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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS UNIVERSIDADEESCOLA FEDERAL DE DE AGRONOMIA GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E ESCOLAMELHORAMENTO DE AGRONOMIA DE PLANTAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA

E MELHORAMENTO DE PLANTAS CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DE FUNGOS PARA A GERMINAÇÃO IN VITRO DE SEMENTES DE Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. E Epidendrum nocturnum Jacq. CARACTERIZAÇÃO(ORCHIDACEAE) MORFOLÓGICA OCORRENTES DE FUNGOS PARANO BIOMA A GERMINAÇÃO IN VITRO DE SEMENTESCERRADO DE Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. E Epidendrum nocturnum

Jacq. (ORCHIDACEAE)KELLEN, OCORRENTES CRISTHINA INÁCIO NO CERRADO SOUSA

KELLEN CRISTHINA INÁCIO SOUSA

Orientador (a): Orientadora: Prof. Dra.Prof.ª Leila GarcêsDra Leila de Araújo Garcês de Araújo

Junho – 2012

Goiânia - GO Junho – 2012 Brasil

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KELLEN CRISTHINA INÁCIO SOUSA

CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DE FUNGOS PARA A GERMINAÇÃO IN VITRO DE SEMENTES DE Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. E Epidendrum nocturnum Jacq. (ORCHIDACEAE) OCORRENTES NO BIOMA CERRADO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas, da Universidade Federal de Goiás, como exigência para obtenção do título de Mestre em Genética e Melhoramento de Plantas.

Orientadora: Prof.a Dra. Leila Garcês de Araújo Coorientador:

Prof. Dr. Sérgio Tadeu Sibov

GOIÂNIA, GO – Brasil

2012

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“Devemos lembrar que o dia de ontem faz parte da história; o futuro é um eterno enigma; e o hoje é um dom de Deus, por isso tem o nome de presente”

(Luiz Eduardo Boudakian)

À minha mãe, Sra Maria Ester, pelo amor incondicional e pela capacidade renovadora de fazer um mundo melhor a cada dia.

Ao meu pai, Sr Josué, por sua integridade estimável e seu humor sensível.

DEDICO

Aos meus queridos: tio Quim, tio avô Zé Rita e vovô Antônio Brandão. Meu avô eu não pude conhecer pessoalmente, mas sinto que o conheço de outros tempos. Atualmente estes entes queridos residem no Plano Maior, mas se fazem presentes em minha vida me instigando o desejo de ser alguém melhor e seguir em frente com serenidade e discernimento.

OFEREÇO

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AGRADECIMENTOS

Deus eu sou grata, de todo o meu coração, espírito e corpo, por me conceder, a quietude suficiente para caminhar pelas estradas da vida. Por ser meu Guia e meu Porto Seguro. Por me encher os olhos de brilho e admiração diante tantas descobertas maravilhosas. Por me proporcionar bons momentos, e também pelos “maus bocados”, pois como eu poderia apreciar o Bom se eu não conhecesse aquilo que não me faz bem?

Sou grata à Universidade Federal de Goiás pelas instalações, e à CAPES, por financiar meus estudos e minha “fome” de saber e de viver. Quero agradecer ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas, na pessoa da professora Dra Patrícia Guimarães Santos Melo, pela oportunidade de incrementar meus conhecimentos e respaldar meu anseio de estudar sempre, mais e mais.

À professora, Dra Leila Garcês de Araújo que, com graça e bondade, assumiu a missão de me orientar tanto na Graduação quanto no Mestrado. Aos professores Dr Sérgio Tadeu Sibov e Dra Letícia de Almeida Gonçalves, que me orientaram em áreas nas quais, sozinha, eu não alcançaria êxito.

Aos meus queridos pais Maria Ester e Josué por serem minhas fontes de inspiração e caráter. Ao meu irmão Antônio Netto, por ser um Ser esplêndido e por me fazer sorrir com tanta facilidade. Aos meus irmãos Diogo, Nádia e Glaucia aos quais, por generosidade divina, conquistei além de vínculos familiares. Em quantas vidas eu viver, em todas serei apaixonada por vocês, enquanto pessoas e enquanto “peças” ímpares do meu círculo de afetos.

Ao meu avô Antônio Inácio, por seu jeito manso e brasilidade apurados. Às minhas avós Virgínia e Francisca, por terem me educado na infância e na adolescência, e por trazerem consigo a grandiosidade dos Bons Costumes e da Honra.

À tia Angela, por ter me acolhido em um momento decisivo para o que vivo agora. Agradeço também às Senhoras Célia Cunha, Célia Seabra, Aparecida, Antônia Regina, Maria Janete, Célia Aparecida, Dalva e Teresinha, por se entilurem “minhas mães” de coração e pelo apoio em diversas ocasiões.

Aos professores, funcionários e amigos da Escola Municipal de Primeiro Grau Procópio Faria ou Núcleo Escolar Caxangá. Aos colegas e vizinhos do Projeto de Assentamento Itaporã do Norte em Vila Rica – MT, bem como aos companheiros da Comunidade Santa Inês, de cujas celebrações me recordo com carinho e sorrio, sorrio para não chorar por tanta saudade.

Aos colegas do Ensino Médio, que cursei no Colégio Estadual Ariston Gomes da Silva em Iporá – GO, em especial aos amigos Edson, Estevão e Renata. 7

Aos meus eternos amigos da Uni-ANHANGUERA (Goiânia-GO). Jamais esquecerei o CDBio (Centro de Distribuição de Biólogos) montado em minha casa pelos “anfitriões às avessas” Danusy, Diogo, Aline, Patrícia, Fabiano e Samir.

Aos meus padrinhos, Iraci e Gilmar, por estarem sempre por perto e desempenhando o papel que assumiram em meu Batismo. Aos Padres Pedro Casaldáliga, Fábio de Melo, Robson, Zezinho e Saraiva, vocês foram cruciais para meus dias de reencontro comigo mesma e com o Bem Maior.

Ao querido Chico Xavier, que embora eu só saiba de nome e obras, é meu referencial de fé e caridade. Aos queridos tios e primos os quais não citarei por nome, se o fizer será o mesmo que construir um gigantesco Jardim Genealógico.

A todos os amigos que conquistei por estes trajetos da vida, espero revê-los em uma das voltas que terei nesta e tantas outras existências.

Às amigas Ana Paula e Stella Cristina por formarmos um belo e animado trio de aspirantes ao Mestrado. Foi difícil, mas agora podemos sorrir de tantas “dores de cabeça” por não entender os “fenômemos” biológicos e estatísticos.

Ao querido amigo Paulo Faria que, com tantos ensinamentos e muitas risadas nos últimos três anos, auxiliou-me na caminhada.

À Flávia por ter contribuído, de modo solene, em momentos de grande dificuldade. À Dra Tatiane e ao Laboratório Multiusuário de Microscopia de Alta Resolução (LabMic) por proporcionarem a realização de um sonho dentro da Pesquisa e também uma realização pessoal.

Às amigas Vaneide e Selma, por serem tão solícitas e engraçadas. Às amigas funcionárias do ICB 1, em especial a querida Verinha que, infelismente, não mais trabalha por lá. A todos os demais amigos com os quais tenho a honra de conviver no Campus II, bem como em todas as instalações da UFG.

Não posso terminar sem agradecer, de forma suntuosa, aos caríssimos amigos do Laboratório de Genética de Microrganismos. Aqui deixo meus sinceros aplausos a uma turma que se renova, se organiza para trabalhar e se mobiliza para festejar, e que serão sempre meus queridos amigos. Agradeço a ternura que recebi de Amanda, Jacqueline, Denise, Isa, Dani, Aline, Carlos, Acássio, Ernane, Fernanda, Alini, Aldeíde, Rejane, Luciano, Daniela, Talita, Diego, Lívia e a todos os que passaram por mim e deixaram seus vestígios de carinho.

Termino por dizer que a amizade e o trabalho em equipe fizeram de mim um Ser Renovado. Ter amigos é cavalgar por entre pastagens verdes em pleno inverno, é se banhar nas águas mais profundas da felicidade, e é por ter amigos que eu quero continuar desvendando os mistérios da vida.

Aos tantos integrantes importantes nesta jornada, obrigada!

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SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ...... 10 LISTA DE TABELAS ...... 12 RESUMO ...... 13 ABSTRACT ...... 14 1 INTRODUÇÃO ...... 15

2 REFERENCIAL TEÓRICO ...... 18 2.1 FAMÍLIA ORCHIDACEAE ...... 18 2.1.1 Características das orquídeas ...... 18 2.1.2 Orquídeas no Cerrado ...... 20 2.1.3 As espécies Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. e Epidendrum nocturnum Jacq ...... 21 2.1.4 Formação de cápsulas e sementes de orquídeas ...... 23 2.2 FUNGOS MICORRÍZICOS ...... 26 2.2.1 Micorrizas ...... 26 2.2.2 Micorrizas Orquidóides ...... 27 2.2.3 Identificação de Fungos Micorrízicos Rizoctonioides ...... 28 2.2.4 Associação entre Fungos micorrízicos e orquídeas ...... 29 2.3 GERMINAÇÃO IN VITRO DE SEMENTES DE ORQUÍDEAS ...... 30 2.3.1 Germinação assimbiótica ...... 30 2.3.2 Germinação simbiótica ...... 31

3 MATERIAL E MÉTODOS ...... 33 3.1 COLETA DO MATERIAL VEGETAL ...... 33 3.2 ISOLAMENTO DOS FUNGOS ...... 34 3.3 IDENTIFICAÇÃO E MANUTENÇÃO DOS ISOLADOS ...... 34

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3.4 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DOS ISOLADOS ...... 35 3.4.1 Características qualitativas ...... 35 3.4.2 Características quantitativas ...... 36 3.4.2.1 Diâmetro do isolado ...... 36 3.4.2.2 Taxa de crescimento do isolado ...... 36 3.4.2.3 Células monilioides e hifas em microscopia óptica e Microscopia 36 Eletrônica de Varredura (MEV) ......

3.4.2.4 Diâmetro da hifa vegetativa e condição nuclear ...... 37 3.5 TESTE ENZIMÁTICO PARA POLIFENOL OXIDASE ...... 38 3.6 HISTOLOCALIZAÇÃO DOS FUNGOS NAS RAÍZES ...... 40 3.7 TESTE DE VIABILIDADE DAS SEMENTES ...... 41 3.7.1 C. saintlegerianum ...... 41 3.7.2 E. nocturnum ...... 42 3.8 CULTIVO SIMBIÓTICO IN VITRO...... 42 3.8.1 Cultivo simbiótico de sementes de E. nocturnum conduzido com 42 escuro inicial e transferência para fotoperíodo ...... 3.8.2 Cultivo de sementes de Cyrtopodium saintlegerianum e E. 43 nocturnum conduzidos em fotoperíodo ......

3.8.2.1 Meios de cultivo ...... 43 3.8.2.2 C. saintlegerianum ...... 44 3.8.2.3 E. nocturnum ...... 46 3.9 CARACTERIZAÇÃO DA INTERAÇÃO FUNGO-PLANTA ...... 47 3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA ...... 47

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 48 4.1 IDENTIFICAÇÃO DOS ISOLADOS FÚNGICOS DE C. saintlegerianum E DE E. nocturnum ...... 48 4.1.1 Isolados não micorrízicos ...... 49 4.1.2 Isolados micorrízicos ...... 52

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4.2 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DOS ISOLADOS MICORRÍZICOS ...... 56

4.2.1 Características qualitativas ...... 56 4.2.2 Características quantitativas ...... 63 4.2.2.1 Diâmetro e taxa de crescimento dos isolados ...... 63 4.2.2.2 Condição nuclear e diâmetro de hifa vegetativa; presença, formato e 68 tamanho de células monilioides dos isolados ......

4.3 TESTE ENZIMÁTICO PARA POLIFENOL OXIDASE ...... 72

4.4 HISTOLOCALIZAÇÃO DE PELOTONS EM RAÍZES DE C. 78 saintlegerianum E E. nocturnum ...... 4.5 VIABILIDADE DE SEMENTES DE C. saintlegerianum E E. 85 nocturnum ......

4.6 GERMINAÇÃO SIMBIÓTICA IN VITRO ...... 88 4.6.1 Cultivo simbiótico de sementes de E. nocturnum em escuro inicial e 88 em fotoperíodo ...... 4.6.2 Cultivo simbiótico de sementes de C. saintlegerianum em 90 fotoperíodo ......

4.7 CARACTERIZAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO MICORRÍZICA PARA C. 102 saintlegerianum ......

5 CONCLUSÕES ...... 107

6 REFERÊNCIAS ...... 108

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Aspecto geral de plantas de Cyrtopodium saintlegerianum (A e B) e de Epidendrum nocturnum (C e D)...... 22

Figura 2 Frutos ou cápsulas e sementes de Cyrtopodium saintlegerianum (A, C e E) e Epidendrum nocturnum (B, D e F)...... 24

Figura 3 Frequência de Isolados Fúngicos obtidos de C. saintlegerianum e E. nocturnum identificados com base nas características morfológicas propostas por Hanlin (1990), Currah & Zelmer (1992) e Barnett e Hunter (2003)...... 48

Figura 4 Isolados pertencentes ao gênero Xylaria sp., oriundos de C. saintlegerianum crescidos em CMA por vinte dias...... 51

Figura 5 Isolados rizoctonioides pertencentes ao gênero Epulorhiza sp. obtidos da espécie C. saintlegerianum...... 53

Figura 6 Isolados rizoctonioides dos gêneros Epulorhiza sp. (A-E) e Rhizoctonia sp. (F e G) obtidos de E. nocturnum...... 55

Figura 7 Características morfológicas dos isolados Cs02, Cs10 e Cs21 de C. saintlegarianum cultivados em BDA...... 57

Figura 8 Características morfológicas dos isolados Cs16 e Cs18 pertencentes ao gênero Xylaria sp. procedentes da espécie C. saintlegerianum...... 59

Figura 9 Características morfológicas dos isolados En02, En03, En05, En07 e En24 de E. nocturnum cultivados em BDA...... 61

Figura 10 Teste de polifenol oxidase nos isolados rizoctonioides e pertencentes ao gênero Xylaria sp., oriundos de C. saintlegerianum...... 70

Figura 11 Produção de polifenol oxidases por isolados micorrízicos de Cyrtopodium vernum (A-D) e fitopatogênicos de arroz e feijão (E-J)...... 73

Figura 12 Produção de polifenol oxidases por isolados micorrízicos de Cyrtopodium vernum (A-D) e fitopatogênicos de arroz e feijão (E-J)...... 75

Figura 13 Isolados micorrízicos de E. nocturnum avaliados para a produção de polifenol 77 oxidases......

Figura 14 Disposição de pelotons em raízes de C. saintlegerianum (A e C) e E. 79 nocturnum (B e D)......

Figura 15 Histolocalização de fungos nas raízes ( A e C) e habitat natural de C. saintlegerianum (B) e E. nocturnum (D)...... 81

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Figura 16 Histolocalização de fungos nas raízes C. saintlegerianum (A e B) e E. nocturnum (C e D)...... 82

Figura 17 Presença de cristais de oxalato de cálcio, do tipo ráfide, no córtex radicular de C. saintlegerianum (A) e E. nocturnum (B)...... 83

Figura 18 Microscopia eletrônica de varredura em raízes de C. saintlegerianum (A-C) e E. nocturnum (D-F)...... 84

Figura 19 Teste de trifeniltetrazólio (TTC) em sementes de C. saintlegerianum (A) e E. nocturnum (B), mostrando a porcentagem de sementes com embrião viável...... 85

Figura 20 Sementes de C. saintlegerianum (A e B) e de E. nocturnum (C e D) submetidas à solução de TTC...... 86

Figura 21 Sementes de C. saintlegerianum em associação com fungos (A, C, D e F) e tratamento controle (B e E) em Ágar-Aveia-Padrão (AAP)...... 92

Figura 22 Experimento 1 de germinação simbiótica de C. saintlegerianum, em meio AAP, com a porcentagem de sementes nos estádios 0= sementes não germinadas; 1= Embriões intumescidos e presença de rizoides, a partir deste estádio considera-se germinação; e 2= Ruptura do tegumento. Foram avaliadas entre 100 e 150 sementes para cada repetição de cada tratamento...... 94

Figura 23 Experimento 2 de germinação simbiótica de C. saintlegerianum, em meio AAP...... 96

Figura 24 Porcentagem de sementes de C. saintlegerianum germinadas (somatória dos estádios 1 e 2) em meio AAP...... 98

Figura 25 Sementes de C. saintlegerianum em associação com fungos rizoctonioídes após 270 dias de cultivo in vitro...... 100

Figura 26 Sementes de C. saintlegerianum em associação como com o gênero Xylaria sp. (A) e fungos rizoctonioides (B-D)...... 103

Figura 27 Sementes de C. saintlegerianum, germinadas ou intactas, analisadas em MEV...... 105

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Fungos utilizados no teste para a produção de polifenol oxidase em meio de cultivo acrescido com ácido tânico a 5% ...... 39 Tabela 2 Comparação dos componentes entre os meios de cultivo Ágar Aveia Padrão (AAP), Ágar Aveia Modificado (AAM) e Knudson C (KC). As medidas dos componentes estão dispostas em miligramas por litro de água destilada e deionizada ...... 44 Tabela 3 Isolados fúngicos, e suas respectivas plantas de origem, utilizados na germinação de sementes de C. saintlegerianum para testar a especificidade da interação fungo-planta ...... 45 Tabela 4 Isolados cultivados por sete dias em BDA e utilizados como inóculo para a germinação de sementes de E. nocturnum ...... 46 Tabela 5 Avaliação das características morfológicas qualitativas como presença de micélio aéreo, formato da margem, aspecto e cor do micélio dos isolados rizoctonioides de C. saintlegerianum e E. nocturnum, e também dos isolados de Xylaria sp. obtidos de C. saintlegerianum .... 58 Tabela 6 Avaliação de diâmetro e taxa de crescimento dos isolados; diâmetro horizontal (DH) e vertical (DV), em centímetros, após 72 h de crescimento em CMA e BDA; taxa de crescimento horizontal (TCH) e vertical (TCV), em mm/h-1, após três intervalos de tempo, 72, 144 e 216 h de crescimento dos isolados em BDA e CMA. (Isolados Cs02, Cs10 e Cs21 de Epulorhiza sp.; Cs16 e Cs18 de Xylaria sp.; En02, En03 e En05 de Epulorhiza sp.; e En07 e En24 de Rhizoctonia sp...... 65 Tabela 7 Dados microscópicos para condição nuclear e diâmetro das hifas vegetativas para os isolados rizoctonioides de C. saintlegerianum e E. nocturnum, e para os dois isolados de Xylaria sp. de C. saintlegerianum microcultivados em BDA por cinco dias; e medidas de células monilioides dos isolados rizoctonioides crescidos por dois meses em CMA ...... 69

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RESUMO SOUSA, K. C. I. Caracterização morfológica de fungos para a germinação in vitro de sementes de Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. e Epidendrum nocturnum Jacq. (Orchidaceae), ocorrentes no Cerrado. 2012. 127 f. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas) – Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2012. 1

O Brasil possui entre 2500 e 3000 espécies de orquídeas, das quais cerca de 300 são encontradas em áreas de Cerrado. Cyrtopodium saintlegerianum (epífita) e Epidendrum nocturnum (rupícola) ocorrem em áreas antropizadas de Cerrado e Cerrado Rupestre, respectivamente. As orquídeas possuem associação micorrízica com fungos rizoctonioides, e fungos endofíticos também podem ser encontrados nessas plantas. Os fungos rizoctonioides são utilizados para a germinação simbiótica in vitro de sementes de orquídeas, tendo em vista a conservação das espécies vegetais e fúngicas. O presente trabalho objetivou o isolamento e a caracterização morfológica de fungos oriundos do sistema radicular de C. saintlegerianum e E. nocturnum, visando a germinação simbiótica in vitro de suas sementes. Foram obtidos três isolados de Epulorhiza sp. para C. saintlegerianum, e para E. nocturnum obteve-se três de Epulorhiza sp. e dois de Rhizoctonia sp. Das raízes de C. saintlegerianum também foram obtidos dois isolados de Xylaria sp. Houve diferença entre os isolados de Epulorhiza sp. oriundos de C. saintlegerianum e os originários de E. nocturnum quanto as características morfológicas e enzimáticas. Os fungos micorrízicos foram histolocalizados, por microscopia óptica e eletrônica de varredura, em raízes de ambas as espécies. A viabilidade de sementes foi realizada pelo teste do cloreto de tetrazólio e verificou-se 80,3 e 32,33% de embriões viáveis para C. saintlegerianum e para E. nocturnum, respectivamente. Não houve germinação simbiótica in vitro de E. nocturnum devido a baixa viabilidade das sementes. Para as sementes de C. saintlegerianum foram realizados dois experimentos de germinação simbiótica, ambos em fotoperíodo de 16/8 h (Luz/Escuro) a 26°C ± 2°C. Os tratamentos foram dois isolados de Xylaria sp., três fitopatogênicos (Rhizoctonia solani de feijão e R. oryzae de arroz), e três micorrízicos de C. saintlegerianum, dois de Cyrtopodium vernum Rchb.f. & Warm., e um de E. nocturnum. Foram testados três meios de cultivo, mas somente o meio agar aveia padrão proporcionou a germinação. Verificou-se que o isolado En07 de Rhizoctonia sp. oriundo de E. nocturnum foi o melhor para germinar as sementes com 81,64 e 90,73% de germinação nos experimentos 1 e 2, respectivamente. Observou-se que um isolado não específico, dois isolados fitopatogênicos e um específico foram eficientes em germinar as sementes de C. saintlegerianum. Portanto, para a germinação simbiótica in vitro de C. saintlegerianum não houve especificidade entre esta orquídea e um único fungo rizoctonioide. Estes resultados indicam que C. saintlegerianum pode ser propagada utilizando fungos rizoctonioides, o que facilita futuros programas de reintrodução e comercialização da espécie. Palavras-chave: germinação simbiótica; especificidade micorrízica; orquídeas tropicais ______

1Orientador: Prof. Dra. Leila Garcês de Araújo, EA-UFG.

Co-orientador: Prof. Dr. Sérgio Tadeu Sibov, EA-UFG.

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ABSTRACT SOUSA, K. C. I. Morphological characterization of fungi for in vitro seed germination of Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. and Epidendrum nocturnum Jacq. (Orchidaceae), occurring in Cerrado. 2012. 127 f. Dissertation (Master’s in Plant Breeding), Federal University of Goiás, UFG, Goiânia, 2012.

ABSTRACT In Brazil, 2500 to 3000 species of orchids have been reported to occur, of which 300 are found in the “cerrado” region. The orchids Cyrtopodium saintlegerianum (epiphyte) and Epidendrum nocturnum (rupicola) occur in areas anthropized of cerrado and cerrado rupestre, respectively. The orchids posses mycorrhizal association with rhizoctonia-like and endophytic fungi. The identification of these fungi can be done by microscopic and morphological characters. Root infecting fungi also are utilized for in vitro symbiotic germination of orchid seeds, aiming the conservation of plant species and fungi. The objective of the present investigation was isolation and morphological characterization of mycorrhizal and endophytic fungi originating from roots of C. saintlegerianum and E. nocturnum, as well as symbiotic in vitro seed germination. Three isolates of Epulorhiza sp. from each one of C. saintlegerianum, and E. nocturnum and two of Rhizoctonia sp. from E. nocturnum were obtained. Also, two isolates of Xylaria sp. were obtained from roots of C. saintlegerianum. There were, however, differences among isolates Epulorhiza sp. of C. saintlegerianum and of the E. nocturnum, in relation to morphological and enzymatic characters. The fungus was localized in root tissues of both species by optical and scanning electronic microscopes. The seed viability was tested by tetrazolium chloride and found 80.3 and 32.33% viable embryos of C. saintlegerianum and E. nocturnum, respectively. There was no in vitro symbiotic germination of E. nocturnum due to low seed viability. Two experiments of symbiotic germination of C. saintlegerianum seeds were conducted, both under photoperiods of 16/8 h (light/dark) at 26°C ± 2°C. The treatments were two isolates of Xylaria sp., three plant pathogens (Rhizoctonia solani of common beans and R. oryzae of rice ), and three mycorrhiza of C. saintlegerianum, two of Cyrtopodium vernum, and one of E. nocturnum. Of three culture media tested, germination was obtained only in oat meal agar culture. The isolate En07 of Rhizoctonia sp. from E. nocturnum was found better for seed germination with 81.64 and 90.73% of germination of experiments 1 and 2, respectively. One non-specific isolate, two plant pathogenic isolates and one specific isolate were efficient for seed germination of C. saintlegerianum. On the other hand, for symbiotic in vitro seed germination of C. saintlegerianum, there was no specificity between this orchid and only one rhizoctonia-like fungus. These results showed that C. saintlegerianum can be propagated utilizing different root infecting fungi, which facilitates future programs of reintroduction and commercialization of species.

Key words: symbiotic germination; mycorrhizal specificity; tropic orchids

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1Adviser: Prof. Dra. Leila Garcês de Araújo, EA-UFG.

Co- Adviser: Prof. Dr. Sérgio Tadeu Sibov, EA-UFG.

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1 INTRODUÇÃO A família Orchidaceae é uma das maiores e mais diversificadas do reino vegetal. Sua distribuição é cosmopolita, tendo na América e na Ásia os seus principais centros de diversidade (Dressler, 1993; Ferreira et al., 2010). O Brasil possui entre 2500 e 3000 espécies de orquídeas que ocorrem em todos os tipos de vegetação e clima (Dressler, 1981; Colombo et al., 2004). Contudo, a Mata Atlântica e o Cerrado são as regiões mais ricas em biodiversidade. Cerca de 300 espécies de orquídeas estão distribuídas em áreas de Cerrado (Pabst & Dungs, 1975; Batista & Bianchetti, 2003; Batista et al., 2005). As orquídeas podem ser terrestres, epífitas e rupícolas, entretanto duas em cada três espécies são encontradas crescendo sobre o tronco de árvores (Dressler, 1981). De acordo com Dressler (1993) a subfamília Epidendroideae abrange 50% dos gêneros de orquídeas, e é composta principalmente por plantas epífitas, embora possua exemplares terrestres e rupícolas. No Brasil, Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. ocorre como epífita em palmeiras dispersas em áreas antropizadas de Cerrado (Menezes, 2000), mas pode ser encontrada com terrestre na Floresta Amazônica e na Caatinga (Batista & Bianchetti, 2003; 2004; 2005; 2006). A espécie Epidendrum nocturnum Jacq. ocorre como epífita, rupícola e terrestre, encontra-se registrada na flora da Floresta Amazônica (Bonates 2007; Medeiros & Jardim, 2011). Têm-se, ainda, notificações de E. nocturnum no Sul, em zona de vegetação mista entre floresta ombrófila densa e savana estacional ou Cerrado (Stancik et al., 2009) e no centro do país, com regiões de planalto e prevalência de Cerrado (Batista & Bianchetti, 2003; 2005; Batista et al., 2005; Royal, 2006; Barbero, 2007). A comercialização de orquídeas com potencial ornamental e a conservação de espécies ameaçadas de extinção enfrentam alguns percalços, como por exemplo, os baixos níveis de germinação das sementes sem a presença de simbiontes compatíveis (Hossain et al., 2010). Na natureza a maior parte das orquídeas associa-se à fungos micorrízicos rizoctonioides visando aumentar a absorção de água e nutrientes, seja durante a germinação e desenvolvimento inicial das protocormos e plântulas, ou até mesmo na fase adulta, nos períodos de seca e floração (Rasmussen & Rasmussen, 2007; 2009). Além disso, estes fungos promovem tolerância a estresses de natureza biótica como fitopatógenos e/ou 17

abiótica, incluindo estresse hídrico, salinidade e metais pesados (Ramussen, 2002; Peterson et al., 2004; Arnold, 2007; Dearnaley, 2007; Maia, 2010). As orquídeas utilizam-se da digestão enzimática de hifas enoveladas, os pelotons, como fonte de energia durante o estágio heterotrófico do seu ciclo de vida. Esse fenômeno é conhecido por micoheterotrofismo (Pereira & Kasuya, 2010). Os fungos micorrízicos presentes nas raízes de diversas espécies de orquídeas contribuem para a manutenção da biodiversidade, tanto dos microrganismos, quanto das espécies vegetais (Smith & Read, 1997; Zettler et al., 1997; Otero et al., 2002; Massey & Zettler, 2007; Sequeira, 2007; Aggarwal & Zettler, 2010). A caracterização morfológica e a observação de dados microscópicos como a espessura de hifas, presença de células monilioides e a condição nuclear, são os métodos mais utilizados para identificar os fungos rizoctonioides (Currah & Zelmer, 1992; Zelmer & Currah, 1995; Rasmussen & Whigham, 2002; Athipunyakon et al., 2004a; 2004b; Peterson et al., 2004; Rasmussen & Rasmussen, 2009; Agarwall, 2010). Pesquisas com orquídeas brasileiras demonstram a ocorrência de três gêneros anamórficos, Rhizoctonia sp., Ceratorhiza sp., e Epulorhiza sp. (Pereira et al., 2003; Nogueira et al., 2005; Linhares, 2006; Valadares et al., 2008; Pereira et al., 2009; Pereira et al., 2011; Valadares et al., 2011). Estudos com Oncidium flexuosum Sims (Pereira et al., 2005a) sugerem uma estreita especificidade com Ceratorhiza sp. Pereira et al. (2009) observaram que há especificidade na interação de isolados de Epulorhiza sp. com sementes de Epidendrum secundum Jacq. Por outro lado, Otero et al. (2004) observaram germinação superior a 80% em sementes de Tolumnia variegata (Sw.) Braem em associação com fungos micorrízicos de Ionopsis utricularioides (Sw.) Lindl. Zettler et al. (2007) avaliaram a interação de Epulorhiza repens (Bernard) Moore, isolada de Spiranthes brevialabris Lind., com sementes de Epidendrum nocturnum e demonstraram que a não houve especificidade, visto que as sementes de E. nocturnum germinaram e desenvolveram plântulas in vitro. Em sua maioria, as pesquisas sobre interação simbiótica entre fungos e orquídeas estão limitadas às plantas terrestres e aos ambientes temperados. Pouca atenção é direcionada para espécies tropicais, visto que ainda são encontradas em abundância em seu habitat natural. Ainda há pouca informação científica sobre espécies epífitas e rupícolas do Cerrado, evidenciado a necessidade de trabalhos que verifiquem a presença de fungos micorrízicos in situ e a germinação simbiótica in vitro de sementes destas espécies. A caracterização de fungos micorrízicos associados ao sistema radicular de orquídeas, bem como o seu uso em 18

programas de propagação simbiótica, é de grande importância para a reintrodução, conservação e manejo das espécies vegetais e fúngicas.

Diante do exposto, o presente estudo teve como objetivo principal a caracterização morfológica de fungos para a germinação de sementes das orquídeas C. saintlegerianum e de E. nocturnum. Os objetivos específicos foram: isolar, manter, e caracterizar, morfologicamente e enzimaticamente, fungos rizoctonioides e endofíticos das duas espécies de orquídea; histolocalizar pelotons no córtex radicular destas espécies; testar a eficiência destes fungos e de fitopatógenos (Rhizoctonia sp.) em germinar as sementes viáveis das duas orquídeas; e avaliar se existe especificidade para a germinação simbiótica de C. saintlegerianum e de E. nocturnum.

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2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 FAMÍLIA ORCHIDACEAE

A família Orchidaceae é considerada a maior dentre as famílias de monocotiledôneas e estima-se que tenha entre vinte e trinta mil espécies distribuídas em aproximadamente novecentos gêneros (Pabst & Dungs, 1975; Dressler, 1981; 1993; 2005; Van Den Berg & Azevedo, 2005). A família Orchidaceae pertence à Ordem Asparagales, Classe Liliopsida, Divisão Magnoliophyta, ao Reino Plantae e ao Domínio Eukarya. Apresentam maior diversidade nas regiões tropicais e concentram-se nas áreas mais úmidas, em especial nos trópicos americanos e no Sudeste asiático (Pereira & Ribeiro, 2004).

No continente americano as florestas de altitude, encontradas na faixa média dos Andes, a oeste, e na Serra do Mar, a leste, são as mais ricas em quantidade de espécies (Pereira & Ribeiro, 2004; Van Den Berg & Azevedo, 2005). Para o Brasil são descritos cerca de duzentos gêneros e três mil espécies (Pabst & Dungs, 1975; Joly, 2002; Batista & Bianchetti, 2003; Batista et al., 2005; Dressler, 2005; Giulietti et al., 2005) ocorrendo desde a Mata Atlântica até a Amazônia. Na flora do Cerrado, a família Orchidaceae apresenta-se com cerca de trezentas espécies (Mello, 2000; Mendonça et al., 1998; Batista & Bianchetti, 2003).

2.1.1 Características das orquídeas

O termo orquídea foi utilizado pela primeira vez na Grécia Antiga por Theophrastus (372 - 287 a.C.), botânico grego, que em seu trabalho denominado "Investigação sobre as Plantas" usa a palavra orchis para denominar certas espécies. Orkhis é a palavra grega para testículos, Theophrastus observou semelhança entre as raízes de orquídeas terrestres que vegetam nas zonas temperadas da Europa e os testículos. Ainda hoje as espécies são conhecidas pelo mesmo nome, Orchis maculata, Orchis simia Lam., Orchis mascula (L.) L., e Orchis spectabilis L. Após nomear as espécies com flores e raízes 20

exóticas, Theophrastus derivou o nome em latim para toda a família, Orchidaceae (Campos, 2008).

As orquídeas podem ser epífitas, saxícolas, terrestres ou humícolas e rupícolas ou litófitas (Van Den Berg & Azevedo, 2005; Campos, 2008). Podem apresentar grande diversidade morfológica tanto vegetativa quanto reprodutiva. A maior parte das orquídeas exibe algumas características florais bastante conservadas, como, por exemplo, flores de simetria bilateral, com uma das pétalas modificada e geralmente maior, que é chamada labelo, e em geral um único estame fundido com estiletes e estigma formando a coluna ou ginostêmio (Van Den Berg & Azevedo, 2005). As raízes de espécies epífitas e rupícolas, em geral, apresentam velame. Caules secundários intumescidos, formando pseudobulbos, folhas carnosas e raízes dotadas de velame cobrindo grande superfície são algumas estratégias adaptativas das orquídeas, importantes na economia de água. As inflorescências podem ser terminais ou laterais, algumas vezes reduzidas a uma única flor. Os frutos são em forma de cápsulas e possuem milhares de sementes minúsculas ou diminutas, com tegumento membranáceo, embrião reduzido e endosperma ausente (Dressler, 1981; 1993; Arditti & Ghani, 2000).

As peculiaridades de cada espécie são responsáveis por intensificar a importância econômica destas plantas. Espécies e híbridos naturais são comercializados para a ornamentação, com destaque para o gênero Cattleya Lindl. (Zanenga-Godoy & Costa, 2003; Silva & Milaneze-Gutierre, 2004; Mesquita et al., 2007). Algumas espécies do gênero Vanilla Mill. produzem frutos dos quais é extraído o aroma de baunilha, utilizado para dar sabor a bebidas e comidas (Joly, 2002; Peterson et al., 2004). O gênero Cyrtopodium sp. possui espécies que apresentam atividade inflamatória e analgésica, como por exemplo, Cyrtopodium andersonii (Lamb. ex Andrews) R. Br. (Barreiro et al., 2004), e Cyrtopodium cardiochilum Lindl. (Barreto & Parente, 2006). O gênero Gastrodia sp. também apresenta espécies com potencial fitoterápico, exemplos são Gastrodia confusa e Gastrodia sesamoides R. Br. (Ogura-Tsujita et al., 2009; Dearnaley & Bougoure, 2010).

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2.1.2 Orquídeas no Cerrado

Com uma área de aproximadamente duzentos milhões de hectares, o Cerrado é o segundo maior bioma brasileiro, e localiza-se, essencialmente, no Planalto Central. O Cerrado abrange áreas contínuas nos estados de Goiás, Tocantins e Distrito Federal, parte dos estados da Bahia, Ceará, Maranhão, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Piauí, Rondônia e São Paulo, e também ocorre em áreas disjuntas nas regiões Norte e Sul (Ribeiro & Walter, 2008). O clima deste bioma é estacional, com um período chuvoso, que dura de outubro a março, e um período seco, de abril a setembro. A precipitação média anual é de 1.500 mm e as temperaturas são geralmente amenas ao longo do ano, entre 22 e 27º C (Klink & Machado, 2005).

O Cerrado é considerado um dos biomas mais ricos e diversos do mundo, com cerca de sete mil espécies vegetais das quais 40% são endêmicas (Mendonça et al., 1998). Por outro lado, as transformações ocorridas no Cerrado trouxeram grandes danos ambientais como extinção da biodiversidade, invasão de espécies exóticas, erosão dos solos, poluição de aquíferos, degradação de ecossistemas, alterações nos regimes de queimadas, desequilíbrios no ciclo do carbono e modificações climáticas regionais (Myers et al., 2000; Pereira et al., 2004; Klink & Machado, 2005; Ferreira et al., 2010).

A família Orchidaceae está entre as cinco maiores e mais representativas do Cerrado (Mello, 2000; Mendonça et al., 1998; Batista & Bianchetti, 2003; Batista et al., 2005). Os gêneros mais significativos são Cattleya Lindl., Catassetum Rich. Kunth., Cleistes Rich. Lindl., Epidendrum Lindl. e Cyrtopodium Rchb. (Batista & Bianchetti, 2003; Zanenga-Godoy & Costa, 2003; Batista et al., 2005; Royal, 2006; Barbero, 2007). O Cerrado é o centro de diversidade do gênero Cyrtopodium Rchb., uma vez que, dentre as cinquenta espécies registradas pelo continente americano cerca de trinta espécies, dentre terrestres e epífitas, ocorrem no referido bioma (Batista & Bianchetti, 2003; 2004; 2005, 2006; Romero- Gonzáles et al., 2008).

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2.1.3 As espécies Cyrtopodium saintlegerianum Rchb. f. e Epidendrum nocturnum Jacq.

A espécie Cyrtopodium saintlegerianum (Figura 1 A) pertence à subfamília Epidendroideae, tribo Cymbidieae, subtribo Cyrtopodiinae e ao gênero Cyrtopodium. Pode ser terrestre ou epífita, e enquanto epífita cresce sobre o tronco de palmeiras ou, às vezes, na bainha das palmas das folhas. Produz pseudobulbos com cerca de 60 cm, recobertos por bainhas firmemente aderidas. Suas raízes são bastante lignificadas, apresentam velame e raízes adventícias formando uma rede em torno do caule da planta suporte. A inflorescência é apical, às vezes com hastes secundárias, e apresenta flores amarelas com pontos em marrom, como mostrado na Figura 1 B (Menezes, 2000).

O nome Cyrtopodium tem os radicais gregos Cyrtos, arqueado, e podium, pés, devido aos pseudobulbos e o epíteto específico “saintlegerianum” em homenagem ao pesquisador francês Saint Léger (Campacci, 2000; Menezes, 2000). C. saintlegerianum ocorre nos estados do Pará, Tocantins, Piauí, Bahia, Minas Gerais Mato Grosso, Grosso do Sul, Distrito Federal e Goiás (Menezes, 2000; Batista et al., 2005; Barros et al., 2011). Na Floresta Amazônica é encontrada como terrestre e epífita (Barros et al., 2003) e no Cerrado, segundo Menezes (2000), é comumente observada crescendo, como epífita, sobre o caule de palmeiras (Figura 1 A).

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A B

C D

Figura 1. Aspecto geral de plantas de Cyrtopodium saintlegerianum (A e B) e de Epidendrum nocturnum (C e D). A: Planta de C. saintlegerianum sobre caule de palmeira do gênero Acrocomia sp. em área antropizada de Cerrado; B: Flor de C. saintlegerianum apresentando formação de cápsula; C: Planta de E. nocturnum sobre rocha em Cerrado Rupestre; e D: Flor de E. nocturnum. (Fotos: K. C. I. Sousa, 2010).

Epidendrum nocturnum (Figura 1 C) é uma espécie pertencente à subfamília Epidendroideae, tribo Epidendreae, subtribo Laeliinae e ao gênero Epidendrum. Pode ser terrestre, epífita e rupícola. Apresenta caule ereto com variações de 20 a 80 cm de altura, folhas espaçadas e alternadas, coriáceas e finas de cor verde claro. A flor aparece no ápice dos caules, com pétalas e sépalas muito similares e finas, a coloração é amarelo-esverdeadas. O labelo é trilobado com lóbulos laterais e globiformes de cor branca (Figura 1D). Suas raízes apresentam velame, são fasciculadas e filiformes, e situam-se na base do caule (Bonates, 2007).

A espécie E. nocturnum é denominada “night scented orchid” por apresentar um aroma noturno agradável e, por este motivo, possui grande apelo ornamental, como também conservacionista (Zettler et al., 2007). E. nocturnum ocorre em todas as regiões brasileiras, com destaque para os estados do Amazonas, Pará, Mato Grosso do Sul, Paraná, São Paulo, Minas Gerais e Goiás (Batista & Bianchetti, 2003; Royal, 2006; Barbero, 2007; Bonates, 2007; Stancik et al., 2009; Barros et al., 2011; Medeiros & Jardim, 2011). 24

2.1.4 Formação de cápsulas e sementes de orquídeas

As orquídeas possuem diversos mecanismos de fecundação, os dois principais são a autofecundação e a fecundação cruzada (Jersáková et al., 2006). Apresentam os órgãos sexuais fundidos na coluna ou ginostêmio, e o pólen é condensado em uma estrutura viscosa, a massa polínica ou polínia. O tamanho da coluna e a posição da polínia influenciam na polinização e, consequentemente, na formação de sementes (Vallius, 2000; 2001). Há uma aderência da polínia na coluna e a polinização cruzada ocorre, principalmente, auxiliada por insetos de diversos grupos (Hymenoptera, Diptera, Lepidoptera e Coleoptera). Algumas flores de orquídeas possuem cores, formatos e aromas que atraem os polinizadores (Borba & Braga, 2003; Pansarin et al., 2008).

As sementes de orquídeas também podem ser polinizadas artificialmente. O procedimento consiste em retirar a polínia da parte frontal do ginostêmio, referente ao estame. Após ser removido o envoltório, faz-se a reintrodução da polínia na parte mais profunda do ginostêmio, ou seja, na região que corresponde ao pistilo e onde será formada a cápsula. Este modelo de autofecundação artificial ou manual foi descrito, na integra, para a espécie Spathoglottis parsonii (Kauth et al., 2008).

A partir da fecundação, as orquídeas produzem frutos ou cápsulas com diferentes formatos e tamanhos (Figura 2 A-D). Cada cápsula pode conter entre 1300 e 4 milhões de sementes (Arditti & Ghani, 2000). Além disso as sementes de orquídeas são diminutas, ou dust seeds, com variação no comprimento, de 0,5 a 3 mm (Figura 2 E e F), e na massa, de 3 a 15 µg (Rasmussen, 1995; Arditti & Ghani, 2000). Além disso, as sementes podem variar em morfologia, estrutura, cor e formato do tegumento (Yam & Arditti, 2009). Em geral as sementes de orquídeas são formadas por um embrião pequeno situado no centro de um tegumento celular reticulado (Figura 2 E e F). Não há formação de endosperma, portanto, as sementes de orquídeas não possuem reserva de nutrientes para suportar a germinação do embrião e o estabelecimento da plântula (Rasmussen, 1995; Arditti & Ghani, 2000; Peterson et al., 2004). 25

Figura 2. Frutos ou cápsulas e sementes de Cyrtopodium saintlegerianum (A, C e E) e Epidendrum nocturnum (B, D e F). A: Cápsulas de C. saintlegerianum oriundas da mesma inflorescência (seta); B: Cápsulas de E. nocturnum oriundas de inflorescências distintas (setas); C: Cápsula de C. saintlegerianum com peso total de 7,26 g; D: Cápsula de E. nocturnum pesando 2,57 g; E: Embrião (1) e tegumento (2) de semente de C. saintlegerianum; e F: Embrião (1) e tegumento (2) de semente de E. nocturnum. (Barras: C e D: 1 cm; e E e F: 50 µm – Fotos: K. C. I. Sousa, 2010)

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O amido é a principal fonte de carbono nos embriões imaturos de sementes de orquídeas. Com a maturação do embrião o amido é substituído por lipídios, proteínas e fontes de reservas complexas, como a celulose e a hemicelulose. A complexidade dos compostos proteicos implica em dormência da semente, pois a quantidade de nutrientes é suficiente apenas para a respiração basal, ou seja, não é suficiente para o metabolismo de germinação das sementes, bem como para o desenvolvimento inicial de plântulas (Rasmussen, 1995; Arditti & Ghani, 2000). Portanto, as sementes não germinam sem que haja o fornecimento externo de carbono, que em habitat natural é fornecido pela associação com um fungo micorrízico compatível (Rasmussen, 1995; Peterson et al., 2004).

Em cultivo in vitro os nutrientes podem ser fornecidos por meios nutritivos desenvolvidos com base nas necessidades das orquídeas, germinação assimbiótica (Lo et al., 2004; Dutra et al., 2009; Gonçalves, 2009; Nunes, 2009; Godo et al., 2010) ou por geminação simbiótica, na qual se utiliza um meio com uma fonte de carbono e um fungo micorrízico que proporcione germinação às sementes (Dixon, 1987; Masuhara et al., 1993; Pereira et al., 2005a; Pereira et al., 2009; Valadares et al., 2011; Aggarwal & Zettler, 2010; Roche et al., 2010; Steinfort et al., 2010).

As sementes de orquídeas podem desenvolver dormência devido à baixa quantidade de nutrientes e os embriões podem não ser viáveis caso não haja fecundação. Para distinguir sementes dormentes de sementes inviáveis são propostos testes químicos de viabilidade do embrião (Rasmussen, 1995; Gosling, 2003; Wood et al., 2003). Os testes de viabilidade mais utilizados para sementes de orquídeas são realizados com diacetato de fluoresceína (FDA), que expõe as sementes viáveis sob luz de espectro fluorescente (Wood et al., 2003; Faast et al., 2010) e com cloreto de trifenil tetrazólio (TTC), que cora em vermelho os embriões viáveis (Vujanovic et al., 2000; Alvarez-Pardo & Ferreira, 2006; Hosomi et al, 2012). Vujanovic et al. (2000) e Vujanovic & Vujanovic (2007) realizaram um teste de viabilidade para sementes de Cypripedium reginae Walter, utilizando um isolado fúngico do gênero Fusarium sp. como indutor de coloração vermelha nos embriões viáveis e obtiveram resultados similares ao teste de TTC.

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2.2 FUNGOS MICORRÍZICOS

2.2.1 Micorrizas

O termo “simbiotismo” foi proposto por Albert Frank, em 1877, para descrever quaisquer relações entre diferentes organismos. Atualmente o termo é utilizado para designar relações mutualísticas, ou seja, que beneficiem ambos os envolvidos. Em 1885, A. Frank propôs o termo “micorriza”, palavra composta pelos radicais gregos, mykes, fungos e, rhizae, raíz, considerando a associação simbiótica não patogênica entre fungos e raízes de plantas (Siqueira, 1996; Maia, 2010). Os fungos micorrízicos são encontrados em cerca de 90% das famílias botânicas que, provavelmente, coevoluiram desde os primórdios da ocupação terrestre pelos vegetais. O não estabelecimento destas associações é considerado um evento evolutivo e ocorre em poucas famílias botânicas, dentre as quais se destacam Brassicaceae, Caryophyllaceae e Chenopodiaceae, e alguns representantes das famílias Commelinaceae, Cuprecaceae, Polygonaceae, Urticaceae, entre outras (Saggin Junior & Silva, 2005).

As micorrizas podem ser classificadas, de forma simplificada, em ectomicorrizas, que se desenvolvem pouco e entre as células do córtex e amplamente na superfície; e em endomicorrizas, que se estabelecem essencialmente no córtex da raiz (Miranda, 2008). No entanto, existem diferenças entre as interações, os tipos de fungos micorrízicos e suas plantas hospedeiras. As micorrizas estão subdividas em: ectomicorrizas, ectendomicorrizas, micorriza arbutoide, micorriza monotropoide, micorriza ericoide, micorriza arbuscular e micorriza orquidoide (Smith & Read, 1997; Peterson et al., 2004; Maia, 2010).

Maia (2010) sugere que as ectomicorrizas associam-se à plantas arbóreas e perenes de Gimnospermas e Angiospermas. Os fungos ectomicorrízicos podem ser ascomicetos, basidiomicetos ou do gênero Endogone sp. (Zygomycota). Para as endomicorrizas são citados diversos gêneros de Ascomycota, Basidiomycota e Glomeromycota. As ectendomicorrizas são, geralmente, basidiomicetos e ocorrem em Pinus sp. e Larix sp. As micorrizas arbutoide e monotropoide são formadas por fungos basidiomicetos e ocorrem nas famílias Arbutoideae e Monotropoideae, respectivamente. As micorrizas ericoides são pertencentes ao grupo dos ascomicetos e associam-se às família Ericaceae, Epacridaceae, Cassiopoideae, dentre outras. Os fungos que compõem as 28

micorrizas arbusculares são do filo Glomeromycota e associam-se às Briófitas, Pteridófitas, Gimnospermas e Angiospermas.

2.2.2 Micorrizas Orquidóides

As micorrizas orquidoides formam endomicorrizas e, comumente, são fungos basidiomicetos pertencentes ao gênero-forma Rhizoctonia sp. (Currah & Zelmer, 1992; Pereira et al., 2003; Taylor et al., 2003; Stewart & Kane, 2007; Rasmussen & Rasmussen, 2007; 2009; Keel et al., 2011). Porém, fungos ectomicorrízicos da família Thelephoraceae também são encontrados em associação com algumas espécies de orquídeas, como por exemplo, para as espécies Corallorhiza maculata, Corallorhiza mertensiana, Cephalanthera longifolia e Cephalanthera falcata (Taylor & Bruns, 1997; Bidartondo & Read, 2008; Roy et al., 2009).

O gênero Rhizoctonia sp. foi descrito em 1815 por De Candolle, e a espécie R. solani é a mais conhecida por ser um fitopatógeno de ocorrência mundial e por apresentar importância agrícola e florestal. Rhizoctonia sp. engloba espécies micorrízicas, fitopatogênicas e saprófitas (Ogoshi, 1987; Agarwall, 2010). Relata-se também que o gênero Rhizoctonia sp. pode ocorrer em associação endofítica com espécies florestais, como, por exemplo, o Pinus spp. (Sen et al., 1999).

Rhizoctonia sp. é a basionímia do gênero e e apresenta-se como fase anamórfica. As fases anamórficas Epulorhiza sp. e Ceratorhiza sp., sinonímias de Rhizoctonia sp., são binucleadas e possuem fase teleomórfica em Tulasnella sp. e em Ceratobasidium sp., respectivamente. Já o gênero multinucleado Moniliopsis sp., fase anamórfica, tem como teleomorfos Waitea sp. e/ou Thanatephorus sp., mas mantém-se o nome Rhizoctonia sp. por conservação (nomina conservanda) em função da importância desse táxon e do número de trabalhos já publicados (Valadares, 2009; Agarwall, 2010).

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2.2.3 Identificação de Fungos Micorrízicos Rizoctonioides

Os fungos rizoctonioides, na natureza, dificilmente formam estruturas reprodutivas sexuais, sendo utilizadas características vegetativas morfológicas como constrição da hifa na região do septo, ramificação logo após o septo em ângulo reto, condição nuclear, formação de células de resistência espessadas (células monilioides) e forma do septo dolipórico para classificá-los nos gêneros anamórficos Epulorhiza sp. e Ceratorhiza sp. que são basionímios de Rhizoctonia sp. (Currah & Zelmer, 1992; Pereira et al., 2003; Taylor et al., 2003; Athipunyakon et al., 2004a; 2004b; Agarwall, 2010; Nontachaiyapom et al., 2010).

Há trabalhos que mostram a interação entre orquídeas e fungos micorrízicos rizoctonioides nas fase anamórficas de Epulorhiza sp. e Ceratorhiza sp. (Stewart & Zettler, 2002; Pereira et al., 2005a; 2005b; Stewart & Kane, 2007; Zettler et al., 2007; Pereira et al., 2009; Valadares, 2009; Keel et al., 2011). Em outros estudos são observadas interações entre as orquídeas e os fungos micorrízicos rizoctonioides nas fases teleomórficas como Tulasnella sp., com anamorfo em Epulorhiza sp., e Ceratobasidium sp., que tem Ceratorhiza sp. como seu anamorfo (Cameron et al., 2006; 2007; Taylor & McCormick, 2008; Roche et al., 2010; Graham & Dearnaley, 2011). A fase teleomórfica ou estado perfeito de Rhizoctonia sp. pode ser induzida de algumas maneiras, em meio de cultivo ágar e extrato de solo (Warcup & Talbot, 1967, 1971, 1980). Athipunyakon et al., 2004a; 2004b

A classificação e identificação de Rhizoctonia sp. pode ser realizada pelo método de anastomose em hifas com isolados de grupos padrões, denominados grupos de anastomose ou AG’s (Carling et al, 1999; 2002). Segundo os autores o método consiste em parear isolados desconhecidos com isolados padrões, observar a reação de anastomose nas hifas situadas na área de confluência e categorizar em um grupo a partir da análise e interpretação do tipo de reação citológica. Os isolados multinucleados de R. solani (teleomorfo - Thanatephorus cucumeris) foram agrupados em 12 AG’s e os isolados binucleados de Ceratorhiza sp. (teleomorfo - Ceratobasidium spp.) em 21 AG’s (Carling et al., 1999).

O uso de marcadores moleculares derivados da análise direta do polimorfismo de sequências de DNA são também utilizados como ferramentas na identificação e caracterização de Rhizoctonia sp., bem como em estudos de filogenia e taxonomia de fungos 30

deste grupo (Liu & Sinclair, 1992; Vigalys & Cubeta, 1994; Cubeta & Vigalys, 1997; Hyakumachi et al., 1998; González-Hernández, 2002; García et al., 2006; Nakatani, 2006). A técnica de PCR-RFLP e sequenciamento da região ITS (Internal Transcribed Spacer) são as mais utilizadas para estudos de filogenia e taxonomia de espécies de Rhizoctonia sp. associadas às orquídeas (Otero et al., 2002; 2004; Bougoure et al., 2009; Huynh et al., 2009).

2.2.4 Associação entre Fungos micorrízicos e orquídeas

Para minimizar os impactos decorrentes de estresses ambientais bióticos e abióticos, as raízes de orquídeas associam-se aos fungos micorrízicos visando aumentar a absorção de nutrientes (Rasmussen, 1995; 2002; Sequeira, 2007). A associação entre fungo e orquídea é mutualistica, haja vista que ocorre transferência bidirecional de nutrientes conforme evidenciado na interação entre a espécie Serapias strictiflora e o fungo rizoctonioide, Epulorhiza sp. (Latálová & Baláz, 2010). A troca de nutrientes entre a orquídea e o fungo também foi verificada no modelo de interação Goodyera repens Br.- Ceratobasidium cornigerum devido à transferência bilateral de carbono usando isótopo de carbono marcado (Cameron et al., 2006). Utilizando, ainda, o modelo Goodyera repens- Ceratobasidium cornigerum, Cameron et al. (2007) observaram o papel C. cornigerum na captura e transferência de fósforo inorgânico para a orquídea.

Os fungos rizoctonioides produzem enzimas, tais quais celulases e polifenol oxidases, que lhes permitem quebrar os componentes orgânicos do substrato, que são utilizados por ambos os simbiontes, orquídea e fungo micorrízico (Peterson et al., 2004). Os fungos micorrízicos colonizam as células do córtex das raízes de orquídeas, formando um enovelamento de hifas, denominado peloton (Peterson et al., 2004; Nogueira et al., 2005). As orquídeas utilizam-se da digestão dos pelotons como fonte de energia durante o estágio heterotrófico, ou seja, na fase de protocormo antes da formação de folhas e do desenvolvimento da plântula. Na natureza, o protocormo é totalmente dependente de um fungo simbionte para se desenvolver até tornar-se plântula autotrófica e este processo é denominado de mico-heterotrofismo (Rasmussen, 1995; Pereira et al., 2003; Peterson et al., 2004; Rasmussen & Rasmussen, 2009). 31

Dois tipos de micorrizas de orquídeas são reconhecidos: o ptiofágico, notado em um menor número de espécies, e o tolipofágico, mais amplamente difundido nas orquídeas pesquisadas. A ptiofagia não apresenta estrutura definida e é caracterizada por um contínuo processo de digestão da hifa intracelular. Já a tolipofagia, o modelo mais estudado, sugere que há a formação dos pelotons, a degradação e a reinfecção por uma hifa remanescente. As hifas fúngicas são separadas da célula do hospedeiro por meio de uma interface constituída de parede celular fúngica, matriz interfacial e membrana plaamática do hospedeiro (Rasmussen, 1995). Na fase adulta são propostos dois modelos de colonização, a persistência da simbiose e o sincronismo de pelotons intactos e degradados. No primeiro, sugere-se que os pelotons formados na parte mais externa do córtex não são degradados, pois servem como inóculo para a recolonização, como acontece em Corallorhiza sp. Por outro lado, avalia-se que há um sincronismo de formação e degradação de pelotons ao longo do córtex, conforme ocorre para espécies dos gêneros Spiranthes sp. e Platanthera sp. (Zelmer et al., 1996; Linhares, 2006). Orquídeas aclorofiladas são mico-heterotróficas durante todo o ciclo de vida, pois dependem do micobionte para a aquisição de carbono e demais nutrientes (Peterson et al., 2004). Algumas orquídeas clorofiladas, embora sejam autotróficas em sua fase adulta ainda encontram-se associadas a fungos micorrízicos (Pereira, 2001; Pereira et al., 2005a; 2005b; Valadares et al., 2008; Matsuda e al., 2009; Pereira et al., 2009; Valadares et al., 2011).

2.3 GERMINAÇÃO IN VITRO DE SEMENTES DE ORQUÍDEAS

2.3.1 Germinação assimbiótica

O cultivo in vitro de orquídeas foi realizado pela primeira vez por Lewis Knudson, em 1922 nos Estados Unidos, com sementes de espécies dos gêneros Cattleya sp. e Laelia sp. (Knudson, 1922). O sucesso no cultivo de embriões de ambos os gêneros em diferentes concentrações de nutrientes resultou na elaboração domeio de cultivo assimbiótico Knudson empregado até os dias atuais, porém com algumas modificações (Lo et al., 2004; Stewart & Kane, 2006a; Dutra et al., 2008; Dutra et al., 2009; Gonçalves, 2009; Nunes, 2009; Godo et al., 2010; Long et al., 2010). Em 1960, na França, G. M. Morel, conseguiu multiplicar orquídeas do gênero Cymbidium sp. a partir do cultivo in vitro de 32

ápices caulinares e da regeneração de protocormos, possibilitando a expansão da micropropagação comercial destas plantas (Souza et al., 2006).

O cultivo assimbiótico in vitro de orquídeas resulta em altas taxas de germinação quando comparado à germinação em habitat natural. Meios de cultivo como o Knudson C (Knudson, 1946), o VW (Vacin & Went, 1949), e o MS (Murashige & Skoog, 1962) são complexos em suas composições, possuem elevados custos de produção, e as plântulas oriundas de germinação asséptica ainda podem sofrer pressão biótica e abiótica com a aclimatização (Wu et al., 2011). Por outro lado, plântulas originadas de germinação simbiótica, ou seja, na presença de um isolado micorrízico, adaptam melhor às condições naturais quando comparadas às plantas produzidas a partir de germinação assimbiótica de sementes (Pereira et al., 2003; Zettler et al., 2007).

2.3.2 Germinação simbiótica

O cultivo simbiótico de sementes de orquídeas tem apresentado altas porcentagens de germinação conforme foi observado para Tolumnia variegata (Swartz) Braem e Ionopsis utricularioides (Swartz) Reichenbach (Otero et al., 2004), Epidendrum nocturnum Jacq. (Zettler et al., 2007), Spiranthes brevilabris Lindley (Stewart & Kane, 2007), Habenaria repens Nuttall (Keel et al., 2011) e Epidendrum secundum Jacq. (Pereira et al., 2011). Valadares et al. (2011) testaram a germinação simbiótica da espécie Coppensia doniana, orquídea epífita e ameaçada de extinção, com isolados de Rhizoctonia sp. e Ceratorhiza sp. A porcentagem de germinação atingiu 90%, o que demonstra a eficiência dos fungos em promover a germinação de sementes. As plantas oriundas da germinação simbiótica foram aclimatizadas após dez meses da inoculação com fungo, portanto, depreende-se que o cultivo simbiótico pode ser uma alternativa viável à conservação de espécies ameaçadas.

Masuhara et al. (1993) testaram a eficiência de Rhizoctonia oryzae, oriunda de Oryza sativa, em germinar sementes Spiranthes sinensis (Persoon) Ames. var. amoena

(M. Bieberstein) Hara, mas não obtiveram êxito. No entanto, Masuhara & Katsuya (1994) obtiveram altas porcentagens de germinação para sementes de S. sinensis quando inoculadas com isolados binucleados de Rhizoctonia sp. oriundos de arroz. Pereira et al. (2011) 33

avaliaram a germinação e o desenvolvimento de protocormos em Epidendrum secundum com dezesseis isolados de Epulorhiza sp. oriundos de cinco populações de plantas de E. secundum. Observaram que as sementes de E. secundum germinaram com fungos das cinco populações de plantas, porém nem todos os isolados foram promissores até os estágios mais avançados de desenvolvimento do protocormo.

Os fungos presentes no sistema radicular de uma orquídea podem não ser os responsáveis pela germinação de suas sementes, bem como uma espécie de orquídea pode estar associada com vários gêneros de fungos (Perkins & McGee, 1995; Otero et al., 2002; 2004; Shan et al., 2002; McCormick et al., 2006). Espécies como Oncidium flexuosum Sims. e Coppensia doniana possuem especifidade micorrízica com os fungos isolados de seu próprio sistema radicular (Pereira et al., 2005a; Valadares et al., 2011), enquanto que outras são mais flexíveis quanto à associação micorrízica (Otero et al., 2004; Chutima et al., 2011), como por exemplo, E. nocturnum que apresentou alta porcentagem de germinação com um isolado de Epulorhiza sp. oriundo de S. brevilabris (Zettler et al., 2007).

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3 MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram conduzidos no Campus II da Universidade Federal de Goiás (UFG), em Goiânia, GO. A maior parte da pesquisa foi desenvolvida no Instituto de Ciências Biológicas (ICB) envolvendo os Laboratórios de: Genética de Microrganismos, Anatomia Vegetal, Cultura de Tecidos Vegetais e Biologia Molecular & Citogenética. O Laboratório Multiusuário de Microscopia de Alta Resolução (LabMic), no Instituto de Física, e a Coleção de Orquídeas e Bromélias situada na Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos da UFG também colaboraram para a realização deste trabalho.

3.1 COLETA DO MATERIAL VEGETAL

O material vegetal utilizado neste estudo foi coletado, nos meses de março 2010 e agosto de 2011, na Reserva Biológica Prof. José Ângelo Rizzo (S 16 04 36.4, W 50 11 16.9, 1006 m de altitude), e em áreas adjacentes. A reserva é constituída por 500 ha com predominância de vegetação do tipo cerrado rupestre e está localizada na Área de Proteção Permanente da Serra Dourada entre os municípios de Mossâmedes, Itaberaí e Goiás, GO.

No Herbário da UFG, situado no ICB 1 do Campus II em Goiânia, estão depositadas exsicatas das espécies Cyrtopodium saintlegarianum Rchd. f. e Epidendrum nocturnum Jacq., com os registros Herb. UFG 25.278 e Herb. UFG 22.848, respectivamente. As especificações para C. saintlegarianum são: Local de coleta: Arredores do córrego Batéias, Reservatório em formação da AHE Serra da Mesa, Segmento 1 (Grande Lago) no município de Minaçu – Goiás; Ambiente: Ambiente secundário formando quase um “macaubal”; Hábito: Erva epífita sobre macaúba; Det: B. M T. Walter – 01/1998; Col: B. M T. Walter et al. – 28/01/1998. Para E. nocturnum tem-se as seguintes especificações: Local de coleta: Serra Dourada a 3 k à esquerda do Trevo de Mossâmedes para a cidade de Goiás; Descrição: Planta com 50 cm, labelo branco com pétalas e sépalas esverdeadas, formação rupestre; Det: J. A. Rizzo 11197 et al. – 14/04/1994; Col: Fábio de Barros – 20/07/1999.

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3.2 ISOLAMENTO DOS FUNGOS

Para o isolamento dos fungos coletou-se fragmentos de raízes em três plantas de Cyrtopodium saintlegarianum, epífita, estabelecidas no tronco de palmeiras do gênero Acrocomia sp. que estão dispersas em áreas antropizadas de Cerrado. As plantas de C. saintlegarianum foram denominadas Cyrt-1, Cyrt-2 e Cyrt-3 para facilitar a identificação da proveniência dos fungos. As raízes de Epidendrum nocturnum, rupícola, foram coletadas de três plantas (Epid-1, Epid-2 e Epid-3) localizadas em afloramentos rochosos de cerrado rupestre. Todas as raízes foram desbastadas superficialmente com o uso de estiletes e pinças e, em seguida, foram armazenadas em sacos plásticos em câmara fria (4°C) para manter a umidade (Gonçalves, 2009; Valadares, 2009).

Após cinco dias de armazenamento foram selecionados seis fragmentos de raízes para cada planta, os quais foram seccionados em amostras de três centímetros. As amostras foram submetidas à lavagem em água corrente durante dez minutos e imersões sucessivas em solução de álcool 70% por um minuto, solução de hipoclorito de sódio comercial

(NaClO2) diluído em água destilada e deionizada na proporção de 1:10 por quatro minutos, e enxaguados por cinco vezes em água destilada, deionizada e autoclavada conforme descrito por Otero et al. (2002) e Valadares (2009).

Em câmara de fluxo laminar, fez-se a maceração das amostras em almofarizes com pistilos de porcelana previamente autoclavados. O macerado obtido foi espalhado aleatoriamente em placas de Petri contendo meio de cultura BDA (Batata – Dextrose – Ágar) obtido com 20 g de ágar, 20 g de dextrose, 1 L de caldo do cozimento de 200 g de batata. Para evitar o surgimento de bactérias foram adicionados 200 µL de Tetraciclina (5 mg/mL em álcool 95%) para cada litro de BDA. Para cada amostra fez-se três repetições, as placas foram incubadas em sala de crescimento a 26°C ± 2°C com luz contínua. Após o crescimento dos fungos, partes de micélio crescido foram repicadas para novas placas de Petri e tubos de ensaio contendo BDA, para a purificação dos isolados.

3.3 MANUTENÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DOS ISOLADOS

Para a identificação dos isolados preparou-se lâminas microscópicas com parte do micélio fúngico, 100 µL de água destilada e deionizada e, em alguns casos, 10 µL de azul 36

de metileno na concentração de 0,1% para corar hifas hialinas. A observação foi realizada em microscópio óptico com câmera fotográfica digital acoplada e o programa BelView. Os fungos com características de gêneros micorrízicos associados às orquídeas foram identificados segundo a chave dicotômica de Currah & Zelmer (1992) e de acordo com Athipunyakon et al. (2004a, 2004b). Os demais fungos isolados foram identificados segundo Hanlin (1990) e Barnett & Hunter (2003).

Fez-se a manutenção dos isolados por meio de repicagens periódicas a cada vinte dias para BDA em placas de Petri e em tubos de ensaio. Placas e tubos foram armazenados em sala de crescimento com temperatura de 26°C ± 2°C e fotoperíodo (16/8 h, Luz/Escuro).

3.4 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DOS ISOLADOS

Realizou-se a caracterização morfológica dos isolados identificados como rizoctonioides e para dois isolados endofíticos. Os isolados endofíticos foram identificados com base nas características morfológicas e reprodutivas descritas na chave de Hanlin (1990). Os fungos rizoctonioides raramente formam estruturas reprodutivas, portanto, são identificados por meio da avaliação de características morfológicas vegetativas. Estas características peculiares são descritas como a presença de constrição a 90º com a hifa ramificada logo após o septo, a condição nuclear (célula uni, bi ou multinucleada), o estado de perfuração do septo dolipórico e a formação ou não de células de resistência espessadas, as células monilioides (Moore, 1987; Currah & Zelmer, 1992; Zelmer & Currah, 1995; Rasmussen, 2002; Pereira et al., 2003; Taylor et al., 2003; Nogueira et al., 2005; Pereira et al., 2009; Rasmussen & Rasmussen, 2009; Valadares et al., 2011).

3.4.1 Características qualitativas

Foram utilizadas cinco placas de Petri (repetições) para cada isolado endofítico e rizoctonioide. As placas de Petri permaneceram incubadas em escuro contínuo sob a temperatura de 26°C ± 2°C durante o período da avaliação. As características qualitativas como presença e aspecto de micélio, formato e cor do isolado foram avaliadas após 72 e 336 h nos isolados fúngicos cultivados em BDA (Nogueira et al., 2005; Valadares, 2009).

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3.4.2 Características quantitativas

3.4.2.1 Diâmetro do isolado

A avaliação do diâmetro do isolado (DI) foi realizada em BDA e CMA (Caldo de Milho Ágar). O meio CMA foi feito com 15 g de ágar e 1 L de caldo obtido do cozimento de 30 g de farelo de milho, e para cada litro do meio, tanto BDA quanto CMA, foram acrescidos de 200 µL de Tetraciclina (5 mg/mL em álcool 95%). Discos de 9 mm de diâmetro retirado da borda do micélio do isolado fúngico com sete dias de crescimento em BDA foram transferidos para o centro de placas de Petri medindo 9 cm de diâmetro e contendo 20 mL de meio BDA ou CMA.

Montou-se um delineamento inteiramente casualizado (DIC) com arranjo fatorial com dez isolados fúngicos, cinco repetições e dois meios. As placas foram incubadas em escuro contínuo a 26°C ± 2°C. Após 72 horas mediu-se o diâmetro do isolado, em centímetros, sobre duas linhas perpendiculares traçadas no verso das placas, tomando-se o disco de micélio como o ponto de interseção entre as linhas (Pereira et al., 2009).

3.4.2.2 Taxa de crescimento do isolado

As taxas de crescimento horizontal (TCH) e vertical (TCV), tanto em BDA quanto em CMA, foram determinadas com base na variação das medidas de diâmetro do isolado em três intervalos de tempo, durante um período de dez dias. As placas utilizadas para medir o diâmetro dos isolados, também foram utilizadas para medir a taxa de crescimento. A TC (taxa de crescimento) foi determinada, em mm/h-1, com base na variação das medidas das linhas horizontal e vertical do isolado após 72, 144 e 216 horas.

3.4.2.3 Células monilioides e hifas em microscopia óptica e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Os isolados foram cultivados em placas contendo de 5 a 10 mL de CMA durante dois meses sob temperatura de 26°C ± 2°C e fotoperíodo (16/8 h, L/E). Uma amostra medindo 1 cm3 da borda do isolado foi removida, com o auxílio de bisturi e espátulas 38

estéreis, e transferida para uma lâmina estéril. Adicionou-se 10 µL de azul de metileno, na concentração de 0,1%, para corar as células monilioides, as quais foram fotografadas em microscópio óptico. As imagens capturadas serviram para determinar a largura e o comprimento das três células monilioides de cada isolado, utilizando o programa BelAnalyzer MicroImage. Realizou-se fotografias em MEV para hifas e células monilioides para alguns isolados rizoctonioides e endofíticos. Os fungos foram colocados para crescer sobre papel de filtro (MN-615, Macherey-Nagel, Alemanha) imerso em BDA durante sete dias. Os papéis foram removidos e dessecados com sílica gel branca (1 a 4 mm) por dez dias, até a secagem completa do material fúngico. Fragmentos do papel nas regiões extremas do micélio foram cortados em amostras de 3 mm e transferidos para fita dupla face em um stub. O stub, que é um disco de alumínio com 2,5 cm de diâmetro e 0,8 cm de espessura, foi previamente higienizado com acetona pura (C3H6O) e álcool isopropílico (C3H8O). As amostras foram expostas, por dois minutos, à deposição de filmes de ouro – aparelho Denton Vacuum (Desc V), e observadas em MEV – aparelho Jeol (JSM-6610) equipado com EDS, Thermo Scientific NSS Spectral Imaging.

3.4.2.4 Diâmetro da hifa vegetativa e condição nuclear

Pequenos segmentos de micélio dos isolados previamente crescidos em meio BDA foram transferidos para lâminas microscópicas contendo 50 μL de meio BDA e incubados por cinco dias. As lâminas foram tratadas com 10 μL da solução composta por 5 ® μL SYBR Green I , 0,00684 g de KH2PO4 e 995 μL de água Mili-Q (adaptado de Meinhardt et al., 2001; e Campos et al., 2006) e mantidas no escuro para serem observadas em microscópio óptico com assessório para Epifluorescência e câmera digital acoplada Leica®. Utilizou-se o filtro FITC – WB com excitação de 450-480 e emissão de 515 nm. A condição nuclear foi observada sob fluorescência e as imagens capturadas foram processadas pelo editor Leica IM50 e, posteriormente, utilizadas na medição do diâmetro de cinco hifas vegetativas para cada isolado.

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3.5 TESTE ENZIMÁTICO PARA POLIFENOL OXIDASE

O meio de cultura Ágar – Água – Extrato de levedura (AAEL), obtido com 15 g de Ágar, 1 L de água destilada e deionizada, 15 g de extrato de levedura e ácido tânico

(C76H52O46) a 5% foi utilizado para testar a produção de polifenol oxidases. O controle negativo constituiu-se em um tratamento com meio AAEL sem o acréscimo do ácido tânico. Foram utilizadas quatro repetições para o meio com o ácido tânico e quatro para o controle. Após cinco dias de crescimento sob a temperatura de 26°C ± 2°C e fotoperíodo (16/8 h, L/E) foram considerados produtores de polifenol oxidase os isolados que apresentaram halo de cor âmbar em torno da margem do micélio crescido em meio acidificado (Conceição et al., 2005). As demais colorações em tons marrons não caracterizaram produção de polifenol oxidase.

Foram avaliados quinze isolados/tratamentos conforme descritos na Tabela 1. Os isolados micorrízicos oriundos de Cyrtopodium vernum Rchb. f. & Warm. foram obtidos por Gonçalves (2009) e os fitopatogênicos provenientes de arroz e feijão foram cedidos pelo Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Arroz e Feijão, Santo Antônio de Goiás, GO.

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Tabela 1. Tratamentos utilizados no teste para a produção de polifenol oxidase em meio de cultivo acrescido com ácido tânico a 5%.

Tratamento Código do isolado Gênero Planta de origem

T1 Cs02 Epulorhiza sp. C. saintlegerianum

T2 Cs10 Epulorhiza sp. C. saintlegerianum

T3 Cs16 Xylaria sp. C. saintlegerianum

T4 25 Xylaria sp. C. saintlegerianum

T5 Cs21 Epulorhiza sp. C. saintlegerianum

T6 En02 Epulorhiza sp. E. nocturnum

T7 En03 Epulorhiza sp. E. nocturnum

T8 En05 Epulorhiza sp. E. nocturnum

T9 En07 Rhizoctonia sp. E. nocturnum

T10 En24 Rhizoctonia sp. E. nocturnum

T11 Cv17 Epulorhiza sp. C. vernum

T12 Cv10 Rhizoctonia sp. C. vernum

T13 Ro88 Rhizoctonia oryzae Oryza sativa

T14 Ro89 R. oryzae O. sativa

T15 Rh2 Rhizoctonia solani Phaseolus vulgaris

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3.6 HISTOLOCALIZAÇÃO DOS FUNGOS NAS RAÍZES

Foram coletados fragmentos de raízes das plantas de C. saintlagerianum e E. nocturnum utilizadas também no isolamento fúngico. Estes fragmentos foram fixados por

48 horas em FAA70 (Formaldeído – Ácido Acético – Álcool 70%) no escuro, e posteriormente armazenados em álcool 70% até o momento dos cortes histológicos. Os fragmentos radiculares foram submetidos a cortes micrométricos, nos sentidos transversal e longitudinal, utilizando-se lâminas de aço. No processo de clareamento, os cortes foram submergidos em hipoclorito de sódio comercial (2%) até ser notada a transparência dos tecidos vegetais radiculares e, posteriormente, lavados por quatro vezes em água destilada e deionizada.

Para corar as células do cilindro central e do velame, nas quais há maior concentração de lignina, utilizou-se o corante safranina na concentração de 1% por aproximadamente um minuto. Para as células do córtex parenquimático da raiz e para as hifas dos fungos, onde está presente um grande volume de celulose, foi usado o corante azul de Astra na concentração de 0,3% por cerca de trinta segundos (adaptado de Krauss & Arduin, 1997). Ao final da coloração, para remover o excesso de corante nos cortes, estes foram submergidos em álcool 50% por duas vezes. Quatro cortes de cada fragmento foram depositados sobre lâmina microscópica, sobre a qual foi colocada uma gota de glicerina a 70%. Para fixar a lamínula sobre a lâmina usou-se esmalte comercial do tipo base. A visualização dos pelotons foi realizada em microscópio óptico acoplado à câmera fotográfica digital (Gonçalves, 2009).

Para a observação em MEV alguns fragmentos de raízes, previamente fixados em FAA70 e armazenados em álcool 70%, foram seccionados em amostras com aproximadamente 1 cm de espessura. As amostras passaram por desidratação em série alcoólica (álcool etílico a 70, 80, 90 e 99,1%) e, subsequentemente, foram submetidas ao sistema de secagem durante quarenta minutos por ponto crítico de CO2 – aparelho Autosamdri ®, 815, Série A. Em seguida, amostras intactas foram coladas no stub, metalizadas com ouro e observadas no MEV.

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3.7 TESTE DE VIABILIDADE DAS SEMENTES

Utilizou-se o cloreto de trifeniltetrazolio – 2, 3, 5 (TTC) em uma solução a 1% composta por 1,1 g de KH2PO4, 0,9 g de Na2HPO4 e 2 g de TTC dissolvidos em 200 mL de água destilada e deionizada, pH neutro (adaptado de Vujanovic et al., 2000; Alvares-Pardo & Ferreira, 2006 e Hosomi, 2009).

3.7.1 C. saintlegerianum

Coletou-se uma cápsula, oriunda de fecundação cruzada, de uma planta em habitat natural. A assepsia da cápsula, antes da abertura, foram realizadas desinfestações por meio de agitação constante em solução de hipoclorito de sódio comercial diluído em água destilada e deionizada numa proporção de 1:1 (2%) durante dez minutos e imersão em álcool 70% por dois minutos, seguida por cinco lavagens em água destilada, deionizada e autoclavada (Otero et al., 2005; Gonçalves, 2009; Nunes, 2009).

Em câmara de fluxo, o excesso de água na superfície da cápsula foi removido com papel de filtro autoclavado. Em seguida fez-se um corte longitudinal com bisturi, sendo que uma parte das sementes foi separada para o cultivo simbiótico e a outra foi utilizada no teste de viabilidade dos embriões. Avaliou-se o efeito de quatro tratamentos, sendo eles:

T1) Sementes que não receberam pré-tratamento antes de serem submetidas à solução de TTC (controle);

T2) Sementes com pré-tratamento em solução aquosa de sacarose (C6H12O6) a 2,75% por 24 horas;

T3) Sementes submetidas ao banho ultrassônico a 40°C por dois minutos; e

T4) Sementes em solução aquosa exposta à bomba de vácuo por dois minutos.

Após os pré-tratamentos pesou-se, para cada lote de sementes, aproximadamente 0,001 g de sementes transferindo-as para microtubos de ensaio com 2 mL de solução aquosa de TTC. O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado com quatro tratamentos e dez repetições. O experimento foi conduzido em banho-maria a 40°C e em escuro contínuo para a não precipitação do cloreto de tetrazólio. Quando observada a penetração do corante 43

nos embriões, pipetou-se 20 µL da solução para a contagem das sementes viáveis (%) em microscópio óptico com câmera fotográfica digital acoplada e o programa BelView.

3.7.2 E. nocturnum

Uma cápsula coletada quatro meses após a autofecundação artificial foi coletada de uma planta mantida na Coleção de Orquídeas e Bromélia. Os procedimentos de assepsia da cápsula, montagem e avaliação do experimento foram os mesmos estabelecidos no item 3.7.1. No entanto, para E. nocturnum fez-se mais um tratamento (T5) no qual as sementes foram submetidas ao banho ultrassônico a 40°C durante dois minutos e, em seguida, expostas à vácuo por dois minutos.

3.8 CULTIVO SIMBIÓTICO IN VITRO

3.8.1 Cultivo simbiótico de sementes de E. nocturnum conduzido com escuro inicial e transferência para fotoperíodo

Coletou-se uma cápsula nove meses após a autofecundação a qual foi armazenada por três semanas em câmara fria (4ºC). A assepsia foi realizada conforme descrito no item 3.7.1, porém para as sementes desta cápsula não foi realizado o teste de tetrazólio descrito no item 3.7.2.

Foram utilizados como tratamentos os isolados rizoctonioides oriundos de E. nocturnum e dois isolados provenientes das raízes de C. vernum. O meio de cultivo simbiótico foi o Aveia Ágar (AA), obtido com o cozimento de 4 g de aveia em flocos, 15 g de Ágar e 1 L de água destilada e deionizada, pH 5,6 e 200 µL de Tetraciclina (5 mg/mL em álcool 95%) para cada litro de meio (Valadares, 2009).

As placas de Petri medindo 9 cm, com aproximadamente 20 mL de meio, foram inoculadas, à direita, com um disco de 9 mm de diâmetro, contendo o micélio fúngico micorrízico, retirado da margem do isolado crescido por sete dias em BDA (Rasmussen, 1990; Valadares, 2009). À esquerda, espalhou-se cerca de 350 sementes de E. nocturnum com o auxílio de espátulas estéreis (Steinfort et al., 2010). As placas inoculadas com 44

sementes na ausência do fungo foram utilizadas como controle. O delineamento usado foi o inteiramente casualizado com oito tratamentos e quinze repetições. As placas foram vedadas com filme PVC e distribuídas em uma Câmara de Germinação – Technal com temperatura de 26°C ± 2°C, sob ausência de luz (Stewart & Zettler, 2002; Pedroza-Manrique et al., 2005; Zettler et al., 2005; Stewart & Kane, 2006b; Johnson et al., 2007).

A avaliação dos estádios de germinação foi realizada a cada quinze dias em microscópio óptico com câmera digital acoplada. Aos diferentes estádios apresentados pelas sementes foram atribuídas notas de 0 a 5, a saber: 0 – embrião intacto; 1 – embrião intumescido e presença de rizoides (germinação); 2 – rompimento do tegumento que envolve o embrião; 3 – estabelecimento do protocormo e formação da protuberância foliar; 4 – surgimento da primeira folha; e 5 – alongamento da primeira folha e surgimento da segunda folha (Zettler & Hofer, 1998; Stewart & Zettler, 2002; Stewart & Kane, 2006a, 2006b, 2007; Chutima et al., 2010).

Após 120 dias de incubação as placas foram abertas em câmara de fluxo. Um bloco de meio com aproximadamente 1 cm3 contendo as sementes foi removido, com bisturí e espátula, e transferido para novas placas de Petri com 20 mL de AA. Discos de micélio de isolados em BDA por sete dias foram inoculados. As placas foram colocadas sob fotoperíodo de 16/8 h (L/E), porém mantida a temperatura.

3.8.2 Cultivo de sementes de Cyrtopodium saintlegerianum e E. nocturnum conduzidos em fotoperíodo

3.8.2.1 Meios de cultivo

Foram utilizados três meios: Ágar Aveia Padrão – AAP (Dixon, 1987; Masuhara et al., 1993; Chou & Chang, 2004; Pereira et al., 2005a; Stewart & Kane, 2006b; Chang & Chou, 2007; Porras-Alfaro & Bayman, 2007; Zettler et al., 2007; Aggarwal & Zettler, 2010; Roche et al., 2010; Steinfort et al., 2010), Ágar Aveia Modificado – AAM (Clements et al., 1986; Zettler et al., 2007) e Knudson – KC, que é largamente usado na germinação assimbiótica de orquídeas terrestres e epífitas (Knudson, 1946; Lo et al., 2004; Stewart & Kane, 2006a; Dutra et al., 2008; Dutra et al., 2009; Gonçalves, 2009; Nunes, 2009; Godo et 45

al., 2010; Long et al., 2010). A composição nutritiva dos meios AAP, AAM e KC está disposta na Tabela 2.

Tabela 2. Composição dos meios de cultivo Ágar Aveia Padrão (AAP), Ágar Aveia Modificado (AAM) e Knudson C (KC). As medidas dos componentes estão dispostas em miligramas por litro de água destilada e deionizada. Componentes (mg / L1) Meios de Cultivo AAP AAM KC Aveia 3000 3000 – Ágar 10000 10000 7000 Extrato de levedura – 100 – Sacarose – 2000 20000

Ca(NO3)2 4H2O – 200 1000

KH2PO4 – 200 250 KCl – 100 –

MgSO4 7H2O – 100 250

(NH4)2SO4 – – 500

FeSO4 7H2O – – 25

MnSO4 4H2O – – 7,5 1Adição de 200 µL de Tetraciclina (5 mg/mL em álcool 95%) por litro de meio. O pH, quando necessário, foi ajustado para 5,6.

3.8.2.2 Cyrtopodium saintlegerianum

Foram utilizados isolados fúngicos endofíticos e rizoctonioides oriundos de orquídeas em habitat natural, e três isolados rizoctonioides fitopatogênicos de arroz e feijão (Tabela 3).

46

Tabela 3. Tratamentos utilizados na germinação de sementes de C. saintlegerianum para testar a especificidade da interação fungo-planta.

Tratamento Código Gênero Espécie vegetal

T1 Cs02 Epulorhiza sp. C. saintlegerianum

T2 Cs10 Epulorhiza sp. C. saintlegerianum

T3 Cs16 Xylaria sp. C. saintlegerianum

T4 Cs18 Xylaria sp. C. saintlegerianum

T5 Cs21 Epulorhiza sp. C. saintlegerianum

T6 Cv17 Epulorhiza sp. C. vernum

T7 Cv10 Rhizoctonia sp. C. vernum

T8 Ro88 Rhizoctonia oryzae Oryza sativa

T9 Ro89 R. oryzae Oryza sativa

T10 Rh2 Rhizoctonia solani Phaseolus vulgaris

T11 Cs181 Xylaria sp. C. saintlegerianum

T12 En07 Rhizoctonia sp. E. nocturnum

T13 Cs161 Xylaria sp. C. saintlegerianum

T14 - - Controle

1 Para os tratamentos T11 e T13 utilizou-se placas com sessenta dias de crescimento do isolado.

Para a inoculação usou-se placas de Petri de 9 cm de diâmetro com aproximadamente 20 mL de meio. À esquerda foi depositado um disco com 9 mm de diâmetro contendo micélio fúngico retirado da margem do isolado. À direita, mantendo 2,5 cm de distância do disco de micélio, espalhou-se cerca de 150 sementes usando espátulas estéreis (Steinfort et al., 2010). Placas contendo apenas as sementes serviram como controle. As sementes utilizadas foram as remanescentes do experimento de viabilidade do item 3.7.1

O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado em desenho fatorial com quatorze tratamentos, três meios e quatro repetições. Conduziram-se, simultaneamente, dois experimentos que permaneceram incubados em Câmara de Germinação – Technal com temperatura de 26°C ± 2°C e fotoperíodo de 16/8 h – L/E (Tomita, 1995; Santos-Hernández 47

et al., 2005; Kauth et al., 2006; Johnson & Kane, 2007; Otero et al., 2007; Ávila- Díaz et al., 2009; Díaz & Álvarez, 2009; Johnson et al., 2011). A avaliação dos estádios de germinação das sementes procedeu conforme exposto no item 3.8.1. Após 150 dias de inoculação, as placas contendo AAP foram abertas e um bloco, com 1 cm3 do meio contendo as sementes, foi transferido para novas placas. Inoculou-se um disco de micélio jovem do fungo original para cada placa. As placas retornaram para a câmara de germinação mantendo-se a temperatura e o fotoperíodo.

3.8.2.3 Epidendrum nocturnum

Para o experimento de germinação simbiótica das sementes de E. nocturnum foram utilizados fungos micorrízicos oriundos de três espécies de orquídeas e três fungos rizoctonioides fitopatogênicos procedentes de espécies cultivadas (Tabela 4).

Tabela 4. Tratamentos utilizados na germinação de sementes de E. nocturnum para testar a especificidade da interação fungo-planta.

Tratamento Código Gênero Planta

T1 En02 Epulorhiza sp. E. nocturnum

T2 En03 Epulorhiza sp. E. nocturnum

T3 En05 Epulorhiza sp. E. nocturnum

T4 En07 Rhizoctonia sp. E. nocturnum

T5 En24 Rhizoctonia sp. E. nocturnum

T6 Cv17 Epulorhiza sp. C. vernum

T7 Cv10 Rhizoctonia sp. C. vernum

T8 Cs02 Epulorhiza sp. C. saintlegerianum

T9 Ro88 Rhizoctonia oryzae Oryza sativa

T10 Ro89 R. oryzae Oryza sativa

T11 Rh2 Rhizoctonia solani Phaseolus vulgaris

48

Foram conduzidos dois experimentos, no primeiro as sementes foram submetidas ao aquecimento em banho-maria a 50ºC durante cinco minutos e, em seguida, inoculadas no meio de cultivo. No segundo experimento não foi realizado o aquecimento, as sementes foram retiradas da cápsula e inoculadas diretamente nas placas. Os métodos de condução e avaliação do experimento ocorreram seguindo o estabelecido no item 3.8.2.2.

3.9 CARACTERIZAÇÃO DA INTERAÇÃO FUNGO-PLANTA

Sementes em diferentes estádios de desenvolvimento foram coradas com azul de tripano diluído em lactoglicerol (0,05%) conforme descrito por Ishii & Loynachanv (2004). Também foi utilizado o corante azul de metileno na concentração de 0,1%. As sementes foram depositadas em lâminas estéreis, e em seguida observadas em microscópio óptico, para verificar a presença e formação de estruturas fúngicas intracelulares, os pelotons (Phillips & Hayman, 1970; Chutima et al. 2010).

Para a visualização em MEV coletou-se sementes em diferentes estádios de germinação dispostas nos tratamentos e meios. As sementes foram agrupadas em amostras e fixadas em FAA70 por 12 h. A desidratação ocorreu em série alcoólica de 70, 80, 90 e 99,1%.

As amostras foram submetidas à secagem por ponto crítico de CO2, coladas em stub e expostas à deposição de ouro e, em seguida, observadas em MEV (adaptado de Chou & Chang, 2004).

3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados obtidos na caracterização morfológica quantitativa, no teste de tetrazólio e na germinação simbiótica in vitro foram submetidos à análise de variância e à comparação de médias pelo teste Tukey a 5% de probabilidade, utilizando-se o Software R versão 2.11.0. Os dados obtidos para o teste de tetrazólio foram submetidos à transformação de √x. A porcentagem de germinação e desenvolvimento das sementes foi calculada dividindo-se o número de sementes em cada estádio pelo número total de sementes inoculadas em cada placa (Otero et al., 2004; Valadares, 2009). Os dados de germinação foram transformados utilizando-se arc sen √x/100.

49

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 IDENTIFICAÇÃO DOS ISOLADOS FÚNGICOS DE Cyrtopodium saintlegerianum E DE Epidendrum nocturnum

Após a purificação dos micélios crescidos a partir dos fragmentos radiculares foram identificados vinte e nove isolados para as três plantas amostradas de C. saintlegerianum, e vinte e oito isolados nas três plantas de E. nocturnum (Figura 3). Das plantas amostradas em C. saintlegerianum foram obtidos seis fungos em Cyrt-1, doze em Cyrt-2 e onze em Cyrt-3. Em E. nocturnum, nas plantas Epid-1 e Epid-2 obteve-se quatro isolados em cada uma e na Epid-3 foram obtidos vinte isolados.

7 Cyrtopodium saintlegerianum Epidendrum nocturnum 6 6 5 5 5 5 4 4 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 Frequência de Isoladosde Frequência 1 0 0 0 0 0 0 0 0

Figura 3. Frequência de Isolados Fúngicos obtidos de C. saintlegerianum e E. nocturnum identificados com base nas características morfológicas propostas por Hanlin (1990), Currah & Zelmer (1992) e Barnett e Hunter (2003).

50

4.1.1 Isolados fúngicos não rizoctonioides obtidos em C. saintlegerianum e E. nocturnum

Em C. saintlegerianum verificou-se que mais de 50% dos vinte e nove isolados pertencem aos gêneros Fusarium sp., Neurospora sp. e Nigrospora sp. com seis, cinco e cinco isolados, respectivamente. Do mesmo modo, em E. nocturnum foram obtidos cinco isolados de Chaetomium sp., quatro de Aspergillus sp., três de Phoma sp. e dois de Fusarium sp., representando a metade de um total de vinte e oito isolados.

A ocorrência de gêneros não micorrízicos tem sido observada em diversas espécies de orquídeas (Bayman et al., 1997; Tremblay et al., 1998; Bayman et al., 2002; Tao et al., 2008; Gezgin & Eltem, 2009; Yuan et al., 2009; Herrera et al., 2010; Chen et al., 2010; Chen et al., 2011; Jiang et al., 2011; Kasmir et al., 2011). Porém, a atuação de fungos endofíticos em orquídeas não está totalmente elucidada, visto que a maior parte das pesquisas está direcionada às interações micorrízicas (Bayman & Otero, 2006).

No presente estudo, o gênero Fusarium sp. foi obtido nas duas espécies de orquídeas. Em C. saintlegerianum, Fusarium sp. foi o gênero mais frequente com seis isolados de um total de vinte e nove, e em E. nocturnum foram obtidos dois isolados. Na literatura foram observados diferentes tipos de interação entre o gênero Fusarium sp. e representantes da família Orchidaceae. Smith-White et al. (2001) observaram a podridão de raízes, doença causada por Fusarium oxysporum, em espécies de Cymbidium sp., Dendrobium sp., Phalaenopsis sp., Coelogyne sp., e Oncidium sp. Espécies de Fusarium sp. também foram observadas ocasionando danos aos pseudobulbos, às folhas e às raízes de Cymbidium sp. (Ichikawa & Aoki, 2000; Kim et al., 2002; Lee et al., 2002), e causando podridões em raízes e em hastes de Dendrobium sp. (Latiffah et al., 2010).

Por outro lado, a espécie Fusarium semitectum Berk. & Rav. foi isolada de protocormos in situ de Cypripedium reginae. F. semitectum e mostrou-se eficiente para assinalar a viabilidade nos embriões e germinar as sementes, bem como promover o desenvolvimento in vitro de protocormos de C. reginae. (Vujanovic et al., 2000; Vujanovic & Vujanovic, 2007). Tsavkelova et al. (2008) avaliaram a eficiência de Fusarium sp., proveniente de Dendrobium moschatum (Buch.– Ham.) Swartz, em produzir ácido giberélico (GA3). Dentre cinco isolados, a espécie Fusarium proliferatum apresentou genes para a biossíntese de giberelina, porém não produziu quantidade detectável de GA3. No 51

entanto, as sequências de nucleotídeos da espécie Fusarium fujikuroi, que é um fungo produtor de giberelina em nível comercial, mostraram similaridades quando alinhadas às sequências do isolado de F. proliferatum. Yuan e colaboradores (2009) desinfestaram 288 amostras de raízes, hastes e folhas de Dendrobium nobile Lindl., e obtiveram 172 isolados fúngicos. Foram obtidos quatorze gêneros dos quais Fusarium sp., Phomopsis sp. e Xylaria sp. se destacaram com doze, nove e onze isolados, respectivamente. Chen et al. (2010) isolaram fungos de amostras de raízes e hastes da espécie epífita Dendrobium loddigesii Rolfe e obtiveram quarenta e oito isolados dos quais um isolado de Fusarium sp. foi obtido da haste e dez foram provenientes de raízes, ou seja, cerca de 17% do número total de isolados.

O gênero Xylaria sp. ocorre em todas regiões do mundo, porém está mais difundido nas regiões tropicais do que nas de clima temperado (Whalley, 1996; Souza et al., 2004; Rogers et al., 2005; Hladkil & Romero, 2007; Ju & Hsieh, 2007; Persoh et al., 2009; Medel et al., 2010; Fournier et al., 2011). Pode ser encontrado, como fungo endofítico, em diversas famílias vegetais de clima tropical, incluindo espécies de orquídeas epífitas e rupícolas (Bayman et al., 1997; Bayman et al., 1998; Tremblay et al., 1998; Davis et al., 2003; Bayman & Otero, 2006; Yuan et al., 2009; Xing et al., 2011). Algumas espécies de Xylaria sp. já foram relatadas promovendo o desenvolvimento de plantas e a inibição de fitopatógenos microbianos em espécies florestais (Bayman et al., 1998; Souza et al., 2004).

No presente estudo foram obtidos dois isolados de Xylaria sp. em duas das três plantas amostradas para a espécie C. saintlegerianum. O isolado Cs16 (Figura 4 A) foi obtido da planta Cyrt-2 e Cs18 (Figura 4 B) da planta Cyrt-1, ambos foram identificados com base nas características microscópicas descritas na chave para gêneros ascomicetos proposta por Hanlin (1990). 52

Figura 4. Isolados pertencentes ao gênero Xylaria sp., oriundos de C. saintlegerianum crescidos em CMA por vinte dias. A: Isolado Cs16 obtido da planta Cyrt-2; e B: Cs18 isolado da planta Cyrt-1. (Barras: 1 cm).

Bayman e colaboradores (1997) isolaram fungos endofíticos de folhas e raízes obtidas de sete espécies, epífitas e rupícolas, do gênero Lepanthes sp. As plantas das quais foram coletados as amostras apresentavam aspecto saudável. Os gêneros obtidos foram Xylaria sp. e Rhizoctonia sp., ambos estavam presentes tanto nas folhas quanto nas raízes. Em orquídeas, alguns representantes do gênero Rhizoctonia sp. colonizam as raízes e, quando estão em associação micorrízica, são denominados rizoctonioides (Currah & Zelmer, 1992; Otero et al., 2002, 2005, 2007; Pereira et al., 2009; Rasmussen & Rasmussen, 2009; Valadares et al., 2011).

Em plantas de Lepanthes rupestris cultivadas in vivo, nas quais foram aplicadas dosagens de fungicidas comerciais, Bayman e colaboradores (2002) perceberam uma redução no aparecimento de fungos em relação às plantas não tratadas. Entretanto, o gênero Xylaria sp. foi encontrado em raízes e folhas, tanto nos tratamentos com fungicida, como no tratamento controle. Nas raízes tratadas com o fungicida benomyl foram obtidos 92 isolados e o gênero Xylaria sp. foi o mais frequente com 25 isolados. Já no tratamento controle, ou seja, plantas sem a ação de fungicida, os mesmos autores obtiveram 97 isolados, dos quais somente sete foram do gênero Xylaria sp. 53

Richardson & Currah (1995) realizaram um levantamento de fungos em raízes de orquídeas epífitas pertencentes a diversos gêneros, dentre eles Catasetum sp., Epidendrum sp., Encyclia sp., Maxillaria sp. e Oncidium sp. Dos gêneros obtidos por estes autores, sete se assemelham aos isolamentos procendentes de C. saintlegerianum e E. nocturnum, obtidos no presente trabalho, que são Chaetomium sp., Curvularia sp., Fusarium sp., Nigrospora sp., Phomopsis sp., Pyrenochaeta sp. e Xylaria sp.

Chen et al. (2010) obtiveram um isolado de Nigrospora sp. e outro de Pyrenochaeta sp. em raízes de plantas saudáveis de Dendrobium loddigesii. Xing et al. (2011) obtiveram fungos endofíticos de Dendrobium devonianum e de Dendrobium thyrsiflorum. Para a primeira espécie os gêneros mais frequentes foram Fusarium sp. e Phoma sp., e para a segunda, Fusarium sp. e Epicoccum sp. Tais fungos demonstraram efeito antagônico à Escherichia coli, Candida albicans, Aspergillus fumigatus, dentre outros. Tan e colaboradores (2012) avaliaram a quantidade de gêneros fúngicos em raízes de nove espécies epífitas de Holcoglossum sp. Obtiveram 46 isolados perfazendo um total de 16 gêneros, e os mais frequentes foram Fusarium sp. e Epulorhiza sp. com sete e cinco isolados, respectivamente. Os demais isolados foram Alternaria sp., Cladosporium sp.,

Colletotrichum sp., Phomopsis sp., Pyrenochaeta sp., dentre outros.

No presente trabalho foi observado que nas espécies C. saintelegerianum e E. nocturnum, os gêneros não rizoctonioides apresentaram se em maior número em relação aos fungos do complexo Rhizoctonia sp. Pesquisas que identifiquem e proponham soluções para espécies de fungos patogênicos às orquídeas são necessárias. Já se sabe que os fungos endofíticos associados às orquídeas podem ser responsáveis pelo controle biológico de fitopatógenos, bem como por aumentar a produção de substâncias promotoras de crescimento nas plantas e, portanto, são importantes para estudos futuros direcionados a estas áreas.

4.1.2 Isolados rizoctonioides

Foram obtidos oito isolados micorrízicos do grupo dos rizoctonioides, três em C. saintlegerianum e cinco em E. nocturnum. Os três isolados obtidos de C. saintlegerianum, cujos códigos de identificação são Cs02, Cs10 e Cs21, foram identificados como Epulorhiza sp. por apresentarem hifas hialinas, finas, septadas, constrições de 90º com a hifa ramificada, e quando cultivados por dois meses em CMA, produziram células monilioides (Figura 5). 54

Figura 5. Isolados rizoctonioides pertencentes ao gênero Epulorhiza sp. obtidos da espécie C. saintlegerianum. A: Isolado Cs02 (Epulorhiza sp.) apresentando células monilioides (seta); B: Cadeia de células monilioides (seta) do isolado Cs10 (Epulorhiza sp.); C: Hifa septada do isolado Cs10 (círculo); e D: Cadeia de células monilioides (seta) do isolado Cs21 (Epulorhiza sp.). (Barras: A, B e D: 50 m; e C: 10 m).

Dos cinco isolados provenientes de E. nocturnum três, En02, En03 e En05, foram identificados como Epulorhiza sp., e dois, En07 e En24, como Rhizoctonia sp. (Figura 6). Os três isolados de Epulorhiza sp. de E. nocturnum apresentaram as mesmas características dos isolados rizoctonioides de C. saintlegerianum (Figura 6 A-D). Porém, na espécie E. nocturnum, os isolados En07 e En24 foram identificados como Rhizoctonia sp. (Figura 6 E-G), pois apresentaram hifas largas, septadas e com constrição em ângulo reto com a ramificação, embora estes isolados não tenham formado células monilioides em nenhum dos dois meios observados. O isolado En07 apresentou glóbulos de óleo nas hifas 55

em colônias crescidas por dois meses em CMA (Figura 6 F). Athipunyakom et al. (2004b) verificaram que um isolado de Rhizoctonia sp., oriundo de Paphiopedilum niveum, e dois de Ceratorhiza sp., obtidos de Goodyera procera e Paphiopedilum exul, também produziram grande quantidade de óleo nas hifas com mais tempo de crescimento no meio de cultivo, ou seja, as hifas mais próximas do segmento de micélio que deu origem à colônia.

56

Figura 6. Isolados rizoctonioides dos gêneros Epulorhiza sp. (A-E) e Rhizoctonia sp. (F e G) obtidos de E. nocturnum. A: Constrição de hifas (círculo) em En02 (Epulorhiza sp.); B: Formação de células monilioides de En02; C: Isolado En03 (Epulorhiza sp.) com células monilioides (seta) e constrição de hifas (círculo); D: Isolado En05 (Epulorhiza sp.), apresentando cadeia de células monilioides; E: Isolado En07 (Rhizoctonia sp.), apresentado constrição de hifas; F: Glóbulos de óleo (setas) nas hifas de En07; e G: Isolado En24 (Rhizoctonia sp.), apresentando constrição de hifas a 90º logo após o septo (círculo). (Barras: A, C, E, F e G: 50 m e B e D: 10 m). 57

As características microscópicas, como o formato das hifas e a presença de células monilioides, são utilizadas para a distinção dos gêneros micorrízicos rizoctonioides. No entanto, estes fungos podem, no decorrer do tempo ou do meio de cultivo in vitro, apresentar variações no crescimento, aspecto e na coloração do micélio. Estas variações morfológicas são de fundamental importância para uma correta descrição dos gêneros rizoctonioides (Currah & Zelmer, 1992; Zelmer & Currah, 1995; Pereira, 2001; Athipunyakon et al., 2004a; 2004b; Peterson et al., 2004; Bougoure et al., 2005; Nogueira et al., 2005; Pereira et al., 2005b; Pereira et al., 2009; Pereira & Kasuya, 2010; Nontachaiyapom et al., 2010; Steinfort et al., 2010, Valadares et al., 2011).

4.2 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DOS ISOLADOS RIZOCTONIOIDES E DO GÊNERO Xylaria sp.

4.2.1 Características qualitativas

O isolado Cs02, Epulorhiza sp., proveniente da planta Cyrt-1, apresentou crescimento esparso, micélio aéreo escasso e coloração branca (Figura 7 A). Os isolados Cs10 e Cs21, ambos de Epulorhiza sp. e embora sejam procedentes da mesma planta (Cyrt- 3), apresentaram diferenças morfológicas qualitativas. Observou-se que o aspecto e a coloração do micélio no isolado Cs10 foram diferentes após quatorze dias (Tabela 5). Às 72 h de crescimento em BDA ambos, Cs10 e Cs21, apresentaram micélio floculento e de cor branca. O isolado Cs21 (Figura 7 B) manteve estas propriedades após 336 h, entretanto no isolado Cs10 houve mudança no aspecto do micélio, de floculento para mucoso, e na cor, de branco para marrom claro (Figura 7 C e D).

Os isolados Cs02 e Cs21 apresentaram a margem submersa no meio de cultura e crescimento micelial esparso. O isolado Cs10, apesar de formar micélio denso apresenta células moniliódes de formato redondo do mesmo modo que Cs02 e Cs21. Tais características sugerem a identificação dos três isolados de C. saintlegerianum como Epulorhiza sp. (Currah & Zelmer, 1992; Pereira, 2001; Athipunyakon et al., 2004a; 2004b; Nontachaiyapoom et al. 2010), confirmando os dados microscópicos descritos anteriormente no presente trabalho.

58

Figura 7. Características morfológicas dos isolados Cs02, Cs10 e Cs21 de C. saintlegarianum cultivados em BDA. A: Cs02 (Epulorhiza sp.) com micélio esparso e com coloração branca após 336 h de cultivo; B: Cs21 (Epulorhiza sp.) com micélio esparso e branco após 336 h de cultivo; C: Cs10 (Epulorhiza sp.) com micélio denso, floculento e branco após 72 h de cultivo; e D: Cs10 com micélio denso, mucoso e de cor marrom após 336 h crescimento. (Barras: 1 cm).

59

Tabela 5. Avaliação das características morfológicas qualitativas como presença de micélio aéreo, formato da margem, aspecto e cor do micélio dos isolados rizoctonioides de C. saintlegerianum e E. nocturnum, e também dos isolados de Xylaria sp. obtidos de C. saintlegerianum.

Código do Gênero Planta Micélio Margem Aspecto do micélio Cor do isolado isolado de Aéreo origem 1 1 72h 336h 72h 336h

Cs02 Epulorhiza sp. Cyrt-1 Escasso Submersa Floculento Floculento Branco Branco

Cs10 Epulorhiza sp. Cyrt-3 Abundante Aérea Floculento Mucoso Branco Marrom

Cs16 Xylaria sp. Cyrt-2 Abundante Aérea Floculento Floculento Branco Branco e cinza e cinza

Cs18 Xylaria sp. Cyrt-1 Escasso Aérea Floculento Grumoso Branco Branco e marrom

Cs21 Epulorhiza sp. Cyrt-3 Escasso Submersa Floculento Floculento Branco Branco

En02 Epulorhiza sp. Epid-1 Abundante Aérea grumoso grumoso Branco Creme

En03 Epulorhiza sp. Epid-3 Abundante Submersa Floculento Floculento Branco Branco

En05 Epulorhiza sp. Epid-3 Escasso Aérea Grumoso Grumoso Branco Creme

En07 Rhizoctonia sp. Epid-3 Escasso Submersa Grumoso Mucoso Branco Creme

En24 Rhizoctonia sp. Epid-1 Abundante Aérea Grumoso Floculento Branco Creme

1 Os dados de presença de micélio aéreo e margem dos isolados foram iguais quando avaliadas após 72 e 336 horas.

O isolado Cs16 não apresentou mudanças quanto ao aspecto e à cor do micélio quando avaliado às 72 h e após 336 h de cultivo em BDA (Figura 8 A e B). Porém, após o período de trinta dias de cultivo, o isolado Cs16 formou estroma, estrutura característica do gênero Xylaria sp. (Figura 8 B). Em Cs16 também foram observados, ascósporos alongados e menores que 25 m (Figura 8 C). O isolado Cs18, apresentou micélio pouco floculento e branco após 72 h, e depois de 336 h seu micélio adquiriu aspecto de crosta e coloração escura (Figura 8 D e E). As características, morfológicas e microscópicas, observadas nos isolados Cs16 e Cs18 são condizentes com as descrições do gênero Xylaria sp. propostas na chave de identificação para ascomicetos de Hanlin (1990) e observadas em outros trabalhos que visaram identificar espécies do referido gênero (Rogers et al., 2005; Persoh et al., 2009; Yuan et al., 2009; Fournier et al., 2011). 60

Figura 8. Características morfológicas dos isolados Cs16 e Cs18 pertencentes ao gênero Xylaria sp. procedentes da espécie C. saintlegerianum. A: Isolado Cs16 crescido após 72 h em BDA; B: Cs16 com 336 h de crescimento apresentando estroma (seta); C: ascósporos (seta) de Cs16 em microscopia óptica; D: Isolado Cs18 crescido por 72 h em BDA com micélio escasso branco com pequena área em marrons; e E: Cs18 crescido após 336 h em BDA com micélio grumoso com áreas de cor branca, marrom e preta. (Barras: A, B, D e E: 1 cm; e C: 30 m).

Para a espécie E. nocturnum, os isolados En02 e En24 originaram-se das raízes da planta Epid-1 e os demais procederam da planta Epid-3. Assim como aconteceu na planta Cyrt-2, nos fragmentos amostrados das raízes de Epid-2 não foram encontrados isolados micorrízicos. Os isolados En03 e En05, ambos Epulorhiza sp. e provenientes da mesma planta, foram diferentes para todas as características avaliadas. Pereira et al. (2009) (Pereira et al. 2005) coletaram doze fragmentos de raízes de Epidendrum secundum, mas apenas oito originaram isolados micorrízicos. Dos outros fragmentos, os autores obtiveram fungos não micorrízicos que foram armazenados para estudos posteriores. O isolado En03 (Figura 9 C e D) de Epulorhiza sp. foi diferente de En02 e En05 (Figura 9 A, B, E e F) quanto à cor, ao 61

zoneamento e ao aspecto do micélio após 336 h de avaliação. Notou-se a diferenciação da cor, de branco após 72 h para creme às 336 h, no micélio dos isolados En02 e En05 de Epulorhiza sp., e nos isolados En07 e En24 de Rhizoctonia sp. (Figura 9 G-J).

Os isolados En07 e En24 foram similares quanto à coloração do micélio nos dois períodos de avaliação. Por outro lado, depois de 72 h ambos tinham aspecto grumoso, mas após 336 h distinguiram-se quanto ao aspecto, pois o isolado En07 apresentou micélio mucoso e En24, micélio floculento. Os dois isolados também diferiram entre si no que se refere ao zoneamento da margem e à formação de micélio aéreo, enquanto o isolado En07 apresentou pouco micélio aéreo e margem submersa, o isolado En24 teve micélio aéreo abundante com a margem bastante cotonosa.

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Figura 9. Características morfológicas dos isolados En02, En03, En05, En07 e En24 de E. nocturnum cultivados em BDA. A: Isolado En02 (Epulorhiza sp.) com coloração branca após 72 h; B: En02 com cor creme claro após 336 h; C: Isolado En03 (Epulorhiza sp.) com coloração branca após 72 h; D: En03 manteve a cor após 336 h; E: Isolado En05 (Epulorhiza sp.) crescido por 72 h com cor branca; F: En05 após 336 h de crescimento apresentando cor creme claro; G: En07 (Rhizoctonia sp.) crescido após 72 h com micélio de cor branca; H: En07 após 336 h apresentando cor creme escuro; I: Isolado En24 (Rhizoctonia sp.) com cor branca após 72 h; e J: En24 com micélio de cor creme escuro após 336 h. (Barras: 1 cm). 63

Athipunyakon et al. (2004a) obtiveram isolados de Epulorhiza sp. e Rhizoctonia sp. das raízes de Spathoglottis plicata. Os autores verificaram que a cor dos isolados mudou, no decorrer de dez dias, de branco para creme em Epulorhiza sp. e de creme para amarelo em Rhizoctonia sp. Em outro estudo, Athipunyakon et al. (2004b) isolaram sete gêneros de fungos micorrízicos de onze orquídeas terrestres oriundas de diferentes locais da Tailândia. Dos fungos obtidos, dois isolados de Rhizoctonia sp. e um de Epulorhiza repens apresentaram mudanças na cor do micélio. Estes resultados foram similares ao apresentado, no presente estudo, pelos isolados Cs10, En02 e En05 de Epulorhiza sp., e En07 e En24 de Rhizoctonia sp.

O gênero Epulorhiza sp. encontra-se associado à maioria de espécies de orquídeas tropicais e subtropicais (Pereira, 2001; Nogueira et al., 2005; Pereira et al., 2005a; Linhares, 2006; Pereira et al., 2009). No Brasil, Pereira (2001) isolou fungos micorrízicos de seis orquídeas epífitas e uma terrestre, provenientes de diferentes localidades de Minas Gerais, Brasil. Foram obtidos sete isolados, quatro pertencentes ao gênero Ceratorhiza sp. e três, Epulorhiza sp. Todos os isolados de Epulorhiza sp. apresentaram o micélio com a coloração creme e a margem submersa no meio de cultura. Pereira e colaboradores (2003) constataram que os isolados de Epulorhiza sp. obtidos das orquídeas epífitas Epidendrum rigidum Jacq. e Polystachia concreta (Jacq.) Garay and Sweet, pertencem à uma nova espécie, e classificaram-na como Epulorhiza epiphytica O. L. Pereira, Rollemberg & Kasuya, sp. nov. Pereira et al. (2005c) identificaram o isolado de Epulorhiza sp. oriundo da orquídea terrestre Oeceoclades maculata (Lindl.) Lindl. como Epulorhiza repens. Estes autores observaram que as espécies E. epiphytica e E. repens diferem quanto ao tamanho e formato de células monilioides, e diâmetro das hifas vegetativas. Pereira et al. (2005b) isolaram Rhizoctonia sp. de pelotons em raízes de Gomesa crispa, e este foi o primeiro registro de Rhizoctonia sp. multinucleada como fungo micorrízico de orquídea no Brasil. O isolado apresentou micélio aéreo abundante e coloração branca que, depois de alguns dias incubada em BDA, tornou-se marrom claro. Pereira et al. (2009) obtiveram 26 isolados rizoctonioides de um total de 44 fungos isolados de quatro diferentes populações de E. secundum. Os isolados rizoctonioides apresentaram coloração creme, aspecto aveludado, liso ou cotonoso e, portanto todos foram identificados como Epulorhiza sp. Gonçalves (2009) obteve dois isolados micorrízicos, um de Cyrtopodium 64

eugenii e um de Cyrtopodium vernum. Estes isolados foram identificados como Epulorhiza sp., com base nas características microscópicas e por apresentarem aspecto grumoso, micélio aéreo escasso e coloração acinzentada. Nogueira et al. (2005) coletaram oito gêneros de orquídeas em áreas degradadas de campo rupestre. Obteve-se um fungo micorrízico para cada orquídea, perfazendo um total de dois isolados de Epulorhiza sp., dois de Rhizoctonia sp. e quatro de Ceratorhiza sp. Uma das espécies avaliadas foi Epidendrum dendrobioides, orquídea rupícola, da qual foi isolado o gênero Epulorhiza sp. Linhares (2006) obteve vinte e oito isolados de Epulorhiza sp. em plantas rupícolas de Epidendrum secundum e Zygopetalum mackaii. O gênero Epulorhiza sp. também foi isolado de plantas rupícolas e terrestres de E. secundum (Pereira et al., 2009). Por outro lado, Valadares et al. (2008) isolaram Ceratohiza sp. e Rhizoctonia sp. de uma espécie terrestre do gênero Gomeza sp., plantas oriundas de floresta de araucária. Valadares et al. (2011) isolaram diversos fungos micorrízicos de plantas epífitas de Coppensia doniana, originárias da mata Atlântica. Os fungos foram agrupados em três clados, sendo dois de fungos binucleados, Ceratohiza sp., e um de fungos uninucleados, Rhizoctonia sp. Os resultados obtidos no presente trabalho apontam que Epulorhiza sp. está associada à fase adulta de plantas da espécie C. saintlegerianum, enquanto que Epulorhiza sp. e Rhizoctonia sp. estão presentes no sistema radicular de plantas da espécie E. nocturnum. Por este resultado nota-se que C. saintlegerianum está associado ao gênero Epulorhiza sp. enquanto que para Epidendrum nocturnum não se observa um padrão de especificidade micorrízica, pois esta é estabelecida pela relação estreita ou ampla entre fungos rizoctonioides e um gênero de orquídea. A alta especificidade micorrízica pode acarretar problemas à conservação e distribuição de determinadas espécies de orquídeas em habitat natural (Masuhara & Katsuya, 1994; Batty et al., 2001; Brundrett, 2002; Taylor et al., 2003; Diez, 2007; Jacquemyn et al., 2011; Phillips et al., 2011).

4.2.2 Características quantitativas

4.2.2.1 Diâmetro e taxa de crescimento dos isolados

As medidas de diâmetro e taxa de crescimento dos oito isolados rizoctoniódes e dos dois pertencentes à família Xylareaceae constam na Tabela 6. Após 72 h de crescimento em BDA os isolados Cs02 e En05, ambos de Epulorhiza sp., apresentaram o maior diâmetro 65

tanto horizontal quanto vertical. Em CMA, os isolados rizoctonioides com maiores diâmetros, horizontal e vertical, foram Cs02 e En02 também de Epulorhiza sp. Em CMA notou-se que o isolado Cs18 de Xylaria sp., não diferiu do isolado Cs02 (Epulorhiza sp.) quanto aos diâmetros horizontal e vertical. Os diâmetros, horizontal e vertical, dos cinco isolados rizoctonioides de E. nocturnum foram maiores em BDA do que em CMA. Entre os isolados Cs10 e Cs21 não houve diferença significativa para ambos os diâmetros, mas foi notado um crescimento micelial mais denso em BDA e mais esparso em CMA. O meio CMA é, comumente, utilizado para promover o surgimento de células monilioides e microescleródios nos isolados micorrízicos (Pereira, 2001; Athipunyakon et al., 2004a; 2004b; Nogueira et al, 2005; Pereira et al., 2005b; Valadares et al., 2008; Pereira et al., 2009).

66

Tabela 6. Dados de diâmetro e taxa de crescimento dos isolados fúngicos de C. saintlegerianum e E. nocturnum. [Diâmetro horizontal (DH) e vertical (DV), em centímetros, após 72 h de crescimento em CMA e BDA; taxa de crescimento horizontal (TCH) e vertical (TCV), em mm/h-1, após três intervalos de tempo, 72, 144 e 216 h de crescimento dos isolados em BDA e CMA]. (Isolados Cs02, Cs10 e Cs21 de Epulorhiza sp.; Cs16 e Cs18 de Xylaria sp.; En02, En03 e En05 de Epulorhiza sp.; e En07 e En24 de Rhizoctonia sp.

Isolado DH DV TCH TCV Fúngico BDA CMA BDA CMA BDA CMA BDA CMA

Cyrtopodium saintelegerianum

Cs02 8,10a1A2 4,76aB 7,80aA 5,66aB 0,41aA 0,41aA 0,41aA 0,41aA

Cs18 5,32bA 5,52aA 5,10abA 5,10aA 0,41aA 0,41aA 0,41aA 0,41aA

Cs10 4,90bcA 4,04abA 4,68bcA 4,14bA 0,40aA 0,41aA 0,40aA 0,41aA

Cs21 3,40cdA 3,60abA 3,20cdA 3,40bcA 0,41aA 0,41aA 0,41aA 0,41aA

Cs16 2,18dA 2,36bA 2,16dA 2,20cA 0,32bA 0,28bA 0,34bA 0,28bB

Epidendrum nocturnum

En05 4,70aA 1,76bB 4,92aA 1,50bB 0,38abA 0,38abA 0,39aA 0,38aA

En24 4,54aA 1,40bB 4,56aA 1,32bB 0,36abB 0,39aA 0,38aA 0,34bB

En03 4,44aA 2,38abB 4,44aA 2,16aB 0,40aA 0,38abA 0,39aA 0,40aA

En02 4,40aA 2,94aB 4,02abA 2,78aB 0,40aA 0,39aA 0,40aA 0,40aA

En07 3,36bA 2,44abB 3,52bA 2,24aB 0,33bA 0,34bA 0,34bA 0,35bA

1 Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas, na coluna e para cada parâmetro, não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de significância. 2 Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas, na linha, para cada parâmetro, não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de significância.

Pereira (2001) avaliou o diâmetro de sete isolados micorrízicos em cinco diferentes meios de cultivo, dentre eles BDA e FA (Fubá-Ágar). O meio FA é composto por fubá e ágar, logo possui características nutritivas similares ao meio CMA que é produzido a partir do cozimento de farelo de milho. Foi notado que dos três isolados de Epulorhiza sp. dois apresentaram o mesmo diâmetro radial após 72 h de crescimento em BDA e FA, e o terceiro foi maior em FA do que em BDA. Já para os quatro isolados de Ceratorhiza sp., três apresentaram maior diâmetro radial em FA e um foi maior em BDA. 67

Valadares et al. (2008) obtiveram de Gomeza sp., um isolado de Rhizoctonia sp. e cinco de Ceratorhiza sp. Observaram que o diâmetro radial do isolado de Rhizoctonia sp. cresceu 9 cm às 72 h de crescimento em BDA, e os cinco isolados de Ceratorhiza sp. apresentaram entre 1,2 e 7,5 cm de diâmetro no mesmo período de avaliação. Valadares et al. (2011) avaliaram fungos rizoctonioides originários de Coppensia doniana e observaram que todos os nove isolados de Rhizoctonia sp. apresentaram maior diâmetro em CMA do que em BDA. Dos dezesseis isolados de Ceratorhiza sp. quatorze apresentaram maior diâmetro em CMA e dois em BDA.

Valadares et al. (2011) também verificaram que o micélio dos isolados de Rhizoctonia sp. cresceu mais denso, enquanto que os isolados de Ceratorhiza sp. apresentaram micélio esparso na placa de Petri. Também foi observado que os isolados de Rhizoctonia sp., após 72 h de crescimento apresentaram diâmetro radial entre 4,45 e 6,35 cm, enquanto os isolados de Ceratorhiza sp. cresceram entre 2,53 e 5,95 cm. No presente trabalho os dois isolados de Rhizoctonia sp., En07 e En24, apresentaram diâmetros variando de 1,4 a 4,54 cm na horizontal e 1,32 cm a 4,56 cm na vertical. Dentre os seis isolados de Epulorhiza sp., Cs02, Cs10, Cs21, En02, En03 e En05, houve uma variação de 1,76 a 8,10 cm na horizontal e de 1,5 a 7,80 cm na vertical, demostrando que o padrão de crescimento dos fungos pode ser bastante variável.

As TCH e TCV dos três isolados rizoctonioides de C. saintlegerianum não apresentam dados contrastantes para os dois meios. No entanto, na avaliação visual do isolado Cs10 foi possível notar o desenvolvimento de micélio aéreo denso em BDA, o que não foi verificado em CMA. Os isolados Cs02 e Cs21 crescem de forma similar nos dois meios, seja qualitativa ou quantitativamente. Os isolados do gênero Xylaria sp. diferiram entre si para a taxa de crescimento em todos os parâmetros avaliados, onde Cs16 cresceu menos do que Cs18. Porém o isolado Cs18 não diferiu dos isolados rizoctonioides quando comparadas as TCH e TCV em ambos os meios avaliados.

Para E. nocturnum observou-se que os isolado En02 (Epulorhiza sp.), apresentou o maior crescimento horizontal e vertical nos dois meios de cultivo. Porém não houve diferença significativa entre o isolado En02 e os isolados En05 e En03, também de Epulorhiza sp., em nenhum dos parâmetros avaliados. O crescimento dos isolados En02, En03 e En05 também não foi influenciado, quantitativamente, pelo meio de cultura, visto que não houve diferença significativa entre BDA e CMA. No entanto, observou-se que em 68

BDA o crescimento do micélio foi mais denso do que em CMA. O isolado En24 de Rhizoctonia sp., apresentou diferença significativa de crescimento em BDA e CMA, enquanto que o isolado En07 demonstrou a mesma taxa de crescimento em ambos os meios. Os dois isolados de Rhizoctonia sp. diferiram entre si quanto aos diâmetros horizontal e vertical para BDA, no diâmetro horizontal para CMA, mas não houve diferença significativa entre En07 e En24 para o diâmetro vertical em CMA.

Nogueira et al. (2005) obtiveram taxas de crescimento em centímetros por dia de isolados de Rhizoctonia sp. e Epulorhiza sp. em dois meios de cultivo, BDA e FA. Observaram que o crescimento radial dos dois isolados OM18 e OM20, ambos de Epulorhiza sp. foi de 0,06 e 0,31 cm, em BDA, respectivamente e de 0,12 e 0,43 cm em FA, respectivamente. Dos dois isolados de Rhizoctonia sp., o crescimento radial de OM19 foi de 1,49 cm em BDA e 1,02 cm em FA, enquanto que o isolado OM21 cresceu mais em FA com 1,07 cm, do que em BDA com 0,95 cm. Valadares et al. (2011) avaliaram nove isolados de Rhizoctonia sp. e dezesseis de Ceratorhiza sp., oriundos de diversas plantas de Coppensia doniana. Observaram que a taxa de crescimento radial não diferiu entre BDA e CMA para dois isolados de Ceratorhiza sp., mas foi maior em CMA para todos os demais, tanto de Ceratorhiza sp. quanto de Rhizoctonia sp.

Para diferenciar os fungos micorrízicos foram utilizadas a avaliação morfológica tanto de dados qualitativos quanto quantitativos, bem como de estruturas microscópicas, como por exemplo, o formato e o tamanho de células monilioides (Pereira, 2001; Athipunyakon et al., 2004a; 2004b; Nogueira et al, 2005; Pereira et al., 2005b; Pereira et al., 2009; Nontachaiyapom et al., 2010; Valadares et al., 2011). Visto que os fungos micorrízicos do grupo dos rizoctonioides possuem diferenças minuciosas e características peculiares, são também utilizadas as avaliações microscópicas de alta definição, como por exemplo, com acessório para epifluorescência (Pereira et al., 2005b; Valadares et al., 2011). Testes enzimáticos para a produção de polifenol oxidases também são empregados para diferenciar Epulorhiza sp. de Ceratorhiza sp. (Pereira, 2001; Linhares, 2006; Pereira & Kasuya, 2010).

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4.2.2.2 Condição nuclear e diâmetro de hifa vegetativa; presença, formato e tamanho de células monilioides dos isolados

Os isolados micorrízicos Cs02, Cs10 e Cs21, procedentes de C. saintlegerianum, possuem hifas jovens binucleadas e com diâmetros menores do que 4 m (Tabela 7). Os três isolados, quando cultivados por dois meses em CMA, produziram células monilioides ovais a arredondadas em cadeias com até cinco células. Na Figura 10 A visualiza-se a formação de uma célula monilioide no isolado Cs02 e na Figura 10 B observa-se a presença de dois núcleos (seta) em célula monilioide em formação. Embora sejam todos pertencentes ao gênero Epulorhiza sp., as células monilioides produzidas pelo isolado Cs02 apresentaram média de tamanho de 9,44 m de comprimento por 9,38 m de largura, enquanto que as monilioides de Cs10 e Cs21 tiveram 5,97 por 5,44 m e 4,27 por 4,3 m, respectivamente.

O isolado Cs10, após cinco dias de crescimento em microcultura (meio BDA), apresentou hifas enoveladas com diferentes tamanhos, estas estruturas são denominadas pelotons (Peterson et al., 2004). Na Figura 10 C visualiza-se um peloton formado pelo isolado Cs10 com 30 m na horizontal e 25,3 m na vertical. Ma et al. (2003) observaram, em microscopia óptica, a formação de um peloton em meio de cultivo BDA para um isolado de Epulorhiza sp. oriundo de um híbrido de Oncidium sp.

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Tabela 7. Condição nuclear e diâmetro das hifas vegetativas para os isolados rizoctonioides de C. saintlegerianum e E. nocturnum, e para os dois isolados de Xylaria sp. de C. saintlegerianum microcultivados em BDA por cinco dias; e medidas de células monilioides dos isolados rizoctonioides crescidos por dois meses em CMA.

Código do Gênero Condição Diâmetro de Tamanho das células isolado nuclear hifas jovens1 monilioides1

Comprimento Largura

Cs02 Epulorhiza sp. Binucleada 3,031 m 9,442 m 9,382 m

Cs10 Epulorhiza sp. Binucleada 2,312 m 5,97 m 5,44 m

Cs16 Xylaria sp. * 5,458 m * *

Cs18 Xylaria sp. * 5,958 m * *

Cs21 Epulorhiza sp. Binucleada 2,384 m 4,27 m 4,3 m

En02 Epulorhiza sp. Binucleada 1,176 m 5,06 m 5,46 m

En03 Epulorhiza sp. Binucleada 1,482 m 6,4 m 6,82 m

En05 Epulorhiza sp. Binucleada 2,028 m 7,05 m 7,6 m

En07 Rhizoctonia sp. Multinucleada 3,354 m - 3 -

En24 Rhizoctonia sp. Multinucleada 2,656 m - -

1 A média de cinco hifas vegetativas para cada isolado; 2 Média de três células monilioides para cada isolado; 3 Os isolados En07 e En24 não formaram células monilioides . (*Não observado)

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Figura 10. Isolados de Epulorhiza sp. (A-D) e Rhizoctonia sp. (E e F) observados em microscopia óptica com acessório para epifluorescência (MOF) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). A: Célula monilioide sendo formada em Cs02; B: Célula monilioide binucleada (seta) em Cs10; C: Formação de peloton em microcultivo de Cs10; D: Hifas vegetativas do isolado En03 apresentando dois núcleos a partir dos septos (setas); E: Hifa septada (setas) e multinucleada de En07; e F: Septo logo após a constrição a 90º (seta branca) de hifa multinucleada em En24. (Barras: A, B e E: 5 m; C e D: 10 m; e F: 20 m).

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Em E. nocturnum, os isolados En02, En03 e En05 (Epulorhiza sp.) apresentaram hifas jovens binucleadas e menores que 4 m (Tabela 7 – Figura 10 D). Os três isolados produziram células monilioides arredondadas a ovais. As células monilioides do isolado En05 apresentaram 7,05 m de comprimento por 7,6 m de largura, ao passo que En02 e En03 mediram 5,06 por 5,46 m e 6,4 por 6,82 m, respectivamente. O isolado En05 exibiu cadeias com mais de cinco células, enquanto En02 e En05 apresentaram cadeias curtas com no máximo quatro células monilioides. As células monilioides são estruturas fúngicas de resistência e armazenam nitrogênio e fósforo, dentre outros nutrientes. As cadeias de células monilioides são consideradas o estádio primário da formação dos escleródios, que são estruturas reponsáveis pela latência de fungos no solo (Rasmussen, 1990; Peterson et al., 2004; Cameron et al., 2007; 2008; Rasmussen & Rasmussen, 2009; Látalová & Baláz, 2010). No entanto, no presente trabalho, não foram observados escleródios para nenhum dos isolados rizoctonioides obtidos para as duas espécies de orquídeas estudadas.

Os isolados En07 e En24, ambos de Rhizoctonia sp. apresentaram muitos núcleos por hifa vegetativa (Figura 10 E e F). O diâmetro das hifas vegetativas para En07 e En24 foi menor que 4 m, porém maiores do que os diâmetros dos isolados de Epulorhiza sp. (Tabela 7). A microscopia óptica com acessório para epifluorêscencia quando utilizada para determinar a condição nuclear de fungos rizoctonioides demonstrou-se eficaz também em outros trabalhos (Linhares, 2006; Valadares et al., 2008; Valadares et al., 2011). Na Chave Dicotômica proposta por Currah & Zelmer (1992) os isolados multinucleados, quando em fase anamórfica são denominados Moniliopsis sp., e quando produzem esporos são pertencentes ao gênero Thanatephorus sp. Sugerem, ainda, que as características morfológicas do isolado em meio de cultivo e os dados microscópicos são de fundamental importância para identificar os gêneros de isolados rizoctonioides associados às orquídeas.

Currah & Zelmer (1992) também reportam que Epulorhiza sp. possui crescimento lento, pouco aéreo ou cotonoso, margem submergida no meio de cultivo, micélio de cor creme e hifas jovens menores que 4 m. Destacam que Ceratorhiza sp. possui cor creme, amarelo claro ou escuro, micélio cotonoso, e hifas jovens maiores que 4 m. Porém outros trabalhos apontam diferentes formatos e colorações para isolados rizoctonioides (Athipunyakon et al., 2004a; 2004b; Nontachaiyapom et al., 2010; Valadares et al., 2011). Para facilitar a diferenciação de Epulorhiza sp. e Ceratorhiza sp. há um teste 73

de simples e rápida realização, utilizado para verificar a produção de polifenol oxidases (Zelmer & Currah, 1995; Pereira, 2001; Read & Pérez-Moreno, 2003; Linhares, 2006).

4.3 TESTE ENZIMÁTICO PARA POLIFENOL OXIDASE

Os três isolados de Epulorhiza sp. oriundos de C. saintlegerianum cresceram razoavelmente bem no meio de cultura AAEL acrescido de ácido tânico quando comparado com o meio controle. Entretanto, não produziram o halo de cor âmbar, ou seja, não houve produção de polifenol oxidase para estes isolados (Figura 11 A-E). As colorações de tons marrons em torno do micélio do isolado Cs10 (Epulorhiza sp. - Figura 11 C) não caracterizam produção de polifenol oxidase. Houve produção de polifenol oxidases para os dois isolados de Xylaria sp., Cs16 (Figura 11 F) e Cs18 (Figura 11 G), porém visualizou-se um halo de cor âmbar bem escuro em torno da margem do micélio de Cs16, enquanto Cs18 apresentou halo âmbar mais claro. Baldrian (2006) verificou que cepas de Xylaria polymorpha e X. hypoxylon podem produzir elevadas quantidades de polifenol oxidases em meio de cultivo específico para estas espécies. Liers et al. (2007) obtiveram produção moderada de polifenol oxidase por X. polymorpha.

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Figura 11. Teste de polifenol oxidase nos isolados rizoctonioides e pertencentes ao gênero Xylaria sp., oriundos de C. saintlegerianum. A: Cs02 (Epulorhiza sp.) crescido em AAEL acrescido com 5% de ácido tânico; B: Cs02 crescido em AAEL sem ácido tânico; C: Cs10 (Epulorhiza sp.) crescido em AAEL com ácido tânico; D: Cs10 crescido em meio sem ácido tânico; E: Cs21 (Epulorhiza sp.) crescido em AAEL com ácido tânico (esquerda) e em AAEL sem ácido tânico (direita); F: Cs16 (Xylaria sp.) crescido em AAEL com ácido tânico formando halo de cor âmbar escuro característico de polifenol oxidase; e G: Cs18 (Xylaria sp.) crescido em AAEL com ácido tânico formando polifenol oxidase. (Barras: 1 cm).

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Os isolados Cv17 (Epulorhiza sp.) e Cv10 (Rhizoctonia sp.), de C. vernum, também não produziram polifenol oxidades (Figura 12 A-D). O isolado fitopatogênico Ro88 (Rhizoctonia oryzae), cresceu em toda a placa de Petri (9 cm de diâmetro) no meio de cultivo sem ácido tânico. Já no meio acrescido com o referido ácido, Ro88 cresceu entre 1,5 e 3 cm na horizontal, e 2 e 3,5 cm na vertical, no entanto, não formou halo característico para a produção de polifenol oxidase (Figura 12 E e F).

Os isolados fitopatogênicos Ro89 (R. oryzae) e Rh2 (R. solani) cresceram em toda a placa de Petri após cinco dias quando o meio não continha ácido tânico (Figura 12 XG e I). Mas não cresceram mais que 0,5 cm no meio acrescido de ácido tânico, após cinco dias de incubação a 28°C ± 2°C (Figura 12 H e J). O não crescimento de Ro89 e Rh2 sugere que houve influência do ácido tânico no desenvolvimento dos isolados fitopatogênicos ao arroz e ao feijão, dado este que pode ser mais bem explorado em futuros trabalhos. 76

Figura 12. Produção de polifenol oxidases por isolados micorrízicos de Cyrtopodium vernum (A-D) e fitopatogênicos de arroz e feijão (E-J). A: Isolado Cv17 (Epulorhiza sp.) crescido em AAEL sem ácido tânico; B: Cv17 em AAEL com ácido tânico; C: Isolado Cv10 (Rhizoctonia sp.) em AAEL sem ácido tânico; D: Cv10 em AAEL com ácido tânico formando um halo de cor marrom claro, mas não há produção de polifenol oxidase; E: Isolado Ro88 (Rhizoctonia oryzae) em AAEL sem ácido tânico; F: Ro88 crescido em AAEL com ácido tânico; G: Isolado Ro89 (R. oryzae) crescido em AAEL sem ácido tânico; H: Ro89 não apresenta crescimento em AAEL com ácido tânico; I: Isolado Rh2 (R. solani) crescido em AAEL sem ácido e apresentando escleródios (seta); e J: Rh2 não crescido em AAEL com ácido tânico. 77

O isolado En03 (Epulorhiza sp.) de E. nocturnum (Figura 13 X A e B) não produziu halo para polifenol oxidase. Por outro lado, os isolados En02 e En05 (Epulorhiza sp., Figura 13 C-E)., e En07 e En24, (Rhizoctonia sp., Figura 13 F-I) produziram polifenol oxidase. Estes isolados cresceram de forma similar nos meios com e sem ácido tânico, e observou-se nitidamente o halo de produção de polifenol oxidase. Zelmer & Currah (1995) avaliaram a produção de polifenol oxidase nas espécies Ceratorhiza pernacatena e Epulorhiza calendulina. Observaram que C. pernacatena não produziu ou produziu quantidade baixa, enquanto que Epulorhiza calendulina não produziu polifenol oxidase. Zelmer et al. (1996) sugerem que a maioria das espécies de Ceratorhiza sp. produzem polifenol oxidases e que espécies de Epulorhiza sp. são negativas para esta enzima.

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Figura 13. Isolados micorrízicos de E. nocturnum avaliados para a produção de polifenol oxidases. A: Isolado En03 (Epulorhiza sp.) crescido em AAEL sem ácido tânico; B: En03 crescido em AAEL com ácido tânico não apresentando halo de cor âmbar; C: Isolado En02 (Epulorhiza sp.) crescido em meio sem ácido tânico; D: En02 crescido em AAEL com ácido tânico apresentando halo para polifenol oxidase; E: Isolado En05 (Epulorhiza sp.) crescido em meio sem ácido tânico (esquerda) e em meio com ácido tânico (direita); F: Isolado En07 (Rhizoctonia sp.) crescido em meio sem ácido tânico; G: En07 apresentando halo de polifenol oxidase em AAEL com ácido tânico; H: Isolado En24 (Rhizoctonia sp.) crescido em meio sem ácido tânico; e I: En24 apresentando halo de cor âmbar em AAEL com ácido tânico. (Barras: 1 cm). 79

Pereira e colaboradores (2005c) notaram que os três isolados de Epulorhiza sp., originários de Epidendrum rigidum, Oceoclades maculata e Polystachia concreta foram negativos para polifenol oxidase. Já os quatro de Ceratorhiza sp., procedentes de Oncidium flexuosum, Isochillus lineares, Maxillaria marginata e Oncidium varicosum produziram a enzima. Linhares (2006) obteve vinte e oito isolados de Epulorhiza sp, oriundos de E. secundum e Z. mackaii, e todos foram negativos para polifenol oxidases. No presente trabalho, os isolados En02 e En05 possuem características morfológicas e microscópicas que os classificam como Epulorhiza sp., embora tenham produzido polifenol oxidases no teste enzimático. Do mesmo modo que C. pernacatena não produz, pode ser que haja espécies de Epulorhiza sp. que produzam polifenol oxidases.

4.4 HISTOLOCALIZAÇÃO DE PELOTONS EM RAÍZES DE C. saintlegerianum E E. nocturnum

Foram observados pelotons, estruturas características de fungos rizoctonioides (Rasmussen, 1995; Peterson et al., 2004), no córtex parenquimático de fragmentos radiculares em todas as plantas amostradas de C. saintlegerianum e de E. nocturnum. Em um corte de raiz de C. saintlegerianum observou-se pelotons intactos e em diferentes fases de degradação (Figura 14 A), e em outro corte foi possível visualizar pelotons degradados com hifas conectivas (Figura 14 B). Em cortes de raízes de E. nocturnum foi notada a presença de pelotons intactos dentro das células corticais (Figura 14 C) e pelotons em degradação e ainda conectados (Figura 14 D). 80

Figura 14. Disposição de pelotons em raízes de C. saintlegerianum (A e C) e E. nocturnum (B e D). A: Corte radicular apresentando pelotons intactos (1), e em fase inicial (2) e final de degradação (3); B: Pelotons intactos ocupando a célula do córtex; C: Pelontos conectados (seta); e D: Hifa conectiva (seta) entre dois pelotons em fase de degradação. (Barras: A, B e D: 100 m; e C: 50 m. Siglas: cv: cilindro vascular; cp: córtex parenquimático; cc: células do córtex; ce: células da exoderme; pi: peloton intacto; e pd: peloton degradado).

Os pelotons observados nos cortes de C. saintlegerianum estavam, em sua maioria, intactos (hifas ocupando grande parte da célula cortical) e aglomerados em um lado do córtex (Figura 15 A). Este resultado pode ser estar relacionado ao fato da fixação de raízes desta espécie epífita ocorrer na superfície do caule de palmeiras do gênero Acrocomia sp. (Figura 15 B). Provavelmente, há uma maior quantidade de células colonizadas no lado do córtex da raiz que fica em contato com o substrato, que consiste em resquícios de material vegetal presentes no caule da planta que serve de suporte à epífita, que neste caso é a orquídea C. saintlegerianum. Em E. nocturnum obteve-se cortes com pelotons intactos e em fase degradação. Para ambas as espécies de orquídea, as coletas de raízes foram realizadas 81

no período chuvoso, ou seja, quando há maior disponibilidade de água e nutrientes nos substratos.

A natureza da interação entre fungos micorrízicos e orquídeas em fase adulta ainda é fonte de controvérsia, pois não se sabe como e quando ocorre a degradação dos pelotons (Peterson et al., 2004; Rasmussen & Rasmussen, 2009). Duas das três plantas de E. nocturnum estavam floridas no momento da coleta das raízes. Pode ser que pequena quantidade de pelotons demonstrada nas raízes da planta Epid-3 (Figura 15 C) esteja relacionada com uma maior disponibilização de nutrientes para o período de floração (Figura 15 D). Por outro lado, em C. saintlegerianum, que floresce entre os meses de agosto e setembro, e de cujas plantas as raízes foram coletadas em maio, observou-se uma grande quantidade pelotons intactos (Figura 15 A e B).

Látr et al. (2008) observaram maior quantidade de pelotons intactos em Dactylorhiza majalis, espécie terrestre com raízes tuberosas e que armazenam mais nutrientes. Todavia, notaram poucos pelotons intactos em Cephalanthera longifolia, espécie terrestre com crescimento em forma de rizoma. Gonçalves (2009) observou um maior número de pelotons degradados do que intactos em raízes de Cyrtopodium vernum. As raízes coletadas, no presente trabalho, foram obtidas de planta epífita de C. saintlegerianum e rupícola de E. nocturnum, e isso provavelmente explica o fato de muitos pelotons estarem em estádio de degradação, pois segundo Linhares (2006) a atividade micotrófica na fase adulta é mais intensa para plantas que crescem em subtratos com escassez de nutrientes.

Rasmussen & Whigham (2002) avaliaram nove espécies de orquídeas terrestres, dentre elas Tipularia discolor, e observaram que a colonização do córtex radicular desta espécie foi ocupado entre 25-70% por pelotons. Irwin et al. (2007) também observaram alta porcentagem de células corticais de Pterostylis nutans, planta terrestre, colonizadas por Ceratobasidium sp. Graham & Dearnaley (2011) obtiveram Ceratobasidium sp. da orquídea epífita Sarcochilus weinthalli e verificaram que poucas células do córtex foram colonizadas por pelotons e que a maior parte deles estavam em processo de degradação. 82

Figura 15. Histolocalização de fungos nas raízes ( A e C) e habitat natural de C. saintlegerianum (B) e E. nocturnum (D). A: Corte histológico em raiz da planta Cyrt-1 de C. saintlegerianum apresentando vasta colonização do córtex por pelotons intactos e degradados; B: Planta Cyrt-1 fixada no tronco de uma palmeira do gênero Acrocomia sp. fotografada no mesmo dia da coleta dos fragmentos de raiz; C: Corte em raiz da planta Epid-3 de E. nocturnum com poucos pelotons totalmente degradados; e D: Planta Epid-3 fixada em rocha e florida no momento da coleta de raízes para a histolocalização de fungos micorrízicos. (Barras: A e C: 100 m e Siglas: cv: cilindro vascular e cp: córtex parenquimático).

As raízes de C. saintlegerianum possuem velame com dez a quatorze camadas de células. Já as raízes de E. nocturnum possuem velame com quatro ou cinco camadas de células lignificadas. O córtex, em ambas as orquídeas, apresentou células grandes e coradas em sua grande maioria de azul por apresentarem grande concentração de celulose. Algumas células corticais apresentaram coloração vermelho claro o que pode estar relacionado com a lignificação dos tecidos devido aos hábitos epífita e rupícola de C. saintlegerianum e E. nocturnum, respectivamente. 83

Os pelotons coraram de azul escuro nos cortes das raízes das três plantas de C. saintlegerianum, (Figura 16 A) e também nas três plantas de E. nocturnum (Figura 16 B). Em E. nocturnum foram observadas estruturas arredondadas (Figura 16 C) nas extremidades das hifas dos pelotons intactos (Figura 16 D) em cortes da planta Epid-3. Nesta planta foram encontrados três isolados rizoctonioides, um de Rhizoctonia sp., que não produziu células moniliódes após sessenta dias de crescimento em CMA no experimento anterior, e dois isolados de Epulorhiza sp., que produziram células monilioides arredondadas. Rasmussen (1990) obteve estruturas fúngicas em raízes de Dactylorhiza majalis similares às observadas na Figura 16 C e D.

Figura 16. Histolocalização de fungos nas raízes C. saintlegerianum (A e B) e E. nocturnum (C e D). A: Corte na planta Cyrt-1 de C. saintlegerianum mostrando pelotons, intactos (seta em preto) e degradados (seta em vermelho), por toda a região do córtex parenquimático; B: Pelotons degradados e conectados (seta) em corte de raiz da planta Epid-3 de E. nocturnum; C: Corte em raiz da planta Epid-3 de E. nocturnum enfatizando o estado pouco condensado ou intacto do peloton e a extremidade arredondada da hifa (seta); e D: Células monilioides em peloton localizado no córtex de raiz da planta Epid-3. (Barras: A: 100 m; B, C e D: 50 m).

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Foi observada, tanto em C. saintlegerianum quanto em E. nocturnum, a presença de cristais de oxalato de cálcio do tipo ráfide em células cristalíferas (Figura 17 A e B). As ráfides ocupam, na maioria das vezes, algumas células parenquimáticas das raízes e, em uma avaliação descuidada, podem ser confundidas com as massas enoveladas dos pelotons.

Figura 17. Presença de cristais de oxalato de cálcio, do tipo ráfide, no córtex radicular de C. saintlegerianum (A) e E. nocturnum (B). A: Cristal de oxalato de cálcio, do tipo ráfide, localizado no córtex radicular da planta Cyrt-3 de C. saintlegerianum, e B: Ráfide em célula do córtex parenquimático em raiz de Epid-1 de E. nocturnum. (Barras: A e B: 50 m).

Nas imagens obtidas por MEV foram observados pelotons intactos (Figura 18 A) e degradados (Figura 18 B e C) nas raízes de Cyrt-1 oriunda de C. saintlegerianum. Na Figura 18 D observa-se várias células parénquimáticas de Epid-3, E. nocturnum, colonizadas por pelotons ainda intactos. Já nas Figuras 18 E e 18 F observa-se pelotons intacto e degradado, respectivamente (seta), em E. nocturnum. Chang & Chou (2007) fixaram amostras de raízes de Anoectochilus formosanus em glutaraldeído e realizaram a desidratação em acetona. No presente estudo, em que o método de fixação utilizado foi diferente do demonstrado pelos referidos autores, foram obtidas imagens de hifas com certo grau de deterioração. Para a varredura em microscópio eletrônico, a fixação por glutaraldeído é mais eficiente do que o FAA para manter o aspecto original de fungos em associação com os tecidos vegetais. Entretanto, a desidratação em série de acetona não poderia ser realizada para os cortes histológicos de C. saintlegerianum e E. nocturnum, pois o aparelho de MEV 85

disponível para uso nesta avaliação é receptor, apenas, de amostras desidratadas por série alcoólica.

Figura 18. Microscopia eletrônica de varredura em raízes de C. saintlegerianum (A-C) e E. nocturnum (D-F). A: Peloton em fase inicial de degradação no interior da célula cortical em raiz de Cyrt-1; B: Visão geral de peloton degradado no córtex radicular de Cyrt-1; C: Visão de peloton em degradação em Cyrt-1 com hifa conectiva com constrição (seta); D: Visão de corte em Epid-3 com pelotons intactos; E: Peloton no interior da célula do córtex radicular de Epid-3; e F: Peloton condensado em fase de degradação (seta) em Epid-3. (Barras: A, B, C e E: 10 m; D: 50 m e F: 20 m). 86

4.5 VIABILIDADE DE SEMENTES DE C. saintlegerianum E E. nocturnum

Os embriões viáveis nas sementes de C. saintlegerianum apresentaram coloração após três horas e trinta minutos do início do experimento. Nos tratamentos propostos não houve diferença estatística na porcentagem de viabilidade nos tratamentos T1 e T3 (Figura 19 A). O tratamento T1 constitui-se no controle, sementes que não foram submetidas a um pré-condicionamento. No tratamento T3, antes de serem depositadas em solução de TTC a 1%, as sementes foram escarificadas por dois minutos em banho ultrassom a 40º C. O T1 apresentou viabilidade para 77,24% das sementes e no T3, 80,3% das sementes observadas foram viáveis. Este resultado demonstra que apenas o teste de tetrazólio, sem pré- condicionamento químico ou físico, é suficiente para avaliar a viabilidade nas sementes de C. saintlegerianum.

Figura 19. Teste de trifeniltetrazólio (TTC) em sementes de C. saintlegerianum (A) e E. nocturnum (B), mostrando a porcentagem de sementes com embrião viável. (T1: tratamento controle, sem pré-tratamento antes da imersão em solução de TTC; T2: Sementes com pré-tratamento em solução aquosa de sacarose a 2,75% por 24 horas; T3: Sementes submetidas ao banho ultrassônico a 40°C por dois minutos; T4: Sementes em solução aquosa exposta à bomba de vácuo por dois minutos; e T5: sementes expostas aos pré-tratamentos T3 e T4).

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Para C. saintlegerianum, quando a semente foi viável ocorreu a penetração do TTC, por intermédio da testa no tegumento, corando o embrião de vermelho escuro (Figura 20 A), por outro lado, os embriões inviáveis permaneceram com cor marrom claro (Figura 20 B).

Figura 20. Sementes de C. saintlegerianum (A e B) e de E. nocturnum (C e D) submetidas à solução de TTC. A: Embrião viável no tratamento T1 de C. saintlegerianum, onde não houve pré-tratamento das sementes e detalhe da célula suspensora do tegumento (seta); B: Embriões não viáveis (1) e embrião viável corado de vermelho pela reação à solução de TTC (2); C: Sementes de E. nocturnum com aspecto de palha, não apresentam embrião; e D: Semente de E. nocturnum viável submetida ao tratamento T5 que associou dois tipos de escarificação física nas células suspensoras do embrião, permitindo a penetração do TTC. (Barras: A: 10 m; B e D: 50 m e C: 100 m).

Nas sementes de E. nocturnum foram realizados quatro pré-tratamentos. O tratamento T5, no qual foi empregada a dupla escarificação, observou-se a infiltração de 88

corante nos embriões após vinte e duas horas da adição da solução de TTC. Nos demais tratamentos a penetração foi notada somente após trinta horas. O T5 foi eficiente em corar 32,33% dos embriões (Figura 19 B), ou seja, foi preciso realizar dois processos de escarificação física onde as sementes foram submetidas a banho ultrassônico a 40º C por dois minutos e a penetração do TTC em bomba de vácuo por dois minutos. Foi necessário, mesmo após a pressão por vácuo, deixar as sementes no tratamento T5 submergidas na solução de TTC.

Em C. saintlegerianum, a cápsula foi obtida a partir de fecundação cruzada em habitat natural o que pode ter proporcionado a alta porcentagem de sementes com morfologia regular e embriões viáveis. Para as sementes de E. nocturnum, coletou-se uma cápsula, autofecundada artificialmente em planta da Coleção de Orquídeas e Bromélias, após quatro meses de maturação. A maioria das sementes observadas não apresentou embrião (Figura 20 C) e, nas poucas sementes com embrião viável, verificou-se que o TTC foi eficiente em corar os embriões após uma dupla escarificação física (Figura 20 D).

A autofecundação, as variações climáticas durante o período de maturação e o tempo de maturação dos frutos/cápsulas são fatores que podem ocasionar a inviabilidade do embrião de sementes de orquídeas (Vallius, 2000; 2001; Lee et al., 2005; Seaton et al., 2009; Yam & Arditti, 2009). As sementes de orquídeas também são muito pequenas, denominadas diminutas, e possuem baixa concentração de nutrientes o que leva a desenvolverem dormência (Arditti & Ghani, 2000; Wood et al., 2003).

As sementes de orquídeas possuem diferenças morfológicas, estruturais, químicas e físicas (Arditti & Ghani, 2000). Algumas diferenças, como por exemplo: a espessura e a composição de células suspensoras do tegumento envoltório do embrião: podem influenciar na taxa de viabilidade das sementes. Algumas sementes possuem tegumentos com grande quantidade de células, e também uma resistente junção destas células, o que pode dificultar a permeabilidade de corantes utilizados para testes de viabilidade do embrião (Swamy et al., 2004; Seaton et al., 2009; Yam & Arditti, 2009, Schwallier et al., 2011). Contudo, a viabilidade de sementes de orquídea pode ser detectada por testes químicos com FDA (Wood et al., 2003; Faast et al., 2010) ou com TTC (Vujanovic et al., 2000; Alvarez-Pardo & Ferreira, 2006; Hosomi et al, 2012). 89

Faast et al. (2010) realizaram teste com FDA em sementes de Caladenia rigida e obtiveram baixa porcentagem de embriões viáveis. Vujanovic et al. (2000) realizaram testes com TTC e Fusarium sp. para avaliar a viabilidade de quatro lotes de sementes de Cypripedium reginae. Observaram que para o TTC, a viabilidade foi de 48%, enquanto que as sementes inoculadas com o fungo apresentaram 55% de viabilidade. Alvarez-Pardo & Ferreira (2006) armazenaram sementes de dezesseis espécies de orquídeas por 42 meses a 5ºC. Realizaram o teste de tetrazólio, com pré-condicionamento das sementes em água destilada por 24 h, para avaliar a viabilidade das sementes após 12 meses de armazenamento e observaram 100% de viabilidade para todas as espécies. Porém após 24 meses de armazenamento as sementes apresentaram apenas 50% de viabilidade.

Hosomi et al. (2012) avaliaram a viabilidade de sementes de Cattleya walkeriana e Cattleya leopoldii. Foi realizado um pré-condicionamento durante 24 h em solução de sacarose a 10% e sementes foram mantidas a seco até a imersão em solução de TTC. As sementes de C. walkeriana apresentaram viabilidade de 96% no tratamento com pré- condicionamento e 85% no tratamento controle, e as sementes de C. leopoldii, 95% de viabilidade para as sementes pré-condicionadas e 86% para as sementes sem pré- condicionamento. A viablididade de C. walkeriana e C. leopoldii foi comprovada pelo teste de germinação assimbiótica em meio Knudson. No presente estudo, observou-se que o pré- condicionamento, bem como a escarificação física, foram importantes para avaliação da viabilidade de sementes de E. nocturnum, mas não foram significativos para as sementes C. saintlegerianum.

4.6 GERMINAÇÃO SIMBIÓTICA IN VITRO

4.6.1 Cultivo simbiótico de sementes de E. nocturnum em escuro inicial seguido de fotoperíodo

O experimento conduzido com sementes de E. nocturnum e isolados micorrízicos no escuro não observou-se germinação após 120 dias de incubação. O meio foi renovado e as placas foram transferidas para fotoperíodo de 16/8 h (luz/escuro), ainda assim não houve germinação para nenhum dos tratamentos avaliados. Apenas o isolado En07, Rhizoctonia sp. oriundo de E. nocturnum, intumesceu o embrião de algumas sementes. 90

Porém no tratamento controle os embriões apresentaram-se intumescidos. Portanto, não se pode afirmar que o intumescimento visto no tratamento En07 se deve ao fungo, uma vez que no tratamento onde só as sementes foram espalhadas também houve intumescimento dos embriões

A metodologia de germinação simbiótica no escuro empregada neste experimento seguiu os trabalhos realizados com orquídeas de clima temperado (Stewart & Zettler, 2002; Zettler et al., 2005; Stewart & Kane, 2006b; Johnson et al., 2007; Chutima et al., 2010). Stewart & Zettler (2002) testaram a germinação simbiótica para três espécies semi-aquáticas, Habenaria repens, Habenaria quinquiseta e Habenaria macroceratitis, em experimento conduzido no escuro. Obtiveram sementes em todos os estádios de germinação (de 0 a 5) para H. repens, e estádio 2 para H. quinquiseta e H. macroceratitis. Stewart & Kane (2006b) avaliaram o desenvolvimento simbiótico entre sementes de Habenaria macroceratitis, orquídea terrestre ocorrente na Flórida (EUA), e seis isolados de Epulorhiza sp. O experimento foi realizado em três diferentes fotoperíodos e a porcentagem de sementes no estádio 2 foi maior no fotoperído 0/24 h (L/ E).

Porém, como as espécies pesquisadas no presente trabalho são tropicais adotou- se um cultivo simbiótico com fotoperíodo de 16/8 h (L/E). Porém, em experimento preliminar de germinação simbiótica em fotoperíodo com as sementes de E. nocturnum foram observados, após um mês de cultivo, ácaros da família Tarsonamidae. Ácaros das famílias Penthaleidae, Tarsonamidae e Tenuipalpidae são comuns atacando diversas orquídeas tropicais, tanto em habitat natural, quanto em casas de vegetação (Childers et al., 2003; Childers & Rodrigues, 2005; Rivera-Coto & Corrales-Moreira, 2007; Cating et al., 2010; González-Díaz et al., 2010).

No presente estudo, os ácaros encontravam-se na região das sementes de E. nocturnum e para evitar o aparecimento deste inseto foi realizado um segundo experimento no qual aplicou-se choque térmico em metade das sementes. A outra metade foi semeada diretamente da cápsula para avaliar se o aumento de temperatura seria prejudicial às sementes. O choque térmico foi efetivo para conter o desenvolvimento dos insetos, mas não foram aprofundadas as avaliações acerca da germinação das sementes porque não houve desenvolvimento dos embriões. 91

As sementes de E. nocturnum utilizadas no experimento em fotoperíodo são remanescentes da cápsula que foi testada com TTC para a viabilidade dos embriões. Após cinco meses de avaliação não foram observados ácaros nas placas de Petri nos dois experimentos, o que sugere que a cápsula utilizada não continha ovos ou larvas de ácaros. Porém, visto que esta cápsula de E. nocturnum foi coletada após quatro meses de maturação, percebeu-se que as sementes não apresentavam morfologia regular, e que mesmo as sementes com embriões não exibiam diferenciação sugerindo intumescimento. Vallius (2001) sugere que o período de maturação das cápsulas tem influência direta na composição nutritiva dos embriões.

As sementes de plantas da família Orchidaceae apresentam diversos tipos morfológicos de embrião e tegumento, sugerindo a complexidade da viabilidade e germinação destas sementes (Arditti & Ghani, 2000; Wood et al., 2003; Yam & Arditti, 2009). Sementes de orquídeas também podem apresentar diversos tamanhos, há registros para a espécie neotrópica Epidendrum secundum sementes com até 6 mm de comprimento, enquanto que para Anoectochilus imitans, de clima temperado, tem-se sementes de apenas 0,05 mm (Arditti & Ghani, 2000).

A autofecundação é um dos fatores que também pode diminuir a quantidade de sementes viáveis em uma cápsula, bem como a fecundação cruzada por plantas geograficamente próximas (Light & MacConaill, 1998; Tremblay et al., 2005). No presente estudo, a autofecundação de E. nocturnum pode ter ocasionado a baixa viabilidade das sementes, pois foi observado um elevado número de sementes sem embrião. Por outro lado, as sementes que apresentavam embriões viáveis só demonstraram viabilidade quando submetidas ao pré-condicionamento por banho ultrassom e exposição a vácuo. Lee et al. (2007) abordam a necessidade de submeter sementes de orquídeas a pré-condicionamentos como, por exemplo, banho ultrassom, refrigeração ou imersão em soluções mais concentradas (entre 35 e 45%) de hipoclorito de sódio para quebrar a dormência presente nos embriões.

4.6.2 Cultivo simbiótico de sementes de C. saintlegerianum em fotoperíodo

Após trinta dias os fungos cresceram em toda a placa de Petri nos meios de cultivo Ágar Aveia Modificado (AAM) e Knudson C (KC). Portanto, as sementes que estavam nestas repetições foram sobrepostas por micélio, impossibilitando a avaliação a 92

cada quinzena. Já as sementes inoculadas em Ágar Aveia Padrão (AAP) apresentaram intumescimento do embrião após sessenta dias nos tratamentos T2 (isolado Cs10, Epulorhiza sp. de C. saintlegerianum) (Figura 21 C), T9 (isolado Ro89, Rhizoctonia oryzae), T10 (isolado Rh2, Rhizoctonia solani). Porém, o isolado que promoveu, após sessenta dias, a formação de rizoides foi o En07 (Rhizoctonia sp.) oriundo de E. nocturnum (Figura 21 A e F). No tratamento controle (T14), sem isolado fúngico, as sementes apresentaram embrião intumescido, mas não formaram rizoides (Figura 21 B e E).

Observou-se que os tratamentos T3 (Cs16 – Xylaria sp., Figura 21 D) e T11 (Cs18 – Xylaria sp.), ambos endofíticos de C. saintlegerianum, não causaram danos às sementes. Contudo, não foram eficientes em promover a germinação de C. saintlegerianum. Vujanovic et al. (2000) induziram 55% de germinação em sementes de Cypripedium reginae utilizando cepas de Fusarium sp. endofítico desta orquídea. O papel de Xylaria sp. em orquídeas é objeto de estudo em diversos aspectos, mas ainda não se tem dados sobre germinação de sementes (Davis et al., 2003; Yuan et al., 2009; Xing et al., 2011). 93

Figura 21. Sementes de C. saintlegerianum em associação com fungos (A, C, D e F) e tratamento controle (B e E) em Ágar-Aveia-Padrão (AAP). A: Sementes apresentando rizoides (seta) no tratamento T12, isolado En07 (Rhizoctonia sp. de E. nocturnum) após 60 dias de cultivo; B: Tratamento controle, T14, após 60 dias cultivo; C: Sementes apresentando rizoides (seta) após 120 dias no tratamento T2, isolado Cs10 (Epulorhiza sp. de C. saintlegerianum); D: Sementes no tratamento T11, isolado Cs16 (Xylaria sp. de C. saintlegerianum); E: Sementes em T14 após 270 dias de cultivo apresentando embriões intumescidos; e F: Sementes em associação com o isolado En07 apresentando embriões intumescidos e rizoides (setas). (Barras: 200 m). 94

Nos experimentos 1 e 2 foram descartados, após 120 dias, os tratamentos T4 (Xylaria sp.) e T13 (Xylaria sp.), pois apresentaram crescimento micelial sobre as sementes. No experimento 2 descartou-se, também, o T3 (Xylaria sp.), pois todas as repetições apresentaram desenvolvimento de colônias de bactérias, o que pode influenciar na avaliação da germinação das sementes.

Após 150 dias fez-se o transplante dos blocos contendo as sementes para novas placas de Petri, repicando o mesmo isolado e mantendo as mesmas condições experimentais. Após este procedimento as avaliações passaram a ser semanais, visto que antes eram quinzenais. No entanto, não foi observada mudança de estádios de germinação para nenhum dos tratamentos, ou seja, não houve efeito de mudança de meio.

Após 270 dias de condução dos experimentos 1 e 2, obteve-se na avaliação final, os dados para o desenvolvimento de sementes. No Experimento 1, permaneceram no estádio 0, com grande número de sementes, os tratamentos T3 (Xylaria sp.) e T7 (Rhizoctonia sp. de C. vernum) com 82,71 e 79,98%, respectivamente (Figura 22). No estádio 1, há o intumescimento do embrião e a formação de rizoide(s) que é considerado estádio de germinação conforme proposto por Zettler & Hofer (1998), Stewart & Kane, (2006a, 2006b) e Chutima et al. (2010). No presente trabalho foram observados embriões intumescidos para todos os tratamentos, inclusive o tratamento controle. Entretanto, somente os tratamentos T2, T9, T10 e T12 foram promotores de desenvolvimento dos tricomas unicelulares denominados de rizoides por Pereira et al. (2011).

95

Figura 22. Experimento 1 de germinação simbiótica de C. saintlegerianum, em meio AAP, com a porcentagem de sementes nos estádios 0= sementes não germinadas; 1= Embriões intumescidos e presença de rizoides, a partir deste estádio considera-se germinação; e 2= Ruptura do tegumento. Foram avaliadas entre 100 e 150 sementes para cada repetição de cada tratamento. (Tratamentos: T1= isolado Cs02, Epulorhiza sp. de C. saintlegerianum; de T2= isolado Cs10, Epulorhiza sp. de C. saintlegerianum; T3= Cs16, Xylaria sp. de C. saintlegerianum; T4= Cs18, Xylaria sp. de C. saintlegerianum; T5= isolado Cs21, Epulorhiza sp. de C. saintlegerianum; T6= isolado Cv17, Epulorhiza sp. de C. vernum; T7= isolado Cv10, Rhizoctonia sp. de C. vernum; T8= isolado Ro88, R. oryzae de arroz; T9= isolado Ro89, R. oryzae de arroz; T10= Rh2, R. solani de feijão; T11= Cs18 com dois meses de crescimento; T12= isolado En07, Rhizoctonia sp. de E. nocturnum; e T14= Controle, placas inoculadas sem fungo). 96

No experimento 1, os tratamentos T12 (Rhizoctonia sp. de E. nocturnum) e T11 (Xylaria sp. de C. saintlegerianum) com 66,85 e 61,6%, respectivamente, foram os mais eficientes em promover sementes no estádio 1, porém não diferiram significativamente dos isolados T2 (Epulorhiza sp. de C. saintlegerianum), T6 (Epulorhiza sp. de C. vernum), T8 (Ro88, R. oryzae de arroz), T9 (Ro89, R. oryzae de arroz) e T10 (R. solani de feijão).

Já no experimento 2, os tratamentos T7 (Rhizoctonia sp. de C. vernum) e T8 (R. oryzae de arroz) apresentaram as maiores porcentagens de sementes não germinadas com 67,84 e 63,66%, respectivamente. O tratamento T12 (Rhizoctonia sp. de E. nocturnum) com 70,39% foi o que apresentou maior porcentagem de sementes no estádio 1, diferindo significativamente de T8 e T7 que apresentaram 33,28 e 29,1%, respetivamente. Nos experimentos 1 (Figura 22) e 2 (Figura 23), o tratamento T12 apresentou 14,27 e 23,06%, respectivamente de sementes no estádio 2, no qual as sementes apresentam o rompimento do tegumento que envolve o embrião. No experimento 1, T12 diferiu significativamente de todos os outros tratamentos no estádio 2 (Figura 22). No experimento 2, T12 não foi estatisticamente diferente dos tratamentos T2 (Epulorhiza sp. de C. saintlegerianum) e T10 (R. solani de feijão) que apresentaram 10,52 e 7,33%, respectivamente, de sementes no estádio 2 (Figura 23).

97

Figura 23. Experimento 2 de germinação simbiótica de C. saintlegerianum, em meio AAP, com a porcentagem de sementes nos estádios 0= sementes não germinadas; 1= Embriões intumescidos e presença de rizoides, a partir deste estádio considera-se germinação; e 2= Ruptura do tegumento. Foram avaliadas entre 100 e 150 sementes para cada repetição de cada tratamento (Tratamentos: T1= isolado Cs02, Epulorhiza sp. de C. saintlegerianum; de T2= isolado Cs10, Epulorhiza sp. de C. saintlegerianum; T3= Cs16, Xylaria sp. de C. saintlegerianum; T4= Cs18, Xylaria sp. de C. saintlegerianum; T5= isolado Cs21, Epulorhiza sp. de C. saintlegerianum; T6= isolado Cv17, Epulorhiza sp. de C. vernum; T7= isolado Cv10, Rhizoctonia sp. de C. vernum; T8= isolado Ro88, R. oryzae de arroz; T9= isolado Ro89, R. oryzae de arroz; T10= Rh2, R. solani de feijão; T11= Cs18 com dois meses de crescimento; T12= isolado En07, Rhizoctonia sp. de E. nocturnum; e T14= Controle, placas inoculadas sem fungo). 98

Quando comparados os dados de sementes germinadas, ou seja, a soma dos estádios 1 e 2, percebeu-se que T12 (isolado En07 - Rhizoctonia sp. de E. nocturnum) apresentou 81,64 e 90,73% de germinação para os experimentos 1 e 2, respectivamente. Estes valores demonstram que os valores porcentuais de tratamento T12 para a germinação das sementes de C. sainltlegerianum se aproximaram dos valores porcentuais obtidos no teste de tetrazólio, evidenciando que o isolado En07 foi o mais eficiente em germinar as sementes. Entretanto, no experimento 1 (Figura 24 A)., T12 diferiu significativamente apenas dos tratamentos T7 (Rhizoctonia sp. de C. vernum), T1 (Epulorhiza sp. de C.saintlegerianum), T3 (Xylaria sp. de C.saintlegerianum), T5 (Epulorhiza sp. de C.saintlegerianum) e T14 (controle) que apresentam 23,73; 23,25; 21; 20,02 e 32%, respectivamente, de sementes germinadas. Observou-se que os tratamentos T1 e T5, ambos de Epulorhiza sp. oriundos de C. saintlegerianum, e o tratamento T7 (Rhizoctonia sp. de C. vernum) não foram eficientes em germinar sementes de C. sainltlegerianum tendo em vista que apresentaram porcentagem menores que o controle (T14).

No experimento 2 (Figura 24 B), o tratamento T12 (Rhizoctonia sp. de E. nocturnum) com 90,73% diferiu significativamente de T6 (Epulorhiza sp. de C. vernum ), T8 (R. oryzae de arroz) e T7 (Rhizoctonia sp. de C. vernum) que apresentaram 56,02; 42,68; e 36,71% de sementes germinadas, respectivamente. Porém, o T12 não diferiu do controle (T14) que apresentou 71% de germinação. Chutima et al. (2011) utilizaram três isolados de Epulorhiza sp. oriundos de Pecteilis susannae e oitos isolados não específicos, originários de três espécies de orquídeas, para germinar as sementes P. susannae. Observaram que no estádio 3, de formação de protocormos, o tratamento controle (ausência de fungo micorrízico) foi mais eficiente diferindo estatisticamente de todos os onze tratamentos com fungos micorrízicos.

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Figura 24. Porcentagem de sementes de C. saintlegerianum germinadas (somatória dos estádios 1 e 2) em meio AAP. A: Experimento 1; e B: Experimento 2. Foram avaliadas entre 100 e 150 sementes por cada tratamento. (Tratamentos: T1= isolado Cs02, Epulorhiza sp. de C. saintlegerianum; de T2= isolado Cs10, Epulorhiza sp. de C. saintlegerianum; T3= Cs16, Xylaria sp. de C. saintlegerianum; T4= Cs18, Xylaria sp. de C. saintlegerianum; T5= isolado Cs21, Epulorhiza sp. de C. saintlegerianum; T6= isolado Cv17, Epulorhiza sp. de C. vernum; T7= isolado Cv10, Rhizoctonia sp. de C. vernum; T8= isolado Ro88, R. oryzae de arroz; T9= isolado Ro89, R. oryzae de arroz; T10= Rh2, R. solani de feijão; T11= Cs18 com dois meses de crescimento; T12= isolado En07, Rhizoctonia sp. de E. nocturnum; e T14= Controle, placas inoculadas sem fungo).

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No presente estudo o fungo que melhor promoveu a germinação em sementes de C. saintlegerianum foi o isolado não específico En07 (Rhizoctonia sp.) originário de E. nocturnum. Porém o experimento foi conduzido por 270 dias (nove meses) e não foram notadas sementes em estádios 3, 4 e 5. Rasmussen (1995) pontua que a germinação de sementes de orquídeas pode levar de um a doze meses para acontecer. Zettler et al. (2007) utilizaram Epulorhiza repens oriunda de Spiranthes brevilabris para germinar sementes de Epidendrum nocturnum. Obtiveram porcentagens maiores que 58% e o isolado foi eficiente em promover a germinação até o estádio 5 em 48 dias. As plântulas de E. nocturnum foram reintroduzidas em habitat natural em dois sítios de preservação no estado da Flórida, onde esta espécie encontra-se ameaçada de extinção.

Pereira et al. (2005a) avaliaram um isolado de Ceratorhiza sp. (M2) de Oncidium flexuosum, e um isolado de Ceratorhiza sp. (M7) de Oncidium varicosum quanto à eficiência de germinação para sementes de O. flexuosum. O isolado específico, M2, conduziu as sementes até o estádio cinco, enquanto que M7, o não específico, só conduziu até o estádio 2. No presente estudo, os isolados de C. vernum (T6= Epulorhiza sp. e T7= Rhizoctonia sp. – Figuras 22, 23 e 24) também não foram promotores de germinação para as sementes de C. saintlegerianum.

Os isolados Ro89 (T9 - R. oryzae) e Rh2 (T10 - R. solani), oriundos de arroz e feijão, respectivamente, proporcionaram a formação de rizoides nos embriões de C. saintlegerianum. Os isolados Cs02 (Epulorhiza sp. de C. saintlegerianum) e En07 (Rhizoctonia sp. de E. nocturnum) também promoveram o surgimento de rizoides a partir dos embriões de C. saintlegerianum (Figuras 25). Masuhara et al. (1993) testaram a eficiência de R. oryzae, oriunda de arroz, em germinar sementes Spiranthes sinensis, mas não obtiveram êxito. Por outro lado, Masuhara & Katsuya (1994) obtiveram porcentagens de germinação oscilando entre 5,5% e 82% para sementes de S. sinensis inoculadas com isolados binucleados de Rhizoctonia sp. oriundos de arroz.

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Figura 25. Sementes de C. saintlegerianum em associação com fungos rizoctonioídes após 270 dias de cultivo in vitro. A: Tratamento T2, isolado Cs02 (Epulorhiza sp.), apresentando sementes com rizoides em formação (seta); B: Tratamento T12, isolados En07 (Rhizoctonia sp.), apresentando rizoides bem definidos; C: Tratamento T10, isolado Rh2 (R. solani), apresentando hifas com constrição (seta em preto) e rizoide emergindo do embrião intumescido (hifa em vermelho); e D: Semente com rizoides longos e ainda unicelulares em T9, Ro89 (Rhizoctonia oryzae). (Barras: 100 m).

Perkins & McGee (1995) observaram que Rhizoctonia solani foi mais eficiente do que Ceratorhiza sp. em promover a germinação e formação de rizoides em sementes de Pterostylis acuminata. Ambos são oriundos de P. acuminata, sendo que R. solani foi isolada nas raízes e em folhas da orquídea, mas não apresentou sinal de patogenicidade à parte aérea desta orquídea. R. solani mesmo quando isolada das folhas foi tão eficiente em promover a germinação quanto os isolados obtidos nas raízes. Otero et al. (2004) avaliaram quatro 102

fungos micorrízicos de Tolumnia variegata e quatro de Ionopsis utricularioides para germinar as sementes destas duas espécies. Obtiveram porcentagens de germinação superiores a 80% para T. variegata e maiores que 95% para I. utricularioides. Os fungos que melhor germinaram ambas as espécies foram isolados de I. utricularioides, sugerindo que T. variegata não possui especificidade micorrízica.

Stewart & Kane (2007) avaliaram a eficiência de quatro isolados em germinar sementes de Spiranthes brevilabris. Três isolados de Ceratorhiza sp. oriundos de S. floridana e um de Epulorhiza sp. específico de S. brevilabris. Verificou-se que todos foram eficientes em germinar as sementes, porém o único isolado que proporcionou a formação de protocormo (estádio 3) foi o isolado específico de S. brevilabris. Kell et al. (2011) obtiveram germinação de sementes Habenaria repens com quatro dos seis isolados de Epulorhiza sp. obtidos a partir da espécie. Todos os quatro isolados promoveram a geminação até o estádio 4, no qual ocorreu a formação de folha nos protocormos.

Valadares et al. (2011) obtiveram altos valores de germinação das sementes de Coppensia doniana inoculadas com Rhizoctonia sp. e Ceratorhiza sp. Observaram que RBSV19 UNR e RBSV25 UNR, isolados de Rhizoctonia sp., promoveram 89,63% e 92,65% de germinação, enquanto que os três isolados de Ceratorhiza sp., RBSV18 BNR2, RBSV05 BNR2 e RBSV25 BNR2, apresentaram 92,12; 89,09 e 85,48%, respectivamente de germinação das sementes. Todos os isolados foram eficientes em promover os estádios 1, 2, 3 e 4 de germinação. Após dez meses de desenvolvimento as plântulas de C. doniana germinadas simbioticamente foram transplantadas para o substrato sphagno e aclimatizadas.

Pereira et al. (2011) avaliaram a germinação e o desenvolvimento de protocormos em Epidendrum secundum com dezesseis isolados de Epulorhiza sp. oriundos de cinco populações de plantas de E. secundum. Observaram que as sementes de E. secundum germinaram com diferentes fungos das cinco populações de plantas. Após 44 dias, M65 e M73 foram os dois isolados mais promissores na germinação de sementes, com 25 e 31%, respectivamente. M65 promoveu a germinação até os estádios 5 e 6, ao passo que o isolado M73 promoveu desenvolvimento somente até o estádio 4.

Os fungos presentes no sistema radicular de orquídeas podem não ser os responsáveis pela germinação de suas sementes, bem como uma espécie de orquídea pode estar associada com vários gêneros de fungos (Otero et al., 2002; 2004; Shan et al., 2002; 103

McCormick et al., 2006). Há espécies que possuem especifidade micorrízica com os fungos isolados de seu próprio sistema radicular (Pereira et al., 2005a; Valadares et al., 2011), enquanto que outras são mais flexíveis quanto à associação micorrízica (Zettler et al., 2007; Chutima et al., 2011). Para compreender a relação fungo-planta é preciso avaliar o micobionte associado ao hospedeiro em diferentes idades e estádios nutricionais (Dearnaley, 2007; Rasmussen & Rasmussen, 2007; 2009).

4.7 CARACTERIZAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO MICORRÍZICA PARA C. saintlegerianum

Foram observadas hifas do isolado En07 (Rhizoctonia sp. de E. nocturnum), penetrando a extremidade do rizoide e peloton em degradação dentro do rizoide de semente de C. saintlegerianum (Figura 26 D). Rasmussen (1990) observou colonização de rizoides e degradação de pelotons em sementes e protocormos de Dactylorhiza majalis. Chang et al. (2007) observaram a presença de peloton em degradação no interior de rizoides e células do embrião Anoectochilus formosanus. Pereira et al. (2005a) e Pereira et al. (2011) também observaram a penetração da hifa micorrízica pela extremidade dos rizoides em sementes e protocormos de Oncidium flexuosum e Epidendrum secundum, respectivamente.

Chutima et al. (2011) observou grande quantidade de pelotons intactos e degradados em protocormos de Pecteilis sussanae, utilizando o corante azul de tripano a 5% em Lactoglicerol para colar os pelotons, similar ao método utilizado no presente trabalho, e que cora somente as estruturas fúngicas. Weber & Webster (2001) observaram a hifas de Rhizoctonia cerealis penetrando os pelos epidérmicos (rizoides) em sementes germinadas de Dactylorhiza maculata. A germinação das sementes ocorreu devido ao meio nutritivo, porém houve colonização de hifas de R. cerealis tanto nos rizoides quanto nas células corticais dos protocormos de D. maculata.

Na Figura 26 A, tem-se uma semente oriunda de associação com o isolado Cs16 (Xylaria sp.), apresentando-se intacta tanto para a textura do tegumento como do embrião. Os isolados Rh2 (R. solani) e Cs10 (Epulorhiza sp. de C. saintlegerianum) apresentaram aglomeração de hifas e células monilioides por sobre o tegumento e próximo aos rizoides (Figura 26 B e C). 104

Figura 26. Sementes de C. saintlegerianum em associação como com o gênero Xylaria sp. (A) e fungos rizoctonioides (B-D). A: Semente após nove meses de inoculação no tratamento T3 com o isolado Cs16 (Xylaria sp.); B: Rizoide (seta em vermelho) emergindo de semente após três meses de inoculação com o isolado Rh2 (T10 - R. solani), hifas com constrição e célula moilióide (seta em preto); C: Semente inoculada com o isolado Cs10 (T2 - Epulorhiza sp. de C. saintlegerianum) apresentando rizoide (seta em vermelho) e célula monilioide (seta em preto); e D: Rizoide (seta em vermelho) emergindo do embrião e peloton (seta em preto) em degradação dentro do rizoide (seta em vermelho) de semente no tratamento T12 com o isolado En07 (Rhizoctonia sp. de E. nocturnum). (Barras: A: 100 m, B e C: 50 m; e D: 10 m).

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No presente trabalho, as sementes de C. saintlegerianum em associação com o isolado En07 (T12 – Rhizoctonia sp. de E. nocturnum) submetidas ao MEV, apresentaram rachaduras no tegumento o que indica a ruptura deste devido ao inchaço do embrião (Figura 27 A e B). As sementes sem a inoculação de fungo micorrízico apresentaram-se intumescidas, mas não foram rompidas (Figura 27 C). Já as sementes germinadas no tratamento T5, embora não tenham apresentado rizoides, mostram a ruptura do tegumento

(Figura 27 D). Chou & Chang (2004) visualizaram em MEV sementes de A. formosanus com embrião exposto e resquícios de tegumento envolvendo o embrião quando germinadas assimbioticamente. Já nas sementes geminadas em associação com Rhizoctonia sp. observaram vasta colonização do tegumento e do embrião por hifas, bem como a penetração de hifas no embrião.

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Figura 27. Sementes de C. saintlegerianum, germinadas ou intactas, analisadas em MEV. A: Semente intumescida apresentando rachadura no tegumento, sugerindo que o isolado En07 (T12 – Rhizoctonia sp. de E. nocturnum) colonizou as células embrionárias; B: Sementes intactas, não germinadas (0) e sementes intumescidas (1) oriundas de associação com o isolado En07; C: Sementes com embrião intumescidos, porém não germinadas, no tratamento controle (T14); e D: Sementes com tegumento rompido (seta em preto) e hifas (seta em preto) do trtamento T5, isolado Cs21 (Epulorhiza de C. saintlegerianum). (Barras: A: 100; B e C: 200, e D: 500 m).

Os resultados obtidos para germinação simbiótica in vitro de C. saintlegerianum e a observação da interação de estruturas fúngicas apontam que não há especificidade entre esta orquídea e um grupo de fungos rizoctonioides. Estes dados suscitam estudos futuros no que se refere à interação entre o fungo e os diferentes estádios de desenvolvimento de protocormos e plântulas. Tais estudos serão favoráveis tanto à comercialização de plantas ornamentais, ofertando plantas com menor exigência nutritiva, quanto à manutenção de 107

associações simbióticas em habitat natural, proporcionando a reintrodução de plantas germinadas simbioticamente in vitro.

A manutenção dos fungos rizoctonioides e endofíticos, tanto de C. saintlegerianum quanto de E. nocturnum, é importante para a elaboração de estratégias como por exemplo a micorrização de plantas germinadas assimbioticamente (Sequeira, 2007; Wu et al., 2011). As pesquisas também podem ser direcionadas à melhor compreensão da especificidade entre os fungos oriundos de C. saintlegerianum, C. vernum e E. nocturnum, com outras espécies de orquídeas. Os resultados obtidos constituem-se no primeiro relato de isolamento, caracterização morfológica e germinação simbiótica para a espécie C. saintlegerianum.

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5 CONCLUSÕES

 Foram isolados fungos endofíticos tanto das raízes de C. saintlegerianum quanto das raízes de E. nocturnum;

 Para C. saintlegerianum, três isolados possuem características morfológicas e microscópicas descritas para o grupo rizoctonioide;

 Em E. nocturnum, cinco isolados apresentam características morfológicas e microscópicas de fungos rizoctonioides;

 Os isolados de En03 e En05 de Epulorhiza sp. e originários de E. nocturnum produzem polifenol oxidase;

 Pelotons intactos e degradados estão presentes no córtex radicular de C. saintlegerianum e E. nocturnum;

 Não houve germinação das sementes de E. nocturnum devido a baixa quantidade de embriões viáveis e à necessidade de escarificação física demonstrada para a espécie;

 Os isolados Cs16 e Cs18, ambos de Xylaria sp. e oriundos de C. saintlegerianum, não causam danos às sementes no cultivo in vitro;

 A espécie C. saintlegerianum não possui especificidade quanto a germinação simbiótica in vitro de suas sementes;

 São necessários estudos posteriores para comprovar a eficiência de isolados rizoctonioides e endofíticos em promover o desenvolvimento de plântulas de C. saintlegerianum.

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