Investigación Tema

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

MODALIDAD: INVESTIGACIÓN

TEMA:

“ANÁLISIS FARMACOGNÓSTICO DE LAS SEMILLAS DE LOS FRUTOS DE Mimusops sp. DE DIFERENTES GRADOS DE MADURACIÓN”

TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO Y FARMACÉUTICO

AUTOR:

Álvaro Froilan Maquilón Montalvo

TUTORA:

Ph.D. Migdalia Miranda Martínez

COTUTORA:

MSC. Katherine E. Bustamante Pesantes

GUAYAQUIL – ECUADOR

2017 – 2018

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DEDICATORIA

A mis padres por ser el pilar fundamental en todo lo que soy, en toda mi educación, tanto académica, como de la vida, por su incondicional apoyo perfectamente mantenido a través del tiempo.

A mi tutora Migdalia Miranda Martínez por su gran apoyo y motivación para la culminación de nuestros estudios profesionales y para la elaboración de esta tesis, por su apoyo ofrecido en este trabajo, por su tiempo compartido y por impulsar el desarrollo de mi formación profesional. ii

AGRADECIMIENTO

Primero quiero agradecer a Dios, por dejarme llegar donde estoy, sin las fuerzas que me ha dado día a día mis motivaciones no estarían plasmados en realidad en este momento, a mis padres que han sido instrumentos de fortaleza, amor que, gracias a sus consejos, apoyo que me han brindado sin esperar nada a cambio, tan solo con el objetivo de convertirme en profesional de éxito. A mi tutora Dra. Migdalia Miranda, por su apoyo incondicional haciendo notar siempre mis errores y fortaleciéndome mis aptitudes, rescatando con su aliento mi desenvolvimiento como profesional capaz de resolver situaciones que se presente en el camino.

ÍNDICE

APROBACIÓN DEL TUTOR ...... ¡Error! Marcador no definido. CERTIFICADO DEL TRIBUNAL ...... ¡Error! Marcador no definido. CARTA DE AUTORÍA DE TESIS ...... ¡Error! Marcador no definido. DEDICATORIA ...... iii AGRADECIMIENTO ...... ii INTRODUCCIÓN ...... 1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ...... 2 HIPÓTESIS ...... 2 OBJETIVO GENERAL ...... 2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 2 CAPÍTULO I. MARCO TEÓRICO ...... 3 I.1 FAMILIA SAPOTACEAE JUSS ...... 3 I.1.1 Descripción botánica ...... 3 I.1.1 Distribución y hábitat ...... 3 I.1.2. Especies ...... 3 I.1.1. Importancia económica ...... 4 I.1.4 Géneros importantes ...... 4 I.2 GÉNERO MANILKARA ADAMS...... 4 I.2.1 Taxonomía ...... 4 I.2.2 Distribución natural y hábitat...... 5 I.2.3 Descripción botánica ...... 5 I.2.4 Morfología de frutos y semillas ...... 6 I.3.1 Taxonomía ...... 7 I.3.4 Morfología de frutos y semillas ...... 10 I.3.5 Sinonimia entre los géneros Manilkara y Mimusops ...... 10 I.3.6 Composición química ...... 11 CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS ...... 18 II.1. Método de Investigación ...... 18 II.1.1 Variables ...... 18 II.1.1.2 Variable dependientes ...... 18

II.1.2 Criterios de inclusión y exclusión ...... 18 II.1.2.1 Criterios de exclusión ...... 18 II.1.2.2 Criterios de inclusión...... 18 II.1.3 Operacionalización de las variables ...... 19 II.2 Recolección, selección y secado del material...... 19 II.3 Caracterización botánica de la especie ...... 20 II.3.1 Evaluación macromorfológica de las semillas y frutos ...... 20 II.4 Almacenamiento ...... 20 II.5 Determinación de los parámetros físico-químicos ...... 20 II.5.1 Humedad residual ...... 20 II.5.2 Sustancias solubles...... 21 II.5.3 Cenizas totales ...... 21 II.6 Identificación de los Metabolitos Secundarios por Tamizaje Fitoquímico ...... 22 II.7 Extracción, Saponificación y Análisis del Aceite de las Semillas ...... 25 II.7.1 Extracción ...... 25 II.7.2 Saponificación ...... 25 II.7.3 Reacción de metilación ...... 26 II.7.4 Análisis por Cromatografía gaseosa-Espectrometría de masas (CG-EM) ..... 26 CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...... 27 III.1 Evaluación macromorfológica de las semillas ...... 27 III.2 Determinación de los Parámetros Físico-Químicos ...... 29 III.3 Extracción y Análisis del Aceite de las Semillas ...... 31 III.4 Análisis de los aceites de las semillas por el sistema acoplado Cromatografía Gaseosa- Espectrometría de Masas...... 32 CAPÍTULO IV. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...... 40 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 42 GLOSARIO ...... 49

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Manilkara. Principales caracteres vegetales y reproductivos de a) hojas y fruto, b) semillas, c) fuste cilíndrico y corteza externa agrietada, d) corteza interna rojiza y exudado (látex)...... 6 Figura 2. Semillas de Manilkara...... 7 Figura 3. Frutos y semillas de Mimusops sp ...... 10 Figura 4. Tamizaje fitoquímico. Extracción sucesiva con disolventes...... 23 Figura 5. Reacciones cualitativas a realizar en los extractos ...... 24 Figura 6. Estudio macromorfológico de frutos y semillas: a) fruto verde, b) fruto maduro, c) semillas frutos verdes con cáscara, d) semillas frutos maduros con cáscara, e) endospermos semillas verdes, f) endospermos semillas maduras.e 27 Figura 7. Cromatograma (CG-EM) de una fracción saponificable del aceite de las semillas de los frutos Mimusops sp, a) semillas fruto maduro, b) semillas fruto verde ...... 33 Figura 8. Cromatograma gaseoso analítico de la fracción insaponificable de los frutos de Mimusops sp...... 37

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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I. Taxonomía ...... 5 Tabla II. Clasificación Taxonómica ...... 8 Tabla III. Sinonimia Entre Especies Mimusops y Manilkara ...... 11 Tabla IV. Principales usos otorgados por diferentes culturas amazónicas ...... 14 Tabla V. Actividades farmacológicas de Mimusops elengi...... 16 Tabla VI. Operacionalización de las variables ...... 19 Tabla VII. Resultados del análisis estadístico de los parámetros macromorfológicos de frutos y semillas de Mimusops sp...... 28 Tabla VIII. Resultados físico-químicos de las semillas de Mimusops sp...... 29 Tabla IX. Tamizaje fitoquímico de las semillas de Mimusops sp...... 30 Tabla X. Rendimiento en aceite fijo del endospermo de las semillas de los frutos verdes y maduros de Mimusops sp...... 32 Tabla XI. Compuestos identificados en la fracción de compuestos saponificables de las semillas de los frutos verdes y maduros de Mimusops sp ...... 34 Tabla XII. Componentes identificados en la fracción de compuestos insaponificables del aceite del endospermo de las semillas de los frutos verdes y maduros de Mimusops sp...... 38

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RESUMEN

Algunas especies de la familia Sapotácea y del género Mimusops se emplean tradicionalmente y se han identificado algunos componentes químicos. El género es nativo de Asia y para las especies introducidas en América existe poca información. La especie objeto de estudio se encuentra bajo clasificación genética y se ha identificado taxonómicamente como Mimusops sp. En este trabajo se realizó el estudio farmacognóstico y químico de los frutos en los estados de maduración verde y maduro del aceite obtenido de las semillas de éstos. Se observaron diferencias en el tamaño de los frutos y las semillas, en los parámetros físicos-químicos, en el tamizaje fitoquímico y en el rendimiento del aceite de las semillas de los frutos. Las diferencias más importantes se presentaron en la composición cuali y cuantitativas en las fracciones de ácidos grasos y compuestos insaponificables de los frutos.

Palabras claves: Sapotáceas, Mimusops, frutos, composición química

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ABSTRACTS Some species of the Sapotacea family and the Mimusops genus are traditionally used and some chemical components have been identified. The genus is native to Asia and for the introduced species in America there is little information. The species under study is under genetic classification and has been identified taxonomically as Mimusops sp. In this work the pharmacognostic and chemical study of the fruits was carried out in the maturation states of green and mature and the oil obtained from the seeds of these. Differences were observed in the size of the fruits and seeds, in the physical-chemical parameters, in the phytochemical screening and in the oil yield of the seeds of the fruits. The most important differences were presented in the qualitative and quantitative composition in the fractions of fatty acids and unsaponifiable compounds of the fruits.

Keywords: Sapotaceae, Mimusops, fruits, chemical compositio

INTRODUCCIÓN

Desde tiempos remotos el reino vegetal ha brindado virtudes curativas, que han sido aprovechadas para el beneficio de la humanidad. Desde entonces y hasta la actualidad muchos hombres se han dedicado y todavía dedican sus esfuerzos, al descubrimiento y estudios de las propiedades curativas que se pueden obtener de este reino vegetal.

Los aceites vegetales son sustancias que han sido extraídas de las semillas y frutos oleaginosos de diferentes especies de plantas. Tienen grandes aportaciones en vitaminas, minerales y ácidos grasos, que son utilizados en la terapéutica y en cosmética, por sus propiedades para mantener la piel en buen estado y prevenir su envejecimiento prematuro gracias a sus cualidades excepcionales para hidratar, nutrir y regenerar la piel.

La familia Sapotácea del orden Ebenales, tiene aproximadamente 800 especies de árboles perennes y arbustos distribuidas en 65 géneros, con una distribución pantropical.

Muchas de sus especies producen fruta comestible, y/o de otros usos económicos y otras producen un importante látex con diversos usos. También de las semillas de algunas especies se obtienen aceites de uso comercial.

Dentro de los géneros que conforman esta familia se encuentra Mimusops, que comprende 136 especies descritas y de estas, solo 45 han sido aceptadas, hasta el 2015. Su origen fundamentalmente es de las zonas de África, Europa y Asia, aunque ha sido cultivada en diversas regiones de América.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

¿Cuáles son las variaciones que presentara la composición química el aceite de las semillas de Mimusops sp, en dependencia del grado de maduración del fruto?

HIPÓTESIS  La composición del aceite de las semillas de los frutos varía en dependencia del grado de maduración.

OBJETIVO GENERAL

 Estudiar las caracteristicas farmacognósticos y químicos de los frutos de Mimusops sp.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Determinar las características organolépticas de los frutos de Mimusops sp. de diferentes grados de maduración.  Evaluar los parámetros físicos-químicos de las semillas que permitan determinar sus parámetros de calidad  Establecer el estudio comparativo de los rendimientos de los aceites de los frutos.  Identificar las fracciones de ácidos grasos y compuestos insaponificables de los frutos estudiados.

CAPÍTULO I. MARCO TEÓRICO

I.1 FAMILIA SAPOTACEAE JUSS

I.1.1 Descripción botánica

Son árboles o arbustos, monoicos o dioicos, ocasionalmente armados, con ramificación generalmente simpodial; tronco, rama y frutos con látex blanco, amarillo o azul; pubescentes, con tricomas malpigiáceos, rara vez simples. Hojas espiraladas, alternas, dísticas, simples, enteras o dentadas, estipuladas, pecioladas. Flores bisexuales o unisexuales, actinomorfas, sésiles o pediceladas. Frutos en bayas, rara vez drupas o dehiscentes tardíamente por una valva lateral; pericarpo carnoso, coriáceo o leñoso. Semillas grandes y numerosas, globosas, oblongas, con frecuencia comprimidas lateralmente, generalmente con testa libre del pericarpo, parda, brillante, ocasionalmente áspera, rugosa o punteada (UNAM, 2008).

I.1.1 Distribución y hábitat

Familia de distribución pantropical, cuyas especies se encuentran distribuidas en América, África y Asia. Prosperan principalmente en bosques húmedos, pero algunos géneros, como Sideroxylon y Argania se extienden a regiones áridas y semiáridas (Carranza, 2005).

I.1.2. Especies

Está constituida por 53 géneros y más de 1100 especies (Carranza, 2005). De ellas al género Manilkara corresponden 80 especies, de las cuales 30 se encuentran en Centro y Suramérica (Armstrong, 2010) y al género Mimusops con 45 especies reconocidas, la mayoría de regiones de África, Asia y Europa, aunque distribuidas en diferentes zonas de Centro y Suramérica (UNMSM, 2006).

Los generos Manilkara y Mimusops están íntimamente relacionados siendo considerados para algunas especies como basónimos.

I.1.1. Importancia económica

Las Sapotaceae son de considerable importancia económica, ya que varias especies de algunos géneros como Chrysophyllum, Manilkara y Pouteria se cultivan por sus frutos que son comestibles, a su vez la goma de mascar natural se obtiene de Manilkara zapota (L.) van Royen (Carranza, 2005).

Los árboles del género Palaquium (Gutapercha) producen un importante látex con muchos usos. Las semillas del árbol Argania spinosa (L.) Skeels producen un aceite comestible: aceite de Argán, tradicionalmente cosechado en Marruecos. En el género Manilkara se da atención especial a la producción de maderas duras (Rivera et al., 2013).

I.1.4 Géneros importantes

Pouteria (325), Palaquium (110), Madhuca (100), Manilkara (80), Sideroxylon (75), Chrysophyllum (70), y Mimusops (50) (Liogier, 2000; Funk et al., 2007). Estos géneros son importantes ya que muestran una composición química similar y tienen un mayor uso en el campo medicinal e industrial.

I.2 GÉNERO MANILKARA ADAMS.

I.2.1 Taxonomía

La descripción taxonómica del género se presenta en la tabla I

Tabla I. Taxonomía

Manilkara Adams Reino Plantae Subreino Tracheobionta División Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Subclase Dilleniidae Orden Ericales Familia Sapotaceae Tribu Mimusopeae Subtribu Manilkarinae Género Manilkara Adans Fuente: USDA, 2017

I.2.2 Distribución natural y hábitat.

Manilkara es un genero de arboles de los tropicos. Las especies más conocidas son Manilkara zapota (ácana), Manilkara chichle (chicle) y Manilkara bidentata (balatá). Sus especies dan frutos comestibles, madera y látex.

Se lo encuentra a bajas altitudes en el sudeste asiático Camboya, India, Sri Lanka, Tailandia, Vietnam Diversas especies del género presentan una amplia distribución en diversas regiones de Centroamérica, Suramérica y el Caribe (USDA, 2014).

I.2.3 Descripción botánica

Para el género Manilkara, Rivera et al., (2013) lo describe como: Son arbustos o árboles, de 3-12 m de altura. Corteza gris. Ramas glabras. Hojas alternas, frecuentemente en grupos cerrados al final de las ramas, con cicatrices conspicuas; peciolo de 0,8-2 cm; vaina de hojas obovadas a obovada- elípticas, de 5-10 x 3-7 cm, ambas superficies glabras, ancha base cuneada a

obtusa, ápex retuso. Flores axilares, fasciculadas. Pedicelo grueso, de 1-1,8 cm; sépalos ovado-triangular, 3-4 mm, por fuera amarillento gris tomentoso. Corola blanca o amarillo brillante, ca. 4 mm; lóbulos oblongos, ca. 3 mm; estambres ca. 5 mm; estaminodios 2-partido, lóbulos lineales, ca. 3mm. Ovario ovoide, ca. 2mm, 6-locular, tomentoso. Drupa obovoide-oblongo a elipsoide, de 1-1,5 cm, 1º 2 semillas. Semillas de 8-10 mm; florecen en otoño, las siguientes características se podrán apreciar en la figura 1.

Las semillas contienen 25 % aceite comestible y tienen valor medicinal. Se hierve y se ingiere. Y, fritas o tostadas, su sabor recuerda a las nueces, pero contiene un alcaloide, por lo que debe consumirse frugalmente.

Figura 1. Manilkara. Principales caracteres vegetales y reproductivos de a) hojas y fruto, b) semillas, c) fuste cilíndrico y corteza externa agrietada, d) corteza interna rojiza y exudado (látex).

Fuente: Rivera et al., (2013)

I.2.4 Morfología de frutos y semillas

Los frutos y semillas de este género van a presentar diferente forma y tamaño, dependiendo de la especie. Para Manilkara bidentata, que presenta sinonimia con algunas especies del género Mimusops, los frutos son simples, carnosos e indehiscentes, tipo baya globosa de forma elipsoide (figura 2), color amarillo-

naranja al madurar, tornándose marrón una vez cae al suelo. En sentido longitudinal presenta un diámetro de 2 cm (rango: 1.6-2.3 cm) y en sentido transversal un diámetro de 1.5 cm (rango: 1.2-1.8 cm). Estos valores son similares a los reportados por Forget et al. (2001) con 2-2.2 cm de largo y 1.2-1.6 cm de ancho. Con respecto al peso fresco puede alcanzar en promedio 14.3 g. En condiciones de peso seco, el 16% corresponde a nutrientes, principalmente glúcidos (73%), lípidos (16%) y proteínas (3%) con una humedad del 82% (Ratiarison & Forget 2011). El endocarpio es carnoso, jugoso, gomoso, comestible y muy dulce. Por lo general contienen una sola semilla y excepcionalmente dos.

La semilla es de forma obovada, color negro y lustrosa (figura 2), presenta un peso fresco de 1.7 g y seco al aire de 0.8 g (Ratiarison & Forget 2011). Tiene una dimensión de 1.8 cm de longitud, 1.0 cm de ancho y 0.4 cm de grosor. Externamente posee una testa dura y quebradiza. Presenta una arista ventral e hilo blanco, grande y conspicuo en el borde. Es una semilla endospérmica masiva, parenquimatosa de consistencia carnosa. Posee dos cotiledones planos y delgados los cuales funcionarían como órganos de asimilación de las sustancias de reserva contenidas en la semilla. El embrión es axial, folial, espatulado y recto (Rivera et al., 2013).

a b

Figura 2. Semillas de Manilkara. Fuente: Ratiarison & Forget 2011

I.3 GÉNERO MIMUSOPS L.

I.3.1 Taxonomía La clasificación taxonómica se muestra en la tabla II.

Tabla II. Clasificación Taxonómica

Mimusops sp Reino Plantae Filo Tracheophyta Clase Magnoliopsida Orden Ericales Familia Sapotaceae Género Mimusops Fuente: (Global Biodiversity Information Facility 2017)

I.3.2 Distribución natural y hábitat

La distribución que presenta Mimusops sp se extiende en bosques tropicales y subtropicales del viejo mundo como Asia, África y Oceanía. Incluye países como Sri Lanka, India, Tanzania, Malawi, Kenia, Congo, Madagascar, Mozambique, Papúa Nueva Guinea, Islas Salomón, Indonesia, Arabia Saudita, Yemén, Islas Comoras, República de Mauricio y distribuidas en diferentes zonas de Centro y Suramérica (WCSP, 2017).

Mimosups sp. Es un árbol siempreverde, algo tortuoso, de 6-8 m de altura en cultivo, alcanzando hasta 20 metros de altura en su estado adulto, con la copa densa algo irregular y un tronco corto, de corteza muy resquebrajada que al cortar exuda abundante látex blanco, espeso y pegajoso (Rivera et al., 2013).

Hojas simples, alternas, generalmente agrupadas hacia el final de las ramas, con la lámina elíptica o de obovado-elíptica a oblonga, de hasta 20 x 11 cm, aunque generalmente más pequeñas, con la base obtusa, el margen entero y algo revoluto y el ápice obtuso o redondeado; son gruesas y de textura coriácea, glabras, de color verde brillante, con el nervio central destacado y 10-20 pares de nervios laterales. Pecíolo de 1-1,5 cm de longitud, al principio pubescente, tornándose luego glabro (Rivera et al., 2013).

Inflorescencias axilares, compuestas por flores solitarias o fascículos de 2-6 flores, rotáceas, blancas, aromáticas, sobre pedicelos pelosos de 5-7 (-8) cm de largo. Cáliz con 8 sépalos triangulares, de 11-12 mm de largo, con pelos castaños externamente, los sépalos exteriores ligeramente mayores que los interiores; corola con un tubo de unos 2 mm de largo y 8 lóbulos de 9-10 mm de longitud, cada uno con 2 apéndices profundamente laciniados. Androceo con 8 estambres opuestos a los pétalos, con los filamentos de 3-3,5 mm de largo, pelosos en la base, y las anteras de 4-4,5 mm de largo, alternando con 8 estaminodios de unos 5 mm de largo, pelosos por la cara externa. Ovario pubescente, cónico, con 8 lóculos; estilo glabro (Rivera et al., 2013).

I.3.3 Clasificación taxonómica

Inflorescencias axilares, compuestas por flores solitarias o fascículos de 2-6 flores, rotáceas, blancas, aromáticas, sobre pedicelos pelosos de 5-7 (-8) cm

de largo. Cáliz con 8 sépalos triangulares, de 11-12 mm de largo, con pelos castaños externamente, los sépalos exteriores ligeramente mayores que los interiores; corola con un tubo de unos 2 mm de largo y 8 lóbulos de 9-10 mm de longitud, cada uno con 2 apéndices profundamente laciniados. Androceo con 8 estambres opuestos a los pétalos, con los filamentos de 3-3,5 mm de largo, pelosos en la base, y las anteras de 4-4,5 mm de largo, alternando con 8 estaminodios de unos 5 mm de largo, pelosos por la cara externa. Ovario pubescente, cónico, con 8 lóculos; estilo glabro (Rivera et al., 2013).

I.3.4 Morfología de frutos y semillas

Fruto en baya subesférica de 3-4 cm de diámetro, sobre un pedúnculo de más de 6 cm de largo, amarillenta en la madurez, con una pulpa dulce y carnosa- harinosa, comestible, conteniendo de una a varias semillas elipsoides, de color castaño amarillento (figura 3) (Gopalkrishnan & Shimpi, 2010).

Figura 3. Frutos y semillas de Mimusops sp

Fuente: Gopalkrishnan & Shimpi, 2010

I.3.5 Sinonimia entre los géneros Manilkara y Mimusops

La sinonimia describe la presencia de más de un nombre científico para un mismo taxón; esto a su vez puede darse por coincidencias dentro de la ciencia de la taxonomía o por una estrecha similitud de las características fenotípicas de dos o más especies. Este es el caso de la especie Binectaria laurifolia, que es un sinónimo de Mimusops kauki L; y este al presentar flores hexámeras se la transfiere al género Manilkara (Friis, 1980).

Existen otros casos de sinonimia presente en otras especies de ambos géneros, como se expresa en la tabla III. Tabla III. Sinonimia Entre Especies Mimusops y Manilkara

Género Mimusops Género Manilkara Mimusops amazonica Huber Manilkara bidentata subsp. surinamensis (Miq.) T.D.Penn. Mimusops balata (Aubl.) C.F.Gaertn Manilkara bidentata (A.DC.) A.Chev. subsp. bidentata Mimusops bidentata A.DC Manilkara bidentata (A.DC.) A.Chev Mimusops cearensis Huber Manilkara triflora (Allemão) Monach. Manilkara bidentata (A.DC.) A.Chev. Mimusops darienensis Pittier subsp. bidentata Mimusops elata Allemão ex Miq Manilkara elata (Allemão ex Miq.) Monach. Mimusops excelsa Ducke Manilkara excelsa (Ducke) Standl Mimusops floribunda Mart Manilkara subsericea (Mart.) Dubard Manilkara bidentata (A.DC.) A.Chev. Mimusops globosa C.F.Gaertn subsp. bidentata Mimusops rufula Miq Manilkara rufula (Miq.) H.J.Lam Fuente: (Zappi et al., 2015)

I.3.6 Composición química

Para algunas especies de la familia Sapotacea y de los géneros Manilkara y Mimusops se han encontrado diferentes estudios (Moustafa et al., 2016).

En las hojas de Manilkara zapota: se han identificado compuestos fenólicos entre los cuales se citan: miricetin-3-O-α-Lrhaminopiranosido, apigenina-7-O-α-L- rhamnopiranosido y ácido cafeico, además de los ácidos grasos oleico, linoleico, linolénico y los triterpenoides acetato de lupeol y ácido oleanólico (Fayek et al., 2012; Parle Milind y Preeti, 2015).

Los compuestos fenólicos quercetrina, (+)-catequina, (-)-epicatequina, (+)- gallocatequina, ácido gálico, dihidromiricetina, metilclorogenato, metil-4-O-galoil clorogenato y ácido 4-O-galoilclorogenico, se han informado para los frutos (Ma et al., 2003); Parle Miland y Pretti, (2015), identificaron leucodelfinidina, leucocianidina y leucoperalgonidina; mientras que Rao et al., (2014) identificaron el D-quercitol en semillas y hojas. Fayek et al., (2013) han informado la presencia de β-amirina, 3-(3´-dimetil)-butirato, lupeol 3-acetato y ácido cafeilquinico en los frutos.

Para la especie Manilkara subceracea, Fernández et al. (2013), han informado ácido hexadecanoico, ácido hexadecanoico etilester, 9- octadecenoico etilester y octadecanoico etilester, β-amirina caproato y caprilato y α-amirina acetato.

La especie Mimusops elengi perteneciente al género Mimusops, es una de las más estudiadas, para ella se han informado diferentes compuestos. El extracto etanólico de las hojas produjo quercitol, hentriancontano, β-caroteno y glucosa, D- manitol, β-sitosterol, β-sitosterol –β-D-glucósido y quercetina (Kalita & Saikia, 2004; Bharat, 2007; Manjeshwar et al., 2011).

La madera contiene taninos, caucho, ceras y materia colorante, almidón y sales minerales (Bharat & Parabia, 2010). Del extracto etanólico del tallo se ha aislado saponinas, el extracto etanólico después de hidrolizado produjo β-amirina y un ácido graso. De la fracción soluble en hexano del extracto alcohólico se aislaron taraxasterona, taraxasterol, α-espinasterol, ursolato de sodio y ácido betulínico, mientras que en la fracción insoluble en hexano se separaron el β-D- glucósido del β-sitosterol y el extracto acuoso produjo quercitol

De la corteza del tallo Jahann et al., (2001), aislaron: Taraxerona, taraxerol, ácido betulinico y espinasterol, sal de sodio de ácido betulinico y ácido ursolico, ésteres de ácidos grasos de alfa-espinasterol, también excluyeron un nuevo triterpeno, el 3β-hidroxi-LUP-20 (29)-en-23, acido 28-dioico, amirina beta, lupeol. Akhtar y col., (2009), retrayeron un nuevo farnanetipo de triterpeno pentaciclico,

farnan-2-ona-3 beta-ol (Mimusopfarnanol), junto con los triterpenoides conocidos, farnan-3-ona, y olean-18-en-2-ona-3-ol y lup-20 (29) -en-3 beta-ol.

Los frutos y semillas de bakula (Mimusops elengi), mostraron después de la saponificación, presencia de quercitol, ácido ursolico, dihidro quercetina, quercetina, β-D-glicosidos de sitosterol y α-espinasterol. Se aislaron dos nuevos ácidos triterpenicos pentacíclicos los ácidos mimusops y mimusopsic, los cuales poseen un nuevo esqueleto oleanano y mimusopano, mimugenona y los triterpenos pentacíclicos 3β, 6β, 19α, 23- tetrahidroxi-urs-12-eno y 1 β-hidroxi-3β- hexanoillup-20 (29) -eno-23-acido 28-dioico. También se han aislados dos nuevas saponinas de las semillas junto con dos saponinas triterpenoides conocidas, además de taxofolina y otros glucósidos triterpenicos (Kadam et al., 2012; Bharat et al., 2012).

Para la especie se han informado minerales como calcio y fósforo en cantidades de 212 mg y 30 mg por 100 g respectivamente. El tamizaje fitoquímico del Mimusops elengi dio ausencia de alcaloides en la madera y las semillas y presencia en las flores. Aunque no del tipo pirrolizidínicos (Bharat, 2007, Bharat & Parabia, 2010, Kala et al., 2011).

Para las semillas de Mimusops laurifolia, Eskander et al., (2006), aislaron e identificaron 9 saponinas triterpénicas. Para Mimusops caffra Chivandi et al., (2015) informó la composición en minerales, aminoácidos y ácidos grasos de las semillas.

I.3.7 Usos tradicionales

Los pobladores locales de la Amazonia han otorgado diversos usos a Manilkara bidentata, derivados de la madera, frutos y látex (tabla IV). La madera es una de las más apreciadas por su dureza, pero principalmente por su alta durabilidad como postes o columnas dispuestas a la intemperie, los cuales son enterrados directamente en el suelo. La madera se usa generalmente aserrada, aunque también son empleados individuos juveniles y adultos como madera rolliza para viviendas, puentes comunales entre otros. El fruto recolectado del bosque es

muy apreciado por el agradable sabor dulce y la goma que se obtiene. La corteza cocinada es utilizada como calmante para los cólicos hepáticos y dolores intestinales (López et al. 2006). En la siguiente tabla podremos observar el uso que da cada parte del árbol.

Tabla IV. Principales usos otorgados por diferentes culturas amazónicas Uso Parte del árbol Alimento Fruto Artesanal Látex Aserrío Duramen Construcción Duramen Cultural Látex Medicinal Corteza Industrial Látex

El uso industrial más importante se refiere al látex en forma de goma similar a la gutapercha. El látex se obtiene mediante incisiones poco profundas practicadas en la corteza del tronco. Es una sustancia blanca, químicamente inerte y tiene la propiedad de volverse plástico (pero no elástico) a altas temperaturas y endurecerse nuevamente al enfriarse, extensible pero no elástica (diferencia importante con el caucho) y se emplea en la preparación de capas aislantes para cables eléctricos, fuerza, láminas impermeables, plantas para calzado impermeable, conductos radiculares en odontología y la industria de goma de mascar; además se emplea en amortiguadores para aviones jet y pelotas de golf (Rivera et al., 2013).

Algunas especies del género Mimusops son empleadas en medicina tradicional en la India, en especial Mimusops. elengi.

Desde la antigüedad, el polvo de la corteza del árbol y la corteza de los tallos tiernos se usaban como cepillo para limpiar los dientes. En Ayurveda, la decocción se recomienda para tratar diversas dolencias dentales y mantener las encías saludables. Enjuagar la boca con decocción de corteza se cree que

fortalece las encías, reduce la inflamación, previene el sangrado de las encías y detiene el mal aliento causado por la piorrea y la caries dental. Además, la decocción de la corteza o de la hoja también se supone que es útil en la limpieza de heridas dérmicas y para las hemorragias. También se informa que posee efectos antiulcerosos y aumenta la fertilidad en las mujeres. La decocción se considera útil como tónico y febrífugo. También se supone que los tallos tiernos son útiles en el tratamiento de la uretrorrea, la cistorrea, la diarrea y la disentería (Manjeshwar et al., 2011).

La corteza de M. elengi posee actividad cardiotónica, alexifármica, estomacal, antihelmíntica y astringente (Shah et al., 2003).

Al tabaco hecho con las flores secas se atribuye utilidad en el tratamiento de Ahwa, una enfermedad con fiebre fuerte, dolor de cabeza y cuello, los hombros y otras partes del cuerpo. El tabaco también se cree que es un neurotónico y sirve para aliviar el dolor de cabeza y la cefalea. La loción preparada a partir de las flores es efectiva en la curación de heridas y úlceras y la decocción de las flores es útil contra las enfermedades del corazón, para actuar como antidiurético en la poliuria, como antitoxina, para tratar la leucorrea y la menorragia. A los frutos también se les señalan algunas propiedades medicinales, entre las que se citan prevenir la disentería crónica y el estreñimiento, prevenir las eyaculaciones precoces (Manjeshwar et al., 2011).

I.3.8 Actividad farmacológica

Algunos estudios farmacológicos realizados a especies del género Manilkara han demostrado algunos de los usos tradicionales atribuidos. Fernández et al. (2013a), encontraron que los extractos de los frutos de M. subcericea presentaban actividad antimicrobiana frente a S. aureus, además de presentar baja toxicidad ante células vero. En otro trabajo, estos mismos autores informaron una potente acción inhibidora del crecimiento de plagas de cultivo (Fernández et al., 2013 b).

La actividad antiinflamatoria para la resina de Manilkara. bidentata fue informada por Rhourri-Frih et al. (2013).

Diversos estudios farmacológicos realizados a Manilkara zapota por Osman et al. (2011) y Sakala et al. (2013), informaron que las raíces, hojas y corteza, presentaban un amplio espectro antimicrobiano. Para esta especie, las actividades hipoglucemiante, hipolipemiante y antioxidante para los extractos de las hojas y de los frutos se informaron por Fayek et al. (2012 y 2013) y Saradha et al. (2014).

La actividad citotóxica in vitro para una nueva saponina aislada de la corteza fue informada por Awasare et al. (2012) y la actividad antitumoral sobre el carcinoma de Erlich en ratones para extractos de corteza de M. zapota fue reportada por Rashid et al. (2014).

Para diferentes extractos de las hojas de M. zapota (Manirujjaman et al., 2014), informaron la actividad antiinflamatoria, antipirética y analgésica. Otras actividades farmacológicas demostradas han sido: hepatoprotectora de hojas y corteza (Islam et al., 2010 y 2012) y antidiarreica de extractos metanólicos de las hojas (Manirujjaman et al., 2013).

Para la especie Mimusops elengi se han demostrado algunas actividades farmacológicas que se resumen en la tabla V.

Tabla V. Actividades farmacológicas de Mimusops elengi.

Propiedades Observación y referencias Farmacológicas Efecto antioxidante 1. El extracto metanólico de las hojas de Bakul (95%) es efectivo en DPPH, antioxidante total y ensayos de potencia reductora in vitro (Saha et al., 2008) 2. El extracto preparado a partir de frutos maduros verdes, maduros y anaranjados inmaduros y los diversos ácidos fenólicos libres de fracciones, ésteres fenólicos solubles y ésteres de ácido fenólico insolubles poseen actividades de eliminación de

radicales libres tanto en ensayos DPPH como ABTS (Boonyuen et al., 2009). 3. El extracto metanólico de la corteza del tallo posee ión férrico que reduce el poder antioxidante, DPPH y la actividad de eliminación de radicales hidroxilo in vitro (Ganu et al., 2010). Antibacteriana 1. Se ha demostrado que los extractos acuosos y etanólicos de las hojas de Bakul poseen una acción antibacteriana (Nair y Chanda, 2007). 2. El éter de petróleo, el acetato de etilo y los extractos metanólicos de la corteza, las frutas y las hojas también poseen efectos antibacterianos (Ali et al., 2008). 3. Los extractos de corteza, fruta y semilla también se muestran efectivos (Shahwar y Raza, 2009). 4. Las pentahidroxifloras 2,3-dihidro-3,3'4'5,7- pentahidroxifloxa y 3,3', 4', 5,7-pentahidroxifloxa aisladas del extracto de acetato de etilo de la semilla se muestran eficaces Escherichia coli ATCC 25922, Bacillus subtilis ATCC 6633 y Salmonella typhi ATCC 6539 (Hazra et al., 2007). Efecto Anti- 1. El éter de petróleo, la acetona, el metanol y los cariogenico extractos acuosos de la planta son altamente efectivos en diversas bacterias cariogénicas (Ajaybhan et al., 2010). Actividad Antifungica 1. Se ha demostrado que el éter de petróleo, el acetato de etilo y los extractos metanólicos de la corteza, las frutas y las hojas poseen actividad antifúngica (Ali et al., 2008).

Efecto 1. Se ha demostrado que Bakul es eficaz para reducir Gastroprotectora las ulceraciones gástricas inducidas por etanol, ligadas por el píloro y la inmersión en agua más el estrés inducido por el estrés en ratas (Shah et al., 2003). Efecto Hipotensor 1. Se ha demostrado que el extracto metanólico de Bakul posee actividad hipotensora en ratas anestesiadas (Dar et al., 1999).

Actividad 1. Se ha demostrado que el extracto acuoso de la Antidiabética corteza posee efectos hiperglucémicos en ratas diabéticas inducidas por alloxan. El extracto disminuyó la glucosa en sangre y la hemoglobina glucosilada, aumentó los niveles de insulina en suero y rectificó algunas enzimas glucogénicas (Jerline et al., 2009). 2. El extracto metanólico de la corteza del tallo también posee un efecto antihiperglucémico (Ganu et al., 2010

CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS

II.1. Método de Investigación

El método de investigación empleado en este trabajo de titulación fue empírico y experimental.

II.1.1 Variables

II.1.1.1 Variable Independiente

Estado de madurez de los frutos

II.1.1.2 Variable dependientes

Rendimiento de aceite graso

II.1.1.3. Variable interviniente

Época del año

II.1.2 Criterios de inclusión y exclusión

II.1.2.1 Criterios de exclusión

Frutos en estado de putrefacción

II.1.2.2 Criterios de inclusión

Todos los frutos verdes y maduros

II.1.3 Operacionalización de las variables

Tabla VI. Operacionalización de las variables

Variables Indicadores Tipo Análisis por Dependiente: Cromatografía Rendimiento de compuestos Cuantitativo gaseosa-Espectometría grasos de masas Independiente: Fruto verde y maduro Cualitativo Estado de madurez Interviniente: Estado fenológico Cualitativo Época del año

II.2 Recolección, selección y secado del material

La especie vegetal utilizada fue el endospermo de la semilla de Mimusops sp., para lo cual se recolectó el fruto, en una zona de vegetación natural “Jardin Botánico” de la Ciudad de Guayaquil, Ecuador, el 16 de agosto de 2017. La especie vegetal se encontraba en estado de floración-fructificación. La identificación botánica fue realizada por el Biolg. Xavier Cornejo Sotomayor. Ms.C y registrada en el Herbario GUAY de la Facultad de Ciencias Naturales en la Universidad de Guayaquil con la clave 13111.

Los frutos recolectados, fueron lavados con agua corriente y secados a temperatura ambiente durante 5 días. De éstos fueron extraídas las semillas, las cuales se clasificaron en semillas de frutos verdes y maduros, según las características de los frutos. A éstas se les retiró la cáscara con ayuda de un mortero, obteniendo el endospermo.

II.3 Caracterización botánica de la especie

II.3.1 Evaluación macromorfológica de las semillas y frutos

Se emplearon 60 frutos y semillas extraídas de los mismos, a las cuales se determinaron sus caracteres morfológicos: forma y dimensiones de los frutos, semillas con cáscara y endospermo.

II.4 Almacenamiento

Una vez trituradas las semillas, el material vegetal se almacenó en fundas de polietileno a temperatura ambiente, para su posterior análisis igualmente con las semillas no trituradas.

II.5 Determinación de los parámetros físico-químicos

Se siguieron las técnicas establecidas por la WHO, (2011), realizando los ensayos por triplicado.

II.5.1 Humedad residual

Se empleó el método gravimétrico, a partir de 4 g de muestra, se utilizó una estufa a 105ºC marca Mettler Toledo y para las pesadas una balanza analítica marca Kern Modelo: ABS-220-4.

Expresión de los resultados: M − M Hg = 2 1 X 100 M2 − M Donde: Hg = pérdida en peso por desecación (%)

M2 = masa de la cápsula con la muestra de ensayos (g)

M1 = masa de la cápsula con la muestra de ensayo desecada (g) M = masa de la cápsula vacía 100 = factor matemático para el cálculo

II.5.2 Sustancias solubles

Este ensayo se determinó por el método en caliente. Se colocaron alrededor de 4,0 g de polvo grueso del material vegetal secado al aire, exactamente pesados, en un matraz erlenmeyer. Se añadieron 100 ml de disolvente y se pesó para obtener el peso total incluyendo el matraz. Se agitó bien y dejó reposar durante 1 hora. Se acopló un condensador de reflujo al matraz y se hirvió suavemente durante 1 hora; se enfrió y pesó. Se Ajustó al peso total original con el disolvente especificado en el procedimiento de prueba para el material vegetal en cuestión. Se Agitó y filtró por succión a través de un filtro seco.

Se transfirieron de 25 ml del filtrado a un plato de fondo plano tarado evaporando hasta sequedad en un baño de agua. Se Secó a 105° C durante 2 horas, enfrió en un desecador durante 30 minutos, y luego se pesó sin demora. Los disolventes utilizados fueron agua y etanol al 98% y hexano respectivamente. Se calculó el contenido de materia extraíble en mg por g de material secado al aire, según la fórmula:

m % SS = x 100 M

Dónde: m = masa del residuo M = masa de la porción de ensayo 100 = factor matemático

II.5.3 Cenizas totales

Para el análisis se empleó una mufla MLW Eliktro Modelo: 245.3E por 2 horas, las pesadas se realizaron en una balanza analítica marca Kern Modelo: ABS-220-4. A partir de 3 g de muestra, se utilizó ácido nítrico hasta obtener cenizas blancas.

Expresión de los resultados:

M − M C = 2 X 100 M1 − M Donde: C= porcentaje de cenizas totales en base hidratada M= masa del crisol vacío (g)

M1= masa de crisol con la porción de ensayo (g)

M2= masa del crisol con la ceniza (g) 100= factor matemático para el calculo

II.6 Identificación de los Metabolitos Secundarios por Tamizaje Fitoquímico

El tamizaje fitoquímico se realizó a las semillas secas y pulverizadas, según procedimiento descrito por Miranda y Cuellar (2000).

Se utilizó un sistema de extracción con disolventes de polaridad creciente, a partir del mismo material vegetal. La droga seca se extrajo sucesivamente con éter etílico, etanol y agua por 48 horas para obtener los extractos etéreo, alcohólico y acuoso (figura 4), los cuales se sometieron a diferentes ensayos (figura 5).

30g Material vegetal

Extraer con 90mL de éter etílico por maceración durante 48 horas a temperatura ambiente Filtrar

EXTRACTO ETÉREO RESIDUO SÓLIDO Medir volumen y Secar y pesar calcular concentración

Extraer con 3 veces el peso del

residuo en volumen con etanol por maceración durante 48 horas Filtrar

EXTRACTO RESIDUO SÓLIDO ALCOHÓLICO Secar y pesar Medir volumen y

calcular concentración

Extraer con 3 veces el peso del residuo en volumen con agua destilada por

maceración durante 48 horas

Filtrar

EXTRACTO ACUOSO RESIDUO SÓLIDO Medir volumen y Secar y pesar calcular concentración

Figura 4. Tamizaje fitoquímico. Extracción sucesiva con disolventes. Fuente: Miranda y Cuéllar, 2000

 SUDÁN (ACETES Y GRASAS)  DRAGENDORFF, MAYER Y WAGNER EXTRACTO (ALCALOIDES) ETÉREO  BALJET (LACTONAS Y COUMARINAS)  LIEBERMANN-BUCHARD (TRITERPENOS- ESTEROIDES)

 CATEQUINAS  RESINAS  FEHLING (AZÚCARES REDUCTORES)  BALJET (LACTONAS)  LIEBERMANN-BUCHARD (TRITERPENOS- ESTEROIDES)  ESPUMA (SAPONINAS) EXTRACTO  CLORURO FÉRRICO (FENOLES Y ALCOHÓLICO TANINOS)  NINHIDRINA (AMINOÁCIDOS)  BORNTRAGER (QUINONAS)  SHINODA (FLAVONOIDES)  KEDDE (CARDENÓLIDOS)  ANTOCIANIDINA  DRAGENDORFF. MAYER Y WAGNER (ALCALOIDES)

 DRAGENDORFF, MAYER Y WAGNER (ALCALOIDES)  CLORURO FÉRRICO (TANINOS) EXTRACTO  SHINODA (FLAVONOIDES) ACUOSO  FEHLING (AZÚCARES REDUCTORES)  ESPUMA (SAPONINAS)  MUCÍLAGOS  PRINCIPIOS AMARGOS

Figura 5. Reacciones cualitativas a realizar en los extractos

Fuente: Miranda y Cuéllar 2001

II.7 Extracción, Saponificación y Análisis del Aceite de las Semillas

II.7.1 Extracción

Se empleó el método de Soxhlet en la extracción de los aceites de las semillas contenidos en los frutos en dos estados: verdes y maduros, de forma independiente. Éstas muestras se agregaron en un cartucho de papel filtro y como disolvente se empleó hexano, con un tiempo de extracción fue de 2 horas.

Una vez culminada la extracción, los extractos se destilaron en rotaevaporador de marca alemana Heildoph Laborato modelo 4001 efficient HB digital a presión reducida y a temperatura de 80° C aproximadamente, hasta eliminación total del disolvente. Los residuos se pesaron para calcular el rendimiento.

II.7.2 Saponificación

A los residuos sólidos obtenidos de la extracción por el método de Soxhlet, se añadieron de forma independiente tres veces el peso en volumen de NaOH 1N en etanol y se dejó en reflujo por 2 horas. Luego se dejó enfriar, se añadió igual volumen de agua destilada y se extrajo tres veces con 25 mL de éter di etílico. Las fracciones etéreas reunidas se lavaron con agua destilada hasta pH 7. El extracto etéreo se secó con sulfato de sodio anhidro y se rotuló como fracción insaponificable de semillas de frutos maduros y de frutos verdes.

Los extractos acuosos se ajustaron hasta pH 3 con ácido clorhídrico concentrado y se extrajeron tres veces con 25 mL de éter dietílico. Las fracciones etéreas reunidas se lavaron con agua destilada hasta pH 7, se secaron con sulfato de sodio anhidro y se rotularon como fracción saponificable de semillas de frutos verdes y maduros.

II.7.3 Reacción de metilación

Se empleó una cantidad de metanol equivalente al 40% en peso de la fracción, es decir se utilizó siempre una relación molar metanol / aceite de 11,66:1, y se añadió 1,5% en peso de la fracción de NaOH. La mezcla se agitó a temperatura de 35° C durante 3 minutos.

II.7.4 Análisis por Cromatografía gaseosa-Espectrometría de masas (CG-EM)

Las fracciones de los compuestos saponificables metilados y las insaponificables, se analizaron en un cromatógrafo de gases Agilent 7890A acoplado a espectrómetro de masas Agilent 5975C con fuente de ionización con impacto electrónico con un analizador de simple cuádruplo. Temperatura del inyector: 280°C, volumen de inyección 2 μL con gas portador helio a 1 mL/min. Las condiciones de trabajo fueron: columna HP-5 5% Phenyl Methyl Siloxan de 30 m x 0,30 mm x 0,25 μm, temperatura inicial: 150° C por 4 minutos incrementando 2° C/ min hasta 300°C por 2 min. Tiempo de análisis: 79 min. Espectrómetro de masas operado a 70 eV en modo full scan desde 50 hasta 600 unidades de masa. Temperatura de la fuente 230°C, temperatura del cuadrupolo 150°C.

CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

III.1 Evaluación macromorfológica de las semillas

En el estudio macromorfológico se tomó en consideración el largo y ancho, de los frutos verdes y maduros, de las semillas con cáscara y del endospermo de las mismas (figura 6). Se realizó el análisis estadístico comparativo de los parámetros evaluados, cuyos resultados se describen en la tabla VII.

a b

c d

e f

F f

i g Figurau 6. Estudio macromorfológico de frutos y semillas: a)r fruto verde, b) fruto maduro, c) semillas frutos verdes cona cáscara, d) semillas frutos maduros con cáscara, e) endospermos6 semillas verdes, f) endospermos semillas maduras..

Fuente:E Autor s t

u d i o 27 m

a c r o

Tabla VII. Resultados del análisis estadístico de los parámetros macromorfológicos de frutos y semillas de Mimusops sp.

CÁLCULOS ESTADÍSTICOS PARÁMETROS (cm) DESVIACIÓN VALOR CV MEDIO ESTÁNDAR FV 2,978 0,184 0,061 LARGO FRUTO FM 2,899 0,214 0,073 ENTERO FV 3,148 0,251 0,083 ANCHO FM 2,970 0,258 0,086 SV 1,663 0,138 0,054 LARGO SEMILLA CON SM 1,790 0,097 0,009 CÁSCARA SV 1,156 0,214 0,080 ANCHO SM 1,208 0,097 0,080 EV 1,426 0,092 0,064 LARGO EM 1,439 0,095 0,066 ENDOSPERMO EV 1,006 0,076 0,074 ANCHO EM 0,915 0,091 0,076

El fruto es redondeado, contiene una o dos semillas, con dimensiones de 2,97 cm de largo y 3,14 de ancho cuando está verde, reduciendo su tamaño al madurar a 2,89 de largo y 2,97 de ancho.

Las semillas con cáscara son de color café oscuro de 1, 66 cm de largo por 1,15 cm de ancho cuando el fruto es verde y de 1,79 x 1,20 cm, cuando el fruto es maduro, con un aumento de dimensiones al madurar el fruto.

Gopalkrishnan & Shimpi, (2010), informaron para M elengi que la cáscara de las semillas era de color marrón claro a negruzco, con medidas de 1,7-1,9 cm de largo y 1,2-1,5 cm de ancho, lo cual difiere con las obtenidas para la especie estudiada.

El endospermo presentó dimensiones de 1,42 x 1,00 cm cuando procedía de frutos verdes y de 1,43 x 0,91 cm cuando procedía de frutos maduros, disminuyendo en este caso su grosor.

Como se puede observar, existe diferencia significativa entre los parámetros evaluados de los frutos enteros y sus semillas al madurar.

III.2 Determinación de los Parámetros Físico-Químicos

A las semillas de la especie se le determinaron los parámetros físico-químicos de calidad, como: humedad residual, cenizas totales, sustancias solubles en hexano, en etanol al 98% y en agua; los resultados se exponen en la tabla VIII.

Se observó valores de cenizas totales bajos, comparadas a las informadas para M elengi por Gopalkrishnan & Shimpi, (2010), los frutos maduros presentaron valores de cenizas algo superiores a los verdes. El porcentaje de pérdida en peso fue elevado, ya que las semillas se emplearon frescas, aunque para las semillas de los frutos verdes, fue ligeramente superior. Con respecto a las sustancias solubles se observó que en el agua se obtuvo los porcentajes más altos, seguido del alcohol y el hexano, lo que demuestra la naturaleza mayoritariamente polar de los componentes, los valores obtenidos para las semillas de los frutos maduros son en todos los casos inferiores a los de los frutos verdes, lo que sugiere pérdidas durante el proceso de maduración.

Gopalkrishnan & Shimpi, (2010), estudiando el endospermo de las semillas de M elengi, obtuvieron valores inferiores a los encontrados para esta especie. Estos autores informaron valores de sustancias extraíbles en agua inferiores a los de etanol, aunque similar a este estudio encontraron que las sustancias extraíbles en cloroformo (disolvente apolar), eran menores.

Tabla VIII. Resultados físico-químicos de las semillas de Mimusops sp.

PORCENTAJE PARÁMETRO SV SM PÉRDIDA EN PESO (%) 60,10 59,90 CENIZAS TOTALES (%) 0,40 0,50 SUSTANCIAS SOLUBLES EN HEXANO (%) 3,20 2,11 SUSTANCIAS SOLUBLES EN ETANOL AL 98% (%) 24,00 14,00 SUSTANCIAS SOLUBLES EN AGUA (%) 32,61 31,82

El estudio se complementó con los ensayos de tamizaje fitoquímico, cuyos resultados se resumen en la tabla IX.

Tabla IX. Tamizaje fitoquímico de las semillas de Mimusops sp.

EXTRACTO ETÉREO RESULTADO ENSAYO METABOLITO SV SM SUDÁN ACEITES Y GRASAS ++ ++ LACTONAS Y BALJET + - COUMARINAS LIEBERMANN- TRITERPENOS- + ++ BUCHARD ESTEROIDES DRAGENDORFF ALCALOIDES - - EXTRACTO ACUOSO RESULTADO ENSAYO METABOLITO SV SM DRAGENDORFF ALCALOIDES + + FEHLING AZ. REDUCTORES + + ESPUMA SAPONINAS + - SHINODA FLAVONOIDES - - CLORURO FÉRRICO TANINOS - - BALJET LACTONAS - - NINHIDRINA AMINOÁCIDOS + + MUCÍLAGOS MUCÍLAGOS AMARGO AMARGO EXTRACTO ALCOHÓLICO RESULTADO ENSAYO METABOLITO SV SM DRAGENDORFF ALCALOIDES + + BALJET LACTONAS - - LIEBERMANN- TRITERPENOS- + + BUCHARD ESTEROIDES FEHLING AZ. REDUCTORES + + ESPUMA SAPONINAS - - SHINODA FLAVONOIDES - - CLORURO FÉRRICO TANINOS - - CATEQUINAS CATEQUINAS - - RESINAS RESINAS - + ANTOCIANIDINA ANTOCIANIDINA + + BORNTRAGER QUINONAS - - NINHIDRINA AMINOÁCIDOS + +

Se observaron algunas diferencias en la composición cualitativa entre las semillas verdes y las maduras entre ellas la ausencia de lactonas y coumarinas y saponinas en las semillas de los frutos maduros y en los frutos maduros se logró obtener la aparición de resinas en comparación en los frutos verdes las cuales estuvieron ausentes.

Los metabolitos que se obtuvieron como resultado positivo se los representa con el símbolo más y para los negativos con el símbolo negativo. Para los resultados positivos se le dio un rango máximo hasta 4 símbolos, dependiendo de la intensidad de color y precipitado que se haya obtenido.

Los metabolitos que resultaron positivos para los frutos verdes y maduros fueron: aceites y grasas, lactonas, coumarinas y triterpenos-esteroides para el extracto etéreo; alcaloides, triterpenos-esteroides, compuestos reductores, antocianidina y aminoácidos para el extracto alcohólico: alcaloides, compuestos reductores y saponinas para el extracto acuoso.

Para M. elengi se han informado como metabolitos secundarios: terpenoides, mucílagos, antraquinonas, glicósidos cardiotónicos, saponinas y taninos (Gopalkrishnan & Shimpi, 2010). Las cuales en el tamizaje fitoquímico se obtuvo una gran parte de estos metabolitos secundarios.

Las saponinas han sido aisladas de los frutos por diferentes autores, señalados en el capítulo de antecedentes.

III.3 Extracción y Análisis del Aceite de las Semillas

A partir de los endospermos de las semillas del fruto verde y maduro, se obtuvieron los aceites fijos por el método de Soxhlet, empleando hexano como disolvente. Los rendimientos de los mismos se exponen en la tabla X.

Tabla X. Rendimiento en aceite fijo del endospermo de las semillas de los frutos verdes y maduros de Mimusops sp.

SEMILLAS MADURAS 1,710

RENDIMIENTO DE ACEITE (%)

SEMILLAS VERDES 1,494

Se observó un mayor rendimiento en aceite fijo para los frutos maduros con un 1,71 % y de color café claro, a diferencia de las semillas verdes que rindieron un 1, 49 % de un aceite de color café oscuro.

En un estudio realizado por Castro y Coronel, (2016), en frutos recolectados en febrero de 2016 en la misma zona de estudio se encontró un rendimiento de 1,25 % para las semillas de los frutos maduros y 0,86 % para las de los frutos verdes, lo cual parece un comportamiento normal, es decir que al madurarse los frutos se incrementa el rendimiento de aceite. En las diferencias en los rendimientos influye la época de cosecha, ya que en este estudio la colecta se realizó en el mes de agosto.

Los aceites obtenidos fueron sometidos a saponificación para separar la fracción de compuestos saponificables (ácidos grasos) de los compuestos insaponificables para realizar su caracterización por CG-EM.

III.4 Análisis de los aceites de las semillas por el sistema acoplado Cromatografía Gaseosa- Espectrometría de Masas.

Análisis de las fracciones saponificables

El análisis de los aceites de las semillas por el sistema acoplado CG-EM de las fracciones saponificables de los frutos se presentan en la figura 7

Figura 7. Cromatograma (CG-EM) de una fracción saponificable del aceite de las semillas de los frutos Mimusops sp, a) semillas fruto maduro, b) semillas fruto verde

Se pudo apreciar que existían algunas diferencias entre los perfiles cromatográficos de las fracciones de ácidos grasos de los frutos verdes y maduros, habiendo una mayor abundancia de compuestos en la fracción saponificable de los frutos maduros.

La asignación estructural de los compuestos presentes en la fracción se llevó a cabo por comparación de los espectros de masas obtenidos con los de la biblioteca del equipo, seleccionando aquellos que presentaron un factor de similitud mayor al 95%. Los resultados se presentan en la tabla XI.

Tabla XI. Compuestos identificados en la fracción de compuestos saponificables de las semillas de los frutos verdes y maduros de Mimusops sp

FRACCIÓN SAPONIFICABLE FRUTOS FRACCIÓN SAPONIFICABLE FRUTOS MADUROS VERDES tr tr %* # Compuesto % * Compuesto (min) (min) 1 19,26 ácido 7.21 19,26 ácido 28.01 Hexadecanoico Hexadecanoico 2 26,11 ácido 8,11- 2.51 26,10 ácido 8,11- 12.33 Octadecadienoico Octadecadienoico ácido 9- 26,45 ácido 9- 46.21 3 26,45 12.26 Octadecenoico Octadecenoico ácido 27,67 ácido 7.35 4 27,66 1.73 Octadecanoico Octadecanoico 5 34,88 Tricosano 1.25 6 37,73 NI 8.88 7 38,87 Tetracosano 2.33

8 42,75 Pentacosano 2.89 42,21 NI 2.16

9 46,50 Hexacosano 4.68

10 50,12 Eicosano 8.28 Acetato de 11 51,23 20.80 β-amirina Urs-12-en-24-oic 12 51,84 5.09 acid, 3 oxo 13 53,63 Escualeno 12.83 53,68 Escualeno 3.91

14 57,38 Eicosano 9.19

Leyenda: * Abundancia relativa

En la fracción de los frutos maduros, fueron identificados 13 compuestos, de los cuales la β- amirina fue el mayoritario, aunque otros como: ácido Hexadecanoico (palmítico) 7,21%; ácido 9-Octadecenoico (ácido oleico) 12,26 %; Eicosano 8,28 %; Escualeno 12,83 % y Eicosano 9,19 %, presentaron una abundancia relativa media.

En la fracción de los frutos verdes, sólo se identificaron cinco compuestos, todos ellos presentes en los frutos maduros, pero con abundancias relativas muy superiores. El compuesto de mayor abundancia fue el ácido oleico, con 46,21 %, seguidas del ac. esteárico 28,01 %, ácido 8,11- Octadecadienoico 12,33% y el ácido Octadecanoico (esteárico) 7,35 %.

Resultados similares fueron obtenidos por Castro & Coronel, (2016), con algunas variaciones cuali y cuantitativa, aunque con coincidencia en los compuestos mayoritarios.

Análisis de las fracciones insaponificables

Para las fracciones de compuestos insaponificables, los respectivos cromatogramas por (CG-EM), se presentan en la figura 8.

A diferencia de lo planteado por Castro y Coronel, (2016), se encontraron algunas diferencias entre las fracciones de los frutos verdes y maduros, pero muchas similitudes. En total se pudieron asignar estructuras a 51 compuestos identificando a 39 de la fracción de los frutos verdes y 42 de los frutos maduros. En la fracción de los frutos verdes el componente mayoritario fue el éster etílico del ácido oleico (ácido 9-octadecenoico etil éster), con un 7,41 % de abundancia y en los frutos maduros presentó solamente un 2,61 %. También se encontró una moderada abundancia del ácido graso libre y de su éster metílico, lo cual es lógico si se tiene en cuenta que este ácido graso fue el de mayor abundancia en la fracción de compuestos saponificables. En la fracción de los frutos maduros los componentes mayoritarios fueron el esterol acetato de ciclolanosterol 6,25% y el ácido ursólico 5,55%, sólo presentes en esta fracción, al igual que los

triterpenoides acetato de α y β- amirinas 1,56 y 3,33% respectivamente. El hidrocarburo triterpeno acíclico escualeno fue otro compuesto con una abundancia de 5,14 % para la fracción de los frutos verdes y 4,96 % en los frutos maduros.

Cabe destacar, la presencia de hidrocarburos abundantes en la especie y el hecho de que la mayoría de los triterpenos y esteroles son principalmente componentes de la fracción de los frutos maduros. La composición determinada para ambas fracciones se presenta en la tabla XII.

Figura 8. Cromatograma (CG-EM) de una fracción insaponificable del aceite de las semillas de los frutos Mimusops sp, a) semillas frutos maduro, b) semillas fruto verde

Tabla XII. Componentes identificados en la fracción de compuestos insaponificables del aceite del endospermo de las semillas de los frutos verdes y maduros de Mimusops sp.

FRACCIÓN INSAPONIFICABLE FRUTOS FRACCIÓN INSAPONIFICABLE FRUTOS VERDES MADURO Tr Tr No COMPUESTO % * COMPUESTO %* (min) (min) 1 10,13 2-Decanona 0,28 2 13,60 2,4-Decadienal 0,16 13,58 2,4-Decadienal 0,17 3 14,75 2-undecenal 0,06 4 15,67 Tetradecano 0,11 15,68 Metil eugenol 0,06 5 20,54 Hexadecano 0,12 20,52 Hexadecano 0,04 6 21,21 .Difenil-metanona 0,17 7 21,80 Undecano 0,16 8 22,26 8-heptadeceno 0,20 22,25 8-heptadeceno 0,17 9 22,78 Heptadecano 0,16 10 23,78 Octanal 0,09 11 24,32 3 metil-heptadecano 0,06 12 24,79 1-octa-deceno 0,06 13 24,94 Octadecano 0,30 24,94 Octadecano 0,08 25,42 ácido tetradecanoico-1- 0,32 25,42 ácido tetradecanoico-1- 14 0,04 metil, etil éster metil, etil éster 15 26,99 n-nonadecano 0,41 26,99 n-nonadecano 0,32 27,48 ácido pentadecanoico 0,25 27,48 ácido pentadecanoico 16 0,28 metil éster metil éster 28,36 ácido hexadecanoico metil 1,06 28,41 ácido hexadecanoico metil 17 1,67 éster éster 18 28,96 n-eicosano 0,70 28,95 n-eicosano 0,46 30,64 ácido 9-12- 0,11 30,63 Ácido 9-12- 19 octadecadienoico metil octadecadienoico metil 0,21 éster éster 20 30,82 Heneicosano 1,22 30,82 Heneicosano 1,11 31,29 ácido octadecanoico metil 0,24 ácido octadecanoico metil 21 31,28 0,25 éster éster 31,69 ácido 9-octadecenoico 2,77 ácido 9-octadecenoico 22 31,68 1,94 trans trans 31,87 ácido 9,12- 1,71 ácido 9,12- 23 octadecadienoico etil éster 31,87 octadecadienoico etil 1,00 éster 32,02 ácido 9-Octadecenoico etil 7,41 ácido 9-Octadecenoico etil 24 32,00 2,61 éster éster 32,50 ácido octadecanoico etil 1,04 ácido octadecanoico etil 25 32,49 0,60 éster éster

26 32,63 Docosano 1,64 32,62 Docosano 1,23 27 33,85 14-β-pregnano 0,29 28 34,24 14-β-pregnano 0,36 29 34,91 14-β-pregnano 0,67 30 35,08 14-β-pregnano 0,21 35,06 14-β-pregnano 0,23

31 35,30 1-eicosene 0,50 32 35,40 tetracosano 0,74 35,38 tetracosano 0,68 33 36,37 Acetato de β-amirina 1,55 34 36,88 Acetato de α-amirina 3,33 n-pentacosano 35 37,60 3,92 37,60 1-octadeceno 3,23

36 38,1 n-pentacos-3-eno 1,08 38,1 n-pentacos-3-eno 0,84 37 38,45 n-pentacos-3-eno (isom) 0,76 38,45 n-pentacos-3-eno (isom) 0,54 38 38,55 tricosano 1,12 38,55 tricosano 0,89 39 39,13 hexacosano 3,41 39,13 hexacosano 2,54 40 39,45 z-12-pentacoseno 0,50 39,44 z-12-pentacoseno 0,42 41 39,97 tetracosano 0,55 39,96 tetracosano 0,46 42 40,38 1-hexacoseno 0,54 ácido Urs-12-en-24-oic -3- 43 40,60 5,55 oxo-metil éster

44 41,05 2,62 nonadecano 9,19-Ciclolanost-24-en-3- 45 41,39 6,25 ol, acetato 46 41,50 nonacosano 0,48 47 42,04 octadecano 1,29 48 42,16 Escualeno 5,14 42,16 Escualeno 4,96 49 42,45 Nonacosano 1,11 50 43,09 nonacosene 0,62 43,09 nonacosene 0,45 51 44,74 triacontano 0,68 44,72 triacontano 0,71 Leyenda: * Abundancia relativa

CAPÍTULO IV. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

IV.1 Conclusiones

Los resultados obtenidos permiten arribar a las siguientes conclusiones:

 Se observaron diferencias en el tamaño de los frutos y las semillas de acuerdo con el grado de maduración  En los parámetros físicos-químicos de las semillas se encontraron diferencias marcadas, presentando las semillas maduras, con excepción de las cenizas totales, valores inferiores de sustancias solubles y pérdida en peso.  En el tamizaje fitoquímico efectuado los metabolitos que resultaron positivos para la especie fueron: aceites y grasas, lactonas y coumarinas, triterpenos-esteroides, alcaloides, compuestos reductores, antocianidina, aminoácidos y saponinas. Entre las semillas de los frutos verdes y los maduros se observaron diferencias de intensidad en la reacción de Lierberman-Buchard para triterpenos y esteroides  El rendimiento del aceite de las semillas de los frutos maduros fue superior a la de las semillas de los frutos verdes, observándose también diferencias en su coloración.  Se encontraron diferencias cuali y cuantitativas en las fracciones de ácidos grasos y compuestos insaponificables de los frutos, en dependencia del grado de maduración. .

IV.2 Recomendaciones

 Profundizar en el estudio químico de los frutos, así como de las semillas en sus diferentes estados de maduración.  Profundizar en el estudio genético de la especie para lograr su caracterización definitiva  Profundizar un estudio complementario de los compuestos no identificados por la CG-EM de la fracción insaponificable, ya que pueden estar compuestos de gran interés.

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GLOSARIO Actinomorfo: (flor, vegetal) Que tiene dos planos de simetría, por lo menos

Androceo: Estructura reproductora masculina que consta del conjunto de los estambres de una flor.

Ápice: Extremo superior o punta de la hoja, del fruto, del pólipo, etc.

Cáliz: Verticilo externo en las flores con perianto heteroclamídeo, es decir, con dos clases de piezas.

Catequina: Antioxidante polifenólico que procede de las plantas en las cuales aparece como un metabolito secundario.

Coriácea: Hojas muy duras semejante al cuero en su aspecto y consistencia.

Corola: Conjunto de pétalos que forman la flor y protegen sus órganos de reproducción.

Dioico: Planta que tiene las flores unisexuales en tallos y troncos separados.

Drupa: Fruto carnoso de forma redondeada que tiene en su interior una única semilla envuelta en una capa leñosa dura o hueso.

Ebenales: Orden de dicotiledóneas metaclamídeas de flores diplostémonas o triplostémonas, a veces, por aborto, haplostémonas, o con estambres en número indefinido.

Endocarpio: Capa interna de las tres que forman el pericarpio de los frutos, que puede ser de consistencia leñosa, como el hueso del melocotón.

Fascículo foliar: Conjunto de hojas o de flores (inflorescencia) dispuestas de forma agrupada, desde una vaina que actúa como base común de dichas hojas o flores.

Glabra: Planta que está desprovisto de pelos y glándulas.

Lupeol: Principio activo triterpenoides.

Mimusops: Género de plantas en la familia Sapotaceae cuyos árboles son con jugo lechoso.

Monoicos: Especies en las cuales ambos sexos se presentan en una misma planta.

Ovario: Sector que contiene la cavidad seminal, esto es, la cavidad con los óvulos a fecundar.

Pantropical: Que se extiende por un territorio que incluye los países tropicales y subtropicales de todo el Mundo.

Pedicelo: Soporte delgado y alargado que sostiene una sola flor o un solo fruto.

Quercetina: Flavonol que se encuentra presente generalmente como O - glicósidos en altas concentraciones tanto en frutas como en verduras en especial en la cebolla.

Sapotácea: Familia de fanerógamas, en el orden Ebenales.

Sépalo: Hoja que forma el cáliz de una flor.

Sésil: Falta de un órgano que sirva de pie o soporte.

Tricomas: Apéndices epidérmicos con diversa forma, estructura y función. Su nombre proviene del griego trichos, que significa cabellera