Histoplasmose

IBMR – LAUREATE INTERNATIONAL UNIVERSITIES

CURSO DE BIOMEDICINA

KARINE BRUCATT DA SILVA PIRES

HISTOPLASMOSE

RIO DE JANEIRO 2017

KARINE BRUCATT DA SILVA PIRES

HISTOPLASMOSE

Trabalho de conclusão de curso apresentada ao IBMR – Laureate International Universities como requisito parcial para a obtenção do Grau de Bacharel em biomedicina em 2017.

ORIENTADOR (A): Jorgenilce Sales

RIO DE JANEIRO 2017

KARINE BRUCATT DA SILVA PIRES

HISTOPLASMOSE

Trabalho de conclusão de curso apresentada ao IBMR – Laureate International Universities como requisito parcial para a obtenção do Grau de Bacharel em . Biomedicina em 2017.

Aprovada em 14 de novembro de 2017.

BANCA EXAMINADORA

______Prof. Dr. Alan Carneiro

IBMR - Laureate International Universities

______

Prof. Dr. Arnaldo Couto

IBMR - Laureate International Universities

Dedico esse trabalho primeiramente a Deus, minha mãe, irmã e madrinha por serem primordiais na minha vida e por terem me ajudado a prosseguir com a graduação.

AGRADECIMENTOS

Agradeço em primeiro lugar a Deus por ter me concedido a vida e me dado forças para chegar até aqui.

Agradeço aos meus pais, especificamente a minha mãe, pela boa educação que se propuseram a me dar e por me incentivarem a crescer na vida. A vocês meus sinceros agradecimentos e gratidão por tudo que fizeram de melhor para mim.

De forma especial agradeço a minha tia e madrinha Dagmar Esteves, por realizar o meu sonho, por estar ao meu lado sempre que precisei e que sem ela na minha vida eu nada seria.

Um agradecimento ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) por ter me concedido uma bolsa de iniciação cientifica na Fundação Oswaldo Cruz.

A toda minha família por todo amor e carinho, por me encorajar nos momentos de angustias em que pensei em desistir de tudo e pelos momentos de alegria em toda a minha vida.

À minha orientadora durante a iniciação cientifica (IC) na Fiocruz, Drª Rosely Maria Zancopé, grande pesquisadora que me proporcionou essa monografia dando-me conhecimento sobre o assunto em questão, por me acolher nos momentos em que precisei, por todos os ensinamentos, pela cordialidade, paciência, por toda a dedicação que teve com esse trabalho me explicando nos momentos de dúvida e pela sua atenção.

À minha orientadora e professora durante a preparação do trabalho de conclusão de curso Jorgenilce Sales, por me auxiliar sempre que foi preciso sendo amigável, atenciosa e por me estimular a fazer sempre o melhor não duvidando da minha capacidade.

Ao meu co-orientador durante minha IC, Marcos Almeida, que no decorrer desse tempo se propôs a me ensinar sendo bastante paciente e amigável nos vários momentos que necessitei de sua ajuda.

Ao pessoal do laboratório de Micologia do setor de Imunodiagnóstico, do Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas: Dr. Mauro Muniz, Drª Claudia Vera Pizzini, Dr. Leonardo Barbedo, Luã Cardoso, Fernando Almeida e Vanessa por estarem sempre presentes me

auxiliando nos momentos de dúvidas, agradeço por tudo que aprendi com vocês e por me proporcionarem momentos felizes durante a minha IC.

Aos meus amigos da faculdade Natália Cassilhas, Fernanda Silveira, Michely Moraes, Luís Felipe, Elisabeth Pereira, Élida de Souza e Claudio Coelho pela paciência que tiveram comigo nesse processo, pela amizade de cada um e por me ajudarem a ser uma pessoa melhor me trazendo conhecimento de coisas que eu não tinha.

Aos meus professores e coordenadores do IBMR que tiveram importância na minha formação profissional.

RESUMO

A histoplasmose é uma doença sistêmica causada pelo fungo dimórfico chamado Histoplasma capsulatum, descrita pela primeira vez em 1905 por Darling, após a realização de uma autopsia de um paciente nativo do Panamá que apresentava hepatoesplenomegalia. As principais fontes de infecção são locais como grutas, cavernas, galinheiros, árvores ocas, construções antigas ou abandonadas e áreas rurais. A histoplasmose é a micose endêmica mais comum nos Estados Unidos, atingindo em maior número indivíduos HIV positivos. Atualmente a histoplasmose apresenta distribuição mundial, com a maior prevalência nas regiões temperadas e tropicais. Este fungo possui inúmeros fatores de virulência que lhe conferem resistência para sobreviver a diferentes condições ambientais. A infecção humana se dá pela via respiratória, onde ocorre a inalação dos microconídios de H. capsulatum presentes no meio ambiente. Estes conídios alcançam os alvéolos pulmonares e induzem uma resposta inflamatória por parte do hospedeiro. Em imunocomprometidos, essa infecção primária assume quadro progressivo podendo levar a fatalidade. O diagnóstico da histoplasmose é clínico-epidemiológico e laboratorial. O isolamento de H. capsulatum em meios de cultura específicos é padrão ouro no diagnóstico laboratorial, porém requer maior demanda de tempo. O histopatológico oferece agilidade no diagnóstico, no entanto possui sensibilidade menor que 50%. Este estudo tem como objetivo realizar uma revisão de literatura científica comparando as metodologias tradicionais e alternativas no diagnóstico imunológico da histoplasmose baseado na detecção de antígenos e anticorpos específicos. A revisão literária incluiu artigos originais e utilizou como seleção as plataformas de consulta PubMed, Scielo, Google acadêmico e também livros de editoras nacionais e internacionais. O imunodiagnóstico é de grande importância no diagnóstico laboratorial da histoplasmose, pois apresentam sensibilidade superior a 90% e detectam de forma indireta a existência do patógeno no hospedeiro. O diagnóstico imunológico tem sido usado rotineiramente auxiliando no diagnóstico da histoplasmose. Técnicas moleculares como PCR, têm sido utilizadas recentemente como alternativa de um diagnóstico rápido para a histoplasmose, porém apresenta baixa sensibilidade quando aplicado diretamente a amostras clínicas.

Palavras-chave: Histoplasma capsulatum, histoplasmose, diagnóstico, sorologia

ABSTRACT

Histoplasmosis is a systemic disease caused by the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum, first described in 1905 by Darling after performing an autopsy on a native patient from Panama who had hepatosplenomegaly. The main sources of infection are sites such as caves, caves, chicken coops, hollow trees, old or abandoned buildings and rural areas. Histoplasmosis is the most common endemic mycosis in the United States, reaching more HIV-positive individuals. The histoplasmosis is currently distributed worldwide, with the highest prevalence in temperate and tropical regions. This fungus has numerous virulence factors that give it resistance to survive different environmental conditions. The human infection occurs through the respiratory pathway, where the inhalation of H. capsulatum microconidia present in the environment occurs. These conidia reach the pulmonary alveoli and induce an inflammatory response on the part of the host. In immunocompromised patients, this primary infection is progressive and can lead to fatality. The diagnosis of histoplasmosis is clinical-epidemiological and laboratory. Isolation of H. capsulatum in specific culture media is a gold standard in laboratory diagnosis, but requires a greater time demand. The histopathology offers agility in diagnosis; however, it has a sensitivity of less than 50%. This study aims to conduct a review of scientific literature comparing traditional and alternative methodologies in the immunological diagnosis of histoplasmosis based on the detection of antigens and specific antibodies. The literary review included original articles and used as a selection the consultation platforms PubMed, Scielo, Google academic as well as books of national and international publishers. Immunodiagnosis is of great importance in the laboratory diagnosis of histoplasmosis, since they have sensitivity greater than 90% and indirectly detect the existence of the pathogen in the host. Immunological diagnosis has been routinely used to aid in the diagnosis of histoplasmosis. Molecular techniques such as PCR have recently been used as an alternative to a rapid diagnosis for histoplasmosis, but it presents low sensitivity when applied directly to clinical samples.

Keywords: Histoplasma capsulatum, histoplasmosis, diagnosis, serology.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Ilustração 1: Diferenciação celular de Histoplasma capsulatum...... 19

Ilustração 2: Distribuição geográfica de H. capsulatum var. Capsulatum (roxo) e H. capsulatum var. Duboisii (área sombreada). Os círculos indicam o número de casos publicados de histoplasmose autóctone associada à AIDS. A maioria dos casos africanos foi observada fora da África...... 20

Ilustração 3: Distribuição da histoplasmose no Brasil, conforme indicado pela positividade do teste cutâneo de histoplasmina...... 21

Ilustração 4: Ciclo biológico do fungo Histoplasma capsulatum no hospedeiro...... 23

Ilustração 5: Radiografia do tórax de paciente do sexo masculino com histoplasmose pulmonar aguda, com múltiplos nódulos pulmonares, resultante da grande quantidade de conídios presentes em galinheiro...... 24

Ilustração 6: Radiografia do tórax de paciente com histoplasmose pulmonar crônica, sendo visível cavitações e perda de volume no pulmão direito...... 25

Ilustração 7: A. Paciente antes do início do tratamento; B. Paciente após o tratamento com anfotericina B/itraconazol...... 27

Ilustração 8: Histoplasma capsulatum. A. aspecto macromorfológico em ágar batata dextrose, comprovando colônia algodonosa branca e ao lado micromorfologicamente mostrando hifas e os macroconídios tuberculados em lactofenol azul de algodão; B. forma leveduriforme a 35°C em ágar-BHI comprovando colônias de aspectos úmidos de coloração branco-amarelada e ao lado micromorfologicamente mostrando estrutura leveduriforme com brotamento em lactofenol azul de algodão...... 29

Ilustração 9: Aspecto histopatológico de amostra da medula óssea, mostrando leveduras de Histoplasma capsulatum corados pela prata...... 31

Ilustração 10: Teste de Imunodifusão dupla com presença das precipitinas H e M. O orifício central é destinado a histoplasmina (extrato antigênico obtido em laboratório da fase miceliana de H. capsulatum). Os números 1 e 4 são destinados para o soro padrão que é um controle positivo comercializado. Os números 2,3,5 e 6 são destinados para o soro teste (amostras). Considera-se reação positiva (soro reagente) quando houver a presença de linhas de precipitação com identidade total com o soro padrão...... 34

LISTA DE ABREVIAÇÕES

AC Anticorpo AG Antígeno PH Potencial de hidrogênio AIDS Síndrome da Imunodeficiência humana HIV Vírus da Imunodeficiência humana TARV Terapia Antirretroviral ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Ensaio imunoenzimático) PCR Reação em Cadeia da Polimerase RIA Radioimunoensaio TNF-α Tumor Necrosis Factor alpha (Fator de Necrose Tumoral alfa) ROS Espécies reativas de oxigênio RNS Espécies reativas de nitrogênio HD Histoplasmose disseminada LCR Líquido cefalorraquidiano LBA Lavado broncoalveolar KOH Hidróxido de potássio HE Hematoxilina eosina PAS Ácido periódico de Schiff ITS Regiões espaçadoras intergênicas ID Imunodifusão Dupla RFC Reação de Fixação do Complemento HMIN Antígeno histoplasmina

Sumário

1. INTRODUÇÃO ...... 12 2. OBJETIVOS ...... 15 2.1 OBJETIVO GERAL ...... 15 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 15 3. METODOLOGIA ...... 16 4. DESENVOLVIMENTO ...... 17 4.1 HISTÓRIA DO AGENTE ETIOLÓGICO ...... 17 4.2 HISTOPLASMA CAPSULATUM ...... 18 4.3 EPIDEMIOLOGIA ...... 19 4.4 FATORES DE VIRULÊNCIA ...... 21 4.5 PATOGENIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS ...... 23 4.6 TRATAMENTO ...... 26 4.7 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL ...... 28 4.7.1 DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO ...... 28 4.7.2 DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO ...... 30 4.7.3 DIAGNÓSTICO MOLECULAR ...... 31 4.7.4 IMUNODIAGNÓSTICO ...... 33 5. CONCLUSÃO ...... 37 6. REFERÊNCIAS ...... 38

1. INTRODUÇÃO

A histoplasmose é uma micose sistêmica causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum, um ascomiceto que se aloja em solos úmidos, fartos de excrementos de aves e morcegos com alto teor de nitrogênio que tornam o pH do solo ácido. Os nutrientes provenientes das fezes acoplados a condições ambientais de temperatura, umidade e pH favoráveis, compõem o nicho ecológico deste fungo. As principais fontes de infecção para H. capsulatum são grutas, galinheiros, árvores ocas, porões de casas, sótãos, construções inacabadas ou antigas e áreas rurais (LONDERO; WANKE, 1988). Atualmente a histoplasmose está presente mundialmente, porém apresenta maior prevalência na América do Norte, mais especificamente na região centro-oeste dos Estados Unidos, ao longo dos vales dos Rios Mississipi e Ohio. Na América Central, em países como México, Guatemala, Nicarágua, Panamá. Na América do Sul, países como o Brasil, Argentina, Colômbia, Uruguai, Paraguai, Peru, também são endêmicos. Alguns casos esporádicos diagnosticados com histoplasmose foram relatados na África, Ásia e Europa (ROSSINI, 2006; SIMÃO; BORGES, 2009). A ocorrência de histoplasmose no Brasil é relativamente comum e se atribui pela observação de casos clínicos nativos, seja em casos isolados ou sob a forma de microepidemias(CHANG et al., 2007). A infecção humana ocorre após a entrada de H. capsulatum no hospedeiro onde os microconídios infectantes são inalados junto com pequenos fragmentos de hifas, que ao alcançarem os alvéolos pulmonares são fagocitados por fagolisossomos. Ao entrar em contato com a temperatura corporal entre 36,5°C e 37°C, H. capsulatum atinge sua forma leveduriforme que se multiplica e desloca-se até os linfonodos onde ganham acesso a corrente sanguínea podendo migrar para outros órgãos (CONCES, 1996). As manifestações clínicas dos pacientes com histoplasmose podem variar de doença assintomática à disseminada grave, dependendo da quantidade de inóculo, virulência da cepa e de fatores predisponentes do hospedeiro (GOODWIN; DES PREZ, 1978; SATHAPATAYAVONGS et al., 1983; KAUFFMAN, 2007). No final do século XX, houve um aumento significativo da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), síndrome essa causada pela infecção do vírus da imunodeficiência humana

(HIV) responsável por infectar componentes do sistema imunológico, como células T CD4+, células dendríticas e macrófagos, levando a imunodepressão do sistema de defesa do organismo humano. Indivíduos infectados que não fazem o uso da terapia antirretroviral (TARV) podem cursar com um estado grave de comprometimento do sistema imunológico, abrindo portas para a instalação de doenças oportunistas (COSTA, 2010). A histoplasmose aparece como primeira manifestação de AIDS de 50% a 75% em HIV positivos e em pacientes com contagem de CD4 abaixo de 150 células/mm3(WHEAT, 1994; KAUFFMAN, 2007; GÓMEZ, 2011). Os sintomas de pacientes com histoplasmose nem sempre são bem definidos, uma vez que se assemelha com os de outras doenças como gripes, pneumonia, tuberculose. Por este motivo, a detecção rápida da histoplasmose é essencial para a definição do diagnóstico e tratamento adequado tanto em pacientes imunodeprimidos como em imunocompetentes (CASOTTI et al., 2006). O isolamento e identificação do fungo é padrão ouro para confirmação do diagnóstico através de procedimentos microbiológicos, porém o cultivo de H. capsulatum é bastante demorado. Técnicas imunológicas podem fornecer um diagnóstico rápido e presuntivo de infecções agudas, na sua fase inicial ou crônicas. Dentre as principais técnicas sorológicas utilizadas para detecção de anticorpos da histoplasmose podemos destacar a imunodifusão dupla em gel e reação de fixação do complemento, apontados como testes de referência quando usadas conjuntamente. Porém estas metodologias apresentam limitações no que diz respeito ao diagnóstico da forma disseminada da histoplasmose, podendo apresentar resultados falso-negativos e reações cruzadas com outros patógenos (GUIMARÃES et al., 2006). Foi demonstrado que ensaios imunoenzimáticos, tais como Western blot e ELISA apresentaram bom rendimento para detecção de anticorpos na histoplasmose (PIZZINI et al., 1999). A detecção do antígeno em fluidos corporais para diagnóstico da histoplasmose disseminada pode ser mais efetivo do que métodos que visam detecção de anticorpos (KLOTZ et al., 1986). A técnica de Radioimunoensaio (RIA) é bastante eficaz na identificação do antígeno polissacáride e demonstra alta sensibilidade em pacientes com HIV e histoplasmose disseminada. Um Elisa de inibição (inh- ELISA) é uma técnica de

diagnóstico onde utiliza-se anticorpos monoclonais e que apresenta percentuais de sensibilidade e especificidade que variam de acordo com a forma clínica da doença, empregado em amostras de urina de pacientes (GOMEZ et al., 1997; 1999). Métodos moleculares vem sendo descritos visando aplicação no diagnóstico da histoplasmose. Reação em cadeia da polimerase (PCR) tendo como alvo o gene do antígeno M de H. capsulatum já foi descrito e demonstrou uma sensibilidade de 70% e especificidade de 100%. Recentemente foi desenvolvido um Nested real time PCR utilizando a região do DNAr e também regiões específicas como o gene que codifica a proteína Hc100 (100kDa) onde a sensibilidade variou de 33 a 77% (GUEDES HL et al., 2003; BRILHANTE et al., 2016; MURAOSA et al., 2016).

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Realizar uma revisão de literatura científica comparando metodologias tradicionais e alternativas para o imunodiagnóstico da histoplasmose.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Revisar informações gerais sobre a histoplasmose: o agente etiológico, epidemiologia, fatores de virulência, a patogenia, as manifestações clínicas, tratamento;

Pesquisar sobre o diagnóstico micológico, histopatológico, diagnóstico molecular com enfoque no sorodiagnóstico baseado na detecção de antígenos e anticorpos;

Comparar o emprego das metodologias moleculares baseadas em proteínas utilizadas para detecção indireta de Histoplasma capsulatum no hospedeiro.

3. METODOLOGIA

A revisão literária incluiu artigos originais e utilizou como seleção as seguintes plataformas de consulta: PubMed (Public Medical Literature Analysis and Retrieval System Online), Scielo (Scientific Eletronic Library Online) e Google acadêmico. Foram utilizados também livros de editoras nacionais e internacionais.

Os descritores utilizados para a busca de artigos foram: “histoplasma capsulatum”, “micoses sistêmicas”, “infecções fúngicas”, “diagnóstico de histoplasmose”, “sorologia para histoplasmose” na língua portuguesa e diagnosis of histoplasmosis”, “immunodiagnostic of histoplasmosis”, na língua inglesa.

A seleção dos mesmos buscou citações referentes aos últimos 20 anos (1997 – 2017).

4. DESENVOLVIMENTO

4.1 HISTÓRIA DO AGENTE ETIOLÓGICO

A histoplasmose foi primeiramente descrita no ano de 1905 por Samuel Taylor Darling, patologista americano, que ao realizar a autopsia em um paciente negro de 27 anos, carpinteiro nativo do Panamá que apresentava anemia, leucopenia, febre e hepatoesplenomegalia, Darling encontrou dentro de macrófagos alveolares parasitas intracelulares com corpos ovais de aproximadamente 3 µm de diâmetro. O parasita recebeu o nome de Histoplasma capsulatum baseado na presença no mesmo no interior de histiócitos (DARLING; ZONE, 1909).Darling sempre procurava em suas necropsias casos suspeitos de leishmanioses, dando-lhe preferência a doentes que haviam falecido com quadro de leucopenia, febre e hepatoesplenomegalia. Três anos depois, Darling relatou mais dois casos fatais da nova doença que envolvia um paciente chinês que residia há 15 anos no Panamá e um negro martinicano. Pela semelhança com as características da leishmaniose visceral, o agente etiológico da histoplasmose foi incorretamente classificado como um protozoário encapsulado chamado de Histoplasma capsulatum (GOODWIN; PREZ, 1978). Em Berlim no ano de 1912, o patologista e infectologista brasileiro Henrique da Rocha Lima revendo o material de Darling chegou à conclusão que o processo era micótico demonstrando a natureza fúngica da histoplasmose. Somente em 1934, H. capsulatum foi corretamente identificado como fungo de dimorfismo térmico por De Monbreum que produziu infecções experimentais em animais de laboratório (De MONBREUM, 1934). Em 1949, Emmons realizou o primeiro isolamento de H. capsulatum através de amostras de solo recolhidas de tocas de ratos com histoplasmose (POND, 1949).

4.2 HISTOPLASMA CAPSULATUM

A histoplasmose é uma micose sistêmica causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum, que apresenta duas variedades: var. capsulatum e var. duboisii, que são infectantes a indivíduos imunodeprimidos e imunocompetentes (LACAZ et al., 2002).Taxonomicamente, H. capsulatum é um eucarioto pertencente ao Reino Fungi e encontra-se na divisão (filo) Ascomycota, Classe Eurotiomycetes, Ordem Onygenales, Família Ajellomycetaceae, Gênero Histoplasma, Espécie Histoplasma capsulatum (KASUGA et al., 2003). H. capsulatum é um fungo saprófita e solos contaminados com fezes de aves e morcegos servem como reservatório para o mesmo. As fezes desses animais são formadas por fontes de compostos nitrogenados, que são nutrientes necessários para o crescimento desse fungo. Histoplasma capsulatum pode ser encontrado em ocos de árvores, construções abandonadas e inacabadas, cavernas e grutas habitadas por morcegos (AIDÉ, 2009; ZANCOPÉ-OLIVEIRA; TAVARES; MUNIZ, 2005). O fungo H. capsulatum apresenta-se sob duas formas, miceliana e leveduriforme. Em forma de micélio ou também chamada filamentosa, cresce em uma temperatura de 25°C, é composto de hifas hialinas, septadas e ramificadas, que produzem microconídios geralmente esféricos, medindo de 2-4 µm (infectantes ao homem) e macroconídios que medem em torno de 8-20 µm (podem ou não ser tuberculados). Na forma parasitária ou em cultivo a 37ºC, o fungo é encontrado sob a forma leveduriforme, que são estruturas unibrotantes e arredondadas, medindo de 2-5 µm de diâmetro (Ilustração 1) (ZANCOPÉ-OLIVEIRA et al., 2013).

Ilustração 1: Diferenciação celular de Histoplasma capsulatum. A) Cultivo da fase leveduriforme do fungo por 72h à 37°C, aspecto microscópico de levedura unibrotante. B) Cultivo da fase de transição de levedura para micélio por 48h à 25°C, aspecto microscópico de algumas hifas hialinas septadas em formação. C) Cultivo da fase filamentosa do fungo por 96h à 25°C, aspecto microscópico de hifas hialinas septadas e presença de microconídios e dos macroconídios tuberculados (Fonte: Cortesia de MARCOS DE ABREU ALMEIDA).

4.3 EPIDEMIOLOGIA

A histoplasmose possui maior prevalência em zonas tropicais e temperadas. Essa micose sistêmica é amplamente distribuída no continente americano, mais especificamente na região centro-oeste dos Estados Unidos, onde estão localizados os vales dos Rios Mississipi e Ohio e na região dos Grandes Lagos. Na América do Sul, os países da Argentina, Venezuela, Equador, Paraguai, Uruguai, Colômbia e Brasil possuem alta incidência da doença. Países da América Central como México, Panamá, Guatemala, Honduras e Nicarágua também apresentam alta predominância da doença. Parte do continente africano é acometida com casos esporádicos de histoplasmose, sendo a espécie Histoplasma duboisii responsável pela infecção. Poucos casos reportados na Ásia e Europa conforme na ilustração 2, são referentes a indivíduos que viajaram para áreas endêmicas e se infectaram com H. capsulatum regressando com a doença latente para suas residências(COLOMBO et al., 2011; PANACKAL et al., 2002).

Ilustração 2: Distribuição geográfica de H. capsulatum var. Capsulatum (roxo) e H. capsulatum var. Duboisii (área sombreada). Os círculos indicam o número de casos publicados de histoplasmose autóctone associada ou não à AIDS. A maioria dos casos africanos foi observada fora da África (WHEAT, LAWRENCE J. et al., 2016).

No Brasil, as epidemias de histoplasmose ocorrem em áreas endêmicas e não- endêmicas de acordo com a exposição a locais contaminados com H. capsulatum. As microepidemias no país estão relacionadas a grupos de indivíduos que foram infectados após visitas a grutas habitadas por morcegos, galinheiros ou pombais (ROSSINI, 2006). Em oito estados brasileiros já foram registradas 26 microepidemias em um curto espaço de tempo, são eles: Amazonas, Bahia, Distrito Federal, Minas Gerais, Paraíba, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul e São Paulo (AIDÉ, 2009). Pesquisas recentes revelaram a ocorrência de histoplasmose em outros estados, como do Maranhão e Piauí, o que remete a existência de microfocos também nessas regiões do país (FILHO et al., 2009). A real prevalência da doença no Brasil é subestimada pela falta de métodos diagnósticos mais eficazes, associada a não notificação dos casos constatados da doença aos órgãos de saúde. As áreas em que o índice de histoplasmose é endêmico estão localizadas entre as regiões centro-oeste e sudeste e isto se deve pelo fato dessas regiões apresentarem condições favoráveis para o crescimento fúngico associadas ao clima moderado com umidade constante (Ilustração 3).Numerosos inquéritos epidemiológicos realizados no Brasil, através da reatividade

intradérmica àhistoplasmina, demonstraram expressivos índices de positividade da infecção nas diferentes regiões do país (GUIMARÃES et al., 2006).

Ilustração 3: Distribuição da histoplasmose no Brasil, conforme indicado pela positividade do teste cutâneo de histoplasmina. No Brasil, as áreas endêmicas estão localizadas entre a região centro-oeste e sudeste, onde a prevalência gira em torno de 4.4 – 63% e 3.0 – 93,2%, respectivamente. Geralmente as condições ambientais presentes em áreas de alta endemicidade são um clima moderado com umidade constante (Adaptado de GUIMARÃES et al., 2006).

4.4 FATORES DE VIRULÊNCIA

O H. capsulatum apresenta diversos fatores de virulência que favorecem a adesão fúngica, colonização, disseminação e habilidade para sobreviver a ambientes desfavoráveis driblando os mecanismos de defesa do sistema imunológico do hospedeiro (KUROKAWA et al., 1998). Um dos principais fatores de virulência de H. capsulatum é o dimorfismo, um aspecto considerável na patogênese da doença, visto que a forma filamentosa é a que garante a infecção e a forma leveduriforme a que parasita o homem causando a doença (NEMECEK, 2006). A expressão de vários genes específicos da fase leveduriforme de H. capsulatum tem relação com a virulência fúngica, em resposta a altas temperaturas e

outras condições adversas; genes relacionados à transição de fases do desenvolvimento e a presença de uma estrutura polissacarídica na parede celular, composta por galactomananasα -1,3 glucana, β -1,3 glucano, quitina, proteínas e lipídeos. A fase de transição do fungo estimulada pela temperatura pode alterar a biossíntese de glucanos, ou seja, a síntese do α-1,3 glucano é uma particularidade própria da fase leveduriforme de H. capsulatum. Esta estrutura interfere na ativação das células do sistema imune o que permite sua permanência dentro dos fagolisossomos e está diretamente ligado à virulência das cepas (RIBEIRO, 2012). Em parte, o β -1,3 glucano que é prevalente na fase filamentosa atuam na organização de mediadores inflamatórios (TNF-α) e no recrutamento de leucócitos (KUROKAWA et al., 1998). O galactomanano está localizado na parte externa da parede celular, sendo considerado um polissacarídeo antigênico desse fungo (HOLBROOK; RAPPLEYE, 2008). Algumas cepas de H. capsulatum, possuem melanina aderidas a parede celular. Esse pigmento fúngico auxilia na proteção do fungo contra fatores ambientas como intensas temperaturas, mecanismos de defesa do sistema imune do hospedeiro e tratamento com antimicrobianos. Por ventura, este mesmo pigmento interfere na ação de antifúngicos, reduzindo a sensibilidade de H. capsulatum a drogas como a anfotericina B e a caspofungina(DUIN; CASADEVALL; NOSANCHUK, 2002). Outro fator de virulência de extrema importância que envolve alguns fungos patogênicos, incluindo H. capsulatum, é a capacidade de tolerar a espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS). Isso ocorre devido a uma enzima chamada catalase que decompõem H2O2 (peróxido de hidrogênio) em H2O e O2,que é encontrada em todos os organismos aeróbicos e funciona como uma proteção a mecanismos oxidativos do hospedeiro (MARESCA; KOBAYASHI, 2000). Sendo assim, H. capsulatum, quando fagocitado por macrófagos, poderia secretar a catalase no interior dos fagolisossomos impedindo a oxidação das suas estruturas fúngicas, escapando de uma lise celular. O gene yps-3 é encontrado especialmente na fase leveduriforme de H. capsulatum. Atualmente, alguns estudos proteômicos obtiveram achados de uma proteína codificada (YPS3p) encontrada tanto como constituinte da parede da célula fúngica como uma molécula secretada. Embora a função exata dessa proteína ainda for desconhecida, ela tem sido associada com a virulência de algumas cepas visto que o

silenciamento deste gene diminui a virulência in vitro e durante a infecção murina. (BOHSE; WOODS, 2005; RAPPLEYE; ENGLE; GOLDMAN, 2004).

4.5 PATOGENIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS

A infecção humana ocorre através da via respiratória, onde os esporos infectantes inalados pelo hospedeiro alcançam os alvéolos pulmonares, induzindo a uma estimulação de resposta inflamatória por parte do hospedeiro como observado na ilustração4. Macrófagos e células reticuloendoteliais do local, fagocitam os conídios e leveduras onde os mesmos podem sobreviver dentro de estruturas chamadas fagolisossomos (GILDEA et al., 2005). As leveduras de H. capsulatum quando se encontram no interior de macrófagos, elas se multiplicam e deslocam-se até os linfonodos hílares e mediastinais atingindo a circulação sanguínea podendo obter acesso para outros órgãos como baço, fígado, medula óssea entre outros (CONCES, 1996). A manifestação clínica da histoplasmose vai desde infecção assintomática a disseminação hematogênica (GOODWIN, 1978).

Ilustração 4: Ciclo biológico do fungo Histoplasma capsulatum no hospedeiro. (A) Aves e morcegos deixam suas excretas em solo onde ocorre o crescimento fúngico; (B) O homem inala os microconídios infectantes presentes no ambiente; (C) após a inalação, ocorre à transição da fase filamentosa para leveduriforme nos alvéolos pulmonares, forma esta que parasita o homem causando a doença; macrófagos fagocitam as leveduras de H. capsulatum (adaptado de MURRAY et al., 2006).

O desenvolvimento de infecção assintomática ou sintomática na histoplasmose é diretamente dependente do estado de competência imunológica do hospedeiro, da virulência da cepa infectante e da carga parasitária adquirida (COLOMBO et al., 2011).A grande maioria dos pacientes expostos a H. capsulatum permanecem assintomáticos ou desenvolvem apenas sintomas leves, que nunca são reconhecidos como sendo devidos à esta doença. A histoplasmose pulmonar aguda é evidente após incubação de um período de 14 dias, e são caracterizadas por febre, calafrios, dispnéia e tosse. Radiografias do tórax geralmente demonstram opacidades irregulares bilaterais difusas com hilar visível e adenopatia mediastinal (Ilustração 5) (BUXTON et al., 2002).

A infecção pulmonar crônica desenvolve-se geralmente em indivíduos que já possuem uma doença pulmonar adjacente, em especial indivíduos tabagistas com mais de 50 anos de idade (FERREIRA; BORGES, 2009). Os sintomas mais comuns são febre, tosse produtiva, dor retroesternal, suores noturnos, perda de peso, mas normalmente se repetem em crises de exacerbação, acompanhadas de agravamento radiográfico.As radiografias de tórax mostram infiltrados irregulares, na maioria das vezes nos lobos superiores que eventualmente consolidam progresso a áreas que se assemelham a cavitação representando a inflamação circundante bolhas pré-

existentes(KENNEDY; LIMPER, 2007). De muitas maneiras, a síndrome se assemelha a uma tuberculose pulmonar (Ilustração 6).

Ilustração 6: Radiografia do tórax de paciente com histoplasmose pulmonar crônica, sendo visível cavitações e perda de volume no pulmão direito (FERREIRA; BORGES, 2009).

A histoplasmose disseminada (HD) ocorre especialmente em indivíduos HIV positivos, porém um estudo de caso recente no leste da Índia identificou uma mulher de 35 anos de idade imunocompetente que apresentou linfadenopatia generalizada com quatro meses de duração. A mesma foi clinicamente diagnosticada com linfoma Não Hodgkin erradamente. O médico cirurgião responsável fez uma biópsia excepcional de um linfonodo. Seções histopatológicas apresentaram tecido repleto de histiócitos aumentados com citoplasma repletos de H. capsulatum e células inflamatórias no mesmo local(REPORT, 2017). Os sintomas de HD são os de uma infecção grave com febre, sudorese, cansaço, hemorragia intestinal e conjuntamente hepatoesplenomegalia, hipertrofia ganglionar e ulcerações das mucosas(WHEAT, LAWRENCE J. et al., 2016).Exames laboratoriais geralmente apontam anemia, trombocitopenia, leucopenia e o aumento das enzimas hepáticas e bilirrubina(KAUFFMAN, 2007). É considerada a forma clínica mais grave da histoplasmose, em que a multiplicação do fungo não só acontece nos pulmões, mas também em órgãos extrapulmonares (KNOX; HAGE, 2010).

4.6 TRATAMENTO

Em indivíduos saudáveis a histoplasmose normalmente não necessita de tratamento posto que o próprio sistema imunológico do hospedeiro é capaz de combater o agente etiológico desta infecção.As principais exceções são indivíduos saudáveis com exposição recente a um sítio contaminado com o organismo, em que o tratamento profilático com antifúngicos mais fracos como o fluconazol, também utilizado no tratamento geralmente é recomendado para encurtar a duração da doença e prevenir a ocorrência rara de histoplasmose disseminada. Por outro lado, a histoplasmose na maioria dos indivíduos imunodeprimidos é de forma progressiva e o tratamento sempre é recomendado (SATHAPATAYAVONGS et al., 1983; MYINT et al., 2014). A escolha do tratamento correto depende do estado imunológico do paciente e da gravidade em que se encontra a doença. O H. capsulatum é vulnerável a diversos antifúngicos, como a anfotericina B, itraconazol e fluconazol. Atualmente a anfotericina B é a droga mais eficaz no tratamento desta doença, principalmente nos casos disseminados. O fluconazol tem se apresentado menos eficaz no tratamento da histoplasmose em pacientes com AIDS e geralmente só é utilizado como terapia alternativa quando o paciente demonstra intolerância ao mesmo ou apresenta doença renal (WHEAT, JOSEPH, 1995; WHEAT, L JOSEPH et al., 2007). Maior parte dos pacientes com histoplasmose pulmonar aguda não necessita de tratamento antifúngico, uma vez que é uma infecção moderada e a recuperação ocorre no prazo de quatro a sete semanas após o início dos sintomas. Aqueles que manifestam sintomas por longo tempo devem ser tratados com itraconazol (200mg) uma ou duas vezes por dia, durante seis a doze semanas. O tratamento da forma pulmonar crônica é fundamental por ser uma doença de curso progressivo e fatal, onde se deve fazer o uso deitraconazol (200 mg) com acompanhamento cuidadoso para a detecção de recidivas. A anfotericina B só é administrada em pacientes que necessitam de internação ou são inaptos de absorver o itraconazol por via oral (WHEAT, JOE et al., 2017; WHEAT, L JOSEPH et al., 2007). Um relato de caso envolvendo um paciente do sexo masculino com 27 anos de idade nativo de Parintins, Amazonas, com quadro de histoplasmose disseminada cutânea, confirmada pelo exame histopatológico, tinha sorologia positiva para HIV há

seis meses e não fazia TARV. O mesmo apresentava sintomas como mal-estar geral, perda ponderal, linfoadenomegalia axial e lesões cutâneas (Ilustração7A). A contagem de linfócitos T CD4+ era 42 células/mm3e a carga viral 153.024 cópias RNA/ml, o que confirmou o diagnóstico de AIDS. O paciente foi tratado inicialmente com anfotericina B (dose de 0,5g) e TARV (zidovudina 600mg/dia, lamivudina 300mg/dia e efavirenz 600mg/dia), apresentando boa resposta terapêutica. Após a alta hospitalar e regressão das manifestações cutâneas, a anfotericina B foi substituída por itraconazol (200mg/dia), por via oral, durante 30 dias; logo após, a dose foi diminuída para 100mg/dia. As manifestações cutâneas regrediram e meses depois o paciente interrompeu, voluntariamente, o tratamento antifúngico (Ilustração7B). Nesse momento, a contagem de células TCD4+ era 434 células/mm3 e a carga viral do HIV-1 indetectável. O estudo demonstrou a eficácia da anfotericina B/ itraconazol associada à TARV em aidéticos que apresentam histoplasmose disseminada cutânea(TALHARI; RIBEIRO-RODRIGUES, 2011).

Ilustração 7: A. Paciente antes do início do tratamento; B. Paciente após o tratamento com anfotericina B/itraconazol ( Adaptado de TALHARI; RIBEIRO-RODRIGUES, 2011).

4.7 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

O diagnóstico da histoplasmose é estabelecido através da avaliação clínica (que engloba os sintomas da doença), epidemiológica, radiológica e laboratorial. Ainda que as manifestações clínicas sejam bem definidas, o diagnóstico dessa doença não pode ser só fundamentado com base nos aspectos clínicos e radiológicos uma vez que existe uma sobreposição considerável da histoplasmose com outras infecções sistêmicas. Desse modo, o diagnóstico definitivo da histoplasmose deve ser confirmado através das técnicas laboratoriais como as técnicas micológicas, histopatológicas, moleculares e imunológicas (GUIMARÃES et al., 2006; AKRAM; KOIRALA, 2017).

4.7.1 DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO

O diagnóstico definitivo da histoplasmose requer o isolamento do fungo H. capsulatum em meios de cultura específicos ou a visualização de formas leveduriformes do fungo em materiais biológicos (GUIMARÃES et al., 2006).O material a fresco usado no exame direto são tratados com hidróxido de potássio (KOH) a 10% e podem ser corados pela hematoxilina-eosina (HE) ou por impregnação pela prata, porém tem pouco valor pois se trata de um parasita com pequenas dimensões e de difícil diferenciação (SIDRIN; ROCHA, 2004).

Considerado padrão ouro no diagnóstico da histoplasmose, a obtenção de cultura fúngica de Histoplasma capsulatum é um procedimento que demanda tempo mínimo de quatro semanas para crescimento em meio de cultura específico, sendo ainda necessária a conversão da fase miceliana do fungo para a leveduriforme, aumentando o tempo para diagnóstico definitivo. As amostras devem ser cultivadas a 37° podendo ser utilizados para o cultivo meios como ágar batata, ágar-Sabourad dextrose (acrescido ou não de clorofenicol e cicloeximida) ou ágar BHI (ágar-infusão cérebro-coração). Quando incubados a 25°C as colônias do fungo são inicialmente lisas, mas com o tempo tornam- se filamentosas algodonosas e acastanhadas. Microscopicamente são observadas finas hifas hialinas, septadas e ramificadas compostas de microconídios e macroconídios (tuberculados) (Ilustração8A). A conversão da forma filamentosa para a forma leveduriforme é necessária para a confirmação do diagnóstico, pois essas estruturas

podem ser confundidas com estruturas de outros fungos saprófitas dos gêneros Chrysosporium e Sepedonium (WANKE; LAZÉRA, 2004). A transformação para a fase leveduriforme pode ocorrer quando a cultura de H. capsulatum é incubada a 35-37°C (semelhante à temperatura corporal humana), formando colônias de coloração branca a marrom de superfície lisa e textura cremosa. Porém a conversão não acontece facilmente, necessitando de nutrientes especiais dependendo das características fisiológicas de cada cepa. Microscopicamente observam-se pequenas leveduras redondas ou unibrotantes (Ilustração 8B). É interessante ressaltar que o manuseio das culturas de H. capsulatum é um procedimento considerado de risco para quem os manipula, e devem ser realizados em laboratórios com nível de biossegurança 3 (GUIMARÃES et al., 2006).

Ilustração 8: Histoplasma capsulatum. A. forma filamentosa a 25ºC, aspecto macromorfológico em ágar batata dextrose, comprovando colônia algodonosa branca e ao lado micromorfologicamente mostrando hifas e os macroconídios tuberculados em lactofenol azul de algodão; B. forma leveduriforme a 35°C em ágar-BHI comprovando colônias de aspectos úmidos de coloração branco-amarelada e ao lado micromorfologicamente mostrando estrutura leveduriforme com brotamento em lactofenol azul de algodão (GUIMARÃES et al., 2006).

4.7.2 DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO

O estudo histopatológico é feito através da visualização das leveduras de H. capsulatum dentro de células do sistema imune como macrófagos ou monócitos e também fora delas. As amostras biológicas mais empregadas para o exame direto são: escarro, líquido cefalorraquidiano (LCR), lavado broncoalveolar (LBA), aspirado de medula óssea e biópsias.

As leveduras aparecem como um corpúsculo ligeiramente basofílico, esférico ou ovalado, cercadas por um halo claro delimitado por uma parede celular fina. Os cortes histológicos de vários tipos de tecidos (pulmão, linfonodo, medula óssea e fígado) revela a presença de granulomas, com ou sem necrose de caseosa (degeneração onde o tecido se transforma em matéria seca e amorfa), em indivíduos imunocompetentes, ao mesmo tempo em que indivíduos imunocomprometidos a presença de granulomas frouxo, agregados linfo-histiocitários (de macrófagos inativos) ou somente infiltrado mononuclear difuso é frequentemente encontrado (AIDÉ, 2009).

A colheita histológica deve ser realizada da seguinte maneira: em caso de biópsias deve-se colocar a amostra entre duas gazes estéreis umedecidas com água destilada ou soro fisiológico, acondicionando em recipiente estéril para transporte. O processamento é caracterizado pelo corte histológico em pequenos fragmentos seguido de maceração. Em aspirados como de medula óssea e lavado broncoalveolar ou escarro, deve ser feito o armazenamento do material em tubo estéril e imediatamente realizar o exame direto a fresco após a coloração (GUARNER; BRANDT, 2011).

A técnica de coloração comumente usada na rotina laboratorial é a hematoxilina- eosina (HE), porém não permite a visualização das leveduras pequenas minúsculas, sendo assim, necessário o uso de colorações mais específicas como a prata (Gomori metenamina ou Grocott) e PAS (ácido periódico de Schiff) que permitem uma melhor visualização fúngica. A prata metenamina Gomori é considerada melhor técnica de coloração porque oferece bom contraste e frequentemente cora células fúngicas que são resistentes ao PAS (Ilustração 9) (WHEAT, L JOSEPH et al., 2016).

Ilustração 9: Aspecto histopatológico de amostra da medula óssea, mostrando leveduras de Histoplasma capsulatum corados pela prata (adaptado de KAUFFMAN, 2009).

Dificuldades de interpretação no exame histopatológico podem acontecer devido ao fato da estrutura das leveduras de H. capsulatum serem similares as de outros patógenos como Candida glabrata, Penicillium marneffei, Pneumocystis jirovecii, Cryptococcus neoformans, Toxoplasma gondii e Leishmania donovani, levando a resultado falso-positivos(AZAR; HAGE, 2017). Desta forma, é interessante estar familiarizado com a morfologia destes agentes patogênicos e com suas características de coloração por diferentes métodos (GUIMARÃES et al., 2006).

4.7.3 DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Com o objetivo de melhorar o diagnóstico da histoplasmose, novas técnicas moleculares têm sido utilizadas na detecção e sequenciamento de DNA e RNA e estão dando suporte aos métodos tradicionais oferecendo uma maior rapidez assim como sensibilidade e especificidade no diagnóstico da histoplasmose (PRACTICE; DIAL, 2007). A técnica de PCR é uma técnica segura na qual ocorre à rápida degradação do patógeno por meio da extração do material genético, limitando o risco de contaminações laboratoriais permitindo um diagnóstico precoce antes da cultura se tornar positiva. Apesar de oferecer vantagens, essa técnica não substitui a obtenção do isolamento do agente etiológico, mas acrescenta muito ao conjunto de métodos diagnósticos(BUITRAGO et al., 2006). Diferentes alvos moleculares têm sido

utilizados nas reações de PCR para o reconhecimento de Histoplasma capsulatum. O mais utilizado recentemente é feito através de DNA ribossomal (DNAr), que apresenta uma série repetitiva de três regiões gênicas (18S, 5.8S e 28S) e duas regiões espaçadores intergênicas (ITS). As regiões ITS estão localizadas entre as regiões gênicas 18S e 28S, apresentam níveis de variações medianas, o que a torna apropriável para a identificação de gênero e/ou espécie, particularmente na revelação de polimorfismos do agente em questão(JIANG et al., 2000).

A utilização do DNAr na identificação de H. capsulatum é devido a alta sensibilidade que ele apresenta, posto que várias copias estão presentes no genoma. Entretanto, altas taxas de resultados falso-positivos foram encontradas ao utilizar a região 18S do RNAr como finalidade, o que sugere a utilização de uma nova região alvo complementar no intuito de obter uma técnica de PCR com alta especificidade(BIALEK et al., 2002). Estudos recentes têm avaliado técnicas como Nested PCR para o reconhecimento de H. capsulatum utilizando a região do DNAr e também regiões específicas como o gene que codifica a proteína Hc100 (100kDa), proteína esta fundamental para a supervivência de H. capsulatum na célula humana e o gene que codifica o antígeno M (glicoproteína fúngica que ativa a resposta imune humoral e celular no hospedeiro humano) de H. capsulatum. Desse modo, a busca por novas sequências alvo é fundamental para que se consiga uma técnica molecular de alta especificidade e sensibilidade auxiliando no diagnóstico rápido e seguro da histoplasmose(AZAR; HAGE, 2017).

4.7.4 IMUNODIAGNÓSTICO

O imunodiagnóstico da histoplasmose baseia-se na identificação indireta da infecção por H. capsulatum, por meio da detecção de antígenos e/ou anticorpos específicos em fluidos orgânicos (ZANCOPÉ-OLIVEIRA et al., 2013). O principal complexo antigênico usado para fins diagnósticos na histoplasmose é a histoplasmina, um filtrado de cultura na forma filamentosa crescido em meio sintético de H. capsulatum. Os principais componentes desse complexo são as glicoproteínas H e M consideradas espécie-específicas no diagnóstico da histoplasmose e o antígeno C, o qual foi caracterizado como uma galactomanana responsável pelas reações cruzadas compartilhadas pelos principais fungos dimórficos (ZANCOPÉ- OLIVEIRA et al., 1994; GUIMARÃES et al., 2011). Vale ressaltar que o teste cutâneo com histoplasmina é somente usado em investigação epidemiológica e nunca para se diagnosticar a doença. O teste é dado como positivo caso no local da inoculação ocorra a formação de uma pápula ou nódulo medindo mais que 5 milímetros de diâmetro, a leitura deve ser realizada 48 e 72 horas após a aplicação do antígeno (AIDÉ, 2009).

Os testes sorológicos direcionados para diagnóstico da histoplasmose propiciam a obtenção de resultado com maior rapidez, sendo extremamente uteis quando comparados com o tempo necessário para a obtenção da cultura. Grande parte dos ensaios sorológicos apresentam sensibilidade superior a 90% e são fundamentais para diagnosticar infecções agudas, na sua fase inicial e infecções disseminadas (ALMEIDA et al., 2016).

As reações de imunodifusão dupla em gel (ID) e fixação do complemento (RFC) são apontadas como metodologias empregadas para a detecção de anticorpos de Histoplasma capsulatum e quando usadas conjuntamente apresentam alta especificidade e sensibilidade (GUIMARÃES et al., 2006).A RFC fundamenta-se na capacidade de complexos antígeno-anticorpo se fixarem e inativar moléculas de complemento presentes no soro, seguidos por um sistema indicador composto de hemácias de carneiro revestidas de anticorpos anti-hemácias usado para revelar se houve ou não o consumo do sistema complemento pelo imunocomplexo que está sendo pesquisado.Na presença de complemento, a ligação desses anticorpos a membrana dos eritrócitos recruta moléculas do complemento resultando em hemólise positivando o teste. Na ausência de

complemento ativo (ou livre), a ligação dos anticorpos na membrana dos eritrócitos não ocasiona qualquer alteração, pois as mesmas são dependentes do complemento o que torna o teste negativo. A RFC nos últimos anos vem sendo menos utilizada em laboratórios, devido ao surgimento técnicas mais práticas, sensíveis e automatizadas como a de Imunodifusão dupla em gel(AKRAM; KOIRALA, 2017).

A ID é um teste qualitativo que está apoiado na detecção de anticorpos produzidos contra o antígeno H e M de H. capsulatum que apresenta sensibilidade de 70% e 100% de especificidade. Por oferecer valores de sensibilidade e especificidade relativamente satisfatórios, ser de fácil execução e baixo custo este teste tornou-se utilizado por muitos laboratórios. A linha H usualmente coexiste com a linha M, no entanto, frequentemente a linha M se apresenta como única. A linha H geralmente aparece depois da linha M, e está presente no soro de pacientes com histoplasmose ativa, e em alguns casos persiste por um a dois anos após a recuperação (Ilustração 10) (WHEAT, JOSEPH; HAGE, 2001). Anticorpos anti-M são desencadeados na histoplasmose aguda ou crônica e em parte dos indivíduos sensibilizados após o teste cutâneo com histoplasmina (KAUFFMAN, 2007). As precipitinas aparecem após a exposição de 3 a 5 semanas e após o surgimento dos anticorpos fixadores do complemento (ZANCOPÉ-OLIVEIRA et al., 1994).

H M

Contudo, estes testes apresentam limitações, pois anticorpos anti-histoplasma podem ocasionar reação cruzada em pacientes que possuem outros tipos de infecções sistêmicas fúngicas como blastomicose, coccidioiodomicose, aspergilose e paracoccidioidomicose.

Testes de aglutinação em partícula de látex foram desenvolvidos para diagnosticar histoplasmose com o intuito de eliminar reações cruzadas e elevar a sensibilidade, porém apresenta resultado falso-positivo em pacientes com tuberculose (DISALVO; CORBETT, 1976; LAND; FOXWORTH; SMITH, 1978; GUIMARÃES etal., 2006). Neste teste, as partículas de látex recobertas com anticorpos específicos anti-polissacáride capsular de Histoplasma capsulatum reagem com o antígeno presente na amostra provocando uma reação de aglutinação proporcional à concentração de antígenos existentes. A técnica de Western Blot (WB) tem sido utilizada com sucesso para o diagnóstico da histoplasmose. Estudos demonstram que quando o antígeno histoplasmina purificado e deglicosilado (pt-HMIN) é empregado nesta técnica, apresenta alta especificidade e melhora na sensibilidade (PIZZINI et al., 1999). Por essa razão, tem-se recomendado a associação das técnicas de Imunodifusão dupla em gel e Western blot para o diagnóstico da histoplasmose nas fases agudas da doença e disseminadas graves (ALMEIDA et al., 2016). Na técnica de WB as proteínas são separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida. A eletroforese proporciona a migração de partículas carregadas (as proteínas) em um solvente condutor, sob a influência de um campo elétrico. Ao final da eletroforese, as proteínas separadas no gel são transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A membrana passa a conter, então, a impressão ou cópia das proteínas separadas durante a eletroforese. A partir de então, o procedimento para a detecção de anticorpos segue o protocolo de um ensaio imunoenzimático convencional, ou seja, incuba-se as fitas com o soro suspeito por uma hora em tampão de incubação a temperatura ambiente, seguida de 3 lavagens com tampão especifico. Incuba-se as fitas com anticorpo secundário conjugado a uma enzima, realiza-se novamente as três lavangens e ao fim é aplicado o substrato da reação para visualização das bandas.

A detecção antigênica em fluidos corporais é constantemente utilizada para se diagnosticar a histoplasmose na fase aguda da infecção e fazer o acompanhamento de pacientes que apresentam a forma disseminada da doença (WHEAT, L JOSEPH et al., 2016). Um método amplamente utilizado é o Radioimunoensaio (RIA) que pode ser realizado em espécimes clínicos como urina e soro, com base na detecção de um antígeno polissacarídeo de H. capsulatum empregando soro de coelho policlonal. Neste teste, ocorre a competição do antígeno a ser detectado na amostra com o antígeno radiomarcado pelos receptores da molécula de anticorpos fixados na fase sólida em uma única etapa, seguido de lavangens e leitura. O RIA tem sido particularmente efetivo, demonstrando sensibilidade de 92% em pacientes com HIV e histoplasmose disseminada, uma vez que os títulos de anticorpos estão escassos ou baixos para acompanhamento do paciente. Em geral, os pacientes com histoplasmose disseminada possuem altos níveis de antígenos para Histoplasma capsulatum, além de ser importante para o diagnóstico, é vantajoso para monitoração do tratamento.O antígeno é menos detectável nas formas pulmonar aguda e crônica da histoplasmose (WHEAT; KAUFFMAN, 2003). Outro método para detecção de antígenos é um Elisa de inibição (inh- ELISA), onde a placa é sensibilizada com antígeno de 70 kDa de interesse e ao mesmo tempo a amostra do paciente a ser analisada é adicionada em tubo estéril contendo os anticorpos monoclonais direcionados contra a mesma proteína. Após a incubação de ambos, ocorrendo presença de antígenos na amostra será formado do complexo AG-AC, e consequentemente quando esta solução for adicionada a placa não ocorrerá ligação com o antígeno que se encontra aderido a placa logo, o material será perdido quando forem realizadas as lavagens, então quando o conjugado e o substrato forem adicionados não ocorrerá reação, porém a resposta para essa amostra será positiva. O inh-ELISA é um bom método para diagnóstico quando utilizado em urina de pacientes com a forma pulmonar aguda e crônica da doença, apresentando sensibilidade de 71,4% e especificidade entre 86 e 98% (AZAR; HAGE, 2017).

5. CONCLUSÃO

O isolamento de Histoplasma capsulatum em cultura e a identificação da levedura no histopatológico são padrões ouro no diagnóstico da histoplasmose, porém, conforme já foi descrito, as colônias fúngicas crescem lentamente, além de que este fungo apresenta uma micromorfologia muito semelhante à de outros patógenos quando em parasitismo, o que leva a uma dificuldade na obtenção do diagnóstico definitivo. Infecções fúngicas sistêmicas como a histoplasmose, tem sido uma grande ameaça nas últimas décadas principalmente com o aumento do número de pacientes imunocomprometidos, decorrentes do uso de drogas imunossupressoras, infecção pelo HIV e terapia pós transplante. Por esse motivo, as dificuldades referentes ao diagnóstico laboratorial de micoses sistêmicas, induzem aos médicos uma estratégia de terapia empírica, levando a uma falha no tratamento da doença estabelecida proporcionando um maior custo no tratamento desses pacientes. Em casos como a forma disseminada da doença, o diagnóstico pode ocorrer de forma tardia após óbito do paciente. Deste modo o diagnóstico imunológico pode auxiliar fornecendo resultados de forma mais rápida e precisa. Na histoplasmose, o imunodiagnóstico tem sido usado rotineiramente auxiliando no diagnóstico dessa infecção. Os métodos moleculares apesar de oferecer vantagens não substituem a cultura fúngica, mas completam todo o conjunto de métodos diagnósticos.

Dada à importância do assunto, quando se trata de saúde pública no Brasil, a ideia de um diagnóstico rápido e preciso como o do imunodiagnóstico para a histoplasmose, deve ser levado em consideração relacionando-se as seguintes vantagens:

 Relação à exposição do laboratorista a agentes nocivos à saúde;  A agilidade na obtenção de resultados prevenindo o agravo da doença e facilitando o tratamento precoce de pacientes com HD;  Monitoramento do tratamento e detecção dos casos de recidivas;  Possibilidade de automatização, para que sejam realizados em órgãos públicos de saúde no Brasil.

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