 2003).

Source et transport de MOCs Air

Dégradationde Eau Occurrence de MOC Lumière MOC Ecotoxicologie et Bactéri biodisponibilité de MOCs e Réactifs Association de MOCs avec le sédiment chimiques

Transport de MOC sur le sédiment suspendu

Diffusion de MOC dans Oligochètes le sédiment Influence de bioturbation sur MOCs

Fig 3. Devenir des pesticides et des contaminants micro-organiques (MOC) dans le milieu aquatique (Warrena et al., 2003)

b. Propriétés physico-chimique des pesticides

Les pesticides sont considérés parmi les contaminants environnementaux les plus dangereux en raison de leur tendance à la bioaccumulation, de leur persistance, de leur mobilité et de leurs effets à long terme sur les organismes vivants (Nowell et al., 2014 ; Andreu et Picó, 2012). Le coefficient de partage carbone organique/eau et le temps de demi-vie des matières actives des différents pesticides assurent leurs biodisponibilité (Worrall et Kolpin, 2004). La demi-vie est le temps nécessaire pour qu’une matière active perde la moitié de son activité pharmacologique ou physiologique. Le coefficient de partage carbone organique/eau (Koc) nous renseigne sur l’aptitude de la molécule à être adsorbée ou désorbée sur la matière organique : Les matières actives représentant un Koc élevé sont fortement adsorbées et retenues à la surface du sol donc elles seront moins lessivées, donc elles ne seront transportées dans le milieu aquatique que par érosion (Willis et al., 1983). Les molécules aux faibles Koc vont être retrouvées avec les plus fortes concentrations dans la phase aqueuse du ruissellement. (Klöppel et al., 1997 ; Klöppel et al., 1994 ; Southwick et al., 1997 ; Wauchope et al., 1978 ; Wauchope et al. 2002). En arrivant dans les écosystèmes marins les pesticides sont biodisponibles (Siriwong et al., 2009, Warrena et al., 2003). La biodisponibilité de ces

15 contaminants augmente suite à la biotransformation de ces molécules par les biofilms microbiens (Widenfalk et al., 2008).

I.2. Polluant d’origine industrielle : HAP et PCB

a. Contamination des écosystèmes par les HAP

Les hydrocarbures peuvent être classés en trois familles :  les hydrocarbures saturés, qui ne possèdent pas de double ou de triple liaison ; ils peuvent être linéaires (alcanes ou paraffines), ramifiés (isoparaffines) ou cycliques (cycloalcanes, appelés aussi naphtènes).  les hydrocarbures insaturés, qui possèdent une ou plusieurs doubles liaisons (alcènes) ou triple(s) liaisons (alcynes), les hydrocarbures (poly)insaturés, alcènes, sont principalement d’origine biogénique, synthétisés par des organismes vivants.  Les hydrocarbures aromatiques, qui comportent un cycle aromatique (composés monoaromatiques) ou plusieurs cycles aromatiques (composés polyaromatiques), une description plus précise des hydrocarbures polyaromatiques sera présentée ultérieurement.

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des composés benzéniques dont le nombre des cycliques est variable. L’arrangement des anneaux de benzènes diffère aussi d’une molécule à l’autre (Blumer, 1976). Ces deux critères permettent de distinguer des HAP de faible poids moléculaire (LMW-HAP), dont la masse molaire est comprise entre 150 et 180 g mol-1 (moins de quatre cycles aromatiques), des HAP de haut poids moléculaire (HMW- HAP) dont les masses molaires varient au delà de 200 à 280 g mol-1 (au moins quatre cycles aromatiques) (Bouchez et al., 1996). Ces molécules sont ubiquistes dans l’environnement. Deux sources d’HAP sont connues dans l’environnement soit pyrogéniques ou pétrogéniques. Les sources pyrogéniques proviennent de la combustion de combustibles fossiles brute, de la combustion incomplète de matière organique (par exemple le charbon, le pétrole, le bois). Les sources pyrogènes comprennent aussi les opérations industrielles et des centrales électriques, de l’utilisation de combustibles fossiles, la fusion, d’incinérateurs de déchets, gaz d'échappement des véhicules à l'essence ou diesel, et d’incendies de forêt. La plupart des HAP pyrogènes sont émis dans l'atmosphère sous forme de suies ou de gaz. Ils se retrouvent en milieux marins suite aux retombées atmosphériques directe et aux ruissellements de surface (Boonyatumanond et al., 2006). Les sources pétrogéniques sont le pétrole brut et les produits pétroliers (le kérosène, l'essence, le carburant diesel, l'huile de lubrification, et de l'asphalte) 16 qui pénètrent dans l'environnement aquatique par les déversements direct d'hydrocarbures, ou dans l’eau de ballast (Boonyatumanond et al., 2006) et les suitements naturels (Safronov et al., 2014).

Les HAP ont des propriétés physico-chimiques qui les rendent persistants dans l’environnement. A l’exception du naphtalène, leur solubilité dans l’eau est très faible.

Parallèlement, leurs coefficients de partage octanol/eau (Kow) sont relativement élevés, témoignant d’un important potentiel de bioconcentration dans les organismes. Plusieurs travaux ont prouvé la contamination des écosystèmes aquatiques par les HAP. Ils sont présents dans les sédiments un peu partout dans le monde avec des teneurs plus ou moins élevées. Ils ont été retrouvés dans les sédiments de Caleta Cordova, Patagonia en Argentina (Isaac et al., 2013), de Sydney Harbour, en Nouvelle-Écosse (Smith et al., 2009) et du golfe de Lion en France (Domine et al., 1994). Une étude analytique des HAP dans les sédiments côtiers, de la mer Caspienne et des zones humides d’Anzali menée en 2010, a montré que les concentrations de HAP totaux se situaient entre 212 et 9009 ng.g-1 ms (Yancheshmeh et al., 2014). Les mêmes concentrations ont été reportées pour les sédiments du sud-ouest de la mer de Barents (Boitsov et al., 2009). La variation des concentrations des HAP dans les sédiments collectés de différents sites de Hamilton Harbour a été investiguée par Slater et al., (2008). Ils ont montré la contamination élevée de plusieurs sites. En Tunisie plusieurs travaux ont montré la contamination de la lagune de Bizerte par les HAP (Mzoughi et al., 2002 ; Trabelsi et Driss, 2005 ; Ben Said et al., 2010).

Fig 4. Structures chimiques des 16 HAP prioritaires de la liste de l’Agence Américaine de

l’Environnement

b. Contamination des écosystèmes par les PCB

Les PCB sont des molécules exclusivement synthétiques. Ils sont formés essentiellement de deux atomes de phényls. Ces contaminants proviennent essentiellement des rejets industriels puisqu’ils sont présents dans les retardateurs de flammes. Ils ont été synthétisés la première fois en 1881 (Schmidt et Schultz 1881), mais la production de ces composés a fortement augmenté en 1960. Une enquête a été effectuée par Breivik et al. (2002) afin d’estimer les quantités de PCB produites dans le monde, elle atteint un total d’environs 1,3 106 tonnes. La distribution de la consommation de ces quantités dans les différents pays est présentée sur la figure 4. Les PCB sont inertes chimiquement, très peu inflammables, très peu soluble dans l’eau. Par contre, ils sont très solubles dans les solvants organiques. Ces propriétés physico- chimiques leur donnent une résistance à l’oxydation et aux fortes températures, d’où leurs utilisations intensive dans l’industrie. Ces mêmes propriétés qui les ont rendu très utiles dans

18 l’industrie, leur confère un effet néfaste sur l’environnement (Leaute, 2008). Les écosystèmes aquatiques recevant des rejets industriels sont contaminés par les PCB à des degrés différents. Les PCB ont été détectés dans l’eau, le sédiment et des espèces animales de la rivière Arrone en Italie (Bazzanti et al., 1997) et la lagune de Terminos au Mexique (Carvalho et al., 2009) ainsi que dans les sédiments de l’aire protégé le lake Qarun en Egypte et dans les sédiments et les moules collectés de l’étroit des côtes de Istanbul en Turquie (Okay et al., 2009).

Fig 5: Estimation de la consommation mondiale cumulée de PCB (légendes en tonnes)

(Breivik et al., 2002)

I.3. Réglementation et normes

La littérature scientifique a montré que les résidus de pesticides et HAP peuvent affecter la santé humaine. Les pesticides provoquent une toxicité neurologique aigue, un dysfonctionnement des systèmes immunitaire, de reproduction et endocrinien. L’exposition aux pesticides peut être la cause de développement de cancer. Les HAP sont mutagènes et carcinogènes (Shabad, 1973). Ainsi la prise de conscience croissante du public concernant l’utilisation des pesticides et la réglementation dans les années 1970 et 1980 ont donné lieu à l'interdiction de nombreux pesticides traditionnels tels que le DDT et la plupart des organochlorés. Ceci a conduit à la mise au point et l'homologation d’une nouvelle génération moins persistante telle que les organophosphorés (Andreu et Picó, 2012).

Plusieurs organisations de santé et de protection de l'environnement, tels que le Centre international de recherche sur le cancer et l'Agence de Protection Environnementale ont classé presque tous les POC comme potentiellement cancérogènes pour l'homme (2B) et les PCB comme cancérogène probable (2A) pour l'homme (IARC, 1991; USEPA, 1996 ; Çok et al., 2012). Selon ces mêmes organisations, plusieurs HAP sont mutagènes, cancérogènes et ils ont des propriétés de perturbation endocrinienne (IARC, 1983; USEPA, 1984; Çok et al., 2012).

La Convention de Stockholm sur les polluants organiques persistants (POP), qui est entrée en vigueur en 2004, exigent l’élimination ou la réduction des rejets dans l'environnement de plusieurs pesticides organochlorés, à savoir l'aldrine, le chlordane, DDT, dieldrine, endrine, heptachlore, hexachlorobenzène, mirex, toxaphène, le chlordécone, l’hexachlorocyclohexane, le lindane et le pentachlorobenzène. Certains de ces pesticides, comme le DDT, sont encore permis pour certaines applications et sont donc encore en mesure de contaminer l'environnement.

Plusieurs normes ont été élaborées par les centres de recherches en environnement. Parmi celles-ci, les normes américaines NOAA (Administration Océanique et Atmosphérique Nationale) en déterminant le niveau du seuil d’effet appelé TEL (threshold effects level), le niveau d’effet probable PEL (Prabable effect level) et d’autres normes dans le sédiment marin et d’eau douce, dans l’eau et le sol pour les HAP, pesticides et autres polluants (NOAA, 1999).

TEL Sediment marin Sediment d’eau douce (ng.g-1 ms) (ng.g-1 ms)

HAP: Acenaphtène 6,71 Acenaphtylène 5,87 Anthracène 46,85 Benzo[a]pyrène 88,1 31,9 Benz[a]anthracène 74,83 31,7 Chrysène 107,77 57,1 Dibenz[a,h]anthracene 6,22 Fluoranthène 112,82 111 Fluorène 21,17 Naphtalène 34,57 Phénanthrène 86,68 41,9 Pyrène 152,66 53 Pesticides: Chlordane 2,26 4,5 p,p DDD 1,22 3,54 p,p DDE 2,07 1,42 p,p DDT 1,19 DDT total 3,89 6,98 Dieldrin 0,715 2,85 Endrin 2,67 Lindane 0,32 0,94

II. Biosurveillance des écosystèmes aquatiques

II.1.Importance du Benthos dans la biosurveillance des écosystèmes aquatiques

a. Sédiment

Le sédiment est un dépôt de matériel meuble d’origine minérale ou biogène qui subit des processus de diagenèse pour constituer une roche sédimentaire. Les particules solides de sédiment dans les milieux côtiers sont constituées au moins de 1% de matière organique provenant de la décomposition des organismes aquatiques (Azandegbe, 2010) et de l’apport continental qui constitue la principale source d'énergie pour la vie dans la mer profonde (Smith et al., 2008). L’élément majeur de la matière organique est le carbone organique total (Leaute, 2008). Le sédiment est aussi le lieu où se déroulement plusieurs cycles biogéochimiques comme ceux du carbone, de l’azote, du soufre et du phosphore. Les cycles biogéochimiques du fer et du carbone organique sont fortement interdépendants, le fer est un facteur clé dans le stockage à long terme du carbone organique (Lalonde et al., 2012). Des considérations thermodynamiques et géochimiques indiquent que les cométabolismes microbiens sont susceptibles de jouer un rôle crucial dans le cycle sédimentaire du carbone organique (Prokopenko et al., 2013). Le rôle des flux de la matière organique dissoute benthique dans les cycles océaniques de carbone et d'azote est important. Elle a un rôle dans la préservation du carbone (Burdige et Komada, 2015). Le sédiment est soumis à des mouvements de remise en suspension. La vitesse de la remise en suspension du sédiment augmente en proportion directe avec la vitesse du vent, ceci est en relation avec les paramètres des vagues (hauteur des vagues et densité de l'énergie des vagues). Avec la hausse du vent de surface, une augmentation correspondante de la concentration et de la taille des particules de la matière particulaire en suspension est observée dans la colonne d'eau (Zheng et al., 2015).

b. Benthos

Le benthos désigne l’ensemble des organismes qui vivent dans le sédiment et à l’interface eau-sédiment. On distingue le phytobenthos (végétaux benthiques) et le zoobenthos (animaux benthiques). Ce dernier est subdivisé en trois groupes : le macrobenthos, visible à l’œil nu de taille supérieure à 1 mm, le méiobenthos, de taille comprise entre 40 et 100 µm visible sous loupe binoculaire et le microbenthos, de taille inferieure à 63 μm nécessitant la microscopie

22 pour leur visualisation. Le benthos joue un rôle dans la chaine trophique benthique et il a aussi un rôle comme témoins des variations environnementales et des perturbations anthropiques (Guidi-Guilvard et Dallot, 2014 ; Walters et al., 2014 ; Losi et al., 2013 ; Moreno et al., 2011). Le benthos subit une variété de perturbations qui peuvent être occasionnelles, telles les tempêtes benthiques, les flux de turbidité, les changements de locaux et l’abondance de certaines espèces. Ces différents processus ont des répercussions importantes sur les assemblages benthiques (Jumars et Wheatcroft, 1989).

Le microbenthos est représenté par les bactéries qui sont les organismes les plus anciens sur Terre. Elles sont présentes dans pratiquement tous les environnements et sont abondants dans tous les écosystèmes aquatiques. Les processus microbiens jouent un rôle primordial dans le fonctionnement des écosystèmes. Les communautés bactériennes dépendent des facteurs abiotiques tels que les nutriments et le carbone qui servent de ressources pour leur métabolisme énergétique. De nombreuses réactions biogéochimiques se produisant dans les sédiments marins sont catalysées par les communautés complexes de bactéries. L’identification des microorganismes spécifiques à des transformations chimiques bien déterminées a été un défi pour les microbiologistes, car les microorganismes manquent généralement de détails morphologiques et sont donc beaucoup plus difficile à identifier que les macro-organismes. Contrairement à leur gamme étroite de morphologies, les microorganismes sont génétiquement très diversifiés. Cette diversité génétique a été récemment exploitée pour l'identification in situ des cellules microbiennes individuelles, et même de leurs activités biochimiques. Ceci permet aux scientifiques d’utiliser des outils basés sur les acides nucléiques tels que le clonage, le séquençage et l'hybridation permettant l’analyse de la diversité, de la structure et des fonctions des communautés microbiennes (MacGregor et al., 2003).

En écotoxicologie, l’évaluation de la qualité des milieux aquatiques se base sur des analyses chimiques par dosage des contaminants, mettant en oeuvre des biomarqueurs ou des bioindicateurs. Les bio-indicateurs sont des organismes biologiques animaux ou végétaux qui donnent des indications sur la présence ou l’effet de xénobiotiques. L’effet des xénobiotiques, direct ou indirect, peut être évalué par la disparition de certaines espèces sensibles ou, au contraire, par la prolifération d’espèces résistantes (Fleeger et al., 2003). La meiofaune, en général, et particulièrement les nématodes libres marins, sont des bioindicateurs. La méiofaune, vivant à l’interface eau/sédiment et dans les premiers centimètres du sédiment, regroupent différents taxons : les nématodes, les oligochètes, les polychètes, les copépodes et

23 d’autres. Les nématodes libres marins sont des vers ronds, pseudo-coelomates, insegmentés, circulaires et recouverts d’une cuticule. Les nématodes représentent le taxon le plus diversifié du règne Animal avec un intervalle estimé de 0,1 à 100 millions d’espèces (Meldal et al., 2007). Ils sont utilisés comme bioindicateurs de la pollution. Parmi le benthos, les nématodes libres marins témoignent les perturbations environnementales. Ils ont été utilisés comme des bioindicateurs dans de nombreuses études écotoxicologiques, ce choix est dû à leurs avantages par rapport aux autres taxons méiobenthique (Aissa, 1991) :

 Les nématodes sont les métazoaires les plus abondants dans les sédiments marins, ils représentent avec les formes parasites jusqu’à 95% du domaine benthique en substrats meubles et ils sont qualifiés d’animaux ubiquistes  Ils possèdent des cycles vitaux particulièrement courts sans phases larvaires planctonique  Leur taille minuscule ne nécessite pas de grandes enceintes

Les nématodes ont un rôle bioturbateur, ils sont les plus actifs, avec les ostracodes, parmi les différents taxons méiobentiques. Ils creusent des galeries et brassent le sédiment favorisant ainsi l’oxygénation des strates les plus profondes (Fig 6) (Cullen, 1973 ; Aissa 1991).

Fig 6. Réseau complexe de terriers de nématodes rapprochés dans le sédiment, vu à travers la paroi latérale du verre de réservoir aquarium (Cullen, 1973).

Les nématodes ont aussi un rôle important dans la minéralisation de la matière organique. Cette dernière joue un rôle crucial dans le cycle biogéochimique du carbone dans les écosystèmes marins, fournissant ainsi la principale source de nourriture pour le benthos d'eau profonde. Les sources de la matière organique sont différentes. Elle provient des détritus exogène et les détritus endogène issue de la dégradation des organismes animaux ou végétaux morts ou des excréta des animaux s’accumulant sur le fond (Aissa, 1991). La composition

24 chimique des particules organiques change lors de l'immersion à cause de leur colonisation et la consommation par des bactéries hétérotrophes, de sorte que leur teneur en matière organique labile est largement utilisé avant qu'ils n’atteignent le fond en haute mer. En revanche, les particules de grande taille telles que les boulettes fécales, les phytodétritus et les macro-agrégats ont un fort taux de sédimentation et atteignent le fond de la mer en subissant seulement quelques petites modifications chimiques (Danovaro et al., 2000). Les communautés microbiennes benthiques jouent le rôle le plus important dans la minéralisation de la matière organique présente dans le sédiment (Jorgensen, 1982). Les nématodes libres marins contribuent aussi dans le processus de décomposition de la matière organique, ceci a été révélé par l’augmentation particulière de la densité nématologique à l’intérieur des feuilles en décomposition (Odum et Heald, 1972).

c. Inter-relation : bactérie-nématode libres marins et chaine trophique dans le

milieu marin

Les communautés bactériennes et méiofaunistiques jouent un rôle essentiel dans la reminéralisation de la matière organique (Odum et Heald, 1972 ; Jorgensen, 1982). Les inter- relations trophiques benthiques sont plus complexes dans les zones côtières que dans les océans ouverts (Graf, 1992). Ces communautés sont structurées par des relations de compétition et de prédation. Les communautés benthiques dépendent de leur nourriture essentiellement la matière organique particulaire, qui est principalement dérivé de couche supérieure productive du phytoplancton (Cocito et al., 1990 ; Pape et al., 2013). Le métabolisme de l'écosystème est intimement lié au flux du carbone et d'azote des producteurs primaires aux consommateurs de niveaux trophiques supérieurs (Gillies et al., 2012 ; Pape et al., 2013 ; McTigue et Dunton, 2014). Ce transfert trophique détermine la productivité des écosystèmes en fonction de la structure et l'efficacité des réseaux trophiques. Ainsi les bactéries essentiellement et les nématodes libres marins interviennent dans la minéralisation de la matière organique (Jorgensen, 1982 ; Aissa, 1991 ; Pape et al., 2013). Les nématodes libres marins bactériophages appartenant aux groupes trophiques microvores et déposivores se nourrissent des bactéries benthiques (Moens et Vincx, 1997 ; Pape et al., 2013). Ainsi la méiofaune en général et les nématodes libres marins en particulier assurent un lien entre le microbenthos et le macrobenthos (Fig 7) (Moens et Vincx, 1997).

Selon Leguerrier, (2005) l’inclusion de la méiofaune et plus précisément les nématodes libres marins dans le réseau trophique microbien se fait essentiellement via : 25

 La prédation directe sur les bactéries dont elles peuvent stabiliser la croissance  La prédation sur les protozoaires l’excrétion de mucus qui peut être colonisé par des micro-organismes consommé en retour  La bioturbation provoqué qui peut entre autre augmenter la profondeur de la couche oxique  Les produits d’excrétion qui servent de nourriture aux micro-organismes, voir les relations de symbioses entre méiofaune et microfaune.

Fig 7. Réseau trophique benthique (Leguerrier, 2005)

II.2. Impacts des polluants sur les communautés benthiques

Les communautés benthiques ne sont pas indifférentes à l’accumulation des polluants dans le sédiment. La présence de ces polluants impacts la diversité du benthos tel que les communautés bactériennes (Guo et al., 2015 ; Korlevic et al., 2015 ; Louati et al., 2013) et les nématodes libres marins (Louati et al., 2013 ; Mahmoudi et al, 2005 ; Soltani et al., 2012) ainsi les micoorganismes créent des gènes de résistances à ces polluants organiques et interviennent dans leur biodégradation (Louati et al., 2011 ; Parellada et al., 2013 ; Wang et al., 2015). La contamination des écosytèmes aquatique impact les communautés biologiques ainsi elle provoque l’élimination des espèces sensibles la prolifération des espèces résistantes

26 et l’adaptation d’autres espèces qui diminue d’abondance au début de la contamination après ils s’adaptent et reviennent à l’abondance normale (Duran et al., 2015 ; Louati et al., 2013 ; Mahmoudi et al., 2005 ; Soltani et al., 2012).

II.3. La biodiversité bactérienne

L’écologie microbienne décrit la variabilité des microorganismes selon trois niveaux (génétique, spécifique et écosystémique) intégrant les interactions entre les microorganismes et les interactions entre microorganismes et leur environnement. La biodiversité alpha désigne le nombre d'espèces dans un milieu donné. La biodiversité bêta, qui correspond au taux de remplacement des espèces le long d'un gradient (par exemple climatique, spatial, d'altitude), au sein d'une région donnée. La diversité gamma, qui correspond à la distribution spatiale des espèces dans un écosystème. Les informations concernant la composition ou la distribution taxonomique sont consignées sous forme de matrices croisant des échantillons et des taxons. Selon le niveau d’inventaire réalisé, il peut s’agir de matrices de présence - absence (composition) ou de matrices où figurent les abondances relatives (distribution taxonomique) (Meisterhans, 2012). Le traitement des données de la matrice donne des indices de diversité. Les indices permettent à l’écologiste d’interpréter et de comparer la diversité à différents niveaux spatial et temporel. Selon Meisterhans (2012), les indices de Fisher (Fisher et al., 1943) et de Margalef (Margalef, 1951) sont peu utilisés car basés seulement sur la richesse taxonomique de la communauté (Krebs, 1998). Par contre, les indices de Simpson (Simpson, 1949) et de Shannon (Shannon et Weaver, 1963) sont les plus utilisés. Pour comparer les échantillons deux à deux en calculant le pourcentage de ressemblance entre les communautés. La comparaison des matrices de présence/absence de taxons dans les échantillons donne les indices de Jaccard (Jaccard, 1912) ou de Sorensen (Sorensen, 1948). Alors que la comparaison des matrices d’abondance relative des taxons présents dans les échantillons comme l’indice de Bray-Curtis (Bray et Curtis, 1957) ou l’indice de Czekonowski (Czekonowski, 1909).

L’interaction entre la biodiversité et le fonctionnement des écosystèmes en milieu marina toujours attiré l’attention des scientifiques. Les indices de diversité permettent d’estimer les effets sur l'écosystème à partir des caractéristiques structurelles des communautés fauniques et leur fonctionnalité. Les modifications de la biodiversité induites par le changement climatique et les activités anthropiques, permettent d’appréhender les relations structure/fonction.

Les premières études qui ont considéré l’ARN ribosomal comme marqueur de l’évolution bactérienne ont divisé le monde vivant en trois domaines : Eucarya, Bacteria et Archaea (Woese et al., 1987, Woese et al., 1990). Les travaux de Zuckerand et Paulling (1965), ont commencé l’étude de la biodiversité du monde bactérien et les techniques de phylogénie moléculaire, après l’utilisation de méthodes classiques d’enrichissement et d’isolement. Ces méthodes donnent des résultats partiels à cause de la faible cultivabilité des microbes (Ward et al., 1990). Le concept d’écologie microbienne a commencé avec les travaux de Oslen et al., (1986) ainsi que Pace et al., (1986). Parmi les techniques moléculaires pertinentes, utilisées en écologie microbienne, toutes basées sur la réaction en chaine par polymérase (PCR), les approches d’empreintes moléculaires comme le polymorphisme de longueur des fragments de restriction terminaux (TRFLP) permettent la comparaison des structures des communautés microbiennes, et le séquençage de nouvelle génération comme le pyroséquençage et le MiSeq donnent un inventaire exhaustif des microorganismes présents.

a. Techniques moléculaires en écologie microbienne

Les développements récents des techniques moléculaires ont permis d'étudier la diversité et l'activité des communautés bactériennes dans divers écosystèmes. Ces techniques sont basées sur la détection d'acides nucléiques à l'intérieur des cellules vivantes ou après extraction directement de l’échantillon. Plusieurs techniques empreintes digitales d’ADN, hybridation et techniques analytiques basées sur la PCR peuvent être mises en œuvre. Les techniques moléculaires ont été conçues pour contourner les limitations associées aux méthodes microbiologiques traditionnelles. L'utilisation de méthodes moléculaires a grandement contribué à une compréhension globale de la microbiologie des systèmes écologiques. Les techniques moléculaires ont servi d'outils de surveillance pour suivre les changements et les réponses des communautés bactériennes à un traitement donné. Ainsi, les corrélations entre la composition de la communauté microbienne et la capacité de biodégradation ont pu être déterminées (Abed, 2009). Les méthodes moléculaires ont permis un nouvel aperçu dans la composition de la communauté microbienne et élargir les questions écologiques qui peuvent désormais être abordées. Malgré les progrès, la diversité de la plupart des communautés microbiennes sur Terre reste inexplorée (Neufled et al., 2006). Il est important d'estimer la diversité microbienne avec précision afin de réaliser des analyses comparatives entre diversité microbienne et les différents paramètres environnementaux. Les connaissances acquises par les techniques moléculaires ont facilité la sélection de microorganismes appropriés pour la

28 conception de traitements de bioremédiation (Chaerun et al., 2004). Les avantages ainsi que les inconvénients de chaque technique sont présentés ci-dessous (d’après Jung et Kang, 2014).

Empreintes moléculaires

Les techniques d’empreintes dans l’écologie microbienne permettent la séparation des espèces en fonction de leur séquence d’ADN. Elles associent une identification moléculaire de la microflore basée sur la séquence des gènes l’ARNr 16S. Les empreintes moléculaires permettent de caractériser, sans mise en culture, la diversité d’une microflore, de comparer des microflores semblables, d’en suivre la dynamique. Ainsi une communauté microbienne est représentée par un profil où chaque pic correspond à une séquence et par extension à une « espèce » de microorganisme, l’aire de chaque pic donnant une indication sur son abondance relative. Le polymorphisme de longueur des fragments de restriction terminaux (TRFLP) est un exemple de technique d’empreinte moléculaire accessible et relativement peu coûteuse (Cao et al., 2013). Cette technique a été initiée par Liu et al. en 1997 puis s’est considérablement développée au cours de la dernière décennie, elle est robuste et très utilisée pour comparer les communautés microbiennes (Culman et al., 2008).

Ces techniques donnent une information rapide et globale sur la structure et l’évolution des écosystèmes microbiens. L’inconvénient des techniques d’empreintes est qu’ils n’arrivent pas à identifier les souches bactériennes à partir des séquences d’ADN déterminées.

Séquençage

Le séquençage Sanger, dit de première génération, produit quelques centaines de séquence d’une longueur d’environ 1000 pb, les nouvelles générations de séquençage génèrent de 106 jusqu’à 109 séquences d’une taille allant de 100 à 700 pb (Scholz et al., 2012). Ces techniques, désignées par les termes séquençage haut débit (HTS pour high-throughput sequencing), constituent un ensemble de méthodes apparues à partir de 2005, permettant le séquençage de centaines de milliers de fragments simultanément, à faible coût et en quelques heures. Elles permettent de s’affranchir des étapes de constitution de banques génomiques. Leur utilisation en écologie microbienne trouve de nombreuses applications. Les méthodes de séquençage ont été utilisées pour détecter la diversité bactérienne et la structure de la communauté dans les différentes matrices environnementales (Basak et al., 2015).La technologie 454 trouve son application en écologie microbienne à travers le séquençage de génomes bactériens, l’analyse de diversité de métagénomes sur la base de gènes de référence 29 ou l’analyse de gènes de fonction d’un métagénome. Elle permet d’identifier plusieurs milliers d’OTU (Unités Opérationnelles Taxonomiques) au sein d’une population microbienne complexe. L’avantage de la technique 454 par rapport aux autres techniques de séquençage à haut débit est la taille des séquences (400 pb), plus longue et mieux adaptée à l’identification des espèces et aux attentes en écologie microbienne (Claesson et al., 2010). Aussi elle a l’avantage de séquencer en même temps, et en une seule lecture un certain nombre d’échantillon par l’incorporation de la séquence barecode sur les amorces (Lu et al., 2014). La première étape est l’obtention de fragments simple brin (sb) par fragmentation de l’ADN génomique (ex : par nébulisation) ou PCR des gènes d’ARNr 16S (Theodorakopoulos, 2013). Deux adaptateurs (A et B) sont fixés par légation aux deux extrémités de ces fragments. Ensuite, les fragments d’ADNsb sont mis en contact avec des microbilles qui possèdent en surface des amorces complémentaires à un des adaptateurs et vont ainsi permettre de fixer une molécule d’ADNsb à la fois. Les microbilles porteuses des brins d’ADNsb sont mises en émulsion en présence des réactifs pour PCR. Chaque goutte (microréacteur) englobe une microbille et donc une molécule d’ADN, ce qui permet une amplification clonale de chaque fragment. L’étape suivante est la PCR en émulsion, qui consiste à isoler les billes dans des bulles qui servent de microréacteurs. Ainsi, chaque bille sera couverte par une amplification clonale d’un seul fragment à séquencer. Après la PCR, des millions de séquences identiques recouvrent ainsi chaque bille. Après amplification, les microgouttelettes (microréacteurs) sont dissociées, et les microbilles porteuses de l’ADN simple brin largement amplifié sont transférées dans une plaque en fibre optique contenant 1,4 million de puits. Les puits possèdent un diamètre qui assure le dépôt d’une microbille par puits. Avec ce système, 400 000 réactions de séquençage peuvent être réalisées en parallèle. C’est au sein de chacun de ces puits que va se réaliser la réaction de pyroséquençage. Contrairement à un séquençage de type Sanger, les types de nucléotides (A, T, C, G) seront rajoutés de manière séquentielle et ce plusieurs fois de suite définissant ainsi le « flow cycle ». Après chaque ajout d’un nucléotide, un traitement par une apyrase permet d’éliminer le surplus, puis le nucléotide suivant est incorporé et ainsi de suite. La détermination de la séquence repose sur la détection d’une émission de lumière résultant de l’incorporation d’un ou plusieurs nucléotides lors de la polymérisation de l’ADN en utilisant le brin d’ADN fixé sur la bille comme matrice. Le second adaptateur est utilisé pour initier cette polymérisation. Si le nucléotide ajouté correspond à celui devant être intégré, il y a libération de pyrophosphate inorganique. Celui-ci est alors utilisé par l’ATP sulphurylase pour produire de

30 l’ATP. La luciférase utilise cet ATP et la luciférine pour produire de l’oxyluciférine et de la lumière.

La méthode 454 pyroséquençage est une technique très appliquée pour déterminé la diversité et la structure de la communauté bactérienne on peut citer les travaux de Dong et al. (2014) dans la mer de Chine orientale, l’étude de Lu et Lu (2014) dans la rivière Nanxijiang en chine. Cette technique a réussit l’exploration du microbiota dans une variété d’échantillons environnementaux comme le sol (Roesch et al., 2007), etles eaux usée (Ye et Zhang 2013). Cette technique est maintenant de moins en moins utilisée, elle est remplacée par la technique Illumina. La plate-forme Illumina MiSeq fournit Illumina séquençage à grande profondeur pour un prix nettement inférieur par rapport à la technique 454 sequençing (Schmidt et al., 2013).

III. Méthode d’analyse chimique

L’extraction est une étape très importante pour les analyses chimiques. Elle consiste à extraire les molécules à analyser de la matrice. Lors de l’extraction de matrice solide, les composés sont libérés de la matrice à l’aide d’un solvant et selon un mécanisme chimique et/ou mécanique puis transférés dans le milieu d’extraction. Durant cette étape une perte éventuelle d’une petite quantité de composés se produit. Les chimistes cherchent donc à mettre au point des méthodes d’extraction plus fiables. La difficulté augmente avec le nombre de composés ciblés et aussi la diversité des interactions analytes/matrice. Ainsi Le choix de la méthode est basé surtout sur la fiabilité. Différentes méthodes d’extraction ont été développées comme l’extraction soxhlet (Itoh et al., 2008), par micro-onde (Letellier et al., 1999 ; Bartolomé et al., 2005 ; Itoh et al., 2008, Ramalhosa et al., 2012) et par ultrason (Banjoo et Nelson, 2005 ; Navarro et al., 2009). Elles ont été appliquées sur différentes matrices telles que l’eau de surface (Villaroel et al., 2014), le sol (Zhou et al., 2013), le sédiment (Bartolomé et al., 2005 ; Itoh et al., 2008 ; Navarro et al., 2009 ; Hu et al., 2010), les végétaux, les fruits de mer (Navarro et al., 2009), et pour un très grand nombre de composés organiques tels que les pesticides (Hu et al., 2010. Navarro-Ortega et al., 2010), les HAP (Bartolomé et al., 2005 ; Itoh et al., 2008, Hu et al., 2010 ; Navarro-Ortega et al., 2010), les PCB (Bartolomé et al., 2005 ). Ces méthodes sont utilisées jusqu’à présent, néanmoins de nouvelles méthodes se développent comme la méthode QuEChERS introduite par Anastassiades en 2003. Les avantages de cette technique sont la fiabilité, la rapidité et le coût. Cette méthode vise la fiabilité souhaitée pour un minimum de temps, d’effort et de coût. Elle vise à minimiser la

31 quantité de solvant organique utilisée et le temps nécessaire pour l’extraction. La méthode QuEChERS a commencé à être appliquée principalement sur les fruits et les végétaux car c’est une méthode rapide pour tester les aliments. Puis, cette méthode a été adaptée et optimisée afin de l’appliquer à d’autres matrices (sédiment, sol, eau…).

IV. Présentation de l’écosystème étudié : Complexe Lac Ichkeul-Lagune de Bizerte

L’extrême nord de la Tunisie, plus précisément la région de Bizerte, est caractérisé par deux écosystèmes aquatiques, la lagune de Bizerte appelé couramment « elmetzawka » et le lac Ichkeul ou « Gareat Ichkeul ». Ce dernier constitue, avec jbel Ichkeul et les marais, le parc national Ichkeul. La superficie totale du bassin versant de la lagune de Bizerte est d’environ 380 km2 dont 150 km2 de plan d’eau. La profondeur maximale de la lagune est située au niveau du chenal de navigation et atteint 12 mètres. Le parc national de l'Ichkeul est formé du lac Ichkeul qui couvre une superficie d’environ de 8 500 hectares, de marais d'une superficie de 2 737 hectares et d'un massif montagneux culminant à 510 mètres d'altitude.

Le lac Ichkeul est un rare site au monde inscrit sur trois conventions internationales :

- Site Ramsar en 1980 - Réserve de la biosphère de l’UNESCO en 1977 - Site naturel du Patrimoine Mondiale de l’UNESCO en1979.

Il est aussi reconnu comme l’une des quatre principales zones humides du bassin occidental de la méditerranée.

Fig 8. Carte de la position du complexe Lac Ichkeul-Lagune de Bizerte

La lagune de Bizerte est la troisième plus grande lagune en Tunisie, elle s’étend sur une superficie de 150 km2 (Fig 8). La longueur de la lagune est d’environ 13 km et son largueur est de l’ordre de 11 km. Ce plan d’eau semi fermé communique avec la mer Méditerranée via un chenal et de l’autre coté elle est en relation avec le lac Ichkeul à travers l’oued Tinja (Fig 9). La lagune reçoit un amalgame de polluants provenant des sources situées au bord de cet écosystème aquatique. Ce dernier est entouré par deux zones industrielles au niveau des villes de Menzel Jemil et Menzel Bourguiba, des zones agricoles au sud ouest ainsi qu’au niveau de Bizerte sud et Menzel Bourguiba, des zones urbaines qui sont de plus en plus populaire ce qui évoque le problème des eaux usées. L’activité conchylicole est très développée au niveau de la lagune, elle est aussi une source de pollution. Le complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte est caractérisé par une diversité biologique considérable, il est connu par une grande production halieutique et aussi aquacole. Le complexe est alimenté par plusieurs oueds (Fig 9).

Fig 9. Carte du réseau hydrographique (CRDA, 2007)

L’hydrologie du complexe est saisonnière : - En hiver le lac Ichkeul est alimenté en eau douce par les oueds principalement : Douimiss (15.106m3/an), Sejnane (201.106m3/an), Melah (47.106m3/an), Ghezala 29.106m3/an), Joumine 84.106m3/an), et Tine 51.106m3/an) (ANPE, 2005) d’où 33

une élévation du niveau d’eau, ce qui provoque un déversement en eau vers la lagune de Bizerte à travers l’oued Tinja. - En été l’évaporation intense entraine une baisse du niveau d’eau dans le lac et un arrêt de l’alimentation du lac par les oueds d’où un passage de l’eau lagunaire vers le lac Ichkeul toujours par l’oued Tinja (M’barek, 2001).

Mais l’apport d’eau continentale par les oueds vers le lac a chuté après la construction de plusieurs barrages. Les conséquences ont été dramatiques sur la biocénose et le biotope. Pour réduire les impacts négatifs de ces aménagements hydrauliques sur l’équilibre de l’écosystème d’Ichkeul, afin de contrôler le niveau d’eau et le débit, l’écluse de Tinja a été construite à l’embouchure de l’oued Tinja dans le lac Ichkeul (M’barek, 2001). L’ANPE est le seul responsable de la gestion de l’écluse, la gestion de l’écluse de Tinja est dépendante de la salinité de l’eau du lac.

Planche 1. Photo de l’écluse de Tinja

Planche 2. Photo d’une vanne de l’écluse de Tinja

Avant 2001 la gestion de l’écluse a été dépendante du climat selon les résultats d’un modèle de prévision qui a été établit au cours de l’étude faite pour le sauvegarde du Parc National de l’Ichkeul par l’ANPE (1993/1994). Pour cela l’écluse de Tinja est maintenue fermée à partir du moment (Mars ou Avril) où la salinité moyenne et les niveaux de l’eau du lac sont égaux à des valeurs critiques qui sont déterminées par le modèle de prévision. Après l’an 2001 il y avait la mise en eau du barrage de Sidi Barrak. Ce denier permet le transfert d’une partie des eaux mobilisées vers le barrage de Sedjnane (90Mm3). Une partie ces eaux pourrait être directement lâchée, en cas de besoin vers l’Ichkeul (M’barek et Shimi, 2002). Dans ce cas l’écluse sera maintenue ouverte de façon à améliorer le passage des organismes marins (alevins et juvéniles) à travers l’oued Tinja. Les résultats de la gestion de l’écluse de Tinja : Les vannes de l’écluse se ferment si les conditions climatiques sont favorables, la salinité du lac diminue à plus de 19 g L-1 à la fin de l’hiver (mars et avril) et le niveau de l’eau du lac devient supérieur à 100 cm, les périodes d’ouverture et de fermeture de l’écluse sont gérées par l’ANPE avec l’aide de la CRDA de Bizerte, ceci suivant les résultats du modèle de prévision qui permettent d’évaluer le comportement du lac au cours des 12 mois de l’année en fonction de la salinité et du niveau de l’eau du lac. Depuis Janvier 2011 l’écluse est en panne et reste ouverte depuis cette date. La carte des pentes de la région montre que les pentes les plus faibles entourent le complexe et en s’éloignant de ces deux écosystèmes la pente augmente. Ceci montre, que les deux

bassins versants se rencontrent, les eaux de ruissellement et celle des oueds se déversent dans le lac et la lagune (Fig 10).

Fig 10. Carte des pentes de la région de Bizerte

La lagune de Bizerte connaît une intense activité halieutique très productive (INSTM, 1999 ) (Tableau 2).

Tableau 2: Production halieutique annuelle (kg) au niveau de la lagune de Bizerte (d’après la Direction Générale de la Pêche et de l’Aquaculture Bizerte, 1999 ; Essid, 2001).

1989 1991 1993 1995 1997 1998

Aiguillette 0 0 828 405 108 293

Anguille 1860 2056 1437 874 1914 2928

Bigeron 7300 4879 2684 7936 9998 6280

Calmar 85 0 40 1097 206 124

Chien de mer 1000 2752 60 0 1931 4081

Crevette 4050 1210 386 8640 1849 1095

Daurade 2400 670 1438 2588 5216 4544

Loup 2860 735 4158 3976 2373 2000

Marbré 17770 17986 8631 3415 8907 19217

Merlu 0 124 137 0 0 0

Muge doré 3000 1486 48 0 0 242

Pageot 250 244 30 0 754 516

Poulpe 1180 260 117 0 17 203

Rascasse 70 0 61 0 95 0

Rouget rouge 3100 696 769 6218 1524 2014

Saupe 3330 2501 907 228 3232 3427 Seiche 16090 18066 14530 15451 45031 65915 Serre 0 913 553 0 0 0 Sole 685 650 3127 2085 1568 2075 Spars 8300 2187 4482 6910 10253 8460 Autres muges 0 0 3846 0 2700 347 Divers 0 3774 2834 5996 3359 4347 Total 73330 61189 51103 65819 101035 128108

La lagune de Bizerte souffre du phénomène d’eutrophisation, elle reçoit un amalgame de polluants provenant de deux zones industrielles : cimenterie, El Fouledh (société Tunisienne de Sidérurgie) et la STIR (Société Tunisienne des Industrie de Raffinage). Et d’origines agricoles provenant des zones d’agricultures situées sur le bord de la lagune. La lagune est aussi soumise à la menace de contamination par les hydrocarbures du trafic maritime intense du port de Bizerte-Menzel Bourguiba soit pour le chargement et le déchargement de marchandises ou pour la maintenance et réparation des navires. Malgré le grand nombre des études écotoxicologiques faites sur la lagune de Bizerte aucune étude ne s’est intéressée aux pesticides agricoles. De même le lac Ichkeul n’a fait l’objet d’aucune étude, ni écotoxicologique (à part quelques donnée sur les métaux) ni microbiologique malgré qu’il reçoit un mélange de polluants provenant de zones agricoles et de zones urbaines non connectées au réseau d’assainissement. Le lac reçoit également des hydrocarbures de la lagune de Bizerte à travers oued Tinja. Le lac constitue donc un site multicontaminé par les pesticides, les métaux et les hydrocarbures.

Références bibliographiques

Abed RMM, 2009. Nucleic Acid-Based Techniques for Studying Diversity and Activity of Bacterial Communities in Oil-Contaminated Sediments. Handbook of Environmental Chemistry, 5: 97-160.

Aissa P, 1991. Ecologie des nématodes libres de la lagune de Bizerte. Dynamique et biocénotique. Thèse doctorat d'état, Université de Tunis II, Faculté des Sciences de Tunis : 370p.

Andreu V, Picó Y, 2012. Determination of currently used pesticides in biota. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 404(9): 2659-81.

Azandegbe A, 2010. Etude de la structure des communautés bactériennes du sédiment et de l'écologie de Vibrio aestuarianus pathogène de l'huître creuse Crassostrea gigas dans deux sites ostréicoles. Thèse de Doctorat, Université Européenne de Bretagne, p 28.

Banjoo DR, Nelson PK, 2005. Improved ultrasonic extraction procedure for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons insediments. Journal of Chromatography A, 1066: 9-18.

Bartolomé L, Cortazar E, Raposo JC, Usobiaga A, Zuloaga O, Etxebarria N, Fernandez LA, 2005. Simultaneous microwave-assisted extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons, polychlorinated biphenyls, phthalate esters and nonylphenols in sediments. Journal of Chromatography A, 1068 : 229-236.

Basak P, Majumder NS, Nag S, Bhattacharyya A, Roy D, Chakraborty A, SenGupta S, Roy A, Mukherjee A, Pattanayak R, Ghosh A, Chattopadhyay D, Bhattacharyya M, 2015. Spatiotemporal Analysis of Bacterial Diversity in Sediments of Sundarbans Using Parallel 16S rRNA Gene Tag Sequencing. Microbial Ecology, 69: 500-511.

Bazzanti M, Chiavarini S, Cremisini C, Soldati P, 1997. Distribution of PCB congeners in aquatic ecosystems: A case study. Environment International, 23 : 799-813.

Ben M’barek N, Slim-Shimi N, 2002. Evolution des parmètres physico-chimiques des eaux du lac Ichkeul après la réalisation des aménagements hydrauliques (Tunisie). Proceedings of International Symposium and Workshop on Environmental Pollution Control and Waste Management 7-10 January 2002, Tunis (EPCOWM’2002), p.20-27.

Blumer M, 1976. Polycyclic aromatic compounds in nature. Scientific American, 234: 35-45.

Boitsov S, Jensen HKB, Klungsøyr J. 2009. Natural background and anthropogenic inputs of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in sediments of South-Western Barents Sea. Marine Environmental Research, 68: 236-245.

Boonyatumanond R, Wattayakorn G, Togo, A, Takada H, 2006. Distribution and origins of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in riverine, estuarine, and marine sediments in Thailand. Marine Pollution Bulletin, 52: 942-956.

Bouchez M, Blanchet D, Haeseler F, Vandecasteele JP, 1996. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques dans l’environnement. 1ère partie : Propriétés, origine, devenir. Oil & Gas Science and Technology-Revue de l’IFP, 51: 407-419.

Bray JR, Curtis JT, 1957. An ordination of the upland forest communities in southern Wisconsin. Ecological Monographs, 27: 325-349.

Breivik K, Sweetman A, Pacyna JM, Jones KC, 2002. Towards a global historical emission inventory for selected PCB congeners — a mass balance approach: 1. Global production and consumption. Science of The Total Environment, 290: 181-198.

Burdige DJ, Komada T, 2015. Sediment Pore Waters, Biogeochemistry of Marine Dissolved Organic Matter (Second Edition). Chapter 12: 535–577.

Cao Y, Van De Werfhorst LC, Dubinsky EA, Badgley BD, Sadowsky MJ, Andersen GL, Griffith JF, Holden PA, 2013. Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste. Water Research, 47: 6862-6872.

Carvalho FP, Villeneuve JP, Cattini C, Rendón J, de Oliveira JM, 2009. Pesticide and PCB residues in the aquatic ecosystems of Laguna de Terminos, a protected area of the coast of Campeche, Mexico. Chemosphere, 74: 988-995.

Chaerun SK, Tazaki K, Asada R, Kogure K, 2004. Bioremediation of coastal areas 5 years after the Nakhodka oil spill in the Sea of Japan: isolation and characterization of hydrocarbon- degrading bacteria. Environment International, 30: 911 – 922.

Chang S, Doong R, 2006. Concentration and fate of persistent organochlorine pesticides in estuarine sediments using headspace solid-phase microextraction. Chemosphere, 62: 1869- 1878.

Choi JY, Yang DB, Hong GH, Shin KH, 2014. Distribution and bioaccumulation of polychlorinated biphenyls and organochlorine pesticides residues in sediments and Manila clams (Ruditapes philippinarum) from along the Mid-Western coast of Korea. Marine Pollution Bulletin, 85: 672-678.

Çok I, Mazmanci B, Mazmanci MA, Turgut C, Henkelmann B, Schramm KW, 2012. Analysis of human milk to assess exposure to PAHs, PCBs and organochlorine pesticides in the vicinity Mediterranean city Mersin, Turkey. Environment International, 40: 63-69.

Cocito S, Fanucci S, Niccolai I, Morri C, Bianchi CN, 1990. Relationships between trophic organization of benthic communities and organic matter content in Tyrrhenian Sea sediments. Hydrobiologia, 207: 53-60.

Claesson MJ, Wang Q, O'Sullivan O, Greene-Diniz R, Cole JR, Ross RP, O'Toole PW, 2010. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Research, 38: e200.

Cullen DJ, 1973. Bioturbation of superficial marine sediments by interstitial meiobenthos. Nature, 242: 323-324.

Culman SW, Gauch HG, Blackwood CB, Thies JE, 2008. Analysis of T-RFLP data using analysis of variance and ordination methods: A comparative study. Journal of Microbiological Methods, 75: 55-63.

Czekanowski J, 1909. Zyr differential-diagnose der Neadertalgruppe. Korrespondenz-Blatt der deutschen Gesellschaft für Anthropologie Ethnologie und Urgeschichte, 40: 44-47.

Darko G, Akoto O, Oppong C, 2008. Persistent organochlorine pesticide residues in fish, sediments and water from Lake Bosomtwi, Ghana. Chemosphere, 72: 21-24.

Danovaro R, Tselepides A, Otegui A, Della Croce N, 2000. Dynamics of meiofaunal assemblages on the continental shelf and deep-sea sediments of the Cretan Sea (NE

Mediterranean): relationships with seasonal changes in food supply. Progress in Oceanography, 46: 367-400.

Domine D, Devillers J, Garrigues P, Budzinski H, Chastrette M, Karcher W, 1994. Chemometrical evaluation of the PAH contamination in the sediments of the Gulf of Lion (France). Science of The Total Environment, 155: 9-24.

Dong Y, ZhaoY, Zhang W, Li Y, Zhou F, Liu C, Wu Y, Liu S, Zhang W, Xiao T, 2014. Bacterial diversity and community structure in the East China Sea by 454 sequencing of the 16S rRNA gene. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 32: 527-541.

Fabro L, Varca LM, 2012. Pesticide usage by farmers in Pagsanjan-Lumban catchment of Laguna de Bay, Philippines. Agricultural Water Management, 106: 27-34.

Fisher RA, Corbet AS, Williams CB, 1943. The relation between the number of species and the number of individuals in a random sample of animal population. Journal of Animal Ecology, 12: 42- 58.

Fleeger JW, Carman KR, Nisbet RM, 2003. Indirect effects of contaminants in aquatic ecosystems. Science of The Total Environment, 317: 207-233.

Fukuto TR, 1990. Mechanism of action of organophosphorus and carbamate insecticides. Environmental Health Perspectives, 87: 245–254.

Galvao P, Henkelmann B, Longo R, Lailson-Brito J, Machado Torres JP, Schramm KW, Malm O, 2012. Distinct bioaccumulation profile of pesticides and dioxin-like compounds by mollusk bivalves reared in polluted and unpolluted tropical bays: Consumption risk and seasonal effect. Food Chemistry, 134: 2040-2048.

Gevao B, Semple KT, Jones KC, 2000. Bound pesticide residues in soils: a review. Environmental Pollution, 108: 3-14.

Gillies CL, Stark JS, Johnstone GJ, Smith SDA, 2012. Carbon flow and trophic structure of an Antarctic coastal benthic community as determined by δ13C and δ15N. Estuarine, Coastal and Shelf Science, 97: 44-57.

Goh KT, Ong KH, Tan IK, Yew FS, 1990. Acute organophosphorus food poisoning caused by contaminated green leafy vegetables. Archives of Environmental Health, 45: 180-184.

Graf G, 1992. Benthic-pelagic coupling: a benthic view. Oceanography and Marine Biology, 30: 149-190.

Guidi-Guilvard LD, Dallot S, 2014.Metazoan Meiobenthos temporal fluctuations in the deep NW Mediterranean Sea (DYFAMED-BENTHOS 1993–1995).Contribution of spatial variability and disturbance. Deep Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers, 92: 127-140.

Guo J, Zhao L, Lu W, Jia H, Wang L, Liu X, Sun Y, 2015. Effect of historical residual hexachlorocyclohexanes and dichlorodiphenyltrichloroethane on bacterial communities in sediment core collected from an estuary in northeastern China by next-generation sequencing. Marine Pollution Bulletin, 93: 68–74.

Guo Y, Meng XZ, Tang HL, Zeng EY, 2008. Tissue distribution of organochlorine pesticides in fish collected from the Pearl River Delta, China: Implications for fishery input source and bioaccumulation. Environmental Pollution, 155: 150-156.

Guo W, Zhang H, Huo S, 2014. Organochlorine pesticides in aquatic hydrophyte tissues and surrounding sediments in Baiyangdian wetland, China. Ecological Engineering, 67: 150-155.

Hu G, Luo X, Li F, Dai J, Guo J, Chen S, Hong C, Mai B, Xu M, 2010. Organochlorine compounds and polycyclic aromatic hydrocarbons in surface sediment from Baiyangdian Lake, North China: Concentrations, sources profiles and potential risk. Journal of Environmental Sciences, 22: 176-183.

Isaac P, Sánchez LA, Bourguignon N, Eugenia Cabral M, Ferrero MA, 2013. Indigenous PAH-degrading bacteria from oil-polluted sediments in Caleta Cordova, Patagonia Argentina. International Biodeterioration & Biodegradation, 82: 207- 214.

IARC, 1983. Polynuclear aromatic compounds, Part 1, chemical, environmental and experimental data. IARC Monogr Eval Carcinog Risk Chem Hum, 32: 1–453.

IARC (1991) IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Vol. 52, Chlorinated Drinking-Water; Chlorination By-Products; Some Other Halogenated Compounds; Cobalt and Cobalt Compounds, Lyon, pp. 269–296.

Itoh N, Numata M, Aoyagi Y, Yarita T, 2008. Comparison of low-level polycyclic aromatic hydrocarbons in sediment revealed by Soxhlet extraction, microwave-assisted extraction, and pressurized liquid extraction. Analytica Chimica Acta, 612: 44-52.

Jaccard P, 1912. The distribution of flora in the alpine zone.New Phytology, 11: 37-50.

Jiang YF, Wang XT, Jia Y, Wang F, Wu MH, Sheng GY, Fu JM, 2009. Occurrence, distribution and possible sources of organochlorine pesticides in agricultural soil of Shanghai, China. Journal of Hazardous Materials, 170: 989-997.

Jumars, PA, Wheatcroft RAW, 1989. Responses of benthos to changing food quality and quantity, with a focus on deposit feeding and bioturbation. 235-253p in W.H. Berger, V.S. Smetacek and G. Wefer, Eds.Productivity of the Ocean: Present and Past. Wiley, Chichester.

Jung SP, Kang H, 2014. Assessment of microbial diversity bias associated with soil heterogeneity and sequencing resolution in pyrosequencing analyses. Journal of Microbiology, 52: 574-580.

Jorgensen BB, 1983. Mineralization of organic latter in the sea bed-the role of sulphate reduction. Nature, 296: 643-645.

Klöppel H, Kordel W, K’rdel W, 1994. Herbicide in surface run-off: A rainfull simulation study on small plots in the field. Chemosphere, 4: 649-662.

Klöppel H, Kordel W, Stein B, 1997. Herbicide transport by surface runoff and herbicide retention in a filter strip rainfall and runoff simulation studies. Chemosphere, 35:129-141.

Korlevic M, Zucko J, Dragic MN, Blazina M, Pustijanac E, Zeljko TV, Gacesa R, Baranasic D, Starcevic A, Diminic J, Longe PF, Cullumg J, Hranueli D, Orlic S, 2015. Bacterial diversity of polluted surface sediments in the northern Adriatic Sea. Systematic and Applied Microbiology, 38:189-197.

Krebs CJ, 1989. Ecological Methodology, 654 pp. Harper Collins Inc., New York.

Lakshmi Sita G, Raghava Swamy BV, 1993. Regeneration of plantlets from leaf disc cultures of rosewood: control of leaf abscission and shoot tip necrosis. Plant Science, 88: 107-112.

Lalonde K, Mucci A, Ouellet A, Gelina Y, 2012. Preservation of organic matter in sediments promoted by iron. Nature, 483: 198-200.

Lambshead PJD, Schalk PH, 2001. Invertebrates, Marine, Overview. Encyclopedia of Biodiversity (Second Edition), 379-391.

Lazartigues A, 2010. Pesticides et polyculture d'étang : de l'épandage sur le bassin versant aux résidus dans la chair de poisson. Thèse de l'Université de Nancy, 191 p.

Leaute F, 2008. Biogéochimie des contaminants organiques HAP, PCB et pesticides organochlorés dans les sédiments de l’Etang de Thau. Thèse de Doctorat, Université Pierre et Marie Curie, p 39.

Leguerrier D, 2005. Construction et étude d’un modèle de réseau trophique de la vasière de Brouage (bassin de marennes Oléron, France). Thèse de Doctorat, Université de la Rochelle, p23.

Letellier M, Budzinski H, Bellocq J, Connan J, 1999. Focused microwave-assisted extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons and alkanes from sediments and source rocks. Organic Geochemistry, 30: 1353-1365.

Lintellman J, Katayama A, Kurihara N, Shore L, Wenzel A, 2003. Endocrine disruptors in the environment (IUPAC Technical Report). Pure and Applied Chemistry, 75: 631–681.

Levitan L, 2000. “How to” and “why”: assessing the enviro–social impacts of pesticides. Crop Protection, 19: 629-636.

Losi V, Ferrero TJ, Moreno M, Gaozza L, Rovere A, Firpo M, Marques JC, Albertelli G, 2013. The use of nematodes in assessing ecological conditions in shallow waters surrounding a Mediterranean harbour facility. Estuarine, Coastal and Shelf Science, 130: 209-221.

Louati H, Ben Said O, Soltani A, Got P, Mahmoudi E, Cravo-Laureau C, Duran R, Aissa P, Pringault O, 2013. The roles of biological interactions and pollutant contamination in shaping microbial benthic community structure. Chemosphere, 93: 2535–2546.

Lu XM, Lu PZ, 2014. Diversity, abundance, and spatial distribution of riverine microbial communities response to effluents from swine farmversus farmhouse restaurant. Applied Microbiology and Biotechnology, 98: 7597–7608.

Lu XM, Lu PZ, Zhang H, 2014. Bacterial communities in manures of piglets and adult pigs bred with different feeds revealed by 16S rDNA 454 pyrosequencing. Applied Microbiology and Biotechnology, 98: 2657–2665.

MacGregor BJ, Ravenschlag K, Amann R, 2003. Nucleic Acid-Based Techniques for Analyzing the Diversity, Structure, and Function of Microbial Communities in Marine Waters and Sediments. Ocean Margin Systems, 419-438.

Margalef DR, 1951. Diversidad de especies en les communideades natural. Public Institutte of Biologic Barcelonia, 9: 5-27.

McTigue ND, Dunton KH, 2014. Trophodynamics and organic matter assimilation pathways in the northeast Chukchi Sea, Alaska. Deep Sea Research Part II: Topical Studies in Oceanography, 102: 84-96.

Masiá A, Campo J, Vázquez-Roig P, Blasco C, Picó Y, 2013. Screening of currently used pesticides in water, sediments and biota of the Guadalquivir River Basin (Spain). Journal of Hazardous Materials, 263: 95-104.

Meisterhans MG, 2012. Dynamique de la structure génétique des communautés procaryotes en zone benthique côtière : caractérisation de la microflore des sédiments et des bivalves fouisseurs par empreintes moléculaires. Université Bordeaux I.

Meldal BHM, Debenham NJ, De Ley P, De Ley IT, Vanfleteren JR, Vierstraete AR, Bert W, Borgonie G, Moens T, Tyler PA, Austen MC, Blaxter ML, Rogers AD, Lambshead PJD, 2007. An improved molecular phylogeny of the Nematoda with special emphasis on marine taxa. Molecular Phylogenetics and Evolution, 42: 622-636.

Moens T, Vincx M, 1997. Observations on the feeding ecology of estuarine nematodes. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, 77: 211−227.

Moreno M, Semprucci F, Vezzulli L, Balsamo M, Fabiano M, Albertelli G, 2011.The use of nematodes in assessing ecological quality status in the Mediterranean coastal ecosystems. Ecological Indicators, 11: 328-336.

Mzoughi N, Hellal F, Dachraoui M, Villeneuve JP, Cattini C, de Mora SJ, El Abed A, 2002. Méthodologie de l'extraction des hydrocarbures aromatiques polycycliques. Application à des sédiments de la lagune de Bizerte (Tunisie). Comptes Rendus Geoscience, 334: 893-901.

Navarro P, Etxebarria N, Arana G, 2009. Development of a focused ultrasonic-assisted extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons in marine sediment and mussel samples. Analytica Chimica Acta, 648: 178-182.

Navarro-Ortega A, Tauler R, Lacorte S, Barceló D, 2010.Occurrence and transport of PAHs, pesticides and alkylphenols in sediment samples along the Ebro River Basin. Journal of Hydrology, 383: 5-17.

Neufeld JD, Mohn WW, De Lorenzo V, 2006. Composition of microbial communities in hexachlorocyclohexane (HCH) contaminated soils from Spain revealed with a habitat specific microarray. Environmental microbiology, 8: 126-140.

NOAA, 1999. Screening Quick References Tabe. Administration Océanique et Atmosphérique Nationale.

Nowell LH, Norman JE, Moran PW, Martin JD, Stone WW, 2014. Pesticide Toxicity Index— A tool for assessing potential toxicity of pesticide mixtures to freshwater aquatic organisms. Science of The Total Environment, 476–477: 144-157.

Odum W, Heald ET, 1972. Trophic analysis of an estuarine mangrove community.Bulletin of Marine Science, 22: 671-738.

Okay OS, Karacık B, Başak S, Henkelmann B, Bernhöft S, Schramm KW, 2009. PCB and PCDD/F in sediments and mussels of the Istanbul strait (Turkey). Chemosphere, 76: 159-166.

Olsen GJ, Lane DJ, Giovannoni SJ, Pas NR, Stahl DA, 1986. Microbiol ecology and evolution: a ribosomal RAN approach. Annual Review of Microbiology, 40: 337-365.

Pace NR, Stahl DA, Lane DJ, Olsen GJ, 1986. The analysis of natural microbial populations by ribosomal RNA sequences. Advances in Microbial Ecology, 9: 1-55.

Pape E, van Oevelen D, Moodley L, Soetaert K, Vanreusel A, 2013. Nematode feeding strategies and the fate of dissolved organic matter carbon in different deep-sea sedimentary environments. Deep-Sea Research I, 80: 94-110.

Phyu YL, Warne MStJ, Lim RP, 2006. Toxicity and bioavailability of atrazine and molinate to the freshwater fish (Melanotenia fluviatilis) under laboratory and simulated field conditions. Science of The Total Environment, 356: 86-99.

Prokopenko MG, Hirst MB, De Brabandere L, Lawrence DJP, Berelson WM, Granger J, Chang BX, Dawson S, Crane III EJ, Chong L, Thamdrup B, Townsend-Small A, Sigman DM, 2013. Nitrogen losses in anoxic marine sediments driven by Thioploca–anammox bacterial consortia. Nature, 500: 194-198.

Ramalhosa MJ, Paiga P, Morais S, Delerue-Matos C, Oliveira MB, 2009. Analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in fish: evaluation of a quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe extraction method. Journal of Separation Science, 32: 3529-3538.

Roesch LFW, Fulthorpe RR, Riva A, Casella G, Hadwin AKM, Kent AD,Daroub SH, Camargo FAO, Farmerie WG, Triplett EW, 2007. Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity. The ISME Journal, 1: 283-290.

Schmidt PA, Bálint M, Greshake B, Bandow C, Römbke J, Schmitt I, 2013. Illumina metabarcoding of a soil fungal community. Soil Biology & Biochemistry, 65: 128-132.

Scholz MB, Lo CC, Chain PSG, 2012. Next generation sequencing and bioinformatic bottlenecks: the current state of metagenomic data analysis. Current Opinion in Biotechnology, 23: 9-15.

Shannon C, Weaver W, 1963. The mathematical theory of communication. Urbana University of Illinois Press, Chicago

Simpson EH, 1949. Measurement of diversity. Nature 163:688.

Siriwong W, Thirakhupt K, Sitticharoenchai D, Rohitrattana J, Thongkongowm P, Borjan M, Robson M, 2009. DDT and derivatives in indicator species of the aquatic food web of Rangsit agricultural area, Central Thailand. Ecological Indicators, 9: 878-882.

Slater GF, Cowie BR, Harper N, Droppo IG, 2008. Variation in PAH inputs and microbial community in surface sediments of Hamilton Harbour: Implications to remediation and monitoring. Environmental Pollution, 153: 60-70.

Smalling KL, Kuivila KM, Orlando JL, Phillips BM, Anderson BS, Siegler K, Hunt JW, Hamilton M, 2013.Environmental fate of fungicides and other current-use pesticides in a central California estuary. Marine Pollution Bulletin, 73: 144-153.

Smith JN, Lee K, Gobeil C, Macdonald RW, 2009. Natural rates of sediment containment of PAH, PCB and metal inventories in Sydney Harbour, Nova Scotia. Science of The Total Environment, 407: 4858-4869.

Sorensen T, 1948. A method of establishing group of equal amplitude in plant sociology based on similarity of species content and its application to analyses of the vegetation on Danish commons. Kongelige Danske Videnskabernes Selskab, 5: 1-34.

Southwick LM, Willis GH, Fouss JL, Rogers JS, Carter CE, 1997. Effect of sediment on runoff losses of pesticides of low water solubility. American Society of Agricultural Engineers, 972204:17.

Szlinder-Richert J, Barska I, Mazerski J, Usydus Z, 2008. Organochlorine pesticides in fish from the southern Baltic Sea: Levels, bioaccumulation features and temporal trends during the 1995–2006 period. Marine Pollution Bulletin, 56: 927-940.

Shabad LM, 1973. Circulation of carcinogens in the environment, Meditsina, Moscow.

Temme AJAM, Verburg PH, 2011. Mapping and modelling of changes in agricultural intensity in Europe. Agriculture, Ecosystems & Environment, 140: 46-56.

Theodorakopoulos, 2013. Analyse de la biodiversité bactérienne d’un sol contaminé de la zone d’exclusion de Tchernobyl et caractérisation de l’interaction engagée par une souche de Microbacterium avec l’uranium. Thèse de Doctorat, Université d’Aix-Marseille, p11.

Teske A., 2013. Marine Deep Sediment Microbial Communities. The Prokaryotes :123-138.

Totten LA, Gigliotti CL, Vanry D, Offenberg JH, Nelson E, Dachs J, Reinfelder JR, Eisenreich SJ, 2004. Atmospheric concentrations and deposition of polychorinated biphenyls to the Hudson River Estuary. Environmental Science and Technology, 38: 2568–2573.

Trabelsi S, Driss MR, 2005. Polycyclic aromatic hydrocarbons in superficial coastal sediments from Bizerte Lagoon, Tunisia. Marine Pollution Bulletin, 50: 344-348.

USEPA. 1984. Technical Guidance Manual for Performing Wasteload Allocations - Book VI, Design Conditions. Chapter 2, Temperature, pH, and Hardness. United States Environmental Protection Agency, Office of Water, Washington, DC.

USEPA, 1996. Technical Guidance Manual for Performing Wasteload Allocations - Book IV, Lakes and Impoundments.Chapter 2, Nutrient/Eutrophication Impacts. (EPA 440/4-84-019). United States Environmental Protection Agency, Office of Water, Washington, DC.

Villaroel E, Silva-Agredo J, Petrier C, Taborda G, Torres-Palma RA, 2014. Ultrasonic degradation of acetaminophen in water: Effect of sonochemical parameters and water matrix. Ultrasonics Sonochemistry, 21: 1763-1769.

Walters E, Kätzl K, Schwarzwälder K, Rutschmann P, Müller E, Horn H, 2014. Persistence of fecal indicator bacteria in sediment of an oligotrophic river: Comparing large and lab-scale flume systems. Water Research, 61: 276-287.

Warren N, Allan IJ, Carter JE, House WA, Parker A, 2003. Pesticides and other micro- organic contaminants in freshwater sedimentary environments—a review. Applied Geochemistry, 18: 159-194.

Warrena N, Allan IJ, Carter JE, House WA, Parker A, 2003.Pesticides and other micro- organic contaminants in freshwater sedimentary environments—a review. Applied Geochemistry, 18: 159-194.

Ward DM, Weller R, Bateson MM, 1990. 16rRNA sequences reveal uncultured inhabitants of a wellsstudied thermal community. FEMS Microbiology Reviews, 6: 105-115.

Wauchope RD, 1978. The pesticide content of surface water draining from agricultural fields - a review. Journal of Environmental Quality, 7(4): 459-478.

Wauchope RD, Estes TL, Allen R, Baker JL, Hornsby AG, Jones RL, Richards RP, Gustafson DI, 2002. Predicted impact of transgenic, herbicide-tolerant corn on drinking water quality in vulnerable watersheds of the mid-western USA. Pest Management Science, 58: 146-160.

WHO, 1986. Organophosphate Insecticides: A General Introduction, vol. 63. World Health Organization, New York.

Widenfalk A, Bertilsson S, Sundh I, Goedkoop W, 2008. Effects of pesticides on community composition and activity of sediment microbes – responses at various levels of microbial community organization. Environmental Pollution, 152: 576-584

Willis GH, McDowell LL, Murphree CE, Southwick LM, and Smith SJr, 1983. Pesticide concentrations and yields in runoff from silty soils in the lower Mississippi valley. Journal ofAgricultural and Food Chemistry, 31: 1171-1177.

Woese CR, 1987. Bacterial evolution. Microbiol Rev, 51: 221-271.

Woese CR, Kandler O, Wheelis ML, 1990. Towards a natural system of organisms: propostal for the domains Archae, Bacteria, Eucarya. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 87: 45576-4579.

Worrall F, Kolpin DW 2004. Aquifer vulnerability to pesticide pollution—combining soil, land-use and aquifer properties with molecular descriptors. Journal of Hydrology, 293: 191- 204.

Yancheshmeh RA, Bakhtiari AR, Mortazavi S, Savabieasfahani M, 2014.Sediment PAH: Contrasting levels in the Caspian Sea and Anzali Wetland. Marine Pollution Bulletin, 84: 391-400.

Ye L, Zhang T, 2013. Bacterial communities in different sections of a municipal wastewater treatment plant revealed by 16S rDNA 454 pyrosequencing. Applied Microbiology and Biotechnology, 97(6): 2681-90.

Zhao Z, Zhang L, Wu J, Fan C, 2009. Distribution and bioaccumulation of organochlorine pesticides in surface sediments and benthic organisms from Taihu Lake, China. Chemosphere, 77: 1191-1198.

Zheng S, Wang P, Wang C, Hou J, 2015. Sediment resuspension under action of wind in Taihu Lake, China. International Journal of Sediment Research, 30: 48-62.

Zhou Q, Wang J, Meng B, Cheng J, Lin G, Chen J, Zheng D, Yu Y, 2013. Distribution and sources of organochlorine pesticides in agricultural soils from central China. Ecotoxicology and Environmental Safety, 93: 163-170.

Zuckerand E, Paulling L, 1965. Evolutionary divergence and convergence and in proteins in evolvind genes and proteins, V. Bryson and H.J.Vogel (èd), academic Press, New York, pp 97-166.

CHAPITRE II :

MATERIELS ET METHODES

CHAPITRE II : MATERIELS ET METHODES

I. STRATEGIE D’ECHANTILLONNAGE :

Notre stratégie d’échantillonnage consiste à considérer deux campagnes de prélèvements d’eau et de sédiment au niveau du complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte. La première compagne a été effectuée en septembre 2011 fin de la période sèche et la deuxième en avril 2012 fin de la période pluvieuse.

Vingt sites ont été prospectés, huit dans le lac Ichkeul et onze dans la lagune de Bizerte ; une station dans la mer Méditerranée a été considérée comme témoin par rapport à tous le complexe (Fig 11). La plupart des sites sont situés aux embouchures des oueds qui alimentent les deux écosystèmes aquatiques. Deux points témoins aux centres du lac et de la lagune, les sites 4 et 20 sont considérés comme témoins. Les stations du lac ont été choisies par l’ANPE en fonction des conditions de drainage et des paramètres écologiques au niveau de cet écosystème. Elles correspondent aux différentes embouchures des oueds alimentant le lac Ichkeul et une seule station du centre du lac le site 8 afin d’estimer l’effet du ruissellement direct à partir des zones d’agricultures. Au niveau de la lagune, le site 9 permet d’estimer l’effet du trafic maritime au niveau du canal. Les stations 18 et 19, proposées par l’ANPE, permettent d’estimer l’effet de la pollution provenant des stations mytilicoles.

Fig 11: Localisation des stations d’échantillonnage dans le lac Ichkeul et la lagune de Bizerte

Le prélèvement de sédiment a été effectué grâce à une benne Van Veen en triplicats, soit 120 échantillons au total. Des boites stériles ont été remplies pour l’étude microbiologique (NPP et l’étude moléculaire), des boites en verre pour les analyses chimiques, des boites en plastiques pour l’étude méiofaunistique.

Le prélèvement d’eau a été effectué par remplissage des bouteilles en polystyrène pour le dosage de chlorophylle a et des éléments nutritifs.

Planche 3. Photo de la benne Van Veen 54

Planche 4. Station située au niveau de l’oued Tinja du coté sud de l’écluse (site 1)

Planche 5. Station située au niveau de l’embouchure d’un oued (site2)

Planche 6. Station située au centre du lac (site 4)

Planche 7. Station située au niveau de l’embouchure d’un oued (site 3)

Planche 8: Station située au niveau de l’embouchure de l’oued (site 5)

Planche 9. Station située au niveau de l’embouchure de l’oued Sejnane (site 6)

Planche 10. Station située au niveau de l’embouchure de l’oued Douimiss (site 7)

Planche 11. Station localisée en face de la briqueterie (site 8).

II. PARAMETRES DESCRIPTEURS DES SITE D’ECHANTILLONNAGE

Plusieurs paramètres abiotiques ont été mesurés, pour avoir une idée complète des écosystèmes étudiés, tels que les paramètres hydrologiques de routine qui ont été mesurés sur place : la température, le pH, la salinité et l’oxygène dissous ont été mesurés à l’aide d’un multi paramètre de type WTW Multi-197i.

1. La salinité La salinité représente la quantité de sels dissous dans l’eau. C’est un paramètre déterminant au niveau des écosystèmes aquatiques en particulier le lac Ichkeul puisqu’elle varie énormément entre les saisons. Elle dépend de l’hydrologie, principalement des apports en eaux douces des oueds du bassin versant et des précipitations. Mais, elle dépend aussi des échanges avec la lagune de Bizerte et de l’intensité de l’évaporation, notamment en été. Les apports d’eaux douces diluent les eaux du lac induisant ainsi une diminution de la salinité surtout après lessivage des sels par un flux sortant vers la lagune de Bizerte (ANPE, 2007). Au printemps et en été, la diminution des apports en eaux douces et des précipitations, et l’intensification de l’évaporation, induisent une augmentation de la salinité.

2. Le pH Le pH de l’eau de mer varie généralement entre 7,5 et 8,4, pour une moyenne de l’ordre de 8,2. Elle est légèrement basique. Le pH des eaux du lac varie généralement entre 7.6 pendant la période d’ouverture de l’écluse et 8.53 durant la période de fermeture de l’écluse (Ben M’barek, 2001).

3. L’oxygène dissous

L’oxygène dissous est un paramètre important des écosystèmes aquatiques. L’oxygène gouverne la majorité des processus biologiques, c’est un excellent indicateur de la qualité de l'eau (Ramade, 1982).

4. Les éléments nutritifs Les éléments nutritifs ont été aussi analysés dans les échantillons d’eau prélevés, le nitrate et le nitrite ont été déterminés selon Wood et al. (1967), l’ammonium a été analysé selon la procédure d’Aminot and Chaussepied (1983), le phosphate a été déterminé selon le protocole de Murphy et Riley (1962). Concernant la chlorophylle a (Chl a), les échantillons d’eau de mer ont été filtrés par filtre Whatman GF/F puis les concentrations des pigments ont été

58 déterminés selon la méthode standard spectrophotométrique de Parsons et al. (1984), après l’extraction effectuée avec 10 mL d’acétone 90% pendant toute une nuit à l’obscurité. Le carbone organique a été déterminé selon la procédure d’Espitalie et al. (1986). La matière en suspension a été déterminée selon la méthode de Baretta-Beakker et al. (1992). La MES a été mesurée au laboratoire après filtration d’un litre d’eau sur des filtres Whatman millipores (0,45μm). Les filtres utilisés ont été pesés avant et après filtration, la différence des pesées indique la quantité de matières en suspension relative au volume d’eau filtrée.

III. Analyses chimiques

III.1. Adaptation et validation de la méthode QuEChERS

La méthode QuEChERS a été adaptée par la réalisation de plusieurs tests de type de solvant utilisé, la méthode d’agitation et la masse de sédiment utilisée à fin de déterminer la meilleure méthode pour extraire les composés organiques HAP, PCB et OCP. Après cette méthode a été validée avec le GC-MS.

III.1.1. Optimisation de l’extraction des HAP, PCB et OCP

Les conditions d'extraction selon la méthode QuEChERS ont été optimisées pour l'analyse simultanée des HAP, PCB et OCP. La méthode d’extraction QuEChERS classique en utilisant l'acétonitrile a été comparée à une méthode modifiée en utilisant des mixtures de solvants: hexane-acétone (HA) et le dichlorométhane-acétone (DA). La méthode d'extraction a été optimisée en comparant l'agitation manuelle aux ultrasons et deux masses de sédiment ont été testées.

III.1.2. Extraction et purification des HAP, PCB et OCP

Le sédiment a été broyé dans un mortier, puis un aliquot de 5 g de sédiment a été pesé dans un tube en polypropylène (50 ml). Ensuite, 4 ml d'eau ultra-pure a été ajouté, le tube a été agité à la main et des standards internes (le naphtalène d8, le phénanthrène d10, pérylène d12, PCB 209, atrazine d5) ont été introduits. Ensuite 20 ml de solvant d'extraction ont été ajoutés et le tube a été agité vigoureusement à la main pendant 1 minute. Après le mélange de sels de tampon citrate est ajouté et le tube a été agité vigoureusement : manuellement pendant 5min puis par agitation aux ultrasons pendant 15 min. Enfin, le tube a été centrifugé pendant 3 min à 2500 rpm et 10 ml du surnageant ont été transférés dans un autre tube en polypropylène (15 ml), ce tube contient déjà 900 mg de MgSO4 et 150 mg de PSA. Le tube a été agité

59 vigoureusement à la main pendant 30 s et on le centrifuge pendant 3 min à 2500 rpm. Les extraits ont été ensuite séchés sous un léger courant d'argon en utilisant un système de concentration de l'évaporateur Turbovap LV. Le résidu séché a été re-dissous avec 1 mL d'acétonitrile maintenu à -20°C jusqu'à l'analyse.

III.1.3. Dosage des HAP, PCB et OCP

Le sédiment des échantillons conservés pour les analyses chimiques a été lyophilisé et broyé puis l’extraction et la purification ont été effectuées selon le protocole décrit en 3.1.2. Les analyses ont été effectuées à l'aide de la Chromatographie en phase gazeuse Agilent 7890A couplé à un spectromètre de masse Agilent 5975C avec une source d'ionisation par impact électronique (El). Le système GC-MS a été équipé d'une colonne Agilent DB5-MS UI. La température de la source d'ions et la température de quadrupôle ont tous les deux été maintenu à 230 ° C et 150 ° C, respectivement. Un volume de 1 µL de l'extrait concentré de l'échantillon a été injecté en mode sans division pulsé à une température d'entrée de 280 ° C.

IV. ANALYSES MOLECULAIRES

IV.1. Extraction de l’ADN génomique

L'ADN génomique de 250 mg d'échantillon de sédiment congelé a été extrait en utilisant un kit d’extraction d'ADN UltraClean du sol (mobio Laboratories, CA) en suivant le protocole du fabricant avec des modifications mineures, comme décrit précédemment par (Precigou et al., 2001).

IV.2. Amplification des gènes de l’ARNr 16S

Les gènes de l'ARNr 16S ont été amplifiés par PCR à partir de l'ADN génomique extraits des sédiments avec les amorces bactériennes universelles marquées par des fluorochromes 63F : 5'-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3' et 1387R 5'-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3' (Marchesi et al, 1998). Le mélange d'amplification par PCR contenait : 12,5 µl Ampli Taq or 360 Master Mix (Applied Biosystems), 0,25 pM de chaque amorce (20 pM), 0,5 µl des extraits d'ADN dilués 10x ont été ajoutés aux réactions de PCR. Le volume final de a été ajusté à 25 µl avec de l'eau distillée. La réaction de PCR a été réalisée dans un thermocycleur de PTC200 (MJ Research), dans les conditions suivantes : 95°C pendant 10 min, 35 cycles de

95°C pendant 45 secondes, 58°C pendant 45 secondes, 72°C pendant 1 min, avec une étape d'extension finale à 72°C pendant 10 min. Les produits de PCR ont alors été visualisés par électrophorèse en gel d’agarose puis purifiés en utilisant un kit de purification d'ADN sur gel (Takara, Japon) en suivant le protocole du fabricant.

IV.3. Analyse TRFLP

Les produits de PCR purifiés (100 ng) ont été digérés avec quatre unités d'enzyme AluI (Takara, Japon) pendant 3 heures à 37°C puis les fragments générés ont été séparés par électrophorèse capillaire. En bref, environ 50 ng de l'ADN digéré à partir de chaque échantillon a été mélangé avec 8,75 µl de formamide désionisée et 0,25 µl de Rox500 (Applied Biosystems ; marqueur de taille moléculaire), puis dénaturé à 94°C pendant 2 min et refroidi immédiatement dans la glace avant l'électrophorèse capillaire. Après une étape d'injection de 10s, l'électrophorèse a été réalisée pendant 30 min en appliquant une tension de 15 KV.

IV.4. Pyroséquençage Le séquençage 454 a été réalisé par la société Mr DNA, selon la méthode de Scott et al.,() puis le traitement des données par le logiciel Mothur a été effectué à fin de nettoyer les séquences et calculer la matrice. Au début l’extraction des séquences et la génération de 3 files fasta, qual et flow, ensuite la séparation des flowgrams en fonction des barcodes et primers a été réalisée, les séquences des barcodes et des primers ont été enlevées et filtrées. L’alignement selon la référence Silva, nécessaire pour rechercher les chimères et les contaminants, a été effectué. Puis une préclusterisation a été réalisée pour éliminer les erreurs de séquençage. Les chimères ont été recherchées et supprimées. Après, la classification et la suppression des contaminants ont été réalisées. L’alignement a été re-calculé pour le calcul de la matrice de distance. Enfin le calcul de la matrice de distance a été réalisé.

V. ETUDE DE LA MEIOFAUNE

La méiofaune a été extraite par la méthode de lévigation-tamisage (Vitiello et Dinet, 1979), colorés au rose Bengale et comptés après 24 heures sous la loupe binoculaire pour le calcul des densités moyennes des nématodes libres marins.

VI. TRAITEMENT STATISTIQUE DES DONNEES

Des traitements statistiques des résultats obtenus dans les différentes analyses chimiques, microbiologiques et nématologiques ont été effectués.

VI.1. Analyses univariées

Des indices d’analyses univariées ont été considérés : La diversité (indice de diversité de Shannon, H’), la richesse spécifique (R). Ces indices ont été calculés pour chaque site.

VI.2. Analyses multivariées

Les analyses multivariées ont été effectuées avec le logiciel PRIMER (Clarke et Gorley, 2001). Le coefficient de similarité de Bray-Curtis (Bray et Curtis, 1957) a été utilisé pour construire la matrice de similarité entre les différents sites. Le test d’analyse de similarités (ANOSIM) (Clarke, 1993) a été employé pour mettre en évidence l’existence d’éventuelles différences significatives entre les communautés microbiennes des différents sites. La procédure SIMPER (similarity percentages) a été utilisée pour déterminer la contribution de chaque souche (ou OTU) à la dissimilarité de Bray-Curtis moyenne entre les sites. Les analyses multivariées des données ont été réalisées par le logiciel MVSP v3.12d software (Kovach Computing Service, Anglesey Wales). Le croisement des résultats des analyses chimiques et microbilogique dans l’Analyse des Correspondances Canonique (CCA) a permis de voir l’impact des HAP et des POC présents dans les différents sites sur les communautés bactériennes. Le logiciel R a été aussi utilisé pour les analyses multivariées tels que le diagramme de veen, le heat map et les réseaux à fin d’analyser les communautés microbiennes des différents sites ainsi que les relations entres les souches.

Références bibliographiques Aminot A, Chaussepied M, 1983. Manuel des analyses chimiques en milieu marin, Centre National pour l’Exploitation des Océans. 395 p.

ANPE, 2007. Site Agence nationale de protection de l’environnement : www.anpe.nat.tn/fr. Consulté le 6 avril 2007.

Baretta-Beakker JG, Duursma EK, Kuipers BR, 1992. Encyclopodia of marine Science. Springer.

Ben M’barek N, 2001. Étude de l’écosystème du lac Ichkeul et de son bassin versant : caractéristiques physiques et géochimiques des eaux et des sédiments. Thèse Doctorat, Université de Tunis, 235 p.

Bray JB, Curtis JT, 1957. An ordination of the upland forest communities of Southern Wisconsin. Ecological Monographs, 27 : 325-349.

Clarke KR, 1993.Non-parametric multivariate analyses of changes in community structure. Australian Journal of Ecology, 18: 117-143.

Clarke KR, Gorley RN, 2001.PRIMER v5: User manual/tutorial. PRIMER-E: Plymouth, UK, 91 p.

Espitalie JGD, Marquis F, 1986. La pyrolyse Rock-Eval et ses applications. Institut français du pétrole.

Marchesi JR, Sato T, Weightman AJ, Martin TA, Fry JC, Hiom SJ, Dymock D, Wade WG, 1998. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology, 64:795-9.

Murphy J, Riley JP, 1962. A modified single solution method for the determination of phosphate in natural water. Analytica Chimica Acta, 27 : 31-36.

Parsons TR, Maita Y, Lalli CM, 1984.A manual of chemical and biological methods for seawater analysis. Oxford, Pergammon Press: 173p.

Precigou S, Goulas P, Duran R, 2001. Rapid and specific identification of nitrile hydratase (NHase) encoding genes in soil samples by polymerase chain reaction. FEMS Microbiology Letters, 204(1):155-61.

Ramade F, 1982. Eléments d’écologie, écologie appliquée « action de l’homme sur la biosphère» Ed. Mc Graw-Hill.,. 452. Vitiello P, Dinet A, 1979.Définition et échantillonnage du méiobenthos. Rapport de la Commission internationale pour l’Exploration Scientifique de la Mer Méditérranée, 25 : 279- 283.

Wood E D, Armstrong F A J, Richards F A, 1967. Determination of nitrates in sea water by cadmium-copper reduction of nitrites. Journal of the Marine Biological Association UK, 47 : 23-31.

CHAPITRE III : STRATEGIE DE HIERARCHISATION DES POLLUANTS CHIMIQUES D’INTERET A RECHERCHER DANS LE COMPLEXE LAC ICHKEUL-LAGUNE DE BIZERTE

Partie A : Premier recensement des pesticides agricoles utilisés en Tunisie : cas du bassin agricole du lac Ichkeul et la lagune de Bizerte

Introduction

La présence des polluants organiques les HAP, les PCB et les pesticides dans les écosystèmes aquatiques est préoccupante. Plusieurs études se sont intéressées à ces contaminants à travers le monde avec pour objectifs de mettre en évidence leur présence dans la mer, les lagunes, les lacs et les oueds et de déterminer leur quantité dans différentes matrices environnementales

(eau, sédiment et organismes biologiques) (Ke et al., 2002 ; Verweij et al., 2004 ;Wendt-

Rasch et al., 2004 ; Fernando et al., 2009 ; Berg et al., 2011 ; Engraff et al., 2011 ; Szlinder-

Richert et al., 2014). En Tunisie, depuis quelques années des études sont menées, mais elles se sont surtout intéressé aux HAP dans les sédiment de Sfax (Louati et al., 2001 ; Zaghden et al., 2007) et les sédiments de la lagune de Bizerte (Ben Said et al., 2010). Une seule étude s’est intéressée aux PCB dans les sédiments de la baie de Monastir (Nouira et al., 2013).

Concernant les pesticides, une seule étude a déterminé les concentrations des pesticides organochlorés chez des poissons collectés dans la lagune de Bizerte (Ben Ameur et al., 2013).

La détection de la contamination par les HAP et les PCB est facilitée car ces contaminants représentent un nombre limité de molécules (e.i. 16 HAP préconisés par l’agence américaine de protection de l’environnement) alors que pour les pesticides le nombre de matières actives est très élevé. En effet, le problème de résistance des plantes exige de changer le pesticide d’une période à une autre afin que de garder l’effet biocide. Afin de définir les molécules de pesticides à rechercher dans le complexe lac Ichkeul-Lagune de Bizerte, une enquête a été

66 effectuée auprès des agriculteurs, des revendeurs et le commissariat régional de développement agricole de Bizerte, dans le bassin versant du complexe. Le résultat de l’enquête permet d’avoir une idée claire des pesticides problématiques qu’il faut analyser dans le sédiment du complexe.

Références bibliographiques

Ben Ameur W, Trabelsi S, El Megdiche Y, Ben Hassine S, Barhoumi B, Hammami B,

Eljarrat E, Barceló D, Driss MR, 2013. Concentration of polychlorinated biphenyls and organochlorine pesticides in mullet (Mugil cephalus) and sea bass (Dicentrarchus labrax) from Bizerte Lagoon (Northern Tunisia). Chemosphere, 90: 2372-2380.

Ben Said O, Goñi-Urriza M, El Bour M, Aissa P, Duran R, 2010.Bacterial Community

Structure of Sediments of the Bizerte Lagoon (Tunisia), a Southern Mediterranean Coastal

Anthropized Lagoon. Microbial Ecology, 59: 445–456.

Berg K, Puntervoll P, Klungsøyr J, Goksøyr A, 2011. Brain proteome alterations of Atlantic cod (Gadus morhua) exposed to PCB 153. Aquatic Toxicology, 105: 206-217.

Engraff M, Solere C, Smith KEC, Mayer P, Dahllöf I, 2011. Aquatic toxicity of PAHs and PAH mixtures at saturation to benthic amphipods: Linking toxic effects to chemical activity. Aquatic Toxicology, 102: 142-149.

Carvalho FP, Villeneuve JP, Cattini C, Rendón J, Mota de Oliveira J, 2009. Pesticide and PCB residues in the aquatic ecosystems of Laguna de Terminos, a protected area of the coast of Campeche, Mexico. Chemosphere, 74 : 988-995.

Ke L, Wong TWY, Wong YS, Tam NFY, 2002.Fate of polycyclic aromatic hydrocarbon

(PAH) contamination in a mangrove swamp in Hong Kong following an oil spill. Marine

Pollution Bulletin, 45 : 339-347.

Louati A, Elleuch B, Kallel M, Saliot A, Dagaut J, Oudot J, 2001. Hydrocarbon

Contamination of Coastal Sediments from the Sfax Area (Tunisia), Mediterranean Sea.

Marine Pollution Bulletin, 42 :444-451.

Nouira T, Risso C, Chouba L, Budzinski H, Boussetta H, 2013. Polychlorinated biphenyls

(PCBs) and Polybrominated Diphenyl Ethers (PBDEs) in surface sediments fromMonastir

Bay (Tunisia, Central Mediterranean): Occurrence, distribution and seasonal variations.

Chemosphere, 93: 487-493.

Szlinder-Richert J, NermerT, SzatkowskaU, 2014.PAH metabolites in European eels

(Anguilla anguilla) as indicators of PAH exposure: Different methodological approaches.

Science of The Total Environment, 496 : 84–91.

Wendt-RaschL, Van den BrinkPJ, CrumSJH, WoinP, 2004.The effects of a pesticide mixture on aquatic ecosystems differing in trophic status: responses of the macrophyte Myriophyllum spicatum and the periphytic algal community. Ecotoxicology and Environmental Safety, 57:

383-398.

Zaghden H, Kallel M, Elleuch B, Oudot J, Saliot A, 2007. Sources and distribution of aliphatic and polyaromatic hydrocarbons in sediments of Sfax, Tunisia, Mediterranean Sea.

Marine Chemistry, 105: 70-89.

I. Publication 1 :

A soumettre dans le journal Cahiers Agricultures

Premier recensement des pesticides agricoles utilisés en grandes cultures dans le bassin versant du lac Ichkeul et la lagune de Bizerte (Tunisie)

First survey of agricultural pesticides used for crops in Ichkeul Lake- Bizerta Lagoon watershed (Tunisia)

Fida Ben Salema,b*, Olfa Ben Saida, Patricia Aissaa, Robert Duranb & Olivier Grunbergerc

a Laboratoire de Biosurveillance de l’Environnement, Faculté des Sciences de Bizerte, 7021, Zarzouna, Tunisie. b Equipe Environnement et Microbiologie – UMR CNRS IPREM 5254- IBEAS- Université de Pau et des Pays de l'Adour - France. c IRD, UMR-LISAH (IRD-INRA-SupAgro), Bat 24, 2 place Viala, F-34060, Montpellier cedex 01, France

*Corresponding author present address:

Equipe Environnement et Microbiologie

UMR CNRS IPREM 5254- IBEAS

Université de Pau et des Pays de l'Adour - France.

Tel: +216 72 400 121 Fax: + 216 72 590 566

Email: [email protected]

Résumé

L’objectif de cette étude consiste à recenser les pesticides utilisés au niveau du bassin agricole entourant le complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte. Ce complexe est un bassin versant à majorité de grandes cultures (blé, orge, fourrage…). Le recensement auprès des agriculteurs et des revendeurs de produits phytosanitaires montre que les matières actives les plus utilisées sont l’iodosulfurone (2014 kg), le mésosulfurone (1218 kg), le 2,4D (4618 kg), le glyphosate

(2886kg) et le fénoxaprop (5300 kg) comme matières actives des herbicides ; le tébuconazole

(9260 kg) et l’époxiconazole (17168 kg) comme fongicide ; et la deltaméthrine (341 kg), matières active d’insecticides. Les herbicides sont utilisés deux fois par an (pré et post

émergence), le traitement par les fongicides se fait suite aux attaques de rouille, les insecticides sont appliqués contre les insectes tel les pucerons par exemple. Les pourcentages des matières actives utilisées ont été déterminés permettant d’établir un classement selon les paramètres physico-chimiques de chaque principe actif (solubilité, DT50 et KOC). Ensuite, une estimation théorique de la quantité de chaque matière active a été déterminée. Les grandes cultures du bassin agricole du lac Ichkeul et de la lagune de Bizerte sont d’importantes utilisatrices d’herbicides, fongicides et insecticides alors que les cultures maraîchères utilisent de grandes quantités d’insecticides et d’herbicides.

Mots clés: recensement, pesticide, rive sud de la Méditerranée, quantifier, complexe lac

Ichkeul-lagune de Bizerte.

Abstract :

The objective of this study is to identify the pesticides used in the agricultural watershed surrounding the complex Ichkeul Lake-Bizerta lagoon. The complex is a watershed majority of field crops (wheat, barley, feed ...). The survey of farmers and dealers of pesticides shows that the most commonly used active ingredients are iodosulfuron (2014 kg), mesosulfuron

(1218 kg), 2.4D (4618 kg), glyphosate (2886kg) and fenoxaprop (5300 kg) as herbicidal active ingredient; tebuconazole (9260 kg) and epoxiconazole (17168 kg) as a fungicide; and deltamethrin (341 kg), as insecticide. Herbicides are used twice a year (pre- and post- emergence), treatment with fungicides is a result of rust attacks, insecticides are applied against insects such as aphids, for example. The percentages of active ingredient were determined to establish a ranking according to the physicochemical parameters of each active ingredient (solubility, DT50 and KOC). Next, a theoretical estimation of the amount of each active ingredient was determined. Crops agricultural basin of Ichkeul Lake and Bizerta lagoon are important users of herbicides, fungicides and insecticides while vegetable crops use large amounts of insecticides and herbicides.

Keywords: survey, pesticide, southern shore of the Mediterranean, quantify, Ichkeul Lake-

Bizerta lagoon.

Introduction

L'intensification de la production agricole à travers le monde s'accompagne souvent d’une utilisation excessive et abusive de pesticides (Grovermann et al., 2013; Schreinemachers et

Tipraqsa, 2012). La production de céréales, source millénaire de la nutrition humaine ne cesse de s’amplifier en liaison avec la croissance démographique et le développement. Selon la FAO (2009) la production totale annuelle de céréales devra augmenter d'environ 3 milliards de tonnes pour répondre à la demande mondiale d'ici 2050. L'utilisation de pesticides

(herbicides, fongicides, insecticides…) permet la sécurisation des rendements en diminuant les pertes des cultures par les mauvaises herbes, les moisissures et les insectes (Fabro et

Varca, 2012). Cependant leur usage peut entraîner la présence de résidus toxiques dans les produits de consommation, la biosphère et l’environnement. Les pesticides se retrouvent dans les flux hydriques car ils peuvent se dissoudre facilement. Ils peuvent rejoindre les milieux aquatiques par ruissellement ou infiltration et se retrouvent alors liés aux matières en suspension dans l’eau et le sédiment (Rodrigues et al., 2013). Sur le pourtour méditerranéen, l’utilisation des pesticides dans les bassins versants agricoles s'est intensifiée ces dernières décennies. Les pesticides utilisés se sont diversifiés afin de répondre aux problèmes de résistances. La prise en compte des risques sanitaires et écologiques liés à l’utilisation des pesticides est un enjeu important mais pourrait affecter la production alimentaire (Carvalho,

2006). En Tunisie, à l’exception des retombées du protocole de Stockholm sur les pesticides périmés (Dasgupta et al., 2010), très peu d'information publique est disponible sur l’utilisation des pesticides. Une estimation par le "Pesticide Action Network" a évalué les quantités de pesticides importés en Tunisie à 3985 tonnes de pesticides en 2004 et 3632 tonnes en 2005.

L’agriculture tunisienne est donc utilisatrice de produits phytosanitaires, mais son contexte ne privilégie pas une vision claire des quantités utilisées, ni une estimation de leur impact sur

72 l’environnement et la santé humaine, malgré que la grande culture est une source de contamination ailleurs : en Italie (Screpanti et al., 2005) et en Turquie (Uludag et al., 2007).

Le système de la lagune de Bizerte et du lac d'Ichkeul est un site d’étude privilégié.

Premièrement, le lac Ichkeul est un des rares sites au monde inscrits sur trois conventions internationales (Ben M’barek, 2002). Deuxièmement, le lac Ichkeul et la lagune de Bizerte reçoivent une quantité inconnue de polluants provenant de leur bassin versant, zones agricoles principalement cultivées en céréaliculture. Ces deux écosystèmes communiquent entre eux à travers l’oued Tinja. L’exploitation du complexe présente des enjeux importants en termes de services écosystémiques comme la préservation de la biodiversité, la fourniture de produits de la pêche et de l'aquaculture pour la consommation humaine. Le complexe est sous l’influence de grandes superficies agricoles, majoritairement spécialisées en grandes cultures (céréales et fourrage) utilisatrices de pesticides (Stevenson et Battarbee, 1991) (Fig 1). L’utilisation des pesticides dépend de l’exploitant agricole dans le contexte de sa filière de production qui comprend les fournisseurs de produits et de semences, les cahiers de charges, la réglementation, etc… L’agriculteur vise le niveau optimal de traitements pesticides du point de vue de son appréciation des risques.

Malgré plusieurs études éco-toxicologiques sur la lagune de Bizerte (Ben Said et al., 2010) et quelques données sur la pollution métallique du lac Ichkeul (Ben M’barek, 2002) aussi sur plusieurs écosystèmes aquatiques du sud de la méditerranée aucune étude n’a été entreprise pour estimer les apports en pesticides agricoles dans ce complexe ni dans tous le sud de la méditerranée. Les objectifs de cette étude consistent donc à définir, pour le bassin versant du complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte, les pratiques agricoles afin de recenser les pesticides les plus utilisés et d’en estimer leurs quantités. La collecte des pratiques agricoles dans les zones entourant les deux plans d’eau, nous a permis de comparer avec les pratiques agricoles

73 aux autres pays et de mettre en évidence quelques molécules problématiques susceptible de se retrouver dans les eaux et le sédiment du complexe.

Matériels et Méthodes

Site d'étude

Le terrain d’étude appartient à deux étages bioclimatiques. L’étage méditerranéen humide sous étage inférieur à hiver doux et l’étage méditerranéen subhumide à hiver doux. La pluviométrie annuelle moyenne de la région varie de 450 à 650 mm par an. Le complexe lac et lagune est alimenté par plusieurs oueds. L’apport d’eau douce du bassin versant du lac

Ichkeul est de 0,15 m3/km2 de superficie alors qu’il est de 0,06 m3/km2, la lagune est donc plus faible et plus plat ainsi elle reçoive moins de ruissellement (ANPE, 2005). Le lac Ichkeul est le point terminal d’un important réseau hydrographique drainant un bassin versant d’une surface d'environ 2080 km2 (Ben Garali et al., 2009). Les pentes les plus faibles entourent le complexe. En s’éloignant de ces écosystèmes la pente augmente, l’eau de drainage et des oueds se déversent finalement dans le lac et la lagune (CRDA, 2007). La salinité du lac dépend de l’hydrologie du complexe cependant elle est de l’ordre de 4 gL-1 en hiver (eau douce) et elle passe à 35 gL-1 en été à cause de l’évaporation et de l’influence de l’eau marine provenant de la lagune. Une base de données, établie par le Commissariat Régional de

Développement Agricole CRDA, permet de mieux comprendre les caractéristiques des deux bassins versants. L’analyse de l’occupation du sol dans ce bassin versant montrent que les grandes cultures (Céréales et fourrage) occupent les plus grandes superficies agricoles

(Céréales 77620 ha et fourrage 46470 ha). L’arboriculture fruitière (18465 ha), située dans les parties hautes, est plus marginalement tout comme les zones maraichères et légumineuses

(5230 et 11770 ha respectivement).

Stratégie d’échantillonnage

Le contact avec les agriculteurs est pris à travers le commissariat régional de développement agricole (CRDA) et leurs représentants au niveau des délégations appelées les cellules territoriales de vulgarisation (CTV). Les données ont été collectées aussi auprès des revendeurs des produits phytosanitaires et enfin chez les agriculteurs. Les CTV visités sont celles qui appartiennent aux bassins versants du lac Ichkeul et de la lagune de Bizerte. Les revendeurs des pesticides dans la région de Bizerte sont constitués par un seul grand fournisseur de produits phytosanitaires situé à Mateur qui vend ses produits aux agriculteurs qui ont des terrains aux alentours du lac Ichkeul et des revendeurs situé à Bizerte ville, la clientèle de ces revendeurs sont plutôt les agriculteurs qui ont des terrains aux alentours de la lagune de Bizerte. Lors des visites, les questions portaient sur la nature et les quantités de pesticides vendues. Chaque agriculteur enquêté exploite des terrains qui appartiennent tous aux bassins versants du lac et de la lagune. Un échantillon représentatif de la population globale d'exploitations comportant environ 100 individus a été interrogé (Fig 1).

Grandes cultures Forêts Arboriculture fruitière Cultures maraîchères Implantation d’olives

Fig .1 Carte d’occupation du sol de la région de Bizerte et localisation approximative des terrains des agriculteurs questionnés

Une liste des agriculteurs a été fournit par la CRDA puis le choix a été établit par rapport à l’emplacement des terrains le plus proche du lac et de la lagune et des oueds qui alimentent le complexe. L'entretien est semi directif. Il débute à propos des problèmes auxquels font face les agriculteurs de façon générale, puis sur les pesticides utilisés comme traitement aux maladies et aux mauvaises herbes dans les cultures céréalières et fourragères. Le discours a toujours été amical. Trois informations minimales sont déterminées (type de culture, pesticides utilisés, superficie du champ cultivé) (Voir questionnaire en annexe 1).

Entre Avril 2011 et Mars 2012, 100 agriculteurs, 4 ingénieurs des (CTV) et des ingénieurs de l’office des terres domaniales (OTD) ont été questionnés. L’OTD est propriétaire de 4102 ha, situé dans les délégations de Mateur et Ghezella, dont 3524 ha sont des grandes cultures. La pluviométrie durant cette saison a été mesurée, elle est d’une moyenne de 600 mm entre

Septembre 2011 et Mars 2012. Une démarche logique a été adoptée pour calculer les quantités globales des matières actives utilisées dans les bassins versant du lac et de la lagune.

Méthode de calcul global

Des pourcentages d’utilisation des matières actives correspondant aux pesticides (nom commercial) ont été déterminés en divisant le nombre d’agriculteurs qui utilisent cette matière active sur le nombre total d’agriculteurs enquêtés (* 100). Après un classement établit selon les paramètres physico-chimiques de chaque principe actif une estimation de la quantité de chaque matière active, utilisée dans le bassin agricole entourant le complexe lac Ichkeul- lagune de Bizerte, a été déterminée. Cette quantité (Qsubstance) est le produitdes surfaces cultivées (ha) par le pourcentage d'utilisation du pesticide (%) par le dosage de la matière active dans le pesticide.

Méthode de calcul par agriculteur

Pour chaque agriculteur, le pourcentage des superficies consacrées pour les grandes cultures a

été déterminé. Ensuite, les quantités des pesticides utilisés ont été calculées en multipliant la surface par le dosage des herbicides les plus utilisés par cet agriculteur.

Résultats

Utilisation des pesticides dans le complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte

D’après les agriculteurs et les ingénieurs du CRDA les grandes cultures (céréalières et fourrages) occupent le plus grand pourcentage des superficies des champs cultivés au niveau des délégations concernés. Elles sont de grandes utilisatrices d’herbicides, de fongicides et d’insecticides (Tableau 1).

Tableau 1. La liste des matières actives utilisées dans le bassin versant lac Ichkeul-Lagune de Bizerte

Type de pesticides Matières actives Noms commercials Herbicides Iodosulfuron Puma, Amilcar Fénoxaprop Puma Mésosulfuron Amilcar 2,4D Sansac, Factor, Dialene super, Mustang Glyphosate Kalach Diclofop Ilexan super, Dopler, Tribenuron Granstar Fongicides Tébuconazole Horizon Epoxiconazole Opus, Ogam, Soprano, RexDuo, Spike Flusilazole Punch Cyproconazole Amistar, Altosuper Dimoxystrobine Swing gold azoxystrobine Amistar Insecticides Deltaméthrine Decis

Les herbicides sont utilisés pour détruire les mauvaises herbes afin de supprimer la compétition interspécifiques sur l’espace entre d’une part le blé, l’orge et le fourrage et d’autre part les mauvaises herbes. Les traitements se font généralement deux fois par an, en automne (octobre) et au printemps (mars). Les fongicides sont utilisés deux fois par an comme traitement préventif. Ils sont aussi utilisés comme traitement curatif de la "rouille" à chaque fois qu’il y est la maladie. La rouille est une maladie très répandue causée par les moisissures. Les insecticides sont utilisés à chaque fois qu’il y’a une maladie. Au total au mois deux applications d’herbicides, deux pulvérisations de fongicides et une application d’insecticide (Fig 2).

Pluviométrie Herbicides Herbicides

Fongicides

Sep Oct Nov Déc Janv Fév Mars Avr Mai Juin Juil Août

Fig.2 Pluviométrie du mois du septembre 2011 au mois d’Août 2012 avec l’horloge d’utilisation des herbicides

Les pesticides utilisés sont pulvérisés par avion pour les grandes superficies agricoles et par tracteurs sur les petites superficies. Il faut noter que les agriculteurs indiquent toujours utiliser le dosage consigné par les revendeurs qui est celui indiqué dans les catalogues et sur les bouteilles de pesticides. Il est donc impossible d’établir la variété des doses par ce biais. Dans l’entretien, il est difficile dans la discussion d’aller au delà de cette indication très générale, alors que ce posent des problèmes d’estimation des volumes, lors de la dilution du produit, et de quantité par surface, lors de l’épandage, ces deux paramètres induisant une forte imprécision sur la quantité réellement répandue. Des agriculteurs indiquent qu’il y avait des

échecs et des résistances, qui sont des occasions où ils demandent l’aide technique surtout des ingénieurs de CRDA et parfois des revendeurs et font des traitements supplémentaires. Les quantités de substances actives appliquées dans le bassin versant sont estimées à 44,7 t/an

(Tableau 2). Ces valeurs correspondre approximativement à 0,5% des importations de pesticides en Tunisie. Il s’agit de substances actives herbicides (17,9t), de fongicides (26,4t) et d’insecticides (0,4t kg).

Tableau 2. Estimation des quantités des principales matières actives utilisées dans les zones

agricoles concernées après dire des agriculteurs.

Matière active (nom Superficie Dosage du Quantité de Nombre Quantité de Quantité de commercial) des cultures pesticide matière d’applicatio matière matière céréalières active n minimal active utilisée active et par an vendue fourragères traités

Unité Ha L ha-1 g L-1ou Kg Kg -1 traités ou g ha-1 g kg Iodosulfuron(Puma) 41410 1 L/ha 8 g/L 662 192 Iodosulfuron(Amilcar) 61480 330 g/Ha 30 g/Kg 1352 1013 Iodosulfuron (Total) 2 2014 1205 Fénoxaprop (Puma) 41410 1 L/HA 64 g/L 2 5300 1536 2,4D 8016 0,8 L/ha 360 g/L 2 4618 2400 Mésosulfuron(Amilcar) 61480 330 g/Ha 30 g/Kg 2 1218 1013 Glyphosate 8016 1 L/Ha 360 g/L 2 4772 2160 Tébuconazole (Horizon) 18520 1L/Ha 250 g/L 2 9260 3750 Epoxiconazole (Opus) 18520 0,8 L/Ha 125 g/L 3704 2340 Epoxiconazole (Rex Duo) 21136 0,5 L/Ha 187 g/L 3952 2280 Epoxiconazole (Soprano) 25082 1L/Ha 125 g/L 6270 1950 Epoxiconazole (Ogam) 18520 0,7L/Ha 125 g/L 3242 780 Epoxiconazole (Total) 2 17168 7350 Deltaméthrine (Decis) 91049 0,25L/Ha 15 g/L 1 341 300

Estimation des pesticides vendus

Les visites effectuées au fournisseur et aux revendeurs ont permis de déterminer la nature et

les quantités de pesticides vendus dans la zone d’étude (Tableaux 2&3). Les quantités de

matières actives vendues durant l’année 2012 ont été calculées en se basant sur le pourcentage

de matière active présent dans les pesticides. Le bilan montre une consommation de 28 t/an de

substances actives. Les plus grandes quantités vendues sont celles de l’iodosulfurone

(1205kg), le mésosulfurone (1013kg), le 2,4D (2400kg), le glyphosate (2160kg), et le

fénoxaprop (1536kg) comme matières actives herbicides ; le tébuconazole (3750kg) et

l’époxiconazole (7350kg) comme fongicide et la deltaméthrine (300kg) matières active des

insecticides.

Tableau 3: Les quantités des pesticides vendues par an au niveau des délégations concernées (L : Litres, kg)

Types de Nom Ventes Principes actifs Kg pesticides commercial annuelles produits Herbicides Puma 24000 L Fénoxaprop 6.4% 1536

Iodosulfuron 0.8% 192

Méfenpyr 2.4% 576

Amilcar 135000 L Mésosulfuron0.75% 1013

Iodosulfuron0.75% 1013

Méfenpyr 2.25% 3087

Glyphosate 6000 L Glyphosate36% 2160

Mustang 8000 L 2,4D 30% 2400

Florasulam 0.6% 36

Total 12013 Fongicides Soprano 15000 L Epoxiconazole 13% 1950 Ogam Epoxiconazole 13% 6000 L Krésoxim 13% 780 780

Rex Duo 12000L Epoxiconazole19% 2280

Thiophanate 31% 3720

Horizon 15000 L Tébuconazole 25% 3750 Opus 18000 L Epoxiconazole 13% 2340 Total 15600 Insecticides Decis 3000 L Deltaméthrine 10% 300

Grand Total 27913

Estimation des pesticides utilisés par les agriculteurs

L’enquête de terrain couvre une surface de 113390 hectares de grandes cultures (céréales et fourrages). Le bilan montre que les quantités de pesticides utilisées au niveau du bassin versant de la lagune de Bizerte et du lac Ichkeul, pour les grandes cultures céréalières et fourragères, sont de 17,9t de matières actives d’herbicides, 26,4t de matières actives de fongicides et de 0,4t de matières actives d’insecticides, soit au total 44,7t de matières actives pour 113390 hectares de grandes cultures. Ainsi les agriculteurs utiliseraient 0,4 kg de matière active par hectare par an au minimal.

Comparaison pesticides vendus et pesticides utilisés

Les différences entre les quantités de matières actives déclarées être vendues par les revendeurs et celles déclarées être utilisées par les agriculteurs ne sont pas très importantes pour la plupart des substances. Ainsi les matières actives telles que l’iodosulfurone

(1205/2014kg), mésosulfurone (1013/1218kg), 2,4D (2400/4618kg), glyphosate

(2160/4772kg) et la deltaméthrine (341/300kg) semblent bien déterminées par l’enquête auprès des agriculteurs. En revanche, des différences en faveurs des quantités utilisées apparaissent plus importantes pour le fénoxaprop (1536/5300kg), l’époxiconazole

(7350/17168kg), le tébuconazole (3750/9260kg) laissant penser que les agriculteurs ont d’autres fournisseurs de produits phytosanitaires à part le fournisseur au niveau du gouvernorat de Bizerte, dont on peut citer le CRDA qui intervient dans des cas de résistance surtout à fournir une nouvelle matière active.

Les résultats de ce recensement indiquent qu’actuellement les formules commerciales

Amilcar et Puma sont les deux herbicides les plus employés en alternances à fin d’éviter les problèmes de résistance, bien que deux des trois principes actifs soient identiques dans les deux produits. Le glyphosate et les autres herbicides sont minoritaires en volumes répandus mais peuvent représenter des quantités de substances actives non négligeables du fait des

82 concentrations. Amilcar et Puma semblent particulièrement conseillés par les revendeurs, surtout que les couts de traitement ne sont pas comparables. Les statistiques sur l’exploitation indiquent que 38% des agriculteurs utilisent deux fongicides de mêmes matières actives l’époxiconazole et le tébuconazole (Opus, Ogam, Soprano, RexDuo, Spike, horizon), 62% utilisent une gamme très variée.

Discussion

Le potentiel de transfert des produits phytosanitaires et la possibilité de détection des matières actives peuvent être évalués à partir de quelques propriétés physico-chimiques (tableau 4) qui caractérisent chaque substance active tel que le coefficient de partage carbone organique/eau, la solubilité et le temps de demi-vie (Worrall et Kolpin, 2004). Le coefficient de partage carbone organique/eau donne une indication sur l’aptitude de la molécule à être adsorbée ou désorbée sur la matière organique : Les pesticides fortement adsorbés sont en principe retenus

à la surface du sol (moins lessivables). Dans ce cas, les quantités de pesticides ruisselées vont dépendre des quantités de sédiments érodés et transportés (McDowell et al., 1981 ;Willis et al., 1983). Les molécules aux faibles Koc vont être retrouvées avec les plus fortes concentrations dans la phase aqueuse du ruissellement. (Dabrowski et al., 2002 ; Klöppel et al., 1997 ; Klöppel et al. 1994 ; Southwick et al., 1997 ; Wauchope et al., 1978 ; Wauchope et al., 2002). La demi-vie est le temps mis par une substance pour perdre la moitié de son activité biocide.

Tableau 4. Les propriétés physico-chimiques de certaines matières actives http://sitem.herts.ac.uk/aeru/footprint/fr/index.htm, Stuart et al., 2012 ; Passeportet al., 2013

Matière active Koc Solubilité DT50 dans l'eau ML g-1 mg l-1 Jours

Herbicides

Fénoxaprop 9490 0.9 1

Iodosulfuron 97.7 25000 181

Méfenpyr 634 20 135

Mésosulfuron 3 483 48

Glyphosate 1435 10500 12

2,4D 88.4 23180 29

Fongicides

Epoxiconazole 1073 7.1 119.8

Tébuconazole 769 36 365

Insecticides

Deltaméthrine 10240000 0.0002 65

Les différentes matières actives utilisées dans le bassin versant étudié (Tableau 1) sont utilisées actuellement dans les pays européens. D’après les résultats du tableau 2, Les pesticides les plus utilisés au niveau du bassin agricole de la lagune de Bizerte et lac Ichkeul sont en majorité des herbicides et des fongicides. Les agriculteurs utilisent 0,4 kg de matière active par hectare. Cette quantité est faible par rapport à 3-4 kg de matière active par hectare utilisée en France et aux états unis (Schreinemachers et Tipraqsa, 2012) ainsi que 13 kg de matière active par hectare utilisées en Thaïlande sur des bassins versants de cultures d’exportations (Grovermann et al., 2013). Plus proche, une étude du ministère de l’agriculture français (Agreste, 2014) indique que pour la campagne agricole 2011, Les blés reçoivent un

84 nombre moyen de traitement proche de 2 par an aussi bien en herbicides qu’en fongicides alors que les traitements insecticides se font en moyenne de 0,25 a 0,5 fois par an, ceci confirme nos résultats.

Schreinemachers et Tipraqsa, (2012) indiquent qu’une intensification de la production agricole de 1% impliquerait une augmentation de l’utilisation des pesticides de 1,8%. Les auteurs indiquent également que la diminution de l'utilisation d'insecticides serait compensée par une augmentation de l’utilisation d’herbicides et de fongicides, ce qui semble être le cas en Tunisie. Selon Schreinemachers et Tipraqsa, 2012, l'utilisation de pesticides par hectare de terres cultivées dépend des revenus des pays. L’utilisation de 0,2 kg de matière active par hectare place la Tunisie dans l’intervalle des pays à faible revenu, beaucoup plus faible que 13 kg de substances actives par hectare utilisés en Thaïlande (Schreinemachers et Tipraqsa,

2012). Du point de vue des molécules utilisées, ce premier recensement, réalisé dans le bassin versant du lac Ichkeul et de la lagune de Bizerte, montre une utilisation de fongicides, d’herbicides et d’insecticides de « nouvelle génération ». Ces pesticides ont remplacé les pesticides d’ancienne génération, les pesticides organochlorés, très persistants dans l’environnement et encore présents aujourd’hui dans les sédiments de la lagune de Bizerte et probablement présents dans les sédiments d’Ichkeul. Ces molécules sont autorisées pour utilisation en France.

Les herbicides actuels peuvent causer de nouvelles perturbations écologiques dans le complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte. Ainsi, le Glyphosate et le 2,4D sont retrouvées dans plus de 20% des eaux superficielles françaises, il est donc probable que ces molécules se retrouvent dans les sédiments du lac d’Ichkeul et de la Lagune de Bizerte avec leurs métabolites, tout particulièrement acide aminométhylphosphonique (AMPA) (dont la solubilité et les temps de demi-vie sont supérieurs à la molécule mère et qui a été retrouvé dans près de 50% des eaux de surfaces françaises).

En ce qui concerne les fongicides, le tebuconazole présente un motif de préoccupation dans la mesure où son temps de demi-vie est élevé (dans certains cas jusqu'à 620 jours) et que sa mobilité en crue est avérée (Tahgavi et al, 2010). Même si sa toxicité animale est faible, un impact sur les populations bactériennes est toujours possible affectant ainsi le bon fonctionnement de l’écosystème.

Conclusion

Le recensement auprès des agriculteurs du bassin agricole du complexe lac Ichkeul-lagune de

Bizerte, à majorité de grandes cultures, montre une utilisation massive de fongicides, d’herbicides et d’insecticides. Toutefois, il est nécessaire de s’assurer de leurs présences par les dosages dans les différentes matrices environnementales et de comprendre leurs effets et leurs devenirs. Afin de compléter nos connaissances sur l’utilisation des pesticides dans le complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte, une enquête recensant les pesticides utilisés dans les cultures maraichères et de légumineuses est nécessaire. Enfin, les teneurs des principales substances utilisées dans le bassin versant doivent faire l’objet d’une surveillance, particulièrement pendant les épisodes de ruissellements afin de limiter les effets sur l’environnement.

Remerciement

Nous remercions vivement Mr Taher Kaabi, ingénieur principal au Commissariat Régionale de Développement Agricole (CRDA) de Bizerte, pour son aide logistique et pédagogique.

Annexe 1 : Questionnaire d'enquête auprès des agriculteurs : Est-ce qu’il y’a un problème d’insecte ou de champignon ces dernières années ?

Comment vous éliminez les mauvaises herbes ?

Quels sont les pesticides que vous utilisés?

Est-ce que vous alternez le choix des pesticides chaque année? 86

Combien de fois vous pulvérisez vos champs et pendant qu’elle période de l’année?

Qu’elle est la quantité de pesticide que vous utilisez ?

Pratique d’utilisation des pesticides :

Comment vous pulvérisez les champs par les pesticides par avion avec des tracteurs ?

Références bibliographiques

Agreste (2014) http://www.agreste.agriculture.gouv.fr/IMG/pdf/dossier21_protection.pdf

Ben M’Barek N, 2001. Etude de l’écosystème du lac Ichkeul et de son bassin versant: Caractéristiques physiques et géochimiques des eaux et des sédiments». Thèse 3ème cycle, Univ. Tunis, 235p.

Ben M’Barek, N., Slim-Shimi, N., 2002. Evolution des parmètres physico-chimiques des eaux du lac Ichkeul après la réalisation des aménagements hydrauliques (Tunisie) Proceedings of International Symposium and Workshop on Environmental Pollution Control and Waste Management 7–10 January 2002, Tunis (EPCOWM’2002), pp 20–27 (in French)

Carvalho FP, 2006. Agriculture, pesticides, food security and food safety. Environmental Science & Policy, 9 : 685-692.

Dabrowski, J.M., Peall, S.K.C., Van Niekerk, Z., Reinecke, A.J., Day, J.A., Schulz, R., 2002. Predicting runoff-induced pesticide input in agricultural sub-catchment surface waters: linking catchment variables and contamination. Water Res. 36, 4975–4984.

Dasgupta S, Meisner C, Wheeler D, 2010. Stockpiles of obsolete pesticides and cleanup priorities: A methodology and application for Tunisia. Journal of Environmental Management, 91 : 824-830.

Fabro L, Varca LM, 2012. Pesticide usage by farmers in Pagsanjan-Lumban catchment of Laguna de Bay, Philippines. Agricultural Water Management, 106 : 27-34.

Grovermann C, Schreinemachers P, Berger T, 2013. Quantifying pesticide overuse from farmer and societal points of view: An application to Thailand. Crop Protection, 53 : 2013 : 161-168.

Klöppel H, Haider J, Kordel W (1994) Herbicides in Surface Runoff: A Rainfall Simulation Study on small Plots in the field. Chemosphere 23:649-662.

Klöppel H, Kordel W, Stein B (1997) Herbicide transport by surface runoff and herbicide retention in a filter strip - rainfall and runoff simulation studies -. Chemosphere 35:129-141.

Rodrigues ET, Lopes I, Pardal MA, 2013. Occurrence, fate and effects of azoxystrobin in aquatic ecosystems: A review. Environment International, 53 : 18–28.

Schreinemachers P, Tipraqsa P, 2012. Agricultural pesticides and land use intensification in high, middle and low income countries. Food Policy, 37 : 616-626.

Southwick LM, Willis GH, Fouss JL, Rogers JS, Carter CE (1997). Effect of sediment on runoff losses of pesticides of low water solubility. Am Soc Agric Eng 972204:17.

Stevenson AC, Battarbee RW, 1991. Palaeoecological and documentary records of recent environmental change in Garaet El Ichkeul: A seasonally Saline Lake in NW Tunisia. Biological Conservation, 58:275-295.

Taghavi, L., Probst, J.-L., Merlina, G., Marchand, A.-L., Durbe, G., & Probst, A. (2010). Flood event impact on pesticide transfer in a small agricultural catchment (Montoussé at Auradé, south west France). International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 90(3-6), 390–405.

Uludag, A., Y. Nemli, A. Tal and B. Rubin. 2007. Fenoxaprop resistance in sterile wild oat (Avena sterilis) in wheat fields in Turkey. Crop Prot. 26(7): 930-935.

Wauchope RD (1978). The pesticide content of surface water draining from agricultural fields J Environ Qual 7(4):459-478.

Wauchope, RD, Estes TL, Allen R., Baker JL, Hornsby AG, Jones RL, Richards et al. (2002). Predicted impact of transgenic, herbicide-tolerant corn on drinking water quality in vulnerable watersheds of the mid-western USA. Pest Manage Sci 58:146-160.

Willis, G.H., L.L. McDowell, C.E. Murphree, L.M. Southwick, and S. Smith, Jr. 1983. Pesticide concentrations and yields in runoff from silty soils in the lower Mississippi valley. J. Agric. Food Chem. 31:1171–1177.

Worrall F, Kolpin DW, 2004. Aquifer vulnerability to pesticide pollution—combining soil, land-use and aquifer properties with molecular descriptors. J Hydrol, 293:191-204.

CHAPITRE III : STRATEGIE DE HIERARCHISATION DES POLLUANTS CHIMIQUES D’INTERET A ETUDIER DANS LE COMPLEXE LAC ICHKEUL- LAGUNE DE BIZERTE

Partie B : Validation et adaptation d’une méthode d’analyse chimique pour la détermination simultanée des HAP, PCB et OCP dans le sédiment du complexe Lac Ichkeul-Lagune de Bizerte par GC-MS

Introduction

La surveillance des écosystèmes aquatiques se base en premier lieu sur les analyses chimiques des polluants dans les différentes matrices. Une fois la liste des molécules de HAP, PCB et pesticides à rechercher est établie, la détermination de leurs teneurs peut être envisagée. Ces polluants provenant de différentes activités humaines rejoignent les milieux aquatiques marins et, en fin de compte, se retrouvent accumulés dans les sédiments. Le choix de la méthode d’analyse chimique est basé sur l’obligation du dosage simultané de trois types de polluants afin de minimiser le temps d’analyse, surtout en considérant le grand nombre d’échantillons à analyser. La méthode choisie doit offrir la fiabilité souhaitée en un minimum de temps, avec un moindre effort et un coût réduit. Traditionnellement, la technique standard a été l'extraction soxlhet avec des solvants non polaires (Boer et Law, 2003), mais en raison de plusieurs inconvénients, d'autres techniques alternatives ont été développées telles que l’extraction par micro-ondes (Carvalho et al., 2008 ; Cueva-Mestanza et al., 2008 ; Itoh et al.,

2008 ; Moreno et al., 2006 ; Bartolomé et al., 2005). La micro-onde génère un champ

électrique alternatif qui permet aux molécules polaires de tourner sur elles mêmes. Une autre alternative est l’extraction par ultrasons (Errekatxo et al., 2008 ; Vagi et al., 2007) c'est-à-dire l’extraction des composés organiques de la matrice par les vibrations mécaniques générées par les ondes sonores. Les techniques micro-onde et ultrason sont moins coûteuses, plus rapide et plus effectives que l'extraction soxhlet (Liu et al., 2013). Toutes ces techniques ont

été largement utilisés pour plusieurs extractions à partir de différentes matrices environnementales comme les sols, l’eau, les sédiments, les tissus biologiques. Mais, ces techniques ne sont pas toujours faciles à utiliser et à adapter pour les applications de routine.

Les inconvénients des méthodes classiques sont l’utilisation de grands volumes de solvant d’extraction et des durées d’incubations très longues. Ceci a amené les chercheurs à rechercher des méthodes qui réduisent le volume de solvants d’extraction et le temps nécessaire pour réaliser cette étape.

La méthode QuEChERS est une nouvelle approche appelée ainsi « Quick, Easy, Cheap,

Effective, Rugged, and Safe ». Cette méthode combine les étapes d'extraction et de purification (Pinto et al., 2011 ; Satpathy et al., 2011). Les avantages de cette nouvelle méthode par rapport aux méthodes classiques sont la diminution du temps nécessaire pour accomplir l’extraction et la purification. Ainsi le volume de solvant utilisé pour l’extraction est réduit.

La méthode QuEChERS a été adaptée et validée pour l’analyse simultanée des HAP, PCB et

OCP dans le sédiment du complexe lac Ichkeul-Lagune de Bizerte. Puis l’analyse chimique de 50 molécules organiques (16 HAP, 12 PCB et 22 pesticides organochlorés (POC)) a été réalisée pour les sédiments collectés à 20 différents sites du complexe et à deux campagnes de prélèvement.

Références bibliographiques

Bartolomé L, Cortazar E, Raposo JC, Usobiaga A, Zuloaga O, Etxebarria N, Fernández LA, 2005. Simultaneous microwave-assisted extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons, polychlorinated biphenyls, phthalate esters and nonylphenols in sediments. Journal of Chromatography A, 1068: 229-236. de Boer J, Law RJ, 2003. Developments in the use of chromatographic techniques in marine laboratories for the determination of halogenated contaminants and polycyclic aromatic hydrocarbons. Journal of Chromatography A, 1000: 223-251.

Carvalho PN, Rodrigues PNR, Alves F, Evangelista R, Basto MCP, Vasconcelos MTSD, 2008. An expeditious method for the determination of organochlorine pesticides residues in estuarine sediments usingmicrowave assisted pre-extraction and automated headspace solid- phase microextraction coupled to gas chromatography–mass spectrometry. Talanta, 76 :1124-1129.

Cueva-Mestanza R, Sosa-Ferrera Z, Torres-Padrón ME, Santana-Rodríguez JJ, 2008. Preconcentration of pharmaceuticals residues in sediment samples using microwave assisted micellar extraction coupled with solid phase extraction and their determination by HPLC–UV. Journal of Chromatography B, 863: 150-157.

Errekatxo A, Prieto A, Zuloaga O, Usobiaga A, Etxebarria N, Fernández LA, 2008. Simultaneous extraction of several persistent organic pollutants in sediment using focused ultrasonic solid-liquuid extraction. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 392: 1471-1478.

Itoh N, Numata M, Yarita T, 2008. Alkaline extraction in combination with microwave- assisted extraction followed by solid-phase extraction treatment for polycyclic aromatic hydrocarbons in a sediment sample. Analytica Chimica Acta, 615(1): 47-53.

Pinto CG, Herrero Martín S, Pérez Pavón JL, Moreno Cordero B (2011) A simplified Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe approach for the determination of trihalomethanes and benzene, toluene, ethylbenzene and xylenes in soil matrices by fast gas chromatography with mass spectrometry detection. Analytica Chimica Acta, 689 (1): 129-136.

92 chromatography–mass spectrometry with Deconvolution reporting software (DRS). Food Chemistry, 127: 1300-1308.

Vagi MC, Petsas AS, Kostopoulou MN, Karamanoli MK, Lekkas TD, 2007. Determination of organochlorine pesticides in marine sediments samples using ultrasonic solvent extraction followed by GC/ECD. Desalination (special issue on Water Quality/9th CEST conference), 210: 146-156.

Moreno DV, Ferrera ZS, Santana Rodríguez JJ, 2006. Microwave assisted micellar extraction coupled with solid phase microextraction for the determination of organochlorine pesticides in soil samples. Analytica Chimica Acta, 571: 51-57.

I. Publication 2 :

Submitted to: Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology

Validation of an adapted quick, easy, cheap, effective, rugged and safe method for the

simultaneous analysis of poly-aromatic hydrocarbons, polychlorinated biphenyls and

organo-chlorine pesticides in sediment by Gas chromatography–mass spectrometry

Fida Ben Salem1,2, Olfa Ben Said1,2, Robert Duran2, Mathilde Monperrus3

1Laboratoire de Biosurveillance de l’Environnement, Faculté des Sciences de Bizerte,

Université de Carthage, Tunisie.

2Equipe Environnement et Microbiologie – IPREM UMR 5254 CNRS – Université de Pau et des Pays de l’Adour, France

3Laboratoire de Chimie Analytique Bio-Inorganique et Environnement, IPREM UMR 5254

CNRS – Université de Pau et des Pays de l’Adour, France

Corresponding author: Mathilde Monperrus, UFR Sciences et Techniques de la Côte Basque

Allée du Parc Montaury - 64600 Anglet – France, [email protected], Fax :

+33(0)5 59 57 44 09,

Abstract:

A quick, easy, cheap, effective, rugged and safe (QuEChERS) method has been adapted and validated for the simultaneous analysis of poly-aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs) and organo-chlorine pesticides (OCPs) in sediment samples. The sample preparation method was adapted by modifying the solvent and the extraction technique, and then optimized to the sediment amount. The performances were evaluated in terms of accuracy, linearity and limits of detection and validated by the analysis of a reference marine sediment material (SRM 1941b). Satisfactory recoveries were obtained for the simultaneous analysis of PAHs, PCBs and OCPs, with the mixture dichloromethane- acetone as solvent for extraction combined with an ultrasonic agitation. Correlation coefficients obtained R2>0.95 for all compounds show that the method is linear over the range assayed (0-1000 ng g-1) and low quantification limits were obtained from 0.02 to 9.6 ng g-1,

0.11 to 1.15 ng g-1and 0.01 to 8.1 ng g-1for PAHs, PCBs and OCPs, respectively. The obtained concentrations for the SRM 1941b are in good agreement with the certified values with recoveries ranging from 60% to 103% for PAHs, from 76 to 131% for PCBs and from 81 to 137% for OCPs. The repeatability was acceptable for all the compounds with RSD% lower than 15%. The validated method was applied to the analysis of sediments from Bizerte area

(Tunisia) showing the presence of PAHs in the Bizerta lagoon while OCPs were the major compounds found in the Ichkeul Lake.

Keywords: QuEChERS extraction, sediment, poly-aromatic hydrocarbons, polychlorinated biphenyls, organo-chlorine pesticides.

1. Introduction

The analysis of organic compounds in sediment is very complex because they are strongly bound to sediment organic matter and requires optimization and validation of rapid, robust and sensitive analytical procedures. The main critical step in the analytical procedure for sediment analysis is the extraction which needs suitable solvent and extraction technique to obtain corrected recoveries for the analytes of interest. Many extraction techniques used for the analysis of organic compounds were developed. Traditionally, the standard technique has been the Soxlhet extraction with non-polar solvents (de Boer and Law 2003). But this technique present several drawbacks such as long extraction time and large volume of solvent, alternative techniques were developed including microwave-assisted extraction (Bartolomé et al. 2005; Moreno et al. 2006; Carvalho et al. 2008; Cueva-Mestanza et al. 2008; Itoh et al.

2008) and ultrasonic-assisted extraction (Vagi et al. 2007; Errekatxo et al. 2008). Moreover, the extraction step is generally followed by a clean-up step to remove any interfering substances, which involves a time consuming solid phase extraction. All these techniques have been used extensively for extractions on several environmental matrices such as soils, sediments, biological tissues but they are not always easy to use and suitable for routine applications. Recently, novel approaches, combining the extraction and the purification steps, were developed and called QuEChERS method for ‘‘Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe’’ method (Anastassiades et al. 2003; Pinto et al. 2011). These methods involve extraction with acetonitrile partitioned from the aqueous matrix using anhydrous MgSO4 and

NaCl followed by a dispersive-SPE cleanup with MgSO4 and primary secondary amine

(PSA).The sample handling requirements of such methods are friendlier and the time required to accomplish an extraction/clean up is significantly shorter. QuEChERS provides high recoveries with simple analytical steps, low solvent consumption and could be applied to any kind of solid matrices (mineral or organic) and appropriate to very volatile compounds

(Rouvière et al. 2012). Mainly applied for pesticides in food matrices (Lehotay et al. 2010;

Cieslik et al. 2011; Lee et al. 2011; Wilkowska and Biziuk 2011; Wang et al. 2012), the application of QuEChERS methods to other organic pollutants is limited. QuEChERS method was successfully applied for determining PAHs (Ramalhosa et al. 2009) and PCBs (Norli et al. 2011) in fish, pharmaceuticals and hormones in sewage sludge (Peysson and Vulliet 2013) and soil (Bragança et al. 2012). QuEChERS method was also validated for trihalomethanes

(chloroform, bromodichloromethane, dibromochloromethane and bromoform) and BTEX

(benzene, toluene, ethylbenzene and xylenes) in soil samples (Anastassiades et al. 2003).

Recently, Peysson and Vulliet (2013) applied the QuEChERS method for the determination of

136 pharmaceutical compounds and hormones in sewage sludge (Peysson and Vulliet 2013).

The objective of the present study was the adaptation and the validation of QuEChERS method for the simultaneous analysis of PAHs, PCBs and OCPs in sediment by GC-MS

2. Experimental

2.1. Reagents and chemicals

PCB standard solutions, either as compound mix, containing PCB 18, 28, 31, 44, 52, 101,

138, 118, 153, 149, 180, 194 and single compound solution of PCB 209 were purchased from

Sigma Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). The 16 priority PAHs (Naphthalene,

Acenaphthylene, Acenaphthene, Fluorene, Phenanthrene, Anthracene, Fluoranthene, Pyrene,

Benzo[a] anthracene, Chrysene, Benzo[b] fluoranthene, Benzo[k] fluoranthene, Benzo[a] pyrene, Indeno[1,2,3-cd] pyrene, Dibenzo[a,h] anthracene, Benzo[ghi] perylene), as well as three deuterated internal standards naphthalene-d8, phenanthrene-d10 and perylene-d12 were supplied as pure reference materials (purity: 99.5%) also from Sigma Aldrich. OCPs standard solutions of HCB, aldrin, dieldrin, heptachlor, heptachlor epoxide isomer B, endrin, endrin aldéhyde, α and β endosulfan, endosulfan sulfate, 4,4'-DDE, 4,4'-DDD, 4,4'-DDT, α and β

97 chlordane, α and β nonachlor and an internal standards atrazine-d5 were purchased from

Sigma Aldrich. All standard stock solutions were prepared in acetonitrile and stored at-20°C.

Organic solvents (hexane, acetone, acetonitrile, and dichloromethane) were of analytical grade and were supplied by Sigma Aldrich. The QuEChERS extract tubes were obtained from

Agilent Technologies (Massy, France) and contained the citrate buffer salt mixture (4g of

MgSO4, 1g of NaCl, 0.5g disodium citrate sesquihydrate and 1 g of trisodium citrate dehydrate). Dispersive SPE tubes (containing 900 mg of MgSO4 and 150 mg of primary secondary amine exchange PSA) were obtained from Agilent Technologies (Massy, France).

2.2. Standard reference material and real samples

Marine sediment standard reference material (SRM 1941b) was obtained from the National

Institute of Standards & Technology (Gaithersburg, MD, USA), Value for Total Organic

Carbon in SRM 1941b is 2.99±0.24 g/100g Mass fraction. Real sediment samples used for application were collected from the lagoon of Bizerta and the Ichkeul Lake (Tunisia). The sediments were placed in glass bottles and were kept frozen at -20°C. Samples were freeze dried in a ZirBus Vaco2 lyophilier and stored at 4°C before analysis.

2.3. QuEchERS extraction/purification procedure

The QuEChERS method normalized and validated by Yang et al. (2010) for the analysis of pesticides in soil was adapted and validated for the simultaneous analysis of PAHs, PCBs and

OCPs. An aliquot of 5g of sediment was weighed into a polypropylene tube (50 mL capacity).

Then, 4 mL ultrapure water was added, the tube was manually shaken and internal standards

(naphthalene d8, phenanthrene d10, perylene d12, PCB 209, Atrazine d5) were introduced. 20 mL of extraction solvent were then added and the tube was shaken vigorously by hand for 1 min. Afterwards, the citrate buffer salt mixture was added and the tube was shaken vigorously either manually (5min) or by ultrasonic agitation (15min). Finally, the tube was centrifuged 98

for 3 min at 2500 rpm and 10 mL of the supernatant were transferred into another

polypropylene tube (15 mL capacity) already containing 900 mg of MgSO4 and 150 mg PSA.

The tube was shaken vigorously by hand for 30 s and centrifuged for 3 min at 2500 rpm. The

extracts were then dried under a gentle argon stream using a Turbovap LV Concentration

Evaporator system. The dried residue was re-dissolved with 1 mL acetonitrile and kept at

−20°C until analysis. The conventional QuEChERS extraction conditions using acetonitrile

was compared with modified methods using tow mixture of solvents: hexane-acetone (HA)

(50:50 v:v) and dichloromethane-acetone (DA) (50:50 v:v). Although extraction methods

were adapted with comparison of manual or ultrasonic agitation and two amounts of sediment

used for extraction were tested (Table 1). Two replicates were considered for each experiment

with two injections. An internal standard correction was used for the quantification of the

analytes.

Table 1. The different experiments performed for the adaptation of the QuEChERS extraction

Experiment name Extraction solvent Extraction technique Amount of

sediment (g)

Experiment 1 Acetonitrile manual agitation 2

Experiment 2 1:1 hexane:acetone manual agitation 2

Experiment3 1:1 dichloromethane:acetone manual agitation 2

Experiment4 1:1dichloromethane:acetone Ultrasonic agitation 2

Experiment5 1:1dichloromethane:acetone Ultrasonic agitation 5

2.4. GC-MS Analysis

The analyses were performed by using a gas chromatograph (Agilent 7890A) coupled to a

mass spectrometer with an electron impact ionization source (EI) Agilent 5975C. The GC–

MS system was equipped with an Agilent DB5-MS UI column. The ion source temperature

99 and the quadrupole temperature were both kept at 230°C and 150°C, respectively. A sample volume of 1 μL of the concentrated extract was injected in pulsed splitless mode at an inlet temperature of 280°C. Retention time and target monitoring of the different compounds analyzed by GCMS are summarized in Table 2.

Table 2. Retention time and target monitoring of the different compounds analyzed by GCMS

Compounds Retention Time Target ion m/z Qualifier ion m/z PAHs Naphthalene 6.54 128 129 Acenaphthylene 10.25 152 153 Acenaphthene 10.83 153 154 Fluorene 12.84 166 165 Phenanthrene d10 18.54 188 189 Phenanthrene 18.83 178 179 Anthracene 18.25 178 179 Fluoranthene 26.98 202 203 Pyrene 28.51 202 203 Benzo[a]anthracene 37.90 228 226 Chrysene 38.15 228 226 Benzo[b]fluoranthene 45.60 252 253 Benzo[k]fluoranthene 45.68 252 253 Benzo[a]pyrene 47.31 252 253 Perylene-d12 48.00 264 260 Indeno[1,2,3-cd]pyrene 54.42 276 277 Dibenzo[a,h]anthracene 54.74 276 277 Benzo[ghi]perylene 55.72 276 277 PCBs PCB 18 18.50 186 256 PCB 31 21.22 256 186 PCB 28 21.38 186 256 PCB 52 23.53 220 292 PCB 44 24.78 292 220 PCB101 28.92 326 254 PCB 149 32.55 360 362 PCB 118 32.68 326 328 PCB 153 34.04 360 362 PCB 138 35.63 360 290 PCB 180 39.57 394 396 PCB 194 44.88 430 428 PCB 209 48.60 498 214 Pesticides Hexachlorobenzene 16.36 284 286 Atrazine d5 17.00 220 205 α Endosulfan 29.20 241 39 Dieldrin 30.50 79 81 β Endosulfan 32.52 195 241 Heptachlor 22.13 100 272 Heptachlor Epoxide Isomer B 26.54 81 353 Endrin 30.44 81 263 Endrin aldéhyde 33.58 67 345 Aldrin 24.23 66 263 4,4'-DDE 30.85 246 318 4,4'-DDD 33.37 235 237 100

4,4'-DDT 35.55 235 235 α chlordane 28.20 373 375 β chlordane 29.13 373 375 cis-Nonachlor 29.44 407 409 trans-Nonachlor 33.21 409 407

3. Results

3.1. Adaptation of the QuEChERS method

The results obtained with the different tested extraction methods are presented in Table 3.

Table 3. Concentrations of the target PAHs, PCBs and OCPs in the certified reference

materials SRM 1941b by the different experiments (see Table 1) and comparison with the

certified values (CV) (concentration ng.g-1 ± SD standard deviation), na: not available, -: not

determined.

Compounds CV Exp1 Exp2 Exp3 Exp4 Exp5 PAHs Naphthalene 848±95 824.0±38.9 398.5±26.5 161.5±152.0 310.8±7.7 335.6±64.5 Acenaphthylene 53.3±6.4 50.9±2.7 52.9±2.9 53.7±5.6 47.8±3.4 40.1±3.5 Acenaphthene 38.4±5.2 24.0±2.4 12.0±4.3 5.8±0.9 12.7±2.8 11.2±1.7 Fluorene 85±15 52.1±6.6 29.4±11.3 18.4±0.2 27.5±3.4 19.5±2.4 Phenanthrene 406±44 287.1±21.8 182.5±84.1 174.0±23.3 243.6±13.1 243.7±11.8 Anthracene 184±18 151.3±8.4 78.6±1.3 75.9±7.1 141.9±3.3 114.2±6.2 Fluoranthene 651±50 541.8±6.6 482.0±20.3 482.0±38.1 602.5±88.0 580.0±20.1 Pyrene 581±39 532.4±36.1 414.1±17.2 414.4±28.7 517.8±81.7 473.3±13.1 Benzo[a]anthracene 335±25 332.1±62.3 194.3±13.7 374.7±14.1 332.3±68.7 337.2±32.3 Chrysene 291±31 325.2±35.1 215.4±0.2 273.5±14.9 280.8±34.1 239.3±13.5 Benzo[b]fluoranthene 453±21 417.0±43.9 347.5±24.2 467.6±21.9 394.6±61.2 410.6±28.1 Benzo[k]fluoranthene 225±18 191.4±14.0 179.3±20.6 224.2±24.3 201.1±38.2 221.6±9.8 Benzo[a]pyrene 358±17 219.9±31.7 191.8±0.6 201.2±42.3 204.5±38.0 244.6±9.3 Indeno[1,2,3-cd]pyrene 341±57 255.6±28.7 154.9±5.4 156.5±22.8 258.4±21.7 222.7±15.5 Dibenzo[a,h]anthracene 53±10 65.6±5.4 75.1±6.5 65.2±10.8 66.3±7.2 53.5±2.5 Benzo[ghi]perylene 307±45 256.0±60.0 191.6±17.0 203.1±30.4 312.8±20.2 315.6±17.2 PCBs PCB 18 2.39±0.29 0.86±0.15 1.42±0.16 1.04±0.14 1.61±0.10 2.01±0.21 PCB 28 4.52±0.57 1.32±0.04 3.04±0.86 2.83±0.66 2.64±0.35 3.45±0.22

101

PCB 31 3.18±0.41 1.44±0.15 2.03±0.26 2.22±0.15 2.77±0.46 3.27±0.30 PCB 44 3.85±0.2 1.73±0.24 2.99±0.54 3.33±0.51 3.34±0.09 3.80±0.35 PCB 52 5.25±0.28 2.11±0.25 2.87±0.49 3.79±1.06 4.12±0.28 4.54±0.29 PCB101 5.11±0.34 2.34±0.19 3.29±0.48 3.52±0.29 4.16±0.20 4.25±0.38 PCB 118 4.23±0.19 3.08±0.25 4.74±0.72 5.01±0.49 5.47±0.22 3.91±0.36 PCB 138 3.6±0.28 2.64±0.23 3.45±0.10 4.16±0.11 5.07±0.14 4.17±0.42 PCB 149 4.35±0.26 1.94±0.18 3.42±0.49 3.35±0.25 3.98±0.07 4.57±0.70 PCB 153 5.47±0.32 3.28±0.10 5.17±0.87 5.3±0.2 6.32±0.14 4.90±0.72 PCB 180 3.24±0.51 2.33±0.29 3.75±0.66 3.54±0.36 3.87±0.15 4.23±0.46 Pesticides Hexachlorobenzene 5.83±0.38 - - - - 4.72±0.31 2,4'-DDE 0.38±0.12 - - - - 0.70±0.13 4,4'-DDE 3.22±0.28 - - - - 3.18±0.37 4,4'-DDD 4.66±0.46 - - - - 3.94±0.43 4,4'-DDT 1.12±0.42 - - - - 1.44±0.04 α chlordane 0.85±0.11 - - - - 0.73±0.07 β chlordane 0.5±0.09 - - - - 0.69±0.08 cis-Nonachlor 0.38±0.05 - - - - 0.41±0.04 trans-Nonachlor 0.44±0.07 - - - - 0.45±0.05

The analysis of the certified reference sediment showed that ACN (acetonitrile) was the best

solvent for PAHs extraction and the mixture DA (dichloromethane/acetone) was better than

the HA (hexane/acetone) mixture (Figure 1a). The best extraction efficiencies for most PCBs

were obtained with the DA and HA solvent mixtures (Figure 1b) whereas lower recoveries

were obtained using ACN. Thus, the DA mixture was found to be the best solvent for the

simultaneous extraction of PAHs and PCBs. Pesticides were not analyzed during these

experiments but previous reports showed that dichloromethane was the best solvent for the

simultaneous extraction of PAHs, PCBs and pesticides (Thompson et al. 2002) as well as for

OCPs in soil (Norli et al. 2011). The mixture DA was thus chosen for the simultaneous

extraction of PAHs, PCBs and OCPs.

The comparison of the techniques used for extraction showed that the ultrasonic agitation

improved extraction efficiencies compared to manual agitation for PAHs and PCBs (Figures

102

1a and 1b). This result is consistent with previous works that showed highest recoveries when sediment samples were extracted by ultrasonication (Pinto et al. 2011). It was also shown that the time of ultrasonication had no statistically significant effect on the extraction efficiency

(Anastassiades et al. 2003), thus 15 minutes of ultrasonication was applied in this study.

Regarding the mass of sample used for the analysis, when increasing the amount of sediment from 2 to 5 g for the extraction (experiments 4 and 5) no significant difference was observed for both PAHs and PCBs (Figures 1a and 1b). Therefore, it was decided to use a mass of 5 g to avoid problems with the limits of detection when working with real samples.

1000 900 CV 800 Exp 1 Exp 2 700 Exp 3 600 Exp 4 500 Exp 5 400 300 200 100 0

103

7 CV Exp 1 6 Exp 2 Exp 3 5 Exp 4 4 Exp 5

0 PCB18 PCB28 PCB31 PCB44 PCB52 PCB101 PCB118 PCB138 PCB149 PCB153 PCB180

Fig1. Comparison of concentrations of the target PAHs, PCBs and OCPsin the different extraction experiments and in the certified reference materials SRM 1941b for PAHs (a) and

PCBs (b).

3.2. Analytical performances

Analytical performances of the adapted method were evaluated in terms of linearity (R2), detection and quantification limits (LOD, LOQ), recovery (R%) and repeatability (RSD%).

Results are presented in Table 4. The linearity was verified using standard solutions in the range of 0-1000 ng g-1. Good correlation coefficients (R2>0.95) were obtained for all compounds except for Endrin, demonstrating that the method is linear over the range assayed.

The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were determined by considering a signal value 3 and 10 times respectively that of background noise obtained for blank samples.

The LOQ values are below 10 ng g-1, 2 ng g-1 and 2.5 ng g-1 for PAHs, PCBs and OCPs

(except for Endrin), respectively. These low LOQs allow application of the QuEChERS

104

method followed by GC-MS to monitor simultaneously these compounds in environmental

studies.

Table 4. Analytical performances of the QuEChERS method.na not avalaible, R2=linearity,

LOD=Limits of detection, LOQ=Limits of quantification, R%=Recoveries,

RSD=reproducibility.

Compounds R2 LOD (ng.g-1) LOQ (ng.g-1) R (%) RSD (%)

Naphthalene 0.999 0.01 0.03 40 19 Acenaphthylene 0.999 0.02 0.05 75 9 Acenaphthene 0.992 0.01 0.02 29 16 Fluorene 0.999 0.06 0.15 23 13 Phenanthrene 0.999 0.18 0.31 60 5 Anthracene 0.999 0.04 0.10 62 5 Fluoranthene 0.999 0.07 0.12 89 3 Pyrene 0.999 0.09 0.22 81 3 Benz[a]anthracene 0.998 0.38 0.85 101 10 Chrysene 0.999 0.47 1.19 82 6 Benzo[b]fluoranthene 0.998 0.60 1.16 91 7 Benzo[k]fluoranthene 0.996 0.54 1.17 98 4 Benzo[a]pyrene 0.998 0.95 1.34 68 4 Indeno[1,2,3-cd]pyrene 0.996 0.95 1.40 65 7 Dibenz[a,h]anthracene 0.997 3.85 9.64 101 5 Benzo[ghi]perylene 0.996 0.52 1.60 103 5

PCB18 0.989 0.04 0.11 84 10 PCB28 0.984 0.11 0.29 76 6 PCB31 0.984 0.09 0.24 103 9 PCB44 0.974 0.06 0.18 99 9 PCB52 0.985 0.01 0.02 87 6 PCB101 0.980 0.07 0.18 83 9 PCB118 0.978 0.09 0.20 92 9 PCB138 0.962 0.42 1.15 116 10 PCB149 0.978 0.20 0.52 105 15 PCB153 0.957 0.05 0.13 90 15 PCB180 0.959 0.12 0.34 131 11

105

Hexachlorobenzene 0.993 0.01 0.05 81 7 2,4'-DDE 0.988 0.14 0.45 na 18 4,4'-DDE 0.971 0.03 0.11 99 12 4,4'-DDD 0.954 0.27 0.90 85 11 4,4'-DDT 0.954 0.38 1.27 129 3 α chlordane 0.999 0.00 0.01 86 10 β chlordane 0.985 0.00 0.01 137 12 cis-Nonachlor 0.996 0.00 0.01 108 9 trans-Nonachlor 0.999 0.00 0.01 102 12

The accuracy of the whole adapted method was evaluated by determining the recoveries

obtained for the certified reference sediment. The obtained data with the adapted method

showed acceptable recoveries ranging from 60% to 103 % for heavier PAHs with values of

relative standard deviation lower than 10%. For the light PAHs, the recoveries ranged from

23% to 75% with higher RSD% (9-19%). As expected, the values for PAHs were higher

according to the molecular weight. Lower recoveries and lower repeatability for lighter

molecular weight can be attributed to loss, mainly by evaporation during the sample

preparation. Recoveries ranging from 76% to 131% for PCBs and from 81% to 137% for

pesticides with RSD% lower than 15% for both compounds families were obtained.

Our results are almost in the same range of recoveries than those obtained in precious studies

for heavy PAHs (Concha-Grana et al. 2010; Thompson et al. 2002), but better and more

reproducible than those obtained for PCBs (53-149%) and pesticides (71-420%) using a

microwave extraction and dichloromethane as solvent extraction with the same materiel

reference 1941b (Wang et al. 2012). Moreover, it is more efficient than the method used by

Brondi et al. (2011) for pesticides (48-115%) using a QuEChERS method with MeCN as

extraction solvent and without ultrasonic agitation.

106

3.3. Application to real samples

The adapted method was applied to the analysis of real sediments samples from the hydrosystem complex of the Bizerta Lagoon /Ichkeul Lake (Tunisia) constituting 2 different ecosystems. The results (Table 5) showed that Bizerta Lagoon sediments contained high

PAHs levels with concentrations ranging from 6 to 2605ng g-1whereas the Ichkeul Lake sediments exhibited a low PAHs contents (from 3 to 202 ng g-1). Concentrations of PAHs from Bizerta Lagoon were similar to those observed previously in sediment from the same ecosystem (Ben Said et al. 2010; Mzoughi et al. 2005). The sediments from Ichkeul Lake exhibited higher concentrations of pesticides (from 1.06 to 862 ng g-1) than those from the

Bizerte Lagoon (from 0.56 to 24 ng g-1). High concentrations were specially observed for

Dieldrin and Endrin.

For both ecosystems no contamination by PCBs was observed with concentrations ranging from 0.15 to 1.88 ng g-1. These results confirmed our assumption on the sources of contamination since the area of Bizerta Lagoon is subject to contamination by two industrial zones while the Ichkeul Lake is surrounded by a vast agricultural area. Further analysis of sediments using this rapid and efficient developed method would help to determine precisely the dispersion and the reactivity of these contaminants in the Bizerte area.

Table 5. Concentrations of PAHs, PCBs and OCPs in sediment collected from Bizerta Lagoon and Ichkeul Lake (concentrations ng g-1± SD (n=3)).

Compounds Bizerta lagoon Ichkeul lake

Naphthalene 3169±437 103±8 Acenaphthylene 121±30 2.41±1.89 Acenaphthene 399±131 5±1 Fluorene 298±5 5.1±0.2 Phenanthrene 1882 ±566 29.1±7.4 Anthracene 323 ±87 5.03±0.56 Fluoranthene 1658 ±262 13 ±5 Pyrene 1790 ±244 21 ±6 Benz[a]anthracene 951 ±662 6.1±0.1

107

Chrysene 791 ±478 7.3±0.6 Benzo[b]fluoranthene 1827 ±340 11.4±3.5 Benzo[k]fluoranthene 674 ±11 3.4±0.1 Benzo[a]pyrene 1215 ±189 8.6±0.3 Indeno[1,2,3-cd]pyrene 2605 ±836 202 ±24 Dibenz[a,h]anthracene 607 ±41 7 ±5 Benzo[ghi]perylene 1290 ±105 15 ±11

PCB 18 0.244 ±0.137 0.247 ±0.139 PCB 28 0.195±0.004 0.251 ±0.001 PCB 31 0.215 ±0.025 0.372 ±0.018 PCB 44 0.175 ±0.050 0.422 ±0.055 PCB 52 0.948 ±0.063 1.093 ±0.021 PCB101 0.206 ±0.023 0.296 ±0.014 PCB 138 0.223 ±0.024 0.268 ±0.032 PCB 118

αEndosulfan 4±1 107.3±0.2 Dieldrin 20 ±2 744 ±36 β Endosulfan 2.1 ±0.2

4. Concluding remarks

The simultaneous extraction of PAHs, PCBs and OCPs in sediment was successfully validated using a QuEChERS method combining a dichloromethane-acetone extraction with ultrasonic agitation. This method was found to be accurate and reproducible for the analytes of interest and sufficiently sensitive for the analysis of real sediment samples in the ng g-1 range. The simplicity, the rapidity and the low cost of the QuEChERS extraction are advantages for using this method in environmental studies as demonstrated by the analysis of

PAHs, PCBs and OCPs contents in sediments in two ecosystems.

108

References de Boer J, Law RJ (2003) Developments in the use of chromatographic techniques in marine laboratories for the determination of halogenated contaminants and polycyclic aromatic hydrocarbons. J Chromatogr A 1000:223-251

Carvalho PN, Rodrigues PNR, Alves F, Evangelista R, Basto MCP, Vasconcelos MTSD

(2008) An expeditious method for the determination of organochlorine pesticides residues in estuarine sediments using microwave assisted pre-extraction and automated headspace solid- phase microextraction coupled to gas chromatography-mass spectrometry. Talanta 76:1124-

1129

Cueva-Mestanza R, Sosa-Ferrera Z, Torres-Padrón ME, Santana-Rodríguez JJ (2008)

Preconcentration of pharmaceuticals residues in sediment samples using microwave assisted micellar extraction coupled with solid phase extraction and their determination by HPLC–UV.

J Chromatogr B 863:150-157

Itoh N, Numata M, Aoyagi Y, Yarita T (2008) Comparison of low-level polycyclic aromatic hydrocarbons in sediment revealed by Soxhlet extraction, microwave-assisted extraction, and pressurized liquid extraction. Anal Chim Acta 612:44-52

Moreno DA, Ilic N, Poulev A, Raskin I (2006) Effects of Arachis hypogaea nutshell extract on lipid metabolic enzymes and obesity parameters. Life Sci 78:2797-2803

Bartolomé L, Cortazar E, Raposo JC, Usobiaga A, Zuloaga O, Etxebarria N, Fernandez LA

(2005) Simultaneous microwave-assisted extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons, polychlorinated biphenyls, phthalate esters and nonylphenols in sediments. J Chromatogr A

1068:229-236

109

Errekatxo A, Prieto A, Zuloaga O, Usobiaga A, Etxebarria N, Fernández LA (2008)

Simultaneous extraction of several persistent organic pollutants in sediment using focused ultrasonic solid-liquuid extraction. Anal Bioanal Chem 392:1471-1478

Vagi MC, Petsas AS, Kostopoulou MN, Karamanoli MK, Lekkas TD (2007) Determination of organochlorine pesticides in marine sediments samples using ultrasonic solvent extraction followed by GC/ECD. Desalination 210:146-156

Anastassiades M, Lehotay SJ, Stajnbaher D, Schenck FJ (2003) Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and “dispersive solid-phase extraction” for the determination of pesticide residues in produce. JAOAC Int 86:412-431

Pinto CG, Herrero Martín S, Pérez Pavón JL, Moreno Cordero B (2011) A simplified Quick,

Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe approach for the determination of trihalomethanes and benzene, toluene, ethylbenzene and xylenes in soil matrices by fast gas chromatography with mass spectrometry detection. Anal Chim Acta 689:129

Rouvière F, Bulete A, Cren-Olive C, Arnaudguilhem C (2012) Multiresidue analysis of aromatic organochlorines in soil by gas chromatography-mass spectrometry and QuEChERS extraction based on water/dichloromethane partitioning. Comparison with accelerated solvent extraction. Talanta 93:336-344

Lehotay SJ, Ae Son K, Kwon H, Koesukwiwat U, Fu W, Mastovska K, Hoh E,

Leepipatpiboon N (2010) Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables. J Chromatogr A 1217:2548–2560

Lee SW, Choi JH, Cho SK, Yu HA, Abd El-Aty AM, Shim JH (2011) Development of a new

QuEChERS method based on dry ice for the determination of 168 pesticides in paprika using tandem mass spectrometry. J Chromatogr A 1218:4366– 4377.

110

Cieslik E, Sadowska-Rociek A, Molina Ruiz JM, Surma-Zadora M, (2011) Evaluation of

QuEChERS method for the determination of organochlorine pesticide residues in select groups of fruits. Food Chem. 125:773-778

Wilkowska A, Biziuk M (2011) Determination of pesticide residues in food matrices using the QuEChERS methodology. Food Chem 125:803–812

Wang L, Zhao P, Zhang F, Li Y, Du F, Pan C (2012) Dissipation and residue behavior of emamectin benzoate on apple and cabbage field application. Ecotox Environ Safe, 78:260-264

Ramalhosa M J, Paiga P, Morais S, Delerue-Matos C, Oliveira M B (2009) Analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in fish: evaluation of a quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe extraction method. J Sep Sci 32:3529-3538

Norli HR, Christiansen A, Deribe E (2011) Application of QuEChERS method for extraction of selected persistent organic pollutants in fish tissue and analysis by gas chromatography mass spectrometry. J Chromatogr A 1218:7234-7241

Peysson W, Vulliet E (2013) Determination of 136 pharmaceuticals and hormones in sewage sludge using quick, easy, cheap, effective, rugged and safe extraction followed by analysis with liquid chromatography-time-of-flight-mass spectrometry. J Chromatogr A 1290:46-61

Bragança I, Plácido A, Paíga P, Domingues VF, Delerue Matos C (2012) QuEChERS: a new sample preparation approach for the determination of ibuprofen and its metabolites in soils.

Sci Total Environ 433:281-289

Yang XB, Ying GG, Kookana RS (2010) Rapid multiresidue determination for currently used pesticides in agricultural drainage waters and soils using gas chromatography-mass spectrometry. J Environ Sci Health B 45:152-161

111

Thompson S, Budzinski H, LeMenach K, Letellier M, Garrigues P (2002) Multi-residue analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons, polychlorobiphenyls, and organochlorine pesticides in marine sediments Anal Bioanal Chem 372:196-204

Concha-Graña E, Fernández-González V, Grueiro-Noche G, Muniategui-Lorenzo S, López-

Mahía P, Fernández-Fernández E, Prada-Rodríguez D (2010) Development of an environmental friendly method for the analysis of organochlorine pesticide in sediments

Chemosphere 79:698-705

Brondi SHG, de Macedo AN, Vicente GHL, Nogueira ARA (2011) Evaluation of the

QuEChERS Method and Gas Chromatography–Mass Spectrometry for the Analysis Pesticide

Residues in Water and Sediment. Bull Environ Contam Toxicol 86:18-22

Ben Said O, Goñi-Urriza M, El Bour M, Aissa P, Duran R (2010) Characterization of aerobic polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria from Bizerte lagoon sediments, Tunisia.

Microb Ecol 59:445-456

Mzoughi N, Dachraoui M, Villeneuve JP (2005) Evaluation of Aromatic Hydrocarbons by

Spectrofluorometry in Marine Sediments and Biological Matrix: What Reference Should be

Considered?CRChim8:97-10

112

II. Publication 3 :

To be submitted to: Marine Pollution Bulletin

Organic contamination of sediments from Ichkeul Lake (protected area) and Bizerta

Lagoon (Anthropized ecosystem) watershed (Tunisia)

Fida Ben Salema,b,c*, Olfa Ben Saida,b, Ezzeddine Mahmoudia, Robert Duranb,

Mathilde Monperrusc

(a) Laboratory of Environment Biomonitoring, Faculty of Sciences of Bizerte, 7021, Zarzouna, Tunisia – University of Carthage

(b) Equipe Environnement et Microbiologie – MELODY group - UMR CNRS IPREM 5254- IBEAS- Université de Pau et des Pays de l'Adour - France. (c) Laboratoire de Chimie Analytique Bio-Inorganique et Environnement, IPREM UMR 5254 CNRS – Université de Pau et des Pays de l’Adour, France

*Corresponding author present address:

Equipe Environnement et Microbiologie

UMR CNRS IPREM 5254- IBEAS

Université de Pau et des Pays de l'Adour - France.

Tel: +216 72 400 121 Fax: + 216 72 590 566

Email: [email protected]

109

Abstract

Determination of organochlorine pesticides (OCPs), Polycyclic Aromatic Hydrocarbons

(PAHs), Polychlorinated biphenyls (PCBs) and butyltin (BuSn) was conducted in sediments from Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon watershed (Tunisia). A total of 59 compounds (16 PAHs,

12 PCBs, 22 OCPs and 9 BuSn) were monitored in forty surface sediment samples collected during two campaigns. High concentrations of total PAHs were recorded ranging from 122 to

19600 ng.g-1. Some OCPs such as Endrin, Dieldrin and Lindane (Hexachlorocyclohexane:

HCH) presented high concentration levels ranging from 28 to 2021 ng.g-1. The concentration of total PCBs was between 0.6 and 9.6 ng.g-1 indicating that there was contamination by PCBs low than the internationals norms. Regarding butyltin there was contamination except for the stations subject to maritime traffic, located in the path of vessels entering the channel of

Bizerta arriving to the port of Menzel Bourguiba and Ichkel lake. This study is the first attempt to investigate organic contamination in Ichkeul Lake, which is a RAMSAR site and

UNESCO World Heritage site. Also pesticides are newly sought in environmental matrix and the first in sediment in Tunisia.

Keywords: organochlorine pesticide, polycyclic aromatic hydrocarbon, polychlorinated biphenyl, butyltin, UNESCO World Heritage site, aquatic ecosystem.

Highlights :

 Bizerta lagoon is contaminated essentially by PAHs in sites submitted to maritime

traffic

 Ichkeul lake is contaminated essentially by pesticides from the vast agriculture areas

 There is no contamination by PCBs in the complex Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon

110

1. Introduction

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), organochlorine pesticides (OCPs), polychlorinated biphenyls (PCBs) are classes of persistent organic pollutants (POPs). PAHs may originate from incomplete combustion of organic matter, biosynthesized by some plants and fungi, exploitation, transformation and combustion of fuel, tanker ballast washings, tanker accidents and oil exploration and production (Biache et al., 2014). Commercial production of PCBs began in 1929 and increased dramatically as their use as inter alia dielectric fluids in capacitors and transformers, became more widespread. PCBs play a major part in the contamination of the environment, because of their high physical-chemical stability. OCPs were excessively used in agriculture to control pests (Gonzalez et al., 2005). These contaminants enter into the environment from numerous sources, including river run-off, atmospheric precipitation, industry, households and all types of transportation (Wen et al.,

1994; Chang et al., 2006). POPs have been detected in various environmental matrixes and biota (Chang et al., 2006; Schoellhamer et al., 2007; Wasswa et al., 2011; Lin et al., 2012;

Figueiredo et al., 2014; Szlinder-Richert et al., 2014; Li et al., 2015). They were detected in rivers (Yang et al., 2014; Yu et al., 2014; Jürgens et al., 2015), marine water (Brondi et al.,

2011; Miège et al., 2012; Yadav et al., 2015) and sediments (Li etal., 2015; Ma et al., 2015).

Aquatic ecosystem receives these pollutants from agricultural and industrial activities

(Sharma et al., 2014). Several studies have shed light on the presence of industrial pollutants like PAH, metals, PCB called priority substances (Wenzel et al., 2006; Deycard et al., 2014), in environment (Shu et al., 2000; Vane et al., 2007; Ben Said et al., 2010; Opel et al., 2011) and their impacts on different trophic levels (Carro et al., 2014; Yohannes et al., 2014).

While, pesticides are newly sought. Although environmental concentrations are highest near the sources, the presence of contaminants in places distant from primary sources indicates that

POPs are persistent in the environment and they can be transported at long distances (Pozo et

111 al., 2014). Pollutants from different origins reach the end in the sediment known as the principal reservoir of environmental contaminants (Birch and Davey, 1995). Many of these compounds are toxic to aquatic life and potentially harmful to humans (Tolosa et al., 2005;

Sharma et al., 2014). Coastal lagoons and lakes are generally ecosystems stressed by the impact of large cities, industrial activities and intensive agriculture. Rivers and estuaries can serve as important sources of metal and organic contaminants to coastal marine environments

(Pozo et al., 2014; Yang et al., 2014). Bottom sediments are considered as important elements of aquatic ecosystems, the binding of organic Pollutants compounds with sediments is very complex, which requires laborious analytical procedures for their analysis. In Tunisia, during the past decades researchers have taken the determination of PAHs (Ben said et al., 2010;

Mzoughi et al., 2002; Trabelsi and Driss, 2005) and organotin (Mzoughi et al., 2005) in the sediment of Bizerta Lagoon, but only one study was performed for the determination of PCB contamination in surface sediments at Monastir Bay (Nouira et al., 2013). Even throughout

Tunisia, there is no study reported for the determination of pesticides in sediments but pesticides were investigated in other biological matrixes such as human milk, from Bizerta and various Tunisia places (Ben Hassine et al., 2012; Ennaceur et al., 2008), in mullet and sea bass (Ben Ameur et al., 2013). Pollutants from agricultural activities may impact the health of aquatic organisms and subsequently local and migratory birds. But, surprisingly the Ichkeul

Lake, it is an important stopover point for hundreds of thousands of migrating birds each year

(Stevenson, 1991), has never been investigated regarding organic contamination.

The current study aimed to investigate the occurrence and distribution patterns of OCPs,

PAHs, PCBs and BuSn compounds in sediment of the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex

(Tunisia). A QuEChERS extraction method was applied with Gas chromatography–mass spectrometry (GC-MS) for the determination of these pollutants. Sediment composition and

112 contaminant profiles from different sites of each ecosystem and the entire complex were comparedin order to evaluate the organic contamination and the potential sources.

2. Materials and Methods

2.1. Study region and sampling

Ichkeul Lake –Bizerta Lagoon complex is located at the Northern region of Tunisia. The Tinja

River connects the Lake to the Lagoon and several rivers feed the hydrosystem complex (Fig.

1). The complex has been exploited for fishing activities since several centuries and the lagoon also for mussel farming since 1964. Bizerta Lagoon is open to the Mediterranean Sea by a channel. The area of Bizerta Lagoon is approximately128 km2 and it is subjected to contamination from two industrial zones, oil refinery, cement plant... (Ben Said et al., 2010;

Mzoughi et al., 2010; Trabelsi et al., 2012) and agricultural lands located on the Bizerta

Lagoons’ edge. The Ichkeul Lake is a protected area covering 90 km2; it is an important stopover point for hundreds of thousands of migrating birds each year (Stevenson, 1991). The area is a Biosphere reserve, a Ramsar site, and a UNESCO World Heritage Site (Kraïem and

Ben Hamza, 2000; Ramdani et al., 2001; Ben M’barek and Slim-Shimi, 2002). The hydrology of the complex is seasonal. During winter, Ichkeul Lake is fed by fresh water from the rivers increasing the water level. Then large volume of water is spilled to the Bizerta

Lagoon through the Tinja River. During the summer, the water level in the Ichkeul Lake is low due to high evaporation and because it is no longer supplied by rivers. Hence, water from

Bizerta Lagoon enters to the Ichkeul Lake through the Tinja River. Thus, the Ichkeul Lake is connected to the Mediterranean Sea and formerly had a seasonal salinity regime, freshwater increasing with winters’ rainfall and decreasing in summer. The Ichkeul Lake receives principally agricultural inputs as it is surrounded by a vast agricultural area(Stevenson and

Battarbee, 1991).

113

A total of 40 surface sediments samples were collected from 20 coastal sites of the complex

Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon, during two campaigns in September 2011 and April 2012, by using a Van Veen grab. Sites were chosen as the mouths of the various rivers that feed the complex, sites next to industrial and two sites centers of the lake and the lagoon. The position sites of the samples are presented in Fig. 1. The sediments were placed in glass bottles and were kept frozen at -20°C. Before analysis samples were freeze dried in a ZirBus Vaco2 lyophiliser.

Fig 1: Map of the Ichkeul Lake-Bizerte Lagoon complex indicating the location of the sampling sites (numbers)

114

2.2. Physical and chemical parameters

Water column temperature, pH, dissolved oxygen, salinity were determined in the field with a

handheld multi-parameter system WTW Multi-197i (Table 1). Nitrite and nitrate were

analyzed following the procedure of Wood et al. (1967). Ammonia was determined according

to Aminot and Chaussepied (1983). Phosphate levels were determined as described in Murphy

and Riley (1962). For chlorophyll a (Chla), seawater samples were filtered through Whatman

GF/F filters. Pigment concentrations were determined using the standard spectrophotometric

method (Parsons et al. 1984), following extraction with 10 mL 90% acetone overnight at 4°C

in the dark. Carbon organic contents were determined according to Espitalie et al. (1986).

Table 1. Physicochemical Parameters of water from the complex Ichkeul Lake-Bizerta

Lagoon

Conductivity dissolved Ammon Suspended Organic Salinity (ms cm-1) oxygen Nitrite Nitrate Phosphore ium Chla material (mg) carbon ST/HAPs T°C pH (PSU) (mg l-1) (µM) (µM) (µM) (µM) (µg L-1) (mg g-1) September ST1 Sep 21.8 7.52 39.1 58.9 7.4 0.07 11.30 0.05 5.47 0.27 0.01 3.15 ST2 Sep 22.6 7.71 39.7 59.5 10 0.64 6.19 0.30 14.88 0.40 0.04 3.02 ST3 Sep 23.2 7.89 37.0 55.9 8.4 0.19 5.34 5.73 12.52 0.13 0.02 3.02 ST4 Sep 23.3 8.06 37.3 56.2 9.6 0.00 18.26 0.12 6.05 0.27 0.02 2.90 ST5 Sep 23.4 8.05 35.4 53.8 8.2 0.82 1.91 2.69 16.05 0.94 0.02 2.94 ST6 Sep 23.5 8.04 36.4 55.1 8.8 0.03 6.07 0.37 4.29 0.67 0.01 3.76 ST7 Sep 23.2 8.15 35.4 53.7 8.7 0.06 21.47 0.69 1.94 0.80 0.01 3.06 ST8 Sep 23.6 8.08 36.1 54.6 9.5 0.13 18.22 0.44 11.94 1.47 0.02 3.14 ST10 Sep 24.1 7.33 37 56.1 6.3 0.51 0.59 0.51 19.00 0.16 0.03 3.55 ST11 Sep 24.6 7.72 36.4 55.4 5.4 0.84 9.52 0.05 15.47 0.27 0.03 3.51 ST12 Sep 23.9 7.77 36.5 55.3 5.5 0.34 17.22 0.37 11.35 0.14 0.03 4.34 ST13 Sep 24.3 7.66 36.4 55.4 5.9 0.69 7.02 0.62 18.41 0.35 0.03 2.12 ST14 Sep 24.5 7.70 37.4 56.5 6 0.03 17.82 0.65 6.64 0.95 0.04 4.12 ST15 Sep 24.3 7.67 36.7 55.5 5.6 0.52 7.83 0.62 13.70 0.73 0.06 2.90 ST16 Sep 24.4 7.76 36.8 55.9 5.9 0.88 13.48 1.51 36.64 0.49 0.04 3.41 ST17 Sep 24.5 7.79 34.9 53.4 6.1 0.64 3.37 1.08 16.64 0.67 0.04 5.08 ST18 Sep 24.6 7.74 37.4 56.6 6.1 0.49 5.20 0.98 21.94 0.53 0.03 5.72 ST19 Sep 24.4 7.84 37.7 57.0 6.2 0.56 15.88 0.15 13.11 0.84 0.03 7.24 April ST1 Apr 22.8 8.24 2.4 4.6 9.6 0.09 1.73 0.02 7.32 0.45 0.04 ST2 Apr 22.5 8.24 2.5 4.9 11 0.53 6.09 0.09 11.09 0.68 0.06 ST3 Apr 23.8 8.32 2.6 5.0 9.2 0.09 2.41 0.74 13.98 0.41 0.05 ST4 Apr 23.6 8.32 2.6 5.0 10.8 0.07 1.76 0.16 9.83 0.52 0.04 ST5 Apr 23.2 8.32 2.6 5.01 9 0.57 7.22 1.26 14.54 2.06 0.03 ST6 Apr 23.4 8.32 2.4 4.7 9.7 0.0 3 1.28 0.17 6.87 1.50 0.04 ST7 Apr 23.1 8.31 2.3 4.4 9.3 0.09 3.65 0.41 10.85 1.75 0.04 ST8 Apr 22.9 8.27 2.6 5.0 10.7 0.15 1.97 0.27 3.94 3.98 0.06 ST9 Apr 23.4 8.18 32.2 49.3 8.5 0.41 3.71 0.36 11.64 1.73 0.02 ST10 Apr 23.2 8.21 32.4 45.6 8.5 0.46 2.91 0.32 13.91 0.39 0.02

115

ST11 Apr 23.5 8.34 24.5 40.2 8.4 0.32 4.78 0.63 18.79 0.57 0.02 ST12 Apr 22.9 8.33 30 46.3 8.7 0.50 5.99 0.54 10.19 0.36 0.03 ST13 Apr 23.1 8.34 27 42.6 8.6 0.57 8.21 1.46 8.37 0.49 0.02 ST14 Apr 23.2 8.34 28.8 45.1 8.4 0.71 11.43 1.22 16.22 0.74 0.04 ST15 Apr 23.7 8.37 28.5 43.5 8.6 0.01 0.97 1.64 11.07 1.44 0.03 ST16 Apr 23.6 8.39 28.6 45.1 8.5 0.60 5.81 0.32 7.88 0.96 0.05 ST17 Apr 23.7 8.42 29 45.3 8.7 0.74 6.91 1.72 11.54 0.91 0.03 ST18 Apr 23.2 8.46 28.4 45.1 8.5 0.50 3.72 0.50 16.02 0.65 0.02 ST19 Apr 23.6 8.45 29.1 45.6 8.6 0.53 4.23 0.36 8.74 1.97 0.04 ST20 Apr 23.5 8.40 29.2 45.7 8.2 0.46 5.98 0.16 8.34 0.76 0.01

2.3. Solvents and chemical standards

Organic solvents (hexane, acetone, acetonitrile, and dichloromethane) were of analytical

grade and were supplied by Sigma Aldrich. Buffer salt mixture was obtained from Agilent.

Deionized water used in the experiment was obtained from a Milli-Q water Ultrapure Water

Purification Systems (France).

PCB standard solutions, either as compound mix, containing PCB-18, 28, 31, 70, 52, 101,

138, 118, 153, 149, 180, 194 and singles compounds solutions of PCB 209 and PCB 30 were

purchased from Sigma Aldrich. The 16 priority PAHs, as well as two perdeuterated internal

standards phenanthrene-D10 and perylene-D12 were supplied as pure reference materials

(purity: 99.5%) also from Sigma Aldrich. OCPs standard solutions of HCB, aldrin, dieldrin,

heptachlor, heptachlor epoxide isomer B, endrin, endrinaldehyde, α and β endosulfan,

endosulfan sulfate, 4,4'-DDE, 4,4'-DDD, 4,4'-DDT, α and β chlordane, α and β nonachlor and

an internal standards atrazine-D5 were purchased from Sigma Aldrich. Standard solutions

were prepared in acetonitrile.

2.4. Analytical methods

The samples were analyzed according to an adapted QuEChERS method for the simultaneous

analysis of OCPs, PAHs and PCBs in sediment by gas chromatography–mass spectrometry.

BuSn were analysed according to methods validated by Moreno et al., 2006.

116

QuEchERS extraction/purification procedure

The samples were analyzed according to an adapted QuEChERS method for the analysis of

OCPs, PAHs and PCBs in sediment by gas chromatography–mass spectrometry. The

QuEChERS method validated by Yang et al. (2010) for the analysis of pesticides in soil was adapted for the analysis of OCPs, PAHs and PCBs in sediment samples. Briefly, an aliquot of

5 g of sediment was weighed into a polypropylene tube (50 mL capacity). Then, 4 mL ultrapure water was added, the tube was manually shaken and the internals standards (atrazine d5, PCB 30, phenanthrene-D10 and perylene-D12) were introduced. Then, 20 mL of extraction solvent (dichloromethane-acetone (50:50 v:v)) were added and the tube was shaken vigorously by hand for 1 min. Then, a citrate buffer salt mixture (4 g MgSO4, 1 g NaCl, 0.5 g disodium citrate sesquihydrate and 1 g of trisodium citrate dehydrate) was added and the tube was shaken vigorously manually (5 min). Finally, the tube was centrifuged for 3 min at 2500 rpm and 10 mL of the supernatant were transferred into another polypropylene tube (15 mL capacity) already containing 900 mg of MgSO4 and 150 mg PSA. The tube was shaken vigorously by hand for 30 s and centrifuged for 3 min at 2500 rpm. The extracts were then dried under a gentle argon stream using a Turbovap LV Concentration Evaporator system.

The dried residue was re-dissolved with 1 mL acetonitrile and kept at −20°C until analysis.

GC-MS Analysis

The analyses were performed by using a gas chromatograph (Agilent 7890A) coupled to a mass spectrometer (Agilent 5975C) with an electron impact ionization source (EI). The GC–

117 was programmed as follows: the initial oven temperature was set at 80°C for 1 min, increased to 160°C at 10°C/min (hold 5 min), then ramped at 3°C/min to 300°C (hold 2min). The MS interface temperature was maintained at 300°C. The quantification was carried out in the selected ion monitoring mode (SIM) selecting two characteristics fragments ions for each compound. Two replicates were performed for each sample with two injections. An internal standard correction was used for the quantification of the analytes.

2.5.Quality control

The accuracy of the method was evaluated by the recoveries obtained for the certified reference sediment. The obtained data show acceptable recoveries ranging from 60% to 103% for PAHs, from 76 to 131% for PCBs and from 81 to 137% for pesticides.

3. Results and discussions

The physical and chemical parameters observed in the sampling stations are summarized in

Table 1.Water temperature at all sampled sites exhibited comparable temporal ﬂuctuation from 21.8 to 24.6 °C in September and from 22.5 to 23.7 °C in April (Table 1). In dry season, salinity varied from 34.9 to 37.7 PSU in Bizerta Lagoon and from 34.4 to 39.7 PSU in Ichkeul

Lake. In rainy season salinity varied from 31.2 to 34.4 PSU in Bizerta Lagoon and from 2.3 to

2.6 PSU in Ichkeul Lake. The drop in salinity at the Ichkeul Lake from 35 to 2.5 PSU is due to the contribution of continental water from dams and rivers. In Bizerta Lagoon the channel and marine stations 9, 10 are submitted to the marine influence with higher salinities.

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)

All PAH target compounds were detectable in sediment samples collected from the complex

Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon. Bizerta Lagoon was much more contaminated with PAHs than

Ichkeul Lake for two campaigns September and April. In September 2011, stations 10, 18 and

118

19 were the most contaminated at Bizerta Lagoon. Stations 9 and 12 were the most affected in

April (Fig.2). The site 10 located in the Mediterranean Sea near oil refining industry and sites

18 near the industrial area were contaminated by PAHs, as previously reported (Ben Said et al., 2010). It is not surprising to found high PAHs levels in the sites 9 and 12 since they are located at the channel of the Bizerta Lagoon, strongly impacted by maritime traffic of Menzel

Bourguiba harbor. The results are comparable to those reported previously (Mzoughi et al.,

2005; Ben Said et al., 2010). site 17 at Bizerta Lagoon was the less contaminated in April and in September. This site is always subjected to water flow with permanent water renewal eliminating all type of contaminant (Harzallah, 2003). For the Ichkeul Lake, sites 6 and 1 were the most contaminated in September. In April, stations 5, 1 and 2 were the most affected by PAHs. Whatever the season, station 7 was the less affected with PAHs in September and

April. Site 1 was the most contaminated with PAHs at both seasons because there are fishing boats installed and it is located near the Tinja River, which brings PAHs-contaminated waters from Bizerta Lagoon (Fig 2). These results indicate that contamination by PAHs in the lagoon and lake mainly due to accumulation of PAH in sediment from the maritime traffic. Seasonal variation showed that contamination by PAHs was stronger in rainy season (April) than in dry season (September) for the two ecosystems studied. These results were consistent with those obtained by Mzoughi et al. (2005, 2002). Comparison with threshold published by the

National Oceanic and Atmospheric Administration (NOAA) showed that the PAHs contents in sites 6, 9, 10, 12, 18 exceeded the threshold effects level (TEL), site 12 exceeding the probable effects level (PEL) (Table 2).

119

Fig 2: Spatial distribution of total PAHs in sediments of Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex in April 2012. Gray rectangle: concentrations of total PAHs in April; black rectangle: concentrations of total PAHs in September.

Table 2. Threshold effects level (TEL) (ng.g-1dry wt) of OCPs from NOAA screening quick references table

Compounds Marine sediment Freshwater sediment

Lindane 0.32 0.94

Chlordane 2.26 4.5

p,p DDD 1.22 3.54

p,p DDE 2.07 1.42

p,p DDT 1.19 -

DDT total 3.89 6.98

Dieldrin 0.715 2.85

Endrin - 2.67

Heptachlor Epoxide - 0.6

120

700 600 500 ST1 400 ST2 300 200 ST3 100 ST4 0 ST5 ST6 ST7 ST8

Fig 3a: Concentrations (ng.g-1dry wt) of PAHs in sediment of different sites from Ichkeul Lake in April (ST1-ST8)

3500,00 3000,00 ST11 2500,00 2000,00 ST12 1500,00 ST13 1000,00 ST14 500,00

0,00 ST15

ST16

ST17

Fluorene

Pyrene ST18

Naphthalene

Chrysene

Anthracene

Acenaphthene

Phenanthrene Fluoranthene

Acenaphthylene ST19

cd]pyrene -

ST20

Benzo[a]pyrene

Benz[a]anthracene

Benzo[b]fluoranthene

Benzo[k]fluoranthene Benzo[ghi]perylene

Dibenz[a,h]anthracene Indeno[1,2,3

Fig 3b: Concentrations (ng.g-1dry wt) of PAHs in sediment of different sites from Bizerta lagoon in April (ST9-ST20)

121

Polychlorinated Biphenyls (PCBs)

Concentrations of PCBs detected in the sediment of Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex were relatively low. This result is comparable to the range of concentrations of PCBs detected in sediment from Monastir Bay in Tunisia (1.1 and 9.3ng.g-1) (Nouira et al., 2013). However, the contents detected in the tissues of fishs Mugilcephalus and Dicentrarchuslabrax from

Bizerta Lagoon were higher in the range of 1.43-156 ng.g-1 wt (Ben Ameur et al., 2013), probably due to biomagnification. There was not a clear spatial and seasonal variation between the Ichkeul Lake and the Bizerta Lagoon as reported previously (Nouira et al., 2013), except for site 9 at Bizerta Lagoon which was more contaminated than the other sites in April, and for site 5 at Ichkeul Lake in September. The complex Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon was not affected by PCBs. PCBs contents exceeding neither the threshold set by NOAA nor the

Interim sediment quality guidelines (ISQGs) for total PCBs, which is determined at 21.5

μg·kg-1 dw for marine sediment and at 34.1 μg.kg-1 dw for freshwater sediment. The probable effect levels (PELs) for total PCBs being 189 μg.kg-1 for marine sediment and 277 μg.kg-1 for freshwater sediment.

122

Fig 4: Spatial distribution of totals PCBs (ng.g-1) in sediments of complex Ichkeul Lake- Bizerta Lagoon in April 2012. Light blue rectangle: concentrations of totals PCBsin April; Light blue rectangle: concentrations of totals PCBs in April; dark blue rectangle: concentrations of totals PCBs in September

Organochlorine pesticides (OCPs)

Pesticides were detectable in sediment from all prospected sites of the complex. These concentrations were in the same range of those detected in the tissues of fishes Mugilcephalus and Dicentrarchuslabrax in Bizerta Lagoon from 1.25 to 227 ng.g-1dry wt (Ben Ameur et al.,

2013). Lindan (HCH), Dieldrin and Endrin are the most represented in the sediments of

Ichkeul Lake. Sites 2, 8 and 1 were the most contaminated. The maximum concentration of endrin was recorded at site 2 and the minimal at site 6. Regarding Dieldrin, the highest concentrations were observed at sites 8, 2 and 1. The lowest concentration was detected at the site 6. Lindan (HCH) was detected in all sites with comparable concentrations. The maximum

123 dose was detected in site 8 and the minimum at site 6. Endosulfan has been detected in the sediments of different sites with maximum at sites 8 and 2. Heptachlor, Aldrin,

Hexachlorobenzene (HCB), dichlorodiphenyltrichloroethane (DDTs), chlordane and nonachlor were detected in the different sites, but at very low concentrations. A maximum total concentration of up to 2021 ng.g-1 dry wt OCPs was detected in the sediments from sites

8. Interestingly site 2 is located near agricultural areas (4102 hectares) of the office of public lands. Site 8 was the only site chosen because it is not located in the mouth of a river in order to estimate the effect of direct runoff from agricultural areas. According to the results, it is likely that direct runoff had a greater effect in the transport of pesticides that rivers flow. This observation may be explained by a dilution effect in rivers. The OCPs were detected at low levels in all sites of Bizerta Lagoon. The OCPs contents exceeded the threshold of the standards published by NOAA (Table 2) in almost all sites in the lake and lagoon.

124

Fig 5: Spatial distribution of totals OCPs (ng.g-1) in sediments of complex Ichkeul Lake- Bizerta Lagoon in September 2011 and April 2012.

1000,0 800,0 600,0 ST1 400,0 ST2 200,0 ST3

0,0 ST4

ST5

…

HCB

ST6

Beta BHC Beta

Alpha BHC Alpha

Dieldrin

Delta BHC Delta

Endrin

DDE

Aldrin -

DDD ST7

DDD

DDT

Gamma BHC Gamma

Heptachlor

2,4' DDE 2,4'

Endosulfan I

4,4' Endosulfan II

2,4' ST8

4,4'

Endrin aldéhydeEndrin HeptachlorEpoxide

Fig 6a: Concentrations (ng.g-1dry wt) of OCPs in sediment of different sites from Lake Ichkeul in April (ST1-ST8)

ST9 250,0 ST10 200,0 150,0 ST11 100,0 ST12 50,0 ST18 ST13

0,0 ST15

ST14

ST12

…

HCB

ST9

ST15

Beta BHC Beta

DDE

Endrin

Alpha BHC Alpha

Dieldrin

DDD

Aldrin

Delta BHC Delta DDD

DDT ST16

Gamma BHC Gamma

2,4' DDE 2,4'

Heptachlor

4,4'

Endosulfan I

2,4'

4,4' 4,4' Endosulfan II ST17

ST18 Endrin aldéhydeEndrin

HeptachlorEpoxide ST19

Fig 6b: Concentrations (ng.g-1dry wt) of OCPs in sediment of different sites from Lake Ichkeul-Bizerta lagoon in April (ST11-ST20)

125

Butyltin:

Concentrations of butyltin detected in the sediments of the lake/lagoon complex were relatively low compared to norms. The spatial distribution of the BuSn in the sediment of the complex shows that the sites subjected to the action of martime traffic are most contaminated but the contents are substandard. The lake is more contaminated than the lagoon by BuSn because the water column is deeper in the lagoon.

Conclusion

The Ichkeul Lake was found with high levels of OCPs contents. The OCPs input is probably coming from the agricultural areas located at the edge of this aquatic ecosystem. Bizerta

Lagoon was found with high levels of PAHs contents, which are probably coming from the maritime traffic. The PCBs content levels were found low indicating that there was not a real

126

contamination by these compounds. The hydrological characteristics of the complex Ichkeul

Lake-Bizerta Lagoon, such as seasonal variation of flow rates, may influence the spatial and

temporal distribution of persistent organic pollutants in sediments. It is thus important to

survey the impact of human activities on the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon hydrologic

complex in order to protect this area with high ecosystemic value.

Table 3. Mean and range of detected concentrations of PAHs, PCBs and OCPs (ng.g-1 DW) in September and April

Complex Lake-Lagoon Ichkeul Lake Bizerta Lagoon Mean Range Mean Range Mean Range PAHs : Naphtalene 326 7-3169 200 7-512 418 45-3169 Acenaphtylene 11 1-121 3 1-9 17 1-121 Acenaphtene 37 5-62 19 7-62 49 5-62 Fluorene 31 3-399 25 3-172 36 5-399 Phenanthrene 111 4-298 49 11-188 156 4-298 Anthracene 22 2-1882 9 2-37 31 5-1882 Fluoranthene 116 2-1658 54 9-389 161 2-1658 Pyrene 115 4-1790 52 7-339 161 4-1790 Benz[a]anthracene 99 2-1253 31 3-281 149 2-1253 Chrysene 67 2-791 28 6-155 95 2-791 Benzo[b]fluoranthene 145 4-1825 56 10-251 209 4-1825 Benzo[k]fluoranthene 64 3-675 21 3-134 95 3-675 Benzo[a]pyrene 106 3-1215 43 9-210 152 3-1215 Indeno[1,2,3-cd]pyrene 178 4-2604 83 17-602 247 4-2604 Dibenz[a,h]anthracene 37 3-607 12 3-29 55 5-607 Benzo[ghi]perylene 112 8-1290 41 11-166 164 8-1290 PCBs : PCB 18 0.150 0.042-0.362 0.163 0.055-0.482 0.161 0.042-0.362 PCB 28 0.186 0.117-0.337 0.111 0.130-0.337 0.164 0.117-0.204 PCB 31 0.208 0.104-0.471 0.235 0.104-0.471 0.194 0.105-0.359 PCB 44 0.432 0.080-1.280 0.422 0.080-1.280 0.439 0.114-1.111 PCB 52 0.114 0.013-0.583 0.118 0.013-0.452 0.111 0.017-0.583 PCB101 0.176 0.071-0.434 0.240 0.086-0.309 0.153 0.071-0.434 PCB 138

127

Aldrin 0.5 0.1-1.4 0.5 0.2-1.1 0.4 0.1-1.4 2,4' DDE 0.1 0.0-1.3 0.1 0.0-0.9 0.1 0.0-1.3 4,4'-DDE 1.3 0.7-4.9 1.4 0.8-4.9 1.3 0.7-4.4 2,4'-DDD 0.9 0.1-4 0.8 0.1-3 0.9 0.2-4 4,4'-DDD 0.9 0.3-4.9 0.9 0.6-1.5 1 0.3-4.9 4,4'-DDT 2.2 0.0-3.2

Acknowledgement

The authors would like to thank Mme Nabiha M’barek (National Agency of Environment

Protection Tunisia) and Mr Taher Kaabi (Commissariat Regional Commission for

Agricultural Development of Bizerta) for their logistic contribution. We acknowledge the

Regional Platform forEnvironmental Microbiology PREMICE supported by the Aquitaine

Regional Government Council (France) and the urban community of Pau-Pyrénées (France).

References

Aminot, A., Chausspied, M., 1983.Manuel des analyses chimiques en milieu marin. Centre national pour l’exploitation des océans, Brest. ISBN: 2.902721.10.2.

Ben Ameur, W., Trabelsi, S., El Megdiche, Y., Ben Hassine, S., Barhoumi, B., Hammami, B., Eljarrat, E., Barceló, D., Driss M.R., 2013. Concentration of polychlorinated biphenyls and organochlorine pesticides in mullet (Mugil cephalus) and sea bass (Dicentrarchus labrax) from Bizerte Lagoon (Northern Tunisia).Chemosphere 90, 2372-2380.

Ben Hassine, S., Ben Ameur, W., Gandoura, N., Driss M.R., 2012.Determination of chlorinated pesticides, polychlorinated biphenyls, and polybrominated diphenyl ethers in human milk from Bizerte (Tunisia) in 2010.Chemosphere 89, 369-377. Ben M’Barek, N., Slim-Shimi, N., 2002. Evolution des parmètres physico-chimiques des eaux du lac Ichkeul après la réalisation des aménagements hydrauliques (Tunisie) Proceedings ofInternational Symposium and Workshop on Environmental Pollution Control and Waste Management 7–10 January 2002, Tunis (EPCOWM’2002), pp 20–27 (in French)

Ben Said, O., Goñi-Urriza, M., El Bour, M., Aissa, P., Duran, R., 2010. Bacterial Community Structure of Sediments of the Bizerte Lagoon (Tunisia), a Southern Mediterranean Coastal Anthropized Lagoon. Microbial Ecology 59, 445–456.

128

Biache, c., Mansuy-Huault, L., Faure, P., 2014.Impact of oxidation and biodegradation on the most commonly used polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) diagnostic ratios: Implications for the source identifications.Journal of Hazardous Materials 267, 31-39.

Birch, G.F., Davey, S., 1995. Accumulation of metallic contaminants in surficial sediments on a high energy continental shelf (Sydney, Australia). The Science of the Total Environment 170, 81-93.

Brondi, S.H.G., de Macedo, A.N., Vicente, G.H.L., Nogueira, A.R.A., 2011. Evaluation of the QuEChERS Method and Gas Chromatography–Mass Spectrometry for the Analysis Pesticide Residues in Water and Sediment. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 86, 18–22. Carro, N., Cobas, J., García, I., Ignacio, M., Mouteira, A., 2014. Distribution and trend of organochlorine pesticides in galicia coast using mussels as bioindicator organisms. Possible relationship to biological parameters.Chemosphere 102, 37-47.

Chang, K.F., Fang, G.C., Chen, J.C., Wu, Y.S., 2006. Atmospheric Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) in Asia: A Review from 1999 to 2004. Environmental Pollution 142, 388–396.

Deycard, V.N., Schäfer, J., Blanc, G., Coynel, A., Petit, J.C.J., Lanceleur, L., Dutruch, L., Bossy, C., Ventura, A., 2014. Contributions and potential impacts of seven priority substances (As, Cd, Cu, Cr, Ni, Pb, and Zn) to a major European Estuary (Gironde Estuary, France) from urban wastewater.Marine Chemistry 167, 123-134.

Ennaceur, S., Gandoura, N., Driss, M.R., 2008.Distribution of polychlorinated biphenyls and organochlorine pesticides in human breast milk from various locations in Tunisia: Levels of contamination, influencing factors, and infant risk assessment. Environmental Research 108, 86-93.

Figueiredo, k., Mäenpää, K., Leppänen, M.T., Kiljunen, M., Lyytikäinen, M., Kukkonen, J.V.K., Koponen, H., Biasi, C., Martikainen, P.J., 2014. Trophic transfer of polychlorinated biphenyls (PCB) in a boreal lake ecosystem: Testing of bioaccumulation models. Science of The Total Environment 466–467, 690-698.

129

Gonzalez, M., Miglioranza, K.S.B., Aizpun de Moreno J.E., Moreno, V.J., 2005. Evaluation of conventionally and organically produced vegetables for high lipophilic organochlorine pesticide (OCP) residues. Food and Chemical Toxicology 43, 261–269.

Harzallah, A., 2003. Transport des polluants dans la lagune de Bizerte simulé par un modèle de circulation de l’eau. Institut National des Sciences et Technologies de laMer de Salammbô 30, 115-133.

Jürgens, M.D., Chaemfa, C., Hughes, D., Johnson, A.C., Jones K.C., 2015. PCB and organochlorine pesticide burden in eels in the lower Thames River (UK).Chemosphere 118, 103-111.

Kraïem, M.M., Ben Hamza, C., 2000. Sites description, water chemistry and vegetation transect of Tunisian lakes. Fish populations study of the nine CASSARINA lakes. London, CASSARINA Final Reports. Unpubl Report of INSTM, Salambo, 74.

Li, C.C., Huo, S.L., Xi, B.D., Yu, Z.Q., Zeng, X.Y., Zhang, J.T., Wu, F.C., Liu H.L., 2015. Historical deposition behaviors of organochlorine pesticides (OCPs) in the sediments of a shallow eutrophic lake in Eastern China: Roles of the sources and sedimentological conditions. Ecological Indicators 53, 1-10.

Lin, T., Hu, L., Shi, X., Li, Y., Guo, Z., Zhang, G., 2012.Distribution and sources of organochlorine pesticides in sediments of the coastal East China Sea.Marine Pollution Bulletin 64, 1549–1555.

Ma, Y., Xie, Z., Halsall, C., Möller, A., Yang, H., Zhong, G., Cai, M., Ebinghaus, R., 2015. The spatial distribution of organochlorine pesticides and halogenated flame retardants in the surface sediments of an Arctic fjord: The influence of ocean currents vs. glacial runoff. Chemosphere 119, 953-960.

Miège, C., Schiavone, S., Dabrin, A., Coquery, M., Mazzella, N., Berho, C., Ghestem, J.P., Togola, A., Gonzalez, C., Gonzalez, J.L., Lalere, B., Lardy-Fontan, S., Lepot, B., Munaron, D., Tixier, C., 2012. An in situ intercomparison exercise on passive samplers for monitoring metals, polycyclic aromatic hydrocarbons and pesticides in surface waters.TrAC Trends in Analytical Chemistry 36, 128-143. Moreno M.J., Pacheco-Arjona J., Rodrıguez-Gonzalez P., Preud’Homme H., Amouroux D., Donard O.F.X., 2006. Simultaneous determination of monomethylmercury, monobutyltin,

130 dibutyltin and tributyltin in environmental samples by multi-elementalspecies-specific isotope dilution analysis using electron ionisation GC-MS. Journal of Mass Spectrometry 41, 1491– 1497. Murphy, J., Riley, J.P., 1962. A modified single solution method for the determination of phosphate in natural waters. Analytica Chimica Acta 27, 31-36.

Mzoughi, N., Hellal, F., Dachraoui, M., Villeneuve, J.P., Cattini, C., de Mora, S.J., El Abed A., 2002. Méthodologie de l'extraction des hydrocarbures aromatiques polycycliques. Application à des sédiments de la lagune de Bizerte (Tunisie). Comptes Rendus Geoscience 334, 893-901. Mzoughi, N., Lespes, G., Bravo, M., Dachraoui, M., Potin-Gautier, M., 2005. Organotin speciation in Bizerte lagoon (Tunisia). Science of The Total Environment 349, 211-222. Nouira, T., Risso, C., Chouba, L., Budzinski, H., Boussetta H., 2013. Polychlorinated biphenyls (PCBs) and Polybrominated Diphenyl Ethers (PBDEs) in surface sediments from Monastir Bay (Tunisia, Central Mediterranean): Occurrence, distribution and seasonal variations. Chemosphere 93, 487-493. Opel, O., Palm, W.U., Steffen, D., Ruck, W.K.L., Inside-sediment partitioning of PAH, PCB and organochlorine compounds and inferences on sampling and normalization methods.Environmental Pollution 159 (2011) 924-931. Parsons, T.R., Takahashi, M., Hargrave, B., 1984. Biological Oceanographic Processes, third ed. Pergamon Press, Oxford, p. 330 Pozo, K., Urrutia, R., Mariottini, M., Rudolph, A., Banguera, J., Pozo, K., Parra, O., Focardi, S., 2014. Levels of Persistent Organic Pollutants (POPs) in sediments from Lenga estuary, central Chile. Marine Pollution Bulletin 79, 338–341. Ramdani, M., Flower, R.J., Elkhiati, N., Kraïem, M.M., Fathi, A.A., Birks, H.H., Patrick, S.T., 2001. North African wetland lakes: characterization of nine sites included in the CASSARINA Project. Aquatic Ecology 35, 281–302.

Schoellhamer, D.H., Mumley, T.H., Leatherbarrow, J.E., 2007. Suspended sediment and sediment-associated contaminants in San Francisco Bay. Environmental Research 105, 119– 131.

Sharma, B.M., Bharat, G.K. Tayal, S., Nizzetto, L., Čupr, P., Larssen, T., 2014. Environment and human exposure to persistent organic pollutants (POPs) in India: A systematic review of recent and historical data. Environment International 66, 48-64.

131

Shu, Y.Y., Lao, R.C., Chiu, C.H., Turle, R., 2000. Analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in sediment reference materials by microwave-assisted extraction.Chemosphere 41, 1709-1716.

Stevenson, A.C., 1991. Palaeoecological and Documentary Records of Recent Environmental Change in Garaet El Ichkeul: A Seasonally Saline Lake in NW Tunisia. Biological Conseroation 58, 275-295.

Stevenson, A.C., Battarbee, R.W., 1991. Palaeoecological and documentary records of recent environmental change in Garaet el Ichkeul: A seasonally saline lake in NW Tunisia. Biol Conserv 58, 275–29.

Szlinder-Richert, J., Nermer, T., Szatkowska, U., 2014. PAH metabolites in European eels (Anguilla anguilla) as indicators of PAH exposure: Different methodological approaches. Science of The Total Environment 496, 84-91.

Tolosa, I., de Mora, S.J., Fowler, S.W., Villeneuve, J.-P., Bartocci, J., Cattini, C., 2005. Aliphatic and aromatic hydrocarbons in marine biota and coastal sedimentsfrom the Gulf and the Gulf of Oman.Marine Pollution Bulletin 50, 1619-1633.

Trabelsi, S., Driss, M.R., 2005.Polycyclic aromatic hydrocarbons in superficial coastal sediments from Bizerte Lagoon, Tunisia.Marine Pollution Bulletin 50, 344-348.

Vane, C.H., Harrison, I., Kim, A.W., 2007. Assessment of polyaromatic hydrocarbons (PAHs) and polychlorinated biphenyls (PCBs) in surface sedimentsof the Inner Clyde Estuary, UK.Baseline / Marine Pollution Bulletin 54, 1287–1306.

Wasswa, J., Kiremire, B.T., Nkedi-Kizza, P., Mbabazi, J., Ssebugere, P., 2011. Organochlorine pesticide residues in sediments from the Uganda side of Lake Victoria.Chemosphere 82, 130–136.

Wen, J., Jirka, G.H., Raggio, G., 1994.Linked Sediment/Contaminant Transport Model for Rivers with Application to the Buffalo River, New York. Journal of Great Lakes Research 20, 671-682.

Wood, E.D., Armstrong, F.A.J., Richards, F.A., 1967. Determination of nitrate in sea water by cadmium-copper reduction to nitrite. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 47, 23-31.

132

Yadav, I.C., Devi, N.L., Syed, J.H., Cheng, Z., Li, J., Zhang, G., Jones, K.C., 2015. Current status of persistent organic pesticides residues in air, water, and soil, and their possible effect on neighboring countries: A comprehensive review of India, Science of The Total Environment, Volume 511: 123-137. Yang, X., Wang, F., Meng, L., Zhang, W., Fan, L., Geissen, V., Ritsema C.J., 2014. Farmer and retailer knowledge and awareness of the risks from pesticide use: A case study in the Wei Rivercatchment, China. Science of The Total Environment497–498, 172-179. Yang, X.B., Ying, G.G., Kookana, R.S., 2010. Rapid multiresidue determination for currently used pesticides in agricultural drainage waters and soils using gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Environmental Science and Health Part B 45, 152-61. Yohannes, B., Ikenaka, Y., Saengtienchai, A., Watanabe, K.P., Nakayama, S.M.M., Ishizuka M., 2014. Concentrations and human health risk assessment of organochlorine pesticides in edible fish species from a Rift Valley lake—Lake Ziway, Ethiopia.Ecotox Environ Safe 106: 95-101.

Yu, Y., Li, Y., Shen, Z., Yang, Z., Mo, Li., Kong, Y., Lou, I., 2014. Occurrence and possible sources of organochlorine pesticides (OCPs) and polychlorinated biphenyls (PCBs) along the Chao River, China.Chemosphere, 136-143.

133

CHAPITRE IV : BIO-SURVEILLANCE DU COMPLEXE LAC ICHKEUL LAGUNE DE BIZERTE : DIVERSITE MICROBIENNE ET DES NEMATODES LIBRES MARINS

134

CHAPITRE IV : BIO-SURVEILLANCE DU COMPLEXE LAC ICHKEUL LAGUNE DE BIZERTE : BIODIVERSITE MICROBIENNE ET DES NEMATODES LIBRES MARINS

Introduction

Les analyses chimiques montrent que la lagune de Bizerte est contaminée par les HAP et le lac Ichkeul est polluée par les OCP. Des sites de pollutions multiples HAP et OCP ont été retrouvés dans le lac et la lagune. Dans certaines stations, les teneurs dans les sédiments dépassent les normes. Il est maintenant indispensable d’étudier l’impact de la présence de ces polluants sur les organismes biologique. La bio-surveillance est le suivi de la qualité de l’écosystème aquatique à travers les communautés biologiques qui l’abritent. L’écologie de ces communautés, leurs interactions avec les autres communautés et avec leur milieu peut changer suite à la présence de polluants (Eadie et al., 1982 ; Xu et al., 2014). Les communautés benthiques qui habitent le sédiment sont très diversifiées (Holmes et al., 2008).

Le choix des microorganismes et des nématodes libres marins est essentiellement lié à leurs rôles de bioindicateurs (Moreno et al., 2011), mais surtout basé sur leurs capacités de bioremédiation (Isaac et al., 2013). L’étude de ces communautés permet de déterminer les espèces résistantes, possibles solutions pour la mise en place de procédés de bioremédiation.

135

Références bibliographiques

Eadie BJ, Faust W, Gardner WS, Nalepa T, 1982. Polycyclic aromatic hydrocarbons in sediments and associated benthos in lake erie. Chemosphere, 11 : 185 – 191.

Holmes KW, Van Niel KP, Radford B, Kendrick GA, Grove SL, 2008. Modelling distribution of marine benthos from hydroacoustics and underwater video. Continental Shelf Research, 28 : 1800– 1810.

Isaac P, Sánchez LA, Bourguignon N, Cabral ME, Ferrero MA, 2013. Indigenous PAH- degrading bacteria from oil-polluted sediments in Caleta Cordova, Patagonia Argentina. International Biodeterioration & Biodegradation, 82 : 207-214

Moreno M, Semprucci F, Vezzulli L, Balsamo M, Fabiano M, Albertelli G, 2011. The use of nematodes in assessing ecological quality status in the Mediterranean coastal ecosystems. Ecological Indicators, 11 : 328-336.

Xu WZ, Cheung SG, Shin PKS, 2014. Structure and taxonomic composition of free-living nematode and macrofaunal assemblages in a eutrophic subtropical harbour, Hong Kong. Marine Pollution Bulletin, 85 : 764-773.

136

I. Publication 4:

To be submitted to: Microbes and Environments

Bacterial Community Structure of the sediments from the complex Bizerta Lagoon (Anthropized ecosystem)-Ichkeul lake (RAMSAR site) in Tunisia and pyrosequencing analysis of four interesting sites

Fida Ben Salema,b,c,e, Olfa Ben Saida,b,e, Ezzeddine Mahmoudia, NoëlleBrud,e,

Mathilde Monperrusc,e, Robert Duranb,e

aLaboratoire de Biosurveillance de l’Environnement, Faculté des Sciences de Bizerte, Tunisie. bEquipe Environnement et Microbiologie – MELODY group - IPREM UMR 5254 CNRS – Université de Pau et des Pays de l’Adour, France cLaboratoire de Chimie Analytique Bio-Inorganique et Environnement, IPREM UMR 5254 CNRS – Université de Pau et des Pays de l’Adour, France dLaboratoire de Mathématiques et de leurs Applications, PAU UMR CNRS 5142 –Université de Pau et des Pays de l’Adour, France eFédération de recherche MIRA,Université de Pau et des Pays de l’Adour, France

137

Abstract:

To investigate how the pollution affects the bacterial community structure and composition in sediments, chemical and molecular approaches were combined to survey twenty stations around the Ichkeul Lake-Bizerte Lagoon complex.Terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis of PCR-amplified 16S rRNA genes revealed that each site was characterized by a specific bacterial community structure. The combination of this data with those of chemical analysis showed a correlation between the bacterial fingerprint and the pollutant content, principally with pesticides in Ichkeul Lake and PAHs in Bizerta Lagoon.

The 16S rRNA gene pyrosequencing of bacterial communities for four sitesresulted in 17661 sequences and 858 operation taxonomic units (OTUs). The taxonomic analysis of the pyrosequencing data grouped the sequences into 44 different phyla. In general, Proteobacteria were the most dominant phyla with predominance of Gammaproteobacteria,

Alphaproteobacteria and Deltaproteobacteria within the sediments. Besides Proteobacteria, there are a number of sequences affiliated to the following major phyla detected in all four sites: Chloroflexi, Bacteroidetes, Nitrospirae, Planctomycetes, Actinobacteria,

Gemmatimonadetes, Firmicutes, Cyanobacteria, Spirochaetes, Acidobacteria. The bacterial communities of the four sites shared 211 common OTUs. The Lake Ichkeul was characterized by 219 specific OTUs and the Bizerta lagoon by 235 OTUs.

138

1. Introduction:

Lagoons and lakes are crucial environments for nature preservation. These ecosystems are highly productive and need careful monitoring because they are very vulnerable. Their status may change rapidly in response to natural- and human-driven events. Sediments are complex habitats densely colonized bydiverse microorganisms. In sediments microbial communities are involved in the decomposition of organic matter (Schultz and Urban, 2008).

Microorganisms play a key role in carbon, nitrogen and phosphorus cycling (Andrews et al,

2011) as well as in determining the fate of pollutants (Zhang et al., 2008). Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs) and organochlorine pesticides

(OCPs) (Kjellerup et al., 2014) are persistent organic pollutants (POPs).These contaminants are ubiquitous in aquatic ecosystems (Doong et al., 2008; Wang et al., 2011; Assem et al.,

2013; Galvaoet al., 2014; Mwanamoki et al., 2014). They are mainly from industrial sources, agricultural and maritime traffic (Chang et al., 2006; Wen et al., 1994). They meet the sea aquatic environments through spray drift, accidental offsite movement in herbicide rainfall events, or through transport in surface runoff from agricultural areas (Shultz, 2001; Botta et al., 2009). Recent developments in molecular techniques have provided an outstanding opportunity to investigate in situ diversity and activity of bacterial communities in various ecosystems. These techniques are based on the detection of nucleic acids within living cells or after extraction directly from ﬁeld material. The rapid development of molecular methods allowed to obtain more detailed information on microbial diversity and dynamics in marine sediments (Thiyagarajan et al., 2010). High-throughput sequencing (HTS) technologies are highly efficient tools for identifying the entire phylogenetic profile of microbial communities

139 without prior culturing of organisms or knowledge of the species present. These HTS technologies are useful for biomonitoring aquatic ecosystem.

During the past decades several projects have studied the PAHs in the sediment of Bizerta lagoon and their impact on the benthic microorganisms and organisms (Ben said et al., 2010;

Mzoughiet al., 2002; Trabelsi and Driss, 2005). But pesticides and PCBs were neglected in these studies. The current study aims to characterize the bacterial communities from the sediments of the complex Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon. The bacterial communities were analysed at the taxonomic level using molecular methods such as T-RFLP and 454- pyrosequencing targeting 16S rRNA genes. The effect of organic contaminants such as PAHs,

PCBs, OCPs on the bacterial assemblages were determined.

2. Materiels and Methods 2.1. Site description

The lake Ichkeul is a Biosphere reserve, a Ramsar site, and a World Heritage Site (Kraïem and Ben Hamza, 2000; Ramdani et al., 2001a; Ben M’barek and Slim-Shimi, 2002). It is internationally important for its wintering water fowl (Carp, 1980; Scott, 1980; Hollis, 1986); it is an important stopover point for hundreds of thousands of migrating birds each year.

Because surrounded by a vast agricultural area the Ichkeul Lake receives agricultural pollutant (Stevenson and Battarbee, 1991). Such pollutants may impact the health of aquatic organisms and subsequently local and migratory birds. The lake is a freshwater ecosystem

(average salinity 4 PSU) in winter when the rivers are in flood and turns in a saline ecosystem

(average salinity 35 PSU) in summer because of evaporation and the inflow of seawater.

Ichkeul Lake - Bizerta lagoon watershed is located in the Northern of Tunisia, these aquatic ecosystems are connected by Tinja river and Bizerta Lagoon is open to the Mediterranean

Seaby a channel. These two water bodies are also fed by several rivers. The area of Bizerta

Lagoon is approximately 128 km2. The complex receives contamination from two industrial

140 zones (Ben Said et al., 2010; Mzoughi et al., 2010; Trabelsi et al., 2012) and agricultural areas located on the edge of the lagoon.

2.2. Sampling

Sediment samples were obtained from 20 coastal sites of the complex Ichkeul Lake - Bizerta

Lagoon (Fig. 1). 13 sites were chosen as the mouths of the various rivers that feed the complex and 4 sites next to industrial or agricultural area and two sites centers of the lake and the lagoon and one site in Mediterranean Sea.The sampling was performed during two campaigns in September 2011 and April 2012. Three replicates were collected for each site.

Fig 1. Map of the complex Ichkeul Lake-Bizerte Lagoon indicating the location of the sampling stations

2.3. Physical-chemical analyses

141

Water column temperature, pH, dissolved oxygen and salinity were determined in the field with a handheld multi-parameter system (WTW Multi-197i). Nitrite and nitrate were analyzed following the procedure of Wood et al. (1967). Ammonia was determined according to

Aminot and Chaussepied (1983). Phosphate levels were determined as described in Murphy and Riley (1962). For chlorophyll a (Chla), water samples were filtered through Whatman

GF/F filters. Pigment concentrations were determined using the standard spectrophotometric method (Parsons et al. 1984), following extraction with 10 mL 90% acetone overnight at 4°C in the dark. Suspended material was analysed according to (Baretta-Beakker et al. 1992).

Carbon organic was determined according to Espitalie et al. (1986).

2.4. DNA extraction, PCR, T-RFLPanalysis

The total genomic DNAs, 250 mg of the frozen sediment sample, were extracted using an

UltraClean soil DNA isolation Kit (MoBio Laboratories, CA) by following the manufacturer’s protocol with minor modifications as previously described by (Precigou et al.,

2001). The 16S rRNAgenes were PCR amplified from the genomic DNA with the bacterial universal fluorescent-labeled primers 63F: 5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’ and

1387R 5’ GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’ (Marchesi et al., 1998).

The PCR amplification mixture contained: 12.5 µl AmpliTaq Gold 360 Master Mix (Applied

Biosystems), 0.25 µl of each primer (20 µM), 0.5 µl of the DNA extracts and dilluated 10× were added to the PCR reactions.A final volume of 25 μL was adjusted with distilled water.

Thermal cycling was carried out, in a PTC200 thermocycler (MJ Research), under the following conditions: 95°C for 10 min, 35 cycles of 95°C for 45 seconds, 58°C for 45 seconds, 72°C for 1 min, with a final extension step at 72°C for 10 min. PCR products were then purified using a DNA purification kit (MoBio Laboratories, CA). Purified PCR products were digested with four units of enzyme AluI (Takara, Japan).

142

One µl of the digested DNA from each sample was mixed with 8.75 μL of deionized formamide and 0.25 μL of Rox 500 (Applied Biosystems). T-RF profiles were analyzed with

Gene Scan Software version 3.1 (Applied Biosystem), after an injection step of 10 s, electrophoresis was carried out for up to 30 min applying a voltage of 15 KV. Only profiles with a more than 1% of the total fluorescence were fluorescence units were used for the analysis. T-RFLP profiles were compared by canonical correspondence analysis (CCA) using

MVSP software (multivariate statistical package 3.12d, Kovach Computing Services, 1985–

2001, UK). This test is based on the linear correlation between community data (abundance of each T-RF) and environmental parameters in the sediments. Linear regression analysis between some T-RFs, and chemical data was performed in order to avoid over interpretation of the correlation.

2.5. 454 Pyrosequencing

454 pyrosequencing of 12 samples was made: 4 sites among the 20 were selected according to the environmental parameters ST12 most contaminated by PAHs, ST8 most contaminated by

OCPs, ST5 with multiple contamination by PAHs and pesticides and ST17 station, the less contaminated of the entire complex. Three replicates for each site have been analysed at

MRDNA (MR DNA, Shallowater, TX). The HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen,

Valencia, CA) was used for PCR amplification as follows: 94°C for 3 minutes, 28 cycles of

94°C for 30 seconds, 53°C for 40 seconds and 72°C for 1 minute. Finally, an elongation step at 72°C for 5 minutes was performed. The different PCR products were mixed in equal concentrations and purified using AgencourtAmpure beads (Agencourt Bioscience

Corporation, MA, USA). The Roche 454 FLX titanium was used for sequencing, following the manufacturer’s guidelines. The sequencing data were processed using a proprietary analysis pipeline (www.mrdnalab.com, MR DNA, Shallowater, TX). After depletion of barcodes and primers in sequences, those showing a low quality score, i.e. sequences < 200

143 bp with ambiguous base calls or with homopolymer runs exceeding 6 bp, were removed.

Sequences were then denoised and chimeras removed. Operational taxonomic units were defined after removal of singleton sequences, clustering at 3% divergence (97% similarity)

(Dowd et al. 2008a; Dowd et al. 2011; Dowd et al. 2008b; Edgar 2010). OTUs were then taxonomically classified using BLASTn against a curated GreenGenes database (DeSantis et al. 2006). A cut-off similarity of 97% was applied for species, 95% for genera and 90% for families’ assignation. In order to minimise the variability of libraries size and the pyrosequencing errors, sequences representing less than 0.1% were not considered.

2.6. Statistical analysis

Canonical Correspondence Analysis (CCA) crossing bacterial community structure (relative abundances of T-RFs) with chemicals data (concentrations of PAHs and pesticides) of each site were performed with MVSP v3.22 software (Kovach Computing Service, Anglesey

Wales).

Univariate indices of pyrosequencing results were calculated for each site, including total strains abundance, diversity (Shannon-Wiener index H’) and strains richness (R) using the

PRIMER v5.0 (Plymouth Routines in Multivariate Ecological Research) software package.

One-way analysis of variance (ANOVA) was used to test for overall differences of these indices between controls and treatments and the Tukey HSD multiple comparisons test was used in pairwise comparisons. Significant difference was assumed when p<0.05. Similarity percentages (SIMPER) were used to determine the contribution of individual OTUs towards the dissimilarity between sites. Statistical analysis of bacterial community structure (relative abundances of OTUs) were performed by R i386 3.1.0 to obtained heat map, venn diagram, networks (gplot).

3. Results and discussions

144

3.1. Bacterial community structure Crossing TRFLP and chemical data showed a clear separation of bacterial communities of the two ecosystems lake and lagoon irrespective of the season (Fig.2). This observation may be explained by the effect of the large salinity difference between the ecosystems. The CCA analysis shows also that the bacterial communities of the lake are under the influence of pesticides while those of the lagoon by PAHs (Fig.2). Our results confirm those of Ben said et al., (2010) indicated by the impact of PAH on bacteria community structure in sediment of

Bizerta lagoon. Considering the lake, the bacterial communities were more influenced by

PAHs in September than in April (Fig.3). This is related to the hydrology of the ecosystem: during the dry season there has entrance of the lagoon water contaminated by PAHs to the lake. For the lagoon pollution by PAHs and pesticides is most pronounced in April until

September (Fig.4).

145

Fig 3. Canonical Correspondence Analysis (CCA) between sediment bacterial communities from Ichkeul Lake in two campaigns (September and April) characterized by T-RFLP fingerprints and chemical analysis: PAHs and Pesticides.

146

Fig 4. Canonical Correspondence Analysis (CCA) between sediment bacterial communities from Bizerta Lagoon in two campaigns (September and April) characterized by T-RFLP fingerprints and chemical analysis: PAHs and Pesticides.

3.2.Bacterial community composition 454 pyrosequencing was used to determine the identity of the microorganisms of four sites:

Site 17 the less contaminated, site 12 the most contaminated in PAHs, site 8 the most contaminated in pesticides and site 5 with mixture PAHs and pesticides. Three replicates from each site were considered. The taxonomic analysis of the pyrosequencing data reveled 17661

147 sequencesand 858 OTUs, which were grouped into 44 different phyla. In general,

Proteobacteria were the most dominant phyla with predominance of Gammaproteobacteria,

Alphaproteobacteria and Deltaproteobacteria within the sediments. Besides Proteobacteria, there are a number of sequences affiliated to the following major phyla detected in all four stations: Chloroflexi, Bacteroidetes, Nitrospirae, Planctomycetes, Actinobacteria,

Gemmatimonadetes, Firmicutes, Cyanobacteria, Spirochaetes, Acidobacteria.

3.2.1. Univariate indices Results from the one-way ANOVA illustrate significant differences in most univariate indices between bacterial communities from stations 5,8,12 and 17 (Table 1). The number of OTUs and OTUs richness (R) are comparable at the sites of the lagoon and those of the lake.

Regarding each ecosystem, these indexes were lower in the most contaminated (sites 12 and

8), which are retains highest contents of PAHs and OCPs respectively. Shannon index (H’) was significantly higher in site contaminated by PAHs (12).

Table 1: Means of univariate indices for OTUs assemblages from each site. N = Number of species; H' = Shannon-Wiener index; Margalef’s R= species richness.

Samples N R H’ ST5 150 41 3.331 ST8 146 40 3.348 ST12 149 39 3.515 ST17 150 40 3.209

3.2.1. Multivariate indices

SIMPER results showed that the highest value of average dissimilarity was recorded between sites from the lake and sites from the lagoon (50%), between sites from the same ecosystem

(average dissimilarity30%). A total of 858 OTUs and 17661 sequences were recorded in all sites. The Veen diagram (Fig 5) showed that the most OTUs (211 OTUs) were shared by the

148 four sites, this result indicat an ecological continuum between the lake and the lagoon that are closely linked via the Tinja River, 68 OTUs are commun between sites from the lake and 64 between sites from the lagoon, 97 strains characterise the control site (ST17), 85 for ST5 with multiple contamination (PAHs and pesticides) 74 for site 12 contaminated by PAHs and 66 for site 8 contaminated by pesticides. That observation show that the control site is the most diversify. Venn Diagram of the abundance of bacteria (Fig 5) shows that 97 bacterial strains characterize the site 17, they are only present in this site, 85 in the site 5, 74 in the site 12 and

66 in the site 8. Site 17 is the most diverse, it has the highest shannon index (H’). This may be due to the fact that this site is the less contaminated of the complex. The sites of the lagoon

(12 and 17) have 64 common bacterial strains. The sites of the lake have 68 common bacterial strains. The common bacterial strains between all the sites are among 211.

Fig 5: Comparison of bacterial communities from the different sites of the Ichkeul Lake-

149

Bizerta Lagoon complex. Venn diagram shows the number of shared OTUs between

sites.The specific OTUs for each site are indicated. OTUs were determined at the species

level (97%)

Simper and the heat map (Fig 6) clusteringshowed that the site 17 was dominated byacidithiobacillus spp. (11%), nannocystineae spp. (3%), anaerolineaceae spp. (3%) and actibacter spp. (2%). Site 12 was dominated by acidithiobacillus spp. (6%), actibacter spp.

(5%), nannocystineae spp. (4%), robiginitalea spp. (3%) and anaerolineaceae spp. (3%).

The site 8 from the lake was dominated bysinobacteraceae spp. (6.36%), nannocystineae spp. (5.19%) and anaerolineaceae spp. (5.03%). Finally station 5 was dominated by anaerolineaceae spp. (7.12%), sinobacteraceae spp. (3.69%) and nannocystineae spp.

(3.74%). Significant differences between sites resulted mainly from changes in the abundances of the dominant strains. Lowest abundance of acidithiobacillus spp. and highest number of actibacter spp. and robiginitalea spp. were responsible for 31.58% of average dissimilarity between site 17 and site 12 from the lagoon caused by the contamination of site

12 by PAHs compared to site control ST17 so acidithiobacillus spp. is a strain sensitive to

PAHs, acidithiobacillus are extremely acidophilic, chemolithotrophic, sulfur-oxidizing proteobacteria that have distinct advantages in improving leaching efficiency of metal sulfides (Wang et al., 2014). Acidithiobacillus spp. is a strain present in ecosystems contaminated by metals (Nguyen and Lee, 2015; Nguyen et al., 2015). Actibacter spp. is a strain resistant to PAHs, this strain was present in ecosystems contaminated by PAHs

(Rubin-Blum et al., 2014), which confirms our results since the site 12 is contaminated by

PAHs. The abundance of sinobacteraceae spp., and nannocystineae spp. is higher and the abundance of anaerolineaceae spp. is lowest causing 34.42% of significant difference between sites 5 and 8 from the lake caused by contamination of site 8 by pesticides, so sinobacteraceae spp. and nannocystineae spp. are bacterial strains resistant to pesticides and

150 anaerolineaceae spp. are sensitive to this type of compounds. The difference between the

Ecosystems Lake and Lagoon caused essentially by variation of salinity levels influence bacteria community: highest abundance of acidithiobacillus spp. and actibacter spp. and lowest abundance of anaerolineaceae spp. were responsible for 53.38% of average dissimilarity between site 5 and site 17. Highest abundance of anaerolineaceae spp.

Andactibacter spp. and lowest number of acidithiobacillus spp. were responsible for 53.18% of average dissimilarity between site 5 and site 12. Sites 8 and 12 are different at 52.44% because lowest abundance of sinobacteraceae spp. and anaerolineaceae spp. and increasing of actibacter spp. and acidithiobacillus spp. highest abundance of acidithiobacillus spp. was responsible for 51.30% of average dissimilarity between site 8 and site 17.

151

Fig 6. Heat map for clustering abundance of OTUs in different sites with replicates.

The Canonical Correspondence Analysis (CCA) between sediment bacterial community composition from the complex Ichkeul Lake - Bizerta Lagoon in four sites 5,8,12 and 17 in

April based on variables characterized by OTUs and chemical analysis: PAHs and OCPs shows that the replicates of each site are very close sometimes they overlap (Fig. 7). There is also a clear separation between OTUs from Ichkeul Lake and those of the lagoon. Arrows

152 environmental parameters in this case PAHs and OCPs are opposite which the impact of this parameters are anti-correlated.

4. Conclusion

The determination of microbial community composition in sediment of the complex Ichleul

Lake-Bizerta Lagoon indicated that the bacterial communities from thelake were impacted by pesticides and those of the lagoon by PAHs. In the Ichkeul Lake the bacterial communities were more impacted by PAHs in September than in April. Such observation may be explained by the hydrology of the ecosystem since during the dry season there has entrance of the

153 lagoon water contaminated by PAHs to the lake. The Shanon index H’ indicated that the

Bizreta Lagoon showed more bacterial diversity than the Ichkeul Lake.

References

Aminot A, Chausspied M (1983) Manuel des analyses chimiques en milieu marin. Centre national pour l’exploitation des océans, Brest. ISBN: 2.902721.10.2.

Barakat AO, Khairy M, Aukaily I, 2013. Persistent organochlorine pesticide and PCB residues in surface sediments of Lake Qarun, a protected area of Egypt. Chemosphere, 90 : 2467-2476. Baretta-Beakker JG, Duursma EK, Kuipers BR, 1992. Encyclopodia of marine Science. Springer.

Ben Said O, Goñi-Urriza M, El Bour M, Aissa P, Duran R (2010) Bacterial community structure of sediments of the Bizerte Lagoon (Tunisia), a southern mediterranean coastal anthropized lagoon. Microbial Ecology, 59:445-456

Botta F, Lavison G, Couturier G, Alliot F, Moreau-Guigon E, Fauchon N, Guery B, Chevreuil M, Blanchoud H (2009) Transfer of glyphosate and its degradate AMPA to surface waters through urban sewerage systems. Chemosphere, 77:133-139

Chang S, Doong R, 2006. Concentration and fate of persistent organochlorine pesticides in estuarine sediments using headspace solid-phase microextraction. Chemosphere, 62 : 1869- 1878. Carp E (1980) Directory of wetlands of international importance in the western palaearctic. IUCN/UNEP/acVWF, Gland.

154

DeSantis TZ, Hugenholtz P, Larsen N, Rojas M, Brodie EL, Keller K, et al. 2006. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology, 72:5069–5072. Doong R, Lee S, Lee C, Sun Y, Wu S, 2008. Characterization and composition of heavy metals and persistent organic pollutants in water and estuarine sediments from Gao-ping River, Taiwan. Marine Pollution Bulletin, 57 : 846-857. Dowd SE, Wolcott RD, Sun Y, McKeehan T, Smith E, Rhoads D. 2008a. Polymicrobial nature of chronic diabetic foot ulcer biofilm infections determined using bacterial tag encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP). PLoS ONE, 3:e3326. Dowd SE, Sun Y, Secor PR, Rhoads DD, Wolcott BM, James GA, Wolcott RD. 2008b; Survey of bacterial diversity in chronic wounds using Pyrosequencing, DGGE, and full ribosome shotgun sequencing. BMC Microbiology, 8:43. Dowd SE, Wolcott RD, Kennedy J, Jones C, Cox SB, 2011. Molecular diagnostics and personalised medicine in wound care: assessment of outcomes. Journal of Wound Care, 20: 232, 234– 232, 239. Edgar 2010. Edgar RC. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics, 26:2460–2461. Espitalie JGD, Marquis F, 1986. La pyrolyse Rock-Eval et ses applications. Institut français du pétrole

Klöppel H, Kordel W, Stein B (1997) Herbicide transport by surface runoff and herbicide retention in a filter strip rainfall and runoff simulation studies. Chemosphere, 35:129-141.

Kjellerup BV, Naff C, Edwards SJ, Ghosh U, Baker JE, Sowers KR, 2014. Effects of activated carbon on reductive dechlorination of PCBs by organohalide respiring bacteria indigenous to sediments. Water Research, 52 : 1-10. Marchesi JR, Sato T, Weightman AJ, Martin TA, Fry JC, Hiom SJ, Dymock D, Wade WG, 1998. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology, 64:795-9.

Mwanamoki PM, Devarajan N, Thevenon F, N Birane, de Alencastro LF, Grandjean D, Mpiana PT, Prabakar K, Mubedi JI, Kabele CG, Wildi W, Poté J, 2014. Trace metals and persistent organic pollutants in sediments from river-reservoir systems in Democratic Republic of Congo (DRC): Spatial distribution and potential ecotoxicological effects. Chemosphere, 111 : 485-492.

155

Mzoughi N, Hellal F, Dachraoui M, Villeneuve JP, Cattini C, de Mora SJ, El Abed A(2002) Méthodologie de l'extraction des hydrocarbures aromatiques polycycliques. Application à des sédiments de la lagune de Bizerte (Tunisie). Comptes rendus Geoscience, 334: 893-901.

Murphy J, Riley JP, 1962. A modified single solution method for the determination of phosphate in natural waters. Analytica Chimica Acta, 27: 31-36.

Nguyen VK, Lee MH, 2015. Effect of sulfur concentration on microbial removal of arsenic and heavy metals from mine tailings using mixed culture of Acidithiobacillus spp. Journal of Geochemical Exploration, 148: 241-248.

Nguyen VK, Lee MH, Park HJ, Lee JU, 2015. Bioleaching of arsenic and heavy metals from mine tailings by pure and mixed cultures of Acidithiobacillus spp. Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 21: 451-458. Parsons TR, Takahashi M, Hargrave B (1984) Biological Oceanographic Processes, third ed. Pergamon Press, Oxford, p. 330

Readman JW, Liong Wee Kwong L, Mee LD, Bartocci J, Nilve G, Rodriguez-Solano JA, Gonzalez-Farias F (1992) Persistent organophosphorus pesticides in tropical marine environments. Marine Pollution Bulletin, 24: 398-402.

Rubin-Blum M, Shemesh E, Goodman-Tchernov B, Coleman DF, Ben-Avraham Z, Tchernov D, 2014. Cold seep biogenic carbonate crust in the Levantine basin is inhabited by burrowing Phascolosoma aff.turnerae, a sipunculan worm hosting a distinctive microbiota. Deep Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers, 90: 17-26. Schultz P, Urban NR, 2008. Effects of bacterial dynamics on organic matter decomposition and nutrient release from sediments: A modeling study. Ecological Modelling, 210 : 1-14. Stevenson AC, Battarbee RW, 1991. Palaeoecological and documentary records of recent environmental change in Garaet El Ichkeul: A seasonally Saline Lake in NW Tunisia. Biological Conservation, 58:275-295.

156

Thiyagarajan V, Tsoi MMY, Zhang W, Qian PY, 2010. Temporal variation of coastal surface sediment bacterial communities along an environmental pollution gradient. Marine Environmental Research, 70: 56–64.

Trabelsi S, Driss MR, 2005. Polycyclic aromatic hydrocarbons in superficial coastal sediments from Bizerte Lagoon, Tunisia. Marine Pollution Bulletin, 50: 344–348.

Wang H, Liu S, Liu X, Li X, Wen Q, Lin J, 2014. Identification and characterization of an ETHE1-like sulfur dioxygenase in extremely acidophilic Acidithiobacillus spp. Applied Microbiology and Biotechnology, 98: 7511-22. Wen J, Jirka GH, Raggio G, 1994. Linked Sediment/Contaminant Transport Model for Rivers with Application to the Buffalo River, New York. Journal of Great Lakes Research, 20 : 671- 682.

Whiteley AS, Jenkins S, Waite I, Kresoje N, Payne H, Allcock R, O'Donnell A, 2011. Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform. Journal of Microbiological Methods, 91: 80-88. Wood ED, Armstrong FAJ, Richards FA (1967). Determination of nitrate in sea water by cadmium-copper reduction to nitrite. Journal of the Marine Biological Association UK, 47: 23-31

II. Publication 5:

157

Published in: ESPR

Pesticides in Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon Watershed in Tunisia: Use, occurrence, and effects on bacteria and free-living marine nematodes

Fida Ben Salem1,2,3*, Olfa Ben Said1, Patricia Aissa1, Ezzeddine Mahmoudi1, Mathilde Monperrus3, Olivier Grunberger4 & Robert Duran2

(a) Laboratory of Environment Biomonitoring, Faculty of Sciences of Bizerta, 7021, Zarzouna, University of Carthage –Tunisia (b) Equipe Environnement et Microbiologie – MELODY group - UMR CNRS IPREM 5254- IBEAS- Université de Pau et des Pays de l'Adour - France. (c) Laboratoire de Chimie Analytique Bio-Inorganique et Environnement, IPREM UMR 5254 CNRS – Université de Pau et des Pays de l’Adour - France (d) IRD, UMR-LISAH (IRD-INRA-SupAgro), Bat 24, 2 place Viala, F-34060, Montpellier cedex 01, France,

*Corresponding author present address:

Equipe Environnement et Microbiologie

UMR CNRS IPREM 5254- IBEAS

Université de Pau et des Pays de l'Adour - France.

Tel: +216 72 400 121 Fax: + 216 72 590 566

Email: [email protected]

158

Abstract

This study aimed to identify the most commonly used agricultural pesticides around Ichkeul

Lake-Bizerta Lagoon watershed. First survey of pesticides use on agricultural watershed was performed with farmers, Regional Commissioner for Agricultural Development and pesticides dealers. Then, sediment contamination by pesticides and response of benthic communities

(bacteria and free-living marine nematode) were investigated. The analysis of 22 active organochlorine pesticides in sediments was performed according to QuEChERS method, biodiversity of indigenous bacterial community sediment was determined by T-RFLP and free-living marine nematodes were counted. The results of the field survey showed that iodosulfuron, mesosulfuron, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4 D), glyphosate and fenoxaprops were the most used herbicides, tebuconazol and epoxiconazol the most used fungicides and deltamethrin the most used insecticide. Sixteen organochlorine pesticides compounds among the 22 examined were detected in sediments up to 2ppmin Ichkeul Lake, endrin, dieldrin and hexachlorocyclohexane being the most detected molecules. The most pesticide-contaminated site in the lake, presented the higher density of nematode but when considering all sites no clear correlation with OCPs content could be established. The bacterial community structure in the most contaminated site in the lake was characterized by the T-RFs 97, 146, 258, 285 and 335 while the most contaminated site in the lagoon was characterized by the T-RFs54, 263, 315, 403 and 428. Interestingly, T-RFs 38 and 143 were found in the most contaminated sites of both lake and lagoon ecosystems indicating that they were resistant to OCPs and able to cope with environmental fluctuation of salinity. In contrast, the T-RFs 63, 100, 118 and 381 in the lake and the T-RFs 40, 60, 80, 158, 300, 321 and 357 in the lagoon were sensitive to OCPs. This study highlighted that the intensive use of pesticides in agriculture, through transfer toaquaticecosystem, may disturb the benthic ecosystem functioning of the protected area. The free-living marine nematodes and bacterial

159 communities represent useful proxy to follow the ecosystem health and its capacity of resilience.

Keywords: organochlorine pesticides, survey, bacterial community structure, T-RFLP, bacterial diversity, sediment, resistant, sensitive.

160

Abbreviations list

OCPs: organochlorine pesticides

QuEChERS: Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe

T-RFLP: Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism bp: base pair ppm : part per million

DDT: Dichlorodiphenyltrichloroethanes

Koc: carbon partition coefficient organic/water rRNA: ribosomal Ribonucleic acid

CRDA: Regional Commission for Agricultural Development

CTV: territorial extension cells

Chla: chlorophyll a

HCHs: hexachlorocyclohexanes: lindane

HCB: hexachlorobenzene

GC–MS: Gas chromatography–mass spectrometry

DNA: deoxyribonucleic acid

PCR: Polymerase chain reaction

HEX: 5-Hexa-chloro-fluorescein

TET: Tetrachloro-fluorescein

T-RFs: Terminal Restriction Fragment

PAH: Polycyclic aromatic hydrocarbon

161

Introduction

Pesticides have been of great benefit inagriculture by decreasing the adverse effect of plant pathogens on crops.Farmers have always used botanical and inorganic chemicals to protect crops against pests. From the discovery of DDT toxic effect against insects in 1939, organochlorine pesticides have been largely used for pest control through the 1960s (Boland et al. 2004). After the adverse impact of organochlorine pesticides on human and animal health as well as on the environment was reported in 1962 (Boland et al. 2004), the organophosphate pesticides, which are not persistent in the environment, were used (Boland et al. 2004). Since the 1990s, governments and international agencies have introduced guidelines to reduce the use of pesticides (Boland et al.2004). But pesticides are still an environmental issue of concern because of their persistence. Pesticides and their metabolites are toxic, with capacity to bio-accumulate in food chain threatening environment and human health (Fabro and Varca 2012). The intensification of the agricultural production around the world associated with problems of overuse and misuse of pesticides have increased the interest on environmental effect of pesticides. Pesticides have been detected in different environmental matrices, such as surfaces water (De Gerónimo et al. 2014; Palma et al. 2014), sediments (Guo et al. 2014; Li et al. 2014), fish tissue (Yohannes et al. 2014; Zhang et al.

2014) and mussels (Boonyatumanond et al. 2002; Khaled et al. 2004; Carro et al. 2014;

Herceg-Romanić et al. 2014). Particularly, pesticide contamination of aquatic ecosystems has emerged as an important environmental issue in the last few decades. After application on land, pesticides enter aquatic environment by effluent discharge, agricultural runoff, atmospheric deposition, and air/water exchange (Macdonald et al. 2005; Botta et al. 2009).

Thus, pesticides are major concern in freshwater and coastal ecosystems (Kuranchie-Mensah et al. 2012; YurtkuranandSaygı 2013). Donald et al. (1999) estimated that, in a given year,

37,000 to 500,000 wetlands in Saskatchewan (Canada) may be contaminated by herbicides

162 atlevels exceeding the limits. A large variety of pesticide compounds are released in the environment because farmers alternate the choice of pesticide compounds year by year in order to avoid the problem of resistance of fungi, weeds and insects to pesticides (Roush

1989). Little information is currently available on use and presence of pesticides in Southern

Mediterranean countries because of the lack of statistical data related to pesticide uses and the high costs for analytical environmental survey.

Potential transfer of pesticides and the possible presence of the active ingredients can be evaluated from several physical-chemical properties that characterize each active substance such as carbon partition coefficient organic/water (Koc), solubility and half-life (Worrall and

Kolpin 2004). The partition coefficient organic carbon/water gives an indication of the adsorbtion/desorbtionability of compound into organic matter. The strongly adsorbed pesticides are retained at surface. In this case, quantities of lixiviated pesticides will depend on the quantity of eroded and transported sediment (McDowell et al. 1981; Willis et al. 1983).

Compounds with low Koc will be left with the highest concentrations in aqueous phase of runoff (Klöppel et al. 1997; Dabrowski et al. 2002; Wauchope et al. 2002).

Impact of pesticides in aquatic ecosystems has been largely studied (for review see Lew et al.

2009). Microcosm experiments involving molecular biology approaches revealed significant shifts in bacterial community composition after pesticides treatments (Widenfalk et al. 2008).

It was demonstrated that periphyton bacterial communities from the most contaminated site were more resistant to pesticide (Vercraene-Eairmal et al. 2010). Biofilm organization appears to increaseability of some bacterial strains to biodegrade pesticides since the highest pesticides degradation was obtained with biofilm (Tien et al. 2013). Similarly, in situ studies involving pyrosequencing of bacterial 16S rRNA genes analyses revealed notable modifications in bacterial community composition. Abundance of Gammaproteobacteria and

Verrucomicrobia members decreased downstream the pesticide input while particularly,

163 members related to Acidobacteria, Chloroflexi, Deltaproteobacteria and Firmicutes were found in higher relative abundance (Marti and Balcazar 2014). Impact of pesticides has also been demonstrated on free-living marine nematode assemblages. Several studies on the impact of pesticides on a free-living marine nematode community were performed in microcosm experiments showing controversial effects (Boufahja et al. 2011; Soltani et al.

2012). The total nematode abundance, diversity (Shannon-Wiener index H’) and species richness were reduced in all treatments compared to control (Soltani et al. 2012) while the abundance of nematodes in all pesticide concentrations significantly exceeded those in the control (Boufahja et al. 2011). The species of free-living marine nematode: Pselionema sp.,

Prochromadorella neapolitana, Spiriniager lachiand, Daptonema trabeculosum, were found sensitive to permethrin, while the species: Trichotheristus mirabilis, Xyala striata,

Araeolaimus bioculatus, Calomicrolaimus honestus, Oncholaimus campylocercoides and

Theristus pertenuis, were found resistant and proliferated (Boufahja et al. 2011; Soltani et al.

2012).

In the present study we performed for the first time in Tunisia a survey of pesticides used by farmers to identify the pesticides most used in watershed of complex Ichkeul Lake-Bizerta

Lagoon. Then, concentrations of pesticides in sediment from this complex were determined.

Finally, influence of these pesticides on microbial community structure and free-living nematodes was investigated.

164

Materials and methods

Site description and survey of pesticides use

The complex Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon (latitude37°07'–37°12'N, longitude: 9°36'–9°45'E

(lake)/latitude: 37°8'–37°14'N, longitude: 9°46'–9°56'E (lagoon)) is located in South of

Mediterranean Sea in the North of Tunisia. The Tinja River connects the lake to the lagoon and several rivers feed the hydrosystem complex (Fig1). The complex is home to a variety of fishing and aquaculture activities since several centuries. The Bizerta Lagoon is open to the

Mediterranean Sea by an artificial channel. The area of Bizerta Lagoon is approximately128 km2 and it is subjected to contamination from industrial zones including oil refinery, cement and steel plants (Ben Said et al. 2010; Mzoughi et al. 2010; Trabelsi et al. 2012), agricultural areas located on the Bizerta Lagoons’ edge and domestic wastes released by the neighbouring towns; 400 000 inhabitants are recorded in the Bizerta district and 400 industrial units are present around the lagoon (ANPE, 1989). Ichkeul Lake is a protected area by Ramsar

Convention (1980), classified biosphere reserve by UNESCO (1977) and natural World

Heritage Site by UNESCO. It is an important stopover point for hundreds of thousands of migrating birds each year (Carp, 1980). The watershed of Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex is surrounded by vast agricultural areas.

Survey of pesticides use strategy was firstly to collect data from the agency responsible for agriculture in Bizerta region (Regional Commission for Agricultural Development, CRDA) and their representatives in delegations called cells territorial extension (CTV). Then, dealers of pesticides were questioned and finally farmers were interviewed. Representative samples of the general population of farms with about 100 personswereinterviewed; they were distributed in agricultural watershed around Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex (Fig1).

The information collected was: i) type of crop, ii) pesticides used and iii) field superficies. A classification of the active substances was established according to their physical-chemical

165 parameters. Based on the content of active ingredient in the commercial formula, we have followed a logical approach to calculate the total quantities of active ingredients: Percentages of use of the active ingredients were determined by dividing the number of farmers using this active ingredient on the total number of surveyed farmers (*100). After ranking established according to the physical-chemical characteristics of each active ingredient, the amount of each active ingredient was estimated. This amount (Qsubstance) is product of the cultivated area (ha) by the percentage of use of pesticide (%) by the assay of the active ingredient in the pesticide.

Sediment samples collection

Surface sediments samples were collectedin4 coastal sites of IchkeulLake-BizertaLagoon complex. The sampling sites were located at the mouths of three rivers: Site 1 (37°10'31.

57"N / 9°38'17.09"E) in the Ichkeul Lake selected to determine the contribution of rivers in pesticides level in the lake; Sites 3 (37°11’25.02”N / 9°47’16.26”E) and Site 4

(37°11’58.06”N / 9°55’72.01”E) in the Bizerta Lagoon to determine the contribution of rivers in pesticides level in the lagoon; and Site 2 (37°10'27.66"N / 9°42'30.85"E) in Ichkeul Lake close to agricultural area to determine the direct runoff impact in the lake; (Fig1). Sampling was performed in April 2012in triplicate at each site. Sediment was collected with a Van

Veen grab. For bacterial analysis sediments were placed incryotubes, frozen quickly and stored at -80°C until use.The sediments used for chemical analysis were placed in glass bottles and were kept frozen at -20°C. Before analysis samples were freeze dried in a ZirBus

Vaco2 lyophiliser. Sediment for free-living marine nematode counting wasfixed in 4% formalin.

166

Fig 1. Aerial map of the complex and location of sampling sites (red circles)

Physical and chemical parameters

Aminot and Chaussepied (1983). Phosphate levels were determined as described in Murphy and Riley (1962). For chlorophyll a (Chla), water samples were filtered through Whatman

Carbon organic was determined according to Espitalie et al. (1986).

167

Analytical methods

Concentrations of 22 organochlorine pesticides (OCPs), including lindane

(hexachlorocyclohexanes=HCHs), endosulfanes, dieldrin, endrin, aldrin, heptachlores,

dichlorodiphenyltrichloroethanes (DDTs), nonachlores, chlordanes, in sediment from the

different sites were determined. The samples were analyzed according to an adapted

QuEChERS method for the analysis of pesticides in sediment by gas chromatography–mass

spectrometry. Analytical performances of the QuEChERS method are presented in Table 1.

Table 1. Analytical performances of the QuEChERSmethod.R2, linearity; LOD, Limit of

detection; LOQ, Limits of quantification; R%, Recoveries; RSD, reproducibility.na, not

available,

Compounds R2 LOD (ngg-1) LOQ (ngg-1) R (%) RSD (%)

Hexachlorobenzene 0.993 0.01 0.05 81 7

2,4'-DDE 0.988 0.14 0.45 na 18

4,4'-DDE 0.971 0.03 0.11 99 12

4,4'-DDD 0.954 0.27 0.90 85 11

4,4'-DDT 0.954 0.38 1.27 129 3

α chlordane 0.999 0.00 0.01 86 10

β chlordane 0.985 0.00 0.01 137 12 cis-Nonachlor 0.996 0.00 0.01 108 9 trans-Nonachlor 0.999 0.00 0.01 102 12

168

QuEchERS extraction/purification procedure

The QuEChERS method validated by Yang et al. (2010) for the analysis of pesticides in soil was adapted for the analysis of OCPs in sediment samples. Briefly, an aliquot of 5g of sediment was weighed into a polypropylene tube (50 mL capacity).Then, 4 mL ultrapure water was added, the tube was manually shaken and the internal standard (atrazine d5) was introduced. Then, 20 mL of extraction solvent (dichloromethane-acetone (50:50 v:v)) were added and the tube was shaken vigorously by hand for 1 min. Then, a citrate buffer salt mixture (4g MgSO4, 1g NaCl, 0.5g disodium citrate sesquihydrate and 1 g of trisodium citrate dehydrate) was added and the tube was shaken vigorously manually (5min). Finally, the tube was centrifuged for 3 min at 2500 rpm and 10 mL of the supernatant were transferred into another polypropylene tube (15 mL capacity) already containing 900 mg of MgSO4 and 150 mg PSA. The tube was shaken vigorously by hand for 30 s and centrifuged for 3 min at 2500 rpm. The extracts were then dried under a gentle argon stream using a Turbovap LV

Concentration Evaporator system. The dried residue was re-dissolved with 1 mL acetonitrile and kept at −20°C until analysis.

GC-MS Analysis

The analyses were performed by using a gas chromatograph (Agilent 7890A) coupled to a mass spectrometer (Agilent 5975C) with an electron impact ionization source (EI). The GC–

MS system was equipped with an Agilent DB5-MS UI column. The carrier gas was helium used at 1 mL min−1 flow rate. The ion source temperature and the quadrupole temperatures were kept at 230°C and 150°C, respectively. A sample volume of 1 μL of the extracts was injected in pulsed splitless mode at an inlet temperature of 280°C. The column temperature was programmed as follows: the initial oven temperature was set at 80°C for 1 min, increased to 160°C at 10°C/min (hold 5 min), then ramped at 3°C/min to 300°C (hold 2min). The MS

169 interface temperature was maintained at 300°C. The quantification was carried out in the selected ion monitoring mode (SIM) selecting two characteristics fragments ions for each compound. Two replicates were performed for each sample with two injections. An internal standard correction was used for the quantification of the analytes.

Density of free-living marine nematodes

Sediments were first sieved (1mm and 0.04 mm) and nematodes, the most abundant taxon among the meiofauna, were separated following a resuspension-decantation methodology

(Wieser 1960). Then they were stained with Rose-Bengal (0.2 g L-1). The counting was performed after 24 hours of colouring, pouring the sample in a tank Dollfus Plaid background with 200 boxes of 5 mm side and separated by raised limits to prevent movement of animals during counting. The determination of nematode densities in each sample was performed under a binocular microscope WILD-M3B type (x10). Nematode numbers was determined by the lateral displacement of the vessel Dollfus on the platen of the microscope.

Bacterial community analysis

Total genomic DNA was extracted from 250 mg of frozen sediment using the Ultra Clean soil

DNA isolation Kit (MoBio Laboratories, CA) following the manufacturer’s recommendations with minor modifications as previously described (Duran et al. 2008).

The 16S rRNA genes were amplified by PCR with the bacterial universal fluorescent-labeled primers 63F HEX (5-Hexa-chloro-fluorescein;5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’) and

1387R TET (Tetrachloro-fluorescein; 5’ GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’) (Marchesi et al.

1998). The PCR amplification mixture contained: 12.5 µL AmpliTaq Gold 360 Master Mix

(Applied Biosystems), 0.25 µL of each primer (20 µM), 0.5 µL of the DNA extracts diluted

10× were added to the PCR reactions. A final volume of 25 μL was adjusted with distilled water. Thermal cycling was carried out, in a PTC200 thermocycler (MJ Research), under the

170 following conditions: 95°C for 10 min, 35 cycles of 95°C for 45 s, 58°C for 45s, 72°C for 1 min, with a final extension step at 72°C for 10 min. PCR products were then purified using a

DNA purification kit (MoBio Laboratories, CA). Purified PCR products were digested with four units of enzyme AluI (Takara, Japan).

One µl of the digested DNA from each sample was mixed with 8.75 μL of deionized formamide and 0.25 μL of Rox 500 (Applied Biosystems). After an injection step of 10 s, electrophoresis was carried out for up to 30 min applying a voltage of 15 KV. T-RFLP profiles were analyzed with Gene Scan Software version 3.1 (Applied Biosystem). Data sets were constructed by using peak height thresholds of at least 30 fluorescence units. Then, raw data were normalized by dividing each peak height by the total signal intensity of the corresponding profile (Stauffert et al. 2014). T-RFLP profiles of sampling replicate (three independent replicates per Site) were averaged in order to obtain a profile per Site as previously described (Paissé et al. 2011). T-RFLP profiles were compared with Heat map and

Venn diagram. The Heat map was performed with CIMminer at the Genomics and

Bioinformatics Group of the Center for Cancer Research (CCR) web site

(http://discover.nci.nih.gov/cimminer/). The Venn diagram was draw with Venny (Oliveros

2007).

Statistical analysis

One-way analysis of variance (ANOVA) was used to test for overall differences of abundance of free-living nematodes between sites and the Tukey HSD multiple comparisons test was used in pairwise comparisons. Significant difference was assumed when p<0.05.

171

Results and discussion

Pesticide use

The survey of pesticides used by farmers showed that organochlorine pesticides (OCPs) were used for long time even after prohibition by law. The organophosphorus pesticides are used since the 80s, the survey relates the current use of these compounds. The most commonly pesticides used in the agricultural watershed of the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex are herbicides and fungicides (Table 2). These results were in agreement with the statistics determined by Schreinemachers and Tipraqsa (2012) for a large cross-section of countries using FAO data for the period 1990–2009, which demonstrated that intensification of agriculture increases pesticide use, with a decrease of insecticides and an increase of herbicides and fungicides. The repartition of active ingredients corresponds to 9461 kg from herbicides, 13445 kg from fungicides and 341kg from insecticides for 113.390 ha of crops

(cereal and fodder) per application. So farmers use 0.2 kg of active ingredient per hectare, corresponding to the range of concentrations used in low-income countries, lower amount in comparison to the range between 3-4 kg of active compounds per hectare used in France and

United States (Schreinemachers and Tipraqsa 2012). Additionally, the field survey showed that iodosulfuron, mesosulfuron, 2,4 D, glyphosate and fenoxaprops were largely used as herbicides. Among the fungicides tebuconazol and epoxiconazol were dominant. Finally, deltamethrin was the most insecticide widely used around the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex (Table 2).

172

Table 2. Estimated quantities of the main active compounds used in the agricultural areas of the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex by farmers’ survey

Active ingredient Quantity of active Amount of active ingredient used ingredient sold

(Kg) (Kg)

Herbicides

Iodosulfuron 1007 1205

Fenoxaprop 2650 1536

2,4D 2309 2400

Mesosulfuron 609 1013

Glyphosate 2886 2160

Fongicides

Tebuconazol 4630 3750

Epoxiconazol 8815 7350

Insecticides

Deltamethrin 341 300

Farmers are now using organophosphorus compounds, the second generation of pesticides.

These compounds are used worldwide for controlling weeds in oat (Uludag et al. 2007), wheat (Vazan et al. 2011), soybean crops (López González et al. 2013; Reddy and Duke

2015) and as curative compounds to control fava bean rust for example (Emeran et al. 2011).

The survey of farmers also revealed that the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex received

OCPs for long time. The input of OCPs was from farmers that used these compounds even after prohibition by law and from obsolete DDT stocked (50 tons, AFE, 2006) in totally neglected state for forty years until 2011, the year when DDT stock was moved.

Organophosphorus pesticides have short half-lives, they can be degraded quickly (Readman et al. 1992) while OCPs have longer half-lives and they are very persistent in the environment

173

(Cruz et al. 2003; Kalyoncu et al. 2009), this persistence is due to their lipophilic and hydrophobic properties (Kalyoncu et al. 2009). The half-lifes of DDT and HCH in surface soil were estimated as 6.7 and 4.9 years, respectively (Brevik et al.1996; Toan et al. 2009). The impact of OCPs in aquatic organisms is more important than that of organophosphorus pesticides and considered really alarming (Alava et al. 2011; Tao et al. 2013) because OCPs contents were higher (Serrano et al. 1999; Hernandez et al. 2000; Fatta et al. 2007). We choose to determine the OCP contents, the first generation of pesticides, because of their persistence in the environment and their alarming impact on aquatic organisms estimating thus the old contamination in the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex.

Pesticides concentrations in sediment

Because the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex received OCPs for many years and organophosphorus pesticides are rapidly degraded, only their degradation products can be found in aquatic ecosystems but not the active substance, we focused the study on OCPs. The

OCPs content was determined in four representative sites of the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex. The sites were selected based on a preliminary analysis of twenty sites around the complex (personal communication). Site 2 in the lake and Site 3 in the lagoon were the sites most contaminated by pesticides, sites surrounded by many farmers. Two other sites, Site 1 in the lake and Site 4 in the lagoon, were chosen as “control” because they presented lower pesticide concentration. The chemical analyses confirmed that pesticides were detectable in sediment at the four sites (Table 3). The old contamination by OCPs (first generation pesticides) was proved by detecting 16 compounds of OCPs among the 22 searched in the sediments of the complex at levels that reached 2 ppm (Table 3). First of all, it is important to notice that DDT was below the detection limit in all sites but the detection of its metabolites even at low levels in the sediment (Table 3) of the four sites suggested that DDT was still used around the complex. 174

Table 3. Concentrations (ngg-1dry wt sediment) of OCPs in sediment from the four sites studied in Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon. SD are indicated. LOD: limit of detection.

Sites Site 1 Site 2 Site 3 Site 4

α HCH 2.7±0.2 1.8±0.02 2.0±0.2 3.6±0.9 γ HCH 0.3±0.1 0.3±0.05 0.2±0.01 0.3±0.1 β HCH 84.2±10.3 235±10.5 182.2±15.7 84.8±17.4 δ HCH 34.2±5.6 45.8±8.1 37.7±5.2 5.7±2.1 HCB 0.2±0.04 0.1±0.1 < LOD < LOD α Endosulfan 2.1±0.2 107.3±0.2 22.6±0.7 7.4±2.4 Dieldrin 5.0±0.5 744±36 140±12 36±4 β Endosulfan 2.3±0.1 < LOD 3.5±1.2 < LOD Heptachlor 2.7±0.5 1.1±0.01 0.3±0.1 3.0±0.9 Heptachlor Epoxide Isomer B 11.8±1.9 12.8±2.2 13.3±1.7 8.7±5.1 Endrin < LOD 862±59 163±13 40±4 Endrin aldéhyde 4.5±0.5 3.0±0.1 4.8±0.5 2.4±0.1 Aldrin 0.7±0.2 1.1±0.03 0.9±0.7 0.2±0.1 2,4’-DDE < LOD 0.2±0.2 < LOD < LOD 4,4'-DDE 1.3±0.1 1.5±0.2 1.2±0.4 1.1±0.4 2,4’-DDD 0.8±0.2 3±0.1 1.1±0.7 0.4±0.08 4,4'-DDD 0.6±0.1 1.5±0.7 0.9±0.1 < LOD 4,4'-DDT < LOD < LOD < LOD < LOD α chlordane < LOD 0.5±0.4 < LOD < LOD β chlordane 0.1±0.07 0.4±0.3 < LOD < LOD cis-Nonachlor < LOD < LOD < LOD < LOD trans-Nonachlor < LOD

Focusing on the most abundant OCPs detected, hexachlorocyclohexane, dieldrin and endrin, the results showed that Site 2 at Lake and Site 3 at Lagoon were the most contaminated with

OCPs reaching respectively 2021 and 574 ng g-1 dry weight of total OCPs (Fig 2, Table 3).

175

2500,0

2000,0

)

1 -

1500,0 Site1 Site2

1000,0 Site3

Site4 Concentrations(ng.g

500,0

0,0 Beta BHC Endrin Dieldrin ∑ Pesticides

Fig 2. Concentrations of organochlorine pesticides at the different sites (colors). The error bar corresponds to the standard deviation (n=3).

The Site 2 showed higher concentrations for lindane (235 ng g-1), endrin (862 ng g-1) and dieldrin (744 ng g-1) while the concentrations at Site 3 were 182 ng g-1 of lindane, 163 ng g-1 of endrin and 140 ng g-1 of dieldrin. Thus, the Ichkeul Lake, the protected area and UNESCO site, was more contaminated with OCPs than Bizerta Lagoon (Fig 2).This result was logical since agricultural watershed of Ichkeul Lake is broader than that of Bizerta Lagoon. Since the

Site 2, located next to an agricultural area in the Ichkeul Lake, was more contaminated

(2021ng g-1of total OCPs) than the other site located at mouth of the river (574 ng g-1 of total

OCPs), it is likely that pesticides enter in the aquatic ecosystem by direct input through lixiviation rather than through the river flow. This observation was in accordance with previous report indicating that pesticides may enter water bodies through both diffuse and point sources (Vymazal and Březinová 2015), but diffuse sources are probably the most important. Among diffuse pollution, surface runoff and erosion, leaching and drainage represent the major pathways. The concentrations of OCPs in Site 2 and Site 3 were

176 comparable to those detected in the tissues of fish (Mugilcephalus and Dicentrarchuslabrax) from Bizerta Lagoon ranging between 1.25 and 227 ng.g-1dry wt (Ben Ameuret al. 2013). The bioconcentration and bioamplification of these OCPs in fishes and mussels present a potential risk for consumers. The concentration range of OCPs detected in the complex was much higher than those detected in other regions such as in Singapore coastal marine sediments

(Wurl and Obbard 2005) and in the coast of Quanzhou Bay in southeast China (Yang et al.

2013). The same range of OCPs’ level was detected in harbor sediments from Sea Lots, Port- of-Spain, Trinidad and Tobago (Mohammed et al. 2011). The OCPs concentrations in

Baiyangdian wetland (China) were in the range 3.60–11.12 ng g−1 (Guo et al. 2014) much lower than that determined in our study. No correlation could be established between OCPs contents and physical-chemical parameters. A positive correlation between the concentrations of total pesticides and total organic carbon content was found in the sediments of the Danshui

River (China; Hung et al. 2007). In our study no correlation between total organic carbon and

OCPs contents could be established. Indeed,the highest organic carbon content in the lagoon being detected at Site 4 (lower OCPs content) and the lowest organic carbon at Site 3 (higher

OCPs content) while organic carbon was similar in both sites of the lake though OCPs contents were contrasted (Table 3 and 4). This observation is in accordance with a previous study in coastal sediments at Sousse (Tunisia; Pavoni et al. 2000). It is thus unclear why the

Site 2 retains the highest OCPs content, further sediments characterization, as granulometry for example, together with the analysis of a larger number of sites are required in order to determine the rules for OCPs accumulation in sediment. A recent study showed that pesticides accumulate in sediments through terrigenous fine-grained sediment discharge (Gwiazda et al.

2015) that corresponds to the situation of the Site 2 in which OCPs arrive by lixiviation.Such behaviour is due to the capacity of OCPs with high Koc to be absorbed on soil particles, as it

177 is the case for endrin (Koc: 10,000), dieldrin (Koc: 12,000) and hexachlorocyclohexane (Koc:

50,000).

Table 4. Physical-chemical parameters at the sampling sites of the complex Ichkeul Lake-

Bizerta Lagoon

Sites Site 1 Site 2 Site 3 Site 4

Temperature (°C) 23.4 22.9 23.1 23.7

pH 8.32 8.27 8.34 8.42

Salinity (PSU) 2.4 2.6 27 29

Conductivity (mscm-1) 4.7 5.0 42.6 45.3

Dissolved oxygen (mg L-1) 9.7 10.7 8.6 8.7

Nitrite (µM) 0.03 0.15 0.57 0.74

Nitrate (µM) 1.28 1.97 8.21 6.91

Phosphore (µM) 0.17 0.27 1.46 1.72

Ammonium (µM) 6.87 3.94 8.37 11.54

Chla (µgL-1) 1.50 3.98 0.49 0.91

Suspended material (mg) 0.04 0.06 0.02 0.03

Organic carbon (mgg-1) 3.52 3.27 2.09 5.17

Nematode abundances

The average densities of free-living marine nematode, at different sites of the Ichkeul Lake were generally low, 25 individuals/10 cm2 in Site 1 and 133 individuals/10 cm2 in Site 2, in comparison to that recorded at Bizerta Lagoon with 571 individuals/10 cm2 in Site 3 and 832 individuals/10 cm2 in Site 4 (Fig3). This result was consistent with previous reports showing that the abundance of free-living marine nematodes in the Bizerta Lagoon (between 373-7087 individuals/10 cm-2, Aissa 1991; between 150-1000 individuals/10 cm-2, Essid 2008) exceeded that observed in the Ichkeul Lake (between 128-740 individuals/10 cm-2; Beyrem 178

1999). This may be due to the nature of the clay sediment at the Ichkeul Lake and/or to the important variation of salinity observed at the Ichkeul Lake between seasons and/or the contamination level. In the Ichkeul Lake, the Site 2, the most contaminated by pesticides, presented higher abundance of free-living marine nematodes than Site 1. This can be explained by the growth of some nematodes species resistant to pesticides as demonstrated in previous reports showing that the density of free-living marine nematodes was higher in microcosms contaminated by permethrin than the uncontaminated controls (Boufahja et al.

2011). In contrast, in the Bizerta Lagoon the abundance of free-living marine nematodes was higher at the less contaminated Site 4 than at the contaminated Site 3. It is likely that the level of pesticide content in the Bizerta Lagoon was under the lethal doses and thus the sensitive nematode species were not removed. These results were in accordance with a previous study showing that the abundance of free-living marine nematodes decreased in contaminated microcosms by hydrocarbon after elimination of sensitive species (Mahmoudi et al. 2005). It is important to notice that the toxic compounds may have indirect effects on macrofaunal communities (Fleeger et al. 2003) through the microbial activity as demonstrated recently

(Ben Said et al. 2015). Also, the presence of contaminant may change the behaviour of macrofauna modifying the predation/grazing rate that, in turn, alter species abundances and community composition (Fleeger et al. 2003).

179

1000 900

800

) 2 700 600 500 400

300

(individuals/10 (individuals/10 cm Nematodeabundance 200 100 0 Site 1 Site 2 Site 3 Site 4

Fig 3. Average densities of nematodes (individuals/10 cm2) in the different sites from the complex Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon. The error bar corresponds to the standard deviation.

Bacterial communities

The T-RFLP profiles from the different sites contained 98 T-RFs, with an average of 61±4 T-

RFs in all sites (Fig4). The T-RFs repartition between the different sites, depicted by the Venn diagram (Fig5), revealed that most T-RFs (28) were shared between all sites. Such observation suggested an ecological continuum between both ecosystems that are closely linked via the Tinja River (Fig1). The related bacterial members to these T-RFs may play an important role in ecosystem functioning probably ensuring most basic functions. They also have the capacity to tolerate different environmental conditions, particularly the important salinity fluctuation between seasons observed in the Ichkeul Lake.

180

181

Fig 4. Comparison of bacterial communities from the studied sites by heat map with

clustering analysis. The circles indicate the specific T-RFs for Site 1 (blue), Site 2 (yellow),

Site 3 (green) and Site 4 (red).

The Venn diagram also revealed that each ecosystem was characterized by specific T-RFs.

The Ichkeul Lake was characterized by the T-RFs 73, 89, 170, 174 and183 whereas the T-RFs

120, 180, 188, 221, 235, 236 and 247 were detected exclusively in the Bizerta Lagoon (Fig4 and 5). These T-RFs explained the clear separation of the bacterial communities of the different ecosystems observed in the clustering analysis (Fig 4), which could be explicated by the differences in salinity. Such influence of salinity on bacterial community is in accordance with a previous report showing that salinity is a main driver for bacterial communities organization (Xi et al. 2014). Similarly, a previous observation in the Bizerta Lagoon showed that the lowest bacterial diversity was detected in sites with highest salinity (Ben Said et al.

2010).

182

Fig 5. Comparison of bacterial communities from the different sites of the Ichkeul Lake-

Bizerta Lagoon complex. Venn diagram shows the number of shared T-RFs between sites.

The specific T-RFs for each site are indicated.

Additionally, the Venn diagram revealed that each site had specific T-RFs indicating that bacterial communities were structured according to the environmental conditions as previously reported (Ikenaga et al. 2010; Paissé et al. 2010). Regarding the sites with the highest OCPs content, the Site 2 was characterized by four specific T-RFs (97, 146, 258, 285 and 335) and the Site 3 by five specific T-RFs (54, 263, 315, 403 and 428). These T-RFs were linked with high levels of endrin, dieldrin and lindane suggesting that they are resistant to

OCPs. It is likely that the related bacterial members to these T-RFs might play a role in OCPs degradation/transformation determining thus the fate of OCPs in the environment. Previous studies showed that the presence of pesticides caused changes in bacterial community structure (Sura et al. 2012), decreasing bacterial diversity and demonstrating pesticide removal capacities (Lopez et al. 2003; Tien et al. 2013). River biofilms have been particularly studied, they have been found to be able to metabolize the herbicides atrazine and diclofop methyl (Lawrence et al. 2001), the organophosphorous pesticide diazinon (Tien et al. 2011) and the carbamate pesticides methomyl, carbaryl and carbofuran (Tien et al. 2013). Such studies allowed the identification of resistant bacteria with capacity to degrade pesticides.

Several strains have been isolated for their capacity to remove pesticides as for example bacterial strains affiliated to Pseudomonas pseudoalcaligenes, Micrococcus luteus, Bacillus sp. and Exiguobacterium aurantiacum (Lopez et al. 2005).Gram-positive bacteria have been found in heavily pesticide-polluted sediments (Rajendran et al. 1994; Stainer et al. 1977;

Widenflak et al. 2008). Recently, a metagenomic study of pesticide-contaminated marine ecosystems allowed the detection of nearly complete biodegradation pathways of DDT and atrazine, and the partial degradation pathway of lindane (Fang et al. 2014). The genes

183 involved in pesticide degradation, such as the hdt (DDT degradation), hdg (lindane degradation), and atzB (atrazine degradation) genes, were the most abundant in sites with highest pesticide content while generalist genes, such as carA (laccase), lip (lipase) and mnp

(peroxidase) genes, were most abundant in site contaminated with other organic compounds

(Fang et al. 2014). Thus, our T-RFLP results suggested that the presence of OCPs selected bacterial populations having the capacity to cope with the presence of such toxic compounds.

It is important to notice that Site 2 and Site 3 share two T-RFs (38 and 143) that were not detected in the other sites (Fig4 and 5). It is likely that members related to these T-RFs may have the capacity to cope both the environmental fluctuations and the presence of OCPs, which could represent an ecological advantage. Bacterial strains harbouring such capacities may also have a biotechnological potential. It will be of interest to isolate, characterize and determine their metabolic potential.

Regarding the sites with the lowest pesticide contents, T-RFLP patterns (Fig4 and 5) showed that the Site 1 was characterized by four specific T-RFs (63, 100, 118 and 381) and the Site 4 by seven specific T-RFs (40, 60, 80, 158, 300, 321 and 357). It is likely that these T-RFs were sensitive to OCPs with no capacity to degrade these pesticides. This observation is in accordance with a previous study reporting that T-RFLP analyses identified sensitive T-RFs corresponding to bacterial strains unable to resist to the presence of pesticide (Widenfalk et al.

2008). Such sensitive species, because they cannot develop in adverse conditions, are indicative of an ecological alteration that can serve as “early warming” as previously suggested for soil (Donkova and Kaloyanova 2008).

Conclusion

The comparison of different sites in the Ichkeul Lake-Bizerta Lagoon complex allowed the description of different benthic communities (bacterial and free-living nematodes) according

184 to the content of OCPs. First of all, we could not determine a correlation between the density of the free-living nematodes and the levels of OCPs. In contrast, the T-RFLP bacterial community analysis highlighted three groups of T-RFs: i) T-RFs detected in all sites corresponding to “generalist” bacterial populations able to develop in diverse conditions and to perform general biogeochemical functions, ii) T-RFs detected only in an ecosystem (Lake or Lagoon) irrespective of the presence of OCPs, which are probably controlled by the salinity, and iii) T-RFs specific for a site corresponding to “specialist” bacterial populations, which may be useful as ecosystem health markers and to estimate the degradation capacities.

The T-RFs from the later group, particularly those inhabiting the sites with high OCPs content

(Site 2 and Site 3) correspond probably to bacterial members resistant to and capable to degrade OCPs, particularly endrin, dieldrin, β HCH (lindane). They represent a metabolic potential for the implementation of bioremediation processes in marine ecosystems. In contrast, T-RFs only detected in the sites with low OCPs content (Site 1 and Site 4) are sensitive to OCPs, not capable to degrade these pesticides. However, further studies are still required, particularly in a multi-contamination context, to determine the impact of organophosphorus pesticide and others pollutants such as PAHs, metals and organo-metals on the “specialist” bacteria. The combination of both culture-dependent and culture-independent approaches will be required to characterize their ecological role and their metabolic potential.

Acknowledgements

The authors would like to thank Mme Nabiha M’barek (National Agency of Environment

Protection Tunisia) and Mr Taher Kaabi (Commissariat Regional Commission for

Agricultural Development ofBizerta) for their logistic contribution. We acknowledge the

Regional Platform for Environmental Microbiology PREMICE supported by the Aquitaine

Regional Government Council (France) and the urban community of Pau-Pyrénées (France).

185

References

AFE (2006) Les pesticides en Tunisie. Newsletter Alliance Femme et Environnement, p4.

Aissa P (1991) Ecologie des nématodes libres de la lagune de Bizerte. Dynamique et biocénotique Thèse doctorat d'état, Univ. de Tunis II, Faculté des Sciences de Tunis: 370p

Alava J, Ross PS, Ikonomou MG, Cruz M, Jimenez-Uzcátegui G, Dubetz C, Salazar S, Costa

DP, Villegas-Amtmann S, Howorth P, Gobas FAPC (2011) DDT in endangeredGalapagosSea lions (Zalophuswollebaeki). Mar Pollut Bull 62:660-671

Aminot A, Chausspied M(1983) Manuel des analyses chimiques en milieu marin. Centre national pour l’exploitation des océans, Brest. ISBN: 2.902721.10.2.

Baretta-BeakkerJG,Duursma EK, Kuipers BR (1992) Encyclopodia of marine Science.

Springer.

Ben Ameur W, Trabelsi S, El Megdiche Y, Ben Hassine S, Barhoumi B, Hammami B,

Eljarrat E, Barceló D, Driss MR (2013) Concentration of polychlorinated biphenyls and organochlorine pesticides in mullet (Mugilcephalus) and sea bass (Dicentrarchuslabrax) from

Bizerte Lagoon (Northern Tunisia). Chemosphere 90: 2372-2380

Ben Said O, Louati H, Soltani A, Cravo-LaureauC,Got P, Pringault O, Aissa P, Duran R

(2015) Changes of benthicbacteria and méiofauneassemblagesduring bio-treatments of anthracene-contaminatedsedimentsfromBizerta Lagoon (Tunisia). Environ Sci Poll Res (in press; DOI 10.1007/s11356-015-4105-7)

186

Beyrem H (1999) Ecologie des nématodes libres de deux milieux anthropiquement perturbés : la baie de Bizerte et le lac Ichkeul. Thèsedoct, FacScBizerte: 297 p

Boland J, koomen I, de Jeude JVL, Oudejans J (2004). Les pesticides : Composition, utilisation et risques, Pays Bas, ISBN : 90-77073-01-9, p7-10

Boonyatumanond R, Jaksakul A, Puncharoen P, Tabucanon MS (2002) Monitoring of organochlorine pesticides residues in green mussels (Pernaviridis) from the coastal area of

Thailand.EnvironPollut 119:245-252

Boufahja F, Sellami B, Dellali M, Aïssa P, Mahmoudi E, Beyrem H (2011)A microcosm experiment on the effects of permethrin on a free-living nematode assemblage. Nematology

13:901-909

Botta F, Lavison G, Couturier G, Alliot F, Moreau-Guigon E, Fauchon N, Guery B, Chevreuil

M, Blanchoud H (2009) Transfer of glyphosate and its degradate AMPA to surface waters through urban sewerage systems. Chemosphere 77:133-139

Carro N, Cobas J, García I, Ignacio M, Mouteira A (2014) Distribution and trend of organochlorine pesticides in galicia coast using mussels as bioindicator organisms. Possible relationship to biological parameters.Chemosphere 102:37-47

Carp E (1980) Directory of wetlands of international importance in the western palaearctic.

IUCN/UNEP/acVWF, Gland.

Cruz S, Lino C, Silveira MI (2003) Evaluation of organochlorine pesticide residues in human serum from an urban and two rural populations in Portugal. Sci Total Environ 317:23-35

De Gerónimo E, Aparicio VC, Bárbaro S, Portocarrero R, Jaime S, Costa JL (2014) Presence of pesticides in surface water from four sub-basins in Argentina.Chemosphere 107:423-431

187

Donald DB, Syrgiannis J, Hunter F, Weiss G (1999) Agricultural pesticides threaten the ecological integrity of northern prairie wetlands. Sci Total Environ 231: 173-181

Donkova R, Kaloyanova N (2008) The impact of soil pollutants on soil microbial activity. In soil chemical pollution, risk assessment, remediation and security. NATO Science for Peace and Security Series.pp 73-93

Emeran AA, Sillero JC, Fernández-Aparicio M, Rubiales D (2011) Chemical control of faba bean rust (Uromycesviciae-fabae). CropProt 30:907-912

EspitalieJGD, Marquis F(1986) La pyrolyse Rock-Eval et ses applications. Institut français du pétrole

Essid N (2008) Caractérisation de la pollution organique et minérale des sédiments de la lagune de Bizerte et impact écologique sur les peuplements de nématodes libres : Etude à grande échelle et au niveau d’un parc mytilicole. Thèse doct Fac Sc Bizerte: 303 p

Fabro L, Varca LM (2012) Pesticide usage by farmers in Pagsanjan-Lumban catchment of

Laguna de Bay, Philippines. Agric Water Manag 106:27-34

Fang H, Cai L, Yang Y, Ju F, Li X, Yu Y, Zhang T (2014) Metagenomic analysis reveals potential biodegradation pathways of persistent pesticides in freshwater and marine sediments. Sci Total Environ 470–471:983–992

Fatta D, Canna-Michaelidou S, Michael C, Demetriou Georgiou E, Christodoulidou M,

Achilleos A, Vasquez M (2007) Organochlorine and organophosphoric insecticides, herbicides and heavy metals residue in industrial wastewaters in Cyprus. J Hazard Mater

145:169-179

188

Fleeger JW, Carman KR, Nisbet RM (2003) Indirect effects of contaminants in aquatic ecosystems. Sci Total Environ 317: 207-233

Guo W, Zhanga H, Huo S (2014) Organochlorine pesticides in aquatic hydrophyte tissues and surrounding sediments in Baiyangdian wetland, China. Ecol Eng 67:150-155

Gwiazda R, Paull CK, Ussler W, Alexander CR (2015) Evidence of modern fine-grained sediment accumulation in the Monterey Fan from measurements of the pesticide DDT and its metabolites. Marine Geology 363: 125-133

Herceg-Romanic S, Kljakovic-Gašpic Z, Klincic D, Ujevic I (2014) Distribution of persistent organic pollutants (POPs) in cultured mussels from the Croatian coast of the Adriatic

Sea.Chemosphere 114:69-75

Hernández F, Serrano R, Roig-Navarro AF, Martı nez-Bravo Y, López FJ (2000) Persistent

Organochlorines and Organophosphorus Compounds and Heavy Elements in Common Whale

(Balaenopteraphysalus) from the Western Mediterranean Sea. Mar Pollut Bull 40:426-433

Hung CC, Gong GC, Chen HY, Hsieh HL, Santschi PH, Wade TL, Sericano JL (2007)

Relationships between pesticides and organic carbon fractions in sediments of the Danshui

River estuary and adjacent coastal areas of Taiwan. Environ Pollut148: 546-554

Ikenaga M, Guevara R, Dean AL, Pisani C, Boyer JN (2010) Changes in Community

Structure of SedimentBacteria Along the Florida Coastal Everglades Marsh-Mangrove-

Seagrass Salinity Gradient. MicrobEcol 59: 284-295

Kalyoncu L, Ağca I, Aktümsek A, 2009. Some organochlorine pesticide residues in fish species in Konya, Turkey. Chemosphere 74:885-889

189

Khaled A, El Nemr A, Said TO, El-Sikaily A, Abd-Alla AMA (2004) Polychlorinated biphenyls and chlorinated pesticides in mussels from the Egyptian Red Sea coast.

Chemosphere 54:1407-1412

Klöppel H, Kordel W, Stein B (1997) Herbicide transport by surface runoff and herbicide retention in a filter strip rainfall and runoff simulation studies. Chemosphere 35:129-141

Kuranchie-Mensah H, Atiemo SM, Naa-Dedei Palm LM, Blankson-Arthur S, Osei Tutu A,

Fosu P, Law RJ (2014) An overview of time trends in organic contaminant concentrations in marine mammals: Going up or down. Mar Pollut Bull 82:7-10

Lew S, Lew M, Szarek J, Mieszczynski T (2009) Effect of pesticides on soil and aquatic environmental microorganisms - a short review. Fresen Environ Bull 18: 1390-1395

Li Y, Niu J, Shen Z, Zhang C, Wang Z, He T (2014) Spatial and seasonal distribution of organochlorine pesticides in the sediments of the Yangtze Estuary. Chemosphere 114:233-240

Loganathan BG, Kannan K (1994) Global organochlorine contamination trends: an overview.

Ambio 23: 187–191

Lopez L, Pozo C, Rodelas B, Calvo C, Juarez B, Martinez-Toledo Mv, Gonzalez-Lopez J

(2005) Identification of bacteria isolated from an oligotrophiclake with pesticide removal capacities. Ecotoxicol 14: 299-312

Macdonald RW, Harner T, Fyfe J (2005) Recent climate change in the Arctic and its impact on contaminant pathways and interpretation of temporal trend data. Sci Total Environ 342:5-

190

Mahmoudi E, Essid N, Beyrem H, Hedfi A, Boufahja F, Vitiello P, Aissa P (2005) Effects of hydrocarbon contamination on a free-living marine nematode community: Results from

Microcosm Experiments. Mar Pollut Bull 50:1197-1204

Marti E, Balcázar JL (2014) Use of pyrosequencing to explore the benthic bacterial community structure in a river impacted by wastewater treatment plant discharges. Res

Microbiol 165:468-471

Mohammed A, Peterman P, Echols K, Feltz K, Tegerdine G, Manoo A, Maraj D, Agard J,

Orazio C (2011) Polychlorinated biphenyls (PCBs) and organochlorine pesticides (OCPs) in harbor sediments from Sea Lots, Port-of-Spain, Trinidad and Tobago. Marine Poll Bull

62:1324-1332

Murphy J, Riley JP (1962) A modified single solution method for the determination of phosphate in natural waters.Anal Chim Acta 27: 31-36

Mzoughi N, Hellal F, Dachraoui M, Villeneuve JP, Cattini C, de Mora SJ, El Abed A(2002)

Méthodologie de l'extraction des hydrocarbures aromatiques polycycliques. Application à des sédiments de la lagune de Bizerte (Tunisie). C R Geosci334: 893-901

Oliveros J (2007) VENNY. An interactive tool for comparing lists with Venn Diagrams. http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html

Paisse S, Goni-Urriza M, Coulon F, Duran R (2010) How a Bacterial Community Originating from Contaminated Coastal Sediment Responds to an Oil Input. Microb Ecol 60: 394-405

Paisse S, Duran R, Coulon F, Goñi-Urriza M (2011) Are alkane hydroxylase genes (alkB) relevant to assess petroleum bioremediation processes in chronically polluted coastal sediments? Appl Microbiol Biotechnol 92: 835-844

191

Palma P, Köck-Schulmeyer M, Alvarenga P, Ledo L, Barbosa IR, López de Alda M, Barceló

D (2014) Risk assessment of pesticides detected in surface water of the Alqueva reservoir

(Guadiana basin, southern of Portugal). Sci Total Environ 488-489:208-219

Parsons TR, Takahashi M, Hargrave B (1984) Biological Oceanographic Processes, third ed.

Pergamon Press, Oxford, p. 330

Pavoni B, Berto D, Rigoni M, Salizzato M (2000) Micropollutants and organic carbon concentrations in surface and deep sediments in the Tunisian coast near the city of Sousse.

Mar Environ Res 49: 177-196

Qiu X, Zhu T, Yao B, Hu J, Hu S (2005) Contribution of dicofol to the current DDT pollution in China. Environ Sci Technol 39: 4385-4390

Rajendran N, Matsuda O, Urushigawa Y, Simidu U (1994) Characterization of microbial community structure in the surface sediment of Osaka Bay, Japan, by phospholipid fatty-acid analysis. Appl Environ Microbiol 60: 248-257

Readman JW, Liong Wee Kwong L, Mee LD, Bartocci J, Nilve G, Rodriguez-Solano JA,

Gonzalez-Farias F (1992) Persistent organophosphorus pesticides in tropical marine environments.Mar Pollut Bull 24: 398-402

Reddy KN, Duke SO (2015) Soybean Mineral Composition and Glyphosate Use.In: Preedy V

(ed) Processing and Impact on Active Components in Food. Academic Press, UK, pp 369-376

Roush RT (1989) Designing Resistance Management Programs: How Can You Choose?

PesticSci 26:423-441

Schreinemachers P, Tipraqsa P (2012) Agricultural pesticides and land use intensification in high, middle and low income countries. Food Policy 37:616-626

192

Serrano R, Lopez FJ, Hernandez F (1999) Multiresidue determination of persistent organochlorine and organophosphorus compounds in whale tissues using automated liquid chromatographic clean up and gas chromatographic–mass spectrometric detection. J

Chromatogr A 855: 633-643

Soltani A, Louati H, Hanachi A, Ben Salem F, Essid N, Aissa P, Mahmoudi E, Beyrem H

(2012) Impacts of permethrin contamination on nematode density and diversity: A microcosm study on benthic méiofaune from a Mediterranean coastal lagoon. Biologia 67: 377-383

Stainer RY, Adelberg EA, Ingraham JL (1977) General Microbiology. The Mac Millan Press

Ltd., London, UK.

Sura S, Waiser M, Tumber V, Farenhorst A (2012) Effects of herbicide mixture on microbial communities in prairie wetland ecosystems: A whole wetland approach. Sci Total Environ

435-436: 34-43

Stauffert M, Gassie C, Duran R, Cravo-Laureau C (2014) Response of archaeal communities to oil spill in bioturbated mudflat sediments. Microb Ecol 67: 108-119.

Tien CJ, Lin MC, Chiu WH, Chen CS (2013) Biodegradation of carbamate pesticides by natural river biofilms in different seasons and their effects on biofilm community structure.

Environ Pollut 179:95-104

Uludag A, Nemli Y, Tal A, Rubin B (2007)Fenoxaprop resistance in sterile wild oat

(Avenasterilis) in wheat fields in Turkey. Crop Protect 26:930-935

Vazan S, Oveisi M, Baziar S (2011) Efficiency of mesosulfuron-methyl and clodinafop- propargyl dose for the control of Loliumperenne in wheat. Crop Protect 30:592-597

193

Vercraene-Eairmal M, Lauga B, Saint Laurent S, Mazzella N, Boutry S, Simon M, Karama S,

Delmas F, Duran R (2010) Diuron biotransformation and its effects on biofilm bacterial community structure. Chemosphere 81:837-843

Vymazal J, Březinová T (2015) The use of constructed wetlands for removal of pesticides from agricultural runoff and drainage: A review. Environ Int 75:11-20

Wauchope RD, Estes TL, Allen R, Baker JL, Hornsby AG, Jones RL, Richards RP, Gustafson

DI (2002) Predicted impact of transgenic, herbicide-tolerant corn on drinking water quality in vulnerable watersheds of the mid-western USA. Pest Manage Sci 58: 146-160

Widenfalk A, Bertilsson S, Sundh I, Goedkoop W (2008). Effects of pesticides on community composition and activity of sediment microbes – responses at various levels of microbial community organization.Environ Pollut 152: 576-584

Willis GH, McDowell LL, Murphree CE, Southwick LM, and Smith SJr (1983) Pesticide concentrations and yields in runoff from silty soils in the lower Mississippi valley. J Agric

Food Chem 31: 1171-1177

Wood ED, Armstrong FAJ, Richards FA (1967). Determination of nitrate in sea water by cadmium-copper reduction to nitrite. J Mar Biol Assoc U K 47:23-31

Worrall F, Kolpin DW (2004) Aquifer vulnerability to pesticide pollution—combining soil, land-use and aquifer properties with molecular descriptors. J Hydrol 293: 191-204

Wurl O, Obbard JP (2005) Organochlorine pesticides, polychlorinated biphenyls and polybrominateddiphenyl ethers in Singapores coastal marine sediments. Chemosphere

58:925-933

194

Xi XF, Wang L, Hu JJ, Tang YS, Hu Y, Fu XH, Sun Y, Tsang YF, Zhang YN, Chen JH

(2014) Salinity influence on soil microbial respiration rate of wetland in the Yangtze River estuary through changing microbial community. J Environ Sci 26: 2562-2570

Yang D, Qi S, Zhang J, Wu C, Xing X (2013) Organochlorine pesticides in soil, water and sediment along the Jinjiang River mainstream to Quanzhou Bay, southeast China.Ecotox

Environ Safe 89:59-65

Yohannes B, Ikenaka Y, Saengtienchai A, Watanabe KP, Nakayama SMM, Ishizuka M

(2014) Concentrations and human health risk assessment of organochlorine pesticides in edible fish species from a Rift Valley lake—Lake Ziway, Ethiopia.Ecotox Environ Safe 106:

95-101

Yurtkuran Z, Saygı Y (2013) Assessment of Pesticide Residues in Karabogaz Lake from

Kızılırmak Delta, Turkey. Bull Environ ContamToxicol 91:165-170

Zhang J, Liu F, Chen R, Feng T, Dong S, Shen H (2012) Levels of polychlorinated biphenyls and organochlorine pesticides in edible shellfish from Xiamen (China) and estimation ofhuman dietary intake. Food ChemToxicol 50: 4285-4291

195

CHAPITRE V : CONCLUSIONS GENERALES & PERSPECTIVES

Nos travaux visaient à caractériser l’écotoxicologie du complexe lac Ichkeul – lagune de

Bizerte. Les polluants organiques présents dans le complexe ont été révélés par une enquête de terrain et des analyses chimiques. Puis l’impact de la présence de ces contaminants dans le sédiment du complexe sur les communautés microbiennes et la densité des nématodes libres marins a été déterminé. Les teneurs en HAP dans le sédiment dépassent les limites tolérées au niveau de la station 12 de la lagune de Bizerte, station soumise au trafic maritime, placée sur le trajet des navires allant vers le port de Menzel Bourguiba. Cette station est plus contaminée que la station 9 située dans le canal recevant la pollution provenant du trafic maritime ainsi que du port commercial de Bizerte. Concernant les pesticides, le recensement effectué auprès des agriculteurs, des revendeurs de produits phytosanitaires et le commissariat régional de développement agricole de Bizerte a permis d’identifier les molécules les plus utilisées au niveau des zones agricoles du bassin versant du complexe lac Ichkeul – lagune de Bizerte: l’iodosulfurone (1007 kg), le mésosulfurone (609 kg), le 2,4D (2309 kg), le glyphosate (2886 kg) et le fénoxaprop (2650 kg) comme matières actives des herbicides ; le tébuconazole (4630 kg) et l’époxiconazole (8815 kg) comme fongicide et la deltaméthrine (341 kg) matières active des insecticides. Ainsi cette enquête nous a permis d’identifier la contamination ancienne provoquée par les pesticides organochlorés, qui ont de très longues durées de vie. Ils ont été utilisés même après leur interdiction et stockés dans des sites de pesticides obsolètes délaissés. La station au niveau de Menzel Bourguiba sur le bord de la lagune de Bizerte était un site de stockage qui a été déménagé en 2012. Les analyses chimiques des pesticides organochlorés ont prouvé la contamination ancienne par ces pesticides qui existe encore dans le sédiment, surtout dans le lac Ichkeul. La comparaison des teneurs en pesticides entre les

196 stations situées à l’embouchure des oueds du lac Ichkeul et la station 8, soumise uniquement à la contamination par les eaux de ruissellement provenant des zones agricoles sur le bord du lac, a montré que la station 8 était la plus contaminée en pesticides organochlorés de tout le complexe, avec des teneurs qui dépassent les normes. Ceci peut être dû aussi au mouvement d’érosion du sédiment suite à l’apport sédimentaire par les oueds vers le lac ce qui amène la contamination ancienne de plus en plus loin des embouchures des oueds.

La structure des communautés bactériennes du sédiment des 20 sites prospectés du complexelac Ichkeul–lagune de Bizerte a été déterminée par T-RFLP. Les analyses par des

CCA, visant à associer la structure des communautés bactériennes avec les concentrations en polluants, ontmontré qu’indépendamment des saisons, les communautés bactériennes des stations de la lagune de Bizerte sont impactées par les HAP alors que celles du lac Ichkeul sont influencées par les pesticides. En s’intéressant à chaque écosystème seul et dépendamment des saisons, les CCA ont montré que les communautés bactériennes du lac ont

été plus influencées par les HAP en septembre (fin de la période sèche) qu’en avril (fin de la période pluvieuse). Ceci est en rapport avec l’hydrologie de l’écosystème puisque pendant la saison sèche l’eau lagunaire entre vers le lac. Concernant la lagune de Bizerte, la pollution par les HAP et les pesticides est plus prononcée en avril qu’en septembre. Donc, du point de vue

écotoxicologique les résultats permettent de conclure que la lagune influence le lac par les

HAP pendant la saison sèche alors que le lac influence la lagune par les pesticides pendant la saison pluvieuse (Fig 1.).

197

Fig 1. L’inter-relation lac-lagune de point de vue écotoxicologique

L’impact de la présence des HAP et des POC dans le sédiment a été étudié aussi sur la densité des nématodes libres marins. La station 8, la plus contaminée en pesticides, représente la densité la plus élevée en nématodes libres marins, ce qui est le contraire de la réponse des nématodes libres marins par rapport aux HAP.

Les analyses chimiques ont montré que la station 17 est la moins contaminée de tout le complexe, la station 12 de la lagune est la plus contaminée en HAP dans tout le complexe, la station 8 du lac Ichkeul est la plus contaminée en pesticides de tout le complexe et enfin la station 5 du lac Ichkeul possède une contamination multiple par les HAP et les pesticides. Le pyroséquençage a été effectué pour ces 4 sites intéressants afin d’analyser de manière

198 exhaustive leurs communautés bactériennes. Certaines OTUs ont été détectées dans les 4 sites, ces OTUs peuvent être responsables du fonctionnement de base de tout écosystème aquatique, des écosystèmes semi-fermés, ou de cet écosystème précisément. Les fonctions de base assurées sont la dégradation de la matière organique, le déroulement des cycles de carbone, azote… Les OTUs détectées exclusivement dans la lagune sont résistantes à la salinité élevée. D’autres OTUs ont été présentes uniquement dans le lac Ichkeul, ceux sont des OTUs résistantes à la variation de la salinité, elles ont été détectées en fin de la période pluvieuse à des salinités faibles, est-ce qu’on retrouve les mêmes aux deux saisons? Des analyses sont donc nécessaires pour des échantillons collectés fin de la période sèche pour pouvoir comparer.

Dans nos travaux de recherches futurs, nous allons nous intéresser à :

 Déterminer les souches bactériennes sensibles et résistantesà tout un ensemble de

contaminants et multicontaminants.Les analyses effectuées autour de la lagune et du

lac ont montré des sites contaminés par des multicontaminants, une mixture de

plusieurs types de contaminants. Ainsi les analyses de la structure des communautés

permet de déterminer des espèces sensibles et résistantes à tout un ensemble de

contaminants et multicontaminants.

 Etudier in vitro l’impact de la mixture des HAP, mixture des POC et le mélange HAP-

POC sur les communautés benthiques. Est-ce que la communauté bactérienne après

contamination sera la même trouvée dans les sites in situ contaminés par le même type

de contamination? L’étude in vitro sera effectuée pour tester les effets de la mixture

des HAP, mixture des POC et le mélange HAP-POC, les plus trouvés dans le sédiment

du complexe avec des profils qui ressemblent à ceux rencontrés dans le lac et la lagune

c'est-à-dire avec des concentrations des HAP plus élevées dans la lagune et les teneurs

des pesticides plus élevés dans le lac, sur la densité et la diversité des communautés

199

benthiques (bactériennes et des nématodes libres marins), avec la détermination des

doses des contaminants ajoutés au début de l’expérience et à la fin de l’expérience à

fin de suivre la dégradation de ces contaminants. L’efficacité de l’étude in vitro a été

prouvée dans les travaux de Louati et al., 2013 qui ont déterminé l’impact des HAP

sur les communautés benthiques.

 L’analyse chimique des pesticides organophosphorés dans le sédiment du complexe, et

la détermination de leur impact sur le benthos. Dans ce présent travail on a déterminé

les teneurs en pesticides organochlorés (contamination ancienne). L’analyse chimique

des pesticides organophosphorés, qui sont utilisés actuellement dans le bassin agricole

du complexe ainsi que leurs principales produits de dégradation, du fait de leurs faible

demie vie, dans le sédiment du complexe et dans des matrices biologiques telles que

les bivalves et l’étude d’impact des polluants détectés en forte concentration sur les

communautés benthiques (bactériennes, de nématodes libres marins et des bivalves)

donnera une vision complète sur la contamination par les pesticides dans le complexe.

Il faut viser les bivalves aussi pour voir la différence des teneurs entres les matrices et

déduire s’il yaura un effet de bioaugmentation et bioconcentration.

 Suivi du transfert des pesticides dans le bassin versant et dans le complexe. Le

transfert des pesticides depuis la pulvérisation des champs jusqu’à l’arrivée aux

écosystèmes aquatiques, la colonne d’eau puis le sédiment doit être étudié à fin de

déterminer l’extension de la contamination par les pesticides dans les différents

compartiments, les pertes, et les teneurs arrivant aux écosystèmes aquatiques. Ce ci

peut être réalisé par l’implantation des capteurs de pesticides dans les compartiments à

étudiés et les analyses chimiques derrières avec des périodes du temps bien

déterminés.

200

 Isolement des bactéries qui dégradent les pesticides et tester leurs capacités en

bioremédiation. Ceci peut être réalisé par isolement des bactéries capable de dégrader

les pesticides au niveau des sédiments des sites du complexe les plus contaminés en

pesticides (site 8) et les utilisées dans des tests de bioremédiation par bioaugmentation.

De même pour les HAP dans le site 12.

201

Résumé

L’objectif principal de ce travail était de réaliser une étude écotoxicologique du complexe lac Ichkeul-lagune de Bizerte. Un recensement des pesticides agricoles les plus utilisés dans le bassin versant agricole a été effectué afin de déterminer les pesticides les plus problématiques. Le recensement effectué auprès des agriculteurs, des revendeurs de produits phytosanitaires et le commissariat régional de développement agricole de Bizerte a permis d’identifier les molécules les plus utilisées au niveau des zones agricoles du bassin versant du complexe lac Ichkeul – lagune de Bizerte: l’iodosulfurone, le mésosulfurone, le 2,4D, le glyphosate et le fénoxaprop comme matières actives des herbicides ; le tébuconazole et l’époxiconazole comme fongicide et la deltaméthrine matières active des insecticides.

Ensuite, les concentrations en pesticides, HAP et PCB ont été déterminées. Les résultats ont montré une contamination au niveau de certains sites du complexe. Les stations situées dans la lagune de Bizerte ont des teneurs en HAP dépassant les limites tolérées. Les concentrations en pesticides dépassent les normes au niveau de quelques sites du lac Ichkeul.

Enfin, l’impact de ces polluants sur les communautés microbiennes et la densité de nématodes a été déterminé. La CCA combinant les résultats des analyses chimiques et les données T-RFLP des communautés bactériennes met en évidence que les communautés bactériennes du lac sont influencées parles pesticides alors que celles de la lagune sont influencées par les HAP. La répartition des T-RFs montre la présence de T-RFs spécifiques dans les sites contaminés : le T-RF 114 bp caractérise le site le plus contaminé en pesticide, les microorganismes associés à ce T-RF correspondent probablement à des microorganismes résistants aux pesticides et capables de les dégrader. La composition des communautés bactériennes a été déterminée par pyroséquençage 454 sur les sites les plus représentatifs : le moins contaminé du complexe, le plus contaminé en HAP, le plus contaminé en pesticides et un site présentant une contamination multiple HAP-Pesticides. L’impact de la présence des pesticides sur la densité des nématodes libres marins a été étudié.

L'analyse taxinomique des données de pyroséquençage regroupe les séquences dans 44 embranchements différents. En général, Proteobacteria étaient l’embranchement le plus dominant avec une prédominance de Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria et deltaproteobacteria dans les sédiments. Les communautés bactériennes des quatre sites ont 211 OTU commun. Le lac Ichkeul a été caractérisé par 219 OTU spécifique et la lagune de Bizerte 235 OTU. Le Site 2, le plus contaminé en pesticides présente l’abondance la plus élevée en nématodes libres marins.

202

Abstract

The main objective of this work was to conduct an ecotoxicological study of the complex Ichkeul Lake-Bizerta lagoon. A survey of the most used agricultural pesticides in the watershed of the complex was conducted to determine the most problematic compounds. The survey of pesticides use with farmers, dealers of pesticides and the Regional Commissioner for Agricultural Development Bizerte has helped to identify the most used pesticides in agricultural areas of the watershed of the complex Ichkeul Lake-Bizerta lagoon: iodosulfuron, the mesosulfurone, 2,4D, glyphosate and fenoxaprop as herbicides active materials, tebuconazol epoxiconazol as fungicide active materials and deltamethrin as insecticides.

Then, the concentrations of pesticides, PAHs and PCBs were determined in the sediment of the complex. The results showed a contamination of some complex sites. Stations located in the lagoon of Bizerte have a level of PAH in excess of permissible limits. Pesticide concentrations exceed the standards at some sites from the Ichkeul Lake.

Finally, the impact of these pollutants on microbial communities and nematode density was determined. CCA combines the results of chemical analyzes and T-RFLP data of bacterial communities shows that the bacterial communities of the lake are influenced by pesticides while those of the lagoon are influenced by PAHs. The distribution of T-RFs showed the presence of specific T- RFs in contaminated sites: the T-RF 114 bp characterizes the most contaminated site in pesticides, microorganisms associated with the T-RF are probably microorganisms resistant to pesticides and capable of degrading this pollutant. The composition of bacterial communities was determined by 454 pyrosequencing of the most representative sites: the least contaminated of the complex, the most contaminated by PAH, the most contaminated by pesticides and a site with multiple PAH-pesticides contamination. The impact of the presence of pesticides on the density of free living marine nematodes was studied.

The taxonomic analysis of the pyrosequencing data grouped the sequences into 44 different phyla. In general, Proteobacteria were the most dominant phyla with predominance of Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria and Deltaproteobacteria within the sediments. Besides Proteobacteria, there are a number of sequences affiliated to the following major phyla detected in all four sites: Chloroflexi, Bacteroidetes, Nitrospirae, Planctomycetes, Actinobacteria, Gemmatimonadetes, Firmicutes, Cyanobacteria, Spirochaetes, Acidobacteria. The bacterial communities of the four sites shared 211 common OTUs. The Lake Ichkeul was characterized by 219 specific OTUs and the Bizerta lagoon by 235 OTUs. Site 2, the most contaminated by pesticides has the highest abundance of free living marine nematodes.

203