Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem Institut für Angewandte Physiologie des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf

Biophysikalische und pharmakologische Eigenschaften der erg-K+-Kanäle der Ratte

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr.med.vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von Katja Birgitta Mandel aus Mannheim

Hannover 2006 Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. K. Huber PD Dr. CK. Bauer

1.Gutachter: PD Dr. K. Huber 2.Gutachter: Prof. Dr. H. Naim

Tag der mündlichen Prüfung: 16.05.06 INHALTSVERZEICHNIS

1 Einleitung...... 1

2 Literaturübersicht...... 3 2.1 Biophysikalische Eigenschaften der erg-K+-Kanäle...... 3 2.2 Pharmakologische Eigenschaften der erg-K+-Kanäle...... 9 2.3 Arbeitshypothese und Zielsetzung...... 16

3 Material und Methoden...... 17 3.1 Zellkultur ...... 17 3.2 Molekularbiologische Methoden...... 18 3.2.1 Synthese von siRNA...... 18 3.2.2 Westernblot...... 19 3.3 Heterologe Expression...... 19 3.4 Micro-Injektion...... 22 3.5 Elektrophysiologie...... 23 3.6 Lösungen und Chemikalien...... 26 3.6.1 Messlösungen...... 26 3.6.2 Chemikalien...... 27 3.7 Datenerfassung und Auswertung...... 28 3.8 Herstellerverzeichnis...... 30

4 Ergebnisse...... 31 4.1 Biophysikalische Untersuchungen der erg-K+-Kanäle...... 31 4.1.1 Native erg-Ströme in MMQ-Zellen...... 31 4.1.2 Heterologe Expression von erg-Kanälen...... 40 4.1.3 Unterdrückung endogener erg-Kanäle mit silencer-RNA...... 47 4.2 Pharmakologische Untersuchung der erg-Kanäle...... 54 4.2.1 Wirkung von Ciprofloxacin...... 54 4.2.2 Wirkung von Enrofloxacin...... 55 5 Diskussion...... 66 5.1 Beschreibung der langsamen Deaktivierung in laktotrophen und MMQ- Zellen...... 66 5.2 Überexpression von erg-Kanälen in verschiedenen Zelllinien...... 68 5.3 Unterdrückung endogener erg-Kanäle in MMQ-Zellen...... 70 5.4 Modulation durch Faktoren als Ursache der langsamen Deaktivierung...... 71 5.5 Einfluss der Fluorochinolonantibiotika Ciprofloxacin und Enrofloxacin auf erg-Kanäle...... 72

6 Zusammenfassung...... 77

7 Summary...... 79

8 Literaturverzeichnis...... 81

9 Anhang...... 108 VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN

A Adenosin AB Antibiotikum AS Aminosäuren Bp Basenpaare C Cytosin CHO Zelllinie aus dem Ovarialtumor des chinesischen Hamsters cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleotidphosphat G Guanosin

GH3B6 somatomammotrophe Zelllinie (Growth Hormone, 3.Klon, Linie B6) GΩ GigaOhm HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure hPa Hektopascal EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure EGTA Ethylenglycol-bis-(2-aminoethyl)-N,N,N,N-tetraessigsäure HERG Humanes „ether-à-go-go-related-gene“ kD Kilodalton MMQ neuroendokrine Zelllinie die ausschließlich Prolaktin sekretiert mRNA „messenger“ Ribonukleinsäure PCR Polymerasekettenreaktion r-erg Ratten „ether-à-go-go-related-gene“ RNA Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur S.E.M. Standardfehler (standard error of the mean) siRNA silencer Ribonukleinsäure T Thymidin τ Zeitkonstante TRH Thyreotropin releasing Hormon Upm Umdrehungen pro Minute

1 Einleitung 1

1 Einleitung

Kaliumkanäle bilden unter allen Ionenkanälen der eukaryontischen Organismen die umfangreichste Gruppe. Ihre Aufgaben sind vielfältig. Sie sind beteiligt an der Osmoregulation, der K+-Homöostase, sekretorischen Prozessen und der Signalübertragung an elektrisch erregbaren Membranen (Pongs, 1999). Die in dieser Arbeit untersuchten erg (éther-à-go-go-related gene)-K+-Kanäle gehören der Familie der EAG (éther-à-go-go)-Kanäle an, die zunächst von Mutanten der Fruchtfliege Drosophila melanogaster geklont wurden. Der Name entstand aufgrund eines „Go-Go-Tanz“ ähnlichen Beinschlagens, das diese Fliegen nach Anästhesie mit Äther zeigten (Warmke et al., 1991). Erg-Kanäle sind bereits in vielen verschiedenen Geweben beschrieben (Shi et al., 1997; Wymore et al., 1997; Papa et al., 2000; Bauer & Schwarz, 2001), wobei ihre Expression in Herz und Hypophyse die Grundlage für diese Arbeit bildet. In laktotrophen Zellen der Hypophyse und Zellen der Hypophysentumorzelllinie MMQ wurde über eine zweigeteilte Deaktivierungskinetik der erg-Kanäle berichtet (Corrette et al., 1996; Rosati et al., 1998; Schäfer et al., 1999; Lecchi et al., 2002), die sich aus einer schnellen und einer langsamen Komponente zusammensetzt. Dieser besonderen Eigenschaft liegt möglicherweise die Existenz zellspezifischer, erg-Kanal modulierender Faktoren zugrunde (Buhk, 2004). Es wird allerdings auch ein neuer, bisher unbekannter erg-ähnlicher Kanal als Ursache diskutiert (Lecchi et al., 2002). Am besten charakterisiert ist der erg-Strom wohl im Myokard. Bei Untersuchungen des Aktionspotentials in Kardiomyozyten ergab sich eine Unterteilung des späten + repolarisierenden K -Stroms („delayed rectifier“) in den relativ schnell aktivierenden IKr und den langsam aktivierenden IKs (Sanguinetti & Jurkiewicz, 1990). Der IKr wird von erg1a- (Sanguinetti et al., 1995) und 1b- (Jones et al., 2004) α–Untereinheiten getragen. Eine Beteiligung von verschiedenen β-Untereinheiten wird teilweise kontrovers diskutiert (McDonald et al., 1997; Abbott et al., 1999; Cui et al., 2001; Finley et al., 2002; Weerapura et al., 2002). 1 Einleitung 2

Bei einer Reduktion des IKr-Stroms wird bei humanen wie animalen Patienten das Herz- Aktionspotential verlängert. Es entsteht das sog. Long QT-Syndrom (LQTS1), infolgedessen es zu den lebensgefährlichen Torsade-des-pointes-Arrhythmien kommen kann (Curran et al., 1995). Die typische Verlängerung des QT-Intervalls im Elektrokardiogramm kann durch Mutationen im für erg1 (HERG) kodierenden Gen verursacht werden. Eine pharmakologische Blockade des erg1-Kanals kann aber dieselbe Symptomatik auslösen. Arzneimittel mit erg- blockierender Wirkung sind weit verbreitet. Klasse III-Antiarrhythmika wie das Methansulfonanilid E-4031 sind als spezifische Blocker für erg-Kanäle experimentell von Bedeutung. Klinisch relevant ist hingegen die große Zahl von Arzneimitteln, die den erg- Kanal unspezifisch blockieren. Die dadurch hervorgerufenen Nebenwirkungen haben in der Vergangenheit nicht selten zu einem Widerruf der Zulassung und Rücknahme dieser Arzneimittel vom Markt geführt. Neben dem LQT-Syndrom wird seit 2000 auch über ein SQT (short QT)-Syndrom berichtet (Gussak et al., 2000). Als Ursache wurden 2 Mutationen im Codon 588 des HERG identifiziert (Brugada et al., 2004). Im Gegensatz zum LQT fließt hier nicht weniger, sondern mehr Strom durch den Kanal. Durch Verkürzung des QT Intervalls kann es ebenfalls zu atrialen oder ventrikulären Arrhythmien und plötzlichen Todesfällen kommen. Da dieser genetische Defekt häufig bereits im Säuglingsalter zum Tod führt, wird ein Zusammenhang mit dem plötzlichen Kindstod diskutiert (Brugada et al., 2004; Siri & Torleiv, 2004).

1 Der Name erklärt sich durch die Verlängerung der (frequenzadaptierten) QT-Zeit im Oberflächen-Elektrokardiogramm (EKG) bei verlängertem Herz-Aktionspotential (vergl. Abb. 4). 2 Literaturübersicht 3

2. Literaturübersicht 2.1 Biophysikalische Eigenschaften der erg-K+-Kanäle

Abb. 1: Die éther-à-go-go (EAG) K+-Kanal-Familie (Abb. modifiziert nach Bauer, 1998) A: Die éther-à-go-go-Familie besteht aus drei Subfamilien mit jeweils zwei bzw. drei Mitgliedern: eag (éther-à-go-go bzw. Kv 10), erg (eag-related-gene bzw. Kv 11) und elk (eag-like bzw. Kv 12). B: eine eag-Kanal-α-Untereinheit mit sechs Transmembrandomänen (S1-S6), einer Porenregion, EAG-Domäne und einer putativen Bindungsstelle für zyklische Nukleotide (cNBD). C: Die eag-Kanäle bilden Tetramere aus vier α-Untereinheiten. 2 Literaturübersicht 4

Zur Einteilung der verschiedenen K+-Kanäle werden funktionelle und morphologische Eigenschaften herangezogen. Nach ihrer bevorzugten Flussrichtung wird zwischen auswärts- (outward rectifier) und einwärtsgleichrichtenden (inward rectifier) Kanälen differenziert, die entweder spannungs-abhängig oder –unabhängig sind (Brandts & Pott, 2000). Morphologisch lassen sich K+-Kanal α-Untereinheiten mit zwei, vier, sechs oder acht Transmembrandomänen unterscheiden (Pongs, 1999). Es können Homo- oder Heteromultimere entstehen, an die sich zusätzlich noch β-Untereinheiten anlagern können. Bei der in dieser Arbeit relevanten Familie der EAG-Kanäle (Abb. 1A) handelt es sich um spannungsabhängige K+-Kanäle mit sechs Transmembrandomänen, die sich als Tetramere zu einem Kanal zusammenlagern (Abb. 1B). Ihr gehören neben den eag- und den erg-Kanälen als dritte Gruppe die elk-( éther-à-go-go-like-K+)-Kanäle an (Warmke & Ganetzky, 1994; Bauer & Schwarz, 2001). Während eag- und elk1-Kanäle (Engeland et al., 1998; Shi et al., 1998) auswärtsgleichrichtend sind, haben elk2-Kanäle (Engeland et al., 1998) und die erg- Kanäle (Shi et al., 1997; Bauer et al., 1998) aufgrund ihres besonderen Schaltverhaltens einwärtsgleichrichtende Eigenschaften. In Abb. 2 ist die Einwärtsrektifizierung der erg- Kanäle schematisch wiedergegeben. Bei Depolarisation aktivieren die erg-Kanäle; durch die zeitgleiche, wesentlich schnellere Inaktivierung entsteht aber nur ein geringer Auswärtsstrom. Je positiver der depolarisierende Puls, desto kleiner die Auswärtströme. Auch die Erholung von der Inaktivierung bei dem anschließenden repolarisierenden Puls ist schneller als die Deaktivierung der Kanäle. Bei Hyperpolarisation auf Werte negativer als das Kalium- Gleichgewichtspotential (ca. -80 mV in Ringer-Lösung, –33 mV in 40 K+-Lösung und 0 mV in iso KCl-Lösung) entsteht dann ein großer Einwärtsstrom. Das Zusammenspiel der Vorgänge (langsame Aktivierung und schnelle Inaktivierung bei Depolarisation sowie schnelle Erholung von der Inaktivierung und langsame Deaktivierung bei Hyperpolarisation) bewirkt die Einwärtsgleichrichtung der Kanäle (Trudeau et al., 1995; Smith et al., 1996; Spector et al., 1996A; Wang et al., 1997). Diese Einwärtsgleichrichtung ist begleitet von Konformationsänderungen des Kanals und unterscheidet sich damit von dem Mechanismus bei klassischen einwärtsgleichrichtenden K+-Kanälen mit zwei Transmembrandomänen (Nichols & Lopatin, 1997). 2 Literaturübersicht 5

Abb. 2: Schematische Darstellung des Schaltverhaltens von erg-Kanälen Bei Depolarisation werden die Kanäle aktiviert, durch die gleichzeitige Inaktivierung entsteht aber nur ein geringer Auswärtsstrom. Die schnelle Erholung von der Inaktivierung führt bei Hyperpolarisation auf stark negative Werte zu einem großen Einwärtsstrom mit anschließender Deaktivierung.

Charakteristisch für die EAG-Kanäle ist die EAG-Domäne am N-Terminus (Warmke & Ganetzky, 1994). Sie kommt bei keinen anderen K+-Kanälen vor. Ihre genaue Bedeutung ist bisher nicht vollständig geklärt, es konnte allerdings gezeigt werden, dass sie bei der Deaktivierung der Kanäle eine wichtige Rolle spielt. So deaktivieren erg-Kanäle, bei denen der N-Terminus deletiert wurde, deutlich schneller als Wildtyp-Kanäle (Schönherr & 2 Literaturübersicht 6

Heinemann, 1996; Spector et al., 1996A). Aufgrund der Ähnlichkeit dieser Domäne mit Per-

Arnt-Sim-Domänen (Morais Cabral et al., 1998), die in anderen Proteinen als O2-Sensor fungieren (Pellequer et al., 1999), wird eine entsprechende Funktion auch bei den erg-Kanälen diskutiert (Taglialatela et al., 1997; Overholt et al., 2000; Zhang et al., 2003). Typisch für die Familie ist außerdem die Aminosäurensequenz GFGN, die in der Porenregion als Selektivitätsfilter dient, und das Vorhandensein einer Bindungsdomäne für zyklische Nukleotide (cNBD) im C-Terminus (Warmke & Ganetzky, 1994). Neben der großen Bedeutung des HERG im Herzen, auf die im zweiten Kapitel dieses Abschnitts näher eingegangen wird, übernehmen erg-Kanäle auch in anderen Geweben wichtige Aufgaben. Erg-Ströme sind maßgeblich an der Regulation der TRH-abhängigen Prolaktin-Sekretion in der Adenohyphophyse beteiligt (Bauer et al., 1998). Die Gruppe der laktotrophen Zellen (Corrette et al., 1996; Schäfer et al., 1999) ist die für diese Hormonausschüttung verantwortliche Zellart. Die erg-Kanäle dieser Zellen werden durch TRH blockiert, was zu einer Depolarisation mit anschließender Erhöhung der Aktionspotential-Frequenz führt (Barros et al., 1997). Es kommt zu einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration, dem schließlich eine vermehrte Sekretion von Prolaktin folgt. Die intrazelluläre Signalkaskade, die die Verringerung des erg-Stroms auslöst, ist noch nicht vollständig aufgeklärt (Schledermann et al., 2001). In diesen Hypophysenzellen trat eine bis dahin unbekannte zusätzliche, langsam deaktivierende Stromkomponente in unterschiedlicher Ausprägung auf (Corrette et al., 1996; Schäfer et al., 1999; Abb. 3). Laktotrophe Zellen exprimieren erg1, erg2 und erg3 in unterschiedlicher Kombination. Der unterschiedliche Anteil der langsamen Komponente in den einzelnen Zellen stand dabei nicht in Zusammenhang mit der jeweiligen Expression der verschiedenen erg-Untereinheiten. In den Hypophsentumorzelllinien GH3-/GH3B6 (Bauer et al., 1990; Barros et al., 1992) und MMQ (Judd et al., 1988; Rosati et al., 1998) der Ratte, die in dieser Arbeit überwiegend verwendet wurden, finden sich ebenfalls erg-Kanäle. Mit PCR konnten in beiden Zellsystemen erg1 und erg2 nachgewiesen werden (Schäfer et al., 1999; Wimmers et al., 2001). Der erg-Strom in MMQ-Zellen zeigt eine ähnliche zusammengesetzte Deaktivierungskinetik wie in laktotrophen Zellen. Es tritt eine ungewöhnlich große, langsam deaktivierende Stromkomponente auf (Schäfer et al., 1999; Lecchi et al., 2002). Im

Unterschied dazu deaktiviert der native erg-Strom in GH3B6-Zellen schnell (Abb. 4). 2 Literaturübersicht 7

Abb. 3: E-4031-sensitive erg-Ströme in verschiedenen laktotrophen Zellen (Abb. modifiziert nach Schäfer et al., 1999) Die Membranströme der drei Zellen wurden in 150 mM K+-Lösung, mit dem abgebildeten Protokoll erhalten. Die Nulllinie ist als gestrichelte Linie dargestellt.

Abb. 4: E-4031-sensitive erg-Ströme in GH3B6- und MMQ-Zellen (Abb. modifiziert nach Buhk, 2004)

Erg-Strom einer GH3B6-Zelle mit schneller Deaktivierung und einer MMQ-Zelle mit zusätzlicher langsamer Komponente der Deaktivierung. Messungen in 150 mM K+-Lösung, abgeleitet mit dem angegebenen Protokoll. Die Nulllinie ist als gestrichelte Linie dargestellt. 2 Literaturübersicht 8

Die heterologe Ko-Expression von verschiedenen erg-Kanälen in CHO (Chinese-Hamster- Ovary)-Zellen ergab bisher keinen Hinweis für einen Zusammenhang der erg-Untereinheiten mit der langsamen Komponente der Deaktivierung in laktotrophen und MMQ-Zellen (Wimmers et al., 2001). Als Verursacher dieser langsamen Deaktivierung kommt zum einen ein neues, bisher unbekanntes Kanalprotein mit erg-ähnlichen Eigenschaften in Frage (Lecchi et al., 2002). In GH3B6-Zellen mit schnell deaktivierenden erg-Kanälen würde diese neue Kanalpopulation folglich fehlen. Alternativ werden spezifische, bisher unbekannte Faktoren in laktotrophen und MMQ-Zellen diskutiert, die für eine Modulation der erg-Kanäle mit der Verlangsamung der Deaktivierung verantwortlich sind (Buhk, 2004). Das Modell in Abb. 5 veranschaulicht beide Erklärungsansätze.

Abb. 5: Verschiedene erg-Kanal-Modelle bei GH3B6- und MMQ-Zellen

Links: Modell einer GH3B6-Zelle mit den bekannten, „schnellen“ erg-Kanälen Rechts: MMQ-Zelle mit Modell A: Modulation der erg-Kanäle durch Faktoren und Modell B: neuen, „langsamen“ erg-ähnlichen Kanal-Untereinheiten.

Neben dem Vorkommen der erg-Kanäle in der Hypophyse, dass Anlass zur Untersuchung der zusätzlich langsamen Deaktivierung gab, haben erg-Kanäle auch bei der Regulation von Peristaltik und Tonus in der glatten Muskulatur des Magen-Darm-Traktes eine wichtige Funktion. Akbarali et al. (1999) isolierten einen funktionellen erg-Strom aus der Ringmuskulatur der Speiseröhre des Opossum. Darüberhinaus wurde erg1 in Myozyten der 2 Literaturübersicht 9

Pfortader (Ohya et al., 2002) und der Muskulatur von Gallenblase und Dünndarm nachgewiesen (Farrelly et al., 2003; Lillich et al., 2003; Parr et al., 2003). Über das Vorkommen einer nur in der glatten Muskulatur exprimierten Isoform bestehen zur Zeit noch Unklarheiten (Shoeb et al., 2003; Shoeb et al., 2004). Weiter kommen erg-Kanäle im zentralen Nervensystem vor (Saganich et al., 2001), wo sie an der K+-Homöostase beteiligt zu sein scheinen (Emmi et al., 2000). Es gibt Hinweise, dass die Expression von erg-Kanälen mit dem Zellzyklus assoziiert ist. Dies führt gerade in bestimmten Tumorzelltypen zu Abweichungen in der Expression (Arcangeli et al., 1995; Crociani et al., 2003). Da in dieser Arbeit alle Experimente an passagierten Zellen durchgeführt wurden, kann ein Einfluss des Zellstadiums auf die Expression nicht ausgeschlossen werden.

2.2 Pharmakologische Eigenschaften der erg-K+-Kanäle

Die Repolarisation des Herz-Aktionspotentials und die Rückkehr zum Ruhemembranpotential werden wesentlich durch die schnelle Erholung von der Inaktivierung bei Repolarisierung und die folgende Deaktivierung des IKr bewirkt. Bei einer Reduktion des IKr-Stroms wird die Dauer des Herz-Aktionspotentials im Sinne eines Long QT-Syndroms verlängert. Abb. 6 zeigt eine Übersicht über die wichtigsten Ströme, aus denen sich das Herz-Aktionspotential zusammensetzt. Das hereditäre LQTS wird nach dem betroffenen Genlocus eingeteilt (Tab. 1).

Tab.1: Hereditäre Long QT-Syndrome beim Menschen

Syndrom betroffener Genlocus (α− bzw. β−Untereinheiten) Quelle LQTS1 KCNQ1 (cardialer K+-Kanal) Wang et al., 1996 LQTS2 HERG bzw. erg1 (cardialer K+-Kanal) Sanguinetti et al., 1996A LQTS3 SCNA5A (cardialer Na+-Kanal) Wang et al., 1995 LQTS4 Membranprotein Ankyrin-B bzw. Ankyrin2 Yong et al., 2003 LQTS5 MinK bzw. KCNE1 (β-Untereinheit) Sanguinetti et al., 1996B LQTS6 MiRP1 bzw. KCNE2 (β-Untereinheit) Abbott et al., 1999 LQTS7 Kir2.1 bzw. KCNJ2 (K+-Kanal) Tristani-Firouzi et al.,2002 2 Literaturübersicht 10

Abb. 6: Übersicht über die einzelnen depolarisierenden Ein- und die repolarisierenden Auswärtsströme während des Herz-Aktionspotentials (Abb. modifiziert nach Roden et al., 2002) Die durchgezogenen Linien zeigen den normalen Verlauf. Die gestrichelten Linien zeigen, wie bei einer Reduktion der Amplitude des IKr auf 50% eine QT-Verlängerung entsteht. 2 Literaturübersicht 11

Klassisch wurde beim LQTS1 zwischen dem Romano-Ward-Syndrom (autosomal dominant) und dem Jervell und Lange-Nielsen-Syndrom (autosomal rezessiv, in Verbindung mit Taubheit) unterschieden. Das Zustandekommen des LQTS5 bei Funktionsausfall von KCNE1 lässt sich dadurch erklären, dass erst die Kombination des KCNQ1-Kanals mit der β-

Untereinheit KCNE1 den funktionellen IKs ergibt. Zur Erklärung des LQTS6 ist ein entsprechendes Modell zusammengesetzt aus erg1 und KCNE2 beschrieben (Abbott et al., 1999). Das LQT2 wird kongenital durch Mutationen im für erg1 kodierenden Gen verursacht. Von größerer Relevanz ist in dieser Arbeit ebenso wie klinisch das durch pharmakologische Blockade dieses Kanals ausgelöste LQT-Syndrom (Tab. 2, siehe Kapitel 9, Anhang).

Alle in Tab. 2 aufgeführten Wirkstoffe führen zu einer Blockade des IKr. Ob diese allerdings auch zu einer klinischen Symptomatik führt, hängt von individuellen Patientendaten ab. Herzfrequenz, Alter, Geschlecht, Elektrolytspiegel im Plasma und zusätzliche coronare Erkrankungen spielen hier eine Rolle. Auch die Kombination mehrerer, allein nur geringgradig blockierender Arzneien kann schließlich zu Symptomen führen. Aus der Vielzahl der potenten erg-Kanal-Blocker wurde in der Arbeit gezielt auf Wirkstoffe der Gruppe der Chinolonantibiotika eingegangen. Die Ära der Chinolone (Gyrasehemmer) begann 1962 mit Einführung der Nalidixinsäure (Lesher et al., 1962). Die Substanz wurde im Rahmen der Malariaforschung bei der Synthese von Chloroquin entdeckt. Als gemeinsames Strukturmerkmal besitzen die Verbindungen dieser Wirkstoffgruppe entweder einen 4-Chinolonring oder ein strukturähnliches Naphtyridingrundgerüst mit zusätzlichem Stickstoffatom und Carboxylgruppe (Abb. 7). Jeder Position der Ringstruktur fällt eine spezifische Funktion zu wie die Bindung an die Gyrase, das antibakterielle Spektrum, die Potenz oder pharmakokinetische und pharmakodynamische Eigenschaften. Mit der Einführung eines Fluoratoms in Position 6 (daher der Name Fluorochinolone) und der Piperazinsubstitution in Position 7 konnte eine erhebliche Wirkungsverbesserung erzielt werden. Das Wirkungsspektrum aller neuen Fluorochinolone erstreckt sich somit auf die meisten grampositiven und gramnegativen Keime (Tab. 3). Der allen Chinolonen gemeinsame antibakterielle Wirkungsmechanismus beruht auf einer Hemmung der Gyrase, wofür die Carboxylgruppe in Position 3 und die Carbonylgruppe in Position 4 die strukturellen Voraussetzungen bilden (Rubinstein, 2001). Die Gyrase ist eine Topoisomerase, die durch Aufspaltung und Wiederverknüpfung eine Überspiralisierung der bakteriellen DNA bewirkt. Die Überspiralisierung ist für die 2 Literaturübersicht 12

Unterbringung der DNA in der Zelle notwendig, aber auch entscheidend für den geregelten Ablauf von DNA-Funktionen wie Replikation, Transkription und Reparatur. Fluorochinolone haben keinen direkten Angriffspunkt in Zellen höherer Lebewesen, da die der bakteriellen Gyrase entsprechende Topoisomerase II von Säugerzellen ca. 1000-fach weniger empfindlich gegenüber diesen Wirkstoffen ist.

Tab. 3: Minimale Hemmkonzentrationen (MHK) von Enrofloxacin gegen veterinärmedizinisch wichtige Bakterien in vitro (Tab. modifiziert nach Frey & Löscher, 1996)

Erreger MHK (µg/ml) Staphylococcus aureus 0,03 - 0,5 Streptococcus spp. 0,25 - 2 Streptococcus agalactiae 0,25 – 1 β-hämolysierende Streptokokken 0,25 – 1 Streptococcus faecalis 1,6 – 3,1 Escherichia coli 0,016 – 0,031 Salmonella typhimurium 0,031 – 0,25 Klebsiella spp. 0,016 – 0,031 Proteus spp. 0,06 – 0,25 Bordetella bronchiseptica 0,5 – 2 Pasteurella spp. 0,008 – 0,12 Pseudomonas aeruginosa 0,2 – 2 Brucella canis 0,12 – 0,5 Clostridium spp. 1 – 16 Bacteroides fragilis 0,8 – 12,5 Mycoplasma hyorhinis 1,6 – 3,1 Mycoplasma bovis 0,12 – 0,25 Mycoplasma gallisepticum 0,06 – 0,08 2 Literaturübersicht 13

Abb. 7: Struktur der Chinolonantibiotika (Abb. modifiziert nach Rubinstein et al., 2001) Oben: die Grundgerüste 4-Chinolonring und Naphthyridinring In der Mitte: Nalidixinsäure, der Prototyp aller Topoisomerase-Inhibitoren Unten: Ciprofloxacin und Enrofloxacin, die beiden in der vorliegenden Arbeit verwendeten Fluorochinolone

Ebenso wie den Strukturen der Chinolone spezifische Funktionen zuzuordnen sind, wurde festgestellt, dass bestimmte Nebenwirkungen in Zusammenhang mit gewissen Bestandteilen des Chinolonrings stehen (Domagala, 1994). So wurde auch gezeigt, dass das Radikal in Position 5 des Fluorochinolonringes verantwortlich ist für die Verlängerung der QT-Phase. Sparfloxacin war das erste Antibiotikum dieser Familie, bei dem eine verlängerte QT-Zeit durch Blockade des HERG-Kanals und das Risiko ventrikulärer Arrhythmien beschrieben wurde (Jaillon et al., 1996). 2 Literaturübersicht 14

Die Methylgruppe dieses Wirkstoffes in Position 5 bewirkt eine Verlängerung des frequenzadaptierten QTc2-Intervalls um 14 ms. Eine Aminogruppe in Position 5, wie bei Grepafloxacin führt zu einer Verlängerung der QTc-Zeit um11 ms. Ein Proton an dieser Position ist verbunden mit einer QTc-Verlängerung von weniger als 2 ms für Ciprofloxacin, 3 ms für Gatifloxacin und 5-6 ms für Gemifloxacin, Moxifloxacin und Levofloxacin (Iannini & Tillotoson, 2001). Anhand ihres antibakteriellen Spektrums, der Pharmakokinetik und Indikationen lassen sich die Fluorochinolone in vier Gruppen einteilen (Tab. 4).

Tab.4: Einteilung der Fluorochinolone (Tab. modifiziert nach ZCT 1998; 19:27-28, aktualisiert Mai 2004; Empfehlung nach PEG (Paul-Ehrlich-Gesellschaft))

Gruppe Definition Beispiele I orale Fluorochinolone mit im wesentlichen Norfloxacin auf Harnwegsinfektionen beschränkter Pefloxacin Indikation II systemisch anwendbare Fluorochinolone mit Enoxacin breiter Indikation Fleroxacin Ofloxacin Ciprofloxacin Enrofloxacin III Fluorochinolone mit verbesserter Aktivität Levofloxacin gegen grampositive und „atypische“ Erreger Sparfloxacin wie Chlamydien und Mykoplasmen Grepafloxacin IV Fluorochinolone mit verbesserter Aktivität Trovafloxacin gegen grampositive und „atypische“ Erreger Gatifloxacin sowie Anaerobier Moxifloxacin Clinafloxacin kursiv: nicht mehr im Handel fett: in der vorliegenden Arbeit untersuchte Wirkstoffe

2 Die frequenzadaptierte QT-Zeit (QTc) ergibt sich aus der Formel nach Bazett: QTc = QT/RR 2 Literaturübersicht 15

Enrofloxacin wurde in der vorliegenden Arbeit erstmals auf seine Wirkung auf erg-K+-Kanäle hin untersucht. Der breite Einsatz dieses Antibiotikums in der tierärztlichen Praxis gab Anlass zu den Versuchen und weist auf die Relevanz der ermittelten Ergebnisse hin. Über die Beeinflussung von erg-Kanälen durch Ciprofloxacin lagen bereits Resultate vor (Bischoff et al., 2000; Kang et al., 2001B). Zumal diese widersprüchlich waren und Enrofloxacin im Körper teilweise zu Ciprofloxacin metabolisiert wird (Cester & Toutain, 1997), wurden diese Effekte hier erneut überprüft. 2 Literaturübersicht 16

2.3 Arbeitshypothese und Zielsetzung

Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung der biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften der erg-K+-Kanäle.

Die vorliegende Arbeit soll beitragen,

1. die ungewöhnliche Kinetik der erg-Kanäle in bestimmten Zelllinien genauer zu beleuchten. Es gilt den Zusammenhang zwischen dem Expressionssystem und Änderungen im Schaltverhalten der Kanäle zu klären. Der Theorie der Modulation bereits bekannter erg-Kanäle durch zellspezifische Faktoren steht dabei die Existenz eines neuen erg- ähnlichen Kanals gegenüber. Die Kinetik der erg-Kanäle wurde endogen, nach Überexpression und nach Blockade mit siRNA untersucht.

2. herauszufinden, ob die Wirkstoffe Ciprofloxacin und Enrofloxacin erg-Kanäle blockieren und dies über ein LQT-Syndrom zu Herzarrhythmien führen kann.

Die elektrophysiologischen Experimente wurden mit Hilfe von verschiedenen Expressionssystemen unter Anwendung der Patch-clamp-Technik durchgeführt. Als Grundlage der Untersuchungen dienten hierbei die bereits vorhandenen Erkenntnisse über die Eigenschaften der erg-K+-Ströme in laktotrophen Zellen sowie in den beiden Zelllinien

GH3B6 und MMQ. 3 Material und Methoden 17

3 Material und Methoden

3.1 Zellkultur Alle verwendeten Zelllinien wurden in einem Brutschrank bei 37°C in einer Atmosphäre aus

95% Luft und 5% CO2 in 50 ml Zellkulturflaschen (Nunc) gehalten. Ein Wechsel des Mediums erfolgte alle zwei bis drei Tage. Für die elektrophysiologischen Versuche wurden die Zellen auf Poly-D-Lysin (Sigma)- beschichtete Glasplättchen in 35 mm-Kulturschälchen (Nunc) ausplattiert.

GH3B6-Zellen sind ein Subklon der GH3-Zelllinie, die aus einem Hypophysentumor der Ratte (Tashjian et al., 1968) gewonnen wurde. Es handelt sich hierbei um eine somatomammotrophe Zelllinie, die Prolaktin und Wachstumshormon (GH) sezerniert. Sie besitzt außerdem Rezeptoren für TRH (Thyreotropin-Releasing-Hormon), VIP (Vasoaktives intestinales Peptid), CCK (Cholecystokinin) und SST (Somatostatin). Die perlschnurartig wachsenden Zellen wurden ein Mal pro Woche passagiert. Die in der Arbeit vorwiegend verwendeten MMQ-Zellen (Judd et al., 1988) entstammen ursprünglich ebenfalls einem Hypophysentumor der Ratte und ähneln in ihren elektrophysiologischen Eigenschaften nativen laktotrophen Zellen. Sie sezernieren ausschließlich Prolaktin und besitzen neben D2-Rezeptoren für Dopamin noch Rezeptoren für VIP, SST und Acetylcholin. Es handelt sich um nicht adhärente abgerundete Zellen mit großem sphärischen Kern und prominenten Nukleoli. Die Zellen wurden, je nach Wachstum, zwei bis drei Mal pro Woche umgesetzt. Im Gegensatz zu den beiden bereits beschriebenen neuroendokrinen Zelllinien besitzen CHO- Zellen (Puck et al., 1958) nur wenige endogene Ionenkanäle. Sie sind deshalb besonders geeignet, überexprimierte Kanäle isoliert darzustellen. Die Zelllinie entstammt einem Ovarialtumor des chinesischen Hamsters (Chinese Hamster Ovary). Aufgrund ihres schnellen Wachstums wurden diese Zellen drei Mal pro Woche passagiert. 3 Material und Methoden 18

Für jede Zelllinie wurde ein definiertes Nährmedium hergestellt:

Medium für GH3B6-Zellen: - 82% Ham`s F12 (Sigma) - 15% Pferdeserum (Roche) - 2,5% Fetales Kälberserum (Biother GmbH) - 0,5% L-Glutamin (Sigma)

Medium für MMQ-Zellen: - 90% RPMI 1640 Medium mit L-Glutamin (Gibco BRL) - 7,5% Pferdeserum (Roche) - 2,5% Fetales Kälberserum (Biother GmbH)

Medium für CHO-Zellen: - 89,5% MEM alpha Medium (Gibco BRL) - 10% Fetales Kälberserum (Biother GmbH) - 0,3% L-Glutamin (Sigma) - 100 U/ml Penicillin (Sigma) - 100 µg/ml Streptomycin (Sigma)

3.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.1 Synthese von siRNA Die Möglichkeit einer pharmakologischen Unterscheidung einzelner Mitglieder der erg- Kanalfamilie besteht bisher nicht. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit zur differenzierten Betrachtung der erg-Kanäle ihre Expression mittels spezifischer siRNAs unterdrückt. Von Interesse war das Verhalten des erg-Stroms in MMQ-Zellen nach Ausschalten der endogenen erg1- und erg2- Kanäle. Für die elektrophysiologischen Untersuchungen wurde die siRNA in Verbindung mit einem Vektorensystem in die Zellen injiziert. Hierzu wurden in unserem Labor in die Vektoren pSilencer 2.0-U6 und pSilencer 3.0-H1 (Ambion) 62-65 Bp große DNA-Fragmente stromabwärts der Promotorregion einkloniert. 3 Material und Methoden 19

Die DNA-Fragmente enthielten einen 19 Basen langen „Sense“-Strang-Bereich aus der jeweiligen Kanal-cDNA: Sequenzstränge für erg1: 5` GGACACAGAGCAGCCAGGG 3` (Nukleotid 2697-2715) 5` GTGCAGACATGGCCACTGT 3` (Nukeotid 3182-3200) Sequenzstränge für erg2: 5` CTTCGTGGAGTTCAACCTG 3` (Nukleotid 593-611) 5` CACCCCGACAGGCCCCAGG 3` (Nukleotid 2203-2221) Der Strang wurde mit dem zugehörigen „Antisense“-Strang durch eine „Loop“-Struktur verbunden. Als weitere Klonierungsstelle wiesen die DNA-Fragmente eine „Consensus“- Sequenz für die RNA-Polymerase III Termination auf. Bei der Expression der Vektoren in den Zellen wird eine siRNA-Hairpin-Struktur synthetisiert, die spezifisch gegen die mRNA des jeweiligen erg-Kanals gerichtet ist.

3.2.2 WesternBlot Um die Wirkung der siRNA nach den elektrophysologischen Untersuchungen auch molekularbiologisch nachzuweisen, wurden in unserem Labor WesternBlot-Analysen durchgeführt. Für die Versuche wurden MMQ-Zellen mit siRNA gegen erg1 und erg2 transfiziert. Als Antikörper wurden Anti-erg1 der Firma Chemicon (Pond et al., 2000) und ein in unserem Labor aus dem Kaninchen selbst generierter Anti-erg2 (Hirdes et al., 2005) verwendet. Zur Kontrolle wurde je eine Flasche mit unbehandelten Zellen mitgeführt, die in allen Analyseschritten gleich behandelt wurde. Die Inkubation im Brutschrank wurde nach 24, 48, bzw. 72 Stunden abgebrochen.

3.3 Heterologe Expression

Zur Überexpression der erg-Kanäle in MMQ-, GH3B6- und CHO-Zellen wurden die in Tab. 5 aufgeführten Vektoren verwendet. Die unterschiedlichen Sequenzen der verwendeten Kanal- Untereinheiten sind in Abb. 8 veranschaulicht. 3 Material und Methoden 20

Tab. 5: Verwendete Vektoren Die in der vorliegenden Arbeit eingesetzten cDNAs wurden in die Vektoren pcDNA3 oder pSilencer einkloniert.

Vektor relevantes Merkmal / Referenz pcDNA3 Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland r-erg1 (r-erg 1a) Bauer et al., 1998 r-erg1b Hirdes et al., 2005 HERG−∆866-1159,S631A Schönherr et al.,1996 HERG−∆2-373 Schönherr et al.,1996 r-erg2 Shi et al., 1997 r-erg3 Shi et al., 1997 EGFP-N1 Fa. Clontech, Heidelberg, Deutschland; enhanced green-fluorescent protein pSilencer 2.0-U6 Fa. Ambion, Austin, USA -Sequenz gegen r-erg1 (Nukleotid 2697-2715) -Sequenz gegen r-erg1 (Nukleotid 3182-3200) pSilencer 3.0-H1 Fa. Ambion, Austin, USA -Sequenz gegen r-erg1 (Nukleotid 2697-2715) -Sequenz gegen r-erg1 Nukleotid 3182-3200) -Sequenz gegen r-erg2 (Nukleotid 593-611) - Sequenz gegen r-erg2 (Nukleotid 2203-2221) 3 Material und Methoden 21

Abb. 8: Schematischer Vergleich der Sequenzen der erg-Kanäle Von oben nach unten werden folgende erg-Kanal-Untereinheiten verglichen: Die Ratten-erg-Kanaluntereinheit r-erg1 und r-erg1b, eine Splicevariante mit verkürztem N- Terminus. Die HERG1-Untereinheit, das menschlichen Korrelat von r-erg1. Zwei Deletionsmutanten des HERG (∆2-373; ∆866-1159,S631A) mit verändertem N- bzw. C- Terminus. Die beiden Ratten-erg-Kanaluntereinheit r-erg2 und r-erg3.

In der vorliegenden Arbeit wurde ausschließlich die Ratten-erg-Kanaluntereinheit r-erg1 (Acc. nr. Z96106; Bauer et al., 1998) verwendet. Diese entspricht der als erg1a definierten Kanaluntereinheit (Acc. nr. AF012868; London et al., 1997), die 1994 erstmals bei Warmke & Ganetzky beschrieben wurde. Der r-erg1 ist zu 98,7 % homolog und zu 96 % identisch mit dem humanen erg1 (HERG) (Bauer et al., 1998). Der Splicevariante r-erg1b des r-erg1 fehlt der größte Teil des N-Terminus. Im Unterschied zu der Deletionsmutante HERG−∆2-373, die auch N-terminal verkürzt ist, besitzt er aber ein extra Stück mit 36 AS. Die zweite eingesetzte Deletionsmutante, HERG−∆866-1159,S631A, verfügt über einen vollständigen N-Terminus mit EAG-Domäne; ihr fehlt der distale C-Terminus. 3 Material und Methoden 22

3.4 Micro-Injektion

Für die elektrophysiologischen Versuche wurde durch Injektion der cDNA eine Expression der entsprechenden Kanäle in den Zellen induziert. Die Micro-Injektion der einzelnen Zellen fand an einem Platz statt, der mit einem Transjektor 5246 (Eppendorf) und einem inversen Mikroskop (Axiovert 25, Zeiss) ausgestattet war. Die frisch aufgetauten Stammlösungen mit den Vektoren wurden zunächst 20 min mit 12000 Upm bei 4°C zentrifugiert (Tischzentrifuge

5415 C, Eppendorf) und im Anschluss mit sterilem H2O auf die gewünschte Endkonzentration verdünnt. Mittels feiner Pipetten (Microloader, Eppendorf) wurde die fertige Injektionslösung in sterile Glaspipetten (Femtotips, Eppendorf) gefüllt und diese über dem Mikroskoptisch an einer dafür vorgesehenen Vorrichtung des Transjektors befestigt. Die Zellen konnten in Petrischalen (Nunc) mit Nährmedium in eine passende Ausfräsung im Mikroskoptisch eingesetzt werden. Die cDNA wurde 0,5 - 0,6 s lang mit einem Druck von 80 bis 110 hPa injiziert. Aufgrund der unterschiedlichen Expressionseigenschaften der verwendeten cDNAs der erg- Kanäle variierten die zu injizierenden Endkonzentrationen (Tab. 6). Jede Injektionslösung enthielt außerdem 0,01 µg/µl EGFP-cDNA. Durch das grüne Leuchten dieses Proteins unter Fluoreszenzlichtanregung (485 nm) konnten die injizierten Zellen nach einiger Zeit eindeutig wiedererkannt werden (vgl. Abb. 20). Nach der Injektion wurden die Zellen 6-36 Stunden unter standardisierten Kulturbedingungen inkubiert. Alle ausgewerteten Messungen wurden innerhalb dieses Zeitfensters unternommen.

Tab. 6: Konzentrationen der Vektoren in der Injektionslösung Vektor Verdünnung r-erg1 0,01 µg/µl r-erg1b 0,01 µg/µl HERG −∆ 2-373 0,02 µg/µl HERG −∆ 866-1159,S631A 0,01 µg/µl r-erg2 0,2 µg/µl r-erg3 0,1-0,2 µg/µl pSilencer 2.0-U6 0,2 µg/µl pSilencer 3.0-H1 0,2 µg/µl 3 Material und Methoden 23

3.5 Elektrophysiologie

Bei der hier angewendeten Patch-clamp-Technik (Abb. 9) wird mit einer Glaspipette ein Abschnitt der Zellmembran (patch) elektrisch von seiner Umgebung isoliert. Je nach gewählter Methode können so Ströme oder Spannungen von der Zellmembran abgeleitet werden. Im Voltage-clamp (Spannungsklemme)-Modus soll verhindert werden, dass sich das Membranpotential der untersuchten Zelle ändert. Durch negative Rückkopplung im Verstärker wird ein Kompensationsstrom erzeugt, der das gemessene Membranpotential einer vorgegebenen Sollspannung angleicht. Das Verhalten dieses Kompensationsstroms entspricht dem Ionenstrom durch die Membran.

Abb. 9: Vereinfachtes Schaltbild eines Patch-Clamp-Verstärkers (Abb. modifiziert nach Numberger & Draghun, 1996) Vorverstärker zusammengesetzt aus Operationsverstärker (OPA (operational amplifier)) und

Rückkopplungswiderstand (Rf (Rfeedback)). An den beiden Eingängen des OPA werden

Pipettenpotential (Upip) und die vorgegebene Sollspannung (Usoll) gemessen. Durch die unterschiedlichen Spannungen fließt ein Strom durch Rf, der nur in die Pipette fließen kann und aufgrund des hohen Eingangswiderstandes von ca. 10 GΩ nicht zurück in den OPA. Der

Strom fließt solange, bis keine Differenz mehr zwischen den beiden Eingängen besteht, Upip und Usoll gleich sind. An Rf entsteht damit eine Spannung, die proportional zu diesem Strom ist, der dann mittels eines zweiten Verstärkers gemessen werden kann.

Im Current-clamp (Stromklemme)-Modus kann ein Strom vorgegeben werden und das Membranpotential bleibt variabel. Die Aufzeichnung der Potentialschwankungen dient der Aufklärung des physiologischen Erregungsmusters der Zellen. 3 Material und Methoden 24

Alle elektrophysiologischen Experimente der Arbeit wurden bei Raumtemperatur (22-25°C) im Spannungsklemmenmodus durchgeführt. Die Glasröhrchen, die als Messelektroden dienten, wurden aus Borosilikatglas hergestellt (Vitrex GB150T-8P, Science Products GmbH). Mit einem Pipettenziehgerät (DMZ Universal Puller, Zeitz-Instrumente GmbH und Flaming/Brown Micropipette Puller, Model P-97, Sutter Instrument Company) wurden Pipetten hergestellt, die nach Eintauchen in die Badlösung Widerstände zwischen 2 und 5 MΩ aufwiesen. Dies entspricht einer Öffnung von weniger als 1 µm. Jede Pipette wurde nur einmal verwendet und jeweils am Tag der Herstellung verbraucht. Zum Füllen der Pipetten wurde intrazelluläre Lösung verwendet, da im Verlauf der Experimente die Zellmembran durchbrochen wird (Whole-cell-Konfiguration, Abb. 10, Abb. 11) und es zu einem Austausch von Pipettenlösung und Zytoplasma kommt. Die Pipette wurde zum Messen über einen chlorierten Silberdraht am Elektrodenhalter mit dem Vorverstärker verbunden. Um die Pipettenspitze vor Verunreinigungen zu schützen, wurde über ein Schlauchsystem und ein mit Wasser gefülltes U-Rohr ein geringer Überdruck angelegt. Als Messkammern für die Zellen dienten Petrischalen aus Plexiglas (Nunc) mit einem Durchmesser von 35 mm, die in eine passende Ausfräsung im Mikroskoptisch eingesetzt werden konnten. In das Schälchen wurde vor Beginn der Messung eine zweite Elektrode eingehängt, die geerdet wurde. Zur Herstellung dieser Agarbrücke wurde eine Borosilikatglaskapillare mit einer Lösung aus 150 mmol/l KCl und 2% Agar-Agar (v/w) gefüllt. Nach Kontakt der Messpipette mit der Lösung wurde ihr Widerstand bestimmt, und die Pipettenkapazität kompensiert. Bei vorsichtiger Annäherung an die Zelle, Lösen des Überdrucks und leichtem Ansaugen erhält man eine mechanische Verbindung zwischen Zellmembran und Pipette, die einen sehr hohen Widerstand besitzt (mindestens 1 GΩ), das Gigaseal. Man befindet sich nun in der Cell-attached-Konfiguration. Im Anschluss an das Gigaseal können Messungen in verschiedenen Konfigurationen durchgeführt werden (Cell-attached-Konfiguration, Whole-cell-Konfiguration, Inside-out- Konfiguration, Outside-out-Konfiguration). Die in dieser Arbeit beschriebenen Experimente wurden ausschließlich in der Whole-cell- Konfiguration (Abb. 10; Abb. 11) durchgeführt. Hierbei werden die Ströme über der gesamten Zellmembran dargestellt. 3 Material und Methoden 25

Abb. 10: Ersatzschaltbild der Ganzzellabbleitung (Whole-cell-Konfiguration) (Abb. modifiziert nach Numberger & Draghun, 1996)

Zelle mit Membranwiderstand (Rm) und Kapazität der Membran (Cm). Der Serienwiderstand

(Rs) des Zugangs zur Zelle wird durch Zellorganellen und Membranfragmente höher als der reine Pipettenwiderstand.

Abb. 11: Herstellung der Whole-cell-Konfiguration (Abb. modifiziert nach Hamill et al., 1981) Nach Annäherung an die Zelle wird durch Lösen des Unterdrucks und leichtes Ansaugen eine mechanische Verbindung, das Gigaseal, zwischen Zellmembran und Pipette hergestellt (Cell- attached-Konfiguration). Nach einem weiteren kurzen Saugpuls wird die Membran unter der Pipette durchbrochen und ein Zugang zum Zytoplasma hergestellt (Whole-cell- Konfiguration). 3 Material und Methoden 26

Nach erfolgreicher Herstellung des Gigaseals, wurde durch einen kurzen Saugpuls das Membranstück unter der Pipette durchbrochen und ein Zugang zum Zytoplasma hergestellt. Der elektrische Zugang zum Zellinneren wird am Computerbildschirm durch eine plötzliche Zunahme der kapazitiven Umladeartefakte angezeigt. Hierbei handelt es sich um Ladeströme der Zellmembrankapazität, die anschließend kompensiert wurden. Zeit und Spannung wurden anhand von Pulsprotokollen vorgegeben, die mit Hilfe der Pulse- Software (HEKA Elektronik) erstellt und erfasst werden konnten.

3.6 Lösungen und Chemikalien 3.6.1 Messlösungen Die Messungen wurden in verschiedenen extrazellulären Lösungen durchgeführt: a) Ringer-Lösung (Angaben in mmol/l): 140 NaCl 5 KCl

2 CaCl2

2 MgCl2 10 HEPES 5 Glukose pH = 7,35 (eingestellt mit 1 mol/l NaOH) b) 40 K+-Lösung (Angaben in mmol/l): 100 NaCl 40 KCl

4 MgCl2

1 CaCl2 2,5 EGTA 10 HEPES 5 Glukose pH = 7,3 ( eingestellt mit 1 mol/l NaOH) freie Ca2+-Konzentration: 75 nmol/l (nach EQCal) 3 Material und Methoden 27

c) isotonische KCl-Lösung (Angaben in mmol/l): 140 KCl

4 MgCl2

1 CaCl2 10 HEPES 10 Glukose 2,5 EGTA pH = 7,3 (eingestellt mit 1 mol/l KOH) freie Ca2+-Konzentration: 75 nmol/l (nach EQCal)

Als Pipettenlösung wurde in allen Versuchen folgende intrazelluläre Lösung verwendet (Angaben in mmol/l): 140 KCl

2 MgCl2

1 CaCl2 2,5 EGTA 10 HEPES pH = 7,3 (eingestellt mit 1 mol/l KOH) freie Ca2+-Konzentration: 66 nmol/l (nach EQCal)

3.6.2 Chemikalien a) E-4031 (Eisai GmbH, D-60528 Frankfurt) ist ein Klasse III-Antiarrhythmikum aus der Gruppe der Methansulfanilide, das als spezifischer Blocker für erg-Kanäle beschrieben wurde (Follmer & Colatsky, 1990; Trudeau et al., 1995; Weinsberg et al., 1997). Zur Darstellung der E-4031-sensitiven erg-

Kanäle in MMQ-, GH3B6- und CHO-Zellen wurde dieser Blocker in der Arbeit in einer Endkonzentration von 10 µmol/l eingesetzt. b) Ciprofloxacin (Ciprofloxacin Hydrochlorid, ICN Biomedicals, Inc.) ist ein Antibiotikum der Substanzgruppe der Fluorochinolone, das sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin eingesetzt wird. In dieser Arbeit wurde seine Wirkung auf erg-Kanäle im Hinblick auf das Krankheitsbild des LQT-Syndroms überprüft. Hierzu wurde der 3 Material und Methoden 28

Wirkstoff in Endkonzentrationen von 1,5 mmol/l und 3 mmol/l eingesetzt. Die erg- blockierende Wirkung dieses Arzneimittels wurde in der Literatur bereits kontrovers diskutiert (Bischoff et al., 2000; Kang et al., 2000). c) Enrofloxacin (Enrofloxacin, Sigma-Aldrich Chemie) gehört ebenfalls zur Gruppe der Fluorochinolone. Das Antibiotikum wurde 1980 ausschließlich für den tiermedizinischen Gebrauch entwickelt und ist seit 1988 zugelassen. Der Wirkstoff ist als Injektionslösung, orale Lösung und in Tablettenform in verschiedenen Konzentrationen erhältlich (BaytrilR, Bayer). Die übliche Dosierung beträgt 5 mg/kg Körpergewicht. Ausgehend von einer Bioverfügbarkeit von 100% und einem Molekulargewicht von 359,4 g/l entspricht dies ungefähr einer Konzentration von 0,014 mmol/l. Die Wirkung auf erg-Kanäle wurde in der vorliegenden Arbeit mit Konzentrationen von 5 mmol/l, 3 mmol/l, 1,5 mmol/l, 0,5 mmol/l und 0,014 mmol/l überprüft.

3.7 Datenerfassung und Auswertung

Der Messplatz bestand aus einem schwingungsgedämpften Tisch mit einem inversen Mikroskop (Axiovert 135, Zeiss). Der daran angeschlossene Mikromanipulator (Patchman, Eppendorf) und einzelne Zu- und Absaugvorrichtungen befanden sich auf einer Arbeitsplatte, die den Tisch berührungsfrei abdeckte. Zur elektrischen Abschirmung war der Messplatz von einem Faradaykäfig umgeben. Ein Patch-clamp-Verstärker (EPC-9, HEKA Elektronik) und ein Macintosh-Computer (Apple Inc.), der später durch einen PC (Maxdata BTO) ersetzt wurde, vervollständigten den Arbeitsplatz. Zur Detektion EGFP-exprimierender Zellen stand eine Fluoreszenzeinrichtung (Zeiss) mit einem Filtersatz für 485 nm (Filtersatz 09, Zeiss) zur Verfügung. Die Erfassung der elektrophysiologischen Daten erfolgte mit Hilfe der Pulse- Software (HEKA Elektronik). Bei allen durchgeführten Messungen wurden Deaktivierungsprotokolle verwendet. Hierbei wird ein depolarisierender Vorpuls vorgegeben, bei dem die Kanäle aktivieren, durch die zeitgleiche Inaktivierung aber nur wenig Strom fließt. Bei der anschließenden Hyperpolarisation erholen sich die Kanäle schnell von der Inaktivierung und man erhält einen, abhängig vom angelegten Potential, unterschiedlich 3 Material und Methoden 29

großen Aus- oder Einwärtsstrom mit langsamer Deaktivierung. Im Anschluss erfolgte ein kurzer Sprung auf ein hyperpolarisierendes Potential, um den Strom durch die zu diesem Zeitpunkt noch verfügbaren, d.h. noch nicht deaktivierten erg-Kanäle zu messen. Der auf diese Weise erhaltene Strom wird als Tailstrom bezeichnet und die maximale Amplitude dient, gegen die Vorpulsspannung aufgetragen, zur Darstellung der Spannungsabhängigkeit der Verfügbarkeit der erg-Kanäle. Zur Auswertung und Analyse wurden die Programme PulseFit (HEKA Elektronik), Igor (WaveMetrics, Inc.) und Excel (Microsoft Inc.) verwendet. Die Spannungsabhängigkeit der Verfügbarkeit der erg-Kanäle wurde in den meisten Fällen mit der Summe aus zwei Boltzmannfunktionen beschrieben (vergl. Schäfer et al., 1999): f(x)= Imin + Imax,f / (1+exp(x-E0,5,f)/ Sf) + Imax,s/ (1+exp(x- E0,5,s)/ Ss) So lässt sich eine zweiphasige Spannungsabhängigkeit der Verfügbarkeit darstellen. Mit f im Index wird hier die schnelle (fast) und mit s (slow) die langsame Komponente der

Deaktivierung des erg-Stroms beschrieben. Imin entspricht der Abweichung der Kurve von 0 auf der Ordinate und Imax der maximalen Amplitude der Kurve. E0,5 ist das Potential, bei dem der halbmaximale Wert der Verfügbarkeit des gemessenen Stroms vorliegt. S gibt die Steilheit der Kurve als den Bereich der Abszisse an, innerhalb dessen die Amplitude von

I1=1/e (~37%) auf I2=1-1/e (~ 63%) zunimmt. Diese Variable, die auch als Steigungsfaktor (Slope) bezeichnet wird, beschreibt also den Kurvenverlauf im Bereich der größten Dynamik. Je größer der Wert, desto flacher der Kurvenverlauf. Zur Überprüfung signifikanter Änderungen wurde der t-Test verwendet. Der Vergleich zweier Datengruppen kann zu einer oder zwei Seiten erfolgen und wurde aus gepaarten Stichproben, oder Stichproben mit gleicher Varianz (homoskedastisch) ermittelt. Das Signifikanz-Niveau der Veränderungen wurde auf 5% festgelegt. In den Abbildungen werden Werte für p ≤ 0,05 mit * bezeichnet, p- Werte ≤ 0,01 mit ** und p ≤ 0,001 mit ***. Die Daten wurden nicht im Hinblick auf Fehler im Diffusionspotential hin korrigiert. In Ringer-Lösung lag dieser bei 24°C bei 4,8 mV und in 40 K+-Lösung bei 3,7 mV. In isotonischer KCl wurde ein Potentialfehler von 0,2 mV errechnet. 3 Material und Methoden 30

3.8 Herstellerverzeichnis

AGS, D-69115 Heidelberg Ambion, Austin, Texas-USA Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA Apple Inc., Cupertino, Kalifornien-USA BD Bioscience Clontech, D-69126 Heidelberg Bio-Rad Laboratories GmbH, D-80939 München Carl Zeiss Jena GmbH, D-07745 Jena Consort, Parklaan 36, B-2300 Turnhout Eisai GmbH, D-60528 Frankfurt Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, D-22083 Hamburg GIBCO BRL Life Technology GmbH, D-76131 Karlsruhe HEKA Electronic, D-66466 Lambrecht ICN Biomedicals, Inc., D-37269 Eschwege Invitrogen GmbH, D-76131 Karlsruhe Kendro Laboratory Products GmbH, D- 63505 Langenfeld MAXDATA, Computer GmbH & Co. KG, D-45769 Marl Microsoft Inc., Seattle, Washington-USA Millipore GmbH, D-65824 Schwalbach Nunc, D-65203 Wiesbaden OwL Separation Systems, Inc., Portsmouth, NH, USA Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim Perkin Elmer, Applied Biosystem, Niederlande Schleicher & Schuell, D-37582 Dassel Science Products GmbH, D-65719 Hofheim Sigma, D-82041 Deisenhofen Sigma-Aldrich Chemie GmbH, D-89555 Steinheim Stratagene Europe, Amsterdam, Niederlande Sutter Instrument Company, Novato-Ca 94949, USA WaveMetrics, Inc. Lake Oswego, Oregon 97035-0032, USA Zeitz-Instrumente GmbH, D-81377 München 4 Ergebnisse 31

4. Ergebnisse

4.1 Biophysikalische Untersuchungen der erg-Kanäle

4.1.1 Native erg-Ströme in MMQ-Zellen In allen in der vorliegenden Arbeit gemessenen MMQ-Zellen konnte bei den erg-Strömen eine langsame Komponente der Deaktivierung beobachtet werden. Diese konnte, wie bereits beschrieben (Schäfer et al., 1999; Leechi et al., 2002, Buhk, 2004) in unterschiedlicher Ausprägung auftreten (Tab. 7).

Tab. 7: Absolute Stromamplituden in MMQ-Zellen in 40 mmol/l K+-Lösung

Zelle Nr. Gesamtamplitude Amplitude Is Ampl.-Anteil Is (pA) (pA) (%) 1 179,8 133,4 74,2 2 202,5 162,8 80,4 3 229,2 163,0 71,1 4 118,9 87,5 73,6 5 197,4 197,4 100,0 6 87,4 87,4 100,0 7 72,6 72,6 100,0 8 114,8 45,8 39,9 9 164,6 137,7 83,7

Zur Erklärung des besonderen Stromverhaltens in den MMQ-Zellen bietet das bereits eingeführte Zellmodell zwei Ansätze (vergl. Kapitel 2.1, Abb.5). Der Modulation bekannter erg-Kanäle durch Faktoren steht dabei die Theorie eines neuen, bisher unbekannte erg- ähnlicher Kanal gegenüber. Um eine der Thesen zu favorisieren, wurden zunächst Untersuchungen an nativen MMQ- Zellen vorgenommen. Nach der Beschreibung der langsamen Komponente in den nativen Zellen wurde zur weiteren Aufklärung eine Reihe von erg-Kanälen in den verschiedenen Zellsystemen überexprimiert. 4 Ergebnisse 32

Die elektrophysiologischen Versuche wurden in einer 40 mmol/l K+-Lösung durchgeführt. Bei Messungen in physiologischer K+-Lösung hätten die erg-Ströme eine für die Auswertung nicht ausreichend große Amplitude. Eine Zunahme der Leitfähigkeit mit Erhöhung der + extrazellulären K -Konzentration ist für alle drei erg-Kanäle, sowie den IKr beschrieben (Shibasaki, 1987; Sanguinetti et al., 1995; Trudeau et al., 1995; Kiehn et al., 1999; Schönherr & Heinemann, 1996; Wang et al., 1996; Zou et al., 1998; Sturm et al., 2005). Eine Erhöhung der K+-Konzentration in der Messlösung war außerdem durch die bekannte Abhängigkeit der langsamen Komponente der Deaktivierung von der extrazellulären K+-Konzentration indiziert (Lecchi et al., 2002). Desweiteren wurde der Ca2+-Gehalt der Lösung erniedrigt, um Ströme durch endogene Calcium-Kanäle sowie Ca2+-aktivierte Kalium-Kanäle zu unterdrücken (vergl. Bauer et al., 1990). Um die langsame Deaktivierungskomponente darstellen zu können, wurde ein Pulsprotokoll verwendet, mit dem die Spannungsabhängigkeit der Verfügbarkeit bestimmt wird (vergl. Kapitel 3.7; Abb. 12). Hierbei wird ein zwei Sekunden langer, depolarisierender Vorpuls von +40 mV vorgegeben, bei dem die Kanäle aktivieren. Durch die zeitgleiche, schnelle Inaktivierung entsteht allerdings nur ein geringer Strom, der auch nicht aufgezeichnet wird. Anschließend wurden über einen Zeitraum von 1,5 s in 10 mV Schritten Potentiale von +60 mV bis –140 mV angelegt. Durch hyperpolarisierende Pulse erholen sich die Kanäle schnell von der Inaktivierung und man erhält einen, abhängig vom Potential, unterschiedlich großen Strom mit langsamer Deaktivierung. Im Anschluss an die variablen Pulse erfolgte ein kurzer (10 ms) Sprung auf -120 mV um den Tailstrom aufzuzeichnen. Die maximale Amplitude wurde gegen die Vorpulsspannung aufgetragen und die erhaltenen Datenpunkte an die Summe zweier Boltzmannfunktionen angepasst. Diese Art der Auswertung wurde in der Arbeit zur Veranschaulichung der kinetischen Unterschiede, die erg-Kanäle in den verschiedenen Expressionssystemen und nach Überexpression besitzen, angewendet. Die entstehende Kurve wird als Verfügbarkeitskurve bezeichnet (siehe Kapitel 3.7). In MMQ-Zellen war, neben der auffallend langsamen Deaktivierung, bei direkt aufeinanderfolgenden Messungen eine weitere Veränderung in der Kinetik der Ströme zu beobachten (Abb. 12). 4 Ergebnisse 33

Abb. 12: Native Ströme in einer MMQ-Zelle Aufzeichnung der endogenen erg-Ströme in 40 mmol/l K+-Lösung. Zur Verdeutlichung ist nur jede zweite Stromspur zwischen –140 und 0 mV abgebildet. Oben (schwarz): erste durchgeführte Messung In der Mitte (rot): direkt darauffolgende, zweite Messung mit geringerem langsamen Stromanteil und schnellerer Deaktivierung. Unten (grün): dritte Messung, 3 min nach einem Haltepotential von 0 mV und wieder deutlich größerer langsamer Komponente. Die Nulllinie ist jeweils als gestrichelte Linie dargestellt. 4 Ergebnisse 34

Im zweiten Protokolldurchlauf nahm infolge der hyperpolarisierenden Pulse, wie von Schäfer et al. (1999) und Lecchi et al. (2002) bereits beschrieben, der für diese Zellen typische langsame Anteil der Deaktivierung deutlich ab. Dass bei der Untersuchung der erg-Ströme sonst häufig eingesetzte Aktivierungsprotokoll, das von negativen Potentialen ausgeht, konnte deshalb nicht zur Aufzeichnung und Untersuchung der langsamen Komponente verwendet werden. Um das Auftreten und „Verschwinden“ des langsamen Anteils der Deaktivierung weiter zu untersuchen, wurden Versuche durchgeführt, bei denen im Anschluss an die beiden aufeinanderfolgenden Messungen eine bestimmte Zeit bei einem depolarisierenden Haltepotential abgewartet wurde, um danach erneut zu messen (Abb. 12; Abb. 13). Dabei war zu erkennen, dass der Anteil der langsamen Komponente beim dritten Protokolldurchlauf wieder zunahm. Entscheidend ist, dass die Gesamtamplitude der Ströme im Verlauf der Ableitungen weitestgehend konstant blieb (Abb. 13).

Abb. 13: Stromamplituden im Verlauf der 3 Messungen Die Gesamtstromamplitude der endogenen erg-Ströme bleibt während der 3 Ableitungen weitestgehend konstant. Zur Verdeutlichung ist nur jede zweite Stromspur zwischen –140 und 0 mV abgebildet. Die Nulllinie ist als gestrichelte Linie dargestellt. 4 Ergebnisse 35

Abb. 14: Verfügbarkeitskurven der 3 Ableitungen Oben: erste, zweite und dritte Ableitung der endogenen erg-Ströme in 40 mmol/l K+-Lösung (vergl. Abb. 12). Zur Verdeutlichung ist nur jede zweite Stromspur zwischen –140 und 0 mV abgebildet. Die Nulllinie ist als gestrichelte Linie dargestellt. Unten: Die Tailströme bei –120 mV wurden, normiert auf die maximale Amplitude in der ersten Messung und gegen die Vorpulsspannung aufgetragen. Schwarz: Verfügbarkeitskurve der ersten Messung mit großer, langsamer Komponente. Rot: Rechtsverschiebung der Kurve durch Abnahme der langsamen Komponente und Zunahme des schnellen Anteils in der zweiten Messung. Grün: „Wiederkehren“ der langsamen Komponente in der dritten Messung nach 3 min bei einem Haltepotential von 0 mV. 4 Ergebnisse 36

Abb. 15: Anteile der beiden Stromkomponenten in der 1. und 2. Messung normierte Stromamplitude mit jeweiligem Anteil der Deaktiverungskomponenten. In der ersten Messung überwiegt die langsame (Is), in der zweiten die schnelle (If) Komponente. Die so erhaltenen E0,5f - und E0,5s-Werte stellen das Potential dar, bei dem der halbmaximale Wert der Verfügbarkeit des gemessenen Stromanteils vorliegt.

Zur Untersuchung der Potential- und Zeitabhängigkeit der langsamen Komponente der Deaktivierung wurde nach ihrem „Verschwinden“ ein, drei oder zehn Minuten lang bei Potentialen von 0, -30 und –50 mV abgewartet und bei der anschließenden Messung die Zunahme des langsamen Anteils an der Deaktivierung ausgewertet (Abb. 16; Abb. 17). Zur 4 Ergebnisse 37

ersten und zweiten Messung sowie zur dritten Ableitung drei Minuten nach einem Haltepotential von 0 mV wurde eine Verfügbarkeitskurve erstellt (Abb. 14). In der zweiten Ableitung ist die Verfügbarkeitskurve deutlich nach rechts verschoben. Das bedeutet, die Kanäle deaktivieren schneller und bei positiveren Potentialen. Nachdem die Zellen eine Zeit lang depolarisierenden Potentialen ausgesetzt waren, konnte auch die rückläufige Tendenz dargestellt werden (Abb. 14). Anhand der bisigmoidalen Verfügbarkeitskurven konnten die Anteile der schnellen und der langsamen Stromkomponente bestimmt werden (Abb. 15). Mit s im Index wird die langsame (slow) und mit f die schnelle (fast) Komponente der Deaktivierung des erg-Stroms beschrieben.

Für die halbmaximale Verfügbarkeit (Aktivierung) der schnellen (If) und der langsamen (Is) Komponente ließen sich folgende Werte ablesen:

Tab. 9: Halbmaximale Verfügbarkeit (E0,5) von If und Is Die Werte sind der 1. Messung entnommen.

Zelle Nr. E 0,5f Slope Ampl.-Anteil If E 0,5s Slope Ampl.-Anteil Is (mV) (mV) (%) (mV) (mV) (%) 1 - - - -103,6 9,8 100,0 2 -50,8 6,4 43,1 -114,5 7,3 56,9 3 -53,8 7,8 30,2 -112,7 7,3 69,8 4 - - - -109,2 7,2 100,0 5 -38,0 3,6 19,6 -98,4 7,5 80,4 6 -33,7 4,9 28,9 -94,9 10,9 71,1 7 - - - -91,7 11,7 100,0 8 - - - -99,5 15,2 100,0 9 -49,8 11,6 28,7 -106,8 7,4 71,3 10 - - - -112,6 6,6 100,0 11 - - - -94,8 12,4 100,0 Mittelwert -45,2 6,9 30,1 -103,5 9,4 86,3 SD 8,8 3,1 8,4 8,6 2,8 16,6 4 Ergebnisse 38

Abb. 16: Anteile der langsamen Komponente (Is) unter verschiedenen Messbedingungen

A: Ampl.-Anteil Is in der ersten Messsung (schwarz), der zweiten, direkt darauffolgenden Messung (rot) und der dritten Messung (grün) nach einer Wartezeit von 1 (n = 6), 3 (n = 8) und 10 (n = 5) min bei 0 mV. Werte in Prozent der Gesamtstromamplitude.

B: Ampl.-Anteil Is in der dritten Messung (grüne Balken) bei Haltepotentialen von 0, und -30 mV, bei Wartezeiten von 1, 3 und 10 min im Vergleich mit dem Ampl.-Anteil Is in der ersten Messung (schwarze Balken). Werte in Prozent der Gesamtstromamplitude. 4 Ergebnisse 39

In den Diagrammen der Abb. 16 ist der Anteil der langsamen Komponente der Deaktivierung am Gesamtstrom als Balken mit Standardfehler (S.E.M.) dargestellt. In der zweiten Messung lässt sich eine signifikante (vergl. Kapitel 3.7) Abnahme des langsamen Anteils Is ablesen (p

< 0,001). Im dritten Protokolldurchlauf stellt sich die Wiederzunahme des Is dar. Nach Wartezeiten von 3 und 10 Minuten nahm der Anteil der langsamen Komponente signifikant (p < 0,01) zu, war aber untereinander nicht signifikant verschieden (p = 0,18). Eine Minute hingegen hatte nicht ausgereicht, um bei einem Potential von 0 mV ein Wiederkehren der langsamen Komponente zu bewirken (p = 0,69). Auch bei einem Haltepotential von –30 mV verschob sich das Verhältnis der erg-Strom-Komponenten nach 3 und 10 Minuten wieder signifikant zu Gunsten des langsamen Anteils (p < 0,05).

Abb. 17: Prozentualer Stromanteil der langsamen Komponente (Is) in der 3. Messung Vergleich des „wiedergekehrten“ Anteils der langsamen Komponente, nach 1, 3 und 10 min bei Potentialen von 0, -30, und –50 mV. Eine Wartezeit von 1 min war bei keinem angelegten Potential ausreichend, um eine Zunahme der langsamen Stromkomponente zu bewirken. Bei einem Haltepotential von –50 mV lässt sich auch nach 3 und 10 min kein Wiederkehren des Is auslösen. Bei Potentialen von –30 und 0 mV lässt sich aber bereits nach 3 min eine deutliche Zunahme der langsamen Komponente feststellen. 4 Ergebnisse 40

Im Gegensatz zu den Experimenten mit Potentialen von 0 und –30 mV konnte in Messungen mit einem Haltepotential von –50 mV nach 3 (n = 5) und 10 (n = 6) min keine signifikante Zunahme der langsamen Komponente mehr verzeichnet werden (Abb. 17). In den Messungen mit einer Wartezeit von 1 min (n = 4) konnte, wie bereits bei den Potentialen 0 und –30 mV beschrieben, ebenfalls keine Zunahme der langsamen Stromkomponente festgestellt werden.

Um eine eventuelle K+-Abhängigkeit der Kinetik feststellen zu können, wurden Experimente mit zwei direkt aufeinanderfolgenden Ableitungen in isotonischer KCl-Lösung wiederholt

(n = 7; E0,5s = -108,3 ± 5,0 mV; E0,5f = -51,9 ± 5,3 mV). Die Zellen verhielten sich wie in den Versuchen, die in 40 mmol/l K+-Lösung durchgeführt worden waren. Auch in 140 mmol/l KCl-Lösung dominierte die zusätzliche langsame Komponente der Deaktivierung in der ersten Messung (Ampl.-Anteil Is = 93,2 ± 9,5%) und nahm in der Folgenden ab (Ampl.-Anteil

Is = 52,3 ± 13,1%) (Daten nicht gezeigt).

4.1.2 Heterologe Expression von erg-Kanälen

Falls nun zelleigene Faktoren ursächlich an der Entwicklung der langsamen Komponente beteiligt wären, sollte es möglich sein, nach Überexpression (Abb. 18) von erg-Untereinheiten auch einen Teil dieser Kanäle kinetisch zu verändern. Hierzu wurde cDNA von erg1, erg1b, erg2 und erg3 verwendet und den MMQ-Zellen injiziert. Zum Vergleich wurde die Überexpression in GH3B6- und CHO-Zellen wiederholt. Zur Detektion der injizierten Zellen enthielt die Injektionslösung EGFP (0,01 µg/µl). 4 Ergebnisse 41

Abb. 18: Überexpression von erg-Kanälen in MMQ-Zellen A: Photographie: Links: mehrere MMQ-Zellen unter Hellfeldbelichtung auf einem CellocateR. Rechts: Unter Fluoreszenzlichtanregung lässt sich eine mit cDNA von erg1 und EGFP injizierte Zelle erkennen. B: MMQ-Zellmodell: Obere Hälfte: Modell A mit Modulation endogener sowie überexprimierter erg-Kanäle durch spezifische Faktoren Untere Hälfte: Modell B mit hypothetischen, langsamen erg-ähnlichen Kanaluntereinheiten 4 Ergebnisse 42

Es konnte gezeigt werden, dass die Deaktivierung in MMQ-Zellen auch nach Überexpression von erg1 eine zusätzliche langsame Komponente aufwies (Abb. 19; Tab. 10). In GH3B6- Zellen war die Deaktivierung in der Mehrzahl der Fälle rein schnell (Abb. 19), in einer von sieben Messungen ließ sich eine kleine langsame Komponente auswerten (Tab. 10). In CHO- Zellen war eine langsame Deaktivierungskomponente nach Überexpression von erg1 in den meisten Versuchen nachzuweisen (Abb. 20; Tab. 10). Die Überexpression von erg1 in CHO-

Zellen wurde ein Jahr nach den Versuchen mit MMQ- und GH3B6-Zellen als Kontrolle nachgeholt. Dabei wurden Zellen der Passage 31 und 32 verwendet.

Abb. 19: Ströme nach Überexpression von erg1 in GH3B6- und MMQ –Zellen Ströme in 40 K+-Lösung, erhalten mit dem angegebenen Protokoll. Erg-Strom in einer

GH3B6-Zelle mit schneller Deaktivierung. In MMQ-Zellen tritt eine zusätzliche langsame Deaktivierung auf. Die Nulllinie ist gestrichelt dargestellt. Die Stromspur bei –100 mV ist jeweils rot hervorgehoben. 4 Ergebnisse 43

Abb. 20: Verfügbarkeitskurven nach Überexpression von erg1 (A), erg1b (B), erg2 (C) und erg3 (D) in MMQ- (grün), GH3B6- (orange) und CHO- (blau) Zellen A: erg1 mit langsamer Komponente in MMQ-Zellen und CHO-Zellen.

B: erg1b mit Is in den meisten MMQ-Zellen und einigen CHO-Zellen. C: erg2 mit kleiner langsamer Komponente in MMQ-Zellen und rein schneller

Deaktivierungskinetik in CHO- und GH3B6-Zellen.

D: erg3 mit sehr großem langsamen Anteil in MMQ-Zellen. Der Is tritt in geringerem Ausmaß auch in einigen CHO- und GH3B6-Zellen auf. Alle Messungen wurden in 40 K+-Lösung mit dem abgebildeten Protokoll bei einem Haltepotential von –20 mV erhalten. 4 Ergebnisse 44

Entsprechende Versuche wurden in den drei Zelllinien auch für erg2 durchgeführt. MMQ-

Zellen zeigten eine zusätzliche langsame Deaktivierungskomponente, GH3B6- und CHO- Zellen nicht (Abb. 20; Tab. 10). Bei Überexpression von erg3 konnte die langsame Komponente in allen MMQ-Zellen nachgewiesen werden. Der vergleichsweise schnell deaktivierende erg3-Kanal (vergl. Abb. 36A) zeigte auch in CHO- und GH3B6-Zellen eine zusätzliche langsame Komponente, die aber wesentlich weniger ausgeprägt war als in MMQ- Zellen (Abb. 20). Um die These der modulierenden Faktoren weiter zu verfolgen und eventuell die Interaktionsstelle der Faktoren auf dem Protein näher zu lokalisieren, wurde cDNA von erg1b, einer Splicevariante des erg1 mit verkürztem N-Terminus (Kapitel 2.3.1, Abb. 8) in den drei Zelllinien überexprimiert. Auch nach Überexpression dieses Kanals konnte das Auftreten der langsamen Komponente der Deaktivierung in den MMQ-Zellen beobachtet werden (Abb. 20). In GH3B6-Zellen trat diese zusätzliche Komponente nicht auf. In der CHO- Zelllinie zeigte erg1b vereinzelt einen geringen langsamen Anteil.

Tab. 10: E0,5-Werte für If und Is für alle überexprimierten erg-Kanäle in MMQ-, GH3B6- und CHO-Zellen erg1 erg2 erg3 erg1b

MMQ E 0,5f -66,8 ± 2,3 78,3 ± 2,4 -65,4 ± 10,4 -29,4 ± 7,2 (mV) (n=8) (n=9) (n=4) (n=9)

E 0,5s -111,6 ± 0,9 -126,2 ± 2,8 -93,0 ± 1,5 -77,2 ± 2,3 (mV) (n=6) (n=5) (n=12) (n=6)

GH3B6 E 0,5f -60,4 ± 2 -69,8 ± 2,3 -50,7 ± 1,5 -21,9 ± 1,9 (mV) (n=7) (n=10) (n=11) (n=6)

E 0,5s -103,0 -104,6 ± 2,1 (mV) (n=1) (n=8)

CHO E 0,5f -75,9 ± 1,1 -75,2 ± 5,4 -60,6 ± 2,3 -27,0 ± 1,7 (mV) (n=5) (n=8) (n=9) (n=19)

E 0,5s -122,3 ± 0,5 -106,6 ± 3,0 -99,1 ± 2,4 (mV) (n=4) (n=6) (n=4) 4 Ergebnisse 45

Um abzuschätzen, ob der Anteil der langsamen Komponente am Gesamtstrom nach Überexpression in MMQ-Zellen allein durch den bereits endogen vorhandenen Anteil repräsentiert wird, wurden die Amplituden des langsamen Stromanteils in unbehandelten MMQ-Zellen mit denen nach Überexpression verglichen. Aus Abb. 21 geht hervor, dass der „langsame“ Anteil der Stromamplitude bei allen Zellen mit überexprimierten Kanälen signifikant größer war als der ursprüngliche (p < 0,01).

Abb. 21: Stromamplitude der langsamen Komponente (Is) in nativen Zellen und nach Überexpression verschiedener erg-Kanäle

A: absolute Stromamplituden des Is in nativen MMQ-Zellen und nach Überexpression von erg1, erg1b, erg2 und erg3 als Balkendiagramm mit Standardfehler (S.E.M.). B: Gesamtstromamplitude nach Überexpression von erg1b verglichen mit dem endogenen erg-Strom einer MMQ-Zelle. Messungen in 40 K+-Lösung, erhalten mit dem angegebenen Protokoll. Zur Veranschaulichung sind nur die Ströme bei –140 mV, -120 mV, -100 mV, -60 mV, -20 mV, 20 mV und 60 mV dargestellt.

Dass die langsame Deaktivierung nach Überexpression nicht nur durch die native langsame Komponente repräsentiert wird, wird in Abb. 22 bestätigt. Bei der Auswertung der Tailströme war zu erkennen, dass sich die Spannungsabhängigkeit der Verfügbarkeit der langsamen Komponente in Abhängigkeit von den überexprimierten erg-Kanälen verschob (Abb. 22; Tab. 10). 4 Ergebnisse 46

Abb. 22: E0,5-Werte für Is und If „wandern“ mit dem überexprimierten Kanal

Die Differenz der E0,5f- und E0,5s-Werte sind als Balkendiagramm mit Standardabfehler in nativen MMQ-Zellen und nach Überexpression von erg1, erg1b, erg2 und erg3 dargestellt. Die Spannungsabhängigkeit der langsamen Komponente (unterer Abschnitt der Balken) verschiebt sich mit Überexpression der verschiedenen erg-Kanäle.

Bei allen überexprimierten Kanälen wurde im Anschluss an die erste Messung direkt eine zweite Ableitung aufgezeichnet, bei der sich die langsame Komponente ähnlich verhielt wie in den nativen Zellen. Auch hier ging ihr Anteil an der Gesamtamplitude nach den hyperpolarisierenden Pulsen in der zweiten Messung in den meisten Fällen deutlich zurück (Daten nicht gezeigt). Da ein fehlender N-Terminus nicht zum Verlust der langsamen Deaktivierungskomponente führte, sollte, Zellmodell A folgend, die Interaktionsstelle der Faktoren weiter eingeschränkt werden. Zu diesem Zweck wurden zwei Deletionsmutanten des HERG (ΗERG-∆2−373 und HERG−∆866-1159, S631A) (Kapitel 2.3.1; Abb. 8) in MMQ-Zellen eingesetzt. Nach Überexpression der Deletionsmutante HERG-∆2-373, der nahezu der gesamte N- Terminus fehlt (vergl. Kapitel 3.3; Abb. 8), ließ sich in MMQ-Zellen anhand des Tailstroms eine langsame Komponente der Deaktivierung in zwei von sechs Zellen auswerten (E0,5f = -

27,2 ± 6,8 mV; E0,5s = -85,6 ± 9,0 mV). Nach Injektion des HERG-∆866-1159, S631A, dem der distale Teil des C-Terminus fehlt (vergl. Kapitel 3.3; Abb. 8), traten beim Messen Ströme mit sehr unterschiedlicher Kinetik der Deaktivierung auf (Abb. 23). Es gab Zellen mit fast ausschließlich langsamer Deaktivierung, Zellen die rein schnell deaktivierten und Messungen 4 Ergebnisse 47

in der beide Anteile der Deaktivierung vorkamen (n=6; E0,5f= -61,5 ± 2,9 mV; E0,5s= -122,5 ± 5,8 mV). Aufgrund der Diversität der Zellen war eine Mittelung der Werte nicht möglich. Um ein „Verschwinden“ der langsamen Komponente zu provozieren, wurde hier ebenfalls, im direkten Anschluss an die erste Messung eine zweite durchgeführt. Wie in allen bisherigen Versuchen wechselten die Anteile der Komponenten am Gesamtstrom zwischen den beiden Ableitungen (Daten nicht gezeigt). Die Ausbildung und die „Umwandlung“ der zusätzlichen, langsamen Deaktivierungskomponente bei dieser Deletionsmutante sprechen gegen eine Interaktion der putativen, akzessorischen Faktoren am äußeren C-Terminus des Proteins.

Abb. 23: Verfügbarkeitskurven nach Überexpression von HERG-∆866-1159, S631A in einzelnen MMQ-Zellen Normierte Stromamplituden aufgetragen gegen die Vorpulsspannung. Ströme aus sechs Zellen mit unterschiedlicher Deaktivierungskinetik.

4.1.3 Unterdrückung endogener erg-Kanäle mit silencerRNA

Der Idee der Modulation durch Faktoren weiter folgend, sollte durch Behandlung der MMQ- Zellen mit silencerRNA (vergl. Kapitel 3.2.1) gegen erg1 und erg2 die Aufgabe dieser endogen vorhandenen Kanäle bei der Entstehung der langsamen Komponente der Deaktivierung geklärt werden. Eingesetzt wurde zunächst siRNA gegen erg1. Die Messungen 4 Ergebnisse 48

erfolgten in 140 K+-Lösung, um größere Amplituden der endogenen erg-Ströme zu erhalten und einen Effekt der siRNA somit besser darstellen zu können. Zunächst sollte mit dem verwendeten Protokoll die Abnahme des erg-Stroms erkennbar sein und gleichzeitig, durch die Aufzeichnung des A-Stroms, eine generelle Beeinträchtigung der Zellen durch die Behandlung mit der silencer RNA ausgeschlossen werden (Abb. 24). Zusätzlich zur siRNA wurde zur Wiedererkennung der injizierten Zellen EGFP mit injiziert. Um Injektionsstress als Ursache einer Stromreduktion auszuschließen, wurden zur Kontrolle zeitgleich Zellen nur mit EGFP behandelt. Das Messen der mit siRNA behandelten Zellen und der Kontrollzellen fand am selben Tag und im gleichen zeitlichen Abstand zur Injektion statt. Auf den Einsatz von E-4031 wurde zunächst verzichtet. Um erfolgreiche Experimente zu erhalten, mussten verschiedene Promotoren getestet und der zeitliche Abstand von Injektion und Ableitung variiert werden. Mit dem Promotor U6 (Ambion, USA) und Vektoren, die erg1 an nur einem Nukleotidsequenzstrang greifen (vergl. Kapitel 3.2.1), konnte in keinem zeitlichen Rahmen (6, 24, und 48 Stunden) eine signifikante Reduktion des erg-Stroms erzielt werden. Mit dem Promotor H1 (Ambion, USA) und der Bindung an zwei Nukleotidstellen des erg1 konnte 24 Stunden nach der Injektion eine Reduktion des nativen erg-Stroms um etwa 50% erreicht werden (Abb. 24). Ausgewertet wurden jeweils die maximalen Stromamplituden der erg- und A-Ströme bei –120 mV. Bei den mit siRNA behandelten Zellen konnte eine im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikante (p = 0,007) Abnahme der Stromdichte der erg-Kanäle verzeichnet werden. Für den A-Strom bestanden zwischen den beiden Zellgruppen keine signifikanten Unterschiede der Stromdichten. Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden war die erg-Stromdichte der mit siRNA behandelten Zellen (n = 7) nicht signifikant verschieden von der erg-Stromdichte 24 Stunden nach Injektion der siRNA. Nach erfolgreicher Reduktion des nativen erg1-Stroms sollte nun der übrige erg-Strom genauer untersucht werden. Mit einem Pulsprotokoll, das in der Arbeit bereits zur Beschreibung der nativen und überexprimierten erg-Ströme verwendet wurde, wurde die Deaktivierungskinetik des E-4031-sensitiven Reststroms untersucht (Abb. 25). Der um 60,2% reduzierte erg-Strom verhielt sich in den Messungen wie der endogene Strom. Auch hier ließ sich die zusammengesetzte Deaktivierung feststellen. Der überwiegende Anteil der langsamen Komponente zu Beginn der Versuche ging, wie in den nativen Zellen, in der unmittelbar darauffolgenden Messung zurück (Abb. 26). 4 Ergebnisse 49

Mit siRNA gegen erg2 konnte mit keinem der Promotoren nach 24 Stunden eine signifikante Reduktion des nativen erg-Stroms erzielt werden (Daten nicht gezeigt). In den mit siRNA gegen erg2 behandelten Zellen (n = 14) war die Stromdichte für den erg-Strom mit 26,9 ± 3,7 pA/pF nicht signifikant verschieden (p = 0,79) von der erg-Stromdichte der Kontrollzellen (n = 15; Stromdichte: 25,8 ± 2,3 pA/pF).

Abb. 24: erg-Stromreduktion nach Behandlung mit siRNA Effekt der siRNA auf den erg-Strom ohne Beeinflussung des A-Stroms. Stromkurven nach Behandlung mit siRNA im Vergleich mit Stromkurven nach Injektion von EGFP. Messungen in iso-KCl-Lösung, erhalten mit dem angegebenen Protokoll. Ausgewertet wurden jeweils die maximalen Amplituden der erg- und A-Ströme während bzw. nach dem Puls an –120 mV. Die Nulllinie ist als gestrichelte Linie dargestellt. Balkendiagramm mit Angabe der Stromdichten für erg-Strom und A-Strom. Signifikante Abnahme der erg-Stromdichte bei den Zellen nach Behandlung mit siRNA gegen erg1. 4 Ergebnisse 50

Abb. 25: Reduktion des E-4031-sensitiven Stroms nach Behandlung mit siRNA A: E-4031-sensitiver Strom nach Injektion von siRNA gegen erg1 in der ersten und zweiten Messung. Kontrollstrom nach Injektion von EGFP. Neben der Reduktion der Amplitude, bleiben unter siRNA die kinetischen Eigenschaften des erg-Stroms erhalten: zusätzliche, langsame Komponente der Deaktivierung in der ersten Messung und schnellere Deaktivierung in der zweiten Messung. Messungen in iso KCl-Lösung, mit dem angegebenen Protokoll. B: Verfügbarkeitskurven des in A aufgezeigten Stroms mit siRNA (offene Symbole) und des Kontrollstroms (geschlossene Symbole) in der ersten (schwarz) und der zweiten Messung (rot). Abnahme der absoluten Stromamplitude unter siRNA. Die Summe aus zwei Boltzmannfunktionen an die Daten angepasst, erhält man eine bisigmoidale Kurve, bzw. im Fall des Stroms unter siRNA in der ersten Messung mit einer einfachen Boltzmannfunktion eine sigmoidale Kurve. 4 Ergebnisse 51

Abb. 26: Verhalten des endogenen Stroms in MMQ-Zellen nach Unterdrückung von erg1

Links: absolute Amplitude des E-4031-sensitiven Stroms (Is + If) in Zellen ohne ( n= 8) und mit (n = 6) Behandlung mit siRNA.

In der Mitte: Amplitude der langsamen Stromkomponente (Is) in pA in der 1. durchgeführten Messung. Vergleich der mit siRNA behandelten Zellen mit den EGFP-injizierten Kontrollzellen.

Rechts: Amplitude der langsamen Stromkomponente (Is) in pA in der zweiten, direkt darauffolgenden Messung. Vergleich der mit siRNA behandelten Zellen mit den EGFP- injizierten Kontrollzellen.

Die Wirkung der siRNA konnte in unserem Labor auch in WesternBlot-Analysen nachvollzogen werden (Abb. 27A). Die für erg1 mit einem spezifischen Antikörper (Anti-erg1, Chemicon) im Bereich 135-155 kD erhaltene Bande ist bei den mit siRNA gegen diesen Kanal behandelten Zellen nach 24 Stunden optisch deutlich schwächer. Im Zytoplasma war dieser Effekt nicht sichtbar, was eventuell auf den geringen Umfang an Material zurückzuführen ist (Daten nicht gezeigt). Als Kontrollen wurden Membran- und Zytoplasmapräparationen von nativen und von mit siRNA gegen erg2 und erg3 transfizierten MMQ-Zellen aufgetragen. 4 Ergebnisse 52

Abb. 27: Expression von erg1 und erg2 in MMQ-Zellen in WesternBlot-Analysen A: Nachweis von erg1 in MMQ-Zellen mit Anti-erg1 (Chemicon). Mit siRNA gegen erg1 behandelte MMQ-Zellen zeigen im Bereich 135-155 kD eine schwächere Bande. In den Negativkontrollen mit siRNA gegen erg2 und erg3 ist keine Veränderung der Expression von erg1 zu erkennen. Die höhere abgebildete Bande stellt die glykosylierte Form der Proteine dar. B: Nachweis von erg2 in Membran und Zytoplasma von MMQ-Zellen mit in unserem Labor generiertem Antikörper gegen erg2. In der Membran lässt sich erg2 nicht nachweisen. In der Zytoplasmapräparation findet sich auf Höhe von 96 kD (Pfeil) die unglykosylierte Form und darüber die glykosylierte Form der erg2-Proteine. 4 Ergebnisse 53

Auch auf die mangelnde Wirkung der gegen erg2 gerichteten siRNA konnten die WesternBlot-Analysen hinweisen. In den Membran- und Zytoplasmapräparationen ließ sich bei den mit siRNA behandelten Zellen keine Veränderung in den für erg2 typischen Banden feststellen. Erg2 scheint größtenteils im Zytoplasma vorzuliegen und weniger in der Membran (Abb. 27B). Als Antikörper wurde hierbei Anti-erg2 eingesetzt, der in unserem Labor aus dem Kaninchen generiert wurde. Die Spezifität des Antikörpers wurde im Vorfeld an CHO- Zellen überprüft. Zellen nach Überexpression von erg2-Kanälen wurden hierbei mit unbehandelten CHO-Zellen verglichen (Daten nicht gezeigt). Blot-Analysen mit siRNA gegen erg1 und erg2 nach Inkubationszeiten von 48 und 72 Stunden zeigten die gleichen Ergebnisse wie nach 24 Stunden.

. 4 Ergebnisse 54

4.2 Pharmakologische Untersuchung der erg-Kanäle

Aufgrund der stetig zunehmenden Zahl erg-blockierender Arzneimittel (vergl. Kapitel 9, Tab. 2) und deren klinischer Bedeutung wurden in dieser Arbeit auch pharmakologische Untersuchungen durchgeführt. Überprüft wurde in diesem Zusammenhang die Wirkung von Ciprofloxacin und Enrofloxacin auf erg-Kanäle. Um eine Reduktion des erg-Stroms gut zu sehen, sind große Stromamplituden von Vorteil. Hierzu wurde cDNA von erg1 in CHO-Zellen überexprimiert. Die Messungen fanden in Ringerlösung statt. In der gleichen Lösung wurden auch die Wirkstoffpulver gelöst. Bei dem an dieser Stelle verwendeten Protokoll wurden die erg-Ströme zunächst durch einen depolarisierenden Puls auf +20 mV voll aktiviert, um anschließend bei einem Potential von –120 mV die Erholung von der Inaktivierung und die Deaktivierung aufzeichnen zu können.

4.2.1 Wirkung von Ciprofloxacin

Nach Zugabe von Ciprofloxacin in Endkonzentrationen von 1,5 mmol/l bzw. 3 mmol/l konnte eine Reduktion des erg-Stroms festgestellt werden (Abb. 28A). Das Lösen des Wirkstoffes in der extrazellulären Messlösung bewirkte allerdings eine pH- Wert Verschiebung von 0,4 bzw. 0,8 in den sauren Bereich. Der Versuch, die Lösung mit 1M NaOH wieder auf einen pH-Wert von 7,35 einzustellen, wurde durch den Ausfall des weißen Arzneipulvers verhindert. Da kinetische Veränderungen des erg-Stroms infolge einer Erhöhung der extrazellulären H+-Konzentration bereits bekannt sind (Jo et al., 1999), wurden Kontrollversuche durchgeführt, bei denen reine Ringerlösung mit einem entsprechend sauren pH-Wert zugegeben wurde. Auf diese Weise konnte eine ähnliche Stromreduktion wie zuvor mit dem Wirkstoff erreicht werden (Daten nicht gezeigt). In den folgenden Versuchen wurden die Messungen deshalb in Lösung mit bereits saurem pH-Wert (6,93 bzw. 6,54) begonnen. Bei Zugabe des Wirkstoffes (1,5 mmol/l bzw. 3 mmol/l Ciprofloxacin) konnte nun dessen Wirkung ohne eine zusätzliche pH-Wert-Veränderung überprüft werden. Eine Stromreduktion ließ sich so nicht mehr feststellen (Abb. 28B). Eine erg-blockierende Wirkung von Ciprofloxacin konnte somit, wie bereits von Bischoff et al. (2000) beschrieben, nicht nachgewiesen werden. 4 Ergebnisse 55

Abb. 28: Effekt von Ciprofloxacin auf erg1-Ströme in CHO-Zellen Ströme in Ringerlösung nach Überexpression von erg1 in CHO-Zellen (schwarz). A: Reduktion des erg1-Stroms durch 1,5 mmol/l (oben) und 3 mmol/l (unten) Ciprofloxacin (rot). B: keine Stromreduktion bei Messungen in Lösung mit korrigiertem pH-Wert. Vor Zugabe von 1,5 mmol/l Ciprofloxacin wurde der pH-Wert der Ringerlösung mit 1 mol/l NaOH auf 6,9 eingestellt (oben), bei Einsatz von 3 mmol/l des Wirkstoffes auf 6,55 (unten). Die Nulllinie ist jeweils als gestrichelte Linie dargestellt.

4.2.2 Wirkung von Enrofloxacin

Enrofloxacin, das in der Veterinärmedizin als Antibiotikum erfolgreich eingesetzt wird, verursachte nach Lösen in Ringer eine ähnliche Ansäuerung wie sie bereits bei Ciprofloxacin beobachtet worden war. Allerdings ließ sich die Lösung mit 1 mol/l NaOH auf ihren ursprünglichen pH-Wert einstellen, ohne dass es zum Ausflocken des Wirkstoffes kam. Die Experimente konnten deshalb in Standard-Ringerlösung mit einem pH-Wert von 7,35 durchgeführt werden. Mit Enrofloxacin konnte auf diese Weise eine dosisabhängige Reduktion des erg-Stroms beobachtet werden (Abb. 29). Die blockierende Wirkung ließ sich sowohl am Ein- wie am Auswärtsstrom nachvollziehen (Abb. 29A). Bei Auswaschen des Wirkstoffes kam es in allen Versuchen zu einer Wiederzunahme des Stroms (Abb. 29B). 4 Ergebnisse 56

Abb. 29: Effekt von Enrofloxacin auf erg1-Ströme in CHO-Zellen E-4031-sensitive Ströme in Ringerlösung nach Überexpression von erg1 in CHO-Zellen. A: erg1-Ströme vor (schwarz) und nach (rot) Zugabe von 0,5 mmol/l (oben links), 1,5 mmol/l (oben rechts), 3 mmol/l (unten links) und 5 mmol/l (unten rechts) Enrofloxacin. B: Reversibilität der Wirkung von Enrofloxacin. Nach Auswaschen des Wirkstoffes mit Ringerlösung nahm die Stromamplitude in allen Versuchen wieder zu (grau). 4 Ergebnisse 57

Abb. 30: Wirkungseintritt nach Ein- und Auswaschen von 3 mmol/l Enrofloxacin Effekte auf den Aus- und Einwärtsstrom von erg1 in CHO-Zellen, nach Zugabe von 3 mmol/l Enrofloxacin, nach Auswaschen mit Ringerlösung und vollständigem Block durch E-4031. A: Erg1-Stromamplitude einer CHO-Zelle in nA im Zeitverlauf der Messung. Obere Hälfte: Amplitude des stationären Auswärtsstroms bei –20 mV, gemessen vor dem Puls auf –120 mV. Untere Hälfte: Amplitude des maximalen Einwärtsstroms bei –120 mV

B: halbmaximale Zeit (t1/2) in s bis zum maximalen Block mit 3 mmol/l Enrofloxacin und t1/2 bis zum maximalen Wirkungseintritt bei Auswaschen mit Ringer.

Der halbmaximale Block des erg-Stroms nach Zugabe von 3 mmol/l Enrofloxacin war für

Ein- und Auswärtsstrom nach ca. 25 s erreicht (Abb. 30; t1/2 für den Einwärtsstrom = 25,3 ±

6,1 s; t1/2 für den Auswärtsstrom = 26,9 ± 5,5 s; n = 5). Nach Auswaschen mit Ringer stellte sich der rückläufige Effekt bis zum Erreichen der maximalen Stromamplitude für beide 4 Ergebnisse 58

Ströme signifikant langsamer ein (vergl. Kapitel 7.3). Für den Auswärtsstrom lag t1/2 bei 44,25 ± 3,42 s (p < 0,03) und für den Einwärtsstrom bei 53,8 ± 3,1 s (p < 0,003) (Abb. 30). Zur genauen Bestimmung der erg-Strom-Amplitude wurde zum Ende der Messungen 10 µmol/l E-4031 appliziert. In den Experimenten deutete sich eine Spannungsabhängigkeit des Blocks an. Der Effekt auf den Auswärtsstrom schien proportional größer zu sein, als der auf den Einwärtsstrom (vergl. Abb. 29; Abb. 30). Die Auswertung der Amplituden bei –120 mV und –20 mV nach Reduktion durch 3 mmol/l Enrofloxacin bestätigte diesen Eindruck (Abb. 31).

Abb. 31: Reversibilität des Effekts von Enrofloxacin Die Stromamplituden nach 3 mmol/l Enrofloxacin bei –20 mV (Auswärtsstrom: 15,4 ± 9,0%) und -120 mV (Einwärtsstrom: 39,8 ± 8,1%) werden signifikant reduziert (vergl. Kapitel 3.7). Nach Auswaschen mit Ringer nehmen die Stromamplituden wieder signifikant zu (Auswärtsstrom: 84,3 ± 10,1%; Einwärtsstrom: 82,4 ± 2,4%). Angaben in Prozent des Kontrollstroms (erg1 in CHO-Zellen in Ringerlösung zu Beginn der Messung).

Der Auswärtsstrom wurde durch Enrofloxacin auf 15,4 ± 9,0% (p = 0,001) und der Einwärtsstrom auf 39,8 ± 8,1% (p = 0,002) des Ausgangsstroms reduziert (Abb. 31). Nach Auswaschen des Wirkstoffes konnte für beide Stromrichtungen wieder eine signifikante Amplitudenzunahme auf über 80% des Ausgangsstroms verzeichnet werden (p = 0,001 für den Auswärtststrom und p = 0,005 für den Einwärtsstrom; Abb. 31). 4 Ergebnisse 59

Abb. 32: Potentialabhängigkeit der Wirkung von Enrofloxacin A: erg1-Ströme in CHO-Zellen bei Testpulsen auf Potentiale von +60 mV bis –140 mV (in 20 mV Schritten) in Ringerlösung (schwarz) und nach Zugabe von 3 mmol/l Enrofloxacin (rot), erhalten mit dem abgebildeten Protokoll bei einem Haltepotential von –20 mV. B: auf den maximalen Auswärtsstrom normierte maximale Stromamplituden bei Potentialen von –140 mV bis +60 mV in Ringerlösung und nach Zugabe von 3 mmol/l Enrofloxacin. Offene Symbole kennzeichnen den Einwärtsstrom, geschlossene Symbole den Auswärtsstrom C: prozentualer Block bei den unterschiedlichen Potentialen. 4 Ergebnisse 60

In Abb. 32 ist die maximale erg-Stromamplitude in Ringerlösung und nach Zugabe von Enrofloxacin in einer Endkonzentration von 3 mmol/l bei verschiedenen Potentialen dargestellt. Die Daten (n = 8) wurden normiert auf den maximalen Auswärtsstrom. Das hierbei verwendete Protokoll gibt, nach einem depolarisierenden Vorpuls (+40 mV) von 2 s und Aktivierung der Kanäle, in 20 mV Schritten Potentiale von +60 mV bis –140 mV vor. Im Anschluss an die variablen Pulse erfolgte ein kurzer (10 ms) Sprung auf –120 mV, um den Anteil der zu diesem Zeitpunkt noch verfügbaren, d.h. noch nicht deaktivierten Kanäle zu bestimmen. Ein entsprechendes Protokoll wurde bereits zur Untersuchung der langsamen Komponente der Deaktivierung im ersten Teil der Arbeit verwendet. Bei der Darstellung in einem Balkendiagramm (Abb. 32C) wird deutlich, dass die blockierende Wirkung bis zu einem Potential von +20 mV zunahm. Die Hemmung des E-4031-sensitiven erg1-Stroms lag zwischen 42,0 ± 5,7% bei –140 mV und erreichte bei +20 mV mit 81,2 ± 2,2% ihr Maximum. Der reduzierende Effekt tritt deshalb beim Auswärtsstrom stärker in Erscheinung, ein direkter Zusammenhang mit der Richtung des Stroms ist nicht erkennbar. Wie bereits beschrieben (Kapitel 4.1.1), dient der Tailstrom am Ende des Protokolls als Maß für die zu diesem Zeitpunkt noch verfügbaren Kanäle. Die maximalen Amplituden gegen die Vorpulsspannung aufgetragen, wurde eine einfache Boltzmannfunktion an die normierten Datenpunkte angepasst und die in Abb. 33 dargestellten Verfügbarkeitskurven erhalten. Gezeigt sind hier die Verfügbarkeitkurven der erg1-Ströme in Ringer, nach Zugabe von 3 mmol/l Enrofloxacin und nach Auswaschen des Wirkstoffes mit Ringer. Die Werte für die halbmaximale Verfügbarkeit sind über den gesamten Messzeitraum nicht signifikant verschieden (p ≥ 0,35; n = 9). Der E0,5-Wert lag in Ringer bei -59,8 ± 2,9 mV, nach 3 mmol/l Enrofloxacin bei einem Potential von -67,7 ± 3,3 mV und nach dem Auswaschen bei -77,0 ± 2,9 mV. Neben der Stromreduktion ließ sich unter Enrofloxacin außerdem noch eine Verlangsamung der Deaktivierungskinetik beobachten (Abb. 29; Abb. 34). Ein entsprechender Effekt ist für andere Fluorochinolone bereits beschrieben (Kang et al., 2001B). Nach Auswaschen des Antibiotikums mit Ringer wurde dann neben der Zunahme des Stroms auch die Deaktivierung wieder schneller (Abb. 34). Der genaue Zeitverlauf der Erholung von der Inaktivierung und der Deaktivierung wurde im folgenden mittels Exponentialfunktionen ausgewertet. Zur Analyse der Deaktivierungskinetik war die Summe aus zwei Exponentialfunktionen notwendig. 4 Ergebnisse 61

Abb. 33: Halbmaximale Verfügbarkeit (E0,5-Werte) in Ringer, nach 3 mmol/l Enrofloxacin und nach Auswaschen mit Ringer Maximale Amplituden der Tailstöme bei –120 mV in Abhängigkeit von der Vorpulsspannung in Ringer (schwarz), nach Zugabe von 3 mmol/l Enrofloxacin (rot) und nach Auswaschen (grau). Die Stromamplituden wurden normiert auf den maximalen Ausgangsstrom (schwarz) und eine Boltzmannfunktion an die Daten angepasst. 4 Ergebnisse 62

Abb. 34: Kinetik der erg-Ströme unter 3 mmol/l Enrofloxacin Oben: E-4031-sensitive erg1-Ströme bei Potentialen von +60 bis –140 mV (in 20 mV Schritten) in Ringerlösung (schwarz), nach Zugabe von 3 mmol/l Enrofloxacin (rot) und nach Auswaschen mit Ringer (grau). Mitte: Stromspuren bei –140 mV in einheitlicher Größe. Unter Enrofloxacin wurde die Deaktivierung langsamer (rot). Der Effekt bildete sich nach Auswaschen mit Ringer wieder zurück (grau). Die Nulllinie ist jeweils als gestrichelte Linie dargestellt. Unten: Auswertung des Zeitverlaufs der Erholung von der Inaktivierung und der zweiphasigen Deaktivierung des E-4031-sensitiven erg1-Stroms in CHO-Zellen bei –140 mV.

Zeitkonstanten (in ms) der Erholung von der Inaktivierung (τrec) und der Deaktivierung (τdeact,f

τ deact,s) in Ringer (schwarz), nach Zugabe von 3 mmol/l Enrofloxacin (rot) und nach Auswaschen mit Ringer (grau). Unter Enrofloxacin ist sowohl die Erholung aus der Inaktivierung signifikant langsamer (p = 0,01) als auch beide Phasen der Deaktivierung (p < 0,001). 4 Ergebnisse 63

Die so für die Zeitkonstanten der Erholung von der Inaktivierung (τrec) und der Deaktivierung

(τdeact,f, τdeact,s) erhaltenen Werte sind als Balkendiagramm (Abb. 34 unten) für den

Stromverlauf in Ringer (τrec= 2,7 ± 0,01 ms; τdeact,f,= 13,4 ± 1,0 ms; τdeact,s = 70,7 ± 3,5 ms), unter 3 mmol/l Enrofloxacin (τrec= 3,6 ± 0,3 ms; τdeact,f,= 24,7 ± 1,1 ms; τdeact,s = 104,4 ± 7,1 ms) und nach Auswaschen (τrec= 2,9 ± 0,2 ms; τdeact,f,= 15,6 ± 1,2 ms; τdeact,s = 67,6 ± 5,1 ms) dargestellt. Für die Erholung von der Inaktivierung und beide Anteile der Deaktivierung war unter Enrofloxacin eine signifikante (prec = 0,01; pdeact < 0,001; vergl. Kapitel 3.7) Zunahme der Zeitdauer zu verzeichnen, die nach Auswaschen des Wirkstoffes wieder rückläufig war. Die Zeitkonstanten vor Ein- und nach Auswaschen des Antibiotikums waren nicht signifikant verschieden (prec = 0,27; pdeact,f = 0,14; pdeact,s = 0,55). Anhand der eingesetzten Konzentrationen von Enrofloxacin konnten für Ein- und Auswärtsstrom sigmoidale Dosis-Wirkungs-Kurven erstellt werden (Abb. 35). Die unterschiedlich starke Hemmung von Ein- (bei –120 mV) und Auswärtstrom (bei –20 mV) wurde dabei erneut gezeigt. Mit 0,5 mmol/l Enrofloxacin bleiben 78 ± 8% des Auswärtsstroms und 80 ± 3% des Einwärtstroms bestehen. 1,5 mmol/l des Antibiotikums blockieren den Auswärtsstrom auf 40 ± 3% und den Einwärtstrom auf 61 ± 3% des Ausgangsstroms. 3 mmol/l Enrofloxacin reduzierte den Strom bei –20 mV auf 15 ± 9% und den Strom bei –120 mV auf 40 ± 8%. Mit 5 mmol/l des Wirkstoffes konnte ein Stromabnahme auf 10 ± 2% für den Auswärtsstrom und 30 ± 3% für den Einwärtsstrom verursacht werden. Um die Frage der klinischen Relevanz der blockierenden Wirkung von Enrofloxacin zu überprüfen, wurde es in einer weiteren Versuchsreihe in einer Konzentration von 0,014 mmol/l eingesetzt was einer reellen therapeutischen Dosierung von 5mg/kg entspricht. Mit dieser Konzentration war kein hemmender Effekt auf den funktionell entscheidenden Auswärtsstrom festzustellen (103 ± 3%, n = 5). Zusätzlich wurde eine Hillfunktion an die Werte für Aus- und Einwärtsstrom angepasst (Daten nicht gezeigt). Der Hillkoeffizient, der die Steilheit der Kurve der Bindung eines Inhibitors (Enrofloxacin) angibt, lag für den Auswärtsstrom bei 1,6 und für den Einwärtsstrom bei 1,1. Bei einem Hillkoeffizienten > 1 spricht man von dem Phänomen der positiven Kooperativität. Die Bindung eines Ligandenmoleküls erhöht dabei die Affinität des Proteins für weitere Ligandenmoleküle. Mit der Hill-Gleichung wurden außerdem IC50-Wert von 1,18 mmol/l für den Auswärtsstrom und 2,44 mmol/l für den Einwärtsstrom errechnet. 4 Ergebnisse 64

Abb. 35: Dosis-Wirkungs-Kurven Konzentrationsabhängiger Effekt von Enrofloxacin auf den Einwärtsstrom (○) bei –120 mV und den Auswärtsstrom (●) bei –20 mV des erg1 in CHO-Zellen. Es wurde je eine sigmoidale Funktion an die erhaltenen Werte angepasst und gegen eine logarithmische Skala aufgetragen. Angabe in Prozent des Blocks.

Nachdem die Wirkung von Enrofloxacin auf den erg1-Strom feststand, war von Interesse, ob der Wirkstoff auch in der Lage ist, andere erg-Kanäle zu blockieren. Hierzu wurde cDNA von erg2 und erg3 in CHO-Zellen exprimiert und die Ströme in Ringer und unter dem Einfluss von 3 mmol/l Enrofloxacin gemessen. Eine Reduktion der erg-Strom-Amplitude konnte sowohl für erg2 als auch für erg3 festgestellt werden (Abb. 36A). Die unterschiedliche Hemmung von Aus- und Einwärtsstrom, die hier für erg1 bei 84,6 ± 9,0% und 60,2 ± 8,1% lag, war für erg2 weniger deutlich. Der Auswärtsstrom wurde um 73,2 ± 7,6% reduziert, der Einwärtsstrom um 66,7 ± 2,8%. Auf den erg3-Strom war die hemmende Wirkung von Enrofloxacin auf beide Ströme etwas geringer. Der Auswärtsstrom wurde um 67,5 ± 8,5% verringert und der Einwärtsstrom um 51,3 ± 6,9%. Der stärkere Effekt auf den Auswärtsstrom konnte aber auch für erg2 und erg3 nachgewiesen werden (Abb. 36B). Die für erg1 beschriebene Veränderung der Deaktivierungskinetik konnte auch für erg2 (n = 3) und erg3 (n = 3) nachvollzogen werden (Daten nicht gezeigt). Bei Auswaschen des Antibiotikums mit Ringerlösung konnte die Reversibilität der Wirkung beobachtet werden. Es wurden 78-82% des Einwärtsstroms und 90-100% des Auswärtsstroms zurück erhalten (Daten nicht gezeigt). 4 Ergebnisse 65

Abb. 36: Wirkung von Enrofloxacin auf erg1, erg2, und erg3 A: erg1-, erg2- und erg3-Ströme in CHO-Zellen in Ringerlösung (schwarz) und nach Zugabe von 3 mmol/l Enrofloxacin (rot). B: Hemmung der Auswärtsströme bei –20 mV (schwarze Balken) und der Einwärtsströme bei –120 mV (weiße Balken) durch Enrofloxacin bei allen drei erg-Kanälen. Abgebildet ist der prozentuale Block des Kontrollstroms. 5 Diskussion 66

5 Diskussion

In der Arbeit wurde ausschließlich mit erg cDNA von der Ratte (r-erg) gearbeitet. Der erg1- Kanal der Ratte ähnelt dem humanen erg (h-erg) und dem caninen erg (c-erg) sehr. In der PAS-Domäne, den Transmembransegmenten S1, S3-S6 und der für die Interaktion mit Pharmaka entscheidenden Porenregion sind sie zu 100% identisch (Zehelein et al., 2001). Die in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Daten sind somit auch für diese Spezies relevant.

5.1 Beschreibung der langsamen Deaktivierung in laktotrophen und MMQ-Zellen

Ein Ziel der Arbeit war herauszufinden, ob in den MMQ-Zellen bestimmte Faktoren oder ein neues erg-ähnliches Kanalprotein für die Entstehung der langsamen Deaktivierung des E-4031 sensitiven Stroms verantwortlich sind (vergl. Kapitel 2.1; Abb. 5). Ausgegangen wurde hierbei von der Beschreibung einer langsamen Deaktivierungskomponente in laktotrophen Hypophysenzellen (Corette et al., 1996; Schäfer et al., 1999). Der dort beschriebene, unterschiedlich große Anteil der langsamen Komponente am erg-Gesamtstrom konnte in MMQ-Zellen ebenfalls bereits nachgewiesen werden (Lecchi et al., 2002; Buhk, 2004). In neueren Untersuchungen an Neuronen der Rapheregion des Rhombencephalon wurde eine zusätzliche langsame Deaktivierungskomponente des erg- Stroms in 17% der untersuchten Zellen gefunden (Hirdes et al., 2005). Zwischen MMQ- und den nativen laktotrophen Zellen ließ sich infolge der besonderen Kinetik eine Übereinstimmung in der Spannungsabhängigkeit der Verfügbarkeit finden. Diese wird in beiden Fällen mittels der Summe aus zwei Boltzmannfunktionen beschrieben, wobei die Werte für E0,5f und E0,5s bei beiden Zellarten in isotonischer Messlösung nahezu identisch waren (Schäfer et al., 1999; Buhk, 2004). Der langsame Anteil der Deaktivierung ging infolge hyperpolarisierender Pulse zurück, nahm aber nach einer Zeit bei depolarisierenden Haltepotentialen wieder zu. Diese Potentialabhängigkeit mag die bisher seltene Beschreibung der langsamen Komponente teilweise erklären. Die „Umwandlung“ erfolgte ohne relevante Veränderung der Gesamtstromamplitude (Schäfer et al., 1999). Angenommen, eine eigene Kanalpopulation wäre für die Entstehung der langsamen Komponente verantwortlich, könnte das allmähliche „Wiederkehren“ des langsamen Stromanteils durch eine ebenfalls extrem verlangsamte 5 Diskussion 67

Aktivierung der neuen Kanäle erklärt werden. Bildet man den durch das „Verschwinden“ der langsamen Komponente entstehenden Differenzstrom ab (Abb. 37), zeigt sich, dass in diesem

Fall auch die Zeitkonstanten der Erholung von der Inaktivierung des langsamen Stroms (τrec,s) und der schnellen Deaktivierung (τdeact, f) gleich sein müssten.

Abb. 37: „Umwandlung“ der langsamen Komponente Schwarze Stromspuren: endogener erg-Strom in MMQ-Zelle bei –100 mV in der ersten Messung mit langsamer Deaktivierung und in der zweiten, direkt darauffolgenden Messung mit schneller Deaktivierung bei nahezu gleicher maximaler Stromamplitude. Rot: Differenzstrom der beiden abgeleiteten Ströme. Die Nulllinie ist als gestrichelte Linie dargestellt.

Wesentlich einfacher ist die konstante Stromamplitude durch eine einzige Kanalpopulation mit wandelnden Eigenschaften zu erklären (Modell A). Modulierende Faktoren würden dann mit den aktivierten Kanälen interagieren. Da zur Aktivierung bestimmte Potentiale notwendig sind, ist eine reine Abhängigkeit der Faktoren vom Potential denkbar oder ihre Bindung geht mit Konformationsänderungen der Kanäle einher. Die von Lecchi et al. (2002) favorisierte Theorie neuer erg-ähnlicher Kanäle wird vor allem mit der unterschiedlichen pharmakologischen Reaktion der beiden Deaktivierungskomponenten begründet. Der Ca2+-Kanal Blocker Verapamil blockiert bevorzugt den schnellen Stromanteil (If) und das Skorpiontoxin ErgTx2 den langsamen (Is). Diese auf die Pharmakologie gestützte These ist in zweierlei Hinsicht kritisch zu bewerten. 5 Diskussion 68

Zunächst hängt die blockierende Wirkung von Arzneimitteln vom Zustand des Kanals ab. Verapamil blockiert die Kanäle im aktivierten Zustand (Zhang et al., 1999), wohingegen ErgTx2 bei depolarisierenden Potentialen weniger effektiv wirkt (Pardo-Lopez et al., 2002). Darüberhinaus konnte mit E-4031 und anderen spezifischen erg-Kanal-Blockern keine Unterscheidung der Komponenten erzielt werden (Schäfer et al., 1999; Lecchi et al., 2002). Die separaten Kanäle müssten sich also die strukturellen Anteile zur Bindung dieser Wirkstoffe teilen. Die unterschiedliche Reaktion auf Verapamil und ErgTx2 schließt aber das Vorkommen modulierender Faktoren nicht aus. Je nach Zustand des Kanals, mehr oder weniger aktiv, könnten diese schließlich auch von der Wirkung der Arzneimittel mehr oder weniger beeinflusst werden. Die langsame Komponente am erg-Gesamtstrom konnte in der vorliegenden Arbeit bei allen gemessenen MMQ-Zellen nachgewiesen werden. Die „Umwandlung“ zur schnelleren Deaktivierung trat, wie bereits für laktotrophe Zellen beschrieben (Schäfer et al., 1999), ohne nennenswerte Veränderung der Stromamplitude auf. Durch Überexpression verschiedener erg-Kanaluntereinheiten in MMQ-Zellen sollte die Idee der modulierenden Faktoren weiter verfolgt werden. Zum Vergleich wurden die erg-Kanäle in GH3B6 –Zellen exprimiert, die wie MMQ-Zellen als Expressionsmodell für laktotrophe Zellen eingesetzt werden, denen aber die zusätzliche langsame Komponente der Deaktivierung fehlt. Zur isolierten Darstellung der einzelnen erg-Kanäle wurde die Expression in CHO-Zellen, die über kaum endogene Kanäle verfügen, wiederholt.

5.2 Überexpression von erg-Kanälen in verschiedenen Zelllinien

Die durchgeführten Experimente zeigen, dass alle in MMQ-Zellen überexprimierten erg- Kanäle (erg1, erg1b, erg2 und erg3) in unterschiedlicher Ausprägung eine zusätzliche, langsame Komponente der Deaktivierung entwickeln können. Diese ist in GH3B6–Zellen nach Injektion von cDNA für erg1, erg1b und erg2 nicht nachzuweisen. Die Theorie der MMQ-spezifischen, erg-modulierenden Faktoren ginge mit diesen Ergebnissen konform. Gegen einen eigenen erg-ähnlichen Kanal als Verursacher der langsamen Deaktivierung spricht die Größenzunahme der Amplitude der langsamen Komponente nach Überexpression verschiedener erg-Kanäle in den MMQ-Zellen. Die Verschiebung der Spannungsabhängigkeit 5 Diskussion 69 der langsamen Komponente nach der Überexpression ist ein weiteres entscheidendes Indiz für die Modulation der erg-Kanäle durch Faktoren und gegen eine eigene Kanalpopulation. Mit dem Nachweis der langsamen Komponente in MMQ-Zellen nach Überexpression von erg1b mit eigenem, sehr kurzem N-Terminus und Überexpression von HERG-∆2-373, dem der N-Terminus fehlt, konnte eine Lokalisation der modulierenden Faktoren am N-Terminus des erg-kodierenden Proteins weitestgehend ausgeschlossen werden. Durch die Expression des HERG−∆866-1159, S631A in MMQ-Zellen konnte gezeigt werden, dass auch der distale C-Terminus nicht zur Ausbildung der langsamen Komponente notwendig ist. Theoretisch könnte auch eine Heteromultimerbildung zwischen Untereinheiten der überexprimierten erg-Kanäle und den neuen erg-ähnlichen Kanälen zur Bildung von Ionenkanälen mit den beschriebenen Eigenschaften führen. Die endogenen Kanäle müssten in diesem Fall in ausreichend großer Menge vorhanden sein, um die Überzahl der zusätzlich exprimierten Kanäle zu binden.

Denkbar ist auch, dass die gesuchten Faktoren nicht in den MMQ-, sondern in den GH3B6 – Zellen vorhanden sind und hier die Ausbildung der langsamen Komponente verhindern. Die in einzelnen GH3B6–Zellen nach Expression von erg3 auftretende langsame Komponente spricht aber gegen eine generelle Blockierung der Ausbildung der langsamen Deaktivierungskinetik in diesen Zellen.

Die Überexpression von erg1, erg1b und erg3 führte auch in einigen CHO-Zellen zum Auftreten einer zusätzlichen langsamen Komponente der Deaktivierung. Da CHO-Zellen kaum endogene Kanäle besitzen, scheint ein neues Kanalprotein, allein oder unter Bildung von Heteromultimeren mit zelleigenen Kanälen als Ursache der langsamen Komponente nicht in Frage zu kommen. Dagegen ist vorstellbar, dass die bisher nicht identifizierten Faktoren unter bestimmten Bedingungen auch in CHO-Zellen auftreten können. Dabei könnte ein Zusammenhang mit dem Auftreten der veränderten Kinetik und der Passage der Zellen bestehen. Es ist bekannt, dass häufiges Passagieren zu Änderungen der Eigenschaften der Zelllinien führen kann. Bei der hohen Inzidenz der langsamen Komponente nach Überexpression von erg1 muss außerdem der große zeitliche Abstand zu den Versuchen mit

Überexpression von erg1 in MMQ- und GH3B6–Zellen bedacht werden. An diesem Beispiel wird um so deutlicher, wie entscheidend die Durchführung aller anderen Versuche mit den Kontrollen in einem engen zeitlichen Rahmen war. 5 Diskussion 70

Gegenüber den Beschreibungen bei Shi et al., 1997; Schledermann et al., 2001; Wimmers et al., 2002 und Sturm et al., 2005 mit 4 s langen Pulsen, war die Spannungsabhängigkeit des schnellen Anteils der Deaktivierung nach Überexpression von erg1 in CHO-Zellen wesentlich negativer. Die Verschiebung der Spannungsabhängigkeit kann durch die, in der vorliegenden Arbeit 1,5 s kurzen Pulse verursacht worden sein.

5.3 Unterdrückung endogener erg-Kanäle in MMQ-Zellen

Von Interesse war nun die differenzierte Betrachtung der endogenen erg-Kanäle in MMQ- Zellen. Hierzu sollte ihre Expression mittels spezifischer siRNAs unterdrückt und das Verhalten des Reststroms näher untersucht werden. Zur Unterdrückung der endogenen erg-Kanäle wurde ein siRNA-Vektorsystem eingesetzt, mit dem Cotella et al., (2005) eine Reduktion des Herz-Kaliumstroms Kv4.3 (Ito) von 80% erreichen konnten. Mit silencer RNA gegen erg1 konnte der endogene erg-Strom in MMQ- Zellen nach 24 Stunden um etwa 60% reduziert werden. Mit der Injektion einer dominant negativen Mutante des erg1 konnten Wimmers et al., (2001) eine ähnliche Unterdrückung des endogenen erg-Stroms in GH3B6- und MMQ-Zellen erzeugen. Beschrieben ist eine langsam fortschreitende Reduktion, die 70 Stunden nach der Injektion ihr Maximum erreicht. Bei Behandlung mit siRNA wird die Bildung neuer Kanalproteine verhindert, so dass die maximale Wirkung schneller sichtbar sein sollte. Dem entspricht die hier mit siRNA gegen erg1 nach 24 Stunden erzielte Reduktion, die durch längere Inkubation nicht weiter zu steigern war. Eine andere Erklärung für den nicht weiter zu steigernden Effekt könnte eine vermehrte Beeinträchtigung der Zellen durch die Injektion des Materials anstelle der Transfektion (vergl. Cotella et al., 2005) sein. Die verwendete Kombination aus Vektoren und Oligonukleotidfragmenten könnte ebenso eine Rolle spielen. Bei der Auswertung des mit siRNA gegen erg1 erhaltenen Reststromes zeigten sich dieselben kinetischen Eigenschaften wie beim ursprünglichen Strom der MMQ-Zellen. Das Verhältnis der beiden Stromkomponenten verschob sich auch hier bei Hyperpolarisation in Richtung des schnellen Anteils (If) und bei Depolarisation zum langsamen (Is), ohne dabei die Amplitude zu beeinflussen. Dieses Ergebnis wäre durch die Existenz von Faktoren, die auch eine geringere Anzahl an erg-Kanälen entsprechend modifizieren, erklärbar. Ausgehend vom Vorkommen eines eigenen erg-ähnlichen Kanaltyps mit langsamer Deaktivierungskinetik, 5 Diskussion 71 würde man erwarten, dass nach Unterdrückung des erg1 die Eigenschaften dieser Kanalsorte stärker hervorträte und folglich die langsame Komponente die Deaktivierung dominiert. Spezifische Faktoren, die auch nach dieser Behandlung in den Zellen vorkommen und die nun geringere Anzahl an erg-Kanälen ebenso modifizieren, stimmen dagegen mit den erhaltenen Ergebnissen eher überein. Mit siRNA gegen erg2 konnte weder in den elektrophysiologischen noch in den molekularbiologischen Untersuchungen mit einem der Promotoren eine hemmende Wirkung nachgewiesen werden. Eventuell ist dies einer mangelhaften Wirkung der verwendeten Kombination von Promotoren und Nukleotidfragmenten zuzuschreiben. Erg2 wird aber im allgemeinen schlechter exprimiert (vergl. Schledermann et al., 2001 und Kapitel 3.4; Tab. 6). Erg2 liegt größtenteils im Zytoplasma gebunden vor und weniger in der Membran, wo die Ableitungen erfolgen (vergl. Kapitel 4.1.3; Abb. 26). Die von Wimmers et al. (2001) beschriebene geringere Effektivität der erg2 Mutante weist ebenfalls daraufhin. Es ist also naheliegend, dass der endogene erg-Strom in MMQ-Zellen hauptsächlich von erg1 getragen wird.

5.4 Modulation durch Faktoren als Ursache der langsamen Deaktivierung

Die bisherigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass es einen MMQ-spezifischen Faktor gibt, der je nach Konzentration oder auch Zustand des erg-Kanals die Größe der nativen langsamen Komponente bestimmt, und in der Lage ist, auch eine hohe Dichte an erg-Kanälen kinetisch zu verändern. Bei der Suche nach der Lokalisation des Faktors konnte das Zytoplasma als Aufenthaltsort weitestgehend ausgeschlossen werden (Buhk, 2004). Mit einem Zytoplasmaextrakt aus

MMQ-Zellen wurden hierzu Versuche an GH3B6-Zellen durchgeführt, denen vorher cDNA von erg1 injiziert worden war. Der Extrakt wurde zunächst in der Pipettenlösung eingesetzt und die GH3B6-Zellen im Whole-cell-Modus gemessen. Um die Diffusionszeit zu verkürzen, wurde in der Inside-out-Konfiguration der Zytoplasmaextrakt der Badlösung zugegeben. Es konnte in beiden Fällen keine Änderung der Deaktivierungskinetik hervorgerufen werden. Im Inside-out-patch von MMQ-Zellen gelang es im Gegenzug auch nicht, den Faktor von der Membraninnenseite „abzuwaschen“ und die Deaktivierung damit zu beschleunigen. 5 Diskussion 72

Es ist deshalb wahrscheinlich, dass der Faktor, wie bereits von Schäfer et al. (1999) vermutet, membranständig oder zumindest mit der Membran assoziiert vorliegt. KCNE1-3 β-Untereinheiten konnten als „Modulatoren“ bereits weitestgehend ausgeschlossen werden (Buhk, 2004). In der vorliegenden Arbeit konnten durch den Einsatz verschiedener Splicevarianten und Deletionsmutanten des HERG des Weiteren der distale C-Terminus und der N-Terminus als Interaktionsstelle der Faktoren ausgeschlossen werden.

5.5 Einfluss der Fluorochinolonantibiotika Ciprofloxacin und Enrofloxacin auf erg-Kanäle

Über die Wirkung von Ciprofloxacin auf erg-Kanäle lagen bereits Untersuchungen vor. Kang et al. berichteten 2000 über eine blockierende Wirkung mit einem IC 50-Wert von 966 µmol/l. Andere Quellen beschrieben ebenfalls eine Wirkung von Ciprofloxacin in einer Konzentration von 220 ± 80 µmol/l mit einer Verlängerung der QT- Zeit um 15% (Patmore et al., 2000). Dagegen konnten Bischoff et al. (2000) mit einer Konzentration von 0,3 mmol/l keinen Effekt auf HERG nachweisen. Eine erg-blockierende Wirkung von Ciprofloxacin konnte in dieser Arbeit bis zu einer Konzentration von 3 mmol/l nicht nachvollzogen werden. Höhere Konzentrationen des Wirkstoffes waren in Ringer nicht mehr zu lösen. Ansatz zur Erklärung der konträren Ergebnisse mit Ciprofloxacin könnten die unterschiedlichen verwendeten Wirkstoffzubereitungen liefern. Die Arbeitsgruppen, die über eine blockierende Wirkung von Ciprofloxacin berichten, gehören pharmakologischen Einrichtungen (Aventis; Department of Pharmacology, Edinburgh) an, denen für die Experimente eventuell die Reinsubstanz von Ciprofloxacin zur Verfügung stand. In der vorliegenden Arbeit wurde hingegen mit dem therapeutisch relevanten Ciprofloxacin Hydrochlorid (ICN Biomedicals, Inc.) gearbeitet. Es ist nicht auszuschließen, dass Unterschiede im Verhalten der Wirkstoffzubereitung und der Reinsubstanz bestehen. Die zunächst auch hier festgestellte Reduktion des Stroms ließ sich bei Kontrolle der Messlösung auf die Ansäuerung der Lösung zurückführen. Das Lösen des Wirkstoffs führte bei einer Konzentration von 1,5 mmol/l zu einer pH-Wert Verschiebung auf 6,91, mit 3 mmol/l des Stoffes auf 6,55. Entsprechend dem Ausmaß der pH-Wert-Änderung war auch die Stromreduktion. Eine Blockade des HERG durch einen Anstieg der H+-Konzentration ist seit langem bekannt (Jo et al., 1999). Eine Hemmung des erg-Stroms durch Ciprofloxacin lässt sich dennoch nicht ausschließen. 5 Diskussion 73

Es wurde gezeigt, dass die arzneimittelinduzierte Blockade des HERG in einigen Fällen mit dem pH-Wert abnimmt (Lin et al., 2005). Die reduzierte Wirkung von Arzneimittel in saurem Milieu spielt bei der Behandlung von Patienten nach einem Myokardinfarkt eine große Rolle. In diesen Fällen besteht in der zellulären Umgebung des Infarkts eine Azidose, die in Arrhythmien resultieren kann. Als Prophylaxe werden antiarrhythmische HERG-Blocker gegeben. Eine pH-abhängige Wirkungseinbuße ist für Azimilid, Dofetilid und Quinidin bekannt (Lin et al., 2005). Mit Amiodaron dagegen lässt sich bei diesem Krankheitsbild die Zahl der Todesfälle reduzieren. Die Auswirkungen der Azidose auf die Effektivität antiarrhythmischer Arzneimittel gilt es, in Anbetracht der klinischen Bedeutung, in Zukunft dringend zu untersuchen. Auch die Wirkung von Ciprofloxacin gegen einige Bakterien scheint in saurem Milieu geringer zu sein (Blaser et al., 1986). Trotzdem ist möglich, dass Ciprofloxacin in höherer Konzentration einen Effekt zeigt. Dies konnte hier allerdings nicht überprüft werden, da sich größere Mengen des Wirkstoffes nicht mehr lösten. Mit Enrofloxacin konnte bei einem pH-Wert von 7,35 eine deutliche Reduktion des erg1- Stroms nachgewiesen werden. Dabei fiel eine Potentialabhängigkeit des Effekts auf, die bereits für andere Mitglieder der Familie der Fluorochinolone beschrieben ist (Kang et al., 2001B). Der größte Block trat bei depolarisierenden Potentialen auf, was für die Interaktion von Enrofloxacin mit einem aktivierten Stadium der erg-Kanäle spricht. In dieser Hinsicht verhält sich das Antibiotikum ähnlich wie andere HERG-blockierende Arzneimittel, wie z.B. Cisaprid (Mohammed et al., 1997; Rampe et al., 1997) oder Sertindol (Rampe et al., 1998), die im Elektrokardiogramm eine QT-Verlängerung hervorrufen. Die Tatsache, dass auch erg2 und erg3 durch Enrofloxacin blockiert wurden, spricht für eine allen erg-Kanälen gemeinsamen Bindungsstelle (vergl. Kapitel 3.3; Abb. 8). Für die Klinik ist der an der Repolarisation des Herzaktionspotentials beteiligte Auswärtsstrom entscheidet. In der Hypophysenzelllinie, die in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden, konnte der Auswärtsstrom mit einer Konzentration von 5 mmol/l bis auf 10 ± 2,0 % reduziert werden. Auf die Verhältnisse am Herzen übertragen, wäre Enrofloxacin folglich in der Lage eine Verlängerung der QT-Zeit zu bewirken. Daraus resultierende Arrhythmien könnten für die behandelten Patienten lebensbedrohlich sein. 5 Diskussion 74

In therapeutisch relevanter Konzentration eingesetzt (0,014 mmol/l = 5 mg/kg), wurde der Auswärtsstrom allerdings nicht gehemmt. Bei einem ordnungsgemäßen Gebrauch dieses Arzneimittels scheinen deshalb cardiale Nebenwirkungen unwahrscheinlich. Gegen einen absolut bedenkenlosen Umgang mit dem Arzneimittel sprechen dennoch einige Faktoren. Es ist bekannt, dass die Potenz von Arzneimitteln mit der Temperatur zunehmen kann (Davie et al., 2004; Guo et al., 2005; Yao et al., 2005). Da die Experimente bei Raumtemperatur durchgeführt wurden, ist eine Steigerung der hemmenden Wirkung von Enrofloxacin auf den

IKr bei Körpertemperatur möglich. Dies ist gerade deshalb von großer Relevanz, da Antibiotika in der Regel bei Erkrankungen mit Fieber verabreicht werden. Zu bedenken ist auch, dass die blockierende Wirkung der Arzneimittel vom Zustand des Kanals und somit den in der Zelle vorherrschenden Potentialdifferenzen abhängt (Zhou et al., 1998; Yao et al., 2005). Des Weiteren wird Enrofloxacin im Körper zu 40 bis 50 % in Ciprofloxacin umgewandelt (Cester & Toutain, 1997), für das eine QT-Verlängerung mehrfach beschrieben wurde (Kang et al., 2001B; Patmore et al., 2000). Die Kombination mit anderen Arzneimitteln, die ebenfalls eine QT-Verlängerung verursachen, kann außerdem einen kumulativen Effekt haben. Zusätzliche individuelle Faktoren beeinflussen die Pharmakokinetik und Pharmakodynamik der Arzneistoffe und bestimmen das Ausmaß der QT-Verlängerung. Ein Risikofaktor ist z.B Bradykardie. Die Herzfrequenz verhält sich umgekehrt proportional zur Länge des QT-

Komplexes (Hondeghem et al., 2001). Klasse III Antiarrhythmika, bekannte Ikr-Blocker, wie Sotalol oder Dofetilid, wirken bradykard und können so über eine Verlängerung des QT- Intervalls wieder Arrhythmien auslösen. Entsprechende Veränderungen im EKG können auch durch Imbalancen im Elektrolythaushalt entstehen. So führt eine niedrige extrazelluläre

Kaliumkonzentration über eine Abnahme der Leitfähigkeit des IKr (Shibasaki, 1987) zur Verlängerung des QT-Intervalls (Sanguinetti et al., 1992; Yang et al., 1997). Außerdem wird bei einer Hypokaliämie die Wirkung einiger Arzneimittel auf den IKr verstärkt ( Yang et al., 1996). In diesem Zusammenhang konnte in klinischen Studien bereits gezeigt werden, dass eine Kaliumgabe vor LQTS schützen kann (Compton et al., 1996; Tan et al., 1999).

In der Vergangenheit wurden bereits viele Arzneimittel, die den IKr blockieren, das QT- Intervall verlängern und dadurch beim Menschen zu ventrikulären Arrhythmien führen, wieder vom Markt genommen (Kapitel 9, Tab.2). Durch die Möglichkeit der Umwidmung humanmedizinischer Präparate und deren Einsatz in der Tierarztpraxis bedeutet dies unter Umständen einen Verlust wichtiger Therapeutika (Gering et al., 1991; Hall & Washabau, 1999; Moses et al., 2000). 5 Diskussion 75

Inwieweit die Tiere von dem Risiko eines LQT Syndroms oder ventrikulärer Arrhythmien betroffen sind, ist dabei noch unklar. Der IKr wurde bisher in Myokardzellen von Pferd, Hund, Katze, Kaninchen, Meerschweinchen, Frettchen, Maus und Regenbogenforelle identifiziert (Finley et al., 2003; Nurmi & Vornanen, 2002; Brahmajothi et al., 1997; Gintant GA, 1996; Li et al., 1996; Wang et al., 1996; Follmer & Colatsky, 1990). Somit erfüllen die meisten unserer Haustiere die genetischen Voraussetzungen für die Bindung von Arzneimitteln mit QT- verlängernder Wirkung. Da Enrofloxacin eines der wichtigsten Antibiotika in der tierärztlichen Praxis darstellt, sind die hier erzielten Ergebnisse und Überlegungen auf unsere Haustiere zu übertragen und sollten den Umgang mit dem Arzneimittel beeinflussen.

Das erworbene LQTS2 entsteht infolge einer Blockade des IKr (HERG) durch Arzneimittel, jedoch führen nicht alle Medikamente, die den Ikr hemmen, zu ventrikulären Arrhythmien (Yang et al., 2001). Bei einer Reihe von Wirkstoffen wurde unter Laborbedingungen bei Hund und Katze bereits eine QT-Verlängerung nachgewiesen (Tab. 9). Ob sich ein LQT Syndrom klinisch manifestiert, hängt wie beim Menschen von vielen zusätzlichen Faktoren ab. Die im Vergleich zum Menschen hohe Herzfrequenz bei Katzen und kleinen Hunden mag diesen Tieren einen gewissen Schutz vor dem arzneimittelinduzierten LQTS bieten. Aber auch wenn das Risiko schwerer Arrhythmien mit zunehmender Verlängerung des QT-Intervalls steigt (Moss, 1999; Hill & Friedman, 1997), ließ sich bisher keine eindeutige Korrelation zwischen einem kritischen QT-Wert und dem Auftreten ventrikulärer Arrhythmien festsetzen (Ball, 2000). Die niedrige Herzfrequenz bei Pferden sollte die Entwicklung eines LQTS dagegen eher begünstigen. Es ist allerdings unter der Therapie mit Quinidin nur ein Fall von torsade des pointes Arrhythmien beim Pferd beschrieben (Reef et al., 1995). Eine Erklärung hierfür kann die zu geringe Zahl untersuchter

Fälle sein. Finley et al. (2003) diskutieren in diesem Zusammenhang die Rolle des Ikur im Ventrikel des Pferdes. Zusätzlich an der Repolarisation des Herzaktionspotentials beteiligt und von reinen IKr Blockern unbeeinflusst, könnte er die Entstehung eines LQTS behindern. Die Auswirkungen einer Hypokaliämie oder Arzneimittel-Wechselwirkungen auf die QT-Zeit betreffen die Tiere in gleichem Maße wie den Menschen (Weissenburger et al., 1991; Sugiyam et al., 2002). 5 Diskussion 76

Tab. 9: Einige Arzneimittel die ein LQTS bei Hund (H) und Katze (K) auslösen ( Tab. modifiziert nach Finley et al., 2003)

Wirkstoff Klasse Referenz QuinidinH Antiarrhythmika Chezalviel-Guilbert et al., 1995 Sotalol H Weissenburger et al.,1999 BromopheniraminK Antihistaminika Wang et al., 1998 ChlorpheniraminK Wang et al., 1998 ClemastinK Wang et al., 1998 DiphenhydraminK Wang et al., 1998 HydroxyzinK Wang et al., 1998 CyproheptadinK Wang et al., 1998 Terfenadin H Gras et al., 1999 Erythromycin H Antibiotika Rubart et al., 1993 Sparfloxacin H Chiba et al., 2000; Satoh et al., 2000A Haloperidol HK Neuroleptikum Drici et al., 1998; Satoh et al., 2000C Cisaprid HK Prokinetikum Satoh et al., 2000B; Kii et al., 2001; Sugiyam et al., 2002 kursiv: nicht mehr auf dem Markt fett: Chinolonantibiotikum

Neben den für das Krankheitsbild des LQT-Syndroms im Herzen relevanten erg1a und erg1b- Kanälen können Arzneimittel auch die in anderen Organen vorhandenen erg-Kanäle beeinträchtigen (vgl. Kapitel 4.2.2), wobei erg2 und erg3 hauptsächlich neuronal vorkommen. Wie in der vorliegenden Arbeit am Beispiel der laktotrophen Hypophysenzellen aufgeführt, können erg-Kanäle in verschiedenen Zellen unterschiedliche biophysikalische Eigenschaften entwickeln. Da die Wirkung von Arzneimitteln von der Konformation des Kanals abhängt, ist somit möglich, dass dieselbe Konzentration einer Substanz unterschiedlich auf „gleiche“ Kanäle wirkt 6 Zusammenfassung 77

Katja Mandel: Biophysikalische und pharmakologische Eigenschaften der erg-K+-Kanäle der Ratte 6. Zusammenfassung

In der Arbeit sollte geklärt werden, ob die unterschiedlichen elektrophysiologischen Eigenschaften des E-4031-sensitiven Stroms in verschiedenen Zellsystemen durch spezifische Faktoren zustande kommen, oder ob ein bisher unbekannter Kanal für deren Entstehung verantwortlich ist. Ausgegangen wurde hierbei von der Beschreibung einer neuen, langsamen Deaktivierungskinetik in laktotrophen und MMQ-Zellen (Schäfer et al., 1999; Lecchi et al., 2002) mit bisher ungeklärter Ursache. Alle in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse deuten auf die Existenz zellspezifischer Faktoren hin und sprechen gegen das Vorkommen eines neuen Kanals: 1. Die langsam deaktivierende Stromkomponente konnte in allen MMQ-Zellen nachgewiesen werden. Die „Umwandlung“ des endogenen erg-Stroms mit Rückgang des langsamen und Zunahme des schnellen Deaktivierungsanteils bei Hyperpolarisation trat ohne eine Veränderung der maximalen Stromamplitude auf. 2. Nach Injektion verschiedener erg-Kanäle in MMQ-Zellen ließ sich bei allen exprimierten Kanälen eine Veränderung der Deaktivierungskinetik beobachten. Die Spannungsabhängigkeit der Verfügbarkeit der langsamen Stromkomponente verschob sich dabei mit jedem exprimierten Kanal. 3. Die besonderen kinetischen Eigenschaften des E-4031-sensitiven Stroms in MMQ-Zellen blieben auch nach Hemmung des endogenen erg1 mit siRNA erhalten, wobei auch die Amplitude der langsamen Komponente signifikant reduziert war.

Bei der Suche nach der Lokalisation der Faktoren war das Zytoplasma als Aufenthaltsort bereits weitestgehend ausgeschlossen (Buhk, 2004) und eine Assoziation der Faktoren mit der Membran schien wahrscheinlich (Schäfer et al., 1999). Durch den Einsatz verschiedener Splicevarianten und Deletionsmutanten des HERG konnten der distale C-Terminus und der N-Terminus als Interaktionsstelle für mögliche Faktoren, die verantwortlich für die langsame Komponente der Deaktivierung sind, ausgegrenzt werden. 6 Zusammenfassung 78

Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurde die Wirkung zweier Fluorochinolonantibiotika auf erg-Kanäle überprüft. Eine erg-blockierende Wirkung von Ciprofloxacin konnte in dieser Arbeit bis zu einer Konzentration von 3 mmol/l nicht nachgewiesen werden. Enrofloxacin reduzierte den erg-Auswärtsstroms in MMQ-Zellen mit einem IC50-Wert von 1,18 mmol/l. Übertragen auf die Verhältnisse am Herzen, wo der Auswärtsstrom an der Repolarisation des

Herzaktionspotentials beteiligt ist, könnte Enrofloxacin somit durch Blockade des IKr eine Verlängerung der QT-Zeit bewirken, was in lebensbedrohlichen Arrhythmien resultieren kann. In therapeutisch relevanter Dosierung konnte in der vorliegenden Arbeit aber kein hemmender Effekt nachgewiesen werden. Die ausschließliche, ordnungsgemäße Behandlung von Tieren mit Enrofloxacin sollte deshalb nicht bedenklich sein. Dennoch ist vor möglichen cardialen Nebenwirkungen zu warnen, gerade wenn Enrofloxacin in Kombination mit anderen Arzneimitteln, die ebenfalls eine QT-Verlängerung bewirken, verabreicht wird. Vorsicht ist auch bei der Therapie von Risikopatienten geboten, zu denen solche mit Elektrolytstörungen oder bereits bestehenden cardialen Erkrankungen zählen. Die Zahl der Arzneimittel und Risikofaktoren, die beim Menschen in Zusammenhang mit dem LQTS bekannt sind, rechtfertigen weitere Untersuchung dieses Syndroms beim Tier.

Arzneimittel, die unerwartet den IKr blockieren und das QT-Intervall verlängern, können lebensbedrohlich für Mensch und Tier sein, kostspielige Behandlungen nach sich ziehen, und die Zulassung des betroffenen Arzneimittels zum Markt verhindern. Im Hinblick auf die Entwicklung neuer Arzneimittel ist zu bedenken, dass, trotz standardisierter Patch-clamp- Technik durch die verschiedenen experimentell genutzten Expressionssysteme, die Temperatur und die verwendeten Protokolle Diskrepanzen in der Affinität zum HERG-Kanal bestehen (vergl. Kapitel 9; Tab. 2). Gefordert sind deshalb standardisierte HERG-Kanal-IC 50 Tests und in silico Modelle für die Überprüfung nicht nur human- sondern auch tiermedizinischer Wirkstoffe. 7 Summary 79

Katja Mandel: Biophysical and pharmacological properties of rat erg-K+-channels 7. Summary The present study should clarify whether the diverse electrophysiological properties of the E-4031-sensitive current in different cell systems are determined by cell-specific factors or by an so far unknown erg channel subunit. The question of this work arose because of the discription of the unexplained mechanism of slowly deactivating erg currents in lactotrope cells (Schäfer et al., 1999; Lecchi et al., 2002). The following results suggest the existence of cell-specific factors and argue against the presence of a new channel: 1. The slowly deactivating component of the erg current could be detected in all lactotrope MMQ-cells. The endogenous erg current could be „conversed“ by hyperpolarizing the cells from a slowly to a fast deactivating current without apparent change of the maximal current amplitude. 2. After injection of cDNA of different erg channel subunits in MMQ cells a slowly deactivating current component emerged in all expressed channels. The voltage dependence of the availability of the slow current component was shifted by the expressed channel subunits. 3. After suppression of endogenous erg1 channel subunits with siRNA the special kinetic properties of the E-4031-sensitive current in MMQ-cells remained to the same degree, whereas the amplitude of the slow current component was reduced too.

Previous results largely excluded the involvement of cytoplasmic cell-specific factors (Buhk, 2004). Therefore, the earlier suggested association of the factors with the membrane became more likely (Schäfer et al., 1999). By testing different splice variants and deletion mutants of the HERG channel, the distal C-terminus and the N-terminus could be excluded as the interaction site for putative factors, responsible for the slow deactivation.

In the second part of the present work the effect of two different fluorochinolone antibiotics on erg currents was investigated. In this work 3 mmol/l ciprofloxacin had no erg-blocking effect. Enrofloxacin reduced the erg outward current in MMQ-cells with an IC50 value of 1,18 mmol/l. Applied to the conditions in the heart, where the erg outward current contributes as Ikr 7 Summary 80

to the repolarisation of action-potential, enrofloxacin could prolong the QT-interval what can result in life-threatening arrhythmias. In therapeutic doses an inhibitory effect on erg currents was not found in this study. An exclusive, adequate therapy of pets with enrofloxacin should therefore be safe. Anyhow, it must be warned of adverse cardiac effects, especially if enrofloxacin is administered with other drugs which are known to prolong the QT-interval. Caution is also demanded during medication of risk patients, those with electrolyte interferences or pre-existing cardiac diseases. The number of drugs and risk factors which are connected with the long QT-syndrome in human warrants further analysis of this syndrome in animals. Use of drugs that block Ikr and prolong the QT interval can be life-threatening for man and domestic animals and can result in expensive treatments, which can prevent the admission of the drug to the market. With regard to the development of new drugs discrepancies in the affinity to HERG channels in different expression systems, different temperature and potentials have to be considered despite standardised patch-clamp techniques (chapter 9; Tab. 2). It is therefore postulated that standardised HERG channel-IC50 tests and in silico models should also be conducted for testing medical agents used for animals. 8 Literaturverzeichnis 81

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Tab. 2: Arzneimittel mit QT-Verlängerung durch Blockade des HERG

Wirkstoffname Gruppe IC-50- Zu- Verweis Wert lassung Astemizol H1-Antihistaminikum 60 nmol/l N Chachin et al., 1999; 0,9 nmol/l Zhou et al., 1999; 431 nmol/l Paakkari, 2002 Desmethylastemizol H1-Antihistaminikum 1 nmol/l N Zhou et al., 1999 Norastemizol H1-Antihistaminikum 28 nmol/l N Zhou et al., 1999

Terfenadin H1-Antihistaminikum 431 nmol/l Z Chachin et al., 1999; 204 nmol/l Crumb, 2000 Loratadin H1-Antihistaminikum 3 µmol/l Z Taglialatela et al., 1998; 173 nmol/l Crumb, 2000 Mizolastin H1-Antihistaminikum 350 nmol/l Z Taglialatela et al., 2000 Ebastin H1-Antihistaminikum kA Z Ko et al., 1997; Roberts et al., 1999 Josamycin Makrolid- 102 µmol/l N Volberg et al., 2002 Antibiotikum (AB) Roxithromycin Makrolid-AB 37 µmol/l Z Volberg et al., 2002 Erythromycin Makrolid-AB 72 µmol/l Z Volberg et al., 2002; 39 µmol/l Stanat, 2003 Des- Makrolid-AB 147 µmol/l Z Volberg et al., 2002 Methylerythromycin Erythromycylamin Makrolid-AB 274 µmol/l N Volberg et al., 2002 Clarithromycin Makrolid-AB 33 µmol/l Z Volberg et al., 2002; 46 µmol/l Stantat 2003 Oleandomycin Makrolid-AB 340 µmol/l N Volberg et al., 2002 Telithromycin Makrolid-AB kA Z Iannini & Tillotoson, 2002 Levofloxacin Chinolon-AB 915 µmol/l Z Kang et al., 2001 (Gyrasehemmer) 9 Anhang 109

Gatifloxacin Chinolon-AB 130 µmol/l N Kang et al., 2001 Moxifloxacin Chinolon-AB 129 µmol/l Z Kang et al., 2001; 75 µmol/l Lacroix et al., 2003 Sparfloxacin Chinolon-AB 18 µmol/l N Kang et al., 2001 Ofloxacin Chinolon-AB 1,4 nmol/l Z Kang et al., 2001 Grepafloxacin Chinolon-AB 50 µmol/l N Kang et al., 2001 Ciprofloxacin Chinolon-AB 966 µmol/l Z Kang et al 2001 Cisaprid Prokinetikum, 6,5 nmol/l N Mohammed et al., Magen-Darm- 1997; Motilität förderndes 45 µmol/l Rampe et al., 1997 Mittel Metoclopramid Prokinetikum 5,4 µmol/l Z Claasen & Zunkler, 2005 Domperidon Antiemetikum, 57 µmol/l Z Claasen & Zunkler, Magen-Darm- 2005 Motilität förderndes Mittel Ketanserin Antiemetikum, 5- kA N Le Grand et al., 1995

HT3-Antagonist Ondansetron Antiemetikum, 5- 0,8 µmol/l Z Kuryshev et al., 2000

HT3-Antagonist Granisetron Antiemetikum, 5- 3,7 µmol/l Z Kuryshev et al., 2000

HT3-Antagonist Dolasetron Antiemetikum, 5- 6 µmol/l Z Kuryshev et al., 2000

HT3-Antagonist Terodilin Anticholinergikum 0,5 µmol/l N Jones et al., 2000 S-Oxybutynin Anticholinergikum, 12 µmol/l Z Jones et al., 2000 urologisches Spasmolytikum Tolterodin Anticholinergikum 17 nmol/l Z Kang et al., 2003A Risperidon Neuroleptikum 261 nmol/l Z Drolet et al., 2003 Pimozid Neuroleptikum 18 nmol/l Z Kang et al., 2000 Sertindol Neuroleptikum 14 nmol/l N Rampe et al., 1998 9 Anhang 110

Haloperidol Neuroleptikum, 1 µmol/l Z Suessbrich et al., Dopamin-Antagonist 1997A; 0,2 µmol/l Martin et al., 2004 Ziprasidon Neuroleptikum, 0,2 µmol/l Z Ducroq et al., 2005 Dopamin-Antagonist Chlorpromazin Neuroleptikum 22 µmol/l Z Thomas et al., 2003C; 10 µmol/l Lee et al., 2004; 224 nmol/l Kim et al., 2005C Thioridazin Neuroleptikum 1,6 mmol/l Kim et al., 2005C Perphenazin Neuroleptikum 1 mmol/l Kim et al., 2005C Trifluoperzin Neuroleptikum 1,4 mmol/l Kim et al., 2005C Droperidol Neuroleptikum 28 nmol/l N Drolet et al., 1999 Mesoridazin Neuroleptikum 550 nmol/l Z Su et al., 2004 Quetiapin Neuroleptikum nB Z Kongsamut et al., 2002 Fluoxetin Antidepressivum 3,1 µmol/l Z Thomas et al., 2002 (Selektiver Serotonin- wiederaufnahmehem mer) Citalopram Antidepressivum 4 µmol/l Z Witchel et al., 2002 (Selektiver Serotonin- wiederaufnahmehem mer) Quinin Malariamittel 57 µmol/l N Sanchez-Chapula et al., 2003 Quinidin Malariamittel, 4,6 µmol/l N Sanchez-Chapula et al., Antirheumatikum 2002; 0,4 µmol/l Paul et al., 2002 Chloroquin Malariamittel, 8,4 µmol/l Z Sanchez-Chapula et al., Antirheumatikum 2002; 2,5 µmol/l Traebert et al., 2004 Lumefantrin Malariamittel 8 µmol/l Z Traebert et al., 2004 Desbutyl- Malariamittel 5,5 µmol/l Z Traebert et al., 2004 lumefantrin 9 Anhang 111

Mefloquin Malariamittel 5,6 µmol/l Z Kang et al., 2001A; 2,6 µmol/l Traebert et al., 2004 Halofantrin Malariamittel 22 nmol/l N Mbai et al., 2002; 0,04 µmol/l Traebert et al., 2004 N-desbutyl- Malariamittel 72 nmol/l N Mbai et al., 2002 halofantrin 1-alpha- Narkotikum 3 µmol/l N Kang et al., 2003B acetylmethadol Noraacetylmethadol Narkotikum 12 µmol/l N Kang et al., 2003B Halothan Inhalations- kA N Li et al., 2002 narkotikum Phenytoin Antiepileptikum, 240 µmol/l Z Danielsson et al., 2003 Antiarrhythmikum Phenobarbital Antiepileptikum, 3 mmol/l Z Danielsson et al., 2003 Hypnotikum Procainamid Klasse Ia 139 µmol/l N Ridley et al.,2003 Antiarrhythmikum Disopyramid Ia Antiarrhythmikum 7,2 µmol/l Z Paul et al., 2001 Encainid Ia Antiarrhythmikum 6 µmol/l N Follmer et al., 1992 Flecainid Ia Antiarrhythmikum 3,9 µmol/l Z Paul et al., 2002 Propafenon Ia Antiarrhythmikum 0,4 µmol/l Z Paul et al., 2002 5-hydroxy- Ia Antiarrhythmikum kA Z Arias et al., 2003 propafenon Bertosamil Klasse III 63 µmol/l N Zitron et al., 2002 Antiarrhythmikum Dronedaron Klasse III 9,2 µmol/l N Thomas et al., 2003B Antiarrhythmikum Sotalol Klasse III 150 µmol/l Z Numaguchi et al., 2000 Antiarrhythmikum Azimilid Klasse III 1,4 µmol/l N Busch et al., 1998 Antiarrhythmikum Clofilium Klasse III 150-250 N Suessbrich et al., Antiarrhythmikum µmol/l 1997B 9 Anhang 112

Dofetilid Klasse III 10 nmol/l N Amos et al., 2003; Antiarrhythmikum 0,3 µmol/l Ficker et al., 2001 Ibutilid Klasse III 1 µmol/l N Yang et al., 2001 Antiarrhythmikum Amiodaron Klasse III 9,8 µmol/l Z Kiehn et al., 1999 Antiarrhythmikum Almokalant Klasse III 250 nmol/l N Amos et al., 2003 Antiarrhythmikum Dopamin Antiarrhythmikum nB Z Kongsamut et al., 2002 Pilsicainid Na-Kanal-Blocker, kA N Wu et al., 2003 Antiaarhythmikum Vesnarinon Kardiotonikum 18 µmol/l N Kamiya et al., 2001 Bepridil Calcium-Antagonist, 0,6 µmol/l N Chouabe et al., 2000 Antiarrhythmikum Verapamil Calcium-Antagonist 0,8 µmol/l Z Chouabe et al., 2000 Mibefradil Calcium-Antagonist 1,4 µmol/l N Chouabe et al., 2000 Perhexilin Calcium-Antagonist 7,8 µmol/l N Walker et al., 1999 Irbesartan Angiotensin II 193 µmol/l Z Moreno et al., 2003 Rezeptor- Antagonist Eprosartan Angiotensin II kA N Caballero et al., 2001 Rezeptor- Antagonist Candesartan Angiotensin II kA Z Caballero et al., 2001 Rezeptor- Antagonist Losartan Angiotensin II kA Z Caballero et al., 2000 Rezeptor- Antagonist

Carvedilol Vasodilatator, α1- 10 µmol/l Z Karle et al., 2001 und ß- Rezeptorenblocker Bupivacain Lokalanästhetikum 20 µmol/l Z Friederich et al., 2004; 22 µmol/l Siebrands et al., 2005 Levobupivacain Lokalanästhetikum 10 µmol/l Z Friederich et al., 2004; 13 µmol/l Siebrands et al., 2005 Ropivacain Lokalanästhetikum 20 µmol/l Z Friederich et al., 2004 9 Anhang 113

Norpropoxyphen Opiat, Analgetikum 40 µmol/l N Ulens et al., 1999 Propoxyphen Opiat, Analgetikum 40 µmol/l N Ulens et al., 1999 Sildenafil Phosphodiesterase 5 100 µmol/l Z Geelen et al., 2000; Hemmer, Vasodilatator, Mittel 33 µmol/l Sarazan et al., 2004 gegen erektile Dysfunktion Tadalafil Phosphodiesterase 5 100 µmol/l Z Sarazan et al., 2004 Hemmer Vardenafil Phosphodiesterase 5 12 µmol/l Z Sarazan et al., 2004 Hemmer Apomorphin Dopamin-Agonist, 2,4 µmol/l Z Hurst et al., 2003 Emetikum Pergolid Dopamin-Agonist, 0,1 µmol/l Z Hurst et al., 2003 Parkinsonmittel Ropinirol Dopamin-Agonist 1,2 µmol/l Z Hurst et al., 2003 Sumanirol Dopamin-Agonist kA N Hurst et al., 2003 Budipin Parkinsonmittel 10 µmol/l Z Scholz et al., 2003 Tamoxifen Zytostatikum 45 µmol/l Z Thomas et al., 2003A (Antiestrogen) Ketokonazol Antimykotikum 49 µmol/l N Dumaine et al., 1998 Probucol Lipidsenker kA N Hayashi et al., 2004 4-Aminopyridin K-Kanal-Blocker 4,4 mmol/l N Ridley, 2003 experimentell eingesetzte und andere Wirkstoffe E-4031 Klasse III 397 nmol/l Sanguinetti et al., 1990; Antiarrhythmikum 7,7 nmol/l Zhou et al., 1998 MK-499 Klasse III 123 nmol/l Spector et al., 1996B Antiarrhythmikum H 345/52 Antiarrhythmikum 40 µmol/l Amos et al., 2001; 230 nmol/l Amos et al., 2003 AVE 0118 Antiarrhythmikum 10 µmol/l Gogelein et al., 2004 9 Anhang 114

BRL-32872 Antiarrhythmikum 241 nmol/l Thomas et al., 2001; 20 nmol/l Karle et al., 2002 EGIS-7229 Antiarrhythmikum 1,1 µmol/l Magyar et al., 2001 (S21407) DW-224a Fluorocchinolon-AB 218 µmol/l Kim et al., 2004 DW-286a Fluorocchinolon-AB 89 µmol/l Kim et al., 2005B MDL 74,156 Antiemetikum 12 µmol/l Kuryshev et al., 2000 Methadon Opioid 20 µmol/l Kornick et al., 2003 Cocain Indirektes 4,4 µmol/l Ferreira et al., 2001; Sympathomimetikum und Lokalanästhetikum Cocaethylen Cocainmetabolit 1,2 µmol/l Ferreira et al., 2001 Methylecgonidin Cocainmetabolit 171 µmol/l Ferreira et al., 2001 As203 Arsenic trioxide for 0,1 µmol/l Drolet et al., 2004 acute promyelocytic leukemia Naringenin Flavonoid 36-102 Zitron et al., 2005 µmol/l Morin Flavonoid 111 µmol/l Zitron et al., 2005 Hesperetin Flavonoid 288 µmol/l Zitron et al., 2005 ERG-Tx Skorpiontoxin kA Zhang et al., 2003A BmTX 3 Toxin des Skorpions 1,9 µmol/l Huys et al., 2004 Buthus martensi karsch BeKm-1 Toxin des asiatischen 3,3 nmol/l Korolkova et al., 2002; Skorpions Buthus . 7 nmol/l Angelo et al., 2003 eupeus APETX 1 Toxin der 34 nmol/l Diochot et al., 2003 Seeanemone Anthopleura elegantissima Glukose kA Zhang et al., 2003B 9 Anhang 115

Ginseng kA Kim et al., 2005 Lanthanum 1 µmol/l Sanguinetti et al., 1990 Nikotin 2-16 Wang et al., 1999 µmol/l

Die Angabe unterschiedlicher IC-50-Werte bei einigen Wirkstoffen ergibt sich durch die verschiedenen Versuchsbedingungen. kA= keine Angabe nB= Veröffentlichung nicht bestellt Z= zugelassen N= nicht zugelassen Danksagung

Sehr herzlich möchte ich mich bei Frau PD Dr. CK Bauer bedanken, die bei allen kleinen oder größeren Problemen jederzeit zur Verfügung stand. Ihr vorbildhaftes Engagement bereitete Freude beim praktischen Arbeiten und hat eine zügige Fertigstellung der Dissertationsschrift ermöglicht.

Herrn Prof. Dr. J Schwarz danke ich für die Möglichkeit in seiner Abteilung wissenschaftlich arbeiten und promovieren zu können.

Mein Dank gilt ebenso Frau PD Dr. K Huber für die Übernahme dieser Arbeit zur Vorlage beim Fachbereich der Tierärzlichen Hochschule Hannover und für ihre engagierte Unterstützung bei der Fertigstellung der Dissertationsschrift.

Dem ganzen Team von Prof. Schwarz möchte ich für die freundliche Aufnahme in den Arbeitskreis und die hilfsbereite Unterstützung bei allen Problemen danken. Frau Dr. I Wulfsen dabei besonders für ihre tatkräftige Unterstützung auf molekularbiologischer Ebene.

Der größte Dank gilt meinen Eltern, Christian und Ulrike Mandel, deren emotionale wie finanzielle Unterstützung mein Studium und die Promotion überhaupt ermöglichten.

Großer Dank gilt auch den Personen, die mich in den letzten Monaten trotz kleiner Krisen weiter ermutigt und unterstützt haben, insbesondere Roger Berchtold.