Méndez Zumba Joaozinho Enmanuel TUTORA: Migdalia Miranda, Phd

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS MODALIDAD: INVESTIGACIÓN

TEMA: IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN GENÉTICA, FARMACOLÓGICA Y QUÍMICA DE LAS HOJAS DE UNA ESPECIE DE LA FAMILIA SAPOTACEAE

TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO Y FARMACÉUTICO

AUTOR: Méndez Zumba Joaozinho Enmanuel

TUTORA: Migdalia Miranda, PhD.

GU AY AQUIL – ECUADOR

201 7 - 20 18

AGRADECIMIENTOS

A Dios por ser mi guía y darme la oportunidad de cumplir mis metas. A mi hermana (Andrea), por brindarme su apoyo incondicional durante todos estos años. A mis padres (Tanya y Juan), por darme su confianza y la oportunidad de demostrar mis capacidades. A mi abuelita (Esperanza), por ser la mujer que me enseñó buenos valores éticos y morales y por ser quien me apoyó siempre sin esperar nada a cambio. A mi tutora (Migdalia Miranda PhD) por toda su paciencia, ayuda y colosales aportes en la realización de este trabajo. A mis tías (Maribel y Carmen) por brindarme su mano y compañía todo este tiempo. A mis amigas y compañeras de estudio (Mayra, Sara, Karen y Sandy) por hacer todo este tiempo de estudio más corto y divertido, así como también por su ayuda en el ámbito académico y por alentarme en todos los momentos de tensión. A mi gran amigo (Robert) por darme fuerzas, por todos sus consejos y su ayuda desinteresada. A mí cotutora y gran amiga (Dra. Katherine Bustamante) por su gran colaboración en este trabajo.

A todos un millón de gracias…

ÍNDICE CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN ...... 1 I.1 Problema científico: ...... 3 I.2 Hipótesis: ...... 3 I.3 Objetivo general: ...... 4 I.4 Objetivos específicos: ...... 4 CAPITULO II: MARCO TEÓRICO ...... 5 II.1 Familia Sapotaceae ...... 5 II.1.1 Género Manilkara ...... 5 II.1.1.1 Taxonomía del género Manilkara ...... 5 II.1.1.2 Descripción del Género Manilkara ...... 6 II.1.1.3 Distribución natural y hábitat ...... 7 II.1.1.4 Usos...... 8 II.1.2 Género Mimusops ...... 8 II.1.2.1 Taxonomía de la especie Mimusops sp...... 8 II.1.2.2 Descripción del Género Mimosups ...... 9 II.1.2.3 Distribución natural y hábitat ...... 10 II.1.2.4 Usos...... 10 II.1.3 Sinonimia entre los géneros Manilkara y Mimusops ...... 11 II.1.4 Principales compuestos de los géneros Manilkara y Mimusops12 II.1.5 Principales actividades farmacológicas de los géneros Manilkara y Mimusops ...... 18 CAPÍTULO III: MARCO METODOLÓGICO ...... 20 III.1 Metodología de la investigación ...... 20 III.2 Estudio farmacognóstico de la especie ...... 20 III.2.1 Recolección y selección del material vegetal ...... 20 III.2.2 Secado y almacenamiento ...... 21 III.2.3 Caracterización botánica de la especie ...... 21 III.2.3.1 Evaluación macromorfológica de la hoja...... 21 III.2.3.2 Evaluación micromorfológica de la hoja...... 22

III

III.2.3.3 Caracterización genética de la hoja ...... 23 III.2.4 Determinación de los parámetros fisicoquímicos...... 26 III.2.4.1 Humedad residual ...... 26 III.2.4.2 Cenizas totales ...... 27 III.2.4.3 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico ...... 27 III.2.4.4 Sustancias solubles ...... 28 III.2.5 Análisis cualitativo por tamizaje fitoquímico ...... 29 III.3 Estudios químicos de las hojas...... 29 III.3.1 Extracción y fraccionamiento preliminar. método 1 ...... 29 III.3.1.1 Análisis por cromatografía en capa delgada (CCD) de los extractos ...... 30 III.3.2 Extracción y fraccionamiento. método 2 ...... 31 III.3.2.1 Eliminación del látex por agotamiento ...... 31 III.3.2.2 Método de extracción y concentración ...... 31 III.3.2.3 Análisis por cromatografía en capa delgada de los extractos32 III.3.2.4 Fraccionamiento en columna cromatográfica ...... 32 III.3.2.5 Análisis por cromatografía en capa delgada (CCD) de las fracciones ...... 33 III.4 Toxicología aguda dérmica (TAD) y oral (TAO) del extracto acuoso de las hojas ...... 34 III.4.1 Toxicología Aguda Dérmica (TAD) ...... 34 III.4.1.1 Condiciones de tenencia de los animales ...... 34 III.4.1.2 Desarrollo del ensayo...... 35 III.4.1.3 Modo de aplicación ...... 35 III.4.2 Toxicología aguda oral (TAO) ...... 36 III.4.2.1 Condiciones de tenencia de los animales ...... 36 III.4.2.2 Desarrollo del ensayo...... 37 III.4.2.3 Modo de aplicación ...... 37 CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...... 39 IV.1 Estudio farmacognóstico y fitoquímico ...... 39 IV.1.1 Caracterización botánica de la especie ...... 39 IV.1.1.1 Caracterización Taxonómica ...... 39

IV.1.1.2 Caracterización genética de la hoja ...... 39 IV.1.1.3 Evaluación macromorfológica de la hoja ...... 45 IV.1.1.4 Evaluación micromorfológica de la hoja ...... 48 IV.1.2 Determinación de los parámetros Fisico-Químicos ...... 52 IV.1.3 Análisis cualitativo de los metabolitos por tamizaje fitoquímico54 IV.2 Estudios químicos preliminares ...... 55 IV.2.1 Extracción y fraccionamiento del material vegetal ...... 55 IV.2.2 Análisis por cromatografía en capa delgada de los extractos . 55 IV.3 Estudios químicos ...... 56 IV.3.1 Eliminación de látex por agotamiento ...... 56 IV.3.2 Método de extracción y concentración ...... 57 IV.3.3 Análisis por cromatografía en capa delgada (CDD) de los extractos ...... 57 IV.3.4 Fraccionamiento en columna cromatográfica ...... 58 IV.4 Toxicología dérmica (TAD) y aguda oral (TAO) del extracto acuoso de las hojas ...... 66 IV.4.1 Toxicología Aguda Dérmica (TAD) ...... 66 IV.4.2 Toxicología aguda oral (TAO)...... 67 CAPÍTULO V: CONCLUSIONES ...... 70 CAPÍTULO VI: RECOMENDACIONES ...... 72 BIBLIOGRAFÍA ...... 73

INDICE DE TABLAS

Tabla I Clasificación Taxonómica ...... 6 Tabla II Clasificación Taxonómica ...... 9 Tabla III Sinonimia Entre Especies Mimusops y Manilkara ...... 12 Tabla IV Principales compuestos encontrados en los géneros Manilkara y Mimusops ...... 13 Tabla V Principales actividades farmacológicas de los géneros Manilkara y Mimusops ...... 19 Tabla VI Primers ...... 24 Tabla VII. Disolventes y proporciones utilizadas en el fraccionamiento en columna cromatográfica de las hojas ...... 33 Tabla VIII Resultado del BLAST/NCBI ...... 41 Tabla IX Dimensiones de las hojas ...... 46 Tabla X Parámetros Fisicoquímicos de las hojas ...... 53 Tabla XI Tamizaje fitoquímico de las hojas ...... 54 Tabla XII. Fracciones obtenidas para los diferentes sistemas de solventes...... 59 Tabla XIII. Fracciones agrupadas por similitud de polaridad ...... 59 Tabla XIV. Compuestos identificados en las fracciones 36-106 ...... 62

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. PCR punto final con el marcador molecular rbcl a una temperatura de hibridación de 60ºC. La foto muestra la amplificación con la muestra de árbol. En el extremo derecho se cargó el marcador molecular 100bp DNA Ladder (Cat.# 62101, Promega). El tamaño de banda y los códigos de los pares de primers se los puede apreciar en la tabla VI ...... 40 Figura 2. PCR punto final con el marcador molecular matk a una temperatura de hibridación de 56ºC. La foto muestra la amplificación con la muestra de árbol. En el extremo derecho se cargó el marcador molecular 100bp DNA Ladder (Cat.# 62101, Promega). El tamaño de banda y los códigos de los pares de primers se los puede apreciar en la tabla VI...... 40 Figura 3. Árbol filogenético correspondiente al método Neighbor- joining. El árbol fue realizado tomando como base la secuencia de la muestra desconocida con el marcador rbcl y las secuencias del resultado del Blast-n...... 43 Figura 4. Árbol filogenético correspondiente al método Neighbor- joining. El árbol fue realizado tomando como base la secuencia de la muestra desconocida con el marcador matk y las secuencias del resultado del Blast-n...... 44 Figura 5. Caracteres macromorfológicos de la hoja ...... 45 Figura 6. Histograma del largo de las hojas ...... 46 Figura 7. Histograma del ancho de las hojas ...... 47 Figura 8. Corte transversal a nivel del nervio central de la hoja ...... 48 Figura 9. Diafanizado de la hoja ...... 50 Figura 10. Detalles micromorfológicos de la droga en polvo...... 50 Figura 11. Sección transversal de la hoja (Chanda et al., 2010)...... 51 Figura 12. Cromatografía en capa delgada del estudio químico preliminar. Izq: Sin revelado; Der: Revelado con luz UV y ácido sulfúrico. (H) Hojas; (Cl) Cloroformo; (AcOEt) Acetato de etilo; (Met) Metanol...... 56 Figura 13. Cromatografía en capa delgada del estudio químico preliminar. Izq: Sin revelado; Der: Revelado con luz UV y ácido sulfúrico. (1H) Extracto 1 de hojas; (2H) Extracto 2 de hojas; (Cl) Cloroformo; (AcOEt) Acetato de etilo; (Met) Metanol...... 58

VII

Figura 14. CCD de las fracciones agrupadas por similitud de polaridad ...... 60 Figura 15. Cromatograma gaseoso analítico del grupo de fracciones 36-106 ...... 61 Figura 16. Variación en el peso corporal (gramos) de los animales en el ensayo de Toxicidad Aguda Dérmica de Extracto acuoso de hojas. Letras diferentes indican significación estadística p< 0.05 ...... 66 Figura 17. Variación en el peso corporal (g) de los animales en el ensayo de Toxicidad Aguda Oral del extracto acuoso de hojas a la dosis de 2000 mg/kg...... 68

VIII

Title: Identification and genetic, pharmacological and chemical characterization of the leaves of a species of the Sapotaceae family.

Author: Joaozinho Méndez Zumba Advisor: Migdalia Miranda Martínez PhD.

ABSTRACT

Sapotaceae, is a family of flowering plants with more than a thousand species of trees and shrubs and pantropical distribution. There is more than one scientific name to characterize the species taxonomically, by close similarity in genotypic and phenotypic characteristics. The leaves of a specie of this family were identified and characterized in a genetic and chemical way. The morpho-anatomical characteristics of the leaves are reported; also, it was possible to determine its genetic characteristics, without being able to classify it taxonomically, by similarity between 4 species. Some of the physicochemical parameters of these leaves are also reported. Fatty, phenolic, flavonoid and terpenoid compounds were found as its main components. The most suitable solvent for the extraction and fractionation method was ethyl acetate; and analyzed it by gas chromatography, it was very complex. The aqueous extract of the leaves does not induce Acute Dermal or Oral Toxicity, for this reason it is considered practically harmless.

Keywords: genotypes, leaves, phenotypes, Sapotaceae, synonymy.

Título: Identificación y Caracterización Genética, Farmacológica y Química de las Hojas de una Especie de la Familia Sapotaceae

Autor: Joaozinho Méndez Zumba Tutor: Migdalia Miranda Martínez PhD.

RESUMEN

Sapotaceae, es una familia de plantas fanerógamas con más de mil especies de árboles y arbustos y distribución pantropical. Existe más de un nombre científico para caracterizar las especies taxonómicamente, por estrecha similitud en características genotípicas y fenotípicas. Se identificó y caracterizó de manera genética y química las hojas de una especie de esta familia. Se informa las características morfoanatómicas de las hojas; también se logró determinar sus características genéticas, sin poder clasificarla taxonómicamente, por similitud entre 4 especies. También se informan algunos de los parámetros fisicoquímicos de estas hojas. Se encontraron compuestos grasos, fenólicos, flavonoides y terpenoides como sus componentes principales. El disolvente más idóneo para el método de extracción y fraccionamiento fue el acetato de etilo; y al ser analizado por cromatografía gaseosa, resultó muy complejo. El extracto acuoso de las hojas no induce Toxicidad Aguda Dérmica ni Oral, por esto se considera prácticamente inocuo.

Palabras clave: fenotipos, genotipos, hojas, sinonimia, Sapotaceae

CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN

Sapotaceae, es una familia botánica que contiene 58 géneros de plantas con 1271 especies. Dentro de ésta se encuentran otras 451 plantas de rango infraespecífico. (Cárdenas-López et al. 2002; Duque, Cárdenas, and Rodríguez 2003; UNAM 2008). Comprende árboles, arbustos, raramente subarbustos, hermafroditas, monoicos, dioicos o polígamos, algunas veces espinosos; con látex por lo general blanco, raras veces amarillo, casi siempre presente en el tronco, ramas y fruto; y ocasionalmente con ramificación simpodial. Las hojas están dispuestas en espiral o alternas y dísticas, generalmente enteras; la inflorescencia son fasciculadas, axilares, ramifloros o caulifloros (UNNE, 2010).

Entre los géneros más importantes de esta familia se encuentran Pouteria, Palaquium, Madhuca, Manilkara, Sideroxylon, Chrysophyllum y Mimusops. De los cuales se destacan los géneros Manilkara y Mimusops por su distribución geográfica e importancia farmacológica (UNNE, 2010).

Al género Manilkara corresponden 79 especies, de las cuales 30 se encuentran en Centro y Sudamérica (Armstrong, 2011). Manilkara spp es un árbol que alcanza alrededor de 35 m de altura, el tallo es cilíndrico con base recta y alcanza 90 cm de diámetro a 1.3 m del suelo (Barthélémy and Caraglio, 2007).

Esta especie es empleada por diferentes grupos étnicos de la Amazonia quienes la reconocen y hacen referencia a las características organolépticas de la madera, fauna asociada, forma del fruto y/o usos (Rivera et al., 2013).

Las hojas son simples, alternas, glabras, cartáceas, elípticas a oblanceoladas, base cuneada y ápice obtuso a redondeado. Se agrupan hacia el final de las ramas, las cuales a su vez son horizontales, con ramas plagiotropas por aposición (Barthélémy and Caraglio, 2007). La corteza interna del árbol es rojiza y al corte exuda abundante látex blanco, espeso y pegajoso. (Camacho, 2005)

En las hojas de la especie se describe la presencia de flavonoides en extractos etanólicos y además otros constituyentes fenólicos y ácidos grasos insaturados (Fayek et al., 2012; Guzmán & Guerrero, 2005).

Por otro lado, se indica que en su resina se encuentran triterpenos pentacíclicos, que como se sabe tienen propiedades antiinflamatorias muy importantes tanto para la industria farmacéutica como cosmética (Rhourri-Frih et al., 2013).

Al género Mimusops le corresponde 45 especies descritas y se encuentran distribuidas en Asia, África, Australasia u Oceanía (James, 2013). Mimusops sp, es un árbol que alcanza alrededor de 25 m de altura con la copa densa y algo irregular, un tronco corto y de corteza muy resquebrajada. Sus hojas son simples, alternas, generalmente agrupadas y de color verde brillante; las flores tienen su cáliz con 8 sépalos triangulares con pelos externos de color castaño (Sánchez, 2001). Esta especie es empleada por diferentes grupos étnicos quienes la reconocen y hacen referencia a características organolépticas, usos medicinales e industriales (Semenya et al., 2012; Chivandi et al.,2016).

Se ha descrito que en la corteza del árbol se han encontrado una serie de triterpenoides como taraxerol, acetato de taraxetilo, cinamato de α-amirina, α- espinosterol y un ácido triterpenoide (Misra and Mitra 1966).

Manilkara y Mimusops son dos géneros que tiene ubicado 124 especies, en las cuales se han desarrollado una serie de investigaciones de tipo farmacognóstico y fitoquímico, a diferentes partes de las plantas.

En el Ecuador se han realizado muy pocos estudios a estos géneros de la familia Sapotaceae, por este motivo en este trabajo se hace un aporte científico, en su caracterización e identificación genética, farmacológica y composición química.

El desarrollo de estas investigaciones en el país, son muy importantes, porque la distribución de la flora es muy extensa y variada, es decir, que pueden existir miles de moléculas de interés farmacológico y drogas que aún no se han desarrollado; motivo por el cual se debe fomentar el interés hacia este tipo de estudios.

I.1 Problema científico:

¿El estudio taxonómico, genético y fitoquímico de las hojas permitirá clasificar la especie de la familia Sapotaceae?

Citando estas referencias se plantea la siguiente hipótesis.

I.2 Hipótesis:

El estudio taxonómico, genético y fitoquímico de las hojas permitirá clasificar la especie de la familia Sapotaceae en estudio.

Para demostrar dicha hipótesis se proponen como objetivos de trabajo:

I.3 Objetivo general:

 Caracterizar desde el punto de vista genético y farmacognóstico las hojas de la especie de la familia Sapotaceae.

I.4 Objetivos específicos:

 Establecer la caracterización morfoanatómica y genética para reafirmar su clasificación taxonómica.  Determinar los principales parámetros de las hojas que permitan establecer su calidad como droga vegetal.  Emplear un método de extracción y fraccionamiento para el estudio de la composición química de las hojas.  Evaluar la Toxicidad Aguda Oral (TAO) y la Toxicidad Aguda Dérmica (TAD) del extracto acuoso de las hojas de la especie.

CAPITULO II: MARCO TEÓRICO

II.1 Familia Sapotaceae

La familia Sapotaceae son árboles o arbustos que presentas hojas alternas o subopuestas, simples y enteras; con flores en cima, perfectas y actinomorfas. Su perianto está formado con un cáliz que contiene de 4 a 5 sépalos libres y una corola que presenta de 4 a 5 pétalos soldados y a veces urceolada. El Androceo está constituido por estambres, de 4 a 5 soldados a la corola y 0 a 5 estaminoidios petaloides. Por lo general el Gineceo está compuesto por un ovario súpero; a menudo 4 carpelos, de 2 a 5 lóculos, uniovular con cantidades de óvulos indefinidas. Las frutas que comprenden las Sapotaceae son bayas con semillas grandes endospermicas oleaginosa que se pierde en la madurez (UNNE, 2010).

II.1.1 Género Manilkara

II.1.1.1 Taxonomía del género Manilkara

Manilkara es un género que pertenece a la familia Sapotaceae de distribución pantropical (Pennington, 1990; UNNE, 2010). A este género pertenecen 70-90 especies, de las cuales 30 se encuentran en centro y surámerica (Armstrong, 2011). La clasificación taxonómica viene dada como se expresa en la Tabla I.

Tabla I Clasificación Taxonómica

CLASE Equisetopsida

SUB CLASE Magnolidae

SUPERORDEN Asteranae

ORDEN Ericales

FAMILIA Sapotaceae

GENERO Manilkara

Fuente: (Rivera, 2013).

II.1.1.2 Descripción del Género Manilkara

Son arbustos o árboles que alcanzan alrededor de 3-12 m de altura. La asta tiene forma cilíndrica con base recta y alcanza los 90 cm de diámetro a 1,3 m del suelo. La corteza muerta es de color gris, con fisuras verticales profundas, desprendible en placas rectangulares. La corteza interna es rojiza y por lo general al corte exuda látex espeso y pegajoso (Rivera, 2013).

Sus ramas son glabras y sus hojas alternas, frecuentemente en grupos cerrados al final de las ramas, con cicatrices conspicuas; vaina de hojas obovadas a obovada-elípticas, ambas superficies glabras, base ancha cuneada a obtusa, apex retuso. (Barthélémy & Caraglio, 2007). Las flores son axilares y fasciculadas (Pennington, 1990). El pedicelo es grueso; sépalos ovado- triangular, por fuera amarillento grisáceo tomentoso (Maués & de Oliveira 2010). Corola blanca o amarillo brillante, lóbulos oblongos; estambres de 5 mm aproximadamente; lóbulos lineales tomentosos (Camacho et al., 2005). Drupa obovoide-oblongo a elipsoide. Semillas de 8-10 mm de largo. Su florescencia se suele dar en otoño (Weaver, 1990).

II.1.1.3 Distribución natural y hábitat

Comprende cerca de 79 especies, destacándose entre ellas: Manilkara bidentata, Manilkara zapota, Manilkara hexandra, Manilkara huberi y Manilkara kauki.

La distribución que presenta el género es extensa, están diseminados en lugares tropicales y semitropicales, en varias islas del Pacífico y el Caribe, en muchas zonas de Madagascar en África, a bajas altitudes en el sudeste asiático como Camboya, India, Sri Lanka, Tailandia y Vietnam, también en Australia y América Latina. En la Panamazonia incluye los países de Brasil, Colombia, Guayana Francesa, Perú, Surinam y Venezuela, En Colombia está presente en las regiones del Pacifico, Orinoquia y Amazonia (López et al., 2006).

Está a 30 y 1000 metros sobre el nivel del mar, en climas húmedos y muy húmedos tropicales. Habita en bosques primarios de tierra firme y zonas con inundaciones ocasionales en la Amazonia. En Brasil las especies crecen sobre tierra firme, en la cuenca alta del rio Negro cerca de la frontera colombiana (Stropp et al., 2011). En la Amazonia peruana se encuentra en planos inundables y pantanos de las cuencas de los ríos Amapiyacú y Yaguasyacú (Duivenvoorden & Balslev 2001). En Bolivia se reporta para la región de Pando creciendo en bosques de igapó y várzea (Rodriguez & Montero 2002). En la Guyana, (Forget et al., 2001) se reporta que la especie da preferencia a suelos hidromórficos.

Ecuador tiene reportado 49 especies vegetales de la familia Sapotaceae, y solo dos especies del género Manilkara: Manilkara bidentata y Manilkara bidentata subs. surinamensis. (Balslev H et al., 2008)

II.1.1.4 Usos

Los pobladores nativos de diferentes zonas, les han dado diversos usos a la madera, fruto o látex de algunas especies a lo largo de los años (Mayorca, 1973).

El látex de las diferentes especies se usó de diversas maneras (Francis & Lowe, 2000). La savia del árbol supuestamente pudo ser utilizada como un reemplazo de la leche de vaca. Su látex posee un sabor muy agradable a crema, puede ser consumido, pero en exceso puede causar estreñimiento (Weaver, 1990). Este látex también se lo usaba a veces en la cobertura de pelotas, cables, y también en la industria del chicle o goma de mascar (Francis & Lowe, 2000; Rivera, 2013). Se menciona también que existe una aplicación en resortes de aviación jet (Sibille & Rodriguez, 1996).

La corteza cocinada se la aplicaba para el tratamiento de cólicos hepáticos y malestares intestinales. Esta especie es también muy importante por su madera, ya que posee una gran dureza y durabilidad, por su resistencia a las termitas y a los hongos de la fermentación. Se la empleó inicialmente, en los cimientos de las viviendas, puentes y otros tipos de construcciones. El fruto, comestible en la mayoría de los casos, presentando un excelente sabor (López et al., 2006).

II.1.2 Género Mimusops

II.1.2.1 Taxonomía de la especie Mimusops sp.

La clasificación taxonómica viene dada como se expresa en la Tabla II.

Tabla II Clasificación Taxonómica

Reino Plantae

Filo Tracheophyta

Clase Magnoliopsida

Orden Ericales

Familia Sapotaceae

Género Mimusops

Fuente: (Global Biodiversity Information Facility 2017)

II.1.2.2 Descripción del Género Mimosups

Mimosups sp. son árboles siempreverdes, algo tortuoso, de 6-8 m de altura en cultivo, alcanzando hasta 20 metros de altura en su estado adulto, con la copa densa algo irregular y un tronco corto, de corteza muy resquebrajada (Sánchez, 2001) que al cortar exuda abundante látex blanco, espeso y pegajoso (Rivera et al., 2013).

Hojas simples, alternas, generalmente agrupadas hacia el final de las ramas, con la lámina elíptica o de obovado-elíptica a oblonga, de hasta 20 x 11 cm, aunque generalmente más pequeñas, con la base obtusa, el margen entero y algo revoluto y el ápice obtuso o redondeado; son gruesas y de textura coriácea, glabras, de color verde brillante, con el nervio central destacado y 10- 20 pares de nervios laterales. Pecíolo de 1-1,5 cm de longitud, al principio pubescente, tornándose luego glabro (Sánchez, 2001).

Inflorescencias axilares, compuestas por flores solitarias o fascículos de 2-6 flores, rotáceas, blancas, aromáticas, sobre pedicelos pelosos de 5-8 cm de largo. Cáliz con 8 sépalos triangulares, de 11-12 mm de largo, con pelos

castaños externamente, los sépalos exteriores ligeramente mayores que los interiores; corola con un tubo de unos 2 mm de largo y 8 lóbulos de 9-10 mm de longitud, cada uno con 2 apéndices profundamente laciniados. Androceo con 8 estambres opuestos a los pétalos, con los filamentos de 3-3,5 mm de largo, pelosos en la base, y las anteras de 4-4,5 mm de largo, alternando con 8 estaminodios de unos 5 mm de largo, pelosos por la cara externa. Ovario pubescente, cónico, con 8 lóculos; estilo glabro (Sánchez, 2001).

Fruto en baya subesférica de 3-4 cm de diámetro, sobre un pedúnculo de más de 6 cm de largo, amarillenta en la madurez, con una pulpa dulce y carnosa-harinosa, comestible, conteniendo de una a varias semillas elipsoides, de color castaño amarillento (Sánchez, 2001).

II.1.2.3 Distribución natural y hábitat

Comprende cerca de 45 especies aceptadas, destacándose entre ellas: Mimusops elengi, Mimusops hexandra, Mimusops manilkara, Mimusops balata, Mimusops globosa y Mimusops zeyheri

La distribución que presenta Mimusops sp se extiende en bosques tropicales y subtropicales del viejo mundo como Asia, África y Oceanía. Incluye países como Sri Lanka, India, Tanzania, Malawi, Kenia, Congo, Madagascar, Mozambique, Papúa Nueva Guinea, Islas Salomón, Indonesia, Arabia Saudita, Yemén, Islas Comoras, República de Mauricio entre otros (WCSP, 2017).

En Ecuador aún no se han reportado especies del género Mimusops. II.1.2.4 Usos

Los pobladores les han dado diversos usos a las diferentes partes de la planta Mimosups sp, a lo largo de los años; como a su madera, fruto, látex, etc. En primer lugar, se sabe que se la apreció por su madera, ya que posee una gran dureza y durabilidad, incluso en contacto con el agua, resistente a las

termitas y no requiere cualquier tratamiento preservativo, por lo general se la usó para construcciones pesadas, puentes, muebles y en la fabricación de vagones (Misra and Mitra, 1966).

Su corteza, flores, frutos y semillas se utilizaron en la medicina ayurvédica en la que se dice que es astringente, refrescante, antihelmíntica, tónica y febrífuga. También para dolencias dentales como sangrado de encías, piorrea, caries dental y en la pérdida de piezas dentales (India Biodiversity, 2018).

II.1.3 Sinonimia entre los géneros Manilkara y Mimusops

La sinonimia describe la presencia de más de un nombre científico para un mismo taxón; esto a su vez puede darse por coincidencias dentro de la ciencia de la taxonomía o por una estrecha similitud de las características fenotípicas de dos o más especies. Este es el caso de la especie Binectaria laurifolia, que es un sinónimo de Mimusops kauki L; y este al presentar flores hexámeras se la transfiere al género Manilkara (Friis, 1980).

Existen otros casos de sinonimia presente en otras especies de ambos géneros, como se expresa en la Tabla III.

Tabla III Sinonimia Entre Especies Mimusops y Manilkara Género Mimusops Género Manilkara Mimusops amazonica Huber Manilkara bidentata subsp. surinamensis (Miq.) T.D.Penn. Mimusops balata (Aubl.) C.F.Gaertn Manilkara bidentata (A.DC.) A.Chev. subsp. bidentata Mimusops bidentata A.DC Manilkara bidentata (A.DC.) A.Chev Mimusops cearensis Huber Manilkara triflora (Allemão) Monach. Manilkara bidentata (A.DC.) A.Chev. Mimusops darienensis Pittier subsp. bidentata Mimusops elata Allemão ex Miq Manilkara elata (Allemão ex Miq.) Monach. Mimusops excelsa Ducke Manilkara excelsa (Ducke) Standl Mimusops floribunda Mart Manilkara subsericea (Mart.) Dubard Manilkara bidentata (A.DC.) A.Chev. Mimusops globosa C.F.Gaertn subsp. bidentata Mimusops rufula Miq Manilkara rufula (Miq.) H.J.Lam Fuente: (Zappi et al., 2015)

II.1.4 Principales compuestos de los géneros Manilkara y Mimusops

La composición química ha sido investigada para algunas especies de ambos géneros. Los principales compuestos se expresan en la Tabla IV.

Tabla IV Principales compuestos encontrados en los géneros Manilkara y Mimusops

Compuesto Especie Matriz Referencia Triterpenoides (Misra G. and Hojas, Mitra R, Mimusops elengi Corteza, 1968; Misra Raiz et al., 1974) Taraxerol Corteza, (Misra et al., Mimusops manilkara Hojas 1974) Corteza, (Misra et al., Mimusops hexandra Raiz, Hojas 1974) (Misra et al., Taraxerona Mimusops manilkara Corteza 1974) ( Misra and Mitra 1966; Corteza, Misra G. and Mimusops elengi Raiz, Mitra R, Semillas 1968; Misra et al., 1974) Látex, (Misra et al., Lupeol Mimusops manilkara Corteza 1974) (Misra et al., Mimusops balata Látex 1974) (Misra et al., Mimusops globosa Látex 1974) (Fayek et al., Manilkara zapota Hojas 2012) (Misra G. and Mitra R, Hederagenina Mimusops elengi Corteza 1968; Misra et al., 1974) ( Misra and Mitra 1966; Corteza, Misra G. and Mimusops elengi Fruto Mitra R, 1968; Misra Ácido Ursólico et al., 1974) (Misra et al., Mimusops manilkara Hojas 1974) Fruto, (Misra et al., Mimusops hexandra Corteza 1974) (Misra and Mitra 1966; Mimusops elengi Semillas Misra et al., 1974) Saponinas Semillas, (Misra et al., Mimusops manilkara Látex, 1974) (Misra et al., Mimusops hexandra Semillas 1974)

(Misra et al., Mimusops heckelii Semillas 1974) (Misra et al., Mimusops djave Semillas 1974) (Cocker, Manilkara bidentata Corteza 1962) Corteza, (Misra et al., Mimusops manilkara Fruto, 1974) Hojas Fruto, (Misra et al., Mimusops hexandra Corteza, 1974) Raiz Amirina (Misra et al., Mimusops globosa Látex 1974) (Misra et al., Mimusops balata Látex 1974) (Cocker, Manilkara bidentata Corteza 1962) (Fayek et al., Ácido Oleanólico Manilkara zapota Hojas 2012) Tetraterpenos (Misra G. and Mitra R, β-Caroteno Mimusops elengi Hojas 1968; Misra et al., 1974) Compuestos Fenólicos y Flavonoides ( Chanda & Nagi, 2010; Ácido cafeico Fayek et al., miricetina-3-O-α-L- Manilkara zapota Hojas 2012; Kaneria ramnósido & Chanda, 2012; Baky et al., 2016) (Shui, Wong, L-Ácido Ascórbico Manilkara zapota Fruto & Leong, 2004) (Shui, Wong, & Leong, Galocatequina Manilkara zapota Fruto 2004; Baky et al., 2016) (Shui, Wong, & Leong, Catequina Manilkara zapota Fruto 2004; Baky et al., 2016) (Baky et al., Epicatequina Manilkara zapota Fruto 2016) (Baky et al., Ácido Gálico Manilkara zapota Fruto 2016) (Baky et al., Metilclorogenato Manilkara zapota Fruto 2016)

Metil-4-O-galoyl (Baky et al., Manilkara zapota Fruto clorogenato 2016) Acido 4- (Baky et al., Manilkara zapota Fruto ogaloilclorogénico 2016) (Baky et al., Leucodelphinidina Manilkara zapota Fruto 2016) (Baky et al., Leucocyanidina Manilkara zapota Fruto 2016) (Baky et al., Leucoperalgonidina Manilkara zapota Fruto 2016) (Baky et al., Dihidromiricetina Manilkara zapota Fruto 2016) (Misra et al., 1974; Mimusops elengi Semillas Sharma et al., 2009) Semillas, (Misra et al., Mimusops manilkara Hojas 1974) (Misra et al., Quercetina Mimusops hexandra Semillas 1974) Frutos y (Baky et Manilkara bidentata Semillas al.,2016) (Baky et al., Manilkara zapota Frutos 2016) (Almeida et Manilkara subsericea Hojas al., 2015) (Misra et al., Mimusops manilkara Hojas 1974) Miricetina (Almeida et Manilkara subsericea Hojas al., 2015) Frutos y (Baky et Dihidroquercetina Manilkara bidentata Semillas al.,2016) ( Chanda & Nagi, 2010; Fayek et al., Apigenina-7-O-α-L- Manilkara zapota Hojas 2012; Kaneria ramnósido & Chanda, 2012; Baky et al., 2016) Miricetina-3-O α-L- (Fayek et al., Manilkara zapota Hojas Raminopiranosido 2012) (Baky et al., Dihidromiricetina Manilkara zapota Frutos 2016) (Almeida et Kaempferol Manilkara subsericea Hojas al., 2015) Esteroles (Misra G. and Corteza, Mitra R, Mimusops elengi α-Espinasterol Raiz 1968; Misra et al., 1974) Mimusops hexandra Semillas, (Misra et al.,

Frutos, 1974) Raiz (Cocker, Manilkara bidentata Corteza 1962) (Misra G. and Corteza, β-D-glucósido de β- Mitra R, Mimusops elengi Raiz, sitosterol 1968; Misra Semillas et al., 1974) Ácidos Grasos

Insaturados (Misra and Mitra 1966; Mimusops elengi Semillas Misra et al., 1974) (Misra et al., 1974; Mimusops caffra Semillas Chivandi et al., 2016) (Misra et al., Mimusops manilkara Semillas 1974) (Misra et al., Ácido Linoleico Mimusops longifolia Semillas 1974) (Misra et al., Mimusops mottleyana Semillas 1974) (Misra et al., Mimusops hexandra Semillas 1974) (Misra et al., Mimusops djave Semillas 1974) ( Fayek et al., Semillas, Manilkara zapota 2012; Sathish Hojas et al., 2015) (Misra and Mimusops elengi Mitra 1966; Ácido Erúcico Semillas Misra et al., Mimusops caffra 1974) (Misra and Mitra 1966; Mimusops elengi Semillas Misra et al., 1974; ) (Misra et al., 1974; Mimusops caffra Semillas Chivandi et Ácido Oleico al., 2016) (Misra et al., Mimusops manilkara Semillas 1974) (Misra et al., Mimusops longifolia Semillas 1974) (Misra et al., Mimusops mottleyana Semillas 1974) Mimusops hexandra Semillas (Misra et al.,

1974) (Misra et al., Mimusops heckelii Semillas 1974) (Misra et al., Mimusops djave Semillas 1974) ( Fayek et al., Semillas, Manilkara zapota 2012; Sathish Hojas et al., 2015) (Misra and Mitra 1966; Mimusops elengi Semillas Misra et al., Ácido Linolénico 1974) ( Fayek et al., Semillas, Manilkara zapota 2012; Sathish Hojas et al., 2015) (Misra et al., 1974; Ácido Ginkgolico Mimusops caffra Semillas Chivandi et al., 2016) (Misra et al., 1974; Ácido Gadoleico Mimusops caffra Semillas Chivandi et al., 2016) (Misra et al., 1974; Ácido Nervónico Mimusops caffra Semillas Chivandi et al., 2016) (Misra et al., 1974; Ácido Araquidónico Mimusops caffra Semillas Chivandi et al., 2016) Ácidos Grasos

Saturados (Misra et al., 1974; Mimusops caffra Semillas Chivandi et al., 2016) Ácido Palmítico (Cocker, Manilkara bidentata Corteza 1962) (Sathish et Manilkara zapota Semillas al., 2015) (Misra et al., 1974; Mimusops caffra Semillas Chivandi et al., 2016) Ácido Esteárico (Cocker, Manilkara bidentata Corteza 1962) (Sathish et Manilkara zapota Semillas al., 2015) (Misra et al., Ácido Mirístico Mimusops caffra Semillas 1974; Chivandi et

al., 2016) (Misra et al., 1974; Ácido Heptadecanoico Mimusops caffra Semillas Chivandi et al., 2016) (Misra et al., 1974; Ácido Eicodecanoico Mimusops caffra Semillas Chivandi et al., 2016) Hidrocarburos

Saturados (Misra G. and Mitra R, Mimusops elengi Hojas 1968; Misra et al., 1974) Hentriacontano (Misra et al., Mimusops manilkara Hojas 1974) (Misra et al., Mimusops hexandra Hojas 1974) Ciclitoles Misra G. and Mitra R, Mimusops elengi Hojas 1968; Misra et al., 1974 ( Misra and Mitra 1966; Corteza, Misra G. and Mimusops elengi Fruto, Mitra R, Semillas 1968; Misra Quercitol et al., 1974) Semillas, (Misra et al., Mimusops manilkara Corteza, 1974) Hojas Semillas, (Misra et al., Mimusops hexandra Corteza, 1974) Raiz, Hojas Semillas, (Baky et al., Manilkara zapota Hojas 2016)

II.1.5 Principales actividades farmacológicas de los géneros Manilkara y Mimusops

De igual forma, algunas especies del género han sido evaluadas farmacológicamente para validar su uso tradicional. En la Tabla V se reflejan algunas actividades demostradas para algunas especies de estos géneros.

Tabla V Principales actividades farmacológicas de los géneros Manilkara y

Actividad Referencia Especie Matriz Farmacológica (Kaneria et al., 2009; Chanda & Manilkara zapota Hojas Nagani, 2010;

Fayek et al., Actividad 2012) antioxidante Mimusops elengi Corteza (Rao et al., 2011) Mimusops elengi Hojas (Kar et al., 2012) (Kiran Kumar et Mimusops elengi Pericarpio al., 2014) Kaneria & Manilkara zapota Hojas Chanda, (2012) Kothari & Manilkara zapota Semillas Actividad Seshadri, (2010) antimicrobiana Sumitra & Jigna, Manilkara hexandra Hojas (2010) (Kiran Kumar et Mimusops elengi Pericarpio al., 2014) (Saradha et al., Manilkara zapota Semillas Actividad 2014) hipoglucemiante Fayek et al., Manilkara zapota Hojas (2012) Actividad hipotensora Mimusops elengi Hojas (Dar et al., 1999) Actividad (Fayek et al., Manilkara zapota Hojas Hipocolesterolemica 2012) Actividad (Konuku et al., Manilkara zapota Hojas Antiinflamatoria 2017) Actividad analgésica Manilkara zapota Hojas (Jain et al., 2011) (Ganguly et al., Actividad antipirética Mannilkara zapota Hojas 2013) Mimusops

CAPÍTULO III: MARCO METODOLÓGICO

III.1 Metodología de la investigación

La presente investigación es de tipo exploratoria y se llevó a cabo en el laboratorio de productos naturales de la facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil.

III.2 Estudio farmacognóstico de la especie

III.2.1 Recolección y selección del material vegetal

La especie vegetal utilizada fue recolectada por Migdalia Miranda, PhD y sus colaboradores el 9 de noviembre del 2016; en una zona de vegetación natural protegida denominada Jardín Botánico de Guayaquil ubicado en la zona Norte de la ciudadela "las Orquídeas" Av. Francisco De Orellana, en las cumbres del Cerro Colorado, de la ciudad de Guayaquil provincia del Guayas - Ecuador con las coordenadas 02°12′13.6800″S 079°53′50.6400″O. Correspondiendo a plantas adultas de aproximadamente 30 m de altura, con presencia de flores y frutos. La misma fue herborizada, caracterizada por el Biolg. Xavier Cornejo Sotomayor. Ms.C y registrada en el Herbario GUAY de la Facultad de Ciencias Naturales en la Universidad de Guayaquil con la clave 13111.

III.2.2 Secado y almacenamiento

El secado se realizó mediante el uso de una estufa universal de convección natural o circulación de aire forzada de la marca MEMMERT de modelo 160 de +30º C a +300º C; utilizando 3 Kg de muestra de hojas aproximadamente, a una temperatura de 50º C ± 5. Se tomó en cuenta el número de días (3 días), que demoraba la muestra en secar por completo y posterior retirado de la estufa.

Una vez secado el material vegetal, se trituraron en una licuadora de marca americana Forever Super Blender, modelo DI9995; sin que la muestra esté totalmente pulverizada y fueron almacenados en frascos de vidrio transparente con tapa. Se realizaron determinación de características organolépticas (olor y color).

III.2.3 Caracterización botánica de la especie

III.2.3.1 Evaluación macromorfológica de la hoja

Se realizó una valoración de las características macromorfológicas de la especie, considerándose la disposición de las hojas sobre el tallo. Se describieron 50 hojas, a las cuales se les determinó la forma del limbo, borde, ápice, base, peciolo, venación y color. Las observaciones se realizaron a simple vista y con ayuda de un microscopio estéreo NTB-2B, de fabricación china, empleando cámara modelo HDCE-50B. También se efectuaron mediciones de largo y ancho de las hojas con ayuda de una regla graduada; se calcularon los valores promedios y la desviación estándar (Miranda y Cuéllar, 2000).

III.2.3.2 Evaluación micromorfológica de la hoja

Para el análisis histológico se realizaron cortes transversales de las hojas en estado fresco, por el método manual, los que fueron hidratados y aclarados con hipoclorito de sodio al 1 %. Los mismos se colorearon con safranina al 1 % en agua, se fijaron con gelatina glicerinada, según los procedimientos descritos por Gattuso y Gattuso (1999).

Para observar los detalles anatómicos a nivel de la epidermis de la hoja se efectuó la técnica del diafanizado (corte longitudinal), donde se aclaró la muestra con solución de hipoclorito de sodio, se lavó con agua destilada y se coloreó con safranina al 1 % en agua (Gattuso y Gattuso, 1999).

Se determinaron las características microscópicas de la droga en polvo. Las muestras fueron aclaradas con hipoclorito de sodio y después de lavadas se colorearon con safranina al 1% para finalmente ser fijadas en gelatina glicerinada. Se realizaron algunas reacciones histoquímicas tales como: la determinación de almidón (reactivo de lugol), lignina (safranina al 1 % en agua) y aceite esencial (solución de Sudan III al 5 % en etanol al 70 %) (Gattuso y Gattuso, 1999; Miranda y Cuéllar, 2000).

Para visualizar los diferentes caracteres anatómicos internos del vegetal se empleó un microscopio NOVEL (lente 10X) con cámara acoplada modelo HDCE-50B.

III.2.3.3 Caracterización genética de la hoja

La caracterización genética fue realizada en el laboratorio de Biología Molecular en el Centro de Investigaciones Biotecnológicas de la Escuela Superior Politécnica del Ecuador CIBE-ESPOL en 2017.

III.2.3.3.1 Preparación de muestra

La muestra de hoja fue sumergida en nitrógeno líquido para una rápida congelación, luego se la trituró con la ayuda del molino “Retsch MM400” para obtener un polvo fino y se la almacenó en un congelador a -80° C hasta ser usada en los análisis moleculares.

III.2.3.3.2 Extracción de ADN.

El aislamiento de ADN se realizó con el protocolo a base de CTAB (Doyle and Doyle 1990), modificado por técnicos del laboratorio de Biología Molecular del CIBE-ESPOL (2,8 % CTAB, 1,3 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris – HCl pH 8, 1 % PVP40000, 2 % 2-mercaptoethanol), se utilizó entre 100 – 150 mg de muestra triturada como partida. El ADN fue resuspendido en 50 µl de TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA) y cuantificado con 2 µl de muestra de ADN a una densidad óptica de 260 nm y 280 nm utilizando el espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). La concentración se la determinó en ng/µl y se determinó su calidad tomando en cuenta la relación A260/A280. Luego el ADN fue diluido a 20 ng/µl y almacenado a -20º C hasta ser usado en las reacciones de PCR.

III.2.3.3.3 Primers.

Los primers usados en este trabajo se los muestras en la Tabla VI. Todos los primers fueron obtenidos de la marca Macrogen (Corea del sur) de

forma liofilizada y fueron resuspendidos con agua estéril y llevados a una concentración stock de 100 µM.

Tabla VI Primers

pares de Peso Molecular Código Secuencia Referencia Primer (pares de base) 5' ATGTCACCACAAA CAGAGACTAAAGC rbcLA_F/ (Costion et A 3' 550 rbcLA_R al. 2011) 5' GTAAAATCAAGTC CACCRCG 3' 5' CGTACAGTACTTTT matK_3F_KI GTGTTTACGAG 3' M (Costion et B 5' 850 f/matK_1R_KI al. 2011) ACCCAGTCCATCT M R GGAAATCTTGGTT C 3'

III.2.3.3.4 Condiciones de la PCR punto final

Para realizar la PCR cualitativa o punto final se usó el equipo Mastercycler ep Gradient S No. 5345 (Eppendorf). Se realizó un master mix por cada gen y cada reacción de PCR consistía de un volumen final de 50 µl que contenía 25 µl de 2x-GoTaq® Green Master Mix (Cat. # M7123, Promega), 0,5 µM de cada primer, 3 µl del ADN molde y fue completado con Agua estéril hasta alcanzar los 50 µl, para cada reacción se usaron tubos de 0,2 ml (PCR-02-C- 500, Axigen). El programa de amplificación fue el siguiente: 95° C por 3 min como desnaturalización inicial; 38 ciclos de [95° C por 30 segundos de la desnaturalización, 60° C (rbcLA_F/ rbcLA_R) y 56° C (matK_3F_KIM f/matK_1R_KIM R) por 30 segundos de hibridación de los primers, 72° C por 90 segundos de la elongación]; y 72° C por 5 minutos de elongación final. Se tomó 5 µl del producto final de la PCR para correr en electroforesis horizontal y detectar amplificación de las bandas esperadas, los 45 µl restantes fueron

purificados con el kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Cat. # A9282, Promega), y luego se las almacenó a -20° C hasta ser enviadas a secuenciar.

III.2.3.3.5 Electroforesis en gel de agarosa.

Para confirmar la existencia de ADN del aislamiento y para determinar la amplificación de la banda esperada de cada producto de la PCR punto final se realizó una corrida de electroforesis al 1 % y 1,8 % (w/v) respectivamente en gel de agarosa. Para la preparación del gel se usó el buffer tae (1x) y sybr® safe dna gel stain (1x) (cat. s33102, invitrogen). Se corrió en cámaras de electroforesis (biorad) a 95 v por 35 min, usando tae 1x, para determinar el peso de la banda esperada se usó el marcador 100bp DNA ladder (cat.# 62101, promega) y 1kb DNA ladder (cat. g5711, promega). El resultado de la corrida se visualizó usando en el equipo geldoc xr+ (biorad) usando el software quantity one.

III.2.3.3.6 Secuenciación

Se preparó entre 1,7 y 2 µg del producto PCR purificado en un volumen de 35 µl y se envió a secuenciar a Macrogen en dirección forward a una concentración stock de primers de 10 µM (las condiciones de envío fueron exigidas por Macrogen).

III.2.3.3.7 Análisis bioinformático de secuencias

Para realizar el análisis de las secuencias se utilizaron los siguientes programas bioinformáticos:

“FinchTV” fue usado para realizar una limpieza de ruidos y determinar la calidad de la secuencia

Se utilizó la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information, 2018) para realizar un BLAST (BLAST: Basic Local Alignment Search Tool, 2018) de nucleótido y encontrar similitudes entre secuencias biológicas, luego se escogió del resultado con la opción más cercana en referencia a identidad y el menor valor esperado. Finalmente se descargó la secuencia de diez de los resultados para realizar un análisis filogenético utilizando el programa MEGA6 (MEGA: Molecular Evolutionary Genetics Analysis, 2018)

III.2.4 Determinación de los parámetros fisicoquímicos

Para la realización de los parámetros fisicoquímicos se siguieron los procedimientos planteados por WHO, 2011 y los ensayos se hicieron por triplicado.

III.2.4.1 Humedad residual

Se empleó el método gravimétrico, a partir de 2 g de muestra, se utilizó una estufa a 105o C marca alemana Mettler Toledo y para pesar, se usó una balanza analítica marca Kern Modelo: ABS-220-4

Expresión de los resultados.

M2 − M1 Hg: x 100 M2 − M

Dónde:

Hg: Perdida en peso por desecación

M2: masa de la cápsula con la muestra de ensayos (g)

M1: masa de la cápsula con la muestra de ensayo desecada (g)

M: masa de la cápsula vacía

100: factor matemático para calculo

III.2.4.2 Cenizas totales

Para el análisis se empleó una mufla modelo MLW Eliktro Modelo: 245.3E por 2 horas, las pesadas se realizaron en una balanza analítica marca Kern Modelo: ABS-220-4. Se partió de 2 g de muestra, se utilizó ácido nítrico hasta obtener cenizas blancas.

Expresión de los resultados.

M2 − M C: x 100 M1 − M

Dónde:

C: porcentaje de cenizas totales en base hidratada

M: masa del crisol vacío (g)

M1: masa de crisol con la porción de ensayo (g)

M2: masa del crisol con la ceniza (g)

100: factor matemático para cálculo

III.2.4.3 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico

A las cenizas totales obtenidas según la técnica, se le añadieron de 2-3 mL de ácido clorhídrico al 10 %. El crisol se tapó con un vidrio reloj y se calentó sobre un baño de agua hirviente durante diez minutos. Se lavó el vidrio reloj con 5 mL de agua caliente y se unió al contenido del crisol. La solución se filtró a través de un papel de filtro libre de cenizas; se lavó el residuo con agua caliente

y se lo transfirió con el papel incluido al crisol. Se incineró en la mufla modelo MLW Eliktro Modelo: 245.3E a una temperatura de 700-750º C durante dos horas. Posteriormente se colocó en una desecadora, hasta que alcanzó la temperatura ambiente para poder pesar.

Expresión de los resultados.

M2 − M B: x 100 M1 − M

Dónde:

B: porcentaje de cenizas insolubles en ácido clorhídrico en base

hidratada

M: masa del crisol vacío (g)

M1: masa de crisol con muestra vegetal deseca (g)

M2: masa del crisol con la cenizas insolubles (g)

100: factor matemático para cálculo

III.2.4.4 Sustancias solubles

Este ensayo se determinó a partir de 5 g de la droga. Los disolventes utilizados fueron agua, alcohol al 98 % y hexano.

Expresión de los resultados.

R. 500 x 100 Ss: M(100 − H)

Dónde:

Ss: sustancias solubles (%)

H: humedad de la muestra (%)

500 y 100: factores matemáticos para los cálculos

R: residuo de la muestra (g)

M: masa de la muestra (g)

III.2.5 Análisis cualitativo por tamizaje fitoquímico

El tamizaje fitoquímico se realizó a las hojas secas, según procedimiento descrito por Miranda y Cuellar (2000).

Se utilizó un sistema de extracción con disolventes de polaridad creciente, a partir del mismo material vegetal. La droga seca se extrajo sucesivamente con éter di etílico, etanol y agua por 48 horas para obtener los extractos etéreo, alcohólico y acuoso, los cuales se sometieron a diferentes ensayos (anexos 1 y 2).

III.3 Estudios químicos de las hojas

III.3.1 Extracción y fraccionamiento preliminar. Método 1

Para el estudio se desarrolló un proceso de extracción por maceración continua (anexo 3) con disolventes de diferentes polaridades: hexano y metanol. A partir de 973,1 g de hojas, utilizando una balanza de marca alemana BOECO modelo BBL 52 con un tamaño de plato de 174 x 143 mm.

En la primera prueba se utilizó hexano en cantidades de 1300 mL de 7 a 14 días; previo a esto se realizó una humectación con el mismo solvente en 460 mL. Este ensayo se lo realizó dos veces, variando el suministro de hexano esta

vez con 1120 mL. Luego de este procedimiento se pesaron los residuos sólidos con un peso de 939,3 g; después se procedió a trabajar de la misma manera cambiando el disolvente a metanol; este ensayo se lo realizo cuatro veces, en donde el suministro de metanol para la primera maceración fue 1700 mL, para la segunda fue 1190 mL, en la tercera fue 930 mL y en la última maceración se utilizó 1500 mL.

Los extractos obtenidos se reunieron y filtraron con papel filtro y gasa, luego se concentraron sin llegar a sequedad en un rotaevaporador de marca alemana HEILDOPH Laborato modelo 4001 efficient HB digital a presión reducida y a temperatura de 80º C aproximadamente; se conservaron en refrigeración a una temperatura de 3º C aproximadamente para los análisis correspondientes.

III.3.1.1 Análisis por cromatografía en capa delgada (CCD) de los extractos

Los extractos hexánicos y metanólicos fueron analizados por cromatografía de capa delgada. Se emplearon placas de 20 x 10 cm, de gel de sílice F254 sobre soporte de aluminio, de la Merck.

El desarrollo cromatográfico fue de forma ascendente y se utilizaron las siguientes mezclas de disolventes como fases móviles:

 Hexano: Cloroformo: Acetato de Etilo (AcOEt): Metanol (10:5:5:2,5)  Cloroformo: Metanol (50:50)  Cloroformo: AcOEt (20:80)

Para el revelado de las placas fue empleado las condiciones:

 Luz ultravioleta de longitud de onda 254 nm

Rociado con Ácido sulfúrico: Metanol (50:50) y calor: se calentó a una temperatura de 100º C aproximadamente, hasta la aparición de manchas o modificación de la apariencia de las ya existentes.

III.3.2 Extracción y fraccionamiento. Método 2

III.3.2.1 Eliminación del látex por agotamiento

En vista a que en los análisis preliminares la presencia de látex en los extractos predominó en el hexánico; interfería en su estudio, se optó por realizar la eliminación del látex por agotamiento con diferentes solventes como éter de petróleo y hexano, aplicando el método de Soxhlet utilizando 110 g de muestra y un tiempo de 3 horas, como se observa en el anexo 4.

III.3.2.2 Método de extracción y concentración

Posterior a la determinación del chicle, se desarrolló un proceso de extracción por maceración continua (anexo 5) con disolventes de diferentes polaridades: Cloroformo, AcOEt y Metanol. A partir del residuo de las extracciones con Soxhlet.

En la primera extracción se utilizó cloroformo en cantidades de 600 mL de 7 a 14 días. Este ensayo se lo realizó dos veces, variando el suministro de cloroformo esta vez con 344 mL. Después se procedió a trabajar de la misma manera cambiando el disolvente a AcOEt; este ensayo se lo realizo dos veces también, en donde el suministro para la primera maceración fue 400 mL y para la segunda fue 265 mL y por último se utilizó metanol en cantidades de 350 mL para la primera maceración y 275 mL para la segunda. Los extractos obtenidos se reunieron y filtraron con papel filtro y gasa, luego se concentraron sin llegar a sequedad en un ratoevaporador de marca alemana HEILDOPH Laborato modelo 4001 efficient HB digital a presión reducida y a temperatura de 80º C aproximadamente; se conservaron en refrigeración a una temperatura de 3º C aproximadamente para los análisis correspondientes.

III.3.2.3 Análisis por cromatografía en capa delgada de los extractos

Los extractos fueron analizados por cromatografía de capa delgada. Se emplearon placas de 20 x 10 cm, de gel de sílice F254 sobre soporte de aluminio, de la Merck.

El desarrollo cromatográfico fue de forma ascendente y se utilizaron las siguientes mezclas de disolventes como fases móviles:

 Hexano: Cloroformo: AcOEt: Metanol (10:5:5:2,5)  Cloroformo: Metanol (50:50)  Cloroformo: AcOEt (20:80)

Para el revelado de las placas fue empleado las condiciones:

 Luz ultravioleta de longitud de onda 254 nm

Rociado con Ácido Sulfúrico: Metanol (50:50) y calor: se calentó a una temperatura de 100º C aproximadamente, hasta la aparición de manchas o modificación de la apariencia de las ya existentes.

III.3.2.4 Fraccionamiento en columna cromatográfica

El extracto de acetato de etilo seco y lavado con hexano, obtenido por extracción sucesiva de las hojas, se sometió a fraccionamiento en columna cromatográfica de 80 cm de largo y 4,5 cm de diámetro, empaquetada con gel de sílice activada de 60-200 (mesh), en proporción 3:1 respecto al peso del residuo a separar, el cual fue previamente adsorbido en gel de sílice, secado en corriente de aire y colocado en la parte superior de la columna. La elución se realizó empleando presión atmosférica, con disolventes de grado analítico Merck en orden creciente de polaridad. El sistema de disolventes empleados para el fraccionamiento se expone en la Tabla VII.

Tabla VII. Disolventes y proporciones utilizadas en el fraccionamiento en columna cromatográfica de las hojas Disolventes Proporción (%) Hexano 100% Hexano - Diclorometano 75:25 Hexano - Diclorometano 50:50 Hexano - Diclorometano 40:60 Hexano - Diclorometano 25:75 Diclorometano 100% Diclorometano – AcOEt 75:25 Diclorometano – AcOEt 50:50 Diclorometano – AcOEt 25:75 AcOEt 100% AcOEt – Metanol 75:25 AcOEt – Metanol 50:50

III.3.2.5 Análisis por cromatografía en capa delgada (CCD) de las fracciones

En los fraccionamientos realizados por cromatografía de columna se empleó como criterio para el cambio de disolvente la CCD. Para ello se emplearon cromatoplacas Merck de 20 x 8 cm, de gel de sílice 60 GF254 sobre soporte de aluminio. El desarrollo cromatográfico fue de forma ascendente, se utilizó indistintamente como fases móviles, las mezclas de disolventes siguientes:

 Hexano: Cloroformo: AcOEt: Metanol (10:5:5:2,5)

Para el revelado de las placas cromatográficas, se empleó:

 Luz ultravioleta de longitud de onda 254 nm  Rociado con Ácido sulfúrico: Metanol (50:50) y calor: se calentó a una temperatura de 100º C aproximadamente, hasta la aparición de manchas o modificación de la apariencia de las ya existentes.

Las fracciones 36 - 106 de esta columna, obtenida con la mezcla de disolventes Hexano - Diclorometano 50:50 y Hexano - Diclorometano 40:60, se reunieron, se analizaron por CCD y se enviaron para su análisis por CG-EM con las siguientes condiciones:

Estas fracciones reunidas se analizaron en un cromatógrafo de gases Agilent 6890 acoplado a espectrómetro de masas 5973N, las condiciones de trabajo fueron: columna Ultra 2 de 30 m x 0,320 um x 0,25 µm, temperatura inicial: 70º C por 2 minutos incrementando 5º C/ min hasta 285º C por 5 min. Tiempo de corrida: 45 min. Espectrómetro de masas operado a 70 eV en modo full scan desde 50 hasta 600 unidades de masa. Temperatura de la fuente 250º C, temperatura del cuadrupolo 150º C. Temperatura del inyector: 280º C, volumen de inyección 2 µL con gas portador helio a 1 mL/min. Los compuestos fueron identificados por comparación de los espectros con la base de datos del equipo, tomando como referencia aquellos que superaban el 95 % de coincidencia.

III.4 Toxicología aguda dérmica (TAD) y oral (TAO) del extracto acuoso de las hojas

III.4.1 Toxicología Aguda Dérmica (TAD)

Se desarrolló la metodología descrita por la OECD TG 402 y establecida en el CEIEB. Para la preparación de la muestra se tuvo en cuenta la metodología descrita en el anexo 4. Luego de ello al residuo se lo sometió a reflujo con agua destilada por dos horas.

III.4.1.1 Condiciones de tenencia de los animales

Se emplearon ratas albinas Wistar procedentes del Centro para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB) con su correspondiente certificado de salud y un peso comprendido entre 170 y 180 g.

Las condiciones de cuarentena y aclimatación fueron las del bioterio y se siguieron los procedimientos establecidos: Temperatura: 20 ± 3º C, Humedad Relativa: 30 - 70 % (La variación no debe ser mayor de ± 5 %), Luz/ oscuridad: 12/ 12 horas. El agua y la comida fueron suministradas “ad libitum”.

III.4.1.2 Desarrollo del ensayo

En el ensayo se confeccionaron 2 grupos tratados (machos y hembras) o sea recibieron el producto en estudio. Los grupos estaban compuestos de 5 animales cada uno. Al inicio del experimento todas las ratas fueron pesadas, para de esta manera hacer una dosificación exacta de acuerdo con el peso de las mismas.

III.4.1.3 Modo de aplicación

La sustancia que se administró fue el extracto acuoso de las hojas, de manera tal que se empleó una dosis de 2000 mg/kg, y teniendo en cuenta los sólidos totales del producto (6 %) fue entonces la cantidad suministrada a cada animal.

24 horas antes del inicio del ensayo las ratas fueron peladas en un área del 10 % de la superficie corporal en el dorso de la misma , posteriormente el sitio de aplicación se cubrió con una almohadilla de gasa atada de forma segura a la piel y toda la región fue cubierta con una banda de goma elástica hipoalergénica y enrollada en la región media del cuerpo para de esta manera evitar que el animal pudiera lamerse la zona de aplicación y por ende se falsearan los resultados.

La sustancia en estudio se dejó en contacto con la piel por 24 horas, transcurrido este tiempo se removió la cubierta y el agente residual fue eliminado por lavado con solución de Cloruro de Sodio al 0,9 % con la ayuda de una almohadilla de gasa estéril.

Después de la administración se realizaron las observaciones, y se registraron sistemáticamente en el récord individual para cada animal, varias veces durante el primer día y al menos una vez al día para los 13 restantes. Las pesadas de las ratas se realizaron en los tiempos siguientes: 1, 7 y 14 días.

Al final del ensayo se procedió a sacrificar los animales empleando para ello una sobredosis de tiopental sódico, siguiendo los procedimientos de Refinamiento que se emplean actualmente en la Toxicología Experimental.

Si en las observaciones realizadas de los órganos (pulmones, corazón, bazo, riñones y estómago) u otro signo clínico, se notan problemas graves, entonces se toman muestras para su procesamiento histopatológico.

III.4.2 Toxicología aguda oral (TAO)

Se desarrolló la metodología descrita por la OECDTG 423 y establecida en el CEIEB. Para la preparación de la muestra se tuvo en cuenta la metodología descrita en el anexo 4. Luego de ello al residuo se lo sometió a reflujo con agua destilada por 2 horas.

III.4.2.1 Condiciones de tenencia de los animales

Se emplearon ratas albinas Wistar procedentes del Centro para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB) con su correspondiente certificado de salud y un peso comprendido entre 186 y 202 g.

Las condiciones de cuarentena y aclimatación fueron las del cuarto y se siguieron los procedimientos establecidos: Temperatura: 20 ± 3° C, humedad Relativa: 30 – 70 % (La variación no debe ser mayor de ± 5 %), ciclo de luz/ oscuridad: 12/ 12 h. El agua y la comida fueron suministradas “ad libitum”.

III.4.2.2 Desarrollo del ensayo

En el ensayo se confecciona primero un grupo tratado con una dosis de 2000 mg/kg (hembras) de tres animales que recibieron el producto en estudio. Si los resultados obtenidos indican que no hay muertes, se repite el mismo procedimiento en un grupo de otros 3 animales, del mismo sexo. de encontrarse muertes, se disminuía la dosis según lo indicado en la guía de la OECD y se desarrollaba el mismo procedimiento. Al inicio del experimento todas las ratas fueron pesadas, para de esta manera hacer una dosificación exacta de acuerdo con el peso de las mismas.

III.4.2.3 Modo de aplicación

La tarde noche anterior fue retirada la comida de los animales, transcurridas las horas de ayuna se comenzó la prueba, para ello todas las ratas fueron pesadas para de esta manera hacer una dosificación exacta de acuerdo con el peso de las mismas. Transcurridas de 2 a 3 horas de la administración de la sustancia se procedió a colocar nuevamente la comida.

Después de la administración se realizaron las observaciones, y se registraron sistemáticamente en los registros individuales para cada animal, varias veces durante el primer día y al menos una vez al día para los 13 restantes.

Atendiendo a que la vía de administración fue la oral se incluyeron los signos de toxicidad retardada. Las pesadas de las ratas se realizaron en los tiempos siguientes: 1, 7 y 14 días.

Al final del ensayo se procedió a sacrificar los animales empleando para ello una sobredosis de barbitúrico, evitando en lo posible que el animal sufriera y cumpliendo de esta manera con el principio de las 3 ERRES, establecido por la Toxicología Alternativa.

En las observaciones que se realizaron de los órganos (pulmones, corazón, bazo, riñones y estómago u otro que durante los días de observación se manifestó mediante los signos clínicos) si se encontraba alguna afectación, entonces se tomaban muestras para su procesamiento histopatológico.

CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN

IV.1 Estudio farmacognóstico y fitoquímico

IV.1.1 Caracterización botánica de la especie

IV.1.1.1 Caracterización Taxonómica

La especie objeto de estudio fue caracterizada por el biólogo Xavier Cornejo Sotomayor. Ms.C como Mimusops sp. a partir del material de herbario que fue entregado. (Anexo 6)

Clase: Equisetiopsida C. Agardh Subclase: magnoliidae Nóvak ex. Takdt. Superorden: Asteranae Takht. Orden: Ericales Bercht. & J. Presl Familia: Sapotaceae Juss Género: Mimusops L. Nombre científico: Mimusops sp.

IV.1.1.2 Caracterización genética de la hoja

IV.1.1.2.1 Producto PCR

Se realizó un análisis de PCR punto final con las condiciones mencionadas en la metodología. Se obtuvo una amplificación en los dos pares de primers utilizados en este estudio (figura 1 y 2). Como control negativo se usó un ADN de coral y un control sin ADN. Para el control positivo se utilizó ADN de hojas de banano.

Figura 2. PCR punto final con el marcador molecular matk a una temperatura de hibridación de 56º C. La foto muestra la amplificación con la muestra de árbol. En el extremo derecho se cargó el marcador molecular 100 bp DNA Ladder (Cat.# 62101, Promega). El tamaño de banda y los códigos de los pares de primers se los puede apreciar en la tabla VI.

Tabla VIII Resultado del BLAST/NCBI

RESULTADO BLAST-N CÓDIGO PRIMER Hit/ Description Max score Total score Query cover E value Ident Accession Mimusops elengi voucher ARG324 ribulose-1,5- bisphosphate A rbcLA_F 797 797 100 % 0.0 100% KX807132.1 carboxylase/oxygenase large subunit (rbcL) gene, partial cds; chloroplast Manilkara hexandra isolate 233 ribulose-1,5-bisphosphate A rbcLA_F carboxylase/oxygenase large 797 797 100 % 0.0 100% JX856723.1 subunit (rbcL) gene, partial cds; chloroplast Mimusops laurifolia isolate 4R2 voucher KSU:21544 ribulose-1,5- bisphosphate A rbcLA_F 797 797 100 % 0.0 100% JQ304271.1 carboxylase/oxygenase large subunit (rbcL) gene, partial cds; chloroplast Mimusops elengi voucher SBB- B matK_3F_KIM f 1082 maturase K (matK) gene, 1131 1131 100 % 0.0 100% JN114760.1 partial cds; chloroplast Mimusops obtusifolia voucher B matK_3F_KIM f OM2627 maturase K (matK) 1131 1131 100 % 0.0 100% JX518165.1 gene, partial cds; chloroplast Palaquium sp. JH-2017 isolate B matK_3F_KIM f 16-2990 maturase K (matK) 1131 1131 100 % 0.0 100% MF418677.1 gene, partial cds; chloroplast Payena lucida voucher BT_0070234360 maturase K B matK_3F_KIM f 1131 1131 100 % 0.0 100% KJ709037.1 (matK) gene, partial cds; chloroplast

La Tabla VIII muestra el resultado del Blast N con las secuencias producto de la amplificación de los marcadores rbcl y matk con la muestra de árbol desconocido. En esta tabla sólo se muestran las especies que presentaron mayor similitud, tomando en cuenta el mayor porcentaje de identidad (Ident) y el menor valor esperado (E value). En el marcador rbcl se observó que 3 especies distintitas presentaron los mismos resultados y dos de ellos correspondían a un mismo género: Mimusops elengi, Mimusops laurifolia, Manilkara hexandra. Por otro lado, con el marcador matk presentó 4 especies distintas con los mismos resultados y dos de ellos correspondían al mismo género: Mimusops elengi, Mimusops obtusifolia, Palaquium sp., Payena lucida. El género Mimusops se presenta en ambos marcadores con un alto porcentaje de identidad.

IV.1.1.2.2 Análisis de secuencia

Las secuencias fueron analizadas realizando un Blast-nucleotide (Tabla VIII). Luego se escogió 10 secuencias del resultado para realizar un árbol filogenético incluyendo la secuencia de la muestra desconocida. (Figura 3 y 4)

Figura 3. Árbol filogenético correspondiente al método Neighbor-joining. El árbol fue realizado tomando como base la secuencia de la muestra desconocida con el marcador rbcl y las secuencias del resultado del Blast-n.

Figura 4. Árbol filogenético correspondiente al método Neighbor-joining. El árbol fue realizado tomando como base la secuencia de la muestra desconocida con el marcador matk y las secuencias del resultado del Blast-n.

IV.1.1.3 Evaluación macromorfológica de la hoja

La evaluación macromorfológica permitió observar hojas oblongas de textura coriácea-cerosa, peciolo corto, ápice retuso, borde entero y base obtusa (Miranda y Cuéllar, 2001; González, 2013). La venación es del tipo cerrada, la cual se corresponde con un sistema reticular (las venas se ramifican y se anastomosan unas con otras formando una red que facilita la difusión de líquidos), muy frecuente en las dicotiledóneas, en este caso, del tipo penninervia, el cual es uno de los sistemas más avanzados que asegura la nutrición a todas las partes de la hoja (González, 2013). En la figura se muestran los detalles macroscópicos de las hojas.

Figura 5. Caracteres macromorfológicos de la hoja

Con respecto a las dimensiones de las hojas, los resultados se muestran en la Tabla IX. Se pudo observar que el valor promedio para el largo de las hojas era de 13,56 cm y el ancho de 7,49 cm.

Tabla IX Dimensiones de las hojas VALOR DESVIACIÓN PARÁMETRO VARIANZA MEDIO ESTÁNDAR Largo (cm) 13,56 1.46 2,14 Ancho (cm) 7,49 0,65 0,43

Para el largo y ancho de las hojas se realizaron los histogramas de frecuencia y los resultados representan en las figuras 6 y 7.

Figura 6. Histograma del largo de las hojas

Figura 7. Histograma del ancho de las hojas

Como se observa, las mayores frecuencias de valores se encontraron entre 12,8 -14,2 cm para el largo y 7,4 – 8,0 cm para el ancho, existiendo una gran dispersión para el tamaño de las hojas.

Para Mimusops elengi L., Gami et al., (2012), informaron que las hojas presentaban forma elíptica, poco acuminadas en el ápice, glabras de base aguda y peciolos de 1,3 – 2,5 cm de longitud, informa que las dimensiones de las hojas oscilan entre 6,3 – 10,0 cm de largo por 3,2 – 5,0 cm de ancho.

Mimusops hexandra Roxb (sin. Manilkara hexandra Roxb), presenta hojas oblongas, redondeadas en el ápice, glabras, verde oscuro en el haz y claro en el envés, con una dimensión de 2,5 – 11 cm de largo y 1,0 – 6,0 cm de ancho (Chanda et al., 2010).

Algunas especies genéticamente similares a la especie objeto de estudio, presentan algunas diferencias sobre todo en dimensiones de las hojas respecto a las estudiadas, que son superiores.

La información referenciada en la literatura respecto a las características de las hojas es escasa, por lo que no fue posible realizar comparaciones al respecto.

IV.1.1.4 Evaluación micromorfológica de la hoja

figura 8. Corte transversal a nivel del nervio central de la hoja

En la anatomía foliar a nivel de un corte transversal del nervio central (G) se pudo observar que la superficie adaxial es convexa, ligeramente ondulada y la cara abaxial es cóncava. Una vista ampliada del nervio (H) muestra una cutícula de textura cerosa que recubre toda la hoja, y que fue bien visible en el estudio macromorfológico, seguida de la epidermis la cual está conformada por células tabulares, que dan paso al conjunto de células que forman el parénquima esponjoso, dado los espacios intercelulares que se definen. También se observan posibles cristales de oxalato de calcio.

Bordeando la parte central del nervio central, existe un cordón (C), coloreado de rojo, que debe corresponderse con la endodermis, estructura que rodea al periciclo. En centro se encuentra el tejido conductor formado por haces vasculares xilema y floema (H e I).

Una imagen del mesófilo de la hoja (J) evidencia una cutícula algo gruesa en la superficie abaxial, seguida de la epidermis, un parénquima empalizada con células alargadas que por momentos se tornan estratificadas; de igual forma se aprecia todo el centro de la estructura ocupado por el parénquima esponjoso, que limita con la epidermis superior que concluye con la cutícula, ya referida anteriormente.

El diafanizado a una porción de la hoja por la cara adaxial mostró una epidermis con células de forma y tamaño variable (K). Sin embargo, la epidermis abaxial evidenció gran cantidad de estomas del tipo anomocítico donde las células epidérmicas que rodean el par de células oclusivas no son morfológicamente diferentes del resto de las células epidérmicas (L). Una tinción con el reactivo de Sudan III a nivel de la epidermis, permitió visualizar bolsas de aceites esenciales, las cuales tomaron coloración rojiza (M).

Figura 9. Diafanizado de la hoja

El análisis micromorfológico de la droga en polvo mostró diferentes fibras y haces vasculares, en este caso pertenecientes al tejido xilemático, encargado del transporte de la savia bruta hacia los centros fotosintéticos y de la circulación del mayor porciento de agua. Los vasos xilemáticos presentados se clasifican como escalariforme o escaleriforme.

Figura 10. Detalles micromorfológicos de la droga en polvo

Solo para la especie Mimusops hexandra Roxb; se encontró información acerca de las características micromorfológicas. Chandra y col, (2010) señala similitud en cuanto a la epidermis con células rectangulares, pero en su caso estas

estaban cubiertas con una cutícula delgada contraria a la de la especie en estudio que es gruesa.

Las estomas de ambas son anomocíticos y más abundantes en la epidermis abaxial. También se observaron cristales de oxalato de calcio, tejido esponjoso con espacios intercelulares.

La diferencia más marcada en la microscopía de las hojas, es en la forma del nervio central, que en el caso de M. hexandra es más pronunciado hacia la superficie abaxial que la especie objeto de estudio (Figura 11).

Figura 11. Sección transversal de la hoja (Chanda et al., 2010).

Si se tiene en cuenta que las características micromorfológicas, son la huella dactilar de una especie, podemos señalar, que a pesar de sus similares características genéticas, no parece de tratarse de la misma especie.

IV.1.2 Determinación de los parámetros Fisico-Químicos

A las hojas se le determinaron los parámetros fisicoquímicos de calidad. Estos fueron: humedad residual, cenizas totales, cenizas insolubles en HCl y sustancias solubles en agua, etanol al 80 % y hexano. Los resultados se muestran en la Tabla X.

La determinación de humedad residual en el material vegetal es uno de los índices numéricos que ayudan a complementar la calidad del método de secado evaluado. Las Normas y Farmacopeas establecen, en dependencia del material vegetal, un contenido de humedad residual entre 8 y 14 % (LouZhi-cen, 1980; WHO, 1998; Miranda, 2001). El estudio realizado proporcionó un valor de 14.34 %, estando este valor fuera del rango establecido, pero se puede aceptar por tolerancia matemática.

Dada las características de las hojas, con una gran superficie y consistencia coriácea, es de esperar valores altos de humedad residual. Sin embargo, Chanda et al., (2010) señala valores de pérdida en peso de un 4 %.

Las cenizas son indicativas de la calidad del material con que se trabaja y constituye una base para juzgar su pureza e identidad, brindando información relativa a la posible adulteración con materias inorgánicas o cuerpos extraños que posea (Miranda y Cuéllar, 2001).

Las Farmacopeas plantean un índice de cenizas totales hasta el 5 % (LouZhi-cen, 1980; WHO 1998). El ensayo realizado dio un valor de 7,35 %, valor que está por encima de lo establecido. La cantidad de cenizas insolubles en HCl al 10 %, es también un parámetro que ayuda a evaluar la pureza de la droga. Al

analizar los resultados se pudo observar que el porcentaje de estas cenizas insolubles fue de 4,23 %, valor que se encuentra fuera del límite establecido (alrededor del 2 % para plantas medicinales) (LouZhi-cen, 1980; WHO 1998).

Al ser las cenizas indicativas de la concentración de minerales del suelo dónde se desarrolla la especie, se considera necesario realizar un estudio más profundo sobre las cenizas de la especie. Chanda et al., (2010) encontraron para M. hexandra, valores altos de cenizas totales, pero las insolubles en el rango establecido.

Los valores obtenidos para las sustancias solubles indican que el mayor porcentaje de metabolitos presentes en las hojas son de naturaleza medianamente polar, lo que se demuestra en el porcentaje de sustancias solubles en alcohol, es superior a las solubles en agua y hexano.

Valores similares para las sustancias solubles en disolventes apolares fueron obtenidos para M. hexandra; sin embargo, las sustancias extraídas en etanol y agua fueron bajo en comparación con la especie en estudio (Chanda et al., 2010).

Tabla X Parámetros Fisicoquímicos de las hojas Valor reportado PARÁMETRO PORCENTAJE (%) para M. hexandra* Humedad Residual 14,34 4,00 Cenizas Totales 7,35 6,00 Cenizas Insoubles en HCl 4,23 1,00 Sustancias Solubles en Agua 19,26 12,30 Sustancias Solubles en Etanol 90 44,03 10,60 % Sustancias Solubles en Hexano 4,67 3,74

*(Chanda et al., 2010).

IV.1.3 Análisis cualitativo de los metabolitos por tamizaje fitoquímico

Uno de los aspectos considerados de interés en el estudio de una droga es conocer de forma preliminar su composición química general por métodos de tamizaje fitoquímico. Para el estudio se utilizaron tres extractos con diferentes solventes como se expresa en la Tabla XI.

Tabla XI Tamizaje fitoquímico de las hojas Ensayo Metabolito Resultado Extracto Etéreo Sudán Aceites y Grasas + Lieberman-Buchard Triterpenos-Esteroides Morado Extracto Alcohólico Resinas Resinas +++ Lieberman-Buchard Triterpenos-Esteroides Verde Oscuro Espuma Saponinas ++ Cloruro Férrico Fenoles y Taninos Azul Intenso Borntrager Quinonas ++ Extracto Acuoso Cloruro Férrico Fenoles-Taninos Azul Intenso Shinoda Flavonoides + Fehling Azúcares Reductores +++ Espuma Saponinas ++ Compuestos Amargos y Principios Amargos + Astringentes

Al efectuar los análisis correspondientes a los extractos etéreos (Tabla XI) se evidenciaron resultados positivos para núcleos triterpénicos y esteroidales y compuestos grasos. Los extractos alcohólicos (Tabla XI) respondieron positivo para resinas, núcleos triterpénicos y esteroides, saponinas, fenoles, taninos y quinonas. En los extractos acuosos (Tabla XI) resultaron positivos los ensayos para fenoles, taninos, flavonoides, compuestos reductores, saponinas y sustancias amargas.

Aunque en la literatura consultada no se referencian estudios de tamizaje fitoquímico; para los géneros Manilkara y Mimusops si se ha informado el aislamiento y caracterización de diversos compuestos en las hojas, que pudieran ser los responsables de los ensayos positivos del tamizaje, entre ellos: taraxasterol, saponinas, α-amirina, ácido ursólico (triterpenoides), quercetina, miricetina (flavonoides) (Misra et al., 1974).

IV.2 Estudios químicos preliminares

IV.2.1 Extracción y fraccionamiento del material vegetal

Como resultado del proceso se obtuvieron dos extractos: hexánico y metanólico. Los extractos hexánicos presentaron una alta pigmentación verde, que con el pasar del tiempo se pudo presenciar la aparición de un precipitado muy viscoso (látex) de color verde oscuro que interfería durante los ensayos. Luego se obtuvo el extracto metanólico con una coloración igualmente de color verde intenso, lo que sugiere que la composición química que prevalece en la planta es de alta polaridad.

IV.2.2 Análisis por cromatografía en capa delgada de los extractos

En el extracto hexánico se pudo observar la presencia de látex en abundancia al pasar del tiempo. En el extracto metanólico también se presenció la aparición de látex, pero en menor proporción.

No obstante, para el análisis por cromatografía en capa delgada, de los tres tipos de fases móviles utilizados para los extractos hexánico y metanólico, se obtuvo

mejor resultado con hexano: cloroformo: AcOEt: metanol (10:5:5:2,5), la cual mostró tanto al visible con luz UV como al revelado con metanol: ácido sulfúrico (50:50), un comportamiento cromatográfico con cierta complejidad, como se observa en la Figura 12; pero sin lograrse una adecuada separación. No se pudo destacar ninguna mancha bien separada.

Figura 12. Cromatografía en capa delgada del estudio químico preliminar. Izq: Sin revelado; Der: Revelado con luz UV y ácido sulfúrico. (H) Hojas; (Cl) Cloroformo; (AcOEt) Acetato de etilo; (Met) Metanol.

IV.3 Estudios químicos

IV.3.1 Eliminación de látex por agotamiento

Se agotó casi en su totalidad el látex del material vegetal como se observa diagramado en el anexo 4. Este látex se encontró en mayor concentración en el extracto hexánico presentando una consistencia dura de color amarillo verdoso.

IV.3.2 Método de extracción y concentración

Como resultado del proceso se obtuvieron tres extractos: clorofórmico, AcOEt y metanólico, los que fueron concentrados en el rotaevaporador y luego almacenados en vasos de precipitación.

Los extractos clorofórmicos presentaron una alta pigmentación verde negruzca, para los extractos con AcOEt, la apariencia fue verde oscuro y para los metanólicos también fueron oscuros, muy similares a los extractos clorofórmicos.

IV.3.3 Análisis por cromatografía en capa delgada (CDD) de los extractos

Para el análisis por CCD se usaron los extractos clorofórmicos, AcOEt y metanólicos. Como fase móvil se usó la que dio mejores resultados en los estudios preliminares la cual fue hexano:cloroformo:AcOEt:metanol (10:5:5:2,5); mostrando tanto al visible con luz UV como al revelado con metanol: ácido sulfúrico (50:50), un comportamiento cromatográfico también con cierta complejidad, como se observa en la Figura 13.

Figura 13. Cromatografía en capa delgada del estudio químico preliminar. Izq: Sin revelado; Der: Revelado con luz UV y ácido sulfúrico. (1H) Extracto 1 de hojas; (2H) Extracto 2 de hojas; (Cl) Cloroformo; (AcOEt) Acetato de etilo; (Met) Metanol.

Todos los extractos fueron analizados según su complejidad cromatográfica, apariencia y consistencia; llegándose a la conclusión de descartar los extractos hexánicos y clorofórmicos, para luego continuar el ensayo con una columna cromatográfica con los extractos de AcOEt y metanol.

IV.3.4 Fraccionamiento en columna cromatográfica

A partir de 0,19 g de extracto de acetato de etilo seco, lavado con hexano; se procedió a fraccionar el mismo por cromatografía en columna, empleando como criterio la CCD para el cambio de disolvente. En la Tabla XII se exponen las fracciones obtenidas para cada uno de los sistemas de solventes empleados.

Tabla XII. Fracciones obtenidas para los diferentes sistemas de solventes

Sistemas de solvente Número de fracciones Hexano 100% 5 (1 - 5) Hexano - Diclorometano 75:25 5 (7 – 11) Hexano - Diclorometano 50:50 88 (13 – 100) Hexano - Diclorometano 40:60 5 (102 – 106) Hexano - Diclorometano 25:75 10 (108 – 117) Diclorometano 100% 10 (119 – 128) Diclorometano – AcOEt 75:25 11 (130 – 140) Diclorometano – AcOEt 50:50 10 (142 – 151) Diclorometano – AcOEt 25:75 11 (153 – 163) AcOEt 100% 6 (165 – 170) AcOEt – Metanol 75:25 6 (172 – 177) AcOEt – Metanol 50:50 6 (179 – 184) Metanol 100% 6 (186 – 191)

Las fracciones se reunieron de acuerdo con similitud de polaridad, mostradas en la tabla XIII; y luego se les realizó CCD, para observar su complejidad.

Tabla XIII. Fracciones agrupadas por similitud de polaridad

#1: 1-5 #2: 7-11 #3: 13-15 #4: 16-17 #5: 18-20 #6: 21-26 #7: 27-29 #8: 30-35 #9: 36-106 #10: 108- #11: 119- #12: 130- 117 128 140 #13: 142- #14: 153- #15: 165- #16: 172- #17: 179- #18: 186- 151 163 170 177 184 191

Figura 14. CCD de las fracciones agrupadas por similitud de polaridad

Después de ver el resultado de la CCD, las fracciones se reunieron por segunda ocasión, de acuerdo con similitud cromatográfica:  Primer grupo: 21 – 35 (Hexano - Diclorometano 50:50)  Segundo grupo: 36 – 106 o 36 – 100 (Hexano - Diclorometano 50:50) o 102 – 106 (Hexano - Diclorometano 40:60)  Tercer grupo: 108 – 163 o 108 – 117 (Hexano - Diclorometano 25:75) o 119 – 128 (Diclorometano 100%) o 130 – 140 (Diclorometano – AcOEt 75:25) o 142 – 151 (Diclorometano – AcOEt 50:50) o 153 – 163 (Diclorometano – AcOEt 25:75)

Al finalizar se seleccionaron las fracciones 36 - 106, que fueron las más numerosas, por que aparecía una sola mancha cromatográfica, la cual precipitaba en la mezcla de disolventes Hexano - Diclorometano 50:50 y Hexano - Diclorometano 40:60. La misma fue enviada para ser caracterizada por

cromatografía gaseosa – espectrometría de masas. El cromatograma gaseoso analítico de esta fracción se presenta en la Figura 15.

Figura 15. Cromatograma gaseoso analítico del grupo de fracciones 36-106

Como se aprecia la mancha que por CCD parecía ser un solo compuesto, al ser analizada por cromatografía gaseosa, presentó un cromatograma complejo con alrededor de 147 picos cromatográficos, de los cuales pudieron asignárseles estructuras, por comparación de los espectros con la base de datos del equipo a 88 compuestos, los cuales se presentan en la Tabla XIV.

Tabla XIV. Compuestos identificados en las fracciones 36-106

Área de % Pico TR Compuesto Pico Abundancia 1 8,16 Prehnitol 0,12 0,18 2 8,25 Isodureno 0,22 0,32 3 10,35 α-Terpineno 0,31 0,46 4 13,05 Tridecano 0,40 0,59 5 15,26 β-Patchouleno 0,07 0,10 6 15,46 1-Tetradeceno 0,10 0,15 7 15,67 Tetradecano 0,37 0,54 8 16,54 α-Guaieno 0,19 0,28 9 16,91 Seychelleno 0,27 0,40 10 17,20 α-Patchouleno 0,26 0,38 11 17,46 α-Isometilionona 0,82 1,21 12 18,06 Ciclododecano 0,09 0,13 13 18,16 Pentadecano 0,22 0,32 14 18,93 Docosano 0,12 0,18 15 20,36 1-Hexadeceno 0,50 0,74 16 20,53 Hexadecano 0,08 0,12 17 21,65 Metil dihidro jasmonato 0,08 0,12 18 22,19 Alcohol Patchouli 0,45 0,66 19 22,64 2-Tetradeceno 0,03 0,04 20 22,72 Tetracosano 0,08 0,12 21 22,79 Heptadecano 0,09 0,13 22 23,69 Heneicosano 0,09 0,13 23 24,17 Pentadecano 0,17 0,25 24 24,29 Benzoato de Bencilo 0,22 0,32 25 24,81 1-Octadeceno 1,41 2,07 26 24,95 Octadecano 0,18 0,26 27 25,06 1-Octadeceno 0,08 0,12 28 25,43 Miristato de isopropilo 0,13 0,19 29 26,85 Ácido 9-Octadecenoico 0,15 0,22 30 27,00 Nonadecano 0,26 0,38 Éster metílico del Ácido 14-metil- 31 27,48 0,57 0,84 Pentadecanoico 32 28,38 Ácido Palmítico 1,50 2,21 33 28,85 1-Eicoseno 1,81 2,66 34 28,96 Eicosano 0,60 0,88 Éster metílico del Ácido10,13- 35 30,65 0,19 0,28 octadecadienoico 36 30,84 Heneicosano 1,28 1,88 37 31,12 1-Eicoseno 0,24 0,35 38 31,29 Éster metílico del Ácido octadecanoico 0,25 0,37 39 31,41 9-Tricoseno 0,10 0,15

40 31,69 Ácido oleico 2,30 3,38 41 32,00 Éster etílico del Ácido 9-octadecenoico 0,90 1,32 42 32,11 1,2-dietil-ciclohexadecano 0,36 0,53 43 32,22 14β-Pregnano 0,31 0,46 44 32,54 1-Docoseno 1,57 2,31 45 32,64 Docosano 1,56 2,29 46 33,15 Tricosano 0,23 0,34 47 33,72 Eicosano 0,28 0,41 48 33,87 14β-Pregnano 0,27 0,40 49 34,36 Tricosano 1,85 2,72 50 34,54 14β-Pregnano 0,52 0,76 51 34,94 3-Pentacoseno 0,59 0,87 52 35,09 14β-Pregnano 0,22 0,32 53 35,29 14β-Pregnano 0,33 0,49 54 35,40 Heneicosano 0,56 0,82 55 35,55 14β-Pregnano 0,71 1,04 56 35,92 1-Docoseno 1,07 1,57 57 36,03 Tetracosano 2,53 3,72 58 36,56 14β-Pregnano 0,76 1,12 59 36,70 3-Pentacoseno 0,53 0,78 60 36,93 Docosano 0,50 0,74 61 37,02 14β-Pregnano 0,69 1,01 62 37,43 14β-Pregnano 1,21 1,78 63 37,62 Pentacosano 3,63 5,34 64 38,47 3-Pentacoseno 0,70 1,03 65 38,57 Tricosano 0,93 1,37 66 38,72 Tetracosano 0,87 1,28 67 39,15 Hexacosano 3,93 5,78 68 39,46 Z-12-Pentacoseno 0,40 0,59 69 39,62 Nonacosano 1,24 1,82 70 39,87 Escualano 1,70 2,50 71 39,97 Tetracosano 0,58 0,85 72 40,06 14β-Pregnano 0,81 1,19 73 40,21 Hexacosano 1,45 2,13 74 40,40 1-Hexacoseno 0,67 0,99 75 40,62 Eicosano 4,43 6,52 76 41,50 Octacosano 0,96 1,41 77 41,64 Nonacosano 2,98 4,38 78 42,04 Eicosano 1,94 2,85 79 42,14 Escualeno 1,19 1,75 80 42,47 Nonacosano 1,03 1,51 81 42,71 Triacontano 0,26 0,38 82 42,82 Octacosano 0,23 0,34 83 42,89 1-Hexacoseno 0,37 0,54

84 43,04 14β-Pregnano 0,43 0,63 85 43,41 Heptadecano 1,06 1,56 86 43,81 Nonacosano 0,97 1,43 87 44,24 Nonacosano 0,20 0,29 88 44,74 Triacontano 1,08 1,59 TOTAL 67,99 100,00

Del total de compuestos encontrados, 7 de ellos pertenecen a los ácidos grasos tanto libres como metilados, de los cuales 2 se encuentran reportados en la literatura, como es el ácido oleico, que está presente en las semillas de Mimusops elengi (Misra y Mitra 1966; Misra et al., 1974), Mimusops caffra (Misra et al., 1974; Chivandi et al., 2016), Mimusops manilkara, M. longifolia, M. mottleyana, M. hexandra, M. heckelii, M. djave (Misra et al., 1974) y Mimusops zapota (Fayek et al., 2012; Satish et al., 2015). El ácido palmítico reportado en semillas de Mimusops caffra (Misra et al., 1974; Chivandi et al., 2016) y Mimusops zapota (Satish et al., 2015), y en corteza de Manilkara bidentata (Cocker et al., 1962).

También 33 compuestos corresponden a hidrocarburos saturados e insaturados; 6 pertenecen a terpenoides, de éstos 1 es un monoterpeno, el α- Terpineno; y 5 a sesquiterpenos, el α-Patchouleno, β-Patchouleno, α-Guaieno, Seychelleno y Patchoulenol.

Se encontraron compuestos fenólicos, iononas, ésteres bencílicos y propílicos y una hormona natural de defensa como el metil dihidro jasmonato.

Aparece en varias ocasiones el 14β-pregnano; y se puede recalcar que en la naturaleza, se presentan solamente los derivados de tres estereoisómeros del pregnano: el 5β-pregnano, el 14β-pregnano y el 5β-pregnano, 14β-pregnano.

Cabe mencionar que la fracción resultó muy compleja, y se puede destacar a tres compuestos, todos alcanos de cadena lineal: el eicosano, pentacosano y el hexacosano, ya que estos sobrepasaron el 5% de abundancia;

IV.4 Toxicología dérmica (TAD) y aguda oral (TAO) del extracto acuoso de las hojas

IV.4.1 Toxicología Aguda Dérmica (TAD)

No se reportaron signos clínicos en ninguno de los grupos estudiados.

En la figura 16 se muestran los resultados obtenidos para el peso corporal (en valores medio y desviación estándar) para los días 1, 7, y 14 de la experiencia.

Figura 16. Variación en el peso corporal (gramos) de los animales en el ensayo de Toxicidad Aguda Dérmica de Extracto acuoso de hojas. Letras diferentes indican significación estadística p< 0.05

Como se puede apreciar en la Figura 16, los animales tratados con el extracto de hojas tuvieron ganancia en peso durante todas las pesadas efectuadas, encontrándose en algunos casos diferencias estadísticamente significativas como lo demuestran las letras diferentes.

Las muestras tomadas de los órganos seleccionados no presentaron afectaciones desde el punto de vista macroscópico, por lo que el patólogo decidió no efectuar la toma de las mismas para su estudio histopatológico.

No se observaron signos clínicos de toxicidad en ninguno de los animales sometidos a ensayo. Desde el punto de vista de las necropsias efectuadas a los animales no se presentaron afectaciones en los órganos seleccionados. El producto estudiado no afecta la ganancia en peso de los animales en prueba. Cuando se administra de forma aguda en la piel el extracto de hojas, no se producen efectos tóxicos en los animales de experimentación.

El extracto no indujo toxicidad aguda dérmica observable en los animales de experimentación cuando se utiliza el ensayo descrito por la OECD TG 402, a una dosis de 2000 mg/kg. El producto se considera prácticamente inocuo para los humanos, cuando se aplica de forma aguda.

IV.4.2 Toxicología aguda oral (TAO)

Las pesadas de las ratas en los diferentes tiempos se procesaron estadísticamente para obtener la media y la desviación estándar.

Con el empleo de la dosis de 2000 mg/kg no murió ninguna de las ratas administradas con el producto objeto de estudio.

Se realizaron observaciones diarias durante 14 días de duración de todo el ensayo. No se reportaron signos clínicos en ninguno de los animales estudiados con el empleo de la dosis de 2000 mg/kg.

En la Figura 17 se muestran los resultados obtenidos para el peso corporal (en valores medio y desviación estándar) para los días 1, 7, y 14 de la experiencia que se corresponde con la dosis de 2000 mg/kg.

Figura 17. Variación en el peso corporal (g) de los animales en el ensayo de Toxicidad Aguda Oral del extracto acuoso de hojas a la dosis de 2000 mg/kg.

Como se puede apreciar en la Figura 17, los animales de los dos grupos tratados con el extracto acuoso de hojas tuvieron ganancia en peso durante todas las pesadas efectuadas lo que sugiere ausencia de efectos tóxicos sistémicos.

Las muestras tomadas de los órganos seleccionados no presentaron afectaciones desde el punto de vista macroscópico, por lo que se decidió no efectuar la toma de las mismas para su estudio histopatológico en los animales de 2000 mg/kg.

Cuando se utilizó la dosis de 2000 mg/kg no murieron ninguno de los animales sometidos a ensayo. No se observaron signos clínicos en ninguno de los animales. Desde el punto de vista de las necropsias efectuadas a los animales no se presentaron afectaciones en los órganos seleccionados de ninguno de los grupos sometidos a estudio.

El producto estudiado no afecta la ganancia en peso de los animales en prueba. Cuando se administra oralmente de forma aguda del extracto acuoso de hojas no se producen efectos tóxicos sobre los animales en prueba.

CAPÍTULO V: CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos permitieron arribar a las siguientes conclusiones:

 Se informaron las características morfoanatómicas de las hojas de la especie estudiada.

 Se determinaron las características genéticas de la especie estudiada, sin llegar a la confirmación de su clasificación taxonómica, por estrecha similitud entre seis especies de la familia Sapotaceae; las cuales fueron Mimusops elengi, Mimusops obtusifolia, Palaquium sp, Payena lucida.

 Se informaron por primera vez, algunos de los principales parámetros fisicoquímicos de las hojas de la especie: Humedad Residual, Cenizas Totales, Cenizas Insolubles en HCl, Sustancias Solubles en Agua, Etanol 90 % y Hexano.

 Para la composición química cualitativa a través del tamizaje fitoquímico, se encontraron los compuestos grasos, fenólicos, flavonoides y terpenoides como los componentes principales.

 Se diseñó y aplicó un método de extracción y fraccionamiento para el estudio de la composición química de las hojas, observándose que el disolvente más adecuado para el método fue el acetato de etilo, cuyo extracto resultó muy complejo, destacándose tres alcanos de cadena larga: el eicosano, pentacosano y hexacosano, ya que estos lograron sobrepasar el 5 % de abundancia en la cromatografía gaseosa.

 El extracto acuoso de las hojas en estudio no indujo Toxicidad Aguda Dérmica (TAD) ni Toxicidad Aguda Oral (TAO), observable en los

animales de experimentación. Cuando se utiliza el ensayo descrito por la OECDTG 423 y OECD TG 402; a una dosis de 2000 mg/kg de peso. El producto se considera prácticamente inocuo para los humanos, cuando se aplica en forma aguda.

CAPÍTULO VI: RECOMENDACIONES

 Se recomienda utilizar marcadores moleculares más elevados en la caracterización genética.

 Se considera necesario realizar un estudio más profundo sobre las cenizas de la especie.

 Ampliar el aislamiento y fraccionamiento químico de los diferentes extractos

 Realizar estudios farmacológicos a diferentes extractos de las hojas estudiadas.

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ANEXOS

Anexo 1. Tamizaje fitoquímico. Extracción Sucesiva con Disolvente

Anexo 2. Reacciones cualitativas a realizar en los extractos

Anexo 3. Esquema de extracción y fraccionamiento preliminar

Anexo 4. Esquema del agotamiento del látex

Anexo 5. Esquema de extracción y fraccionamiento químico

Anexo 6. Caracterización Taxonómica