L'universite De Nantes

THÈSE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE DE NANTES

COMUNE UNIVERSITÉ BRETAGNE LOIRE

ECOLE DOCTORALE N°598 Sciences de la Mer et du littoral Spécialité : Chimie des substances naturelles marines

Par Van-Tuyen LE

Exploration de la chimiodiversité d'un Penicillium restrictum d'origine marine par approches métabolomique et lipidomique.

Volume I

Thèse présentée et soutenue à l’Université de Nantes, le 01 décembre 2020 Unité de recherche : Laboratoire Mer-Molécules-Santé MMS - EA 2160 Thèse N°:

Composition du jury

Rapporteurs

RICHOMME Pascal Professeur - Université d'Angers LOHEZIC-LE DÉVÉHAT Françoise Maîtres de Conférences - HDR - Université de Rennes 1

Président

MAMBU Angèle Lengo Professeur - Université de Limoges

Examinateurs

MAMBU Angèle Lengo Professeur - Université de Limoges EPARVIER Véronique Directeur de recherche - CNRS-Gif-sur-Yvette

Directeur de thèse

GROVEL Olivier Professeur - Université de Nantes

Encadrante de thèse

BERTRAND Samuel Maîtres de Conférences - HDR - Université de Nantes

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier Monsieur Yves Francois Pouchus pour m’avoir accuillie au sein de son laboratoire MMS-EA2160 (Mer, Molécules, Santé).

Je remercie très sincèrement Monsieur Olivier Grovel, mon directeur de thèse, pour votre aide, votre disponibilité, vos conseils scientifiques toujours précieux et pertinents, vos explications tout au long de ma vie en France. Je sais bien que vous avez passé beaucoup de temps pour moi avec patience, pour la correction des manuscrits, ansi que m’écouter et à m’expliquer tellement de choses que je ne connais pas depuis mon arrivée en France jusqu’aujour’hui. Je n’ai jamais vu que vous étiez énervé même quand j’avais fait beaucoup des bêtises, des ereurs. Votre optimiste et votre sympathie ont m’aidé à passer des moments difficiles et à apprendre à partir de mes erreurs passées. Votre soutien moral et profes- sionnel et vos compétences scientifiques m’ont été d’une grande aide et m’ont donnée beaucoup de motivation pour élargir mon horizon de rercherche. Votre aide m’a permis de m’apporter de continuer mes recherches jusqu’au bout. Je n’aurais jamais pu y arriver sans vous.

Je tiens à remercier mon encadrant, Monsieur Samuel Bertrand pour toute l’aide que vous m’avez accompagnée au cours de ma thèse. Je vous remercie pour votre aide, votre disponibilité en partience à m’écouter et m’expliquer des enseigements statistiques, des nouvelles méthodes d’analyse de donné métabolome. Merci beaucoup pour votre temps que vous avez passé pour moi afin de corriger des manuscrits avec beaucoup de fautes, et de traitement des données et de valorisation de ma thèse. Votre passion pour la recherche m’a inspirée. Merci beaucoup pour vos encouragements.

Je remercie sincèrement les membres de mon jury de thèse : Monsieur Pascal Richomme, Madame Francoise Lohezic- Le Dévéhat, Madame Angèle Lengo Nambu, Madame Éparvier Véronique de me faire l’honneur et de prendre votre temps pour participer à ce jury.

Un grande mercie aux membres de mon comité de suivi de thèse : Madame Marieke Vantseelandt et Madame Gaëlle Pencreac’h. Je vous remercie pour votre disponibilité à suivre mon travail, votre soutien et vos conseils scientifiques très précieux.

Je tiens à remercie Madame Nathalie Caroff pour votre gentillesse, votre disponibilité, votre aide lors de la réalisation des tests antibactériens et quorum sensing.

Je tiens à remercie Monsieur Pascal Marchand, Madame Muriel Duflos et votre équipe pour votre acceuil chaleureux au sein de votre laboire ICIMED. Je vous remercie à Monsieur Cédric Logé pour votre gentillesse, votre disponibilité, votre aide afin de réaliser modélisation moléculaire, ainsi que votre aide pour comprendre des cours de master 1 lors de ma première année en France. Vous m’avez bien soutenue.

J’adresse mes remerciements à Monsieur Fabrice Fleury pour m’avoir acceuillie au sein du laboratoire IMPACT. Merci pour votre gentillesse, votre disponibilité suivre à mon travaille.

J’adresse aussi mes remerciements à Monsieur Joël Boustie pour m’avoir acceuillie au sein du laboratoire ISCR UMR CNRS 6226. Merci Madame Marylène Chollet-Krugler pour votre disponibilité, votre aide afin que je puisse faire des manifs de détermination de la rotation optique.

Je tiens à remercie Monsieur Hassan Nazih de l’équipe ANC du laboratoire MMS, vos collèges pour votre acceuil chaleureux, votre aide lors de la réalisation des tests de cytotoxicité.

Mes plus chaleureux remerciements s’adressent également à Madame Marie-Claude Boumard pour ses conseils techniques avisés et sa gentillesse, à Monsieur Thibaut Robiou du Pont pour son aide quotidienne précieuse, son soutien et sa gentillesse, à Madame Auror Michaud pour son aide, son conseil technique.

Je remercie également chaleureusement Madame Karina-Ethel Petit, Monsieur Nicolas Ruiz, Madame Vony Rabesao- tra, Madame Wielgosz-Collin Gaétane, Madame Aurélie Couzinet-Mossion pour leur aide et leur gentillesse. Un grand merci à tous les membres du labo MMS, professeurs, docteurs, doctorants pour leur aide, leur bonne humeur et leur accueil chaleureux.

Je remercie l’Ecole supérieur de pharmacie de Phutho, spécifiquement Monsieur Ha Quang Loi pour votre soutien, votre encouragement à faire mes études en France.

Je vous remercie aux personnes de l’université de Nantes qui m’ont aidé de venir faire mes études en France : Monsieur Francois Resche, Monsieur Yves Perraudeau, Madame Christine Bobin-Dubigeon, Madame Nelly Moré. Je vous remercie tout particulièrement à Madame Christine Bobin-Dubigeon, Madame Nelly Moré votre acceuil chaleureux, votre aide, votre disponibilité lors de ma première arrivée en France.

De tout mon cœur, je remercie tous mes amis francais, vietnamiens qui sont toujours disponibles à m’aider et à partager de bons moments avec moi.

Pour ma famille, merci pour votre amour indesscriptible pour moi, pour votre soutien quotidien. En particuliere, je vous remercie ma femme afin d’avoir créé une famille, semé des valeurs et attendu avec patience le réultats qu’elles offrent chaque jour. De tout mon cœur, tu es toujours à mes côtés.

Merci à tous de m’avoir fait partager votre amour de la recherche.

Sommaire

Remerciements ...... I Sommaire ...... III Liste des Figures ...... V Liste des Tableaux ...... VII Liste des Abréviations ...... VIII Liste des publications scientifiques réalisées au cours de la thèse de doctorat ...... X Préface ...... 1 CHAPITRE 1 – Introduction générale ...... 4 1. Les champignons en milieu marin : définition, diversité, écologie ...... 4 2. Les champignons filamenteux du genre Penicillium ...... 7 2.1. Morphologie ...... 7 2.2. Classification ...... 8 2.3. Distribution et abondance ...... 11 2.4. Métabolites ...... 11 3. Les champignons filamenteux du genre Penicillium d’origine marine ...... 12 4. L’espèce Penicillium restrictum J.C. Gilman & E.V. Abbott (1927) ...... 16 5. Stratégies d’accès à la chimio-diversité fongique...... 20 6. Les approches métabolomiques en chimie des produits naturels ...... 22 6.1. La métabolomique ...... 22 6.2. La stratégie métabolomique ...... 23 6.3. Des données brutes LC-HRMS à la matrice de donnée ...... 24 6.4. Les méthodes d’analyse statistique des données ...... 25 6.5. La déréplication ...... 26 6.6. Les réseaux moléculaires ...... 27 7. Contexte et objectifs des travaux de thèse ...... 28 CHAPITRE 2 – Etude du métabolome de la souche MMS417 P. restrictum et isolement de métabolites d’intérêt et/ou bioactifs...... 31 1. Influence du milieu de culture sur le phénotype de P. restrictum MMS417 ...... 32 2. Influence du milieu de culture sur le rendement d’extraction et sur la production globale de métabolites spécialisés ...... 33 3. Etude métabolomique par LC-HRMS/MS de la souche P. restrictum MMS417 et isolement des composés induits par la présence d’extrait de Mytilus edulis et d’eau de mer dans le milieu de culture...... 34 Article 1: ...... 38

III

4. Etudes complémentaires sur les composés de la souche MMS417 P. restrictum...... 66 4.1. Déréplication et annotations des molécules présentes dans les extraits ...... 66 4.2. Focus sur les macrolides à 13 carbones, les méléarorides...... 68 4.3. Isolement des métabolites bioactifs de la souche MMS417 P. restrictum...... 74 5. Conclusion et perspectives ...... 79 Chapitre 3. Etude l’évolution de la chimiodiversité de la souche MMS417 au cours du temps, sur milieu MES-SSW – cas de la voie de biosynthèse des pyran-2-ones ...... 83 1. Introduction générale ...... 83 2. Étude cinétique de la diversité chimique des pyran-2-ones par la souche MMS417 sur milieu MES-SSW ...... 84 Aticle 2: ...... 85 3. Conclusion et perspectives ...... 104 Chapitre 4. Etude globale du métabolisme de Penicillium restrictum MMS417 dans un milieu à base de moule et en réponse à un stress salin ...... 105 1. Analyse lipidique des fractions F1 à F4 de l’extrait brut MES-SSW ...... 105 2. Le lipidome fongique...... 106 Article 3: ...... 108 3. Conclusion et perspective ...... 130 Conclusion générale...... 132 Référence bibliographique ...... 135

Liste des Figures

Figure 1: Observation morphologique d’un Penicillium...... 7 Figure 2 : Structure des conidiophores de Penicillium (Pitt 1988) : a) Penicillium monoverticillés, b) Penicillium biverticillés, c) Penicillium triverticillés...... 8 Figure 3 : Variabilité phénotypique des Penicillium: exemple de morphologie macroscopique de colonies d’une souche de P. atrolazulinum sur milieux CYA, MEA and YES (rev : dessus, obv : dessous). (Visagie et al. 2016) ...... 9 Figure 4 : Diversité et distribution du genre Penicillium présent dans différents habitats (Yadav et al. 2018)...... 11 Figure 5 : Structure de la pénicilline G et de la griséofulvine ...... 11 Figure 6 : Proportions des types d’habitats des Penicillium marins étudiés pour leur production de produits naturels (gauche) et types de structure des nouveaux métabolites décrits à partir de ces souches (droite) (Ma et al. 2016) ...... 13 Figure 7 : Structure de métabolites spécialisés isolés à partir des Penicillium issus de mollusques ...... 15 Figure 8 : conidiophores monoverticillés et conidies de P. restrictum (Figueroa et al. 2014) ...... 16 Figure 9: Structure des métabolites spécialisés décrits chez l’espèce P. restrictum ...... 18 Figure 10: Visualisation des données MS/MS par réseau moléculaire (Boudreau et al. 2015), ...... 28 Figure 11: Profils métaboliques obtenus par CLHP-SM/SM en mode positif de la souche MMS417 cultivée sur milieux YES et MES. Annotations putatives : A, LL-P880γ ; B, hydroxypestalotine ou pestalrone A ; C, pestalotine ou pestalrone B ; D, 5,6-dihydro-4-méthoxy-6-(1-oxopentyl)-2H-pyran-2-one (Geiger et al 2013)...... 29 Figure 12: Aspect morphologique de la souche MMS417 cultivée sur 14 milieux de culture ...... 32 Figure 13 : Masses d’extrait brut de culture de la souche MMS417 sur 14 milieux différents (BL : milieu d’agar non inoculés, EB : extrait brut de culture de la souche MMS417, DW : l’eau distillée, SSW : l’eau de mer) ...... 33 Figure 14: Structure des composés de structure pyran-2-one isolés...... 35 Figure 15 : Structures des composés potentiellement annotés chez P. restrictum MMS417 (la stéréochimie des composés décrits dans la littérature est présentée bien que la déréplication ne puisse pas donner d’informations à ce niveau)...... 67 Figure 16 : Cluster 2 du réseau moléculaire de l’extrait brut MES-SSW avec des composés dérépliqués ...... 68 Figure 17 : Modèle de fragmentation général proposé pour le Méléaroride A sur la base de son spectre HRMS/MS obtenu en mode d’ionisation positive...... 70 Figure 18 : Modèle de fragmentation général proposé pour le N-déméthylméléaroride A sur la base de son spectre HRMS/MS obtenu en mode d’ionisation positive...... 70 Figure 19 : Modèle de fragmentation général proposé pour le PF1163B sur la base de son spectre HRMS/MS obtenu en mode d’ionisation positive...... 71 Figure 20 : Modèle de fragmentation général proposé pour le PF1163E sur la base de son spectre HRMS/MS obtenu en mode d’ionisation positive...... 71 Figure 21 : Modèle de fragmentation général proposé pour le N-déméthylPF1163E à 23.44 min (nouveau produit naturel) sur la base de son spectre HRMS/MS obtenu en mode d’ionisation positive...... 72 Figure 22: Modèle de fragmentation général proposé pour l’isomère du N-déméthylPF1163E à 23.13 min (nouveau produit naturel) sur la base de son spectre HRMS/MS obtenu en mode d’ionisation positive...... 72 Figure 23: Modèle de fragmentation général proposé pour le N-déméthydehydroméléaroride A (nouveau produit naturel) sur la base de son spectre HRMS/MS obtenu en mode d’ionisation positive...... 73 Figure 24: Bilan du fractionnement de l’extrait brut MES-SSW et CCM des fractions de l’extrait brut MES-SSW obtenues par CLV (silice, éluant = CH2Cl2/MeOH 90/10 (V/V) puis Hexane/AcOEt 60/40 (v/v), révélateur – vanilline sulfurique)...... 74 Figure 25 : Schéma de purification de fractions F-5-1 à F5-13 à partir de fraction F5 et CCM de fractions F5 (Silice,

éluant CH2Cl2/MeOH : 9/1 (v/v), révélateur : vanilline sulfurique) ...... 75

Figure 26 : CCM et CCM dimension des fractions de fractions F5 et F5R (Silice, éluant CH2Cl2/MeOH : 9/1 (v/v), révélateur : vanilline sulfurique) ...... 76 Figure 27 : Chromatogrammes de masse (ESI +, base peak) des fractions F5 et F5R ...... 76 Figure 28 : Chromatogrammes de masse (ESI -, base peak) des fractions F5 et F5R ...... 77 Figure 29 : résultat de la comparaison des chromatogrammes des fractions F5 et F5R, liste des pics observés dans la fraction F5 (points verts) mais absents de la fraction F5R (points rouges)...... 78

Figure 30 : CCM des fractions F1 à F4 et des témoins (silice, éluant : Hexan/Ether/Acide acétique 65mL/15mL/0,75 mL), révélateur : vaniline sulfurique) ...... 105

Liste des Tableaux

Tableau 1 : Revue des principales classifications successives du sous-genre Aspergilloides de Penicillium ...... 10 Tableau 2 : Métabolites spécialisés décrits chez l’espèce P. restrictum ...... 19 Tableau 3 : Données de composés TLV1-TLV8 ; TLV10, TLV14, TLV15, TLV18 ...... 36 Tableau 4 : Déréplication et données des principaux méléarorides détecté dans l’extrait brut par analyse LC- (+)ESIHRMS/MS. En bleu les molécules décrites dans la littérature, en vert les analogues potentiellement nouveaux. 69

VII

Liste des Abréviations1

ACN Acétonitrile EtOAc Acétate d’éthyle AcOH Acide acétique ATCC American type culture collection HCA Analyse de classification hiérarchique ANOVA Analyse de la variance ACP Analyse en composantes principales BPC Base pic chromatogramme MTT Bromure de 3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényl-2H-tétrazolium

CDCl3 Chloroforme deuthéré HPLC Chromatographie liquide à haute performance HPLC-HRMS Chromatographie liquide à haute performance couplé avec spectrométrie de masse haute résolution HPLC-HRMS/MS Chromatographie liquide à haute performance couplé avec spectrométrie de masse haute résolution avec la fragmentation HPLC-(+)HRESIMS Chromatographie liquide à haute performance couplé avec spectrométrie de masse haute résolution, ionisation par électrospray en mode possitif CLBP Chromatographie liquide basse pression CLV Chromatographie liquide sous vide UHPLC chromatographie liquide ultra haute performance UPLC Chromatographie liquide ultra performance LC-UV/DAD-MS Chromatographie liquie - Détecteur en UV à barrette de diodes - couplé avec spectrométrie de masse CCM Chromatographie sur couche mince CP Composante principale

CI50 Concentration inhibitrice 50 CMI Concentration minimale inhibitrice QC Contrôle qualité (Quality Control) COSY Corrélations en RMN 2D entre des protons couplés de façon scalaire (2JHH, 3JHH protons portés par des carbones voisins) TIC Courant ionique total VIPc cumulated variable importance in the projection CYA Czapek yeast agar (concentré de czapek-extrait de levure-agar ; milieu de culture fongique) δ Déplacement chimique DAD Détecteur à barrette d’iode DCA Dextrose - extrait de caséine - agar (milieu de culture fongique) PDC Dichromate de pyridinium DNP Dictionnary of Natural Product, base de données de produits naturels DMSO Diméthylsulfoxyde DMEM Dulbecco’s modified eagle’s medium (milieu de culture cellulaire) SSW Eau de mer reconstituée DW Eau distillée HMBC En RMN 2D : intéraction à longue distance 1H-13C (2JCH, 3JCH voire 4JCH) HSQC En RMN 2D : les interactions 1H-13C NOESY En RMN 2D, interaction dipolaire (spatiale) entre deux protons (1H-1H) EMAG Esters méthyliques d’acides gras

1 Certaines abréviations bien que correspondant à l’acronyme anglophone seront préférées tout au long du manuscrit de thèse car ces termes sont utilisés de façon courante aujourd’hui par les scientifiques francophones.

VIII

EtOH Ethanol GC-MS Gas chromatography-mass spectrometry ESI Ionisation par électrospray (Electrospray Ionization) KMS Kohlmeyer modifié solide (milieu de culture fongique) MCF-7 Ligné cellulaire du sein KB Lignée cellulaire kératine λ longueur d’onde (en nm) MEA Malt extract agar (extrait de malt - agar ; milieu de culture fongique) MMS Mer-Molécules-Santé MeOH Méthanol MeOD Méthanol deuthéré MN Molecular networking (réseau moléculaire) MES Moule Extract Sucrose agar (milieu de culture fongique) MBPLS-DA Multiblock partial least square discriminant analysis NAP N-Acyl Pyrrolidide NI Negative ionisation OSMAC One Strain Many Compounds O-PLSDA Orthogonal partial least square discriminant analysis GNPS Plateforme “The Global Natural Product Social Molecular Networking” PI Positive ionisation PDA Potato dextrose agar (Extrait de pomme de terre - agar ; milieu de culture) αD Pouvoir rotatoire PTP1B protein-tyrosine phosphatase 1B QS Quorum Sensing m/z Rapport masse sur charge d’un composé ER+ Réceptors estrogen - positif ITS Régions non-codantes espaçant les gènes ribosomaux (Internal Transcri- bed Spacer) RMN Résonnance magnétique nucléaire RMN 2D Résonnance magnétique nucléaire à deux dimensions RMN 1D Résonnance magnétique nucléaire à une dimension PBS Tampon phosphate salin (Phosphate Buffered Saline) tR Temps de rétention TOF Temps de vol THF Tétrahydrofurane rpm Tour par minute (round per minute) XIC Trace des ions (Chromatogramme d'extrait des ions) IT Trappe ionique UV Ultraviolet v/v Volume pour volume YES Yeast extract sucrose agar (milieu de culture fongique)

Liste des publications scientifiques réalisées au cours de la thèse de doctorat

Articles dans des périodiques internationaux avec comité de lecture

Van-Tuyen Le, Samuel Bertrand, Thibaut Robiou du Pont, Fabrice Fleury, Nathalie Caroff, Sandra Bourgeade-Delmas, Cedric Logé, Gregory Genta-Jouve, and Olivier Grovel Untargeted metabolomics approach for the discovery of environment-related pyran-2-ones chemodiversity in a marine- sourced Penicillium restrictum Marine Drugs (soumission en cours)

Van-Tuyen Le, Samuel Bertrand, Marion Brandolini-Bunlon, Aurélie Couzinet-Mossion, Vony Rabesaotra, Olivier Grovel Multiblock partial least square discriminant analysis (MBPLS-DA) for Penicillium restrictum chemical diversity exploration by One Strain Many Compound (OSMAC) approach – Tracking see water effect on fungal metabolism Metabolomics (soumission en cours)

Van-Tuyen Le, Samuel Bertrand, Olivier Grovel Toward diversified chemical diversity in shellfish-sourced Penicillium restrictum – impact of time in pyran-2-ones diversity and production (redaction en cours de finilisation)

Communications par affiche dans des congrès internationaux

Van-Tuyen Le, Samuel Bertrand, Olivier Grovel. Metabolome exploration of a marine sourced fungal strain of Penicillium restrictum J.C. Gilman et E.V. Abbott. 5th AFERP International Conference, Angers, France, July 17-19, 2017

Van-Tuyen Le, Samuel Bertrand, Yves Francois Pouchus, Olivier Grovel. UHPLC-HRMS-MS Metabolomic study of a Penicillium restrictum marine-derived fungal strain. 3ème Symposium International AFERP STOLON, Rennes, France July 18-20, 2018

Communications par orale dans des congrès nationaux

Van Tuyen Le, Samuel Bertrand, Fabrice Fleury, Nathalie Caroff, Sandra Bourgeade-Delmas, Cédric Logé, Gregory Genta-Jouve, Olivier Grovel. Eléments de langage estuariens entre champignons et bivalves. Médiation chimique dans l’environnement Ecologie Chimique (MediatEC), Toulouse, France octobre 18-20, 2020.

Préface

Il y a 160 ans, Charles Darwin a déterminé que les organismes s’adaptent à leur environnement dans un processus évo- lutif afin d’assurer leur survie (Darwin 1859). Les animaux, plantes, champignons et les bactéries doivent ainsi sécuriser leur accès à une alimentation et à un espace suffisant et doivent développer des stratégies pour survivre aux attaques de concurrents et de prédateurs. Les différentes espèces vivantes utilisent donc différentes stratégies pour réussir, c’est le cas des champignons qui ont développé une multitude de stratégies de défenses chimiques optimisées (Spiteller 2008). Ainsi, l’existence de composés biologiquement actifs produits par les champignons est reconnue et les chercheurs se sont intéressés à l’isolement et à la caractérisation des métabolites spécialisés biologiquement actifs des champignons depuis plus d’un siècle. La mise en évidence des propriétés antibiotiques de Penicillium rubens par Fleming en 1928 (Fleming 1929) a stimulé la recherche de nouveaux antibiotiques produits par les champignons. Cependant, cette activi- té s’est fortement concentrée sur la mise en évidence de composés chefs-de-file pour le développement de nouveaux médicaments plutôt que chercher à révéler leurs rôles écologiques pour les organismes (Butler 2004; Newman and Cragg 2016; Schueffler and Anke 2014). Plus récemment, la question de connaitre le rôle écologique des métabolites spécialisés lors de l’interaction des organismes avec leur environnement est devenue plus importante, ouvrant les champs de l’écologie chimique aux chimistes des produits naturels. Cependant, jusque-là, il y a peu d’étude sur le rôle des métabolites fongiques par rapport à celui des métabolites dans les plantes et/ou les insectes (Spiteller 2008). Le rôle écologique de ces métabolites spécialisés fongiques est donc encore méconnu.

Ainsi, les champignons sont en constante interaction avec leur environnement. L’organe fructifère des champignons ainsi que leur mycélium doivent faire face et interagir avec concurrents et ennemis. Ainsi, étant donné l’importance des organes de reproduction pour la production des spores, sexuées ou asexuées, ceux-ci contiennent souvent des toxines qui empêchent les organismes fongivores de se nourrir (Spiteller 2008). De plus, les champignons sont des organismes hétérotrophes, ils dépendent donc de sources énergétiques extérieures pour leur croissance, tels que la matière organique morte (champignons saprophytes) ou l’acquisition auprès d’organismes vivant (champignon parasite ou symbiotique) (Thatoi et al. 2013). Par exemple, des champignons phytopathogènes sont capable de parasiter des plantes (Doehlemann et al. 2017) et des champignons endophytes vivent au sein de plantes hôtes (Rana et al. 2019). Les champignons my- corhiziens quand-à eux s’associent avec les racines des plantes et leur fournissent des nutriments inorganiques présents dans le sols en contrepartie de nutriments organiques et d’eau (Begum et al. 2019). Les champignons mycoparasites, eux, ont même la capacité de parasitisme d’autres champignons (Barnett 1963; Barnett and Binder 1973). Certains champignons entomopathogènes sont capables d’entrainer la mort d’insectes ou d’autres arthropodes (Baverstock et al. 2010).

Pour interagir avec succès avec d’autres espèces, les champignons doivent également avoir développé une riche pano- plie de molécules pouvant servir à la communication, à la défense chimique (molécules biocides ou inhibitrice des mé- canismes de défense des hôtes) et aux interactions symbiotiques (Spiteller 2015). C’est pour ces raisons que les champignons sont devenus l’objet de recherches intensives ce qui s’est encore intensifié avec la découverte de métabolites spécialisés biologiquement actifs valorisables en thérapeutique tels que les bêta-lactamines, les statines, la cyclosporine A (Anjum et al. 2012) ou encore le paclitaxel (Zaiyou et al. 2017). Une meilleure compréhension de l’écologie chimique de ces organismes peut donc s’avérer utile pour la découverte de nouveaux métabolites spécialisés biologiquement actifs pour le développement de nouveaux médicaments.

Les champignons marins ont été étudiés pour la première fois en 1856 avec la découverte de l’espèce Sphaeria posido- niae (Halotthia poidoniae) associée avec l’herbe marine Posidonia oceanica (Jones et al. 2019). Depuis, ces organismes ont été isolés d’un grand nombre d’environnements marins différents tels que des algues marines, des éponges, des invertébrés ou des sédiments, ceci depuis toutes les niches écologiques de la surface aux grandes profondeurs océa- niques. La découverte de la céphalosporine C, premier antibiotique fongique à noyau β-lactame isolé à partir d’une souche champignon d’origine marine en 1953 (Abraham et al. 1953), a montré l’intérêt qu’il y avait de travailler sur des souches marines. Depuis ce jour, les champignons marins sont une source importante de métabolites spécialisés utiles pour la découverte de médicaments et un nombre croissant de molécules nouvelles issues de champignons marins, même si aucun n’est à ce jour arrivé sur le marché (Blunt et al. 2012, 2016, 2018). Ils sont ainsi une source proportion- nellement importante des métabolites spécialisés, possédant des activités antibiotiques, antivirales, antifongiques, etc. (Jin et al. 2016). Parmi les champignons d’origine marine, ceux du genre Penicillium sont parmi les plus représentés dans l’environnement, et reconnus comme des champignons pouvant produire une grande variété de métabolites bioactifs (Ma et al. 2016; Nicoletti and Trincone 2016; Vansteelandt et al. 2014).

Les travaux présentés dans cette thèse s’inscrivent dans l’étude de la chimiodiversité de l’espèce Penicillium restrictum, peu étudiée du point de vue de son métabolisme spécialisé, et en particulier d’une souche isolée de coquillages d’une zone conchyliculture. De ce fait, des considérations écologiques concernant les interactions entre cette souche et son hôte d’origine ont été intégrées à ce travail. Des investigations originales sur son lipidome ont également été réalisées, les lipides des champignons marins ayant à ce jour fait l’objet de très peu d’études, que ce soit descriptives ou en terme de valorisation.

Ce manuscrit s’articule en 4 chapitres :

- Le chapitre 1 présente une bibliographie concernant les champignons en milieu marin incluant définition, diversité, écologie. Ce chapitre introduit également les champignons filamenteux du genre Penicillium, les champignons filamenteux du genre Penicillium d’origine marine et l’espèce P. restrictum étudiée. Les stratégies d’accès à la chimio-diversité fongique et les approches métabolomiques en chimie des produits naturels ainsi que les objectifs des travaux réalisés sont présentés.

- Le chapitre 2 consiste en l’étude des variations de l’expression du métabolisme spécialisé de la souche MMS417 P. restrictum et l’isolement de métabolites d’intérêt et/ou bioactifs. Pour cela, l’approche OSMAC couplée à une étude métabolomique non ciblée par analyses LC-HRMS/MS a guidé l’isolement de métabolites spécialisés à noyau pyran-2-one sur un milieu de culture à base de moule (MES-SSW). Des évaluations biologiques de ces molécules sont présentées.

- Le chapitre 3 présente les résultats d’une étude métabolomique cinétique principalement focalisée sur la voie de biosynthèse des pyran-2-ones et son expression séquentielle au cours de la croissance fongique sur milieu MES-SSW. Les analyses LC-HRMS/MS et la construction d’un réseau moléculaire « dynamique » ont permis d’émettre des hypothèses sur la cinétique d’expression de cette voie de biosynthèse.

- Le chapitre 4 présente une étude cette fois-ci globale du métabolisme de Penicillium restrictum MMS417, en incluant à la fois le métabolome spécialisé et le lipidome. Pour cela, les extraits de l’étude OSMAC ont été analysés par analyses HPLC-HRMS selon deux protocoles différents pour d’abord profiler le métabolisme

spécialisé, puis les lipides. En parallèle, ces extraits ont aussi été analysés par GC-MS après transesterification en esters méthyliques d’acides gras (EMAG). Afin d’analyser l’ensemble de ces données obtenues une approche par analyse statistique multi-blocs a été entreprise.

- Enfin, une conclusion générale vient présenter les principaux résultats obtenus et les perspectives qui en découlent.

3 Chapitre 1. Introduction générale

CHAPITRE 1 – Introduction générale

1. Les champignons en milieu marin : définition, diversité, écologie

Longtemps les champignons ont été considérés comme une forme de vie fondamentalement terrestre. Au cours des dernières décennies, ce concept a commencé à être révisé sur la base des nouvelles preuves que ces micro-organismes sont également isolés dans le milieu marin. Quelques définitions des champignons marins ont été rapportées basées uniquement sur des critères physiologiques (Gareth Jones and Jennings 1964; Johnson and Sparrow 1961; Tubaki 1969). Mais ces postulats semblent néanmoins trop restrictifs car les champignons terrestres possèdent une certaine tolérance à la salinité du milieu marin. Cette définition a été reconsidérée par Kohlmeyer et Kohlmeyer à la fin des années 1970 en intégrant des critères écologiques (Kohlmeyer and Kohlmeyer 1979). Selon celle-ci, deux voire trois groupes de champignons pouvaient être distingués :

- les champignons marins dits « obligatoires », se développant et sporulant exclusivement dans les environnements marins ou estuariens ;

- les champignons marins dits « facultatifs », provenant des eaux douces ou du milieu terrestre, qui sont capable de se développer et éventuellement de sporuler en milieu marin ;

- les champignons isolés dans les milieux marins par méthodes de culture ou métagénomiques, mais dont la nature marine obligatoire ou facultative n’est pas certaine, ils s’appellent « champignon d’origine marine ».

Cependant, cette définition a récemment été considérée comme trop contrainte. Par exemple, des champignons initialement décrits comme appartenant à des espèces terrestres, mais isolés par la suite à partir de sédiments marins, ont géné- ralement été étiquetés comme champignons terrestres. Du fait de leur présence dans divers sites marins, ces espèces pourraient tout autant être considérées comme marines (Jones et al. 2015). Il a été ainsi récemment postulé que les champignons « marins » formeraient un groupe beaucoup plus large et qu’il faudrait également considérer l’activité et le rôle des champignons terrestres adaptés aux écosystèmes côtiers et marins. Ainsi contrairement à la définition initiale, les espèces marines n’ont pas nécessairement besoin de se développer ou de sporuler dans le milieu marin pour avoir une incidence ou y jouer un rôle important (Houbraken and Samson 2011). Une nouvelle définition des champignons marins les a donc classé en trois groupes suivant leurs rôles actifs ou passifs dans la mer : 1) les champignons marins actifs endémiques stricts, 2) les champignons marins actifs ubiquistes, 3) les champignons marins passifs ubiquistes (Mahé et al. 2013).

Plus récemment, en 2016, une autre définition a été rapportée, considérant qu’un champignon pouvait être considéré comme marin s’il (1) est capable de croitre et ou sporuler (sur des substrats) en milieu marin, (2) forme des relations symbiotiques avec d’autres organismes marins, et (3) montre une évolution génétique et une adaptation spécifique ou une métabolisme actif en milieu marin (Pang et al. 2016). Il y a ainsi de nombreux champignons terrestres ou d’eau- douce qui pourraient se développer dans un environnement hyper-salin (Gostinčar et al. 2011; Jančič et al. 2016; Schulz Chapitre 1. Introduction générale et al. 2008). En conséquence, la définition d’un champignon marin n’est pas encore fondée sur une histoire évolutive unificatrice.

L’adjectif marin dans le terme « champignons marins » dans la plupart cas, fait référence à l’environnement à partir duquel les champignons sont isolés. Dans le domaine de la chimie des produits naturels, le terme « champignons d’origine marine » a été souvent utilisé pour décrire des souches de champignons isolées d’habitats et/ou de substrats marins et/ou liés à la mer. Si ce terme est maintenant largement employé et accepté, il ne comporte guère de sens écolo- gique parce qu’on ne sait pas si les champignons y jouent un rôle écologique ou s’ils y forment des relations stables avec autres organismes vivants (Pang et al. 2016).

Les champignons marins peuvent se développer dans des salinités très différentes mais nécessitent généralement des conditions relativement stables (Alderman and Gareth Jones 1971; Gareth Jones and Jennings 1964). De nombreux genres de champignons contiennent des espèces et des souches d’espèces dont la tolérance au sel diffèrent considéra- blement (Gal-Hemed et al. 2011). Plusieurs études ont décrit que la salinité est un facteur important influençant la croissance et la production de métabolites spécialisés chez certaines espèces. Ceci peut d’ailleurs être utilisé pour la recherche de nouveaux métabolites à partir de champignons marins ou pour augmenter la production ciblée de métabo- lites spécialisés en fermentation industrielle (Geiger et al. 2013; Hoang et al. 2018; Huang et al. 2011; Kerzaon et al. 2008; Lorenz and Molitoris 1992; Masuma et al. 2001; Venkatachalam et al. 2019).

Dans les environnements marins, les champignons sont ubiquistes : ils ont été retrouvés depuis la colonne d’eau jusqu’aux grandes profondeurs et pouvant coloniser tous les types de substrats. Ils sont également associés à de nombreux types d’organismes tels qu’éponges, coraux, poissons, et mollusques. Parmi ces derniers, les bivalves sont des organismes suspensivores qui peuvent filtrer, retenir et concentrer activement les particules de leur environnement dont des microorganismes tes que les bactéries, les virus, les protozoaires et les champignons. A ce jour, les interactions entre champignons et mollusques bivalves sont peu connues, les recherches s’étant principalement focalisées sur l’étude de la structure taxonomique des champignons filamenteux et leur distribution sur la surface de la coquille et dans les organes internes des mollusques. Si la présence de champignons dans les mollusques est connue depuis plus d’un siècle (Bornet and Flahault 1889), ce n’est que plus récemment que leur distribution y a été analysée finement : en 2005, Zvereva et al. ont isolé 35 espèces de champignons filamenteux appartenant à huit genres tels que Aspergillus, Penicillium, ou Alter- naria à partir des organes internes (muscles, hépatopancréas, gonades femelle, gonades mâles, manteau, reins, bran- chies) des deux mollusques bivalves Crenomytilus grayanus et Modiolus modiolus (Zvereva and Vysotskaya 2005). La composition taxonomique fongique d’échantillons de manteau, muscles, gonades et reins d’huitres creuses du Pacifique Crasssostrea gigas a été décrite en 2012 par Borzykh and Zvereva, recensant 22 espèces identifiées appartenant aux six genres Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Fusarium, Penicillium, et Trichoderma (Borzykh and Zvereva 2012). Santos et al. ont eux rapporté la présence de huit genres de champignons (Aspergillus, Penicillium et Fusarium,…) dans les arcs branchiaux, les intestins, et les tissus musculaires du pétoncle de Nodipecten nodosus de fermes marines au Brésil (San- tos et al. 2017). Une autre étude mycologique a identifié 52 espèces de champignons filamenteux de 19 genres d’ascomycètes (et leurs stades anomorphiques) (Aspergillus, Penicillium, Cladosporium,…) et de zygomycètes à partir des coquilles et des organes internes de trois espèces de bivalves commerciaux : la pétoncle Mizuhopecten yessoensis, l’huitre creuse du Pacifique Crassostrea gigas, et la moule Mytilus trossulus (Borzykh and Zvereva 2018). Au sein du laboratoire MMS, Sallenave-Namont et al. ont observé la présence des mêmes genres Penicillium, Trichoderma, Clas- dosporium et Aspergillus à partir d’échantillons de moules Mytilus edulis et de coques Cerastoderma edule provenant

5 Chapitre 1. Introduction générale de zones aquacoles marines du littoral de la Loire-Atlantique (Sallenave-Namont et al. 2000). Les champignons sont des organismes extrêmement diversifiés et polyvalents qui sont des acteurs importants dans l’écosystème naturel. En plus de leur rôle principal de décomposeurs de la matière organique (saprotrophe), les champignons peuvent établir de nombreuses interactions avec d’autres organismes ; certaines de ces interactions peuvent être bénéfiques pour tous les partenaires impliqués (interactions mutualistes), d’autres nuisibles pour au moins un partenaire (interactions antago- nistes, parasitisme). Ainsi, si la présence de champignons toxinogènes dans les mollusques a été rapportée et peut pré- senter un risque de mortalité pour les bivalves ou d’intoxications lors de la consommation de coquillages, (Sallenave- Namont et al. 2000, Grovel et al. 2003), aucune hypothèse n’existe à ce jour concernant le rôle écologique de la production de substances naturelles par les champignons au sein des bivalves. Au cours d’une étude précédente réalisé au laboratoire MMS, un screening biologique sur des souches de Penicillium isolées de mollusques bivalves et de sédiments adjacents a montré que les souches fongiques dérivées des coquillages produisaient en laboratoire plus de composés bioactifs que leurs homologues prélevées dans le milieu environnemental à proximité (Geiger et al. 2013). Ainsi, les champignons, au sein d’un système écologique complexe (holobionte) tel qu’un mollusque bivalve, pourraient y exprimer un métabolome spécifique, dédié soit à des mécanismes de communication chimique, soit aux défenses contre des agresseurs extérieurs.

6 Chapitre 1. Introduction générale

2. Les champignons filamenteux du genre Penicillium

Le terme Penicillium, décrit pour la première fois par Link en 1809, dérive du latin « penicillus », signifiant « pinceau ». Les champignons du genre Penicillium sont dotés d’un appareil végétatif constitué d’hyphes septés hyalins ou peu colorés et d’un appareil reproductif sporifère (Figure 1). Ils sont filamenteux, polyphages et ubiquistes. Ce genre est présent dans tous les environnements : les sols, l’air, les denrées alimentaires, les matières organiques en décomposition et les débris végétaux. Ils jouent un rôle écologique clé puisqu’ils interviennent dans les processus naturels de recyclage de la matière organique morte (Samson et al. 2003). Certaines espèces sont parasites des végétaux ou des animaux mais aucune n’est un parasite obligatoire (Pitt 2002).

Figure 1: Observation morphologique d’un Penicillium.

Les champignons possèdent deux types de reproduction, asexuée et sexuée. Historiquement, le genre Penicillium est un genre asexué dit anamorphe qui regroupe des champignons qui se reproduisant grâce à une production importante de conidies. Les formes sexuées dites téléomorphs étaient associées aux genres Eupenicillium et Talaromyces (Hübsch 1981). Depuis l’accord d’Amsterdam 2011, le concept « un champignon, un nom » (« One Fungus = One Name ») a été adopté de façon consensuelle afin d’éviter la co-existence de plusieurs noms pour une seule espèce : seul le nom de genre Penicillium est aujourd’hui retenu pour décrire l’ensemble des espèces qu’elles soient anamorphes ou télé- morphes (Hawksworth et al. 2011).

2.1. Morphologie

Les Penicillium sont constitués par des conidiophores ramifiés qui se terminent par des phialides disposées en verti- cilles (Figure 2). Leur classification peut se baser sur le mode d’insertion des phialides sur les conidiophores : directement pour les Penicillium monoverticillés (Figure 2a), par une rangée intermédiaire de métules pour les Penicillium biverticillés (Figure 2b) et par deux rangées successives de métules pour les Penicillium triverticillés (Figure 2c). Les phialides sont serrées les unes contre les autres et à leur extrémité se trouvent des conidies. Les conidies sont disposées en longues chaînes et contribuent à donner à la tête conidienne un aspect en pinceau (Hübsch 1981).

7 Chapitre 1. Introduction générale

(a) (b) (c)

Figure 2 : Structure des conidiophores de Penicillium (Pitt 1988) : a) Penicillium monoverticillés, b) Penicillium biverticillés, c) Penicillium triverticillés.

2.2. Classification

La classification du genre Penicillium est la suivante :

Règne : Mycota

Embranchement : Eumycota

Sous-embranchement : Ascomycotina

Classe : Euascomycètes

Ordre : Eurotiales

Famille : Aspergillaceae

Genre : Penicillium

Le genre Penicillium est très répandu. Il est estimé que le genre Penicillium regroupe actuellement 483 espèces, un nombre en constante augmentation au fur et à mesure de la révision de sa taxonomie (Houbraken et al. 2020; Nguyen et al. 2020). La classification des espèces de Penicillium était initialement basée sur des critères de description macro et microscopique ce qui la rendait complexe du fait de l’importante variabilité phénotypique de ces champignons. En effet, leur phénotype dépend des facteurs biotiques et abiotiques de leur environnement. La figure 3 illustre ces variations phénotypiques : une même souche du genre Penicillium peut avoir des morphologies très différentes lorsqu’elle est cultivée sur différents milieux de culture.

8 Chapitre 1. Introduction générale

Figure 3 : Variabilité phénotypique des Penicillium: exemple de morphologie macroscopique de colonies d’une souche de P. atrolazulinum sur milieux CYA, MEA and YES (rev : dessus, obv : dessous). (Visagie et al. 2016)

La classification des Penicillium est modifiée presque continuellement (Table 1). Dierckx et Biourge ont d’abord subdivisé ce genre dans les sous-genres Aspergilloides (synonyme : Monoverticillium) et Eupenicillium qui a été séparé en sections Biverticillium et Bulliardium (synonyme : Asymmetrica). Par la suite, Thom et al. n’a pas suivi le groupement de Dierckx et Biourge et a proposé un nouveau schéma de classification en sous-genres pour Penicillium, composé de quatre divisions principales où les espèces ont été regroupées en fonction des caractéristiques de leurs colonies et des modèles de ramification de leurs conidiophores. Le système mis en place par Thom et al. pour Penicillium a été adopté pendant 30 années jusqu’à ce que Pitt, ainsi que Stolk et Samson dans les années 1980, proposent 4 sous-genre : Aspergilloides, Furcatum, Penicillium and Biverticillium, basés sur les caractéristiques des conidiophores, la morphologie des phialides et les caractéristiques de croissance, ainsi que sur les modèles de ramification des conidiophores et de la morphologie des phialides. cette classification basée sur des critères phénotypiques est aujourd’hui remplacée par un système basé sur les données de séquençages ADN (Houbraken et al. 2020; Houbraken and Samson 2011; Visagie et al. 2016). Penicillium comprend donc actuellement deux sous-genres, 32 sections, et 89 séries (Houbraken et al. 2020). Actuellement, il n’est pas possible de reconnaitre toutes les sections sans employer des données de séquençage ADN (Perrone and Susca 2017; Tsang et al. 2018). Néanmoins, les dernières publications des taxonomistes du règne fongique vont dans le sens de l’emploi d’une méthodologie taxonomique idéale qui consisterait en la combinaison des approches phénomiques (caractéristiques de croissance, caractéristiques d’écophysiologie, dégradation des polysaccharides…) et génomiques (analyses séquence génomiques : Espaceur interne transcrit – Internal Transcribed Spacer, ITS –, bêta-tubuline – BenA –, Calmoduline – CaM – et RNA polymérase II deuxième plus grande sous-unité – RPB2), aidant à suggérer une taxonomie et une phylogénie hautement prédictives dans le futur (Houbraken et al. 2020; Kjærbølling et al. 2020).

9 Chapitre 1. Introduction générale

Tableau 1 : Revue des principales classifications successives du sous-genre Aspergilloides de Penicillium

divaricata

Aspergilloides Penicillium

Gracilenta Lanata Ochrosalmonea Torulomyces Thysanophora Griseola Lasseniorum Osmophila Turbata

Alfrediorum Aspergilloides Charlesii Cinnamopurpurea Citrina Exilicaulis Fracta Ramigena Sclerotiora Stolkia Cypta Eremophila Brevicompacta Canescentia Chrysogena Eladia Fasiculata Paradoxa Penicillium Ramosum Robsamsonia Roquefortorum Formosana

genre genre genre

- -

Houbraken et al. 2020 al. Houbraken et

Sous Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Sous Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section

son

divaricata

2016

Aspergilloides Penicillium

Gracilenta Lanata Ochrosalmonea Torulomyces Thysanophora Digitata Osmophila Turbata

Aspergilloides Charlesii Cinnamopurpurea Citrina Exilicaulis Fracta Ramigena Sclerotiora Stolkia Brevicompacta Canescentia Chrysogena Eladia Fasiculata Paradoxa Penicillium Ramosa Robsamsonia Roquefortorum

genre genre genre

- -

tion tion

Houbraken & Sa Houbraken&

2011, Houbraken et al. 2011,al. et Houbraken

Sous Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section Sous Section Section Sec Section Section Section Section Section Section Section Section Section Section

ladia

Biverticillium

Divaricatum Geosmithia Inordinate Torulomyces

Aspergilloides Coremigenum Ramosum Penicillium

Stolk & Samson 1986SamsonStolk&

Section Section bSection Section Section E Section Section Section Section Section Section

Biverticillium

Aspergilloides Furcatum Penicillium

Pitt 1979

Inordinate

Aspergilloides Exilicaulis Coremigenum Simplicium Coronatum Cylindrosporum Penicillium

genre genre

genre genre genre genre

- - -

Sous Section Section b Sous Section Section Sous Sous Section Section Section Section

Biverticillata

Asymmetrica Monoverticillata Polyverticillata

Raper et 1949al.Raper et

Section Section bSection symmetrica Section Section symmetrica

- -

divaricata typica

- -

virida

compacta

Biverticillata

Asymmetrica Monoverticillata Polyverticillata

Thom 1930

Lanata Lanata Luteo

Brevi Fasciculata Funiculosa Velutina Ascogena Coremigena Miscellanea Monoverticillata Monoverticillata

Section Section Section Section Section Section Section bDivision symmetrica Section Section Section Section Division Section stricta Section Ramigena Division symmetrica Division Division

a. Ne faisant pas référence au genre sexuel Eupenicllium Ludwig ; b. Transféré au genre Talaromyces et exclu de Penicillium

10 Chapitre 1. Introduction générale

2.3. Distribution et abondance

Le genre Penicillium est ubiquiste dans la nature et représente des modes de vie et des habitats variés. Il a été rapporté dans presque tous les environnements. Il peut être isolé à partir de différent environnements extrêmes (température, salinité, acides, alcalins et habitats déficients en eau), associé à des plantes (épiphytes, endophytes, rhizosphériques), sur des matières en décomposition et sur différents fruits. Dans une revue des différents habitats et associations avec des plantes, il a été montré que plus de 400 espèces de Penicillium pouvaient être retrouvées, dont sept espèces prédomi- nantes et toujours uniformément présentes : P. chrysogenum, P. citrinum, P. digitatum, P. funiculosum, P. griseofulvum, P. hirsutum et P. islandicum. D’autres espèces sont plus sporadiquement recensées, voire peuvent être inféodées à un type spécifique d’environnement (Figure 4) (Yadav et al. 2018).

Figure 4 : Diversité et distribution du genre Penicillium présent dans différents habitats (Yadav et al. 2018).

2.4. Métabolites

Les Penicillium sont parmi les champignons les plus étudiés et représentent d’importants producteurs de médicaments, avec pour plus célèbres représentants P. chrysogenum (aussi connu comme P. rubens) en tant que producteur de la pénicilline G et P. griseofulvum produisant la griséofulvine (Figure 5).

pénicilline G griséofulvine

Figure 5 : Structure de la pénicilline G et de la griséofulvine

11 Chapitre 1. Introduction générale

La production de pénicilline G a révolutionné les approches médicales pour traiter les infections bactériennes (Fleming 1929). La structure de base de la pénicilline G, l’acide 6-aminopénicillanique présente un cycle β-lactame caractéris- tique fusionné à un noyau thiazolidine pour créer le noyau péname qui est la structure commune à toutes les pénicil- lines. D’un point de vue biosynthétique, c’est un tripeptide à biosynthèse non-ribosomale. La découverte de la pénicil- line G, a favorisé la recherche intensive sur les micro-organismes comme sources de nouveaux composés bioactifs pour l’industrie pharmaceutique, aboutissant à la découverte et la mise sur le marché des céphalosporines comme antibiotiques (Caprile 1988), de l’acide mycophénolique comme immunosuppresseur, des statines telles que la lovastatine comme hypocholestérolémiants (Seenivasan et al. 2008)…

La griséofulvine a été découverte en 1939 à partir d’une souche de P. griseofulvum (Oxford et al. 1939). C’est un antifongique d’origine polycétidique utilisé pour traiter différents types de dermatophytoses (teigne), incluant les infections fongiques des ongles et du cuir chevelu, de la peau. Il est inscrit sur la liste des médicaments essentiels de l’Organisation mondial de la santé (“Lists of Essential Medicines” 2019). La griséofulvine est un métabolite spécialisé qui peut également être produit par d’autres champignons comme des Aspergillus, mais la majorité des espèces productrices appartiennent au genre Penicillium, où au moins seize espèces sont connues pour être des producteurs de griséo- fulvine (Larsen et al. 2005). Cette molécule est connue comme antifongique mais elle présente également des activités antimitotiques, antivirales et antiprolifératives contre divers types de cellules cancéreuses (Ishida and de Morais Barroso 2020; Petersen et al. 2014; Rathinasamy et al. 2010). Des analogues de la griséofulvine sont régulièrement isolés et évalués pour leurs activités antifongiques et antitumorales. Ainsi, un analogue de la griséofulvine portant un groupement N-isopentane, 4’-déméthoxy-4’-N-isopentylisogriséofulvine a été récemment isolé à partir de la souche P. griseofulvum CPCC 400528 (Zhang et al. 2017).

Au-delà de ces deux exemples, beaucoup de métabolites ont été rapportés comme produits par des souches du genre Penicillium, d’origine biosynthétique et de squelettes extrêmement variés, parfois même au sein d’une seule espèce (Blunt et al. 2016; Rateb and Ebel 2011). Ainsi, une étude récente a rapporté l’isolement de 15 composés, dont 7 alca- loïdes, un sesquiterpène, un dérivé acétylénique, deux stérols, et un sphingolipide à partir de la souche Penicillium sp. KH Link 1809 (Hamed et al. 2019). Avec les Aspergillus, proches taxonomiquement, les Penicillium constituent donc le groupe de champignons les plus prolifiques et dont le potentiel biosynthétique est un des plus importants du monde vivant.

3. Les champignons filamenteux du genre Penicillium d’origine marine

Parmi les champignons marins, les espèces du genre Penicillium sont largement présentes dans l’environnement marin. Par exemple, les études réalisées précédemment au laboratoire « Mer, Molécules, Santé » de l’Université de Nantes ont mis en évidence qu’il s’agissait d’un genre fongique prédominant dans les zones conchylicoles de Loire-Atlantique, avec plus de 500 souches de Penicillium spp. qui ont pu être isolée de ces biotopes (Sallenave-Namont et al. 2000). D’autres études mettent en évidence l’importance de la colonisation des habitats marins par des champignons de ce genre. Matallah-Boutiba indiquent que parmi les 251 champignons filamenteux isolés le long de la côte algérienne suite à des prélèvements d’eau de mer, de moules et de sédiments, 131 appartiennent au genre Penicillium (Matallah-Boutiba

12 Chapitre 1. Introduction générale et al. 2012). De même, environ 150 souches marines appartenant à 39 espèces de Penicillium et 5 espèces de Talaro- myces ont été isolées à partir de substrats inertes, sédiments et eau de mer, d’éponges (avec 33 souches) ou autres animaux (crustacés, gorgones, coraux) et des plantes, telles que des algues brunes, des algues rouges, et une plante Angios- perme (Zostera marina) (Nicoletti and Trincone 2016).

Les Penicillium en général, et les Penicillium marins en particulier, sont reconnus comme des champignons pouvant produire une grande variété de métabolites bioactifs. Ainsi, une revue en 2016 a décrit plus de 550 composés ou familles de composés produits par un total d’environ 150 souches marines appartenant à 39 espèces de Penicillium et 5 espèces de Talaromyces (Nicoletti and Trincone 2016). Les métabolites spécialisés isolés peuvent posséder un panel d’activités biologiques large : antibactériennes, antivirales, antifongiques, antiparasitaires, anti-inflammatoires, antitumorales, etc.

Dans une revue de la littérature portant sur la période 1991 à 2014 a été entreprise pour recenser les produits naturels marins originaux décrits : 390 nouvelles molécules produites par Penicillium ont été collectées au cours de cette période (Ma et al. 2016). La figure 6 (gauche) montre que les sédiments et les éponges sont les principaux habitats des souches de Penicillium marins étudiés pour leur production de nouveaux composés. Ces derniers ont diverses structures chimiques, notamment des polycétides, des stérols, des terpènes et des alcaloïdes. La figure 6 (droite) montre cette grande variété de molécules avec pour grande majorité des polycétides.

Figure 6 : Proportions des types d’habitats des Penicillium marins étudiés pour leur production de produits naturels (gauche) et types de structure des nouveaux métabolites décrits à partir de ces souches (droite) (Ma et al. 2016)

La découverte de métabolites bioactifs dépend de l’organisme étudié et de l’environnement auquel il est adapté (Raghu- kumar 2017). Une revue de tous les composés cytotoxiques isolés à partir d’espèces Penicillium marin (Vansteelandt et al. 2014) a rapporté que l’eau de mer ne semblait pas être un habitat propice à l’isolement de souches de Penicillium cytotoxiques. En revanche, les sédiments marins, les végétaux, et les animaux représentent une source beaucoup plus favorable à l’isolement de souches Penicillium cytotoxiques. Les champignons tirés de mollusques sont aussi l’une des sources de nouvelles molécules (Bugni and Ireland 2004; Rateb and Ebel 2011), mais ces sources n’ont pas encore reçus l’attention appropriée des chercheurs pour permettre de conclure sur leur intérêt particulier. Différentes espèces de bivalves ont été à l’origine de l’isolement de souches productrices de composés originaux ou d’intérêt. Les premières découvertes de molécules originales à partir de champignons isolés de bivalves marins datent de 2000 avec l’isolement d’un métabolite contenant un cycle 1,3-dioxane, le coruscol A (Kagata et al. 2000) et de phénalénones, les sculezonones

13 Chapitre 1. Introduction générale

A et B (Komatsu et al. 2000) par des souches de Penicillium isolées à partir du bivalve Mytilus coruscus. De plus, des souches de Penicillium isolées dans des zones conchylicoles peuvent produire, comme leurs analogues terrestres, des mycotoxines telles de la roquefortine C et la patuline (Vansteelandt et al. 2012). Récemment, neuf meroterpénoïdes, deux épimères de stéroïdes en C25, et l’acide α-dimorphécolique ont été isolés à partir d’une souche de P. ubiquetum isolée à partir de la moule bleu Mytilus edulis collectée sur l’estuaire de la Loire en France (Hoang et al. 2018, Hoang et al. 2019). Une souche Penicillium isolée à partir du bivalve marin Scapharca broughtonii a produit neuf dérivés de phénalénone et une anthraquinone (Li et al. 2018). Douze indole-terpenoides ont été isolés à partir une souche de Peni- cillium sp. KFD28 isolée à partir d’un bivalve Meretrix lusoria. Ils ont présenté une activité inhibitrice de la tyrosine phosphatase PTP1B (Kong et al. 2019; Zhou et al. 2019, p. 28). Enfin, dernière étude en date, une souche de P. vancouverense YY-1 isolée à partir de l’escargot de mer Monodonta neritoides a été à l’origine de la description d’alcaloïdes originaux à noyaux pyridin-2-one et pyrrolidine-2,4-dione nommés vancouverone A, PF-1140 et B, et des polycétides 10,11-dihydroxy-citreoviridine et néocitréoviridinol (Yokoyama et al. 2020).

Les Penicillium marins sont aussi connus pour la capacité de produire des lipides comme des stérols et des acides gras. Comme la grande majorité des champignons, les Penicillium produisent majoritairement de l’ergostérol et son peroxide, comme l’a montré l’étude d’une souche de Penicillium sp. F00120 isolée d’un sédiment marin (Lin et al. 2012). Li et al. ont aussi décrit deux stérols polyoxygénés, dont l’acide stérolique, et des spiroditerpénoïdes brevianes isolés à partir d’extrait bruts de Penicillium sp de sédiments profonds. Ils ont présenté une activité cytotoxique contre les cellules MCF-7 et A549 (Li et al. 2012). Enfin, diverses études menées sur des Penicillium marins isolés à partir de sources variées (algues brunes, sédiments, coraux mous, sol marin) ont montré que toutes les souches produisent une grande variété d’acides gras sous forme libre ou non, saturés ou mono- ou pol-insaturés, dont principalement les acide palmitique, acide linoléique, acide oléique, acide stéarique et des hydrocarbures linéaires en C16 à C24 (Khudyakova et al. 2009; Oleinikova et al. 2013, 2015, 2017).

14 Chapitre 1. Introduction générale

Patuline CoruscolA Sculezonone A: R = H Roquefortine C Berkeleyacétal A Sculezonone B: R = OH

22-déoxyminiolutelide A: R = H

Eupéniacétal A Miniolutelide A: R = OH

Miniolutelide C 22-déoxy-10-oxo-miniolutelide B

24-O-méthyl-24-epi-cyclocitrinole: R1 = OCH3 R2 = H

24-O-méthylcyclocitrinole : R1 = H R2 = OCH3

4S-Hydroxy-22-déoxyminiolutelide B: R1 = OH R2 = H

22-Déoxyminiolutelide B: : R1 = H R2 = H

Miniolutelide B R1 = H R2 = OH Acide α-dimorphécolique

Péniciphénalénin A Péniciphénalénin B Péniciphénalénin C Péniciphénalénin D Péniciphénalénin E Péniciphénalénin F

(+)-sclérodine (+)-sclérodérolide (+)-sclérodione Physcione Pénerpène E

Pénerpène F Pénerpène G Pénerpène H Pénerpène I

7-hydroxypaxilline-13-ène Paspalinine Paspaline B Pyrapaxilline

Shearinine B Shearinine P 3-déoxo-4b-déoxypaxilline

VancouveroneA Vancouverone B 10,11-dihydroxy-citréoviridine

Néocitréoviridinol PF1140

Figure 7 : Structure de métabolites spécialisés isolés à partir des Penicillium issus de mollusques

15 Chapitre 1. Introduction générale

4. L’espèce Penicillium restrictum J.C. Gilman & E.V. Abbott (1927)

L’espèce Penicillium restrictum a parfois été désignée comme à l’interface entre les genres Penicillium et Aspergillus (Raper et Thom, 1949, Pitt et Hocking, 1985). L'espèce P. restrictum a été classée dans la section Exilicaulis du sous- genre Aspergilloides du genre Penicillium (Houbraken and Samson 2011) sur la base de ses conidiophores monoverti- cillés qui sont non vesciculaires, lisses, assez courts (10-30 µm), et portent peu de phialides ampulliformes produisant des conidies très rugueuses de forme globuleuse à ellipsoïde. Ses structures conidiales sont les plus petites du genre Penicillium, rappelant le nom de l'espèce qui reflète également un développement des colonies assez restreint sur milieu gélosé. La croissance du mycélium peut être observée à 37 °C, alors qu’aucune germination de conidie n’est observée à 5 °C. Cependant, la variation intra-espèce est loin d’être occasionnelle et de nombreuses souches ont montré une certaine déviation de ce critère (Pitt 2002).

Figure 8 : conidiophores monoverticillés et conidies de P. restrictum (Figueroa et al. 2014)

Pitt (1980) avait défini la section Exilicaulis comme des espèces monoverticillées avec des chainons ne présentant pas de gonflement vésiculaire terminal. La délimitation phylogénétique est aujourd’hui plus large et aussi plusieurs espèces avec une branche supplémentaire sont inclues dans cette section dont le représentant typique est P. restrictum (P. raci- borski, P. melinii, P. velutinum, P. corylophilum).

P. restrictum présente une répartition géographique mondiale et est communément considérée comme une espèce typique du sol. Elle a été retrouvée dans des contextes naturels très divers, terrestres et aériens dont tous types d’organes et de produits végétaux, et même de quelques organismes marins. Elle affiche également une aptitude à coloniser l’environnement « anthropique » comme en atteste sa présence dans l’air, l’eau, les usines de traitement des aliments, les bâtiments, les bibliothèques, etc. (Nicoletti and Stefano 2012)

A ce jour, 30 composés ont déjà été rapportés chez P. restrictum (Tableau 2 et Figure 8). Les premiers métabolites spé- cialisés décrits chez cette espèce ont été l’acide citrique (1) (Kinoshita et al. 1961), l’acide déhydrocarolique (2) (un dérivé d’acide tétronique) et la gliotoxine (3) (une épidithiodicétopipérazine) (Sankhala 1968). Plus tard, trois métabo- lites de nature polycétidique, la 2,3-dihydro-3,6-dihydroxy-2-méthyle-4-pyran-2-one (4), la curvularine (5) et la dihy-

16 Chapitre 1. Introduction générale drocurvularine (6) ont été identifiés dans une culture d’une souche alors décrite comme P. gilmanii, espèce aujourd’hui considérée comme un synonyme de P. restrictum (Raistrick and H. Rice 1971; Rice and Chen 1984). Plus tard, une nouvelle classe de composés antifongiques a été caractérisée à partir d'extraits de culture d'un isolat indien : la restricticine (7), son produit d’hydrolyse (8) et son dérivé diméthylé (9). Ces composés originaux qui présentent une chaine alkyle triènique, un pyrane et un ester de glycine, sont actifs contre une large gamme de levures et de champignons filamenteux (Schwartz et al. 1991). En outre, 4 terpènes analogues de la calbistrine (10-13), dont la dénomination est dérivée de leurs propriétés inhibitrices contre Candida albicans, ont été extraits à partir de cultures en milieu liquide d'un isolat brésilien (Brill et al. 1993). En 1993, un brevet japonais a décrit trois composés de type benzopyranes (14- 16) isolés à partir d’une souche. Ces molécules sont présentées comme ayant une faible toxicité, et auraient pour effet de prévenir et de traiter l’insuffisance cardiaque congestive par une activité diurétique via des propriétés anti- angiotensine II (Ishimaru et al. 1993). Enfin, la patuline (17) et l’acide pénicilique (18), polycétides très communs dans le genre Penicillium, ont été observés chez cette espèce, ainsi qu’un grand nombre de pigments de type anthraquino- niques polyhydroxylés : une série de polyhydroxy-anthraquinones (19-27) a été isolée à partir d’une souche endophyte provenant de tiges de chardon-marie (Silybum marianum). Ces composés possèdent des propriétés inhibitrices du quorum sensing démontrées sur un isolat clinique de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (MRSA) avec des valeurs de CI50 de 8 à 120 µM, suggérant une potentielle antivirulence de ces composés (Figueroa et al. 2014). Plus récemment, cette souche a montré qu’elle produisait trois autres composés que sont les méroterpènes andrastines A et C (28-29) et la phoménone (30) (Antipova et al. 2018). Les andrastines A et C (28-29), initialement isolées de cultures d’une souche non identifiée de Penicillium sp., présentent une inhibition de la farnésyltransférase avec des valeurs d’IC50 de 24.9 et 13.3 µM respectivement (Omura et al. 1996).

La littérature décrit également l’espèce Penicillium restrictum comme une espèce particulièrement intéressante pour sa capacité à produire des acides gras. Une étude sur sa composition en acides gras a montré qu’une souche produisait les acides gras saturés, monoinsaturés et polyinsaturés suivants : acide myristique, acide pentadécanoique, acide palmitique, acide palmitoléique, acide margarique, acide 9-heptadécènoique, acide linoléique, acide oléique, acide stéarique et acide arachidique (Stahl and Klug 1996). En 2013, une seconde étude a montré qu’une souche isolée de sédiment marins produisait les acide palmitique, acide oléique, acide stéarique (Oleinikova et al. 2013).

17 Chapitre 1. Introduction générale

1 2 3 4 5 6

7: R = 10: R = 12: R =

8: R = H 11: R = 13: R = 9: R =

14 16 17 18

19: R1 = H R2 = CH2OH 28: R = CHO 30 20: R1 = H R2 = COOH 29: R = CH3

21: R1 = OH R2 =

22: R1 = H R2 = CH3

23: R1 = OH R2 = COOH

24: R1 = H R2 =

25: R1 = H R2 =

26: R1 = H R2 =

27: R1 = Cl R2 = COOH

Figure 9: Structure des métabolites spécialisés décrits chez l’espèce P. restrictum

18 Chapitre 1. Introduction générale

Tableau 2 : Métabolites spécialisés décrits chez l’espèce P. restrictum

donnée UV (λ nm et ε ) Formule Masse moléculaire N0 Nom Activité références brute (g/mol) MeOH (Kinoshita et al. 1 Acide citrique C H O 192,12 - - 6 8 7 1961) Acide déhydroca- 2 C H O 180,16 - cytotoxique (Sankhala 1968) rolique 9 8 4

3 Gliotoxine C13H14N2O4S2 326,39 269, 310, 340 cytotoxique (Sankhala 1968) 2,3-dihydro-3,6- dihydro-2- (Raistrick and 4 C H O 144,13 298 (12,800) - méthyle-4-pyran- 6 8 4 H, Rice 1971) 2-one (Raistrick and 5 Curvularine C H O 292,33 300 (12000), 273 (6000), 220 (5000) - 16 20 5 H, Rice 1971) Dihydrocurvula- (Rice and Chen 6 C H O - - rine 16 22 5 1984) (Schwartz et al. 7 Restricticine C H NO 337,23 286 (28,682); 275 (36,453); 265 (28,007) antifongique 19 31 4 1991) 284 (35,854); 275 (45,658); 265 (35,294); (Schwartz et al. 8 Restrictinole C H O 280,20 Non 17 28 3 201 (7,983) 1991)

N,N-diméthyl 287 (39,89); 275 (50,842); 266 (38,938), (Schwartz et al. 9 C H NO 365,26 antifongique restricticine 21 35 4 205 (12,124) 1991)

10 Calbistrine A C31H40O8 563,26 237 (22,3); 331 (42,5) antifongique (Brill et al. 1993)

11 Calbistrine B C31H40O8 563,26 237 (22,8); 330 (29,4) - (Brill et al. 1993)

12 Calbistrine C C31H42O8 565,28 237 (19,8); 329 (52,4) - (Brill et al. 1993)

13 Calbistrine D C31H42O8 565,28 238 (21,8); 331 (32,6) - (Brill et al. 1993) 215 ± 3 (12,6 ±1,5), 227 ±3 (12,4 ± 1,5) , (Ishimaru et al. 14 TAN 1446A C H O 306,36 anti-angiotensine II 17 22 5 323 ±3 (10,6 ± 1,5), 400 ± 3(2,4± 3) 1993)

214 ± 3(25,5 ±3); 223 ± 3 (22,8 ±2,5); 255 ± (Ishimaru et al. 15 TAN1446B C H O 560,68 anti-angiotensine II 31 44 9 3 (10,2 ±1,5); 315 ± 3 (3,9 ±0,5) 1993)

216 ± 3 (25 ±3); 253 ± 3 (11,3 ±1,5); 314 ± (Ishimaru et al. 16 TAN 1446C C H O 308,37 anti-angiotensine II 17 24 5 3 (3,6 ±0,5) 1993)

17 Acide pénicillique C8H10O4 170,16 228 antibactérien (Martín et al. 2004)

18 Patuline C7H6O4 154,12 276 antibactérien (Martín et al. 2004)

(Daly et al. 2015; ω- cytotoxique, antibac- 19 C H O 286,23 - Figueroa et al. hydroxyémodine 15 10 6 térien 2014) cytotoxique, antibac- (Figueroa et al. 20 Acide émodique C H O 300,22 - 15 8 7 térien 2014) (+)-2′(S)- cytotoxique, antibac- (Figueroa et al. 21 isorhodoptilomé- C H O 314,29 - 17 14 6 térien 2014) trine cytotoxique, antibac- (Figueroa et al. 22 Émodine C H O 270,05 222(100); 254sh; 266(54); 287(60); 440(36) 15 10 5 térien 2014) Acide 2- (Figueroa et al. 23 C H O 315,21 433 (3,54), 289 (3,79), 222 (3,79) antibactérien hydroxyémodique 15 7 8 2014) 1’- 437 (3,95), 290 (4,47), 253 (4,13), 223 (Figueroa et al. 24 hydroxyisorho- C H O 329,28 antibactérien 17 13 7 (4,18) 2014) doptilométrine 1’-hydroxy-2’- (Figueroa et al. 25 ketoisorhodopti- C H O 327,27 435 (3,69), 250 (3,84), 225 (3,90) antibactérien 17 11 7 2014) lométine Desméthyle 436 (3,76), 288 (3,96), 251 (3,98), 223 (Figueroa et al. 26 C H O 311,27 antibactérien dermoquinone 17 11 6 (4,10) 2014) Acide 2- (Figueroa et al. 27 C H O 308,28 435 (3,46), 258 (3,78), 222 (3,88) antibactérien chloroémodique 15 16 7 2014) (Antipova et al. 211 (10580), 235 (sh, 5520), 250 (sh, 4010), 28 Andrastine A C H O 486,60 cytotoxique 2018; Omura et al. 28 38 7 286 (10580) 1996) (Antipova et al. 211 (11820), 235 (sh, 5670), 250 (sh, 4540), 29 Andrastine C C H O 472,61 cytotoxique 2018; Omura et al. 28 40 6 286 (11440) 1996) (Anderson et al. antiparasitaire (Plas- 1988; Antipova et 30 Phoménone C H O 208,21 - 11 12 4 modium) al. 2018; Isaka et al. 2000)

19 Chapitre 1. Introduction générale

5. Stratégies d’accès à la chimio-diversité fongique.

Les champignons sont des organismes hétérotrophes. En conséquence, la production de métabolites spécialisés par les champignons est strictement liée aux conditions de croissance. Dans la découverte et la production de nouveaux méta- bolites fongiques, le principal objectif est l’augmentation des rendements et/ou l’amélioration de la diversité chimique basée sur la manipulation des conditions de fermentation comme la simulation de l’environnement natif de champignons marins, y compris les interactions avec d’autres micro-organismes (Combès et al. 2012; Takahashi et al. 2013; Vallet et al. 2017). En conséquence, la culture de champignons dans des conditions standard au laboratoire ne favorise pas toujours la production de métabolites spécialisés d’intérêt (Reich and Labes 2017) car l’expression des gènes codant pour ces voies de biosynthèse reste silencieuse ou « cryptique » (Reen et al. 2015). Il existe plusieurs stratégies afin d’activer ces voies comme les approches culturales, l’utilisation de modificateurs épi-génétiques, l’ingénierie génique ou l’expression hétérologue de gènes sélectionnés (Rédou et al. 2016).

Une approche simple utilisée en laboratoire est la modification des paramètres nutritionnel ou l’ajout de composants pour simuler des environnements natifs, ainsi que le changement de température, de pH, de luminosité, l’absorption d’oxygène, de sel de mer… Cette méthode s’appelle l’approche OSMAC (« One Strain Many Compounds ») (Bode et al. 2002). L’approche OSMAC a mis en évidence qu’une souche d’Aspergillus ochraceus qui était connue pour ne produire qu’un seul composé, l’aspinonène, a pu produire jusqu’à quinze nouveaux analogues grâce à sa culture dans différents milieux (Bode et al. 2002). Les glucides sont les principaux nutriments dans les métabolismes fongiques. Afin d’augmenter le rendement d’obtention d’une molécule souhaitée, le calcaride A, une souche du champignon marin Calcarisporium sp, a été cultivée dans un milieu défini avec toutes les différentes sources de carbone (du glucose, du saccharose, du fructose, du maltose, du lactose, un extrait de malt, l’amidon). La présence de saccharose et de fructose a permis d’augmenter de manière significative la production de calcaride A (Tamminen et al. 2015). L’ajout de sel dans les cultures est un autre paramètre fréquemment utilisé pour étudier la chimiodiversité des métabolites spécialisés de champignons (Overy et al. 2017; Wijesekera et al. 2017). Une étude de la souche terrestre Dothideomycete sp, CRI7 cultivée dans différents milieux (eau de mer, eau dés-ionisée, eau dés-ionisée additionnée de bromure de potassium ou d’iodure de potassium) a montré que cette souche possède la capacité de produire neuf nouveaux métabolites dans des milieux contenant des halogènes (Wijesekera et al. 2017). Il est important de noter ici que la salinité est un facteur important du processus biochimique fongique qui régit les caractéristiques physiologiques des champignons, telles que la pression osmotique et l’activité d’enzymes impliquées dans la croissance et le métabolisme de champignon. Par consé- quent, si une salinité appropriée peut être nécessaire pour une croissance optimale de certaines souches, une pression osmotique élevée peut entraîner une déshydratatation des cellules fongiques et affecter des réactions biochimiques (Ga- reth Jones and Jennings 1964; Huang et al. 2011; Venkatachalam et al. 2019). Une modification de la salinité et du type de milieux complété par divers halogènes peut déclencher leur voie de synthèse pour restaurer le déséquilibre osmotique, activant des gènes biosynthétiques silencieux (Overy et al. 2017). Afin d’accéder à des métabolites impliqués dans la communication chimique entre deux espèces et dont l’expression silencieuse dans les conditions de culture de laboratoire, une stratégie couramment utilisée est la culture in vitro de champignons en présence de substrats dérivés de l’hôte (Overy et al. 2005, 2006; Overy and Blunt 2004). Les cultures dérivées de l’hôte ont également été appliquées avec succès pour augmenter le rendement des inocula fongiques (Cagigal and Sánchez 2017; Osman et al. 2020), pour stimuler la production de métabolites de faible abondance (Overy et al. 2006) et pour promouvoir la production de nou-

20 Chapitre 1. Introduction générale velles enzymes extracellulaires et pour améliorer l’expression des protéines (Dhillon et al. 2015; Medina et al. 2004; Stajic et al. 2004; Torrado et al. 2013). Au sein du laboratoire MMS, afin d’étudier l’influence de métabolites de moules sur l’activité des extraits de souches isolées de coquillages, un milieu (MES-Mussel Extract Sucrose) a été créé par remplacement de l’extrait de levure du milieu YES (Yeast Extract Sucrose) par un lyophilisat de broyat de chair de moule. Son emploi a permis de montrer que la toxicité des extraits obtenus à partir de souches de Penicillium isolées de moules et cultivées sur ce milieu MES était, pour certaines souches, plus forte que celle des extraits YES correspon- dants (Geiger et al. 2013). Cela a montré que les champignons issus de coquillages cultivés sur un milieu dérivé de l’hôte pouvaient exprimer un métabolome spécifique et augmenter la production de composé cytotoxiques (Geiger et al. 2013). Enfin, il existe de nombreuses autres possibilités de modifier les conditions de culture pour diversifier la production métabolites spécialisés de champignons. Le challenge est de trouver celui qui réussit pour la souche fongique cible.

Dans l’environnement marin, il y a une forte diversité de micro-organismes en constantes interactions. Afin de vivre ou survivre dans cet environnement, les champignons marins doivent produire des molécules pour leur défense ou d’initier une communication chimique avec d’autres organismes symbiotiques ou non. L’idée des approches par co-culture consiste à mimer ces interactions fongiques en recréant des interactions biotiques, en cultivant ensemble les champignons avec d’autres micro-organismes afin d’étudier l’induction de nouveaux métabolites par l’activation de gènes silencieux (Bertrand, Bohni, et al. 2014; Romano, Jackson, Patry, and Dobson 2018). Cette approche, bien que aléa- toire, permet la production de nombreuses molécules d’intérêt (Arora et al. 2020; Bertrand, Bohni, et al. 2014). Par exemple, Aspergillus fumigatus est une espèce pathogène opportuniste commune qui a été rapportée pour produire au moins 226 métabolites bioactifs (Frisvad et al. 2009). Aspergillus fumigatus co-cultivé avec Streptomyces peucetius a conduit à la formation d’analogues de formyl xanthocilline (Zuck et al. 2011). De même, la co-culture entre A, fumigatus et Streptomyces bullii a induit la production d’ergostérol et de sept nouvelles dicétopipérazines (E, Rateb et al. 2013). Dans l’environnement naturel, les micro-organismes forment normalement des communautés multi-espèces, ils sont donc soumis à des interactions intra- ou inter-espèces. L’approche co-culture complexe basée sur la stimulation d’interactions multiples entre plusieurs micro-organismes au sein d’un même milieu permet de réellement simuler les conditions naturelles. Cette approche pourrait permettre la découverte d’une large diversité de nouveaux métabolites spécialisés (Netzker et al. 2018; Pettit 2009).

Les champignons produisent des métabolites spécialisés variés tout au long de leur croissance. Les profils métaboliques des champignons changeront donc au fil du temps de croissance. Une étude cinétique de la production de métabolites spécialisés des champignons Penicillium canescens et Penicillium sp, a montré des différences en termes de métabolites intermédiaires et finaux ainsi que leur comportement de production dans les temps de croissance (Roullier et al. 2016). En conséquence, des études à un temps fixé du métabolome de champignons ne pourraient pas permettre de détecter de nombreux composés originaux. Une procédure de criblage optimale pour accéder à une chimio-diversité de métabolites spécialisés de champignons serait alors d’effectuer une série d’extractions sur une même culture fongique à des temps différents couvrant les différentes phases de croissance. L’étude de l’impact du temps de culture est une nouvelle approche pour accéder à une chimio-diversité de métabolites spécialisés de champignons.

Parce que dans les champignons la plupart des clusters gènes biosynthétiques sont soit silencieux/cryptiques soit à des niveaux d’expression trop bas pour entrainer une détection dans des conditions normales de culture au laboratoire, une méthode alternative qui peut interférer avec les mécanismes de biosynthèse fongique en favorisant l’expression des voies de biosynthèse cryptiques des produits naturels est requise dans la recherche de nouveaux métabolites fongiques

21 Chapitre 1. Introduction générale

(C,-Y, Li et al. 2020). C’est la méthode d’emploi de modificateurs épi-génétiques qui est une méthode de modulation de la production de métabolites spécialisés de champignons par ajoût de produits chimiques dans le milieu. Ces modificateurs comme les inhibiteurs de l’ADN méthyltransférase (DNMT) et les inhibiteurs d’histones désacétylases (HDAC) sont capables de modifier les caractéristiques physiologiques et métaboliques des champignons en fonction de l’altération de leur statut épigénétique (C,-Y, Li et al. 2020; Pan et al. 2019; Rédou et al. 2016). Par exemple, Asai et ses collèges ont appliqué avec succès cette méthode pour diversifier la production de métabolites fongiques en utilisant l’acide suberyl-bis-hydroxamique (SBHA), l’acide suberoylanilide hydroxamique (SAHA) (inhibiteur HDAC), la 5- azacytidine (inhibiteur DNMT), ce qui a induit la production de nouveaux métabolites à partir de Torubiella luteorostrata (Asai et al. 2011), Aspergillus sydowii (Chung, Wei, et al. 2013), Beauveria felina (Chung, El-Shazly, et al. 2013), Cordyceps indigotica (Asai, Yamamoto, and Oshima 2012; Asai, Yamamoto, Chung, et al. 2012)…

6. Les approches métabolomiques en chimie des produits naturels

6.1. La métabolomique

La métabolomique est issue du profilage métabolique et est un terme utilisé pour décrire l’étude des intermédiaires de petites molécules et des produits du métabolisme présents dans les fluides biologiques, les tissus et les extraits cellulaires. La métabolomique a pour objectif de mieux comprendre les processus métaboliques dans une condition donnée (Giovane et al. 2008). Le mot métabolome a été décrit pour la première fois par Oliver et al. (Oliver et al. 1998) comme l’ensemble des composés de faible masse moléculaire synthétisés par un organisme. Quelques années plus tard, le terme métabolomique a été introduit, comme l’indentification et la quantification de chaque métabolite présent dans un système biologique (Fiehn 2002). Les deux termes métabolomique et métabonomique sont souvent associés. Ils ont été initialement définis séparément avec origines en phytologie et en pharmacologie, respectivement, mais en réalité, le mot métabolomique est maintenant plus largement accepté. Le métabolome comprend un grand nombre de petits méta- bolites (< 1,500 Da) appartenant à différentes classes de composés, tels que les acides aminés, les peptides, les acides organiques, les lipides, les nucléotides… Ces molécules jouent un rôle important dans divers processus physiologiques en intervenant dans de nombreuses réactions biologiques participant ainsi à des fonctions biologiques variées (Lv 2013). Ces fonctions peuvent être « primaires » comme le métabolisme de base, la synthèse d’énergie, le stockage (Dawes and Ribbons 1964), ou peuvent aussi être « spécialisés » (aussi appelé « secondaires ») (Schaefer et al. 2008). Les études métabolomiques permettent donc l’analyse simultanée des métabolites primaires mais aussi des métabolites spécialisés (Fridman and Pichersky 2005). La métabolomique se focalise sur tous les petits composés et elle est souvent utilisée pour étudier les systèmes végétaux et microbiens.

Du fait de la spécificité de certaines classes de molécules et de la difficulté à appréhender le métabolome dans son inté- gralité, certaines sous-catégories d’études métabolomiques ont émergées, chacune se focalisant sur une partie du méta- bolome, dont voici quelques exemples :

- la lipidomique : la lipidomique est une sous-classe de la métabolomique qui se focalise uniquement sur la détection et l’analyse des lipides. Ce terme a été utilisé la première fois en 2001 (Kishimoto et al. 2001) pour faire référence à l’ensemble des lipides d’une cellule, d’un tissu et/ou d’un organisme (Dennis 2009).

22 Chapitre 1. Introduction générale

La lipidomique a été définie par le GERLI (Groupe d’Etudes et de Recherche sur les Lipides) comme la caractérisation complète des molécules lipidiques et de leur rôles biologiques propres ou leur interactions avec les protéines ou les régulations des gènes dans les processus métabolomiques (Lagarde et al. 2003).

- la glycomique : c’est l’étude de l’ensemble des molécules osidiques dans les systèmes biologiques. Les glycanes sont l’un des éléments indispensables au bon fonctionnement de l’organisme et jouent différents rôles de signalisation de reconnaissance ou d’adhérence (Cao et al. 2020).

- la volatolomique : c’est une approche de recherche des composés organiques volatils (VOCs) au sein du métabolome (Giannoukos et al. 2019). Les VOCs sont des composés organiques de faible masse moléculaire (< 350 amu) qui peuvent passer de la phase liquide à la phase gazeuse à température ambiante (25 oC) et à une pression de 760 mmHg. Cette approche est appliquée dans une large gamme d’applications : recherche biomédicale, analyse toxicologique, interactions biologiques, criminalistique, agro-alimentaire, sureté et sécurité (Giannoukos et al. 2019).

6.2. La stratégie métabolomique

Au-delà de ses objectifs d’analyse globale, les limitations analytiques ont imposé des choix stratégiques qui ont vu émerger deux grandes catégories au sein de la métabolomique :

- Les analyses non-ciblées (global) : dans ce cas, l’ensemble des composés d’un échantillon biologique est éva- lué sans a priori. Les propriétés biochimiques et physiques des molécules récupérées seront déterminées par les méthodes d’extraction et de séparation utilisées. La grande quantité de données obtenues nécessitera des outils statistiques complexes pour leur interprétation. Cette approche est très efficace pour mettre en évidence de nouvelles pistes de travail. Cependant, les signaux détectés peuvent ne pas être clairement identifiés.

- Les analyses ciblées : les analyses sont dirigées spécifiquement vers un certain nombre de molécules connues et déjà clairement identifiées. La quantification peut être plus précise. La concentration de l’analyte dans un échan- tillon biologique est extrapolée à partir d’une courbe standard pour le métabolite d’intérêt. Cette approche est une partie importante du flux de travail de la métabolomique car elle fournit une validation analytique des bio- marqueurs identifiés par les techniques non ciblées.

Le métabolome est un système complexe et dynamique composé d’un grand nombre de molécules très diverses aussi bien au niveau de leur structures (et donc de leurs propriétés physico-chimiques) que de leurs concentrations physiologiques. Malheureusement, à ce jour, aucune méthode universelle ne permet l’observation simultanée de l’ensemble des molécules présentes dans un échantillon biologique. Le choix de la méthode analytique employée pour l’acquisition des empreintes métaboliques est donc crucial et dépend des résultats attendus et des éventuelles voies métaboliques d’intérêt. L’approche analytique utilisée reflète donc un compromis fait entre les besoins de globalité des profils méta- boliques et les capacités de profilage de la méthode (rapidité, sélectivité et sensibilité).

Parmi toutes les méthodes utilisées, trois méthodes analytiques se détachent : la RMN, la GC-MS et la LC-MS ; chacune ayant des avantages et des inconvénients (Shulaev 2006). La spectrométrie de masse est sensible même au niveau du femtogramme, mais peut ne pas être reproductible entre les types instruments et les capacités d’ionisation des méta-

23 Chapitre 1. Introduction générale bolites. A l’inverse, les données de RMN sont reproductibles, mais cette technique peut ne pas être assez sensible pour détecter des métabolites à des concentrations faibles.

Au-delà de son aspect purement analytique, l’analyse métabolomique est une approche multidisciplinaire mettant en jeu le traitement du signal et l’analyse statistique pour appréhender les altérations chimiques observées.

Pour l’exploration de la chimiodiversité fongique à la recherche de nouveaux métabolites spécialisés, la stratégie de choix est l’approche métabolomique non-ciblée appliquée à l’analyse de la composition en métabolites d’un extrait ; généralement le profilage est effectué par spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide. Dans le cadre de cette thèse, une approche non-ciblée par LC-HRMS a été mise en œuvre.

6.3. Des données brutes LC-HRMS à la matrice de donnée

L’étape de traitement des données a pour principaux objectifs de sélectionner les signaux analytiquement pertinents présents dans les données brutes, d’aligner les empreintes des différents échantillons, d’éliminer le bruit de fond, et de présenter les données extraites sous un format matriciel, compatible avec leur injection dans les logiciels de traitement statistiques qui ne sont que rarement en mesure de lire les formats propriétaires utilisés par les appareils d’acquisition d’empreintes.

6.3.1. Extraction des données LC-MS

Différents logiciels de traitement de données sont actuellement disponibles. Certains d’entre eux sont des logiciels commerciaux, fournis ou non par les fabricants d’instruments, d’autres sont des logiciels à accès libre. Dans ce dernier cas, il est parfois possible d’accéder aux algorithmes de façon à les modifier ou à les améliorer. D’autre part, ces logiciels diffèrent aussi par les approches mises en jeu. Alors que la soustraction du bruit de fond repose souvent sur des algorithmes de filtrage classiquement utilisés en traitement du signal, de grandes différences sont observées au niveau des étapes d’extraction et d’alignement des signaux. A titre d’exemple, la détection de pics est effectuée dans deux dimensions (temps de rétention et rapports m/z) de manière indépendante avec le logiciel Mzmine 2 (Pluskal et al. 2010). De nombreux logiciels sont caractérisés par le type de format pris en charge et les algorithmes utilisés.

Dans cette thèse, le logiciel Mzmine 2 (Pluskal et al. 2010) a été utilisé. Ainsi, après le chargement des données dans le logiciel, la première étape consiste à effectuer la détection des ions d’intérêts. Ce logiciel permet de répondre aux diffé- rentes caractéristiques du signal résultant des systèmes de couplage : niveau de bruit, résolution. Puis, dans un second temps, une étape de déconvolution est effectuée afin d’extraire l’information des pics chromatographiques. Au sein de Mzmine 2, divers algorithmes sont disponibles (Myers et al. 2017; Pluskal et al. 2010; Tautenhahn et al. 2008; Treviño et al. 2015). Ensuite, une étape d’alignement est essentielle pour pouvoir comparer les différents métabolites entre les échantillons. Cet alignement est nécessaire pour s’affranchir de la variabilité de rétention d’une analyse à une autre. Elle est réalisée par le calcul d’un indice de vraisemblance entre les pics. Ce calcul est basé sur l’écart de masse et de temps de rétention entre les pics par rapport à une tolérance définie. Finalement, l’étape de remplissage des données man- quantes permet de retrouver les signaux manquants en les recherchant dans les données brutes.

24 Chapitre 1. Introduction générale

6.3.2. Contrôle de la qualité des données

Avant d’effectuer l’analyse statistique des données, il est important de s’assurer de la qualité des données acquises et de corriger d’éventuelle dérive analytique. En effet, l’ionisation à pression atmosphérique étant sujette à de nombreuses variations et notamment au phénomène d’encrassement de la source ESI au cours du temps, il faut s’assurer que le signal enregistré ne varie pas significativement au cours de l’expérience car cela pourrait masquer les variations biologiques recherchées. En métabolomique non ciblée, l’utilisation d’au moins un échantillon de contrôle qualité (QC) doit être effectué afin d’évaluer et garantir que le processus analytique est exécuté de manière appropriée et répond aux critères prédéfinis (Evans et al. 2020). L’échantillon de contrôle qualité (QC) doit être représentatif qualitativement et quantitativement de l’ensemble de la collection d’échantillons inclus dans l’étude, fournissant une moyenne de tous les métabolomes analysés dans l’étude. L’échantillon de QC idéal est un échantillon de QC groupé dans lequel un petit aliquote de chaque échantillon de l’ensemble d’étude est mélangé. Le QC est analysé plusieurs fois pendant la durée de l’étude analytique. Les données des échantillons QC sont utilisées pour surveiller la dérive, séparer les données de haute et basse qualité, équilibrer la plate-forme analytique, corriger la dérive du signal et permettre l'intégration de multiples expériences analytiques.

6.4. Les méthodes d’analyse statistique des données

En pratique, il est difficile de comparer visuellement l’ensemble de données métabolomiques fongiques, d’autant plus quand le nombre d’échantillons est important. Les analyses statistiques sont alors utilisées afin d’étudier ou de décrire un ensemble de données. Elles peuvent être univariées (chaque ion détecté est analysé séparément) ou multivariées (l’ensemble des ions est analysé simultanément).

6.4.1. L’analyse statistique non-supervisée : l’analyse en composante principale

L’analyse en composante principale (ACP) est la plus simple et la plus connue des techniques d'analyse de données multivariées. C’est une méthode de réduction des variables. Elle a donc pour objectif de décrire un ensemble de don- nées (n individus, p variables – comprend ici les ions) par de nouvelles variables en nombre restreint. C’est une mé- thode factorielle car la réduction des variables ne se fait pas par une simple sélection de certaines d’entre elles mais par la construction de nouvelles variables synthétiques obtenues à partir des variables initiales par combinaison linéaire. Cette méthode de classification est dite non supervisée car elle ne tient pas compte de l’appartenance des échantillons à des groupes préexistants et cherche uniquement à représenter au mieux la variance du jeu de données.

L’ACP est souvent la première méthode employée pour l’analyse des données afin d’étudier l’ensemble de données pour de mettre en évidence des valeurs aberrantes et des tendances. Etant très visuelle, elle permet de voir la structura- tion intrinsèque des données, cependant l’ensemble des informations recherchées n’y sont pas toujours visibles. L’ACP est donc généralement suivie d’analyses dites « supervisées » afin de mettre en évidence les effets recherchés et leurs significativités.

25 Chapitre 1. Introduction générale

6.4.2. L’analyse statistique supervisée (ou explicative)

Il existe un grand nombre de méthodes dites supervisées pour mettre en évidence les effets recherchés dans les données. Cependant, une méthode est plus largement utilisée. Il s‘agit de la régression PLS (Partial Least Square ou Projection to Latent Structure), utilisés plus récemment sous sa déclinaison OPLS pour Orthogonal-PLS. Contrairement à l’ACP qui cherche à représenter au mieux la variabilité des données, cette approche multivariée cherche à représenter au mieux la séparation entre plusieurs groupes d’échantillons (généralement deux). L’analyse du modèle mathématique créé permet de mettre en évidence les variables expérimentales responsables des différences entre les groupes d’échantillons et leur significativité. Cette significativité est appelée « importance de la variable dans la projection » (« Variable Importance in the Projection » – VIP).

L’OPLS consiste à diviser la variation observée dans les données entre (1) celle reliée aux groupes d’échantillons à comparer de façon supervisée et (2) celle indépendante de ces groupes de façon non-supervisée. Ainsi, au-delà de mettre en évidence les variables associées à l’effet recherché, cette approche permet de mettre en évidence des effets sous-jacents et non anticipés. Cette approche permet généralement d’analyser plus en détail les résultats d’une expé- rience métabolomique.

6.5. La déréplication

L’un des principaux défis dans le domaine des produits naturel est le taux élevé de « re-découverte » de produits naturel connus. Le processus consistant à utiliser les informations sur la structure chimique d’un produit naturel connu pour identifier ce composé dans un échantillon (sans avoir à répéter l’ensemble du processus d’isolation et de détermination de la structure) est appelé «déréplication ». La déréplication ou l’indentification de composés connus au début du processus de recherche de nouveaux produits naturels minimise le temps, les efforts et les couts. Dans le cadre de la méta- bolomique par LC-HRMS, ce processus de déréplication se focalise souvent sur les composés mis en évidence par l’analyse statistique.

En LC-HRMS, la première approche de déréplication a été basée sur la déduction de la formule chimique exacte d’un ion détecté grâce à sa masse monoisotopique obtenue par une mesure à haute résolution, suivie de la recherche de com- posés décrits par cette formule dans des bases de données de structures chimiques (Wolfender et al. 2019). Ensuite, les structures des composés sont confirmées par la recherche d’informations bibliographiques et l’interprétation des spectres de fragmentation. Cependant, rien ne remplace actuellement l’identification par comparaison des données avec un composé de référence (standards). Dans le cadre de la «Metabolomics Standards Initiative», Sumner et al. (Sumner et al. 2007) ont défini quatre niveaux d’identification en fonction des informations disponibles :

- Métabolite identifié : un minimum de deux paramètres physico-chimiques indépendants identiques à ceux du standard dans les mêmes conditions analytiques. En LC/MS cela peut correspondre à la masse précise, au temps de rétention ou encore le spectre de MSn.

- Métabolite putativement annoté : en cas d’indisponibilité du standard, l’identification peut être basée sur les propriétés physico-chimiques et/ou les similarités spectrales (ex : MS/MS) avec les informations des bases de données publiques ou privées.

26 Chapitre 1. Introduction générale

- Métabolite putativement caractérisé : l’identification peut être basée sur les propriétés physicochimiques d’une classe de composés et/ou les similarités spectrales (ex : MS/MS) avec des composés de la même classe chimique.

- Métabolite inconnu : bien que non identifiés, ces métabolites peuvent être différenciés à partir de données spectrales qui peuvent permettre une quantification relative. Dans ce cas, il est important de bien fournir les données acquises.

Malheureusement, dans un grand nombre de cas, les composés d’intérêt ne figurent pas dans les bases de données et l’identification par l’utilisation de la spectrométrie de masse seule devient une tâche extrêmement complexe. Il est ainsi le plus souvent nécessaire de procéder aux longues étapes de purification et de concentration pour permettre l’analyse par RMN de composés initialement détectés par spectrométrie de masse, mais très fréquemment, seules les données de spectrométrie de masse sont disponibles et la caractérisation des métabolites passe par une interprétation méticuleuse des spectres de masse et de MSn.

6.6. Les réseaux moléculaires

Le profilage par LC-MS/MS est maintenant devenu l’une des techniques phares utilisée en chimie des produits naturels. Devant l’ampleur du travail que représente l’analyse de ces données, une nouvelle stratégie de représentation, appelée réseau moléculaire, a été développée par les équipes de Pieter Dorrestein et de Nuno Bandeira de l’Université de Cali- fornie en 2012 (Guthals et al. 2012).

La construction d’un réseau moléculaire est basée sur la comparaison de tous les spectres MS/MS des composés détec- tés dans d’un mélange complexe (extrait, ensemble d’extraits, etc,) et permet de les regrouper en fonction de leur simi- larité (Aron et al. 2020). Cette similarité est mesurée par le calcul du score de cosinus (Allard et al. 2017; Boudreau et al. 2015). Les schémas de fragmentation étant intimement liés à la structure moléculaire, mais indépendants des autres paramètres tels que la masse des ions parents, le profil isotopique ou le temps de rétention des analyses LC-MS, le ré- seau ainsi construit permet de regrouper les ions correspondant à des structures chimiques proches. Le réseau molécu- laire est ensuite utilisé pour représenter les relations structurales (en réalité spectrales) entre ions parents au sein de clusters (Boudreau et al. 2015; Olivon et al. 2017). Ainsi, sur le réseau, chaque ion parent associé à son spectre MS/MS est schématisé sous la forme d’un « rond » ou « nœud » qu’on nommera perle et le score de cosinus est matérialisé par l’épaisseur des traits reliant les perles pour montrer leur degré de similitude. Les perles peuvent être annotées par des données complémentaires (m/z de l’ion parent, aire des pics, temps de rétention, type d’échantillon, etc,,) qui peuvent être reflétées par la taille ou la couleur des perles (Figure 10) (M, Wang et al. 2016),

27 Chapitre 1. Introduction générale

Figure 10: Visualisation des données MS/MS par réseau moléculaire (Boudreau et al. 2015),

La mise en réseau se fait via une plate-forme à libre accès permettant à la communauté scientifique l’interprétation des données MS/MS et le partage d’informations, accessible sur le site Global Natural Product Social Molecular Networ- king (GNPS) https://gnps,ucsd,edu/ (Aron et al. 2020). Cette plateforme permet de plus de rapidement dérépliquer les composés grâce à la base de données MS/MS disponible et très régulièrement complétée de façon collaborative (M, Wang et al. 2016).

7. Contexte et objectifs des travaux de thèse

Le genre Penicillium représente l’un des genres prédominants en milieu marin (Ma et al. 2016; Nicoletti and Trincone 2016). Au sein du laboratoire MMS de l’université de Nantes, une étude mycologique menée en 2000 avait montré que sur 456 souches fongiques d’origine marine collectées à partir de coquillages (coques Cerastoderma edule L et moules Mytilus edulis L,), d’eau de mer et de sédiment (en surface et à 5 cm de profondeur), le genre Penicillium représentait 47% du total des souches et la proportion la plus importante des souches bioactives (51,6% des souches testées) avec une toxicité modérée à forte sur le modèle Artemia salina (Sallenave-Namont et al. 2000). Cette toxicité est le reflet de la production de métabolites bioactifs (Geiger et al. 2013; Hoang et al. 2018; Kagata et al. 2000; Kong et al. 2019; Vansteelandt et al. 2012; L,-M, Zhou et al. 2019). Au sein du laboratoire MMS, plusieurs études ont déjà été menées sur des souches de Penicillium afin d’investiguer leur chimiodiversité et d’y rechercher de nouveaux dérivés bioactifs (O, Grovel et al. 2008; Hoang et al. 2018; Roullier et al. 2016; Vansteelandt et al. 2013, 2014). Au cours de l’une d’entre elles, un screening sur 14 souches isolées des bivalves a mis en évidence une souche marine de P, restrictum MMS417 présentant une activité cytotoxique prometteuse sur la lignée cellulaire cancéreuse humaine KB, activité pro- noncée pour certains de ses extraits de cultures (Geiger et al. 2013). Un profilage métabolique préliminaire par cou-

28 Chapitre 1. Introduction générale plage LC-HRMS/MS a montré des différences dans les abondances de certains métabolites, entre les extraits actifs et non actifs, mais l’observation visuelle des profils métaboliques et une déréplication menée sur les métabolites majoritaires de l’extrait MES/EDM (milieu à base de lyophilisat de moules et d’eau de mer) n’ont pas permis d’identifier les composés observés : seuls 4 pics parmi les métabolites majoritaires pouvaient correspondre à des molécules déjà dé- crites, avec une incertitude sur leur annotation soit du fait de la non-concordance entre certaines données observées et la littérature, soit à cause de l’absence de données spectrales publiées (figure 11),

Figure 11: Profils métaboliques obtenus par HPLC-MS/MS en mode positif de la souche MMS417 cultivée sur milieux YES et MES. Annotations putatives : A, LL-P880γ ; B, hydroxypestalotine ou pestalrone A ; C, pestalotine ou pestalrone B ; D, 5,6-dihydro-4-méthoxy-6-(1-oxopentyl)-2H-pyran-2-one (Geiger et al. 2013).

29 Chapitre 1. Introduction générale

Ainsi, les objectifs principaux des travaux réalisés sur la souche d’origine marine MMS417 P. restrictum et présentés dans ce manuscrit concernaient l’étude du métabolome de cette espèce peu étudiée et l’isolement de métabolites d’intérêt et/ou bioactifs, en prenant en compte les variations possibles de l’expression des métabolites en fonction des conditions culturales. L’origine écologique de la souche a été intégrée dans cette étude.

Quels sont les métabolites, spécialisés et lipidiques, qui peuvent être produits par cette souche ?

Y a-t-il une spécificité marine du métabolome de cette souche ?

Ces métabolites sont-ils produits dans certaines conditions précises en rapport avec son environnement d’origine ?

Le temps d’incubation a-t-il une influence sur l’expression métabolique, et l’étude cinétique permet-elle de reconstruire une voie de biosynthèse ?

Quelles sont les molécules bioactives responsables de la cytotoxicité de certains de ses extraits ?

Pour cela, trois études successives ont été menées :

- une étude métabolomique non-ciblée, mais focalisée sur les métabolites spécialisés en vue d’en décrire la diversité et d’identifier les composés bioactifs ;

- une étude centrée sur l’évolution de la chimiodiversité de la souche MMS417 au cours du temps de culture, et en particulier sur la voie de biosynthèse des pyran-2-ones. Pour cela, la construction de réseaux moléculaires dynamiques a été réalisée.

- une étude de l’influence des facteurs abiotiques sur le du métabolisme global de Penicillium restrictum MMS417, en prenant en compte à la fois le métabolome spécialisé et le lipidome.

30 Chapitre 2. Etude du métabolome

CHAPITRE 2 – Etude du métabolome de la souche MMS417 P. restrictum et isolement de métabolites d’intérêt et/ou bioactifs.

Nous avons vu que l’espèce P. restrictum, bien que décrite comme ubiquiste, a fait l’objet de peu d’investigations chimiques, en particulier en ce qui concerne les souches isolées du milieu marin. Nous nous sommes donc attachés à investiguer les capacités métaboliques de la souche MMS417 de façon approfondie par l’utilisation du protocole OSMAC de façon à, par la modification des conditions de culture, induire une expression optimale de clusters de gènes de biosyn- thèses. Cette étude a également intégré une approche en écologie chimique : en effet, la souche a été isolée d’un prélè- vement de chair de moules, et la possibilité que cette origine écologique ait une influence sur le métabolome exprimé par la production spécifique de métabolites impliqués dans des interactions entre le champignon et son hôte animal a été investiguée.

Les types d’interactions entre les microorganismes et les autres organismes dépendent de la disponibilité des nutriments dans le substrat fongique et des conditions environnementales (Gleason et al. 2017). Pour cette raison, d’un point de vue écologique, les composants et la nature d’un substrat en plus des conditions environnementales doivent être pris en compte lors de l’étude des interactions fongiques et des assemblages communautaires. Pour ça, ces interactions peuvent être examinées dans des milieux de cultures et sur des substrats où les champignons se développent naturellement.

Ainsi, un milieu dérivé de l’hôte, MES, a été utilisé pour évaluer l’influence des constituants des moules sur la production de métabolites spécialisés par la souche MMS417. Ce milieu, développé précédemment au laboratoire, est un milieu riche en source de carbone (saccharose, 150 g/L) et en oligoéléments, qui ne comporte comme source d’azote qu’un lyophilisat de broyat de chair de moules. L’expérience du laboratoire MMS a montré qu’il est généralement favorable à la croissance des champignons isolés de moules et à leur production de métabolites spécialisés. Ce milieu peut ainsi être considéré comme le plus proche possible des conditions de vie d’origine de la souche, et peut être qualifié d’ « écologique » ou « environnemental ». Outre ce milieu de culture, la souche a été cultivée sur 6 autres milieux semi- synthétiques classiquement employés en mycologie : DCA, MEA, PDA, CYA, YES et KMS. La composition de ces milieux de culture est présentée en annexe 1, dans le volume II de ce manuscrit.

Du fait de l’origine marine de notre souche, et afin de comparer nos données avec celles de la littérature, l’effet de la salinité de l’eau de mer a également été exploré. Ainsi, ce sont 14 milieux de compositions différentes (7 milieux, 2 salinité, 4 réplicats par condition) qui ont été employés. Différents paramètres ont été observés à l’issue de l’incubation des cultures réalisées à 27 °C pendant 10 jours : phénotype, rendement d’extraction, composition des extraits en méta- bolites et activité cytotoxique des extraits.

Chapitre 2. Etude du métabolome

1. Influence du milieu de culture sur le phénotype de P. restrictum MMS417

Comme le montrent les photographies des cultures de 10 jours présentées dans la figure 12, la morphologie de cette souche est clairement différente influencée par les conditions culturales. Un aspect particulièrement inhabituel a été observé pour les cultures sur milieu MES-SSW, celles-ci apparaissant « mouillées » ou « submergées » en leur centre avec une absence des structures mycéliennes classiques. Cette zone centrale est translucide et luisante, faisant penser à une production lipidique importante. Ceci sera confirmé par les analyses CCM et GC-MS, et cette observation a motivé l’étude lipidomique présentée dans le chapitre 4. Il semble donc que la présence des constituants de moules dans le milieu induise une réponse particulière sur le développement de la souche. Du point de vue de la croissance, il a été observé que cette souche se développe moins sur le milieu KMS par rapport aux autres milieux (Figure 12). Ceci est à mettre en relation avec la composition des différents milieux : le milieu KMS ne comporte pas d’apport en azote organique et contient moins de sucre que les autres milieux, ce qui est généralement défavorable à la croissance des espèces du genre Penicillium. On n’observe également que la présence d’eau de mer dans les milieux de culture induit des modifications morphologiques : elle semble favorable au développement de la souche et à la sporulation, quel que soit le milieu de culture.

KMS MEA DCA CYA PDA YES MES

Eau distillée

Eau de mer

Figure 12: Aspect morphologique de la souche MMS417 cultivée sur 14 milieux de culture (10 j d’incubation à 27 °C).

32 Chapitre 2. Etude du métabolome

2. Influence du milieu de culture sur le rendement d’extraction et sur la production globale de métabolites spécialisés

Après 10 jours d’incubation, les cultures ont été extraites selon un protocole standardisé de microextraction adapté de Smedsgaard et al., 1997 (voir détails en annexe). A partir des cultures sur les 14 milieux, 56 extraits ont été obtenus ainsi que qu’un extrait réalisé pour chaque milieu non ensemencé. Les résultats des masses d’extraits sont présentés dans la figure 13.

0.4

0.3

brut (mg) brut 0.2 BL

0.2 EB d’extrait

0.1 Masse Masse

0.1

0.0 KMS DW KMS SSW PDA DW PDA SSW MEA DW MEA SSW CYA DW CYA SSW DCA DW DCA SSW YES DW YES SSW MES DW MES SSW

Milieu de culture

Figure 13 : Masses d’extrait brut de culture de la souche MMS417 sur 14 milieux différents (BL : milieu d’agar non inoculés, EB : extrait brut de culture de la souche MMS417, DW : l’eau distillée, SSW : l’eau de mer)

On observe que les masses d’extrait les plus importantes ont été obtenues pour les cultures sur les milieux YES et MES, c’est-à-dire les milieux parmi les plus riches en nutriments. Le milieu « écologique » est donc un des plus favorables à la production de métabolites, ce qui peut indiquer un effet de l’environnement d’origine de la souche. Comme pour ce qui a été vu pour le développement du champignon, le milieu KMS est le moins favorable à la production de métabo- lites extractibles, ce qui est concordant avec la littérature. Par contre, les extraits obtenus sur CYA sont en très faibles quantités, alors que la composition du milieu est proche de celle du YES. Le milieu CYA étant décrit comme propice à la production de molécules azotées (alcaloïdes et peptides non-ribosomaux) selon les travaux du DTU au Danemark, cela signifierait donc que la souche ne produit que peu de ce type de molécules, ce qui est également concordant avec les molécules déjà recensées dans la littérature. Il ne semble pas y avoir d’effet global de la salinité sur la production de métabolites spécialisés.

Tous ces extraits ont été testés sur la lignée cellulaire KB afin d’en déterminer la cytotoxicité, mais aucun d’entre eux n’a entraîné une activité significative permettant d’observer un effet d’inhibition de la prolifération cellulaire pour 50% des cellules (CI50) à la concentration maximale de 100 µg/mL. Ces résultats, contradictoires avec ceux de l’étude préli- minaire faite sur cette souche puisque l’extrait MES-SSW obtenu avait présenté une CI50 de 5 µg/mL (Geiger et al. 2013), ont par la suite été expliqués par la forte production lipidique sur ce milieu, masquant la présence bien réelle de métabolites cytotoxiques (cf. chapitre 4.1.).

33 Chapitre 2. Etude du métabolome

3. Etude métabolomique par LC-HRMS/MS de la souche P. restrictum MMS417 et isolement des composés induits par la présence d’extrait de Mytilus edulis et d’eau de mer dans le milieu de culture.

Les résultats de ce travail ont fait l’objet de la rédaction d’un article intitulé : « Untargeted metabolomics approach for the discovery of environmentally dependant pyran-2-ones chemodiversity in a marine-sourced Penicillium restrictum», qui sera soumis prochainement dans le journal Marine Drugs. Cet article est reproduit intégralement après une présentation des principaux objectifs et résultats obtenus.

Résumé de l’étude :

Dans le but d’étudier l’influence de la composition du milieu de culture sur le métabolome de la souche MMS417 et de mettre en évidence les composés surproduits et/ou potentiellement responsables de l’activité, une étude métabolomique a été réalisée.

Pour cela, les extraits repris dans le méthanol ont été analysés par UHPLC-UV/DAD-HRMS/MS en ionisations positive et négative. Les données brutes obtenues ont été converties dans le format .netCDF puis traitées par logiciel Mzmine 2 (Pluskal et al. 2010) pour générer une matrice de données qui a été analysée statistiquement à l’aide du logiciel SIMCA (Bylesjö et al. 2006). Les principaux résultats issus des analyses par ACP et OPLS-DA ont montré que la souche P. restrictum MMS417 cultivée sur milieu MES-SSW y exprime spécifiquement la voie de biosynthèse aboutissant à des composés de noyau pyran-2-one.

Ces composés sont très nombreux, ce qui est visible par la construction du réseau moléculaire de la souche cultivée sur les différents milieux, avec un cluster « pyran-2-ones » particulièrement important, comprenant un certain nombre de molécules isobares ce qui a rendu les annotations complexes voire impossibles. En effet, il est apparu que pour certains nœuds plusieurs stéréoisomères pouvaient leur correspondre, dont certains étaient décrits dans la littérature et d’autres non. Pour cela, et afin d’en déterminer l’activité biologique, les pyran-2-ones majoritaires et/ou détectées dans le cluster ont été isolées et purifiées.

Un extrait brut de 11,65 g a alors été obtenu après culture de la souche à grande échelle sur 54 Erlenmeyers de milieu MES-SSW. Cet extrait a été soumis à plusieurs étapes de fractionnement chromatographiques (schéma récapitulatif en annexe), aboutissant à l’isolement d’un grand nombre de fractions purifiées, dont 13 pyran-2-ones ou dérivés qui ont pu faire l’objet d’une analyse structurale complète (figure 14) :

- la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one (TLV-11, 1), composé original,

- la 6S, 1’R, 2’S-LL-P880β (TLV-7, 2), composé original,

- la 6S, 1’R, 2’R-LL-P880β (TLV-8, 3), composé original,

- la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxypent-3-ényl)-2H-pyran-2-one (TLV-10, 4), composé original,

34 Chapitre 2. Etude du métabolome

- la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxypentanyl)-2H-pyran-2-one (TLV-15, 5),

- la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxypent-3-ényl)-2H-pyran-2-one (TLV-14, 6), composé original,

- la 4-méthoxy-2H-pyran-2-one (TLV-1, 7), composé décrit ici pour la première fois comme un produit naturel,

- la 5,6-dihydro-4-méthoxy-2H-pyran-2-one (TLV-2, 8),

- la 6S, 1’S, 2’R-LL-P880β (TLV-18, 9),

- la 6S, 1’S-pestalotine (TLV-4, 10),

- la 1’R-déhydropestalotine (TLV-5, 11),

- la 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one (TLV-6, 12),

- l’acide 5-acétoxy-3-méthoxypent-2-ènoïque (TLV-3), composé original proposé comme étant un intermédiaire lors de la biosynthèse des pyran-2-ones : cette molécule est présentée dans l’article 2, chapitre 3.

TLV-11 TLV-7 TLV-8 TLV-10 (1) (2) (3) (4)

TLV-15 TLV-14 TLV-1 TLV-2 TLV-4 (5) (6) (7) (8) (9)

TLV-5 TLV-6 TLV-18 TLV-3 (10) (11) (12)

Figure 14: Structure des composés de structure pyran-2-one isolés.

35 Chapitre 2. Etude du métabolome

-dihydroxy-3-

,2’

-pyran-2-one

-(1’

-pyran-2-one

-dihydroxypentanyl)-2

-dihydroxy-3-pentényl)-2

β S β

, 2’ , 2' ,

R R

-hydroxyéthyl-4-méthoxy-2

-pyran-2-one

-LL-P880

-LL-P880 -LL-P880

S R

, 2' , 2' ,

, 2' ,

-Pestalotine

R R S

-déhydropestalotine

, 1' , 1' , 1' , ,1'

S S S S

Nom de composé de Nom

5,6-dihydro-6 pyran-2-one 6 6 5,6-dihydro-4-méthoxy-6 pentényl)-2 4-méthoxy-6-(1’ pyran-2-one 4-méthoxy-6-(1’ pyran-2-one 4-méthoxy-2 5,6-Dihydro-4-méthoxy-2 6 6 1' 6-pentyl-4-methoxy-2 acide5-acétoxy-3-éthoxy-2-penténoique

235.09

253.105 253.104 251.088 251.089 249.074 237.109 211.058

[M+Na]

Adduits

[M+H] 159.065 231.123 231.123 229.107 229.107 227.092 127.042 129.052 231.119 215.125 213.111 197.116

(MeOH)

(c 0.58 (c mg/mL) 1.75 (c mg/mL)

(c 0.42 (c mg/mL) 13.25 (c mg/mL) 0.67 (c mg/mL) 20

(c 0.83 (c mg/mL)

(c 0.17 (c mg/mL) o o

(c = 1.0 mg/mL)= (c o o o

(c 0.17 (c mg/mL) o

o o

[α]

-30

+30

-80.4

+ 63 +

+55.2 +97.5

- 61.71 - 38.29 -

- 49.28 -

P. restrictum P.

M) M)

-4

M) -4

-3

full scale)full

M) o

-3

+ 3.08 + 9.56 (c x10

+ 3.01 + 8.77 (c x10

+ 0.66 + 4,78 (c x10

= +3.18 1.74 = (c x10

221.1

223.6

222.8

+1.316.2 (c x 10

221.4

+2.0421.2 (c x 10

-1.92 5.06 (c x10

275.7

240.9

281.9

-1.2Δε Δɛ

Δε

Δɛ

- 3.75, - Δɛ

- 5.2,Δε -

- 11.54, - Δε

245.6

247

246.6

245.2

Δε

Δɛ

CD (MeOH) (0.2cm cell 0.1(MeOH) and CD

Δε

)

max

238 239 238 239 280 280 238 238 238 233

198,274 202,280 202,282

spectre UV (λ spectreUV

(Da) (Da)

228.1

230.128 230.112 188.069

158.0675 230.1273 228.1112 226.0843 126.0343 128.0451 214.1176 212.1037 196.1083

massemonoisotopique

5 5 5 5 5 5 4 4 3

3 5

3 3

O O O O O O O O O

O O

18 18 16 16 14 6 8 18 18 16 16

14 12

H H H H H H H H H H H

H H

6 6

brute

8 8

11 11 11 11 11 11 11 11 11

C C

Formule

C C

C C C C C C C C C

1.2 2.9 2.1

2.01 2.78 1.85 1.82 3.33 9.58

2.347 8.828 6.093

temps temps

11.533

retentions

0.5 3.2 0.7 1.4 0.7 0.9 0.5 4.9 1.3 1.3 2.1

16.2

quantité quantité

isolé(mg)

TLV-7 TLV-8 TLV-1 TLV-2 TLV-4 TLV-5 TLV-6 TLV-3

TLV-11 TLV-10 TLV-15 TLV-14 TLV-18

Composé

composé1 composé2 composé3 composé4 composé5 composé6 composé7 composé8 composé9

composé10 composé11 composé12

Tablecomposés8: de Données TLV-1-TLV-8 TLV-10, ; TLV-11, TLV-14, TLV-15, TLV-18 isoléà partir de

Tableau 3 : Données de composés TLV1-TLV8 ; TLV10, TLV14, TLV15, TLV18

Chapitre 2. Etude du métabolome L’activité biologique de certains de ces composés a été évaluée sur des tests de cytotoxicité (lignée cancéreuse humaine KB), d’activité antibactérienne (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus et Enterococcus faecalis, collaboration Pr Nathalie Caroff, laboratoire Thérapeutiques cliniques et expérimen- tales des infections, Université de Nantes) et d’activité antileishmanienne (Leishmania infantum, collaboration Dr Marieke Vansteelandt, laboratoire Pharmadev, Université Paul Sabatier de Toulouse). Aucun d’entre eux n’a présenté d’activité significative aux doses testées. Un essai préliminaire de criblage virtuel a alors été réalisé par docking, en collaboration avec le Dr Cédric Logé du laboratoire IiciMed, Université de Nantes). En effet, il a été récemment décrit pour des pyrones de structure proche de nos composés - les chrysopyrones A and B isolées d’une souche marine de Penicillium chrysogenum (Han et al. 2020) - une activité inhibitrice de la tyrosine phosphatase PTP1B, impliquée entre autres dans la régulation des effets de la sécrétion d’insuline. Le modèle construit par modélisation moléculaire a montré que la pestalotine pouvait interagir avec certains des acides aminés essentiels de la poche catalytique de l’enzyme, faisant ainsi de cette série de petites molécules de potentiels inhibiteurs de tyrosine phosphatases, atoxiques.

L’ensemble de ces résultats est présenté dans un article (1) intitulé : « Untargeted metabolomics approach for the discovery of environmentally dependant pyran-2-ones chemodiversity in a marine-sourced Penicillium restrictum », qui sera prochainement soumis dans le journal Marine Drugs.

37 Chapitre 2. Etude du métabolome Article 1:

Untargeted metabolomics approach for the discovery of environment-related pyran-2-ones chemodiversity in a marine-sourced Penicillium restrictum

Van-Tuyen Le1, Samuel Bertrand1, Thibaut Robiou du Pont1, Fabrice Fleury2, Nathalie Caroff3, Sandra Bourgeade-Delmas4, Cedric Logé5, Gregory Genta-Jouve6, and Olivier Grovel1*

1EA 2160 - Mer Molécules Santé, Université de Nantes, 9 rue Bias BP 53508, 44035 Nantes-Cedex 1, France. 2Group of Mechanism and Regulation of DNA Repair and IMPACT Platform, UFIP UMR CNRS 6286, University of Nantes, 44322, Nantes, France 3EA3826, Université de Nantes, IRS2 Nantes Biotech, Nantes-Cedex1, F-44100, France 4UMR 125 PharmaDev, Université de Toulouse, IRD, Toulouse 31400, France 5EA1155-IICIMED, Université de Nantes, IRS2 Nantes Biotech, Nantes-Cedex1, F-44100, France 6 C-TAC, UMR 8638 CNRS, Faculté de Pharmacie de Paris, Paris-Descartes University, Sorbonne, 4 Avenue de l’Observatoire, 75006 Paris, France.

* Correspondence: [email protected]. Received: date; Accepted: date; Published: date

Abstract: Very little is known about chemical interactions between fungi and their mollusks host in marine environments. Here, we investigated the metabolome of a Penicillium restrictum MMS417 strain isolated from the blue mussel Mytilus edulis collected on the Loire estuary, France. Following the OSMAC approach with the use of 14 culture media, the effect of salinity and of a mussel- derived medium on the metabolic expression were analysed using HPLC-UV/DAD-HRMS/MS. An untargeted metabolomics study was performed using principal component analysis (PCA), orthogonal partial least square discriminant analysis (O-PLSDA) and molecular networking (MN). It highlighted some compounds belonging to sterols, macrolides and pyran-2-ones which were specifically induced in marine conditions. In particular, a high chemical diversity of pyran-2-ones was found related to the presence of mussel extract in the culture medium. MS- and UV-guided purification allowed to isolate seven new natural pyran-2-one derivatives 5,6-dihydro-6S- hydroxymethyl-4-methoxy-2H-pyran-2-one (1), (6S, 1’R, 2’S)-LL-P880β (2), (6S, 1’R, 2’R)-LL-P880β (3), 5,6-dihydro-4-methoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy pent-3’(E)-enyl)-2H-pyran-2-one (4), (1’R, 2’S)- LL-P880γ (5), 4-methoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy pent-3’(E)-enyl)-2H-pyran-2-one (6), 4-methoxy- 2H-pyran-2-one (7) together with the known 5,6-dihydro-4-methoxy-2H-pyran-2-one (8), (6S, 1’S, 2’R)-LL-P880β (9), (6S, 1’S)-pestalotin (10), 1’R-dehydropestalotin (11), 6-pentyl-4-methoxy-2H- pyran-2-one (12) from the mussel-derived culture medium extract. The structures of 1-7 were determined by 1D- and 2D-MMR experiments as well as high-resolution tandem mass spectrometry. Some of these compounds were evaluated for their cytotoxic, antibacterial, antileishmanial and in- silico PTP1B inhibitory activities. These results illustrate the utility in using host-derived media for the discovery of new natural products.

Keywords: Penicillium restrictum, Mussel-derived fungi, OSMAC, Metabolome, Pyran-2-one.

38 Chapitre 2. Etude du métabolome 1. Introduction

The phylum Mollusca is one of the largest and most diverse group in the animal kingdom. Es- timated at 30,000 species in the sea, it comprises various bivalves such as oysters, mussels and clams [1]. As filter feeders, these shellfishes can actively retain and concentrates particles and micro-organisms from their surrounding environment like bacteria [2], viruses [3,4], protozoa [5] and fungi [6–8]. Zvereva et al. reported that fungal strains belonging to Aspergillus, Penicillium, Acremo- nium, and Alternaria genera are the most predominantly found in the two bivalve mollusks Creno- mytilus grayanus and Modiolus modiolus [7]. Santos et al. reported eight fungal genera, such as Asper- gillus, Penicillium, and Fusarium from the branchial arches, intestine, and muscle tissue of the No- dipectennodosus scallop from marine farms in Brazil [8]. Sallenave-Namont et al. reported the presence of genera Penicillium, Trichoderma, Clasdosporium, Aspergillus, Paecilomyces along with Mu- corales from mussel samples from marine shellfish farming areas [6]. In this way, all marine bivalves are colonized with a high diversity of microorganisms and fungi are major contributors to the microbiome of these holobionts. Various lifestyles such as symbiosis, parasitism, and mutualism have been described for fungi, depending on the species and the host [9,10]. In these ecosystems, fungi can establish numerous interactions with their hosts, mediated by secondary metabolites that serve communication or chemical war purposes [10]. But if relationship between plants and endophytic fungi or between animals and fungal parasites have been the object of numerous works, nearly none study has investigated the chemical ecology of the association between mollusk bivalves and associated fungi.

Penicillium is one of the predominant genera in marine environments [14] and shellfish-derived Penicillium strains have been demonstrated to produce a high range of metabolites. Some of these are identical to compounds from terrestrial origin such as roquefortine C [15], patulin, cladosporin, festuclavin or griseofulvin [16,17], but other have been first detected from marine strains [10]. It seems that under the very specific conditions observed in marine environments such as pressure, salinity or tides, some chemical pathways or chemical conditions are expressed that are not observed in terrestrial media. An interaction with marine invertebrates is one further condition that can be supposed to induce a dedicated chemistry. In this way, in a previous work, it was demonstrated that Penicillium strains isolated from shellfishes produced more bioactive compounds than strains sampled from their surrounding environment [18,19].

To access metabolites involved in the chemical communication between two species and whose expression is silenced under usual laboratory culture conditions, culture-based strategies such as OSMAC (One-Strain-Many-Compounds) are mandatory [20,21]. As part of this strategy, in vitro cultivation of fungi in the presence of host-derived substrates can induce specific metabolites. For example, the cultivation of Penicillium hordei strain on plant-tissue agar led to the medium- dependent production and the structure elucidation of the novel metabolites corymbiferone [22] and corymbiferan lactones A-D [23]. Host-derived media have also been successfully applied to enhance the yield of fungal inocula [24,25], to stimulate the production of low abundance metabolites [26] and to promote novel extracellular enzyme production and to enhance protein expression [27–30]. In the marine field, the in vitro cultivation of fungi on mussel-derived substrates has been employed to convert agricultural and marine residues into microbial metabolites [30–35] and a recent study showed that mussel-processing wastewaters were a promising nutritive medium for astaxanthin production by the basidiomycetous species Xanthophyllomyces dendrorhous [32]. How- ever, very little information is available on fungal metabolome expression induced by bivalves.

39 Chapitre 2. Etude du métabolome

Only one study has shown that the use of a mussel flesh-derived culture medium enhanced the production of cytotoxic metabolites by some mussel-derived fungi [21].

During our ongoing search for new marine fungal natural products, a Penicillium restrictum J.C. Gilman & E.V. Abbott strain has been isolated from a mussel sample in the Loire estuary, France. If it is mainly considered as a typical terrestrial soil species, it has been also sampled from seawater, corals and marine sponges [36]. Penicillium restrictum isolates have been shown to produce some bioactive metabolites such as dehydrocarolic acid, gliotoxin [37], restricticin and its dimethyl derivative [38,39], curvularins [40], calbistrins [41,42], and the mycotoxins patulin and penicillic acid [43].

In this study, we present a metabolome investigation of a mussel-derived strain of P. restrictum MMS417, with a focus on environment-derived culture conditions. Alterations of culture conditions were performed following the OSMAC approach using 7 culture media including a host-derived medium to evaluate the influence of mussel components on the production of specialized metabolites. In addition the effect of salinity was also explored. Culture extracts were submitted to an untargeted metabolomics study using UPLC-IT/ToF–MS/MS based molecular networking (MN) [44]. This resulted in highlighting some classes of metabolites overexpressed by the presence of mussel and sea-water and to the MS-guided isolation of twelve pyran-2-ones including seven new compounds. Some of these compounds were tested for cytotoxic, antibacterial, antileishmanial activity and virtual PTP1B inhibition.

2. Results

2.1. Effects of culture medium components on the metabolome of P. restrictum

To explore the chemical diversity produced by P. restrictum MMS417 according to culture media, a complete metabolomics study was performed following the OSMAC approach. The strain was grown over six usual agar-based media Czapek Yeast Agar (CYA), Dextrose Casein Agar (DCA), Potato Dextrose Agar (PDA), Yeast Extract Sucrose agar (YES), Malt Extract Agar (MEA) and Kohlmeyer-Medium Solid (KMS). A seventh medium was employed, Mussel Extract Sucrose Agar (MES), a host-derived medium [19] to evaluate the influence of mussel flesh on the production of specific metabolites. Two different osmotic conditions were also used separately for each medium, by employing either distilled water (DW) or synthetic seawater (SSW) for the reconstitution of the media. Colony morphology was observed throughout the culture growth (Figure S1), showing that the morphology of the strain was dramatically modified according to each medium. A particularly unusual aspect was observed for cultures in the MES-SSW medium, which appeared “wet” and “submerged” at the centre of the colony with an absence of classical aerial mycelial structures.

Extracts of the cultures after 10 days were analysed by HPLC-HRMS using both the positive and negative ionisation modes. The chemical profiles of the 14 types of cultures (4 replicates each) were converted to a data matrix using automated peak picking and compared by multivariate data analyses. The data were preliminarily analysed by principal component analysis (PCA) including quality control samples (QC), which confirmed data consistency (Pareto scaling) (Figure S2). In the positive ionization mode, the PCA scores plot achieved on all the 56 samples (Figure 1) showed a

40 Chapitre 2. Etude du métabolome variation in the chemical profiles, with the first two components of PCA explaining 26.4% of the variance (15 % and 11.4 % for PC1 and PC2 respectively).

Figure 15: PCA (Pareto scaling) of the 14 P. restrictum metabolic profiles (HPLC-HRMS data in positive ionization mode, n = 4).

It clearly appeared that both the medium composition and the presence of seawater had an influence on the extract composition. Extracts from media with the lowest content in nutrients (KMS, PDA and DCA) clustered closely together on the left part of the scores plot, while YES and MES extracts, issued from media for which the composition was similar except the presence of mussel flesh in MES instead of yeast extract on YES, clustered in the other same part of the scores plot. On another hand, DW and SSW extracts were separated from each other whatever the composition of the medium. Of particular interest was the observation that MES-SSW extracts appeared clearly individualized from the other ones, suggesting that environment-based culture conditions can induce the production of specific compounds.

Figure 16. a) OPLS-DA of the 14 P. restrictum metabolic profiles (HPLC-HRMS data in positive ionization mode, n = 4) with separation of extracts following salinity (R2X cum 0.316 and R2Y cum 0.89, Q2 cum 0.766; CV-ANOVA (p-value = 5.61e-11)), b) Corresponding S-plot showing regions (blue: SSW; grey: DW) of highly specific features following salinity.

41 Chapitre 2. Etude du métabolome

The influence of Sea Water/Distilled Water on the induction/repression of production of metabolites was then globally investigated. For that purpose, a supervised orthogonal partial least square discriminant analysis (OPLS-DA), comparing the two osmotic conditions was performed to highlight the distribution differences of metabolites in DW or SW extracts.

The OPLS-DA (Figure 2a) showed a significant discrimination between the two groups following the first dimension, and that the DW extracts metabolic profiles were less dispersed than for the SSW extracts on the orthogonal component. This was particularly obvious for MES-SSW and YES- SSW profiles which clustered separately from the other SSW extracts. They were also the most in- fluenced by the type of water used. The S-loadings plot represented in Figure 2b highlighted the metabolites distinct between the two groups. Features with large VIP values (VIP > 2) were considered to be the most contributing ones and they were subjected to dereplication based on their (+)- HRESIMS spectrum, UV-vis spectrum and retention time (Table 1). Nevertheless, many annotations could not be ascertained, as regioisomers and stereoisomers that can be produced simultaneously by the same fungal strain were described in literature. In this way, these isobaric compounds were annotated as putative isomers of a reference compound already described from fungi. Most of the VIP compounds were found to correspond to some pyran-2-one derivatives, which could be clearly annotated due to the characteristic UV absorption of either the pyran-2-one (λmax = 280 nm) [44] or the 5,6-dihydropyran-2-one moieties (λmax = 238 nm) [45]. In SSW extracts, pestalotin and 2’- hydroxypestalotin isomers [46,48] were highly produced whereas dehydropestalotin, LL-P880γ [47], 5,6-dihydro-4-methoxy-2H-pyran-2-one and 8-macommelinol [48] were correlated with DW culture conditions. Various steroids derivatives were also detected as compounds distinctive of SSW extracts with antibiotic Mer-NF 8054A [49], 3β-hydroxyergosta-8,14,24(28)-trien-7-one [50] and paxisterol [51], together with the two macrolides melearoride A [52] and N-demethylmelearoride A [53]. Among all the metabolites detected and annotated, only antibiotic TAN-1446A has been previously described from P. restrictum [54]. Some unidentified metabolites at m/z 412.333 [M+H]+ (Rt = 23.28 min) and m/z 427.322 [M+H]+ (Rt = 23.76 min) were also highlighted in SSW profiles which did not match to any compound in natural products databases.

42 Chapitre 2. Etude du métabolome

Table 1. Putative identification of characteristic ions highlighted in the OPLS-DA S-plot comparing media following salinity.

VIP m/z Rt (min) Observed Molecular ∆ppm UV-vis Putative annotation features formula absorption (ionic for M (λmax nm) species) 4.05 231.123 6.52 [M+H]+ C11H18O5 -1.08 238 2’-hydroxy pestalotin isomer 253.105 [M+Na]+ 3.46 411.325 23.41 [M+H]+ C28H42O2 -3.17 n.d. 3β-hydroxyergosta- 8,14,24(28)-trien-7-one 3.43 472.342 22.27 [M+H]+ C29H45NO4 -1.45 n.d. N-demethylmelearoride A + 494.32 [M+Na]

3.15 486.358 23.86 [M+H]+ C30H47NO4 -0.69 n.d. Melearoride A SSW 508.341 [M+Na]+ 2.8 443.315 23.87 [M+H]+ C28H42O4 -2.56 n.d. Paxisterol 2.5 215.128 9.08 [M+H]+ C11H18O4 -1.55 237 Pestalotin isomer 2.42 412.333 23.28 [M+H]+ C26H41N3O 0.51 n.d. - 2.34 427.322 23.76 [M+H]+ C28H42O3 1.82 n.d. - 2.12 467.316 19.62 [M+Na]+ C28H44O4 4.86 n.d. Antibiotic Mer-NF 8054A 6.33 213.114 9.82 [M+H]+ C11H16O4 6.18 279 Dehydropestalotin isomer 235.097 [M+Na]+ 4.08 213.113 10.03 [M+H]+ C11H16O4 1.48 237 Pyran-2-one derivative 3.89 307.158 14.92 [M+H]+ C17H22O5 11.24 n.d. Antibiotic TAN 1446A 3.88 213.113 9.09 [M+H]+ C11H16O4 1.48 288 Dehydropestalotin isomer 3.82 251.09 11.56 [M+Na]+ C11H16O5 1.82 275 LL-P880γ isomer 267.063 [M+K]+ + 3.72 129.055 2.18 [M+H] C6H8O3 -1.31 237 5,6-dihydro-4-methoxy-2H-

pyran-2-one DW 3.24 431.279 22.98 [M+Na]+ C24H40O5 3.84 n.d. Aspergillus acid A 2.97 515.265 24.36 [M+H]+ C29H38O8 0.98 n.d. Citreohybridone B 2.9 147.065 2.13 [M+H]+ C6H10O4 -4.99 237 5-hydroxy-3-methoxy-2- pentenoic acid 2.79 379.336 20.40 [M+H]+ C28H42 -1.26 n.d. - 2.58 185.085 5.88 [M+H]+ C9H12O4 19.54 285 8-macommelinol 2.22 544.365 18.59 [M+H]+ C32H49NO6 2.18 n.d. Pestalotiopin B 2.11 520.341 16.45 [M+Na]+ C31H47NO4 1.39 n.d. - n.d.: UV maxima not determined; -: not hit from fungal natural product databases.

To observe the specific effect of the mussel-flesh on the induction of metabolites in P. restrictum an OPLS-DA was carried-out comparing the MES-SSW extracts to other SSW extracts (Figure 3). The validated OPLS-DA model (Figure 3, R2Y cum 0.89, Q2 cum 0.766) exhibited a significant discrimination between the two groups following the first component; the MES-SSW extracts being well separated from the others. The S-plot showed that ions responsible for distinction of MES-SSW (VIP > 3) were still pyran-2-ones derivatives: isomers of pestalotin, 2’-hydroxypestalotin, dehydroxypestalotin and LL-P880γ were dereplicated among the compounds with the highest VIP values. The ion at m/z 211.058 [M+H]+ eluted at 6.58 min remained unidentified when searched in fungal natural products database. However its UV-Vis spectrum showed an absorption band at

λmax = 237 nm which is characteristic of a 5,6-dihydropyran-2-one moiety [45]. The compound at m/z 147.065 was annotated as 5-hydroxy-3-methoxy-2-pentenoic acid (verrucolone or arabenoic acid), which corresponds to an open acidic form of 5,6-dihydro-4-methoxy-2H-pyran-2-one, two compounds which have been previously described from Penicillium strains [55,56]. From this OPLS-DA, it could also be noticed that on the first orthogonal component, which corresponds to an unsupervised direction, the YES-SSW extracts were clearly distinguished from the other SSW extracts. An-

43 Chapitre 2. Etude du métabolome other OPLS-DA (Figure S3, Table S1) was conducted comparing these extracts to other SSW extracts, which shown that other pyran-2-ones together with melearorides were responsible for this discrimination.

Figure 17. a) OPLS-DA scores-plot of MES-SSW extracts versus the 6 other SSW extracts (positive ionization, n = 4; R2X cum 0.317 and R2Y cum 0.927, Q2 cum 0.777; CV-ANOVA (p-value = 2.72e-6)); b) Corresponding S-plot: features highlighted in blue correspond to discriminatory ions with VIP > 3.

Table 2. Identification of characteristic ions highlighted in the OPLS-DA S-plot comparing MES- SSW extracts to other SSW extracts. Observed Molecular UV-vis features VIP m/z Rt (min) formula ∆ppm absorption Putative annotation (ionic spe- for M (λmax nm) cies) 8.95 231.123 6.52 [M+H]+ C11H18O5 -1.08 238 2’-hydroxypestalotin isomer 253.105 [M+Na]+ 269.080 [M+K]+ 483.222 [2M+Na]+ 7.95 211.058 6.58 [M+H]+ C10H10O5 -12.55 237 Unknown pyran-2-one derivative 5.45 213.114 9.82 [M+H]+ C11H16O4 6.18 279 Dehydroxypestalotin isomer 4.59 129.055 2.18 [M+H]+ C6H10O4 -1.31 237 5,6-dihydro-4-methoxy-2H- pyran-2-one 4.53 215.128 9.08 [M+H]+ C11H18O4 -1.55 237 Pestalotin isomer 237.112 [M+Na]+ 3.57 251.091 6.68 [M+Na]+ C11H16O5 5.8 275 LL-P880γ isomer 3.5 147.065 2.13 [M+H]+ C6H10O4 -4.99 237 5-hydroxy-3-methoxy-2- pentenoic acid 3.24 251.090 11.56 [M+Na]+ C11H16O5 1.82 275 LL-P880γ isomer

2.2. Molecular networking of P. restrictum MES-SSW extract.

A molecular network (MN, Figure 4) of the MES-SSW extract was constructed using LC- HRMS/MS data obtained in the positive ionization mode, including the retention time of all detected ions in order to distinguish the isobaric compounds. The MN consisted of 83 nodes representing the most abundant ions in the chemical profile, which were grouped into 7 clusters. Com- pounds significantly discriminating the MESS-SSW extract on the OPLS-DA were searched among the nodes and mapped on the MN. Among a total of 43 nodes corresponding to compounds for 44 Chapitre 2. Etude du métabolome which VIP > 1 (light blue nodes), 7 of the ions with VIP > 3 (dark blue nodes) were present in the MN. Five compounds were not detected due to a too low relative abundance in the extract to be fragmented using the MS/MS parameters. The largest cluster corresponded to ergosterol derivatives, some of them were dereplicated as ergostapentaene (m/z 375.301), ergostahexaene (m/z 377.316), ergostatetraen-3-one (m/z 393.312), ergostatetraen-3-ol (m/z 395.327) and hydroxyergosta- trien-7-one (m/z 411.322) analogues [50], among which 5 were overproduced in the mussel-derived medium. A more detailed list of metabolites annotated can be found in Table S1. In the second cluster, the node at m/z 508.335 was annotated as melearoride A (C30H47NO4, [M+Na]+), a 13-membered macrolide previously isolated from a marine-derived Penicillium meleagrinum var. viridiflavum [52].

Four other melearoride derivatives, PF 1163E (m/z 536.365, [M+Na]+, C32H51NO4) [57], PF 1163B (m/z

484.297, [M+Na]+, C27H43NO5) [58,59], N-demethylmelearoride A (m/z 472.339, [M+Na]+, C25H39NO6) [53], were dereplicated in the same cluster for which the annotation was confirmed by a thorough manual interpretation of their MS/MS fragmentation pattern (Figure S4). Two nodes at m/z 522.349 and 522.355 were connected with the m/z 536.365 node with a difference of 14.01 Da suggesting that they corresponded to two undescribed demethyl derivatives. Two other nodes at m/z 492.31, 746.529 corresponding to unknown compounds were also strongly connected within this cluster showing a high diversity of new compounds in this rare macrolide family which were specifically produced by the fungus on YES-SSW and MES-SSW media.

Figure 18. MS/MS molecular network obtained from the MES-SSW extract of P. restrictum MMS417. Left: complete network. Right: pyran-2-one cluster. Light blue nodes represent features with VIP > 1, dark blue nodes represent features with VIP > 3. Bold numbers highlight isolated compounds.

The third cluster was composed of 10 nodes related to pyran-2-one compounds, linked together by an accurate mass difference of 2.01 or 18.01. Three of them were some of the ions highlighted in the OPLS-DA with VIP > 3: m/z 215.125 (pestalotin isomer), m/z 213.110 (dehydropestalotin isomer) and m/z 231.120 (2’-hydroxypestalotin isomer). Among the other nodes, 4 exhibited a VIP score between 1 and 3. Two of them were dereplicated as other analogs of dehydroxypestalotin and 2’-hydroxypestalotin, and the node at m/z 229.105 was consistent with LL-P880. Two other nodes with the same accurate mass and similar fragmentation pattern (cosine score = 0.70 and 0.86)

45 Chapitre 2. Etude du métabolome were linked to this last but with different retention time showing that 3 different isomers of LL- P880 were present. Some of the ions with VIP > 3 in the O-PLSDA model did not appeared connected to this pyran-2-one cluster because they were observed as [M+Na]+ adducts and thus exhibit different fragmentation patterns than their corresponding protonated molecule. In particular, two other LL-P880 isomers were observed as isolated nodes at m/z 251.086. Other pyran-2-ones were searched among the self-loop nodes using their UV-vis absorbance spectra. A node at m/z 197.115

[M+H]+ was then annotated as 6-pentyl-4-methoxy-2H-pyran-2-one (max 280 nm) a dehydroxy derivative of dehydropestalotin [15]. Manual curation of its MS/MS spectrum and comparison with those of other pyran-2-ones confirmed this annotation as it did not present an [M-18+H]+ fragment ion characteristic of the hydroxyl group found in all the compounds of the pyran-2-one cluster. It appeared then that most of the pyran-2-one compounds could not be clearly annotated, due to the possibilities of many regio- or stereo-isomerism. In this way, none of the 3 m/z 229.105 nodes could be assigned as one of the 4 diastereoisomers of LL- P880 among which only the (1’S, 2’R) analogue has been described as a natural product. It was the same for the m/z 231.12 nodes, for which 2 of the 8 possible 2’-hydroxypestalotin (LL-P880) configurations have been described as natural products, these two in the 6S series. Thus, as some of the compounds would likely be new ones, it was decid- ed to engage the purification and structure elucidation of all pyran-2-one derivatives found in the MES-SSW extract.

2.3. Isolation and structure elucidation of pyran-2-ones.

Targeted isolation of pyran-2-ones was both MS- and UV-guided, and led to the isolation of twelve pyran-2-ones including seven new compounds (Figure 5). The five know compounds were identified as 5,6-dihydro-4-methoxy-2H-pyran-2-one (8) [60], (6S,1'S,2'R)-LL-P880β (9) [46], (6S,1’S)- pestalotin (10) [61,62], 1’R-dehydropestalotin (11) [63,64] and 6-pentyl-4-methoxy-2H-pyran-2-one (12) [64]. Identification of these substances was established by comparison of their physical and spectroscopic data with those reported previously and their absolute configuration was established by circular dichroism and comparison of their spectra with published data.

Figure 5. Structures of compounds 1 - 12

Compound 1 was obtained as a white amorphous powder. Its molecular formula was deduced as C7H10O4 with three degrees of unsaturation from the (+)-HRESIMS ions at m/z 159.0652 [M+H]+. The 13C NMR spectrum (Table 3) showed 7 carbons including one oxygenated methyl group, one 46 Chapitre 2. Etude du métabolome unsaturated methine, one oxygenated methine, one methylene, one oxygenated methylene, one unsaturated quaternary carbon and one carbonyle. The 1H-NMR spectrum (Table 3) revealed the presence of one methoxy group at δH 3.77 (3H, s, O-CH3), one methine olefinic proton at δH 5.16 (1H, dd, 1.52 Hz, H-3), one oxygenated methine at δH 4.51 (1H, m, H-6), two methylene protons at δH 2.8 (1H, ddd, J = 1.52, 12.48, 16.74 Hz, H-5a) and 2.28 (1H, dd, J = 3.8, 17.2 Hz, H-5b) and two oxygenated methylene protons at δH 3.73(1H, dd, J = 4.57, 12.17 Hz, H-1’b); 3.92 (1H, m, H-1’a). Compari- son of these data with those of 5,6-dihydro-(6R)-hydroxymethyl-4-methoxy-2H-pyran-2-one [65] revealed that the two compounds possessed the same planar structure. This was supported by 1H-

1H COSY correlations between H-6 (δH 4.51) and H-5a/H-5b/H-1’a/H-1’b. HMBC correlations from

H-3 (δH 5.16) to C-2 (δC 166.73)/C-4 (δC 172.94)/C-5 (δC 28.84), from H-5a (δH 2.8) to C-3 (δC 89.95)/C-4

(δC 174.94)/C-6 (δC 76.21)/C-1’(δC 63.74) and 4-OCH3 to C-3 (δC 89.95)/C-4 (δC 174.94) confirmed that the methoxy group and the hydroxymethyl were located at C-4 (δC 174.94) and C-6 (δC 76.21) respectively of a 5,6-dihydro-2H-pyran-2-one moiety (Figure 6). The UV spectrum with an absorption band at λmax 238 nm was also in accordance with a 5,6-dihydropyran-2-one moiety [45]. The absolute configuration of 1 was assigned as (6S) using optical rotation which was found of similar mag- nitude than for 5,6-dihydro-(6R)-hydroxymethyl-4-methoxy-2H-pyran-2-one but opposite. The ECD spectrum confirmed this assignment as it showed a negative Cotton effect at 240 nm (Figure 7), similar to the one reported for (6S,1’S)-pestalotin [61] and compound 9 (also isolated and analysed in this study). 5,6-dihydro-6-hydroxymethyl-4-methoxy-2H-pyran-2-one can be found reported as two different products in the chemical literature. It is referenced under the CAS no: 1013918-20-1 as the (6R) enantiomer isolated from the endophytic fungus Pestalotiopsis sydowian and obtained as a synthetic intermediate by Pospisil et al. 2008. However it is also found under the reference CAS no: 1332747-99-5 as a compound isolated from the endophytic fungus Pestalotiopsis palmarum but without determination of its absolute configuration [65]. Therefore, compound 1 was assigned as the previously unreported 5,6-dihydro-6S-hydroxymethyl-4-methoxy-2H-pyran-2-one.

(1) (4)

COSY

HMBC

(5)

Figure 6. Selected HMBC and COSY correlations for compound 1, 4, 5

47 Chapitre 2. Etude du métabolome

6 5

3 4

)

1 -

1 λ (nm)

cm 1 - 2

-1 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

)

ɛ (M ɛ - Δ -3

cm λ (nm) 1

- 0

-5 200 220 240 260 280 300 ɛ (M ɛ -7 Δ -2

-9 1 2 -4 -11 3 6 4 -13 -6 9(6S,1'S,2'R)-LL-P880β 5

Figure 7. ECD curves of compounds 1- 6 and reference compound 9

Compound 2 was obtained as a white powder. Its (+)-HRESIMS data (m/z 231.1229 [M+H]+ ,

253.1050 [M+Na]+) indicated a molecular formula of C11H18O5 corresponding to an hydroxylated derivative of pestalotin such as (6S,1’S,2’R)-LL-P880β [46]. The UV spectrum in MeOH showed an absorption maximum at 238 nm revealing a 5,6-dihydro-2-pyrone moiety [45]. The 13C NMR spectrum displayed 11 carbons including two methyl groups, three methylenes, three methines, and two quaternary carbons. Inspection of the 1H NMR spectrum showed one methyl group at δH 0.95

(3H, t, J = 7.1 Hz, H-5’), one olefinic proton at δH 5.12 (1H, s, H-3), six methylenes at δH 1.38-1.5 (2H, m, H-4’), δH 1.5-1.63 (2H, m, H-3’), δH 3.05 (1H, dd, J = 13.78, 16.67 Hz, H-5a), δH 2.19 (1H, dd, J = 2.89,

16.99 Hz, H-5b), three oxygenated methines δH 3.37 (1H, dd, J = 2.0, 6.73 Hz, H-1’), δH 3.80 (1H, t, J =

7.05, 7.69 Hz, H-2’), δH 4.76 (1H, d, 12.82 Hz, H-6) and one methoxy group δH 3.76 (3H, s, 4-OCH3). The analysis of the 1H-1H COSY spectrum indicated the presence of a spin system (C-3-C-5-C-6-C-

1’-C-2’-C-3’-C-4’-C-5’). Key HMBC correlations from H-3 (δH 5.12) to C-2 (δC 167.03)/C-4 (δC

173.94)/C-5 (δC 29.49)/C-6 (δC 75.41), from H-1’ (δH 3.37) to C-2 (δC 167.03)/C-5 (δC 29.49)/C-6

(δC 75.41)/C-2’ (δC 74.13), H-5a (δH 3.05) to C-2 (δC 167.03)/C-3 (δC 89.51)/C-4 (δC 173.94)/C-6

(δC 75.41)/C-1’ (δC 71.27) and from 4-OCH3 (δH 3.76) to C-2 (δC 167.03)/C-4 (δC 173.94)/C-5 (δC 29.49) confirmed that the methoxy group and an 1’,2’-dihydroxy five-carbon side chain were respectively located at C-4 and C-6 of the 5,6-dihydro-pyran-2-one. The planar structure of 2 was then established as the same as hydroxypestalotin [(6S,1’S,2’R)-LL-P880β]. The ECD spectrum of compound 2 was similar to compound 1 (Δε240.9 nm = -1.92) and (6S,1’S,2’R)-LL-P880β (Δε245.2 nm = -11.54) with a negative Cotton effect at 247 nm indicating its (6S) absolute configuration (Figure 7). The 3JH-6-H-1’ (J =

6.73 Hz) of 2 was different from that of (6S,1’S,2’R)-LL-P880β (3JH-6-H-1’ = 4.0 Hz) [46] but similar to that of (6S,1’R,2’S)-nodulisporipyrone D (3JH-6-H-1’ = 6.5 Hz) [66] and (6R, 1’S, 2’R)-LL-P880β (3JH-6-H-1’ =

6.7 Hz) [67] which indicated that the relationship between H-6 and H-1’ was anti. Besides, the 3JH-1’-H-

2’ (J = 2.0 Hz) of 2 was equivalent to that of (6S,1’R,2’S)-nodulisporipyrone D (3JH-1’-H-2’ = 2.1 Hz) [66], which identified that the relationship between H-1’ and H-2’ was syn. Furthermore, the NOESY spectrum showed both an absence of correlation between H-6 and H-2’ and a strong correlation between H-1’ and H-2’. On the basis on these results, the absolute configuration of 2 was determined as 6S,1’R,2’S (Figure 8) and compound 2 was assigned as the previously unreported (6S,1’R,2’S)-LL-P880β.

Compound 3 was obtained as a white powder and showed the same molecular formula

C11H18O5 as compound 2, with ions m/z 231.1225 [M+H]+, 253.1041 [M+Na]+ in (+)-HRESIMS. The 1D NMR (1H, 13C NMR), 2D NMR (HSQC, COSY, and HMBC), UV and ECD spectra were very similar to those of 2 indicating a same planar structure. However, the 3JH6-H1’ (J = 3.85 Hz) and 3JH-1’-H-2’ (J = 48 Chapitre 2. Etude du métabolome

3.53 Hz) of 3 were different from those of 2 but similar to (6S, 1’S, 2’R)-LL-P880β (3JH6-H1’ = 4.0 Hz; 3JH-

1’-H-2’ = 4.0 Hz) [46]. The NOESY spectrum revealed a strong H-6/H-2’ correlation and the absence of H-1’/H-2’, and H-1’/H-6 correlation (Figure 8). Compound 3 was then assigned as (6S, 1’R, 2’R)-LL- P880β, a synthetic compound [68] found for the first time as a new natural product in this study.

NOESY

(2) (3) (9)

Figure 8. Selected NOESY correlations for compounds 2, 3 and 9.

Compound 4 was isolated as a white amorphous powder. Its (+)-HRESIMS spectrum displayed ions at m/z 211.0964 [M-H2O+H]+, 229.1068 [M+H]+, 251.0884 [M+Na]+ with the formula C11H16O5 and 4 degrees of unsaturation. The UV spectrum in MeOH showed an absorption maximum at 238 nm revealing a 5,6-dihydro-2-pyrone moiety [45]. The 1H-NMR and 13C-NMR spectra have demonstrated that 4 was closely related with 2 and 3 except for the difference in the chemical shift of H-2’

(δH 4.32)/C-2’ (δH 72.62), H-3’(δH 5.53)/C-3’ (δC 129.24), H-4’(δH 5.88)/C-4’(δC 130.60) and H-

5’(δH 1.74)/C-5’(δC 17.88). The differences in molecular formula and NMR data indicated that 4 was a reduced homologue of 2. The HMBC correlation from H-4’ (δH 5.88) to C-2’ (δC 72.62)/ C-5’ (δC

17.88) and from H-2’ (δH 4.32) to C-1’ (δC 74.79)/C-3’ (δC 129.24)/C-4’ (δC 130.60)/C-6 (δC 75.94) indicated that the double bond was adjacent to a methyl group and occurred at C-3’ and C-4’. The ge- ometry of C-3’ (δC 129.24) was deduced to be E by the NOESY correlation between H-2’ and H-4’, the 13C-NMR the deshielded chemical shift of the methyl group and the coupling constant 3JH3’-H4’ = 15.71 Hz. The planar structure of 4 was established, which was confirmed by the exhaustive analysis of the 2D-NMR data (HSQC, 1H-1H COSY, and HMBC) (Figure 6). The ECD spectrum of compound 4 was found similar to those of 1-3 (Figure 7). NOESY correlations between H-6 and H-1’ and between H-1’ and H-2’ together with diagnostic coupling constants 3JH6-H1’ = 2.01 Hz (similar to that of (6S,1’S,2’S)-LL-P880[69] and 3JH1’-H2’ = 6.09 Hz (equivalent to that of 3), permitted the assignment of the structure and absolute configuration for 4 as the new compound 5,6-dihydro-4- methoxy-6S-(1’S,2’S-dihydroxy pent-3’(E)-enyl)-2H-pyran-2-one.

Compound 5 was obtained as a white amorphous powder. The (+)-HRESIMS analysis returned a molecular formula of C11H16O5 with 4 degrees of unsaturation from ions m/z 211.0969 [M-H2O+H]+, 229.1069 [M+H]+, 251.0896 [M+Na]+. The UV spectrum of compound 5 in MeOH showed an absorption maximum at 280 nm characteristic of an unsaturated pyran-2-one moiety [44]. The 1H-NMR spectrum showed the presence of one methoxy group at δH 3.83 (3H, s, 4-OCH3), a pair of olefinic hydrogens at δH 5.46 (1H, d, J = 2.01 Hz, H-3) and 6.16 (1H, d, J = 2.01 Hz, H-5), a methyl at δH 0.93

(3H, 7.39, H-5’), four methylenes at δH 1.43 (2H, m, H-3’), δH 1.54 (1H, m, H-4’) and δH 1.35 (1H, m,

H-4’), and two oxygenated sp3 methines at δH 4.44 (1H, d, J = 4.03 Hz, H-1’) and 4.02 (1H, m, H-2’). These data suggested that compound 5 is the reduced product of 2 in the lactone ring, which was confirmed by comparison of the 13C, COSY, HSQC and HMBC spectra with those of LL-P880γ

49 Chapitre 2. Etude du métabolome

[refs]. The coupling constant 3JH1’-H2’ = 4.03 Hz and a correlation observed between H-1’ and H-2’ in the NOESY spectrum experiment of 5 indicated that they were syn and that the relative configuration of 5 was 1’R*,2’S* or 1’S*,2’R*. The optical rotation of compound 5, with [α]20D + 63 (c 1.0, MeOH), had the same sign than (1’R,2’S)-LL-P880γ and (1’R,2’R)-LL-P880γ and the ECD spectrum of compound 5 (Δε281.9nm = + 2.042) exhibited a positive Cotton effect at 282 nm already described for 6-(1R, 2’R-dihydroxyheptyl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one [66] and 6-(1R, 2’S-dihydroxyheptyl)-4- methoxy-2H-pyran-2-one [66]. These observations allowed the assignment of the structure and absolute configuration of 5 as the new natural product (1’R, 2’S)-LL-P880γ, previously described as a synthetic compound [70].

Compound 6 was isolated as a white amorphous powder. The (+)-HRESIMS spectrum of 6 displayed ions at m/z 209.0822 [M-H2O+H]+, 227.0921 [M+H]+, 249.0743 [M+Na]+, corresponding to the formula C11H14O5 with 5 degrees of unsaturation. This difference in molecular formula compared to

5 (-2H) and its UV spectrum presenting the same λmax = 280 nm indicated that 6 was a reduction product of 5 on the side chain of the pyran-2-one moiety. The 1H and 13C-NMR spectra (Table 3) were also very similar to those of compound 5, except for the absence of the signals corresponding to the H-3’ and H-4’ methylenes. Instead, two olefinic methines were observed at δH 5.5 (1H, ddd, J

= 2.01, 1.34, 15.45 Hz, H-3’) and δH 5.83 (1H, dq, J = 6.72, 15.45 Hz, H-4’) with an HMBC correlation from H-5’ to C-3’ and C-4’ suggesting that the double bond was adjacent to the methyl group. A mutual trans-form coupling (J = 15.45 Hz) indicated an E configuration of the double bond. Based on the above analysis, the planar structure of 6 was established. The absolute configuration at C-1’ was deduced to be R from the observation that the ECD spectrum of compound 6 was similar to that of 5 (Figure 6). According to these data, the relative configuration of compound 6 could be proposed as 1’R*, 2’R* or 1’R*, 2’S*. The 1H and 13C NMR shifts of these two regioisomers possible were computed by DP4 probability calculation [71,72]. After correlating the experimental and simu- lated data through the DP4 probability method, the relative configuration of 1’R, 2’R was identified as the most likely candidate in high probability, with 99.9% (both 13C and 1H NMR), 99.8 (only 1H NMR), and 73.9% (only 13C NMR) probabilities values according to DP4 calculations (Figure 9). Finally, the structure of compound 6 was established as 4-methoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxy pent- 3’(E)-enyl)-2H-pyran-2-one.

Proton 99.8 % 0.2 % Carbon 73.9 % 26.1 % Both Proton and Carbon 99.9 % 0.1 %

Figure 9: Chemical structures of two possible regioisomers of compound 6 with their respective DP4 probabilities

50 Chapitre 2. Etude du métabolome

Compound 7 had the molecular formula C6H6O3 as indicated by the (+)-HRESIMS m/z 127.0416 [M+H]+. As for compounds 5 and 6, the UV spectrum of compound 7 was consistent with the presence of a pyran-2-one moiety [44]. The 1H, 13C-NMR analysis (Table 3) allowed a final identification of compound 7 as 4-methoxy-2H-pyran-2-one. Compound 7 was originally reported as a synthetic intermediate during the synthesis of patulin [73] and is reported here for the first time as a natural product.

51 Chapitre 2. Etude du métabolome

1 13 Table 3. H (500 MHz) and C NMR (125 MHz) data for compounds 1-7 and the reference compound (6S,1’S,2’R)-LL-P880β (in CDCl3). 1 (6S ,1’S ,2’R )-LL-P880β 2 3

Position δC, type δH, (m, J Hz) δC, type δH, (m, J Hz) δC, type δH, (m, J Hz) δC, type δH, (m, J Hz) 2 166.73 C 166.58 C 167.03 C 167.18 C 3 89.95 CH 5.16, s 89.73 CH 5.14 (d, 1.52) 89.51 CH 5.12, s 89.55 CH 5.11, s 4 172.94 C 173.40 C 173.94 C 173.68 C

5 28.84 CH2 a. 2.8 (dd, 12.78, 16.74) 29.35 CH2 a. 2.89 (ddd, 1.52, 12.88, 17.18) 29.49 CH2 a. 3.05 (dd, 13.78, 16.67) 29.30 CH2 a. 2.88 (dd, 13.9, 16.19) b. 2.28 (dd, 3.65, 17.04) b. 2.32 (dd, 3.67, 16.93) b. 2.19 (dd, 2.89, 16.99) b. 2.31 (dd, 3.53, 17.2) 6 76.21 CH 4.51, m 77.95 CH 4.52 (dt, 4.04, 4.04, 12.88) 75.41 CH 4.76 (d, 12.82) 77.88 CH 4.5 (dt, 3.85, 4.17, 12.8)

4-OCH3 56.18 3.77, s 56.16 3.76, s 56.16 3.76, s 56.18 3.74, s

1’ 63.74 CH2 a. 3.73 (dd, 4.57, 12.17) 73.80 CH 3.49 (dd, 2.9, 4.17) 71.27 CH 3.37 (dd, 2.0, 6.73) 70.77 CH 3.47 (t, 3.53, 3.85) b. 3.91, m 2’ - - 70.93 CH 3.80, m 74.13 CH 3.80 (t, 7.05, 7.69) 73.78 CH 3.77 (t, 3.53, 4.27)

3’ - - 35.94 CH2 1.5-1.63, m 35.71 CH2 a. 1.66, m 35.84 CH2 1.5-1.58, m b. 1.5, m

4’ - - 18.78 CH2 1.38-1.5, m 18.78 CH2 a. 1.58, m 18.72 CH2 1.38-1.5, m b. 1.4, m

5’ - - 13.94 CH3 0.94 (t, 7.07) 13.98 CH3 0.95 (t, 7.1) 13.92 CH3 0.92 (t, 6.73)

4 5 6 7

Position δC, type δH, (m, J Hz) δC, type δH, (m, J Hz) δC, type δH, (m, J Hz) δC, type δH, (m, J Hz) 2 166.58 C 164.12 C 162.7 C 163.75 C 3 89.81 CH 5.14, s 88.4 CH 5.46 (d, 2.01) 88.35 CH 5.44 (d, 2.69) 89.98 CH 5.53 (d, 2.3) 4 173.32 C 171.11 C 171.18 C 170.56 C

5 29.55 CH2 a. 2.97 (dd, 13.78, 17.31) 100.45 CH 6.16 (d, 2.01) 100.19 CH 6.14 (d, 2.02) 103.13 CH 6.01, m b. 2.27 (dd , 3.85, 17.31) 6 75.94 CH 4.51 (dt, 3.21, 3.21, 12.82) 163.19 C - 167.3 C - 150.90 CH 7.35 (d, 6.1)

4-OCH3 56.18 3.76, s 55.99 3.83, s 55.96 3.82, s 55.51 3.81, s 1’ 74.79 CH 3.49 (dd, 2.01, 6.09) 73.44 CH 4.44 (d, 4.03) 73.75 CH 4.51, br,m - -

2’ 72.62 CH 4.32 (t, 6.41) 72.56 CH 4.02, m 72.98 CH 4.51, br,m - -

3’ 129.24 CH 5.53 (dd, 7.69, 15.71) 33.24 CH2 1.43, m 127.1 CH 5.5 (dd, 1.34, 2.01, 15.45) - - 1.54, m 5.83 (dq, 6.72, 15.45)

4’ 130.60 CH 5.88, m 18.91 CH2 1.35, m 131.48 CH - -

5’ 17.88 CH3 1.74 (d, 6.41) 13.91 CH3 0.93 (t, 7.39) 17.9 CH3 1.71 (dd, 1.34, 6.72) -

Chapitre 2. Etude du métabolome

2.6. Biological evaluation of isolated compounds

Due to limited amount, only some of the isolated products were tested for cytotoxic, antibacterial and antileishmanial activities. Compounds 7, 10-12 did no exhibit antiproliferative activity against the epithelial cancer cell line KB when assayed at a concentration of 50 µg/mL. Compounds 2, 3, 7, 10-12 were screened for their antibacterial activities against Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Entero- coccus faecalis. None of them showed antibacterial activity at a concentration of 100 µg/mL. Antileishmanial activity of 10 was evaluated through determination of 50% efficient concentration against Leishmania infantum amastigotes. Results of this assay showed no detectable activity at concentrations ≤ 50 µg/mL.

2.7 PTP1B inhibition virtual screening

Recently, 3,4,6-trisubstituted pyran-2-one derivatives, chrysopyrones A and B have been described as potent inhibitors of protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) [74]. Compound 10 was then assayed in a preliminary docking-based virtual screening process. As shown in Figure 10, the binding analysis revealed that the carbonyl group of the pyran-2-one core forms hydrogen bonds with the –NH of Gly220 and –SH of Cys215. This last residue belongs to the PTP-loop of PTP1B, the catalytic site in which Cys215 and Arg221 are the most vital amino acids for the enzyme activity. The model also showed that the –OH group of the lateral chain of 10 forms an hydrogen bond with the carbonyl group of Gln262 inside the pTyr loop involved in substrate recognition. These results are promising to engage further enzyme inhibitory assays.

Gly220

Cys215 Gln262

Figure 10: Representative amino acid residues surrounding compound 10 in the binding pocket of PTP1B 3. Discussion

Stress adaptation and metabolic response are critical mechanisms for the survival of microbes in a dynamic environment and for the colonization of host niches. Fungi sense and then transduce external changes in osmotic pressure mainly through cellular signalling pathways such as the HOG pathway and then activated transcriptional activators, in turn, modulate the pattern of gene expression, produced of osmoprotec- tant compounds such as glycerol [75]. Some of the studies in the literature have shown that in some cases the response to osmotic stress by fungi is linked to the biosynthesis of natural products [75–78]. For investigating

Chapitre 2. Etude du métabolome new bioactive compounds in marine fungi, several strategies have been used to induce the expression of silent natural products including the use of abiotic stresses such as high NaCl concentrations [76,77]. In As- pergillus aculeatus, osmotic and saline stress exerted by glycerol and NaCl, respectively, can modulate the production of natural products [77]. Similarly, the expression of polyketides was upregulated and de novo observed following the use of a combination of SAHA and osmotic stress in A. cruciatus [75]. Here we observed that it was the combination of the use of seawater and the mussel-derived medium which induced the overexpression of some specialized compounds, i.e. culture conditions which can be considered as the closest to the original environment of the P. restrictum strain. This illustrates that there may be a specific metabolome of the living conditions within holobionts such as bivalves, which can be reconstituted in vitro.

The use of both metabolomics and feature-based molecular networking (FBMN allowed to highlight compounds and to cluster them into chemical series. These tools are of high value for enhancing the dereplication of known compounds and can allow annotation propagation for the discovery of new analogs in a chemical series [79,80], as it is shown here for melearorides. However, for small molecules and trace compounds such as pyran-2-ones described here, fragmentation informations are usually poor and they can escape MS/MS fragmentation because they are below the method threshold, especially in complex mixtures such as fungal culture extracts. Furthermore, some compounds can be undetected and unrepresented in the MN as in the case of isomers which can lead to similar fragmentation patterns. The observation of multiple isobaric compounds in a MN highlights these limits of MS-based dereplication, as shown in this study for LL-P880β stereoisomers. Then adding further physico-chemical properties such as retention time and UV-Vis spectrum in the MN is mandatory to optimize the resolution of the detection of metabolites diversity, but it does not enhance the strength of annotations. In this work, using a combination of MS-guided and UV- guided fractionation was the only way to fully characterize the targeted compounds, which successfully yielded to the isolation of, among others, three isomers of LL-P880β, including two new molecules.

The twelve pyran-2-ones isolated were found to belong to two sub-series according to their degree of insaturation of the lactone ring. These kinds of compounds are commonly found among fungi, but only the 6S stereoisomers have been described as natural products with the exception of 5,6-dihydro-(6R)- hydroxymethyl-4-methoxy-2H-pyran-2-one, the smallest C6-substituted analogue which was previously isolated from Pestalotiopsis sydowiana [65]. In our study, all the compounds belonged to the 6S series, including the new 1 which completes the chemical family, showing that the biosynthetic route induced in these environment-related conditions was unique and stereospecific.

If monocyclic pyran-2-ones attracted much attention due to their wide distribution and chemodiversity in microbes, their biological evaluations always reported that they exert no or minor cytotoxicity nor antibacterial or antiparasitic activity, as we observed here [81,82]. Only some members were found to inhibit seed germination or plant growth, to inhibit 20S proteasome [65], to enhance the growth-stimulating action of gibberellic acid [61], or to be selectively active against some yeast or filamentous fungi [83,84]. Their role in the chemical interaction between a fungus and its host remains then unknown, but hypotheses can be proposed. Due to their structural similarity with homoserine lactones, some synthetic and natural pyran-2-ones have been shown to act as quorum sensing inhibitors. Usually, it is considered that the longer the alkyl chain is, the higher is the QS inhibition activity [85]. However, it has also been discovered that pyran-2-ones, including short-branched ones, can act as signalling molecules in some bacteria such as Pseudomonas luminescens [86]. It can then be envisaged that small pyran-2-ones can be engaged in signal recognition processes and in chemical interactions between fungi and hosted bacteria inside the bivalve.

Chapitre 2. Etude du métabolome

Protein tyrosine phosphatases (PTPs) are of importance in the regulation of a myriad of cellular signal transduction systems. They are involved in meiosis, metabolism, cell-substrate and cell-cell adhesion and sporulation in yeasts, and then play a role in responses to environmental changes and stresses [87]. A whole- genome sequencing project of the cosmopolitan Mediterranean mussel (Mytilus galoprovincalis) has been conducted recently, showing that some genes with tyrosine phosphatase related functions were present in mussel [88]. It was also reported that two 3,4,6-trisubstituted pyran-2-one derivatives, chrysopyrones A and B isolated from a marine Penicillium chrysogenum, showed potent inhibitory activities against PTP1B [74]. PTP1B is the major negative regulator of insulin signalling in mammals and thus it catalyses the phosphory- lation of the insulin receptor or insulin receptor substrate [89]. Furthermore, small pyran-2-ones seem to be promising candidates for developing new PTP1B inhibitors [90–92]. The results we obtained from the in silico docking of 6S, 1’S-pestalotin (10) showed that it can bind with important residues of the catalytic site of PTP1B, including some amino acids inside the PTP-loop which is highly conserved in all PTPs. Therefore, it can be envisaged that an inhibition of PTPs would be one of the mechanisms involved in the interaction of the fungus within its host. Further biological studies should be conducted to determine whether pyran-2- ones play these or other roles within molluscs.

4. Materials and Methods

4.1. Fungal Material

The studied strain, Penicillium restrictum MMS417, was isolated from a sample of the blue mussel Myti- lus edulis collected in January 1997 at Port Giraud on the Loire estuary in France. The strain is preserved at the laboratory Mer-Molécule-Santé (MMS) EA2160, University of Nantes, France. After, The strain has been identified according to macroscopic and microscopic observations, and sequencing of the internal transcribed spacer (ITS) and β-tubulin regions of the rDNA and nucleotide BLAST search (GenBank accession number for MMS417: KU720404, KU720398)..

4.2. Culture Media Preparation

Fungal cultures were performed in Petri dishes (10 cm diameter) containing 15 mL of solid agar-based medium in 14 different media. Two osmotic conditions were prepared based on the presence or absence of artificial seawater (36 g/L of salinity). Media composition were as follows: DCA (Dextrose 40 g/L, enzymatic digest of Casein 10 g/L, Agar 15 g/L, Difco); MEA (Malt Extract 20 g/L, peptone 1 g/L, glucose 20 g/L, Agar

20 g/L); PDA (Potato extract 4 g/L, Dextrose 20 g/L, ZnSO4.7H2O 0.01 g/L, CuSO4.5H2O 0.005 g/L, Agar 15 g/L); YES (Yeast Extract 20 g/L, Sucrose 150 g/L, agar 20 g/L); MES (Mussel Extract 20 g/L, Sucrose 150 g/L, agar 20 g/L); CYA (Czapek concentrate 10 mL, Yeast extract 5 g/L, K2HPO4 1 g/L, sucrose 30 g/L, Agar 15 g/L); Czapek concentrate (NaNO3 3 g/L, KCl 0.5 g/L, MgSO4.7H2O 0.5g/L, FeSO4.7H2O 0.01g/L, ZnSO4.7H2O

0.01 g/L, CuSO4.5H2O 0.05g/L); KMS (MgSO4.7H2O 2.4 g/L, NH4NO3 2.4 g/L, Tris (tampon) 1.21 g/L, Agar 20 g/L). Details for the preparation of Mussel Extract are presented in a previous study [19].

4.3. Fermentation and Extraction for OSMAC Approach

Fungal cultures were carried out in triplicate for each medium from culture stocks of the strain stored at - 20 OC and transplanted on Petri dishes of DCA medium 10 days before inoculation. The fungus (fragments of mycelium and conidia) were taken using a sterile Pasteur pipette and transplanted by depositing three points on the top of the agar. The cultures were incubated at 27 0C for 10 days under natural light. Plugs (6

Chapitre 2. Etude du métabolome mm diameter) were taken in three distinct places of cultures (at the point of central impact, on the outskirts of the colony, in the periphery but contact with an adjacent colony). The three plugs were gathered together and extracted twice with 1.5 mL of CH2Cl2/EtOAc 1:1 (v/v). Fungal mycelium and the agar layer were extracted together to obtain both intra- and extracellular metabolites. Mixtures were finely sonicated for 30 min and filtered on regenerated cellulose filters 0.45 µm (Sartorius). Organic phases were combined and evapo- rated to dryness leading to an organic extract. Media without inoculated fungi were also extracted following the same protocol and considered as controls (blanks samples).

4.4. HPLC-MS analyses

HPLC-(+)-HRESI-MS and HPLC-(+)-HRESI-MS/MS analyses were performed on a UFLC-MS (IT-TOF) Shimadzu instrument (combining ion trap and time of flight analyzers), using a Kinetex C18 column (2.6 µm, 2.1 x 100 mm, Phenomenex) and following previously described conditions [93,94]. MS/MS fragmentations were obtained by applying the following parameters: energy 50%, collision gas 50%, q (frequency) 0.251 (45.0 Hz). Precursor ion selection was performed in the range m/z 150-1000. Daughter ions were measured in the range m/z 100-1000 with 30 ms accumulation, an execution trigger set at 1 x 106, and an excluding dynamic range of 3 s. Samples (5 µL) were injected at the concentration of 1 mg/mL in MeOH. MeOH blanks were injected randomly during the analysis sequences. A mixture of all extracts at the same concentration was also prepared as quality control (QC) and regularly injected throughout the sequences. The purpose of quality control (QC) is to monitor the performance of metabolomics workflows against standards to detect prob- lems and inform corrective actions. The QC samples were analysed intermittently for the duration of the analytical study to assess the variance observed in the data throughout the sample preparation, data acquisition, and data pre-processing steps.

4.5. Data Processing

The HPLC-(+)-HRESI-MS chromatogram raw data files were converted to *.netCDF files by using LCMS solution (version 3.60 – Shimadzu). The *.netCDF files were subjected to MZmine 2 [95] for automatic peak picking. The mass detection was performed using a centroid algorithm with a noise level of 1.4E4. The chromatogram building was established using the ADAP algorithm with the minimum of group size in the number of scans of 4, group intensity threshold of 1E5, a minimum of the highest intensity of 2.1E4 and m/z tolerance of 100 ppm. The peak deconvolution was performed using the ADAP algorithm with median m/z center calculation, signal to noise threshold of 5, minimum feature height of 1, coefficient/area threshold of 100, peak duration range from 0.08 to 23.69 min and retention time wavelet range from 0.01 to 0.2 min. The chromatograms were deisotoped with m/z tolerance of 0.003 m/z, retention time tolerance of 1 min, maximum charge of 2, and the lowest m/z was chosen as representative. The duplicate peaks were filtered with m/z tolerance of 10 ppm and retention time tolerance of 0.05 min. The peak list was aligned using the Ransac aligner algorithm with m/z tolerance of 100 ppm, retention time tolerance of 1 min, retention time tolerance after correction 1 min, Ransac interactions of 20000, minimum number of points of 50.0%, the value of threshold was 1, and a linear model was chosen. The peak list rows were filtered with minimum peaks in a row of 3. Then, the gap-filling step was performed with a peak finder (multithreaded) algorithm, intensity tolerance of 30%, m/z tolerance of 5 ppm, retention time tolerance of 0.5 min. All duplicate peaks were filtered by setting the m/z tolerance of 5 ppm and retention time tolerance of 0.05 min. The results were exported as a *.csv file containing all peaks observed and referenced by their mass to charge ratio (m/z) and retention times (tR) together with their respective peak areas in each sample. The generated matrix was cleaned by removing all peaks abundantly found in blank samples (culture media extracts) and technical

Chapitre 2. Etude du métabolome

blank samples (MeOH injections). The final data matrix corresponded to a total of 882 features (m/z-tR) and their respective areas in the 56 samples investigated (14 groups of four biological replicates).

4.6. Statistical Analysis

The data set containing 882 features was first transformed to reflect full compound production by multiplying each peak area by the extract amount of the corresponding samples. Then the data was normalized by using Pareto scaling and submitted to principal component analysis (PCA) and orthogonal projection to latent structures discriminates analysis (OPLS-DA) using SIMCA13 (UMETRICS).

4.7. Molecular networking

The HPLC-(+)-HRESI-MS/MS raw data files were converted to *.netCDF files by using LCMS solution (version 3.60 – Shimadzu). The LC-MS/MS data was subjected to automatic peak picking using MZmine 2 [95] with the above mentioned parameters. The peak list was exported as a *.mgf file for GNPS. The *.mgf file was subjected to the online workflow of the Global Natural Products Social molecular networking platform (https://gnps.ucsd.edu) [96]. The molecular network was generated using the following settings: precursor ion mass tolerance of 2 Da and fragment ion mass tolerance of 0.3 Da, minimum pairs cosine of 0.1, network topK of 10, minimum matched fragment ions of 2, minimum cluster size of 1, run MS cluster and filter precursor window tolls were turned off, via the following link: https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/status.jsp?task=58f66fb7b73745ce95ea632e948dc1a9

The molecular network was finally visualized using Cytoscape 3.7.1 [97].

4.8. Annotation of MS features

Compound annotation based on MS/MS data was performed first using the GNPS platform [79,96]. Then unannotated features were further identified using an alternative strategy [98]. Feature molecular formula was determined using SIRIUS3 [99] and used to mine for possible annotation in various Natural Prod- uct Databases, such as Dictionary of Natural Products (DNP) or KNApSAcK [100]. Fungal related annotations were further confirmed by exhaustive literature search for taxonomic consistency.

4.9. Isolation and identification of specialized metabolites.

Large scale cultivation on the MES-SSW medium was performed in 54 Erlenmeyer flasks (250 mL), containing 50 mL of media. Extraction with CH2Cl2/EtOAc 1:1 (v/v) resulted in 11.5 g extract. The extract was fractionated using silica gel vacuum liquid chromatography (VLC) eluting with mixtures of solvents with increasing polarity: hexane/EtOAc (from 100:0 to 30:70 (v/v)) to yield six fractions, then CH2Cl2/MeOH (from 100:0 to 0:100 (v/v)) to yield five fractions. Fractions F8 (250.2 mg) was subjected to silica gel flash chromatography (column Reveleris, Silica 40 µm, 4 g) eluting with mixtures of CH2Cl2/EtOAc (from 100:0 to 60:40

(v/v)), and then CH2Cl2/MeOH (50:50 (v/v)) at a flow rate of 15 mL/min to afford 13 subfractions. Fraction F8- 6 (84 mg) was subjected to silica HPLC (column Luna® 5 µm, Silica, 100 Å, 250 x 10 mm), with a mobile phase consisting in MeOH/H2O (from 3:97 to 25:75 (v/v)) at a flow rate of 4 mL/min, to yield 12 subfractions. F8-6-4 (15 mg) was fractionated by RP-pentafluorophenyl HPLC (column Kinetex® 5 µm F5, 100 Å, 250 x 4.6 mm), with the mobile phase MeOH/H2O (20:80 (v/v)) at a flow rate of 1 mL/min, to obtain 1 (0.5 mg), 2 (3.2 mg) and 3 (5 mg). Fraction F8-6-7 (5.5 mg) was purified by RP-pentafluorophenyl HPLC (column Kinetex® 5

µm F5, 100 Å, 250 x 4.6 mm), with the mobile phase MeOH/H2O (25:75 (v/v)) at a flow rate of 0.5 mL/min, to afford 5 (1.4 mg) and 6 (0.7 mg). F8-7 (8.7 mg) was subjected to silica HPLC (column Luna® 5 µm, Silica, 100

Å, 250 x 10 mm), with the mobile phase MeOH/H2O (from 3:97 to 25:75 (v/v)) at a flow rate of 4 mL/min,

Chapitre 2. Etude du métabolome giving 4 (0.7 mg). Fraction F6 (253.8 mg) was subjected to another silica gel flash chromatography (column

Macherey-Nagel, Chromabond® flash RS25-SiOH) eluting with mixtures of CH2Cl2/MeOH (from 100:0 to 0:100 (v/v)), at a flow rate of 20 mL/min to afford 12 subfractions. F6-3 (25.2 mg) was subjected to another silica gel flash chromatography eluting with mixtures of Hexane/EtOAc (from 100:0 to 0:100 (v/v)) followed by 100% MeOH to yield six fractions. F6-3-3 (2 mg) was purified by isocratic silica HPLC (column Inter- chim® 5µm, Silica, 250 x 4.6 mm), with a mobile phase of CH2Cl2/EtOAc 98:2 (v/v) at a flow rate of 1 mL/min, to afford 7 (0.9 mg).

5,6-dihydro-6S-hydroxymethyl-4-methoxy-2H-pyran-2-one (1) White amorphous powder; [α]20D -30 (c 0.2,

MeOH); UV (MeOH) λmax 238 nm; CD ( 5.06 x 10-3 M, MeOH) Δε240.9 = - 1.92; 1H and 13C NMR data, Table 3;

(+)-HRESIMS m/z 159.0652 [M+H]+ (calcd for C7H10O4, 158.058 Da).

6S-(1’R,2’S-dihydropentyl)-4-methoxy-5,6-dihydro-2H-pyran-2-one (2): White amorphous powder; [α]20D - 61.71

(c 0.58, MeOH); UV (MeOH) λmax 238 nm; CD (1.74 x 10-3M, MeOH) Δε221.4 = + 3.18, Δε247 = - 5.2; 1H and 13C

NMR data, Table 3; (+)-HRESIMS m/z 231.1229 [M+H]+ (calcd for C11H18O5, 230.1156 Da).

6S-(1’R,2’R-dihydropentyl)-4-methoxy-5,6-dihydro-2H-pyran-2-one (3): White amorphous powder; [α]20D - 38.29

(c 0.067, MeOH); UV (MeOH) λmax 238 nm; CD (4.78 x 10-3M, MeOH) Δε222.8+ 0.66, Δε245.6 = - 1.2; 1H and 13C

NMR data, Table 3; (+)-HRESIMS m/z 231.1225 [M+H]+ (calcd for C11H18O5, 230.1152 Da).

5,6-dihydro-4-methoxy-6S-(1’S,2’S-dihydroxypent-3(E)-enyl)-2H-pyran-2-one (4). White amorphous powder; UV

(MeOH) λmax 239 nm; CD (8.77 x 10-4M, MeOH) Δε223.6 = + 3.01, Δε246.6 = - 3.75; 1H and 13C NMR data, Table 3;

(+)-HRESIMS m/z 229.1068 [M+H]+ (calcd for C11H16O5, 228.1 Da).

(1’R, 2’S)-LL-P880γ (5): White amorphous powder; [α]20D + 63 (c 1.0, MeOH). UV (MeOH) λmax 280 nm; CD

(1.2 x 10-3M, MeOH) Δε281.9 = + 2.042; 1H and 13C NMR data, Table 3; (+)-HRESIMS m/z 229.1069 [M+H]+ (calcd for C11H16O5, 228.1 Da).

4-methoxy-6-(1’R,2’R-dihydroxypent-3’(E)-enyl)-2H-pyran-2-one (6). White amorphous powder; [α]20D + 55.2 (c

0.42, MeOH); CD (6.2 x 10-3M, MeOH) Δε275.7 = + 1.31; UV (MeOH) λmax 280 nm; 1H and 13C NMR data, Table 3;

HRESIMS m/z 227.0921 [M+H]+ (calcd for C11H14O5, 226.0848 Da).

4-methoxy-2H-pyran-2-one (7) White amorphous powder; UV (MeOH) λmax 198, 274 nm; 1H and 13C NMR data,

Table 3; (+)-HRESIMS m/z 127.0411 [M+H]+ (calcd for C6H6O3, 126.034 Da).

4.9. DP4 computational analyses

To be completed

4.10. Cytotoxicity assays.

Cytotoxicity assays were carried out using the MTT assay and following the procedure previously described [93].

4.11. Antimicrobial assay

Compounds were tested for antimicrobial activity via a paper disk diffusion method. Seed cultures of Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Enterococcus faecalis ATCC 19433 were prepared by incubating the organism for 12 h at 37 0C. Aliquots of

Chapitre 2. Etude du métabolome overnight cultures at 1 x 108 CFU/mL were spread onto the surfaces of nutrient agar. Sterile filter disks (6 mm diameter) that were plotted with 10 µL of test solution (100 µg/mL in EtOH 1%), positive control (gen- tamicin sulfate) or vehicle only (EtOH 1%) were added to the plates. Plates were left upright for 30 min at room temperature before being placed in an incubator at 37 0C for 12h, and then the growth inhibition zone diameter was recorded.

4.12. Antileishmanial activity on Leishmania infantum axenic amastigotes

Leishmania infantum promastigotes (MHOM/MA/67/ITMAP-263, CNR Leishmania, Montpellier, France, expressing luciferase activity) were cultivated in RPMI 1640 medium supplemented with 10% foetal calf serum (FCS), 2 mM L-glutamine and antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 µg/mL streptomycin) and har- vested in logarithmic phase of growth by centrifugation at 900 g for 10 min. The supernatant was removed carefully and was replaced by the same volume of RPMI 1640 complete medium at pH 5.4 and incubated for 24 h at 24 °C. The acidified promastigotes were then incubated for 24 h at 37 °C in a ventilated flask to transform promastigotes into axenic amastigotes. The effects of the tested compounds on the growth of L. infantum axenic amastigotes were assessed as follows. L. infantum amastigotes were incubated at a density of 2× 106 parasites/mL in sterile 96-well plates with various concentrations of compounds dissolved in MeOH (final concentration less than 0.5% v/v), in duplicate. Appropriate controls, DMSO, MeOH and amphotericin were added to each set of experiments. After a 48 h incubation period at 37°C, each plate-well was then mi- croscopically-examined to detect any precipitate formation. To estimate the luciferase activity of axenic amastigotes, 80 µL of each well were transferred to white 96-well plates, Steady Glow® reagent (Promega) was added according to manufacturer's instructions, and plates were incubated for 2 min. The luminescence was measured in Microbeta Luminescence Counter (PerkinElmer). Efficient concentration 50% (EC50, mean of three independent experiences) was defined as the concentration of drug required to inhibit by 50% the metabolic activity of L. infantum amastigotes compared to control.

4.13. Docking study

Molecular docking study was carried out by using the crystallographic structure of PTP1B (PDB ID: 1nwl) which was downloaded from Protein DataBank.

To be completed

Supplementary Materials: The following are available online at www.mdpi.com/xxx/s1, Figure S1: Morphology of strain P. restrictum on 14 different media after 12 days of growth (7 media, 2 salinity), Figure S2: a) PCA of OSMAC data in positive mode of 14 media (7 media, 2 salinity, 4 replicates) with QC (quality control), Figure S3: a) OPLS- DA score-plot of YES-SSW versus the 6 other SSW extracts (positive ionization, n=4; R2X cum 0.366 and R2Y cum 0.98, Q2 cum 0.703; CV-ANOVA (p-value = 5.37e-4); b) Corresponding S-plot: features highlighted in yellow correspond to discriminatory ions with VIP>3, Table S1: Identification of representative characteristics ions of OPLS-DA separation YES-SSW media from other, Table S2: Dereplication from HRMS/MS data sets of the crude ethyl acetate extract of P. restrictum MMS417 on MES-SSW medium, Figure S4: Annotation of cluster 3. Light blue nodes represent features with values VIP>1, Figure S5: LC-(+)-ESI HRMS spectrum and UV-Vis spectrum of compound 1 with corresponding structure, Figure S6: LC-(+)-ESI HRMS spectrum and UV-Vis spectrum of compound 2 with corresponding structure, Figure S7: LC-(+)-ESI HRMS spectrum and UV-Vis specter of compound 3 with corresponding structure, Figure S8: LC-(+)-ESI HRMS spectrum and UV-Vis spectrum of compound 4 with corresponding structure, Figure S9: LC-(±)-ESI HRMS spectrum and UV-Vis spectrum of compound 5 with corresponding structure, Figure S10: LC-(+)-ESI HRMS spectrum and

Chapitre 2. Etude du métabolome

UV-Vis spectrum of compound 6 with corresponding structure, Figure S11: LC-(+)-ESI HRMS spectrum and UV-Vis spectrum of compound 7 with corresponding structure, Figure S12 - S45: 1D and 2D NMR spectra of compounds 1-6.

Author Contributions: Conceptualization, S.B, N.C., C.L., G.G.-J., O.G.; methodology and investigation, V.- T.L., T.R.P., F.F., S.B-D., C.L., G.G.-J.; data analyses, S.B, N.C., S.B-D., C.L., G.G.-J., O.G., writing, reviewing and editing V.-T.L., S.B., N.C., C.L., G.G.-J., O.G. All authors have read and approved the final version of the manuscript.

Acknowledgments:

Authors acknowledge the Vietnam International Education Development program for a Ph.D. grant for V.T. Le. Authors are grateful to Pascal Richomme from laboratory SONAS, University of Angers and Muriel Duflos and Pascal Marchand from laboratory IiciMed, University of Nantes for NMR analyses, and Marylène Chollet-Krugler from laboratory ISCR UMR CNRS 6226, University of Rennes 1, for optical rota- tions determinations. Authors also aknowledge the IMPACT Core Facility of Biogenouest, UMR CNRS 6286 Fonctionnalité et Ingénierie des Protéines (UFIP), Universiy of Nantes, for ECD experiments, and the Cor- saire-ThalassOMICS Metabolomics Core Facility of Biogenouest, for LC-HRMS/MS analyses and automated dereplication.

Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.

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B.; Torres-Mendoza D.; Gonzalez D.J.; Silva D.B.; Marques L.M.; Demarque D.P.; Pociute E.; O'Neill E.C.; Briand E.; Helfrich E.J.N.; Granatosky E.A.; Glukhow E.; Ryffel F.; Houson H.; Mohimani H.; Kharbush J.J.; Zeng Y.; Vorholt J.J.; Kurita K.L.; Charusanti P. McPhail K.L.; Nielsen K.F.; Vuong L.; Elfeki M.; Trazler M. Engene N.; Koyama N.; Vining O.B.; Baric R.; Silva R.R.; Mascuch S.J.; Tomasi S.; Jenkins S.; Macherla V.; Hoffman T.; Agarwal V.; Wil- liams P.G.; Dai J.; Neupane R.; Gurr J.; Rodríguez A.M.C.; Lamsa A.; Zhang C.; Dorrestein K.; Duggan B.M.; Almaliti J.; Allard P.M.; Phapale P.; Nothias L.F.; Alexandrov T.; Litaudon M.; Wolfender J.L.; Kyle J.E.; Metz T.O.; Peryea T.; Nguyen D.T.; VanLeer D.; Shinn P.; Jadhav A.; Müller R.; Waters K.M.; Shi W.; Liu

Chapitre 2. Etude du métabolome

X.; Zhang L.; Knight R.; Jensen P.R.; Palsson B.O.; Pogliano K.; Linington R.G.; Gutiérrez M.; Lopes N.P.; Gerwick W.H.; Moore B.S.; Dorrestein P.C.; Bandeira N. Sharing and community curation of mass spectrometry data with GNPS. Nat. Biotechnol. 2016, 34, 828–837. 80. Yang, J.Y.; Sanchez, L.M.; Rath, C.M.; Liu, X.; Boudreau, P.D.; Bruns, N.; Glukhov, E.; Wodtke, A.; de Felicio, R.; Fenner, A.; Wong W.R.; Linington R.G.; Zhang L.; Debonsi H.M.; Gerwick W.H.; Dorrestein P.C. Molecular networking as a dereplication strategy. J. Nat. Prod. 2013, 76, 1686–1699. 81. Trisuwan, K.; Rukachaisirikul, V.; Borwornwiriyapan, K.; Phongpaichit, S.; Sakayaroj, J. Pyrone derivatives from the soil fungus Fusarium solani PSU-RSPG37. Phytochem. Lett. 2013, 6, 495–497. 82. Liu, D.; Li, X.-M.; Meng, L.; Li, C.-S.; Gao, S.-S.; Shang, Z.; Proksch, P.; Huang, C.-G.; Wang, B.-G. Nigerapyrones A–H, α-pyrone derivatives from the marine mangrove-derived endophytic fungus Aspergillus niger MA-132. J. Nat. 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Chapitre 2. Etude du métabolome

100. Shinbo, Y.; Nakamura, Y.; Altaf-Ul-Amin, M.; Asahi, H.; Kurokawa, K.; Arita, M.; Saito, K.; Ohta, D.; Shi- bata, D.; Kanaya, S. KNApSAcK: a comprehensive species-metabolite relationship database. In Plant metabolomics; Saito, K., Dixon, R.A., Willmitzer, L., Eds.; Biotechnology in agriculture and forestry; Springer: Ber- lin, Heidelberg, 2006; 165–181 ISBN 978-3-540-29782-6.

Chapitre 2. Etude du métabolome

4. Etudes complémentaires sur les composés de la souche MMS417 P. restrictum.

4.1. Déréplication et annotations des molécules présentes dans les extraits

Outre les composés dérépliqués dans l’extrait MES-SSW et décrits dans l’article précédent (voir annexe 2), d’autres pics ont été soumis à un processus d’annotation sur la base de leurs données obtenues en spectrométrie de masse en ionisation positive. Pour cela, un traitement automatisé des données brutes de HPLC-HRMS a été réalisé sous R (XCMS et CAMERA). Le logiciel a ainsi fait ressortir une liste de pics présents dans l’ensemble d’extrait bruts et cor- respondants potentiellement à des molécules, pour lesquelles la présence de plusieurs adduits ([M+H]+, [M+Na]+, [M+K]+, [2M+H]+, [2M+Na]+,…) a permis de déduire l’ion moléculaire [M+H]+ et donc de calculer une ou plusieurs formules brutes probables. Ces dernières ont été recherchées dans la base de données du « Dictionary of Natural Pro- ducts » (DNP, 2014) pour savoir si elles étaient connues ou non et proposer une identification. Cette base de donnée comprenant l’ensemble des molécules isolées à partir d’organismes vivants, un grand nombre de hits sont ressortis, souvent improbables car correspondant à des composés décrits chez des plantes, animaux,…. Ainsi, la recherche a été limitée aux molécules déjà décrites chez les Ascomycètes. A l’issue de ce travail, une hypothèse d’annotation a pu être proposée pour 6 pics dont la liste suit, et dont les structures potentielles sont présentées dans la figure 15:

+ - le pic de tR = 2.13 min et de m/z 147,065 ([M+H] , C6H10O4) pourrait correspondre à l’acide (E)-5-hydroxy-3- méthoxy-2-penténoique (acide arabenoique, verrucolone), un métabolite connu chez les champignons (Isaac et al. 1991; Larsen et al. 1998).

+ - le pic de tR = 5.88 min et de m/z 215,120 ([M+H] , C9H12O4) pourrait correspondre au 8-macommélinol, un composé décrit chez le champignon Macrophoma commelinae (Sakurai et al. 1988).

+ - le pic de tR = 19.62 min et de m/z 147,065 ([M+Na] , C28H44O4) pourrait correspondre au Mer-NF 8054A, un composé décrit chez champignon (Sakai et al. 1994).

+ - le pic de tR = 20.72 min et de m/z 451,322 [M+NH4] , C25H39NO5) pourrait correspondre à l’aspochalasine K, une cytochalasine décrite intialement chez une souche d’Aspergillus flavipes ( Zhou et al. 2004), qui présente

une activité cytotoxique modérée contre des lignée cellules cancéreuses NCI-H460, MCF-7, SF-268 (CI50 = 14.3, 13.1, 19.9 µM, respectivement).

+ - le pic de tR = 22.98 min et de m/z 431,289 ([M+Na] , C24H40O5) pourrait correspondre à la simplicissine, un composé décrit chez Penicillium cf. simplicissimum (Kusano et al. 1997).

+ - le pic de tR = 24.08 min et de m/z 433,298 ([M+H] , C26H40O5) pourrait correspondre au curvicollide B décrit chez Podospora curvicolla NRRL 25778 (Che et al. 2004).

Chapitre 2. Etude du métabolome

Verrucolone 8-macommélinol Mer-NF 8054A

Aspochalasine K Simplicissine Curvicollide B

Figure 19 : Structures des composés potentiellement annotés chez P. restrictum MMS417 (la stéréochimie des composés décrits dans la littérature est présentée bien que la déréplication ne puisse pas donner d’informations à ce niveau).

Chapitre 2. Etude du métabolome

4.2. Focus sur les macrolides à 13 carbones, les méléarorides.

Dans le réseau moléculaire construit à partir de l’extrait MES-SSW, un cluster a attiré notre attention. Il s’agit du cluster 2, reproduit dans la Error! Reference source not found. ci-dessous.

PF 1163B Méléaroride A [M+Na]+ C27H43NO5 C30H47NO4

[M+Na]+

[M+H]+ [M+H]+ [M+Na]+ PF 1163E C32H51NO4 N-déméthylméléarorideA

C29H45NO4

Figure 20 : Cluster 2 du réseau moléculaire de l’extrait brut MES-SSW avec des composés dérépliqués

Dans ce cluster, les nœuds colorés en bleu correspondent aux ions surexprimés dans milieu MES-SSW. La déréplication de ces ions, basée sur l’analyse de leur masse exacte et des fragmentations observées par MS/MS, a permis de poser l’hypothèse qu’ils appartiennent tous à la famille des méléarorides qui comporte à ce jour 8 produits naturels isolés de champignons et 9 analogues synthétiques. Ainsi 4 molécules correspondent à des composés décrits dans la littérature, le méléaroride A, le N-déméthylméléaroride A, le PF1163B, le PF1163E observés sous la forme de molécules protonnées ou d’adduits sodium, alors que 3 autres pourraient être de nouveaux analogues dans cette série rare. Le tableau 3 rapporte les données obtenues par LC-HRMS/MS pour ces différents composés.

Chapitre 2. Etude du métabolome

-déméthyl1163E PF

PF 1163B PF 1163E PF

Annotation

MéléarorideA

-déméthyl1163E PF

-déméthylmélérarorideA

-déméthyldehydromélérarorideA

Isomèredu N

, abondancerelative) ,

m/z

486,38(2,71)

444,37(2,45), 454,33 (2,45)

423,23(5,42), 424,24 (100), 425,24 (5,42)

459,35(0,85), 468,34 (0,85), 469,34 (0,65)

216,10(100), 217,11 (18,18), 262,11 (48,18) 272,12(48,18), 454,28 (100), 455,29 (18,18)

251,21(21,21), 272,12 (75,76), 454,29 (100), 504,34 (21,21)

Ionsfragments ( principauxparobtenus MS/MS

233,12(59,60), 250,1 (76,77), 404,32 (13,13), 432,30 (100), 454,36 (23,23)

(1,49),286,46 (1,49), 287,14 (7,24), 440,27 (22,99), 441,28 (6,90), 490,34 (2,30)

194,11(5,00), 209,08 (6,92), 240,12 (100), 241,12 (5,77), 416,30 (2,50), 434,32 (2,50)

186,95(2,71), 196,09 (2,71), 205,96 (2,71), 264,15 (100), 265,16 (2,71), 446,32 (29,17),

248,12(2,45), 250,14 (100), 404,28 (79,25), 405,28 (2,45), 416,27 (2,45), 426,33 (30,19,

372,29(1,50), 418,29 (24,50), 419,29 (9,00), 440,35 (1,30), 441,36 (0,85), 458,36 (3,15), 220,11(5,42), 227,10 (5,42), 261,18 (7,08), 272,12 (41,25), 295,16 (5,42), 317,18 (8,33),

218,06(7,22), 223,12 (7,22), 240,13 (100), 241,13 (12,78), 286,14 (61,11), 468,31 (23,33)

128,64(2,45), 165,05 (2,45), 182,08 (11,89), 204,14 (16,60), 205,20 (2,45), 233,11 (58,49),

(0,65),264,15 (100), 264,30 (4,30), 264,38 (1,65), 264,47 (3,55), 24,3 (1,35), 265,16 (13,00),

181,08(1,49), 218,15 (1,49), 240,13 (100), 21,13 (9,54), 263,20 (5,40), 286,14 (89,66), 286,28

165,06(1,30), 166,06 (0,65), 196,09 (6,00), 218,15 (4,30), 219,16 (0,65), 233,11 (1,15), 254,24

4 4 4 5 5 4 4 4 4 4 4

NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO

47 47 45 43 43 51 51 49 49 49 43

H H H H H H H H H H H

brute

30 30 29 27 27 32 32 31 31 31 29

Formule

C C C C C C C C C C C

+ + + + +

+ + + +

[M+H] [M+H] [M+H] [M+H]

M+Na]

Adduits Adduits

[[M+H]

[M+Na] [M+Na] [M+Na] [M+Na] [M+Na]

possibles

(min) 18,1 18,1 24,7 24,7

23,25 23,25 21,47 23,13 23,44 23,44 21,05

détecté

486,354 508,335 472,339 462,318 484,296 514,383 536,366 522,355 500,371 522,349 492,308

m/z

Tableau 4 : Déréplication et données des principaux méléarorides détecté dans l’extrait brut par analyse LC- (+)ESIHRMS/MS. En bleu les molécules décrites dans la littérature, en vert les analogues potentiellement nouveaux.

Chapitre 2. Etude du métabolome

Les ions-fils observés par MS/MS ont permis d’établir des hypothèses sur les mécanismes de fragmentation communs à cette famille chimique et de définir des ions diagnostiques caractéristiques des substitutions sur différentes positions. En effet, le noyau macrolide est commun à tous les analogues fongiques décrits, et seuls le noyau aromatique, l’azote de l’amide et la position en alpha de la lactone présentent des variations structurales. Les figures 17 à 20 présentent ainsi les différentes interprétations pour les 4 méléarorides connus et détectés ici.

-18.0098 H2O -68.0637 C5H8

-290.2617 -27.9984 -46.0034 -268.2008 C20H34O CO CH2O2 -222,2000 C16H28O3 C15H26O -222,1165 C15H26O

Figure 21 : Modèle de fragmentation général proposé pour le Méléaroride A sur la base de son spectre HRMS/MS obtenu en mode d’ionisation positive.

-68.0634 -18.0075 C5H8 H2O

-290.2584 C H O -27.9718 20 34 CO

-268.1949 -222,1950 C H O C15H26O -46.0052 -222.1980 16 28 3 CH2O2 C15H26O -239.2251 C15H30O2

Figure 22 : Modèle de fragmentation général proposé pour le N-déméthylméléaroride A sur la base de son spectre HRMS/MS obtenu en mode d’ionisation positive.

Chapitre 2. Etude du métabolome

-46.0211 C2H6O -28.0018 CO

-222.2002 C15H26O

-268.2040 C16H28O3

Figure 23 : Modèle de fragmentation général proposé pour le PF1163B sur la base de son spectre HRMS/MS obtenu en mode d’ionisation positive.

-68.0620 -28.0024 C5H8 CO

-250.2286 C17H30O -318.2891 -296.2329 C22H38O C18H32O3

-250.2271 C17H30O

Figure 24 : Modèle de fragmentation général proposé pour le PF1163E sur la base de son spectre HRMS/MS obtenu en mode d’ionisation positive.

Ainsi il apparaît que :

- les pertes de neutres de 18,007 (H2O), 27,99 (CO) (28 uma) et 46,004 (H2CO2) nous informent de la présence d’un groupement carboxylique, ici la lactone du noyau macrolide.

- la perte de 68,063 est caractéristique d’un groupe prényle sur l’hydroxyle du phénol, alors que la présence d’un éther éthylique sur le noyau aromatique est signée par la perte de 46,021 (C2H6O)

Chapitre 2. Etude du métabolome

- deux fragments caractéristiques sont obtenus par un clivage des liaisons ester et amide (les incluant ou non), après des pertes de neutre de 222,2 et 268,2 pour les analogues comportant une chaîne latérale C5H11, et de 250,2 et

296,2 pour les analogues comportant une chaîne latérale C7H15 (Okabe et al. 2016).

Sur cette base, des propositions de structure ont pu être faites pour les 3 composés non dérépliqués : les figures 21 à 23 présentent l’interprétation putative de leurs fragmentations. Ces trois composés sont proposés comme étant des analogues N-déméthylés, du fait de l’observation (comme pour le N-déméthyl méléaroride A) d’ions fragments inférieurs de 14 uma à ceux observés pour les méléarorides N-méthylés. Il s’agirait de deux isomères de position du N-déméthyl- PF1163E et du N-déméthyldéhydroméléaroride A. Ces propositions seront toutefois à vérifier et confimer, certaines de ces molécules ayant généré peu d’ions fragments.

-18.0134 H2O -68.0672 C5H8

-46.0074 -267.2559 CH O 2 2 -250.2296 C17H32O2 C17H30O

Figure 25 : Modèle de fragmentation général proposé pour le N-déméthylPF1163E à 23.44 min (nouveau produit naturel) sur la base de son spectre HRMS/MS obtenu en mode d’ionisation positive.

-68.0672 C5H8

-250.2296 C17H30O

Figure 26: Modèle de fragmentation général proposé pour l’isomère du N-déméthylPF1163E à 23.13 min (nouveau produit naturel) sur la base de son spectre HRMS/MS obtenu en mode d’ionisation positive.

Chapitre 2. Etude du métabolome

-68.0689 C5H8

-220.1860 C15H24O

Figure 27: Modèle de fragmentation général proposé pour le N-déméthydehydroméléaroride A (nouveau produit naturel) sur la base de son spectre HRMS/MS obtenu en mode d’ionisation positive.

Chapitre 2. Etude du métabolome

4.3. Isolement des métabolites bioactifs de la souche MMS417 P. restrictum.

Nous avons vu précédemment qu’aucune des pyran-2-ones isolées ne présentait d’activité cytotoxique, alors qu’elles sont les principales molécules surexprimées dans l’extrait brut MES-SSW et que lors de l’étude préliminaire à ces travaux de thèse cet extrait était le plus antiprolifératif sur la lignée KB avec une CI50 de 5 µg/mL (Geiger et al. 2013). Nous nous sommes alors attachés à isoler les composés cytotoxiques par un processus classique de bioguidage. Pour cela, l’extrait brut (CH2Cl2/EtOAc (50/50, v/v), 11,65 g) obtenu à partir d’une culture à grande échelle sur 54 Erlen- meyers incubés pendant 14 jours a d’abord été soumis à une première étape fractionnement par CLV sur silice, par

élution successive par des mélanges Hexane/EtOAc puis CH2Cl2/MeOH de polarité croissance. Les fractions ont été analysées par chromatographie sur couche mince (CCM) afin d’évaluer la séparation des composés, puis regroupées en fonction de leur profil. La figure 25 présente les poids des onze fractions F1 à F11 obtenues, leur profil CCM ainsi que leur CI50 sur lignée KB.

Extrait brut/MES-SSW 11,65g

CLV, silice, Hexan/EtOAc de100:0 à 30:70 et CH2Cl2 /MeOH de 100:0 à 0:100

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 15.9mg 3.2mg 5214.5mg 2223.1mg 388.1mg 253.8mg 53.3mg 943.4mg 230.5mg 124.8mg 27.4mg

Activité sur nom de cellules KB (CI50 fraction µg/ml)

F5 2.04 F6 0.03 F7 2.23 F8 Non F9 11.31 F10 31.34 F11 1.52

Figure 28: Bilan du fractionnement de l’extrait brut MES-SSW et CCM des fractions de l’extrait brut MES- SSW obtenues par CLV (silice, éluant = CH2Cl2/MeOH 90/10 (V/V) puis Hexane/AcOEt 60/40 (v/v), révélateur – vanilline sulfurique).

On observe que la séparation a été efficace et que les composés sont répartis des plus apolaires dans les fractions F1 à F5 aux plus polaires dans les fractions F10 et F11. L’analyse qui a été faite par CCM et GC/MS des fractions F1 à F4 a montré qu’elles étaient principalement constituées de lipides (voir chapitre 4) et représentaient à elles quatre 7,46 g soit 84% de l’extrait brut initial. Elles n’ont pas été testées du fait de problèmes de solubilité dans le milieu de cultures cellulaires.

Chapitre 2. Etude du métabolome

Les fractions F5, F6 et F7 ont montré une forte cytotoxicité avec des CI50 respectives de 2,04, 0,03 et 2,23 µg/mL. Ain- si, l’absence d’activité de l’extrait brut est due à son masquage par la très forte proportion de lipides. On voit donc que les composés cytotoxiques sont principalement concentrés dans la fraction F6. Cependant, cette fraction n’a pas pu être choisie pour la suite de ce travail de bioguidage : en effet, les fractions F6 et F8 n’étaient plus disponibles car ayant déjà fait l’objet de fractionnements pour l’obtention des pyran-2-ones.

C’est la fraction F5 qui a donc fait l’objet de fractionnements supplémentaires pour en isoler les composés d’intérêt. Elle a été soumise à une chromatographie Flash sur colonne de silice pour obtenir 13 sous-fractions nommées F5-1 à F5-13 qui ont ensuite été testées sur la ligné cellulaire KB (Figure 29). Aucune de ces sous-fractions n’a présenté d’activité supérieure à la fraction F5 initiale, les F5-6 et F5-9 étant les plus actives avec des CI50 respectives de 16,8 et 19,6 µg/mL. Ce résultat inattendu pouvait être expliqué de plusieurs façons :

- les composés bioactifs ont été dégradés lors de la chromatographie Flash du fait du caractère acide et oxydant de la silice non-greffée.

- la fraction F5 contiendrait une combinaison synergique ou additionnelle de composés bioactifs, l’activité cytotoxique observée étant la résultante des effets des composés bioactifs.

Extrait brut/MES 11,65g

CLV, silice, Hexane/EtOAc de 100:0 à 30:70 et de CH2Cl2 /MeOH 100:0 à 0:100

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 15.9mg 3.2mg 5214.5mg 2223.1mg 400.1mg 253.8mg 53.3mg 943.4mg 230.5mg 124.8mg 27.4mg

Chromatographie flash, silice, Hexane/Acétone de 100:0 à 0:100

5-1 5-2 5-3 5-4 5-5 5-6 5-7 5-8 5-9 5-10 5-11 5-12 5-13 1.5mg 2.3mg 1.8mg 16mg 24.1mg 96.5mg 10.5mg 7.9mg 42.9mg 43.2mg 82.2mg 13.9mg 59.6mg

Activité sur nom de cellules KB

fraction (CI50 µg/ml) F5-1 26.4 F5-2 Inactif F5-3 30.2 F5-4 Inactif F5-5 46.8 F5-6 16.8 F5-7 25.7 F5-8 24.4 F5-9 19.6 F5-10 23.5 F5-11 36.8 F5-12 Inactif F5-13 Inactif

Figure 29 : Schéma de purification de fractions F-5-1 à F5-13 à partir de fraction F5 et CCM de fractions F5 (Silice, éluant CH2Cl2/MeOH : 9/1 (v/v), révélateur : vanilline sulfurique)

Afin d’évaluer ces hypothèses, la fraction F5 a été comparée à sa reconstitution à l’aide de ses sous-fractions : une fraction nommé F5R a ainsi été obtenue par mélange proportionnel des sous-fractions F5-1 à F5-13.

Chapitre 2. Etude du métabolome

La fraction F5R a été testée sur la lignée KB afin de déterminer si l’activité biologique était restaurée : une CI50 de 31.58 µg/mL a été déterminée, montrant que les produits bioactifs initialement présents se sont dégradés et que l’hypothèse de synergie ne peut pas être retenue.

Les deux fractions F5 et F5R ont ensuite été analysées par CCM et CCM bi-dimensionnelle, cette dernière permettant de visualiser l’apparition de produits de dégradation dues au contact avec la phase de silice (Figure 30).

Figure 30 : CCM et CCM dimension des fractions de fractions F5 et F5R (Silice, éluant CH2Cl2/MeOH : 9/1 (v/v), révélateur : vanilline sulfurique)

La figure 26 montre que les profils des fractions F5 et F5R sont proches voire identiques en CCM simple, et que l’ensemble des composés révélés par la vanille sulfurique ou absorbant en UV à 254 nm proches voire identiques et 365 nm sont répartis sur la diagonale de la CCM bidimensionnelle. Cela signifie donc que l’on n’observe pas parmi les composés observés d’apparition de produits de dégradation dus au contact avec la silice et donc que les composés bioactifs, certainement dégradés dans F5R, sont minoritaires et non révélés sur les profils CCM.

Les deux fractions ont alors été analysées par CLHP-HRMS (Figures 30, 31)

TLV5 TLV6

F5R TLV6 TLV5

Figure 31 : Chromatogrammes de masse (ESI +, base peak) des fractions F5 et F5R

Une première observation des chromatogrammes obtenus en ionisation positive (figure 31) montre la présence majori- taire des produits TLV5 (m/z 213,113, tR= 8,23 min) et TLV6 (m/z 197,118, tR= 11,66 min). Peu de différences sont

Chapitre 2. Etude du métabolome

visibles, hormis l’apparition d’un pic de faible intensité de m/z 376,259 à tR = 12,57 min et de formule brute probable

C21H33N3O3. Ceci confirme néanmoins que les composés de type pyran-2-one ne sont pas responsables de l’activité cytotoxique initialement observée.

F5R

Figure 32 : Chromatogrammes de masse (ESI -, base peak) des fractions F5 et F5R

En ionisation négative, les deux chromatogrammes de masse des fractions F5 et F5R sont également peu différents. On note toutefois la présence dans F5R d’un pic de m/z 339,2323 à tR= 20,75 min d’intensité relative beaucoup plus importante que dans la fraction d’origine.

Ainsi, les produits bioactifs dans la fraction F5 et absents (ou moins concentrés) dans la fraction F5R sont des produits invisibles à l’œil nu sur les chromatogrammes. Pour tenter de les identifier, les données brutes obtenues par CLHP- HRMS (modes positif et négatif) ont été converties dans le format .CDF puis traitées à l’aide du logiciel MZmine 2 afin d’obtenir les listes des pics présents dans ces deux fractions.

Chapitre 2. Etude du métabolome

Figure 33 : résultat de la comparaison des chromatogrammes des fractions F5 et F5R, liste des pics observés dans la fraction F5 (points verts) mais absents de la fraction F5R (points rouges).

La figure 29 présente la liste de 28 pics observés dans la fraction F5 (points verts) mais absents dans la fraction F5R (points rouges). Il est à noter qu’aucun de ces pics ne correspond à un des méléarorides dérépliqués précédemment, excluant de fait qu’ils supportent l’activité. On observe que ces 28 ions discriminants sont extrêmement minoritaires (hauteur moyenne de pic d’environ 3.33 % comparé au pic du composé TLV5 d’abondance 1.2E7), à l’exception du + produit de m/z 251.1763 [M+H] observé à tR = 9.38 min, correspondant à une formule brute la plus probable de

C14H22N2O2 (Δ ppm = -3.49). Il pourrait s’agir d’un des composés responsables de l’activité biologique de la fraction F5. Une recherche dans les bases de données de composés fongiques n’a identifié aucun composé pouvant correspondre à cette formule brute. Il serait donc particulièrement intéressant de poursuivre cette étude pour isoler ce composé, même si sa très faible abondance présente des risques d’échec.

Chapitre 2. Etude du métabolome

5. Conclusion et perspectives

Cette étude était motivée par le fait que la souche MMS417 P. restrictum appartient à une espèce peu étudiée du point de vue chimique et écologique, et qu’un premier criblage biologique avait montré une activité cytotoxique pour un de ses extraits de cultures. Les travaux présentés ici ont été multiples avec pour objectif la description du métabolome de la souche, l’étude des variations de production de métabolites selon les conditions culturales, l’isolement de métabolites ciblés et leur évaluation biologique. Ils ont nécessité l’emploi de méthodes et techniques complémentaires, des do- maines de la mycologie (OSMAC, observations morphologiques), de la chimie analytique (profilage chimique par LC- HRMS/MS, déréplication, analyses statistiques et comparatives, réseaux moléculaires) et de la chimie des produits naturels (extractions, purifications et analyse structurale). Pour cela, la souche MMS 417 a été cultivée sur sept milieux de culture différents, dont un milieu « écologique » à base de lyophilisat de l’hôte d’origine de la souche, dans deux conditions osmotiques dépendant de la salinité. Les résultats ont montré que la composition des milieux de culture avait une influence sur le phénotype de la souche, le rendement d’extraction et la production de métabolites spécialisés. L’analyse métabolomique des données de profilage chimique a mis en évidence l’influence du milieu de culture sur l’expression du métabolome de la souche. En particulier, l’extrait brut MES-SSW a attiré notre attention parce qu’il présentait un profil nettement distinct des autres extraits : les analyses statistiques par ACP et OPLS-DA ont montré que la souche MMS417 cultivée sur milieu à base de moules y exprime spécifiquement la voie biosynthèse aboutissant à des composés de noyau pyran-2-one. La réalisation d’un réseau moléculaire a mis en évidence une chimiodiversité importante dans cette famille, mais toutefois sans pouvoir annoter les composés détectés avec certitude du fait du grand nombre de stéréoisomères possibles pour certains d’entre eux. Ceci représente une des limites majeures de cette métho- dologie pourtant performante en analyses déréplicatives, et a nécessité l’isolement des composés d’intérêt afin d’en définir la nature exacte. Les travaux de purification sur un extrait MES-SSW obtenu après cultures à grande échelle ont conduit à isoler 12 composés de type pyran-2-ones, dont 7 se sont révélés originaux après détermination de leurs configurations relative et absolue par RMN bi-dimensionnelle, dichroïsme circulaire et analyse conformationnelle DP4. Il est particulièrement intéressant de noter que tous les composés de noyau dihydro-pyran-2-one appartiennent à la série 6S, y compris la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one (1) alors que seul son épimère 6R était décrit comme un produit naturel. Ces résultats montrent donc que la présence de l’hôte dans le milieu de culture a entraîné l’activation de l’expression de gènes impliqués dans une voie de biosynthèse extrêmement spécifique.

Malgré les travaux engagés et les composés isolés, il n’a pas été possible d’identifier les substances cytotoxiques pré- sentes dans l’extrait brut initial. Celles-ci semblent très minoritaires, ce qui laisse présumer d’une activité très importante, mais également très sensibles à la dégradation lors des processus de purification.

Les pyran-2-ones se sont révélées inactives sur les tests de cytotoxicité, antibactériens et antiparasitaires réali- sés. Bien qu’elles soient réputées comme étant des molécules généralement peu actives, du moins pour les composés monocycliques et peu substitués, certaines ont montré des activités biologiques. Leurs activités antimicrobiennes sont présentées de façon résumée dans le tableau présenté en Annexe 1 (Volume II du manuscrit). Ainsi, quelques études ont relaté une activité antibactérienne pour des pyran-2-ones (Dickinson 1993; Fairlamb et al. 2004). Par exemple, les in- fectopyrones A et B ont été isolées à partir d’une souche champignon marin Stemphylium sp. 33231 ( Zhou et al. 2014). L’infectopyrone A a présenté une activité antibactérienne modérée contre Bacillus subtilis (ATCC 6633), Micrococcus luteus (ATCC 9341) avec valeurs de MIC de 10.0 µg/mL pour chacun, et l’infectopyrone B a aussi présenté une activité

Chapitre 2. Etude du métabolome significative contre Staphyloccocus albus (ATCC 8799) et Escherichia coli (ATCC 25922) avec valeurs de MIC de 0.5 mg/mL et 2.5 mg /mL, respectivement. La solanapyrone A isolée d’une souche fongique endophyte d’Alternaria tenuissima SP-07 a présenté une activité antibactérienne contre Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, et Micrococcus tetra- genus avec valeurs de MIC de 12.5, 50, et 6.25 µg/mL (Wang et al. 2014). D’autres études ont évalué des pyran-2-ones contre des maladies parasitaires telles que la leishmaniose et la maladie de Chagas. Deux pyran-2-ones isolées de Podo- lepsis hieracioides (Asteraceae), ont présenté une activité anti-leishmanienne dans la gamme micromolaire, tandis que l’acide kojique isolé de souches de divers Aspergillus a présenté une efficacité antileishmanienne in vitro et in vivo (Kayser et al. 2003; Rodrigues et al. 2014). Une styrylpyrone, la 11-méthoxyyangonine, a présenté une activité contre

Trypanosoma brucei rhdesiense (CI50 = 31 nM) et Plasmodium falciparum (CI50 = 3.0 mM), tandis que deux pyran-2- ones marines, les pseudopyronines A et B, ont été trouvées être des inhibiteurs de croissance de Trypanosoma brucei rodesiense (CI50 13.09 et 12.46 µg/mL, respectivement), Leishmania donovani (CI50 2.63 et 1.38 µg/mL, respectivement) et Plasmodium falciparum (CI50 14.89 et 14.2 µg/mL, respectivement). Cinq 5,6-dihydro-2-pyran-2-ones, les cryptorigidifoliols A-E, isolés à partir de Cryptocarya rigidifolia ont présenté une activité modérée contre Plasmodium falciparum Dd2 (CI50 9.2 ± 0.9, 5.8 ± 1.8, 5.5 ± 0.7, 7.4 ± 0.6, 9.0 ± 3.0 µM, respectivement) (Liu et al. 2015). Récem- ment, un groupe a synthétisé 27 analogues de 4-hydroxy-6-méthyl-2-pyran-2-ones 3-substitués et évalué leur efficacité antiparasitaire contre Leishmania (L.) infantum et Trypanosoma cruzi. Les résultats ont montré que plusieurs analogues ont une efficacité in vitro contre L. infantum et T. cruzi, dont un a montré une efficacité modérée mais non-toxique in vivo contre T. cruzi (Tempone et al. 2017).

Malgré cette faible activité antimicrobienne générale, on peut se poser la question du rôle de ces molécules produites en quantités majoritaires par diverses espèces fongiques, et même surexprimées dans le milieu MES par notre souche de P. ubiquetum, Une hypothèse qui peut être émise est un rôle de communication et de régulation des populations microbiennes environnantes, voire au sein de l’holobionte représenté par le bivalve hôte. Ainsi, une certaine ana- logie structurale peut être établie entre les pyran-2-ones isolées et certaines molécules impiquées dans le Quorum Sen- sing (QS), telles que les homosérines lactones (HSL) qui comportent elles aussi une partie lactonique reliée à chaîne alkyle plus ou moins et longue plus ou moins ramifiée et fonctionnalisée. Des études ont rapporté des activités dans ce sens pour certaines pyrones. Ainsi, Fu et al a décrit que trois pyran-2-ones, les nocapyran-2-ones H, I et M isolées à partir d’une souche d’actinomycète marin Nocardiopsis dassonvillei subsp. Dassonvillei XG-8-1 présentaient des activi- tés inhibitrices sur l’expression des gènes contrôles QSIS-lasI du QS dans C. violaceum CV026 et P.aeruginosa à une concentration de 100 µg/mL (Fu et al. 2013). Ceci a constitué le premier rapport de pyran-2-ones inhibant l’expression de gènes de régulation du QS dans des bactéries pathogènes. Récemment, quatre pyran-2-ones et huit analogues ont été identifiés dans Streptomyces sp. OUCMDZ-3436 isolé de l’algue verte Enteromorpha prolifera. Les résultats des essais biologiques ont suggéré que ces pyran-2-ones ne présentent aucune activité inhibitrice QS. Cependant, le squelette pyran-2-one peut être facilement transformé en pyridine-2(1H)-one, moyau présent dans de nombreux composés inhibiteurs de l’expression du gène QSIS-lasI chez P. aeruginosa (Du et al. 2018). Afin d’obtenir de plus puissants inhibiteurs du QS (QSI) Park et al. ont designé et synthétisé plusieurs nouveaux QSIs dérivés de 2-pyran-2-ones capables d’inhiber la liaison de l’acide N-(3-oxododécanoyl)-L-homosérine lactone (OdDHL) à la protéine LasR de P. aeruginosa, un des principaux récepteurs du QS chez cette bactérie modèle. Les résultats ont montré que les analogues de pyran- 2-ones avec des chaines alkyles de plus de 9 carbones inhibent significativement la formation de biofilm (Park et al. 2015). En particulier, Brachmann et al ont montré que dans une bactérie pathogènes des insectes, Photorhabdus lumi-

Chapitre 2. Etude du métabolome nescens, le récepteur de type LuxR orphelin PluR détecte de manière endogène des composés à noyau pyran-2-one qui servent de molécules de signalisation à des concentrations nanomolaires (Brachmann et al. 2013).

Au cours de cette thèse, des essais d’inhibition du Quorum Sensing ont été réalisés de façon préliminaire, mais n’ont pas permis d’aboutir à des résultats concluants :

- un essai in vitro d’inhibition du Quorum Sensing par détection de la production de protéase chez P. aeruginosa (collaboration Pr Nathalie Caroff). Si l’acide 5-acétoxy-3-méthoxypent-2-ènoïque (TLV-3) et la 6S,1’S- pestalotine (10) ont pu montrer lors d’un test une très faible activité, les essais se sont néanmoins révélés peu reproductibles et devront être poursuivis sur d’autres modèles plus fiables ;

- un essai de criblage virtuel par docking moléculaire des pyran-2-ones 2, 10 et TLV-3 sur la protéine LasR- LBD de P. aeruginosa liée à son ligand la 3-oxo-C12-HSL (code PDB 2UV0, Bottomley et al. 2007) a été réalisé par le Dr Cédric Logé (laboratoire IIcimed, Université de Nantes). Il est apparu que le méthoxyle de nos composés, trop volumineux, empêche l’ancrage dans le tunnel de la poche de reconnaissance des HSL de la protéine. D’autres essais pourront être réalisés sur d’autres modèles de protéines impliqués dans le Quorum Sensing, soit d’autres systèmes LasI-LasR chez d’autres types bactériens, soit sur les 3 autres grands systèmes de signalisation RhlI-RhlR, PQS-MvfR et IQS (Lee et al. 2013).

Ces essais ont été faits sur des modèles de QS bactériens, et il serait également intéressant d’envisager un rôle pour les pyran-2-ones dans la régulation des populations fongiques. Cependant, à notre connaissance il n’existe pas de système QS décrit en détail chez les champignons filamenteux, ni de modèle in vitro qui permette de tester cette hypothèse.

A côté des pyran-2-ones, les analyses déréplicatives et le réseau moléculaire construit ont mis en évidence deux familles importantes de métabolites produits par la souche investiguée.

La première (cluster 1) est constituée de dérivés de type stéroliques, dont certains voient leur production augmenter sur milieu MES-SSW. La comparaison des données structurales obtenues ont permis de proposer les annotations pour

- des isomères de l’ergosta-2,5,7,9(11),14,22-hexaene, un stérol précédemment isolé à partir du champignon Suillus luteus (Nieto and Ávila C 2008).

- quatre isomères de l’ergosta-4,6,15,22-tétraen-3-one, un stérol également présent chez certaines fongiques (Ngoc Quang and Dinh Bach 2008; Nieto and Ávila C 2008).

- deux isomères de la 3β-Hydroxyergosta-8,14,24(28)-trien-7-one, un stérol décrit chez des Penicillium marins (Li et al. 2019).

- un métabolite pouvant correspondre à l’ergosta-3,5,7,9(11),22-pentanène, un stérol trouvé également chez Suillus luteus (Nieto and Ávila C 2008).

- un métabolite dont la formule brute la plus probable est identique à celle de l’ergosta-4,6,8(14),22-tétraen-3-ol, un stérol trouvé chez Marasmius oreades (Pang and Sterner 1993).

Chapitre 2. Etude du métabolome

Cette importante diversité de stérols mériterait d’être investiguée plus en profondeur, certains stérols fongiques ayant montré des activités biologiques intéressantes (Ory et al. 2019).

La seconde famille (cluster 2) correspond aux méléarorides, macrolides lactames à 13 atomes de carbone dont huit membres naturels ont été rapportés, tous isolés à partir de souches Penicillium sp. (Gao et al. 2017; Nose et al. 2000; Okabe et al. 2016; Sasaki et al. 2000). Du fait de leur originalité structurale et de leur appartenance à une classe chimique porteuse de nombreuses activités thérapeutiques, d’autres dérivés synthétiques ont été obtenus. Cependant, très peu de résultats d’évaluations biologiques ont été publiés pour les méléarorides. Les PF 1163A et PF 1163B présentent une activité antifongique contre Candida albicans avec des valeurs de la CMI de 8 et 32 µg/mL respectivement, par inhibition de la biosynthèse de l’ergostérol. L’étude menée par Okabe et al. a montré que les composés PF1163A, PF1163B, PF1163D, PF1163H, PF1163F et les mélérarorides A et B présentent un effet synergique avec le fluconazole contre des souches de C. albicans résistantes aux azolés (Okabe et al. 2016). Du point de vue de leur toxicité, les PF1163A et B ne présentent pas de cytotoxicité vis-à-vis des cellules HepG2, mais le N-déméthylméléaroride A pos- sède une activité antiproliférative modérée sur ce modèle cellulaire avec une CI50 de 36.6 ± 4.0 µmol/L. Dans la littéra- ture, un seul autre macrolide à 13 carbones a été rapporté : il s’agit de la spongidepsine, métabolite isolé de l’éponge Spongia sp. collectée aux Vanuatu (Grassia et al. 2001), qui diffère des méléarorides par la présence d’un alcyne terminal et de l’absence de substitution sur le phényle. Ce métabolite est présenté comme cytotoxique avec une activité anti- proliférative contre les lignées cancéreuses J774.A1, WEHI-164 et HEK-293 avec des valeurs CI50 de 0.5, 0.66, 0.42 µM (Grassia et al. 2001). Cette observation est surprenante : comment des métabolites extrêmement peu distribués dans la nature et présentant un squelette totalement atypique peuvent-ils être biosynthétisés par deux taxons aussi éloignés, et retrouvés chez des individus également très éloignés géographiquement ? L’hypothèse d’une origine fongique pour la spongidepsine peut être évoquée pour répondre à cette question, sujet qu’il serait particulièrement intéressant d’investiguer.

Pour finir, il est à noter qu’à l’issue du processus de déréplication, aucun des composés décrits chez P. restrictum, hormis certaines des pyran-2-ones, des stérols et des méléarorides, n’a été détecté dans nos extraits de cultures. Cela pourrait s’expliquer par une spécificité du métabolisme de cette souche marine, adapté à ces conditions environnementales. Ceci souligne l’intérêt du ré-examen chimique d’isolats marins d’espèces décrites originellement comme terrestres.

Chapitre 3. Etude cinétique

Chapitre 3. Etude l’évolution de la chimiodiversité de la souche MMS417 au cours du temps, sur milieu MES-SSW – cas de la voie de biosynthèse des pyran-2-ones

1. Introduction générale

En général, la nature est connue pour évoluer au fil du temps. L’étude d’une série temporelle permet un suivi des processus dans le temps et permet d’avoir une vision plus complète des mécanismes mise en jeu. Dans l’histoire, les études temporelles ont été utilisées pour étudier l’impact de modification nutritionnelles, d’un stress thermique, abiotique ou biotique, ou à des réactions médicamenteuses (Rusilowicz et al. 2018). Cependant, il y a très peu d’étude sur l’impact du temps sur le métabolisme des champignons, car la chimiodoversité fongique est souvent étudié à un temps de culture particulier souvent plutôt long. La plupart des micro-organismes adaptent leur métabolisme aux différentes fluctuations environnementales du rythme diurne (Bell-Pedersen et al. 1996; Curtis 1967; Staley et al. 2017). De plus, les processus de biosynthèse chez le micro-organisme sont une succession de réactions catalysées par des enzymes devant elle-même être synthétisées, modifiées puis dégradées si besoins.

Le champignon produit des métabolites spécialisés variés et en particulier lors de sa croissance (Roullier et al. 2016). Les profils métaboliques de ces champignons vont donc évoluer au cours du temps de croissance. Par conséquence, de nombreux métabolites ont une demi-vie finie, et leur production et leur présence varieront naturellement de manière dynamique dans le temps. Par exemple Choi et al. ont montré des différences dans la composition des métabolites de Cordyceps militaris cultivé dans le soja germé au fil du temps, ce qui avait permis l’identification de nouveaux compo- sés (Choi et al. 2010). Bertrand et al. ont montré la complexité et la nature dynamique du métabolisme fongique. Il a détecté des produits qui ont disparu aux quatrième jour et septième jour et sont présentés au neuvième jour dans l’extrait de co-culture mais ces produits ont détecté aux quatrième jour et septième jour dans les cultures pures (Bertrand, Azzol- lini et al. 2014). Récemment, Roullier et al. ont aussi rapporté que le paramètre « temps » est un facteur important de variation du métabolome des souches de Penicillium marins grâce à une étude métabolomique non ciblée à l’échelle temporelle de 18 jours. Cette étude a montré les différences en termes de métabolites intermédiaires et finaux, ainsi que de leur production au cours du temps de croissance (Roullier et al. 2016).

En conséquence, des études en temps fixé du métabolome de champignons sont particulièrement susceptibles de ne pas mettre en évidence de nombreux composés originaux. Une procédure de criblage optimale pour accéder à une chimio- diversité de métabolites spécialisés de champignons serait d’effectuer une série d’extractions sur une même culture fongiques à des temps différents couvrant les différentes phases de croissance. Étude l’impact du temps de culture est une nouvelle approche pour accéder à une chimio-diversité de métabolites spécialisés de champignons.

Chapitre 3. Etude cinétique

2. Étude cinétique de la diversité chimique des pyran-2-ones par la souche MMS417 sur milieu MES-SSW

Mes travaux précédents montrent que la souche P. restrictum cultivé sur milieu d’origine de l’hôte peut produire des métabolites spécifiques tels que les pyran-2-ones. Afin d’observer la diversité chimiques des pyran-2-ones dans cette souche, une étude métabolome temporelles a été réalisée. Cette souche a cultivé sur milieu MES-SSW (Mussel Extract Sucrose avec de l’eau de mer) pendant 11 jours. Les extraits bruts obtenus chaque jour ont été analysés par HPLC- HRMS/MS. Les données brutes ont été analysées par l’approche métabolomique non ciblée pour mettre en évidence les différences en termes de métabolites intermédiaires et finaux, ainsi que leur comportement de production dans le temps, focalisé sur la voie biosynthétique des pyran-2-ones. Dans ces travaux, la construction d’un réseau moléculaire « dynamique » a permis de mettre en évidence l’évolution des clusters des pyran-2-ones, et donc la cinétique d’expression de cette voie de biosynthèse.

Tous ces résultats seront présentés dans un article (2) intitulé: « Toward diversified chemical diversity in Shellfish- sourced Penicillium restrictum – impact of time in pyran-2-ones diversity and production ».

Chapitre 3. Etude cinétique

Aticle 2: Toward diversified chemical diversity in Shellfish- sourced Penicillium restrictum – impact of time in pyran-2- ones diversity and production

Van-Tuyen LE 1, Samuel Bertrand 1 and Olivier Grovel 1,*

1 Univerisité de Nantes, 44035 Nantes, France; [email protected]; [email protected]; Oli- [email protected] * Correspondence: [email protected]; Tel.: +33 253484192 (334192)

Received: date; Accepted: date; Published: date

Abstract: This work aimed at studying metabolome variations of marine fungal strains along their growth to highlight the importance of the parameter “time” for the discovery of new natural products. An untargeted time-scale metabolomic study has been performed on the shellfish-derived Penicillium restrictum MMS417 strain. They were cultivated for 11 days and their crude extracts were analysed by HPLC-DAD- HRMS/MS (High-Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detector-High Resolution Mass Spec- trometry tandem Mass Spectrometry) each day. Statistical analysis of the profiles shows the dynamic of specialised metabolism showing compound produced at a very early, intermediate or late stage of growth. One compound appearing at the very late stage was successfully isolated and characterised. It corresponded to an unreported artefact of pyran-2-one biosynthesis, (2E)-5-acetoxy-3-methoxy-2-pentenoic acid (1). Pyran-2-one biosynthesis dynamic was further explored using a dynamic molecular network approach, which highlighted the great diversity of pyran-2-one produced Penicillium restrictum MMS417. Such diversity can be observed only at specific time point.

Keywords: dynamic molecular network, pyra-2-ones, time-scale metabolomics, marine fungi, Penicillium restrictum.

1. Introduction

Microorganisms represents a major sources of specialized metabolites with a vast chemical diversity [1]. Nowadays, they are taking a great place in drug discovery programs because of their ease for biomass production and resourcing by fermentation. Unfortunately, even from those sources, continuous rediscovery of known chemical entities is still one major bottleneck of natural products (NPs) discovery programs [2]. Such difficulties do discover new chemical structures remain in contradiction the high structural diversity revealed by genome sequencing of microorganisms [3]. In fungi – like other microorganisms – investigation of new natural product relies on the development of strategies to awake silent biosynthetic gene clusters. For this purpose, various strategies were developed, such as: the “One Strain Many Compounds” (OSMAC) strategy consisting of altering culture condition [4], the addition of epigenetic modifier in the culture medium [5] and the use of microbial interaction [6]. Among all strategies, the variation of compound production through time is still largely under explored, even though some studies have already proved the production of compound a specific moment during fungal growth [7–9]. Obtaining extensive view of metabolic alteration relies on accurate analytical methods. In this context metabolomics, which aim at quantifying in a holistic way the complete set of metabolites within a given biological system, provides a strategy of choice to evaluate NP induction strategies [10,11]. Such strategy was successfully applied to provides insight in induction strategies such as OSMAC [12] addition of epigenetic modifier [13] and microbial co-cultivation [14]. Thus, it remain obvious that metabolomics is also a method of choice to explore metabolic variation in fungi according to growth duration [7]. This study aims at exploring the metabolic evolution of a marine-derived strain of the Penicillium restrictum MMS417 strain isolated from mussels in a shellfish farming area in the west cost of France [15]. This

Chapitre 3. Etude cinétique strain was already reported to produce a large variety of original pyran-2-ones (Le, et al. 2020). This study was performed using an environmentally relevant culture medium [16–18], here this corresponds to mussel- derived culture medium [19]. Extractions were performed every day, during a 11 days, to explore metabolic variation by a metabolomic approach using high-performance liquid chromatography coupled to a diode array detector and a high-resolution mass spectrometer tandem mass spectrometry (HPLC-DAD-HRMS/MS) profiling. The untargeted metabolomic approaches highlighted differences during fungal growth. One new compound having a particular time pattern was successfully isolated and characterised and provided insight into the biosynthetic pathway of pyran-2-one. This latter pathway was further explored using dynamic molecular network. 2. Results and Discussion

During the 11 days of growth of P. restrictum MMS417 using mussel derived agar culture medium, obvious morphological changes occur (Figure 34 top). The mycelium spreads in all directions from the seeding point, and forms typical circular colonies, which diameter can be followed through time to assess the fungal growth (Figure 34 bottom). The first two days corresponded to germination. From the third day, colonies began to expand exponentially (Phase I), with the central part forming white-green spores and the around part forming dark-green spores [7]. Around day 11, the mycelium covered the whole plate with colonies attaining confluence and the growth curve reaching a plateau (Phase II).

Germ Phase I

) 25 2

0 Average colonies area (in cm (in area colonies Average 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Time (in days)

Figure 34: Morphological aspect (top) of Penicillium restrictum MMS417 cultures from day 1 to day 11 with its associated fungal growth curve (bottom).

2.1. Time dependence of metabolic profiles.

An extraction of the fungal material along with culture medium was achieved at each time points. They were then profiled by HPLC-DAD-HRMS/MS to assess chemical diversity. Metabolite production profiles were then analysed over time to highlight variations during the fungal growth using a metabolomic ap-

Chapitre 3. Etude cinétique

proach [7]. All the features detected by LC-MS (m/z at tR associated with its peak area) were automatically retrieved from raw data using dedicated peak detection software [20]. This yields a data matrix for in depth analysis. The data matrix was then explored by principal component (PCA) analyses – an unsupervised multivariate approach – to highlight self-structure of the data. The first two axes represent 25% of the total explained variance. The PCA loading plot (Figure 35A) clearly showed the time drift (semicircle shape) from day 1 (bottom left) to day 11 (bottom right). This indicated the ordinal structural characteristics in the data, as typically reported for the kinetic studies [7,21] which highlight the sequential apparition and disappear- ance of compounds within the extract.

Figure 35: Principal component analysis (Pareto scaling) obtained from LC-(+)ESI-HRMS profiles corresponding to the extracts of Penicillium restrictum MMS417 from day 1 to day 11 (n=9). A) loading plot, B) Scatter plot along with some characteristic fitted trend curves (x-axis representing harvesting days and y-axis representing normalized peak area in the extracts).

Chapitre 3. Etude cinétique

Exploration of the scatter plot (Figure 35B) allows to find features that appears during the germination process, and the different stages of the growth [7]. Various characteristic behaviours were observed as highlighted with some example fitted trend curves in Figure 35B. For example, features [email protected] (this nota- tion corresponds to an ion detected using the PI mode that had an m/z of 354.103 Da at a tR of 0.879 min) corresponds to a compound present during spore germination which then decreased rapidly. Those early appearing compounds are located in the bottom left of the scatter plot (Figure 35B). Another pattern corresponded to the feature [email protected], which possess a maximum content in the middle of the phase I and is not detected at the beginning and the end of the experiment. Those compounds appearing in the middle of the growth are located in the middle top of the PCA scatter plot (Figure 35B). Another pattern exists and corresponds to features accumulating at the end of phase one with a tendency to accumulate, as it is the case for [email protected]. Such features are located in the middle right of the scatter plot (Figure 35B). Finally, the late compounds arising at a very late stage during phase I are located in the bottom right of Figure 35B, one example feature is [email protected]. The features with highly characteristic behaviours are listed in

Chapitre 3. Etude cinétique

Table 4. For all of them, dereplication was attempted based on MS1 data and phylogenetic consistency (restricted to Penicillium genus). These annotations are of level 3 confidence according to the Metabolite Standard Initiative (MSI) [22]. As previously reported in this Penicillium restrictum strain, pyran-2-ones were identified at level 1 consistency (fully characterised in comparison to standards) (Le, et al. 2020). Unfortu- nately, as usual in annotation of specialized metabolites from fungi, most of features were unsuccessfully dereplicated.

Chapitre 3. Etude cinétique

Table 4. Features with highly characteristic behaviours in the PCA (Figure 35B) with their putative annotation based on compounds already reported in Penicillium spp. *: compound were identified by comparison with standards. Molecular ∆pp tR m/z Adduct Putative annotation Already reported in formula m Germination specific features 0.87 527.152

0.88 354.103 0.89 118.086 0.90 257.143 0.91 277.107 Mid-phase-I specific features

5-hydroxy-3-methoxy-2- 1.29 147.064 [M+H]+ C6H10O4 -8 Penicillium verrucosum [23,24] pentenoic acid* 5,6-dihydro-4-methoxy-2H- 1.37 129.055 [M+H]+ C6H8O3 3 Penicillium italicum [25] pyran-2-one* 2.69 253.101 [M+Na]+ C11H18O5 -16 6S, 1’S, 2’R-LL-P880β * Penicillium sp. [26] 2.71 231.119 [M+H]+

6.94 213.111 [M+H]+ C11H16O4 -6 1R-dehydropestalotin* Penicillium sp. [27,28] 13.17 515.256 14.14 320.253 14.62 172.132 14.66 336.246 14.71 318.237 19.72 369.293 19.86 256.26 20.29 265.25 End-phase-I specific features

1.39 325.128 [M+H]+ C16H20O7 -1 11,12-dihydroxycurvularin Penicillium citreoviride [29] 3.28 211.055 12.13 393.255

12.19 391.242 [M+H]+ C23H34O5 -15 penostatin G Penicillium sp. [30] 22.72 375.3 21.92 463.275 19.94 481.287

23.26 377.316 [M+H]+ C28H40 -11 ergostapentaene various fungi [31–34]

23.31 395.325 [M+H]+ C28H42O -15 ergostatetraenol various fungi [34–36] 28.00 571.389 28.00 531.358 28.02 639.488 29.25 615.489

Chapitre 3. Etude cinétique

Interestingly, during the germination phase, only very polar compounds were highlighted. This may indicates that those compounds could be very close in structure to core metabolism (“primary metabolism”) mostly constituted of polar compounds. According to previously published data on the P. restrictum MMS417 strain (Le et al. 2020) various Mid- phase-I specific features corresponds to previously isolated pyran-2-ones, such as [email protected], [email protected], [email protected] [M+H]+ (also detected as [email protected] [M+Na]+) and [email protected], which corresponds to 5-hydroxy-3-methoxy-2-pentenoic acid, 5,6-dihydro-4-methoxy-2H-pyran-2-one, and a dehydropestalotin isomer. In the end-phase-I some highlighted features were annotated as 11,12-dihydroxycurvularin, penostatin G, ergostapentaene and ergostatetraenol. It is interesting to note, that only lately appearing compounds were successfully annotated. This further emphasis that studying the effect of time on fungal metabolite production is an important factor to access new chemical diversity. Amoung all end-phase-I features, one in particular seemed rather unusual. The feature [email protected] corresponded to an unannotated compound with a rather small m/z value. Its UV absorbance characteristic (λmax = 239 nm, see Supplementary data) was similar to pyran-2-ones previously isolated in P. restrictum MMS417 (Le. et al. 2020), however, no pyran-2-one structures could be devised for such mass. In addition, the MS/MS fragmentation pattern did align correctly with pyran-2-one (no fragments and neutral losses in common). 2.2. Isolation and structure elucidation of feature [email protected] with the extract of P. restrictum MMS417 grown on MES-SSW.

The features [email protected] was selected for targeted isolation due to its unusual characteristics. A previous achieved large scale culture extract (Le, et al. 2020) was explored for presence of this characteristic ion within its fractions. A reasonably intense ion was observed in on fraction to initiate its targeted isolation. The feature [email protected] was successfully isolated and first analysed by high resolution mass spectrometry. The HR-(+)-ESIMS spectrum showed ions at m/z 211.058 and 227.0299 corresponding to the protonated molecules and to the [M+Na]+ adduct, respectively. The main ion detected corresponded to the [M+Na]+ adduct, and none of the other related ions were detected in the initial profiles of the MES extract. Based on high mass and spectral resolution the molecular formula (MF) of C8H12O5 was determined, which led to a compound with three unsaturations. NMR spectra (1H, 13C COSY, HSQC, HMBC and NOESY) were acquired to fully elucidate the structure of feature [email protected] (Table 5). The 1H-NMR spectrum showed the presence of 11 protons, with one methoxy group at δH 3.7 (3H, s, O-CH3), one methine group at δH 5.13 (1H, s, H-2), two methylenes at δH 3.13 (2H, t, J=6.88Hz, H-4), δH 4.30 (2H, t, J=6.88Hz, H-5) and one methyl group at δH 2.06 (3H, s, H-2’). The absence of one proton in comparison to MF, highlight the presence of a labile proton in the molecule. Interpre- tation of the coupling constants of signals at δH 3.13 and δH 4.30 along with the analysis of the COSY spectrum highlighted the presence of a -CH2-CH2- spin system in the structure of the molecule. This corresponds to the only correlation deductible from 1H spectra. Chemical shifts of δH 4.30 indicated the presence of an oxygen connected to the corresponding carbon.

Table 5. 1H, 13C-NMR spectral data, and COSY, HMBC, NOESY for compound 4

Position 13C, δC type 1H, δH, J in Hz COSY HMBC NOESY 1 171.70 C 2 91.68 CH 5.13, s C-4, C-3, C-1 3-OCH3 3 174.12 C 4 31.74 CH2 3.13 (t, 6.88) H-5 C-2, C-3, C-5 H-5 5 61.60 CH2 4.3 (t, 6.88) H-4 C-4, C-1’, C-3 H-4 1’ 170.95 C 2’ 20.91 CH3 2.06, s C-1’ 3-OCH3 55.87 OCH3 3.7, s C-3, C-2, C-4 H-2

Chapitre 3. Etude cinétique

The 13C-NMR and HSQC spectra showed 3 highly deshielded 3 quaternary carbons at δC 170.95, δC 171.70 and δC 174.12. In addition, one methyl group at δC 20.91 (δH 2.06, 3H, s, H-2’), one methoxy group at δC 55.87, (δH 3.7, 3H, s, O-CH3) two methylene carbon at δC 31.74 (δH 3.13, 2H, t, J=6.88Hz, H-4), δC 61.60 (δH 4.30, 2H, t, J=6.88Hz, H-5), one methine hybrid carbon sp2 at δC 91.68 (δH 5.13, 1H, s, H-2 were observed. The number of detected carbon is in accordance with the determined MF. The interpretation of the HMBC spectrum (Table 5. ) provides sufficient information to fully character- ise the structure of feature [email protected]. The HMBC correlation between δH 2.06 (3H, s, H-2’) and δC 170.95 (C-1’) is characteristic of an acetyl moiety which is then connected to the methylene at δC 61.60 and δH 4.30 (2H, t, J=6.88Hz, H-5). The other correlations are characteristic of the 5-acetoxy-2-pentenoic acid with a methoxy in position 3 (connected to the double bond). Thus, features [email protected] was identified as 5- acetoxy-3-methoxy-2-pentenoic acid. The double bond configuration was determined based on the 1H-1H NOESY experiment (Table 5. ). A clear correlation was observed between the H-2 (δH 5.13) and the 3-OCH3 (δH 3.13). This allowed the characterisation of the E configuration of the double bond. In conclusion, features [email protected] was identified as (2E)-5-acetoxy-3-methoxy-2-pentenoic acid (1) (Figure 36). This corresponded to a previously unreported compound. It is the ester formed between an acetic acid and arabenoic acid (also called verrucolone and (2E)-5-hydroxy-3-methoxy-2-pentenoic acid). Arabe- noic acid was previously isolated from the fungus P. verrucosum [29] and an unidentified fungus F6286 [24], the endophytic fungus Pestalotiopsis manguiferae [37].

Figure 36: Structure of 5-acetoxy-3-methoxy-2-pentenoic acid (1)

This small ester (1), could be considered as an artefact of pyran-2-one biosynthesis. In fact, as is free alcohol in position 5, thus corresponding to arabenoic acid, one could easily imagine its cyclisation between alcohol in position 5 and the carboxylic acid in position 1 to form the corresponding 5,6-dihydropyran-2-one ring (Figure 37). This should yield 5,6-dihydro-4-methoxy-2H-pyran-2-one (3) that was previously isolated from (Le et al. 2020).

Chapitre 3. Etude cinétique

(Arabenoic acid)

(3) (1)

Figure 37: biosynthesis of (2E)-5-acetoxy-3-methoxy-2-pentenoic acid (1) in relation to the known compound (3) and arabenoic acid.

2.3. Exploration of pyran-2-one diversity trough time

The characterisation of the compound (3) further question the biosynthesis of pyran-2-ones by the shellfish-derived fungus P. restrictum MMS417 grown on a host-derived medium (Le, et al. 2020). To get the picture about the kinetics of production of such compounds, all previously isolated compounds were tracked specifically in the LC-HRMS data at every time points. The relative quantification the following pyran-2- ones (4-methoxy-2H-pyran-2-one (2), 5,6-dihydro-4-methoxy-2H-pyran-2-one (3), 6-pentyl-4-methoxy-2H- pyran-2-one (4), 1'R-dehydropestalotine (5), 6S,1'S-pestalotine (6), 4-methoxy-6-(1’R, 2'S-dihydroxy-3- pentenyl)-2H-pyran-2-one (7), 5,6-dihydro-4-methoxy-6S-(1’S,2’S-dihydroxy-3-pentenyl)-2H-pyran-2-one (8), 4-methoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy pentanyl)-2H-pyran-2-one (9), 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β (10), 6S, 1'R, 2'R-LL- P880β (11), 6S, 1'S, 2'R-LL-P880β (12)) and ester (1) are represented in Figure 38A. The fitted curves indicated the presence or not of the different compounds in the extract indicating when they are mostly observed (and accumulated) by the P. restrictum MMS417.

Chapitre 3. Etude cinétique

Figure 38: kinetics of pyran-2-ones production by P. restrictum MMS417; A) fitted production curves (in relative abundance to max production) of the different pyran-2-ones (2-12) and ester (1) during 11 days of growth; B) molecular network of pyran-2-ones and related compounds (unfragmented compounds were introduced using previously acquired MS/MS data and are represented as blue nodes; green and blue nodes are fully characterised pyran-2-ones by comparison with standards; red border on nodes highlights compounds that were manually connected to the network – red edges – based on chemical structure relevance – modification of the 4-5 bond of pyran-2-ones from double to single bond). In each node, the fitted production curves are indicated in black curves.

The analysis of the production kinetics of pyran-2-ones highlighted some specific trends. The first pyran-2-ones observed corresponded to the smallest one produced by this fungus: 4-methoxy-2H-pyran-2- one (2). The corresponding reduced compound (5,6-dihydro-4-methoxy-2H-pyran-2-one (3) appears only at a later time point, with a maximum around day 8. This indicates that the hydrogenation of the double bond appears later in the biosynthetic pathways. A similar observation occurs with the hydrogenated (10) appearing after its related compound (5). Most of the pyran-2-ones were produced between days 6 to 9, showing the very dynamic nature of this production. One compound possesses a much-delayed appearance, it corresponded to (2E)-5-acetoxy-3-methoxy-2-pentenoic acid (1). Thus, it could come from the inhibition of the production of (2) and (3), redirecting its precursor as a more stable structure, corresponding to (1) (Figure 37).

Chapitre 3. Etude cinétique

The compound (1) appeared in the end of phase 1 when P. restrictum MMS417 has fully recovered the Petri dishes, which suggested that compound (1) may play important roles in the mediate cell-to-cell communication and/or fungal cell fusion. To further investigate the whole metabolite production overtime of a period of 11 days by the P. restrictum MMS417, a molecular network [10,38] was constructed using the Global Natural Product Social Molecu- lar Networking (GNPS) [39]. Based on an in-house database of pyran-2-ones the corresponding cluster was highlighted (Figure 38B). According to previously reported pyran-2-ones produced by P. restrictum MMS417, compounds (2), (3), (4), (7) and (11) were not connected to the cluster due to the absence of common fragments for (1), (4) and (11), and the absence of acquires MS/MS spectra for (2) and (3) (the compounds were too small to be fragmented). Thus, (7) and (11) were manually connected to the cluster based on the very high structural similarity [40] between (7) and (8), and between (9) and (11) (modification of the 4-5 bond of pyran-2-ones from double to single bond). Similarly, (2) was linked to (3). Finally, the pyran-2-one cluster was composed of 21 nodes representing an increased variety of pyran-2-ones produced by P. restrictum MMS417. Interestingly, the presence of a new isomer of pestalotin observed corresponding to feature [email protected]. In addition, larger compounds were also present, going up to m/z 336.250. In the case presented here, exploring chemical diversity according to time growth allowed clearly to reveal further the presence of new compounds. In each node of Figure 38B, the relative amount of compound detected was represented as an in-node graph. This allowed to represents the production trend of each detected pyran-2-ones observed in the cluster. To further explore the dynamic production of pyran-2-ones, the relative amount of compound was presented in the network presented in Figure 38B at every time point by modifying the node size. Undetected nodes were removed from the network along with their connected edges. For sake of clarity, the node positions were kept as it is. The Figure 39 show the evolution of this network through the eleven day explored during this kinetic study.

Chapitre 3. Etude cinétique

Figure 39: Dynamic pyran-2-one molecular network representing its evolution from day 1 to 11. Undetected nodes were removed from the original network (Figure 38B) along with their connected edges; and node size were reflect- ing relative abundance trough time (unfragmented compounds were introduced using previously acquired MS/MS data and are represented as blue nodes; green and blue nodes are fully characterised pyran-2-ones by comparison with standards; red border on nodes highlights compounds that were manually connected to the network – red edges – based on chemical structure relevance – modification of the 4-5 bond of pyran-2-ones from double to single bond).

Chapitre 3. Etude cinétique

Exploring the dynamic network (Figure 39), it could be clearly observed that diversity of pyran-2-ones is evolving according to times. If at the beginning of the growth (day 1) the number of detected pyra-2-ones is low (8 nodes), this number is increasing with growth time up to day 8 (25 nodes) before decreasing again (at day 11, 17 nodes were observed). It also clear that (2) is produced before (3) and that (1) is appearing at the end of the explored growth time. Also the middle of the cluster (nodes (5), (6), (9), (10) and (12)) are only observed from day 6 to 9. The whole pyran-2-one cluster mays only be observed at those specific days. Such a representation clearly shows the limit of exploring chemical diversity only at one time-point.

3. Conclusion

In the present study, the P. restrictum MMS417 strain was cultivated over 11 days. Macroscopic modifications of the fungal colonies in terms of size and colour were observed. This highlights the metabolic changes in the fungus, as previously reported [7,41–43]. Every day fungal material with culture media was extracted and profiled by HPLC-HRMS/MS. This metabolomic analysis highlighted the dynamic of specialised production in fungi. This pointed out the importance of studying the presence of specific compounds according to growth time. Such dynamic production was already highlighted in fungal culture [7], but also during fungal interaction [8,44]. These results may explain the apparent difficulties observed by natural product chemists when working with fungi, reported as a “capricious behavior” [45]. One late compound was successfully isolated and identified as (2E)-5-acetoxy-3-methoxy-2-pentenoic acid (1). This compound corresponds to a stabilisation through ester formation of the precursor of the pyran- 2-one: 5,6-dihydro-4-methoxy-2H-pyran-2-one (3). This also pointed out the importance of pyran-2-ones production by the fungi. The compound (1) appeared at the end of phase 1 when P. restrictum MMS417 has fully recovered the Petri dishes, which suggested that compound (1) may be play important roles in quorum sensing, such as sporulation, secondary metabolite production, morphological transition and enzyme secretion [46]. As previously reported bacteria, a similar compound – (4S)-4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione (DPD) – was described as a single common precursor of autoinducer-2 (AI-2) produced by Gram-negative and Gram-positive species [47–51]. In bacteria, AI-2 is known to be part of quorum-sensing [50]. In addition, a pyran-2-one deri- vate, named photopyrone (PPYs) was also described as bacterial signalling molecules in Photorhabdus luminescens [52]. In fungi, the signalling molecules are usually not strain specific and a huge chemical diversity has been reported [53]. For example, farnesol and tyrosol were described as signalling compounds in Candida albicans having opposite effects on hyphae development [54–56]. Further studies are needed to elucidate the role of (1) in the quorum sensing of P. restrictum MMS417. A dynamic molecular network was constructed using GNPS to explore pyran-2-one diversity through time. This highlights that such compound chemical diversity produced by P. restrictum MMS417 is wider than previously reported (Le. et al. 2020). The isolation of those unreported pyran-2-ones need to be further explored to understand their ecological role. However, to achieve such goal, optimisation of production of each of those targeted pyran-2-ones need to be achieved prior to any isolation and characterisation. This confirms that kinetics study has to be taken into consideration when exploring chemical diversity of microorganisms at the same level than OSMAC, epigenetic modification and co-cultivation.

4. Materials and Methods

4.1 Fungal Strains

The fungal material comes from the MMS laboratory strain collection, consisting of various samples isolated from the French Atlantic coast near the estuary of the Loire River as previously described [15]. Penicil- lium restrictum referenced as MMS417 was initially collected in January 1997 from mussels (Mytilus edulis) in France. After macroscopic and microscopic observations, the strain was identified by DNA amplification and sequencing of the ITS and β-tubulin regions (GenBank accession number for MMS417: KU720404, KU720398). They all have a voucher specimen conserved both at room temperature on agar under sterile paraffin oil and at -20 °C.

Chapitre 3. Etude cinétique

4.2. Culture Conditions

Cultivation of the strains was performed on seawater semi-solid Mussel Extract Sucrose medium (MES medium) containing 150 g/L sucrose, 20 g/L mussel extract, 0.005 g/L copper sulphate (CuSO4,5H2O), 0.5 g/L magnesium sulphate (MgSO4,7H2O), 0.01 g/L zinc sulphate (ZnSO4,7H2O) and 20 g/L agar. Artificial seawater was reconstituted from the Coral Reef® salts at 33 g/L. Seeding was performed on 10 cm Ø-Petri dishes containing 25 mL of solid culture medium and following 3 points fungal spores deposit in the solid-state. Alto- gether, 99 dishes corresponding to 9 replicates per day of observation were prepared together with 9 replicates of non-seeded dishes corresponding to the controls. The culture was then maintained at 27 °C.

4.3. Sample Preparation

Micro-scale extraction was performed for each Petri dish on three 7 mm diameter-plugs obtained on 3 different points on the plate, namely one in the middle of a colony, on the edge of a colony as far as possible from another colony, and on the in the vicinity of another colony. To avoid modification on fungal metabolism due to plug sampling, processed plates were not used for further experiments. The crushed agar and mycelium were extracted twice with 1 mL of CH2Cl2/EtOAc (50:50 v:v) solvent mixture after 30 min and 10 min ultrasounds treatment respectively. The supernatants were combined and filtered over a 0.2 µm regenerated cellulose membrane to remove spores. Solvents were removed under a nitrogen stream and the crude extracts were freeze-dried before analysis. This process was applied to 3 dishes each day for 11 con- secutive days. Media without inoculated fungi were also extracted following the same protocol. 4.4. HPLC-HRMS analysis HPLC-HRMS profiling were achieved using a UFLC-HRESIMS (IT-TOFMS) Shimadzu instrument (Prominence Ultra-Fast Liquid Chromatography coupled to High-Resolution Electrospray Ionization Mass Spectrometry combining Ion trap and Time of Flight analysers) with a previously published protocol [7]. The volume of injection was 5 µL of crude extracts diluted at 1 mg/mL in MeOH (UPLC grade, Biosolve). Elution was performed as follow: using a KinetexTM C18 column (100 x 2.1 mm, 2.6 µm) maintained at 40 °C ,and using the following gradient: 15% CH3CN (+ 0.1% formic acid – FA) during 2 min; from 15% CH3CN (+ 0.1% FA) to 100% CH3CN (+ 0.1% FA) in 23 min, hold at 100% CH3CN (+ 0.1% FA) for 5 min; and back to initial conditions and equilibration for the last 5 min. Water, CH3CN and FA were of UHLC grade (Biosolve). The detection using ESI was performed both in positive and negative modes with a coupled ion trap and TOFMS analyser in the mass range m/z 100-1000 with a resolution of 10.000 at m/z 500. MS2 acquisition was performed using data dependant acquisition strategy. Blank samples and QC samples were injected regularly throughout the sequence, and samples were injected in random order using a dedicated Excel macro[57].

4.5. Data Treatment

Automatic feature detection was performed with MZmine 2 software [20]. The mass detection was performed using a centroid algorithm with a noise level 1E4. The chromatogram building was established using the ADAP algorithm with minimum group size in # of the scan of 3, group intensity threshold of 2E4, minimum of the highest intensity of 1.7E4, m/z tolerance of 50 ppm. The peak deconvolution was performed using a wavelets ADAP algorithm with m/z center calculation: Median, S/N threshold of 5, S/N estimator of 10, coefficient/area threshold of 100, peak duration range of 10, and retention time wavelet range from 0 to 1 min. The chromatograms were deisotoped using isotopic peak grouper algorithms with m/z tolerance of 30 ppm, retention time tolerance of 0.7 min, maximum charge of 2; the lowest m/z was chosen for the representative. The peak lists were aligned using Ransac algorithms with m/z tolerance of 30 ppm, retention time tolerance of 0.7 min, retention time tolerance after correction of 0.7 min, Ransac iterations of 20000, Mini- mum number of point of 30%, Value of threshold was 1 and a linear model was chosen. The peak lists were gap filling with intensity tolerance of 30%, m/z tolerance of 30 ppm, retention time tolerance of 0.7 min. The

Chapitre 3. Etude cinétique features detected from blank samples and non-inoculated agar samples were removed from the generated matrix to focus on the features corresponding to the fungus production. Before data analysis, data were normalized according to the total amount of extract to avoid the amplification of compound presence due to a low extract amount at early growth stages. Statistical analysis was performed using SIMCA13 (UMETRICS).

4.6. Molecular networking

Feature based molecular network [58] was performed using MZmine 2 [20] for LC-HRMSMS data analysis prior to submission to GNPS platform. Pick picking procedure was achieved using previously described parameters. The peak list was exported as a *.mgf file for GNPS. The *.mgf file was subjected to the online workflow of the Global Natural Products Social molecular networking platform (https://gnps.ucsd.edu) [39]. The molecular network was generated using the following settings precursor ion mass tolerance of 2 Da and fragment ion mass tolerance of 0.3 Da, minimum pairs cos of 0.1, network topK of 10, minimum matched fragment ions of 2, the minimum cluster size of 1, run MS cluster and filter precursor window tolls were turned off. The resulting molecular network was finally visualized using Cyto- scape 3.7.1 [59].

4.7. Isolation and Identification of (2E)-5-acetoxy-3-methoxy-2-pentenoic acid

The large scale extract was obtained according to Le et al. (Le et al. 2020). The extract (11.5 g) was fractionated by vacuum liquid chromatography using silica gel and elution was performed with mixtures of solvents with increasing polarity: hexane/EtOAc (from 100:0 to 30:70 (v/v)) to yield six fractions (F1-F6). Frac- tions F6 (253.8 mg) was subjected to flash chromatography on silica (column Macherey-Nagel, Chroma- bond® flash RS25SiOH) and elution was performed with a mixtures of CH2Cl2/MeOH (from 100:0 to 0:100 (v/v)), at a flow rate of 20 mL/min to afford 12 subfractions. Fraction F6-5 (18.2 mg) was purified by HPLC using a silica column (Interchim 5 µ 250 x 4.6 mm) with a mobile phase of Hexane/EtOAc 70:30 (v/v) at a flow 1 mL/min, to afford 1 (6.5 mg). (2E)-5-acetoxy-3-methoxy-2-pentenoic acid (1): White crystal; UV (MeOH) λmax 239 nm; 1H and 13C NMR data are available in Table 5; HRESIMS m/z 211.0581 [M+Na]+, 227.0299 [M+K]+.

Author Contributions:

OG initiated the project. OG and SB supervised the experimental work. VTL was in charge of the experiment. The manuscript was written by VTL and SB and corrected by all authors. All the authors read and approved the final manuscript.

Funding:

The author was supported by the Government of Vietnam, program 911 for a Ph.D. This project was supported by the Corsaire-ThalassOMICS metabolomics core facility of Biogenouest for LC-HRMS/MS analyses and data treatment (University of Nantes).

Acknowledgments:

We sincerely thank the team of laboratory IICiMed EA 1155 (University of Nantes) for NMR spectra acquisition.

Conflicts of Interest:

The authors declare no conflict of interest.

Chapitre 3. Etude cinétique

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Chapitre 3. Etude cinétique

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Chapitre 3. Etude cinétique

54. Hornby, J.M.; Jensen, E.C.; Lisec, A.D.; Tasto, J.J.; Jahnke, B.; Shoemaker, R.; Dussault, P.; Nickerson, K.W. Quorum sensing in the dimorphic fungus Candida albicans is mediated by Farnesol. Appl. Envi- ron. Microbiol. 2001, 67, 2982–2992, doi:10.1128/AEM.67.7.2982-2992.2001. 55. Polke, M.; Leonhardt, I.; Kurzai, O.; Jacobsen, I.D. Farnesol signalling in Candida albicans – more than just communication. Crit. Rev. Microbiol. 2018, 44, 230–243, doi:10.1080/1040841X.2017.1337711. 56. Lindsay, A.K.; Deveau, A.; Piispanen, A.E.; Hogan, D.A. Farnesol and cyclic AMP signaling effects on the hypha-to-yeast transition in Candida albicans. Eukaryot. Cell 2012, 11, 1219–1225, doi:10.1128/EC.00144-12. 57. Bertrand, S.; Schumpp, O.; Bohni, N.; Bujard, A.; Azzollini, A.; Monod, M.; Gindro, K.; Wolfender, J.- L. Detection of metabolite induction in fungal co-cultures on solid media by high-throughput differential ultra-high pressure liquid chromatography–time-of-flight mass spectrometry fingerprinting. J. Chromatogr. A 2013, 1292, 219–228, doi:10.1016/j.chroma.2013.01.098. 58. Olivon, F.; Grelier, G.; Roussi, F.; Litaudon, M.; Touboul, D. MZmine 2 Data-preprocessing to enhance molecular networking reliability. Anal. Chem. 2017, 89, 7836–7840, doi:10.1021/acs.analchem.7b01563. 59. Shannon, P.; Markiel, A.; Ozier, O.; Baliga, N.S.; Wang, J.T.; Ramage, D.; Amin, N.; Schwikowski, B.; Ideker, T. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 2003, 13, 2498–2504, doi:10.1101/gr.1239303.

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Chapitre 3. Etude cinétique

3. Conclusion et perspectives

Cette étude montre des modifications macroscopiques (taille et couleur) des colonies fongiques de P. restrictum MMS417 au cours du temps, mettant ainsi en évidence ses changements métaboliques. De tels résultats ont déjà été rapporté chez les champignons (Berepiki et al. 2011; Meletiadis et al. 2001; Riquelme 2013; Roullier et al. 2016). L’analyse de l’évolution du métabolome par HPLC-HRMS/MS met clairement en évidence cette dynamique. Cela a souligné l'importance d'étudier la présence de composés spécifiques en fonction du temps de croissance. D’ailleurs, seuls les composés de fin de croissance ont été dérépliqué avec succès, montrant qu’une partie de la nouveauté chimique produite par ce champignon se retrouve dans les métabolites produits uniquement en début de croissance. Une telle dynamique de production a déjà été mise en évidence lors de culture de souches seules (Roullier et al. 2016), mais aussi lors d'interactions fongiques (Azzollini et al. 2018; Bertrand et al. 2014). Cette dynamique de production peut expliquer les difficultés apparentes observées par les chimistes de produits naturels lorsqu'ils travaillent sur des champignons, et en particulier leur « comportement capricieux » (Williams et al. 2008).

Ici, un composé nouveau a été isolé, il s’agit de l'acide (2E)-5-acétoxy-3-méthoxy-2-penténoïque (1). Ce composé est un ester d’un précurseur de 5,6-dihydro-4-méthoxy-2H-pyran-2-one (3); surement une forme stabilisée. L’apparition du composé (1) en fin de la phase 1, lorsque P. restrictum MMS417 a complètement récupéré les boîtes de Pétri, suggère qu’il pourrait jouer des rôles importants dans son quorum-sensing (mécanismes régulant par exemple la sporulation, la production de métabolites secondaires, la transition morphologique et/ou la sécrétion d’enzymes) (Barriuso et al. 2018). Chez les bactéries, un composé similaire – le (4S)-4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione (DPD) – a été décrit comme précurseur de l'autoinducteur-2 (AI-2) produit aussi bien chez les espèces à Gram négatif et à Gram positif (Kadirvel et al. 2014; Marques et al. 2011; Surette et al. 1999; Tsuchikama et al. 2012; Zhu et al. 2003). L’AI-2 est connu pour faire partie du quorum-sensing (Zhu et al. 2003). Une autre pyran-2-one bactérienne, appelé photopyrone (PPY) a également été décrit comme des molécules de signalisation chez Photorhabdus luminescens (Brachmann et al. 2013). Chez les champignons, les molécules de signalisation ne sont généralement pas spécifiques de la souche et une grande diversité de structure chimique a déjà été rapportée (Padder et al. 2018). Par exemple, le farnésol et le tyrosol ont été décrits comme des composés de signalisation chez Candida albicans et ayant des effets opposés sur le développement d’hyphes (Barriuso et al. 2018). D'autres études seront donc nécessaires pour élucider le rôle du composé (1) dans le quorum sensing chez P. restrictum MMS417.

Dans les résultats présentés précédemment, un réseau moléculaire dynamique a été construit afin d’explorer la diversité structurale des pyran-2-ones au cours du temps chez P. restrictum MMS417. Cela a permis de mettre en évidence le caractère dynamique de la production de ces molécules. De plus, des pyran-2-ones non identifiées ont pu ainsi être mis en évidence. Pour comprendre leur rôle chez P. restrictum MMS417 il sera donc nécessaire de les isoler. Cependant, pour atteindre cet objectif, l'optimisation de la production de chacun de ces pyran-2-ones ciblés doit être réalisée.

En conclusion, cette étude confirme qu’il est important de prendre en compte l’aspect temporel de la production de métabolites spécialisés au même niveau que l'approche OSMAC, la modification épigénétique et la co-culture pour permettre de révéler une chimiodiversité fongique nouvelle.

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

Chapitre 4. Etude globale du métabolisme de Penicillium restrictum MMS417 dans un milieu à base de moule et en réponse à un stress salin

1. Analyse lipidique des fractions F1 à F4 de l’extrait brut MES-SSW

L’extrait brut de la souche MMS417 présenté précédemment (Chapitre 2) contenait 4 fractions très apolaires (Figure 24) qui n’ont pas été analysé plus en détail dans les parties précédentes de ce manuscrit. Les fractions F3 et F4, correspondant à une forte proportion de la masse, formait une huile jaunâtre, se solidifiant au froid. Ces propriétés thermiques laissaient à penser qu’elles pourraient contenir des lipides. Les fractions de F1 à F4 ont donc été analysées par CCM selon un protocole permettant d’identifier simplement les types de composés lipidiques contenus (Figure 30). Les résul- tats ont montré que des traces de stérols et une grande quantité d’hydrocarbures composent la fraction F2. La fraction F3 est, elle, principalement constituée de triglycérides, alors que la fraction F4 semble contenir majoritairement des acides gras libres. Ainsi, cette analyse a confirmé la très forte proportion de lipides dans l’extrait brut, la somme des quatre fractions F1 à F4 représentant 7,4567 g, soit 84.60% de la totalité de l’extrait brut.

Figure 40 : CCM des fractions F1 à F4 et des témoins (silice, éluant : Hexan/Ether/Acide acétique 65mL/15mL/0,75 mL), révélateur : vaniline sulfurique)

Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

Du fait de l’observation au cours des premiers travaux de la très forte production de lipides par la souche MMS417 cultivé dans milieu MES-SSW, Il est apparu intéressant de s’intéresser aussi au lipidome de cette souche, en complé- ment du métabolisme spécialisé, pour observer plus en détail le métabolisme de la souche de P. restrictum MMS417.

La souche MMS417 a été cultivée sur les 7 milieux différents avec deux conditions osmotiques suivant l’approche OSMAC précédemment décrite. Les extraits de tous les milieux ont été analysés par analyses HPLC-HRMS selon deux protocoles différents pour d’abord profiler le métabolisme spécialisé (Roullier et al. 2016), puis les lipides (Dos Santos Dias et al. 2017). En parallèle, les extraits de l’étude OSMAC ont aussi été analysés par GC-MS après trans- estérification en esters méthyliques d’acides gras (EMAG). Les données acquises sur les échantillons OSMAC étaient donc de cinq types: les profils LC-HRMS du métabolisme spécialisé (ionisation positive et négative), profils lipidique LC-HRMS (ionisation positive et négative) et composition en acide gras par analyse GC-MS. Afin d’analyser l’ensemble de ces données obtenues une approche par analyse statistique multi-blocs a été entreprise. L’ensemble des blocs a ainsi été fusionné de façon à ce qu’aucun des blocs ne prenne plus de poids statistique qu’un autre. Ensuite des analyses multivariées non-supervisé puis supervisé ont été effectué pour mettre en avant les composés :

(1) spécifiques du milieu MES et donc associé à la présence de moule, dont est issue la souche MMS417, dans le milieu de culture,

(2) spécifique du stress osmotique ici mise en place par la substitution de l’DW par de l’eau de mer synthétique (SSW).

2. Le lipidome fongique

Les lipides sont présents dans les champignons en tant que constituants majeurs des systèmes membranaires et compo- sant mineur dans la paroi cellulaire. De plus, ils peuvent stocker de l’énergie dans les corps lipidiques et dans certains cas, ils peuvent agir comme signaux intra-extracellulaires (Athenaki et al. 2018; Weete 1980). Les champignons contiennent un ensemble varié de lipides, y compris : acides gras, oxylipines, sphingolipides, phospholipides, glycolipides et stéroles (principalement lié à la voie de biosynthèse de l’ergostérols) (Siebers et al. 2016). Les lipides produits par les champignons présentent un intérêt sans cesse croissant concernant des aspects de recherche tant appliquée que fonda- mentale (Athenaki et al. 2018; Papanikolaou and Aggelis 2011, 2011; Xue et al. 2018). En général, les champignons accumulent des lipides différents des animaux et des plantes (Siebers et al. 2016).

Etant donné que les champignons marins ont été trouvés dans tous les milieux marins, ils ont dû s’adapter au changement de l’environnement pour survire. Parmi les changements auxquels ils ont dû s’adapter, la salinité est surement l’un des facteurs environnementaux qui affecte le changement de la composition lipidique de la membrane des champignons (El-Mougith 1993; Turk et al. 2004). Ces modifications sont nécessaires pour maintenir un état de fluidité de la membrane cellulaire. Plusieurs lipides sont directement responsables et influencent indirectement le maintien de la fluidité membranaire : le type de chaines d’acyle gras, le nombre de stérols, la nature des groupes de tête des phospholipides polaires (Russell 1989). Majoritaires des études précédentes ont été réalisées sur l’effet du stress salin sur la composition lipidique et la fluidité membranaire des levures (Andreishcheva et al. 1999; Hosono 1992; Khaware et al. 1995; Sharma et al. 1996; Swan and Watson 1997; Tunblad-Johansson et al. 1987; Turk et al. 2004). Par conséquent, les champignons marins n’ont pas encore reçu une attention suffisante. Avec les observations d’études précédentes, mes

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme travaux sont orientés vers l’étude du métabolome complet, y compris le lipidome d’une souche champignon marin par des changements de salinité, et composition de culture.

Tous ces résultats seront présentés dans un article (3) intitulé : « Multiblock partial least square discriminant analysis (MBPLS-DA) for Penicillium restrictum chemical diversity exploration by One Strain Many Compound (OSMAC) approach – Tracking see water effect on fungal metabolism ». Cet article sera soumis dans le journal Metabolomics.

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

Article 3: Multiblock partial least square discriminant analysis (MBPLS-DA) for Penicillium restrictum chemical diversity exploration by One Strain Many Compound (OSMAC) approach – Track- ing see water effect on fungal metabolism

Van-Tuyen Le,a,b Samuel Bertranda,c, Marion Brandolini‑Bunlond, Aurélie Couzinet-Mossiona, Vony Rabesaotraa, Oli- vier Grovela,c aEA 2160 – Mer Molécules Santé, University of Nantes, 44035 Nantes, France bPhu Tho College of Pharmacy, 290000 Phu Tho, Vietnam cCorsaire-ThalassOMICS Metabolomics Facility, Biogenouest, University of Nantes, Nantes, France. dUniversité Clermont Auvergne, INRA, UNH, Plateforme d’Exploration du Métabolisme, MetaboHUB Clermont, 63000 Clermont-Ferrand, France

Abstract

Introduction. Marine fungi have been found in all habitats and are able to adapt to their environmental niche conditions. In this study, a combination of LC-HRMS and GC-MS analytical approaches was used to analyse the whole metabolic changes of a marine sourced Penicillium restrictum strain isolated from a marine shellfish area.

Methods. The P. restrictum MMS417 strain was grown on the seven different media with two different osmotic conditions following the OSMAC approach. The extracts of all media were analysed by LC-HRMS (lipid and specialized metabolic profiling) and GC-MS (fatty acid profiling). The acquired data were analysed using a multiblock strategy to highlight metabolic modification in regards to environmentally relevant condition (mussel based culture medium) and to change of osmotic conditions.

Results. The multiblock analysis highlighted first the specificity of metabolic modification in response to a growth in mussel based culture medium. In particular, the fungal strain is able to produce fatty acids usually produced by the mussel itself. This study also provides insight into the P. restrictum adaptation to marine salinity.

Conclusion. This study suggests the ability of the P. restrictum to alter mussel microbiome growth and chemically mimic mussel chemical signals. In addition, it provides explanation to the difficulties to delineate the effect of osmotic stress in fungi.

Keywords: Marine-derived fungi, OSMAC, multiblock, Data fusion, seawater effect,

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

1 Introduction

Marine fungi have been found in all habitats and make a significant contribution to the marine environment (Rédou et al. 2016). They have been regarded as saprotrophs, parasites, or symbionts (epiphytic an endophytic), as a consequence of the evolution of fungal cell biology and feeding strategies (Dighton and White 2017; Spiteller 2015). In the dynamic natural environment, fungi must be able to adapt to the change from the local environment to survive and colonize a niche. Such adaptation could be considered as a physiologic adaptation to its environment or a response to abiotic stresses (rapid modification of its environment) (Danilova et al. 2020; Feofilova et al. 2000). However, in such ecological niches, fungi are also in competition or interactions (biotic stresses) with other micro- and/or macro-organisms, such as bacteria (Lof et al. 2017; Scherlach et al. 2013), algae (Kohlmeyer and Volkmann-Kohlmeyer 2003), sponges (Bovio 2019), molluscs (Guo and Ford 2016; Zannella et al. 2017; Zvereva and Vysotskaya 2005), etc

In a natural product perspective, such biotic or abiotic stresses are responsible to activation of secondary metabolite biosynthetic gene clusters (BGCs) yielding the production of stress specific compounds. Such culture based strategies for chemical diversity exploration are usually called OSMAC (One-Strain-Many-Compounds) (Bode et al. 2002) or microbial co-cultivation (Arora et al. 2020). Such strategies allows to reduce the significant discrepancy between the actual number of chemically characterized compounds obtained from microorganisms and the number of bioinformati- cally characterised BGCs (Reen et al. 2015; Romano et al. 2018). The OSMAC approach is now largely used to explored the effect of various factors on fungal specialized metabolisms (Romano et al. 2018), such as temperature (Weinstein et al. 2000), culture medium (Hoang et al. 2018), carbon source (Weinstein et al. 2000; Xu et al. 2013).

Considering marine-sourced fungi, salinity represents one of the main environmental factors to be considered to achieve one step further in understanding adaptation to marine environment. However, studying such effect on fungi remains quite challenging (Overy et al. 2017). As one well documented effect, salinity affected membrane lipid composition of fungi to maintain its fluidity. Several lipids are directly responsible and indirectly influence in the maintenance of membrane fluidity: the type of fatty acyl chains, the number of sterols, the nature of the polar phospholipids head- groups (Russell 1989). Most of previous studies were performed on the effect of salt stress on lipid composition and membrane fluidity in the yeasts (Andreishcheva et al. 1999; Hosono 1992; Khaware et al. 1995; Sharma et al. 1996; Tunblad-Johansson et al. 1987; Turk et al. 2004). However, up to now, no global studies trying to show an overall effect on various metabolic compartments were initiated.

Recent trends in metabolomics tend to performed global analysis at multiple layers from core metabolome, to lipids and specialized metabolome (Boccard and Rudaz 2014). This reflects the ability that emerge from the last decades to char- acterise extract chemical composition using different high resolution strategies, such as gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) and/or nuclear magnetic resonance (NMR) (Wolfender et al. 2015, 2019). But also it is the consequence of the use of chemometrics strategy than are able to correctly fusion data from various instrumentation using so-called “multiblock datamining approach” (Boc- card and Rutledge 2013; Brandolini-Bunlon et al. 2019; Tchandao Mangamana et al. 2019). Thus, in studying fungal adaptation to specific environmental conditions, it is now possible to acquired high resolution data using different methods and then analysing them together (Palaric et al. 2019).

The present study, proposed to explore the adaptation of the mussel derived fungus Penicillium restrictum MMS417 isolated from mussel flesh within shellfish farming area (Sallenave-Namont et al. 2000). An OSMAC strategy was used to explore metabolism adaptation to various culture conditions. Six traditional culture medium (Hoang et al. 2018) were used along with a mussel based medium (Geiger et al. 2013). This latter culture medium may be considered as an environmentally relevant medium (Overy et al. 2005, 2006; Overy and Blunt 2004). In addition, each medium was studied as marine relevant medium using synthetic sea water (SSW) or basic medium using distilled water (DW). Thus, all together, the P. restrictum MMS417 metabolism corresponding to those 14 cultures conditions were explored using specialized metabolite (Roullier et al. 2016), lipid (Dos Santos Dias et al. 2017; Knittelfelder et al. 2014) profiling by LC-HRMS and fatty acid lipid content profiling by GC-MS (Dos Santos Dias et al. 2015). The multi-block analysis of the acquired data allowed highlighting specific metabolic changes in the P. restrictum MMS417 strain according to the presence of mussel extract in the culture medium. In addition, the impact of SSW, and thus “osmotic stress” on P. restrictum was also explored.

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

2 Materials and methods

2.1 Fungal Material

The studied strain, Penicillium restrictum MMS417, was isolated from a sample of the blue mussel Mytilus edulis collected in January 1997 at Port Giraud on the Loire estuary in France (Sallenave-Namont et al. 2000). The strain is preserved at the laboratory Mer-Molécule-Santé (MMS) EA2160, University of Nantes, France.

2.2 Culture Media Preparation

The fungal cultures were performed in Petri dishes (10 cm diameter) containing 15 mL of solid agar-based medium in 14 different media. Details for the preparation of MES are presented in a previous study (Geiger et al. 2013). Two osmotic conditions were prepared on the basic of the presence or absence of artificial seawater (36 g/L of salinity). Me- dium composition was as follow : DCA (Dextrose 40 g/L, enzymatic digest of Casein 10 g/L, Agar 15 g/L, Difco), MEA (Malt Extract 20 g/L, peptone 1 g/L, glucose 20 g/L, Agar 20 g/L), PDA (Potato extract 4 g/L, Dextrose 20 g/L,

ZnSO4.7H2O 0.01 g/L, CuSO4.5H2O 0.005 g/L, Agar 15 g/L), YES (Yeast Extract 20 g/L, Sucrose 150 g/L, agar 20 g/L), MES (Mussel Extract 20 g/L, Sucrose 150 g/L, agar 20 g/L), CYA (Czapek concentrate 10 mL, Yeast extract 5 g/L, K2HPO4 1 g/L, sucrose 30 g/L, Agar 15 g/L), Czapek concentrate (NaNO3 3 g/L, KCl 0.5 g/L, MgSO4.7H2O

0.5g/L, FeSO4.7H2O 0.01g/L, ZnSO4.7H2O 0.01 g/L, CuSO4.5H2O 0.05g/L), KMS (MgSO4.7H2O 2.4 g/L, NH4NO3 2.4 g/L, Tris (tampon) 1.21 g/L, Agar 20 g/L).

2.3 Fermentation and Extraction for OSMAC Approach

The fungal cultures were carried out in triplicate for each medium from culture stocks of the strain stored at 20 °C and transplanted on Petri dishes of MES medium 10 days before inoculation. The fungus (fragments of mycelium and conidia) were taken using a sterile Pasteur pipette and transplanted by depositing three points on the top of the agar. The cultures were incubated at 27 °C for 10 days under natural light. Samples were taken in three distinct places of cultures (at the point of central impact, on the outskirts of the colony, in the periphery but contact with an adjacent colony). The samples were extracted twice with 1.5 mL of CH2Cl2/EtOAc 1:1 (v/v) for each flask. Fungal mycelia and the agar layer were extracted together to obtain both intra- and extracellular metabolites. Mixtures were sonicated for 30 min and filtered on regenerated cellulose filters 0.45 µm (Sartorius). Media without inoculated fungi were also extracted following the same protocol and considered as controls (blanks samples). Finally, the extract was dried and weighed.

2.4 HPLC-MS analyses of specialized metabolites

HPLC-(+)-HRESI-MS analyses were performed on a UFLC-MS (IT-TOF) Shimadzu instrument (combining ion trap and time of flight analysers), using a Kinetex C18 column (2.6 µm, 2.1 x 100 mm, Phenomenex) and following previously described conditions (Roullier et al. 2016). Samples (5 µL) at a concentration of 1 mg/mL in MeOH were injected. A mixture of all extracts at the same concentration was also prepared as quality control (QC). All samples were injected at random, and MeOH blanks and QC samples were regularly injected during the analysis sequences (Bertrand et al. 2013)

2.5 HPLC-MS analyses of lipids

HPLC-(+)-HRESI-MS analyses were performed on a UFLC-MS (IT-TOF) Shimadzu instrument (combining ion trap and time of flight analysers), using a Kinetex C18 column (2.6 µm, 2.1 x 150 mm, Phenomenex) and following previously described conditions (Dos Santos Dias et al. 2017). Samples (2 µL) at a concentration of 1 mg/mL in isopropanol were injected. A mixture of all extracts at the same concentration was also prepared as quality control (QC). All samples were injected at random, and isopropanol blanks and QC samples were regularly injected during the analysis sequences (Bertrand et al. 2013)

2.6 Processing of HPLC-MS data

The HPLC-HRESI-MS chromatogram raw data files were converted to *.netCDF files by using LCMS solution (version 3.60 – Shimadzu). Automatic peak picking on the *.netCDF files was achieved using MZmine 2 (Pluskal et al.

110

Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

2010) with appropriate parameters (Table 1). All data files including media controls and MeOH blanks were examined to determine a minimum noise level threshold.

Table 6. Parameters used for automatic peak picking using MZmine 2

Lipids Specialized metabolites

Step Parameter Positive Negative ionization Positive Negative ionization mode mode ionization mode ionization mode

0) Crop filter Retention time 0.66-45 min 0-45 min 0.9-24.6 min 0.9-24.6 min 1) Mass detection Mass detection, mass Centroid Centroid Centroid Centroid detector Noise level 2.10E+04 1.20E+04 2.10E+04 1.40E+04 Scans MS level 1 1 1 1 3) Chromatogram builder ADAP ADAP ADAP ADAP Algorithm Chromatogram Chromatogram Chromatogram Chromatogram builder builder builder builder

Min group size in ≠ of scans 2 2 4 4

Group intensity threshold 6.00E+04 2.00E+04 1.00E+05 1.00E+05

Min highest intensity 2.10E+04 1.00E+04 2.10E+04 2.10E+04

m/z tolerance 30 ppm 20 ppm 100 ppm 100 ppm 4) Chromatogram deconvolution

Algorithm Wavelets ADAP Wavelets ADAP Wavelets ADAP Wavelets ADAP

S/N threshold 10 10 5 5

Intensity window Intensity window Intensity window Intensity window S/N estimator SN SN SN SN

Minimum feature height 20 100 1 1

Coefficient/area threshold 150 110 100 100

Peak duration range 0.0- 10 0.0-10 0.03- 23.69 0.03- 23.69

RT wavelet range 0.0 – 0.20 0.0 – 0.07 0.01-0.5 0.01-0.5

5) Isotope peak grouper m/z tolerance 30 ppm 20 ppm 0.003 m/z 0.003 m/z

Retention time tolerance 1.8 min 0.5 min 1 min 1 min

Maximum charge 2 2 2 2

Representative isotope Lowest m/z Lowest m/z Lowest m/z Lowest m/z

6) Normalisation m/z tolerance 30 ppm 20 ppm 100 ppm 100 ppm 1.5 min RT tolerance 1.8 min 0.5 min 1.5 min (absolute) (absolute)

Minimum standard intensity 2.00E+05 1.00E+04 2.00E+04 2.00E+04

7) Join aligner Algorithm Ransac aligner Ransac aligner Ransac aligner Ransac aligner 0.0 m/z or 30 m/z tolerance 50 ppm 100 ppm 100 ppm ppm

RT tolerance 1.8 absolute (min) 0.7 absolute (min) 1 absolute (min) 1 absolute (min)

RT tolerance after 1.8 absolute (min) 0.7 absolute (min) 1 absolute (min) 1 absolute (min) correction

Ransac iteractions 200000 20000 20000 20000

Minimum number of points 50.00% 50.00% 50.00% 50.00%

Threshold value 1 1 1 1

Linear model 8) Duplicate Peak list filters m/z tolerance 1 ppm 1 ppm 0.05 absolute RT tolerance 0.05 absolute (min) (min) 8) Peak list rows filters

Minimum peaks in a row 4 4

9) Grap filling

Peak finder Peak finder Peak finder Peak finder Algorithm (multithreaded) (multithreaded) (multithreaded) (multithreaded)

Intensity tolerance 50% 30% 30% 30%

m/z tolerance 30 ppm 20 ppm 5 ppm 5 ppm

Retention time tolerance 1.8 min absolute 0.7 min absolute 0.5 min 0.5 min

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

The results were exported as a *.csv file containing all peaks observed and referenced by their mass to charge ratio

(m/z) and retention times (tR) together with their respective peak areas in each sample. The generated matrix was cleaned by removing all peaks abundantly found in blank samples (culture media extracts) and technical blank samples (MeOH injections).

2.7 Protocol trans-esterification (preparation of Fatty Acid Methyl Esters (FAME) and N-Acyl Pyrrolidides)

Crude extract Fatty acid methyl esters (FAME) for the OSMAC approach was prepared by protocol transesterification of (5 h at 80 °C under reflux with methanolic hydrogen chloride 3N /MeOH/CHCl3 (5:3:1 v/v/v). NAP were prepared by direct treatment of the FAME with pyrrolidine/acetic acid (5:1 v/v) for 60 min at 85 oC under reflux.

2.8 GC-MS analyses

FAME was analysed using a GC-MS instrument (Hewlett Packard HP 6890-GC System, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) linked to a mass detector (HP 6890-E.I. 70eV) equipped with a SLB-5TM column (60 m x 0.25 mm x 0.25 µm). The carrier gas was helium at a flow rate of 1 mL/min. The temperature of the injector and detector were respectively set at 250 oC and 280 oC. One microliter was injected in splitless mode. The column temperature was held at 170 °C for 4 min and programmed to 300 °C at 3 °C/min. The solvent delay was 9 min.

2.9 Processing of GC-MS data

The GC-MS chromatogram raw data files were converted to *.CDF files by using GC-MS solution (Hewlett Packard 1989-1997, G1701BA version B.00.00).

2.10 Statistical Analysis

All data analysis was performed using R 4.0.0 (CRAN). The data from HPLC-MS profiling were subjected to QC correction using the statTarget package (Luan et al. 2018) using the following parameters: Frule 0, QCspan 0.75, degree 2, imputeM “KNN” and coCV 100. The corrected peak areas were further corrected to reflect the absolute compound amount in the fungus by multiplying it by the corresponding extract weight. A similar correction was applied to GC-MS peak area. All data analyses were performed using Unit-Variance (UV) scaling. The PCA was performed using the ROPLS package (Thévenot et al. 2015). The ComDim data analysis (Qannari et al. 2000) was performed using the R function “accps()” available from E. Tchandao Mangamana (Essomanda 2016). The MBPLS-DA was achieved using the packMBPLSDA package (Brandolini-Bunlon et al. 2019) and the variables were selected based on VIPc (cumulated variable importance in the projection) values.

2.11 Annotation of LC-HRMS data

The feature selected based on cumulated variable importance in the projection (VIPc) were identified based on their accurate molecular masses. Measured accurate masses were used for compounds molecular formula determination considering a 6 ppm error, which was compared with the information available on the dictionary of natural products (DNP) database. The UV spectra were used to suggest secondary metabolite classes.

3 Result

To assess the impact of the modification of culture condition on the metabolism of P. restrictum 14 culture conditions were used in an OSMAC experiment. The fungus was grown for 10 days using seven solid culture media (CYA, DCA, PDA, YES, MEA, KMS, and MES), supplemented or not with synthetic seawater, prior to extraction. Tracking a global effect of replacing distilled water (DW) with synthetic seawater (SSW) needs to analyses all metabolic changes in every culture condition, having in mind to get as much information as necessary on the fungal metabolism. Thus, after extraction of the culture medium and the mycelium, all extracts (n = 56) were profiled focusing on specialised metabolites (SM), lipids, and fatty acids (FA) (Figure 1). Two different LC-HRMS protocols were used for first profiling specialised metabolism (Roullier et al. 2016) and then lipids (Dos Santos Dias et al. 2017). In parallel, part of each extract was subjected to transesterification to get full FA composition of lipids.

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

Figure 41. Experimental design used to assess synthetic seawater effect on marine sourced Penicillium restrictum metabolome and lipidome.

3.1 General profiling

Simple LC-MS-based metabolomics analysis was performed to compare the metabolic profiles of all culture conditions. This provided a snapshot of this strain’s chemical composition when grown on different media. Figure 2 provides an overview of all acquired metabolic profiles (LC-MS and GC-MS) of P. restrictum MMS 417 cultured in all 14 culture conditions (CYA, DCA, PDA, YES, MEA, KMS, and MES using either DW or SSW). It already revealed some outstanding changes in metabolome and lipidome.

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

Specialized metabolites Lipids Fatty acids

KMS

MEA

PDA

DCA

YES

MES

CYA

KMS

MEA

PDA

DCA

SSW

YES

MES CYA

Rt (min) 0 5 10 15 20 0 10 20 30 40 8 18 28 38 48

Figure 42. LC-HRMS and GC-MS profiles of the extract from Penicillium restrictum MMS 417. These profiles highlight differences observed in the raw LC-MS (BPI) (the red line corresponds to the positive mode and line blue to negative mode) and GC-MS (TIC) among all 14 cultures conditions: CYA, DCA, PDA, YES, MEA, KMS, and MES using either DW or SSW.

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

As a general observation on specialized metabolite profiles, in the positive ionisation mode, the majority of the peaks appeared at the end of the chromatograms (18-25 min). Interestingly, there are some particular peaks observed mostly the profiles corresponding to MES-SSW extracts in comparison to the others medium (5-10 min). That confirms the specificity related to the growth of this strain on MES-SSW. Surprisingly, many peaks appears only in the synthetic seawater extracts profiles acquired in the negative mode in comparison to distilled water extracts (except CYA-DW). This is particularly observed in the case of PDA-SSW, DCA-SSW extracts.

A similar observation was achieved on lipidome. In the lipid profiles (middle chromatograms from Figure 2), the most polar lipids (i.e. FA) along with SM are eluted at the beginning of the chromatogram (approx. 2-18 min), phospholipid (PL), and the glycolipids (GL) between 18 and 35 min, at finally, the neutral lipid (NL) (mostly triglycerides) between 38 and 45 min. The profiles obtained from both KMS and CYA medium crude extract are clearly different with almost no PL, GL, NL observed. Contrarily, all lipid categories are observed in profiles from the extract of P. restrictum MMS417 when grown on MES and YES medium. In addition, to general lipidome composition, fatty acid compositions of the lipids present in the extracts were also characterized. All of the extracts of the cultures after 10 days were transesterification and analysed by GC-MS (Table S1). In the first observation, the GC-MS profiles obtained from MEA- DW and MES-SSW extracts showed a strongly different composition in comparison to others. Penicillium restrictum MMS417 contained fatty acids of carbon chain lengths ranging from 12 to 26. The most common and abundant fatty acids were 16:0, 18:0, 18:1, and 18:2 which often made up greater than 90% of the total fatty acid content of fungi (Khudyakova et al. 2009; Stahl and Klug 1996). These four fatty acids were present in all of the media culture in this study. Minor fatty acids (12:0, 14:0, 15:0, 16:1, 17:0, 17:1, 19:1, 19:0, etc.) were also detected however representing less than 10% of the total fatty acid content. As expected, FA composition was clearly altered by culture condition modification (Dos Santos Dias et al. 2015, 2017; Oleinikova et al. 2013; Stahl and Klug 1996), differences were in the number and kinds of fatty acids present, and in their relative concentrations. The relative concentration of an individual fatty acid ranged from less than 1% of the total acid fatty acid content to over 47%. These results are consistent with previously published data (Cooney et al. 1993; Dos Santos Dias et al. 2015, 2017; Oleinikova et al. 2013, 2017; Stahl and Klug 1996).

To further analysed the chemical composition data, multivariate unsupervised data analysis was performed on all individual acquired data using principal component analysis (PCA): LC-HRMS metabolome profiles in positive ionisation (883 features), LC-HRMS metabolome profiles in negative ionisation (544 features), LC-HRMS lipidome profiles in positive ionisation (1748 features), LC-HRMS lipidome profiles in negative ionisation (10535 features), GC-MS FA composition (34 features). In all PCA performed (Figure 3), the first axes represented 24% (LC-HRMS metabolome profiles in positive ionisation) to 61% (LC-HRMS lipidome profiles in negative ionisation) of the overall variability, and a rather good level of clustering according to culture medium could be observed using the first two components depending on the culture media. Most of the analytical conditions showed some specificity of MES and YES culture medium (independently of the presence of Synthetic see water). In addition, the second axes of the lipidome data in positive ionisation also highlight KMS culture medium specificity; and fatty acid profiling also highlighted clear differences between YES and MES culture medium.

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

Figure 43. PCA score plot (UV scaling) of all acquired data (LC-HRMS and GC-MS) highlighting differences between 14 culture media (4 replicates) (7 media with salt against 7 media without salt).

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

However, the ability to conclude on a global culture medium effect using such a high amount of data is impaired by the difficulties to uses at the same level the different data acquired on the extracts. Therefore, it could be interesting to analyse all data simultaneously. In such cases, so-called multi-block data analysis could be performed (Boccard and Rudaz 2014).

Multi-block data analysis corresponds to strategies allowing the co-analysis of different datasets on the same samples; one block corresponding to one analytical method. One major difficulty that multi-block strategies encounter is block size differences effect. In the study presented here five blocks of data were acquired: LC-HRMS metabolome profiles in positive ionisation (883 features), LC-HRMS metabolome profiles in negative ionisation (544 features), LC-HRMS lipidome profiles in positive ionisation (1748 features), LC-HRMS lipidome profiles in negative ionisation (10535 features), GC-MS FA composition (34 features), with the high data size variation from 34 (GC-MS) to 10535 features (LC-HRMS lipidome in negative ionisation). To overcome block size differences effect, the unsupervised multivariate ComDim strategy (also called common components and specific weights analysis – CCSWA) (Tchandao Mangamana et al. 2019) was used to analyse the data. Such a multi-block strategy is still very rarely used to explores metabolomic data, particularly in the natural product (Palaric et al. 2019). Such strategy, in addition to perform simultaneous analysis of all data, also provides information about the importance of each data block (understand analytical methods).

The ComDim scores plot allowed visualising in an unsupervised way all the data self-structure (Figure 4AB). As observed in the individual data set (Figure 3), the MES and YES culture medium (using both DW and SSW) correspond to first dimension separation which accounts for 59% of total variance representation. This first dimension (Dim1) is mostly derived from the lipidome in a negative ionisation data block as observed in Figure 4C. This indicates that YES and MES medium composition is different from the other culture medium. The second dimension (Dim2), which ac- count for 8% of the total variance, highlights the MES specific composition. Interestingly, in addition to lipidome specificity, FA composition possesses a high specificity in the MES medium. Exploring further the dimension of the Com- Dim analysis (Figure 4B) was highlighting the trend of culture medium clustering. Intriguingly, no SSW cluster was observed.

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

Figure 44. Multiblock unsupervised data analysis using ComDim (extract weight correction and UV scaling) of all acquired data (LC-HRMS and GC-MS) highlighting differences between all culture media. A) Score plots of dimension 1 and 2 and B) Score plots of dimension 1 and 3; C) Block influence on the separation (salience on the separation) of dimension 1 and 2.and D) Block influence on the separation (salience on the separation) of dimension 1 and 3.

3.2 Effect of mussel extract

As clearly observed in Figure 4A, the composition of P. restrictum MMS417 extract when grown on MES and YES medium possess specific chemical patterns without considering DW vs SSW effect. To observe such an effect on overall fungal metabolism, data were analysed in a supervised way using MBPLS-DA. The analysis was focused on highlighting differences between the MES culture medium in comparison to all other media, disregarding DW, and SSW. Optimisation of the number of PLS components indicated that only the first 2 should be kept to avoid overfitting (Bran- dolini-Bunlon et al. 2019). The resulting score plot (Figure 5A) showed significant separation between MES media and the others. Exploration of the importance of each block in the separation (Figure 5B) indicated that the FA block is the most important in the separation; all other blocks being of similar importance.

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

Figure 45. Multiblock supervised data analysis using MBPLS-DA (extract weight correction and UV scaling) of all acquired data (LC-HRMS and GC-MS) highlighting differences between MES media and all other culture conditions. A) Scores Plot; B) Block importance in the projection. FA: fatty acid profiles by GC-MS; LP: Lipid profiles either in the negative (NI) or positive (PI) ionization; SM: specialized metabolites profiles either in the negative (NI) or positive (PI) ionization.

Interestingly, a clustering based on a culture medium (without considering the MES medium) is still observed (Figure 5A). This indicates the rather high differences between the chemical compositions of the extracts according to the culture medium used. Besides the MES medium located in the top/right of the score plot (Figure 5), the YES medium was separated from another medium in the bottom/right location. On the opposite side of the score plot (top/left) was located the KMS, PDA, and CYA media (SSW and DW together).

Based on the cumulated variable importance in the projection (VIPc), features of interest were selected (Table 1). Inter- estingly, the top30 VIPc variables related to this discrimination are related to the FA composition of lipids. The only feature from another data block corresponds to m/z = 415.2713 [M-H]- eluted at 15.03 min and was annotated as the tricarboxylic acid fatty acid – agaric acid (C22H40O7, calculated m/z 415.2697, ∆ppm 3.85); this compound is known to be widespread in fungi (Freedland and Newton 1981; Robbins et al. 1946). Interestingly, some branched fatty acids (BCFA) and polyunsaturated FA (PUFA) were present only in the extracts obtained using the MES media such as 4,8,12-TM-13:0, 18:0-iso, 18:0-anteiso, 18:0-DMA, br-18:0, 20:4, 20:5.

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

Table 7. Most altered features (TOP30) regarding MES media and all other culture conditions are highlighted by MBPLS-DA (Figure 5) and selected based on cumulated variable importance in the projection (VIPc). *for GC annotation is not putative, in comparison to LC-MS annotation

Overexpressed Features Block VIPc Putative annotation* in MES C22.2 FA 0.0504 yes docosadienoic acid 4.8.12.C13.0 FA 0.0494 yes 4,8,12-trimethyltridecanoic acid C17.0.iso FA 0.0493 yes 15-methylhexadecanoic acid C20.1 FA 0.0491 yes eicosenoic acid C17.0.anteiso FA 0.0442 yes 14-methylhexadecanoic acid C20.2 FA 0.0439 yes 6,11-eicosadienoic acid C20.4 FA 0.0439 yes eicosatetraenoic acid C16.1 FA 0.0423 yes palmitoleic acid C20.5 FA 0.0403 yes eicosapentaenoic C16.0.iso FA 0.0304 yes 14-methylpentadecanoic acid C18.0.iso FA 0.0287 yes 16-methylheptadecanoic acid C15.0 FA 0.0284 yes pentadecanoic acid C18.0.anteiso FA 0.0279 yes 15-methylheptadecanoic acid C18.0.DMA FA 0.0268 yes dimethyl acetal stearic acid branched saturated fatty acid with 18 C18.0.br FA 0.0257 yes carbons C16.0 FA 0.0218 yes palmitic acid C18.0 FA 0.017 - stearic acid C14.0 FA 0.0142 yes myristic acid C19.0 FA 0.0141 yes nonadecylic acid C20.0 FA 0.0139 - arachidic acid C17.0 FA 0.0108 - margaric acid C18.1 FA 0.0106 - oleic acid C22.0 FA 0.0088 - behenic acid C12.0 FA 0.0087 yes lauric acid C24.0 FA 0.0084 - lignoceric acid C18.2 FA 0.0082 - linoleic acid C17.1 FA 0.0043 - 9-heptadecenoic acid C22.1 FA 0.0033 yes docosenoic acid C19.1 FA 0.0031 - nonadecenoic acid agaric acid (Freedland and Newton 1981; 15.03neg415.2713 SM NI 0.0012 yes Robbins et al. 1946)

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

3.3 Effect of synthetic seawater

As observed in Figure 4, no DW vs SSW salt effect was observed unsupervisedly from the data. To observe such an effect on fungal metabolism, data have to be analysed in a supervised way using MBPLS-DA. The analysis was focused on highlighting differences between culture medium prepared with DW and SSW. Optimization of the number of PLS components indicated that only the first 2 should be kept to avoid overfitting (Brandolini-Bunlon et al. 2019). The resulting score plot (Figure 6A) showed the significant separation between medium based on DW and SSW. Exploration of the importance of each block in the separation (Figure 6B) indicated that all block impact similarly the separation, however the most important block in the separation remains the lipid profiles acquired in negative ionization (NI) and the less important block is the FA composition. Such importance does not seem to rely on block size as expected using MBPLS-DA.

Figure 46. Multiblock supervised data analysis using MBPLS-DA (extract weight correction and UV scaling) of all acquired data (LC-HRMS and GC-MS) highlighting differences between all DW and SSW. A) Scores Plot; B) Block importance in the projection. FA: fatty acid profiles by GC-MS; LP: Lipid profiles either in the negative (NI) or positive (PI) ionization; SM: specialized metabolites profiles either in the negative (NI) or positive (PI) ionization.

However, a clustering based on a culture medium (without considering the type of water) is again observed (Figure 6A), even if it remains less strong than wham comparing MES media from all others (Figure 5A). This indicated the rather high differences between the chemical compositions of the extracts according to the culture medium used. Thus, besides a general effect on the metabolic pattern concerning DW/SSW differences, a culture medium effect (not considering DW/SSW) effect was highlighted; YES and MES medium were located in the top/right direction, and CYA, KMS, and

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

MEA being located in the bottom/left direction. This highlighted the combined effect of DW/SSW and culture medium in modifying the chemical composition of P. restrictum MMS417 extract composition. Thus even if a general effect of SSW can be pointed out, a specific effect according to culture medium composition is expected (i.e. CYA-DW vs CYA- SSW, KMS-DW vs KMS-SSW, YES-DW vs YES-SSW, etc.).

Table 8. Most altered features (TOP30) regarding DW and SSW differences are highlighted by MBPLS-DA (Figure 6) and selected based on cumulated variable importance in the projection (VIPc). *for GC annotation is not putative, in comparison to LC-MS annotation

features of interest Block VIPc value Water type Putative annotation* Branched C18:0 FA 0.0124 SSW branched saturated fatty acid with 18 carbons C16.0.iso FA 0.0123 SSW 14-Methylpentadecanoic acid C18.0.DMA FA 0.0106 SSW dimethyl acetal stearic acid C12.0 FA 0.0085 SSW lauric acid C14.0 FA 0.0084 SSW myristic acid C19.1 FA 0.0065 DW nonadecenoic acid C14.1 FA 0.0050 DW myristoleic acid C17.0.DMA FA 0.0050 DW dimethyl acetal margaric acid C18.2.cj FA 0.0050 DW octadecadienoic acid C26.0 FA 0.0045 SSW cerotic acid 7.40neg209.0781 SM NI 0.0029 SSW unidentified metabolite 4.8.12.C13.0 FA 0.0027 SSW 4,8,12-trimethyl tridecanoic acid C19.0 FA 0.0022 DW nonadecanoic acid 23.86pos524.3151 SM PI 0.0021 SSW unidentified metabolite 11.21neg363.0273 SM NI 0.0021 SSW unidentified metabolite 10.04neg214.1452 SM NI 0.0020 DW unidentified metabolite 19.59neg429.2867 SM NI 0.0020 SSW unidentified metabolite 21.13neg437.2544 SM NI 0.0020 DW unidentified metabolite 14.08neg386.2595 SM NI 0.0020 DW unidentified metabolite 21.88pos427.3208 SM PI 0.0020 SSW dankasterone B (Amagata et al. 2007; Zhou et al. 2018) 21.68pos482.2927 SM PI 0.0019 SSW cytochalasin B5 (Kim et al. 2015) C20.5 FA 0.0019 SSW eicosapentaenoic acid 1.21pos255.0626 SM PI 0.0019 DW unidentified metabolite 19.41pos484.3054 SM PI 0.0019 SSW unidentified metabolite 1.06neg295.0643 SM NI 0.0018 DW unidentified metabolite 19.68pos232.6385 SM PI 0.0018 SSW unidentified metabolite 23.13pos744.5735 SM PI 0.0018 DW unidentified metabolite 23.45pos744.5733 SM PI 0.0017 DW unidentified metabolite 19.62pos467.3157 SM PI 0.0017 SSW unidentified metabolite C20.0 FA 0.0017 DW arachidic acid

Based on VIPc value, features of interest were selected (Table 3). Among the top30 features selected, besides fatty acids profiles by GC-MS, 16 features correspond to ions detected in specialized metabolites profiles. The feature correspond- + ing to m/z 427.3208 [M+H] eluted at 21.88 min was annotated as dankasterone B (C28H42O3, calculated m/z 427.3207, ∆ppm 0.23), a fungal steroid (Amagata et al. 2007; Qi et al. 2014; Zhou et al. 2018). The feature m/z 482.2927 [M+H]+ eluted at 21.68 min was annotated as cytochalasin B5 (C29H39NO5, calculated m/z 482.2901, ∆ppm 5.39), a macrolide isolated from a marine-derived fungus Phoma sp. (Kim et al. 2015). Some unidentified metabolites at + + - - - - m/z 209.0781 [M+H] , 524.3151 [M+H] , 363.0273 [M-H] , 214.1452 [M-H] , 429.287 [M-H] , 437.2544 [M-H] ,

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

386.2595 [M-H]-, 484.3054 [M+H]+, 232.6385 [M+H]+ and two isomers at m/z 744.5735 [M+H]+, 744.5733 [M+H]+ did not find a hit from fungal natural product databases.

Interestingly the top10 VIPc variables related to this discrimination are related to FA composition. However, the FA block impact on MBPLS-DA discrimination remains the smallest. This reflects that a large number of lipids observed in ionisation negative mode profiles are altered slightly but significantly. Concerning FA, it was observed that their lipids composition in the extracts using SSW culture media corresponds mostly to BCFA (br-18:0, 18:0-DMA, 16:0-iso, 4, 8,12-TM-13:0), saturated fatty acids (SFA) (12:0, 14:0, 19:0, 20:0, 26:0), PUFA (cj-18:2, 20:5) and the one in the extracts using DW culture corresponds to mono-unsaturated fatty acids (MUFAs) (14:1, 19:1), BCFA (17:0-DMA), PUFA (cj-18:2).

4 Discussion

Several studies demonstrated the fungal capacity to adapt to the effect of environmental variables on temperature, and salinity conditions (El-Mougith 1993; Gostinčar et al. 2011; Hosono 1992; Su et al. 2020; Vallet et al. 2020). This adaptive response of fungi in environments was about the metabolic changes. It was proposed that the fungus was modifying the structures of its cell membrane, through modification of their lipid composition such as modification of saturated, unsaturated, branched, or cyclic fatty acids content in individual phospholipids (Mysyakina and Funtikova 2007; Šajbi- dor 1997). In the present study, composition of fatty acids composition of lipids, lipids and specialized metabolites of P. restrictum cultivated under different conditions was explored. As expected, all studied part of the fungal metabolism was altered by culture condition used in the OSMAC strategy.

Concerning FA composition of lipids produced by P. restrictum, the most abundant were 16:0, 18:0, 18:1, and 18:2; representing more than 90 % of the total fatty acid content. These results are consistent with the previous study in that the most abundant fatty acid were 16:0, 16:1 18:0, 18:1 and 18:2 which represent approximately 88% of the total fatty acid content (Ahumada-Rudolph et al. 2014). Stahl & Klug were also reported that the most common and abundant were 16:0, 18:0, 18:1, 18:2 that constituted 95% of the total fatty acid content after analysing 100 strains of filamentous fungi including Oomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes and Mycelium Esterilia (Stahl and Klug 1996). However, more unusual FAs were also highlighted to be produced in some conditions, such as (Arjuna 2014; Oleinikova et al. 2017; Yu et al. 1996). The results presented here highlighted that the changes of the culture conditions were significantly modifying fatty acid composition of P. restrictum (Figure 3).

The preliminary analysis of the data (Figure 4) clearly pointed out the effect of environmentally relevant culture conditions. Here a mussel extract was added to the culture medium because the P. restrictum MMS417 strain was isolated from mussel’s flesh. Such results are in accordance with previous studies, using plant material and demonstrating that in the standard laboratory conditions addition host-derived media can modify the expression of low abundance metabolites, and play an important role in producing novel compounds (Overy et al. 2005, 2006; Overy and Blunt 2004). Such results, to our knowledge, were here demonstrated for the first time in marine environments. Thus, this shows that a smart choice of culture condition during OSMAC strategy could expand further accessible chemical diversity produced by microorganisms. In addition, the use of a multiblock approach (Figure 5A) highlighted that all evaluated part of the metabolism is impacted by the OSMAC strategy, here, this corresponded to lipids (and their FA composition) and specialized metabolisms. Interestingly, the most significantly altered part of the analysed metabolism is the FA composition of lipids (Figure 5B). This highlight the drastic metabolic change to the production of branched (4,8,12-trimethyl- 13:0, iso-17:0, anteiso-17:0, iso-16:0, iso-18:0, anteiso-18:0, dimethylacetal 18.0 and branched 18:0) and long (20:1, 20:2, 20:4, 20:5, 22:1, 22:2) FAs which are then incorporated in lipids. Such FAs are rather unusual in fungi (Dembits- ky et al. 1993; Dos Santos Dias et al. 2015; Nsa et al. 2020; D. Tyrrell 1967, 1971; David Tyrrell and Weatherston 1976; Yu et al. 1996). Very interestingly, 4,8,12-trimethyl-13:0, iso-18:0, anteiso-18:0, dimethylacetal 18.0, branched- 18:0, 20:4, 20:5 were previously reported to be produced by mussels (Murphy et al. 2002; Zhukova 2019). Until now, there were not reported to be produced by fungi. This observation may be explained by (1) the presence of signal metabolites in the mussel extract that initiate such unusual FA production, or (2) the presence of their precursors in the mussel extract. It is also interesting to note that a feature annotated as agaric acid was significantly induced by the use MES extract in the culture medium. This compound is known to strongly inhibit fatty acid synthesis (Freedland and Newton 1981; Newton and Freedland 1980), alter sterol synthesis (Freedland and Newton 1981) and reduced bacterial

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme biofilm formation (Lories et al. 2020). Thus, those results taken together, may suggest that P. restrictum MMS417 possess capabilities to modify mussel microbiome growth and chemically mimic mussel signals.

The analysis of the data (Figure 4) did not clearly showed any effect of using SSW in the culture medium on the metabolisms of P. restrictum MMS417. Thus, a supervised multiblock data mining strategy was used to highlight such effect. Such analysis revealed a clear effect of addition of SSW in the culture medium in all profiling strategies and related data (Figure 6). All studied metabolisms (specialized and lipid) were significantly altered with the same statistical importance (Figure 6B). However, this also highlighted the specificity of salts attrition effect according to the culture medium used (Fan et al. 2019). Thus, culturing the fungal strain on just one medium usually did not highlight the effect of salinity (Ariantari et al. 2019; Overy et al. 2017).

The most altered features correspond to FAs (Table 3). According to top significant features, the use of SSW, increased to production of branched 18:0, iso-16:0, dimethylacetal 18:0, 12:0, 14:0, 26:0, 4,8,12-trimethyl-13:0 and 20:5. Except the latter FA, all corresponded to unsaturated FAs. In comparison, FA features overproduced in DW conditions corresponded to 19:1, 14:1, dimethylacetal 17:0, conjugated 18:2, 19:0, 20:0; three being unsaturated. Various studies have reported the impact of osmotic stress or salinity on membrane fluidity through modification of FA saturation. In fact, the modification of the FA composition is essential for normal cell function in response to salinity change (Mysiakina et al. 2012). However, the observed effect remains different according to the fungal strain studied. In the literature, several studies in yeasts reported that an increase in salinity of culture media of fungus increased fatty acid unsaturation (18:1, 18:2) (Ahumada-Rudolph et al. 2014; El-Mougith 1993; Šajbidor 1997; Swan and Watson 1997; Turk et al. 2004). Such an increase may appears only is a high level of NaCl, as reported in the case of Debaryomyces hansenii (Turk et al. 2004). Contrarily, sometime, the presence of NaCl in culture media increased the saturated fatty acids (16:0, 18:0), while significantly decreasing the unsaturated ones (18:1, 18:2), which is the case with P. notatum, P. chrysogenum and Aspergillus flavus (El-Mougith 1993). One studies deals with the phenomenon in marine derived fungi, and highlighted changes in the fatty acids composition (16:0, 16:1, 18:2, 18:3) as an adaptive response to salinity stress (Ahumada- Rudolph et al. 2014). However, these changes in the fatty acid composition were varied in pH and temperature. In the other direction, such stress did not always induces significant changes in the unsaturation of fatty acid as with Yarrowia lipolytica (Andreishcheva et al. 1999). Altogether, this study further highlights the diversity of salinity adaptation mechanisms in fungi.

In addition to FAs, two features belonging to top30 VIPc variables were putatively identified, corresponding dankasterone B, cytochalasin B5. Dankasterone B was a steroid isolated from a marine-derived fungus Penicillium sp. which showed significant cytotoxic activity against HL-60, Hela, and K562 with IC50 values of 3.25, 4.74, and 7.89 µM, respectively (Qi et al. 2014). Cytochalasin B5 was a macrolide of the family cytochalasin. This class was isolated from a range of fungi and showed various potential biological activities particularly the cytotoxic as anticancer agents, antimicrobial, phytotoxins (Scherlach et al. 2010). This result further demonstrated that the salinity yield to alter specialized metabolisms and induced the production of potential bioactive metabolites (Huang et al. 2011; Overy et al. 2017; Pan et al. 2019; Wang et al. 2011; Wijesekera et al. 2017; Yamazaki et al. 2015).

In conclusion, this study explored OSMAC approach used to expand fungal chemical diversity using not only specialized metabolite profiling but also lipid profiling and FA characterisation. All those data were explored, for the first time in this context, simultaneously using multiblock data mining strategies (COMDIM and MBPLS-DA). First, environmentally relevant culture condition was used in comparison to tradition culture medium. This suggested the ability of the P. restrictum MMS417 strain to alter mussel microbiome growth and chemically mimic mussel signals by producing lipids containing mussel’s specific FAs. This also showed the ability of fungi to produce a very large variety of FAs in such specific culture conditions. Finally, exploring the effect of SSW use in culture medium on seven differences cultures mediums pointed out the difficulties to get the global picture of such metabolic alteration. This proving that beside the strain specificity of adaptation to “osmotic stress”, the results may be different when different culture medium was used. Thus it remains important to study further marine derived fungi to explore further adaptation of fungi to such environment.

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

Acknowledgments This work is a part of the Ph.D. thesis of the first author Van Tuyen Le. Authors would like to thank the Corsaire-ThalassOMICS Metabolomics Core Facility of Biogenouest, the University of Nantes for supporting LC- HRMS analyses.

Author contributions Olivier Grovel initiated the project. Samuel Bertrand designed the experimental works and carried out the multi-block analysis. Marion Brandolini‑Bunlon performed the multi-block analysis validation. Aurélie Couzinet-Mossion supervised the GC-MS experiments and their analysis. Vony Rabesaotra performed the GC-MS experiments. Van-Tuyen Le was involved in the collection of all data analysis and performed the all data analysis. Van- Tuyen Le and Samuel Bertrand wrote the manuscript. All authors were revised, read, and approved the final version of the manuscript.

Funding Author was grateful to the Vietnam International Education Development program for Ph.D. for their financial support.

Availability of data The data of multi-block analysis reported in this paper was available in the laboratory MMS (Mer Molécules Santé, EA 2160) of the University of Nantes.

Compliance with ethical standards

Conflicts of interest The authors declare that they have no conflict of interest.

Ethical approval This article does not contain any study with human and/or animal participants performed by any of the authors.

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme

3. Conclusion et perspectives

Une étude multi-blocs a été effectuée pour approfondir la vision du métabolisme de la souche de P. restrictum MMS417. Les données comportaient cinq blocs : les profils du métabolome spécialisé par LC-HRMS en ionisation positive et négative, profils du lipidome par LC-HRMS en ionisation positive and négative et la composition en acide gras par GC-MS. Les approches d’analyse des données multi-blocs COMDIM (non-supervisée) et MBPLS-DA (super- visée) ont permis de montrer l’effet de la salinité et de la composition du milieu culture sur la composition chimique des extraits de P. restrictum. Ces travaux confirment que cette souche pourrait être capable de s’adapter aux changements de l’environnement tels que la composition de milieu culture ou la salinité. Ceci est en éccord avec les études sur les champignons halophiles comme P. notatum, P. chrysogenum, Aspergillus flavus (El-Mougith 1993), Hortaea werneckii, Wallemia ichthyophaga (Gostinčar et al. 2011), Zygosaccharomyces rouxii (Hosono 1992) et Paradendry- phiella salina (Vallet et al. 2020). Il a été proposé que le champignon modifiait les structures de sa membrane cellulaire, en modifiant sa composition lipidique telle que la modification de la teneur en acides gras saturés, insaturés, rami- fiés ou cycliques dans les phospholipides individuels (Mysyakina and Funtikova 2007; Šajbidor 1997).

Ces travaux sont en accord avec les études antérieures, utilisant du matériel végétal, et montrant que dans les conditions de laboratoire standard, l’addition de milieux d’origine l’hôte peut induire la production de nouveaux composés (Overy et al. 2005, 2006; Overy and Blunt 2004). Cette stratégie d’utilisation de milieu à base de moule, couplé avec l’approche multi-blocs, a été mis en évidence des changements métaboliques drastique de la production d’AG à chaine branché (4,8,12-triméthyl-13:0, iso-17:0, anteiso-17:0, iso-16:0, iso-18:0, anteiso-18:0, diméthylacétal-18:0 et 18:0 ramifié) et d’acide gras à longue chaine (20:1, 20:2, 20:4, 20:5, 22:1, 22:2). Ces AG, ensuite incorporés dans les lipides, sont plutôt inhabituels chez les champignons (Dembitsky et al. 1993; Dos Santos Dias et al. 2015; Nsa et al. 2020; D. Tyrrell 1967, 1971; David Tyrrell and Weatherston 1976; Yu et al. 1996). Il est intéressant de noter que le 4,8,12- triméthyl-13:0, iso-18:0, anteiso-18:0, diméthylacétal-18:0, 18:0 ramifié, 20:4 et 20:5 etaient produit par les moules (Murphy et al. 2002; Zhukova 2019). Jusqu’à présent, aucun article de rapporte leur production par des champignons. Cette observation peut s’expliquer par 1) la présence de métabolites signal dans l’extrait de moule qui initient une telle production inhabituelle d’AG, ou 2) la présence de leurs précurseurs dans l’extrait de moule. De plus, Il est intéressant de voir que de l’acide agarique a été significativement induite par l’utilisation d’extrait MES dans le milieu de culture. Ce composé est connu pour inhiber fortement la synthèse des AG (Freedland and Newton 1981; Newton and Freedland 1980), modifier la synthèse des stérols (Freedland and Newton 1981) et réduire la formation de biofilm bactérien (Lo- ries et al. 2020). Ces résultats peuvent suggérer que P. restrictum MMS17 possède des capacités pour modifier la croissance du microbiome des moules et d’imiter chimiquement ses signaux moléculaires. Une étude approfondie de l’interaction entre les champignons et l’hôte serait intéressant à effectuer à la prochaine étude. Ensuite, une étude méta- bologenomics combinant métabolomique et génomique pour se connecter à leurs métabolites exportés par des gènes biosynthèse est nécessaire afin d’identifier des gènes associés à cette intéraction (Goering et al. 2016; Hooft et al. 2020; Kelleher 2015).

Cette étude a aussi mis en évidence la diversité chimique en réponse aux changements de salinité chez P. restrictum MMS417. En particulier, la production d’AG 18:0 ramifié, iso-16:0, diméthylacétal-18:0, 12:0, 14:0, 26:0, 4,8,12- triméthyl-13:0 et 20:5 ont été augmenté par l’utilisation d’eau de mer. En comparaison, les AG surproduis dans les conditions « eau distillée » correspondaient au 19:0, 14:1, DMA 17:0, 18:2 conjugué, 19:0, 20:0. Beaucoup d’étude ont

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Chapitre 4. Etude globale du métabolisme rapporté l’impact du stress osmotique ou de la salinité sur la fluidité de la membrane par modification de la saturation des AG. Cependant, l’effet observé reste différent selon la souche fongique étudiée. Dans la littérature, la majorité d’étude sur les levures ont rapporté qu’une augmentation de salinité des milieux de culture des champignons augmentait l’insaturation des acides gras (18:1, 18:2) (Ahumada-Rudolph et al. 2014; El-Mougith 1993; Šajbidor 1997; Swan and Watson 1997; Turk et al. 2004). Cependant, parfois, la présence de NaCl dans les milieu de culture augmentait la proportion d’AG gras saturés (16:0, 18:0), et diminuait les AG insaturés (18:1, 18:2), come montré chez P. notatum, P. chrysogenum, Aspergillus flavus (El-Mougith 1993).

De plus, cette souche pourrait accumuler de métabolites cytotoxiques comme la danskastérone B, la cytochalasine B5 qui ont été significativement induite par la salinité dans le milieu de culture. La dankastérone B est un stéroïde isolé d’un champignon marin Penicillium sp. qui a montré une activité cytoxique significative contre HL-60, Hela, K562 avec des valeurs CI50 de 3.25, 4.74, 7.89 µM, respectivement (Qi et al. 2014). La cytochalasine B est un macrolide de la famille des cytochalasines. Cette classe a été isolée à partir d’un grand nombre de souches fongiques et a montré diverses activité biologiques en particulier cytotoxiques comme agent anti-tumoral, antimicrobien, phytotoxique (Scher- lach et al. 2010). Ce résultat montre que la salinité induit la modification du mébolisme spécialisé en produisant molé- cules potentiellement bioactives (Huang et al. 2011; Overy et al. 2017; Pan et al. 2019; Wang et al. 2011; Wijesekera et al. 2017; Yamazaki et al. 2015).

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Conclusion générale

Les travaux réalisés au cours de cette thèse se sont focalisés sur une souche originale de P. restrictum MMS417 d’origine marine. Ceux-ci avaient pour objectif d’approfondir les connaissances sur sa chimiodiversité accessible via l’approche OSMAC. Cette souche a été choisie sur la base d’un criblage biologique précédent (Geiger et al. 2013). Les résultats obtenus lors de cette thèse ont pu l’être grâce à des approches métabolomiques adaptées à l’étude de la chimio- diversité de P. restrictum MMS417. Ces méthodes se sont focalisées sur des approches de profilages métabolique, lipidique et de réseau moléculaire par LC-HRMS/MS.

L’approche OSMAC a été employée pour générer des profils métaboliques différents selon les conditions de cultures, en incluant un volant d’écologie chimique pour évaluer l’effet de l’hôte d’origine de la souche sur son métabolome exprimé. Les analyses statistiques des profils métaboliques couplée à des approches de réseau moléculaire et déréplica- tives ont permis de mettre en évidence une série de molécules potentiellement originales de type pyran-2-ones. Ces molécules ont été isolées par une succession d’étapes chromatographiques puis identifiées sur la base de données RMN, MS et de dichroïsme circulaire. Ainsi 13 pyran-2-ones ont été isolées : la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy- 2H-pyran-2-one (TLV-11, 1), le 6S,1’R,2’S-LL-P880β (TLV-7, 2), la 6S,1’R,2’R-LL-P880β (TLV-8, 3), la 5,6-dihydro- 4-méthoxy-6S-(1’S,2’S-dihydroxypent-3-ényl)-2H-pyran-2-one (TLV-10, 4), la 4-méthoxy-6-(1’R,2’S- dihydroxypentanyl)-2H-pyran-2-one (TLV-15, 5), la 4-méthoxy-6-(1’R,2’R-dihydroxypent-3-ényl)-2H-pyran-2-one (TLV-14, 6), la 4-méthoxy-2H-pyran-2-one (TLV-1, 7), la 5,6-dihydro-4-méthoxy-2H-pyran-2-one (TLV-2, 8), le 6S, 1’S, 2’R-LL-P880β (TLV-18, 9), la 6S,1’S-pestalotine (TLV-4, 10), la 1’R-déhydropestalotine (TLV-5, 11), la 6-pentyl- 4-méthoxy-2H-pyran-2-one (TLV-6, 12), et un dérivé non cyclisé de pyran-2-one, l’acide 5-acétoxy-3-méthoxypent-2- ènoïque (TLV-3). Les composés 1, 2, 3, 4, 5, 6, et TLV-3 n’étaient pas rapporté dans la littérature précédemment, et le composé 7 est décrit ici pour la première fois comme un produit naturel. Tous ces composés appartiennent à une même série d’énantiomères 6S, et ces travaux complètent les données de la littérature sur l’existence de stéréoisomères pour certains analogues déjà décrits. L’activité biologique (cytotoxique, antibactérienne, antiprotéase) de ces molécules a été recherchée. Cependant, aucun n’a montré d’activité significative sur les différents modèles évalués. D’autre part, la déréplication a permis de mettre en évidence la présence d’autres composés dans l’extrait tels que des stérols et des macrolides à 13 atomes de crabone produits par cette souche. L’analyse des données nous a montré que certains analogues originaux de ces macrolides seraient présents dans l’extrait et leur isolement permettrait d’évaluer leur activité biologique. En parallèle, un fractionnement bioguidé a été effectué et nos travaux ont montré que les composés bioactifs dans l’extrait brut MES-SSW sont très minoritaires mais certainement peu stables. En particulier, les composés responsables de l’activité biologique de la fraction F5 se sont dégradés au cours du processus de purification. De plus, nous proposons que l’activité de l’extrait brut puisse résulter d’un mélange de composés à activité synergique.

Ces travaux montrent que la souche P. restrictum MMS417 cultivée sur milieu d’origine de l’hôte peut y produire des métabolites spécifiques dont certaines des pyran-2-ones isolées. Afin d’observer la diversité chimique des pyran-2-ones produites par cette souche sur milieu MES-SSW, une étude de l’évolution de son métabolome au cours du temps a été réalisée sur 11 jours. Cette étude montre des modifications morphologiques (taille et couleur) des colonies fongiques de P. restrictum MMS417 au cours du temps, mettant ainsi en évidence ses changements métaboliques. Les extraits bruts obtenus chaque jour ont été analysés par HPLC-HRMS/MS. Les données brutes analysées par l’approche métabolo- mique non ciblée a mis en évidence les différences en termes de métabolites intermédiaires et finaux, ainsi que leur

Conclusion générale comportement de production dans le temps, focalisée sur la voie biosynthétique des pyran-2-ones. Ces travaux montrent que la diversité métabolique observable chez un champignon est extrêmement variable selon son état physiologique et de croissance, et peut expliquer les difficultés apparentes en termes de reproductibilité d’observation de métabolites observées par les chimistes des produits naturels lorsqu'ils travaillent sur des microorganismes, et en particulier leur comportement souvent considéré comme « capricieux ». L’étude du métabolome de P. restrictum MMS417 au cours du temps a mis en évidence un composé original en particulier, isolé et identifié structuralement comme l’acide 5-acétoxy- 3-méthoxypent-2-ènoïque (TLV-3), qui apparait et s’accumule tardivement au cours du développement du champignon. Ce composé est proposé comme étant un ester d’un précurseur biosynthétique de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-2H-pyran- 2-one (TLV-2, 8). L’apparition de ce composé lorsque la boite de Petri était entièrement recouverte par les structures mycéliennes suggère qu’il pourrait jouer un rôle dans la régulation de la croissance fongique, via un mécanisme de type quorum-sensing. D'autres études seront nécessaires pour confirmer cette hypthèse.

L’étude du métabolisme de la souche de P. restrictum MMS417 en fonction des conditions de culture a ensuite été entreprise d’un point de vue plus global. Des profilages ciblant les lipides (LC-HRMS et GC-MS) ont complété les données acquises sur les métabolites spécialisés. À l’aide de méthodes statistiques multi-blocs, l’ensemble des données a été analysé conjointement. Les résultats ont montré que cette souche s’adapte aux changements du milieu de culture par une modification multifactorielle de son métabolisme. Ainsi, la culture de cette souche sur milieu à base d’hôte induit la production d’acides gras similaires à ceux retrouvé chez l’hôte lui-même tels que l’acide 4,8,12- triméthyltridecanoique, l’acide 14-méthylpentadecanoique, l’acide 16-méthylheptadecanoique, l’acide 15- methylheptadecanoique, l’acide diméthylacétalstéarique - un acide gras ramifié saturé à 18 carbones -, l’acide eicosaté- traènoique et l’acide eicosapentaènoique. Cette observation peut s’expliquer par 1) la présence de métabolites signaux dans l’extrait de moule qui initient une telle production inhabituelle d’acide gras, ou 2) la présence de leurs précurseurs dans l’extrait de moule, ce qui devra être vérifié. Ces travaux ont également mis en évidence la présence d’un acide gras tricarboxylique particulier, l’acide agarique (ou agaricine, ou acide 2-hydroxynonadecane-1,2,3-tricarboxylique), dont la production par le champignon est significativement induite par l’utilisation d’extrait MES dans le milieu de culture. Ce composé est connu pour inhiber fortement la synthèse des acides gras (Freedland and Newton 1981; Newton and Freedland 1980), modifier la synthèse des stérols (Freedland and Newton 1981) et réduire la formation de biofilm bac- térien (Lories et al. 2020). Ces résultats pris ensemble peuvent suggérer que P. restrictum MMS17 possède des capaci- tés pour modifier la croissance du microbiome des moules et imiter chimiquement les signaux des moules. Une étude approfondie de l’interaction entre les champignons et l’hôte serait intéressante à entreprendre de ce point de vue.

De plus, l’analyse multi-blocs a mis en évidence que cette souche en présence d’une forte salinité produit des métabo- lites spécialisés tels que la dankasterone B et la cytochalasine B5 ayant montré des activités biologiques. Cela montre que la salinité a pour effet d’altérer le métabolisme du champignon conduisant à la production des molécules potentiellement bioactives et des acides gras ramifiés.

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Conclusion générale

Plusieurs perspectives sont envisagées pour la suite.

La souche P. restrictum MMS417 est capable d’activer spécifiquement la voie de biosynthèse aboutissant des composés à noyau pyran-2-one, de façon stéréo-orientée sur le carbone 6 de la lactone. La grande diversité d’analogues, mono- et di-hydroxylés sur la chaîne latérale, dont la longueur et le degré de saturation sont variables, pose des questions sur l’unité de leur voie de biosynthèse, qui méritera que l’on approfondisse son étude. Pour cela, une collaboration a déjà été engagée avec le laboratoire LUBEM de l’université de Brest. Des résultats préliminaires ont déjà mis en évidence la présence d’un cluster de gènes PKS de type III très certainement impliquée dans cette voie biosynthèse. Son fonctionnement et son expression, en relation avec l’observation des métabolites produits, feront l’objet d’études ultérieures.

Les réseaux moléculaires générés dans ces travaux ont mis en évidence beaucoup de composés inconnus dans le cluster des pyran-2-ones, ainsi que des macrolides rares et des stérols. Il sera intéressant de pousser plus loin les investigations afin d’isoler de façon MS-guidée certaines de ces molécules et de compléter ainsi l’étude de la chimiodiversité de l’espèce P. restrictum.

Enfin, les travaux réalisés n’ont pas permis d’identifier les métabolites responsables de l’activité de l’extrait de culture du champignon, qui avait motivé initialement cette étude. Afin de mener au bout cet objectif, et du fait de la potentielle instabilité des composés supposés très cytotoxiques et donc potentiellement d’intérêt, il sera nécessaire d’adapter et d’optimiser les méthodes de fractionnement.

Enfin, les criblages virtuels par docking initiés sur les pyran-2-ones donnent des pistes sur de potentielles valorisations thérapeutiques et implications dans la régulation du microbiome associé au champignon dans l’hôte bivalve. Ainsi, l’inhibition de la PTP1B devra être confirmée sur modèles in vitro, et d’autres essais d’inhibition du QS par les pyran-2- ones devront être réalisés. L’obtention des 13 molécules au cours de cette thèse devrait permettre d’établir des relations structure-activité dans cette série.

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Titre : Exploration de la chimiodiversité d'un Penicillium restrictum d'origine marine par approches métabolo- mique et lipidomique.

Mots clés : Penicillium restrictum, champignons marins, OSMAC, métabolomique, lipidomique, pyran-2-ones.

Résumé : Cette thèse s’inscrit dans un contexte d’investigations du Le second axe de recherche a concerné l’étude de la biosynthèse des métabolome de souches fongiques marines en vue de l’étude des différentes pyran-2-ones produites par cette souche. Une étude ciné- interactions chimiques entre organismes marins et de la valorisation de tique sur milieu MES-EDM a été effectuée pendant une durée 11 jours produits naturels. La souche Penicillium restrictum MMS417 a été pour comprendre l’enchaînement des différentes étapes biosynthé- isolée de moules Mytilus edulis. Lors d’un screening biologique réalisé tiques menant à la production des pyran-2-ones observées chez au sein du laboratoire MMS (Mer, Molécules, Santé), cette souche a MMS417. Un réseau moléculaire « dynamique » a été élaboré à partir présenté une activité cytotoxique sur lignée cellulaire tumorale. Notre des profils UHPLC-HRMS/MS, qui montre l’évolution des clusters travail s’est donc porté sur cette souche avec trois axes de recherche : d’ions au cours de la croissance fongique. L’analyse ciblée de premièrement, une approche OSMAC couplée à un profilage métabo- l’évolution cinétique du sous-réseau des pyran-2-ones, et l’isolement lique par UHPLC-HRMS/MS a été réalisée sur 7 milieux de culture, d’un précurseur biosynthétique original, a permis de proposer des dont un milieu original à base d’extrait de moules (MES -Mussel hypothèse sur cette voie de biosynthèse. Enfin, une troisième ap- Extract Sucrose). Deux conditions osmotiques pour chaque milieu ont proche a concerné l’étude du lipidome de la souche MMS417, celle-ci été utilisées : l’une utilisant de l’eau distillée (ED) et l’autre de l’eau de produisant une fraction lipidique extrêmement abondante sur milieu mer reconstituée (EDM). L’étude métabolomique non-ciblée et la MES-EDM. Pour cela, les extraits issus de l’étude OSMAC ont été construction du réseau moléculaire de l’extrait MES-EDM ont montré analysés à la fois par UHPLC-HRMS (méthode lipidomique, ionisa- que la souche MMS417 exprimait spécifiquement la voie de biosyn- tions positive et négative) et par profilage GC-MS des extraits lipi- thèse aboutissant à des composés de type pyran-2-one sur milieu MES- diques totaux après transesterification en esters méthyliques d’acides EDM dont des analogues originaux. A partir d’une culture à grande gras. Une analyse multi-blocs a été développée pour concaténer et échelle, des travaux d’isolement et de purification guidés par la spec- traiter de façon globale les quatre jeux de données disponibles : profils trométrie de masse puis d’analyse structurale ont abouti à la description UHPLC-HRMS « métabolites spécialisés », profils « lipides-(+/-) » et de douze pyran-2-ones dont sept produits naturels originaux. Une profils « GC-MS acides gras ». Cela a mis en évidence l’influence de évaluation biologique préliminaire de certains de ces composés a été la présence de moules et d’eau de mer sur la production de globale de réalisée (cytotoxicité sur lignée cancéreuse humaine KB, tests antibac- lipides et en particulier de certains acides gras inhabituels. tériens, test anti Quorum Sensing), ainsi qu’une évaluation in silico d’inhibition de la protéine phosphatase PTP1B.

Title : Exploration of the chemiodiversity of a marine-derived Penicillium restrictum by metabolomic and lipidomic approaches.

Keywords : Penicillium restrictum, marine-derived fungi, OSMAC, metabolomics, lipidomics, pyran-2-ones.

This thesis falls within the context of investigations of the metabolome of The second line of research concerned the study of the biosynthesis of the marine fungal strains for the study of chemical interactions between marine different pyran-2-ones produced by this strain. A time-series study on the organisms and the valorization of natural products. A Penicillium restrictum MES-EDM medium was carried out for 11 days to understand the sequence MMS417 strain was isolated from blue mussels Mytilus edulis. During a of the different biosynthetic steps leading to the production of pyran-2-ones biological screening carried out in the MMS laboratory (Mer, Molécules, observed in MMS417. A "dynamic" molecular network was developed from Santé), this strain exhibited a cytotoxic activity on a tumor cell line. Our UHPLC-HRMS/MS profiles, which showed the evolution of ion clusters work, therefore, focused on this strain with three scopes of research: first, during fungal growth. The targeted analysis of the kinetic evolution of the an OSMAC approach coupled with UHPLC-HRMS/MS metabolic profiling pyran-2-ones subnetwork, and the isolation of an original biosynthetic was carried out on 7 culture media, including an original medium based on precursor, allowed us to propose hypotheses on this biosynthetic pathway. mussel extract (MES -Mussel Extract Sucrose). Two osmotic conditions Finally, a third approach concerned the study of the lipidome of the were also used for each medium: one using distilled water (ED) the other MMS417 strain, this latter producing an extremely abundant lipid fraction using artificial seawater (EDM). An untargeted metabolomics study togeth- on MES-EDM medium. For this purpose, extracts from the OSMAC study er with the construction of the molecular network of the MES-EDM extract were analyzed both by UHPLC-HRMS (lipidomic method, positive and showed that the MMS417 strain specifically expressed on MES-EDM negative ionizations) and by GC-MS profiling of the total lipid extracts after medium a biosynthetic pathway leading to pyran-2-one type compounds transesterification into fatty acids methyl esters. A multi-block analysis has including original analogues. From a large-scale culture, a mass spectrome- been developed to concatenate and comprehensively process the four avail- try-guided isolation and purification work followed by structural analyses able datasets: UHPLC-HRMS “specialized metabolites” profiles, “lipid - resulted in the description of twelve pyran-2-ones, including seven original (+/-)” profiles, and “GC-MS fatty acid” profiles. This highlighted the natural products. A preliminary biological evaluation of some of these influence of the presence of mussel and seawater on the production of lipids compounds was carried out (cytotoxicity on human cancerous line KB, and on some unusual fatty acids. antibacterial tests, anti Quorum Sensing test), as well as an in silico evaluation of inhibition of the PTP1B protein phosphatase.

THÈSE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE DE NANTES

COMUNE UNIVERSITÉ BRETAGNE LOIRE

ECOLE DOCTORALE N°598 Sciences de la Mer et du littoral Spécialité : Chimie des substances naturelles marines Par Van-Tuyen LE

Exploration de la chimiodiversité d'un Penicillium restrictum d'origine marine par approches métabolomique et lipidomique.

Volume II

Thèse présentée et soutenue à l’Université de Nantes, le 01 décembre 2020 Unité de recherche : Laboratoire Mer-Molécules-Santé MMS - EA 2160 Thèse N°:

Composition du jury Rapporteurs RICHOMME Pascal Professeur - Université d'Angers LOHEZIC-LE DÉVÉHAT Françoise Maîtres de Conférences - HDR - Université de Rennes 1

Président MAMBU Angèle Lengo Professeur - Université de Limoges

Examinateurs MAMBU Angèle Lengo Professeur - Université de Limoges EPARVIER Véronique Directeur de recherche - CNRS-Gif-sur-Yvette

Directeur de thèse GROVEL Olivier Professeur - Université de Nantes

Encadrante de thèse BERTRAND Samuel Maîtres de Conférences - HDR - Université de Nantes

Sommaire

Sommaire ...... 2

Liste des figures ...... 4

Liste des tableaux ...... 7

Annexe 1. Activités biologiques décrites pour les composés de type pyran-2-one ...... 9

Références bibliographiques ...... 10

Annexe 2. Déréplication des composés produits par la souche P. restrictum MMS417 (en mode positive) ...... 12

Références bibliographiques ...... 13

Annexe 3. Matériels et méthodes ...... 15

1. Réactifs et solvants ...... 15

2. Souches fongiques ...... 15

2.1. Séquence ITS ...... 15

2.2. Séquence β-tubuline ...... 16

2.3. Identification de la souche MMS417 par alignements de séquences avec BLAST ...... 16

3. Cultures fongiques ...... 17

3.1. Préparation des milieux de culture ...... 17

3.2. Ensemencement et incubation des cultures fongiques ...... 18

3.3. Extraction de la biomasse fongique ...... 19

4. Méthodes de chromatographies ...... 20

4.1. Chromatographie sur couche mince (CCM) ...... 20

4.2. Chromatographie liquide sous vide (CLV) ...... 20

4.3. Chromatographie liquide basse pression (Chromatographie flash)...... 20

4.4. Chromatographie liquide haute performance (HPLC) ...... 20

4.5. Chromatographie liquide haute performance (HPLC) couplée à la spectrométrie de masse haute résolution (HRMS) ...... 21

5. Analyses des acides gras par GC-MS ...... 22

5.1. Formation des esters méthyliques d’acides gras (EMAG) ...... 22

5.2. Formation de N-acyl pyrrolidides (NAP) ...... 22

5.3. Analyses GC-MS ...... 23

6. Analyse des données LC-HRMS/MS ...... 23

6.1. Prétraitement des données et détection de pics automatique ...... 23

6.2. Analyse statistiques ...... 25

6.3. Déréplication ...... 25

7. Évaluation biologiques ...... 25

7.1. Tests de cytotoxité in vitro sur lignée KB...... 25

7.2. Tests antibactériens et test protéase ...... 26

7.3. Évaluation antiparasitaires ...... 27

8. Fractionnement de l’extrait MMS417-MES-SSW ...... 28

Annexe 4. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN des 4-méthoxy-2H-pyran-2-one (TLV- 1) et 5,6-dihydro-4-méthoxy-2H-pyran-2-one (TLV-2) ...... 29

Annexe 5. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxy-2- penténoique (TLV-3) ...... 36

Annexe 6. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN de la 6S, 1’S-pestalotine (TLV-4) et de la 1’R-déhydropestalotine (TLV-5) ...... 43

Annexe 7. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN de la 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2- one (TLV-6)...... 51

Annexe 8. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β (TLV-7)...... 58

Annexe 9. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β (TLV-8)...... 66

Annexe 10. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy-pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one (TLV-10)...... 74

Annexe 11. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN de la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl- 4-méthoxy-2H-pyran-2-one (TLV-11)...... 82

Annexe 12. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R- dihydroxy-pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one (TLV-14)...... 89

Annexe 13. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S- dihydroxy-pentanyl)-2H-pyran-2-one (TLV-15)...... 97

Annexe 14. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN du 6S,1’S,2’R-LL-P880β (TLV-18) ...... 105

Liste des figures

Figure 1 : Alignement de la séquence ITS de MMS417 avec l’ensemble des séquences ITS disponibles sur les bases de données Genbank (60621169 séquences) ...... 16 Figure 2 : Alignement de la séquence ITS de MMS417 avec l’ensemble des séquences ITS disponibles sur les bases de données Genbank d’une souche de P. restrictum décrites dans l’article de Houbraken et al. 2020 ...... 17 Figure 3 : Schéma d’isolement des produits par la souche MMS417 à partir de l’extrait brut MES- SSW...... 28 1 Figure 4 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) des 4-méthoxy-2H-pyran-2-one et 5,6-dihydro-4- méthoxy-2H-pyran-2-one (mélange) ...... 31 13 Figure 5 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) des 4-méthoxy-2H-pyran-2-one et 5,6-dihydro-4- méthoxy-2H-pyran-2-one (mélange) ...... 32

Figure 6 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) des 4-méthoxy-2H-pyran-2-one et 5,6-dihydro-4- méthoxy-2H-pyran-2-one (mélange) ...... 33

Figure 7 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) des 4-méthoxy-2H-pyran-2-one et 5,6-dihydro-4- méthoxy-2H-pyran-2-one (mélange) ...... 34

Figure 8 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) des 4-méthoxy-2H-pyran-2-one et 5,6-dihydro-4- méthoxy-2H-pyran-2-one (mélange) ...... 35 1 Figure 9 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxy-2-penténoique ...... 37 13 Figure 10 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxy-2-penténoique ...... 38

Figure 11 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxy-2-penténoique ...... 39

Figure 12 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxypent-2-énoique ...... 40

Figure 13 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxypent-2-énoique ...... 41

Figure 14 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxypent-2-énoique ...... 42 1 Figure 15 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) de la 6S, 1’S-pestalotine et de la 1’R- déhydropestalotine (mélange) ...... 46 13 Figure 16 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) de la 6S, 1’S-pestalotine et de la 1’R- déhydropestalotine (mélange) ...... 47

Figure 17 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) de la 6S, 1’S-pestalotine et de la 1’R-déhydropestalotine (mélange) ...... 48

Figure 18 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) de la 6S, 1’S-pestalotine et de la 1’R- déhydropestalotine (mélange) ...... 49

Figure 19 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) de la 6S, 1’S-pestalotine et de la 1’R-déhydropestalotine (mélange) ...... 50 1 Figure 20 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) de la 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one...... 52 13 Figure 21 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) de la 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one...... 53 4

Figure 22 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) de la 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one ...... 54

Figure 23 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) de la 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one ...... 55

Figure 24 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) de la 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one ...... 56

Figure 25 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) de la 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one ...... 57 1 Figure 26 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β...... 60 13 Figure 27 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β...... 61

Figure 28 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β ...... 62

Figure 29 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β ...... 63

Figure 30 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β...... 64

Figure 31 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β ...... 65 1 Figure 32 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β ...... 68 13 Figure 33 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β ...... 69

Figure 34 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β ...... 70

Figure 35 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β ...... 71

Figure 36 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β...... 72

Figure 37 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β...... 73 1 Figure 38 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy- pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one...... 76 13 Figure 39 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy- pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one...... 77

Figure 40 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy- pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one...... 78

Figure 41 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy- pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one...... 79

Figure 42 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy- pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one...... 80

Figure 43 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy- pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one...... 81 1 Figure 44 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H- pyran-2-one...... 83 13 Figure 45 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H- pyran-2-one...... 84

Figure 46 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H- pyran-2-one ...... 85

Figure 47 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H- pyran-2-one...... 86

Figure 48 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H- pyran-2-one...... 87

Figure 49 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H- pyran-2-one...... 88 1 Figure 50 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxy-pent-3-ényl)- 2H-pyran-2-one ...... 91 13 Figure 51 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxy-pent-3-ényl)- 2H-pyran-2-one...... 92

Figure 52 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxy-pent-3-ényl)-2H- pyran-2-one ...... 93

Figure 53 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxy-pent-3-ényl)- 2H-pyran-2-one...... 94

Figure 54 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxy-pent-3-ényl)-2H- pyran-2-one...... 95

Figure 55 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxy-pent-3-ényl)- 2H-pyran-2-one...... 96 1 Figure 56 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy-pentanyl)-2H- pyran-2-one...... 99 13 Figure 57 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy-pentanyl)- 2H-pyran-2-one...... 100

Figure 58 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy-pentanyl)-2H- pyran-2-one...... 101

Figure 59 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy-pentanyl)-2H- pyran-2-one...... 102

Figure 60 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy-pentanyl)-2H- pyran-2-one...... 103

Figure 61 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy-pentanyl)-2H- pyran-2-one...... 104 1 Figure 62 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) du 6S,1’S,2’R-LL-P880β ...... 107 13 Figure 63 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) du 6S,1’S,2’R-LL-P880β ...... 108

Figure 64 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) du 6S,1’S,2’R-LL-P880β ...... 109

Figure 65 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) du 6S,1’S,2’R-LL-P880β ...... 110

Figure 66 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) du 6S,1’S,2’R-LL-P880β ...... 111

Figure 67 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) du 6S,1’S,2’R-LL-P880β ...... 112

Liste des tableaux

Tableau 1 : Composition des milieux de cultures fongiques...... 18 Tableau 2 : Gradient d’élution de méthode 1 permettant une somme réparation des métabolites spécialisés ...... 21 Tableau 3 : Gradient d’élution de méthode 2 permettant la séparation de principaux composés lipidiques ...... 22 Tableau 4 : Paramètres utilisés pour la sélection automatique des pics à l'aide de MZmine 2 ...... 24 Tableau 5 : Caractéristiques physico-chimiques de la 4-méthoxy-2H-pyran-2-one ...... 29 13 1 Tableau 6 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-2H-pyran-2-one ...... 29 Tableau 7 : Caractéristiques physico-chimiques de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-2H-pyran-2-one ...... 29 13 1 Tableau 8 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-2H- pyran-2-one ...... 30 Tableau 9 : Caractéristiques physico-chimiques de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxy-2-penténoique ...... 36 13 1 Tableau 10 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxy- 2-penténoique ...... 36 Tableau 11 : Caractéristiques physico-chimiques de la 6S, 1’S-pestalotine ...... 43 13 1 Tableau 12 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 6S, 1’S-pestalotine ...... 44 Tableau 13 : Caractéristiques physico-chimiques de la 1’R-déhydropestalotine ...... 44 13 1 Tableau 14 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 1’R-déhydropestalotine ...... 45 Tableau 15 : Caractéristiques physico-chimiques de la 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one...... 51 13 1 Tableau 16 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 6-pentyl-4-méthoxy-2H- pyran-2-one...... 51 Tableau 17 : Caractéristiques physico-chimiques du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β...... 58 13 1 Tableau 18 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β...... 59 Tableau 19 : Caractéristiques physico-chimiques du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β...... 66 13 1 Tableau 20 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β...... 67 Tableau 21: Caractéristiques physico-chimiques de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy- pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one...... 74 13 1 Tableau 22: Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S- (1’S, 2’S-dihydroxy-pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one...... 75 Tableau 23 : Caractéristiques physico-chimiques de la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H- pyran-2-one...... 82 13 1 Tableau 24 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-6S- hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one ...... 82 Tableau 25 : Caractéristiques physico-chimiques de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxy-pent-3-ényl)- 2H-pyran-2-one...... 89 7

13 1 Tableau 26 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R- dihydroxy-pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one...... 90 Tableau 27 : Caractéristiques physico-chimiques de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy-pentanyl)-2H- pyran-2-one...... 97 13 1 Tableau 28 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S- dihydroxy-pentanyl)-2H-pyran-2-one...... 98 Tableau 29 : Caractéristiques physico-chimiques du 6S,1’S,2’R-LL-P880β ...... 105 13 1 Tableau 30 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) du 6S,1’S,2’R-LL-P880β ...... 106

Annexe 1. Activités biologiques décrites pour les composés de type pyran-2- one

Les souches Activité biologique Métabolites isolés Modèle testé Références producteurs

HEK 293, PC-3, HT-29, Cytotoxique Pestalotine Phomopsis amygdali (Akay et al. 2014) MDA-MB-231

Verticillium Pyrenocine A BC-1, Vero, KB (Nilanonta et al. 2003) hemipterigenum Albatrellus SW480, SMMC-7721, (Guo et al. 2013; Zhou Aurovertin B confluens HL60, MCF-7, A549 et al. 2009) Staphylococcus aureus, Chlorohydroaspyrone methicillin-resistant S. Antibactérienne Exophiala sp. (Zhang et al. 2008) A aureus, multidrug-resistant S. aureus

Escherichia coli, 6-isovaléryl-4- Aspergillus Pseudomonas aeruginosa, (Ma et al. 2016) méthoxy-pyran-2-one tubingensis Streptococcus lactis, S. aureus Microsporum gypseum (Rukachaisirikul et al. Antifongique Pyrenocine B Penicillium paxilli SH-MU-4 2007) Botrytis cinerea, Nigrospora sp. YB- Phomalactone Aspergillus niger, (Wu et al. 2009) 141 Ophiostoma minus Antiparasitaire Aszonapyrone A Neosartorya tatenoi Plasmodium falciparum (Yim et al. 2014)

Conoideocrella (Pittayakhajonwut et al. BR-050 P. falciparum K1 luteorostrata 2009) (Cole et al. 1981; Anticancéreux Citréoviridin Penicillium charlesii L'ATPase mitochondriale Linnett et al. 1978) Système Keap-Nrf2 et (Shiono et al. 2010; Allantophomopsis Allantopyrone A facteur de nécrose Uesugi et al. 2017; lycopodina tumorale (TNF-α) Yokoigawa et al. 2015) Les AND polymérases (Ichihara et al. 1983; Solanapyrone A Alternaria solani mammifères β et λ Mizushina et al. 2002) Conoideocrella (Pittayakhajonwut et al. Anti-inflammatoire BR-050 COX-2 luteorostrata 2009) NO, PGE , iNOS, COX-2, Penicillium sp. JF- 2 Penstyrylpyrone TNF-α, IL-1β, IκB-α, NF- (Lee et al. 2013) 55 κB Aspergillus (Koch et al. 2014; Ma et Antioxidante Campyrone A radicaux chimiques DPPH tubingensis al. 2016) Concanavaline A (Con A) Trichurus de cellule T et (Fujimoto et al. 2005; Immunosuppressive Rasfonin terrophilus Lipopolysaccharide (LPS) Xiao et al. 2014) de cellule B Concanavaline A (Con A) Trichurus de cellule T et Trichurusin B (Fujimoto et al. 2005) terrophilus Lipopolysaccharide (LPS) de cellule B Antivirale Ficipyrone A Pestalotiopsis thea Virus respiratoire syncytial (Uzor et al. 2016)

Références bibliographiques

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Annexe 2. Déréplication des composés produits par la souche P. restrictum MMS417 (mode d’ionisation positive)

R Formule t m/z Monoisotopique Annoté possible Références (min) moléculaire

+ 2.13 147.065 [M+H] C6H10O4 acide 5-hydroxy-3-méthoxy-2- (Isaac et al. 1991; penténoique Larsen et al. 1998) + 2.18 129.055 [M+H] C6H8O3 5,6-dihydro-4-méthoxy-2H-pyran-2- (Gorst-Allman and one Steyn 1983) + 4.65 231.123 [M+H] C11H18O5 2'-hydroxy pestalotine isomère (Kimura et al. 1986; McGahren et al. 1973) + 5.66 229.109 [M+H] C11H16O5 LL-P880γ isomère (Kimura et al. 1986) + 5.88 185.085 [M+H] C9H12O4 8-macommélinole (Sakurai et al. 1988) + 6.09 229.108 [M+H] C11H16O5 LL-P880γ isomère (Kimura et al. 1986) + 6.52 231.124 [M+H] C11H18O5 2'-hydroxy pestalotine isomère (Ellestad et al. 1972; Kimura and Tamura 1972) + 6.58 211.059 [M+H] C10H10O5 pyran-2-one dérivative + 7.29 229.108 [M+H] C11H16O5 LL-P880γ isomère (Kimura et al. 1986)

+ 9.08 215.129 [M+H] C11H18O4 (-)-Pestalotine (Ellestad et al. 1972; Kimura and Tamura 1972) + 9.71 235.096 [M+K] C11H18O3 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one (Evidente et al. 2011)

+ 9.09 213.114 [M+H] C11H16O4 dehydropestalotine isomère (Ayer et al. 2000; Kimura et al. 1978) + 9.82 213.114 [M+H] C11H16O4 dehydropestalotine isomère (Ayer et al. 2000; Kimura et al. 1978) + 10.03 213.113 [M+H] C11H16O4 pyran-2-one dérivative + 13.75 197.119 [M+H] C11H18O3 6-pentyle-4-méthoxy-2H-pyran-2-one (Evidente et al. 2011) + 15.08 371.282 [M+H] C21H38O5 n.d. + 19.41 484.358 [M+Na] C27H43NO5 PF 1163B (Nose et al. 2000) + 19.62 467.316 [M+Na] C28H44O4 Mer-NF 8054A (Sakai et al. 1994) + 20.72 451.322 [M+NH4] C25H39NO5 aspochalasine K (Zhou et al. 2004) + 21.96 349.236 [M+H] C21H32O4 brassicicene C (Minami et al. 2009)

+ 21.97 393.317 [M+H] C28H40O ergostatetraen-3-one isomère (Kawahara et al. 1994; Ngoc Quang and Dinh Bach 2008) 22.27 472.342 [M+H]+ C H NO N-deméthylméléaroride A (Gao et al. 2017) 29 45 4 + 22.35 441.303 [M+H] C22H40N4O5 n.d. + 22.64 384.351 [M+H] C23H45NO3 n.d. + 22.98 431.289 [M+Na] C24H40O5 simplicissine (Kusano et al. 1997) + 23.22 393.312 [M+H] C28H40O ergostatetraen-3-one isomère (Kawahara et al. 1994; Ngoc Quang and Dinh Bach 2008) + 23.41 411.328 [M+H] C28H42O2 3β-hydroxyergosta-8,14,24(28)-trien- (Li et al. 2019) 7-one isomère + 23.53 393.315 [M+H] C28H40O ergostatetraen-3-one isomère (Kawahara et al. 1994; Ngoc Quang and Dinh Bach 2008) + 23.77 375.301 [M+H] C28H38 ergostahexaene isomère (Nieto and Ávila C 2008) + 23.81 486.358 [M+H] C30H47NO4 méléaroride A (Okabe et al. 2016) + 23.87 443.315 [M+H] C28H42O4 paxistérole (Nakano et al. 1988) + 23.87 393.316 [M+H] C28H40O ergostatétraene-3-one isomère (Kawahara et al. 1994; Ngoc Quang and Dinh Bach 2008) + 23.88 522.358 [M+Na] C29H47NO5 N-déméthyle PF 1163E isomère + 23.97 393.317 [M+H] C28H40O ergostatétraene-3-one isomère (Kawahara et al. 1994; Ngoc Quang and Dinh Bach 2008) + 24.07 500.374 [M+H] C29H47NO5 N-déméthyle PF 1163E isomère + 24.07 411.328 [M+H] C28H42O2 3β-hydroxyergosta-8,14,24(28)- (Li et al. 2019) triene-7-one isomère + 24.08 433.298 [M+H] C26H40O5 Curvicollide B (Che et al. 2004) 24.2 395.334 [M+H]+ C28H42O ergostatetraen-3-ol (Pang and Sterner 1993)

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Annexe 3. Matériels et méthodes

1. Réactifs et solvants

Tous les constituants entrant dans la composition des milieux de cultures ont été fournis par Becton-Dickinson (Le Pont de Claix, France) et les laboratoires CONDA (Torrejón de Ardoz Madrid, Espagne). Les solvants utilisés pour l'extraction et la purification provenaient de Carlo Erba (Val de Reuil, France) et étaient redistillés lors de chaque utilisation. L’eau ultra pure était filtrée sur un appareil de type arium® comfort (Sartorius, Göttingen, Allemagne). Les solvants utilisés pour l’HPLC-HRMS étaient de grade ULC-MS et fournis par Biosolve Chimie (Dieuze, France).

2. Souches fongiques

La souche étudiée au cours de cette thèse MMS417 a été collectées à partir à partir de zone de coquillages (coques Cerastoderma edule L. et moules Mytilus edulis L.) sur la côte atlantique (Sallenave-Namont et al. 2000).

L’identification de cette souche a été réalisée au cours de travaux antérieurs à la fois par observations microscopiques et par séquencage des régions ITS 1 et 2 et β-tubuline permettant d’attribuer cette souche à l’espèce P. restrictum J.C. Gilman & E.V. Abbott (1927) (Geigeret al. 2013). Les séquences ont été enregistrées dans GenBank® sous les codes d’accès « KU720404 » pour le séquencage ITS et « KU720398 » pour le séquencage β-tubuline. La comparaison des séquences ADN avec des séquences de souches de référence afin d’identifier l’espèce a ensuite été réalisé à l’aide de l’outil d’alignement de séquences en ligne « BLAST » (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) (Altschul et al. 1990; Johnson et al. 2008; Madden et al. 1996).

2.1. Séquence ITS Codes d’accès dans la banque de données GenBank® : KU720404 ctcccacccg tgtttatcgt accttgttgc ttcggcgggc ccgcctcacg gccgccgggg ggcttctgcc ctcgggcccg cgcccgccga agacaccatt gaacgctgtc tgaagattgc agtctgagca attagctaaa taagttaaaa ctttcaacaa cggatctctt ggttccggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgatacg taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgagtctttg aacgcacatt gcgccccctg gtattccggg gggcatgcct gtccgagcgt cattgctgcc ctcaagcacg gcttgtgtgt tgggcctccg tcctcctccc gggggacggg cccgaaaggc agcggcggca ccgcgtccgg tcctcgagcg tatggggctt cgtcacccgc tcttgtaggc ccggccggcg cttgccgaca catcaatctt ttttccaggt tgacctcgga tcaggtaggg atacccgctg aacttaagca tat

2.2. Séquence β-tubuline Codes d’accès dans la banque de données GenBank® : KU720398 caattgaggc ttcgagagaa cagcatactg acttattttc aggcaaacca ttgctggtga gcatggcctt gatggcgatg gccagtaagt cacgcacaac acacgtcgac acgaactggc ggtctgatgt tttggtatag gtacgctggt gtctccgacc tccagcgcga gcgcatgaac gtctacttca acgaggtatg tgtcatctat acagccttga tcgacctcat ctaatcatga ttcctttgtt tatctaggcc agcaacgaca agtacgttcc ccgtgccgtc ctggtcgact tggagcccgg taccatggat gctgtccgtg ccggtccctt cggcaagctc ttccgccccg acaacttcgt cttcggtcag tctggtgccg gtaacaactg ggccaagggt cactac

2.3. Identification de la souche MMS417 par alignements de séquences avec BLAST

Figure 1 : Alignement de la séquence ITS de MMS417 avec l’ensemble des séquences ITS disponibles sur les bases de données Genbank (60621169 séquences)

Figure 2 : Alignement de la séquence ITS de MMS417 avec l’ensemble des séquences ITS disponibles sur les bases de données Genbank d’une souche de P. restrictum décrites dans l’article de Houbraken et al. 2020

3. Cultures fongiques

Les cultures fongiques réalisées au cours de ces travaux ont toutes été effectuées sur milieu solide gélosé tel que décrit ci-après.

3.1. Préparation des milieux de culture

Les cultures fongiques utilisées ont été réalisées sur les milieux gélosés dont la composition est décrite dans le tableau 1. Il s’agit de 6 milieux classiques (DCA, MEA, PDA, CYA, YES, KMS) et d’un milieu original à base d’extrait de moules Mytilus edulis, développé au laboratoire afin d’étudier plus particulièrement l’influence de métabolites de moules sur la production de composés bioactifs par des souches isolées de coquillages (MES - Mussel Extract Sucrose) (Geiger et al. 2013). Deux conditions osmotiques pour les milieux ont été utilisées : l’une utilisant de l’eau distillée (DW – « Distilled Water ») et l’autre de l’eau de mer reconstituée (Reef Crystals 36 g/L) (SSW – « Synthetic Sea Water »). La gélose nutritive a été solubilisée par autoclavage après reconstitution dans de l’eau de mer à 120 oC puis 25 mL de milieu de culture ont été coulés à chaud soit dans des boites de Pétris, soit dans des Erlenmeyer de 250 mL.

Tableau 1 : Composition des milieux de cultures fongiques.

KMS MEA PDA DCA CYA YES MES

Pomme de Dextrose - Extrait de Extrait de Kohlmeyer Czapek- Extrait de terre - extrait de levure - moule - modifié extrait de malt - agar dextrose - caséine - sucrose - sucrose - solide levure-agar agar agar agar agar

CuSO4·5H2O (g) 0,005 0,005 0,005 0,005 0,006

FeSO4·7H2O (g) 0,01

MgSO4·7H2O (g) 2,4 0,5 0,5 0,5

ZnSO4·7H2O (g) 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 KCl (g) 0,5

K2HPO4 (g) 1

NaNO3 (g) 3

NH4NO3 (g) 2,4

Tampon tris (R-NH2) (g) 1,21

Glucose (=dextrose) C6 (g) 5 20 20 40

Saccharose (= sucrose) C12 (g) 30 150 150 Peptone (g) 1 Digestion enzymatique de caséine (g) 10 Extrait de moule (g) 20 Extrait de levure (g) 5 20 Extrait de malt (g) 20 Extrait de pomme de terre (g) 4 Agar (g) 20 20 15 15 15 20 20 Eau (L) 1 1 1 1 1 1 1

3.2. Ensemencement et incubation des cultures fongiques

Après solidification de la gélose, les boites de Pétri ont été ensemencées à partir de stocks de culture de la souche conservés à -20 °C et repiqués sur milieu gélose sur boîte de Pétri quelques jours avant l’ensemencement. L’ensemencement a été effectué sous hotte à flux laminaire, par prélèvements à l’aide d’une pipette Pasteur stérile de fragments de mycélium et de conidies qui ont été repiqués par dépôts en 3 points. Les cultures ont ensuite été mises à incuber dans une étuve à une température de 27 °C. L’incubation a duré en fonction du temps entre 1 et 14 jours en fonction de l’étude pour que la souche se développe sur toute la surface de la gélose et produise suffisamment de biomasse.

Tous les jours, la morphologie et la croissance du champignon ont été observé et chaque culture a été prise en photo (recto et verso).

3.3. Extraction de la biomasse fongique

3.3.1. Extraction de la biomasse fongique par micro-extraction

Une micro-extraction a été réalisée pour chaque culture en boite de Pétri, après 10 jours d’incubation. La méthode utilisée a consisté à prélever à l’aide d’un emporte-pièce des cylindres de 6 mm de diamètre sur des cultures en boites de Pétri ensemencées par 3 impacts, donnant après incubation 3 colonies confluentes. Les prélèvements ont été réalisé en 3 endroits distincts des cultures.

- Au point d’impact central (champignons âgé)

- En périphérie de la colonie (champignon jeune)

- En périphérie mais au contact d’une colonie adjacente.

Les prélèvements ont été rassemblés puis traités en deux fois par 1,5 mL de CH2Cl2/AcOEt 1:1 (v/v). L’extraction a été potentialisée par ultrason, pendant une durée de 30 min. Après filtration sur membrane de porosité 0.2 µm, les extraits organiques ont été évaporés à sec puis repris dans du MeOH de 0.1 mg/mL pour les analyser par CLHP-UV/DAD-HRMS, et de 10 mg/mL afin de les tester sur cellules KB.

3.3.2. Extraction des cultures en Erlenmeyers pour l’obtention d’un extrait brut MMS417-MES-SSW

La procédure d’extraction des cultures fongiques employée pour ces travaux correspond à une méthode couramment utilisée au laboratoire (Geigeret al. 2013; Hoanget al. 2018; Kerzaonet al. 2008). L’ensemble de la culture fongique (biomasse fongique et gélose) est extrait afin d’obtenir aussi bien les métabolites excrétés dans la gélose que ceux contenus dans le mycélium et les spores. Le choix du système de solvants d’extraction

CH2Cl2/AcOEt (1:1, v/v) permet d’accéder à une large gamme de polarité au niveau des métabolites extraits, tout en restant non miscible à l’eau pour éviter l’extraction de l’agar. L’extrait a ensuite été filtré sur membrane de cellulose régénérée (porosité 0.45µm) afin d’éliminer les morceaux de gélose, de mycélium et tous les débris de spores. Le solvant a ensuite été évaporé jusqu’à siccité de l’extrait brut. Les résidus de culture après filtration ont alors été récupérés pour une deuxième étape d’extraction par macération pendant une nuit dans le même mélange de solvants (et le même volume), afin de récupérer le maximum de molécules extractibles par ce mélange, suivie des deux même filtrations. Les deux extraits récupérés ont été additionnés pour donner un extrait brut. La double macération avec l’utilisation sur une courte durée de la sonication est un moyen supplémentaire d’obtenir de façon la plus exhaustive possible l’ensemble des métabolites spécialisés produits par les champignons.

4. Méthodes de chromatographies

Dans le but d’analyser, de purifier et d’isoler les différentes molécules produites, différentes méthodes de séparation par chromatographie ont été utilisées, de la méthode classique très simple de chromatographie sur couche mince jusqu’à des méthodes de plus en plus performantes telles que la chromatographie liquide sous vide, la chromatographie liquide basse pression ou la chromatographie liquide haute performance.

4.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)

Les chromatographies sur couche mince ont été réalisées sur des plaques d’aluminium recouvertes de gel de silice avec indicateur de fluorescence UV254 (porosité de 60 Å, épaisseur 0,2 mm, Macherey-Nagel, Düren, Allemagne). Le système de migration était choisi selon les profils des échantillons. La révélation après la migration s’est faite par différentes méthodes : en lumière visible, sous rayons ultraviolets à 254 nm et à 365 nm ainsi qu’à la vanilline sulfurique.

4.2. Chromatographie liquide sous vide (CLV)

Les CLV ont été réalisées sur phase normale de silice (porosité de 60 Å, granulométrie de 35-70 mesh) provenant des fournisseurs Macherey-Nagel (Düren, Allemagne) respectivement. Les systèmes de migration ont été choisis selon les caractéristiques des échantillons.

4.3. Chromatographie liquide basse pression (Chromatographie flash)

Au cours des étapes de purification, les chromatographies flashs a été effectuée sur un appareil de type Puriflash 430 Interchimex (Interchim, Montluçon, France). La fraction a été déposée sur une colonne sous la forme d’un dépôt sec (L’échantillon est solubilisé dans CH2Cl2, et puis séché). L’élution a été réalisée par un gradient de solvants de polarité croissante selon les caractéristiques des échantillons sur des colonnes en phase normale SiOH (column Reveleris, Silica 40 µm, 4 g; column Macherey-Nagel, Chromabond® flash RS25-SiOH) et une colonne en phase inverse constituées de silice greffé C18 (column 5µm, 6g, IRC18 Puriflash, Interchim). Les fractions de 10 mL ont été recueillies séparément dans des tubes. Après avoir réalisé les CCM, les fractions ont été rassemblées selon leur profil chromatographique.

4.4. Chromatographie liquide haute performance (HPLC)

Les séparations ont été réalisées sur une chaîne HPLC de la série Agilent 1200 (Agilent, Waldbronn, Allemagne) qui était constituée d’un dégazeur, d’une pompe quaternaire, d’un détecteur UV à barrette de diodes, d’un collecteur de fractions semi-préparatif (Agilent Technologies, 1200 séries) et d’un injecteur automatique (Hewlett Packard, 1100 séries).

Pour les différentes séparations réalisées dans ce travail, différentes colonnes ont été utilisées : des colonnes en phase normale SiOH (5 µm, 250 x 4,6 mm, Interchim, Montluçon, France, 5 µm, 250 x 10 mm, Interchim, Montluçon, France ; Luna 5 µm, 250 x 10 mm, Phenomenex, Le Pecq, France) et une colonne RP- pentafluorphenyl (column Kinetex® 5 µm F5, 100 Å, 250 x 4.6 mm, Phenomenex, Le Pecq, France). La phase mobile était choisie selon les caractéristiques des échantillons et après optimisation sur CCM.

La détection a été réalisée dans la gamme de longueurs d’ondes 200 - 600 nm. Les échantillons ont été injectés dans la colonne à l’aide d’une boucle d’injection (50, 100, 150, 200, 500, 1000 µL) et ont été élués par la phase mobile. Les échantillons sortant du système ont été collectés dans des tubes de 5, 22 ou 45 mL. L’acquisition et le retraitement des données ont été réalisés à l’aide du logiciel Chemstation B.03.01 (Agilent).

4.5. Chromatographie liquide haute performance (HPLC) couplée à la spectrométrie de masse haute résolution (HRMS) Les extraits obtenus chaque souche ont été analysés par chromatographie liquide haute performance couplé à un détecteur UV à barrettes de diodes et à un spectromètre de masse haute résolution (HPLC-UV/DAD-HRMS) afin d’identifier et de évaluer de façon semi-quantitative les molécules d’intérêt. Deux méthodes d’élution ont été utilisés pour analyser chaque extrait, l’une permettant une somme réparation des métabolites spécialisés (méthode 1), la secondaire étant adopté à la séparation de principaux composés lipidiques (méthode 2).

4.5.1 Analyse des métabolites spécialisés (Méthode 1) La séparation a été réalisé suivant un protocol déjà utilisé au laboratoire (Roullier et al. 2016). Il s’effectue sur une colonne de type C18 Kinetex 2.6 µm (2.1 x 100 mm, Phenomenex) avec une élution suivant un gradient de solvant à un débit de 0.3 mL/min sur 35 minutes. L’injection correspondait à 5 µL d’échantillon à une concentration de 1 mg/mL dans le MeOH. Les analyses de masse ont été réalisées en modes positif et négatif pour des valeurs de m/z comprises entre 100 et 1000.

Tableau 2 : Gradient d’élution de méthode 1 permettant une somme réparation des métabolites spécialisés

(Solvant A = H2O + 0.1 % acide formique ; solvant B = Acétonitrile + 0.1 % acide formique) Temps (min) Solvant A (%) Solvant B (%) 0 85 15 2 85 15 25 0 100 30 0 100 31 85 15 35 85 15

4.5.2. Analyse des lipides (Méthode 2) La séparation a été réalisé suivant un protocol déjà utilisé au laboratoire (Dos Santos Diaset al. 2017). Il s’effectue sur une colonne de type C18 Kinetex 2.6 µm avec un débit de 0.4 mL/min sur 59 minutes. Le volume injecté de 2 µL à 1 mg/mL dans l’isopropanol. Le gradient d’élution est composé d’H2O (A), de MeOH (B) et d’IPA (C), chacun modifié par 0.1 % d’acide formique et 10 mM de formiate d’ammonium. Les solvants A et B sont constamment en proportions équivalentes tout le long du gradient. Le spectromètre de masse va permettre de détecter les molécules ayant un m/z compris entre 100 et 1200.

Tableau 3 : Gradient d’élution de méthode 2 permettant la séparation de principaux composés lipidiques

(Solvant A = H2O + 0.1 % acide formique + 10 mM de formiate d’ammonium ; solvant B = MeOH + 0.1 % acide formique + 10 mM de formiate d’ammonium, solvant C = Isopropanol + 0.1 % acide formique + 10 mM de formiate d’ammonium) Temps (min) Solvant A (%) Solvant B (%) Solvant C (%) 0 37.500 37.500 25.000 5 37.500 37.500 25.000 13 27.500 27.500 45.000 45 12.365 12.365 75.270 46 0.000 0.000 100.000 53 0.000 0.000 100.000 54 37.500 37.500 25.000 59 37.500 37.500 25.000

5. Analyses des acides gras par GC-MS Afin d’analyser les acides gras par GC-MS, les extraits les contenant ont été prétraités selon les procédures ci- dessous.

5.1. Formation des esters méthyliques d’acides gras (EMAG)

Une partie d’extraits bruts obtenus par microextractions est transvasé dans les tubes avec 500 µL MeOH/HCl

(HCl 3N methanolic) completé avec 300 µL MeOH et 100 µL CHCl3. Ces tubes sont chauffés à reflux à 80 °C pendant 5h. Après refroidissement de la solution, 500 µL d’hexane sont ajoutés. Le tout est centrifugé 5 min à 300 rpm pour obtenir deux phases, phase hexane contenant les acides gras qui peuvent être convertis en esters méthyliques d’acides gras (EMAG). Le surnageant est prélevé et transvasé dans un tube préalablement taré. Après avoir enlevé le surnageant, 500 µL d’hexane sont rajouté. Le mélange est centrifugé 5 min à 300 rpm, et puis le surnageant est prélevé. Toutes les fractions hexane sont rassemblées, séché sous l’air conprimé et pesé.

L’extrait est solubilisé dans du CH2Cl2 à concentration de 1 mg/mL et placé dans un vial pour l’analyse en GC- MS.

5.2. Formation de N-acyl pyrrolidides (NAP)

Une partie des EMAG obtenus est transférée dans un tube en verre et évaporée à sec. Ensuite 300 µL de pyrrolidine et 50 µL d’acide acétique sont ajoutés. Ces tubes sont chauffés à reflux à 80 °C pendant 1h. Après refroidissement à température ambiante de la solution, 500 µL d’eau distillée et 4 mL de CH2Cl2 sont ajoutés. Ces tubes est centifugé 5 min à 300 rpm. La phase organique est récupérée, évaporée sous azote puis pesée avant analyse en GC-MS. L’extrait est solubilisé dans du CH2Cl2 à concentration de 1 mg/mL et placé dans un vial pour l’analyse en GC-MS.

5.3. Analyses GC-MS Les acides gras ont été analysés à l’aide d’un appareil de GC-MS (Hewlett Packard HP 6890 – GC system / HP 6890 – 70 eV) équipé d’une colonne SLB-5TM (60 m x 0.25 mm x 0.25 µm). Les températures de l’injecteur et du détecteur sont respectivement 250 oC et 280 oC. Un microlite a été injecté en mode splitless. La température de la colonne débute par un palier à 170 oC pendant 4 minutes, puis d’une augmentation de la température de 3 oC/min jusqu’à 300 oC (cycle = 58.33 min). Le gaz vecteur était l’hélium à un débit de 1 mL/min et le solvant delay est de 9 minutes.

6. Analyse des données LC-HRMS/MS

6.1. Prétraitement des données et détection de pics automatique Les données brutes HPLC-MS ont été converties en netCDF en utilisant le logiciel LCMS-solution Shimadzu- Version 3.60. La détection automatique des pics a été réalisée en utilisant les parameters sélectionés selon le profile donné obtenu par l’analyseur HPLC-ESI-HRMS avec le logiciel MZmine 2 (Pluskal et al. 2010). Les pics détectés à partir d’échantillons blanc (solvant ou d’échantillons d’agar non inoculés) ont été éliminés de la matrice générée.Les donnés ont été normalisé en fonction du poid d’extrait.

Tableau 4 : Paramètres utilisés pour la sélection automatique des pics à l'aide de MZmine 2

Profils lipidiques (méthode 2) Profils metabolites spécialisés (méthode 1) Parameter Step Positive ionization mode Negative ionization mode Positive ionization mode Negative ionization mode

0) Crop filter Retention time 0.66-45 min 0-45 min 0.9-24.6 min 0.9-24.6 min 1) Mass detection Mass detection, mass Centroid Centroid Centroid Centroid detector 2.1E4 1.2E4 2.1E4 1.4E4 Noise level Scans MS level 1 1 1 3) Chromatogram builder Algorithm ADAP Chromatogram ADAP Chromatogram ADAP Chromatogram ADAP Chromatogram builder builder builder builder Min group size in ≠ 2 2 4 4 of scans Group intensity 6E4 2E4 1E5 1E5 threshold Min highest intensity 2.1E4 1E4 2.1E4 2.1E4 m/z tolerance 30 ppm 20 ppm 100 ppm 100 ppm 4) Chromatogram deconvolution Algorithm Wavelets ADAP Wavelets ADAP Wavelets ADAP Wavelets ADAP S/N threshold 10 10 5 5 S/N estimator Intensity window SN Intensity window SN Intensity window SN Intensity window SN Minimum feature 20 100 1 1 height Coefficient/area 150 110 100 100 threshold Peak duration range 0.0- 10 0.0-10 0.03- 23.69 0.03- 23.69 RT wavelet range 0.0 – 0.20 0.0 – 0.07 0.01-0.5 0.01-0.5 5) Isotope peak grouper m/z tolerance 30 ppm 20 ppm 0.003 m/z 0.003 m/z Retention time 1.8 min 0.5 min 1 min 1 min tolerance Maximum charge 2 2 2 2 Representative Lowest m/z Lowest m/z Lowest m/z Lowest m/z isotope 6) Normalisation m/z tolerance 30 ppm 20 ppm 100 ppm 100 ppm RT tolerance 1.8 min 0.5 min 1.5 min (absolute) 1.5 min (absolute) Minimum standard 2E5 1E4 2E4 2E4 intensity 7) Join aligner Algorithm Ransac aligner Ransac aligner Ransac aligner Ransac aligner m/z tolerance 0.0 m/z or 30 ppm 50 ppm 100 ppm 100 ppm RT tolerance 1.8 absolute (min) 0.7 absolute (min) 1 absolute (min) 1 absolute (min) RT tolerance after 1.8 absolute (min) 0.7 absolute (min) 1 absolute (min) 1 absolute (min) correction Ransac iteractions 200000 20000 20000 20000 Minimum number of 50.0% 50.0% 50.0% 50.0% points Threshold value 1 1 1 1 Linear model 8) Duplicate Peak list filters m/z tolerance 1 ppm 1 ppm RT tolerance 0.05 absolute (min) 0.05 absolute (min) 8) Peak list rows filters Minimum peaks in a 4 4 row 9) Grap filling Algorithm Peak finder (multithreaded) Peak finder Peak finder (multithreaded) Peak finder (multithreaded) (multithreaded) Intensity tolerance 50% 30 % 30% 30% m/z tolerance 30 ppm 20 ppm 5 ppm 5 ppm Retention time 1.8 min absolute 0.7 min absolute 0.5 min 0.5 min tolerance 24

6.2. Analyse statistiques

L’analyse de données multivariée a été effectuée en utilisant SimcaP 14.1 (UMETRICS). Les variables (comprendres ici ions) d'intérêt ont été sélectionnés en fonction de leur importance variable en valeur de projection (VIP) supérieur à 3. Un modèle considère significative si des scores R2Y et Q2 est supérieur à 0.5 et la valeur de p-value est inférieur à 0.05.

6.3. Déréplication

L’indentification des composés est faite grâce aux bases de données DNP (Dictionary of Natural Products). La prédiction de formules brutes a été effectuée sur les pics détectés avec un seuil de tolérance de 0-30 ppm.

7. Évaluation biologiques

7.1. Tests de cytotoxité in vitro sur lignée KB.

La lignée KB, référencée à l’ATCC (America Type Culture Collection) sous le code CCL-17TM (Eagle 1955) est utilisée.

Des microplaques de 96 puits ont été utilisées pour les tests de cytotoxicité. Ainsi, 5 µL d’une suspension contenant environ 2 x 105 cellules/mL ont été introduit dans chacun de ces puits en évitant des agrégats. Les plaques ont ensuite été mises à incuber 48h à 37 °C, 5% de CO2.

Les extraits et fractions à tester ont été dissout dans du MeOH à concentration 1 mg/mL. 20 µL de ces solutions ont été prélevés et dilués au 1/10ème dans du BME. Les extraits ont été testés aux concentrations obtenues par des dilutions sériées de demi en demi et 50 µL de solutions aux différentes concentrations ont été introduits dans les puits à l’exception des puits périphériques. Un témoin négatif MeOH a également été réalisé par ajout de 50 µL/puits d’une solution de MeOH à 5% (v/v) dans du BME.

Après 72 h d’incubation des cultures cellulaires en plaques 96 puits en présence des échantillons à tester, 50 µL de réactif MTT (bromure de 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium) à 5 mg/mL dans du PBS sont déposés dans chaque puits, et les microplaques sont remises à incuber pendant 3 h à 3 °C, sous atmosphère enrichie à 5% de CO2. Après ce délai, le surnageant de chaque puits est éliminé et 100 µL de tampon de lyse préparés extemporanément (isopropanol, 0.04% HCl 1N) sont ajoutés dans chaque puits afin de solubiliser les cristaux de formazan formés. Après homogénéisation, les absorbances à 570 nm (longueur d’onde d’absorbance de la solution de formazan) et à 630 nm (mesure du bruit de fond) sont lues avec un spectrophotomètre (Lecteur de microplaques ELx800TM, Universal Microplate Reader, Bio-Teck® Instruments, INC).

Les extraits de champignons ont été considérés comme très actifs si la CI50 était inférieure à 10 µg/mL, moyennement actifs si elle était comprise entre 10 et 30 µg/mL, et inactifs si elle était supérieure à 30 µg/mL

(Geiger et al. 2013). Une molécule est considérée active si sa CI50 (Concentration Inhibitrice 50) est inférieure à 10 µM.

7.2. Tests antibactériens et test protéase

7.2.1. Tests antibactériens

Les souches de Staphylococcus aureus 25923, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli 25922 sont founies par laboratoire EA3826 Thérapeutiques cliniques et expérimentales des infections - Université de Nantes. Leur croissance est réalisée à 37 0C en milieu gélosé. Nous avons mis à profit la méthode de diffusion en milieu gélosé à partir de puits pour étude de la sensibilité des produits isolées (Vandepitte et al. 1994). Les produits à tester sont à concentratin 10 mg/mL dans l’éthanol pur.

Et puis, nous les diluons au 1/100 dans de l’eau (10 µL de produit + 990 µL H2O).

Une suspension bactérienne de densité équivalente au standard 0.5 de Mac Farland (108 UFC/mL) est préparée puis diluée au 1/10. 20 mL de milieu gélosé MHA sont coulés par boites de Pétri. 10 µL de la suspension à 100 µg/mL sont déposés sur chaque boite. À la surface de chaque boite, 7 disques de papier filtre stériles sont déposés (au maximum). Deux témoins sont réalisés : un témoin négatif avec 10 µL d’éthanol à 1%, et un disque d’antibiotique (gentamicine à 3 mg/mL) comme témoins positif. Les boites sont laissées 1 heures à température ambiante puis retournées et incubées à 37 0C pendant 24 heures. Après incubation, le diamètre d’inhibition est mesuré en millimètres, disque inclus. Chaque test est réalisé trois fois au cours de trois expériences successives.

7.2.2. Test protéase

La méthode plus simple à farie pour screener un éventuel effet anti quorum sensing est de screener l’effet sur la production de protéase de P. aeruginosa. P. aeruginosa possède et utilisse un vaste arsenal de facteurs de virulence. Ces derniers lui permettant de s’adapter à différents environnements et coloniser divers types d’hôtes. Ces différents facteurs de virulence sont employés par la bactérie à des niveaux différents au cours du processus infectieux. P. aeruginosa produit deux types de protéases : les métalloprotéases et les sérine-protéases. La production des protéases est régulée par le quorum sensing (Gambello et al. 1993; Gambello and Iglewski 1991).

Protocole : On a utilisé méthode diffusion pour détermination d’activité protéase. La souche produit protéase (P. aeruginosa) a été utilisé pour screener protéase. 1 mL de milieu de culture LB est été ajouté avec 100 µL produits à tester à 10 µg/mL et avec 1% (20 µL) de culture PAO1 O/N (0.4 OD à 600 nm). Toutes les cultures ont été incubées à 37 0C pendant au moins 18 heures. DMSO et acide Azithromycine (pourdre pure Sigma) ont utilisé comme control négative et positive. 100 µL de cellules libres surnageant de traité (produits et acides Azithromycine) et non traité (control négatif) PAO1 ont été chargé dans chaque puits contenant Muller Hinton Agar avec 2% lait écrémé et incubé à 37 0C pendant 24 heures.

Après incubation, l’activité protéase a déterminé par a lait écrémé plaque essai (Chu et al. 2013; Gupta et al. 1993). L’activité de protéase est été mise en évidence par la présence d’une zone d’hydrolyse de caséine entourant le puits. Le test a été effectué en doublé et son activité a été exprimée par le diamètre moyen d’une zone hydrolysé (mm) produits par les produits testés.

7.3. Évaluation antiparasitaires Leishmania infantum promastigotes (MHOM/MA/67/ITMAP-263, CNR Leishmania, Montpellier, France, expressing luciferase activity) ont été cultivé dans du milieu RPMI 140 supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (FCS), 2 mM de L-glutamine et des antibiotiques (100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine) et récoltées en phase logarithmique de croissance par centrifugation à 900 g pour 10 minutes. Le surnageant a été éliminé et a été remplacé par le même volume de milieu complet RPMI 16640 à pH 5.4 et incubé pendant 24 h à 24 oC. Les promastigotes acidifiés ont ensuite été incubés pendant 24 h à 37 oC dans un ballon ventilé pour transformer les promastigotes en amastigotes axéniques. Les effets des composés testés sur la croissance des amastigotes axéniques de L. infantum ont été évalués comme suit. Les amastigotes de L. infantum ont été incubés à une densité de 2 x 106 parasites/mL dans des plaques stériles à 96 puits avec diverses concentrations de composés dissous dans MeOH (concentration finale inférieur à 0.5% v/v), en duplicate. Les controles appropriés, du DMSO, du MeOH et de l’amphotécine ont été ajoutés à chaque série d’expériences. Après une période d’incubation de 48 h à 37 oC, chaque puits de plaque a ensuite été examiné au microscope pour détecter toute formation de pécipité. Pour estimer l’activité luciférase des amastigotes axéniques, 80 µL de chaque puits ont été transférés sur des plaques blanches à 96 puits, le réactif Steady Glow® (Promega) a été ajouté selon les instructions du fabricant et les plaques ont été incubées pendant 2 minutes. La luninescense a été mesurée dans Microbeta Luminescence Counter (PerkinElmer). La concentration efficace de 50% (EC50) a été définie comme la concentration de médicament nécesssaire pour inhiber de 50% l’activité de L. infantum amastigotes par rapport au témoin. Les valuers EC50 ont été calculées par analyse de régression non linéaire traitée sur des courbes dose-réponse, à l’aide du logiciel TableCurve 2D V5. Les valeurs EC50 réprésentent la moyenne de trois épériemences indépendantes.

8. Fractionnement de l’extrait MMS417-MES-SSW

MMS417 P. restrictum MES-SSW 11.65g

CLV, silice, Hexane/EtOAc 100/0 à 30/70 et CH2Cl2 /MeOH de 100/0 à 0/100

F5 F6 F8 388.1 mg 253.8 mg 279.6 mg

Chromatographie Chromatographie flash, Chromatographie flash, flash, silice, silice, CH2Cl2/MeOH silice, CH2Cl2/AcOEt et Hexane/acétone de CH2Cl2/MeOH 100:0 à 0:100 5-5 24.1 mg 6-3 6-4 6-6 8-6 8-7

HPLC, silice, 25.2 mg 10 mg 53.4 mg 84 mg 8.7 mg Hexan/ActOEt Chromatographie flash, HPLC, silice, Chromatographie flash, HPLC, silice, silice, Hexan/EtOAc Hexane/EtOAc C18, MeOH/H2O MeOH/H2O 3/97 HPLC, silice, 30/70 MeOH/H2O 3/97

5-5-3 6-6-1 6-6-B 3.2 mg 8.8 mg 18.5 mg 8-6-3 8-6-4 8-6-7 8-7-6 HPLC, silice, F6-3-3 F6-3-5 6-4-3 Hexan/AcOEt 36.9 mg 15 mg 5.5 mg 0.7 mg 85/15 2 mg 13.8 mg 4.7 mg HPLC, F5, HPLC, F5, HPLC, F5, HPLC, silice, 5-5-3-4 HPLC, silice, MeOH/H2O MeOH/H2O MeOH/H2O CH2Cl2/EtOAc 98/2 20/80 20/80 25/75 1.3 mg CH2Cl2/EtOAc 95/5 8-6-3-8 6-3-3-2 6-3-5-3 16.2 mg TLV-10 0.9 mg 0.5 mg TLV-3 6-6-C 8-6-7-2 8-6-7-7 27.4 mg 0.7 mg 1.4 mg

TLV-6 HPLC, silice, Hexan/EtOAc 80/20

TLV-1 TLV-2 TLV-18

TLV-14 TLV-15

6-6-C-1-5 6-6-C-4 8-6-4-6 8-6-4-8 8-6-4-11 1.3 mg 4.9 mg 0.5 mg 3.2 mg 5 mg

TLV-5 TLV-4 TLV-11 TLV-7 TLV-8

Figure 3 : Schéma d’isolement des produits par la souche MMS417 à partir de l’extrait brut MES-SSW.

Annexe 4. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN des 4- méthoxy-2H-pyran-2-one (TLV-1) et 5,6-dihydro-4-méthoxy-2H-pyran-2- one (TLV-2)

Tableau 5 : Caractéristiques physico-chimiques de la 4-méthoxy-2H-pyran-2-one

Formule développée

Formule brute: C6H6O3 Nom de la molécule: 4-méthoxy-2H-pyran-2-one Masse mono-isotopique: 126,0243 Da tR = 1.82 min HRMS/ESI: m/z 127,0416 [M+H]+

λmax : 198, 274 nm

13 1 Tableau 6 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-2H-pyran-2-one

1 13 H, ẟH (ppm) Position C, ẟC (ppm), type (multiplicité, couplage J en Hz) 2’ 164.07 C

3’ 90.30 CH 5.53, (d, 2.27) 4’ 170.20 C

103.45 CH 5’ 2 6.01, (dd, 5.81, 2.53) 151.21 CH 6’ 2 7.35 (dd, 6.1, 0.6) 4’-OCH 3 55.82 3.81, s

Tableau 7 : Caractéristiques physico-chimiques de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-2H-pyran-2-one

Formule developpée Formule brute: C H O 6 8 3 Nom de la molécule: 5,6-dihydro-4-méthoxy-2H- pyran-2-one Masse mono-isotopique: 128.0451 Da t = 2.347 min R + HRMS/ESI: m/z 129.0524 [M+H] λ : 238 nm max

13 1 Tableau 8 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-2H-pyran- 2-one

1H, ẟH (ppm) Position 13C, ẟC (ppm), type (multiplicité, couplage J en Hz) 2 166.93 C

3 90.49 CH 5.14 , s 4 173.09 C

5 27.55 CH2 2.52 (t, 6.3) 6 64.37 CH2 4.34 (t, 6.3) 4-OCH3 55.90 3.74, s

7.36 7.36 7.34 7.34 6.02 6.01 6.00 6.00 5.54 5.53 5.14 4.35 4.34 4.32 3.81 3.74 2.54 2.52 2.50

1.0

0.9

0.8 4-OCH3

0.7

0.6

0.5 4’-OCH3 0.4 NormalizedIntensity H6 0.3 H H3 5

0.2

0.1 H6’ H5’ H3’

0 0.15 0.16 0.16 1.00 2.02 0.48 3.05 2.03

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 Chemical Shift (ppm)

1 Figure 4 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) des 4-méthoxy-2H-pyran-2-one et 5,6-dihydro-4-méthoxy- 2H-pyran-2-one (mélange)

173.09 170.20 166.93 164.07 151.21 103.45 90.49 90.30 77.31 77.00 76.68 64.37 55.90 55.82 27.55

1.0

0.9

0.8

55.90 55.82 0.7 C1.0

0.9 90.49 90.30 6

1.0 0.8

0.7 0.9 0.6 4-OCH 0.8 3 0.6 0.5

0.7 NormalizedIntensity 0.4 0.6 0.3 4’-OCH 0.2 3 0.5

NormalizedIntensity 0.1 0.5 0.4 C 0 0.3 3 55.95 55.90 55.85 55.80 Chemical Shift (ppm) 0.2 NormalizedIntensity C3’ 0.4 0.1 0

90.55 90.50 90.45 90.40 90.35 90.30 90.25 Chemical Shift (ppm)

0.3 C4 0.2 C5’ C2 C6’ 0.1 C 4’ C2’ 0

180 160 140 120 100 80 60 40 20 Chemical Shift (ppm)

13 Figure 5 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) des 4-méthoxy-2H-pyran-2-one et 5,6-dihydro-4-méthoxy- 2H-pyran-2-one (mélange)

Figure 6 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) des 4-méthoxy-2H-pyran-2-one et 5,6-dihydro-4-méthoxy- 2H-pyran-2-one (mélange)

Figure 7 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) des 4-méthoxy-2H-pyran-2-one et 5,6-dihydro-4-méthoxy- 2H-pyran-2-one (mélange)

4’-OCH3 4-OCH H 3 H3 6 H5

H6’ H5’ H3’

4-OCH3 4’-OCH3 H6

H3 H3’ H5’

H6’

Figure 8 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) des 4-méthoxy-2H-pyran-2-one et 5,6-dihydro-4-méthoxy-2H- pyran-2-one (mélange)

Annexe 5. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxy-2-penténoique (TLV-3)

Tableau 9 : Caractéristiques physico-chimiques de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxy-2-penténoique

Formule developpée

Formule brute: C8H12O5 Nom de la molécule: acide 5-acétoxy-3-méthoxypent-2-énoique Masse mono-isotopique: 188.067 Da HRMS/ESI: m/z 211.0581 [M+Na]+, 227.0299 [M+K]+,

λmax : 233 nm

13 1 Tableau 10 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxy-2- penténoique

13 1 Position C, ẟC H, ẟH (ppm) (ppm), type (multiplicité, couplage J en Hz) 1 171.70 C

2 91.68 CH 5.13, s 3 174.12 C

4 31.74 CH2 3.13 (t, 6.88)

5 61.60 CH2 4.3 (t, 6.88) 1’ 170.95 C

2’ 20.91 CH3 2.06, s

3-OCH3 55.87 OCH3 3.7, s

5.13 4.30 3.70 3.13 2.06

1.0

0.9

0.8 3-OCH3 H2’

0.7

0.6

0.5

0.4 NormalizedIntensity

0.3 H5 H4 0.2 H2

0.1

0 1.13 2.06 2.96 2.03 3.00

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 Chemical Shift (ppm)

1 Figure 9 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxy-2-penténoique

174.12 171.70 170.95 91.68 61.60 55.87 31.74 20.91

0.045

0.040 C5 C4 0.035 3-OCH3 C 0.030 2’

0.025

NormalizedIntensity 0.020 C1’

0.015

C1 0.010 C3 C2 0.005

180 160 140 120 100 80 60 40 20 Chemical Shift (ppm)

13 Figure 10 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxy-2-penténoique

3-OCH3 H2’

H5 H4 H2

C2’

3-OCH3 C5

Figure 11 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxy-2-penténoique

3-OCH3 H5 H2’ H4

C2’

3-OCH3 C5

C1’ C1

Figure 12 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxypent-2-énoique

3-OCH3 H2’ H5 H4

H2’

3-OCH3

Figure 13 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxypent-2-énoique

3-OCH3 H2’

H5 H4 H2

H2’

3-OCH3

Figure 14 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) de l’acide 5-acétoxy-3-méthoxypent-2-énoique

Annexe 6. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN de la 6S, 1’S-pestalotine (TLV-4) et de la 1’R-déhydropestalotine (TLV-5)

Tableau 11 : Caractéristiques physico-chimiques de la 6S, 1’S-pestalotine

Formule developpée

Formule brute: C11H18O4 Nom de la molécule: 6S, 1’S-pestalotine Masse mono-isotopique: 214.1176 Da HRMS/ESI: m/z 215.1249 [M+H]+, 237.1087 [M+Na]+, + + 197.1147 [M+H-H2O] , 451.2274 [M+2Na] ,

λmax: 238 nm

20 o [α] D = - 80.4 (c 0.83 mg/mL, MeOH)

13 1 Tableau 12 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 6S, 1’S-pestalotine

13 1 Position C, ẟC H, ẟH (ppm) (ppm), type (multiplicité, couplage J en Hz)

2 166.67 C 3 90.01 CH 5.15 (d, 1.5) 4 173.10 C 29.60 CH 5a 2 2.8 (ddd, 17.2, 12.9, 1.8) 5b 29.60 2.25 (dd, 17.2, 3.8) 6 78.39 CH 4.3 (dt, 13.1, 4.1, 4.1) 1’ 72.47 CH 3.64 (dd, 8.1, 4.8) 32.38 CH 2’ 2 1.72 (dd, 8.2, 4.7) 27.57 CH 3’ 2 1.43, m 22.57 CH 4’ 2 1.36, m 13.95 CH 5’ 2 0.94 (d, 3.4) 4-OCH 3 56.15 3.77, m

Tableau 13 : Caractéristiques physico-chimiques de la 1’R-déhydropestalotine

Formule developpée

Formule brute: C11H16O4 Nom de la molécule: 1’R-déhydropestalotine Masse mono-isotopique: 212.1037 Da HRMS/ESI: m/z 213.111 [M+H]+, 235.0902 [M+Na]+

λmax: 202, 280 nm 20 o [α] D = + 97.5 (c 0.67 mg/mL, MeOH)

13 1 Tableau 14 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 1’R-déhydropestalotine

13 1 Position C, ẟC H, ẟH (ppm) (ppm), type (multiplicité, couplage J en Hz)

2’’ 164.24 C 3’’ 88.19 CH 5.44 (d, 2.3) 4’’ 171.20 C 5’’ 98.47 CH 6.08 (d, 2.3) 6’’ 166.15 C 1’’’ 70.80 CH 4.39 (dd, 7.8, 4.8) 34.87 CH 2’’’ 2 1.81, m 27.15 CH 3’’’ 2 1.62, m 22.38 CH 4’’’ 2 1.38, br, m 13.91 CH 5’’’ 3 0.91 (d, 4) 4’’-OCH 3 55.94 3.82, m

6.09 6.08 5.44 5.44 5.15 5.15 4.39 4.33 4.32 4.31 4.30 4.29 4.28 3.82 3.77 3.64 2.80 2.79 2.77 2.76 2.28 2.27 2.24 2.23 1.64 1.58 1.40 1.38 1.37 1.36 0.94 0.93 0.92 0.92 0.91 0.90

1.0

0.9 4’’-OCH3

0.8

0.94 0.93 0.92 0.92 0.91 0.90

0.45 0.7 4-OCH 0.40 H5’ 3 0.35 0.30 H5’’’ 0.6 0.25

0.20

4.40 4.39 4.38 4.37 4.33 4.32 4.31 4.30 4.29 4.28 NormalizedIntensity

0.15

2.28 2.27 2.24

2.23 0.10

2.84 2.84 2.81 2.81 2.80 2.79 2.77 2.76 0.5 0.05 0.09 0 0.15 0.08 0.20 3.69 3.00

0.07

1.00 0.99 0.98 0.97 0.96 0.95 0.94 0.93 0.92 0.91 0.90 0.89 0.88 0.87 0.86 0.85 0.84 5.15 5.15 Chemical Shift (ppm) 0.4 0.06 H5a 0.25

NormalizedIntensity 0.15 0.05 5.44 0.10 5.44 H 0.20 3 0.04 H1’’’ NormalizedIntensity H5b 0.20 0.03

0.15

NormalizedIntensity

3.65 3.64 3.63 3.62 H 0.10 3.61 0.02

NormalizedIntensity 0.055

3’’ NormalizedIntensity 0.15 0.3 0.10

0.050 6.09 H6.08 H 0.01 0.045 0.05 5’’ 0.10 0.05 6 NormalizedIntensity 0.040 H 0 0.15 1’ 0.05 1.33 0.035 0 0.05 1.30 0.10 0.030 2.85 2.80 2.75 Chemical Shift (ppm)

NormalizedIntensity 5.25 5.20 5.15 5.10 5.05 5.00 0.025 Chemical Shift (ppm) H 0.2 0.05 0 NormalizedIntensity 4’ 1.01 0.020

5.47 05.46 5.45 5.44 5.43 5.42 5.41 5.40 5.39 5.38 0 0.015 0 Chemical Shift (ppm) 1.02 H 0.010 1.25 4’’’ 6.100 6.095 6.090 6.085 6.080 6.075 6.070 1.01 1.30 Chemical Shift (ppm) 0.005

02.55 2.50 2.45 2.40 2.35 2.30 2.25 2.20 2.15 2.10 2.05 4.60 4.55 4.50 4.45 4.40 4.35 4.30 4.25 4.20 4.15 1.26 Chemical Shift (ppm) H Chemical Shift (ppm) 0.1 3.68 3.67 3.66 3.65 3.64 3.63 3.62 3.61 3.60 3.59 3.58 3’ Chemical Shift (ppm) H3’’’

0 1.02 1.01 1.30 1.011.30 3.29 3.97 1.26 1.331.25 0.92 2.33 2.052.13 2.01 0.72 3.69 3.00

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Chemical Shift (ppm)

1 Figure 15 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) de la 6S, 1’S-pestalotine et de la 1’R-déhydropestalotine (mélange)

34.87 32.38 29.60 27.57 27.15 22.57 22.38

0.13

173.10 171.20 166.67 166.15 164.24 98.47 90.01 88.19 78.39 77.31 77.20 77.00 76.68 72.47 70.80 56.15 55.94 34.87 32.38 29.60 27.57 27.15 22.57 22.38 13.95 13.91

0.12

0.11

0.10

0.09 0.08 C 0.07 4’’’ C2’ C5 C3’’’ 0.06

NormalizedIntensity C4’ 13.95 C 13.91 0.05 2’’’ 0.04 C3’ 0.15 0.03 0.20

0.02

56.15 55.94

0.01 0.13

0.12 0.15 0.11 36 35 34 33 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 0.10 Chemical Shift (ppm)

0.09

0.08

4-OCH0.07 3 NormalizedIntensity 0.10

173.10 171.20 166.67 166.15 164.24 4’’-OCH 0.06 NormalizedIntensity 3 0.10 0.065 0.05 0.060 0.04 C 0.055 5’ 0.03 0.05 C

NormalizedIntensity 0.050 5’’’ 0.02 0.045 0.01 0.040 C4’’ 0.035 56.25 56.20 56.15 56.10 56.05 56.00 55.95 55.90 55.85 55.80 0.030

NormalizedIntensity C 1’ Chemical Shift (ppm) 0.025 C C C 6’’ 14.22’ 14.1 14.0 13.9 13.8 13.7 13.6 13.5 13.4 0.020 C 2 Chemical Shift (ppm) 0.015 4 C C C C 0.010 2’’ 3 1’’’ 2’’’ 0.05 0.005 C 175 174 173 172 171 170 169 168 167 166 165 164 163 162 161 160 6 Chemical Shift (ppm) C5’’ C3’’

180 160 140 120 100 80 60 40 20 Chemical Shift (ppm)

13 Figure 16 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) de la 6S, 1’S-pestalotine et de la 1’R-déhydropestalotine (mélange)

Figure 17 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) de la 6S, 1’S-pestalotine et de la 1’R-déhydropestalotine (mélange)

4’’-OCH3 H5’ 4-OCH H H3 3 4’ H5’’’ H4’’’ H H3’’ 5’’ H H5b 1’’’ H3’ H6 H5a H1’ H3’’’

C5’ C5’’’ C4’C C 4’’’ 3’’’C3’ C5 C2’ C2’’’

4-OCH3 4’’-OCH3 C1’’’ C1’

C6 C3’’ C3 C5’’

C2’’ C6’’ C2 C4’’ C4

Figure 18 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) de la 6S, 1’S-pestalotine et de la 1’R-déhydropestalotine (mélange)

4’’-OCH 3 H5’ H3’’ 4-OCH H H 3 4’ H5’’’ H 3 H4’’’ 5’’ H H 5b H 1’’’ H 3’ H6 5a H H1’ 3’’’

H5’’’ H5’ H4’ H4’’’ H3’ H3’’’ H5b

H5a

H1’ 4-OCH3 4’’-OCH3 H1’’’ H6

H3 H3’’

H5’’

Figure 19 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) de la 6S, 1’S-pestalotine et de la 1’R-déhydropestalotine (mélange)

Annexe 7. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN de la 6- pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one (TLV-6).

Tableau 15 : Caractéristiques physico-chimiques de la 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one.

Formule developpée

Formule brute: C11H16O3 Nom de la molécule: 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one. Masse mono-isotopique: 196.1083 Da HRMS/ESI: m/z 197.1156 [M+H]+ λ max: 202, 282 nm

13 1 Tableau 16 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2- one.

13 1 C, ẟC H, ẟH (ppm) Position (ppm), type (multiplicité, couplage J en Hz)

2 165.14 C 3 87.45 CH 5.41,s 4 171.31C 5 99.63 CH 5.77,s 6 165.83 C 1’ 33.55 CH2 2.44 (t, 7.5, 7.5)

2’ 26.28 CH2 1.65, m

3’ 22.27 CH2 1.32, m

4’ 31.03 CH2 1.32, m

5’ 13.88 CH3 0.9, m

4-OCH3 55.77 3.80, s

TVL6.1H.esp

7.27 5.77 5.41 3.80 2.45 2.44 2.42 1.66 1.65 1.63 1.33 1.32 1.25 0.91 0.90 0.88 0.87

1.0

0.9 4-OCH 0.8 3

0.7 X 0.6

0.5 H5’ H4’ 0.4 NormalizedIntensity H3’ H1’ 0.3 H3 H5

0.2 H2’

0.1

0 0.90 0.89 2.82 1.86 2.16 4.07 3.31

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 Chemical Shift (ppm)

1 Figure 20 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) de la 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one.

171.31 165.83 165.14 99.63 87.45 77.25 77.00 76.75 55.77 33.55 31.03 26.28 22.27 13.88

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5 NormalizedIntensity 0.4 C2’ C 0.3 1’ C3’ C3 C4’ 0.2 C5 4-OCH3 C5’ C6 C4 0.1 C2 X

220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 Chemical Shift (ppm)

13 Figure 21 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) de la 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one.

H H 4-OCH3 H 4’ H H3 5 1’ H3’ 5’ H2’ X

C5’ C C 4’ 3’C C1’ 2’

4-OCH3

Figure 22 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) de la 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one

Figure 23 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) de la 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one

Figure 24 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) de la 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one

H 4-OCH 4’ H 3 H3’ 5’ H H X H3 5 1’ H2’

H5’ X H4’ H3’ H2’

H1’

4-OCH3

Figure 25 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) de la 6-pentyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one

Annexe 8. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β (TLV-7).

Tableau 17 : Caractéristiques physico-chimiques du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β.

Formule developpée

Formule brute: C11H18O5 Nom de la molécule: 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β Masse mono-isotopique: 230.1273 Da + + HRMS/ESI: m/z 213.1134 [M-H2O+H] , 231.1229 [M+H] , 253.105 [M+Na]+, 269.075 [M+K]+, 461.2378 [2M+H]+, 483.2237 [2M+Na]+,

λmax: 239 nm 20 o [α] D = - 61.71 (c 0.58 mg/mL, MeOH) -3 CD (MeOH): Δε247 - 5.2, Δε221.4 = + 3.18 (c 1.74 x 10 M, 0.2 cm cell and 0.1o full scale)

13 1 Tableau 18 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β.

13 1 C, ẟC H, ẟH (ppm) Position (ppm), type (multiplicité, couplage J en Hz)

2 167.03 C 3 89.51 CH 5.12,s 4 173.94 C 29.49 CH a. 3.05 (dd, 13.78, 16.67) 5 2 b. 2.19 (dd, 2.89, 16.99) 6 75.41 CH 4.76 (d, 12.82) 1’ 71.27 CH 3.37 (dd, 2.0, 6.73) 2’ 74.13 CH 3.80 (t, 7.05, 7.69) 35.71 CH a. 1.66, m 3’ 2 b. 1.5, m 18.78 CH a. 1.58, m 4’ 2 b. 1.4, m

5’ 13.98 CH3 0.95 (t, 7.1)

4-OCH3 56.16 3.76, s

5.12 4.76 4.74 3.82 3.80 3.78 3.76 3.38 3.37 3.08 3.05 3.02 2.21 2.21 2.18 2.17 1.67 1.66 1.64 1.60 1.58 1.52 1.51 1.50 1.40 0.97 0.95 0.94

1.0

0.9 4-OCH3

0.8

0.7

0.6 H5’ 0.5

0.4 NormalizedIntensity H3 0.3

0.2 H2’ H6 H1’ H5b H5a H3’ H4’ 0.1

0 1.00 1.03 1.08 3.031.01 1.02 1.01 2.08 1.99 3.14

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Chemical Shift (ppm)

1 Figure 26 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β.

173.94 167.03 89.51 75.41 74.13 71.27 56.16 35.71 29.49 18.78 13.98

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5 C5’ C6 NormalizedIntensity C C C 0.4 2’ 4-OCH3 3’ 4’ C C 1’ C5 0.3 3 C4

0.2 C2

0.1

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Chemical Shift (ppm)

13 Figure 27 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β.

4-OCH3 H5’ H3

H1’ H2’ H5b H6 H5a H3’ H4’

C5’ C4’

C5 C3’

4-OCH3

C6 C2’ C1’

Figure 28 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β

4-OCH3 H5’ H3

H1’ H2’ H5b H6 H5a H3’ H4’

C5’ C4’ C5 C3’

4-OCH3

C6 C2’ C1’

C2 C4

Figure 29 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β

Figure 30 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β

H3 4-OCH3 H5’

H2’ H6 H1’ H5b H5a H3’ H4’

H5’

H4’

H3’

H5b

H5a

H2’

4-OCH3 H1’

Figure 31 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'S-LL-P880β

Annexe 9. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β (TLV-8).

Tableau 19 : Caractéristiques physico-chimiques du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β.

Formule developpée

Formule brute: C11H18O5 Nom de la molécule: 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β Masse mono-isotopique: 230.128 Da HRMS/ESI: m/z 231.1225 [M+H]+, 253.1041 [M+Na]+, 269.0758 [M+K]+, 461.238 [2M+H]+, 483.2169 [2M+Na]+,

λmax: 238 nm 20 o [α] D = - 38.29 (c 1.75 mg/mL, MeOH)

-3 CD (MeOH) Δε245.6 - 1.2, Δε222.8 + 0.66 (c 4.78 x 10 M, 0.2 cm cell and 0.1o full scale)

13 1 Tableau 20 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β.

13 1 C, ẟC H, ẟH (ppm) Position (ppm), type (multiplicité, couplage J en Hz)

2 167.18 C 3 89.55 CH 5.11,s 4 173.68 C 29.30 CH a. 2.88 (dd, 13.9, 16.19) 5 2 b. 2.31 (dd, 3.53, 17.2) 6 77.88 CH 4.5 (dt, 3.85, 4.17, 12.8) 1’ 70.77 CH 3.47 (t, 3.53, 3.85) 2’ 73.78 CH 3.77 (t, 3.53, 4.27)

3’ 35.84 CH2 1.5-1.58, m

4’ 18.72 CH2 1.38-1.5, m

5’ 13.92 CH3 0.92 (t, 6.73)

4-OCH3 56.18 3.74, s

5.11 4.52 4.51 4.50 4.48 3.78 3.77 3.76 3.74 3.48 3.47 3.46 2.91 2.88 2.87 2.33 2.32 2.29 2.29 1.59 1.57 1.56 1.52 1.50 1.49 1.38 1.37 1.36 0.94 0.92 0.91

1.0

0.9 4-OCH3

0.8

0.7 H5’

0.6

0.5

0.4 NormalizedIntensity H3 0.3 H1’

H4’ 0.2 H2’ H3’ H6 H5b H5a 0.1

0 0.99 0.97 0.97 2.921.02 0.96 0.96 1.28 2.35 1.38 4.33

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 Chemical Shift (ppm)

1 Figure 32 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β

173.68 167.18 89.55 77.88 73.78 70.77 56.18 35.84 29.30 18.72 13.92

1.0

0.9

0.8

0.7 C5’

0.6 C2’ C6 C C 0.5 C 3’ 4’ C 1’ NormalizedIntensity 3 C 0.4 4-OCH3 5 C4 0.3 C2

0.2

0.1

220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 Chemical Shift (ppm)

13 Figure 33 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β

4-OCH3 H3 H5’ H1’ H2’ H3’ H4’

H6 H5a H5b

C5’ C4’

C5 C3’

4-OCH3

C6 C2’

C1’ C3

Figure 34 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β

H3 4-OCH3 H5’ H1’ H3’ H2’ H4’ H6 H5a H5b

C5’ C4’ C5 C3’

4-OCH3 C6 C2’

C1’ C3

C2 C4

Figure 35 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β

4-OCH3 H5’ H3 H1’ H2’ H3’ H4’ H6 H5a H5b

H5’

H4’ H3’

H5b

H5a

H2’

4-OCH3 H1’

Figure 36 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β.

4-OCH3 H5’ H3 H1’ H3’H4’ H2’ H5b H6 H5a

H5’

H4’

H3’

H5b

H5a

H2’

4-OCH3 H1’

Figure 37 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) du 6S, 1'R, 2'R-LL-P880β.

Annexe 10. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN de la 5,6- dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy-pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one (TLV-10).

Tableau 21: Caractéristiques physico-chimiques de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy- pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one.

Formule developpée

Formule brute: C11H16O5 Nom de la molécule: 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S- dihydroxy-pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one. Masse mono-isotopique: 228.1112 Da HRMS/ESI: m/z 229,1185 [M+H]+, 251,1012 [M+Na]+, + + 211,1073 [M+H-H2O] , 457,2288 [M+2H] , 479.2158 [M+2Na]+

λmax: 239 nm

-3 CD (MeOH): ∆ɛ247 -5.2, ∆ɛ221.4 + 3.18 (c 1.74x 10 M, 0.2 cm cellules et 0.1o fulle scale.

13 1 Tableau 22: Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy-pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one.

13 1 Position C, ẟC H, ẟH (ppm) (ppm), type (multiplicité, couplage J en Hz) 2 166.58 C

3 89.81 CH 5.14, s 4 173.32 C

a) 2.97 (dd, 13.78, 17.31) 5 29.55 CH 2 b) 2.27 (dd, 3.85, 17.31) 6 75.94 CH 4.51 (dt, 3.21, 3.21, 12.82) 1’ 74.79 CH 3.49 (dd, 2.01, 6.09) 2’ 72.62 CH 4.32 (t, 6.41) 3’ 129.24 CH 5.53 (dd, 7.69, 15.71) 4’ 130.60 CH 5.88, m 17.88 CH 5’ 3 1.74 (d, 6.41) 4-OCH 3 56.18 3.76, s

TLV10.1H.esp

7.27 5.90 5.88 5.87 5.85 5.56 5.54 5.53 5.51 5.14 4.53 4.50 4.33 4.32 4.30 3.84 3.76 3.50 3.49 3.48 3.48 3.00 2.97 2.94 2.30 2.29 2.26 2.25 1.74 1.73 1.26 0.92

1.0

0.9 4-OCH3

0.8

TLV10.1H.esp 0.11

0.10 0.09 H5a

0.7 0.08 2.97

0.07

0.06

0.05

0.04 0.6 NormalizedIntensity 0.03

0.02

0.01

0 0.5 1.00 3.05 3.04 3.03 3.02 3.01 3.00 2.99 2.98 2.97 2.96 2.95 2.94 2.93 2.92 2.91 2.90 Chemical Shift (ppm) TLV10.1H.esp 0.11 H TLV10.1H.esp 5’ 0.10

0.09 TLV10.1H.esp

0.15

0.4 0.08 0.15 H2’ NormalizedIntensity

H H 4.32 H 0.07 4’ 3’ TLV10.1H.esp 5b TLV10.1H.esp 0.15 0.11 5.54 H 5.88 0.106 H 0.06 CDCl 1’ 0.10

3 0.10 0.09 2.25 0.05 4.50 0.08 H 0.10 3.48 3 NormalizedIntensity

0.04 0.05 0.07

NormalizedIntensity NormalizedIntensity 0.3 0.06 0.03 0.05

0.05 NormalizedIntensity 0.05 0.02 0.04 0 NormalizedIntensity 1.01 0.03 0.01 4.36 4.35 4.34 4.33 4.32 4.31 4.30 4.29 4.28 4.27 4.26 4.25 Chemical Shift (ppm) 0.02

0 0 0.01 0 1.00 0.98 1.01 1.01 0 3.54 3.53 3.52 3.51 3.50 3.49 3.48 3.47 3.46 3.45 Chemical Shift (ppm) 0.99 0.2 5.95 5.90 5.85 5.80 5.75 5.70 5.65 5.60 5.55 5.50 5.45 4.65 4.60 4.55 4.50 4.45 2.35 2.30 2.25 2.20 Chemical Shift (ppm) Chemical Shift (ppm) H Chemical Shift (ppm) 2’ H1’ H H5b X H4’ H3’ 6 H5a 0.1 X X 0 0.99 1.07 1.19 1.07 1.07 3.311.06 1.06 1.04 3.30

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 Chemical Shift (ppm)

1 Figure 38 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy-pent- 3-ényl)-2H-pyran-2-one.

173.32 166.58 130.60 129.24 89.81 75.93 74.79 72.62 56.18 29.55 17.88

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5 NormalizedIntensity 0.4

0.3 C6

C2’ 0.2 C1’

C3’ C4’ C5’ 0.1 C3 C5 C4 4-OCH3 C2 0

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Chemical Shift (ppm)

13 Figure 39 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy- pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one.

Figure 40 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy-pent-3- ényl)-2H-pyran-2-one.

H3 4-OCH3 H5’

H2’ H1’ H5b H4’ H6 H5a H3’

C5’

4-OCH3 C2’ C1’ C6

C3’

C4’

C2 C4

Figure 41 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy-pent- 3-ényl)-2H-pyran-2-one.

4-OCH3 H3 H5’

H2’ H6 H1’ H4’ H5b H3’ H5a

H5’

H5b

H5a

H1’ 4-OCH3

H2’ H6

H3 H3’ H4’

Figure 42 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy-pent-3- ényl)-2H-pyran-2-one.

H H 3 4-OCH3 5’ H2’ H H6 H1’ H5b 4’ H3’ H5a

H5’

H5b

H5a H1’ 4-OCH3 H2’ H6

H3 H3’ H4’

Figure 43 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-4-méthoxy-6S-(1’S, 2’S-dihydroxy-pent- 3-ényl)-2H-pyran-2-one.

Annexe 11. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN de la 5,6- dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one (TLV-11).

Tableau 23 : Caractéristiques physico-chimiques de la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H- pyran-2-one.

Formule developpée

Formule brute: C8H14O3 Nom de la molécule: 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H-pyran-2-one. Masse mono-isotopique: 158.058 Da HRMS/ESI: m/z 159,0652 [M+H]+

λmax: 238 nm 20 o [α] D = - 30 (c 0,.2 mg/mL, MeOH)

-3 o CD (MeOH): ∆ɛ240.9 - 1.92 (c 5,06 x 10 M, 0,2 cm cellules et 0,1 fulle scale).

13 1 Tableau 24 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl- 4-méthoxy-2H-pyran-2-one

13 1 Position C, ẟC H, ẟH (ppm) (ppm), type (multiplicité, couplage J en Hz)

2 166.73 C

3 89.95 CH 5.16, s 4 172.94 C

a) 2.8 (dd, 12.78, 16.74) 5 28.84 CH 2 b) 2.28 (dd, 3.65, 17.04) 6 76.21 CH 4.51, m 1’a 3.73 (dd, 4.57, 12.17) 63.74 CH 1’b 2 3.91, m 4-OCH 3 56.18 3.77, s

5.16 4.53 4.52 4.51 4.51 4.50 4.50 4.49 3.93 3.90 3.77 3.75 3.74 3.72 2.83 2.81 2.80 2.77 2.30 2.29 2.27 2.26

1.0

0.9

4-OCH3 0.8

0.7

0.6

0.5

0.4 NormalizedIntensity

0.3 H3 H1’a 0.2 H5b H6 H1’b H5a 0.1 X X 0 1.00 0.90 1.29 2.77 0.86 0.91 0.90

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 Chemical Shift (ppm)

1 Figure 44 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H- pyran-2-one.

172.94 166.73 89.95 76.21 63.74 56.18 28.84

0.55

0.50

0.45

0.40

0.35

0.30

NormalizedIntensity 0.25

0.20

0.15

0.10 C C6 C 0.05 3 C1’ 4-OCH3 5 C4 C2

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Chemical Shift (ppm)

13 Figure 45 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H- pyran-2-one.

H1’a 4-OCH3 H3 H5b H6 H 1’b H5a

4-OCH3

C1’

Figure 46 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H-pyran- 2-one

4-OCH3 H1’a H3 H5b H1’b H5a H6

4-OCH3 C1’ C6

C2 C4

Figure 47 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H-pyran- 2-one.

4-OCH3 H3 H1’a

H5b H1’b H5a H6

H5b

H5a

H1’b 4-OCH3 H1’a

Figure 48 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H-pyran- 2-one.

4-OCH3 H3 H1’a

H5b H1’b H5a H6

H5b

H5a

H1’b 4-OCH3 H1’a

Figure 49 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) de la 5,6-dihydro-6S-hydroxyméthyl-4-méthoxy-2H-pyran- 2-one.

Annexe 1. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN de la 4- méthoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxy-pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one (TLV-14).

Tableau 25 : Caractéristiques physico-chimiques de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxy-pent-3-ényl)-2H- pyran-2-one.

Formule developpée

Formule brute: C11H14O5 Nom de la molécule: 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxy-pent-3-ényl)- 2H-pyran-2-one. Masse mono-isotopique: 226.0843 Da HRMS/ESI: m/z 227.0921 [M+H]+, 249.0743 [M+Na]+, 209.0822 [M+H- + + + - H2O] , 265.0527 [M+K] , 475.1613 [M+2Na] , 271.0804 [M+FA-H]

λmax: 280 nm 20 o [α] D = + 55.2 (c 0.42 mg/mL, MeOH)

-3 o CD (MeOH): ∆ɛ275.7 + 1.31 (c 6.2 x 10 M, 0.2 cm cellules et 0.1 fulle scale.

13 1 Tableau 26 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R- dihydroxy-pent-3-ényl)-2H-pyran-2-one.

13 1 Position C, ẟC H, ẟH (ppm) (ppm), type (multiplicité, couplage J en Hz) 2 162.7 C

3 88.35 CH 5.44 (d, 2.69) 4 171.18 C

5 100.19 CH 6.14 (d, 2.02) 6 167.3 C

1’ 73.75 CH 4.51, br, m 2’ 72.98 CH 4.51, br, m 3’ 127.1 CH 5.5 (dd, 1.34, 2.01, 15.45) 4’ 131.48 CH 5.83 (dq, 6.72, 15.45) 17.9 CH 5’ 3 1.71 (dd, 1.34, 6.72) 4-OCH 3 55.96 3.82, s

6.14 6.14 5.85 5.84 5.82 5.80 5.53 5.53 5.51 5.44 5.44 4.52 4.51 4.50 3.82 1.72 1.70 1.70

0.55

0.50

0.45

0.40

0.35

0.30 TLV14_Proton-1-1.esp

1.72 1.72 1.70 1.70

4.52 4.51 4.50 0.25 4.50 0.07 0.045 0.06

NormalizedIntensity 0.040

TLV14_Proton-1-1.esp

6.14 6.14 5.87 5.85 5.84 5.83 5.82 5.82 5.80 5.78 5.53 5.53 5.52 5.52 5.51 5.51 5.49 5.49 5.48 5.47 5.47 5.44 5.44 0.05 0.20 0.035 0.025 H 3 0.04 0.030 H5’ 0.020 H 5 0.025 Intensity Normalized 0.03 X 0.15 H /H 4-OCH 0.015 0.020

1’ 2’ 3 0.02 NormalizedIntensity 0.015 Normalized Intensity Normalized 0.010 H5’ H3’ 0.01 0.10 0.010 0.005 0 0.005 3.91

0 0 1.75 1.70 1.65 1.00 1.03 1.03 0.97 Chemical Shift (ppm) 2.11 0.05 6.1 6.0 5.9 5.8 5.7 5.6 5.5 5.4 Chemical Shift (ppm) 4.70 4.65 4.60 4.55 4.50 4.45 4.40 4.35 4.30 Chemical Shift (ppm)

0 1.01 1.05 1.051.01 2.11 3.14 3.41

9 8 7 6 5 4 3 2 1 Chemical Shift (ppm)

1 Figure 50 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxy-pent-3-ényl)- 2H-pyran-2-one

171.18 167.30 162.70 131.48 127.16 100.19 88.35 73.75 72.98 55.96 17.90

0.09

0.08

0.07

73.75 72.98 0.06

0.020

0.05 0.015

NormalizedIntensity C2’

0.04 0.010 C1’ NormalizedIntensity

0.03 0.005

75.0 74.5 74.0 73.5 73.0 72.5 0.02 Chemical Shift (ppm)

C6 4-OCH3 C4 0.01 C2 C4’ C3 C5’ C3’ C5

240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 -40 -60 Chemical Shift (ppm)

13 Figure 51 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxy-pent-3-ényl)- 2H-pyran-2-one.

4-OCH3 H5’ H3 H5 H1’/H2’ X H5’ H3’

C5’

4-OCH3

C2’ C1’

C3’ C4’

Figure 52 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxy-pent-3-ényl)-2H- pyran-2-one

4-OCH3 H5’ H3 H1’/H2’ X H5 H 5’H3’

4-OCH3 H5’ C5’ 144 120 152 125 160 C3’ C3’/H5’ 130 4-OCH3 168 C4’ C4’/H5’ C4 135 C2’ 176

140 F1 Chemical Shift (ppm) Shift Chemical F1 C1’ (ppm) Shift Chemical F1 184 C4/4-OCH3 145 C3 4.05 4.00 3.95 3.90 3.85 3.80 3.75 3.70 3.65 3.60 3.55 1.85 1.80 1.75 1.70 1.65 1.60 1.55 F2 Chemical Shift (ppm) F2 Chemical Shift (ppm) C5

C3’ C4’

C2 C6 C4

Figure 53 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxy-pent-3-ényl)-2H- pyran-2-one.

H 4-OCH3 5’ H3 H5 H1’/H2’ H X H4’ 3’

X H5’

4-OCH3

H1’/H2’

H3 H3’ H4’ H5

Figure 54 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxy-pent-3-ényl)-2H- pyran-2-one.

H5’ 4-OCH3 H H 3 5 H1’/H2’ X H H4’ 3’

X H5’

4-OCH3

H1’/H2’

H3 H3’ H5’ H5

Figure 55 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’R-dihydroxy-pent-3-ényl)- 2H-pyran-2-one.

Annexe 2. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN de la 4- méthoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy-pentanyl)-2H-pyran-2-one (TLV-15).

Tableau 27 : Caractéristiques physico-chimiques de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy-pentanyl)-2H- pyran-2-one.

Formule developpée

Formule brute: C11H16O5 Nom de la molécule: 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy- pentanyl)-2H-pyran-2-one. Masse mono-isotopique: 228.1 Da HRMS/ESI: m/z 229.1069 [M+H]+, 251.0896 [M+Na]+, 211.0969 + + - [M+H-H2O] , 479.1883 [M+2Na] , 273.0967 [M+FA-H]

λmax: 280 nm 20 o [α] D = + 63 (c 1.0 mg/mL, MeOH)

-3 o CD (MeOH): ∆ɛ281.9 + 2.042 (c 1.2 x 10 M, 0.2 cm cellules et 0.1 fulle scale.

13 1 Tableau 28 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S- dihydroxy-pentanyl)-2H-pyran-2-one.

13 1 Position C, ẟC H, ẟH (ppm) (ppm), type (multiplicité, couplage J en Hz) 2 164.12 C

3 88.4 CH 5.46 (d, 2.01) 4 171.11 C

5 100.45 CH 6.16 (d, 2.01) 6 163.19 C

1’ 73.44 CH 4.44 (d, 4.03) 2’ 72.56 CH 4.02, m 33.24 CH 3’ 2 1.43, m 1.54, m 4’ 18.91 CH 2 1.35, m 13.91 CH 5’ 3 0.93 (t, 7.39) 4-OCH 3 55.99 3.82, s

6.16 6.16 5.46 5.45 4.45 4.44 4.04 4.03 4.02 4.01 4.01 4.00 3.83 1.53 1.46 1.44 1.42 1.42 1.42 1.41 1.40 1.37 0.95 0.93 0.91

1.0

0.9 4-OCH3

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4 NormalizedIntensity H5’

0.3

0.2 H3 H5 H3’ H1’ 0.1 H2’ X H4’

0 1.02 1.00 1.05 1.07 3.24 1.47 2.18 0.93 3.35

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 Chemical Shift (ppm)

1 Figure 56 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy-pentanyl)-2H- pyran-2-one.

171.11 164.12 163.19 100.45 88.40 73.44 72.56 55.99 33.24 18.91 13.91

0.30

0.25

0.20

NormalizedIntensity 0.15

0.10

C1’ C2’ C5 C3 0.05 C3’ C5’ C2 4-OCH3 C6 C4’ C4

160 140 120 100 80 60 40 20 0 Chemical Shift (ppm)

13 Figure 57 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy-pentanyl)-2H- pyran-2-one.

100

H H 4-OCH H 5 H3 1’ 3 5’

H2’ X H4’ H3’

C5’ C4’

C3’

4-OCH3

C2’ C1’

Figure 58 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy-pentanyl)-2H- pyran-2-one.

101

4-OCH3 H3 H5’ H5 H X 1’ H4’ H3’ H2’

C5’ C4’

C3’

4-OCH3 C2’ C1’

C3 C5

C6 C2 C4

Figure 59 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy-pentanyl)-2H- pyran-2-one.

102

4-OCH3 H5’ H5 H3 H H1’ X 4’ H3’ H2’

H5’ H4’ H3’ X

4-OCH3 H2’

H1’

Figure 60 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy-pentanyl)-2H-pyran- 2-one.

103

H3 4-OCH3 H5’ H5 H4’ H1’ X H3’ H2’

H5’ H4’ H3’ X

4-OCH3 H2’ H1’

Figure 61 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) de la 4-méthoxy-6-(1’R, 2’S-dihydroxy-pentanyl)-2H- pyran-2-one.

104

Annexe 3. Caractéristiques physico-chimiques et spectres RMN du 6S,1’S,2’R-LL-P880β (TLV-18)

Tableau 29 : Caractéristiques physico-chimiques du 6S,1’S,2’R-LL-P880β

Formule developpée

Formule brute: C11H18O5 Nom de la molécule: 6S,1’S,2’R-LL-P880β Masse mono-isotopique: 230.112 Da + + HRMS/ESI: m/z 231.1193 [M+H] , 213.1109 [M+H-H2O] , 483.2134 [M+2Na]+

λmax: 238 nm 20 o [α] D = - 49.28 (c 13.25 mg/mL, MeOH) -4 CD (MeOH): ∆ɛ245.2 – 11.54, ∆ɛ221.1 + 3.08 (c 9.56 x 10 M, 0.2 cm cellules et 0.1o full scale.

105

13 1 Tableau 30 : Données C (125 MHz, CDCl3), H (500 MHz, CDCl3) du 6S,1’S,2’R-LL-P880β

13 1 Position C, ẟC (ppm), H, ẟH (ppm) type (multiplicité, couplage J en Hz) 2 166.58 C 3 89.73 CH 5.14 (d, 1.52)

4 173.40 C

a) 2.89 (ddd, 1.52, 12.88, 17.18) 29.35 CH 5 2 b) 2.32 (dd, 3.67, 16.93)

6 77.95 C 4.52 (dt, 4.04, 4.04, 12.88)

1’ 73.80 CH 3.49 (dd, 2.9, 4.17)

2’ 70.93 CH 3.8, m

3’ 35.94 CH 1.5-1.63, m 2 4’ 18.78 CH 1.38-1.5, m 2 5’ 13.94 CH 0.94 (t, 7.07) 3 4-OCH 56.16 3.76, s 3

106

TLV18.010.001.1r.esp1

5.14 5.14 4.54 4.53 4.50 3.81 3.81 3.80 3.79 3.78 3.78 3.76 3.50 3.49 3.48 2.89 2.34 2.34 2.30 2.29 1.61 1.54 1.53 1.52 1.52 1.51 1.50 1.50 0.96 0.94 H RMN 0.93

1.0 4-OCH 0.9 3

0.8

0.7

TLV18.010.001.1r.esp

0.96 0.94

TLV18.010.001.1r.esp H 0.93

2.93 2.93 2.90 2.90 2.89 2.89 2.86 2.86 5’ 0.6 0.40 0.35

0.07 0.30

0.25 0.06 H5a 0.20 0.05 Intensity Normalized 0.15

0.10 0.04 0.5 0.05

0 Normalized Intensity Normalized 0.03

TLV18.010.001.1r.esp 3.45

5.14 5.14 1.01 1.00 0.99 0.98 0.97 0.96 0.95 0.94 0.93 0.92 0.91 0.90 0.89 0.88 0.87 Chemical Shift (ppm) 0.02

0.30 0.01

0.25 0 0.4 H 0.91 Normalized Intensity Normalized 3 0.20 2.97 2.96 2.95 2.94 2.93 2.92 2.91 2.90 2.89 2.88 2.87 2.86 2.85 2.84 2.83 2.82 2.81 Chemical Shift (ppm)

TLV18.010.001.1r.esp

2.34 2.34 2.30 0.15 2.29

TLV18.010.001.1r.esp

Normalized Intensity Normalized

3.50 3.49 3.49 3.48

0.10

TLV18.010.001.1r.esp 0.15

4.54 4.53 4.52 4.51 4.50 0.3 0.05 4.49 H1’ 0.10 0.11 H 0.10 5b 0 1.00 0.09 H6 0.10 5.165 5.160 5.155 5.150 5.145 5.1400.085.135 5.130 5.125 5.120 5.115 5.110 5.105 5.100 5.095

Chemical Shift (ppm) Intensity Normalized 0.07 Normalized Intensity Normalized 0.05 0.06 0.05

0.05 Normalized Intensity Normalized 0.2 0.04 0.03

0.02 0 0 1.01 1.06 H 0.01 3’ 0 3.525 3.520 3.515 3.510 3.505 3.500 3.495 3.490 3.485 3.480 3.475 3.470 3.465 3.460 3.455 2.38 2.37 2.36 2.35 2.34 2.33 2.32 2.31 2.30 2.29 2.28 2.27 2.26 2.25 1.03 Chemical Shift (ppm) Chemical Shift (ppm)

4.57 4.56 4.55 4.54 4.53 4.52 4.51 4.50 4.49 4.48 4.47 4.46 H Chemical Shift (ppm) 2’ H4’ 0.1

0 1.00 1.03 1.10 3.05 0.95 0.79 1.04 4.86 3.29

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Chemical Shift (ppm)

1 Figure 62 : Spectre H-RMN (500 MHz, CDCl3) du 6S,1’S,2’R-LL-P880β

107

TLV18.011.001.1r.esp

173.40 166.58 89.73 77.95 77.31 77.00 76.68 73.80 70.93 56.18 35.94 29.35 18.78 13.94

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5 Normalized Intensity Normalized 0.4

0.3 4-OCH3 C1’ 0.2 C6 C2’ C4’ C5’ C3 C3’ C5 C4 0.1 C2

220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 Chemical Shift (ppm)

13 Figure 63 : Spectre C-RMN (125 MHz, CDCl3) du 6S,1’S,2’R-LL-P880β

108

4-OCH3 H5’ H3 H6 H1’ H5a H5b H3’ H4’ H2’

0 H5’/C5’ C5’ H4’/C4’ 20 C4’ H5a/C5a H5b/C5b C H /C C 5 3’ 3’ 3’ 40

H4-OCH3/C4-OCH3 4-OCH3 60 H2’/C2’ C2’ C1’ H6/C6 C6 80 H1’/C1’ H3/C3 C3

100 (ppm) Shift Chemical F1

120

140

7 6 5 4 3 2 1 0 F2 Chemical Shift (ppm)

Figure 64 : Spectre HSQC (500 MHz, CDCl3) du 6S,1’S,2’R-LL-P880β

109

4-OCH3 H5’ H3 H H1’ H H5b H 6 H2’ 5a H3’ 4’

0 C5’ C4’ 20 C5 C3’ 40

4-OCH3 60 C1’ C2’ 80 C6 C3 100

120 F1 Chemical Shift (ppm) Shift Chemical F1 140

160 C2

C4 180

200

7 6 5 4 3 2 1 0 F2 Chemical Shift (ppm)

Figure 65 : Spectre HMBC (500 MHz, CDCl3) du 6S,1’S,2’R-LL-P880β

110

4-OCH3 H5’ H3 H H1’ H H 6 H2’ H5a 5b H3’ 4’ 0

1 H5’ H4’ H3’ 2 H5b

H5a 3

H1’ 4-OCH3 H2’ 4

5 (ppm) Shift Chemical F1 H3

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 F2 Chemical Shift (ppm)

Figure 66 : Spectre COSY (500 MHz, CDCl3) du 6S,1’S,2’R-LL-P880β

111

4-OCH3 H5’ H3 H6 H1’ H5a H H3’ H4’ H2’ 5b 0

H5’ 1 H4’ H3’ 2 H5b

H5a 3 H1’ 4-OCH3 H2’ 4 H6

5 (ppm) Shift Chemical F1 H3

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 F2 Chemical Shift (ppm)

Figure 67 : Spectre NOESY (500 MHz, CDCl3) du 6S,1’S,2’R-LL-P880β

112