Myotis Vivesi UNA ESPECIE DE MURCIÉLAGO ENDÉMICO DEL GOLFO DE CALIFORNIA, MÉXICO

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

ASPECTOS ECOLÓGICOS Y FILOGEOGRAFÍA DE Myotis vivesi UNA ESPECIE DE MURCIÉLAGO ENDÉMICO DEL GOLFO DE CALIFORNIA, MÉXICO.

T E S I S que como uno de los requisitos para obtener el grado de DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS

PRESENTA:

JOSÉ JUAN FLORES-MARTÍNEZ

MÉXICO, D. F., JULIO DE 2009.

El presente trabajo se realizo en el laboratorio de Variación Biológica y Evolución de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional y en el laboratorio de Ecofisiología de Vertebrados de Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de México; bajo la dirección del Dr. Carlos Fabián Vargas Mendoza y él Dr. Gerardo Herrera Montalvo, respectivamente.

Beca de Doctorado por Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (203671).

Instituciones que apoyaron de alguna forma la realización de esta tesis: CONACYT. Instituto de Biología, UNAM. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, POLI. Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales. Secretaría de Marina Armada de México. Comisión Nacional de Áreas Naturales Protegidas. Programa para la Conservación de los Murciélagos de México. Prescott College Kino Bay. UC Mexus-CONACYT. Idea Wild. Resumen. i Abstract. ii Introducción 1 Antecedentes 4 Objetivos 6 Capítulo I. Conservación del murciélago pescador mexicano (Myotis vivesi), una especie amenazada. Estimaciones de la variabilidad genética indican altos niveles de flujo génico entre las Islas del Golfo de California Introducción. 7 Materiales y Métodos. 9 Resultados. 13 Discusión. 18 Conclusiones. 19

Capítulo II. Densidad poblacional y características microclimáticas de los refugios de Myotis vivesi en Isla Partida, Golfo de Baja California Introducción. 21 Materiales y Métodos. 23 Resultados. 27 Discusión. 37 Conclusiones. 41

Capítulo III. Estrategia de ecolocalización del murciélago pescador Myotis vivesi en Isla Partida, Golfo de California Introducción. 42 Materiales y Métodos. 45 Resultados. 47 Discusión. 51 Conclusiones. 54 Discusión Genera 55 Bibliografía. 60 Anexo 74

2 Índice de Tablas. Tabla 1.1. Variación Mitocondrial (282 bp fragmentos de la región control DNAmt, 134 individuos) y variación de microsatélites (seis loci), 257 para Myotis vivesi a lo largo de su distribución en el Golfo de California. 14 Tabla 1.2. Matriz pareada de distancias genéticas (arriba diagonal) y distancia geográfica (bajo diagonal, Km) ente las islas del golfo de California, donde las muestras fueron colectadas a partir de los murciélagos pescadores mexicanos (Myotis vivesi) en 2003. 15 Tabla 2.1. Número de cuadrantes y áreas muestreadas en cuatro zonas de la zona sur de Isla Partida Norte, Golfo de California. 25 Tabla 2.2. Densidad de individuos adultos (media ± desviación estándar) de Myotis vivesi en cuatro zonas de refugio en Isla Partida Norte, Baja California. Entre paréntesis el número de individuos adultos estimados en cada zona. Para cada mes se brinda el valor de la prueba de comparación múltiple de media de Kruskal-Wallis (KW), el valor crítico de p es de 0.01 mediante la corrección de Bonferroni. 28 Tabla 2.3. Variación del cociente sexual (m:h) en refugios de indivuos adultos Myotis vivesi en refugios cuatro zonas de Isla Partida Norte, Baja California. El valor crítico de p es de 0.01, estimado mediante la corrección de Bonferroni. 29 Tabla 2.4. Resultados del análisis de varianza de dos vías (mes y zona) para los valores de temperatura y humedad relativa dentro de los refugios (todos los zonas combinados) y el exterior. 31 Tabla 2.5. Resultados del análisis de varianza de dos vías (mes y zona) para los valores de temperatura y humedad relativa dentro de los refugios para los cuatro zonas estudiados en isla Partida. 35

2 Índice de Figuras. Figura 1.1-Islas donde se tomaron muestras de M. vivesi. Estructura genética. 1.- Cayo. 2.-Tijera. 3.- Colorado. 4.- Santa Inés. 5.- San Rafael. 6.- Salsipuedes. 7.- Partida Norte. 8.- Estanque. 9.- Piojo. 10.- Muela. 11.- Encantado. 9 Figura 1.2. Relación entre la distancia genética y la distancia geográfica (km) entre 11 poblaciones de los murciélagos pescadores (Myotis vivesi) muestreados en el Golfo de California en el 2003. Valores r son los coeficientes de correlación de los rangos de Spearman; los valores de P fueron determinados la prueba de Mantel (1967). (a) relación para

seis loci de microsatélites nucleares (257) usando la medida DLR (Paetkau et al., 1997). Una relación similar se encontró usando los

valores de FST linealizados (FST/1FST; r=0.26; P=0.07). (b) relación para haplotipos mitocondriales (282 pb) de un fragmento de la región

control mitocondrial usando FST linealizados. 17 Figura 2.1.- Ubicación geográfica de Isla Partida Norte, indicando las zonas donde se colocaron los data logger. Zonas: 1.- Campamento, 2.- Estero, 3.- Cardonosa, 4.- Monte, y 5.- Externo. 24 Figura 2.2. Densidad de individuos adultos de Myotis vivesi por unidad de área (m2) en cuatro zonas de Isla Partida Norte, Baja California. Los datos corresponden a censos realizados en tres meses del año 2006 (media + 1 DE). 28 Figura 2.3. Variacion mensual (media + 1 DE) de la densidad de individuos adultos de Myotis vivesi por unidad de área (m2) en Isla Partida Norte, Baja California. Los datos representan los valores obtenidos en todos los refugios combinados. 29 Figura 2.4. A. Variación mensual (media ± ES) de los valores de temperatura (0C) dentro de refugios de Myotis vivesi en Isla Partida, comparado con la temperatura ambiental. B. Valor de temperatura promedio dentro de los refugios y en el ambiente exterior. La barra de error representa la desviación estándar y la caja el error estándar de la media. 32 Figura 2.5. A. Variación mensual (media ± ES) de los valores de humedad relativa (%) dentro de refugios de Myotis vivesi en Isla Partida. B. Valor de humedad promedio dentro de los refugios y en el ambiente

2 exterior. La barra de error representa la desviación estándar y la caja el error estándar de la media. 33 Figura 2.6. Correlación entre la temperatura y humedad relativa dentro de los refugios (A) y en el exterior (B). 34 Figura 2.7. Valores promedio anual de temperatura (A) y humedad relativa (B) en refugios de Myotis vivesi ubicados en cuatro zonas del sur de Isla Partida. La barra de error representa el intervalo de confianza del 95%. 36 Figura 2.8. Variación mensual de la temperatura (A) y la humedad (B) dentro de refugios de Myotis vivesi en cuatro zonas distribuidos en la zona sur de Isla Partida. 37 Figura 3.1. Isla Partida Norte, Golfo de California México. 45

Figura 3.2.- Sonograma y orientación de los sonidos de Myotis vivesi a la hora de estar cazando, Isla Partida Norte. Se muestran tres fases de ecolocalización: fase de búsqueda, fase de acercamiento y fase terminal. 47 Figura 3.3. Comportamiento de ecolocalización de Myotis vivesi cazando sobre el mar, fase de búsqueda. 48 Figura 3.4. Comportamiento de ecolocalización de Myotis vivesi cazando sobre el mar, fase de acercamiento. 49 Figura 3.5. Comportamiento de ecolocalización de Myotis vivesi cazando sobre el mar, fase de terminal. 49 Figura 3.6. Conducta de Myotis vivesi a la hora de tomar su alimento en la jaula de vuelo. 51

2 RESUMEN Las islas del Mar de Cortez presentan un gran número de organismos nativos que son endémicos. Un ejemplo es el murciélago pescador Myotis vivesi (Vespertilionidae, Menegaux, 1901) que se distingue del resto de las especies de murciélagos porque se alimenta principalmente de crustáceos y peces marino; así como también se refugia en oquedades y debajo de las rocas. En este trabajo tratamos de contestar algunas preguntas sobre las estrategias que M. vivesi tiene para vivir y permaneces en las Islas del Golfo de California, México. La primera pregunta se relacionó con la introducción de fauna exótica que hay en las islas con la capacidad de dispersión de M. vivesi. Para responder esta pregunta se analizaron 11 poblaciones y un total de 257 individuos. Se usaron seis microsatélites de DNA los cuales dieron un total de 40 haplotipos; adicionalmente se utilizó un fragmento en 282bp del Citocromo b mitocondrial. Los resultados mostraron que con los microsatélites se detecta una débil estructura poblacional, y un modelo de aislamiento por la distancia, mientras que en los resultados de ADNmt por el contrario, se encontró una marcada estructura poblacional, aunque no hubo aislamiento por distancia, esto sugiere una dispersión diferencial entre sexos. Nuestros resultados indican que existen subpoblaciones moderadamente separadas que mantiene de medio a altos niveles de flujo genético que puede ser diferente dependiendo del sexo del murciélago. La segunda pregunta se enfocó en la selección de los refugios dentro de Isla Partida y la densidad de individuos. El estimado de la población adulta varió entre 8,291 individuos en abril a 16,117 en julio, presentando un incremento de hembras en los meses de verano y una disminución en los meses de invierno. Los valores encontrados son similares a otros reportes lo cual indica que la población se ha mantenido estable durante varios años; adicionalmente se observó que en el verano la isla es una colonia de maternidad. Dentro de los refugios de los murciélagos existieron variaciones significativas de la temperatura y la humedad en todo el año. Se observó una relación significativa de la densidad de M. vivesi dentro de los refugios con la temperatura y no así con la humedad relativa. Esto nos podría indicar que la temperatura es uno de los factores importantes en la elección de un refugio. Con relación a la tercera pregunta, se describe la manera en que M. vivesi localiza y toma su alimento en el mar. Se asumía una conducta a típica dado que la alimentación de fuentes marinas es rara en las especies de murciélagos. Sin embargo, de los resultados se encontró que durante la ecolocalización M. vivesi emite una serie de sonidos cortos en banda ancha (25-35 kHz), característico también en otros murciélagos. Las frecuencias de ecolocalización están constituidas por dos tipos principales de elementos estructurales: Frecuencia Modular (FM) o banda amplia y de Frecuencia Constante (CF) o banda estrecha. Tiene tres fases o etapas en donde se noto que la duración de estos sonidos variaba en duración pero no en la frecuencia. Preliminarmente, se considera que el sistema de ecolocalización es el tipo más común en este género.

i ABSTRACT

The Islands of Mar de Cortez have many species which are also endemic. One example is the Fish-eating bat Myotis vivesi (Vespertilionidae; Menegaux, 1901) distinguishable from the other bat species because it feed mainly on crustaceans and marine fishes. It also roosts under round, Cobble-size rocks. In this study, we tried to answer some questions on the different strategies that M. vivesi has to make for a living in the islands of Gulf of California, Mexico. The first question was about the effect of introduced fauna on the dispersion ability of M. vivesi. To answer this question, 257 individuals (out of 11 populations) were analyzed. We used 6 different microsatellites, which yield 40 haplotypes. Additionally, a fragment of mtDNA cytochrome b (282 bp long) was used. Results shown that microsatellites markers detected weak population structure and an isolation by distance model, whereas mtDNA data shown strong population structure with no isolation by distance. These results suggest different patterns of dispersion of both males and females. Ours results also indicate the occurrence of separated subpopulations with high levels of gene flow, which in turn may be dependent on sex. The second question was focused on the selection of refugia (roost) within an island and population density. Estimation of adult populations has range of 8,291-16,117 individuals between April and July, with a number of females increasing in summer and decreasing in winter. These values are similar to those found in other studies, indicating a stable population over the years. Additionally, it was also observed that in summer, the island is a maternal colony. Within the roosts of bats, significant variation of temperature and humidity over a year was also observed. There was a significant relationship between population density of M. vivesi and temperature, but not against relative humidity. This may be indicative of temperature as one of the most important factors taken into account for roost selection. The third question was focused on the description of the way in which M. vivesi forage in the open sea. It was assumed as an atypical behavior, because foraging from marine food is uncommon in bat species. However, our results found that during echolocation M. vivesi emits a series of short sounds in broad band (25-35 kHz), which is characteristic in other bat species. The echolocation frequencies are constituted by two main structural elements: Frequency Modulation (FM) or broad band and Constant Frequency (CF) or narrow band. Three phases were observed in which the sound varied in time but not in frequency. Our preliminary results showed that the echolocation system is as common as in the other species of the genus.

ii INTRODUCCIÓN GENERAL Aproximadamente existen en el Planeta 4624 especies de mamíferos, de los cuales 927 son murciélagos (Orden: Chiroptera) siendo el segundo orden más diverso, solo superado por los roedores (Nowak, 1994; Neuweiler, 2000). Los murciélagos, tienen una amplia distribución y se encuentran a través de latitudes tropicales, subtropicales y templadas, excepto en la Antártida. Los murciélagos consumen diversos alimentos que van desde insectos, peces, sangre y pequeños vertebrados hasta néctar y frutos (Nowak, 1994; Neuweiler, 2000). Estos mamíferos, usan una alta variedad de refugios de origen natural, así como artificial; entre los que se encuentran cuevas, edificios, árboles huecos, hojas de los árboles, y minas abandonadas por mencionar algunos. La mayoría de los murciélagos son de hábitos nocturnos, aunque algunas especies del viejo mundo pueden llegar a tener actividad diurna (Nowak, 1994; Neuweiler, 2000). Al parecer el éxito del orden de los murciélagos (ampliamente distribuidos en el mundo) se debe en gran medida a la capacidad de adaptarse al medio donde viven, como puede ser: su elevada movilidad, su gran diversidad de refugios y al tipo de alimentación; a diferencia de otros mamíferos que no vuelan (Emlen y Oring, 1977; McCraken, 1987; Kalko et al., 1998; Kerth et al. 2001; Schnitzler y Kalko, 2001; Lausen y Barclay 2003; Ma et al., 2003; Laurenço y Palmeirim, 2004; Brock y Ractcliffe, 2004). En el contexto anterior se considero que para una especie particularmente exitosa, como lo es M. vivesi el conocer algunos aspectos de estas tres estrategias, era fundamentales para la conservación de la especie. En este sentido, cuando una población se fragmenta se producen varios fenómenos negativos, uno de ellos es tener varías poblaciones subdivididas. Esta fragmentación tiene asociada la pérdida de individuos y por lo tanto los niveles de diversidad genética; cuando una población desaparece del Planeta, toda la información genética de las mismas se pierde; cuando se pierden algunos individuos, la perdida va mas allá, y es, la perdida de la diversidad genética (Primack et al., 2001; Frankham et al., 2002).

1 Para conocer lo que esta pasando en una población, podemos hacer uso de la Genética de Poblaciones ya que con este tipo de análisis genético se puede monitorear la dispersión de individuos, estimar tamaños poblacionales, determinar el sistema reproductivo de una especie, entre otras cosas (Primack et al., 2001). Los trabajos de análisis y monitoreo de poblaciones está aumentado con las nuevas técnicas de análisis de ADN; estas herramientas y la genética de población pueden complementar estudios ecológicos y de comportamiento, a fin de prevenir tendencias negativas en poblaciones amenazadas (Steinberg y Jordan 1998; Primack et al., 2001). Se sabe que para ciertas especies de plantas y animales habitar en islas disminuye su diversidad genética (Frankham, 1997). Sin embargo, en el caso de los murciélagos vivir en estos sitios no representa una barrera significativa para el intercambio genético como se ha observado en Mystacina tuberculata (Lloyd, 2003), Eonycteris spelaea (Hisheh et al., 1998), Nyctalus noctula (Petit y Mayer, 2000), Rhinolophus affinis (Maharadatunkamsi et al., 2000) y Myotis myotis (Petri et al., 1997; Castella et al., 2000). Aunque a veces para las poblaciones pequeñas pero con alta fragilidad (el poder volar distancias relativamente grandes) les permite compensar potencialmente la pérdida de diversidad genética con flujos génicos altos (Castella et al., 2000). No obstante, factores como el comportamiento y la disponibilidad de recursos (alimento, refugios, depredadores etc.) pueden limitar los movimientos entre las poblaciones insulares de murciélagos (Wilmer et al., 1999; Rossiter et al., 2000; Burland et al., 2001; Castella et al., 2001; Kerth et al., 2003).

Por otro lado con respecto a la capacidad para adaptarse al medio, se sabe que la selección de los refugios es importante para los murciélagos, ya que, les proporciona las condiciones microclimáticas para la supervivencia y la reproducción (Laurenço y Palmeirim, 2004). Además, les provee protección contra depredadores y les ayuda a determinar la estructura social (Kerth et al., 2001; Lausen y Barclay, 2003; Laurenço y Palmeirim, 2004). Por ejemplo; en Pipistrellus pygmaeus existe relación entre la temperatura del refugio y el

2 estado reproductivo del murciélago; ya que las hembras preñadas seleccionan aquellos refugios que tienen temperaturas altas, esto debido a las ventajas que les proporciona en el ahorro de energía y la aceleración del período de gestación (Laurenço y Palmeirim, 2004). En el caso del murciélago Myotis evotis, se observo que elige el tipo de refugio dependiendo del estado reproductivo; ya sea preñado o lactando, este murciélago tiene preferencias diferentes, las hembras preñadas seleccionan refugios horizontales, en estos lugares la temperatura es alta en el día mientras que disminuye en la noche; a diferencia de los refugios verticales que son ocupados por hembras lactando, estos refugios mantiene temperaturas calidas durante la noche y el día (Chruszcz y Barclay, 2002). Esta selección se realiza como estrategia termoregulador para evitar la perdida de calor y un gasto energético, en el mantenimiento de la temperatura.

Finalmente, en cuanto a la alimentación, una de las dietas menos estudiadas, es la de los murciégalos que consumen fuentes acuáticas; como es el caso de Noctilio leporinus, Myotis vivesi y M. ricketti, por mencionar algunos (Maya, 1968; Schnitzler et al., 1994; Ma et al., 2003). Otras especies consumen peces de manera ocasional, como N. albiventris, M. pilosus, M. macropus y M. daubentonii (Nowak, 1994; Kalko et al., 1998). La ecolocalización está asociada al tipo de alimento del murciélago y al hábitat donde éste forrajea. La ecolocalización es un sistema activo de orientación a través del cual el murciélago utiliza los ecos de pulsos de sonidos autogenerados, para localizar lo que se encuentra en sus alrededores (Schnitzler et al., 2003). Para llevar acabo la ecolocalización, los murciélagos utilizan pulsos de frecuencia sónica o ultrasónica (por definición, sonidos de altas frecuencias que se encuentran por arriba del intervalo de audición humana). Dentro de las frecuencias, existen dos tipos dependiendo del hábitat (donde vuelan y donde cazan); son la frecuencia modular o banda amplia (FM) y frecuencias o banda estrecha (CF). Algunos murciélagos pueden solo utilizar una frecuencia, aunque la mayoría emplea la combinación de ambos (Schnitzler y Kalko, 2001; Schnitzler et al., 2003). Las señales de FM son de una duración

3 de 1-5ms, cubriendo una banda amplia de frecuencias. Se cree que estas señales las usan los murciélagos para perseguir a sus presas, en especial insectos, en distancias cortas (Schnitzler y Kalko, 2001). Las señales de CF poseen una duración de 10-100ms, y los murciélagos las utilizan para detectar objetos a larga distancia (Schnitzler y Kalko, 2001). La mayoría de los murciélagos emiten ultrasonidos entre los 20kHz y los 215 kHz que utilizan para recibir información de los objetos que se encuentran a su alrededor. La duración de las llamadas (ultrasonidos) es variable en cada especie (Kalko et al., 1998; Neuweiler, 2000; Schnitzler y Kalko, 2001). Con la ayuda de la ecolocalización, los murciélagos pueden distinguir entre un objeto y una presa así como el tamaño de un objeto, su forma, dirección, distancia y movimiento (Schnitzler y Kalko, 2001). La conducta y la ecolocalización de murciélagos piscivoros ha sido estudiada en N. leporinus y N. albiventris. N. leporinos se alimenta principalmente de peces y ocasionalmente de insectos acuáticos (Aguilar- Cervantes y Álvarez-Solorzano, 1991), mientras que N. albiventris es principalmente insectívoro y peces ocasionalmente (Howell y Burch, 1974; Kalko et al., 1998), N. leporinus utiliza la ecolocalización para detectar las perturbaciones en la superficie del agua que indican la presencia de pequeños peces mientras vuela sobre el agua a una altura de 20 a 50 cm. La duración de las ondas van de 13-17ms, utilizando ambas frecuencias (CF y FM). N. albiventris, se alimenta sobre la superficie del agua (+ 20 cm sobre el agua), y la duración de las ondas van de 10-11ms, utilizando ambas frecuencias (CF y FM).

Antecedentes En México se han registrado 137 especies y subespecies de murciélagos y se podría decir que debido a su variedad climática, el territorio de nuestro país es el lugar donde se encuentra la mayor diversidad de murciélagos del mundo (Villa 1966; Fa y Morales, 1993; Medellín, 2003; Ramírez-Pulido et al., 2005). Cerca del 10% de los mamíferos endémicos de México son murciélagos, y algunas de estas especies tienen una distribución geográfica restringida a islas

4 (Fa y Morales, 1993). Este es el caso del murciélago pescador M. vivesi, que habita exclusivamente enel Golfo de California; desde Isla San Jorge, hasta Isla Cayo (Maya, 1968; Blood y Clark, 1998; Flores-Martínez, 2005). Aparentemente las poblaciones de esta especie han disminuido (Arita y Ortega, 1998; Medellín, 2003), por lo que está incluida en la lista de especies amenazadas o en peligro de extinción (Nom-Ecol-059-2001). En los últimos cuatro años, he estudiado varios aspectos de la biología y ecología de M. vivesi, los resultados muestran una disminución en la distribución histórica de la especie. El murciélago pescador se encuentra distribuido probablemente en más de 60 sitios en el Golfo de California, Flores-Martínez (2005) visito 43 localidades, solo tomo registro de M. vivesi en 22 de ellas, en 21 islas no encontró registro de la especie, de las cuales 17 corresponden a registros históricos, 11 de estas islas presenta alteración del hábitat, principalmente fauna exótica, la cual probablemente está asociada a factores antropogénicos, como lo son la introducción de fauna exótica (gatos y ratas) (Herrera y Flores- Martínez, 2001; Flores-Martínez, 2005). La colonia más numerosa reportada para esta especie de murciélago se encuentra en Isla Partida Norte. Esta colonia tiene gran diversidad genética con un valor de heterocigosidad observado de 76% y un número promedio de alelos por sitio de 9.5. El tamaño poblacional efectivo en Isla Partida es de 14,170 a 68,570 individuos (Flores-Martínez et al., 2005). Los datos indican que los valores de diversidad genética son similares a los valores encontrados en otras especies de Myotis que no están en peligro de extinción, lo cual fue interpretado como producto de una gran movilidad del murciélago entre islas. Esto quiere decir que la distancia entre islas no es una barrera para la dispersión de los murciélagos y estos pueden viajar de una isla a otra, formando una gran red de poblaciones en el Golfo de California (Flores- Martínez, 2005).

5 Con base en los datos ya recopilados y de acuerdo a los estudios antes mencionados surgen algunas preguntas relacionadas con las estrategias de supervivencia de M. vivesi. Estas preguntas son:

1) ¿Cómo son los patrones de dispersión del murciélago pescador M. vivesi a lo largo del Golfo de California?

2) ¿Cuáles son las características microclimáticas de los refugios que determinan la presencia de M. vivesi? y 3) ¿Cuáles son las estrategias de ecolocalización de M. vivesi?

Las cuales están relacionadas con diversos aspectos de la historia de vida de esta especie y las cuales nos generaron los siguientes objetivos.

Objetivos

Estimar la dispersión del M. vivesi con métodos indirectos “marcadores moleculares” para conocer la capacidad de recolonización y restauración de los hábitats dañados y determinar el flujo génico histórico que a tenido entre las poblaciones en el Golfo de California.

Estimar la densidad de murciélagos y medir los valores de temperatura y humedad relativa a lo largo de un ciclo anual en diferentes zonas de Isla Partida Norte.

Describir las señales de ecolocalización que emite Myotis vivesi relacionadas con su conducta alimentaria.

6 Capítulo I Conservación del murciélago pescador mexicano (Myotis vivesi), una especie amenazada Estimaciones de la variabilidad genética indican altos niveles de flujo génico entre las Islas del Golfo de California

Introducción La mayoría de los registros de especies extintas o que están actualmente amenazadas ocurren en islas (Ricketts et al., 2005). Muchas de estas especies están solamente en estos habitatas insulares, que suelen estar fuertemente fragmentados (Garner et al., 2005; Loewl et al., 2005; Ricketts et al., 2005). Cuando la población de una isla desaparece, normalmente se hacen algunos trabajos de restauración en los habitats dañados, con la esperanza de que la dispersión en poblaciones remanentes, recolonice estos parches vacíos (Scott et al., 2001). De esta forma, una dispersión no interrumpida, parece ser una necesidad en el mantenimiento de las poblaciones vulnerables para lograr un intercambio de individuos que remplace la diversidad genética pérdida, por efectos de la deriva génica (Hanski, 1999; Frankham et al., 2002). Así, la eficiencia en los esfuerzos de restauración dependen fuertemente de la conducta de dispersión de las especies (Scott et al., 2001). Sin embargo, son muy pocos los casos donde se tiene información adecuada de la dispersión, debido a las dificultadas de seguir el movimiento de las especies de amplia movilidad en el campo (Macdonald y Johnson 2001). Una de las especies insulares fuertemente amenazada es la del murciélago pescador Myotis vivesi. Esta especie es la única reportada, de la familia vespertilionide, que vive exclusivamente en islas e islotes en el Golfo de California (Maya 1968; Villa 1979). El murciélago pescador generalmente anida en grietas y oquedades, lo cual los hace presa fácil de fauna introducida como gatos domésticos (Felis catus) y ratas (Rattus spp.; Villa 1979; Donlan et al.,2003). Esta fauna exótica se ha diseminado ampliamente en las islas del Golfo de California y ha contribuido a la desaparición de diversas especies en esta zona (Mellink 2002; Tershy et al., 2002; Wood et al., 2002; Vázquez- Domínguez et al., 2004). Ceballos y Navarro (1991) reportaron que la

7 introducción de esta fauna exótica había afectado la densidad poblacional de M. vivesi y trabajos más recientes determinaron que incluso la ratas y los gatos habían ya extinguido al murciélago pescador de varias islas entre las que estaba “Encantada”, “Granito” y “San Pedro Mártir” (Mellink 2002; Flores-Martínez 2005). Estos hechos hicieron que el gobierno mexicano y la IUCN pusieran en la lista de especies amenazadas (SEMARNAT 2002) y vulnerables (IUCN 2006) a M. vivesi. En un intento por conservar al murciélago pescador, así como a otra fauna nativa de las islas del Golfo de California, un grupo de investigadores comenzaron a retirar la fauna nociva de estos sitios (Mallink, 2002). Estos programas de restauración se basan en la idea de que, al retirar la fauna exótica y que las islas queden libres, la dispersión desde otras islas recolonizará estos sitios y se detendrá el proceso de vulnerabilidad en que se encuentran varias poblaciones (Scott et al., 2001). Sin embargo, la capacidad de dispersión de Myotis vivesi es desconocida y los estudios donde se ha tratado de documentar sus movilidad entre islas de manera directa han sido infructuosos (Flores-Martínez datos no publicados). Recientemente, los marcadores moleculares se han considerado como herramientas invaluables para inferir los movimientos de dispersión y colonización de las espacies (Hartl y Clarck 2002). Estos estudios se basan en modelos que unen la estructura genética (la diferenciación entre las frecuencias alélicas de poblaciones distintas) con el flujo génico y la dispersión (Waples y Gaggitti 2006). De esta forma en este estudio, se buscó conocer la estructura genética de M. vivesi usando dos tipos distintos de marcadores (microsatélites nucleares y ADN mitocondrial), para determinar el potencial de dispersión y recolonización que nos pudiera dar una idea de la capacidad de restauración en las islas del Golfo de California de donde las poblaciones se extinguieron.

8 Material y Método Zona de estudio, colecta de tejido y extracción del ADN Se tomaron muestras de 11 islas en el Golfo de California durante los meses de marzo a julio de 2003 (Figura 1). Nueve de estas islas no tienen fauna introducida, ni ha sido reportada su presencia, así como tampoco se ha reportado algún otro tipo de perturbación en el momento de la colecta (Flores- Martínez 005). En “Estanque” se erradicó una población de gatos en 1999 (B.R. Tershy, comunicación personal), y en “Salsipuedes” esta especie de fauna introducida aún persistía en la fechas que se hizo este estudio (Flores-Martínez 2005). Se ha reportado, sin embargo, que M. vivesi puede mantener poblaciones con fauna introducida, siempre y cuando haya otras fuentes de alimento para los gatos o estos se encuentren en densidades muy bajas (Maya 1968; Vázquez-Domínguez et al., 2004). La distancia más pequeña registrada entre islas fue de 6 Km., y la más grande de 685 Km; por otro lado, la distancia a la isla más cercan varió de 6 a 154 Km. (Tabla 1). En lo que respecta a las superficie de los sitios de muestreo los valores variaron de islas pequeñas con 80 ha a la más grande con 1,300 ha.

Figura 1.1.- Islas donde se tomaron muestras de M. vivesi. Estructura genética.1.- Cayo. 2.-Tijera. 3.- Colorado. 4.- Santa Inés. 5.- San Rafael. 6.-

9 Salsipuedes. 7.- Partida Norte. 8.- Estanque. 9.- Piojo. 10.- Muela. 11.- Encantado.

Se muestreó un total de 257 individuos de los cuales, 161 fueron hembras, 90 machos y a seis de ellos no se les pudo determinar el sexo. En cuanto a la distribución de edades se registraron 117 hembras adultas y 41 juveniles; de los machos 73 fueron adultos y 4 juveniles (también aquí hubo 13 individuos que no se les pudo determinar la edad). La captura de los ejemplares se hizo con redes de niebla de 12 m colocadas junto a las coloniza de los murciélagos durante una o dos noches de las 18:00 a 6:00. Para obtener material genético, se cortó una pequeña porción (aprox 3 mm) de tejido de la membrana interalar con un bisturí estéril. Cada muestra fue depositada en un vial criogenético con alcohol al 95% (Worthington y Barratt, 1996). El ADN se extrajo usando un kit comercial GenElute (Sigma-Aldrich®), siguiendo las instrucciones del fabricantes, con excepción de que se uso únicamente 1 mm2 de tejido alar por individuo y se digirió el tejido a 55oC por 24 horas con movimiento constante.

Trabajo de laboratorio con los marcadores genéticos Secuenciación del ADN mitocondrial Se analizó la variación genética en un fragmento de 282 pb de la región control, para una submuestra de 134 individuos de los 257 colectados en las once islas. Para amplificar este fragmento se usaron los primers L16517 (5´-CAT CTG GTT CTT ACT TCA GG-3’) y el V23 (5´-AAC TTG TTC AGC ACT TTA GAT-3’) modificados de Kocher et al. 1989 (H00651). La amplificación (PCR) se hizo en un volumen de 50 μl, que contenía entre 5-10 ng de ADN, 0,5 μM de cada primer, 3.0 mM de MgCl, 175 μM de dNTPs y 1 U de FastStat Taq con su buffer respectivo (Roche). Las condiciones de amplificación fueron: una fase de 4 minutos a 95oC, seguido de 40 ciclo a 95oC por 30 segundos, 55oC también por 30 segundos y 72oC durante 2 minutos, para finalizar con una extensión de 7 minutos a 72oC. Los productos de la amplificación fueron purificados usando el

10 kit QIAquick PCR de QIAGEN®. La secuenciación en ambas direcciones se hizo en un secuenciador ABI 377 (Applied Biosystems Inc®).

Genotipificación de microsatélites Se probaron primers diseñados para 24 loci nucleares en M. myotis (Petri et al., 1997; Castella y Ruedi 2000) y P auritus (Burland et al., 1998). Se seleccionó una submuestre de ocho murciélagos para estimar cuales de estos marcadores eran adecuados en el murciélago pescador. Trece de estos loci fueron monomórficos y cuatro tuvieron muy poca resolución. De los restantes siete loci (D9, D15, MM5, G30, E24, Paur-03 y Paur-06) la variación registrada fue consistente y bien definida, por eso, se decidió utilizar estos marcadores, quitando solamente Paur-03 ya que mostró estar ligado al sexo. De esta forma nos quedó un total de seis loci para realizar nuestro estudio, con los restantes 274 individuos. Las reacciones de PCR se hicieron en un volumen de 10 μl, que contenía entre 5-10 ng de ADN, 0,5 μM de cada primer, 2-3 mM de MgCl, 175 μM de dNTPs y 1 U de FastStat Taq con su buffer respectivo (GIBCO). Las condiciones de amplificación fueron: una fase de 2 minutos a 95oC, seguido de 40 ciclo a 95oC por 40 segundos, 50-57oC también por 40 segundos y 72oC durante un minuto, para finalizar con una extensión de 5 minutos a 72oC. Los productos de la amplificación fueron diluidos en Formamida al 98% como una tinción de carga y separados en un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 5%. La tinción se hizo con fluorescencia y observada en un Fotodocumentador de imágenes.

Análisis de la variabilidad genética Las secuencias mitocondriales fueron alineadas con el programa Clustal X (Thompson et al., 1997) y después corregidas manualmente. Para cuantificar la diversidad genética tanto haplotípica (h) como nucleotídica (π; Nei, 1987) dentro y entre islas se usó el programa Arlequin 3.01 (Excoffier et al., 2005). Para los loci microsatélites se calculó la diversidad genética y la heterocigosidad observada (Ho; Nei, 1987) usando el programa TFPGA 1.3 (Miller, 1997). La

11 riqueza alélica se estimó usando el programa Fstat 2.9.3 el cual, usa un procedimiento de rarefacción para hacer las estimaciones (Goudet, 1995). Para determinar si había deficiencia de heterocigotos, por la presencia de alelos “nulos” (productos no apmlificados), se usó una prueba para medir las desviaciones de Hardy-Weinberg usando un remuestreo mediante cadenas de Marcov con el programa Genepop (Raymond y Rousset, 1995). De igual forma se hizo una prueba usando cadenas de Marcov para probar si había o no desequilibrio de ligamiento entre los marcadores, las diferencias entre pares de loci se hizo con el programa Genepop (Raymond y Rousset, 1995) y la significancia se probó usando el método de Dunn-Sidak (Gotelli y Ellison, 2004).

Flujo génico y estructura genética Se hicieron diversas pruebas para estimar la estructura genética y de esta forma el flujo génico que hay entre las islas. La primera aproximación fue usando el programa Arlequin 3.01 (Excoffier et al., 2005), para estimar la magnitud de la diferenciación genética entre subpoblaciones (Fst), tanto para el mtADN como para los microsatélites (Weir y Cockerham, 1984). La significancia de este valor se hizo con un bootstrat de 20,000 permutaciones sobre loci, con estos valores se generó un intervalo de confianza al 95%. En la segunda prueba, se midió la relación entre las distancias genéticas y las distancias geográficas, usando el programa Genepop (Raymond y Rousset,

1995) para medir las distancias genéticas tanto las DLR (proporción de verosimilitud genotípica), como Fst/1-Fst entre poblaciones (Slatkin, 1985). De esta forma, se calcula el logaritmo natural de la distancia geográfica (ln km) y se correlaciona con un método de rango (Spearman) con la distancia genética (r). La significancia se hace con una prueba de Mantel con 1,000,000 permutaciones que generan el intervalo de confianza de r al 95%. Para evitar sesgos se eliminaron las poblaciones o lo loci con solo un individuo muestreado (Paetkau et al., 1997). En la tercera aproximación se usó el programa Structure 2.0 (Pritchard et al., 2000; Falush et al., 2003) para tener un método Bayesiano de estimación de Fst. Este programa estima el número de subpoblaciones (k) genéticamente

12 diferentes calculado una probabilidad a posteriori. El número de subpoblaciones o “k” que tenga la probabilidad mayor es tomado y cada individuo se asigna con una probabilidad (q) a cada grupo reconocido (Pritchard et al., 2000).

Resultados Variación genética Se reconocieron 39 haplotipos para los datos de ADN mitocondrial. La diversidad haplotípica varío de 0.00 a 0.945, con un valor promedio de 0.543. La diversidad nucleotídica, por su parte varió de 0.000 a 0.017 con un promedio de 0.009. Solo la población de Cayo fue monomórfica (Tabla 1.1). Con lo que respecta a los microsatélites la variación registrada fue muy alta, ya que el número de alelos por locus varió de 3 a 19. La diversidad genética estimada (He) se encontró en un rango de 0.36 a 0.92; sólo un locus (MM5) mostró deficiencia de heterocigotos (P<0.0004). La riqueza alélica varió de 6.8 a 8.0 (Tabla 1.1). De la misma forma sólo en una de las once poblaciones muestreadas se detectó una deficiencia significativa de los heterocigotos (“La Muela” P<0.005). De las 165 comparaciones que se hicieron con los microsatélites solo en una se detectó desequilibrio de ligamiento entre E24 y P06 en “Isla Partida Norte” (P<0.0004).

13 Tabla 1.1. Variación Mitocondrial (282 bp fragmentos de la región control DNAmt, 134 individuos) y variación de microsatélites (seis loci), 257 para Myotis vivesi a lo largo de su distribución en el Golfo de California.

Sitio N-mt H h  N-mc A HO HE

Cayo 12 1 0.00 0.000 26 7.3 0.70 (0.23-0.96) 0.72 (0.22-0.92)

Tijeras 14 6 0.604 0.017 18 7.9 0.77 (0.39-0.94) 0.75 (0.32-0.94)

Colorado 11 6 0.181 0.004 22 7.4 0.71 (0.23-0.91) 0.76 (0.27-0.92)

Santa Inés 13 4 0.423 0.012 19 7.5 0.75 (0.42-0.95) 0.76 (0.39-0.91)

San Rafael 12 3 0.439 0.010 20 7.8 0.74 (0.30-0.90) 0.75 (0.26-0.92)

Salsipuedes 11 9 0.945 0.011 11 6.8 0.68 (0.27-1.00) 0.69 (0.33-0.94)

Partida Norte 13 7 0.730 0.011 59 7.7 0.74 (0.39-0.93) 0.77 (0.45-0.93)

Estanque 13 5 0.538 0.015 17 7.7 0.85 (0.59-1.00) 0.79 (0.51-0.93)

Piojo 10 3 0.378 0.003 16 8.0 0.84 (0.50-1.00) 0.78 (0.39-0.92)

Muela 12 9 0.939 0.012 20 7.7 0.69 (0.30-0.89) 0.76 (0.34-0.93)

Encantada 13 7 0.794 0.007 29 7.4 0.75 (0.34-0.97) 0.75 (0.34-0.91)

Mean 12 5 0.543 0.009 23 7.6 0.75 (0.37-0.91) 0.76 (0.36-0.92)

N es el número de individuos muestreados para mitocondriales (-mt) y microsatélites (-mc); H es el número de haplotipos mitocondrales DNAmt; h y  son la diversidad genica y nucleotídica, respectivamente; A es la riqueza alélicas; HO y HE son las heterosigosidad observada y la esperada, respectivamente (distribución a lo largo de seis loci en paréntesis).

Estructura y flujo génico Se encontró una diferenciación genética mas intensa con los haplotipos de ADN mitocondrial que con los microsatélites. Los valores de Fst estimados con el ADN mitocondrial varió de 0.00 a 0.76 (Tabla 1.2) con un promedio de 0.15. Con los microsatélites la prueba exacta reveló diferencias significativas entre las islas para los seis loci (X2 = 22.6, gl = 12; P<0.04). Sin embargo, los valores de Fst fueron más bajos (-0.029 a 0.028) con un promedio de 0.002 (Tabla 1.2).

14 Solo el 8% de los alelos fueron privativos, dos en “Partida Norte” y uno en las siguientes islas “Muela”, “Estanque”, “San Rafael” y “Tijera”.

Tabla 1.2. Matriz pareada de distancias genéticas (arriba diagonal) y distancia geográfica (bajo diagonal, Km) ente las islas del golfo de California, donde las muestras fueron colectadas a partir de los murciélagos pescadores mexicanos (Myotis vivesi) en 2003.

Los tres valores arriba de la diagonal son, de arriba a bajo, Fst mitocondrial

(fragmento de 280bp de la región control del DNAmt, 134 individuos), Fst de microsatélites (seis loci, 257 individuos), y medidas DLR de microsatélites (Paetkaul et al., 1997). Significancia estadística (disponibles solo para los valores de Fst) siguiendo el ajuste para comparaciones multiples (a =0.05; Dunn-Sidak method; Gotelli and Ellison 2004) es indicado por un asterisco (*). Islasa: Partida Norte (PN), Salsipuedes (Sa), Muela (Mu), Encantada (En), Piojo (Pi), Estanque (Es), San Rafael (SR), Colorado (Co), Tijeras (Ti), Santa Inés (SI), Cayo (Ca).

Cuando se analizó la relación entre la distancia genética con la distancia geográfica con los datos del ADN mitocondrial, no se vió que hubiera una correlación significativa (r=0.11 P = 0.12; Figura 1.2). Esto contrastó con los resultados obtenidos con los marcadores de microsatélites, en los cuales se detectó una correlación positiva y significativa usando las distancias genéticas

DLR (r=0.32 P = 0.03) y marginalmente usando los valores de Fst/1-Fst (r=0.26 P = 0.07). Esto nos indica que hay un efecto de aislamiento por distancia visto con este marcador (Figura 1.2).

Figura 1.2. Relación entre la distancia genética y la distancia geográfica (km) entre 11 poblaciones de los murciélagos pescadores (Myotis vivesi) muestreados en el Golfo de California en el 2003. Valores r son los coeficientes de correlación de los rangos de Spearman; los valores de P fueron

16 determinados la prueba de Mantel (1967). (a) relación para seis loci de microsatélites nucleares (257) usando la medida DLR (Paetkau et al., 1997). Una relación similar se encontró usando los valores de FST linearizados (FST/1FST; r=0.26; P=0.07). (b) relación para haplotipos mitocondriales (282 pb) de un fragmento de la región control mitocondrial usando FST linearizados

El análisis Beyesiano hecho con el programa Structure no detectó una estructura genética en estas muestras. El valor de verosimilitud más alto se obtuvo con k = 1, es decir, con un solo grupo (Ln = -5,907.64). Así de acuerdo con el análisis de grupos el modelo mas probable en las poblaciones del murciélago pescador en el Golfo de California es de una gran población en panmixia (Pritchard et al., 2000).

Discusión Los resultados encontrados con los microsatélites nos indican que hay un nivel de flujo génico alto entre islas, lo cual nos indica que la dispersión entre poblaciones de M vivesi es buena. En primer lugar, los valores de diversidad genética son altos (He = 0.76) y mayores que los reportados para otras especies del género (M. myotis en España He = 0.71 y M. punicus en Maruecos He = 0.56; Castella et al., 2000). Aunque son similares los valores de Heterocigosidad observada para lo reportado en otros vespertiliódidos en Norteamérica y Europa central (M. bechsteinii Ho = 0.83 Kerth et al., 2003; P. auritus Ho = 0.79 Veith et al., 2003). Los valores altos de diversidad genética se esperan en grupos donde la dispersión entre poblaciones es intensa, porque el flujo génico restablece los alelos que se pierden por efectos de la deriva génica (Hartl, 2000). Altos niveles de flujo génico, también, evitan que ocurran muchos alelos privativos en las poblaciones (Slatkin 1985), lo cual, se observó en este estudio donde el porcentaje de estos alelos fue solamente del 8%. En segundo lugar podemos decir que, se registró solamente una ligera estructuración en las poblaciones medido con los microsatélites, ya que el valor de Fst = 0.002 fue muy cercano a cero. Incluso, entre las poblaciones más distantes (“Cayo” y “Escondida” a una distancia de 685 Km.) el valor de

17 Fst=0.009 fue muy bajo. Ninguno de los valores de Fst calculado entre pares de poblaciones fue mayor a 0.03. Estos valores, son significativamente menores a los reportados para otros vespertiliónidos en colonias continentales en Europa (Castella et al., 2000). Así en España para poblaciones de M. myotis separadas por 270 a 770 Km a otras en el Norte de África los valores de Fst = 0.02 (Castella et al., 2000) son mucho mayor al 0.002 del murciélago pescador en el Golfo de California. Lo mismo se aprecia en lo reportado en M. nattereri en Inglaterra (Rivers et al., 2005) donde las colonias estaban separadas a una distancia de entre 5 a 150 Km y el valor de Fst = 0.017 también es mayor al de M. vivesi. Aunado a lo anterior, se observó una correlación positiva (r=0.26-0.32) entre la distancia genética estimada con los microsatélites y la distancia geográfica. Este aislamiento por distancia es consistente con la gran dispersión de los murciélagos entre islas cercanas, que sin embargo, puede ser restringido por grandes distancias geográficas. Esto es, el flujo génico es menos improbable a grandes distancias en esta zona. Este resultado es similar a lo que se encontró en M. bechsteinii (r=0.20; Kerth y Petit, 2005) y M. myotis (r=0.26-0.30 Ruedi y Castella 2003). Estas dos especies tienen amplias distribuciones en Europa. Finalmente, el análisis Bayesiano y los grupos registrados con el programa Structure, revelaron que no hay una estructura genética y que existe un alto flujo génico entre las poblaciones del murciélago pescador en el Golfo de California, ya que se detectó una sola gran población en panmixia. En contraste, los datos con los marcadores mitocondriales mostraron una clara estructura genética entre las islas (75 veces mayor a los valores con los microsatélites). Una explicación que se puede dar a este patrón, aparentemente contradictorio, es que existe un flujo génico diferencial entre sexos, siendo las hembras grupos filopátricos y los machos los que tienen una dispersión muy alta (Chen et al., 2008). Esto se ha observado también, en otros vespertiliónidos, así por ejemplo, para Nyctalus nocturla (Petit & Mayer, 1999), M. myotis (Ruedi y Castella 2003) y M. bechsteinii (Kerth et al., 2008) se ha reportado estas mismas diferencias de dispersión entre ambos sexos. Aunado a

18 lo anterior, el hecho de que no se haya detectado aislamiento por distancia con el ADN mitocondrial sugiere que la dispersión entre islas por las hembras es un evento raro que no alcanza a compensar la fuerza de la deriva génica (Hartl 2000).

Conclusiones - De nuestros datos podemos decir que hay altos niveles de diversidad genética en esta especie en todas las poblaciones - Los niveles de flujo génico son suficientemente altos como para decir que entre islas se puede dar una colonización o recolonización entre poblaciones remanentes. - Sin embargo, las hembras y los machos no tienen la misma capacidad de dispersión y se debe de tener una estrategia de conservación adecuada, libre de fauna introducida, para no afectar a esta especie.

Capítulo II. Densidad poblacional y características microclimáticas de los refugios de Myotis vivesi en Isla Partida Norte, Golfo de Baja California.

Introducción Los refugios juegan un papel importante en la vida de muchas especies de animales ya que les proveen de protección (Kunz, 1982; Newton, 1994; Nelsony Martin, 1999; Hartman y Oring, 2003), y les brindan condiciones abióticas para llevar acabo procesos como la reproducción y la crianza de sus vástagos (Martin, 2001; Sedgeley, 2001; Wiebe, 2001; Kunz y Lumsden, 2003). Numerosas especies de murciélagos incluidas en diferentes familias y géneros utilizan las cuevas como refugio durante el día y parte de la noche, pero existen especies que usan como refugio preferencial el follaje, oquedades de árboles, palmas, y estructuras antrópicas (Kunz, 1982; Kerth et al., 2001; Ceballos, 2005; Ortiz-Ramírez et al., 2006; Rodríguez-Herrera et al., 2008). A lo largo de su ciclo de vida algunas especies utilizan diferentes tipos de refugios durante la hibernación, migración, reproducción y crianza (Stones y Jacob, 1965; Kunz, 1982; Dechmann et al., 2004). Debido a ésto, las características y los sucesos relacionados con la selección de los refugios desempeñan un papel vital en la ecología e historia de vida de los murciélagos (Kunz, 1982; Dechmann et al., 2004). La elección de los refugios depende de varios factores entre los que se destacan las características topográficas y las condiciones microclimáticas (Kunz, 1982, 1990). Por ejemplo durante el período reproductivo las hembras de algunas especies de murciélagos buscan zonas de crianza con condiciones adecuadas de temperatura y humedad para facilitar el desarrollo de las crías (Racey 1973; Tuttle, 1976; Hoying y Kunz, 1998). En latitudes elevadas, donde las estaciones del año son marcadas, algunas especies se ven confinadas a los refugios durante largos períodos del año sin acceso a comida o agua (Willis y Brigham, 2005). Tal es el caso de Myotis evotis, el cual utiliza como refugio preferencial las grietas en las rocas, donde se reduce la competencia potencial

20 y aprovechan las ventajas termodinámicas de este tipo de sitios, además de la evasión de los depredadores (Rancourt et al., 2005). Eptesicus fuscus hace uso también de grietas en las rocas como lugares de refugio y entra en torpor o aletargamiento, por lo que selecciona lugares con micro-ambientes de acuerdo a sus necesidades fisiológicas (Lausen y Barclay, 2003). Rodríguez-Duran y Soto-Centeno (2003) encontraron que la selección del refugio por dos especies de murciélagos cavernícolas antillanos (Erophylla sezekorni y Pteronotus quadridens) estuvo influenciado por la temperatura. Estos autores señalaron que las diferencias en la temperatura preferencial de refugio entre especies son importantes para explicar la asociación y segregación espacial dentro de una cueva. Así lo demuestra también Wilkinson (1985) quien encontró que las condiciones microclimáticas del refugio determinaron la conducta de las hembras del murciélago vampiro, Desmodus rotundus. Rodríguez-Duran (1995) propone que los murciélagos que habitan en refugios con altas temperaturas pueden mostrar una tasa metabólica basal reducida como una adaptación a reducir la ganancia de calor endógeno y así promover la conservación de agua. La mayoría de estos trabajos muestran la relación entre las condiciones climáticas y los sitios de búsqueda y elección de refugio en especies de zonas continentales (Rancourt et al., 2005; Willis y Brigham, 2005). De manera general, en una isla se espera que el número de sitios disponibles para encontrar un refugio adecuado sean menores y por lo tanto más competidos (Flores-Martínez et al., 2005; Flores-Martínez, 2005) y éste puede ser el caso del murciélago pescador Myotis vivesi. M. vivesi es una especie endémica de México que se distribuye en islas e islotes del Golfo de California (Maya, 1968; Flores-Martínez, 2005), la población con el mayor número de individuos se encuentra en Isla Partida Norte (Flores- Martínez et al., 2005). Este murciélago está incluido en la UICN-2003 como una especie vulnerable y en peligro de extinción en la NOM-ECOL-059-2001, debido a lo frágil del hábitat donde se encuentra. Al igual que otras especies de murciélagos antes mencionadas, Myotis vivesi se refugia principalmente debajo de las rocas y en ciertas ocasiones en grietas (Maya, 1968; Blood y

21 Clark, 1998). Es por eso que las condiciones microclimáticas de los refugios pudieran ser un aspecto esencial en la biología, la supervivencia y distribución de esta especie de murciélago en estos hábitats con condiciones ambientales extremas como lo es la humedad y la temperatura (Flores-Martínez, 2005). En este sentido, en este trabajo se describen las características microclimáticas (temperatura y humedad relativa) de los refugios de M. vivesi en Isla Partida Norte. Esta isla presenta condiciones climáticas extremas durante todo al año donde la temperatura ambiental puede fluctuar dramáticamente entre los meses. En enero se han registrado temperaturas mínimas de 5 0C, mientras que en mayo ésta puede subir hasta 45 oC (García, 1987; Case et al., 2002; Flores-Martínez datos no publicados), por lo que es probable que, como ocurre con otras especies de Myotis (Stones y Jacob, 1965; Kunz, 1982; Kerth et al., 2001), los murciélagos seleccionan los refugios con mejores condiciones microclimáticas. La isla presenta varias zonas que son utilizadas como refugio por los murciélagos y que, debido a su ubicación, difieren en su exposición a los rayos del sol y a los vientos fríos del norte (Flores-Martínez datos no publicados). Es de esperar, por lo tanto, que en el invierno exista una mayor densidad de murciélagos en aquellas zonas en las cuales los refugios muestren mayores valores de temperatura y humedad; en contraste, durante los meses más cálidos las mayores densidades se encontrarán en los refugios con humedad y temperaturas más bajas.

Materiales y Métodos Zona de estudio El estudio se realizó en Isla Partida Norte en el Golfo de California, México (28º 52´ latitud N 113º02´ longitud W, Figura 2.1). La isla tiene una longitud de 2.2 2 km por 900 m de ancho, con una superficie aproximada de 1.3 km (Case et al., 2002). La vegetación es de matorral desértico espinoso con cactáceas, donde predominan los cardones, Pachycereus pringlei, y numerosos tipos de leguminosas y arbustos tales como Amaranthus watsonii, Perityle emoryi, y Cryptantha maritima pilosa (Rzedowsky 1986, Bourillo et al., 1998; Case et al., 2002). También se encuentran algunas aves como los petreles Oceanodroma

22 melania y O. microsoma, la gaviota occidental Larus occidentalis, la gaviota de pico amarillo, el cuervo común Corvus corax, el halcón peregrino Falco peregrinus, el águila pescadora Pandion haliaetus y la lechuza de campanario Tyto alba (Villa,1979; Bourillon et al., 1998; Case et al., 2002). El único mamífero terrestre presente es el murciélago pescador. Se seleccionaron 4 zonas de estudio, de acuerdo a la exposición solar y a los vientos que reciben del norte; estas zonas se encuentran en la parte sur de la isla. La zona 1, 2 y 3 forman parte de las laderas de un monte, al encontrarse ubicadas en los costados de una pendiente, esto influye en la intensidad del sol, así como de los vientos que reciben a diferentes horas del día. Mientras que la zona 4 está en la parte alta de la isla y recibe la luz del sol y los vientos del norte durante todo el día (Figura 2.1).

Figura 2.1. Ubicación geográfica de Isla Partida Norte, indicando las zonas donde se colocaron los data logger. Zonas: 1.- Campamento, 2.- Estero, 3.- Cardonosa, 4.- Monte, y 5.- Externo.

Estimación de la densidad de murciélagos. El estudio de la densidad de murciélagos se realizó en los sitios antes mencionados (Figura 2.2). Debido a las características geomorfológicas de esta isla, solo 10,306m2 o sea el 0.79% del área total de la isla pudiera ser potencialmente utilizado por los murciélagos como refugio. Se muestrearon

23 aproximadamente 7,033 m2 en las cuatro zonas (Tabla 2.1), lo cual representa aproximadamente 0,54% de la superficie total de la isla. En cada una de estas zonas se estimó la densidad promedio de murciélagos adultos (número de individuos/m2). Para ello de la siguiente forma, se colocaron al azar de cinco a diez cuadrantes de 1 m2 (Tabla 2.1), y en cada cuadrante se retiraron las rocas y se capturaron todos los murciélagos que se encontraban dentro del cuadrante. Asumiendo que en cada una de estas zonas los murciélagos presentaban una distribución uniforme, se estimó la densidad total de adultos de cada zona multiplicando la densidad promedio observada por el área total de cada zona.

Tabla 2.1. Número de cuadrantes y áreas muestreadas en cuatro zonas de la zona sur de Isla Partida Norte, Golfo de California. Zona No. Cuadrantes Área (m2) Campamento 10 941 Cardonosa 10 2800 Estero 10 2622 Monte 5 670

Este procedimiento se realizó durante los años 2006 (en los meses de abril, julio, y diciembre). Durante los meses del muestreo se registró también la presencia de juveniles (Flores-Martínez 2005; Carmona, 2007). A cada individuo capturado se le registró el sexo; con estos datos en cada zona y en cada mes de muestreo se estimó el cociente sexual (macho:hembra).

Caracterización microclimática en los refugios. Se obtuvieron datos de temperatura (°C) y humedad relativa (%) dentro de cuatro refugios activos de M. vivesi uno en cada una de las zonas estudiadas. Los datos se tomaron a intervalos de 1 hora a lo largo de un ciclo anual (2006). Ambas variables climáticas fueron registradas mediante el uso de data loggers (modelo HOBO U12). Adicionalmente se colocó un data logger en el exterior de

24 los refugios en un lugar escogido al azar en la parte más elevada de la isla coincidiendo con una posición central a los otros cuatro sitios para tener un sitio control. Los “data loggers” fueron colocados dentro de un recipiente de plástico para protegerlos de la intemperie y presentaban numerosas perforaciones y ranuras para disminuir al máximo la creación de un microclima dentro del recipiente. Los datos fueron recuperados utilizando el programa HOBO-ware versión 2.0.0. Los datos de temperatura y humedad fueron promediados por día (esto fue estimado a partir de la lectura de luminosidad de los data loggers). En este estudio sólo se tuvieron en cuenta los valores diurnos (de las 07:00 a.m a las 19:00 p.m., 12 horas), ya que es el tiempo que los murciélagos están en sus refugios y por lo tanto podrían tener mayor efecto sobre la selección del refugio por parte de los mismos.

Análisis de los datos La variación de la densidad promedio de murciélagos (individuos/m2) entre las zonas y entre los meses estudiados fue evaluada mediante pruebas no paramétricas de comparación múltiple de medias de Kruskal-Wallis (Zar 1999). Para probar si el cociente de las proporciones sexuales difería de una proporción 1:1 se usó una prueba de Chi-cuadrado (2; Za,r 1999). Los análisis se hicieron con el programa Statistica versión 6.0 (StatSoft, 2001). Para evaluar si existían diferencias entre la temperatura y la humedad relativa del interior de los refugios y del ambiente externo a lo largo del año, se realizaron análisis de varianza (ANOVA) considerando la ubicación (dentro del refugio vs. exterior) y el mes como factores y la temperatura y humedad relativa mensual promedio de las cuatro zonas en conjunto como variables dependientes. Para estimar si existían diferencias en la temperatura y la humedad relativa a lo largo del año entre las zonas se hicieron análisis de varianza con la zona y el mes como factores y la temperatura y humedad promedio mensual como variables dependientes (Zar, 1999). Los promedios mensuales de temperatura y humedad fueron estimados de los valores registrados cada hora. Cuando existieron diferencias significativas en los

25 ANOVA se usaron pruebas a posteriori de Tukey y el nivel de significancia se ajustó mediante la corrección de Bonferroni (Zar, 1999). Se usaron los programas Statistica versión 6.0 (StatSoft, 2001) y PAST (Hammer et al., 2008). La relación entre la densidad de los murciélagos con las variables temperatura y humedad dentro de los refugios se exploró con los promedios mensuales mediante una correlación no paramétrica de Spearman (Zar, 1999). Los datos de temperatura y humedad presentaron una distribución normal (estimada mediante la prueba de Wilks-Shapiro) y el nivel de significación se ajustó mediante la corrección de Bonferroni. Los análisis estadísticos fueron realizados mediante los programas Statistica versión 6.0 (StatSoft, 2001) y PAST (Hammer et al., 2008).

RESULTADOS Densidad poblacional La zona de Cardonosa tuvo la tendencia a presentar valores más elevados de densidad de murciélagos en los meses de julio y diciembre (Figura 2.2). Sin embargo, no se observaron variaciones significativas en los valores de densidad entre las cuatro zonas, ni entre los meses para cada una de las zonas (Tabla 2.2). El mes de junio tuvo los mayores valores de densidad promedio, aunque la densidad total (combinando las cuatro zonas) no varió significativamente entre los meses del año (Kruskal-Wallis = 3.32; gl= 2, 105; p = 0.18). Julio tuvo los mayores valores de densidad promedio (Figura 2.3.). En lo que respecta a la proporción sexual Cardonosa en julio (X2= 9.14, p < 0.01), y Campamento (X2= 10.6, p < 0.01) y Estero (X2= 6.4, p < 0.01) en el mes de abril, tuvieron una composicion de sexos sesgada hacia las hembras (Tabla 2.3). En el resto de las zonas y los meses diciembre las proporciones sexuales se mantuvieron en la proporción 1:1.

26 Tabla 2.2. Densidad de individuos adultos (media ± desviación estándar) de Myotis vivesi en cuatro zonas de refugio en Isla Partida Norte, Baja California. Entre paréntesis el número de individuos adultos estimados en cada zona. Para cada mes se brinda el valor de la prueba de comparación múltiple de media de Kruskal-Wallis (KW), el valor crítico de p es de 0.01 mediante la corrección de Bonferroni.

Zonas de refugio Campamento Cardonosa Estero Monte KW p Abril 1.8 ± 2.1 (1693) 0.9 ± 0.8(2520) 1.3 ± 1.7(3408) 1.0 ± 1.0(670) 0.51 0.9 Julio 2.3 ± 2.4 (2164) 3.1 ± 3.2 (8680) 1.5 ± 1.1 (3933) 2.0 ± 2.4 (1340) 0.84 0.8 Diciembre 1.4 ± 1.4 (1317) 2.1 ± 2.0 (5880) 1.8 ± 1.6 (4719) 1.2 ± 0.8 (804) 0.84 0.8 KW= 0.41, p = 0.8 KW= 3.02, p = 0.2 KW= 0.85, p = 0.6 KW= 0.35, p = 0.8

Figura 2.2. Densidad de individuos adultos de Myotis vivesi por unidad de área (m2) en cuatro zonas de Isla Partida Norte, Baja California. Los datos corresponden a censos realizados en tres meses del año 2006 (media + 1 DE).

Figura 2.3. Variacion mensual (media + 1 DE) de la densidad de individuos adultos de Myotis vivesi por unidad de área (m2) en Isla Partida Norte, Baja California. Los datos representan los valores obtenidos en todos los refugios combinados.

Tabla 2.3. Variación del cociente sexual (m:h) en refugios de indivuos adultos Myotis vivesi en refugios cuatro zonas de Isla Partida Norte, Baja California. El valor crítico de p es de 0.01, estimado mediante la corrección de Bonferroni.

Zonas Cociente sexual X2 P (m:h) (ob. vs. esp.) Abril Campamento 1:14 10.62 P < 0.01 Cardonosa 1:2 1.36 P > 0.05 Estero 1:9 6.4 P < 0.01 Monte 1:0.66 0.2 P > 0.05 Julio Campamento 1:1.25 0.22 P > 0.05 Cardonosa 1:3.6 9.14 P < 0.01 Estero 1:0.62 0.69 P > 0.05 Monte 1:1 0 P > 0.05 Diciembre Campamento 1:1.4 0.33 P > 0.05 Cardonosa 1:2.75 3.51 P > 0.05 Estero 1:1.6 0.69 P > 0.05

28 Monte 1:1 0 P > 0.05

Comparación del ambiente exterior con el interior de los refugios La temperatura dentro de los sitios de refugio fue significativamente diferente de la temperatura exterior en todos los meses del año (F= 1287.4, g.l. = 1, 625; p < 0.001) (Tabla 2.4). La interacción entre la temperatura registrada en los dos ambientes (externo vs. interno) y la temperatura en cada mes fue significativa (F= 2.93, g.l. = 11, 625, p < 0.001). La diferencia de temperatura promedio mensual observada entre el exterior y dentro de los refugios fue de 8.4 °C (Figura 2.4B). La humedad relativa en los refugios y en el exterior fue estadísticamente diferente (F= 516.3, g.l. = 1, 625, p < 0.001), y varió entre los meses del año (F= 27.0, g.l. = 1, 625, p < 0.001; Figura 2.5A), pero no dependió de la época del año dado que la interacción entre el ambiente (externo vs. interno) y el mes no fue significativa (F= 0.27, g.l. = 11, 625, p > 0.05). pero hay una correlación clara La diferencia de humedad promedio mensual observada entre el exterior y dentro de los refugios fue de aproximadamente 30% (Figura 2.5B).

Tabla 2.4. Resultados del análisis de varianza de dos vías (mes y zona) para los valores de temperatura y humedad relativa dentro de los refugios (todos los zonas combinados) y el exterior. Efecto Suma de cuadrados G.L. F p

Temperatura (0C)

Zonas 7503.6 1 1287.4 < 0.001

Meses 13350.8 11 208.2 < 0.001

Interacción 188.2 11 2.93 < 0.001

Error 3642.8 625

Humedad relativa (%)

Zonas 38766 1 516.3 < 0.001

Meses 22302 11 27.0 < 0.001

29 Interacción 226 11 0.27 0.9 n.s

Error 46925 625

Figura 2.4. A. Variación mensual (media ± ES) de los valores de temperatura (0C) dentro de refugios de Myotis vivesi en Isla Partida, comparado con la temperatura ambiental. B. Valor de temperatura promedio dentro de los refugios y en el ambiente exterior. La barra de error representa la desviación estándar y la caja el error estándar de la media.

Figura 2.5. A. Variación mensual (media ± ES) de los valores de humedad relativa (%) dentro de refugios de Myotis vivesi en Isla Partida. B. Valor de humedad promedio dentro de los refugios y en el ambiente exterior. La barra de error representa la desviación estándar y la caja el error estándar de la media.

Dentro de los refugios la humedad relativa fluctuó menos que en el ambiente exterior, (r = -0.031, n = 515, p > 0.05, Figura 2.6A); sin embargo, en el exterior de los refugios la humedad relativa disminuyó significativamente

32 con el aumento en la temperatura ambiental (r = -0.24, n = 130, p <0.001, Figura 2.6B).

(0C)

Figura 2.6. Correlación entre la temperatura y humedad relativa dentro de los refugios (A) y en el exterior (B).

Comparación microclimáticas entre los zonas de refugio Se observaron diferencias significativas en la temperatura promedio anual de los refugios entre los cuatro zonas (F= 87.8, g. l. = 2, 513, p < 0.001, Tabla 2.5). Cardonosa presentó valores significativamente mayores de temperatura que Monte y Estero (Prueba de Tukey, p < 0.001, Figura 2.7A). Entre las demás comparaciones no hubo diferencias significativas. La interacción entre la zona y el mes fue significativa (F= 4.81, g. l. = 10, 513, p < 0.001, Figura 2.8): la zona de Cardonosa presentó una mayor temperatura en diciembre y febrero que en el resto de las otras zonas (Prueba de Tukey, p < 0.01, Figura 2.8).

33 La humedad relativa también fue significativamente diferente entre algunas de las zonas (F= 14.3, g. l. = 3, 513, p < 0.001, Figura 2.7B): Cardonosa presentó valores de humedad menores que el resto de las localidades, y en Campamento fue menor a la de Estero (p < 0.01). La interacción entre la zona y el mes fue significativa (F= 1.66, g. l. = 10 513, p < 0.05, Figura. 2.8B): la zona de Cardonosa presentó menor humedad relativa en diciembre y febrero que en el resto de las zonas de refugio (Prueba de Tukey, p < 0.01, Figura 2.8).

Tabla 2.5. Resultados del análisis de varianza de dos vías (mes y zona) para los valores de temperatura y humedad relativa dentro de los refugios para las cuatro zonas estudiadas en Isla Partida.

Efecto Suma de cuadrados G.L. F p

Temperatura (0C)

Zonas 445.8 2 87.8 < 0.001

Meses 16924.6 10 666.7 < 0.001

Interacción 391.2 32 4.81 < 0.001

Error 1192.9 470

Humedad relativa (%)

Zonas 2339.1 2 17.8 < 0.001

Meses 27760.8 10 42.4 < 0.001

Interacción 3475.1 32 1.66 < 0.05

Error 30739.1 470

Figura 2.7. Valores promedio anual de temperatura (A) y humedad relativa (B) en refugios de Myotis vivesi ubicados en cuatro zonas del sur de Isla Partida. La barra de error representa el intervalo de confianza del 95%.

Figura 2.8. Variación mensual de la temperatura (A) y la humedad (B) dentro de refugios de Myotis vivesi en cuatro zonas distribuidas en la zona sur de Isla Partida.

Discusión. Los puntos Densidad poblacional. El estimado de la población adulta de Myotis vivesi en Isla Partida Norte varió entre 8, 291 individuos en abril a 16,117 en julio del 2006. Teniendo en cuenta que el presente estudio no muestreó la isla completa, la población podía quizá duplicarse en este sitio. Con anterioridad a este estudio, Maya (1968) estimó mediante el método de cuadrantes una población de entre 10,000 y 12,000 individuos en el verano (julio) de 1963. Los datos obtenidos en el presente estudio sugieren que el número de individuos de M. vivesi en Isla Partida Norte

36 los últimos 40 años se ha mantenido constante. Se observó, también que en los meses de abril y julio hubo un aumento en la proporción de hembras en algunas zonas. Estos resultados puede ser explicados por el supuesto de que Isla Partida Norte funcione como una zona de maternidad para esta especie de murciélago, donde las hembras de otras islas pudieran concentrarse para el nacimiento de sus crías entre abril y junio (Maya, 1968; Flores-Martínez, 2005). Al parecer Isla Partida les provee de un buen lugar para el desarrollo de las crías, desde que nacen hasta que son juveniles, esto, por el echo de que en esta isla se juntan o regresan hembras cada año a tener a sus crías en los meses de verano, lo cual se concluye que la isla es importanate ya que en ciertos meses del año se transforma en una gran guardería (Maya, 1968; Flores-Martínez, 2005). Aunado a lo anterior es probable que los machos abandonen la isla en estas fechas; estudios previos demuestran que en los meses de invierno la proporción de machos con referente a las hembras es 1 a 1 (Flores-Martínez, 2005). Esta conducta ha sido observada en otras especies del genero Myotis como M. myotis, M. emarganatus y M. daubentonii (Newak, 1994; Burlan et al., 1998; Laucen y Barclay, 2003), en las cuales los machos migran y las hembras permanecen en el mismo sitio todo el año.

Características microclimáticas y selección de los refugios Geográficamente, el Golfo de California se ubica dentro de la región subtropical y presenta marcadas fluctuaciones en el clima (Case et al., 2002). Durante el invierno y parte de la primavera, los vientos dominantes son del norte, lo que ocasiona bajas temperaturas en esta parte norte del Golfo (Bourillon et al., 1998). El resto del año predominan los vientos cálido-húmedos del sureste (Bourillon et al., 1988; Case et al., 2002). Debido a que la vegetación es escasa y a la ausencia de cuevas en estas islas, el uso efectivo de las grietas y las rocas ha permitido a M. vivesi utilizar estas islas como zonas de refugio durante todo el año. Sin embargo, a pesar de que el tipo de refugio utilizado por M. vivesi es relativamente ubicuo en estas islas la selección de los lugares de refugio pudiera estar determinada a minimizar el impacto de los vientos fríos durante el invierno y el intenso calor provocado por las radiaciones solares

37 durante el verano. Posiblemente la selección de refugios con características térmicas adecuadas pudiera tener su impacto sobre el éxito reproductivo de esta especie. (Kunz 1982, 1990; Brigham y Fenton, 1986; Entwistle et al., 1997; Bihari 2004). Esto lo demostró Kerth et al. (2001), al ver que las hembras de Myotis bechteinii prefieren tener un refugio con temperatura adecuada para sus crías. Dentro de los refugios de los murciélagos existieron variaciones significativas de la temperatura y la humedad a lo largo del año, siendo el verano la etapa más cálida y seca y estos valores fueron significativamente diferentes al del exterior. Durante noviembre y febrero la temperatura promedio dentro de los refugios fue baja (entre 14 y 20 oC). En diciembre los murciélagos tuvieron una conducta pasiva ante nuestra presencia y presentaban una temperatura corporal baja al tacto cuando eran capturados; esto nos sugiere de manera indirecta que probablemente M. vivesi tiene la capacidad de entrar en torpor durante los periodos más fríos. Esta conducta podría permitirles reducir el gasto energético durante el periodo de reposo ya que la tasa metabólica de descanso se incrementa linealmente con la disminución de la temperatura ambiental (Hamilton y Barclay, 1994; Speakman y Thomas, 2003). El entrar en torpor es una estrategia que tienen los murciélagos para el ahorro de energía en periodos de invierno. Estudiando las hembras de Eptesicus fuscus Lausen y Barclay (2003) vieron que existía una relación entre las características del refugio y el estado de torpor. El refugio con una entrada larga y profunda donde los murciélagos están en estado de lactancia, es más estable y mantienen el calor, en comparación con las perchas poco profundas usadas por hembras preñadas y en pos-lactancia. En el análisis de correlación entre las variables ambientales y la densidad, se observó una relación significativa de la densidad de M. vivesi dentro de los refugios con la temperatura y no así con la humedad relativa. Esto nos podría indicar que la temperatura es un factor más importante en la selección de las zonas de refugio en esta especie que las condiciones de humedad. De manera similar en otras especies de murciélagos insectívoros neárticos se ha encontrado que la temperatura es un parámetro importante en

38 la selección del refugio (Swier, 2003). Dentro de los refugios los valores de humedad relativa se mantuvieron relativamente estables con los cambios de temperatura. A pesar de que este estudio tiene la limitación de no haber estimado los parámetros de temperatura y humedad bajo piedras en zonas no usadas por murciélagos, es posible que el calor generado por los murciélagos y la pérdida de agua a través de la membrana durante los meses más secos contribuyan a modificar el microambiente del interior de los refugios (Burnett y August, 1981; Bakken y Kunz, 1988). Posiblemente, junto con el periodo de mayor disponibilidad de alimentos, el tiempo de parto en estas especies está sincronizado a fin de que los neonatos nazcan en el periodo en que los valores de temperatura sean más apropiados. El rango de los parámetros diurnos de temperatura y humedad dentro de los refugios de M. vivesi en el tiempo de aparición de los neonatos se encuentra en el observado para otras especies de murciélagos insectívoros (Kerth et al., 2001; Craig et al., 2006; Lausen y Barclay, 2003; Solick y Barclay. 2006) A pesar de no haber diferencia estadística en la densidad de murciélagos entre las cuatro zonas estudiadas, la localidad de Cardonosa tuvo la tendencia a presentar valores mayores de densidad en julio y diciembre. Probablemente esto está relacionado con la posición geográfica de esta zona (sureste) y la topografía del terreno, ya que la zona de Cardonosa se encuentra dentro de una cañada, la cual la protege de los vientos del noreste. Es por esta razón que durante los meses de invierno (diciembre–marzo) Cardonosa tiene temperaturas más elevadas que el resto de las zonas estudiadas y en el único muestro realizado en invierno (diciembre) Cardonosa presentó los valores más alto de densidad de murciélagos. Esto sugiere que M. vivesi podría realizar movimientos locales a lo largo del año dentro de Isla Partida a fin de encontrar condiciones más óptimas de temperatura del refugio.

Conclusiones - En este trabajo se confirmó que la población de murciélagos que vive en Isla Partida Norte es importante para su conservación, ya que en ciertas fechas del año alberga un gran número de hembras y de crías. Estos datos sugieren que Isla Partida Norte es una población de maternidad.

- En el análisis de correlación entre las variables ambientales y la densidad, se observó una relación significativa de la densidad de M. vivesi dentro de los refugios con la temperatura y no así con la humedad relativa. Esto nos podría indicar que la temperatura es el factor más importante en la selección de las zonas de refugio de esta especie; y no así, las condiciones de humedad.

Capítulo III. Estrategia de ecolocalización del murciélago pescador Myotis vivesi en Isla Partida, Golfo de California

Introducción Las especies de murciélagos que tienen una flexibilidad para cazar pueden tener acceso a más recursos y explorar otros hábitats en comparación con las especies que son más restringidas. Por ejemplo, se sabe que especies de Noctilio (Noctilionidae) y algunas especies de Myotis (Vespertilionidae) a la hora de alimentarse de pequeños peces aprovechan de los insectos que están sobrevolando el agua, de esta forma están tomando recursos de dos hábitats distintos (Britton et al., 1997; Jones y Rayner, 1988, 1991; Kalko et al., 1998; Schnitzler et al., 1994). Sin embargo, esta flexibilidad de poder obtener alimento de diferentes medios requiere de adaptaciones especificas, conductivas y sensoriales. Las características acústicas del comportamiento y la forma de encontrar su alimento determina la importancia de la ecolocalización en los murciélagos. Por ejemplo, al arrastrar las garras sobre el agua el murciélago provoca una serie de ondas, esto produce una serie de ecos (Boonman et al., 1998), y por lo tanto se cree que puede localizar a su presa (Siemers et al., 2005) esto es semejante en las especies de murciélagos que cazan en el aire lejos de obstáculos. En ambos casos, la ecolocalización es la herramienta principal para obtener alimento; esto difiere con especies de murciélagos que obtienen su alimento en selvas con obstáculos y que su alimento esta estático, como son las frutas (Siemers et al., 2005). Cuando los ecos se enmascaran unos con otro, por las condiciones del ambiente, éstos utilizan herramientas sensoriales adicionales como son la vista, el olfato, lo cual les ayuda a encontrar su alimento (Arlettaz et al., 2001; Fenton, 1990).

41 La flexibilidad de la conducta de los murciélagos en la mayoría de los grupos es subestimada en estos tiempos (Schnitzler y Kalko, 1998; Weinbeer y Kalko, 2004). En especial en algunas familias de murciélagos como los son los murciélagos, como son los Neotropicales (Phyllostomidae). Estos murciélagos toman su alimento cerca o en la superficie de la vegetación (Schnitzler y Kalko, 1998). Sin embargo, estudios recientes de radiotelemetría sugieren que algunos murciélagos insectívoros de la familia de los Phyllostomidos como es Lampronycteris brachyotis el cual se creía obtenía su alimento en la parte del dosel del bosque, se encontró alimentándose en la parte alta de los bosques (Weinbeer y Kalko, 2004). Otro phyllostomido, como Micronycteris hirsuta, Tonatia saurophila, y Trachops cirrhosus, fueron observados en una jaula de vuelo, con un pequeño saltamontes como presa. En este trabajo, se vio que los saltamontes eran localizados en el momento del vuelo o en el momento que éste aterrizaba, es decir que los murciélagos localizaban a sus presas por el movimiento de las alas del saltamos (Schnitzler et al., 1994). En este sentido la ecolocalización se asume como parte de una adaptación para orientarse en el espacio y para encontrar su alimento entre la densa vegetación. Se ha visto que todos los murciélagos Phyllostomidos emiten un sonido típico de baja frecuencia, débil, corto de una frecuencia-modular (FM las llamadas de ecolocalización de banda ancha), son para ubicarse en el espacio (Kalko, 2004; Kalko y Condon, 1998). Al acercarse a su alimento, en contraste con murciélagos que cazan insectos aéreos, los murciélagos Phyllostomidos no cambian los parámetros de las llamadas, en particular, ellos no producen la fase terminal, llamadas cortas emitidas en una tasa alta de repetición antes de la captura (Weinbeer y Kalko, comunicación personal). Una explicación de esta conducta es que probablemente el hecho de que sus presas estén inmóviles, no le requiere al murciélago las maniobras complejas de persecución y localización de objetivo móvil como es el caso de insectívoros aéreos (Kalko, 2004; Kalko y Condon, 1998). Dentro de los Phyllostomidos se encuentra el murciélago Macrophyllum macrophyllum Schinz, el cual obtiene su alimento sobre el agua (Harrison, 1975). Características acústicas especiales permiten utilizar la ecolocalización

42 para la captura de insectos (Weinbeer y Kalko, 2004). En contraste a la ecolocación uniformemente estructurada de la mayoría de los Phyllostomidos, las llamadas de M. macrophyllum se parecen a otros murciélagos que cazan insectos en el aire de diferentes familias (Jones y Rayner, 1988, 1991; Kalko 2004; Schnitzler et al., 1994). En particular, con las llamadas típicas de la búsqueda y del acercamiento y de la fase terminal (Weinbeer y Kalko, comunicación personal). En el campo, M. macrophyllum tiene una flexibilidad para obtener su alimento, ya que rastrea en la mayor parte de la superpie del agua para obtener insectos (Weinbeer et al., 2006). También se observó que agarra insectos en el aire, al igual que se le vio capturándolos cerca a bancos de plantas acuáticas (Hydrilla verticillata; Meyer et al., 2005). Aunque la mayoría de las partes de esta planta están sumergidas, las hojas de esta planta están en la parte superior del agua, sobresaliendo unos pocos milímetros de la superficie. En este caso se asume que los ecos que producen H. verticillata que rebotan en estas hojas le ayuden a obtener su alimento (Schnitzler y Kalko, 2001). Por otro lado, podemos ver que la alimentación constituida por peces es muy rara en los murciélagos (Kalko et al., 1998), este tipo de alimentación pudo haber evolucionado independientemente en dos familias de murciélagos Vespertilionidae y Noctilionidae (Kalko et al., 1998). En el caso de los Vespertilionidae está Myotis vivesi cuya alimentación está constituida principalmente por fuentes marinas y es muy poco conocida (Maya 1968; Flores-Martínez 2005). Esta especie presenta algunas modificaciones en su sistema renal para soportar una gran cantidad de sal en su alimentación (Casotti et al., 2006). De igual forma, tiene algunas modificaciones en su anatomía como es la gran elongación del uropatagio, el cual le sirve de bolsa para depositar a sus presas y unas garras muy grandes oprimidas lateralmente en forma de gancho lo cual le facilita la captura de los peces (Villa 1966; Maya 1968; Flores-Martínez 2005; Casotti et al., 2006). El sistema o comportamiento de ecolocalización de M. vivesi es a un desconocido, así como las características físicas y espectrales de sus llamadas de ecolocalización (Flores-Martínez, 2005). En base a las características físicas

43 de la especie, uñas muy grandes lateralmente comprimidas en los pies en forma de gancho y grabaciones preliminares de los sonidos emitidos por individuos de M. vivesi saliendo de sus refugios en Isla Partida hacia la zona de caza (Flores-Martínez observaciones de campo), nosotros podemos predecir que M. viveis localiza su alimento mediante ecolocalización. Así el objetivo de este trabajo fue el de conocer como M. vivesi localiza, discrimina y captura sus presas sobre la superficie del mar. Materiales y Métodos Sitio de estudio El trabajo de campo se llevo acabo en Isla Partida, Golfo de California (28º 52 latitud N 113º 02´ longitud W), donde se encuentra la población más grande de M. vivesi (Flores-Martínez et al. 2005) (Figura 3.1).

Figura 3.1. Isla Partida Norte, Golfo de California, México.

Grabaciones

44 Premier etapa. Se realizaron grabaciones de las llamadas de murciélagos a la hora de alimentarse en el mar abierto en Isla Partida Norte, estas se grabaron con un Ultrasoundgate (Avisoft Co., Berlin, Alemania), el cual cuenta con un micrófono diseñado para detectar ultrasonido, permitiendo grabar señales que van desde los 20 kHz. hasta más de 200 kHz. Las señales se grabaron y se guardaron directamente en una computadora.

Segunda etapa. Consistió en mantener murciélagos en condiciones controladas en una jaula de vuelo (7 mts. largo X 3 mts. ancho), esta casa de vuelo tenia una piscina de 2mts. de ancho X 5mts. de largo. Para no hacer replicas de las grabaciones, se soltaban sólo un murciélago.

Para documentar la conducta del murciélago, se filmó con una cámara de alta velocidad sensible a la luz infrarroja (CamRecord, Slomotec) Las filmaciones se realizaron con una sensibilidad de 1000/s y una capacidad de 8GB, lo que nos mostró detalles de la captura las presas de M. vivesi. Simultáneamente, se grabaron las llamadas o sonidos emitidos por los murciélagos (ecolocalización), que produjeron para encontrar su presa, este aparato registró el tipo de frecuencia que emitió el murciélago (grabadora Avisoft Co., Berlin, Alemania). Todas las grabaciones se analizaron con el programa SASLab, Avisoft Co., Berlin, Alemania. Todas las grabaciones se analizaron con el programa SASLab, Avisoft Co., Berlin, Alemania.

45 Resultados Se describo el llamado de ecolocalización de Myotis vivesi en Isla Partida Norte, Golfo de California, en total, se revisaron 395 grabaciones de sonidos en condiciones naturales aun que algunas etapas fueron registradas en más de mil ocasiones. El patrón registrado más común está principalmente constituido por un componente de frecuencia modulada, con barrido descendente, amplia banda de frecuencias y corta duración (Figura 3.2). En la parte final de los pulsos se puede apreciar un componente corto de banda estrecha. En general, presentan una forma curvilínea. En la figura 3.2 se aprecian sonidos cortos (<10 ms), de banda ancha (ca. De 25-35 kHz), y en la frecuencia modular (FM) Las señales de la búsqueda están en 50 kHz, con un rango de 16-18 kHz. Los resultados muestran que los llamados de ecolocalización de M. vivesi están compuestos por las tres fases: de búsqueda, de acercamiento y fase terminal, como lo presentas otras especies murciélagos (Figura. 3.3, 3.4 y 3.5).

Descripción de las fases Los resultados muestran que los llamados de ecolocalización de M. vivesi están compuestos por las tres fases: de búsqueda, de acercamiento y fase terminal, como lo presentan otras especies de murciélagos (Figura. 3.3-3.5). Fase de búsqueda. En las figuras 3.3, 3.4 y 3.5 se muestran con más detalle los eventos de ecolocalización registrados en las tres fases ya señaladas.

• Fase de búsqueda

Valor más alto en el primer armónico

Intervalo de pulso

Búsqueda 1074 llamadas

Duración del pulso (ms) 6.1 ± 09 Intervalo del pulso (ms) 97.5 ± 24.6

Ancho de banda (kHz) 16.3 ± 5.9

Figura 3.3. Comportamiento de ecolocalización de Myotis vivesi cazando sobre el mar, fase de búsqueda.

47 Valor más alto en el primer armónico

Acercamiento 266 llamadas

Duración del pulso (ms) 4.7 ± 1.0 Intervalo del pulso (ms) 40.5 ± 11.9

Ancho de banda (kHz) 16.3 ± 5.9

Figura 3.4. Comportamiento de ecolocalización de Myotis vivesi cazando sobre el mar, fase de acercamiento.

Valor más alto en el primer armónico

Terminal 566 llamadas

Duración del pulso (ms) 2.3± 0.4 Intervalo del pulso (ms) 20.7± 4.4

Ancho de banda (kHz) 14.5± 4.9

Figura 3.5. Comportamiento de ecolocalización de Myotis vivesi cazando sobre el mar, fase terminal.

Estrategia de búsqueda en la jaula de vuelo Búsqueda. En esta parte, el murciélago se encuentra girando de un extremo a otro de la piscina, lleva las piernas abiertas con las garras extendidas y el uropatagio extendido y la boca abierta. Al pasar de un lado a otro de la piscina

48 éste mantiene las garras y una parte del uropagion sumergido dentro del agua (2 cm) recorriendo una distancias entre 20 y 30 centímetros a lo largo de la piscina, en algunas ocasiones el murciélago tiene un leve movimiento de un lado a otro, pero casi siempre su cuerpo va perpendicular al agua, las distancias entre el murciélago y el agua, va entre 10 y 20 centímetros. En esta parte, el murciélago tiene dos conductas, la primera es que esta sin dirección y dando vueltas alrededor de la piscina y la segunda es que sólo esta pasando sobre un solo lugar. Durante todo este tiempo el murciélago se encuentra emitiendo sonidos. Cuando esta pasando por el mismo lugar siempre es en la misma dirección, es decir, siempre es de ida y nunca de vuelta, dichos movimientos regularmente son sobre ó entre los trozos de peces, tratando de ubicarlos para después tomarlos, aunque en ciertas ocasiones tomaba trozos de peces de otro lugar, diferente en el que estaba dando vueltas. En algún momento se encontraron dos murciélagos dentro de la jaula de vuelo, se noto que si uno de ellos empezaba pasar por un solo lugar el segundo lo seguía hasta que el primero tomaba un trozo de pez, mientras que el segundo daba una o dos vueltas más por el mismo lugar. También lo que se observó, es que al pasar con las garras dentro del agua esto provocaba una leve ondulación, en el agua lo cual provocaba que los trozos de peces que se encontraban sobre el agua se hicieran más visibles, por el choque entre pequeña olas. Lo cual posiblemente, ayudaban a los murciélagos a encontrarlos más fácilmente. También lo que se aprecia, es que el murciélago posiblemente recuerde donde esta el alimento, ya que en ocasiones regresaban al mismo lugar donde tomaron el primer trozo de pez, a realizar la búsqueda con varios vuelos y por el mismo lugar (Figura 3.6).

Captura en el primer intento. En esta parte, el murciélago antes de iniciar la captura siempre emite algunos sonidos, cuando se dirige al objetivo éste va con las patas abiertas y las garras extendidas, lo cual ayuda a que el uropatagio se encuentre totalmente abierto. Durante esta parte, lleva las piernas y el uropatigio perpendicular al cuerpo, al mismo tiempo el murciélago mantiene la boca abierta hasta llegar a su objetivo. Para tomar el trozo de pez, el murciélago hace una leve inclinación del cuerpo hacia arriba, lo cual le permite

49 sumergir las patas con el uropatigio dentro del agua, de esta forma toma el trozo de pez, ya que lo coloca dentro del uropatigio y lo envuelve (en algunos casos lo lleva directo a su boca). El vuelo es directo, es decir, mantiene el cuerpo sin movimientos y paralelo al agua; a una distancia de 10 a 20 cm., separación del agua. La mayoría de las veces que tomo el pez, el murciélago no toca el agua hasta llegar a su objetivo. Al realizar el experimento con trozos de peces, dos arriba y dos abajo del agua, para el murciélago fue indistinta la posición del pez, ya que los tomó en ambos lugares sin problema alguno. De esta parte, al registrar que el murciélago toma los peces sin problema (arriba y abajo) del agua y el que lleve la boca abierta durante la captura son dos cosas sumamente importantes en cuanto a la conducta del murciélago (Figura 3.6).

Figura 3.6. Conducta de Myotis vivesi a la hora de tomar su alimento en la jaula de vuelo.

Discusión La alimentación de fuentes marinas es rara en las especies de murciélagos, se sabe que Myotis vivesi se alimenta de pequeños peces y crustáceos, las características morfológicas del murciélago, como es el tener grandes garras le

50 permite tomar peces del agua. La ecolocalización es un método de percepción sensorial por el cual este murciélagos pueden localizar su alimento (Thomas et al., 1987). Durante la ecolocalización M. vivesi emitió una serie de sonidos cortos en banda ancha (25-35 khz), característico también en otros murciélagos (Thomas et al., 1987). Las frecuencias de ecolocalización están constituidas por dos tipo principales de elementos estructurales: Frecuencia Modular (FM) o banda amplia y de Frecuencia Constante (CF) o banda estrecha. Estos componente son utilizados por los murciélagos de manera alternativa dependiendo del tipo de hábitat que explotan, la situación de forrajeo y la distancia a la cual se hallan de su presa; los murciélagos pueden producir pulsos con uno de los dos componentes, aunque gran parte de ellos emplean combinaciones de ambos (Neuweiler, 1989). Algunos autores como Schitzler y Kalko (1998; 2001) emplean el término de Frecuencia Casi Constante (QFC), para describir los elementos con baja modulación que barren una banda estrecha de frecuencias en tiempos relativamente largos, como los encontrados aquí para esta especie. Los resultados de nuestro estudio revelaron que M. vivesi tiene un comportamiento típico de ecolocación, se puede pensar que se alimenta en mar abierto sin ningún problema. M. vivesi, al igual que otras especies de murciélagos, emite las tres fases para obtener su alimento, fase de búsqueda, de aproximación y fase terminal; emitiendo sonidos cortos de banda ancha (<10ms) (ca. De 25-35 kHz), y frecuencia-modular (FM) con señales de búsqueda que van de aproximadamente 50 kHz a 16-18 kHz con la principal energía en la parte más baja del primer armónico. Los registros tomados para M. vivesi concuerdan con los descritos para la familia de los Verpertilionidos que cazan insectos, los pulsos son generalmente de banda de frecuencia ancha, cuyo patrón normalmente es de FM-QFC de duración intermedia de (3-10 ms) y frecuencia media de 30-60 kHz. El componente FM presenta una modulación lineal del periodo con respecto al tiempo, que en el sonograma aparece con forma curvilnear (Guillén, 1996). En comparación con especies que se alimentan de peces, como es el caso de

51 M. ricketti, emite sonidos cortos y de alta velocidad de ecolocalización. Los sonidos registrados de este murciélago van entre la frecuencia de 70 a de 28 kHz, los cuales son similares a los registrados para M. vivesi en el Golfo de California. Un caso similar fue reportado por Kalko et al. (1998) en N. leporinus, en este trabajo menciona que este murciélago recurre primero la frecuencia CF y posteriormente una combinación de frecuencias de CF-FM, como lo hacen algunos murciélagos insectívoros; al parecer Noctilio leporinus, caza a los peces a la hora de que estos saltan, lo cual provoca movimiento en el agua, en este momento son detectados por el sistema de ecolocalización del murciélago. También, mencionan que N. leporinus hace a uso del método de rastreo o “trawling”, el murciélago se la pasa volando en una cierta área sumergiendo las garras en al agua, el área donde este rastrea regularmente es una zona donde sabe existe la presencia de peces y sabe que un momento dado capturara alguno (Kalko et al., 1998). M. vivesi mantiene una frecuencia FM la cual es similar a la reportada para la especie de Noctilio leporinus, los valores de los sonidos emitidos por esta especie van de entre 3.9 a 17ms. Mientras que M. vivesi es de 10ms, los valores de las señales van entre 52.8 a 56.2 kHz. Aunque esta especie presenta diferentes llamados son similares a los que se encontró en M. vivesi (Schnitzler et al., 1994). La información obtenido de M. vivesi es similar a la de otra especie que se alimenta sobre el agua, como lo reporta y Kalko et al., (1998) ya que ella reporta que N. albiventris busca sus presas entre 20 y 30 cm sobre el agua. Captura insectos en la superficie del agua, N. albiventris emite un grupos de señales de ecolocación que va de 10-11 ms. Cuándo N. albiventris caza la duración de pulso e intervalo de pulso son reducidos, el componente de CF es eliminado, y una fase terminal con señales cortas de FM (la duración 2 ms) en tasas altas de repetición (150-170 kHz) (Roald y Grinnell, 1985) El grabar el comportamiento de la conducta de M. vivesi con una cámara, reveló que el murciélago se alimenta directamente de la superficie del agua, al capturara su alimento sobre el agua el murciélago emite una sucesión rápida de llamadas antes de la captura (fase de búsqueda, de acercamiento y

52 de captura). Se creé que M. vivesi al igual que otras especies, utiliza ciertas estrategias para obtener su alimento, como lo es, el estar volando en un solo lugar durante varias veces (rastrillando el área) como lo presenta Macrophyllum macrophyllum, Myotis albescens, Rhynchonycteris naso y Noctilio albiventris, Noctilio leporinus, M. daubentonii, Myotis capaccinii (Schnitzler et al., 1994; Kalko et al., 1998; Fenton y Bell 1999; Aihartza et al., 2008). M. vivesi a la hora de estar buscando su alimento sobrevuela la superficie a una altura de mas o menos 10 a 20 centímetros, esta conducta la presentan N. leporinus y Mcrophyllum macrophyllum (Schnitzler et al., 1994; Weinbeer et al., 2006), como una estrategia para obtener su alimento. Otra posible estrategia que utiliza M. vivesi es la ondulación del agua al estar rastrillando sobre ella, al igual que las ondulaciones que forman los peces al tocar la superficie del agua, esta estrategia la presenta M. macrophyllum ya que utilizan las ondulaciones del agua al chocar con una planta acuática, Hydrilla verticillata, aunque la mayoría de las partes de esta planta están sumergidas, las hojas de esta planta están en la parte superiores, sobresaliendo unos pocos milímetros encima de la superficie. Probablemente los ecos que se producen con estas hojas le ayuden a obtener su alimento (Schnitzler y Kalko, 2001).

Conclusión Encontramos que los llamados de M. vivesi para obtener su alimento son de baja frecuencia, presenta las tres fases como son la de búsqueda, acercamiento y captura. También describimos como el murciélago utiliza otras técnicas para capturar su alimento como lo es el estar sobrevolando una zona varias veces (rastrillando). Esta información nos dará pie para planear trabajos de conservación con la especie, ya que al tener identicaza sus llamados podremos individuos en lugares donde se cree esta exterminado y de igual forma podremos buscar nuevas colonias.

53 DISCUSIÓN GENERAL La información obtenida en esta tesis nos muestra algunas de las estrategias que tiene Myotis vivesi para poder vivir en las Islas del Golfo de California, como lo es: la manera de dispersarse a lo largo de su distribución, la selección de refugios, el modo de ecolocalizar y de encontrar su alimento.

La estructura genética de Myotis vivesi a lo largo de su distribución geográfica, indica que los valores de heterocigosidad se asemejan a los encontrados en especies de murciélagos que habitan en islas y continentes. M. vivesi mantiene niveles elevados de flujo genético, similares a los encontrados en otras poblaciones de murciélagos que viven en islas como R. affinis FST

=0.40; M. myotis FST = 0.35). El flujo de genes o el intercambio genético ocurre a través de inmigraciones y emigraciones de individuos (Couvet, 2001). Los valores elevados de flujo genético indican que las poblaciones de M. vivesi no están aisladas entre si por la distancia que existe entre las islas donde habitan. Estudios con microsatélites en poblaciones de murciélagos han mostrado una diferenciación genética mínima, debido a la capacidad de volar que tienen los murciélagos, dando como resultado un extenso flujo genético entre sus poblaciones (McCraken, 1987; Worthing et al., 1999). Por otra parte, el resultado del análisis de ADNmt sugiere que este alto flujo génico no se puede traducir en altas probabilidades de restaurar las islas para ser colonizadas de nuevo. La filopatría femenina parece ser una conducta característica de los Vespertilionidos; una alta tasa de flujo genético en algunas especies de murciélagos donde las hembras son filopátricas se mantiene debido a los movimientos migratorios de los machos, conectando así las poblaciones (Burland et al., 1998; Nowak, 1994, Petit y Meyer, 2000; Castella et al., 2000). Es probable que en M. vivesi ocurra un fenómeno similar, ya que en este trabajo, y en trabajos anteriores encontramos que la mayor parte del año se encuentran grupos de hembras en Isla Partida Norte, en los meses de verano cuando las hembras tiene a sus crías la proporción es mayor para las hembras, mientras que en los meses de invierno la proporción de sexos es uno a uno (Maya, 1968; Flores Martínez, et al., 2005)

54 Otra posibilidad del elevado flujo genético de la especie puede deberse a la dispersión de la especie. Se encontraron nuevas poblaciones de Myotis vivesi a lo largo de su distribución y, aunque se puede pensar que estas poblaciones no se hayan descrito con anterioridad, no se descarta la idea de que la especie pueda estar colonizando nuevos lugares; lo cual incrementaría su diversidad genética (McCracken, 1987). Entre las colonias europeas de M. bechsteinii, M. nattereri, y P. auritus, por ejemplo, la mayor parte del flujo genético parecen ocurrir vía acoplamiento, (localizada 10-500 kilómetros de las colonias maternales) donde los sexos se encuentran y copulan durante finales del verano (Kerth et al., 2003; Veith et al., 2004). En las colonias de maternidad de M. bechsteinii, la filopatría de las hembras casi es completos (p. ej. la permanencia de hembras en sus colonias natales para criar), por lo cual la nueva formación de colonias es muy rara (Kerth et al., 2003). Los altos niveles de flujo genético en M. vivesi probablemente estén mediados por los movimientos migratorios de los machos, ya que al menos en Isla Partida Norte los machos migran de la población en ciertas épocas del año. Esta conducta ha sido reportada en algunas especies de murciélagos, como M. myotis, M. emarginatus y M. daubentonii y Plecotus auritus, los cuales tienen un aumento en la presencia de machos en otoño-invierno y una disminución en el verano (Villa, 1966; McCraken, 1987; Nowak, 1994). Lamentablemente, poco se sabe sobre el modelo espacial de dispersión o el sistema de acoplamiento del murciélago pescador, por consecuencia, no sabemos el grado de la alta conexión genética encontrada en nuestro estudio. Las 11 islas de nuestro estudio, apoyo la densidad del área sustancial del murciélago pescador (por ejemplo>. 10000 individuos en Isla Partida Norte; Herrera y Flores-Martínez et al., 2005; Flores-Martínez, 2005), pudiendo determinar que esta isla les provee de un hábitat conveniente. Sin embargo, otras islas pueden ser deficientes en una o varias características importantes para su hábitat. Por ejemplo, Isla San Jorge, donde los murciélagos aparecen en menor número, grandes cantidades de guano de pájaro se han acumulado en los intersticios del talus, haciéndolo inaccesible para la creación de refugios

55 para estos murciélagos (Flores-Martínez y Herrera, observaciones personales). Las islas restauradas también pueden ser deficientes en señales (p.ej. los sonidos de llamadas de murciélagos) para indicar la presencia de individuos. Recientemente, los trabajos en conservación se han hecho cada vez más concientes a cerca de la importancia de atracción, específicamente en la selección de hábitat (Reed, 1999).

Nuevamente Isla partida sigue siendo una de las colonias más importantes de esta especie de murciélagos. Flores-Martínez (2005) reporta una población de murciélagos mayor a 10 mil individuos en esta isla. Los datos obtenidos en esta tesis muestran que la población tiene valores más altos con una población de 16 mil individuos. Los censos realizados en este trabajo abarcan las temporadas de invierno y verano, como podemos ver, la información obtenida muestra que las hembras son filopátricas; ya que durante todo el año se encuentran individuos en la isla aumentado de abril a julio, ya que son los meses cuando tienen a sus crías, por lo que se confirma que Isla Partida es una colonia de maternidad durante estos meses del año. Mientras que el número de machos disminuye en el verano y aumenta en invierno (Flores-Martínez, 2005). La decisión de donde vivir trae grandes consecuencias a los animales, en los murciélagos la correcta selección del refugio es importante, se decide tomando en cuanta diferentes factores, uno de ellos es el denominadas microclimas, está cualidades influyen en la supervivencia y reproducción de los murciélagos. Los factores térmicos son muy importantes en la selección de refugio de los murciélagos (Kerth et al., 2001). En el caso de M. vivesi al igual que otras especies de murciélagos la temperatura y la humedad juegan un papel importante en la selección del refugio. Encontramos que la temperatura tiene mayor importancia que la humedad, a diferencia de otros trabajos en los cuales mencionan que tanto la temperatura como la humedad son importantes para la selección del refugio (Lacki, 1984; Kerth et al., 2001; Lausen y Barclay, 2003). Durante los registros de la temperatura y los censos de las zonas de estudio, se observó que la

56 actividad de los murciélagos es menor en los meses de invierno, lo cual puede indicar que esta especie entra en estado de torpor, pudiendo estar relacionado con la temperatura de los refugios ya que en estos meses la temperatura es menor a los meses de invierno. Esta conducta la tienen otras especies de Myotis ya que de esta forma conservan energía para otras actividades, principalmente para su alimentación (Kerth et al., 2001). Otra información importante es que los murciélagos mantienen movimientos locales, ya que en verano los individuos se encontraban en números iguales en todas las zonas de estudio, pero en el mes de diciembre se encontró un mayor número de individuos solo en la solo zona de Cardonosa, esto se puede deber a que esta zona se encuentra protegida al encontrarse en una cañada. Una de las limitantes de este estudio fue no tener información de lugares donde no haya grupos de murciélagos, es decir, posibles refugios. También el no tener datos de otros refugios en otras islas, de esta forma podríamos tener información para comparar, y poder confirmar que las hembras regresan a Isla Partida Norte a tener a sus crías.

Más de 760 especies de microquiropetra tienen desarrollado el sistema de ecolocalización para su orientación y la detección de su alimento. La evolución del vuelo y la posibilidad de ecolocalizar les provee a los murciélagos una oportunidad de subsistir en diferentes hábitas, así como obtener diferentes tipos de alimentación como insectos, pequeños vertebrados, frutas, sangre, peces y polen (Schnitzler et al., 2003). Recientes métodos han ayudado a la descripción de la ecolocalización de los murciélagos, grabación de sonidos y su análisis, monitoreo acústico, documentación fotográfica, visión nocturna, cámaras infrarrojas y radiotelemetría (Weinbeer et al., 2006; Weinbeer y Kalko, 2007; Aihartza et al., 2008). La descripción de la ecolocalización de M. vivesi, nos indica que tiene un llamado tipo de murciélago, el cual cuenta con las tres fases: de búsqueda, de acercamiento y la fase final de captura (Fenton y Bell, 1979). Para obtener su alimento hace uso de otras estrategias, como la de estar sobrevolando un solo lugar durante un tiempo determinado, como si estuviera rastrillando la zona, lo

57 cual en un momento dado puede obtener su alimento al azar. También podemos pensar que utiliza la forma de las ondas que se forman en el mar al estar introducción sus garras en el agua, lo cual produce que los sonidos hechos por el murciélago se reflejen en dichas olas y de estar forma pueda detectar a sus presas (Kalko et al., 1998; Fenton y Bell, 1999; Weinbeer et al., 2006, 2007; Aihartza et al., 2008). La morfología de M. vivesi es determinante para el tipo de alimentación que tiene, es decir, la forma de gancho que tienen sus garras le permiten tomar su alimento a una distancia minima del agua, como lo hace las especies de murciélagos Macrophyllum macrophyllum, Myotis albescens, Rhynchonycteris naso, Noctilio albiventris, Noctilio leporinus, M. daubentonii y Myotis capaccinii (Schnitzler et al., 1994; Kalko et al., 1998; Fenton y Bell, 1999; Weinbeer et al., 2006; 2007; Aihartza et al., 2008). Ya que al sobrevolar el agua los murciélagos solo introducen sus garras y pueden capturar a sus presas, también la forma del uropatigio, ya que es grande y se puede envolver como si fuera una bolsa, lo cual lo utilizándo para transportar sus presas El tener identificados los llamados de M. vivesi, es decir, la ecolocalización, da pie para crear programas de recuperación de la especie en el Golfo de California. Existen islas grandes en las cuales se ha reportado la presencia del murciélago, el buscarlo con métodos de redes implica demasiado tiempo, pero ahora con la descripción de los llamados será más fácil tratar de encontrarlo. También, se pueden utilizar para la reintroducción de la especie en otras islas donde se sabe que ha sido extirpado por factores antropogénicos.

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RESEARCH ARTICLE

Conserving the endangered Mexican ﬁshing bat (Myotis vivesi): genetic variation indicates extensive gene ﬂow among islands in the Gulf of California

Chris H. Floyd Æ Jose´ Juan Flores-Martı´nez Æ L. Gerardo Herrera M. Æ Omar Mejı´a Æ Bernie May

Received: 11 November 2007 / Accepted: 12 March 2009 Ó Springer Science+Business Media B.V. 2009

Abstract The endangered Mexican fishing bat, Myotis we found weak population genetic structure and a pattern of vivesi, appears to have suffered widespread extinction and isolation by distance, while with mtDNA we found strong population decline on islands throughout the Gulf of Cal- structure but no isolation by distance. Our results indicate ifornia, largely due to predation by introduced cats and rats. that island subpopulations separated by large expanses of To restore populations of fishing bats and other native open water are nonetheless capable of maintaining high species, conservation efforts have focused on eradicating genetic diversity and high rates of gene flow. Unfortunately, introduced vertebrates from several Gulf islands. These little is known about the spatial patterns of dispersal or efforts assume that individuals from existing populations mating system of fishing bats, and these behavioral factors, will recolonize islands and that continued dispersal will in particular female philopatry, might reduce the probability help sustain vulnerable populations thereafter. However, of the species recolonizing Gulf islands. the extent of inter-island dispersal in fishing bats is unknown. In this study we analyzed patterns of genetic Keywords Dispersal Gene flow Gulf of California variation to gauge the extent of gene flow and, thus, Vespertilionidae potential dispersal among islands. DNA was sampled from 257 fishing bats on 11 Gulf islands (separated by ca. 6–685 km of open water), and individuals were genotyped Introduction at six microsatellite loci and haplotyped at a 282 bp fragment of the mtDNA control region. With microsatellites, Most of the historically recorded extinctions have occurred on islands (Ricketts et al. 2005), and many of the presently threatened species persist only in insular habitat fragments & C. H. Floyd ( ) (e.g., Garner et al. 2005; Loewl et al. 2005). When insular Department of Biology, University of Wisconsin-Eau Claire, 105 Garfield Ave, Eau Claire, WI 54701, USA populations go extinct, efforts often are made to restore e-mail: fl[email protected] habitat at those sites in the hope that dispersers from extant populations will recolonize empty patches (Scott et al. J. J. Flores-Martıńez O. Mejıá 2001). Continuing dispersal thereafter may be needed to Department of Zoology, National School of Biological Sciences, National Polytechnic Institute, Prolongacioń de Carpio y Plan de sustain vulnerable populations by boosting population size Ayala S/N, Colonia Casco de Santo Tomas, 11340 Mexico City, (Hanski 1999) and replacing genetic diversity lost to DF, Mexico genetic drift (Frankham et al. 2002). Thus, the effective- ness of restoration efforts depends largely on the dispersal L. G. Herrera M. Chamela Biological Station, Institute of Biology, National behavior of the threatened species (Scott et al. 2001). Autonomous University of Mexico, P. O. Box 21, However, accurate information on dispersal is often lack- 48980 San Patricio, Jalisco, Mexico ing because of the difficulty of tracking animal movements (Macdonald and Johnson 2001). C. H. Floyd B. May Genomic Variation Laboratory, Department of Animal Science, One of the many threatened island-dwelling species is Meyer Hall, University of California, Davis, CA 95616, USA the Mexican fishing bat (Myotis vivesi), a vespertilionid 123 Conserv Genet found almost exclusively on small islands in the Gulf of located in southern Spain, and M. punicus, in northern California (Maya 1968; Villa 1979). Fishing bats generally Morocco, suggested that neither species had ever bred on roost within rock crevices in talus, making them easy prey the opposite side of the intervening Gibraltar Strait, despite for introduced cats (Felis catus) and rats (Rattus spp., Villa its narrow width (14 km, Castella et al. 2000). We propose 1979; Donlan et al. 2003). These exotic vertebrates have that the much greater distances separating islands in the decimated populations of many native species on Gulf Gulf of California might present a considerable impedi- islands (Mellink 2002; Tershy et al. 2002; Wood et al. ment to fishing bat dispersal and, thus, to conservation of 2002;Va´zquez-Domıńguez et al. 2004) and have contrib- this species. To gauge the extent of inter-island gene flow uted to the apparent extinction and decline of fishing bat and, thus, potential dispersal by fishing bats in the Gulf, we populations in the Gulf (Ceballos and Navarro 1991). sampled DNA from fishing bats on Gulf islands and ana- Recent surveys of eight Gulf islands with historical records lyzed the distribution of genetic variation within and of M. vivesi found no sign of the species (Flores-Martıńez among islands. If inter-island dispersal by fishing bats were 2005; J. J. Flores-Martıńez and L. G. Herrera, unpublished rare, then we would expect to find substantial genetic dif- data). On at least three of these islands (Encantada, Gra- ferentiation, reflecting a divergence of allele/haplotype nito, and San Pedro Ma´rtir, Mellink 2002) cats and rats are frequencies among islands due to low levels of gene flow present. These issues prompted the Mexican government (Bohonak 1999; Hisheh et al. 2004). Because gene flow and IUCN to list the fishing bat as endangered (SEMAR- replaces alleles lost to genetic drift (Hartl 2000), we would NAT 2002) and vulnerable (IUCN 2006), respectively. also expect to find low genetic diversity relative to that In an attempt to restore fishing bats and other native found in non-insular populations (e.g., Telfer et al. 2003). fauna, conservation groups recently began eradicating Finally, if inter-island gene flow is restricted by distance exotic vertebrates, including cats and rats, from some of the then we should find a positive relationship between genetic Gulf islands (Mellink 2002). The restoration programs distance and geographic distance, in which more closely assume that, in lieu of artificial translocation, the threa- situated populations are genetically more similar than those tened species will recolonize restored islands by dispersal farther apart (Hutchison and Templeton 1999). from other islands (or the mainland) and that continued dispersal will thereafter sustain vulnerable populations (Scott et al. 2001). However, the extent of dispersal by Materials and methods fishing bats is unknown, and documenting these movements using direct methods would be problematical due to Study locations, tissue collection, and DNA extraction the volant, nocturnal activity of the species. Recently, however, molecular markers such as microsatellite loci and Fishing bats were sampled from 11 islands in the Gulf of mitochondrial DNA sequences and have become valuable California during March–July 2003 (Fig. 1). Nine of these tools for inferring the extent of dispersal, based on models islands had no introduced fauna or other environmental that link genetic structure (differentiation of allele fre- perturbations before or at the time of sampling. On Estanque quencies among populations) to gene flow, an outcome of cats were eradicated in 1999 (B.R. Tershy, personal com- dispersal (Waples and Gaggiotti 2006). munication), but they still persist on Salsipuedes (Mellink In this study, we used microsatellite and mitochondrial 2002). Fishing bats apparently can survive on islands with markers to measure genetic structure of fishing bats in the cats if alternative roosting sites on steep cliffs are available Gulf of California. Our objective was to use this informa- (Maya 1968) or predator densities are very low (Va´zquez- tion to infer the potential for reestablishment and Domıńguez et al. 2004). Minimum distance (Euclidean) persistence of fishing bats on restored islands. Microsatel- between sampled islands ranged from ca. 6 to 685 km; lite studies of other vespertilionids (Plecotus auritus, minimum distance between an island and the nearest of the Burland et al. 1999; M. myotis, Castella et al. 2000, 2001; other sampled islands ranged from ca. 6 to 154 km (Table 1). M. bechsteinii, Kerth et al. 2002a) in Europe and N. Africa Sampled islands ranged in size from 80 to 1,300 ha. found only weak genetic structure among mainland colo- Total number of individuals sampled was 257, consisting nies separated by distances ranging ca. 0.1–770 km, of 161 females (117 adults, 41 juveniles, three unknown indicating extensive gene flow in these bats. Racey et al. age), 90 males (73 adults, four juveniles, 13 unknown age), (2007) found that the presence of sea channels ca. 20– and six individuals of unknown sex and age. Bats were 90 km wide (English Channel and North Sea) did not captured using 12 m mist nets placed near bat colonies significantly affect the degree of genetic differentiation in during 18:00–06:00. To obtain genetic material, a 3 mm pipistrelle bats (Pipistrellus spp.), which indicated exten- diameter piece of wing membrane was removed with a sterile sive over-water movement. However, microsatellite biopsy-punch and stored in a cryogenic vial with 95% eth- analyses of two closely related Myotis species, M. myotis, anol (Worthington Wilmer and Barratt 1996). Genomic 123 Conserv Genet

Fig. 1 Islands in the Gulf of California where genetic samples of Mexican ﬁshing bats (Myotis vivesi) were collected. 1 Cayo, 2 Tijeras, 3 Colorado, 4 Santa Ine´s, 5 San Rafael, 6 Salsipuedes, 7 Partida Norte, 8 Estanque, 9 Piojo, 10 Muela, and 11 Encantada

DNA was extracted using GenElute (Sigma–Aldrich, St. 175 lM dNTPs, and 1 U each of FastStart Taq DNA Louis, MO, USA) tissue kits. We followed the manufac- polymerase and buffer (Roche, Indianapolis, IN, USA). turer’s extraction procedure except that we used only 1 mm2 Amplification conditions were 95°C for 4 min; 40 cycles of tissue per individual and digested the tissue at 55°C for of 95°C for 30 s, 55°C for 30 s, and 72°C for 2 min; then a 24 h while turning continuously. final extension of 7 min at 72°C. Double-stranded ampli- cons were purified using QIAquick PCR purification kits Laboratory analysis of genetic markers (Qiagen, Hilden, Germany) and sequenced in both direc- tions by using BigDye chain terminators on an ABI 377 mtDNA sequencing automated DNA sequencer (Applied Biosystems, Inc., Foster, CA, USA). We analyzed variation in a 282 bp fragment of the mtDNA control region amplified in a random subsample of 134 Microsatellite genotyping individuals from the eleven islands. The fragment was amplified using the primers L16517 (50-CATCTGGTTCTT We tested 24 microsatellite loci for polymorphism in eight ACTTCAGG-30; Fumagalli et al. 1996) and V23 (50-AACT fishing bats using primers developed for M. myotis (Petri TGTTCAGCACTTTAGAT-30, modified from H00651; et al. 1997; Castella and Ruedi 2000) and P. auritus Kocher et al. 1989). Polymerase chain reaction (PCR) (Burland et al. 1998). Thirteen of these loci were mono- amplifications were performed in 50 ll reactions contain- morphic and four others showed variation with poor ing 5–10 ng DNA, 0.5 lM each primer, 3.0 mM MgCl, resolution. The remaining seven loci (D9, D15, MM5, G30,

123 Conserv Genet

Table 1 Pairwise matrix of genetic distance (above diagonal) and geographic distance (below diagonal; km) between islands in the Gulf of California, where genetic samples were collected from Mexican ﬁshing bats (Myotis vivesi) in 2003 Islandsa Ca Ti Co SI SR Sa PN Es Pi Mu En

Ca – 0.135 0.008 0.763* 0.121 0.365 0.197 0.115 0.078 0.374* 0.250 0.008 0.000 0.001 0.001 0.017 0.008 0.022 0.012 -0.003 0.009 0.229 -0.057 0.187 0.052 0.341 0.374 0.586 0.276 -0.042 0.360 Ti 113.2 – 0.041 0.458* 0.000 0.066 0.000 0.000 0.000 0.084 0.006 -0.003 0.001 0.009 0.016 0.005 0.017 -0.006 -0.003 0.010 -0.296 0.004 0.038 0.326 -0.048 0.427 -0.513 -0.304 0.062 Co 118.8 5.6 – 0.666* 0.020 0.251 0.094 0.021 0.000 0.265 0.145 -0.001 0.001 0.028 0.002 0.011 -0.004 -0.004 0.001 -0.031 0.062 0.571 0.000 0.411 -0.104 -0.186 -0.086 SI 272.3 159.6 154.1 – 0.471 0.311* 0.398* 0.492* 0.571* 0.310* 0.369* -0.008 0.010 0.001 0.008 -0.006 -0.008 0.002 -0.355 0.194 0.153 0.177 -0.302 -0.298 0.154 SR 300.0 187.2 181.6 28.5 – 0.134 0.017 0.000 0.000 0.152 0.054 0.008 0.001 0.004 -0.012 -0.004 -0.002 -0.027 0.149 -0.017 -0.553 -0.087 0.080 Sa 487.9 375.2 369.6 215.7 188.0 – 0.011 0.091 0.148 0.000 0.000 0.010 0.011 0.005 0.014 0.017 0.413 0.063 -0.221 0.158 0.470 PN 504.0 391.3 385.7 231.8 204.1 16.1 – 0.034 -0.289 -0.189 -0.013 0.001 -0.006 -0.029 -0.002 0.004 -0.006 -0.003 -0.001 Es 524.5 411.9 406.4 252.3 224.8 76.7 21.1 – -0.482 0.095 0.256 -0.007 0.006 0.006 -0.006 0.008 0.010 Pi 537.7 424.6 419.0 266.0 237.8 55.0 42.2 33.6 – -0.490 -0.356 -0.009 -0.007 -0.008 -0.008 Mu 597.3 484.5 478.9 325.1 297.2 109.5 93.5 73.8 63.0 – -0.305 -0.004 -0.003 En 684.7 571.5 565.9 414.0 385.6 202.3 187.4 169.8 148.6 98.8 –

The three values above the diagonal are, from top to bottom, mitochondrial (282 bp fragment of mtDNA control region, 134 individuals) FST, microsatellite (six loci, 257 individuals) FST, and microsatellite DLR measures (Paetkau et al. 1997). Statistical signiﬁcance (available only for FST values) following adjustment for multiple comparisons (a = 0.05; Dunn-Sidak method; Gotelli and Ellison 2004) is indicated by an asterisk (*) a Islands: Cayo (Ca), Tijeras (Ti), Colorado (Co), Santa Ine´s (SI), San Rafael (SR), Salsipuedes (Sa), Partida Norte (PN), Estanque (Es), Piojo (Pi), Muela (Mu), Encantada (En)

E24, Paur-03, and Paur-06) produced consistently inter- separated on 5% denaturing polyacrylamide gels, stained pretable variation. However, Paur-03 was sex-linked, with fluorescent dye, and visualized with a Molecular leaving six loci to be used as the microsatellite markers for Dynamics FluorImager (Belfiore and May 2000). this study. PCR amplifications were performed in 10 ll reactions containing 5–10 ng DNA, 0.5 lM each primer, Analysis of genetic variation 2–3 mM MgCl, 175 lM dNTPs, and 1 U each of Taq DNA polymerase and buffer (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD, Mitochondrial sequences were edited by eye and aligned in USA). Amplification conditions were 94°C for 2 min; CLUSTAL_X (Thompson et al. 1997). We used ARLEQUIN 40 cycles of 94°C for 40 s, 50–57°C for 40 s, and 72°C for 3.01 (Excoffier et al. 2005) to quantify within-island haplo- 1 min; then a final extension of 5 min at 72°C. PCR typic variability as gene (h) and nucleotide (p;Nei1987) products were diluted in 98% formamide loading dye, diversity. For microsatellite loci, we quantified within-island 123 Conserv Genet

genetic diversity by calculating observed heterozygosity (HO) zero (Paetkau et al. 1997). We used GENECLASS2 (Piry and Nei’s (1987) unbiased estimate of average expected het- et al. 2004) to calculate likelihood values for DLR. erozygosity (HE), using the program TFPGA (ver. 1.3, Miller Third, as an alternative to traditional FST methods, 1997). Microsatellite allelic richness was estimated using which specify subpopulations a priori, we used the FSTAT (ver. 2.9.3, updated from Goudet 1995; http://www2. Bayesian clustering method in STRUCTURE (ver. 2, unil.ch/popgen/softwares/fstat.htm). In order to detect het- Pritchard et al. 2000; Falush et al. 2003) to measure pop- erozygote deficiency, as might result from the presence ulation structure of microsatellite variation. This program of non-amplifying (‘‘null’’) alleles, we tested one-tailed estimates, without regard to sampling location, the number probabilities of departure from Hardy–Weinberg (HW) of genetic subpopulations (K), as deduced by posterior equilibrium, using the Markov chain exact test in GENEPOP probabilities [LnP(D)]. STRUCTURE assigns genotypes to (web version\http://genepop.curtin.edu.au[; Raymond and genetic clusters (subpopulations) such that linkage and HW Rousset 1995). To test for linkage disequilibrium we used the disequilibrium are minimized within clusters. Using the Markov Chain approximation in GENEPOP, which estimates admixture model and correlated allele frequency parame- the probability of genotype independence for each pair of ters, five replicates of each run from K = 1 (a single microsatellite loci within each island. Significance level was panmictic population) to K = 11 (each island representing adjusted for multiple comparisons using the Dunn-Sidak a different subpopulation) were performed. Each replicate method (a = 0.05, Gotelli and Ellison 2004). was run for 200,000 Markov chain Monte Carlo (MCMC) generations with an initial burn-in of 20,000 generations. Genetic structure and gene flow For the K with the highest likelihood, we determined for each sampled individual its probability of membership in We used multiple approaches to measure population each genetic cluster based on its degree of ancestry (q) that genetic structure of fishing bats in the Gulf (for conve- could be attributed to that cluster (Pritchard et al. 2000). nience we sometimes refer to the different islands as ‘‘subpopulations’’ within the greater Gulf population of fishing bats). First, we used ARLEQUIN 3.01 (Excoffier Results et al. 2005) to quantify the magnitude of genetic differentiation (FST) among subpopulations for mtDNA Genetic variation haplotypes and microsatellite alleles (Weir and Cockerham 1984). We tested for statistical significance of differentia- We recovered 39 mtDNA haplotypes and deposited the tion estimates by bootstrapping over loci (20,000 sequences in GenBank under accession nos EF119455– permutations) to generate 95% confidence intervals and EF119493. Haplotype diversity ranged from 0.000 to jackknifing over loci to obtain standard errors. We tested 0.945, averaging 0.543, while nucleotide diversity ranged for overall heterogeneity in microsatellite allele frequen- from 0.000 to 0.017, averaging 0.009 (only one island, cies using the Markov Chain approximation in GENEPOP Cayo, lacked diversity; Table 2). Microsatellite variation to estimate the one-tailed probability of allelic differenti- averaged over subpopulations was high, with the number of ation under the null hypothesis of no difference among alleles per locus ranging from 3 to 19, and heterozygos- subpopulations. ity (HE) estimates ranging from 0.36 to 0.92. Only one Second, we measured the relationship between genetic locus, MM5, showed significant heterozygote deficiency distance and geographic distance among subpopulations (P \ 0.009). Averaged over loci, allelic richness ranged using GENEPOP, which regresses genetic distance measures from 6.8 to 8.0; mean HE per island ranged from 0.69 to on geographic distance (ln km), calculates Spearman rank 0.79, averaging 0.76 (Table 2). Significant heterozygote correlation coefficients (r), and uses a Mantel (1967) per- deficiency was detected in only one of the 11 subpopula- mutation procedure (1,000,000 permutations) to establish tions (La Muela, P \ 0.005). When analyzed within 95% confidence intervals for r. We used two genetic distance islands, significant linkage disequilibrium was found in measures: linearized FST values (FST/1-FST; Slatkin 1985) only one of the 165 comparisons (E24/P06 on Partida and the genotype likelihood ratio distance, DLR (for micro- Norte, P \ 0.0004). Analyzed across islands, no significant satellites only), which measures differences between linkage disequilibrium among loci was detected among any likelihood values calculated as the expected probabilities of of the 15 possible pairwise comparisons. each individual’s genotype in each subpopulation (Paetkau et al. 1997). To avoid biasing the likelihood values, the test Genetic structure and gene flow individual was excluded from its sample subpopulation when estimating allele frequencies and assigned a frequency We found much greater subpopulation differentiation for value of 0.01 if this subtraction resulted in a probability of mtDNA haplotypes than for microsatellite loci. For 123 Conserv Genet

Table 2 Mitochondrial (282 bp fragment of mtDNA control region, 134 individuals) and microsatellite variation (six loci, 257 individuals) for Mexican ﬁshing bats (Myotis vivesi) sampled from eleven islands in the Gulf of California

Site N-mt Hh p N-mc AHO HE

Cayo 12 1 0.00 0.000 26 7.3 0.70 (0.23–0.96) 0.72 (0.22–0.92) Tijeras 14 6 0.604 0.017 18 7.9 0.77 (0.39–0.94) 0.75 (0.32–0.94) Colorado 11 6 0.181 0.004 22 7.4 0.71 (0.23–0.91) 0.76 (0.27–0.92) Santa Ine´s 13 4 0.423 0.012 19 7.5 0.75 (0.42–0.95) 0.76 (0.39–0.91) San Rafael 12 3 0.439 0.010 20 7.8 0.74 (0.30–0.90) 0.75 (0.26–0.92) Salsipuedes 11 9 0.945 0.011 11 6.8 0.68 (0.27–1.00) 0.69 (0.33–0.94) Partida Norte 13 7 0.730 0.011 59 7.7 0.74 (0.39–0.93) 0.77 (0.45–0.93) Estanque 13 5 0.538 0.015 17 7.7 0.85 (0.59–1.00) 0.79 (0.51–0.93) Piojo 10 3 0.378 0.003 16 8.0 0.84 (0.50–1.00) 0.78 (0.39–0.92) Muela 12 9 0.939 0.012 20 7.7 0.69 (0.30–0.89) 0.76 (0.34–0.93) Encantada 13 7 0.794 0.007 29 7.4 0.75 (0.34–0.97) 0.75 (0.34–0.91) Mean 12 5 0.543 0.009 23 7.6 0.75 (0.37–0.91) 0.76 (0.36–0.92) N is number of individuals sampled for mitochondrial (-mt) and microsatellite (-mc); H is the number of mtDNA haplotypes; h and p are gene and nucleotide diversity, respectively; A is allelic richness; HO and HE are observed and expected heterozygosity, respectively (range across six loci in parentheses)

F mtDNA, ST ranged from 0.00 to 0.76 (Table 1) averaging a r = 0.32, P = 0.03 0.15. For microsatellites, exact tests revealed statistically 0.7 significant differentiation of islands over all six loci ) 2 LR 0.5 (X = 22.6; df = 12; P \ 0.04). However, the magnitude D 0.3 of differentiation was extremely low, with FST values ranging from -0.029 to 0.028 (Table 1), averaging 0.002 0.1 (SE = 0.002; 95% CI: -0.001–0.007). Only 8% of the alleles (6/75 alleles at six loci) were private (i.e., unique to -0.1 a particular island), two on Partida Norte and one each on -0.3 Muela, Estanque, San Rafael, and Tijeras. -0.5 For mtDNA there was no relationship between genetic Microsatellite Distance ( distance and geographic distance (r = 0.11; P = 0.12; -0.7 Fig. 2). This contrasted with our result for microsatellite 0 200 400 600 loci, for which we found a positive (i.e., isolation by dis- b 0.9 r = 0.11, P = 0.12 0.8 tance) relationship using the DLR (r = 0.32, P = 0.03; ) 0.7 Fig. 2) distance measure and a marginally significant F 0.6 relationship using FST (r = 0.26; P = 0.07). Bayesian analyzes using STRUCTURE found no 0.5 genetic structure in our samples. The highest mean likeli- 0.4 hood was found for K = 1 (Ln =-5,907.640). For K = 9 0.3 (i.e., the model with nine subpopulations), one of the five 0.2 replicates produced a slightly higher likelihood (Ln = mtDNA Distance ( 0.1 -5,902.100); however, the proportion of membership 0 0 200 400 600 assigned to each of the nine subpopulations was roughly Geographical Distance (km) symmetric (q = 0.111), and the likelihood values varied considerably among the replicates (from -5,902.1 to Fig. 2 Relationship between genetic distance and geographic dis- -8,730.2; mean =-6,724.6). Conversely, for K = 1, the tance (km) among 11 island populations of fishing bats (Myotis vivesi) sampled in the Gulf of California in 2003. r values are Spearman rank likelihood values among the five replicates did not vary correlation coefficients; P values were determined using Mantel substantially (from -5,904.2 to -5,909.6). Thus, accord- (1967) tests. (a) relationship for six nuclear microsatellite loci (257 ing the cluster analysis, the mostly likely model for fishing individuals) using the DLR measure (Paetkau et al. 1997). A similar bats on the Gulf Islands sampled in our study is that of a relationship was found using linearized FST values (FST/1-FST; r = 0.26; P = 0.07). (b) Relationship for mtDNA haplotypes (282 bp single panmictic population (Pritchard et al. 2000; Evanno fragment of mtDNA control region, 134 individuals) using et al. 2005). linearized FST 123 Conserv Genet

Discussion islands (ca. 75 times greater than with microsatellites). This combination of strong mtDNA versus weak micro- Results of our microsatellite analyzes point to extensive satellite structure has been found in several other inter-island gene ﬂow, and thus potential dispersal, by vespertilionids (e.g., Nyctalus noctula, Petit and Mayer ﬁshing bats in the Gulf of California. First, genetic diver- 1999; M. myotis, Ruedi and Castella 2003; M. bechsteinii, sity was high. Mean heterozygosity (HE = 0.76) was Kerth et al. 2008) and is generally attributed to strong greater than that found in populations of M. myotis in female philopatry and extensive, male-biased dispersal mainland Spain and M. punicus in mainland Morocco (Chen et al. 2008). In addition, we found no isolation by

(HE = 0.71 and 0.56, respectively, Castella et al. 2000), distance pattern with mtDNA markers. The strong mtDNA and was similar to that in colonies of other vespertilionids structure and lack of isolation by distance suggest that in northern/central Europe: M. myotis (HO = 0.78, Castella female dispersal among islands was too rare to overcome et al. 2001), M. bechsteinii (HO = 0.83, Kerth et al. 2003), genetic drift. P. auritus (HE = 0.79, Veith et al. 2004), and M. nattereri (HE = 0.79, Rivers et al. 2005). High levels of genetic Conservation implications diversity would be expected if dispersal among islands were extensive, because gene flow replaces alleles lost to Our results show both positive and negative implications for genetic drift (Hartl 2000). Extensive dispersal should also efforts to conserve Mexican fishing bats. On the one hand, prevent the buildup of private alleles (Slatkin 1985). Indeed our results indicate that island subpopulations separated by the frequency of private alleles in our study was only 8%. large expanses of open water are nonetheless capable of Second, we found only slight population structure at maintaining high rates of gene flow; thus, the maintenance microsatellite loci. Mean overall FST was nearly zero of genetic diversity does not appear to be strongly limited (0.002), and even between the most distantly separated of by distance from potential sources of immigrants. In this sampled islands (Cayo and Encantada, ca. 685 km apart), respect, the prospects seem more favorable for conserving

FST values were negligible (0.009). None of the between- populations of ﬁshing bats than for less vagile island- island FST estimates were higher than 0.030. Our FST dwelling species (e.g., some lizards on islands of New estimates are lower than those found among mainland (i.e., Zealand, Towns 2002). On the other hand, results from our non-insular) colonies of vespertilionids in Europe: M. my- mtDNA analyzes suggest that this high gene ﬂow might not otis colonies separated by 130-580 km in Spain, and M. translate into high probabilities that restored islands will be punicus colonies separated by 270–770 km in North Africa recolonized. Strong female philopatry seems to be the rule

(FST \ 0.02, Castella et al. 2000); M. nattereri colonies in vespertilionid bats (e.g., Petit and Mayer 1999; Castella separated by ca. 5–150 km in England (mean FST = 0.017, et al. 2001; Ruedi and Castella 2003; Chen et al. 2008); and Rivers et al. 2005). Our mean FST was also lower than that when dispersal is rare, colonization of empty habitat might found among European colonies of Pipistrellus spp., which be even rarer (Kerth and Petit 2005). In addition, inter- included populations separated by the English Channel and island gene ﬂow can occur in ways other than individuals

North Sea (FST = 0.024–0.044, Racey et al. 2007). immigrating to an island and reproducing there. Among Third, there was positive relationship between micro- European colonies of M. bechsteinii, M. nattereri, and P. satellite genetic distance and geographic distance; this auritus, for example, much of the gene flow appears to isolation by distance pattern is consistent with dispersal occur via mating swarms, which are sites (located 10– among islands being limited by geographic distance, such 500 km from the maternal colonies) where the sexes meet that gene flow is increasingly less likely at greater and and copulate during the late summer/fall (Kerth et al. 2003; greater distances. Our results (r = 0.26–0.32) were similar Veith et al. 2004; Rivers et al. 2005). In maternal colonies of to those found in colonies of M. bechsteinii (r = 0.20; the endangered M. bechsteinii, female philopatry is almost Kerth and Petit 2005) and M. myotis (r = 0.26–0.30; Ruedi complete (i.e., females stay in their natal colonies to rear and Castella 2003), both distributed across hundreds of pups), and thus new colony formation apparently is very kilometers in Europe. rare (Kerth et al. 2002a). The greatest source of new genetic Finally, Bayesian clustering/MCMC analyses by diversity in maternal colonies of M. bechsteinii apparently STRUCTURE revealed a lack of genetic structure and very comes from foreign males encountered at mating swarms, high inter-island gene flow estimates, respectively. leading Kerth et al. (2003) to urge strict protection of According to these analyses the island subpopulations of swarming sites. Unfortunately, little is known about the fishing bats sampled in the Gulf of California could not be spatial pattern of dispersal or the mating system of fishing distinguished from a single panmictic population. bats, so we do not know to what degree the high genetic In contrast to our results from microsatellite analyzes, connectedness found in our study represents successful we found strong mtDNA haplotype differentiation among mating by immigrant females. 123 Conserv Genet

Habitat characteristics may also play a large role in should be conducted before and after removal of exotic determining whether an immigrant female stays and suc- predators. If fishing bats do not recolonize or if densities cessfully reproduces on an island. All 11 islands in our decrease (or fail to increase sufficiently), managers should study area support substantial densities of fishing bats (e.g., consider habitat modification, such as making available [10 000 individuals on Partida Norte; Herrera and Flores- more roosting areas or enhancing their social context. The Martıńez 2002; J. J. Flores-Martıńez and L. G. Herrera, latter approach is gaining more attention as a potential tool unpublished data) and thus presumably contain suitable in bird conservation; namely, the use of playback calls to habitat. However, other islands may be deficient in one or attract conspecifics to an unoccupied but suitable habitat more key habitat characteristics. For example, on the island patch (Ward and Schlossberg 2004; Hahn and Silverman of San Jorge, where fishing bats appear to be rare, large 2007). If fishing bats are attracted to conspecific calls (e.g., amounts of bird guano have accumulated in the interstices as found with spear-nosed bats, Phyllostomus hastatus, of the talus, making it inaccessible to fishing bats (J. J. Wilkinson and Boughman 1998; but see Kerth et al. Flores-Martıńez and L. G. Herrera, unpublished data). 2002b), then installing bat call playback systems in colo- Thus, it is possible that frequent movement through the nies or potential colony sites might be used to increase interstices is required to keep the talus open to bat roosting. densities. Innovative and experimental approaches may be Restored islands may also be deficient in cues (e.g., sounds necessary to ensure the long-term persistence of Mexican of bat calls) indicating the presence of conspecifics. fishing bats in the Gulf of California. Recently, conservation biologists have become increasingly aware of the importance of conspecific attraction in Acknowledgments This study was funded by a grant from the UC habitat selection (Reed 1999). For example, loggerhead Mexus-CONACYT Faculty Visits Program to LGHM and BM; grants from Bat Conservation International and Programa para la Conser- shrikes preferentially settle near conspecifics, thus reducing vacioń de los Murcie´lagos de Me´xico to LGHM and JJFM; and a grant the probability that unoccupied patches of habitat will be (#203671) from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologıá to JJFM. recolonized (Etterson 2003). Higher densities of conspe- Samples were collected with permission from the Secretarıá de Medio cifics in some species can provide protection from Ambiente y Recursos Naturales. Transportation to Partida Norte island was generously provided by the Secretarıá de Marina-Armada de predators or facilitate reproduction (Stephens and Suther- Me´xico. Alfredo Zavala, Carlos Godıńez, Juan Pablo Gallo, Tad land 1999). Fishing bats in the Gulf of California form Pfister, Lorayne Meltzer and the Prescott College Kino Bay Center large aggregations (Maya 1968; Herrera and Flores- provided invaluable logistic support during fieldwork. We also thank Martıńez 2002; Flores-Martıńez 2005; Flores-Martıńez J. Ventura and T. Jenkins for their assistance in the field and lab, respectively, and R. Schwartz, A. Richman, D. Lonzarich and two et al. 2005); thus, low densities or the absence of conspe- anonymous reviewers for providing helpful comments on the paper. cifics on restored islands may reduce the probability of immigrants settling there. References

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