VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON
Année 2019 - Thèse n°111
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE SUR LE MICROBIOTE INTESTINAL ET SON ETUDE DANS DES MODELES ANIMAUX DE MALADIES METABOLIQUES, EN PARTICULIER CHEZ LE PRIMATE NON HUMAIN
THESE
Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 6 décembre 2019 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire
par
SCHUTZ Charlotte Née le 5 mars 1994 à Zürich (Suisse)
VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON
Année 2019 - Thèse n°111
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE SUR LE MICROBIOTE INTESTINAL ET SON ETUDE DANS DES MODELES ANIMAUX DE MALADIES METABOLIQUES, EN PARTICULIER CHEZ LE PRIMATE NON HUMAIN
THESE
Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 6 décembre 2019 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire
par
SCHUTZ Charlotte Née le 5 mars 1994 à Zürich (Suisse)
Liste du corps enseignant
Liste des Enseignants du Campus Vétérinaire de Lyon (01-09-2019)
ABITBOL Marie DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur ALVES-DE-OLIVEIRA Laurent DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de conférences ARCANGIOLI Marie-Anne DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur AYRAL Florence DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de conférences BECKER Claire DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de conférences BELLUCO Sara DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de conférences BENAMOU-SMITH Agnès DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de conférences BENOIT Etienne DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur BERNY Philippe DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur BONNET-GARIN Jeanne-Marie DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur BOULOCHER Caroline DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de conférences BOURDOISEAU Gilles DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur BOURGOIN Gilles DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de conférences BRUYERE Pierre DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de conférences BUFF Samuel DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de conférences BURONFOSSE Thierry DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur CACHON Thibaut DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de conférences CADORÉ Jean-Luc DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur CALLAIT-CARDINAL Marie-Pierre DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de conférences CAROZZO Claude DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de conférences CHABANNE Luc DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur CHALVET-MONFRAY Karine DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur DE BOYER DES ROCHES Alice DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de conférences DELIGNETTE-MULLER Marie-Laure DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur DJELOUADJI Zorée DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de conférences ESCRIOU Catherine DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de conférences FRIKHA Mohamed-Ridha DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de conférences GALIA Wessam DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de conférences GILOT-FROMONT Emmanuelle DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur GONTHIER Alain DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de conférences GRANCHER Denis DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de conférences GREZEL Delphine DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de conférences HUGONNARD Marine DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de conférences JANKOWIAK Bernard DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de conférences JOSSON-SCHRAMME Anne DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de conférences JUNOT Stéphane DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de conférences KODJO Angeli DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur KRAFFT Emilie DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de conférences LAABERKI Maria-Halima DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de conférences LAMBERT Véronique DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de conférences LE GRAND Dominique DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur LEBLOND Agnès DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur LEDOUX Dorothée DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de conférences LEFEBVRE Sébastien DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de conférences LEFRANC-POHL Anne-Cécile DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de conférences LEGROS Vincent DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de conférences LEPAGE Olivier DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur LOUZIER Vanessa DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur MARCHAL Thierry DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur MOISSONNIER Pierre DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur MOUNIER Luc DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur PEPIN Michel DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur PIN Didier DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur PONCE Frédérique DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur PORTIER Karine DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur POUZOT-NEVORET Céline DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de conférences PROUILLAC Caroline DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de conférences REMY Denise DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur RENE MARTELLET Magalie DEPT-ELEVAGE-SPV Maître de conférences ROGER Thierry DEPT-BASIC-SCIENCES Professeur SABATIER Philippe DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur SAWAYA Serge DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de conférences SCHRAMME Michael DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur SERGENTET Delphine DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur THIEBAULT Jean-Jacques DEPT-BASIC-SCIENCES Maître de conférences THOMAS-CANCIAN Aurélie DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de conférences TORTEREAU Antonin DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de conférences VIGUIER Eric DEPT-AC-LOISIR-SPORT Professeur VIRIEUX-WATRELOT Dorothée DEPT-AC-LOISIR-SPORT Maître de conférences ZENNER Lionel DEPT-ELEVAGE-SPV Professeur
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4 Remerciements au jury
A Monsieur le Professeur Serge NATAF, De l’Université Claude Bernard Lyon-1, Pour m'avoir fait l'honneur d'accepter la Présidence de mon jury de thèse, Hommages respectueux.
A Madame la Docteure Delphine GREZEL, De VetAgro Sup – Campus vétérinaire de Lyon, Pour m’avoir fait l'honneur d'accepter d'encadrer cette thèse, Pour m’avoir soutenue dans toutes les étapes de cette dernière année, Pour votre gentillesse, votre soutien, votre patience, votre disponibilité, et vos précieux conseils, Mes plus sincères remerciements.
A Madame la Professeure Marie-Anne ARCANGIOLI, De VetAgro Sup – Campus vétérinaire de Lyon, Pour m'avoir fait l'honneur de participer à ce jury de thèse, Pour m’avoir permis de réaliser cette année mixte si enrichissante, Pour votre gentillesse et votre ouverture, Mes sincères remerciements.
5
6 Remerciements
A toute l’équipe de la société CYNBIOSE, Merci de m’avoir proposé ce sujet passionnant, de m’avoir accueillie chaleureusement dans votre entreprise, .et de m’avoir fait aimer travailler avec les primates.
A mes parents, Pour tout l’amour que vous m’avez donné, votre soutien sans faille, l’exemple que vous me donnez tous les jours. Merci de m’avoir donné cette force de caractère et cette détermination. Je vous aime.
A Jeanne, Louis et Pierre, Mes frères et ma sœur, pour tous ces moments partagés ensemble, et tous ceux qui restent à partager. Merci d’avoir supporté votre grande-sœur, dans les moments tristes et joyeux. Je vous aime et je suis si fière de vous.
A mes grands-parents angevins, A mon grand-père Jean, pour m’avoir transmis l’amour de ce métier si petite, d’avoir été un exemple depuis toujours. A ma grand-mère Anne, pour m’avoir inculquée cet amour des animaux, cette sensibilité et tellement d’autres choses.
A mes grands-parents alsaciens, Merci d’être un si bel exemple d’amour et de courage. Merci de m’avoir transmis cette force de travail et cette énergie.
A Mathilde, Clémence et Hugo, Mes chers cousins, pour tous les moments de joie et de rire qui ont fait de moi ce que je suis. Merci pour votre soutien, votre amour et votre folie. Je me languis de vivre la suite avec vous.
A mes amis, Pour m’avoir toujours soutenue, d’avoir toujours accepté et compris qui je suis. Pour tous les souvenirs que nous avons ensemble. Merci pour tout ce que nous vivrons encore.
7
8 Table des matières
Table des figures ...... 15
Table des tableaux ...... 17
Table des annexes ...... 21
Liste des abréviations ...... 23
Glossaire ...... 27
Introduction ...... 33
Le microbiote intestinal : Généralités ...... 37
1.1. Le microbiote intestinal : définitions ...... 37
1.1.1. Le microbiote intestinal sain : notion de noyau fonctionnel ...... 37
1.1.1.a Définition du microbiote ...... 37
1.1.1.b Notion de noyau fonctionnel ...... 38
1.1.2. Propriétés du microbiote intestinal...... 39
1.1.2.a Quantité et diversité microbienne : ...... 39
1.1.2.b Stabilité et résilience : ...... 40
1.1.3. Mise en place du microbiote intestinal ...... 40
1.1.3.a Phase 1 : Développement fœtal ...... 41
1.1.3.b Phase 2 : Facteurs périnataux ...... 43
1.1.3.c Phase 3 : Mise en place et stabilisation chez l’enfant ...... 44
1.2. Fonctions et interactions métaboliques du microbiote intestinal ...... 47
1.2.1. Fonctions de protection et de barrière ...... 47
1.2.2. Fonction immune ...... 48
1.2.2.a Rôle dans le développement et la maturation du système immunitaire ...... 48
1.2.2.b Rôle dans l’activation des mécanismes de l’immunité innée et de l’inflammation ...... 49
1.2.2.c Rôle dans la régulation de l’immunité adaptative ...... 50
1.2.3. Fonctions métaboliques ...... 52
1.2.3.a Métabolisme des glucides et microbiote intestinal ...... 52
9 1.2.3.b Métabolisme des gaz ...... 55
1.2.3.c Métabolisme et dégradation des protéines ...... 56
1.2.3.d Métabolisme des lipides et des acides biliaires ...... 57
1.3. Composition du microbiote intestinal et facteurs de variations ...... 59
1.3.1. Composition taxonomique et quantitative du microbiote intestinal humain ...... 59
1.3.1.a Composition bactérienne ...... 59
1.3.1.b Composition du virome intestinal humain ...... 64
1.3.1.c Archées et Fungi présents dans le microbiote intestinal humain ...... 65
1.3.2. Facteurs de variations et conséquences sur la composition taxonomique et fonctionnelle ...... 66
1.3.2.a Facteurs de variations chez le jeune : influence sur la mise en place et la composition du microbiote ...... 66
1.3.2.b Régime alimentaire et conséquences sur la composition du microbiote intestinal ...... 67
1.3.2.c Facteurs intrinsèques ...... 71
1.3.2.d Facteurs externes ...... 72
1.4. Pathologies métaboliques et microbiote intestinal ...... 75
1.4.1. Implication du microbiote intestinal dans les maladies métaboliques ...... 75
1.4.1.a Microbiote intestinal et syndrome métabolique ...... 78
1.4.1.b Microbiote intestinal et obésité ...... 80
1.4.1.c Microbiote intestinal et diabète de type 2 ...... 82
1.4.1.d Microbiote intestinal et diabète de type 1 ...... 85
1.4.2. Le microbiote, un moyen thérapeutique ? ...... 88
1.4.2.a Manipulation du microbiote via des changements de régime alimentaire : aliments prébiotiques ou fibres diététiques ...... 88
1.4.2.b Probiotiques ...... 89
1.4.2.c Transplantation fécale ...... 92
1.5. Techniques d’étude du microbiote du microbiote intestinal ...... 94
1.5.1. Historique de l’étude du microbiote ...... 94
1.5.2. Prélèvement du microbiote intestinal et conservation avant analyse ...... 95
10 1.5.3. Techniques actuelles d’évaluation de la composition du microbiote intestinal ...... 97
1.5.3.a Culture des microorganismes ...... 97
1.5.3.b Méthodes moléculaires ...... 98
1.5.3.c Séquençage de l’ADN...... 99
1.5.3.d Analyse métabolique ...... 101
1.5.4. Concepts de l’analyse du microbiote ...... 102
1.5.4.a Définitions des concepts de l’analyse de la structure du microbiote ...... 102
1.5.4.b Représentation visuelle des similarités et divergences entre communautés microbiennes ...... 103
Comparaison des modèles d’études du microbiote intestinal : PNH, Souris, Humain ...... 105
2.1. Intérêts des modèles animaux dans l’étude du microbiote intestinal ...... 105
2.2. Système digestif et régime alimentaire : comparaison de l’Homme, du macaque et de la souris ...... 109
2.1.1. Régime alimentaire de la souris et du macaque ...... 109
2.1.5.a Comparaison des régimes alimentaires de l’Homme, de la souris et du macaque ...... 109
2.1.5.b Maitrise du régime alimentaire chez l’animal de laboratoire et imitation des régimes alimentaires humains ...... 110
2.1.2. Comparaison anatomique, histologique et physiologique du tractus digestif ...... 114
2.1.2.a Comparaison du tractus gastro-intestinal de la souris à celui de l’Homme ...... 114
2.1.2.b Comparaison du tractus gastro-intestinal du macaque à celui de l’Homme ...... 117
2.1.3. Composition du microbiote intestinal à l’équilibre ...... 120
2.1.3.a Pertinence de l’étude et de la comparaison du microbiote intestinal de ces deux espèces à l’Homme ...... 120
2.1.3.b Comparaison de la composition du microbiote intestinal de ces trois espèces à l’état d’équilibre ...... 120
2.1.3.c Les entérotypes, sont-ils retrouvés chez le PNH et la souris ? ...... 124
2.1.3.d Variations du microbiote intestinal à la suite de changements d’alimentation ... 125
2.1.3.e Comparaison fonctionnelle du microbiote intestinal de ces trois espèces ...... 127
2.1.3.f Limites de la comparaison du microbiote intestinal entre les espèces mammifères...... 128
11 2.3. Système immunitaire et microbiote ...... 130
2.4. Modèle d’étude de pathologies métaboliques humaines associées au microbiote intestinal ...... 132
2.1.4. Modélisation du microbiote intestinal humain ...... 132
2.1.4.a Modèle murin gnotobiotique humanisé ...... 132
2.1.5. Modèles d’obésité ...... 133
2.1.5.a Modèle d’obésité spontané chez le PNH et la souris ...... 133
2.1.5.b Modèles génétiquement modifiés d’obésité ...... 137
2.1.5.c Modèles d’obésité induits par maitrise du régime alimentaire ...... 140
2.1.6. Modèles de diabète de type 2 ...... 143
2.1.6.a Modèles de diabète de type 2 spontanés ou génétiques naturels ...... 143
2.1.6.b Modèles de diabète de type 2 induits par un régime alimentaire...... 145
2.1.6.c Modèles de diabète de type 2 induits chimiquement ...... 147
2.1.6.d Modèles de diabète de type 2 induits chirurgicalement ...... 149
2.1.6.e Modèles de diabète de type 2 transgéniques ...... 150
2.1.7. Modèles de diabète de type 1 ...... 152
2.5. Synthèse : apports du modèle souris et PNH à l’étude du microbiote intestinal et des pathologies métaboliques associées ...... 155
Microbiote intestinal, maladies métaboliques et primate non humain ...... 159
3.1. Cadre éthique et réglementaire de l’utilisation de l’animal en expérimentation...... 159
3.1.1. Ethique et expérimentation animale ...... 159
3.1.2. Institutions et textes fondateurs du cadre éthique et réglementaire de l’expérimentation animale ...... 160
3.1.3. Mise en pratique du cadre éthique et réglementaire ...... 161
3.2. Cadre de l’utilisation du PNH en recherche biomédicale ...... 164
3.2.1. Finalité des études et espèces de PNH utilisées ...... 164
3.2.2. Cadre règlementaire s’appliquant aux établissements détenant des PNH ...... 165
3.2.3. L’accréditation AAALAC ...... 166
3.3. Constitution d’une cohorte d’étude du microbiote chez les modèles PNH : que prendre en compte ? ...... 167
12 3.3.1. Choix de l’espèce de PNH pour l’étude du microbiote intestinal ...... 167
3.3.1.a Caractéristiques des PNH utilisés en recherche biomédicale ...... 167
3.3.1.b Régime alimentaire, anatomie du système digestif et composition du microbiote intestinal des PNH ...... 172
3.3.1.c Composition du microbiote intestinal chez un individu sain en fonction de l’espèce de PNH considérée ...... 174
3.3.2. Choix de l’espèce pour l’étude du microbiote intestinal dans le cadre des maladies métaboliques ...... 178
3.3.3. Taille de la cohorte ...... 179
3.3.4. Choix du sexe des animaux ...... 180
3.3.5. Choix de l’âge des animaux ...... 180
3.3.5.a Mise en place du microbiote chez le PNH et alimentation du juvénile ...... 180
3.3.5.b Âge réglementaire au sevrage ...... 182
3.3.5.c Vieillissement et modifications du microbiote intestinal ...... 183
3.3.5.d Vieillissement et évolution des maladies métaboliques ...... 183
3.3.6. Origine et conditions sanitaires ...... 184
3.3.6.a Origine captive ou sauvage des animaux ...... 184
3.3.6.b Colonies d’origine ...... 184
3.3.6.c Statut sanitaire des animaux ...... 185
3.4. Hébergement du Primate Non Humain pour l’étude du microbiote ...... 187
3.4.1. Recommandations pour l’hébergement du PNH en recherche biomédicale ...... 187
3.4.2. Conditions environnementales spécifiques pour la maitrise du microbiote chez le PNH en captivité ...... 189
Conclusion ...... 191
Bibliographie ...... 193
Annexes ...... 217
13
14 Table des figures
Figure 1 : Arbre phylogénétique de 10 primates ...... 34
Figure 2 : Composition fonctionnelle du génome et métagénome intestinal minimal (séquençage de l’ADN présent dans les prélèvements fécaux de 124 européens adultes)...... 39
Figure 3 : Vue d’ensemble des facteurs influençant la mise en place du microbiote chez l’Homme ...... 41
Figure 4 : Comparaison histologique de la rate, de la paroi intestinale et des plaques de Peyer entre des souris axéniques et des souris holoxéniques ...... 49
Figure 5 : Voies métaboliques majeures de fermentation anaérobies des carbohydrates par le microbiote intestinal ...... 53
Figure 6 : A - Voies métaboliques majeures de la fermentation protéique par le microbiote intestinal et principales bactéries associées. B – Processus de nitrosation...... 57
Figure 7 : Structure d’un acide biliaire et sites principaux de transformation par le microbiote intestinal...... 58
Figure 8 : Arbre phylogénétique des espèces bactériennes les plus prévalentes et abondantes des cohortes des études Human Microbiome Project et Métahit combinées...... 60
Figure 9 : Charge microbienne totale en fonction des entérotypes identifiés...... 62
Figure 10 : Composition et densité du microbiote intestinal ...... 64
Figure 11 : La diversité bactérienne du microbiote intestinal augmente avec l’âge dans chaque population étudiée ...... 72
Figure 12 : Diversité du microbiote intestinal selon la zone géographique...... 73
Figure 13 : Impact du régime alimentaire sur le microbiote intestinal et la santé de l’hôte ...... 75
Figure 14 : Questions non résolues sur la transplantation du microbiote fécal : exemple du traitement des MICI ...... 92
Figure 15 : Avancées marquantes des méthodes de taxonomie bactérienne dans le monde depuis le 19ème siècle ...... 95
Figure 16 : Anatomie simplifiée du tractus gastro-intestinal de la souris et de l’Homme ...... 115
Figure 17 : Structure anatomique de la paroi intestinale (intestin grêle) chez la souris (A) et chez l’Homme (B) ...... 116
Figure 18 : Anatomie simplifiée du tractus gastro-instestinal du macaque (gauche) et de l’Homme (droite) ...... 118
Figure 19 : Méta-analyse de la composition du microbiote fécale chez des adultes sains humains ou murins analysées par séquençage ADNr 16 ...... 121
15 Figure 20 : Le microbiote humain dans un contexte évolutif ...... 122
Figure 21 : Abondance relative des familles bactériennes (A) et genres bactériens (B) majeurs détectés dans le microbiote fécal de la souris, du rat, du macaque cynomolgus et de l’Homme. 123
Figure 22 : Genres bactériens les plus prédominants et prévalents détectés dans le microbiote fécal de la souris, du rat du macaque cynomolgus et de l’Homme...... 124
Figure 23 : Entérotypes mis en évidence chez le macaque cynomolgus (Macaca fascicularis) ..... 125
Figure 24 : Proximité phylogénétique du microbiote intestinal du macaque rhésus et de l’Homme...... 126
Figure 25 : Niveaux fécaux des SCFAs majoritairement produits par le microbiote intestinal de la souris, du rat, du macaque et de l’humain...... 127
Figure 26 : Paramètres expérimentaux importants et potentielle facteurs de confusion dans le cadre de la recherche sur l’obésité et le diabète ...... 157
Figure 27 : Principales espèces de PNH utilisées en recherche biomédicale...... 168
Figure 28 : Anatomie simplifiée du tractus gastro-intestinal du singe écureuil (Saimiri sciureus) 170
Figure 29 : A – Composition de la cohorte de l’étude ; B – Analyse principale coordonnée (PcoA) des distances UniFrac non pondérées entre les communautés bactériennes aux différents âges prélevés ...... 181
Figure 30 : A – Graphique représentant la proportion relative des différents phyla en fonction des âges ; B – Abondance relative en fonction de l’âge des Spirochetes et des Actinobacteria ...... 182
16 Table des tableaux
Tableau I : Facteurs de variation de la mise en place du microbiote intestinal...... 46
Tableau II : Résumé des principaux PRRs (Pattern Recognition Receptors) ...... 50
Tableau III : SCFAs produits à l’issue de la fermentation des carbohydrates par le microbiote intestinal et principales bactéries participant à leur production...... 54
Tableau IV: Gaz produits à l’issue de la fermentation des carbohydrates par le microbiote intestinal et principales bactéries participant à leur production...... 55
Tableau V : Résumé des principaux métabolites issus de la dégradation protéique et les bactéries associées ...... 56
Tableau VI : Résumé des principaux métabolites issus de la dégradation des acides biliaires et les bactéries associées ...... 58
Tableau VII : Vue d’ensemble de la composition du microbiote intestinal humain ...... 61
Tableau VIII : Principales familles virales retrouvées dans le microbiote intestinal humain ...... 65
Tableau IX : Abondance relative des phyla du microbiote intestinal chez l’enfant de moins de 1 an et chez l’adulte...... 67
Tableau X : Impact de la consommation de protéines sur la composition du microbiote intestinal...... 68
Tableau XI : Influence de la consommation de lipides sur la composition du microbiote intestinal...... 68
Tableau XII : Carbohydrates digestibles et variations de la composition du microbiote intestinal...... 69
Tableau XIII : Consommation de fibres non digestibles et impact sur la taxonomie du microbiote intestinal...... 69
Tableau XIV : Impact des probiotiques ou aliments fermentés sur la composition du microbiote intestinal...... 70
Tableau XV : Effets des polyphénols sur la composition du microbiote intestinal...... 70
Tableau XVI : Impact des différentes classes d’antibiotique sur le microbiote et l’immunité intestinale ...... 74
Tableau XVII : Régimes alimentaires et impacts sur la composition du microbiote intestinal...... 76
Tableau XVIII : Définition de principales maladies métaboliques systémiques ...... 77
Tableau XIX : Principaux symptômes et voies impliquées dans la physiopathologie du syndrome métabolique...... 78
17 Tableau XX : Principaux symptômes et voies impliquées dans la physiopathologie de l’obésité et potentielles implications du microbiote intestinal ...... 80
Tableau XXI : Principaux symptômes et voies impliquées dans la physiopathologie du diabète de type 2 ...... 82
Tableau XXII: Changements de la composition du microbiote intestinal chez des individus atteints de diabète de type 2 ...... 84
Tableau XXIII : Principaux symptômes et voies impliquées dans la physiopathologie du diabète de type 1 ...... 85
Tableau XXIV : Changements de la composition du microbiote intestinal chez des individus atteints de diabète de type 1 ...... 86
Tableau XXV : Définitions des principaux termes en relation avec le sujet « Microbiote intestinal et thérapeutique »...... 88
Tableau XXVI : Avantages et inconvénients des méthodes de cultures pour l’identification et la quantification des microorganismes du microbiote intestinal...... 97
Tableau XXVII : Avantages et inconvénients des méthodes moléculaires pour l’étude des microorganismes du microbiote intestinal...... 98
Tableau XXVIII : Avantages et inconvénients des méthodes moléculaires pour l’étude des microorganismes du microbiote intestinal...... 100
Tableau XXIX : Principaux concepts pour l’analyse du microbiote intestinal...... 102
Tableau XXX: Principales représentations graphiques des analyses de composition, de diversité et de quantification du microbiote ...... 103
Tableau XXXI : Exemples de bactéries du microbiote intestinal humain transplantées chez des modèles animaux axéniques...... 107
Tableau XXXII : Résumé des différents avantages et limites de quelques modèles animaux pour l’étude du microbiote intestinal ...... 108
Tableau XXXIII : Définitions des principaux régimes alimentaires humains étudiés dans le cadre des maladies métaboliques et de leur influence sur le microbiote intestinal ...... 111
Tableau XXXIV : Résumé des principaux régimes alimentaires utilisés pour induire des modèles animaux de pathologies métaboliques ...... 112
Tableau XXXV : Similarités et différences de l’anatomie du tractus gastro-intestinal de la souris et de l’humain ...... 116
Tableau XXXVI : Comparaison du tractus gastro-intestinal de l’Homme (Homo sapiens) et du macaque rhésus (Macaca mulatta) ...... 118
Tableau XXXVII : Synthèse des modèles spontanés d’obésité disponibles chez la souris et les PNH ...... 133
18 Tableau XXXVIII : Synthèse des modèles génétiquement modifiés d’obésité disponibles chez la souris ...... 138
Tableau XXXIX : Synthèse des modèles induits d’obésité disponibles par administration de régimes obésifiants chez la souris et les PNH ...... 140
Tableau XL : Synthèse des modèles spontanés ou génétiquement naturels de diabète de type 2 chez la souris et le PNH ...... 143
Tableau XLI : Synthèse des modèles de diabète de type 2 induits par un régime alimentaire spécifique chez la souris et le PNH ...... 145
Tableau XLII : Synthèse des modèles murins de diabète de type 2 induits chimiquement ...... 147
Tableau XLIII : Modèles de diabète de type 2 induits chirurgicalement par une pancréatectomie totale ou partielle...... 149
Tableau XLIV : Synthèse des modèles transgéniques de diabète de type 2 chez la souris...... 150
Tableau XLV : Synthèse des modèles de diabète de type 1 chez la souris et les PNH ...... 152
Tableau XLVI : Synthèse des principaux critères de similarité avec l’Homme, des avantages et limites majeures de la souris et du macaque pour l’étude du microbiote intestinal et des pathologies métaboliques associées...... 155
Tableau XLVII : Les principes des 3R ...... 160
Tableau XLVIII : Classification simplifiée des primates d’intérêt en recherche biomédicale du sous ordre des simiens ...... 165
Tableau XLIX : Récapitulatif des régimes alimentaires des espèces PNH d’intérêt pour l’étude des maladies métaboliques liées au microbiote intestinal ...... 172
Tableau L : Comparaison de l’anatomie digestive et du temps de transit de quatre genres de PNH (Chlorocebus, Macaca, Papio et Callithrix)...... 173
Tableau LI : Comparaison du microbiote intestinal des espèces de PNH d’intérêt en recherche biomédicale (une couleur par phylum prédominant) ...... 175
Tableau LII : Synthèse des différents modèles de maladies métaboliques disponibles chez les PNH utilisés en recherche biomédicale ...... 178
Tableau LIII : Âges légaux au sevrage des principales espèces de PNH utilisées à des fins scientifiques ...... 183
Tableau LIV : Recommandations concernant l’hébergement des PNH à des fins expérimentales ...... 188
19
20 Table des annexes
Annexe 1 : La phylogénie moléculaire de 61 genres de Primates, 2 genre de Dermoptères et un genre de Scandentien, ancré sur les Lagomorphes ...... 217
Annexe 2 : Schéma synthétique de l’organisation de l’immunité intestinal ...... 218
Annexe 3 : Synthèse des principaux glucides contenu dans les aliments...... 219
Annexe 4 : Abondance relative de 57 génomes microbiens fréquents trouvés chez les individus de la cohorte ...... 220
Annexe 5 : Relations entre les espèces de bactéries les plus abondantes du microbiote intestinal...... 221
Annexe 6 : Tableau récapitulatif des principales caractéristiques des bactéries retrouvées dans le microbiote intestinal ...... 222
Annexe 7 : Différences phylogénétiques entre les différents entérotypes ...... 223
Annexe 8 : Composition archéale et fongique du microbiote intestinal...... 224
Annexe 9 : Grandes étapes d’une étude du microbiote intestinal ...... 225
Annexe 10 : Comparaison du microbiote intestinal de l’Homme, de la souris, du porc et du macaque cynomolgus ...... 226
Annexe 11 : Abondance relative moyenne des classes bactériennes et ordres bactériens majeurs détectés dans le microbiote fécal de la souris, du rat, du macaque cynomolgus et de l’Homme ...... 227
Annexe 12 : Repères choisis du développement du système immunitaire chez l’humain, la souris et le macaque cynomolgus ...... 228
Annexe 13 : Différents types de régimes alimentaires administrés chez le rat en vue d’induire un trouble métabolique ou de l’obésité ...... 229
Annexe 14 : Fiche récapitulative des principales caractéristiques du Callithrix jacchus dans le cadre de la recherche biomédicale ...... 230
Annexe 15 : Fiche récapitulative des principales caractéristiques du Saguinus oedipus dans le cadre de la recherche biomédicale ...... 232
Annexe 16 : Fiche récapitulative des principales caractéristiques du Saimiri sciureus dans le cadre de la recherche biomédicale ...... 233
Annexe 17 : Fiche récapitulative des principales caractéristiques du Chlorocebus aethiops dans le cadre de la recherche biomédicale ...... 234
Annexe 18 : Fiche récapitulative des principales caractéristiques du Macaca fascicularis, du Macaca mulatta et du Macaca fuscata dans le cadre de la recherche biomédicale ...... 235
21 Annexe 19 : Fiche récapitulative des principales caractéristiques du Papio papio et du Papio anubis dans le cadre de la recherche biomédicale ...... 237
22 Liste des abréviations
AAALAC : de l’anglais « Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International » ou association internationale pour l’évaluation et l’accréditation du traitement des animaux de laboratoire
ADN : Acide désoxyribonucléique
Afssa : Agence française de sécurité sanitaire des aliments
AMM : Autorisation de Mise sur le Marché
AOS : Arabino-oligosaccharides
ARNr : Acide ribonucléique ribosomique
AVC : Accident Vasculaire Cérébral
BEA : Bien-Être Animal
BFS : Bactéries Filamenteuses Segmentées
BPL : Bonnes Pratiques de Laboratoire
CAFD : de l’anglais « Cafeteria Diet »
CEEA : Comité d’Ethique en Expérimentation Animale
CITES : Convention sur le commerce international des espèces de faune et de flore sauvages menacées d'extinction
CRO : de l’anglais « Contract Research Organization » ou sociétés de recherche sous contrat
DAP : Demande d’Autorisation de Projet
DDPP : Direction Départementale des Populations
DGAL : Direction Générale de l’Alimentation
DT1 : Diabète de type 1
DT2 : Diabète de type 2
EPI : Equipement de Protection Individuelle
FISH : de l’anglais « Fluorescent in situ hybridization »
FODMAPs : de l’anglais « Fermentable Oligo-, Di-, Mono-saccharides And Polyols »
FOS : Fructo- Oligosaccharides
FTO : de l’anglais « Fat Mass and Obesity-associated protein »
23 GALT : de l’anglais « Gut-associated lymphoid tissue »
GF : de l’anglais « Germ Free » ou sans germe
GIP : de l’anglais « Gastric inhibitory polypeptide » ou peptide insulinotrope dépendant du glucose
GLP-2/GLP-1 : de l’anglais « Glucagon-Like Peptide 2 or 1 »
GOS : Galacto-Oligosaccharides
HDL : de l’anglais « High Density Lipoprotein » ou lipoprotéines de haute densité
HFD : de l’anglais « High Fat Diet »
HFHSD : de l’anglais « High Fat High Sugar Diet »
HMP : de l’anglais « Human Microbiome Project »
HSD : de l’anglais « High Sugar Diet »
Ig : Immunoglobuline
IgAs : Immunoglobuline A sécrétoire
IMC : Indice de Masse Corporelle
IL : Interleukine
IUCN : Union internationale pour la conservation de la nature
Kcal : une kilocalorie
KO : de l’anglais « Knock out »
LDL : de l’anglais « Low Density Lipoprotein » ou lipoprotéines de faible densité
LPS : LipoPolySaccharide
MADI-TOF MS : de l’anglais « Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation Time-Of-Flight Mass Spectrometry »
MCA : Ministère Chargé de l’Agriculture
MCR : Ministère Chargé de la Recherche
MeSH : de l’anglais « Medical Subject Headings », il s’agit du thesaurus de vocabulaire contrôlé pour l’indexation des articles référencés par PubMed.
MétaHit : de l’anglais « Metagenomes of the Human Intestinal Tract »
MICI : Maladies Inflammatoires Chroniques Intestinales
NASH : de l’anglais « Nonalcoholic steatohepatitis »
NIDDM : de l’anglais « Non-insulin-dependent diabetes mellitus »
24 NGS : Nouvelles générations de séquençage
NK : de l’anglais « Natural Killer »
NMDS : de l’anglais « Non-metric MultiDimensional Scaling »
NOD : de l’anglais « Non Obese Diabetic » : modèle de souris diabétique
NSG : souris NOD scid gamma
OGM : Organisme Génétiquement Modifié
OTUs : de l’anglais « Operational Taxonomic Unit »
PAMPs : de l’anglais « Pathogen-Associated Molecular Patterns » ou motifs moléculaires associés aux pathogènes
PCoA : de l’anglais « Principal coordinate analysis »
PCR : de l’anglais « Polymerase Chain Reaction »
PNH : Primate Non Humain
PRRs : de l’anglais « Pattern Recognition Receptors » ou récepteurs de reconnaissance des motifs moléculaires qPCR : de l’anglais « quantitative Polymerase Chain Reaction » s (16s) : Svedberg
SBEA : Structure chargée du Bien-Être Animal
SCFAs : de l’anglais « Short Chain Fatty Acids »
SPF (ou EOPS) : de l’anglais « Specific Pathogen Free » (ou Exempt d'Organisme Pathogène Spécifique)
STZ : de l’anglais « Streptozotocin » ou streptozotocine
TGF : de l’anglais « Transforming growth factor »
TGH : Transferts Génétiques Horizontaux
TMAO : Trimethylamine N-oxide
TMF : Transplantation du Microbiote Fécal
TLR : de l’anglais « Toll-Like Receptor »
T-RFLP : de l’anglais « Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism »
UFC : Unité Formant Colonies ( de l’anglais CFU « Colony-forming unit »)
UCP : de l’anglais « Uncoupling »
25 UNIFRAC : de l’anglais « Unique Fraction Metric ».
XOS : Xylo-Oligosaccharides
26 GLOSSAIRE
Terme Définition Référence
Les additifs alimentaires sont des substances qui Additif alimentaire permettent d’améliorer la sécurité sanitaire, la fraicheur, Wu et al., 20191 le goût la texture ou la couleur d’un aliment.
Affection invalidante « Diminution des capacités physiques ou psychologiques Directive normales d’une personne. » 2010/63/UE2
Un épaississement et une perte d’élasticité des parois Athérosclérose des artères qui survient avec la formation de plaques MeSH3 athérosclérotiques dans l’intima de l’artère.
Ou « sans germe ». Se dit d’un animal qui « n’héberge Axénique TermSciences4 aucun microorganisme décelable »
Phylum bactérien : bactéries Gram négatives, ne formant Nguyen et al., Bacteroidetes pas de spores, anaérobies 20155
Nguyen et al., Coprophagie Consommation de fèces 20155
Technique récente de culture massive de bactéries en utilisant différents milieux de cultures et conditions Costa et Weese, Culturomique (aérobie, anaérobie etc.), parfois en essayant de mimer les 20196 conditions d’origine intestinale des bactéries
Groupe hétérogène de maladies caractérisées par une Diabète TermSciences7 hyperglycémie et une intolérance au glucose.
Il s’agit d’un sous-type du diabète sucré, caractérisé par une déficience en insuline. Il se manifeste par un commencement brutal via une sévère hyperglycémie, une progression rapide vers une acidocétose diabétique, Diabète de type 1 TermSciences8 et la mort s’il n’est pas traité rapidement à l’insuline. Cette maladie peut survenir à n’importe quel âge, mais est plus fréquemment détectée pendant l’enfance ou l’adolescence.
27 Il s’agit d’un sous-type de diabète sucré, qui ne répond pas ou n’est pas dépendant de l’insuline (NIDDM, de l’anglais « Non Insulin-Responsive or Dependent Diabetes Mellitus »). Il est caractérisé initialement par une résistance à l’insuline et une hyperinsulinémie ; et éventuellement une intolérance au TermSciences9 Diabète de type 2 glucose ; une hyperglycémie ; et un diabète déclaré. Le diabète sucré de type 2 n’est plus considéré comme une maladie exclusivement trouvée chez les adultes. Les patients atteints développent rarement une cétose mais montrent souvent une obésité.
Distance De l’anglais « unique fraction metric ». C’est une mesure Rosenbaum et al., UNIFRAC de la distance phylogénétique entre des jeu de taxons 201510
Il s’agit d’une mesure du nombre d’espèces différentes présentes, et elle dépend des indices de diversité et de Valdes et al., Diversité microbienne leur répartition plus ou moins équitable. Une faible 201811 diversité microbiotique est un marqueur de dysbiose (équilibre microbiotique) dans l’intestin.
Changements quantitatifs et qualitatifs de la composition du microbiote qui peuvent conduire à une Dysbiose altération des interactions entre l’hôte et son microbiote MeSH12 ou à un déséquilibre qui peut contribuer à un état pathologique souvent lié à un état inflammatoire.
Classification de types humains ou d’autres espèces hôtes Nguyen et al., Entérotype basées sur la composition de leur microbiote intestinal 20155
« Ensemble des micro-organismes vivant, à l'état normal Flore microbienne ou pathologique, sur les tissus ou dans les cavités Larousse13 naturelles de l'organisme. »
Phylum bactérien : bactéries Gram positives, Nguyen et al., Firmicutes productrices d’endospores, anaérobies 20155
Des polymères glucidiques d’origine végétale (amidon, Glucide cellulose, hémicellulose, …), associés ou non dans la fermentescible ou fibre plante, à de la lignine ou à d’autres constituants non Afssa, 2002 diétiétique glucidiques (polyphénols, cires, saponines, cutine, phytates, phytostérols...)
Se dit d’un « animal hébergeant exclusivement un ou Gnotobiotique plusieurs microorganismes vivants parfaitement TermSciences14 connus »
Petites poches segmentant le gros intestin à cause de la Nguyen et al., Haustrations tension provoquée par les taenia coli 20155
28 Il s’agit « d’animaux axéniques associés à une flore bactérienne étrangère à son espèce et qui est maintenu en isolateur. La flore associée à un animal axénique peut Hétéroxénique TermSciences15 être connue ou inconnue », c’est notamment des modèles souris axénique colonisée par la flore microbiotique intestinale humaine.
Processus par lequel l’environnement interne d’un Homéostasie MeSH16 organisme tend à rester équilibré et stable.
Se dit d’un animal « librement exposé depuis sa naissance aux microorganismes de leur milieu naturel et Holoxénique notamment à ceux que son espèce a acquis au cours de TermSciences17 son évolution. » Sa charge microbienne est inconnue et non contrôlée.
Augmentation du taux d’acide urique dans le sang due à Hyperuricémie une surproduction d’acide urique ou bien une TermSciences18 élimination rénale défaillante.
Terme générique comprenant les maladies dues à un processus métabolique anormal. Il peut être congénital Stedman, 26ème Maladie métabolique ou acquis lors d’une maladie d’un organe endocrine ou édition19 lors d’une défaillance d’un organe primordial pour le métabolisme comme le foie.
Cela correspond à la quantité totale de tous les Métabolome métabolites d’un échantillon c’est-à-dire les molécules à Cani, 201820 faible poids moléculaire.
Cela correspond à l’intégralité du matériel génétique présent dans un échantillon. Il est composé de des génomes de plusieurs organismes par exemple le Métagénome Cani, 201820 génome des cellules du corps humain et celui des différents microorganismes des microbiotes chez l’homme.
Ensemble complet des microorganismes (bactérie, fungi, virus, protozoaire, etc.) qui existent naturellement dans une niche biologique particulière comme un Microbiote organisme, un sol, une étendue d’eau etc. Le microbiote MeSH21 gastro-intestinal est donc l’ensemble des microorganismes qui existent naturellement dans le tractus gastro-intestinal.
« Le microbiote intestinal est un écosystème complexe qui comprend l’ensemble des êtres unicellulaires Landman et Microbiote intestinal hébergés dans le tube digestif, principalement des Quévrain, 201622 bactéries mais aussi des virus, des champignons et des archées. »
29 Ce terme désigne initialement le génome total des microorganismes d’un environnement particulier. Il est Knight et al., Microbiome aujourd’hui utilisé de manière courante pour désigner le 201723 microbiote en anglais.
Il s’agit d’un animal, non humain, choisi pour ses caractéristiques spécifiques pour une utilisation en Modèle animal MeSH24 recherche expérimentale, pour l’enseignement ou des tests
Ensemble des fungi qui existent dans une niche Mycobiome biologique particulière comme un organisme, un sol, MeSH25 une étendue d’eau etc.
La NASH ou stéato-hépatite non alcoolique ou encore maladie du « foie gras » est une maladie inflammatoire chronique du foie, causée par une accumulation de graisse dans cet organe. Elle ne provoque chez la « Nonalcoholic plupart des personnes aucun symptômes. Mais pour Steatohepatitis NASH (NASH) », certains individus, la graisse entraine des lésions Standford Health hépatiques. Elle peut se compliquer en cirrhose. Elle est Care26 généralement due à une consommation d’alcool importante sur le long terme. Parfois elle se déclare chez des personnes ne consommant pas d’alcool.
Condition liée au poids corporel qui se trouve au-dessus du poids acceptable ou souhaitable, généralement dus à l’accumulation de graisse dans le corps. Les standards peuvent variés avec l’âge, le sexe ou la génétique ou le Obésité MeSH 27 bagage culturel. Si l’IMC est supérieur à 30kg/m2, la personne est considérée comme obèse. Si l’IMC est supérieur à 40kg/m2, la personne est atteinte d’obésité morbide.
OTU ou Unité De l’anglais « Operational Taxonomic Unit » Costa et Weese, Opérationnelle Niveau taxonomique auquel les analyses de microbiote 20196 Taxonomique sont menées et définies par les chercheurs
« Le « point limite » est le moment auquel la souffrance et/ou la détresse d’un animal d’expérimentation doit est arrêtée, minimisée ou diminuée à l’aide de mesures telles Point limite que l’euthanasie (à condition qu’elle soit faite de façon Pau B., 200228 supportable pour l’animal), par l’arrêt du processus qui le fait souffrir, ou par un traitement visant à le soulager. »
Composants non digestibles principalement des Prébiotique carbohydrates qui améliore la santé humaine et la MeSH29 croissance et/ou l’activité des bactéries du côlon
30 Microorganismes vivants qui supplémentent Probiotique l’alimentation à des fins bénéfiques pour l’hôte en MeSH30 améliorant son équilibre microbien intestinal
Elle est fondée sur le concept que les autres espèces Recherche Ericsson et al., animales partagent des caractéristiques physiologiques, translationnelle 201331 comportementales, ou autres avec l’espèce humaine.
Capacité du microbiote à retourner à son état d’équilibre Lloyd-Price, J. et Résilience après une perturbation al.32
Il s’agit d’acides gras avec 2 à 6 atomes de carbone Short Chain Fatty Valdes et al., produits par des bactéries par fermentation des fibres Acids ou SCFAs 201811 diététiques.
Il s’agit d’une souris greffée avec des cellules fonctionnelles ou des tissus humains, de différents types Fujiwara, 2018 Souris humanisée (cellules du système immunitaire, hépatocytes, tissu 33 cutané, îlots pancréatiques, etc.)
Capacité du microbiote à conserver un état d’équilibre, Stabilité du Lloyd-Price, J. et une composition taxonomique et fonctionnelle au cours microbiote al.32 du temps
Deux entités sont en état de symbiose ou de Symbiotique ou mutualisme, définit comme une relation entre deux MeSH34 mutualisme organismes qui sont inter-indépendants. La présence de chacun procure des bénéfices à l’autre.
Groupe de symptômes qui représentent des facteurs de risques pour les maladies cardiovasculaires et le diabète Syndrome sucré de type 2. Les composantes majeures de ce MeSH35 métabolique syndrome sont une obésité abdominale, une dyslipémie athérogène, une hypertension, une résistance à l’insuline, un état pro-inflammatoire et un état pro-thrombotique.
Il s’agit de trois muscles lisses longitudinaux sur la paroi Nguyen et al., Taenia coli externe du côlon humain. 20155
Transfert du microbiote d’un individu à un autre par Transplantation de administration de fèces d’un donneur par voie orale ou MeSH36 microbiote fécal voir rectale du receveur.
Cela représente le matériel génétique viral total présent Virome Cani, 201820 dans un échantillon. C’est le génome des virus.
31
32 INTRODUCTION
Au cours de son évolution, l’Homme s’est développé conjointement avec son microbiote. Celui-ci joue un rôle majeur dans notre développement, notre immunité et notre métabolisme. Le système digestif et surtout l’intestin représente la plus grande surface d’échange avec l’extérieur, colonisée par de multiples microorganismes : le microbiote intestinal. A cet endroit, cette communauté microbienne a de nombreux rôles : la protection de l’intégrité de l’épithélium intestinal, la défense contre les pathogènes, l’absorption des nutriments et la régulation de l’immunité de son hôte37. Pour mener à bien l’ensemble de ses fonctions, on estime à environ 1014 le nombre de microorganismes présents dans le tractus digestif soit 10 fois plus de cellules bactériennes que de cellules dans l’organisme humain37. L’ensemble « Homme et son microbiote » peut alors être considéré comme un super-organisme.
Les anciennes techniques d’étude du microbiote, dépendantes d’une culture des microorganismes, rendaient cette tâche difficile et lente, d’autant plus que certaines espèces sont strictement anaérobies. Aujourd’hui, grâce aux nouvelles techniques d’étude du génome (séquençage de l’ARN ribosomal 16s ou séquençage du génome complet), les chercheurs ont pu identifier un grand nombre de nouvelles espèces. Entre 2013 et 2017, plus de 12 900 papiers ont été publiées sur le sujet, ce qui représente plus de 80% des publications sur le sujet des dernières 40 années20.
Actuellement le microbiote est considéré comme une source potentielle immense de nouveaux moyens thérapeutiques20. Les chercheurs se sont rendu compte que le microbiote était non seulement impliqué dès la naissance d’un individu38, dans son développement, mais qu’il avait un rôle dans les désordres cardio-métaboliques, dans les maladies inflammatoires intestinales et maladies neuropsychiatriques et aussi dans les mécanismes de cancer39.
Bien qu’il y ait de nombreux microbiotes différents, occupant une niche écologique spécifique (respiratoire, cutané, vaginal, etc.), nous nous intéresserons ici seulement au microbiote intestinal, à son étude, ses fonctions chez l’Homme, le Primate Non Humain (PNH) et la souris (Mus musculus). « Le microbiote intestinal est un écosystème complexe qui comprend l’ensemble des êtres unicellulaires hébergés dans le tube digestif, principalement des bactéries mais aussi des virus, des champignons et des archées. »22. L’implication de ce microbiote dans les pathologies humaines ne sera volontairement abordée dans cette thèse que dans le cas des maladies métaboliques. Le terme de “maladie métabolique” est un terme générique comprenant les maladies dues à un processus métabolique anormal. Il peut être congénital ou acquis lors d’une maladie d’un organe endocrine ou lors d’une défaillance d’un organe primordial pour le métabolisme comme le foie (Stedman, 26ème édition)19. Nous verrons en quoi le microbiote intestinal semble être impliqué dans la pathogénèse de ces maladies.
L’étude du microbiote a pu progresser grâce aux modèles rongeurs aux statuts sanitaires particuliers, mais les conclusions sont difficilement transférables de manière directe chez l’Homme du fait des différences phylogénétiques. Par ailleurs, l’étude directe du microbiote chez l’humain est limitée car on ne contrôle pas l’environnement du sujet et on se limite pour des raisons éthiques évidentes à des investigations simples telles qu’un prélèvement fécal. Il y a par conséquent un réel besoin d’un modèle translationnel capable de reproduire les aspects clés de la physiologie et du système immunitaire de l’Homme, sur lequel des analyses approfondies peuvent être menées, comme la biogéographie du microbiote intestinal dans l’article de Yasuda et al.40 chez le macaque rhésus. De plus, bien qu’actuellement les probiotiques et prébiotiques ne soient pas considérés comme des médicaments et peuvent être rapidement testés chez l’Homme sans les contraintes d’un réel essai clinique, leur statut pourrait être amené à changer et nécessiter une AMM, donc des essais
33 pré-cliniques. Dans cette thèse, nous nous intéresserons au primate non humain (PNH) en tant que modèle d’étude candidat pour analyser de manière approfondie le microbiote intestinal dans le cadre de la recherche translationnelle pour l’Homme.
L’appellation « primate non humain » (PNH) n’est pas un terme scientifique. Il s’agit d’un terme utilisé dans le domaine de l’expérimentation animale qui désigne l’ensemble des primates excepté l’Homme. L’ordre des primates appartient aux mammifères et comprend plus de 300 espèces répartis dans 14 familles présentées dans l’arbre phylogénétique de Perelman, P. et al. de l’Annexe 1. Ils sont caractérisés par un cerveau relativement large par comparaison avec d’autres mammifères terrestres, des yeux orientés vers l’avant, la présence d’une scissure calcarine et de mécanorécepteurs spécialisés au niveau des mains et des pieds qui permet une perception fine au toucher19. L’arbre phylogénétique de Moorjani, P. et al.41 présentant seulement 10 espèces de primates (cf. Figure 1) illustre bien la distance phylogénétique entre les espèces de primates utilisées en expérimentation animale (Singes du Nouveau Monde et de l’Ancien Monde) et l’Homme, par rapport à la souris qui en est très éloignée. Les autres espèces de la famille Hominidés que l’Homme ne sont généralement pas utilisées en recherche biomédicale car elles sont classées en Annexe A du Règlement (CE) N° 338-97 Du Conseil du 9 décembre 1996 relatif à la protection des espèces de faune et de flore sauvages par le contrôle de leur commerce42.
Figure 1 : Arbre phylogénétique de 10 primates – Taux de substitution autosomal neutre pour 10 primates et un groupe extérieur (souris, en gris) à partir des données Multiz estimé avec Phylofit. La longueur des branches reflète le nombre de substitutions neutre attendu par site pour chaque lignée. (Source : « Variation in the molecular clock of primates », Moorjani, P. et al., 201641)
34
Cette thèse va donc s’intéresser à l’intérêt du modèle primate non humain pour l’étude du microbiote. L’utilisation du PNH pour l’étude du microbiote intestinal, de ses interactions avec les maladies métaboliques est-elle scientifiquement et éthiquement justifiée ? Présente-t-elle un réel intérêt translationnel chez l’Homme en comparaison avec le modèle le plus courant i.e. la souris ? Techniquement, comment mettre en place l’étude du microbiote intestinal dans de potentielles études pré-cliniques ?
Dans une première partie, nous ferons un état des lieux des connaissances sur le microbiote intestinal, sa composition et ses grandes fonctions. Nous aborderons ses implications dans les troubles métaboliques mais aussi nous l’envisagerons en tant que traitement lui-même. Nous ferons un point sur les techniques actuelles d’étude de sa composition et l’intérêt des modèles animaux pour mieux comprendre l’ensemble de ses mécanismes. Cette première partie a pour objectif de comprendre le fonctionnement général du microbiote sain et pathologique chez l’Homme afin d’identifier les caractéristiques d’un modèle d’étude adapté, d’identifier donc ses caractéristiques attendues.
Dans une seconde partie, nous comparerons l’Homme, le PNH et la souris en tant que modèle d’étude du microbiote intestinal et des maladies métaboliques associées. L’objectif est de montrer ce qu’apporte chacun de ces modèles d’un point de vue scientifique, et donc d’identifier leurs avantages et limites respectives.
Enfin, dans une troisième et dernière partie, nous réfléchirons à l’utilisation concrète du PNH dans une étude préclinique pour l’étude du microbiote intestinal et des troubles métaboliques. Nous aborderons les contextes réglementaires et éthiques de son utilisation en recherche biomédicale en Europe. Puis nous essaierons de déterminer les critères de choix d’une cohorte de PNH dans ce cadre et enfin, nous évoquerons les contraintes d’hébergement relatives au contrôle du microbiote et du statut sanitaire des animaux.
L’écriture de ce travail s’est faite dans un contexte concret. En effet, dans le cadre du Master 2 Recherche Animale Préclinique et Clinique, j’ai choisi de faire mon stage au sein de l’entreprise Cynbiose. Créée en 2008 le Dr. Hugues Contamin, Cynbiose est une société de recherche sous contrat spécialisée dans l’utilisation de modèles PNH. Actuellement, cette entreprise monte une nouvelle filière : PRIMEx. Elle a pour grand objectif l’aménagement d’un bâtiment accueillant des modèles PNH pour l’étude du microbiote. C’est dans cet objectif de développement que le Dr. Hugues Contamin et le Dr. Joachim Confais, Directeur scientifque, m’ont proposé le sujet de cette thèse d’exercice vétérinaire.
35
36 LE MICROBIOTE INTESTINAL : GENERALITES
1.1. LE MICROBIOTE INTESTINAL : DEFINITIONS 1.1.1. Le microbiote intestinal sain : notion de noyau fonctionnel
1.1.1.a Définition du microbiote
Le microbiote est l’ensemble complet des microorganismes (bactérie, fungi, virus, protozoaire, ...) qui existent naturellement dans une niche biologique particulière comme un organisme, un sol, une étendue d’eau etc. Le microbiote gastro-intestinal est donc l’ensemble des microorganismes qui existent naturellement dans le tractus gastro-intestinal (définitions du MeSH21 traduites de l’anglais). Ces microorganismes ont évolué conjointement à leur hôte, jusqu’à devenir indispensable à leur santé. En effet, le microbiote est aujourd’hui considéré comme un organe à part entière : on peut alors considérer que l’ensemble « hôte et microbiote » forme un super-organisme.
Avant d’étudier les relations entre dysbiose et maladie, il est important de caractériser et définir le microbiote sain. Mais cette tâche s’avère plus difficile qu’on imagine du fait de sa grande variabilité de composition, comme le montre l’étude « Human Microbiome Project » (HMP)43 , et de sa complexité de fonctionnement. En effet, des différences majeures sont observées, dans sa composition taxonomique, d’une personne à une autre au sein de la même population mais aussi d’une région à une autre (résumé dans un paragraphe de l’article de Lloyd-Price, J. et al. The healthy human microbiome32). L’étude européenne MétaHIT (de l’anglais « Metagenomes of the Human Intestinal Tract ») et le projet américain HMP ont mis en évidence au sein du microbiote intestinal l’existence de 2172 espèces, dont 386 anaérobies44 ; elles appartiennent à 12 phyla. Quatre phyla sont représentés en majorité (93,5%) : Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria et Bacteroidetes37 (dont les Firmicutes représentés de 60 à 75% et les Bacteroidetes de 30 à 40 % selon les individus22).
Bien que moins étudiés et connus, les microorganismes autres que les bactéries, comme les archées, virus, phages, levures et fungi sont tout aussi importants. La revue sur le virome de Foulongne (2015)45 aborde l’exemple des virus qui infectent en permanence leur hôte de manière asymptomatique. Il s’agit d’un équilibre avec leur hôte qui les tolère et les contrôle par son immunité. Le virome est directement impliqué dans des processus physiologiques notamment via l’intégration de séquences rétrovirales « fossiles » dans le génome humain. Certaines séquences sont devenues même indispensables à certains processus comme lors de la placentation (développé dans l’article de Mi, S. et al., 200046). Il ne faut pas non plus oublier que les virus bactériophages sont des véhicules de matériel génétique qui concourent à l’adaptabilité aux bactéries45.
Le mycobiome (revue de Botterel et al., 201547)est de la même façon essentiel, notamment par la coévolution de certains champignons au sein du microbiote. Malassezia et Candida albicans sont ainsi devenus acteurs de la modulation du système immunitaire adaptatif de l’hôte. D’autres fungi peuvent avoir une action préventive dans certaines pathologies, comme par exemple Saccharomyces boulardii dans des maladies diarrhéiques (développé dans l’article de L. V. McFarland et al., 199348).
37 1.1.1.b Notion de noyau fonctionnel
Être capable de décrire le microbiote sain permettrait de mieux diagnostiquer un état de dysbiose et une potentielle maladie. Dans un premier temps, les chercheurs ont essayé de décrire le microbiote à partir de sa composition microbienne, d’un point de vue taxonomique. Mais la problématique de sa grande variabilité intraspécifique rend la définition d’un noyau identifié d’espèces illusoire, car il existe une multitude de compositions saines du microbiote intestinal32. Un noyau fonctionnel, physiologique, a donc été envisagé pour permettre la définition du microbiote sain. Il ne s’agit plus d’identifier les espèces microbiennes de manière individuelle, mais d’identifier, au sein du génome de l’ensemble de ces microorganismes, les différentes fonctions à un niveau moléculaire, cellulaire ou métabolique, que ce génome est capable de réaliser.
La revue de Lloyd-Price J. et al. « The healthy human microbiome » (2016)32 définit les propriétés de ce noyau fonctionnel. Il doit permettre de conserver les voix métaboliques essentielles d’une personne à une autre et être caractérisé par un potentiel génétique commun stable intégrant les fonctions des bactéries présentes dans l’intestin. Trois grandes fonctions doivent être comprises dans le microbiome, c’est-à-dire dans le génome total des microorganismes contenu dans l’intestin (définition issue de la revue « The Microbiome and Human Biology » de Knight et al.49) :
• Entretien de la vie microbienne : Cela correspond à toutes les fonctions nécessaires au maintien de la vie du microorganisme de manière générale (transcription/translation/ production d’énergie et de composants structuraux) ; • Fonctions spécifiques du microbiote : Cela comprend l’ensemble des fonctions qui permettent aux microorganismes de vivre dans une niche écologique chez un hôte et d’interagir avec celui-ci (adhésion aux cellules de l’hôte/production de composants impliqués dans les interactions hôte-microbiote comme des vitamines, composants immuno-stimulateurs) ; • Fonctions spécifiques de la localisation du microbiote chez son hôte : pour le microbiote intestinal, il s’agit par exemple des fonctions métaboliques de dégradation des glycosaminoglycanes, de production de SCFAs (de l’anglais « Short Chain Fatty Acids »), de vitamines et d’acides aminés essentiels, etc.
Les chercheurs Qin, J. et al. (2010)50 ont abordé ce sujet et ont essayé d’identifier l’ensemble des fonctions présentes dans le pool de gènes obtenus dans des échantillons fécaux de 124 européens adultes. Ils ont ainsi défini un génome intestinal minimal et un métagénome intestinal minimal en termes de fonctions présents chez tous les individus et bactéries. Les fonctions à un niveau moléculaire et cellulaire ainsi que leur fréquence relative sont présentées dans la Figure 2 ci-dessous. Le métagénome correspond à l’intégralité du matériel génétique présent dans un échantillon. Il est composé des génomes de plusieurs organismes par exemple le génome des cellules du corps humain et celui des différents microorganismes du microbiote intestinal chez l’homme (définition traduite de l’anglais de la revue de Patrice D Cani, 201820).
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Figure 2 : Composition fonctionnelle du génome et métagénome intestinal minimal (séquençage de l’ADN présent dans les prélèvements fécaux de 124 européens adultes) ( Source : « A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. », Qin, J. et al., 201050).
Les fonctions du métagénome humain et de son microbiote intestinal décrites ci-dessus restent spécifiques à la vie cellulaire et à la fois très générale. Une grande part reste pour l’heure non élucidée (« unknown » ou inconnu : presque 60% des gènes du génome minimal ne sont pas encore associés à une fonction cellulaire particulière). Il reste donc un grand travail d’analyse et d’association entre gènes et fonctions cellulaires pour pouvoir caractériser plus précisément le noyau fonctionnel du microbiote intestinal. 1.1.2. Propriétés du microbiote intestinal
Le microbiote intestinal doit, pour rester sain, posséder un certain nombre de propriétés.
1.1.2.a Quantité et diversité microbienne :
Le groupe américain « Human Microbiome Project »43 définit la diversité du microbiote d’une niche écologique comme étant une diversité de composition et d’abondance de types d’organismes distincts. Le microbiote intestinal de chaque individu est le résultat d’une sélection parmi une population de potentiels colonisateurs32 jusqu’à un état d’homéostasie, et elle est fortement déterminée par l’environnement2 (cf. Partie 1.1.3. Mise en place du microbiote intestinal).
L’article de Vandeputte et al. « Quantitative microbiome profiling links gut community variation to microbial load » (2017)51 a montré que la charge absolue en microorganismes dans l’intestin était différente d’une personne saine à une autre. Les études du microbiote, qui ne quantifient pas les espèces microbiennes et qui ne s’intéressent qu’à leur identification et leur proportion relative, négligent généralement le fait que la quantité absolue en microbes peut être un facteur clé de la dysbiose. Ils
39 ont notamment montré que la quantité absolue de bactéries évaluée dans des échantillons de fèces était moindre pour des personnes atteintes par la maladie de Crohn par rapport à des individus sains. La méthode de profilage du microbiote utilisée doit donc être adaptée aux objectifs de l’étude pour ne pas faire de conclusion erronée. Mais alors que prendre en compte pour l’étude du microbiote intestinal, la quantité absolue en microorganismes ou bien l’abondance relative de chaque espèce et la globale d’un échantillon ? Une analyse de composition du microbiote intestinal par abondance relative peut en effet donner une conclusion très différente d’une analyse quantitative.
1.1.2.b Stabilité et résilience :
Le microbiote est un équilibre dynamique qui perd et accueille des microorganismes en permanence. Son abondance et sa composition taxonomique varie au cours du temps, en fonction de la survenue d’évènement dans la vie de l’individu (traitement antibiotique par exemple). La capacité du microbiote à retourner à son état d’équilibre (résilience), sa capacité à résister et sa stabilité au cours du temps sont 3 propriétés importantes à associer à la définition du microbiote sain, décrite dans la revue de Lloyd-Price, J. et al.(2016)32.
Ces notions peuvent être mis en regard de celle d’homéostasie de l’organisme. L’homéostasie est le processus par lequel l’environnement interne d’un organisme tend à rester équilibré et stable (définition traduite de l’anglais du MeSH16). Le microbiote participe donc à l’équilibre interne de son hôte et inversement, l’hôte participe à l’équilibre du microbiote intestinal. Les deux entités sont donc en état de symbiose ou de mutualisme, définit comme une relation entre deux organismes qui sont inter-indépendants. La présence de chacun procure des bénéfices à l’autre. (Définition du MeSH34)
Le microbiote intestinal est l’ensemble des microorganismes contenus dans l’intestin (bactéries, virus, archées, fungi, …). On le caractérise par sa diversité d’espèces mais aussi par les fonctions clés qu’il est capable d’assurer au sein de son hôte (notion de noyau fonctionnel). A l’équilibre, il est stable au cours du temps et capable de retourner à son état initial après perturbation (résilience). Sa présence est indispensable à la vie de l’hôte puisqu’il participe à son homéostasie et qu’ils ont évolué conjointement. Les deux entités vivent en symbiose.
Nous allons maintenant voir comment le microbiote intestinal se met en place chez l’Homme et selon quels processus il acquiert ses propriétés. 1.1.3. Mise en place du microbiote intestinal
Les animaux ont évolué de manière conjointe avec les microorganismes qui les « habitent ». En effet, les niches écologiques des organismes dans lesquelles les bactéries, virus, archées et fungi se sont développés, sont extrêmement spécifiques. Le microbiote a su s’adapter à ces conditions de vie particulières au cours du temps. La relation hôte/microbiote est un équilibre complexe qui permet de gérer défense et homéostasie de l’organisme (revue de Filleron, A. & Jumas-Bilak sur la mise en place du microbiote chez l’enfant, 201538).
Dans la nature, un animal est dit « holoxénique », i.e. qu’il est « librement exposé depuis sa naissance aux microorganismes de leur milieu naturel et notamment à ceux que son espèce a acquis au cours de son évolution. » Sa charge microbienne est inconnue et non contrôlée. (définitions citées du site Termsciences17).
40 Le microbiote intestinal participe à l’ontogenèse de l’individu par implication dans la maturation de son système lymphoïde. Il fait partie intégralement du développement intestinal même, en participant à la structuration de l’architecture de la muqueuse intestinale.
La revue sur les étapes de la mise en place du microbiote de Kumbhare & Patangia « Factors influencing the gut microbiome in children: from infancy to childhood » (2019)52 synthétise les grandes étapes de ce processus chez l’Homme dans la Figure 3 ci-dessous.
Figure 3 : Vue d’ensemble des facteurs influençant la mise en place du microbiote chez l’Homme (Source : « Factors influencing the gut microbiome in children: from infancy to childhood », Kumbhare & Patangia, 201952)
1.1.3.a Phase 1 : Développement fœtal
➢ Le fœtus in utero, est-il stérile ?
La revue de Walker et al., « The prenatal gut microbiome: are we colonized with bacteria in utero? » (2017)53, aborde la question de la mise en place du microbiote intestinal chez le nouveau-né. Il a longtemps été admis que le fœtus in utero était un organisme stérile, qui commençait à être colonisé par les microorganismes à partir de sa naissance. Cette notion a été remise en question notamment par l’article de Collado et al. paru en 201654, qui montre une composition partagée entre le microbiote détecté dans le placenta, le liquide amniotique et le méconium de l’enfant, et suggère un transfert microbien pendant la grossesse via l’interface fœto-maternelle. La composition du méconium reflète la composition du microbiote intestinal in utero, et est inchangée selon le mode de mise-bas (voie basse/césarienne) : la colonisation des intestins commencerait donc avant la naissance. L’origine de ces bactéries, de diversité réduite par rapport à des fèces d’un adulte sain dont les genres dominants sont Firmicutes et Proteobacteria, serait une ingestion fœtale du liquide amniotique. En effet, plus de 50% des bactéries retrouvées dans le méconium sont aussi présentes dans le
41 liquide amniotique alors qu’il n’y a presque aucun recoupement de la composition avec les microbiotes vaginaux et oraux, comme le montre l’article « Meconium Microbiome Analysis Identifies Bacteria Correlated with Premature Birth » de Ardisson et al. (2014)55. Les sites maternels qui contribueraient à la colonisation des intestins du fœtus sont le microbiote intestinal maternel pendant la grossesse, le microbiote oral ainsi qu’une potentielle ascension de microbes depuis le microbiote vaginal. Les trois voies de translocation au fœtus seraient donc le liquide amniotique, le cordon ombilical et le placenta.
➢ La santé maternelle influence la mise en place du microbiote chez le fœtus
La revue de Kumbhare & Patangia52 explique en quoi la santé maternelle affecte durablement le microbiote intestinal du fœtus puis de l’enfant. Une mère partage, avec son fœtus in utero, des métabolites mais aussi des microbes pendant la grossesse, à la naissance puis pendant l’allaitement. Le microbiote gastro-intestinal joue un rôle important dans la réponse immunitaire et l’homéostasie métabolique, et donc dans une gestation normale. Le microbiote intestinal maternel évolue, d’ailleurs, naturellement au cours de la grossesse. Il est caractérisé par une plus grande abondance et une plus grande diversité de composition bactérienne. Cela suggère que la durée de gestation pourrait être déterminante pour le transfert maternel (les nouveau-nés prématurés ont une diversité bactérienne intestinale moindre comparée à celle d’enfants nés à terme)53.
Une stabilisation du microbiote vaginal (dominance des Lactobacillus) se met aussi en place. Elle représente potentiellement une adaptation évolutive qui favoriserait une colonisation de la progéniture avec une flore bénéfique, pendant la gestation et à la naissance53. La santé du microbiote vaginal est particulièrement importante en cas de naissance par voie basse, car c’est la première flore avec laquelle le nouveau-né est en contact.
L’obésité de la mère ou le développement d’un diabète gestationnel peuvent avoir un impact important sur le développement du microbiote du fœtus et donc sur sa santé. En effet, dans le cas de ces deux maladies, le microbiote intestinal est caractérisé par une présence abondante de Bacteroides, Staphylocoques et Enterobacteriaceae, dont une concentration forte de Proteobacteria et une faible concentration en Acinetobacter, Bacteroides and Firmicutes. Ces modifications prédisposent la descendance au développement de syndrome métabolique pendant l’enfance en lien avec cette dysbiose (développé dans l’article de Singh et al., 201756). Des traitements à base de probiotiques pour éviter cet impact sur la santé fœtale et la santé de la mère sont à l’étude (revue de Kumbhare & Patangia, 201952).
➢ Le régime alimentaire maternel influence la mise en place du microbiote fœtal
Les chercheurs Collado et al. (2016)54ont observé chez l’Homme qu’à l’âge de 3/4 jours, le microbiote intestinal de l’enfant ressemble à celui détecté dans le colostrum maternel. La composition du microbiote varie selon le régime alimentaire et le niveau de santé de chaque individu. Une gestation affecte le microbiote intestinal varie sur toute sa durée comme précédemment évoqué, ce qui influence le fœtus in utero52. Il a été prouvé chez l’Homme qu’un régime riche en graisse altère le microbiote intestinal du nouveau-né indépendamment de l’Indice de Masse Corporel de la mère (développé dans l’article de Chu et al., 201657).
Les changements du microbiote intestinal maternel peuvent donc affecter, de manière marquée et pérenne, la colonisation du tractus intestinal de la descendance, qui la rend plus sujette à des infections ou des maladies dans sa vie future.
42 1.1.3.b Phase 2 : Facteurs périnataux
➢ Mode de mise-bas
Le mode de mise-bas est primordial. En effet, le microbiote vaginal et intestinal de la mère est la première flore en contact avec le nouveau-né. La composition du microbiote intestinal postpartum du nouveau-né sera alors de composition proche de celle du microbiote vaginal de sa mère avec une petite composante liée à la flore environnementale. Chez les enfants nés par césarienne, le premier microbiote intestinal a au contraire une composition proche du microbiote cutané de sa mère (Staphylococcus sp., Corynebacterium sp. et Propionibacterium spp. avec parfois un retard à la colonisation de Bifidobacterium et Bacteroides)38. Le mode de mise-bas influence durablement la mise en place du microbiote et donc sa composition finale. La revue de Kumbhare & Patangia52 recense les pathologies dont le risque est augmenté en cas de naissance par césarienne par rapport aux enfants nés par voie basse. Cela concerne l’asthme, l’obésité, la maladie cœliaque et le diabète de type 1. Des chercheurs sont actuellement en train de développer des techniques d’ensemencement du nouveau-né par césarienne à partir d’écouvillons vaginaux de leur mère, afin de réduire les risques de développer certaines maladies (premier article publié sur le sujet, Dominguez-bello et al., 201658).
➢ Naissance à terme ou avant terme
L’environnement de la naissance joue grandement sur la colonisation du tractus intestinal. C’est d’ailleurs une vraie problématique pour les nouveau-nés prématuré, qui n’ont presque aucun contact avec leurs parents dans leurs premières heures voire premiers jours de vie. Chez le prématuré, la dynamique de mise en place est en effet très différente sans doute à cause de son milieu de vie particulier. Leur faible poids à la naissance, leur alimentation particulière en soins intensifs, l’antibioprophylaxie systématique, etc. conduisent à une difficulté de l’enfant à développer un microbiote sain, à une diversité du microbiote intestinal réduite et une augmentation de la colonisation de microorganismes pathogènes52. L’article de Fouhy et al. « Perinatal factors affect the gut microbiota up to four years after birth » (2019)59 confirme que la durée de gestation à la naissance influence encore les microbiote intestinal de l’enfant quatre années après sa naissance. Il faut savoir que plus de 10% des enfants dans le monde naissent prématurément et que 25% des prématurés qui survivent ont un mauvais développement neurologique, qui pourrait être en partie lié à cette dynamique altérée du microbiote intestinal, associée à une sous-oxygénation, des difficultés respiratoires etc.
➢ Alimentation du nourrisson
Dans la revue de à Kumbhare & Patangia52, il est expliqué que le lait maternel a une composition complexe et dynamique qui est extrêmement différente de celle du lait maternisé industriel (pas de facteurs de croissance, enzymes, anticorps etc.). Ces composés présents dans le lait maternel sont bénéfiques pour l’enfant, pour son développement et pour renforcer son système immunitaire. C’est notamment prouvé que les oligosaccharides contenu dans le lait humain joue un rôle particulier pour faire croître les Bifidobacteria et las Bacteroides (développé dans l’article de Marcobal and Sonnenburg, 201260). En effet, ils modulent la santé des nouveau-nés en ayant une action « prébiotique » notamment en influençant le système immunitaire inné. Le lait maternel a aussi été associé à une plus grande diversité du microbiote intestinal de l’enfant comparé au lait maternisé (développé dans l’article de Cong et al., 201661).
Il faut enfin garder à l’esprit que le régime alimentaire maternel influe grandement sur la composition du lait maternel, donc sur sa composition en oligosaccharides. Le régime alimentaire maternel joue donc indirectement un rôle sur le microbiote intestinal de l’enfant via la consommation du lait52.
43 1.1.3.c Phase 3 : Mise en place et stabilisation chez l’enfant
A partir du sevrage, le microbiote intestinal de l’enfant va peu à peu tendre vers une composition proche de celle de l’adulte. La diversité microbienne va notamment avoir tendance à croître de plus en plus (article de Fouhy, F. et al., 201959).
La revue de Kumbhare & Patangia52 étudie de nombreux facteurs de variation, tels que la génétique, l’hygiène ou le type de régime lacté et l’introduction de l’alimentation solide, qui sont brièvement exposés ci-dessous.
➢ Régime alimentaire
L’influence du régime alimentaire sur la flore du jeune a été montrée grâce au modèle souris gnotobiotique colonisé expérimentalement avec des communautés microbiennes humaines. Le microbiote obtenu est particulièrement instable et peut être altéré en une seule journée par un changement d’alimentation (développé dans l’article de Turnbaugh et al. 200962). L’introduction de nourriture solide dans l’alimentation de l’enfant conduit à une augmentation des Enterobacteria et des Enterococcus, parallèlement à la colonisation des Bacteroides spp., des Clostridium et des Streptococcus. Les enfants nourris au lait maternisé industriel depuis leur naissance sont exposés à un régime déjà complexe et donc leur flore est déjà habituée à ce genre d’aliments et n’ont donc pas de transition aussi brutale que pour un enfant allaité. De plus, le type de régime alimentaire influe sur la structure de la composition du microbiote intestinal. Les enfants nourris avec un régime riche en fibre (communauté plus rurale) ont un taux très élevé en Bacteroidetes et très faible en Firmicutes par rapport aux enfants nourris avec un régime occidental. Ils ont aussi un taux de SCFAs plus élevés en lien avec les bactéries des genres Prevotella et Xylanibacter, connues pour être responsables de la fermentation de la cellulose et libérer de l’énergie (développé dans l’article de De Filippo et al., 201063).
➢ Hygiène de l’enfant en bas-âge
Bien que le risque principal pour la santé de l’enfant résulte d’une hygiène insuffisante exposant aux infections et parasitoses, paradoxalement le manque de challenge du système immunitaire à cause d’environnements trop propres de certains enfants en bas-âge conduit à un dysfonctionnement immunitaire et à un risque plus élevé de développer des infections dans le futur (hypothèse formulée par Strachan, « Hay fever, hygiene, and household size », 198964).
44
➢ Génétique de l’hôte
La génétique de l’hôte joue également sur les liens qui existent entre le microbiote et la paroi de la muqueuse intestinale. Le gène FUT2 code en effet pour une enzyme responsable de l’expression des antigènes des groupes sanguins ABO sur la surface des muqueuses. Plusieurs études rapportent le lien entre la non sécrétion de cette enzyme (deux allèles mutées récessives) et l’altération la composition du microbiote intestinal car cela favoriserait un environnement pro-inflammatoire. Des études plus poussées chez l’enfant et chez les adultes doivent être menées pour pouvoir comprendre en profondeur les mécanismes entrant en jeu.
Les facteurs de variation de microbiote intestinal résultant des interactions avec la mère, l’alimentation et l’environnement seront présentés plus en détail dans la partie 3.2 : Compositions du microbiote intestinal et facteurs de variations.
Selon la revue de Kumbhare et Patangia52, le microbiote intestinal se met en place dès la vie in utero du fœtus. Il dépend donc grandement de la santé et de l’alimentation maternelle. Son développement est ensuite conditionné par le mode de mise-bas, l’âge à la naissance et l’alimentation du nourrisson, puis celle de l’enfant ainsi que son hygiène et son génome (Synthèse dans le Tableau I). Le microbiote se diversifie tout au long de la croissance de l’enfant pour atteindre un état stable et fonctionnel entre 2 et 4 ans.
45 Tableau I : Facteurs de variation de la mise en place du microbiote intestinal.
Facteurs de Conséquence(s) sur la composition du microbiote intestinal Référence variation (s)
Santé maternelle et Régime maternel riche en graisse : Ma et al., 201465 ; régime alimentaire Dysbiose du microbiote intestinal du nouveau-né : altération du pendant la Chu et al., fonctionnement et de la composition taxonomique 57 grossesse 2016 (Composition du microbiote Une mauvaise santé maternelle peut provoquer une dysbiose du Kumbhare et intestinal maternel microbiote du nouveau-né Patangia, normalement plus divers et 201952 ; Il y a un transfert maternel in utero de métabolites et de microbes riche pendant la gestation) Singh et al., bénéfiques pour la mise en place d’un microbiote intestinal équilibré et 201756 stable
Mode de mise-bas : Enfant né par césarienne : bactéries fécales moins abondantes Wu et al., 20191 ; Césarienne ou voie Premier microbiote intestinal proche de celui de la peau de la mère : Biasucci et basse Staphylococcus sp., Corynebacterium sp. et Propionibacterium spp avec parfois un al., 201066 ; retard à la colonisation de Bifidobacterium et Bacteroides Premiers contacts avec les Huurre et al., microorganismes déterminent Influence durablement le microbiote intestinal 200867 ; l’abondance et la Filleron et composition du microbiote Enfant né par voie-basse : Jumas-Bilak, intestinal 201538 ; Premier microbiote intestinal proche de celui du vagin de sa mère Kumbhare et Patangia, 201952
Enfant prématuré : Dynamique de mise en place du microbiote très différente Filleron et Jumas-Bilak environnement à la Diversité du microbiote intestinal réduite et une augmentation de la 201538 ; naissance colonisation de microorganismes pathogènes Kumbhare et Paramètres Composition microbiotique affectée jusqu’à 4 années après la naissance Patangia, environnementaux du 201952 ; prématuré déterminants Fouhy et al., (soins intensifs, alimentation 201959 stérile parentérale, antibiothérapie etc.)
Alimentation du Enfant allaité : Wu et al., 20191 ; nourrisson : Abondance en Lactobacillus, des Bacteroides et des Bifidobacterium Kumbhare et allaitement ou lait augmentée (concentration en Lactobacillus deux fois plus élevés que les Patangia, maternisé industriel enfants nourris au lait maternisé industriel) 201952 ; Diversité du microbiote intestinal importante Marcobal and Enfant nourri au lait maternisé industriel : Sonnenburg, 201260 ; Concentration plus faible en Lactobacillus Cong et al., Diversité taxonomique plus faible 201661
46 1.2. FONCTIONS ET INTERACTIONS METABOLIQUES DU MICROBIOTE INTESTINAL
En essayant de définir le microbiote intestinal dans le paragraphe précédent, nous avons évoqué le noyau fonctionnel, comprenant un ensemble de gènes associées aux fonctions du microbiote présent dans l’intestin.
Pour comprendre quelles sont les grandes fonctions et donc l’intérêt de la présence de nombreux microorganismes au niveau des intestins d’un mammifère, il faut réfléchir à l’échelle de l’hôte. Le microbiote intestinal a ainsi trois grandes fonctions pour la vie de son hôte :
➔ La protection de la muqueuse intestinale et le rôle de barrière naturelle ➔ La maturation et l’entretien du système immunitaire de son hôte ➔ La digestion d’une partie des apports de l’hôte et donc un rôle métabolique 1.2.1. Fonctions de protection et de barrière
Le microbiote est généralement structuré en biofilm (matrice extracellulaire polysaccharidique et bactéries). Ce petit espace est à l’origine d’interactions fréquentes et étroites qui résultent d’une longue coévolution entre les microbes au sein du biofilm et avec leur hôte. Ces proches relations sont à l’origine d’échanges de gènes par transferts génétiques horizontaux (TGH) à l’origine de l’acquisition de diverses capacités comme notamment la résistance aux antibiotiques38.
Cette structure du microbiote et l’abondance des bactéries a un effet de barrière qui permet de protéger l’hôte des bactéries pathogènes exogènes mais aussi des multiplications néfastes de bactéries commensales opportunistes. Cet effet barrière est possible grâce à plusieurs actions (« Les Fondamentaux de la Pathologie Digestive » - Chapitre 13 : Microbiote et immunité, 201468 ; « Le microbiote intestinal : description, rôle et implication physiopathologique », Landman et Quévrain, 201622):
o La grande abondance du microbiote intestinal crée un environnement de compétition entre les bactéries. Il y a une compétition pour l’accès aux ressources nutritives ainsi que pour adhérer aux sites d’adhésion cellulaire ou de fixation extracellulaire (matrice polysaccharidique extracellulaire). o Les bactéries du microbiote intestinal induisent également la production de peptides antimicrobiens par les cellules épithéliales. Ces peptides permettent une défense contre de potentielles bactéries pathogènes et régulent les différentes populations microbiennes présentes dans l’intestin. o Les bactéries, elles-mêmes, produisent des bactériocines qui régulent les populations bactériennes par des actions antibiotiques. o Enfin, la présence du microbiote intestinal stimule la production des IgA sécrétoires par les cellules épithéliales et permet le renfort des jonctions serrées entre les cellules épithéliales de la muqueuse intestinale.
Nous venons d’expliquer le rôle de protection de l’organisme du microbiote intestinal, grâce à la présence de ses nombreux microorganismes, à leur abondance, à leurs interactions avec leur hôte et leur production de peptides antimicrobiens. Tout ceci est possible grâce à la grande proximité du microbiote avec la muqueuse intestinale, à l’origine également d’une stimulation permanente du système immunitaire de l’hôte.
47 1.2.2. Fonction immune
Les intestins forment une surface d’échange importante avec le milieu extérieur, où les interactions entre le microbiote et le système immunitaire de l’hôte sont « multiples, complexes et bidirectionnelles » (revue de Shreiner et al., « The gut microbiome in health and in disease », 201569). Une régulation fine du système immunitaire permet en même temps de contrôler le microbiote sans le détruire et de défendre l’organisme contre des agents pathogènes, bien qu’ils aient parfois des fortes similitudes génétiques et antigéniques avec les agents du microbiote.
Le système immunitaire digestif est résumé dans un schéma présenté en Annexe 2, réalisé à partir des informations tirées du chapitre 13 du livre « Les Fondamentaux de la Pathologie Digestive » (© CDU- HGE/Editions Elesevier-Masson - Octobre 2014 )68. De nombreux mécanismes immuns anti-infectieux, innés ou adaptatifs, sont présents tout au long du système digestif. En dépit de leur rôle protecteur, ces mécanismes génèrent parfois des symptômes locaux (diarrhée...) et même généraux (fièvre...) ; au contraire, l’action régulatrice de lymphocytes différenciés réduit ces symptômes.
Les modifications du microbiote affectent l’immunité et réciproquement. Des revues présentent régulièrement ces interactions : on peut citer la revue de Round et Mazmanian en 200970 sur l’apport des modèles murins à microbiote défini, la revue de Fujimura et Lynch en 201571 sur le lien entre le microbiote et les allergies, et la revue de Landman et Quévrain en 201622 sur le lien entre le microbiote et les maladies inflammatoires chroniques.
Les facteurs qui activent ou qui altèrent l’immunité, même de façon subtile et localement, peuvent occasionner des déséquilibres du microbiote et augmenter la susceptibilité aux infections. En conséquence, il est important de prendre en compte les effets secondaires de nombreuses interventions (antibiotiques, anti-inflammatoires, stress, etc.) sur la sphère digestive. Kishida et al. présentent en 201872 une étude sur l’effet d’un traitement antibiotique chez la souris : les populations lymphocytaires ainsi que la production de cytokines sont affectées même au niveau systémique.
1.2.2.a Rôle dans le développement et la maturation du système immunitaire
L’article de McPherson et Harris en 200473 a été à la base de cette analyse en comparant des souris axéniques, « n’hébergeant aucun microorganisme décelable » (définition du site Termsciences33), à des souris conventionnelles. « Les souris axéniques présentaient de nombreuses anomalies au niveau du système immunitaire intestinal : hypoplasie des plaques de Peyer, diminution des lymphocytes intraépithéliaux, déficit en certaines populations lymphocytaires T, diminution de la sécrétion intestinale d’IgA, de la concentration d’immunoglobulines sériques et de la production de cytokines. Mais le plus intéressant est que ces anomalies ne se cantonnaient pas au système immunitaire intestinal, puisqu’on observait dans la rate et les ganglions lymphatiques des zones lymphocytaires atrophiées. » La Figure 4 illustre les conséquences histologiques de l’absence de germes sur le système immunitaire et digestif. Après inoculation de microbiote de souris « holoxéniques », l’ensemble de ces anomalies disparaissent chez les souris axéniques.
La “théorie de l’hygiène” a représenté une première approche, dans les années 1990, mettant en relation des infections et parasitoses précoces, ou plutôt leur absence, avec des dysfonctionnements de l’immunité ultérieurs tels que l’allergie : on constatait ainsi une plus grande fréquence de troubles allergiques chez les enfants nés par césarienne ou peu exposés à l’environnement agricole. Des facteurs non spécifiques (PAMPs...) ou spécifiques (antigènes propres à certains agents) expliquaient les altérations de l’immunité. En fait, comme le présente le § suivant, le développement normal du système immunitaire, ou au contraire son dysfonctionnement, dépend plutôt de l’équilibre entre des sous populations lymphocytaires activatrices de différents mécanismes (Th1, Th2, Th17) ou inhibitrices (TReg) ; la différenciation de ces sous populations, leur diffusion dans
48 le territoire local ou systémique et leur activité, sont en grande partie dépendante de stimulations provenant du microbiote (pour revue, Fujimura et Lynch, 201571).
Figure 4 : Comparaison histologique de la rate, de la paroi intestinale et des plaques de Peyer entre des souris axéniques et des souris holoxéniques (Source : « Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system », Macpherson et Harris, 200473) – Sections histologiques de la rate et des intestins de souris sauvage C57BL/6 axénique ou colonisées par des bactéries intestinales. En l’absence de bactéries intestinales, la rate a relativement peu de centres germinatifs et présente des zones de cellules T (rose) et B peu développées. a – les intestins de la souris GF ont un nombre faible de cellules CD4+ de la lamina propria (brun) ; b – un nombre grandement réduit de cellules productrices d’IgA (brun) ; c – et une hypoplasie des plaques de Peyer.
1.2.2.b Rôle dans l’activation des mécanismes de l’immunité innée et de l’inflammation
Au sein du tube digestif, la reconnaissance et le suivi des microorganismes présents se fait par le système immunitaire inné via les adhésines et via les récepteurs de l’immunité innée ou PRRs (de l’anglais « Pattern Recognition Receptors »). Les adhésines fixent les bactéries à différents types cellulaires, selon des motifs de reconnaissance communs à certaines familles bactériennes. Les PRRs reconnaissent des motifs associés aux pathogènes ou PAMPs (de l’anglais « Pathogen- Associated Molecular Patterns ») qui peuvent être de nature multiple (lipopolysaccharides, peptidoglycanes, acide lipotechoïque, flagelline ou des signaux de souffrances tissulaires, etc.) ; ils induisent l’activation de nombreuses cellules de l’immunité telles que les macrophages et autres phagocytes mononucléés, les cellules dendritiques, les neutrophiles et les lymphocytes. Le Tableau II synthétise les différents types de récepteurs et leurs PAMPs associés.
Il est important de noter que ces adhésines et ces récepteurs présentent des variations spécifiques qui modulent l’effet de chaque microorganisme ; par exemple, un article d’Adrian et al. en 201974 décrit une famille d’adhésines CEACAM3 présentant des variations propres aux Primates.
49
Tableau II : Résumé des principaux PRRs (Pattern Recognition Receptors) (Source : Chapitre 13 du livre Les Fondamentaux de la Pathologie Digestive (© CDU-HGE/Editions Elesevier-Masson - Octobre 2014)68).
Nom du récepteur Caractéristiques PAMPs détectés
Récepteurs membranaires à la surface Toll-Like Receptors Grande variété de PAMPs bactériens, des cellules ou endosomes (10 fongiques, parasitaires et viraux (TLR) différents chez l’Homme)
NOD-Like Receptors Récepteurs intracellulaires PAMPs cytoplasmiques et signaux de (NLR) (20 différents chez l’Homme) danger
RIG-I-Like Receptors Récepteurs cytoplasmiques ARN viraux (RLR) (3 différents chez l’Homme)
C-type lectin-like Receptors Grande famille de récepteurs Motifs hydrocarbonés (sucres) contenus (CLR) membranaires principalement dans les parois fongiques
« L’activation des PRRs induit une cascade de signalisation intracellulaire conduisant à l’activation et/ou la modulation de la réponse immunitaire. Au niveau des cellules épithéliales intestinales, l’activation des PRRs induit notamment la production de peptides antimicrobiens, la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et le recrutement de polynucléaires neutrophiles et de macrophages. » (« Les Fondamentaux de la Pathologie Digestive » - Chapitre 13 : Microbiote et immunité, 201468).
Cependant, de nombreuses bactéries intestinales Gram négatives anaérobies (Bacteroides par exemple) possèdent des variants glycosylés du LPS qui n’activent pas ou peu les TLR, voire même sont antagonistes du TLR4 (Munford et Varley, 200675) : elles sont dites “furtives” et n’induisent pas de réponse immune typique. Il y a donc une modulation de l’activation par les PRRs selon qu’il s’agit d’un microbiote “profond” (anaérobie) ou de surface (aéro-anaérobie).
Lors de dysbiose, notamment d’une proportion importante de bactéries Gram négatives, ce qui peut être induit chez la souris obèse ou diabétique par un régime alimentaire particulier, le taux circulant importants de LPS (lipopolysaccharides) de ces bactéries conduit à un état d’inflammation à bas bruit ou de résistance à l’insuline. Ceci a été confirmé chez l’humain qui atteint dans ce cas un état d’endotoxémie métabolique (revue de Cani P, 201812).
1.2.2.c Rôle dans la régulation de l’immunité adaptative
Sans prétendre à l’exhaustivité, nous pouvons présenter ici deux aspects de l’immunité digestive qui ont été particulièrement étudiés : la régulation de la production d’anticorps IgA et la régulation des populations lymphocytaires présentes dans les muqueuses.
En ce qui concerne la production d’anticorps de classe IgA, particulièrement abondante dans les muqueuses, il a été décrit un phénomène d’exclusion immune. Cela correspond à un équilibre entre l’activation ou la désactivation de la production d’anticorps, selon que l’antigène est présenté respectivement au niveau des plaques de Peyer sous forme libre ou sous forme complexée aux IgA sécrétoires (la complexation modifie son passage à travers l'épithélium vers la plaque de Peyer). Ce mécanisme évite de solliciter encore et encore la réponse spécifique vis à vis de bactéries implantées durablement, et permet donc de répondre différemment vis-à-vis d’un nouvel agent infectieux qui traverse l'épithélium ou vis-à-vis d’un élément du microbiote. En revanche, les IgA exercent des effets opposés, pro-inflammatoires ou anti-inflammatoires, par fixation aux récepteurs RFc-alpha de différents types de cellules immunocompétentes (pour revue Mantis et al., 201176).
50 En ce qui concerne les lymphocytes, de nombreuses études ont montré que l’équilibre entre les lymphocytes T de différents phénotypes (Th1, Th2, Th17, Treg) est largement influencé par le microbiote. Ces populations lymphocytaires ont des effets différents sur l’inflammation et la réponse spécifique, les TReg étant capables d’induire la tolérance immune. Par ailleurs, la muqueuse intestinale contient des lymphocytes NK atypiques (p46+IL22+) qui réagissent en combinaison avec les phagocytes et qui ont un effet anti-inflammatoire. Réciproquement, les lymphocytes T et NK produisent alors des cytokines (IL22, IL23, IL25, TGF-beta, etc.) qui modulent la production de défensines par l'épithélium digestif, et régulent donc le microbiote (pour revue Geuking et al., 201477).
Le rôle des bactéries filamenteuses segmentées (BFS) comme inductrices de la différenciation des Th17 a été documenté à la fois chez la souris et chez l’homme. De même, le rôle des Clostridies non pathogènes (des groupes IV, XIVa et XVIII) dans la différenciation des TReg a été documenté à la fois chez la souris et chez l’Homme. La production de butyrate par les Clostridies active le promoteur Foxp3 et favorise la différenciation des lymphocytes TReg du côlon.
Les facteurs contrôlant ces différenciations lymphocytaires, que ce soit des antigènes, des cytokines ou des facteurs chimiques, sont étudiés principalement chez la souris. Cela fait appel à des lignées murines génétiquement modifiées (déficientes en un ou plusieurs éléments de l’immunité). Mais, cela requiert en même temps un contrôle strict de l’état sanitaire des souris. Les premiers travaux sur les Th17 avaient en effet révélé des résultats discordants selon l’élevage d’origine des souris (Ivanov et Manel, 201078).
Globalement, le système immunitaire est dans une configuration tolérogène vis-à-vis du microbiote à l’homéostasie. Ceci a été analysé principalement au niveau du système digestif, mais la question se pose également pour d’autres territoires muqueux ou la peau. Si l’équilibre se rompt entre les sous populations Th1 et Th2 (avec des effets sur la qualité de la réponse immune spécifique), ou entre les sous populations Th17 et TReg (avec des effets sur le niveau d’inflammation), cela peut conduire à des maladies intestinales (maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, etc.), mais aussi extra-intestinales (allergies, asthme, maladies auto-immunes …), comme présenté dans la revue de Shreiner et al., 201569.
Le microbiote intestinal participe à la maturation et à l’éducation du système immunitaire, grâce à sa proximité et ses multiples échanges avec les cellules de la muqueuse intestinale. Il intervient à la fois dans l’immunité innée, via les PRRs cellulaires de l’hôte et les PAMPs de ses microorganismes, et à la fois dans l’immunité adaptative en induisant certaines populations de lymphocytes T, modulant ainsi le niveau d’inflammation intestinal.
Le microbiote intestinal a donc un rôle de protection de la muqueuse intestinale physique (effet barrière) et immunitaire, grâce à ses multiples interactions avec son hôte. Nous allons maintenant aborder les multiples fonctions métaboliques du microbiote intestinal, participant à la digestion de l’hôte.
51 1.2.3. Fonctions métaboliques
Au niveau du côlon, les fibres et nutriments non digérées par le tractus digestif antérieur arrivent aux multiples microorganismes du microbiote, très riche à cet endroit. Ces éléments nutritionnels constituent leur principale source d’énergie qui varie donc en fonction du régime alimentaire de leur hôte. « La biotransformation de ces différents substrats par le microbiote colique, d’une part, permet aux bactéries d’obtenir l’énergie nécessaire à leur croissance et, d’autre part, génère la production d’une diversité de métabolites qui sont pour la plupart absorbés et utilisés par l’hôte. » (revue de Landman et Quévrain , 201622). Récemment, les nouvelles techniques d’étude du microbiote via l’ADN, ARN, les protéines et métabolites ont permis de faire de grands progrès pour comprendre les implications du microbiote intestinal dans le métabolisme. L’objectif majeur est de comprendre les mécanismes et les espèces de microorganismes impliquées dans les voies métaboliques, afin d’identifier les liens entre la composition du microbiote, son activité et la santé de l’hôte. Dans le paragraphe qui suit, nous allons décrire le métabolisme des glucides, des protéines, des gaz, des lipides et des acides biliaires.
1.2.3.a Métabolisme des glucides et microbiote intestinal
Tout d’abord, il faut distinguer parmi les glucides deux grands types : les glucides simples et les glucides complexes. L’Annexe 3 résume les différents types de glucides que l’on peut trouver dans l’alimentation (liste non exhaustive).
Selon le régime alimentaire de l’Homme, 10 à 60 grammes de glucides fermentescibles, ou fibres alimentaires, arrivent au côlon22. Ces polymères carbohydrates échappent à la digestion car les unités monosaccharides dans ces poly- ou oligosaccharides sont liés par des liaisons chimiques qui ne peuvent être dégradées par les enzymes digestives humaines. Il peut s’agir de la cellulose, de l’hémicellulose, de l’inuline ou de l’amidon, qui atteignent la partie distale du tube digestif et sont donc utilisés par le microbiote. De la même façon, le microbiote est amené à dégrader les glycoprotéines du mucus intestinal qui seront fermentés par les microorganismes. Les mono- ou disaccharides sont, quant à eux, absorbés rapidement dans l’intestin grêle. La fermentation des carbohydrates contribue à une production d’énergie efficace à partir de fibres non digérées. Les métabolites produits en premier lieu sont des gaz (dihydrogène, dioxyde de carbone), de l’éthanol et des acides (butyrique, propionique, acétique, formique, lactique ou succinique). Ils sont transformés par des bactéries du microbiote colique dites « fibrolytiques » : des genres Bacteroides, Bifidobacterium, Ruminococcus et Roseburia22. Après utilisation croisée par l’ensemble du microbiote, les métabolites finaux sont des gaz et des acides gras à chaine courte ou SCFAs (de l’anglais « Short Chain Fatty Acid »). Les SCFAs ont des propriétés particulières (anti-inflammatoires et anticancéreuses notamment). Leur présence est associée à un bon état de santé de l’hôte et son microbiote (revue de Rajilić-Stojanović et al., « Function of the microbiota », 201379). La chaine trophique de dégradation anaérobie des carbohydrates en métabolites fermentaires est illustrée en Figure 5. Il y a cinq SCFAs principaux obtenus : le propionate, l’acétate, le succinate, le lactate et le butyrate. Leurs rôles respectifs sont décrits dans le Tableau III.
Le xylane, particulièrement résistant, peut être dégradé par différentes bactéries : Bacteroides sp., Roseburia intestinalis, Paraprevotella sp. et Prevotella sp. La plupart des types de cellulose et d’hémicellulose peuvent être dégradé par les bactéries du phylum des Bacteriodetes. Des études chez l’Homme ont montré que la consommation d’inulines favoriserait la croissance des Bifidobacterium sp. et de Faecalibacterium prausnitzii. L’amidon résistant conduit à la production de butyrate, bénéfique pour la santé. Il est dégradé par Ruminococcus bromii, qui elle-même produit de l’acétate. L’acétate est en parallèle transformé en butyrate par Eubacterium rectale et Roseburia sp. (revue de Rajilić-Stojanović et al., 201379).
52 Les FODMAPs, de l’anglais « Fermentable Oligo-, Di-, Mono-saccharides And Polyols », sont un ensemble de glucides qui comprend les fructo-oligosaccharides (FOS), les galacto- oligosaccharides (GOS), les disaccharides (par exemple le lactose), les polyols (par exemple le sorbitol). Actuellement, les régimes pauvres en FODMAPs sont très étudiés car ils seraient bénéfiques pour le traitement des maladies inflammatoires intestinales et de la constipation. Les individus qui mal-absorbent ou sont sensibles aux FODMAPs présentent des symptômes de ballonnements, diarrhées, gaz, constipation ou de douleur abdominale, souvent interprétées comme une maladie inflammatoire intestinale. Lorsqu’elles sont mal-absorbées par l’intestin grêle, les substances FODMAPs sont hautement osmotiques et peuvent provoquer un influx d’eau dans le côlon ou bien une fermentation excessive par les bactéries du microbiote intestinal et conduire à une production importante de gaz. (développé dans la revue « Systematic review: dietary fibre and FODMAP-restricted diet in the management of constipation and irritable bowel syndrome », Rao et al., 201580)
Globalement, il faut retenir que les monosaccharides sont très vite digérés par l’organisme au niveau de l’intestin grêle alors que les sucres complexes, et particulièrement les fibres alimentaires, ne peuvent pas être digérés par le système enzymatique du tube digestif et arrivent directement au niveau du côlon. Ils constituent le groupe des glucides dits « fermentescibles », qui sera dégradé par le microbiote colique en SCFAs, bénéfiques pour la santé de l’hôte, ainsi que des gaz.
Figure 5 : Voies métaboliques majeures de fermentation anaérobies des carbohydrates par le microbiote intestinal (Source : « Function of the microbiota de Rajilić-Stojanović et al., 201379)
53 Tableau III : SCFAs produits à l’issue de la fermentation des carbohydrates par le microbiote intestinal et principales bactéries participant à leur production
Bactérie(s) Référence SCFAs impliquée(s) dans Fonctions (s) leur production
Croissance des microorganismes Landman et Espèces Quévrain prédominantes du Atteint les tissus périphériques et entre dans (2016)22 côlon dont les genre le métabolisme du cholestérol et la Bacteriodes et lipogenèse Valdes et al. Acétate 11 Clostridium Rôle central dans la régulation de l’appétit (2018) Ruminococcus bromii Utilisé comme source ou précurseur pour la Rajilić- synthèse de molécules complexes par le foie, Stojanović Prevotella sp. 79 les muscles ou d’autres tissus périphériques (2013)
Principale source d’énergie pour les colonocytes/entérocytes Landman et Provoque l’apoptose en cas de cancer du Quévrain 22 Eubacterium, côlon (2016) Coprococcus, Valdes et al. Butyrate Faecalibacterium, Active la glycogenèse intestinale et à des (2018)11 Anaerostipes, effets bénéfiques sur l’homéostasie du Roseburia glucose et de l’énergie Rajilić- Consomme l’oxygène et provoque une Stojanović 79 hypoxie stable dans l’intestin qui empêche (2013) une dysbiose
Landman et Bacteroides et Utilisé par les tissus adipeux Quévrain également par (2016)22 Propionibacterium et Transporté dans le foie : régule la Valdes et al. Propionate Veillonella néoglucogénèse et les signaux d’appétit (2018)11 Megamonas, Améliore la sensibilité à l’insuline Megasphaera, Rajilić- Potentiel anti-inflammatoire Phascolarctobacterium Stojanović (2013)79
Rajilić- Succinate Bacteroides, Prevotella / Stojanović (2013)79
Rajilić- Bifidobacterium, Lactate / Stojanović Lactobacillus (2013)79
54 Globalement, il faut retenir que les monosaccharides sont très vite digérés par l’organisme au niveau de l’intestin grêle alors que les sucres complexes, et particulièrement les fibres alimentaires, ne peuvent pas être digérés par le système enzymatique du tube digestif et arrivent directement au niveau du côlon. Ils constituent le groupe des glucides dits « fermentescibles », qui sera dégradé par le microbiote colique en SCFAs, bénéfiques pour la santé de l’hôte, ainsi que des gaz.
1.2.3.b Métabolisme des gaz
Une part des produits de la dégradation des carbohydrates complexes, précédemment décrite, sont des gaz. Les principaux groupes produisant des gaz sont les Dorea sp. qui produisent du dioxyde de carbone CO2 et du dihydrogène H2. Les genres Collinsella sp. et Bacteroides sp. produisent, quant à elle, uniquement du H2. Ces gaz sont par la suite éliminés par différentes voies dont la plus efficace est la synthèse de méthane par les archées méthanogènes (cf. Figure 5), mais seul un tiers des caucasiens possède des archées méthanogènes dans son microbiote intestinal. Pour les autres, les gaz produits sont consommés lors de la synthèse d’acétate, dans laquelle l’espèce Blautia sp. joue un rôle primordial (informations issues de la revue de Rajilić-Stojanović et al , 201379).
Tableau IV: Gaz produits à l’issue de la fermentation des carbohydrates par le microbiote intestinal et principales bactéries participant à leur production
Microorganisme(s) Métabolite Voie métabolique Référence(s) impliquée(s)
Produit par processus fermentaire Elimination par des gaz rectaux, Landman et Bactéries Dihydrogène par voie pulmonaire ou Quévrain hydrogénotrophes transformé par des bactéries (2016)22 Transformé en méthane/acétate/sulfure
Landman et Quévrain Produit à partir de l’hydrogène : Archées méthanogènes (2016)22 Méthane Présent dans le microbiote principalement colique de 30 à 50% des adultes Methanobrevibacter smithii Rajilić- Stojanović (2013)79
Landman et Quévrain Bactéries acétatogènes (2016)22 Acétate Produit à partir de l’hydrogène Blautia sp. Rajilić- Stojanović (2013)79
55 Bactéries Produits à partir de l’hydrogène sulfatoréductrices (genre Landman et et du sulfate issus de la prédominant Quévrain dégradation protéique (2016)22 Sulfures Desulfovibrio) Dégradation de la taurine Bilophila wadsworthia (à Rajilić- Potentiellement délétères pour partir de la taurine) Stojanović 79 les colonocytes (2013)
La dégradation d’acides aminés sulfurés conduit lors de la dégradation protéique à la synthèse de sulfure d’hydrogène (H2S). H2S est très toxique puisqu’il conduit à l’apoptose des cellules de la muqueuse une diminution des cellules caliciformes, des ulcères superficiels, des lésions de l’ADN. H2S peut être produit aussi par la dégradation de la taurine, provenant de la déconjugaison des sels biliaires ou de l’alimentation.
1.2.3.c Métabolisme et dégradation des protéines
Représentant une part majeure du régime alimentaire humain, les protéines sont pour la plupart dégradées par les enzymes du tractus digestif. Les acides gastriques gênent l’assimilation des protéines et donc une grande partie d’entre-elles se retrouvent au niveau du côlon. En plus des protéines ingérées par l’hôte, des protéines de l’hôte même sont disponibles pour la dégradation par le microbiote : protéines pancréatiques, mucus et cellules épithéliales en renouvellement. Cette dégradation protéique est d’autant plus importante qu’elle constitue la seule source azotée des bactéries présentes dans le côlon distal. Elle conduit à la production de SCFAs mais aussi de composés potentiellement toxiques (ammoniac, composés nitreux, composés phénoliques et sulfures)( revue de Rajilić-Stojanović et al., « Function of the microbiota », 201379).
Tableau V : Résumé des principaux métabolites issus de la dégradation protéique et les bactéries associées
Bactérie(s) Référence Métabolite Voie métabolique Fonctions impliquée(s) (s)
Métabolite toxique : Fermentation aromatique lésions de l’ADN des Rajilić- Clostridium du P-crésol des acides aminés cellules épithéliales Stojanović groupe 1 79 Elimination urinaire (cancer du côlon) (2013) Défaillance rénale
Groupe amine d’un acide Composés aminé qui réagit avec des Gamma- Rajilić- nitreux ou nitrates sous un pH bas Proteobacteria Carcinogène Stojanović 79 N-nitroso ou à cause de l’action Peptococcus (2013) d’enzymes bactériennes
A partir de l’urée ou de Bacteroides, Utilisation des acides Rajilić- Acides l’ammoniac (activité Roseburia, aminés essentiels par Stojanović aminés aminotransférase) Streptococcus l’hôte (2013)79
La première étape de la protéolyse (liée à la cellule pour les Bacteroides sp., ou par des protéases extracellulaires) consiste en l’hydrolyse de longues chaines protéiques en peptides et acides aminés libres. Cette première hydrolyse se fait grâce aux bactéries des genres Bacteroides, Clostridium, Propionibacterium, Fusobacterium, Streptoccoccus et Lactobacillus22. La fermentation aromatique des acides
56 aminés peut conduire à la formation de p-crésol, un métabolite toxique. Certains acides aminés contiennent des sulfures et leur dégradation conduit à la production de sulfure d’hydrogène (H2S), également néfaste (cf. paragraphe précédent : Métabolismes des gaz). La digestion protéique est aussi associée à la production de composés nitreux (N-nitroso) qui sont connus pour être carcinogènes. Le microbiote intestinal participe également à synthèse d’acides aminés qui sont ensuite utilisés par l’hôte. La Figure 6 résume l’ensemble de ces voies et les bactéries impliquées (informations tirées de la revue de Rajilić-Stojanović et al., 201379).
Figure 6 : A - Voies métaboliques majeures de la fermentation protéique par le microbiote intestinal et principales bactéries associées. B – Processus de nitrosation. (Source : “Function of the Microbiota”, Rajilić-Stojanović, 201379)
1.2.3.d Métabolisme des lipides et des acides biliaires
Les lipides constituent la troisième entité principale du régime alimentaire de l’Homme. Les lipides présents dans le côlon correspondent aux lipides non absorbés dans l’intestin grêle, à ceux provenant de la desquamation des colonocytes et aux lipides bactériens. Les acides gras sont transformés par les bactéries par hydrolyse, oxydation, réduction et hydroxylation. « Le cholestérol colique vient à 70% de la bile et pour le reste : de l’alimentation (20 %) et de la desquamation des cellules épithéliales intestinales (10 %). »22 Il est transformé en coprostanol par les microorganismes et éliminé dans les fèces (informations tirées de la revue de Landman et Quévrain, 201622). La majorité (95%) des acides biliaires suivent un cycle entéro-hépatique : « sécrétion biliaire, réabsorption au niveau de l’iléon terminal (ou le côlon), retour au foie via le système porte, avant d’être à nouveau sécrété dans la bile »22. Le reste des acides biliaires parvient au côlon où ils sont « métabolisés (déconjugaison, oxydation, épimérisation, 7-α-déshydroxylation, désulfuration, etc.) par le microbiote en acides biliaires dits secondaires »22. Une petite partie des acides biliaires subit d’autres
57 transformations enzymatiques par le microbiote intestinal. La transformation supplémentaire la plus courante est la déshydroxylation 7-α, par les Clostridies des groupes XI et XIVa (cf. Figure 7)79.
Tableau VI : Résumé des principaux métabolites issus de la dégradation des acides biliaires et les bactéries associées
Bactérie(s) Référence Métabolite Voie métabolique Conséquences impliquée(s) (s)
Potentiellement carcinogène Acides biliaires Déconjugaison, Landman secondaires oxydation, Bacteroides, Protection secondaire de et Principalement acide épimérisation, 7-α- Bifidobacterium, l’épithélium du Quévrain, cholique et déshydroxylation, Clostridium 22 côlon par 2016 chénodésoxycholique désulfuration, etc. déconjugaison des acides biliaires
Figure 7 : Structure d’un acide biliaire et sites principaux de transformation par le microbiote intestinal. (Source : « Function of the microbiota » de de Rajilić-Stojanović, 201379)
Le microbiote intestinal participe à la digestion des glucides et particulièrement à la dégradation des polymères carbohydrates non digestibles par les enzymes des parties supérieurs du système digestif. Ils parviennent au niveau du côlon, dans lequel ils subissent une fermentation anaérobie par les bactéries qui s’y trouvent (principalement du phylum Bacteroidetes). Leur dégradation conduit à la production de SCFAs dont les principaux sont le butyrate, l’acétate et le propionate et qui participent à la santé de l’hôte (nutrition cellulaire, rôle anti-inflammatoire, etc.). La fermentation des carbohydrates complexes conduit également à la production de dihydrogène, lui-même transformé par d’autres bactéries en méthane, acétate et sulfures.
Le microbiote participe également à la dégradation protéique d’origine alimentaire ou de son hôte (mucus par exemple). Leur hydrolyse par les bactéries du microbiote, produit des SCFAs et d’autres composés, qui pour certains, sont essentiels à la vie de l’hôte (acides aminés) et pour d’autres, sont toxiques ou carcinogènes.
Enfin les microorganismes du microbiote intestinal participent à la dégradation des lipides, qui proviennent majoritairement de la bile. La plupart subit un cycle entéro-hépatique, mais le reste (5%) est dégradé en acides biliaires dits secondaires par les bactéries du microbiote.
58 1.3. COMPOSITION DU MICROBIOTE INTESTINAL ET FACTEURS DE VARIATIONS 1.3.1. Composition taxonomique et quantitative du microbiote intestinal humain
1.3.1.a Composition bactérienne
Depuis quelques années, grâce aux progrès techniques réalisés dans le domaine du séquençage à haut débit de l’ADN et de la diminution de leur coût, la quantité d’informations collectées sur le microbiote humain s’est considérablement développée. En effet, 99% des bactéries du microbiote intestinal sont anaérobies, et les conditions de vie (pourcentage d’oxygène, pH, etc.) varient en fonction de la localisation dans l’intestin, ce qui conduit à des variations parallèles de la composition du microbiote. La détection des microorganismes par culture classique est donc difficile. Les études MetaHit et HMP ont largement contribué à cette avancée. La Figure 8, issue de l’article « Genomic variation landscape of the human gut microbiome » de Schloissnig et al., du MétaHit consortium, 201381, illustre la phylogénie la plus probable des 101 espèces les plus prévalentes du microbiote intestinal dont les 66 espèces dominantes (branches de couleur verte). Ces 66 espèces les plus fréquentes représentent plus de 99% des espèces identifiées par lecture de 929 génomes de référence. La fréquence relative de l’apparition d’une espèce est représentée par une barre rouge81. Cette figure permet surtout de se rendre compte de la grande variabilité en termes d’espèces bactériennes au sein du microbiote intestinal. Et il ne s’agit ici que des espèces les plus fréquentes au sein d’une cohorte.
59
Figure 8 : Arbre phylogénétique des espèces bactériennes les plus prévalentes et abondantes des cohortes des études Human Microbiome Project et Métahit combinées. (Source : informations supplémentaires de l’article « Genomic variation landscape of the human gut microbiome » de Schloissnig et al., 2013 81)
Un adulte en bonne santé dispose généralement d’au moins 160 espèces, appartenant en grande majorité à un nombre limité de phyla. L’étude « A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing » de Qin et al., 201050 s’est intéressée au génome de 124 européens par la méthode de séquençage métagénomique à partir d’échantillons de fèces. Les gènes identifiés sont largement retrouvés chez les individus de la cohorte et ils ont identifié entre 1000 et 1150 espèces. De manière attendue, les phyla les plus représentés sont les Bacteroidetes (classé en 5 groupes : Alistipes, Prevotella, Paraprevotella, Parabacteroides, et Odoribacter) et les Firmicutes. L’abondance relative de 57 bactéries identifiées au sein de cette cohorte est représentée en Annexe 4. Deux autres phyla sont aussi prédominants : les Actinobacteria et les Proteobacteria.
Cette même équipe de chercheurs a essayé de mettre en évidence et comprendre de potentielles corrélations entre certaines bactéries du microbiote intestinal. Le coefficient de corrélation de Pearson par paire a été utilisé entre 155 espèces fréquentes détectées au sein de leur cohorte (au moins chez un individu et à un niveau d’au moins 1% du génome total). L’Annexe 5 illustre ces relations entre l’abondance et la présence de certaines bactéries. Elle met en évidence les multiples liens potentiels entre toutes les espèces du microbiote intestinal et leur dépendance hypothétique. De nouveau, la prédominance des Bacteroidetes et des Firmicutes est notable. Il faut retenir qu’en plus
60 d’une pression sélective de l’hôte sur son microbiote, il existe aussi des relations entre les microorganismes au sein de l’intestin qui favorisent ou défavorisent la présence de leurs homologues.
Le Tableau VII résume les différents phyla et les genres associés du microbiote intestinal, d’après la revue « The gut microbiota in human energy homeostasis and obesity », de Rosenbaum et al., 201510. Un tableau récapitulatif des principales caractéristiques de ces bactéries est présenté en Tableau VII : Vue d’ensemble de la composition du microbiote intestinal humain (Source : tableau traduit de l’anglais de l’article « The gut microbiota in human energy homeostasis and obesity », Rosenbaum et al., 201510)
Pourcentage du Phylum Genres et espèces microbiote
Phyla majoritaires (supérieurs à 1% chez la plupart des individus)
- Clostridium - Eubacterium Firmicutes ~60–65% - Faecalibacterium - Lactobacilli - Roseburia - Ruminococcus
- Alistipes - Bacteroides Bacteroidetes ~20–25% - Parabacteroides - Prophyromonas - Prevotella
Proteobacteria −5–10% - E. coli
- Bifidobacterium Actinobacteria −3% - Collinsella
Phyla minoritaires (inférieurs à 1% chez la plupart des individus)
- Methanobrevibacter Archaea <1% - Methanosphaera
Deferribacteres <1%
Fusobacteria <1% - Fusobacterium nucleatum
Melainabacteria <1%
Spirochaetes <1% - Treponema
Verrucomicrobia <1% - Akkermansia muciniphila
61 ➢ Notion d’entérotype
Une équipe de chercheurs, du MetaHit consortium, ont essayé d’identifier des entérotypes, c’est-à- dire des groupes d’individus sains caractérisés par une composition du microbiote intestinal similaire (article « Enterotypes of the human gut microbiome », Arumugam et al., 201182). Cette équipe a combiné 22 métagénomes fécaux nouvellement séquencés de 4 pays différents avec des jeu de données publiés antérieurement et a pu identifier trois entérotypes, non spécifiques d’une région. Cela suggère que les variations de compositions du microbiote seraient stratifiées et non continues. Il y aurait donc un nombre limité d’états symbiotiques possibles entre l’hôte et son microbiote intestinal, à l’état d’équilibre.
Les trois entérotypes identifiés (illustrés en Annexe 7) sont :
- Entérotype 1 : Riche en Bacteroides qui est concomitant avec Parabacteroides notamment ; - Entérotype 2 : Riche en Prevotella et concomitant avec Desulfovibrio ; - Entérotype 3 : Riche en Ruminococcus et concomitant avec Akkermansia (le plus fréquent) ;
Chaque entérotype est associé à un type fonctionnel que nous ne détaillerons pas. Ces différences fonctionnelles et taxonomiques entre entérotypes reflètent la possibilité de différentes combinaisons d’une chaîne trophique microbienne au niveau de l’intestin avec un impact semblable sur la relation synergique avec l’hôte. (Article complet : « Enterotypes of the human gut microbiome », Arumugam et al., 201182). Les chercheurs Vandeputte et al. ont montré que la charge globale microbienne (cellules par gramme de fèces) était associée avec les entérotypes était significativement différente dans une population comprenant des patients atteints de la maladie de Crohn. Ils ont identifiés les 3 mêmes grands entérotypes mais ont distingué au sein du groupe « Bacteroides », un groupe avec une charge microbienne élevée (B1) et un groupe avec une charge microbienne totale faible (B2) représenté en majorité par les individus malades (cf. Figure 9) (Article complet « Quantitative microbiome profiling links gut community variation to microbial load », Vandeputte et al., 201751).
Figure 9 : Charge microbienne totale en fonction des entérotypes identifiés. CD : Crohn Disease ; Test double de Dunn ajusté, ** p<0,01, ***p<0,001 (Source : figures supplémentaires de l’article « Quantitative microbiome profiling links gut community variation to microbial load », Vandeputte et al., 201751)
62 ➢ Notion de biogéographie
La biogéographie joue aussi sur la composition réelle du microbiote intestinal. Les propriétés physiologiques de chaque région du tractus gastro-intestinal sont stratifiées dans l’axe transverse et longitudinal. Les conditions environnementales varient de l’estomac au rectum : l’acidité et la quantité de dioxygène diminue progressivement pour arriver aux conditions anaérobies, favorables au développement des bactéries au niveau du côlon. Au niveau de l’estomac, les bactéries se font rares en quantité et en diversité (cf. Figure 10). La densité et la composition du microbiote est affectée par des gradients chimique, nutritionnel et immunologique tout le long de l’intestin. L’intestin grêle est caractérisé par des taux d’acide, de dioxygène et d’antimicrobiens élevés, ainsi qu’un temps court de transit. Cela limite le développement des bactéries de telle sorte que seules les bactéries à croissance rapide, anaérobies facultatives et capables d’adhérer facilement à la muqueuse peuvent s’y développer. Au contraire, au niveau du côlon, les conditions sont telles qu’une communauté microbienne dense et diverse peut s’y implanter (informations tirées de la revue « Introduction to the human gut microbiota », Thursby et Juge, 2017 37). Enfin, il faut distinguer deux localisations ou niches au sein de la même portion intestinale : celles liées à la muqueuse (notamment colorectale) et celles de la lumière intestinale. Lors d’analyse sur prélèvements fécaux, c’est le microbiote de la lumière intestinal que l’on étudie. Pour étudier le microbiote muqueux, il est nécessaire de faire des biopsies de la paroi intestinale, ce qui est difficilement réalisable chez l’humain mais que nous verrons chez le macaque rhésus dans la troisième partie (développé dans l’article « Biogeography of the Intestinal Mucosal and Lumenal Microbiome in the Rhesus Macaque », Yasuda et al., 201540). A ce jour chez l’Homme, la différence entre les deux reste mal évaluée. A priori, les bactéries du biofilm composant le microbiote muqueux possèdent des fonctions métaboliques particulières de transformation des aliments, d’échange de nutriments et d’éducation du système immunitaire de l’hôte22. Le phylum Bacteroidetes serait plus important dans le microbiote fécal que dans celui lié à la muqueuse. Et inversement, les Firmicutes, spécifiquement les Clostridium du groupe XIVa, seraient présents de manière plus importante dans les prélèvements de microbiote muqueux.37
63
Figure 10 : Composition et densité du microbiote intestinal (Source : illustration de Caroline Fumat tirée du livre « Les Fondamentaux de la Pathologie Digestive - Chapitre 13 : Microbiote et immunité intestinale »,© CDU-HGE/Editions Elesevier-Masson - Octobre 201468)
1.3.1.b Composition du virome intestinal humain
La revue « Le virome humain » de Foulongne de 201545 fait une synthèse des connaissances actuelles du virome humain dont le virome digestif. Les récentes études métagénomiques ont pu mettre en évidence une immense « diversité, complexité et variabilité » du virome humain et particulièrement au niveau des barrières naturelles avec l’extérieur dont font partie les intestins. L’analyse métagénomique de fèces d’individus ont mis en évidence des adénovirus, des anellovirus, des picornavirus, des parvovirus et des circovirus. Ces virus persistent dans le tractus digestif sous forme infection continuelle et asymptomatique. On retrouve aussi de nombreux bactériophages et également des virus animaux et végétaux. Le Tableau VIII résume les espèces virales retrouvées dans le microbiote intestinal.
64 Tableau VIII : Principales familles virales retrouvées dans le microbiote intestinal humain (Source : « Le virome humain » de Foulongne (2015)45)
Génome Famille virale Exemple d’espèces retrouvées
Adenoviridae Adenovirus humain
Anelloviridae Virus transmis par transfusion
Circoviridae Cyclovirus ADN Herpesviridae Cytomegalovirus
Papillomaviridae Herpès Virus 6
Polyomaviridae BK virus
Caliciviridae Norovirus
ARN Reoviridae Rotavirus
Picornaviridae Entérovirus
1.3.1.c Archées et Fungi présents dans le microbiote intestinal humain
Les auteurs Hoffman et al. ont étudié l’influence du régime alimentaire de l’hôte et des populations bactériennes du microbiote intestinal sur les populations d’archées et de fungi commensales. (Article complet de Hoffmann et al., “Archaea and fungi of the human gut microbiome: correlations with diet and bacterial residents”, 2013)83.
Pour les archées, ils ont identifié 99 131 séquences génomiques regroupées dans 5 genres. Le genre Methanobrevibacter sp. a été détecté dans 30 échantillons et Nitrososphaera sp. dans 16 échantillons et les deux n’ont été détectées de manière concomitante que dans 6 échantillons. La comparaison de l’efficacité d’amplification a montré que les Methanobrevibacter sp. sont présentes de manière abondante alors que les Nitrososphaera le sont moins.
332 659 séquences génomiques de fungi ont été détectées à l’issue de ces analyses. 66 genres et 13 lignées non classées au niveau du genre ont été identifiées. Chaque échantillon contenait des fungi et le phylum des ascomycètes semblait inversement corrélé à la présence des basidiomycètes. Le genre le plus prévalent était Saccharomyces (présent dans 89% des échantillons) puis Candida (57%) et enfin Cladosporium (42%).
Les genres d’archées et de fungi détectés dans les échantillons analysés dans cette étude sont représentés dans la carte thermique en Annexe 8. Elle représente les proportions relatives de chaque espèce microbienne détectée, indiquée sur la droite du graphique.
65 La composition taxonomique bactérienne du microbiote intestinal est extrêmement variable et diverse d’un individu à un autre. Quatre phyla sont majoritairement retrouvés chez l’adulte sain (Rosenbaum et al., 201510) :
➢ Firmicutes (60-65%) ➢ Bacteroidetes (20-25%) ➢ Proteobacteria (5-10%) ➢ Actinobacteria (environ 3%)
On peut regrouper les individus par entérotype, caractérisé par une composition globale du microbiote intestinal similaire au sein de ce groupe. Il en existerait trois différents.
Les autres microorganismes présents dans l’intestin comme les virus, les archées et les fungi rentrent aussi dans la composition du microbiote intestinal et ont des fonctions tout aussi essentielles que les bactéries.
1.3.2. Facteurs de variations et conséquences sur la composition taxonomique et fonctionnelle
Le microbiote intestinal est un équilibre dynamique qui perd et accueille des microorganismes en permanence. Un microbiote en bonne santé est un microbiote très diversifié, capable de stabilité dans le temps et de revenir à son état d’équilibre initial. Parfois, un facteur externe est si perturbateur que l’équilibre du microbiote est profondément et durablement altéré. Ce paragraphe synthétise les grands facteurs de variations de la composition et du fonctionnement du microbiote intestinal et leurs conséquences directes.
1.3.2.a Facteurs de variations chez le jeune : influence sur la mise en place et la composition du microbiote
Comme vu dans le paragraphe 1.1.3. « Mise en place du microbiote intestinal » , la mise en place du microbiote est primordiale pour la santé du futur enfant. Elle se fait dès la grossesse in utero puis un certain nombre de facteurs façonnent de manière durable l’équilibre microbien de l’intestin de l’enfant. Le Tableau IX ci-dessous décrit l’abondance relative des phyla présent dans le microbiote intestinal d’un enfant de moins d’un an et celui d’un adulte sain. Les Firmicutes et les Bacteroidetes, qui sont les plus représentés dans les intestins à l’âge adulte, sont moins représentés que les Proteobacteria chez l’enfant. Avant d’acquérir cette homéostasie, de nombreux stades de développement du microbiote sont nécessaires, mais surtout ils conditionnent profondément le microbiote final de l’adulte.
66 Tableau IX : Abondance relative des phyla du microbiote intestinal chez l’enfant de moins de 1 an et chez l’adulte. (Source : “Interactions Between Food and Gut Microbiota: Impact on Human Health” de Wu et al., 20191).
1.3.2.b Régime alimentaire et conséquences sur la composition du microbiote intestinal
L’influence du régime alimentaire sur la composition et le fonctionnement du microbiote intestinal est largement démontrée par de nombreux articles. Ce que l’on ingère conditionne de manière directe ce qui atteint les intestins et notamment le côlon. Cette proportion non digérée au niveau de l’estomac et de l’intestin grêle est ensuite dégradée par les microorganismes présents dans le gros intestin. Il est donc logique que certaines espèces soient favorisées lors de la consommation de certains aliments. Et au contraire, il parait tout aussi logique qu’une population bactérienne décroisse en cas d’arrêt ou de diminution d’un apport nutritionnel. L’article de Singh et al. « Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health » (2017)56 est une revue systématique sur les données récentes de l’influence de certains composants de notre alimentation sur le microbiote intestinal. Ils ont également synthétisé ce que chaque régime a pour conséquence sur notre système immunitaire et notre métabolisme. Ce paragraphe retranscrit de manière résumée leur travail.
➢ Protéines et composition du microbiote intestinal
D’une manière générale, leurs recherches ont montré que la consommation de protéines favorise la diversité globale du microbiote intestinal. En effet, la consommation de protéines de pois et de petit-lait augmente les Bifidobacterium et les Lactobacillus commensales et diminue les bactéries pathogènes comme Bacteroides fragilis et Clostridium perfringens. Ils ont ensuite distingué les protéines d’origine végétale et celle d’origine animale. La consommation de protéines de pois augmente notamment le taux de SCFAs qui a une action anti-inflammatoire et bénéfique pour la muqueuse intestinale. A contrario, une augmentation de bactéries tolérante de la bile comme les Bacteroides, les Alistipes et la Bilophila est notée en cas de consommation de protéines animales. Une synthèse de l’influence de la consommation de protéines sur la taxonomie des bactéries présentes dans le microbiote intestinal est présenté dans le Tableau X ci-dessous.
67 Tableau X : Impact de la consommation de protéines sur la composition du microbiote intestinal. (Source : « Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health », Singh et al., 201756)
➢ Lipides et composition du microbiote intestinal
Un régime riche en graisses augmente de manière générale la flore totale anaérobie dont de nombreuses Bacteroides. A contrario, un régime pauvre en graisses conduit à une diminution des Bifidobacterium ainsi qu’à une diminution de la glycémie à jeun et du cholestérol total. Par ailleurs, la proportion relative de Faecalibacterium prausnitzii augmente avec un régime riche en graisses saturées alors qu’un régime riche en graisses insaturées provoque une réduction totale de la charge bactérienne intestinale, et du cholestérol total et LDL plasmique. Des études sur modèle rongeurs ont permis d’étudier les effets de la consommation de lipides sur le microbiote intestinal. Une étude sur souris a notamment montré que la consommation de lipides issus de lard augmentait le taux de Bacteroides et Bilophila alors que l’abondance en Actinobacteria (Bifidobacterium et Adlercreutzia) se trouvait diminuée. La consommation de lard provoquait aussi l’activation des TLR et altérait la sensibilité à l’insuline. Au contraire, les bactéries productrices d’acides lactiques (Lactobacillus et Streptococcus) et les Verrucomicrobia (Akkermansia muciniphila) étaient augmentés chez les souris consommant de la graisse de poisson. Et, après transfert de la flore des souris nourris à la graisse de lard aux souris de l’autre groupe, ces dernières développaient le phénotype inflammatoire et métabolique des souris donneuses. L’ensemble des informations relatives à l’influence de la consommation des lipides sur la taxonomie du microbiote intestinal est résumé dans le Tableau XI ci-dessous.
Tableau XI : Influence de la consommation de lipides sur la composition du microbiote intestinal. (Source : « Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health », Singh et al., 201756)
➢ Carbohydrates et composition du microbiote intestinal
o Carbohydrates digestibles
Les carbohydrates digestibles correspondent à l’amidon et aux sucres (glucose, lactose, fructose, sucrose), qui peuvent être dégradés classiquement par les enzymes présents dans le tube digestif de l’individu qui les consomme. Ils passent ensuite directement dans le sang et participe à la réponse en insuline. Les sujets qui consomment beaucoup de ces sucres présentent une abondance relative en Bifidobacterium plus élevée et en Bacteroides plus faible. La consommation de lactose est associée avec une diminution de la présence de Clostridium et un taux de SCFAs bénéfiques augmentés. Le
68 Tableau XII résume l’effet de chaque type de sucres simples sur quelques espèces bactériennes du microbiote intestinal.
Tableau XII : Carbohydrates digestibles et variations de la composition du microbiote intestinal. (Source : « Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health », Singh et al., 201756)
o Polymères carbohydrates ou fibres non digestibles
Les fibres peuvent être qualifiées de prébiotiques. Les prébiotiques sont des composants non digestibles principalement des carbohydrates qui améliore la santé humaine et la croissance et/ou l’activité des bactéries du côlon (définition traduite de l’anglais issue du MeSH29). En absence d’apports de fibres non digestibles du régime de leur hôte, la quantité de bactéries diminue au sein du microbiote intestinal et a contrario, un régime abondant en carbohydrates non digestibles conduit à une augmentation de la richesse génomique bactérienne. Globalement, un régime riche en fibres augmente la quantité de Bifidobactéries et de Lactobacilles (particulièrement lors de consommation de son de blé et de grains entiers). En fonction du type de carbohydrates non digestibles, les espèces bactériennes effectées varient. Par exemple, l’amidon « résistant » augmente la quantité relative de Ruminococcus sp., d’Enterococcus rectale et de Roseburia sp. L’ensemble de des conséquences de la consommation de fibres prébiotiques est résumé dans le Tableau XIII ci-dessous.
Tableau XIII : Consommation de fibres non digestibles et impact sur la taxonomie du microbiote intestinal. (Source : « Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health », Singh et al., 201756)
De plus, les prébiotiques ont un effet notable sur le métabolisme et le système immunitaire. Ils permettent notamment de réduire un état pro-inflammatoire et participe à la sensation de satiété via une meilleure sensibilité à l’insuline.
➢ Aliments fermentés ou « probiotiques »
Les aliments fermentés contiennent des bactéries productrices d’acides lactiques. Généralement, il s’agit de produits à base de lait fermenté comme des yaourts, qui représentent une source importante de microorganismes. Ces bactéries peuvent réguler positivement la santé intestinale en favorisant des microorganismes bénéfiques et en induisant la production de cytokines anti- inflammatoire (par exemple IL-10). On peut alors qualifier ces aliments de probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes vivants qui supplémentent l’alimentation à des fins bénéfiques pour l’hôte en améliorant son équilibre microbien intestinal (définition traduite de l’anglais issue du MeSH30. De manière générale, la charge microbienne est augmentée suite à la consommation d’aliments fermentés. Les genres Bifidobacterium et Lactobacillus ont une abondance relative augmentée grâce à la supplémentation en divers probiotiques. Un résumé de l’influence des
69 probiotiques sur la composition taxonomique du microbiote intestinal de Singh et al. (2017)56 est présenté dans le Tableau XIV.
Tableau XIV : Impact des probiotiques ou aliments fermentés sur la composition du microbiote intestinal (Source : « Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health », Singh et al., 201756)
➢ Consommation de polyphénols
Les polyphénols diététiques correspondent à divers composés dont les acides phénoliques étudiés pour leur pouvoir anti-oxydant. Ils sont contenus dans les fruits, légumes, le thé, les graines, le cacao et le vin. Les genres communément favorisés par ce type d’aliments sont les Bifidobacterium et Lactobacillus. Lors de la consommation de vin rouge, l’abondance relative de Bacteroides est augmentée. On observe également une réduction de clostridies pathogènes (C. perfringens et C. histolyticum) après la consommation de polyphénols de diverses origines. Un résumé des effets des polyphénols sur la composition taxonomique du microbiote intestinal est présenté en Tableau XV.
Tableau XV : Effets des polyphénols sur la composition du microbiote intestinal. (Source : « Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health », Singh et al., 201756)
➢ Additifs alimentaires
Les additifs alimentaires sont des substances qui permettent d’améliorer la sécurité sanitaire, la fraicheur, le goût la texture ou la couleur d’un aliment. Depuis la deuxième moitié du 20ème siècle, de nombreux additifs, naturels ou chimiques, ont été introduits pour la conservation de la nourriture. Les émulsifiants et les édulcorants artificiels favorisent le développement de syndromes métaboliques. Par exemple, certains émulsifiants ont été mis en cause dans la diminution de la diversité du microbiote et des niveaux réduits de Bacteroidetes et des niveaux élevés en Ruminococcus gravus et en Proteobacteria. Le succralose, l’aspartame et la saccharine semblent provoquer la rupture de l’équilibre du microbiote intestinal, ce qui a été mis en évidence sur des modèles rongeurs nourris sur des périodes longues avec ces substances (informations tirées de la revue « Role of the gut microbiota in nutrition and health », Valdes et al., 2018 11). De manière générale, les additifs alimentaires semblent contribuer à la mise en place de maladies métaboliques par modulation du microbiote intestinal. Mais il manque actuellement d’études qui s’intéressent de manière précise aux liens entre la santé humaine, les additifs et le microbiote intestinal (revue « Interactions Between Food and Gut Microbiota: Impact on Human Health », Wu et al., 20191).
70 De manière très simplifiée, on peut retenir qu’il y a des composés nutritionnels bons pour la santé du microbiote humain : les protéines végétales, un régime pauvre en graisses, les graisses insaturées les prébiotiques et les probiotiques et les polymères carbohydrates. Ces composés alimentaires favorisent la diversité bactérienne, la croissance des Bifidobacterium, des Lactobacillus et inhibent la croissance des Bacteroides. Au contraire, les protéines animales, un régime riche en graisses, les graisses saturées, les additifs alimentaires et les sucres artificiels peuvent être considérés comme néfaste pour la santé de l’hôte et de son microbiote. De manière inverse, ils provoquent une diminution de la diversité bactérienne, des Bifidobacterium, des Lactobacillus, un état pro-inflammatoire et favorisent la croissance des Bacteroides.
1.3.2.c Facteurs intrinsèques
➢ Âge
Les auteurs Yatsunenko et al. se sont intéressés aux variations du microbiote intestinal de trois populations humaines de tout âge, notamment à l’intervention de facteurs liés au développement postnatal, aux fonctions métaboliques du microbiote, et aux expositions environnementales. Ils ont analysé le microbiote fécal de 531 individus sains : des amérindiens originaires de l’Etat d’Amazonas au Venezuela, des résidents ruraux du Malawi et des habitants des aires métropolitaines des Etats-Unis (article complet « Human gut microbiome viewed across age and geography », de Yatsunenko et al., 201284).
Nous nous intéressons à cet article pour son étude de l’impact de l’âge sur la composition du microbiote. En effet, comme nous l’avons vu précédemment, le microbiote intestinal subit diverses modifications jusqu’à obtention d’un équilibre et d’une stabilité fonctionnelle et taxonomique entre 2 et 4 ans (cf. paragraphe 1.1.3.). L’étude du microbiote intestinal de cette cohorte montre que la diversité microbienne augmente avec l’âge dans les trois populations, et pas seulement dans l’enfance des individus (illustré en Figure 11).
71
Figure 11 : La diversité bactérienne du microbiote intestinal augmente avec l’âge dans chaque population étudiée. Nombre d’OTUs observés en fonction de l’âge des individus (Source : « Human gut microbiome viewed across age and geography » de Yatsunenko et al., 201284)
➢ Influence du genre
Les chercheurs Haro et al. ont montré en 201685 que la diversité globale du microbiote fécal humain n’était pas influencée par le sexe de l’individu. Certains genres et espèces de microorganismes étaient, par ailleurs, plus abondants chez la femme que chez l’homme et vice versa. (Bilophila est plus abondante chez la femme, Veillonella et Methanobrevibacter sont plus abondantes chez l’homme).
1.3.2.d Facteurs externes
➢ Influence de la zone géographique
La zone géographique a été très vite mise en cause dans les variations de composition du microbiote intestinal. En effet, lors d’études de comparaison de communautés microbiennes ou de méta- analyses sur le sujet, des différences notables sont mises en évidence entre les communautés de diverses régions. Mais ce qui semble être en cause au-delà de la zone géographique, sont les habitudes alimentaires différentes entre chaque région. Par exemple, une étude a comparé le microbiote d’enfants italiens à des enfants du même âge originaire de zones rurales africaines. Ils ont montré que les enfants italiens, dont le régime alimentaire est plus riche en protéine animale, ont une abondance relative en Bacteroides et en Alistipes plus élevée dans leur microbiote intestinal (article complet « Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. », de De Fillipo et al., 201063).
La revue de Senghor et al., « Gut microbiota diversity according to dietary habits and geographical provenance » de 201886 a synthétisé les données actuelles sur les effets des régimes alimentaires et des zones géographiques sur la composition taxonomique du microbiote intestinal. Ils ont inclus les études s’intéressant aux différents produits alimentaires, aux différents régimes, aux zones géographiques mais aussi aux différences de populations au sein d’une même zone géographique. Ils ont observé que les régimes omnivores étaient associés à une diversité plus grande du microbiote que les régimes végétariens. La composition du microbiote intestinal est largement différente d’une région à une autre mais aussi entre différents groupes ethniques d’une même zone géographique. Les
72 populations des régions africaines montrent une diversité microbienne intestinale plus grande. Ils ont surtout pu mettre en évidence que la composition différait surtout selon le régime alimentaire et que les habitudes alimentaires étaient corrélées avec la région considérée. La Figure 12 illustre leur conclusion.
Figure 12 : Diversité du microbiote intestinal selon la zone géographique. (Source : « Gut microbiota diversity according to dietary habits and geographical provenance », Senghor et al., 201886)
➢ Relations sociales et microbiote intestinal
Un grand nombre d’autres paramètres environnementaux participent au façonnage du microbiote tout au long de la vie d’un individu. On peut encore citer les relations sociales. Les auteurs Dill- McFarland et al. dans l’article « Close social relationships correlate with human gut microbiota composition » de 201987 ont montré que les couples avaient une composition taxonomique du microbiote intestinal plus proche que des paires de frères et sœurs, en prenant en compte des facteurs alimentaires. Ils ont aussi montré que les personnes mariées présentaient une diversité et une richesse de leur microbiote intestinal plus vastes que les individus vivant seuls (article complet « Close social relationships correlate with human gut microbiota composition », Dill-McFarland et al., 201987).
➢ Traitements médicamenteux : Antibiothérapie
La prise d’antibiotiques est délétère quel que soit le stade de développement du microbiote. Pendant la grossesse, si la mère est traitée avec un antibiotique, cela peut affecter le microbiote intestinal du fœtus, et donc la santé et le développement fœtal. Lors d’affections du nourrisson, un traitement antibiotique va inhiber ou tuer les bactéries pathogènes mais aussi bénéfiques pour le développement du nouveau-né. Cela peut aussi conduire à une sélection des bactéries résistantes aux antibiotiques, et rendre l’individu encore plus sensible aux infections. De plus, ces changements ne sont pas brefs, ils peuvent perdurer dans le temps, pendant plusieurs semaines ou mois. L’usage d’antibiothérapie prophylactique chez les prématurés ou les nouveau-nés légers est une pratique très courante dans les unités de soins intensifs en maternité. Cela conduit à une diversité réduite du microbiote intestinal, retarde la mise en place de la flore commensale et affecte le métabolisme du nouveau-né. Il faudrait réévaluer la balance bénéfices/risques de ces pratiques et peut-être utiliser des antibiotiques à spectre étroit sur des périodes les plus courtes possibles, pour limiter les effets néfastes de l’antibioprophylaxie sur le microbiote intestinal en développement.
73 La revue « Effects of Antibiotics on Gut Microbiota » de Lange et al. (2016)88 évoque que même de courts traitements antibiotiques sont capables d’altérer le microbiote intestinal au long terme. La dysbiose peut favoriser la mise en place de pathologies ainsi que leur aggravation. Ils ont synthétisé les effets démontrés de certains antibiotiques sur la composition taxonomique du microbiote dans le Tableau XVI ci-dessous.
Tableau XVI : Impact des différentes classes d’antibiotique sur le microbiote et l’immunité intestinale (Source : « Effects of Antibiotics on Gut Microbiota » de Lange et al., 2016 qui ont synthétisé les données des articles de Sullivan et al. (2001)89, de Ubeda et Pamer (2012)90 et de Jernberg et al. (2007)91)
D’autres traitements médicamenteux peuvent modifier la composition du microbiote intestinal, mais aussi une chirurgie, une anesthésie, etc.
➢ Influence des maladies sur le fonctionnement et la composition du microbiote intestinal
La microbiote intestinal, participant à la santé et à l’homéostasie de son hôte, est, de manière logique, largement impacté dans sa composition et son fonctionnement en cas de maladie intestinale. En effet, que la pathologie soit d’origine métabolique, inflammatoire, immunitaire, le microbiote change de dynamique de manière concomitante aux troubles qui s’installent. Nous verrons dans le paragraphe suivant le cas particulier des maladies métaboliques, dans lesquelles le microbiote intestinal semble jouer un rôle central.
Le microbiote intestinal impacte également de manière conséquente d’autres systèmes, comme l’immunité ou le système nerveux. Bien que ces phénomènes ne soient pas négligeables, nous n’aborderons pas ces sujets par choix.
De nombreux facteurs influencent la composition du microbiote intestinal d’un individu à un temps donné. Sa colonisation initiale, l’âge, le type d’alimentation, la zone géographique, les traitements médicamenteux sont tous des facteurs qui peuvent perturber l’équilibre du microbiote intestinal et par conséquent, les espèces qu’il contient.
74 1.4. PATHOLOGIES METABOLIQUES ET MICROBIOTE INTESTINAL 1.4.1. Implication du microbiote intestinal dans les maladies métaboliques
Nous avons jusque-là défini le microbiote intestinal, décrit sa mise en place. Nous avons explicité ses multiples fonctions et décrit sa composition à l’état d’équilibre avec son hôte. Nous avons aussi évoqué la multitude de facteurs qui peuvent influencer sa composition taxonomique et son fonctionnement, dont les maladies métaboliques. Dans cette section, il ne s’agit pas de faire une description poussée de la physiopathologie de ces maladies mais bien de montrer les implications du microbiote intestinal dans la mise en place et l’aggravation des pathologies dites métaboliques. Inversement, nous essaierons de montrer quelles sont les conséquences de ces maladies sur l’état de dysbiose du microbiote intestinal.
Le microbiote intestinal influence donc par de nombreux biais la physiologie humaine. La dysbiose est définie comme des changements quantitatifs et qualitatifs de la composition du microbiote. En cas de dysbiose, il n’est donc pas surprenant que les changements puissent alors contribuer à un état pathologique, souvent lié à un état inflammatoire. (définition traduite de l’anglais du MeSH12). Dans de nombreux cas, les liens précis entre la pathologie et la dysbiose ne sont pas élucidés clairement69.
Figure 13 : Impact du régime alimentaire sur le microbiote intestinal et la santé de l’hôte. (Source : « Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health », Singh et al., 201756)
Comme nous pouvons l’observer sur la Figure 13, l’alimentation est centrale dans la pathogénèse des troubles métaboliques. Les auteurs Singh et al. (2017)56 se sont intéressés aux régimes
75 particuliers et leurs effets sur le microbiote. Le régime occidental, caractérisé par une richesse en graisses, en protéine animale et une pauvreté en fibres, a été associé à une diminution des Bifidobacterium, une diminution des Lactobacillus, des Eubacteria, une augmentation des Bacteroides et des Enterobacteria. Globalement, ce régime est associé une dysbiose intestinale, à un état inflammatoire permanent de la muqueuse, qui peut conduire à diverses maladies métaboliques et inflammatoires chroniques. Le régime méditerranéen semble être le plus équilibré et le plus sain pour le fonctionnement et la stabilité du microbiote intestinal (cf. Tableau XVII).
Tableau XVII : Régimes alimentaires et impacts sur la composition du microbiote intestinal. (Source : « Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health », Singh et al., 201756)
De manière globale, nous pouvons simplifier la mise en place de des pathologies métaboliques liées à l’alimentation et au microbiote en quatre étapes :
1- Régime alimentaire et mode de vie malsain : régime hyperglycémiant et riche en graisse, peu d’activité physique 2- Dysbiose 3- Altération des interactions métaboliques, immunitaires et mise en place d’un état pro- inflammatoire non adapté et d’une endotoxémie métabolique 4- Déclaration de la maladie chez l’hôte
Il ne faut pas oublier qu’entre tous ces éléments peut se mettre en place un cercle vicieux d’auto- entretien voire d’aggravation de la dysbiose et de la pathologie.
Nous aborderons quatre troubles dits métaboliques et leurs liens potentiels avec le microbiote intestinal : le syndrome métabolique, l’obésité, et diabète de type 1 et de type 2. Le Tableau XVIII ci-dessous présente ces maladies.
76 Tableau XVIII : Définition de principales maladies métaboliques systémiques
Pathologie Définition Référence(s)
Groupe de symptômes qui représentent des facteurs de risques pour les maladies cardiovasculaires et le diabète sucré Syndrome de type 2. Les composantes majeures de ce syndrome sont MeSH35 métabolique une obésité abdominale, une dyslipémie athérogène, une hypertension, une résistance à l’insuline, un état pro- inflammatoire et un état pro-thrombotique
Condition liée au poids corporel qui se trouve au-dessus du poids acceptable ou souhaitable, généralement dus à l’accumulation de graisse dans le corps. Les standards peuvent variés avec l’âge, le sexe ou la génétique ou le Obésité MeSH 27 bagage culturel. Si l’IMC est supérieur à 30kg/m2, la personne est considérée comme obèse. Si l’IMC est supérieur à 40kg/m2, la personne est atteinte d’obésité morbide.
Groupe hétérogène de maladies caractérisées par une TermSciences7 Diabète hyperglycémie et une intolérance au glucose.
Il s’agit d’un sous-type de diabète sucré, qui ne répond pas ou n’est pas dépendant de l’insuline (NIDDM, de l’anglais « Non Insulin-Responsive or Dependent Diabetes Mellitus »). Il est Diabète de caractérisé initialement par une résistance à l’insuline et une hyperinsulinémie ; et éventuellement une intolérance au TermSciences9 type 2 glucose ; une hyperglycémie ; et un diabète déclaré. Le diabète sucré de type 2 n’est plus considéré comme une maladie exclusivement trouvée chez les adultes. Les patients atteints développent rarement une cétose mais montrent souvent une obésité.
Il s’agit d’un sous-type du diabète sucré, caractérisé par une déficience en insuline. Il se manifeste par un commencement Diabète de brutal via une sévère hyperglycémie, une progression rapide vers une acidocétose diabétique, et la mort s’il n’est pas traité TermSciences8 type 1 rapidement à l’insuline. Cette maladie peut survenir à n’importe quel âge, mais est plus fréquemment détectée pendant l’enfance ou l’adolescence.
La NASH ou stéato-hépatite non alcoolique ou encore maladie du « foie gras » est une maladie inflammatoire chronique du foie, causée par une accumulation de graisse dans cet organe. Elle ne provoque chez la « Nonalcoholic plupart des personnes aucun symptômes. Mais pour Steatohepatitis NASH (NASH) », certains individus, la graisse entraine des lésions Standford Health hépatiques. Elle peut se compliquer en cirrhose. Elle est Care26 généralement due à une consommation d’alcool importante sur le long terme. Parfois elle se déclare chez des personnes ne consommant pas d’alcool.
77 Deux choses sont à souligner après lecture de ces définitions. D’une part, le syndrome métabolique, l’obésité et le diabète de type 2 sont liées les unes aux autres. En effet, le syndrome métabolique est caractérisé par une obésité viscérale et est un facteur de risque pour le diabète de type 2. L’obésité n’est pas vraiment définie comme une maladie mais comme un symptôme associé à ces deux troubles. Le diabète de type 1 ne semble à première vue pas associé à un mode de vie et à un régime alimentaire particulier. D’autre part, le microbiote n’est mentionné nulle part comme potentiel facteur de ces maladies.
Nous n’aborderons pas plus la NASH dans la suite de ce travail, car ses liens avec le microbiote intestinal sont pour l’instant très peu étudiés.
Pour chacune de ces pathologies, nous résumerons la physiopathologie et nous synthétiserons les grands liens potentiels avec le microbiote intestinal.
1.4.1.a Microbiote intestinal et syndrome métabolique
La prévalence du syndrome métabolique est aujourd’hui estimée à environ 20 à 25% des adultes dans le monde et elle est en augmentation depuis 20 ans, notamment dans les pays industrialisés (article « Gut microbiome and metabolic syndrome », Mazidi et al., 201692).
Le Tableau XIX résume les principaux symptômes, les grandes voies de pathogénèse et les liens potentiels de ce syndrome avec le microbiote intestinal chez l’Homme.
Tableau XIX : Principaux symptômes et voies impliquées dans la physiopathologie du syndrome métabolique
Critère Description Référence(s)
Plusieurs anomalies métaboliques athérogènes (cliniques Ministère de et/ou biologiques) : l'Agriculture et - Obésité avec répartition préférentielle de la graisse de la Pèche - au niveau du tronc, Direction - Anomalies lipidiques (élévation des triglycérides, Générale de diminution du cholestérol HDL) l'Alimentation et Sous- Symptômes - Troubles de la glycorégulation (hyperglycémie à jeun ou diabète, hyperinsulinisme et Direction de la insulinorésistance) réglementation, - Hypertension artérielle de la recherche - Troubles de la coagulation (notamment de la et de la fibrinolyse) coordination des - Hyperuricémie contrôles, 93 - Foie gras (stéatose non alcoolique) 2007
- Variation de l’homéostasie et des processus métaboliques (endotoxémie métabolique) Principales voies - Modulations des signaux pro- et anti- impliquées dans inflammatoires (état pro-inflammatoire de bas Mazidi et al., la grade permanent associé à un rôle central des 201692 physiopathologie adipokines) - Interactions avec le système immunitaire - Interactions avec le système Rénine-Angiotensine
78 Modèle souris obèse ob/ob : un simple traitement antibiotique (Norfloxacine et ampicilline) permet une amélioration de la résistance à l’insuline, de la glycémie à Membrez et al., jeun et de la tolérance au glucose des souris obèses 200894 ; Kootte traitées par rapport à des souris obèses non traitées mais et al., 201295 aussi une réduction de l’endotoxémie métabolique et des paramètres inflammatoires
Potentielles Rôle du récepteur TLR-5 implications du microbiote Modèle de souris génétiquement modifiées TLR-5 KO intestinal dans la (de l’anglais « Knock Out ») : hyperphagie et syndrome métabolique (hyperlipémie, hypertension, résistance à pathologie Vijay-Kumar l’insuline et obésité) et al.,201096 Abondance relative (souris TLR-5 KO) Firmicutes, 54% ; Tilg et Kaser, Bacteroidetes, 39.8% ; Proteobacteria, 1.1% ; Tenericutes, 201197 Actinobacteria, Saccharibacteria ou TM7, et Verrucomicrobia, <0.2% Transfert de ce microbiote chez des souris axénique : induction d’un syndrome métabolique
Rôle du récepteur TLR-5 dans la pathogénèse du syndrome métabolique
Les auteurs Vijay-Kumar et al. (2010)96 ont mis en évidence que des souris génétiquement modifié TLR5- KO présentent de l’hyperphagie et développent un syndrome métabolique (hyperlipémie, hypertension, résistance à l’insuline et obésité). La plupart de ces symptômes sont contrôlés par restriction alimentaire bien que même des souris TLR5-KO, qui ne développent pas d’obésité et dont le poids est normal, présentent une résistance à l’insuline. En faisant l’hypothèse que la perte du gène codant pour le TLR5 provoquait une altération du microbiote intestinal, ils ont analysé sa composition dans le cæcum par séquençage génomique à l’aide de l’ARNr 16s. Ils ont trouvé une abondance relative en bactéries similaires à celles d’autres études sur des souris TLR5-KO (Firmicutes, 54% ; Bacteroidetes, 39.8% ; Proteobacteria, 1.1% ; Tenericutes, Actinobacteria, Saccharibacteria ou TM7, et Verrucomicrobia, <0.2% des séquences lues). Par rapport aux souris obèses, les proportions de Firmicutes et Bacteroidetes sont similaires entre les souris conventionnelles et TLR5-KO. Mais bien qu’elles présentent une proportion au niveau des phyla commune, leur composition au niveau taxonomique des espèces est significativement différente. De plus, 116 types de bactéries de divers phyla sont enrichies ou réduites chez les souris TLR5- KO par rapport aux souris conventionnelles. Enfin, ils ont montré qu’en transférant le microbiote de ces souris TLR5-KO chez des souris axéniques, elles développent un syndrome métabolique. Ces données montrent à la fois que le système immunitaire inné a un rôle critique dans l’induction du syndrome métabolique mais aussi que ces altérations du microbiote intestinal sont suffisantes pour induire ce syndrome. Plus récemment, cet article a été remis en question par un étude sur 2 colonies de souris TLR5- KO, pour lesquelles un état intestinal inflammatoire et un dysfonctionnement métabolique n’étaient pas évidents. Ils ont alors supposé que les différents phénotypes obtenus chez ces animaux dépendent de l’animalerie d’origine des animaux et donc de différences potentielles dans la composition du microbiote (revue de Tilg et Kaser, « Gut microbiome, obesity, and metabolic dysfunction », 201197).
79 Il faut noter qu’ici toutes les preuves d’une potentielle implication du microbiote intestinal dans la pathologie n’ont été trouvées seulement chez des modèles rongeurs et génétiquement modifiés. Il manque actuellement d’un consensus concernant la définition de ce syndrome et de données sur ses liens avec le microbiote intestinal obtenues à partir de cohortes humaines malades.
Nous verrons dans les prochains paragraphes concernant l’obésité et le diabète sucré de type 2 les différentes implications métaboliques du microbiote dans ces maladies, à l’origine de la rupture de l’homéostasie intestinale et de l’état pro-inflammatoire permanent, qui sont communes et liées à la mise en place du syndrome métabolique.
1.4.1.b Microbiote intestinal et obésité
L’obésité résulte d’un déséquilibre énergétique entre les apports nutritifs et leur dépense. Elle est aussi associée à un état inflammatoire de bas grade qui peut conduire à des maladies métaboliques comme le diabète sucré de type 2. La prévalence ce trouble est actuellement en augmentation, en lien avec des facteurs socio-économiques, l’occidentalisation du régime alimentaire (plus gras, plus riche en protéine animale, moins riche en fibre et peu divers) et le mode de vie de plus en plus sédentaire des populations favorisées. Le Tableau XX synthétise les principales informations concernant la physiopathologie de l’obésité et ses liens possibles avec le microbiote intestinal.
Tableau XX : Principaux symptômes et voies impliquées dans la physiopathologie de l’obésité et potentielles implications du microbiote intestinal
Critère Description Référence(s)
- Déséquilibre énergétique entre les apports nutritifs et leur dépense - Etat inflammatoire de bas grade - Production moindre en SCFA : influence sur la satiété et l’appétit réduite, barrière épithéliale Sanz et al., Principales voies affaiblie, production de mucus et effets anti- 201598; Valdes impliquées dans inflammatoires diminués et al., 201811; la - Passage d’endotoxines (LPS) dans le sang Górowska- physiopathologie - Stimulation permanente du système immunitaire Kowolik et inné (TLR4) : état pro-inflammatoire permanent Chobot, 201999 (cytokine) - Acétate et butyrate : augmentation de la dépense énergétique et favorisation de l’oxydation des acides gras
Landman et Diversité taxonomique du microbiote plus faible du Quévrain, microbiote intestinal par manque de fibre diététique dans 201622 ; l’alimentation Valdes et al., 201811
Comparaison souris axénique/conventionnelle : Sanz et al., Les effets du microbiote intestinal sur le phénotype obèse 201598; Caesar sont en partie indépendant du régime alimentaire de et al., 2012100 l’hôte
Landman et Le microbiote contribue à l’absorption par l’hôte de Quévrain, glucides et de lipides et régule le stockage des graisses 201622 ; (induction de la lipogenèse hépatique et le stockage des 80 Potentielles Turnbaugh et triglycérides dans les adipocytes) implications du al., 2006101 microbiote intestinal dans la Souris obèses (ob/ob) : pathologie - Réduction de 50% de l’abondance en Bacteroidetes et augmentation proportionnelle en Firmicutes Landman et - Le transfert du microbiote de souris obèses à des Quévrain, 22 souris axéniques provoque « l’augmentation de 2016 ; Ley et 102 l’extraction énergétique des aliments ingérés, al., 2005 supérieure à celle induite par le transfert d’un microbiote de souris minces. »
Homme obèse : proportion augmentée de Firmicutes et diminuée de Bacteroidetes, (comparativement aux sujets Landman et minces) dans le microbiote fécal Quévrain, 201622 « La perte de poids est corrélée avec l’augmentation de la proportion de Bacteroidetes » Critère Description Référence(s)
- Déséquilibre énergétique entre les apports nutritifs et leur dépense - Etat inflammatoire de bas grade - Production moindre en SCFA : influence sur la satiété et l’appétit réduite, barrière épithéliale Sanz et al., Principales voies affaiblie, production de mucus et effets anti- 201598; Valdes impliquées dans inflammatoires diminués et al., 201811; la - Passage d’endotoxines (LPS) dans le sang Górowska- physiopathologie - Stimulation permanente du système immunitaire Kowolik et inné (TLR4) : état pro-inflammatoire permanent Chobot, 201999 (cytokine) - Acétate et butyrate : augmentation de la dépense énergétique et favorisation de l’oxydation des acides gras
Landman et Diversité taxonomique du microbiote plus faible du Quévrain, microbiote intestinal par manque de fibre diététique dans 201622 ; l’alimentation Valdes et al., 201811
Comparaison souris axénique/conventionnelle : Sanz et al., Les effets du microbiote intestinal sur le phénotype obèse 201598; Caesar sont en partie indépendant du régime alimentaire de et al., 2012100 l’hôte
Landman et Le microbiote contribue à l’absorption par l’hôte de Quévrain, glucides et de lipides et régule le stockage des graisses 201622 ; (induction de la lipogenèse hépatique et le stockage des Potentielles Turnbaugh et triglycérides dans les adipocytes) implications du al., 2006101 microbiote intestinal dans la Souris obèses (ob/ob) : pathologie - Réduction de 50% de l’abondance en Bacteroidetes et augmentation proportionnelle en Firmicutes Landman et - Le transfert du microbiote de souris obèses à des Quévrain, 22 souris axéniques provoque « l’augmentation de 2016 ; Ley et 102 l’extraction énergétique des aliments ingérés, al., 2005 supérieure à celle induite par le transfert d’un microbiote de souris minces. »
Homme obèse : proportion augmentée de Firmicutes et diminuée de Bacteroidetes, (comparativement aux sujets Landman et minces) dans le microbiote fécal Quévrain, 201622 « La perte de poids est corrélée avec l’augmentation de la proportion de Bacteroidetes »
Le microbiote intestinal entre sans aucun doute en jeu dans l’installation et la progression de l’obésité, en grande partie en lien avec l’alimentation d’une personne obèse, riche en graisse et pauvre en fibre. Comme vu précédemment, cela conditionne la proportion et le type de nutriments qui arrivent aux bactéries du côlon et donc ce régime sélectionne certaines espèces. Il faut noter que les implications du microbiote semblent multiples, la bibliographie sur le sujet est d’ailleurs extrêmement vaste. Mais certaines publications contredisent totalement les précédentes, comme par exemple l’article de Schwiertz et al., 2010103, qui a trouvé sur une cohorte humaine obèse des proportion en Firmicutes et Bacteroidetes totalement inversées par rapport au reste de la littérature (augmentée en Bacteroidetes et diminuée en Firmicutes). Il faut donc toujours garder un œil critique sur les résultats obtenus et conclusions tirées des articles.
81 1.4.1.c Microbiote intestinal et diabète de type 2
La prévalence globale du diabète a été estimée à 5% en 2016, dont 90% des individus étaient atteints de diabète de type 2 (DT2). Ce chiffre est sous-estimé car la maladie présente un caractère silencieux qui la rend difficilement détectable à ses premiers stades : 20 à 30% des adultes diabétiques ne sont a priori pas diagnostiqués et traités. L’incidence du DT2 a tendance à augmenter avec l’âge. Généralement, le DT2 se déclare après 40 ans et il est en moyenne diagnostiqué à 65 ans. Néanmoins, le DT2 touche une population de plus en plus jeune, en lien avec des modes de vie inadaptés. La prévalence du DT2 a récemment beaucoup augmenté, en lien avec les déséquilibres nutritionnels et la sédentarité (informations tirées de l’article de l’INSERM, « Le diabète de type 2 »,2019104).
Tableau XXI : Principaux symptômes et voies impliquées dans la physiopathologie du diabète de type 2 (Source : tableau construit à partir des informations tirées de l’article de l’INSERM, « Le diabète de type 2 »,2019104)
Critère Description
Asymptomatique pendant de nombreuses années Hyperglycémie (évaluée à jeun) : Symptômes - Entre 1,1 et 1,26 g/L : patient prédiabétique - Au-dessus de 1,27 g/L sur deux dosages successifs : diabète déclaré
Baisse de sensibilité des cellules à l’insuline, en particulier celles du foie, du muscle et du tissu adipeux → Les cellules insulino-sécrétrices du pancréas produisent de l’insuline jusqu’à « épuisement » : le glucose s’accumule alors dans le sang Physiopathologie Mécanismes moléculaires associés au microbiote intestinal encore à simplifiée l’étude : - « Processus inflammatoires intestinaux - Sécrétion et action des incrétines : GLP1 et GIP (peptide insulinotrope dépendant du glucose), deux hormones gastro- intestinales stimulant la sécrétion d'insuline après les repas - Immunité intestinale - Système nerveux entérique (axe intestin-cerveau) »
- Athérosclérose à l’origine d’infarctus du myocarde, d’AVC ou d’artérites des membres inférieurs - Rétinopathies - Neuropathies périphériques Complications - Néphropathies - Maladies hépatiques - Problème de cicatrisation - Neurodégénérescence
82 « L’insuline est une hormone essentielle à la régulation de la glycémie, est normalement produite par cellules spécialisées du pancréas : les cellules ß des îlots de Langerhans. L’insuline favorise l’entrée du glucose dans plusieurs types de cellules, notamment dans les cellules musculaires, les adipocytes (cellules graisseuses) et les hépatocytes (cellules du foie). L’absence de cette hormone empêche l’organisme de stocker du sucre. »
« La glycémie normale est d’environ 1 g/L à jeun. Elle varie au cours de la journée, augmentant en particulier durant plusieurs heures après les repas, d’où la nécessité de réaliser cette mesure à jeun le matin. » (Article de l’INSERM, « Le diabète de type 2 »,2019104)
Le Tableau XXII ci-dessous, synthétisant des études sur le lien entre microbiote intestinal et le DT2, montre de nouveau que certaines études peuvent se contredire selon les cohortes étudiées. Actuellement, nous sommes donc encore incapables de prédire le risque de développer une pathologie métabolique en fonction de la composition du microbiote intestinal d’un individu. Globalement, une signature du microbiote potentielle liée au diabète sucré de type 2 et à une intolérance au glucose serait une abondance diminuée en bactéries productrices de butyrate (dont Roseburia et F. prausnitzii) et une abondance augmentée de pathogènes opportunistes (Clostridium clostridioforme, E. coli). Par ailleurs, il a été proposé que le microbiote participerait à l’entretien de l’inflammation chronique de bas grade associée à la résistance à l’insuline et au DT2. Cette hypothèse est basée sur la présence de LPS de bactéries Gram négatives dans le sang de patients atteints d’un syndrome métabolique et de DT2. Des études sur des populations très contrôlées sont nécessaires pour déterminer les liens de cause à effet entre le microbiote et les maladies métaboliques (informations tirées de la revue « Understanding the role of gut microbiome in metabolic disease risk », Sanz et al., 201598).
83 Tableau XXII: Changements de la composition du microbiote intestinal chez des individus atteints de diabète de type 2 (Source : « Understanding the role of gut microbiome in metabolic disease risk », Sanz et al., 201598)
84 1.4.1.d Microbiote intestinal et diabète de type 1
Le diabète de type 1 (DT1) concerne environ 10% des diabétiques105. Le Tableau XXIII présente les grandes caractéristiques de ce diabète, d’origine auto-immune.
Tableau XXIII : Principaux symptômes et voies impliquées dans la physiopathologie du diabète de type 1(Sources : tableau construit à partir des informations tirées des articles de l’INSERM, « Le diabète de type 1 »,2019105 ; de Knip et Siljander, 2016106 ; et de Sanz et al., 201598)
Critère Description
- Production insuffisante voire nulle d’insuline entrainant une hyperglycémie prolongée - Risque majeur d’hyperglycémie au moment des prises alimentaires - Augmentation de la perméabilité intestinale chez les Symptômes diabétiques et prédiabétiques de type 1 - Symptômes apparaissant plusieurs mois/années après le début de la maladie : peut se déclarer à tout âge - Acidocétose diabétique secondaire (libération des corps cétonique dans le sang) qui peut conduire à des douleurs abdominales voire un coma
Chez des individus génétiquement prédisposés Mécanisme auto-immun : dysfonctionnement de lymphocytes T qui Principales voies éliminent sélectivement les cellules ß des ilots pancréatiques impliquées dans la physiopathologie Les mécanismes qui lient le microbiote intestinal, l’initiation de l’auto- immunité des cellules ß et la progression de la séroconversion ne sont pas encore élucidés
- Lésions vasculaires (athérosclérose, infarctus du myocarde, AVC, artérite des membres inférieurs) Complications - Complications microvasculaires : au niveau des rein, membres inférieurs et rétine
85 Tableau XXIV : Changements de la composition du microbiote intestinal chez des individus atteints de diabète de type 1 (Source : « Understanding the role of gut microbiome in metabolic disease risk », Sanz et al., 201598)
Le Tableau XXIV ci-dessus synthétise les principaux changements de composition du microbiote intestinal lors de DT1 évalués dans quatre études. Le rôle du microbiote dans la physiopathologie de la maladie n’est pas clair. On ne sait pas encore dire si le trouble immunitaire et la maladie surviennent avant la dysbiose ou si c’est la dysbiose qui favorise le trouble immunitaire. Néanmoins de nombreuses études sur modèles animaux (dont les souris NOD : de l’anglais « Non Obese Diabetic ») montrent que l’exposition à des antigènes bactériens et à des infections dès le plus jeune âge prévient le DT1. Cela voudrait dire que la stimulation immunitaire microbienne en participant à la maturation du système immunitaire protège contre le DT1. Comme on peut le voir dans le Tableau XXIV, les résultats obtenus ne sont pas tous cohérents. Les bactéries productrices de butyrate et les Bifidobacteria semblent être protectives contre le DT1, alors que les Proteobacteria et les Enterobacteria semblent être un facteur de risque. D’un point de vue fonctionnel, le microbiote joue un rôle protecteur contre le trouble métabolique grâce à sa production de SCFAs. En effet, le microbiote et les SCFAs ont un rôle de renforcement de l’intégrité de la muqueuse, de modulation des hormones du métabolisme du glucose et peuvent moduler les signaux de l’inflammation. Il existe d’autres facteurs de risques du DT1, comme les infections virales, le mode de naissance et l’alimentation du jeune (notamment l’allaitement) (informations issues de la revue « Understanding the role of gut microbiome in metabolic disease risk », Sanz et al., 201598).
86 Globalement, on peut retenir que dès l’apparition d’anticorps prédictifs de la maladie, les enfants en voie de devenir diabétique de type 1 déclaré, présentent une diversité bactérienne réduite et une réduction de l’abondance des bactéries produisant du lactate et du butyrate (revue très complète sur le sujet : « The role of the intestinal microbiota in type 1 diabetes mellitus », Knip et Siljander, 2016106).
Les maladies métaboliques sont en constante augmentation dans les pays industrialisés, à cause d’un mode de vie sédentaire et d’une alimentation de plus en plus riche en graisses, en protéines animales et pauvre en fibres. Les syndrome métabolique, l’obésité et le DT2 sont directement liés à ce type d’alimentation, à l’origine d’une dysbiose intestinale. Le microbiote intestinal semble être un facteur déterminant, comme le prouvent l’amélioration des symptômes (résistance à l’insuline notamment) par traitement antibiotique. Mais les mécanismes qui le lient aux troubles métaboliques restent à élucider.
De manière plus étonnante, alors que le DT1 est d’origine dysimmunitaire, le microbiote intestinal est impacté par cette pathologie. Là encore, les liens qui unissent dysbiose et troubles métaboliques ne sont pas précisément définis
87 1.4.2. Le microbiote, un moyen thérapeutique ?
Comme nous venons de le voir, le microbiote joue un vrai rôle dans les pathologies métaboliques mais pas seulement (maladies intestinales inflammatoires, infectieuses etc.). Partant de ce constat, les chercheurs ont commencé à développer de nouvelles pistes thérapeutiques en jouant sur les effets du microbiote dans diverses pathologies. On peut se servir du microbiote intestinal pour corriger la dysbiose et potentiellement les symptômes selon 3 axes :
• Contrôler l’apport de nutriments qui arrivent au niveau du côlon et donc des bactéries fermentaires, c’est-à-dire contrôler l’alimentation dans le but de sélectionner un équilibre microbiotique particulier et favoriser ou défavoriser des espèces bactériennes choisies : il s’agit des prébiotiques ; • Apporter des bactéries vivantes bénéfiques pour l’hôte via l’alimentation pour favoriser leur implantation dans l’intestin : il s’agit des probiotiques ; • Implanter une nouvelle flore saine en éliminant au préalable celle d’origine : il s’agit de la transplantation de microbiote fécal.
Tableau XXV : Définitions des principaux termes en relation avec le sujet « Microbiote intestinal et thérapeutique »
Terme Définition Référence
Prébiotique Composants non digestibles principalement des MeSH29 carbohydrates qui améliore la santé humaine et la croissance et/ou l’activité des bactéries du côlon
Probiotique Il s’agit de microorganismes vivants qui supplémentent MeSH30 l’alimentation à des fins bénéfiques pour l’hôte en améliorant son équilibre microbien. Chez l’Homme, les Lactobacilles sont communément utilisés comme probiotiques, seules ou associés à d’autres espèces bactériennes. Les Bifidobactéries et les Streptocoques sont aussi utilisées dans cet objectif.
Transplantation Transfert du microbiote d’un individu à un autre par MeSH36 de microbiote administration de fèces d’un donneur par voie orale ou fécal voir rectale du receveur.
1.4.2.a Manipulation du microbiote via des changements de régime alimentaire : aliments prébiotiques ou fibres diététiques
Les fibres diététiques ou aliments prébiotiques se trouvent naturellement dans l’alimentation. Les sources sont multiples : soja, inuline, blé et orge non raffiné, avoine brute etc. Il s’agit comme vu précédemment d’oligosaccharides non digestibles comme les fructanes, les polydextroses, les fructo-oligosaccharides (FOS), les galacto-oligosaccharides (GOS), les xylo-oligosaccharides (XOS) et les arabino-oligosaccharides (AOS). Leur présence dans l’alimentation favorise la diversité génomique du microbiote intestinal (se reporter au Tableau XIII). En plus de moduler la composition du microbiote, les prébiotiques provoquent des changements métaboliques et immunitaires notables (réduction de la production de cytokine IL-6, de la résistance à l’insuline, du pic de glycémie post-prandiale, etc.). Les prébiotiques ont des effets bénéfiques, métaboliques et immunitaires, grâce à leur participation à l’élévation du taux de SCFAs produits et au renforcement
88 du tissu lymphoïde associé à l’intestin (informations tirées de la revue « Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health », Singh et al., 201756).
Caractéristiques souhaitées d’un prébiotique (revue « Mechanism of action of prebiotic and probiotic », Khare et al., 2018107) :
- Résistance à l’acidité gastrique, à l’hydrolyse des enzymes des mammifères et à l’absorption gastro-intestinale. - Fermentation par le microbiote intestinal - Stimulation sélective de la croissance et/ou de l’activité des bactéries bénéfiques pour la santé de l’hôte - Amélioration luminale ou d’aspects systémiques de la défense du système de l’hôte - Avoir une influence globale positive sur la santé du gros intestin ou sur le bien-être de l’hôte
Comme le microbiote et l’alimentation jouent un rôle crucial dans l’obésité et le DT2, les chercheurs ont pensé que la modulation de l’équilibre intestinal via l’apport des fibres diététiques dans l’alimentation pourrait être un nouveau moyen thérapeutique. En effet, les prébiotiques améliorent la fonction de barrière intestinale, permettent de réduire l’endotoxémie métabolique et l’inflammation présente dans l’obésité et le DT2. Les effets positifs du microbiote intestinal via les prébiotiques peuvent être associés avec l’augmentation de la production endogène d’un peptide entéro-endocrine impliqué dans la régulation de la prolifération de l’épithélium et de l’intégrité de la barrière intestinale : le Glucagon-Like Peptide 2 (GLP-2) (démontré grâce à un traitement antagoniste au GLP-2). Par ailleurs, l’abondance de l’espèce bactérienne Akkermansia muciniphila serait multipliée par 100 grâce à la prise de prébiotiques. Akkermansia muciniphila représente 3 à 5 % de la communauté bactérienne intestinale chez une personne saine et sa présence est inversement corrélée à la prise de poids, le DT1 ou les maladies intestinales chez l’Homme et la souris. Cette espèce bactérienne semble avoir un rôle très important dans le maintien de l’intégrité de la barrière intestinale. Enfin, les prébiotiques participent non seulement à la diminution de l’inflammation, de l’endotoxémie, de la perméabilité mais aussi à la réduction du poids corporel, de l’accumulation de la graisse et à l’amélioration de l’homéostasie du glucose, du métabolisme des lipides et de la sensibilité à la leptine (informations tirées de la revue « Diabetes, obesity and gut microbiota », Everard et Cani, 2013108).
Cette piste thérapeutique semble prometteuse pour traiter les maladies métaboliques à implication du microbiote, de manière simple et non contraignante. Cependant, bien que l’on connaisse de mieux en mieux toutes les voies par lesquelles les prébiotiques améliorent les symptômes de dysbiose et de troubles métaboliques, il manque aujourd’hui d’essais précliniques et cliniques précis, permettant de conseiller sur la nature des prébiotiques à ingérer, sur la quantité et sur la durée nécessaire pour que les effets soient notables (transition alimentaire, autre aliment à bannir de son alimentation, différences d’un individu à un autre en fonction de sa composition du microbiote initiale, etc.).
1.4.2.b Probiotiques
Les probiotiques sont des microorganismes vivants administrés per os dans l’objectif d’une implantation intestinale aux effets bénéfiques du microbiote. Ils sont contenus dans des aliments fermentés (yaourts, lait fermenté etc.) comme par exemple les Bifidobacteria ou Lactobacillus (cf. Tableau XIV). Ils peuvent aussi être administrés sous la forme de complément alimentaire sous la forme de gélule, généralement gastro-résistante. Les probiotiques contribuent à la bonne santé du
89 microbiote seulement lorsqu’ils sont administrés régulièrement, en quantité suffisante et de manière adaptée.
Caractéristiques souhaitées d’un bon probiotique (revue « Mechanism of action of prebiotic and probiotic », Khare et al., 2018107) :
- Sa croissance doit exercer un effet positif sur l’hôte. Il devrait être Gram positif, résistant à l’acide gastrique, aux acides biliaires et devrait contenir au minimum 30×109 UFC par gramme - Sa croissance doit avoir des taux de survie élevés et se multiplier plus rapidement dans le tractus digestif. - L’organisme implanté doit être sûr : non potentiellement pathogène ou toxique pour l’hôte - Sa capacité d’adhésion doit être ferme et rapide
Les espèces classiquement utilisées sont les suivantes : Lactobacillus, Bifidobacterium, Saccharomyces, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Bacillus.
Les principaux mécanismes d’action bénéfiques des probiotiques sont :
- Renforcement de la barrière épithéliale - Renforcement de l’adhésion à la muqueuse intestinale et inhibition parallèle de celle de pathogènes - Compétition avec les microorganismes pathogènes - Production de substances antimicrobiennes - Modulation du système immunitaire
Consommer des bactéries non pathogènes semble contribuer à maintenir ou renforcer l’intégrité de la barrière intestinale. Malgré de nombreuses études sur le sujet, les mécanismes d’action précis ne sont pas encore complètement élucidés. Les bactéries probiotiques semblent être capables d’adhérer aux cellules épithéliales et ainsi bloquer le développement de pathogènes, si elles arrivent vivantes au niveau du gros intestin. De plus, cette adhésion cellulaire semble conduire à une modulation immunitaire. Pour les bactéries qui auraient été partiellement détruites par la digestion haute, les composants non lysés peuvent provoquer une activation directe ou indirecte des cellules immunitaires. C’est cette immuno-modulation qui joue un rôle essentiel dans le traitement de maladies infectieuses ou inflammatoires. Les cellules épithéliales intestinales produisent de la mucine, un complexe glycoprotéique qui compose le mucus et empêche l’adhésion des cellules microbiennes pathogènes. Les probiotiques produisent des acides organiques (acide lactique, acide acétique), qui inhibent les bactéries Gram négatives, et des substances antimicrobiennes (bacitracine). Les mécanismes utilisés par une espèce bactérienne pour détruire ou réduire la croissance d’une autre espèce bactérienne sont multiples : création d’un environnement micro- écologique hostile, élimination des récepteurs bactériens disponibles, production et sécrétion d’antimicrobiens et de métabolites sélectifs, compétition pour les nutriments essentiels.
90 L'effet des probiotiques est double : grâce aux bactéries qui arrivent vivantes au niveau du côlon et grâce aux produits de leur décomposition. La majorité des bactéries probiotiques ingérées est détruite par les mécanismes de digestion des mammifères :
- Acidité gastrique - Acides biliaires (influencent la survie des Lactobacillus et Bifidobacteria) - Mucus (réseau macromoléculaire contenant de nombreuses substances antimicrobiennes (IgAs, lactoferrine, lactoperoxydase, lysozyme) - Peptides antimicrobiens ou défensines (sécrétés par les cellules de Paneth au fond des cryptes intestinales.
Le transit intestinal (complexes moteurs migrants), rapide dans les portions supérieures du tube digestif, est un frein à l’implantation des bactéries probiotiques. Les conditions sont plus favorables au niveau du côlon, mais seule une très faible proportion des bactéries ingérées atteint le gros intestin en étant encore vivantes et aptes à se développer. « L’ingestion de probiotiques constitue », surtout, « un moyen de véhiculer des principes actifs (enzymes, substances antibactériennes, peptides immunomodulateurs...) jusqu’à leur site d’action dans le tube digestif. Comme la nature exacte des principes actifs est souvent inconnue (à l’exception de la lactase contenue dans les bactéries du yaourt), les études pharmacocinétiques décrivent habituellement le devenir des probiotiques eux-mêmes, c’est-à-dire leur survie dans le tube digestif de l’homme. » (article complet : « Propriétés fonctionnelles des probiotiques », Flourié et Nancey, 2007109)
Les probiotiques sont étudiés par les chercheurs comme traitement potentiel des troubles cardiovasculaires, associés notamment aux diabètes. En effet, le microbiote intestinal ayant une réelle influence sur le métabolisme lipidique, la modulation de la composition du microbiote intestinal par les probiotiques est une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des dyslipémie et de l’athérosclérose. De nombreuses études, chez l’Homme et chez des modèles animaux, montrent des effets contradictoires quant aux réels bénéfices de leur administration. Globalement, les probiotiques semblent corriger la dyslipémie et réduire le risque de maladies cardiovasculaires mais aucun consensus ne ressort concernant les espèces bactériennes bénéfiques, leur quantité administrée, la durée d’administration, l’association avec un type d’alimentation, les associations possibles entre probiotiques etc. (informations issues de l’article « Gut microbiome and metabolic syndrome », Mazidi et al., 2016 92).
Les probiotiques peuvent également être associés à des prébiotiques, pour favoriser doublement la santé du microbiote intestinal. On parle alors de symbiotique. Il semble qu’une démarche individuelle d’adaptation du traitement probiotique ou symbiotique au microbiote intestinal initial soit intéressante pour cibler directement les effets bénéfiques voulus11.
91 1.4.2.c Transplantation fécale
La transplantation du microbiote fécal ou TMF, est un traitement incontournable lié au microbiote intestinal, qui est actuellement à l’étude pour de nombreuses pathologies. Elle consiste en l’administration d’une préparation de fèces d’un donneur sain à un receveur atteint d’une pathologie liée à l’équilibre du microbiote intestinal. Elle nécessite une organisation et une logistique complexe :
1- Validation de l’indication de la TMF 2- Sélection du donneur 3- Préparation des selles du donneur 4- Choix du mode et du contexte d’administration 5- Préparation colique 6- Administration
Il faut que cette transplantation de microorganismes d’une personne à une autre soit, comme tout traitement, sûre et qu’elle ne comporte aucun risque potentiel pour la santé de receveur. C’est pourquoi les étapes de sélection du donneur sont longues et strictes. Au début de la pratique des TMF, les administrations étaient faites à partir de selles fraîches administrées dans les 6 heures suivant leur prélèvement. Aujourd’hui, l’ajout de cryoprotecteurs permet de réaliser les préparations de microbiote fécal à transplanter à partir de matériel congelé. La TMF nécessite une préparation du receveur : son côlon doit être préalablement lavé au polyéthylène glycol.
La TMF est une stratégie thérapeutique intéressante pour de nombreuses pathologies. Aujourd’hui, son utilisation n’est validée uniquement pour les infections récidivantes à Clostridium Difficile mais de nombreux essais sont en cours pour valider son efficacité dans d’autres pathologies, dont les troubles liés à l’insulino-résistance. « Ces indications potentielles de la TMF en sont encore à un stade très précoce d’investigation et des études contrôlées d’efficacité sont indispensables avant d’éventuellement proposer la TMF dans ces contextes. D’autre part, les questions non résolues pour les MICI s’appliqueront également dans ces autres indications potentielles avec des réponses probablement différentes. » (cf. Figure 14) (Article « Transplantation fécale », Harry Sokol, », FMC-HGE – Association Française de Formation Médicale Continue en Hépato-Gastro-Entérologie, 2018110)
Figure 14 : Questions non résolues sur la transplantation du microbiote fécal : exemple du traitement des MICI (Source : « Transplantation fécale », FMC-HGE – Association Française de Formation Médicale Continue en Hépato-Gastro- Entérologie, Sokol, 2018110)
92 Les prébiotiques, les probiotiques et la TMF sont trois moyens thérapeutiques prometteurs, aux applications potentielles multiples. Néanmoins, leurs effets restent peu clairs et de nombreux aspects de leur possible prescription restent à déterminer. Il manque aujourd’hui d’études précliniques et cliniques, permettant de statuer sur la nature des pré- ou probiotiques à administrer, sur la durée, sur la quantité en fonction des effets thérapeutiques voulus. De la même manière que pour la TMF, de nombreux points restent à éclaircir, à l’aide d’études bien construites, offrant des résultats clairs in vivo. Ces questions nous amènent au paragraphe suivant de cette partie, sur les techniques d’études du microbiote intestinal.
93 1.5. TECHNIQUES D’ETUDE DU MICROBIOTE DU MICROBIOTE INTESTINAL 1.5.1. Historique de l’étude du microbiote
La revue de Hugon et al., « A comprehensive repertoire of prokaryotic species identified in human beings » de 2015, faisant partie du HMP, dresse un état des lieux des connaissances sur les microorganismes formant le microbiote humain. Ils ont ainsi construit une base de données en ligne comprenant l’intégralité des espèces procaryotes associées à l’Homme décrites dans la littérature. Ils ont listé 2172 espèces bactériennes classées dans 12 phyla dont majoritairement les Proteobacteria, les Firmicutes, les Actinobacteria et les Bacteroidetes. En réalisant cette grande synthèse bibliographique, ils se sont intéressés à l’évolution des techniques d’étude du microbiote depuis le début du 19ème siècle et le nombre de bactéries connues à chaque avancée technologique (cf. Figure 15). Depuis les années 1990, on peut voir que les techniques moléculaires comme le séquençage à partir de l’ARN ribosomal 16s et la technique de MALDI-TOF MS (de l’anglais « Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation Time-Of-Flight Mass Spectrometry »), ont largement contribué à l’identification des microorganismes pathogènes ou commensaux. Avant la découverte des méthodes moléculaires dans les années 1980 et plus tard du séquençage haut débit, la découverte de l’extraordinaire diversité des organismes procaryotes était impossible à cause des limites des techniques traditionnelles de cultures. Seulement 1% des bactéries peut être, en effet, facilement cultivé in vitro. Les méthodes moléculaires ont notamment permis d’identifier des bactéries qui n’étaient pas détectables via les méthodes phénotypiques. Malgré cela, le nombre d’espèces procaryotes découvertes, de 143 000 espèces le 16 Février 2015, est bien plus faible que celui prédit de 10 millions ! Il y aurait donc une très grande proportion d’espèces bactériennes encore à découvrir.
94
Figure 15 : Avancées marquantes des méthodes de taxonomie bactérienne dans le monde depuis le 19ème siècle (Source : « A comprehensive repertoire of prokaryotic species identified in human beings » de Hugon et al., 201544) 1.5.2. Prélèvement du microbiote intestinal et conservation avant analyse
Le microbiote varie en fonction de la portion du tractus intestinal choisi (cf. Figure 10). Dans la grande majorité, les études conduites chez l’Homme sont réalisées à partir d’’échantillons de fèces. Ces prélèvements sont effectivement simples et peu coûteux, réalisables sur de très grandes cohortes. Mais ces échantillons ne reflètent, d’une part, uniquement le microbiote luminal de la portion terminale du tractus digestif. Ce type de prélèvement ne permet donc pas de distinguer le microbiote muqueux et luminal, qui sont pourtant bien différents. D’autre part, les prélèvements fécaux ne permettent pas d’accéder aux informations concernant le microbiote des parties supérieures de l’intestin.
Le prélèvement permettant d’accéder aux données sur le microbiote de l’intestin grêle et de distinguer microbiote muqueux et luminal est la biopsie intestinale. Pour des raisons éthiques, ces prélèvements sont réalisables chez les modèles animaux uniquement, ce qui justifie en partie l’intérêt de leur utilisation pour l’étude du microbiote. C’est pour cette raison que l’on dispose actuellement de peu d’informations à propos du microbiote de l’intestin grêle.
Pour l’obtention de données non biaisées, le choix préalable et optimal de la méthode d’échantillonnage est indispensable. Dans l’étude des cohortes humaines, cela peut être un biais majeur pour l’interprétation des résultats. En effet, les prélèvements fécaux sont :
95 - Soit prélevé frais et envoyé à température ambiante au laboratoire pour analyses - Soit prélevé frais à la maison et congelé dans le congélateur personnel du sujet avant dépôt au laboratoire - Soit congelé directement au laboratoire avec utilisation de cryoprotecteurs (revue sur les cryoprotecteurs, « Cryoprotectants: the essential antifreezes to protect life in the frozen state », Fuller, 2004111)
Les prélèvements de microbiote fécal contiennent des cellules, notamment bactériennes. En cas de comptage de ces cellules, pour déterminer l’abondance totale en bactéries par cytométrie, la congélation biaise potentiellement ce comptage, puisqu’elle altère l’intégrité des cellules. Des chercheurs ont comparé le comptage cellulaire par cytométrie de flux d’échantillons congelés et d’échantillons frais. Il s’avère que les deux résultats obtenus sont fortement corrélés (Test de Pearson, n=39, r = 0.91, P = 4.9 × 10-16) (Article complet « Quantitative microbiome profiling links gut community variation to microbial load », Vandeputte et al., 201751). Donc ce biais ne pose pas de problème en cas de comparaison de l’abondance relative d’échantillons congelés entre eux. Mais les prélèvements fécaux congelés ne sont potentiellement pas adaptés à une évaluation exacte de la charge microbienne d’un échantillon.
De nouvelles technologies visant à prélever le microbiote in situ de manière non invasive sont en cours de développement. Nous pouvons citer notamment l’équipe de chercheurs Nejad et al., qui ont développé en 2019112 une pilule osmotique, capable de prélever à différents niveaux du tube digestif le microbiote intestinal. Cette biotechnologie a été validée sur modèle porcin et PNH. Ce type de méthodes de prélèvements ouvre de nouveaux horizons pour l’étude de la biogéographie du microbiote intestinal.
La méthode de transport et de conservation des prélèvements, qu’ils soient fécaux ou non, reste une vraie problématique puisqu’elle représente une source potentielle de biais (délai de transport, température de conservation, délai de congélation, température de congélation etc.) (informations issues de l’article « The role of the intestinal microbiota in type 1 diabetes mellitus », Knip et Siljander, 2016 106). L’échantillonnage doit être adapté aux analyses et objectifs d’étude, pour éviter toute conclusion erronée.
Chez l’Homme, seul le prélèvement fécal est réalisable. Chez les modèles animaux, des biopsies intestinales post-mortem et autres prélèvements luminaux peuvent être pratiqués à tous les niveaux du tube digestif. De nouvelles technologies, comme les pilules de prélèvements du microbiote in situ, sont très intéressantes d’un point de vue scientifique et éthique, puisqu’elles semblent permettre de prélever des échantillons de flore en temps réel, de manière suivie, à différents niveaux de l’intestin tout au long d’une étude préclinique.
96 1.5.3. Techniques actuelles d’évaluation de la composition du microbiote intestinal
Les auteurs Costa et Weese, dans leur revue « Methods and basic concepts for microbiota assessment » de 20196, ont fait un bilan des techniques actuellement disponibles pour analyser la composition du microbiote. Ce paragraphe résume leurs recherches sur les principales méthodes d’analyses du microbiote intestinal.
1.5.3.a Culture des microorganismes
La culture bactérienne est la méthode historique d’étude des microorganismes du microbiote. Elle est d’ailleurs à l’origine de la majorité des connaissances actuelles sur le microbiote. C’est la première technique qui a permis d’identifier les populations bactériennes intestinales. La culturomique, quant à elle, est une technique récente de culture massive de bactéries en utilisant différents milieux de cultures et conditions (aérobie, anaérobie etc.), parfois en essayant de mimer les conditions d’origine intestinale des bactéries.
Tableau XXVI : Avantages et inconvénients des méthodes de cultures pour l’identification et la quantification des microorganismes du microbiote intestinal.
Méthode Avantage(s) Inconvénient(s) Référence(s)
La plupart des espèces
bactériennes du microbiote intestinale sont anaérobies et ne poussent pas dans On évalue à ce jour des conditions Eckburg et al., l’antibiorésistance et la conventionnelles de 2005113 détection d’organisme présents laboratoire à faible abondance (milieu Costa et Weese, Sous-estimation de la 6 sélectif de croissance) 2019 richesse du microbiote
Culture difficile voire standards de laboratoire de standards impossible pour les Culture classique en conditions classique conditions en Culture archées, virus, fungi
Culture difficile voire A priori capables de détecter la Lau et al., impossible pour les 114 majorité des bactéries 2015 archées, virus, fungi intestinales Lagier et al., Reste un outil pour la 115 Récentes avancées significatives 2015 recherche avec une dans la découverte de nouvelles Costa et Weese,
Culturomique disponibilité limitée pour la espèces 6 clinique 2019
Aujourd’hui, la méthode de la culturomique associée aux approches technologiques MADI-TOF- MS est prometteuse. Elle permet en effet une identification des bactéries précise rapide et peu coûteuse. Cette méthode permet et permettra d’étendre nos connaissances sur les microorganismes et leurs conditions de vie au sein du microbiote intestinal44. Une étude de Lagier et al. (2016) a montré qu’après comparaison avec de la métagénomique, la culturomique associée à l’identification des bactéries par MALDI-TOF-MS ou séquençage via ARNr 16s a permis d’assigner des séquences jusque-là non associées à une espèce. (Hugon et al., 201544, Lagier et al., 2016116)
97
1.5.3.b Méthodes moléculaires
Il existe de nombreuses méthodes moléculaires d’identification bactériennes. Le Tableau XXVII présente les avantages et les inconvénients des principales techniques moléculaires utilisées.
Tableau XXVII : Avantages et inconvénients des méthodes moléculaires pour l’étude des microorganismes du microbiote intestinal.
Référence Méthode Avantage(s) Inconvénient(s) (s)
Manque de classification taxonomique : on met en
évidence les différences entre les communautés sans les lier
Terminal Terminal à des différences de taxons
RFLP)
et - Coût faible et résultats Sous-estimation de la richesse Costa et obtenus facilement pour des échantillons Weese, orienter le choix d’analyses Devenu obsolète pour l’étude 20196 plus approfondies du microbiote intestinal car ces méthodes ne représentent aucun avantage
Polymorphism (T Polymorphism supplémentaire par rapport au Restriction Fragment Length Fragment Restriction
température (TGGE) température séquençage de nouvelle Électrophorèse sur gel en gradient en gel sur gradient Électrophorèse
dénaturant (DGGE) et en gradient de de et (DGGE) gradient en dénaturant génération
Bonne sensibilité pour la détection d’organismes
(FISH) présents en faible quantité
Peut permettre la situ quantification des bactéries in in Les oligonucléotides utilisés Wagner et 117 Peut être utilisé directement sont spécifiques d’espèces ou al., 2003 sur des échantillons de tissus de groupes de bactéries. Il n’y Costa et pour spécifier la localisation a donc pas de détection Weese, des microorganismes d’espèces inconnues 20196 (exemple : muqueuse intestinale) Utilité clinique (association avec une pathologie par
Hybridation fluorescente Hybridation exemple)
98 Nombre limité d’oligonucléotides pour une séquence individuelle ciblée Costa et
Les brins hydrolysés peuvent réseaux
- qui sous-estime les Weese, être visualisés et quantifiés microorganismes les plus 20196 abondants et la richesse du Micro microbiote étudié
Quantification des fragments Besoin d’un jeu d’amorces
d’ADN amplifiés spécifiques et différents pour
Utilisation d’amorces cibler chaque espèce universelles qui amplifie bactérienne l’ADN bactérien de manière Méthode qui peut être très Costa et générale pour quantifier longue et fastidieuse pour Weese, l’ensemble des bactéries étudier la diversité du 20196 présentes dans l’échantillon microbiote intestinal
ou PCR réel ou temps Outil spécifique pour Méthode non adaptée pour Réaction en chaîne par par chaîne en Réaction répondre à une question explorer la richesse d’un
précise échantillon polymérase quantitative polymérase (qPCR)
D’un point de vue général, ces techniques servent pour étudier des points spécifiques sur le microbiote intestinal (question clinique, à propos d’une espèce bactérienne définie etc.). Mais ces méthodes ne sont pas adaptées pour étudier la richesse et la diversité bactérienne d’un échantillon.
1.5.3.c Séquençage de l’ADN
La méthode de séquençage de Sanger ou didésoxy est la première méthode de séquençage de l’ADN qui a été mise au point. Après vectorisation du matériel génétique de l’échantillon, celui-ci est extrait et séquencé selon la méthode standard de terminaison de chaîne didésoxy ou de Sanger. Cette méthode a vite été abandonnée et remplacée par le séquençage haut débit à cause de sa durée et de ses biais (sous-estimation de la richesse des échantillons, …).
Le séquençage de génome entier consiste en une fragmentation, une amplification par PCR grâce à des promoteurs (par exemple ARNr 16s), puis un réassemblage des données obtenues pour identification des espèces.
Enfin, le séquençage métagénomique ou séquençage « shotgun » est un séquençage aléatoire d’un fragment d’ADN présent dans un échantillon issu d’un environnement. Il permet un séquençage direct de l’échantillon en sautant l’étape d’amplification PCR.
99 Tableau XXVIII : Avantages et inconvénients des méthodes moléculaires pour l’étude des microorganismes du microbiote intestinal. (Source : tableau construit à partir des informations tirées de la revue de Costa et Weese, 20196)
Méthode Avantage(s) Inconvénient(s)
») Non infaillible, beaucoup d’études,
Peut-être utilisé sur génome entier, abondance de données métagénome, et séquençage Manque de quantification absolue et d’amplicons introduction de biais aux différentes Utilisé aujourd’hui couramment pour étapes de la méthode (Extraction de l’évaluation du microbiote l’ADN, promoteurs choisis, amplification par PCR, paramètres Ne donne qu’une abondance relative bioinformatiques etc.) (comparaison des proportions de Surestimation ou sous-estimation de Generation Sequencing Generation chaque bactérie les unes par rapport
aux autres) : perte de l’information certaines espèces bactériennes
New d’abondance lors de l’amplification Limite majeure : la taille des par PCR fragments d’ADN introduit une Utilisation de la qPCR (PCR difficulté pour classer les organismes quantitative) pour quantifier les à des niveaux bas taxonomiques bactéries Difficultés de détection des bactéries
de l’anglais « l’anglais de Séquençage de Nouvelle Génération ou NGS NGS ou Nouvelle de Génération Séquençage ( présentes en faible quantité
Réduction des biais dus à la PCR Données peuvent être utilisées pour des analyses fonctionnelles (regroupement des séquences selon leur fonction métabolique ou cellulaire) Plus coûteux car rendement plus
Informations taxonomiques peuvent
» faible que le NGS et difficultés bio- être obtenues informatiques plus importantes Bonne méthode pour mesurer la Absence d’informations
énomique ou séquençage séquençage ou énomique capacité génétique d’une
shotgun taxonomiques précises dans des
« communauté échantillons dont la richesse est Séquençage d’ARN (méta- importante transcriptomique) et analyse des protéines (méta-protéomique) peuvent être mis en place pour connaître ensuite l’expression de ces Séquençage métag Séquençage gènes mais très coûteux et manque de qualité des données obtenues
Attention, il faut garder à l’esprit que la détection de l’ADN d’un microorganisme de signifie pas sa réelle présence dans le microbiote (transitoire, bactérie morte, etc.). Toutes ces techniques sont très performantes et informatives mais que les délais sont extrêmement longs à cause de la difficulté d’analyse bio-informatique de la masse de données générées.
100 1.5.3.d Analyse métabolique
C’est une évaluation des produits bactériens (métabolomique). Elle inclut différentes méthodes permettant de séparer et identifier les métabolites. La spectrométrie de masse ou spectroscopie par résonnance magnétique nucléaire sont les plus adaptées pour la quantification et l’identification (Costa et Weese, 20196). Elles informent sur les fonctions potentielles des microorganismes présentes dans le prélèvement.
De manière générale, il faut retenir que ces méthodes, bien qu’extrêmement performantes, présentent plusieurs défauts. D’une part, la plupart introduit des biais, importants, dont il faut avoir conscience pour l’interprétation des résultats. D’autre part, ces méthodes sont longues, car elles génèrent une masse énorme de données, qu’il faut ensuite analyser par des outils informatiques. Les délais d’obtention des résultats peuvent être de l’ordre de plusieurs mois voire années.
101 1.5.4. Concepts de l’analyse du microbiote
1.5.4.a Définitions des concepts de l’analyse de la structure du microbiote
Pour comprendre les articles étudiants le microbiote, quelques concepts utiles sont définis ci- dessous.
Tableau XXIX : Principaux concepts pour l’analyse du microbiote intestinal. (Source : tableau construit à partir des informations tirées de la revue de Costa et Weese, 20196)
Concept Définition
Diversité Il s’agit d’index issus de calculs mathématiques qui prennent en compte le nombre de taxons différents représentés mais aussi leur uniformité. C’est la vraisemblance qu’un même taxon soit identifié dans deux échantillons distincts.
Diversité alpha Terme écologique qui se réfère aux propriétés d’un unique échantillon et qui peut être évalué selon de multiples approches
Diversité béta Concept utilisé pour la comparaison entre les communautés microbiennes et prend en compte la taxonomie (espèce présente ou absente)
Richesse Nombre de taxons différents présents dans une communauté microbienne.
Uniformité Distribution de chaque taxon au sein d’une communauté microbienne
OTU ou Unité Niveau taxonomique auquel les analyses sont menées et définies par les Opérationnelle chercheurs Taxonomique Le niveau standard pour l’analyse d’amplicon 16s regroupe les (de l’anglais séquences obtenues selon un certain pourcentage seuil de similarité « Operational (généralement 97%) en OTUs. Pour chaque OTU, une seule séquence Taxonomic Unit ») est choisie comme représentante puis est annotée. Cette annotation est appliquée ensuite à toutes les autres séquences de cette OTU.
Distance De l’anglais « Unique Fraction Metric ». C’est une mesure de la distance UNIFRAC phylogénétique entre des jeu de taxons
102 1.5.4.b Représentation visuelle des similarités et divergences entre communautés microbiennes
Tableau XXX: Principales représentations graphiques des analyses de composition, de diversité et de quantification du microbiote (Source : tableau construit à partir des informations tirées de la revue de Costa et Weese, 20196)
Type Description
Représentation des abondances relatives respectives de deux communautés
microbiennes à comparer. Les analyses statistiques permettent d’identifier les différences qui sont significatives et celles qui ne le sont pas et le visualiser sur le graphique Difficile à utiliser à des niveaux taxonomiques faibles Exemple en Annexe 7
On peut aussi illustrer les abondances relatives par des « cartes thermiques » qui utilise une échelle de couleur pour comparer chaque groupe Difficile d’interprétation quand le nombre de taxons est élevé
Exemple en Annexe 8 Graphique des abondances des Graphique relatives
Elles sont obtenues en traçant le nombre de séquences lues (axe des abscisses) en fonction du nombre d’OTUs identifiés dans une communauté (axe des ordonnées)
Elles représentent une mesure de la diversité de l’échantillon puisque l’allure raréfaction Courbes de de Courbes de la courbe sera différente en fonction de la diversité
Représentations de la similarité entre des communautés La représentation PCoA résulte de la construction d’une matrice des
distances basée sur une table qui compte le nombre de fois où on détecte
gradation gradation
t une espèce dans une communauté microbienne.
e
NMDS NMDS Elle peut être représentée en 2 voire 3 dimensions après analyse PCoA ou
NMDS.
PCoA
non métrique ou ou métrique non
multidimensionelle multidimensionelle Analyse coodonnée Analysecoodonnée
ou ou Exemple en Annexe 7
Il s’agit d’une représentation en arbre qui regroupe les échantillons sur la même branche dont la communauté est similaire. Elle est fréquemment utilisée pour représenter l’affiliation des communautés ou leur structure.
Exemple en Figure 8 Dendrogramme
103 Synthèse : principales étapes d’une étude sur le microbiote intestinal
Le poster « Microbiome analysis – a review of current recommendations and utilization of a proven crowdsourcing solution to benchmark methods. » de Battey et al.118 résume les études sur le microbiote en trois grandes étapes (illustré en Annexe 9) :
1- Formulation de la question scientifique (implications du microbiote dans une pathologie, effet d’un composant nutritionnel, etc.) puis conception du design expérimental et création de la cohorte (en cas d’études sur fèces humain), échantillonnage et conservation des échantillons. 2- Analyse des échantillons en choisissant la technique adaptée à la question scientifique du départ. 3- Analyse des données obtenues et interprétation en utilisant les concepts précédemment décrits. Enfin, représentation visuelle des résultats.
Dans le cas d’une étude préclinique, ie. sur modèle animal, le choix de l’espèce utilisé et du modèle pathologique doit être réfléchi et largement documenté, pour la justification éthique de l’utilisation de cet animal et pour une conception optimale du design expérimental. Dans le cadre de l’étude du microbiote intestinal et des maladies métaboliques associées, nous nous intéresserons, dans la seconde partie, aux modèles souris et Primate Non Humain, pour essayer d’identifier leurs intérêts et leurs limites respectives.
104 COMPARAISON DES MODELES D’ETUDES DU MICROBIOTE INTESTINAL : PNH, SOURIS, HUMAIN
L’étude du microbiote intestinale est complexe, et encore plus dans le cadre métabolique. Les prélèvements fécaux humains sont informatifs, mais les données scientifiques obtenues restent limitées et imprécises. L’étude du microbiote intestinal humain, par le biais d’une autre espèce, élevée spécifiquement pour la recherche, a plusieurs intérêts. Cela permet de pouvoir faire des prélèvements non réalisables chez l’Homme, de maitriser certains facteurs environnementaux, de connaître parfaitement l’historique de chaque individu, etc. Dans cet objectif, nous allons évaluer et comparer l’intérêt de deux modèles animaux : d’une part, le modèle animal le plus couramment utilisé, ie. la souris (Mus musculus), et d’autre part, le modèle primate non humain et particulièrement le macaque (Macaca spp.), le genre de PNH le plus utilisé en recherche biomédicale. Dans un premier temps, nous allons définir ce qu’est un modèle animal, d’un système ou d’une pathologie à étudier. Puis, nous comparerons selon des critères choisis et pertinents ces trois modèles d’étude du microbiote et des maladies métaboliques associées. L’objectif final est d’identifier les principales caractéristiques du modèle souris et du modèle PNH, ainsi que leurs apports scientifiques respectifs pour étudier le microbiote intestinal et les maladies métaboliques.
2.1. INTERETS DES MODELES ANIMAUX DANS L’ETUDE DU MICROBIOTE INTESTINAL
L’étude du microbiote est un travail complexe et fastidieux. De manière simple, les communautés microbiennes intestinales sont étudiées chez l’Homme par prélèvement fécal. Ces études représentent un réel intérêt pour la comparaison de microbiote intestinal entre différentes populations, car les cohortes peuvent être très vastes. La durée de ces études est uniquement fonction du temps de traitement des prélèvements, mais surtout du délai des analyses bio- informatiques. L’étude du microbiote intestinal chez l’humain présente malgré cela plusieurs limites :
• Même si l’alimentation peut être plus ou moins maitrisée, un certain nombre de paramètres peuvent faire varier le microbiote intestinal et sont à prendre en compte. Chez l’Homme, ces paramètres externes ne sont pas maitrisables (cf. paragraphe 1.3.2. Facteurs de variations et conséquences sur la composition). • Les prélèvements ne peuvent être uniquement fécaux et donc les informations sur la biogéographie du microbiote restent très limitées. • Pour l’étude du microbiote intestinal dans le cadre de pathologies, les paramètres de la mise en place ou de l’aggravation de la maladie ne sont pas maitrisés. Les facteurs environnementaux et alimentaires sont difficilement contrôlables. Enfin, l’étude de nouveaux traitements de ces maladies ne peut se faire que sur des modèles animaux avant la phase clinique de développement d’un potentiel nouveau candidat médicament.
105 • Aujourd’hui, les probiotiques ne sont pas considérés comme des médicaments, et n’ont donc pas besoin d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM). Ils sont donc actuellement directement testés chez l’Homme, sans phase d’études précliniques chez l’animal. Il est possible que leur statut change et que de vrais dossiers d’AMM soient nécessaires pour leur commercialisation, auquel cas l’utilisation de l’animal sera donc indispensable pour les études de toxicités, par exemple, de ces produits.
Qu’est-ce un modèle animal ?
Un modèle animal est défini comme un animal, non humain, choisi pour ses caractéristiques spécifiques pour une utilisation en recherche expérimentale, pour l’enseignement ou des tests (définition du MeSH traduite de l’anglais24). La recherche translationnelle est fondée sur le concept que les autres espèces animales partagent des caractéristiques physiologiques, comportementales, ou autres avec l’espèce humaine. La valeur translationnelle d’un modèle animal est sa ressemblance avec ce que l’on étudie chez l’Homme et la fiabilité des résultats d’étude préclinique faite sur ce modèle animal pour pouvoir passer à des essais humains.
Généralement, un modèle mime les symptômes d’une maladie humaine (et/ou sa mise en place et/ou son aggravation) ou bien simplement un organe humain pour mieux comprendre ses mécanismes fonctionnels ou tester de nouveaux traitements. Depuis plus de 2400 ans, il a été reconnu qu’en étudiant les animaux on pouvait apprendre de nombreuses choses sur l’organisme humain (informations issues de l’article « A Brief History of Animal Modeling », Ericsson et al., 201331). Les modèles animaux communément utilisés sont des modèles immunodéficients, induits chimiquement, chirurgicalement, ou modifiés génétiquement. Le modèle de loin le plus utilisé est la souris génétiquement modifiée (OGM). L’évaluation histologique est souvent un point limite de la valeur translationnelle d’un modèle animal. Elle nécessite donc d’être réalisée par des pathologistes avertis et formés car leur expertise a un impact important sur la validation du modèle d’une pathologie humaine. Il est important de bien comprendre le but ultime d’un modèle animal étudié ou proposé pour une évaluation et une interprétation adéquate (informations tirées de l’article « Pathology Principles and Practices for Analysis of Animal Models », Knoblaugh et al., 2019119). Ce qui compte surtout est la qualité translationnelle du modèle pour la pathologie ou le système étudié.
L’utilisation de modèle animaux dans le cadre de la recherche fondamentale et préclinique solutionne les limites de l’étude du microbiote intestinal chez l’Homme. En effet, le cadre du laboratoire permet un contrôle certain des paramètres environnementaux, de l’alimentation, du microbiote environnemental, par exemple pour des souris hébergées en isolateur. L’historique de mise en place du microbiote et des évènements influençant sa composition sont connus. L’élevage de ces animaux pour la recherche permet l’utilisation d’animaux naïfs, qui n’ont subi aucun traitement, antibiotique notamment.
Le cadre du laboratoire permet aussi l’utilisation d’animaux hétéroxéniques, c’est-à-dire « d’animaux axéniques associés à une flore bactérienne étrangère à son espèce et qui est maintenu en isolateur » (définition du site Termsciences15). « La flore associée à un animal axénique peut être connue ou inconnue », c’est notamment des modèles souris axéniques colonisées par la flore microbiotique intestinale humaine. Ce concept offre un contexte écologique pertinent pour étudier l’influence de médicaments ou d’aliments sur le microbiote C’est un outil inestimable pour
106 comprendre les liens entre microbiote intestinal d’une part, et pathologie ou dysbiose d’autre part. Comme tout modèle, il présente ces avantages mais aussi un certain nombre de limites. Les souris hétéroxéniques, colonisées à l’aide d’un microbiote intestinal humain, ne présentent pas une composition identique à celle du microbiote implanté. En effet, comme le montre le Tableau XXXI, les bactéries colonisent plus ou bien les intestins du modèle dans lequel elles sont transplantées. De plus, les souris axéniques ou GF (de l’anglais « Germ free ») présentent de nombreuses anomalies du système immunitaire notamment du système immunitaire digestif. Cela a permis de comprendre les nombreuses implications du microbiote intestinal dans la mise en place et la maturation du système immunitaire digestif. Mais pour l’étude du microbiote intestinal dans d’autres contextes, notamment pour étudier les relations métaboliques entre l’hôte et son microbiote, c’est une vraie limite.
L’utilisation d’autres modèles, comme le chien qui aurait un microbiote intestinal plus proche de l’Homme que celui de la souris de laboratoire et du porc, est envisageable. Le choix d’un modèle est dans tous les cas un compromis entre son aspect pratique, ses contraintes éthiques, son coût, son accessibilité, et bien sûr sa valeur translationnelle attendue. Des méthodes alternatives dans certains cas sont mêmes envisageables. Par exemple, dans le cas d’études des interactions métaboliques au sein du microbiote en faisant abstraction des relations hôte-microbiote, un simulateur intestinal in vitro pourrait être une alternative valide (article complet de Lundberg, 2018120).
Tableau XXXI : Exemples de bactéries du microbiote intestinal humain transplantées chez des modèles animaux axéniques. (Source : « Humanizing the gut microbiota of mice: Opportunities and challenges », de Lundberg, 2018120)
107 L’article « The use of non-rodent model species in microbiota studies » de Ericsson (2019)121 fait un bilan des avantages et des inconvénients d’autres modèles animaux pour l’étude du microbiote que les modèles rongeurs, précédemment évoqués. En effet, pour d’autres domaines de recherche ou questions expérimentales que des études concentrées uniquement sur le microbiote, le modèle rongeur n’est plus suffisant. Cette revue ne discute que de quatre modèles, le porc, le lapin, les invertébrés et les poissons zèbres dont les principaux intérêts et limites pour l’étude du microbiote intestinal sont présentés dans le Tableau XXXII.
Tableau XXXII : Résumé des différents avantages et limites de quelques modèles animaux pour l’étude du microbiote intestinal (Source : « The use of non-rodent model species in microbiota studies » de Ericsson, 2019121)
Modèle animal Avantages/utilisations Limites - Tractus gastro-intestinal simplifié - Haute capacité de rendement - Composition du microbiote et grande taille d’échantillons intestinal simplifiée : phyla Invertébrés - Génétique malléable dominants différents chez - Peu coûteux l’Homme - Etudes de symbiose et - Incapacité de modéliser vieillissement différentes maladies
- Haute capacité de rendement
et grande taille d’échantillons - Environnement aquatique
- Génétique malléable - Anatomie du tractus digestif - Peu coûteux simplifiée - Phyla dominants du microbiote Poissons zèbres - Similarité avec les systèmes nerveux et endocrines intestinal différents de chez humains l’Homme - Incapacité de modéliser beaucoup - Etudes du développement, gnotobiotiques, de l’axe de pathologies humaines cerveau-intestin. - Population non consanguine - Coûteux à entretenir et à héberger avec un environnement - Etudes sur de grandes cohortes similaire à l’humain non réalisables Chiens - Composition du microbiote - Génétique difficilement intestinal similaire à celle de manipulable l’humain. - Opinion publique généralement - Anatomie du tractus digestif défavorable similaire à l’humain - Population non consanguine avec un environnement similaire à l’humain - Coûteux à entretenir et à héberger - Composition du microbiote - Etudes sur de grandes cohortes Porcs intestinal similaire à celle de non réalisables l’humain. - Anatomie du tractus digestif similaire à l’humain - Génétique manipulable
108 Au cours de mes recherches bibliographiques, aucun article décrivant les intérêts et limites du modèle PNH pour l’étude du microbiote n’est ressorti. Malgré sa grande proximité phylogénétique avec l’Homme, le PNH ne semble actuellement pas être beaucoup utilisé pour l’étude du microbiote intestinal, contrairement à la souris. Les données sur la qualité scientifique de ce modèle potentiel pour l’étude du microbiote sont quasi inexistantes. Dans la suite de cette partie, nous allons comparer le modèle souris et le modèle PNH à l’Homme. Nous nous intéresserons aux différents aspects qui permettent d’évaluer la valeur translationnelle de ces 2 espèces dans le cadre de l’étude du microbiote et des pathologies métaboliques humaines. Nous essaierons alors d’évaluer pour chacun leurs apports et intérêts, mais aussi leurs limites et biais scientifiques potentiels.
2.2. SYSTEME DIGESTIF ET REGIME ALIMENTAIRE : COMPARAISON DE L’HOMME, DU MACAQUE ET DE LA SOURIS 2.1.1. Régime alimentaire de la souris et du macaque
2.1.5.a Comparaison des régimes alimentaires de l’Homme, de la souris et du macaque
A l’état sauvage, la souris domestique (Mus musculus) est un animal omnivore. Elle mange une grande part de végétaux (graines, feuilles, fruits, racines, tiges, tubercules, bois, etc.). Elle se nourrit aussi d’insectes et de charognes. Dans les habitations, elle peut consommer toute nourriture accessible et potentiellement les matériaux de construction (Site web « Animal Diversity Web », de l’Université du Michigan, Museum of zoology, Mus Musculus, Ballenger122).
Habituellement, les souris de laboratoire sont nourries avec un aliment standardisé complet sous forme de granulés. Les fournisseurs ne donnent en général pas la composition exacte de ces aliments, et leur teneur en différents nutriments varie d’un lot à un autre, dépendant souvent des fluctuations du marché agronomique. Les matières premières sont majoritairement des produits végétaux. Et par conséquent, ce régime alimentaire strict et uniforme diffère de manière considérable du régime alimentaire quotidien varié de l’Homme. Les expérimentateurs essaient dans la plupart des cas de nourrir les animaux utilisés avec le même aliment du même fournisseur tout au long d’une étude. Comme vu précédemment, l’alimentation influence fortement la composition du microbiote intestinal. L’aliment industriel pour souris de laboratoire contient des composants qui impactent significativement la composition du microbiote, comme le coumestrol, un phyto-œstrogène. L’ingestion totale d’équivalents en œstrogène par la souris est significativement plus élevée que celle de l’Homme. Cela peut induire un biais dans l’analyse de composition du microbiote intestinal puisqu’il a été démontré que les œstrogènes provoquent des changements de composition microbienne à la fois chez l’Homme et la souris(Degen et al., 2002123).
Un comportement alimentaire de la souris, que ne présentent naturellement ni le macaque ni l’Homme, est la coprophagie. La coprophagie est le fait de consommer des excréments, ici ses propres fèces (fèces d’origine cæcale principalement), pour absorber les nutriments et minéraux restants. On ne parle pas de cæcotrophie pour la souris, car elle n’a pas vraiment deux types de fèces, cæcale et intestinale. L’hébergement en groupe des souris est donc un facteur d’influence de la composition du microbiote intestinal d’autant plus important, puisqu’elles peuvent potentiellement manger les fèces de leurs congénères5. La coprophagie peut être observée chez le PNH en captivité, mais elle toujours révélatrice d’un trouble comportemental ou d’un défaut de santé (Cheyssac, 2015124).
109
Le macaque, à l’état sauvage, est lui aussi omnivore. Il mange une grande diversité d’aliments, en fonction de son habitat et de la région dans laquelle il vit. Par exemple, le macaque cynomolgus (Macaca fascicularis) mange des fruits, des crabes, des fleurs, des insectes, des feuilles des champignons, des herbes, mais aussi de l’argile (source de potassium). De manière générale, les macaques sont omnivores à tendance frugivore (Site internet « Animal Diversity Web », de l’Université du Michigan, Museum of zoology, Macaca fascicularis, Bonadio125).
En captivité, et plus particulièrement dans les laboratoires de recherche biomédicale, les animaux sont nourris à base d’un aliment complet sous forme de bouchons extrudés. Ces aliments, de la même façon que pour la souris, sont fabriqués par des sociétés spécialisées, qui ne communiquent que rarement la composition de leurs aliments. Mais contrairement à la souris, l’alimentation du macaque est complétée par une distribution quotidienne de fruits ou de légumes frais. Les soigneurs animaliers peuvent aussi distribuer plusieurs fois par jour des friandises de toutes sortes (fruits secs, féculents, pois, noix, etc.). Ce complément et cette diversification de l’alimentation est nécessaire chez le PNH, et participe fortement à l’enrichissement de son environnement en captivité. Bien que le régime du primate en laboratoire soit plus diversifié que celui de la souris, il reste uniforme dans un groupe donné et masque de potentielles variations inter-individuelles. Ce régime alimentaire reste tout de même extrêmement différent de celui d’un Homme en région occidentalisé, qui contient plus de protéines animales, plus de graisse et moins de fibres diététiques.
La souris, le macaque et l’Homme sont trois mammifères omnivores. Le régime alimentaire murin est basé principalement sur la consommation de végétaux et celui du macaque sur celle des fruits. A l’état sauvage, ces deux espèces ont certes un régime omnivore, mais il reste largement différent de celui de l’Homme.
Hébergés en laboratoire, leur régime alimentaire s’éloigne un peu plus de celui de l’humain. En effet, ils y reçoivent un aliment complet sous forme de bouchons extrudés, de composition identique ad libitum ou divisé en repas. Cela gomme les variations inter-individuelles, pourtant présentes au sein des populations humaines. Mais cela permet surtout d’avoir des conditions standardisées et répétables d’étude. Ces régimes alimentaires peuvent d’ailleurs être adaptés et modifiés pour ressemble à ce que l’on observe chez l’humain.
2.1.5.b Maitrise du régime alimentaire chez l’animal de laboratoire et imitation des régimes alimentaires humains
Le modèle souris a l’avantage, comme les autres animaux utilisés en expérimentation animale, de permettre aux chercheurs d’avoir un contrôle sur n’importe quel facteur perturbateur du microbiote intestinal, en minimisant son exposition ou bien en évaluant les niveaux exacts d’exposition. Ce qu’il faut retenir, c’est que le modèle murin offre un contrôle possible total sur les apports nutritifs et potentiellement ceux qui perturbent le microbiote intestinal, que l’on peut donc étudier de manière individuelle et isolée. Cela permet une configuration expérimentale limpide permettant de défaire les associations entre la composition du microbiote intestinal, ses fonctions et les perturbations étudiées, comme une pathologie. Malgré tout, il ne faut pas oublier que ce régime uniforme peut biaiser les analyses car il gomme les variations inter-individuelles naturelles du microbiote intestinal (informations issues de la revue « How informative is the mouse for human gut microbiota research? », Nguyen et al., 20155).
110 Comme nous l’avons vu en partie 1, d’une part, l’alimentation a une grande influence sur la composition du microbiote intestinal et sur l’équilibre entre lui et son hôte. D’autre part, l’alimentation représente un réel facteur de risque dans les maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète. Ci-dessous, nous allons caractériser les grands types de régimes humains, qui sont transposés chez l’animal pour évaluer leur influence dans la physiopathologie des maladies métaboliques ainsi que leurs effets sur le microbiote intestinal de l’hôte. Le Tableau XXXIII ci- dessous présente trois régimes alimentaires rencontrés dans les pays favorisés : le régime occidental, facteur de risque pour les maladies métaboliques, le régime méditerranéen, considéré comme un régime sain, associé à une bonne santé du microbiote intestinal et de son hôte, et enfin les régimes strictement végétariens, de plus en plus pratiqués dans les pays industrialisés.
Tableau XXXIII : Définitions des principaux régimes alimentaires humains étudiés dans le cadre des maladies métaboliques et de leur influence sur le microbiote intestinal ( Source : Influence of Gut Microbiome on Obesity in Western- Style Dietary Practices Versus Other Diets: A Systematic Review », Niemeyer et al., 2019126)
Régime Définition alimentaire
Les pratiques alimentaires de la culture occidentale incluent des aliments riches en graisses, riches en calories et riches en fructose (et généralement riches en protéines et graisses animales, et en carbohydrates simples). Les sociétés industrialisées fonctionnent souvent dans un système de surconsommation, Régime dans lequel on trouve un grand nombre de chaines de restauration rapide, des grandes surfaces distribuant des plats préparés, emballés et contenant des occidentalisé ou conservateurs. Ce type d’alimentation affecte le microbiote intestinal et a un « Western diet » impact négatif évident sur la santé. Riche en graisses, il conduit à une inflammation basale permanente du tractus digestif, à une dysbiose intestinale, une diminution de la diversité du microbiote, un risque accru de développer une obésité et une dyslipémie. Le régime alimentaire occidentalisé est très souvent associé avec un mode de vie de plus en plus sédentarisé.
Il s’agit d’un régime constitué de fruits, légumes, carbohydrates complexes, d’huile d’olive, de poissons, et d’une quantité faible de viande rouge. Ce régime est associé avec une amélioration de la santé et un risque diminué pour certaines maladies (cancer ; maladie auto-immune, maladie liée à une inflammation importante comme la maladie de Crohn par exemple). Il permet Régime une production élevée de SCFAs grâce à l’ingestion d’une grande quantité méditerranéen d’aliments riches en fibres. Le microbiote intestinal des personnes consommant ce type de régime présente une diversité importante d’espèces. Il présente aussi plusieurs composés qui contribuent à des propriétés anti- inflammatoires. Ce régime permet aussi une réduction des niveaux de TMAO comme le régime végan ou végétarien, permettant potentiellement une barrière contre des conditions pro-inflammatoires.
Opposé au régime occidental, ces régimes sont basés sur la consommation de végétaux, de fruits, de légumes, de protéines végétales, ce qui conduit à Régime augmenter la diversité du microbiote intestinal humain et une production supérieure en SCFAs. Ce type de régime conduit à la production d’une grande végétarien et quantité de métabolites, protecteurs de la muqueuse et de la santé intestinale. végan Un régime végétarien augmente également la sensibilité à l’insuline et influence ainsi l’absorption du glucose dans les cellules et permet la stabilisation de la glycémie.
111 Les chercheurs tentent donc de reproduire des régimes alimentaires comparables chez les différents modèles animaux pour pouvoir ensuite transposer leurs résultats chez l’humain. Le chapitre 8 « Hypercaloric Diet-Induced Obesity and Obesity-Related Metabolic Disorders in Experimental Models » du livre « Reviews on Biomarker Studies of Metabolic and Metabolism-Related Disorders », de Pinheiro-Castro et al. (2019)127 résume les différents régimes utilisés au laboratoire pour imiter les régimes « réels » humains et notamment induire de potentielles maladies métaboliques chez ces modèles animaux (cf. Tableau XXXIV). L’Annexe 13 montre des exemples de régimes administrés chez le rat, leur temps d’ingestion et ce que les chercheurs ont pu observer par la suite (revue « Diet-induced obesity: rodent model for the study of obesity-related disorders », Rosini et al., 2012128).
Tableau XXXIV : Résumé des principaux régimes alimentaires utilisés pour induire des modèles animaux de pathologies métaboliques (Source : chapitre 8 du livre « Reviews on Biomarker Studies of Metabolic and Metabolism-Related Disorders », Pinheiro-Castro et al., 2019127)
Régime Définition
Le régime HFD est un terme large. Pour induire une obésité ou promouvoir une résistance à l’insuline, les chercheurs nourrissent les animaux de laboratoire avec 30 à 85 % de calories dérivées de lipides. Les types de graisse distribués (graisse saturée ou insaturée notamment) peuvent varier de l’huile Régime riche végétale (tournesol ou soja), à des graisses animales (lard ou suif de bœuf). En en graisse ou fonction du protocole choisi, les carbohydrates et les protéines sont HFD (de complètement remplacés par des composés lipidiques ou bien la graisse est l’anglais « High simplement ajoutée aux régimes complets classiques de laboratoire. Pour Fat Diet ») réussir l’induction du modèle, le régime doit être commencé chez un animal jeune, préférablement sur une longue période (minimum 2 semaines, différence de poids plus prononcée en 4 semaines chez les rongeurs). La captivité des animaux de laboratoire leur confère un mode de vie sédentaire Ils vivent plus longtemps et ont des besoins faibles en énergie.
Il s’agit d’un régime (type HFD) appétant et hautement calorique, fréquemment observé dans les sociétés occidentalisées, associé avec un taux élevé d’obésité. Ce régime inclut une ingestion élevée de céréales, de sucres, de produits laitiers, de graisses et de viandes. La procédure d’administration d’un régime CAFD à des animaux de laboratoire est une distribution classique Régime de ad libitum des granulés complets standards pour l’espèce concernée en ajoutant cafétéria ou un libre accès à des aliments de style « cafétéria » (biscuit, fromage, viande CAFD (de transformée, gâteau, chocolat, beurre de cacahuète, etc.). Ce régime provoque l’anglais une hyperphagie, à cause de l’appétence de ces aliments. Sa standardisation « Cafeteria est cependant problématique, car il inclut des « snacks », qu’il faut donc choisir Diet ») et qui varient en fonction des régions du monde. De plus, les préférences des animaux les poussent à choisir certains types d’aliments au détriment d’autres, ce qui induit une variation de régime et donc de phénotypes au sein d’une étude et entre les études utilisant le régime CAFD. Une grande variabilité de compositions aux niveaux des macro- et micro-nutriments (notamment au niveau des additifs) ingérés est, par conséquent, inévitable.
112 Le régime HFHSD combine à la fois l’apport de sucres et de lipides, et semble être plus efficace pour induire des altérations métaboliques et de l’obésité par comparaison aux régimes HFD. Pour induire ces troubles chez les animaux de laboratoire, une approche consiste à les nourrir avec un repas contenant du lard, des sucres simples, des polysaccharides et des protéines pour un total Régime riche calorique de 4,5 kcal/g d’aliments, accompagné avec du lait concentré sucré. en graisses et L’effet obésogène de ce régime est lié à la grande quantité d’acides gras saturés. riche en Ils sont moins disponibles en tant que source énergétique et sont donc sucres ou acétylés en triacylglycérols et stockés dans le tissu adipeux. Par ailleurs, les HFHSD (de sucres simples du lait concentré sucré provoque une élévation rapide du taux l’anglais « High d’insuline sanguin puis une diminution rapide de la glycémie. Il s’en suit une Fat and High cascade de signaux neurochimiques, provoquant une réponse comparable à Sugar Diet ») celle d’une addiction. Ce régime est décrit dans la littérature pour différentes espèces. Tout comme le régime CAFD, il est important de prendre en compte la composition au niveau des macronutriments, pour leurs rôles dans la régulation de l’insulinémie et du métabolisme qui semblent primer sur leur simple valeur calorique. Il faut donc choisir ces macronutriments en fonction de l’objectif d’étude et du trouble métabolique à induire voulu.
Le régime HSD a aussi été utilisé pour induire de l’obésité et des troubles métaboliques chez les animaux. Pour induire un syndrome métabolique, il y a deux modèles classiquement utilisés (chez le rat) : riche en sucrose ou bien Régime riche riche en fructose. Le régime riche en sucrose est parfois controversé par en sucres ou rapport à son efficacité pour induire l’obésité. Cependant, il est prouvé que le HSD (de régime HSD induit le développement de l’obésité et une résistance à l’insuline, l’anglais « High mais la réussite de cette manipulation dépendrait de l’administration du Sugar Diet ») sucrose. Il doit être donné séparément des repas standards, par exemple en étant mélangé à l’eau de boisson ou en supplément. Lorsqu’il est administré avec la nourriture, les animaux ont tendance à réduire leur prise alimentaire et à conserver le même poids.
Ces différents types de régimes permettent donc de reproduire artificiellement les régimes consommés par des personnes humaines, saines ou malades (obèses, en surpoids ou présentant du diabète sucré). Il y a de nombreux biais dans l’administration de ces régimes. Le plus important reste la préférence et le choix possible des animaux pour tel ou tel aliment composant son régime obésifiant129. Il faudrait disposer d’un régime uniforme, dont la composition serait parfaitement connue et qui ne laisserait pas de choix possible aux animaux lors de sa consommation.
Nous allons maintenant comparer l’anatomie de système digestif de ces trois espèces, qui s’est adapté dans le temps à ces régimes alimentaires spécifiques.
113 2.1.2. Comparaison anatomique, histologique et physiologique du tractus digestif
2.1.2.a Comparaison du tractus gastro-intestinal de la souris à celui de l’Homme
Les chercheurs Nguyen et al. ont fait dans la revue « How informative is the mouse for human gut microbiota research? » (2015)5 une comparaison détaillée de l’anatomie, la physiologie et l’histologie digestive humaine et murine, dont je reprends les principales informations ci-dessous.
Le système digestif de la souris est plutôt similaire à celui de l’Homme, d’un point de vue anatomique et physiologique. Les organes du tractus gastro-intestinal retrouvé chez la souris sont similaires à ceux de l’Homme. Mais des différences notables sont tout de même à souligner, en lien avec leur différence de régime alimentaire, leur taille et leurs besoins métaboliques différents. Le ratio entre la surface intestinale et la surface corporelle est un bon moyen de comparer la taille des organes d’une espèce à une autre. Pour l’intestin en entier, ce ratio est similaire entre l’Homme et la souris, mais pour deux sections intestinales, ce rapport diffère. En effet, le côlon humain est beaucoup moins étendu et long que celui de la souris par rapport à l’intestin grêle (rapport moyen de la longueur intestin grêle/côlon de 2,5 chez la souris, 7 chez l’Homme ; rapport moyen de surface intestin grêle/côlon de 18 chez la souris, 400 chez l’Homme). Chez l’humain, le côlon est divisé en plusieurs parties : côlon ascendant, transverse et descendant. Il présente sur toute sa longueur des bandelettes longitudinales appelées taenia coli. Cette structuration et le taenia coli sont absents chez la souris. Par ailleurs, le cæcum de la souris est plus développé. Il s’y déroule la fermentation des matériaux végétaux, ainsi que l’absorption de la vitamine K et B, notamment après coprophagie des fèces cæcales. Le cæcum humain est comparativement très petit et ne présente aucune fonction évidente. Ce long côlon et ce cæcum développé s’explique chez la souris comme une adaptation à la forte proportion en aliments non digestibles de leur alimentation, contrairement au régime humain. L’Homme présente par ailleurs un appendice, probable vestige du cæcum, qui est absent chez la souris (cf. Figure 16). Il a été récemment supposé que cet appendice pourrait avoir un rôle de réservoir de bonnes bactéries du microbiote, pour pouvoir recoloniser le tractus digestif et revenir à l’équilibre après une perturbation (« Multiple independent appearances of the cecal appendix in mammalian evolution and an investigation of related ecological and anatomical factors. », Smith et al., 2013).
Les villosités intestinales de la souris sont plus longues que celles humaines (cf. Figure 17). La surface intestinale est donc augmentée chez la souris. Il est supposé que cette différence morphologique soit là pour compenser l’absence de replis au niveau de l’intestin grêle. En effet, les intestins murins sont plutôt lisses, sans division, et particulièrement au niveau du côlon, qui est chez l’Homme extrêmement sous-compartimenté en « poches » (appelées haustrations). La fermentation des carbohydrates non digestibles se fait dans le gros intestin chez l’humain, et non dans le cæcum ou l’appendice. Ces différences majeures anatomiques influencent probablement la composition, la diversité et le fonctionnement du microbiote du côlon.
Au niveau histologique, les structures microscopiques sont aussi très différentes entre l’humain et la souris. Le côlon murin contient une mince musculeuse muqueuse (muscularis mucosae) sans sous- muqueuse discernable. Chez l’Homme, la paroi est plus épaisse. Des replis transverses sont présents tout le long de la muqueuse du côlon humain alors qu’ils sont localisés seulement sur le cæcum et le côlon proximal chez la souris. Cette compartimentation et structuration du côlon créent des micro-niches écologiques hébergeant différentes communautés microbiennes, qui différeront donc entre l’Homme et la souris.
114 Au niveau cellulaire, là encore, il y a de nombreuses différences :
• Distribution des cellules caliciformes (productrices du mucus) différente. Chez la souris, elles sont nombreuses au fond des cryptes du côlon proximal mais moins nombreuses au niveau du côlon distal et du rectum. • Distribution des cellules de Paneth différente (sécrétion de composés antimicrobiens dans l’intestin grêle). Chez la souris, leur présence se limite au cæcum alors que chez l’humain, ces cellules sont présentes dans le cæcum et le côlon proximal. Il y aurait aussi une différence de quantité de défensines produites par les cellules de Paneth, de leur stockage et leur sécrétion.
Ces différences de distribution et de sécrétion entre les deux espèces suggèrent que la réponse immunitaire locale n’est pas la même, ce qui influence la composition du microbiote dans le côlon et le cæcum. Ces cellules sont indispensables pour maintenir l’intégrité intestinale et l’équilibre hôte- microbiote. Même si la présence de ces cellules est conservée d’une espèce à une autre, leur localisation diffère.
Figure 16 : Anatomie simplifiée du tractus gastro-intestinal de la souris et de l’Homme. (Source : « How informative is the mouse for human gut microbiota research? », Nguyen et al., 20155)
115
Figure 17 : Structure anatomique de la paroi intestinale (intestin grêle) chez la souris (A) et chez l’Homme (B). Grossissement identique (× 20) ; C - cryptes intestinaux ; G – cellules caliciformes ; L – lamina propria ; MM – musculeuse muqueuse ; P – cellules de Paneth ; SM – sous-muqueuse ; V- villosité (Sources : « How informative is the mouse for human gut microbiota research? », Nguyen et al., 20155 ; A mouse and human atlas” by Piper M. Treuting and Suzy Dintzis, 2012).
Tableau XXXV : Similarités et différences de l’anatomie du tractus gastro-intestinal de la souris et de l’humain (Source : « How informative is the mouse for human gut microbiota research? », Nguyen et al., 20155).
Caractéristiques Souris Homme
Anatomie globale : le tractus gastro- Oui Oui intestinal est composé d’une bouche, d’un œsophage, d’un estomac, d’un intestin grêle, d’un gros intestin et d’un anus.
Composition d’une section tissulaire de Oui Oui l’intestin grêle : muqueuse, lamina propria, muscularis mucosa, sous-muqueuse, musculeuse, plexus nerveux et séreuse
Cellules de l’intestin grêle : entérocytes, Oui Oui cellules caliciformes, cellules endocrines, cellules de Paneth, cellules M, cellules « tuft »
Composition d’une section tissulaire du gros Oui Oui intestin : muqueuse, lamina propria, muscularis mucosa, sous-muqueuse, musculeuse et séreuse
116 Présence de cellules dans le côlon : Oui Oui colonocytes absorbants, cellules caliciformes, cellules endocrines, cellules M
Estomac Divisé en estomac non Pas de pré-estomac ; Pas de glandulaire/pré-estomac et limite claire estomac glandulaire ; les deux parties sont séparées par une limite nette
Intestin grêle Plus long, villosités sans Plus court que chez la replis souris, villosités avec replis de la muqueuse
Cæcum Large, lieu de la Petit, absence de fermentation fermentation
Appendice Non Oui
Côlon Plutôt lisse, pas de divisions Nettement divisé en différentes sections : côlons ascendant, transverse, et descendant
Paroi du côlon Fine muscularis mucosae Epaisseur variable
Présence d’haustration et de taenia coli au Non Oui niveau du côlon
Distribution des cellules de Paneth Localisées seulement dans Dans le cæcum et le côlon l’intestin grêle proximal
Distribution des cellules caliciformes Abondantes dans le côlon Abondantes du cæcum au proximal, leur nombre rectum
décroit à la base des cryptes dans le côlon distal et le rectum
Distribution des replis transverses Restreint au cæcum et au Tout le long de la côlon proximal muqueuse du côlon
2.1.2.b Comparaison du tractus gastro-intestinal du macaque à celui de l’Homme
L’anatomie du tractus digestif de l’Homme est extrêmement similaire à celle du macaque. Sur la Figure 18, on peut voir que les organes du tractus gastro-intestinal sont les mêmes chez les deux espèces, à l’exception du cæcum. En effet, le cæcum est très développé chez le macaque alors qu’il est quasiment absent chez l’Homme, potentiellement réduit à l’appendice (cf. Tableau XXXVI). L’appendice est d’ailleurs absente chez le macaque. Le cæcum et le côlon du macaque présente de nombreuses haustrations et des bandelettes longitudinales (taeniae coli), comme le long du gros intestin de l’Homme. La longueur totale du tractus digestif est de 6-7 mètres pour un Homme adulte contre 1,5-2 mètres chez le macaque rhésus adulte. On peut voir dans le Tableau XXXVI que les rapports de longueur intestinale (%, rapporté sur une longueur totale de 6,5m pour l’Homme et de 1,75m pour le macaque) de la dernière colonne sont quasi similaires pour chaque portion du tractus
117 digestif, preuve d’une grande similarité entre les deux espèces. Le pH de chaque section est aussi très proche d’une espèce à une autre, ce qui peut laisser penser que les niches écologiques de chaque section peuvent présenter les mêmes conditions de vie microbienne. Le temps de transit est plus faible pour le macaque mais reste peu éloigné de celui de l’humain.
Une dissection anatomique comparative d’un macaque et d’un humain par l’équipe de Ramalanjaona et al. (2016)130 a montré que l’Homme présente un omentum plus riche en tissu adipeux et plus vascularisé par rapport au macaque. La différence la plus notable de leur dissection est l’adiposité supérieure de l’omentum et du mésentère. Mais son origine n’est pas claire : potentiellement une adaptation évolutive ou bien liée au régime peu diversifié et à la sédentarité de l’individu humain.
Tableau XXXVI : Comparaison du tractus gastro-intestinal de l’Homme (Homo sapiens) et du macaque rhésus (Macaca mulatta) (Source : informations supplémentaires de l’article « Biogeography of the Intestinal Mucosal and Lumenal Microbiome in the Rhesus Macaque », Yasuda et al., 201540).
Figure 18 : Anatomie simplifiée du tractus gastro-instestinal du macaque (gauche) et de l’Homme (droite) (Source : « Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System », Stevens et Hume, 2004131)
118 Le tractus digestif des mammifères est globalement fortement conservé d’une espèce à une autre. La majorité des différences sont liées aux différences de régime alimentaire et donc aux différences de besoins physiologiques de digestion. Le macaque, l’Homme et la souris étant omnivores, leurs tractus digestifs présentent de fortes similarités. Mais les primates omnivores ont évolué vers un cæcum et un côlon plus petits et un intestin grêle relativement plus long par rapport au système digestif murin. Chez la souris, il y a nécessité de fermenter la grande proportion d’aliments non digestibles ingérés. Cette fermentation a lieu dans le cæcum, très développé, alors qu’elle se déroule dans le côlon chez l’humain. La fermentation des carbohydrates non digestibles se déroule également dans le cæcum chez le macaque mais aussi dans le côlon.
La grande similarité entre le système digestif du macaque et celui de l’Homme nous laisse penser qu’il est un modèle relativement adapté pour l’étude du système digestif humain, et aurait une meilleure valeur translationnelle que la souris. En effet, la coévolution hôte-microbiote a pu probablement être influencée par ces divergences anatomiques (revue « How informative is the mouse for human gut microbiota research? », Nguyen et al., 20155).
Nous avons jusque-là comparé le régime alimentaire et l’anatomie digestive associée de ces trois espèces. Nous allons maintenant comparer leur microbiote intestinal respectif, adapté donc à leur alimentation et l’anatomie.
119 2.1.3. Composition du microbiote intestinal à l’équilibre
2.1.3.a Pertinence de l’étude et de la comparaison du microbiote intestinal de ces deux espèces à l’Homme
Les comparaisons entre le microbiote intestinal de la souris et celui de l’Homme sont nombreuses et complètes. Ce n’est malheureusement pas le cas pour le PNH, pour qui la littérature sur le sujet est plutôt pauvre. Pourtant, le macaque est un modèle largement utilisé en recherche biomédicale et pour le développement de médicaments, grâce à sa grande promiscuité phylogénétique avec l’Homme. Des informations précises sur son microbiote intestinal, son fonctionnement et ses interactions avec la physiologie de son hôte ainsi que des données sur une potentielle ressemblance avec l’humain ou d’autres mammifères sont nécessaires pour augmenter la qualité scientifique des résultats obtenus via son utilisation. (« Establishment of a Macaca fascicularis gut microbiome gene catalog and comparison with the human, pig, and mouse gut microbiomes », de Li et al. (2018)132). Cette comparaison est également primordiale pour comprendre, d’une part, certaines clés de notre évolution, et d’autre part, certains facteurs qui ont participé à la formation de cet équilibre complexe entre le microbiote intestinal et l’humain. Les auteurs Nagpal et al. (2018)133 font le même constat qu’il manque de données sur les signatures spécifiques du microbiote par espèce de PNH et sur leurs métabolites (SCFAs notamment). Les connaissances sur leurs ressemblances et différences par rapport à l’Homme restent limitées alors qu’elles sont indispensables pour faire une recherche translationnelle qualitative.
2.1.3.b Comparaison de la composition du microbiote intestinal de ces trois espèces à l’état d’équilibre
La composition du microbiote intestinal de la souris est, comme chez l’Homme, dominée par deux phyla majoritaires : les Bacteroidetes et les Firmicutes. Mais lorsqu’on affine la comparaison au niveau du genre des espèces microbiologiques présentes, la souris possède des microorganismes bactériens absents dans le tractus digestif humain. Environ 80 genres sont retrouvés à la fois chez l’Homme et la souris (Nguyen et al., 20155 ; Krych et al., 2013134). Les abondances relatives des genres dominants sont relativement différentes entre l’humain et la souris (cf. Figure 19). Les genres Prevotella, Faecalibacterium et Ruminococcus sont plus abondants chez l’Homme par rapport à la souris alors que les Lactobacillus, Alistipes et Turicibacter sont plus nombreux chez la souris. Les genres Clostridium, Bacteroides et Blautia ont une abondance relative similaire chez les deux espèces. Les observations et analyses de différentes cohortes montrent que le noyau retrouvé d’un individu à un autre est plus restreint chez la souris que chez l’Homme (revue « How informative is the mouse for human gut microbiota research? », Nguyen et al., 20155). Les auteurs Krych et al. ont, quant à eux, identifié des genres exclusifs à l’Homme (Faecalibacterium, Mitsuokellla, Megasphera, Dialister, Asteroleplasma, Succinivibio, Sutterella, Paraprevotella) et seulement deux genres retrouvés exclusivement chez la souris (Phascolarctobacterium et Mucispirillum). Mais Faecalibacterium a été retrouvé par d’autres chercheurs au sein du microbiote intestinal murin. Il est a priori difficile de prouver l’exclusivité d’une espèce pour un hôte (« Quantitatively Different, yet Qualitatively Alike: A Meta-Analysis of the Mouse Core Gut Microbiome with a View towards the Human Gut Microbiome », Krych et al., 2013134).
120
Figure 19 : Méta-analyse de la composition du microbiote fécale chez des adultes sains humains ou murins analysées par séquençage ADNr 16s – Comparaison réalisée à partir des données du « Human Microbiome Project » et de 5 jeux de données sur la souris (* signifie que l’abondance du genre concerné est significativement différente (p<0,05) entre les deux espèces (Test non paramétrique de Wilcoxon)) (Source : « How informative is the mouse for human gut microbiota research? », Nguyen et al., 20155)
Les auteurs Chen et al. ont analysé des échantillons de microbiote (oral, vaginal et fèces) de macaques rhésus (Macaca mulatta) sauvages sains, qu’ils ont comparé aux données du HMP. L’analyse et la comparaison des échantillons de fèces ont montré qu’au niveau des phyla, le microbiote intestinal humain est dominé par les Bacteroidetes (abondance moyenne 69%) et les Firmicutes (27%) alors que les macaques présentent trois phyla dominants à des abondances relatives plutôt similaires : les Bacteroidetes (27%), les Firmicutes (35%) et les Proteobacteria (36%). Un grand nombre de genres communs à l’Homme et au macaque ont été détectés : Dialister, Eubacterium, Faecalibacterium et Phascolarctobacterium. Au sein du phylum Bacteroidetes, les genres les plus abondants sont différents pour les deux espèces (macaque : Prevotella et Prevotellamassilia ; humain : Bacteroides, Alistipes et Parabacteroides). Une caractéristique notable du microbiote intestinal du macaque rhésus sauvage est la haute prédominance d’OTUs du phylum Proteobacteria. Et notamment le genre Helicobacter représente 87% des séquences de ce phylum et est présent dans 97% des échantillons, alors qu’il est extrêmement rare chez l’Homme sain. (« Diversity of macaque microbiota compared to the human counterparts », Chen et al., 2018135).
Par opposition à nos plus proches ancêtres, les grands singes africains, les Hommes ont une diversité du microbiote intestinal plus faible, une abondance relative en Bacteroides plus élevée et en Methanobrevibacter et Fibrobacter plus faible (revue « The human microbiome in evolution », Davenport et al., 201712).
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Figure 20 : Le microbiote humain dans un contexte évolutif ; a – Microbiote intestinal de différentes populations humaines ; b – Proximité phylogénétique entre le microbiote intestinal de primates non humains sauvages, captifs et de différentes populations humaines ; c – Proximité du microbiote intestinal de l’Homme avec d’autres vertébrés (Source : « The human microbiome in evolution », Davenport et al., 201712).
De manière globale, la Figure 20 ci-dessus montre bien que le microbiote intestinal de l’Homme reste le plus proche des mammifères et surtout des autres primates. La partie b de la figure illustre le fait que le microbiote intestinal de l’Homme est le plus proche des grands singes et des singes de l’Ancien Monde, et non des singes du Nouveau Monde et des lémurs136.
Des chercheurs ont réalisé un séquençage métagénomique d’échantillons fécaux frais de 20 macaques cynomolgus (Macaca fascicularis). Les Bacteroidetes et les Firmicutes étaient, dans cet article, les deux phyla majoritaires et les Prevotella et les Bacteroides, les deux genres dominants. Ils ont trouvé un noyau taxonomique composé de 80 genres. Le catalogue génomique du microbiote intestinal du macaque cynomolgus ainsi obtenu possède 39,49% de gènes communs avec l’Homme alors qu’il ne partage que 0,6% des gènes avec ceux répertoriés dans le catalogue du microbiote intestinal de la souris. Seulement 0,4% des gènes identifiés sont partagés par les quatre espèces de l’étude, ce qui montre bien la grande différence entre ces 4 mammifères (humain, souris, macaque, porc). 32 genres bactériens sont retrouvés chez les quatre espèces, mais l’abondance relative de ces genres est bien évidemment différente d’une espèce à une autre. Les 10 genres partagés parmi les 20 genres les plus abondants des quatre espèces sont : Prevotella, Bacteroides, Clostridium, Eubacterium, Parabacteroides, Ruminococcus, Faecalibacterium, Roseburia, Blautia, et Coprococcus. (« Establishment of a Macaca fascicularis gut microbiome gene catalog and comparison with the human, pig, and mouse gut microbiomes », Li et al., 2018132).
Une autre étude a montré que la diversité β du microbiote intestinal humain semblait plus proche de celle du macaque par rapport à la souris et au rat. Alors que la composition du microbiote chez les rongeurs semble dominée par les Bacteroidetes suivis par les Firmicutes, le macaque et l’humain
122 montrent une proportion de ces deux phyla comparable ou légèrement plus élevée en Firmicutes par rapport au Bacteroidetes. Le microbiote intestinal humain est dominé par les Bacteroides suivi des Ruminococcaceae et des Clostridiales. Le microbiote fécal de la souris est dominé par la famille S24-7 suivi des bactéries de l’ordre des Clostridiales, alors que le macaque présente une abondance plus élevée en Prevotella par comparaison à l’Homme et à la souris. Au niveau des familles et genres bactériens, bien que de nombreux genres bactériens soient partagés par les quatre espèces, leur abondance relative varie grandement d’une espèce hôte à une autre (cf. Figure 21). On observe la même chose au niveau des classes et ordres bactériens (cf. Annexe 11). La Figure 22 illustre les 20 genres les plus prévalents chez quatre espèces (rat, souris, humain et PNH) par ordre d’abondance relative. On observe que la souris partage a priori plus de genres différents (10) parmi ces 20 genres avec l’Homme mais à des niveaux d’abondance non comparables, alors que les primates partagent moins de genres (6) mais à des abondances relatives similaires. (« Comparative Microbiome Signatures and Short-Chain Fatty Acids in Mouse, Rat, Non-human Primate, and Human Feces », Nagpal et al., 2018133).
Figure 21 : Abondance relative des familles bactériennes (A) et genres bactériens (B) majeurs détectés dans le microbiote fécal de la souris, du rat, du macaque cynomolgus et de l’Homme. (Source : « Comparative Microbiome Signatures and Short- Chain Fatty Acids in Mouse, Rat, Non-human Primate, and Human Feces », Nagpal et al., 2018133)
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Figure 22 : Genres bactériens les plus prédominants et prévalents détectés dans le microbiote fécal de la souris, du rat du macaque cynomolgus et de l’Homme. (Source : « Comparative Microbiome Signatures and Short-Chain Fatty Acids in Mouse, Rat, Non-human Primate, and Human Feces », Nagpal et al., 2018133
2.1.3.c Les entérotypes, sont-ils retrouvés chez le PNH et la souris ?
Chez l’Homme, des équipes ont réussi à identifier des entérotypes, comme vu dans la partie 1. Cette théorie fait débat, mais de plus en plus de chercheurs en voient l’utilité comme un outils de stratification. Deux entérotypes ont aussi pu être identifiés chez la souris : l’un dominé par les Lachnospiraceae et les Ruminococcaceae, l’autre par les Bacteroidaceae et les Enterobacteriaceae (article complet « Inflammation-associated enterotypes, host genotype, cage and inter-individual effects drive gut microbiota variation in common laboratory mice », Hildebrand et al., 2013137). D’autres chercheurs ont mis en évidence des entérotypes dominés par Alistipes, Akkermansia, et Clostridium (très différents des entérotypes décrits ci-dessus). La raison de cette potentielle stratification reste inconnue mais on peut faire une parallèle entre les entérotypes humains et murins. En effet, l’entérotype murin dominé par les Lachnospiraceae/Ruminococcaceae semble similaire à l’entérotype humain dominé par les Ruminococcaceae. Chez la souris sauvage, deux entérotypes ont aussi été identifié (Bacteroides et Robinsoniella) (informations tirées de la revue « How informative is the mouse for human gut microbiota research? », Nguyen et al., 20155).
Chez l’Homme, les chercheurs ont identifié des entérotypes dominés par Bacteroides, Prevotella, et Ruminococcus (parfois Bifidobacterium, Alistipes, et Faecalibacterium). Chez le macaque cynomolgus, trois semblants d’entérotypes peuvent être distingués : l’un dominé par les Lactobacillus, un autre par Prevotella et le dernier par Ruminococcus (cf. Figure 23). Comme précédemment décrit, chez l’Homme la présence de Prevotella est corrélée négativement avec le genre Bacteroides alors que chez le macaque l’abondance de Prevotella est corrélée positivement avec les Bacteroides. Mais à la fois chez l’Homme et le macaque, Ruminococcus est corrélé positivement avec les genres Blautia et Dorea. Chez l’Homme, la différence entre les différents entérotypes a été associée avec l’alimentation ce qui reste à prouver chez les autres espèces. (« Establishment of a Macaca fascicularis gut microbiome gene catalog and comparison with the human, pig, and mouse gut microbiomes », Li et al. (2018)132)
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Figure 23 : Entérotypes mis en évidence chez le macaque cynomolgus (Macaca fascicularis) (Source : « Establishment of a Macaca fascicularis gut microbiome gene catalog and comparison with the human, pig, and mouse gut microbiomes », Li et al. (2018)132)
2.1.3.d Variations du microbiote intestinal à la suite de changements d’alimentation
Il faut noter que chez l’Homme, l’entérotype dominé par Prevotella est sensible aux changements de régime alimentaires et est lié aux régimes riches en fibres/carbohydrates. Chez l’Homme et la souris, l’abondance en Prevotella évolue selon les changements alimentaires (Nguyen et al., 20155). Les chercheurs Wang et al. ont même montré que le passage à la captivité de souris sauvage, en laboratoire, provoquait un changement d’entérotype : de l’entérotype dominé par Bacteroides (dont les métabolisme est spécialisé dans la dégradation protéique) à l’entérotype dominé par Robinsoneilla (plus spécialisé pour la dégradation des carbohydrates). Il faut néanmoins garder un esprit critique sur ces conclusions, car cette étude a été conduite sur un petit nombre d’animaux (8 souris) (article complet « Dietary history contributes to enterotype-like clustering and functional metagenomic content in the intestinal microbiome of wild mice », Wang et al., 2014138).
Une méta-analyse sur le microbiote intestinal des Hommes et des PNH, permet de conclure sur d’autres aspects. Les variations inter-populations humaines semblent similaires entre les populations de PNH. Chez l’Homme, ces variations sont en effet associées majoritairement aux différences de régime alimentaire. Chez les PNH en milieu sauvage, on retrouve des variations liées aux saisons et à l’habitat qui sont en fait réellement liées aux variations d’aliments disponibles, dans leur lieu de vie et en fonction du temps (revue « The human microbiome in evolution », Davenport et al., 201712). La Figure 24 montre que les cohortes de macaques étudiées présentent une proximité phylogénétique supérieure avec les cohortes humaines du Malawi et amérindienne par rapport aux cohortes américaines. On peut supposer que cette proximité vient de la composition du régime alimentaire des populations de macaques et des populations humaines plus rurales, qui présenteraient un régime plus riche en polymères carbohydrates que les populations américaines (article « Biogeography of the Intestinal Mucosal and Lumenal Microbiome in the Rhesus Macaque », Yasuda et al., 201540).
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Figure 24 : Proximité phylogénétique du microbiote intestinal du macaque rhésus et de l’Homme ; D- Dissimilitude de Bray-Curtis mesurant la distance de 5 études ; E – Distance Unifrac pondérée des communautés microbiennes étudiées dans les études de Yatsunenko et al. et Yasuda et al. (Source : « Biogeography of the Intestinal Mucosal and Lumenal Microbiome in the Rhesus Macaque », Yasuda et al., 201540)
Pour comprendre les transitions alimentaires et leurs conséquences sur le microbiote intestinal, les primates captifs, pour lesquels on peut manipuler artificiellement l’alimentation, ont un vrai intérêt scientifique. Les espèces primates captives, consommant un régime moins riche en fibres que leurs homologues sauvages, présentent un microbiote intestinal moins divers, tout comme pour les régimes occidentaux/non occidentaux chez l’Homme. Par ailleurs, la captivité semble « humaniser » le microbiote (« Captivity humanizes the primate microbiome », Clayton et al., 2016139), en lien avec la diminution des fibres dans la ration de ces animaux. Malgré tout, le microbiote de ces primates captifs reste toujours plus proche de celui des Hommes consommant un régime non occidentalisé, riche en fibre diététique que celui d’un individu consommant un régime occidentalisé. Ceci prouve que les relations entre le régime de l’hôte et le microbiote intestinal sont différentes entre l’Homme et les PNH, lorsqu’on les étudie au niveau de la composition taxonomique spécifique. Ces données indiquent que l’évolution des relations entre les différents taxons ne s’est pas faite vers les mêmes fonctions métaboliques chez l’Homme et chez les PNH (informations tirées de la revue « The human microbiome in evolution », Davenport et al., 201712).
126 2.1.3.e Comparaison fonctionnelle du microbiote intestinal de ces trois espèces
Les auteurs Li et al. (2018)132 ont mis en évidence une similarité fonctionnelle entre le microbiote intestinal du macaque, de la souris et de l’Homme malgré les différences marquées au niveau taxonomique du genre (cf. Annexe 10). Les chercheurs Nagpal et al. (2018)133 ont analysé les taux de SCFAs contenu dans les échantillons fécaux de la souris, du rat, du PNH et de l’humain, donnant une idée de l’activité microbienne intestinale du microbiote de chaque espèce. L’acétate est présent de manière plus concentré dans les fèces des individus humains prélevés par rapport à la souris, au rat et au macaque. Le lactate est plus concentré dans les fèces des rongeurs par rapport à l’Homme et au macaque. Ce qu’on peut remarquer sur la Figure 25, est que le macaque et l’Homme ont des taux pour les quatre métabolites étudiés extrêmement similaires par rapport à la souris.
Figure 25 : Niveaux fécaux des SCFAs majoritairement produits par le microbiote intestinal de la souris, du rat, du macaque et de l’humain. A – Boxplot représentant la concentration du lactate, de l’acétate, du propionate et du butyrate dans les fèces des quatre espèces. B – Proportion moyenne relative des mêmes métabolites chez ces quatre espèces. (* : p<0,05 ; ** : p<0,001) (Source : « Comparative Microbiome Signatures and Short-Chain Fatty Acids in Mouse, Rat, Non-human Primate, and Human Feces », Nagpal et al., 2018133)
127 2.1.3.f Limites de la comparaison du microbiote intestinal entre les espèces mammifères
Plusieurs différences techniques entre l’analyse du microbiote de l’Homme et la souris gênent une comparaison optimale de leur composition. D’une part, les études du microbiote intestinal chez l’Homme se font en majorité sur des prélèvements de fèces, alors que chez la souris, elles sont souvent réalisées sur le contenu cæcal. D’autre part, les analyses de composition microbienne chez l’Homme se font le plus souvent par métagénomique et/ou séquençage haut débit (ADNr 16s) alors que les études standards chez la souris se font à l’aide du séquençage haut débit en grande majorité. La comparaison faite par l’équipe de chercheurs Nguyen et al. est basée sur les données obtenues par séquençage à l’aide d’ADNr 16s chez des adultes sains des deux espèces Malgré tout, ces résultats sont à prendre avec du recul à cause de la taille limitée des groupes étudiés. Il faut garder à l’esprit que ces études peuvent présenter de nombreux biais liés à la population étudiée, aux types et à la réalisation des prélèvements, à la technique de séquençage et la méthode d’analyse. (Nguyen et al., 20155).
Par ailleurs, il faudrait étudier d’autres souches de souris utilisées en laboratoire. Les études comparant le microbiote fécal des différentes souches de souris de laboratoire se faisant rares, il faudra à l’avenir conduire ce type d’étude pour mesurer la valeur translationnelle de la souris pour l’étude du microbiote intestinal humain (Nagpal et al., 2018133). Une étude datant de 2017 « Modeling a Superorganism – Considerations Regarding the Use of “Dirty” Mice in Biomedical Research » de Ericsson et al.140, fait le constat de l’aspect artificiel du microbiote intestinal de la souris de laboratoire, sélectionnée pour ses qualités sanitaires particulières, notamment SPF (de l’anglais « Specific Pathogen Free »). La souris de laboratoire a donc perdu sa diversité, sa richesse et la complexité attendue de son microbiote intestinal. De plus, son environnement ultra hygiénique a conduit son système immunitaire à rester sous un état plus proche de celui d’un nouveau-né que de celui d’un adulte, par rapport notamment aux souris sauvages ou d’animaleries pour animaux domestiques. Cette revue compare donc quatre types de souris aux statuts sanitaires différents Les données recueillies démontrent que des sources de rongeurs alternatives fournissent des modèles qui semblent plus transposables aux conditions de vie humaine, ce qui suggère l’intérêt de revenir à des modèles murins moins « aseptisés ».
L’idéal serait des études analysant exactement de la même façon le microbiote intestinal des différentes espèces à comparer, comme l’article de Nagpal et al., « Comparative Microbiome Signatures and Short-Chain Fatty Acids in Mouse, Rat, Non-human Primate, and Human Feces » (2018)133, qui a comparé le microbiote intestinal selon le même protocole de la souris, du rat, du PNH et de l’humain.
128 Au niveau génomique, le microbiote intestinal est largement conservé entre ces trois espèces de mammifères. L’Homme et la souris présentent les mêmes deux phyla majoritaires, Firmicutes et Bacteroidetes, mais à un ratio différent. Il existe des différences claires entre la composition du microbiote intestinal murin et celui de l’Homme, en termes d’abondance et d’identité de genres et d’espèces. Qualitativement le microbiote intestinal de la souris est semblable à celui de l’Homme mais quantitativement ils restent extrêmement éloignés. Certains aspects semblent néanmoins comparables : par exemple les entérotypes. Malgré une impossibilité de comparaison absolue avec l’Homme, les modèles murins semblent pertinents pour étudier des processus de variations et de perturbations du microbiote de manière spécifique. La différence de ratio Firmicutes/ Bacteroidetes limite potentiellement son utilisation dans ce domaine. Malgré tout, en gardant un certain esprit critique, le modèle murin peut s’avérer utile pour l’étude de certaines pathologies, pour lesquelles ce ratio est justement modifié.
Les PNH ont le microbiote intestinal le plus proche de l’Homme par rapport notamment à la souris, d’un point de vue de la composition taxonomique, mais aussi fonctionnelle. Néanmoins, certains articles ont mis en évidence que le microbiote intestinal du PNH présente de nombreuses différences par rapport au microbiote humain. En effet, les macaques sont caractérisés par de nombreuses spécificités à la fois physiologique, anatomique (cerveau plus petit, intestin plus large, dépôt adipeux moindre) et immunitaire. Il est possible que d’un point de vue évolutif, les PNH aient développé, à cause d’une physiologie différente, de facteurs environnementaux et d’un régime alimentaire différents, un microbiote intestinal éloigné de celui de l’Homme. Malgré ces éléments, le PNH présente de nombreux intérêts pour l’étude du microbiote intestinal notamment par sa réaction aux changements alimentaires qui semble similaire aux variations observées chez l’Homme (Nagpal et al., 2018141).
D’un point de vue purement métagénomique, l’utilisation des PNH en recherche biomédicale, pour l’étude du microbiote intestinal, a besoin d’être encore explorée. Il faudra à l’avenir étudier plus en profondeur la composition du microbiote des PNH et notamment l’intérêt de certaines bactéries présentes dans leurs intestins. Une comparaison du microbiote intestinal de plusieurs espèces de PNH pourra apporter des conclusions supplémentaires sur les similitudes et les divergences par rapport à celui de l’Homme.
Enfin, basé sur la haute similarité entre l’Homme et le macaque, il serait intéressant de déterminer si une colonisation avec un microbiote fécal humain serait plus réussie et informative chez les espèces de PNH que chez la souris.
129 2.3. SYSTEME IMMUNITAIRE ET MICROBIOTE
Après le paragraphe descriptif présenté en partie 1, ce paragraphe a pour objectif de comparer ce que chaque modèle animal peut apporter. Hooper et al. en 2012142 présentent une revue très détaillé des découvertes effectuées grâce à des modèles murins dans des lignées porteuses d’anomalies du système immunitaire (délétion de récepteurs ou de voies de signalisation...), mais indique que de nombreux aspects restent à traiter. On trouve aussi plusieurs revues comparant les systèmes immunitaires de l’Homme à ceux des espèces usuelles dans les études précliniques comme le rat, la souris et le macaque, mais les comparaisons sur le système immunitaire digestif sont souvent incomplètes (Holsapple et al. 2003143 ; Buse, 2005144).
Plusieurs différences apparaissent notables entre l’Homme, les PNH et la souris :
- La cinétique de développement de l’immunité est très différente : la souris naît avec un système nettement plus immature que l’Homme et le macaque. Les tissus intestinaux sont déjà colonisés à la naissance chez l’humain et le macaque par des lymphocytes différenciés, tandis que la colonisation ne commence chez la souris qu’après la naissance. Il y a donc une temporalité très différente dans les premières interactions entre le microbiote et le système immunitaire (cf. Annexe 12). - Les nœuds lymphatiques et les plaques de Peyer de la souris sont nettement moins nombreux que chez l’Homme et leur distribution est plus étalée le long de l’intestin. Il existe aussi une forte variabilité individuelle du nombre et du degré d’activation des plaques de Peyer chez l’homme (Jung et al., 2010145). Il n’y a pas actuellement de données claires chez le macaque. - De nombreux aspects de l’immunité, en particulier les PRRs, les fonctions des classes d’Ig (et la présence ou non de récepteurs cellulaires pour les IgA), les types de populations lymphocytaires T et NK et les mécanismes de différenciation, présentent des variations importantes entre l’homme et la souris. - L’impact de ces variations est difficile à évaluer, mais elles peuvent obérer l’extrapolation à l’homme des résultats observés chez la souris, particulièrement en tant que modèle de maladie à composante immune ou inflammatoire (pour revue des différences entre l’homme et la souris : Mestas et Hughes, 2004 146 ; Seok et al., 2013147). - Il est à noter que les modèles NHP (macaques rhésus et fascicularis surtout, mais aussi marmousets et babouins), ont bénéficié d’efforts pour obtenir des outils d’analyse immunologique comparable à ceux utilisés pour l’homme (pour revue Grow et al., 2016148). Veazey et al. ont publié en 1997149 une analyse détaillée du GALT du macaque rhésus qui est citée dans de nombreuses études ultérieures en infectiologie chez le PNH. Elhmouzi-Younes et al. ont publié en 2017150 une étude des marqueurs phénotypiques des lymphocytes.
De plus, l’immunologie chez la souris repose beaucoup sur l’utilisation de lignées murines consanguines (C57BL6/J, BALB/c, etc.). Il n’y a pas chez ces individus de polymorphisme des gènes de l’immunité (CMH, PRRs, …) et ils produisent donc des réponses immunes homogènes (mais différentes d’une lignée murine à l’autre). Cette homogénéité apporte une bonne puissance statistique même pour des études à petits effectifs, mais elle peut être la source d’erreurs d’interprétation, le risque de généraliser à tort un résultat obtenu avec une lignée qui aurait une réponse atypique. On peut citer par exemple le fait que la différence de production d’IgA par les souris des lignées C57BL6/J et BALB/c impacte leur microbiote (Fransen et al., 2015151), ou que le taux de TReg dans le tissu adipeux de la souris C57BL/6 est plus élevé que dans d’autres lignées murines et chez l’homme (Laparra et al., 2019152). Il est en revanche très difficile d’envisager des études à ce niveau de contrôle génétique chez le PNH (bien qu’il soit possible de typer le CMH des
130 PNH pour sélectionner des animaux conformes aux objectifs, il n’existe pas à notre connaissance de colonies consanguines).
Enfin, nous avons vu en partie 1, que le développement du système immunitaire digestif est profondément influencé par le microbiote dès la naissance : ces études sont possibles chez la souris grâce aux pratiques d’élevage en statut sanitaire contrôlé. Il faut pour cela recourir à des équipements permettant un confinement biologique strict des animaux, à des techniques de transfert de flore et à des techniques de reproduction assistée (pour maîtriser le microbiote du nouveau-né indépendamment du microbiote de la mère). Il est en revanche très difficile d’envisager des études à ce niveau de contrôle sanitaire chez le PNH, à la fois par manque d’élevage appropriés et par manque d’équipement de confinement (il n’existe pas à notre connaissance de PNH en statut sanitaire axénique ou gnotobiotique), et à la fois en raison de contraintes excessives pour le bien- être animal (environnement appauvri, séparation précoce mère-jeune, etc.).
Malgré les limites par rapport aux modèles murins sur le plan génétique et sanitaire, il serait possible de procéder chez le PNH à des investigations plus pertinentes, pour la transposition à l’Homme, concernant la régulation spatio-temporelle des interactions entre le microbiote et les populations lymphocytaires intestinales diffuses ou concentrées dans les plaques de Peyer, et l’efficacité des thérapies des maladies intestinales.
131 2.4. MODELE D’ETUDE DE PATHOLOGIES METABOLIQUES HUMAINES ASSOCIEES AU MICROBIOTE INTESTINAL
Dans ce paragraphe, nous allons faire une synthèse des différents modèles murins et PNH disponibles, et identifier leurs apports respectifs pour chacune des maladies métaboliques étudiées. Nous essaierons de prendre en compte, lorsque la littérature le permet, des données à propos des effets du microbiote intestinal dans ces modèles de pathologies. Nous ne détaillerons pas les modèles de syndrome métaboliques puisque le syndrome métabolique est un ensemble de symptômes (dont l’obésité abdominale) et représente un facteur de risque important du diabète de type 2 et de troubles cardio-vasculaires secondaires. Sa modélisation est donc équivalente aux stades précoces de l’obésité et du DT2.
De nombreux modèles animaux, murins ou simiens, sont utilisés depuis longtemps pour étudier les maladies métaboliques. La question est de savoir si les changements du microbiote intestinal observés chez l’Homme ont été étudiés chez ces modèles animaux de pathologies métaboliques, et s’ils sont semblables à ce qui est observé chez l’humain. 2.1.4. Modélisation du microbiote intestinal humain
Pour étudier le microbiote humain à partir de modèles animaux, les chercheurs peuvent étudier ce qui se passe chez une espèce saine (par exemple un macaque) et transposer les résultats obtenus à l’humain, en se servant de la littérature déjà existante sur le sujet. La souris permet une autre approche qui peut être tout aussi informative : la souris gnotobiotique humanisée.
2.1.4.a Modèle murin gnotobiotique humanisé
Un animal gnotobiotique est défini comme « un animal hébergeant exclusivement un ou plusieurs microorganismes vivants parfaitement connus » (définition du site TermSciences14). Le modèle murin gnotobiotique humanisé est un modèle obtenu à partir d’une souris axénique, c’est-à-dire stérile, inoculée par un microbiote intestinal humain. Ce modèle un outil puissant pour étudier le microbiote intestinal humain, car il récapitule une grande part de sa composition phylogénétique. Ce système a été largement étudié car on peut aisément lui infliger des perturbations « semblables » à celles observables chez l’Homme. Cette méthode est considérée comme la méthode de référence pour prouver le lien de cause à effet entre une perturbation et les variations d’équilibre et de composition du microbiote. Il faut néanmoins souligner le fait que les relations entre l’hôte et son microbiote, au sein de ce type de modèle, ne reflètent pas nécessairement la relation réelle observée chez l’humain. En effet, on implante un microbiote, originellement associé à une autre espèce, qui n’a pas évolué conjointement avec les microorganismes transplantés. Certains genres bactériens du microbiote intestinal humain sont absents dans le microbiote intestinal de la souris gnotobiotique humanisée, car ils n’ont pas réussi à s’y implanter. Certains auteurs considèrent que ces bactéries à faible abondance ne sont pas primordiales pour l’équilibre et les fonctions du microbiote intestinal. Cependant, les interactions entre les bactéries du microbiote intestinal et l’hôte sont si complexes que ce n’est sans doute pas le cas ! De plus, il ne faut pas oublier que les souris axéniques ont un système immunitaire immature voire altéré, ce qui les empêchent d’interagir correctement avec les microorganismes intestinaux. Bien que largement utilisé pour étudier le microbiote intestinal humain, ce modèle n’est pas vraiment représentatif des interactions réelles entre l’hôte et les microorganismes du microbiote intestinal humain. Il faut l’utiliser dans un contexte d’étude d’un lien précis de causalité, entre une espèce bactérienne et un type de nutriment par exemple. Ce modèle devra par la suite être amélioré et raffiné pour en améliorer la valeur translationnelle (Nguyen et al., 20155).
132 Il ne semble pas exister de modèle primate axénique, auquel on pourrait potentiellement transplanter un microbiote intestinal humain connu. Cela semble d’ailleurs difficilement envisageable, à cause du potentiel passage bactérien transplacentaire, sur une longue durée de gestation, qui constitue un début de colonisation du microbiote intestinal. Par conséquent, même en faisant naitre la descendance par césarienne strictement stérile, il est quasiment impossible de laisser et faire grandir un jeune PNH de manière stérile. De plus, ce n’est évidemment pas envisageable d’un point de vue éthique et règlementaire, car il faudrait séparer le jeune de sa mère dès la naissance.
Il est cependant envisageable d’imaginer des transplantations de microbiote fécal humain chez le PNH, dont les intestins seraient préalablement préparés, de la même façon que pour une transplantation fécale à visée médicale.
2.1.5. Modèles d’obésité
La part génétique impliquée dans l’obésité est connue et très étudiée chez l’Homme. C’est un facteur déterminant de l’expression des symptômes, en association avec divers facteurs de risques. C’est pourquoi les premiers modèles animaux d’obésité décrits ci-dessous sont des modèles à implication génétique, spontanés ou artificiels.
2.1.5.a Modèle d’obésité spontané chez le PNH et la souris
Tableau XXXVII : Synthèse des modèles spontanés d’obésité disponibles chez la souris et les PNH
Critères Souris PNH
Babouin de Guinée (Papio papio) Vervet (Chlorocebus aethiops) Macaques (Macaca mulatta, Souris obèse mutée ob/ob Macaca fascicularis) Mutation spontanée simple du gène Espèces prédisposées à l’obésité codant pour la leptine (produite dans Modèles les adipocytes) 10–15% des macaques captifs d’obésité développent avec l’âge de l’obésité disponibles Au moins 10 mutations génétiques (avec un régime complet pauvre en simples aujourd’hui décrites chez la graisse ad libitum) souris provoquant une perte de fonction et un phénotype obèse La faible activité physique liée aux conditions de captivité ne semble pas être un facteur de risque pour le développement de l’obésité chez le PNH
133 Comparaison de femelles babouins gestantes (proche du terme) obèses ou non obèses : 3 familles prédominantes chez les individus sains et obèses dans le microbiote du côlon Prevotellaceae (25.98% et 32.71% respectivement), Ruminococcaceae (12.96 % et 7.48%), et Lachnospiraceae (8.78% et 11.74%). Sept familles bactériennes caractérisent les différences trouvées entre les femelles saines et obèses Quelques études ont étudié les Une étude récente (2019) a montré variations de la composition du qu’il n’y avait pas de différence microbiote intestinal chez ce modèle significative entre les abondances murin : relatives des phyla Bacteroidetes, Prise en - Réduction de 50% de Firmicutes et Prevotella de macaques compte du l’abondance en Bacteroidetes et cynomolgus obèses et sains. Mais microbiote augmentation proportionnelle l’abondance relative en Spirochetes était intestinal en Firmicutes significativement différente entre les - Changement des abondances animaux sains et obèses. La richesse et relatives des espèces diversité microbienne étaient similaires bactériennes intestinales mais de grandes variations inter- majoritaires individuelles étaient à souligner, indifféremment du statut obèse ou non obèse de l’animal. Les animaux obèses et non obèses ont été élevés dans les mêmes conditions (même alimentation). L’absence de différence significative de composition du microbiote entre les deux groupes montrent que les changements associés à l’obésité, connus chez l’Homme notamment, sont liés à des facteurs environnementaux, dont le régime alimentaire plutôt qu’à l’obésité en elle-même153.
134 Ces modèles spontanés chez la souris Etude des facteurs de risques d’obésité permettent de comprendre de manière et de ses complications : précise le fonctionnement du système - Influence du régime alimentaire de régulation énergétique. Beaucoup maternel pendant la gestation de ces gènes (mutation monogénique) - Influence du régime alimentaire Objectifs semblent être impliqués dans une voie postnatal des études commune qui inclut la leptine et - Influence du schéma de croissance utilisant l’insuline comme molécules de - Influence du sexe ces signalement. - Influence de l’âge modèles Cette voie métabolique a été Etude clinique poussée de la maladie principalement découverte et décrite Le vervet est un modèle génétique grâce à des études sur ces modèles pertinent pour élucider l’ontogénèse de souris de mutation simple spontanée l’obésité mais aussi les facteurs provoquant une perte de fonction du d’influence environnementaux à tous gène concerné et un phénotype obèse. les stades de vie
Ces trois espèces développent des symptômes d’obésité avec l’âge de Seule une très faible part de la manière spontanée population humaine cliniquement obèse présente une mutation délétère Chez le vervet, aucun gène muté n’a homozygote du gène codant pour la été identifié, seulement plusieurs leptine régions sont soupçonnées d’être impliquées dans le phénotype obèse. Il C’est aussi le cas pour toutes les autres existe une influence des facteurs du mutations découvertes provoquant Qualité sexe, du régime maternel et postnatal, des symptômes d’obésité scientifique et du schéma de croissance Le microbiote intestinal de ces souris du modèle La proximité du Babouin et de ob/ob a un ratio Bacteroidetes/Firmicutes l’Homme d’un point de vue augmenté comme chez l’Homme physiologique et de développement obèse. Ce fait est régulièrement associé à la capacité de collectes controversé en fonction des études, d’informations cliniques précises ainsi des cohortes, du type que le contrôle de son environnement d’échantillonnage et d’analyses du fait du babouin un modèle d’une microbiote. grande qualité scientifique pour l’étude de l’obésité
135 Chez le babouin, la répartition corporelle du tissu adipeux est très Obésité massive chez les animaux proche de ce que l’on peut observer homozygotes ob/ob chez l’Homme Surpoids chez les souris hétérozygotes Les résultats (notamment cliniques) ob/+ obtenus chez le vervet sont La cause primaire d’obésité chez la extrêmement similaires à ce que l’on souris homozygote ob/ob est trouve chez l’Homme. Il développe l’augmentation de la prise alimentaire à spontanément une obésité, une cause de la déficience en leptine. Le résistance à l’insuline, et les microbiote intestinal associé à l’obésité changements associés des lipides plasmatiques, même en cas de Qualité chez ce modèle montre une capacité élevée à stocker de l’énergie à partir de consommation d’un régime faible en clinique du graisse. Ces paramètres sont en plus son régime alimentaire modèle héréditaires. Les femelles sont Critères d’évaluation clinique limités particulièrement sujettes à une obésité (animal de petite taille, faible volume centrale et un profil lipidique sanguin total donc impossibilité défavorable d’étudier de manière régulière les variations des profils lipidiques Possibilités d’étudier cliniquement les plasmatiques, critères cliniques complications de l’obésité (DT2, mesurables limités, répartition maladies cardiovasculaires secondaires corporelle des tissus adipeux etc.) difficilement comparable à celle de Possibilité d’étudier de manière précise l’humain obèse) les variations d’hormones endocrines spécifiques du tissu adipeux, de faire des biopsies du tissu adipeux.
Modèles spontanés mais les Modèles découverts de manière symptômes d’obésité apparaissent spontanée dans les grands élevages de seulement à un âge déjà avancé (non rongeurs de laboratoire, puis juvénile). L’étude notamment de Facilité de caractérisés par séquençage. l’obésité de femelles gestantes mise en Ils ont été ensuite sélectionnés pour concerne des femelles sexuellement place leur phénotype particulier (d’abord matures (âge supérieur à 2,5 ans chez sélection des hétérozygote ob/+ puis le vervet). Il faut donc disposer création d’animaux homozygotes d’animaux d’un certain âge issus de ob/ob) colonies possédant des phénotypes obèses.
136 Les souris expriment d’autres phénotypes malades inexistant chez l’Homme, qu’il faudrait être capable Au long terme, il faudra raffiner ces de maitriser. modèles en identifiant les gènes Aujourd’hui, les variations de la impliqués dans l’ontogénèse de Limites et composition du microbiote intestinal l’obésité humain en cas d’obésité semblent besoins de Etudier de manière plus systématique similaires à celle de la souris obèse raffinement le facteur de variation « composition mais uniquement lorsqu’on reste au du microbiote intestinal » dans les niveau des phyla, ce qui reste modèles PNH spontanés d’obésité et extrêmement imprécis. Il faudra que en évaluer l’impact réel de futures études s’intéressent exactement à ce qu’il se passe au niveau du genre.
Speakman et al., 2007129 ; Schmitt et al., Speakman et al., 2007129 ; Ley et al., 2018155 ; Kavanagh et al., 2007156 ; Référence 2005102 ; Turnbaugh et al., 2006154 ; Comuzzie et al., 2003157 ; Li et al., (s) Nguyen et al., 20155 2018158 ; Pinheiro-Castro et al., 2019127 ; Koo et al., 2019153
2.1.5.b Modèles génétiquement modifiés d’obésité
Pour accélérer le processus de mutation et pouvoir créer d’autres modèles, les chercheurs ont mis au point des méthodes permettant d’augmenter le taux de mutations génétiques artificiellement, en traitant les animaux avec des molécules chimiques mutagènes ou bien en les exposant à des radiations. L’objectif est d’obtenir une mutation provoquant la perte totale d’une fonction métabolique ou cellulaire. Les animaux obtenus après ces manipulations peuvent nous faire comprendre divers aspects fonctionnels, notamment le métabolisme énergétique. L’inconvénient majeur de cette approche est le coût du phénotypage et l’énorme perte que représente tous les animaux créés qui ne possèderont pas de mutations intéressantes et à conserver, voire des mutations rendant les animaux non viables. Sachant que le génome de la souris est constitué de 30 000 à 40 000 gènes, et qu’une mutation provoque seulement une perte de fonctionnalité dans 3 à 5 % des cas, il faut un demi-million d’animaux pour découvrir l’effet de la perte d’une fonction pour un gène donné. Dans le cas de l’étude de l’obésité, pour mesurer une potentielle influence sur le phénotype, il faudrait faire un suivi pondéral de tous les animaux ce qui est excessivement coûteux et chronophage. De plus, il faudrait que l’effet de la mutation soit déjà considérable chez un animal hétérozygote pour qu’il soit remarqué. Il n’y a donc eu peu de progrès fait grâce à ces modèles, à propos des régulation énergétiques129.
Les modèles transgènes sont en grande majorité mis en œuvre chez la souris. En effet, sa prolificité et son faible coût sont deux critères indispensables pour pouvoir créer des modèles transgènes. Le PNH n’est jamais utilisé en recherche transgénique, pour des raisons de faisabilité, de coût et d’éthique. Il faut savoir que les établissements utilisant des organismes génétiquement modifiés doivent posséder une structure et un agrément particuliers.
137 Tableau XXXVIII : Synthèse des modèles génétiquement modifiés d’obésité disponibles chez la souris
Critères Souris
Modèles 248 gènes identifiés chez l’Homme obèse qui affectent le poids ou d’obésité l’adiposité des souris chez qui ces gènes sont mutés ou exprimés comme disponibles transgènes
Peu d’articles sur le microbiote intestinal des souris transgéniques obèses
Néanmoins, une étude s’est intéressée à la contribution de la génétique de l’hôte et le régime alimentaire pour façonner le microbiote intestinal et permettre la mise en place d’un phénotype de syndrome métabolique chez la souris. Elle a comparé des souris sauvages à des souris transgéniques KO pour le gène Apoa-I (présentent une tolérance altérée au glucose, une masse Prise en compte adipeuse augmentée). Les souris étaient ensuite nourries pendant 25 du microbiote semaines avec un régime HFD et un régime normal. Les changements de intestinal régimes ont permis d’expliquer 57% des variations du microbiote intestinal alors que la génétique seulement 12%. Les animaux nourris avec un régime riche en graisse n’avaient pratiquement plus de Bifidobacterium spp. (rôle protecteur de la barrière intestinale) quel que soit le génotype. La famille Desulfovibrionaceae (productrice d’endotoxines) était en abondance supérieure chez tous les animaux présentant une intolérance au glucose (particulièrement chez les souris sauvages nourries avec un régime riche en graisse)159.
Objectifs des Identifier le rôle du gène muté, supprimé ou implémenté dans le génome études utilisant de l’animal génétiquement modifié, notamment son rôle dans certaines ces modèles voies métaboliques, hormonales ou dans la physiopathologie de l’obésité
- Surexpression du gène ciblé de manière globale ou localisé dans un tissu de la descendance. Exemple : modèles souris de surexpression de la protéine associée à la masse graisseuse et à l’obésité (FTO, de l’anglais « fat mass and obesity-associated protein ») - Modèle « KO » (de l’anglais « Knock Out » ou bien « éliminer ») : le gène concerné es totalement supprimé dans tous les tissus : effets non Qualité prévisibles du gène étudié et offre parfois un aperçu non attendu de scientifique du l’action du gène ciblé modèle Exemple : modèle de souris obèse KO pour le gène codant pour le récepteur 4 de la mélanocortine (MC4R) - Modèle « Knock In » (que l’on peut traduire par « insérer ») : remplacement d’un gène endogène par un gène muté. Les souris « Knock In » ont la capacité de déterminer plus spécifiquement le rôle et les changements dans la structure et la fonction de la protéine codée par le transgène.
L’intérêt des modèles transgéniques n’est pas d’identifier un profil Qualité clinique clinique mais uniquement le rôle de certains gènes dans le métabolisme du modèle énergétique ou la physiopathologie de la maladie
138 Facilité de mise Très coûteux et complexe (cf. ci-dessus) en place
Modèle généralement muté sur un seul gène impactant une unique voie métabolique alors que l’obésité présente un caractère polygénique Limites et Dans l’étude de Zhang et al. (2010), on observe que finalement le régime besoins de alimentaire semble avoir un rôle plus déterminant pour façonner le raffinement microbiote intestinal et le phénotype de syndrome métabolique/obésité de la souris que son bagage génétique. Ceci remet donc grandement en cause l’utilisation de tous les modèles génétiquement modifiés.
Référence(s) Speakman et al., 2007129 ; Pinheiro-Castro et al., 2019127 ; Zhang et al., 2010159
Les modèles murins génétiquement modifiés sont de puissants outils pour étudier les mécanismes physiopathologiques de maladies humaines, et sont utilisés de plus en plus pour étudier les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte, à la fois en situation d’homéostasie avec son hôte et en cas de maladies. Toutefois, il ne faut pas oublier que ces maladies métaboliques mettent en jeu pas seulement une voie et un gène, mais de nombreuses voies métaboliques et de nombreux gènes différents. Il y a une accumulation de preuves en faveur d’un caractère polygénique de l’obésité chez l’humain, avec l’implication de gènes multiples et des différences marquées inter-individuelles de susceptibilité génétique. Mais contrairement aux modèles polygéniques, les modèles monogéniques sont souvent cliniquement plus prononcés et sévères. Ils sont ainsi de bons modèles à la fois pour comprendre les effets du gène considéré mais aussi pour développer des traitements pharmacologiques ciblés. Malgré tout, le tableau clinique de ces modèles murins diffère souvent, de manière importante, de celui décrit chez l’Homme. Ces différences sont donc absolument à prendre en considération pour transposer les résultats d’une étude sur un modèle génétiquement modifié à l’humain (informations tirées de l’article « How informative is the mouse for human gut microbiota research? », Nguyen et al., 20155 et du chapitre 8 du livre « Reviews on Biomarker Studies of Metabolic and Metabolism-Related Disorders », Pinheiro-Castro et al., 2019127). Par ailleurs, les facteurs de risques associés à l’obésité, comme le régime alimentaire chez la souris, semble avoir un impact plus fort sur la structure du microbiote intestinal et le phénotype d’obésité que la génétique elle-même (Zhang et al., 2010159). Il faut donc penser à prendre en compte systématiquement ces facteurs d’influence, ce qui nous amène au paragraphe suivant.
139 2.1.5.c Modèles d’obésité induits par maitrise du régime alimentaire
Tableau XXXIX : Synthèse des modèles induits d’obésité disponibles par administration de régimes obésifiants chez la souris et les PNH
Critères Souris PNH
Souris de la souche C57BL/6 : modèle polygénique induit par un régime HFD ad libitum le plus utilisé Macaque cynomolgus (Macaca pour modéliser l’obésité et le syndrome facsularis) nourri avec un régime métabolique humain. Elles sont riche en carbohydrates solubles Modèles sujettes à développer une obésité, à Vervet (Chlorocebus aethiops) d’obésité avoir des niveaux altérés de sécrétion disponibles d’insuline, une intolérance au glucose et Généralement, les chercheurs utilisent une adiposité élevée. des espèces de PNH prédisposées pour l’obésité, qu’ils nourrissent avec Beaucoup d’autres souches de souris un régime HFD. peuvent développer une obésité à la suite d’une période de régime HFD.
Chez le macaque cynomolgus nourri avec un régime méditerranéen ou occidentalisé : La diversité du microbiote intestinal chez le macaque consommant le Les souris nourries avec un régime régime méditerranéen est HFD montrent un ratio considérablement supérieure à celle du Prise en Bacteroidetes/Firmicutes diminué, une macaque consommant un régime compte du diversité taxonomique dans le phylum HFD. microbiote des Bacteroidetes réduite (diminution des Chez le macaque nourri avec un intestinal Prevotella, Roseburia et augmentation régime occidentalisé ou HFD : ratio significative des Barnesiella, Bacteroides, plus faible Bacteroidetes/Firmicutes Alistipes) (familles plus abondantes : Clostridiacea et Lactobacillaceae ; genres plus abondants : Lactobacillus, Clostridium, Faecalibacterium, et Oscillospira ; genres moins abondants : Ruminococcus et Coprococcus)
Comparer les effets de différents régimes alimentaires trouvés chez l’humain sur des modèles PNH Objectifs Identifier de manière précise sur un d’obésité, de syndrome cardio- des études point spécifique l’effet d’un régime métabolique, de DT2 ou utilisant alimentaire sur le métabolisme, le d’athérosclérose (ingestion calorique, ces microbiote intestinal ou la développement d’obésité, modèles physiopathologie de l’obésité métabolisme, stéatose hépatique etc.) sur le long terme. Etude des effets de l’obésité sur le corps et l’organisme dans sa globalité
140 La tendance générale observée dans les études souris est en accord avec ce que l’on trouve chez l’humain. C’est le cas pour les variations du microbiote La variation du ratio intestinal. Cela souligne le fait que ce Firmicutes/Bacteroidetes est la même que modèle souris (et aussi la souris chez l’Homme obèse. gnotobiotique humanisée) permet de mimer les variations de microbiote Il manque d’études comparant le microbiote intestinal d’une cohorte Qualité observée chez l’humain, en lien avec humaine obèse avec celui d’une scientifique l’alimentation. cohorte de PNH obèses, de manière du modèle Malgré tout, des divergences similaire et répétable. subsistent entre les deux espèces (notamment les changements Adipocytes intra-abdominaux du d’entérotypes à la suite d’un macaque cynomolgus similaire d’un changement alimentaire). Ces point de vue métabolique à ceux des différences peuvent être expliquées humains. par les effets du génome sur la mise en place d’un entérotype et l’influence de certains facteurs externes.
Régime obésifiant (riche en carbohydrates solubles) permettant jusqu’à trois fois plus de prise de masse graisseuse que chez des Lors d’administration d’un régime animaux contrôles HFD ou équivalent, les rongeurs présentent deux types de réaction : Suivi clinique approfondi : état général de l’animal, mesure de l’ingestion et de - Augmentation de leur masse la digestibilité des rations (cages Qualité adipeuse corporelle (par exemple métaboliques), mesure de l’activité clinique du chez la souris C57BL/6) physique des animaux, de la dépense modèle - Résistance au régime HFD et énergétique, de la composition du conservation du poids initial corps (pourcentage de graisse, Ceci serait en lien avec une pourcentage de muscles etc.), physiologie et une génétique différente répartition du tissu adipeux, des souches murines. métabolisme des carbohydrates ou d’autres nutriments, évaluation de la stéatose hépatique sur le long terme après biopsie/autopsie, mesure non invasive de la graisse péricardique.
Etude sur le long terme (pour certaines 2,5 ans). Cela permet d’avoir du recul sur la progression de l’obésité Facilité de Choix du régime obésifiant et de ses et de la mise en place de ses mise en composés ainsi que de la souche de complications de la même manière place souris primordiaux que cela se passe chez un humain qui se nourrirait avec un régime HFD sur le long terme
141 Besoin d’études de ces modèles d’obésité en ajoutant le facteur Limites et Lien avec le microbiote encore mal « variation du microbiote intestinal » besoins de exploré de manière précise et que ce soit dans sa composition, ses raffinement répétable. fonctions et ses interactions métaboliques avec son hôte
Shively et al., 2019160 ; Astuti et al., Référence Nguyen et al., 20155 ; Pinheiro-Castro et 2009161 ; Schmitt et al., 2018155 ; Nagpal (s) al., 2019127 et al., 2018 141 ; Pinheiro-Castro et al., 2019127
Plus récemment, les chercheurs ont découvert que des facteurs épigénétiques, in utero, prédisposent également les individus à l’obésité. Cela a été observé en premier lieu chez l’Homme. Mais l’animal semble pouvoir être un bon modèle pour étudier les mécanismes prédisposant les individus dès leur développement fœtal. Le modèle animal présente en effet un avantage éthique évident, et la faible durée de vie des rongeurs permet aussi de pouvoir dans un premier temps étudier ces effets sur le long terme de manière réduite dans le temps (Speakman et al., 2007129). Cependant, la prolificité des rongeurs et leurs différences en termes de placentation rend l’étude des phénomènes épigénétiques de prédisposition à l’obésité peu valable d’un point de vue translationnel. Là encore, la proximité phylogénétique des PNH avec l’Homme en fait un modèle de choix pour étudier ces facteurs. Des études s’intéressant aux altérations du microbiote du juvénile à cause d’un régime HFD pendant la gestation ont d’ailleurs déjà été publiées (Ma et al., 2014162).
L’obésité humaine peut être modélisée chez la souris et les PNH de différentes manières (spontanés, OGM ou induits par un régime obésifiant). A la fois chez le modèle murin et simien, les variations du microbiote intestinal en réponse à la pathologie métabolique semblent être orientées de la même façon que chez l’Homme. Les modèles murins génétiquement modifiés permettent d’étudier l’origine génétique de manière spécifique de cette maladie. Chez les PNH, plusieurs espèces sont naturellement prédisposées à ces symptômes, dont l’origine est multifactorielle, comme chez l’humain. Les symptômes de l’obésité chez le PNH sont par ailleurs très similaires à ceux observés chez l’Homme. Le grand avantage des PNH, par rapport à la souris, est la possibilité de suivre et mesurer un grand nombre de paramètre clinique, permettant une évaluation juste et complète de la pathologie. Enfin, les PNH permettent un suivi des symptômes sur tous les stades de développement de manière comparable à l’Homme (pendant la gestation, le développement et lors de complications cardio-métaboliques) et donc de potentielles études à la fois de méthodes préventives et thérapeutiques.
Néanmoins, bien que ce soit pour des objectifs d’études différents, la littérature sur le microbiote intestinal de la souris et des PNH obèses est limitée et aura besoin d’être approfondie à l’avenir.
142 2.1.6. Modèles de diabète de type 2
De la même façon que les modèles animaux d’obésité, il y a différentes manières d’induire un modèle diabétique. Les modèles souris et PNH diabétiques présentés et comparés ci-dessous sont classés en fonction de leur mode d’induction.
2.1.6.a Modèles de diabète de type 2 spontanés ou génétiques naturels
Tableau XL : Synthèse des modèles spontanés ou génétiquement naturels de diabète de type 2 chez la souris et le PNH
Critères Souris Macaque
Modèles obèses - Souris mutée (monogénique) db/db (affecte le récepteur de la Espèces PNH prédisposées au leptine) diabète sucré (spontané avec l’âge) : - Souris mutée ob/ob (gène de la leptine) Macaques cynomolgus (Macaca - Souris KK fascicularis), rhesus (Macaca mulatta) Modèles de - Souris KK/Ay (modèle obèse), à bonnet (Macaca diabète de - Souris NZO radiata), de Formose (Macaca cyclopis), à type 2 - Souris NONcNZO10 queue de cochon (Macaca nemestrina), et disponibles - Souris TSOD des Célèbes (Macaca nigra) - Souris M16 Singe vert africain ou vervet (Chlorocebus aethiops) Modèles non obèses Babouin (Papio papio) - Souris non obèse mutée C57 BL/6 (Akita) - Souris ALS/Lt
L’influence de régime HFD sur le Des liens entre la présence du microbiote intestinal du PNH a été microbiote et l’endotoxémie ont été Prise en étudiée mais il ne semble pas exister montré chez la souris diabétique mais compte du d’études dans la littérature, qui il ne semble pas exister d’études de la microbiote considèrent comme un réel facteur de composition et de variations de la intestinal variation et qui analysent le composition du microbiote intestinal microbiote intestinal chez le PNH chez la souris diabétique diabétique
Evaluation génétique : identification Objectifs de gènes candidats qui contribueraient Prise en compte de la clinique du des études à la pathogénèse de la maladie (intérêt DT2 et de ses complications dans sa utilisant ces double des modèles animaux souris : globalité, sur le long terme modèles connaissances de leur fond génétique et suivi clinique possible)
143 Développement spontané du DT2 sous dépendance génétique Caractéristiques globales ressemblantes au DT2 humain Fond génétique homogène et contrôle Contrairement aux modèles rongeurs, des facteurs environnementaux : la perte finale de la sécrétion possibilité de faire facilement des d’insuline est liée au dépôt Qualité études génétiques poussées de cette d’amyline/amyloïde dans les cellules β scientifique maladie multifactorielle. et le développement de complications du modèle Part génétique importante du similaires à celles observées chez développement de la maladie chez les l’Homme atteint de DT2 modèles souris Souris KK : obésité, hyperinsulinémie et hyperglycémie modérées Souris NYS1 : développe un diabète seulement avec l’âge
Développe une obésité, une hyperinsulinémie et une résistance à l’insuline lorsqu’il est nourri ad libitum avec un repas complet classique de Chez l’Homme, on ne sait pas dire si laboratoire. Cela va progressivement c’est l’obésité qui provoque la conduire à la nécrose des cellules β, résistance à l’insuline ou le contraire ; une chute sévère de la production Qualité chez les modèles souris, c’est d’insuline et une hyperglycémie clinique du clairement l’obésité qui les prédispose déclarée sur une période de plusieurs modèle au DT2. années. Dépend comme chez l’Homme du Généralement les symptômes et la sexe, de l’âge et du bagage génétique physiopathologie de la maladie est très de l’animal similaire à ce qui se passe chez l’humain (état prédiabétique puis diabète déclaré) : c’est démontré pour le macaque rhésus, cynomolgus et le babouin
Disponibilité réduite et modèles coûteux, maintenance complexe Facilité de Mortalité élevée liée à des problèmes Nécessite un temps très long pour mise en de cétose chez les modèles dont le observer les symptômes et les place pancréas est fragile et nécessite des complications du DT2 traitements à l’insuline pour permettre la survie pour les stades terminaux.
144 Il n’y a pour l’instant aucun modèle souris qui remplit tous les critères d’un bon modèle de DT2 humain (résistance à l’insuline, obésité, dysfonctionnement pancréatique et complications cardiovasculaire) Il manque d’études sur le microbiote Limites et intestinal des PNH diabétiques, besoins de Modèles hautement consanguins, permettant de statuer sur la similarité raffinement homogènes et pour la plupart liés à de variations de composition avec une mutation sur un unique gène et le celle de l’Homme développement du diabète de ces modèles est principalement d’origine génétique contrairement à l’Homme, pour lequel le DT2 à de multiples origines.
Pinheiro-Castro et al., 2019127 ; K. Srinivasan et P. Ramarao, 2007163 ; Pound Référence(s) Srinivasan et P. Ramarao, 2007163 ; et al., 2014165 Cefalu, 2006164
2.1.6.b Modèles de diabète de type 2 induits par un régime alimentaire
De la même façon que pour les modèles d’obésité, les modèles de diabète de type 2 peuvent être induits par un régime alimentaire spécifique, choisi pour sa capacité à favoriser la mise en place d’un diabète sucré.
Tableau XLI : Synthèse des modèles de diabète de type 2 induits par un régime alimentaire spécifique chez la souris et le PNH
Critères Souris Macaque
PNH (Macaca mulatta) nourri avec un régime riche en fructose Animaux nourris pendant 1 an avec un repas complet de laboratoire (11% Souris obèse C57 BL/6J kcal de matière lipidique) supplémentée avec une boisson Modèles de Souris obèse Spiny sucrée au fructose (environ 30% des diabète de Administration d’un régime riche en calories totales du régime) type 2 graisse et en sucrose : accélère le Possibilité de nourrir les animaux avec disponibles développement de la maladie chez ces un régime HFD, mais les symptômes animaux obtenus après régime sont aléatoires (parfois l’animal reste mince et métaboliquement sain, d’autres fois, il développe une obésité, une résistance à l’insuline et une dyslipémie)
145 Prise en compte du Littérature très limitée voire Littérature très limitée voire microbiote inexistante sur le sujet inexistante sur le sujet intestinal
Modèle du macaque rhésus supplémenté en fructose : modèle pratique pour réaliser des études de Objectifs pathogénèses, préventives et de Etude à la fois de l’implication du des études thérapeutiques génome et des facteurs de risques du utilisant ces DT2 Capacité de développer des études de modèles génotypes/phénotypes du DT2 (notamment gènes impliqués dans la défaillance des cellules β pancréatiques)
Ce modèle développe un diabète à cause d’une sévère obésité, à cause une surnutrition/surconsommation d’aliments obésifiants Développe une obésité et un diabète à Qualité Facteurs physiopathologiques cause une scientifique identiques à l’Homme : sécrétion et surnutrition/surconsommation du modèle action de l’insuline altérées d’aliments obésifiants Facteurs à la fois génétiques et environnementaux contrairement aux autres modèles souris de DT2
Apparition d’un syndrome métabolique en 6 à 12 mois chez tous les macaques supplémentés avec du Obésité marquée, hyper insulinémie, fructose (dyslipémie, adiposité Qualité résistance à l’insuline, notamment centrale, résistance à l’insuline). Cette clinique du périphérique, et intolérance au réponse est tout à fait similaire à ce modèle glucose que l’on observe chez l’humain Hyperglycémie basale marquée à jeun Cependant, d’autres études n’ont pas observé de syndrome métabolique prédiabétique mais seulement des biomarqueurs d’altérations hépatiques
Facilité de Demande une longue période d’alimentation selon un régime HFD ou mise en équivalent avant de voir les premiers symptômes (très supérieure chez le PNH) place
146 Pas d’hyperglycémie franche chez les animaux qui n’ont pas un terrain génétique diabétique. Ils ne sont donc Pas d’hyperglycémie franche chez les pas adaptés pour l’étude de potentiels animaux qui n’ont pas un terrain traitements du diabète. Limites et génétique diabétique. Ils ne sont donc besoins de pas adaptés pour l’étude de potentiels Les modèles PNH supplémentés raffinement traitements du diabète. seulement en fructose excluent le régime HFD (notamment les graisses
saturées et le cholestérol) des facteurs d’influence de la mise en place du DT2
Pound et al., 2014165 ; Bremer et al., Référence(s) K. Srinivasan et P. Ramarao, 2007163 2011166 ; K. Srinivasan et P. Ramarao, 2007163 ; Cefalu, 2006164
2.1.6.c Modèles de diabète de type 2 induits chimiquement
Il est possible d’utiliser un certain nombre de molécules cytotoxiques pour induire un DT2. En effet, le Goldthioglucose (GTG) ou la streptozotocine (STZ) sont classiquement utilisées pour provoquer la destruction des cellules β du pancréas chez la souris. Il est possible d’utiliser cette technique chez le PNH, mais ce modèle reste peu utilisé.
Tableau XLII : Synthèse des modèles murins de diabète de type 2 induits chimiquement
Critères Souris
Modèles de Souris obèse traitée au GTG diabète de type 2 disponibles Souris non obèse traitée à faible dose à l’alloxane ou le STZ
Prise en compte Rares études sur le sujet du microbiote Pas d’étude sur l’influence des produits cytotoxiques sur le microbiote intestinal intestinal de la souris
Objectifs des Etude sur le court terme études utilisant Etude simple, ne s’intéressant uniquement aux effets de la diminution de ces modèles la sécrétion d’insuline rapide
Perte sélective des cellules β pancréatiques (alloxane ou STZ) laissant les autres cellules du pancréas intactes Qualité Mais l’hyperglycémie instantanée est due à l’action cytotoxique du produit scientifique du administré sur les cellules β et à la déficience en insuline plutôt qu’à la modèle résistance à l’insuline Diabète obtenu peu stable et parfois réversible (régénération des cellules β). Il faut donc éviter d’utiliser ce modèle sur le long terme
147 En plus de la petite taille de l’animal, qui limite grandement l’étude clinique, l’induction chimique est radicale, non progressive et ne permet pas d’obtenir un tableau clinique complet similaire au DT2 chez l’Homme. Qualité clinique du modèle Induction au GTG : hyperphagie et obésité, augmentation des lipides corporels, de la lipogenèse hépatique et de la sécrétion de triglycérides, augmentation de la lipogenèse du tissu adipeux et diminution du métabolisme musculaire du glucose (similaire aux souris génétiquement modifiées)
Une sécrétion résiduelle d’insuline persiste et permet de maintenir les animaux en vie longtemps sans traitement à base d’insuline Peu de mortalité liée à une cétose secondaire Peu coûteux, facile à mettre en place et animaux plus simple à entretenir Facilité de mise sur le long terme en place L’induction via le GTG nécessite un temps très long avant la mise en place de l’obésité et la mortalité suivant l’injection est très haute. Il existe de nombreuses complications à la suite de l’administration d’alloxane ou de STZ : neuropathies, cardiomyopathies et aussi de sévères rétinopathies
Il faut voir si un composé chimique permettrait une destruction irréversible des cellules β du pancréas pour pouvoir utiliser ce modèle à long terme. Les actions cytotoxiques des produits d’induction ne se limitent pas aux cellules β mais peuvent altérer d’autres organes de l’animal. La potentielle action délétère du composé chimique cytotoxique sur le Limites et microbiote intestinal pose un problème. En effet, cela peut provoquer besoins de une réelle perturbation de l’équilibre du microbiote intestinal et donc un raffinement biais pour l’étude de son implication dans la physiopathologie du DT2. Ce modèle reste éthiquement critiquable, puisque la viabilité des animaux induits reste incertaine, et qu’il faut donc prévoir un nombre important d’animaux pour avoir des résultats statistiquement exploitables et interprétables. De plus, il existe une variabilité d’hyperglycémie entre les animaux induits ce qui ajoute encore un biais et rend ce modèle difficilement transposable à l’Homme.
Référence(s) K. Srinivasan et P. Ramarao, 2007163
Les PNH sont aussi fréquemment rendu diabétique à avec un traitement à la STZ, mais ce modèle présente un large panel d’effets secondaires dus à la molécule. Ces effets secondaires ont été montrés par les chercheurs Kim et al. (2016)167 chez le macaque rhésus (Macaca mulatta). Ils ont observé de sévères effets néfastes tels que la mort d’un animal, une sévère toxicité hépatique et une sévère pancréatite. Il faut donc encore largement raffiner ce modèle pour qu’il soit acceptable. Il faut d’ailleurs se demander s’il possède une réelle justification scientifique d’utiliser cette méthode sur des animaux naturellement prédisposés au diabète et à l’obésité. Il se pose également une question éthique, car il est difficilement concevable d’utiliser des molécules cytotoxiques, potentiellement mortelles, à des animaux si précieux scientifiquement, si chers et si peu disponibles.
148 2.1.6.d Modèles de diabète de type 2 induits chirurgicalement
L’un des moyens les plus efficaces pour étudier les effets de l’hyperglycémie chez un modèle animal est de lui retirer le pancréas, de manière partielle ou totale. Le choix de l’espèce animale dépend de nombreux facteurs. De manière globale, plus l’animal choisi est petit moins le coût de chirurgie, d’entretien et de manipulation est élevé. La souris et le rat ayant subi une pancréatectomie sont les modèles animaux les plus utilisés pour cette méthode d’induction. On part généralement du principe en recherche biomédicale que si l’objectif d’une étude ne peut être rempli en utilisant un modèle rongeur, alors on utilisera un modèle mammifère plus grand (chien, chat, porc, ou PNH). Souvent, les modèles rongeurs ne permettent pas de mimer pleinement les symptômes ou caractéristiques d’une maladie humaine ce qui justifie l’utilisation de modèles plus complets comme le primate non humain168.
Tableau XLIII : Modèles de diabète de type 2 induits chirurgicalement par une pancréatectomie totale ou partielle.
Critères PNH
Modèles de PNH ayant subi une pancréatectomie partielle diabète de type 2 disponibles (Technique utilisée également chez la souris, le rat, le porc et le chien)
Objectifs des Etude clinique du DT2 études utilisant ce modèle Etude d’efficacité de traitement
Prise en compte du microbiote Absence de données chez le PNH ayant subi une pancréatectomie intestinal
Permet d’éviter les effets cytotoxiques sur d’autres organes que le Qualité pancréas des modèles chimiquement induits scientifique du De la même façon que précédemment, l’arrêt de sécrétion brutal de modèle l’insuline provoque une hyperglycémie qui n’est pas due à une résistance à l’insuline progressive.
Qualité clinique Ressemble fortement au DT2 humain à cause du nombre réduit de du modèle cellules β pancréatiques
Processus chirurgical et anesthésique lourd Soins postopératoires complexes, pouvant provoquer de nombreuses Facilité de mise complications liées à la laparotomie en place La chirurgie peut provoquer d’autres problèmes digestifs (déficience d’autres enzymes et hormones produites par le pancréas) Mortalité élevée à la suite de cette procédure
149 Modèle à envisager chez le PNH uniquement en cas d’une maitrise Limites et parfaite de l’analgésie et de l’anesthésie au cours et après la chirurgie besoins de On peut s’interroger de la justification scientifique du modèle pour une raffinement procédure si lourde et risquée pour des animaux très peu accessibles et qui de plus sont capables de développer spontanément du DT2
Référence(s) K. Srinivasan et P. Ramarao, 2007163
2.1.6.e Modèles de diabète de type 2 transgéniques
Tableau XLIV : Synthèse des modèles transgéniques de diabète de type 2 chez la souris.
Critères Souris
Souris obèse KO pour le récepteur β3 Souris obèse KO pour la protéine UCP1 (de l’anglais « Uncoupling ») Souris non obèse transgénique ou KO pour des gènes impliquant Modèles de l’insuline ou les récepteurs de l’insuline et les molécules de signal en aval diabète de type 2 de la libération de l’insuline (par exemple : IRS-1, IRS-2, GLUT-4, PTP- disponibles 1B …) Souris non obèse KO pour le gène PPAR-γ (tissu spécifique) Souris non obèse KO pour le gène de la glucokinase ou GLUT 2
Prise en compte du microbiote Littérature très limitée voire inexistante sur le sujet intestinal
Objectifs des Etude d’un gène unique et de ses effets in vivo études utilisant ces modèle Permet une dissection de la génétique complexe du microbiote intestinal
Qualité Modèles non représentatifs de la pathologie humaine dans son entièreté scientifique du modèle
Les phénotypes obtenus varient en fonction de la mutation étudiée : Qualité clinique hyperglycémie modérée à sévère, une résistance à l’insuline, une du modèle hyperinsulinémie, une tolérance au glucose altérée.
Facilité de mise Comme pour les modèles transgéniques d’obésité, extrêmement lourd et en place coûteux à mettre en place, demande énormément d’animaux
150 Etude de la mutation d’un gène en ajoutant le facteur « composition du microbiote » comme facteur d’influence potentiel. Limites et Récemment, des modèles murins KO tissus spécifiques ont été mis au besoins de point, et permettent d’étudier les actions locales de l’insuline notamment. raffinement Maladies multifactorielles et très souvent polygéniques donc les modèles monogéniques sont intéressants mais ne représentent pas ce qui est observé chez l’Homme.
Référence(s) K. Srinivasan et P. Ramarao, 2007163
Bien qu’il soit très avantageux d’utiliser le modèle souris par rapport aux autres espèces (coûts moindres, cohortes plus importantes etc.), la souris ne présente pas la même pathologie au niveau des cellules pancréatiques que l’Homme diabétique (îlots amyloïdes). Les modèles diabétiques murins développent surtout un diabète en lien avec une obésité sévère. De plus, aucun des modèles souris ne présente actuellement l’ensemble des caractères nécessaires pour mimer le diabète sucré de type 2 humain. Cependant, les souris restent un modèle intéressant pour étudier un point précis de la physiopathologie de la maladie, comme le rôle d’un gène, d’une protéine, etc. (Cefalu, 2006164).
Les PNH sont adaptés pour étudier le DT2 et de potentielles traitements. Comme chez les humains, la maladie se déclare spontanément chez les individus âgés et obèses. Avant de déclarer un vrai diabète, les PNH ont un état prédiabétique, c’est-à-dire une période de résistance à l’insuline associée à une obésité, qui se compense dans un premier temps avec une augmentation de la sécrétion d’insuline. Lorsque la déficience en insuline totale ou partielle est en place, la glycémie à jeun commence à augmenter et les premiers symptômes de diabète se mettent en place. Les changements dans les îlots pancréatiques sont les mêmes que chez l’humain diabétique (hyperplasie des îlots remplacé progressivement par des îlots amyloïdes). Les PNH diabétiques présentent des changements de concentrations plasmatiques des lipides et lipoprotéines, des changements de composition des lipoprotéines et une glycation ce qui contribuent à la mise en place de l’athérosclérose. Leur état prédiabétique est similaire à ce que l’on définit chez l’Homme comme le syndrome métabolique. Un des avantages majeurs de l’utilisation du PNH pour l’étude du DT2 est le développement d’athérosclérose, ce qui permet d’étudier ces complications cardiovasculaires également présentes chez l’Homme. Tous ces éléments justifient le fait que le PNH est de plus en plus utilisé comme modèle de DT2, notamment pour des études pharmacologiques, des études de progression et d’aggravation de la maladie, ainsi que de ses facteurs de risques (informations tirées de la revue « Old World Nonhuman Primate Models of Type 2 Diabetes Mellitus », Wagner et al., 2006169).
151 Le diabète de type 2 humain peut être modélisée chez la souris et les PNH de différentes manières (spontanés, OGM, induits par un régime alimentaire spécifique, chimiquement et chirurgicalement). La littérature sur l’implication du microbiote intestinal dans la mise en place des troubles métaboliques chez les modèles murins et simiens est quasiment limitée aux articles disponibles sur l’obésité. De la même manière que pour les modèles obèses, les modèles murins permettent d’étudier l’origine génétique, ou bien une voie métabolique précise de la maladie. Chez les PNH, plusieurs espèces sont naturellement prédisposées au DT2, dont l’origine est multifactorielle, comme chez l’humain. L’intérêt clinique de ces espèces est le même que pour l’obésité. Les complications notamment cardiovaculaires sont chez le PNH identiques à celles trouvées chez l’Homme ce qui en fait un très bon modèle pour une étude des effets chroniques de cette maladie.
La littérature à propos des liens unissant le microbiote intestinal et le DT2 ne sont que très peu étudiés chez les modèles animaux.
2.1.7. Modèles de diabète de type 1
Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune, caractérisée par un commencement brutal via une sévère hyperglycémie, une progression rapide vers une acidocétose diabétique, et la mort s’il n’est pas traité rapidement à l’insuline. Cette maladie atteint des personnes génétiquement prédisposées. De la même façon que pour l’obésité et le diabète de type 2, il existe des modèles animaux permettant d’étudier sa physiopathologie mais aussi de mettre au point et de tester de nouvelles thérapeutiques. L’origine auto- immune du diabète de type 1 rend sa modélisation plus délicate, puisqu’il n’existe a priori aucun animal, rongeur ou PNH, chez lequel le diabète sucré a cette même origine.
Tableau XLV : Synthèse des modèles de diabète de type 1 chez la souris et les PNH
Critères Souris Macaque
Modèles transgéniques : Souris NOD (de l’anglais « Non Obese Diabetic ») Modèles induits Modèles de Souris NOD KO-MyD88 chimiquement (STZ) diabète de Ces souris transgéniques développent Destruction des cellules β type 1 spontanément un DT1 globalement pancréatiques (macaque rhésus, vervet disponibles similaire à ce que l’on observe chez ou autre PNH) l’Homme Modèles induits chimiquement (STZ)
152 Il n’existe pas de modèle souris qui présente spontanément une destruction auto-immune des cellules β du pancréas, qui présente toutes les Comme pour la souris, il n’existe pas caractéristiques du DT1 humain. C’est de modèle reconnu qui développerait pourquoi la souris NOD qui un diabète d’origine auto-immune. développe un diabète spontanément est utilisé. Les seuls modèles primates Qualité disponibles sont les modèles qui Modèle induit chimiquement scientifique développent un diabète sucré avec permettent une destruction totale des du modèle l’âge ou les modèles induits par des cellules β pancréatiques et provoque produits chimiques principalement la un phénotype de DT1 insulino- STZ dépendant (hyperglycémie importante qui peut nécessiter un traitement avec L’étiologie reste donc différente de de l’insuline exogène). celle de la maladie humaine Mais pour ces deux modèles, l’étiologie est différente de celle de la maladie humaine
Modèle malgré tout d’une grande valeur pour l’étude des complications microvasculaires (neuropathie, néphropathie, rétinopathie etc.) Développement d’une insulite chez la souris NOD vers 4-5 semaines suivi par une destruction subclinique des cellules β et une diminution de la concentration d’insuline. Un diabète franc se déclare entre 12 et 30 Symptômes similaires à ce que l’on semaines d’âge. L’acidocétose est observe chez l’humain présentant un Qualité relativement modérée contrairement à DT1 : hyperglycémie brutale par clinique du l’Homme et les animaux atteints absence ou taux sanguin très faible modèle peuvent survivre plusieurs semaines d’insuline sans administration d’insuline. Contrairement à ce que l’on observe chez l’Homme, il y a chez la souris une grande différence liée au genre : le diabète se développe chez 90% des femelles contre 60% chez les mâles Le modèle souris NOD est très analogue au DT1 humain : il a permis de nombreuses découvertes sur la maladie notamment génétiques
Rees et Alcolado, 2005168 ; Lu et al., Référence(s) Rees et Alcolado, 2005168 ; Cefalu, 2006164 2015170
153 2.1.7.a Modèle murin humanisé de diabète de type 1
Dans l’objectif de gommer les différences entre la souris et l’Homme et ainsi augmenter la valeur translationnelle du modèle murin, la souris humanisée présente de nombreux avantages, permettant l’évaluation du développement de cellules et tissus humains dans un contexte in vivo chez un petit animal. La souris humanisée est définie comme une souris greffée avec des cellules fonctionnelles ou des tissus humains, de différents types (cellules du système immunitaire, hépatocytes, tissu cutané, îlots pancréatiques, etc.). Pour l’étude du DT1, la destruction des îlots pancréatiques par des autoantigènes provoque l’arrêt de sécrétion d’insuline et une hyperglycémie chez les individus atteints. Des souris NSG (immunodéficientes) exprimant le gène HLA-DR4 peuvent être greffées avec des lymphocytes T CD4+ sensibilisés à un peptide spécifique des îlots pancréatiques dérivés d’un autoantigène. L’insulite médiée par les autoantigènes induite par l’infiltration des lymphocyte T humain dans les îlots pancréatiques murins provoque leur destruction (informations tirées de l’article « Humanized mice: A brief overview on their diverse applications in biomedical research » Fujiwara, 2018 33). On obtient alors un DT1 d’origine auto-immune, ce qui permet d’étudier la pathogénèse de la maladie chez l’animal.
On peut conclure que les modèles murins et PNH ne sont a priori pas de bons modèles du DT1 humains puisque l’étiologie des symptômes n’est pas auto-immune. Néanmoins, ces modèles induits chimiquement ou génétiquement peuvent permettre d’étudier de nouveaux traitements. La souris humanisée est dans ce cas un meilleur modèle pour l’étude de la pathogénèse, puisque l’origine des symptômes de DT1 est dysimmunitaire.
Alors que le microbiote intestinal est supposé être en lien avec cette maladie chez l’Homme, aucune étude sur le sujet n’a été conduite chez les modèles animaux.
154 2.5. SYNTHESE : APPORTS DU MODELE SOURIS ET PNH A L’ETUDE DU MICROBIOTE INTESTINAL ET DES PATHOLOGIES METABOLIQUES ASSOCIEES
Comme nous l’avons vu, la souris et les PNH présentent des qualités scientifiques différentes en tant que modèle d’étude du microbiote intestinal humain et des maladies métaboliques associées.
Pour étudier le microbiote intestinal dans un contexte sain ou pathologique, les modèles animaux présentent de nombreux avantages par rapport à l’étude des populations humains. En effet, dans le milieu du laboratoire, les chercheurs peuvent parvenir à maitriser tous les facteurs voulus, et notamment des facteurs environnementaux (hébergement, congénères, etc.), influençant la composition du microbiote. Ils peuvent donc choisir une espèce voire une souche avec un statut sanitaire identifié voir un microbiote intestinal connu (animal gnotobiotique). En les soumettant ensuite à un régime alimentaire spécifique et contrôlé, ils sont capables de reproduire des conditions retrouvées dans les populations humaines et ainsi d’en évaluer les effets. De plus, ils ont à leur disposition un large choix de modèles pathologiques aussi bien chez le PNH et la souris. Les principaux avantages et inconvénients scientifiques des modèles murins et simiens de maladies métaboliques sont résumés dans le Tableau XLVI ci-dessous.
Tableau XLVI : Synthèse des principaux critères de similarité avec l’Homme, des avantages et limites majeures de la souris et du macaque pour l’étude du microbiote intestinal et des pathologies métaboliques associées. (Sources : Kleinert et al., 2018171 ; Nguyen et al., 20155)
Souris PNH
• Physiologie et anatomie très proche de celles de l’humain • Très nombreux modèles disponibles (obésité, • Identité génétique proche de celle de DT2, DT1) l’humain (environ 99% de similarité) • Outil pertinent pour la manipulation • Valeur translationnelle incontestable génétique : possibilité de créer des souris • Possibilité de mener un suivi clinique transgéniques approfondi et divers examens • Permet de cibler un gène et son rôle complémentaires (biopsie, prélèvements métabolique dans les interactions sanguins, endoscopie, etc.) hôte/microbiote dans un contexte sain ou • Système immunitaire semble très similaire à pathologique en utilisant par exemple des celui de l’Homme modèles murins KO • Microbiote intestinal le plus proche de celui • Technologies de phénotypage disponibles de l’humain parmi les mammifères utilisés • Mammifère omnivore dont l’anatomie et la en expérimentation animale physiologie restent proches de celles de • Qualité scientifique et surtout clinique des
l’Homme modèles de pathologies métaboliques Avantages du modèle Avantagesdu • Génétique homogène et système « propre » largement supérieure aux modèles rongeurs permet de pouvoir distinguer chaque signal de • Présentent généralement les mêmes l’interaction hôte/microbiote et d’améliorer la mécanismes physiopathologiques et les répétabilité des expérimentations mêmes complications des maladies • Modèles généralement peu coûteux métaboliques • Cycle de vie court et prolificité élevée • Animaux peu consanguins, donc plus représentatifs des populations humaines
155 • Différents de l’humain d’un point de vue génétique, anatomique et physiologique et donc le modèle murin ne peut pas complètement mimer une pathologie humaine • Architecture des îlots pancréatiques distincts de • Coûteux à l’achat et l’entretien chez l’humain • Animal peu disponible • Composition du microbiote intestinal • Peu de structures adaptées différente quantitativement de l’Homme • Potentiels problèmes éthiques • Les variations de composition du microbiote • Cycle de vie long et prolificité réduite (1
intestinal ne sont pas toujours les mêmes pour seul descendant par gestation, rarement 2)
une pathologie donnée selon le modèle murin • Mise en place des pathologies spontanées utilisé sur le long terme • Les interactions hôte-microbiote sont • Encore de nombreuses lacunes dans les spécifiques de l’hôte : ce qui se passe chez la connaissances sur les signatures spécifiques souris n’est pas forcément similaires à ce que de son microbiote intestinal et sur les l’on observe chez l’Homme. différences qu’il présente par rapport à • Les multiples facteurs environnementaux l’Homme
Limites du modèle du Limites influençant la composition du microbiote • Certains articles mettent en évidence de intestinal chez l’Homme ne sont pas retrouvés réelles différences entre le microbiote du dans le milieu du laboratoire PNH et celui de l’Homme • Génétique homogène des souris utilisées en • Pas de possibilité de mener une étude sur recherche : non représentatif de la variabilité une grande cohorte génétique des populations humaines • Les modèles monogéniques ne sont pas, dans la majorité des cas, représentatifs des maladies humaines • Souvent non adaptée pour l’étude de nouveaux traitements
Lors d’études de ces pathologies métaboliques, il faudra désormais raffiner les modèles, et tenir compte de manière quasi systématique de l’influence des espèces de microorganismes vivant dans le tractus digestif. Les différents facteurs à prendre en compte lors de la conception du design de ces études sont résumés dans la Figure 26. Il y manque cependant le paramètre « microbiote intestinal » qui a tout à fait sa place dans ce schéma.
156
Figure 26 : Paramètres expérimentaux importants et potentielle facteurs de confusion dans le cadre de la recherche sur l’obésité et le diabète (Source : « Animal models of obesity and diabetes mellitus », Kleinert et al., 2018171)
157
158 MICROBIOTE INTESTINAL, MALADIES METABOLIQUES ET PRIMATE NON HUMAIN
Dans les parties précédentes, nous avons vu que l’utilisation des espèces PNH avait un réel intérêt scientifique pour l’étude du microbiote intestinal sain ou dans le cadre de pathologies métaboliques et que sa valeur translationnelle pour l’Homme était indéniablement supérieure que celle des autres mammifères utilisés à des fins scientifiques pour ce domaine. Nous allons maintenant discuter des questions éthiques et réglementaires de l’utilisation des PNH à des fins scientifiques dans ce contexte d’étude du microbiote. Nous essaierons ensuite d’identifier l’ensemble des critères à prendre en compte lors de l’élaboration du design d’une étude de ce type, notamment le choix de l’espèce, le choix du modèle de maladie métabolique, mais aussi l’âge, le sexe, l’origine et le statut sanitaire des animaux choisis. Enfin, nous aborderons l’aspect pratique de l’hébergement des PNH en laboratoire, d’un point de vue réglementaire d’une part, et pour l’étude du microbiote d’autre part.
3.1. CADRE ETHIQUE ET REGLEMENTAIRE DE L’UTILISATION DE L’ANIMAL EN EXPERIMENTATION 3.1.1. Ethique et expérimentation animale
Bien que controversée, l’utilisation de l’animal en recherche reste une pratique encore nécessaire pour comprendre la complexité du vivant, pour progresser dans les domaines scientifiques et médicaux, pour protéger l’Homme de manière générale. Comme le disait déjà Claude Bernard en 1865, utiliser un animal en expérimentation n’est pas moins légitime que toutes ses autres utilisations (élevage, compagnie etc.). Chaque espèce n’est de même pas plus légitime qu’une autre. Elles sont toutes susceptibles d’apporter une valeur scientifique différente, en fonction de l’objectif de leur utilisation et par rapport à leur proximité avec l’Homme.
« L’éthique de l’expérimentation animale est fondée sur le devoir qu’a l’Homme de respecter les animaux en tant qu’êtres vivants et sensibles, susceptibles de ressentir douleur, souffrance et angoisse. » (Article 1 de la Charte Nationale portant sur l’Ethique de l’Expérimentation animale172). En effet, l’Homme est responsable moralement quant à l’utilisation raisonnée et respectueuse de l’animal en recherche. Selon les articles 5 et 6 de cette même charte, l’utilisation des animaux doit toujours être précédée d’une réflexion portant sur le « bien-fondé scientifique, éthique et sociétal » de l’expérimentation. Un grand nombre de critères doivent être évalués au préalable pour une utilisation raisonnée et optimale de l’animal et pour une finalité scientifique précise. Ces axes de réflexions peuvent être résumés dans les principes des 3R.
3R : Remplacer, Réduire et Raffiner, sont les grands axes de la réflexion pour une bonne utilisation de l’animal en recherche. Ces principes ont été créés en 1959 par W. Russel et R. Burch dans leur ouvrage « The Principles of Humane Experimental Research »173. Les grands axes des 3R sont décrites succinctement dans le Tableau XLVII ci-dessous.
159 Tableau XLVII : Les principes des 3R (Source : W Russel et R Burch, UFAW 1959173)
REMPLACER • Utiliser des méthodes alternatives à l’animal (modélisation informatique, test in vitro, etc.) • Utiliser les espèces les « moins sensibles »
REDUIRE • Le nombre d’animaux • Le nombre de procédures
RAFFINER • Les procédures expérimentales pour une meilleure qualité scientifique des données • Les pratiques pour réduire au maximum le stress, la douleur (télémétrie, anesthésie, analgésie etc.) et maximiser le bien-être (hébergement, enrichissement, etc.)
L’étude du microbiote chez le PNH rentre bien dans le cadre de l’expérimentation animale car elle demande un contrôle des paramètres environnementaux d’hébergement et ne peut être réalisée en milieu sauvage. En effet, pour contrôler le microbiote du primate, il faut contrôler l’apport des germes par l’environnement dans lequel il vit : l’opérateur, les aliments, les enrichissements, la litière, etc. Le régime alimentaire, certains traitements (antibiotiques, immunosuppresseur, ...) peuvent être nécessaires. Les prélèvements réalisés peuvent être des prélèvements fécaux ou des biopsies intestinales mais ne doivent en aucun cas être en contact avec un environnement microbien non contrôlé. Enfin, pour l’étude des relations entre maladies et microbiote dans le cadre de la recherche translationnelle, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux de maladies déjà existants et de les raffiner en y ajoutant le facteur « microbiote ». Toutes ces potentielles actions sur le PNH en vue de l’étude du microbiote sont des expérimentations, et doivent donc respecter le cadre éthique décrit ci-dessus, mais aussi le cadre règlementaire détaillé ci-après. 3.1.2. Institutions et textes fondateurs du cadre éthique et réglementaire de l’expérimentation animale
En France, la règlementation idoine est basée sur la Directive 2010/63/UE2 du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques, décrit le cadre règlementaire de l’utilisation de l’animal en expérimentation. Ce texte est transcrit dans la loi française par le Décret 2013-118174 et par 5 arrêtés (application au premier Février 2013) :
- Evaluation éthique et autorisations de projets - Agrément des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs - Acquisition et validation des compétences - Conditions de fourniture de certaines espèces - Acquisition et utilisation des médicaments
Cette règlementation régit l’expérimentation des animaux vertébrés et des céphalopodes. L’utilisation du PNH y est particulièrement décrit car il est considéré comme une espèce « sensible ». On parle d’espèce « sensible », c’est-à-dire contraignante à héberger, dotée d’importantes capacités cognitives, et sensible enfin par rapport à l’opinion du grand public. Trois grandes entités interagissent et interviennent à différents niveaux dans l’élaboration et l’autorisation
160 de nouveaux projets de recherche. L’autorité est représentée par deux ministères : le Ministère chargé de la Recherche (secrétariat des autorisations de projets) pour la gestion des autorisations de projet et le Ministère chargé de l’Agriculture (préfectures et DDPP) pour la surveillance sanitaire et la protection animale. Les projets sont conduits dans des établissements agrées (utilisateurs, éleveurs ou fournisseurs d’animaux) (Arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d'agrément, d'aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs, éleveurs ou fournisseurs d'animaux utilisés à des fins scientifiques et leurs contrôles175). 3.1.3. Mise en pratique du cadre éthique et réglementaire
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques (recherche, enseignement supérieur ou professionnelle ...) ne peut être réalisée que dans un établissement disposant d’un agrément délivré par la préfecture de son secteur, après validation par la DDPP. Cet agrément comprend notamment un plan détaillé du(des) bâtiment(s) et de ses(leurs) fonctions. L’annexe II de l’Arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d'agrément, d'aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs, éleveurs ou fournisseurs d'animaux utilisés à des fins scientifiques et leurs contrôles175 décrit de manière précise les caractéristiques d’un bâtiment éligible à l’agrément. Globalement, il y est expliqué ce qui est attendu en termes de conception générale, de paramètres environnementaux de soins aux animaux etc.
Un arrêté du 1er février 2013 précise les modalités d’approvisionnement des animaux, et la traçabilité des animaux dans l’établissement (registre, fiche individuelle, ...).
Le personnel de l’établissement doit détenir des compétences et formations adaptées à la réalisation des procédures, dans le cadre de 4 fonctions : conception de projet, application de procédures, soins aux animaux ou mise à mort des animaux ; une formation continue est obligatoire. Plusieurs responsables sont identifiés (bien-être animal, pharmacie, suivi des compétences, ...) et les conseils d’un vétérinaire sont obligatoires. Les Arrêtés du 1er février 2013 explicitent les formations ad hoc et comment l’établissement doit tenir à jour les compétences dans le dossier.
Chaque projet est conduit par un responsable de projet, qui soumet une DAP sous couvert de l’établissement : la demande d’autorisation de projet (DAP) est adressée au Ministère Chargé de la Recherche, qui confie son évaluation éthique à un CEEA (Comité d’Ethique en Expérimentation Animale). Le CEEA est une structure enregistrée au Ministère, auquel l’établissement s’affilie ; son fonctionnement et sa composition et les principes d’évaluation sont décrits dans le Chapitre 1 de de l’Arrêté du 1er février 2013 relatif à l’évaluation éthique et à l’autorisation des projets impliquant l’utilisation d’animaux dans des procédures expérimentales176. La DAP est codifiée et demande un certain niveau de détail ; elle comprend une ou plusieurs procédures, tel que décrite dans le Chapitre 2 Article 5 de ce même arrêté176. Elle comprend :
- Un résumé non technique : il est accessible du grand public ; il doit être anonyme, garantir le respect de la propriété intellectuelle et la confidentialité des informations ; il doit fournir les objectifs du projet, le nombre d’animaux, les espèces concernées, ainsi qu’une démonstration du respect de la démarche des 3R ; - La justification du projet au regard des domaines acceptables de recherche, en l’absence d’une alternative ; - Les méthodes appliquées pour le respect de 3R (remplacer/réduire/raffiner) ; - Le recours à des points limites adaptés ; - La stratégie d’expérimentation ou d’observation et le modèle statistique utilisé ; - Le descriptif des procédures (ensemble des actes et des observations prévus) en présentant plus particulièrement les méthodes d’anesthésie et d’analgésie cas échéant ; - La classification des procédures expérimentales estimées et le degré de gravité ; - Les méthodes de mises à mort ;
161 - La réutilisation potentielle des animaux (très important pour les PNH) ; - De nombreuses informations administratives dont la personne responsable du bien-être des animaux, les différents numéros d’agrément (établissements utilisateurs, fournisseurs et éleveurs concernés) etc. ;
Enfin, l’établissement doit disposer d’une Structure Chargée du Bien-Être Animal (ou SBEA) (d’après l’Arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d'agrément, d'aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs, éleveurs ou fournisseurs d'animaux utilisés à des fins scientifiques et leurs contrôles175).
La SBEA est une structure en charge de toute la gestion du bien-être des animaux hébergés au sein de l’établissement. Elle est composée a minima du responsable du BEA et d’une autre personne ayant une formation spécifique pour la conception ou la réalisation des procédures expérimentales, l'application de procédures expérimentales aux animaux, pour le soin des animaux hébergés et leur mise à mort (Code rural et de la pêche maritime - Article R214-114177). Elle applique le principe des 3R, donne son opinion sur toutes problématiques liées au BEA au sein de la structure. Pour un établissement utilisant des PNH, la problématique du BEA est complexe. En effet, ce sont des animaux qui présentent un grand nombre de contraintes d’hébergement lié à leurs grandes capacités cognitives. La SBEA s’intéresse dans ce cas à l’apport d’un hébergement adapté, d’un enrichissement complet et rythmé, alimentaire ou matériel, pour éviter que les animaux s’ennuient ou développent des troubles comportementaux. Elle réfléchit aussi à la constitution des groupes sociaux et conseille les équipes techniques en cas de difficulté. Rétrospectivement, elle peut aussi donner son avis et permettre en place des actions correctives puis préventives pour que certains évènements ne surviennent plus. Elle peut participer à la mise en place et à l’amélioration d’entrainements des animaux pour la réalisation d’actes. Cette méthode est très employée chez les PNH et permet une bonne habituation et une réduction du stress des animaux pendant les manipulations des procédures expérimentales. C’est un organe essentiel et indispensable pour améliorer continuellement les pratiques au sein des établissements qui pratique l’expérimentation animale. (Article 4 de l’Arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d'agrément, d'aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs, éleveurs ou fournisseurs d'animaux utilisés à des fins scientifiques et leurs contrôles175)
Dans le cadre d’un projet d’étude du microbiote à l’aide d’un modèle animal l’établissement utilisateur devra soumettre une DAP, en décrivant chaque procédure ainsi que sa classe de gravité. Quatre types de gravité (sans réveil, sévère, modéré et léger) sont décrits dans la Section 1 de l’annexe de l’Arrêté du 1er février 2013 relatif à l’évaluation éthique et à l’autorisation des projets impliquant l’utilisation d’animaux dans des procédures expérimentales176 : le classement est fondé sur l’impact physique et psychique cumulé des actes pouvant causer de la douleur (par exemple une chirurgie) ou de l’angoisse (par exemple l’isolement d’un individu hors de son groupe). sur l’ensemble des actes pouvant causer de la douleur ou de la souffrance On peut imaginer qu’une procédure contribuant à l’étude du microbiote intestinal dans le cas d’une maladie métabolique serait de classe légère à modérée. En effet, l’induction d’une maladie comme l’obésité chez un animal pourrait provoquer une angoisse ou un stress modéré et « avoir une incidence modérée sur le bien-être ou l’état général des animaux ». Le recueil de prélèvements fécaux n’a pas d’incidence sur le bien-être animal. La réalisation de biopsies intestinales devra en revanche être faite sous anesthésie générale et dans le cadre d’une procédure sans réveil si leur invasivité est incompatible avec la survie.
Un autre point primordial pour le respect du bien-être animal est la définition dès la conception de la DAP de points limites adaptés. « Le « point limite » est le moment auquel la souffrance et/ou la détresse d’un animal d’expérimentation doit est arrêtée, minimisée ou diminuée à l’aide de mesures telles que l’euthanasie (à condition qu’elle soit faite de façon supportable pour l’animal), par l’arrêt
162 du processus qui le fait souffrir, ou par un traitement visant à le soulager. » (définition issue du document de Pau B., « Le « point limite » en expérimentation animale », 200228 ). Les points limites identifiés peuvent être extrêmement divers en fonction de l’étude, du type de modèle utilisé, de la procédure mise en place. Pour objectiver l’atteinte d’un point limite, il faut observer et examiner les animaux en étude régulièrement et de manière appropriée (suivi du poids, de l’apparence externe, de signes cliniques mesurables, de changement de comportement etc.). Pour l’étude du microbiote intestinal chez un animal obèse, un point limite à prendre en compte serait par exemple de définir un critère ou score à partir duquel l’obésité ne serait plus supportable pour l’animal.
Enfin, selon l’article 39 paragraphe 2 de la Directive Européenne 2010/632, tous les projets utilisant des PNH ou des projets impliquant des procédures de classe sévère feront l’objet d’une analyse rétrospective, validée par la SBEA de l’établissement puis contrôlée par le CEEA. L’analyse rétrospective permet de faire un bilan de l’étude centré sur le bien-être animal en mettant en évidence ce qui a été bien fait et ce qui est à raffiner. C’est en partie grâce à cela que tous les ans, des informations statistiques sur le nombre d’animaux utilisées, leur espèce, leur origine et les informations concernant la gravité réelle des procédures sont collectées puis publiées (Article 54 paragraphe 2 de la Directive Européenne 2010/632).
163 3.2. CADRE DE L’UTILISATION DU PNH EN RECHERCHE BIOMEDICALE 3.2.1. Finalité des études et espèces de PNH utilisées
Selon les articles 5 et 8 de la Directive Européenne 2010/63/UE2, les PNH ne peuvent être utilisés qu’à des fins :
- de recherche fondamentale ; - de recherche en vue de la conservations des espèces ; - de recherche en vue de la prévention, de la prophylaxie, du diagnostic ou du traitement d’affections humaines invalidantes ou potentiellement mortelles ;
Il faut nécessairement « qu’il existe des éléments scientifiques démontrant que la finalité de la procédure ne peut être atteinte en utilisant d’autres espèces que celles de primates non humains »2.
Les primates inscrits à l’annexe A du règlement (CE) N0 338/97 du Conseil du 9 décembre 1996 relatif à la protection des espèces de faune et de flore sauvages par le contrôle de leur commerce42(CITES), ne sont pas utilisés à des fins scientifiques, sauf s’ils ont été élevés en captivité, que leur utilisation a les mêmes objectifs de recherche que cités précédemment et « qu’il existe des éléments scientifiques démontrant que la finalité de la procédure ne peut être atteinte en utilisant d’autres espèces que celles de primates non humains ». Les Etats Membres de l’Union Européenne peuvent cependant interdire la détention d’espèces de l’annexe A du CITES (article 8 du règlement (CE) N0 338/du Conseil du 9 décembre 199642).
Deux institutions internationales participent à la conservation des espèces et à sa réglementation. D’une part, l’IUCN ou « International Union for Conservation of Nature » s’occupe principalement de soutenir et développer scientifiquement la conservation des espèces dans le monde. Elle répertorie le statut des espèces (cf. Annexes 14 à 19) et leur répartition estimée. D’autre part, la convention sur le commerce international des espèces de faune et de flore sauvages menacées d’extinction ou convention de Washington (CITES) encadre le commerce international des espèces animales ou végétales. Elle possède plusieurs annexes qui regroupent les espèces selon leur statut de conservation. L’annexe I comprend les espèces menacées d’extinction, « pour lesquelles le commerce n’est autorisé que dans des conditions exceptionnelles » ; l’annexe II comprend des espèces non nécessairement menacées d’extinction dont le commerce est restreint ; l’annexe III correspond aux espèces protégées dans un pays demandant aux autres parties de la convention de contrôler son commerce. (Faivre, 2008178)
La clause de sauvegarde prévu par l’article 55 paragraphe 1. de la Directive 2010/63/UE2 autorise l’utilisation du PNH à des fins autres que celles décrites à l’article 8 si et seulement si aucune autre espèce que le PNH ne peut permettre d’atteindre la finalité. Il faut garder à l’esprit que l’utilisation du PNH est un dernier recours, qu’elle est extrêmement encadrée et qu’elle représente toujours un intérêt scientifique important.
Les PNH utilisés en recherche peuvent entrer en étude s’ils ont été élevés à cette fin et s’ils sont descendants de parents eux même élevés en captivité ou issus de colonies entretenues sans apport extérieur2, c’est-à-dire des animaux dont les grands-parents sont nés en captivité (génération F2). L’un des grands intérêts de l’élevage des PNH, en outre d’éviter la capture d’animaux sauvages, est la standardisation des conditions de vie des animaux, de faire des lots d’âge, de poids, d’origine et de statut sanitaire similaires179. Des stratégies d’élevage des primates non humains ont d’ailleurs été
164 élaborées par les Etats membres de l’Union Européenne afin « d’accroître la proportion d’animaux issus de PNH élevés en captivité » (Article 28 de la Directive Européenne 2010/63/UE2). Il est à noter que l’approvisionnement des PNH est souvent difficile, et que des considérations économiques et pragmatiques sont régulièrement discutés par les associations professionnelles.
Les espèces de primates non humain classiquement utilisées en recherche biomédicale sont :
- le macaque rhésus ou Macaca mulatta ; - le macaque cynomolgus ou Macaca fascicularis ; - le macaque japonais ou Macaca fuscata ; - le babouin de Guinée ou Papio papio ; - Le babouin olive ou Papio anubis ; - le singe vert ou Chlorocebus aethiops ; - le singe écureuil ou Saimiri sciureus ; - le marmouset commun ou Callithrix jacchus ; - le tamarin pinché ou Saguinus oedipus ;
Tableau XLVIII : Classification simplifiée des primates d’intérêt en recherche biomédicale du sous ordre des simiens (Source : Perelman et al., 2011180)
Infra-ordre Famille Genre Espèce(s)
Cercopithecus Cercopithecus ou Chlorocebus aethiops
Macaca mulatta Singe de Macaca Macaca fascicularis Cercopithecidae l’Ancien Monde Macaca fuscata
Papio papio Papio Papio anubis
Callithrix Callithrix jacchus Singe du Cebidae Nouveau Monde Saguinus Saguinus oedipus Saimiri Saimiri sciureus
3.2.2. Cadre règlementaire s’appliquant aux établissements détenant des PNH
Outre les règles générales décrites ci-dessus, des règles spécifiques s’appliquent aux établissements utilisant, élevant ou fournissant des PNH (par exemple de surface d’hébergement : nous nous y intéresserons en partie 3.4.1., dans laquelle nous décrirons toutes les recommandations pour l’hébergement des espèces de PNH utilisées en recherche biomédicale).
Ces établissements sont inspectés une fois par an par la DDPP (Article 34 paragraphe 3 de la Directive Européenne 2010/632). Il faut que le registre des animaux hébergés ou qui ont été hébergés dans la structure soit à jour, de même que les informations individuelles concernant chaque PNH (antécédents reproductifs, vétérinaires, sociaux et projets dans lesquels il a été inclus). Selon l’article
165 32 de la Directive 2010/63/UE2, les PNH doivent être identifié individuellement de manière permanente et non douloureuse au plus tard au sevrage. Les PNH type « macaque » sont généralement tatoués au niveau de la face médiale de la cuisse. Le registre des animaux comprend son identité, son lieu et sa date de naissance, si l’animal a été élevé en vue d’une utilisation expérimentale. Pour les PNH, cela doit préciser si ses parents étaient eux aussi captifs. Toutes ces informations doivent restées disponibles au moins 3 ans après la mort ou le départ de l’animal de la structure (d’après l’article 31 de la Directive Européenne 2010/632). Tout établissement utilisateur d’animaux non domestiques doit employer un « personnel détenant un certificat de capacité pour l’entretien et l’élevage des espèces hébergées » (Article R413-1 du code de l’environnement181 ; article de l’INSERM, « Le certificat de capacité » 182). Délivré par le préfet, le certificat de capacité est personnel, accordé pour une durée indéterminée ou limitée, pour des espèces et des activités spécifiées.
En revanche, il est à noter qu’il n’est pas possible d’utiliser des PNH pour la formation, et que donc les personnels ne peuvent acquérir les compétences requises qu’en participant à un projet autorisé sous la supervision de personnels déjà formé. 3.2.3. L’accréditation AAALAC
Les établissements utilisateurs d’animaux à des fins scientifiques peuvent également faire la démarche volontaire pour obtenir l’accréditation internationale AAALAC ou association internationale pour l’évaluation et l’accréditation du traitement des animaux de laboratoire (de l’anglais « Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International »). Cette organisation privée est « dédiée à la protection des animaux utilisés pour la science » et « met au point des programmes d’accréditation », évaluant le niveau éthique des laboratoires. C’est une démarche lourde mais l’AAALAC est de plus en plus exigée par les entreprises clients des CRO ou sociétés de recherche sous contrat (de l’anglais « Contract Research Organization »), sous-traitants des études in vivo. Cette accréditation, reconnue internationalement, fait gage de qualité éthique et du respect du BEA au sein de la structure, ainsi que d’une démarche de bon niveau en matière d’hygiène et sécurité. Elle se base d’abord sur la conformité à la législation en vigueur, mais elle utilise des référentiels mondialement reconnus tels que le « Guide for the Care and Use of Laboratory Animals » (Guide pour le traitement et l’utilisation des animaux de laboratoire, publié par le National Research Council en 1996183,8ème édition en 2011) et s’intéresse particulièrement à la qualification et à l’engagement des personnels. Aujourd’hui en France, 22 établissements ont obtenu et/ou renouvelé une accréditation AAALAC, et cette démarche tend à se démocratiser (Site internet de l’AAALAC184).
L’utilisation des PNH pour l’étude du microbiote intestinal et des maladies métaboliques est indéniablement de l’expérimentation animale. Elle est réalisée dans un cadre éthique et réglementaire stricte, qui permet une utilisation de l’animal contrôlée, scientifiquement et éthiquement justifiée. La Directive Européenne 2010/63/UE2 encadre l’utilisation des animaux à des fins scientifiques en France, appliquée en droit français dans le Décret 2013-118174. Les établissements hébergeant et utilisant des PNH doivent posséder un agrément, du personnel qualifié (notamment détenteur d’un certificat de capacité) ainsi qu’une SBEA interne, chargée de l’application pratique des principes des 3R et du respect du BEA. Enfin, certains établissements sont accrédités AAALAC, une accréditation faisant gage d’un niveau élevé d’éthique et de soins apportés aux animaux de laboratoire.
166 3.3. CONSTITUTION D’UNE COHORTE D’ETUDE DU MICROBIOTE CHEZ LES MODELES PNH : QUE PRENDRE EN COMPTE ?
Dans ce paragraphe, nous allons aborder chacun des éléments à prendre en compte pour la constitution d’une cohorte de PNH pour étudier le microbiote intestinal et les maladies métaboliques humaines. En fonction de la question expérimentale, du problème à résoudre, les caractéristiques requises des primates à utiliser ne seront pas les mêmes. Les sujets d’étude de ce domaine peuvent être multiples :
- Etude spécifique du microbiote intestinal dans un contexte sain ; - Etude du microbiote intestinal dans un contexte de maladie métabolique ; - Etude clinique des complications des maladies métaboliques en lien avec le microbiote ; - Etude de l’efficacité d’un traitement en fonction du microbiote ; - Etude d’un traitement d’une maladie métabolique faisant effet sur le microbiote intestinal ; - Etude des facteurs de prévention des maladies métaboliques en lien avec le microbiote ; - Etc. ;
Dans un premier temps, nous essaierons de discerner les avantages et les inconvénients des principales espèces de PNH utilisées en recherche biomédicale. Parmi ces espèces, nous verrons lesquelles sont les plus adaptées pour l’étude du microbiote intestinal par comparaison de leur régime alimentaire, leur anatomie digestive et des principaux phyla et espèces qui composent leur microbiote. Puis dans un contexte pathologique, nous synthétiserons les différents modèles de maladies métaboliques disponibles. Enfin, nous réfléchirons aux critères de l’âge, du sexe ainsi que de leur origine et statut sanitaire. 3.3.1. Choix de l’espèce de PNH pour l’étude du microbiote intestinal
Dans cette partie, nous allons nous essayer d’identifier quelles sont les espèces de PNH les plus adaptées pour la recherche translationnelle pour l’étude du microbiote intestinal et des maladies métaboliques de l’humain. Nous nous intéresserons uniquement aux espèces classiquement utilisées en expérimentation animale en Europe, citées dans le Tableau XLVIII ci-dessus.
3.3.1.a Caractéristiques des PNH utilisés en recherche biomédicale
Ce paragraphe fait une synthèse des informations principales qui permettent d’évaluer l’intérêt de neuf espèces de PNH pour l’étude du microbiote et des maladies métaboliques. Une fiche récapitulative de chaque espèce étudiée est présentée en annexes 14 à 19. Ces fiches synthétiques reprennent les caractéristiques générales de vie de ces espèces, permettant de nous orienter sur ses potentiels avantages mais aussi inconvénients pour son utilisation en recherche. Il s’agit de critères de taille, de durée de vie, etc. mais aussi de statut de conservation, de richesse bibliographique à leur sujet, de leur disponibilité etc. La Figure 27 illustre les neuf espèces étudiées : 3 singes du Nouveau Monde et 6 singes de l’Ancien Monde. La Figure 1 présentée en introduction illustre la proximité phylogénétique de ces espèces avec l’homme.
167 Callitrix jacchus Saguinus oedipus
Saimiri sciureus Chlorocebus aethiops
Macaca fascicularis Macaca mulatta Macaca fuscata
Papio papio Papio anubis
Figure 27 : Principales espèces de PNH utilisées en recherche biomédicale
(Sources : Callithrix Jacchus : http://animalia.bio/common-marmoset ; Saguinus oedipus : http://animalia.bio/cotton-top-tamarin ; Saimiri sciureus : http://animalia.bio/common-squirrel-monkey : Chlorocebus aethiops : http://animalia.bio/green-monkey ; Macaca fascicularis : http://animalia.bio/long-tailed-macaque ; Macaca mulatta : © naturemates, certains droits réservés (CC-BY-NC) / https://www.inaturalist.org/observations/31325539 ; Macaca fuscata : © Brian Jeffery Beggerly certains droits réservés (CC-BY-NC) / https://www.inaturalist.org/photos/12751097 ; Papio papio : http://animalia.bio/guinea-baboon ; Papio anubis : © Vince Smith, certains droits réservés (CC-BY-NC) / https://www.inaturalist.org/photos/33148)
168 ❖ Famille des Cebidae ➢ Genre Callithrix
Le marmouset est le PNH qui, par sa petite taille, reste le PNH le plus accessible pour la recherche biomédicale. Même si son acquisition et son entretien reste plus coûteux que n’importe quel rongeur, il présente des qualités translationnelles supérieures, notamment par sa plus grande proximité phylogénétique avec l’Homme. Par rapport aux autres PNH, sa prolificité (jumeaux homozygotes fréquents) en fait un modèle d’une grande valeur, par une homogénéisation génétique des cohortes, permettant une plus grande répétabilité des expérimentations, ainsi qu’une meilleure qualité scientifique (en comparant un traitement test et contrôle chez des paires appariées). Il présente, par ailleurs, une maturité sexuelle rapide, qui permet d’étudier de jeunes adultes à partir d’un an d’élevage pour les mâles et un an et demi pour les femelles. De plus, son espérance de vie est bien moindre que celle des singes de l’Ancien Monde, ce qui en fait un modèle intéressant pour étudier sur un délai restreint les effets de l’âge de certains troubles, notamment de potentielles complications de pathologies.
➢ Genre Saguinus
Le statut actuel de conservation du tamarin pinché, les difficultés importantes de sa conservation en captivité ainsi que l’absence de données bibliographiques sur cette espèce en tant que modèle de maladies métaboliques nous conduisent à l’abandonner comme modèle animal candidat. Il n’est, pour ces raisons, pas adapté pour l’étude des maladies métaboliques liées au microbiote intestinal. Cependant, il semble être un bon modèle pour l’étude des maladies inflammatoires intestinales, qui sont, elles-aussi, liées au microbiote intestinal. Il développe en effet ce type de troubles de manière spontanée. Le livre de Clapp, « A Primate Model for the Study of Colitis and Colonic Carcinoma The Cotton- Top Tamarin (Saguinus oedipus) » (2018)185 évoque le rôle de la flore intestinale dans la dégradation des acides biliaires mais ne donne pas plus d’informations sur sa composition et les interactions potentielles avec la maladie chez cette espèce. Il faudra sans doute raffiner ce modèle en prenant totalement en compte le rôle essentiel du microbiote intestinal dans ces pathologies inflammatoires intestinales.
➢ Genre Saimiri
Le singe écureuil est un bon modèle de maladies neurodégénératives liées au vieillissement notamment grâce au modèle MPTP (1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine) (développé dans l’article de Porras et al., 2012186) mimant les symptômes de cette maladie. Il ne semble cependant pas être un bon modèle d’étude du microbiote intestinal et a une anatomie digestive assez différente de celle de l’Homme. En effet, le saïmiri a un gros intestin extrêmement simple, un tube droit et sans haustration. Il possède un cæcum très large et une boucle supplémentaire du gros intestin. De plus, son intestin grêle est différent, car il est adapté à un régime alimentaire riche en insectes (cf. Figure 28). Par ailleurs, il n’y a aucun article faisant référence à cette espèce en tant que modèle de maladie métabolique. La littérature à son sujet est de plus assez limitée. C’est pourquoi nous ne le retiendrons pas en tant que modèle animal pour l’étude des maladies métaboliques en lien avec le microbiote intestinal.
169
Figure 28 : Anatomie simplifiée du tractus gastro-intestinal du singe écureuil (Saimiri sciureus) (Source : « Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System », Stevens et Hume, 2004131)
❖ Famille des Cercopithecidae ➢ Genres Chlorocebus
Le singe vert africain, ou vervet, est un modèle très utilisé en recherche biomédicale, notamment pour l’étude des maladies métaboliques, dont l’obésité à laquelle il est naturellement prédisposé. La littérature relativement riche à son sujet nous permet de dire qu’il est un modèle a priori intéressant pour l’étude du microbiote intestinal dans le cadre de l’obésité et du DT2. D’un point de vue pratique, c’est un singe d’une taille raisonnable, peu contraignante en captivité.
➢ Genre Macaca
Le macaque cynomolgus, rhésus et japonais sont largement utilisés pour la recherche biomédicale translationnelle. La littérature est très riche à leur propos et les connaissances sur ces animaux, notamment cliniques, sont complètes et détaillées. De plus, ce sont des modèles fréquemment utilisés pour l’étude des maladies métaboliques à savoir le syndrome métabolique, le DT2 et l’obésité, car ils y sont prédisposés avec l’âge. D’un point de vue pratique, il s’agit de singes peu contraignants en captivité. Etant le genre de PNH le plus utilisé dans le monde, il est relativement facile de s’en procurer. Mais la forte demande actuelle le rend moins disponible qu’il n’était par le passé.
➢ Genre Papio
Le babouin est un modèle contraignant par sa taille mais il semble être un bon candidat pour l’étude de l’obésité et du microbiote intestinal. En effet, il est naturellement prédisposé à l’obésité, et est notamment étudié pour les effets de cette maladie sur la gestation et la santé du juvénile. Malheureusement, il reste un modèle très peu disponible et extrêmement rare. La littérature à son sujet est plus limitée et la connaissance clinique de cet animal par conséquent aussi.
170 Bien que les PNH restent des modèles peu accessibles (coût et structure d’accueil), ils sont des modèles extrêmement informatifs d’un point de vue clinique, comme nous l’avons montré en partie 2. Nous n’étudierons pas plus le Saimiri et le Saguineus, qui ne présentent pas assez d’intérêts scientifiques pour notre sujet. A contrario, le marmouset, le vervet, les macaques et les babouins sont des modèles a priori intéressants pour l’étude du microbiote intestinal dans le contexte des maladies métaboliques ou non.
Malheureusement, concernant l’utilisation des PNH, beaucoup d’informations ne sont pas publiées par la recherche académique et restent très confidentielles ; il est donc difficile de savoir s’il n’y a pas eu d’études, si elles étaient concluantes mais couvertes par un secret industriel, ou pas suffisamment concluantes pour être publiées. Il est difficile de trouver les élevages d’import de PNH pour les laboratoires européens, la disponibilité actuelle des différentes espèces ainsi que les prix d’achat pratiqués selon le marché actuel. Le coût à l’entretien est aussi très difficile à estimer. Ces éléments manquants réduisent la qualité de la comparaison pratique entre ces différentes espèces.
Dans les paragraphes suivants, pour ces quatre genres d’espèces PNH, nous allons nous intéresser à leur régime alimentaire, à leur anatomie digestive, leur composition microbienne intestinale, ainsi qu’au différents modèles de maladies métaboliques disponibles. L’objectif est d’identifier les grands avantages et les grands inconvénients de chacun de ces genres pour l’étude du microbiote intestinal et des maladies métaboliques humaines associées.
171 3.3.1.b Régime alimentaire, anatomie du système digestif et composition du microbiote intestinal des PNH
Ce paragraphe a pour objectif de comparer, dans un premier temps, les régimes alimentaires des genres Callithrix, Chlorocebus, Macaca et Papio, puis leurs adaptations anatomiques à leur régime alimentaire. Dans un deuxième temps, nous comparerons la composition du microbiote intestinal de ces genres de PNH, en essayant d’en faire ressortir leurs grandes spécificités respectives.
❖ Régime alimentaire :
Ci-dessous, le Tableau XLIX synthétise le régime alimentaire des quatre genres et espèces comparées.
Tableau XLIX : Récapitulatif des régimes alimentaires des espèces PNH d’intérêt pour l’étude des maladies métaboliques liées au microbiote intestinal (moyenne et intervalle des proportions consommées) (Sources : site internet « Animal Diversity Web », de l’Université du Michigan, Museum of zoology187,125,188,189 ; « Nutrient Requirements of Nonhuman Primates: Second Revised Edition », 2003190)
Régime omnivore à tendance Régime omnivore à tendance frugivore frugivore et consommation de sèves, gommes et latex
Chlorocebus spp. Macaca spp. Papio spp. Callithrix Jacchus
Fruits et petites Fruits et graines proies (insectes, 46% (0-86%) ; oiseaux et petits herbes, carex 16% (0- mammifères) Extrêmement varié 97%) ; bulbes et Exsudats (gomme, sève, latex) 45% (varie en fonction de Fruits 46% ; feuilles racines 10% (0-85%) ; (24-70%) ; fruits 16% (14-30%) ; la saison, de lieu de 23% (plutôt des feuilles d’arbres 10% insectes 39% (30-70%) ; nectar en l’espèce) feuilles matures que (0-61%) ; fleurs 8% saison sèche ; proies animales jeunes) ; fleurs et Fruits, fleurs, insectes, (0-27%) ; exsudats ou (grenouilles, serpents, lézards, bourgeons 10% ; feuilles, racines sèves 4% (0-15%) ; araignées, insectes) écorce, branchage, ou champignons, autres parties des Part de consommation de proies moelle du bois 6% ; graminées, cultures, végétaux 6% (0- relativement importante champignons ou petits animaux 19%) ; proies (petits gommes 3% ; herbe mammifères, œufs, 1% ; proies 13%, oiseaux, insectes) 7 % cultures (0-72%) ; cultures
Comme l’illustre la lecture de ce tableau, les singes de l’Ancien Monde présentent tous les trois un régime alimentaire extrêmement divers, basé principalement sur la consommation de végétaux mais aussi de petites proies animales. Le marmouset, appartenant aux singes du Nouveau Monde, présente une particularité puisqu’il consomme des exsudats végétaux tels des latex ou gommes, ce qui diverge fortement du régime alimentaire humain.
172 ❖ Anatomie du système digestif :
Ci-dessous, le Tableau L compare de manière simplifiée l’anatomie digestive des espèces de PNH précédemment retenues pour l’étude du microbiote intestinal, montrant leur grande similitude.
Tableau L : Comparaison de l’anatomie digestive et du temps de transit de quatre genres de PNH (Chlorocebus, Macaca, Papio et Callithrix).
Espèces Chlorocebus spp. Macaca spp. Papio spp.
Anatomie du tractus digestif
Intestin grêle relativement court Cæcum très développé, lieu de la fermentation des carbohydrates complexes 3 taeniae coli le long du cæcum et du côlon nombreuses haustrations le long du cæcum et du côlon
Référence Yasuda et al., 201540 ; Lambert, 1998191 ; Warter, 2006192 ; Stevens et Hume, 2004131 ; (s) Faivre, 2008178
Comme nous l’avons vu dans la partie précédente, le macaque a une anatomie digestive très proche de celle de l’humain ; chaque portion du tube digestif a une longueur proportionnellement comparable à celle de l’humain, ainsi que des conditions chimiques (pH) comparables (cf. Tableau XXXVI40). Les haustrations et les taenia coli sont présents chez les deux espèces au niveau du côlon et du rectum. Ces haustrations sont également retrouvées sur le cæcum chez les primates de l’Ancien Monde : Chlorocebus spp. et Papio spp. Le vervet, le macaque et le babouin ont un cæcum plus développé que l’homme, spécialisé dans la fermentation de la grande proportion de fibres contenues dans leur régime alimentaire. Ces trois espèces ne présentent également pas d’appendice, structure uniquement retrouvé chez les hominoïdes (chimpanzé, orang-outan, gorille et humain) et chez divers mammifères phylogénétiquement plus éloignés que les PNH ; il est intéressant de noter que le rôle de l’appendice reste controversé et qu’il est pourtant impliqué dans plusieurs maladies intestinales (« The vermiform appendix: an immunological organ sustaining a microbiome inoculum », Vitetta et al., 2019193).
Le marmouset commun présente un système digestif adapté à la digestion d’exsudats végétaux, c’est-à-dire avec un cæcum large et développé, contenant une flore microbienne spécifique. En effet, ces exsudats (comme la gomme) sont des polysaccharides non digérés par le système enzymatique digestif de ce primate. Globalement, la digestion du marmouset passe par « une
173 digestion rapide des aliments de haute qualité tels que les insectes, les fruits sucrés, dans l’intestin grêle » puis par « une digestion par fermentation bactérienne dans le cæcum qui sélectionne et retient les polysaccharides solubles des exsudats de plantes et quelques particules alimentaires très petites » (Faivre, 2008178).
Le temps de transit pourrait être un critère intéressant pour comparer la digestion de ces espèces. Des données sont disponibles mais leur grande disparité rend cette donnée peu exploitable. En fonction des auteurs (Yasuda et al., 201540 et Lambert, 1998191), notamment pour l’Homme (3,5 à 12 heures selon Yasuda et al. ; 26 heures selon Lambert), ces grandes différences peuvent s’expliquer soit par une méthode d’évaluation différente, soit à cause d’un régime alimentaire extrêmement différent (sauvage et captif ; occidentalisé ou rural). En effet, le temps de passage digestif des primates frugivores dépend de la proportion de fruits, de feuilles et de proies animales composant leur régime alimentaire. Le type de fibres et non leur concentration réduit le temps de transit de 10 à 6 heures chez le marmouset commun. La taille et le poids corporel des espèces considérées sont également à prendre en compte dans la comparaison du temps de transit. Ceci explique par exemple le temps de transit réduit du marmouset par rapport à celui de l’Homme et des autres PNH. Selon la comparaison de Yasuda et al., le temps de transit de l’Homme et du macaque rhésus est extrêmement proche, contrairement à leur différence de taille et de poids. Selon les références utilisées dans la revue de Lambert, le babouin (25,8 heures) et l’humain (26 heures) ont un temps de transit extrêmement proche, alors que le vervet a, a priori, un transit plus long (31,5 heures). On peut conclure que le temps de transit, qui nous informe de manière globale sur le fonctionnement du système digestif de l’espèce, est comparable entre les primates de l’Ancien Monde et l’Homme, alors que le marmouset a une digestion beaucoup plus rapide. Des études ont par ailleurs montré que les ouistitis présenteraient une adaptation du temps de transit pour la digestion de la gomme : « le temps de transit alimentaire augmente lorsqu’on ajoute de la gomme dans la ration des ouistitis, sans que la digestibilité apparente de la matière sèche ou de l’énergie ait changé. » Cela pourrait avoir comme effet une augmentation du temps de contact entre le bol alimentaire et le microbiote intestinal et surtout cæcal permettant une meilleure assimilation des exsudats végétaux (Faivre, 2008178).
Le régime alimentaire ainsi que l’anatomie digestive et le temps de transit des Singes de l’Ancien Monde sont plus proches de l’humain que ceux du Marmouset commun. Mais des nombreuses différences persistent entre ces PNH et l’Homme, notamment par la présence d’un cæcum développé, adapté pour la digestion d’une forte proportion de polymères carbohydrates dans leur régime alimentaire et l’absence d’appendice.
Cette différence anatomique est à mettre en regard avec la composition microbienne cæcale, fortement spécialisée pour la fermentation des polysaccharides non digestibles, et donc probablement très différente de celle de l’Homme.
3.3.1.c Composition du microbiote intestinal chez un individu sain en fonction de l’espèce de PNH considérée
Une synthèse bibliographique, « The gut microbiome of non human primates : Lessons in ecology and evolution » des auteurs Clayton et al. (2018)194 a recensé toutes les études qui ont étudié la composition du microbiote intestinal chez toutes espèces de PNH en identifiant à chaque fois si possible les quatre phyla principaux détectés et les genres associés lorsque c’était précisé. Ci-dessous, dans le Tableau LI sont recensées leurs recherches bibliographiques à propos des espèces qui nous intéressent, auxquelles sont ajoutés les résultats d’autres articles. A noter que ces études portent sur des effectifs très réduits.
174 Tableau LI : Comparaison du microbiote intestinal des espèces de PNH d’intérêt en recherche biomédicale (une couleur par phylum prédominant)
Principaux phyla détectés par ordre d’abondance Captif ou décroissante (classes et genres si disponibles) Référence sauvage (s)
Espèces 1 2 3 4
Captif Fusobacteria (Moyennes des abondances Bacteroidetes Actinobacteria (12%) puis Reveles et al., Firmicutes (20%) 195 relatives pour (34,9%) (25,4%) Proteobacteria 2019 jacchus (9%) Callithrix Callithrix les jeunes adultes)
Amato et al., Les deux Firmicutes Proteobacteria Bacteroidetes Spirochaetes 2015196
aethiops
Chlorocebus Chlorocebus
Enterococcus - Clostridium - Wireman et al., Captif Lactobacillus Bacteroides Bifidobacterium - Eubacterium 2006197 Escherichia coli
Captif Spirochaetes Bacteroidetes Firmicutes (37%) (4.6%) (Résultats du (44%) groupe nourri Ruminococcaceae Proteobacteria Fibrobacteres Nagpal et al., 141 avec un régime PrevotellaceaePara Lachnospiraceae (6.2%) (4.5%) 2018 type prevotellaceae Lactobacillaceae Verrucomicrobia (0.7%) méditerranéen)
Firmicutes Bacteroidetes Lactobacillus Proteobacteria Li et al., Captif Prevotella Ruminococcus Spirochaetes 132 2018 fascicularis Bacteroides Eubacterium Clostridium
Firmicutes Macaca (Lactobacillus- Streptococcus- Clostridium- Proteobacteria Enterococcus- Bacteroidetes Seekatz et al., Captif Tenericutes Spirochaetes Oscillospira- (Prevotella) 2013198 Bulleidia- (Treponema) Ruminococcus- Sarcina- Coprococcus- Blautia)
Firmicutes
Bacteroidetes (Faecalibacterium- Spirochaetes Proteobacteria Ma et al., Captif Roseburia- 162 (Prevotella) (Treponema) (Helicobacter) 2014 Macaca fuscata Ruminococcus- Sporobacter)
175 Enterococcus - Clostridium- Wireman et al., Captif Lactobacillus Bacteroides Bifidobacterium - Eubacterium 2006197 Escherichia coli
Spirochaetes (0.76%) Proteobacteria Firmicutes Bacteroidetes Tenericutes Chen et al., Sauvage (35.55%) (34.92%) (27.13%) (0.55%) 2018135 Actinobacteria (0.37%)
Cyanobacteria
(2.40%), Sauvage Actinobacteria (Comparaison Firmicutes Bacteroidetes Tenericutes (1.55%), Zhao et al., 199 de 6 colonies (53.60%) (33.60%) (6.10%) Spirochaetae 2018 mulatta chinoises) (1.36%), Proteobacteria (0.75%)
Macaca Tenericutes (Mollicutes) Bacteroidetes Firmicutes Proteobacteria (Prevotella- Spirochetes (Enterobacteriacea McKenna et Captif (Clostridia- Lactobacilli- Rikenella) (Treponema) e, Helicobacter) al., 2008200 Actinobacteria Bacilli) Verrucomicrobia Fibrobacter
Fèces et Fèces et Fèces et Fèces et lumière lumière lumière lumière Yasuda et al., Captif intestinale : intestinale : intestinale : intestinale : 201540 Proteobacteria Firmicutes Bacteroidetes Spirochaetes Euryarchaeota
Proteobacteria Firmicutes Bacteroidetes Actinobacteria Captif (Arthrobacter), (Alphaproteobacte (Clostridia- (Bacteroidia- Chlorobi McKenney et (Papio ria-Acidiphilium- Bacilli- Flavobacteria- (Chlorobium), al., 2014201 hamadryas) Arcobacter- Ruminococcus- Prevotella- Verrucomicrobia Sorangium) Lactobacillus) Flavobacterium) (Opitutus)
Sauvage Tung et al., (Papio Firmicutes Proteobacteria Actinobacteria Bacteroidetes 2015202 cynocephalus)
Sauvage Ren et al., (Papio Firmicutes Actinobacteria Bacteroidetes Proteobacteria 2015203 Papio spp. cynocephalus)
Actinobacteria Bacteroidetes Tsukayama et Les deux Firmicutes (babouins (babouins Proteobacteria al., 2018204 sauvages) sauvages)
Actinobacteria puis Spirochaetes Li et al., Captif Firmicutes Bacteroides Proteobacteria et 2018158 Verrucomicrobia
176 Si nous comparons les données présentées ci-dessus avec celles obtenues chez l’Homme du Tableau VII de Rosenbaum et al. (2015)10, en limitant la comparaison au niveau des phyla, nous pouvons dire que :
- Les résultats des études sont très variables pour une même espèce et difficilement comparables : cela pourrait s’expliquer à la fois par les variations inter-individuelles naturelles du microbiote mais aussi par le choix de population étudiée (variation de régime alimentaire, d’environnement, etc.) ; - Globalement, les quatre phyla les plus représentés chez les PNH sont les mêmes que chez l’Homme mais dans des proportions différentes ; - De manière générale, les PNH sauvages présentent une composition du microbiote intestinal plus éloignée de celle de l’Homme que les animaux captifs (présence marquée des Tenericutes, absents chez l’humain ; phylum des Proteobacteria en plus grande abondance) ; - Le marmouset commun présente une composition du microbiote intestinale éloignée de celle de l’Homme (Actinobacteria et Bacteroidetes en plus grande abondance ; Firmicutes en abondance plus faible) ; - Les genres Macaca et Chlorocebus présentent une abondance relative en Spirochaetes plus marquée que chez l’Homme (moins d’1% chez l’humain10) ; - Le genre Papio présente pour toutes les références les quatre même phyla prédominants que chez l’Homme, mais dans des ordres variables. - Le phylum Verrucomicrobia est rapporté comme phyla minoritaire de la même façon que chez l’Homme dans plusieurs études.
Bien que le microbiote intestinal des PNH présentent une grande similarité avec celui de l’Homme, des variations interspécifiques et interindividuelles sont notables. Le marmouset commun semble présenter le microbiote le plus éloigné de l’humain, ce qui est cohérent avec ses différences de régime alimentaire et d’anatomie digestive. Mais par manque de références, il est difficile d’en tirer une conclusion claire. Par rapport à des animaux captifs, les PNH sauvages semblent être moins adaptés pour étudier le microbiote intestinal humain, car leur composition microbienne intestinale parait plus différente de celle de l’Homme. Les macaques, le vervet et les babouins semblent posséder un microbiote intestinal avec des phyla comparables à ceux de de l’Homme et la ressemblance entre le microbiote du babouin et de l’Homme parait se distinguer.
Il faut néanmoins garder à l’esprit que cela n’est qu’une comparaison qualitative et seulement au niveau des phyla. Il faudrait réaliser une réelle méta-analyse pour avoir une meilleure compréhension du sujet. Pour l’étude du microbiote, l’idéal reste la réalisation d’une comparaison animal/humain au sein de la même étude, selon les mêmes méthodes analytiques et dans les mêmes conditions.
177 3.3.2. Choix de l’espèce pour l’étude du microbiote intestinal dans le cadre des maladies métaboliques
Le Tableau LII ci-dessous synthétise les différents modèles d’espèces PNH de maladies métaboliques décrits dans la littérature.
Tableau LII : Synthèse des différents modèles de maladies métaboliques disponibles chez les PNH utilisés en recherche biomédicale
Modèles d’obésité Modèles de diabète de type 2
Modèles spontanés : Macaca fascicularis ; Macaca mulatta (modèle Modèles spontanés : obèse) ; Chlorocebus aethiops ; Papio papio Chlorocebus aethiops ; Papio papio ; Macaca fascicularis ; Macaca mulatta Modèles induits par alimentation spécifique :
Beaucoup d’espèces de PNH, particulièrement Type Macaca mulatta nourri avec un régime riche en d’induction fructose et espèces Modèles chirurgicaux : Modèles induits par alimentation N’importe quelle espèce, pancréatectomie spécifique : totale ou partielle
Callithrix jacchus ; Chlorocebus aethiops ; Modèles induits chimiquement : Macaca fascicularis ; Macaca mulatta N’importe quelle espèce, traité chimiquement à la STZ ou autre molécule cytotoxique
Callithrix jacchus : étude de l’obésité Chlorocebus aethiops : étude des facteurs pédiatrique, de l’obésité chronique et de ses environnementaux (alimentaires) et dommages effets à long terme systémiques (hépatiques)
Papio spp. : Etude clinique approfondie, de Chlorocebus aethiops : étude de la mise en nouveaux traitements place de l’obésité, des troubles associés à son développement, dont les facteurs génétiques et Macaca fuscata : étude des facteurs Objectifs environnementaux, à tous les âges de la vie alimentaires (régime chronique HFD) chez les juvéniles et des dommages pancréatiques d’études Papio spp. : étude de l’obésité pendant la Macaca mulatta : étude de la pathogénèse, des gestation et étude de facteurs alimentaires, traitements de la résistance à l’insuline induite étude clinique approfondie, de nouveaux par l’alimentation ainsi que ses complications traitements, étude des facteurs génétiques potentielles
Macaca fascicularis : étude des facteurs de Macaca fascicularis : étude des facteurs prévention sur le long terme (par exemple environnementaux (alimentaires) et dommages l’alimentation) systémiques (hépatiques)
Prise en Callithrix jacchus : absence de littérature compte du Pas de littératures plus spécifiques que les Chlorocebus aethiops : Réaction du articles déjà cités pour l’obésité microbiote microbiote humain différente que celle du intestinal microbiote du vervet à un régime occidentalisé
178 Papio spp. : pas de différence significative entre les proportions de Bacteroidetes et Firmicutes des babouins obèses et non obèses ce qui est opposé aux résultats chez l’humain
Macaca fascicularis : pas de différence significative entre les phyla (sauf pour Spirochaetes) d’individus obèses et non obèses élevés selon les mêmes conditions. Variations du microbiote en fonction de l’alimentation
Tardif et al., 2013205 ; Tardif et al., 2009206 ; Koo et al., 2019153 ; Nagpal et 141 160 163 Référence al., 2018 ; Shively et al., 2019 ; K. Srinivasan et P. Ramarao, 2007 ; Kavanagh et al., 2007156 ; Schmitt et al., Kavanagh et al., 2013208 ; Bremer et al., (s) 2018155 ; Amato et al., 2015196 ; Li et al., 2011166 ; Nicol et al., 2013209 ; 2018158 ; Comuzzie et al., 2003157 ; Chavez et al., 2009207
Le DT1 peut être induit chez le PNH par destruction des cellules β pancréatiques grâce à la STZ. Il n’est pas particulièrement un bon modèle de DT1, car l’étiologie de la maladie n’est pas la même que chez l’Homme. Il peut néanmoins servir à tester de nouveaux traitements. (Rees et Alcolado, 2005168 ; Lu et al., 2015170).
Les modèles de pathologies métaboliques, spontanés ou induits par un régime HFD, sont largement répandus parmi les espèces PNH. Chacune des espèces présentent ses spécificités, comme par exemple le babouin, adapté à l’étude de l’obésité pendant la gestation, ou bien le marmouset, intéressant pour l’étude de l’obésité pédiatrique. Tous ces modèles présentent, comme vu en partie 2, une grande qualité scientifique et clinique pour la recherche translationnelle humaine. Leur grande limite est le manque de données concernant leurs variations de composition microbienne intestinale lors de ces troubles métaboliques.
3.3.3. Taille de la cohorte
Un paramètre important à considérer lors de l’élaboration d’un design expérimental pour répondre à une question scientifique est le nombre d’individus constituant la population étudiée. La réduction du nombre d’animaux (selon le principe des 3R) doit être d’autant plus stricte qu’il s’agit de PNH. Contrairement à beaucoup d’autres espèces utilisées en expérimentation animale, aucun animal « réserve », c’est-à-dire inclus dans l’étude en surplus pour parer à l’éventualité de la perte d’un des animaux, n’est prévu dans la cohorte initiale, pour des raisons de coûts, de disponibilité et surtout d’éthique. Par ailleurs, le nombre d’animaux sera réduit au minimum particulièrement pour les procédures sévères ou sans réveil (comme par exemple pour le prélèvement de biopsies intestinales).
Le nombre total d’individus par groupes expérimentaux est déterminé selon la puissance statistique nécessaire pour obtenir des résultats interprétables. Cette notion est très importante car il vaut mieux en effet prévoir un plus grand nombre d’animaux pour pouvoir avoir une puissance statistique forte que de devoir renouveler cette étude par manque de puissance statistique.
179 3.3.4. Choix du sexe des animaux
Le choix du sexe des animaux est un paramètre déterminant pour l’étude du microbiote intestinal. Pour l’étude du microbiote pendant la gestation, notamment en cas de diabète gestationnel ou d’obésité, la question ne se pose pas. En revanche, dans des contextes plus généraux, sains ou pathologiques, se pose le problème de l’influence du sexe sur les résultats obtenus. Dans l’idéal, il faudrait avoir pour chaque étude 50% de femelles et 50% de mâles afin de s’affranchir d’un potentiel biais et de prendre en compte ce facteur d’influence.
Une étude chez l’Homme a montré qu’il y a une potentielle influence du sexe sur la répartition de la graisse et sur la composition du microbiote intestinal. Ceci suggère qu’il faudrait systématiquement tenir compte de ce facteur dans l’étude de l’obésité, chez l’Homme mais également chez le PNH par transposition. Des études plus poussées pour investiguer les mécanismes en jeu restent néanmoins nécessaires (Min et al., 2019210).
Les femelles sont par ailleurs extrêmement influencées par leurs cycles hormonaux. Une étude sur le macaque cynomolgus (Macaca fascicularis) a montré que le microbiote rectal des femelles présentait une diversité variable sur 15 semaines (de 15 à 25 taxons identifiés) retrouvée de manière comparable entre les individus (Nugeyre et al., 2019211). Il serait intéressant de poursuivre les recherches à ce sujet afin de comprendre les mécanismes de ces variations.
Nous pouvons conclure de ces deux études ( Min et al., 2019210 ; Nugeyre et al., 2019211) qu’il est important de prendre en compte le sexe dans la constitution d’une cohorte de PNH pour l’étude du microbiote intestinal et dans l’idéal, d’y inclure une moitié de femelles et une moitié de mâles.
3.3.5. Choix de l’âge des animaux
L’âge est un facteur d’influence primordial dans l’étude du microbiote intestinal. En effet, comme nous l’avons vu précédemment, le système immunitaire, qui poursuit son éducation après la naissance chez l’humain et les PNH, façonne le microbiote intestinal et inversement, le microbiote intestinal participe à la mise en place de son immunotolérance. Le microbiote n’est donc pas le même à la naissance du primate non humain, à 2 ou à 8 mois, en lien avec l’immunité mais aussi avec l’évolution de son alimentation.
3.3.5.a Mise en place du microbiote chez le PNH et alimentation du juvénile
Les auteurs Rhoades et al. ont étudié la mise en place du microbiote intestinal chez le macaque rhésus (Macaca mulatta) entre 1 et 8 mois (avant sevrage) (« Maturation of the infant rhesus macaque gut microbiome and its role in the development of diarrheal disease », Rhoades et al., 2019212). Ils ont évalué le microbiote intestinal par prélèvements fécaux de 80 macaques juvéniles captifs (qu’ils ont prélevé à 1 mois, 3 mois, 6 mois et enfin à 8 mois. Leurs résultats nous permettent de dire que :
• La diversité phylogénétique de la communauté microbienne augmente de 1 à 8 mois avec une légère diminution à 6 mois (cf. Figure 29) ; • Le microbiote des mères est encore plus diversifié que celui des juvéniles de 8 mois donc on peut supposer qu’il continue sa maturation au-delà (cf. Figure 29) ; • Après comparaison entre le microbiote de macaques de 1 mois et celui d’enfants de 0,5 à 2 ans, et entre le microbiote de macaques de 8 mois et celui d’enfants de 2 à 6 ans, le
180 microbiote des macaques rhésus juvéniles est plus proche de celui d’enfants de pays en voie de développement que le microbiote intestinal des enfants de pays occidentalisés ; • Sans prendre en compte les âges, le microbiote est dominé par le phylum Bacteroidetes (principalement Prevotella, sans doute à cause du faible taux de graisse animale distribuée dans leur nourriture) et le phylum Firmicutes. (cf. Figure 30 A ) • Les Actinobacteria (principalement les Bifidobacteria) et les Spirochetes (genre principal Treponema) présentent une tendance opposée en fonction de l’âge. En effet, la décroissance en Bifidobacteria s’explique vers 6 mois lorsque beaucoup de juvéniles sont sevrés, car les Bifidobacteria jouent un rôle essentiel dans la digestion des oligosaccharides du lait maternel. (cf. Figure 30 B )
Figure 29 : A – Composition de la cohorte de l’étude ; B – Analyse principale coordonnée (PcoA) des distances UniFrac non pondérées entre les communautés bactériennes aux différents âges prélevés (Source : « Maturation of the infant rhesus macaque gut microbiome and its role in the development of diarrheal disease », Rhoades et al., 2019212)
181
Figure 30 : A – Graphique représentant la proportion relative des différents phyla en fonction des âges ; B – Abondance relative en fonction de l’âge des Spirochetes et des Actinobacteria (ANOVA double p < 0.0001, test de comparaison multiple de Bonferroni *p < 0.05, ***p < 0.001) (Source : « Maturation of the infant rhesus macaque gut microbiome and its role in the development of diarrheal disease », Rhoades et al., 2019212)
La mise en place chez le jeune PNH est tout aussi importante et impactante qu’elle ne l’est chez l’Homme. En effet, par exemple, les chercheurs Ma et al. ont montré que l’exposition à une régime riche en graisse altérait durablement le microbiote intestinal du PNH (« High-fat maternal diet during pregnancy persistently alters the offspring microbiome in a primate model », Ma et al., 2014162). Ils ont nourri de jeunes Macaques japonais (Macaca fuscata), ainsi que leurs mères avant la naissance, avec un régime riche en graisse (HFD) ou un régime contrôle (CTD). Au moment du sevrage, ils ont échangé les régimes pour la moitié des cohortes (CTD/HFD et HFD/CTD) et gardé deux groupes contrôles (CTD/CTD et HFD/HFD). La diversité du microbiote intestinal des deux groupes « contrôle » restent stables dans le temps. Les résultats obtenus pour les deux groupes « test » suggèrent que l’alimentation maternelle et juvénile a la capacité d’altérer durablement le microbiote intestinal de la descendance, puisque sa composition ne revient pas à la norme malgré un rééquilibrage alimentaire. Néanmoins ces auteurs ont travaillé sur seulement 5 individus, il faut donc nuancer les résultats obtenus.
3.3.5.b Âge réglementaire au sevrage
Par ailleurs, il faut savoir que le sevrage est encadré par la Directive 2010/63/UE2 et dans les recommandations de la Commission du 18 juin 2007179 pour chacune des espèces de PNH classiquement utilisées en expérimentation animale. Il s’agit de recommandations, mais un sevrage plus jeune de ces espèces est difficilement justifiable d’un point vue scientifique et éthique. Il faudra donc, en cas d’étude du microbiote intestinal du juvénile, héberger les animaux avec leur mère dans la mesure du possible. Une séparation du jeune avant 6 mois peut être à l’origine de graves troubles durables comportementaux ou physiologiques179. Le Tableau LIII résume les âges recommandés au sevrage des différentes espèces qui nous intéressent.
182 Tableau LIII : Âges légaux au sevrage des principales espèces de PNH utilisées à des fins scientifiques (Source : Recommandations de la Commission du 18 juin 2007 concernant des lignes directrices relatives à l'hébergement et aux soins des animaux utilisés à des fins expérimentales ou à d'autres fins scientifiques179)
Espèces Marmouset Macaques et vervets Babouins
Minimum 8 mois, dans Minimum 8 mois, dans Âge au sevrage Minimum 8 mois l’idéal 12 mois l’idéal 12 mois
L’âge au sevrage sera donc aussi une contrainte dans la constitution d’une cohorte de PNH, dans le cadre de l’étude du microbiote intestinal chez les primates juvéniles. Pour l’étude du microbiote adulte, il faudra que les animaux aient au moins un an, car comme nous l’avons vu précédemment, à 8 mois, le PNH ne présente toujours pas la composition adulte et stable du microbiote intestinal.
3.3.5.c Vieillissement et modifications du microbiote intestinal
Le microbiote intestinal se met en place progressivement avant la naissance jusqu’à un état d’équilibre à l’âge adulte, âge qui varie en fonction de l’espèce et qu’il reste encore à formellement déterminer. Mais au cours du vieillissement, le microbiote intestinal évolue. Une étude sur des marmousets gériatriques (Callithrix jacchus) a montré qu’ils présentaient une diversité et une composition microbienne intestinale altérées, en comparaison avec de jeunes marmousets (Reveles et al., 2019195). Des études sont néanmoins requises pour déterminer si on retrouve ce phénomène chez les macaques, vervets et babouins.
3.3.5.d Vieillissement et évolution des maladies métaboliques
Enfin, les maladies métaboliques sont généralement des pathologies chroniques, aux multiples effets secondaires apparaissant dans le temps. Dans le cadre de l’étude du microbiote intestinal et des complications des maladies métaboliques, il faudra donc utiliser des PNH âgés, présentant potentiellement ces complications. Les auteurs Tigno et al. se sont intéressées à la nature de ces complications liées au vieillissement des PNH (Macaca mulatta), et ont montré que notamment chez les animaux diabétiques présentent une diminution de la tolérance au glucose vers 14 ans environ (Tigno et al.,2004213). Une autre étude sur le vervet (Chlorocebus aethiops) a mis en évidence que la détérioration progressive de la fonction intestinale était normale avec l’âge et qu’elle pouvait être à l’origine d’une inflammation qu’il reste encore à mettre en lien avec une pathologie ou une régime alimentaire particulier chez les PNH (Mitchell et al., 2017214).
183 La prise en compte de l’âge des PNH pour l’étude du microbiote intestinal est primordiale. En effet, le microbiote varie au cours de la première année de vie et sa maturation chez le macaque rhésus juvénile était similaire à celle décrite pour l’Homme. La haute proportion de Bifidobacteria est notamment est notamment retrouvées chez l’enfant pour la digestion des oligosaccharides du lait humain. (Rhoades et al., 2019212). De plus, cette maturation est intéressante à étudier puisqu’elle impacte le microbiote intestinal de l’adulte PNH de manière pérenne, comme chez l’Homme. (Ma et al., 2014162). Par ailleurs, pour l’étude du microbiote et des maladies métaboliques chez le juvénile, il faudra prendre en compte les âges au sevrage indiqués dans les recommandations de la Commission du 18 juin 2007179 et la Directive 2010/63/UE2 (au moins 8 moins pour le marmouset, les macaques, les vervets et les babouins).
Enfin, le vieillissement du microbiote intestinal et des fonctions métaboliques et intestinales sera aussi un facteur à prendre en compte à l’inverse pour l’étude des complications des maladies métaboliques et des variations naturelles de la composition microbienne intestinale liée à l’âge (Mitchell et al., 2017214 ; Reveles et al., 2019195).
3.3.6. Origine et conditions sanitaires
Comme nous l’avons vu en partie 1, un certain nombre de facteurs environnementaux participent au façonnage du microbiote intestinal. Nous nous intéresserons ci-dessous au statut sanitaire des PNH et à leur colonie ou zone géographique d’origine.
3.3.6.a Origine captive ou sauvage des animaux
Nous avons vu précédemment que le microbiote intestinal des animaux sauvages divergeait de celui de l’Homme de manière plus importante. Nous nous intéresserons donc ici aux avantages de la captivité sur le statut sanitaire des animaux et notamment à ses effets directs sur le microbiote intestinal. Un article de 2016 « Captivity humanizes the primate microbiome » de Clayton et al. a montré que le microbiote intestinal présentait une perte massive de diversité chez les PNH captifs. Cette perte de diversité est comparable à celle observée chez l’Homme dans les pays industrialisés. Le PNH captif est donc un modèle informatif pour comprendre les effets de l’occidentalisation du mode de vie humain sur le développement des maladies liées au régime alimentaire et au microbiote intestinal, tel que le diabète ou l’obésité (Clayton et al., 2016139).
La captivité permet aussi un contrôle des groupes sociaux, et leur prise en compte dans la constitution de cohorte d’étude. En effet, une étude a montré que l’épouillage, le toilettage mutuel et le fait que les animaux se blottissent les uns contre les autres participent à la transmission de microbes fécaux les uns aux autres, particulièrement entre les femelles et chez les individus de haut rang hiérarchique. C’est aussi une voix potentielle de passage de parasites et germes pathogènes, pouvant de la même manière influencé le statut sanitaire, sain ou malade de l’individu, mais aussi la composition de son microbiote intestinal (Balasubramaniam et al., 2019215).
3.3.6.b Colonies d’origine
La captivité permet, par ailleurs, un contrôle environnemental et alimentaire des animaux. Elle offre donc une homogénéité sanitaire dans les groupes expérimentaux, critère non négligeable pour la qualité des résultats d’une étude. En effet, beaucoup de chercheurs ont montré une similarité entre les individus d’un même environnement, partageant les mêmes lieux, les mêmes habitudes et la même alimentation. Les chercheurs ont étudié 6 populations chinoises de macaques rhésus
184 sauvages et ont démontré qu’il existait une corrélation importante entre la composition du microbiote intestinal et de l’environnement géographique (Zhao et al., 2018199). Il est donc intéressant d’inclure des animaux de la même origine, du même élevage voire du même groupe social dans une étude sur le microbiote. L’autre solution serait de caractériser le microbiote intestinal d’origine de chacun des individus de la cohorte avant toute procédure expérimentale mais ce serait extrêmement chronophage et peu répétable.
La question de l’élevage intérieur ou extérieur des macaques pose donc également question. Certains animaux élevés pour la recherche biomédicale sont élevés dans des enclos avec un accès extérieur, donc potentiellement en contact avec d’autres animaux. Il serait sans doute intéressant, pour avoir un contrôle total de microbiote dès la naissance, de maitriser l’environnement totalement dès la naissance du PNH juvénile.
3.3.6.c Statut sanitaire des animaux
Comme nous l’avons évoqué en partie 1, le statut sain ou malade, un traitement médicamenteux, un évènement médical, etc., peuvent impacter significativement le microbiote intestinal de l’Homme.
Les chercheurs Rendina et al., (2019)216 ont démontré que l’effet du mode de naissance (voie basse ou césarienne) et de l’allaitement sur la composition du microbiote du macaque juvénile était comparable à celui observé chez l’Homme. Les macaques rhésus nés par césarienne et biberonnés présentent un microbiote intestinal avec un ratio Firmicutes/Bacteroidetes plus élevé que le groupe né par voie basse et allaité naturellement. (Rendina et al., 2019216).
Par ailleurs, l’historique de santé de l’animal sera intéressant à connaître car il peut fortement impacter le microbiote, comme l’administration d’antibiotiques, qui peuvent être d’importants facteurs de risques dans certaines maladies métaboliques (Sidener et al., 2017217). Le statut vaccinal sera aussi important à prendre en compte. En effet, le microbiote intestinal est largement influencé par le système immunitaire lui-même éduqué de manière dirigée par les vaccins. La revue de Ciabattini et al. a montré que le microbiote pourrait représenter un élément clé capable d’affecter la réussite d’une vaccination, par son action immunomodulatrice et son potentiel naturel d’adjuvant vaccinal (Ciabattini et al., 2019218). Comme il y a une probable variation de réponse vaccinale liée au microbiote intestinal, l’hypothèse d’une influence des vaccins sur la composition du microbiote intestinal est tout à fait envisageable. Les élevages de PNH pour la recherche sont obligés de suivre de manière stricte le statut sanitaire de leurs animaux, notamment comme le conseille le groupe de travail de la FELASA (« Revised recommendations for health monitoring of non-human primate colonies (2018): FELASA Working Group Report », Balansard et al., 2019219) ; un grand nombre d’agents infectieux et parasites à tropisme digestif sont dépistés et exclus des élevages (Salmonelles, Shigelles, Campylobacter, Yersinia..). La difficulté demeure dans les grandes différences sanitaires entre les élevages de différentes zones géographiques, qui ne sont pas confrontées aux mêmes problématiques. Il faudra donc toujours bien se renseigner sur le statut vaccinal, de vermifugation, de dépistage de certains pathogènes des animaux avant tout lancement d’études en général et particulièrement du microbiote intestinal.
185 Comme évoqué précédemment, il serait intéressant de construire et valider un modèle PNH, transplanté avec un microbiote fécal humain, après une préparation du tube digestif équivalente aux TMF. Au cours de mes recherches bibliographiques, aucun modèle de ce genre ne semble encore avoir été mis au point. Mais il serait intéressant de voir si le microbiote intestinal humain s’implanterait mieux chez les PNH que chez les souris axéniques, auquel cas les chercheurs pourraient directement étudier le microbiote humain chez les primates utilisés en recherche biomédicale. Un modèle PNH axénique étant presque inenvisageable, il s’agirait d’implanter un microbiote intestinal sain ou « dysbiotique », issu d’un individu sain ou malade, chez un PNH au statut sanitaire identifié, potentiellement après un traitement antibiotique à large spectre pour éliminer la flore résidente initiale. On pourrait potentiellement identifier les dynamiques de certaines compositions microbiotiques et à quels effets systémiques elles peuvent conduire.
Il sera donc intéressant de connaître l’historique de vie d’un animal, de sa naissance à son acquisition, pour pouvoir évaluer l’influence des différents événements qui ont pu impacter son microbiote intestinal. Dans l’idéal, il faudrait étudier des animaux captifs, du même élevage d’origine (même statut vaccinal, parasitaire, même environnement et alimentation). Cette configuration offre une homogénéité entre les individus, intéressante pour comparer des facteurs de variations du microbiote et des facteurs de risques des maladies métaboliques, sans biais majeur. Cependant cela reste peu représentatif de la variabilité interindividuelle du microbiote intestinal humain au sein d’une population.
186 3.4. HEBERGEMENT DU PRIMATE NON HUMAIN POUR L’ETUDE DU MICROBIOTE
Maintenir des primates en captivité est une tâche complexe, d’autant plus difficile dans le milieu du laboratoire. En effet, l’hébergement du PNH pose un certain nombre de problématiques qui n’existent pas pour la plupart des animaux utilisés à des fins scientifiques. Il s’agit d’animaux sauvages dont le mode de vie est généralement arboricole. Plus alertes, ils sont très sensibles à tout type de stimulus. Leur réaction de fuite est verticale plutôt qu’horizontale, c’est pourquoi la hauteur et l’agencement de leur volière doit leur permettre de « se réfugier à une hauteur suffisante pour qu’ils se sentent en sécurité ». Utilisant l’espace tridimensionnel mis à leur disposition, des perchoirs et des dispositifs d’escalade doivent être mis en place179.
Les PNH disposent de « capacités cognitives développées, d’un comportement de recherche alimentaire et d’un comportement social très élaborés »179. Il faut donc nécessairement que l’environnement artificiel mis à leur disposition en animalerie leur permette d’exprimer au maximum leur répertoire normal de comportement. 3.4.1. Recommandations pour l’hébergement du PNH en recherche biomédicale
Les recommandations en matière d’hébergement des animaux utilisés à des fins scientifiques sont répertoriées dans le texte « Recommandation de la Commission du 18 juin 2007 concernant des lignes directrices relatives à l'hébergement et aux soins des animaux utilisés à des fins expérimentales ou à d'autres fins scientifiques »179. Les paramètres environnementaux à contrôler sont la ventilation, la température (optimal pour les animaux, confortable pour les soigneurs), l’humidité (40 à 70%), le niveau sonore (fond sonore musical apaisant recommandé) et l’éclairage (cycle de 12h de lumière par jour).
L’hébergement des animaux doit être encadré par une personne compétente, formée pour le soin de ces animaux en captivité. Les PNH sont sociaux, toujours hébergés en groupe dans la mesure du possible. Dans le contexte du laboratoire, des groupes unisexes de plusieurs femelles ou plusieurs mâles peuvent remplacer les groupes retrouvés dans la nature type harem. La structure des groupes hébergés dépend de l’espèce considérée. Comme leur environnement est clos, il est important de prévoir des barrières visuelles ainsi que des itinéraires de fuites, leur permettant d’éviter les agressions par un congénère dominant. En cas de groupe unisexué, il faut, dans l’idéal, éviter d’héberger des groupes de femelles à proximité de groupes de mâles, car cela peut attiser des comportements agressifs.
Ce qui reste primordial pour l’hébergement du PNH est l’enrichissement du milieu. Il faut effectivement apporter un programme d’activités diverses à ces animaux en prévention de potentiels troubles comportementaux lié à la captivité (comme la stéréotypie). Il faut donc complexifier le volume qui lui est disponible, prévoir des perchoirs, un toit grillagé lui permettant de se pendre, des balançoires, un endroit confortable et sécurisant. Ces éléments doivent lui permettre de sauter, grimper, courir. Périodiquement, des changements peuvent être opérés lui offrant un nouveau type de jeu, déplacement, etc. La taille de l’espace disponible dépend de l’espèce, de son âge adulte, du nombre de congénères hébergés dans la même volière. Les spécificités de chaque espèce sont résumées dans le Tableau LIV ci-dessous. Généralement, pour des raisons de résistances des matériaux et de facilité de nettoyage, les volières sont constituées de métal. Mais cela présente plusieurs défauts : il s’agit d’un matériau froid et peu confortable ; sa manipulation provoque beaucoup de bruits, stressants pour les animaux. D’autres matériaux peuvent être utilisés comme le bois, le plexiglas, etc. mais généralement ils présentent tous un manque de résistance ou un coup trop élevé. Pour la contention des PNH, qui restent des animaux sauvages, des modules
187 de contention à fond mobile peuvent être installés dans les volières. Grâce à une habituation, les PNH rentrent naturellement dans ces modules et cela offre une simplicité de nettoyage, de distribution de l’alimentation, isolement des animaux avant une procédure expérimentale etc. Le sol doit être idéalement plein, pour y répandre de la litière (type copeaux de bois, non toxiques) et favoriser les comportements de recherche de nourriture par fouissage. Des enrichissements alimentaires comme des noix, des fruits secs, etc. peuvent y être distribués plusieurs fois par jour. Des jouets de tout type peuvent être distribués aux PNH et changés régulièrement pour stimuler régulièrement sa curiosité.
Il est très important que le personnel au contact soit formé. Tout d’abord, parce qu’il s’agit d’animaux sauvages, apeurés par l’Homme, qui vont avoir tendance à présenter des comportements d’agressivité envers lui (griffures, morsures, …). Il faut donc être averti et connaître le comportement naturel du PNH et anticiper ses potentielles réactions. Ensuite, il est important de bien connaître la gamme de comportements naturels des primates pour pouvoir favoriser leur expression, mais aussi savoir repérer un trouble comportemental quand il survient. Enfin, il faut connaitre ces animaux pour être capable de mettre au point des entrainements adaptés au différentes manipulations expérimentales et ainsi réduire au maximum leur stress potentiel.
Tableau LIV : Recommandations concernant l’hébergement des PNH à des fins expérimentales (Source : « Recommandation de la Commission du 18 juin 2007 concernant des lignes directrices relatives à l'hébergement et aux soins des animaux utilisés à des fins expérimentales ou à d'autres fins scientifiques »179)
Macaques et Espèce Marmouset Babouins Vervets
< 3 ans > 3 ans < 4 ans > 4 ans
Dimension minimale du 0,5 2,0 2,0 4,0 7,0 compartiment (m2)
Hauteur 1,5 1,8 1,8 minimale (m)
Nombre maximal 1 ou 2 de moins de 5 d’animaux dans 3 2 2 mois la surface minimale
Humidité trop faible peut Animal très fort : provoquer des problèmes nécessite une respiratoires Groupes matriarcaux contention multimâles ou Particularités Evite de descendre au sol appropriée multifemelles liées à l’espèce Marquage olfactif de son comptant plusieurs Groupe d’animaux territoire mâles adultes par paire ou groupes Bagarres parfois violentes multiples du même entre adultes sexe
188 Bois à ronger, avec des trous remplis de gomme Jouets à mâcher arabique ou de sirop Facilité d’érable par exemple Facilité d’apprentissage de la Enrichissements Enrichissement de d’apprentissage de la coopération pour des spécifiques fouissage suspendu coopération pour des procédures simples contenant un mélange procédures simples de routine copeaux/aliments de routine Nidification
L’hébergement des PNH est contraignant et demande une attention toute particulière. Ce sont des animaux nécessitant pour leur bien-être d’un enrichissement réfléchi et renouvelé régulièrement. Chaque espèce présente des spécificités qu’il faut prendre en compte, que ce soit dans la constitution des groupes sociaux et expérimentaux mais aussi pour leur environnement.
3.4.2. Conditions environnementales spécifiques pour la maitrise du microbiote chez le PNH en captivité
Nous venons de décrire les grands principes à respecter lors de l’hébergement captif des PNH. Mais quelles mesures supplémentaires prendre en compte pour l’étude du microbiote intestinal ?
Chez la souris, ces études sont généralement conduites dans des isolateurs ou des cages ventilées individuellement, permettant un contrôle quasi absolu des germes environnementaux (Lundberg et al., 2017220). Cela présente un réel intérêt pour l’étude d’une voie métabolique en lien avec une espèce bactérienne par exemple. Chez le PNH, sauf peut-être le marmouset qui est de plus petite taille, ce genre de systèmes serait trop contraignants et coûteux. De plus, le PNH présente un intérêt pour l’étude clinique de pathologies liées au microbiote, ou bien du fonctionnement du microbiote intestinal dans sa globalité. Il ne sera donc pas utile d’avoir un contrôle aussi poussé des germes environnementaux, tant que ces germes restent équivalents pour tous les animaux de l’étude et qu’ils restent de composition stable sur toute sa durée.
Pour réduire au minimum l’introduction de nouveaux germes, des mesures peuvent néanmoins être prises :
- Surpression de la salle d’hébergement - Présence d’un sas pour chaque salle d’étude du microbiote pour un changement d’équipements de protection individuelle (EPI) adapté : combinaison intégrale, manchettes, doubles paires de gants, changement de chaussures. Cela permet d’éviter tout passage de microorganismes depuis les manipulateurs vers les animaux. - Alimentation et litière traitées spécialement pour ne pas contenir de germes ou a minima identiques pour tous les animaux, en quantité et qualité - Jouets autoclavés avant distribution - Traitement de l’eau d’abreuvement et de nettoyage pour être au maximum stérile
189 Si l’étude ne concerne que la diversité globale, ou bien une caractérisation générale du microbiote intestinal, toutes ces mesures ne seront pas nécessaires. Elles sont à adapter en fonction de la problématique expérimentale et du niveau sanitaire requis. La charge microbienne environnementale peut être aussi maitrisée par choix de la fréquence des nettoyages à l’eau et/ou des produits utilisés pour l’entretien des hébergements.
Des mesures pratiques peuvent être mises en place pour contrôler au maximum les microorganismes environnementaux. Mais il n’y a priori pas d’intérêts à ce que les conditions soient aussi strictes que pour les souris gnotobiotiques.
Ce qui comptera surtout est le choix de l’alimentation, car comme nous l’avons vu à plusieurs reprises, elle est un facteur de variation primordiale de la composition du microbiote intestinal. Sa composition nutritionnelle sera donc à maitriser parfaitement pour en tester les effets sur la composition du microbiote ainsi que sur les troubles métaboliques.
190 CONCLUSION
Afin de démontrer que l’utilisation du Primate Non Humain était scientifiquement et éthiquement justifiée pour étudier les relations entre microbiote intestinal et maladies métaboliques, cet écrit a été développé selon trois axes.
Dans une première partie, nous avons fait un état des lieux des connaissances actuelles sur le microbiote intestinal chez l’Homme. Le microbiote intestinal, qui débute sa formation avant la naissance, possède de multiples fonctions de protection, d’immunité mais surtout de métabolisme. Sa composition varie en fonction de divers facteurs externes et la qualité de l’homéostasie avec l’hôte tient à sa stabilité et sa résilience. En cas de maladie métabolique, de nombreux liens avec le microbiote intestinal sont aujourd’hui soupçonnés et il représente une source potentielle immense de nouvelles pistes thérapeutiques.
C’est dans ce cadre et pour pallier aux nombreuses limites de l’étude du microbiote chez l’Homme que nous nous sommes intéressés, dans une seconde partie, aux apports scientifiques des modèles animaux, pour leur transposition chez l’Homme. Du fait de sa grande proximité phylogénétique avec ce dernier, nous avons choisi de comparer le modèle Primate Non Humain (PNH) au modèle murin. Cette comparaison anatomique, immunitaire, de composition microbienne intestinale et de modèles de maladies métaboliques disponibles a montré que ces deux modèles avaient des intérêts tout à fait complémentaires. Ils ne sont en effet pas utilisés pour répondre aux mêmes questions scientifiques : la souris permet de s’intéresser à des mécanismes précis, au rôle d’un gène, à une voie métabolique spécifique, aux variations de l’abondance d’une espèce microbienne etc., alors que le PNH permet une approche clinique d’une grande qualité, l’étude de facteurs de risques des maladies métaboliques, mais aussi de leurs complications. La souris permet des manipulations génétiques et sanitaires difficiles à réaliser chez le PNH. En revanche, le PNH présente une anatomie digestive et un système immunitaire plus proche de l’homme et une temporalité plus représentative. Cela fait des modèles PNH de très bons candidats pour l’étude du microbiote intestinal, à la fois dans un contexte sain et pathologique.
Enfin, dans une troisième et dernière partie, nous avons abordé le cadre réglementaire, éthique et pratique de l’utilisation du PNH en recherche translationnelle, et spécifiquement pour l’étude du microbiote intestinal et des maladies métaboliques humaines. La constitution d’une cohorte PNH pour ce type d’étude mérite d’être longuement réfléchie, car elle comporte un certain nombre de critères indispensables à déterminer au préalable : l’espèce (composition du microbiote intestinale spécifique), le modèle pathologique (différent chez chaque espèce), l’âge, le sexe ainsi que l’origine et le statut sanitaire des animaux. De manière concrète, l’hébergement des primates en laboratoire est contraignant, mais il doit être d’autant plus maitrisé pour l’étude du microbiote intestinal.
191 Cette synthèse bibliographique a mis en évidence la très grande richesse bibliographique, mais également les inconnues, aussi bien chez l’homme, la souris ou le PNH, notamment. Elle constitue cependant un préambule à la mise en œuvre d’études prenant en compte le microbiote intestinal dans les modèles de maladies métaboliques chez le PNH.
Cette thèse s’inscrit dans le cadre global de l’amélioration de la santé humaine. Mais il est fortement probable que le microbiote intestinal soit impliqué de la même façon dans la santé des animaux, de rente ou de compagnie. Il serait alors bienvenu d’intégrer cette dimension, à l’avenir, pour le progrès de nos connaissances de la médecine vétérinaire.
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215
216 ANNEXES
Annexe 1 : La phylogénie moléculaire de 61 genres de Primates, 2 genre de Dermoptères et un genre de Scandentien, ancré sur les Lagomorphes (Source : Perelman et al., 2011)180
217 Annexe 2 : Schéma synthétique de l’organisation de l’immunité intestinal (Source : chapitre 13 du livre Les Fondamentaux de la Pathologie Digestive (© CDU-HGE/Editions Elesevier-Masson - Octobre 2014)68).
218 Annexe 3 : Synthèse des principaux glucides contenu dans les aliments. (Source : « Rapport du groupe de travail PNNS sur les glucides – Annexes », Ministère de l'Agriculture et de la Pèche - Direction Générale de l'Alimentation et Sous-Direction de la réglementation, de la recherche et de la coordination des contrôles, 200793)
Famille Nom Caractéristiques
« Hexose présent dans les aliments à l’état libre ou lié Glucose à d’autres glucides »
« Hexose, possédant une fonction cétone, présent Fructose naturellement dans les fruits et dont le pouvoir Sucre simple : sucrant est supérieur à celui du saccharose » monosaccharide « Disaccharide naturel composé d’une unité glucose (ou ose, hexose, Saccharose liée à une unité fructose » carbohydrate) et disaccharide « Disaccharide naturel (présent dans le lait) composé Lactose d’une unité galactose liée (α-1-4) à une unité glucose) »
« Hexose naturellement lié à d’autres glucides Galactose (composant du lactose par exemple) »
« Polymère de glucose dans lequel les oses sont liés Amidon entre eux par des liaisons α-1,4 et α-1,6 »
« Ensemble de l'amidon et de ses produits de Amidon résistant dégradation non absorbés dans l'intestin grêle »221
« Polymère de glucose (constituant de l’amidon) dans Amylose lequel les oses sont liés entre eux par des liaisons α- 1,4 » Glucide complexe : Polysaccharides constitués d’unités de glucose liées Cellulose comme dans la cellobiose (diholoside provenant de la Polysaccharide dégradation de la cellulose)222 ou polyholoside ou polyoside ou Fructo- « Chaînes de fructoses terminées (ou pas polymère oligosaccharides systématiquement, dans le cas des oligofructoses carbohydrate (FOS) dérivés de l’inuline) par une unité glucose » (Nombre d’hexoses Polysaccharide non soluble dans l’eau constitutive de Hémicellulose supérieur ou la paroi cellulaire végétale et composante du bois égal à 3) « Fructane (polymère de fructose liés en β (2→1)) Inuline naturellement présent dans des plantes telles que oignons, asperges, chicorée, ail, blé ou seigle »
« Des polymères glucidiques d’origine végétale Fibre alimentaire (amidon, cellulose, hémicellulose, …), associés ou non dans la plante, à de la lignine ou à d’autres constituants (Afssa, 2002) non glucidiques (polyphénols, cires, saponines, cutine, phytates, phytostérols...) »
219 Annexe 4 : Abondance relative de 57 génomes microbiens fréquents trouvés chez les individus de la cohorte (Source : « A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing », Qin et al., 201050)
220 Annexe 5 : Relations entre les espèces de bactéries les plus abondantes du microbiote intestinal. La taille des cercles correspond à l’abondance de l’espèce et la longueur des ligne entre les espèces correspond à la valeur du coefficient de corrélation de Pearson (seulement les valeurs obtnenues au-dessus de 0,4 ou en-dessous de -0,4) (Source : « A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing », Qin et al., 201050)
221 Annexe 6 : Tableau récapitulatif des principales caractéristiques des bactéries retrouvées dans le microbiote intestinal (Source : Singh et al., 201756)
Caractéristiques Phylum Genre Conditions de vie morphologiques Gram + ; bâtonnet ; Clostridium Anaérobie stricte produit des spores Eubacterium Gram + ; bâtonnet Anaérobie stricte Gram + ; bâtonnet ; non Faecalibacterium Anaérobie stricte Firmicutes mobile Lactobacillus Gram + ; bâtonnet Anaérobie facultative Gram variable ; bâtonnet Roseburia Anaérobie stricte incurvé ; mobile Ruminococcus Gram + ; coque ; Anaérobie stricte Gram - ; bâtonnet ; Alistipes résistant à la bile et Anaérobie stricte producteur de pigment Bacteroidetes Gram - ; bâtonnet ; Bacteroides Anaérobie stricte motilité variable Prevotella Gram - ; Anaérobiose stricte Escherichia Coli Gram - ; bâtonnet Anaérobie facultative Gram - ; résistant à la Proteobacteria Bilophila bile ; uréase et catalase Anaérobie stricte positif Actinobacteria Bifidobacterium Gram + ; non mobile Anaérobie stricte
222 Annexe 7 : Différences phylogénétiques entre les différents entérotypes (Source : « Enterotypes of the human gut microbiome », Arumugam et al., 201182).
223 Annexe 8 : Composition archéale et fongique du microbiote intestinal. A – Genre archéens ; B – Genres bactériens ; C – Genres de fungi (Source : “Archaea and fungi of the human gut microbiome: correlations with diet and bacterial residents”, Hoffmann et al., 201383)
224 Annexe 9 : Grandes étapes d’une étude du microbiote intestinal (Source : Battey et al., « Microbiome analysis – a review of current recommendations and utilization of a proven crowdsourcing solution to benchmark methods. »118)
225 Annexe 10 : Comparaison du microbiote intestinal de l’Homme, de la souris, du porc et du macaque cynomolgus ; a – Gènes uniques non redondants des catalogues des gènes contenu dans le microbiote intestinal des quatre espèces ; b – Comparaison du microbiote intestinal des quatre espèces basée sur la notation KEGG ; c – Distance phylogénétique (basée sur l’analyse des gènes orthologues par notation KEGG) ; d – Top 20 du noyau des genres du microbiote intestinal des 4 espèces étudiées. Les genres notés en rouge sont les 10 genres partagés entre les espèces (Source : « Establishment of a Macaca fascicularis gut microbiome gene catalog and comparison with the human, pig, and mouse gut microbiomes » de Li et al., 2018132)
226 Annexe 11 : Abondance relative moyenne des classes bactériennes et ordres bactériens majeurs détectés dans le microbiote fécal de la souris, du rat, du macaque cynomolgus et de l’Homme (Source : figures supplémentaires de l’article « Comparative Microbiome Signatures and Short-Chain Fatty Acids in Mouse, Rat, Non-human Primate, and Human Feces », Nagpal et al., 2018133)
227 Annexe 12 : Repères choisis du développement du système immunitaire chez l’humain, la souris et le macaque cynomolgus ; la couleur est à mettre en relation avec la gestation ; couleur claire – premier trimestre ; couleur intermédiaire – second trimestre ; couleur foncée – troisième trimestre (Source : « Development of the Immune System in the Cynomolgus Monkey: The Appropriate Model in Human Targeted Toxicology? », Buse, 2005144)
228 Annexe 13 : Différents types de régimes alimentaires administrés chez le rat en vue d’induire un trouble métabolique ou de l’obésité (Source : « Diet-induced obesity: rodent model for the study of obesity-related disorders », Rosini et al., 2012128)
229 Annexe 14 : Fiche récapitulative des principales caractéristiques du Callithrix jacchus dans le cadre de la recherche biomédicale
Espèce Callithrix jacchus
Marmouset commun, Ouistiti à toupets blancs, Ouistiti commun Nom vernaculaire ou Ouistiti sagouin
Taille Corps : 2 à 15 cm ; Queue : 29.5 à 35 cm
Poids 300 à 360 g
Espérance de vie Milieu naturel : 10 ans ; Captivité : 12 à 16,8 ans
Maturité sexuelle Mâle : 382 jours ; Femelle : 477 jours
Milieu de vie d’origine Caatinga, forêt galerie et forêt humide atlantique du Brésil
IUCN : Préoccupation mineure Statut de conservation CITES : Annexe II
Omnivore : Fruits, fleurs, nectar, exsudats de plantes (gomme, sève, Régime alimentaire latex), proies animales (grenouilles, serpents, lézards, araignées, insectes)
Comportement social Groupe familial de 4 à 15 individus
Petit primate, facile à manipuler et moins contraignant à héberger par sa taille. Espace adapté selon la réglementation et prise en compte des besoins comportementaux (fourrageage, nidation), forte odeur Particularités et Reproduction difficile des conditions climatiques (température et contraintes en hygrométrie) et environnementales (lumière et niveau sonore) captivité Gestation gémellaire homozygote extrêmement fréquente Exigences alimentaires (syndrome de dépérissement du marmouset ou « Wasting Marmoset Syndrom ») Groupes sociaux parfois instables
Neurologie (sclérose en plaques, Parkinson, etc.), toxicologie, infectiologie (leptospirose, Herpès virus humain, Syndrome Types de modèles respiratoire aigu sévère lié au coronavirus, Encéphalite équine de expérimentaux l’Est, Fièvres hémorragiques (Filovirus, Junin virus, Virus Lassa), etc.), immunologie, reproduction (ménopause), maladies métaboliques (Obésité et obésité pédiatrique)
Fréquemment élevage propre dans les laboratoires qui les utilisent Elevage(s) d’apport Elevage français (donc relativement facilement disponible)
230 Site « Animal Diversity Web », de l’Université du Michigan, Museum of zoology189 ; « The IUCN Red List of Threatened Species » 223 ; Faivre, Références 2008178 ; Carrion et Patterson, 2012224 ; Tardif et al., 2013205 ; Tardif et al., 2009206
231 Annexe 15 : Fiche récapitulative des principales caractéristiques du Saguinus oedipus dans le cadre de la recherche biomédicale
Espèce Saguinus oedipus
Nom vernaculaire Tamarin pinché, Pinché à crête blanche ou Tamarin à crête blanche
Taille Corps : 23 cm ; Queue : 37 cm
Poids 260 à 380 g
Espérance de vie Captivité : 23 ans
Maturité sexuelle Mâle : 1,5 à 2 ans ; Femelle : 1,5 ans
Milieu de vie d’origine Forêt tropicale humide, forêt broussailleuse ; Nord de la Colombie
IUCN : En danger critique d'extinction Statut de conservation CITES : Annexe I
Omnivore : insectivore (40%), frugivore (38.4%), gomme et Régime alimentaire exsudat (14,4%)225
Groupe de 1 à 19 individus, fréquemment de 3 à 9 individus Comportement social Territorial (marquage olfactif)225
Espace adapté selon la réglementation, prise en compte des besoins Particularités et comportementaux (fourrageage, nidation) contraintes en Exigences alimentaires contraignantes captivité Reproduction difficile des conditions climatiques (température et hygrométrie) et environnementales (lumière et niveau sonore)
Types de modèles Cancer colorectal (adénocarcinome du côlon), Maladies expérimentaux inflammatoires intestinales (dont la colite ulcérative et chronique)
Elevage(s) d’apport Pas d’informations, animal a priori très rarement utilisé
Site « Animal Diversity Web », de l’Université du Michigan, Museum of Références zoology 225 ; « The IUCN Red List of Threatened Species » 223 ; Clapp, 2018185
232 Annexe 16 : Fiche récapitulative des principales caractéristiques du Saimiri sciureus dans le cadre de la recherche biomédicale
Espèce Saimiri sciureus
Nom vernaculaire Saïmiri commun ou Singe écureuil commun
Taille Corps : 31,75 cm ; Queue : 40,64 cm
Poids 925 g
Espérance de vie Milieu naturel : 21 ans ; Captivité : 21 à 27 ans
Maturité sexuelle Mâle : 4 à 5 ans ; Femelle : 2,5 à 2,7 ans
Différents types de forêt (principalement forêt tropicale humide) Milieu de vie d’origine d’Amérique du Sud sauf forêt côtière du Brésil
IUCN : Préoccupation mineure Statut de conservation CITES : Annexe II
Régime alimentaire Omnivore : frugivore, herbivore (graines et feuilles), insectivore
Comportement social Groupe jusqu’à 300 individus, hiérarchie par dominance importante
Espace adapté selon la réglementation, prise en compte des besoins Particularités et comportementaux (fourrageage) contraintes en Reproduction des conditions climatiques (température et captivité hygrométrie) et environnementales (lumière et niveau sonore), forte odeur
Infectiologie (Malaria, Plasmodium Falciparum, etc.), immunologie, Types de modèles neurologie (maladies d’Alzheimer, de Parkinson), ophtalmologie, expérimentaux pharmacologie, toxicologie
Elevage(s) d’apport Pas d’informations, animal a priori peu utilisé
Site « Animal Diversity Web », de l’Université du Michigan, Museum of Référence zoology226 ; « The IUCN Red List of Threatened Species » 223 ; Abee, 1989227 ; Porras et al., 2012186
233 Annexe 17 : Fiche récapitulative des principales caractéristiques du Chlorocebus aethiops dans le cadre de la recherche biomédicale
Espèce Chlorocebus aethiops (ou Cercopithecus aethiops)
Nom vernaculaire Vervet, Grivet d’Ethiopie, Singe vert africain
Taille Corps : 40 à 60 cm ; Queue : 30 à 50 cm
Poids 3 à 5 kg
Espérance de vie Milieu naturel : 30 à 31 ans ; Captivité : 23 à 31,6 ans
Maturité sexuelle Mâle : 5 ans ; Femelle : 2,8 ans
Savane et forêts broussailleuses ; du Sénégal au Nord-Est de Milieu de vie d’origine l’Afrique (Ethiopie, Soudan), jusqu’au sud de l’Afrique du Sud ; introduit par l’Homme sur l’île de la Barbade
IUCN : Préoccupation mineure Statut de conservation CITES : Annexe II
Omnivore : frugivore et petites proies (insectes, oiseaux et petits Régime alimentaire mammifères)
Comportement social Petits groupes, parfois groupes formés uniquement de mâles
Espace adapté selon la réglementation, prise en compte des besoins Particularités et comportementaux (Fourrageage) contraintes en captivité Reproduction des conditions climatiques (température et hygrométrie) et environnementales (lumière et niveau sonore)
Infectiologie (Dengue, etc.), reproduction (maladies ovariennes pour les femelles), neurologie (maladie d’Alzheimer), maladies Types de modèles métaboliques et cardio-métaboliques (obésité, diabète), expérimentaux maladies cardiovasculaires et rénales, pharmacologie Cellules Vero obtenues à partir de cellules rénales du Vervet utilisées pour les cultures cellulaires dans divers objectifs
Pas d’informations disponibles, mais a priori disponibilité Elevage(s) d’apport relativement bonne
Site « Animal Diversity Web », de l’Université du Michigan, Museum of Références zoology 187 ; « The IUCN Red List of Threatened Species » 223 ; Kavanagh et al., 2007156 ; Schmitt et al., 2018155
234 Annexe 18 : Fiche récapitulative des principales caractéristiques du Macaca fascicularis, du Macaca mulatta et du Macaca fuscata dans le cadre de la recherche biomédicale
Espèce Macaca fascicularis Macaca mulatta Macaca fuscata
Macaque cynomolgus, Nom macaque crabier ou Macaque rhésus ou Macaque japonais vernaculaire macaque à longue Bandar queue
Mâle : 57 cm Taille 40 à 47 cm 45 à 64 cm Femelle : 52.3 cm
Mâle : 11,3 kg Poids 3 à 7 kg 4 à 12 kg Femelle : 8,4 kg
Milieu naturel : 28 à 32 Espérance de Milieu naturel : 30 ans Captivité : 25 à 38 ans ans vie Captivité : 23 à 36 ans Captivité : 22,7 à 27 ans
Maturité Mâle : 4,2 à 6 ans Mâle : 4,5 à 7 ans Mâle : 4,5 ans sexuelle Femelle : 3,4 à 4 ans Femelle : 2,5 à 4 ans Femelle : 3,5 ans
De l’ouest de l’Afghanistan au nord Sud-Est de l’Asie (du de la Thaïlande en Myanmar aux Forêt subtropicale, passant par l’Inde Philippines, Indochine, subalpine, de feuillus ou Milieu de vie Malaisie et Indonésie) Habitats variés de conifères d’origine (Désert ou dunes, Habitats variés (Forêts, 3 îles du Sud du Japon et savane, prairie, forêt, marais, euax saumâtres, de plus petites îles montagne, milieu zone agricole, côtes) urbain, suburbain ou agricole)
Statut de IUCN : Préoccupation mineure conservation CITES : Annexe II
Omnivore : herbivore, Omnivore (fruits, Omnivore (racines, folivore, frugivore, crabes, fleurs, insectes, plantes, fruits, nectarivore (feuilles, feuilles, champignons, insectes, cultures, racines, tubercules, Régime graminées, et de petits animaux) graines, noix, fruits, alimentaire l’argile) nectar et fleurs), petites Variation en fonction proies, œufs, insectes, Régime extrêmement du lieu de vie et des champignon ; variation varié saisons saisonnière de l’alimentation
235 Groupes sociaux Groupe jusqu’à 200 Vivent en groupe dont la d’environ 30 individus individus structure est basée sur la Comportement hiérarchie des femelles Hiérarchie par social Hiérarchie linéaire avec généralement un dominance stricte par dominance mâle alpha, hiérarchie pour les mâles Non territorial très forte
Espace adapté selon la réglementation, prise en compte des besoins Particularités et comportementaux (fourrageage) contraintes en captivité Reproduction des conditions climatiques (température et hygrométrie) et environnementales (lumière et niveau sonore)
Modèles nombreux et divers Infectiologie, immunologie, toxicologie, pharmacologie, chirurgie, neurologie (sclérose en plaques), psychologie (dépression), reproduction (endométriose), maladies métaboliques (obésité, diabète), etc. Macaque rhésus : surtout utilisé en recherche fondamentale Types de Macaque cynomolgus : surtout utilisé en toxicologie modèles expérimentaux Certaines espèces de macaques montrent des mutations qui les prédisposent à différentes infections ou pathologies (par exemple, les macaques rhésus sont sensibles au SIV, alors que les macaques cynomolgus sont porteurs sains). De plus, au sein d’une même espèce, l’origine géographique et la colonie d’origine va influencer grandement le Complexe Majeur d’Histocompatibilité et donc la sensibilité aux infections de chaque individu.
Elevage(s) Île Maurice, Vietnam, Île Maurice, Vietnam, Elevage japonais pour la d’apport Chine Asie recherche biomédicale
Importation, ou rachat pour réutilisation entre les laboratoires, disponibilité Disponibilité actuelle en flux tendu car demande très importante en Europe
Coût à l’achat A l’achat entre 2000 et 6000 € (jeune singe adulte naïf) et à l’entretien
Site « Animal Diversity Web », de l’Université du Michigan, Museum of zoology Références 125,228,229 ; « The IUCN Red List of Threatened Species » 223 ; Bauer et al., 2011230 ; Pound et al., 2014165 ; Bremer et al., 2011166
236 Annexe 19 : Fiche récapitulative des principales caractéristiques du Papio papio et du Papio anubis dans le cadre de la recherche biomédicale
Espèce Papio papio Papio anubis
Babouin olive, babouin doguéra, Nom Babouin de Guinée babouin vert-olive ou encore vernaculaire Babouin du Kenya
Corps : 50,8 à 114,3 cm Corps : 48 à 76 cm Taille Queue : 45,6 à 71,1 cm Queue : 56 cm
Poids 13 à 26 kg 14 à 25 kg
Espérance de Captivité : 25,8 à 40 ans Captivité : 25,2 ans vie
Maturité Mâle : 7 à 10 ans Femelle : 4,3 ans sexuelle Femelle : 7 à 8 ans
Petite portion d’Afrique équatoriale de l’Ouest (Guinée, Guinée-Bissau, Afrique subsaharienne centrale Milieu de vie et Sénégal, et quelques populations d’origine en Mauritanie et au Mali) Désert, savane, prairie, forêt, forêt broussailleuse, forêt tropicale Savane, prairies, forêts et forêts tropicales, zones agricoles
Statut de IUCN : Quasi menacé IUCN : Préoccupation mineure conservation CITES : Annexe II CITES : Annexe II
Omnivore (racines, tubercules, Omnivore (oiseaux, mammifères, Régime bulbes, bulbes de graminées, feuilles, œufs de reptiles, charogne, insectes, alimentaire fruits, graines, noix, petits feuilles, racines, graines, céréales, mammifères, œufs, oiseaux, insectes) noix, fruits)
Terrestre, nomade ou sédentaire, Les mâles adultes maintiennent territorial, social, hiérarchie par Comportemen chacun une unité sociale séparée qui dominance importante t social contient des femelles, des juvéniles et des mâles subadultes. Groupes sociaux de 39 à 97 en moyenne
Espace adapté selon la réglementation, prise en compte des besoins Particularités comportementaux (fourrageage), structure renforcée (animaux extrêmement et contraintes fort) en captivité Reproduction des conditions climatiques (température et hygrométrie) et environnementales (lumière et niveau sonore)
237 Types de Athérosclérose, ostéoporose, génétique, maladies hépatiques, infectiologie modèles (Ebola, schistosome, etc., modèle de sepsis), reproduction, immunologie, expérimentau pharmacologie, maladies métaboliques (syndrome métabolique, x obésité, diabète de type 2)
Elevage(s) Pas d’informations disponibles, animaux a priori très rarement utilisés d’apport
Site « Animal Diversity Web », de l’Université du Michigan, Museum of zoology 188,231 ; Références « The IUCN Red List of Threatened Species » 223 ; Rogers et Hixson, 1997232 ; Chavez et al., 2009207 ; Wagner et al., 2006169
238
SCHUTZ Charlotte
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE SUR LE MICROBIOTE INTESTINAL ET SON ETUDE DANS DES MODELES ANIMAUX DE MALADIES METABOLIQUES, EN PARTICULIER CHEZ LE PRIMATE NON HUMAIN
Thèse d’Etat de Doctorat Vétérinaire : Lyon, le 6 décembre 2019
RESUME : Le microbiote intestinal est un domaine de la recherche biomédicale actuellement en plein essor. En effet, le microbiote interviendrait à la fois dans la bonne santé de son hôte mais aussi dans la pathogénèse de nombreuses maladies. Son étude chez l’Homme permet un accès à des informations limitées que solutionnent les modèles animaux. Dans ce travail, nous nous intéresserons à l’intérêt des modèles animaux pour l’étude du microbiote intestinal sain ou dans un contexte de maladies métaboliques (obésité, diabètes). Cette thèse se compose de trois parties. Dans un premier temps, nous aborderons les généralités concernant le microbiote intestinal et ses possibles liens avec les maladies métaboliques. Puis, nous comparerons le modèle murin aux modèles Primates utilisés en recherche biomédicale, leurs avantages et leurs inconvénients respectifs pour l’étude du microbiote intestinal et des maladies métaboliques. Enfin, nous verrons les spécificités de l’utilisation du Primate en laboratoire, dans ce contexte particulier. L’objectif est de démontrer que l’utilisation du Primate pour la recherche translationnelle sur le microbiote intestinal associé aux maladies métaboliques est scientifiquement et éthiquement justifiée. Nous essaierons également de donner quelques pistes pour la conception pratique de ce type d’étude chez le Primate en laboratoire.
MOTS CLES : - Flore intestinale - Expérimentation animale - Obésité - Diabètes - Babouins - Macaques
JURY :
Président : Monsieur le Professeur Serge Nataf
1er Assesseur : Madame la Docteure Delphine Grezel 2ème Assesseur : Madame la Professeure Marie-Anne Arcangioli
DATE DE SOUTENANCE : Vendredi 6 décembre 2019
ADRESSE DE L’AUTEUR : 4 allée Berger 69160 Tassin La Demi Lune