รายงานวจิ ยฉบั ับสมบูรณ์

เรื่อง พนธั ุศาสตร์เซลล์ของปลาแมนดาริน(Synchiropus spp.) Cytogenetics of Madarinfish (Synchiropus spp.)

หัวหน้าโครงการวจิ ยั นางสาววรรณภา กสิฤกษ์ ผู้ร่วมวจิ ยั นายณฐวั ุฒ ิ เหลองอื ่อน รศ. ดร.อลงกลด แทนออมทอง

ได้รับทุนสนับสนุนการวจิ ยจากงบประมาณแผั ่นดนผิ ่านมหาวทยาลิ ยบั ูรพา ประจาปํ ีงบประมาณ 2556 สถาบันวทยาศาสตริ ์ทางทะเล มหาวทยาลิ ยบั ูรพา สิงหาคม 2557 กตติ กรรมประกาศิ

รายงานวจิ ยฉบั บนั ้ีไดร้ ับการจดสรรงบประมาณสนั บสนั ุนการวิจยั ทุนอุดหนุนการวิจยงบประมาณั เงินรายได ้ (เงินอุดหนุนรัฐบาล) มหาวิทยาลยบั ูรพา ประจาปํ ี 2556 ซ่ึงผวู้ ิจยใครั ่ขอขอบพระคุณอยางมาก่ ขอขอบพระคุณผอู้ านวยการํ และ เจาหน้ าท้ ี่ สถาบนวั ทยาศาสตริ ์ทางทะเลทุกท่านที่ช่วยอานวยํ ความสะดวกในการเขามาท้ างานวํ ิจยั และอนุเคราะห์การใชสถานท้ ี่และเครื่องมือในการทางานวํ ิจยั ขอขอบคุณคณะนิสิตนกศั ึกษาคณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลยขอนแกั ่นที่ใหความร้ ่วมมือช่วยเหลือ ในการทางานวํ ิจยนั ้ีเป็นอยางด่ ี คุณประโยชนท์ ี่มีในรายงานการวิจยฉบั บนั ้ี ผวู้ ิจยขอมอบเปั ็นกตเวทิตาแก่บิดา มารดา บูรพาจารย์ และผมู้ ีพระคุณทุกๆ ท่าน รวมท้งมหาวั ิทยาลยบั ูรพา และมหาวิทยาลยขอนแกั ่น

คณะผทู้ างานวํ จิ ยั วรรณภา กสิฤกษ ์ ณฐวั ฒุ ิ เหลืองอ่อน อลงกลด แทนออมทอง สิงหาคม 2557 ก

พนธั ุศาสตร์เซลล์ของปลาแมนดาริน(Synchiropus spp.)

บทคดยั ่อ

การศึกษาพนธั ุศาสตร์เซลลของปลาในวงศ์ ปลาแมนดาร์ ิน (วงศ์ Callionymidae) 3 ชนิด ไดแก้ ่ ปลาแมนดารินเขียว (Synchiropus splendidus) ปลาแมนดารินจุด (S. picturatus) และปลาสกูตเตอร์ (S. ocellatus) เตรียมโครโมโซมจากไตดวยว้ ิธีการบดขย้ีเซลล ์ และการเพาะเล้ียงเซลลเม์ ดเล็ ือดขาวทาการํ ยอมส้ ีโครโมโซมแบบธรรมดาและแถบสีแบบนอร์ ผลการศึกษาพบวาจ่ านวนโครโมโซมดํ ิพลอยดของปลา์ แมนดารินเขียวในเพศผเทู้ ่ากบั 39 แท่ง และในเพศเมีย 40 แท่ง ส่วนปลาแมนดารินจุด และปลาสกูตเตอร์มี ท้งในเพศผั ูและเพศเม้ ียเท่ากนคั ือ 40 แท่ง ปลาท้งสามชนั ิดมีจานวนโครโมโซมพํ ้ืนฐานเท่ากบั 40 โดย t t สามารถจดสั ูตรคาริโอไทป์ ไดด้ งนั ้ี ปลาแมนดารินเขียวเพศผ ู้ 2n (39) = L 8 + M 28 +X1X2Y เพศเมีย 2n (40) = t t t t t t t L 8 + M 28 +X1X1X2X2 ปลาแมนดารินจุด 2n (40) = L 14 + M 24 + S 2 และปลาสกตเตอรู ์ 2n (40) = L 16 + M 18 + t S 6 ปลาแมนดารินเขียวมีการกาหนดเพศระบบํ X1X1X2X2/X1X2Y สาหรํ ับปลาแมนดารินจุดและปลาสกตเตอรู ์ ตรวจไม่พบความแตกต่างของของคาริโอไทป์ ระหว่างปลาเพศผและเพศเมู้ ียการยอมแถบส้ ีแบบนอร์พบนอร์ 3 ตาแหนํ ่งในปลาแมนดารินเขียว สาหรํ ับปลาแมนดารินจุดและปลาสกตเตอรู ์พบตาแหนํ ่งนอร์ 2 ตาแหนํ ่ง จาก ขอม้ ูลเบ้ืองตนน้ ามาสรํ ้างแบบจาลองสมมตํ ิฐานสายวิวฒนาการของโครโมโซมั ทาใหํ ส้ ันนิษฐานไดว้ ่าปลา แมนดารินท้งั 3 ชนิดที่ศึกษาในคร้ังน้ีมาจากบรรพบุรุษร่วมที่มีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยดเท์ ่ากบั 48 แท่ง มี

จานวนโครโมโซมพํ ้ืนฐานเท่ากบั 48 และเป็นโครโมโซมชนิดเทโลเซนทริกท้งหมดั

คาสํ าคํ ญั : ปลาแมนดารินวงศ ์ Callionymidae, โครโมโซม, คาริโอไทป์

ข

Cytogenetics of Madarinfish (Synchiropus spp.)

ABSTRACT

Cytogenetics of three species of the some fishes (family Callionymidae) was studied such as Mandarin fish (Synchiropus splendidus), Picturesque dragonet (S. picturatus) and Ocellated dragonet (S. ocellatus). Chromosomes from kidney tissue and T-lymphocyte cell culture were prepared by breaking cell and followed by conventional staining and NOR-banding techniques. The result showed that diploid chromosome number (2n) of Mandarin fish as 39 in male and 40 in female, both male and female of Picturesque dragonet and Ocellated dragonet as 40 in equal. There were 40 fundamental numbers (NF) or chromosome arms in all species. The karyotypic formula of fishes can be shown as following: S. splendidus t t t t t 2n (39) = L 8 + M 28 +X1X2Y in male, 2n (40) = L 8 + M 28 +X1X1X2X2 in female, S. picturatus 2n (40) = L 14 + t t t t t M 24 + S 2 and S. ocellatus 2n (40) = L 16 + M 18 + S 6. The present discovery knowledge, the sex-chromosome

system of S. splendidus was X1X1X2X2/X1X2Y system, in which the X1, X2 and Y classified as large telocentric, medium telocentric and large metacentric chromosomes, respectively. No strange size chromosomes related to sex was observed in S. picturatusand S. ocellatus. The results showed that there were 3 positions of NORs in S. splendidus while S. picturatus and S. splendidus showed 2 positions with NORs. As a consequence the data above can be used to simulate the evolution hypothesis. The three fish species apparently evolved from a common ancestor of 48 telocentric chromosomes (NF = 48).

Key Words: Family Calloionymidae, chromosome, karyotype

ค

สารบัญ

เรื่อง หน้า

บทคดยั อ่ ก สารบญั ค สารบญภาพั จ สารบญตารางั ช บทที่ 1 บทนาํ 1.1 ความสาคํ ญและทั ี่มาของปัญหาที่ทาการวํ ิจยั 1 1.2 วตถั ุประสงคของโครงการว์ ิจยั 2 1.3 ขอบเขตของโครงการวิจยั 2 บทที่ 2 ตรวจสอบเอกสารงานวิจยั 2.1 การศึกษาพนธั ุศาสตร์เซลล ์ 3 2.2 อนุกรมวิธาน สัณฐานวิทยา และชนิดพนธั ุ์ของปลาวงศปลาแมนดาร์ ิน 4 2.3 การยอมแถบส้ ีบนโครโมโซม 4 2.4 การกาหนดเพศในปลาํ 7 2.5 รายงานการศึกษาพนธั ุศาสตร์เซลลของปลาวงศ์ Calloonymidae์ 10 บทที่ 3วิธีการวิจยั 3.1 การเกบต็ วอยั าง่ 11 3.2 การเตรียมโครโมโซม 11 3.3การเตรียมสไลดโครโมโซม์ และการยอมส้ ีโครโมโซม 13 3.4 การตรวจสอบโครโมโซม การจดคารั ิโอไทป์ และอิดิโอแกรมมาตรฐาน 13 บทที่ 4ผลการวิจยั 4.1 ปลาแมนดารินเขียว (Synchiropussplendidus) 16 4.2 ปลาแมนดารินจุด (Synchiropuspicturatus) 23 4.3 ปลาสกตเตอรู ์ (Synchiropusocellatus) 29 บทที่ 5สรุปและวิจารณ์ผลการวิจยั 5.1 สรุปผลการวิจยั 35 5.2 วิจารณ์ผลการวิจยั 36 ง

สารบัญ (ต่อ)

เรื่อง หน้า

เอกสารอางอ้ ิง 40 ภาคผนวก 42

จ

สารบัญภาพ

ภาพท ี่ หน้า ภาพที่ 4.1 ลกษณะปลาแมนดารั ินเขียว (Mandarin fish, Synchiropussplendidus)สเกลบาร์ 3 เซนติเมตร 17 ภาพที่ 4.2 เซลลเมทาเฟสโครโมโซม์ (ภาพบน) และคาริโอไทป์ (ภาพล่าง) ของปลา แมนดารินเขียว (Synchiropussplendidus)เพศผ ู้มีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยดเท์ ่ากบั 39 แท่ง ดวยว้ ิธีการยอมส้ ีแบบธรรมดา (สเกลบาร์ 10 ไมโครเมตร) 18 ภาพที่ 4.3เซลลเมทาเฟสโครโมโซม์ (ภาพบน) และคาริโอไทป์ (ภาพล่าง) ของปลา แมนดารินเขียว (Synchiropussplendidus)เพศเมีย มีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยด ์ เท่ากบั 40 แท่ง ดวยว้ ิธีการยอมส้ ีแบบธรรมดา (สเกลบาร์ 10 ไมโครเมตร) 19 ภาพที่ 4.4 เซลลเมทาเฟสโครโมโซมของปลาแมนดาร์ ินเขียว (Synchiropussplendidus)เพศผ ู้ มีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยด39์ แท่ง (ภาพบน) และเพศเมียมีจานวนโครโมโซมํ ดิพลอยด40์ แท่ง (ภาพล่าง) ดวยว้ ิธีการยอมแถบส้ ีแบบนอร์ (สเกลบาร์ 10 ไมโครเมตร) 20 ภาพที่ 4.5อิดิโอแกรมของปลาแมนดารินเขียว (Synchiropussplendidus) มีระบบการกาหนดเพศํ

แบบ X1X1X2X2/X1X2Yเพศผมู้ ีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยด39์ แท่ง และเพศเมีย มีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยด40์ แท่ง ดวยว้ ิธีการยอมส้ ีแบบธรรมดา 21 ภาพที่ 4.6 ลกษณะปลาแมนดารั ินจุด (Picturesque dragonet, Synchiropuspicturatus)สเกลบาร์ 3 เซนติเมตร 23 ภาพที่ 4.7เซลลเมทาเฟสโครโมโซม์ (ภาพบน) และคาริโอไทป์ (ภาพล่าง) ของปลาแมนดารินจุด (Synchiropuspicturatus)เพศผ ู้มีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยดเท์ ่ากบั 40 แท่ง ดวยว้ ิธีการ ยอมส้ ีแบบธรรมดา (สเกลบาร์ 10 ไมโครเมตร) 24 ภาพที่ 4.8เซลลเมทาเฟสโครโมโซม์ (ภาพบน) และคาริโอไทป์ (ภาพล่าง) ของปลาแมนดารินจุด (Synchiropuspicturatus)เพศเมีย มีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยดเท์ ่ากบั 40 แท่ง ดวย้ วิธีการยอมส้ ีแบบธรรมดา (สเกลบาร์ 10 ไมโครเมตร) 25 ภาพท่ี 4.9 เซลลเมทาเฟสโครโมโซมของปลาแมนดาร์ ินจุด (Synchiropuspicturatus)เพศผ ู้ (ภาพบน) และเพศเมีย (ภาพล่าง)มีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยดเท์ ่ากบั 40 แท่ง ดวย้ วิธีการยอมแถบส้ ีแบบนอร์ (สเกลบาร์ 10 ไมโครเมตร) 26 ฉ

สารบัญภาพ(ต่อ)

ภาพท ี่ หน้า ภาพที่ 4.10 อิดิโอแกรมของปลาแมนดารินจุด (Synchiropuspicturatus) มีจานวนโครโมโซมํ ดิพลอยดเท์ ่ากบั 40 แท่ง ดวยว้ ิธีการยอมส้ ีแบบธรรมดา 27 ภาพที่ 4.11 ลกษณะปลาสกั ตเตอรู ์ (Ocellated dragonet, Synchiropusocellatus)สเกลบาร์ 1 เซนติเมตร 29 ภาพที่ 4.12เซลลเมทาเฟสโครโมโซม์ (ภาพบน) และคาริโอไทป์ (ภาพล่าง) ของปลาสกตเตอรู ์ (Synchiropusocellatus)เพศผ ู้มีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยดเท์ ่ากบั 40 แท่ง ดวย้ วิธีการยอมส้ ีแบบธรรมดา (สเกลบาร์ 10 ไมโครเมตร) 30 ภาพที่ 4.13เซลลเมทาเฟสโครโมโซม์ (ภาพบน) และคาริโอไทป์ (ภาพล่าง) ของปลาสกตเตอรู ์ (Synchiropusocellatus)เพศเมีย มีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยดเท์ ่ากบั 40 แท่ง ดวย้ วิธีการยอมส้ ีแบบธรรมดา (สเกลบาร์ 10 ไมโครเมตร) 31 ภาพที่ 4.14 เซลลเมทาเฟสโครโมโซมของปลาสก์ ตเตอรู ์ (Synchiropusocellatus)เพศผ ู้(ภาพบน) และเพศเมีย (ภาพล่าง)มีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยดเท์ ่ากบั 40 แท่ง ดวยว้ ิธีการยอม้ แถบสีแบบนอร์(สเกลบาร์ 10 ไมโครเมตร) 32 ภาพที่ 4.15 อิดิโอแกรมของปลาสกตเตอรู ์ (Synchiropusocellatus) มีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยด ์ เท่ากบั 40 แท่ง ดวยว้ ิธีการยอมส้ ีแบบธรรมดา 33

ช

สารบัญตาราง

ตารางท ี่ หน้า ตารางที่ 2.1รายงานการศึกษาพนธั ุศาสตร์เซลลของวงศ์ ปลาแมนดาร์ ิน (Callionymidae) 10 ตารางที่ 4.1 คาเฉล่ ี่ยความยาวของแขนโครโมโซมขางส้ ้นั (short arm; Ls), ความยาวของแขน โครโมโซมขางยาว้ (long arm; Ll), ความยาวท้งหมดของโครโมโซมแตั ่ละคู ่ (total length; LT), คา่ relative length (RL), คา่ centromeric index (CI), คาเบ่ ี่ยงเบน มาตรฐาน (standard deviation, SD) ของคา่ RL, CI ขนาดและชนิดของโครโมโซม แต่ละแท่งจากเซลลระยะเมทาเฟส์ ของปลาแมนดารินเขียว (Synchiropussplendidus) เพศผและเพศเมู้ ียจานวนํ 20 เซลลม์ ีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยดเท์ ่ากบั 39 แท่งใน เพศผ ู้และ 40 แท่งในเพศเมีย 22 ตารางที่ 4.2 คาเฉล่ ี่ยความยาวของแขนโครโมโซมขางส้ ้นั (short arm; Ls), ความยาวของแขน โครโมโซมขางยาว้ (long arm; Ll), ความยาวท้งหมดของโครโมโซมแตั ่ละคู ่ (total length; LT), คา่ relative length (RL), คา่ centromeric index (CI), คาเบ่ ี่ยงเบน มาตรฐาน (standard deviation, SD) ของคา่ RL, CI ขนาดและชนิดของโครโมโซม แต่ละแท่งจากเซลลระยะเมทาเฟส์ ของปลาแมนดารินจุด (Synchiropuspicturatus) เพศผและเพศเมู้ ียจานวนํ 20 เซลลม์ ีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยดเท์ ่ากบั 40 แท่ง 28 ตารางที่ 4.3 คาเฉล่ ี่ยความยาวของแขนโครโมโซมขางส้ ้นั (short arm; Ls), ความยาวของแขน โครโมโซมขางยาว้ (long arm; Ll), ความยาวท้งหมดของโครโมโซมแตั ่ละคู ่ (total length; LT), คา่ relative length (RL), คา่ centromeric index (CI), คาเบ่ ี่ยงเบน มาตรฐาน (standard deviation, SD) ของคา่ RL, CI ขนาดและชนิดของโครโมโซม แต่ละแท่งจากเซลลระยะเมทาเฟส์ ของปลาสกตเตอรู ์ (Synchiropusocellatus) เพศผ ู้ และเพศเมียจานวนํ 20 เซลลม์ ีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยดเท์ ่ากบั 40 แท่ง 34 ตารางที่ 5.1 ผลการศึกษาลกษณะของคารั ิโอไทป์ ในปลาแมนดาริน (วงศCallionymidae)์ ที่ได ้ จากการศึกษาในคร้ังน้ี เปรียบเทียบกบรายงานการศั ึกษาที่มีมาก่อนหนาน้ ้ี 39

šš¸É 1 šœÎµ

1.1 ‡ªµ¤­Îµ‡´Â¨³š¸É¤µ °Šž´®µš¸ÉšÎµ„µ¦ª·‹´¥ ž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁžÈœž¨µš¸É¤¸­¸­´œ‹´—‹oµœÂ¨³¨ª—¨µ¥š¸ÉŽ´Žo°œ ‹¹ŠšÎµÄ®oÁžÈœž¨µš¸É¤¸‡ªµ¤Ã——Á—nœ ­ª¥Šµ¤ÁžÈœš¸Éœ·¥¤Á¨¸Ê¥ŠÄœ®¤¼nœ´„Á¨¸Ê¥Šž¨µ­ª¥Šµ¤Äœž¦³Áš«Åš¥ Ž¹ÉŠ‡ªµ¤˜o°Š„µ¦—´Š„¨nµª¤¸Ÿ¨šÎµÄ®o¤¸„µ¦ ‹´ž¨µ‹µ„›¦¦¤µ˜·„´œ¤µ„ ¹Êœ„°ž¦„´­£µ¡›¦¦¤µ˜·š¸ÉÁž¨¸É¥œÂž¨ŠÅžÂ¨³„µ¦»„¦»„šÎµ¨µ¥¡ºÊœš¸ÉÁžÈœ ™·Éœ°µ«´¥­nŠŸ¨Ä®o‹Îµœªœž¦³µ„¦ °Šž¨µÁ¦·É¤¨—œo°¥¨Š™¹ŠÂ¤oªnµž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹³Å¤n‹´—°¥¼nĜ„¨»n¤­´˜ªrš¸É Ą¨o‹³­¼¡´œ›»r˜n™oµÅ¤n¤¸„µ¦°œ»¦´„¬rŪoĜ°œµ‡˜„Ȥ¸Ã°„µ­š¸É‹³­¼¡´œ›»rŗo¨³ÁœºÉ°Š‹µ„ž¨µÂ¤œ—µ¦·œ Ťn¤¸™·Éœš¸É°¥¼n°µ«´¥Äœž¦³Áš«Åš¥‹¹Š‹ÎµÁžÈœ˜o°ŠœÎµÁ oµ‹µ„˜nµŠž¦³Áš«šÎµÄ®ož¦³Áš«Åš¥˜o°ŠÁ­¸¥—»¨Å¤n¤µ„„È œo°¥šµŠ‡–³Ÿ¼oª·‹´¥­™µ´œª·š¥µ«µ­˜¦ršµŠš³Á¨¤®µª·š¥µ¨´¥¼¦¡µŗošÎµ„µ¦š—¨°ŠÁ¡µ³Á¨¸Ê¥Šž¨µ ¤œ—µ¦·œÂ¨³¡ªnµž¨µÂ¤œ—µ¦·œ¤¸«´„¥£µ¡Äœ„µ¦š¸É‹³œÎµ¤µšÎµ„µ¦Á¡µ³Á¨¸Ê¥ŠÅ—o—oª¥Á®˜»Ÿ¨š¸É„¨nµª¤µ oµŠ˜oœš´ÊŠ®¤—šµŠ‡–³Ÿ¼oª·‹´¥‹¹Š­œÄ‹š¸É‹³šÎµ„µ¦Á¡µ³Á¨¸Ê¥ŠÂ¨³ ¥µ¥¡´œ›»rž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ¡ºÉ°Äož¦³Ã¥œr ĜÁ·Š°œ»¦´„¬r¨³Á·Š¡µ–·¥r˜n°Åž ¤¸„µ¦«¹„¬µ¡´œ›»«µ­˜¦rÁŽ¨¨r°¥nµŠ„ªoµŠ ªµŠÄœ­´˜ªr®¨µ¥œ·—šÎµÄ®o¤¸„µ¦¡´•œµÁš‡œ·‡®¨µ¥Ç °¥nµŠÁ¡ºÉ°Ä®o„µ¦ª·‹´¥Å—o¦¦¨»Ÿ¨š¸É˜o°Š„µ¦¦ª¤™¹Š„µ¦ž¦´Áš‡œ·‡Ä®oÁ oµ„´œ·—­´˜ªrš¸É«¹„¬µÁœºÉ°Š‹µ„ª·›¸„µ¦ ¨³­µ¦Á‡¤¸š¸ÉÁ®¤µ³­¤­Îµ®¦´ÄoĜ­´˜ªr˜n¨³œ·—ŤnÁ®¤º°œ„´œ„µ¦«¹„¬µ ¡´œ›»«µ­˜¦rÁŽ¨¨rĜ„¨»n¤ž¨µ š³Á¨Äœž¦³Áš«Åš¥¥´Š¤¸œo°¥¤µ„‹Îµœªœ¤µ„œ·—¥´ŠÅ¤n¤¸ o°¤¼¨Äœ¦³—´­µ„¨ž´‹‹»´œ„µ¦«¹„¬µšµŠ ¡´œ›»«µ­˜¦rÁŽ¨¨rĜž¨µš³Á¨„ε¨´ŠÁžÈœš¸É­œÄ‹ °Šœ´„¡´œ›»«µ­˜¦rÁœºÉ°Š‹µ„ o°¤¼¨š¸Éŗo­µ¤µ¦™ÄoÁžÈœ Á‡¦ºÉ°Š¤º°Á¡·É¤Á˜·¤­Îµ®¦´„µ¦‹´—‹ÎµÂœ„šµŠ°œ»„¦¤ª·›µœ (taxonomy) Ĝ„¦–¸š¸É¤¸‡ªµ¤¥»nŠ¥µ„Äœ„µ¦‹´— ‹ÎµÂœ„ o°¤¼¨—oµœÁ®¨nµœ¸Ê¥´Šnª¥Ä®oÁ¦µÁ oµÄ‹ª·™¸„µ¦Á„·—ª·ª´•œµ„µ¦ °Š„¨»n¤­´˜ªr¤¸„¦³—¼„­´œ®¨´ŠÁœºÉ°Š‹µ„ ž¨µÁžÈœ‹»—Á¦·É¤˜oœ °Š­´˜ªr¤¸„¦³—¼„­´œ®¨´Šž¨µ®¨µ¥œ·—¤¸‡ªµ¤Â˜„˜nµŠŸ´œÂž¦šµŠ—oµœ¡´œ›»„¦¦¤ ‡n°œ oµŠ¤µ„„µ¦ª·Á‡¦µ³®r¨´„¬–³Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤Â¨³Äœ¦³—´¥¸œ­µ¤µ¦™šÎµÄ®oÁ¦µÁ oµÄ‹„¦³ªœ„µ¦Á„·— ­·ÉŠ¤¸¸ª·˜œ·—Ä®¤n (speciation) „µ¦ž¦´ž¦»Š­µ¥¡´œ›»r¨³„µ¦Á¡µ³Á¨¸Ê¥Šž¨µš³Á¨¥´Š­µ¤µ¦™Äo‡ªµ¤¦¼o šµŠ—oµœ¡´œ›»«µ­˜¦rÁŽ¨¨rÁ oµnª¥„µ¦‡´—Á¨º°„¡n°¡´œ›»r¤n¡´œ›»rž¨µš³Á¨¨³„µ¦ª·Á‡¦µ³®r‡ªµ¤Âž¦ž¦ªœ šµŠ¡´œ›»„¦¦¤ °Šž¨µš³Á¨¦ª¤™¹Š„µ¦°œ»¦´„¬r®¨nŠ¡´œ›»„¦¦¤Äœ›¦¦¤µ˜·

2

1.2 ª´˜™»ž¦³­Š‡r °ŠÃ‡¦Š„µ¦ª·‹´¥ 1.2.1 Á¡ºÉ°¦³»œ·— °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œš¸ÉœÎµ¤µ‹µ„®¨nŠš¸É¤µ˜nµŠÇ„´œ—oª¥¨´„¬–³­´–“µœª·š¥µ¨³ ª·›¸„µ¦šµŠ¡´œ›»«µ­˜¦rÁŽ¨¨r 1.2.2 Á¡ºÉ°šÎµ„µ¦Áž¦¸¥Áš¸¥‹Îµœªœ (diploid number, 2n) œ·— (type) œµ— (size) °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤ ‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤¡ºÊœ“µœ (fundamental number, NF) ¨³Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤Á‡¦ºÉ°Š®¤µ¥ (chromosome marker) °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œ 1.2.3 Á¡ºÉ°‹´—‡µ¦·Ã°Åšžr (karyotype) ¤µ˜¦“µœ °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œ 1.2.4 Á¡ºÉ°ÁžÈœ o°¤¼¨¡ºÊœ“µœš¸É­Îµ‡´­Îµ®¦´„µ¦«¹„¬µ—oµœ„µ¦ž¦´ž¦»Š­µ¥¡´œ›»r„µ¦‡´—Á¨º°„¡n°¤n ¡´œ›»rž¨µ Á¡ºÉ°„µ¦Á¡µ³Á¨¸Ê¥Š„µ¦°œ»¦´„¬r®¨nŠ¡´œ›»„¦¦¤Äœ›¦¦¤µ˜·

1.3 °Á ˜ °ŠÃ‡¦Š„µ¦ª·‹´¥ šÎµ„µ¦«¹„¬µ­´–“µœª·š¥µ¨³¡´œ›»«µ­˜¦rÁŽ¨¨r °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹µ„®¨nŠš¸É¤µ˜nµŠÇ„´œ¨³ ‹µ„¨¼„¡´œ›»rš¸ÉÁ¡µ³Á¨¸Ê¥ŠÅ—o

บทท ี่ 2 การตรวจสอบเอกสารงานวจิ ัย

2.1 การศึกษาพนธั ุศาสตร์เซลล์ พนธั ุศาสตร์เซลล์ (cytogenetics) เป็นการศึกษาโครโมโซม (chromosomes) ซ่ึงเป็นหน่วย โครงสร้างที่สาคํ ญในการถั ่ายทอดพนธั ุกรรมของเซลล ์ การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของโครโมโซมยอมม่ ีผล โดยตรงต่อการถ่ายทอดลกษณะทางพั นธั ุกรรม ทาใหํ เก้ ิดการแสดงออกในส่ิงมีชีวิตในรูปแบบที่จาเพาะตํ วั และแตกต่างกนั มีผลต่อการเจริญพฒนาและวั ิวฒนาการของสั ่ิงมีชีวิต (อมรา คมภั ิรานนท,2546)์ ดงนั ้ัน การศึกษาเกี่ยวกับพันธุศาสตร์เซลล์จะทาใหํ ้ทราบถึงความแตกต่างผนแปรทางพั นธั ุกรรมในระดับ โครโมโซมของส่ิงมีชีวิตแต่ละชนิด ตลอดจนทราบถึงความสัมพนธั ์ทางสายวิวฒนากรั อีกท้งยั งสามารถั ประยุกตใช์ ในการศ้ ึกษาดานอ้ ื่น ๆ เช่น การปรับปรุงพนธั ุ์ การจดจั าแนกชนํ ิด และการบริหารจดการและั อนุรักษความหลากหลายทางพ์ นธั ุกรรม เพื่อก่อใหเก้ ิดความมนคงของฐานความหลากหลายทางช่ั ีวภาพ และ นาไปสํ ู่การใชประโยชน้ ์อยางย่ นย่ั นจากตื นท้ ุนความหลากหลายทางชีวภาพในที่สุด การศึกษาโครโมโซมเพื่อตรวจจานวนํ และรูปร่างของโครโมโซมมีหลายวิธีแต่ละวิธีจะเลือกเอา เซลลระยะเมทาเฟส์ (metaphase) เพราะเป็นระยะที่มีโครโมโซมหดส้ันมากที่สุดเห็นลกษณะไดั ช้ ดเจนั เพื่อที่จะเก็บเกี่ยวเซลลในระยะเมทาเฟส์ ไดน้ าสารโคลชํ ิซิน(colchicines) ซ่ึงเป็นสารสกดจากพั ืชสกุล Colchicumมาใชเพ้ ื่อยบยั ้งการสรั ้างสายใยสปินเดิล(spindle fiber) ทาใหํ เซลล้ ท์ ี่มีการแบ่งตวไมั ่สามารถเขาส้ ู่ ระยะแอนาเฟส (anaphase) ได้ วิธีการเตรียมโครโมโซมแบ่งไดเป้ ็น 2 วิธี คือ วิธีโดยตรง (direct chromosome preparation) เป็นวิธีที่เลือกเอาเซลลในร์ ่างกายที่กาลํ งมั ีการแบ่งตวมาศั ึกษาโครโมโซม เป็น เซลลท์ ่ียงอั ่อนและยงมั ีการแบ่งตวอยั ตลอดเวลาู่ เช่น เซลลเม์ ดเล็ ือดจากไขกระดูก (bone marrow) อีกวิธี คือ วิธีโดยออม้ (indirect chromosome preparation) จะเลือกเซลลในร์ ่างกายชนิดที่สามารถนามาเพาะเลํ ้ียงใน อาหารเล้ียงเซลลภายนอกร์ ่างกาย (in vitro) ใหเซลล้ ม์ ีการแบ่งตวั (อมรา คมภั ิรานนท,์ 2546) การเพาะเล้ียงเซลลเพ์ ื่อเตรียมโครโมโซมเมื่อเกบเก็ ี่ยวเซลล ์ และหยดเซลลลงบนสไลด์ แล์ ว้ เพื่อให้ สามารถศึกษาโครโมโซมภายใตกล้ องจ้ ุลทรรศน์ไดอย้ างช่ ดเจนั โดยเห็นรูปร่างและนบจั านวนโครโมโซมํ ไดอย้ างถ่ ูกตอง้ จาเปํ ็นตองม้ ีการยอมส้ ีใหต้ ิดเฉพาะโครโมโซม ซ่ึงมีหลายวิธีใหเล้ ือกใชตามจ้ ุดประสงคของ์ การศึกษา (Halnan, 1989) การยอมส้ ีโครโมโซมแบบธรรมดา (conventional staining) จะใชส้ ียอมท้ ี่ติดกรด นิวคลีอิก (nucleic acid) โดยสีที่นิยมใชในการย้ อมโครโมโซมได้ แก้ ่ ออร์ซีน(orcein) คาร์มีน (carmine) และ จิมซ่า (Giemsa’s) ภาพโครโมโซมจะติดสีตลอดแท่งสามารถบอกจานวนํ และชนิดของโครโมโซมประจาํ ส่ิงมีชีวิตน้ัน ๆ ได้ และอาจบอกลักษณะบางอย่างของโครโมโซม เช่น รอยคอดที่หน่ึง (primary constriction) รอยคอดที่สอง (secondary constriction) และแซทเทลไลท(satellite)์ ปัจจุบนมั ีการพฒนาการั 4

ยอมแถบส้ ีแบบต่าง ๆ นอกจากการยอมส้ ีโครโมโซมแบบธรรมดาข้ึนมากมาย แต่ละวิธีปรับปรุงให้ เหมาะสมกบตั วอยั างเซลล่ ท์ ี่ใช ้

2.2 อนุกรมวิธาน สัณฐานวิทยา และชนิดพันธ์ุของปลาวงศ์ปลาแมนดาริน ปลาแมนดาริ นเดิมมีชื่อเรี ยกว่าCallionymussplendidusต่อมาภายหลังได้จัดอยู่ในสกุล (genus)Synchiropus มีชื่อสามญหลายชั ื่อไดแก้ ่ ปลาบู่แมนดาริน (Mandarin goby), ปลาแมนดารินเขียว (green Madarin), ปลาแมนดารินลาย (stripped Mandarin),stripped dragonet และ green dragonetปลาแมน ดารินจดอยั ในวงศู่ ์ (family)Callionymidaeซ่ึงประกอบไปดวย้ 10สกุลมีประมาณ182ชนิด (species)ในสกุล Synchiropusมีจานวนํ 51 ชนิดแบ่งเป็ น 10 สกุลย่อย (subgenera)ปลาแมนดารินจัดอยู่ในสกุลย่อย Synchiropus(Pterosynchiropus) การวิจยในครั ้ังน้ีทาในวงศํ ปลาแมนดาร์ ิน 3 ชนิด ไดแก้ ่ ปลาแมนดารินเขียว (Mandarin fish, Synchiropussplendidus)ปลาแมนดารินจุด (picturesque dragonet, Synchiropuspicturatus) และ ปลาสกตเตอรู ์ (ocellated dragonet, Synchiropusocellatus)

2.3 การย้อมแถบสีบนโครโมโซม การเตรียมโครโมโซมโดยการเพาะเล้ียงเซลล ์ เกบเก็ ี่ยวเซลลและหยดเซลล์ ลงบนสไลด์ ์ ทาการยํ อม้ สีโดยเลือกวิธีตามจุดประสงคของการศ์ ึกษา (Halnan, 1989) ดงนั ้ี การย้อมสีโครโมโซมแบบธรรมดา (conventional staining) ในช่วงเร่ิมแรกของการศึกษาพนธั ุศาสตร์เซลลของส์ ่ิงมีชีวิต จะใชว้ ิธีการยอมส้ ีแบบธรรมดาหรือแบบ ด้งเดั ิม ใชส้ ียอมท้ ี่ติดกรดนิวคลีอิกจึงเห็นโครโมโซมติดสีเขมท้ ้งแทั ่ง โดยสีที่นิยมใชได้ แก้ ่ ออร์ซีน(orcein) คาร์มีน (carmine) และสีที่นิยมมากที่สุด คือ จิมซ่า (Giemsa’s) สามารถบอกจานวนํ และชนิดของโครโมโซม ประจาสํ ่ิงมีชีวิตน้นั ๆ ได ้ และอาจบอกลกษณะบางอยั างของโครโมโซม่ เช่น รอยคอดที่หน่ึง รอยคอดที่สอง และแซทเทลไลท ์ การติดสีของโครโมโซมดงกลั ่าวบางคร้ังอาจพบวาม่ ีการติดสีไดไม้ ่เท่ากนั เช่นในขณะที่ โครโมโซมผานเข่ าส้ ู่วงชีพของเซลลจะม์ ีการยืดหดตวไมั ่เท่ากนั ระยะใดที่หดตวมากจะตั ิดสีเขมมาก้ แต่ถา้ หดตวนั ้อยก็จะติดสีจางกว่าอีกท้งในโครโมโซมแทั ่งเดียวกนยั งตั ิดสีไดไม้ ่เท่ากนขั ้ึนอยูก่ บองคั ประกอบ์ ของเฮเทอโรโครมาทิน(heterochromatin)และยโครมาทู ิน (euchromatin) การยอมส้ ีโครโมโซมแบบธรรมดา ในบางกรณีน้นอาจจะไมั ่สามารถจาแนกโครโมโซมไดํ เท้ ่าที่ควร คือไม่สามารถระบุแน่ชดไดั ว้ ่าเป็นโครโมโซม แท่งที่เท่าใด และจบคั ูไม่ ่ได ้ การย้อมแถบสีแบบควิ (Q-banding หรือ Quinacrine banding) วิธีน้ียอมโครโมโซมให้ ้เกิดแถบมืดและสว่างเป็นช่วง ๆ ตลอดความยาวแท่งโครโมโซมไดภายใต้ ้ กลองจ้ ุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต(fluorescence์ microscope) โดยใชส้ ียอมชน้ ิด Quinacrine mustard มีลกษณะั แถบที่เหมือนกับการยอมแถบส้ ีแบบซี และสามารถจาแนกความแตกตํ ่างของโครโมโซมทุกแท่งได ้ 5

โดยเฉพาะเซลลในระยะอ์ ินเตอร์เฟสของมนุษยน์ ้นเมั ื่อยอมด้ วยส้ ีชนิดน้ีจะทาใหํ โครโมโซมวายต้ ิดสีเขียวสวาง่ มากเรียกวา่ Y-chromatin หรือ Y-body จึงเป็นการตรวจโครโมโซมวายของมนุษยได์ อ้ ีกดวย้ นอกจากจะใช้ สี Quinacrine mustard ในการยอมแล้ ว้ ยงปรากฏมั ีสีอื่น ๆ ที่ยอม้ Q-band ไดเช้ ่นกนั คือ beziimidazole derivative และพบว่าส่วนที่ติดสีเขมเป้ ็นบริเวณที่มีเบส A-T มาก (มียีนทางานนํ อย้ ) ส่วนที่ติดสีจางเป็น บริเวณที่มีเบส G-C มาก (มียนที างานมากํ ) การย้อมแถบสีแบบซี (C-banding หรือ constitutive heterochromatinbanding หรือ centromeric banding) เป็นเทคนิคที่ทาใหํ ต้ ิดแถบสีเขมบร้ ิเวณ constitutive heterochromatin ซ่ึงเป็นบริเวณที่โครโมโซม ขดตวกั นแนั ่น และเป็นตาแหนํ ่งของดีเอ็นเอที่มีการเรียงตวของเบสทั ี่ซ้ากํ นั (repeated sequence ชนิด satellite DNA)และมีการจาลองตํ วเองชั าท้ ี่สุด ซ่ึงไดแก้ ่ บริเวณเซนโทรเมียร์ของเกือบทุก ๆ โครโมโซม ยกเวนโครโมโซมวาย้ นอกจากน้ียงพบบรั ิเวณเทโลเมียร์ของโครโมโซมบางแท่งอีกดวยเทคน้ ิคน้ีทาไดํ โดย้ ผานเซลล่ ระยะเมทาเฟสในกรดไฮโดรคลอร์ ิก (HCl) และโซเดียมไฮดรอกไซด ์ (NaOH) แลวอบเซลล้ ใน์ เกลือโซเดียมที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส ยอมด้ วยส้ ีจิมซ่า ส่วนของยโครมาทู ินจะไม่ติดสี แต่เฮเทอโรโคร มาทินจะติดสีเขม้ โดยโซเดียมไฮดรอกไซด์จะช่วยให้ดีเอ็นเอคลายจากเกลียวคู่เป็นสายเดี่ยว และเกลือ โซเดียมจะช่วยในการจบคั ู ่ คือพนเกลั ียวจากสายเดี่ยวเป็นสายคู ่ เทคนิคน้ีสามารถใชในการศ้ ึกษาโครโมโซม เพศ เพราะโครโมโซมวายจะไม่ติดสีเขมบร้ ิเวณเซนโทรเมียร์ หรือบริเวณ constitutive heterochromatin การย้อมแถบสีแบบอาร์(R-banding หรือ reverse banding) หลกการคั ือนาสไลดํ ไปอบในฟอสเฟต์ บฟเฟอรั ์ (phosphate buffer) pH 6.5 ที่อุณหภูมิสูง 80-90 องศาเซลเซียส แลวตามด้ วยการย้ อมส้ ีจิมซ่า ก็จะปรากฏแถบสีเขมและจาง้ เช่นเดียวกบแถบสั ีแบบคิว และ แถบสีแบบจี แต่แถบสีที่เกิดข้ึนจะตรงขามก้ บแถบสั ีแบบคิว และแถบสีแบบจี คือ แถบที่ติดสีเขมในแถบส้ ี แบบคิว และแถบสีแบบจีจะติดสีจางแทนในแถบสีแบบอาร์การยอมส้ ีแบบอาร์มกจะตั ิดสีเขมมากบร้ ิเวณเซน โทรเมียร์ บางคร้ังจึงเรียกการยอมส้ ีแบบน้ีว่าการยอมแถบส้ ีแบบที (T-banding) การยอมส้ ีแบบอาร์จะติดสี เขมมากบร้ ิเวณที่มีเบส G-C มาก (มียนที างานมากํ ) แต่บริเวณที่ยอมต้ ิดสีเขมของการย้ อมส้ ีแบบจีและคิวจะ ติดบริเวณที่มีเบส A-T มาก (มียนที างานนํ อย้ ) การยอมส้ ีแบบอาร์ยงชั ่วยยนยื นโรคทางพั นธั ุกรรมบางชนิด ของมนุษยได์ ถ้ ูกตองมากข้ ้ึน การย้อมแถบสีแบบนอร์ (NORs-banding) เป็นเทคนิคที่ทาใหํ ส้ ่วนnucleolar organizer regions (NORs) ติดสีเขม้ เรียกอีกอยางหน่ ่ึงวาเทคน่ ิค silver staining เพราะใชสารละลายซ้ ิลเวอร์ไนเตรต(silver nitrate) ซ่ึงจะเลือกติดบริเวณน้ีเท่าน้นั (Howell and Black, 1980) เทคนิคน้ีใชตรวจหา้ NORs ซ่ึงในสตวั ม์ ีกระดูกสันหลงสั ่วนน้ีมียนสี าหรํ ับสังเคราะห์ไรโบ โซมอลอาร์เอนเอชน็ ิด 18S และ 28S อย ู่ ในมนุษยจะอย์ ในบรู่ ิเวณรอยคอดที่สองของโครโมโซมคู่ที่ 13, 14, 15, 21 และ 22 ตาแหนํ ่งของ NORs น้ี อยบรู่ ิเวณกานของแซทเท้ ิลไลทโครโมโซม์ หรือบริเวณรอยคอดที่สอง 6

ของโครโมโซม จึงเรียกโครโมโซมที่มีรอยคอดที่สองน้ีว่าแซทเทลไลท์โครโมโซม NORs มีความ หลากหลาย (polymorphism) ไดในโครโมโซมแท้ ่งเดียวกนของบั ุคคลต่างกนั ซ่ึงใชเป้ ็นโครโมโซมเครื่องหมาย (marker chromosome หรือ marked chromosome) ไดและใช้ ในการต้ ิดตามดูพฤติกรรมการถ่ายทอดบาง ลกษณะของสั ่ิงมีชีวิตต่าง ๆ ได ้ซ่ึงการถ่ายทอดเป็นไปตามกฎของเมนเดล การย้อมแถบสีแบบจี (G-banding) เป็นเทคนิคที่นิยมทากํ นมากทั ี่สุด เพราะเป็นเทคนิคที่ทาไดํ ง้ ่าย และวสดั ุที่ใชย้ อมไม้ ่สิ้นเปลือง เทคนิคน้ีเหนี่ยวนาใหํ ้เกิดแถบโดยใช้สารเคมีที่สามารถย่อยโปรตีนที่เป็นองค์ประกอบของโครโมโซม สารเคมีที่นิยมใช ้ คือ เอนไซมทร์ ิปซิน(trypsin) แลวจ้ ึงยอมด้ วยส้ ีจิมซ่าตามปกติ ซ่ึงก่อนยอมไสด้ ต์ องเต้ ิม เอนไซมย์ อยโปรต่ ีน เช่น เอนไซมทร์ ิปซิน หรือบ่มสไลดใน์ saline-citrate ที่ร้อน แถบที่เห็นมี 2 แบบ คือ แถบมืด (dark bands) และแถบสวาง่ (light bands) หรือแถบสีเขมสล้ บกั บจางบนแทั ่งโครโมโซม กลไกการติด สีอาศยคั ุณสมบตั ิของความแตกต่างกนในองคั ประกอบของโปรต์ ีนที่อยบนโครโมโซมู่ จะติดสีไดด้ ีในส่วนของ เฮเทอโรโครมาทินที่โปรตีนมีกรดอะมิโนไลซีน (lysine) และอาร์จินีน (arginine) อยหนาแนู่ ่น สายดีเอนเอจะ็ พนกั นแนั ่น เอนไซม์ทริปซินจึงเขาไปย้ ่อยโปรตีนไดน้ ้อยบริเวณน้ีจึงติดสีเขม้ ทาใหํ ้เกิดแถบสีมืด ในทาง ตรงกนขั าม้ ส่วนที่เป็นยูโครมาทินในแท่งโครโมโซมจะไม่ค่อยติดสี เพราะสายดีเอ็นเออยู่อย่างหลวม ๆ เอนไซมทร์ ิปซินจึงเขาไปย้ อยโปรต่ ีนไดมากบร้ ิเวณจึงติดสีจาง โดยทวไปสไลด่ั ท์ ี่จะนามายํ อมแบบจ้ ี ควรทิ้งไว้ สกั 3-5 วนั ที่อุณหภูมิหอง้ หรือบ่มใน hot plate ที่อุณหภูมิ 56-60 องศาเซลเซียส นาน 16-18ชวโมง่ั หลงจากหยดั ตะกอนบนสไลด์ สไลดท์ ี่หยดไวนานต้ องใช้ เอนไซม้ ทร์ ิปซินที่เขมข้ นกว้ ่าหรือใชเวลาในการย้ อยนานกว่ ่า เพื่อที่จะให้ไดแถบโครโมโซมท้ ี่ชดั ซ่ึงในปฏิกิริยาน้ี เอนไซมทร์ ิปซินจะไปสลาย (hydrolizes) สายโพลีเปป ไทด ์ (polypeptide) บริเวณที่มีดานคาร้ ์บอกซิลของกรดอะมิโนอาร์จินีนและไลซีน การย้อมแถบสีแบบจีทใหี่ ้รายละเอยดสี ูง (high resolution G-banding) สาหรํ ับการยอมแถบส้ ีโดยทวไปจะใช่ั โครโมโซมในระยะเมทาเฟส้ ซ่ึงเป็นระยะที่ดีที่สุดในการ ยอมส้ ี ตรวจดูรูปร่าง เนื่องจากโครโมโซมหดส้ันที่สุด แต่มีขอจ้ ากํ ดในบางกรณั ีที่มีความตองการให้ ้ไดแถบส้ ี จานวนมากํ และมีรายละเอียดเพ่ิมข้ึน เพื่อความชัดเจนในการวิเคราะห์โรคทางพนธั ุกรรมบางโรค หรือ ตรวจสอบการเกิดการกลาย (mutation) ของชิ้นส่วนเล็ก ๆ บนโครโมโซม ดังน้ัน จึงได้มีการปรับปรุง เทคนิคการเพราะเล้ียงเซลล ์ และทาใหํ ้เซลลหย์ ดการแบุ ่งเซลลในระยะก์ ่อนเมทาเฟส (prometaphase) หรือ ปลายโพรเฟส (late prophase) ทาใหํ เซลล้ ในขวดเพาะเล์ ้ียงเกือบท้งหมดอยั ในระยะเดู่ ียวกนของวั ฏจั กรเซลลั ์ (synchronize)ใช้สารเคมี เช่น เมโทเทรกเซท (methotrexate) ไทมิดีน (thymidine) ฟลูออโรดีออกซียูริดีน (fluorodexyuridine) เป็นตน้ ซ่ึงจะทาใหํ ้ได้โครโมโซมที่ขนาดไม่หดส้ันมาก และไม่ยืดยาวเกินไป เรียก เทคนิคน้ีวาการย่ อมแถบส้ ีแบบจีที่ใหรายละเอ้ ียดสูง ในกรณีของเซลลเม์ ดเล็ ือดขาวจะเพาะเล้ียงเป็นเวลา 72- 96 ชวโมง่ั ในชวโมงท่ั ี่ 72 ใส่สารเมโทเทรกเซทเพื่อหยดเซลลุ ให์ อย้ ในระยะู่ S-phase เป็นเวลา 17 ชวโมง่ั ต่อมาจึงใส่ไทมิดีน เพื่อให้เซลลเข์ าส้ ู่วงชีพเซลลต์ ่อไป เมื่อเก็บเกี่ยวเซลลจะได์ เซลล้ ในระยะปลายโพรเฟส์ 7

เท่า ๆ กบระยะเมทาเฟสั โดยระยะปลายโพรเฟสให้แถบที่ปรากฎบนโครโมโซมมนุษย ์ 843-1,256 แถบ ต่อ จานวนชํ ุดแฮพลอยด ์ (haploid set) ส่วนระยะเมทาเฟสใหแถบท้ ี่ปรากฎบนโครโมโซมมนุษย ์ 320-554 แถบ ต่อจานวนชํ ุดแฮพลอยด ์ ซ่ึงจะใหรายละเอ้ ียดสูงกวาการย่ อมแถบส้ ีแบบธรรมดา (Yunis, 1976; อมรา คมภั ิรา นนท,์ 2546; อลงกลด แทนออมทอง, 2554) เมโทเทรกเซทเป็นอนุพนธั ์ของกรดโฟลิก (folic acid, FA) จดวั ่าเป็นแอนติเมทาบอไลท ์ (antimetabolite) คือ มีเป้ าหมายในการยบยั ้งเอนไซมั ์ไดไฮโดรโฟเลทรีดักเทส (dihydrofolatereductase, DHFR) การยบยั ้งปฏั ิกิริยาน้ีเป็นไปอย่างสมบูรณ์แบบ เมโทเทรกเซทจะยบยั ้งการเปลั ี่ยนไดไฮโดรโฟเลท

(dihydrofolate, FH2) ไปเป็นเตตระไฮโดรโฟเลท (tetrahydrofolate, FH4) ซ่ึงเป็นตวใหั ้คาร์บอนแก่การ สังเคราะห์ dUMPไปเป็ น dTMPซ่ึงจาเปํ ็ นต่อการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ ดังน้ันเซลล์จึงถูกยงยั ้งกั ่อนที่จะ

สังเคราะห์ดีเอนเอในระยะ็ G1/S ของวงชีพเซลล ์ เนื่องจากภาวะขาดไทมิดีน การยบยั ้งโดยเมโทเทรกเซทจะั ถูกปลดปล่อยไดโดยการล้ างออกและเต้ ิมไทมิดีน ซ่ึงช่วงเวลาในการปลดปล่อยและเก็บเกี่ยวเซลลจะต์ องม้ ี ความเหมาะสม (ชาคริต ดวงใจ, 2534; Rooney and Czepulkowski, 1986; Wike, 1989; Rooney, 2001) การยอมแถบส้ ีโครโมโซมแบบต่าง ๆ น้ีมีประโยชน์ช่วยในการจับคู่โครโมโซมคู่เหมือน (homologous chromosome) ช่วยตรวจสอบเอกลกษณั ์ของโครโมโซม ช่วยตรวจสอบความผิดปกติของ โครโมโซม ช่วยตรวจสอบพฤติกรรมของโครโมโซม และช่วยในการจาแนกสํ ่ิงมีชีวิตไดถ้ ูกตองย้ ่ิงข้ึน การ เปรียบเทียบทางพนธั ุศาสตร์เซลล์ (comparative cytogenetics)ยงเปั ็นขอม้ ูลพ้ืนฐานเพื่อช่วยอธิบาย วิวฒนาการของสั ่ิงมีชีวิตได ้ (Rooney, 2001; อมรา คมภั ิรานนท,์ 2546)

2.4 การกาหนดเพศในปลาํ (Jesus et al.,1999; BornandBertollo,2000;Artoniet al., 2001) ปลาเป็นสตวั ม์ ีกระดูกสนหลั งกลั ุ่มโบราณ (primitive stage)การกาหนดเพศจํ ึงมีหลายแบบแตกต่าง กนออกไปั โดยหลกั ๆ จะมี 2 แบบ คือ ถูกควบคุมและไม่ถูกควบคุมดวยพ้ นธั ุกรรม การพฒนาอวั ยวะเพศั ในปลามีกระบวนการที่ถูกควบคุมท้งปั ัจจยภายในั (พนธั ุกรรม) และพฒนาไดั โดยตรงก้ บปั ัจจยภายนอกั เช่น ฮอร์โมน เมื่ออวยวะเพศพั ฒนาไปแลั วจะม้ ีความคงที่ไม่มีการเปลี่ยนแปลง แต่มีขอยกเว้ นในกรณ้ ีที่ปลามีการ สืบพันธุ์แบบกระเทย ที่พบได้ในปลาหลายชนิดในวงศ์เซอรานิดี (Serranidae)และปลาไหลนา (Monopterusalbus) การกาหนดเพศในปลาเปํ ็นกระบวนการทางชีวเคมีที่ซบซั อนเพ้ ื่อนาไปสํ ู่การการกาหนดเซลลํ เพศ์ แลวเก้ ิดการเปลี่ยนสภาพรูปร่างของเซลล ์ จากการศึกษาพบวาย่ นบางยี นอาจมี ีผลโดยตรงต่อการพฒนาของั รังไข่ และบางยีนมีผลต่อการพฒนาของอั ณฑะั เช่น ในกรณีของปลา Medaka(Oryziaslatipes)พบว่ายีน DMYเป็ นยีนที่กําหนดเพศ และมีผลต่อการพัฒนาของอัณฑะ ส่วนในปลานิล (tilapia) ชนิด Oreochromisniloticusพบวาม่ ีท้งยั นและปี ัจจยภายในรั ่างกาย ที่จะมีผลต่อการกาหนดเพศและการพํ ฒนาของั โกแนด โดยฮอร์โมนเอสโทรเจน (estrogen) ภายในร่างกายเป็นตวเหนั ี่ยวนาตามธรรมชาตํ ิ สําหรับการ 8

พฒนาการของรั ังไข่ ขณะที่ยนี DMRT1จะมีความสาคํ ญตั ่อการพฒนาการของอั ณฑะั ในปลาส่วนใหญ่แลว้ การกาหนดเพศจะถํ ูกควบคุมโดยพนธั ุกรรม ดงนั ้ี แบบที่ไม่มีโครโมโซมเพศ เป็นพนธั ุกรรมการกาหนดเพศทํ ี่โบราณมากที่สุด เพศจะถูกควบคุมดวย้ ยีนหลายตาแหนํ ่ง ซ่ึงจะมีการกระจายตวอยั ู่บนโครโมโซมร่างกาย ปลาจะแสดงออกเป็นเพศใดเพศหน่ึง ข้ึนกบสมดั ุลของยีนเหล่าน้นั และเนื่องจากถูกควบคุมดวยย้ ีนหลายตาแหนํ ่ง ยีนแต่ละตาแหนํ ่งจะมีอิทธิพล ค่อนขางน้ อย้ ดงนั ้นสั ่ิงแวดลอมจ้ ึงมีอิทธิพลต่อการแสดงออกเป็นเพศใดเพศหน่ึง ปลาที่มีการควบคุมเพศ แบบน้ีจะมีอตราสั ่วนเพศในรุ่นลูกที่ไม่แน่นอน เช่นพบไดในปลาหางดาบ้ (Xiphophorushelleri) แบบทมี่ ีโครโมโซมเพศ แบ่งออกเป็น 2 ลกษณะั คือ 1. Homomorphic sex chromosome โครโมโซมเพศมีลกษณะไมั ่แตกต่างกบโครโมโซมรั ่างกาย และไม่แตกต่างระหว่างโครโมโซมที่กาหนดเพศผํ ูและเพศเม้ ีย ปลาเหล่าน้ีสัดส่วนเพศในรุ่นลูกค่อนขาง้ แน่นอน แต่อาจพบว่าสัดส่วนเพศอาจเปลี่ยนแปลงไปบาง้ เนื่องจากอิทธิพลของยีนซ่ึงมีตาแหนํ ่งอยู่บน โครโมโซมร่างกาย การควบคุมแบบน้ีมกกั าหนดสํ ัญลกษณั ์ X แทนโครโมโซมเพศเมีย และ Y แทน โครโมโซมเพศผ ู้ในกรณีที่ปลาชนิดน้นมั ีการควบคุมเพศแบบเฮเทอโรแกมีติกฟีเมล ปลาเพศเมียจะสร้างไข่ ที่มีจีโนไทป์ ที่เหมือนกนทั ้งหมดั (มีแต่โครโมโซมเอกซ็ ์) ดงนั ้นเพศเมั ียจะมีจีโนไทป์ XX ส่วนเพศผมู้ ีจีโน ไทป์ XY เช่น ในปลาหมอเทศ (O. mossambicus) ในทางตรงขามถ้ าการควบค้ ุมเพศเป็นแบบเฮเทอโรแกมีติ กเมล จะใชส้ ัญลกษณั ์ Z แทนโครโมโซมเพศผ ู้และ W แทนโครโมโซมเพศเมียดงนั ้นเพศผั จะมู้ ีจีโนไทป์ ZZ ส่วนเพศเมียมีจีโนไทป์ ZW เช่น ในปลานิลชนิดO. aureusและ O. hornorumระบบควบคุมเพศในปลา เหล่าน้ีไม่อาจตรวจสอบไดโดยแคร้ ิโอไทป์ แต่สามารถตรวจสอบไดโดยการเปล้ ี่ยนแปลงเพศของปลา โดย นาเอาปลาเพศเมํ ียปกติ (XX หรือ ZW) มาผสมพนธั ุ์กบปลาเพศผั ทู้ ี่เกิดจากการเปลี่ยนเพศ (XX หรือ ZW) แลวศ้ ึกษาสดสั ่วนเพศที่ได ้ เพศผ ู้XX (แปลงเพศ) x เพศเมีย XX100% เพศเมีย (XX) เพศผ ู้ZW (แปลงเพศ) x เพศเมีย ZW 25% เพศผ ู้(ZZ)+50% เพศเมีย (ZW)+25% ตาย (WW) จากแผนการผสมพนธั ุ์ ในกรณีไดล้ ูกเพศเมียท้งหมดแสดงวั าการควบค่ ุมเพศเป็นระบบ XY และใน กรณีไดล้ ูกท้งั 2 เพศ แสดงวาการควบค่ ุมเพศเป็นระบบ ZW 2. Heteromorphic sex chromosome โครโมโซมเพศที่มีลกษณะแตกตั ่างกนสาเหตั ุที่ทาใหํ ้ โครโมโซมเพศของปลามีลกษณะหลายรั ูปแบบที่แตกต่างกนั เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงเพียงเลกน็ อย้ หรือ การจดเรั ียงตวใหมั ่ของโครโมโซม ความแตกต่างที่ตรวจพบทางพนธั ุศาสตร์เซลลระหว์ ่างโครโมโซมเพศ ไดแก้ ่ การเพ่ิมหรือขาดหายไปของเฮเทอโรโครมาทิน การลดขนาดของโครโมโซม การเพ่ิมขนาดของ โครโมโซม และการจดเรั ียงตวใหมั ่ของโครโมโซม ซ่ึงความแตกต่างทางโครงสร้างของโครโมโซมที่เกิด ข้ึนกบแตั ่ละประชากร จะจากํ ดเพั ียงเพศเดียวเท่าน้นั โครโมโซมเพศในลกษณะเหลั ่าน้ีที่พบไดในปลาจะ้ จาแนกไดํ เป้ ็น 2 แบบ (8 ระบบ)คือ 9

2.1 แบบเฮเทอโรแกมีติกเมล ปลาเพศผสรู้ ้างเซลลส์ ืบพนธั ุ์ได ้ 2 แบบ เพศเมียสร้างไดแบบ้ เดียวดงนั ้ี ระบบ XX/XY เป็นระบบกาหนดเพศทํ ี่เกี่ยวของก้ บโครโมโซมั 2 แท่ง โดยที่โครโมโซม X และโครโมโซม Y มีลกษณะแยกจากกั นอยั างช่ ดเจนั เมื่อศึกษาทางพนธั ุศาสตร์เซลลปลาเพศผ์ มู้ ีแคริโอไทป์ XY ส่วนปลาเพศเมียเป็ น XX แต่จํานวนโครโมโซมของท้ังสองเพศเท่ากัน เช่น ปลา tiger(Hopliasmalabaricus) ระบบ XX/XOเป็นระบบการกาหนดเพศทํ ี่คลายก้ บระบบแรกั แตกต่างตรงที่โครโมโซม Y สูญหายไป และเพศผมู้ ีโครโมโซมนอยกว้ ่าเพศเมีย 1 แท่ง เช่น ปลา Mediterranean rainbow wrasse (Corisjulis)

ระบบ X1X1X2X2/X1X2Yเป็นระบบโครโมโซมเพศหลายแท่ง เกิดจากโครโมโซม Y เกิด การเคลื่อนยายไปรวมก้ บกั บโครโมโซมรั ่างกาย ส่งผลให้ปลาเพศผและปลาเพศเมู้ ียมีจานวนโครโมโซมดํ ิ พลอยดต์ ่างกนั เช่น ปลา splendid alfonsino(Beryxsplendens)

ระบบ XX/XY1Y2เป็นระบบโครโมโซมเพศมีหลายแท่ง โดยที่โครโมโซม X ชนิดอะโคร เซนทริก หรือเทโลเซนทริก ไดไปเช้ ื่อมรวมกบโครโมโซมรั ่างกาย ทาใหํ ปลาเพศผ้ และปลาเพศเมู้ ียมีจานวนํ โครโมโซมดิพลอยดต์ ่างกนั เช่น ปลา wolf fish(Hopliasmalabaricus) 2.2แบบเฮเทอโรแกมีติกฟีเมล ปลาเมียเพศสร้างเซลลส์ ืบพนธั ุ์ได ้ 2 แบบ ปลาเพศผสรู้ ้างได้ แบบเดียว ระบบ ZZ/ZW เป็นระบบการกาหนดเพศทํ ี่เกี่ยวของก้ บโครโมโซมั 2 แท่ง แต่ตรงขามก้ บั ระบบ XX/XY โครโมโซม Z และโครโมโซม W มีลกษณะแยกจากกั นอยั ่างชัดเจน เมื่อศึกษาทางพนธั ุ ศาสตร์เซลลปลาเพศผ์ มู้ ีแคริโอไทป์ เป็น ZZ ส่วนปลาเพศเมียเป็น ZW แต่จานวนโครโมโซมของปลาทํ ้งสองั เพศเท่ากนั ระบบน้ีพบวาม่ ีรายงานในปลามากที่สุด เช่น ปลา Triportheusguentheri ระบบ ZZ/ZOเป็นระบบการกาหนดเพศทํ ี่คลายก้ บระบบแรกั มีความแตกต่างกนตรงทั ี่ โครโมโซม W สูญหายไป และเพศเมียมีโครโมโซมนอยกว้ ่าเพศผ ู้ 1 แท่ง ระบบน้ีมีรายงานค่อนขางน้ อย้ เช่น ปลา Lepidocephalichthysguntea

ระบบ Z1Z1Z2Z2/Z1Z2Wเป็นระบบที่มีโครโมโซมเพศหลายแท่ง โดยโครโมโซม W ไป เชื่อมรวมกบโครโมโซมรั ่างกาย ส่งผลให้ปลาเพศผูและปลาเพศเม้ ียมีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยด์ต่างกนั

ลกษณะจะตรงขั ามก้ บระบบั X1X1X2X2/ X1X2Y

ระบบ ZZ/ZW1W2เป็นระบบที่มีโครโมโซมเพศหลายแท่ง โดยโครโมโซม Z ไดไปเช้ ื่อม รวมกบโครโมโซมรั ่างกาย ส่งผลใหปลาเพศผ้ และปลาเพศเมู้ ียมีจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยดต์ ่างกนั ลกษณะั

จะตรงขามก้ บระบบั XX/XY1Y2เช่น ปลา Apareiodonaffinis

10

2.5รายงานการศึกษาพันธุศาสตร์เซลล์ของปลาวงศ์ Callionymidae จากการตรวจสอบเอกสารงานวิจยั พบว่ามีรายงานการศึกษาพนธั ุศาสตร์เซลลของปลาวงศ์ ปลา์ แมนดารินน้อยมาก โดยมีรายงานการศึกษาที่น้อยกว่า 3เปอร์เซ็นต์ จากจานวนชนํ ิดพนธั ุ์ของปลาที่ได้ รายงานไวโดยม้ ีรายงานไวเพ้ ียง 5 ชนิด ดงนั ้ี ตารางท ี่ 2.1 รายงานการศึกษาพนธั ุศาสตร์เซลลของวงศ์ ปลาแมนดาร์ ิน(Callionymidae) (Arai, 2011)

ชนิด 2n NF NORs สูตรคาริโอไทป์ แหล่งตวอยั ่าง อ้างองิ Eleutherochir mirabilis 36 36 - 36a Japan Sawada and Sakamoto (1980) Repomucenusbeniteguri 38 38 - 38st Japan Murofushi et al. (1983) 37 38 2 1m+36st Japan Murofushi et al. (1983) R. huguenini 32 34 2 2m+30a Japan Murofushi et al. (1984) R. ornatipinnis 38 38 - 38st Japan Murofushi et al. (1983) 37 38 2 1m+36st Japan Murofushi et al. (1983) R. richardsonii 38 38 2 38a Japan Murofushi et al. (1984) 38 74 - 36sm+2a Japan Ojima and Kikuno (1987)

หมายเหตุ:2n = จานวนดํ ิพพลอยดโครโมโซม์ ,NF= จานวนโครโมโซมพํ ้ืนฐาน,NORs=รอยคอร์ดที่สองของ โครโมโซม,m=โครโมโซมชนิดเมทาเซนทริก,sm=โครโมโซมชนิดซับเมทาเซนทริก,t=โครโมโซมชนิด เทโลเซนทริก, st=โครโมโซมชนิดซับเทโลเซนทริก (เทียบไดก้ บโครโมโซมชนั ิดอะโครเซนทริกใน การศึกษาคร้ังน้ี), a=โครโมโซมชนิดอะโครเซนทริกและ – ไม่มีขอม้ ูล

บทท ี่ 3 วธิ ีดาเนํ ินการวจิ ัย

การดาเนํ ินงานวิจยแบั ่งออกเป็น 4 ข้นตอนั คือ การเกบต็ วอยั าง่ การเตรียมโครโมโซม การยอมส้ ี โครโมโซม การตรวจสอบโครโมโซม และการจดคารั ิโอไทป์ มาตรฐาน

3.1 การเกบต็ ัวอย่าง 3.1.1 เกบต็ วอยั างแมนดาร่ ินจานวนํ 3ชนิด ไดแก้ ่ ปลาแมนดารินเขียว (Synchiropussplendidus)ปลา แมนดารินจุด (Synchiropuspicturatus)และปลาสกตเตอรู ์ (Synchiropusocellatus)ที่มีการเล้ียงเป็นปลาสวยงาม ในประเทศไทย จานวนตํ วอยั างปลาแต่ ่ละชนิดแสดงในตารางที่ 3.1(รวมตวอยั างปลาแมนดาร่ ินท้งหมดั 28 ตวั )ตวอยั ่างปลาที่เก็บมาไดจะถ้ ูกแบ่งออกเป็น 2 กลุ่ม คือตวอยั ่างสําหรับตรวจสอบเอกลกษณั ์ปลา และ ตวอยั างส่ าหรํ ับเตรียมโครโมโซม

ตารางท ี่ 3.1 จานวนตํ วอยั างปลาแมนดาร่ ินที่ศึกษาในคร้ังน้ี

ชนิดปลา เพศผู้ (ตัว) เพศเมีย (ตัว) รวม (ตัว) ปลาแมนดารินเขียว 4 4 8 ปลาแมนดารินจุด 5 5 10 ปลาสกตเตอรู ์ 4 6 10

3.1.2 นาตํ วอยั างปลาท่ ี่เก็บไดมาเล้ ้ียงที่หองปฏ้ ิบตั ิการเรือนสัตวทดลองโดยเล์ ้ียงในตูเล้ ้ียงปลา ขนาด 60x120x50 ลูกบาศกเซนต์ ิเมตร ที่ให้ก๊าซออกซิเจนตลอดเวลา และให้อาหารวนละั 1 คร้ัง เล้ียงไว้ อยางน่ อย้ 7 วนั 3.1.3 นาตํ วอยั างปลามาตรวจสอบและระบ่ ุชนิดถ่ายภาพตวอยั างปลาแมนดาร่ ินแต่ละชนิด

3.2 การเตรียมโครโมโซม 3.2.1 เตรียมโดยวิธีทางตรง (direct method) อวยวะทั ี่ใช ้ คือไต เนื่องจากเป็นอวยวะทั ี่มีการแบ่งเซลลตลอดเวลา์ โดยเตรียมจากในตวั ส่ิงมีชีวิต (in vivo) และภายนอกตวสั ่ิงมีชีวิต (in vitro)การเตรียมโครโมโซมโดยวิธีทางตรง ในสภาพ in vivo ดดแปลงจากวั ิธีของ Chen and Ebeling (1968) และ Nanda et al. (1995) ดงนั ้ี ฉีดสารละลายไฟโตฮีแมกกลูตินิน (Phytohemagglutinin, PHA) เขมข้ น้ 4% เขาช้ ่องทอง้ ของปลา (intraperitoneal injection) ขนาด 1 มิลลิลิตร ต่อน้าหนํ กตั วั 100 กรัม เป็นเวลา 24 ชวโมง่ั เมื่อครบ 12

23 ชวโมงฉ่ั ีดโคลชิซิน0.05% ขนาด 1 มิลลิลิตร ต่อน้าหนํ กตั วั 100 กรัม เขาไปในกล้ ามเน้ ้ือ (intramusculary injection) ของปลา 1 ชวโมง่ั สลบปลาโดยใชน้ ้าแขํ ง็ นาเฉพาะสํ ่วนของไตมา ตดเปั ็นชิ้นเลกๆ็ และบดโดย เติมสารละลายโพแทสเซียมคลอไรด ์ เขมข้ น้ 0.075 โมลาร์(KCl0.075 M)กรองเศษเซลลขนาดใหญ์ ่ออกดวย้ ตะแกรงขนาดเส้นผ่าศูนยกลาง์ 1 มิลลิเมตร เทตะกอนเซลล์ขนาดเล็กลงในหลอดป่ันเหวี่ยง ขนาด 15 มิลลิลิตร บ่มที่อุณหภูมิหองประมาณ้ 25 นาที นาตะกอนเซลลํ ไปป์ ่ันที่ 1,200-1,500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที ทิ้งส่วนใสขางบน้ เติมน้ายาตรํ ึงสภาพ (fixative)ที่มีส่วนผสมของเมทานอล 3 ส่วนต่อกรดอะซิติก1 ส่วน (methanol:acetic acid; 3:1) ที่เตรียมใหม่ ๆ และเยนจ็ ดั นาสารละลายไปปํ ่ันที่ 1,200-1,500 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที ทิ้งส่วนใสขางบน้ เติมน้ายาตรํ ึงสภาพลงไป 7-8 มิลลิลิตร ป่ันอีกคร้ัง ทาซํ ้าเพํ ื่อลางตะกอน้ เซลลให์ สะอาด้ เกบตะกอนเซลล็ ในสารละลายตร์ ึงเซลลไว์ ท้ ี่ -20 องศาเซลเซียส การเตรียมโครโมโซมโดยวิธีทางตรง ในสภาพ in vitroโดยดดแปลงจากวั ิธีการของ Gold et al. (1990) ดงนั ้ี ฉีดสารละลายไฟโตฮีแมกกลูตินินเขมข้ น้ 4% เขาช้ ่องทองของปลา้ ขนาด 1 มิลลิลิตร ต่อ น้าหนํ ักตวั 100 กรัม เป็นเวลา 24 ชวโมง่ั สลบปลาดวยน้ ้าแขํ ็ง ผาเป่ ิดช่องทอง้ ตดเอาสั ่วนไตใส่ในจาน เพาะเล้ียงเช้ือที่มีอาหารเล้ียงเซลล ์ RPMI 1640 ในปริมาณพอท่วมเน้ือเยอื่ (ประมาณ 5 มิลลิลิตร) ใชม้ ีดและ กรรไกรสับให้เป็นชิ้นละเอียด เติมสารละลายโคลซิชิน 0.1% จานวนํ 2-3 หยด แลวน้ าไปบํ ่มท่ี 27 องศา เซลเซียส เป็นเวลา 1 ชวโมง่ั 30 นาที ยายสารละลายท้ ี่มีตะกอนเซลลลงในหลอดป์ ่ันเหวี่ยงขนาด 15 มิลลิลิตร นาไปปํ ่ันที่ความเร็ว 1,200-1,500 รอบต่อนาที เป็นเวลา 5 นาที ทิ้งสารละลายส่วนบนเหลือแต่ ตะกอนเซลล ์ เติมสารละลายKClเขมข้ น้ 0.075M 6 มิลลิลิตร ผสมใหเข้ าก้ นโดยใชั การกล้ บหลอดไปมาั 2-3 คร้ัง แลวน้ าไปบํ ่มที่ 27 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 นาที นาไปปํ ่ันอีกรอบ และทิ้งสารละลายส่วนบนเหลือ แต่ตะกอนเซลล ์ ค่อยๆ เติมน้ายาตรํ ึงสภาพที่เตรียมใหม่ ๆ และเยนจ็ ดั ทีละหยด นาไปปํ ่ัน 3-4 คร้ังจนได้ ตะกอนเซลลส์ ีขาว เกบตะกอนเซลล็ ในสารละลายตร์ ึงเซลลไว์ ท้ ี่ -20 องศาเซลเซียส 3.2.2 เตรียมโดยทางออม้ (indirect method) โดยวิธีการเพาะเล้ียงเซลลเม์ ดเล็ ือดขาว (white blood cell culture) ใชว้ ิธีเพาะเล้ียงเซลลเม์ ด็ เลือดขาวปริมาณนอย้ ดดแปลงจากวั ิธีของ Fujiwara et al.(2001) มีวิธีการดงนั ้ี เกบต็ วอยั างเล่ ือดจากเส้นเลือดดาบรํ ิเวณใตเส้ ้นขางล้ าตํ วั หรือจากหัวใจโดยใชเข้ มท็ ี่ติดกบั กระบอกฉีดยาปลอดเช้ือที่เคลือบสารโซเดียมเฮพาริน เกบต็ วอยั างเล่ ือดในน้าแขํ ง็ หรือ 4 องศาเซลเซียส เติม อาหารเล้ียงเซลล ์ DMEM media ที่เยน็ 5 มิลลิลิตรลงในเลือด 0.1 มิลลิลิตรในหลอดปลอดเช้ือ แช่ในน้าแขํ ง็ เป็นเวลา 5 นาที นาไปปํ ่ันที่ 1,250 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาที เกบเม็ ดเล็ ือดขาวที่อยบรู่ ิเวณช้นบนของเซลลั ์ เมดเล็ ือดแดงใชป้ ิเปตดูดวนเบา ๆ โดยแตะปลายปิเปตที่ขางหลอด้ และยายไปลงในหลอดใหม้ ่ เติมอาหาร DMEM media ไปจนมีปริมาตรเป็น 5 มิลลิลิตรป่ันที่ 1,500 รอบต่อนาที นาตะกอนเซลลํ เม์ ดเล็ ือดขาวมาเติม อาหารเล้ียงเซลลชน์ ิด DMEM media (Gibco) หรือ m-199 (Gibco) ที่ประกอบดวย้ ไฟโตฮีแมกกลูตินิน ความเขมข้ น้ 4-6%, ฟีทลโบไวนั ์ซีรัม (fetal bovine serum: FBS) 10%, ยาปฏิชีวนะ และยาฆ่าเช้ือราซ่ึง ประกอบดวย้ เพนนิซิลินและสเตรบโตไมซิน (penicillin streptomycin)3% และแอมโฟ- เทอริซินบี 13

(Amphothericin B) 250 นาโนกรัม บ่มที่ 27 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 6 วนั เขยาเล่ ือดทุกวนวั นละั 2 คร้ัง ก่อนเกบเก็ ี่ยว 1.5 ชวโมง่ั เติมโคลชิซิน0.01% 50 ไมโครลิตร เมื่อครบเวลา นาไปปํ ่ันที่ 1500 รอบต่อนาที เป็นเวลา 5 นาที ดูดของเหลวส่วนบนทิ้ง จากน้นเตั ิมสารละลาย KClความเขมข้ น้ 0.075 Mบ่มที่ 27 องศา เซลเซียส เป็นเวลา 30 นาที ป่ันและดูดของเหลวส่วนบนทิ้ง เติมน้ายาตรํ ึงสภาพที่เตรียมใหม่ๆ และเยนจ็ ดั แลวน้ ามาปํ ่ันที่ 1500 รอบต่อนาที 5 นาที ดูดของเหลวส่วนบนทิ้ง เติมน้ายาตรํ ึงสภาพอีก เพื่อลางตะกอน้ เซลล ์ 3 คร้ัง หรือจนตะกอนเซลลสะอาด์ แลวเก้ บตะกอนเซลล็ ไว์ ท้ ี่ -20 องศาเซลเซียส

3.3 การเตรียมสไลด์โครโมโซม และการย้อมสีโครโมโซม เตรียมสไลด์โครโมโซมโดยนาตะกอนเซลลํ ท์ ี่เตรียมไวแล้ วมาหยดบนสไลด้ ท์ ี่สะอาด 2-3 หยด โดยหยดห่างจากสไลด์ 2 เซนติเมตร ปล่อยให้แห้งในอากาศ การเตรียมสไลด์จะเตรียมจากตวอยั ่างปลา แมนดารินตวละั 8 สไลด ์ การยอมส้ ีโครโมโซม โดยเทคนิคการยอมแบบธรรมดา้ ดงนั ้ี ยอมสไลด้ ด์ วยส้ ีจิมซ่า 10% ในฟอสเฟตบฟเฟอรั ์ (phosphate buffer)pH 7.2 เป็นเวลา 20-30 นาที แลว้ ลางสไลด้ ด์ วยน้ ้ากลํ นให่ั สะอาด้ ผ่งใหึ แห้ ง้ นาไปตรวจสอบภายใตํ กล้ องจ้ ุลทรรศน์แบบใชแสง้

3.4 การตรวจสอบโครโมโซม การจัดคาริโอไทป์ และอดิ ิโอแกรมมาตรฐาน ประกอบด้วยข้นตอนการตรวจสอบโครโมโซมั จัดคาริโอไทป์ และสร้างอิดิโอแกรมมาตรฐาน ดดแปลงจากวั ิธีการของกนยารั ัตน์ ไชยสุต (2532) และ Turpin and Lejeune (1965) 1) การตรวจสอบโครโมโซมเลือกเซลลท์ ี่มีโครโมโซมระยะเมทาเฟสกระจายตวดั ีไม่ซอนท้ บกั นั นามาถํ ่ายภาพโครโมโซมโดยใชเลนส้ ์วตถั ุ (objective lens) กาลํ งขยายั 100X โดยใชช้ ุดถ่ายภาพที่ต่อกบั กลองจ้ ุลทรรศน์ หรือใชกล้ องด้ ิจิตอล เพื่อตรวจนบจั านวนโครโมโซมจากภาพถํ ่ายโครโมโซมจานวนํ 100 เซลล ์ ความถี่ของจานวนโครโมโซมทํ ี่พบมากที่สุด จะเป็นค่าของจานวนโครโมโซมดํ ิพลอยดของส์ ่ิงมีชีวิต น้นั ๆ จากน้นจั บคั ู่โครโมโซมที่เหมือนกนั (homologous chromosome) และศึกษาโครโมโซมโดยการหาค่า ความยาวของแขนโครโมโซมขางยาว้ (long arm; Ll) ความยาวของแขนโครโมโซมขางส้ ้ัน (short arm; Ls) และคานวณหาความยาวของโครโมโซมแตํ ่ละแท่ง (total length; LT, LT = Ll + Ls) คานวณคํ ่า relative length (RL) และ centromeric index (CI) เพื่อระบุชนิดของโครโมโซม และนาคํ ่าที่ไดไปใช้ ประกอบในการจ้ ดทั าํ คาริโอไทป์ และอิดิโอแกรม 2) การจัดทาคารํ ิโอไทป์ ใช้รูปถ่ายที่ได้ในการจับคู่โครโมโซมที่เหมือนกัน โดยการกาหนดํ ตาแหนํ ่งเซนโทรเมียร์ของโครโมโซมแต่ละแท่งในเซลล์ วดคั ่าความยาวของแขนโครโมโซมขางยาว้ ค่า ความยาวของแขนโครโมโซมขางส้ ้ัน นาคํ ่าที่ไดมาค้ านวณหาความยาวของโครโมโซมแตํ ่ละแท่ง จดเรั ียง คาริโอไทป์ ให้เรียงตามความยาวของโครโมโซมแต่ละคู่จากมากไปหาน้อย ยกเวนโครโมโซมเพศจะวาง้ 14

เป็นคู่สุดทายม้ ุมล่างซ้ายเสมอ ตองบอกหมายเลขของโครโมโซมแต้ ่ละคู่ดานล้ ่าง วางแท่งโครโมโซมให้ แขนขางส้ ้นอยั ดู่ านบน้ แขนขางยาวอย้ ดู่ านล้ ่าง การจัดทาคารํ ิโอไทป์ มาตรฐาน 1) เลือกเซลลในระยะเมทาเฟส์ ที่มีขนาดของโครโมโซมไม่ยาวหรือส้นเกั ินไป มี การกระจายที่ดีไม่ซ้อนทบกั นั และนับจานวนโครโมโซมไดํ ครบเท้ ่ากบจั านวนโครโมโซมของสํ ่ิงมีชีวิต ชนิดน้นั ถ่ายภาพเซลลท์ ี่เลือกไวโดยใช้ เลนส้ ์วตถั ุกาลํ งขยายั 100X เลือกมาจดจั านวนํ ชนิดละ 20 เซลล ์ 2) ใชร้ ูปถ่ายที่ไดในการจ้ บคั ู่โครโมโซมที่เหมือนกนั โดยกาหนดตํ าแหนํ ่งของ เซนโทรเมียร์ของโครโมโซมแต่ละแท่งในเซลล ์ จากน้นวั ดคั าความยาวของแขนโครโมโซมข่ างยาว้ ค่าความ ยาวของแขนโครโมโซมขางส้ ้ัน นาคํ ่าที่ไดมาค้ านวณหาความยาวของโครโมโซมแตํ ่ละแท่ง การวดคั ่าความ ยาวของโครโมโซมอาจจะใช้วิธีการตัดโครโมโซมออกมาจากรูปถ่ายทีละแท่ง กาหนดหมายเลขใหํ ้ โครโมโซมทุกแท่งก่อนการวดั เมื่อวดความยาวเสรั ็จแลวจ้ ึงจบคั ู่โครโมโซมที่มีความยาวของแขนแต่ละขาง้ และความยาวท้งแทั ่งใกลเค้ ียงกนมากทั ี่สุด 3) การคานวณหาคํ า่ relative length (RL) คานวณไดํ จากส้ ูตร ดงนั ้ี คา่ relative length (RL) = ความยาวของโครโมโซมแต่ละแท่ง (LT) ความยาวท้งหมดของโครโมโซมทั ุกแท่ง (LT) การใชค้ ่า RL น้ีสามารถช่วยในการจบคั ู่โครโมโซมไดแน้ ่นอนกวาการใช่ ค้ ่าความ ยาวของโครโมโซม เพราะค่า RL ของโครโมโซมแต่ละแท่งจะคงที่ในทุก ๆ เซลล ์ ส่วนค่าความยาวของ โครโมโซมจะแตกต่างกนไปในเซลลั แต์ ่ละเซลล ์ 4) การคานวณหาคํ า่ centromeric index (CI) คานวณไดํ จากส้ ูตร ดงนั ้ี คา่ centromeric index (CI) = ความยาวของแขนโครโมโซมขางยาว้ (Ll) ความยาวของโครโมโซมแต่ละแท่ง (LT) นาคํ า่ CI ที่ไดน้ ามาระบํ ุชนิดของโครโมโซม โดยใชเกณฑ้ ์ ดงนั ้ี คา่ CI อยระหวู่ าง่ 0.500–0.599 จดเปั ็นโครโมโซมชนิดเมทาเซนทริก คา่ CI อยระหวู่ าง่ 0.600–0.699 จดเปั ็นโครโมโซมชนิดซบเมทาเซนทรั ิก คา่ CI อยระหวู่ าง่ 0.700–0.899 จดเปั ็นโครโมโซมชนิดอะโครเซนทริก คา่ CI อยระหวู่ าง่ 0.900–1.000 จดเปั ็นโครโมโซมชนิดเทโลเซนทริก 5) การกาหนดขนาดของโครโมโซมํ แบ่งขนาดของโครโมโซมออกเป็น 3 ขนาด โดยกาหนดใหํ ้โครโมโซมคู่ที่ยาวที่สุดเป็นโครโมโซมคู่ที่ 1 และโครโมโซมคู่ที่ส้ันที่สุดเป็นโครโมโซมคู่ สุดทาย้ โครโมโซมขนาดใหญ่ (large=L) คือ โครโมโซมที่มีความยาวมากกว่าคร่ึงหน่ึง ของผลบวกความยาวเฉลี่ยของโครโมโซมใหญ่สุด รวมกบโครโมโซมคั ูเล่ กท็ ี่สุด

15

ดงนั ้นั L > LT เฉลี่ยคูท่ ี่ 1 + LT เฉลี่ยคูส่ ุดทาย้ 2 โครโมโซมขนาดกลาง (medium=M) คือ โครโมโซมที่มีค่าความยาวน้อยกว่า คร่ึงหน่ึงของความยาวเฉลี่ยของโครโมโซมใหญ่สุด รวมกบโครโมโซมคั ูเล่ กท็ ี่สุด ดงนั ้นั M < LT เฉลี่ยคูท่ ี่ 1 + LT เฉลี่ยคูส่ ุดทาย้ 2 โครโมโซมขนาดเลก็ (small=S) ไดแก้ ่ โครโมโซมที่มีความยาวนอยกว้ าคร่ ่ึงหน่ึง ของความยาวเฉลี่ยของโครโมโซมคูใหญ่ ่สุด ดงนั ้นั S < LT เฉลี่ยคูท่ ี่ 1 2 6) จดเรั ียงคาริโอไทป์ ให้เรียงตามชนิดโครโมโซมก่อน แลวค้ ่อยเรียงตามความ ยาวของโครโมโซมแต่ละคู่จากมากไปหาน้อยยกเวนโครโมโซมเพศจะวางเป้ ็นคู่สุดทายม้ ุมล่างซ้าย ตอง้ บอกหมายเลขของโครโมโซมแต่ละคู่ดานล้ ่างวางแท่งโครโมโซมใหแขนข้ างส้ ้ันอยดู่ านบน้ แขนขางยาวอย้ ู่ ดานล้ ่าง และนิยมวางแท่งโครโมโซมใหต้ าแหนํ ่งเซนโทรเมียร์ตรงกนั การทาอํ ดิ ิโอแกรมมาตรฐาน อิดิโอแกรม คือ ไดอะแกรมแสดงคาริโอไทป์ ของโครโมโซม 1 ชุดแฮพลอยด์ ซ่ึง ประกอบดวยโครโมโซมร้ ่างกาย และโครโมโซมเพศ โดยใชข้ อม้ ูลค่าเฉลี่ยความยาวของโครโมโซม รูปร่าง ของโครโมโซม และตาแหนํ ่งเซนโทรเมียร์อิดิโอแกรมจากเทคนิคการยอมส้ ีโครโมโซมแบบธรรมดาใช้ เซลลระยะเมทาเฟสชน์ ิดละ 20 เซลล ์ นามาจํ ดคารั ิโอไทป์ แลวว้ ดความยาวของแขนโครโมโซมขั างยาว้ และ แขนโครโมโซมขางส้ ้ันของโครโมโซมทุกคู่ด้วยเวอร์เนียร์(vernier) จัดทาภาพวาดอํ ิดิโอแกรมด้วย คอมพิวเตอร์ โดยการนาคํ ่าเฉลี่ยความยาวของโครโมโซมแต่ละคู่มาสร้างกราฟโดยใชโปรแกรม้ Microsoft Excel XP/2003 ให้แกนต้งั (Y) เป็นความยาวของโครโมโซมแต่ละคู่ และแกนนอน (X) เป็นลาดํ บของั โครโมโซมคูท่ ี่ใหญ่ที่สุดไปหาคูท่ ี่เลกท็ ี่สุด ยกเวนโครโมโซมเพศจ้ ดเปั ็นคู่สุดทาย้ แลวน้ ามาปรํ ับรูปร่างของ โครโมโซมโดยใชโปรแกรม้ Microsoft Word XP/2003 หรือ Microsoft Powerpoint XP/2003

šš¸É 4 Ÿ¨„µ¦ª·‹´¥

„µ¦«¹„¬µ¡´œ›»«µ­˜¦rÁŽ¨¨r (cytogenetics) °Šž¨µªŠ«r¤œ—µ¦·œš¸É¡Äœž¦³Áš«Åš¥‹Îµœªœ 3 œ·—¡ªnµž¨µÂ¤œ—µ¦·œÂ˜n¨³œ·—¤¸¤µ˜¦“µœ¨´„¬–³‡µ¦·Ã°Åšžr (karyotype) š¸ÉÁžÈœ¨´„¬–³ž¦³‹Îµ¡´œ›»r —´Šœ¸Ê

4.1 ž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ª (Synchiropus splendidus) ÁžÈœ¦µ¥Šµœ‡¦´ÊŠÂ¦„ (first report) °Š„µ¦«¹„¬µ¡´œ›»«µ­˜¦rÁŽ¨¨r °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ª¡ªnµ¤¸ ‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°—r (diploid) ĜÁ¡«Ÿ¼oÁšnµ„´ 39 šnŠ¨³ÄœÁ¡«Á¤¸¥Ášnµ„´ 40 šnŠ¤¸‹Îµœªœ ǦäΤ¡ºÊœ“µœ (fundamental number, NF) Ášnµ„´ 40 š´ÊŠÄœÁ¡«Ÿ¼o¨³Á¡«Á¤¸¥ ž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ª¤¸¦³

„µ¦„ε®œ—Á¡«Â X1X1X2X2/X1X2YÁžÈœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤Á¡«®¨µ¥ÂšnŠÁ„·—‹µ„ǦäΤ Y Á‡¨ºÉ°œ¥oµ¥Åž ¦ª¤„´„´Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤¦nµŠ„µ¥­nŠŸ¨Ä®ož¨µÁ¡«Ÿ¼o¨³ž¨µÁ¡«Á¤¸¥¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—r˜nµŠ„´œ ǦäΤ¦nµŠ„µ¥ °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ªž¦³„°—oª¥Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤œ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ (telocentric) œµ—Ä®n

8 šnŠÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—„¨µŠ 28 šnŠǦäΤ X1ÁžÈœœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—Ä®nǦäΤ X2 ÁžÈœ œ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—„¨µŠ¨³Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤ Y ÁžÈœœ·—Á¤šµÁŽœš¦·„ (metacentric) œµ—Ä®n¤¸ ǦäΤÁ‡¦ºÉ°Š®¤µ¥ŗo„nǦäΤ‡¼nÄ®n­»—ÁžÈœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤ªµ¥¨³Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤‡¼nÁ¨È„­»—ÁžÈœ ǦäΤ¦nµŠ„µ¥œ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„‡¼š¸É 18 ×¥š¸ÉǦäΤ‡¼nš¸ÉÄ®n¤µ„š¸É­»—¤¸ œµ—Ä®n„ªnµÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤‡¼n Á¨È„­»—ž¦³¤µ– 2 Ášnµ ‹µ„„µ¦¥o°¤Â™­¸Âœ°¦r¡˜ÎµÂ®œnŠœ°¦r (nucleolar organizer regions, NORs) ‹Îµœªœ 3 ˜ÎµÂ®œnŠ £µ¡š¸É 4.1, 4.2, 4.3, 4.4 ¨³ 4.5) ž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ª¤¸‡µ¦·Ã°ÅšžrÅ¤n­¤¤µ˜¦ (asymmetrical karyotype) ×¥¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤ 2 œ·—ŗo„nœ·—Á¤šµÁŽœš¦·„¨³ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„¨³¤¸­¼˜¦ ‡µ¦·Ã°Åšžr—´Šœ¸Ê t t Á¡«Ÿ¼o 2n (diploid) 39 = L 8 + M28 + X1X2Y t t Á¡«Á¤¸¥ 2n (diploid) 40 = L 8 + M 28 + X1X1X2X2

1716

£µ¡š¸É 4.1 ¨´„¬–³ž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ª (Mandarin fish, Synchiropus splendidus) ­Á„¨µ¦r 3 ÁŽœ˜·Á¤˜¦

1817

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

11 12 13 14 15

16 17 18 X1 X2 Y

£µ¡š¸É 4.2 ÁŽ¨¨rÁ¤šµÁ¢­Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤ (£µ¡œ) ¨³‡µ¦·Ã°Åšžr (£µ¡¨nµŠ) °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ª (Synchiropus splendidus) Á¡«Ÿ¼o¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 39 šnŠ—oª¥ª·›¸„µ¦¥o°¤­¸ ›¦¦¤—µ (­Á„¨µ¦r 10 ŤÇ¦Á¤˜¦)

1918

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

11 12 13 14 15

16 17 18 X1 X1 X2 X2

£µ¡š¸É 4.3 ÁŽ¨¨rÁ¤šµÁ¢­Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤ (£µ¡œ) ¨³‡µ¦·Ã°Åšžr (£µ¡¨nµŠ) °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ª (Synchiropus splendidus) Á¡«Á¤¸¥¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 40 šnŠ—oª¥ª·›¸„µ¦¥o°¤­¸ ›¦¦¤—µ (­Á„¨µ¦r 10 ŤÇ¦Á¤˜¦)

1920

£µ¡š¸É 4.4 ÁŽ¨¨rÁ¤šµÁ¢­Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤ °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ª (Synchiropus splendidus) Á¡«Ÿ¼o¤¸‹Îµœªœ ǦäΤ—·¡¨°¥—r 39 šnŠ (£µ¡œ) ¨³Á¡«Á¤¸¥¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—r 40 šnŠ £µ¡¨nµŠ) —oª¥ª·›¸„µ¦¥o°¤Â™­¸Âœ°¦r (­Á„¨µ¦r 10 ŤÇ¦Á¤˜¦)

2021

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

12 13 14 15 16 17 18 X1 X2 Y

£µ¡š¸É 4.5 °·—·Ã°Â„¦¤ °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ª (Synchiropus splendidus) ¤¸¦³„µ¦„ε®œ—Á¡«Â

X1X1X2X2/X1X2Y Á¡«Ÿ¼o¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—r 39 šnŠ¨³Á¡«Á¤¸¥¤¸‹Îµœªœ ǦäΤ—·¡¨°¥—r 40 šnŠ—oª¥ª·›¸„µ¦¥o°¤­¸Â›¦¦¤—µ

2122

˜µ¦µŠš¸É 4.1 ‡nµÁŒ¨¸É¥‡ªµ¤¥µª °ŠÂ œÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤ oµŠ­´Êœ (short arm; Ls), ‡ªµ¤¥µª °ŠÂ œÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤ oµŠ¥µª (long arm; Ll), ‡ªµ¤¥µªš´ÊŠ®¤— °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤Â˜n¨³‡¼n (total length; LT), ‡nµ relative length (RL), ‡nµ centromeric index (CI), ‡nµÁ¸É¥ŠÁœ¤µ˜¦“µœ (standard deviation, SD) °Š ‡nµ RL, CI œµ—¨³œ·— °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤Â˜n¨³ÂšnŠ‹µ„ÁŽ¨¨r¦³¥³Á¤šµÁ¢­ °Šž¨µ ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ª (Synchiropus splendidus) Á¡«Ÿ¼o¨³Á¡«Á¤¸¥‹Îµœªœ 20 ÁŽ¨¨r ¤¸‹Îµœªœ ǦäΤ—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 39 šnŠÄœÁ¡«Ÿ¼o¨³ 40 šnŠÄœÁ¡«Á¤¸¥

ǦäΤ‡nš¸É¼ Ls Ll LT CI+SD RL+SD œµ— œ·— 1 0.000 6.021 6.021 1.000±0.000 0.067±0.001 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 2 0.000 5.613 5.613 1.000±0.000 0.062±0.003 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 3 0.000 5.083 5.083 1.000±0.000 0.057±0.002 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 4 0.000 5.159 5.159 1.000±0.000 0.057±0.002 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 5 0.000 4.941 4.941 1.000±0.000 0.055±0.003 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 6 0.000 4.821 4.821 1.000±0.000 0.053±0.002 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 7 0.000 4.747 4.747 1.000±0.000 0.052±0.004 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 8 0.000 4.118 4.118 1.000±0.000 0.046±0.002 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 9 0.000 4.235 4.235 1.000±0.000 0.047±0.002 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 10 0.000 4.283 4.283 1.000±0.000 0.047±0.005 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 11 0.000 4.077 4.077 1.000±0.000 0.045±0.002 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 12 0.000 4.479 4.479 1.000±0.000 0.049±0.002 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 13 0.000 4.069 4.069 1.000±0.000 0.045±0.004 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 14 0.000 3.974 3.974 1.000±0.000 0.044±0.001 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 15 0.000 4.055 4.055 1.000±0.000 0.045±0.003 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 16 0.000 3.951 3.951 1.000±0.000 0.043±0.002 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 17 0.000 3.560 3.570 1.000±0.000 0.039±0.001 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 18 0.000 3.574 3.564 1.000±0.000 0.019±0.002 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„

X1 0.000 6.582 6.582 1.000±0.000 0.073±0.002 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„

X1 0.000 4.967 4.967 1.000±0.000 0.055±0.002 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ Y 5.304 5.519 10.823 0.510±0.001 0.076±0.002 Ä®n Á¤šµÁŽœš¦·„

2223

4.2 ž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹»— (Synchiropus picturatus) ÁžÈœ¦µ¥Šµœ‡¦´ÊŠÂ¦„ °Š„µ¦«¹„¬µ¡´œ›»«µ­˜¦rÁŽ¨¨r °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹»—¡ªnµ¤¸‹Îµœªœ ǦäΤ—·¡¨°—rÁšnµ„´ 40 šnŠ¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤¡ºÊœ“µœÁšnµ„´ 40 Ťn¡‡ªµ¤Â˜„˜nµŠ °Š‡µ¦·Ã°Åšžr ¦³®ªnµŠž¨µÁ¡«Ÿ¼o¨³Á¡«Á¤¸¥ǦäΤ °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹»—ž¦³„°—oª¥Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤œ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—Ä®n 14 šnŠÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—„¨µŠ 24 šnŠ¨³ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—Á¨È„ 2 šnŠ¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤ Á‡¦ºÉ°Š®¤µ¥ŗo„nǦäΤ‡¼nÄ®n­»—ÁžÈœœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„¨³Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤‡¼nÁ¨È„­»—ÁžÈœœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ ×¥š¸ÉǦäΤ‡¼nš¸ÉÄ®n¤µ„š¸É­»—¤¸ œµ—Ä®n„ªnµÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤‡¼nÁ¨È„­»—ž¦³¤µ– 2 Ášnµ‹µ„„µ¦¥o°¤Â™­¸Â œ°¦r¡˜ÎµÂ®œnŠœ°¦r 2 ˜ÎµÂ®œnŠš´ÊŠÄœÁ¡«Ÿ¼o¨³Á¡«Á¤¸¥ £µ¡š¸É 4.6, 4.7, 4.8. 4.9 ¨³ 4.10) ž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹»—¤¸ ‡µ¦·Ã°ÅšžrÅ¤n­¤¤µ˜¦×¥¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤Á¡¸¥Šœ·—Á—¸¥ª‡º°œ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„¨³¤¸­¼˜¦‡µ¦·Ã°Åšžr —´Šœ¸Ê t t t 2n (diploid) 40 = L 14 + M 24 + S 2

£µ¡š¸É 4.6 ¨´„¬–³ž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹»— (Picturesque dragonet, Synchiropus picturatus) ­Á„¨µ¦r 3 ÁŽœ˜·Á¤˜¦

2324

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

11 12 13 14 15

16 17 18 19 20

£µ¡š¸É 4.7 ÁŽ¨¨rÁ¤šµÁ¢­Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤ (£µ¡œ) ¨³‡µ¦·Ã°Åšžr (£µ¡¨nµŠ) °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹»— (Synchiropus picturatus) Á¡«Ÿ¼o¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 40 šnŠ—oª¥ª·›¸„µ¦¥o°¤­¸ ›¦¦¤—µ (­Á„¨µ¦r 10 ŤÇ¦Á¤˜¦)

2425

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

11 12 13 14 15

16 17 18 19 20

£µ¡š¸É 4.8 ÁŽ¨¨rÁ¤šµÁ¢­Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤ (£µ¡œ) ¨³‡µ¦·Ã°Åšžr (£µ¡¨nµŠ) °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹»— (Synchiropus picturatus) Á¡«Á¤¸¥¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 40 šnŠ—oª¥ª·›¸„µ¦¥o°¤­¸ ›¦¦¤—µ (­Á„¨µ¦r 10 ŤÇ¦Á¤˜¦)

2526

£µ¡š¸É 4.9 ÁŽ¨¨rÁ¤šµÁ¢­Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤ °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹»— (Synchiropus picturatus) Á¡«Ÿ¼o (£µ¡œ) ¨³ Á¡«Á¤¸¥ (£µ¡¨nµŠ) ¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 40 šnŠ—oª¥ª·›¸„µ¦¥o°¤Â™­¸Âœ°¦r ­Á„¨µ¦r 10 ŤÇ¦Á¤˜¦)

2627

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

£µ¡š¸É 4.10 °·—·Ã°Â„¦¤ °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹»— (Synchiropus picturatus) ¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 40 šnŠ—oª¥ª·›¸„µ¦¥o°¤­¸Â›¦¦¤—µ

2728

˜µ¦µŠš¸É 4.2 ‡nµÁŒ¨¸É¥‡ªµ¤¥µª °ŠÂ œÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤ oµŠ­´Êœ (short arm; Ls), ‡ªµ¤¥µª °ŠÂ œÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤ oµŠ¥µª (long arm; Ll), ‡ªµ¤¥µªš´ÊŠ®¤— °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤Â˜n¨³‡¼n (total length; LT), ‡nµ relative length (RL), ‡nµ centromeric index (CI), ‡nµÁ¸É¥ŠÁœ¤µ˜¦“µœ (standard deviation, SD) °Š ‡nµ RL, CI œµ—¨³œ·— °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤Â˜n¨³ÂšnŠ‹µ„ÁŽ¨¨r¦³¥³Á¤šµÁ¢­ °Šž¨µ ¤œ—µ¦·œ‹»— (Synchiropus picturatus) Á¡«Ÿ¼o¨³Á¡«Á¤¸¥‹Îµœªœ 20 ÁŽ¨¨r ¤¸‹Îµœªœ ǦäΤ—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 40 šnŠ

ǦäΤ‡nš¸É¼ Ls Ll LT CI+SD RL+SD œµ— œ·— 1 0.000 6.085 6.085 1.000±0.000 0.072±0.002 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 2 0.000 5.893 5.893 1.000±0.000 0.069±0.002 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 3 0.000 5.556 5.556 1.000±0.000 0.065±0.001 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 4 0.000 5.368 5.368 1.000±0.000 0.063±0.003 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 5 0.000 4.936 4.936 1.000±0.000 0.058±0.002 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 6 0.000 4.551 4.551 1.000±0.000 0.054±0.002 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 7 0.000 4.748 4.748 1.000±0.000 0.056±0.003 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 8 0.000 4.288 4.288 1.000±0.000 0.051±0.002 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 9 0.000 4.312 4.312 1.000±0.000 0.051±0.002 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 10 0.000 4.050 4.050 1.000±0.000 0.048±0.004 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 11 0.000 4.195 4.195 1.000±0.000 0.049±0.002 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 12 0.000 3.713 3.713 1.000±0.000 0.044±0.002 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 13 0.000 3.880 3.880 1.000±0.000 0.046±0.005 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 14 0.000 3.643 3.643 1.000±0.000 0.043±0.002 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 15 0.000 3.736 3.736 1.000±0.000 0.044±0.002 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 16 0.000 3.458 3.458 1.000±0.000 0.041±0.004 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 17 0.000 3.286 3.286 1.000±0.000 0.039±0.001 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 18 0.000 3.190 3.190 1.000±0.000 0.038±0.003 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„

19 0.000 3.118 3.118 1.000±0.000 0.037±0.002 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„

20 0.000 2.830 2.830 1.000±0.000 0.033±0.001 Á¨È„ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„

2829

4.3 ž¨µ­„¼˜Á˜°¦r (Synchiropus ocellatus) ÁžÈœ¦µ¥Šµœ‡¦´ÊŠÂ¦„ °Š„µ¦«¹„¬µ¡´œ›»«µ­˜¦rÁŽ¨¨r °Šž¨µ­„¼˜Á˜°¦r¡ªnµ¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤ —·¡¨°—rÁšnµ„´ 40 šnŠ¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤¡ºÊœ“µœÁšnµ„´ 40 Ťn¡‡ªµ¤Â˜„˜nµŠ °Š‡µ¦·Ã°Åšžr¦³®ªnµŠž¨µ Á¡«Ÿ¼o¨³Á¡«Á¤¸¥ǦäΤ °Šž¨µ­„¼˜Á˜°¦rž¦³„°—oª¥Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤œ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—Ä®n 16 šnŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—„¨µŠ 18 šnŠ¨³ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—Á¨È„ 6 šnŠ¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤Á‡¦ºÉ°Š®¤µ¥ŗo„n ǦäΤ‡¼nÄ®n­»—ÁžÈœœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„¨³Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤‡¼nÁ¨È„­»—ÁžÈœœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„×¥š¸ÉǦäΤ ‡¼nš¸ÉÄ®n¤µ„š¸É­»—¤¸ œµ—Ä®n„ªnµÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤‡¼nÁ¨È„­»—ž¦³¤µ– 3 Ášnµ ‹µ„„µ¦¥o°¤Â™­¸Âœ°¦r¡˜ÎµÂ®œnŠ œ°¦r 2 ˜ÎµÂ®œnŠš´ÊŠÄœÁ¡«Ÿ¼o¨³Á¡«Á¤¸¥ (£µ¡š¸É 4.11, 4.12, 4.13. 4.14 ¨³ 4.15) ž¨µ­„¼˜Á˜°¦r¤¸‡µ¦·Ã°Åšžr Å¤n­¤¤µ˜¦×¥¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤Á¡¸¥Šœ·—Á—¸¥ª‡º°œ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„¨³¤¸­¼˜¦‡µ¦·Ã°Åšžr—´Šœ¸Ê t t t 2n (diploid) 40 = L 16 + M 18 + S 6

£µ¡š¸É 4.11 ¨´„¬–³ž¨µ­„¼˜Á˜°¦r (Ocellated dragonet, Synchiropus ocellatus) ­Á„¨µ¦r 1 ÁŽœ˜·Á¤˜¦

2930

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

11 12 13 14 15

16 17 18 19 20

£µ¡š¸É 4.12 ÁŽ¨¨rÁ¤šµÁ¢­Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤ (£µ¡œ) ¨³‡µ¦·Ã°Åšžr (£µ¡¨nµŠ) °Šž¨µ­„¼˜Á˜°¦r (Synchiropus ocellatus) Á¡«Ÿ¼o¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 40 šnŠ—oª¥ª·›¸„µ¦¥o°¤­¸Â›¦¦¤—µ ­Á„¨µ¦r 10 ŤÇ¦Á¤˜¦)

3031

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

11 12 13 14 15

16 17 18 19 20

£µ¡š¸É 4.13 ÁŽ¨¨rÁ¤šµÁ¢­Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤ (£µ¡œ) ¨³‡µ¦·Ã°Åšžr (£µ¡¨nµŠ) °Šž¨µ­„¼˜Á˜°¦r (Synchiropus ocellatus) Á¡«Á¤¸¥¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 40 šnŠ—oª¥ª·›¸„µ¦¥o°¤­¸Â›¦¦¤—µ ­Á„¨µ¦r 10 ŤÇ¦Á¤˜¦)

3132

£µ¡š¸É 4.14 ÁŽ¨¨rÁ¤šµÁ¢­Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤ °Šž¨µ­„¼˜Á˜°¦r (Synchiropus ocellatus) Á¡«Ÿ¼o (£µ¡œ) ¨³Á¡«Á¤¸¥ £µ¡¨nµŠ) ¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 40 šnŠ—oª¥ª·›¸„µ¦¥o°¤Â™­¸Âœ°¦r ­Á„¨µ¦r 10 ŤÇ¦Á¤˜¦)

3233

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

£µ¡š¸É 4.15 °·—·Ã°Â„¦¤ °Šž¨µ­„¼˜Á˜°¦r (Synchiropus ocellatus) ¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 40 šnŠ—oª¥ª·›¸„µ¦¥o°¤­¸Â›¦¦¤—µ

3334

˜µ¦µŠš¸É 4.3 ‡nµÁŒ¨¸É¥‡ªµ¤¥µª °ŠÂ œÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤ oµŠ­´Êœ (short arm; Ls), ‡ªµ¤¥µª °ŠÂ œÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤ oµŠ¥µª (long arm; Ll), ‡ªµ¤¥µªš´ÊŠ®¤— °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤Â˜n¨³‡¼n (total length; LT), ‡nµ relative length (RL), ‡nµ centromeric index (CI), ‡nµÁ¸É¥ŠÁœ¤µ˜¦“µœ (standard deviation, SD) °Š ‡nµ RL, CI œµ—¨³œ·— °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤Â˜n¨³ÂšnŠ‹µ„ÁŽ¨¨r¦³¥³Á¤šµÁ¢­ °Šž¨µ­„¼˜Á˜°¦r (Synchiropus ocellatus) Á¡«Ÿ¼o¨³Á¡«Á¤¸¥‹Îµœªœ 20 ÁŽ¨¨r¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 40 šnŠ

ǦäΤ‡nš¸É¼ Ls Ll LT CI+SD RL+SD œµ— œ·— 1 0.000 6.557 6.557 1.000±0.000 0.076±0.002 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 2 0.000 6.076 6.076 1.000±0.000 0.070±0.002 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 3 0.000 5.842 5.842 1.000±0.000 0.068±0.002 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 4 0.000 5.669 5.669 1.000±0.000 0.066±0.002 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 5 0.000 5.456 5.456 1.000±0.000 0.063±0.002 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 6 0.000 5.134 5.134 1.000±0.000 0.059±0.002 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 7 0.000 4.628 4.628 1.000±0.000 0.054±0.002 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 8 0.000 4.358 4.358 1.000±0.000 0.050±0.001 Ä®n ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 9 0.000 4.232 4.232 1.000±0.000 0.049±0.001 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 10 0.000 4.157 4.157 1.000±0.000 0.048±0.001 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 11 0.000 4.081 4.081 1.000±0.000 0.047±0.002 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 12 0.000 3.929 3.929 1.000±0.000 0.046±0.002 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 13 0.000 3.809 3.809 1.000±0.000 0.044±0.001 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 14 0.000 3.711 3.711 1.000±0.000 0.043±0.001 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 15 0.000 3.570 3.570 1.000±0.000 0.041±0.001 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 16 0.000 3.468 3.468 1.000±0.000 0.040±0.001 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 17 0.000 3.346 3.346 1.000±0.000 0.039±0.001 „¨µŠ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 18 0.000 3.208 3.208 1.000±0.000 0.037±0.001 Á¨È„ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„

19 0.000 3.027 3.027 1.000±0.000 0.035±0.001 Á¨È„ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„

20 0.000 2.120 2.120 1.000±0.000 0.024±0.016 Á¨È„ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„

šš¸É 5 ­¦»žÂ¨³ª·‹µ¦–rŸ¨„µ¦ª·‹´¥

5.1 ­¦»žŸ¨„µ¦ª·‹´¥ „µ¦«¹„¬µ¡´œ›»«µ­˜¦rÁŽ¨¨r °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹Îµœªœ 3 œ·—Ĝž¦³Áš«Åš¥Á˜¦¸¥¤Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤ —oª¥ª·›¸˜¦ŠÂ¨³ª·›¸°o°¤ŗoŸ¨„µ¦ª·‹´¥—´Šœ¸Ê 5.1.1 ž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ª (Synchiropus splendidus) ž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ª¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°—rĜÁ¡«Ÿ¼oÁšnµ„´ 39 šnŠ¨³ÄœÁ¡«Á¤¸¥Ášnµ„´ 40 šnŠ ¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤¡ºÊœ“µœÁšnµ„´ 40 š´ÊŠÄœÁ¡«Ÿ¼o¨³Á¡«Á¤¸¥ž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ª¤¸¦³„µ¦„ε®œ—

Á¡«Â X1X1X2X2/X1X2YÁžÈœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤Á¡«®¨µ¥ÂšnŠÁ„·—‹µ„ǦäΤ Y Á‡¨ºÉ°œ¥oµ¥Åž¦ª¤„´„´ ǦäΤ¦nµŠ„µ¥­nŠŸ¨Ä®ož¨µÁ¡«Ÿ¼o¨³ž¨µÁ¡«Á¤¸¥¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—r˜nµŠ„´œǦäΤ ¦nµŠ„µ¥ °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ªž¦³„°—oª¥Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤œ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—Ä®n 8 šnŠÁšÃ¨ÁŽœš¦·„

œµ—„¨µŠ 28 šnŠǦäΤ X1ÁžÈœœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—Ä®nǦäΤ X2 Á žÈ œ  œ· — Á š à ¨ ÁŽœš¦·„ œµ—„¨µŠ¨³Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤ Y ÁžÈœœ·—Á¤šµÁŽœš¦·„ œµ—Ä®n¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤Á‡¦ºÉ°Š®¤µ¥ŗo„n ǦäΤ‡¼nÄ®n­»—ÁžÈœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤ªµ¥¨³Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤‡¼nÁ¨È„­»—ÁžÈœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤¦nµŠ„µ¥œ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„‡¼ š¸É 18 ×¥š¸ÉǦäΤ‡¼nš¸ÉÄ®n¤µ„š¸É­»—¤¸ œµ—Ä®n„ªnµÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤‡¼nÁ¨È„­»—ž¦³¤µ– 2 Ášnµ‹µ„„µ¦¥o°¤Â™ ­¸Âœ°¦r¡˜ÎµÂ®œnŠœ°¦r‹Îµœªœ 3 ˜ÎµÂ®œnŠž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ª¤¸‡µ¦·Ã°ÅšžrÅ¤n­¤¤µ˜¦×¥¤¸ ǦäΤ 2 œ·—ŗo„nœ·—Á¤šµÁŽœš¦·„¨³ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„¨³¤¸­¼˜¦‡µ¦·Ã°Åšžr—´Šœ¸Ê t t Á¡«Ÿ¼o 2n (diploid) 39 = L 8 + M28 + X1X2Y t t Á¡«Á¤¸¥ 2n (diploid) 40 = L 8 + M 28 + X1X1X2X2

5.1.2 ž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹»— (Synchiropus picturatus) ž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹»—¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°—rÁšnµ„´ 40 šnŠ¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤¡ºÊœ“µœÁšnµ„´ 40 Ťn¡‡ªµ¤Â˜„˜nµŠ °Š‡µ¦·Ã°Åšžr¦³®ªnµŠž¨µÁ¡«Ÿ¼o¨³Á¡«Á¤¸¥ǦäΤ °Šž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹»— ž¦³„°—oª¥Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤œ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—Ä®n 14 šnŠÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—„¨µŠ 24 šnŠ¨³ ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—Á¨È„ 2 šnŠ¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤Á‡¦ºÉ°Š®¤µ¥ŗo„nǦäΤ‡¼nÄ®n­»—ÁžÈœœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ ¨³Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤‡¼nÁ¨È„­»—ÁžÈœœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„×¥š¸ÉǦäΤ‡¼nš¸ÉÄ®n¤µ„š¸É­»—¤¸ œµ—Ä®n„ªnµÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤ ‡¼nÁ¨È„­»—ž¦³¤µ– 2 Ášnµ‹µ„„µ¦¥o°¤Â™­¸Âœ°¦r¡˜ÎµÂ®œnŠœ°¦r 2 ˜ÎµÂ®œnŠš´ÊŠÄœÁ¡«Ÿ¼o¨³Á¡«Á¤¸¥ž¨µ ¤œ—µ¦·œ‹»—¤¸‡µ¦·Ã°ÅšžrÅ¤n­¤¤µ˜¦×¥¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤Á¡¸¥Šœ·—Á—¸¥ª‡º°œ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„¨³¤¸­¼˜¦ ‡µ¦·Ã°Åšžr—´Šœ¸Ê t t t 2n (diploid) 40 = L 14 + M 24 + S 2

3648

5.1.3 ž¨µ­„¼˜Á˜°¦r (Synchiropus ocellatus) ž¨µ­„¼˜Á˜°¦r¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°—rÁšnµ„´ 40 šnŠ¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤¡ºÊœ“µœÁšnµ„´ 40 Ťn¡‡ªµ¤Â˜„˜nµŠ °Š‡µ¦·Ã°Åšžr¦³®ªnµŠž¨µÁ¡«Ÿ¼o¨³Á¡«Á¤¸¥ǦäΤ °Šž¨µ­„¼˜Á˜°¦rž¦³„°—oª¥ Ǧäԍœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—Ä®n 16 šnŠÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—„¨µŠ 18 šnŠ¨³ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ— Á¨È„ 6 šnŠ¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤Á‡¦ºÉ°Š®¤µ¥ŗo„nǦäΤ‡¼nÄ®n­»—ÁžÈœœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„¨³Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤‡¼nÁ¨È„ ­»—ÁžÈœœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„×¥š¸ÉǦäΤ‡¼nš¸ÉÄ®n¤µ„š¸É­»—¤¸ œµ—Ä®n„ªnµÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤‡¼nÁ¨È„­»—ž¦³¤µ– 3 Ášnµ ‹µ„„µ¦¥o°¤Â™­¸Âœ°¦r¡˜ÎµÂ®œnŠœ°¦r 2 ˜ÎµÂ®œnŠš´ÊŠÄœÁ¡«Ÿ¼o¨³Á¡«Á¤¸¥ž¨µ­„¼˜Á˜°¦r¤¸ ‡µ¦·Ã°ÅšžrÅ¤n­¤¤µ˜¦×¥¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤Á¡¸¥Šœ·—Á—¸¥ª‡º°œ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„¨³¤¸­¼˜¦‡µ¦·Ã°Åšžr —´Šœ¸Ê t t t 2n (diploid) 40 = L 16 + M 18 + S 6

5.2 ª·‹µ¦–rŸ¨„µ¦ª·‹´¥ ÁžÈœ¦µ¥Šµœ‡¦´ÊŠÂ¦„ °Š„µ¦«¹„¬µ¡´œ›»«µ­˜¦rÁŽ¨¨rĜž¨µÂ¤œ—µ¦·œ (ªŠ«r Callionymidae) ‹Îµœªœ 3 œ·—ŗo„nž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ªž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹»—¨³ž¨µ­„¼˜Á˜°¦r ¤¸¦µ¥Šµœ¤µ„n°œ®œoµœ¸ÊĜ ž¦³µ„¦ °Šž¦³Áš«¸Éž»nœ‹Îµœªœ 5 œ·—) ‹µ„„µ¦˜¦ª‹­°Á°„­µ¦¡ªnµÄœž´‹‹»´œ¤¸ž¨µš³Á¨Å¤nœo°¥ „ªnµ 13,000 œ·—ץĜ‹Îµœªœœ¸Ê¤¸¦µ¥Šµœ„µ¦«¹„¬µ¡´œ›»«µ­˜¦rÁŽ¨¨r 1,200 œ·—‡·—ÁžÈœ¦o°¥¨³ 9.23 ­nªœ Ä®n¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—r (2n) Ášnµ„´ 48 šnŠ‡·—ÁžÈœ¦o°¥¨³ 54 (¡ 648 œ·—‹µ„‹Îµœªœ 1,200 œ·—) Ĝ„¨»n¤ž¨µ„¦³—¼„ Ȋ (osteicthyes) ǦäΤ—·¡¨°¥—r‹³¤¸‡ªµ¤Ÿ´œÂž¦¤µ„¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rœo°¥ ­»— 22 šnŠĜž¨µœ„ »œš°Šœ·— Xyrichthys twistii ªŠ«r Labridae) ¨³ž¨µš¸É°µ«´¥°¥¼nĜšª¸ž°µ¦r„˜·„ œ·— Notothenia coriiceps (ªŠ«r Nototheiidae) ‹œ¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—r¤µ„­»—¦³®ªnµŠ 240 ™¹Š 280 šnŠ Ĝž¨µ­Á˜°Á‹¸¥œ (ªŠ«r Acipenseridae) Ž¹ÉŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤¤¸ œµ—Á¨È„¤µ„ (‡¨oµ¥‹»—) ¨³‡µ—ªnµÁ„·—‹µ„„µ¦š¸É¤¸ ǦäΤÁ¡·É¤ ¹ÊœÁžÈœ 4 »— (4n, tetraploid) ­Îµ®¦´„¨»n¤ž¨µ„¦³—¼„°n°œ (chondrichthyes) ĜªŠ«rŒ¨µ¤ žµ„ÁžÈ— (Polyodontidae) ¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—r¦³®ªnµŠ 112 ™¹Š 120 šnŠ Ĝž¨µ„¦³Áœ (´Êœ Elasmobranchii) ¡ªnµ¦o°¥¨³ 55 š¸É¤¸¦µ¥Šµœ„µ¦«¹„¬µÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—r¦³®ªnµŠ 64 ™¹Š 86 šnŠ (NF = 90 ™¹Š 124) (Galetti et al., 2000) ‹µ„„µ¦˜¦ª‹­°Á°„­µ¦¦µ¥Šµœš¸É¤¸¤µ„n°œ®œoµœ¸Ê¡ªnµž¨µÄœªŠ«r Callionymidae ¤¸‹Îµœªœ ǦäΤ°¥¼n 4 ¦¼žÂŗo„n¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 32, 36, 37 ¨³ 38 šnŠ (Arai, 2011) Ž¹ÉŠÂ˜„˜nµŠ„´¦µ¥Šµœ„µ¦«¹„¬µÄœ‡¦´ÊŠœ¸Êš¸É¡ªnµž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ªž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹»—¨³ž¨µ­„¼˜Á˜°¦r¤¸ ‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 39 ®¦º° 40, 40 ¨³ 40 šnŠ˜µ¤¨Îµ—´¨³¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤¡ºÊœ“µœ Ášnµ„´ 40 Ĝš»„œ·—Á¤ºÉ°šÎµ„µ¦Áž¦¸¥Áš¸¥„´¦µ¥Šµœ„µ¦«¹„¬µ„n°œ®œoµœ¸Ê¡ªnµž¨µªŠ«rœ¸Ê‹³¤¸‹Îµœªœ ǦäΤ¡ºÊœ“µœ°¥¼nĜnªŠ 34-74 (Arai, 2011) 3749

ž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ª¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 39 šnŠÄœÁ¡«Ÿ¼oÁžÈœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤¦nµŠ„µ¥

œ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 36 šnŠ¨³Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤Á¡«ÁžÈœ X1X1Y ž¨µÁ¡«Á¤¸¥¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rÁšnµ„´

40 šnŠÁžÈœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤¦nµŠ„µ¥œ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„š´ÊŠ®¤— 40 šnŠ¨³¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤Á¡«ÁžÈœ X1X1X2X2×¥

ǦäΤ X1 ÁžÈœœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—Ä®nǦäΤ X2 ÁžÈœœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—„¨µŠ¨³ ǦäΤ Y ÁžÈœœ·—Á¤šµÁŽœš¦·„ œµ—Ä®n­Îµ®¦´ž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹»—¨³ž¨µ­„¼˜Á˜°¦r¤¸‹Îµœªœ ǦäΤ—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 40 šnŠǦäԞ¦³„°—oª¥Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤œ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„š´ÊŠ®¤— 40 šnŠ ¨³˜¦ª‹Å¤n¡‡ªµ¤Â˜„˜nµŠ °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤Á¡« ˜µ¦µŠš¸É 5.1) ­°—‡¨o°Š„´¦µ¥Šµœ„µ¦«¹„¬µ„n°œ®œoµœ¸Êš¸É ¡ªnµž¨µÄœªŠ«r Callionymidae ǦäԞ¦³„°—oª¥Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤œ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„š´ÊŠ®¤—¨³Äœž¨µ µŠœ·—¡Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤œ·—Á¤šµÁŽœš¦·„Á¡·É¤ ¹Êœ¤µ 1-2 šnŠ¥„ÁªoœÄœž¨µ Repomucenus richardsonii‹µ„ ž¦³µ„¦ Hyogo °Šž¦³Áš«¸Éž»nœ¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 38 šnŠǦäԞ¦³„°—oª¥ Ǧäԍœ·—Ž´Á¤šµÁŽœš¦·„ 36 šnŠ¨³ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ 2 šnŠ (Sawada and Sakamoto, 1980; Murofushi et al., 1983, 1984; Ojima and Kikuno, 1987; Arai, 2011) Ÿ¨„µ¦«¹„¬µÄœ‡¦´ÊŠœ¸Ê¡ªnµž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹»—¨³ž¨µ­„¼˜Á˜°¦rŤn¤¸‡ªµ¤Â˜„˜nµŠ °Š‡µ¦·Ã°Åšžr ¦³®ªnµŠž¨µÁ¡«Ÿ¼o¨³Á¡«Á¤¸¥Ž¹ÉŠ­°—‡¨o°Š„´ž¨µ Eleutherochir mirabilis, Repomucenus huguenini ¨³ R. richardsonii š¸É°¥¼nĜªŠ«rÁ—¸¥ª„´œš¸ÉŤn¡‡ªµ¤Â˜„˜nµŠ °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤Á¡« (Sawada and Sakamoto, 1980; Murofushi et al., 1984; Ojima and Kikuno, 1987; Arai, 2011) ­Îµ®¦´Äœž¨µÂ¤œ—µ¦·œÁ ¸¥ª‹µ„

„µ¦«¹„¬µÄœ‡¦´ÊŠœ¸Ê¡ªnµÁ¡«Á¤¸¥¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤Á¡«ÁžÈœ X1X1X2X2¨³Á¡«Ÿ¼o¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤Á¡« X1X2Y ×¥ ž¨µÁ¡«Á¤¸¥¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤¤µ„„ªnµž¨µÁ¡«Ÿ¼o 1 šnŠÁ„·—‹µ„ǦäΤ Y Á‡¨ºÉ°œ¥oµ¥Åž¦ª¤„´„´ ǦäΤ¦nµŠ„µ¥­nŠŸ¨Ä®ož¨µÁ¡«Ÿ¼o¨³ž¨µÁ¡«Á¤¸¥¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—r˜nµŠ„´œץǦäΤ

X1ÁžÈœœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—Ä®nǦäΤ X2ÁžÈœœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ œµ—„¨µŠ¨³Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤ Y ÁžÈœ œ·—Á¤šµÁŽœš¦·„ œµ—Ä®n ­°—‡¨o°Š„´¦µ¥Šµœ„µ¦«¹„¬µ °Šž¨µš¸É°¥¼nĜªŠ«rÁ—¸¥ª„´œ (Callionymidae) š¸É ¡Å—oĜž¨µ Repomucenus beniteguri¨³ R. ornatipinnis š¸ÉÁ¡«Ÿ¼o¨³Á¡«Á¤¸¥¤¸‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤Å¤n

Ášnµ„´œÂ¨³¤¸¦³„µ¦„ε®œ—Á¡«Â X1X1X2X2/X1X2Y ÁnœÁ—¸¥ª„´œ (Murofushi et al., 1983; Arai, 2011) ž¨µÁžÈœ­´˜ªrš¸É¤¸¦³„µ¦‡ª‡»¤¨´„¬–³‡ªµ¤ÁžÈœÁ¡«š¸É®¨µ„®¨µ¥œ°„‹µ„œ¸Ê¥´Š¡ªnµÄœž¨µ µŠœ·—­—Š¨´„¬–³„µ¦ÁžÈœ„¦³Áš¥ (hermaphrodite) µŠœ·—­µ¤µ¦™Áž¨¸É¥œÂž¨ŠÁ¡«Å—o (sex reversed) ¨³¤¸ž¨µ®¨µ¥œ·—š¸É„ε®œ—Á¡«—oª¥¥¸œ‹µ„„µ¦«¹„¬µ¡ªnµÄœž¨µš³Á¨‹³¤¸¦¼žÂ„µ¦ „ε®œ—Á¡«—oª¥Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤Á¡«Á¡¸¥ŠÅ¤n„¸Éœ·—Ž¹ÉŠÂ˜„˜nµŠ‹µ„ž¨µœÎʵ‹º—š¸É¤¸„µ¦¦µ¥ŠµœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤Á¡«Á°µÅªo ÁžÈœ‹Îµœªœ¤µ„Ĝž¨µš³Á¨‹³¡¦¼žÂ„µ¦„ε®œ—Á¡«—oª¥Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤Á¡« 5 ¦³ŗo„n XX/XY (Á¡«

Ÿ¼o XY Á¡«Á¤¸¥ XX), XX/XO (Á¡«Ÿ¼o XO Á¡«Á¤¸¥ XX), ZZ/ZW (Á¡«Ÿ¼o ZZ Á¡«Á¤¸¥ ZW), ZZ/ZW1W2 (Á¡«Ÿ¼o

ZZ Á¡«Á¤¸¥ ZW1W2) ¨³ X1X1X2X2/X1X2Y (Á¡«Ÿ¼o X1X2Y Á¡«Á¤¸¥ X1X1X2X2) ) (Galetti et al., 2000)

5038

‹µ„„µ¦¥o°¤Â™­¸Âœ°¦r¡ªnµž¨µÂ¤œ—µ¦·œ‹»—¨³ž¨µ­„¼˜Á˜°¦r¤¸˜ÎµÂ®œnŠœ°¦r 2 ˜ÎµÂ®œnŠ ­°—‡¨o°Š„´ž¨µÄœªŠ«rÁ—¸¥ª„´œš¸É¤¸¦µ¥Šµœ¤µ„n°œ®œoµœ¸ÊĜž¨µ Repomucenus beniteguri, R. huguenini, R. ornatipinnis ¨³ R. richardsonii š¸É¡ªnµ¤¸˜ÎµÂœnŠœ°¦r 2 ˜ÎµÂ®œnŠÁnœÁ—¸¥ª„´œ (Murofushi et al., 1983, 1984; Ojima and Kikuno, 1987; Arai, 2011) ˜n˜„˜nµŠ„´¦µ¥Šµœ„µ¦«¹„¬µÄœ‡¦´ÊŠœ¸ÊĜž¨µÂ¤œ—µ¦·œ Á ¸¥ªš¸É˜¦ª‹¡˜ÎµÂ®œnŠœ°¦r 3 ˜ÎµÂ®œnŠš´ÊŠÄœž¨µÁ¡«Ÿ¼o¨³ž¨µÁ¡«Á¤¸¥ ­µÁ®˜» °Š‡ªµ¤Ÿ´œÂž¦ °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤Äœž¨µš³Á¨ ¦ª¤š´ÊŠªŠ«rž¨µÂ¤œ—µ¦·œ) ‹µ„„µ¦«¹„¬µ ¡ªnµ¦¦¡»¦»¬ °Šž¨µ„¦³—¼„ Ȋ¤¸­¤¤»˜·“µœªnµ¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤—·¡¨°¥—rÁšnµ„´ 48 šnŠ¨³ÁžÈœ Ǧäԍœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„š´ÊŠ®¤— (NF = 48) Ž¹ÉŠ¨´„¬–³‡µ¦·Ã°Åšžr—´Š„¨nµª¥´Š­µ¤µ¦™¡Å—oĜž¨µ š³Á¨®¨µ¥œ·—×¥ÁŒ¡µ³Äœ°´œ—´ž¨µ„³¡ŠŽ¹ÉŠÁžÈœ°´œ—´š¸É¤¸‡ªµ¤®¨µ„œ·—¡´œ›»r¤µ„š¸É­»—Ĝ„µ¦ ¡·‹µ¦–µ™¹Š„µ¦‹´—Á¦¸¥Š˜´ªÄ®¤n °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤‹³¡·‹µ¦–µ‹µ„ǦäΤ—·¡¨°¥—r¨³œ·— °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤ Ĝž¨µœ·—˜nµŠÇĜ˜n¨³ªŠ«rĜ„¦–¸š¸É¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤ÁžÈœœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„š´ÊŠ®¤—™º°ªnµÁžÈœ„¨»n¤š¸ÉŤn¤¸ „µ¦Áž¨¸É¥œÂž¨Š¨³‹´—ªnµÁžÈœ‡µ¦·Ã°ÅšžrÃ¦µ– (primitive stage) —´Šš¸É¡Å—oĜªŠ«rž¨µŸ¸Á­ºÊ°¨³ ªŠ«rž¨µ­¦o°¥œ„Á µš³Á¨š¸É¡ªnµž¨µš´ÊŠ­°ŠªŠ«rœ¸Ê¤¸„µ¦Â¡¦n„¦³‹µ¥˜´ªÁžÈœªŠ„ªoµŠ˜µ¤Âœªž³„µ¦´Šš¸É‹³ ­nŠŸ¨Ä®o¤¸­·ÉŠ„¸— ªµŠšµŠ£¼¤·«µ­˜¦r¦³®ªnµŠž¦³µ„¦˜ÎɵšÎµÄ®oÁ„·—„µ¦Á‡¨ºÉ°œ¥oµ¥ °Š¥¸œÅ—o­¼Š (gene flow) Ž¹ÉŠÁžÈœÅž˜µ¤Ã¤Á—¨¡´œ›»«µ­˜¦rž¦³µ„¦—´ÊŠÁ—·¤˜µ¤š§¬‘¸ °ŠÂ¨œÁ— (Lande) ‡«. 1979 š¸É¡ªnµ¤¸ ‡ªµ¤­´¤¡´œ›r„´œ°¥nµŠ¤µ„¦³®ªnµŠ„µ¦Å¤n¤¸­·ÉŠ ªµŠ„´ÊœšµŠ£¼¤·«µ­˜¦r‹µ„­£µ¡Âª—¨o°¤Äœš³Á¨¨³„µ¦ Á‡¨ºÉ°œš¸ÉĜ¦³—´­¼Š °Š„¨»n¤ž¨µš³Á¨š¸É‹³­nŠŸ¨šÎµÄ®oŤn¤¸„µ¦Áž¨¸É¥œÂž¨Š °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤œ°„‹µ„œ¸Ê¥´Š ¡ªnµ‡µ¦·Ã°ÅšžrÁ—·¤š¸É¤¸Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤œ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„š´ÊŠ®¤—‹³Å¤n¤¸„µ¦Áž¨¸É¥œÂž¨ŠÁœºÉ°Š‹µ„¤¸„µ¦¦´„¬µ ‡ªµ¤­¤—»¨Äœ¦³—´ °ŠÁŽ¨¨r×¥‹³¤¸Áž¨¸É¥œÂž¨ŠÅ—oÁ¡¸¥ŠÁ¨È„œo°¥Ášnµœ´ÊœĜšµŠ˜¦Š„´œ oµ¤­Îµ®¦´„¨»n¤ ž¨µš¸É™¼„‹Îµ„´—„µ¦Â¡¦n„¦³‹µ¥˜´ª¦nª¤„´„µ¦š¸É¤¸­£µ¡Âª—¨o°¤šµŠš³Á¨š¸É¤¸‡ªµ¤Â˜„˜nµŠ„´œ¤µ„¡ªnµ‹³ ¤¸„µ¦Áž¨¸É¥œÂž¨Š °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤­¼Š¤µ„Ž¹ÉŠ¦ª¤™¹Š„µ¦¡´•œµÁž¨¸É¥œÂž¨ŠÄœ¦³—´ž¦³µ„¦—oª¥ ‹µ„­¤¤»˜·“µœ—´Š„¨nµª oµŠ˜oœ­nŠŸ¨šÎµÄ®ož¨µš³Á¨¤¸‡µ¦·Ã°Åšžrš¸ÉŤn®¨µ„®¨µ¥Ášnµ„´ž¨µœÎʵ‹º— œÎʵš³Á¨­nªœÄ®nÁžÈœŸºœÁ—¸¥ª„´œš´ªÃ¨„É ) ˜nÁ¤ºÉ°¤¸„µ¦¡·‹µ¦–µ¨ŠÅžÄœ¦³—´œ·—¡´œ›»r °Šž¨µÂ˜n¨³ªŠ«r ¡ªnµ‹³¤¸‡ªµ¤Ÿ´œÂž¦ °Š‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤š¸É˜„˜nµŠ„´œ—´Šš¸É„¨nµª¤µÂ¨oª‹µ„„µ¦«¹„¬µ¡ªnµ„¨Å„„µ¦ ‹´—Á¦¸¥Š˜´ªÄ®¤n °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤š¸ÉšÎµÄ®oÁ„·—‡ªµ¤Ÿ´œÂž¦ °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤ž¨µš³Á¨‹³Á„¸É¥ª o°Š„´ „¦³ªœ„µ¦š¸É­Îµ‡´ 3 „¦³ªœ„µ¦ŗo„n 1) „µ¦®´„¨³˜n°­¨´Ä®¤n¤¸ÁŽœÃš¦Á¤¸¥¦r¦nª¤—oª¥ 2) „µ¦ ÁºÉ°¤¦ª¤„´œ °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤¨³ 3) „µ¦®´„ °Š·Êœ­nªœ °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤ªŠ«rž¨µš³Á¨š¸É¤¸ª·ª´•œµ„µ¦ Áž¨¸É¥œÂž¨ŠšµŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤œ´Êœ°µ‹‹³Á„¸É¥ª o°Š„´„¦³ªœ„µ¦Ä—„¦³ªœ„µ¦®œ¹ÉŠ®¦º°š»„„¦³ªœ„µ¦„È ÁžÈœÅžÅ—oŽ¹ÉŠšÎµÄ®o¤¸¨´„¬–³ÁŒ¡µ³ÄœÂ˜n¨³ªŠ«rš¸É˜„˜nµŠ„´œ°°„Åž (Ojima and Kashiwagi, 1981; Ojima, 1983; Galetti et al., 2000)

5139

˜µ¦µŠš¸É 5.1 Ÿ¨„µ¦«¹„¬µ¨´„¬–³ °Š‡µ¦·Ã°ÅšžrĜž¨µÂ¤œ—µ¦·œ (ªŠ«r Callionymidae) š¸Éŗo‹µ„„µ¦«¹„¬µ Ĝ‡¦´ÊŠœ¸ÊÁž¦¸¥Áš¸¥„´¦µ¥Šµœ„µ¦«¹„¬µš¸É¤¸¤µ„n°œ®œoµœ¸Ê

œ·— 2n NF NORs ­¼˜¦‡µ¦·Ã°Åšžr ®¨nŠ˜´ª°¥nµŠ °oµŠ°·Š

Synchiropus splendidus 39, 40 40 3 36t+X1X1X2X2/X1X2Y Thailand „µ¦«¹„¬µÄœ‡¦´ÊŠœ¸Ê S. picturatus 40 40 2 40t Thailand „µ¦«¹„¬µÄœ‡¦´ÊŠœ¸Ê S. ocellatus 40 40 2 40t Thailand „µ¦«¹„¬µÄœ‡¦´ÊŠœ¸Ê Eleutherochir mirabilis 36 36 - 36a Japan Sawada and Sakamoto (1980) Repomucenus beniteguri 38 38 - 38st Japan Murofushi et al. (1983) 37 38 2 1m+36st Japan Murofushi et al. (1983) R. huguenini 32 34 2 2m+30a Japan Murofushi et al. (1984) R. ornatipinnis 38 38 - 38st Japan Murofushi et al. (1983) 37 38 2 1m+36st Japan Murofushi et al. (1983) R. richardsonii 38 38 2 38a Japan Murofushi et al. (1984) 38 74 - 36sm+2a Japan Ojima and Kikuno (1987)

®¤µ¥Á®˜»: 2n = ‹Îµœªœ—·¡¡¨°¥—rǦäΤ, NF = ‹ÎµœªœÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤¡ºÊœ“µœ, NORs = ¦°¥‡°¦r—š¸É­°Š °ŠÃ‡¦Ã¤ÃŽ¤, m = Ǧäԍœ·—Á¤šµÁŽœš¦·„, sm = Ǧäԍœ·—Ž´Á¤šµÁŽœš¦·„, t = Ǧäԍœ·—ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„, st = Ǧäԍœ·—Ž´ÁšÃ¨ÁŽœš¦·„ (Áš¸¥Å—o„´Ã‡¦Ã¤ÃŽ¤œ·—°³Ã‡¦ ÁŽœš¦·„Äœ„µ¦«¹„¬µ‡¦´ÊŠœ¸Ê), a = Ǧäԍœ·—°³Ã‡¦ÁŽœš¦·„¨³ – Ťn¤¸ o°¤¼¨

Á°„­µ¦°oµŠ°·Š

„´œ¥µ¦´˜œrō¥­»˜. 2532. ÁŽ¨¨r¡´œ›»«µ­˜¦r¨³ÁŽ¨¨r°œ»„¦¤ª·›µœ °Š¡º­„»¨ Zephyranthes. £µ‡ª·µ¡§„¬«µ­˜¦r‡–³ª·š¥µ«µ­˜¦r‹»¯µ¨Š„¦–r¤®µª·š¥µ¨´¥, „¦»ŠÁš¡². °¤¦µ‡´¤£·¦µœœšr. 2546. ¡´œ›»«µ­˜¦r °ŠÁŽ¨¨r. ¡·¤¡r‡¦´ÊŠš¸É 2. £µ‡ª·µ¡´œ›»«µ˜¦r‡–³ ª·š¥µ«µ­˜¦r¤®µª·š¥µ¨´¥Á„¬˜¦«µ­˜¦r, „¦»ŠÁš¡². °¨Š„¨—šœ°°¤š°Š. 2554. ¡´œ›»«µ­˜¦rÁŽ¨¨r. ¡·¤¡r‡¦´ÊŠš¸É 1. £µ‡ª·µ¸ªª·š¥µ‡–³ª·š¥µ«µ­˜¦r ¤®µª·š¥µ¨´¥ °œÂ„nœ, 抡·¤¡r¤®µª·š¥µ¨´¥ °œÂ„nœ, °œÂ„nœ. Arai, R. 2011. Fish Karyotype. Springer, Japan. Artoni, R. F., Falcáo, J. N., Moreira-Filho, O. and Bertollo, L. A. C. 2001. An uncommon condition for a sex chromosome system in Characidae fish. Distribution and differentiation of the ZZ/ZW system in Triportheus. Chromosome Research 9: 449-456. Born, G. G. and Bertollo, L. A. C. 2000. An XX/XY sex chromosome system in a fish species, Hoplias malabaricus, with a polymorphic NOR-bearing X chromosome. Chromosome Research 8: 111-118. Chen, T. R. and Ebeling, A. W. 1968. Karyological evidence of female heterogamety in the mosquito fish, Gambusia affinis. Copeia 1: 70-75. Fujiwara, A., Nishida-Umehara, C., Sakamoto, T., Okamoto, N., Nakayama, I. and Abe, S. 2001. Improved fish lymphocyte culture for chromosome preparation. Genetica 111: 78-89. Galetti, P. M., Aguilar, C. T. and Molina, W. F. 2000. An overview of marine fishes cytogenetics. Hydrobiologia 420: 55-62. Gold, J. R., Li, Y., Shipley, N. S. and Powers, P. K. 1990. Improved methods for working with fish chromosomes with a review of metaphase chromosome banding. Journal of Fish Biology 37: 563-575. Halnan, C. R. E. 1989. Cytogenetics of Animals. CAB International, United State of Kingdom. Jesus, C. M., Bertollo, L. A. C. and Moreira-Filho, O. 1999. Comparative cytogenetics in Apareiodon affinis (Pisces, Characiformes) and considerations regarding diversification of the group. Genetica 105: 63-67. 6241

Lande, R. 1979. Effective dame sizes during long-term evolution estimated from rates of chromosomal rearrangement. Evolution 33: 234–251. Murofushi, M., Nishikawa, S. and Yosida, T. H. 1983. Cytogenetical studies on fishes. V. Multiple sex chromosome mechanism (XX-Y) found in two dragonet fishes. Proc. Japan Acad., Ser. B., 59: 58-61. Murofushi, M., Nishikawa, S. and Yosida, T. H. 1984. Cytogenetical studies on fishes. VI. Karyotype comparison of four species in the dragonet fish. La Kromosomo, II, 34: 1079-1084. Nanda, I., Schartl, M., Feichtinger, W., Schlupp, I., Parzefall, J. and Schmid, M. 1995. Chromosomal evidence for laboratory synthesis of triploid hybrid between the gynogenetic teleost Poecilia Formosa and its host species. Journal of Fish Biology 47: 619-623. Ojima, Y. 1983. Fish cytogenetics. In: Chromosomes in evolution of eukaryotic groups. Sharma, A. K. and Sharma, A. (Eds.), Vol. I. pp. 111-145. CRC press, Florida. Ojima, Y. and Kikuno, T. 1987. Karyotype of a gobiesociform and two perciform fishes (Teleostei). Proc. Japan Acad., Ser. B, 63: 201-204. Ojima, Y. and Kashiwagi, E. 1981. Chromosomal evolution associated with Robertsonain fusion in the genus Dascyllus (Chromininae, Pisces). Proceedings of the Japan Academy 57: 368 p. Sawada, Y. and Sakamoto, K. 1980. Chromosomes of a rare callionymid, Draculo mirabilis. Janpan. J. Ichthyol., 26: 367-368.

63

£µ‡Ÿœª„ ¦µ¥„µ¦ª´­—»°»ž„¦–r­µ¦Á‡¤¸¨³„µ¦Á˜¦¸¥¤­µ¦˜nµŠÇ

6443

¦µ¥„µ¦ª´­—»°»ž„¦–r­µ¦Á‡¤¸¨³„µ¦Á˜¦¸¥¤­µ¦˜nµŠÇ 1. ª´­—»°»ž„¦–r¨³­µ¦Á‡¤¸ 1.1 ª´­—»°»ž„¦–r - Á‡¦ºÉ°ŠÂ„oª œµ—˜nµŠÇ - Hot plate ¨³ magnetic stirrer - ª—Á„ȝ media œµ— 1000, 500 ¨³ 100 ¤¨. - ª—Á¨¸Ê¥ŠÁŽ¨¨r œµ— 10 ¨³ 15 ¤¨. - ®¨°—­»µ„µ« (vacuum tube) œµ— 10 ¤¨. š¸ÉÁ‡¨º°—oª¥Á±žµ¦·œ (hepalin) - „¦³°„Œ¸—¥µ (syling) ¨³Á ȤŒ¸—¥µ œµ—˜nµŠÇ - Automicropipette, micropipette ¨³ pipette œµ—˜nµŠÇ - ٭宦´¥o°¤­¸ (staining jar) - Á‡¦ºÉ°Šž´ÉœÁ®ª¸É¥Š (centrifuge) - Á‡¦ºÉ°Š„¦°Š­µ¦¨³ÂŸnœ„¦°ŠÁ¤¤Á¦œ (millipore membrane filter) œµ— 0.2 ŤÇ¦¨·˜¦ - Á‡¦ºÉ°Š´ŠÂ¨³Á°¸¥—É (balance) - ˜¼oÁ¥Èœ - °nµŠœÎʵ°»nœ (water bath) - ®¤o°œ¹ÉŠ‡ªµ¤—´œÅ° (autoclave) - Á‡¦ºÉ°Š vortex mixture - ˜¼oÁ¡µ³Á¨¸Ê¥Š (incubater) - ˜¼ož¨°—ÁºÊ° (laminar air flow carbinet) - „¨o°Š‹»¨š¦¦«œrÄo­Š¡¦o°¤°»ž„¦–r™nµ¥£µ¡

1.2 ­µ¦Á‡¤¸ - °µ®µ¦Á¡µ³Á¨¸Ê¥ŠÁŽ¨¨r RPMI 1640 - áš­ÁŽ¸¥¤‡¨°Å¦—r (KCl) - Fetal calf serum (FCS) - ¥µž’·¸ªœ³ Penicilli-Streptomycin - Ţر¸Â¤„„¨¼˜·œ·œ (phytoheamagglutinin, PHA) - Ǩ·Ž·œ (colchicine) - Á¤šµœ°¨ (methanol) - Á°šµœ°¨ 95 ¨³ 70 Áž°¦rÁŽÈœ˜r (ethanal 95% ¨³ 70%) - ­¸¥o°¤‹·¤Žnµ (Giemsa’s stain) 6544

- ÎÁ—¸¥¤Å±Ã—¦Á‹œ‡µ¦r°Áœ˜ (NaHCO3)

- ÎÁ—¸¥¤Å±Ã—¦Á‹œ¢°­Á¢˜ (NaHPO4)

- áš­ÁŽ¸¥¤Å±Ã—¦Á‹œ¢°­Á¢˜ (KH2PO4) áš­ÁŽ¸¥¤‡¨°Å¦—r (KCl) - „¦—űצ‡¨°¦·„ (HCl) - ÎÁ—¸¥¤Å±—¦°„ÅŽ—r (NaOH) - HBSS powder

2. „µ¦Á˜¦¸¥¤°µ®µ¦Â¨³­µ¦Á‡¤¸ 2.1 „µ¦Á˜¦¸¥¤°µ®µ¦Á¡µ³Á¨¸Ê¥ŠÁ¨º°— (working media) Á˜¦¸¥¤°µ®µ¦Á¡µ³Á¨¸Ê¥ŠÁ¨º°— 100 ¤¨. ž¦³„°—oª¥ 1) DMEM/ M-199 solution 80 ¤·¨¨·¨·˜¦ 2) Fetal calf serum 20 ¤·¨¨·¨·˜¦ 3) Penicilin/Streptomycin 1-2 ¤·¨¨·¨·˜¦ 4) Mitogen 1-2 ¤·¨¨·¨·˜¦

2.2 „µ¦Á˜¦¸¥¤ Hypotonic solution ­µ¦¨³¨µ¥ Hypotonic solution 0.075 M HCl ­µ¦š¸ÉčoÁ˜¦¸¥¤ 1) KCl crystal 2) œÎʵ„¨´œÉ ª·›¸Á˜¦¸¥¤ (ž¦·¤µ˜¦š¸ÉÁ˜¦¸¥¤ 100 ¤·¨¨·¨·˜¦) ´ŠŸ¨¹„É KCl 0.5588 „¦´¤¨³¨µ¥ÄœœÎʵ„¨´œÉ 100 ¤·¨¨·¨·˜¦Á ¥nµ‹œŸ¨¹„¨³¨µ¥®¤—Á„ȝĭn ª— Ūoš¸É°¼–®£¼¤·®o°Š ®¤µ¥Á®˜» : œÎʵ¥µœ¸Ê¤¸°µ¥»„µ¦ÄoŠµœ 1-2 ­´ž—µ®r

2.3 „µ¦Á˜¦¸¥¤ Colchicine -­¼˜¦š¸É 1 ´ŠÉ colchicine 0.005 „¦´¤¨³¨µ¥œÎʵ„¨´œÉ 10 ¤·¨¨·¨·˜¦ ŗo‡ªµ¤Á o¤ oœ 0.5 ¤·¨¨·„¦´¤¤·¨¨·¨·˜¦ -­¼˜¦š¸É 2 ´ŠÉ colchicine 0.0025 „¦´¤¨³¨µ¥œÎʵ„¨´œÉ 10 ¤·¨¨·¨·˜¦ ŗo‡ªµ¤Á o¤ oœ 0.25 ¤·¨¨·„¦´¤¤·¨¨·¨·˜¦ -Colchicine powder Á„ȝŪoš¸É°¼–®£¼¤· 2-8 °Š«µÁŽ¨ÁŽ¸¥­

6645

2.4 „µ¦Á˜¦¸¥¤ Fixative ­µ¦š¸ÉčoÁ˜¦¸¥¤ 1) Glacial acetic acid 2) Absolute methanol ª·›¸Á˜¦¸¥¤ čo glacial acetic acid 1 ­nªœŸ­¤„´ absolute methanol 3 ­nªœÁ„ȝĭn ª—nĜ˜¼oÁ¥Èœ (˜o°Š Á˜¦¸¥¤Ä®¤nš»„‡¦´ÊŠ)

2.5 „µ¦Á˜¦¸¥¤ Sorensen buffer ­µ¦š¸ÉčoÁ˜¦¸¥¤

1) Stock solution A : čo KH2PO4 9.1 „¦´¤ ¨³¨µ¥œÎʵ„¨´œÉ 1,000 ¤·¨¨·¨·˜¦

2) Stock solution B : čo NaHPO4 9.5 „¦´¤¨³¨µ¥œÎʵ„¨´œÉ 1,000 ¤·¨¨·¨·˜¦ ª·›¸Á˜¦¸¥¤ čo Stock solution A 50.8 ¤·¨¨·¨·˜¦Ÿ­¤„´ Stock solution B 49.2 ¤·¨¨·„¦´¤‹³Å—o Sorensen buffer (pH 6.8) 100 ¤·¨¨·„¦´¤

2.6 „µ¦Á˜¦¸¥¤­¸¥o°¤ Giemsa „µ¦Á˜¦¸¥¤­¸‹·¤Žnµ 10% (10% Giemsa,s solution) ­¸‹·¤Žnµ 10% Á˜¦¸¥¤‹µ„ Giemsa,s stain čoœ·— Stock Giemsa,s solution ×¥—¼—­¸‹·¤Žnµ‹µ„ Stock Giemsa,s solution ¤µ 5 ¤·¨¨·¨·˜¦¨³¨µ¥Äœ Sorensen buffer 45 ¤·¨¨·¨·˜¦

2.7 „µ¦Á˜¦¸¥¤ phytoheamagglutinin (PHA) ­µ¦š¸ÉčoÁ˜¦¸¥¤ 1) PHA powder 2) œÎʵ„¨´œÉ ª·›¸Á˜¦¸¥¤ ¨³¨µ¥ŸŠ PHA —oª¥œÎʵ„¨´œÉ 10 ¤·¨¨·¨·˜¦Á ¥nµÄ®oÁ oµ„´œÁ„ȝŪoš¸É 2-8 °Š«µÁŽ¨ÁŽ¸¥­

2.8 „µ¦Á˜¦¸¥¤­µ¦¨³¨µ¥ 1 NHCl ­µ¦š¸ÉčoÁ˜¦¸¥¤ 1) Conc. HCl 2) œÎʵ„¨´œÉ

6746

ª·›¸Á˜¦¸¥¤ (ž¦·¤µ˜¦š¸ÉÁ˜¦¸¥¤ 500 ¤·¨¨·¨·˜¦) čo Conc. HCl ‹Îµœªœ 43.68 ¤·¨¨·¨·˜¦Ÿ­¤„´œÎʵ„¨´œÉ 456.32 ¤·¨¨·¨·˜¦×¥‡n°¥Ç¦·œ„¦— HCl Ä­n¨ŠÄœœÎʵ„¨´œÉ ( o°‡ª¦¦³ª´Š®oµ¤ÁšœÎʵ„¨´œ¨ŠÄœÉ HCl ÁžÈœ°´œ µ—˜nÄ®oÁš„¦— HCl ¨ŠÄœœÎʵ„¨´œÉ )

2.9 „µ¦Á˜¦¸¥¤­µ¦¨³¨µ¥ 1 N NaOH ­µ¦š¸ÉčoÁ˜¦¸¥¤ 1) NaOH crystal 2) œÎʵ„¨´œÉ ª·›¸Á˜¦¸¥¤ (ž¦·¤µ˜¦š¸ÉÁ˜¦¸¥¤ 500 ¤·¨¨·¨·˜¦) ´ŠŸ¨¹„É NaOH 20 „¦´¤¨³¨µ¥ÄœœÎʵ„¨´œÉ 500 ¤·¨¨·¨·˜¦Á„ȝĭn ª—Ūoš¸É°¼–®£¼¤·®o°Š

2.10 „µ¦Á˜¦¸¥¤ Hank, balance salt solution (HBSS) ­µ¦š¸ÉčoÁ˜¦¸¥¤ 1) HBSS powder

2) NaHCO3 crystal 3) 1 N HCl 4) 1 N NaOH 5) œÎʵ„¨´œÉ ª·›¸Á˜¦¸¥¤ 1) ¨³¨µ¥ HBSS powder 1 Ž°ŠÄœ Erlenmeyer flask š¸É¤¸œÎʵ„¨´œ°¥¼nÉ 500 ¤·¨¨·¨·˜¦¨oµŠŸŠ HBSS š¸É˜·—°¥¼nĜŽ°Š °°„Ä®o®¤—Á˜·¤œÎʵ„¨´œ‹œÅ—ož¦·¤µ˜¦É 1,000 ¤·¨¨·¨·˜¦Á ¥nµ‹œŸŠ¨³¨µ¥Á oµ„´œÅ—o—¸

2) ´ŠÉ NaHCO3 0.35 „¦´¤¨³¨µ¥Ÿ¨¹„ NaHCO3Ĝ­µ¦¨³¨µ¥ HBSS Á ¥nµ‹œŸ¨¹„¨³¨µ¥®¤— 3) ž¦´ pH ץčo 1 N HCl ¨³ 1 N NaOH ‹œÅ—o pH 7.1-7.3 4) šÎµÄ®ož¨°—ÁºÊ°Ã—¥Äo millipore membrane filter œµ— 0.2 ŤÇ¦Á¤˜¦ 5) nŠÄ­n ª—Ǩ³ 100 ¤·¨¨·¨·˜¦ (aseptic technique) Á„ȝš¸É 2-8 °Š«µÁŽ¨ÁŽ¸¥­