Afrikkalaisten Combretum- Ja Terminalia-Lajien Uutteet, Fraktiot Ja Yhdisteet Ja Niiden Antimikrobiset Ominaisuudet

AFRIKKALAISTEN COMBRETUM- JA TERMINALIA-LAJIEN UUTTEET, FRAKTIOT JA YHDISTEET JA NIIDEN ANTIMIKROBISET OMINAISUUDET

Satu Helenius Pro gradu Helsingin yliopisto Farmasian tiedekunta Farmaseuttisen biologian osasto

Joulukuu 2013

SISÄLLYS

Lyhenteet ...... 3 I KIRJALLISUUSKATSAUS ...... 1 1. JOHDANTO ...... 1 2. AFRIKKALAINEN TERVEYDENHUOLTO ...... 2 2.1. Johdatus afrikkalaiseen terveydenhuoltoon ...... 2 2.2. Perinteinen lääketiede Afrikassa ...... 5 2.3. Kasvilääkinnän merkitys afrikkalaisessa terveydenhuollossa ...... 8 2.3.1. Perinteisen kasvilääkinnän heikkouksia ...... 11 2.3.2. Perinteisten lääkekasvien ekologinen käyttö ja luonnon monimuotoisuuden säilyttäminen ...... 12 2.4. Perinteisen lääketieteen asema Afrikan perusterveydenhuollossa ...... 15 3. COMBRETACEAE-HEIMO ...... 18 3.1. Combretaceae-heimon systematiikka, morfologia, levinneisyys ja kansanlääkinnällinen käyttö ...... 18 3.1.1. Combretum-suku ...... 18 3.1.2. Terminalia-suku ...... 20 3.2. Combretum- ja Terminalia-sukuihin kuuluvien lajien biologisesta aktiivisuudesta ja niiden sisältämistä yhdisteistä ...... 21 3.2.1. Antimikrobisesti aktiiviset uutteet ja yhdisteet ...... 21 3.2.2. Kombretastatiinit ...... 22 3.2.3. Ellagitanniinit ...... 24 3.2.4. Tanniinien erotusdiagnostiikasta ...... 27 3.3. Taustaa työssä käytetyistä mikrobeista ...... 29 4. TYÖN TARKOITUS JA TAUSTA ...... 31 II KOKEELLINEN OSUUS ...... 32 5. MATERIAALIT JA MENETELMÄT ...... 32 5.1. Kasvimateriaali ...... 32 5.2. Uuttomenetelmät ...... 32 5.2.1. Soxhlet-uutto ...... 32 5.2.2. Neste-neste-uutto ...... 33 5.3. Kromatografiset menetelmät ...... 34 5.3.1. Analyyttinen ohutkerroskromatografia ...... 34 5.3.2. Pylväskromatografia ...... 34 5.3.3. Preparatiivinen ohutkerroskromatografia ...... 36 5.4. Antimikrobiset kokeet ...... 36 5.4.1. Bakteerikannat...... 37 5.4.2. Agardiffuusiomenetelmä ...... 37 5.4.3. Mikrodiluutiomenetelmä ...... 38 6. TULOKSET JA TULOSTEN TARKASTELU ...... 41 6.1. Raakauutteiden ja neste-neste-uutto fraktioiden saannot ...... 41 6.1.1. Soxhlet-uuttomenetelmän saannot ...... 41 6.1.2. Neste-neste-uuton saannot ...... 42 6.2. Kromatografisten menetelmien tulokset ...... 45 6.2.1. Tulokset tutkittujen Combretum- ja Terminalia-lajien uutteiden kvalitatiivisesta koostumuksesta käyttäen analyyttistä ohutkerroskromatografiaa ...... 45 6.2.2. Terminalia kaiserana -lajin juuren kuoren raakauutteesta preparatiivisella Lobar RP-8 -pylväskromatografialla eristetyt fraktiot ...... 46 6.2.3. Terminalia kaiserana -lajin juuren kuoren raakauutteesta preparatiivisella ohutkerroskromatografialla saadut fraktiot ...... 48 6.3. Antimikrobiset vaikutukset ...... 50 6.3.1. Agardiffuusiomenetelmällä saadut tulokset neste-neste-uuttofraktioiden antibakteerista vaikutuksista ...... 50 6.3.2. Mikrodiluutiomenetelmällä saadut tulokset neste-neste-uuttofraktioiden antibakteerista vaikutuksista ...... 54 6.3.3. Mikrodiluutiomenetelmällä saadut tulokset Terminalia kaiserana -lajin juuren kuoren raakauutteesta preparatiivisella Lobar RP-8-pylväskromatografialla eroteltujen fraktioiden antimikrobisuudesta ...... 60 7. JOHTOPÄÄTÖKSET ...... 63 Kirjallisuusluettelo ...... 66

LYHENTEET

AAMPS Association of African Medicinal Plant Standars AI Activity index, aktiivisuusindeksi ATCC American Type Culture Collection BuOH Butanoli CA-1 Kombretastatiini A-1 CA-4 Kombretastatiini A-4 CA-4P Kombretastatiini A-4 fosfaatti CB-5 Kombretastatiini B-5 Cfu Colony forming unit, pesäkkeen muodostava yksikkö

CHCl3 Kloroformi Cr Crude extract, raakauute GC Growth Control, kasvukontrolli

H2O Deionisoitu vesi

H3PO4 ortofosforihappo HHDP Heksahydroksidifenyyliyksikkö HIV-1 Human Immunodeficiency Virus, ihmisen immuunikatovirus, tyyppi 1 HPLC High Performance Liquid Chromatography, korkean erotuskyvyn nestekromatografia

IC50 50 % Inhibitory Concentration, pitoisuus, joka estää tutkitun mikrobin kasvua 50 % verrattuna kasvukontrolliin MDR Multidrug Resistant, useille antibiooteille resistentti MeOH Metanoli MIC Minimum Inhibitory Concentration, pienin mikrobin näkyvää kasvua estävä pitoisuus vuorokauden kasvatuksen jälkeen MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, metisilliinille resistentti S. aureus MTB Mycobacterium tuberculosis NaCl Natriumkloridi NC Negative Control, negatiivinen kontrolli NMR Nuclear Magnetic Resonance, ydinmagneettinen resonanssi OAU Organisation of African Unity, Afrikan yhtenäisyysjärjestö Pmy Pesäkkeen muodostava yksikkö, colony forming unit

Rf-arvo Retardation factor, retardaatioarvo; ohutkerroskromatografiassa yhdisteen kulkeman matkan suhde liuotinrintaman kulkemaan matkaan Rpm Rounds per minute, kierrosta minuutissa SC Solvent Control, liuotinkontrolli SEM Standard Error of Mean, keskiarvon keskivirhe T Tutkittava yhdiste TLC Thin Layer Chromatography, ohutkerroskromatografia tR Retention time, retentioaika UNDP United Nations Development Programme, Yhdistyneiden kansakuntien kehitysohjelma UV max Ultraviolettivalon absorbtiomaksimin aallonpituus V/V Volume/Volume, pitoisuus ilmoitettuna tilavuus/tilavuus WHO World Health Organization, Maailman terveysjärjestö Wi Water insoluble, veteen liukenematon Ws Water soluble, veteen liukeneva

I KIRJALLISUUSKATSAUS

1. JOHDANTO

Luonnonaineet ovat yhdisteitä, joita syntetisoidaan luonnossa – kasveissa, eläimissä tai mikrobeissa. Kaikki nämä tuottavat primaarimetaboliitteja, kuten nukleiinihappoja, hiilihydraatteja tai rasvoja, energia-aineenvaihduntaan. Kasvit tuottavat myös sekundaarimetaboliitteja, jotka eivät ole elämän kannalta välttämättömiä, mutta kuitenkin hyödyllisiä kasvin kannalta. Sekundaarimetaboliitit saattavat esimerkiksi suojata kasvia bakteereita ja kasvinsyöjiä vastaan tai houkutella pölyttäjiä huolehtimaan kasvin lisääntymisestä. Monet kasvien tuottamat yhdisteet ovat myös osoittautuneet toimiviksi hoitovaihtoehdoiksi ihmisten tai eläinten sairauksien hoidossa, ja nykyään noin 50 % kaikista kaupallisista lääkkeistä on alun perin kasveista peräisin tai muokattu kasvien sisältämistä yhdisteistä (Drewes 2012). Kasvit ja niiden sisältämät yhdisteet ovat edelleen tärkeä osa terveydenhuoltoa maailmanlaajuisesti, ja erityisen tärkeää tämä on kehitysmaissa, joissa ne voivat olla ainoa mahdollisuus hoitaa vakaviakin sairauksia (Singh ja Kumar 2012). Jopa 80 % Aasian, Afrikan ja latinalaisen Amerikan väestöstä käyttää kasveja sairauksiensa hoitoon, ja yhtä suuri osa afrikkalaisista luottaa perinteisen lääketieteen ja kansanparantajien apuun terveytensä hoidossa (WHO 2002). Kasvilääkinnän pitkästä historiasta, rohdosten yleisyydestä ja luonnon monimuotoisuudesta huolimatta afrikkalaisista lääkekasveista on eristetty ja tunnistettu huomattavan vähän biologisesti aktiivisia yhdisteitä (Singh ja Kumar 2012). Perinteisen lääketieteen asemaa ja lääkkeinä käytettävien kasvien tuntemusta onkin pyritty vahvistamaan julistamalla vuodet 2001 – 2010 ja 2011 – 2020 Afrikan perinteisen lääketieteen ensimmäiseksi ja toiseksi vuosikymmeneksi.

Mikrobien, virusten, sienten ja syöpäkasvainten vastustuskyky perinteisille lääkkeille on lisääntynyt (Makesh ja Satish 2008). Etenkin resistenssi mikrobilääkkeitä kohtaan on maailmanlaajuinen ongelma, joka aiheuttaa infektioiden ja kuolleisuuden lisääntymistä, sekä terveydenhuoltomenojen kasvua (Kimang’a 2012, Sheril ja Chandrasekharan 2012). Antibioottiresistenssi johtuu useammasta tekijästä – toisaalta resistenssi on 2

mikrobeille luontainen kyky vastustaa epäsuotuisia ympäristöoloja, kun taas toisaalta nykyisten mikrobilääkkeiden harkitsematon ja liiallinenkin käyttö on kiihdyttänyt resistenssin kehittymistä. Resistenttien mikrobikantojen vähentämiseksi tehokkaiden antibioottien käyttöä tulisi vähentää ja rajata vain välttämättömiin tapauksiin. Lisäksi tarvitaan jatkuvasti uusia mikrobilääkkeitä. Kasvien sisältämillä yhdisteillä voi olla täysin uudenlaisia toimintamekanismeja, joilla resistenssiongelmaa voitaisiin vähentää (Barbour ym. 2004, Ahmad ja Aqil 2007). Viimeisen parinkymmenen vuoden aikana kiinnostus kasveja kohtaan onkin lisääntynyt myös länsimaisten tutkijoiden ja lääketehtaiden keskuudessa, ja perinteisessä lääketieteessä käytettyjä kasveja sekä niiden sukulaislajeja on tutkittu ja seulottu mahdollisten biologisten aktiivisuuksien ja uusien aktiivisten yhdisteiden osalta.

Tämän työn tarkoituksena oli tutkia kolmen Afrikkalaisen Combretaceae-heimoon kuuluvan kasvin, Terminalia kaiserana, Terminalia sambesiaca ja Combretum psidioides, antimikrobisia ominaisuuksia, sekä selvittää tarkemmin, mikä tai mitkä fraktiot ja yhdisteet vastaavat mahdollisesta antimikrobisesta tehosta. T. kaiserana -lajia ei ole tutkittu sen sisältämien antimikrobisten yhdisteiden osalta. T. sambesiaca ja C. psidioides -lajeista on vain muutama tutkimus uutteiden antimikrobisesta tehosta, mutta näiden kasvilajien aktiivisia yhdisteitä ei ole karakterisoitu. Kaikkia mainittuja lajeja käytetään antimikrobi-lääkkeinä Afrikan kansanlääkkeessä ja tämän vuoksi olisi tärkeää selvittää näiden kasvien uutteiden sisältämien antimikrobisten yhdisteiden rakenteita.

2. AFRIKKALAINEN TERVEYDENHUOLTO

2.1. Johdatus afrikkalaiseen terveydenhuoltoon

Afrikka on maailman toiseksi suurin maanosa, jossa asuu yli miljardi asukasta, n. 14,8 % koko maailman väestöstä (Wikipedia). Väkiluvun odotetaan kasvavan vuoteen 2025 mennessä 1,4 miljardiin. Ihmiset muodostavat useita tuhansia yhteisöjä ja etnisiä ryhmiä, jotka jakavat saman kulttuurin, kielen, uskonnon ja historian. Suurin osa Afrikasta kuuluu trooppiseen ilmastovyöhykkeeseen, ja mantereelta löytyy useita 3

kasvillisuusvyöhykkeitä päiväntasaajan sademetsistä savannien ja aavikoiden kautta lauhkeaan välimerenilmastoon. Rikkaasta ja monimuotoisesta kasvillisuudesta ja eläimistöstä huolimatta Afrikka on maailman köyhin asutettu manner, mikä on johtanut mm. terveysongelmiin ja alentuneeseen elinajanodotteeseen, sotiin ja epävakauteen. Myös luonnonvaroja kulutetaan ihmisen toimesta nopeasti: Afrikassa metsiä kaadetaan kaksi kertaa nopeammalla tahdilla kuin muualla maailmassa (Wikipedia), ja yli puolet viljelysmaasta kärsii maaperän köyhtymisestä (McCarthy 2008).

Köyhyys on tuonut mukanaan monia kansanterveyteen liittyviä ongelmia, kuten infektioita ja korkean kuolleisuuden (Ssenyonga 2007, Kiguli-Malwadde ym. 2013). Etenkin äitiys- ja lapsikuolleisuus ovat korkeita, ja lapsikuolleisuuden esiintymistiheys on noin 77 tapausta 1000 syntynyttä lasta kohti (Kaschula 2013). HI-virus on koko mannerta koskettava, vakava ja leviävä ongelma, kuten ovat myös malaria ja tuberkuloosi (De Zulueta 2001, Macklin 2001). Lisäksi erityisesti lapsia koskettavia tartuntatauteja ovat keuhkokuume, tuhkarokko, hinkuyskä ja ruuansulatuskanavan tulehduksista johtuvat ripulit (Kaschula 2013) – tauteja, jotka länsimaissa ovat vältettävissä rokotuksilla tai hoidettavissa lääkkeillä. Kuvassa 1 on esitetty Maailman terveysjärjestön (World Health Organization, WHO) tilastoista koottu diagrammi Afrikan 20 yleisimmästä kuolemaan johtavasta sairaudesta tai muusta syystä. Tuberkuloosin osuus tässä tilastossa on suhteellisen pieni (2,3 %), ja voikin olla, että osa tuberkuloositapauksista on diagnosoimattomina ryhmitelty alempien hengitysteiden infektioihin. Syy kansanterveyden heikkoon tilanteeseen lienee perusterveydenhuollon riittämättömyys ja terveydenhuoltohenkilökunnan puute varsinkin maaseudulla ja esikaupungeissa (Kaschula 2013). Tämä johtuu mm. lääketieteen opetuksen, sopivien tilojen, välineiden ja lääkkeiden puutteesta sekä yhteiskuntien hallinnollisista järjestelmistä ja taloudellisesta tilanteesta. Kaschula (2013) arvelee, että veronmaksajien suhteellisen alhainen määrä (lähes puolet asukkaista voi olla alle 15-vuotiaita), koulutettujen ihmisten ja siten osaamisen puute, rahoituksen puute koskien etenkin laboratoriolääketiedettä (esimerkiksi kliiniset laboratoriotestit, patologia) ja kaupungistuminen, joka aiheuttaa liian tiheää asutusta, huonolaatuisia asuinolosuhteita, riittämättömiä hygieniaolosuhteita sekä monesti tupakan ja alkoholin liikakäyttöä, vaikuttavat negatiivisesti kansanterveyteen. 4

Kuva 1. Yleisimmät kuolemaan johtaneet syyt Afrikassa vuonna 2011 (Koottu WHO:n tilastoista: Disease and injury regional mortality estimates for 2000 – 2011, WHO regions).

Afrikan kolonisaation aikana kristityt lähetysseurat ja siirtomaita hallitsevat valtiot perustivat länsimaisia sairaaloita ja perinteistä lääketiedettä väheksyttiin (Kaschula 2013). Kansanparantajien toimintaa yritettiin jopa tukahduttaa. Nykyään kuitenkin 40 000 henkilöä kohden on vain yksi länsimaisen lääketieteen lääkäri, kun taas perinteisen lääketieteen harjoittajia on käytettävissä yksi 500 henkilöä kohden (WHO 2002). Länsimainen hoito ja lääkkeet ovat erittäin kalliita tai täysin tavoittamattomissa alhaista toimeentuloa saaville tai köyhille afrikkalaisille (Tangwa 2007, Renckens ja Dorlo 2013). Maailman terveysjärjestön mukaan (WHO 2002) 80 % afrikkalaisista käyttääkin ensisijaisesti perinteisen lääketieteen keinoja terveytensä hoidossa. Sairaalat ja klinikat sijaitsevat usein pitkän ja vaikean matkan päässä, ja niissä hoitoon pääsyn odotusajat ovat pitkiä (Elujoba ym. 2005, Tateke ym. 2012, Kaschula 2013). Tilat ja käytettävä teknologia ovat heikkolaatuisia usein myös länsimaisissa sairaaloissa. Terveysongelmat koetaan usein koko yhteisön huoleksi, ja yksin länsimaiseen hoitoon hakeutunut potilas jää ilman perheen ja kyläyhteisön tukea. Länsimainen lääketiede ei myöskään tarjoa samanlaista henkistä hoitoa, jota perinteinen afrikkalainen lääketiede 5

tarjoaa. Potilaat ovat kokeneet, että länsimaiset lääkärit eivät kerro heille sairauksien syistä tarpeeksi, jotta he osaisivat välttää niitä jatkossa. Taulukkoon 1 on koottu länsimaisen ja perinteisen lääketieteen eroja kustannusten ja tavoitettavuuden osalta. Perinteisen lääketieteen suuresta suosiosta ja Afrikan runsaista luonnonvaroista huolimatta kuitenkin vain vähän tutkittuja tai standardoituja kasvilääkkeitä sekä systemaattisia analyysejä lääkinnässä käytetyistä kasveista on saatavilla (Addae-Mensah ym. 2011).

Taulukko 1. Länsimaisen ja perinteisen lääketieteen kustannusten ja tavoitettavuuden erot (mukailtu Isola 2013). Osa-alueet Länsimainen lääketiede Perinteinen lääketiede Lääkkeiden/lääkekasvien Kallis Edullinen hinta Helppoa kaikille Helppoa hyvin Hoidon tavoitettavuus toimeentulosta toimeentuleville riippumatta Hallinnolliset kulut Kallis Taloudellinen Paljon hyvin Paljon keskituloisia, toimeentulevia, vähän Asiakaskunta alhaista toimeentuloa köyhiä (johtuen hoidon saavia sekä köyhiä kalliista hinnasta) Helposti Kustannettavissa myös Kustannettavuus kustannettavissa hyvin alhaista toimeentuloa toimeentuleville saaville ja köyhille

2.2. Perinteinen lääketiede Afrikassa

Maailman terveysjärjestö määrittelee perinteisen lääketieteen seuraavasti (2000):

”Perinteinen lääketiede on eri kulttuurien synnynnäisiin teorioihin, uskomuksiin ja kokemuksiin perustuvien tiedon, taidon ja käytännön summa, olkoon selitettävissä tai ei, jonka avulla terveyttä ylläpidetään ja fyysisiä tai psyykkisiä sairauksia pyritään ehkäisemään, diagnosoimaan, parantamaan tai hoitamaan.”

Perinteisen lääketieteen menetelmät eroavat paljon eri maiden ja ihmisryhmien välillä, sillä kulttuuri, historia, henkilöiden asenteet ja ajattelumallit vaikuttavat siihen (WHO 2002). Vaikka perinteisellä lääketieteellä on vuosisatoja pitkät perinteet ja sen suosio on kasvanut viime vuosikymmenellä, useimmissa maissa sillä ei ole virallista asemaa. Näin ollen myös siihen liittyvä koulutus ja tutkimus ovat olleet puutteellisia, ja laatu- turvallisuus- sekä tehokkuusvaatimukset eivät ole riittäviä suhteessa sen laajaan maailmanlaajuiseen käyttöön. Syitä näihin puutteisiin voidaan etsiä sekä kansallisista terveydenhuollon menettelytavoista, että riittämättömistä perinteisen lääketieteen tutkimus- ja arviointimenetelmistä. Monilla valtioilla on olemassa julkaistua tai julkaisematonta tutkimustietoa liittyen perinteisen lääketieteen käytäntöihin, mutta etenkin menetelmien ja käytettyjen lääkkeiden turvallisuutta ja tehokkuutta tulisi tutkia tarkemmin, ja tutkimusten laatua parantaa.

Afrikassa perinteisellä lääketieteellä on jopa vuosisatoja pitkät perinteet (Elujoba ym. 2005, Renckens ja Dorlo 2013). Se on edelleen usein ensimmäinen vaihtoehto, josta ihmiset hakevat apua terveysongelmiinsa. Monissa afrikkalaisissa kulttuureissa terveys ei liity pelkästään fyysiseen hyvinvointiin, vaan ihmisellä on lisäksi psyykkinen sekä hengellinen puoli, joiden hyvinvointi on yhtä tärkeää (Kale 1995). Perinteinen afrikkalainen lääketiede perustuu aineelliseen maailmaan, ympäröivään yhteisöön ja henkien olemassaoloon (Isola 2013). Sairaudet ovat yliluonnollisia ilmiöitä, joiden ilmenemiseen vaikuttavat jumalien ja esi-isien henget, elävät ihmiset, eläimet ja kasvit sekä muut asiat (Kale 1995). Epätasapaino näiden tekijöiden välillä voi aiheuttaa sairauden puhkeamisen. Hoitona puolestaan voidaan käyttää kasveista, eläimistä tai muualta luonnosta peräisin olevia valmisteita sekä erilaisia talismaaneja, jotka auttavat tasapainon palauttamisessa ja taudin parantamisessa. Perinteinen afrikkalainen lääketiede voidaankin jakaa karkeasti kahtia selitettävissä olevaan ja selittämättömään osaan (Elujoba ym. 1995, Isola 2013). Selitettävissä oleva perinteinen lääketiede käsittää sairauksien hoitoon käytettävät menetelmät ja lääkevalmisteet, joiden teho on todistettavissa tieteellisin tutkimuksin. Selittämätön osa puolestaan liittyy parantaviin voimiin, henkiin, noituuteen ja yliluonnollisiin ilmiöihin, joita ei voi selittää tai tutkia perinteisillä tieteellisillä menetelmillä. Perinteisestä lääketieteestä haetaan apua sairauksien lisäksi myös epäonnisten tapahtumien – onnettomuuksien, huonon tuurin ja 7

keskenmenojen – syihin, jotta näitä voitaisiin välttää jatkossa (Isola 2013). Ylipäätään perinteinen afrikkalainen lääketiede keskittyy ensisijaisesti sairauksien ennaltaehkäisyyn. Elujoban ja kollegoiden mukaan (2005) perinteinen lääketiede on jo osoittanut merkityksensä vähentämällä osaltaan AIDS:iin, malariaan, tuberkuloosiin ja muihin tauteihin liittyvää kuolleisuutta, sekä edistänyt terveydenhoitoon pääsyä ja lisännyt väestön hyvinvointia vähentäen näin myös köyhyyttä.

Perinteisen lääketieteen harjoittajien eli kansanparantajien asema on edelleen vahva Afrikan eri osissa (Renckens ja Dorlo 2013). Heidän tarjoama hoito on edullista ja hoitoonpääsy usein helpompaa verrattuna länsimaiseen hoitoon, varsinkin maaseudulla (Isola 2013). Kylien asukkaat arvostavat kansanparantajia ja luottavat heihin, koska tuntevat heidät henkilökohtaisesti (Fyhrquist 2007). Lisäksi hoito sopii ihmisten kulttuuriperintöön paremmin, joten hoitomyöntyvyys on usein korkeampi (Elujoba ym. 2005). Toisaalta kansanparantajien tarjoaman hoidon negatiivisia puolia ovat tieteellisen tutkimustiedon puute, epävarmat diagnoosit ja lääkeannosten epätarkkuus, jolloin potilaiden turvallisuus on uhattuna.

Parantajat voidaan jakaa eri ryhmiin, joista jokaisella on omat hoitomenetelmänsä (Kale 1995, Isola 2013, Kaschula 2013). Samoja kansanparantajaryhmiä on useissa Afrikan maissa, mutta nimitykset voivat vaihdella eri heimojen välillä. Esimerkiksi monien Etelä-Afrikkalaisten heimojen keskuudessa inyangat ovat herbalisteja, joilla on valtava tietomäärä sairauksien hoitoon käytettävistä kasveista ja eläimistä (Kale 1995, Kaschula 2013). Suurin osa heistä on miehiä. Isangomat ovat ennustajia, jotka selvittävät tautien syitä henkien avulla. Suurin osa heistä on puolestaan naisia. Umathandazit ovat kristittyjä, jotka parantavat uskon voimalla, apunaan rukoukset, pyhä vesi ja tuhka sekä kosketus (Kale 1995). He kuuluvat usein pieniin, itsenäisiin, afrikkalaisiin seurakuntiin. Apuna synnytyksissä on mukana kätilönä yleensä vanhempi nainen, jonka kokemusta koko kyläyhteisö arvostaa. Komplikaatioiden ilmetessä lisäapua voidaan pyytää inyangalta. Lisäksi luuston ja nivelten hyvinvoinnista ja murtumien hoidosta vastaavat nk. ”nikamanniksauttajat” (bonesetter) (Mhame ym. 2010). Yhteistä eri ryhmiin kuuluville parantajille on yhteisön arvostus.

Kansanparantajaksi kouluttautumisen tapa ja pituus vaihtelevat (Isola 2013). Usein se tapahtuu ”oppisopimuksella”, ja voi kestää vuosia ennen kuin uusi kansanparantaja on valmis toimimaan itsenäisesti. Tiedot ja taidot voivat myös kulkea tietyissä suvuissa suullisesti sukupolvelta toiselle (Boudjelal ym. 2013). Isangomaksi ryhtymistä ei voi itse päättää, vaan henget kutsuvat sopivaa henkilöä (Kale 1995). Monet kansanparantajat haluavat pitää hoitomenetelmänsä salaisuutena (Isola 2013). Kokeilut, tarkkaileminen ja päätelmät ovat suuressa roolissa perinteisen lääketieteen harjoittajien parissa. He hoitavat samoja vaivoja kuin länsimainen lääketiedekin (Isola 2013), mutta mieltävät potilaan fyysiset, psyykkiset ja hengelliset puolet yhdeksi kokonaisuudeksi (Kale 1995). Lisäksi potilasta ei eristetä omaksi yksilökseen, vaan kohdellaan osana yhteisöä. Myös perhe saa osallistua tiiviisti hoitoprosessiin. Esimerkkejä kansanparantajien suorittamista hoidoista ovat leikkaukset, ortopedia, psykoterapia, äitiysajan seuranta sekä yleislääketiede (Isola 2013). Leikkaukset ovat usein pienimuotoisia, kuten ympärileikkaukset tai hampaanpoistot, ja yleisiä ongelmia ovat huono hygienia, verenvuoto sekä kipu. Kivun lievittämiseen on käytössä paljon rohdoksia, mutta erittäin tehokkaista kipua hillitsevistä lääkekasveista on olemassa vain vähän tietoa (Isola 2013). Harpagophytum procumbens, jonka juurimukulat sisältävät kipua ja tulehdusta lievittäviä iridoidiglykosideja, ja niitä käytetäänkin muun muassa kuumeen ja nivelreuman hoitoon (Stark ym. 2013, Wikipedia). H. procumbens -kasvia esiintyy luonnonvaraisena Afrikan itä- ja eteläosissa, ja sitä käytetään myös länsimaissa rohdoksena reumasäryn hoitoon. Heteromorpha trifoliate -kasvin juuria ja lehtiä käytetään ripulin lisäksi myös tulehduskipulääkkeenä nivel-, selkä- ja pääkipuun (Stark 2013). Osa kansanparantajista käyttää hypnoosia kivun poistoon tai potilaan rauhoittamiseen (Isola 2013).

2.3. Kasvilääkinnän merkitys afrikkalaisessa terveydenhuollossa

Perinteinen afrikkalainen kasvilääkintä on kenties yksi vanhimmista kansanlääkintämuodoista, jota edelleen harjoitetaan (Falodun 2010, Stark ym. 2013). Perinteinen afrikkalainen lääketiede perustuukin pääasiassa kasviperäisiin valmisteisiin, joita käytetään ihmisten ja eläinten sairauksien hoitoon. Myös eläinperäisiä tai 9

mineraaleihin perustuvia lääkevalmisteita voidaan käyttää (Kale 1995, Elujoba ym. 2005). Trooppisessa Afrikassa on arvioitu olevan noin 40 000 – 45 000 kasvilajia, joista 5000 on käytössä lääkinnällisissä tarkoituksissa (Gurib-Fakim ja Kasilo 2010). Taulukkoon 2 on koottu muutamia esimerkkejä Afrikassa, etenkin Tansaniassa käytössä olevista rohdoksista. Lääkevalmisteet tehdään monesti uuttamalla yhdisteitä eri kasvinosista, kuten juurista, lehdistä, kuoresta, kukista tai siemenistä. Uuttoliuottimena käytetään usein vettä, harvemmin etanolia tai muita orgaanisia liuottimia. Kansaparantajat saattavat kuitenkin käyttää myös paikallisia alkoholijuomia yhdisteiden uuttamiseen (Stark ym. 2013). Eri kasvinosia, eri kasvilajeja tai näiden uutoksia voidaan myös yhdistellä tai annostella eri tavalla sairaudesta riippuen. Kasvivalmisteita käytetään esimerkiksi erilaisina keitteinä, kuten dekokteina (kuumavesikeitos) tai konkokteina (veteen liuotettu monen kasvilajin seos), suun kautta annosteltavina infuuseina, hengitettävinä inhalaatioina tai peräruiskeina (Fyhrquist 2007, Stark ym. 2013). Paikalliseen, ulkoiseen käyttöön voidaan valmistaa tahnoja, tai lääkevalmisteita voidaan käyttää ihon pesuun (Kale 1995). Eri kansanparantajien käyttämät lääkekasvit, kasvinosat ja seokset monesti vaihtelevat, mikä osaltaan kertoo, että lääkkeiden tehosta, vaikuttavista aineista tai toksisuudesta ei ole riittävää tietoa (Stark ym. 2013).

Taulukko 2. Esimerkkejä Tansaniassa käytetyistä lääkekasveista. Esimerkit keskittyvät Tansaniassa käytettäviin rohdoksiin, sillä myös tämän työn kokeellinen osuus liittyy olennaisesti Tansaniasta kerättyihin kasveihin (koottu Chhabra ja Mahunnah 1994; Moshi ym. 2012). Paikallinen Käytetty Lääkekasvi Heimo Indikaatio Kylä nimi kasvinosa Justicia Acanthaceae Ikingura maanpäälliset ehkäisy Buyekela diclipteroide osat, dekoti s Lindau Markhamia Bignoniaceae Ng’ubu varren kuori, käärmeenpuremat Isamilo obtusifolia dekokti (Baker) juuret koukkumato, Sprague ekspektorantti, käärmeenpuremat Cassia kirkii Caesalpinaceae Kashenganzili lehdet, infuusi traumaperäiset Kahororo Oliv. var. tai dekokti kivut kirkii (onnettomuudet) Pentas Rubiceae Kashenda juuret tippuri, kuppa Tukutuku Zanzibarica (Klotzsch) maanpäälliset päänsärky, kuume, Vatke osat reumasärky Amaranthus Amaranthaceae Olulele lehdet (keitos vatsahaava Kikuku spinosus L. maidon kanssa) Catharanthu Apocynaceae Kiua lehdet, verenpaine Kikuku s roseus (L.) dekokti G. Don

Koska länsimaiset lääkkeet ovat monille liian kalliita tai niiden saatavuudessa on puutteita, afrikkalaiset käyttävät paljon perinteisiä lääkekasveja (Isola 2013). Lisäksi länsimaiset lääkkeet saatetaan mieltää haitallisiksi niiden aiheuttamien haittavaikutusten takia (Kaschula 2013). Joidenkin kasvien parantavat ominaisuudet ovat yleisessä tiedossa, toisinaan vain kansanparantajat osaavat hyödyntää kasveja oikein (Fyhrquist 2007). Länsimaiden kasvava kiinnostus afrikkalaisia potentiaalisia lääkekasveja kohtaan luo Afrikalle ”kilpailuedun”, jota oikein hyödynnettäessä voisi johtaa kasvien lisääntyneeseen tutkimukseen, standardisoitujen kasviperäisten valmisteiden kehitykseen ja taloudelliseen kasvuun (Addae-Mensah ym. 2011). Useat afrikkalaiset tutkijat länsimaisten ohella ymmärtävät kasvien merkityksen uusien potentiaalisten lääkemolekyylien kehityksessä. Varsinkin fytokemian rooli korostuu uusien aktiivisten yhdisteiden etsimisessä. Afrikkalaisille itselleen tulisi antaa mahdollisuus osallistua tähän tutkimustyöhön ja kehitykseen sen sijaan, että länsimaiset lääkeyhtiöt saavat suurimman osan voitoista. Afrikkalaiset tutkimusyhteisöt tarvitsevat kuitenkin tukea, 11

jotta maanosan sisäinen tieto ja luonnonvarat osattaisiin hyödyntää standardisoitujen uutteiden tai lääkevalmisteiden tuottamiseen.

2.3.1. Perinteisen kasvilääkinnän heikkouksia

Kasvilääkintään liittyy vielä paljon epäselvyyksiä johtuen tiedon ja tutkimuksen puutteesta sekä standardisoimattomien valmisteiden käytöstä, joissa aktiivisten yhdisteiden pitoisuudet voivat vaihdella (Gurib-Fakim ja Kasilo 2010, Silva ym. 2011, Stark ym. 2013). Tällaisten lääkkeiden käyttö on johtanut jopa myrkytyksiin. Kasvilääkkeiden valmistukseen käytettävät reseptit ovat usein salaisuuksia (Kale 1995), ja muistinvarainen tieto on altis virheille (Isola 2013). Myös valmistuksen hygieenisyydessä, mittatarkkuudessa, oikean annoksen varmistamisessa ja säilytysolosuhteissa on parannettavaa.

Peräruiskeet ja oksentelua aiheuttavat emeetit ovat yleisimpiä Etelä-Afrikassa käytetyistä lääkemuodoista (Kale 1995). Paikalliset Swazi-lapset saattavat saada jopa 50 peräruisketta vuodessa, ja Zulu-heimoon kuuluvat ihmiset kolme peräruisketta viikossa. Peräruiskeiden sisältämät yhdisteet saattavat ärsyttää suolen limakalvoja, aiheuttaa verenvuotoja, johtaa limakalvon nekroosiin tai jopa verenmyrkytykseen. Myös sydänglykosidien sekä kaliumdikromaatin yliannostusta on kuvattu (Wood ym. 1990, Mc Vann ym. 1992). Raskauden ja synnytyksen aikana käytetään kymmenistä eri kasvilajeista valmistettuja lääkkeitä, joiden turvallisuudesta äidin tai lapsen terveyteen ei ole tietoa. Suun kautta annosteltavat lääkevalmisteet ovat myös usein epämiellyttävän makuisia, ja puhtaan veden puute altistaa veteen valmistettavia lääkkeitä käyttävät potilaat infektioille (Isola 2013).

Jotta kasviperäisten lääkevalmisteiden asemaa voitaisiin parantaa, tulisi niiden tehoa, turvallisuutta, aktiivisia yhdisteitä sekä toimintamekanismeja tutkia tarkemmin (Falodun 2010, Stark ym. 2013). Lääkekasveja tutkitaan paljon, mutta vain pieni osa tutkimuksesta on kliinistä (Willcox ym. 2012). Esimerkiksi yli 1200 kasvilajia käytetään malarian hoitoon, mutta vain 13 niistä on läpikäynyt kliinisiä tutkimuksia. Kansanparantajien osaaminen tulisi tallentaa kirjallisesti, jotta voitaisiin välttää muistinvaraisen tiedon muuttuminen tai katoaminen (Magoro ym. 2010, Bruschi 2011). 12

Afrikan farmakopean (African Herbal Pharmacopoeia) ensimmäinen painos on julkaistu vuonna 1985, mutta sisältö ei ole kattava (Stark 2013). Arfikkalainen yhdistys, the Association of African Medicinal Plant Standars (AAMPS) onkin äskettäin julkaissut uuden, kattavamman painoksen Afrikan farmakopeasta, joka nykyään sisältää yli 50 tärkeän lääkekasvin monografiat (Gurib-Fakin ja Kasilo 2010, AAMPS 2013). Tutkimusryhmät ovat alkaneet systemaattisesti haastatella kansanparantajia kerätäkseen ja tallentaakseen tietoa käytetyistä lääkekasveista, mutta työmäärä on valtava, ja tiedon keräys- ja tallennustyötä riittää vielä vuosiksi eteenpäin (Fyhrquist 2007, Bruschi ym. 2011, Boudjelal ym. 2013, Isola 2013). Tällä hetkellä suurin osa kasvitutkimuksesta on keskittynyt kuitenkin eteläisen ja itäisen Afrikan, Nigerian ja Egyptin alueen kasveihin, ja lisää tutkimusta kaivattaisiin myös muilta alueilta (Stark ym. 2013). Stark ryhmineen myös korostaa, että tutkimuksen ei tulisi keskittyä vain uusien vaikuttavien aineiden löytämiseen, vaan kasviperäisten lääkehoitojen kokonaisvaltaiseen kehittämiseen. Tämä tarkoittaa esimerkiksi raaka-uutteiden, puolijalostettujen valmisteiden (sisältävät fraktion/fraktioita) tai eroteltujen yhdisteiden käyttöä lääkevalmisteissa. Myös kliinisen tutkimuksen osuutta tulisi lisätä, sillä sen avulla voidaan varmistua käytettyjen kasvien turvallisuudesta, sopivasta annoksesta sekä mahdollisista haittavaikutuksista.

2.3.2. Perinteisten lääkekasvien ekologinen käyttö ja luonnon monimuotoisuuden säilyttäminen

Magoro kollegoineen (2010) on tutkinut laajasti perinteisessä lääketieteessä käytettyjen lääkekasvien säästävää käyttöä ja mahdollista häviämisen uhkaa Etelä-Afrikassa. Kansanparantajien tiedot käytetyistä kasvilajeista, niiden ekologiasta ja säästävästä käytöstä ovat korvaamattomia, mutta harvoin dokumentoituja. Magoron kaksiosainen haastattelututkimus paljastaa, että kansanparantajilla on vakavia ongelmia harvinaisempien lääkekasvien löytämisessä, ja he ovat huolissaan joistakin lajeista, joita mahdollisesti uhkaa sukupuutto. Ennen siirtomaa-aikaa Afrikassa oli vallassa ”perinteisen johtajuuden aika”, jolloin yhteisöt luottivat heimopäälliköiden ja kylänvanhimpien auktoriteettiin. Tällöin kansanparantajat olivat itse vastuussa käyttämiensä lääkekasvien säästävästä ja luontoa kunnioittavasta käytöstä. Nykyään kuitenkin teollistumisen lisääntyessä sosiaaliset, ekonomiset ja poliittiset muutokset ovat johtaneet ympäristöolojen muutoksiin monilla syrjäisilläkin alueilla, ja kasvien 13

sekä eläinten ekologiset lokerot ovat kaventuneet ja luontaiset elinolot muuttuneet. Ihmismäärän lisääntyminen, kaupungistuminen ja asutusten leviäminen, luonnontilaisten metsien ja niittyjen raivaaminen peltojen tieltä, lisääntyvät jätemäärät sekä kuivuus ja eroosio ovat vähentäneet kasvien ja eläinten sopivia elinympäristöjä. Vaikka Maailman terveysjärjestö (2003) on julkaissut lääkekasvien ekologisen ja kestävän viljelyn ja keräyksen ohjeistuksen, voittoa tavoittelevien kasviperäisiä valmisteita tuottavien yritysten kasvien keräys tapahtuu usein ekologisia arvoja kunnioittamatta ja kasveja säästämättä. Yhdessä nämä tekijät ovat heikentäneet lääkkeiksikin käytettyjen kasvien elinmahdollisuuksia, ja jotkut lajit ovat harvinaistuneet tai jopa sukupuuton partaalla. Myös polttopuiden keräys sekä kansanparantajien oma toiminta ovat edesauttaneet lääkekasvien häviämistä (Appiah ym. 2009). Tämä on aiheuttanut kansanparantajille vaikeuksia löytää lääkekasveja alueilta, joilla niitä on aikaisemmin kasvanut. Näin ollen potilaiden hoito voi vaarantua, mikäli tarvittavaa kasvia ei löydykään.

Magoron ja kollegoiden (2010) haastatteluista käy ilmi, että kansanparantajat ovat tietoisia lääkekasvien kestävästä käytöstä ja vääränlaisten keräystapojen aiheuttamasta kasvien vähenemisestä. He ymmärtävät myös kasveja säästävän keräystavan ja näitä tukevien toimien kehittämisen tärkeyden. Kansanparantajien suorittama kasvien keräys edellyttää usein erilaisia uskomuksia ja rituaaleja, jotta sairauden hoito olisi mahdollisimman tehokasta. Kuten kappaleessa 2.2. mainittiin, perinteinen afrikkalainen lääketiede hoitaa potilasta yhtenä kokonaisuutena, johon kuuluu fyysinen, psyykkinen ja hengellinen hyvinvointi. (Kale 1995). Osaltaan nämä uskomukset ovat myös varmistaneet etenkin lääkekasvien säilymisen ja kestävän kehityksen (Mavi ja Shava 1997). Afrikassa monista lääkekasveista käytetään juuria, mikä altistaa kasvin suuremmille vahingoille kuin esimerkiksi lehtien tai kuoren kerääminen. Kansanparantajat osaavat kaivaa esiin vain osan juuristosta ja leikkaavat palan sivujuuresta lääkekäyttöön jättäen pääjuuren koskemattomaksi, jolloin kasvi voi jatkaa kasvuaan. Uskomuksen mukaan kasvin kuollessa keräämisen aiheuttamiin vahinkoihin, myös lääkettä käyttänyt potilas kuolee (Mavi ja Shava 1997). Osaamattomat kerääjät puolestaan nostavat koko kasvin ylös maasta saadakseen mahdollisimman paljon juuristoa talteen, välittämättä kasviyksilön kuolemasta. Samalla he saattavat vahingoittaa ympäröivien kasvien juuria. Myös juuristoon kajoaminen väärään aikaan, 14

esimerkiksi kukinnan tai rankkasateiden aikaan on kasvin uudiskasvun kannalta vahingollista (Magoro ym. 2010). Kansanparantajat eivät myöskään kerää kasvinosia sellaisesta kasvista, josta toinen parantaja on jo kerännyt osia lääkkeeksi (Mavi ja Shava 1997). Potilaan sairauden uskotaan nimittäin siirtyvän kasviin ja sitä kautta uuteen potilaaseen. Kasvin kuoren kerääminen tapahtuu kasvin itä- tai länsipuolelta, sillä muuten parantavien ominaisuuksien uskotaan muuttuvat tehottomiksi. Itä- ja länsipuolelle kasvi saa myös enemmän aurinkoa, mikä kansanparantajien mukaan edistää kasvin toipumista keräyksestä. Tätä uskomusta tukee myös tieteellinen tutkimus (Magoro ym. 2010). Joidenkin kasvien käytön tai vahingoittamisen uskotaan houkuttelevan pahoja henkiä tai onnettomuuksia, joten usein myös tietämättömämmät kyläläiset osaavat välttää näihin kasveihin kajoamista (Mavi ja Shava 1997). Osa esi- isien ajoista peräisin olevista uskomuksista on edelleen käytössä, mutta osa on kuitenkin menettänyt tehoaan eri kulttuurien sekoittumisen ja kaupungistumisen myötä.

Afrikkalaisten ihmisten voi joskus olla vaikea hyväksyä ja noudattaa länsimaista tulevia moderneja sääntöjä luonnon monimuotoisuuden säilyttämiseksi (Mavi ja Shava 1997). Usein he omaksuvat paremmin tapoja, jotka pohjautuvat jollakin tavalla heidän omaan kulttuurinsa ja perinteisiinsä. Vanhojen luonnonsuojelumenetelmien opettaminen paikallisille ihmisille voisikin olla toimivampi tapa saada ihmiset ymmärtämään ympäristön kunnioittamisen tärkeyttä, sekä lääkekasvien että luonnon monimuotoisuuden säilymisen kannalta. Esimerkiksi Zimbabwessa luonnonsuojelussa on saatu näkyviä tuloksia (UNDP 2012). Paikallisia ihmisiä kehotetaan luonnonvaraisten kasvien kaatamisen sijaan istuttamaan nopeasti kasvavia lajeja, joita voi käyttää polttopuuksi tai käsitöihin. Maassa on otettu käyttöön kansallinen puidenistutuspäivä, ja perustettu suojelualueita. Näistä toimista huolimatta esimerkiksi lääkekasvien viljeleminen ei ole kovin yleistä, sillä edelleen on vallassa uskomus, jonka mukaan viljeltyjen kasvien lääkinnälliset ominaisuudet eivät ole yhtä tehokkaita kuin luonnonvaraisten (Fyhrquist 2007). Uskomuksessa voi olla perää, sillä viljellyt kasvit eivät joudu kilpailemaan elintilasta ja ravinteista samalla tavalla kuin luonnonvaraisena elävät kasvit, jolloin ne saattavat tuottaa pienemmän määrän aktiivisina yhdisteinä usein toimivia sekundaarimetaboliitteja. Joitain lääkekasveja viljellään osana kestävää kehitystä, esimerkiksi AIDS:in ja malarian hoitoon käytettävää Spirulina-levää Burkina Fasossa, AIDS:in oireisiin, anemian ja syövän hoitoon käytettävää Sutherlandia 15

frutescens -kasvia Etelä-Afrikassa sekä malarian hoitoon käytettävää Artemisia annua - kasvia Tansaniassa (Kasilo ym. 2010).

2.4. Perinteisen lääketieteen asema Afrikan perusterveydenhuollossa

Koska perusterveydenhuolto on jokaisen ihmisen perusoikeus riippumatta taloudellisesta asemasta, on lähes koko Afrikkaa koskettavaa terveydenhoidon huonoa tilannetta pyritty korjaamaan vahvistamalla perinteisen lääketieteen asemaa ja tuomalla perinteinen lääketiede ja länsimainen lääketiede lähemmäksi toisiaan (Elujoba ym. 2005, Angole ym. 2013, Isola 2013). Jo vuonna 1978 perusterveydenhuollon kansainvälisessä kokouksessa (Internationan Conference on Primary Health Care) julkaistiin nk. ”Alma-Ata julistus” (Declaration of Alma-Ata), jonka tavoite oli saada valtiot, päättäjät ja terveydenhuollon työntekijät ympäri maailmaa puhaltamaan yhteen hiileen niin, että jokaisella ihmisellä olisi oikeus perusterveydenhoitoon vuoteen 2000 mennessä (Wikipedia, Alma-Ata Declaration). Myös Maailman terveysjärjestöllä on perusterveydenhoitoa edistävä ohjelma, Health For All, jonka on tarkoitus edistää terveyttä ja ihmisoikeuksia sekä parantaa elämänlaatua (WHO, Health21). Afrikassa Alma-Ata julistus ei päässyt lähellekään tavoitettaan vuoteen 2000 mennessä, joten Maailman terveysjärjestön Afrikan alueen jäsenvaltiot asettivat uuden tavoitteen: ”Promoting the role of traditional medicine in health care systems: A strategy for the African Region”, jonka on tarkoitus edistää perinteisen afrikkalaisen lääketieteen sulauttamista jokaisen jäsenvaltion perusterveydenhuollon toimintoihin (Kofi-Tsekpo 2004). Lisäksi Afrikan yhtenäisyysjärjestö (OAU) julisti vuodet 2001 – 2010 Afrikan perinteisen lääketieteen vuosikymmeneksi (African Decade on African Traditional Medicine), ja 31.8. on vuosittainen perinteisen afrikkalaisen lääketieteen päivä. Kaikki nämä julistukset osoittavat perinteisen lääketieteen tärkeyden Afrikassa ja tarpeen sen aseman vakiinnuttamiselle.

Afrikan perinteisen lääketieteen vuosikymmenen aikana perinteisen lääketieteen asemaa on onnistuttu vakiinnuttamaan ja tietoisuutta lisäämään (WHO 2013). Maailman terveysjärjestön edistymisraporttien (2011 ja 2013) mukaan esimerkiksi niiden afrikkalaisten valtioiden, jotka olivat luoneet omat perinteisen lääketieteen 16

toimintaperiaatteet, määrä oli noussut vuosien 2000 – 2010 aikana kahdeksasta 39:ään. Niiden valtioiden, joilla oli perinteisen lääketieteen tulevaisuuden toimintasuunnitelma, määrä oli noussut nollasta 18:ta. Valtioiden sisäisten valvontamenetelmien määrä oli puolestaan noussut yhdestä 28:aan. Näistä edistymisistä huolimatta perinteisen lääketieteen aseman vakiinnuttamista hidastaa edelleen varojen ja osaavien työntekijöiden puute sekä joidenkin valtioiden puutteelliset valvontakeinot ja tästä johtuvat väärinkäytökset (WHO 2011). Käytettävistä lääkevalmisteista puuttuu edelleen tarpeellinen tieteellinen näyttö turvallisuudesta, tehosta ja laadusta. Lisäksi lääkevalmisteiden paikalliselle tuotannolle on heikot edellytykset johtuen riittävän valvonnan ja resurssien puutteesta. Korjatakseen puutteet näillä osa-alueilla, toimintasuunnitelma tulisi päivittää vastaamaan muuttuneita tarpeita. Valtioiden tulisi keskittyä etenkin varojen ja resurssien ohjaamiseen perinteisten lääkevalmisteiden tehoa ja turvallisuutta koskevaan tutkimukseen, sekä perinteisten lääkevalmisteiden, kansanparantajien ja käytettyjen hoitomenetelmien tarkempaan valvontaan. Lisäksi yhteistyötä eri tahojen välillä olisi vahvistettava, lääkekasvien viljelemistä ja säilymistä edistävää käyttöä tuettava ja perinteiseen lääketieteeseen liittyvää osaamista suojeltava (WHO 2013). Vuodet 2010 – 2020 onkin julistettu Afrikan perinteisen lääketieteen toiseksi vuosikymmeneksi. Mallia perinteisen lääketieteen aseman vakiinnuttamisesta ja mahdollisesta sulauttamisesta perusterveydenhuoltoon voisi ottaa esimerkiksi Kiinasta ja Intiasta, joissa paikallisella perinteisellä lääketieteellä on vahva asema ja useita perinteisiä lääkevalmisteita markkinoilla (Isola 2013). Taulukossa 3 on esitetty Afrikan perinteisen lääketieteen ensimmäisen (2001 – 2010) ja toisen (2011 – 2020) vuosikymmenen aikaansaamat edistysaskeleet perinteisessä lääketieteessä.

Taulukko 3. Afrikan perinteisen lääketieteen ensimmäisen (2000 – 2010) ja toisen (2011 – 2020) vuosikymmenen aikana tapahtunut edistys perinteisen lääketieteen asemassa Afrikan valtioissa vuosina 2000 – 2012 (Mukailtu WHO 2013). Valtioiden lukumäärä Arviointikriteerit 1999/2000 2002 2005 2010 2012 N=30 N=35 N=37 N=39 N=42 Kansalliset perinteisen lääketieteen 8 12 22 39 40 toimintamallit Perinteisen lääketieteen juridiset 1 5 16 28 29 viitekehykset Kansalliset perinteisen lääketieteen osa-alueita sisältävät 0 2 10 18 19 terveydenhuoltostrategiat Perinteisen lääketieteen harjoittajia 0 0 1 18 19 koskevat eettiset säädökset Terveysministeriöiden alaiset 22 25 31 39 39 perinteisen lääketieteen virastot Kansalliset perinteisen lääketieteen 10 16 18 25 25 asiantuntijapaneelit Terveysministeriöiden alaiset 10 12 15 24 24 perinteisen lääketieteen projektit Perinteisen lääketieteen harjoittamista 8 10 15 21 21 koskevat lait ja säädökset Perintestä lääketiedettä koskevat 4 8 10 15 15 rekisteröintimenetelmät Perinteisille lääkevalmisteille 1 1 4 12 13 myönnetyt myyntiluvat Perinteisen lääketieteen kansalliset 18 21 28 28 28 tutkimuslaitokset Kasvilääkkeitä koskevat lait ja 10 12 16 20 20 säädökset Kansallisiin tärkeiden lääkevalmisteiden listoihin sisällytetyt 1 1 2 5 7 kasvilääkevalmisteet Uudet tutkimuslaitokset 0 2 3 4 4 Paikallinen perinteisten 15 17 15 17 17 lääkevalmisteiden tuotanto 18

3. COMBRETACEAE-HEIMO

3.1. Combretaceae-heimon systematiikka, morfologia, levinneisyys ja kansanlääkinnällinen käyttö

Heimo Combretaceae kuuluu Myrtales-lahkoon ja se sisältää noin 20 sukua ja 600 lajia puita, pensaita ja puuvartisia köynnöskasveja eli liaaneja (Tan ym. 2002). Combretaceae-heimoon kuuluvat kasvit elävät trooppisilla ja subtrooppisilla alueilla ympäri maapalloa. Heimon kolme suurinta sukua ovat Combretum, Terminalia ja Quisqualis. Puut ja liaanit kasvavat yleensä metsissä ja metsäsavanneilla (Miombo woodland), kun taas pensaat kasvavat savanneilla tai kosteilla mangrove-alueilla (Tan ym. 2002, Eloff ym. 2008). Eri lajien välillä esiintyy suurta vaihtelua kukissa, hedelmissä ja silmuissa, kun taas toiset lajit ovat morfologisesti hyvinkin samankaltaisia, mikä voi hankaloittaa näiden lajien tunnistamista. Hedelmien muoto, koko ja väri ovat joidenkin afrikkalaisten lajien kohdalla verrattain hyviä lajituntomerkkejä (Fyhrquist 2007).

Afrikassa Combretum- ja Terminalia-lajeja on käytetty mm. infektioiden, vatsavaivojen, kuumeen, sydänvaivojen ja verenpaineen sekä ihosairauksien hoitoon. Association for African Medicinal Plant Standards valitsi Terminalia sericea ja Combretum micranthum -lajit 50 tärkeimmän Afrikkalaisen lääkinnällisen kasvin joukkoon (Phillips 2013). Terminalia-lajeja käytetään lääketieteen ohella myös esimerkiksi puu- ja nahkateollisuudessa (Tan ym. 2002).

3.1.1. Combretum-suku

Combretaceae-heimon suurin suku on Combretum, johon kuuluu noin 250 lajia (Tan ym. 2002). Sukuun kuuluvia lajeja kasvaa trooppisella ja subtrooppisella vyöhykkeellä Australiaa ja Tyynenmeren saaria lukuun ottamatta (Fyhrquist 2007). Kasvutavaltaan Combretum-lajit ovat usein puita, pensaita tai puuvartisia köynnöksiä (Kuva 2). 19

Afrikassa puina kasvavia lajeja löytyy monesti Miombo-metsistä, kun taas pensaita kasvaa savanneilla.

Ainakin 24 Combretum-lajia käytetään perinteisessä afrikkalaisessa lääketieteessä useisiin eri sairauksiin, kuten käärmeenpuremiin, sydän- ja mielenterveysongelmiin sekä matojen ja infektioiden häätöön (Fyhrquist ym. 2002). Kaikkia kasvinosia voidaan käyttää lääketieteellisiin tarkoituksiin, jopa myrkyllisinä pidettyjä hedelmiä. Combretum-lajeista voidaan valmistaa suun kautta annosteltavia kuumavesikeitoksia (dekokteja) ja uutteita, tai kasvinosia voidaan sekoittaa suoraan puuroon tai muuhun ruokaan. Toisinaan kasvien vaikuttavia yhdisteitä hengitetään höyryn tai savun mukana, tai annostellaan ulkoisesti linimenttinä esimerkiksi haavoihin ja ihottumiin. Combretum- lajeja saatetaan myös sekoittaa toistensa tai muiden lääkekasvien kanssa sairaudesta riippuen.

Combretum psidioides Welw. -laji on noin kahdeksan metriseksi kasvava pieni puu. Sen juuria on käytetty ripuliin ja lihaskipuihin, lehtiä turvotukseen (Fyhrquist 2007). Yhdessä C. molle tai C. zeyheri -lajien kanssa C. psidioides -lajia on käytetty rintakipuihin, selkärankakipuihin sekä turvotukseen. Kasvia on käytetty myös malarian ja reumaattisen selkäkivun hoitoon.

Kuva 2. Combretum hereroense. Kuva: Pia Fyhrquist. 20

3.1.2. Terminalia-suku

Terminalia on Combretaceae-heimon toiseksi suurin suku, ja siihen kuuluu noin 200 lajia (Tan ym. 2002), joista noin 30 kasvaa Afrikassa (Fyhrquist 2007). Nämä ovat puita, joiden koko vaihtelee kasvupaikan mukaan – sademetsissä elävät puut voivat olla jopa 50 metrin korkuisia, kun taas Miombo-metsissä ne ovat 10-20 metrisiä. Afrikassa erittäin harvat Terminalia-lajit kasvavat pensaina.

Monia Terminalia-lajeja käytetään perinteisessä afrikkalaisessa lääketieteessä sisäisesti ja ulkoisesti esimerkiksi ruuansulatuskanavan ongelmiin, ripuliin, bakteeri- ja sieni- infektioiden hoitoon, haavojen hoitoon ja malariaan (Fyhrquist 2007). Yleisimmin käytetään kuumavesikeitoksia ja infuuseja, mutta kuivattuja ja jauhettuja kasvinosia voidaan käyttää myös sellaisenaan ruokaan sekoitettuna, tai niistä voidaan valmistaa höyryhengitykseen sopivia valmisteita. T. glaucescens -lajia on käytetty myös hampaiden hoitoon pureskelemalla sen juuria (Ogundiya ym. 2008).

Terminalia kaiserana F. Hoffm. on 10 metriseksi kasvava matala puu tai pensas (Fyhrquist 2007). Sen osia on käytetty paljon perinteisessä afrikkalaisessa lääketieteessä. Toisaalta sen käyttö lääkkeenä on vähentynyt, mahdollisesti koska sitä käytetään myös polttopuuna. Esimerkiksi juurilla lääkitään pää- ja selkäsärkyä sekä skistosomiaasia eli halkiomatotautia tai bilhartsiaa. Juuria käytetään myös nesteenpoistolääkkeenä. Juurilla, lehdillä ja varren kuorella voidaan hoitaa tippuria, ripulia ja oksentelua. Lehtiä ja juuria yhdessä on käytetty skistosomiaasiin, syyhyyn, yskään ja sydänongelmiin. Yhdessä C. molle -lajin kanssa T. kaiserana -lajia on käytetty diabeteksen hoitoon.

Terminalia sambesiaca Engl. & Diels. voi kasvaa lähes 40 metriä korkeaksi puuksi (Kuva 3) (Fyhrquist 2007). Sen juuria käytetään veriripuliin, varren kuorta ja lehtiä puolestaan syöpään, vatsahaavoihin ja umpilisäkkeen tulehdukseen (Chhabra ym.1989).

Kuva 3. Terminalia sambesiaca. Kuva: Pia Fyhrquist.

3.2. Combretum- ja Terminalia-sukuihin kuuluvien lajien biologisesta aktiivisuudesta ja niiden sisältämistä yhdisteistä

Combretum- ja Terminalia-sukuihin kuuluvia lajeja on tutkittu verrattain laajalti mikrobien kasvua ja syöpää estävästä tehostaan (Tozer ym. 2001, Saleem ym. 2002, Eloff ym. 2005a, Taganna ym. 2011). Tutkimuksissa on useimmiten käytetty erilaisia uutteita, ja harvemmissa tapauksissa on eristetty aktiivinen yhdiste. Combretum- ja Terminalia-lajeista on löytynyt laaja joukko tanniineja, flavonoideja, terpenoideja ja stilbenoideja sekä muita yhdisteitä (Eloff ym. 2008). Osan näihin kemiallisiin ryhmiin kuuluvista yhdisteistä tiedetään estävän mikrobien (Hatano ym. 2005, Green ym. 2010), sienten (Liu ym. 2009) tai syöpäkasvainten kasvua (Saleem ym. 2002, Fyhrquist ym. 2006, Chen ym. 2009). Seuraavissa kappaleissa tarkastellaan Combretum- ja Terminalia-lajien uutteiden biologisia vaikutuksia sekä keskitytään kombretastatiineihin ja ellagitanniineihin, sillä Combretum- ja Terminalia- sukujen lajit sisältävät runsaasti näitä yhdisteitä.

3.2.1. Antimikrobisesti aktiiviset uutteet ja yhdisteet

Combretum- ja Terminalia-lajeilla on todettu olevan lupaavaa antibakteerista tehoa mikrobeja vastaan. Eloff kollegoineen (2005b) on tutkinut C. woodii -lajia, jonka lehtien uutteet estivät Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia 22

coli ja Enterococcus faecalis -bakteerien kasvua MIC-arvojen vaihdellessa välillä 0,4- 1,6 mg/ml. Katere (2003) puolestaan on ryhmänsä kanssa tutkinut C. imberbe ja T. stuhlmannii- lajeja ja eristänyt näistä pentasyklisiä triterpeenejä, joista erityisesti imberbihappo on osoittanut antibakteerista tehoa Mycobacterium fortuitum ja S. aureus- bakteereita vastaan MIC-arvjojen ollessa 1,56 µg/ml mykobakteerille ja 3,13 µg/ml stafylokokille. Ayepola (2009) on tutkinut T. glaucescens -lajin juurten ja lehtien uutteiden vaikutusta useiden bakteerien kasvuun agardiffuusiomenetelmällä ja määrittämällä MIC-arvot. Molemmat uutteet estivät P. aeruginosa ja S. aureus- bakteerien kasvua. Juuriuute, joka osoittautui tehokkaammaksi, esti P. aeruginosa bakteerin kasvua MIC-arvolla 6,25 mg/ml ja S. aureus bakteerin kasvua MIC-arvolla 25 mg/ml. Myös Ogundiyan ja kollegoiden (2008) tutkimuksissa T. glaucescens -lajin juuriuute osoittautui tehokkaammaksi joitakin suun patogeeneja vastaan verrattuna varren uutteeseen. He arvelevat syyksi sen, että juuriuute sisältää suuremmat määrät alkaloideja, tanniineja ja saponiineja verrattuna varren uutteisiin.

3.2.2. Kombretastatiinit

Kombretastatiinit kuuluvat stilbenoidien ryhmään ja ne rakentuvat kahdesta bentseenirenkaasta, joiden välissä on eteenisilta (Lawrence ym. 2003, Fyhrquist 2007). Renkaissa on useita metoksisubstituentteja (Kuva 4A). Huolimatta niiden yksinkertaisesta rakenteesta, ne ovat osoittautuneet erittäin potentiaalisiksi syöpäsolujen vastaisiksi yhdisteiksi (Tozer ym. 2002, Lawrence ym. 2003). Rakenne muistuttaa läheisesti kolkisiinia, tehokasta mutta verraten toksista anti-mitoottista lääkettä, jota käytetään mm. reuman hoitoon (Kuva 4B).

A) B)

Kuva 4. A) Kombretastatiinin A-4 (CA-4), kombretastatiini A-4 fosfaatin (CA-4P) ja kombretastatiinin A-1 (CA-1) sekä B) kolkisiinin rakenteet (Tozer ym. 2002, Lawrence ym. 2003).

Kombretastatiineja eristettiin ensimmäiseksi Combretum caffrum -lajista 1980-luvulla (Pettit ym. 1987). Niitä on löytynyt myös kolmesta muusta Combretum-lajista, ja on hyvinkin mahdollista, että niitä löytyy muista, toistaiseksi tutkimattomista lajeista (Fyhrquist ym. 2006). 17:sta eristetystä kombretastatiinista (CA) CA-1 ja CA-4 osoittautuivat tehokkaimmiksi kombretastatiineiksi syöpäsoluja vastaan (Pettit ym. 1987, Pettit ym. 1989). 1990-luvun puolessa välissä CA-4:sta tehtiin paremmin liukeneva dinatrium kombretastatiini 3-O-fosfaatti (CA-4-P, ZybrestatTM), joka on sittemmin läpikäynyt useita prekliinisiä ja kliinisiä tutkimuksia ja osoittautunut erittäin lupaavaksi lääkkeeksi kiinteiden kasvainten hoidossa yhdessä muiden hoitomuotojen kanssa (Tozer ym. 2002, He ym. 2011). Myös CA-1:sta on tehty natriumfosfaattisuola CA-1P, joka on prekliinisissä kokeissa osoittautunut jopa tehokkaammaksi kuin CA-4P, ja joka on myös kliinisissä kokeissa (Tozer ym. 2008).

Kombretastatiini CA-4P sitoutuu voimakkaasti solun tukirangan muodostaviin tubuliini- proteiineihin estäen mikrotubulusten muodostumisen (Tozer ym. 2002). Sitoutumiskohta on sama tai lähellä kolkisiinin sitoutumiskohtaa. Tämä johtaa solusyklin pysähtymiseen G2/mitoosi-vaiheeseen, sillä jakautumiseen tarvittavaa tumasukkulaa ei muodostu. Solutyypistä, CA-4P:lle altistumisen ajasta ja muista tekijöistä kuitenkin riippuu solun herkkyys CA-4P:lle, solun mahdollinen toipuminen tai lopullinen tuhoutuminen. CA-4P:n tiedetään myös aiheuttavan selektiivistä ja irreversiibeliä nekroosia kiinteiden kasvainten verisuonissa, jättäen kuitenkin normaalit verisuonet rauhaan (Woods ym. 1995, Dark ym. 1997). Näin kasvaimen syöpäsolut eivät saa ravinteita ja kuolevat.

Eloff kollegoineen (2005a) eristi ensimmäisenä C. woodii -lajin lehdistä stilbeenin, jolla huomattiin olevan antibakteerista tehoa. Tämä kombretastatiini B-5 (Kuva 5) on osoittanut lupaavaa antibakteerista tehoa ainakin S. aureus ja P. aeruginosa ja E. faecalis -bakteereita vastaan (MIC-arvot 16 µg/ml S. aureus -bakteeria vastaan ja 125 µg/ml kahta muuta bakteeria vastaan). Yhdiste on aiemmin eristetty myös C. kraussi - lajin siemenistä, mutta C. woodii -lajin lehdissä pitoisuudet olivat huomattavasti korkeammat. 24

Kuva 5. Kombretastatiini B-5 (CB-5) (Eloff ym. 2005b)

3.2.3. Ellagitanniinit

”Tanniini” on kuvaava nimitys polymeerisille fenoliyhdisteille, joita voidaan käyttää nahan parkitsemiseen, tai jotka saostavat proteiineja liuoksesta (Kallithraka ja Bakker 1998, Cowan 1999). Ne ovat kasvien sekundaarimetaboliitteja, ja niitä löytyy laajalti kehittyneemmistä kasveista lähes kaikista kasvinosista, kuten kuoresta, puuaineesta, lehdistä, hedelmistä ja juurista (Haslam 1996, Cowan 1999). Tanniinien molekyylipaino vaihtelee yleensä välillä 500-4000. Ne voidaan jakaa karkeasti kahteen ryhmään, hydrolysoituviin ja kondensoituneisiin tanniineihin. Hydrolysoituvien tanniinien perusrakenteessa on usein gallushappoja esteröityneenä D-glukoosin kanssa, kun taas kondensoituneet tanniinit rakentuvat flavonoidimonomeereistä.

Ellagitanniinit ovat monimuotoinen joukko vesiliukoisia hydrolysoituvia tanniineja, jotka ovat rakenteeltaan yhden tai useamman heksahydroksidifenyyliyksikön (HHDP) ja polyolin, usein glukoosin, estereitä (Clifford ja Scalbert 2000, Aguilera-Carbo ym. 2008b, Ascacio-Valdés ym. 2011). Ne muodostuvat vaiheittain gallotanniineista hapettumis- ja oligomerisaatioprosessin seurauksena (Okuda ym. 2000, Okuda ym. 2009). Ellagitanniinien hydrolyysin seurauksen vapautuu laktonisaatiovaiheen kautta ellagihappoa (Aguilera-Carbo ym. 2008a). Kuvassa 6 on esitetty ellagitanniinien muodostuminen ja hydrolyysi.

hapettuminen

1,2,3,4,6-Pentagalloyyliglukoosi Tellimagrandin

hydrolyysi laktonisaatio

3,4,5,3´,4´,5´- Ellagihappo Heksahydroksidifeenihappo Kuva 6. Ellagitanniinin muodostuminen ja hydrolyysi laktonisaation kautta ellagihapoksi. (Grundhöfer ym. 2001)

Toisin kuin kondensoituneet tanniinit, joita löytyy ympäri kasvikuntaa, ellagitanniineja esiintyy vain koppisiemenisten (Angiospermae) kasvien kaksisirkkaisilla lajeilla (Okuda ym. 2009). Ellagitanniineja esiintyy erityisen runsaasti heimoissa Myrtaceae, Lythraceae, Onagraceae, Melastomataceae ja Combretaceae (Okuda ym. 1993, Yoshida ym. 2010). Ellagitanniinien rakenteellinen monimuotoisuus on suuri (Grundhöfer ym. 2001). Kuten muutkin tanniinit, ne ovat tärkeitä kasvien fysiologian kannalta, sillä ne suojaavat kasvia mikrobeilta, hyönteisiltä ja laiduntamiselta (Haslam 1996, Ascacio- Valdés ym. 2011). Ne muodostavat vahvoja komplekseja proteiinien ja polysakkaridien kanssa vetysidosten, hydrofobisten voimien ja myös kovalenttisten sidosten välityksellä. Antimikrobinen teho perustuneekin tanniinien kykyyn inaktivoida mikrobien adhesiineja, entsyymejä ja solukalvon kuljetusproteiineja (Haslam 1996, Cowan 1999). Tanniinit voivat myös muodostaa komplekseja metalli-ionien kanssa, mikä vähentää mikrobeille vapaina olevien metalli-ionien määrää ja vaikeuttaa mikrobien kasvua. Ellagitanniinien mahdollisiksi vaikutusmekanismeiksi on ehdotettu myös niiden kyky muodostaa komplekseja mikrobien soluseinän kanssa, solukalvojen hajottamista ja biofilmien muodostumisen estämistä (Scalbert, 1991, Cowan 1999, Akiyama ym. 2001).

Useiden polyfenolisten yhdisteiden on huomattu vaikuttavan ihmisten terveyteen (Törrönen 2009). Niillä on esimerkiksi antioksidanttisia, antimikrobisia, tulehdusta lievittäviä ja antikarsinogeenisiä vaikutuksia, jotka voivat suojata kroonisilta taudeilta kuten sydän- ja verisuonitaudeilta, hermostosairauksilta ja syövältä. Tutkimus on kuitenkin keskittynyt lähinnä flavonoideihin, fenolihappoihin ja proantosyaaneihin, joita ravinnosta saa runsaammin, kun taas ellagitanniineita saa ravinnosta lähinnä marjoista, pähkinöistä, siemenistä ja hedelmistä (Clifford ja Scalbert 2000, Törrönen 2009). Monia ellagitanniineja sisältäviä kasvilajeja on kuitenkin käytetty perinteisessä lääketieteessä sairauksien hoitoon (Okuda ym. 2009), ja on esitetty että näiden rohdosten vaikuttavat yhdisteet olisivat ellagitanniineja (Haslam ym. 1989). In vitro -tutkimuksissa on havaittu runsaasti antioksidanttiaktiivisuutta ellagitanniineja sisältävien marjojen, kuten mansikan (Meyers ym. 2003), vadelman (Beekwilder ym. 2005) ja lakan (Kähkönen ym. 2001) sekä granaattiomenan uutteilla (Gil ym. 2000). Vähemmän kuitenkin tiedetään ellagitanniineja sisältävien ruokien in vivo -antioksidanttivaikutuksista (Törrönen 2009). Pfundstein kollegoineen (2010) tutki kolmen Terminalia-lajin hedelmien sisältämien polyfenolisten yhdisteiden antioksidanttivaikutuksia in vitro -kokeella ja he huomasivat, että chebulic-happoa sisältävillä ellagitanniineilla oli lupaavia antioksidanttivaikutuksia, ja ne voisivat siten mahdollisesti toimia syöpää ehkäisevinä yhdisteinä. He myös huomasivat, että vaikka tarkka aktiivisuuden ennustaminen on mahdotonta, ellagitanniinien antioksidanttivaikutukset riippuvat jonkin verran kolmesta tekijästä: molekyylin hydroksyyliryhmien määrästä, galloyyliyksiköiden konjugaatioasteesta sekä vapaasti pyörivistä galloyyliryhmistä.

Ellagitanniineja runsaasti sisältävien ruokien on huomattu vähentävän syöpäsolujen kasvua in vitro -kokeissa estämällä solujen erilaistumista, indusoimalla apoptoosia ja vaikuttamalla solusykliin sekä signaalinvälitysreitteihin (Törrönen 2009). Ross ryhmineen (2007) huomasi, että vadelmien ellagitanniinit estävät syöpäsolujen erilaistumista. Chen ryhmineen (2000) havaitsi Terminalia catappa -lajin lehtien pääellagitanniinin, punicalagiinin estävän bleomysiini-indusoitua genotoksisuutta kiinanhamsterien munasoluissa. Terminalia calamansanai -lajin lehtien sisältämät ellagitanniinit puolestaan indusoivat HL-60-syöpäsolujen apoptoosia (Chen ym. 2009). Fyhrquist (2006) kollegoineen arvelee, että Terminalia sambesiaca -lajin juurien 27

voimakas antiproliferatiivinen vaikutus HeLa-syöpäsoluja vastaan voisi johtua ainakin osittain sen sisältämistä tanniineista.

Ellagitanniinien antimikrobisia, antifungaalisia ja antiviraalisia vaikutuksia on myös tutkittu. Esimerkiksi marjat jotka sisältävät runsaasti ellagitanniineja (lakka, vadelma, mansikka), ovat osoittaneet antibakteerista tehoa useita gram-positiivisia ja gram- negatiivisia bakteereita vastaan (Puupponen-Pimiä ym. 2001, 2005). T. macroptera -lajin juurista tehtyjen neste-neste-uuttofraktioiden antimikrobista tehoa tutkittiin eri bakteerilajeja vastaan (Silva ym. 1997). Parhaimmat tulokset saatiin Shigella dysenteriae ja Vibrio cholerae -bakteereita vastaan, ja tehokkaimmat fraktiot sisälsivät ellagitanniineja pääasiallisina komponentteina. Tagannan tutkimusryhmä (2011) on puolestaan osoittanut Terminalia catappa -lajin lehtien tanniineja sisältävän fraktion estävän Chromobacterium violaceum -bakteerin quorum sensingiä (QS, ”joukkotunto”, jolla bakteerit viestivät keskenään) ja P. aeruginosa -bakteerin biofilmin muodostusta. Sarabhai (2013) on saanut samankaltaisia tuloksia – hänen ryhmänsä on huomannut, että Terminalia chebula -lajin hedelmien sisältämät ellagihappojohdannaiset vaimentavat P. aeruginosa -bakteerin QS-geenien ilmentymistä, jolloin bakteerin virulenssi heikkenee. Liun tutkimusryhmän (2009) Terminalia brachystemma -lajin lehdistä eristämä ellagitanniini punicalagiini osoitti antifungaalista tehoa kolmea Candida-lajia kohtaan. Myös Fyhrquist ryhmineen (2004) on tutkinut Terminalia- ja Combretum-lajien tehoa hiivoja vastaan ja saanut lupaavia tuloksia. Terminalia triflora -lajin lehdistä on puolestaan eristetty kaksi ellagitanniinia, punicalin ja O-galloyylipunicalin, jotka estävät tyypin 1 HI-viruksen käänteistranskriptaasia (Martin ym. 2004).

3.2.4. Tanniinien erotusdiagnostiikasta

Combretum- ja Terminalia-lajit sisältävät paljon erilaisia tanniineja, flavonoideja, terpenoideja ja stilbenoideja (Eloff ym. 2008). Tarkempia tutkimuksia afrikkalaisten Combretum- ja Terminalia-lajien sisältämistä yhdisteistä ja niiden määrästä on kuitenkin tehty vain vähän ja vain muutamilla, lähinnä Länsi- ja Pohjois-Afrikkalaisilla lajeilla. Tiedetään kuitenkin, että tanniinit muodostavat ison osan näistä yhdisteistä 28

(Silva ym. 1997, Silva ym. 2000, Juan ym. 2004, Pfundfstein ym. 2010). Useat tutkimusryhmät ovat käyttäneet korkean erotuskyvyn nestekromatografiaa (HPLC) tanniinien ja muiden yhdisteiden erottelemiseen. Silva ryhmineen (2000) erotteli neljä pääkomponenttia, ellagihappo, gallushappo ja ellagitanniinit punicalagiini ja terchebuliini, sekä kolme muuta ellagitanniinia Länsi-Afrikkalaisen Terminalia macroptera -lajin juurista. He fraktioivat neste-neste-uutolla juurten etanoliuutteen, ja valitsivat HPLC- analyyseihin vain antimikrobisesti aktiivisimmat fraktiot, eli vesiliukoisen ja dietyylieetteri-fraktion. Fraktioista tunnistettiin ellagihappoa sekä ellagitanniinit α,β-terflaviini, α,β-punicalagiini ja α,β-terchebuliini tutkimalla yhdisteiden UV-valon absorbtiomaksimi-spektrejä (UV max) ja retentioaikoja analyyttisella korkean erotuskyvyn nestekromatografialla sekä yhdisteiden molekyylimassoja elektronisuihkuionisaatio-massaspektrometria-menetelmällä. Juang ryhmineen (2004) eristi Aasialaisen Terminalia chebula -lajin hedelmistä 14 fenolisia yhdisteitä, ja jakoi nämä neljään ryhmään: fenolikarboksyylihapot, gallotanniinit, ellagitanniinit ja muut. He käyttivät erottelemiseen käänteisfaasi-HPLC:tä ja tunnistamiseen HPLC-UV-fotodiodimenetelmää (HPLC-UV-DAD). Myös Mahajan ja Pai (2011) eristivät T. chebula -lajista seitsemän komponenttia käänteisfaasi-HPLC:llä. Liun ryhmä (2009) eristi ensimmäisenä Terminalia mollis ja Terminalia brachystemma -lajeista kuusi triterpeeniä, kahdeksan flavonoidia ja kaksi ellagitanniinia semipreparatiivisella HPLC:llä. Pfundstein ryhmineen (2010) puolestaan eristi 34 polyfenolista yhdistettä, joista pääosa kuului hydrolysoituviin tanniineihin, Terminalia bellerica, Terminalia chebula ja Terminalia horrida -lajien hedelmistä käänteisfaasi- HPLC:llä. Näistä tutkituista lajeista T. horrida on Pohjois-Afrikkalainen laji, ja kaksi muuta kotoisin Aasiasta. Suurimmat yhdisteryhmät näillä lajeilla olivat ellagitanniinit jotka eivät sisällä chebulic-happoa, gallushappo ja gallaattiesterit sekä chebulic-happoa sisältävät ellagitanniinit.

3.3. Taustaa työssä käytetyistä mikrobeista

Työhön valittiin gram-positiivisen ja gram-negatiivisen bakteerin mallikannoiksi Staphylococcus aureus ja Pseudomonas aeruginosa. Lisäksi käytettiin tuberkuloosibakteerin mallibakteeria, Mycobacterium smegmatis.

S. aureus on gram-positiivinen bakteeri, joka tartuttaa sekä terveitä että immuunipuolustukseltaan heikentyneitä potilaita (Onanuga ja Awhowho 2012). Se aiheuttaa märkäisiä infektioita, esimerkiksi haavainfektioita, paiseita, verenmyrkytyksiä, ruokamyrkytyksiä, suolistoinfektioita sekä virtsatieinfektioita. Ihmisillä bakteeri voi kolonisoida sieraimet oireita aiheuttamatta, ja epäilläänkin, että jopa 25 % maailman väestöstä toimii bakteerin kantajana (Shaumburg ym. 2011). S. aureus -kannat voivat olla resistenttejä useille käytetyille antibiooteille, ja MRSA- kannat (Methicillin-resistant, metisilliinille resistentti S. aureus) ovatkin lisäntyneet (Hatano ym. 2005, Onanuga ja Awhowho 2012).

P. aeruginosa on gram-negatiivinen opportunistinen patogeeni, joka aiheuttaa korkeita antibioottikuluja ja korkean kuolleisuuden (Askoura ym. 2011). Se infektioi esimerkiksi palovammoja, virtsateitä ja hengitysteitä. P. aeruginosa -bakteeria esiintyy lähes kaikkialla luonnossa, koska se selviytyy vaatimattomissa olosuhteissa ja kykenee sopeutumaan erilaisiin ympäristöoloihin (Smith ym. 2012). Tämä perustuu sen kykyyn ilmentää sopivia fenotyyppejä eri ympäristöoloissa, ja toisaalta tekee bakteerista resistentin myös useille antibiooteille. P. auruginosa onkin erittäin tunnettu sen monista resistenssimekanismeistaan ja moni-resistenteistä (MDR, multi-drug resistant) kannoista (Askoura ym. 2011). P. aeruginosa tuottaa mm. β-laktamaaseja ja muita antibiootteja muokkaavia entsyymejä, ja sen membraanit sisältävät lääkemolekyyleja ulos pumppaavia effluksipumppuproteiineja. Lisäksi sen ulkokalvo on erittäin huonosti molekyylejä läpäisevä. Toistaiseksi kinoloni- ja aminoglykosidiantibiootit ovat tehokkaita P. aeruginosa -infektioiden hoidossa.

Tuberkuloosi, jonka aiheuttaja on Mycobacterium tuberculosis (MTB), on maailmanlaajuisesti yksi huomattavimmista taudeista ja viidenneksi suurin 30

kuolleisuuden syy (Green ym. 2010). Tautia esiintyy varsinkin kehitysmaissa, sillä MTB leviää herkästi suurissa väkijoukoissa, ahtaissa asuinoloissa ja ihmisten ollessa aliravittuja tai muuten immuunipuolustuksen heiketessä esim. HIV-infektion seurauksena. Jopa kolmanneksen maailman väestöstä arvellaan olevan oireettomia MTB:n kantajia. Tämä perustuu bakteerin kykyyn ”piilotella” elimistössä nukkuvana, mutta tilaisuuden tullen se voi aktivoitua uudelleen ja aiheuttaa infektion (Sarathy ym. 2012). Aiemmin käytössä olleet tuberkuloosilääkkeet ovat hiljalleen muuttuneet tehottomiksi resistenssin lisääntyessä, ja vuonna 2009 Maailman Terveysjärjestö (WHO) arvioi, että 5 % kaikista uusista tuberkuloositapauksista oli useille antibiooteille resistenttejä MDR-tuberkuloosi-tapauksia.

4. TYÖN TARKOITUS JA TAUSTA

Tämän työn tavoitteena oli tutkia kolmen Afrikkalaisen Combretaceae-heimoon kuuluvan kasvilajin, Terminalia kaiserana, Terminalia sambesiaca ja Combretum psidioides, antimikrobisia ominaisuuksia, sekä selvittää tarkemmin, mikä tai mitkä uutteet, pylväskromatografialla eristetyt fraktiot ja yhdisteet vastaavat mahdollisesta antimikrobisesta tehosta.

Työ on osa laajempaa tutkimusprojektia, jossa keskitytään tutkimaan Tansaniasta kerättyjen, Itä-Afrikkalaisten Terminalia- ja Combretum-sukuihin kuuluvien lajien biologisia aktiivisuuksia in vitro (Fyhrquist 2007), sekä eristämään uusia aktiivisia yhdisteitä keskittyen ellagitanniineihin, ellagihappojohdannaisiin ja stilbeeneihin. T. kaiserana, T. sambesiaca ja C. psidioides lajien metanoliin valmistetut raakauutteet ovat osoittaneet erittäin lupaavia antibakteerisia (Fyhrquist ym. 2002) ja antifungaalisia (Fyhrquist ym. 2004) vaikutuksia. Näistä lajeista T. kaiserana -lajin sisältämiä yhdisteitä ei ole tutkittu lainkaan, T. sambesiaca -lajin lehtien sisältämästä saponiinista on yksi julkaisu, (Masoko ym. 2005) ja C. psidioides-lajista on kolme julkaisua varren ja juurten sisältämistä fenantreeneista ja terpeeneistä (Letcher ja Nhamo 1972, Pettit ym. 1987, Kilonda ym. 2003). Tästä johtuen on hyvinkin mahdollista löytää uusia antimikrobisia yhdisteitä näistä lajeista.

II KOKEELLINEN OSUUS

5. MATERIAALIT JA MENETELMÄT

5.1. Kasvimateriaali

Työssä käytetyt kasvinäytteet valmistettiin Tansaniasta vuonna 1999 (Fyhrquist, 2007) kerätyistä, kuivatuista Combretum ja Terminalia lajeista. Eri kasvinosat erotettiin (lehdet, varren kuori, juuren kuori, hedelmät) ja kuivattiin heti kenttätyömatkan jälkeen. Kasvinäytteet on varastoitu huoneenlämmössä, paperipusseissa valolta suojattuna. Tässä työssä keskityttiin tutkimaan Terminalia kaiserana (F. Hoffm.), Terminalia sambesiaca (Engl. & Diels) ja Combretum psidioides (Welw.) lajeja. Työssä on käytetty sekä valmiiksi jauhettua kasvimateriaalia että kuivattuja, kokonaisia kasvinosia. Kuivat kasvinosat, kuten lehtiä, juurta sekä varren kuorta jauhettiin tehosekoittimessa karkeaksi jauheeksi.

5.2. Uuttomenetelmät

5.2.1. Soxhlet-uutto

Jauhetulle kasvimateriaalille tehtiin Soxhlet-uutto. Käytetyt kasvilajit ja kasvinosat näkyvät Taulukossa 2. 20 grammaa jauhettua kasvimateriaalia punnittiin Soxhlet- uuttohylsyyn, jota uutettiin 4-8 tuntia 500 ml:lla kiehuvaa metanolia (MeOH). Uutteen jäähdyttyä se siirrettiin punnittuun kolviin, metanoli haihdutettiin pois Rotavapor- laitteella (Büchi), ja saatu raakauute (merkitty myöhemmin Cr) kuivattiin täysin kuivaksi lyofilisaattorissa. Kuiva raakauute punnittiin, uute raaputettiin irti kolvista ja säilytettiin 4 ºC:ssa lasipullossa.

5.2.2. Neste-neste-uutto

Raakauutteelle tehtiin neste-neste-uutto neljällä eri liuottimella (Kuva 7). Käytetyt kasvilajit ja kasvinosat on esitetty Taulukossa 3. 1,5 grammaa kuivattua Soxhlet- raakauutetta liuotettiin 50 ml:aan (Milli-Q, Millipore) deionisoitua vettä. Liuosta inkuboitiin 20 minuuttia ultrasonikaattorissa huoneenlämmössä, minkä jälkeen se sentrifugoitiin 2000 rpm 5 min. Supernatantti siirrettiin 500 ml:n erotussuppiloon. Veteen liukenematon pelletti liuotettiin metanoliin veteen liukenemattomaksi fraktioksi (Wi-fraktio, water insoluble). Vesiliukoista osaa uutettiin 3 kertaa 50 ml:lla kloroformi- etanoli-seosta (2:1, v/v) ja uuttofraktiot yhdistettiin (CHCl3-fraktio). Vesiliukoista osaa uutettiin edelleen kerran 50 ml:lla ja kerran 25 ml:lla 1-butanolia. Butanolifraktiot yhdistettiin (BuOH-fraktio). Jäljelle jäi vesiliukoinen fraktio (Ws-fraktio, water soluble). Kaikki fraktiot siirrettiin taarattuihin pyörökolveihin, kuivattiin Rotavaporilla (Büchi) ja haihdutettiin täysin kuivaksi lyofilisaattorissa. Ws-, Wi- ja BuOH-fraktiot punnittiin, raaputettiin irti pyörökolvista ja säilytettiin 4 ºC:ssa jauheena tummissa lasipulloissa. CHCl3-fraktio punnittiin ja liuotettiin metanoliin pitoisuuteen 50 mg/ml ja säilytettiin 4 ºC:ssa koeputkessa.

Kuva 7. Neste-neste-uuttokavio

5.3. Kromatografiset menetelmät

5.3.1. Analyyttinen ohutkerroskromatografia

Neste-neste-uutosta saadut fraktiot tutkittiin ohutkerroskromatografialla (TLC, Thin Layer Chromatography). Koska keskityimme tutkimaan poolisia yhdisteitä, kuten ellagitanniineja, valittiin kiinteäksi tai stationäärifaasiksi alumiinilevylle sidottua RP-18 käänteisfaasia (RP-18 F254s TLC-levyt, Merck, Darmstadt, Saksa). Liikkuvana faasina käytettiin kyseisille yhdisteille soveltuvaa vesi-metanoli-ajoliuosta (1:1, v/v) joka sisältää 1 % ortofosforihappoa (H3PO4). Liuotinta lisättiin ajokammion pohjalle n. 1 cm ja liuotinhöyryt saivat tasapainottua ajokammiossa puoli tuntia ennen kromatografia- ajoa. Fraktiot ja kontrollina käytetty raakauute liuotettiin metanoliin pitoisuuteen 50 mg/ml, ja jokaista näytettä pipetoitiin TLC-levylle 10 µl lasikapillaarin avulla 1,5 cm välein 1 cm:n korkeudelle levyn alalaidasta. Kontrolleina käytettiin lisäksi ellagihappoa, gallushappoa ja (+)-katekiinia (1 mg/ml, Sigma-Aldrich), joita pipetoitiin 1 µl. Levyn annettiin kuivua ennen kromatografia-ajoa. Levy nostettiin ajokammioon ja ajon annettiin jatkua, kunnes liuotinrintama oli 1 cm:n päässä levyn ylälaidasta (yhteensä 8 cm:n ajomatka). TLC-levyn annettiin kuivua, ja fraktioiden sisältämät yhdisteet detektoitiin UV-lampulla 254 ja 366 nm aallonpituuksilla. Erottuneiden yhdisteiden retentiota, eli kulkunopeutta kuvaavat Rf-arvot (retardation factor) laskettiin ja taulukoitiin.

5.3.2. Pylväskromatografia

Lobar RP-8 low pressure (matalan paineen) -pylväskromatografialla pyrimme erottelemaan T. kaiserana-lajin sisältämiä yhdisteitä omiksi fraktioikseen, jotta voisimme selvittää, mikä tai mitkä yhdisteet vaikuttavat antimikrobiseen tehoon. Fraktiointiin valittiin T. kaiserana-lajin juuren kuori, sillä se oli osoittanut antimikrobista tehoa jo aiemmissa tutkimuksissa (Fyhrquist ym 2002, 2004), ja toisaalta kasvi on kiinnostava sillä julkaisuja muilta tutkimusryhmiltä ei ole ollut.

Pylväänä käytettiin Lobar Fertigsäule -lasipylvästä kokoa B (pituus 310 mm, Ø 25 mm), jossa stationäärifaasina on käänteisfaasi LiChroprep RP-8 (partikkelikoko 40-63 µm). Kromatografia suoritettiin gradienttiajona, jossa eluenttina käytettiin veden ja metanolin seosta. GF 425 ohjelmaa käytettiin gradientin ohjaamiseksi HPLC-pumppusysteemiin (Waters Corp., Milford, USA), joka koostui pumpuista A ja B. Ajoliuoksia ultrasonikoitiin 20 minuuttia ennen käyttöä ilmakuplien poistamiseksi. Käytetyt gradientit ja eluutioajat on merkitty Taulukkoon 4. Yhteensä suoritettiin kaksi ajoa.

Taulukko 4. Lobar RP-8 -pylväskromatografiassa käytetyt gradientit ja eluutioajat. A = 1 % MeOH + 99 % H2O (v/v); B = 100 % MeOH. Virtausnopeus: 1 ml/min. Aika min Ajo1 Ajo 2 A % B % A % B % 0 100 0 100 0 120 100 0 95 5 240 80 20 85 15 360 60 40 70 30 480 40 60 40 60

Pylvästä tasapainotettiin ennen näytteen lisäämistä ajamalla läpi ajoliuos A:ta kaksi tuntia. Näyte valmistettiin liuottamalla 400 mg T. kaiserana -lajin juuren kuivattua raakauutetta 4 ml:aan metanolia, ultrasonikoimalla 20 minuuttia ja sekoittamalla voimakkaasti vortexilla minuutin ajan. Näyte sentrifugoitiin 2000 rpm 5 min, ja supernatantti säilytettiin 4 ºC:ssa, kunnes se injisoitiin pylvääseen. Kromatografian aikana kerättiin 5 ml:n fraktioita automaattisella fraktionkerääjällä (Hitachi, Merck). Fraktioiden värin intensiteetin perusteella jokainen, joka toinen tai joka kolmas fraktio analysoitiin RP-18 ohutkerroskromatografialla (ks. kappale 5.3.1.). Tutkittavaa fraktiota pipetoitiin TLC-levylle 10 µl, kontrollina käytettiin 5 µl T. kaiserana -lajin juuren raakauutetta (50 mg/ml). Samaa tai samoja yhdisteitä sisältävät fraktiot yhdistettiin punnittuihin koeputkiin ja haihdutettiin kuiviin typpikaasun ilmavirtauksella. Mikrodiluutiokokeita varten kuivat fraktiot liuotettiin metanoliin pitoisuuteen 20 mg/ml.

5.3.3. Preparatiivinen ohutkerroskromatografia

T. kaiserana -lajin juuren raakauutteen sisältämiä yhdisteitä haluttiin erotella myös ohutkerroskromatografian avulla. Erotuksen stationäärifaasina käytettiin lasilevylle sekä alumiinilevylle sidottua RP-18 käänteisfaasia (RP-18 F254s, Merck, Darmstadt, Saksa). Liikkuvana faasina käytettiin vesi-metanoli-ajoliuosta (1:1, v/v) joka sisälsi 1 % ortofosforihappoa (H3PO4). T. kaiserana -lajin juuren raakauutetta (50 mg/ml) pipetoitiin TLC-levylle 15 µl lasikapillaarin avulla 1,5 cm välein 1 cm:n korkeudelle levyn alalaidasta. Samasta uutteesta pipetoitiin lasipohjaisille levyille 54 ja alumiinipohjaisille levyille 68 rinnakkaista näytettä. Kontrolleina käytettiin ellagihappoa, gallushappoa ja (+)-katekiinia (1 mg/ml, Sigma-Alrdich), joita pipetoitiin 1 µl. Levyn annettiin kuivua ennen kromatografia-ajoa. Levy nostettiin ajokammioon ja kromatografian annettiin jatkua, kunnes liuotinrintama oli 5 cm:n päässä levyn ylälaidasta (yhteensä 14 cm:n ajomatka). TLC-levyn annettiin kuivua, ja fraktioiden sisältämät yhdisteet detektoitiin UV-lampulla, 254 ja 366 nm aallonpituuksilla.

Erottuneiden yhdisteiden Rf-arvot laskettiin ja saman Rf-arvon omaavat yhdisteet raaputettiin irti levyltä ja yhdistettiin. Irti raaputettuihin näytteisiin lisättiin 5 ml metanolia jolla yhdisteet uutettiin kiinteästä faasista. Näytteitä sekoitettiin Vortex- laitteella ja inkuboitiin ultrasonikaattorissa huoneenlämmössä tunti. Näytteet sentrifugoitiin 2000 rpm 5 min jonka jälkeen supernatantit otettiin talteen punnittuihin koeputkiin. Supernatantit haihdutettiin kuiviin ja fraktioiden saannot määritettiin punnitsemalla koeputket.

5.4. Antimikrobiset kokeet

T. kaiserana, T. sambesiaca ja C. psidioides -lajien raakauutteiden ja neste-neste- uuttofraktioiden mikrobien_vastaista tehoa tutkittiin agardiffuusio- ja mikrodiluutio- menetelmillä. Kyseisiä lajeja valittiin jatkotutkimuksiin, sillä näiden lajien metanoliin liuotetut raaka-uutteet ovat antaneet lupaavia antimikrobisia vaikutuksia (Fyhrquist ym. 2002, 2004).

5.4.1. Bakteerikannat

Työssä käytettiin Staphylococcus aureus ATCC 25923 ja Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 bakteerikantoja gram-positiivisen ja gram-negatiivisen bakteerin mallikantoina. Lisäksi käytettiin tuberkuloosibakteerin mallibakteeria, Mycobacterium smegmatis ATCC 14468.

S. aureus ja P. aeruginosa kasvatettiin ennen agar-diffuusiokoetta ravintoagar- vinopinnalla, tai ennen mikrodiluutiokoetta Mueller-Hinton II (Becton-Dickinson & Company, USA) -kasvatusliemessä ravistelussa +37 ºC:ssa 18-20 tuntia. M. smegmatis -bakteeria kasvatettiin ennen mikrobiologisia kokeita Löwenstein-Jensen agar-vinopinnoilla (Becton-Dickinson & Company, USA) +37 ºC:ssa 4-5 vuorokautta. Kokeiden välissä S. aureus ja P. aeruginosa -kantoja nuorennettiin noin kahden viikon välein ravintoagar-vinopinnoille ja M. smegmatis -kantaa 4 viikon välein Löwenstein- Jensen -vinopinnoille. Bakteerikantoja säilytettiin +4 ºC:ssa.

5.4.2. Agardiffuusiomenetelmä

Agardiffuusiomenetelmän avulla tutkittiin, kykenevätkö kasviuutteet estämään bakteerien kasvua agar-alustalla petrimaljalla. Menetelmällä tutkittiin T. kaiserana -lajin juuren ja varren kuoren, T. sambesiaca -lajin juuren kuoren sekä C. psidioides -lajin varren kuoren raakauutteiden ja neste-neste-uutto fraktioden vaikutusta P. aeruginosa ja S. aureus -bakteerien kasvuun. Antimikrobinen teho määriteltiin mittaamalla kasviuutteen mahdollisesti aikaansaaman estovyöhykkeen läpimitta ja vertaamalla sitä tehokkaaksi todetun antibiootin vastaavaan mittaan. Antimikrobiset yhdisteet voivat joko tappaa bakteereita, jolloin puhutaan bakterisidisestä tehosta (kirkas estovyöhyke lähempänä kasvua estävää uutetta), tai lähinnä estää bakteerien kasvua, jolloin puhutaan bakteriostaattisesta tehosta (samea, yksittäisiä pesäkkeitä sisältävä estovyöhyke ulompana renkaana). Molemmat alueet mitattiin maljoilta, ja estovaikutuksena ilmoitettiin erikseen bakterisidisten ja bakteriostaattisten vyöhykkeiden läpimitat neljän rinnakkaisnäytteen keskiarvona ja keskiarvon keskivirheenä (SEM). Tutkittavien kasviuutteiden aktiivisuusindeksi (AI, Activity 38

index) laskettiin vertaamalla kasviuutteen ja kontrolliantibiootin bakteriostaattisen vyöhykkeen kokoa (Kaava 1).

Kaava 1. Aktiivisuusindeksin laskeminen

AI = Kasviuutteen estovyöhyke Kontrolliantibiootin estovyöhyke

Agardiffuusiokokeissa käytettiin petrimaljoja (Ø 14 cm), joiden pohjalle valettiin 30 ml Base-agaria (Difco) ja pinnalle 30 ml Isosensitest-agaria (Difco). Agarit valmistettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tutkittavia kasviuutteita (50 mg/ml) ja positiivisena kontrollina käytettyjä antibiootteja (penisilliini G, tetrasykliini ja rifampisiini, kaikki Sigma-Aldrich, 10 mg/ml) pipetoitiin suodatinpaperikiekoille (Ø 13 mm, Whatman) 4 kertaa 50 µl/kiekko (yhteensä 200 µl/kiekko). Kiekkojen annettiin kuivua ennen seuraavan annoksen pipetoimista. Vinopinnoilla kasvaneista S. aureus ja P. aeruginosa -bakteerikannoista tehtiin suspensio 2 ml:aan 0,9 % NaCl-liuokseen ja bakteeritiheys määritettiin mittaamalla suspension absorbanssi spektrofotometrisesti 625 nm:ssa. Bakteerisolujen määrä säädettiin vastaamaan noin 1,0 × 108 cfu (colony forming unit, pesäkkeen muodostava yksikkö, pmy)/ml inokulaatiosuspensiota jota pipetoitiin 200 µl/petrimalja ja levitettiin tasaiseksi siirrostuskolmiolla. Siirrostettujen maljojen annettiin kuivua 10 min ennen suodatinpaperikiekkojen lisäämistä. Suodatinpaperikiekkoja asetettiin maljojen pinnalle 6 kpl/malja, tasaiselle etäisyydelle toisistaan, ja jokaisesta tutkittavasta uutteesta sekä kontrollista tehtiin neljä rinnakkaista määritystä. Maljoja inkuboitiin ensin +4 ºC:ssa tunti, jonka jälkeen niitä inkuboitiin +37 ºC:ssa 18-20 tuntia. Estovyöhykkeiden läpimitta (mm) mitattiin pesäkkeenlaskijan suurentavan linssin alla työntömitalla, ja maljat kuvattiin Camaq Video dokumentaatio- laitteella jossa käytetään VideoStore (Camaq)-ohjelmaa.

5.4.3. Mikrodiluutiomenetelmä

Mikrodiluutiomenetelmällä pyrittiin selvittämään tarkemmin, millaisilla pitoisuuksilla tutkittavat kasviuutteet ovat tehokkaita. Tutkittavaksi valittiin näytteitä jotka olivat 39

antaneet erityisen lupaavia tuloksia agardiffuusiokokeella. Koe tehtiin 96- kuoppalevyilla (ELISA), tasapohjaisilla kuopilla, ja tulokset perustuvat turbidimetrisiin mittauksiin. Tutkittavat kasviuutteet olivat C. psidioides -lajin varren kuori, T. sambesiaca -lajin juuren sekä T. kaiserana -lajin juuren ja varren kuoren raakauutteet (Cr) sekä butanoli (BuOH) ja vesiliukoinen (Ws) fraktio. Lisäksi mikrodiluutiokokeet tehtiin Lobar RP-8-pylväskromatografialla saaduilla T. kaiserana -lajin juuren kuoren raakauutteen fraktioilla S. aureus ja P. aeruginosa -bakteereille. Kontrolleina käytettiin penisilliini G:tä (kaikki antibiootit Sigma-Aldrich) ja tetrasykliiniä (S. aureus ja P. aeruginosa), gentamisiinia (P. aeruginosa) sekä rifampisiinia (M. smegmatis), joiden bakteerien kasvua estävään tehoon kasviuutteiden tehoa verrattiin.

Kasviuutteet laimennettiin Mueller-Hinton II -liemeen (Difco; S. aureus ja P. aeruginosa) tai Dubos-liemeen (Difco; M. smegmatis) pitoisuuksiin 5000, 2500, 1250, 625, 313, 156, 78, 39, 19, 9.7 µg/ml. Lobar RP-8 -pylväskromatografiasta saadut T. kaiserana -lajin juuren kuoren fraktiot laimennettiin pitoisuuksiin 2000, 1000, 500, 250, 125, 63, 31, 16, 8, 4 µg/ml. Gentamysiini ja rifampisiini laimennettiin Mueller-Hinton II tai Dubos-liemeen pitoisuuksiin 1000, 500, 250, 125, 62, 31, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 µg/ml. Penisilliini G:tä ja tetrasykliiniä laimennettiin vielä lisää pitoisuuksiin 0,24, 0,12, 0,06, 0,03, 0,015 µg/ml, 7,5, 3,75, 1,88, 0,94 ng/ml, jotta S. aureus -bakteerille voitiin määrittää MIC ja IC50-arvot. Lisäksi metanolia laimennettiin ravintoliemeen pitoisuuksiin 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625 % (v/v), jotta voitiin varmistua, ettei alkuperäisten kasviuuteseosten sisältämä metanoli vaikuta bakteerien kasvuun (liuotinkontrolli, SC).

Liemessä kasvaneista bakteereista määritettiin absorbanssi ja bakteeritiheys säädettiin vastaamaan 1,0 × 108 cfu/ml. Tästä suspensiosta tehtiin vielä 100-kertainen käyttölaimennos, jonka solutiheys oli 1,0 × 106 cfu/ml. Lopullinen solutiheys kuoppalevyllä oli 5 × 105 cfu/ml, sillä kuoppiin pipetoitiin 100 µl bakteerisuspensiota ja 100 µl kasviuutetta tai muuta liuosta (Kuva 8). M. smegmatis bakteeria laimennettiin solutiheyteen 5 × 105 cfu/ml, ja lopullinen solumäärä kuopissa oli 2,5 × 105 cfu/ml.

Tutkittavat kasviuutteet, kontrolliantibiootit ja liuotinkontrolli pipetoitiin 96- kuoppalevylle Taulukon 5 pipetointikaavion mukaisesti. Kasvukontrollikuoppiin (GC, 40

growth control) pipetoitiin 100 µl bakteerisuspensiota (1,0 × 106 cfu/ml, muut bakteerit tai 5 x 105 cfu/ml, M. smegmatis) ja 100 µl kasvulientä. Testikuoppiin (T, tutkittava yhdiste) pipetoitiin 100 µl bakteerisuspensiota (1,0 × 106 cfu/ml, muut bakteerit tai 5 x 105 cfu/ml, M. smegmatis) ja 100 µl tutkittavien kasviuutteiden laimennoksia. Kontrolliantibiootti-kuoppiin (A, positiivinen kontrolli) pipetoitiin 100 µl bakteerisuspensiota (1,0 × 106 cfu/ml, muut bakteerit tai 5 x 105 cfu/ml, M. smegmatis) ja 100 µl antibioottilaimennoksia. Negatiivisiin kontrolli-kuoppiin (NC) pipetoitiin 100 µl kasviuutteiden/antibioottien laimennoksia ja 100 µl kasvatuslientä. Liuotinkontrolli- kuoppiin (SC, solvent control) pipetoitiin 100 µl bakteerisuspensiota (1,0 × 106 cfu/ml, muut bakteerit tai 5 x 105 cfu/ml, M. smegmatis) ja 100 µl metanolilaimennoksia. Jokaista kasviuute-/antibioottilaimennosta ja vastaavat kontrollit pipetoitiin kahtena rinnakkaisena laimennoksena. Koska kuoppien kokonaistilavuudeksi tuli 200 µl, on huomioitava että Kuvassa 7 ilmoitetut pitoisuudet ovat kuopissa vain puolet ilmoitetusta pitoisuudesta. Yhteensä yhtä mikrodiluutiokoesarjaa varten tarvittiin 4 × 96- kuoppalevyä, jolloin kaikki laimennokset saatiin tutkittua samalla koesarjalla. Kuoppalevyn reunoille jääviin tyhjiin kuoppiin pipetoitiin 200 µl steriiliä vettä ehkäisemään mittaustilanteessa joskus ilmenevää reunavaikutusta, sekä kuoppien kuivumista. Kuoppalevyjä inkuboitiin kannella ja parafilmillä peitettynä kevyessä ravistelussa +37 ºC:ssa 18-20 tuntia, jonka jälkeen kuoppien turbiditeetti mitattiin Victor 1420 Manager (Wallac, Finland) -spektrofotometrillä 620 nm aallonpituudella. MIC- arvo ilmoitettiin pienimpänä pitoisuutena kasviuutetta, fraktiota ja antibioottia joka esti bakteerien näkyvää kasvua (90 % tai enemmän kasvukontrollin kasvusta). IC50 arvo ilmoitettiin sinä pitoisuutena, joka esti 50 % tutkittavan bakteerin kasvusta.

Taulukko 5. Mikrodiluutiokokeen pipetointikaavio. Esimerkkinä T. kaiserana -lajin juuren kuoren (25R) raakuute, cr; BuOH, butanolifraktio; WS, veteen liukeneva fraktio. Positiivisena kontrollina PenG, penisilliini G; H2O, steriili vesi; GC, kasvukontrolli; T, tutkittava kasviuute; NC, negatiivinen kontrolli; A, antibiootti; SC, liuotinkontrolli. H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O

H2O GC T NC T NC T NC A NC SC H2O 25Rcr 25Rcr 25RBuOH 25RBuOH 25RWS 25RWS Pen G Pen G 10 % 5 5 5 mg/ml 5 mg/ml 5 mg/ml 5 mg/ml 1 mg/ml 1 mg/ml MeOH mg/ml mg/ml H2O GC T NC T NC T NC A NC SC H2O 25Rcr 25Rcr 25RBuOH 25RBuOH 25RWS 25RWS Pen G Pen G 10 % 5 5 5 mg/ml 5 mg/ml 5 mg/ml 5 mg/ml 1 mg/ml 1 mg/ml MeOH mg/ml mg/ml H2O GC T NC T NC T NC A NC SC H2O 25Rcr 25Rcr 25RBuOH 25RBuOH 25RWS 25RWS Pen G Pen G 5 % 2.5 2.5 2.5 mg/ml 2.5 mg/ml 2.5 mg/ml 2.5 mg/ml 500µg/ 500µg/ MeOH mg/ml mg/ml ml ml H2O GC T NC T NC T NC A NC SC H2O 25Rcr 25Rcr 25RBuOH 25RBuOH 25RWS 25RWS Pen G Pen G 5 % 2.5 2.5 2.5 mg/ml 2.5 mg/ml 2.5 mg/ml 2.5 mg/ml 500 500 MeOH mg/ml mg/ml ug/ml ug/ml H2O GC T NC T NC T NC A NC SC H2O 25Rcr 25Rcr 25RBuOH 25RBuOH 25RWS 25RWS Pen G Pen G 2.5 % 1.25 1.25 1.25mg/ml 1.25mg/ml 1.25mg/ml 1.25mg/ml 250ug/ 250ug/ MeOH mg/ml mg/ ml ml ml H2O GC T NC T NC T NC A NC SC H2O 25Rcr 25Rcr 25RBuOH 25RBuOH 25RWS 25RWS Pen G Pen G 2.5 % 1.25 1.25 1.25mg/ml 1.25mg/ml 1.25mg/ml 1.25mg/ml 250µg/ 250µg/ MeOH mg/ml mg/ml ml ml H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O

6. TULOKSET JA TULOSTEN TARKASTELU

6.1. Raakauutteiden ja neste-neste-uutto fraktioiden saannot

6.1.1. Soxhlet-uuttomenetelmän saannot

Soxhlet-uuttojen saannot on esitetty Taulukossa 6. Kuivien raakauutteiden saannot vaihtelevat 6,75 – 35,55 %:n välillä. T. sambesiaca -lajin juuren kuoren raakauutteen saanto on lähes 36 %. Myös T. kaiserana -lajin lehtien raakauutteen saanto on yli 35 %, kun taas saman lajin juuren kuoren saanto on 28,6 % ja varren kuoren vain 14,22 %. Matalin saanto on T. stenostachya -lajin lehdillä, vain 6,75 %. Tulokset osoittavat että T. sambesiaca ja T. kaiserana sopivat varsin hyvin lääkekasveiksi, sillä molempien saanto on korkea ja saanto on korkea myös käytettäessä kuumaa vettä liuottimena, eli kuumavesikeitosten (dekoktien) valmistuksessa. Saantoon vaikuttaa muun muassa 42

kasvilaji, kasvinosa ja sen sisältämät yhdisteet sekä kasvin ikä, kasvupaikka ja keräysajankohta. Myös uuttomenetelmä (käytetty liuotin, uuttoaika, uuttolämpötila), kasvimateriaalin partikkelikoko sekä kuivaustekniikka vaikuttavat saantoon. On esimerkiksi todettu, että enemmän fenoleita vapautuu kasvimateriaalista, joka on kuivattu varjossa verrattuna auringossa kuivattuun kasvimateriaaliin (Khoddami ym. 2013). Proteiineihin kiinnittyminen saattaa myös osittain estää joidenkin polyfenolisten yhdisteiden uuttumisen kasvimateriaalista.

Taulukko 6. Soxhlet-uuttojen saannot. Punnittu uuttoa Kuiva Kasvinäyte Saanto (%) varten (g) uute (g) Terminalia sambesiaca, juuren kuori 20,00 7,1100 35,55 Terminalia kaiserana, varren kuori 20,01 2,8453 14,22 Terminalia kaiserana, juuren kuori 30,28 8,6610 28,60 Terminalia kaiserana, lehdet 20,00 7,0521 35,26 Terminalia stenostachya, lehdet 35,88 2,4236 6,75 Terminalia stenostachya, varren kuori 20,00 2,6695 13,35 Combretum psidioides, varren kuori 20,00 3,9190 19,59

6.1.2. Neste-neste-uuton saannot

Neste-neste-uuttojen saannot on esitetty Taulukossa 7. Kloroformifraktioiden saannot ovat selvästi pienempiä verrattuna muihin fraktioihin, jotka ovat keskenään enemmän samaa luokkaa. Kokonaissaannot vaihtelevat 66,77 – 109,76 %:n välillä. Yli 100 %:n saannot voivat johtua siitä, että uutteita ei ole saatu täysin kuiviksi, ja niitä olisi pitänyt kuivattaa lyofilisaattorissa pidempään. Joillekin kasvinäytteille (T. kaiserana, varren ja juuren kuori) tehtiin neste-neste-uutot kaksi kertaa. Kokonaissaannot näiden uuttokertojen välillä eroavat toisistaan kaikilla muilla fraktioilla paitsi CHCl3-fraktioilla.

Kloroformi uuttaa lipofiiliset yhdisteet, kuten rasvat (mm. sterolit), non-pooliset terpeenit, klorofyllit ja joitakin stilbeenejä. Suurin osa fenolisista yhdisteistä, stilbeeni- glykosideista ja saponiineista ei liukene kloroformiin, mutta sen sijaan hyvin esimerkiksi metanoliin ja butanoliin, sekä osittain myös veteen. Koska fenoliset 43

yhdisteet, ja erityisesti gallo- ja ellagitanniinit, muodostavat valtaosan sekundaariyhdisteistä Combretum- ja Terminalia-lajeissa, suurimmat saannot saadaan metanolilla, butanolilla ja vedellä. Eräät ellagitanniinit liukenevat hyvin veteen, ja erityisesti kiehuvaan veteen. Terminalia- ja Combretum -lajeista valmistetaankin usein kuumavesi-dekokteja Afrikan kansanlääkinnässä (Fyhrquist 2007), joten tässä työssä osoitetut suuret saannot vesifraktioilla osoittavat näiden rohdosten sisältävän ellagi- ja gallotanniineja.

Taulukko 7. Neste-neste-uuttojen saannot. Wi, veteen liukenematon fraktio; Ws, veteen liukeneva fraktio; BuOH, butanolifraktio; CHCl3, kloroformifraktio. Korkeimmat saannot lihavoitu. Raakauutetta Kuiva Kasvinäyte Fraktio Saanto % punnittu (g) uute (g) Terminalia kaiserana 1,5002 Wi 0,4954 33,022 varren kuori Ws 0,4628 30,849 BuOH 0,3833 25,550 CHCl3 0,0183 1,220 Yhteensä 1,3598 90,64 Terminalia kaiserana 1,5000 Wi 0,5953 39,681 varren kuori Ws 0,8126 54,166 BuOH 0,215 14,331 CHCl3 0,0237 1,580 Yhteensä 1,6466 109,76 Terminalia kaiserana 1,5000 Wi 0,2729 18,193 juuren kuori Ws 0,1945 12,967 BuOH 0,4959 33,060 CHCl3 0,0382 2,547 Yhteensä 1,0015 66,77 Terminalia kaiserana 1,5000 Wi 0,5063 33,753 juuren kuori Ws 0,3097 20,647 BuOH 0,7693 51,287 CHCl3 0,0425 2,833 Yhteensä 1,6278 108,52 Terminalia sambesiaca 1,5000 Wi 0,2089 13,927 juuren kuori Ws 0,3108 20,720 BuOH 0,8771 58,473 CHCl3 0,044 2,933 Yhteensä 1,4408 96,05 Combretum psidioides 1,5000 Wi 0,6266 41,773 varren kuori Ws 0,1916 12,773 BuOH 0,4582 30,547 CHCl3 0,0298 1,987 Yhteensä 1,3062 87,08 Combretum zeyheri 1,5000 Wi 0,262 17,467 Juuren kuori Ws 0,6002 40,013 BuOH 0,6825 45,500 CHCl3 0,0471 3,140 Yhteensä 1,5918 106,12 Combretum zeyheri 1,5000 Wi 0,2654 17,693 varren kuori Ws 0,6348 42,320 BuOH 0,5402 36,013 CHCl3 0,0279 1,860 Yhteensä 1,4683 97,89 Terminalia stenostachya 1,5000 Wi 0,4999 33,327 lehdet BuOH 0,4839 32,260 CHCl3 0,0404 2,693 Yhteensä 1,0242 68,28 Terminalia stenostachya 1,5000 Wi 0,851 56,733 varren kuori Ws 0,2125 14,167 BuOH 0,2854 19,027 CHCl3 0,0125 0,833 Yhteensä 1,3614 90,76

6.2. Kromatografisten menetelmien tulokset

6.2.1. Tulokset tutkittujen Combretum- ja Terminalia-lajien uutteiden kvalitatiivisesta koostumuksesta käyttäen analyyttistä ohutkerroskromatografiaa

T. kaiserana ja T. sambesiaca -lajien sekä C. psidioides -lajin raakauutteita ja näiden neste-neste-uutolla saatujen fraktioiden koostumuksia tutkittiin RP-18 käänteisfaasi- ohutkerroskromatografialla (Kuva 8). Tarkoituksena oli tutkia millä tavoin ja miten paljon neste-neste-uutolla saadut fraktiot erosivat toisistaan koostumukseltaan. Raakauutteissa näkyy eniten yhdisteitä. Raakauutteissa näkyvät TLC-levyjen yläosissa poolisimmat ellagitanniiinit, keskiosissa ellagihapon glykosidit ja gallotanniinit, ja vähän alempana metyloituneet ellagihappojohdannaiset. Metyyliryhmä pidentää yhdisteen retentioaikaa korkean erotuskyvyn nestekromatografiassa (HPLC) ja vastaavasti lyhentää ajoaikaa RP-18 ohutkerroskromatografiassa. Suurin osa kyseisten kasvien yhdisteistä on ellagitanniineja sekä ellagihapon johdannaisia. T. kaiserana lajissa esiintyy myös jonkin verran kondensoituneita tanniineja (Fyhrquist ym. 2014). Poolittomimmat yhdisteet, kuten esimerkiksi ellagihapon metyloituneet johdannaiset, uutettiin kloroformilla, mikä näkyy myös TLC:llä. Kaikki kloroformifraktiot (CHCl3) sisältävät määrällisesti eniten RP-18 käänteisfaasi-TLC-levyn alaosaan kulkeutuvia keskipoolisia yhdisteitä, kuten ellagihapon johdannaisia ja stilbeenejä sekä poolittomia yhdisteitä. T. kaiserana -lajin juuren kloroformifraktiota dominoivat ellagihapon glykosidit ja metyloituneet ellagihapon johdannaiset (Fyhrquist ym. 2014). T. kaiserana ja C. psidioides -lajien varren kuoren kloroformifraktioissa on myös poolisia yhdisteitä, kuten ellagihappoglykosideja ja ellagitanniineja, jotka näkyvät vyöhykkeinä TLC- levyjen yläosissa, mutta paljon pienemmissä konsentraatioissa kuin muissa fraktioissa. Butanolifraktioissa (BuOH) on eri poolisuuden omaavia yhdisteitä, kuten ellagitanniineja, ellagihapon glykosidisia johdannaisia ja metyloituneita ellagihappojohdannaisia, ja tämä fraktio sisältää lähes kaikkia samoja yhdisteitä joita raakauutteetkin sisältävät. Vesiliukoisiin (Ws) fraktioihin on jäänyt poolisimmat yhdisteet, kuten ellagitanniinit, jotka kulkeutuvat TLC-levyn yläosaan. Vesiliukoisissa fraktioissa näkyy myös pieni määrä poolittomia yhdisteitä, jotka ovat luultavasti metyloituneita ellagihappojohdannaisia (Fyhrquist ym. 2014). Veteen liukenemattomat 46

fraktiot (Wi) sisältävät sekä poolittomia, keskipoolisia ja poolisempia yhdisteitä, lähinnä metanoliin liukenevia ellagitanniineja ja ellagihappojohdannaisia, gallagihappoja sekä gallotanniineja.

Terminalia kaiserana Terminalia kaiserana Terminalia sambesiaca Combretum psidioides juuri varren kuori juuri varren kuori

Cr BuOH Ws Wi CHCl3 Cr BuOH Ws Wi CHCl3 Cr BuOH Ws Wi CHCl3 Cr BuOH Ws Wi CHCl3

Kuva 8. T. kaiserana, T. sambesiaca ja C. psidioides -lajien uuttofraktioiden ohut kerroskromatografia. Punaisella aaltosululla on merkitty fraktioiden sisältämät ellagitanniinit, vihreällä aaltosululla ellagihappoglykosidit ja sinisellä aaltosululla metyloituneet ellagihappojohdokset. Cr, raakauute; BuOH, butanolifraktio; Ws, vesiliukoinen fratio; Wi, veteen liukenematon fraktio; CHCl3, kloroformifraktio.

6.2.2. Terminalia kaiserana -lajin juuren kuoren raakauutteesta preparatiivisella Lobar RP-8 -pylväskromatografialla eristetyt fraktiot

Lobar RP-8 -pylväskromatografialla saavutettiin jonkin asteista yhdisteiden erottumista T. kaiserana -lajin juuren kuoren raakauutteesta, mutta kaikkia yhdisteitä ei saatu eroteltua omiksi fraktioikseen. Tämä johtuu osittain siitä, että monien ellagitanniinien ja ellagihapon johdannaisten isomeerien retentioajat ovat lähes samat, jonka takia nämä yhdisteet eluoituvat samanaikaisesti pylväästä. Lisäksi pylvääseen laitettiin hieman liikaa materiaalia (400 mg/4 ml MeOH uuttetta), sopivampi määrä olisi voinut olla 100 mg/4 ml. Fraktioiden koostumusta tutkittiin RP-18 -ohutkerroskromatografialla, ja tämän perusteella samankaltaisia yhdisteitä sisältäviä fraktioita yhdistettiin 11 fraktioksi (Kuva 9, toisen Lobar RP-8 -pylväskromatografian fraktiot). Ensimmäisenä pylväästä eluoituivat poolisimmat yhdisteet, joita on todettu ellagitanniineiksi ja jotka näkyvät TLC-levyn ylälaidassa. Viimeisinä eluoituivat poolittomimmat yhdisteet, kuten eräät ellagihappojohdannaiset, jotka näkyvät TLC-levyn alalaidassa. Sekä hyvin pooliset että hyvin poolittomat yhdisteet ovat erottuneet kohtalaisen hyvin, mutta keskipooliset 47

yhdisteet (kuvassa 9 fraktiot 2F8, 2F9, 2F10) eivät ole erottuneet toisistaan käytetyllä menetelmällä toivotulla tavalla. Toisessa ajossa fraktioiden määrä oli suurempi ja erottuminen jonkin verran parempi kuin ensimmäisessä ajossa, mutta saannot alhaisempia (Taulukko 8). Saannot ovat molemmilla ajoilla samaa suuruusluokkaa, 26 ja 20 % alkumateriaalista. Aineiden hävikki johtuu osittain uutteen sisältämien yhdisteiden irreversiibelistä kiinnittymisestä (adsorbtiosta) pylvään kiinteään faasiin. Jatkossa tarvitaan useampia ajoja eri olosuhteilla sekä pienempiä ainemääriä (esim. 100 mg/4 ml), jotta ajo-olosuhteet voidaan optimoida parhaan erotuskyvyn ja hyvän saannon mukaisiksi. Lisäksi Lobar RP-8 -pylväällä eristettyjä fraktioita voisi ajaa uudestaan samalla pylväällä jotta fraktion eri yhdisteet saisi paremmin eroteltua toisistaan. Pylväskromatografialla eristettyjen fraktioiden antimikrobisia vaikutuksia tutkittiin S. aureus ja P. aeruginosa -bakteereita vastaan (kappale 6.3.3.).

Terminalia-lajit sisältävät tunnetusti runsaasti erilaisia ellagitanniineja joiden erottaminen pylväskromatografialla on erittäin vaikeaa ja hidasta. Han ryhmineen (2006) ehdottaakin tavallisen pylväskromatografian tilalle high-speed counter-current partition -tekniikkaa käytettävän yhdistettynä HPLC-tekniikkaan hydrolysoituvien tanniinien erottamiseksi Terminalia chebula -lajin hedemistä.

25R Cr

Kuva 9. Lobar RP-8 -pylväskromatografiasta saadut yhdistetyt fraktiot. Yksittäiset fraktiot analysoitiin RP-18 -ohutkerroskromatografialla, ja samat yhdisteet sisältävät fraktiot yhdistettiin 11 fraktioksi. Kontrollina T. kaiserana -lajin juuren raakauute (25R Cr). Kuva toisesta Lobar RP-8 -pylväskromatografiasta, yhdistetyt fraktiot on nimetty 2F1-2F11.

Taulukko 8. Lobar RP-8 -pylväskromatografialla eroteltujen fraktioiden saannot Terminalia kaiserana -lajin juuren kuoren metanoliuutteista (400 mg lähtö- materiaalia). saanto saanto saanto Ajo 1 saanto mg % Ajo 2 mg % F1 7,2 1,80 2F1 2,1 0,53 F2 5,3 1,33 2F2 10,1 2,53 F3 23,6 5,90 2F3 0,4 0,10 F4 10,9 2,73 2F4 2,2 0,55 F5 53,5 13,38 2F5 1,8 0,45 F6 4,0 1,00 2F6 11,7 2,93 2F7 7,6 1,90 2F8 26 6,50 2F9 6,7 1,68 2F10 7,7 1,93 2F11 5,9 1,48 yhteensä 104,5 26,13 yhteensä 82,2 20,55 näyte 400,0 100,00 näyte 400,0 100,00

6.2.3. Terminalia kaiserana -lajin juuren kuoren raakauutteesta preparatiivisella ohutkerroskromatografialla saadut fraktiot

Lasipohjaisilla RP-18 TLC-levyillä suoritettu preparatiivinen ohutkerroskromatografia

T. kaiserana -lajin juuren kuoresta tuotti 15 eri fraktiota. Rf-arvot määritettiin ja saman

Rf-arvon omaavat fraktiot yhdistettiin. Rf-arvot ja saannot on merkitty) Taulukkoon 9. Kuvassa 10 on esimerkkinä yksi lasipohjainen ja yksi alumiinipohjainen RP-18 -levy. Alumiinipohjaisilla RP-18 TLC-levyillä suoritettu kromatografia tuotti puolestaan 18 eri fraktiota. Myös näiden Rf-arvot ja saannot on esitetty Taulukossa 9. Lasipohjaisilla levyillä stationäärifaasia on paksumpi kerros ja saanto näin parempi, toisaalta taas alumiinipohjaisilla levyillä erotuskyky oli parempi. Levyjen ylälaidoissa näkyvät pooliset yhdisteet, ellagitanniinit, erottuivat huomattavasti paremmin alumiinipohjaisilla levyillä. Kaikki yhdisteet raaputettiin irti levyiltä ja niiden antimikrobisia vaikutuksia tutkitaan myöhemmässä vaiheessa.

Taulukko 9. Preparatiivisella RP-18 -ohutkerroskromatografialla eroteltujen T. kaiserana -lajin juuren kuoren raakautteen sisältämien fraktioiden Rf-arvot ja prosentuaaliset saannot. Esimerkkinä yksi lasipohjaiselta ja yksi alumiinipohjainen levy. Fraktioiden numerointi on aloitettu levyn alalaidasta. Lasipohjainen RP-18 - Alumiinipohjainen RP-18 - ohutkerroskromatografia ohutkerroskromatografia

Yhdiste nro Rf-arvo saanto % Yhdiste nro Rf-arvo saanto % 1 0,000 8,21 1 0,000 10,95 2 0,051 8,35 2 0,077 5,79 3 0,122 8,69 3 0,117 4,32 4 0,170 8,69 4 0,154 5,89 5 0,271 8,21 5 0,193 5,89 6 0,310 8,01 6 0,225 5,37 7 0,408 8,69 7 0,334 4,32 8 0,450 8,35 8 0,366 4,53 9 0,510 8,08 9 0,430 4,95 10 0,631 7,88 10 0,481 4,74 11 0,685 7,47 11 0,519 4,84 12 0,738 3,80 12 0,609 6,42 13 0,791 2,31 13 0,699 6,00 14 0,836 1,56 14 0,737 6,00 15 0,884 1,70 15 0,782 5,47 16 0,846 6,63 17 0,897 3,47 18 0,955 4,42 Ellagihappo 0,162 Ellagihappo 0,208 Gallushappo 0,712 Gallushappo 0,727 (+)-katekiini 0,575 (+)-katekiini 0,636

Lasipohjainen RP-18-levy Alumiinipohjainen RP-18-levy

- -

katekiini katekiini

- -

Ellagihappo Ellagihappo

Gallushappo (+) Gallushappo (+)

raakauute raakauute

T. kaise rana - T. kaise rana -

Kuva 10. Preparatiivinen ohutkerroskromatografia. T. kaiserana -lajin juuren raakauutteen sisältämien yhdisteiden erottelu suoritettiin lasipohjaisella ja alumiinipohjaisella RP-18-levyllä. Punaisilla aaltosuluilla on merkitty raakauutteen sisältämiä ellagitanniineja, jotka erottuivat alumiinipohjaisella levyllä paremmin verrattuna lasipohjaiseen levyyn.

6.3. Antimikrobiset vaikutukset

6.3.1. Agardiffuusiomenetelmällä saadut tulokset neste-neste-uuttofraktioiden antibakteerista vaikutuksista

Agardiffuusiokokeessa tutkittavaa kasviuutetta sisältävien suodatinpaperikiekkojen bakteriostaattinen ja bakterisidinen estovyöhyke mitattiin millimetreissä. Tulokset on koottu Taulukkoon 10 (P. aeruginosa) ja Taulokkoon 11 (S. aureus). Kuvassa 11 on esitetty esimerkkimaljat T. sambesiaca -lajin juuren kuoren neste-neste-uuttofraktiolla tehdyistä kokeista.

Tutkittavien kasviuutteiden bakteriostaattista tehoa verrattiin antibioottien tehoon, ja estovyöhykkeiden koon perusteella laskettiin aktiivisuusindeksi (AI, Kaava 1). P. aeruginosa -bakteeria vastaan. Korkein prosentuaalinen kasvun esto kaikkiin vertailuantibiootteihin verrattuna on T. sambesiaca -lajin juuren veteen liukenevalla fraktiolla (WS, merkitty lihavoidulla tekstillä, Taulukko 10). Myös sen raakauute (Cr) sekä butanolifraktio (BuOH) antavat korkean prosentuaalisen eston. Osittain veteen 51

liukenevien fraktioiden tehokkuus saattaa selittyä sillä, että niiden hydrofiiliset yhdisteet diffundoituvat agar-alustassa helpoiten, kun taas esimerkiksi kloroformin sisältämät lipofiilisemmat yhdisteet eivät pääse vesipohjaisessa agarissa niin helposti diffundoitumaan.

P. aeruginosa -bakteeri on luonnostaan resistentti penisilliinille, minkä vuoksi tutkittavien uutteiden prosentuaaliset estot ovat erittäin korkeita verrattuna penisilliiniin. P. aeruginosa -bakteerilla on membraanissaan antibiootteja solusta ulos kuljettavia pumppu- tai kuljetusproteiineja, ja bakteerin soluseinä läpäisee vieraita molekyylejä erittäin huonosti, mikä tekee tästä bakteerista resistentin myös monelle muulle antibiooteille (Askoura ym. 2011). T. sambesiaca -lajin juuriuutteet näyttävät sisältävän tämän bakteerin kasvua tehokkaasti estäviä ellagitanniineja, joita on määrällisesti enemmän kuin muita yhdisteitä erityisesti raaka- ja vesiliukoisissa uutteissa (Fyhrquist ym. 2014).

Myös S. aureus -bakteeria vastaan tutkituista kasviuutteista T. sambesiaca -lajin juurten veteen liukeneva fraktio (WS) antaa korkeimman prosentuaalisen eston, ja raakauute (Cr) sekä butanolifraktio (BuOH) ovat seuraavaksi tehokkaimmat (merkitty lihavoidulla tekstillä, Taulukko 11). Kasviuutteiden estovaikutukset eivät yllä kuitenkaan yhtä korkeiksi kuin P. aeruginosa -bakteeria vastaan, mikä on mielenkiintoista sillä gram- negatiiviset bakteerit kuten P. aeruginosa ovat yleensä vähemmän herkkiä antibiooteille (Manzur ym. 2011). Tämä saattaa johtua gram-positiivisten ja -negatiivisten bakteerien erilaisesta soluseinän rakenteesta; gram-positiivisilla soluseinä koostuu useammasta peptidoglykaanikerroksesta, kun taas gram-negatiivisilla soluseinän ulkopuolella on vielä fosfolipideistä ja lipopolysakkarideista muodostuva ulkokalvo, mikä antaa lisäsuojaa bakteerille (Medical Microbiology 2013).

Taulukko 10. Agardiffuusiokokeen estovyöhykkeet (mm) P. aeruginosa - bakteerilla. Suodatinpaperikiekko 12,7-13,0 mm. Cr, raakauute; WI, veteen liukenematon fraktio; WS, veteen liukeneva fraktio; BuOH, butanolifraktio; CHCl3, kloroformifraktio; Rinnakkaisia mittauksia on kolme, joiden hajontaa on ilmaistu keskiarvon keskivirheellä (SEM). Parhaimmat tulokset lihavoidulla tekstillä.

Aktiivisuusindeksi (AI)

tinen (bakteriostaattinen)

Pseudomonas aeruginosa staat

o SEM SEM vs. vs. vs.

Penisil- Tetra- Rifampi- bakterisidinen

bakteri liini G sykliini siini Terminalia sambesiaca juuret, Cr 38,50 ± 0,87 23,75 ± 1,70 1,54 0,92 1,03 T. sambesiaca juuret WS 41,25 ± 0,48 19 ± 0,71 1,65 0,98 1,10 T. sambesiaca juuret BuOH 40,00 ± 0,41 19,25 ± 1,11 1,60 0,95 1,07 T. sambesiaca juuret WI 36,25 ± 0,48 23,00 ± 1,68 1,45 0,86 0,97 T. sambesiaca juuret CHCl3 28,50 ± 0,35 1,14 0,68 0,76 Terminalia kaiserana juuret, Cr 32,63 ± 1,23 25,88 ± 0,43 1,31 0,78 0,87 T. kaiserana juuret WS 34,75 ± 0,88 20,25 ± 0,18 1,39 0,83 0,93 T. kaiserana juuret BuOH 32,13 ± 3,18 18,75 ± 0,63 1,29 0,76 0,86 T. kaiserana juuret WI 29,13 ± 0,43 20,63 ± 0,52 1,17 0,69 0,78 T. kaiserana juuret CHCl3 29,38 ± 1,39 18,00 ± 0,41 1,18 0,70 0,78 Terminalia kaiserana varren kuori, Cr 30,63 ± 0,24 20,00 ± 0,00 1,23 0,73 0,82 T. kaiserana varren kuori WS 28,38 ± 1,31 15,38 ± 0,55 1,135 0,68 0,76 T. kaiserana varren kuori BuOH 21,25 ± 3,33 16,00 ± 0,50 0,85 0,51 0,57 T. kaiserana varren kuori WI 25,63 ± 0,52 18,25 ± 0,48 1,03 0,61 0,68 T. kaiserana varren kuori CHCl3 25,88 ± 3,49 19,38 ± 2,15 1,04 0,62 0,69 Combretum psidioides varren kuori, Cr 32,25 ± 2,46 17,50 ± 0,29 1,29 0,77 0,86 C. psidioides varren kuori WS 27,00 ± 4,02 18,00 ± 0,00 1,08 0,64 0,72 C. psidioides varren kuori BuOH 29,50 ± 5,84 16,00 ± 0,41 1,18 0,70 0,79 C. psidioides varren kuori WI 24,00 ± 2,12 17,50 ± 1,06 0,96 0,57 0,64 C. psidioides varren kuori CHCl3 29,00 ± 0,71 21,50 ± 0,35 1,16 0,69 0,77 Penisilliini G 25,00 ± 0,50 19,88 ± 0,92 Tetrasykliini 42,00 ± 0,87 38,00 ± 0,87 Rifampisiini 37,50 ± 0,96 30,38 ± 0,38

Taulukko 11. Agardiffuusiokokeen estovyöhykkeet (mm) S. aureus -bakteerilla. Suodatinpaperikiekko 12,7-13,0 mm. Cr, raakauute; WI, veteen liukenematon fraktio; WS, veteen liukeneva fraktio; BuOH, butanolifraktio; CHCl3, kloroformifraktio; Rinnakkaisia mittauksia on kolme, joiden hajontaa on ilmaistu keskiarvon keskivirheellä (SEM). Parhaimmat tulokset lihavoidulla tekstillä.

Aktiivisuusindeksi

(AI)

(bakteriostaattinen)

Staphylococcus aureus

SE SEM vs.

bakterisidinen Penisil- vs. Tetra- bakteriostaattinen liini G sykliini Terminalia sambesiaca juuret, Cr 27,17 ± 0,38 24,33 ± 0,52 0,42 0,83 T. sambesiaca juuret WS 28,67 ± 0,38 24,50 ± 0,90 0,44 0,88 T. sambesiaca juuret BuOH 27,67 ± 0,38 23,17 ± 0,14 0,42 0,84 T. sambesiaca juuret WI 24,67 ± 0,76 20,67 ± 0,29 0,38 0,75 T. sambesiaca juuret CHCl3 15,00 ± 0,71 0,00 ± 0,00 0,23 0,46 Terminalia kaiserana juuret, Cr 21,00 ± 0,43 18,67 ± 0,76 0,32 0,64 T. kaiserana juuret WS 23,67 ± 0,29 20,83 ± 0,58 0,36 0,72 T. kaiserana juuret BuOH 24,00 ± 0,50 20,50 ± 0,25 0,37 0,73 T. kaiserana juuret WI 17,67 ± 0,29 14,17 ± 0,29 0,27 0,54 T. kaiserana juuret CHCl3 13,75 ± 0,18 Terminalia kaiserana varren kuori, 20,67 ± 0,29 17,50 ± 0,25 0,32 0,63 T.Cr kaiserana varren kuori WS 20,25 ± 0,18 18,75 ± 0,18 0,31 0,62 T. kaiserana varren kuori BuOH 22,50 ± 0,90 19,50 ± 1,25 0,34 0,69 T. kaiserana varren kuori WI 16,00 ± 0,00 15,00 ± 0,00 0,25 0,49 T. kaiserana varren kuori CHCl3 Combretum psidioides varren 22,33 ± 0,29 20,00 ± 0,50 0,34 0,68 C.kuori, psidioides Cr varren kuori WS 24,00 ± 0,00 20,25 ± 0,00 0,37 0,73 C. psidioides varren kuori BuOH 19,00 ± 2,12 17,50 ± 1,77 0,29 0,58 C. psidioides varren kuori WI 20,33 ± 0,29 16,00 ± 0,00 0,31 0,62 C. psidioides varren kuori CHCl3 Penisilliini G 65,25 ± 0,63 55,25 ± 0,85 Tetrasykliini 32,75 ± 1,49 30,50 ± 1,26

A B

BuOH Ws BuOH Ws

CHCl3 Wi CHCl3 Wi

Cr Rif Cr PenG

2 cm

Kuva 11. Agardiffuusiokokeet Terminalia sambesiaca -lajin juuren kuoren neste- neste-uuttofraktioilla ja vertailuantibiooteilla. A) Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 B) Staphylococcus aureus ATCC 25923; CHCl3, kloroformifraktio; BuOH, butanolifraktio; WS, veteen liukeneva fraktio; Wi, veteen liukenematon fraktio; Cr, raakauute; Rif, rifampisiini; PenG, penisilliini G

6.3.2. Mikrodiluutiomenetelmällä saadut tulokset neste-neste-uuttofraktioiden antibakteerista vaikutuksista

Mikrodiluutiomenetelmällä tutkittiin, mitkä ovat raakauutteiden ja neste-neste- uuttofraktioiden pienimmät bakteerien näkyvää kasvua estävät pitoisuudet (MIC-arvo, Minimum Inhibitory Concentration). Kuvissa 12 ja 13 on esitetty annos-vastetulokset pylväsdiagrammeina. Lisäksi Taulukkoon 12 on merkitty MIC- (estää näkyvää kasvua, eli 90 % tai enemmän kasvukontrolliin nähden) ja IC50-arvot (estää 50 prosenttia kasvusta kasvukontrolliin (= 100 % kasvu) nähden). Joissain tapauksissa MIC- tai IC50- arvoa oli vaikea määrittää, jolloin on merkitty toinen IC-arvo. MIC- ja IC50-arvot on määritetty prosentuaalisen kasvun eston mukaan. 55

A) Terminalia kaiserana, juuren kuoren neste-neste- uuttofraktiot; Staphylococcus aureus 110 100 90

80 70 60 Cr 50 40 BuOH inhibitio % inhibitio 30 20 Ws 10 0 19 39 78 156 312 625 1250 2500 konsentraatio µg/ml

B) Terminalia sambesiaca, juuren kuoren neste-neste- uuttofraktiot; Staphylococcus aureus 140 130 120 110

100 90 80 70 60 Cr

inhibitio % inhibitio 50 40 BuOH 30 WS 20 10 0 19 39 78 156 312 625 1250 2500 konsentraatio µg/ml

C) Combretum psidioides, varren kuoren neste-neste- uuttofraktiot; Staphylococcus aureus 130 120 110 100 90 80 70 60 Cr 50

inhibitio % 40 BuOH 30 20 Ws 10 0 19 39 78 156 312 625 1250 2500 konsentraatio µg/ml

Kuva 12. Neste-neste-uuttofraktioiden annosvasteet. Bakteerin kasvun esto prosentteina. A) Terminalia kaiserana, juuren kuori; B) Terminalia sambesiaca, juuren kuori; C) Combretum psidioides, varren kuori. Cr, raakauute; BuOH, butanolifraktio; Ws, veteen liukeneva fraktio; Rinnakkaisia mittauksia oli 2 (n=2), joiden keskihajontaa virhepalkit kuvaavat. 56

A) Terminalia kaiserana, juuren kuoren neste-neste- uuttofraktiot; Pseudomonas aeruginosa 110 100 90

80 70 60 Cr 50 40 BuOH inhibitio % inhibitio 30 20 Ws 10 0 4,8 9,7 19 39 78 156 312 625 1250 2500 konsentraatio µg/ml

B) Terminalia sambesiaca, juuren kuoren neste-neste- uuttofraktiot; Pseudomonas aeruginosa 110 100 90

80 70 60 Cr 50 40 BuOH inhibitio % inhibitio 30 20 Ws 10 0 4,8 9,7 19 39 78 156 312 625 1250 2500 konsentraatio µg/ml

C) Combretum psidioides, varren kuoren neste-neste- uuttofraktiot; Pseudomonas aeruginosa 110 100 90

80 70 60 50 Cr 40

inhibitio % inhibitio BuOH 30 20 Ws 10 0 4,8 9,7 19 39 78 156 312 625 1250 2500 konsentraatio µg/ml

Kuva 13. Neste-neste-uuttofraktioiden annosvasteet. Bakteerin kasvun esto prosentteina. A) Terminalia kaiserana, juuren kuori; B) Terminalia sambesiaca, juuren kuori; C) Combretum psidioides, varren kuori. Cr, raakauute; BuOH, butanolifraktio; Ws, veteen liukeneva fraktio; Rinnakkaisia mittauksia oli 2 (n=2), joiden keskihajontaa virhepalkit kuvaavat. 57

S. aureus -bakteeria vastaan tehokkaimmalta vaikuttavat T. sambesiaca -lajin juuren kuoren veteen liukeneva fraktio sekä C. psidioides -lajin varren kuoren butanolifraktio. Niiden MIC-arvot ovat T. sambesiaca -lajin kohdalla 156 µg/ml ja C. psidioides -lajin kohdalla 312 µg/ml. Korkeammilla pitoisuuksilla T. sambesiaca -lajin raakauute ja butanolifraktion vaikuttavat tehokkaammilta kuin veteen liukeneva fraktio. Tämä voi johtua ainakin osittain yhdisteiden synergiavaikutuksista erityisesti raakauutteilla, jotka sisältävät suurimman määrän erilaisia sekundaarimetaboliitteja. Lisäksi aktiivisten yhdisteiden pitoisuus vaihtelee eri uutteiden välillä huomattavasti. Samoin C. psidioides -lajin raakauute ja veteen liukeneva fraktio vaikuttavat tehokkaammilta kuin butanolifraktio korkeammilla pitoisuuksilla. Kasviuutteiden MIC-arvot eivät myöskään yllä lähellekään vertailuantibioottien MIC-arvoja, jotka ovat penisilliini G:llä 0,24 µg/ml ja tetrasykliinillä 0,97 µg/ml. Puhdistamalla uutteiden sisältämiä ellagitanniineja ja ellagihappojohdannaisia omiksi fraktioiksi saisi todennäköisesti ratkaisevasti pienempiä MIC-arvoja. Korkeammilla T. sambesiaca ja T. kaiserana -lajien uuttofraktiopitoisuuksilla kasvun estoprosentit eivät nouse loogisesti, vaan näyttävät jopa laskevan (ks. Kuvat 12 A ja B). Tämä johtuu kasviuutteiden korkeista tanniinipitoisuuksista ja niiden muodostamasta sakasta ravintoliuoksen proteiinien ja suolojen sekä bakteerien kanssa. Tällöin näytekuopan (tutkittava fraktio bakteerisuspensiossa) absorbanssi-arvo muodostuu niin suureksi että vähentäessä negatiivisen kontrollin (tutkittava fraktio ravintoliemessä) absorbanssilukua näytekuopan absorbanssiluvusta saadaan edelleen korkea absorbanssilukema. Tämä puolestaan virheellisesti viittaa bakteerin kasvuun kuopassa, vaikka sitä ei olisi tapahtunutkaan. Yksi keino ratkaista tämä ongelma olisi poistaa kasvinäytteitä kuopista ennen solumäärien mittauksia, esimerkiksi sentrifugoimalla. Toinen keino olisi suorittaa useampia mittauksia, esimerkiksi kokeen alussa ajankohtana T0 ja lopussa T16h, ja laskea mittauspisteiden absorbanssien eroja ja tällä tavoin selvittää bakteerien mahdollista kasvua. Myöskin pintajännitystä alentava Tween-80 voisi auttaa lieventämään sakan muodostumista. Bromokresolivihreä-reagenssia on käytetty sakkaa sisältävien tanniini-näytteiden MIC-arvojen määrittämiseen (Engels ym. 2011). Kyseinen reagenssi mittaa ravintoliuoksen pelkistymistä (acidification), eli bakteerien kasvua.

P. aeruginosa -bakteeria vastaan tehokkaimmalta kasviuutteelta vaikutti C. psidioides -lajin varren kuoren butanolifraktio (Taulukko 12 ja Kuva 13). Sen MIC-arvo oli 625 µg/ml, kun tehokkaimmalla vertailuantibiootilla gentamisiinilla vastaava arvo oli 31.5 µg/ml. Myöskään tämän bakteerin kohdalla korkeimmat kasviuutepitoisuudet eivät anna välttämättä korkeimpia kasvun estoarvoja, mikä johtuu edellä mainitusta tanniinien aiheuttamasta sakan muodostamisesta proteiinien ja bakteerien kanssa.

Vaikka S. aureus ja P. aeruginosa -bakteereita vastaan tutkittujen uutteiden MIC-arvot eivät ole yhtä pieniä kuin vertailuantibiooteilla, ne ovat kuitenkin samaa suuruusluokkaa kuin muiden tutkimusryhmien saamat tulokset Afrikkalaisilla Combretum- ja Terminalia-lajeilla, ja näin ollen merkittäviä. Tämän työn tulokset ovat yhdenmukaisia Fyhrquist ym. (2002) ilmoittamiin tuloksiin jossa T. sambesiaca ja T. kaiserana osoittautuivat tehokkaiksi gram-negatiivisten ja gram-positiivisten bakteerien kasvun estäjiksi MIC-arvoilla 0,9 – 4,7 mg/ml. Eloff tutkimusrymineen (2005b) osoittivat että C. woodii -lajin lehtien uutteet estivät P. aeruginosa, S. aureus, E. coli ja Enterococcus faecalis -bakteerien kasvua MIC-arvojen vaihdellessa 0,4-1,6 mg/ml välillä. Ayepola tutkimusryhmineen (2009) ovat puolestaan osoittaneet että T. glaucescens -lajin juurten ja lehtien uutteet estävät P. aeruginosa ja S. aureus -bakteerien kasvua MIC-arvoilla 6,25 mg/ml ja 25 mg/ml.

Gram-positiiviset bakteerit ovat usein herkempiä antibiooteille kuin gram-negatiiviset bakteerit. S. aureus -bakteeria vastaan saadut pienemmät MIC-arvot P. aeruginosa -bakteeriin verrattuna voivat johtua osittain eroista soluseinän rakenteessa; gram-negatiivisilla bakteereilla on uloinna lipopolysakkaridikalvo, jossa on vaikeasti yhdisteitä läpäiseviä aukkoja, poriineja. Esimerkiksi vankomysiinin läpäisy estyy kokonaan, ja muiden antibioottien kulkeutuminen solun sisään vaikeutuu ja hidastuu. Lisäksi gram-negatiivisten bakteerien solumembraanissa on runsaasti effluksipumppuproteiineja jotka kuljettavat solusta pois myrkyllisiä aineita (Askoura ym. 2011).

Mycobacterium smegmatis -bakteerilla tehtyjen mikrodiluutiokokeiden tulosten tulkitsemista vaikeutti se, että tämä bakteerilaji kasvaa solurykelmissä. Solurykelmät 59

vaikuttavat turbidimetristen mittausten tuloksiin. Tween-80 tensidiä onkin käytetty paljon tämän ongelman ratkaisuksi. Alustavia IC-arvoja on esitetty Taulukkossa 12. T. kaiserana lajin juuren kuoren kloroformiuute ja C. psidioides -lajin varren kuoren butanoliuute estivät verrattain tehokkaasti M. smegmatis bakteerin kasvua (IC80 = 2500 µg/ml). Tulos on yhdenmukainen muiden tutkijoiden ilmoittamien tulosten kanssa; Eldeen ja Van Staaden (2007) ovat osoittaneet että T. kaiserana -lajille lähisukuinen laji, T. sericea antaa lupaavaa antimykobakteerisia vaikutuksia Mycobactreium fortuitum -bakteeria vastaan MIC-arvojen ollessa 1560-3120 µg/ml. Mbwambo (2011) ryhmineen puolestaan raportoi T. stenostachya -lajin varren, juuren ja lehtien uutteiden antavan erinomaisen estovaikutuksen M. madagascariense ja M. indicus -bakteerien kasvua vastaan.

Taulukko 12. Neste-neste-uuttofraktioiden mikrodiluutiomenetelmällä saadut MIC- ja IC-arvot. MIC, estää bakteerin kasvua 90 prosenttisesti tai enemmän kasvukontrolliin nähden. IC50, estää bakteerin kasvua 50 prosenttisesti verrattuna kasvukontrolliin. Cr, raakauute; WS, veteen liukeneva fraktio; BuOH, butanolifraktio; CHCl3, kloroformifraktio. Parhaimmat tulokset lihavoitu. S. aureus P. aeruginosa M. smegmatis MIC/IC-arvot (µg/ml) ATCC 25923 ATCC 27853 ATCC 14468 Kasvilajit, uuttofraktiot MIC90 IC50 MIC90 IC50 IC IC50 Terminalia sambesiaca juuren kuori Cr 312 78 1250 78 T. sambesiaca juuren kuori WS 156 39 1250 625 T. sambesiaca juuren kuori BuOH 312 78 1250 78 Terminalia kaiserana juuren kuori Cr 1250 156 1250 78 T. kaiserana juuren kuori WS 625 78 1250 312 T. kaiserana juuren kuori BuOH 625 78 1250 156 T. kaiserana juuren kuori CHCl3 IC80=2500 312 Combretum psidioides varren kuori Cr 625 312 1250 156 IC60=2500 1250 C. psidioides varren kuori WS 625 312 1250 156 C. psidioides varren kuori BuOH 312 312 625 78 IC80=2500 312 C. psidioides varren kuori CHCl3 - IC25=2500 Penisilliini G 0,24 0,0075 - - Tetrasykliini 0,97 0,12 125 7,8 Rifampisiini 125 7,8 125 7,8 Gentamisiini 31,2 1,95

6.3.3. Mikrodiluutiomenetelmällä saadut tulokset Terminalia kaiserana -lajin juuren kuoren raakauutteesta preparatiivisella Lobar RP-8-pylväskromatografialla eroteltujen fraktioiden antimikrobisuudesta

Lobar RP-8 -pylväskromatografialla eroteltuja fraktiota oli rajallisesti, mutta sisältö riitti muutamaan mikrodiluutiokokeeseen. Kuvassa 14 on esitetty tulokset pylväsdiagrammeina ja regressiosuorina. Lisäksi Taulukkoon 13 on merkitty MIC- ja IC50-arvot (estävät kasvua 90 % tai enemmän ja 50 prosenttisesti kasvukontrolliin nähden). Joissain tapauksissa MIC- tai IC50-arvoa oli vaikea määrittää, jolloin on merkitty toinen IC-arvo. . MIC- ja IC50-arvot on määritetty prosentuaalisen kasvun eston mukaan. Lobar RP-8 -fraktioiden sisältämät yhdisteet on esitetty Kuvassa 10.

A) Lobar RP-8-fraktiot; Staphylococcus aureus 150 140 130 120 110 2F6

100 90 80 2F7 70 60 2F8 inhibitio % inhibitio 50 40 2F9 30 20 10 2F10 0 1,95 3,9 7,8 15,6 31,2 62,5 125 250 500 1000 konsentraatio µg/ml

B) Lobar RP-8-fraktiot; Pseudomonas aeruginosa 110 100 90 2F6 80

70 2F7

60 50 2F8 40 inhibitio % inhibitio 2F9 30 20 2F10 10 0 1,95 3,9 7,8 15,6 31,2 62,5 125 250 500 1000 konsentraatio µg/ml

Kuva 14. Annos-vasteet Terminalia kaiserana -lajin juuren kuoren raakauutteesta Lobar RP-8 -pylväskromatografialla erotelluilla fraktioilla. Bakteerin kasvun esto prosentteina. (A) Staphylococcus aureus ATCC 25923 ja (B) Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Rinnakkaisia mittauksia oli 2 (n=2), joiden keskihajontaa virhepalkit kuvaavat.

Molempia bakteereita vastaan fraktio 2F8 vaikuttaa tehokkaimmin kasvua estävältä. MIC-arvo S. aureus -bakteeria vastaan on 250 µg/ml ja P. aeruginosa -bakteeria vastaan 500 µg/ml. P. aeruginosa -bakteeria vastaan myös fraktion 2F9 MIC-arvo on 500 µg/ml. Kuten Kuvasta 9 näkyy, 2F8-fraktio sisältää lähes kaikkia samoja yhdisteitä 62

kuin T. kaiserana -lajin juuren kuoren raakauutekin, kuten ellagitanniineja ja ellagihapon johdannaisia. Verrattuna raakauutteeseen 2F8-fraktio sisältää kuitenkin paljon pienempiä pitoisuuksia kaikkein poolisimpia ellagitanniineja. 2F9-fraktio koostuu suurimmaksi osaksi ellagihapon johdannaisista. Tämä on erittäin mielenkiintoista, sillä T. chebula -lajin hedelmistä eristettyjen ellagihappojohdannaisten on todettu estävän joidenkin P. aeruginosa -bakteerin quorum sensing (QS) -geenien ilmentymisen ja näin estävän tämän bakteerin kasvua (Sarabhai ym., 2013). Fraktion 2F9 sisältämät ellagihapon johdannaiset näyttävät olevan tehokkaita P. aeruginosa -bakteerin kasvun estäjiä myös hyvin pienissä pitoisuuksissa. Fraktioiden 2F8 ja 2F9 erot yhdistekoostumuksissa voivat selittää näiden fraktioiden eroavaisuuksia kasvua estävässä tehossa S. aureus ja P. aeruginosa -bakteereita vastaan.

Fraktio 2F6 antoi jonkin verran antimikrobista vaikutusta P. aeruginosa -bakteeria vastaan (MIC 1000 µg/ml). Tämä fraktio sisältää suurimmaksi osaksi poolisia ja keskipoolisia ellagitanniineja. Kuten ellagihapon johdannaiset, myös ellagitanniinien on todettu estävän P. aeruginosa -bakteerin quorum sensing geenien ilmentymisen (Adonizio, 2008, Taganna ym., 2011). Fraktion 2F6 sisältämät ellagitanniinit voisivat siis vaikuttaa kyseisellä tavalla P. aeruginosa -bakteerin kasvuun.

Tehokkaimpien Lobar RP-8 -fraktioiden MIC-arvot ovat alhaisemmat kuin neste-neste- uuttofraktioiden MIC-arvot. Jatkossa yhdisteitä pyritään saamaan paremmin eroteltua omiin fraktioihinsa, jotta yksittäisten yhdisteiden bakteerien kasvua estävää vaikutusta voitaisiin tutkia tarkemmin. Toisaalta voi myös olla, että mikään yksittäinen yhdiste ei ole pelkästään vastuussa antimikrobisesta vaikutuksesta, vaan useat yhdisteet toimivat yhdessä synergistisesti saaden aikaan voimakkaamman antimikrobisen vaikutuksen kuin komponentit yksinään. Standardoituja kasvipohjaisia lääkkeitä (phytomedicines) käytetäänkin jo esimerkiksi Etelä-Afrikan terveydenhuollossa. Näiden lääkkeiden vaikutukset perustuvat usein monien komponenttien yhteisvaikutukseen.

Taulukko 13. Terminalia kaiserana -lajin juuren kuoren raakauutteesta saatujen Lobar RP-8 -fraktioiden MIC- ja IC-arvot. MIC, estää bakteerin kasvua 90 prosenttisesti tai enemmän verrattuna kasvukontrolliin. IC50, estää bakteerin kasvua 50 prosenttisesti verrattuna kasvukontrolliin. Parhaimmat tulokset lihavoitu. MIC/IC-arvot (µg/ml), S. aureus ATCC 25923 P. aeruginosa ATCC 27853 Lobar RP-8-fraktiot MIC/IC IC50 MIC/IC IC50 2F6 - 1000 1000 250 2F7 IC80=250 125 IC80=1000 125 2F8 250 125 500 62,5 2F9 500 250 500 62,5 2F10 IC70=1000 - IC80=1000 125

7. JOHTOPÄÄTÖKSET

Tässä työssä tutkitut kasvit ovat olleet käytössä perinteisessä Afrikkalaisessa kansanlääkinnässä jo pitkään, mutta tarkemmin niiden sisältämiä yhdisteitä tai toimintamekanismeja on tutkittu vain vähän varsinkin T. kaiserana -lajin osalta. Työn tarkoituksena oli tutkia kolmen Combretaceae-heimoon kuuluvan kasvin antimikrobista tehoa. T. sambesiaca -lajin juuren kuorelle, T. kaiserana -lajin juuren ja varren kuorelle sekä C. psidioides -lajin varren kuorelle tehtiin neste-neste-uuttofraktiot, ja saatuja fraktioita seulottiin ensin agardiffuusiomenetelmällä S. aureus ja P. aeruginosa -bakteererita vastaan. Tehokkaimmiksi neste-neste-uuttofraktioiksi osoittautui T. sambesiaca -lajin juuren kuoren veteen liukeneva fraktio molempia bakteerilajeja vastaan. Myös muut tutkitut kasvilajit osoittivat antimikrobista tehoa näitä bakteereita vastaan.

Tutkittavien fraktioiden annos-vasteet määritettiin myös, ja pienimmät MIC-arvot S. aureus -bakteeria vastaan antoivat T. sambesiaca -lajin juuren kuoren raakauute ja butanolifraktio sekä C. psidioides -lajin varren kuoren raakauute ja veteen liukeneva fraktio. P. aeruginosa -bakteeria vastaan pienimmän MIC-arvon antoi C. psidioides -lajin varren kuoren butanolifraktio. MIC-arvot määritettiin T. kaiserana -lajin juuren kuoren ja C. psidioides -lajin varren kuoren osalta myös M. smegmatis -bakteerille, mutta tarvitaan vielä lisää tutkimuksia, sillä tulokset olivat vaikeasti tulkittavia. S. aureus ja P. aeruginosa -bakteereita vastaan saadut tulokset 64

tutkittujen fraktioiden antimikrobisesta tehosta ovat kuitenkin erittäin lupaavia. Uusia antibiootteja tarvitaan jatkuvasti, sillä vanhat, kauan käytössä olleet mikrobilääkkeet menettävät tehoaan, ja antibioottiresistenssi on lisääntyvä, erittäin vakava ongelma. Lisäksi köyhissä Afrikan maissa asukkailla ei ole varaa hankkia länsimaisia antibiootteja, joten omat ”antibioottivarastot” luonnossa kasvavien kasvien muodossa olisi taloudellisesti ja käytännön kannalta hyödyllinen ratkaisu.

Työssä haluttiin myös selvittää, mikä tai mitkä yhdisteet vastaavat T. kaiserana -lajin juuren kuoren antimikrobisesta tehosta. Lajin raakauutetta fraktioitiin Lobar RP-8 -pylväskromatografialla ja fraktioiden MIC-arvot määritettiin. Valitettavasti käytetyn ajan puitteissa yhdisteitä ei saatu eroteltua kunnolla omiksi fraktioikseen, ja pienimmän MIC-arvon antoi fraktio 2F8, joka sisälsi lähes kaikki samat yhdisteet kuin T. kaiserana -lajin juuren kuoren raakauutekin, lukuun ottamatta joitakin poolisia ja keskipoolisia ellagitanniineja. Runsaasti ellagihapon johdannaisia sisältävä fraktio 2F9 antoi toiseksi lupaavimmat MIC-arvot, ja oli tehokas erityisesti P. aeruginosa -bakteeria vastaan. Fraktion 2F8 kohdalla aktiiviset aineet ovat siis todennäköisesti ellagitanniineja, kun taas fraktion 2F9 kohdalla ne ovat todennäköisesti ellagihapon johdannaisia.

Yhdisteitä eroteltiin myös ohutkerroskromatografialla, jolla erottuminen oli pylväskromatografiaan verrattuna hieman parempaa mutta työläämpää. Eroteltujen yhdisteiden sisältöä tai antimikrobista tehoa ei kuitenkaan ehditty analysoimaan tarkemmin, vaan tämä jää tehtäväksi tulevaisuudessa. Ohutkerroskromatografialla saatujen fraktioiden koostumuksia on tarkoitus analysoida tarkemmin korkean erotuskyvyn kromatografialla. Tulevaisuudessa erottumista ohutkerroskromatografialla voisi parantaa käyttämällä pienempiä pitoisuuksia näytteitä. Tämä tarkoittaa enemmän ajoja mutta toisaalta puhtaampia yhdisteitä ja fraktioita. Tarkoitus on myös optimoida Lobar RP-8 -pylväskromatografiaolosuhteita, jolloin erottelua saataisiin tehokkaammaksi. Lisäksi voitaisin käyttää muita kiinteitä faaseja, kuten Sephadex LH- 20, RP-18 ja polyamidia, jotka soveltuvat hyvin ellagitanniinien ja ellagihappojohdannaisten erottamiseen. Erotusmenetelmien optimointi laboratorio- olosuhteissa on usein aikaavievää ja kallista, joten apuna voisi myös käyttää 65

tietokonemallinnuksia, esimerkiksi DryLab-ohjelmaa, joka auttaa optimoimaan HPLC- ajo-olosuhteita muutaman testiajon tulosten perusteella.

On myös hyvä pitää mielessä, että mikään yksittäinen yhdiste ei välttämättä ole yksin vastuussa antimikrobisesta tehosta. Kasvien sisältämät yhdisteet toimivat usein yhdessä synergistisesti, jolloin bakteerien kasvua estävä teho voi olla voimakkaampi kuin yksittäisten yhdisteiden yhteenlaskettu antibakteerinen teho. Mikäli yhdisteitä saadaan jatkossa tarkemmin eroteltua omiksi fraktioiksi tai jopa yksittäisiksi yhdisteiksi, voitaisiin myös synergiavaikutusta tutkia eri fraktioita ja yhdisteitä yhdistelemällä. Tämä vaatii kuitenkin ensin tehokkaan menetelmän, jotta tutkittavaa materiaalia saadaan tuotettua tarpeeksi paljon.

KIRJALLISUUSLUETTELO

Addae-Mensah I, Fakorede F, Holtel A, Nwaka S: Traditional medicines as a mechanism for driving research innovation in Africa. Malaria Journal 10 (Suppl 1): S9, 2011

Adonizio A. Anti-quorum sensing agents from South Florida medicinal plants and their attenuation of Pseudomonas aeruginosa pathogenicity. Väitöskirja. FIU Electronic Theses and Dissertations. Paper 13, 2008

Aguilera-Carbo A, Augur C, Prado-Barragán LA, Favela-Torres E, Aguilar CN: Microbial production of ellagic acid and biodegradation of ellagitannins. Appl Microbiol Biotechnol 78: 189-199, 2008a

Aguilera-Carbo A, Augur C, Prado-Barragán LA, Aguilar CN, Favela-Torres E: Extraction and analysis of ellagic acid from novel complex sources. Chem Pap 62: 440- 444, 2008b

Ahmad I, Aqil F: In vitro efficacy of bioactive extracts of 15 medicinal plants against ESbetaL-producing multidrug-resistant enteric bacteria. Microbiol Res 162: 264-275, 2007

Akiyama H., Fujii, K, Yamasaki O, Oono T, Iwatsuki K: Antibacterial action of several tannins against Staphylococcus aureus. J. of Antimicr. Chemother. 48: 487-491, 2001

Angole RO, Jehopio P, Maiga G: Ontology model: Towards bridging the gap between African traditional medicine and conventional medicine. Int J KES 17: 37-43, 2013

Appiah M, Blay D, Damnyag L, Dwomoh FK, Pappinen A, Luukkanen O: Dependence on forest resources and tropical deforestation in Ghana. Environ Dev Sustain11: 471- 487, 2009

Ascacio-Valdés JA, Buenrostro-Figueroa JJ, Aquilera-Carbo A, Prado-Barragán A, Rodríguez-Herrera R, Aguilar CN: Ellagitannins: biosyhtesis, biodegradation and biological properties. J Med Plant Res 5: 4696-4703, 2011

Askoura M, Mottawea W, Abujamel T, Taher I: Efflux pump inhibitors (EPIs) as new antimicrobial agents against Pseudomonas aeruginosa. Libyan J Med 6: 1-8, 2011

Association for African Medicinal Plants Standards (AAMPS): AAMPS is very proud to announce the launch of the first African Herbal Pharmacopoeia. 4.7.2013. Haettu Internetistä 20.11.2013: http://www.aamps.org/en/

Ayepola OO: Evaluation of the antimicrobial activity of root and leaf extracts of Terminalia glaucescens. Adv in Nat Appl Sci 3: 188-191, 2009

Barbour EK, Al Sharif M, Sagherian VK, Habre AN, Talhouk RS, Talhouk SN: Sreening of selected indigenous plants of Lebanon for antimicrobial activity. J Ethnopharmacol 93: 1-7, 2004

Beekwilder J, Jonker H, Meesters P, Hall RD, van der Meer IM, de Vs CHR: Antioxidants in raspberry: on-line analysis links antioxidant activity to a diversity of individual metabolites. J Agric Food Chem 53: 3313-3320, 2005

Boudjelal A, Henchiri C, Sari M, Hendel N, Benkhaled A, Ruberto G: Herbalists and wild medicinal plants in M’Sila (North Algeria): An ethnopharmacological survey. J Ethnopharm 148: 395-402, 2013

Bruschi P, Morganti M, Mancini M, Signorini MA: Traditional healers and laypeople: A qualitative and quantitative approach to local knowledge on medical plants in Muda (Mozambique). J Ethnopharm 138: 543-563, 2011

Chen L-G, Huang W-T, Lee L-T, Wang C-C: Ellagitannins from Terminalia calamansanai induced apoptosis in HL-60 cells. Toxicol in Vitro 23: 603-609, 2009

Chen P-S, Li J-H, Liu T-Y, Lin T-C: Folk medicine Terminaia catappa and its major tannin component, punicalagin, are effective against bleomycin-induce genotoxicity in Chinese hamster ovary cells. Cancer Lett 152: 115-122, 2000

Chabbra SC, Mahunnah RLA, Mshiu EN: Plants used in traditional medicine in Eastern Tanzania. II. Angiosperms (Capparidaceae to Ebenaceae). J Ethnopharmacol 25: 339- 359, 1989

Clifford MN, Scalbert A: Ellagitannins: nature, occurrence and dietary burden. J Sci Food Agric 80: 1118-1125, 2000

CMAJ: African traditional medicine struggles to find its place within health care. CMAJ 184: E831-E832, 2012

Cowan MM: Plant products as antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev 12: 564-582, 1999

Dark GG, Hill SA, Prise VE, Tozer GM, Pettit GR, Chaplin DJ: Combretastatin A-4, an agent that displays potent and selective toxicity toward tumor vasculature. Cancer Res 57: 1829-1834, 1997

De Zulueta P: Randomized placebo-controlled trials and HIV-infected pregnant women in developin countries: ehtical imperialism or unethical exploitation? Bioethics 15: 289- 311, 2001

Drewes SE: Natural products research in South-Africa: 1890-2010. S Afr J Sci 108: 1-8, 2012

Eldeen IMS, Van Staden J: Antimycobacterial activity of some trees used in South African traditional medicine. S Afr J Bot 73: 248-251, 2007

Eloff JN, Famakin JO, Katerere DRP: Combretum woodii (Combretaceae) leaf extracts have high activity against Gram-negative and Gram-positive bacteria. Afr J Biotechnol 4: 1161-1166, 2005a

Eloff JN, Famakin JO, Katerere DRP: Isolation of an antibacterial stilbene from Combretum woodii (Combretaceae) leaves. Afr J Biotechnol 4: 1167-1171, 2005b

Eloff JN, Katerere DR, McGaw LJ: The biological activity and chemistry of the southern African Combretaceae. J Ethnopharmacol 119: 686-699, 2008

Elujoba AA, Odeleye OM, Ogunyemi CM: Traditional medicine development for medical and dental primary health care delivery system in Africa. Afr J Trad CAM, 2: 46-61, 2005

Engels C, Schieber A, Gänzle MG: Inhibitory spectra and models of antimicrobial action of gallotannins from mango kernels (Mangifera indica L.). Appl Environ Microbiol 77: 2215-2223, 2011

Falodun A: Herbal medicine in Africa; Distribution, Standardization and Prospects. Res J Phytochem 4: 154-161, 2010

Fyhrquist P, Laakso, I, Garcia Marco, S, Julkunen-Tiitto R, Hiltunen, R: Antimycobacterial activity of five selected species of Terminalia used for treatment of infectious diseases in African traditional medicine. In manuscript. S Afr J Bot 90: 1-16, 2014

Fyrhquist P: Traditional medicinal uses and biological activities of some plant extracts of African Combretum Loefl., Terminalia L. and Pteleopsis Engl. species (Combretaceae). Väitöskirja. Yliopistopaino, Helsinki 2007

Fyhrquist P, Mwasumbi L, Hæggström C-A, Vuorela H, Hiltunen R, Vuorela P: Antifungal activity of selected species of Terminalia, Pteleopsis and Combretum (Combretaceae) collected in Tanzania. Pharm Biol 42: 308-317, 2004

Fyhrquist P, Mwasumbi L, Hæggström C-A, Vuorela H, Hiltunen R, Vuorela P: Ethnobtanical and antimicrobial investigation of some species of Terminalia and Combretum (Combretaceae) growing in Tanzania. J Ethnopharmacol 79: 169-177, 2002

Fyhrquist P, Mwasumbi L, Vuorela P, Vuorela H, Hiltunen R, Murphy C, Adlercreutz H: Preliminary antiprolifertive effects of some species of Terminalia, Combretum and Pteleopsis collected in Tanzania on some human cancer cell lines. Fitoterapia 77: 358- 366, 2006

Gil MI, Tomás-Barberán FA, Hess-Pierce B, Holcroft DM, Kader AA: Antioxidant activity of pomegranate juice and its relationship with phenolic composition and processing. J Agric Food Chem 48: 4581-4589, 2000

Green E, Samie A, Obi CL, Bessong PO, Ndip RN: Inhibitory properties of selected South African medicinal plants agaist Mycobacterium tuberculosis. J Ethnopharmacol 130: 151-157, 2010

Grundhöfer P, Niemitz R, Schilling G, Gross GG: Biosynthesis and subcellular distribution of hydrolysable tannins. Phytochemistry 57: 915-927, 2001

Gurib-Fakim A, Kasilo OMJ: Promoting African Medicinal through an African Medicinal Pharmacopoeia. The African Health Monitor (WHO), Special issue 13: 65- 67, 2010

Han Q, Song J, Qiao S, Wong L, Xu H: Preparative isolation of hydrolysable tannins chebulagic acid and chebulinic acid from Terminalia chebula by high-speed counter- currentchromatography. J. Sep. Sci. 29:1653 – 1657, 2006

Haslam E, Lilley TH, Cai Y., Martin R., Magnolato, D: Traditional Herbal Medicines- The Role of Polyphenols. Planta Medica 55: 1-8, 1989

Haslam E: Natural polyphenols (vegetable tannins) as drugs: possible modes of action. J Nat Prod 59: 205-215, 1996

Hatano T, Kusuda M, Inada K, Ogawa T, Shiota S, Tsuchiya T, Yoshida T: Effects of tannins and related polyphenols on methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Phytochemistry 66: 2047-2055, 2005

He X, Li S, Huang H, Li Z, Chen L, Ye S, Huang J, Lin T: A pharmacokinetic and safety study of single dose intravenous combretastatin A4 phosphate in Chinese patients with refractory solid tumours. Br J Clin Pharmacol 71: 860-870, 2011

Isola OI: The ”Relevance” of the African traditional medicine (alternative medicine) to health care delivery system in Nigeria. J Develop Area 47: 319-338, 2013

Juang L-J, Sheu S-J, Lin T-C: Determination of hydrolysable tannins in the fruit of Terminalia chebula Retz. by high-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis. J Sep Sci 27: 718-724, 2004 Kale R: Traditional healers in South-Africa: a parallel health care system. BJM 310: 1182-1185, 1995

Kallithraka S, Bakker J, Clifford MN: Evidence that salivary proteins are involved in astringency. J Sens Stud 13: 29-43, 1998

Kaschula ROC: The practice of pathology in Africa. Arch Pathol Lab Med 137: 752- 755, 2013

Kasilo OMJ, Kofi-Tsekpo M, Busia K: Towards sustainable local production of traditional medicines in the African region. The African Health Monitor (WHO), Special issue 13: 80-88, 2010

Katerere DR, Gray AI, Nash RJ, Waight RD: Antimicrobial activity of pentacyclic triterpenes isolated from African Combretaceae. Phytochemistry 63: 81-88, 2003

Khoddami A, Wilkes M, Roberts TH: Techniques for analysis of plant phenolic compounds. Molecules 18, 2328-2375, 2013

Kiguli-Malwadde E, de Maeseneer J, Kansiime C: Developing family medicine in Africa. Afr Health 35: 27-29, 2013

Kilonda A, Babady-Bila O, Lohohola S, Toppet F, Compernolle: Acetylation products of pentacyclic triterpene glucosides from Combretum psidioides. Arkivoc (iv), 3-21, 2003

Kimang’a AN: A situational analysis of antimicrobial drug resistance in Africa: are we losing the battle? Ethiop J Healt Sci 22: 135-143, 2012

Kofi-Tsekpo M: Institutionalization of African traditional medicine in health care systems in Africa. Afr J Health Sci 11: i-ii

Kähkönen MP, Hopia AI, Heinonen M: Berry phenolic and their antioxidant activity. J Agric Food Chem 49: 4076-4082, 2001

Lawrence NJ, Hepworth LA, Rennison D, McGown AT, Hadfield JA: Synthesis and anticancer activity of fluorinated analogues of combretastatin A-4. J Fluorine Chem 123: 101-108, 2003

Letcher RM, Nhamo LRM: Chemical constituents of the Combretaceae. Part III. Substituted phenanthrenes, 9,10-dihydrophenanthrenes, and bibenzyls from the heartwood of Combretum psidioides. J Chem Soc, Perkin Trans 1: 2941-2946, 1972

Liu M, Katere DR, Gray AI, Seidel V: Phytochemical and antifungal studies on Terminalia mollis and Terminalia brachystemma. Fitoterapia 80: 369-373, 2009

Macklin R: Bioethics and public policy in the next millenium: presidetial address. Bioethics 15: 373-381, 2001

Magoro MD, Masoga MA, Mearns MA: Traditional health practitioners’ practices and the sustainability of extiction-prone traditional medicinal plants. Int J Afr Renaiss Stud, 5: 229-241, 2010

Mahajan AD, Pai NR: Development and validation of HPLC method for quantification of phytoconstituents in Haritaki Churna. Int J Chem Tech Res 3: 329-336, 2011

Makesh B, Satish S: Antimicrobial activity of some important medicinal plants against plant and human pathogens. World J Agric Sci 4: 839-843, 2008

Manzur A, Raju A, Rahman S: Antimicrobial activity of Terminalia catappa extracts against some pathogenic microbial strains. Pharmacology Pharmacy 2: 299-305, 2011

Martino V, Morales J, Martínez-Irujo JJ, Font M, Monge A, Coussio J: Two ellagitannins from the leaves of Terminalia triflora with inhibitory activity n HIV-1 reverse transcriptase. Phytoter Res 18. 667-669, 2004

Masoko P, Eloff JN: The diversity of antifungal compounds of six South African Terminalia species (Combretaceae) determined by bioautography. African Journal of Biotechnology 4 (12), 1425-1431, 2005

Mavi S, Shava S: Traditional methods of conserving medicinal plants in Zimbabwe. Haettu Internetistä 30.10.2013. BGCNews 2, 1997: http://www.bgci.org/worldwide/article/0347/

Mbwambo ZH, Erasto P, Nondo ROS, Innocent E, Kidukuli AW: Antibacterial and cytotoxic activities of Terminalia stenostachya and Terminalia spinosa. Tanzan J Health Res 13: 103-105, 2011

McCarthy M: Nature Laid Waste: The destruction of Africa. The Independent 11.6.2008. Haettu Internetistä 2.11.2013: http://www.independent.co.uk/news/world/africa/nature-laid-waste-the-destruction-of- africa-844370.html

McVann A, Havlik I, Joubert PH, Monteagudo FS: Cardiac glycoside poisoning involved in deaths from traditional medicines. S Afr Med J 81: 139-141, 1992

Medical Microbiology, Bacterial morphology, Bacterial structure. 15.4.2013. Saatatvissa internetistä: http://micro.digitalproteus.com/morphology2.php

Meyers KJ, Watkins CB, Pritts MP, Liu RH: Antioxidant and antiproliferative activities of strawberries. J Agric Food Chem 51: 6887-6892, 2003

Mhame PP, Busia K, Kasilo OMJ: Clinical practices of African traditional medicine. The African Health Monitor (WHO), Special issue 13: 30-39, 2010

Ogundiya MO, Kolapo AL, Okunade MB, Adejumobi JA: Evaluation of phytochemical composition and antimicrobial activity of Terminalia glaucescens agaist some oral pathogens. Adv in Nat Appl Sci 2: 89-93, 2008

Okuda T, Yoshida T, Hatano T: Classification of oligomeric hydrolysable tannins and specificity of their occurrence in plants. Phytochemistry, 32, 507–521, 1993

Okuda T, Yoshida T, Hatano T: Correlation of oxidative transformations of hydrolysable tannins and plant evolution. Phytochemistry 55: 513-529, 2000 72

Okuda T, Yoshida T, Hatano T, Ito H: Ellagitannins renewed the concept of tannins. Kirjassa: Chemistry and biology of Ellagitannins. s. 1-54, 1. painos. Toim. Quideau S, World Scientific Publishing Co, Singapore 2009

Onanuga A, Awhowho GO: Antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus strains from patients with urinary tract infection in Yenagoa, Nigeria. J Pharm Bioallied Sci 4: 226-230, 2012

Pettit GR, Singh SB, Hamel E, Lin CM, Alberts DS, Gardia-Kendall D: Isolation and structure of the strong cell growth and tubulin inhibitor combretastatin A-4. Experientia 45: 209-2011, 1989

Pettit GR, Singh SB, Niven ML, Hamel E, Schimdt JM: Isolation, structure, and synthesis of combretastatins A-1 and B-1, potent new inhibitors of microtubule assembly derived from Combretum caffrum. J Nat Prod 50: 119-131, 1987

Pfundstein B, El Desouky SK, Hull WE, Haubner R, Erben G, Owen RW: Polyphenolic compounds in the fruits of Egyptian medicinal plants (Terminalia bellerica, Terminalia chebula and Terminalia horrida): characterization, quantitation and determination of antioxidant capacities. Phytochemistry 71: 1132-1148, 2010

Phillips D: EU Supported African Medicinal Plants Standards Project Paves the Way to Development of African Herbal Pharmacopoeia. Association for African Medicinal Plant Standards. Haettu 25.2.2013. Saatavissa Internetissä: http://www.aamps.org

Puupponen-Pimiä R, Nohynek L, Hartmann-Schmidlin S, Kähkönen M, Heinonen M, Hopia A, Oksman-Caldentey K-M: Antimicrobial properties of phenolic compounds from berries. J Appl Microbiol 90: 494-507, 2001

Puupponen-Pimiä R, Nohynek L, Meier C, Kähkönen M, Heinonen M, Määttä-Riihinen K, Oksman-Caldentey K-M: Berry phenolics selectively inhibit the growth of intestinal pathogens. J Appl Microbiol 98: 991-1000, 2005

Renckens CNM, Dorlo TPC: Please let not Western quackery replce traditional medicine in Africa. Trop Med Int Health 18: 242-244, 2013

Ross HA, McDougall GJ, Stewart D: Antiproliferative activity is predominantly associated with ellagitannins in raspberry extracts. Phytochemistry 68: 218-228, 2007

Saleem A, Husheem M, Härkönen P, Pihjala K: Inhibition of cancer cell growth by crude exctract and the phenolics of Terminalia chebula retz. fruit. J Ethnopharmacol 81: 237-336, 2002

Sarabhai S, Sharma P, Capalash N: Ellagic acid derivatives from Terminalia chebula Retz. downregulate the expression of quorum sensing genes to attenuate Pseudomonas aeruginosa PAO1 virulence. Plos One 8: 1-11, 2013

Sarathy JP, Dartois V, Lee EJD: The role of transport mechanisms in Mycobacterium tuberculosis drug resistance and tolerance. Pharmaceuticals 5: 1210-1235, 2012

Scalbert A: Antimicrobial properties of tannins. Phytochemistry 30: 3875–3883, 1991

Shaumburg F, Ateba Ngoa U, Kösters K, Köck R, Adegnika AA, Kremsner PG, Lell B, Peters G, Mellmann A, Becker K: Virulence factors and genotypes of Staphylococcus aureus from infection and carriage in Gabon. Clin Microbiol Infect 17: 1507-1513, 2011

Sheril KC, Chandrasekharan K: Antibiotics surveillance program: survey to the resistance patterns of microorganisms to antibiotics in nosocomial infections. IJPTP 3: 352-359, 2012

Silva JOC Jr, Costa RMR, Teixeira FM, Barbosa WLR (2011): Processing and Quality Control of Herbal Drugs and Their Derivatives, Quality Control of Herbal Medicines and Related Areas, Shoyama Y (Toim.), InTech 2011. Haettu Internetistä 18.11.2013: http://www.idrc.ca/EN/Resources/Publications/Pages/ArticleDetails.aspx?PublicationID =713

Silva O, Duarte A, Pimentel M, Viegas S, Barroso H, Machado J, Pires I, Cabrita J, Gomes E: Antimicrobial activity of Terminalia macroptera root. J Ethnopharmacol 57: 203-207, 1997

Silva O, Gomes E, Wolfender J-L, Marston A, Hostettmann K: Application of high performance liquid chromatography coupled with ultraviolet spectroscopy and electrospray mass spectrometry to the characterization of ellagitannins from Terminalia macroptera roots. Pharmaceut Res 17: 1396-1401, 2000

Singh G, Kumar P: Evaluation of antimicrobial activity of alkaloids of Terminalia chebula Retz. against some multidrug-resistant microorganisms. Int J Green Pharm 6: 57-62, 2012

Smith S, Ganiyu O, John R, Fowora M, Akinsinde K, Odeigah P: Antimicrobial resistance and molecular typing of Pseudomonas aeruginosa isolated from surgical wounds in Lagos, Nigeria. Acta Medica Iranica 50: 433-438, 2012

Ssenyonga R: Family medicine may be helpful in improving health care delivery in sub_saharan Africa. Afr Health Sci 7: 120-121, 2007 Stark TD, Mtui DJ, Balemba OB: Ethnopharmacological survey of plants used in the traditional treatment of gastrointestinal pain, inflammation and diarrhea in Africa: Future perspectives for integration into modern medicine. Animals, 3: 158-227, 2013

Taganna JC, Quanico JP, Perono RMG, Amor EC, Rivera WL: Tannin-rich fraction from Terminalia catappa inhibits quorum sensing (QS) in Chromobacterium violaceum and the QS-controlled biofilm maturation and LasA staphylolytic activity in Pseudomonas aeruginosa. J Ethnopharmacol 134: 865-871, 2011

Tangwa GB: How not to compare Western scientific medicine wit African traditional medicine. Developing World Bioeth 7: 41-44, 2007

Tan F, Shi S, Zhong Y, Gong X, Wang Y: Phylogenetic relationships of Combretoideae (Combretaceae) inferred from plastid, nuclear gene and spacer sequences. J Plant Res 115: 475-481, 2002

Tateke T, Woldie M, Ololo S: Determinants of patient satisfaction with outpatient health services at public and private hospitals in Addis Ababa, Ethiopia. Afr J Prm Health Care Fam Med 4: 384-385 2012

Tozer GM, Kanthou C, Lewis G, Prise VE, Vojnovic B, Hill SA: Tumour vascular disrupting agents: combating treatment resistance. Brit J Radiol 81: S12-S20, 2008

Tozer GM, Kanthou C, Parkins CS, Hill SA: The biology of the combretastatines as tumour vascular targeting agents. Int J Exp Pathol 83: 21-38, 2002

Törrönen R: Sources and health effects of dietary ellagitannins. Kirjassa: Chemistry and biology of Ellagitannins. s. 298-319, 1. painos. Toim. Quideau S, World Scientific Publishing Co, Singapore 2009

UNDP (United Nations Development Programme): Zimbabwe 2012. Millenium Development Goals Progress Report: 1-75, 2012

U-Pratya Y, Pratumrat T, Jiratchariyakul W, Kummalue T: Antiproliferative activity of Erycibe elliptilimba against human leukemic cancer cell lines. J of Med Plants Res 6 (13): 2606 – 2613, 2012

WHO (World Health Organization): General guidelines for methodologies on research and evaluation of traditional medicine. WHO: Geneva, 2000

WHO (World Health Organization): Disease and injury regional mortality estimates for 2000 – 2011, WHO regions. Haettu Internetistä 11.11.2013: http://www.who.int/healthinfo/global_burden_disease/estimates_regional/en/index.html

WHO (World Health Organization): Enhancing the role of traditional medicine in health systems: A strategy for the African region. AFR/RC63/6, 2013

WHO (World Health Organization): HEALTH21 – health for all in the 21st century. Haettu Internetistä 12.11.2013: http://www.euro.who.int/en/publications/policy- documents/health21-health-for-all-in-the-21st-century

WHO (World Health Organization): Progress report on Decade of traditional medicine in the African region. AFR/RC61/PR/2, 2011

WHO (World Health Organization): Traditional medicine strategy, 2002-2005. WHO: Geneva, 2002

WHO (World Health Organization): WHO guidelines on good agricultural and collection practices (GACP) for medicinal plants WHO: Geneva, 2003

Wikipedia: Afrikka. Haettu Internetistä 2.11.2013: http://fi.wikipedia.org/wiki/Afrikka

Wikipedia: Alma-Ata Declaration. Haettu Internetistä 7.11.2013: http://en.wikipedia.org/wiki/Alma_Ata_Declaration

Wikipedia: Harpagophytum procumbens. Haettu Internetistä 18.11.2013: http://en.wikipedia.org/wiki/Harpagophytum

Willcox M, Siegfried N, Johnston Q: Capacity for clinical research on herbal medicines in Africa. J Altern Complem Med 18: 622-628, 2012

Wood R, Mills PB, Knobel GJ, Hurlow WE, Stokol JM: Acute dichromate poisoning after use of traditional purgatives. S Afr Med J 77: 640-642, 1990

Woods JA, Hadfield JA, Pettit GR, Fox BW, McGown AT: The interaction with tubulin of a series of stilbenes based on combretastatin A-4. Brit J Cancer 71: 705-711, 1995

Yoshida T, Amakura Y, Yoshimura M: Structural features and biological properties of ellagitannins in some plant families of the order Myrtales. Int J Mol Sci 11: 79-106, 2010