Aix Marseille Université Ecole Doctorale Des Sciences De La Vie Et De La Santé

Aix Marseille Université Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé

THESE Pour l’obtention du grade de Docteur d’Aix Marseille Université en Microbiologie

Thèse présentée et soutenue par Nicolas CHABERT Le 21 décembre 2017

Sous la direction de Dr. ACHOUAK Wafa (Directrice de recherche, UMR 7265 CNRS-CEA-AMU)

Conception de biocathode et implication du fer dans de nouveaux modes de transfert d’électrons

Rapporteurs Dr. BERGEL Alain (Directeur de recherche, CNRS) Dr. BOUSSERRHINE Noureddine (Maitre de conférence, UPEC)

Examinateurs Dr. LOJOU Elisabeth (Directeur de recherche, CNRS) Dr. HAICHAR Feteh-El-Zahar (Maitre de conférence, Université de Lyon 1) Pr. CUNY Philippe (Professeur, Aix Marseille Université)

Invités Dr. BONNEFOY Violaine (Directeur de recherche, CNRS) Dr. ROSE Jérôme (Directeur de recherche, CNRS)

Résumé : Les piles à combustible microbiennes (PCMs) sont une technologie convertissant l’énergie chimique stockée dans la matière organique en énergie électrique à l’anode à l’aide de bactéries dites électroactives. Actuellement, les performances sont limitées par l’utilisation de cathodes abiotiques. L’intérêt porté aux cathodes biologiques est récent et ces dernières sont encore peu étudiées. Les objectifs de ces recherches ont donc été d’identifier et de décrire des bactéries ainsi que les mécanismes permettant de catalyser une réduction cathodique notamment celle de l’oxygène. La première partie des travaux portant sur la réalisation d’un criblage pour la formation de biocathodes a révélé l’inefficacité du métabolisme hétérotrophe pour la conception de biocathodes performantes. De ce fait, la suite des travaux a porté sur la bactérie chimiolithoautotrophe acidophile Acidithiobacillus ferrooxidans. Deux mécanismes de transfert d’électrons dépendant du fer ont été mis en évidence générant un courant maximal de -3,8 A.m-2. Nous avons également abordé les mécanismes de transfert d’électrons en milieu neutre chez une bactérie hétérotrophe, Pseudomonas brassicacearum NFM421 bien que peu performante en terme de production de courant. Cette dernière permet une catalyse indirecte de la réduction de l’oxygène à la cathode à pH neutre via un métabolite secondaire le 2,4-diacéthylphloroglucinol associé au fer, mettant encore une fois en lumière l’importance du fer dans le transfert d’électrons. Ce travail a également porté sur la potentielle application des biopiles dans des environnements anthropisés en vue de l’extraction de métaux et plus particulièrement de terre rares qui s’avèrent être une voie de recherche prometteuse. Mots-clés : Biocathode ; Fer ; Acidithiobacillus ferrooxidans ; Pseudomonas brassicacearum ; DAPG ; extraction de métaux

Abstract : Microbial fuel cells (MFCs) are devices that convert chemical energy contained in organic matter into electrical energy using electroactive bacteria that act at the anode. Currently, MFCs performances are limited by the use of abiotic cathode. The interest in biological cathode has recently started and less is known about bacterial diversity and mechanism that catalyze cathodic reduction. The aims of the research work are therefor to identify and describe potential bacteria and mechanism involved in such catalysis. The first part of the work is the realization of a screening that did not show conclusive results and might indicate that heterotrophic metabolism was not an efficient choice. Next, Acidithiobacillus ferrooxidans had been used and shown two extracellular electron transfer mechanism depending on iron. A maximum current intensity of -3,8 A.m-2 had been reached. To be close to operational condition of MFC, Pseudomonas brassicacearum NFM 421 has also be use and shown capacity to indirectly catalyze the oxygen reduction at a neutral pH using the 2,4-diacethylphloroglucinol, a secondary metabolite, associated to iron. However, current reach remained weak. Considering difficulty to build efficiant biocathode at a neutral pH, the end of this work had been focused on a new application of the MFC: metal and rare earth extraction from soil and contaminated site that appeared to be a great research opportunity to follow. Key-words : Biocathode; Iron; Acidithiobacillus ferrooxidans; Pseudomonas brassicacearum; DAPG, metals extraction

3 4 Remerciements

C’est en écrivant ces quelques lignes que je me rends compte que l’aventure touche à sa fin… Mais ce fût une belle aventure !

Tout d’abord, j’aimerais remercier Wafa Achouak. Un grand merci pour m’avoir accueilli dans le laboratoire, m’avoir permis de réaliser cette thèse et pour la confiance que tu as eue en moi dans la réalisation de ce projet. Merci aussi pour ces petits voyages qui ont ponctué ces trois années. Merci également d’avoir rendu cette thèse aussi agréable et désolé d’avoir été aussi stressant ces derniers mois… bref merci pour tout !

J’en profite également pour remercier tout le personnel du LEMiRE. Un grand Merci à Sylvain Fochesato et Marie Bertrand pour votre soutien et votre aide. Philippe Ortet et Mohamed Barakat, merci beaucoup pour votre travail, que je n’ai pas toujours complètement compris mais qui m’a toujours beaucoup servi. Catherine Santaella, merci pour ton aide en chimie. Merci aussi d’avoir bien voulu partager ton café avec moi quand c’était la crise locale du café. Merci aussi à Gilles pour les (très) longues discussions du café matinal. Thierry Heulin, merci de m’avoir accueilli dans ton institut avant que celui- ci ne passe dans d’autres mains… Et merci de croire en moi pour le futur.

Je souhaiterais aussi remercier toutes les Post-doctorantes pour l’ensemble de leurs œuvres, pour les fous rires et les moments de pause scientifique ! Blanche Collin, merci de m’avoir initié au bio, je ne suis toujours pas convaincu et surtout, merci de ne pas m’avoir rendu intolérant au gluten car tu en as fait des victimes ! Wei Liu, la fin fut intense mais je te promets, on découvrira les secrets de la pyramide. Merci de t’être investie dans les travaux avec moi à la fin, ce n’était pas la meilleure période mais on aura réussi à faire quelque chose de bien sur une petite période ! Merci Agnès Roux et Oulfat Amin Ali. Merci d’avoir vécu cette thèse de l’intérieur et de vous être autant impliquées pour moi. Vous avez grandement contribué à la réussite de celle-ci et vraiment, je ne pourrais jamais assez vous remercier pour ça.

Je remercie également Catherine Berthomieu du LIPM pour s’être grandement investie dans une partie de ce travail et aussi Didier Marcelin à qui j’ai pris un temps fou… Merci également à Bernard Angeletti du CEREGE pour le temps passé à doser le presque ensemble du tableau périodique des éléments sur mes échantillons. Je tiens à remercier aussi Andréa Campos du CP2M pour la microscopie, ta grande pédagogie et de

5 t’intéresser de près à notre travail. Je souhaiterais également à remercier Violaine Bonnefoy du LCB. Tout d’abord merci d’avoir répondu présente à chaque fois que nous t’avons sollicitée, merci de nous avoir fait bénéficier de ton expertise sur « Acidithio » et enfin, merci vraiment pour ta gentillesse.

Mes remerciements les plus sincères vont également à l’ensemble du consortium BioElec. Merci pour les partages, vos accueils respectifs lors des différentes réunions et pour votre sympathie. Ce fût un plaisir de travailler avec vous !

Je tiens aussi à adresser mes plus sincères remerciements à Noureddine Bousserrhine et à Alain Bergel d’avoir accepté d’être rapporteurs pour cette thèse. Mes remerciements vont également à Elisabeth Lojou, Zahar Haichar et Philippe Cuny pour avoir accepter d’évaluer cette thèse lors de la soutenance. Merci également à Jérôme Rose et, encore une fois, Violaine Bonnefoy d’avoir accepté l’invitation pour assister à la soutenance.

Enfin, merci à tous mes proches pour m’avoir soutenu et d’avoir supporté mon humeur massacrante ces derniers mois… C’était pour la bonne cause !

Sincèrement, merci à vous tous d’avoir participé de près ou de loin à cette thèse. Je n’en serai pas là sans vous !

Sommaire

LISTE DES ABBREVIATIONS 11

CONTEXTE GENERAL 13

CHAPITRE I INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE 19

1. LES PILES A COMBUSTIBLES MICROBIENNES 21

1.1. PRINCIPE GENERAL DE LA PILE A COMBUSTIBLE MICROBIENNE 21 1.1.1. Historique 21 1.1.2. Fonctionnement d’une pile à combustible microbienne 21

1.2. BIOFILMS BACTERIENS 22 1.2.1. Notions de biofilm 22 1.2.2. Formation d’un biofilm 23 1.2.3. Quorum-sensing 25

1.3. BIOFILMS ELECTROACTIFS ET TRANSFERT D’ELECTRONS 27

1.4. CARACTERISATION D’UN BIOFILM ELECTROACTIF 28

2. LES BIOANODES 31

2.1. TRANSFERT EXTRACELLULAIRE D’ELECTRONS A L’ANODE 31 2.1.1. Transfert indirect d’électrons 31 2.1.2. Transfert direct d’électrons 34 2.1.3. Composition des biofilms électroactifs anodiques 36

3. LES BIOCATHODES 36

3.1. PRINCIPE GENERAL 37

3.2. DIVERSITE BACTERIENNE CATALYSANT LA REACTION DE REDUCTION A LA BIOCATHODE 38

3.3. LES TRANSFERTS EXTRACELLULAIRES D’ELECTRONS A LA CATHODE 39

4. INTERACTION BACTERIES-METAUX 44

4.1. GENERALITE 44

4.2. CYCLE BIOGEOCHIMIQUE DU FER 46

4.3. ACQUISITION DU FER 47

4.4. METABOLISME ENERGETIQUE DU FER 48 4.4.1. La réduction du fer ferrique 49 4.4.2. L’oxydation du fer ferreux 50 4.4.2.1. Les bactéries ferro-oxydantes neutrophiles 50 4.4.2.2. Les bactéries ferro-oxydantes acidophiles 53

4.5. CAPACITE ELECTROACTIVE DES BACTERIES FERRO-OXYDANTES 54

5. LES APPLICATIONS POTENTIELLES DES PCMS 55

5.1. ALIMENTATION ELECTRIQUE EN ZONE DEPOURVUE DE RESEAU ELECTRIQUE 55

5.2. BIOREMEDIATION 57

5.3. ELECTROSYNTHESE DE MOLECULES A HAUTE VALEUR AJOUTEE 58

5.4. BIOSENSEURS 59

5.5. DESALINISATION 60

5.6. ELECTROSYNTHESE DE NANOPARTICULES 61

6. CONCLUSION 62

7. OBJECTIFS DE TRAVAIL 62

8. REVUE BILIOGRAPHIQUE 63

REVUE BIBLIOGRAPHIQUE: ALL ECOSYSTEMS POTENTIALLY HOST ELECTROGENIC BACTERIA 65

CHAPITRE II: RESULTATS PRELIMINAIRES : CRIBLAGE DE SOUCHES ET CONSORTIA HETEROTROPHES. 75

1. CONTEXTE ET OBJECTIF(S) 77

2. PRINCIPAUX RESULTATS 79

3. INTRODUCTION 80

4. MATERIELS ET METHODES 81

4.1. CULTURE BACTERIENNE ET ISOLEMENT 81

4.2. CRIBLAGE EN BIOCATHODE 81

4.3. MESURE ELECTROCHIMIQUE 82

4.4. MICROSCOPIE CONFOCALE 82

4.5. SEQUENÇAGE DE L’ADN 16S 82

5. RESULTATS ET DISCUSSION 82

5.1. CRIBLAGE DES SOUCHES ZSTM 82

5.2. ISOLEMENT ET CRIBLAGE DES SOUCHES VNT 85 5.2.1. Isolement et criblage de consortium 85 5.2.2. Identification des souches 87

6. CONCLUSION 89

7. COMMENTAIRES ET PERSPECTIVES 90

CHAPITRE III: PROMOTION DE LA FORMATION DE BIOFILMS PAR LE QUORUM-SENSING ET MISE EN EVIDENCE DU TRANSFERT DIRECT D’ELECTRONS CHEZ ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS ATCC23270T 91

1. CONTEXTE ET OBJECTIF(S) 93

2. PRINCIPAUX RESULTATS 93

ARTICLE 1: QUORUM SENSING IMPROVES CURRENT OUTPUT WITH ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS 95

3. RESULTATS COMPLEMENTAIRES 100

4. COMMENTAIRES ET PERSPECTIVES 101

CHAPITRE IV: INDUCTION DE L’ELECTROACTIVITE D’ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS PAR LE FE(II) ET TRANSFERT INDIRECT D’ELECTRONS 103

1. CONTEXTE ET OBJECTIF(S) 105

2. PRINCIPAUX RESULTATS 105

ARTICLE 2: DUAL ROLE OF IRON IN ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS FUEL CELL PERFORMANCE 107

3. COMMENTAIRES ET PERSPECTIVES 120

CHAPITRE V: PRODUCTION DE COURANT CATHODIQUE A PH NEUTRE VIA LA CHELATION DU FER FERRIQUE PAR LE DAPG PRODUIT PAR PSEUDOMONAS BRASSICACEARUM 121

1. CONTEXTE 123

2. PRINCIPAUX RESULTATS 124

ARTICLE 3: BUILDING BIOCATHODE WITH IRON CHELATING 2,4-DIACETYLPHLOROGLUCINOL PRODUCED BY

PSEUDOMONAS BRASSICACEARUM NFM421 125

3. COMMENTAIRES ET PERSPECTIVES 148

CHAPITRE VI: EXTRACTION DE METAUX LOURDS ET DE TERRES RARES : APPLICATIONS ENVIRONNEMENTALES DES BIOCATHODES. 149

1. CONTEXTE 151

2. PRINCIPAUX RESULTATS 152

3. RESULTATS PRELIMINAIRES : LE PHOSPHOGYPSE 154

3.1. FORMATION DE BIOCATHODES A PARTIR DU PHOSPHOGYPSE POUR LA RECUPERATION DES METAUX 155

3.1. EXTRACTION DES METAUX A LA BIOCATHODE 156

ARTICLE 4: RECOVERY OF INDUSTRIAL AND STRATEGIC METALS IN SEDIMENT MICROBIAL FUEL CELL FROM

THE BERRE LAGOON 161

4. COMMENTAIRES ET PERSPECTIVES 188

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVE 191

1. ACIDITHIOBACILLUS FERROOXIDANS 193

2. PSEUDOMONAS BRASSICACEARUM 197

3. INTERACTION BACTERIES-CATHODE-METAUX 198

4. CONCLUSION 200

REFERENCES 201

TABLE DES ILLUSTRATIONS 231 TABLE DES TABLEAUX 239

Liste des abbréviations

ADN : Acide désoxyribo nucléique

AHL : Acyl homosérine lactone

CA : Chronoampérométrie

CE : Contre électrode

Cyc2 : Cytochrome c2

CV : Voltamétrie cyclique

DAPG : 2,4-diacetylphloroglucinol

DNA : Desoxyribo nucleic acid

EAB : Bactérie électroactive

EET : Transfert extracellulaire d’électrons

DAPG-Fe : Complexe formé entre le fer et le DAPG

Fe(II) : Fe2+

Fe(III) : Fe3+

FTIR : Spectrométrie infrarouge à transformée de Fourrier

MFC : Microbial Fuel Cell

OCP : Open Circuit Potential

PCM : Pile à combustible microbienne

QS : Quorum-sensing

SMFC : Sediment microbial fuel cell

WE : Electrode de travail

Contexte général

L’énergie est aujourd’hui le moteur de la société. Indispensable, elle est actuellement au cœur de la politique et de l’économie de nombreux pays. L’épuisement des énergies fossiles et le changement climatique global forcent de plus en plus les états à se tourner vers les énergies alternatives et vertes. Le développement de ces énergies donne lieu à une multitude de sujets de recherche à travers le monde. Les énergies alternatives se divisent en plusieurs groupes avec les énergies hydrauliques, hydrogènes, éoliennes, géothermique, solaires et enfin les énergies liées à la biomasse.

La technologie des piles à combustible microbiennes (PCMs) s’insère parfaitement dans ce changement d’axe énergétique et profite, depuis les années 2000, d’une forte expansion mondiale au sein des équipes de recherche. Basée sur la biomasse, les PCMs utilisent des bactéries dites électroactives qui convertissent l’énergie chimique contenue dans la matière organique en énergie électrique par son oxydation. L’intérêt d’une telle technologie est doublé par le traitement des eaux usées associé à la production d’énergie.

Se basant sur le principe de piles à combustible classiques, les PCMs présentent l’avantage d’utiliser les bactéries comme catalyseur rendant ainsi la technologie plus durable et moins coûteuse. Cependant, bien que la prolifération des PCMs au niveau de la recherche mondiale ait largement profité à l’étude du fonctionnement de la partie anodique des PCMs, le compartiment cathodique est beaucoup moins étudié. En effet, la plupart des PCMs utilisent une cathode abiotique faite, en général, de platine afin de catalyser la réduction de l’oxygène or ce dernier s’avère être un métal précieux et onéreux qui n’est pas efficace sur la durée. Les enjeux des PCMs se tournent donc de plus en plus vers le développement des bicoathodes qui représentent aujourd’hui le verrou majeur à l’industrialisation des PCMs.

Au croisement entre la chimie, la physique, l’ingénierie et la microbiologie, l’étude des PCMs est multidisciplinaire. C’est dans cette pluridisciplinarité que s’insère le projet ANR Bioelec. Ce projet se veut complet en travaillant de concert sur les différents aspects de la PCM afin de lever les principaux verrous de cette dernière et d’en améliorer significativement les performances. Ces axes de recherches comprennent ainsi l’amélioration des bioanodes, l’ingénierie des PCMs, l’amélioration des cathodes à air abiotiques, l’amélioration des matériaux d’électrodes et enfin le développement d’une biocathode. Les partenaires impliqués dans le projet ANR Bioelec sont le

15 Contexte général

Laboratoire de Génie Chimique (LGC, CNRS-Université de Toulouse) qui est le porteur du projet, Paxitech SAS (Grenoble) qui a dû interrompre son activité durant le projet, le Laboratoire Analyse et Modélisation pour la Biologie et l’Environnement (LAMBE, Université d’Evry), Toulouse Tech Transfer (TTT, Toulouse) et enfin nous mêmes le Laboratoire d’Ecologie Microbienne de la Rhizosphère et des Environnements Extrêmes (LEMiRE, CEA-CNRS-Université d’Aix-Marseille).

C’est dans le cadre du projet ANR Bioelec que s’inscrivent les travaux de cette thèse. Ces derniers portent sur la biocathode. Les objectifs de la thèse sont multiples : d’une part il est nécessaire d’identifier de nouvelles espèces électroactives catalysant la réaction cathodique et d’autre part, de comprendre et de décrire les mécanismes de transfert extracellulaire d’électrons mis en jeu.

Le présent manuscrit relate les travaux et les principaux résultats obtenus durant cette thèse afin de faire la lumière sur le fonctionnement de la biocathode. Le manuscrit se compose de 6 chapitres comprenant une revue bibliographique, un article publié, un article soumis et deux articles en préparation.

Le chapitre I présente une synthèse bibliographique sur les piles à combustible microbiennes et les biocathodes. Il est fait état des généralités concernant cette technologie. Il y est également abordé les connaissances actuelles sur les biocathodes concernant notamment la diversité microbienne et les transferts électroniques connus. Le fer étant central dans la suite des travaux présentés son cycle est traité ainsi que les bactéries qui y prennent part. Enfin, ce chapitre se termine sur les actuelles applications des piles à combustible microbiennes. Une revue bibliographique intitulé « All ecosystems potentially host electrogenic bacterie » publiée dans Bioelectrochemistry est présentée à la fin du chapitre I.

Le chapitre II expose l’état de l’art concernant les biocathodes ainsi que les premiers travaux réalisés au LEMiRE. Ces derniers portent sur la réalisation d’un criblage en biocathode à partir de souches de la collection du LEMiRE et sur des souches nouvellement isolées.

Les quatre chapitres suivants s’appuient sur un article publié et trois en préparation.

Le chapitre III s’appuie sur l’article « Quorum sensing improves current output with Acidithiobacillus ferrooxidans » publié dans Microbial Biotechnology (2017). Ce

16 Contexte général chapitre traite d’un moyen d’améliorer les biofilms d’A. ferrooxidans sur feutre de carbone et d’augmenter ainsi la production de courant cathodique.

Le chapitre IV repose sur un article soumis à Biotechnology and Bioengineering intitulé « Dual role of iron in the electroactivity of Acidithiobacillu ferrooxidans ». Ce chapitre explique l’induction du caractère électroactif de la bactérie par le fer ainsi que son implication dans le transfert extracellulaire d’électrons.

Le chapitre V se base sur l’article en préparation « Building biocathode with iron chelating 2,4-diacetylphloroglucinol produced by Pseudomonas brassicacearum NFM421 ». Il traite d’une molécule impliquée dans le transfert d’électron à la cathode.

Le dernier chapitre s’appuie sur l’article en préparation intitulé « Recovery of industrial and strategic metals in Sediment microbial fuel cell from the Berre lagoon ». Ce chapitre propose une application potentielle des biocathodes et des bioélectrodes en général.

Le travail présenté dans ce manuscrit a également fait l’objet de communications orales et de posters :

● Center for the Environmental Implication of NanoTechnology (CEINT 2017 Annual meeting ; Duke University, Durham (NC, USA)

● 3rd European Meeting of the International Society for Microbial Electrochemistry and Technology 2016 (EU-ISMET) ; Rome (Italia) ● Bioelectrofuel seminar ; CEA Minatech, Grenoble (France)

● 9th CEA/Industry meeting for innovation and technology transfer “Biotechnology: Energie – Environment” ; Ecole des Mines, Gardanne (France)

● 7th symposium of RNB (National Network for Biofilm) ; INP, Toulouse (France)

● 7th symposium of AFEM (francophone association of microbial ecology) “Microbiology and environment: Fundamental knowledge and application” ; Anglet (France)

Chapitre I

Introduction bibliographique

Chapitre I : Introduction générale

1. Les piles à combustibles microbiennes

1.1. Principe général de la pile à combustible microbienne

1.1.1. Historique

La capacité à extraire de l’énergie depuis la matière organique est connue depuis plus d’un siècle. En effet, le premier à avoir mis en avant la première pile à combustible microbienne (PCM) est le botaniste M. C. Potter en 1911. Il parvint à produire une tension évoluant entre 0,3 et 0,5 V en utilisant des électrodes de platine dans des suspensions de Escherichia coli et de Saccharomyces (Potter, 1911). L’idée fut reprise vingt ans plus tard par B. Cohen qui a augmenté la tension des PCMs en les branchant en série pour atteindre une tension de 35 V (Cohen, 1931). La première pile microbienne anaérobie a été conçue en 1962 par Rohrback et al. qui ont utilisé Clostridium butyricum pour fermenter le glucose en hydrogène, ce dernier s’oxydant par la suite à l’anode. En 1983, le concept de pile tel qu’on le connaît aujourd’hui est évoqué par Bennetto et al. qui proposent des architectures de pile avec une anode et une cathode séparées par une membrane échangeuse d’ions. De plus, il fut le premier à utiliser un médiateur électrochimique, la phénotiazine, pour améliorer le transfert d’électrons entre E. coli et les électrodes.

L’évolution et l’intérêt portés aux PCMs ont commencé à se développer en 2000 en se focalisant essentiellement sur la bioanode alors que l’intérêt porté à la biocathode est arrivé bien plus tard. Cette envolée peut s’expliquer par plusieurs points détaillés par Schröder (2011). L’évidence étant que cette biotechnologie s’adapte parfaitement à l’époque actuelle connaissant une diminution de ressources fossiles et un regain d’intérêt pour la préservation de l’environnement. De plus, un autre point important justifiant l’intérêt des PCMs sont les diverses applications, autres que la production d’énergie, qui en découlent.

1.1.2. Fonctionnement d’une pile à combustible microbienne

Les PCMs sont des systèmes électrochimiques qui permettent de convertir l’énergie chimique provenant de l’oxydation de la matière organique en énergie électrique. Ces réactions se font grâce à l’action d’un biofilm bactérien développé sur l’anode que l’on appelle alors bioanode ou anode microbienne. Le rôle de ce biofilm est de catalyser la

21 Chapitre I : Introduction générale réaction d’oxydation et ainsi d’assurer le transfert d’électrons issus de l’oxydation de la matière organique vers la bioanode. Les microorganismes assurant le rôle de catalyseur dans les PCMs sont couramment appelés bactéries électroactives (EABs). Le fonctionnement d’une PCM se rapproche des piles à combustible dans leur généralité (Fig. 1).

Figure 1 : Principe général simplifié d’une pile à combustible microbienne.

La figure 1 montre un schéma simplifié d’une PCM fonctionnant avec une bioanode (à gauche), dans un seul compartiment au sein duquel se trouve également une cathode abiotique (à droite). Bien évidemment, il existe différentes architectures de PCMs pouvant mettre en jeu un ou plusieurs compartiments (anodique et cathodique), avec ou sans membrane entre ces compartiments et enfin, pouvant mettre également en jeu une biocathode. Ce dernier point sera détaillé ultérieurement.

1.2. Biofilms bactériens

1.2.1. Notions de biofilm

Un biofilm bactérien se décrit comme étant un ensemble de cellules fixées à une surface grâce à des exopolymères produits par des bactéries qui présentent une différence au niveau de leur physiologie et de l’expression de gènes par rapport aux cellules planctoniques (Donlan et Costerton 2002). La notion de « biofilm » a été évoquée pour la

22 Chapitre I : Introduction générale première fois en 1981 (McCoy et al., 1981) pour décrire les phénomènes de fouling de surface. Aujourd’hui, il est couramment admis que la majorité des bactéries adoptent préférentiellement un mode de vie en biofilms plutôt que planctonique (Costerton et al. 1995). Ce mode de vie confère divers avantages. Il permet notamment d’améliorer la résistance aux toxiques et aux divers stress environnementaux. Au même titre, la formation d’un biofilm dépend de nombreux facteurs environnementaux et signaux biologiques (Tolker-Nielsen, 2015 ; Toyofuku et al., 2016).

1.2.2. Formation d’un biofilm

Le processus de formation d’un biofilm comprend 4 étapes (Fig. 2).

Figure 2 : Représentation du cycle de formation d’un biofilm dépendant de divers facteurs environnementaux (modifié d’après Toyofuku et al., 2016).

Etape 1 : Adhésion réversible

Cette première étape de la formation du biofilm résulte de plusieurs facteurs. Le premier est le conditionnement de la surface d’adhésion par l’environnement qui va permettre ainsi l’adhésion des cellules. Ces dernières sont transportées par les fluides circulant autour de la surface d’adhésion mais peuvent également se mouvoir d’elles-mêmes via des pili et des flagelles (Tran et al. 2011). Les liaisons maintenant les bactéries à la surface sont fragiles, de types Van der Waals, interactions stériques et électrostatiques (Garret et al., 2008). Ces liaisons sont de faibles énergies et font qu’à cette étape de

23 Chapitre I : Introduction générale formation du biofilm, les cellules peuvent se détacher et reprendre un mode de vie planctonique (Fig. 2).

Etape 2 : Adhésion irréversible

Les cellules qui ne sont pas immédiatement détachées de la surface lors de la première étape commencent à synthétiser une matrice polymérique permettant de renforcer l’adhérence entre les cellules et la surface (Fig. 2). Cette matrice se compose essentiellement de polysaccharides, protéines, acides nucléiques ainsi que des lipides (Flemming et Wingender, 2010, Toyofuku et al., 2016).

Etape 3 : Maturation du biofilm

Cette étape correspond à l’accroissement du biofilm par la division des cellules (Fig. 2). La division binaire des bactéries joue un rôle majeur dans la formation d’un biofilm mature permettant aux cellules « filles » d’agrandir le biofilm dans la hauteur et la largeur (Stoodley et Stoodley, 2002). Bien que la structure d’un biofilm dépende de l’espèce bactérienne considérée, elle peut aussi être dépendante des conditions environnementales pour une espèce donnée (Donlan, 2002 ; Tolker-Nielsen, 2015). De manière générale, un biofilm bactérien est une structure 3D organisée au sein de laquelle circulent les nutriments nécessaires au maintien et à la croissance du biofilm (Yawatta et al. 2008).

Etape 4 : Dispersion du biofilm

La dispersion est l’étape finale de la vie d’un biofilm (Fig. 2). Elle peut résulter d’un simple vieillissement mais peut aussi être la conséquence d’un changement environnemental engendrant un changement phénotypique des bactéries (Sauer et al. 2004). Les cellules ainsi libérées peuvent aller coloniser de nouvelles surfaces.

La formation et la dispersion de biofilms sont contrôlées par des déterminants génétiques dont le quorum sensing.

24 Chapitre I : Introduction générale

1.2.3. Quorum-sensing

Le quorum-sensing (QS) est un « dialogue moléculaire » entre bactéries inter- et intra- spécifique permettant à ces dernières de contrôler les fluctuations de densité cellulaire et de coordonner une réponse synchrone à divers stress environnementaux. Le QS joue un rôle majeur dans la formation d’un biofilm (Fig. 3).

Figure 3 : Représentation de la vie d’un biofilm durant lesquelles le quorum sensing intervient (modifié d’après Irie et Parsek, 2008).

Tel qu’illustré dans la figure 3, le QS peut agir à plusieurs étapes de la vie d’un biofilm. Il permet par exemple de donner le signal aux bactéries fixées de former un biofilm lorsque celles-ci sont suffisamment nombreuses et de démarrer la synthèse de la matrice en vue de favoriser l’agrégation et la cohésion entre cellules mais peut également contrôler la dispersion du biofilm (Parsek et Greenberg, 2005). Il peut être également impliqué dans la virulence de certaines bactéries pathogènes comme Pseudomonas aeruginosa (Rumbaugh et al., 2000 ; Smith et Iglewski, 2003).

Bien souvent, la communication intercellulaire utilisant le QS implique un système mettant en jeu une protéine de synthèse de la molécule signal et un régulateur (Miller et Bassler, 2001 ; Waters et Bassler, 2005). Très brièvement, les bactéries synthétisent des molécules signal en réponse à un stress environnemental et qui diffusent librement hors des cellules. Lorsque la concentration en molécules signal devient importante celles-ci sont internalisées et viennent se fixer au régulateur et l’activer. Une fois activé, le

25 Chapitre I : Introduction générale régulateur va à son tour activer l’expression de gènes cibles. Ces gènes cibles sont alors exprimés de manière concertée, coordonnée et simultanée chez toutes les bactéries de la population. Le modèle le plus simple est celui de la protéobactérie Vibrio ficheri faisant intervenir les protéines LuxI et LuxR (Ng et Bassler, 2009 ; Dunlap, 2014) (Fig. 4A). LuxI est impliqué dans la synthèse de la molécule signal (Engebrecht et Silverman, 1984 ; Moré et al., 1996 ; Schaefer et al., 1996). LuxR est un régulateur qui, en se liant aux molécules signal internalisées, change de conformation pour former un dimère actif qui à son tour active la transcription des gènes cibles (Steven et al., 1994). Dans le cas de V. ficheri, LuxI et LuxR régulent la transcription de l’opéron luxICDABE (Ng et Bassler, 2009 ; Dunlap, 2014) codant pour la luciférase. Bien évidemment, il existe d’autres systèmes de régulation proches du système LuxI/LuxR. Par exemple, chez l’espèce Pseudomonas aeruginosa, la virulence est régulée par le système LasI/LasR et RhlI/RhlR (Williams et Cámara, 2009 ; Rutherford et Bassler, 2012). Dans le cas des bactéries à Gram-négatif (particulièrement chez les protéobactéries) les protéines de type LuxI sont impliquées dans la synthèse d’Acyl-Homosérine lactones (AHL) (Whitehead et al., 2001 ; Galloway et al. 2011 ; Papenfort et Bassler, 2016) servant de molécules signal pour LuxR.

Figure 4 : Représentation générique des systèmes de régulation chez (A) les bactéries à Gram-négatif faisant intervenir un système de type LuxI/LuxR et (B) les bactéries à Gram-positif faisant intervenir un système à deux composantes. Chez les bactéries à Gram-négatif la molécule signal impliquée est généralement de type AHL (rouge) et chez

26 Chapitre I : Introduction générale

les les bactéries à Gram-positif c’est généralement un peptide (bleu) (modifié d’après Ng et Bassler, 2009).

Chez les bactéries à Gram-positif, les molécules signal majoritairement retrouvées sont des oligopeptides (Kleerebezem et al., 1997 ; Rocha-Estrada et al., 2011). Du fait de l’imperméabilité des membranes aux peptides, la reconnaissance du signal se fait différemment. Chez les bactéries à Gram-positif, la reconnaissance des signaux du QS se fait par l’intermédiaire d’un’ senseur qui est une histidine kinase qui une fois activé s’auto-phosphoryle puis transfère le phosphate à un régulateur de réponse qui active la transcription des gènes cibles (Ng et Bassler, 2009 ; Büttner et Bonas, 2010 ; Jimenez et Federle ; 2014) (Fig. 4B). Bien que ce modèle soit représentatif des bactéries à Gram- positif, des homologues du système LuxI/LuxR sont également retrouvés (Rajput et Kumar, 2017).

1.3. Biofilms Electroactifs et transfert d’électrons

Le transfert extracellulaire d’électrons (EET) est un mécanisme bactérien retrouvé dans l’environnement permettant aux microorganismes d’échanger des électrons avec des métaux ioniques associés à des minéraux. Ces interactions sont diverses et remplissent plusieurs rôles métaboliques (Shi et al., 2016) (Fig. 5). Ainsi, ces échanges peuvent profiter à des bactéries hétérotrophes qui utilisent les métaux comme accepteur final d’électrons, (e.g. Geobacter) ou à des chimiotrophes qui les utilisent comme donneurs d’électrons (e.g. Rhodopseudomonas palustris). Des interactions plus complexes peuvent également exister où le métal sert de « pont électronique » entre diverses espèces de microorganismes. De ces interactions découlent les PCMs au sein desquelles les biofilms éléctroactifs échangent des électrons avec les électrodes. Bien que seule la notion de bactérie ou biofilm bactérien électroactif soit abordée, les archées semblent aussi en être capables (Abrevaya et al., 2011). Du fait de l’imperméabilité des membranes bactériennes à ces éléments conducteurs, les bactéries disposent de divers mécanismes permettant d’assurer le transfert extracellulaire d’électrons avec ces éléments conducteurs. On distingue les EETs en deux catégories : les EETs directs et les EETs indirects (cf. I.2.1.). La technologie des PCMs repose sur ces EETs permettant aux bactéries d’échanger également des électrons avec les électrodes (Fig. 5).

27 Chapitre I : Introduction générale

Figure 5 : Interactions métaboliques ayant lieu entre une bactérie est un minéral conducteur. Le minéral peut servir de (a) accepteur final d’électron chez des bactéries hétérotrophes anaérobies, (b) donneur d’électrons pour des bactéries autotrophes, (c) médiateur entre deux bactéries d’une même ou différentes espèce(s) et (d) stockeurs d’électrons (d’après Shi et al., 2016)

1.4. Caractérisation d’un biofilm électroactif

Dans les PCMs, les bactéries électroactives sont soumises à de nombreux paramètres aussi bien biologiques que abiotiques (Hasany et al., 2016 ; Saratale et al., 2017a ; Saratale et al., 2017b) (Fig. 6). Il est évident que l’inoculum et les conditions de culture influent sur la formation et l’architecture du biofilm. Cependant, les paramètres propres aux PCMs sont également à prendre en compte. En effet, des critères tels que le choix des matériaux d’électrodes (Kumar et al., 2013), le potentiel de travail (Torres et al., 2009 ; Commault et al., 2013) où encore la dynamique du système (Vilajeliu-Pons et al., 2016). Du fait de la quantité de variables à prendre en compte dans les biofilms de bactéries électroactives, différents niveaux d’analyse existent allant de l’architecture du biofilm, la composition en microorganismes aux protéines ou molécules impliquées dans le transfert d’électrons (Fig. 6) (Harnisch et Rabaey, 2012).

28 Chapitre I : Introduction générale

Figure 6 : Résumé des différents paramètres influant sur la composition d’un EAB (d’après Saratale et al., 2017b)

Considérant que seules certaines bactéries présentes au sein d’un biofilm électroactif jouent un rôle dans la production de courant, il est primordial de les identifier. Les techniques moléculaires représentent un outil essentiel dans la description de ces biofilms (Saratale et al., 2017a). Ainsi des approches comme la DGGE (Erable et al., 2009 ; Kim et al., 2011 ; Cercado et al., 2013 ; Ketep et al., 2013 ; Cai et al., 2015 ; Erable et al., 2017), la T-RFLP (Lefebvre et al., 2010 ; Commault et al., 2013) où encore les techniques de séquençage nouvelle génération à haut débit (Lee et al., 2010 ; Shebab et al., 2013 ; Blanchet et al., 2014 ; Park et al., 2014 ; Sanchez-Herrera et al., 2014 ; Yamamuro et al., 2014 ; Hao et al., 2016 ; Sotres et al., 2016 ; Takahashi et al., 2016 ; Vilajeliu et al., 2016 ; Park et al., 2017, Ketep 2014) sont de puissants outils permettant une vue globale de la composition d’un biofilm. L’isolement de nouvelles souches bactériennes est également un outil intéressant pour identifier de nouvelles EABs en vue de mieux caractériser les mécanismes de transfert d’électrons. Cette approche, moins globale sur la description, permet en revanche de caractériser les bactéries cultivables et impliquées dans la production de courant. D’autre part, les bactéries isolées d’un biofilm électroactif peuvent produire plus de courant en culture pure qu’en biofilm complexe

29 Chapitre I : Introduction générale

(Nercessian et al., 2012). Plusieurs bactéries ont ainsi été isolées de PCM, par exemple Corynebacterium humireducens (Wu et al., 2011), Dysgonomonas oryzarvi (Kodama et al., 2012), Ochrobactrum anthropi (Zuo et al., 2008), une bactérie ferro-réductrice proche de Aeromonas hydrophilia (Pham et al., 2003), Raoultella electrica (Kimura et al., 2014), Rhizomicrobium electricum (Kodama et Watanabe, 2011) ou encore Geobacter bremensis (Nercessian et al., 2012).

Les techniques d’imageries telles que l’hybridation in situ avec des sondes fluorescentes (« Fluorescent In Situ hybridization » (FISH)), la microscopie confocale (« Laser Scanning Confocal Microscopy » (LSCM)) et autres techniques de microscopie électronique à transmission ou à balayage sont de puissants outils pour déterminer la structure des biofilms associés aux électrodes. L’architecture des biofilms d’EABs a un impact non négligeable sur la production de courant (Rousseau et al., 2016). Le couplage des techniques FISH et LSCM permet d’observer la distribution de certains groupes fonctionnels ou phylogénétiques à la surface des électrodes (Ritcher et al., 2007 ; Tang et al., 2010 ; Wrighton et al., 2011 ; Inglesby et al., 2013). La microscopie Raman peut également être utilisée d’autant que cette dernière consiste en une approche non destructive (Virdis et al., 2012). La microscopie électronique est également utilisable pour la caractérisation de EABs et des électrodes (Kramer et al., 2012 ; Lefebvre et al., 2012 ; Ren et al., 2012). La microscopie à force atomique (AFM) peut permettre d’évaluer les forces d’adhésion entre le biofilm et l’électrode et permet des observations à très petite échelle (Malvankar et al, 2012). Enfin la microscopie électronique à transmission (TEM) permet d’imager les structures bactériennes tels que les pilli (Zhi et al., 2014).

Les études à plus petite échelle, c’est à dire visant la compréhension des mécanismes de transferts, demandent d’autres types d’outils. Seule l’approche en culture pure permet la mise en évidence de tels mécanismes, l’utilisation de biofilm multi-espèce rendant l’identification des processus mis en jeu difficile de part la complexité des interactions bactéries-bactéries et/ou bactéries-électrodes. Les outils les plus puissants pour déceler les mécanismes de EETs sont les outils génétiques (Rosenbaum et Henrich, 2014 ; Sydow et al., 2014). Ces derniers permettent, par délétion ou surexpression de gènes cibles, de révéler la fonction de protéines ou de molécules potentiellement impliquées dans les EETs. Le tableau 1 illustre des exemples de constructions génétiques utilisées

30 Chapitre I : Introduction générale chez Shewanella oneidensis et Geobacter sulfureducens pour mettre en avant les différents EETs. Les EETs illustrés dans le tableau 1 sont expliqués dans le chapitre suivant (cf. I.2.1.).

2. Les bioanodes

Les bioanodes sont actuellement très bien caractérisées. Elles ont fait l’objet d’études intensives ayant permis de décrire au mieux les divers mécanismes d’EET mis en place, permettant d’assurer la conduction d’électrons depuis l’oxydation de la matière organique jusqu’à l’anode. De plus, au delà des deux bactéries modèles G. sulfureducens et S. oneidensis une grande diversité de bactéries a été décrite pour catalyser la bioanode.

2.1. Transfert extracellulaire d’électrons à l’anode

2.1.1. Transfert indirect d’électrons

Les transferts indirects d’électrons mettent en jeu des médiateurs électrochimiques, aussi appelés navettes rédox. Ces médiateurs peuvent être artificiels ou bien produits par la bactérie (Fig. 7). Les médiateurs produits par les bactéries sont généralement des molécules solubles sécrétées dans l’environnement cellulaire. A titre d’exemple, P. aeruginosa a fait l’objet de plusieurs études ayant montré que des molécules telles que les phénazines (Rabey et al. 2005; Pham et al., 2008; Venkataraman et al., 2010; Qiao 2015), les quinones (Wang et al., 2013) et la pyocyanine (Shen et al., 2014) étaient impliquées dans les EETs indirects à l’anode. Les flavines produites par S. oneidensis sont également impliquées dans le EET indirect (Marsili et al., 2008 ; Von Canstein et al., 2008 ; Brutinel et Gralnick 2012 ; Kotloski et Gralnick 2013). Les produits du métabolisme bactérien tel que le dihydrogène peuvent également jouer un rôle dans le EET indirect (Lovley, 2006) (Fig. 8).

31 Chapitre I : Introduction générale

Tableau 1 : Comparaison de l’électroactivité des mutants construits chez S. oneidensis MR-1 et G. sulfureducens par rapport à la souche sauvage (extrait de Sydow et al., 2014)

Activité électrochimique comparée à la Souche Aleration/génotype souche sauvage Référence

mrtC (plasmide de sur expression sous le contrôle du 135 % (densité de courant) promoteur lacZ) ΔcymA (CymA non fonctionelle) 5 % (densité de courant) ΔmtrA (MtrA non fonctionelle) 2.5 % (densité de courant) ΔfccA (cytochrome c fumarate 143 % (calculé d'après les graphiques; réductase non fonctionel) densité de courant) Bretschger 2,5 % (calculé d'apèrs les graphiques; et al., 2007 ΔmtrB (MtrB non fonctionelle) densité de courant)

ΔomcA/ΔmtrC (cytochrome c de la membrane externe non < 20 % (densité de courant fonctionel) ΔmtrD (MtrD non fonctionelle) Pas de changement significatif S. oneidensis ΔmtrF (MtrF non fonctionelle) Pas de changement significatif MR-1 ΔomcA (OmcA non fonctionelle) 50 % (densité de courant ) Coursolle 15 % (calculé d'après les graphiques; ΔmtrC (MtrC non fonctionelle) et al., 2010 densité de courant) ΔomcA/ΔmtrC (cytochrome c de la membrane externe non 24 % (Courant) Gorby et fonctionel) al., 2006 Immobilisation bactérienne 1,15 % (Courant par unité de protéines (biofilm artificiel de la souche Yu et al., fixées) sauvage) 2011

35 à 100 % (courant; dépend de la Δbfe (Déficience dans la concentration en oxygène et de sécrétion de flavines) l'hydrodynamise) TerAvect et al. 2011 ΔomcS/ΔomcT (OmcS et OmcT 35 % (calculé d'après les graphiques; non fonctionnelles) densité de courant) 35 à 75 % (adaptation après 4 cycles; Holmes et G. ΔomcE (OmcE non fonctionelle) calculé d'après les graphiques; densité de al., 2006 sulfureducen courant) s ΔocmB (OmcB non fonctionelle) Pas de changement significatif

ΔpilA (PilA non fonctionelle; pili 13 % (Courant par unité de protéines Reguera et défficient) fixées) al., 2006

32 Chapitre I : Introduction générale

Figure 7 : Schéma du mécanisme indirect d’électrons mettant en jeu un médiateur à l’anode avec du glucose comme source d’énergie (d’après Lovley, 2006).

Figure 8 : Schéma du mécanisme indirect d’électrons mettant en jeu le H2 issu de la fermentation du glucose à l’anode (d’après Lovley, 2006).

33 Chapitre I : Introduction générale

2.1.2. Transfert direct d’électrons

L’EET direct implique, comme son nom l’indique, un contact direct entre la cellule et l’électrode et correspond ainsi le mieux à la notion de biofilm d’EAB. L’EET direct nécessite la présence de protéines membranaires permettant d’assurer l’échange d’électrons avec la surface conductrice (Fig. 9).

Figure 9 : Schéma du mécanisme de transfert direct d’électrons mettant en jeu une protéine membranaire impliquée dans le transport d’électrons (d’après Lovley, 2006).

Parmi les EABs actuellement décrites, les bactéries métallo-réductrices Geobacter et Shewanella sont les plus étudiées pour leur capacité à échanger par EET direct les électrons issus de l’oxydation de la matière organique avec l’anode. L’imperméabilité de la membrane bactérienne aux métaux et autres matières conductrices implique des adaptations permettant d’échanger les électrons avec ces derniers. Les cytochromes membranaires jouent ce rôle de pont entre la membrane externe et le métal.

Chez S. oneidensis MR-1 le transfert d’électrons a été particulièrement bien décrit. Ce dernier résulte de l’oxydation des quinones au niveau de la membrane interne qui

34 Chapitre I : Introduction générale engendre un flux d’électrons vers le complexe protéique formé des cytochromes de type C OmcA et MtrC. Ce complexe situé sur la membrane externe permet ainsi d’assurer le transfert vers l’accepteur final d’électrons (Shi et al., 2007 ; Shi et al., 2009) (Fig. 10A). Chez G. sulfurreducens le mécanisme est un peu moins bien décrit que chez S. oneidensis. Le transfert d’électrons est supposé se faire à l’aide des cytochromes de type C OmcE et OmcS qui transfèrent ensuite les électrons à un pili de type IV assurant le rôle de conducteur électrique jusqu’à l’accepteur final d’électrons (Shi et al., 2007 ; Shi et al., 2009) (Fig. 10B).

Figure 10 : Modèle de EET direct proposé pour (A) S. oneidensis MR-1 et (B) G. sulfureducens. La flèche jaune indique le flux d’électrons (d’après Shi et al., 2007). Le parallèle peut être fait entre les oxydes métalliques et l’anode.

La conduction des électrons chez G. sulfureducens par le pili de type IV, aussi appelé « nanowire », a été mise en évidence en 2005 (Reguera et al., 2005). Ces derniers sont recouverts de molécules de cytochrome OmcS réparties sur la longueur du pili (Leang et al., 2010). Les nanowires jouent un rôle important dans l’électroactivité de la bactérie et participent grandement à la génération de courant anodique notamment dans le cas de biofilms épais (Reguera et al., 2006). Des structures similaires ont été montrées chez S. oneidensis MR-1 (Gorby et al., 2006) mais il s’est avéré par la suite que ces structures étaient en réalité des extensions cytoplasmiques couvertes de molécules des cytochromes OmcA et MtrC (Pirbadian et al., 2014).

35 Chapitre I : Introduction générale

2.1.3. Composition des biofilms électroactifs anodiques

La composition des EABs est déterminée en fonction du compartiment étudié (anode ou cathode), des paramètres expérimentaux et de l’inoculum (c.f. 1.4.). Bien évidemment des espèces appartenant aux genres Geobacter et Shewanella sont très souvent retrouvées mais également une grande diversité de microorganismes évolue sur les électrodes. Les Protéobactéries dominent généralement les EABs mais des Bacteroidetes, Firmicutes, Acidobactéries et Cyanobactéries sont également retrouvées (Logan et Regan, 2006 ; Logan 2009 ; Franks et al., 2010). La liste des bactéries mises en évidence sur les anodes est longue. Cependant, il n’y a pas d’évidence quant à leur élecroactivité et leur implication dans le transfert d'électrons à l’anode. Il est à noter que, des bactéries ferro-réductrices et sulfo-réductrices sont généralement retrouvées sur les anodes (Rabaey et Verstaete, 2005, Logan 2009). Des bactéries du genre Desulfuromonas et Desulfobulbus sont présentes quand Geobacter sp. est minoritaire ou absent (Ketep et al., 2014). Des espèces telles que Marinobacter sp. et Halomonas sp. dominent les anodes formées à partir d’échantillons marins (Erable et al., 2009). Des bactéries du genre Desulfuromonas peuvent être enrichies sur l’anode à partir d’un marais salant et contribuent majoritairement à la production du courant alors que Marinobacter est aussi présent (Rousseau et al., 2014). Lorsque des échantillons rhizosphériques sont utilisés comme inoculum des MFCs, des genres bactériens comme Rhizobium, Myxococcus et Deferrisoma sont également présents (Ahn et al., 2014 ; Cabezas et al.,2015). Les bactéries du genre Clostridium sont également impliquées dans les biofilms d’EABs (Wong et al., 2014 ; Wang et al., 2015). Il n’est pas possible de décréter un EAB de part sa composition, en revanche il semble évident que les bactéries associées au cycle du fer et du soufre ont un rôle clé dans la formation des biofilms d’EABs. Les EABs associées aux cathodes sont, quant à elles, bien moins décrites.

3. Les biocathodes

Jusqu’à présent, ce chapitre s’est intéressé à la partie anodique de la PCM, celle-ci étant mieux décrite. Cependant, comme expliqué précédemment, les PCMs ont longtemps favorisé l’utilisation d’une cathode abiotique utilisant généralement un catalyseur onéreux tel que le platine pour la réduction de l’oxygène.

36 Chapitre I : Introduction générale

3.1. Principe général

Au même titre que les bioanodes, les biocathodes catalysent une réaction chimique à l’aide de microorganismes interagissant avec la cathode. Toutefois, la réaction ayant lieu est une réduction. Les bactéries récupèrent les électrons de l’électrode et les transfèrent à un accepteur final d’électrons (Fig. 11).

Figure 11 : Schéma général d’une PCM utilisant une bioanode où a lieu la catalyse de l’oxydation de la matière organique couplée à une biocathode où la réduction d’un accepteur final d’électron a lieu. Les accepteurs finaux d’électrons potentiels sont indiqués à droite (d’après He et al. 2015).

Généralement, les biocathodes rencontrées dans la littérature catalysent la réduction de

+ - l’oxygène (O2 + 4H + 4e → 2H2O) mais il existe d’autres réactions possibles (He et Angenent, 2006). La réduction de l’oxygène est la plus énergétique (+0,82 V vs. SHE), c’est pour cela que la plupart des biocathodes l’utilisent comme accepteur final d’électrons. Cependant, en absence d’oxygène, de nombreux composés peuvent agir

37 Chapitre I : Introduction générale comme accepteurs finaux d’électrons. Parmi eux, le fer, le nitrate et le manganèse sont les plus rentables d’un point de vue énergétique (Fig. 12). Dans le cas où l’oxygène est absent et n’est donc pas l’accepteur final d’électrons, le terme de biocathode anaérobie est employé.

+ - 2+ MnO2(s) + 4 H + 3 e → Mn + 2 H20

Fe3+ + e- → Fe2+

C6H6O5 + H20 → H2 + (CH2O)x + O2 + autres produits

3- + - 2- NO + 2 H + 2 e → NO + H2O

2- - 2- - 2 H20 + 2 SO4 + 3 H2 + 10 e → 2 S + 10 OH

+ - CO2 + 8 H + 8 e → CH4 + 2 H2O

Fumarate + 2 H+ + 2 e- → Succinate

Figure 12 : Différentes réactions pouvant avoir lieu à la cathode (gauche) et les potentiels d’oxydoréduction des couples associés (d’après He et Angenent 2006)

3.2. Diversité bactérienne catalysant la réaction de réduction à la biocathode

Comme expliqué précédemment dans ce chapitre, la plupart des efforts de recherche ont historiquement été portés sur la bioanode et donc sur la diversité bactérienne catalysant l’oxydation de la matière organique. L’intérêt porté au biofilm cathodique et à sa capacité à catalyser une réaction de réduction est récent. La diversité est encore peu connue au même titre que les mécanismes de transfert extracellulaire d’électrons mis en jeu à la cathode. Le tableau 2 relate les différents inocula (cultures pures ou échantillons complexes) et les accepteurs finaux d’électrons utilisés pour la formation de biocathode ainsi que les accepteurs finaux d’électrons mis en jeu. Bon nombre d’inocula utilisés sont des consortia soulignant la difficulté d’identifier des espèces bactériennes catalysant une réduction cathodique. En somme, une très faible diversité est mise en avant.

38 Chapitre I : Introduction générale

3.3. Les transferts extracellulaires d’électrons à la cathode

L’étude des mécanismes d’EET mis en place à la biocathode représente un enjeu majeur dans la compréhension de cette dernière. La présence de Geobacter sp. à la biocathode (Greogry et al., 2004 ; Gregory et Lovley 2005 ; Dumas et al., 2008 ; Strycharz et al., 2008) laisse entrevoir que des mécanismes d’EETs pourraient être comparables à l’anode et à la cathode (Rosenbaum et al., 2011). En effet, les EETs directs et indirects se retrouvent également à la biocathode et mettent en jeu des mécanismes similaires (Fig. 13).

Figure 13 : Représentation schématique des transferts extracellulaires d’électrons (A) directs mettant en jeu une protéine membranaire et (B) indirects mettant en jeu un médiateur à la biocathode (d’après Huang et al., 2011)

39 Tableau 2 : Recensement des différents accepteurs finaux d’électrons, inoculum et médiateurs utilisés pour les biocathodes ainsi que les puissances de courant obtenues (modifié d’après Huang et al., 2011 ; Rosenbaum et al., 2011 ; Erable et al., 2012).

Accepteur Densité de Potentiel de final Biocatalyseur Médiateur Courrant Référence travail (V) d'électron (A.m-3) Leptothrix discophora SP-6 Mn(IV) et Mn(II) 0,7 Nguyen et al., 2007 Culture d'enrichissement 0,45 200 Clauwaert et al., Culture d'enrichissement 0,45 188 2007b Culture d'enrichissement Mn(IV) et Mn(II) 0,45 200 Culture d'enrichissement 329 Freguia et al., 2008 Culture d'enrichissement 75 Acinetobacter calcoaceticus 0 100 Sphingobacterium 0 49-103 Rabaey et al., 2008 multivorum Isolement de 44 Bétaproteobactérie C11r0 Culture d'enrichissement 117 Zhang et al., 2008 O 2 Aldrovandi et al., Culture d'enrichissement 0,1 2009 Culture d'enrichissement 0,525 179 You et al., 2009 Culture d'enrichissement 0 24 Culture d'enrichissement 0 0,6 Erable et al., 2010 Winogradskyella proferorum 0 0,04 Acinetobacter johnsonii 0 0,02 Acinetobacter calcoaceticus Pyrroloquinoline quinone 0,1 1,3 Proche (non identifié) d'une Acinetobacter calcoaceticus 0,1 3,3 Pyrroloquinoline quinone Freguia et al., 2010 Composé redox membranaire Shewanella putrefaciens 0,2 0,7 non identifié

Tableau 2 : Suite

Accepteur final Potentiel de Densité de Biocatalyseur Mediateur Référence d'électron travail (V) Courrant (A.m-3) Pseudomonas aeruginosa -0,21 à +0,05 a 1,67 (A.m-2) Pseudomonas fluorescens -0,21 à +0,06 a 1,43 (A.m-2) Brevundimonas diminuta -0,09 à +0,11 a 2,03 (A.m-2) Burkholderia cepacia -0,12 à +0,1 a 2,44 (A.m-2) Branhamella catarrhalis -0,2 à +0,06 a 1,91 (A.m-2) Enterobacter cloacae -0,24 à +0,05 a 1,47 (A.m-2) Escherichia coli -0,25 à +0,03 a 1,46 (A.m-2) O2 Cournet et al., 2010 Shigella flexneri -0,27 à +0,03 a 1,64 (A.m-2) Acinetobacter sp. -0,17 à +0,08 a 1,44 (A.m-2) Kingella kingae -0,25 à +0,02 a 1,37 (A.m-2) Kingella denitrificans -0,25 à +0,03 a 1,71 (A.m-2) Micrococcus luteus -0,22 à +0,05 a 1,93 (A.m-2) Bacillus subtilis -0,25 à +0,06 a 1,66 (A.m-2) Staphylococcus carnosus -0,28 à +0,02 a 1,36 (A.m-2) Gregory et Lovleyi, U(VI) Geobacter sulfurreducens -0,3 2005 Culture d'enrichissement 2 Tandukar et al., 2009 Cr(VI) Culture d'enrichissement 6,9 Huang et al., 2010 Culture d'enrichissement 0 35 Clauwaert et al., 2007a Geobacter -0,3 Gregory et al., 2004 - NO3 metallireducens Culture d'enrichissement 133 Virdis et al., 2008 Culture d'enrichissement 0,6 Lefebvre et al., 2008

41 a Dérive du potentiel de réduction de l’oxygène en début et en fin d’expérience

Tableau 2 : Suite

Accepteur final Potentiel de Densité de Courant Biocatalyseur Médiateur Référence d'électron travail (V) (A.m-3) 2,6-anthraquinone Dechloromonas agitata -0,3 disulfonate 2,6-anthraquinone Azospira suillum -0,3 Trash et al., 2007 Perchlorate disulfonate Clone proche de Hydrogène -0,3 Dechlorospirillum anomalous Culture d'enrichissement 16 Shea et al., 2008 Culture d'enrichissement Méthyl Viologène -0,5 0,05 Aulenta et al., 2007 Trichloroethene Culture d'enrichissement -0,45 Aulenta et al., 2009 Culture d'enrichissement -0,55 Aulenta et al., 2010 Tetrachloroethene Geobacter lovleyi -0,3 4,8 Strycharz et al., 2008 Geobacter sulfurreducens -0,4 2,4-12 Dumas et al., 2008 Fumarate Geobacter lovleyi -0,3 4,8 Strycharz et al., 2008 Acetate Culture d'enrichissement Méthyl Viologène -0,55 Steinbush et al., 2010 Desulfovibrio vulgaris Méthyl Viologène -0,3 Lojou et al., 2002 H2 Culture d'enrichissement -0,45 Aulenta et al., 2008 Culture d'enrichissement -0,5 120 Rozendal et al., 2008 Culture d'enrichissement -0,5 190-330 Jeremiasse et al., 2010 Culture d'enrichissement -0,8 à -0,5 8,7 Cheng et al., 2009 Methanobacterium palustre -0,8 à -0,5 0,07 CO 2 Culture d'enrichissement 0,242 5 Cao et al., 2009 Chlorella vulgaris Bleu de méthylène 0,3 Powell et al., 2009 Culture d'enrichissement -0,75 3,3 Villano et al., 2010

42 Chapitre I : Introduction générale

En revanche, les bactéries catalysant les réactions cathodiques innovent par l’utilisation de métaux comme médiateurs électrochimiques. En effet, le manganèse peut être utilisé à ce titre et contribuer au transport d’électrons entre la cathode et la bactérie qui va ensuite réduire l’oxygène (Nguyen et al., 2007 ; Clauwaert et al., 2007b) (Fig. 14). Plus précisément, les bactéries mangano-oxydantes vont oxyder les Mn2+ solubles qui vont par la suite précipiter sous la forme d’oxyde de manganèse à la surface de la cathode. Par la suite l’oxyde de Mn4+ est réduit par les électrons fournis à la cathode jusqu’à être à nouveau solubilisé.

Figure 14 : Schématisation de l’utilisation de manganèse comme médiateur électrochimique pour la catalyse de la réduction de l’oxygène à la biocathode (d’après He et Angenent, 2006)

Ce mécanisme ne peut être cependant possible qu’en condition aérobie en présence de bactéries métallo-oxydantes capables de catalyser cette réaction (e.g. Leptotrix discophora). En effet, en absence d’oxygène le métal oxydé peut servir d’accepteur final d’électrons pour des bactéries métallo-réductrices. L’utilisation d’un tel mécanisme permet un recyclage « perpétuel » de l’énergie ainsi que le maintien de l’activité bactérienne à la cathode. L’utilisation d’une biocathode fonctionnant avec du manganèse fût l’une des premières recensées dans l’assemblage d’une PCM complète (Rhoads et al., 2005.).

L’interaction entre la cathode et les métaux représente une double voie d’intérêt pour la production d’énergie où i) le métal peut servir de médiateur et ii) comme accepteur final

43 Chapitre I : Introduction générale d’électrons. Dans le cadre de ces recherches nous allons nous intéresser plus particulièrement au rôle du fer.

4. Interaction bactéries-métaux

4.1. Généralité

Les interactions bactéries-métaux résultent de divers mécanismes (Fig. 15). Ces derniers ont été intensivement étudiés à travers les dernières décennies et sont maintenant relativement bien décrits. L’intérêt porté à ces interactions résulte des applications biotechnologiques qui en découlent comme la biolixiviation, les procédés miniers bio- assistés ou encore le traitement des eaux et/ou sites contaminé(e)s (Ike et al., 2011). La bio-réduction peut être assimilée à un processus de détoxification en transformant l’ion métal en sa forme solide. Ce processus peut avoir lieu dans la cellule ou à sa surface (Fig. 15). La bio-réduction de l’ion argent (Ag) en nanoparticule d’Ag(0) a été montrée chez de nombreuses bactéries (Prabhu et Poulose, 2012). Le même processus existe pour l’or (Au) (Deplanche et Macaski, 2008 ; Shedbalkar et al., 2014) et la formation de nanoparticule d’or et palladium (Au-Pd) (Deplanche et al., 2012 ; Hosseinkhani et al., 2012). Le platine (Pt) peut aussi faire l’objet de formation de nanoparticule de Pt(0) par la bioréduction chez Desulfovibrio sulfuricans, Shewanella algae ou Pseudomonas sp. (Yong et al., 2007 ; Capeness et al., 2015). La bioreduction peut également être couplée à la détoxification de sites pollués. L’un des meilleurs exemples est l’uranium (U). Ce dernier peut être réduit de sa forme U(VI), soluble et toxique, à sa forme U(IV) beaucoup moins soluble par l’activité de nombreuses bactéries dont Shewanella, Geobacter, Desulfovibrio et Pseudomonas (Nancharaiah et al., 2006 ; Wall et Krumholz, 2006 ; Paterson-Beedle et al., 2010 ; Newsome et al., 2014). La bio-précipitation est également employée pour la récupération d’uranium en transformant l’U(VI) en phosphate hydrogéné d’uranyle (Paterson-Beedle et al., 2010 ; Kulkarni et al., 2013 ; Newsome et al., 2014). La bio-précipitation implique un produit du métabolisme bactérien qui va précipiter avec un métal ionique pour le rendre insoluble (Fig. 15). La biosorption et la bioaccumulation sont deux processus proches. Cependant, la biosorption est un phénomène passif où les métaux vont avoir tendance à précipiter sur les membranes bactériennes par interaction avec des exopolysaccharides (Fig. 15).

44 Chapitre I : Introduction générale

Figure 15 : Représentation des différentes interactions bactéries-métaux impliquées dans la mobilisation (à gauche) et dans l’immobilisation (à droite) (d’après Nancharaiah et al., 2016)

Par exemple, la bioaccumulation s’apparente à un phénomène actif où la cellule internalise le métal (Fig. 15) pour des besoins physiologiques (e.g. les bactéries magnétotactiques) ou pour détoxifier son environnement proche comme dans le cas de Stenotrophomonas maltophilia qui transforme les tellurites et les séquestrent sous forme de cristaux de tellurium et les sélénites sous forme de granules de sélénium (Pagès et al., 2006). A titre illustratif, Pseudomonas aeruginosa est étudiée pour la biosorption de diverses terres rares sur ses membranes (Texier et al., 1999 ; Ilyas et Lee, 2014) tout comme Escherichia coli ou Bacillus subtilis (Takahashi et al., 2005). Les espèces B. licheniformis, B. subtilis, Brevibacterium helovolum et Rhodococcus elythropolis sont quant à elles capables de bioaccumuler du samarium (Sm) jusqu’à 300 μmol par gramme de matière sèche (Tsuruta et al., 2007). Dans la suite de ce chapitre, nous allons nous intéresser plus particulièrement au fer.

45 Chapitre I : Introduction générale

4.2. Cycle biogéochimique du fer

Le fer est le 4ème élément le plus abondant de la croûte terrestre et c’est un élément essentiel à la vie entrant dans dans la structure de protéines essentielles. A des pH proches de la neutralité, le fer existe essentiellement sous forme insoluble d’oxyde de fer trivalent (Fe(III)) et divalent (Fe(II)) (Cornell et Schwertmann, 2003). La solubilité et l’état d’oxydoréduction du fer sont fortement dépendants du pH, de la concentration en oxygène, et de la température (Schwertmann, 1991 ; Stumm et Morgan, 1996). Ainsi à des pH bas, la solubilité du Fe(III) est amélioré mais également la stabilité du Fe(II) même en présence d’oxygène (Roekens et Van Grieken, 1983). En effet, l’oxygène peut oxyder spontanément le Fe(II) en Fe(III) à des pH élevés. A la forte dynamique chimique du fer s’ajoute également l’activité biologique des bactéries qui jouent un rôle majeur dans le cycle biogéochimique du fer. En effet, celui-ci sert à de nombreuses fonctions biologiques et notamment à la synthèse de protéines telles que les cytochromes ou les hydrogénases. De part son insolubilité à pH neutre, de nombreuses bactéries possèdent divers mécanismes d’acquisition du fer.

Figure 16 : Cycle bactérien du fer. Les flèches noires représentent les métabolismes d’oxydation du Fe(II) en Fe(III) et les flèches blanches, la réduction de Fe(III) en Fe(II). L’acquisition du fer n’est pas représentée (d’après Konhauser et al. 2011).

46 Chapitre I : Introduction générale

Ce dernier peut également être utilisé pour le métabolisme énergétique de certaines espèces bactériennes (Fig. 16). Le Fe(III) peut servir d’accepteur final d’électrons pour les bactéries ferro-réductrices en anaérobiose. Le Fe(II), quant à lui, peut servir de donneur d’électrons pour les bactéries ferro-oxydantes en présence ou absence d’oxygène.

4.3. Acquisition du fer

L’insolubilité du fer dans des environnements neutrophiles et oxygénés fait de lui un nutriment souvent limitant pour la croissance bactérienne. Afin de rendre le fer disponible pour les besoins physiologiques, les bactéries sécrètent des molécules organiques solubles de faible poids moléculaire qui vont pouvoir former des complexes avec le Fe(III) dissous. Ces molécules sont des sidérophores. Elles peuvent avoir un rôle majeur dans la spéciation du fer au niveau des océans par exemple avec la sécrétion de sidérophores par les cyanobactéries (Wilhelm et Trick, 1994).

Parmi les espèces bactériennes produisant des sidérophores, les bactéries du genre Pseudomonas ont fait l’objet de nombreuses études. En effet, ces dernières sont des bactéries ubiquistes (Goldberg, 2000) aussi bien impliquées dans la promotion de croissance des plantes (e.g. P. brassicacearum, P. putida, P. fluorescens) que dans les pathologies végétales (e.g Pseudomonas syringae) et humaines (e.g. P. aeruginosa). Chez ce genre bactérien, l’absence de Fe(III) active la synthèse de sidérophores (Hersman et al., 2000). En présence de Fe(III), son acquisition est extrêmement contrôlée afin de prévenir les réactions toxiques pouvant générer des radicaux hydroxyles via la réaction de Fenton (Braun, 1997 ; Andrews et al., 2003). L’acquisition du fer par les sidérophores dépend de la structure membranaire bactérienne. Chez les protéobacteries, l’acquisition se fait via la reconnaissance d’un complexe fer-sidérophore par un récepteur dépendant de TonB situé sur la membrane externe. Une fois le complexe fer-sidérophore reconnu, le complexe protéique TonB, ExbB et ExbD permet l’entrée dans le périplasme puis dans le cytoplasme par une transférase. Le fer est ensuite libéré sous la forme Fe(II) par l’action d’une réductase. Le Fe(II) peut alors être incorporé aux métalloprotéines. Le sidérophore peut être recyclé ou bien dégradé (Andrews et al., 2003 ; Cornelis, 2010) (Fig. 17). Parmi la diversité de sidérophores existants, deux sont retrouvés uniquement

47 Chapitre I : Introduction générale chez les Pseudomonas fluorescents : la pyoverdine (Meyer et Abdallah, 1978 ; Pool et McKay, 2003) et la pyochéline (Cox et al., 1981 ; Braud et al., 2009).

Figure 17 : Schéma de l’acquisition du fer par l’action de sidérophores chez les bactéries à Gram négatif (d’après Andrews et al .,2003). OM : Membrane externe (Outside- Membrane) ; CM : Membrane cytoplasmique.

4.4. Métabolisme énergétique du fer

Le métabolisme énergétique du fer se décline en deux catégories, les ferro-réductrices et les ferro-oxydantes. Il existe là encore une très grande variabilité d’adaptation des microorganismes pour pallier à l’insolubilité du fer. L’oxydoréduction du fer est réalisée par une grande diversité microbienne répartie sur l’ensemble des phyla bactériens et archéens (Fig. 18). Ainsi, cette diversité phylogénétique laisse entrevoir que la métabolisation énergétique du fer est un métabolisme ancien.

48 Chapitre I : Introduction générale

Figure 18 : Diversité phylogénétique basée sur l’ADNr 16S des procaryotes contribuant au cycle d’oxydoréduction du fer. Les espèces ferro-réductrices sont indiquées en rouge et les espèces ferro-oxydantes en noir (d’après Webber et al., 2006)

4.4.1. La réduction du fer ferrique

La réduction du Fe(III) est un métabolisme microbien réalisable uniquement en anaérobiose par des bactéries fermentant la matière organique (Konhauser et al., 2011) :

- 2+ - - CH3CCO + 8 Fe(OH)3 → 8 Fe + 2 HCO3 + 15 OH + 5 H2O

49 Chapitre I : Introduction générale

Les bactéries ferro-réductrices les mieux décrites à l’heure actuelle sont les Geobacteraceae et Shewanella sp. (Lovley et al. 2004). Toutes deux ont été intensivement étudiées pour leur capacité à réduire l’anode dans les PCMs (cf. I.2.1). Les mécanismes et stratégies permettant à ces bactéries d’échanger leurs électrons avec les oxydes de Fe(III) ont également été décrits dans la section 1.3.2.. En effet, les mécanismes permettant aux bactéries d’échanger avec l’anode sont les mêmes que ceux impliqués dans la réduction du Fe(III). Pour rappel, les transferts d’électrons peuvent avoir lieu par contact entre la cellule et l’oxyde via des protéines extra-membranaires ou des pili conducteurs mais également à l’aide de médiateurs chimiques. La matière humique peut également permettre ou faciliter la réduction du Fe(III) (Lovley et al., 1996 ; Lovley et al., 1998).

4.4.2. L’oxydation du fer ferreux

Du fait de l’instabilité du Fe(II) causée par l’oxydation spontanée par l’oxygène, les bactéries ferro-oxydantes possèdent diverses stratégies adaptatives. Ces stratégies peuvent se décliner de plusieurs façons. Dans le cas présent, nous distinguerons les bactéries ferro-oxydantes neutrophiles des acidophiles.

4.4.2.1. Les bactéries ferro-oxydantes neutrophiles

A pH neutre, le Fe(II) est soumis à une forte oxydation par l’oxygène. Pour pallier à cette compétition abiotique pour le substrat, les bactéries oxydant le Fe(II) sont soit anaérobies et couplent l’oxydation du Fe(II) à la réduction du nitrate, soit aérobies ou bien encore réalisent une photosynthèse anoxygénique.

Oxydation du Fe(II) par la photosynthèse anoxygénique

La photosynthèse anoxygénique couplée à l’oxydation du Fe(II), aussi appelée photoferrotrophie, a été mise en évidence en 1993 par Widdel et ses collaborateurs. Des bactéries pourpres sulfureuses et non sulfureuses et des bactéries vertes sulfureuses catalysent cette réaction (Konhauser et al., 2011) :

2+ - + 4 Fe + HCO3 + 10 H2O + lumière → 4 Fe(OH)3 + CH2O + 7 H

50 Chapitre I : Introduction générale

L’une des représentantes de ce groupe métabolique est l’espèce Rhodopseudomonas palustris. Bien que capable de photoferrotrophie, cette dernière présente une très grande versatilité métabolique (Larimer et al., 2004). L’oxydation du Fe(II) est régulée par l’opéron pioABC qui code pour le cytochrome de type-c PioA présentant des homologies avec le cytochrome MtrA de S. oneidensis MR-1 (Croa et al., 2006 ; Jiao et Newman, 2006 ; Bonnefoy et Holmes, 2012).

Oxydation anaérobie du Fe(II)

En absence d’oxygène, le Fe(II) est relativement stable. Etant donnée l’absence d’oxygène, c’est généralement le nitrate qui fait office d’accepteur final d’électrons (Straub et al., 1996) :

2+ - + 10 Fe + 2 NO3 + 24 H2O → 10 Fe(OH)3 + N2 + 18 H

Peu d’espèces bactériennes appartenant à ce groupe métabolique sont disponibles (Hedrich et al., 2011). Aucune bactérie strictement autotrophe neutrophile catalysant cette réaction n’est pour l’heure isolée et pourrait vivre en syntrophie au sein d’un consortium (Blöthe et Roden, 2009). Quelques espèces telles que Acidovorax ont été isolées (Straub et al., 2004 ; Muehe et al., 2009) et le génome d’Acidovorax ebreus TPSY complètement séquencé (Byrne-Bailey et al., 2009). Malgré cela, peu d’informations sont disponibles sur ce métabolisme ou du moins sur les bactéries le catalysant. Il est tout de même intéressant de noter que la capacité de G. metallireducens à oxyder le Fe(II) couplée à la réduction du nitrate est possible (Finneran et al., 2002).

Oxydation aérobie du Fe(III)

Les bactéries catalysant cette réaction font face à la rapide oxydation du Fe(II) par l’oxygène. Pour y faire face, ce métabolisme a essentiellement lieu aux interfaces aérobies/anaérobies où la teneur en oxygène est moindre pour pouvoir limiter la compétition avec l’oxygène (Emmerson et al., 2010 ; Hedrich et al., 2011) :

2+ + 3+ 4 Fe + O2 + 4 H → 4 Fe + H20

La catalyse de cette réaction à pH neutre représente un véritable challenge énergétique (Neubauer et al., 2002). En effet, l’énergie libérée par la réaction est faible. De plus,

51 Chapitre I : Introduction générale l’oxydation spontanée du Fe(II) a lieu rapidement et les bactéries lithotrophes ferro- oxydantes croissent très lentement (Emmerson et Moyer, 1997). A l’heure actuelle, l’ensemble des bactéries ferro-oxydantes neutrophiles aérobies lithotrophes sont des Proteobacteria (Emmerson et al., 2010). Historiquement, Gallionella sp. et Leptothrix sp. étaient les représentantes de ce groupe métabolique. Depuis quelques années, une nouvelle espèce bactérienne, Mariprofundus ferrooxidans, a été décrite comme représentante d’une nouvelle classe : les Zeta-Proteobacteria (Emmerson et al., 2007). Cette dernière, à l’inverse de Gallionella sp. et Leptothrix sp. a été décrite dans les océans. D’autre part, ces bactéries peuvent grandement contribuer à la précipitation d’oxyde de fer (Emerson et Moyer, 2002). Ces espèces partagent un phénotype commun : elles forment des structures en pédoncule ou tubulaires via l’oxydation du fer (Hashimoto et al., 2007 ; Chan et al., 2011 ; Flemming et al., 2014) (Fig 19). Ces structures sont essentiellement composées de polysaccharides sur lesquelles se forment les oxydes de Fe(III) (Banfield et al., 2000 ; Chan et al., 2004 ; Chan et al., 2010 ; Chan et al., 2011). Leur rôle n’est cependant pas encore élucidé (Frankel et al., 2003).

Figure 19 : (A) Evolution de la création d’un pédoncule de fer par M. ferrooxidans, la cellule est indiquée par la flèche blanche et (B) Détail de la structure en hélice (d’après Chang et al., 2011).

D’un point de vue moléculaire, l’oxydation du Fe(II) en Fe(III) implique un cytochrome extra-membranaire. Chez la bactérie Sideroxydans lithotrophicus ES-1, l’oxydation se ferait par l’intervention du cytochrome de type-c MtoA codé par le cluster mtoAB-cymA (Liu et al., 2012 ; Beckwith et al., 2015), et un homologue du cluster pioABC responsable

52 Chapitre I : Introduction générale de l’oxydation du Fe(II) chez Rhodopseudomonas palustris TIE-1 existe chez Gallionella capsiferriformans (Bonnefoy et Holmes, 2011).

4.4.2.2. Les bactéries ferro-oxydantes acidophiles

Toujours dans le souci de pallier à la présence d’oxygène qui peut entrer en compétition avec les bactéries pour le Fe(II), l’acidophilie est un mécanisme original d’adaptation . En effet, à des pH inférieurs à 4, le Fe(II) reste stable et soluble (Roekens et Van Grieken, 1983). Les bactéries ferro-oxydantes peuvent donc catalyser l’oxydation du Fe(II) en Fe(III) en réduisant l’oxygène (Konhauser et al., 2011) :

2+ + 3+ 4 Fe + O2 + 4 H → 4 Fe + H20

D’un point de vue géochimique, les bactéries acidophiles associées à l’oxydation du Fe(II) contribuent grandement à l’apport de Fe(III) soluble. En effet, ces dernières doivent oxyder 50 moles de Fe(II) pour fixer 1 mole de CO2 (Silverman et Lundgren, 1959). Cette forte activité s’explique par la faible énergie libérée par l’oxydation du Fe(II) à ce pH (Ingledew 1982 ; Bird et al., 2011).

La bactérie la plus représentative de ce groupe métabolique et également la plus étudiée est Acidithiobacillus ferrooxidans. Anciennement Thiobacillus ferrooxidans, elle a été découverte dans une eau de drainage minier acide en 1950 par Colmer et al. puis caractérisée l’année suivante (Temple et Colmer, 1951) mettant en avant pour la première fois la preuve de l’oxydation biologique du Fe(II) en condition acide. Depuis l’intérêt porté au genre Acidithiobacillus pour ses attraits biotechnologiques n’a cessé de grandir, notamment pour les procédés miniers bio-assistés et la biolixiviation (Siezen et Wilson, 2009). Chimiolithoautotrophe, A. ferrooxidans fixe le carbone atmosphérique et est capable de coupler l’oxydation du Fe(II) ou des composés soufrés inorganiques réduits à la réduction de l’oxygène mais possède également un métabolisme anaérobie lui permettant de coupler l’oxydation de l’hydrogène ou du soufre à la réduction du Fe(III) (Valdes et al., 2008 ; Osorio et al., 2013). Alors que l’oxydation du soufre a lieu dans le périplasme, l’oxydation du Fe(II) a lieu à la surface de la membrane externe (Valdés et al., 2008). L’oxydation externe du Fe(II) est une solution évitant l’oxydation abiotique du Fe(III) dans le compartiment cytoplasmique dont le pH est neutre (Bird et al., 2011). Pour ce faire, l’oxydation du Fe(II) requiert l’action du cytochrome extra-

53 Chapitre I : Introduction générale membranaire de type c2 (Cyc2) (Fig. 20) ( (Yarzábal et al., 2002 ; Valdés et al., 2008 ; Bonnefoy et Holmes 2012). La synthèse de Cyc2 est codée par l’opéron rus qui code également pour l’ensemble protéique impliqué dans le transport de l’électron vers l’oxygène (Appia-Ayme et al., 1999 ; Valdés et al., 2008 ; Yarzábal et al., 2004).

Figure 20 : Schématisation du complexe protéique impliqué dans l’oxydation du fer chez A. ferrooxidans ATCC 23270T (en bas). L’ensemble protéique impliquant les

cytochromes Cyc1 et Cyc2, la cytochrome oxydase aa3 et la rusticianine A est codé par

l’opéron rus (en haut) (d’après Herich et al., 2011)

4.5. Capacité électroactive des bactéries ferro-oxydantes

Parmi les bactéries citées ci-dessus, plusieurs ont fait l’objet d’études concernant leur capacité à produire du courant en MFC. Bien sûr, les espèces ferro-réductrices Geobacter sp. et Shewanella sp. ont été intensivement étudiées mais les bactéries ferro-oxydantes sont également capables de produire du courant. R. palustris est ainsi capable de produire un courant anodique de l’ordre de 2,7 W.m-2 en culture pure avec de l’acétate comme source de carbone (Xing et al., 2008). L. discophora SP-6 est capable de former une biocathode fournissant 126 mW.m-2 en utilisant le manganèse comme médiateur

54 Chapitre I : Introduction générale

(Rhoads et al., 2005). Les bactéries du genre Acidovorax n’ont pas été étudiées en culture pure pour la production de courant mais se retrouvent cependant sur des cathodes aérobies (Milner et al., 2016). L’espèce M. ferrooxidans PV-1 est, quant à elle, capable de croître en aérobiose uniquement en présence d’une électrode comme source d’électrons et produit des courants cathodiques de l’ordre de -0,55 A.m-2 (Summers et al., 2013). Enfin, A. ferrooxidans est l’espèce produisant les courants cathodiques les plus élevés décrits dans la littérature (ter Hejine et al., 2007 ; Carbajosa et al., 2010).

5. Les applications potentielles des PCMs

Les PCMs ont diverses applications potentielles. La première d’entre elles est d’arriver à remplacer les piles à combustible classiques, coûteuses et peu durables par un système entièrement biologique renouvelable dont la durabilité est améliorée. Un des intérêts majeurs des PCMs est de pouvoir apporter une source d’énergie dans des lieux dépourvus de source électrique. D’autre part, diverses applications parallèles à la production d’énergie ont vu le jour ces dernières années (Erable et al., 2010 ; An et Parkash, 2016 ; Santoro et al., 2017). Ces applications sont parfois propres à l’anode ou à la cathode et certaines d’entres elles sont liées à une PCM comprenant une anode et une cathode biologiques.

5.1. Alimentation électrique en zone dépourvue de réseau électrique

Divers environnements ont été explorés comme niches hébergeant des microorganismes électroactifs (cf. I.8, Tableau 3). Il en ressort que l’électroactivité est un caractère ubiquiste (Chabert et al., 2015).

55 Tableau 3 : Exemple d’échantillons naturels utilisés en PCM (modifié d’après Chabert et al., 2015). B-PCM : Benthique.

Potentiel Source de Performances Environnement Architecture Référence (V vs. SHE) carbone (A.m-2) Sédiment anaérobie de B-PCM - Acétate 0,125 Karra et al., 2013 lac Source froide abyssale B-PCM 0,3 - 0,085 Reimers et al., 2006 Lac volcanique B-PCM - Acétate 0,2 Martins et al., 2010 Sédiment anoxique de PCM (1 compartiment) 0,5 Acétate 0,2 Mathis et al., 2008 marais salant Sable de plage PCM (1 compartiment) -0,1 Acétate 0,6 Erable et al., 2009 Mangrove PCM (1 compartiment) -0,3 Acétate 10,27 Miceli et al., 2012 Biofilm marin PCM (1 compartiment) -0,1 Acétate 2,6 Erable et al., 2009 Marais salant PCM (1 compartiment) 0,1 Acétate 85 Rousseau et al., 2014 García-Muñoz et al., Rivière acide B-PCM - - 3,5 2011 Sédiment B-PCM - Cellulose 0,02 Sajana et al., 2014a d’aquaculture Sédiment B-PCM - - 0,03 Sajana et al., 2013 d’aquaculture Eau minière acide B- PCM - - 0,433 Sulonen et al., 2015 Sédiment de rivière PCM (2 compartiments) - Glucose 3,5 Kim et al., 2011 Sédiment marin PCM (2 compartiments) - Glucose 2,8 Kim et al., 2011 Sol contaminé en PCM équipé d’une 0,25 Phénol 0,18 Huang et al., 2011 hydrocarbure cathode à air Sol anaérobie PCM (1 compartiment) -0,3 Acétate 9,15 Miceli et al., 2012 Compost de jardin PCM (1 compartiment) 0,1 Acétate 9,9 Cercado et al., 2013 Sol riche en fer B-PCM -0,3 Acétate 2,33 Miceli et al., 2012 Solution Sol de rizière PCM (2 compartiments) - 0,12 Lee et al., 2003 hydroponique Sol limoneux PCM (2 compartiments) - Lactate 0,375 Futamata et al., 2013

56 Chapitre I : Introduction générale

Il apparaît qu’une très grande variété d’environnements peut conduire à la production de courant grâce à l’utilisation de PCMs et suggère donc que les EABs peuvent évoluer dans tous types d’écosystèmes. Ainsi, des sédiments provenant de lacs, de marais salants, de lacs volcaniques, fumeurs froids de la croûte océanique, mangroves, composts, sols riches en fer, etc. peuvent être utilisés pour la conception de PCMs offrant des intensités de courant très variables (tableau 3). Les études citées dans le tableau 3 ne font pas toutes l’objets d’implantation in situ à l’exception de PCM benthique (B- PCM). Toutefois la diversité des niches microbiennes permettant la génération d’électricité est encourageante quant à de possibles implantations dans une grande variété d’écosystèmes à travers le monde. L’exemple le plus notable d’utilisation de PCM en zone dépourvue de réseau électrique est celui de Tender et ses collaborateurs (2008). Les auteurs ont mis au point une PCM benthique ayant permis l’alimentation d’une bouée météorologique mesurant la température de l’air et de l’eau, la pression atmosphérique ainsi que l’humidité et assurant un transfert des données en temps réel. Le prototype était capable de fournir une puissance de 36 mW soit l’équivalent de 26 piles alcalines de type D par an.

5.2. Bioremédiation

La bioanode consommant de la matière organique, de nombreuses études ont porté sur l’utilisation des PCMs pour le traitement des eaux d’épuration, eaux de rejets industriels ou encore les eaux phréatiques. En effet, les eaux de rejet d’usine riches en matière organique sont une formidable source de microorganismes pour la production d’électricité à laquelle est couplée l’épuration organique des eaux et donc la demande chimique en oxygène (Durruty et aL, 2012 ; Kaewkannetre et al., 2011 ; Yu et al., 2012 ; Ishii et al., 2013 ; Mansoorian et al., 2013). Au delà du traitement des eaux d’épuration et de rejets, les PCMs peuvent être utilisées par exemple pour le traitement du sédiment des aquacultures permettant une diminution de la demande chimique en oxygène et de la teneur en azote de l’ordre de 80% (Sajana et al., 2013, 2014a, 2014b). De même, les PCMs implantées dans des sites contaminés en hydrocarbures contribuent à leur dégradation (Morris et Jin, 2007 ; Huang et al., 2011 ; Morris et Jin, 2012) tout en produisant du courant. Par exemple, Jain et al. (2016) montrent qu’une PCM fonctionnant avec une bioanode permet de produire environ 20 mA couplé à une

57 Chapitre I : Introduction générale diminution de 91 % de la demande chimique en oxygène et 76 % de la teneur en hydrocarbures présents dans une eau de raffinerie pétrolière.

Les biocathodes peuvent également jouer un rôle dans la bioremédiation couplée à la production de courant. En effet, lorsque l’accepteur final d’électrons est différent de l’oxygène, les biofilms cathodiques vont jouer sur l’état rédox du composé et peuvent ainsi le faire précipiter ou le transformer en une forme non toxique. Gregory et Lovley (2005) ont ainsi pu extraire 87% de l’uranium présent dans un sédiment contaminé en utilisant une biocathode polarisée. Le chrome VI qui présente également des risques environnementaux peut être réduit à l’aide d’un biofilm cathodique de S. oneidensis MR- 1 (Xafenias et al., 2013). Les éléments métalliques ne sont pas les seules cibles des biocathodes. Les éléments chimiques chlorés ont aussi été étudiés comme accepteurs finaux d’électrons (tableau 2). Le pentachlorophénol peut être minéralisé au contact d’une biocathode colonisée principalement par des Desulfobacterium aniline, Actinomycetes et Streptacidiphilus (Huang et al., 2012). La réduction de composés aromatiques chlorés récalcitrants est également possible (Guo et al., 2013 ; Liang et al., 2013). Enfin, la dénitrification d’échantillons pollués peut également être catalysée par les biocathodes (Zhang et al., 2005 ; Kondaveeti et Min, 2013 ; Zhu et al., 2013), tout comme l’ammonium (Zhang et al., 2013).

5.3. Electrosynthèse de molécules à haute valeur ajoutée

L’électrosynthèse est un procédé récent se basant sur la technologie des PCMs. Le principe repose sur la réduction électro-assistée du CO2 à la biocathode. Cependant, un tel processus requiert l’apport d’un courant électrique au lieu d’en produire. Les bactéries présentes utilisent les électrons provenant de la cathode pour réduire le dioxyde de carbone et produire des molécules à haute valeur ajoutée (Rabaey et Rozndal, 2010) (Fig. 21).

Les produits formés par électrosynthèse sont divers tels que le butyrate, l’acétate, l’éthanol, le glycérol ou encore le méthane (Roy et al., 2016 ; Bajracharya et al., 2017). Parmi les espèces bactériennes capables d’électrosynthèse, la classe des Clostridia fait l’objet d’études de plus en plus poussées de part leur capacité à utiliser une large gamme de substrats et à produire une toute aussi grande variété de métabolites (Tracy et al., 2012). Récemment, une pile utilisant une bioanode et une biocathode a permis la

58 Chapitre I : Introduction générale synthèse d’acétate avec la dominance de Methanobrevibacter dans le compartiment cathodique (Xiang et al., 2017). Du bio-hydrogène peut également être produit grâce aux

PCM. Ces dernières ont des rendements pouvant atteindre 8 à 9 moles d’H2/mole de glucose alors que la fermentation du glucose permet d’atteindre des rendements de 4 moles H2/mole de glucose (An et Parkash, 2016)

Figure 21 : Schéma d’une pile à électrosynthèse. Une générateur apporte un courant à la

cathode qui permet au biofilm présent de réduire le CO2 ou des composés organiques en molécules d’intérêt commercial (d’après Bajracharya et al., 2017)

5.4. Biosenseurs

Du fait de leur durabilité et de leur faible coût, les PCMs ont également fait l’objet d’études visant à développer ces dernières comme outils de détection de contamination. Le principe du biosenseur se base sur une variation (chute ou augmentation) du courant ou du voltage émis par la PCM en réponse à une contamination organique ou toxique (Schneider et al., 2016 ; Zhou et al., 2017 ; Jiang et al., 2018) (Fig. 22).

Par exemple, Velasquez-Orta et al., (2017) ont développé un prototype permettant de suivre l’apparition de contamination fécale dans une eau souterraine. Ainsi lors d’événement de contamination, la densité de courant augmente en lien avec un apport important de matière organique (Fig. 22). L’apparition de contamination en métaux lourds peut également être suivie. Une contamination en Hg2+ ou Pb2+ (1 mg.L-1) conduit

59 Chapitre I : Introduction générale respectivement à une diminution de 46 % et 28 % du courant enregistré dans une PCM à deux compartiments (Kim et al., 2007) (Fig. 22). De la même manière, l’apparition de Cu2+ peut être suivie (Deng et al., 2014 ; Labro et al., 2017). L’utilisation de culture pure peut également servir à la détection de contamination en métaux. A titre d’illustration, une PCM utilisant Ochrobactrum anthropi YC152 comme catalyseur permet de répondre en 45 minutes à une contamination en chrome hexavalent dont les concentrations sont de l’ordre de 0,0125 à 0.3 mg/L (Wang et al., 2016).

Figure 22 : Principe des PCMs utilisées comme biosenseurs. Les signaux électriques sont suivis à l’aide d’un potentiostat (A) permettant d’enregistrer une augmentation de courant en cas de contamination organique (B) ou une diminution en cas de contamination d’un toxique (C) (d’après Jiang et al., 2018).

5.5. Désalinisation

La désalinisation de l’eau peut être couplée à la production d’énergie et à la bioremédiation. La séparation des sels se fait par diffusion. En générant du courant, l’anode attire les anions (e.g. Cl-) et la cathode attire les cations (e.g. Na+) depuis le centre du compartiment réactionnel vers les électrodes (Cao et al., 2009). Ainsi, la désalinisation de l’eau peut se faire sans source d’énergie extérieure et peut atteindre 40

60 Chapitre I : Introduction générale

% en 24 heures d’opération quand la teneur initiale est de 10 g.L-1 de NaCl couplée à une production de 3,2 W.m-3 durant 130 jours (Meng et al., 2014). Subramani et Jacangelo (2015) rapportent que la désalinisation assistée par une PCM peut atteindre un taux de 98 % après plusieurs étapes en PCM.

5.6. Electrosynthèse de nanoparticules

Ce dernier point ne concerne pas à proprement parler les PCMs mais utilise des connaissances proches. En effet, le principe repose sur l’utilisation d’EABs catalysant l’oxydation de l’acétate mais, dans ce cas ci, l’accepteur final n’est pas l’anode mais un métal (Kalathil et al., 2013) (Fig. 23). Ainsi l’utilisation de EABs permet la synthèse de nanoparticules d’argents de taille homogène comprise entre 3 et 4 nm (Kalathil et al., 2011) ou de nanoparticules d’or positivement chargées de 5 à 20 nm (Khan et al., 2013). Cette même approche permet également de décorer des nanoparticules comme cela a été montré avec la décoration de nanoparticules d’oxyde de titane avec des nanoparticules d’or (Kalathil et al., 2012).

Figure 23 : principe général de l’utilisation d’un EAB pour la synthèse de nanoparticules (d’après Kalathil et al., 2013)

Il est toutefois important de remarquer que la notion d’EAB est floue dans le cadre de cette application. En effet, les auteurs utilisent le terme d’EAB en partant du principe

61 Chapitre I : Introduction générale que l’enrichissement à partir d’acétate favorise la croissance d’EABs sur l’anode. Cependant, il n’est nullement question ici de travail en PCM.

6. Conclusion

La PCM est une biotechnologie basée sur la biomasse microbienne. Cette dernière repose principalement sur l’action d’un biofilm d’EABs enrichi à l’anode permettant de catalyser l’oxydation de la matière organique, de laquelle le biofilm tire les électrons pour les transférer à l’anode. La diversité microbienne catalysant cette réaction est bien connue et variée. Deux bactéries modèles, S. oneidensis et G. sulfurreducens, ont fait l’objet de nombreuses études ayant permis de mettre en lumière les divers mécanismes de transfert extracellulaire d’électrons mis en jeu à l’anode. De nombreux travaux mêlant ingénierie et microbiologie ont permi aux PCMs fonctionnant avec une bioanode d’atteindre des puissances records. Cependant les performances sont maintenant limitées par la cathode. De plus en plus d’études se tournent maintenant vers l’étude de la biocathode bien que les connaissances concernant ces dernières soient encore peu avancées. Dans le fonctionnement d’une PCM, les bactéries liées au cycle du fer jouent un rôle clé. En effet, les bioanodes fonctionnent efficacement grâce à des bactéries sulfo- réductrices mais également ferro-réductrices. De fait, les bactéries ferro-oxydantes peuvent être prédites comme essentielles dans la formation d’une biocathode. Bien que la génération d’électricité soit à l’heure actuelle difficilement envisageable sans un parfait couplage bioanode-biocathode, de nombreuses applications parallèles ont vu le jour. La PCM se place en tant que système auto-entretenu et durable pour des applications environnementales. Les biocathode bénéficient également d’applications telle que la synthèse de molécules à haute valeur ajoutée à partir du CO2. Ainsi, l’étude et l’optimisation de biocathode se révèlent être un réel enjeu dans la technologie des PCMs.

7. Objectifs de travail

Le travail présenté dans cette thèse s’inscrit dans le cadre du projet ANR Bioelec. Ce projet pluridisciplinaire vise à améliorer les performances actuelles des PCMs en utilisant diverses approches. L’une d’elles consiste à lever l’un des verrous majeurs de la technologie des PCMs, à savoir la cathode. En effet, les performances obtenues aux

62 Chapitre I : Introduction générale anodes biologiques sont de plus en plus importantes mais commencent à plafonner. L’ingénierie représente l’une des approches possibles pour optimiser la PCM. Une seconde approche consiste à développer des biocathodes efficaces permettant de pallier à la courte durée de vie des cathodes abiotiques.

Ainsi, les travaux effectués au cours de cette thèse portent sur la biocathode. Cette dernière est encore peu décrite concernant i) la diversité bactérienne catalysant la réduction cathodique et ii) les mécanismes de transfert extracellulaire d’électrons impliqués. De ce fait, les recherches effectuées au cours de ces trois dernières années sont allées dans ce sens.

Grâce à des approches utilisant des cultures pures ou des échantillons plus complexes, nous nous sommes intéressés à la diversité bactérienne permettant la formation d’une biocathode durable. Dans un même temps, nos recherches ont également porté sur la compréhension des mécanismes de transfert d’électrons permettant la réduction de l’oxygène grâce à des souches sauvages et des constructions génétiques. Nous nous sommes particulièrement concentrés sur le rôle du fer dans la catalyse des réactions cathodiques.

En parallèle de ces objectifs, nous avons également mené des travaux sur des applications potentielles des biocathodes et des PCMs plus généralement.

8. Revue biliographique

La revue bibliographique intitulé « All ecosystems potentially host electrogenic bacteria » traite de divers écosystèmes hébergeant des bactéries électroactives et les intensités de courant, essentiellement anodiques, produites par de tels échantillons. La revue s’intéresse également à la diversité des microorganismes électroactifs et les méthodes de caractérisation des biofilms électroactifs.

Bioelectrochemistry 106 (2015) 88–96

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Bioelectrochemistry

j o u r n a l h o m e p a g e : w w w . e l s e v i e r . c o m / l o c a t e / b i o e l e c h e m

All ecosystems potentially host electrogenic bacteria

Nicolas Chabert, Oulfat Amin Ali, Wafa Achouak a CEA, DSV, IBEB, Lab of Microbial Ecology of the Rhizosphere & Extreme Environment (LEMiRE), 13108 Saint Paul-Lez-Durance, France b CNRS, BVME UMR 7265, ECCOREV FR 3098, 13108 Saint Paul-Lez-Durance, France c Aix Marseille Université, 13284 Marseille Cedex 07, France

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: Instead of requiring metal catalysts, MFCs utilize bacteria that oxidize organic matter and either transfer electrons to the Received 29 January 2015 anode or take electrons from the cathode. These devices are thus based on a wide microbial diversity that can convert a large Received in revised form 9 July 2015 array of organic matter components into sustainable and renewable energy. A wide variety of explored environments were Accepted 9 July 2015 Available online found to host electrogenic bacteria, including extreme environments. In the present review, we describe how different 26 July 2015 ecosystems host electrogenic bacteria, as well as the physicochemical, electro-chemical and biological parameters that control the currents from MFCs. We also report how using new molec-ular techniques allowed characterization of electrochemical Keywords: Biofilm composition biofilms and identification of potentially new electrogenic species. Finally we discuss these findings in the context of future Exocellular electron transfer research directions. Microbial fuel cells © 2015 Elsevier B.V. All rights reserved. Inocula source Molecular tools Imagery

Contents

1. Introduction ...... 88 2. Electrogenic microorganisms ...... 89 3. Do all ecosystems host electrogenic bacteria? ...... 89 3.1. Natural environments ...... 89 3.2. Anthropogenic environments ...... 90 3.3. Extreme environments ...... 90 4. Biological and electrochemical characteristics of EAB ...... 91 4.1. Structure and function of electrogenic communities of EABs ...... 92 4.1.1. Molecular and imagery tools ...... 92 4.1.2. Electrochemical parameters ...... 92 4.2. Electroactive biofilm composition ...... 92 5. Extracellular electron transfer pathways ...... 93 6. Future prospects ...... 94 Acknowledgments ...... 94 References...... 94

1. Introduction

In recent years, industrialization and the global economic system have led to the overexploitation of fossil fuels, especially oil and gas. In-deed, shortage of these latter products has resulted in a global energy crisis warning [1–3]. Corresponding author at: CEA, DSV, IBEB, Lab of Microbial Ecology of the Rhizosphere & Extreme Environment (LEMiRE), 13108 Saint Paul-Lez-Durance, France. Alternative green energy has attracted great atten-tion for new means of E-mail address: [email protected] (W. Achouak). electricity production, including by

N. Chabert et al. / Bioelectrochemistry 106 (2015) 88–96 89 microorganisms [4,5]. One promising yet challenging emerging technol-ogy The comparison of electroactivity between pure cultures and microbial uses microbial fuel cells (MFCs), in which microorganisms generate consortia in wastewater reveals a greater power density with higher columbic electricity by exchanging electrons with electrodes while oxidizing or-ganic efficiency for the consortia [15,33]. or inorganic matter [6,7]. This principle makes use of the fact that bacterial exocellular electron transfer plays an important role in an-aerobic microbial 3. Do all ecosystems host electrogenic bacteria? communities that degrade organic matter and those that use insoluble electron acceptors (such as iron- and manganese-oxide) for growth [8,9]. The presence of diverse EAB raises the question of which environ-ments are the most electrogenic. Although most electrical current stud-ies have focused The ability of microorganisms to produce electricity was demon-strated at on effluent from diverse wastewater treatment facilities, EAB appear to be least one hundred years ago by immersing a platinum elec-trode in a widely distributed as suggested by studies of different environmental types suspension of Escherichia coli and Saccharomyces [10]. However, a greater (Table. 1) [34]. Many soil and aquatic environments have been tested over the interest in this phenomenon only arrived several de-cades later, when years, complicating the ability to address an exhaustive list. Furthermore, anaerobic bacteria such as Clostridium butyricum were used to enhance none of these studied envi-ronments have been tested under the same MFC current density and power output [11]. During this same period, the first fuel conditions. Instead, many studies have focused on optimization and progress cell was conceived with two chambers (one anodic and one cathodic) towards im-proving MFCs, even if accurate comparisons of natural inoculums separated by an ion exchange membrane [12]. Since then, the design of MFCs and their electrical performances are lacking. Therefore, even if these ad- −3 has evolved, and electrical current output now reaches 2.87 kW m [13]. vances are highly useful to future MFC commercialization, a basic un- While most prokaryotes can po-tentially generate electricity [1,14,15], only a derstanding of MFC biology and electrochemistry is still necessary. few bacteria have been highlighted to form electrochemically active biofilm (EAB) to date. EAB is a generic term used to designate biofilm that are able to transfer electrons towards a final electron acceptor (such as electrodes in a 3.1. Natural environments MFC system), thus acting as the catalyst for redox reactions. Different pathways are currently known to be involved in this electron transfer. These Various aquatic natural environments have been investigated (Table. 1), and species will be detailed later in this review. one river with phototrophic biofilm has been reported to have a current of 3.7 −2 A·m [35]. River offers further possibilities such as sediment that could −2 Although biofilm construction is rapid and highly durable, EAB di-versity can perform from about 0.2 to 0.3 A·m [36–38]. Environments that assure the be highly variable depending on culture conditions (which can favor certain transition between continental and marine environments can lead to power bacterial populations), which can therefore modulate electricity production. production. Mangrove sed-iment is naturally rich in organic matter due to For example, Logan and Regan [16] reported that power production could tides and rich forest litter [39], resulting in a potential for energy output as −2 −2 −2 vary from b1 mW·m to N1500 mW·m on the basis of different MFC high as 12 A·m [34, 40]. Beach sediments that play the same role as architectures that use ox-ygen as the final electron acceptor. This huge mangroves produce a current density with values ranging from 0.8 to 8.9 −2 variability could be ex-plained by the different existing MFC types that A·m [26,34]. Even tidal mud has a slight potential to produce current [41]. produce more or less current, since the design of the MFC system affects Sampling direct microbial biofilm from salt marsh [34,42] or marine sediment power generation [17]. −2 [26] provides current densities from approximately 4.45 to 85 and 2 A·m , Different environments have been explored in an attempt to under-stand the respectively. Two types of MFC can be employed in marine and salt marsh diversity of microorganisms involved in this exocellular elec-tron transfer. sediment: a traditional MFC, in which sediment is sam-pled and serves as the Many different types of environments harbor EAB, including anaerobic inoculum for a reactor; and a benthic MFC (BMFC), in which two electrodes sludge from treatment plants, anaerobic sediment, and even soil. Although it are placed in situ (the anode is placed is supposed that bacteria may belong to the rare biosphere, they may dominate under the sediment and the cathode is floating). The BMFC design could be when electrode are in contact with sample [18,19]. Since one of the most applied to any type of environment, but it is more often used in ma-rine promising applications of MFC could be the treatment of wastewater, many environments, since they could be an energy source for different autonomous efforts have been targeted at wastewater treatment plants, paper mill effluents, oceanographic or environmental sensors [43–45]. etc. [20–24]. Microbial fuel cells have been extensively exploited in aquatic envi-ronments The focus of this review is on environments that host EAB, the prin-ciple such as marine sediments or wastewater [27,31]. Terrestrial environments communities of these ecosystems, and their electrogenic potential. have been comparatively underexploited despite they hold a high diversity of Ecosystems that host EAB and the optimal conditions for growth and electron microorganisms and a wide variety of organic and/or inorganic matters transfer will be described in detail. widespread [27,34,46]. Soils that support plant growth (Table. 1) are naturally rich in nutri-ents (e.g. 2. Electrogenic microorganisms carbohydrates, amino acids, aliphatic acids, enzymes, vita-mins…) and should correspond to an electrogenic environment [46]. Indeed, plants produce Many diverse electroactive microorganisms have been studied to date in an organic acids such as acetate that are known to induce a high power density effort to improve the energy production of MFCs. An invento-ry of and enrich EAB [47,48]. For example, one enrichment cultures as well as pure strains known to be involved in MFCs previous study demonstrated the potential of rice paddy fields to pro-duce a −2 was made until late 2008 [15,25]. current density reaching approximately 0.1 A·m [49]. Soils with plants are Different EAB communities can interact as consortia and generate energy. not the only terrestrial ecosystem that can host EAB; rich soils such as This is generally what characterizes natural ecosystems such as wastewater, compost can also offer a promising host environment for electricity river, rice field soils or compost [22,26–31]. Identifica-tion of single production. Compared to ordinary soil, compost is more enriched in organic electrochemically active species in these natural environ-ments has been matter; this could increase bacterial activity and thus the potential to produce performed with type strains that correspond to predominant species in wild electricity using a MFC system. Composts can display current production up EA biofilms. The few strains of bacteria di-rectly isolated from EAB have to four times greater than natural soil displayed a higher electrochemical perfor-mance than their type strains [29]. This confirms that composition and richness of organic matter greatly [25,27]. For example, Ochrobactrum anthropi YZ-1, a strain isolated from affect MFC potential. Garden compost is another good source EAB originally obtained in a prima-ry clarifier overflow from a wastewater of organic matter and EAB for MFC, as it displays a current production (1.5 −2 −2 −2 treatment plant, produced 89 mW·m . This value is two-fold higher than its A·m ) on the same order as industrial composts (1.1 A·m ) [29,50]. Anaerobic soils produce a good electrical current density type strain [32].

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Table 1 Electrochemical activity of various environments.

Environments MFC Natural or Poised Carbon sources Electrode Performances References −2 architecture enriched potential materials (A·m ) samples (V)

Aquatic a Anaerobic lake sediment BMFC Natural – Acetate Carbon fiber brush 0.125 [74] Deep-ocean coldseep BMFC Natural 0.3 – Graphite rod 0.085 [71] Volcanic lake BMFC Natural – Acetate Carbon paper 0.2 [70] Anoxic marine marsh sediment Single chamber Enriched 0.5 Acetate Graphite 0.2 [69] b MFC Beach sand Single chamber Natural −0.1 Acetate Graphite plate 0.6 [26] MFC Mangrove Single chamber Enriched −0.3 Acetate Cylindrical graphite 10.27 [34] MFC rod Natural marine biofilm Single chamber Natural −0.1 Acetate Graphite plate 2.6 [26] MFC Saline microbial mat Single chamber Enriched −0.3 Acetate Cylindrical graphite 4.45 [34] MFC rod Salt marsh Single chamber Natural 0.1 Acetate Carbon felt 85 [42] MFC c Acidic river SMFC Natural – – Graphite 3.5 [28] Aquaculture pond sediment SMFC Natural – Cellulose Graphite plate 0.02 [60] Freshwater aquaculture sediment SMFC Natural – – Graphite plate 0.03 [59] Acid hydrometallurgical mining process Two chamber MFC Enriched – – Graphite plate 0.433 [67] waters River sediment Two chamber Natural – Glucose Carbon paper 3.5 [36] MFC Sea sediment Two chamber Natural – Glucose Carbon paper 2.8 [36] MFC

Terrestrial Hydrocarbon contaminated soils Air cathode MFC Natural 0.25 Phenol Carbon felt 0.18 [22] Anaerobic soils Single chamber Enriched −0.3 Acetate Cylindrical graphite 9.15 [34] MFC rod Garden compost leachate Single chamber Natural 0.1 Acetate Carbon felt 9.9 [27] MFC Iron rich soils Single chamber Enriched −0.3 Acetate Cylindrical graphite 2.33 [34] MFC rod Living (rice) plant (rhizodeposit) SMFC Natural – Hogland's hydroponics Graphite granules 0.12 [46] solution Silt-rich soil Two chamber Enriched – Lactate Graphite felt 0.375 [75] MFC

a Benthic microbial fuel cell. b Microbial fuel cell. c Sediment microbial fuel cell.

−2 ranging from 8.6 to 9.2 A·m [20]. Less typical soils also offer promise for electricity efficiency and bioremediation using MFC. With hydrocarbon −2 MFC technologies. For example, iron-rich soil induces a current den-sity contamination, MFC produce up to 0.6 A·m [62] while MFC use for ni- −2 −2 around 2.3 A·m [34]. trate removal could reach up to 1 A·m [63]. As suggested by Dunaj et al. [64], MFC performance and EAB diversi-ty 3.2. Anthropogenic environments depend strongly on soil composition and the availability of organic matter. MFCs have been shown as efficient technology combining elec-tricity Since effluents are organically rich and could potentially host EAB, many generation and treatment of recalcitrant compounds such as pe-troleum studies have been conducted to develop devices in which waste-water and hydrocarbons [22,62,65]. For instance, a MFC inserted into a waterlogged organic wastes are converted into energy by living microor-ganisms (Table. soil contaminated with hydrocarbons (Table. 1) by simul-taneous 1). The Kraft pulp mill effluent can reach a current density of about 5.1 biodegradation of 27.6% hydrocarbon, 90% phenol removal and generation of −2 A·m [51], while the highest current recorded using wastewater was ranging −2 29.45 mW m power densities [22]. −2 −2 from 200 to 300 A·m [52]. Since MFC technology has a great potential to By contrast, organic contaminated soils are limited to about 0.1 A·m decrease organic content and si-multaneously produce energy, diverse [22,66], although they perform extremely well in remedia-tion with the MFC industrial wastewater sources have been investigated including potato system. wastewater [53], municipal wastewater [54,55], cassava mill wastewater [56], and even domestic wastewater treatment plants [57]. Current between 3.3. Extreme environments −2 different wastewa-ter effluents can range from 0.01 A·m for brewery and −2 bakery waste-water up to more than 0.1 A·m for paper wastewater [58]. As Some extreme environments can reduce the limitations of MFC, such as the in situ MFC offers a great possibility to enhance bioremediation; other organi- pH gradient between the anode and cathode compartments (Table. 1). For −2 cally rich environments have been investigated. The better example is example, acidic sediments display a current production reaching 3.5 A·m aquaculture pond (Table 1), where although, the current production is that correlates with the organic content of the sed-iment and its bacterial −2 relatively low (0.02–0.03 A·m ), average chemical oxygen demand (COD) diversity [28]. Other acidic environment have been found to perform and total nitrogen (TN) removal efficiencies of 80.6 ± 0.3% and 83.0 ± 0.01% electricity production such as acid hydrometal-lurgical mining process waters −2 were obtained [59–61]. Nonetheless, groundwaters are also man- or even aerobic sludge with associated performance about 0.4 and 0.2 A·m contaminated environments that had been tested for respectively [67,68]. Thermo-philic bacteria showing a growth optimal temperature at 60 °C have

N. Chabert et al. / Bioelectrochemistry 106 (2015) 88–96 91 also potential for electricity production with Thermincola carboxydophila that Although, numerous environments haven't been explored yet, none-theless, −2 reach a performance from 0.209 to 0.254 A·m [69]. Hydrother-mal the diversity of ecosystems investigated to date suggests the im-portant ecosystems can also be electroactive, including the Furnas Lake eco-system, distribution of EABs in probably all kind of ecosystems. −2 which displays a low current density around 0.2 A·m [70]. Deep oceans are also a source of EAB. Indeed, Monterey Canyon, com-posed by cold seeps, −2 4. Biological and electrochemical characteristics of EAB had shown electrical performance of 0.1 A·m using BMFC [71]. This performance is supported by sulfur and iron cycle with Deltaproteobacteria such as Desulfuromonas, Desulfocapsa and Syntrophus. Other deep-sea vents Electrical current studies have essentially focused on biofilms associ-ated with could potentially host EAB. Even if the natural environment is not directly the anode, since one of the primary hindrances to current pro-duction is the tested using BMFC for exam-ple, the submarine volcano, lacated at Loihi cathode, where a slow oxygen reduction rate occurs. Here, a cathodic biofilm Seamount, host the species Mariprofondus ferrooxydans belonging to could increase the kinetics. The fact that the diversity of microorganisms −2 Zetaproteobacteria [72] that is able to produce about 0.5 A·m [73]. involved in current production depends on available carbon sources and the materials employed [76] complicates the com-parison of electricity output There is a broad diversity of potential electrogenic environments to exploit. between different systems. Furthermore, it remains useful to include this Nevertheless, electrical current production depends on the characteristics of characterization in comparative studies as microbial ecology is sensitive to a the sample, especially its organic matter content. The sample origin used for wide panel of parameters (Scheme 1) such as pH [77–79], temperature the MFC system is another important factor, since bacterial diversity is [77,80–83], substrate [78,63,84,85] or in the case of MFC, the nature of variable and can thus affect the production of energy. Indeed, highly electrode material and MFC architec-ture or design [78,83,86–88] and poised conductive environments such as sea ecosys-tems are generally able to potential [17,89–92]. However, a study using similar conditions could permit produce greater current density than other types of ecosystems. the comparison of differ-ent ecosystems and their associated communities. As shown above, EABs seem to be widespread and colonize a huge en- Miceli et al. [34] re-ported that the microbial community differs according to vironmental diversity. Actually, these prokaryotes can be found almost the inoculum used, thus indicating that EAB differ depending on various everywhere, like in natural environments (e.g. river, sea, compost) as well as sample location parameters. in extreme areas (e.g. acidic ecosytems, deep sea vents). However, more studies are required to highlight EAB diversity. Indeed, there is evi-dence that One interesting approach to optimize current output would be to mature EAB extremophile bacteria, such as A. ferrooxidans, M. ferrooxidans or T. through successive enrichments of the dominant EAB community, resulting carboxtdophila are involved in current production. Thus, extreme en- in a higher current output [93]. Finally, it ap-pears that whichever community vironments harboring similar microorganisms seem to be an interesting area is involved in power generation depends on a wide range of factors, to explore (e.g. desert soils, tundra, Arctic water). particularly sampling location [34,93].

Scheme 1. A schematic of microbial fuel cell. In blue characters are indicated the main reaction occurring within MFC and producing electricity. Microbial electricity generation in these systems is dependent on microbial inoculum source, the biofilm community composition, their spatial organization within the biofilm, the nature of electron donors, the structure and composition of electrodes materials, the imposed potential…In black characters are indicated electrochemical and microbiological analyses that can be performed. CA, chronoamperometry; CV, cyclic voltammetry; EIS, electrochemical impedance spectroscopy; FISH, fluorescent in situ hybridization; SEM, scanning electro microscopy; LSCM, laser scan-ning confocal microscopy; NGS, new generation sequencing. In gray characters are indicated parameters that may be modulated to improve electrical performance.

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4.1. Structure and function of electrogenic communities of EABs 4.1.2. Electrochemical parameters Biofilm formation and power output are directly affected by electro-chemical 4.1.1. Molecular and imagery tools parameters. First, the type of circuit used can alter the micro-bial community Presuming that bacteria within electroactive biofilms play direct or indirect structure. In an open circuit, bacterial diversity is primarily influenced by the functional roles in the current generation, their identification is required, as anode materials [30], whereas in a closed-circuit configuration, EAB growth well as that of the inoculum to determine the ability of electrodes to select is induced by power generation [17]. In one experiment, microbial anodes certain bacterial populations from the reservoir. Using new molecular formed from compost leachate on carbon cloth electrodes were kept in an techniques, scientists are discovering new electro-genic bacteria. The open circuit, and then the an-odes were polarized at −0.2 V/SCE. By delaying −2 structure of EABs may be determined by using fin-gerprinting techniques like the polarization, cur-rent production reached 9.4 A·m after only 3–9 days denaturing gradient gel electrophoresis fingerprinting (DGGE) [36,68,94,95], of polarization, whereas the anodes that were polarized from the begin-ning −2 terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) [96] or single attained 6–8 A·m within 36 days [31]. The authors attributed these strand conformation poly-morphism (SSCP) [42]. Fingerprinting is a useful differences to the biofilm architecture, in which a thinner and more technique that can allow to quickly obtain an overview of the diversity within heterogeneous biofilm delayed polarization as compared to the thick and and between samples, but does not allow identification of rare biosphere and homogeneous biofilm resulting in full polarization. non-dominant organisms. For this technique, identification must be performed by sequencing after DGGE analysis and band-cutting. In the case of There is no systematic rule to determine whether the power output will be DGGE technique, identification must be performed by sequenc-ing after better under an open- or closed-circuit operation, based on the inoculum DGGE analysis and band-cutting. The ribosomal RNA sequenc-ing by high source and the electrode material. Furthermore, in a closed-circuit, external throughput metagenomic approach using new generation sequencing (NGS) resistance affects both the power output and biofilm growth. Thus, power technics is a powerful new tool that allows microbi-ologists to improve the output increases as external resistance decreases, due to a decrease in the accuracy of biofilm diversity identification [97–101] and to construct bacterial internal resistance within the biofilm [119]. However, a very low external phylogenies (Scheme 1). The func-tional diversity might be performed by resistance promotes better biofilm growth and thus reduces electron transfer targeting a specific functional group such as denitrifying bacteria [102]. The with the anode. The resis-tance within a MFC system is also linked to the 16S rRNA phylogenetic in-formation might be used to set up growth space between the elec-trodes. A large space between the anode and the conditions for bacterial isola-tion from EABs by adapting growth conditions cathode yields a large resistance within the system; conversely, decreasing of the close related known species. Furthermore, using phylogenetic this space lowers the resistance and increases the power output [82]. The information to con-struct highly specific ribosomal RNA probes as a means of anode potential also affects power output. Biofilms grow rapidly at low anode identifying and tracking specific microorganisms within electroactive biofilms potentials, with a large abundance of EAB such as Geobacter sulfureducens; by fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize targeted bacteria in con-trast, biofilms are more diverse and produce less electricity at higher distribution. po-tentials [52]. Electron transfer through the extracellular matrix towards the anode is dependent on the electron concentration on the anode, which may also directly affect EAB physiology. Characterization of biofilm architecture may be imaged by different microscopic technics (Scheme 1), such as laser scanning confocal microscopy (LSCM) mainly used for complex EABs by adding a green fluo- 4.2. Electroactive biofilm composition rescent nucleic acid stain to stain Gram-positive and Gram-negative bacteria, or scanning electron microscopy (SEM), transmission electron microscopy Aquatic environments host a wide microbial diversity and are thus a potential (TEM) or atomic force microscopy (AFM) (Scheme 1). LSCM coupled to reservoir for EAB. Geobacter sp. and Shewanella sp. are gener-ally found, FISH technic allows to visualize the distribution of targeted populations by although species from Proteobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi and using specific probes in a three dimensional structure [103–106]. Raman Cyanobacteria are also present [70,120]. Proteobacteria members typically microscopy could also be used as a noninvasive ap-proach for in situ dominate within biofilms. Among this group, Geobacter sp. is the most observation [107]. Scanning electron microscopy with energy dispersive X- dominant and frequently identified EAB. In some cases where Geobacter sp. ray spectroscopy (SEM/EDX) is nice surface analysis technique providing is absent from biofilms it can be re-placed by other iron- and sulfate-reducing information about chemical elements present into the biofilm structure and on bacteria [111]. In raw paper mill effluent, Geobacter is not found, whereas its surface. This approach re-quires, nonetheless a prerequisite sample Desulfuromonas is the pre-dominant species [122]. Two acidophilic species treatment [108–111]. Com-paratively, AFM, doesn't demand any preliminary from acidic sediments, Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidiphilum spp., preparation of the biofilm to be observed. This advanced method shows have been reported to predominate within biofilms on the anode [28]. adhesion force of cells with the surface they colonize. Moreover, its high Wastewaters have been extensively studied, and there is strong evidence that resolution en-abling observation at micrometric scales [112] could be bacteria in-volved as sulfate-reducing bacteria in the sulfur cycle can play an exploited for microbial fuel cell, for providing interesting information on impor-tant role in wastewater treatment using MFC technology [54,57,123, electron transfer mode. TEM, a well known microscopic technic, is mainly 124]. used to characterize electrode surface material in MFC [113–116] or bacterial structure such as pilli [117]. Marine biofilm diversity has also been investigated as a source of EAB, since the conductive property of marine environments suggests the potential for Other technics are used to characterize biofilms at physiological level as current output. Sediment MFCs are essentially exploited in this case. shown in Scheme 1, by profiling gene expression by transcriptomic approach Sampling biofilms directly from seawater yields a large diversity of species [117,118] or identifying proteins by proteo-mics or by identifying all mainly dominated by Bacteroidetes, Halomonas and Marinobacterium; this produced metabolites by the EAB by metabo-lomics analysis. diversity offers a higher power production than can be obtained from sediments sampled nearby, which are essentially composed of Using these technics to study bacterial physiology of electrochemi-cally Mesoflavibacter [26]. In salt marshes, the composition of microbial active biofilms made by single species or a mixture of species has exciting communities associated with the anode is dominated by Marinobacter and potential in the comprehension of MFC functioning and in the improvement Desulfuromonas [42]. These authors noted that the bioanode performance was −1 of current production. These technics should improve our understanding of decreased at the highest sa-linity (60 g·L ), as well as the proportion of bacterial dynamics within MFCs and show that under an imposed potential Desulfuromonas spp. rela-tive to Marinobacter spp., suggesting that electron certain communities are mostly enriched while others disappear and certain transfer to the anode is mainly performed by Desulfuromonas. Although the functions might be more expressed. same inoculum is

N. Chabert et al. / Bioelectrochemistry 106 (2015) 88–96 93 used, the physico-chemical parameters may favor different bacterial used, the physico-chemical parameters may favor different bacterial populations and/or alter their activity. Deltaproteobacteria dominate in high- populations and/or alter their activity. Deltaproteobacteria dominate in high- −2 −2 salt content mangrove sediments, with a current output of 4.3 A·m . By salt content mangrove sediments, with a current output of 4.3 A·m . By contrast, a greater diversity of EAB that includes Gammaproteobacteria, contrast, a greater diversity of EAB that includes Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria and Clostridia is observed in low-salt content mangrove Alphaproteobacteria and Clostridia is observed in low-salt content mangrove −2 −2 sediments, producing 10.77 A·m . These findings suggest the occurrence of sediments, producing 10.77 A·m . These findings suggest the occurrence of interactions like syntrophy, which could favor current production [34]. interactions like syntrophy, which could favor current production [34].

Terrestrial ecosystems produce current when electrochemical sys-tems are Aerobic bacteria that catalyze the reduction of oxygen at the cath-odes can applied. During MFC operation, different communities are enriched form a biocathode. The inoculum can be derived from different sources depending on what type of soil is used. Generally, Proteobacteria dominate on including bacteria present in the anode inoculum within a membrane-less the anode biofilm, particularly the Deltaproteobacteria, represented by single chamber MFC, from the air, and even from water. Mono- or Geobacter spp. [27,54,55,64]. There is evidence from hydrocarbon-polluted multispecies biofilms can also be constructed at the cathode. soil that some Betaproteobacteria are involved in both current output and hydrocar-bon remediation [66]. Biofilms at the cathode are less studied than those formed at the anode, even though the same trend is observed. Indeed, communities associated with the When Geobacter spp. are absent or in low abundance, Clostridia ap-pear to electrode will evolve depending on electrochemical sets such as circuit type dominate on the anode biofilm [34,64,125]. Since a large part of Clostridia [17] and electrode material [35] or environmen-tal sets [129]. A limited enrichment appears to be related to Clostridium [125], the ni-trogen cycle number of bacterial populations may be specif-ically enriched on the cathode (and N2-fixing bacteria) could play a key role in anaerobic current production. [130], although the opposite trend has also been reported [131]. This Therefore, it is possible that N2-fixing bacteria could operate alone by difference can be explained by the inocu-lum source, the substrate, and even oxidizing the substrate through N2-fixation; alterna-tively, they could act in the cathode material. The main con-cern with these studies is their lack of syntrophy by fermenting the substrates. replicates and reproducibility. Biocathodes are mainly colonized by aerobic Plant roots, such as those in rice paddy fields, host an important diversity of bacteria, which catalyze oxygen reduction. High-throughput sequencing bacteria involved in electrical performance. Deltaproteobacteria and techniques have dem-onstrated that Proteobacteria (including the three classes Clostridia are reported to dominate when agricultural soil is used in MFCs Alpha-, Beta- and Gammaproteobacteria) and Bacteroidetes dominate on ca- and fed with glucose [64]. When electrodes are intro-duced in rice paddy thodic biofilms [17,35,128–131]. Other studies have reported the en-richment fields, a wide diversity of Deltaproteobacteria (Geobacter spp., Myxococcus, of Rhodobacter and Hydrogenophaga [17], and the dominance of Deferrisoma, and Desulfobulbus) and Alphaproteobacteria (Rhizobiales) Desulfobulbus, Comamonas and Desulfovibrio [129]. Interestingly, the latter dominate with the presence of Archaea from the Crenarchaeota group study reported that Desulfobulbus and Desulfovibrio were also enriched [30,126]. Here again, there is strong evidence that iron-, nitrogen- and sulfate- within the anodic biofilm, suggesting that sulfate-reducing bacteria can play a dependent bacteria play a key role in the anode-associated community. role in both the anode and cathode compartments. Bacteria such as Nitrospira, Acidobacteria such as Geothrix can also be enriched [49]. When rice paddy Nitrobacter or Nitrosomonas could also be found in denitrifying biocathode field soil is supplemented with cellulose, the community is dominated by rod- [132,133]. shaped cells affiliated with Rhizobiales and possessing filamentous appendages [126].

Aquatic environments host a wide microbial diversity and are thus a potential 5. Extracellular electron transfer pathways reservoir for EAB. Geobacter sp. and Shewanella sp. are gener-ally found, although species from Proteobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi and Monospecific EA-biofilms have been extensively investigated to de-cipher Cyanobacteria are also present [70,120]. Proteobacteria members typically their electron transfer mechanisms. The thorough examination of electron dominate within biofilms. Among this group, Geobacter sp. is the most transfer over the years has led to numerous discoveries of how dominant and frequently identified EAB. In some cases where Geobacter sp. microorganisms exchange electrons with extracellular insoluble electron is absent from biofilms it can be re-placed by other iron- and sulfate-reducing donors and acceptors [134]. Briefly, electrons can be exchanged between bacteria [121]. In raw paper mill effluent, Geobacter is not found, whereas microorganisms and electrode surfaces via three different pathways: (i) direct Desulfuromonas is the pre-dominant species [122]. Two acidophilic species electron transfer (DET), (ii) mediated electron transfer (MET), and (iii) from acidic sediments, A. ferrooxidans and Acidiphilum spp., have been indirect electron transfer (IET). reported to predominate within biofilms on the anode [28]. Wastewaters have In DET, electrons can be transferred directly to the electrode surface by cell been extensively studied, and there is strong evidence that bacteria involved membrane-bound c-type cytochromes composed of multiheme proteins as sulfate-reducing bacteria in the sulfur cycle can play an important role in [15,134,135]. DET can also occur through electrically conduc-tive pili or waste-water treatment using MFC technology [121,127,128]. “nanowires” [135,136]. These two pathways have been re-ported in pure cultures of Geobacter sulfurreducens and Shewanella oneidensis Marine biofilm diversity has also been investigated as a source of EAB, since [15,136,137]. the conductive property of marine environments suggests the potential for In MET, redox mediators are involved in electron transfer. They can be current output. Sediment MFCs are essentially exploited in this case. naturally secreted by microorganisms, or they can be artificial mole-cules Sampling biofilms directly from seawater yields a large diversity of species added to the medium [135]. Mediators are essential for microor-ganisms that mainly dominated by Bacteroidetes, Halomonas and Marinobacterium; this cannot transfer electrons, as they enable electron shuttle from cell membrane diversity offers a higher power production than can be obtained from to electrode even at larger distance [15,135,138]. For example, Shewanella sediments sampled nearby, which are essentially composed of sulfurreducens can use flavin as a natural medi-ator for its electron transport Mesoflavibacter [26]. In salt marshes, the composition of microbial [15] . communities associated with the anode is dominated by Marinobacter and The third mechanism referred by Sydow et al. [[]], is the IET. In this Desulfuromonas [42]. These authors noted that the bioanode performance was mechanism a wide range of microbial electron donors and acceptors (e.g. −1 decreased at the highest sa-linity (60 g·L ), as well as the proportion of hydrogen, formic acids) are electrochemically synthetized and uti-lized by Desulfuromonas spp. rela-tive to Marinobacter spp., suggesting that electron microorganisms. Moreover, electroactive (metabolic) sub-stances can be transfer to the anode is mainly performed by Desulfuromonas. Although the secreted by microorganisms and transfer electrons between microbes and same inoculum is electrodes [15].

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All three mechanisms detailed here have been examined in pure cul-ture. [2] J.X. Leong, W.R.W. Daud, M. Ghasemi, K.B. Liew, M. Ismail, Ion exchange membranes as separators in microbial fuel cells for bioenergy conversion: a comprehen-sive Currently, genetic tools offer the best approach to improve the review, Renew. Sustain. Energy Rev. 28 (2013) 575–587. characterization of these pathways and to optimize EAB performance. [3] A. ElMekawy, H.M. Hegab, K. Vanbroekhoven, D. Pant, Techno-productive potential of Numerous model organisms can be used for this (such as G. sulfurreducens) photosynthetic microbial fuel cells through different configurations, Renew. Sus-tain. Energy Rev. 39 (2014) 617–627. due to the availability of their complete genomic se-quences and their [4] Y. Feng, H. Lee, X. Wang, Y. Liu, Electricity Generation in Microbial Fuel Cells at Dif- efficiency in electrochemical systems. Genetic tools have been similarly ferent Temperature and Isolation of Electrogenic Bacteria, Power and Energy Engi- applied to study other microorganisms, including S. oneidensis and G. neering Conference, APPEEC, Asia-Pacific 1–5, 2009. metallireducens [139]. The continuing investigation of genetic systems will [5] G.G. Kumar, V.G. Sarathi, K.S. Nahm, Recent advances and challenges in the anode architecture and their modifications for the applications of microbial fuel cells, Biosens. offer many excellent opportunities to improve electrical current densities [15]. Bioelectron. 43 (2013) 461–475. [6] B.E. Logan, B. Hamelers, R. Rozendal, U. Schrorder, J. Keller, S. Freguia, P. Aelterman, W. Verstraete, K. Rabaey, Microbial fuel cells: methodology and technology, Envi-ron. Sci. Technol. 40 (2006) 5181–5192. 6. Future prospects [7] I. Vandecandelaere, O. Nercessian, M. Faimali, E. Segaert, A. Mollica, W. Achouak, P. De Vos, P. 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Potter, Electrical effects accompanying the decomposition of organic com-pounds, discoveries will be forthcoming. Moreover, using inoc-ula from extreme Proceedings of the Royal Society of London, Series B, Containing Papers of a Biological environments will lead to discover new electrogenic bacteria and probably Character 260–276 (1911). new modes of electron transfer to electrodes. [11] S. Suzuki, I. Karube, T. Matsunaga, S. Kuriyama, N. Suzuki, T. Shirogami, T. While it is clear that model organisms are well-suited to study de-tailed Takamura, Biochemical energy conversion using immobilized whole cells of Clos- tridium butyricum, Biochim. 62 (1980) 353–358. electrophysiological mechanisms, studies could be enhanced by the gradual [12] H. Bennetto, J. Stirling, K. Tanaka, C. Vega, Anodic reactions in microbial fuel-cells, addition of other bacterial species. Such an effort will im-prove our Biotechnol. 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Lee, Power densities and microbial communities of brewery evolutionary time, leading to the preferential accumulation of genetic variants wastewater-fed microbial fuel cells according to the initial substrates, Bioprocess that are better adapted to the MFC environment. It is possible to identify Biosyst. Eng. 38 (2014) 85–92. [25] O. Nercessian, S. Parrot, M.L. Delia, A. Bergel, W. Achouak, Harvesting electricity with genetic changes between ancestral and derived organisms on a whole-genome Geobacter bremensis isolated from compost, PLoS One 7 (2012) e34216. scale. [26] B. Erable, M.-A. Roncato, W. Achouak, A. Bergel, Sampling natural biofilms: a new route to build efficient microbial anodes, Environ. Sci. Technol. 43 (2009) 3194–3199. [27] B. Cercado, N. Byrne, M. Bertrand, D. Pocaznoi, M. Rimboud, W. Achouak, A. Bergel, Garden compost inoculum leads to microbial bioanodes with potential-indepen-dent Acknowledgments characteristics, Bioresour. Technol. 134 (2013) 276–284. [28] J. 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Chapitre II

Résultats préliminaires : criblage de souches et consortia hétérotrophes.

Chapitre II : Résultats préliminaires

1. Contexte et objectif(s)

Beaucoup d’études se sont portées sur les bactéries capables de catalyser les réactions anodiques via l’oxydation de la matière organique. En revanche, l’utilisation d’une bioanode seule ne permet pas de s’affranchir de catalyseurs coûteux tel que le platine requis pour la réduction de l’oxygène ayant lieu à la cathode. Or pour que la technologie des PCMs devienne rentable, il devient primordial de trouver des microorganismes capables de palier à l’utilisation de tel catalyseur et de rendre la technologie plus durable pour l’environnement.

Des bactéries modèles telles que Geobacter sulfurreducens et Shewanella oneidensis ont pu être identifiées comme étant électroactives et ont permis d’approfondir les études sur les transferts d’électrons ayant lieu à l’anode. A l’heure actuelle, nous ne disposons pas de bactérie modèle pour l’étude des mécanismes de transfert d’électrons au niveau de la cathode. De plus, la réduction de l’oxygène au niveau de la cathode est le verrou majeur à lever pour l’optimisation de la production du courant par les MFC. La plupart des anodes fonctionnant à des pH proches de la neutralité, il est nécessaire de pouvoir en faire autant à la cathode pour que les deux puissent être compatibles. Or la réduction de l’oxygène n’est pas favorisée à pH neutre. De plus, il existe peu de bactéries capables d’oxyder un élément inorganique à pH neutre en condition aérobie stricte. Le défi de trouver une espèce bactérienne remplissant tous ces critères représente donc un véritable challenge.

De précédentes études au laboratoire se sont penchées sur diverses espèces bactériennes potentiellement capables de remplir le rôle de catalyseur cathodique (Fig. 1) mais aucune d’elles ne s’est avérée réellement efficace, avec des courants proches de - 0,1 A.m-2 pour Pantoea agglomerans NO30 et -0,01 A.m-2 pour Rhizobium YAS34. D’après le travail de Cournet et al., 2010 et les résultats obtenus au LEMiRE, une souche de Micrococcus luteus s’est révélée performante en atteignant -1 A.m-2 mais ces résultats n’ont pu être reproduits ultérieurement.

Les travaux présentés dans ce chapitre présentent un criblage réalisé sur 59 souches et consortia isolés du sable du Sahara. L’objectif était d’identifier une bactérie capable de catalyser la réduction cathodique de l’oxygène afin de l’étudier pour déceler les mécanismes de transfert d’électrons permettant d’assurer cette catalyse.

77 Chapitre II : Résultats préliminaires

Figure 1 : Chronoampérometrie (Ewe = -0,2 V vs. Ref ; 25°C) de différentes souches utilisées pour la formation de biocathodes avec A) NO30, B) YAS34 et C) M. luteus. (Données de Marie Bertrand et Wafa Achouak ; non publiées)

78 Chapitre II : Résultats préliminaires

2. Principaux résultats

Les principaux résultats présentés dans ce chapitre sont les suivants :

● L’utilisation de bactéries hétérotrophes pour la conception de biocathodes réduisant l’oxygène ne s’avère pas efficace. ● Les efforts d’isolement à partir du Sahara sur milieu minéral supplémenté de

FeSO4 ont permis d’isoler 16 consortia bactériens (VNT01 à VNT16) capables de pousser sur milieu minéral et sur milieu organique. ● Le courant maximum atteint est de -0,3 A.m-2 pour les consortia VNT12 et VNT14 lorsque de l’air est bullé dans l’électrolyte. ● Seules 9 bactéries hétérotrophes ont pu être identifiées dans les consortia VNT12 et VNT14. Ces dernières sont Pseudomonas sp. VNT1206, Paenibacillus lautus VNT1409, Ochrobactrum intermedium VNT1201, Microbacterium paraoxydans VNT1208, Microbacterium sp. VNT1204, Enterococcus sp. VNT1210, Skermanella aerolata VNT1202B, Cellulomonas hominis VNT1207, Enterococcus casseiflavus VNT1202A. ● Les bactéries isolées et identifiées ne permettent pas de concevoir une biocathode efficace.

79 Chapitre II : Résultats préliminaires

3. Introduction

Les PCMs sont une technologie reposant sur la catalyse microbienne de réaction telle que l’oxydation de la matière organique. Cette dernière est le carburant majeur des PCMs où les bactéries transfèrent leurs électrons vers l’anode assurant ainsi la production de courant. La puissance délivrée par les PCMs a très rapidement augmentée ces dernières années jusqu’à atteindre 6,4 W.m-2 récemment (Oliot et al., 2017) avec une anode microbienne et une cathode à air abiotique qui, bien que interchangeable, limite le système.

Beaucoup d’efforts ont été faits sur l’étude des bactéries catalysant la réaction anodique afin d’en élucider les mécanismes. De nombreuses espèces bactériennes ont ainsi été formellement identifiées comme pouvant échanger leurs électrons avec une anode. Ces espèces sont essentiellement des bactéries naturellement capables de réduire les métaux et les éléments soufrés comme, par exemple, Geobacter metallireduces (Bond et al., 2002), G. sulfureducens (Bond et Lovley, 2003), Desulfuromonas acetoxidans (Bond et al., 2002) Desulfobulbus propionicus (Holmes et al., 2004) ou encore Rhodoferax ferrireducens (Chaudhuri et Lovley, 2003).

Du fait d’une grande diversité de bactéries connues pour catalyser les réactions anodiques, un métabolisme peut être mis en avant comme modèle des bioanodes. En effet, ces bactéries ont toutes en commun d’évoluer en anaérobiose et de réduire des éléments inorganiques. A l’heure actuelle, nos connaissances sur la diversité des bactéries capables de catalyser la réduction de l’oxygène à la cathode est beaucoup moins avancée. Rosembaum et al., 2011 reportent dans une revue bibliographique la liste des espèces bactériennes capables de catalyser diverses réductions au niveau de la cathodes. De manière très intéressante, plusieurs bactéries capables de former des bioanodes sont également capables de catalyser des réductions cathodiques tel que G. sulfureducens et G. metallireducens (Gregory et al., 2004, Dumas et al., 2008) pour la réduction du fumarate ou S. oneidensis (Freguia et al., 2010). Les mêmes systèmes de transfert d’électrons semblent donc être mis en place que ce soit à la cathode ou à l’anode, par la même bactérie.

Ainsi, réaliser un criblage sur des espèces bactériennes non encore étudiées en biocathode pourrait permettre de mettre en avant de nouvelles espèces électroactives

80 Chapitre II : Résultats préliminaires capables de catalyser la réduction de l’oxygène et potentiellement de découvrir de nouveaux modes de transfert électronique.

4. Matériels et méthodes

4.1. Culture bactérienne et isolement

Les cultures bactériennes et isolements ont été réalisés sur TSB 1/10ème et également

-1 -1 -1 -1 sur milieu minéral M9 contenant 6 g.L Na2HPO4, 3 g.L KH2PO4, 0,5 g.L NaCl et 1 g.L

NH4Cl. Une fois autoclavée, la solution est complétée par 1 mM de MgSO4 et 0,1 mM de

CaCl2 préalablement autoclavés séparément. Le M9 est supplémenté de FeSO4 1 mM.

Les isolements bactériens ont été réalisés à partir d’échantillon de sable provenant du désert du Sahara (Algérie). Les isolements ont été dans un premier temps réalisés sur

ème milieu M9 supplémenté de FeSO4 avant repiquage sur TSB 1/10 .

4.2. Criblage en biocathode

Les criblages en biocathode ont été réalisés dans des réacteurs à trois électrodes. Les réacteurs sont des flacons de 200 ml contenant du TSB 1/10ème ou du M9 comme électrolyte et sont fermés à l’aide d’une mousse (∅ 4 cm ; Dominique Dutscher) pour permettre la diffusion de l’air tout en limitant les contaminations bactériennes. L’électrode de travail, d’une surface projetée de 3 cm2 (1 cm x 3 cm), est en feutre de carbone GDL5 (Paxitech). Du feutre de carbone RVG4000 (Carbone Lorraine) est utilisé comme contre électrode avec une surface projetée de 9 cm2 (3 cm x 3 cm). Les électrodes sont connectées électriquement grâce à des fils en titane (∅ 1,25 mm ; GoodFellow) cousus dans la longueur des électrodes. Une électrode de référence en Ag/AgCl saturée en KCl (Sigma) est placée entre l’électrode de travail et la contre électrode. Les réacteurs sont inoculés avec une culture bactérienne liquide (10%, v/v) ou avec une électrode pré-colonisée, c’est à dire ayant été préalablement formée en culture bactérienne avant d’être placée en réacteur.

81 Chapitre II : Résultats préliminaires

4.3. Mesure électrochimique

Les réacteurs sont connectés à un potentiostat MPG-2 (BioLogic) piloté via le logiciel EC- Lab (V10.44 ; BioLogic). Une chronoampérométrie (CA) est réalisée sur des électrodes de travail polarisées à -0,2 V vs. référence.

4.4. Microscopie confocale

Les biofilms sont observés grâce à un microscope confocal automatisé fluoview FV10i (Olympus). Les électrodes sont marquées avec du SYTO®9 (Invitrogen), un intercalant des acides nucléiques qui fluoresce dans le vert. Les bactéries marquées sont imagées en vert avec une longueur d’onde d’excitation de 489 nm et d’émission de 510 nm. Les fibres de carbone sont imagées en rouge avec une longueur d’onde d’excitation de 645 nm et d’émission de 620 nm d’après le travail de Rousseau et al. 2016.

4.5. Séquençage de l’ADN 16s

Les PCR sont réalisées sur colonies. La polymérase utilisée est la JumpStartTM Taq DNA polymerase (Sigma-Aldrich). Le mélange réactionnel est fait en suivant les instructions

TM fournies dans le kit JumpStart cependant du MgCl2 est ajouté à 3 mM, du DMSO est ajouté à 3% et la concentration en polymérase est doublée. Les amorces utilisées sont fd1 (5'-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3’) et S17 (5’-GTTACCTTGTTACGACTT-3’). La taille du fragment amplifié est attendue à 1500 pb, soit la totalité de l’ADNr 16S. Le séquençage est réalisé par la méthode Sanger (Genewiz). L’identification des séquences est faite par BLASTn (NCBI).

5. Résultats et discussion

5.1. Criblage des souches ZSTM

Les 34 souches ZSTM testées en réacteur (Tableau 1) ont été isolées du désert du Sahara dans la région du Timoudi par Zakia Selmani. La sélection des souches couvrait une vaste phylogénie comprenant des Firmicutes, Actinobactéries, Proteobactéries et Bacteroidetes. Toutes les souches choisies sont hétérotrophes. Afin de permettre leur croissance en réacteur, du TSB 1/10ème est utilisé comme électrolyte.

82 Chapitre II : Résultats préliminaires

Parmi l’ensemble des souches criblées pour la formation de biocathode sur feutre de carbone GDL5, aucune ne s’est avérée être efficace. Quelques résultats sont donnés à titre illustratif (Fig. 2) montrant que les courants obtenus n’atteignaient que quelques µA.m-2.Le criblage des souches ZSTM ne permet donc pas d’identifier un potentiel modèle d’étude pour la suite des travaux mais laisse cependant entrevoir une piste sur le choix de bactéries à utiliser pour la conception de biocathode. Dans l’hypothèse où la bactérie doit tirer son énergie de la cathode pour produire de l’électricité, il est nécessaire qu’aucune autre source d’énergie ne soit présente dans l’environnement de la cathode afin d’éliminer toute compétition possible entre les deux sources d’énergies. Ainsi pour concevoir une biocathode efficace, il est important de devoir apporter une source de carbone permettant à la bactérie de faire sa biomasse mais de la priver d’une source d’énergie autre que l’électrode. Or, les bactéries hétérotrophes tirent leur énergie de la matière organique en même temps qu’elles en tirent le carbone pour la biomasse.

Figure 2 : CA (-0,2 vs. référence ; 30°C) de 4 des 34 souches ZSTM

83 Chapitre II : Résultats préliminaires

Tableau 1 : Liste des espèces utilisées pour la réalisation du criblage

Phylogénie Espèce Bacteroidetes/Cytophagia Rufibacter tibetensis [Brevibacterium] frigoritolerans [Brevibacterium] halotolerans Firmicutes/Bacilli Bacillus mojavensis Bacillus halosaccharovorans

Bacillus tequilensis Lysinibacillus composti Planomicrobium koreense Microbacterium ginsengisoli Schumannella luteola Leifsonia lichenia Leifsonia xyli subsp. xyli str. CTCB07 Agrococcus carbonis Arthrobacter tecti Actinobacteria/Micrococcales Arthrobacter agilis Arthrobacter oryzae

Arthrobacter oxydans Arthrobacter siccitolerans Arthrobacter parietis Arthrobacter subterraneus Arthrobacter siccitolerans Arthrobacter phenanthrenivorans Sphe3 Arthrobacter humicola Proteobacteria/Betaproteobacteria Herbaspirillum seropedicae SmR1 Massilia consociata

Massilia niastensis Sphingomonas dokdonensis Sinorhizobium meliloti 1021 Proteobacteria/Alphaproteobacteria Devosia submarina Microvirga aerilata Microvirga lupini Paracoccus chinensis Proteobacteria/Gammaproteobacteria Stenotrophomonas maltophilia R551-3

84 Chapitre II : Résultats préliminaires

Se basant sur ces premiers résultats, il est impensable de pouvoir concevoir une biocathode efficace à l’aide de bactéries hétérotrophes. La poursuite de ces travaux se concentre alors sur un tout autre métabolisme bactérien au sein duquel les bactéries distinguent la source d’énergie de la source de carbone, c’est le cas des bactéries chimiolithoautotrophes.

5.2. Isolement et criblage des souches VNT

5.2.1. Isolement et criblage de consortium

Pour faire suite au criblage des souches ZSTM, nous avons donc choisi de garder le Sahara comme échantillon dans le but d’isoler de nouvelles souches. L’isolement est fait

ème sur TSB 1/10 après une série d’enrichissement sur FeSO4 en milieu minéral.

Cette approche a permit d’obtenir 16 isolats. Ces derniers semblent capables de pousser

ème aussi bien sur milieu minéral supplémenté de FeSO4 que sur milieu TSB 1/10 et conservent cette réversibilité métabolique malgré plusieurs séries de repiquage en condition organique et minérale suggérant alors une possible mixotrophie des isolats ou la présence de consortia.

Afin de limiter l’apport de matière organique durant le criblage des isolats annotés VNT01 à VNT16, les réacteurs sont inoculés avec des électrodes pré-colonisées sur milieu M9 supplémenté de 10 mM de FeSO4. La polarisation est réalisée à -0,2 V vs. référence dans un milieu minéral M9 servant d’électrolyte. Parmi les 16 souches criblées, deux s’avèrent efficaces dans l’obtention de courant cathodique avec -0,15 A.m- 2 et -0,20 A.m-2 pour les isolats VNT12 et VNT14 respectivement après 2 jours de polarisation (Fig. 3).

Les biocathodes formées avec les isolats VNT12 et VNT14 ont été repiquées dans un milieu M9 neuf avec bullage d’air afin de favoriser la réduction de l’oxygène.

-2 L’augmentation du courant jusqu’à -0,3 A.m (Fig. 4A) ainsi que l’imagerie en microscopie confocale (Fig. 4B) des deux électrodes confirment la présence de biofilms bactériens capables de réduire l’oxygène tout en tirant leur énergie de la cathode.

85 Chapitre II : Résultats préliminaires

Figure 3 : CA (Ewe = -0,2 V vs. Ref ; 30°C) des souches VNT01 (bleu foncé), 04 (rouge), 08 (vert), 12 (violet) et 14 (bleu turquoise) criblées sur feutre de carbone GDL5. Les autres souches VNT criblées ne sont pas représentées.

Figure 4 : A) CA (Ewe = -0,2 V vs. Ref ; 30°C) des souches VNT12 (violet) et VNT14 (bleu) en milieu M9 propre dans lequel de l’oxygène est bullé. B) Imagerie en microscopie confocale des biocathodes formées avec VNT12 (haut) et VNT14 (bas) après 14 jours de polarisation.

86 Chapitre II : Résultats préliminaires

5.2.2. Identification des souches

La première série d’identification des isolats VNT laisse penser que plusieurs espèces bactériennes sont présentes, l’isolement a donc été repris à partir des électrodes ayant permis d’obtenir 0,3 A.m-2. A partir de ces électrodes, 9 souches ont pu être isolées et formellement identifiées :

● Pseudomonas sp. VNT1206 ● Paenibacillus lautus VNT1409 ● Ochrobactrum intermedium VNT1201 ● Microbacterium paraoxydans VNT1208 ● Microbacterium sp. VNT1204 ● Enterococcus sp. VNT1210 ● Skermanella aerolata VNT1202B ● Cellulomonas hominis VNT1207 ● Enterococcus casseiflavus VNT1202A

Parmi les différentes espèces identifiées, aucune ne semble être autotrophe. Le genre Pseudomonas regroupe essentiellement des bactéries hétérotrophes bien que certaines semblent être capables d’oxyder le manganèse (Zhou et al., 2014 ; Geszvain et Tebo, 2014) et le fer (Popa et al., 2012). L’espèce Paenibacillus lautus, initialement Bacillus lautus, n’est pas capable de croître de façon autotrophe (Nakamura, 1984). Ochrobactrum intermedium n’est également pas connue pour sa capacité à oxyder des métaux, en revanche elle semble capable de réduire le chrome et présenterait une certaine tolérance aux métaux lourds (Sultan et Hasnain, 2007 ; Waranusantigul et al., 2011 ; Kavita et Keharia, 2012). L’espèce pathogène Microbacterium paraoxydans est une bactérie capable d’oxyder différents sucres (Laffineur et al., 2003). Le genre Microbacterium contient également des bactéries tolérantes aux métaux lourds, certaines pouvant même oxyder l’arsenic (Mokashi et Paknikar, 2002 ; Kaushik et al., 2012). Le genre Skermanella ne semble lui non plus pas présenter de bactéries connues comme étant capables d’oxyder les métaux, cela dit, plusieurs espèces du genre ont été également isolées d’environnements arides (An et al., 2009 ; Subhash et Lee, 2016). Quant à Cellulomonas hominis et Enterococcus casseiflavus, toutes deux sont cliniques

87 Chapitre II : Résultats préliminaires

(Funke et al, 1995 ; Pappas et al., 2004) mais il n’existe pas d’information sur une possible oxydation des métaux. Il est difficilement explicable que ces souches, à priori incapables d’utiliser le fer comme seule source d’énergie et de fixer le CO2, aient pu être sélectionnées sur un milieu minéral. Cependant, toutes les souches isolées n’ont pas pu être identifiées. Au sein du consortium, des bactéries chimiolithoautotrophes ont pu croître et contribuer à l’apport de matière organique via la sécrétion de métabolites. En effet, en fixant le CO2 les bactéries chimiotrophes peuvent participer activement à l’apport de carbone organique ensuite utilisé par des bactéries hétérotrophes (Boschker et al., 2014).

Les souches identifiées ont été criblées afin de voir si l’une d’elles était capable de produire un courant cathodique. Le criblage est réalisé dans les mêmes conditions que celles des consortia VNT12 et VNT14. Cependant la précolonisation des électrodes est faites sur TSB 1/10ème, les souches identifiées étant hétérotrophes. Les électrodes sont polarisées à -0,2 V vs. référence en milieu minéral. Les 9 souches n’ont pas ou peu produit de courant, avec une intensité maximale de -0,017 A.m-2 pour S. aerolata VNT1208 (Fig. 5).

Figure 5 : CA (-0,2 V vs. Référence ; 30°C) des 9 souches VNT isolées et identifiées

88 Chapitre II : Résultats préliminaires

Parmi les souches criblées, seuls deux genres ont été testés en PCM et ont montré des résultats positifs. O. intermedium peut être une EAB fonctionnant en anode (Chen et al., 2014). Une autre espèce appartenant au même genre, O. anthropi, a été décrite pour la catalyse de transfert d’électrons anodique (Zuo et al., 2008). Le genre Pseudomonas est le plus étudié des deux. Plusieurs études se sont notamment intéressées à l’espèce P. aeruginosa qui est capable d’utiliser l’anode comme accepteur final d’électrons (Luo et al., 2009 ; Jayapriya et Ramamurthy, 2012 ; Shen et al., 2014 ; Yong et al., 2014). Aucune information n’a pu être trouvée concernant la formation d’une biocathode en culture pure avec l’une des autres espèces identifiées.

L’absence de production de courant cathodique lors du criblage des souches identifiées laisse penser que les courants de -0,3 A.m-2 obtenus peuvent être dûs à une syntrophie entre deux ou plusieurs espèces présentes dans les consortia VNT12 et VNT14. Du fait de l’enrichissement du milieu minéral en fer et de la formation de biofilms sur les oxydes de fer, il est probable qu’une bactérie capable d’oxyder le Fe2+ soit présente. Cependant, cette ou ces dernière(s) n’ayant pas pu être identifiée(s), il est impossible d’en tirer une conclusion ou même un modèle sur un quelconque transfert d’électrons mis en jeu entre la cathode et une ou plusieurs espèce(s) présente(s).

6. Conclusion

Le criblage des 59 souches réalisé dans cette étude n’a pas permis de mettre en évidence de nouvelles espèces électroactives efficaces pour la catalyse de la réduction de l’oxygène à la cathode. En revanche il a permis d’obtenir de nouvelles pistes exploratoires sur la façon de concevoir une biocathode. L’utilisation de bactéries strictement hétérotrophes et l’apport de la matière organique en réacteur connus pour être efficaces pour la formation de bioanodes, s’avèrent, à l’issue du criblage que nous avons réalisé, inappropriés pour la conception de biocathodes.

Toutefois, l’étude a permis l’isolement de consortia non identifiés du sable du Sahara. Parmi les 16 consortia, seuls deux se sont avérés capables de catalyser la réduction de l’oxygène à la cathode avec des courants de l’ordre de -0,3 A.m-2. Les seules espèces ayant été formellement identifiées sont toutes hétérotrophes bien que beaucoup puissent présenter une tolérance aux métaux, aucune ne semble connue pour sa capacité à oxyder un composé inorganique pour en tirer de l’énergie. De plus, le criblage en

89 Chapitre II : Résultats préliminaires biocathodes des 9 souches identifiées n’a pas permis de produire de courant cathodique du moins aussi fort que ceux obtenus avec les consortia VNT12 et VNT14 suggérant que ce ne sont pas ces espèces qui participent à l’activité électrochimique du consortium ou que celles-ci nécessitent la présence d’un partenaire pour être efficaces.

7. Commentaires et perspectives

Les deux criblages réalisés, c’est-à-dire sur les souches ZSTM et les souches/consortia VNT ne sont pas réellement comparables. Bien que tous deux apportent des informations complémentaires, ces derniers n’ont pas été réalisés strictement dans les mêmes conditions. En effet, l’un utilise une inoculation planctonique alors que l’autre utilise des électrodes pré-colonisées. Le criblage ZSTM révèle qu’aucune des 34 souches utilisées n’était électroactive, or pour pouvoir l’affirmer, il aurait été judicieux de refaire ce même criblage en précolonisant les électrodes et de les polariser en milieux minéral pour éviter toute compétition entre deux sources d’énergie potentielles.

Il a été montré à l’anode que beaucoup des bactéries participant à sa catalyse étaient des bactéries capables de réduire des composées inorganiques métalliques et soufrés (e.g. G. sulfureducens et G. metallireducens). Dans l’hypothèse où les transferts d’électrons mis en place à la cathode et à l’anode peuvent être similaires (Cheng et al., 2010 ; Rosembaum et al., 2011), un criblage de masse sur des bactéries capables d’oxyder les métaux ou les éléments inorganiques soufrés pourrait apporter de nouvelles informations quant à la diversité et aux mécanismes de transfert d’électrons mis en jeu. Ces dernières étant naturellement capables d’oxyder des éléments minéraux et d’en récupérer l’énergie directement à son contact comme en est capable, par exemple, Acidithiobacillus ferrooxidans sur la pyrite (Valdés et al., 2008).

De ce fait, la suite des travaux va porter sur la bactérie Acidithiobacillus ferrooxidans dans l’objectif de décrypter et d’identifier les mécanismes extracellulaires de transfert d’électrons mis en jeu chez cette bactérie pour la formation de biocathode.

Chapitre III

Promotion de la formation de biofilms par le quorum-sensing et mise en évidence du transfert direct d’électrons chez Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC23270T

Chapitre III : Transfert direct d’électrons chez A. ferrooxidans

1. Contexte et objectif(s)

Suite au criblage réalisé précédemment et aux conclusions qui en ont été tirées, nous avons décidé de nous orienter vers des bactéries capables d’oxyder des éléments métalliques ou soufrés inorganiques afin de faire le parallèle avec les bactéries catalysant les réactions anodiques. Or la réduction de l’oxygène chez de telles bactéries a principalement lieu à faible teneur en oxygène du fait du grand pouvoir oxydant de l’oxygène sur les substrats réduits nécessaires à la croissance bactérienne. Cependant, bien que le projet ANR Bioelec se veuille innovant par la conception d’une biocathode catalysant la réduction de l’oxygène à pH neutre, la réduction de l’oxygène n’a pas spontanément lieu à un tel pH mais se veut être cinétiquement facilitée à pH acide.

Ainsi un choix doit être fait d’un point de vue conceptuel sur la formation de la biocathode. En prenant en compte les critères cités ci-dessus, le choix du pH de l’électrolyte détermine la réaction de réduction catalysée par la biocathode. A pH neutre, il semble impossible d’obtenir une bonne réduction de l’oxygène. En revanche celle-ci peut avoir lieu pour de faibles teneurs en oxygène dissous ou bien par réduction de composés inorganiques oxydés en anaérobiose. La seconde option est de travailler à des pH acides pour favoriser la cinétique de réduction de l’oxygène.

Bien que le choix d’utiliser des pH acides pour l’étude de la biocathode ne concorde pas avec les critères définis dans le projet, du fait de la réaction � + 4� + 4� ↔ 2��, il peut être judicieux de s’y orienter pour l’étude fondamentale des mécanismes de transfert extracellulaire d’électrons pour la réduction de l’oxygène à la cathode.

Du fait de ce choix, la bactérie Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC23270T se révèle être la candidate idéale pour remplir la fonction de catalyseur pour concevoir et comprendre le fonctionnement d’une biocathode réduisant l’oxygène. Nous nous sommes donc intéressés à la capacité d’A. ferrooxidans à former des EABs sur feutre de carbone GDL5 et à tenter d’améliorer ces biofilms en activant le quorum-sensing (QS) de la bactérie par ajout de C14 acyl homosérine lactone (C14-AHL) pour améliorer les performances de cette dernière.

2. Principaux résultats

Les résultats ont fait l’objet d’une publication dans le journal Microbial Biotechnology

93 Chapitre III : Transfert direct d’électrons chez A. ferrooxidans

(2017). Les principaux résultats présentés dans ce chapitre sont les suivants :

● L’utilisation du Fe(II) et du soufre comme source d’énergie primaire (avant la polarisation) montre que la bactérie cultivée sur Fe(II) est capable de produire plus de courant que celle cultivée sur soufre. ● L’activation du QS par l’utilisation de C14-AHL permet d’améliorer la formation du biofilm sur du feutre de carbone GDL5. De cette amélioration en résulte une

-2 meilleure électroactivité de la souche avec des courants de -0,55 A.m atteints lorsque la bactérie est précultivée sur Fe(II) ● La bactérie A. ferrooxidans ATCC 23270T semble donc mettre en jeu un transfert extracellulaire direct d’électrons utilisant un cytochrome de type c (cyc2) induit par le Fe(II). ● L’effet des C14-AHL n’est cependant pas durable sur le long terme et le coût des molécules est rédhibitoire quant à un ajout en batch pour maintenir le QS activé.

Brief report

Quorum sensing improves current output with Acidithiobacillus ferrooxidans

1 2 Nicolas Chabert, Violaine Bonnefoy and 1, Introduction Wafa Achouak * 1 CEA, CNRS, UMR7265, ECCOREV FR 3098, LEMIRE, Microbial fuel cells (MFCs) are devices that convert Laboratoire d’Ecologie Microbienne de la Rhizosphere et chemical energy into electricity via the extracellular Environnement Extremes,^ Aix Marseille Univ, F- transfer of electrons by selected bacteria. While a wide 13108 St Paul Les Durance, France. range of natural environments (and therefore bacteria) 2 CNRS, Laboratoire de Chimie Bacterienne, Institut de can act as catalysts for anodic reactions (Chabert et al., Microbiologie de la Mediterranee, Aix Marseille Univ, 2015), only a limited number of species are known to Marseille, France. catalyse cathodic oxygen reduction. The extracellular electron transfer that allows bacteria to exchange electrons with an electrode is a natural phe- Summary nomenon observed with conductive minerals (Shi et al., 2016). Indeed, bacteria such as Geobacter and Schewa- Acidithiobacillus ferrooxidans is a strict acidophilic nella are known to catalyse anodic respiration. This abil- chemolithoautotrophic bacterium that obtains its energy ity relies on their capacity to reduce heavy metals when from reduced inorganic sulfur species or fer-rous iron growing under anaerobic conditions. Therefore, it is oxidation under aerobic conditions. Carbon felt expected that metal-oxidizing bacteria could play a sig- electrodes were pre-colonized by A. ferrooxidans ATCC T nificant role in the construction of efficient biocathodes. 23270 using ferrous iron or sulfur as electron donors, Ferrous iron oxidation occurs spontaneously in circum- via the addition (or not) of a mixture of C14 acyl- neutral aerobic environments (Roekens and Van Grie- homoserine lactones (C14-AHLs). Electrode cov-erage ken, 1983), and iron-oxidizing bacteria can be during pre-colonization was sparse regardless of the categorized into four physiological groups (Hedrich et al., electron donor source, whereas activation of quorum 2011). Only one of these groups includes bacteria that sensing significantly enhanced it. Microbial fuel cells are able to oxidize ferrous iron under high oxygen level (MFCs) inoculated with pre-colonized elec-trodes (which conditions. Indeed, the spontaneous iron oxidation rate behaved as biocathodes) were more efficient in terms of decreases under acidic conditions, indicating that aci- current production when iron was used as an electron dophilic bacteria such as Acidithiobacillus ferrooxidans donor. Biocathode coverage and current output were can oxidize iron under strict aerobic conditions. More- 2 remarkably increased to 0.56 A m by concomitantly over, as electrocatalytic reduction in O2 to H2O is kineti- using iron-based metabolism and C14-AHLs. Cyclic cally limited by the availability of protons (Erable et al., voltammetry displayed different electrochemical 2009), A. ferrooxidans offers a great prospect for air bio- reactions in relation to the nature of the electron donor, cathode design (Ter Heijne et al., 2007; Carbajosa et al., underly-ing the implication of different electron transfer 2010; Rodrigues and Rosenbaum, 2014; Ishii et al., mechanisms. 2015). Acidithiobacillus ferrooxidans is a strict acidophilic (pH 2) chemolithoautotrophic bacterium that obtains its energy from ferrous iron or reduced inorganic sulfur species oxidation under oxygenic conditions (Kelly and Received 27 June, 2017; accepted 7 July, 2017. Wood, 2000). This bacterium is highly involved in bio- *For correspondence. E-mail [email protected]; Tel. mining (Rawlings, 2002), and additional studies have +33442254961; Fax +33442256648. Microbial Biotechnology (2017) 0(0), 000– thus been conducted on biofilm formation and quorum 000 doi:10.1111/1751-7915.12797 sensing in A. ferrooxidans and related species. Many Funding information Agence Nationale de la Recherche (Grant/Award Number: ‘ANR-13- biomining bacteria demonstrate acyl-homoserine lactone BIME-006’). (AHLs) communication (Ruiz et al., 2008; Bellenberg

ª 2017 The Authors. Microbial Biotechnology published by John Wiley & Sons Ltd and Society for Applied Microbiology. This is an open access article under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits use, distribution and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

2 N. Chabert et al. et al., 2014), and biofilm formation in the A. ferrooxidans coupons and pyrite, A. ferrooxidans biofilm formation T strain ATCC 23270 is more efficient on pyrite and sulfur was highly improved by C14-AHLs mixture containing coupons in the presence of added large acyl chains C14-AHL, 3-hydroxy-C14-AHL and 3-oxo-C14-AHL. AHLs (Gonzalez et al., 2013; Mamani et al., 2016). When 5 lM of C14-AHLs was added to cell culture on In the present study, we compared the impact of sulfur ferrous iron or on sulfur medium, A. ferrooxidans cells and ferrous iron oxidative pathways on the construction almost covered the whole electrode surface after 1 week of efficient biocathodes with A. ferrooxidans ATCC (Fig. 1). Electrode colonization resulted in the adhesion T 23270 . Furthermore, we have investigated the effect of of disparate cells to the carbon fibre in the form of a C14-AHLs on inert carbon electrode biofilm formation as monolayer. No thick biofilms have ever been observed well as current output. These results demonstrate that A. on pyrite with A. ferrooxidans (Vera et al., 2013). T ferrooxidans ATCC 23270 electroactivity could be effectively improved upon iron metabolism activation and C14-AHLs-mediated biofilms improve current output by quorum sensing. Several different mechanisms exist to produce electricity Results and discussion within MFCs. As current output involves a direct electron transfer resulting in a contact between the bacteria and C14-AHLs improve biofilm formation the electrode, one of these mechanisms could potentially Acidithiobacillus ferrooxidans is well known for its ability to be biofilm-dependent. To focus on this type of electron colonize substrates such as pyrite, from which it obtains its transfer with A. ferrooxidans, electricity production was energy by oxidizing iron or sulfur. Imaging col-onized carbon monitored with ferrous iron or sulfur as the primary elec- felt electrodes revealed a low bacterial coverage (Fig. 1) tron donor, with or without C14-AHLs. When electrode when bacteria were cultivated for 1 week with ferrous iron pre-colonization was performed with sulfur as the pri- (0.1 M) or sulfur (~2% m/v) as the energy source. Under mary source of energy, current output only reached 0.05 2 these conditions, bacteria pre-sumably favoured a A m within 1 week (Fig. 2A). On the other hand, when planktonic lifestyle, because electron donors may not bind electrode pre-colonization occurred on ferrous iron, the unpolarized carbon felt elec-trode. As described by current output increased by approximately sixfold, with 2 Gonzalez et al. (2013) for sulfur an intensity reaching 0.31 A m (Fig. 2B) within 1 week.

Our results show that C14-AHLs increase elec-trode colonization, indicating the possibility of a better current output. Chronoamperometry (CA) data confirmed the current output increase using a higher electrode cov-

erage: when 5 lM of C14-AHLs was added during electrode colonization, the current intensity reached 0.12 2 (Fig. 2A) and 0.56 A m (Fig. 2B) for sulfur and fer-rous

iron as the primary energy sources respectively. Subsequently, cyclic voltammetry (CV) was performed

after CA to determine how colonization, sulfur-based or iron-based cell metabolism, and C14-AHLs affect electrochemical reactions.

Sulfur-based metabolism

Electrodes colonized with sulfur as the primary energy source showed slight differences, whether they had been formed with C14-AHLs or not (Fig. 3A). Indeed, CV with and without C14-AHLs displayed redox reactions that

occur at a positive potential but disappear after the first

Fig.1. Confocal microscopy imaging of a carbon felt electrode after 7 cycle. However, the peak intensities were somewhat days of culture. Cells labelled green using Syto 9 were imaged higher when the electrodes were formed with C14-AHLs. using an excitation at 489 nm and an emission at 510 nm. Carbon This same pattern was observed for the reaction at 0.44 fibres were red-imaged using an excitation at 645 nm and emission at 620 nm, in accordance with Rousseau et al., 2016. Electrode bio- V versus the reference. Specifically, after the first cycle, films were formed by using ferrous iron (left column) or sulfur (right the intensity decreased but remained slightly higher than 2 column) as energy sources, either with C14-AHLs (lower panels) or 1.14 A m when the electrode was formed in the without C14-AHLs (upper panels). presence of C14-AHLs, whereas the

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Quorum sensing improves electroactivity 3

Fig. 3. Cyclic voltammetry plots for five consecutive cycles of biocathodes. Electrodes were formed by using either sulfur (A) or ferrous iron (B) as the prior energy source, either with C14-AHLs (red lines) or without C14-AHLs (black lines). CV curves were obtained 1 at a scan rate of 5 mV s . 2 Fig. 2. Chronoamperograms of 3 cm pre-colonized carbon felt biocathodes. Sulfur (A) or ferrous iron (B) was used as the prior energy source, either with C14-AHLs (red lines) or without C14-AHLs (black likely the same as those observed on sulfur with an lines). CA was performed on MPG-2 potentiostat (Biologic) at E =0.2 V versus Ag/AgCl KCl saturated reference and T = 30°C. oxidation at 0.2 V versus the reference, whereas the third reaction corresponded to a reduction occurring 2 around 0 V versus the reference. Therefore, the oxida- maximum was 1.04 A m in the absence of C14-AHLs. tion peak was stable over the five cycles. However, Nevertheless, when C14-AHLs were used during activation of quorum sensing during colonization with electrode colonization, redox reactions occurring at the ferrous iron as the primary energy source affected the positive potential had a tendency to be driven at a lower reduction occurring around 0.4 V versus the refer-ence. potential. This is presumably linked to the higher cover- Specifically, the reduction intensity ranged from 0.82 to age of the electrode surface. 2 1.22 A m and the potential increased from 0.4 V to 0.34 V versus the reference for pre-colonized electrodes Iron-based metabolism without and with C14-AHLs respectively. This

When ferrous iron was used as the primary energy emphasizes the effect of electrode colonization and the T source, significant differences were noticed relative to potential of A. ferrooxidans ATCC 23270 to drive the quorum sensing response and the nature of the oxygen reduction using the cathode as electron donors. primary energy source (Fig. 3B). CV performed on These results demonstrate that a well-colonized electrodes formed without C14-AHLs only showed a electrode tends to decrease the redox potential of the reduction at 0.4 V versus the reference, reaching 0.82 A reaction. Furthermore, when quorum sensing was 2 m . In contrast, at least three reactions occurred upon activated, the current output was nearly increased by quorum sensing activation during colo-nization of the about twofold, whether the electrode was formed with electrode. Two of these reactions were sulfur or ferrous iron as the primary energy source.

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4 N. Chabert et al.

Mechanisms underlying electron transfer Conflict of interest

The twofold increase in current output confirms that The authors declare that they have no conflict of extracellular electron transfer of A. ferrooxidans is linked to interests. cell adhesion on the cathode, because current increase was observed when electrodes were formed with quorum References sensing activation. Nonetheless, differences in current intensity cannot be due exclusively to elec-trode coverage. Bellenberg, S., Diaz, M., Noel, N., Sand, W., Poetsch, A., When quorum sensing was activated, electrodes formed Guiliani, N., and Vera, M. (2014) Biofilm formation, com- with either sulfur or ferrous iron dis-played a similar munication and interactions of leaching bacteria during colonization. Quorum sensing acts at the gene level and colonization of pyrite and sulfur surfaces. Res Microbiol 165: 773–781. may activate other genes than those involved in biofilm Carbajosa, S., Malki, M., Caillard, R., Lopez, M.F., Palo- formation, resulting in improved cur-rent output. Moreover, mares, F.J., Martin-Gago, J.A., et al. (2010) Electrochemi- A. ferrooxidans does not utilize the same metabolic pathway cal growth of Acidithiobacillus ferrooxidans on a graphite to metabolize sulfur or fer-rous iron (Quatrini et al., 2009). electrode for obtaining a biocathode for direct electrocat- The main difference occurs at the beginning of the alytic reduction of oxygen. Biosens Bioelectron 26: 877– respiratory chains: elec-tron uptake occurs at the 880. cytoplasmic membrane for sul-fur oxidation and at the outer Chabert, N., Ali, O.A., and Achouak, W. (2015) All ecosys- membrane for ferrous iron oxidation. Indeed, when ferrous tems potentially host electrogenic bacteria. Bioelectro- chemistry 106: 88–96. iron acts as an electron donor, a c-type cytochrome (Cyc2) Erable, B., Etcheverry, L., and Bergel, A. (2009) Increased is involved in electron uptake (Yarzabal et al., 2002). power from a two-chamber microbial fuel cell with a low- Furthermore, a higher number of c-type cytochromes are pH air-cathode compartment. Electrochem Commun 11: found in A. ferrooxi-dans when it is cultivated on ferrous iron 619–622. as opposed to sulfur (Yarzabal et al., 2002). Finally, it was Gonzalez, A., Bellenberg, S., Mamani, S., Ruiz, L., Echever- previously shown that c-type cytochromes are involved in ria, A., Soulere, L., et al. (2013) AHL signaling molecules extracel-lular electron transfer (Rosenbaum et al., 2011; with a large acyl chain enhance biofilm formation on sul-fur and metal sulfides by the bioleaching bacterium Kumar et al., 2016), suggesting that Cyc2 may be Acidithiobacillus ferrooxidans. Appl Microbiol Biotechnol responsible for improving the efficiency of electricity 97: 3729–3737. T production in A. ferrooxidans ATCC 23270 when the Hedrich, S., Schlomann,€ M., and Johnson, D.B. (2011) The electrodes are pre-colonized on ferrous iron. iron-oxidizing proteobacteria. Microbiology 157: 1551– 1564. Ishii, T., Kawaichi, S., Nakagawa, H., Hashimoto, K., and Nakamura, R. (2015) From chemolithoautotrophs to elec- Conclusions trolithoautotrophs: CO2 fixation by Fe(II)-oxidizing bacteria coupled with direct uptake of electrons from solid electron Quorum sensing activation using C14-AHLs remarkably sources. Front Microbiol 6: 994. increased electrode colonization by A. ferrooxidans Kelly, D.P., and Wood, A.P. (2000) Reclassification of some T ATCC 23270 , resulting in a twofold enhancement of species of Thiobacillus to the newly designated genera Acidithiobacillus gen. nov., Halothiobacillus gen. nov and current output. We have shown that prior activation of Thermithiobacillus gen. nov. Int J Syst Evol Microbiol 50: iron metabolism leads to a higher electroactivity in this 511–516. strain. This phenomenon could be directly linked to the Kumar, R., Singh, L., and Zularisam, A.W. (2016) Exoelec- ability of metal-oxidizing bacteria to take up electrons trogens: recent advances in molecular drivers involved in from a solid surface, whereas other examples such as extracellular electron transfer and strategies used to sulfur metabolism occurs internally. Further investiga- improve it for microbial fuel cell applications. Renew Sus- tions, such as the transcriptomic analysis of electrode- tain Energy Rev 56: 1322–1336. colonizing bacteria, are required to elucidate the extra- Mamani, S., Moinier, D., Denis, Y., Soulere, L., Queneau, cellular electron transfer pathway involved in the elec- Y., Talla, E., et al. (2016) Insights into the quorum sens- T ing regulon of the acidophilic Acidithiobacillus ferrooxi- troactivity of strain ATCC 23270 . dans revealed by transcriptomic in the presence of an acyl homoserine lactone analogue. Front Microbiol 7: 1365. Acknowledgements Quatrini, R., Appia-Ayme, C., Denis, Y., Jedlicki, E., Holmes, This work was supported by an IRTELIS Ph.D. pro- D.S., and Bonnefoy, V. (2009) Extending the models for gramme grant from the CEA. We acknowledge funding iron and sulfur oxidation in the extreme aci-dophile from the ANR BioElec (ANR-13-BIME-006), the Amidex Acidithiobacillus ferrooxidans. BMC Genom 10: 394. Microbio-E program and the CEA’s DRT/DSV program.

ª 2017 The Authors. Microbial Biotechnology published by John Wiley & Sons Ltd and Society for Applied Microbiology.

Quorum sensing improves electroactivity 5

Rawlings, D.E. (2002) Heavy metal mining using microbes. widespread phenomenon in biomining bacteria and Annu Rev Microbiol 56: 65–91. seems to be involved in mineral-adhesion efficiency. Rodrigues de Campos, T., and Rosenbaum, M.A. (2014) Hydrometallurgy 94: 133–137. Microbial electroreduction: screening for new cathodic Shi, L., Dong, H., Reguera, G., Beyenal, H., Lu, A., Liu, J., bio-catalysts. ChemElectroChem 1: 1916–1922. et al. (2016) Extracellular electron transfer mechanisms Roekens, E.J., and Van Grieken, R. (1983) Kinetics of iron between microorganisms and minerals. Nat Rev Microbiol (II) oxidation in seawater of various pH. Mar Chem 13: 14: 651–662. 195–202. Ter Heijne, A., Hamelers, H.V.M., and Buisman, C.J.N. Rosenbaum, M., Aulenta, F., Villano, M., and Angenent, L.T. (2007) Microbial fuel cell operation with continuous biolog- (2011) Cathodes as electron donors for microbial ical ferrous iron oxidation of the catholyte. Environ Sci metabolism: which extracellular electron transfer mecha- Technol 41: 4130–4134. nisms are involved? Bioresour Technol 102: 324–333. Vera, M., Krok, B., Bellenberg, S., Sand, W., and Poetsch, Rousseau, R., Santaella, C., Bonnafous, A., Achouak, W., A. (2013) Shotgun proteomics study of early biofilm for- Godon, J.-J., Delia, M.-L., and Bergel, A. (2016) Halotol- mation process of Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC erant bioanodes: the applied potential modulates the elec- 23270 on pyrite. Proteomics 13: 1133–1144. trochemical characteristics, the biofilm structure and the Yarzabal, A., Brasseur, G., and Bonnefoy, V. (2002) Cyto- ratio of the two dominant genera. Bioelectrochemistry chromes c of Acidithiobacillus ferrooxidans. FEMS Micro- 112: 24–32. biol Lett 209: 189–195. Ruiz, L.M., Valenzuela, S., Castro, M., Gonzalez, A., Frez- za, M., Soulere, L., et al. (2008) AHL communication is a Chapitre III : Transfert direct d’électrons chez A. ferrooxidans

3. Résultats complémentaires

L’effet à long terme du QS a également été regardé afin de mieux comprendre la dynamique de vieillissement d’une biocathode. Pour ce faire, les électrodes cultivées sur fer ont été laissées sur une durée de 60 jours sous polarisation. Le biofilm a été imagé à 0, 3 et 7 jours où le courant maximal est atteint. L’imagerie en microscopie confocale montre que les biofilms évoluent de manière opposée. En effet, le biofilm formé en présence de C14 AHL tend vers un recouvrement plus faible de l’électrode au cours du temps alors que celui formé sans les C14 AHL montre un recouvrement plus important à 7 jours qu’au temps initial (Fig. 1). Il n’a malheureusement pas été possible d’aller plus loin dans la cinétique de vieillissement, l’électrode devenant trop petite pour poursuivre les observations.

Figure 1 : Observation en microscopie confocale à 0, 3 et 7 jours de polarisation à -0,2 V vs. référence de fragment de l'électrode prélevé sur les électrodes formées avec du fer comme seule source d’énergie en présence et absence de C14 AHL

De plus, bien que dans les 7 premiers jours de polarisation les effets du quorum sensing soient visibles, la différence diminue passée cette période pour devenir inexistante après 15 jours (Fig. 2) pour atteindre un plateau à une valeur maximale de -0,55 A.m-2.

100 Chapitre III : Transfert direct d’électrons chez A. ferrooxidans

Ces résultats vont dans le même sens que l’imagerie. En effet, l’homogénéisation des biofilms concorde avec l’amoindrissement des différences de courants obtenus. Cependant, le courant a pu être maintenu sur les 60 jours d’opération aux alentours des -0,55 A.m-2 montrant la stabilité des biocathodes formées avec la souche ATCC 23270T.

Figure 2 : CA (-0,2 V vs. référence ; 30°C) sur 60 jours des biofilms d’A. ferrooxidans formés en présence de Fe(II) comme source d’énergie primaire avec des C14-AHL pour activer le quorum sensing (rouge) et sans C14-AHL (noir).

4. Commentaires et perspectives

La souche ATCC23270T est un très bon modèle d’étude pour les biocathodes. Dans ce chapitre, l’article présente la capacité d’A. ferrooxidans à former un biofilm électroactif sur feutre de carbone en présence de Fe(II) ou de soufre élémentaire comme source d’énergie. Nous avons montré que le Fe(II) était primordial pour l’induction du caractère électroactif qui s’avère être dépendant de la présence du fer et n’est donc pas un caractère constitutif. Le soufre quant à lui ne permet pas d’induire une très forte électroactivité, ce dernier n’impliquant pas de cytochrome de surface pour sa métabolisation. L’utilisation de QS via les C14-AHL permet de doubler la production de courant en augmentant le recouvrement de l’électrode, justifiant ainsi le transfert direct. Cependant, les résultats complémentaires montrent que l’utilisation du QS n’est pas viable sur le long terme. En effet, les molécules sont onéreuses et il n’est donc

101 Chapitre III : Transfert direct d’électrons chez A. ferrooxidans raisonnablement pas envisageable d’ajouter régulièrement des C14-AHL dans les réacteurs pour maintenir le QS à son plus fort niveau d’activation. En revanche, le métabolisme de la bactérie semble être un très bon moyen pour améliorer les performances comme montré avec le Fe(II) et le soufre. Les résultats présentés ici laissent entrevoir plusieurs questions notamment sur la réversibilité métabolique de la bactérie. En effet, si le Fe(II) est vraiment un inducteur, la bactérie cultivée sur soufre peut-elle produire du courant si du Fe(II) est ajouté ? L’ajout de Fe(II) en réacteur permet-il d’améliorer les productions de courant d’A. ferrooxidans au même titre que le QS ? La suite des travaux va tenter de répondre à ces questions.

102

Chapitre IV

Induction de l’électroactivité d’Acidithiobacillus ferrooxidans par le Fe(II) et transfert indirect d’électrons

Chapitre IV : Transfert indirect d’électrons chez A. ferrooxidans

1. Contexte et objectif(s)

Nous avons montré dans le chapitre précédent qu’il était possible d’améliorer l’électroactivité d’A. ferrooxidans via l’activation du quorum-sensing à l’aide de C14- acylhomosérine lactone. Cependant, les résultats ont également montré que l’activation du métabolisme du fer jouait un rôle clé dans la capacité de cette bactérie à récupérer les électrons sur l’électrode. En effet, qu’elle ait un métabolisme basé sur le Fe(II) ou sur le soufre réduit inorganique n’a pas les mêmes implications quant à l’expression de la machinerie métabolique. C’est ainsi qu’a pu être déterminée la nécessité du cytochrome de type c2 (Cyc2) dans l’électroactivité de la bactérie, ce dernier étant impliqué dans l’oxydation extracellulaire du Fe(II).

Cependant plusieurs questions restent en suspens. La bactérie ayant métabolisé le soufre est-elle capable de produire du courant si du fer est ajouté dans le réacteur ? La bactérie ayant métabolisé le fer est-elle capable d’accroître sa capacité à échanger des électrons avec la cathode si du fer est présent dans le réacteur ? Comment le mode de vie (planctonique ou sessile) influence t-il l’électroactivité de la bactérie ?

Pour tenter de répondre à ces quelques questions, un travail similaire au précédent a été réalisé dans ce chapitre. Il vise à étudier de manière plus précise l’importance du métabolisme bactérien dans l’électroactivité d’une espèce.

2. Principaux résultats

Les résultats présentés dans ce chapitre font l’objet d’une publication en cours de soumission à Biotechnology and Bioengeneering. En voici les principaux résultats :

• Le métabolisme du fer d’A. ferrooxidans ATCC23270T permet à la bactérie d’utiliser la cathode comme donneur d’électrons, alors que celui du soufre ne semble pas le permettre. • L’inoculation directe d’une culture bactérienne ayant poussé en présence de Fe(II) produit un courant cathodique maximal de -1,6 A.m-2 alors qu’une précolonisation de l’électrode en présence de fer ne permet d’atteindre qu’un maximum de -0,5 A.m-2. Ces résultats suggèrent que le mode de développement bactérien a aussi un rôle dans son électroactivité.

105 Chapitre IV : Transfert indirect d’électrons chez A. ferrooxidans

• Les résultats de voltamétrie cyclique suggèrent cependant que les bactéries cultivées sur soufre ou sur fer et inoculées directement ou par précolonisation sont toutes capables de catalyser la réduction de l’oxygène. En revanche, seules les bactéries cultivées sur fer et inoculées en liquide montrent un réel shift des potentiels à 0 V vs. référence. • L’ajout de fer dans le réacteur induit une très forte augmentation de l’électroactivité dans l’ensemble des conditions testées avec un courant maximal de -3,6 A.m-2. Cette intensité est atteinte pour les bactéries cultivées en présence du fer et inoculées directement dans un réacteur contenant du fer. Ces données confirment l’importance du fer dans l’électroactivité de A. ferrooxidans. • Les voltamétries cycliques obtenues dans les réacteurs contenant du fer montrent que la catalyse ayant lieu à la cathode n’est plus celle de la réduction de l’oxygène mais du Fe(III) en Fe(II). Ainsi, le fer agirait comme médiateur redox pour la bactérie. • L’imagerie en microscopie confocale montre que les biofilms sont variables d’une condition à l’autre. Qu’elles se soient développées sur soufre ou sur fer, les bactéries directement inoculées dans un réacteur contenant du fer forment un biofilm tridimensionnel constitué de plusieurs couches de cellules qui relient les fibres de l’électrode entre elles. Ce résultat n’avait encore jamais été observé chez A. ferrooxidans dans la littérature. • Le comptage des cellules ayant une croissance planctonique dans les réacteurs indique qu’elles sont majoritairement présentes lorsque du fer est ajouté. Cette observation corrèle avec les fortes intensités de courant cathodique dans les réacteurs contenant du fer suggérant alors que l’utilisation du fer comme médiateur redox est plus efficace que le contact direct avec l’électrode. • L’ensemble de ces résultats montre que A. ferrooxidans est fort probablement capable d’utiliser la cathode grâce au cytochrome Cyc2 de manière directe par contact ou de manière indirecte en utilisant le fer comme médiateur rédox.

106 Chapitre IV : Transfert indirect d’électrons chez A. ferrooxidans

Dual role of iron in Acidithiobacillus ferrooxidans fuel cell performance

Nicolas Chaberta ‡, Agnes Rouxa ‡ and Wafa Achouaka,*

aAix Marseille Univ, CEA, CNRS, UMR7265, ECCOREV FR 3098, LEMIRE, Laboratoire d’Ecologie Microbienne de la Rhizosphère et Environnement extrêmes, F-13108 St Paul Les Durance, France

‡ Co-first authors

*Corresponding author: Lab Ecol Microb Rhizosphere & Environ Extrem (LEMiRE), 13108, Saint Paul-Lez-Durance, France. E-mail address: [email protected]

Abstract

Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270T offers great promise for biocathode development. Here, we monitored microbial fuel cells (MFCs) for biocathode formation, electrode colonization and planktonic growth in various culture conditions. Iron- supplemented reactors produced high current outputs of up to 3.6 A.m-2. In the absence of iron, electrode coverage, planktonic lifestyle and current production were highly diminished, indicating the central role of iron-based metabolism. Moreover, sulfur- cultured bacteria inoculated in iron-supplemented MFCs were able to promptly shift their metabolism and produce the same current as iron-cultured bacteria. Our cyclic voltammetry results revealed a dual role for iron in MFCs, in which iron simultaneously induced direct and indirect bacterial electron transfer, since it likely acts as a redox shuttle. In some conditions, bacteria formed a three-dimensional multilayered biofilm that developed in the spaces between the fibers. This is the first experimental evidence of such a structured A. ferrooxidans biofilm.

Keywords: Acidithiobacillus ferrooxidans; Biocathode; Microbial fuel cell; Iron; Electron transfer

107 Chapitre IV : Transfert indirect d’électrons chez A. ferrooxidans

1. Introduction

Microbial fuel cells (MFCs) use the metabolic activity of microorganisms to convert chemical energy to electricity through electron transfer (Santoro et al., 2017). These cells consist of an anode, which microorganisms use as an electron acceptor, and a cathode, where oxygen is reduced to water. While numerous studies have focused on the anode of MFCs, the cathodic compartment (which is often abiotic) has received less attention. Furthermore, the oxygen reduction rate at the cathode is limiting and requires expensive catalysts such as platinum. This underscores the urgent need for biologically catalyzed cathodes, which have the advantages of being cheaper and renewable (Kim et al., 2015).

The development of biocathodes is currently an area of great interest in MFC research (Kim et al., 2015). Nevertheless, whereas a wide range of bacteria can catalyze anodic reactions, few species are known to catalyze oxygen reduction at the cathode (Chabert et al., 2015). Acidithiobacillus ferrooxidans is a Gram-negative, acidophilic, chemolithoautotrophic bacterium that thrives in harsh environments and exhibits a versatile energy metabolism. It uses CO2 as a carbon source and recuperates energy mainly from the oxidation of ferrous iron (Fe(II)) or from reduced inorganic sulfur compounds (RISCs) at low pH, using O2 as the final electron acceptor. A. ferrooxidans is well known for its bioleaching activity, especially in acid mines (Mishra and Rhee, 2014). Previous studies have demonstrated the ability of A. ferrooxidans to generate current when implemented in an MFC (Carbajosa et al., 2010; Ter Heijne et al., 2007; Chabert et al., 2017). Recently, it was shown that iron-based metabolism results in a higher current output than sulfur-based metabolism (Chabert et al., 2017). This could be explained by the ability of iron to induce the synthesis of c-type cytochrome (Cyc2), which is involved in extracellular electron transfer (Rosenbaum et al., 2011; Kumar et al., 2015).

In the present study, we further investigated the impact of energy source and bacterial inoculation mode on current output, demonstrating that growth conditions greatly impact the capacity of A. ferrooxidans ATCC 23270T to produce a current. These results highlight the essential role of iron in electroactivity, as well as multilayered biofilm formation with A. ferrooxidans.

108 Chapitre IV : Transfert indirect d’électrons chez A. ferrooxidans

2. Materials and methods

2.1. A. ferrooxidans cultivation and electrode pre-colonization

A. ferrooxidans ATCC 23270T growth and pre-colonization of the 3 cm2 (1 cm x 3 cm) carbon felt GDL5 (PaxiTech) working electrode were performed in either 50 ml iron-

-1 -1 -1 supplemented medium (4.3 g.L (NH4)2SO4, 0.7 g.L MgSO4.7H2O, 0.7 g.L K2HPO4, 0.14

-1 g KCl and 0.014 g.L Ca(NO3)2.4H2O adjusted to pH 5.5 using H2SO4 and supplemented with a 30% (v/v) filtered solution (0.2 μM) of FeSO4.7H2O (0.4 M) adjusted to pH 1.4

-1 - using H2SO4) or in 50 ml sulfur-supplemented medium (0.4 g.L (NH4)2SO4, 0.4 g.L

1 -1 MgSO4.7H2O and 0.4 g.L K2HPO4 adjusted to pH 3.5 using H2SO4 and supplemented with ~2% (m/v) sterile sulfur powder). To increase gas exchange with the solution during bacterial growth, 250-ml containers were preferentially used. Cultures were incubated for 3 days at 30°C under agitation (150 rpm). The working electrode was attached to a 1.25 mm diameter titanium wire (GoodFellow).

2.2. Reactor construction and electrochemical measurements

Reactors were made from 250-ml glass bottles containing the growth medium with or without 15 mM FeSO4.7H2O. The reactors were sealed off by sponges to allow air diffusion and limit bacterial contamination during the experiment. An Ag/AgCl KCl- saturated electrode (Sigma) was used as the reference electrode and a 12 cm2 carbon felt RVG 4000 (3 cm x 4 cm; Carbon Loraine) was used as the counter electrode. When specified, pre-colonized electrodes were used as working electrodes. In others cases, reactors were inoculated using 5% (v/v) of bacterial culture grown on either iron or sulfur. Prior to inoculation, cultures were centrifuged twice at 1,000g for 5 minutes to eliminate iron or sulfur oxides. Controls were performed using sterile media or electrodes incubated for 3 days in sterile media at 30°C.

Reactors were connected to an MPG-2 potentiostat (BioLogic). Current production was monitored for 15 days by chronoamperometry (CA) with a poised potential at -0.2 V vs. the reference. Cyclic voltammetry (CV), performed after 15 days of experimentation, began after 5 min of open circuit voltage (OCV). The scan rate was 5 mV.s-1 between -0.8 to 0.8 V vs. the reference, whereas the starting point was 0 V vs. OCV. All analyses were performed in triplicate for each condition.

109 Chapitre IV : Transfert indirect d’électrons chez A. ferrooxidans

2.3. Confocal microscopy

Confocal microscopy was performed on a 0.25-cm2 section of electrode labeled with SYTO®9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain (Invitrogen), using a Fluoview FV10i (Olympus) automatic confocal microscope. Green-tagged cells were imaged using an excitation at 489 nm and an emission at 510 nm. Carbon fibers were red-imaged using an excitation at 645 nm and emission at 620 nm (Rousseau et al., 2016).

3. Results and discussion

A. ferrooxidans is one of the most studied bioleaching microorganisms, due to its ability to recover various metals such as copper, gold, zinc, cobalt, and uranium (Bevilaqua et al., 2004; Vera et al., 2013b). More recently, this species has been shown to produce current when utilized in MFCs (Carbajosa et al., 2010; Ter Heijne et al., 2007; Chabert et al., 2017). A. ferrooxidans utilizes separate pathways to oxidize sulfur and ferrous iron, with the result that the energy source used for growth largely influences bacterial electroactivity; indeed, only bacteria cultivated with Fe(II) were shown to be able to generate current, whereas those cultivated on sulfur were unable (Chabert et al., 2017). We cultivated this bacterium in media containing either Fe(II) or sulfur as the primary energy source. Figure 1-A reveals that Fe(II) is critical for current generation by A. ferrooxidans, confirming that bacteria cultivated in the presence of sulfur as the primary energy source produced a negligible current (Figure 1-A); by contrast, electrode pre- colonization occurred in iron-containing medium, A. ferrooxidans supplied -0.26 A.m-2 after 8 days, as previously reported (Chabert et al., 2017). Interestingly, the current reached a plateau at -1.22 A.m-2, 8 days after the iron-grown bacterial suspension was directly introduced in the reactors (Figure 1-A). Cyclic voltammetries (CVs) were conducted after 15 days to determine how growth conditions affect electrochemical reactions in the bio-electrode. The curve for the bacteria-free control did not display any peak, although the peak of O2 reduction could be observed at -0.8 V vs. the reference (Figure 1-C). Inoculation conditions induced a reduction peak with potentials ranging from -0.6 V vs. the reference for pre-colonized electrodes on sulfur to 0 V vs. the reference for iron-cultured bacteria directly inoculated in the reactor. In all cases, the O2 reduction peak was shifted to higher potentials. The reactor inoculated with iron-

110 Chapitre IV : Transfert indirect d’électrons chez A. ferrooxidans cultured bacteria produced the highest current output and exhibited the best oxygen reduction catalysis at a potential of 0 V vs. the reference. Under this same condition, small reduction and oxidation peaks were respectively observed at 0.2 V and 0.7 V vs. the reference, implicating another process in the cathodic current output (Figure 1-C).

Figure 1 : Electrochemical data monitored for biocathode formation using A. ferrooxidans ATCC 23270T under different operating conditions (with iron or sulfur as the primary energy sources) and inoculation methods (direct inoculation of a planktonic culture or pre-colonization of the working electrodes). CA values (-0.2 V vs. the reference; 30°C) were assessed for 15 days on carbon felt GDL5 electrodes. CA values are shown for reactors (A) without Fe(II) addition and (B) with Fe(II) addition to the

electrolyte (FeSO4.7H2O at 15 mM). CV was performed for 3 cycles at a scan rate of 20 mV.s-1 ranging from -0.8 to 0.8 V vs. the reference. CVs are shown for reactors (C)

without Fe(II) addition and (D) with Fe(II) addition to the electrolyte (FeSO4.7H2O at 15 mM).

111 Chapitre IV : Transfert indirect d’électrons chez A. ferrooxidans

Numerous studies have already deciphered the molecular mechanisms underlying the metabolic pathways of A. ferrooxidans (Quatrini et al., 2009). This bacterium uses CO2 as a carbon source and obtains its energy mainly from the oxidation of ferrous iron (Fe(II)) or reduced inorganic sulfur compounds (RISCs) that use O2 as the final electron acceptor

(Valdés et al., 2008). The electron chain transfer from Fe(II) to O2 is proposed to involve several partners, including the outer membrane Cyc2 cytochrome, that directly oxidize Fe(II) (Yarzábal et al., 2002a, 2002b). In contrast to iron, RISCs are initially internalized into cells, where several enzymes and electron carrier complexes allow electron transfer to O2. This drastic difference could explain why bacteria grown in Fe(II)-supplemented medium were electroactive whereas those cultivated on RISCs were not.

To analyze the role of iron in greater detail, we tested the effect of adding 15 mM

FeSO4.7H2O to the reactors. This concentration was selected because it did not impact the current output in bacteria-free reactors (Figure 1). As shown in Figure 1-B, the presence of iron in the reactors greatly increased current output in all conditions, ranging from -2.04 to -3.6 A.m-2 after 8 days. During the first 6 days the current output increased continuously and then slowly diminished to reach a plateau at around 13 days. Interestingly, bacteria cultivated with sulfur as the unique energy source could rapidly shift to iron metabolism and produce a high current output (Figure 1-B). The presence of Fe(II) may have induced the synthesis of Cyc2, which could then be utilized to capture electrons from the cathode. This may explain why bacteria grown on sulfur can rapidly produce current if Fe(II) is added to the reactor electrolyte. In contrast, the expression of cyc2 decreases rapidly when bacteria are transferred to a medium containing RISCs (Yarzábal et al., 2002a; Kucera et al., 2013). Altogether, our results reveal a crucial role for Fe(II) metabolism in A. ferrooxidans efficiency in MFCs.

In our experiments, CVs of iron-supplemented reactors behaved differently than those of iron-free reactors. In all cases, the presence of bacteria induced the appearance of a reduction peak with maxima observed at potentials ranging from 0.15 V to 0.18 V vs. the reference, and intensities ranging from -12 to -15 A.m-2. This suggests, in iron- supplemented reactors, that bacteria catalyze the oxidation of Fe(II) to Fe(III), and consequently the reduction of Fe(III) at the electrode. Even though oxygen reduction should take place, the Fe(III) reduction rate is probably much higher. Indeed, the large

112 Chapitre IV : Transfert indirect d’électrons chez A. ferrooxidans peak intensity corresponding to Fe(III) reduction could conceal the oxygen reduction driven by bacteria.

Bacterial growth conditions are crucial regarding energy production. When iron- cultured bacteria were directly inoculated in the reactors, 8-day current outputs were 4.6 times higher than when electrodes were pre-colonized (Figure 1-A). A. ferrooxidans is well known for its ability to form monolayer “biofilms” on substrates such as pyrite, from which it obtains its energy by oxidizing iron or sulfur (Yang et al., 2015). To further investigate the effect of bacterial lifestyle on biofilm formation, we performed confocal microscopic observations of the electrodes after 15 days. As expected, the confocal images displayed differences in biofilm development between the electrodes. In accordance with previous data, we observed that the bacteria pre-colonizing the electrodes formed few (if any) biofilms (Figure 2-A; Chabert et al., 2017). Surprisingly, whereas the inoculation of sulfur-grown bacteria led to low electrode coverage, bacteria pre-cultivated in iron-containing media developed as biofilms (Figure 2-B). Indeed, in this condition, confocal imagery revealed the presence of a monolayer biofilm that covered the carbon fibers (Figure 2-C). In contrast, for sulfur-grown bacteria, only a few cells were visible on the electrode carbon fibers (Figure 2-C).

We observed that inoculating planktonic cells directly in the reactors resulted in a higher efficiency than introducing pre-colonized electrodes in MFCs. It is generally accepted that A. ferrooxidans biofilm formation occurs primarily through the synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) and type IV pili (Yang et al., 2015; Barreto et al., 2005; García-Meza et al., 2013). However, transcriptomic analysis has demonstrated that cells have a greater capacity for tight adherence and pilus formation during growth in liquid, suggesting that planktonic cells are prepared to attach on to surfaces (Ossa Henao et al., 2014). This is in accordance with our results demonstrating that iron- grown planktonic bacteria attached and formed biofilms that were thicker than those formed on pre-colonized electrodes which did not progress in the reactor. In addition to biofilm factors, A. ferrooxidans attachment induces a set of metabolic adaptations that are not directly related to sulfur or iron oxidation pathways (Vera et al., 2013a). This difference in bacterial growth strategies could therefore explain how they lead to various current outputs, in which the more efficient output occurs when planktonic bacteria are directly inoculated in the reactor.

113 Without iron addition With iron addition

(A) Iron Sulfur (D) Iron Sulfur Pre-colonized electrode Pre-colonized -0.58 A.m-2 -0.09 A.m-2 -1.32 A.m-2 -0.17 A.m-2

(B) Iron Sulfur (E) Iron Sulfur

Chapitre IV : Transfert indirect d’électrons chez A. ferrooxidans

Without iron addition With iron addition

(A) Iron Sulfur (D) Iron Sulfur (C) (F) Planktonic cells inoculation Pre-colonized electrode Pre-colonized -0.58 A.m-2 -0.09 A.m-2 -1.32-1.58 A.m-2 -2.47-0.17 A.m A.m-2 -2 -2.62 A.m-2 -2.28 A.m-2

(B) Iron Sulfur (E) Iron Sulfur

Without iron addition With iron addition

(A) Iron Sulfur (D) Iron Sulfur (C) (F) Planktonic cells inoculation Pre-colonized electrode Pre-colonized 2 -2 -1.58 A.m-2 -2 -2.47-0.17 A.m A.m-2-2 -2.62 A.m-2 -2.28 A.m-2 -0.58 A.m- -0.09 A.m -1.32 A.m (B) Iron Sulfur (E) Iron Sulfur Figure 2 : Confocal microscopy imaging of carbon felt electrodes after 15 days of polarization at -0.2 V vs. the reference. Cells were labeled green using Syto®9, while carbon fibers appear in red. Electrodes were obtained from reactors inoculated with iron- or sulfur-pre-colonized electrodes (A and D) or iron- or sulfur-grown planktonic cells (B, C, E and F), and received either Fe(II) addition (D, E and F) or no Fe(II) addition (C) (A, B and C) wit(F) hin the electrolyte. White scale bar: 100 µm; black scale bar: 5 µm.

Planktonic cells inoculation We also performed a microscopic analysis of the electrodes implemented in the iron- supplemented reactors. After 15 days, we observed that pre-colonized bacteria presented a low coverage of the electrodes, whereas plankton-inoculated bacteria -1.58 A.m-2 -2.47 A.m-2 -2.62 A.m-2 -2.28 A.m-2 formed biofilms (Figure 2-D and E). As shown in Figure 2 (E and F), three-dimensional structures are present in iron- and sulfur-grown bacteria (Figure 2-E and F). Therefore,

114 Chapitre IV : Transfert indirect d’électrons chez A. ferrooxidans even though only A. ferrooxidans monolayer biofilms have been reported in the literature to date, our results demonstrate that this bacterium can also develop three- dimensional structures.

Although there is no direct correlation between biofilms and electroactivity, high current intensities were monitored with pre-colonized electrodes (Figures 1 and 2). These observations indicate that biofilm is not the only lifestyle involved in current output in iron-supplemented reactors. To confirm this result, we compared bacterial densities in each iron-supplemented reactor. Specifically, samples from the reactor solutions were collected after 15 days and observed by microscope to evaluate bacterial densities in each reactor. Bacteria were only detected in reactors running with planktonic iron-grown bacteria. As expected, we found a good correlation between planktonic growth and current output in the reactors, suggesting that planktonic lifestyle and iron are two factors that promote current output in A. ferrooxidans ATCC 23270T MFCs (data not shown).

Overall, our results indicate that the addition of iron in reactors greatly improves current production, regardless of the energy source used for the pre-culture. Furthermore, the CVs suggest that the underlying mechanism is different from the one that occurs when reactors are iron-free (Figure 3). Finally, iron-activated Cyc2 production was simultaneously involved in direct and indirect bacterial electron transfer, in which iron likely acted as a redox shuttle (Figure 3).

4. Conclusion

The current outputs that we observed varied from -0.05 A.m-2, when reactors were inoculated with bacteria pre-cultured on sulfur as the energy source, to -3.6 A.m-2, when reactors were inoculated with bacteria grown on iron and supplemented with 15 mM

FeSO4.7H2O. Therefore, this represents a 72-fold increase in current output. Aside from the expected Cyc2-mediated direct electron uptake from the cathode, our results indicate that Cyc2 is also likely involved in an indirect electron transfer by oxidizing Fe(II) to Fe(III), which is then reduced on the cathode. Significantly, these findings demonstrate for the first time that A. ferrooxidans can form a structured three- dimensional biofilm.

115 Chapitre IV : Transfert indirect d’électrons chez A. ferrooxidans

Figure 3 : Schematic representation of the main mechanisms involved in A. ferrooxidans ATCC23270T electroactivity. The direct extracellular electron transfer involving a c-type cytochrome Cyc2 (red) allows electron uptake from the cathode. Cyc2 is also involved in the uptake of electrons from Fe(II), converting it to Fe(III); this can then be reduced again on the cathode. This procedure can be performed by either planktonic or sessile bacteria. Both mechanisms can coexist if permitted by the reactor conditions. Sulfur metabolism does not allow electron uptake, as Cyc2 is absent.

5. Acknowledgements

This work was supported by an IRTELIS PhD program grant from the CEA. We acknowledge funding from the ANR BioElec (ANR-13-BIME-006) and Amidex Microbio- E programs, as well as the DRT/DSV program from the CEA.

6. Conflict of interest

The authors declare no conflicts of interest.

116 Chapitre IV : Transfert indirect d’électrons chez A. ferrooxidans

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119 Chapitre IV : Transfert indirect d’électrons chez A. ferrooxidans

3. Commentaires et perspectives

Les résultats obtenus lors de cette étude mettent en évidence l’importance du métabolisme bactérien dans son électroactivité. Ainsi les conditions environnementales de la bactérie telle que la composition de l’électrolyte ou encore sa provenance peuvent avoir un impact fort sur sa capacité à former une bioélectrode. De ce fait, les choix des modèles d’études pour la formation d’une bioanode ou d’une biocathode sont important et doivent impliquer de connaître à minima le métabolisme de ces derniers.

Cependant, bien que la bactérie Acidithiobacillus ferrooxidans soit la candidate idéale pour la formation et l’étude de biocathode, l’utilisation de celle-ci présente quelques aspects négatifs. Premièrement et du point de vue de l’étude fondamentale des mécanismes de transfert extracellulaire d’électrons, aucun outil génétique n’est disponible chez cette espèce. Bien qu’il soit malgré tout possible d’en élucider les quelques moyens mis en place par la bactérie pour utiliser la cathode, les hypothèses avancées dans nos travaux demandent une confirmation. Or il n’est pas meilleur moyen de confirmer que d’inactiver les gènes potentiellement impliqués dans de tels mécanismes. D’un point de vue fonctionnel, la bactérie A. ferrooxidans est à l’heure actuelle la bactérie capable de fournir le courant cathodique obtenu en culture pure le plus élevé dans la littérature. Toutefois, le pH acide nécessaire à l’obtention d’un tel courant de réduction n’est pas compatible avec les bioanodes les plus fonctionnelles rendant alors difficile son exploitation dans une PCM. Il est donc primordial de trouver un candidat travaillant à pH neutre.

120

Chapitre V

Production de courant cathodique à pH neutre via la chelation du fer ferrique par le DAPG produit par Pseudomonas brassicacearum NFM421

Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum

1. Contexte

Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC23270T a montré une très bonne efficacité pour la production de courant cathodique que cela soit par contact direct, impliquant un cytochrome, ou indirect impliquant le Fe(II) comme médiateur rédox. Cependant, l’utilisation de cette bactérie comme catalyseur des biocathodes nécessite de travailler dans des conditions acides qui ne sont pas favorables aux bioanodes. Il est donc nécessaire de trouver une nouvelle voie d’optimisation des biocathodes afin de pallier à ce problème.

L’utilisation de bactéries hétérotrophes est une alternative pour la formation de biocathodes à pH neutre, bien que moins efficaces que les bactéries chimioautotrophes. Le transfert indirect d’électrons utilisant le fer comme médiateur représente une bonne alternative pour travailler à pH neutre. Ce dernier ne mettant pas directement en jeu la bactérie. De ce fait l’utilisation de matière organique dans le réacteur n’est plus compétitive avec la cathode pour l’énergie. Cependant, pour des pH proches de la neutralité, le fer se trouve principalement sous forme insoluble et est donc peu biodisponible pour les bactéries mais également pour la cathode. De ce fait, il est nécessaire de trouver une bactérie capable de solubiliser le fer et de l’utiliser indirectement pour faciliter sa réduction à la cathode.

Les bactéries du genre Pseudomonas représentent de potentielles candidates pour œuvrer dans ce sens. Ces dernières regroupent des bactéries ubiquistes évoluant dans une grande variété d’environnements. Les Pseudomonas sont également connus pour produire des sidérophores et autres molécules solubles aidant à la récupération du fer afin de l’intégrer aux métalloprotéines nécessaires à leur métabolisme.

Plusieurs recherches se sont portées sur P. aeruginosa, un pathogène de l’homme, pour la formation de bioanode. Dans ce chapitre nous allons nous intéresser à Pseudomonas brassicacearum NFM421, une bactérie de la rhizosphère de l’arabette, qui sécrète elle aussi des molécules pouvant être impliquées dans le transfert extracellulaire d’électrons. Contrairement à A. ferrooxidans, des outils génétiques sont disponibles chez P. brassicacearum et peuvent s’avérer être nécessaires pour la compréhension des mécanismes de transferts extracellulaires d’électrons.

123 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum

2. Principaux résultats

Les résultats présentés dans ce chapitre font l’objet d’un article en préparation. Les principaux résultats sont les suivants :

● Pseudomonas brassicacearum NFM421 est capable de produire un courant cathodique sous une polarisation de -0,2 V vs. référence. ● Les courants de -0,15 et -0,10 A.m-2 obtenus en comparant la souche sauvage (WT) avec et sans fer, respectivement, mettent en évidence l’importance du fer dans l’électroactivité de la bactérie. ● La comparaison entre le WT et le mutant ΔphlD, ne produisant plus le 2,4- diacétylphloroglucinol (DAPG), montre que ce dernier a un rôle important dans l’électroactivité de la bactérie. ● L’utilisation d’un mutant NFM421-4D1 ne produisant pas de pyoverdine montre que celle-ci joue aussi un rôle dans l’électroactivité de la bactérie. Celle-ci permet de diminuer le temps de latence nécessaire pour la production de courant cathodique. ● La spectrométrie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) ainsi que la spectrométrie UV-Visible révèlent que le DAPG est un agent chélateur du fer. ● L’utilisation du DAPG pur en électrochimie indique que sous sa forme complexant le fer, le DAPG produit plus de courant et montre un plus grand pouvoir d’oxydation. ● Le complexe formé entre le DAPG et le Fe(III) pourrait agir indirectement sur la réduction de l’oxygène une fois que le Fe(III) associé au complexe a été lui même réduit en Fe(II) à la cathode. ● L’article met en avant une nouvelle navette redox dépendante du fer pour son fonctionnement et produite par P. brassicacearum NFM421 à pH neutre. De plus, le DAPG, très étudié pour son caractère antifongique, n’avait jamais été montré jusqu’ici comme pouvant être un agent chélateur du fer.

124 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum

Building biocathode with iron chelating 2,4-diacetylphloroglucinol produced by Pseudomonas brassicacearum NFM421

N. Chaberta,†, O. Amin Alia,†, C. Berthomieub, W. Achouaka,*

aAix Marseille Univ, CEA, CNRS, UMR7265, ECCOREV FR 3098, LEMIRE, Laboratoire d’Ecologie Microbienne de la Rhizosphère et Environnement extrêmes, F-13108 St Paul Les Durance, France bAix Marseille Univ, CEA, CNRS, UMR7265, ECCOREV FR 3098, Laboratoire des Interaction Protéine-Métal , F-13108 St Paul Les Durance, France

†both authors contribute equally to this work

*Corresponding author: Lab Ecol Microb Rhizosphere & Environ Extrem (LEMiRE), 13108, Saint Paul-Lez-Durance, France. E-mail address: [email protected]

Abstract

Bacteria involved in extracellular electron transfer mechanisms at the cathode, are less known than those that operate at the anode. The secondary metabolites of Pseudomonas brassicacearum pyoverdine and the antifungal compound, 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG), were studied for their involvement in electron transfer between bacteria and cathode. Microbial fuel cells reactors set up with the WT and a phlD mutant impaired in DAPG production, evidenced the importance of DAPG in cathodic reactions. In addition, when pyoverdine was missing the current output has been delayed as displayed when comparing the WT vs the mutant 4D1 for which the pyoverdine gene was deleted. Moreover, the addition of ferric iron improved performances from -0,1 A.m-2 to -0,15 A.m-2. Unexpectedly, infrared and UV-visible spectra indicated that DAPG chelated ferric iron providing a better reducing power at the cathode. Our results highlight a new indirect electron transfer mechanism occurring at the cathode involving the newly described DAPG-Fe complex.

Keywords: Pseudomonas brassicacearum ; Microbial fuel cell ; Biocathode ; Pyoverdine ; DAPG-Fe complex

125 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum

1. Introduction

Microbial fuel cells (MFCs) are devices that convert chemical energy stocked in organic matter into electrical energy using bacteria to catalyse reactions at the electrodes. For a long time, research has focused on the anodic reaction where bacteria catalyse organic matter oxidation and electron transfer toward the anode coupled to a cathode using noble metal, such platinum, as catalyst. Recently, cathodic reaction catalysing bacteria have been investigated. The extracellular electron transfer (EET) allowing bacteria electroactivity is direct when it involves membrane redox proteins such as cytochrome or conductive pili, indirect when it involves soluble electron shuttles (Schröder, 2007; Lovley, 2012).

While direct EETs occurring at the cathode are predicted to be similar to those observed at the anode (Rosenbaum et al., 2011), indirect EETs might act differently. At the anode different redox mediators produced by bacteria have been investigated such as phenazines (Rabey et al. 2005; Venkataraman et al., 2010) or flavins (Marsili et al., 2008; Von Canstein et al., 2008; Brutinel and Gralnic, 2012; Kitloski and Gralnick, 2013). However, very few studies have been conducted with mediators enabling EETs at cathode (Freguia et al., 2010; Aulenta et al., 2009).

Bacteria species belonging to Pseudomonas spp. are known to catalyse the anodic reaction. Pseudomonas aeruginosa is probably the most studied one and has shown capacity to catalyse anodic reaction using phenazines (Rabey et al., 2005; Pham et al., 2008; Venkataraman et al., 2010; Qiao 2015), quinone (Wang et al., 2013) and pyocianine (Shen et al., 2014) but as far as we know, none of them have been evidenced, yet, to operate at the cathode.

Interestingly, Pseudomonas spp. are ubiquitous bacteria (Goldberg, 2000) that highly depend on iron availability for their secondary metabolism (Lim et al., 2012, Deveau et al., 2016). However, iron insolubility in neutrophilic and oxygenated environments (Schwertmann, 1991; Stumm and Morgan, 1996) makes it an often limiting nutrient for bacterial growth. In order to make iron available for physiological purposes, bacteria secrete soluble low molecular weight organic molecules that can form complexes with dissolved Fe(III). Those organic compounds are siderophores for which synthesis is highly regulated to prevent energy losses and toxic reactions such as Fenton’s (Braun, 1997; Hersman et al., 2000; Andrews et al., 2003). They act as Fe(III) chelating agents

126 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum that solubilise iron and make it available for cell growth (Andrews et al., 2003; Cornelis, 2010). Among the diversity of existing siderophores, two are found only in fluorescent Pseudomonads: pyoverdin (Meyer and Abdallah, 1978; Meyer, 2000; Poole and McKay, 2003) and pyochelin (Cox et al., 1981; Braud et al., 2009).

Besides, siderophores are not the only soluble molecules secreted by Pseudomonas spp.. As cited above, a wide range of molecules such as quinone or phenazines could also be produced. In the plant-growth promoting Pseudomonads such as Pseudomonas brassicacearum (Zhou et al., 2012; Paulin et al., 2017), the 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG) is also excreted (Broadbent et al., 1976; Keel et al., 1990). DAPG is a low- molecular weight molecule, encoded by the phl genes cluster (Bangera and Thomashow, 1996; Moynihan et al., 2009), which is highly involved in plant protection against pathogens (Iavicoli et al., 2003; Rezzonico et al., 2007). In addition, phl genes expression and thus DAPG synthesis are also regulated by iron availability (Lim et al., 2012).

Given that the aromatic structure of DAPG (C10H10O5) presents high similarity with quinones, we addressed the question whether DAPG produced by the plant roots- associated bacterium P. brassicacearum NFM421, (Achouak et al., 2000) can act as a redox mediator in MFC. Furthermore, we also investigated how iron modulates the ability of the NFM421 strain to produce cathodic current.

2. Materials and methods

2.1. Electroactivity of P. brassicacearum

Three electrodes MFCs reactors were used. Electrochemical reactors were made of 250 ml glass bottle filled with 200 ml of electrolyte containing: 5 g.l-1 BactoTM Casamino Acids

-1 -1 (Difco); 1,18 g.l K2HPO4 and 0,25 g.l MgSO4.7H2O. The medium (CAA) was supplemented with 300 μM FeCl3 when needed. Reactors were inoculated using a CAA overnight cultures of P. brassicacearum NFM421 wild type strain, a mutant impaired in DAPG production (ΔphlD) and a mutant impaired in pyoverdine production (NFM421- 4D1). A sterilized cylindrical sponge (Sigma) was used to close reactors allowing air diffusion and avoiding external contamination. A 3 cm2 (1 cm x 3 cm) carbon cloth (Paxitech) was used as working electrode and 9 cm2 (3 cm x 3 cm) carbon felt RVG4000 (Carbone Lorraine) as counter electrode. Working electrode and counter electrode were

127 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum spaced 3 cm apart and hooked to titanium wires each (∅ 1,25 mm, Goodfellow). An Ag/AgCl/KCl saturated electrode (Sigma) was used as reference electrode. The three electrodes were connected to an MPG-2 potentiostat (BioLogic) for monitoring electrochemical experiments. Electrochemical data were recorded using Ec-Lab software (BioLogic). After 24 hours at the open circuit voltage (OCV), current production was monitored using chronoamperometry (CA) with a poised potential of -0,2 V vs. reference during a month.

2.2. Electrochemistry of DAPG

Electrochemical reactions of DAPG were monitored in the same conditions as those used for P. brassicacearum except that reactor volume was 20 ml and the electrode surfaces were 3 times smaller. Catholyte containing 10 mM DAPG (Sigma) was used. Cyclic voltammetry (CV) was performed at the end of experimentation. CVs started after 5 min to OCV. Scan rate was 5 mV.s-1 between -0,7 V to 0,7 V versus reference while starting point was 0 V versus OCV.

2.3. Fourier transform infrared spectrometry

The fourier transform infrared spectrometry (FTIR) spectra were recorded on a Bruker IFS66 spectrometer equipped with a DTGS-KBr detector and an Attenuated Total Reflection (ATR) device fitted with a 9 bounce diamond microprism (4.3 mm surface diameter, ZnSe optics, SensIR Technologies, CT). The FTIR spectra were recorded on 5 µL of samples in ethanol deposited and dried on the ATR crystal. The complexes of DAPG and Fe(II) or Fe(III) were prepared from concentrated solutions of FeCl3 (1 M) or FeCl2(1 M) and DAPG 0,1 M in ethanol. Each absorption spectrum corresponded to 25 co-added scans recorded at 4 cm-1 resolution. All frequencies are reported with an accuracy of ± 1 cm-1.

The electrochemically-induced FTIR difference spectra were obtained using a thin- pathlength electrochemical cell equipped with CVD-diamond windows as described in Vita et al., 2013. Oxidizing (0 V vs. Ag/AgCl/3M KCl) and reducing (-0,7 V vs. Ag/AgCl/3M KCl) potentials were applied using EG&G potentiostat. 200 scans were

128 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum recorded for each spectrum and the results from 9 redox cycles were averaged to obtain the spectra of Figure 5.

3. Experimental results and discussion

3.1. Ferric iron and DAPG improve current intensity produced by P. brassicacearum at the cathode.

Pseudomonas spp. are known to produce anodic current using phenazine (Pham et al., 2008; Zhang et al., 2011; Qiao et al., 2015) and pyocianin (Shen et al., 2014; Zheng et al., 2015). As P. brassicacearum NFM421 is also capable of producing closely related molecules, we have investigated the possibility of using it to build an aerobic bioelectrode. We focused on the role of two molecules pyoverdine and DAPG. For this purpose, we used the NFM421 wild type strain (WT), a mutant ΔphlD that does not produce DAPG (Laveilhé et al., submitted) and a mutant NFM421-4D1 that does not produces pyoverdine (Matthijs et al. 2016). Besides pyoverdine, P. brassicacearum produces secondary siderophore ornicorrugatin, a lipopeptidic siderophore, which has a relatively lower affinity for iron (Matthijs et al., 2016).

First the overall chronoamperograms show that P. brassicacearum NFM421 is capable of producing cathodic current for more than a month (Fig. 1). Then, closer observation of the data can glimpse the processes involved in electroactivity of the NFM421 strain.

The comparison of WT and mutants in the absence of iron shows that mutant NFM421- 4D1, which does not produce pyoverdine, is not able of producing cathodic current. However, ΔphlD and WT lead to a current production of -0,08 A.m-2 and -0,1 A.m-2 respectively after a latency time of 15 days (Fig. 1). These results suggest that pyoverdine may be directly or indirectly involved in the ability of P. brassicacearum NFM421 to produce cathodic current. Whether pyoverdine acted as a redox shuttle, though, to our knowledge this has not yet been described. Otherwises, iron uptake by pyoverdine is required for the synthesis of other molecules involved in bacterial electroactivity as iron is a constituent of enzymes with critical roles in various metabolic pathways including electron transfer. It is known that species of genus Pseudomonas finely regulate their secondary metabolism according to the availability of iron (Lim et al., 2012, Deveau et al., 2016) and that iron can also promote electroactivity (Chabert et

129 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum al., 2017). Supplementation of the reactors with iron effectively led to the production of cathodic current by WT as well as by the phlD and NFM421-4D1 mutants (Fig. 1). The maximum cathodic current intensity recorded was -0,15 A.m-2 for the WT in the presence of Fe(III). Mutants NFM421-4D1 and ΔphlD were able to reach -0,12 A.m-2 and - 0,1 A.m-2 respectively. It is interesting to note that the presence of Fe(III) not only affected the intensity performances but also the latency period. Indeed, the pyoverdine- free mutant NFM421-4D1 started current production after 20 days whereas no current was produced under iron depleted conditions while both WT and DAPG free mutant ΔphlD started cathode oxidation after 10 days instead of 15 days when Fe(III) is depleted.

0 -0,02 0 5 10 15 20 25 30 35 -0,04 -0,06 -0,08 A.m-2 -0,1 -0,12 -0,14 -0,16 -0,18 -0,2 Time (Day)

Figure 1 : CA performed at -0,2 V. vs. reference at 30°C on carbon cloth electrodes for P. brassicacearum NFM421 WT (purple line), ΔphlD (grey line), mutant NFM421-4D1

(orange line), WT with 300 μ M FeCl3 (blue line), ΔphlD with 300 μ M FeCl3 (red line)

and mutant NFM421-4D1 with 300 μ M FeCl3 (green line).

Therefore, the CA results suggest that EET inducing cathodic current output with P. brassicacearum as biocatalyst may rely on indirect EET, involving secondary metabolites as DAPG. Other arguments are against direct EET. Indeed, Pseudomonas growth on casamino acids medium takes 24 to 48 hours to reach its maximum (Frimmesdorf et al. 2010) while 10 days were needed to record the start of the current generation. Thus, if

130 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum direct EET were to occur, this would have occurred once the growth had reached its maximum, suggesting that biofilm is not required to produce electricity and that direct EET may not be involved (Borole et al., 2011b).

Electrochemical data (Table 1) demonstrate the importance of iron in the activation of bacterial electroactivity by reducing the latency time from 15 to 10 days except for the NFM421-4D1 where current started after 20 days. This delay might be explained by the lower affinity of ornicurrugatin for iron (Matthjis et al., 2008; Matthjis et al., 2016). In fact, under iron depleted conditions, no current output could be recorded, while under iron repleted conditions, current generation occurred although took longer reaching up to -0,12 A.m-2 suggesting that iron uptake may have been slower over time than for WT and ∆phlD mutant (Fig. 1; Table 1). Probably, the intracellular iron content requires a certain level to activate electroactivity. Whether iron was required for, secondary metabolism as it is finely regulated by iron (Palma et al., 2003; Lim et al., 2012), or for the synthesis of metalloproteins that might be directly or indirectly involved in current output. Altogether, these data suggest that likely intracellular and extracellular iron contents play a crucial role in the electroactivity of P. brassicacearum.

It is worth noting that pyoverdine synthesis is finely regulated by iron availability via the repressor Fur (Escolar et al., 1999; Vasil and Ochsner, 1999) and other regulators (Venturi et al., 1995; Ravel and Cornelis, 2003; Cornelis et al., 2009). Pyoverdine is highly produced under iron depleted conditions until saturation (Gupta et al., 2001; Manwar et al., 2004; Lim et al., 2012), whereas under iron repleted conditions, it is produced during the first 24h and then its synthesis decreases rapidly until disappearance (Visca et al., 1992) to prevent Fenton’s reaction (Salvail and Massé, 2012). Pyoverdine could not therefore have contributed to the production of current output in WT and ∆phlD mutant under iron-rich conditions, while its contribution can not be excluded under iron-limiting conditions, where unlike the pyoverdine free mutant NFM421-4D1, WT and ∆phlD mutant were able to generate current.

The ΔphlD mutant was used to investigate the potential role of the DAPG as redox mediator. When DAPG was missing, current decreased by about 30 % compared to the WT (Fig. 1; Table 1) suggesting a likely implication of DAPG in current output. This assumption is supported by the iron-dependency for DAPG synthesis to take place (Lim et al., 2012; Almario et al., 2013).

131 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum

Electroactivity of strain NFM421 could involve other mechanisms. Under iron-rich conditions neither pyoverdine nor DAPG are produced by the mutant the ΔphlD however, it produced -0,1 A.m-2 (Table 1) which corresponds to 66 % of the maximum current obtained in this work. Cyanide is among the metabolites produced by P. brassicacearum (Lalaouna et al., 2012; Zhou et al., 2012). Cyanide synthesis relies on the hcnABC genes whose expression is positively regulated by iron (Blumer and Haas, 2000). In the presence of iron, cyanide interacts with it to form ferricyanide, which is well known for its electrochemical activity and to improve cathode performances (Oh et al., 2004; Borole et al., 2011a). Thus, cyanides produced by P. brassicacearum might also be involved in cathodic reactions but this hypothesis must be confirmed by using, a mutant impaired in cyanide production. However, the implication of DAPG in the cathodic reduction catalysis is demonstrated with an appropriate genetic construct the PhlD mutant, which is impaired in DAPG synthesis.

Table 1 : Current production by WT strain, NFM421-4D1 and ΔphlD mutants in the presence and absence of Fe (III). Pyoverdine and DAPG potential productions are indicated as well as the start-up time of current generation. NE: non expected.

Current Final current Pyoverdine DAPG Fe(III) production intensity

presence presence addition start time reached (day) (A.m-2)

NFM421- - + - / 0 4D1 - + + 20 -0,12 + - - 15 -0,08 ΔphlD NE - + 10 -0,1 + + - 15 -0,1 WT NE + + 10 -0,15

3.2. Iron chelation by DAPG

Our data seemed to indicate an involvement of DAPG in the electroactivity of the NFM421 strain, moreover this activity was improved in the presence of iron suggesting that either iron simply increased DAPG production or they interacted together. To

132 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum determine whether DAPG interacted with Fe(II) or Fe(III) cations we used UV-Vis and FTIR spectroscopies.

Upon addition of Fe(III) cations to a DAPG solution in ethanol, main spectral changes concerned a decrease in intensity of IR bands of DAPG at 1618-1593 cm-1 and at 1288 cm-1, and the appearance of new IR bands at 1528 and 1425 cm-1 associated with the formation of a FeIII-DAPG complex (Figure 2-A). For DAPG, the bands at 1618-1593 cm-1 can be assigned to a coupling of the acetyl ν (C=O) mode and ring ν (C=C) modes, while the band at 1288 cm-1 can be assigned to the ν (C-OH) of the phenolic groups (Fig. 2A black line). The new bands at 1528 and 1425 cm-1 (Fig. 2A-red line) strongly suggest a bidentate coordination of Fe(III) by DAPG that involves a carbonyl and hydroxyl group, as illustrated in Figure 4. Indeed the strong downshift of the ν (C=O) mode frequency indicates that the carbonyl oxygen is involved in the coordination of the metal ion and the upshift of the ν (C-O) mode frequency indicates a deprotonation of the phenolic oxygen and its direct interaction with Fe cation.

Spectra recorded with different relative concentrations in DAPG and Fe(III) cation further suggest that two DAPG molecules are involved in the coordination of Fe(III) (not shown). At higher Fe(III) to DAPG ratios, the FTIR spectra are further modified. DAPG molecules can be involved in the coordination of two iron cations and this may explain the spectra obtained at a DAPG:Fe ratio of 1. Only small changes are observed between the FTIR spectra recorded with Fe(III) and Fe(II). They consist in small frequency changes of the bands characteristic of the formation of a Fe-DAPG complex with bands at 1532 and 1426 cm-1 for the Fe(II)-DAPG complex.

The UV-Vis spectra also confirmed the formation of a DAPG-Fe(III) complex, with the apparition of a large band at 226 nm (that could be due to the deprotonation of the phenolic oxygen) and charge transfer band at 322 nm (that could be a n to π* transition of the carbonyl oxygen) (Lieu et al, 2008) upon addition of Fe(III) to the DAPG solution in ethanol (Figure 3). Bands in the same region were observed upon formation of 2- hydroxyacetophenone – europium complexes.

133 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum FTIR absorption of DAPG - Fe(III) complex FTIR absorption of DAPG - Fe(III) complex

A A

0,6

0,6 1618 - - 1593 - - 1618 - 1585 - 1593 - 1585 1598 1598

0,4 - 1288 - - 1367 -

0,4 1528 - - 1288 - - 1367 - - 1528 - - 1425 - - 1197 - Absorbance - 1425 - 1428 - 1197 - Absorbance 1203 1428 1512 - 1404 - 1223 1203 1512

0,2 1404 - - 1112 - 1223

0,2 823 - - 966 - - 1112 - 1121 983 - 823 - - 966 - 1121 983

0,0 0,01800 1600 1400 1200 1000 800 1800 1600 1400 1200 1000 800 Wavenumber (cm-1) Wavenumber (cm-1) DAPG seul DAPG seul 100 DAPG - 50 FeIII 100FTIR DAPG absorption- 5020 FeIII of DAPG - Fe(II) complex 100FTIR DAPG absorption- 2030 FeIII of DAPG - Fe(II) complex 100 DAPG - 30 FeIII B B 0,8 0,8 - 1618 - - 1618 -

0,6 1593 -

0,6 1593 - 1587 1587 1610 - 1532 - 1610 - 1532 - - 1288 - - 1367 - - 1288 - 0,4 1367 - 0,4 1426 - - 1426 - - 1197 - Absorbance 1428 - 1197 - Absorbance 1205 1428 - 1404 - 1512 1205 - 1404 - 1223 - 1112 - 0,2 1512 1223 - 823 - - 966 - 1122 - 1112 - 0,2 983 - 823 - - 966 - 1122 983

0,0 0,01800 1600 1400 1200 1000 800 1800 1600 1400 1200 1000 800 Wavenumber (cm-1) Wavenumber (cm-1) DAPG DAPG10DAPG - 3 Fe(II) 10DAPG10 DAPG - - 3 5 Fe(II) Fe(II) 10 DAPG - 5 Fe(II)

Figure 2 : FTIR spectra of A) DAPG-Fe(III) complex and B) DAPG-Fe(II) complex obtained using different ratio between DAPG and Fe.

134 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum

Figure 3 : UV-visible spectra ranging from 200 to 700 nm for the DAPG alone and different ration of DAPG-Fe(III)

3.3. Electrochemistry of the DAPG

To test the hypothesis that the Fe(III)-DAPG complex is involved in electroactivity, abiotic reactors were built using a catholyte containing 10 mM of DAPG. Under a poised potential of -0,2 V vs. reference, the current intensity was -0,05 A.m-2 and -0,11 A.m-2 in the absence and presence of Fe(III), respectively (Fig. 4A). The Fe(III)-DAPG complex increases the current output by 120 %. Moreover, the CV showed that when the DAPG is complexed with Fe(III), the reducing power at the cathode increased as indicated by the reduction occurring around -0,4 V vs. reference (Fig. 4B). Thus, the data confirm that chelation of Fe(III) by DAPG leads to an improvement of cathodic current intensity. In such system, Fe(III) is essential for electron transfer because it gives the DAPG-Fe complex better oxidising power.

135 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum

Figure 4 : Electrochemistry of DAPG with A) CA performed at -0,2 V. vs. reference and 30°C on carbon cloth in CAA electrolyte using 10 mM of DAPG (blue line) and 10 mM of

-1 DAPG with 30 ⎧M FeCl3 (red line). B) CV performed for 5 cycles at a scan rate of 5 mV.s . Profiles are obtained from 10 mM of DAPG (blue line) and 10 mM of DAPG with 30 ⎧M

FeCl3 (red line) after 60 min of polarization at -0,2 V vs. reference.

FTIR spectra showed that complexes of DAPG could be formed with Fe(III) and Fe(II) cations. In addition, we tested the reactivity of such complexes by using electrochemically-induced FTIR difference spectroscopy at a gold electrode. We could observe a high reversibility of oxidation (and reduction) of the Fe-DAPG complexes applying oxidizing and reducing potentials of 0 and -700 mV, respectively (vs. Ag/AgCl/3M KCl), as shown by the reduced-minus-oxidized (and oxidized –minus-

136 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum reduced) FTIR difference spectra (Fig. 5). Thus, Fe-DAPG complex appears to be stable over multiple redox cycle suggesting therefore that Fe remains chelated to the DAPG whether it is Fe(II) or Fe(III). Moreover, this result assumes that Fe-DAPG complex can act Electrochemically-induced as redox mediator for either FTIR oxidation difference or reducti spectraon depending recorded on the with iron’s DAPG ionic and Fe charge. oxidizing potential -0 mV, reducing potential -700 mV vs Ag/AgCl 3M KCl

0,003

0,002 -1580 - 1540 - 1619 0,001 - 1371 - 1394 - 1456 - 1406 - 1333 - 1295 - 1270 - 1211 - 965 0,000

* 1111 - 1111 -0,001 - 1250 1135 - 1135 1492 - 1492 1355 - 1355 1430 - 1430

-0,002

-0,003 1800 1600 1400 1200 1000 800 Wavenumber (cm-1)

Figure 5 : Electrochemically-induced FTIR difference spectra recorded with DAPG and Fe (ratio 2-1). The blue line represents Red minus Ox and the red line represents Ox minus Red. ox -minus- red red -minus- ox

4. Proposed mechanism underlying cathodic catalysis by Fe-DAPG chelated complex

Pseudomonas sp. shows diverse ways to produce cathodic currents using diverse soluble redox molecules (Rabey et al., 2005; Pham et al., 2008; Venkataraman et al., 2010; Wang et al., 2013; Shen et al., 2014; Qiao 2015). These redox molecules like phenazines are usually secondary metabolites, some of which have an antifungal function. As part of this

137 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum work, we considered whether the antifungal compound DAPG produced by P. brassicacearum NFM421 strain could function as an electron shuttle, which we demonstrated. Then, for the first time, we have highlighted the iron chelation by DAPG, giving it a cathodic reduction function, which is is in accordance with Chung et al. (2012) who showed that Fe-chelating agents improve cathodic performances.

But while the reduction process of the complex Fe(III)-DAPG is understood what happens next is less clear. Since Fe(III) is reduced to Fe(II), Fe(III) concentration is supposed to decrease over time. But as shown by the stability of the maximum current intensity obtained, spontaneous oxidation of the reduced complex may take place. One of the Fe(II) oxidation way might be explained by a bacterial metabolism (Fig. 6). Pseudomonas spp. are not highly described as metal-oxidizing bacteria except for some species like Pseudomonas sp. HerbB that is able to oxidize olivine for its growth (Popa et al., 2012), P. stutzeri that oxidize iron or P. putida enabling manganese oxidation. Such metabolism is not described for P. brassicacearum. Indeed, as P. brassicacearum has not been investigated in this way, therefore such oxidation of the Fe(II)-DAPG complex might occur. Abiotic oxidations are probably more credible to explain oxidation of Fe(II). As it has been shown by FTIR coupled to cyclic voltammetry, Fe(III) chelated to DAPG can assume many redox cycles with a total reversibility of the Fe(III)-DAPG and Fe(II)- DAPG complexes suggesting that counter electrode could act as an oxidant for the reduced Fe-DAPG complex. However, this hypothesis assumes that the Fe-DAPG complex is enough diffusible in a stationary system to quickly circulate from one electrode to another. The last possible way to oxidize Fe(II) is the most probable phenomenon occurring in the system. It relies on spontaneous oxidation due to oxygen (Morgan and Lahav, 2007). Such phenomenon has been described with a cathode catalyzing the Fe(III) reduction (Lefebvre et al., 2012). Moreover, Freguia et al. (2010) described phenomenon of pyrroloquinoline quinone auto-oxidation by oxygen once reduced at the cathode. The same process is described for electricity production at the cathode with Fe(III)-EDTA complex (Deng et al., 2009). Aelterman et al. (2009) had shown that abiotic Fe(III) chelating agents drive cathodic oxygen reduction catalyzed by spontaneous oxidation of Fe(II) in contact with oxygen. Thus, it is believed that the same process may happen in our system, in which Fe(II) catalyzes oxygen reduction at the cathode (Fig. 6). However, this work provides a biological intervention to obtain the same process with interesting performances.

138 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum

Figure 6 : Proposed model occurring with a biocathode formed with Pseudomonas brassicacearum NFM421. DAPG is produced by the strain and chelates Fe(III) which is then reduced at the cathode (Red arrows). Once the complex is reduced, two abiotic pathways are predicted to occur. Complex could be reduced by diffusing to counter electrode acting as anode (dotted grey arrow). The other pathway allows a direct catalysis of the oxygen reduction as the reduced complex can be spontaneously oxidized by dissolved oxygen (full grey arrows).

5. Conclusion

In the present work, we demonstrate that P. brassicacearum NFM421 is able to produce electricity using DAPG, which chelates iron forming the not yet described complex Fe- DAPG. Infrared and UV-visible spectra demonstrated the better reducing power at the cathode of DAPG chelating Fe(III) highlighting a new indirect electron transfer mechanisms occurring at the cathode. In addition, our data suggest a new mode of

139 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum action for DAPG by sequestering iron and likely making it less available for pathogens that are insensitive to the toxic effect of DAPG, thereby preventing the pathogens’ access to the already limited pool of soluble iron in the rhizosphere.

6. Acknowledgements

This work was supported by an IRTELIS Ph.D. program grant from the CEA. We acknowledge funding from the ANR BioElec (ANR-13-BIME-006), the Amidex Microbio- E program, and the CEA’s DRT/DSV program.

7. Conflict of interest

The authors declare that they have no conflict of interests.

8. References

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147 Chapitre V : Conception de biocathode avec P. brassicacearum

3. Commentaires et perspectives

Bien que nous ayons mis en évidence le fait que les bactéries hétérotrophes ne sont pas des candidates idéales pour concevoir des biocathodes catalysant la réduction de l’oxygène, il semble que ceci ne puisse pas se généraliser. En effet, la bactérie Pseudomonas brassicacearum NFM421 est une bactérie hétérotrophe capable de catalyser la réduction de l’oxygène à la cathode. Cependant, le mécanisme permettant une telle réaction est différent de celui attendu lors du criblage réalisé dans le chapitre II.

Dans le cas présent, la bactérie n’intervient pas directement dans la catalyse. Cette dernière est présente seulement pour la synthèse du DAPG agissant comme médiateur dans la réduction de l’oxygène grâce à la chélation du Fe(III). Le processus de réduction est bien compris. Le DAPG solubilise le Fe(III) en le chélatant puis se réduit sur la cathode. Une fois réduit, le Fe(II) s’oxyde spontanément avec l’oxygène réduisant ainsi ce dernier. Bien que l’auto-oxydation du Fe(II) ne soit qu’une simple hypothèse émise parmi d’autres, celle-ci reste la plus probable dans un tel système.

Ainsi, entre le travail réalisé sur Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC23270T et Pseudomonas brassicacearum NFM421, nous avons mis en évidence que les métaux et notamment le fer avait un rôle majeur dans la conception d’une biocathode. Cependant, les performances obtenues avec P. brassicacearum sont loin d’égaler celles obtenues avec A. ferrooxidans. Or, les biocathodes doivent être performantes et opérationnelles à pH neutre afin d’être compatibles avec les bioanodes et permettre de rendre les PCM fonctionnelles. Tant que ce défi n’aura pas été relevé, l’utilisation de catalyseur métallique tel que le platine restera le choix le plus performant bien que moins durable. Cependant, de part leurs interactions avec les métaux, les biocathodes peuvent présenter d’autres applications que la production d’énergie. Des applications parallèles aux biocathodes ont déjà été envisagées. Ces dernières utilisent, par exemple, les biocathodes comme puits à CO2 et pour la synthèse de molécules à haute valeur ajoutée. Se rendant compte que la formation d’une biocathode pour améliorer les performances des PCMs en terme de production de courant, est de moins en moins envisageable, nous avons orienté les travaux vers de nouvelles applications utilisant les biocathodes.

148

Chapitre VI

Extraction de métaux lourds et de terres rares : applications environnementales des biocathodes.

Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

1. Contexte

Les précédents travaux ont montré qu’il était possible de concevoir une biocathode fonctionnant à pH neutre ou acide. En revanche, les biocathodes formées à pH neutre se sont révélées moins efficaces pour catalyser la réduction de l’oxygène. Or, à l’heure actuelle, les bioanodes fonctionnent essentiellement à pH neutre rendant difficile leur compatibilité avec des biocathodes efficaces. De fait, les connaissances sur les biocathodes ne permettent pas encore leur utilisation en vue de remplacer les catalyseurs onéreux tel que le platine dans la production d’énergie.

Cependant, les piles à combustible microbiennes profitent de diverses applications couplées à une faible production d’énergie. En effet, les bioanodes trouvent des applications dans le traitement des eaux usées, le tout couplé à la production d’énergie qu’elle tire de la matière organique. A l’inverse, pour fonctionner, la cathode nécessite un apport d’énergie afin de fournir des électrons au système. Dans ce sens, deux solutions existent : l’utilisation d’une bioanode pour fournir ladite énergie ou un générateur tel qu’un potentiostat. Dans le premier cas, le système s'auto-entretient alors que le second a un coût énergétique. Cependant pour que la bioanode fonctionne, l’échantillon doit s’y prêter (condition anaérobie, source organique, etc.).

Du fait des fortes interactions que nous avons démontrées entre la biocathode et le fer, nous avons entrepris une étude sur une possible application environnementale des biocathodes en relation avec la transformation des métaux, voire des terres rares, ces dernières représentant un enjeu tant économique qu’écologique.

Il existe une grande diversité de sites riches en métaux. Ces sites peuvent être naturellement enrichis en métaux mais se trouvent également être des sites subissant ou ayant subi une forte pression anthropique. De ce fait, l’application envisageable se rapprochera plus de la bioremédiation. Cependant, la transformation et la récupération des métaux sur ces mêmes sites peut avoir un intérêt économique non négligeable concernant notamment les métaux stratégiques dont les les terres rares.

Les terres rares représentent un groupe de 17 métaux ayant des applications technologiques potentielles. Leur utilisation remonte aux années 1970 avec l’utilisation de l’yttrium pour la fabrication de tubes cathodiques. Depuis, les terres rares font partie de métaux stratégiques au niveau de l’économie mondiale. Or leur répartition est inégale sur Terre. Bien qu’elles soient bien répandues sous forme de traces, la majorité des

151 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes gisements exploitables se situent en chine (50% d’après l’USGS, 2010) qui possède ainsi le monopole de ce commerce. D’autres pays tels que les Etats Unis et l’Australie possèdent aussi des gisements importants de terres rares, restés longtemps inexploités pour des raisons de sécurité environnementale. Cependant, l’augmentation récente des prix des terres rares a incité la réouverture de ces gisements inexploités ainsi qu’à de nouvelles prospections aux détriments de la sécurité environnementale et de la santé publique. A l’heure actuelle, seuls deux gisements sont exploités en dehors de la Chine. Les terres rares représentent donc un réel enjeu économique estimé à 3,8 milliards de dollars en 2014 d’après la revue spécialisée Bloomberg. Actrices de réelles tensions géopolitiques et économiques, il devient crucial de développer de nouveaux outils permettant une extraction et une récupération durable de cette ressource.

Bien que l’ampleur de la fraction extraite ne soit pas comparable aux tonnes de terres rares actuellement extraites et commercialisées, les PCMs et les biocathodes peuvent représenter une excellente voie de récupération durable de ces éléments présent sous forme de traces de part les fortes interactions entre les métaux et les électrodes.

2. Principaux résultats

Certains des résultats présentés dans ce chapitre font l’objet d’un article en préparation. Les études ont porté sur deux d’échantillons, le phosphogypse et l’étang de Berre. Les principaux résultats sont les suivants :

Phosphogypse :

● L’utilisation du phosphogypse comme inoculum d’une PCM permet la production d’un courant cathodique de -0,6 A.m-², par application d’une tension de -0,3 V vs. référence. En revanche, il n’a pas été possible de former de bioanode à partir de cet échantillon. ● Dans ces conditions opératoires, de nombreux métaux sont récupérés sur l’électrode de travail (i.e. la biocathode). Parmi ces métaux sont retrouvés des métaux précieux tel que l’argent, extrait jusqu’à 99 % (51 µg.cm-2 d’électrode) mais également des métaux stratégiques comme les terres rares avec des rendements allant de 12 % pour le lanthane (3,28 µg.cm-2 d’électrode) à 42 %

152 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

pour le gadolinium (2,21 µg.cm-2 d’électrode).

Etang de Berre:

● La même expérience a été réalisée en mésocosme et in situ dans l’étang de Berre. Les résultats montrent que l’implantation de la PCM in situ fonctionne, bien que celle-ci délivre moins de puissance que dans le mésocosme avec 5.6 mW.m-² (8.13 mA.m-2) et 21 mW.m-² (56.5 mA.m-²) respectivement. ● Des métaux sont également retrouvés sur les PCMs mais ici, les électrodes provenant du in situ présentent des concentrations plus importantes que celles provenant du mésocosme. ● Parmi les métaux séquestrés aux électrodes se retrouve de l’or avec un taux de récupération allant jusqu’à 90 % mais également jusqu’à 16 % des terres rares présentes. ● A l’exception de l’or et des terres rares, les biocathodes sont plus performantes dans l’extraction des métaux. ● Les mécanismes sous-jacents à la séquestration des métaux sur les électrodes ne sont cependant pas encore bien décrits mais il en résulte tout de même que le processus est lié de près ou de loin à l’activité microbienne sur les électrodes qui impose ainsi un potentiel permettant l’électrodéposition des métaux. ● Ces travaux montrent pour la première fois la possibilité d’extraire des terres rares à l’aide d’une PCM fonctionnelle.

153 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

3. Résultats préliminaires : Le phosphogypse

La production d’énergie par les biocathodes est une perspective de plus en plus difficile à envisager. La difficulté de concevoir une biocathode efficace et compatible avec une bioanode, ainsi que l’utilisation de la PCM pour produire de l’énergie de masse a même été décrite comme impossible à réaliser par des experts du domaine lors d’un récent congrès international. De ce fait, pour rendre la technologie viable, il est nécessaire d’orienter les recherches vers des domaines d’applications parallèles couplés à la production d’énergie ou bien d’envisager la PCM comme un système électrochimique auto-entretenu et, de ce fait autonome, pour des applications environnementales.

Nous avons alors envisagé l’utilisation de la biocathode comme un outil dans la bioremédiation et la séquestration des métaux. En effet, cette dernière semblant grandement dépendre des métaux tel que le fer pour son fonctionnement. Il est envisageable qu’elle puisse également intervenir sur l’état rédox d’autres métaux et favoriser ainsi leur changement d’état à sa surface. Dans ce but, nous avons utilisé la biocathode pour la valorisation et le traitement de déchets acides riches en métaux : le phosphogypse (PG).

Le PG est un sous produit acide obtenu lors de l’extraction et la production du phosphate. A titre illustratif, la production d’une tonne d’acide phosphorique implique la production en parallèle de 5 tonnes de PG (USEPA, 2002). De ce fait, la production mondiale de PG est estimée entre 100 et 280 millions de tonnes par an (Parreira et al., 2003 ; Yang et al., 2009). De plus, le PG, bien qu’essentiellement composé de sulfate de calcium, est très riche en radionucléides et métaux (Rutherford et al., 1995). Or, il n’existe à l’heure actuelle aucune solution concrète visant à sa dépollution et le PG est accumulé sous forme d’immenses dunes ou même déversé dans les océans causant d’importants dégâts environnementaux. De plus, malgré les quelques rares applications dans le bâtiment (Kumar, 2003 ; Parreira et al., 2003 ; Yang et al., 2009) , l’exploitation du PG dans le domaine de récupération des métaux peut présenter un intérêt aussi bien économique qu’écologique.

Une étude menée au laboratoire sur sa composition élémentaire par ICP-MS révèle la présence de métaux d’intérêts. En effet, au delà de la présence d’arsenic et d’uranium, les données indiquent la présence de divers métaux présentant un intérêt économique et technologique. Des terres rares sont présentes ainsi que de l’argent à des

154 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes concentrations atteignant les quelques µg.g-1. Ainsi, de part sa composition en métaux d’intérêt, le PG peut représenter une source intéressante d’étude de (bio)extraction. Le PG a donc été utilisé pour i) la formation de biocathodes et ii) la récupération des métaux.

3.1. Formation de biocathodes à partir du phosphogypse pour la récupération des métaux

Le phosphogypse a été utilisé pour inoculer des réacteurs (10 g) de 250 ml contenant 200 ml une solution acide (pH 3). Une électrode de travail de 3 cm2 en feutre de carbone GDL5 et une contre électrode en tissu de carbone sont immergées dans le réacteur et la production de courant cathodique est suivie par CA à -0,3 V après une semaine à -0,2 V vs. Ag/AgCl KCl saturé. Le PG se trouve être efficace pour produire un courant cathodique avec un courant maximal obtenu de -0,6 A.m-2 à 50 jours. Durant les 50 premiers jours le courant diminue progressivement jusqu’à atteindre son maximum, puis augmente jusqu’à -0,2 A.m-2 à 70 jours (Fig. 1A). Les données obtenues par CV montrent également que le PG a un impact sur l’électrode de travail. En effet, bien qu’au moment de l’inoculation une seule réduction soit visible entre -0,4 et -0,5 V vs. référence, plusieurs réactions apparaissent après 70 jours d’opération (Fig. 1B). Tout d’abord la réduction visible à l’inoculation n’apparaît plus, en revanche une forte réduction est visible à 0 V vs. référence. De plus, une forte oxydation est visible à 0,4 V vs. référence ainsi qu’une réduction probablement associée à 0,2 V. Les deux profils, celui de la CA et de la CV, laissent penser que la production de courant est bien due à une activité microbienne conduisant à plusieurs réactions électrochimiques à la biocathode. Plusieurs tentatives d’analyse de la communauté microbienne associée à la biocathode formée à partir du PG n’ont pas abouti probablement à cause des fortes teneurs en métaux.

155 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

Figure 1 : Electrochimie des réacteurs utilisant le PG comme inoculum. A) CA (-0,3 V vs. référence ; 30°C) et B) CV (5 cycles à 20 mV.s-1), la courbe rouge représente le 5ème cycle obtenu directement après l’inoculation et la courbe bleue le 5ème cycle obtenu à 70 jours.

3.1. Extraction des métaux à la biocathode

La récupération des métaux à la biocathode a été déterminée par ICP-MS après les 70 jours d’expérimentation en réacteur. Le tableau 1 montre la concentration en µg.cm-2 des différents métaux étudiés. Une rapide observation montre que l’électrode de travail (WE) permet de récupérer une plus grande quantité de métaux bien que ceux-ci soient également présents sur la contre électrode (CE). Ainsi, parmi les principaux métaux industriels (production minière suppérieure aux millions de tonnes/an) la WE extrait entre 4 et 8 fois plus que la CE à l’exception du cuivre extrait 11 fois plus sur la WE. Ce rapport est beaucoup plus variable concernant les « petits » métaux extraits en plus

156 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes faible quantité (production minière comprise entre 20 kT et 1 millions de tonnes/an) avec des extractions de 6 à 109 fois plus importantes sur la WE que sur la CE pour le magnésium et le molybdène respectivement. Les terres rares, classées parmi les « petits » métaux sont également plus extraites sur la WE mais l’amplitude du rapport est plus faible allant de 9 à 16 fois plus. L’argent, le seul métal précieux (production minière inférieure à 20 kT/an) dosé ici, est extrait plus de 300 fois plus sur la WE que la CE. Enfin des métaux toxiques tel que l’uranium et l’arsenic sont extraits et présentent également une concentration plus importante sur la WE.

Bien que les concentrations soient infimes, de quelque µg.cm-2 à 1 mg.cm-2 pour le magnésium, il n’en reste pas moins que l’extraction des métaux utilisant une biocathode fonctionnelle peut se faire. De plus, les rendements d’extraction obtenus avec le PG surpassent allègrement les résultats obtenus pour l’étang de Berre (Fig. 2). En effet, concernant les grands métaux industriels, plus de 70 % du cuivre présent dans le réacteur est fixé sur l’électrode de travail pour un rendement global avoisinant les 90 % d’extraction (Fig. 2A). Le manganèse et le plomb présentent également un rendement d’extraction total supérieur à 80%. Les « petits » métaux se voient aussi pourvus d’un rendement de même ampleur. A titre d’exemple, le magnésium, le cobalt et le molybdène bénéficient d’une extraction totale de 80 % avec la quasi totalité du molybdène extrait sur l’électrode de travail (Fig. 2B). Les terres rares sont également extraites avec des taux d’extraction moindres variant de 15 % pour le lanthane à 40 % pour le gadolinium sur la biocathode et aux alentours des 10 % sur la contre électrode (Fig. 2C). L’argent est le métal le mieux extrait du PG. Celui ci se voit pourvu d’un rendement d’extraction de 98%, dont 97 % proviennent de la biocathode (Fig. 2D). Enfin, parmi les métaux présentant un faible intérêt économique mais considérés comme toxiques se trouvent l’arsenic et l’uranium avec des rendements totaux de 25 et 68 % respectivement (Fig. 2E). Ces rendements sont élevés et sont extrêmement encourageants quant à l’utilisation de la biocathode pour la récupération des métaux. Cependant, étant donnée la nature du PG, la réalisation d’un témoin négatif est difficile à réaliser. En effet, celui-ci prend en masse à l’autoclave, rendant impossible son utilisation comme contrôle abiotique. Cependant, plusieurs pistes peuvent laisser place à la distinction entre les phénomènes biologiques et les phénomènes d’électrodéposition. Tout d’abord, les potentiels auxquels travaillent les électrodes ne sont pas les mêmes, si le potentiel de la biocathode est imposé à -0,3 V vs. référence,

157 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes celui de la bioanode évolue librement aux alentours de 1 V vs. référence (données non montrées). De ce fait, si les cations sont principalement attirés par la charge négative de la cathode, la fixation de métaux à la contre électrode, suggère que les bactéries développées sur celle-ci séquestrent aussi les métaux et de ce fait peut laisser penser que l’activité bactérienne à la biocathode est également impliquée dans les hauts rendements obtenus. D’autre part, si une grande partie des métaux déposés à la biocathode se fait par électrodéposition, cela n’explique pas la présence de lanthanides dont le potentiel de demi réaction est très nettement inférieur à celui imposé à la cathode (Kamenskaya, 1984 ; Mikheev, 1984 ; Konami et al., 1990). Ainsi, la présence de terres rares à la biocathode peut s’expliquer par l’activité microbienne qui séquestre les éléments en suspension.

Quoi qu’il en soit, si le processus visant à concentrer les métaux à l’électrode n’est pas entièrement compris à l’issue cette étude, les résultats sont encourageants pour une telle application en visant notamment les terres rares dont la séquestration ne peut être pleinement expliquée par le changement d’état en lien avec le potentiel de la cathode. Cependant, cette approche n’est pas complétement autonome. En effet, l’utilisation d’un système potentiostatique nécessite l’apport d’une source d’énergie et n’est alors pas rentable. Afin de valoriser au mieux cette potentielle application des biocathodes, et même des bioélectrodes, il est préférable de pouvoir travailler en pile afin d’avoir un système autonome d’un point de vue énergétique. Cette approche a été envisagée avec le PG mais les PCMs se sont révélées inefficace, l’anode n’étant pas fonctionnelle.

La suite des travaux présentés œuvre dans ce sens. L’étude suivante est le fruit de deux travaux menés en parallèle sur la séquestration des métaux et sur la formation de pile à partir d’un sédiment marin côtier.

158 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

Tableau 1 : Concentration en µg.cm-2 des différents métaux dosés par ICPMS extraits de l’électrode de travail (WE) et de la contre électrode (CE).

WE (GDL5) CE (tissu de carbone) Principaux métaux industriels Al 738,24 (± 464,14) 85,25 (± 5,58) Cr 44,90 (± 25,37) 5,24 (± 0,32) Mn 19,08 (± 8,88) 2,82 (± 0,37) Fe 719,28 (± 308,64) 163,22 (± 33,73) Ni 11,57 (± 5,91) 1,81 (± 0,09) Cu 220,68 (± 70,45) 19,82 (± 8,37) Zn 99,69 (± 37,25) 17,37 (± 2,74) Pb 11,27 (± 3,72) 1,64 (± 0,47) « Petits » métaux V 24,57 (± 11,06) 0,28 (± 0,01) Mg 1 379,43 (± 492,26) 232,75 (± 18,31) Co 0,38 (± 0,18) 0,06 (± 0,00) Mo 15,22 (± 5,17) 0,14 (± 0,01) Terres rares La 3,28 (± 1,52) 0,37 (± 0,06) Ce 7,02 (± 3,19) 0,78 (± 0,06) Pr 1,17 (± 0,61) 0,10 (± 0,02) Nd 6,12 (± 3,25) 0,51 (± 0,09) Sm 1,26 (± 0,70) 0,10 (± 0,02) Eu 0,25 (± 0,14) 0,02 (± 0,00) Gd 2,21 (± 1,34) 0,14 (± 0,02) Tb 0,21 (± 0,12) 0,01 (± 0,00) Dy 0,81 (± 0,47) 0,05 (± 0,01) Ho 0,14 (± 0,08) 0,01 (± 0,00) Er 0,54 (± 0,32) 0,03 (± 0,01) Metaux précieux Ag 50,86 (± 25,79) 0,16 (± 0,03) Autres As 0,45 (± 0,21) 0,05 (± 0,01) U 19,93 (± 9,88) 0,25 (± 0,03)

159 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

Figure 2 : Rendements d’extraction (%) obtenus à l’électrode de travail (WE), la contre électrode (CE) et sur les deux électrodes. A) principaux métaux industriels, B) « petits » métaux dont C) les terres rares, D) métaux précieux et E) des métaux n’appartenant pas à ces catégories

160 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

Recovery of industrial and strategic metals in Sediment microbial fuel cell from the Berre lagoon

Nicolas CHABERTa,‡, Oulfat AMIN ALIa,‡, Philippe ORTETa, Bernard Angelettib, Mohamed BARAKATa and Wafa ACHOUAKa,*

aAix Marseille Univ, CEA, CNRS, UMR7265, ECCOREV FR 3098, LEMIRE, Laboratoire d’Ecologie Microbienne de la Rhizosphère et Environnement extrêmes, F-13108 St Paul Les Durance, France bCEREGE, Europôle de l'Arbois, 13545 Aix en Provence, France

‡These authors contributed equally to this work.

*Corresponding author: Lab Ecol Microb Rhizosphere & Environ Extrem (LEMiRE), 13108, Saint Paul-Lez-Durance, France. E-mail address: [email protected]

Abstract

The Berre lagoon (in Southeastern France) is brackish water that has been subject to discharges of high concentrations of petroleum by-products and metals over the past century. Highly concentrated metals can result in toxic effects but some of them, including rare earth metals and platinoids, are at the heart of many emerging technologies. Here, we report the first investigation of metal recovery including rare earths with microbial fuel cells (MFCs). Experiments of laboratory MFCs and implanted SMFCs in the Berre lagoon were carried out. Both fuel cells could perform efficient power and current generation reaching 5.6 mW/m² (8.13 mA/m²) and 21 mW/m² (56.5 mA/m²) in SMFC and lab-MFC, respectively. These fuel cells electrodes were dominated by the Proteobacteria phylum. Furthermore, metals could be extracted and recovered on electrodes with rate as high as 93% for gold even though it was poorly present in the sediment. Rare earths could also be recovered up to 16% from the natural environment. Hence, microbial fuel cells represent an innovative cost-effective and promising method to recover metals without the need of any external supply.

Keywords: Microbial Fuel Cell; Rare earth elements; metal recovery; bioremediation; in situ MFC

161 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

1. Introduction

The Berre lagoon, located on the French Mediterranean coast in Marseille is one of the largest lagoons in Europe. It is a large basin of brackish water which has an area of 155 km² with average and maximum depths of 6 m and 9 m, respectively. The lagoon is surrounded by one of the largest petrochemical and metallurgical industrials plants since early 1930s. As a result, the lagoon has undergone intense anthropogenic activity over the past 60 years with direct discharges or atmospheric transfer of many contaminants. These emerging contaminants include polycyclic aromatic hydrocarbons, polychlorinated biphenyls, hydrocarbons and heavy metals mostly arsenic, cadmium, copper, lead, mercury and zinc (Hernandez-Raquet et al., 2006, Bernard et al., 2007; Rigaud et al., 2011 and 2012; Kanzari et al., 2015). Although metals are abundant in natural environments, their concentrations have dramatically increased due to the massive industrialization. Heavy metals are considered one of the most serious causes of environmental pollution and health risks. Those components are generally more persistent in the environment than organic contaminants like petroleum by-product or pesticides (Mathuriya et al., 2014). Because of their chemical properties, metals are involved in essential physiological functions but can also, at high concentrations, lead to genotoxicity of microorganisms and humans (Acconero et al., 2007; Bernard et al., 2007; Rigaud et al., 2011 and 2012; Mathuriya et al., 2014; Lu et al., 2015b; Mustapha and Halimoon, 2015; Nancharaiah et al., 2015; Wang et al., 2016).

In another vein, heavy metals are valuable resources for modern technology including many industrial, medical, and household applications (Mathuriya et al., 2014; Nancharaiah et al., 2015). Moreover, elements like gold, silver and rare earths are precious metals widely needed in ornaments and emerging technologies (Mathuriya et al., 2014, Lu et al., 2015b). Neodymium, for instance, is used to make efficient magnet in loudspeakers, hybrid cars and computers hard drives (Rim et al., 2013). However, these elements are very scarce in natural environments and their extraction is very harmful to environment. The great need for these elements leads thus to an increase in their price.

For all these reasons, the development of eco-friendly, cost-effective and sustainable processes to recover and/or remove these metals are needed. In this context, bioelectrochemical systems (BES) have emerged over the past decade as a successful and innovative method to metal removal or recovery (Donovan et al., 2008; Fu & Wang,

162 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

2011; Mathuriya and Yakhmi, 2014; Lu et al., 2015b; Nancharaiah et al., 2015; Wang et al., 2016). Indeed, BES couple the treatment of wastewaters contaminated with metals and/or organic matter with the possibility to produce electricity. BES represent both microbial electrolysis cells (MECs) and microbial fuel cells (MFCs) (Chabert et al., 2015; Nancharaiah et al., 2015).

MFCs are devices that can convert organic matter into electrical energy by microbial catabolism at the anode and generally reducing oxygen at the cathode. Actually, microorganisms catalysis occurs through formation of an electroactive biofilm (Chabert et al., 2015). Over the past years, MFCs have appeared to be eco-friendly, cost-effective and sustainable method to a variety of parallel applications to energy production (Erable et al., 2010; Parkash, 2016; Santoro et al., 2017). The utility of MFCs in metals recovery and electricity generation has been evidenced quite recently but most of these studies have been carried out at lab experimental scale except one sediment microbial fuel cell (SMFC) that was deployed in Pullman river, Washington, USA (Donovan et al., 2008, Mathuriya et al., 2014; Lu et al., 2015). The latter enabled Mn2+ monitoring without the need of any external energy supply (Donovan et al., 2008). Furthermore, rare earths elements as well as vanadium were very poorly studied in MFCs (Zhang et al., 2010; Hao et al., 2015; Li et al., 2016; Qiu et al., 2017).

In this work, we investigated the technical feasibility of recovering metals, including rare earths, using MFCs implanted in situ compared to those carried out in the lab. For this purpose, SMFCs have been implanted in the Vaïne pond, the most impacted area in Berre lagoon (Rigaud et al., 2012) and mesocosms were carried out with samples taken from the same site. Recovery of many metals, including rare earths, coupled to electricity generation in an environmental SMFC deployed in situ and a lab-MFC reactor without the need for an external energy supply has not yet been evidenced to our knowledge.

2. Materials and methods

2.1. Sediment microbial fuel cell build-up

Two SMFCs have been installed at the site of Berre Lagoon, a coastal lagoon in the Mediterranean Sea in southern France (43°23’30.9”N and 5°13’30.8”E, in the Vaïne

163 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes pond, Vitrolles). The lagoon of Berre is characterized by two basins, called the “grand étang” (to the west) and the “petit étang” or “Vaïne pond” (in the southeastern sector, representing about 20% of the surface area of the lagoon) separated by a shallow bottom crossing the lagoon from Berre l’Etang to Marignane (Acconero et al., 2008; Rigaud et al., 2011 and 2012).

The SMFC consisted of a 256 cm² thick carbon felt (Mersen) anode (16 x16 cm) and a cylindrical (3.5 x 16 cm) thin felt carbon (coated with GDL5 and MPL, PaxiTech) cathode. Electrodes were hoocked to titanium wires each and connected to a resistance of 3.3 KΩ. The two electrodes were separated by a distance of 13 cm. Titanium wires and the resistance were protected in PVC hose from water (Fig. 1). The SMFC were implanted on July 2016. The anode was buried at 10 cm depth and the cathode was completely immersed in seawater at 29°C. The experimental SMFC was supported by a stack to prevent from environmental disturbances and was imbedded for one month. In order to verify repeatability of these experiments, three SMFCs were implemented but one was blown away by the strong wind during this period.

Figure 1 : Design and configuration of experimental SMFC. A SMFC imbedded at 3m from the water’s edge is shown on the left. The SMFC is composed of A 256 cm² thick carbon felt anode and a cylindrical carbon felt cathode of 256 cm². Electrodes are hoocked to titanium wires each and connected to a resistance of 3.3 KΩ.

164 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

2.2. MFC reactors build-up

Sediments and seawater were collected at the same site where the SMFCs were implanted. The SMFCs mesocosms were carried out in 500 mL Schott Bottle (Fig. S1). An anode of 20 cm² (4 cm x 5 cm) was buried in the sediment and a cylindrical cathode of 20 cm² (4 cm x 5 cm) immersed in seawater from the Berre lagoon. These two electrodes were composed of a thick carbon felt (MERSEN) and a thin carbon felt GDL5 (Paxitech) respectively. The two electrodes were connected with a 3.3 KΩ resistance. The third electrode was an Ag/AgCl, KCl saturated reference electrode (Fig. 2). This experiment was carried out in triplicate to verify experiment’s repeatability.

2.3. Electrochemical analysis

Every two days, the resistance of the two SMFCs was removed and potentials of each anode and cathode were measured with a multimeter (Metrix MX22) versus an Ag/AgCl saturated with KCl reference electrode. The voltage difference between the two electrodes was also measured.

The current densities and power output were calculated using Ohm’s law mathematical equations:

I = V / R

W = V² / I

Where V (in volt) is the voltage difference between cathode and anode, R (Ohm) the resistance, I (Ampere) the intensity and W (Watt) the power.

A kinetic of current density and power output was performed during the month of operating period.

For lab-MFCs reactors (Mesocosms) (Fig. 2), electrochemical experiments were carried out using a multichannel potentiostat VMP3 and the EC-Lab software (Biologic, France). The kinetics of open circuit voltage was recorded versus reference electrode during one month. Current density and power output were calculated using Ohm’s Law mathematical equations.

165 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

2.4. Laser scanning confocal microscopy

Electrode samples were prepared and observed as described by Rousseau et al. 2016. Briefly, method consisted of labeling about 0.25 cm2 of electrode surface with SYTO®9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain (Invitrogen). Green tagged cells were imaged using an excitation at 489 nm and an emission at 510 nm. Carbon fibers are red-imaged using an excitation at 645 nm and emission at 620 nm using a Fluoview FV10i (Olympus) automatic confocal microscope.

2.5. DNA extraction from electrodes and sediment

Cells were detached from the electrode by first scraping the electrode in an artificial seawater medium with sterile scalpel and then recovered by centrifugation (8000 rpm, 20 min). Second, the electrode was placed in artificial seawater with approximately 2 g of sterile glass beads and vortexed at maximum speed for 10 minutes. After beads removal, the cells were collected by centrifugation and stored at -80°C until DNA extraction.

Genomic DNA was extracted and purified using the protocol described by Godon et al. in 1997. DNA amount and purity of extracts were determined by spectrophotometry (NanoVue-NV-GE, Healthcare Limited; UK).

2.6. DNA sequencing and postrun analyses

The primers of the universal rrs gene (encoding 16SrRNA) shown below have been used to amplify the region of the rrs V3-V4 gene by PCR: forward (5’- TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3’) and reward (5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3’). DNA samples were subjected to HTS By Illumina MiSeq Technology according to Illumina recommendations (16S Meta-genomic Sequencing Library Preparation, Part #15044223_B) with the V3 chemistry (2 x 300 bp). Sequencing procedure was performed as previously described (Demanèche et al., 2017). Barcoded amplicon sequencing processes (bTEFAP) were performed by Illumina miseq system (Lyon). Sequence data resulting from the sequencing process were analysed using the

166 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes protocol described by Hamidat et al. in 2016. Sequence data are available in NCBI SRA bank under accession number SRRxxxxxxx experiment SRXxxxxxxx.

2.7. Quantification of metallic elements by ICP-MS

At the end of the experiment, 1 cm² electrodes surface and 50 mg sediment were collected dried at 50°C, crushed with mortar, and weighed before being used. The samples were then placed in 70 % nitric acid and digested in an oven for 20 min at 250°C and 25 bar. After heat treatment, samples were filtered and diluted in 70% nitric acid at an exact final concentration of 3.5% for ICP-MS analysis. ICP-MS measurements were performed using a Thermo X series II model equipped with a collision cell (Thermo Fisher Scientific Inc.).

3. Results and discussion

3.1. Power generation of MFCs reactors and scaled-up SMFCs

Two sediment microbial fuel cells (SMFCs) were built up and implanted in the Vaïne pond. These SMFCs (in situ) electrodes have been connected to 3.3 KΩ resistances and monitored during one month. At the same time, lab mesocosms (in vitro) were set up with sediment and seawater from the same site. During the operating period, power and current densities kinetics were monitored versus a reference electrode (Fig. 2). The open circuit potential (OCP) of the anode, cathode and tension were monitored for one month for lab-MFCs and in situ SMFCs (Fig. 2A and B), which displayed two different profiles. Immediately after the deployment, the anode and the cathode OCPs for SMFCs were 68 mV and 83 mV vs. reference, respectively. The anode potential began to decrease and the cathode potential started to increase from day 2. The OCP reached a stable value 15 days later, and the cell’s potentials varied between 53 and 687 mV during the SMFC operation. The anode and cathode potentials of lab-MFCs were 191 mV and 156 mV vs. reference, respectively. After a 5 days lag time, the anode OCP reached a stable value of 7 mV while the OCP cathode increased to a value of 400 mV. OCPs values varied from 35 mV to 366 mV.

167 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

Figure 2 : Electricity generation of Sediment microbial fuel cells (SMFC) vs. in vitro lab- MFCs during operating period with 3.3KΩ resistance. A) Potential of the SMFCs in situ. B) Potential of the lab MFCs monitored under controlled conditions. C) Current intensity and power density of the SMFCs in situ and lab MFC in vitro.

168 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

In fact, differences between OCPs may be due to organic matter, metals and low level of oxygen in the lab-MFC compared to environmental conditions that may therefore, impact on the composition and functions of microbial communities (Hasany et al., 2016 ; Saratale et al., 2017a ; Saratale et al., 2017b).

In figure 2C, the current and power densities reached up to 8.13 mA/m² and up to 5.6 mW/m². Power generation under these natural conditions increased sharply in the first two weeks and tended to stabilize thereafter, producing a constant electrical output. In the lab-MFC, a more or less lag latency time was observed (Fig. 2C). However, the current produced in lab-MFC had the same profile as in SMFCs with subsequent increase and stabilization.

Surprisingly, the current produced in lab-MFCs was 4 times higher than that in SMFCs with power output and current density up to 56.5 mA.m-² and 21 mW.m-² respectively (Fig. 2C). In fact, electrical output in SMFCs took about 20 days to stabilize, whereas in lab-MFCs, it was stable from day 5. Changes in electrical values in lab-MFCs may be attributed to established biofilm and low oxygen flow compared to the natural environment (Fig. 2B and C) (Hasany et al., 2016 ; Saratale et al., 2017a ; Saratale et al., 2017b). With respect to power (and current) generation in SMFCs, electrical fluctuations may be related to the electrode high diversity of bacterial populations that slowly proliferate under changing natural conditions and form biofilms. These produce power and current densities in a stable and constant manner. (Borole et al., 2011 ; Hasany et al., 2016 ; Saratale et al., 2017a ; Saratale et al., 2017b).

3.2. Electroactive microbial biofilms development and communities analysis

Electrochemical monitoring for one month was followed by the analysis of electrodes. Figure 3 illustrates the biofilm developed on anodes and cathodes from lab-MFCs and SMFCs in situ. On lab-MFCs cathode, the microbial biofilm mainly covers carbon fibers (Fig. 3A). The cathode of SMFC is totally different because biofilm is observed in the space between the carbon fibers connecting these fibers (Fig. 3C).

Cathodes from SMFC appear to be more covered than those from the lab-MFC. This could be due to the continuous renewal of seawater because of marine current, which

169 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes brings nutrients and new microorganisms each time (Koch et al., 2017; Heidrich et al., 2018; Bowden and Li, 1997; Davey and O’toole, 2000; Stanley and Lazazzera, 2004).

Figure 3 : Confocal laser scanning microscopy images of microbial biofilm stained with SYTO®9. Bar, 20µm, 10X. Imaging was performed using excitation 488 and 647 nm, emission 560–590 nm (green channel) and 585–640 nm (red channel). A) and C) the Biofilms developed on cathodes from lab-MFCs and SMFCs respectively were developed on carbon felt B) and D) The biofilms developed on anodes from lab-MFCs and SMFCs respectively were developed on carbon thick felt.

With regard to anodes, biofilm has developed in the spaces between fibers, whether in MFCs or SMFCs (Fig. 3B and D). In SMFCs, biofilm seems more dispersed. Since biofilm structure influence MFC efficiency (Rousseau et al., 2016), it may explain differences observed in power output variation between in situ SMFCs and lab-MFCs.

DNA from biofilms and sediments was extracted and submitted to 16S metabarcoding to identify the microbial communities that developed on the electrodes and sediments (Fig.

170 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

4). The reads highlighted the presence of unidentified microorganisms affiliated to the Archaea kingdom, some of which were assigned to Crenarchaeota, while Euryarchaeota and Parvarchaeota phyla were poorly represented (data not shown). Archaeas presence in microbial fuel cells has already been shown but their role is not well known (Chae et al., 2010; Abrevaya et al., 2011; Shebab et al., 2013; Park et al., 2014). However, methanogenic archaeas have been widely evidenced for their involvement in syntrophic mechanisms including in microbial fuel cells (Parameswaran et al., 2009; Lu et al., 2012; Dolfing. 2014; Yamamuro et al., 2014; Lu et al., 2015).

Figure 4 : Relative abundance of the major microbial classes selected on anodes and cathodes from in vitro MFCs and in situ SMFCs. A) Anode extracted from SMFC in situ; B) Cathode extracted from SMFC in situ; C) Anode extracted from the lab MFC in vitro; D) Cathode extracted from the lab MFC in vitro.

OTUs clusters revealed that bacteria belonging to Proteobacteria phylum were the most represented on electrodes of lab-MFCs and SMFCs (Fig. 4) which is in concordance with literature where Proteobacteria are commonly found to dominate MFC system (Martins

171 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes et al., 2010, Mathuriya and Yakhmi, 2014; Chabert et al., 2015). However, comparison between SMFCs and lab-MFCs shows important differences in microbial communities repartition (Fig. 4). Apart from the anode of the lab-MFC, all other electrodes were covered by mainly one dominant microbial group. ε-Proteobacteria (66%) and α- Proteobacteria (45%) are respectively found in the anode (Fig. 4A) and cathode (Fig. 4B) extracted from the SMFC in situ. Furthermore, while the cathode extracted from lab- MFC is covered by the class of the γ-Proteobacteria (61%) (Fig. 5D), microorganisms are more spread on the anode. The latter is in fact covered by many predominating classes such as the ε-Proteobacteria (28%), β-Proteobacteria (25%) and γ-Proteobacteria (20%) (Fig. 4C). Proteobacteria phylum is widespread in all environments (Spain et al., 2009; Marin, 2011; Mathuriya et al., 2014; Chabert et al., 2015; Park et al., 2017). Many of the microorganisms belonging to this phylum were investigated and found to be involved in electroactivity as they catalyze extracellular electron transfer in MFCs (Rabaey et al., 2007; Chabert et al., 2015; Rahimnejad et al., 2015). In order to depict

OTU clusters and better insight selective bio-colonization on electrodes, a Venn diagram was realized. It demonstrated that OTUs differed among the lab-MFCs in vitro and in situ SMFCs electrodes (Fig. 5). Actually, compartment-specific OTUs ranged from 574 (lab- MFC cathode) to 5149 (SMFC cathode), while only 68 OTUs were shared among all compartments. Indeed, microorganisms belonging to the class Acidimicrobiia, α- Proteobacteria and Planctomycetia were dominant in all compartments. The comparison with OTUs found in natural sediment illustrated a microbial selective colonization that occurred on electrode surfaces. Nonetheless, anodes shared more OTUs (426) with the natural sediment than cathodes (91), which were mainly colonised by planktonic bacteria from water column. Nevertheless, bacteria belonging to generaas Desulforhopalus sp., Desulfospira sp., Thiomicrospira sp., Sulfurimonas sp. and Ignavibacterium sp. could be selected on SMFC anode. On the other hand, lab-MFC anode was more selective for bacteria belonging to Desulfocapsa sp., Desulfomicrobium sp., Dethiosulfatibacter sp. and Acholeplasma sp. Nonetheless, 680 OTUs were shared by both lab-MFC and SMFC anodes. Indeed, Desulfovibrio sp., Desulfobacter sp., Desulfobulbus and Desulfotignum sp. could be commonly present on both anodes. All these microorganisms have already been found significantly on MFCs anode (Timmers et al., 2012; Daghio et al., 2016; Neave et al., 2011; Heidrich et al., 2014). Regarding both lab-MFC and SMFC cathodes, 574 (lab-MFC cathode) and 5149 (SMFC cathodes) OTUs were specific to each

172 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes cathode, while they shared 148 OTUs (Fig. 5). Among commonly shared OTUs, microorganisms that belong to genera Muricauda, Lewinella, Haliea and Polymorphum were found on both cathodes. However, none of these genera was described in MFCs. On SMFC cathodes, bacteria belonging to Marinicella sp., Shewanella sp., Rhodobacter sp. and Ferrimonas sp. were specifically present. Lab-MFC cathode was colonized specifically by bacteria belonging to genus Nitrosomonas, Hyphomicrobium and Nitratireductor. In fact, microorganisms belonging to these genera are commonly found in marine environments and most of them have been identified and described as marine electroactive bacteria involved in biocathodes catalysis (Vandecandelaere et al., 2010; Sarah M. Strycharz-Glaven et al.,2013; Rowe et al., 2015; Du et al., 2014).

Anode in situ

Anode in vitro 1Sediment

Cathode in situ Cathode in vitro

Figure 5 : Venn diagram representing the degree of bacterial OTUs overlapping among electrodes from lab-MFCs in vitro and in situ SMFCs.

173 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

Regarding SMFC anodes and cathodes, Maribacter sp. Oceanospirillum sp. and Photobacterium sp. could be found commonly. In situ SMFCs anodes (1996 OTUs) and cathodes (5149 OTUs) contained the more broad range OTUs and shared 777 OTUs. This could be due to the renewal of the natural environment, which leads to the colonization of electrodes by many different microorganisms (Bowden and Li, 1997; Davey and O’toole, 2000; Stanley and Lazazzera, 2004; Rousseau et al., 2016; Santoro et al., 2017). The cathode from SMFC in situ displayed the most broad range OTUs (5149), which can be explained by seawater turnover and weather fluctuations that the latter undergone. It should be considered that electroactive as well as non-electroactive microorganisms developed on electrodes from SMFC and lab-MFC, and that so higher microbial diversity is not necessarily correlated with electrical performances (Koch et al., 2017; Heidrich et al., 2018).

Besides, most of the families identified on both electrodes have been found in traces metals and hydrocarbon contaminated sites (Hemme et al., 2010, Quillet et al., 2011; Neave et al., 2011; Gołębiewski et al., 2014; Heidrich et al., 2014, Galitskaya et al., 2016; Hari et al., 2017).

3.3. Metallic elements concentration in lab-MFCs and SMFCs

Electrodes and sediments from the lab-MFCs and SMFCs were then analyzed by ICP-MS to determine metallic elements present on the electrodes. Sediments and electrode materials that have not been treated were used as control. Metallic elements were classified into the following categories: (i) industrials metals that are heavily produced (more than millions of tons per year), (ii) small metals (Less than millions tones but up to 20 kilotons per year), (iii) noble metals (Less than 20 kilotons per year), (iv) other metals (non-included in the previous class) and (v) rare earths (Table. 1 and Fig. 6). In addition, extraction percentages were calculated for lab-MFCs only, as we had a known mass of sediment input. The two electrodes from lab-MFCs and SMFCs showed important concentrations of numerous metallic elements (Table. 1). High concentrations of elements such as Al, Fe, and Mg were found on both electrodes. For instance, Fe was present at 399, 262, 800 and 1400 µg/cm² on the anode and cathode from lab-MFC and SMFC, respectively. Other less concentrated elements such as Ag, Au, Cu, Mn, Mo and Zn were also detected on the electrodes. It is interesting to note that, elements like silver

174 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes and gold were poorly present in the sediment but could be extracted at 55% and 93% on both electrodes, respectively. Most of these metals were particularly concentrated on cathodes. Therefore, these results strongly suggest a higher cathode-metal interaction that could be attributed to a reduction of these elements. Elements such as Arsenic, cadmium, chromium, cobalt, lead, nickel and uranium already present in sediment could also be detected on both electrodes. These elements could be concentrated up to 38% on electrodes with As (6%), Cd (36%), Cr (3%), Pb (16%), Ni (11%) and U (3%). These elements were mostly present on cathodes which showed a strong cathode-metal interaction. Scarce metals such as Vanadium were also found on the electrodes as it could be extracted at 2% on the electrodes. The analysis showed that rare earth elements could also be detected on the electrodes (Fig. 6). Lanthanum (2%), cerium (4%), neodymium (1.2%) and samarium (1%) could be concentrated on the electrodes. Although, these elements were poorly present in natural sediments they could be recovered on the electrodes. For instance, 5 µg/g of lanthanum was present in the sediment and was recoverable at 0.4, 0.17, 1.95 and 1.16 µg/cm2 on the anode and cathode in MFC and SMFCs, respectively (Fig. 6). In this case, rare earths were more concentrated on anodes whether in vitro or in situ. These elements are therefore more in favour of an anode-metal interaction.

It is worth noting that the electrode potential varies according to the treatment applied in situ or in vitro. However, the metals extracted in both treatments have substantially identical concentrations or at least similar orders of magnitude. Hence, the recovery of metals on electrodes whether in lab-MFCs or SMFCs could be indirectly, as well as directly, attributed to microbial activity. Indeed, electroactive bacteria, specifically developed on anodes, induce a negative charge at the cathode by electron transfer where metals are attracted. This process can lead therefore to bacteria-induced electroplating (Choi and Sang, 2016; Ucar et al., 2017). . The most striking example is rare earths, for which the half reaction potentials are very low (Kamenskaya, 1984 ; Mikheev et al., 1984 ; Konami et al., 1990) and which are mainly found on the anode, so the charge is not in favour of cations sequestration. This leads us to consider a biological mechanism that likely results from microbial activity. Diverse bacterial species had been shown to bioaccumulate rare earths on their external membranes (Texier et al., 1999 ; Takahashi et al., 2005 ; Tsuruta et al., 2007 ; Ilyas et Lee, 2014) and, thus, might explain metals recovery on anodes. Actually, bacterial metabolism may be responsible for

175 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes precipitation of metals on the electrodes, for example by oxide formation. Indeed, microorganisms can interact with a wide range of metals and metalloids and remove or recover them through numerous mechanisms such as biosorption, bioaccumulation, bioreduction and biomineralization, bioprecipitation or bioleaching (van Hullebusch et al., 2003; Nancharaiah et al., 2016). Metals also play different roles in bacteria growth. They can be used for physiological needs such as metallo-protein (Foster et al., 2014). Metals also play different roles in bacterial growth. They can be used for physiological needs such as metalloproteins (Foster et al., 2014). Some of them, such iron, can be used as energy sources to sustain chemotrophic growth (Emmerson et al., 2010; Bird et al., 2011; Konhauser et al., 2011; Bonnefoy et Holmes, 2012). Microorganisms can also transform and precipitate metals or metalloids to avoid their toxicity (Haouari et al., 2008; Amin et al., 2013). Metal-microorganisms interaction has been studied extensively for metal biotechnology in many branches including biomining, bioremediation, wastewater treatment, and microbiologically influenced corrosion. Hence, it led to the development of biotechnological processes for the extraction of metals from ores, bioremediation of contaminated sites, treatment of metal-containing wastes, recovery of metals, and mitigation of biocorrosion (Nancharaiah et al., 2015 and 2016). To this end, the impact of microbial activity on metals should be exploited to develop highly innovative and cost-effective method for recovering and removing a wide range of metals from natural environments. In addition, bioelectrochemical recovery and removal of heavy metals from wastewater or solid wastes have been discussed and studied in some detail in recent years (Donovan et al., 2008; Fu & Wang, 2011; Mathuriya and Yakhmi, 2014; Lu et al., 2015b; Nancharaiah et al., 2015; Wang et al., 2016). In fact, Choi and Cui (2012) developed a cost-effective microbial fuel cell system to recover silver metal from silver ion containing wastewaters. With initial concentrations from 50 ppm to 200 ppm, they could recover 99.91 % of Ag. Moreover, silver recovery efficiencies were coupled with current production of 4.25 mW/m² and 5.67 A/m². In 2008, Donovan et al. deployed a SMFC in the Palouse River, Pullman, Washington as a biosensor to monitor Mn2+. The SMFC produced 24.2 mA/m² and a maximum power density of 12 mW/m².

Scarce metals like rare earths have not yet been studied in MFCs except for vanadium, a transition metal. In fact, very few studies have been conducted recently on the reduction or removal of vanadium (Zhang et al., 2010; Hao et al., 2015; Li et al., 2016; Qiu et al.,

176 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

2017). However, up to date, there has been no investigation on rare earths in terms of recovery or removal processes to our knowledge. Here different rare earths have been studied on MFCs and SMFCs and have show a fairly efficient recovery, considering that these elements are not abundant and could be recovered on electrodes without external power supply.

4. Conclusion

Our aim was to propose a new sustainable and cost-efficient way to extract a wide range of metals offering economical and ecological interest. In this way, metal recovery attempted using a lab-MFC using Berre Lagoon’s sediment as inoculum. This one showed good efficiency in both power production and metal recovery on electrodes. Furthermore, SMFCs were implanted in Berre Lagoon to validate in situ application of such system. The latter provided encouraging results. Strategic metals such as gold exhibited up to 96 % of recovery and rare earths extraction rate were about 16 %. Thus MFCs appear to be a self-sustaining system for in situ power production coupled to metal recovery, including rare earth elements. To our knowledge, this is the first time where MFCs were used to recover rare earths on electrodes coupled to energy production. Moreover, this is the first scale-up of a sustainable SMFC with high recovery efficiency for a wide range of metal.

5. Acknowledgements

This work was supported by an IRTELIS Ph.D. program grant from the CEA. We acknowledge funding from the ANR BioElec (ANR-13-BIME-006), the Amidex Microbio- E program, and the CEA’s DRT/DSV program.

6. Conflict of interest

The authors declare that they have no conflict of interests.

177 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

Table 1 : Metallic elements concentrations recovered on SMFCs and lab-MFCs electrodes detected by ICP-MS.

Metal Anode in situ Cathode in situ Anode in vitro Cathode in vitro elements (µg/cm2) (µg/cm2) (µg/cm2) (µg/cm2) Industrial metals Al 311.41 (±155) 1405.91 (±189) 211.84 (±142.5) 296.01 (167.3) Cr 8.22 (±10.5) 10.56 (±6.4) 2.05 (±1.9) 3.63 (±0.4) Cu 3.72 (±3.8) 47.90 (±24.6) 2.89 (±1.6) 60.41(±47.2) Fe 800.29 (±663.2) 1400.50 (±22.4) 399.64 (±289) 262.29 (±63.9) Pb 2.67 (±3.3) 6.23 (±1.3) 0.93 (±0.5) 3.72 (±2.9) Mn 18.83 (±16.1) 127.82 (±93.3) 7.46 (±6.4) 6.00 (±2.8) Ni 1.01 (±1.1) 6.49 (±2.1) 0.82 (±0.9) 2.57 (±1.2) Si 68.38(±73) 758.73 (±112.9) 11.4 (±14.8) 450.95 (±77.8) Zn 9.57 (±6.2) 69.83 (±16.9) 9.00 (±9.9) 89.45 (±36.4) Small metals Cd 0.01 (±0.01) 0.16 (±0.04) 0.03 (±0.03) 0.20 (±0.07) Co 0.14 (±0.08) 0.57(±0.05) 0.10 (±0.07) 0.15 (±0.05) Mg 630.12 (±44) 1110.77 (±364) 887.06 (±581.5) 1339.82 (±383.3) Mo 0.06 (±0.02) 0.34 (±0.1) 0.15 (±1.3) 6.10 (±0.1) V 0.95 (±0.6) 2.92 (±0.3) 0.67 (±0.5) 0.30 (±0.1) Rare earths Ce 4.25 (±4.7) 2.10 (±0.4) 0.81 (±0.4) 0.24 (±0.04) La 1.95 (±2.0) 1.16 (±0.1) 0.42 (±0.2) 0.17 (±0) Nd 1.82 (±2) 0.91 (±0.2) 0.37 (±0.2) 0.09 (±0.04) Sm 0.36 (±0.4) 0.17 (±0.02) 0.07 (±0.04) 0.01 (±0) Noble metals Au 0.007 (±0) 0.04 (±0) 0.74 (±0.2) 0.094 (±0.03) Ag 0.01 (±0) 0.52 (±0.6) 0.05 (±0.1) 0.38 (±0.4) Other metals As 0.27(±0.2) 1.35 (±0.2) 0.34 (±0.1) 0.27 (±0.1) U 0.20 (±0.1) 0.12 (±0.03) 0.05 (±0.03) 0.04 (±0.01)

178 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

Industrial metals 70 60 Al 50 Cr 40 Cu Fe 30 Mn 20 Ni Pb 10 0 Small metals 50 40 Cd 30 Co Mg 20 Mo 10 Extraction rate (%) Extraction rate (%) 0 Rare earths 20

15 Ce La 10 Nd

5 Extraction rate (%) 0 Noble metals 100,0 80,0 Ag 60,0 40,0 Au 20,0 0,0 Other metals 5,0 4,0 3,0 As 2,0 U 1,0

Extraction rate (%) 0,0 Extraction rate (%) Anode Cathode

Figure 6 : Percentage of metallic elements extraction in lab-MFCs detected by ICP-MS. Here are represented isotopes of metallic elements.

179 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

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186 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

Supplementary data

Figure S1 : Schematic representation of the experimental configuration of the MFC reactor. The reactor is a mesocosm of the SMFC. A 20 cm² anode is buried in the sediment and a 20 cm² cathode immersed in the seawater from the Berre lagoon. Both electrodes are connected with a 3.3 KΩ resistance. The third electrode is an Ag/AgCl, KCl saturated reference electrode used here for electrochemical monitoring.

187 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

4. Commentaires et perspectives

L’utilisation des bioélectrodes pour la récupération de métaux à partir de sites industriels contaminés est une application facilement envisageable au vu des résultats obtenus avec les deux études menées sur le phosphogypse et sur l’étang de Berre.

Bien que l’efficacité de l’extraction soit meilleure dans l’étude menée sur le phosphogypse, cette dernière impliquait l’apport d’énergie extérieur au système pour son fonctionnement. La formation d’une biocathode à partir du phosphogypse reste néanmoins possible. Cependant, il n’est pas possible de former un système autonome in situ avec un tel échantillon, sachant que les réactions électrochimiques requièrent de l’eau. Il est toutefois possible de l’envisager en réacteurs électrochimiques. En revanche, l’implantation in situ d’une PCM dans l’étang de Berre a montré des résultats tout aussi encourageants. Auto-entretenue, la PCM a permis la récupération de métaux précieux tel que l’or et les terres rares présents dans le sédiment de l’étang. A l’exception des métaux cités dans ce chapitre, les rendements d’extraction les plus forts se font à la cathode justifiant encore une fois la forte interaction entre les métaux et les biocathodes.

Le fer représente environs 50 % des métaux industriels extraits que ce soit sur l’anode ou la cathode. Il est donc intéressant de se pencher sur la diversité bactérienne métabolisant le fer sur ces électrodes. En s’accordant sur la diversité fournie par Weber et ses collaborateurs (2006), il apparaît que plusieurs bactéries intimement liées au fer sont présentes. La diversité globale des électrodes n’est pas montrée mais il est possible de voir que des bactéries ferro-réductrices telles que Sulfobacillus, Desulfosporsinus, Desulfovibrio, Desulfobulbus, Desulfuromonas, Pelobacter et les archées Thermotoga et Thermodesulfobacterium dominent au niveau des anodes. Les bactéries du genre Rhodobacter sont également présentes. Ces mêmes bactéries se trouvent aussi sur la cathode où elles évoluent avec quelques genres bactériens réduisant le fer et également des bactéries ferro-oxydantes telles que Marinobacter, Thiobacillus et Acidovorax. L’identification a été faite au niveau du genre et non de l’espèce, la profondeur de lecture des séquences ne le permettant pas, et ne peuvent donc être formelles quant à la présence de bactéries ferro-oxydantes ou –réductrices sur les électrodes. Toutefois, dans l’hypothèse où ces dernières peuvent être présentes, elles pourraient participer à la précipitation du fer par formation d’oxyde de fer sur les électrodes.

188 Chapitre VI : Extraction de métaux aux électrodes

Si les résultats obtenus ne font pas la lumière sur les processus impliqués dans la séquestration des métaux il n’en reste pas moins que, dans le cas de l’étang de Berre, l’électrodéposition est assistée par le biofilm bactérien qui est responsable du potentiel des électrodes. Comme discuté précédement, les expériences menées ne font pas la lumière sur les processus impliqués dans la séquestration des métaux aux électrodes. L’un des phénomènes les plus attendus est bien évidemment l’électrodéposition induite par le potentiel des électrodes. Le potentiel étant lui même induit par l’activité bactérienne, notamment celles présentent à l’anode, favorisant la charge négative de la cathode. Cependant, plusieurs pistes sont en faveur de processus biologiques. En effet, les potentiels de travail des électrodes et leurs charges respectives n’expliquent pas entiérement pourquoi des métaux, dans des concentrations sensiblement identiques ou du moins des ordres de grandeur similaires, se retrouvent à l’anode et la cathode. D’autre part, le potentiel d’oxydoréduction de certains métaux étudiés, comme les terres rares, n’est pas en faveur d’une réaction à la surface des électrodes, ce dernier étant très bas. Cela conduit donc à considérer un mécanisme biologique pouvant résulter de l’activité microbienne. En effet, le métabolisme bactérien peut être responsable de la précipitation des métaux sur les électrodes par formation d’oxyde par exemple. D’autre part, des mécanismes comme la biosorption, la bioaccumulation ou encore la bioréduction (cf. I.4.1) peuvent intervenir dans la séquestration des métaux.

Ainsi, ces études ouvrent des perspectives quand à l’utilisation de voies biologiques et biotechnologiques pour la bioremédiation de métaux potentiellement toxiques mais aussi pour la récupération et l’extraction de métaux précieux. Pour continuer dans cette voie, d’autres échantillons sont testés en laboratoire comme notamment des déchets miniers acides qui fournissent d’ores et déjà des résultats très encourageants.

189

190

Discussion générale et perspectives

Conclusion générale et perspective

L’intérêt grandissant des PCMs et de la recherche fondamentale associée à cette technologie ont permis au cours de ces dernières années d’élargir nos connaissances générales concernant l’écologie microbienne associée aux électrodes mais également à mieux appréhender les interactions naturelles de ces bactéries dans leurs environnements. Bien que la technologie soit actuellement en train de prendre place au niveau industriel, il est primordial de continuer à mieux l’appréhender pour améliorer ses performances. C’est dans ce contexte que se place les travaux présentés dans ce mémoire de thèse. S’intégrant à l’ANR Bioelec, portée par le LGC de Toulouse, les objectifs étaient doubles. D’une part, une biocathode fonctionnant à pH neutre devait être conçue et d’autre part, nous devions élargir nos connaissances sur la diversité microbienne et les mécanismes de transfert extracellulaires d’électrons afin de lever un des verrous majeurs de la technologie des PCMs.

Dans le cadre de ce travail de thèse le fer s’est retrouvé au centre de nos recherches, de part son implication dans de nombreuses voies métaboliques. Le fer présente plusieurs aspects intéressants. D’une part, il est l’un des éléments les plus abondants de la croûte terrestre et n’est, de manière générale, que peu limitant dans de nombreuses applications industrielles. D’un point de vue microbiologique, le fer joue divers rôles. Il peut être impliqué dans les voies métaboliques bactériennes tant au niveau de la respiration anaérobie des bactéries ferro-réductrices que servir de source d’énergie chez les bactéries ferro-oxydantes. De plus, le fer est un élément indispensable dans la vie puisqu’il entre dans la composition de nombreuses métalloprotéines.

Le choix du fer comme élément central dans la conception de biocathode s’est fait à la suite du criblage de bactéries hétérotrophes. Dans les conditions opératoires choisies, aucune des souches choisies et isolées ne s’est avérée efficace pour catalyser la réduction de l’oxygène à la cathode. L’une des causes probables est la compétition qu’il peut exister entre la matière organique et la cathode, toutes deux pouvant agir comme potentiel donneurs d’électrons. Afin de palier à ce problème nous avons donc, dans un premier temps, orienté nos recherches vers une bactérie chimiolithoautotrophe.

1. Acidithiobacillus ferrooxidans

Les bactéries chimiolithoautotrophes sont diverses, toutefois peu d’entre elles tolèrent l’oxygène. En effet, ces dernières utilisent un donneur d’électron inorganique réduit

193 Conclusion générale et perspective comme source d’énergie or ces mêmes donneurs d’électrons peuvent aussi être spontanément oxydés par l’oxygène. De ce fait, beaucoup de ces bactéries sont microaérophiles ou anaérobies strictes à l’exception de quelques unes dont Acidithiobacillus ferrooxidans. Cette dernière est une bactérie acidophile ferro-oxydante qui est également capable d’oxyder des composés soufrés inorganiques réduits pour en tirer de l’énergie. Son caractère acidophile fait d’elle un excellent modèle d’étude pour les biocathodes car à ces pH, la réduction de l’oxygène est favorisée du fait de la forte concentration en proton. En revanche, A. ferrooxidans n’est pas connu pour former des biofilms bien structurés et denses.

Nos premiers travaux sur A. ferrooxidans ont donc porté sur cet aspect. La promotion du biofilm par le quorum sensing est un outil efficace chez A. ferrooxidans. En effet, les molécules C14-AHL permettent de densifier le “biofilm” sur le feutre de carbone conduisant également à l’obtention de courant cathodique deux fois plus important (Fig. 1).

Figure 1 : La production de courant cathodique par A. ferrooxidans est dépendante de la densité de cellules adhérées à la surface de l’électrode. L’adhésion de cellules à la surface du feutre de carbone GDL5 peut être améliorée par le quorum sensing. Le métabolisme de la bactérie impact également sur la production de courant pour laquelle le métabolisme du fer est dix fois plus performant.

194 Conclusion générale et perspective

Cette étude permet également de mettre en avant un possible transfert direct d’électrons chez la bactérie du fait que l’intensité du courant obtenu soit liée à la densité cellulaire en contact avec l’électrode. En revanche, la formation du biofilm n’est pas le facteur jouant le rôle majeur dans l’électroactivité de cette bactérie. En effet, la comparaison entre un biofilm sur feutre de carbone formé en présence de soufre ou de fer montre un écart de courant important. Le biofilm ayant métabolisé le fer permet d’obtenir des courants cathodiques dix fois plus importants que ceux obtenus avec un biofilm ayant métabolisé le soufre (Fig. 1).

Cette différence peut s’expliquer par les voies métaboliques d’A. ferrooxidans. En effet, le métabolisme du fer et du soufre n’impliquent pas les mêmes protéines. L’acquisition des électrons provenant du soufre à lieu dans le périplasme après que le soufre ait été internalisé alors que la récupération d’électrons provenant du fer a lieu au niveau de la membrane externe. En effet, le fer libre pouvant être toxique pour la cellule, la bactérie possède un cytochrome à la surface de sa paroi lui permettant d’oxyder le Fe(II) en Fe(III). Ce dernier est le cytochrome de type c2 (Cyc2) et est probablement impliqué dans l’électroactivité de la bactérie. Cette hypothèse se confirme avec la suite des travaux. En effet, les bactéries ayant métabolisé le soufre sont capables de rapidement produire du courant lorsque du fer est présent. Cela suggère donc que l’électroactivité d’A. ferrooxidans n’est pas un caractère constitutif mais bel et bien inductible par le fer.

Nos travaux montrent également que le transfert direct d’électrons n’est pas le seul mode de transfert extracellulaire d’électrons ayant lieu chez A. ferrooxidans. La présence de fer dans l’électrolyte permet de grandement améliorer les performances de la biocathode pour arriver à un maximum de -3,6 A.m-2. Cette amélioration concorde avec d’une part la densification des biofilms et d’autre part avec la présence de bactéries planctoniques qui sont relativement peu nombreuses en absence du fer. De plus, des biofilms tridimensionnels ont été pour la première fois observés chez A. ferrooxidans suggérant que probablement la bactérie a réussi à produire des polymères constituant une potentielle matrice permettant la cohésion entre les cellules et formant un biofilm. L’ensemble des observations réalisées laisse donc entrevoir la possibilité d’un transfert extracellulaire indirect d’électrons médié par le fer et impliquant également cyc2 (Fig. 2).

195 Conclusion générale et perspective

En somme, A. ferrooxidans est capable de produire les plus forts courants de la littérature concernant les biocathodes via deux modes de transfert extracellulaire d’électrons. Le premier est le transfert direct impliquant cyc2 (Fig. 2) dont l’expression est régulée par le fer et explique ainsi l’incapacité de la bactérie à produire du courant lorsque le métabolisme de la bactérie est basé sur l’oxydation du soufre (Fig. 2). Le fer peut agir également comme médiateur électrochimique entre la bactérie qui l’oxyde via Cyc2 et la cathode qui le réduit (Fig. 2).

Figure 2 : Le transfert extracellulaire d’électrons chez A. ferrooxidans est dépendant du métabolisme exprimé. Le métabolisme du soufre ne permet pas à la bactérie d’utiliser la cathode comme donneur d’électrons. Le métabolisme du fer quant à lui permet à la bactérie d’utiliser la cathode grâce au cytochrome Cyc2. Deux mécanismes de transfert extracellulaire d’électrons existent, un transfert direct et un transfert indirect utilisant le fer comme médiateur.

Cependant, les conditions opératoires favorables à l’utilisation d’A. ferrooxidans ne sont pas optimales pour coupler la biocathode à une bioanode, dans la mesure où nous n’avons pas réussi à former des bioanodes en milieu acide.

196 Conclusion générale et perspective

2. Pseudomonas brassicacearum

Pour se rapprocher des conditions optimales de fonctionnement des bioanodes il est nécessaire de trouver des bactéries catalysant la réduction de l’oxygène à la cathode. Or d’après nos premiers résultats, cela s’avère difficile.

Bien que hétérotrophe les bactéries du genre Pseudomonas sont connues pour finement réguler leur métabolisme en fonction du fer et également pour interagir avec ce dernier via des sidérophores et autres molécules excrétées. De plus, les Pseudomonas sont capables de catalyser l’oxydation de la matière organique à l’anode via des transferts indirects d’électrons, notamment l’espèce P. aeruginosa. Notre choix s’est porté sur P. brassicacearum car des outils génétiques sont disponibles chez cette dernière et peuvent permettre d’aller en profondeur dans les mécanismes de transfert d’électrons.

De manière assez inattendue, P. brassicacearum s’avère être capable de former des biocathodes via des médiateurs et là encore, la présence de fer améliore les performances. Plusieurs mécanismes semblent être impliqués mais vont majoritairement tous dans le sens des transferts indirects d’électrons. Premièrement, la pyoverdine, un sidérophore, semble jouer un rôle non négligeable puisque en son absence, la bactérie produit du courant beaucoup plus tardivement. La pyoverdine permet à la bactérie de récupérer le fer présent dans son environnement pour ses besoins physiologiques. Ainsi, son absence peut causer un ralentissement du métabolisme de P. brassicacearum expliquant ainsi ce démarrage tardif. D’autre part, la pyoverdine pourrait également être impliquée dans un transfert extracellulaire d’électrons.

Le DAPG a également été étudié comme potentiellement impliqué dans le transfert extracellulaire indirect d’électrons. Sa production étant régulée par le fer, cette molécule antifongique s’est révélée être un chélateur du fer. Cette action a pour conséquence de solubiliser le Fe(III) le rendant ainsi réductible à la cathode (Fig. 3). Le complexe DAPG- Fe montre également une très forte réversibilité de sa forme DAPG-Fe(II)-à sa forme DAPG-Fe(III) confirmant ainsi son action en tant que médiateur rédox. Ainsi, une fois oxydé à la cathode, le complexe peut réduire spontanément l’oxygène présent (Fig. 3). Dans le cas présent, la bactérie n’est donc pas directement impliquée dans la réduction de l’oxygène mais sa présence est indispensable pour la production de DAPG.

197 Conclusion générale et perspective

Figure 3 : Le DAPG est une molécule antifongique sécrétée par P. brassicacearum. Le DAPG chélate le Fe(III) et le complexe DAPG-Fe(III) formé peut se réduire à cathode. Suite à ça, il est probable que le complexe DAPG-Fe(II) s’oxyde spontanément à l’oxygène favorisant ainsi la réduction de l’oxygène.

Ainsi, il semble donc que le métabolisme hétérotrophe ne soit pas rédhibitoire pour concevoir une biocathode contrairement à ce qu’ont pu laisser penser nos résultats préliminaires. En revanche, le fer joue un rôle non négligeable et peut donc laisser penser que les conditions opératoires du criblages n’étaient pas optimales. Cependant les performances obtenues sont loin d’égaler celles d’A. ferrooxidans probablement car les conditions ne sont pas en faveur de la réduction de l’oxygène. Quoi qu’il en soit, à ce stade, il semble compliqué d’envisager les biocathodes comme efficaces pour améliorer les performances des piles à combustibles microbiennes. Il faut donc reconsidérer leur application. Cette étude à mis en lumière pour la première fois la formation du complexe DAPG-Fe et laisse entrevoir un nouveau mode d’action de ce métabolite antifongique dans le contrôle de pathogènes dans la rhizosphère, en le privant potentiellement du fer.

3. Interaction bactéries-cathode-métaux

Il commence à être d’avis général dans la communauté scientifique que l’utilisation d’une PCMs utilisant une bioanode et une biocathode pour la production d’énergie est de

198 Conclusion générale et perspective plus en plus difficile à envisager, la biocathode étant toujours un verrou majeur pour son implantation de masse. De ce fait, de nouvelles applications sont à envisager pour la biocathode. Nous concernant, nous avons observé la séquestration de métaux sur une électrode fonctionnant en biocathode lorsque du phosphogypse servait d’inoculum au réacteur. La question de savoir si la séquestration de ces métaux à l’électrode était due à la présence d’un biofilm ou au potentiel imposé est resté en suspens. Cependant, une étude similaire menée en parallèle en mésocosme et in situ dans l’étang de Berre, un étang salé et anthropisé, a également montré que même en fonctionnement biopile, des métaux et des terres rares étaient séquestrés à l’anode et à la cathode. Ici aussi les mécanismes intervenant dans la séquestration des métaux ne sont pas directement étudiés mais plusieurs pistes soulignent le rôle potentiel que jouent les bactéries dans la récupération de métaux sur les électrodes. D’une part, la récupération des métaux sur les électrodes, peut être indirectement attribuée à l'activité microbienne. En effet, les bactéries électroactives présentes sur les anodes induisent une charge négative à la cathode par transfert d'électrons où les métaux sont attirés par opposition de charge. Ce processus peut donc mener à l'électrodéposition induite par les bactéries. Cependant, alors que les potentiels des électrodes in situ ou in vitro étaient différents, le type et les concentrations des métaux récupérés au niveau des électrodes étaient similaires. De plus, des métaux, et notamment des terres rares sont retrouvés sur l’anode pour laquelle la charge n'est pas favorable à la séquestration cationique. Ceci amène donc à considérer un mécanisme biologique qui peut directement résulter de l'activité microbienne. En effet, diverses espèces peuvent accumuler des métaux et des terres rares sur leurs membranes et pourraient donc expliquer la récupération des métaux sur les anodes. D’autre part, le métabolisme bactérien peut être responsable de la précipitation des métaux sur les électrodes, par exemple par la formation d'oxydes. De plus, les bactéries peuvent interagir avec un large éventail de métaux et de métalloïdes et les récupérer par de nombreux mécanismes tels que la bioaccumulation, la bioréduction, la biominéralisation ou encore la bioprécipitation.

L’approche choisie reste difficile pour étudier en profondeur les mécanismes. En effet, de nombreuses interactions ont lieu au sein de biofilms multiespèces et rend ainsi difficile l’étude des différents mécanismes mis en jeu. L’utilisation de culture pure est nécessaire pour comprendre plus en profondeur les interactions bactéries-métaux- électrodes permettant la séquestration des métaux.

199 Conclusion générale et perspective

4. Conclusion

En somme, il est donc difficilement envisageable de pouvoir utiliser la biocathode pour améliorer la production d’électricité des piles à combustible microbienne, surtout une biocathode devant fonctionner à pH neutre. Cependant des études fondamentales sur la biocathode sont toujours nécessaires pour mieux comprendre les mécanismes de transfert extracellulaire d’électrons. En effet, l’étude des bioanodes a par exemple permis de mettre en lumière les pili conducteurs naturellement impliqués dans la réduction des oxydes fer. D’un point de vue fondamental l’étude des biocathodes offre d’intéressantes perspectives. Nous avons par exemple mis en évidence la chélation du fer par le 2,4-DAPG. Cette découverte peut avoir des implications importantes dans l’écologie microbienne des sols et les interactions plantes-bactéries. De plus il serait intéressant d’étudier la potentielle implication du DAPG dans l’efflux du fer de la cellule en réponse à un stress oxydant pour éviter la réaction de Fenton.

Les applications parallèles à la biocathode sont un meilleur faire valoir pour celle-ci. Dans notre cas, il est possible de l’envisager comme un outil utile à la bioremédiation des sites contaminés en métaux, traitement des eaux industrielles présentant le même type de pollution mais également pour l’extraction de métaux précieux et stratégiques. La poursuite des recherches au laboratoire se fait et va se poursuivre dans ce sens. C’est à dire comprendre et optimiser les mécanismes de séquestration des métaux aux électrodes microbiennes mais également valoriser ses interactions comme avec, par exemple, la synthèse de nanomatériaux à la biocathode.

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230 Table des illustratrions

Table des illustrations

Chapitre I

Figure 1 : Principe général simplifié d’une pile à combustible microbienne...... 22

Figure 2 : Représentation du cycle de formation d’un biofilm dépendant de divers facteurs environnementaux (modifié d’après Toyofuku et al., 2016)...... 23

Figure 3 : Représentation de la vie d’un biofilm durant lesquelles le quorum sensing intervient (modifié d’après Irie et Parsek, 2008)...... 25

Figure 6 : Résumé des différents paramètres influant sur la composition d’un EAB (d’après Saratale et al., 2017b) ...... 29

Figure 7 : Schéma du mécanisme indirect d’électrons mettant en jeu un médiateur à l’anode avec du glucose comme source d’énergie (d’après Lovley, 2006)...... 33

Figure 8 : Schéma du mécanisme indirect d’électrons mettant en jeu le H2 issu de la fermentation du glucose à l’anode (d’après Lovley, 2006)...... 33

Figure 9 : Schéma du mécanisme de transfert direct d’électrons mettant en jeu une protéine membranaire impliquée dans le transport d’électrons (d’après Lovley, 2006)...... 34

231 Table des illustratrions

Figure 12 : Différentes réactions pouvant avoir lieu à la cathode (gauche) et les potentiels d’oxydoréduction des couples associés (d’après He et Angenent 2006) . 38

Figure 14 : Schématisation de l’utilisation de manganèse comme médiateur électrochimique pour la catalyse de la réduction de l’oxygène à la biocathode (d’après He et Angenent, 2006) ...... 43

Figure 15 : Représentation des différentes intéractions bactéries-métaux impliqués dans la mobilisation (à gauche) et dans l’immobilisation (à droite) (d’après Nancharaiah et al., 2016) ...... 45

Figure 17 : Schéma de l’acquisition du fer par l’action de sidérophores chez les bactéries à Gram négatif (d’après andrews et al 2003). OM : Membrane externe (Outside- Membrane) ; CM : Membrane cytoplasmique...... 48

232 Table des illustratrions

Figure 20 : Schématisation du complexe protéique impliqué dans l’oxydation du fer chez A. ferrooxidans ATCC 23270T (en bas). L’ensemble protéique impliquant les

cytochromes Cyc1 et Cyc2, la cytochrome oxydase aa3 et la rusticianine A est codé par l’opéron rus (en haut) (d’après Herich et al., 2011) ...... 54

Figure 21 : Schéma d’une pile à électrosynthèse. Une générateur apporte un courant à la

cathode qui permet au biofilm présent de réduire le CO2 ou des composés organiques en molécules d’intérêt commercial (d’après Bajracharya et al., 2017) .. 59

Figure 23 : principe général de l’utilisation d’un EAB pour la synthèse de nanoparticules (d’après Kalathil et al., 2013) ...... 61

Revue bibliographique : All ecosystems potentially host electrogenic bacteria

Chapitre II

Figure 1 : Chronoampérometrie (Ewe = -0,2 V vs. Ref ; 25°C) de différentes souches utilisées pour la formation de biocathodes avec A) NO30, B) YAS34 et C) M. luteus . (Données de Marie Bertrand et Wafa Achouak ; non publiées) ...... 78

233 Table des illustratrions

Figure 2 : CA (-0,2 vs. référence ; 30°C) de 4 des 34 souches ZSTM ...... 83

Figure 5 : CA (-0,2 V vs. Référence ; 30°C) des 9 souches VNT isolées et identifiées ...... 88

Chapitre III

Figure 1 : Observation à microscopie confocale à 0, 3 et 7 jours de polarisation à -0,2 V vs. référence de fragment de l'électrode prélevé sur les électrodes formées avec du fer comme seule source d’énergie en présence et absence de C14 AHL ...... 100

Article 1 : Quorum sensing improves current output with Acidithiobacillus

ferrooxidans

Fig.1. Confocal microscopy imaging of a carbon felt electrode after 7 days of culture. Cells labelled green using Syto 9 were imaged using an excitation at 489 nm and an emission at 510 nm. Carbon fibres were red-imaged using an excitation at 645 nm and emission at 620 nm, in accordance with Rousseau et al., 2016. Electrode biofilms were formed by using ferrous iron (left column) or sulfur (right column) as energy sources, either with C14-AHLs (lower panels) or without C14-AHLs (upper panels)...... 96

Fig. 2. Chronoamperograms of 3 cm2 pre-colonized carbon felt bio-cathodes. Sulfur (A) or ferrous iron (B) was used as the prior energy source, either with C14-AHLs (red lines) or without C14-AHLs (black lines). CA was performed on MPG-2 potentiostat (Biologic) at E =0.2 V versus Ag/AgCl KCl saturated reference and T = 30°C...... 97

234 Table des illustratrions

Chapitre IV

Artcile 2 : Dual role of iron in the electroactivity of Acidithiobacillu ferrooxidans

addition to the electrolyte (FeSO4.7H2O at 15 mM). CV was performed for 3 cycles at a scan rate of 20 mV.s-1 ranging from -0.8 to 0.8 V vs. the reference. CVs are shown for reactors (C) without Fe(II) addition and (D) with Fe(II) addition to the

electrolyte (FeSO4.7H2O at 15 mM)...... 111

Figure 2 : Confocal microscopy imaging of carbon felt electrodes after 15 days of polarization at -0.2 V vs. the reference. Cells were labeled green using Syto®9, while carbon fibers appear in red. Electrodes were obtained from reactors inoculated with iron- or sulfur-pre-colonized electrodes (A and D) or iron- or sulfur-grown planktonic cells (B, C, E and F), and received either Fe(II) addition (D, E and F) or no Fe(II) addition (A, B and C) within the electrolyte. White scale bar: 100 µm; black scale bar: 5 µm...... 114

235 Table des illustratrions

reactor conditions. Sulfur metabolism does not allow electron uptake, as Cyc2 is absent...... 116

Chapitre V

Article 2 : Building biocathode with iron chelating 2,4-diacetylphloroglucinol

produced by Pseudomonas brassicacearum NFM421

Figure 1 : CA performed at -0,2 V. vs. reference at 30°C on carbon cloth electrodes for P. brassicacearum NFM421 WT (purple line), ΔphlD (grey line), mutant NFM421-4D1

(orange line), WT with 300 μ M FeCl3 (blue line), ΔphlD with 300 μ M FeCl3 (red

line) and mutant NFM421-4D1 with 300 μ M FeCl3 (green line)...... 130

Figure 2 : FTIR spectra of A) DAPG-Fe(III) complex and B) DAPG-Fe(II) complex obtained using different ratio between DAPG and Fe...... 134

Figure 3 : UV-visible spectra ranging from 200 to 700 nm for the DAPG alone and different ration of DAPG-Fe(III)...... 135

Figure 4 : Electrochemistry of DAPG with A) CA performed at -0,2 V. vs. reference and 30°C on carbon cloth in CAA electrolyte using 10 mM of DAPG (blue line) and 10

mM of DAPG with 30 ⎧M FeCl3 (red line). B) CV performed for 5 cycles at a scan rate of 5 mV.s-1. Profiles are obtained from 10 mM of DAPG (blue line) and 10 mM of

DAPG with 30 ⎧M FeCl3 (red line) after 60 min of polarization at -0,2 V vs. reference...... 136

Figure 5 : Electrochemically-induced FTIR difference spectra recorded with DAPG and Fe (ratio 2-1). The blue line represents Red minus Ox and the red line represents Ox minus Red...... 137

236 Table des illustratrions

Chapitre VI

Figure 2 : Rendements d’extraction (%) obtenus à l’électrode de travail (WE), la contre électrode (CE) et sur les deux électrodes A) grands métaux industriels, B) petits métaux dont C) les terres rares, D) métaux précieux et E) des métaux n’appartenant pas à ces catégories ...... 160

Article 4 : Recovery of industrial and strategic metals in Sediment microbial fuel

cell from the Berre lagoon

Figure 3 : Confocal laser scanning microscopy images of microbial biofilm stained with SYTO®9. Bar, 20µm, 10X. Imaging was performed using excitation 488 and 647 nm, emission 560–590 nm (green channel) and 585–640 nm (red channel). A) and C) the Biofilms developed on cathodes from lab-MFCs and SMFCs respectively were developed on carbon felt B) and D) The biofilms developed on anodes from lab- MFCs and SMFCs respectively were developed on carbon thick felt...... 170

237 Table des illustratrions

Figure 5 : Venn diagram representing the degree of bacterial OTUs overlapping among electrodes from lab-MFCs in vitro and in situ SMFCs...... 173

Figure 6 : Percentage of metallic elements extraction in lab-MFCs detected by ICP-MS. Here are represented isotopes of metallic elements...... 179

Supplementary data

Conclusion générale et perspective

238 Table des tableaux

Table des tableaux

Chapitre I

Tableau 1 : Comparaison de l’électroactivité des mutants construits chez S. oneidensis MR-1 et G. sulfureducens par rapport à la souche sauvage (extrait de Sydow et al., 2014) ...... 32

Tableau 2 : Recensement des différents accepteurs finaux d’électrons, inoculum et médiateurs utilisés pour les biocathodes ainsi que les puissances de courant obtenues (modifié d’après Huang et al., 2011 ; Rosenbaum et al., 2011 ; Erable et al., 2012)...... 40

Tableau 3 : Exemple d’échantillons naturels utilisés en PCM (modifié d’après Chabert et al., 2015). B-PCM : Benthique...... 56

Revue bibliographique : All ecosystems potentially host electrogenic bacteria

Table 1 Electrochemical activity of various environments ...... 67

Chapitre II

Tableau 1 : Liste des souches ZSTM utilisées pour la réalisation du criblage ...... 84

Chapitre V

Article III : Building biocathode with iron chelating 2,4-diacetylphloroglucinol

produced by Pseudomonas brassicacearum NFM421

Chapitre VI

Tableau 1 : Concentration en µg.cm-2 des différents métaux dosés par ICPMS extraits de l’électrode de travail (WE) et de la contre électrode (CE)...... 159

239 Table des tableaux

Article IV : Recovery of industrial and strategic metals in Sediment microbial fuel cell from the Berre lagoon

Table 1 : Metallic elements concentrations recovered on SMFCs and lab-MFCs electrodes detected by ICP-MS...... 178

240